7,5 - Universität Stuttgart

Identifizierung und Charakterisierung
von Endosialin, einem C-Typ Lektin-ähnlichen
Rezeptor auf Tumorendothel
Von der Fakultät Geo- und Biowissenschaften
der Universität Stuttgart
zur Erlangung der Würde eines Doktors
der Naturwissenschaften (Dr. rer. nat.)
genehmigte Abhandlung
vorgelegt von
Sven Christian
aus Arnsberg
Hauptberichter: Prof. Dr. Klaus Pfizenmaier
Mitberichter: Prof. Dr. Peter Scheurich
Tag der mündlichen Prüfung: 18.07.01
Institut für Zellbiologie und Immunologie der Universität Stuttgart
2001
2
Inhaltsverzeichnis
2
Abkürzungsverzeichnis
5
1
Zusammenfassung
7
2
Einleitung
9
2.1
2.2
2.3
2.4
2.4.1
2.4.2
2.4.3
2.5
2.6
Die molekularen Grundlagen der Tumorentstehung
Das Tumorstroma
Tumorstromantigene als Target für Anti-Tumortherapien
Angiogenese
Die VEGF-Familie
Die Angiopoietin-Familie
Die Ephrin-Familie
Endosialin
Ziel der Arbeit
9
11
13
14
15
15
15
18
20
3
Material und Methoden
21
3.1
3.2
3.3
3.4
3.5
3.6
3.7
Chemikalien, Enzyme und Radioisotope
Verwendete Vektoren
Bakterienstämme
Zellinien
Antikörper
Oligonukleotide
Transformation von DNS-Plasmiden in kompetente Bakterien
(Hanahan, 1983)
Plasmid-Mini-Präparation
Plasmid-Maxi-Präparation
Behandlung von DNS-Molekülen mit Restriktionsendonukleasen
(nach Sambrook et al., 1989)
Behandlung von DNS-Molekülen mit alkalischer Phosphatase
(Asubel et al., 1989)
RNS-Isolierung
Isolation von Poly A +-RNS
Northern Blot Analysen
Gelelektrophorese
Blotten der RNS
Herstellung der spezifischen DNS-Sonde
Hybridisierung der spezifischen DNS-Sonde
PCR (Polymerase chain reaction)
5'-RACE-PCR ("Rapid Amplification of cDNA endsPolymerase chain reaction")
Agarosegelelektrophorese
Isolation von DNS-Fragmenten aus Agarosegelen
Ligation von DNS-Fragmenten (Hanahan, 1993)
Sequenzierung
21
21
21
21
21
22
3.8
3.9
3.10
3.11
3.12
3.13
3.14
3.14.1
3.14.2
3.14.3
3.14.4
3.15
3.16
3.17
3.18
3.19
3.20
22
23
24
25
25
25
26
27
27
28
29
30
30
31
33
34
34
34
3
3.21
3.21.1
3.21.2
3.22
3.23
3.24
3.25
3.26
3.27
3.28
3.29
3.30
3.31
3.32
3.33
Proteinaufreinigung
Herstellung einer Immuno-Affinitätsmatrix
Aufreinigung
Edman-Sequenzierung
Transfektionen
Expression der Endosialin-hIgG Fusionsproteine
Bioinformatische Analysen
Aufreinigung der Endosialin-hIgG Fusionsproteine
Immunzytochemie
SDS-Polyacrylamidgelelektrophorese (Laemmli, 1970)
Proteinnachweis mit Coomassie Blau (Goerg et al., 1978)
Silberfärbung von Proteingelen (Morrissey, 1981)
Immunopräzipitations Versuche
Deglykosylierungs Experimente
Western Blot
35
35
36
37
38
39
39
39
40
40
43
43
44
45
45
4
Ergebnisse
47
4.1
4.2
4.2.1
Aufreinigung des humanen Endosialin Proteins
Identifizierung der Endosialin-cDNS
Partielle Identifizierung der Endosialin-cDNS
über Expressed Sequence Tags (ESTs)
Identifizieung des 5' Endes der Endosialin cDNA mittels RACE-Technologie
("rapid amplification of cDNA ends")
Expression der Endosialin-cDNS in transient transfizierten HeLa–S3
Endogene Endosialinexpression in den Zellinien LA1-5s und MF-SH
Bioinformatische Analyse zur Domänenstruktur des Endosialin Proteins
Bioinformatische Analysen identifizieren Endosialin als
eukaryontisches Typ I Transmembranprotein
Bioinformatische Analysen identifizieren Thrombomodulin und
Komplement Rezeptor C1qR als Endosialin-Verwandte
Biochemische Analyse des rekombinanten Endosialin Protein
Analyse der Karbohydrat Modifikationen des
rekombinanten Endosialinproteins
Charakterisierung des Endosialinproteins als Sialomucin
durch O-Sialoglykoprotein Endopeptidase-Verdau
Western Blot Analyse von Endosialin
Northern Blot Analysen zur Expression der Endosialin-mRNS
Northern Blot Analysen der mRNS des endogen exprimierten Endosialin
Northern Blot Analysen zur Expression der Endosialin-mRNS
in verschiedenen humanen Geweben
Chromosomale Lokalisation des humanen Endosialin
Endosialinhomologe in Maus und Ratte
Identifizierung und Nachweis des murinen Endosialinhomologs
Nachweis des murinen Endosialinhomologs in embryonalen
Fibroblasten der Maus
Expression von rekombinantem murinen Endosialin
Konstruktion, Expression und Aufreingung eines
Endosialin-hIgG1 Fusionsproteins
47
48
4.2.2
4.3
4.4
4.5
4.5.1
4.5.2
4.6
4.6.1
4.6.2
4.7
4.8
4.8.1
4.8.2
4.9
4.10
4.11
4.11.1
4.11.2
4.12
48
49
52
53
54
54
56
57
57
59
60
61
61
62
65
65
66
66
68
69
4
4.12.1 Konstruktion des humanen Endosialin-hIgG1 Fusionsproteins
4.12.2 Expression und Aufreinigung des humanen Endosialin-hIgG Fusionsproteins
70
71
5
73
Diskussion
5.1
5.2
5.2.1
Endosialin ist TEM1
Funktion des Endosialin Proteins
Homologievergleich von Endosialin mit Thrombomodulin und dem
Komplementrezeptor C1qR
5.2.2 Homologievergleich von Endosialin aufgrund der Domänenstruktur
5.3
Ist Endosialin ein Tumorendothel-spezifisches Antigen?
5.4
Ausblick
73
75
75
77
80
81
6
Literaturverzeichnis
83
7
Summary
90
5
Abkürzungen
Abb.
Abbildung
APS
Ammoniumpersulfat
AS
Aminosäure
bp
Basenpaare
BSA
Bovines Serumalbumin
C
Celsius
ca.
Circa
Ci
Curie
cm
Zentimeter
d.h.
das heißt
DNS
Desoxyribonukleinsäure
DTT
Dithiothreitol
dNTP
Desoxyribonukleotide
EDTA
Ethylendiamin-N,N,N',N'-tetra-Essigsäure
EGF
epidermal growth factor
ELISA
Enzyme linked immunosorbent assay
EST
Expressed Sequence Tag
FKS
Fötales Kälberserum
g
Gramm, Gravitationskonstante
h
Stunde
HBSS
Hanks Balanced Salt Solution
IgG
Immunglobulin gamma
kb
Kilobasenpaare
kDa
Kilodalton
l
Liter
LB
Luria-Bertani-Medium
m
milli, Meter
M
molar
µ
mikro
6
mAk
monoklonaler Antikörper
min
Minute
MOPS
3-(Morpholino)propansäure
n
nano
OD
Optische Dichte
p
pico
32
Phosphorisotop 32
PBS
phosphate buffered saline
PCR
Polymerase Chain Reaction
pH
negativ dekadischer Logarithmus der Wasserstoffkonzentration
RNS
Ribonukleinsäure
RT
Raumtemperatur
35
Schwefelisotop 35
SDS
Natriumdodecylsulfat
sec
Sekunde
Tab.
Tabelle
TBS
Tris buffered saline
TEMED
N,N,N',N'-Tetramethylendiamin
U
Units
üN
über Nacht
UV
ultraviolett
V
Volt
P
S
7
1 Zusammenfassung
Endosialin wurde als ein 165 kDa Zelloberflächenantigen durch den monoklonalen Antikörper
FB5 identifiziert (Rettig et al., 1992). Immunhistochemische Versuche mit diesem Antikörper
auf verschiedenen humanen Geweben zeigten eine Expression des Antigens auf Blutgefäßen von
67 % aller getesteten Tumorgewebe. In allen anderen getesteten Geweben konnte weder in den
Blutgefäßen, noch in anderen Zellen eine Expression des FB5-Antigens nachgewiesen werden.
Für die genaue biochemische und funktionelle Charakterisierung dieses durch seine
tumorspezifische Verteilung interessanten Antigens sollte die Endosialin-exprimierende
Neuroblastomzellinie
LA1-5s
als
Quelle
für
eine
Proteinaufreinigung
über
eine
FB5–Immunoaffinitätsmatrix dienen. Ungefähr 10 pmol des gereinigten Proteins wurden von
Dr. Horst Ahorn (Boehringer Ingelheim Austria GmbH, Wien) tryptisch verdaut und die
Aminosäuresequenz von sechs isolierten Peptiden in der anschließenden Edman-Sequenzierung
bestimmt. Ein Prosite-Pattern-Search mit den erhaltenen Sequenzen führte zur Identifizierung
eines 330 bp langen EST-Klons (AI371224), dessen korrespondierende Aminosäuresequenz mit
fünf der sechs Peptide übereinstimmt. Die Sequenzierung des kompletten EST-Klons und
Datenbanksuchen nach weiteren überlappenden EST-Klonen und ihre Sequenzierung führten zur
Identifizierung eines 2239 bp langen offenen Leserasters mit einem Stop-Codon und einem
putativen Polyadenylierungssignal am 3' Ende. Das putative Start–ATG und damit das letzte
Fragment der kompletten Endosialin-cDNS wurde mit Hilfe der 5'-RACE-Technologie isoliert.
Die Endosialin cDNS besteht aus einem offenen Leseraster von 2274 bp und kodiert für ein Typ
I Transmembranprotein mit 757 Aminosäuren und einem theoretischen Molekulargewicht von
80,9 kDa. Bioinformatische Analysen ergeben, daß das Protein aus einem N-terminalen
globulären Teil (C-Typ-Lektin Domäne, Sushi Domäne, drei EGF-Repeats) und einem Cterminalen nicht globulären Teil (Mucin-ähnliche Domäne, Transmembranregion und ein kurzer
intrazellulärer Bereich) besteht. Im globulären Teil weist das Protein eine 39 %ige Homologie zu
Thrombomodulin (ein in der Blutgerinnung involvierter Rezeptor) und eine 33 %ige Homologie
zu C1qR (ein Rezeptor des Komplement Systems) auf.
Rekombinantes
in
HeLa-S3
Zellen
exprimiertes
Endosialin
wird
ebenso
wie
endogen–exprimiertes Protein vom monoklonalen Antikörper FB5 erkannt und zeigt eine
deutliche Membranlokalisation, sowie eine Färbung eines perinukleären Kompartiments.
Untersuchungen zur Modifizierung des Proteins mit Kohlenhydraten zeigen, daß es durch einen
8
hohen Anteil O-gebundener Zucker, insbesondere Sialinsäure, modifiziert ist. Die Sensitivität
gegenüber dem Enzym O-Sialoglykoprotein Endopeptidase zeigt, daß Endosialin zur Klasse der
Sialomucine gehört.
Northern Blot Analysen mit DNS-Sonden gegen die Endosialin-mRNS detektieren ein einziges
Transkript von ca. 2600 bp. Ein Transkript dieser Größe wurde auch in humaner Plazenta, sowie
fötalen Geweben (Niere und Lunge) identifiziert.
Zusätzlich
wurden
durch
die
Identifizierung
und
Sequenzierung
der
cDNS
des
Endosialinhomologs der Maus, sowie durch die Konstruktion, Expression und Aufreinigung von
humanen Endosialin-hIgG1-Fusionsproteinen wertvolle molekulare Werkzeuge für die
funktionelle Analyse des Proteins geschaffen.
9
2 Einleitung
2.1 Die molekularen Grundlagen der Tumorentstehung
Untersuchungen zur Entstehung der Tumorerkrankung zeigen, daß ihr eine dynamische
Veränderung des zellulären Genoms zugrunde liegt, die in den mehr als 100 bisher bekannten
Tumorarten zu der Entdeckung von sogenannten Onkogenen und Tumorsupressorgenen
(Hanahan and Weinberg, 2000) führte. Man spricht von Onkogenen, wenn es sich um ein
überaktiviertes Wachstum-stimulierendes Gen handelt und von Tumorsupressorgenen, wenn es
sich um die Inaktivierung eines Wachstum-hemmenden Gens handelt. Die Ansammlung dieser
gen-spezifischen Mutationen in einer Zelle kann zur Entstehung einer Tumorzelle führen. Dieser
mehrstufige Prozeß ist ein Grund, warum die Entstehung vieler Tumorarten mit zunehmendem
Alter wahrscheinlicher wird (Renan, 1993). Dabei verschafft jede Mutation der Körperzelle
einen Wachstumsvorteil gegenüber normalen Körperzellen, der die Zelle in einem langsamen
Prozeß von Mutation und Selektion zur Tumorzelle werden läßt. Hanahan und Weinberg
unterscheiden dabei sechs hauptsächliche Veränderungen in der Zellphysiologie: Die
Unabhängigkeit der Zelle von Wachstumsfaktoren, die Unempfindlichkeit der Zelle für
Inhibitoren des Wachstums, die Vermeidung des programmierten Zelltods, die Fähigkeit zur
unbeschränkten Zellteilung, die Angiogenese, sowie die Metastasierung (Hanahan and
Weinberg, 2000).
Unabhängigkeit von Wachstumsfaktoren kann der Tumor auf verschiedene Arten erlangen. Zum
Beispiel können die Tumorzellen in einer autokrinen Stimulation die zur Rezeptoraktivierung
benötigten Wachstumsfaktoren selbst produzieren, so wie es für TGFα exprimierende
Glioblastome und Sarkome beschrieben wird (Fedi et al., 1997). Weitere Möglichkeiten sind die
Überexpression von Rezeptor-Tyrosinkinasen, Zelloberflächen-Rezeptoren, die WachstumsSignale ins Zellinnere leiten oder Mutationen, die zu konstitutiv-aktiven Rezeptorkinasen oder
signaltransduzierenden Proteinen führen. Dabei ist vor allem das Ras-Protein zu nennen, welches
in mehr als 25 % aller Tumore als konstitutiv aktives Onkogen vorliegt (Medema und Bos,
1993).
Für die Unempfindlichkeit der Zelle für Inhibitoren des Wachstums ist in den meisten Tumoren
der Funktionsverlust des Retinoblastom-Proteins verantwortlich. Dabei handelt es sich um ein im
Kern lokalisiertes Phosphoprotein, welches einen Komplex mit dem für die Aktivierung vieler
verschiedener für die Zellteilung wichtiger Gene verantwortlichen Transkriptionsfaktor E2F-DP
10
bildet und diesen so inaktiv hält. Löst sich E2F-DP aus diesem Komplex zum Beispiel durch
inaktivierende Mutationen im Rb Gen oder durch Phosphorylierung des Proteins, aktiviert E2FDP die Transkription für die Zellteilung wichtiger Gene.
Intrazelluläre Sensoren messen ständig abnormale Veränderungen wie DNS-Schäden, die
Aktivierung eines Onkogens, Hypoxia oder eine unzureichende Nährstoffversorgung und leiten
daraufhin gegebenenfalls Apoptose ein (Evan und Littlewood, 1998). Erst die Vermeidung
dieses programmierten Zelltods kann eine Zelle zur Tumorzelle werden lassen. Eines der
wichtigsten Proteine in diesem Zusammenhang ist das Tumorsupressorprotein p53. Dabei
handelt es sich um ein im Zellkern lokalisiertes Protein, welches bei entstandenen DNS-Schäden
die Expression proapoptischer Gene aktiviert. Dieses Protein ist in mehr als 50 % aller humanen
Tumore durch eine Mutation inaktiviert und vermag somit nicht mehr, die proapoptotische
Kaskade in Gang zu setzen.
Die vierte wichtige Veränderung auf dem Weg zur Tumorzelle ist nach Hanahan und Weinberg
die Fähigkeit zur unbeschränkten Zellteilung. In normalen Zellen limitiert das 3' Ende der
Chromosomen die eigene Verdopplung auf eine definierte Anzahl. Dabei handelt es sich um die
tausendfache Wiederholung der gleichen sechs Basenpaare an den Enden der Chromosomen,
sogenannte Telomere. Da die DNS-Polymerase nicht in der Lage ist, die 3' Enden der
Chromosomen vollständig zu replizieren, verkürzt sich das Telomer bei jeder Zellteilung um 50100 bp. Erreichen Telomere eine kritische Länge, führt dies die Zelle in die Seneszens oder
Apoptose. Deshalb müssen alle Tumorzellen eine Möglichkeit entwickeln, ihre Telomere zu
erhalten. Dies geschieht häufig durch die Induktion des Enzyms Telomerase, welches die
Hexanukleotide an die Telomerenden anhängt und somit der Tumorzelle die Fähikeit zur
unbeschränkten Zellteilung verleiht (Meyerson, 2000).
Neben der Angiogenese, (im Kapitel 2.4 detaillierter beschrieben), ist ein wesentlicher Schritt in
der Tumorgenese die Entstehung von Metastasen. Die Bildung von Metastasen ist in 90 % aller
Fälle für den tödlichen Verlauf der Tumorerkrankungen verantwortlich (Sporn,1996). Die
Mechanismen, die zur Metastasierung führen, sind heute noch weitgehend unklar. Allerdings ist
bekannt,
daß
metastasierende
Tumore
oft
ein
verändertes
Expressionsmuster
von
Zelladhesionsmolekülen und extrazellulären Proteasen (siehe Kapitel 2.2) aufweisen.
In der bisherigen Beschreibung der Tumorentwicklung wurde das Augenmerk auf die
transformierte Tumorzelle gerichtet. Die Tumorentwicklung ist jedoch im wesentlichen Maße
11
von der Entstehung einer die Tumorgenese unterstützenden Matrix, dem sogenannten
Tumorstroma, abhängig, da es in den oben beschriebenen Prozessen eine wichtige Rolle spielt.
