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Aus der Strahlenklinik der Friedrich-Alexander-Universität Erlangen-Nürnberg Direktor: Prof. Dr. R. Fietkau _________________________________________________________ Der Einfluss von Entzündungszellen auf die Prognose von Patienten mit Kardiakarzinomen des Magens Inaugural-Dissertation zur Erlangung der Doktorwürde der Medizinischen Fakultät der Friedrich-Alexander-Universität Erlangen-Nürnberg vorgelegt von Albert Schindler aus Teublitz Gedruckt mit Erlaubnis der Medizinischen Fakultät der Friedrich-Alexander-Universität Erlangen-Nürnberg Dekan: Prof. Dr. J. Schüttler Referent: PD Dr. L. Distel Korreferent: Prof. Dr. R. Fietkau Tag der mündlichen Prüfung: 27.11.2012 Für meine Frau Sylvia 1 Inhaltsverzeichnis 1 Zusammenfassung ............................................................ 4 1.1 Hintergrund und Ziele 4 1.2 Methoden 4 1.3 Ergebnisse und Beobachtung 5 1.4 Praktische Schlussfolgerungen 5 2 Abstract ............................................................................. 6 3 Einleitung ........................................................................... 9 3.1 Magenkarzinom 9 3.1.1 Epidemiologie 10 3.1.2 Ätiologie 10 3.1.3 Histologie 12 3.1.4 Klassifikationen 13 3.1.4.1 Borrmann - Klassifikation 13 3.1.4.2 Siewert - Klassifikation der Karzinome des gastro-ösophagealen Überganges (AEG) 3.1.4.3 14 Laurén - Klassifikation nach dem Wachstumsmuster 15 3.1.4.4 TNM - Klassifikation 15 3.1.5 Klinisch - pathologische Korrelation 20 2 4 5 3.2 Dendritische Zellen 3.2.1 Entwicklung aus hämatopoetischen 21 Stammzellen 21 3.2.2 Reife Dendritische Zellen 21 3.2.3 DC als Nahtstelle 22 3.2.4 DC als Aktivatoren der spezifischen Immunreaktion gegen Tumoren 22 3.2.5 Erste Ergebnisse und Ausblick 23 3.3 Immunologisches Gedächtnis 24 3.3.1 Memory T-Zellen 25 3.3.2 Eigenschaften von Memory T-Zellen 26 Methoden ............................................................................ 28 4.1 Patientenauswahl 28 4.2 Tissue Microarray und Immunhistochemie 29 4.3 Immunhistologische Färbungen 32 4.3.1 Färbung mit Primärantikörper CD1a 33 4.3.2 Färbung mit Primärantikörper CD45RO 34 4.4 Auswertung 35 4.5 Statistik 36 Ergebnisse ........................................................................... 44 5.1 Studiengruppe 44 5.2 Quantifizierung 45 5.3 Prognostische Signifikanz der TIL 49 3 6 Diskussion .......................................................................... 61 7 Anhang ……………………………………………………….... 66 7.1 Tabelle I: Quantitative Auswertung der CD1a+ gefärbten Zellen (DC) 7.2 67 Tabelle II: Quantitative Auswertung der CD45RO+ gefärbten Zellen (Memory T-Zellen) 69 8 Literaturverzeichnis............................................................. 71 9 Abkürzungsverzeichnis ..................................................... 78 10 Danksagung ........................................................................ 80 11 Lebenslauf .......................................................................... 81 4 1 Zusammenfassung 1.1 Hintergrund und Ziele Tumore werden von Lymphozyten infiltriert. Diese Infiltration wird als Reaktion des Immunsystems auf den Tumor angesehen, da die tumorinfiltrierenden Lymphozyten (TIL) aktive Zellen der antitumoralen Immunantwort sind. Der quantitative Umfang dieser Infiltration kann die Prognose für das Überleben der Patienten beeinflussen und ist ein Ziel der gegenwärtigen Forschung, da dieser quantitative Umfang als prognostischer Parameter für den Verlauf einer malignen Erkrankung angesehen wird. Jedoch zeigen sich für verschiedene Tumorarten unterschiedliche, sich zum Teil widersprechende Forschungsergebnisse. Die prognostische Signifikanz dieser TIL in der Krebstherapie wurde bislang noch nicht komplett verstanden. Ziel dieser Arbeit war es, den Einfluss von zwei tumorinfiltrierenden Lymphozytenuntergruppen, nämlich der dendritische Zellen und der Memory T-Zellen auf die Prognose von Patienten mit Kardiakarzinomen des Magens zu untersuchen. 1.2 Methoden Von insgesamt 53 Patienten mit Magenkarzinomen im Bereich der Kardia wurden Tissue Micro Arrays (TMA) aus folgende Gewebearten angefertigt: • Tumorgewebe aus dem Primärtumor • Stromagewebe aus dem Primärtumor • Tumorgewebe aus einer Metastase • Stromagewebe aus einer Metastase und • lymphatisches Gewebe (Lymphknoten) 5 Die TMAs wurden immunhistochemisch mit Antikörpern gegen CD1a (für dendritische Zellen) und gegen CD45RO (für Memory T-Zellen) gefärbt. Zur Optimierung der Auswertung wurden die insgesamt 1126 einzelnen Stanzbiopsien digital aufbereitet und ohne Kenntnis der Patientendaten mit Hilfe eines Bildanalyseprogramms ausgewertet. 1.3 Ergebnisse und Beobachtung Bezogen auf das NED-Überleben ergaben sich aus gegen CD1a+ gefärbten dendritischen Zellen bzw. gegen CD45RO+ gefärbten Memory T-Zellen unterschiedliche Ergebnisse. Während für DC keine einheitliche Signifikanz oder Tendenz nachgewiesen werden konnte, ergab sich für Memory T-Zellen ein deutlicher Trend. Je höher die Anzahl der Memory T-Zellen in den untersuchten Geweben war (Tumor- und Stromagewebe von Primärtumor und Metastasen und im lymphatischen Gewebe), desto besser war die Prognose für das Überleben der Patienten 1.4 Praktische Schlussfolgerungen Die Kenntnis der lokalen Immunantwort innerhalb eines Tumors ist von großer Bedeutung. Sie kann nicht nur Rückschlüsse auf die Prognose für das Überleben der Patienten liefern, sondern auch eine Basis für die Entwicklung neuer immunologischer Therapieverfahren darstellen. Für die dendritischen Zellen konnte in dieser Studie kein einheitliches Ergebnis nachgewiesen werden. Die Anzahl der DC im Tumor- und Stromagewebe des Primärtumors im Vergleich zu den Metastasen und 6 des lymphatischen Gewebes erbrachten keine Signifikanz und auch keine einheitliche Tendenz. Die Ergebnisse dieser Studie zeigen jedoch, dass insbesondere eine hohe Anzahl von Memory T-Zellen im Tumor- und Stromagewebe des Primärtumors und der Metastasen sowie im lymphatischen Gewebe eine positive Tendenz für das Überleben hat. Auch Galon et al. postulieren in ihrer Publikation „Tumor immunosurveillance in human cancers“ (2011), dass die Memory T-Zellen direkt in die Proliferation der Tumorzellen involviert sind. Daraus können direkte Aussagen für die Überlebensprognose von Patienten getroffen werden. In diesen Bereich der Medizin ist noch mehr Forschungsarbeit zu investieren, um ausreichend Wissen für eine bessere Prognose und Therapie von Tumoren zu generieren. 2 Abstract Tumors are infiltrated by lymphocytes. This infiltration is seen as the immune system’s reaction to the tumor, because the tumor infiltrating lymphocytes (TIL) are active cells of the anti-tumoral immune response. The quantitative extent of the infiltration can influence the patient’s prognosis to survive, because the quantitative extent is seen as prognostic parameter for the course of a malignant disease. However, for different types of tumor different, partial contradictory, results of research are found. Up to now the prognostic significance of the TIL in cancer therapy has not been completely understood. 7 This dissertation’s objective is to study the influence of two tumor infiltrated lymphocytes subgroups, namely dendritic cells and Memory T-cells, on the prognosis of patients with cardia carcinoma. Tissue Micro Arrays (TMA) of 53 patients with gastric cancer in the area of the cardia were made from the following tissues: • Tumoral tissue from the primary tumor • Stromal tissue from the primary tumor • Tumoral tissue from a metastasis • Stromal tissue from a metastasis • Lymphatic tissue (lymph node) The TMAs were immunohistochemically stained with antibodies against CD1a (for dendritic cells) and against CD45RO (for Memory T-cells). In order to optimize the analysis, the 1126 punch biopsies were digitally edited and analyzed in an image recognition program without the knowledge of medical patient data. From the dendritic cells stained against CD1a+ and from the Memory T-cells stained against CD45RO+ two different results arose with reverence to NED-survival. While no consistent significance or tendency could be detected for DC, a clear trend could be detected for Memory T- cells. The higher the quantity of Memory T-cells found in the examined tissue (tumor tissue and stroma tissue from the primary tumor and metastasis, and lymphatic tissue), the better was the patient’s survival prognosis. 8 The knowledge about local immune reaction within a tumor is of major importance. Not only does it help draw conclusions about the patient’s survival prognosis but it can also be a basis for the development of new immunological therapies. For the dendritic cells no consistent result could be found in this study. The quantity of DC in the tumor tissue and the stroma tissue from the primary tumor in comparison to the one from metastasis and the lymphatic tissue, did not show any significance or consistent tendency. However, the results of this study show that especially a high quantity of Memory T-cells in the tumor tissue and the stroma tissue of the primary tumor and metastasis, and lymphatic tissue suggest a positive tendency for survival. Also Galon et al. postulate in their publication “Tumor immunosurveillance in human cancers” (2011) that Memory T cells are directly involved in the proliferation of tumor cells. From there concrete conclusions for the patients’ survival prognosis can be made. More research is to be invested in this field in order to generate sufficient knowledge for the forecast and the therapy of tumors. 