AUFKLÄRUNG DER BIOSYNTHESE UND DER FALTUNGSMODI

AUFKLÄRUNG DER BIOSYNTHESE UND DER
FALTUNGSMODI AROMATISCHER
POLYKETIDE IN PFLANZLICHEN
GEWEBEKULTUREN, MIKROORGANISMEN
UND INSEKTEN
SOWIE
STRUKTURAUFKLÄRUNG VON
ENTSPRECHENDEN BIOSYNTHESEINTERMEDIATEN MITTELS HPLC-MS, NMR
UND CD
DISSERTATION ZUR ERLANGUNG DES
NATURWISSENSCHAFTLICHEN DOKTORGRADES DER
BAYERISCHEN JULIUS-MAXIMILIANS-UNIVERSITÄT
WÜRZBURG
vorgelegt von
Torsten Frank Noll
aus
Hanau
Würzburg 2006
Eingereicht am: _____________________________________
Bei der Fakultät für Chemie und Pharmazie
1. Gutachter:
_______________________________________
2. Gutachter:
_______________________________________
der Dissertation
1. Prüfer: __________________________________________
2. Prüfer: __________________________________________
3. Prüfer: __________________________________________
des Öffentlichen Promotionskolloquiums
Tag des Öffentlichen Promotionskolloquiums: ___________________________
Doktorurkunde ausgehändigt am: ________________________
Die vorliegende Arbeit wurde in der Zeit von Mai 2002 bis März 2006
am Institut für Organische Chemie der Universität Würzburg angefertigt
Herrn Prof. Dr. Dr. h.c. G. Bringmann danke ich für
die Überlassung des interdisziplinären Themas,
die dabei gewährten wissenschaftlichen Freiräume
und die exzellenten Arbeitsbedingungen
Teile der im Rahmen dieser Arbeit erzielten Ergebnisse waren bereits Gegenstand von
Publikationen[68,130,147,148,172] sowie von Postern und Vorträgen
Für Patricia
„Nothing in biology makes sense
except in the light of evolution“
Theodosius Dobzhansky (1900-1975)
Inhaltsverzeichnis
i
Inhaltsverzeichnis
ALLGEMEINER TEIL ................................................................................................. 1
1
Einleitung ................................................................................................................ 1
2
Aufklärung von Biosynthesewegen mit Hilfe 13C- isotopenmarkierter
Precursoren und NMR-Analyse ............................................................................ 7
3
Vergleichende Biosynthesestudie zum aromatischen Polyketid
Chrysophanol (4) .................................................................................................. 12
3.1
Kenntnisstand zur Verbreitung und der Biosynthese von
Chrysophanol (4) .................................................................................... 12
3.2
Experimente zur Biosynthese von Chrysophanol (4) in filamentösen
Pilzen....................................................................................................... 17
3.2.1
Kultivierung des pilzlichen Systems ...................................................... 17
3.2.2
Erläuterung zum Screening potentieller pilzlicher ChrysophanolProduzenten............................................................................................. 19
3.2.3
Fütterungsexperiment am pilzlichen System und NMR-Analyse .......... 21
3.3
Experimente zur Biosynthese von Chrysophanol (4) in Pflanzen.......... 24
3.3.1
Kultivierung des pflanzlichen Systems .................................................. 24
3.3.2
Fütterungsexperiment am pflanzlichen System und NMR-Analyse ...... 25
3.4
Experimente zur Biosynthese von Chrysophanol (4) in filamentösen
Bakterien................................................................................................. 27
3.4.1
Kultivierung und Fermentation des bakteriellen Systems...................... 27
3.4.2
Fütterungsexperiment am bakteriellen System und NMR-Analyse ....... 29
3.5
Experimente zur Biosynthese von Chrysophanol (4) in Insekten .......... 31
3.5.1
Kultivierung des Blattkäfers................................................................... 31
3.5.2
Fütterungsexperiment am tierischen System und NMR-Analyse .......... 33
3.5.3
Betrachtungen zur Produktion des Naturstoffs Chrysophanol (4) in
Insekten ................................................................................................... 36
4
3.6
Bemerkungen zur Produktion von Chrysophanol (4) in Flechten.......... 38
3.7
Schlußfolgerungen aus dem vergleichenden Biosyntheseexperiment.... 39
Isolierung und Strukturaufklärung potentieller biosynthetischer Intermediate
polyketidischer Anthrachinone ........................................................................... 43
ii
Inhaltsverzeichnis
4.1
Kenntnisstand zur Anthrachinonbiosynthese ......................................... 43
4.2
Experimente mit dem Bakterium AK 671.............................................. 45
4.2.1
Kultivierung und Fermentation des Mikroorganismus........................... 45
4.2.2
Isolierung und Strukturaufklärung der Metabolite ................................. 47
4.2.2.1
Zusammenfassung der Vorarbeiten ........................................................ 47
4.2.2.2
Isolierung und Strukturaufklärung des neuen Naturstoffs Chrysophanol8-O-β-D-glucuronid (28)......................................................................... 48
4.2.2.3
Isolierung und Strukturaufklärung des neuen Naturstoffs
Prächrysophanol-O-β-D-glucuronid (29) ............................................... 49
4.2.3
Inkorporationsexperimente und NMR-Analyse ..................................... 50
4.2.3.1
Fütterungsexperimente zur Biosynthese des bicyclischen Diketons 23. 51
4.2.3.2
Fütterungsexperimente zur Biosynthese von Chrysophanol-8-O-β-Dglucuronid (28) und Prächrysophanol-8-O-β-D-glucuronid (29)............ 52
5
4.2.4
Schlußfolgerung für die Anthrachinonbiosynthese in Bakterien ........... 53
4.3
Experimente mit planzlichen Gewebekulturen....................................... 53
4.3.1
Isolierung und Strukturaufklärung der Metabolite ................................. 53
Studien zur Stereochemie und Enantiomerenanalytik des dimeren
Anthrachinons Asphodelin (37)........................................................................... 55
5.1
Kenntnisstand zur Verbreitung und chemischen Struktur von
Bichrysophanolen ................................................................................... 55
5.2
Bestimmung der absoluten Konfiguration und des Enantiomerenverhältnisses von Asphodelin (37) aus Asphodelus microcarpus syn.
Asphodelus aestivum (Asphodelaceae)................................................... 57
6
5.2.1
Zur Auswahl des Untersuchungsobjektes............................................... 57
5.2.2
Bereitstellung des Bichrysophanols 37 zur Analyse .............................. 57
5.2.3
Stereochemische Analyse durch CD-Messungen................................... 58
5.2.4
Resultate der Enantiomerenanalytik....................................................... 61
Aufklärung der Biosynthese des Phenylanthrachinons Knipholon (5) ........... 63
6.1
Kenntnisstand zur Verbreitung und zur Biosynthese von
Knipholon (5) ......................................................................................... 63
6.2
Kultivierung des biologischen Systems.................................................. 66
6.3
Fütterungsexperimente mit uniform markiertem 13C2-Acetat ................ 68
Inhaltsverzeichnis
iii
6.3.1
Applikation der isotopenmarkierten Vorstufe ........................................ 68
6.3.2
NMR-Analyse durch 13C- und INADEQUATE-Experimente ............... 68
6.3.3
NMR-Analyse durch SELINQUATE-NMR-Experimente .................... 71
6.4
Fütterungsexperimente mit fortgeschrittenen isotopenmarkierten
Precursoren ............................................................................................. 73
6.4.1
Überlegungen zur Vorgehensweise und zu erwartenden Ergebnissen der
NMR-Analyse......................................................................................... 73
6.4.2
Bereitstellung der isotopenmarkierten Vorstufen................................... 76
6.4.3
Applikation der isotopenmarkierten Vorstufen ...................................... 76
6.4.4
Analyse des Knipholons (5) durch 13C-NMR-Experimente................... 78
6.5
Experimente zum Enantiomerenüberschuß (er) von Knipholon (5) im
untersuchten biologischen System.......................................................... 80
6.6
7
Schlußfolgerungen zur Biogenese von Knipholon (5) ........................... 83
Bereitstellung einer pflanzlichen Gewebekultur zur Untersuchung der
Biosynthese von Naphthylisochinolin-Alkaloiden ............................................. 88
7.1
Motivation der Arbeit ............................................................................. 88
7.2
Etablierung einer Gewebekultur von A. abbreviatus.............................. 90
8
Zusammenfassung ................................................................................................ 99
9
Summary ............................................................................................................. 107
EXPERIMENTELLER TEIL ................................................................................... 115
1
2
3
Allgemeine Methoden (Chemische Analytik).................................................. 115
1.1
Verwendete Apparaturen und Messgeräte............................................ 115
1.2
Chromatographische Methoden............................................................ 117
Allgemeine Methoden (Sterilkultur)................................................................ 119
2.1
Verwendete Geräte ............................................................................... 119
2.2
Allgemeine Techniken.......................................................................... 121
2.3
Kulturbedingungen ............................................................................... 122
2.4
Herkunft des biologischen Materials.................................................... 128
2.5
Materialien............................................................................................ 129
Vergleichende Biosynthesestudie zu dem aromatischen Polyketid
Chrysophanol (4) ............................................................................................... 130
iv
Inhaltsverzeichnis
3.1
Fütterungsexperimente am pilzlichen System...................................... 130
3.2
Fütterungsexperimente am pflanzlichen System.................................. 130
3.3
Fütterungsexperimente am bakteriellen System................................... 130
3.4
Fütterungsexperimente an Insekten ...................................................... 131
3.5
Isolierung und Charakterisierung von Chrysophanol (4) aus den
biologischen Systemen ......................................................................... 131
4
Isolierung und Strukturaufklärung potentieller biosynthetischer Vorstufen
polyketidischer Anthrachinone ........................................................................ 132
4.1
Isolierung und Charakterisierung von Chrysophanol-8-O-β -D-glucuronid
(28)........................................................................................................ 132
4.2
Isolierung und Charakterisierung von Prächrysophanol-8-O-β-Dglucuronid (29)...................................................................................... 133
5
Studien zur Stereochemie und Enantiomerenanalytik des dimeren
Anthrachinons Asphodelin (37)........................................................................ 135
6
5.1
Isolierung und Charakterisierung von Asphodelin (37) ....................... 135
5.2
Stereochemische Analyse von Asphodelin (37)................................... 136
Zur Aufklärung der Biosynthese des Phenylanthrachinons
Knipholon (5) ..................................................................................................... 136
7
6.1
Fütterungsexperimente mit Acetat ....................................................... 136
6.2
Fütterungsexperimente mit fortgeschrittenen Precursoren................... 136
6.3
Isolierung und Charakterisierung ......................................................... 137
6.4
NMR-Spektroskopie............................................................................. 138
Bereitstellung einer pflanzlichen Gewebekultur zur verläßlichen Produktion
von Naphthylisochinolin-Alkaloiden ............................................................... 138
7.1
Materialien............................................................................................ 138
ABKÜRZUNGSVERZEICHNIS .............................................................................. 139
LITERATUR UND ANMERKUNGEN ................................................................... 140
Einleitung
1
ALLGEMEINER TEIL
1
Einleitung
Polyketidische Sekundärmetabolite finden sich in Bakterien, Pilzen, Flechten
und höheren Pflanzen und verkörpern eine der größten und zugleich wichtigsten Klasse
von Naturstoffen überhaupt.[1-11]
Besonders unter den Makroliden und den aromatischen Polyketiden findet sich
eine Vielzahl von therapeutisch bedeutsamen Antibiotika, klinisch relevanten
Chemotherapeutika und eine Reihe von Substanzen mit anderen interessanten
pharmakologischen Eigenschaften.[12-15] Die aromatischen Polyketide unterscheiden
sich von anderen Vertretern dieser Naturstoffklasse durch ihre charakteristische
durchgängig polycyclische, aromatische Struktur. Als Beispiele für aromatische
Polyketide mit Anwendung in der Humanmedizin sollen hier Tetracyclin (1)[16] und
Daunorubicin (2)[17] genannt werden (s. Abb. 1).
Me
H
Me O
S
OH
O
H
H
S
S
OMe
NMe2
S
OH
OH
S
O
HO H O
O
1
R
OH
S
NH2
S
S
NH2
O
H
O
O S
S
OH
O
OH
OH
O
2
Abb. 1. Strukturen von Tetracyclin (1) und Daunorubicin (2).
Trotz ihrer enormen strukturellen Vielfalt ist allen Polyketiden ein ähnlicher
Biosynthesemechanismus gemein.[18] Analog zur Biogenese von Fettsäuren und
reduzierten polyketidischen Verbindungen werden aromatische Polyketide durch
Beteiligung sogenannter Polyketidsynthasen (PKS) generiert, welche sequentielle
Kondensationen zwischen Starter- und Verlängerungseinheiten katalysieren, so daß
zunächst ein lineares Poly-β-Keto-Intermediat entsteht. Hierzu werden einfache
2
Einleitung
biochemische Grundbausteine verwendet. Als Startereinheit dient sehr häufig Acetat
(als Acetyl-Coenzym A (3)), während Malonat den Baustein der Kettenverlängerung
verkörpert. Auch Propionat oder Butyrat bzw. Methyl- oder Ethylmalonat können bei
der Kettenelongation verwendet werden, wobei dann Kettenverzweigungen entstehen,
wie sie besonders für Polyketide bakteriellen Ursprungs charakteristisch sind. Durch
sukzessive Reduktion, Cyclisierung oder Aromatisierung der oben erwähnten linearen
Poly-β-Keto-Zwischenstufe werden polycyclische, aromatische Strukturen gebildet.
Weitere Modifikationen dieser Gerüste durch verschiedenartigste tailoring enzymes,
welche z.B. Oxygenierungen und O-Methylierungen katalysieren, geben dieser Klasse
von Sekundärstoffen ihre enorme strukturelle Mannigfaltigkeit, ihre Komplexität durch
die variable Ausgestaltung der Konfiguration entstehender Chiralitätszentren sowie ihre
Bandbreite an unterschiedlichsten Bioaktivitäten.[19]
Der Konvention für Fettsäuresynthasen (FASs)[20] entsprechend wurden
Polyketidsynthasen aufgrund ihrer enzymatischen Architektur und Genorganisation
zunächst in zwei Klassen untergliedert, der aber bald die Eingliederung einer weiteren,
dritten Klasse folgte:
•
Typ I PKS sind multifunktionelle Enzyme, mit individuellen
Domänen, die sowohl in Pflanzen und Pilzen, als auch in
a1
Bakterien gefunden werden können.[21]
a2
a3
•
Typ II PKS auch als „aromatische“ PKS beschrieben, bestehen
aus Multienzymkomplexen, die diskrete monofunktionelle
Protein-Untereinheiten aufweisen. Diese Gruppe kann in der
[22]
Regel lediglich in Bakterien nachgewiesen werden.
•
B
C A
D
Typ III PKS wie die Chalconsynthase (CHS) sind Homodimere,
die früher lediglich in höheren Pflanzen angetroffen wurden,[23]
doch kürzlich auch in Bakterien nachgewiesen werden
konnten.[24]
A A'
Einleitung
3
Mittlerweile wird stark angezweifelt, daß sich der Erfindergeist der Natur bei der
Produktion von Naturstoffen strikt an diese Einteilung in biosynthetische Klassen
hält.[25] So konnten inzwischen einige Zwischenformen, besonders von PKS I und PKS
II, entdeckt werden, die dafür sprechen, diese Einteilung in Zukunft sehr kritisch zu
betrachten.[24,26]
Gerade die Biochemie und Enzymologie der Polyketidsynthasen wurde von
Biosyntheseforschern als hervorragendes Modellsystem zur Untersuchung der StrukturFunktions-Beziehung von Multienzymkomplexen erkannt.[27] Die Erforschung der
detaillierten Biosynthese von aromatischen Polyketiden ist in mehrfacher Hinsicht ein
lohnendes Ziel: So können zum einen durch die Kenntnis der Biosyntheserouten auf
genetischer und enzymatischer Ebene zielgerichtete Inhibitoren für bestimmte Schritte
entwickelt werden, die als neue Antibiotika Verwendung finden könnten. Zum anderen
wäre es durch kombinatorische Biosynthese möglich, mittels Rekombination einzelner
Gene ganze Bibliotheken sogenannter „unnatürlicher Naturstoffe“ zu generieren, wie
dies schon mehrfach erreicht wurde.[28,29]
Zwar
verursachten
molekularbiologische
Techniken,
wie
z.B.
die
Genklonierung und die Überexprimierung, eine regelrechte Revolution in der
Biosyntheseforschung, doch müssen solche neueren Techniken noch immer Hand in
Hand mit den eher klassischen Ansätzen, wie Fütterungsexperimenten, gehen. Diese
sind nach wie vor unerläßlich, wenn es darum geht, Einblicke auf Metabolitebene zu
erhalten oder Enzym-Essays zu erarbeiten.
Für annelierte aromatische Polyketide hat R. Thomas im Jahr 2001 eine
biosynthetische Klassifizierung auf Metabolitebene vorgestellt, mit deren Hilfe der
biologische Ursprung dieser Sekundärmetabolite durch klassische Methoden bestimmt
werden kann.[30] Bei dieser unter dem Namen „Modus-F/S-System“ bekanntgewordenen
Einteilung
wird
angenommen,
Inkorporationsexperimenten mit
13
daß
durch
die
Durchführung
von
C-markierten Precursoren an biologischen Systemen
und den Einsatz moderner NMR-Techniken, besonders des INADEQUATEExperiments,[31] gezeigt werden kann, ob es sich bei dem produzierenden Organismus
um einen Pilz oder um ein Bakterium handelt.[30] Der Modus F (Fungus) ist dadurch
gekennzeichnet, daß in den ersten aromatischen Ring lediglich zwei intakte C2-
4
Einleitung
Einheiten inkorporiert werden, während es beim Modus S (S Streptomyces) drei sind (s.
Schema 1).
Me
11
11
Me
1
6
1
6
Modus-F-Faltung
(C-6/C-11-Verknüpfung)
Me
7
12
7
1
1
Me
12
Modus-S-Faltung
(C-7/C-12-Verknüpfung)
Schema 1. Modell-Konformationen des nach Modus F und S gefalteten Octaketid-Körpers, die
zur Bildung des initialen Rings führen nach R. Thomas. Die gestrichelten
Bindungen geben die relative Ausrichtung des Gerüsts für den jeweilig alternativen
Faltungsmodus an.
Dieses System wurde bereits mehrfach erfolgreich auf die Biosynthese von
pilzlichen[32,33] und bakteriellen[34,35] Polyketiden angewandt. Allerdings liegen bislang
zur Untersuchung der Produkte pflanzlicher Polyketidsynthasen lediglich zwei Arbeiten
vor.[36,37] Beide wurden in unserer Arbeitsgruppe angefertigt und beschäftigen sich mit
der
Biosynthese
von
Naphthylisochinolin-Alkaloiden,
strukturell
einzigartigen
polyketidischen Alkaloiden und Naphthochinonen. Als Forschungsobjekte dienten
dabei sterile Zellkulturen zweier tropischer Lianen, Triphyophyllum peltatum
(Dioncophyllaceae)
und
Fütterungsexperimente
mit
Ancistrocladus
13
C2-Acetat
heyneanus
zeigten
(Ancistrocladaceae).
eindeutig,
daß
sowohl
Die
die
Naphthalinhälfte als auch die Isochinolinhälfte der Naphthylisochinolin-Alkaloide nach
Modus F aufgebaut wird. Demzufolge verhalten sich aromatische Polyketidsynthasen in
zweikeimblättrigen Pflanzen wie solche in Pilzen. Da bisher keinerlei Untersuchungen
Einleitung
5
zur Biogenese von Naphthylisochinolin-Alkaloiden des Ancistrocladaceen-Typs in vitro
gemacht wurden, sollte hierfür ein zuverlässiges biologisches System generiert werden.
Vor Beginn der vorliegenden Arbeit gab es jedoch keine vergleichenden Studien
bezüglich der Frage, ob ein bestimmtes aromatisches Polyketid notwendigerweise nur
auf
einem
Faltungsmodus
biosynthetisiert
werden
kann.
Das
Anthrachinon
Chrysophanol (4), ein strukturell einfaches aromatisches Polyketid (s. Abb. 2), ist durch
seine chemische Struktur und durch dessen weite Verbreitung in verschiedensten
biologischen
Organismenreichen[38]
komparativen
Biosynthesestudie
ein
über
einzigartiges
Forschungsobjekt
aromatische
Polyketidsynthasen
einer
auf
Metabolitebene (s. dazu Kapitel 3.1).
Modus F
HO
HO
O
O
OH
e
M
Me
OH
O
HO
O
OH
4
Me
HO
O
OH
Me
O
HO
O
4
M
OH
M
Me
O
4
Modus S
MeO O
5
[13C2]-Einheit
Abb. 2. Strukturen von Chrysophanol (4) mit retrosynthetischen Schnitten zur Verdeutlichung
seiner besonderen chemischen Struktur bezüglich des Modus-F/S-Systems und Struktur
von Knipholon (5).
Auch potentielle Intermediate der Chrysophanol-Biogenese und der AnthranoidBiosynthese im Allgemeinen sind noch nicht vollständig charakterisiert. Die
Untersuchung dieser Metabolite und auch dimerer Anthrachinone sowie des
Phenylanthrachinons Knipholon (5), welches als Molekülteil ebenfalls Chrysophanol
(4) enthält, stellt somit ein weiteres lohnendes Ziel zum Verständnis dieser Wege dar.
6
Einleitung
Für die vorliegende Arbeit ergaben sich daraus folgende Aufgabenstellungen:
I.
Durchführung einer vergleichenden Biosynthesestudie zum einfachen
aromatischen Polyketid Chrysophanol (4) auf Metabolitebene:
•
Bestimmung der Polyketidfaltungsmodi von Chrysophanol (4) in Pilzen,
pflanzlichen Gewebekulturen, Bakterien und Insekten durch den Einsatz
von Biotechnologie, Stabilisotopenmarkierung und NMR-Analyse,
•
Anwendung der F/S-Klassifizierung bei der Identifizierung des
Anthrachinon-produzierenden Organismus im Blattkäfer Galeruca
tanaceti,
•
Einsatz von HPLC-UV, -MS/MS und NMR zur Identifizierung und
Charakterisierung von potentiellen Intermediaten der Chrysophanolbzw. Anthranoidbiosynthese,
•
Stereochemische Untersuchungen zu Bisanthrachinonen mittels HPLCCD;
II.
Aufklärung der Biosynthese des Phenylanthrachinons Knipholon (5)
•
Bestimmung
des
13
C2-Acetat-Einbaumusters
unter
besonderer
Berücksichtigung einer möglichen Randomisierung am Phenylring,
•
Einordnung der PKS höherer Pflanzen in das „Modus-F/S-System“,
sowie
•
Fütterungsexperimente mit fortgeschrittenen stabilisotopenmarkierten
Vorstufen;
III.
Ausarbeitung von Zellkulturtechniken für die biotechnologische Gewinnung
von Naphthylisochinolin-Alkaloiden besonders des Ancistrocladaceen-Typs.
Allgemeiner Teil
2
7
Aufklärung von Biosynthesewegen mit Hilfe
13
C-
isotopenmarkierter Precursoren und NMR-Analyse
In der Biosyntheseforschung können im Allgemeinen drei verschiedene
experimentelle Ansätze verfolgt werden: Der Einsatz von In-vitro-Enzymsystemen, die
In-vivo-Untersuchung von lebenden biologischen Systemen, welchen durch selektive
Mutation Biosynthesewege inhibiert wurden und die Verwendung isotopenmarkierter,
potentiell in der jeweiligen Biosynthese benötigter Verbindungen, sogenannter
Precursoren, in Fütterungsexperimenten an Kulturen der Produzenten.[39] Besonders der
letztere experimentelle Ansatz hebt sich durch seine universelle Anwendbarkeit und
seinen
Variantenreichtum
hervor.
Bei
Inkorporationsexperimenten
mit
isotopenmarkierten Verbindungen läßt sich eine Vielzahl von Radio- (z.B. 14C, 3H, 32P)
und Stabilisotopen (z.B.
[40]
detektieren sind,
13
C, 2H,
15
N,
18
O), die mit verschiedensten Methoden zu
verwenden.
Generell werden bei Fütterungsexperimenten mit Precursoren einem mittels
biotechnologischer
Methoden
kultivierten
System
isotopenmarkierte
Biosynthesevorstufen appliziert und die aus dieser Vorstufe resultierenden Metaboliten
auf Einbau und/oder Position der Markierung hin untersucht, damit Rückschlüsse auf
deren Biosynthese gezogen werden können. Früher kamen dabei ausschließlich
Radioisotope zum Einsatz, da diese schon damals radiographisch nachweisbar waren.
So gelang es Calvin 1948, die Photosynthese von Pflanzen durch Verwendung des
Kohlenstoffisotops
14
C aufzuklären.[41] Noch über Jahrzehnte hinaus blieb dies das
wichtigste Markierungsisotop für Biosynthese-Experimente.
Erst in den frühen siebziger Jahren des vergangenen Jahrhunderts erfuhr die
Biosyntheseforschung einen weiteren großen Aufschwung, welcher durch die
Entwicklung der gepulsten Fourier-Transformation-NMR-Spektrometer und die bessere
Verfügbarkeit stabilisotopenmarkierter Precursoren begründet war. Erst das Auftreten
dieser beiden Faktoren führte zu einem Fortschritt in der Erforschung von
Biosynthesewegen zugunsten von Fütterungsexperimenten mit stabilisotopenmarkieren
Verbindungen. Zwar muß betont werden, daß der Einsatz von einfach
13
C-markierten
Precursoren keine Information hervorbringt, die nicht prinzipiell auch durch klassische
radioisotopenmarkierte Methoden erbracht werden konnte, doch besitzten letztere per se
8
Allgemeiner Teil
schon Nachteile: Die Information über den genauen Einbauort einer 14C-Markierung ist
lediglich
über
aufwendige
Stoffwechselproduktes
chemische
Abbaureaktionen
des
isolierten
möglich,[42,43] welches hierzu in einer relativ großen
Substanzmenge vorliegen muß. Darüber hinaus stellt der Umgang mit Radioaktivität im
Laboratorium
eine
unnötige
Sicherheitsvorkehrungen.
Gefahrenquelle
dar
und
erfordert
besondere
[44]
Solche generellen methodischen Nachteile werden durch den Einsatz von
13
C
und anderen Stabilisotopenmarkierungen elegant vermieden, wobei der wichtigste
Fortschritt sicherlich einmal mehr darin bestand, biotechnologische Methodiken mit
solchen der Strukturaufklärung zusammenzubringen.
Eines der häufigsten in der Biochemie benutzten NMR-detektierbaren Isotope ist
das stabile Isotop des Kohlenstoffs
13
C (Kernspin I = ½). Durch dessen niedrigeres
gyromagnetisches Verhältnisses besitzt es jedoch im Vergleich zum Proton (1H) eine
um den Faktor 62 schlechtere NMR-Sensitivität.[45] Bei der Fütterung mit einfach 13Cmarkierten Vorstufen ist es für die Versuchsauswertung entscheidend, daß im 13C-NMR
die Anreicherung einzelner Kohlenstoffpositionen im Analyten – und damit
einhergehend eine Zunahme der Signalintensität – signifikant meßbar und
quantifizierbar ist. Zur Auswertung des Einbaus von
13
C in einem Metaboliten eines
solchen Fütterungsexperiments werden sämtliche Peakintensitäten üblicherweise auf
diejenige eines unmarkierten Kohlenstoffatoms normiert.[46] Es wirkt sich dabei
nachteilig aus, daß relativ hohe Markierungsgrade (ca. 0.25-1%) erforderlich sind,
damit aussagekräftige Peakflächenzunahmen von ca. 25-100% erzielt werden.[47] Solche
hohen Inkorporationsraten werden selten bei aseptischen höheren Ganzpflanzen,
durchaus aber in pflanzlichen Zell- und Gewebekulturen und sowohl in bakteriellen als
auch in pilzlichen Schüttel- und Bioreaktorkulturen erreicht.[48]
Auch das 1H-NMR bietet sich in bestimmten Fällen zur Auswertung von
Spektren von Metaboliten nach Applikation von
werden die beiden
13
13
C1-markierten Vorstufen an. Dabei
C-Satelliten des Protonensignals an der angereicherten
Kohlenstoffposition, sofern diese ein Proton trägt, integriert und in Relation zur
Intensität des Zentralsignals gesetzt. Satellitenintensitäten von mehr als 1.11%
(natürliche Häufigkeit von 13C) der Fläche des Zentralsignals deuten dabei klar auf eine
Anreicherung des Stabilisotops hin.[49] Diese Methode der Analyse bietet sich in
Allgemeiner Teil
9
Einzelfällen, z.B. bei markierten Methoxyfunktionen an, da diese Gruppen intensive
Singuletts mit üblicherweise gutem Signal/Rausch-Verhältnis liefern.[50]
Erst durch die Verwendung von doppelt oder auch mehrfach
stabilisotopenmarkierter Precursoren kann durch die Analyse von
1
13
C-
J(13C,13C)-
Kopplungsmustern der Einbau intakter Vorstufenbausteine im Analyten untersucht
werden. Detailliertere Informationen über den Aufbau, die Cyclisierung und
Umlagerungen
von
Sekundärmetaboliten
können
so
spektroskopisch
verfolgt
werden.[51]
Die Analyse solcher Experimente erfolgt bei unkomplizierten 13C-Spektren über
die Integration der paarweise auftretenden Satelliten benachbarter Kohlenstoffatome
1
sowie den Vergleich von deren
J-Kopplungskonstanten. Nicht-13C-angereicherte
Verbindungen zeigen unter derlei Bedingungen im
13
C-NMR keine sichtbaren
13
C-
Satelliten, da letztere lediglich eine Signalintensität von 1.11% des Zentralsignals und
damit in den meisten Fällen ein zu schwaches Signal/Rausch-Verhältnis aufweisen.
Die Inkorporation diskreter
betroffenen Positionen erhöhte
[52]
Detektion des Einbaus.
13
C2-Einheiten in das Kohlenstoffgerüst hat an den
13
C-Satelliten zur Folge und ermöglicht so eine
Die niedrige natürliche Häufigkeit von
13
C2-Einheiten von
0.012% bedingt die hohe Sensitivität dieser Methode, da bereits geringe
13
C-
Markierungsgrade von ca. 0.02% ausreichen, die Intensität der Satelliten deutlich zu
erhöhen und so einen Einbau sicher nachzuweisen. Dabei müssen sowohl das Zentralals auch die Satellitensignale ein ausreichend gutes Signal/Rausch-Verhältnis
aufweisen.
Besonders bei der Erforschung der Biogenese von Polyketiden gilt noch immer
die Verfütterung von [13C2]-NaOAc als Methode der Wahl, aber auch bei der
Biosynthese terpenoider Naturstoffe.[48] Uniform
13
C2-markiertes Acetat wurde schon
früh in der Forschung eingesetzt.[53,54] Das zugrundeliegende Prinzip ist anhand eines
polyketidischen Modellsystems in Abbildung 3 dargestellt. Betrachtet man dabei ein
Molekül uniform markierten 13C2-Acetats, so enthält dieses zwei benachbarte Kerne mit
dem Kernspin ½, welche miteinander koppeln. Wird ein solches Molekül intakt in einen
Sekundärmetaboliten eingebaut, dann müssen die Kohlenstoffatome der jeweiligen
Paare notwendigerweise in gleichem Maße angereichert sein und werden eine
10
Allgemeiner Teil
wechselseitige Kopplung zeigen. In dem resultierenden
dann
die
typischen
1 13
J C-13C-Kopplungssatelliten
13
C-NMR Spektrum sähe man
mit
identischen
1 13
J C13C-
Kopplungskonstanten (s. Abb. 3b). Durch die Analyse des Kopplungsmusters kann
Aufschluß darüber gewonnen werden, wie sich die entstehende Kette faltet. Wenn
während der Biogenese eines Zielmoleküls die Bindung zwischen einer solchen intakten
C2-Einheit gelöst werden sollte, verschwindet die 1J13C-13C-Kopplung im Spektrum,
und diese Kohlenstoffatome erscheinen als verstärktes Singulett, wie dies für C-3 und
C-4 in Abbildung 3 dargestellt ist. Auf diese Art lassen sich Bindungsbrüche und
Umlagerungen
während
der
Biogenese
aufzeigen.
Die
charakteristischen
1 13
J C13CKopplungskonstanten liegen dabei generell zwischen 30 und 80 Hz.
(a) CH3COSCOA
13
13
(b) CH3- CO2Na
-C1-C2-C3-C4-
-C1-C2-C3-C4-
1
2
3
4
1
2
3
4
1
2
3
4
1,2-Bindungsbruch
(c)
13
Abb. 3 a-c.
-C1 C2-C3-C4-
C=
Prinzip der Einbauexperimente nach Simpson.[55] Simuliertes Protonen-entkoppeltes
C-NMR-Spektrum einer polyketidischen Moleküleinheit: a ohne Anreicherung; b
angereichert nach erfolgter Fütterung mit doppelt markiertem 13C2-Natriumacetat; c
nach Bindungsbruch und Umlagerung der ursprünglich intakten Acetateinheit.