2.2 Das Tumorstroma
Das Tumorstroma macht in epithelialen Tumoren zwischen 20 und 50 % der Masse aus und
besteht aus neu gebildeten Blutgefäßen, "aktivierten" Fibroblasten, infiltrierenden lymphoiden
und phagocytierenden Zellen, sowie extrazellulärer Matrix (Hanahan, 1998). Studien haben
gezeigt, daß die Bildung neuer Blutgefäße für das Wachstum eines Tumors über eine Größe von
2 mm hinaus eine entscheidene Rolle spielt, da die Tumorzellen ab dieser Größe nicht mehr
ausreichend durch die Diffusion von Sauerstoff und Nährstoffen versorgt werden. Durch die
Bildung neuer Blutgefäße wird gewährleistet, daß alle Zellen des Tumors weiterhin mit
Sauerstoff und Nährstoffen versorgt werden können. Einer der ersten Schritte ist dabei die
Entstehung von "durchlässigeren" Blutgefäßen. Dadurch können verschiedene Plasmaproteine in
das Tumorgewebe eintreten, so daß es zur lokalen Gerinnung von Fibrinogen kommt. So entsteht
ein dichtes Gel, auf das sich Endothelzellen anheften, wandern und somit die Bildung neuer
Blutgefäße bewirken (Nagy et al., 1989). Diese Ereignisse werden durch Cytokine und
Wachstumsfaktoren reguliert, die sowohl von Tumorzellen selbst als auch von infiltrierenden
Zellen des Immunsystems gebildet werden. Aktivierte Fibroblasten konzentrieren sich stark auf
den Bereich zwischen diesen neugebildeten Blutgefäßen und den Tumorzellen (Welt et al.,
1994).
Obwohl die Tumorstromazellen selbst nicht transformiert sind, so zeigen sie doch häufig ein
verändertes Expressionsmuster, was unter anderem auch zu einer veränderten Zusammensetzung
der extrazellulären Matrix führt. So zeigen zum Beispiel humane Darmtumore eine veränderte
Expression von Proteoglykanen. Ein Großteil aller humaner Darmtumore haben eine erhöhte
Expression der Proteoglykane Decorin und Perlecan (Hauptmann et al., 1995, Iozzo et al., 1994).
Perlecan und andere Proteoglykane sind in der Lage, Wachstumsfaktoren zu binden und sie
somit besser zugänglich für den entsprechenden Rezeptor zu machen. Perlecan zum Beispiel
unterstützt die Bindung des Wachstumsfaktors FGF (fibroblast growth factor) zu dem
entsprechenden Rezeptor und vermag somit Angiogenese (siehe Kapitel 2.4) zu induzieren.
Das Tumorstroma ist nicht nur in der Lage, Angiogenese durch die Bindung von
Wachstumsfaktoren zu stimulieren, sondern bildet auch selbst für die Angiogenese
verantwortliche Faktoren. So wurde in transgenen Mäusen gezeigt, daß in spontan auftretenden
12
Gebärmuttertumoren eine starke Induktion von VEGF (vascular endothelial growth factor)
stattfindet (Fukumura et al., 1998). Diese Induktion findet jedoch nicht in den transformierten
Zellen, sondern in den aktivierten Fibroblasten statt. Diese Zellen nehmen somit aktiven Anteil
an der Ünterstützung der Angiogenese und somit an der Versorgung des Tumors.
A
B
transformierte Zellen
Fibrozyten
C
nekrotische
Tumorzellen
Extrazelluläre
Matrix
"aktivierte"
Fibroblasten
Tumor
Blutgefäße
Abb.2.1: Entwicklung epithelialer Tumore (Karzinome). In der Entwicklung eines
epithelialen Tumors teilen sich transformierte Zellen bis der Tumor einen Durchmesser von 1-2
mm erreicht hat (A und B). Danach entwickelt er eine zentrale Nekrose, da die Versorgung der
Tumorzellen mit Nährstoffen und Sauerstoff durch Diffusion nicht mehr gewährleistet ist (B). In
dieser Phase kommt es zur Bildung eines den Tumor unterstützenden Gewebes, das
"Tumorstroma", d.h. es werden neue den Tumor versorgende Blutgefäße gebildet und es kommt
zur Rekrutierung "aktivierter Fibroblasten", die die Bestandteile der extrazellulären Matrix
sezernieren (C).
Desweiteren zeichnet sich die extrazelluläre Matrix vieler Tumore durch die Abwesenheit von
Basalmembranproteinen wie Laminin oder Kollagen Typ IV, sowie einer stärkeren Expression
des Matrixproteins Tenascin, aus. Desweiteren ist die Expression einiger Zelladhäsionsmoleküle
der Cadherin-Familie verändert (Scoazec et al. 1996). Die konkreten Auswirkungen dieser
Veränderungen in der Matrix sind weitgehend unbekannt, allerdings scheinen sie eine
Auswirkung auf die Ausbreitung der Tumorzellen und somit auf die Metastasenbildung zu
haben, zum Beispiel durch die Bildung und Regulation von Proteasen. So werden Proteasen
13
sowie ihre Regulatoren, die am Umbau der extrazellulären Matrix beteiligt sind, nicht von den
Tumorzellen selbst gebildet, sondern von den aktivierten Fibroblasten oder Phagozyten (Werb,
1997). Die Expression der Urokinase (uPA) in "aktivierten" Fibroblasten zum Beispiel wird von
Tumorzellen induziert. Die Urokinase bindet daraufhin an den von Tumorzellen exprimierten
Urokinase-Rezeptor (uPAR) (Johnsen et al., 1998) und aktiviert Plasminogen.
Als weitere Tumorstroma assoziierte Antigene wären das Integrin αVβ3 (Brooks et al., 1994), das
Vascular Cell Adhesion Molecule-1 (VCAM-1) (Patey et al., 1996), sowie das Fibroblast
Activation Protein (FAP) (Garin-Chesa et al., 1990), eine Serinprotease mit 48 %iger
Sequenzhomologie zum T-Cell Activation Antigen CD26, zu nennen. Dieses Typ II
Membranglykoprotein mit einem Molekulargewicht von 95 kDa wird spezifisch von mehr als
90 % aller aktivierten Fibroblasten im Tumor exprimiert (Garin-Chesa et al., 1990, Rettig et al.,
1993).
Zusammenfassend läßt sich sagen, daß die Bildung eines Tumorstromas ein wichtiger Schritt in
der Entwicklung eines Tumors ist. Obwohl die genauen Mechanismen der Interaktionen der
Tumorzellen mit den Zellen des Tumorstromas weitgehend unbekannt sind, so scheint das
Tumorstroma doch eine aktivere und wichtigere Rolle zu spielen als noch bis vor kurzem
angenommen. Aus diesem Grund eignen sich die einzelnen Bestandteile des Tumorstromas auch
hervorragend als Angriffsziel für verschiedene Anti-Tumortherapien, zumal das Tumorstroma
eine größere genetische Stabilität und damit eine stabilere Expression eventueller Targetproteine
besitzt als die Tumorzellen selbst (siehe nächstes Kapitel).
2.3 Tumorstromantigene als Target für Anti-Tumortherapien
Ein Ansatz von Anti-Tumortherapien basiert auf der Verwendung von monoklonalen
Antikörpern, die Antigene auf Tumorzellen erkennen. Der Einsatz von monoklonalen
Antikörpern gegen Tumorantigene hat allerdings den Nachteil, daß der Selektionsdruck der
Tumortherapie bewirkt, daß Tumorzellen begünstigt werden, die das entsprechende
Target–Antigen nicht exprimieren. Dadurch können sich einzelne Tumorzellen der Therapie
entziehen und zur Progression der Tumorerkrankung beitragen. Da die Zellen des Tumorstromas
nicht transformiert sind, besitzen sie eine höhere genetische Stabilität und eine geringe Varianz
in der Expression von Antigenen. Aus diesem Grund konzentrieren sich neuere Konzepte auf
Antigene des Tumorstromas, um so die Versorgung des Tumors zu unterbinden. Dabei kommen
spezifische Antigene des Tumorendothels in Frage wie das Vascular Cell Adhesion Molecule-1
14
(Patey et al.1996) und das Integrin αVβ3 oder Antigene auf Tumorstroma Fibroblasten, wie das
oben beschrienene Fibroblast Activation Protein (FAP). Monoklonale Antikörper können
entweder an Immunotoxine (Pai and Pastan, 1998) gekoppelt oder durch Radioisotope markiert
sein, um so die Tumorzelle direkt zu schädigen. Ein relativ neues Konzept ist die Antikörper
vermittelte Aktivierung der Blutgerinnung. Dieses Konzept wurde erstmals von Huang und
Mitarbeitern beschrieben (Huang et al., 1997), die durch einen bispezifischen Antikörper den die
Blutgerinnung fördernden Tissue Factor mit dem Tumorendothel in Kontakt bringen und so die
Blutgerinnung aktivieren. Mit diesem Konstrukt wurde in Mäusen eine Tumorregression
beobachtet.
2.4 Angiogenese
Als Angiogenese wird der Prozeß bezeichnet, bei dem neue Blutgefäße aus bereits bestehenden
auswachsen. Dieser Prozeß findet natürlicherweise hauptsächlich in den weiblichen
Reproduktionsorganen, vor allem der Gebärmutter, statt. Allerdings hat sich gezeigt, daß dieser
Prozeß auch bei der Tumorentwicklung eine wichtige Rolle spielt, da Tumore ab einer
bestimmten Größe nicht mehr ausreichend mit Nährstoffen versorgt werden. Erst durch die
Bildung neuer Blutgefäße haben Tumore die Möglichkeit, über diese Größe hinaus zu wachsen.
Der Mechanismus, mit dem der Tumor die Fähigkeit erlangt, die Bildung neuer Blutgefäße zu
induzieren,
war
lange
unbekannt
und
erst
durch
die
Entdeckung
verschiedener
endothelspezifischer Wachstumsfaktoren und ihrer Rezeptoren bekam man ein genaueres Bild
von deren Zusammenspiel in der Angiogenese. Mittlerweile sind hauptsächlich drei Familien
endothelspezifischer Wachstumsfaktoren bekannt, die VEGF (Vascular endothelial growth
factor)-Familie, die Angiopoietin-Familie, sowie die Ephrin-Familie (Yancopoulos et al., 2000).
Diese Wachstumsfaktoren scheinen im Zusammenspiel mit einigen nicht-endothelspezifischen
Wachstumsfaktoren wie dem Platelet-derived growth factor (PDGF) oder dem Transforming
growth factor- (TGF- ), sowie mit verschiedenen Inhibitoren den Prozeß der Angiogenese zu
kontrollieren. In diesem Zusammenhang spricht man von einem "Angiogenese-Schalter", der
ausgeschaltet ist, wenn sich das Gleichgewicht im Tumor auf der Seite der AngiogeneseInhibitoren befindet und angeschaltet, wenn sich das Gleichgewicht auf der Seite der Moleküle
befindet, die Angiogenese induzieren. Sowohl die Anti-Angiogenese als auch die ProAngiogenese Moleküle stammen entweder von den Tumorzellen selbst oder von den Zellen des
Tumorstromas (siehe Kapitel 2.2).
15
2.4.1 Die VEGF-Familie
Die VEGF-Familie ist die am besten charakterisierte Gruppe der endothelspezifischen
Wachstumsfaktoren bestehend aus fünf Mitgliedern: VEGF-A, VEGF-B, VEGF-C, VEGF-D,
sowie PlGF (Placental growth factor). Diese binden mit unterschiedlicher Affinität und
Spezifität an drei verschiedene Rezeptoren auf der Endothelzelle, die zur Familie der RezeptorTyrosinkinasen (RTK) gehören, Flt-1 (VEGFR1), Flk-1 (VEGFR2), sowie Flt-3 (VEGFR3), die
daraufhin eine Signalkaskade in der Zelle auslösen, die zur Expression verschiedener
Transkriptionsfaktoren führt. Flk-1 scheint die größte Rolle bei der Ausbildung neuer Blutgefäße
zu spielen. So sind Flk-1 knock-out Mäuse in der Embryonalentwicklung nicht in der Lage, ein
Blutgefäßsystem auszubilden (Shalaby et al.,1995). Die Expression des Rezeptors Flt-3
beschränkt sich auf lymphatische Gefäße, der Rezeptor Flt-1 wird ebenfalls endothelspezifisch
exprimiert, allerdings ist wenig über dessen Funktion bekannt.
2.4.2 Die Angiopoietin-Familie
Die Angiopoietin-Familie besteht aus vier Mitgliedern (Angiopoietin 1-4). Die Rezeptoren für
diese Wachstumsfaktoren sind ebenso endothelspezifisch wie die VEGF-Rezeptoren (Korhonen
et al., 1992). Man kennt zwei Rezeptoren, genannt Tie 1 und Tie 2, allerdings binden alle
bekannten Angiopoietine ausschließlich an den Rezeptor Tie 2. Anders als VEGF scheinen die
Angiopoietine nicht direkt an der Ausbildung neuer Blutgefäße beteiligt zu sein, vielmehr sind
sie an der Umformung der neu gebildeten Blutgefäße beteiligt. So bilden Ang 1 oder Tie 2
knock-out Mäuse zwar ein normales primäres Netzwerk aus Blutgefäßen, allerdings werden
diese Gefäße nicht nachträglich stabilisiert, da sie nicht in der Lage sind, mit unter den
Blutgefäßen liegenden Zellen oder Matrix in Kontakt zu treten (Suri et al., 1996). Ang 2 ist ein
natürlicher Ang 1-Antagonist (Maisonpierre et al., 1997), der ebenfalls an Tie 2 bindet, diesen
aber nicht aktiviert. Somit führt die Expression von Ang 2 zur Destabilisierung von Blutgefäßen.
Diese ist vor allem in Regionen nötig, in denen es zu einem starken Umbau der Blutgefäße
kommt, wie zum Beispiel in Tumoren, in denen auch eine erhöhte Ang 2 Expression
nachgewiesen wurde (Zagzag et al., 1999). Über die Funktion von Angiopoietin 3 und 4 ist nur
wenig bekannt.
2.4.3 Die Ephrin-Familie
Die Familie der Ephrine und deren Rezeptoren ist die größte Familie der Rezeptoren für
Wachstumsfaktoren. Obwohl diese Wachstumsfaktoren vor allem für das Nervensystem
16
charakteristisch sind, so sind zumindest das Ephrin-B2, sowie sein Rezeptor EphB4 von
entscheidender Bedeutung in der Ausbildung neuer Blutgefäße (Wang et al., 1998). Sie scheinen
durch ihre entgegengesetzte Verteilung die arteriellen und venösen Blutgefäße zu markieren. So
ist das Ephrin-B2 auf arteriellen, der Rezeptor auf venösen Blutgefäßen exprimiert.
PlGF VEGF VEGF VEGF VEGF
A
B
C
D
Ang1 Ang2 Ang3 Ang4
Ephrin B2
?
VEGFR-1 VEGFR-2 VEGFR-3
(Flt-1) (KDR/Flk-1) (Flt-4)
Tie1
Tie2
EphB2
EphB3
EphB4
Abb. 2.2: Schematische Darstellung der beschriebenen endothelspezifischen
Wachstumsfaktoren und ihre Rezeptoren. Einzelheiten sind dem Text zu entnehmen (rote
Kreise: Immunglobulin-ähnliche Domönen; rote Rechtecke: Fibronectin III-ähnliche Domänen,
gelbe Ellipsen: EGF-Motive gelbe Rechtecke: Kinasedomänen, blaue Ellipsen: Cystein-reiche
Region; hellblaue Kreise: globulare Domäne)
Zur Zeit werden zwei verschiedene Theorien diskutiert, wie diese Wachstumsfaktoren in der
Angiogenese interagieren (Yancopoulos et al., 2000). Die erste geht davon aus, daß sich der
Tumor in der Anfangsphase als nicht-vaskularisierter Zellhaufen entwickelt, der ab einer
bestimmten Größe nicht mehr ausreichend mit Sauerstoff versorgt werden kann. Dieser Zustand
17
induziert die Expression des Wachstumsfaktors VEGF, der im Wechselspiel mit dem die
Blutgefäße destabilisierenden Faktor Ang 2 dann die Bildung neuer Blutgefäße induziert. Ist
dieser Umbauvorgang abgeschlossen wird die Ang 2 Expression herunterreguliert und der von
mesenchymalen Zellen exprimierte Wachstumsfaktor Ang 1 kann jetzt an Tie 2 auf den
Endothelzellen binden. Diese exprimieren daraufhin PDGF, welches die Wanderung
mesenchymaler Zellen in Richtung Endothel bewirkt. Treten beide Zelltypen in Kontakt
zueinander wird TGF-β exprimiert, das die Differenzierung der mesenchymalen Zelle zum
Perizyten oder zur glatten Muskelzelle induziert und somit die neu gebideten Blutgefäße
stabilisiert (Folkman and D'Amore, 1996).
In der zweiten Theorie geht man davon aus, daß sich der Tumor um bereits bestehende
Blutgefäße herum entwickelt. Erst nachträglich, möglicherweise als Abwehrmechanismus
bewirkt die Expression von Ang 2 die Regression dieser Blutgefäße. Erst dadurch kommt es zu
einem hypoxischen Zustand im Tumor, der die Expression von VEGF induziert, das im
Zusammenspiel mit Ang 2 das Wachstum neuer Blutgefäße induziert.
Ein genaueres Wissen über die Abläufe während der Angiogenese bietet die Möglichkeit, diese
als Angriffsziel für Anti-Tumortherapien zu nutzen, um somit ein Absterben des Tumorendothels
zu bewirken. Somit wäre die Versorgung des Tumors nicht mehr gewährleistet, was zu einer
Hemmung des Tumorwachstums und verstärkter Apoptose führen könnte. Dieses würde
verschiedene Vorteile gegenüber herkömmlichen Therapien bieten. Zum einen ist das Endothel
sehr gut zugänglich für therapeutisch wirksame Substanzen. Zum anderen ist es
unwahrscheinlich, daß das nicht transformierte Tumorendothel eine Resistenz gegen das
Medikament entwickeln wird (Folkman, 1995).
Bereits verfolgte Ansätze zur Anti-Tumortherapie basieren (1) auf Substanzen, die mit
endothelspezifischen Wachstumsfaktoren bzw. ihren Rezeptoren, wie zum Beispiel dem
VEGFR2, interagieren und somit ihre Funktion hemmen, (2) auf Antikörpern, die
endothelspezifische Antigene erkennen und somit Toxine oder Radionuklide zum Tumor
transportieren (Wilder et al,. 1996) und (3) auf endogene Inhibitoren. Von diesen endogenen
Inhibitoren der Angiogenese sind vor allem zwei zu nennen. Angiostatin wurde als 38-kDa
großes Fragment von Plasminogen identifiziert, welches in der Lage war die Teilung von
Endothelzellen spezifisch zu hemmen (O'Reilly et al., 1994). Einige Jahre später wurde
Endostatin identifiziert, ein 20-kDa Fragment von Kollagen XVIII, welches ebenfalls in der Lage
18
ist, die Teilung von Endothelzellen spezifisch zu hemmen und somit Angiogenese und
Tumorwachstum zu inhibieren.
