Inhaltsverzeichnis HI I. Einleitung 1 1.1. Das gesunde Immunsystem

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Inhaltsverzeichnis
I.
1.1.
1.1.1.
1.1.2.
1.1.3.
1.1.4.
1.1.5.
1.1.6.
1.1.6.1.
1.1.6.2.
1.1.6.3.
1.1.6.4.
1.1.6.5.
1.1.7.
1.1.8.
1.2.
1.2.1.
1.2.2.
1.2.2.1.
1.2.2.2.
1.2.3.
1.2.4.
1.2.5.
1.2.5.1.
1.2.5.2.
1.3.
II.
II. 1.
11.2.
11.3.
11.3.1.
11.3.2.
IT.3.3.
11.3.3.1.
11.3.3.2.
11.3.3.3.
11.4.
11.4.1.
11.4.2.
H.4.2.1.
11.4.2.2.
11.4.2.3.
11.4.2.4.
11.4.3.
11.5.
11.6.
11.7.
H.8.
II.8.1.
HI
Einleitung
1
Das gesunde Immunsystem
]
Gliederung des immunsystems
1
Antigene fuhren zur Aktivierung von T- Zellen
2
Antigene führen zur Aktivierung der B- Zellen und Produktion von Antikörpern. 3
+
Differenzierung von naiven CD4 T- Zellen zu Effektor- oder Gedächmiszellen.. 3
TH1 / TH2 Dichotomie
4
Die Differenzierungsantigene (CD-Moleküle)
5
CD27
5
CD28
6
CD45- Isoformen
6
CD69
7
CD154
7
Zytokine
9
T-Zelltoleranz
10
Sklerodermie
11
Epidemiologie und Klinik
11
Die Pathologie der Sklerodermie
12
Pathophysiologische Bedeutung der Apoptose
13
Die Sklerodermie zeigt HLA Assoziationen
14
Therapie der PSS
14
Sklerodermie - eine T- Zeil vermittelte Autoimmunerkrankung ?
15
Die Autoantigene Scl-70 und CENP-B
17
Das Autoantigen SCL-70 = Topoisomerase 1
17
Das Autoantigen Centromeric Protein B (CENP-B)
17
Herleitung der Aufgabenstellung
18
Materialien und Methoden
19
Allgemein verwendete Materialien und Geräte
19
Patienten und gesunde Spender
20
Zellpräparation
20
Bestimmung von Zellzahlen
20
Isolierung von PBMC aus peripherem Blut
20
In vitro Stimulation von Vollblut
21
Stimulation
21
Eingesetzte Antigene
22
Erythrozytenlyse und Fixieren der Zellen
23
Fluoreszenzeigenschaften von Zellen und deren methodische Nutzung
23
Fluoreszenz
23
Immunfluoreszenzfärbung von Zellen
23
Extrazelluläre Färbung auf PBMC
23
Extra- und intrazelluläre Färbung von fixierten und permeabilisierten
24
Zellen
24
Verwendete Antikörper und Farbstoffe
24
Das Prinzip der Durchflusszytometrie
25
Fluoreszenz aktivierte Zellsortierung (FACS)
27
Magnetische Zellsortierung (MACS)
28
Analyse der Lymphozytenverteilung
29
Identifizierung autoreaktiver TH- Zellen
30
Isolierung antigenspezifischer CD 154* TH-Zellen
31
Stimulation
31
Bibliografische Informationen
http://d-nb.info/992334055
digitalisiert durch
rv
11.8.2.
11.8.3.
11.8.4.
11.8.5.
U.8.6.
11.8.7.
11.8.8.
H.9.
11.9.1.
II.9.1.1.
H.9.1.2.
11.9.2.
III.
ULI.
III. 1.1.
ni.1.1.1.
m.1.1.2.
IB. 1.1.3.
III.1.2.
III.1.2.1.
in. 1.2.2.
in.1.3.
HI.2.
III.2.1.
IH.2.1.1.
IO.2.1.2.
111.2.1.3.
111.2.1.4.
IH.2.1.5.
111.3.
III.3.1.
HI.3.2.
111.3.3.
111.3.4.
111.3.5.
111.4.
111.4.1.
111.4.1.1.
HI.4.1.2.
IH.4.1.3.
HI.4.1.4.
111.4.2.
HI.4.2.1.
111.4.2.2.
111.4.2.3.
IV.
