Inhaltsverzeichnis HI I. Einleitung 1 1.1. Das gesunde Immunsystem
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Inhaltsverzeichnis I. 1.1. 1.1.1. 1.1.2. 1.1.3. 1.1.4. 1.1.5. 1.1.6. 1.1.6.1. 1.1.6.2. 1.1.6.3. 1.1.6.4. 1.1.6.5. 1.1.7. 1.1.8. 1.2. 1.2.1. 1.2.2. 1.2.2.1. 1.2.2.2. 1.2.3. 1.2.4. 1.2.5. 1.2.5.1. 1.2.5.2. 1.3. II. II. 1. 11.2. 11.3. 11.3.1. 11.3.2. IT.3.3. 11.3.3.1. 11.3.3.2. 11.3.3.3. 11.4. 11.4.1. 11.4.2. H.4.2.1. 11.4.2.2. 11.4.2.3. 11.4.2.4. 11.4.3. 11.5. 11.6. 11.7. H.8. II.8.1. HI Einleitung 1 Das gesunde Immunsystem ] Gliederung des immunsystems 1 Antigene fuhren zur Aktivierung von T- Zellen 2 Antigene führen zur Aktivierung der B- Zellen und Produktion von Antikörpern. 3 + Differenzierung von naiven CD4 T- Zellen zu Effektor- oder Gedächmiszellen.. 3 TH1 / TH2 Dichotomie 4 Die Differenzierungsantigene (CD-Moleküle) 5 CD27 5 CD28 6 CD45- Isoformen 6 CD69 7 CD154 7 Zytokine 9 T-Zelltoleranz 10 Sklerodermie 11 Epidemiologie und Klinik 11 Die Pathologie der Sklerodermie 12 Pathophysiologische Bedeutung der Apoptose 13 Die Sklerodermie zeigt HLA Assoziationen 14 Therapie der PSS 14 Sklerodermie - eine T- Zeil vermittelte Autoimmunerkrankung ? 15 Die Autoantigene Scl-70 und CENP-B 17 Das Autoantigen SCL-70 = Topoisomerase 1 17 Das Autoantigen Centromeric Protein B (CENP-B) 17 Herleitung der Aufgabenstellung 18 Materialien und Methoden 19 Allgemein verwendete Materialien und Geräte 19 Patienten und gesunde Spender 20 Zellpräparation 20 Bestimmung von Zellzahlen 20 Isolierung von PBMC aus peripherem Blut 20 In vitro Stimulation von Vollblut 21 Stimulation 21 Eingesetzte Antigene 22 Erythrozytenlyse und Fixieren der Zellen 23 Fluoreszenzeigenschaften von Zellen und deren methodische Nutzung 23 Fluoreszenz 23 Immunfluoreszenzfärbung von Zellen 23 Extrazelluläre Färbung auf PBMC 23 Extra- und intrazelluläre Färbung von fixierten und permeabilisierten 24 Zellen 24 Verwendete Antikörper und Farbstoffe 24 Das Prinzip der Durchflusszytometrie 25 Fluoreszenz aktivierte Zellsortierung (FACS) 27 Magnetische Zellsortierung (MACS) 28 Analyse der Lymphozytenverteilung 29 Identifizierung autoreaktiver TH- Zellen 30 Isolierung antigenspezifischer CD 154* TH-Zellen 31 Stimulation 31 Bibliografische Informationen http://d-nb.info/992334055 digitalisiert durch rv 11.8.2. 11.8.3. 11.8.4. 11.8.5. U.8.6. 11.8.7. 11.8.8. H.9. 11.9.1. II.9.1.1. H.9.1.2. 11.9.2. III. ULI. III. 1.1. ni.1.1.1. m.1.1.2. IB. 1.1.3. III.1.2. III.1.2.1. in. 1.2.2. in.1.3. HI.2. III.2.1. IH.2.1.1. IO.2.1.2. 111.2.1.3. 111.2.1.4. IH.2.1.5. 111.3. III.3.1. HI.3.2. 111.3.3. 111.3.4. 111.3.5. 111.4. 111.4.1. 111.4.1.1. HI.4.1.2. IH.4.1.3. HI.4.1.4. 111.4.2. HI.4.2.1. 111.4.2.2. 