13
Allgemeiner Teil
11
Neben der Möglichkeit, intakt eingebaute
Kopplungsmusters im
13
13
C2-Einheiten anhand ihres
C-NMR-Spektrum zuzuordnen, bietet die moderne NMR-
Spektroskopie auch noch weitere experimentelle Möglichkeiten, die besonders bei
komplizierten Spektren mit überlappenden Kopplungsmustern oder auch bei
unzureichender spektraler Auflösung der Satellitensignale signifikante Ergebnisse
liefern können. Der bekannteste Vertreter unter ihnen ist eine 2D-NMR-Technik, das
sogenannte INADEQUATE-Experiment[56] (Incredible Natural Abundance Double
Quantum Transfer-Experiment), welches direkte
13
C-13C-Konnektivitäten in einem
Molekül aufzeigt. Das INADEQUATE-Experiment weist eine geringe intrinsische
Empfindlichkeit auf, was zur Folge hat, daß zur Strukturaufklärung unmarkierter
Verbindungen große Probenmengen, d.h. mehr als 100-200 mg bei einem ungefähren
Molekulargewicht von 300 u, benötigt werden. Dieser immense Substanzbedarf, der bei
der Aufklärung der Biosynthese der meist nur in geringen Mengen isolierten
Sekundärstoffe praktisch nicht erreicht werden kann, läßt sich bei Verwendung
markierter Verbindungen stark senken.[57] Eine Inkorporation diskreter
13
13
C-
C2-Einheiten
ist aufgrund der deutlich erhöhten Signalintensität[58,59] je nach Markierungsgrad und
Empfindlichkeit des verwendeten NMR-Spektrometers mit nur noch wenigen
Milligramm Substanz detektierbar.[37,60] Durch Einsatz der Kryoprobenkopf-Technik[61]
kann die für ein INADEQUATE-Experiment benötigte Substanzmenge durch eine
Maximierung der Sensitivität abermals deutlich herabgesetzt werden.
12
3
Allgemeiner Teil
Vergleichende
Biosynthesestudie
zum
aromatischen
Polyketid Chrysophanol (4)
3.1
Kenntnisstand
zur
Verbreitung
und
der
Biosynthese
von
Chrysophanol (4)
Chrysophanol (4), auch unter dem Namen Chrysophansäure bekannt, ist ein in
der Natur weit verbreiteter Sekundärmetabolit. So findet sich dieses Polyketid in
einigen
Familien
(Asphodelaceae)
als
[62]
Rhamnaceae).
höherer
auch
Pflanzen,
in
sowohl
in
einkeimblättrigen
zweikeimblättrigen
Familien
Vertretern
(Polygonaceae,
Es konnte zudem aus knapp 20 verschiedenen filamentösen Pilzen,[38]
in zwei Laubflechtenarten[63,64] und auch in mehreren Insektenarten, namentlich
Blattkäfern (Chrysomelidae; Unterfamilie Galerucinae),[65-67] isoliert werden. Beim
Auftreten von 4 in Insekten stellt sich die Frage, welcher Organismus - das Insekt oder
eher ein mikrobieller Endosymbiont - für die Produktion verantwortlich ist, oder ob das
Insekt den Naturstoff eventuell sequestriert. Bis zu Beginn der vorliegenden Studie war
4 also lediglich aus eukaryontischen Organismenklassen isoliert worden, welche
annelierte aromatische Polyketide über den Modus F biosynthetisieren sollten.
Mit der Entdeckung des Chrysophanols (4) in einem prokaryontischen
Organismus, nämlich dem Nocardia-Stamm Acta 1057 durch unsere Arbeitsgruppe in
enger Zusammenarbeit mit Prof. H.-P. Fiedler, Universität Tübingen, lag erstmalig ein
aromatisches Polyketid vor, welches in mehreren biologischen Organismenreichen,
sowohl in prokaryontischen als auch in eukaryontischen Gruppen als echter Naturstoff
vorkommt.[68] Mittlerweile konnte dieses Polyketid auch in einem weiteren
Bakterienstamm nachgewiesen werden, nämlich in einer Streptomycetenart.[69]
Die enorme Verbreitung dieses Sekundärstoffes drängt die Frage nach dessen
biologischer Bedeutung in der Natur auf. Erstaunlicherweise zeigt dieser hellorangefarbene
Stoff
zwar
sowohl
antimykotische,[70]
[72]
nachweisbare fraßhemmende Wirkung gegenüber Vögeln
antivirale,[71]
[67]
und Insekten,
als
auch
doch sind
die angeführten Bioaktivitäten durchweg als moderat zu bezeichnen, aber von
universeller Wirkung.
Allgemeiner Teil
13
Vielleicht ist der Grund für das breite Vorkommen des Naturstoffs eher in seiner
Biosynthese zu suchen. Schon in den siebziger Jahren des vergangenen Jahrhunderts
wurde mit Hilfe von Fütterungsexperimenten mit radioaktiv markiertem 14C-Acetat der
acetogenine Ursprung des Chrysophanols (4) in höheren Pflanzen nachgewiesen.[73,74]
Die Substanz ist ein strukturell sehr einfaches aromatisches Polyketid, welches durch
die Beteiligung einer Polyketidsynthase aus einer Acetat-Einheit und sieben Malonatabgeleiteten C2-Einheiten über ein octaketidisches Biosyntheseintermediat (7) gebildet
werden sollte (Schema 2). Die Darstellung der Biosynthese in Lehrbüchern[75] gibt
einen Faltungstyp (Modus F) vor, ohne anderen möglichen Faltungsmodi Rechnung zu
tragen.
Dies
ist
jedoch
eine
willkürliche
Fütterungsexperimente mit doppelt markiertem
13
Festlegung,
da
allein
durch
C2-Acetat, die in der Vergangenheit
noch nicht durchgeführt worden sind, der Faltungsmodus bestimmt werden kann.
O
HO
O
7×
6
O
SCoA
O
O
O
O
O
O
O
SCoA
Me
SCoA
Me
3
7
HO
O
OH
1
8
3
6
O
Me
Chrysophanol (4)
Schema 2. In Lehrbüchern[75] postulierte Biogenese des acetogeninen Anthrachinons 4 mit
willkürlich vorgegebenem Faltungsmuster.
Trotz seiner offensichtlch einfachen chemischen Struktur kann 4 mit einer
theoretischen Besonderheit aufwarten, denn es ist eines der wenigen Polyketide
überhaupt, zusammen mit Aloesaponarin II (8), welches hypothetisch durch mehr als
eine, nämlich insgesamt durch vier verschiedene Polyketidfaltungen zustande kommen
könnte (Schema 3 und Schema 4). Retrosynthetisch betrachtet, könnte Chrysophanol (4)
14
Allgemeiner Teil
aus identischen Octaketidketten (9a-d) durch unterschiedliche regiospezifische
Cyclokondensations- und Decarboxylierungsreaktionen hervorgehen (Schema 3).
HO
O
OH
Me
O
4
O
O
O
O
O
O
O
O
Me
O
O
O
O
O
O
O
Me
(9a)
O
SCoA
O
O
Modi S (c)
und S’ (d)
Modi F (a)
und F’ (b)
O
O
O
SCoA
O
O
O
O
O
O
O
Me
(9b)
(9c)
O
Me
O
O
SCoA
O
SCoA
(9d)
Schema 3. Retrosynthetische Betrachtung zu 4 mit den vier möglichen isotopomeren
Octaketidketten 9a-d.
Bei Fütterung von
13
C2-markierten Vorstufen wäre die Bildung von vier
Isotopomeren denkbar. Chrysophanol (4) stellt somit einen biosynthetischen Prototyp
dar. Unter Einbeziehung der F/S-Klassifizierung ergibt sich, daß Chrysophanol (4) auf
dem Modus F, einem Modus F', dem Modus S und einem Modus S' biosynthetisiert
werden könnte, wobei F' und S' jeweils Varianten darstellen, welche sich lediglich im
letzten Ringschluß, d.h. im Einbaumuster des aromatischen Ringes der die
Methylgruppe trägt, unterscheiden sollten. Die Varianten F' und S' sind allerdings
chemisch weniger wahrscheinlich als die Modi F und S.
Allgemeiner Teil
15
HO
Me
8x
SCoA
O
OH
O
Modus F
O
OH
SCoA
O
in Pilzen
O
HO
Me
Me
O
3
HO
Me
8x
SCoA
O
O
O
Modus F'
HO
noch nicht
entdeckt
O
OH
Me
Me
O
11
SCoA
O
SCoA
HO
Me
O
OH
3
8x
4
10
4
O
OH
O
Modus S
HO
O
OH
Me
in Bakterien
Me
O
O
3
HO
Me
8x
SCoA
O
SCoA
4
12
O
OH
Modus S'
HO
Me
O
OH
O
noch nicht
entdeckt
3
O
Me
SCoA
O
4
13
13C
2
13C
1
Schema 4. Hypothetische Polyketidfaltungen von Chrysophanol (4).
Lediglich das isomere Anthrachinon Aloesaponarin II (8)[76] (Abb. 4) wäre ein
weiteres Beispiel für ein polyketidisches Octaketid, welches hypothetisch durch
mehrere Faltungsmodi gebildet werden könnte. Allerdings kommt es nur in Pflanzen,
einem rekombinanten Bakterium[77] und einer Alteromonas-Art[78] vor, nicht aber in
Pilzen oder Tieren.
16
Allgemeiner Teil
O
HO
Me
OH
O
8
Abb. 4. Struktur von Aloesaponarin II (8).
Somit ist das aromatische Polyketid Chrysophanol (4) aus zweierlei Gründen als
Modellsystem für eine vergleichende Biosynthesestudie zur Untersuchung von
biosynthetischer Konvergenz privilegiert:
1. Durch das breite Vorkommen in diversen biologischen Reichen.
2. Durch die Möglichkeit der Biosynthese über vier verschiedene Faltungsmodi.
Da ein Chrysophanol-Molekül, egal ob dieses von Actinomyceten, Pilzen,
Pflanzen oder Insekten stammt, konstitutionell stets identisch ist, müssen, wie bereits
angedeutet, Inkorporationsexperimente mit
13
C2-Acetat durchgeführt werden, welche
die Bildung verschiedener Isotopomere sichtbar machen. Bislang ist noch nicht
untersucht worden, ob ein spezifisches Polyketid notwendigerweise durch einen
bestimmten Faltungsmodus biosynthetisiert werden kann. Biosyntheserouten mit
verschiedenen Polyketidfaltungsmodi könnten nämlich, wie beschrieben, theoretisch zu
identischen Grundstrukturen führen.
Unterschiedliche Faltungsmodi auf Metabolitebene bedingen verschiedene
Enzyme, welche diese Biosynthesewege katalysieren. Trotz der weiten Verbreitung des
aromatischen Polyketids 4 in der Natur ist über die Enzymologie der Biogenese nichts
bekannt. Zwar kann angenommen werden, daß Polyketidsynthasen (PKS) in der
Biosynthese involviert sind, doch bleibt die Einordnung der hier aktiven Proteine in die
einzelnen PKS-Klassen ohne Daten einer Sequenzanalyse und deren Vergleich mit
bereits
untersuchten
Enzymen
rein
spekulativ.
Üblicherweise
katalysieren
Polyketidsynthasen der Klasse II (auch „aromatische PKS“ genannt) die Biosynthese
aromatischer planarer Polyketide, wie z.B. von Pyronen. Allerdings wurden Enzyme
dieser Klasse ausschließlich in Bakterien gefunden. Da Chrysophanol (4) jedoch auch in
anderen (eukaryotischen) Organismengruppen vorliegt, kann diese Argumentation hier
Allgemeiner Teil
17
allein nicht weiterführen. In Pilzen, Bakterien und Pflanzen wird oft die PKS-Klasse des
Typs I angetroffen, die Biokatalysatoren z.B. für die Bildung von Makroliden sind.
Kürzlich wurden, wie bereits in der Einleitung der vorliegenden Arbeit erwähnt,
intermediäre Formen von PKS I und PKS II nachgewiesen.[76] Dieser Befund läßt die
Vermutung zu, daß eine intermediäre PKS-Form bei der Biosynthese von Chrysophanol
(4) involviert sein könnte.
Neben mangelnder Kenntnis bezüglich der Biosynthese von Chrysophanol (4)
auf Enzymebene sind zudem einige postulierte Biosynthese-Vorläufer zwischen dem
octaketidischen Precursor 7 und dem Naturstoff 4 noch nicht charakterisiert (s. Schema
2). So wäre es durchaus aussichtsreich, durch den Einsatz von HPLC-UV, -MS/MS und
NMR nach weiteren biosynthetisch-relevanten Vorstufen zu suchen. Allerdings muß
hierbei zwischen authentischen Vorstufen und sogenannten shunt products (von Engl.
shunt = Abzweig, Nebenanschluß) in den einzelnen biologischen Systemen
unterschieden werden. Auf diese Fragestellungen wird im Kapitel 4 besonders
eingegangen.
3.2
Experimente zur Biosynthese von Chrysophanol (4) in filamentösen
Pilzen
3.2.1 Kultivierung des pilzlichen Systems
Bis zur Anfertigung der vorliegenden Arbeit waren in der Literatur 17
filamentöse Pilze als Chrysophanol-Produzenten bekannt. Erstaunlicherweise erwies
sich die eigene Suche nach einem zuverlässigen pilzlichen System aus mehrerlei
Gründen schwieriger als zunächst angenommen (s. dazu 3.2.2). Als Versuchsobjekt für
die Biosyntheseexperimente wurde der Pilz Helminthosporium catenarium[79] syn.
Drechslera catenaria[80] (Drechsler) S. Ito (Moniliales) verwendet, welcher vom
„Centraalbureau voor Schimmelcultures“ (CBS), Baarn (Niederlande), bezogen worden
war. Neben Chrysophanol (4) und Emodin (14) enthält dieser rote, filamentöse Pilz
noch weitere Anthrachinone, wie Catenarin (15) und Helminthosporin (16) (Abb. 5).
18
Allgemeiner Teil
OH
O
OH
OH
Me
HO
O
OH
OH
Me
HO
O
O
14
15
OH
OH
O
OH
Me
O
16
Abb. 5. Strukturen von Emodin (14), Catenarin (15) und Helminthosporin (16).
In Anlehnung an die Arbeit von van Eijk, der solide Agarkulturen etabliert hatte,
[80]
welche aber prinzipiell für Inkorporationsexperimente ungeeignet sind, wurde eine
Fermentationsvorschrift für Flüssigkulturen erarbeitet. Bei Vorversuchen zum Anlegen
einer mikrobiellen Schüttelkultur mit verschiedenen Rührgeschwindigkeiten (RPM;
Rotations Per Minute) zeigte sich, daß der Pilz bei Werten um 100 RPM das beste
Wachstum aufweist, was für Pilze einen sehr niedrigen Geschwindigkeit darstellt.[81]
Daher war klar, daß eine Kultivierung bei höheren Rührgeschwindigkeiten, wie sie in
einem Bioreaktor erzeugt werden, wenig zweckmäßig sein würde. Aus diesem Grund
wurde der Organismus als Schüttelkultur in 250-mL-Weithals-Erlenmeyerkolben bei
100 RPM in Dunkelheit bei 24 °C fermentiert (s. Abb. 6).
Allgemeiner Teil
19
Abb. 6. Schüttelkultur von Drechslera catenaria.
3.2.2 Erläuterung zum Screening potentieller pilzlicher ChrysophanolProduzenten
In den Datenbanken des CBS (Baarn), des ATCC (American Type Culture
Collection) und dem Scifinder Scholar fanden sich zu Beginn der vorliegenden Arbeit
Einträge und Publikationen zu zahlreichen pilzlichen Chrysophanol-Bildnern.
Allerdings lagen für ein Drittel dieser filamentösen Pilze keinerlei Vorschriften
bezüglich deren Kultivierung vor. Zu einem Screening auf das Vorhandensein von
Chrysophanol (4) wurden sieben kommerziell erhältliche Pilze, zu denen Literatur zur
Kultivierung vorlag, herangezogen: Drechslera catenaria,[80] Drechslera holmii,[82]
Penicillium islandicum,[83] Phoma foveata,[84] Pseudospiropes simplex,[85] Trichoderma
harzianum[86] und Trichoderma viride.[87] Obwohl die Bedingungen in jedem Fall
eingehalten wurden, konnte lediglich in Drechslera catenaria durch DC- und HPLCAnalyse das Anthrachinon 4 nachgewiesen werden (s. Tabelle 1). Aus diesem Screening
20
Allgemeiner Teil
wurde daher deutlich, daß nur Drechslera catenaria als zuverlässiges biologisches
System bei den Biosyntheseexperimenten eingesetzt werden kann.
Was die negativen Befunde der anderen Systeme anbelangt, so lassen sich dafür
mehrere Gründe anführen. Die Kulturvorschriften waren teilweise unvollständig. In den
erwähnten Publikationen werden z.B. keinerlei Angaben bezüglich des einzuhaltenden
pH-Wertes gemacht. Allerdings bilden beispielsweise Aspergillus niger und A. nidulans
je nach pH-Wert des Mediums völlig unterschiedliche Naturstoffe.[88,89] Daher hat es
sich mittlerweile in mikrobiologischen Publikationen durchgesetzt, besonders bei
Metabolitproduktion, genaue Angaben zum pH-Wert zu machen. Außerdem stammen
die genannten Arbeiten teilweise aus Zeiten vor Einführung der HPLC-Technik. Daher
wurde zur Analyse lediglich auf Dünnschicht-Chromatograpie zurückgegriffen, was
gerade bei 4 zu Verwechslungen z. B. mit dessen Dimeren führen kann, da diese nahezu
identische Retentionszeiten aufweisen.[90] Die HPLC-Analyse muß daher generell
komplementär zusätzlich zur Kontrolle mit DC-Analytik eingesetzt werden, wenn
„neue“ Organismen untersucht werden.
Darüber hinaus besteht die Möglichkeit, daß die pilzlichen Stämme der
Kollektionen im Laufe der Jahre ihre Biosynthesefähigkeit verändert haben, und der
gewünschte Sekundärmetabolit nicht mehr produziert werden kann.[91]
Generell bleibt festzustellen, daß mikrobiologische Arbeitsvorschriften zur
Kultivierung pilzlicher Chrysophanol-Produzenten nicht vorbehaltlos übernommen
werden können. Oben genannte Punkte sollten bei der Nachstellung von
Kultivierungsbedingungen Beachtung finden.
Allgemeiner Teil
Tabelle 1.
21
Pilzliche Chrysophanol-Produzenten aus der Literatur und Ergebnisse des eigenen Screenings bezüglich des Naturstoffs Chrysophanol (4)
Als Chrysophanol-Produzent
Vorhandenes
beschriebener Pilz
Kultivierungsvorschrift
Nachweis von 4
van Eijk 1974[80]
positiv
van Eijk, Roeymans 1981[82]
negativ
Penicillium islandicum
Ghosh et al. 1978[83]
negativ
Phoma foveata
Bick, Rhee 1966[84]
negativ
Pseudospiropes simplex
van Eijk 1978[85]
negativ
Trichoderma harzianum
Abou Zeid 2000[86]
negativ
Trichoderma viride
Slater et al. 1967[87]
negativ
Drechslera catenaria
Drechslera holmii
3.2.3 Fütterungsexperiment am pilzlichen System und NMR-Analyse
Das Fütterungsexperiment mit 13C2-Acetat an Schüttelkulturen des filamentösen
Pilzes Drechslera catenaria wurde am fünften Tag nach Animpfung gestartet. Dabei
wurde über einen Zeitraum von 28 Tagen das zuvor sterilfiltrierte uniform markierte
[1,2-13C2]-Natriumacetat in Intervallen von sieben Tagen zugegeben, bis eine
Endkonzentration von 200 mg/L erreicht war.
Das aus dem Pilzmycel nach Beendigung des Experiments isolierte
Chrysophanol (4) wurde zunächst mittels eines 13C-NMR-Experiments auf einen Einbau
hin untersucht. Da eine Inkorporation durch vorhandene Satelliten im Spektrum
augenfällig
war, wurde die Probe im Anschluß einer 2D-INADEQUATE-NMR-
Messung unterzogen, welche zweifelsfrei Interaktionen zwischen C-1a und C-1, C-3
und 3-CH3, C-4a und C-4, C-5a und C-10, sowie zwischen C-7 und C-8 im Spektrum
zeigte (s. Abb. 7).
22
Allgemeiner Teil
Abb. 7. INADEQUATE-Spektrum des aus pilzlicher Quelle isolierten Chrysophanols (4) nach
Fütterung mit [1,2-13C2 ]-Natriumacetat.
Lediglich eine C-C-Konnektivität, nämlich die zwischen C-8a und C-9, war im
Spektrum nicht direkt zu erkennen. Allerdings zeigte sich das Signal von C-9 bei der
korrekten Doppelquantenfrequenz, wie sie für die Korrelation zwischen C-9 und C-8 zu
erwarten ist. Auch die exakt übereinstimmenden Kopplungskonstanten, welche ein
starkes Indiz für zwei Kopplungspartner darstellen, liegen für C-9 und C-8a mit jeweils
55 Hz vor. Für eine weitere, unabhängige Absicherung dieses C2-Elements wurde ein
sogenanntes SELINQUATE-Experiment (Selective Incredible Natural Abundance
Double Quantum Transfer Experiment) mit Einstrahlung bei der Resonanzfrequenz von
C-9 durchgeführt, welches schließlich die letzte, im 2D-INADEQUATE-Spektrum
nicht erkennbare Kopplung eindeutig verifizieren konnte (Abb. 8.).
Allgemeiner Teil
23
(a)
J = 54 Hz
C-8a
(b)
117.08
Abb. 8.
116.91
116.71 (ppm)
SELINQUATE zur Identifizierung der einzigen, im INADEAQUATE nicht
erkennbaren Konnektivität.
Das „Single"-Kohlenstoffatoms C-2, welches nach erfolgter Decarboxylierung
zurückbleibt und sich ursprünglich in Nachbarschaft zum Coenzym A befunden hatte,
konnte dabei nicht durch eine signifikante Anreicherung im
13
C-NMR-Spektrum
detektiert werden. Vielmehr wird dies indirekt durch die paarweise
13
C-13C-
Korrelationen aller übrigen Kohlenstoffatome im Spektrum deutlich und darüber hinaus
durch das Auftreten des Signals von C-2 als Singulett mit einer wesentlich erhöhten
Signalintensität im Vergleich zu C-2 der unmarkieren Substanz (Schema 5).
HO
OH
O
O
HO
O
OH
SCoA
O
Me
Me
O
10
4
Schema 5. „Single“-Bildung bei der Biosynthese von Chrysophanol (4) im Pilz.
Bedingt durch die gefundenen C-C-Konnektivitäten zwischen C-5 und C-6
sowie C-7 und C-8 wurden lediglich zwei C2-Einheiten intakt in den ersten
aromatischen Ring des Polyketids inkorporiert. Dies entspricht per definitionem dem
Modus F. Dieses Resultat spiegelt somit die Erwartungen wider, denn dieser
Polyketidfaltungsmodus wurde bisher stets in Pilzen angetroffen.
24
3.3
Allgemeiner Teil
Experimente zur Biosynthese von Chrysophanol (4) in Pflanzen
3.3.1 Kultivierung des pflanzlichen Systems
Als biologisches System für Fütterungsexperimente an höheren Pflanzen wurde
mit bereits etablierten flüssigen Kalluskulturen der monokotyledonen Pflanze Kniphofia
uvaria Hook (Asphodelaceae) gearbeitet. Die Pflanze ist unter dem Namen Fackellilie
als Zierpflanze bekannt und im Gartenhandel erhältlich (s. Abb. 9).
Abb. 9. Die Fackellilie Kniphofia uvaria (Asphodelaceae).
Die schon für die Kalluskulturen (s. Abb. 10) erarbeiteten optimalen
Kultivierungsparameter[92] wurden unverändert für die Biosyntheseexperimente
übernommen, wobei die Gewebekulturen bei 84 RPM kultiviert wurden. Dies ist bei
pflanzlichen Zellkulturen als normale Rührgeschwindigkeit zu bezeichnen. Sowohl
Allgemeiner Teil
25
Suspensions- als auch flüssige Kalluskulturen werden üblicherweise bei Werten
zwischen 80 und 100 RPM kultiviert.[81] Im Unterschied dazu werden Mikroorganismen
im Allgemeinen bei höheren Rührgeschwindigkeiten fermentiert.
Abb. 10. Flüssige Kalluskultur von Kniphofia uvaria (Asphodelaceae).
Zur Reproduzierbarkeit von Experimenten mit Zellkulturen monokotyledoner
Pflanzen bezüglich des Sekundärstoffspektrums ist zu sagen, daß diese Klasse von
höheren Pflanzen vor allem hinsichtlich ihrer Ein- und Zweijährigkeit, durchaus
Schwankungen in ihrer biosynthetischen Fähigkeit unterliegen. So können gerade bei
älteren Kulturen durchaus starke Abweichungen im Metabolitspektrum auftreten,
weshalb stets auf das Alter der jeweils verwendeten Kultur geachtet werden sollte,
damit identische Resultate erzielt werden können. So sollten die Gewebekulturen
keinesfalls älter als ein Jahr sein.
3.3.2 Fütterungsexperiment am pflanzlichen System und NMR-Analyse
Für das Inkorporationsexperiment mit Suspensionskulturen von Kniphofia
uvaria wurde über einen Zeitraum von 16 Tagen das uniform markierte [1,2-13C2 ]Natriumacetat (4 mg mL-1), welches zuvor sterilfiltriert wurde, in zwei Portionen
appliziert. Dabei wurde die Verfütterung am ersten Tag und am achten Tag
durchgeführt, wobei jeweils 1 mL der Acetatlösung pro 50 mL Flüssigmedium
zugegeben wurde.
26
Allgemeiner Teil
Das aus dem Biomaterial nach Beendigung des Experiments isolierte
Chrysophanol (4) wurde erneut mittels eines
13
C-NMR-Experiments auf Einbau hin
untersucht. Da neuerlich eine Inkorporation durch vorhandene Satelliten im Spektrum
augenfällig war, wurde die Probe im Anschluß wiederum einer 2D-INADEQUATENMR-Messung unterzogen, welche vier Interaktionen, namentlich zwischen C-3 und 3CH3, C-4a und C-4, C-5a und C-6 sowie C-7 und C-8 im Spektrum zeigte (s. Abb. 11).
Abb. 11. INADEQUATE-Spektrum des aus pflanzlicher Quelle isolierten Chrysophanols (4)
nach Fütterung mit [1,2-13C2 ]-Natriumacetat.
Im Vergleich zur pilzlichen Quelle zeigten sich hier im 2D-INADEQUATESpektrum weniger C-C-Konnektivitäten, bedingt durch eine signifikant geringere
Menge an Chrysophanol (4), welche aus dem pflanzlichen System isoliert worden war.
Allerdings
konnten
auch
einige
zusätzliche
C-C-Korrellationen
Übereinstimmung der Kopplungskonstanten der Kohlenstoffsignale im
durch
13
die
C-NMR-
Spektrum nachgewiesen werden. Da der Markierungsgrad nicht zufriedenstellend war,
sollte bei weiteren Inkorporationsexperimenten dieser Art eine höhere Konzentration,
also z.B. 6 mg/mL gewählt werden.
Im ersten aromatischen Ring des Polyketids aus pflanzlicher Quelle wurden
zwei C2-Einheiten intakt eingebaut, was per definitionem dem Modus F entspricht.[30]
Allgemeiner Teil
27
Somit lag hier der erste Beweis für einen Modus F in monokotyledonen Pflanzen vor
und neben früheren Arbeiten zu Naphthylisochinolinen[36,37] der erst zweite zur
Einordnung aromatischer Polyketide pflanzlichen Ursprungs überhaupt.
3.4
Experimente zur Biosynthese von Chrysophanol (4) in filamentösen
Bakterien
3.4.1 Kultivierung und Fermentation des bakteriellen Systems
Zu Beginn der vorliegenden Arbeit waren keinerlei prokaryotische Organismen
bekannt, die Chrysophanol (4) biosynthetisieren. Durch einer Bitte an unseren
langjährigen Kooperationspartner Prof. H. P. Fiedler vom Institut für Mikrobiologie
(Arbeitsgruppe Antibiotika) der Universität Tübingen, bei einem Screeningprogramm
zu neuen bakteriellen Sekundärmetaboliten auch nach diesem bekannten Anthrachinon
gezielt zu suchen, erhielt man einen ersten Hinweis auf einen bakteriellen
Chrysophanolbildner. Die Arbeitsgruppe von Prof. H.P. Fiedler untersuchte dabei ein
Bakterium, welches Prof. M. Goodfellow von der Universität Newcastle (England) aus
einer Bodenprobe einer sehr alten Ackerfläche bei Morpeth, Northumberland, isoliert
hatte. Nachdem das Bakterium zunächst der Gattung Streptomyces zugeordnet worden
war, ergaben chemotaxonomische, morphologische und genetische Untersuchungen,
welche auf Sequenzanalyse der 16S-rRNA basierten, daß es sich um eine eigene
phyletische Linie innerhalb der Gattung Nocardia handelt. Diese Gruppe filamentöser
Bakterien steht der Gattung Streptomyces sehr nahe und beinhaltet eine Reihe von
pathogenen Keimen.[93-95] Die Experimente zur systematischen Eingliederung des
Bakteriums wurden in der Arbeitsgruppe von Prof. M. Goodfellow durchgeführt.[96] Das
Bakterium wird im Folgenden unter der Bezeichnung Nocardia sp. Acta 1057 geführt.
In unserer Arbeitsgruppe wurde eine HPLC- und NMR-Analyse einer aus Acta
1057 isolierten gelben Substanz durchgeführt. Es bestätigte sich durch die NMRSpektren zweifelsfrei, daß es sich um das Anthrachinon Chrysophanol (4) handelte.
Mittlerweile konnte dieses Polyketid auch aus einem Streptomyceten und einem
weiteren Bakterium als Minderkomponente isoliert werden.[69]
Die Kultivierung des bakteriellen Stammes wurde streng nach einer
Kultivierungsvorschrift der Arbeitsgruppe Goodfellow durchgeführt,[97] bei der Gauses
28
Allgemeiner Teil
Medium 2[98] mit Zusätzen von Nalidoxonsäure, Cycloheximid und Nystatin bei pH 7.0
in Petrischalen für die Oberflächenkultur verwendet wurde (s. Abb. 12).
Abb. 12. Nocardia sp. Acta 1057 auf Gauses Medium 2.
Die Fermentation von Nocardia sp. Acta 1057 erfolgte in einem 1-LiterBioreaktor (Biostat S, B. Braun, Melsungen, Deutschland) (s. Abb. 13). Hierbei wurde
ein technisches Substrat bei pH 7.3 und 27 ° C eingesetzt, dem 1 g/L Kochsalz zugefügt
wurde.
Abb. 13. Bild des verwendeten Reaktors der Firma B. Braun.
Allgemeiner Teil
29
3.4.2 Fütterungsexperiment am bakteriellen System und NMR-Analyse
Die im Folgenden beschriebenen Fütterungsexperimente wurden in enger
Zusammenarbeit mit Prof. H. P. Fiedler durchgeführt. Der Stamm wurde dazu im 1Liter-Bioreaktor im komplexen Medium mit getrocknetem Maisquellwasser (cornsteep
powder) kultiviert. Dabei wurde die maximale Chrysophanol-Produktion nach 144
Stunden erreicht. Die Fütterung mit dem zuvor sterilfiltrierten [1,2-13C2]-Acetat wurde
mit einer Flußrate von 3 mL/h während der 85. und der 105. Stunde des
Fermentierungsprozesses durchgeführt. Das aus dem Bakterium isolierte Chrysophanol
(4) zeigte ein signifikant anderes Einbaumuster in den erhaltenen NMR-Spektren als
jenes aus den beiden bereits untersuchten Organismen. Im 2D-INADEQUATESpektrum wurden eindeutig Konnektivitäten zwischen C-1 und C-2, C-3 und 3C-CH3,
C-5a und C-5, C-6 und C-7, C-8 und C-8a, C-9 und C-1a sowie C-10 und C-4a auffällig
(s. Abb. 14).
Abb. 14. INADEQUATE-Spektrum des aus bakterieller Quelle isolierten Chrysophanols (4)
nach Fütterung von [1,2-13C2 ]-Natriumacetat.
30
Allgemeiner Teil
In
den
ersten
aromatischen
Ring
des
Polyketids
wurden
bei
dem
prokaryontischen System drei C2-Einheiten intakt eingebaut. Somit liegt hier
offensichtlich der Modus S vor, welcher bereits zuvor für andere aromatische
Polyketide aus Streptomyceten beschrieben worden war. Der hypothetische Modus S'
konnte hingegen nicht sicher nachgewiesen werden. Die Bildung über den Modus S ist
chemisch wahrscheinlicher, da in diesem Fall der biosynthetisch zuletzt gebildete
methylsubstituierte Ring durch eine Standard-Aldolreaktion unter Angriff einer zweifch
aktivierten und somit stark aciden CH2-Einheit an der Ketogruppe des späteren C-3
aufgebaut wird. Der alternative Modus S' würde hingegen die Bildung eines Enolats
unter Verwendung von lediglich einfach aktiviertem Methyl bedingen. Letzteres scheint
chemisch nicht besonders plausibel zu sein, da bisher kein Nachweis in der Literatur für
eine solche Reaktion in der Biosynthese von Polyketiden vorliegt. Ein Beispiel, welches
dieser Reaktion noch am Ähnlichsten zu sein scheint, ist die Bildung des
Tetrahydroxynaphthalins (THN) (17) (Abb. 15) katalysiert von einer PKS des Typ
III.[99,100] Allerdings ist selbst für dieses analoge Beispiel mittlerweile klar belegt
worden, daß es sich bei der Startereinheit um Malonat handelt, welches somit ebenfalls
eine doppelte Aktivierung ermöglicht.
OH
HO
OH
HO
17
Abb. 15. Struktur des Tetrahydroxynaphthalins (THN) (17).
Im INADEQUATE-Spektrum wurden auch Signale für die Konnektivität C-3/C4 sichtbar, die den Modus S' beweisen würden. Ein zusätzliches Auftreten einer
vergleichbar starken Wechselwirkung zwischen C-4a/C-4 ließ jedoch vermuten, daß
diese beiden Korrellationen eher aufgrund einer nicht-statistischen Verteilung innerhalb
aller gebildeten Chrysophanolmoleküle zu erklären waren. So könnte eine relativ
stärkere Markierung von C-4 durch die nicht-statistischen Effekte zu diesen
Beobachtungen führen. Die Konnektivität C-4a/C-4 liegt in „Gegenrichtung“, wie sie an
dieser Position für das Einbaumuster des Modus F typisch wäre. Das Vorkommen des
Modus S' kann jedoch nicht ausgeschlossen werden. Es bleibt äußerst schwierig zu
Allgemeiner Teil
31
entscheiden, ob hier tatsächlich die postulierte Variante vorliegt, oder ob ein
Startereffekt[101-104] und eine Interacetat-Kopplung auftreten.