2.5 Endosialin
Zur Identifizierung und Charakterisierung neuer Tumorstroma-Antigene wurden 1992 am
Memorial Sloan-Kettering Cancer Center in New York
(BALB/c x A) F1 Mäuse mit
kultivierten, fötalen Fibroblasten immunisiert (Rettig et al., 1992). Anschließend wurden die
Milzzellen der immunisierten Mäuse mit X63-Ag8.653 Myelomzellen fusioniert. Die von diesen
Zellen produzierten monoklonalen Antikörper wurden anschließend zur Expressionsanalyse auf
verschiedene humane Zellinien und Geweben getestet. In dieser Analyse zeigte einer der
getesteten monoklonalen Antikörper, genannt FB5, eine spezifische Reaktivität für
Tumorendothel (Abb. 2.3) in 41 von 61 Sarkomen, in 26 von 37 Karzinomen und in 18 von 25
neuroektodermalen Tumoren. Alle normalen getestesten Gewebe waren FB5-negativ. Auch die
Tumorzellen selbst, sowie die Fibroblasten des Tumorstromas waren in den getesteten Geweben
FB5-negativ.
Dabei
beschränkt
sich
die
Expression
des
FB5-Antigens
auf
kleine
Tumor–Blutgefäße, hauptsächlich auf Kapillare. In größeren Blutgefäßen wurde keine
Expression nachgewiesen. Desweiteren ist die Anzahl an FB5-positiven Blutgefäßen innerhalb
der verschiedenen Tumore sehr unterschiedlich und variiert von nur wenigen Tumorkapillaren
bis hin zu den gesammten Blutgefäßen eines Tumors (Rettig et al, 1992). Solch ein variables
Verteilungsmuster würde man für ein Molekül erwarten, welches in der Reorganisation von
Geweben wie Krebs eine Rolle spielt, in denen Regionen mit einer stabilen Blutzufuhr, sowie
nekrotische Regionen, Regionen mit starkem Wachstum und Regionen, in denen starker Umbau
stattfindet, dicht nebeneinander liegen. Neben den Endothelzellen in einem Teil der humanen
Tumorgewebe zeigten außerdem noch kultivierte Fibroblasten und Neuroblastomzellinien eine
Immunoreaktivität mit dem monoklonalen Antikörper FB5.
Da humanes Tumorendothel nur einen geringen Anteil an der gesammten Tumormasse ausmacht
und schwer zu isolieren ist, wurde die Expression des FB5–Antigens auf Neuroblastomzellen im
weiteren
dazu
benutzt,
das
Antigen
biochemisch
zu
charakterisieren.
Immunoprezipitationsexperimente mit der metabolisch markierten Neuroblastomzellinie LA1-5s
identifizierten das FB5-Antigen als Protein mit einem Molekulargewicht von 165 kDa in der
reduzierten und nicht-reduzierten Polyacrylamidgelelektrophorese. Die Behandlung des Antigens
mit
verschiedenen
Glykosidasen
führen
zu
einer
deutlichen
Verringerung
des
19
Molekulargewichts. Eine Behandlung mit dem Sialin/Neuraminsäure entfernenden Enzym
Neuramidase (Athrobacter ureafaciens) zum Beispiel reduzieren das Molekulargewicht auf
120 kDa. Verdaut man alle O-gebundenen Oligosaccharide durch eine Kombination der Enzyme
Neuramidase und O–Glykanase, so reduziert sich das Molekulargewicht um ca. 70 kDa auf
95 kDa, die nach wie vor vom monoklonalen Antikörper FB5 erkannt werden. Die Behandlung
mit dem Enzym N-Glykanase, welches N-gebundene Oligosaccharide entfernt, hat keinen
Einfluß auf die Größe des Antigens. Somit ist Endosialin nicht bzw. geringfügig N-glykosyliert.
Der hohe Anteil an Sialinsäure, sowie die spezifische Expression des Antigens auf
Tumorendothelzellen, führten dazu, daß das FB5-Antigen den Namen Endosialin erhielt.
A
B
C
D
Abb. 2.3: Immunohistochemische Detektion des FB5–Antigens in Tumorendothelzellen
eines A, Colonkarzinoms, B, Endometrialkarzinoms C, Ovarienkarzinoms und D, eines
Nierenzellkarzinoms (Avidin-Biotin Immunoperoxidase Färbung mit Hematoxylin
Gegenfärbung). Angefertigt von Dr. Garin-Chesa, Abtlg. Onkologische Forschung, Boehringer
Ingelheim Pharma KG.
20
Somatische Mensch-Maus-Zellhybride aus FB5-positiven humanen Neuroblastomzellen und
FB5-negativen murinen Neuroblastomzellen wurden benutzt, um die chromosomale Lokalisation
des humanen Endosialingens zu bestimmen. Die erzeugten Hybridzellen mit unterschiedlichen
Kombinationen menschlicher und muriner Chromosomen wurden auf ihre Endosialinexpression
mit dem monoklonalen Antikörper FB5 getestet. So konnte das Endosialingen auf Chromosom
11q13 lokalisiert werden (Rettig et al., 1992).
2.6 Ziel der Arbeit
Da das von Rettig et al. 1992 beschriebene FB5-Antigen, Endosialin, eventuell eine Rolle in für
den Tumor wichtigen Prozessen wie Angiogenese und Metastasierung spielt oder als Antigen für
neue Tumortherapien dienen könnte, sollte das Antigen im Rahmen dieses Projekts weiter
charakterisiert werden. Dazu sollte im ersten Schritt der monoklonale Antikörper FB5 benutzt
werden, um das Antigen über eine Immuno-Affinitätsmatrix aus Zellysaten der Endosialinexprimierenden Neuroblastomzellinie LA1-5s aufzureinigen. Desweiteren war geplant durch den
tryptischen Verdau des aufgereinigten Proteins und einer anschließenden Edman-Sequenzierung
der entstandenen Peptide Aufschluß über die Endosialin-Aminosäuresequenz zu erlangen.
Im zweiten Teil der Arbeit sollte diese Information über die Aminosäuresequenz des humanen
Endosialins dazu benutzt werden, das entsprechende Gen zu isolieren und zu klonieren. Um
dieses Ziel zu erreichen, sollten die identifizierten Aminosäuresequenzen entweder dazu benutzt
werden, degenerierte PCR-Startermoleküle zu entwickeln, um dann in einer PCR-Reaktion Teile
der Endosialin-cDNS zu amplifizieren oder durch bioinformatische Datenbankanalysen die
cDNS-Sequenz aufzuklären, um über Homologie-Vergleiche, Domänenstrukturen oder eventuell
identifizierte Interaktionspartner die Funktion des humanen Endosialins im Tumorendothel zu
untersuchen.
Im letzten Schritt sollte das rekombinante Endosialin exprimiert und biochemisch charakterisiert
werden.
21
3 Material und Methoden
3.1 Chemikalien, Enzyme und Radioisotope
Soweit nicht anders angegeben, wurden alle Chemikalien von den Firmen Roche, Merck, Fluka,
Roth, Serva oder Sigma bezogen. Alle Chemikalien lagen im Reinheitsgrad p.A. vor. Die
Enzyme wurden von den Firmen Roche, Life Technologies, Pharmacia oder Promega geliefert.
Radiochemikalien wurden von Amersham bezogen.
3.2 Verwendete Vektoren
Im Rahmen dieser Arbeit wurden die Vektoren pCRblunt und pCR2.1 der Firma Invitrogen,
sowie die eukaryontischen Expressionsvektoren pMH der Firma Roche und INPEP4 (IDEC)
verwendet.
3.3 Bakterienstämme
Zur Amplifikation der oben genannten Vektoren wurde der Bakterienstamm Escherichia coli
TOP10 der Firma Invitrogen verwendet.
3.4 Zellinien
Im Rahmen dieser Arbeit wurde mit der Neuroblastomzellinie LA1-5s und der Sarkomazellinie
MF-SH gearbeitet, die in RPMI 1640 Medium + 10% Fetalem Kälberserum und 20 IU/ml
Penicillin/Streptomycin kultiviert wurden. Für die Transfektionsexperimente wurde mit den
Zellinien HeLa–S3 und 293 gearbeitet, die in HAM's F-12 + 10% FKS und
Penicillin/Streptomycin (Life Technologies), bzw. DMEM-F12 (BioWhittaker) + 10% FKS und
Penicillin/Streptomycin (Life Technologies) kultiviert wurden.
3.5 Antikörper
Zur Aufreinigung des Endosialin Proteins und weiterführenden Experimenten wurde der mAk
FB5 (Maus IgG2a) verwendet (Rettig et al., 1992). Außerdem wurde der mAk 9EG7 (Ratte
IgG2a) benutzt (Lenter et al., 1993), sowie mAk HA.11 (Covance).
22
3.6 Oligonukleotide
Alle Oligonukleotide wurden von der Firma MWG bezogen.
Name
Est1987-UP1
Est1987-UP2
Est1987-DN1
Est1987-DN2
Est2243-DN1
Est2243-DN2
Est1987sense3
Est1987sense4
Est1987as3
Est1987as4
GSP2
GSP3
GSP4
HS258155_UP1
HS258155_DN1
AA595199_UP1
AA595199_DN1
HS800162_UP1
HS800162_DN1
HS557165_UP1
HS557165_DN1
Endo5´17_UP
AAP
AUAP
Endo5´HindIII.UP1
EGF3_BspE1_DN1
M_ES_pMH_DN1
Sequenz
5'-CCC ACA CTG GGC CAG GAC CCC TGG G-3´
5'-GCT GAG CCC CGT GCC GCC TGC GGC-3´
5'-AGA GGC TGG CTG GGC CCA GTT GGT G-3´
5'-CCA GTT GGT GAA AGC CGT GTC CTG G-3´
5'-CGG CCT GGC CCG CCT CAT CTT GCA GC-3´
5'-ACA GGT AGC CGT CGA CAG CCA GCG TGC-3´
5'-GGC TTC CGG CTG GCA ACA GAC GGG-3´
5'-GGA AGA TGA AGA CGG AGG CCT GG-3´
5'-GGA AGC CTT GGG CAC CCA TGG-3´
5'-GCA GCG GCA GGA CAC GTG ACC ATC C-3´
5'-GCA GTG GGC GCT GCA GCT GGC ATT GC-3´
5'-CCG ATC CAC AGC AGC CGG CTG GC-3´
5'-ACC CAC CAG GCT GTC CAC ACG CTG G-3´
5'-CCC CCG CTC AGT GCC CCC AGG G-3´
5'-GGC AAA TGA GTG GTG GTC TGG G-3´
5'-CCC CAT TTA TTG GAG AAG ACC CC-3´
5'-GCC TCA CAG GGG TGC AGA CCT GC-3´
5'-GGA ATC CCA CCT AAC CAT GCC CC-3´
5'-GGG AAC TGG GGC CCA TCT TCC CC-3´
5'-CCC TCC TGC CCT CTC AGA GCC CC-3´
5'-GCC ATG GGG GCC ACA GCG GGT GC-3´
5'-AGT CCG GGG GCA TCG CG-3´
5'-GGC CAC GCG TCG ACT AGT ACG GGI IGG GII GGG IIG-3'
5'-GGC CAC GCG TCG ACT AGT AC-3'
5´TGA AGC TTA GTC CGG GGG CAT CGC GAT GC-3´
5´TTG TCC GGA TTG CAG CTG ATG CCA TCA GCC TCC-3´
5´ATT CTC CGC GGA CAC ACT GGT TCT ACA GGT CT-3´
Verwendung
PCR
PCR
PCR
PCR
PCR
PCR
Sequenz.
Sequenz.
Sequenz.
Sequenz.
RACE
RACE
RACE
PCR
PCR
PCR
PCR
PCR
PCR
PCR
PCR
PCR
RACE
RACE
PCR
PCR
PCR
3.7 Transformation von DNS-Plasmiden in kompetente Bakterien (Hanahan, 1983)
Zur Transformation von DNS-Plasmiden in kompetente Bakterien werden pro Ansatz 50 µl One
Shot TOP10 Zellen (Invitrogen) auf Eis aufgetaut. Anschließend fügt man ca. 100 ng DNS hinzu
und inkubiert den Ansatz für weitere 30 min auf Eis. Danach inkubiert man das Bakterien/DNSGemisch für 30 sec bei 42°C, wodurch die Bakterien einen Hitzeschock erleiden, was zur
Aufnahme der DNS durch die Bakterien führt. Nachdem die transformierten Bakterien weitere
2 min auf Eis inkubiert werden, fügt man 250 µl SOC-Medium (Invitrogen) hinzu und schüttelt
die Bakterien für 60 min bei 225 rpm. Nach einer Stunde werden 100 µl auf einer LB-Agarplatte
23
mit dem entsprechenden Antibiotikum ausplatiert. Das Antibiotikum richtet sich dabei nach dem
Resistenzgen auf dem transformierten Plasmid.
LB-Medium:
10 g NaCl
10 g Peptone
5 g Hefeextrakt
einstellen des pH-Wertes auf 7.0 mit 5 N NaOH
H2O bidest ad 1l
Autoklavieren
LB-Agar:
10 g NaCl
10 g Peptone
5 g Hefeextrakt
20 g Agar
einstellen des pH-Wertes auf 7.0 mit 5 N NaOH
H2O bidest ad 1l
Autoklavieren
SOC-Medium:
2 % Trypton
0.5 % Hefeextrakt
10 mM NaCl
2.5 mM KCl
10 mM MgCl2
10 mM MgSO4
20 mM Glucose
3.8 Plasmid-Mini-Präparation
Die Plasmid-Mini-Präparation wurde mit dem QIAprep Spin Miniprep Kit (Quiagen) nach dem
QIAprep Spin Miniprep Kit Protocol unter Benutzung einer Vakuumpumpe aus dem
entsprechenden Handbuch durchgeführt. Die Methode basiert auf eine alkalische Lyse der
Bakterien mit anschließender Adsorbtion der DNS an ein Kieselgel in Anwesenheit hoher
Salzkonzentrationen. Dabei werden 3 ml einer Bakterien-Übernachtkultur für 1 min bei 15000 g
24
zentrifugiert. Das Pellet wird in 250 µl Puffer P1 resuspendiert. Danach erfolgt die alkalische
Lyse der Bakterien durch Zugabe von 250 µl Puffer P2. Nach 6 maligem Invertieren des
Gemisches fügt man 350 µl Puffer N3 hinzu, invertiert erneut 6 x und zentrifugiert das Gemisch
für 10 min bei 15000 g. Der Überstand mit der Plasmid-DNS wird dann auf eine Kieselgel-Säule
gegeben. Durch das Anlegen eines Vacuums wird die Lösung durch das Gel gesogen, wobei die
DNS an das Kieselgel bindet. Nachdem die Salze durch Waschen mit 750 µl PE Puffer entfernt
wurden, wird die DNS mit 50 µl EB Puffer eluiert.
3.9 Plasmid-Maxi-Präparation
Die Plasmid-Maxi-Präparation wurde mit dem QIAfilter Plasmid Maxi Kit (Qiagen) nach dem
QIAfilter Plasmid Midi und Maxi Protocol aus dem entsprechenden Handbuch durchgeführt. Die
Methode basiert auf eine alkalischen Lyse der Bakterien. Anschließend wird die DNS unter
niedrigen Salz- und pH-Bedingungen an eine Anionen-Austausch-Säule gebunden. Die RNS und
Proteine werden dann in einem Waschschritt mit mittleren Salzkonzentrationen entfernt. Nach
der Elution der Plasmid-DNS mit einem Hochsalzpuffer wird sie durch eine Isopropanol
Prezipitation entsalzt und konzentriert. Zur Durchführung der Methode werden 100 ml einer
Bakterien Übernachtkultur für 15 min bei 2500 g und 4°C zentrifugiert. Die Bakterien werden
anschließend in 10 ml Puffer P1 resuspendiert und durch Zugabe von 10 ml Puffer P2 und
6 maligem Invertieren für 5 min bei RT lysiert. Durch die Zugabe von 10 ml Puffer P3 und
erneutem 6 maligem Invertieren werden die genomische DNS, sowie Proteine denaturiert. Die
Lösung wird in eine QIAfilter Spritze gefüllt und für 10 min bei RT inkubiert. Dadurch steigen
die denaturierte DNS, sowie die Proteine nach oben. Anschließend wird die klare Lösung mit der
Plasmid-DNS
durch
die
Spritze
auf
eine
mit
10
ml
Puffer
QBT
equillibrierte
QIAGEN–tip 500–Säule gedrückt. Nachdem die Plasmid-DNS an die Anionen-AustauscherSäule gebunden hat, wird sie mit 2 x 30 ml Puffer QC gewaschen und mit 15 ml Puffer QF
eluiert. Die DNS wird durch die Zugabe von 10,5 ml Isopropanol und Zentrifugation bei 2500 g
für 30 min bei 4°C präzipitiert. Danach wird das Pellet mit 5 ml 70 %igem Ethanol gewaschen
und erneut für 10 min bei 2500 g und 4°C zentrifugiert. Das Pellet wird luftgetrocknet und in
200 µl EB Puffer gelöst.
25
3.10 Behandlung von DNS-Molekülen mit Restriktionsendonukleasen (nach Sambrook et
al., 1989)
Mit der Hilfe von Restriktionsendonukleasen werden DNS-Moleküle an für jedes Enzym
spezifischen Sequenzen gespalten. Zur Restriktionsanalyse der DNS-Pasmide wurden 200500 ng DNS mit 6 U des entsprechenden Enzyms und dem vom Hersteller empfohlenen Puffer
in einem 20 µl Ansatz für 2 h inkubiert. Die Temperatur richtet sich dabei ebenfalls nach den
Angaben des Herstellers. Für präparative Ansätze wurden ca. 1 µg Plasmid-DNS für 2 h mit
10 U Enzym inkubiert.
3.11 Behandlung von DNS-Molekülen mit alkalischer Phosphatase (Asubel et al., 1989)
Die Behandlung von DNS-Molekülen mit alkalischer Phosphatase entfernt die freien 5'Phosphatgruppen von der linearisierten DNS. Dadurch wird verhindert, daß ein durch eine
Restriktionsendonuklease linearisierter Vektor religiert. Daher werden 20 µl Restriktionsansatz
(200-500 ng DNS) mit 1 U alkalischer Phosphatase und dem entsprechenden Puffer in einem
40 µl Ansatz für 1 h bei 37°C inkubiert. Nach 30 min wird der Reaktion erneut 1 U Enzym
zugesetzt.
3.12 RNS-Isolierung
Zur RNS-Isolierung wurde das SV Total RNA Isolation System der Firma Promega benutzt.