9 3 Einleitung 3.1 Magenkarzinom Beginn des Endes Ein Punkt nur ist es, kaum ein Schmerz, Nur ein Gefühl, empfunden eben; Und dennoch spricht es stets darein, Und dennoch stört es dich zu leben. Wenn du es andern klagen willst, So kannst du’s nicht in Worte fassen. Du sagst dir selber: «Es ist nichts!» Und dennoch will es dich nicht lassen. So seltsam fremd wird dir die Welt, Und leis verlässt dich alles Hoffen, Bis du es endlich, endlich weisst, Dass dich des Todes Pfeil getroffen. (Theodor Storm, deutscher Schriftsteller, 14.09.1817 - 04.07.1888, verstorben an einem Magenkarzinom) [Kaiser, 2001]. 10 3.1.1 Epidemiologie Das Magenkarzinom stellt bei Männern die fünfthäufigste (medianes Erkrankungsalter 69 Jahre) und bei Frauen die sechsthäufigste Tumorerkrankung dar (medianes Erkrankungsalter 74 Jahre) [Beckmann et al, 2009]. Pro Jahr erkranken in Deutschland ca. 18.780 Personen an Magenkrebs, wobei die Mehrzahl (rd. 11.000) Männer (in Bayern: 1277 Männer und 893 Frauen im Jahr 2006) sind [Meyer et. al., 2009]. Die Inzidenz in Westeuropa beträgt 13 (m) bzw. 7 (w) / 100.000 / Jahr. Nur rd. 33 % der Patienten sind unter 65 Jahre alt [Beckmann et. al., 2009]. 40 % der Magenkarzinome sind Karzinome vom intestinalen Typ und 25 % vom diffusen Typ. Der Anteil der gastrointestinalen Stromatumore beträgt nur 2 %, der von neuroendokrinen Tumoren nur 1,5 %. In rd. 20 % der Fälle fanden sich bei Diagnosestellung bereits Fernmetastasen. Bei ca. 57 % der diagnostizierten Neuerkrankungen lag eine lokale oder regionale Tumorausbreitung vor [Beckmann et. al., 2009]. Der Anteil der Kardiakarzinome liegt bei rd. 20 % der dokumentierten Fälle [Beckmann et. al., 2009]. 3.1.2 Ätiologie Magenkarzinome haben multifaktorielle Ursachen: Der wichtigste Risikofaktor für das Magenkarzinom ist die Besiedelung der Magenschleimhaut mit dem Bakterium Helicobacter pylori (gramnegatives, mikroaerophiles Stäbchenbakterium mit S- und U-Formen und hoher Urease-Aktivität) [Hof et al, 2005]. Eine HP-Besiedelung des Magens (Gastritis Typ B) geht mit einem 4 - 6 -fach gesteigerten Karzinomrisiko einher. Es wird geschätzt, dass ca. 50 % der Magenkarzinome durch HP 11 verursacht werden. Allerdings stehen die an der Kardia gelegenen Karzinome ätiologisch nicht mit HP in Zusammenhang [Renz-Polster et al, 2008]. Auch Ernährungsfaktoren Magenkarzinomen eine spielen große für Rolle. die Der hohe Entstehung Nitratgehalt von von geräucherten, gesalzenen oder gepökelten Speisen führt zu einer bakteriellen Umwandlung von Nitraten zu Nitriten und weiter zur Bildung von karzinogenen Nitrosaminen. Eine gleichzeitig eingeschränkte Zufuhr von vitaminreicher Nahrung verstärkt diese Wirkung noch, da Obst und Gemüse eine karzinom-protektive Wirkung haben [Renz-Polster et al, 2008]. Weitere Risikofaktoren sind hoher Alkoholkonsum, Tabakrauchen (Nitrosamine aus Nitriten), Morbus Ménétrier (erhebliche Vergrößerung der Schleimhautfalten und Verbreiterung des schleimbildenden Epithels des Magens mit Zurückbildung der Haupt- und Belegzellen mit Hypo- bis Anazidität) und der Zustand nach einer Billroth-II-Operation (Refluxkrankheit des Resektionsmagens) [Renz-Polster et al, 2008]. Etwa 10 % aller Magenkarzinome treten familiär gehäuft auf, womit auch genetische Faktoren wichtig sind, wie z.B. Mutationen des E-CadherinGens (CDH1) oder auch Mutationen hereditärer Karzinomsyndrome (HNPCC, FAP, Peutz-Jeghers-Syndrom, Li-Fraumeni-Syndrom). Gesicherte Präkanzerosen sind adenomatöse Magenpolypen sowie die als Folge einer Schleimhautatrophie auftretende intestinale Metaplasie, z.B. bei autoimmuner Gastritis (Typ A). Auch adenomatöse Magenpolypen steigern die Karziominzidenz um bis zu 20 % [Renz-Polster et al, 2008]. 12 3.1.3 Histologie Magenkarzinome werden histologisch nach den vorherrschenden Wachstumsmustern unterschieden: papilläre, tubuläre, muzinöse oder siegelringzellartige Adenokarzinome. Siegelringzellen speichern den gebildeten Schleim im abgerundeten Zytoplasma, wodurch der Kern an den Rand der Zelle gedrängt und abgeplattet wird. Seltener sind Plattenepithel-, kleinzellige oder undifferenzierte Karzinome [Renz-Polster et al, 2008]. Nach der Ausbreitung werden prognostisch zwei Formen von Magenkarzinomen unterschieden, nämlich frühe und fortgeschrittene Formen: Das Magenfrühkarzinom ist auf die Mukosa (M-Form) und Submukosa (SM-Form) begrenzt und weist keine Infiltration der Muscularis propria auf (T 1 Tumor). Endo- bzw. makroskopisch unterscheidet man dabei noch drei Grundtypen: Typ I (polypöse Form), Typ II (flache Formen mit leicht erhabenem Tumorgewebe) und Typ III (ulzerierte Form). Beim Frühkarzinom Typ II wird nochmals unterschieden, ob die Oberfläche erhöht (Typ II a), eben (Typ II b) oder ob die Oberfläche eingesenkt ist (Typ II c). Auch Kombinationsformen dieser endoskopischen Typen kommen nach sekundärer Ulzeration vor [Böcker et al, 2004]. Das fortgeschrittene Magenkarziom überschreitet die Submukosa. Nach der Wachstumsform wird dieses weiter unterteilt in einen intestinalen Typ, der in das Lumen wuchert (polypöses Wachstum) und einen diffusen Typ, der ein infiltratives (nicht polypöses) Wachstum aufweist [Renz-Polster et al, 2008]. Bei höher differenzierten Adenokarzinomen des Magens sind die Tumorzellen kohärent und bilden Tubuli. Sie werden deshalb tubuläre, sog 13 „intestinale“ Adenokarzinome genannt. Diese entstehen häufiger im Antrum- und Kardiabereich. Bei gering differenzierten Adenokarzinomen liegen die Tumorzellen diffus verstreut bzw. nicht kohärent vor (diffuse Adenokarzinome), wobei das diffuse Wachstum auf Mutation im Gen des Zelladhäsonsmolikuls ECadherin beruht, so dass die Zellhaftung beim diffusen Karzinom gestört ist. Bei Operabilität ist dieser Typ mit einer radikalen Gastrektomie zu behandeln [Renz-Polster et al, 2008]. 3.1.4 Klassifikationen Für die Klassifikation des Magenkarzinoms haben sich verschiedene Klassifikationssysteme eingebürgert (Borrmann-, AEG-, Laurén-, TMNKlassifikation), Lokalisationen womit und die unterschiedlichen prognostische Signifikanz Wachstumsformen, beschrieben werden können. Aus der TNM-Klassifikation ergibt sich das UICC-Stadium, das für die Therapie eine wegweisende Einteilung darstellt [Wittekind, TNM 7. Auflage, 2010]. 3.1.4.1 Borrmann - Klassifikation Die präoperativen makroskopischen Wachstumsformen werden nach Borrmann in die Klassen „I - IV“ eingeteilt: I Vorwiegend exophytisch wachsende, meist breitbasige polypöse Karzinome mit knolliger, papillärer, blumenkohlartiger oder zottiger Oberfläche 14 II Karzinome mit zentraler schüsselförmiger Exulzeration mit steilen wallartig aufgeworfenen Rändern und relativ scharfer Abgrenzung zur Umgebung III Karzinome mit zentraler Exulzeration ohne wallartig aufgeworfene Ränder und mit unscharfer Abgrenzung zur Umgebung IV Diffuse Tumorinfiltration der Magenwand 3.1.4.2 Siewert - Klassifikation der Karzinome des gastroösophagealen Überganges (AEG) Abb. 1: Klassifikation der Adenokarzinome des ösophago-gastralen Übergangs [Gumpp et al, 2010]. AEG I: 1 - 5 cm oralwärts der Kardia. Dieser Tumor entwickelt sich i.d.R. aus einem Barrettepithel des distalen Ösophagus mit entsprechender Karzinom) Refluxanamnese (eigentliches Barrett- 15 AEG II: Tumore in Höhe der Kardia, oral < 1 cm, aboral < 2 cm von der Kardia entfernt (eigentliches Kardiakarzinom) AEG III: 2 - 5 cm von der Kardia entfernt (subkardiales Magenkarzinom); HP-assoziiert 3.1.4.3 Laurén - Klassifikation nach dem Wachstumsmuster Die präoperative, anhand von Biopsiematerial bestimmte LaurénKlassifikation unterscheidet drei Typen und hat Bedeutung für das Ausmaß des Resektionsverfahrens: Intestinaler Typ: expansiv (polypös) wachsend und gut begrenzt Diffuser Typ: infiltrativ wachsend und schlecht begrenzt Mischtyp: im Biopsiematerial keine eindeutige Laurén- Klassifizierung möglich 3.1.4.4 TNM - Klassifikation Diese Klassifikation für Karzinome ist von hoher prognostischer Signifikanz. Die TNM - Klassifikation, die der Stadieneinteilung von malignen Tumoren dient (sog. „Staging“) wurde 1943 - 1952 von dem französischen Chirurgen Pierre Denoix entwickelt und seit 1950 von der UICC (Union Internationale Contre le Cancer) weitergeführt und dabei ständig modifiziert. Die Einstufung in das TNM- System erlaubt 16 prognostische Aussagen und bestimmt grundsätzlich die weitere Therapie, die individuell angepasst wird. Dabei haben die einzelnen Buchstaben folgende Bedeutung: T Tumor Ausdehnung, Größe, Tiefeninfiltration N Nodes lymphatici regionäre Lymphknotenmetastasen M Metastasen hämatogene Fernmetastasen Tx Primärtumor kann nicht beurteilt werden T0 Keine Evidenz für einen Primärtumor oder CUP - Syndrom Tis Carcinoma in situ: intraepithelialer Tumor ohne Infiltration der Lamina propria, hochgradige Dysplasie T1 Tumor infiltriert Lamina propria, Muscularis mucosae oder Tela submucosa T1a Tumor infiltriert Lamina propria oder Lamina muscularis mucosae T1b Tumor infiltriert die Tela submukosa T2 Tumor infiltriert die Muscularis propria T3 Tumor infiltriert die Subserosa T4 Tumor perforiert die Serosa (viszerales Peritoneum) oder infiltriert benachbarte Strukturen T4a Tumor perforiert die Serosa (viszerales Peritoneum) T4b Tumor infiltriert benachbarte Strukturen [Wittekind: TNM 7. Aufl. 2010] 17 Anmerkungen: 1. Benachbarte Strukturen transversum, Leber, des Magens Zwerchfell, sind Milz, Pankreas, Colon Bauchwand, Nebennieren, Niere, Dünndarm und Retroperitoneum. 2. Intramurale Ausbreitung in das Duodenum oder Ösophagus wird nach der tiefsten Infiltration in diesen Organen oder im Magen klassifiziert. 