In einem anderen Bakterium, Streptomyces AK 671, konnte jedoch in einer
bicyclischen Vorstufe 23 des Chrysophanols (4) der Modus S' sicher nachgewiesen
werden (s. Punkt 4.2.3.1.).
3.5
Biosyntheseexperimente zu Chrysophanol (4) in Insekten
3.5.1 Kultivierung des Blattkäfers
Insgesamt sind drei verschieden Insektenarten beschrieben, die Chrysophanol (4)
als Sekundärmetabolit beinhalten, namentlich die drei Blattkäferarten Trirhabda
geminata,[67] Pyrrhalta luteola[65]und Galeruca tanaceti.[66] Alle drei Vertreter gehören
der Familie Chrysomelidae, genauer der Unterfamilie Galerucinae an. Aus Gründen der
lokalen Verfügbarkeit wurde das Insekt Galeruca tanaceti, der Rainfarnblattkäfer, als
Versuchsobjekt gewählt (s. Abb. 16). Dieser Käfer ist in Mitteleuropa beheimatet und
wird bereits seit mehreren Jahren von der Arbeitsgruppe von Prof. M. Hilker vom
Institut für Tierökologie der FU Berlin auf molekularbiologischer Ebene bearbeitet.
Außerdem bot sich dieser Käfer als geeignetes biologisches System zur Untersuchung
der Chrysophanol-Biosynthese in Tieren an, da das Insekt das Anthrachinon nicht
sequestriert, d.h., die Substanz nicht einfach durch pflanzliche Nahrung aufnimmt. Die
folgenden Arbeiten wurden in Zusammenarbeit mit F. Pankewitz aus der Arbeitsgruppe
von Prof. M. Hilker durchgeführt.[105] Hier war man besonders an der Frage interessiert,
wer der authentische Produzent des Naturstoffs in Insekten ist (s. dazu auch 3.5.2).
32
Allgemeiner Teil
Abb. 16. Galeruca tanaceti (Chrysomelidae), der Rainfarnblattkäfer, adultes Tier.
Im März, d.i. direkt nach der Schneeschmelze, wurden zahlreiche Gelege von
Galeruca tanaceti in der Nähe von Berlin gesammelt. Sein deutscher Name ist
irreführend, da der sogenannte Rainfarnblattkäfer vornehmlich an Achillea millefolium
(Asteraceae; Compositae), der Schafgarbe, zu finden ist. Die sehr kleinen, dunklen
Gelege des Kerbtiers wurden im Labor in Plastikgefäßen (Tupperware©) gehalten,
welche mit Gaze überspannte Öffnungen besaßen. Diese Gefäße wurden ihrerseits in
Klimakammern verbracht (s. Abb. 17), die folgende Kultivierungsparameter aufwiesen:
25 °C konstante Temperatur; 18/6 h Photoperiode bei 2000 Lux und 60%
Luftfeuchtigkeit.
Allgemeiner Teil
33
Abb. 17. Klimakammer zur optimalen Kultivierung des Blattkäfers Galeruca tanaceti.
Die Larven von Galeruca tanaceti des L1-Entwicklungsstadiums konnten anstatt
auf ihrer Wirtspflanze Achillea millefolium im Labor problemlos auf handelsüblichem
Chinakohl (Brassica rapa ssp. chinensis, Brassicaceae; Cruciferae) kultiviert werden.
3.5.2 Fütterungsexperiment am tierischen System und NMR-Analyse
Das Fütterungsexperiment mit 13C2-Acetat wurde direkt nach dem Schlüpfen der
Larven (L1-Stadium) begonnen (s. Abb. 18). Etwa 800 Larven, die während dieses
Entwicklungsstadiums ca. zwei Millimeter groß waren, wurden bei diesem
Biosyntheseexperiment eingesetzt.
34
Allgemeiner Teil
Abb. 18. Larven von Galeruca tanaceti im Fütterungsexperiment.
Bereits
die
Applikation
der
13
C-markierten
Vorstufe
in
diesem
Biosyntheseexperiment erwies sich als nicht trivial, da bis zu Beginn der vorliegenden
Studie keinerlei Untersuchungen bezüglich der optimalen Aufnahme von Acetat durch
Insektenlarven vorlagen. Lediglich eine Publikation mit uniform markiertem
13
C2-
Natriumacetat lag zu polyketidischen Isochinolinen in einer australischen Ameisenart
vor,[106] welche zur Orientierung bezüglich der einzusetzenden Konzentration
herangezogen werden konnte. Man entschloß sich, eine sterilfiltrierte Lösung des
markierten Natriumacetats (2 mg mL-1) mit einem üblichen Handzerstäuber auf die
Futterpflanze aufzubringen und antrocknen zu lassen. Dieser Vorgang wurde mehrmals
wiederholt, damit eine Benetzung des Chinakohls mit dem markierten Acetat
gewährleistet war. Somit wurde dafür Sorge getragen, daß der Precursor von den Larven
sowohl über die Haut als auch direkt, durch Fraß, in den Körper aufgenommen wurde.
Zwar ist eine Bildung von Chrysophanol (4) in der Hämolymphe des Insekts durchaus
denkbar, doch erschien die Injektion des markierten Vorläufers in knapp 800 Tiere als
äußerst aufwendig, zudem diese Prozedur mehrmals zu wiederholen gewesen wäre.
Darüber hinaus war der Einfluß einer Injektionswunde bei einem wenige Millimeter
großen Tier auf den Versuchsablauf nicht vorhersehbar.
Bereits wenige Tage nach Beginn des Fütterungsexperiments hatten die Larven
ihr Körpergewicht verdoppelt, und es war notwendig, täglich das Futtermaterial mit
dem aufgebrachten markierten Natriumacetat zu erneuern. Nach vierzehn Tagen, als die
Allgemeiner Teil
35
Larven unmittelbar vor der Verpuppung standen, wurde das Fütterungsexperiment
beendet. Da aus früheren entomologischen Arbeiten[66] hervorgeht, daß der
Höchstgehalt an 4 in diesem Larvenstadium erreicht wird, wurde dieser Zeitpunkt zur
Beendigung des Experiments gewählt.
Das aus dem Biomaterial nach Beendigung des Experiments isolierte
Chrysophanol (4) wurde erneut mittels eines
13
C-NMR-Experiments auf Einbau hin
untersucht. Da eine Inkorporation durch vorhandene Satelliten im Spektrum augenfällig
war, wurde die Probe dann zusätzlich einer 2D-INADEQUATE-Messung unterzogen,
welche zunächst lediglich zwei Korrelationen, nämlich zwischen C-3 und 3-CH3 und
zwischen C-5a und C-6, zeigte. Doch bei Wiederholung des Experiments mit dem neu
am
Institut
erworbenen
Kryoprobenkopf[61]
wurden
insgesamt
sechs
klare
Korrellationen deutlich (C-3 und 3-CH3, C-4a und C-4, C-5 und C-6, C-7 und C-8, C-5a
und C-10, und sowie zwischen C-7 und C-8) (s. Abb. 19). Somit trug die KryoprobenTechnik wesentlich zur Verbesserung der Analyse bei.
Abb. 19. INADEQUATE-Spektrum des aus tierischer Quelle isolierten Chrysophanols (4) nach
Fütterung mit [1,2-13C2 ]-Natriumacetat.
36
Allgemeiner Teil
Nun ließ sich zweifelsfrei Modus F nachweisen, da die detektierten
Korrellationen genau mit den Positionen zusammenfallen, welche diese Variante
determinieren.
Die Anzahl beobachteter Konnektivitäten ist im Wesentlichen auf einen relativ
hohen Markierungsgrad im Zielmolekül zurückzuführen. Die gewählte Konzentration
der markierten Acetatlösung war offensichtlich ausreichend für das tierische System.
Bei der Verfütterung war man vorsichtig an die Dosierung des markierten Vorläufers
herangegangen, da nicht abzusehen war, bis zu welchem Grad der pH-Wert des
verfütterten Materials Einfluß auf das Experiment nehmen würde. Naturgemäß bleibt
die individuell aufgenommene Gesamtmenge des Precursors durch die Tiere, bedingt
durch unterschiedlich starken Fraß, ein Faktor, der nicht standardisiert werden kann.
3.5.3 Betrachtungen zur Produktion des Naturstoffs Chrysophanol (4) in
Insekten
Generell tritt bei einem Vorkommen von Sekundärmetaboliten in Tieren die
Frage auf, wer der Produzent des gefundenen Naturstoffs ist. Die De-novo-Biosynthese
von Sekundärmetaboliten findet hier selten statt. Vielmehr kann sehr oft von anderen
biologischen Produzenten ausgegangen werden. Bei Insekten treten dabei besonders
gehäuft folgende Möglichkeiten auf: Sequestrierung, Bildung der Naturstoffe durch
bakterielle oder aber auch pilzliche Endosymbionten. Da im Falle des vorliegenden
Insekts keine Sequestrierung durch Futterpflanzen vorliegt,[66] könnte es noch sein, daß
es sich um einen mikrobiellen Organismus handelt, der für die Biosynthese des
aromatischen Polyketids verantwortlich ist und der im Körper des Tieres lebt.
Da sich das Polyketidfaltungsmuster von pilzlichen und bakteriellen Organismen
grundlegend voneinander unterscheidet, wie bereits unter 3.1.1 dargelegt worden ist,
kann durch das hier eingesetzte Instrumentarium die Frage nach dem biologischen
Ursprung der Substanz im Insekt beantwortet werden. Das unter 3.5.2 beschriebene
Experiment stellt somit eine erste praktische Anwendung dieser Technik dar.
Mit dem Nachweis des Modus F im Blattkäfer ist es nun möglich, mehrere
Aussagen zu treffen. So kann zunächst definitiv ausgeschlossen werden, daß ein
prokaryotischer Endosymbiont für die Bildung von Chrysophanol (4) verantwortlich ist,
Allgemeiner Teil
37
da dieser den Modus S verwirklichen würde. Auf den ersten Blick scheint zunächst alles
dafür zu sprechen, daß neben dem Insekt als mikrobieller Produzent nur noch ein
pilzlicher Organismus in Frage käme – ähnlich wie bei dem aromatischen Polyketid
Mellein (18), welches in australischen Ameisen vorkommt (s. Abb. 20).[106] Hier war
ebenfalls der Modus F nachgewiesen worden, was für die Existenz eines
endosymbiontischen Pilzes als Produzent spricht.
Me
R
O
OH
O
18
Abb. 20. Struktur von Mellein (18).
Unveröffentlichte Ergebnisse der Arbeitsgruppe von Prof. M. Hilker[107] zeigen,
daß der Einsatz von Antibiotika und von einigen Fungiziden keinerlei Wirkung auf die
Chrysophanol-Produktion bei behandelten Eiern und auch Larven hat, nurmehr eine
korrekte Schlußfolgerung zuläßt: Bei dem Produzenten muß es sich um das Insekt selbst
handeln. Dabei kann nicht ausgeschlossen werden, daß sich vielleicht ein horizontaler
Gentransfer ereignet hat. Denkbar wäre diesbezüglich, daß sich speziell pilzliche Gene
in das Insektengenom insertiert haben und dem Blattkäfer ermöglichen, Chrysophanol
(4) zu produzieren. Kürzlich wurde in der Literatur ein Fall beschrieben, bei dem ein
Käfer durch horizontalen Gentransfer eines mikrobiellen Pathogens (hier allerdings
eines Bakteriums) die Fähigkeit erwarb, einen Sekundärmetaboliten de novo zu
biosynthetisieren.[108] Auch im Falle des Auftretens von Chrysophanol (4) in Blattkäfern
wäre es durchaus denkbar, daß ein Pathogen involviert war, da die Fähigkeit, das
Anthrachinon zu biosynthetisieren, lediglich in einigen Vertretern der Unterfamilie
Galerucinae vorliegt. Möglich wäre jedoch auch eine monophyletische Linie dieser
entomologischen Gruppe, welche gleichsam als ursprünglich betrachtet werden müßte.
Im vorliegenden Fall müssen molekularbiologische Arbeiten darüber Aufschluß geben,
ob tatsächlich ein horizontaler Gentransfer vorliegt.
Es bleibt jedoch zu erwähnen, daß der Einsatz des gezeigten Instrumentariums
Licht in Fragestellungen, gerade bei Symbiosen, bringen kann. So wäre es durchaus
vorstellbar,
Gemeinschaften
wie
Schwämme,
Flechten
oder
eben
die
38
Allgemeiner Teil
Lebensgemeinschaft
„Insekt“
durch
die
Ermittlung
des
vorliegenden
Polyketidfaltungsmodus näher zu untersuchen und solcherart wichtige, erste Hinweise
auf die Biologie zu erhalten, da die Klassifizierung nach dem F/S-Modus-System
zunächst ein grobes Instrument im Vergleich zu biochemischen Methoden darstellt.
3.6
Bemerkungen zur Produktion von Chrysophanol (4) in Flechten
Wie bereits unter 3.5.3 angedeutet, bieten besonders Fragestellungen in
Verbindung mit symbiontischen Lebensgemeinschaften eine Möglichkeit, die
Bestimmung der Polyketidfaltungsmodi anzuwenden und damit biologische Fragen zu
klären. Beim Organisationstyp der Lichenes (Flechten) bilden Hyphen bestimmter
Pilzarten (Mycobionten) einen Verband mit niederen Algen (Phycobionten), der
morphologisch und physiologisch zu einer Einheit geworden ist.[109] Dabei kann es sich
bei den niederen Algen sowohl um prokaryotische Cyanobakterien als auch um
eukaryotische Chlorophyceen handeln.
Bei den beiden Chrysophanol-produzierenden Algen Asahinea chrysantha und
Asahinea scholanderi (Parmeliaceae) sind es Laubflechten, welche mit eukaryotischen
Grünalgen der Ordnung Chlorococcales, namentlich der Gattung Trebouxia als
Phycobionten assoziiert sind.[110]
Aus
mehreren
generellen
Überlegungen
heraus
wurden
keine
Fütterungsexperimente an Flechten durchgeführt, obwohl das enge Zusammenleben der
beiden Organismen in der Symbiose durchaus interessante chemische Aspekte aufweist:
•
Da sowohl der Mycobiont als auch der Phycobiont potentiell F-typische
Organismen sind, kann die Bestimmung des Polyketidfaltungstyps in diesem
Fall kein interpretierbares Resultat bezüglich des Produzenten liefern. Hier gibt
ausschließlich die Anwendung molekularbiologischer und biochemischer
Methoden eine Antwort.
•
Die Sterilkultur von Flechten ist generell noch sehr schwach entwickelt und
gelang
bisher
nur
in
wenigen
Ausnahmefällen.
So
wachsen
einige
Strauchflechten lediglich etwa einen Millimeter pro Jahr. Ein aussagekräftiges
Fütterungsexperiment ist somit nicht durchführbar, da die Produktion von
Allgemeiner Teil
39
Biomasse und den darin enthaltenen Sekundärmetaboliten zu gering ist und die
Applikation zeitlich lange durchgeführt werden müßte.
•
Eine Durchführung des Inkorporationsexperiments mit markierten Vorstufen am
Naturstandort ist hier ebenfalls nicht denkbar, da beide Spezies in Sibirien
vorkommen, wo die schneefreie Vegetatiosperiode nur sehr kurz ist.
3.7
Schlußfolgerungen aus dem vergleichenden Biosyntheseexperiment
Durch die vorliegenden Experimente konnte klar bewiesen werden, daß das
einfache aromatische Polyketid Chrysophanol (4) der erste acetogenine Naturstoff ist,
welcher über mehr als einen, nämlich über beide für andere Systeme etablierten
Polyketidfaltungsmuster F und S, biosynthetisiert wird. Schwächere spektroskopische
Indizien deuten ein Auftreten der Variante S' in Bakterien an. Allerdings konnte in der
vorliegenden vergleichenden Biosynthesestudie nicht der hypothetisch realisierbare
Faltungstyp F' detektiert werden. Gründe für die fehlende Realisierung dieser
postulierten Polyketidfaltungsmodi sind dabei in der chemischen Wahrscheinlichkeit zu
suchen. So erscheinen die unter 3.1 vorgeschlagenen Mechanismen nicht sonderlich
begünstigt zu sein, da hier nicht doppelt aktiviertes Methylen zum Einsatz kommt.
Darüber hinaus gibt es keinerlei Berichte in der biosynthetischen Literatur, daß
solcherlei Mechanismen realisiert werden. Generell könnte es jedoch in diesem
Zusammenhang
von
Interesse
sein,
weitere
pilzliche
und
auch
bakterielle
Chrysophanol-Produzenten durch oben beschriebene Techniken zu untersuchen, damit
die Möglichkeit einer Verwirklichung der beiden postulierten Wege Modus F' und S'
weitergehend erforscht werden kann.
Die erzielten Resultate zeigen eindeutig, daß eukaryotische und prokaryotische
Organismen im Laufe der Evolution unterschiedliche Faltungstypen und damit auch
verschiedene Polyketidsynthasen zur Produktion dieses Sekundärmetaboliten entwickelt
haben. Höhere Pflanzen falten dabei die Acetat-Einheiten während der Biogenese auf
dem gleichen Weg wie die ebenfalls eukaryotische Klasse der Pilze. So ist der
Polyketidfaltungsmodus
Biosyntheseweg.
F
bislang
der
einzige
in
Eukaryonten
detektierte
40
Allgemeiner Teil
Die Biogenese von Chrysophanol (4) kann darüber hinaus wegen der Bildung
durch mehrere Faltungstypen als erstes Beispiel für biosynthetische Konvergenz, ein
Begriff der z.B. in der Evolutionsbiologie verwendet wird, bei polyketidischen
Naturstoffen gelten. Für Terpene ist auch ein Beispiel beschrieben, das Geosmin (19) (s.
Abb. 21), welches durch einen Streptomyceten und ein Moos über leicht abweichende
Biosyntheserouten gebildet wird.[111]
Me
R
S
HO
S
Me
19
Abb. 21. Struktur des Geosmins (19).
Zusammenfassend konnte in dieser Arbeit gezeigt werden, daß während der
Biosynthese von 4 eine Octaketidkette als Vorstufe zu verschiedenen cyclisierten
Konstitutionsisomeren führt, und man zunächst von chemischer Divergenz sprechen
kann. Doch da unterschiedliche biosynthetische Intermediate schließlich wiederum zum
selben Naturstoff führen, liegt auch eine Konvergenz vor. Da hier offensichtlich
verschiedenste Lebewesen unterschiedliche Enzyme und somit unterschiedliche
resultierende
Faltungstypen
entwickelt
haben,
welche
die
Biosynthese
von
Chrysophanol (4) möglich machen, läßt sich zweifellos von chemischer oder aber
biosynthetischer Konvergenz sprechen.
Dieses Phänomen wirft weiterhin die Frage nach der ökologischen Bedeutung
des Anthrachinons im jeweiligen Organismus auf. Die weite Verbreitung dieses
aromatischen Polyketids könnte die Tatsache widerspiegeln, daß die involvierten PKS
vielleicht noch sehr nahe mit Enzymen des Primärstoffwechsels, wie z.B. den
Fettsäuresynthasen (FAS), verwandt sind. Da mehrere PKS im Laufe der Evolution zur
Biosynthese von 4 entwickelt wurden, kann die strukturelle Einfachheit des
aromatischen Polyketids wohl nicht allein für dessen weite Verbreitung verantwortlich
sein. Es wäre darüber hinaus möglich, daß die Natur ihrerseits eine Art von „WirkstoffScreening“ durchführt.
Allgemeiner Teil
41
Bezüglich der in der Biogenese des Chrysophanols (4) involvierten
Polyketidsynthasen bleibt zu bemerken, daß der Unterschied in der Molekülstruktur,
welcher
normalerweise
ohne
Inkorporationsexperimente
verborgen
bleibt,
selbstverständlich auf einem Unterschied in der Struktur der biosynthetischen Enzyme
zurückzuführen ist. Dabei wäre es denkbar, daß Abweichungen besonders im
katalytischen Zentrum von eukaryotischen und prokaryotischen PKS hierfür
verantwortlich sind, obwohl keinerlei empirische Daten hierzu gesammelt werden
konnten. Somit wäre es nicht nur aus biochemischer Sicht äußerst lohnend, mehr über
die Proteinstruktur der beteiligten Enzyme in Erfahrung zu bringen. So wird
angenommen, daß in Pilzen Polyketidsynthasen des iterativen Typs I für die
Biosynthese von aromatischen Polyketiden verantwortlich sind, während in Bakterien
die Biogenese von PKS des Typ II übernommen wird. Da bezüglich der Bildung des
Avilamycins (20) in Streptomyces viridochromogenes bereits gefunden wurde (s. Abb.
22),[26] daß hier eine iterative „pilzliche“ Polyketidsynthase des Typs I arbeitet, wäre es
durchaus denkbar, daß auch in dem hier untersuchten Bakterium Nocardia Acta 1057
eine Polyketidsynthase des Typ I (s. dazu Skizze, Seite 5) vorliegt.
O
Cl
O
R
OMe
OH
Me
Cl
20
R = Polyglycoid
Abb. 22. Teilstruktur des Avilamycins (20).
Solche Annahmen sind noch rein hypothetisch und müssen durch Studien mit
biochemischen und molekularbiologischen Instrumentarium untersucht werden.
Die Ergebnisse dieser vergleichenden Biosynthesestudie sind in einer
Publikation niedergelegt.[68]
Mit dem bewiesenem Auftreten des Modus F in Suspensionskulturen der
monokotyledonen Pflanze Kniphofia uvaria (Asphodelaceae) liegen nunmehr auch drei
42
Allgemeiner Teil
biosynthetische Arbeiten vor, welche diesen Polyketidfaltungsmodus in höheren
Pflanzen nachweisen.[36,37,68] Dabei war es wichtig, neben den Studien an Vertretern der
beiden dikotyledonen Pflanzenfamilien der Ancistrocladaceae und Dioncophyllaceae
jetzt auch einen Nachweis in den Monocotyledonae zu haben. Daher kann der eigentlich
in pilzlichen aromatischen Polyketiden entdeckte Modus F auch als allgemein
vorherrschender Faltungstyp in höheren Pflanzen angesehen werden und nicht etwa als
einmaliges Artefakt. Da Chrysophanol (4) bislang nicht als Sekundärmetabolit in Algen,
Moosen oder Farnpflanzen, sondern lediglich in der Flechtensymbiose, bestehend aus
Chlorophycee und Flechtenpilz auftritt (vergleiche 3.6), ist eine Untersuchung des
Faltungsmusters in niederen Pflanzen bislang nicht möglich.
Das Vorliegen von Modus F erscheint aus evolutionsbiologischer Sicht noch
wesentlich einleuchtender. Da Pflanzen, wie Pilze auch, zu den eukaryotischen
Organismen zählen, sind diese beiden Gruppen streng von Bakterien, die zu den
Prokaryonten gehören, abzugrenzen. Zwischen den beiden biologischen Reichen der
Prokaryota und Eukaryota besteht die tiefste phylogenetische Zäsur innerhalb aller
Lebewesen überhaupt.
Das Auftreten identischer Faltungsmuster in Pilzen und Pflanzen legt eine enge
Verwandtschaft der Polyketidsynthasen innerhalb eukaryotischer Lebewesen nahe.
Somit kann vermutet werden, daß sich diese PKS wohl schon früh nach dem Auftreten
eukaryotischer Organismen aus Enzymen des Primärstoffwechsels, z.B. aus solchen des
Fettsäurestoffwechsels, entwickelte.
Allgemeiner Teil
4
43
Isolierung
und
Strukturaufklärung
biosynthetischer
Vorstufen
potentieller
polyketidischer
Anthrachinone
4.1
Kenntnisstand zur Anthrachinonbiosynthese
Anthrachinone bilden eine große Gruppe von Naturstoffen, welche sich sowohl
durch große strukturelle und pharmakologische Vielfalt auszeichnet.[112] Diese
Stoffklasse wird in verschiedensten biologischen Organismenreichen gebildet.
Chrysophanol (4) und dessen Anthron 21 liegen in der Natur in ihrer freien Form vor.
Zudem
wurden
sie
auch
als
Bausteine
dimerer
Anthrachinone,[113]
Phenylanthrachinone[114,115] und weiterer interessanter Naturstoffe[116] identifiziert. In
frühen Arbeiten mit 14C-markiertem Acetat zeigten die Forschungsgruppen von Zenk[74]
und Fairbairn,[73] daß Chrysophanol (4) über den Acetat-Malonat-Weg biosynthetisiert
wird, d.h. polyketidischen Ursprungs ist. Dabei ist dieser Befund keineswegs trivial, da
einige Anthrachinone, wie auch Naphthochinone,[73,117,118] auch auf dem Shikimat-Weg
gebildet werden können.[119,120] In den folgenden Ausführungen soll jedoch nur auf
acetogenine Anthrachinone eingegangen werden.
Polyketidische Anthranoide werden aus einem Molekül Acetyl-Coenzym A (3)
als Startereinheit und sieben Molekülen Malonyl-Coenzym A (6) aufgebaut (s. Schema
3). Das als enzymgebundenes Intermediat entstehende Polyketid wird dabei durch
Aldolkondensation,
Dehydratisierung
und
Decarboxylierung
der
endständigen
Carboxylfunktion in ein Anthron überführt. Die Reaktionsfolge setzt ein lineares
Polyketid
9a
mit
mono-
und
bicyclischen
Zwischenstufen
als
mögliches
biosynthetisches Intermediat voraus.[121]
Diese biosynthetische Route wurde von Harris et al.[122] durch biomimetische
Cyclisierungsreaktionen elegant nachgeahmt, wobei modifizierte Analoge des linearen
Polyketokörpers 9a cyclisiert wurden und so direkt das bicyclische Diketon 23 gebildet
wurde. Die Zwischenstufe 23 wird in der Anthranoid-Biosynthese anschließend zu
Chrysophanolanthron (21) und anderen Verbindungen (z.B. C-, O-cyclisierte Derivate)
überführt. Die letzten biosynthetischen Schritte über das R-Prächrysophanol (R-25) sind
jedoch noch nicht vollständig verstanden (s. Schema 6). Fütterungsexperimente mit dem
44
Allgemeiner Teil
Diketon 23 in
14
C-markierter Form wurden von der Gruppe um Franck mit dem
filamentösen Pilz Penicillium islandicum durchgeführt.[123] Dabei wurden geringe
Einbauraten des Intermediats in verschiedene natürlich im Pilz vorkommende
Anthrachinone festgestellt.
Acetyl-CoA (3)
+ 7 Malonyl-CoA (6)
O
O
O
O
O
O
OH
SCoA
O
O
O
O
O
O
Me
Me
22
9a
OR
OH
SCoA
O
O
OH
OH
O
O
1
Me
O
a O b
Me
10
HO2C
O
24 R = HO
HO
OH
OH
Me
4
23 R = H
SCoA
OH
?
O
OH
O
OH
- H2O
R
25
Me
OH
Me
X
21 X = H2
4X=O
ox
Schema 6. Von A. Hamm Postulierte Biosynthese des Chrysophanol-Anthrons (21).
Obwohl in jüngerer Zeit bezüglich der Identifizierung von Polyketidsynthasen
(PKS) und den entsprechenden Genen große Fortschritte erzielt wurden,[124-126] ist die
Auffindung und Charakterisierung beteiligter potentieller Vorstufen der Biosynthese
aromatischer Polyketide noch immer ein lohnendes Forschungsobjekt. Solche
Zwischenstufen, vor allem Polyketointermediate, kommen aufgrund ihrer hohen
Allgemeiner Teil
45
chemischen Reaktivität wenn überhaupt nur in sehr geringen Mengen in Organismen
frei vor, sie erfahren eher eine Reihe von Folgereaktionen zu shunt products. So wurden
derartige, empfindliche Vorstufen fast ausschließlich in Mutanten angetroffen, wie z.B.
in Streptomyceten, die Actinorhodin (26) produzieren[127] (Abb. 23). Generell werden
diese Intermediate eigentlich nur als sogenannte shunt products (von Engl. shunt =
Abzweig, Nebenanschluß) gefunden, wie sie aus Folgereaktionen wie Cyclisierungen,
Reduktionen, Decarboxylierungen und schließlich Verlusten von ganzen C2-Einheiten
oder einer Kombination solcher Reaktionen hervorgehen.[128]
O
H
OH
OH
OH
S
R
Me
R
Me
O
O
S
HO
O
O
O
OH
O
OH
H
O
26
Abb. 23. Chemische Struktur von Actinorhodin (26).
Postulierte Intermediate der Anthrachinon-Biogenese zwischen Acetyl-Coenzym
A (3) und den direkten Produkten der Aldoladdition des letzteren, (R)-Prächrysophanol
(R-25), konnten bisher weder in Mikroorganismen noch in höheren Pflanzen
identifiziert werden. Einige Studien zur Isolierung von Prä-Anthrachinonen aus
Pflanzen liegen zwar vor,[129] doch fehlen auch hier Angaben zur Biosynthese.
Wiederum beziehen sich die Arbeiten auf Vertreter der monocotyledonen Familie
Asphodelaceae.[129]
4.2
Experimente mit dem Bakterium AK 671
4.2.1 Kultivierung und Fermentation des Mikroorganismus
Der Bakterienstamm AK 671 wurde von der Arbeitsgruppe Goodfellow von der
Universität Newcastle (England) aus einer Bodenprobe eines Kiefernwaldes bei
Hamsterley Forest, Durham County, Großbritannien, isoliert. Der Stamm weist
alkalophile
Eigenschaften
auf.
Durch
Sequenzanalyse,
Nachweis
von
L,L-
diaminopimelsäure im Peptidoglucangerüst und der Beobachtung charakteristischer
46
Allgemeiner Teil
morphologischer Merkmale wurde der Stamm dem Genus Streptomyces zugeordnet, wo
dieser allerdings eine eigene phyletische Linie bildet. Es könnte sich somit um eine
neue Art handeln.[130] AK 671 ist in der Lage, abhängig von den jeweiligen
Fermentationsparametern eine große Bandbreite verschiedener aromatischer Polyketide
zu produzieren. Dabei treten bei unterschiedlichen Bedingungen jeweils andere
Polyketide als Hauptkomponenten auf. Der hier behandelte Stamm ist somit ein
typischer OSMAC-Stamm (von Engl. OSMAC = one strain many compounds = ein
Stamm viele Verbindungen).[131] Als entscheidende Faktoren für die Bildung
verschiedenster Metabolite durch den Stamm AK 671 wurden das Volumen des
Bioreaktors und die Rührgeschwindigkeit erkannt. So kamen sowohl 10-L- als auch
500-mL-Bioreaktoren (s. Abb. 24) zum Einsatz. Als Substrat wurde bei sämtlichen
Arbeiten mit dem Stamm Hafermehlsubstrat verwendet.
Bedingt durch die Variabilität des Stamms bezüglich der Metabolitproduktion ist
das Bakterium äußerst anspruchsvoll bezüglich der Kultivierung. Auch geringste
Schwankungen des pH-Wertes beeinflussen die Reproduzierbarkeit der Resultate.
Abb. 24.
Bioreaktoren im Labor unseres Kooperationspartners Prof. H.-P. Fiedler mit 500
mL Fassungsvermögen, wie sie zur Produktion einiger gewünschter Metabolite des
Stammes AK 671 eingesetzt wurden.
Allgemeiner Teil
47
4.2.2 Isolierung und Strukturaufklärung der Metabolite
4.2.2.1 Zusammenfassung der Vorarbeiten
Im Rahmen eines HPLC-PDA-Screeningprogramms mehrerer Actinomyceten
nach neuen Sekundärmetaboliten durch die Arbeitsgruppe von Prof. H.-P. Fiedler vom
Institut für Mikrobiologie (Arbeitsgruppe Antibiotika) der Universität Tübingen war der
Stamm AK 671 auffällig geworden. Dr. Hamm, damals ebenfalls in unserer
Arbeitsgruppe tätig, isolierte drei Naturstoffe aus dem Mikroorganismus: den bereits
bekannten Naturstoff 3,8-Dihydroxy-1-methylanthrachinon-2-carbonsäure (DMAC)
(27) und zwei neue Sekundärmetabolite (s. Abb. 25). Bei letzteren handelt es sich um
das bereits erwähnte bicyclische Diketon 23, ein seit langem postuliertes[123] potentielles
biosynthetisches Intermediat und dessen Glucuronid 24. Bei DMAC (27) handelt es sich
um einen Metaboliten, welcher schon als shunt product in mehreren rekombinanten
Streptomyceten, wie z.B. in S. coelicolor/pRM5 identifiziert worden war.[132] Diese
Entdeckungen waren zwar durchaus bemerkenswert, doch ohne Fütterungsexperimente
mit uniform markiertem 13C2-Acetat auf der einen Seite und dem sicheren Nachweis des
Zielmoleküls Chrysophanol (4) auf der anderen Seite konnten keinerlei fundierte
Aussagen zur Biosynthese des Anthrachinons getroffen werden. Gerade auch die
Untersuchung der beteiligten Polyketidfaltungsmodi sollten nun Einblicke in die Details
der biosynthetischen Reaktionsfolge geben.
OR
OH
O
OH
O
COOH
Me
O
Me
OH
O
23 R = H
24 R =
Me
HO2C
HO
HO
27
O
OH
Abb. 25. Naturstoffe, welche von unserer Arbeitsgruppe zuvor aus AK 671 isoliert worden
waren.