Dazu wurden 2 x 107 Zellen mit einem Zellschaber abgelöst und in einem 50 ml Gefäß (Falcon)
für 5 min bei 300 g zentrifugiert. Anschließend werden die Zellen mit 25 ml kaltem PBS (Life
Technologies) gewaschen und erneut für 5 min bei 300 g zentrifugiert. Das Zellpellet wird in
350 µl SV RNS Lysispuffer resuspendiert, 4-5 x durch eine Nadel mit 20iger Ringmaß gesogen
und in 700 µl SV RNS Dilution Buffer verdünnt. Das Gemisch wird 4 x invertiert und für 3 min
bei 70°C inkubiert. Nachdem es für 10 min bei 13000 g zentrifugiert wurde, wird der klare
Überstand in ein neues Gefäß überführt und mit 400 µl 95 %igem Ethanol versetzt. Man
invertiert erneut 4 x und gibt die Lösung auf das Spin Column Assembly (Promega). Nach einer
Zentrifugation bei 14000 g für eine Minute, gibt man 600 µl SV RNA Wash Solution auf die
Säule und zentrifugiert erneut für eine Minute bei 14000 g. Schließlich gibt man 50 µl DNase
Incubation Mix auf die Membran und inkubiert für 15 min bei 25°C. Danach wird die Reaktion
durch die Zugabe von 200 µl SV DNase Stop Solution abgestoppt. Nach einer Zentrifugation
26
von 1 min bei 14000 g wird die Membran zweimal mit SV RNA Wash Solution gewaschen.
Schließlich wird die RNS mit 100 µl Nuklease-freiem Wasser und Zentrifugation bei 14000 g
eluiert. Die Lagerung der RNS erfolgt bei -70°C.
SV RNA Lysis Buffer:
4 M Guanidin Thiocyanat
0,1 M Tris-HCl pH 7,5
0,97 % β-Mercaptomethanol
SV RNA Wash Solution:
60 mM Natriumacetat
10 mM Tris-HCl pH 7,5
60 % Ethanol
DNase Incubation Mix:
40 µl "Yellow Core Buffer"
5 µl 0,09 M MnCl2
5 µl DNase I
Yellow Core Buffer:
0,0225 M Tris-HCl pH 7,5
1,125 M NaCl
0,0025 % gelber Farbstoff
SV DNase Stop Solution:
2 M Guanidin Isothiocyanat
4 mM Tris-HCl pH 7,5
57 % Ethanol
3.13 Isolation von Poly A +-RNS
Zur Isolierung von Poly A+-RNS wurde oligo dT- Zellulose (100 mg oligo dT-Zellulose/mg
Gesamt-RNS; Life Technologies) in H2O+ 0,2% DEPC quellen gelassen und anschließend für
5 min bei 800 g zentrifugiert. Im Rahmen der Doktorarbeit wurden 3 mg Gesamt-RNS mit
300 mg Matrix aufgereinigt. Die Matrix wird in oligo dT-Loading buffer resuspendiert, erneut
für 5 min bei 800 g zentrifugiert und in 3 ml oligo dT Loading buffer resuspendiert. Die GesamtRNS wird 5 min bei 65°C inkubiert und anschließend auf die Konzentrationen des oligo dTLoading buffers eingestellt. Die Gesamt-RNS wird zur Matrix gegeben und 3 h bei RT auf dem
27
Überkopfschüttler inkubiert. Danach wird die Matrix 4 x mit 15 ml oligo dT-Loading buffer,
einmal mit 15 ml oligo dT-Washbuffer und einmal mit 10 ml oligo dT-Washbuffer gewaschen.
Anschließend wird die PolyA+-RNS eluiert einmal mit 1 ml H2O+0,2 % DEPC, einmal mit 2 ml
oligo dT-Elutionbuffer und einmal mit 2 ml H2O+0,2 % DEPC. Die Proben werden vereint und
nochmals für 1 min bei 13000 g zentrifugiert. Der Überstand wird in ein neues Gefäß überführt.
Nach dem Zusatz von 500 µl 3 M NaOAc pH 5,1, 2 µg Glykogen und 14 ml 100% Ethanol wird
die RNS durch Zentrifugation für 15 min bei 4°C und 14000 g präzipitiert. Das Pellet wird mit
80 %igem Ethanol gewaschen, für 1 h im Vacuumtrockner getrocknet und in 100 µl H 2O+0,2 %
DEPC resuspendiert. Der Gehalt an PolyA+-RNS wurde photometrisch (OD260) bestimmt.
oligo dT-Loading buffer:
500 mM NaCl
10 mM Tris-HCl pH 7,5
1 mM EDTA pH 8,0
0,5 % SDS
oligo dT-Washbuffer:
100 mM NaCl
10 mM Tris-HCl pH 7,5
1 mM EDTA pH 8,0
0,2 % SDS
oligo dT-Elutionbuffer:
10 mM Tris-HCl pH 7,5
1 mM EDTA pH 8,0
0,2 % SDS
3.14 Northern Blot Analysen
3.14.1 Gelelektrophorese
Für die Auftrennung der RNS wird ein Agarosegel aus folgenden Lösungen angesetzt:
28
1,6 g Agarose (Agarose ultra pure, Life Technologies)
20 ml 10 x MOPS
175 ml H2O bid.
Nachdem die Agarose kurz aufgekocht wurde, läßt man sie auf ca. 50°C abkühlen und fügt 6 ml
einer 37 %igen Formaldehydlösung hinzu. Anschließend gießt man die Lösung in eine
entsprechende Gelform (MWG) und bereitet die RNS für den Gellauf vor. Dazu werden 4 µg
Poly A+-RNS in einem Endvolumen von 16 µl in H2O+0,2% DEPC verdünnt und mit 2 µl
Formaldehyd-Probenpuffer und 2 µl Ethidiumbromid (50 µg/ml) versetzt. Die Proben werden für
5 min bei 68°C erhitzt und auf das vorbereitete Agarosegel aufgetragen. Die Auftrennung erfolgt
bei 120 V in 1 x MOPS-Puffer. Als Marker dienen 1,5 µl der RNA-Leiter der Firma Life
Technologies.
10 x MOPS:
200 mM MOPS
50 mM Na-Acetat
10 mM EDTA
pH 6,6
Formaldehyd-Probenpuffer: 0,75 ml deionisiertes Formamid (Sigma)
0,15 ml 10 x MOPS
0,24 ml 37 % iges Formaldehyd
0,18 ml H2O+0,2 % DEPC
0,1 ml Glycerin
1 Spatelspitze Bromphenolblau
3.14.2 Blotten der RNS
Nach der Gelelektrophorese wird das Gel 3 x 10 min in 10x SSC equillibriert. Anschließend wird
die Blotmembran (Hybond N+; Amersham) auf Gelgröße zurecht geschnitten, in H2O+ 0,2 %
DEPC angefeuchtet und ebenfalls für 10 min in 10x SSC equillibriert. Daraufhin legt man eine
Saranfolie in eine Plastikwanne, legt das Gel mit der Tasche nach unten auf die Folie, gießt
etwas 10x SSC auf das Gel und legt dann die Blotmembran luftblasenfrei auf das Gel. Auf die
Blotmembran legt man 6 Lagen mit 10 x SSC befeuchtetes Blotting-Papier (Schüll & Schleicher)
29
und 6 Lagen trockenes Blotting-Papier. Darauf legt man einen Stapel Zellstoff und beschwert die
gesammte Konstuktion mit ca. 500 g Gewicht. Anschließend blottet man für 16-20 h.
Beim Abbau des Blots wird die Position der Geltaschen auf der Blotmembran markiert.
Anschließend legt man ein Lineal an mit dem Nullpunkt auf Taschenhöhe und photografiert den
Blot unter UV-Beleuchtung. Nachdem die Höhe der Markerbanden, sowie die Höhe der rRNS
eingezeichnet wurde, spült man die Membran mit 2 x SSC ab und inkubiert sie im "UV
Stratalinker 2400 (Auto Cross Link)" von Stratagene.
20 x SSC:
3 M NaCl
0,3 M NaCitrat
pH 7,0
3.14.3 Herstellung der spezifischen DNS-Sonde
Für die Herstellung einer spezifischen DNS-Sonde wurden die Reagenzien aus dem Multiprime
DNA Labelling system (Amersham) benutzt. Dabei werden Hexanukleotid-Primer eingesetzt,
die von dem Klenow-Fragment der DNS-Polymerase I durch den Einbau sowohl unmarkierter
als auch markierter Nukleotide verlängert werden. Dazu wird folgender Anzatz für die
Markierung von 25 ng DNS angesetzt:
25 ng DNS
4 µl dATP (Multiprime DNA Labelling system)
4 µl dTTP (Multiprime DNA Labelling system)
4 µl dGTP (Multiprime DNA Labelling system)
5 µl Puffer (Multiprime DNA Labelling system)
5 µl Primer (Multiprime DNA Labelling system)
5 µl α-32P dCTP (Amersham, 3000 Ci/mmol)
2 µl Enzym (Multiprime DNA Labelling system)
Der Ansatz wird anschließend für 30 min bei 37°C inkubiert. Vor der Lagerung bei -20°C wird
der markierten DNS-Sonde EDTA in einer Endkonzentration von 20 mM zugesetzt.
30
3.14.4 Hybridisierung der spezifischen DNS-Sonde
Die zu hybridisierenden Blotmembranen werden für 30 min bei 68°C in 15 ml
ExpressHybSolution (Clontech) praehybridisiert. Währenddessen wird die unter 3.14.3 markierte
DNS-Sonde für 5 min bei 95°C denaturiert und anschließend in 5 ml ExpressHybSolution auf
die Membran gegeben. Nachdem die Membran üN bei 68°C mit der Sonde inkubiert wurde,
wäscht man die Membran 1 x kurz mit 2 x SSC; 0,05 % SDS bei RT, 1 x für 40 min mit
2 x SSC; 0,05 % SDS bei RT und 1 x 40 min mit 0,1 x SSC, 0,1 % SDS bei 50°C. Danach
wäscht man die Membran kurz in 5 x SSC, läßt sie gut abtropfen, legt sie zwischen eine
Klarsichthülle und detektiert die hybridisierte Sonde mit einem Biomax MR-Film (Kodak).
3.15 PCR (Polymerase chain reaction)
Diese Metthode wurde neben dem unten beschriebenen 5'-RACE außerdem zum Einfügen von
Schnittstellen für Restriktionsendonukleasen verwendet. Dazu wurden 30 ng der entsprechenden
DNS in folgendem Ansatz mit 1,25 U Pfu-Polymerase inkubiert:
30 ng DNS
1 x Pfu-Puffer (Stratagene)
1 µM Primer A+B
200 µM dNTP mix
1,25 U Pfu-Polymerase (Stratagene)
add 50 µl H 2O
Die Ansätze werden mit 35 Zyklen des folgenden Programms in einem Gene Amp PCR System
9600 (Perkin Elmer) inkubiert.
1. Denaturierung
2 min
94°C
2. Zyklen
45 sec
94°C
45 sec
64°C
120 sec
72°C
7 min
72°C
3. finale Verlängerung
31
3.16 5'-RACE-PCR ("Rapid Amplification of cDNA ends-Polymerase chain reaction")
Diese Methode benutzt man zur Amplifikation eines nicht bekannten mRNS 5' Endes. Dazu wird
mRNS mit einem genspezifischen Primer revers transkribiert. Nachdem das Endprodukt durch
einen Reinigungsschritt von nicht eingebauten Nukleotiden und Primern befreit wird, benutzt
man das Enzym terminale Transferase, um einen dCTP-Schwanz an die transkribierte cDNS zu
hängen. Diese DNS wird dann in einer PCR-Reaktion mit einem zweiten genspezifischen Primer
und einem Adapter-Primer, der an den dCTP-Schwanz bindet, eingesetzt. Nach einer zweiten
PCR mit einem dritten genspezifischen Primer, werden die Banden durch Restriktionsverdau
oder Sequenzreaktion ausgewertet.
Im Rahmen der Doktorarbeit wurde folgender Ansatz für die reverse Transkription angesetzt:
2 µg Gesamt-RNS
4 µl display THERMO-RT Puffer (Display Systems Biotech)
0,5 mM dNTPmix
1 M Betain (Sigma)
1 µl display THERMO-RT Initiator Mix (Display Systems Biotech)
1 µM Primer Est2243-DN2
Dieser Ansatz wurde für 10 min bei 65°C inkubiert, anschließend auf 42°C abgekühlt und nach
dem Zusatz von 2 µl display Thermo-RT Terminator Lösung für weitere 40 min bei 42°C
inkubiert. Der Ansatz wurde dann für 15 min bei 65°C inkubiert und auf 37°C abgekühlt. Dann
wurde 1 µl RNAse Mix (5' RACE System for Rapid Amplification of cDNA Ends Reagent
Assembly, Version 2.0, Life Technologies) hinzugefügt und weitere 30 min bei 37°C inkubiert.
Die cDNS wurde dann über GlassMax (Life Technologies) aufgereinigt und in folgende
Reaktion eingesetzt:
1 M Betain
1x tailing buffer (10 mM Tris-HCl pH 8.4, 25 mM KCl, 1.5 mM MgCl; Life Technologies)
2 mM dCTP
10 µl gereinigte cDNS
H2O ad 24 µl
32
Dieser Ansatz wird für 2 min bei 94°C erhitzt, dann eine Minute auf Eis inkubiert und nach der
Zugabe von 1 µl der terminalen Transferase (TdT; Life Technologies) für 10 min bei 37°C
inkubiert. Nachdem die terminale Transferase für 10 min bei 65°C inaktiviert wurde, kann die
cDNS in der ersten PCR eingesetzt werden.
1. PCR:
1 x PCR Puffer (20 mM Tris-HCl pH 8.4, 50 mM KCl; Life Technologies)
1,5 mM MgCl2
400 nM Abridged Anchor Primer (Life Technologies)
400 nM Est 1987-DN1
2 µl cDNS
1 M Betain
200 µM dNTPmix
2,5 U Taq Polymerase (Promega)
H2O add 50 µl
Mit diesem Ansatz wurden 35 Zyklen des fogenden PCR-Programms durchgeführt.
1. Denaturierung
2 min
94°C
2. Zyklen
40 sec
94°C
40 sec
62°C
105 sec
72°C
7 min
72°C
3. finale Verlängerung
Anschließend wird der Ansatz 1:100 verdünnt und in einer zweiten PCR-Reaktion eingesetzt.
33
2. PCR:
1 x PCR Puffer (20 mM Tris-HCl pH 8.4, 50 mM KCl)
1,5 mM MgCl2
200 nM Abridged Universal Amplification Primer (Life Technologies)
200 nM GSP4
5 µl der verdünnten 1. PCR
1 M Betain
200 µM dNTPmix
2,5 U Taq Polymerase
H2O add 50 µl
Anschließend wurde das gleiche Programm wie oben durchgeführt. Die 2. PCR wurde
abschließend in einem 2 % Agarosegel analysiert.
3.17 Agarosegelelektrophorese
In der Agarosegelelektrophorese werden DNS-Fragmente nach ihrer Größe aufgetrennt. Bei der
Agarose handelt es sich um ein Polysaccharid aus Algen, welches im Gel aus verdünnten
Agaroselösungen Poren bildet. Diese Poren bewirken, daß große DNS-Fragmente in einem
elektrischen Feld langsamer wandern als kleinere DNS-Fragmente. Die Agarosekonzentration
wird so gewählt, daß sie für die aufzutrennenden DNS-Fragmente optimal ist, d.h. 2 % Agarose
für Fragmente unter 1 kb, 1 % Agarose für Fragmente zwischen 1 und 5 kb und 0,8 % Agarose
für Fragmente über 5 kb. Zur Herstellung der Gele wird die entsprechende Menge Agarose
(Agarose ultra pure, Life Technologies) in TBE-Puffer gelöst. Der TBE-Puffer dient ebenfalls als
Laufpuffer für die Gelelektrophorese. Um die DNS unter UV-Licht detektieren zu können, wird
sie mit 0,5 µg/ml Ethidiumbromid (Life Technologies) versetzt. Um das Gel besser mit den
Proben beladen zu können, werden sie zuvor mit Ladepuffer versetzt. Der Größenbestimmung
der DNS diente der Größenstandart "Ready Load 1 Kb DNA Ladder" (Life Technologies).
TBE-Puffer:
0,1 M Tris-HCl pH 8,4
90 mM Borsäure
1 mM EDTA
34
6 x Ladepuffer:
0,25 %Bromphenolblau
0,25 % Xylencyanol
30 % Glycerin
3.18 Isolation von DNS-Fragmenten aus Agarosegelen
Die Isolation von DNS-Fragmenten aus Agarosegelen wurde mit dem QIAquick Gel Extraction
Kit (Qiagen) nach dem QIAquick Gel Extraction Kit Protocol unter Benutzung einer
Vakuumpumpe des entsprechenden Handbuchs durchgeführt. Die Methode basiert wie die
Plasmid-Mini Präparation auf die Bindung der DNS an Kieselgel Membranen bei hohen
Salzkonzentrationen. Dazu werden die Gelstücke in Puffer QB für 10 min bei 50°C aufgelöst.
Anschließend wird der Lösung ein Gelvolumen Isopropanol zugesetzt und auf die QIAquick
Säule gegeben. Mit Hilfe einer Vacuumpumpe wird die Lösung durch die Membran gesogen.
Die an die Membran gebundene DNS wurde mit 750 µl Puffer PE gewaschen. Anschließend
wird der Puffer durch Zentrifugation für 1 min bei 15000 g vollständig entfernt und die DNS mit
50 µl EB Puffer eluiert.
3.19 Ligation von DNS-Fragmenten (Hanahan, 1993)
Für die Ligation werden die entsprechenden DNS-Fragmente in äquimolaren Mengen, bzw. im
dreifachen Überschuß des Inserts zusammen in einem 10 µl Ansatz mit 20 U T4 DNS-Ligase
(Promega) und 1 µl Ligasepuffer üN bei 14°C inkubiert. PCR-Produkte werden direkt entweder
in den pCR-Blunt Vektor (für Fragmente, die mit der Pfu-Polymerase amplifiziert wurden;
Invitrogen) oder in den pCR2.1 (für Fragmente, die mit der Taq-Polymerase amplifiziert wurden;
Invitrogen) kloniert. Dabei wurden die Angaben des Herstellers befolgt.
3.20 Sequenzierung
Sequenzierungen wurden mit der Big Dye Terminatior Cycle Sequencing Ready Reaction (ABIPerkin Elmer), sowie dem ABI PRISM 310 Genetic Analyzer (ABI-Perkin Elmer) durchgeführt.
Dabei wird das zu sequenzierende Template mit einem spezifischen Primer verlängert. Die
Polymerase benutzt dabei ein Gemisch aus unmarkierten dNTPs, sowie ddNTPs, die mit 4
verschiedenen Farbstoffen markiert sind. Wird ein markiertes ddNTP eingebaut, führt dies zum
35
Kettenabbruch. Die terminal markierten DNS-Fragmente werden dann über ein spezifisches
Polymer der Länge nach aufgetrennt und über einen Argon-Laser detektiert.