3. Ein Tumor, der sich in das Ligamentum gastrocolicum oder gastrohepaticum ausbreitet –ohne Perforation des viszeralen Peritoneums– wird als T3 klassifiziert [Gumpp et al, 2010]. NX Regionäre Lymphknoten können nicht beurteilt werden N0 Keine regionären Lymphknotenmetastasen pN0: Regionäre Lymphadenektomie und histologische Untersuchung üblicherweise von 16 Lymphknoten ohne Befund N1 Metastasen in 1 - 2 regionären Lymphknoten N2 Metastasen in 3 - 6 regionären Lymphknoten N3 Metastasen in 7 oder mehr regionären Lymphknoten N3a Metastasen in 7 - 15 regionären Lymphknoten N3b Metastasen in 16 oder mehr regionären Lymphknoten M0 Keine Fernmetastasen M1 Fernmetastasen 18 Die Fernmetastasen können mit folgenden Zusätzen weiter spezifiziert werden: OSS Knochenmetastasen PUL Lungenmetastasen HEP Lebermetastasen BRA Hirnmetastasen MAR Knochenmarksmetastasen PLE Pleurametastasen PER Peretonealmetastasen ADR Nebennierenmetastasen Anmerkung: Fernmetastasen schließen peritoneale Metastasen (Aussaat) und positive Peritonealzytologie sowie Tumoren im Netz, soweit diese nicht Teil einer kontinuierlichen Ausbreitung sind, mit ein. Mit folgenden Präfixen kann dem TNM - System noch weitere Aussagekraft verliehen werden: p postoperativ-histopathologisch c klinisches Stadium r Rezidiv u Nachweis mittels Ultraschall y neoadjuvante Therapie a Feststellung nach Autopsie Daraus ergibt sich die Stadieneinteilung der „Union Internationale Contre le Cancer“ (UICC), die für die Auswahl der Patienten zu dieser Studie (siehe Ziffer 4) ebenfalls eine Rolle spielte [Gumpp et al, 2010]: 19 Stadium 0: T is N0 M0 Stadium I A: T1 N0 M0 Stadium I B: T1 N1 M0 T2 N0 M0 T1 N2 M0 T2 N1 M0 T3 N0 M0 T1 N3 M0 T2 N2 M0 T3 N1 M0 T4a N0 M0 T2 N3 M0 T3 N2 M0 T4a N1 M0 T3 N3 M0 T4a N2 M0 T4b N0, N1 M0 T4a N3 M0 T4b N2, N3 M0 jedes T jedes N M1 Stadium II A: Stadium II B: Stadium III A: Stadium III B: Stadium III C: Stadium IV: 20 3.1.5 Klinisch - pathologische Korrelation Je nach Tumorlokalisation und -ausbreitung haben die Patienten mit Magenkarzinomen unterschiedliche Beschwerden, die diskret und unbestimmt sein können: Gewichtsabnahme, Widerwille gegen Fleisch, Brechreiz, Druckgefühl im Oberbauch, Leistungsknick oder subfebrile Temperaturen. Im fortgeschrittenen Stadium können akute Magenblutungen (u.U. mit Eisenmangelanämie und / oder okkultem Blut im Stuhl), ein tastbar Oberbauchtumor und Magenausgangsstenosen sowie Tumorkachexie diagnostiziert werden. Hepatomegalie, Aszites und das Tasten der Virchow’schen Lymphknoten (links supraklavikulär) sind Zeichen einer Metastasierung. Grundsätzlich existieren folgende Therapiekonzepte mit im jeweiligen Einzelfall individualisierten Anwendungen: UICC Stadium 0 - IB: operative Resektion mit kurativer Intention (Gastrektomie, Lyphadenektomie) UICC Stadium II - III B: multimodale Therapie, möglichst in Studien (OP, ggf. neoadjuvante Cx / IORT / adjuvante RxCx) UICC Stadium IV: palliative lokale / systemische Therapie (Cx, OP, Schmerztherapie) 21 3.2 Dendritische Zellen 3.2.1 Entwicklung aus hämatopoetischen Stammzellen Ausgehend von einer pluripotenten hämatopoetischen Stammzelle werden mit Hilfe von Wachstums- und Differenzierungsfaktoren verschiedene Zelllinien entwickelt. Die myeloische Zelllinie führt zunächst zu einer Vorläuferzelle (GEMM-Vorläuferzelle), aus der sich Granulozyten, Erythrozyten, Megakaryozyten und Markophagen entwickeln. Aus diesen GEMM - Kolonien differenzieren sich über sog. EM-Vorläuferzellen (Erythroblasten und Megakaryozyten) die Erythrozyten und Thrombozyten und über die sog. GM-Vorläuferzellen sowohl die Granulozyten als auch die Monozyten und Markophagen. Aus den im Blut zirkulierenden Monozyten können sich gewebsständige Markophagen und auch DC (Dendritische Zellen) entwickeln. Diese im Blutkreislauf rezirkulierenden Zellen befinden sich im ruhenden Zustand und werden auch als „unreife dendritische Zellen“ bezeichnet [Hof et al, 2005]. 3.2.2 Reife Dendritische Zellen Bei Aktivierung im Rahmen infektiöser Prozesse weisen dendritische Zellen eine sehr starke phagozytierende Aktivität auf. Mit zunehmendem Aktivierungsstatus steigern sie zusätzlich massiv die Expression von MHC-Molekülen und gehen damit von einem antigen-phagozytierenden Zustand in einen antigen-präsentierenden Zustand über. Gleichzeitig lösen sie sich aus dem Gewebeverband und wandern mit der abfließenden Lymphe in die nächsten regionalen Lymphknoten, wo sie in den parakortikalen Bereichen den T-Zellen antigene Peptide im Kontext der MHC-Moleküle präsentieren. Mit diesen Aktivierungsprozessen ist der Übergang von der unreifen zur reifen dendritischen Zelle verbunden [Hof et al, 2005]. 22 3.2.3 DC als Nahtstelle Dendritische Zellen stellen durch ihre Fähigkeit zur Phagozytose und Stimulierung einer spezifischen Nahtstelle zwischen der Antwort von unspezifischen T-Lymphozyten und der eine spezifischen Immunantwort dar. Im Gegensatz zu Markophagen können sie das Gewebe verlassen und über die Lymphe zu den regionalen Lymphknoten gelangen [Hof et al, 2005]. 3.2.4 DC als Aktivatoren der spezifischen Immunreaktion gegen Tumoren Dendritische Zellen sind Immunzellen und werden auch in der Immuntherapie von Tumoren eingesetzt. Sie werden in der Literatur als „Außenposten des Immunsystems“ bezeichnet und sind „Wachposten“, die fast überall im Körper lauern, um "Fremdes" aufzugreifen und dann in die Lymphknoten oder die Milz zu transportieren. Zum "Fremden" gehören in erster Linie Krankheitserreger, aber auch Tumorzellen, die anhand von veränderten Oberflächenmerkmalen als "fremd" eingestuft werden. In den Lymphorganen stimulieren dendritische Zellen die Lymphozyten, die dann in den Körper ausschwärmen, um den Tumor zu bekämpfen. Seit wenigen Jahren ist der Weg bekannt, wie man die sehr schwer zu isolierenden dendritischen Zellen gewinnen kann, nämlich aus ihren Vorstufen, die als "Monozyten" (weiße Blutkörperchen) reichlich im Blut vorkommen. Aus nur 100 ml Blut können genügend Monozyten für eine Impfung gewonnen werden. In spezialisierten Immunlabors werden sie in die Zellkultur genommen, mit stimulierenden Faktoren angeregt und entwickeln sich dann zu "Dendritischen Zellen", die man nach einer Woche gewinnen und für die Therapie einsetzen kann. Sie werden nun dem Lernprozess ausgesetzt, den sie auch im Körper 23 machen sollten, woran sie aber durch den Tumor auf viele Arten gehemmt werden können. Außerhalb des Körpers, in der Zellkultur, lässt sich dieser Entstehungs- und Lernprozess, geschützt vor dem Tumor, durchführen. Die Zellen werden mit aufbereitetem Tumormaterial konfrontiert und anschließend dem Patienten gespritzt. Dort wandern sie in die Lymphknoten bzw. die Milz und kommen ihrer Aufgabe nach. Es handelt sich um eine körpereigene Zellpräparation, wobei Nebenwirkungen, wie sie von Fremdtransplantaten oder Fremdblut gelegentlich vorkommen, hier nicht befürchtet werden müssen [Peters et al, 2003]. 3.2.5 Erste Ergebnisse und Ausblick Die seit einigen Jahren veröffentlichten Ergebnisse zeigen, dass viele Tumoren auf diese Therapie ansprechen. Die Erfahrungen zeigen auch, dass diese Immuntherapie sicher und nebenwirkungsarm ist. Jedoch steht sie nicht in direkter Konkurrenz zu den etablierten Therapien (Chirurgie, Chemotherapie und Strahlentherapie), unterschiedlichen Wirkprinzipien beruht. da jede Vielmehr Therapie kann dies auf eine ergänzende Therapieform sein. Jedoch wurde auch nachgewiesen, dass Hemmfaktoren, die von Tumoren ausgehen, DC an ihrer endgültigen Ausreifung zu sog. „reifen DC“ hindern. Dadurch können DC sogar das Gegenteil des gewünschten Effektes erzielen: anstelle einer Immunaktivierung somit sogar zur Auslösung einer Immunsuppression oder Immuntoleranz führen. Die Ausreifung zu „reifen DC“ bzw. ihre Verhinderung ist abhängig von der Balance zwischen fördernden und hemmenden Signalen, die um die DC konkurrieren. Hierbei scheint das stimulierende Zytokin Interleukin-12 eine wichtige Rolle zu spielen. Weitere Forschungsarbeiten und -ergebnisse bleiben abzuwarten [Peters et al, 2003]. 24 3.3 Immunologisches Gedächtnis Der griechische Geschichtsschreiber Thukydides (454 v. Chr. - ca. 399396 v.Chr.) beschreibt in seinem zweiten Buch über den Peloponnesischen Krieg den Ausbruch der Pest in Athen im Jahre 430 v.Chr.: „Diese Krankheitsart war furchtbarer als die Worte es beschreiben können; sie befiel jeden mit einer Gewalt, die über Menschnatur ging, Mitleid hatten doch noch die Geretteten mit den Sterbenden und Leidenden, weil sie alles bereits kannten und selbst nun in Sicherheit waren; denn zweimal befiel sie denselben nicht, zumindest nicht mit tödlichem Ausgang“ [Thukydides, 2000, S. 147-149]. Diese Beobachtung stellt wahrscheinlich das erste Zeugnis über die wichtigste Funktion des Immunsystems, nämlich die Vermittlung von Schutz gegen Krankheitserreger durch das immunologische Gedächtnis dar. Das „Immunologische Gedächtnis“ kann definiert werden als die Fähigkeit des Immunsystems, Krankheitserreger schneller und effektiver zu bekämpfen, wenn sie dem Immunsystem bereits bekannt sind [Janeway Ch. A. Jr. 1999, S. 402; Busch V., 2006]. Am Ende der Immunantwort auf einen „Fremdstoff“ gehen die daran beteiligten Lymphozyten zum größten Teil durch Apoptose zu Grunde oder werden durch Phagozytose eliminiert. Einige dieser Zellen verbleiben jedoch im Körper und gehen in einen besondern Zustand über. Dieser zeichnet sich durch sehr geringe Zellteilungsraten und Langlebigkeit über Jahre aus. Diese besonderen Lymphozyten bildet die Grundlage für das „immunologische Gedächtnis“. Es werden B- und T-Gedächtniszellen unterschieden („Memory-Zellen“) [Busch V., 2006]. 