48
Allgemeiner Teil
4.2.2.2 Isolierung
und
Strukturaufklärung
des
neuen
Naturstoffs
Chrysophanol-8-O-ß-D-glucuronid (28)
Nach Beendigung der Fermentation des Bakteriums AK 671 wurde das
Kulturfiltrat zunächst zentrifugiert und anschließend auf pH 2 eingestellt. Hiernach
erfolgte eine Extraktion durch mehrfaches Ausschütteln des Filtrats mit Ethylacetat,
wobei der pH-Wert des Kulturfiltrats nach jedem Extraktionsschritt erneut eingestellt
wurde. Der gewonnene Extrakt wurde bis zur Trockene eingeengt, in Methanol
aufgenommen und nach verschiedenen Filtrationsschritten (RP-18-Kartusche und
PTFE-Spritzenvorsatzfilter) per präparativen Aufschluß in mehreren Läufen an der
HPLC
mittels
einer
Chromolith-semipräparativen
Säule
getrennt.
Die
Strukturaufklärung wurde in Zusammenarbeit mit Herrn Gulder und Frau Kajahn aus
unserer Arbeitsgruppe durchgeführt.
Von der Anzahl der Signale des
13
C-NMR-Spektrums sowie durch
Massenspektrometrie (LC-MS2) und HRMS wurde zunächst die Summenformel
C21H18O10 ermittelt.
Nach detaillierter Analyse des 1H-NMR-Spektrums und der zweidimensionalen
Spektren wurde deutlich, daß es sich um ein glucuronidiertes Analogon 28 von
Chrysophanol (4) handelte (s. Abb. 26). Auch der Vergleich mit NMR-Spektren des
Aglycons stützte dies. Die Positionierung des vorliegenden Zuckerrestes an C-8 ließ
sich eindeutig durch die HMBC-Wechselwirkung von 1'-H, dem anomeren Proton, zu
C-8 belegen. Bei dem Zucker handelt es sich um Glucuronsäure, die O- ß-glycosidisch
mit dem Aglycon, also Chrysophanol (4) verknüpft ist. Der Zuckerrest war identisch
mit dem des bicyclischen Diketons 23.
HO
O
O
HO2C
HO
O
OH
O
OH
8
Me
O
28
Abb. 26. Chrysophanol-8-O-ß-D-glucuronid (28).
Allgemeiner Teil
Zwar
gibt
49
es
in
der
Literatur
verschiedenartige
Glycoside
von
Anthrachinonen,[128,133] doch ist das hier gefundene Chrysophanol-8-O-β-D-glucuronid
(28) ein neuer Naturstoff. Darüber hinaus gibt die Detektion eines Derivates des
Chrysophanols (4) im Bakterienstamm AK 671 erstmalig einen Hinweis auf das
Auftreten dieses Anthrachinons neben dessen zuvor bereits identifizierten postulierten
biosynthetischen Intermediaten. Weiterhin ist der Fund eines Chrysophanolderivats in
AK 671 nunmehr ein weiteres Indiz dafür, daß dieses aromatische Polyketid durchaus
ein unter Bakterien recht weit verbreiteter Sekundärmetabolit ist, ähnlich wie in Pilzen
und Pflanzen (vgl. Kapitel 3).
4.2.2.3 Isolierung
und
Strukturaufklärung
des
neuen
Naturstoffs
Prächrysophanol-8-O-β-D-glucuronid (29)
Nach Abbruch der Fermentation wurde das Kulturfiltrat zunächst zentrifugiert
und anschließend ebenfalls auf pH 2 eingestellt. Dann erfolgte eine Extraktion durch
Phasenverteilung des Filtrats mit n-Butanol, wobei der pH-Wert des Kulturfiltrats nach
jedem Extraktionsschritt erneut mit HCl eingestellt werden mußte. Der gewonnene
Exrakt wurde bis zur Trockene eingeengt, in Methanol aufgenommen und nach
verschiedenen Filtrationsschritten (RP-18-Kartusche und PTFE-Spritzenvorsatzfilter) in
mehreren Läufen per präparativer HPLC isoliert.
Die Summenformel, welche durch 13C-NMR sowie durch Massenspektrometrie
(HRMS und LC-MS2) ermittelt wurde, lautete C21H22O10.
Die ein- und zweidimensionalen NMR-Spektren zeigten, daß es sich um ein
Präanthrachinon, genauer um ein glucuroniertes Prächrysophanol (29) handeln mußte
(s. Abb. 27). Der Zuckerrest war identisch mit denen der bereits aus diesem Organismus
isolierten Naturstoffen. Die genaue Position des Glucuronid-Restes wurde eindeutig
durch die HMBC-Wechselwirkungen des anomeren Wasserstoffatoms zu C-8
festgelegt. Der Nachweis von 29 in diesem Mikroorganismus ist interessant, da dieses
erstmalig
gefundene
Prächrysophanol-Glucosid
Anthrachinons sein könnte.
ein
direkter
Vorläufer
des
50
Allgemeiner Teil
HO
O
O
HO2C
HO
O
OH
HO
O
8
Me
OH
29
Abb. 27. Struktur von Prächrysophanol-O-β-D-glucuronid (29).
Auch bei diesem potentiellen Biosyntheseintermediat handelt es sich um einen
neuen Naturstoff. Bisher wurden Glycoside von Präanthrachinonen ausschließlich in
Pilzen[134] gefunden (s. auch Punkt 4.3).
4.2.3 Inkorporationsexperimente und NMR-Analyse
Der Nachweis für das Vorliegen von Chrysophanol-8-O-ß-D-glucuronid (28)
und den potentiellen biosynthetischen Vorläuferstufen, wie dem Diketon 23, dessen
Glucuronid 24 und DMAC (3,8-Dihydroxy-1-methylanthrachinon-2-carbonsäure) (27)
im Bakterienstamm AK 671 ist zwar schon per se ein biosynthetisch interessanter
Befund, doch waren interessante, weitergehende Ergebnisse zur detaillierten Biogenese
dieser Polyketide erst von Fütterungsexperimenten mit doppelt markiertem 13C2-Acetat
mit anschließender 2D-INADEQUATE-NMR-Analyse zu erwarten. Aus diesem Grund
wurden Fütterungsexperimente mit AK 671 durchgeführt. Da AK 671 ein OSMACBakterium ist, konnten die benötigten Inkorporationsexperimente bezüglich 23, 28 und
29 nicht durch einen einzelnen fermentativen Ansatz im Bioreaktor abgedeckt werden,
da die Produktion dieser Sekundärmetabolite jeweils andere Kultivierungsparameter
erfordert. Mehrere Bioreaktoren mussten daher beschickt werden, damit alle
gewünschten Sekundärmetabolite des Mikroorganismus in 13C-markierter Form erhalten
werden konnten. Generell muß die Kultivierung dieses alkalophilen Stammes als
problematisch gelten.
Bei den Fütterungsexperimenten ging es zunächst darum, den auftretenden
Polyketidfaltungsmodus zu etablieren. Wie bereits im vorherigen Kapitel dieser Arbeit
erwähnt, wurde erkannt, daß bakterielle Polyketidsynthasen des aromatischen Typs II
im Falle von Octaketiden und Decaketiden mit einer C-7/C-12 Cyclisierung der
Allgemeiner Teil
51
wachsenden Kette starten, welcher ein weiterer Ringschluß zwischen den Positionen C5 und C-14 folgt. Hieraus resultiert, daß drei intakte C2-Einheiten in den ersten
aromatischen Ring inkorporiert werden, was per definitionem dem Modus S entspricht.
Somit wäre zu vermuten, daß auch im vorliegenden Stamm AK 671 dieser Typ
realisiert sein sollte.
4.2.3.1 Fütterungsexperimente zur Biosynthese des bicyclischen Diketons
23
Nach erfolgter Fütterung mit
13
C2-Natriumacetat wurde das nun isolierte
glucuronidierte bicyclische Diketon 24 spektroskopisch mit unmarkierter Substanz
verglichen. Im
13
C-NMR-Spektrum wurden Satelliten auffällig, was eindeutig einen
Einbau bestätigte. Es wurde eine Einbaurate von 4% im Aglycon bestimmt. Im
Zuckeranteil
wurde
keinerlei
Einbau
von
C2-Einheiten
konstatiert.
Sowohl
Kopplungskonstanten als auch das im 2D-INADEQUATE vorliegende Muster zeigte
paarweise Kopplungen folgender Kohlenstoffatome: C-1/C-2, C-3/C-4, C-5/C-10, C6/C-7, C-8/C-9, C-12/C-13 sowie C-14/C-15 (s. Abb. 28). Das Kohlenstoffatom an
Position 16 blieb isoliert, es zeigte jedoch auch eine erhöhte Intensität im NMRExperiment. Da mit den C-C-Konnektivitäten zwischen C-5/C-10, C-6/C-7 und C-8/C-9
insgesamt drei C2-Einheiten intakt in den ersten aromatischen Ring des bicyclischen
Diketons 23 eingebaut worden waren, war zunächst klar, daß es sich um einen der
beiden Modus-S-Varianten handeln mußte. Allerdings sprach die Position des „SingleC-Atoms“ hier erstmals für eine Polyketidfaltung, welche von der unter Punkt 3.4.2
bereits beschriebenen maßgeblich abweicht und dem bisher lediglich postulierten
Modus S' entspricht. Dieser konnte somit erstmalig in der Natur nachgewiesen werden.
52
Allgemeiner Teil
Aceton-d6
C-13 C-16
Aceton-d6
C-15
C-12
C-6 C-5
C-3
C-4
C-10
C-6'
C-8 C-1
C-2 C-9
C-14
C-7
C-5' C-2'
C-3' C-4'
C-1'
ppm
0
10
HO
HO
20
4'
H
COOH
H
OH
H
HO 1'
H
O
30
1
8
40
12
3
10
3a
24
200
180
160
140
120
100
O
OH
4
5
80
13
CH3
O
15
14
60
40
16
CH3
ppm
Abb. 28. 2D-INADEQUATE-Spektrum des glucuronidierten bicyclischen Diketons 24,
welches nach Applikation von uniform markiertem
13
C2-Natriumacetat an das
Bakterium AK 671 isoliert worden war.
4.2.3.2 Fütterungsexperimente zur Biosynthese von Chrysophanol-8-O-ß-Dglucuronid (28) und Prächrysophanol-8-O-β-D-glucuronid (29)
Für die Fütterungsexperimente wurden sowohl unterschiedliche Bioreaktoren als
auch mehrere Applikationsstrategien eingesetzt. Da sich bereits gezeigt hatte, daß eine
kontinuierliche Fütterung nicht zu einem Einbau des
13
C-markierten Materials führte,
entschloß man sich auch zur Durchführung einer Pulsfütterung mit
13
C2-markierten
Acetat. Doch leider führte auch diese Vorgehensweise nicht zum gewünschten
Ergebnis, weshalb davon ausgegangen werden muß, daß bei den für die Produktion von
28 und 29 benötigen Kultivierungsparametern das Bakterium kein Acetat inkorporieren
kann. Für eine wiederholte Fütterung zur Klärung der biosynthetischen Verhältnisse
Allgemeiner Teil
53
wird wohl 13C-markierte Glucose appliziert werden müssen. Die Fütterungsexperimente
werden generell durch die komplizierte Kultivierung des Stamms AK 671 erschwert.
4.2.4 Schlußfolgerung für die Anthrachinonbiosynthese in Bakterien
Auch trotz der negativen Fütterungsexperimente bezüglich 28 und 29 lassen sich
einige Rückschlüsse zur Anthranoid-Biosynthese im Stamm AK 671 ziehen. So kann
das Vorkommen von DMAC (27), welches bereits als shunt product in Actinorhodinproduzierenden Streptomyceten nachgewiesen worden ist,[127] wohl auch hier als ein
Abzweigungsprodukt
betrachtet
werden,
da
keine
direkten
plausiblen
Biosynthesevorläufer gefunden wurden. Bei 29 handelt es sich jedoch offensichtlich um
eine
Vorstufe
zu
Chrysophanol-8-O-ß-D-glucuronid
(28).
So
müssen
die
Biosynthesewege, welche zu DMAC (27) und zu Chrysophanol-8-O-ß-D-glucuronid
(28) in Streptomyces AK 671 führen, als getrennte metabolische Routen betrachtet
werden.
4.3
Experimente mit planzlichen Gewebekulturen
4.3.1 Isolierung und Strukturaufklärung der Metabolite
Bereits in früheren Arbeiten, die in unserer Arbeitsgruppe mit pflanzlichen
Gewebekulturen durchgeführt worden waren, konnte neben Chrysophanol (4) ein
potentielles biosynthetisches Intermediat 30 in Kulturen von Kniphofia pumila in
markierter Form isoliert werden.[135] Fälschlicherweise wurde der neue Naturstoff dort
als
Aloechryson-8-O-ß-D-glucosid
bezeichnet.
Der
richtige
Name
dieses
Sekundärmetaboliten 30 müßte jedoch Prächrysophanol-8-O-ß-D-glucosid lauten (s.
Abb. 29). Zwar sind Präanthrachinone aus Pflanzen als Aglycone bekannt,[136] doch sind
deren Glucoside lediglich aus Pilzen, nämlich aus Basidiomyceten, isoliert worden.[134]
Der gefundene Naturstoff stellt ein interessantes Intermediat der Biosynthese des
Chrysophanol (4) dar. So ist (R)-Prächrysophanol (25) (Schema 6) bereits aus einem
weiteren Vertreter der Asphodelaceae isoliert worden[129] und könnte eine unmittelbare
54
Allgemeiner Teil
Vorstufe zu Chrysophanol (4) in der Biosynthese höherer Pflanzen sein.[121] Die hier
belegte glucosidierte Form 30 ist als polarere Transportform zu betrachten.
OH
O
HO
HO
O
OH
OH
O
8
Me
OH
30
Abb. 29. Struktur von Prächrysophanol-8-O-ß-D-glucosid (30).
Prächrysophanol-8-O-ß-D-glucosid (30) wurde allerdings nur in geringer
Ausbeute aus dem biologischen System erhalten. Zudem traten Probleme mit der
Stabilität der Substanz auf, die weitere Untersuchungen erschwerten.
Nicht nur im Hinblick auf die Anthranoid-Biosynthese ist Prächrysophanol-8-Oß-D-glucosid (30) interessant, sondern auch aus pharmakologischer Sicht. So zeigt ein
ähnliches Präanthrachinon, Vismion H (31) (s. Abb. 30) eine beachtliche Aktivität
gegenüber dem Malariaerreger Plasmodium falciparum.[137] Es wäre durchaus denkbar,
daß das Glycosid 30 durch dessen polare Eigenschaften, bedingt durch den Zuckerrest,
ebenfalls eine höhere Bioaktivität zeigen könnte. Die Verbindung ist allerdings so
empfindlich, dass sie sich bereits während der Isolierung zersetzt. Somit war eine
Biotestierung mit ausreichend reiner Substanz noch nicht möglich. Die chemische
Instabilität von 30 wird wahrscheinlich das pharmakologische Potential stark
einschränken.
Me
OH
OH
Me
O
Me
O
31
Abb. 30. Struktur von Vismion H (31).
Me
O
O
Allgemeiner Teil
5
55
Studien zur Stereochemie und Enantiomerenanalytik des
dimeren Anthrachinons Asphodelin (37)
5.1
Kenntnisstand zur Verbreitung und chemischen Struktur von
Bichrysophanolen
In der naturstoffchemischen Literatur findet sich eine ganze Reihe von dimeren
Chrysophanolen.[138-140] So kommen diese generell in solchen Organismen vor, die auch
monomeres Chrysophanol (4) biosynthetisieren, wobei jedoch zu Beginn der
vorliegenden Arbeit diese Stoffgruppe weder in prokaryotischen Organismen noch in
Insekten nachgewiesen worden war. Erneut, wie beim Monomer, liegen Bisanthrachinone in höheren Pflanzen vor und zeigen in dieser eukaryotischen Klasse eine
beachtliche Vielfalt. Dimere des Chrysophanols (4) finden sich in Rhamnaceen und
Polygonaceen, wobei ein Hauptverbreitungsschwerpunkt bei den Asphodelaceen (hier
vor allem die namensgebende Gattung Asphodelus) und den Caesalpiniaceen bzw.
Leguminoseae (hier besonders Cassia syn. Senna) liegt.[62] In Abb. 31 ist die
Variabilität der Kupplungsmöglichkeiten von Bichrysophanolen und einigen Derivaten
mit
abweichendem
Oxygenierungsmuster
dargestellt.
Dabei
treten
folgende
Kupplungen auf: C-2/C-2' [= Cassiamin C (32)], C-4/C-4' 33, C-5/C-5' [=
Dianhydrogulosin (34)], C-7/C-7' [= Chrysotalumin (35)], C-2/C-7' [= Microcarpin
(36)] und C-4/C-7' [= Asphodelin (37)].
Unter den Pilzen findet sich allerdings im Vergleich zu 17 nachgewiesenen
Produzenten des monomeren Chrysophanol (4) kein einziger Vertreter, welcher ein
Dimeres des Chrysophanol (4) bildet. Lediglich eine einzige Alternaria-Art, welche
jedoch
kein
monomeres
Chrysophanol
(4)
bildet,
produziert
ein
dimeres
Anthrachinonderivat.[141,142] Nur in zwei Flechtenspezies konnten dimere Anthrachinone
als Sekundärmetabolit sicher nachgewiesen werden.[143,144]
Da verhältnismäßig viele Berichte zu Bisanthrachinonen veröffentlicht wurden,
und bereits zahlreiche phytochemische Arbeitsgruppen auf diesem Gebiet geforscht
haben, ist es erstaunlich, daß Studien zur Stereochemie und Enantiomerenanalytik
dieser interessanten Stoffklasse nahezu vollständig fehlen. Sämtliche Strukturen wurden
lediglich „flach“, d.h. ohne Angabe zur absoluten Stereostruktur publiziert. So liegen
praktisch keinerlei CD-Daten (CD = Circulardichroismus) vor. Darüber hinaus finden
56
Allgemeiner Teil
sich in der Literatur auch keine Angaben zur Analytik an chiraler Phase und somit zu
den Enantiomerenverhältnissen in den produzierenden Organismen, hier Pflanzen.
O
O
O
OH
OH
OH
Me
OH
2’
2
Me
O
Me
OH
4
OH
O
O
4’
Me
O
OH
O
OH
32
O
OH
O
OH
O
Me
O
OH
33
Me
5
5’
Me
OH
7
7’
O
OH
Me
O
OH
O
34
35
O
OH
OH
OH
O
O
OH
Me
OH
2
Me
4
OH
Me
O
O
7’
7’
O
OH
O
OH
OH
O
Me
36
37
Abb. 31. Ausgewählte Strukturen von Dimeren des Chrysophanols (4).
O
OH
Allgemeiner Teil
5.2
Bestimmung
57
der
absoluten
Konfiguration
und
des
Enantiomerenverhältnisses von Asphodelin (37) aus Asphodelus
microcarpus syn. Asphodelus aestivum (Asphodelaceae)
5.2.1 Zur Auswahl des Untersuchungsobjektes
Bereits seit einigen Jahren unterhält unsere Arbeitsgruppe eine Kooperation mit
Dr. A. Yenesew bezüglich pflanzlicher Sekundärmetabolite aus Asphodelaceen. Im
Rahmen einer phytochemischen Arbeit der letzteren Gruppe wurden aus Bulbine spec.
(Asphodelaceae) mehrere Bisanthrachinone, darunter auch Asphodelin (37), z.T. auch
in glycosidierter Form isoliert. Wie bereits in Kapitel 5.1 erwähnt, fanden sich in der
Literatur keinerlei Angaben bezüglich der Stereostruktur von 37 (s. Abb. 31). Aus
diesem Grund sollte M. Reichert aus unserer Arbeitsgruppe die absolute Konfiguration
an der Biarylachse des von A. Yenesew isolierten Naturstoffs durch Vergleich von
quantenchemisch berechneten CD-Spektren mit experimentell gewonnenen Daten
bestimmen. Die Bestimmung der absoluten Konfiguration von Asphodelin (37) durch
diese Methode ergab, daß der Naturstoff in der untersuchten Pflanze P-konfiguriert
vorlag.
Da das experimentell gewonnene CD-Spektrum des Asphodelins (37)
Abweichungen gegenüber dem berechneten aufwies und weil dessen M-Enantiomer
nicht in der Bulbine-Art gefunden werden konnte, entschloß man sich dazu, die Pflanze
zu untersuchen, in der 37 erstmalig beschrieben wurde, nämlich Asphodelus aestivum
syn. Asphodelus microcarpus. Dieser Vertreter der Asphodelaceae kommt im
Mittelmeerraum vor.
5.2.2 Bereitstellung des Bichrysophanols 37 zur Analyse
An einem Wildstandort von Asphodelus aestivum syn. Asphodelus microcarpus
(Aljaraque, Provinz Huelva; Spanien) wurden sowohl Knollen zur Isolierung von
Anthrachinonen als auch Samen zur Anzucht der Ganzpflanze in vitro gesammelt.[145]
Aus den Samen der einkeimblättrigen Pflanze wurde nach einer in der
Arbeitsgruppe vorhandenen Kultivierungsvorschrift für andere Mitglieder der Familie
58
Allgemeiner Teil
Asphodelaceae[92] nach sorgfältiger Oberflächensterilisation eine Sterilkultur gewonnen
(s. Abb. 32).
Somit ließ sich Asphodelin (37) nach einer Standardmethode für die Isolierung
von Anthrachinonen sowohl aus den unterirdischen Teilen der Wildpflanze als auch aus
den Knollen der sterilen Organkultur gewinnen und der stereochemischen Analyse
zuführen.
Abb. 32. In-vitro-Kultur von Asphodelus aestivum syn. Asphodelus microcarpus.
5.2.3 Stereochemische Analyse durch CD-Messungen
Nach der Aufnahme des CD-Spektrums von 37 aus der Asphodelus-Art ergab
ein Vergleich mit den Spektren, welche Herr Reichert durch quantenchemische CDRechnungen generiert hatte, sehr gute Übereinstimmungen. Diese Resultate waren
wesentlich gegenüber denjenigen verbessert, welche für Asphodelin (37) aus der
Bulbine-Art erzielt worden waren, was durch eine verbesserte Messung erklärt werden
kann. So zeigte das experimentell aufgenommene CD-Spektrum des P-Enantiomers nun
Allgemeiner Teil
59
eine optimale Deckung mit der durch CNDO/S ermittelten und gute mit jener durch
OM2 erhaltenen CD-Kurve, wie in Abb. 33 dargestellt ist. Da das aus Asphodelus
microcarpus isolierte Asphodelin (37) keinerlei Verunreinigungen zeigte, wurde eine
Offline-CD-Messung durchgeführt, welche gegenüber der Online-Variante genauer ist.
Dabei wurde auch in Asphodelus aestivum syn. Asphodelus microcarpus wiederum nur
das P-Enantiomer nachgewiesen.
60
Allgemeiner Teil
a) 6
6
berechnet
für (M)-37
[cm2/mol]
3
3
0
De
0
De
[cm2/mol]
berechnet
für (P)-37
-3
-3
exp.
exp.
-6
200
250
-6
200
300
Wellenlänge l [nm]
250
300
Wellenlänge l [nm]
CNDO/S-CI
OH
HO
O
OH
HO
O
Me
M
O
P
O
Me
OH
OH
O
O
OH
P-37
OH
O
O
M-37
Me
Me
OM2-SCI
[cm2/mol]
3
6
berechnet
für (P)-37
Berechnet
für (M)-37
3
0
De
0
De
[cm2/mol]
b)6
-3
-3
exp.
exp.
-6
200
250
300
Wellenlänge l [nm]
-6
200
250
300
Wellenlänge l [nm]
Abb. 33. Zuweisung der absoluten Konfiguration von Asphodelin (37), isoliert aus Asphodelus
microcarpus, durch Vergleich der experimentellen CD-Daten mit den von M.
Reichert berechneten Spektren für das jeweilige Enantiomer mittels a) CNDO/S und
b) OM2.
Allgemeiner Teil
61
5.2.4 Resultate der Enantiomerenanalytik
Zur Enantiomerenanalytik wurden verschiedene chirale Säulen (OD-H, OT, OF,
OD-RH und OD-J), mit vielen, sehr unterschiedlichen Gradienten bei variierenden
Temperaturen an der HPLC verwendet. Sowohl bei dem aus Bulbine spec. als auch aus
sterilem und insterilem Knollenmaterial von Asphodelus microcarpus isolierten
Asphodelin (37) zeigte sich an chiraler Phase jeweils nur ein einzelner Peak. Diese
Beobachtung läßt zwei mögliche diverse Schlußfolgerungen zu. So wäre es durchaus
möglich, daß in beiden verwandten pflanzlichen Produzenten lediglich das PEnantiomer des Bichrysophanols 37 gebildet wird. Es konnte bei anderen axialchiralen
Naturstoffen, wie z. B. bei den Naphthylisochinolin-Alkaloiden bereits gezeigt werden,
daß diese durchaus in enantiomerenreiner Form vorliegen können.[146] Die zweite
mögliche Erklärung wäre allerdings, daß es einfach nur nicht gelungen war, eine
Enantiomerentrennung an chiraler Phase zu erzielen. Aufgrund der Vielzahl der
unterschiedlichen Trennversuche schien letzteres allerdings eher unwahrscheinlich.
Zudem waren in allen Fällen die aufgenommenen CD-Spektren (s. Abb. 34) aus
verschiedenen Bereichen der Peaks in der HPLC jeweils identisch. Diese Arbeiten sind
Teil einer wissenschaftlichen Veröffentlichung.[147]
62
Allgemeiner Teil
22.5
2
[cm2/mol]
1
3
0
1
0
De
De
De
0
[cm2/mol]
6
2
[cm2/mol]
t[min]
23.5
23
-2
200
-1
-3
-1
250
300
Wellenlänge l [nm]
Abb. 34.
-6
200
250
300
Wellenlänge l [nm]
-2
200
250
300
Wellenlänge l [nm]
CD-Spektren von Asphodelin (37) aus unterschiedlichen Bereichen des Peaks
während der LC-CD-Messung.
Allgemeiner Teil
6
63
Aufklärung der Biosynthese des Phenylanthrachinons
Knipholon (5)
6.1
Kenntnisstand zur Verbreitung und zur Biosynthese von
Knipholon (5)
Das axial-chirale Phenylanthrachinon Knipholon (5) ist ein konstitutionell
unsymmetrischer Biaryl-Naturstoff. Der nördliche Teil des Polyketids besteht aus dem
Anthrachinon Chrysophanol (4), welches mit einem Benzolderivat, dem 2,4-Dihydroxy6-methoxyacetophenon (38), über eine Biarylachse verknüpft ist (s. Abb. 35).
Konstitutionell unsymmetrische Biaryle wie das Knipholon (5), d.h. solche, die aus
zwei unterschiedlichen Molekülhälften bestehen, sind in der Natur äußerst selten.
Wesentlich häufiger finden sich homo-gekuppelte Dimere phenolischer Substanzen,
genauer gesagt Dehydro-Dimere, die durch phenoloxidative Kupplung entstehen, und in
verschiedensten Klassen von Naturstoffen auftreten.[116]
HO
HO
O
O
OH
OH
Me
O
Me
X
HO
M
OH
4
OH
HO
Me
Me
MeO O
MeO
O
38
5X=O
39 X = H2
Abb. 35.
Struktur von Knipholon (5) und dessen Molekülhälften 4 und 38 sowie von
Knipholonanthron (39).
Knipholon (5) wurde im Jahr 1984 von Dagne und Steglich in Kniphofia foliosa
(Asphodelaceae,
s.
Abb.
36)
entdeckt.[114]
Mittlerweile
konnte
dieses
Phenylanthrachinon in den drei monokotyledonen Genera Bulbine, Bulbinella und
64
Allgemeiner Teil
Kniphofia nachgewiesen werden.[148] Darüber hinaus wurde der Sekundärmetabolit auch
in der dikotyledonen Spezies Cassia (Senna) didymobotrya (Caesalpiniaceae;
Leguminoseae)
entdeckt.[149]
Inzwischen
ist
die
Zahl
der
gefundenen
Phenylanthrachinone wesentlich gestiegen.[148] Erst kürzlich gelang in unserer
Arbeitsgruppe die Zuordnung der absoluten Konfiguration an der Achse als M durch
quantenchemische CD-Rechnungen.[150] Außerdem wurde in unserer Gruppe eine erste
enantio-divergente Totalsynthese[115] von Knipholon (5) entwickelt. Mittlerweile wurde
eine weitere, alternative Synthese begonnen.[151]
Abb. 36. Die Blüte von Kniphofia foliosa auf einer äthiopischen Briefmarke.
Sowohl Knipholon (5) als auch dessen Anthron 39 weisen moderate In-vitroAktivität gegenüber dem Malariaerreger Plasmodium falciparum (K1) bei nur geringer
Cytotoxizität auf,[152] zudem wurden antitumorale Wirkungen[153,154] berichtet.
Bezüglich der Biogenese des Phenylanthrachinons 5 lagen bis zu Beginn der
vorliegenden Arbeit keinerlei Studien vor. Man konnte annehmen, daß es sich bei
Knipholon (5) um einen acetogeninen Sekundärstoff, genauer um ein aromatisches
Polyketid handelt.
Generell sind beide Molekülhälften des Knipholon (5) von biosynthetischem
Interesse. Die nördliche Molekülhälfte, die in der freien Form als Chrysophanol (4)
bekannt ist (s. auch 3.1.1), könnte prinzipiell auf mehreren Polyketidfaltungsmodi
entstehen, was im speziellen Fall des Knipholons (5) näher zu untersuchen war.
Allgemeiner Teil
65
Der südliche Teil des Naturstoffs 5 ist ein relativ gut bekanntes, allerdings
biosynthetisch weitgehend unerforschtes Trioxybenzolderivat, das 2,4-Dihydroxy-6methoxyacetophenon (38), ein an C-4 O-demethyliertes Analogon des Xanthoxylins
(40).[155] Dieser Naturstoff wurde in seiner freien Form aus Pflanzen isoliert, jedoch
noch nicht aus Pilzen und Bakterien. Betrachtet man dessen Substitutionsmuster,
erscheint eigentlich nur ein Polyketidfaltungsmodus mit vier Acetateinheiten ohne
Decarboxylierung wie in der nördlichen Hälfte 4 realisierbar. Allerdings ist noch eine
völlig andere Entstehung der südlichen Molekülhälfte denkbar, nämlich die durch
Abbau eines Bisanthrachinons. Dimere Anthrachinone wie das 4,4'-Bichrysophanol (33)
(s. Abb. 37) finden sich nämlich als Sekundärmetabolite sowohl in zahlreichen
Vertretern der Asphodelaceae als auch der Caesalpiniaceae (Leguminosae), d.h. in allen
Familien, zu denen auch sämtliche Knipholon-produzierenden Pflanzen zählen.
OH
Me
4
O
4’
OH
O
O
OH
O
Me
OH
33
Abb. 37. Struktur von 4,4'-Bichrysophanol (33).
So ist es mechanistisch durchaus denkbar, daß der Acetophenon-Teil des
Phenylanthrachinons durch oxidativen Abbau eines Anthrachinons hervorgeht, wie dies
in Schema 7 dargestellt ist. Unsymmetrische Biaryle sind selten, doch liegt schon mit
den Naphthylisochinolin-Alkaloiden ein Beispiel vor, wie auf den ersten Blick gänzlich
unterschiedliche Molekülhälften (Isochinolin versus Naphthalin) doch aus identischen
Bausteinen entstehen. Die bisher isolierten Bichrysophanole weisen jedoch per se nicht
das identische Substitutionsmuster des gekuppelten Acetophenons nach dessen
hypothetischer Spaltung auf.
66
Allgemeiner Teil
HO
O
O
3
2’
Me
O
SCoA
4’
1’
O
O
[ C2]-Einheit
O
Me
6’
RO
13
OH
O
Me
O
O
O
38 R = Me
41 R = H
SCoA
Schema 7. Alternative Biosynthese der südlichen Molekülhälfte des Knipholons (5).
Ferner galt es zu untersuchen, welche Substrate der phenoloxidativen Kupplung in
der Biogenese des Phenylanthrachinons auftreten, wozu fortgeschrittene Vorstufen in
13
C-markierter Form appliziert werden sollen.
6.2
Kultivierung des biologischen Systems
Bereits in früheren phytochemischen Analysen von soliden und flüssigen
Kalluskulturen der beiden Asphodelaceen Kniphofia uvaria und K. pumila in unserer
Arbeitsgruppe hatte sich gezeigt,[135] daß diese biologischen Systeme kein Knipholon
(5) biosynthetisieren. Lediglich Chrysophanol (4) ließ sich in beiden Gewebekulturen
sicher
nachweisen.
Weder
die
freie
südliche
Molekülhälfte
38
noch
das
Phenylanthrachinon 5 waren im Extrakt vorhanden. Dieser Befund wies darauf hin, daß
in den Gewebekulturen bestimmte Enzyme, wie etwa das Kupplungsenzym nicht aktiv
vorliegen. Es ist in der Pflanzenbiotechnologie durchaus nicht ungewöhnlich, daß
Gewebekulturen nicht in der Lage sind, Sekundärmetabolite zu produzieren, welche in
der Ausgangspflanze als Hauptmetabolit auftreten.[156] Auch in Zellkulturen weiterer
Kniphofia-Arten wie K. tuckii und K. foliosa, die von der Arbeitsgruppe von Prof. E.