Dabei wird folgender Ansatz für die Sequenzierung eingesetzt:
500 ng der Plasmid-DNS
2 µl Pre-Mix (ABI-Perkin-Elmer)
5 pmol Primer
H2O add 10 µl
Dieser Ansatz wird mit 25 Zyklen des folgenden PCR-Programm verarbeitet:
10 sec
96°C
5 sec
58°C
4 min
60°C
Anschließend werden die Proben über CentriSep Spin Columns (Princeton Separations)
aufgearbeitet. Dazu wird pro Ansatz eine Säule vorbereitet. Man füllt 750 µl H 2O in jede Säule
und läßt das Gel für mindestens 30 min quellen. Danach zentrifugiert man die Säule für 2 min
bei 800 g, um die Flüssigkeit zu entfernen. Anschließend pipettiert man den Reaktionansatz auf
die Mitte der Säule und eluiert durch erneute Zentrifugation für 2 min bei 800 g. Schließlich
werden die Ansätze über den ABI-PRISM 310 Genetic Analyzer analysiert und ausgewertet.
3.21 Proteinaufreinigung
Zur Aufreinigung des Endosialin Proteins wurde der mAk kovalent an eine CNBr-Sepharose
Matrix
gekoppelt.
Anschließend
wurde
die
das
endogen
Endosialin
exprimierende
Neuroblastomzellinie LA1-5s lysiert, um das Protein über die Immuno–Affinitätsmatrix zu
reinigen.
3.21.1 Herstellung einer Immuno-Affinitätsmatrix
Zur Herstellung einer Immuno-Affinitätsmatrix wurde 1 ml mAk FB5 (10 mg/ml) in 4 ml
Kopplungspuffer verdünnt. Anschließend wird die Lösung zweimal 1 h und einmal üN gegen
Kopplungspuffer dialysiert (Dialyses Tubing-3/4 in. Diameter; Life Technologies). Die CNBr-
36
Sepharose (Pharmacia) wird in 1 mM HCl aufgeschlemmt und anschließend mit dem 10-fachen
Bettvolumen 1 mM HCl gewaschen. Die restliche HCl wird durch Waschen mit dem 3-fachen
Bettvolumen Kopplungspuffer entfernt. Anschließend gibt man den dialysierten Ak auf 5 ml
Matrix und inkubiert üN bei 4°C auf dem Überkopfschüttler. Die freien Bindungsstellen der
Matrix werden danach für 90 min bei RT auf dem Überkopfschüttler mit 1 M Ethanolamin
pH 8,0 geblockt. Schließlich wird die Matrix zweimal alternierend mit Waschpuffer A und B (3faches Bettvolumen) gewaschen und in 10 ml Aufbewahrungspuffer gelagert. Zur Herstellung
einer Kontrollmatrix wurde das gleiche Protokoll mit BSA (Sigma) durchgeführt.
Kopplungspuffer:
0,1 M NaHCO3
0,5 M NaCl
Waschpuffer:
A)
100 mM Tris-HCl pH 8,0
0,5 M NaCl
B)
100 mM NaAc pH 4,0
0,5 M NaCl
Aufbewahrungspuffer:
100 mM KPO4 pH 7,5
50 mM NaCl
0,02 % Azid
3.21.2 Aufreinigung
Für die Proteinaufreinigung wurden pro Ansatz ca. 109 Zellen (LA1-5s) aufgereinigt. Die
folgenden Angaben beziehen sich auf 107 Zellen. Diese wurden mit 10 ml HBSS (Life
Technologies) gewaschen. Nach der erneuten Zugabe von 10 ml HBSS wurden sie mit einem
Zellschaber abgelöst und für 5 min bei 200 g zentrifugiert. Das Zellpellet wurde in 1 ml RIPAPuffer resuspendiert und 12 min auf Eis lysiert. Nach einer Zentrifugation für 15 min bei 4°C
und 12000 g wurde der Überstand durch einen 0,2 µm-Filter (Gelman) filtriert und zur
Vorreinigung auf 2,5 µl BSA-geblockte CNBr-Sepharose gegeben. Dieses Gemisch wurde
30 min bei 4°C auf dem Überkopfschüttler inkubiert. Anschließend wurde das Lysat mit 1,5 µl
CNBr-Sepharose-FB5 4 h bei 4°C auf dem Überkopfschüttler inkubiert. Nachdem man die
37
Matrix für 5 min bei 4°C und 320 g pelletiert hatte, wurde sie drei mal mit IP-Waschpuffer und
zwei mal mit 25 mM Tris-HCl pH 8,4/ 250 mM NaCl gewaschen. Die Elution des gebundenen
Proteins erfolgte durch zweimalige Behandlung der Matrix mit 4 µl Elutionspuffer bei 55°C. Das
Eluat aus den Aufreinigungen von 6 x 109 Zellen wurde schließlich in einem BSA-geblockten
Centricon 30 (Amicon) konzentriert.
RIPA-Puffer:
1 % Triton X-100
0,5 % DOC
0,1 % SDS
10 mM Tris-HCl pH 7,6
150 mM NaCl
1 mM Phenylmethylsulfonyl Fluorid
1 mM Benzamidin
0,1 U/ml α2-Makroglobulin
IP-Waschpuffer:
0,025 % Triton X-100
50 mM Tris-HCl pH 8,4
150 mM NaCl
1 mM CaCl2
0,02 % Azid
Elutionspuffer:
1 % SDS
100 mM NH4HCO3
3.22 Edman-Sequenzierung
Die Sequenzierung des aufgereinigten Proteins wurde von Dr. Horst Ahorn (BoehringerIngelheim Austria GmbH) durchgeführt. Dazu wurden die Endosialinbanden aus dem Coomassie
gefärbten Polyacrylamidgel herausgeschnitten und in einer Trypsinlösung (Promega) inkubiert.
Nach der Auftrennung der resultierenden Peptide über HPLC wurden sie mit einem 494 cLC
ABI-PerkinElmer analysiert. Die Peptide wurden durch die ZipTip Prozedur entsalzt und
anschließend im MALDI-TOF (Voyager DE-STR, PerSeptive Biosystems/AB) eingesetzt (Hatzi
et al, 2000).
38
3.23 Transfektionen
Zur Transfektion eukaryotischer Zellen wurde das FuGENE 6 Transfection Reagent der Firma
Roche/Boehringer Mannheim benutzt. Das Verhältnis Fugene 6/DNS ist dabei in der Tabelle 3.1
nachzulesen. Die für die Transfektion benutzte DNS stammt aus einer DNS-Maxipräparation, da
die DNS nach der Durchführung dieser Methode in ausreichender Reinheit vorliegt.
Verunreinigungen in der DNS können für die Zellen toxische Effekte nach sich ziehen. Bei der
Durchführung wurde das FuGENE 6 Reagenz in serumfreien Medium verdünnt und für 5 min
bei RT inkubiert. Dabei ist zu beachten, daß das Reagenz direkt ins Medium pipettiert wird, da
es in konzentrierter Form vom Plastik absorbiert wird. Die entsprechende Menge DNS (siehe
Tabelle 3.1) wird in ein zweites Gefäß pipettiert. Anschließend wird das FuGENE 6/MediumGemisch tropfenweise zur DNS gegeben und für 15 min bei RT inkubiert. In dieser Zeit bilden
sich FuGENE 6/DNS-Komplexe, die dann in der entsprechenden Menge Medium + Serum auf
die Zellen gegeben werden. Am darauffolgenden Tag wird die Zellkulturschale mit Medium +
Serum aufgefüllt. Nach einer weiteren Inkubation üN wurde die Expression durch
Immunzytochemie- oder durch Immunopräzipitationsexperimente analysiert.
Fläche des Zellkulturgefäßes (cm2)
1,2
28
78
serumfreies Medium (µl)
99
96
88
FuGENE 6 (µl)
1
4
12
DNS (µg)
0,25
1
3
frisches Kulturmedium (ml)
0,25
1
3,4
Tab. 3.1: Transfektionsansätze für verschiedene Zellkulturgefäße.
Zur Etablierung stabiler Klone wurden die Zellen 48 h nach der Transfektion mit dem
entsprechenden Kulturmedium mit 200 µg/ml G418 (Bio Rad) selektioniert. Nach der
Vereinzelung der Zellklone wurden die Zellen durch Immunzytochemie oder einem ELISA auf
ihre Expression getestet.
39
3.24 Expression der Endosialin-hIgG Fusionsproteine
Zur Expression der stabilen Endosialin-hIgG Fusionsproteine wurden die stabil exprimierenden
293 Zellklone für eine Woche in serumfreien UltraCulture Medium (BioWhittaker) mit
1 x Glutamax II (Life Technologies) kultiviert. Anschließend wurde der Überstand mit dem
Endosialin-hIgG Fusionsprotein gesammelt, für 5 min bei 2500 g zentrifugiert und bis zur
weiteren Verarbeitung bei 4°C gelagert.
3.25 Bioinformatische Analysen
Die im Rahmen dieser Arbeit durchgeführten bioinformatischen Analysen wurden gemeinsam
mit Dr. Andreas Köhler (Boehringer Ingelheim Pharma KG, Biberach), sowie von Dr. Frank
Eisenhaber (Institut für Molekulare Pathologie, Wien) durchgeführt. Dazu wurden BLAST,
FASTA und Prosite pattern Datenbanksuchen gegen öffentliche Sequenzdatenbanken
durchgeführt. Das SEG Programm wurde für die Suche nach low complexity regions eingesetzt.
Bei der Identifizierung bekannter funktioneller Domänen im Endosialin wurden PFAM und
SMART Domänen Bibliotheken (Schultz et al, 2000) durchsucht.
3.26 Aufreinigung der Endosialin-hIgG Fusionsproteine
Zur Aufreinigung des Endosialin-hIgG Fusionproteins wird Protein A Sepharose CL-4B
(Amersham Pharmacia) in HBSS (Life Technologies) gegeben und 2-3 x mit HBSS gewaschen
(bis HBSS nicht mehr gelb wird). Zwischen den einzelnen Waschschritten wird die Protein A
Sepharose kurz bei 200 g zentrifugiert. Anschließend gibt man den das Fusionsprotein
enthaltenden Überstand der Zellkultur auf Protein A Sepharose (20 mg human IgG/ml Gel) und
inkubiert üN bei 4°C auf dem Überkopfschüttler. Danach gibt man die Protein A Separose in
eine 10 ml Einmalsäule (Biorad) und wäscht mit dem 10-fachen Gelvolumen PBS (Life
Technologies). Zur Elution des Fusionsproteins werden 10 Eppies mit je 140 µl 1 M Tris-HCl
pH 8.4 vorbereitet. Anschließend gibt man 10 ml 0,1 M Glycin pH 2.4 auf die Säule und
sammelt den Durchlauf als 1 ml Fraktionen in den vorbereiteten Eppies. Die Detektion erfolgt
über ein Proteingel oder durch eine photometrische Messung bei OD280 (OD280: 1,3 = 1 mg/ml).
40
3.27 Immunzytochemie
Für die Immunzytochemie Experimente werden Zellen auf 4 Chamber Polystyrene Vessel Tissue
Culture Treated Glass Slides (Falcon) für 10 min in Methanol/Aceton (1:1) fixiert, für 10 min bei
RT getrocknet und zweimal mit PBS (Life Technologies) gewaschen. Die fixierten Zellen
werden 30 min bei RT mit 100 µl 10 %igem Ziegenserum (Life Technologies) in PBS
+2 % BSA inkubiert, um unspezifische Bindungsstellen abzusättigen. Der mAK (10 µg/ml) wird
in 100 µl PBS +2 % PBS für 1 h bei RT auf die Zellen gegeben. Anschließend wird der nicht
gebundene Antikörper durch zweimaliges Waschen mit PBS entfernt. Danach werden die Zellen
mit einem Fluoreszensfarbstoff-markierten sekundären Antikörper inkubiert. Dieser sekundäre
Antikörper richtet sich nach der Spezies aus der der erste Antikörper isoliert wurde. Im Rahmen
dieser Arbeit wurde ein Alexa 488 markierter Ziege anti-Maus Antikörper verwendet. Dieser
wird in 100 µl in einer Konzentration von 2 µg/ml in PBS +2 % BSA für 45 min bei RT auf die
Zellen gegeben. Der nicht gebundene sekundäre Antikörper wird erneut durch zweimaliges
Waschen mit PBS entfernt. Schließlich werden die Zellen für 5 min bei RT in PBS +0,5 %
Triton X 100 gewaschen und in PBS + 90 % Glycerol oder MOWIOL mit 0,06 µg/ml DAPI
eingedeckt. Die gefärbten Zellen werden an einem Axiophot-Mikroskop (Zeiss) und einer
Quecksilberdampf-Kurzbogenlampe (Osram) bei einer Anregungswellenlänge von 495 nm
analysiert.
3.28 SDS-Polyacrylamidgelelektrophorese (Laemmli, 1970)
Bei der SDS-Polyacrylamidgelelektrophorese handelt es sich um ein diskontinuierliches System
zur Auftrennung von Proteinen. Die Gele bestehen aus einem niedermolekularen Sammelgel
(4 % Acrylamid) und aus einem hochmolekularen Trenngel. Die Auftrennung geschieht durch
Poren, die durch Polymerisation von Acrylamid-Monomeren entstehen, die durch Bisacrylamid
quervernetzt werden. Die aufzutrennenden Proteine werden durch SDS denaturiert, indem es alle
nichtkovalenten Wechselwirkungen in nativen Proteinen zerstört. Es lagert sich an die
Hauptketten der Proteine, wodurch die negative Ladung proportional zur Größe des Proteins ist
und die Proteine somit nur noch Aufgrund ihrer Größe bei der Wanderung entlang eines
elektrischen Feldes aufgetrennt werden. Das Verfahren beruht auf folgender Funktionsweise:
Sammelgel und Trenngel besitzen unterschiedliche pH-Werte. Das Sammelgel hat einen pHWert von 6,8. Hier setzt sich das Leition Chlorid wegen seiner hohen Ionenbeweglichkeit in
41
schnelle Bewegung, so daß die Proteine und das Folgeion Glycin zurück bleiben. Da hinter dem
Leition ein Bereich mit geringer Ionendichte entsteht, werden durch die entstehende höhere
Feldstärke die Proteine und Folgeionen beschleunigt und als scharfe Bande hinter den Leitionen
fokussiert. Im Trenngel ändert sich der pH-Wert zu 8,8. Dadurch ändern die Folgeionen ihre
Ladung, so daß deren Ionenbeweglichkeit drastisch zunimmt. Sie überholen die Proteine und
diese werden aufgrund ihrer Größe durch die Poren des Trenngels aufgetrennt.
Bei der Durchführung wurde das "Mini Protean II" System der Firma BioRad eingesetzt. Dabei
werden zwei Glasplatten durch zwei 1 mm dicke Abstandhalter voneinander getrennt in eine
entsprechende Vorrichtung gespannt. Danach wird die Trenngellösung angesetzt und zwischen
die beiden Glasplatten gefüllt. Anschließend wird die Lösung mit H2O überschichtet, da die
Polymerisation der Trenngellösung durch Sauerstoff gestört wird. Nachdem die Polymerisation
vollständig stattgefunden hat, wird das überschichtete Wasser abgegossen. Man setzt die
Sammelgellösung an und gibt sie auf die Trenngellösung. Anschließend führt man einen Kamm
in die Sammelgellösung ein, wodurch Taschen zum späteren Auftragen der Proben entstehen.
Nachdem auch das Sammelgel polymerisiert ist, wird der Kamm herausgezogen. Man spannt das
Gel in die Mini Protean II Vorrichtung und füllt beide Kammern mit Laufpuffer (Laemmli,
1970). Nach dem Vorbereiten der Proben werden diese in die Taschen gefüllt und der Gellauf bei
100 V gestartet. Sobald die Lauffront das Trenngel erreicht, erhöht man die Spannung auf 150 V.
Vorbereiten der Proben: Die für die Gelelektrophorese vorgesehenen Proben werden mit dem
entsprechenden Volumen 3 x Probenpuffer versetzt. Für die Gelelektrophorese unter reduzierten
Bedingungen fügt man zusätzlich 50 mM DTT hinzu. Anschließend werden die Proben 3 min
bei 95°C inkubiert und in die Taschen des Polyacrylamidgels gefüllt.
42
Trenngellösung:
H2O
12 %
10 %
8%
7,5 %
6%
3,5 ml
4 ml
4,7 ml
4,85 ml
5,35 ml
2,5 ml
2,5 ml
2,5 ml
2,5 ml
1,5 M Tris- 2,5 ml
HCl pH 8,8
10% SDS
100 çl
100 µl
100 µl
100 µl
100 µl
Acrylamid/
4 ml
3,3 ml
2,65 ml
2,5 ml
2,0 ml
10 % APS
50 µl
50 µl
50 µl
50 µl
50 µl
TEMED
10 µl
10 µl
10 µl
10 µl
10 µl
Bisacrylamid
(30 %)
Sammelgellösung:
6,1 ml H2O
2,5 ml 0,5 M Tris-HCl pH 6,8
100 µl 10 % SDS
1,3 ml Acrylamid/Bisacrylamid
50 µl 10 % APS
10 µl TEMED
3 x Probenpuffer:
75 ml 0,5 M Tris-HCl pH 6,8
6 g SDS
40 g Sucrose
0,1 % Bromphenolblau
43
3.29 Proteinnachweis mit Coomassie Blau (Goerg et al., 1978)
Nachdem man die Proteine über SDS-PAGE aufgetrennt hat, kann man die durch Anfärben mit
Coomassie-Blau R250 (Pharmacia) sichtbar machen. Dabei kann man mittels dieser Methode
Banden mit ca. 0,1 µg Protein nachweisen. Hierzu werden die Gele mindestens 1 h in
Coomassie-Färbelösung gefärbt und anschließend mit Entfärber behandelt bis das Proteingel
weitgehend entfärbt ist.
Coomassie-Färbelösung:
0,5 % Coomassie Blau R250
30 % Methanol
10 % Essigsäure
Entfärber:
30 % Methanol
10 % Essigsäure
3.30 Silberfärbung von Proteingelen (Morrissey, 1981)
Durch diese Methode kann man deutlich geringere Proteinmengen nachweisen als mit der voher
beschriebenen Coomassie Blau Färbung. Bei der Durchführung der Methode wird das Gel für
1 h in Fixierlösung inkubiert und anschließend 3 x 30 min mit 50% Ethanol gewaschen. Danach
wird das Gel für 1 min in Sensibilisierungslösung inkubiert, 3 x 20 sec mit H2O gewaschen und
für 20 min in Imprägnierlösung inkubiert. Nach erneutem Waschen mit H2O (2 x 20 sec)
inkubiert man das Gel in Entwicklerlösung bis die Proteinbanden die gewünschte Intensität
zeigen. Man wäscht das Gel 2 x 2 min mit H2O und fixiert das Gel erneut in Fixierlösung für
10 min.