25 3.3.1 Memory T-Zellen Bei den T-Lymphozyten unterscheidet man verschiedene Entwicklungsstadien: Naive T-Zellen finden sich vor dem Antigenkontakt in den T-Zellbereichen sekundärer lymphatischer Organe und wandern kontinuierlich auf dem Blut- oder Lymphweg durch den Körper. Die über APC vermittelte Präsentation von Antigenen eines Pathogens aktiviert in den T-Zellen ein Programm zur Proliferation, Produktion von Zytokinen und Differenzierung in Effektorzellen [Busch, 1998; Badovinac, 2002; Kaech, 2001; Mercado, 2000]. Die aktivierten Effektor-T-Zellen verlassen die sekundären lymphatischen Organe auf dem Blutweg, um mit Hilfe von Adhäsionsmolekülen in das Gewebe einzutreten und dort die Infektion zu bekämpfen. Diese primäre Immunantwort endet dann mit der Apoptose bzw. der Phagozytose der meisten T-Zellen. Jedoch bleibt eine kleine Anzahl von T-Zellen im Körper und vermittelt Schutz gegen zukünftige Infektionen mit demselben Pathogen. Diese Zellen werden als „Memory TZellen“ bezeichnet [Busch V., 2006]. Zu welchem Zeitpunkt diese langlebigen Memory T-Zellen entstehen, ist ebenso wie der zugrundeliegende Mechanismus für die effektive Generierung von Memory T-Zellen noch nicht bekannt. Es werden z.Z. zwei Modelle diskutiert [Busch V., 2006]: Zum einen die direkte lineare Abstammung von naiven T-Zellen, wobei sich die Memory T-Zellen direkt -ohne das Stadium der „klassischen“ Effektorzelle durchlaufen zu haben- entwickeln. Das andere Modell geht davon aus, dass sich die Memory T-Zellen aus den Effektorzellen entwickeln. [Opfermann, 1999; Jacob, 1999; Ahmed, 1996; Busch V., 2006]. 26 3.3.2 Der Eigenschaften von Memory T-Zellen Phänotyp von Memory T-Zellen ist durch bestimmte Oberflächenmarker charakterisiert. Man unterscheidet Memory T-Zellen im aktiven Zustand und solche, die im Ruhezustand sind. Dementsprechend ist eine klare phänotypische Definition, die Memory T-Zellen von Effektor T-Zellen und naiven T-Zellen unterscheidet, schwierig [Sprent, 2001]. Für die homöostatische Proliferation und Erhaltung von Memory T-Zellen könnten CD45 eine wichtige Rolle spielen. Homöostatische Proliferation beschreibt den Zustand physiologischer Normalität, in dem ein Gleichgewicht zwischen Depletion und Proliferation herrscht, das die Zellzahl in einem nicht-infizierten Individuum konstant hält [Janeway Ch. A. Jr., 1999, S. 408]. CD45 wird auf allen Lymphozyten exprimiert und amplifiziert das Signal des jeweiligen Rezeptors auf B- und T-Zellen [Michie, 1992; Novak, 1994; Young, 1997]. CD45 erfährt auf T-Zellen alternatives Spleißen seiner extrazellulären Domäne in zwei Isoformen. Während die hoch molekulare Isoform CD45RA auf naiven T-Zellen zu finden ist, findet sich die niedrig molekulare Form CD45RO auf aktivierten T-Zellen und auf Memory T-Zellen. CD45RO erleichtert die Antigenerkennung, was zu einer schnelleren Antwort auf Antigene führt. CD45RO+ T-Zellen werden mit jeder Zellteilung empfindlicher für Apoptose. Dadurch halten sie einerseits das homöostatische Gleichgewicht aufrecht und weisen andererseits aber Probleme bei der Langzeiterhaltung von Memory T-Zellen auf. Somit kommt einer weiteren Subpopulation von Memory T-Zellen, nämlich der CD45RA+, scheinbar eine besondere Rolle für die Erhaltung von T-Zellen Memory zu. [Faint, 2001, Busch V. 2006]. Die auffälligste Eigenschaft von Memory T-Zellen ist ihre Fähigkeit, auf Exposition mit bekannten Antigenen eine schnellere und effektivere Antwort zu geben als naive T-Zellen. Um diese Aufgabe zu erfüllen, haben 27 Memory T-Zellen sowohl bestimmte Fähigkeiten von naiven T-Zellen als auch von Effektor T-Zellen. Die Fähigkeit von Memory T-Zellen zu homöostatischer Proliferation, schneller Proliferation nach Antigenkontakt und Aquisition von Effektorfunktionen und Vermittlung von protektiver Immunität sind die drei bedeutendsten Charakteristika [Murali-Krishna, 1999; Busch V., 2006]. Nach Antigenkontakt haben Memory T-Zellen darüber hinaus die Fähigkeit zur schnellen Expansion und raschen Produktion von Zytokinen [Badovinac, 2000]. 28 4 Methoden 4.1 Patientenauswahl An der Universitätsklinik Erlangen-Nürnberg wurden zwischen 1993 und 2004 insgesamt 135 Patienten mit der Diagnose „Adenokarzinom der Kardia“ behandelt. Für die vorliegende Studie wurde daraus ein homogenes Kollektiv von 53 Patienten ausgewählt, die ein invasives Adenokarzinom des Magens vom intestinalen Subtyp (jedoch ohne distale Metastasen nach der Laurén Klassifikation) hatten [Haas et al, 2009]. Ausgeschlossen für die Studie waren auch Patienten mit einem ösophagealen Barrettadenokarzinom und mit einem Karzinom vom diffusen Subtyp. Patienten ohne eine chirurgische R0-Resektion wurden ebenso nicht in die Studie aufgenommen. Die Patienten in dieser Studie erhielten keine neoadjuvante Radio- oder Chemotherapie [Haas et al, 2009]. Das Staging erfolgte nach der Klassifikation der „Union Internationale Contre le Cancer“ (UICC 2002). Von den 53 Patienten waren 40 männlich und 13 weiblich. Insgesamt verstarben zum Stichtag (31.12.2010) 16 Patienten tumorbedingt und 4 Patienten nicht tumorbedingt wegen: • bösartige Neubildung des Pankreas, • arteriosklerotische Herzkrankheit, • generalisierte und nicht näher bezeichnete Arteriosklerose, sowie • Mammakarzinom. Zum Stichtag (31.12.2010) Mindestbeobachtungszeit lebten betrug 36 noch 33 Monate, Patienten. die Die maximale Beobachtungszeit war 71,2 Monate (Median 61,0 Monate mit einem 95 % Konfidenz - Intervall von 54,7 bis 57,8 Monaten). 29 Die Nutzung der TMAs und der Patientendaten für diese Studie waren durch das Ethik - Komitee der Friedrich-Alexander Universität ErlangenNürnberg genehmigt worden. 4.2 Tissue Micro Array und Immunhistochemie Um ein effizientes Arbeiten zu ermöglichen, wurden Tissue Micro Arrays erstellt, wobei Zylinder mit einem Durchmesser von 2 Millimeter ausgestanzt und fixiert wurden. Insgesamt wurden 8 Objektträger der o.g. Patienten mit 539 Einzelstanzen generiert, so dass aufgrund der Färbungen gegen CD1a+ und CD45RO+ insgesamt 1126 Einzelstanzen beurteilt werden konnten. Objektträger A: -insgesamt 7 Patienten, davon -5 Patienten mit Gewebestanzen von Primärtumor, Metastasen und lymphatischem Gewebe und -2 Patienten mit Gewebestanzen von Primärtumor und lymphatischem Gewebe -insgesamt somit 78 Gewebestanzen Objektträger B: -insgesamt 6 Patienten, davon -3 Patienten mit Gewebestanzen von Primärtumor, Metastasen und lymphatischem Gewebe und -3 Patienten mit Gewebestanzen von Primärtumor und lymphatischem Gewebe -insgesamt somit 63 Gewebestanzen Objektträger C: -insgesamt 6 Patienten, davon -4 Patienten mit Gewebestanzen von Primärtumor, Metastasen und lymphatischem Gewebe und 30 -2 Patienten mit Gewebestanzen von Primärtumor und lymphatischem Gewebe -insgesamt somit 66 Gewebestanzen Objektträger D: -insgesamt 7 Patienten, davon -2 Patienten mit Gewebestanzen von Primärtumor, Metastasen und lymphatischem Gewebe und -5 Patienten mit Gewebestanzen von Primärtumor und lymphatischem Gewebe -insgesamt somit 69 Gewebestanzen Objektträger E: -insgesamt 8 Patienten, davon -2 Patienten mit Gewebestanzen von Primärtumor, Metastasen und lymphatischem Gewebe und -6 Patienten mit Gewebestanzen von Primärtumor und lymphatischem Gewebe -insgesamt somit 68 Gewebestanzen Objektträger F: -insgesamt 7 Patienten, davon -4 Patienten mit Gewebestanzen von Primärtumor, Metastasen und lymphatischem Gewebe und -3 Patienten mit Gewebestanzen von Primärtumor und lymphatischem Gewebe -insgesamt somit 75 Gewebestanzen Objektträger G: -insgesamt 7 Patienten, davon -3 Patienten mit Gewebestanzen von Primärtumor, Metastasen und lymphatischem Gewebe und -4 Patienten mit Gewebestanzen von Primärtumor und lymphatischem Gewebe -insgesamt somit 72 Gewebestanzen 31 Objektträger H: -insgesamt 5 Patienten, davon -1 Patient mit Gewebestanzen von Primärtumor, Metastasen und lymphatischem Gewebe und -4 Patienten mit Gewebestanzen von Primärtumor und lymphatischem Gewebe -insgesamt somit 48 Gewebestanzen Pro Patient wurden aus dem • Primärtumor 6 TMAs (jeweils Tumor- und Stromagewebe) genommen, • aus den Metastasen 3 TMAs (ebenfalls jeweils Tumor- und Stromagewebe) und aus • dem lymphatischem Gewebe ebenfalls 3 TMAs. Somit wurden pro Patient 21 TMAs beurteilt. Diese Tissue Microarrays wurden dann -wie im nächsten Abschnitt beschrieben- immunhistochemisch gefärbt (CD1a: dendritische Zellen sowie CD45RO: Memory T-Zellen) und anschließend getrennt für diese zwei Färbungen ausgewertet. Von den ausgewählten 53 Patienten konnten jedoch nur die TMAs von 52 Patienten verwertet werden, da die TMA einer Patientin qualitativ nicht für eine Auswertung geeignet war. Insgesamt wurden 1092 TMAs beurteilt. 32 4.3 Immunhistologische Färbungen Die immunhistologischen Färbungen mit den Primärantikörpern CD1a und CD45RO wurden jeweils liegend in der „Feuchten Kammer“ bei Raumtemperatur durchgeführt. Alle Waschschritte wurden mit T-Tris durchgeführt. Dabei wurden folgende Puffer und Chemikalien verwendet: Tris-Puffer pH 7,4: 6,05 g Tris(hydroxymethyl)-aminomethan (0,05 mol) (Fa. Merck, Darmstadt) und 9 g Natriumchlorid (0,015 mol) (Fa. Roth, Karlsruhe), gelöst in 1 Liter destilliertem Wasser. Einstellung des pH-Wertes mit 37 % Salzsäure. T-Tris-Puffer: Tris-Puffer pH 7,4 (hergestellt, wie oben beschrieben), Zugabe von 1 ml Tween 20 (0,1 %) (Fa. Merck, Darmstadt) in 1 Liter Tris-Puffer. Citronensäurepuffer pH 6 (0,1 M): 2,1 g Citronensäure-Monohydrat (Fa. Roth, Karlsruhe) in 1 Liter destilliertem Wasser gelöst (0,1 M), pH-Wert mit 3N Natronlauge einstellen (12 g Natriumhydroxid-Plätzchen -Fa. Merck, Darmstadt- in 100 ml Wasser gelöst). TRS 6-Puffer: Target Retrieval Solution, Citrate pH 6 (Fa. DakoCytomation, Hamburg), Fertiglösung Strept-AB-HRP-Komplex: Streptavidin-Biotin-horseradish peroxidase (Vectastain ABC-Kit, Fa. LINARIS; Wertheim), Fertiglösung Polymer-Kit: Blocking Solution , Post Block Reagenz, AP-Polymer (Fa. Zytomed Systems GmbH; Berlin), Fertiglösung 33 4.3.1 Färbung mit Primärantikörper CD1a Nach dem Entparaffinieren der Gewebeproben (Biopsie-Stanzen) in Xylol (3 x 10 Minuten) erfolgte die Rehydratisierung in absteigender Alkoholreihe (100 %, 96 % und 70 % Alkohol) für jeweils 2 Minuten. Anschließend wurde die endogene Peroxidase im Gewebe mit 3 % H 2 O 2 (Fa. Roth, Karlsruhe) für 10 Minuten blockiert. Für die Epitopdemaskierung wurden die Proben in TRS 6 -Puffer für 5 Minuten im Dampfkochtopf gekocht. Nach dem Abkühlen und dem Spülen mit Tris-Puffer wurde die Inkubation mit dem Primärantikörper CD1a (Fa. Immunotech, Marseille, Frankreich) mit einer Verdünnung von 1:2 in Albumin über Nacht durchgeführt. Der Primärantikörper CD1a wurde mit T-TRIS-Puffer