Inhaltsverzeichnis
Sortierung
32
Herstellung von nicht teilungsfähigen PBMC
33
Kultivierung der sortierten antigenspezifischen TH- Zellen
33
Erneute Antigenstimulation nach 2 Wochen
34
Restimulation und Analyse der Spezifität der expandierten TH- Zellen
34
CFDA Markierung
35
Einfrieren von Zellen
35
Auswertungen
35
Auswertung der durchflusszytometrischen Daten
35
Setzen der Analyseregionen
35
Setzen der Analyseregionen für die Oberflächenanalysen:
37
Statistische Auswertung
38
Ergebnisse
39
Vergleich der Lymphozytenverteilung von PSS- Patienten und Normalpersonen...
39
Die Verteilung verschiedener T-Lymphozytenpopulationen
40
Das Verhältnis von CD4* zu CD8'T-Lymphozyten bei Patienten und NP
40
+
Die Verteilung von naiven und Gedächtnis- CD4 T- Lymphozyten
41
Die Verteilung der Subpopulationen innerhalb der CD8* T- Lymphozyten
42
Verteilung verschiedener B- Lymphozytenpopulationen
43
Verteilung von CD19* B-Lymphozyten
43
Verteilung naiver- (IgD+/CD27-), Gedächtnis- B- Zellen (IgD7CD27+) und
CD207CD27H'Plasmablasten
43
Verteilung der NK- Lymphozyten
44
TH- Zellreaktivitäten auf Modellantigene
45
Antigen spezifische Stimulationen mit CMV, EBV und TT
46
Extrazelluläre Ausprägung von CD69 nach Stimulation mit CMV, EBV und TT..
47
Koexpression von CD69 / IFNy nach Stimulation mit CMV, EBV und TT
48
Koexpression von CD69 / TNFa nach Stimulation mit CMV, EBV und TT
49
Koexpression von CD69 / IFNy / TNFa nach Stimulation mit CMV, EBV und TT
50
Zusammenfassung
51
Detektion autoreaktiver TH-Lymphozyten
53
Definition einer spezifischen TH- Zellreaktion
53
IFNy produzierende autoreaktive TH-Zellen
54
TNFa produzierende autoreaktive T- Zellen
55
IFNy und TNFa produzierende autoreaktive T-Zellen
55
Abhängigkeit der Reaktivitäten von der Therapie
56
Generierung Antigen spezifischer TH- Zelllinien
58
Generierung einer Tetanustoxoid spezifischen TH- ZelUinie
58
Auswahl des Blutspenders
58
Aussaat der Zellen und Kultur
58
Entwicklung der Zellzahlen
59
Spezifitätsprüfung der Zelllinie
60
Generierung einer CENP-B spezifischen TH- Zelllinie
62
Auswahl des Spenders
62
Stimulation, Sortierung und Aussaat der Zellen
62
Restimulation und Spezifitätsprüfung nach 4 Wochen Kultur
64
Diskussion
67
Inhaltsverzeichnis
IV.l.
IV.2.
IV.3.
IV.3.1.
IV.3.2.
IV.3.3.
IV.4.
IV.4.1.
IV.4.2.
IV.4.3.
IV.5.
IV.5.1.
IV.5.2.
V.
VI.
VII.
VUI.
DC.
X.
Prinzipielles zur Auswahl der Untersuchungsparameter
67
Therapieeffekte und Patientenauswahl
68
Oberflächenanalysen
69
Oberflächenanalysen von T-Zellen
69
Oberflächenanalysen von B - Zellen
70
Oberflächenanalysen von NK- Zellen
70
Identifizierung antigenreaktiver TH- Zellen mittels intrazellulärer Färbung der
exprimierten Zytokine - methodische Kritik
71
Intrazelluläre Zytokinexpression nach Modellantigenstimulation
73
Nachweis autoreaktiver T- Zellen mittels intrazellulärer Zytokinfärbung methodische Kritik
75
Autoreaktive TH- Zellen sind bei PSS- Patienten und bei Normalpersonen
nachweisbar
76
Sortierung von lebenden CD154 + TH- Zellen
78
Methodenkritik an Sortierung und Kultur
78
Generierung der CENP-B spezifischen Zelllinie
79
Zusammenfassung
81
Abkürzungsverzeichnis
83
Referenzen
85
Danksagung
96
Erklärung
97
Lebenslauf
98
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