Leistner an der Universität Bonn zur Verfügung gestellt worden waren,[157] konnten
keinerlei Spuren des Phenylanthrachinons 5 im Kallusgewebe nachgewiesen werden,
was die oben angeführte Hypothese bestätigte. Auch andere Forscher gelang es bislang
nicht, 5 in Gewebekulturen nachzuweisen.[158]
In den Wurzeln aseptischer Ganzpflanzen der genannten Kniphofia-Arten lagen
jedoch stets Knipholon (5) und auch dessen beide Molekülbestandteile in freier Form
vor. Daher entschloss man sich dazu, die aus biotechnologischer Sicht etwas
Allgemeiner Teil
ungewöhnliche
67
Methode
der
Verwendung
von
Organkulturen
für
die
Inkorporationsexperimente zu verwenden. Auf bereits etablierten Vorschriften
aufbauend,[92] wurde Kniphofia pumila als geeignetes System gewählt (s. Abb. 38),
besonders wegen der Kleinwüchsigkeit dieser Art, welche für die technische
Handhabung essentiell ist.
Die für die Biosyntheseexperimente benötigten, relativ großen Mengen des
biologischen Systems wurden durch parallelen Einsatz zweier Techniken bereitgestellt.
So wurden sowohl Exemplare durch sterile Keimung als auch durch In-vitroVermehrungstechniken nach bereits ausgearbeiteten Vorschriften generiert.[92]
Das
Sekundärstoffspektrum
zunehmendem Alter.
[159]
pflanzlicher
Systeme
schwankt
auch
mit
Besonders einkeimblättrige Pflanzen bereiten aufgrund ihrer
Biologie Probleme bei der reproduzierbaren Metabolitproduktion. Dies trifft auch für
Kniphofia pumila zu. Bei den Experimenten sollten daher nur Organkulturen zum
Einsatz gelangen, die nicht älter als ein Jahr sind.
Abb. 38. Aseptische Ganzpflanze von Kniphofia pumila.
68
6.3
Allgemeiner Teil
Fütterungsexperimente mit uniform markiertem 13C2-Acetat
6.3.1 Applikation der isotopenmarkierten Vorstufe
Für das Inkorporationsexperiment mit doppelt markiertem 13C2-Acetat wurden,
wie unter 6.2 beschrieben, aseptische Ganzpflanzen von K. pumila verwendet, die eine
durchschnittliche Größe von 20 cm aufwiesen. Der isotopenmarkierte Precursor wurde
dem System sterilfiltriert appliziert. Hierbei wurde davon ausgegangen, daß dieser
durch die Wurzel, dem Hauptaufnahmeorgan höherer Pflanzen, in das pflanzliche
Gewebe gelangen würde. Das Fütterungsexperiment wurde zwei Monate lang
durchgeführt, wobei wöchentlich
13
C2-Acetat zugeführt wurde. Die Pflanzen wurden
nach vier Wochen auf frisches Substrat passagiert.
6.3.2 NMR-Analyse durch 13C- und INADEQUATE-Experimente
Im
entkoppelten
13
C-NMR-Spektrum
von
Knipholon
(5)
aus
den
Fütterungsexperimenten zeigten sich zwar Sateliten, jedoch überlappten einige Signale
partiell. Zudem ließ es ein ungünstiges Signal-Rausch-Verhältnis nicht zu, einige
erwartete 13C-Dubletts genau zu lokalisieren. Daher konnten diese Signale nicht für eine
abschließende
Analyse
zum
Vergleich
ihrer
13
C-13C-Kopplungskonstanten
herangezogen werden. Diese Probleme konnte teilweise durch den Einsatz des
INADEQUATE-Experiments[31] beseitigt werden, welches zur Identifizierung direkter
Kohlenstoff-Kohlenstoff-Konnektivitäten dient. Darüber hinaus wurde das relativ
schlechte Signal-Rausch-Verhältnis, welches von der geringen Substanzmenge (ca. 1
mg) herrührte, maßgeblich durch die Verwendung der NMR-Kryoprobenkopftechnik[61]
verbessert. Obwohl dieser spezielle Kryoprobenkopf lediglich in Verbindung mit einem
500-MHz-Spektrometer benutzt wurde,[160] war es dennoch möglich, nahezu sämtliche
zu erwartenden
13
C-Dubletts im NMR-Spektrum zu beobachten. So konnten in der
Anthrachinonhälfte des Knipholons (5) auch sämtliche C-C-Kopplungen detektiert
werden (Abb. 39). Sechs endocyclische (C-1/C-1a, C-9/C-8a, C-8/C-7, C-6/C-5, C5a/C-10 und C-4a/C-4) acetogenine C2-Einheiten und eine exocyclische, nämlich CH33, wurden nachgewiesen. Lediglich C-2 ließ sich kein Kopplungspartner zuordnen, da
es sich hier um die Position handelt, wo die Decarboxylierung in der Biogenese
stattgefunden hatte. Dieses ebenso angereicherte Kohlenstoffatom C-2 stellt somit den
Allgemeiner Teil
69
„Single“ dar, in dessen direkter Nachbarschaft sich im Octoketokörper zuvor das
Coenzym A befunden hatte.
Generell wurde ein Markierungsgrad von ca. 0.6% beobachtet, was für
Inkorporationsversuche mit Ganzpflanzen in ähnlichen Experimenten in der Literatur
vergleichbar ist.
Das somit klar detektierte Einbaumuster der Acetat-abgeleiteten C2-Einheiten
ohne jeglichen Bindungsbruch und speziell der Befund, daß im „ersten“ aromatischen
Ring zwei und nicht drei Einheiten vollständig inkorporiert wurden, belegte, daß die
Faltung des Chrysophanolteils des Phenylanthrachinons 5 dem Modus F folgt. Dieses
Resultat stimmte somit mit dem für das frei in höheren Pflanzen vorliegende Molekül
überein (vergl. 3.3.2).
Abb. 39. 126-MHz-2D-INADEQUATE-NMR-Spektrum von Knipholon (5) in d6-Aceton nach
Fütterung von doppelt markiertem 13C-Acetat und Isolierung aus Kniphofia pumila
(Asphodelaceae). Das Einbaumuster der intakt inkorporierten Einheiten ist in rot
dargestellt. Die einzige Konnektivität, welche nicht nachgewiesen wurde (C-2'/C-3'),
ist in grün dargestellt.
70
Allgemeiner Teil
Unter den bereits angeführten, verbesserten Bedingungen war es ebenfalls
möglich, nahezu sämtliche erwarteten C2-Einheiten der südlichen Acetophenonhälfte im
INADEQUATE-Spektrum zu identifizieren. So konnten C-1'/C-6', C-5'/C-4' und
außerdem die Kopplung zwischen den beiden exocyclischen Kohlenstoffatomen der
Acetylgruppe detektiert werden. Die einzige nicht im INADEQUATE-Spektrum
sichtbare Korrelation war die zwischen C-2' und C-3'. Bei diesen beiden Atomen
handelt es sich um quarternäre Kohlenstoffatome, welche aufgrund langsamerer
Relaxation im
13
C-NMR Sektrum generell niedrigere Intensitäten aufweisen. Deren
Signale fielen derartig klein aus, daß keine Kopplungskonstanten im
13
C-NMR-
Spektrum abgelesen werden konnten. Da zweidimensionale NMR-Experimente per se
wesentlich unempfindlicher sind, war es vorraussehbar, daß auch das INADEQUATE
bezüglich der Detektion quarternärer Kohlenstoff-Atome keine Besserung gegenüber
dem eindimensionalen 13C-NMR-Experiment bringen würde.
Jedoch war es mit den drei von offensichtlich vier existierenden intakten
13
C2-
Einheiten zweifelsfrei möglich, die Polyketidfaltung der südlichen Molekülhälfte des
Phenylanthrachinons 5 nachzuvollziehen. Lediglich ein Inkorporationsmuster, nämlich
das gefundene, führt chemisch von der Faltung eines Tetraketidvorläufers, von einer
Polyketidsynthase (wahrscheinlich des Typs II) katalysiert, schließlich zu einem
Acetophenonderivat 38. Genau aus diesem Grund ist die Klassifizierung des F/SModus-Systems auch nur für annelierte aromatische Polyketide definiert. Demnach
fallen also nur solche aromatischen Polyketide unter die Definition, welche mindestens
aus Heptaketidvorstufen hervorgehen, wie dies bei den Naphthalinderivaten der Fall ist.
Monocyclische aromatische Polyketide, welche aus vier acetogeninen Einheiten
biosynthetisiert werden, wie z. B. die Orsellinsäure (42) und eben Acetophenonderivate,
können folglich nicht gemäß diesem System eingeordnet werden, da überhaupt nur ein
Modus, nämlich S, resultieren kann.
Dennoch
bleibt
das
gewonnene
Inkorporationsmuster
der
vollständig
eingebauten C2-Einheiten der südlichen Molekülhälfte bemerkenswert und beinhaltet
einige biosynthetische Überraschungen. So war das erhaltene Einbaumuster deshalb
unerwartet, da das symmetrische
2,4,6-Trihydroxyacetophenon (41) als direkter
biosynthetischer Vorläufer der südlichen Molekülhälfte 38 vermutet worden war. Von
diesem Molekül war auch angenommen worden, es sei das direkte Substrat für die C-CVerbrückung durch die phenoloxidative Biarylkupplung. Dies könnte zu O-
Allgemeiner Teil
71
Demethylknipholon (43) führen, einem Naturstoff einer verwandten AsphodelaceenArt. Auch war vermutet worden, daß 2,4,6-Trihydroxyacetophenon (41) zunächst einer
O-Methylierung unterzogen werden könnte, was zur eigentlichen authentischen
Südhälfte in freier Form, dem 2,4-Dihydroxy-6-methoxyacetophenon (38), führt, das
dann als Kupplungssubstrat genutzt werden könnte. Ein Vorkommen des konstitutionell
symmetrischen 2,4,6-Trihydroxyacetophenons (41) in der Biogenese des Knipholons
(5) würde eine Randomisierung der involvierten acetogeninen Einheiten im Ring
symmetriebedingt nach sich ziehen. Obwohl hierbei sämtliche C2-Einheiten intakt
blieben, wären die 13C2-Entitäten C-6'/C-1', C-2'/C-3' und C-4'/C-5' nicht mehr von den
entsprechenden C-6'/C-5', C-4'/C-3' und C-2'/C-1' zu unterscheiden, da die exocyclische
Acetylgruppe völlig 'unverdünnt' markiert bleiben sollte. Allerdings konnte keinerlei
Anzeichen für eine derartig chemisch zu erwartende Randomisierung gefunden werden.
Dieser Befund schloß, zumindest auf Grundlage der Fütterung mit doppelt markiertem
13
C2-Acetat, die Existenz eines freien, symmetrischen Biosynthesevorläufers bei der
Biogenese des Knipholons (5) aus.
6.3.3 NMR-Analyse durch SELINQUATE-NMR-Experimente
Der in 6.3.2 dargelegte überraschende Befund einer fehlenden Randomisierung
13
der C2-Einheiten in der südlichen Molekülhälfte des Knipholons (5) sollte noch durch
weitere Experimente abgesichert werden. Daher sollte ein 1D-SELINQUATE-NMRExperiment[161] (selektives 1D-INADEQUATE-Experiment) durchgeführt werden,
welches klären sollte, ob eine Randomisierung von C-6/C-1', C-2'/C-3', C-4'/C-5' versus
C-6'/C-5', C-4'/C-3', C-2'/C-1' eventuell doch zu einem geringen Grad aufgetreten sein
könnte. Das SELINQUATE-NMR-Experiment stellte für diese spezielle Fragestellung
die Methode der Wahl dar. Diese moderne Technik zur effizienten Bestimmung
einzelner C-C-Konnektivitäten bietet speziell in Gegenwart eines Wasserstoffatomtragenden
Kohlenstoffatoms
eine
gute
Sensitivität,[162]
welche
u.a.
in
Eindimensionalität begründet liegt. Wegen der starken Signalüberlappung der
der
13
C-
NMR-Signale im aromatischen Bereich, besonders bei den chemischen Verschiebungen
der Kohlenstoffatome C-4' und C-6', wurde die Einstrahlung für das SELINQUATEExperiment bei 91.89 ppm durchgeführt, also bei der Resonanz von C-5'. Zum
selektiven Kohärenz-Transfer wurde ein selektiver 270°-Gauss-Puls mit einer Länge
von 7 ms bei 91.89 ppm in der SELINQUATE-Pulsfolge eingestrahlt. Der einzige durch
72
Allgemeiner Teil
das Experiment erzielte Kohärenz-Transfer führte zu einem Signal mit der chemischen
Verschiebung von C-4' (δ = 163.6 ppm). Somit zeigte das tertiäre Kohlenstoffatom C-5'
in der südlichen Molekülhälfte des Phenylanthrachinons 5 lediglich eine Korellation zu
C-4', jedoch keine zum Kohlenstoffatom C-6' (s. Abb. 40). Bei dem zu beobachtenden
Signal handelt es sich um zwei Peaks, welche antiphasisch sind und eine 1JCCKopplungskonstante von 71 Hz aufweisen.
J = 71 Hz
(a )
C-4'
C-6'
(b)
164
163
162
(ppm)
Abb. 40. (a) 151-MHz-SELINQUATE-Spektrum von Knipholon (5) (isoliert aus dem
biologischen System nach
13
C2-Acetat-Fütterung) in d6-Aceton. Nach selektivem
Kohärenz-Transfer mit einem selektiven 270° Gauss-Puls (7 ms Pulslänge) bei 91.89
ppm (Resonanzfrequenz von C-5') wurde lediglich ein Signal mit der chemischen
Verschiebung von C-4'beobachtet (b) Ausschnitt aus dem 13C-NMR-Spektrum.
Exemplarisch für diese C2-Einheit bestätigte man durch das Experiment die
Exklusivität des oben beschriebenen Einbaumusters der südlichen Hälfte des
Knipholons (5) sogar zu einem noch höheren Prozentsatz, nämlich über 80%. Darüber
hinaus kann eine Randomisierung und damit verbunden das Auftreten einer freien,
symmetrischen Vorstufe in der Biogenese des Phenylanthrachinons 5 ausgeschlossen
werden (<20%).
Weiterhin führte man SELINQUATE-Experimente mit Einstrahlung auf andere
Kohlenstoffatomresonanzen des Phenylrings, wie z.B. C-2', durch, doch leider verliefen
diese Versuche negativ. So traten keine Signale auf, was sich sowohl mit der geringen
Allgemeiner Teil
73
isolierten Probenmenge als auch mit der Schwierigkeit, quaternäre Kohlenstoffatome in
Doppelquantenfrequenz-Experimenten nachzuweisen, begründen läßt.
13
Aus dem Fehlen der biosynthetischen Randomisierung der intakten
C2-
Einheiten aus der Acetatfütterung resultieren zwei mögliche Schlußfolgerungen:
Entweder scheidet 2,4,6-Trihydroxyacetophenon (41) als symmetrische Vorstufe zu
Knipholon (5) vollständig aus, oder dieses wird vom involvierten Enzym erst nach
erfolgter
Kupplung
zum
Phenylanthrachinon
5
entlassen.
2,4-Dihydroxy-6-
methoxyacetophenon (38) wäre zwar per se unsymmetrisch, doch bleibt dieses Molekül
als biosynthetische Vorstufe aber noch immer problematisch, da zu erwarten ist, daß 38
aus 2,4,6-Trihydroxyacetophenon (41) hervorgeht. Interessanterweise findet sich das ODemethylknipholon (43) als Naturstoff in der nahe verwandten Pflanzenart Bulbine
capitata.[163], bei dem auch die Möglichkeit des Auftretens einer symmetrischen
Vorstufe nicht ausgeschlossen werden kann. Zur Klärung der Fragestellung sollten die
beiden Moleküle 38 und 41 in markierter Form dargestellt und verfüttert werden, da
beide potentielle Precursoren der Biosynthese sind.
6.4
Fütterungsexperimente mit fortgeschrittenen isotopenmarkierten
Precursoren
6.4.1 Überlegungen
zur
Vorgehensweise
und
den
zu
erwartenden
Ergebnissen der NMR-Analyse
In der vorliegenden Arbeit kamen bisher lediglich einfache
13
C-markierte
Vorstufen wie Acetat zum Einsatz, welche in der Regel kommerziell bezogen werden
können. Zur Erforschung der detaillierten Biogenese von strukturell interessanten
Sekundärstoffen ist es aber teilweise nötig, sogenannte fortgeschrittene („advanced“)
Intermediate in isotopenmarkierter Form einzusetzen.[164] Solche biosynthetischen
Precursoren sind üblicherweise gar nicht oder aber unter extrem hohen Kosten zu
beziehen. So war es zur Aufklärung der Biogenese des Phenylanthrachinons Knipholon
(5)
erforderlich,
die
aussichtsreichen
fortgeschrittenen
Vorläuferstufen
2,4,6-
Trihydroxyacetophenon (41) und 2,4-Dihydroxy-6-methoxyacetophenon (38) in
13
C-
markierter Form für Fütterungsexperimente zu synthetisieren. Diese sollten in erster
Linie dazu dienen, Details über die Edukte der phenoloxidativen Kupplung zu erlangen,
74
Allgemeiner Teil
was wiederum weitere Aufschlüsse über ein eventuell doch auftretendes symmetrisches
Biosynthese-Intermediat und die zeitliche Abfolge der einzelnen Schritte liefern könnte.
Würde die unsymmetrische Vorstufe 2,4-Dihydroxy-6-methoxyacetophenon
(38), die am Carbonyl-Kohlenstoff und dem Kohlenstoffatom der Methylgruppe
13
C-
markiert verfüttert wurde, in die südliche Hälfte des Knipholons (5) eingebaut, so wäre
eine Anreicherung der
im
13
13
C-Atome der exocyclischen Acetyl-Gruppe zu erwarten, was
C-NMR-Spektrum zu beobachten wäre (s. Abb. 41). Da es sich hierbei um
benachbarte
13
C-Kerne mit einem Spin von ½ handelt, müßten diese miteinander
koppeln. Im entsprechenden NMR-Spektrum müßten deshalb die beiden Signale (Z) der
Acetyl-Gruppe des unmarkierten Knipholons (5) von einem Dublett (S) flankiert sein,
so wie es in Abb. 41 theoretisch, idealisiert dargestellt ist. Im Allgemeinen liegen die
Aufspaltungen von 1J(13C-13C)-Kopplungen bei 30 bis 80 Hz. Für eine markierte sp2sp3-Bindung, wie in diesem Fall, wäre eine Kopplungskonstante von ungefähr 45 Hz zu
erwarten (im
1
13
C-Spektrum von [13C2]-2,4-Dihydroxy-6-methoxyacetophenon (38)
JCC=42.2 Hz). Bedingt durch Isotopeneffekte liegt das Zentralsignal nicht exakt in der
Mitte der beiden Satelliten.[165]
Allgemeiner Teil
75
J = 42.4 Hz
J = 42.4 Hz
20.6 Hz 21.89 Hz
19.5 Hz 22.9 Hz
Z
Z
HO
S1
OH
Me
S2
S1
MeO O
S2
13
[ C2]-Einheiten
13
=
[ C 2 ]-Einheit im
13
C-Spektrum nur
schwach erkennbar
203.8
203.6
203.4
33.5
33.3
33.1
ä13C [ppm]
Abb. 41. Idealisiertes Modell für das zu erwartende Aufspaltungsmuster bei einem Einbau von
2,4-Dihydroxy-6-methoxyacetophenon (38) in
13
C-markierter Form in die südliche
Hälfte des Knipholons (5).
Auch 2,4,6-Trihydroxyacetophenon (41) sollte in
13
C-markierter Form dem
biologischen System appliziert werden, gewissermaßen als Negativ-Kontrolle, da
bereits aus dem Fütterungsexperiment mit Acetat geschlossen wurde, daß dieses
Intermediat eigentlich ausschied. Ein Nicht-Einbau des Moleküls würde einen weiteren
Hinweis darauf liefern, daß während der Biogenese von 5 kein symmetrisches
Intermediat beteiligt ist.
Generell wären für eine Inkorporation dieses Vorläufers 41 in
13
C-markierter
Form die gleichen Befunde in den 13C-Spektren zu erwarten, wie dies oben bereits für
die unsymmetrische Vorstufe beschrieben worden ist.
76
Allgemeiner Teil
6.4.2 Bereitstellung der isotopenmarkierten Vorstufen
Wie bereits unter 6.4.1 erwähnt, konnten die beiden Acetophenonderivate 38
und 41 in
13
C2-markierter Form nicht kommerziell bezogen werden. Daher mußte erst
eine Markierungssynthese für die beiden relevanten Precursoren 38 und 41 entwickelt
werden, da lediglich Synthesen ohne Markierung in der Literatur[166] beschrieben waren.
Tanja Gulder[167] aus unserer Arbeitsgruppe erarbeitete die Markierungssynthesen für
die beiden Stoffe und stellte das für die Fütterungsexperimente benötigte Material in
ausreichenden Mengen dankenswerterweise zur Verfügung. Zur Vervollständigung der
Versuchsdaten ist die von Ta. Gulder durchgeführte Synthese in Schema 8 dargestellt.
OH
HO
Fries-Verschiebung
13
1. C2-Acetylchlorid,
Mont.-K10,CH2Cl2
2. TiCl4, Chlorbenzol
(62%)
OH
MeO
MeO
MeO
O
38
OH
MeO
oder
13
Me
1.3 Äquiv. AlCl3,
Chlorbenzol
Me
C2-Acetylchlorid,
BCl3, CH2Cl2
(94%)
MeO
O
OH
HO
2.5 Äquiv. AlCl3,
Chlorbenzol
Friedel-Crafts-Acylierung
Me
HO
13
[ C2]-Einheit
O
41
Schema 8. Von Ta. Gulder entwickelte und durchgeführte Markierungssynthese zu den beiden
biosynthetisch relevanten Acetophenon-Derivaten 38 und 41.
6.4.3 Applikation der isotopenmarkierten Vorstufen
Nachdem die beiden oben genannten relevanten Verbindungen 38 und 41 in 13Cmarkierter Form in ausreichender Menge zur Verfügung standen, sollte ein kompetitives
Fütterungsexperiment mit dem bereits unter 6.2 beschriebenen biologischen System
durchgeführt werden. Jedoch können generell bei Inkorporationsexperimenten mit
fortgeschrittenen
Biosynthesestufen
in
isotopenmarkierter
Form
verschiedene
Schwierigkeiten auftreten, welche unter Kontrolle gebracht werden müssen. So ergab
sich hier zunächst das Problem, in welchem Lösungsmittel die beiden potentiellen
Vorstufen dem biologischen System appliziert werden sollten. Vorab durchgeführte
Allgemeiner Teil
77
Löslichkeitsexperimente zeigten, daß eine rein wäßrige Lösung (für pflanzliche Systeme
das Mittel der Wahl) nicht praktikabel war, da sich sowohl 2,4-Dihydroxy-6methoxyacetophenon (38) als auch 2,4,6-Trihydroxyacetophenon (41) erst ab einem
pH-Wert von 11 in Wasser lösten und derart basische Lösungen für pflanzliche
Kulturen schädlich sind. Daher mußte hier ein anderes Solvens verwendet werden.
Außerdem mußte man sich am pH-Wert des verwendeten Kultursubstrats orientieren,
der hier bei pH 5.8 liegt. Aus diesem Grund wurden diverse Lösungsmittel in
Kombination mit dem Detergenz Triton X 100© getestet, wobei letztlich ein
Solvenssystem, bestehend aus 60% 2-Methoxyethanol, 40% Reinstwasser und einem
Tropfen Triton X 100© bezogen auf zehn mL, ausgewählt wurde. Beide markierten
Vorstufen wurden durch Sterilfiltration im Lösungsmittelgemisch appliziert, da ermittelt
worden war, daß diese Precursoren eher thermolabil sind und nicht autoklaviert werden
sollten. Daher mußte die Filtration als Sterilisationsmethode eingesetzt werden.
Wie Ta. Gulder gezeigt hatte,[168] reagieren besonders bereits adoleszente
Kulturen von Kniphofia pumila äußerst sensitiv, d.h. mit Nekrosen auf die Gabe der
beiden Acetophenon-Derivate 38 und 41. Dieses Problem wurde im Rahmen der
vorliegenden Studie sehr leicht durch die Vewendung eines juvenilen Systems gelöst,
bei dem keinerlei Anzeichen von Stress, wie chlorotisches oder gar nekrotisches
Gewebe, auftraten. Vornehmlich juveniles Material, das weniger als ein Jahr alt ist,
mußte eingesetzt werden, damit aussagekräftige Ergebnisse produziert werden konnten.
Basierend auf den Erfahrungen aus den zuvor mit Ta. Gulder aus unserem
Arbeitskreis
durchgeführten
Experimenten,[168]
wurden
zudem
die
Verfütterungsintervalle auf zwei Wochen festgesetzt. Damit wurde dem System die
Möglichkeit gegeben, sich zwischen den Applikationen zu regenerieren. Die
Gesamtdauer des kompetitiven Fütterungsexperiments wurde dabei auf insgesamt sechs
Wochen festgelegt.
Zur Vermeidung jeglicher Artefaktbildung wurde das Biomaterial nach Abbruch
des Experiments unverzüglich in flüssigem Stickstoff eingefroren und anschließend
lyophilisiert. Zuvor entfernte man die Blätter. Zwar ist der genaue Biosyntheseort des
Knipholons (5) nicht geklärt, doch liegt es in sämtlichen Produzenten nahezu
ausschließlich in den Wurzeln vor,[113] in den Blättern kann es nicht einmal in Spuren
nachgewiesen werden. Allerdings ist noch nicht geklärt, ob es sich bei diesem
78
Allgemeiner Teil
Pflanzenorgan lediglich um das Sinkgewebe oder sogar um den eigentlichen
Produktionsort dieses pflanzlichen Sekundärmetaboliten handelt.
Das gewonnene biologische Material des Inkorporationsexperiments wurde nach
Gefriertrocknung und Homogenisierung mit einem Gemisch aus Aceton:Wasser (95:5)
kalt mazeriert. Das Knipholon (5) isolierte man aus dem Extrakt mittels präparativer
HPLC und führte es der phytochemischen Analyse durch 13C-NMR-Messungen zu.
6.4.4 Analyse des Knipholons (5) durch 13C-NMR-Experimente
Als Resultat der Fütterung mit dem unsymmetrischen Biosyntheseintermediat
2,4-Dihydroxy-6-methoxyacetophenon (38) in
eine Inkorporation im
13
13
C-markierter Form konnte man klar
C-NMR-Spektrum des isolierten Knipholons (5) nachweisen.
So zeigten sich hier zwei Dubletts sowohl bei 33.1 ppm, was der chemischen
Verschiebung des Methyl-Kohlenstoffatoms der Acetyl-Gruppe entspricht, als auch bei
204.4 ppm, dem Shift von C-7' mit 1J(13C13C)- Kopplungen im entsprechenden
13
C2-
angereicherten Fragment (s. Abb. 42). Die gefundene Kopplungskonstante ist dabei
jeweils 42.34 Hz und entspricht somit dem im Punkt 6.4.1 vorhergesagten Wert für
diese
Signale.
Darüber
hinaus
wird
durch
die
exakt
übereinstimmende
Kopplungskonstante die Wechselwirkung der beiden Kohlenstoffatome eindeutig
nachgewiesen, womit das unsymmetrische 2,4-Dihydroxy-6-methoxyacetophenon (38)
als biosynthetische Vorläuferstufe in der Biogenese des Phenylanthrachinons Knipholon
(5) bewiesen ist. Bei der Messung kam die sensitivere Kryoprobentechnik[61] an einem
600-MHz-NMR-Spektrometer zum Einsatz.
Bei
der
NMR-Analyse
des
isolierten
Knipholons
Fütterungsexperiment mit dem symmetrischen Precursor 41 in
13
(5)
aus
dem
C-markierter Form
zeigten sich dagegen keine neuen Signale durch Aufspaltung, wie bei einem Einbau zu
erwarten wäre. Nur die „normalen“ Einzelsignale (Zentralsignale) der beiden
betreffenden Kohlenstoffatome waren zu detektieren.
Allgemeiner Teil
5021.40
5002.10
4989.35
4979.05
30870.36
30849.91
30828.02
79
x
205
204 ppm
Abb. 42. Ausschnitte des
13
33.5
33.0
ppm
C-Spektrums des aus dem Fütterungsexperiment mit 2,4-
Dihydroxy-6-methoxyacetophenon (38) in 13C-markierter Form isolierten Knipholons
(5). Der im rechten Teil durchgestrichene Peak ist ein Artefakt bedingt durch eine
Verunreinigung.
Aus beiden Extrakten des aus dem kompetitiven Inkorporationsexperiments
hervorgegangenen biologischen Materials wurde versucht, die jeweils verfütterte
Biosynthesevorstufe zu re-isolieren. Allerdings traten in den HPLC-Chromatogrammen
keinerlei Peaks mit den zu erwartenden Retentionszeiten auf. Auch eine durchgeführte
Coelution mit der entsprechenden Referenzsubstanz[169] verlief negativ. Daher muß
davon ausgegangen werden, daß beide isotopenmarkierte Precursoren vollständig vom
eingesetzten biologischen System metabolisiert wurden und Kontakt mit den
involvierten Enzymen hatten. Doch lediglich die unsymmetrische Vorstufe diente als
Substrat für die katalytischen Proteine der Biogenese des Phenylanthrachinons, wie
Schema 9 zusammenfaßt.
80
Allgemeiner Teil
OH
HO
Me
O
MeO
!
38
HO
O
OH
Me
O
M
HO
OH
Me
MeO O
OH
HO
5
Me
O
HO
41
13
[ C2]-Einheit
Schema 9. Ergebnis des durchgeführten kompetitiven Fütterungsexperiments an In-vitroKulturen von K. pumila.
Somit liegt mit dem klaren Resultat der kompetitiven Fütterung ein weiterer
Beweis für das Fehlen eines freien, symmetrischen Biosyntheseintermediats in der
Biosynthese des Knipholons (5) vor.
Außerdem
liefert
dieses
Ergebnis
weitere
Hinweise
bezüglich
der
phenoloxidativen Kupplung, die im einzelnen in Punkt 6.6 besprochen werden.
6.5
Experimente zum Enantiomerenüberschuß (er) von Knipholon (5) im
untersuchten biologischen System
Bei phytochemischen Analysen anderer Knipholon-Produzenten, wie z. B.
Kniphofia
foliosa
oder
auch
Bulbine
frutescens,[148]
war
bezüglich
der
Enantiomerenreinheit festgestellt worden, daß vorwiegend das M-Enantiomer des
Knipholons (5) von den Pflanzen biosynthetisiert wird. So fiel bei der
Enantiomerenanalytik des aus den sterilen Kulturen von Kniphofia pumila isolierten
Knipholons (5), welche in Kooperation mit Ta. Gulder durchgeführt wurde auf, daß sich
Allgemeiner Teil
81
hier das Enantiomerenverhältnis gegenüber den sonst erhaltenen Resultaten umkehrte.
Im Falle des bei den Fütterungsexperimenten eingesetzten biologischen Systems wurde
durch Analytik an einer chiralen OD-H Phase ein Enantiomerenverhältnis von P:M =
70:30 festgestellt. In Abb. 43 ist das Chromatogramm dieser Enantiomerenanalytik
dargestellt. Dieses Verhältnis wurde auch bei unbehandelten Sterilpflanzen der
Asphodelacee gefunden. Somit steht fest, daß hier nicht etwa ein Streßphänomen
vorliegt, welches durch die markierten Precursoren im Sinne einer Elicitierung auf die
involvierten
Enzyme
wirkte,
sondern
daß
es
sich
um
das
natürliche
Enantiomerenverhältnis dieses Knipholon-Produzenten handelt. Dieser Umstand legt
nahe, daß keine spontane, nicht-enzymatische Reaktion abläuft, sondern ein Enzym
involviert ist, das zudem selektiv arbeitet.
82
Allgemeiner Teil
50000
70% M
45000
40000
Bulbine spec.
35000
30000
25000
30% P
20000
15000
10000
5000
HO
0
O
OH
-5000
20
25
30
Me
O
HO
M
OH
7000
Me
81% P
6000
MeO O
5
5000
Kniphofia pumila
4000
3000
2000
19% M
1000
0
-1000
20
25
30
Abb. 43. Enantiomerenanalytik an chiraler Phase von Knipholon (5), welches aus K. pumila
isoliert wurde (unten), und zum Vergleich Material aus einer Bulbine-Art (oben).
Allgemeiner Teil
6.6
83
Schlußfolgerungen zur Biogenese von Knipholon (5)
In
der
vorliegenden
Studie
zur
Aufklärung
der
Biogenese
des
Phenylanthrachinons Knipholon (5) konnte nachgewiesen werden, daß die nördliche
Hälfte, der Anthrachinon-Teil des Moleküls, aus acht Acetateinheiten nach dem Modus
F biosynthetisiert wird. Dies entspricht den Resultaten, welche in Punkt 3.3 für das freie
Chrysophanol (4) in höheren Pflanzen gefunden worden waren. Somit bildet dieser
Befund, neben den Experimenten mit Plumbagin (44)[37] und Dioncophyllin A (45)[36] in
zweikeimblättrigen Pflanzen, einen weiteren Beweis für den Polyketidfaltungsmodus F
als generelles Biosynthesemotiv für aromatische Polyketide in höheren Pflanzen. Aus
evolutiver Sicht mag dies nicht weiter verwundern, da Pflanzen mit der Gruppe der
Pilze zu den eukaryotischen Organismen zählen und sich auch in diesem Kriterium sehr
von prokaryotischen Lebewesen unterscheiden.
So klar wie für die Biogenese der nördlichen Molekülhälfte liegen die
Verhältnisse bei der südlichen Hälfte nicht. Obwohl auf den ersten Blick die
Biosynthese dieses Teils des Knipholons (5) fast trivial erscheint, da dieses
Acetophenonderivat zwangsläufig aus einer tetraketidischen Vorstufe hervorgehen muß
(s. Schema 10), die auch bezüglich ihrer Faltung festgelegt werden kann, kamen gerade
hier einige biosynthetische Überraschungen zu Tage. Wie ebenfalls in Schema 10
dargestellt, hätten auf dem Weg zu dem Acetophenonderivat 38 aus vier acetogeninen
C2-Einheiten zwei isotopomere Trihydroxyacetophenone 41 hervorgehen können.