abgewaschen und es folgte die Inkubation mit einem biotinylierten antimouse Sekundärantikörper (Verdünnung 1:100) für 30 Minuten. Nachdem der Sekundärantikörper abgewaschen wurde, wurde der StreptAB-HRP-Komplex aufgetragen und für 30 Minuten inkubiert. Nach dem Spülen erfolgte für ca. 15 Minuten die Inkubation mit AEC (3-Amino-9Ethylcarbazol Chromogen). Die Zugabe des Chromogens bewirkt eine enzymatische Reaktion mit der Peroxidase, so dass es dort, wo der Primärantikörper gebunden hat, zu einem Farbniederschlag kommt. Die Färbung wurde durch fließendes Wässern mit Leitungswasser gestoppt. Anschließend wurden die Schnitte in destilliertes Wasser gestellt und dann ca. 30 Sekunden mit Hämalaun (Fa. Merck; Darmstadt) gegengefärbt. Nach erneuten fließenden Wässern mit Leitungswasser (bläuen) und Überführen in destilliertes Wasser, erfolgte das Eindecken mit Aquatex (C 6 H 9 NO; Fa. Nierengewebe. Merck, Darmstadt). Als Positivkontrolle diente 34 4.3.2 Färbung mit Primärantikörper CD45R0 Die Gewebeproben (Biopsie-Stanzen) wurden in Xylol (3 x 10 Minuten) entparaffiniert und jeweils für 2 Minuten in einer absteigenden Alkoholreihe (100 %, 96 % und 70 % Alkohol) rehydratisiert. Anschließend wurden die Objektträger im Dampfkochtopf für 1 Minute in Citronensäurepuffer gekocht. Nach dem Abkühlen und dem Spülen mit Tris-Puffer erfolgte für 5 Minuten die Inkubation mit der „Blocking Solution“, um unspezifische Primärantikörperbindungen zu verhindern und den Hintergrund zu reduzieren. Der Primärantikörper CD45RO wurde in einer Albumin- Verdünnung von 1:200 aufgetragen und über Nacht inkubiert. Es erfolgte dann das Spülen mit T-TRIS-Puffer. Anschließend wurde für 20 Minuten das „Post-Block Reagenz“ zur Signalverstärkung aufgetragen. Nach dem Spülen wurde die Inkubation mit dem „AP-Polymer“ für 30 Minuten durchgeführt. Das AP-Polymer ist ein Gemisch aus Sekundärantikörper und einer alkalischen Phosphatase. Nach erneutem Spülen wurde für 20 Minuten FAST RED (Fa. LINARIS; Wertheim, Fertiglösung) aufgetragen. Das Chromogen bewirkt eine enzymatische Reaktion mit der alkalischen Phosphatase, so dass ein Farbniederschlag nur dort erfolgt, wo der Primärantikörper gebunden hat. Die Färbung wurde durch 2 Minuten langes fließendes Wässern mit Leitungswasser gestoppt. Abschließend wurden die Objektträger mit den Schnitten in destilliertes Wasser gestellt und ca. 2 Minuten mit Hämalaun (Fa. Roth; Karlsruhe) gegengefärbt. Nach erneutem fließenden Wässern mit Leitungswasser und Überführen in destilliertes Wasser erfolgte das Eindecken mit Aquatex (C 6 H 9 NO, Fa. Merck, Darmstadt). Als Positivkontrolle diente Gewebe aus den Tonsillen. 35 4.4 Auswertung Nachdem die Tissue Micro Arrays w.o. beschrieben angefärbt worden sind, erfolgte die Auswertung der Einzelstanzen mittels verschiedener Computerprogramme. Zunächst wurden die Objektträger mit dem MIRAX-Scanner (Fa. Zeiss, Jena) gescannt, wobei jeweils ein kompletter Objektträger mit allen aufgetragenen TMAs in einem Arbeitsgang bearbeitet werden konnte. Der MIRAX-SCAN erzeugt als vollautomatisierte Systemplattform hochaufgelöste digitale Datensätze, sog. „Digital Slides“, die auf einem Monitor beurteilt werden können. Die so generierten „Digital Slides“ wurden zusätzlich mit der Software „MIRAX-Viewer“ für die bessere Weiterverarbeitung zu gleichmäßigen Quadratslides aufbereitet. Diese Bilder wurden anschließend mit den Bildbearbeitungsprogrammen „Photoshop CS 3“ bzw. auch „Photoshop CS 4“ qualitativ nochmals wesentlich verbessert, wobei Hintergrund, Position und Kontrast der digitalen Aufnahmen für die Auswertung optimiert wurden. Diese Digitalfotos wurden auf einer externer Festplatte (VERBATIM) zur Weiterverarbeitung gespeichert. Abschließend erfolgte die Auswertung der optimierten „Digital Slides“ mit dem BIOMAS Auswerteprogramm (Erlangen, Deutschland). Dabei wurden die digitalen Bilder mit einer zweifachen Vergrößerung ausgewertet und die einzelnen ROI (Region of Interest) festgelegt. Im Gewebe des Primärtumors und der Metastasen wurden jeweils Tumorgewebe und Stromagewebe ausgewertet. In den weiteren Arbeitsschritten wurden die auszuwertenden Merkmale (CD1a bzw. CD45RO) definiert und die Ergebnisse der jeweils ausgewerteten TMAs in verschiedenen Excel- 36 Tabellen abgespeichert. Somit konnten die Anzahl der als positiv erkannten Zellen ins Verhältnis zu der Fläche der ausgewerteten Region gesetzt werden. Daraus errechnete sich die Zellzahl pro mm² sowohl für das Gewebe des Primärtumors (aufgeteilt in Tumor- bzw. Stromagewebe) als auch einer Metastase (ebenfalls aufgeteilt nach Tumor- und Stromagewebe) und des Lymphknotens. 4.5 Statistik Die Berechnung der NED-Überlebensraten erfolgte mit Hilfe der KaplanMeier-Methode und der Statistik- und Analyse Software SPSS. Der Name SPSS stand bei der Entwicklung des Programms 1968 als Abkürzung für die Bezeichnung „Statistical Package for the Social Sciences“, da die statistischen Daten Ende der 60-er / Anfang der 70-er Jahre zunächst auf Lochkarten gespeichert wurden. Mit der Einführung und Entwicklung der PC-Programme 1983 stand SPSS für „Superior Performing Software System“. Nach Übernahme der Software durch IBM im Jahr 2009 wurde das Basismodul kontinuierlich weiterentwickelt und erweitert [Janssen, 2005]. Die Software SPSS ist ein modular aufgebautes Programmpaket zur statistischen Analyse von Daten. Das Basismodul ermöglicht das grundlegende Datenmanagement und umfangreiche statistische und grafische Datenanalysen mit den gängigsten statistischen Verfahren. Für die vorliegende Arbeit wurden v.a. die Berechnungen der Mediane der TILs in den verschiedenen untersuchten Geweben, der Signifikanz (pWert) und der Konfidenzintervalle sowie die Darstellung in sog. KaplanMeier-Kurven vorgenommen. Überlebensraten Für (krankheitsfreies die Berechnung Überleben) wurden der bei NEDden 37 untersuchten TMAs eine Teilung am Median vorgenommen und der Logrank-Test diente dem Vergleich der beiden Überlebensraten. Der Beobachtungszeitraum betrug 36 Monate, die maximale Beobachtungszeit war 71,2 Monate (Median 61,0 Monate mit einem 95 % Konfidenz - Intervall von 54,7 bis 57,8 Monaten) [Haas et al, 2009]. 38 Abb. 2: Primärtumor eines Patienten mit Magenkarzinom mit CD1a+ Zellen (x 12,5) (Objektträger B, Ebene 1, Stanze A2, Patientenhistonr. 5882/94) Abb. 3: Ausschnittsvergrößerung (x 400) des in Abb. 2 genannten TMAs 39 Abb. 4: Metastase eines Patienten mit Magenkarzinom mit CD1a+ Zellen (x 12,5) (Objektträger B, Ebene 3, Stanze C4, Patientenhistonr. 6779/94) Abb. 5: Ausschnittsvergrößerung (x 400) des in Abb. 4 genannten TMAs 40 Abb. 6: Lymphatisches Gewebe eines Patienten mit Magenkarzinom mit CD1a+ Zellen (x 12,5) (Objektträger C, Ebene 3, Stanze B1, Patientenhistonr. 9843/95) Abb. 7: Ausschnittsvergrößerung (x 400) des in Abb. 6 genannten TMAs 41 Abb. 8: Primärtumor eines Patienten mit Magenkarzinom mit CD45RO+ Zellen (x 12,5) (Objektträger E, Ebene 12, Stanze A2, Patientenhistonr. 1022/99) Abb. 9: Ausschnittsvergrößerung (x 400) des in Abb. 8 genannten TMAs 42 Abb. 10: Metastase eines Patienten mit Magenkarzinom mit + CD45R0 Zellen (x 12,5) (Objektträger E, Ebene 12, Stanze A5, Patientenhistonr. 680/01) Abb. 11: Ausschnittsvergrößerung (x 400) des in Abb. 10 genannten TMAs 43 Abb. 12: Lymphatisches Gewebe eines Patienten mit + Magenkarzinom mit CD45R0 Zellen (x 12,5) (Objektträger F, Ebene 4, Stanze A4, Patientenhistonr. 987/01) Abb. 13: Ausschnittsvergrößerung (x 400) des in Abb. 12 genannten TMAs 44 5 Ergebnisse 5.1 Studiengruppe Die Einzelmerkmale der Studiengruppe sind aus folgenden Tabellen 1 und 2 zu ersehen [Haas et al, 2009]: Tabelle 1: Details zu den 52 ausgewerteten Patienten: Gesamtanzahl Geschlecht TNM-Klassifizierung (UICC 2002) Grading T Stadium N Stadium männlich weiblich I II III IV G1 G2 G3 G4 T1 T2 T3 T4 N0 N+ N1 N2 Anzahl 52 40 12 20 % 100 76,9 23,1 39,2 19 10 3 1 29 21 1 12 32 5 3 24 28 22 6 36,5 19,2 5,8 2 56 40 2 23 62 10 6 46,2 53,8 42,3 11,5 Tabelle 2: Statistische Merkmale des Patientenkollektives: Alter in Jahren Gesamtüberlebenszeit (Monate) NED-Überlebenszeit (Monate) Zeit zum Rezidiv (Monate) arithmetischer Mittelwert Median 64,6 58,6 67,0 50,0 95 % Konfidenzintervall 61,5 - 67,7 46,4 - 70,8 55,7 41,5 43,1 - 68,3 23,8 17,0 13,8 - 33,7 45 Nach 5 Jahren betrug die Rate der Gesamtüberlebenszeit 53,7 % und die NED -Überlebensrate 63,7 % für das gesamte Studienkollektiv. Das mediane Gesamtüberleben war 50 Monate (46,4 - 70,8 Monate) und das mittlere NED-Überleben 41,5 Monate (43,1 - 68,3 Monate) [Haas et al, 2009]. 5.2 Quantifizierung Die quantitative Erfassung der tumorinfiltrierenden Zellen (TIL) brachte für die dendritischen Zellen (Färbung gegen CD1a) und für die Memory TZellen (Färbung gegen CD45RO) folgende aus der Tabelle 3 zu entnehmenden Labeling Indizes. Tabelle 3: Quantitative Erfassung der TIL: Anzahl der Positivzellen bezogen auf mm² des bezeichneten Gewebes Gewebe CD1a Färbung (Dendritische Zellen) Zellzahl pro mm² TIL Min Max Median Min CD45RO Färbung (Memory T-Zellen) Zellzahl pro mm² TIL Max Median Primärtumor Tumorgewebe Stromagewebe 1,5 0 50,4 40,4 6,56 3,16 23,1 23,0 1255,9 1348,2 331 258 2,2735 14,1 0 36,4 4,24 0,00 16,9 0 1725,1 798,8 349 177 1,02 200,6 3536,6 1023 Metastase Tumorgewebe Stromagewebe Lymphatisches 0 Gewebe 4,8 46 Daraus ist ersichtlich, dass in den untersuchten TMAs quantitativ deutlich weniger CD1a+ gefärbte Zellen (DC) pro mm² untersuchtem Gewebe vorhanden waren, als CD45RO+ (Memory T-Zellen). Sowohl bei CD1a+ als auch bei CD45RO+ gefärbten Zellen waren im Tumorgewebe (Primärtumor und auch Metastase) deutlich mehr positive Zellen zu finden, wie im Stromagewebe. Die mit Abstand am meisten positiv gefärbten Zellen fanden sich im lymphatischen Gewebe der CD45RO+ Färbung (Median: 1023 Zellen / mm2). Eine detaillierte Auflistung der zusammenfassenden quantitativen Resultate (Tabelle 3) für die einzelnen Patienten sowohl für DC (CD1a+) als auch Memory T-Zellen (CD45RO+) ist aus den im Anhang beiliegenden Tabellen I und II zu ersehen. 