Fixierlösung:
50 % Methanol
12 % Essigsäure
44
Sensibilisierungslösung:
520 µM Na2S2O3
Imprägnierlösung:
0,2 g AgNO3
75 µl 37 % HCOH
H2O bidest add 100 ml
Entwicklerlösung:
6 g NaCO3
50 µl 37 % HCOH
0,43 g Na2S2O3
H2O bidest add 100 ml
3.31 Immunopräzipitations Versuche
Für Immunopräzipitations Versuche wurden Zellen in einer 25 cm2-Zellkulturschale in 1,2 ml
MEM with Eaerls salt mit 400 µCi 35S-Methionin und 400 µCi 35S-Cystein üN im feuchten 37°CBrutschrank markiert. Anschließend werden die Zellen mit 1 ml IP-Lysispuffer für 12 min lysiert
und für 15 min bei 15000 g zentrifugiert. Der Überstand wird zur Vorreinigung für 30 min bei
4°C mit 100 µl Protein A-Sepharose (Pharmacia) auf dem Überkopfschüttler inkubiert. Danach
gibt man das Lysat auf den über einen Ziege anti-Maus an 20 µl Protein A-Sepharose
gekoppelten spezifischen Antikörper (10 µg/ 20 µl Protein A-Sepharose) und inkubiert dieses für
2 h bei 4°C. Anschließend wird wie im Kapitel Proteinaufreinigung beschrieben gewaschen und
eluiert. Die Proteine im Eluat werden über SDS-PAGE aufgetrennt und mit Hilfe eines Biomax
MR-Films (Kodak) detektiert.
IP-Lysispuffer:
1 % Triton X-100
20 mM Tris pH 8,0
160 mM NaCl
1 mM CaCl2
45
3.32 Deglykosylierungs Experimente
Die Deglykosylierungs Experimente wurden nach dem unter Immunpräzipitation Versuche
beschriebenen Protokoll durchgeführt. Nach der Kopplung des Antigens an den an Protein ASepharose gebundenen Antikörper wird das Protein für 16 h bei 37°C entweder mit 1 U
PNGase F von Flavobacterium meningosepticum, 10 mU Sialidase von Arthrobacter
ureafaciens, oder einem Gemisch aus 10 mU Sialidase und 0,5 mU O-Glykosidase aus
Diplococcus pneumoniae (Roche) in 25 µl Reaktionspuffer inkubiert. Anschließend wird, wie
vorher beschrieben, gewaschen und eluiert, um die Proteine über SDS-Page und einer
Radiographie zu detektieren.
Reaktionpuffer:
50 mM Natriumphosphat pH 7,0
0,5 % Triton X-100
3.33 Western Blot
Für die Western Blot Experimente wurde das Mini Trans Blot System der Firma BioRad benutzt.
Nachdem die Proteine in einer SDS-Polyacrylamidgelelektrophorese aufgetrent wurden, wurden
sie in Blot-Puffer für 1 h bei 100 V auf eine Nitrocellulose-Membran (Schleicher & Schüll)
geblottet. Anschließend wurde die Membran für 1 h bei RT oder üN bei 4°C in Block-Puffer
inkubiert, um die Membran vollständig mit Proteinen abzublocken. Danach verdünnt man den
1.Ak in Block-Puffer (2 µg/ml) und gibt ihn für 1 h bei RT auf die geblockte Membran. Der
nicht gebundene Ak wird durch Waschen mit TBS-T (3x 10 min) entfernt. Anschließend
verdünnt man den mit dem Enzym Peroxidase gekoppelten sekundären Ziege anti-Maus
Antikörper (Dianova) in Blockpuffer und gibt ihn für 1 h bei RT auf die Membran. Nach
erneutem dreimaligem Waschen mit TBS-T und einmaligen Waschen mit TBS werden die
Proteine mit dem ECL-Reagenz (Amersham) und dem Hyperfilm ECL (Amersham) detektiert.
TBS:
140 mM NaCl
10 mM Tris-HCl pH 7,4
TBS-T:
TBS + 0,05 % Tween 20
46
Block-Puffer:
TBS-T
5 % Milchpulver
47
4 Ergebnisse
4.1 Aufreinigung des humanen Endosialin Proteins
Endosialin wird selektiv im Blutgefäßendothel verschiedener Tumore exprimiert (Rettig et al.,
1992). Dieses Gewebe kann allerdings nicht zur Aufreinigung Endosialins verwendet werden, da
humanes Tumorgewebe nur begrenzt zur Verfügung steht und nur zu einem geringen Teil aus
Endosialin exprimierenden Endothelzellen besteht. Aus diesem Grund wurde die FB5-positive
Neuroblastomzellinie LA1-5s für die molekulare Analyse von Endosialin verwendet. Zur
Aufreinigung des Proteins wurden 6 x 109 dieser LA1-5s Zellen lysiert. Über den monoklonalen
Antikörper FB5, kovalent an CNBr-Sepharose gekoppelt, wurde das FB5-Antigen aus dem Lysat
gebunden. Gebundenes Antigen wurde eluiert und in einem SDS-Polyacrylamidgel aufgetrennt.
Anschließende Silberfärbung diente der Überprüfung von Effizienz und Reinheit der
Antigenaufreinigung (Abb. 4.1).
205
116
97
66
FB5
mIgG
Abb. 4.1: Silberfärbung von affinitätsgereinigtem humanen Endosialin. LA1-5s-Lysat wurde
über eine FB5-CNBr-Sepharosematrix (FB5) oder als Negativkontrolle über eine Maus-IgGCNBr-Sepharosematrix (mIgG) aufgereinigt. Das eluierte Material wurde in einer 6 % SDSPAGE unter reduzierenden Bedingungen aufgetrennt. Das Endosialinprotein migriert bei
165 kDa und ist durch einen Pfeil markiert. Die Position der Molekulargewichtsmarker ist in
kDa angegeben.
48
Die Abbildung zeigt, daß mit der FB5- Immunoaffinitätsmatrix spezifisch ein Protein mit einem
apparenten Molekulargewicht von 165 kDa aufgereinigt wurde. Dieses stimmt mit dem für
Endosialin publizierten überein (Rettig et al., 1992). Der Rest des aufgereinigten Materials
(ca. 95%) wurde daraufhin ebenfalls über ein SDS-Polyacrylamidgel aufgetrennt und mit
Coomassie gefärbt. Durch einen Vergleich der Protein Markerbanden (Biorad) mit dem
aufgereinigten Endosialin ließ sich die Menge auf ca. 1,5 µg abschätzen. Dieses entspricht
ca. 10 picomol Endosialin. Die Endosialin enthaltende Coomassie-gefärbte Proteingelbande
wurde zur Aminosäuresequenzanalyse durch Dr. Horst Ahorn (Abteilung für Drug Discovery,
Böhringer Ingelheim Austria GmbH) mit Trypsin verdaut, um die erhaltenen Peptide über HPLC
aufzutrennen. Die prominentesten Peptide aus dem Trypsinverdau wurden einer Edman
Sequenzanalyse unterworfen. Dabei erhielten wir folgende Sequenzen: 1) AACGPSSCYALFPR,
2) TFLEAWR, 3) ELGGDLATPR, 4) VDSLVGAGPASR , 5) LLWIGLQR und 6) LDLDTKA.
4.2 Identifizierung der Endosialin-cDNS
Die Information über Teile der Aminosäuresequenz des Endosialin Proteins sollte im weiteren
dazu benutzt werden, die entsprechende cDNS zu identifizieren. Die rekombinierte DNS sollte
weitere biochemische und funktionelle Analysen von Endosialin ermöglichen.
4.2.1 Partielle Identifizierung der Endosialin-cDNS über Expressed Sequence Tags (ESTs)
Die sechs identifizierten Peptidsequenzen wurden in einem Prosite Pattern Datenbank Search für
die Suche nach der entsprechenden Endosialin-cDNS eingesetzt. Dabei wurde die 330 bp lange
DNS-Sequenz des EST-Klons AI371224 (Abb. 4.2a) gefunden, die fünf der sechs identifizierten
Peptidsequenzen enthält, wenn diese im ersten Leseraster in die korrespondierende
Peptidsequenz übersetzt wird (Abb. 4.2b). Der EST wurde daraufhin komplett sequenziert,
wodurch die cDNS auf 1394 bp verlängert wurde. Bei diesen 1394 Basenpaaren handelt es sich
um einen offenen Leserahmen, welcher nicht durch ein Stopcodon unterbrochen wird. Diese
Sequenz wurde daraufhin für eine erneute iterative Datenbanksuche (BLAST, FASTA)
eingesetzt, in der zwei weitere mit dem EST-Klon AI371224 überlappende EST-Klone gefunden
wurden (H19258 und AA595199, embl). Die Sequenzierung dieser beiden ESTs verlängerte den
offenen Leseraster auf 2239 bp mit einem Stopcodon im ersten Leserahmen, sowie einem
Polyadenylierungssignal. Diese Sequenz wurde durch DNS Sequenzierung von zwei weiteren
49
mit dem EST-Klon AI371224 überlappenden EST-Klonen bestätigt (H12800 und H12557).
Allerdings beinhaltete diese Sequenz kein putatives Start-ATG am 5' Ende der Sequenz, so daß
davon ausgegangen werden konnte, daß am 5' Ende zusätzliche Basenpaare zur Identifizierung
der vollständigen Endosialin-cDNS fehlten.
A
gggcccacac tgggccagga cccctgggct gctgagcccc gtgccgcctg cggccccagc
agctgctacg ctctcttccc acggcgccgc accttcctgg aggcctggcg ggcctgccgc
gagctggggg gcgacctggc cactcctcgg acccccgagg aggcccagcg tgtggacagc
ctggtgggtg cgggcccagc cagccggctg ctgtggatcg ggctgcagcg gcaggcccgg
caatgccagc tgcagcgccc actgcgcggc ttcacgtgga ccacagggga ccaggacacg
gctttcacca actgggccca gccagcctct
60
120
180
240
300
330
B
GPTLGQDPWAAEPRAACGPSSCYALFPRRRTFLEAWRACRELGGDLATPR
TPEEAQRVDSLVGAGPASRLLWIGLQRQARQCQLQRPLRGFTWTTGDQDT
AFTNWAQPAS
Abb.4.2: Identifizierte tryptische Peptide (farbig dargestellt) humanen Endosialins in A der
DNS -Sequenz des EST- Klons AI371224; B der korrespondierenden Aminosäuresequenz des
EST- Klons AI371224.
4.2.2 Identifizieung des 5' Endes der Endosialin cDNA mittels RACE-Technologie ("rapid
amplification of cDNA ends")
Um das fehlende 5' Ende inclusive Start-Methioninsequenz der Endosialin cDNS zu
identifizieren, wurde die "rapid amplification of cDNA ends (RACE)" Technologie angewendet.
Dazu wurden vorerst zur Gesamt-RNS Isolierung 2 x 107 Zellen der Neuroblastomzellinie
LA1–5s, wie unter Material und Methoden beschrieben, aufgearbeitet und 550 µg Gesamt-RNS
in einer Konzentration von 1,1 µg/µl isoliert. 2,2 µg dieser Gesamt-RNS wurden daraufhin nach
dem Protokoll des "5' RACE System for Rapid Amplification of cDNA Ends, Version 2.0" (Life
Technologies) weiter verarbeitet. Dabei wird die RNS unter Verwendung eines Startermoleküls,
welches spezifisch im Endosialingen bindet, in einzelsträngige cDNS umgeschrieben. Die im
nächsten Schritt eingesetzte terminale Transferase fügt cDNS-Enden Nukleotide, in diesem Fall
dCTPs, hinzu. Dieser "poly-Cytosinphosphat- Schwanz" dient dann in einer PCR-Reaktion, die
mit einem zweiten genspezifischen Primer durchgeführt wird, als Bindungsstelle für einen
sogenannten Adapterprimer. Das Produkt dieser PCR-Reaktion wurde 1:100 verdünnt in einer
50
zweiten mit einem dritten genspezifischen und einem im Adapterprimer bindenden Primer
durchgeführten PCR amplifiziert. Das in dieser Reaktion erhaltene DNS-Fragment wurde
daraufhin durch einen Restriktionsverdau und anschließender Sequenzierung überprüft. Für den
Restriktionsverdau wurden die Enzyme Stu I und Nar I verwendet, da diese im bekannten Teil
der Endosialin-cDNS schneiden. Im Falle eines Stu I Verdaus werden 199 bp vom 3' Ende und
im Falle eines Nar I Verdaus werden 218 bp vom 3' Ende des amplifizierten PCR-Produktes
abgespalten. Allerdings wurden mit dieser Methode nur unspezifische DNS-Fragmente
amplifiziert, die sich im anschließenden Restriktionsverdau entweder nur von einem der beiden
Enzyme oder gar nicht verdauen ließen. Da es sich bei dem Endosialin 5' Ende um ein schwer zu
amplifizierendes DNS-Fragment handelt, wurden verschiedene Veränderungen im OriginalProtokoll vorgenommen, um I) sowohl die cDNS-Synthese als auch die PCR-Reaktion unter
spezifischeren Bedingungen durchzuführen und II) eventuell vorhandene dreidimensionale
Strukturen, die die Amplifikation des Endosialin-Transkripts sowohl in der cDNS-Herstellung
als auch in der Amplifikation bei der PCR-Reaktion stören, aufzulösen.
Im einzelnen wurden folgende Veränderungen zum Original-Protokoll durchgeführt: I) Für die
cDNS-Synthese wurde die "display THERMO-RT" (Display Systems Biotech) eingesetzt. Diese
reverse Transkriptase erlaubt es, die Synthese-Temperatur von 37°C auf 42°C zu erhöhen. II) Bei
der cDNS-Herstellung, dem Anfügen des "poly-Cytosinphosphat-Schwanzes", sowie in den
PCR-Reaktionen wurde Betain (Sigma) in einer Konzentration bis zu 1 M eingesetzt. Betain
beseitigt dreidimensionale Strukturen in RNS und DNS und ermöglicht somit die Amplifikation
schwieriger DNS-Fragmente, wie zum Beispiel DNS-Fragmente mit einem hohen GC-Gehalt.
Diese Veränderungen in der RACE-Technologie führten zu der Amplifikation einer 420 bpBande, die im Restriktionsverdau mit Nar I/Stu I nach anschließender Auftrennung im 2 %igen
Agarosegel das erwartete Bandenmuster zeigte. Die Sequenzierung dieser Bande erweiterte die
Endosialin-cDNS am 5' Ende um 53 weitere Basenpaare. Diese 53 bp am 5' Ende der EndosialincDNS beinhalten ein putatives Start-ATG und bestehen zu 73,5 % aus GC, womit sie schwierig
in PCR-Reaktionen zu amplifizieren sind. Die komplette Endosialin-cDNS besteht aus einem
offenen Leserahmen von 2271 bp, der für ein Protein bestehend aus 757 Aminosäuren mit einem
berechneten Molekulargewicht von 80,9 kDa (Abb 4.3) kodiert.