111.4.2.3. IV. Inhaltsverzeichnis Sortierung 32 Herstellung von nicht teilungsfähigen PBMC 33 Kultivierung der sortierten antigenspezifischen TH- Zellen 33 Erneute Antigenstimulation nach 2 Wochen 34 Restimulation und Analyse der Spezifität der expandierten TH- Zellen 34 CFDA Markierung 35 Einfrieren von Zellen 35 Auswertungen 35 Auswertung der durchflusszytometrischen Daten 35 Setzen der Analyseregionen 35 Setzen der Analyseregionen für die Oberflächenanalysen: 37 Statistische Auswertung 38 Ergebnisse 39 Vergleich der Lymphozytenverteilung von PSS- Patienten und Normalpersonen... 39 Die Verteilung verschiedener T-Lymphozytenpopulationen 40 Das Verhältnis von CD4* zu CD8'T-Lymphozyten bei Patienten und NP 40 + Die Verteilung von naiven und Gedächtnis- CD4 T- Lymphozyten 41 Die Verteilung der Subpopulationen innerhalb der CD8* T- Lymphozyten 42 Verteilung verschiedener B- Lymphozytenpopulationen 43 Verteilung von CD19* B-Lymphozyten 43 Verteilung naiver- (IgD+/CD27-), Gedächtnis- B- Zellen (IgD7CD27+) und CD207CD27H'Plasmablasten 43 Verteilung der NK- Lymphozyten 44 TH- Zellreaktivitäten auf Modellantigene 45 Antigen spezifische Stimulationen mit CMV, EBV und TT 46 Extrazelluläre Ausprägung von CD69 nach Stimulation mit CMV, EBV und TT.. 47 Koexpression von CD69 / IFNy nach Stimulation mit CMV, EBV und TT 48 Koexpression von CD69 / TNFa nach Stimulation mit CMV, EBV und TT 49 Koexpression von CD69 / IFNy / TNFa nach Stimulation mit CMV, EBV und TT 50 Zusammenfassung 51 Detektion autoreaktiver TH-Lymphozyten 53 Definition einer spezifischen TH- Zellreaktion 53 IFNy produzierende autoreaktive TH-Zellen 54 TNFa produzierende autoreaktive T- Zellen 55 IFNy und TNFa produzierende autoreaktive T-Zellen 55 Abhängigkeit der Reaktivitäten von der Therapie 56 Generierung Antigen spezifischer TH- Zelllinien 58 Generierung einer Tetanustoxoid spezifischen TH- ZelUinie 58 Auswahl des Blutspenders 58 Aussaat der Zellen und Kultur 58 Entwicklung der Zellzahlen 59 Spezifitätsprüfung der Zelllinie 60 Generierung einer CENP-B spezifischen TH- Zelllinie 62 Auswahl des Spenders 62 Stimulation, Sortierung und Aussaat der Zellen 62 Restimulation und Spezifitätsprüfung nach 4 Wochen Kultur 64 Diskussion 67 Inhaltsverzeichnis IV.l. IV.2. IV.3. IV.3.1. IV.3.2. IV.3.3. IV.4. IV.4.1. IV.4.2. IV.4.3. IV.5. IV.5.1. IV.5.2. V. VI. VII. VUI. DC. X. Prinzipielles zur Auswahl der Untersuchungsparameter 67 Therapieeffekte und Patientenauswahl 68 Oberflächenanalysen 69 Oberflächenanalysen von T-Zellen 69 Oberflächenanalysen von B - Zellen 70 Oberflächenanalysen von NK- Zellen 70 Identifizierung antigenreaktiver TH- Zellen mittels intrazellulärer Färbung der exprimierten Zytokine - methodische Kritik 71 Intrazelluläre Zytokinexpression nach Modellantigenstimulation 73 Nachweis autoreaktiver T- Zellen mittels intrazellulärer Zytokinfärbung methodische Kritik 75 Autoreaktive TH- Zellen sind bei PSS- Patienten und bei Normalpersonen nachweisbar 76 Sortierung von lebenden CD154 + TH- Zellen 78 Methodenkritik an Sortierung und Kultur 78 Generierung der CENP-B spezifischen Zelllinie 79 Zusammenfassung 81 Abkürzungsverzeichnis 83 Referenzen 85 Danksagung 96 Erklärung 97 Lebenslauf 98