47 Tabelle 4: Zusammenfassende Übersicht der TIL (Zellen pro mm2) und des 95 % Konfidenzintervalls für die Überlebenszeit Gewebe CD1a Färbung (Dendritische Zellen) Trennung am Median Primärtumor Tumorgewebe < 6,56 > 6,56 Stromagewebe < 3,16 > 3,16 95 % Konfidenzintervall für die Überlebenszeit Median (Zellzahl pro mm2) 54,1 - 91,8 48,9 - 109,5 59,9 - 128,2 37,8 - 76,2 6,56 < 4,24 > 4,24 Stromagewebe < Median 0,0 > Median 0,0 53,1 - 129,4 71,4 - 140,7 58,8 - 132,1 65,6 - 139,4 4,24 Lymphat. Gewebe 74,6 - 120,7 80,7 - 129,2 1,02 Metastase Tumorgewebe < 1,02 > 1,02 Gewebe 3,16 0,00 CD45RO Färbung (Memory T-Zellen) Trennung am Median Primärtumor Tumorgewebe < 331 > 331 Stromagewebe < 258 > 258 95 % Konfidenzintervall für die Überlebenszeit Median (Zellzahl pro mm2) 40,3 - 70,7 60,3 - 123,8 36,9 - 67,5 63,7 - 128,3 331 <349 > 349 Stromagewebe < 177 > 177 23,4 - 79,0 69,2 - 119,9 33,8 - 79,7 67,8 - 121,9 349 Lymphat. Gewebe 46,8 - 83,6 53,6 - 124,1 1023 Metastase Tumorgewebe < 1023 > 1023 258 177 48 Tabelle 5: Einfluss immunhistochemischer Parameter auf das NEDÜberleben Gewebe Primärtumor Tumorgewebe Stromagewebe Metastase Tumorgewebe Stromagewebe Lymphat. Gewebe Gewebe Primärtumor Tumorgewebe Stromagewebe Metastase Tumorgewebe Stromagewebe Lymphat. Gewebe CD1a Färbung (Dendritische Zellen) Trennung am Median NED Überleben (5 Jahre) (%) p-Wert < 6,56 > 6,56 < 3,16 > 3,16 50,5 41,5 48,9 44,9 0,241 < 4,24 > 4,24 < Median (0,00) > Median (0,00) 55,0 72,7 64,2 63,8 0,521 < 1,02 > 1,02 66,4 65,8 0,869 0,532 0,906 CD45RO Färbung (Memory T-Zellen) Trennung am Median NED Überleben (5 Jahre) (%) p-Wert < 331 > 331 < 258 > 258 48,7 46,6 45,5 59,8 0,691 < 349 > 349 < 177 > 177 41,7 55,5 41,6 58,4 0,285 < 1023 > 1023 48,1 43,7 0,756 0,328 0,487 49 5.3 Prognostische Signifikanz der TIL Während die Infiltrationsdichte mit CD1a+ gefärbten dendritischen Zellen die Prognose für das NED-Überleben nicht beeinflusste, hatten der hohe Anteil der CD45RO+ gefärbten Memory T-Zellen auf das NED-Überleben einen prognostisch günstigen Einfluss. Diese Korrelation ist aus den folgenden Kaplan-Meier Kurven ersichtlich. Aufgrund der Trennung am Median bedeutet die grüne Kaplan-MeierKurve „viele“ und die blaue Kaplan-Meier-Kurve „wenige“ der jeweils genannten Zellen (DC bzw. Memory T-Zellen). Daraus ist ersichtlich, dass sich für die gegen CD1a gefärbten dendritischen Zellen kein einheitliches Ergebnis ergab. Waren im Tumor und Stromagewebe des Primärtumors (vgl. Abb. 14 und 15) „wenige“ Zellen prognostisch günstig, so verhielt es sich im Tumor- bzw. Stromagewebe der Metastasen und auch im lymphatischen Gewebe geradezu umgekehrt (vgl. Abb. 16, 17 und 18). Hier waren „viele“ DC prognostisch günstiger. Aufgrund des hohen p-Wertes (p > 0.05) lässt sich daraus jedoch keine prognostische Signifikanz ableiten, sondern man kann nur eine Tendenz erkennen. Aber auch diese nicht einheitlich. Dahingegen erkennt man für die gegen CD45RO gefärbten Memory TZellen, dass eine hohe Anzahl dieser Zellen prognostisch günstig für das NED-Überleben ist (vgl. Abb. 19, 20, 21, 22 und 23). Die hohe Anzahl der CD45RO+ gefärbten Zellen findet sich sowohl im • Tumor- und Stromagewebe des Primärtumors, • des Tumor- und Stromagewebes der Metastasen als auch • im lymphatischen Gewebe. 50 Jedoch ist auch hier aufgrund des p-Wertes > 0.05 keine Signifikanz, sondern lediglich eine Tendenz gegeben. Diese Tendenz deckt sich mit den Forschungsergebnissen von Galon et al [Galon, 2011]. 51 < 6,56 50,5 % p = 0,241 > 6,56 mit Risiko 20 18 16 20 16 12 Abb. 14: 14 11 12 8 41,5 % 4 6 NED-Überleben in Abhängigkeit vom Anteil der CD1a+ gefärbten Zellen im Tumorgewebe des Primärtumors getrennt am Median 6,56 52 < 3,16 > 3,16 p = 0,532 mit Risiko 16 15 13 18 14 10 Abb. 15: 10 9 9 7 48,9 % 44,9 % 3 5 NED-Überleben in Abhängigkeit vom Anteil der CD1a+ gefärbten Zellen im Stromagewebe des Primärtumors getrennt am Median 3,16 53 > 4,24 72,7 % < 4,24 55,0 % p = 0,521 mit Risiko 11 7 10 8 Abb. 16: 6 5 6 3 NED-Überleben in Abhängigkeit vom Anteil der CD1a+ gefärbten Zellen im Tumorgewebe der Metastase getrennt am Median 4,24 54 64,2 % 63,8 % p = 0,906 mit Risiko 11 9 7 10 9 8 Abb. 17: 5 8 3 7 2 6 NED-Überleben in Abhängigkeit vom Anteil der CD 1a+ gefärbten Zellen im Stromagewebe der Metastase 55 < 1,02 66,4 % > 1.02 65,8 % p = 0,869 mit Risiko 23 21 18 23 21 20 Abb. 18: 11 17 9 15 7 11 NED-Überleben in Abhängigkeit vom Anteil der CD1a+ gefärbten Zellen im lymphatischen Gewebe getrennt am Median 1,02 56 < 331 48,7 % > 331 46,6 % p = 0,691 mit Risiko 19 15 13 23 20 18 Abb. 19: 11 14 9 12 6 5 NED-Überleben in CD45RO+ gefärbten Abhängigkeit vom Anteil Zellen im Tumorgewebe des Primärtumors getrennt am Median 331 57 > 258 p = 0,328 mit Risiko 21 16 11 21 20 19 Abb. 20: < 258 10 15 7 14 NED-Überleben 59,8 % 45,5 % 5 5 in Abhängigkeit vom Anteil CD45RO+ gefärbten Zellen im Stromagewebe des Primärtumors getrennt am Median 258 58 > 349 p = 0,285 mit Risiko 8 6 4 34 29 27 Abb. 21: < 349 4 22 3 18 55,5 % 41,7 % 2 8 NED-Überleben in Abhängigkeit vom Anteil CD45RO+ gefärbten Zellen im Tumorgewebe der Metastase getrennt am Median 349 59 > 177 58,4 % p = 0,487 < 177 mit Risiko 10 9 6 32 26 24 Abb. 22: 6 20 5 16 41,6 % 4 7 NED-Überleben in Abhängigkeit vom Anteil CD45RO+ gefärbten Zellen im Stromagewebe der Metastase getrennt am Median 177 60 < 1023 48,1 % p = 0,756 > 1023 43,7 % mit Risiko 22 18 14 20 17 16 Abb. 23: 11 14 9 12 7 3 NED-Überleben in Abhängigkeit vom Anteil CD45RO+ gefärbten Zellen im lymphatischen Gewebe getrennt am Median 1023 61 6 Diskussion In der umfangreichen Literatur zur Entstehung von Krebs wird einheitlich festgestellt, dass die Tumorentstehung ein multifaktorielles Geschehen ist. Neben genetischen Faktoren (z.B. bei FAP, HNPCC u.a.), dem persönlichem Verhalten bzw. dem „Lifestyle“, wie z.B. der Konsum von Alkohol, Nikotin u.a., sowie Ernährungs- und Bewegungsgewohnheiten, spielt auch die „Umwelt“ in Form von Viren, Bakterien oder Strahlung eine große Rolle für das Entstehen von benignen und malignen Tumoren. Trotz jahrzehntelanger Forschung konnte dieser „König aller Krankheiten“ [Mukherjee, 2012] noch nicht „besiegt“ werden. Viele Jahre konnten die Ärzte nur mit radikalen Operationen, Chemo- und / oder Strahlentherapien versuchen, die bösartigen Wucherungen zu beseitigen, ohne die eigentlichen zellulären und molekularen Ursachen für das Tumorwachstum zu kennen. Erst mit den grundlegenden Arbeiten von Douglas Hanahan und Robert Weinberg gelang es, strukturierende Regeln für die Entstehung von Krebs zu etablieren. Daraus ergaben und ergeben sich immer neue Ansätze für die Therapie dieser „Geisel der Menschheit“, wie der Krebs oft in der (Populär)-Literatur genannt wird. So werden immer mehr „neue“ Medikamente entwickelt, die direkt in die Abläufe in den Zellen bzw. Zellkernen (z.B. DNA - Synthese) eingreifen, z.B. Imatinib als Thyrosinkinaseinhibitor bei der Chronisch-myeloische Leukämie, um nur eine Entwicklung exemplarisch anzuführen. Unter dem Titel „Hallmarks of Cancer“ (Kennzeichen von Krebs) publizierten Hanahan und Weinberg im Jahr 2000 einen Artikel in der Fachzeitschrift „Cell“. Diese Publikation wurde zu einer der meistzitierten Studie der Krebsforschung überhaupt. Dabei charakterisierten Hanahan und Weinberg 6 Eigenschaften, die Tumorzellen von Normalgewebe unterscheiden: 62 1. Autarkie in den Wachstumssignalen: durch die Aktivierung von Onkogenen, wie z.B. Ras oder Myc eignen sich die Krebszellen einen eigenständigen Vermehrungstrieb an, die sog. „pathologische Mitose“. 2. Unempfindlichkeit gegenüber wachstumshemmenden Signalen: Krebszellen inaktivieren Tumorsuppressorgene wie z.B. Rb, die im Normalfall das Wachstum blockieren. 3. Umgehung des programmierten Zelltodes (Apoptose): Krebszellen unterdrücken und inaktivieren Gene und Signalwege, die Zellen im Normalfall sterben lassen. 4. Grenzenloses spezifische Fortpflanzungspotential: Signalwege in den Krebszellen Genen, die sie aktivieren noch nach generationenlangem Wachstum unsterblich machen. 5. Fähigkeit zur Angiogenese: Krebszellen eignen sich die Fähigkeit an, sich eine eigene Blutversorgung und eigene Blutgefäße zuzulegen (Tumorangiogenese). Jedoch ist die Blutgefäßversorgung in Tumoren in der Regel chaotisch und die Gefäßwände sind fenestriert und durchlässig. Dadurch sickert ständig Plasma aus dem Blutstrom in das Tumorgewebe ein und damit auch Fibrinogen und Thrombin, das durch den Tissue Factor aktiviert wird und Fibrinogen zu Fibrin spaltet [Dvorak HF, 2003]. 6. Gewebeinvasion und Metastasierung: Krebszellen eignen sich die Fähigkeit an, in andere Organe zu wandern, in andere Gewebe einzudringen und sie zu besiedeln, so dass sie sich im ganzen Körper ausbreiten [Mukherjee, 2012]. 