51
-17
1
1
AGTCCGGGGGCATCGCG
ATGCTGCTGCGCCTGTTGCTGGCCTGGGCGGCCGCAGGGCCCACACTGGGCCAGGACCCCTGGGCTGCTGAGCCC
M L L R L L L A W A A A G P T L G Q D P W A A E P
75
25
76
26
CGTGCCGCCTGCGGCCCCAGCAGCTGCTACGCTCTCTTCCCACGGCGCCGCACCTTCCTGGAGGCCTGGCGGGCCTGCCGCGAGCTGGGG
R A A C G P S S C Y A L F P R R R T F L E A W R A C R E L G
165
55
166
56
GGCGACCTGGCCACTCCTCGGACCCCCGAGGAGGCCCAGCGTGTGGACAGCCTGGTGGGTGCGGGCCCAGCCAGCCGGCTGCTGTGGATC
G D L A T P R T P E E A Q R V D S L V G A G P A S R L L W I
255
85
256
86
GGGCTGCAGCGGCAGGCCCGGCAATGCCAGCTGCAGCGCCCACTGCGCGGCTTCACGTGGACCACAGGGGACCAGGACACGGCTTTCACC
G L Q R Q A R Q C Q L Q R P L R G F T W T T G D Q D T A F T
345
115
346
116
AACTGGGCCCAGCCAGCCTCTGGAGGCCCCTGCCCGGCCCAGCGCTGTGTGGCCCTGGAGGCAAGTGGCGAGCACCGCTGGCTGGAGGGC
N W A Q P A S G G P C P A Q R C V A L E A S G E H R W L E G
435
145
436
146
TCGTGCACGCTGGCTGTCGACGGCTACCTGTGCCAGTTTGGCTTCGAGGGCGCCTGCCCGGCGCTGCAAGATGAGGCGGGCCAGGCCGGC
S C T L A V D G Y L C Q F G F E G A C P A L Q D E A G Q A G
525
175
526
176
CCAGCCGTGTATACCACGCCCTTCCACCTGGTCTCCACAGAGTTTGAGTGGCTGCCCTTCGGCTCTGTGGCCGCTGTGCAGTGCCAGGCT
P A V Y T T P F H L V S T E F E W L P F G S V A A V Q C Q A
615
205
616
206
GGCAGGGGAGCCTCTCTGCTCTGCGTGAAGCAGCCTGAGGGAGGTGTGGGCTGGTCACGGGCTGGGCCCCTGTGCCTGGGGACTGGCTGC
G R G A S L L C V K Q P E G G V G W S R A G P L C L G T G C
705
235
706
236
AGCCCTGACAATGGGGGCTGCGAACACGAATGTGTGGAGGAGGTGGATGGTCACGTGTCCTGCCGCTGCACTGAGGGCTTCCGGCTGGCA
S P D N G G C E H E C V E E V D G H V S C R C T E G F R L A
795
265
796
266
GCAGACGGGCGCAGTTGCGAGGACCCCTGTGCCCAGGCTCCGTGCGAGCAGCAGTGTGAGCCCGGTGGGCCACAAGGCTACAGCTGCCAC
A D G R S C E D P C A Q A P C E Q Q C E P G G P Q G Y S C H
885
295
886
296
TGTCGCCTGGGTTTCCGGCCAGCGGAGGATGATCCGCACCGCTGTGTGGACACAGATGAGTGCCAGATTGCCGGTGTGTGCCAGCAGATG
C R L G F R P A E D D P H R C V D T D E C Q I A G V C Q Q M
975
325
976
326
TGTGTCAACTACGTTGGTGGCTTCGAGTGTTATTGTAGCGAGGGACATGAGCTGGAGGCTGATGGCATCAGCTGCAGCCCTGCAGGGGCC 1065
C V N Y V G G F E C Y C S E G H E L E A D G I S C S P A G A 355
1066 ATGGGTGCCCAGGCTTCCCAGGACCTCGGAGATGAGTTGCTGGATGACGGGGAGGATGAGGAAGATGAAGACGAGGCCTGGAAGGCCTTC 1155
356
M G A Q A S Q D L G D E L L D D G E D E E D E D E A W K A F 385
1156 AACGGTGGCTGGACGGAGATGCCTGGGATCCTGTGGATGGAGCCTACGCAGCCGCCTGACTTTGCCCTGGCCTATAGACCGAGCTTCCCA 1245
386
N G G W T E M P G I L W M E P T Q P P D F A L A Y R P S F P 415
1246 GAGGACAGAGAGCCACAGATACCCTACCCGGAGCCCACCTGGCCACCCCCGCTCAGTGCCCCCAGGGTCCCCTACCACTCCTCAGTGCTC 1335
416
E D R E P Q I P Y P E P T W P P P L S A P R V P Y H S S V L 445
1336 TCCGTCACCCGGCCTGTGGTGGTCTCTGCCACGCGTCCCACACTGCCTTCTGCCCACCAGCCTCCTGTGATCCCTGCCACACACCCAGCT 1425
446
S V T R P V V V S A T R P T L P S A H Q P P V I P A T H P A 475
1426 TTGTCCCGTGACCACCAGATCCCCGTGATCGCAGCCAACTATCCAGATCTGCCTTCTGCCTACCAACCCGGTATTCTCTCTGTCTCTCAT 1515
476
L S R D H Q I P V I A A N Y P D L P S A Y Q P G I L S V S H 505
1516 TCAGCACAGCCTCCTGCCCACCAGCCCCCTATGATCTCAACCAAATATCCGGAGCTCTTCCCTGCCCACCAGTCCCCCATGTTTCCAGAC 1605
506
S A Q P P A H Q P P M I S T K Y P E L F P A H Q S P M F P D 535
1606 ACCCGGGTCGCTGGCACCCAGACCACCACTCATTTGCCTGGAATCCCACCTAACCATGCCCCTCTGGTCACCACCCTCGGTGCCCAGCTA 1695
536
T R V A G T Q T T T H L P G I P P N H A P L V T T L G A Q L 565
1696 CCCCCTCAAGCCCCAGATGCCCTTGTCCTCAGAACCCAGGCCACCCAGCTTCCCATTATCCCAACTGCCCAGCCCTCTCTGACCACCACC 1785
566
P P Q A P D A L V L R T Q A T Q L P I I P T A Q P S L T T T 595
1786 TCCAGGTCCCCTGTGTCTCCTGCCCATCAAATCTCTGTGCCTGCTGCCACCCAGCCCGCAGCCCTCCCCACCCTCCTGCCCTCTCAGAGC 1875
596
S R S P V S P A H Q I S V P A A T Q P A A L P T L L P S Q S 625
1876 CCCACTAACCAGACCTCACCCATCAGCCCTACACATCCCCATTCCAAAGCCCCCCAAATCCCAAGGGAAGATGGCCCCAGTCCCAAGTTG 1965
626
P T N Q T S P I S P T H P H S K A P Q I P R E D G P S P K L 655
1966 GCCCTGTGGCTGCCCTCACCAGCTCCCACAGCAGCCCCAACAGCCCTGGGGGAGGCTGGTCTTGCCGAGCACAGCCAGAGGGATGACCGG 2055
656
A L W L P S P A P T A A P T A L G E A G L A E H S Q R D D R 685
2056 TGGCTGCTGGTGGCACTCCTGGTGCCAACGTGTGTTTTTTTGGTGGTCCTGCTTGCACTGGGCATCGTGTACTGCACCCGCTGTGGCCCC 2145
686
W L L V A L L V P T C V F L V V L L A L G I V Y C T R C G P 715
2146 CATGCACCCAACAAGCGCATCACTGACTGCTATCGCTGGGTCATCCATGCTGGGAGCAAGAGCCCAACAGAACCCATGCCCCCCAGGGGC 2235
716
H A P N K R I T D C Y R W V I H A G S K S P T E P M P P R G 745
2236 AGCCTCACAGGGGTGCAGACCTGCAGAACCAGCGTGTGA
746
S L T G V Q T C R T S V *
2274
757
2275
2365
2455
2545
2364
2454
2544
2563
TGGGGTGCAGACCCCCCTCATGGAGTATGGGGCGCTGGACACATGGCCGGGGCTGCACCAGGGACCCATGGGGGCTGCCCAGCTGGACAG
ATGGCTTCCTGCTCCCCAGGCCCAGCCAGGGTCCTCTCTCAACCACTAGACTTGGCTCTCAGGAACTCTGCTTCCTGGCCCAGCGCTCGT
GACCAAGGATACACCAAAGCCCTTAAGACCTCAGGGGGCGGGTGCTGGGGTCTTCTCCAATAAATGGGGTGTCAACCTTAAAAAAAAAAA
AAAAAAAAAAAAAAAAAAA
Abb. 4.3: cDNS und Proteinsequenz humanen Endosialins. Die fünf tryptischen in der
Edman-Analyse identifizierten Peptide sind doppelt unterstrichen. Die putative N-terminale
Signalsequenz, so wie das potentielle Polyadenylierungssignal sind einfach unterstrichen. Die
Transmembrandomäne ist eingerahmt und die potentielle N-Glykosylierungsstelle ist durch
einen Kreis markiert.
52
4.3 Expression der Endosialin-cDNS in transient transfizierten HeLa–S3
Die isolierte cDNS enthält ein offenes Leseraster mit einem putativen Start-ATG. Da das 5' Ende
der cDNS keine typische Kozak-Sequenz aufweist (Kozak, 1992), sollte im Folgenden überprüft
werden, ob es sich dabei tatsächlich um das natürlich verwendete Start-ATG handelt. Dazu
wurde die komplette cDNS in einen eukaryontischen Expressionsvektor kloniert und
anschließend in HeLa–S3 Zellen transient transfiziert. Die transfizierten Zellen wurden daraufhin
zur Expressionsanalyse in einem Immunzytochemie-Versuch mit dem monoklonalen Antikörper
FB5 inkubiert. Wird in den transfizierten Zellen auf diese Weise das exprimierte Protein
nachgewiesen, so zeigt dies, daß es sich bei der transfizierten cDNS I) tatsächlich um die
komplette cDNS mit einem für das Start-Methionin kodierenden Codon handelt und II) daß es
sich bei diesem exprimierten Protein tatsächlich um Endosialin handelt, da es vom monoklonalen
Antikörper FB5 erkannt wird. Zu diesem Zweck wurde die Endosialin-cDNS in den
Expressionsvektor pMH (Boehringer Mannheim) kloniert. Daraufhin wurden HeLa-S3 Zellen
mit diesem Konstrukt transfiziert. Als Negativkontrolle wurde der Expressionsvektor pMH ohne
Insert transfiziert. Beide Transfektanten wurden nach 24 Stunden mit dem monoklonalen
Antikörper FB5 immunzytochemisch untersucht (Abb. 4.4).
A
B
Abb. 4.4: Indirekte Immunfluoreszensfärbung von Zellen transfiziert mit humanem
Endosialin. A, Hela-S3 Zellen transient transfiziert mit rekombinantem humanen Endosialin
oder B, einer Vektorkontrolle. Nachweis der Endosialinexpression, nach Inkubation mit mAk
FB5, durch Alexa 488-konjugiertem Ziege anti-Maus IgG (Vergrößerung 200 x).
53
Während in den Kontroll-transfizierten HeLa-S3 keine FB5-Bindung nachweisbar ist, zeigen die
Endosialin-transfizierten Zellen eine starke Färbung mit dem monoklonalen Antikörper FB5.
Neben einer starken Färbung der Zellmembran ist zudem noch die Färbung eines intrazellulären,
zellkernnahen Kompartiments erkennbar.
4.4 Endogene Endosialinexpression in den Zellinien LA1-5s und MF-SH
Als Vergleich zur Endosialin Expression in transfizierten HeLa-S3 wurde die Expression in
endogen Endosialin exprimierenden Zellinien untersucht. Dazu wurde die Neuroblastomzellinie
LA1-5s (Bild A), sowie die Sarkomzellinie MF-SH (Bild B und C) verwendet. Beide Zellinien
wurden mit dem monoklonalen Antikörper FB5 in einer indirekten Immunfluoreszensfärbung
inkubiert. Die Zellkerne wurden anschließend in einer Propidiumiodidfärbung sichtbar gemacht
(Abb. 4.5). Sowohl die Zellinie LA1-5s, als auch die Zellinie MF-SH zeigen eine deutliche
Membranfärbung (Abb. 4.5 weisse Pfeilspitzen), sowie eine intrazelluläre perinukleäre Färbung
(Abb. 4.5 weisse Pfeile).
A
B
C
Abb. 4.5: Indirekte Immunfluoreszensfärbung von endogenem humanem Endosialin (grün)
mit mAk FB5. A, der Neuroblastomzellinie LA1–5s und B und C, der Sarkomzellinie MF-SH.
Zellkerne wurden mit Propidiumiodid gegengefärbt (rot). Die Membranfärbung wird durch
weisse Pfeilspitzen, die perinukleäre Färbung wird durch weisse Pfeile angezeigt.
54
4.5 Bioinformatische Analyse zur Domänenstruktur des Endosialin Proteins
Die Aminosäuresequenz von Endosialin wurde in bioinformatischen Analysen benutzt, um
Aufschlüsse über mögliche funktionelle Domänen zu gewinnen und/oder Homologien zu
verwandten Proteinen aufzudecken.
4.5.1 Bioinformatische Analysen identifizieren Endosialin als eukaryontisches Typ I
Transmembranprotein
Die Endosialin Proteinsequenz enthält verschiedene funktionelle Elemente (Abb. 4.6).
1
360
C-LEC
S
E
E
E
757
MUCIN
TM
CYT
Abb. 4.6: Domänenstruktur des humanen Endosialinproteins. Die Abbildung zeigt eine Nterminale Signalsequenz (gelbes Dreieck), eine C-Typ-Lektin Domäne (C-LEC), eine
Sushi/SCR/CCP ähnliche Domäne (S), drei EGF-ähnliche Domänen (E) und eine
Transmembrandomäne (TM) flankiert von einer Sialomucin-ähnlichen Domäne (Mucin), sowie
einem kurzen zytoplasmatischen Teil (CYT).
N-terminal enthält Endosialin ein ca. 20 Aminosäuren langes hydrophobes Signalpeptid, welches
für die Translokation des Proteins in das Endoplasmatische Reticulum verantwortlich ist. Das
maturierte Protein teilt sich in zwei Abschnitte, erstens ein globuläres Segment von AS 20-360,
bestehend aus fünf verschiedenen Domänen und zweitens einen C-terminalen Abschnitt von AS
361-757, welches im SEG Programm (siehe Material und Methoden) als Region geringer
Komplexität
ausgewiesen
wird.
In
detailierteren
bioinformatischen
Studien
durch
Sequenzvergleiche von beschriebenen Proteindomänen nach dem "hidden Markov" Modell,
sowie BLAST und PSI-BLAST Datenbanksuchen (siehe Material un Methoden) nach
Sequenzähnlichkeiten wurden signifikante Ähnlichkeiten zu bereits beschriebenen Domänen
gefunden. So wurden in dem globulären Segment eine C-Typ-Lectin Domäne (AS 29-157,
E < 10–2 mit PFAM), sowie drei EGF-ähnliche Domänen (AS 235-271, E < 10-5 mit PFAM;
AS 274-311, E < 10-2 mit SMART; AS 316-350, E < 10-3 mit PFAM) gefunden, wobei die
55
letzten zwei EGF-Domänen zusätzlich Ca++ bindende Domänen sind. Bei der Region zwischen
Aminosäure 176 und 230 handelt es sich möglicherweise um eine Sushi/SCR/CCP Domäne.
Obwohl der E-Wert in der PFAM Datenbanksuche nur 0,72 beträgt, so sind doch alle typischen
Motive in der Endosialinsequenz, wie Cysteine zur Ausbildung von Disulfidbrücken und die
Anzahl der Proline, Glycine und Tryptophane, konserviert.
Eine detailiertere Analyse des C-terminalen, wenig komplexen Abschitts von Aminosäure 360757 läßt keinerlei stabile tertiäre Strukturen vermuten. Das Segment von Aminosäure 363-378
beinhaltet sechs Glutamat- und sieben Aspartatreste. Möglicherweise vermittelt die daraus
resultierende starke negative Ladung eine Bindung zu einem geladenen Liganden. Desweiteren
wurden die Computerprogramme DAS und TOPPRED2 (siehe Material und Methoden) benutzt,
um mögliche Transmembranregionen vorherzusagen. Dabei wurde eine einzelne stark
hydrophobe Region mit hoher Signifikanz als Transmembranregion identifiziert (AS 686-706),
so daß es sich bei Endosialin um ein Typ I Membranprotein handelt. Die extrazelluläre Region
von Aminosäure 391-660 enthält einen erhöhten Anteil an den Aminosäuren Prolin (21,9%),
Threonin (9,3 %) sowie Serin (9,3 %) im Vergleich zum Durchschnitt der in den Datenbanken
befindlichen Proteine. Im Gegensatz dazu enthält dieser Abschnitt nur sehr wenige geladene
Aminosäuren (DEKR insgesamt nur 9,6 %); Glycin (2,2 %); Asparagin (1,1 %) und
Phenylalanin (1,5 %). Der kurze intrazelluläre Abschnitt des Proteins (51 Aminosäuren) ist
überdurchschnittlich reich an Prolin (11,8 %), enthält keinerlei Phenylalanin und nur sehr wenig
hydrophobe Aminosäuren (LVIFM insgesamt nur 17,6 %). Sowohl die extrazelluläre Region von
Aminosäure 391-660, als auch die intrazelluläre Region zeigen in der Datenbankanalyse
keinerlei Ähnlichkeit zu anderen bekannten Proteinen.
Da es sich bei Endosialin um ein stark O-glykosyliertes Protein handelt (Rettig et al., 1992), und
das reine Vorhandensein von Serin/Threonin nicht prediktiv für eine Glykosylierungsstelle ist,
wurde die Sequenz mit Hilfe des NetOGlyc 2.0 servers von J.E. Hansen analysiert
(http://www.cbs.dtu.dk/services/NetOGlyc/).
Dieses
Programm
sagt
eine
mögliche
O-
Glykosylierungsstelle in der C-Typ-Lectin Domäne voraus (Thr-60), sowie weitere 34 Serine in
der Region zwischen 400-669, bei der es sich somit um eine potentielle Mucin-ähnliche Domäne
handelt.
56
4.5.2 Bioinformatische Analysen identifizieren Thrombomodulin und Komplement Rezeptor
C1qR als Endosialin-Verwandte
Abb. 4.7: Proteinsequenzvergleich von humanem Endosialin mit humanem
Thrombomodulin (SwissProt: P07204) und humanem Komplement Rezeptor C1qR
(TREMBL: U94333). Das Alignment umfaßt die ersten 360 N-terminalen Aminosäuren des
Endosialinproteins (Ende durch senkrechten schwarzen Strich markiert) und beinhaltet die CTyp-Lectin Domäne, die Sushi-ähnliche Domäne und die drei EGF-ähnlichen Domänen. In
dieser Region besitzt Endosialin eine 39 %ige Sequenzidentität zu Thrombomodulin und eine
33 %ige Sequenzidentität zu C1qR (weiße Buchstaben auf blauem Hintergrund). Fast alle
Cysteine dieser Region sind zwischen den drei Proteinen konserviert (rot). Das WIGL–Motiv ist
grün gekennzeichnet.
57
Das N-terminale Endosialin Segment zwischen Aminosäure 1 und 360 (C-Typ-Lectin Domäne,
die putative Sushi Domäne, sowie die drei EGF-ähnlichen Domänen) hat eine 39 %ige
Sequenzidentität
zu
dem
entsprechenden
Segment
im
humanen
Thrombomodulin
Vorläuferprotein (auch bezeichnet als Fetomodulin, CD 141 oder emb: CAA29045.1), sowie
eine 33 % Sequenzidentität zum humanen Komplementrezeptor C1qR (auch bezeichnet als
Lymphocyten Antigen 68, Antigen AA4 oder emb: CAC00597.1)( Abb.4.7).
Die meisten der Cysteine sind zwischen den drei Proteinen in dem dargestellten Abschnitt
konserviert, welches für eine ähnliche dreidimensionale Struktur der Proteine in diesem Bereich
spricht. Außerdem haben alle drei Proteine ein sogenanntes WIGL-Motiv. Dieses Motiv kann
man in verschiedenen Zelloberflächenproteinen finden, welche an endozytotischen Prozessen
beteiligt sind.
4.6 Biochemische Analyse des rekombinanten Endosialin Protein
4.6.1 Analyse der Karbohydrat Modifikationen des rekombinanten Endosialinproteins
Das endogene Endosialinprotein zeigt in verschiedenen Zellinien eine starke O-gebundene
Glykosylierung mit einem hohen Anteil an Sialinsäure (Rettig et al., 1992). Deshalb sollte das
Glykosylierungsmuster des transient in HeLa-S3 transfizierten Endosialin untersucht werden.
Dazu wurden die transfizierten Zellen lysiert, um das rekombinant exprimierte Endosialin
anschließend an den monoklonalen Antikörper FB5, kovalent an eine CNBr-Sepharose Matrix
gekoppelt, zu binden. In den Endosialin transfizierten, nicht aber in den Kontroll transfizierten
Zellen, wurde dabei ein 165 kDa Protein detektiert. Behandelt man das an die Matrix gebundene
Endosialin zuvor mit O-Glykosidase oder Sialidase, so führt dieses zu einer deutlichen
Reduzierung des Molekulargewichts im SDS-Gel, die mit dem Glykosylierungsmuster des
endogenen Endosialin in LA1-5s übereinstimmt (Abb. 4.8). Dieses Protein sollte daraufhin mit
verschiedenen Glykosidasen inkubiert werden, die spezifisch bestimmte Zuckerreste entfernen.
Nach einer alleinigen Behandlung des Proteins mit Sialidase hat Endosialin eine Größe von ca.
120 kDa (45 kDa Sialylsäure), eine Behandlung mit Sialidase und O-Glycanase bringt eine
Reduktion der Größe auf 95 kDa (70 kDa O-gebundene Zucker). Nach einer Behandlung mit
dem die N-gebundenen Oligosaccharide entfernenden Enzym PNGase F wurde keine bis sehr
geringe Reduktion der Proteingröße im SDS-Gel beobachtet. Dieses stimmt mit der Tatsache
überein,
daß
in
der
Endosialin
Proteinsequenz
nur
eine
einzige
Asn-X-Ser/Thr
58
Konsensussequenz für eine N-gebundene Glykosylierung an Position Asn-628 vorhanden ist.