Prinzipiell wären für die Kreuzkupplung mit einer symmetrischen Vorstufe 38 dabei
zwei verschiedene Positionen möglich, nämlich a (C-4') und b (C-6'). Aufgrund der
Symmetrie dieses Bausteins 41 wären allerdings beide Kupplungspositionen identisch
und somit eine Randomisierung der
13
C2-Einheiten im südlichen aromatischen System
von 5 chemisch plausibel. Erst eine desymmetrisierende O-Methylierung differenziert
die beiden möglichen Positionen der phenoloxidativen Kupplung.
84
Allgemeiner Teil
O
O
PKS
8 HOAc
O
O
O
O
O
O
O
HO
Modus F
SCoA
Me
Me
X
9a
O
PKS
4 HOAc
=
Me
O
Me
O
O
SR
X = O (Chrysophanol) (4)
X = H2 (Chrysophanol-Anthron) (21)
SR
O
O
O
O
O
a
b
5
HO
OH
3
MeO
HO
=
S
3
HO
Me
O
MeO
HO
HO
O
Me
b
OH
b
2) Phenol-oxidative
Kupplung
S
OH
A
(>90%)
Schema 10.
O
Me
OH
HO
O
OH
HO
PKS
38
a
?
SR O
Me
a!
MeO
O
Me
OH
5
38
Me
Me
O
Me
PKS
+ OMT
1) O-Methylierung
HO
OH
MeO
OH
HO
Me
O
A+B
C2-Randomisierung
(nicht detektierbar)
MeO
O
B
(nicht detektiert)
Vermutliche Biosynthese der nördlichen und südlichen Hälfte von Knipholon (5).
Allgemeiner Teil
85
Das bereits in der NMR-Analyse der Fütterungsexperimente mit
13
C2-Acetat
nachgewiesene Fehlen einer Randomisierung in der Acetophenon-Molekülhälfte 38 ist
nur durch zwei theoretische Erklärungen möglich. So könnte einerseits das Tetraketid
während dessen gesamter Biosynthese bis zur Kupplung mit 4 niemals aus dem Enzym
entlassen werden, oder andererseits könnte bereits sehr früh eine regioselektive OMethylierung stattfinden, die eine Symmetrisierung unterbindet (s. Schema 10).
Letzteres wurde schließlich durch Fütterungsexperimente mit zwei fortgeschrittenen
Biosyntheseintermediaten in isotopenmarkierter Form sicher nachgewiesen. Die frühe
O-Methylierung ist unerwartet, da derartige Modifikationsschritte von Polyketiden
üblicherweise erst sehr spät stattfinden.[170] Die angeführten Punkte deuten auf die
Beteiligung eines höchst spezialisierten tailoring enzyme hin, welches eng mit einer
Polyketidsynthase bei der Biosynthese von Knipholon (5) und verwandten
Phenylanthrachinonen zusammenarbeitet. Besonders dasjenige tailoring enzyme,
welches die Bildung der gekreuzten Biaryl-Kupplung katalysiert, arbeitet regioselektiv,
da das Regioisomer Isoknipholon (46) (s. Abb. 44) nicht im verwendeten biologischen
System nachgewiesen werden kann.
HO
O
OH
HO
O
OH
Me
Me
O
HO
M
OH
O
P
MeO
OH
Me
Me
HO O
MeO O
46
5
Abb. 44. Struktur von Isoknipholon (46), einem Regioisomer von 5.
Schon durch das Inkorporationsexperiment mit
13
C2-Acetat konnte deutlich
gemacht werden, daß die südliche Molekülhälfte unmöglich aus einer Degradation eines
Octapolyketokörpers (Bichrysophanol) hervorgehen kann, da ein solcher Aufbau ein
anderes Einbaumuster im Acetophenon-Teil zeigen würde. So müßten in diesem Fall
86
Allgemeiner Teil
intakte C2-Einheiten zwischen C-1' und C-2'; C-3' und C-4' sowie C-6' und CH3-6'
eingebaut werden und ein „Single"-Kohlenstoffatom würde an Position C-5' vorliegen.
Ob beide Molekülhälften, d.h. der Tetra- und der Octaketokörper, unter
Beteiligung derselben PKS entstehen und somit denselben Ursprung haben oder nicht,
war in diesem Zusammenhang eine sehr interessante Frage. Prinzipiell steht für solche
Fragestellungen für gewöhnlich die Isotopen-Massenspektrometrie (IRMS) zur
Verfügung. Zu diesem Verfahren mußte das Phenylanthrachinon 5 zunächst chemisch
gespalten
werden.
Unglücklicherweise
konnte
die
GC-C-IRMS
in
diesem
Zusammenhang keine interpretierbaren Resultate liefern, da jegliche Form der
Chromatographie, wie sie zwangsläufig bei der Aufarbeitung der durch Spaltung des
Moleküls erhaltenen Hälften verwendet werden muß, zu einer Verfälschung des
Resultats führt.[171] Die in Kooperation mit dem Arbeitskreis von Prof. W. Boland (Max
Planck-Institut für Chemische Ökologie, Jena) ermittelten Werte waren somit nicht
verwertbar.
Speziell die PKS, welche für die Biosynthese des Acetophenons verantwortlich
zeichnet, ist für die Biochemie und die kombinatorische Biosynthese von Interesse. So
wurde von Bechthold eine Polyketidsynthase entdeckt,[26] welche bei der Bildung der
Orsellinsäure (42) beteiligt ist, eines Sekundärmetaboliten, welcher der südlichen Hälfte
des Knipholon (5) recht nahe kommt (s. Abb. 45). Dieses Enzym darf aus mehreren
Gründen als Ausnahme in der Klassifizierung von Polyketidsynthasen generell gelten.
So wurde das Protein zwar aus einem Bakterium isoliert, doch arbeitet es nach dem
Prinzip der pilzlichen modularen PKS des Typs I. Darüber hinaus ist noch keine PKS
dieses Typs beschrieben, welche für die Biosynthese aromatischer Verbindungen
zuständig ist. Somit läßt sich mit Recht vermuten, daß die Isolierung und
Charakterisierung
der
aromatischen
PKS
in
Forschungsobjekt darstellt.
OH
COOH
Me
HO
42
Abb. 45. Struktur von Orsellinsäure (42).
Asphodelaceen
ein
lohnendes
Allgemeiner Teil
87
Die Resultate dieser biosynthetischen Studie sind Gegenstand von zwei
wissenschaftlichen Publikationen.[148,172]
88
7
Allgemeiner Teil
Bereitstellung einer pflanzlichen Gewebekultur zur
Untersuchung der Biosynthese von NaphthylisochinolinAlkaloiden
7.1
Motivation der Arbeit
Insgesamt sind weit über 2500 Tetrahydroisochinolin-Alkaloide bekannt.[173]
Diese stellen somit die größte Gruppe innerhalb der Alkaloide dar.[174] Unter ihnen
finden sich sehr viele Wirkstoffe, wie z.B. das Morphin. [174]
Die junge Gruppe der Naphthylisochinolin-Alkaloide, der mittlerweile mehr als
120 Vertreter angehören, nehmen unter den Tetrahydroisochinolin-Alkaloiden eine
biosynthetische Sonderstellung ein, da sie nicht aus den aromatischen Aminosäuren
Phenylalanin oder Tyrosin durch eine Pictet-Spengler-Reaktion hervorgehen, sondern
auf
acetogeninem
Wege
entstehen.[36]
Fütterungsexperimente mit uniform markiertem
Dieser
13
Befund
wurde
durch
C2-Natriumacetat an pflanzlichen,
soliden Gewebekulturen der tropischen, zeitweise carnivoren Liane Triphyophyllum
peltatum (Dioncophyllaceae) erarbeitet. Dabei konnte durch das genaue
13
C2-
Einbaumuster in das Naphthylisochinolin-Alkaloid Dioncophyllin A (45) der
acetogenine Charakter dieser Naturstoffe bewiesen werden. Noch immer sind sterile
biologische Systeme ein unverzichtbares Instrument zur detaillierten Aufklärung von
interessanten pflanzlichen Biosynthesewegen und stellen darüber hinaus eine
nachhaltige Quelle bioaktiver Inhaltsstoffe dar.[175]
Bei Dioncophyllin A (45) handelt es sich um ein Naphthylisochinolin-Alkaloid
des sogenannten Dioncophyllaceen-Typs mit R-Konfiguration an C-3 und fehlender
Oxygenierung an C-6. Zusätzlich zu diesem Typ können noch drei weitere Typen
innerhalb der Naphthylisochinolin-Alkaloide unterschieden werden (Abb. 46),
namentlich der Ancistrocladaceen-Typ,[176] der Hybrid-Typ[177] und der inverse HybridTyp.[177] Ein wesentliches strukturelles Charakteristikum dieser Naturstoffklasse ist die
Verknüpfung des Naphthalinteils mit dem Isochinolingerüst, was auch die strukturelle
Diversität begründet (Abb. 47). Erst kürzlich gelang es, neuartige N,C-gekuppelte
Vertreter[178] zu entdecken.
Allgemeiner Teil
89
Um die Biogenese dieser Alkaloide detailliert zu untersuchen, reichen die bereits
etablierten soliden Gewebekulturen von Triphyophyllum peltatum also nicht aus, da
diese nur Alkaloide des Dioncophyllaceen-Typs produzieren. Ein wichtiges Ziel war es
somit, Vorschriften für die Entwicklung pflanzlicher Gewebekulturen zu entwickeln,
die dazu befähigen, Naphthylisochinolin-Alkaloide anderer Typen, besonders aber des
Ancistrocladaceen-Typs, zu gewinnen.
Ancistrocladaceae-Typus
Dioncophyllaceae-Typus
Me
Me O 6
Me
3
6
R
P
R
OH
MeO
OH
MeO
NH
3
N
R
M
Me
Me
S
Me
Me
OMe Me
MeO
Ancistrotectorin (47)
Dioncophyllin A (45)
Inverser-Hybrid-Typus
Hybrid-Typus
MeO 6
3 Me
6
R
Me
P
MeO
MeO
Me OH
Me
MeO
3
Me
S
P
R
OH
N
Me
Me
MeO
Ancistrobrevin C (48)
Dioncolin A (49)
Abb. 46. Klassen von Naphthylisochinolin-Alkaloiden.
Bereits in der Vergangenheit war es unserer Gruppe zwar gelungen,
Kalluskulturen von Ancistrocladus heyneanus und Ancistrocladus barteri zu
etablieren,[179] doch mit Hilfe der empfindlichen LC-MS-Analytik ließen sich nur
Spuren von Naphthylisochinolin-Alkaloiden nachweisen, woduch Experimente zur
Biosynthese dieser interessanten Alkaloide nicht durchführbar waren. Diese Kulturen,
besonders Flüssigkulturen von Ancistrocladus heyneanus produzieren allerdings große
Mengen von Naphthochinonen, wie Plumbagin (44). Diese Verbindungen sind als
90
Allgemeiner Teil
Stressmetabolite aufgrund der mechanischen Bewegungen des Schüttlers zu
betrachten.[180]
1 Beispiel
28 Beispiele,
z.B.
24 Beispiele,
z.B.
MeO
OMe
OH
Me
MeO
1'
M
5
MeO
MeO OH
OH
3’
M
5
Me
S
Me
OMe Me
N
Me
bislang
nicht
beobachtet
N
OH
3
8' P
5
HO
R
Ancistrotanzanin A (51)
MeO
Me
HO
Ancistrobenomin A (50)
5,6'
5,3'
5,1'
5,8'
2 Beispiele,
z.B.
1 Beispiel
S
OH
+
M
3'
X
Me
Me
2
R/S
R/S
Me
OMe
Me
8'
N
M
MeO
1'
Me
Ancistrocladinium B (53)
7,8'
5 Beispiele,
z.B.
N
7
Me OH
Me
ent-Dioncophyllein A (56) MeO
MeO
OH
Me
S
M
7
R
N
3'
Me
10 Beispiele,
z.B.
6'
7
OH
Me
Ancistrotectorin (47)
R
OMe
OH
P
7
8'
OH
R
4
Me
R
R
Me
OMe Me
Me
HO
7,6'
7 Beispiele,
z.B.
OMe
OMe Me
Me
7,1'
7,3'
OH
P
X = H, OR
Me
+
N 6'
1'
Ancistrocladinium A (57)
32 Beispiele,
z.B.
S
N,6'
H
7
OH
OMe
Me
MeO
OH
6'
N,8'
N 8’
MeO
NH
Me
Korupensamin A (52)
5
Me
MeO
MeO
Dimere
Me
R
N
OMe Me
HO
H
N
Dimere
Me
MeO
Yaoundamin A (54)
Me
Dioncophyllinol B (55)
Abb. 47. Vielfalt der Kupplungstypen von Naphthylisochinolin-Alkaloiden.
Da für die Biosyntheseforschung Systeme erforderlich sind, die zuverlässig
gewünschte
Metabolite
in
ausreichenden
Mengen
produzieren,
mußte
eine
Gewebekultur einer anderen Ancistrocladus-Art entwickelt werden. Pflanzen der
Familien Ancistrocladaceae und Dioncophyllaceae stellen eine Herausforderung für die
Biotechnologie dar, weil sie als äußerst problematisch in puncto Kultivierung
gelten.[181,182]
7.2
Etablierung einer Gewebekultur von A. abbreviatus
Ancistrocladus abbreviatus aus Westafrika ist ein äußerst lohnendes Objekt für
die Gewinnung einer sterilen Gewebekultur, da diese Pflanze eine große Palette an
Naphthylisochinolin-Alkaloiden produziert, welche nahezu alle Typen dieser Alkaloide
Allgemeiner Teil
91
beinhaltet. Diese tropische Liane wird, von unserer Gruppe betreut, im Gewächshaus
des Botanischen Gartens der Universität Würzburg kultiviert. Somit war es in der
Vergangenheit ausgehend von insterilem Material gelungen, axenische Kulturen
anzulegen,[179] welche routinemäßig auf einem modifizierten Anderson-RhododendronMedium kultiviert werden. Zwar wäre es durchaus denkbar, Biosyntheseexperimente
mit diesen Kulturen durchzuführen, doch brächte die Abkehr von GanzpflanzenSystemen aus mehrerlei Gründen einen wesentlichen Fortschritt. So werden
Gewebekulturen stets gegenüber Organkulturen vorgezogen, weil von ersteren in kurzer
Zeit viel Biomasse und, damit verbunden, meist auch eine größere Menge an
Sekundärmetaboliten gebildet werden, weshalb der Einsatz pflanzlicher Zellkulturen zur
Produktion von einigen Naturstoffen selbst in industriellem Maßstab diskutiert
wird.[183,184] Desweiteren ist sowohl die Handhabung von Gewebekulturen als auch die
Applikation markierter Precursoren einfacher und effektiver als bei Organkulturen, da
ihre Aufnahme durch die Zellen besser gewährleistet ist. Zudem sind die Einbauraten
bei der Verwendung von Gewebekulturen in der Regel sehr viel höher, als dies für
Organkulturen der Fall ist.[48]
Biomaterial zur Induktion von Kallusbildung wurde somit ausgehend von den
bereits angelegten axenischen Kulturen von Ancistrocladus abbreviatus rekrutiert. Zum
Einsatz kamen dabei zwei verschiedene Substratformulierungen: BAP und D14, welche
Cytokine und Auxine in unterschiedlichen definierten Konzentrationen enthielten.
Die Explantatwahl der Kalluskultur hat generell entscheidenden Einfluß auf die
Fähigkeit, Alkaloide zu produzieren. So war die Gewebekultur von Ancistrocladus
heyneanus aus Wurzelexplantaten hervorgegangen, war aber nicht in der Lage,
Naphthylisochinolin-Alkaloide zu biosynthetisieren. Deshalb fiel die Explantatwahl im
Falle von Ancistrocladus abbreviatus auf die Blätter. Alle Blattexplantate in einem
Kulturgefäß bildeten Kallus an den Schnittflächen der Mittelrippe auf MS-basiertem
D14-Medium supplementiert mit je 0.5 mg/L BAP, 2,4-D und NAA und 1/5 der
Makroelemente. Keinerlei Ansatz von Kallusbildung zeigte sich auf Substrat mit 0.5
mL/l BAP und 0.01 mg/L NAA. Dabei hatte die Exposition der Blattexplantate auf dem
D14-Medium wesentlichen Einfluß auf das Resultat. So bildete sich der zunächst rein
weiße Kallus nur auf solchen Blattexplantaten, welche mit der Blattoberseite in das
Substrat plaziert worden waren. Da sich der Kallus, welcher eine vorteilhaft feste
Konsistenz aufwies, erst nach etwa drei Monaten nach Ausbringung der Explantate
92
Allgemeiner Teil
zeigte (s. Abb. 48), mußte darauf geachtet werden, daß die Explantate etwa 0.5 cm breit
waren, damit ein Austrocknen während dieser Periode verhindert werden konnte. Zur
Subkultivierung konnte der gewonnene Primärkallus problemlos mit einem Skalpell von
der Mittelrippe abgetrennt und separat auf demselben Medium (D14-Medium)
ausgebracht werden.
Abb. 48. Weißlicher Kallus von Ancistrocladus abbreviatus.
Leider zeigten sich nach dieser ersten Subkultivierung bereits massive Probleme
mit bräunlich bis schwarz werdendem Kallusgewebe (Abb. 49). Vermutlich wurde
dieses „browning“ durch polyphenolische Substanzen[185] verursacht, welche auch in
das Substrat abgegeben worden waren und chemischen Stress auf das biologische
System ausübten. So wurden sowohl das Wachstum und auch die Biosynthese von
Sekundärmetaboliten beeinflußt. Da bereits dem in der Substratformulierung
enthaltenen Phytohormon 2,4-D eine mutagene Wirkung zugeschrieben wird,[175] war es
unumgänglich, das „browning“ zu unterbinden.
Allgemeiner Teil
93
Abb. 49. Dunkelfärbung des Kallus von Ancistrocladus abbreviatus nach der ersten
Subkultivierung
In der Literatur werden mehrere Strategien diskutiert, die positive Effekte auf
eine solche morphologische Veränderung des Gewebes haben. So kommen
Antioxidantien und Verbindungen in Frage, welche generell polyphenolische
Verbindungen binden können.[186,187] Da auf 2,4-D in der Formulierung nicht verzichtet
werden konnte, sollten Aktivkohle (AC), Glutathion (GSH), Polyvinylpolypyrrolidon
(PVPP) und Polyvinylpyrrolidon (PVP) als mögliche Zusätze des Mediums untersucht
werden. Dabei wurden zwei Versuchsansätze verfolgt. Noch weiße Kalli verbrachte
man zur ersten Passage jeweils auf Medium mit einem Zusatz, um zu beobachten, ob
sich das „browning“ eventuell verhindern ließ. Eine zweite Versuchsreihe sollte zeigen,
ob derart supplementiertes Substrat dazu fähig ist, bräunliches Kallusgewebe wieder in
weißliches Gewebe zu verwandeln. Die Resultate der beiden Versuchsreihen sind in den
Tabellen 2 und 3 zusammengefaßt. Der Schlüssel der dargestellten Ergebnisse ist dabei
wie folgt:
94
Allgemeiner Teil
- = kein bis sehr geringes Wachstum
+ = normales Wachstum
++ = verdoppeltes Wachstum
+++ = verdreifachtes Wachstum
Tabelle 2.
Resultate des Einflusses verschiedener Medien auf die Kalli von A. Abbreviatus
nach der ersten Passage
Medium
Wachstum
Farbe
Kontrolle (D14)
-
schwarz
Zweifach starkes D14
-
schwarz
Häufigere Passage
+
schwarz
D14 supplem. mit GSH
+
weißlich
D14 supplem. mit AC
++
weißlich
D14 supplem. mit PVP
-
weißlich
D14 supplem. mit PVPP
+++
weißlich
Tabelle 3.
Resultate des Einflusses verschiedener Medien auf die Kalli von A. Abbreviatus
nach der zweiten Passage
Medium
Wachstum
Farbe
Kontrolle (D14)
-
schwarz
Zweifach starkes D14
-
schwarz
Häufigere Passage
-
schwarz
+++
weißlich
D14 supplem. mit AC
-
weißlich
D14 supplem. mit PVP
-
weißlich
D14 supplem. mit PVPP
+
weißlich
D14 supplem. mit GSH
Allgemeiner Teil
Tabelle 4.
95
Resultate des Einflusses verschieder Medien auf die Regeneration von Kalli von
A. abbreviatus
Medium
Wachstum
Farbe
Kontrolle (D14)
-
schwarz
Zweifach starkes D14
-
schwarz
+++
weißlich
D14 supplem. mit AC
+
weißlich
D14 supplem. mit PVP
-
braun
D14 supplem. mit PVPP
-
braun
D14 supplem. mit GSH
Was die Verhinderung des „browning“ von noch weißem Kallus anbelangt, so
waren bis auf PVP nahezu alle verwendeten Zusätze geeignet. Zieht man jedoch das
Wachstum als wichtigen Parameter für die biotechnologische Produktion von
Gewebekulturen heran, so zeigte sich, daß besonders D14-Medium mit PVPP
supplementiert nicht nur das Phänomen des „browning“ unterbindet, sondern das
Wachstum nach der ersten Passage sogar verdreifachen kann, bezogen auf die Fläche.
Der potenteste Zusatz nach der zweiten Passage hingegen war Glutathion
(GSH). Dieses Antioxidativum ist darüber hinaus in der Lage, schon dunkles Gewebe
wieder zur Bildung von weißlichen Zonen zu leiten (Tabelle 4).
Zur optimalen Gewinnung von Gewebekulturen von Ancistrocladus abbreviatus
(Ancistrocladaceae) mußte daher ein dreistufiges System herangezogen werden. So
brachte man zunächst Blattexplantate auf zusatzfreiem D14-Medium zur Induktion von
Primärkallus aus. Die erste Passage des Folgekallus wurde auf einem Medium mit
PVPP durchgeführt, damit das Wachstum forciert und das „browning“ verhindert
werden konnte. Alle folgenden Subkultivierung erfolgten auf Medium mit Glutathion
als Zusatz. Ein optimales Wachstum wurde auf Festmedium in Petrischalen in
Dunkelheit bei dreiwöchigem Transfer erreicht. Es war darauf zu achten, daß eine
Temperatur von 25° C eingehalten wurde, was am besten in einem Inkubator
durchzuführen war. Die Kultivierung in Flüssigkultur, d.h. als Schüttelkultur bei 85
96
Allgemeiner Teil
RPM war zwar möglich, doch wurde durch den damit verursachten mechanischen
Stress die Biosynthese der Naphthylisochinolin-Alkaloide eingeschränkt.
Generell produzieren sowohl dunkle als auch weiße Gewebekulturen von
Ancistrocladus abbreviatus Naphthylisochinolin-Alkaloide (Abb. 50 und Abb. 51).
Allerdings liegen bei hellerer Morphologie zusätzlich weitere Alkaloide vor. Ziel war
es, zuverlässig reproduzierbare Resultate mit Zellkulturen zu erhalten, wie dies nur
durch Vermeidung von Stress bedingt durch polyphenolische Verbindungen erreichbar
war.
UV [µAU]
A. abbreviatus
schwarzer Blattkallus
t/[min]
Abb. 50. Chromatogramm des methanolischen Rohextrakts der dunklen Gewebekultur von
Ancistrocladus abbreviatus.
Allgemeiner Teil
97
UV [µAU]
1
2
3
4
A. abbreviatus
weißer Blattkallus
t/[min]
Abb. 51. Chromatogramm des methanolischen Rohextrakts der hellen Gewebekultur von
Ancistrocladus abbreviatus mit gekennzeichneten Peaks, die zur phytochemischen
Analyse isoliert worden waren.
Im Extrakt der Gewebekulturen von Ancistrocladus abbreviatus konnten durch
qualitative phytochemische Analyse (HPLC-UV, -MS und NMR) NaphthylisochonolinAlkaloide nachgewiesen werden. So wies Peak 1 eine Masse von 394.5 [M+], Peak 2
von 378.5 [M+], Peak 3 von 364.5 [M+] und Peak 4 von 408.5 [M+] auf. Neben dem
Laufverhalten in der LC und dem charakteristischen Muster von NaphthylisochinolinAlkaloiden im 1H-NMR-Spektrum waren die gefundenen Massen typisch für diese
Alkaloidklasse. Dies wurde durch die Bestimmung exakter Massen (HRMS) zusätzlich
gestützt: Im HRMS zeigte Peak 1 eine Masse von 394.2013 [M+], Peak 2 von 378.2054
[M+], Peak 3 von 364.1915 [M+] und Peak 4 von 408.2181 [M+] auf. Bei Peak 2
handelte es sich höchst wahrscheinlich um Dioncophyllin A (45), ein Alkaloid des
Dioncophyllaceen-Typs. Bei den anderen Massen hingegen könnte es sich auch um
Alkaloide des Ancistrocladaceen-Typs handeln.
Somit steht mit den soliden Gewebekulturen von Ancistrocladus abbreviatus
erstmalig ein Instrument zur verläßlichen Produktion von NaphthylisochinolinAlkaloiden mehrerer Typen zur Verfügung. Dieses biologische System wird besonders
dazu dienen, die Biosynthese des Ancistrocladaceen-Typus detailliert zu erforschen. In
naher Zukunft werden Precursoren in
13
C-markierter Form, die Herr S. Rüdenauer aus
98
Allgemeiner Teil
unserer Arbeitsgruppe synthetisiert, in Fütterungsexperimenten appliziert werden. Die
hier durchgefühte Studie wurde im Rahmen des DFG-Schwerpunkts „SPP 1152 –
Evolution metabolischer Diversität“ durchgeführt.
Zusammenfassung
8
99
Zusammenfassung
Polyketide stellen aufgrund ihrer großen strukturellen Vielfalt nach wie vor Leit-
und Wirkstoffe für die Pharma- und Pflanzenschutzforschung in den Industrieländern
dar und bilden außerdem eine der wichtigsten Klassen von Naturstoffen
(Sekundärmetaboliten) überhaupt.
Besonders die Biosynthese aromatischer Polyketide und die hierbei involvierten
Enzyme, die Polyketidsynthasen (PKS), wurden von Biosyntheseforschern als
hervorragendes Modellsystem zur Untersuchung von Struktur-Funktions-Beziehungen
von Multienzymkomplexen erkannt. Für annelierte aromatische Polyketide existiert seit
dem Jahr 2001 eine biosynthetische Klassifizierung auf Metabolitebene, das sogenannte
Modus-F/S-System, mit dessen Hilfe man zwischen pro- und eukaryotischen
Produzenten unterscheiden kann. Die Erforschung der detaillierten Biosynthese von
aromatischen Polyketiden ist somit in mehrfacher Hinsicht ein lohnendes Ziel.
In der vorliegenden Dissertation sollten die Biosynthese und die Faltungsmodi
ausgewählter aromatischer Polyketide einschließlich der Charakterisierung potentieller
Vorstufen in verschiedensten biologischen Systemen untersucht werden. Die dabei
gewonnenen Resultate sind das Ergebnis interdisziplinärer Zusammenarbeit.
Im Einzelnen wurden folgende Ergebnisse erzielt:
•
In Kooperation mit Prof. H.-P. Fiedler vom Institut für Mikrobiologie der
Universität Tübingen wurde erstmalig Chrysophanol (4) als Hauptmetabolit des
prokaryotischen Organismus Nocardia Acta 1057, nachgewiesen. Dieser Befund
ermöglichte eine vergleichende Biosynthesestudie bezüglich der auftretenden
Polyketidfaltungsmodi in pro- und eukaryotischen Organismen.
Durch die komparative Biosynthesestudie konnte erstmalig klar nachgewiesen
werden, daß Chrysophanol (4) das erste Polyketid überhaupt ist, welches durch
mehr als einen Faltungsmodus biosynthetisiert wird. So zeigten die
Untersuchungen, daß sowohl der Modus F als auch der Modus S während der
Biogenese von 4 realisiert werden. Zuvor war lediglich vermutet worden, daß
100
Zusammenfassung
dieses einfache aromatische Polyketid auf mehreren Faltungsweisen zustande
kommen könne und einen biosynthetischen Prototyp darstelle.
Inkorporationsexperimente mit uniform markiertem
13
Analyse
mittels
des
isolierten
Chrysophanols
(4)
C2-Acetat und sukzessive
13
C-NMR-
und
INADEQUATE-NMR-Experimenten ergaben folgende Resultate:
•
In
Schüttelkulturen
des
Mikroorganismus
Drechslera
catenaria
syn.
Helminthosporium catenarium wurde der für Pilze erwartete Modus F bestimmt.
•
Beim Fütterungsexperiment mit flüssigen Gewebekulturen von Kniphofia uvaria
(Asphodelaceae) konnte gezeigt werden, daß das pflanzliche System ebenfalls
den Modus F realisiert, wie dies hier bereits für den Pilz gezeigt wurde.
•
Für das Bakterium Nocardia Acta 1057 wurde der Modus S klar nachgewiesen,
jedoch finden sich ebenfalls Hinweise für die Variante S'.
•
Im Chrysophanol-produzierenden Insekt Galeruca tanaceti (Chrysomelidae)
wird das Polyketid nach dem Faltungsmodus F biosynthetisiert.
Zusammenfassung
101
HO
Me
8x
SCoA
O
OH
O
Modus F
Me
O
3
HO
8x
O
O
O
Modus F'
HO
(Noch) nicht
entdeckt
O
OH
Me
Me
O
11
SCoA
O
SCoA
HO
Me
O
OH
3
8x
4
10
SCoA
OH
Me
und Insekt
Me
O
SCoA
O
in Pilz, Pflanze
O
HO
4
O
OH
O
Modus S
HO
O
OH
Me
im Bakterium
Me
O
O
3
HO
Me
8x
SCoA
O
3
•
SCoA
4
12
O
OH
Modus S'
kann nicht
ausgeschlossen
werden
HO
Me
O
O
O
Me
SCoA
O
13
13C
2
OH
13C
1
4
Diese Resultate zeigen, daß Polyketidsynthasen eukaryotischer Organismen das
aromatische Polyketid Chrysophanol (4) nach dem Modus F bilden und sich
ganz erheblich von den PKS der Prokaryonten unterscheiden, welche
ausschließlich den Faltungsmodus S realisieren. Dieser Befund läßt somit
Rückschlüsse bezüglich der Evolution im Sinne einer konvergenten Biosynthese
zu, da beide Organismengruppe verschiedene PKS mit unterschiedlichen
Enzymaktivitäten entwickelt haben. Der Produzent des Chrysophanols (4) im
untersuchten Insekt Galeruca tanaceti ist definitiv kein prokaryotischer
Endosymbiont. Es ist wahrscheinlicher, daß es sich dabei um einen pilzlichen
Endosymbionten oder gar das Insekt selbst handelt. Die letztere These wird
durch Experimente der Arbeitsgruppe von Prof. M. Hilker mit Fungiziden und
Antibiotika gestützt, welche keinerlei Einfluß auf die Produktion von 4 in Eiern
und Larven des Blattkäfers hatten. Denkbar in diesem Zusammenhang wäre ein
102
Zusammenfassung
horizontaler Gentransfer in das Insektengenom, welcher zur Befähigung,
Chrysophanol (4) zu produzieren, geführt haben könnte.
•
Während der vorliegenden Biosynthesestudie konnte allerdings keine der beiden
postulierten Varianten Modus F' oder Modus S' in den untersuchten biologischen
Systemen sicher nachgewiesen werden. Für die Existenz des postulierten Modus
S' finden sich in den NMR-Daten jedoch erste Hinweise, welche dessen
Realisierung zu einem kleineren Prozentsatz nicht eindeutig ausschließen
können.
•
Bei der Suche nach potentiellen Intermediaten der Anthrachinon-Biosynthese
im Bakterium Streptomyces AK 671 wurden neben zwei bereits durch unsere
Arbeitsgruppe isolierten polyketidischen Naturstoffen noch weitere interessante
Verbindungen in Kooperation mit To. Gulder und I. Kajahn durch abgewandelte
Fermentation des OSMAC-Stammes (von Engl. OSMAC = one strain many
compounds = ein Stamm viele Verbindungen) gefunden. Dabei handelt es sich
sowohl bei Chrysophanol-8-O-β-D-(28) als auch bei Prächrysophanol-8-O-β-Dglucuronid (29) jeweils um einen neuen Naturstoff.
HO
O
OH
O
OH
HO2C
HO
8
HO
O
O
O
O
HO2C
HO
O
OH
HO
Me
Me
OH
O
28
•
O
8
29
Für die Biosynthese von Chrysophanol (4) in höheren Pflanzen wies man in
flüssigen Gewebekulturen von Kniphofia pumila (Asphodelaceae) die später in
der Biosynthese auftretende Zwischenstufe Prä-Chrysophanol-8-O-ß-D-glucosid
(30) nach.
Zusammenfassung
103
OH
O
HO
HO
O
OH
O
8
OH
Me
OH
30
•
Aus Wurzeln und Knollen von Asphodelus aestivum syn. Asphodelus
microcarpus (Asphodelaceae) konnte jeweils Asphodelin (37) (= 4,7'Bichrysophanol) sowohl aus einer Wildaufsammlung als auch aus einer In-vitroOrgankultur isoliert werden. Die Sterilkultur wurde auf einem in unserer
Arbeitsgruppe zuvor für Asphodelaceen entwickelten Vorschrift zu diesem
Zweck erfolgreich etabliert.