63 Rund 10 Jahre später versuchten die beiden Wissenschaftler erneut, das gegenwärtige Wissen über die Tumorentstehung zusammenzufassen und veröffentlichten 2011 wieder in der Fachzeitschrift „Cell“ einen Artikel („Hallmarks of Cancer: The Next Generation“). Hierbei erweiterten die Autoren die genannten 6 charakteristischen Merkmale von Tumorzellen um zwei weitere Eigenschaften: 1. Dysregulierung des Energiemetabolismus in den Tumorzellen 2. Fähigkeit, der Erkennung bzw. der Zerstörung durch das Immunsystem zu entgehen Außerdem wird der Einfluss der Mikroumgebung des Tumors im Gewebe besonders betont: Krebszellen sind von verschiedenen Arten normaler, rekrutierter Immunzellen umgeben, die durch proinflammatorische Signale ein entzündungsähnliches Mikromilieu schaffen. Tumorzellen sind eben nicht isolierte Entitäten, sondern stehen in enger Wechselwirkung mit ihrer Umgebung, vor allem mit den umliegenden lokalen und vom Tumor rekrutierten mesenchymalen Zellen und der extrazellulären Matrix. Die Interaktion zwischen Tumorzellen und den umliegenden stromalen Zellen ist noch weitgehend ungeklärt. Zusammenfassend lässt sich feststellen, dass es nicht wirklich möglich ist, die singuläre Schlüsselrolle der Krebsentstehung einem bestimmten Zelltyp zuzuordnen. Vielmehr ist das Zusammenwirken der Tumorzellen mit ihrer Umgebung und den Stromazellen ein bedeutender Aspekt. Hieraus lassen sich künftig weitere Therapieansätze ableiten. Die von Hanahan und Weinberg genannte Interaktion mit dem Immunsystem ist auch für Dr. Jérome Galon (INSERM Forschungsdirektor, Paris) ein wichtiger Bestandteil seiner Forschung. Bisher wird die Prognose der Patienten für das Überleben am 64 Tumorstadium festgemacht. Das „Staging“ durch das TNM - System (vgl. Ziff. 3.1.4.4) orientiert sich dabei an der lokalen Ausbreitung des Tumors (T), dem Ausmaß der Infiltration der regionären Lymphknoten (N) und der hämatogenen Fernmetastaierung (M). Galon konnte mit seinen Mitarbeitern aber zeigen, dass die detaillierte Analyse der lokalen Immunantwort ein viel besserer Prädiktor wäre, der auch bei kleinen Tumoren die besonders gefährdeten Patienten zuverlässig identifiziert [BDI, 2009]. Galon hat die Infiltration der Lymphozyten quantitativ und qualitativ evaluiert. Die statistischen Auswertungen belegen den starken Einfluss der Immunabwehr auf den klinischen Verlauf der Erkrankung. Eine hohe Dichte von Immunzellen im Tumor als Ausdruck einer starken Immunreaktion korrelierte mit einer günstigen Prognose - und zwar unabhängig von der Größe des Primärtumors und der Tumorausbreitung [BDI, 2009]. Jüngste Daten belegen darüber hinaus die Schlüsselrolle von zwei TLymphozyten-Subgruppen: den cytotoxischen CD8-T-Zellen und den -in dieser Arbeit auch untersuchten- gegen CD45RO gefärbten Memory TZellen. Offenbar kontrollieren die Memory T-Zellen die frühen Schritte der Metastasierung. Von ihnen hängt es ab, ob sich der Tumor entlang der Blut-, Lymph- und Nervenbahnen weiter im Körper ausbreiten kann oder nicht. Die Funktion dieser Immunzellen bestimmt maßgeblich das Rezidivrisiko und das Überleben der Patienten - auch bei sehr kleinen Tumoren. Galon und Kollegen haben bereits einen einfachen „Immunscore (Im)“ entwickelt, der möglicherweise für die klinische Praxis der Identifikation von Hochrisikopatienten von großem klinischen Nutzen sein kann: 65 Im 0 wenig CD8- und CD45RO-Zellen im Tumor und im Randbereich Im 1, 2 , 3, 4 jeweils höhere Infiltration von CD8- und CD45RO-Zellen im Tumor und im Randbereich Galon beurteilt also nicht nur den „Tumor“, sondern stattdessen zusätzlich noch die lokale Immunantwort der CD8-T-Zellen sowie der Memory TZellen. Denn diese Art der Antwort bestimmt letztlich, wie es um den Patienten steht [Biotechnologie, 2009]. Die Infiltration mit Lymphozyten ist eine gemeinsame Eigenschaft des menschlichen Krebses. Damit lässt sich der Krankheitsverlauf und das klinische Outcome bei Patenten viel besser als bisher voraussagen. Auch die vorliegende Arbeit konnte diesbezüglich eine Tendenz für das Kardiakarzinom des Magens aufzeigen (vgl. Ziff. 1.3, 1.4 und 5.3). Je höher die Infiltration mit Memory-T-Zellen im Tumor- und Stromagewebe des Tumors und der Metastasten und auch des lymphatischen Gewebes war, desto höher war das NED-Überleben der untersuchten Patienten. Ob und inwieweit die Immunantwort das bislang vorherrschende TNMSystem für das Staging künftig ersetzen oder zumindest ergänzen kann, werden weitere Forschungen zeigen. Die vorliegenden Ergebnisse weisen jedoch in diese Richtung. 66 7 Anhang Einzelauswertung für die gegen CD1a+ bzw. CD45RO+ gefärbte Zellen: Legende für Tabelle I und Tabelle II: Spalte 1: Histo-Nr. des Patienten gem. Pathologisches Institut der Universitätsklinik Erlangen Spalte 2: Bezeichnung des Objektträgers mit den jeweiligen TMAs Spalte 3: Anzahl der Zellen pro mm² im Tumorgewebe des Primärtumors Spalte 4: Anzahl der Zellen pro mm² im Stromagewebe des Primärtumors Spalte 5: Anzahl der Zellen pro mm² im Tumorgewebe der Metastase Spalte 6: Anzahl der Zellen pro mm² im Stromagewebe der Metastase Spalte 7: Anzahl der Zellen pro mm² im lymphatischen Gewebe 67 7.1 Tabelle I: Quantitative Auswertung der CD1a+ gefärbten Zellen (DC) aufgeteilt in die verschiedenen ROI - berechnet auf Anzahl der ausgewerteten Zellen pro mm² Allgemeine Angaben Zellzahl pro mm² 1 2 3 4 5 6 7 Histo Nummer OT Primärtumor Tumor Primärtumor Stroma Metastase Tumor Metastase Stroma KontrollLK 1463/93 1673/93 7063/93 9393/93 11159/93 11279/93 1191/94 A A A A A A A 17,7 14,2 28,3 50,4 31,4 23,3 22,4 28,2 3,7 16,5 40,4 7,8 14,3 22,9 nicht 9,6 4,0 2,6 nicht 4,2 6,2 vorhanden 3,0 5,6 6,0 vorhanden 1,9 0 4,8 1,2 2,6 0,4 0,6 0,4 1,0 5790/94 5882/94 6779/94 10447/94 14365/94 3853/95 B B B B B B 14,6 14,9 19,5 8,8 13,9 9,7 7,3 8,2 4,7 8,8 10,9 5,6 5,6 nicht 5,4 nicht 5,6 nicht 0 vorhanden 0 vorhanden 4,2 vorhanden 0 0,9 1,0 0 0,4 1,0 5785/95 6990/95 9737/95 9843/95 13434/95 8483/96 C C C C C C 8,3 29,2 13,5 10,8 12,2 9,3 2,2 6,7 20,1 4,6 4,7 5,9 nicht 2,7 5,8 nicht 6,1 3,3 vorhanden 0 0 vorhanden 0 4,6 1,3 0,5 0,2 2,7 0 0,9 9019/96 D Auswertung nicht möglich nicht vorhanden 0,2 10965/96 5728/97 230/98 235/98 898/98 2117/98 D D D D D D 7,5 5,9 3,9 3,8 3,7 1,8 12,9 15,5 15,3 2,3 3,7 0 nicht nicht 5,9 nicht 2,2 nicht vorhanden vorhanden 0,5 vorhanden 0 vorhanden 1,0 0,8 0,6 0,5 0,3 0 68 2811/98 1022/99 2175/99 2218/00 103/01 680/01 746/01 511/01 E E E E E E E E 12,4 4,8 8,6 nicht nicht nicht nicht nicht 2,6 nicht nicht vorhanden vorhanden vorhanden vorhanden vorhanden 1,2 vorhanden vorhanden 0,3 0,3 3,2 1,5 7,3 9,7 2,4 2,7 2,8 Stanze 0 0 1,8 0 987/01 419/02 1480/02 2689/02 2918/02 2808/03 3894/03 F F F F F F F 5,7 4,8 4,7 8,9 2,5 2,7 6,8 0 0,8 1,4 3,5 0,7 1,7 0 5,9 14,0 nicht 3,9 3,7 nicht nicht 36,4 0 vorhanden 0 5,4 vorhanden vorhanden 0,8 0,6 0,5 0,2 0,4 0,7 0,5 113/04 549/04 743/04 1016/04 1040/04 1397/04 1608/04 G G G G G G G 2,5 3,1 3,6 4,6 4,1 4,2 3,6 1,9 2,1 0 2,0 1,0 1,3 5,5 nicht 4,2 4,9 nicht nicht 4,5 nicht vorhanden 0 0 vorhanden vorhanden 0 vorhanden 0 0,2 0,4 0 0,5 0,7 0,4 1681/04 3048/04 3402/04 2150/98 2064/00 H H H H H 6,3 4,4 4,6 2,5 4,0 5,3 1,6 2,1 1,3 0 2,9 nicht nicht nicht nicht 3,6 vorhanden vorhanden vorhanden vorhanden 0,2 1,4 1,2 2,0 0 0 0,9 1,2 0,5 69 7.2 Tabelle II: Quantitative Auswertung der CD45R0+ gefärbten Zellen (Memory T-Zellen) aufgeteilt in die verschiedenen ROI berechnet auf Anzahl der ausgewerteten Zellen pro mm² Allgemeine Zellzahl pro mm² Angaben 1 2 3 4 5 6 7 Histo Nummer OT Primärtumor Tumor Primärtumor Stroma Metastase Tumor Metastase Stroma KontrollLK 1463/93 1673/93 7063/93 9393/93 11159/93 11279/93 A A A A A A 376,6 331,4 504,3 470,5 154,3 308,9 274,1 155,4 316,1 172,4 126,9 117,0 nicht 780,8 265,0 91,0 nicht 106,8 vorhanden 147,2 142,6 0 vorhanden 329,5 683,1 634,2 949,6 742,5 307,9 885,7 1191/94 A 268,7 180,1 16,9 117,6 1023,2 5790/94 5882/94 6779/94 10447/94 14365/94 3853/95 B B B B B B 23,7 169,9 23,0 30,4 144,9 57,2 171,7 199,5 30,0 39,6 78,4 247,8 326,8 nicht 118,5 nicht 117,1 nicht 167,0 vorhanden 27,3 vorhanden 164,6 vorhanden 345,2 755,0 236,2 200,6 384,0 452,6 5785/95 C 156,9 90,9 nicht vorhanden 208,9 6990/95 9737/95 9843/95 13434/95 8483/96 C C C C C 103,1 891,7 121,2 194,2 183,7 23,0 259,1 58,2 84,0 221,5 563,0 593,5 nicht 347,7 348,9 98,3 60,3 vorhanden 161,6 173,1 324,1 461,8 572,6 337,6 691,8 70 9019/96 D keine Auswertung möglich nicht vorhanden 376,7 10965/96 5728/97 230/98 D 458,5 D 545,5 D 356,7 383,5 415,8 278,8 nicht nicht 1725,1 vorhanden vorhanden 523,5 1175,3 917,2 1228,1 235/98 898/98 2117/98 2811/98 1022/99 2175/99 2218/00 103/01 680/01 746/01 511/01 D D D E E E E E E E E 357,8 500,4 639,6 848,9 528,4 308,1 425,9 394,9 1137,3 308,0 675,9 141,0 256,0 433,7 402,6 106,2 293,9 443,5 1348,2 585,2 392,9 698,4 nicht 956,3 nicht nicht nicht nicht nicht nicht 1137,8 nicht nicht vorhanden 677,8 vorhanden vorhanden vorhanden vorhanden vorhanden vorhanden 391,3 vorhanden vorhanden 1021,7 1412,6 n.v. 1434,1 789,5 909,2 1364,7 1263,1 1022,6 1270,5 2280,6 987/01 419/02 1480/02 2689/02 2918/02 2808/03 3894/03 F F F F F F F 173,4 1255,9 146,7 406,1 434,0 300,4 313,5 125,9 299,0 226,3 160,3 188,9 245,8 473,2 415,5 1036,0 nicht 305,8 1158,0 nicht nicht 254,4 488,0 vorhanden 261,2 176,7 vorhanden vorhanden 1201,4 1300,0 1862,2 1707,2 1417,0 1545,4 1934,0 113/04 549/04 743/04 1016/04 1040/04 1397/04 1608/04 G G G G G G G 281,8 102,7 213,6 770,5 719,5 161,9 431,2 453,2 497,2 383,1 547,2 392,7 110,8 258,0 nicht 164,3 204,6 nicht nicht 1154,5 nicht vorhanden 740,4 357,5 vorhanden vorhanden 470,2 vorhanden 3536,6 1744,7 2260,7 1734,5 1499,9 751,3 1480,4 1681/04 3048/04 3402/04 2150/98 2064/00 H H H H H 143,6 563,4 366,9 726,1 1192,5 509,0 421,3 639,9 547,5 984,4 395,0 nicht nicht nicht nicht 798,8 vorhanden vorhanden vorhanden vorhanden 1496,8 1426,7 1703,1 2483,3 2459,2 71 8 Literaturverzeichnis 1 Ahmed, R. and Gray, D.: Immunological memory and protective immunity: understanding their relation. Science, 272 (1996) 2 Bericht des Bevölkerungsbezogenen Krebsregisters Bayern für das Jahr 2007/2008. Robert Koch-Institut (Hrsg.) und die Gesellschaft der epidemiologischen Krebsregister in Deutschland e.V. (Hrsg.). Berlin 2008 3 Berufsverband Deutscher Internisten e.V., BDI, Immunantwort entscheidend für Prognose bei Darmkrebs, „News“ v. 30.09.2009 4 Badovinac, V. P. and Harty, J. T.: Intracellular staining for TNF and IFN-gamma detects different frequencies of antigen-specific CD8 (+) T cells. J Immunol. Methods 238 (2000) 107-117. 5 Badovinac, V. P., Porter, B. B. and Harty, J. T. Programmed contraction of CD8 (+) T cells after infection. Nat Immunol 3 (2002) 619-626. 6 Badovinac, V. P., Tvinnereim, A. R. and Harty, J. T. Regulation of antigenspecific CD8 (+) T cell homeostasis by perforin and interferon-gamma. Science 290 (2000) 1354-1358. 7 Baer, H. U., Prof., Dr., Baermed, Magengeschwür Magenkrebs, Patienteninformation, 2008, auf: http://www.baermed.ch/upload/cms/user/Magengeschwürund Magenkrebs.pdf (gesehen am 01.01.2011) und 72 8 Banchereau J., Steinman RM: Dendritic cells and the control of Immunity. Nature, 1998, 392: 245 - 252 9 Beckmann M.W., Borstorff C., Häberle L, Jäger K., Meyd K., Petsch S., Schick S., Tumorzentrum der Universität Erlangen Nürnberg, Qualitätsbericht 2009, Eigenverlag, Oktober 2009 10 Biotechnologie - Studien Immunologen: Raus aus & Statistiken dem - Kongress Elfenbeinturm der (16.09.200), biotechnolgie.de, Internetpublikation (gesehen am 06.07.12) 11 Böcker, W., Denk H., Heitz Ph.: Pathologie, Elsevier GmbH, Urban & Fischer Verlag, 3. Auflage, München 2004 12 Brunner C., Seiderer J., Schlamp A.: Enhanced dendritic cell maturation by TNF- or cytidine-phosphate-guanosine DNA drives T cell activation in vitro and therapeutic anti-tumor immune responses in vivo. J Immunol 2000; 165: 6278–6286. 13 Busch, D. H., Kerksiek, K. M., and Pamer, E. G. Differing roles of inflammation and antigen in T cell proliferation and memory generation. J Immunol 164 (2000) 4063-4070. 14 Busch, D. H., and Pamer, E. G. T lymphocyte dynamics during Listeria monocytogenes infection. Immunol Lett 65 (1999) 93-98. 15 Busch, D. H., Pilip, I. M., Vijh, S., and Pamer, E. G. Coordinate regulation of complex T cell populations responding to bacterial infection. Immunity 8 (1998) 353-362. 73 16 Busch, V., Charakterisierung von Memory T-Zellen bei ihrem Übergang von der Effektor- in die Post - Effektorphase, Med. Diss. München, 2006 17 Dvorak HF: Rous-Whipple Award Lecture. How tumors make bad blood vessels and stroma. Am J Pathol 2003; 162 (6): 1747-57 18 Dwenger A.: Magenkarzinom. Aus: Das Rote Buch. Berger DP (Hrsg.) 3. Auflage 2006 Ecomed 19 Faint, J. M., Annels, N. E., Curnow, S. J., Shields, P., Pilling, D., Hislop, A. D., Wu, L., Akbar, A. N., Buckley, C. D., Moss, P. A., Adams D. H., Rickinson, A. B. and Salmon, M. Memory T cells constitute a subset of the human CD8+CD45RA+ pool with distinct phenotypic and migratory characteristics. J Immunol 167 (2001) 212-220. 20 Galon, J., Costes, A., Sanchez-Cabo, F., Kirilovsky, A., Mlecnik, B., Lagorce-Pages, C. : Typie, density and location of immune cells within human colorectal tumors predict linical outcome. Science, 313, 1960 - 1964 (2006) 21 Galon, J., Fridman, W. H., & Pages, F. : The adaptive immunologic microenviroment in colorectal cancer : A novel perspective. Cancer Reserch, 67, 1883-1886 (2007) 22 Gilboa E: How tumors escape immune destruction and what we can do about it. Cancer Immunol Immunother 1999; 48: 382–385. 23 Glei, Michael, Prävention von Kolonkarzinomen - was kann die Ernährung leisten?, Schweizer Zeitschrift für Ernährungsmedizin, 05/2011, 6-10 74 24 Gumpp, Henß, Klinisches Krebsregister, Kodierhilfe, Tumorzentrum Ludwig Heilmeyer, Uniklinik Freiburg 2010, auf: http://www.uniklinikfreiburg.de/tumorzentrum/live/Wir-ueberuns/Klein-Krebsregister/dokumentation/kodierung/cccf_kkr _kodierhilfe (gesehen am 07.07.2012) 25 Haas, M., Dimmler, A., Hohenberger, W., Grabenbauer, G.G., Niedobitek, G., Distel, L.V..: Stromal regulatory T-cells are associated with a favourable prognosis in gastrc cancer of the cardia. BMC Gastroenterology, 2009 26 Hanahan, D. & Weinberg RA: Hallmarks of Cancer, Cell 2000; 100 (1), 57-70 27 Hanahan, D. & Weinberg RA: Hallmarks of Cancer: The Next. Generation, Cell 2011; 144: 646-674 28 Hof H., Dörries R.: Medizinische Mikrobiologie, Thieme Verlag, 3. Auflage, Stuttgart 2005 29 Jacob, J. and Baltimore, D.: Modelling T-cell memory by genetic marking of memory T-cells in vivo. Nature 399 (1999) 593-597. 30 Janeway Ch. A. Jr., T. P., Walport M., Shlomchik M. J.: The Thymus and the Development of T Lymphocytes Host Defense against Infection 98 Immunological Memory In "Immunobiology: the immune system in health and disease." Garland Publishing, Taylor & Francis Group, New York, 1999, 234, 402, 408 31 Jannsen, Jürgen und Laatz, Wilfried: Statistische Datenanalyse mit SPSS für Windows, 5. Auflage, Springer Verlag, Berlin2005 75 32 Kaech, S. M., and Ahmed, R. Memory CD8+ T cell differentiation: initial antigen encounter triggers a developmental program in naive cells. Nat Immunol 2 (2001) 415-422. 33 Kaiser, Gerhard: Gedichte treffen punktgenau - Beginn des Endes von Theodor Storm; Sonderdrucke aus der Albert-LudwigsUniversität Freiburg, Originalbeitrag erschienen in: Neue Züricher Zeitung (17./18.03.2001), Nr. 64 34 Mercado, R., Vijh, S., Allen, S. E., Kerksiek, K., Pilip, I. M., and Pamer, E.G., Early programming of T cell populations responding to bacterial infection. J Immunol 165 (2000) 6833-6839 35 Meyer, M., Gärtig-Daugs A., Geiss K., Radespiel-Tröger M., Rieß C., Bericht des Bevölkerungsbezogenen Krebsregisters Bayern für das Jahr 2007/2008 - Krebs in Bayern im Jahr 2005, Erlangen 2009 36 Michie, C. A., McLean, A., Alcock, C., and Beverley, P. C. Lifespan of human lymphocyte subsets defined by CD45 isoforms. Nature 360 (1992) 264-265. 37 Mlecnik B., Bindea, G., Pages, F., Galon, J., Tumor immunosurveillance in human cancers. Cancer Metastasis Rev (2011) 30:5-12 38 Mukherjee, Siddhartha, Der König aller Krankheiten, Krebs eine Biographie, DuMont Buchverlag, Köln 2012 39 Murali-Krishna, K., Lau, L. L., Sambhara, S., Lemonnier, F., Altman, J. and Ahmed, R., Persistence of memory CD8 T cells in MHC class I-deficient mice. Science 286 (1999) 1377-1381 76 40 Novak, T. J., Farber, D., Leitenberg, D., Hong, S. C., Johnson, P., and Bottomly, K. Isoforms of the transmembrane tyrosine phosphatase CD45 differentially affect T cell recognition. Immunity 1 (1994) 109-119. 41 Opferman, J. T., Ober, B. T., and Ashton-Rickardt, P. G. Linear differentiation of cytotoxic effectors into memory T lymphocytes. Science 283 (1999) 1745-1748. 42 Peters, J. Hinrich, spezifischen Dendritische Immunreaktion Zellen, gegen Aktivatoren Tumoren, der Skript Universitätsklinik Göttingen, 2003 43 Pfeifer, Ben: Onkologie integrativ: Konventionelle und komplementäre Therapie, Elsevier, Urban & Fischer Verlag, 2006 44 Renz-Polster H., Krautzig S.: Basislehrbuch Innere Medizin, Elsevier GmbH Urban & Fischer Verlang, 4. Auflage, München 2008 45 Sendler A .l.: Magenkarzinom. Manual Gastrointestinale Tumoren. Tumorzentrum München und Zuckschwerdt-Verlag München 2006 46 Sprent, J. and Tough, D. F. T cell death and memory. Science 293 (2001) 245-248. 47 Stein H.: Adenokarzinome des distalen Ösophagus und ösophagastralen Übergangs (sogenannte AEG-Tumoren). Manual Gastrointestnale Tumoren. Tumorzentrum Zuckschwerdt-Verlang, München (2006) München und 77 48 Thukydides "Der Peloponnesische Krieg." Vretska H. u. Rinner W. (Ed.), Phillip Reclam jun. GmbH & Co., 2000, Stuttgart. 49 Wittekind Ch. (Hrsg.): TNM-Atlas 7. Auflage Springer Medizin Verlag (2010) 50 World Health Organization Classification of Tumours. Pathology and Genetics of Tumours of the Digestive System. Edited by Stanley R. Hamilton and Lauri A. Aaltonen. IARC 2000 51 Young, J. L., Ramage, J. M., Gaston, J. S. and Beverley, P. C. In vitro responses of human CD45R0brightRA- and CD45R0RAbright T-cell subsets and their relationship to memory and naive T-cells. Eur J Immunol 27 (1997) 2383-2390. 78 9 Abkürzungsverzeichnis AEG adenocarcinoma of the esophago-gastric junction (Adenokarzinom des ösophagogastralen Überganges) AP Alkalische Phosphatase APC: Antigen-präsentierende Zelle (antigen-presenting cell) BT-Reagenz Biotin-Tyramin-Reagenz CD Cluster Domain CI Confidenz Intervall CUP Cancer of unknown primary Cx Chemotherapie DC Dendritische Zelle (denditic cell) FAP Familiäre Adenomatöse Polyposis HNPCC Hereditäres Non-Polyplöses Colorektales Carzinom HP Helicobacter pylori HRP horseradish phosphatase IFN Interferon IL Interleukin Im Immunscore INSERM Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale IORT Intraoperative Radiotherapie l Liter LI Labeling Index LK Lymphknoten M mol m männlich Myc menschliches Gen, das für ein Protein (C-Myc) codiert 79 N Normalität NED no evidence of disease n.v. nicht vorhanden o.g. oben genannt p Signifikanz pH pondus Hydrogenii Ras Rat sarcoma Rb Retinoblastom Protein ROI Region of Interest Rx Radiotherapie RxCx Radiochemotherapie TIL Tumorinfiltrierende Lymphozyten TMA Tissue Microarray UICC Union International Contre le Cancer v.a. vor allem w weiblich z.B. zum Beispiel 80 10 Danksagung An dieser Stelle möchte ich mich bei allen, die zum Gelingen meiner Arbeit beigetragen haben, bedanken. An erster Stelle möchte ich Herrn Prof. Dr. R. Fietkau, Direktor der Strahlenklinik der Universität Erlangen-Nürnberg, dafür danken, dass er mir die Möglichkeit eröffnete, diese Arbeit im strahlenbiologischen Labor der Strahlenklinik durchzuführen. Ganz besonders möchte ich mich bei meinem Betreuer Herrn PD Dr. Luitpold Distel bedanken, da er mich während der gesamten Zeit hervorragend unterstützt und mir wertvolle Tipps und Anleitungen sowohl bei der Laborarbeit als auch beim Auswerten der Ergebnisse gegeben hat. Durch seine Anregungen, seine ständige Bereitschaft zur Hilfe und durch seine unermüdliche Geduld, mir die computertechnische Aufarbeitung der Daten näher zu bringen, hat er zum Gelingen der Arbeit einen großen Teil beigetragen. Weiterhin möchte ich mich sehr herzlich bei Frau Diplom-Biologin Birgit Meyer (Pathologisches Institut der Universitätsklinik Erlangen) bedanken. Sie stand mir bei den Färbungen mit den Primärantikörpern CD1a bzw. CD45R0 hilfreich mit Rat und Tat zur Seite. Ebenso danke ich meinem Mitkommilitonen Matthias Hass (z.Z. Charité Berlin), der mich mit vielen praktische Hilfen vor allem während der Auswertung unterstützt hat. Für die aufbauende Unterstützung bei der Verfassung und Korrektur der Veröffentlichung danke ich meiner Frau Sylvia.