Vom
isolierten
Naturstoff
Asphodelin
(37)
wurde
während
der
stereochemischen Analyse ein CD-Spektrum (CD = Circulardichroismus)
aufgenommen, welches mit CD-Kurven verglichen wurde, die von der
computerchemischen Sektion unserer Arbeitsgruppe quantenchemisch durch
CNDO/S und OM2 berechnet worden waren. Dabei zeigten sich für das PEnantiomer sehr gute Übereinstimmungen im CNDO/S- und gute im OM2Modell. Somit konnte die absolute Konfiguration als P bestimmt werden. Bei
Enantiomerenanalytik an chiraler Phase wurde das M-Enantiomer nicht
detektiert, was darauf hindeutete, daß Asphodelin (37) in Asphodelus aestivum
wahrscheinlich enantiomerenrein vorliegt.
OH
Me
4
7’
P
HO
O
O
•
OH
O
OH
O
Me
37
104
•
Zusammenfassung
Durch Einsatz von INADEQUATE- und SELINQUATE-NMR-Experimenten
gelang
die
Bestimmung
des
detaillierten
Acetat-Einbaumusters
des
konstitutionell unsymmetrischen Biaryl-Naturstoffs Knipholon (5). Es zeigte
sich, daß die nördliche Molekülhälfte dieses Phenylanthrachinons nach dem
Polyketidfaltungsmodus F biosynthetisiert wird, wie das bereits für die Bildung
dieser Molekülhälfte in freier Form in Pflanzen im Rahmen der vorliegenden
Arbeit nachgewiesen werden konnte.
O
HO
OH
Me
O
HO
M
OH
Me
MeO O
5
Bei der Biogenese des Phenylanteils kommt es überraschenderweise nicht zu
einer chemisch zu erwartenden Randomisierung der C2-Einheiten. Dieses
Phänomen gab einen ersten Hinweis auf das Fehlen einer symmetrischen
Acetophenonvorstufe, genauer des 2,4,6-Trihydroxyacetophenons (41).
OH
HO
Me
OH
O
41
Inkorporationsexperimente mit synthetisierten, fortgeschrittenen Precursoren in
13
C-markierter Form erbrachten endgültig den Nachweis, daß tatsächlich kein
symmetrisches Biosyntheseintermediat in der Reaktionssequenz auftritt, da
lediglich der unsymmetrische Vorläufer 2,4-Dihydroxy-6-methoxyacetophenon
(38) in isotopenmarkierter Form in das Zielmolekül eingebaut wurde. Damit
steht fest, daß es sich bei dem Kupplungsedukt der seltenen unsymmetrischen
Biarylkupplung bereits um ein unsymmetrisches Acetophenon handeln muß. Die
phenoloxidative Kupplung findet sehr früh, d.h. wohl unmittelbar nach der
Zusammenfassung
105
Bildung der beiden acetogeninen Bausteine, statt. Somit ist anzunehmen, daß
das verantwortliche tailoring enzyme auch in einem engen räumlichen Kontakt
zur involvierten PKS steht.
O
O
PKS
8 HOAc
O
O
O
O
O
O
O
HO
SCoA
Me
Me
X
9a
O
PKS
4 HOAc
=
Me
O
Me
O
O
SR
X = O (Chrysophanol) (4)
X = H2 (Chrysophanol-Anthron) (21)
SR
O
O
O
O
O
a
b
5
HO
OH
3
MeO
HO
=
S
3
HO
Me
O
MeO
HO
HO
O
Me
b
OH
b
2) Phenol-oxidative
Kupplung
S
OH
MeO
O
OH
HO
Me
Me
O
MeO
A+B
C2-Randomisierung
(nicht detektierbar)
O
B
(>90%)
•
Me
OH
HO
A
OH
HO
PKS
38
a
(nicht detektiert)
Effiziente Biosyntheseuntersuchungen an
schnellwachsende
Gewebekulturen
pflanzlichen Systemen
voraus,
welche
die
setzen
gewünschten
Zielmoleküle in ausreichenden Mengen produzieren. Ein derartiges biologisches
System wurde aus Explantaten von Organkulturen der Ancistrocladacee
Ancistrocladus abbreviatus generiert. Mit der Etablierung dieser Gewebekultur
wurde
die
Grundlage
für
?
SR O
Me
a!
MeO
O
Me
OH
5
38
Me
O
Me
PKS
+ OMT
1) O-Methylierung
HO
OH
Modus F
weitere
Biosyntheseuntersuchungen
an
Naphthylisochinolin-Alkaloiden geschaffen worden, da die Zellkultur – erstmals
– auf solidem Medium neben Alkaloiden des Dioncophyllaceen-Typs auch
O
106
Zusammenfassung
solche des Ancistrocladaceen-Typs biosynthetisiert. Es wurde eine dreistufige
Vorschrift unter Verwendung mehrerer Phytohormone und Antioxidantien
erarbeitet, um eine Braunfärbung des Substrats und des pflanzlichen Gewebes
durch
polyphenolische
Verbindungen
nachhaltig
zu
unterbinden.
Die
entwickelte Kultivierungsvorschrift garantiert die Bildung einer weißen
Gewebekultur, welche zudem in der Lage ist, auch interessante Molekülhälften
von Naphthylisochinolin-Alkaloiden zu produzieren. Diese Studie wurde im
Rahmen des DFG-Schwerpunkts „SPP 1152 – Evolution metabolischer
Diversität“ in enger Kooperation mit Prof. T. Kutchan durchgeführt.
Abschließend kann festgehalten werden, daß die in dieser Arbeit eingesetzte
Kombination
Aufklärung
biotechnologischer
der
detaillierten
und
chemisch-analytischer
Biosynthese
mehrer
Methoden
aromatischer
zur
Polyketide
unterschiedlicher biologischer Herkunft geführt hat. Insbesondere die Bestimmung
der Faltungsmodi und die klassische Strukturaufklärung biosynthetischer VorläuferStufen trug hier zu einem vertieften Verständnis über den Aufbau aromatischer
PKS-Produkte bei.
Summary
9
107
Summary
Polyketides constitute one of the most important classes of natural products
(secondary metabolites) because of their vast structural variety. The pharmaceutical and
crop protection companies still generate a great deal of lead structures based on
polyketides.
In particular the biosynthesis of aromatic polyketides and the enzymes involved
therein, the polyketide synthases (PKSs), have been recognized by researchers as an
ideal model system for the study of structure-function relationships in multienzyme
complexes. Since 2001, a classification of fused-ring aromatic polyketides at a
metabolic level exists: the so-called F/S-mode-system. This method enables the
experimenter to determine the biological origin (prokaryotes vs. eukaryotes) of a
polyketidic natural product. Therefore, to investigate the detailed biosynthesis of
aromatic polyketides is a rewarding goal in many aspects.
This thesis deals with the biosynthesis and the determination of polyketide
folding modes of selected fused-ring aromatic polyketides in various biological systems.
In addition, the structural elucidation of potential biosynthetic intermediates has been
achieved. The findings reported here arose from fruitful interdisciplinary cooperations.
In detail, the following results were obtained:
•
In cooperation with Prof. H.-P. Fiedler from the Institute of Microbiology at the
University of Tübingen, chrysophanol (4) was detected for the first time as a
main compound in a prokaryotic organism, namely in the Nocardia strain Acta
1057. This finding opened the door for a comparative biosynthetic study on the
polyketide folding modes realized in both, pro- and eukaryotic organisms. In this
comparative biosynthetic study chrysophanol (4) was identified to be the first
polyketide ever built up via more than one mode of folding. The results showed
that mode F as well as mode S were realized during the biogenesis of 4. Before
it was only assumed that the simple aromatic polyketide could be built up via
different polyketide folding modes and could be a biosynthetic prototype.
108
Summary
The incorporation experiments with uniformally labelled
13
C2-acetate in
addition with 13C-NMR and INADEQUATE-NMR analysis of the chrysophanol
(4) isolated showed, in detail, the following results:
•
In shake cultures of the fungus Drechslera catenaria syn. Helminthosporium
catenarium the mode F was clearly identified, which was expected for fungi.
•
During feeding experiments, liquid tissue cultures of Kniphofia uvaria
(Asphodelaceae) were identified to biosynthesize chrysophanol (4) via folding
mode F, as was shown in this study for the fungus (see above).
•
The bacterium Nocardia Acta 1057 was detected to use mode S, but there were
also hints of the existence of variant mode S'.
•
The authentic producer of the natural product in the insect Galeruca tanaceti
(Chrysomelidae) utilizes the polyketide folding mode F.
Summary
109
HO
Me
8x
SCoA
O
O
OH
O
mode F
Me
O
3
HO
8x
O
O
O
HO
not (yet)
detected
O
OH
Me
Me
O
11
SCoA
O
SCoA
HO
Me
O
OH
mode F'
3
8x
4
10
SCoA
OH
Me
and insect
Me
O
SCoA
O
in fungus, plant,
HO
4
O
OH
O
mode S
HO
O
OH
Me
in bacterium
Me
O
O
3
HO
Me
8x
SCoA
O
3
O
OH
mode S'
HO
Me
O
O
OH
O
can not be
excluded
Me
SCoA
O
4
13
13C
•
4
SCoA
12
2
13C
1
These results clearly show that polyketide synthases of eukaryotic organisms
form the aromatic polyketide chrysophanol (4) exclusively by mode F. Hence,
eukaryotic and prokaryotic PKSs differ strongly because the latter produce the
polyketide exclusively via mode S. This finding might raise interesting
conclusions about the evolution of the convergent biosynthesis being presented,
since both groups of organisms have developed different PKSs with varying
enzyme activities. The authentic producer of chrysophanol (4) in the insect
investigated, Galeruca tanaceti (Chrysomelidae), is definitely not a bacterial
endosymbiont. It is more likely that a fungal endosymbiont is involved or that
the insect itself is responsible for the production. The latter assumption was
supported by experiments in the working group of Prof. M. Hilker with
fungicides and antibiotics, which had no impact on the production of 4 in eggs
and larvae of the leaf beetle. It would be conceivable in this context that a
110
Summary
horizontal gene transfer into the insect genome might have occurred, enabling
the production of chrysophanol (4).
•
During the course of the study clear evidence was not gained about the existence
of the postulated polyketide folding mode F' or mode S' in the biological
systems investigated. In the case of the postulated mode S' NMR-data provided
some first hints, which could not exclude its realization, to a smaller extent.
•
The search for potential intermediates of the anthraquinone biosynthesis in the
bacterium Streptomyces AK 671 in cooperation with To. Gulder and I. Kajahn
resulted in the finding of two substances, which had been previously isolated by
our group and the discovery of two new natural products, which have been
isolated from this OSMAC strain (OSMAC = one strain many compounds) by
modified fermentation in different bioreactors. Those two novel natural products
have been named chrysophanol-8-O-β-D-glucuronide (28) and Prächrysophanol8-O-β-D-glucuronide (29).
HO
O
O
OH
OH
HO2C
HO
8
O
O
O
O
HO2C
HO
O
OH
HO
HO
Me
Me
OH
O
28
29
Concerning the biogenesis of chrysophanol (4) in higher plants, a late
biosynthetic intermediate was identified in liquid tissue cultures of Kniphofia
pumila (Asphodelaceae), namely prechrysophanol-8-O-ß-D-glucuside (30).
OH
•
O
8
HO
HO
O
O
OH
OH
O
8
Me
OH
30
Summary
•
111
Out of roots and tubers of Asphodelus aestivum syn. Asphodelus microcarpus
(Asphodelaceae), the 4,7'-bichrysophanol asphodelin (37) was isolated. The
plant material was derived from a collection at a natural site on the one hand and
of in vitro organ cultures established on the other hand. The sterile culture was
raised successfully for this purpose using a procedure developed in our group for
members of the Asphodelaceae family.
•
From the isolated natural product asphodelin (37) a CD-spectrum (CD =
circulardichroism) was recorded during the course of a stereochemical analysis,
which was subsequently subject to comparison with CD-curves calculated
quantumchemically by the computational chemistry section of our research
group, with the two basis sets CNDO/S and OM2. Moreover, a very good
agreement was observed for the P-configured asphodelin enatiomer with the
CNDO/S-approach and good agreement was observed with the curve calculated
using the OM2-method. Therefore, the absolute configuration was determinated
to be P. Further evidence was given by analyzing the pure compound on chiral
phase, with which it was not possible to detect the M-enantiomer. This result
raises the conjecture that asphodelin (37) occurs enatiomerically pure in
Asphodelus aestivum.
Me
4
7’
P
HO
O
O
OH
OH
O
OH
O
Me
37
•
Use of INADEQUATE and SELINQUATE NMR experiments led to the
determination of the detailed acetate incorporation pattern of the constitutionally
112
Summary
unsymmetrical biaryl natural product knipholone (5). During the course of the
biosynthetic study it was shown that the northern moiety of this
phenylanthraquinone is biosynthesized via polyketide folding mode F, as it was
found in this work in plants for the formation of the anthraquinone part in its
free form.
HO
O
OH
Me
O
HO
M
OH
Me
MeO O
5
In the biogenesis of the phenyl portion there is surprisingly no evidence for a
chemically expected randomization of the incorporation of the C2-units. This
phenomenon gave a first hint at the lack of involvement of a symmetrical
acetophenone intermediate, namely 2,4,6-trihydroxyacetophenon (41).
OH
HO
Me
OH
O
41
Only when feeding synthesized advanced precursors in
13
C-labelled form the
information was gained that there is indeed no symmetrical biosynthetic
intermediate occurring in the chemical sequence of the biogenesis, since only the
unsymmetrical intermediate (2,4-dihydroxy-6-methoxyacetophenon (38)) in
isotope-labelled form was incorporated into the target molecule. This finding
clearly evidences the educt of the biaryl cross-coupling to be an unsymmetrical
acetophenone. Moreover, this phenoloxidative coupling takes place at a very
early stage of the biosynthesis, most probably right after the formation of the
two polyketo-chains. One could speculate that the responsible tailoring enzyme
is in close contact with the polyketide synthase (PKS) involved.
Summary
113
O
O
8 HOAc
PKS
O
O
O
O
O
O
O
HO
Mode F
SCoA
Me
Me
X
9a
4 HOAc
O
PKS
=
Me
O
Me
O
O
SR
X = O (Chrysophanol) (4)
X = H2 (Chrysophanol-Anthrone) (21)
SR
O
O
O
O
O
a
b
5
HO
OH
3
MeO
HO
=
S
3
HO
Me
O
MeO
HO
HO
O
Me
b
OH
b
2) phenoloxidativecoupling
S
OH
A
(>90%)
•
O
Me
OH
HO
O
OH
HO
PKS
38
a
?
SR O
Me
a!
MeO
O
Me
OH
5
38
Me
Me
O
Me
PKS
+ OMT
1) O-methylation
HO
OH
MeO
OH
HO
Me
O
A+B
C2-randomization
(not detected)
MeO
O
B
(not detected)
Breaking biosynthetic research on pathways in higher plants demands rapidly
growing tissue cultures with the capability of producing the desired target
molecules in sufficient quantities. Such a biological system was gained from
explants of organ cultures of Ancistrocladus abbreviatus (Ancistrocladaceae).
The production of this tissue culture was the basis for further biosynthetic
research on naphthylisoquinoline alkaloids, since the cell culture produces, for
the first time, alkaloids besides alkaloids of the Ancistrocladaceae-type, in
addition to those of the Dioncophyllaceae-type. Therefore, an instruction based
on three steps using different phytohormones and antioxidants had to be
invented to permanently overcome a browning of both the substrate and the
tissue itself, caused by polyphenolic substances. Only when applying this
114
Summary
instruction with its three different cultivation steps, the formation of a white
tissue with advantageous nature was achieved. Furthermore, this white healthy
tissue
is
able
to
biosynthesize
interesting
molecular
halves
of
naphthylisoquinoline alkaloids. This study was performed within the DFG
project “SPP 1152 – Evolution of metabolic diversity” in close cooperation with
Prof. T. Kutchan.
A combination of biotechnological and chemical-analytical methods presented in this
work led to the elucidation of the detailed biosynthesis of aromatic polyketides derived
from different biological origins. In particular, the determination of the folding modes
and the 'classical' structure elucidation of biosynthetic intermediates resulted in a
broader knowledge about the formation of aromatic PKS-products.
Experimenteller Teil
115
EXPERIMENTELLER TEIL
1
Allgemeine Methoden (Chemische Analytik)
1.1
Verwendete Apparaturen und Messgeräte
Gefriertrocknung: Zur Trocknung wäßriger Proben wurde das Gerät Alpha 1-4 der Fa.
Christ, angeschlossen an eine Vacuubrand-RD-8-Pumpe der Fa. Brand verwendet.
Schmelzpunkte (Schmp.): Die Schmelzpunkte wurden an einem Thermovar-KoflerHeiztisch-Mikroskop der Fa. Reichert-Jung bestimmt. Die angegebenen Werte sind
nicht korrigiert.
Ultraviolettspektren (UV): Die Messung der UV-Spektren wurde an einem CARY-50Conc-UV-vis-Spektrophotometer der Fa. Varian in dem angegebenen Lösungsmittel
durchgeführt. Die Wellenlängen (λ) und Intensitäten (log ε) der Absorptionsmaxima
sind angegeben.
Infrarotspektren (IR): Die Aufnahme der IR-Spektren erfolgte mit einem Jasco-FT-410Spektrometer. ν~ bezeichnet die Wellenzahl. Die Intensitäten der Absorptionsbanden
sind gekennzeichnet durch: s = stark, m = mittel, w = schwach und br. = breit.
Kernresonanzspektren (1H-NMR,
13
C-NMR): Die 1H- und
13
C-NMR-Spektren wurden
an den Spektrometern Avance 400 und DMX 600 (400 und 600 MHz bzw. 100 und 150
MHz) der Firma Bruker bei 298 K aufgenommen. Die chemischen Verschiebungen sind
in Einheiten der δ-Skala angegeben und beziehen sich auf δTMS = 0. Zur Eichung der
1
H-NMR-Spektren dienten die Resonanzsignale der Restprotonen der deuterierten
Lösungsmittel als interner Standard [z.B. δ(CDCl3) = 7.26; δ(CD3OD) = 3.31,
δ-Aceton-d6 = 2.05] und bei den 13C-NMR-Spektren die 13C-Resonanzsignale der
verwendeten Lösungsmittel [δ(CDCl3) = 77.0; δ(CD3OD) = 49.15, δ-Aceton-d6 = 29.8].
Die Auswertung der Spektren erfolgte mit der XWIN-NMR-Software (Version 3.5)
(Bruker). Signalmultiplizitäten sind wie folgt abgekürzt: Singulett = s, Dublett = d,
116
Experimenteller Teil
doppeltes Dublett = dd, Triplett = t, doppeltes Triplett = dt, Quartett = q, doppeltes
Quartett = dq, Quintett = qui, doppeltes Quintett = dqui, Septett = sep, Multiplett = m,
zentriertes Multiplett = mc. Die Angabe der Kopplungskonstanten J erfolgte in Hertz
(Hz). In der Schreibweise nJ gibt n die Anzahl der dazwischen liegenden Bindungen
wieder.
Kryo-System: 5 mm-DGH-Kryoprobenkopf mit z-Gradient und ATM-Einheit.
Massenspektren (MS): Elektronenstoß-Massenspektren (EI) und hochauflösende
Elektronenstoß-Massenspektren (HREIMS) wurden mit dem Spektrometer MAT-8200
der Firma Finnigan bei einem Ionisationspotential von 70 eV aufgenommen. Die in
Klammern gesetzten Zahlen geben die Intensität bezogen auf den Basispeak (I = 100%)
an. Die Messung der CI-, DCI- und FAB-Spektren erfolgte mit Hilfe des Geräts
Finnigan MAT-90, unter Verwendung von iso-Butan, Methan oder Ammoniak als
Ionisationsgas. Elektrospray-Massenspektren (ESIMS) wurden, sowohl in Kopplung
mit der HPLC (HPLC-MS) als auch im stand-alone-Betrieb, mit einem TripleQuadrupol-Massenspektrometer
der
Firma
Finnigan
aufgenommen
(Kapillarentemperatur: 210 °C; ESI-Spannung: 3.5 kV; N2 als Hilfsgas). Einige der ESIMassenspektren
wurden
mit
einer
Ionenfalle
1100SL
der
Firma
Agilent
(Kapillarentemperatur: 350 °C; ESI-Spannung: 3.5 kV; N2 als Hilfsgas) in Kopplung
mit einem Agilent-1100-HPLC-System gemessen. MALDI-Massenspektren wurden mit
dem Spektrometer Bruker Autoflex aufgenommen. Die Matrix hierfür war DCTB 1:10
in Chloroform.
Drehwerte: Zur Ermittlung der optischen Aktivitäten diente ein Polarimeter P-1020 der
Fa. Jasco, wobei direkt bei der Natrium-D-Line (λ = 589 nm) gemessen wurde. Die
Angabe der ermittelten Drehwerte erfolgt in °.
Circulardichroismus (CD): CD-Spektren wurden an einem J-715-Spektropolarimeter
(Fa. Jasco) aufgenommen und mit der dazugehörigen Software verarbeitet. Die
Scangeschwindigkeit betrug 200 nm/min bei einer Bandbreite von 1 nm. Die
differentiellen
Absorptionskoeffizienten
∆ε
[cm2/mol]
bei
einer
bestimmten
Wellenlänge λ [nm] wurden im angegebenen Lösungsmittel bestimmt. Von den
Experimenteller Teil
117
gemessenen Spektren wurde jeweils das Lösungsmittelspektrum abgezogen und die
erhaltene Kurve um den Faktor 5 geglättet. Es wurde in einer 2 mm Standard
Quarzküvette in einem Wellenlängenbereich von 200-400 nm gemessen. Die erhaltenen
Werte wurden in ∆ε (cm2/mol) angegeben.
1.2
Chromatographische Methoden
Dünnschichtchromatographie (DC): Für die Dünnschichtchromatographie wurden
Kieselgel-Aluminiumfolien 60 F254 mit einer Schichtdicke von 0.2 mm der Firma Merck
verwendet. Die Detektion von einzelnen Zonen erfolgte je nach Anforderung durch
Fluoreszenzlöschung bei 254 nm, die Anregung der Eigenfluoreszenz bei 366 nm sowie
durch die Bedampfung mit Iod (reduzierende Verbindungen). Zum Anschärfen des
Startflecks wurde ein Lösungsmittelgemisch bestehend aus Dichlormethan/Methanol
1:1 verwendet.
Hochleistungsflüssigkeitschromatographie (HPLC): Die analytische HPLC mit DADDetektion wurde auf einer computergesteuerten Anlage der Firma Jasco durchgeführt
(Entgasungseinheit DG-1580, Mischer LG-1580, Pumpe PU-1580, Säulenofen CO1560, Probenwechsler AS-1555, Diodenarraydetektor MD-1510). Zusätzlich waren ein
Fluoreszenzdetektor RF-535 der Fa. Shimadzu und ein Lichtstreudetektor (ELSD)
Sedex 75 der Fa. Sedere in Serie geschaltet. Die verwendete Software bestand aus dem
Borwin-Programmpaket der Fa. Jasco. Falls nicht anders angegeben wurden für die
HPLC-UV- und HPLC-MS-Läufe eine Symmetry-C18-Säule (Waters; 4.6 x 250 mm, 5
µm) und der folgende Lösungsmittelgradient verwendet: Wasser + 0.05 % TFA (A),
MeCN + 0.05 % TFA (B); Fluss: 1 mL/min; 0 min 5 % B, 30 min 70 % B, 35 min 100
% B, 40 min 100 % B, 41 min 5 % B, 46 min 5 % B. Für die präparative HPLC wurde
eine Anlage bestehend aus einer Waters-600E-Pumpe, einem Rheodyne-7125i-Injektor
und einem Waters-996-Diodenarraydetektor eingesetzt. Die Steuerung der Geräte und
die Auswertung der Chromatogramme erfolgte mittels PC mit Millenium Software
Version 2.15 der Fa. Waters. Als Säule für die präparativen HPLC-Trennungen wurde
eine SymmetryPrep-C18-Säule (Waters; 19 x 300 mm, 7 µm) und der folgende
Lösungsmittelgradient verwendet: Wasser + 0.05 % TFA (A), MeCN + 0.05 % TFA
(B); Fluss: 11 mL/min; 0 min 20 % B, 20 min 55 % B, 25 min 100 % B, 30 min 100 %
B, 31 min 20 % B, 35 min 20 % B. Die produkthaltigen Fraktionen aus der präparativen
118
Experimenteller Teil
HPLC wurden vereinigt und der Acetonitrilanteil im Vakuum abgedampft. Zur
Abtrennung der Trifluoressigsäure aus dem HPLC-Eluens wurde die Lösung
anschließend durch eine mit Methanol und Wasser vorkonditionierte RP-18-Kartusche
(Merck, mit 500 mg RP-18-Material) gesaugt. Nach Waschen mit etwas Wasser wurden
die am Adsorbens gebundenen Substanzen mit Methanol eluiert.
Tabelle 5. Screeninggradient: Die Flußrate betrug 1mL/min, die Temperatur 25° C.
Zeit [min]
%A
%B
0
95
5
30
30
70
35
0
100
40
0
100
41
95
5
46
95
5
A = Wasser (Millipore) + 0.5 ‰ Trifluoressigsäure
B = Acetonitril (prepsolv) + 0.5 ‰ Trifluoressigsäure
Das Injektionsvolumen zu analytischen Zwecken betrug 10 µl, zu präparativen
Zwecken variierte es bis 500 µl.
HPLC-CD-Kopplung: Das chromatographische System bestand aus einer HPLC-Pumpe
der Fa. Jasco (PU-1580), einem Entgaser Gastorr 153 der Fa. Flow, einem
Gradientenmischer LG-980-02S (Fa. Jasco), einem Säulenofen Jetstream 2 Plus (Fa.
Beckmann) und einem UV-Detektor 7215 der Firma ERC. Als CD-Detektor wurde ein
J-715-Spektropolarimeter (Jasco) verwendet, das mit einer über ein Motorventil 7010
(Fa. Besta) geschalteten 5-mm-Standard-Flusszelle der Fa. Jasco betrieben wurde. Falls
nicht anders angegeben wurden für die HPLC-CD-Läufe eine Chiralcel-OD-H-Säule
(Daicel; 4.6 x 250 mm, 5 µm) und der folgende Lösungsmittelgradient verwendet: nHexan + 0.05 % TFA (A), iso-PrOH + 0.05 % TFA (B); Fluss: 0.5 mL/min; 0 min 10 %
B, 10 min 10 % B, 30 min 50 % B, 40 min 50 % B, 41 min 10 % B.
Experimenteller Teil
119
Die Messung der online-CD-Spektren erfolgte im stop-flow-Modus mit drei
Akkumulationen von 200 bis 400 nm bei einer Scangeschwindigkeit von 500 nm/min,
einer Antwortszeit von 0.5 sec und einer Bandweite von 0.5 nm. Die Spektren wurden
anschließend
durch
Messung
und
Subtraktion
des
Laufmittelspektrums
basislinienkorrigiert und leicht geglättet (Smooth = 5). Die Werte sind in Milligrad (Φ)
angegeben.
Lösungsmittel: Wasser (H2O) für die HPLC wurde über eine Milli-Q-Anlage der Fa.
Millipore gereinigt und entionisiert. Acetonitril für die HPLC (MeCN, HPLC gradient
grade), Methanol (MeOH, Uvasolv) und Ethanol (EtOH, Uvasolv) für UV, CD und
Drehwertbestimmung sowie Trifluoressigsäure (TFA) wurden käuflich erworben (Fa.
Sigma-Aldrich) und ohne weitere Reinigung verwendet. Dichlormethan (CH2Cl2),
Chloroform (CHCl3), Isopropanol (iso-PrOH) und n-Hexan wurden vor Verwendung
destilliert. Für die HPLC wurden die Laufmittel entweder durch vorheriges 5-minütiges
Einleiten oder direkt durch online-Eintrag von Helium entgast.
2
Allgemeine Methoden (Sterilkultur)
2.1
Verwendete Geräte
Sterilbänke (Laminar-flow benches): Alle Arbeiten unter keimfreien Bedingungen mit
pflanzlichen Systemen wurden in einer Laminar-Flow-Bench (Biohazard Laminar Flow
Class II, UniEquip Laborgerätebau, Fraunhoferstraße 11, Martinsried, Deutschland)
durchgeführt. Mikrobiologische Systeme wurden an einer Laminar-Flow-Bench
(Biohazard Uniflow UVUB 1200 Class II, UniEquip Laborgerätebau) bearbeitet.
Autoklav (Dampfsterilisator): Bei dem Autoklaven handelte es sich um einen
Standdampfsterilisator Varioclav Modell 500 E (H+P Labortechnik GmbH,
Oberschleißheim, Deutschland).
Inkubator: Die Vorkulturen für mikrobiologische Arbeiten wurden in einem
Brutschrank der Fa. Heraeus/Kendro Functionline B12 kultiviert.
120
Experimenteller Teil
Rundschüttler: Für Schüttelkulturen biologischer Systeme wurden die Vorrichtungen
TR-150 der Fa. Infors AG (HT), Bottmingen, Schweiz, verwendet.
Bioreaktoren: Zur Kultur der eingesetzten Bakterien kamen 10-L-Bioreaktoren (Biostat
E), 1-L-Fermenter (Biostat S) als auch 500-mL-Mini-Fermenter der Fa. Braun Biotech
International, Melsungen, Deutschland, zum Einsatz.
Zentrifugation: Es wurden die DUPont-Geräte Microspin 12S und Sorvall® RC-5B
(Kendro Laboratory Products GmbH, Hanau) verwendet.
Homogenisator: Gefrorenes Biomaterial wurde mit einem ULTRA-TURRAX T25
(Janke & Kunkel GmbH & Co. KG IKA-Labortechnik, Deutschland) homogenisiert.
Kulturgefäße: Für pflanzliche Organkulturen wurden Weithals-Erlenmeyer-Kolben mit
Volumina von 100 mL und 300 mL verwendet (Firma Schott), welche mit 50 mL bzw.
100 mL Medium befüllt waren. Verschlossen wurden die Kolben mit Cellulose-Stopfen
(Neolab Migge Laborbedarf-Vertriebs GmbH, Heidelberg), die ihrerseits mit Alufolie
abgedeckt wurden. Solide pflanzliche Gewebekulturen und auch mikrobielle
Erhaltungskulturen wurden in Petrischalen (Einwegmaterial, Durchmesser 90 mm mit
Nocken), die routinemäßig mit Parafilm abgedichtet waren, gehalten. Pflanzliche
Flüssigkulturen wurden in oben angeführten Kolben auf Rundschüttlern aufgestellt.
Pilzliche Schüttelkulturen wurden gleichermaßen in 250-mL-Weithals-Erlenmeyer
behandelt. Die untersuchten Insekten wurden in handelsüblichen Plastikgefäßen
(Tupperware©) gehalten, welche mit Gaze überspannte Öffnungen besaßen.
Sterilfiltration: Zur Sterilfiltration wurden Membranfilter-Kartuschen mit 0.22 µm
Porengröße (FP030/0.2-CA-S, Schleicher & Schuell GmbH, Dassel) aus Celluloseacetat
benutzt.
Reinstwasseranlage: Wasser (H2O) für die Sterilkultur wurde über eine Milli-Q-Anlage
der Fa. Millipore (Bedford, USA) gereinigt und entionisiert, wobei dem System eine
VE-Patrone B 10D vorgeschaltet war.
Experimenteller Teil
2.2
121
Allgemeine Techniken
Grundoperationen: Alle Arbeiten unter keimfreien Bedingungen wurden unter den oben
angeführten Laminar-Flow-Benches durchgeführt. Die verwandten Gerätschaften wie
z.B. Pinzetten und Scheren etc. wurden routinemäßig in Abständen autoklaviert und
ansonsten bei jeder Benutzung mit 70% Ethanol abgeflammt (flambiert). Bei Skalpellen
und Pipetten wurde auf Einwegmaterial zurückgegriffen, welches durch γ-Strahlen
sterilisiert wurde. Thermisch instabile Mediumsbestandteile wurden stets sterilfiltriert.
Oberflächensterilisation: Samenmaterial wurde standardmäßig wie folgt sterilisiert:
Zunächst wurde das Material 10 min lang mit einer Lösung bestehend aus
Natriumhypochlorit und sterilem Wasser (1:1) unter Zugabe eines Tropfens des
Detergenz Triton X 100® (Carl Roth GmbH & Co., Karlsruhe, Deutschland) gründlich
in einem sterilen Greiner Tube® gewaschen. Dann wurde zweimal 10 min lang mit
sterilem Wasser nachgewaschen, bis der gebildete Schaum vollständig entfernt war.
Probenvorbereitung:
Solide Pflanzengewebe: Nach Versuchsende wurde das Zellmaterial durch vorsichtiges
Spülen mit Wasser von noch verbleibenden Mediumresten gereinigt und anschließend
umgehend mit flüssigem Stickstoff eingefroren. Das Material wurde dann bis zur
völligen Gewichtskonstanz an der Gefriertrocknungsanlage belassen. Die getrockneten
Kalli wurden dann mit Mörser und Pistill zu feinem Pulver zerrieben. Hierauf folgte bei
Raumtemperatur eine Mazeration mit einem jeweils geeigneten Lösungsmittel, das
nachfolgend bei den einzelnen Versuchen aufgeführt sind. Nach Filtration durch ein
Faltenfilter wurde der Extrakt durch Einengen vom Lösungsmittel befreit und wie bei
den einzelnen Versuchen beschrieben weiter behandelt.
Planzliche Flüssigkulturen: Nach beendetem Experiment wurden die Kulturen geerntet,
indem das Zellmaterial und das Flüssigmedium durch Filtration getrennt wurde.
Anschließend wurde das gewonnene Flüssigmedium erschöpfend extrahiert, i. Vak.
eingedampft und wie bei den einzelnen Versuchen beschrieben weiter behandelt.
Ernte mikrobiologischer Kulturen: Nach beendetem Experiment wurden die
Mikroorganismen aus den Bioreaktoren und den Schüttelkolben geerntet, indem das
122
Experimenteller Teil
Zellmaterial und das Flüssigmedium zunächst durch Filtration getrennt wurde. Im Falle
der pilzlichen Organismen wurden beide Bestandteile mit einem höheren Volumenanteil
Lösungsmittel (Ethylacetat) mehrfach mit destilliertem Wasser extrahiert. Die geerntete
bakterielle Fraktion wurde darüber hinaus zuvor noch zentrifugiert. Anschließend wurde
der gewonnene Rohextrakt i. Vak. eingedampft. Detailliertere Angaben zur Isolierung
sind bei den einzelnen Versuchen weiter behandelt.
Insekten: Nach beendetem Experiment wurden die Insekten sofort in flüssigem
Stickstoff
eingefroren.
Das
Material
wurde
anschließend
bis
zur
völligen
Gewichtskonstanz, an der Gefriertrocknungs-Anlage belassen. Das getrocknete
Biomaterial wurde dann mit Mörser und Pistill zu feinem Pulver zerrieben. Hierauf
folgte bei Raumtemperatur eine Mazeration mit einem Lösungsmittelgemisch (95:5
Aceton:Wasser). Nach Filtration durch ein Faltenfilter wurde der Extrakt durch
Einengen vom Lösungsmittel befreit und wie im betreffenden Unterkapitel (3.5)
beschrieben weiter behandelt.
2.3
Kulturbedingungen
Kulturparameter: Im Kulturraum herrschte eine durchschnittliche Temperatur von 22 ±
2° C. Für photosynthetisch aktive Systeme betrug die Photoperiode 14 h pro d bei 2000
lux (Licht bei 51 µmol m-2s-1 PAR). Flüssigkulturen wurden bei Schwachlicht kultiviert.
Solide Gewebekulturen wurden in völliger Dunkelheit in separaten Styroporkisten bei
sonst gleicher Temperatur gezogen. Die Bedingungen für die bakteriellen Systeme sind
bei den jeweiligen Experimenten detailliert aufgeführt. In den Klimakammern für die
verwandten Insekten wurden konstant 25 °C, eine Photoperiode von 18/6 h (2000 Lux)
und eine Luftfeuchtigkeit von 60% eingehalten.
Medien:
Pflanzliche Systeme: Als Basismedien für die Experimente der vorliegenden Arbeit
dienten die Mineralsalzmischung nach
[174]
(Tab. 6) und ein Medium für Rhododendron
(Anderson-Substrat)[175] (Tab. 9). Zum Teil wurden die Konzentrationen der
anorganischen Komponenten leicht variiert. Die organischen Bestandteile des Mediums
wurden ebenfalls nach Murashige und Skoog[174] zugesetzt. Teilweise wurden dieser
Formulierung allerdings verschiedene Kombinationen an Phytohormonen hinzugefügt
Experimenteller Teil
123
(Tab. 8). Diese mit Hormonen versehenen Medien erhielten spezielle Bezeichnungen,
welche in der vorliegenden Arbeit weiter benutzt werden. Saccharose diente generell als
Kohlenstoffquelle. Bei den Festmedien kam sowohl Gelrite (Carl Roth GmbH & Co.,
Karlsruhe) als auch Agar (Sigma; A-1296) als Geliermittel zum Einsatz. Bei
Flüssigmedien kam kein Geliermittel zum Einsatz. Der pH-Wert wurde dabei vor dem
Autoclavieren standardmäßig mit 1 N NaOH auf 5.8 eingestellt. Es wurde bei 121 °C
und 1.5 bar Druck für 30 min sterilisiert. Die Passage der Pflanzen erfolgte einmal pro
Monat.
Tabelle 6. Mineralsalze nach Murashige und Skoog[188], alle Angaben in mg L-1
Anorg. Makrobestandteile
Eisenquelle
Anorg. Mikrobestandteile
a
KNO3
1900a
NH4NO3
1650a
CaCl2⋅2H2O
440a
MgSO4⋅7H2O
370a
KH2PO4
170a
FeSO4⋅7H2O
27.8
Na2EDTA
37.3
MnSO4⋅4H2O
22.3
ZnSO4⋅4H2O
8.6
H3BO3
6.2
KI
0.83
Na2MoO4⋅2H2O
0.25
CuSO4⋅5H2O
0.025
CoCl2⋅6H2O
0.025
Die Makrobestandteile wurden auch zu 1/2 und zu 1/5 der Originalformulierung
eingesetzt.
124
Experimenteller Teil
Tabelle 7. Organische Zusätze in mg L-1.
Org. Bestandteile
myo-Inositol
100
Nicotinsäure
0.5
Pyridoxalhydrochlorid
0.5
Thiaminiumchlorid
0.1
Glycin
2
Tabelle 8. Zugesetzte Phytohormone und Bezeichnung des jeweiligen Mediums in mg L-1.
2,4-D
NAA
BAP
TDZ
BAP-Medium
-
0.01
2.0
-
D14-Medium
0.5
0.5
0.5
-
TDZ-Medium
-
0.01
-
0.01
Experimenteller Teil
125
Tabelle 9. Mineralsalze nach Anderson,[189] alle Angaben in mg L-1.
Anorg. Makrobestandteile
Eisenquelle
Anorg. Mikrobestandteile
b
KNO3
480
NH4NO3
400
CaCl2⋅2H2O
332.2
MgSO4⋅7H2O
370
KH2PO4
330.6b
FeSO4⋅7H2O
55.7
Na2EDTA
74.5
MnSO4⋅4H2O
22.3
ZnSO4⋅4H2O
8.6
H3BO3
6.2
KI
0.83c
Na2MoO4⋅2H2O
0.25
CuSO4⋅5H2O
0.025
CoCl2⋅6H2O
0.025
anstatt 380 mg L-1 NaH2PO4·H2O; c anstatt 0.3 mg L-1 KI
Tabelle 10. Organische Zusätze in mg L-1.
Org. Bestandteile
myo-Inositol
100
Nicotinsäure
0.5d
Pyridoxalhydrochlorid
0.5d
Thiaminiumchlorid
0.1d
Glycin
2d
d
nicht in der Originalformulierung enthalten
126
Experimenteller Teil
Tabelle 11. Weitere verwendete Zusätze in mg L-1.
Gelrite
2000
Saccharose
30000
Pilzliche Systeme: Als Kulturmedium für Drechslera catenaria kam ein leicht
modifiziertes Czapek-Dox-Medium[190] zum Einsatz.
Tabelle 12. Zusammensetzung von Czapek-Dox-Medium.
Czapek-Dox-Medium
Glucose
30 g
NaNO3
3g
MgSO4 x 7 H2O
0.5 g
KCl
0.5 g
FeSO4 x 7 H2O
0.01g
K2HPO4
1.0 g
Agara
13.00 g
H2O
1000 mL
pH-Wert auf 7.2 eingestellt; a wurde nicht verwendet
Experimenteller Teil
127
Weiterhin wurden folgende Medien für die untersuchten Pilze verwandt:
Tabelle 13.
Pilz
Medium
Drechslera holmii
Czapek-Dox-Medium, [190]modifiziert
Penicillium islandicum
Malz-Dextrose-Agar[191]
Phoma foveata
Sabouraud Medium, modifiziert[192]
Pseudospiropes simplex
Malzagar[193]
Trichoderma harzianum
PDB[194]
Trichoderma viride
PDA[195]
Bakterielle Systeme: Als Kulturmedium für die bearbeiteten Stämme wurden folgende
Medien verwandt: Verändertes Gauses Medium 2 für die Kultivierung von Nocardia
Acta 1057 (Tabelle 14) und ein Komplexmedium (Tabelle 15) für dessen Fermentierung
im Bioreaktor. Streptomyces AK 671 wurde in Hafermehlmedium fermentiert.
Tabelle 14.
A
Glucose
10 g
Pepton
5g
Trypton
3g
NaCl
5g
Agar
15 g
Nalidoxonsäure
10 µg
Cycloheximid
50 µg
Nystatin
50 µg
pH-Wert auf 7.0 eingestellt
128
Experimenteller Teil
Tabelle 15.
B
Stärke
15 g
Glucose
10 g
Glycerin
3g
Cornsteep powder
2.5 g
Pepton
5g
Hefeextrakt
2g
NaCl
1g
pH-Wert auf 7.3 eingestellt
Insekten: Die Tiere wurden nicht steril, jedoch mit maximal möglicher Hygiene auf
frischem handelsüblichem Chinakohl (Brassica rapa ssp. chinensis) gehalten.
2.4
Herkunft des biologischen Materials
Das Saatgut von Kniphofia pumila Kunth wurde von B&T World Seeds, Paguignan,
Frankreich und von Chiltern Seeds, Bortree Stile, Ulverston, Cumbria, LA12 7PB,
Großbritannien bezogen. Samen von Kniphofia uvaria wurden von einer Pflanze
gewonnen, welche von der Firma Maingarten, Hanau, Deutschland erworben worden
war. Das Samenmaterial von Asphodelus microcarpus syn. Asphodelus aestivum
(Asphodelaceae) stammte aus einer Wildaufsammlung aus Aljaraque, Provinz Huelva,
Andalusien, Spanien.
Experimenteller Teil
129
Die filamentösen Pilze stammen aus folgenden kommerziellen Quellen:
Tabelle 16.
Organismus
Bezugsquelle
Drechslera catenaria
CBS, Baarn, Niederlande
Drechslera holmii
CBS, Baarn, Niederlande
Penicillium islandicum
DSMZ, Braunschweig, Deutschland
Phoma foveata
CBS, Baarn, Niederlande
Pseudospiropes simplex
CBS, Baarn, Niederlande
Trichoderma harzianum
DSMZ, Braunschweig, Deutschland
Trichoderma viride
DSMZ, Braunschweig, Deutschland
Die bearbeiteten Bakterienstämme Nocardia Acta 1057 und Streptomyces AK 671
wurden von Prof. M. Goodfellow, Universität Newcastle upon Tyne, aus Bodenproben
einer sehr alten Ackerfläche bei Morpeth, Northumberland, und eines Kiefernwaldes bei
Hamsterley Forest, Durham County, Großbritannien, isoliert und im Rahmen eines
Kooperationsprojekts Prof. H. P. Fiedler zur Verfügung gestellt.
Gelege von Galeruca tanaceti, die sich an Schafgarben (Achillea millefolium) befanden,
stammten aus einer Wildaufsammlung durch Herrn F. Pankewitz in der Nähe von
Berlin.[196]
2.5
Materialien
[1,2-13C2]NaOAc (99% Isotopenanreicherung) wurde von Eurisotop (Saarbrücken,
Deutschland) bezogen. Die Komponenten für die Kulturmedien wurden von SigmaAldrich bezogen mit der Ausnahme von Gelrite®, das von Roth GmbH & Co.,
Karlsruhe, Deutschland, stammte.
130
3
Experimenteller Teil
Vergleichende Biosynthesestudie zu dem aromatischen Polyketid
Chrysophanol (4)
3.1
Fütterungsexperimente am pilzlichen System
Die Schüttelkulturen von Drechslera catenaria wurden bei 100 RPM in Dunkelheit im
Kulturraum bei 24 °C kultiviert. Die Applikation des sterilfiltrierten markierten
13
C2-
Natriumacetats erfolgte in Intervallen (einmal pro Woche, erstmalig zu Beginn des
Experiments) über einen Zeitraum von 28 Tagen bis zu einer Endkonzentration von 200
mg/L.
3.2
Fütterungsexperimente am pflanzlichen System
Die flüssigen Gewebekulturen von Kniphofia uvaria, welche etwa sechs Monate alt
waren, wurden wie unter 2.3 beschrieben kultiviert. Für die Markierungsexperimente
wurden eine wäßrige Lösung von 4 mg mL-1 (0.05 M) [U-13C2]-Natriumacetat
angesetzt, auf pH 5.8 eingestellt und anschließend sterilfiltriert und sowohl zu Beginn
als auch am achten Tag des Experiments zugesetzt. Dabei applizierte man pro 100-mLErlenmeyerkolben mit 50 mL Medium jeweils 1 mL. Man beendete das Experiment
nach 16 Tagen.
3.3
Fütterungsexperimente am bakteriellen System
Im Falle des Nocardia-Bakteriums wurde die Fermentation mit Medium B (s. Punkt
2.3) durchgeführt. Für die Markierungsexperimente setzte man eine wäßrige Lösung
von 8.3 mg mL-1 (0.06 M) [U-13C2]-Natriumacetat an, die anschließend mit Natronlauge
auf pH 7.0 eingestellt wurde. Diese Lösung gab man zwischen der 85. und der 105.
Stunde der Fütterung unter Verwendung von Sterilfiltern bei einer kontinuierlichen
Flußrate von 3 mL h-1 in den Bioreaktor (1L).
Experimenteller Teil
3.4
131
Fütterungsexperimente an Insekten
Die Kultivierung der Insekten (etwa 800 Larven von Galeruca tanaceti) erfolgte wie
bereits unter Punkt 2.3 abgehandelt. Direkt nach dem Schlüpfen der Larven begann man
mit der Fütterung einer zuvor sterilfiltrierten Lösung (2 mg mL-1) von [U-13C2]Natriumacetat, die mit Hilfe eines handelsüblichen Wasserzerstäubers mehrfach auf die
Blätter des Chinakohls (Brassica rapa ssp. chinensis (Brassicaceae; Cruciferae)
aufgetragen wurde und eintrocknete. Die so präparierten Blätter fütterte man täglich
über einen Zeitraum von 14 Tagen an die Larven.
3.5
Isolierung und Charakterisierung von Chrysophanol (4) aus den
biologischen Systemen
Das jeweilige biologische Material wurde für die Aufarbeitung wie beschrieben (s.
Punkt 2.2) vorbereitet. Den Zellaufschluß führte man dabei mit Mörser und Pistill oder
auch mit einem Homogenisator durch. Die Produktisolation wurde durch eine
Kaltextraktion mit 95:5 Aceton/Wasser eingeleitet. Nach Einengen des Solvens löste
man den Rohextrakt in MeOH und reinigte diesen über eine mit MeOH und H2O
vorkonditionierte RP-18-Kartusche und einen 0.2-µm-PTFE-Spritzenvorsatzfilter. Die
Produktisolierung wurde mittels präparativer HPLC vorgenommen. Die Ausbeuten von
3 in den verschiedenen Systemen waren wie folgt: Pflanzliches System (1.08 mg aus
0.45 g Rohextrakt); Pilz (3.6 mg aus 2.9 g Rohextrakt); Bakterium (1.6 mg) und Insekt
(3.9 mg aus 1.9 g Rohextrakt).
Chrysophanol (4):
HO
O
OH
Me
O
4
Schmp. 194 °C (Petrolether/Essigsäureethylester/Dichlormethan).
Lit.[114] 190 °C (Ethanol).
1
H-NMR (600 MHz, Aceton-d6): δ = 2.45 (s, 3H, CH3), 7.05 (d, 4J = 0.85 Hz, 1H, Ar-
H), 7.23 (dd, 3J = 7.32 Hz, 4J = 1.03 Hz, 1H, Ar-H), 7.62 (d, 4J = 1.34 Hz, 1H, Ar-H),
132
Experimenteller Teil
7.65 (t, 3J = 7.32 Hz,1H, Ar-H), 7.80 (dd, 3J = 7.32 Hz, 4J = 1.03 Hz, 1H, Ar-H), 11.97
(s, 1H, OH), 12.08 (s, 1H, OH) ppm.
13
C-NMR (600 MHz, Aceton-d6): δ = 22.59 (CH3), 113.7 (Ar-C), 115.9 (Ar-C), 119.9
(Ar-C), 121.3 (Ar-C), 124.3 (Ar-C), 124.9 (Ar-C), 133.3 (Ar-C), 133.8 (Ar-C), 136.9
(Ar-C), 149.9 (C- CH3), 162.7 (Ar-C), 163.5 (Ar-C), 181.9 (C=O), 192.8 (C=O) ppm.
Alle spektroskopischen Daten sowie das chromatographische Verhalten (Retentionszeit
und PDA-Spektrum) entsprachen denen einer authentischen Probe, welche kommerziell
bezogen worden war (Sigma-Aldrich).
4
Isolierung und Strukturaufklärung potentieller biosynthetischer
Vorstufen polyketidischer Anthrachinone
4.1
Isolierung und Charakterisierung von Chrysophanol-8-O-ß-D-glucuronid
(28)
Nach Beendigung der Fermentation des Bakteriums AK 671 wurde das Kulturfiltrat
zunächst zentrifugiert und anschließend auf pH 2 eingestellt. Hiernach erfolgte eine
Extraktion durch mehrfaches Ausschütteln des Filtrats mit Ethylacetat, nachdem der
pH-Wert des Kulturfiltrats nach jedem Extraktionsschritt erneut eingestellt worden war.
Dann wurde der gewonnene Extrakt bis zur Trockene eingeengt, Man engte den
gewonnenen Extrakt bis zur Trockene ein, nahm den Rückstand in Methanol auf und
trennte
nach
verschiedenen
Filtrationsschritten
(RP-18-Kartusche
und
PTFE-
Spritzenvorsatzfilter) präparativ in mehreren Läufen an der HPLC mittels einer
semipräparativen Chromolith-Säule. 17.0 mg der Verbindung wurden isoliert.
Chrysophanol-8-O-ß-D-glucuronid (28):
HO
O
O
HO2C
HO
O
OH
O
OH
8
Gelber, amorpher Feststoff.
Me
O
Schmp. 164 °C (MeOH).
28
Experimenteller Teil
133
UV (MeOH): λmax (log ε) = 218 (3.83), 253 (3.73), 280 (3.43), 400 (3.20) nm.
IR (KBr): ν% = 3434 (br), 1642 (m), 1206 (w), 449 (s), 437 (s), 422 (s), 405 (s) cm-1.
HRMS (ESI): m/z = 451.06398 [M-2H+Na] - (berechnet für C21H16O10Na): 451.06412
1
H-NMR (600 MHz, MeOD): δ = 2.44 (s, 3H, CH3), 3.58 (dd, 3J = 9.09 Hz, 3J = 8.97
Hz, 1H), 3.68 (dd, 3J = 8.97 Hz, 3J = 9.73 Hz, 1H), 3.74 (dd, 3J = 7.58 Hz, 4J = 1.58 Hz,
1H), 4.04 (d, 3J = 9.73 Hz, 1H), 5.18 (d, 3J = 7.58 Hz 1H), (7.11 (s, 1H, Ar-H), 7.56 (s,
1H, Ar-H), 7.73 (dd, 3J = 8.34 Hz, 4J = 1.14 Hz, 1H, Ar-H), 7.79 (dd, 3J = 8.34 Hz, 3J =
7.71 Hz, 1H, Ar-H), 7.99 (dd, 3J = 7.71 Hz, 4J = 1.39 Hz, 1H, Ar-H) ppm.
13
C-NMR (150.9 MHz, MeOD): δ = 22.1 (CH3), 73.1 (CH), 74.7 (CH), 76.9 (CH), 77.2
(CH), 103.5 (anomeres C), 113.2 (Ar-C), 116.4 (Ar-C), 121.1 (Ar-C), 123.3 (Ar-C),
125.2 (Ar-C), 125.5 (Ar-C), 134.1 (Ar-C), 136.8 (Ar-C), 137.1 (Ar-C), 149.6 (C- CH3),
159.7 (Ar-C), 163.9 (Ar-C), 172.9 (C=O), 183.8 (C=O), 212.8 (COOH) ppm.
4.2
Isolierung und Charakterisierung von Prächrysophanol-8-O-β-Dglucuronid (29)
Nach Abbruch der Fermentation wurde das Kulturfiltrat zunächst zentrifugiert und
anschließend ebenfalls auf pH 2 eingestellt. Hiernach erfolgte eine Extraktion durch
Phasenverteilung des Filtrats mit n-Butanol, wobei der pH-Wert des Kulturfiltrats nach
jedem Extraktionsschritt erneut mit HCl eingestellt werden mußte. Hiernach wurde der
gewonnene Extrakt bis zur Trockene eingeengt und in Methanol aufgenommen. Nach
verschiedenen Filtrationsschritten (RP-18-Kartusche und PTFE-Spritzenvorsatzfilter)
erhielt man die Verbindung in mehreren Läufen mittels präparativer HPLC. Von der der
Verbindung wurden 14.4 mg isoliert.
Prächrysophanol-8-O-β-D-glucuronid (29):
HO
O
O
HO2C
HO
O
OH
HO
O
8
Oranger, amorpher Feststoff.
Me
OH
29
134
Experimenteller Teil
Schmp. 158 °C (MeOH).
UV (MeOH): λmax (log ε) = 208 (3.98), 210 (3.82), 221 (3.74), 259 (3.01), 289 (2.67),
404 (2.14).
IR (KBr): ν% = 3420 (br), 2105 (w), 1643 (m), 1122 (w), 479 (s), 421 (s) cm-1.
MS (MALDI): m/z = 434.039 [M-H] (berechnet für C21H22O10): 434.12130
Tabelle 17.
Position
NMR-Daten von 29 gemessen in MeOD
13
C [ppm]
1
2
3
4
206.0
53.0
71.5
44.2
5
6
7
8
9
10
1a
4a
5a
8a
3-Me
1’
2’
3’
4'
5'
6’
123.5
132.2
113.7
158.8
165.0
119.5
112.8
138.3
141.6
116.7
22.1
104.7
75.1
71.5
73.3
77.1
210.0
1
H [ppm]
HMBC
COSY (JHH [Hz])
2.81; 2.92
C-1, C-3, C-4; C-3Me
3.12
10-H
7.42
7.53
7.31
C-1a, C-2 C-3, C-4a,
C-10, C-3Me
C-5a, C-7, C-8a, C-10
C-5a, C-7, C-8
C-5, C-8a, C-8
7.13
C-1a, C-5a, C-5, C-8a
4-H
1.40
5.03
3.72
3.57
3.67
3.95
C-2, C-3, C-4
C-8
C-1’, C-5’
C-2’, C-4’
C-5’
C-1’, C-4’, C-6’
2’-H
1’-H, 3’-H
2’-H, 4’-H
3’-H, 5’-H
5’-H
6-H, 7-H
5-H
5-H
Experimenteller Teil
5
135
Studien zur Stereochemie und Enantiomerenanalytik
dimerer Anthrachinone
5.1
Isolierung und Charakterisierung von Asphodelin (37)
Sowohl aus axenischer Kultur als auch aus einer Wildaufsammlung stammende
Wurzeln wurden wie unter 2.2 erläutert, behandelt. Das Lösungsmittelgemisch bestand
erneut aus Aceton:Wasser (95:5). Nach Einengen des Solvens wurde der Rohextrakt in
MeOH gelöst und über eine mit MeOH und H2O vorkonditionierte RP-18-Kartusche
und einen 0.2-µm-PTFE-Spritzenvorsatzfilter gereinigt. Die Produktisolierung geschah
durch präparative HPLC-Trennung (Waters Symmetry Prep C18, 7 µm, 19.0 x 300
mm). Die Ausbeuten von 37 betrugen aus dem sterilen Material 0.6 mg aus 0.4 g
Rohextrakt, bei dem Wildmaterial 0.9 mg aus 0.3 g Rohextrakt.
OH
HO
O
Asphodelin (37):
Schmp. 276 °C (MeOH).
4
7’
P
O
Me
OH
O
Lit.[197] 274-278 °C (MeOH).
OH
O
[α ]25
D = + 18 (c = 0.02, CH2Cl2);
Lit.[198] + 20-30.5 (c = 0.02, H20).
1
Me
37
H-NMR (600 MHz, Aceton-d6): δ = 2.05 (s, 3H, CH3), δ = 2.45 (s, 3H, CH3), 7.25 (s,
1H, Ar-H), 7.33 (dd, 3J = 7.26 Hz, 1H, Ar-H), 7.41 (s, 1H, Ar-H), 7.53 (dd, 3J = 6.7 Hz,
1H, Ar-H), 7.57 (d, 3J = 7.58 Hz, 1H, Ar-H), 7.70 (d, 1H, Ar-H), 7.76 (t, 3J = 7.8 Hz,
1H, Ar-H), 7.91 (d, 3J = 7.81 Hz, 1H, Ar-H) ppm.
Auch die anderen spektroskopischen Daten stimmten mit früher veröffentlichten
Werten[197-199] überein. Das chromatographische Verhalten entsprach dem einer
authentischen Probe, welche von Dr. A. Yenesew (Botswana) bezogen worden war.[200]
136
5.2
Experimenteller Teil
Stereochemische Analyse von Asphodelin (37)
Die Analyse wurde mit einer Chiracel OT-Säule durchgeführt. Eluent A: Hexan
(+0.05‰ TFA), Eluent B: iso-Propanol (+0.05‰ TFA). Linearer Gradient: 0 min: A
95%, 40 min A 10%. Flußrate 0.5 mL min-1, Detektion bei 265 nm.
CD (MeOH): ∆ε294 +0.5, ∆ε286 -77.2, ∆ε275 +1.5, ∆ε263 +226.0, ∆ε252 +89.9, ∆ε245
+114.8, ∆ε236 +47.2, ∆ε233 +11.2, ∆ε221 -635.0, ∆ε214 -440.3, ∆ε209 -505.1.
6
Zur Aufklärung der Biosynthese des Phenylanthrachinons
Knipholon (5)
6.1
Fütterungsexperimente mit Acetat
Für die metabolischen Untersuchungen kamen Organkulturen von Kniphofia pumila
(Asphodelaceae) mit einer durchschnittlichen Höhe von 20 cm zum Einsatz. Diese
wurden unter den beschriebenen Kulturbedingungen (s. Punkt 2.3) in 300-mLErlenmeyer-Kolben auf ½ MS-Medium kultiviert. Die Kulturen waren zum Zeitpunkt
des Experiments ein Jahr alt. Eine wäßrige Lösung von 4 mg/mL (0.05 M)
13
C2-
Natriumacetat in Reinstwasser wurde mit Natronlauge auf pH 5.8 eingestellt und den
Wurzeln der Kulturen appliziert. Hierbei wurde jeweils 1 mL der Acetatlösung pro
Woche und Kolben zugesetzt, bis nach acht Wochen eine Menge von 224 mg erreicht
worden war. Die Organkulturen wurden nach vier Wochen routinemäßig passagiert.
6.2
Fütterungsexperimente mit fortgeschrittenen Precursoren
Bei den Inkorporationsexperimenten mit 38 und 41 waren die Kultiverungsparameter
identisch mit jenen der Acetatverfütterung (s. 6.1). Den Organkulturen wurde von
Precursor 38 10.01 mg und von 41 10.2 mg appliziert in gelöster Form appliziert. Das
Solvensgemisch bestand aus 60% 2-Methoxyethanol, 40% Reinstwasser und einem
Tropfen Triton X 100©.
Experimenteller Teil
6.3
137
Isolierung und Charakterisierung
Die Probenvorbereitung des biologischen Materials, hier der Wurzeln, erfolgte wie
bereits unter 2.2 beschrieben. Das pulverisierte Material wurde für 24 h einer
Kaltmazeration mit Aceton:Wasser (95:5) bei Raumtemperatur unterworfen. Nach
Befreiung des Extrakts (0.43 g) vom Lösungsmittelgemisch wurde dieser in MeOH
gelöst und über eine mit MeOH und H2O vorkonditionierte RP-18-Kartusche und einen
0.2-µm-PTFE-Spritzenvorsatzfilter gereinigt. Die Produktisolierung wurde an einer
präparativen HPLC (Waters Symmetry Prep C18, 7 µm, 19.0 x 300 mm) durchgeführt,
wobei ein Gradient (s. Punkt 1.2) mit 11 mL min-1 Flussrate verwendet wurde. Es
wurden 1.04 mg Knipholon (5) gewonnen.
Knipholon (5):
HO
O
OH
Schmp. 221 °C (H2O, dec.).
[114]
Lit.
225 °C (Aceton-Petrolether).
Me
O
HO
M
OH
Me
[α ]
25
D
= + 24 (c = 0.01, MeOH);
Lit.[114] + 22 (c = 0.04, MeOH).
1
MeO O
5
H-NMR (600 MHz, Aceton-d6): δ = 2.21 (s, 3H, CH3), 2.63 (s, 3H, COCH3), 4.02 (s,
3H, OCH3), 5.38 (t, 1H, Ar-H), 6.34 (s, 1H, Ar-H), 7.28 (dd, 3J = 7.64 Hz, 4J = 1.06 Hz,
1H, Ar-H), 7.32 (s, 1H, Ar-H), 7.57 (dd, 3J = 7.64 Hz, 4J = 1.06 Hz,1H, Ar-H), 7.77 (t,
1H, Ar-H), 11.98 (s, 1H, OH), 12.51 (s, 1H, OH), 14.22 (s, 1H, OH) ppm.
13
C-NMR (150.9 MHz, Aceton-d6): δ = 21.23 (CH3), 33.2 (Acetyl-CH3), 56.2 (OCH3),
92.0 (Ar-C), 106.1 (Ar-C), 108.5 (Ar-C), 115.8 (Ar-C), 116.5 (Ar-C), 120.2 (Ar-C),
124.2 (Ar-C), 125.4 (Ar-C), 129.2 (Ar-C), 133.1 (Ar-c), 135.7 (Ar-C), 138.3 (Ar-C),
153.1 (Ar-C), 162.4 (Ar-C), 162.7 (Ar-C), 163.4 (Ar-C),163.7 (Ar-C), 164.8 (ArC),182.8 (Ar-C), 194.2 (Ar-C), 203.7 (Carbonyl-C) ppm.
138
Experimenteller Teil
Die physikalischen und spektroskopischen Daten stimmten mit den Literaturdaten[114]
überein.
6.4
Im
NMR-Spektroskopie
13
C-NMR-Spektrum wurden die Kohlenstoffatome des Knipholons (5) durch
HMBC-Korrelationen (optimiert für nJHC = 8 Hz) zugeordnet. Die Paare miteinander
koppelnder
Kohlenstoffatome
wurden
durch
das
2-D-INADEQUATE-NMR-
Experiment (optimiert für 1JCC = 60 Hz) bestimmt und durch Berechnung ihrer
Doppelquantenfrequenzen und den Vergleich mit den
1
JCC-Kopplungskonstanten
weiterhin abgesichert. Die selektive Einstrahlung beim SELINQUATE-NMRExperiment (optimiert für 1JCC = 67 Hz) wurde durch einen 270°-Gauss-Puls mit einer
Dauer von 7 ms erreicht.
7
Bereitstellung einer pflanzlichen Gewebekultur zur verläßlichen
Produktion von Naphthylisochinolin-Alkaloiden
7.1
Materialien
Die verwandten Chemikalien (AC, PVP, PVPP und GSH) wurden von Sigma-Aldrich
bezogen.
Für die Untersuchung wurden dem D14-Medium im Falle der Aktivkohle (AC) 1g L-1,
bei GSH 100 mg L-1, bei PVP 1g L-1 und bei PVPP 4.4 g L-1zugefügt, wobei die
generelle Mediumskomposition Punkt 2.3 zu entnehmen ist.
Zur qualitativen phytochemischen Analyse wurde der Inhalt von zwei Kulturschalen
wie bereits beschrieben (Punkt 2.2) vorbehandelt. Die Kaltmazeration erfolgte mit 1:1
Dichlormethan:Methanol für 48 h.
Abkürzungsverzeichnis
ABKÜRZUNGSVERZEICHNIS
Abb.
Abbildung
AC
Aktivkohle
BAP
6-Benzylaminopurin
ca.
circa
CD
Circulardichroismus
2,4-D
2,4-Dichlorphenoxyessigsäure
D 14
Medium (MS/5 mit jeweils 0.5 mg/L 2,4-D, BAP und NAA)
GSH
Glutathion
HPLC
High Performance Liquid Chromatography
INADEQUATE
Incredible Natural Abundance Double Quantum Transfer
MS
Murashige und Skoog Medium
NAA
Naphthylessigsäure
NMR
Nuclear Magnetic Resonance (Kernresonanzspektroskopie)
PVP
Polyvinylpyrrolidon
PVPP
Polyvinylpolypyrrolidon
PKS
Polyketidsynthase
RPM
Rotations per minute
TFA
Trifluoressigsäure
139
140
Literatur und Anmerkungen
LITERATUR UND ANMERKUNGEN
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[145] Ich danke Dr. M. Jiménez Romero für den Zugang zum Pflanzenmaterial.
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[157] Ich danke Herrn Prof. E. Leistner für die Überlassung von Zellkulturen einiger
Kniphofia-Arten.
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[160] Ich danke Herrn Dr. D. Moskau für die Aufnahme von NMR-Spektren mit
Kryoprobenkopftechnik.
[161] S. Berger; Selective INADEQUATE. A farewell to 2D-NMR? Angew. Chem.
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[167] Ich danke Frau Dipl. Chem. Tanja Gulder für die Durchführung der
Markierungssynthesen.
[168] T. Gronauer; Untersuchungen zur Biogenese acetogeniner Naturstoffe und
Totalsynthese von Ancisheynin, dem ersten N,8'-gekuppelten
Naphthylisochinolin-Alkaloid; Diplomarbeit, Universität Würzburg, 2004.
[169] Ich danke Frau Dipl. Chem. Tanja Gulder für die Überlassung des
Referenzmaterials.
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[171] Mündliche Mitteilung, Prof. W. Boland, Max-Planck-Institut für Chemische
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[193] Die Zusammensetzung dieses Standardmediums wurde der Homepage des
DSMZ, Braunschweig, entnommen (http://www.dsmz.de/media.htm).
[194] Die Zusammensetzung dieses Standardmediums wurde der Homepage des
DSMZ, Braunschweig, entnommen (http://www.dsmz.de/media.htm).
[195] Die Zusammensetzung dieses Standardmediums wurde der Homepage des
DSMZ, Braunschweig, entnommen (http://www.dsmz.de/media.htm).
[196] Ich danke Herrn Dipl. Biol. F. Pankewitz für die Sammlung der Gelege von
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[200] Ich danke Herrn Dr. A. Yenesew, Universität Nairobi, Kenya, für die
Überlassung des Referenzmaterials.