Bemerkenswert ist die geringe Variation im Glykosylierungsmuster des endogen in LA1-5s
Zellen exprimierten Endosialinproteins. Im Gegensatz zu anderen Glykoproteinen erscheint
Endosialin nach der Detektion im SDS-Gel als einzelne scharf definierte Bande. In transfizierten
HeLa–S3 Zellen erscheint Endosialin als Doppelbande. Dies resultiert wahrscheinlich aus einer
Heterogenität in der O-Glykosylierung, da beide Proteinspezies nach enzymatischer
Deglykosylierung komigrieren (siehe Abb. 4.8, HeLa Transfektanten, O-glyc+ Sial, Sial).
Enzyme
+
+
Sial
Sial
+
O-glyc + Sial
O-glyc + Sial
+
-
PNGase F
PNGase F
-
mIgG
mIgG
-
-
+
+
+
+
220
97
66
mAk FB5
HeLa-Transfektanten
LA1-5s
Abb.
4.8:
Vergleichende
Glykosylierungsanalyse
von
rekombinantem
(HeLa–Transfektanten), sowie endogenem Endosialin (LA1-5s). Zellysate von [35S]Methionin/[35S]-Cystein markierten LA1-5s Zellen (LA1-5s) oder mit der humanen
Endosialin–cDNS transfizierter HeLa-S3 Zellen (HeLa Transfektanten) wurden entweder mit
einer
FB5-Affinitätsmatrix
oder
einer
mIgG–Kontrollmatrix
(mIgG)
inkubiert.
Immunpräzipitiertes
humanes
Endosialin
wurde
daraufhin
zur
enzymatischen
Glykosylierungsanalyse mit PNGase F, Sialidase, O-Glykosidase und Sialidase zusammen (Oglyc + Sial) oder mit Reaktionpuffer inkubiert (-).
59
4.6.2 Charakterisierung des Endosialinproteins als Sialomucin durch O-Sialoglykoprotein
Endopeptidase-Verdau
Bei der O-Sialoglykoprotein Endopeptidase (OSGE) handelt es sich um ein Enzym, welches
spezifisch O-glykosylierte mucin-ähnliche Moleküle spaltet. Da es sich bei Endosialin um ein
O–glykosyliertes Protein handelt, sollte untersucht werden, ob es als Substrat von dem Enzym
OSGE erkannt und fragmentiert wird. Aus diesem Grund wurden Detergenzextrakte von
metabolisch markierten LA1-5s Zellen mit dem monoklonalen Antikörper FB5 aufgereinigt und
anschließend für eine Stunde bei 37°C mit OSGE behandelt. Schließlich wurde das OSGEverdaute Präzipitat in der SDS-PAGE aufgetrennt und analysiert. Abb. 4.9 zeigt, daß Endosialin
nach einer Stunde komplett durch OSGE verdaut wird (FB5, OSGE), wohingegen das als
Kontrolle eingesetzte Glykoprotein β1-Integrin unter diesen Bedingungen größtenteils
unempfindlich gegen OSGE ist (anti-ß1, OSGE). Die Empfindlichkeit des Endosialinproteins
gegenüber dem Enzym OSGE ist ein Indiz, daß es tatsächlich zur Klasse der Sialomucine
zuzurechnen ist.
Enzym
_
OSGE
OSGE
_
220
97
66
mAb
FB5
anti- 1
Abb. 4.9: Verdau von Endosialin durch O-Sialoglykoprotein Endopeptidase. Lysate
metabolisch markierter LA1-5s Zellen wurden entweder mit dem monoklonalen Antikörper FB5
gegen Endosialin (FB5) oder als Kontrolle mit dem monoklonalen Antikörper 9EG7 gegen β1Integrin (anti- 1) inkubiert. Die immunopräzipitierten Antigene wurden daraufhin entweder für
eine Stunde bei 37°C mit der O-Sialoglykoprotein Endopeptidase (OSGE), oder unter
identischen Bedingungen ohne Enzym (-) behandelt. Während Endosialin komplett durch das
Enzym OSGE verdaut wird (OSGE, FB5), wird β1–Integrin nur teiweise und vermutlich
unspezifisch verdaut (OSGE, anti- 1). Das relative Molekulargewicht, in kDa, ist auf der linken
Seite angegeben.
60
4.7 Western Blot Analyse von Endosialin
Um zu testen, ob Endosialin auch unter denaturierenden Bedingungen vom mAk FB5 im
Western Blot erkannt wird, wurden Proteinextrakte der Neuroblastomzellinie LA1-5s in der
SDS-PAGE aufgetrennt und auf eine Nitrocellulose-Membran geblottet. Anschließend wurde der
Blot mit dem monoklonalen Antikörper FB5 inkubiert. Der gebundene Antikörper wurde mit
einem Peroxidase gekoppelten Ziege anti-Maus Antikörper und ECL-Reagenz (Amersham)
nachgewiesen (Abb. 4.10).
Neben der bei 165 kDa detektierten Bande, erkennt der monoklonale Antikörper im Western
Blot außerdem eine Bande bei ca. 90 kDa. Da dies mit dem errechneten Molekulargewicht der
Endosialin-Polypeptidkette übereinstimmt, wird es sich dabei vermutlich um das nicht- oder
FB5
teilmodifizierte Vorläuferprotein handeln.
185
118
85
62
Abb. 4.10: Detektion von humanem Endosialin in der Western Blot-Analyse. Proteinextrakt
von 2 x 105 LA1-5s Zellen wurde in einer 6 %igen SDS-PAGE aufgetrennt und auf eine
Nitrozellulosemembran geblottet. Nach der Inkubation mit Peroxidase-konjugiertem Anti-Maus
IgG wurde der gebundene monoklonale Antiköper FB5 durch eine ECL-Reaktion (Amersham)
sichtbar gemacht.
61
4.8 Northern Blot Analysen zur Expression der Endosialin-mRNS
Da mit der Sequenz des Endosialingens nun Informationen vorlagen, die Expression der mRNS
zu untersuchen, sollten diese Informationen im weiteren dazu benutzt werden, um: I) die
Expression in den endogen Endosialin exprimierenden Zellinien LA1-5s und MF-SH zu
untersuchen und II) die Expression des Endosialingens in verschiedenen humanen Geweben zu
untersuchen.
4.8.1 Northern Blot Analysen der mRNS des endogen exprimierten Endosialin
Zur Analyse der endogenen Endosialinexpression in den Zellinien LA1-5s und MF-SH wurde
poly (A)+ RNS aus diesen Zellen isoliert und im Northern Blot entweder mit einer 32P-markierten
spezifischen Endosialin-cDNS-Sonde (Basenpaar 2237 - 2524) oder mit einer GAPDH
MF-SH
LA1-5s
Kontrollsonde hybridisiert.
9.5
7.5
4.4
Endosialin
2.4
1.35
0.24
GAPDH
Abb. 4.11: Northern Blot Analyse von humanem Endosialin. Poly(A)+ RNS (4 µg pro Spur)
aus den Endosialin-positiven Tumorzellinien LA1-5s und MF-SH wurde nach Gelauftrennung
und Transfer auf eine Nitrozellulosemembran mit einer 32P-markierten Endosialin–cDNS-Sonde
oder als Kontrolle mit einer 32P-markierten GAPDH–cDNS-Sonde hybridisiert. Die Position der
RNS-Größenmarker (in Kilobasen) wird auf der linken Seite angezeigt.
62
Dabei wurde mit der spezifischen Endosialin-Sonde ein einziges Transkript mit einer Länge von
ungefähr 2600 bp nachgewiesen (siehe Abb. 4.11). Die gleichen Ergebnisse wurden mit
verschiedenen Endosialin Sonden erlangt (Basenpaar 1125 - 1407 und 1856 - 2178).
4.8.2 Northern Blot Analysen zur Expression der Endosialin-mRNS in verschiedenen humanen
Geweben
Zur Analyse der Expression der Endosialin-mRNS wurden "Multiple Tissue Northern (MTN)
Blots" der Firma Clontech entweder mit einer
32
P-markierten spezifischen Endosialin-Sonde
(Basenpaar 1856 - 2178) oder mit einer Ubiquitin Kontrollsonde hybridisiert. Dabei wird in
vielen Geweben mit der spezifischen Endosialin-Sonde ein einzelnes Transkript bei 2600 bp in
unterschiedlicher Intensität nachgewiesen (siehe Abb. 4.12 und 4.13). Allerdings ist das Signal
mit der spezifischen Endosialin-Sonde in allen getesteten Geweben sehr viel schwächer als mit
der Ubiquitin Kontrollsonde (Die hybridisierte Endosialin-Sonde wurde 50 x länger exponiert als
die
hybridisierte
Ubiquitin
Kontrollsonde).
Besonders
ausgeprägt
erscheint
die
Endosialin–mRNS Expression in humaner Plazenta (Abb. 4.13 A), sowie in fötalem Gewebe
(Niere und Lunge, Abb. 4.12 B). In Geweben des humanen Immunsystems ist mit der
spezifischen Endosialin-Sonde nur ein sehr geringes Signal detektierbar (Abb. 4.12 A),
besonders im Knochenmark, peripheren Blutleukozyten (PBL) und in der Milz. Auffällig ist
auch die schwache Expression in humanem Gehirn, sowohl in adultem (Abb. 4.13 A), als auch in
fötalem Gewebe (4.12 B) und im Pankreas (Abb. 4.13 A).
Thymus
Lymphknoten
Milz
A
föt. Leber
Knochenmark
PBL
63
9,5
7,5
4,4
Endosialin
2,4
1,35
0,24
Ubiquitin
föt. Niere
föt. Leber
föt. Gehirn
föt. Lunge
B
9,5
7,5
4,4
2,4
Endosialin
1,35
0,24
Ubiquitin
Abb. 4.12 A und B: Multiple
Tissue
Northern
BlotAnalyse
von
A,
lymphoidem Gewebe und
B, fötalem Gewebe (MTNBlots,
Fa.
Clontech).
Membranen wurden mit einer
32
P-markierten
Endosialinspezifischen
cDNS-Sonde
oder
einer
Ubiquitinspezifischen Kontrollsonde
hybridisiert. Pro angegebenes
Gewebe wurden jeweils 2 µg
Gesamt-RNS
aufgetrennt.
Die
Position
der
Größenmarker (in Kilobasen)
wird auf der linken Seite
angezeigt. PBL: periphere
Blutleukozyten.
64
Pankreas
Plazenta
Lunge
Leber
Skelettm.
Niere
9,5
7,5
4,4
Herz
Gehirn
A
Endosialin
2,4
1,35
0,24
Ubiquitin
Ovarien
Dünndarm
Dickdarm
PBL
Prostata
Testikel
Milz
Thymus
B
9,5
7,5
4,4
2,4
Endosialin
1,35
0,24
Ubiquitin
Abb. 4.13 A und B: Multiple
Tissue
Northern
BlotAnalyse
von
addultem
Gewebe (A und B) (MTNBlots,
Fa.
Clontech).
Membranen wurden mit einer
32
P-markierten
Endosialinspezifischen
cDNS-Sonde
oder
einer
Ubiquitinspezifischen Kontrollsonde
hybridisiert. Pro angegebenes
Gewebe wurden jeweils 2 µg
Gesamt-RNS
aufgetragen.
Die
Position
der
Größenmarker (in Kilobasen)
wird auf der linken Seite
angezeigt. PBL: periphere
Blutleukozyten.
65
4.9 Chromosomale Lokalisation des humanen Endosialin
Datenbanksuchen identifizierten einen auf Chromosom 11q13 lokalisierten humanen
genomischen Klon (RP11-755F10, Acc. Nr. AP000759), der mehr als 75 % der kodierenden
Endosialinsequenz in einem einzelnen Exon beinhaltet (Position +521 bis +2533) und in diesem
Bereich eine 99 %ige Identität mit der Endosialin-cDNS aufweist. Die chromosomale
Lokalisation dieses Klons bestätigt Ergebnisse, die mit Hilfe somatischer Zellhybride das
Endosialingen auf Chromosom 11q13ter lokalisiert haben (Rettig et al., 1992).
4.10 Endosialinhomologe in Maus und Ratte
In Datenbankanalysen, ausgehend von der humanen Endosialin-cDNS, wurden eine Vielzahl von
Maus und Ratten ESTs mit einer Länge zwischen 186 und 521 bp identifiziert, die größtenteils
aus embryonalen Geweben stammend eine 82 % bis 92 % Identität zur korrespondierenden
humanen Endosialin-cDNS aufweisen, wobei es sich wahrscheinlich um nahe Homologe in
Nicht-humanen Species handelt.
66
4.11 Identifizierung und Nachweis des murinen Endosialinhomologs
4.11.1 Nachweis des murinen Endosialinhomologs in embryonalen Fibroblasten der Maus
Zur Amplifikation des murinen Endosialinhomologs wurde cDNS aus embryonalen
Mausfibroblasten in einer PCR-Reaktion getestet. Dazu wurden Startermoleküle gegen das
humane Endosialin verwendet, da die DNS-Sequenz des murinen Homologs zu diesem Zeitpunkt
weitgehend unbekannt war. Da auch die Homologie zwischen dem humanen Endosialin und
seinem Maushomolog unbekannt war, mußte die Anlagerungstemperatur der Startermoleküle
variiert werden bis eine optimale Anlagerung der Startermoleküle an die Sequenz des
Maushomologs erreicht wurde. Die verwendeten Startermoleküle waren dabei Endo5'17_UP und
AA595199_UP1 (siehe Kapitel 3.6). Als Positivkontrolle wurden die gleichen Primer zur
Vervielfältigung des humanen Endosialins unter den gleichen Versuchsbedingungen eingesetzt.
1
2
3054
2036
1636
1018
507
Abb. 4.14: Klonierung eines murinen Endosialinhomologs. Amplifizierung murinen
Endosialins aus embryonalen Mausfibroblasten durch RT-Polymerase chain reaction (Spur 1,
Pfeil). Als Primer dienten DNS-Oligonukleotide gegen die humane cDNS (5' Primer:
Endo5'17_UP und 3' Primer: AA595199_UP1 siehe Kapitel 3.6), die in der PCR-Reaktion bei
einer Anlagerungstemperatur von 60°C (Spur 1 und 2) eingesetzt wurden. Als Positivkontrolle
wurde das humane Endosialin-Transkript aus LA1-5s cDNS unter gleichen Bedingungen
amplifiziert (Spur 2). Die Position der DNS-Größenmarker (in Basenpaaren) wird auf der linken
Seite angezeigt.
67
Identities %: 77.4
1 MLLRLLLAWVAAVPALGQVPWTPEPRAACGPSSCYALFPRRRTFLEAWRACRELGGNLAT mm
||||||||| || | ||| || ||||||||||||||||||||||||||||||||| |||
1 MLLRLLLAWAAAGPTLGQDPWAAEPRAACGPSSCYALFPRRRTFLEAWRACRELGGDLAT hs
61 PRTPEEAQRVDSLVGVGPANGLLWIGLQRQARQCQPQRPLRGFIWTTGDQDTAFTNWAQP mm
||||||||||||||| ||| |||||||||||||| ||||||| ||||||||||||||||
61 PRTPEEAQRVDSLVGAGPASRLLWIGLQRQARQCQLQRPLRGFTWTTGDQDTAFTNWAQP hs
121 ATEGPCPAQRCAALEASGEHRWLEGSCTLAVDGYLCQFGFEGACPALPLEVGQAGPAVYT mm
| |||||||| ||||||||||||||||||||||||||||||||||| | |||||||||
121 ASGGPCPAQRCVALEASGEHRWLEGSCTLAVDGYLCQFGFEGACPALQDEAGQAGPAVYT hs
181 TPFNLVSSEFEWLPFGSVAAVQCQAGRGASLLCVKQPSGGVGWSQTGPLCPGTGCGPDNG mm
||| ||| ||||||||||||||||||||||||||||| |||||| |||| |||| ||||
181 TPFHLVSTEFEWLPFGSVAAVQCQAGRGASLLCVKQPEGGVGWSRAGPLCLGTGCSPDNG hs
241 GCEHECVEEVDGAVSCRCSEGFRLAADGHSCEDPCAQAPCEQQCEPGGPQGYSCHCRLGF mm
|||||||||||| ||||| ||||||||| |||||||||||||||||||||||||||||||
241 GCEHECVEEVDGHVSCRCTEGFRLAADGRSCEDPCAQAPCEQQCEPGGPQGYSCHCRLGF hs
301 RPAEDDPHRCVDTDECQIAGVCQQMCVNYVGGFECYCSEGHELEADGISCSPAGAMGAQA mm
||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
301 RPAEDDPHRCVDTDECQIAGVCQQMCVNYVGGFECYCSEGHELEADGISCSPAGAMGAQA hs
361 SQDLRDELLDDGEEGEDEEEPWEDFDGTWTEEQGILWLAPTHPPDFGLPYRPNFPQDGEP mm
|||| |||||||| ||| | | | | ||| |||| || |||| | ||| || | ||
361 SQDLGDELLDDGEDEEDEDEAWKAFNGGWTEMPGILWMEPTQPPDFALAYRPSFPEDREP hs
421 QRLHLEPTWPPPLSAPRGPYHSSVVSATRPMVISATRPTLPSAHKTSVISATRPPLSPVH mm
|
|||||||||||| |||||| | ||| | ||| |||||||
421 QIPYPEPTWPPPLSAPRVPYHSSVLSVTRPVVVSATHPTLPSAHQ--------------- hs
481 PPAMAPATPPAVFSEHQIPKIKANYPDLPFGHKPGITSATHPARPPPYQPPIISTNYPQV mm
|
||| ||
|||| | |||||||
||| | | | || ||| ||| ||
465 -PPVIPATHPALSRDHQIPVIAANYPDLPSAYQPGILSVSHSAQPPAHQPPMISTKYPEL hs
541 FPPHQAPMSPD-----THTITYLPPVPPHLDPGDTTSKAHQHPLLPDAPGIRTQAPQLS- mm
|| || || ||
| | | || ||
| || |
| |||
|||| ||
525 FPAHQSPMFPDTRVAGTQTTTHLPGIPPNHAPLVTTLGAQLPPQAPDALVLRTQATQLPI hs
595 VSALQPPLPTNSRSSV---HETPVPAANQPPAFPSSPLPPQRPTNQTSSISPTHSYSRAP mm
|| | | ||| |
|
|||| || | |
|| | |||||| ||||| | ||
585 IPTAQPSLTTTSRSPVSPAHQISVPAATQPAALPTL-LPSQSPTNQTSPISPTHPHSKAP hs
652 LVPREGVPSPKSVPQLPSVPSTAAPTALAESGLAGQSQRDDRWLLVALLVPTCVFLVVLL mm
||| ||||
|||
||||||| | ||| ||||||||||||||||||||||||
644 QIPREDGPSPKLALWLPSPAPTAAPTALGEAGLAEHSQRDDRWLLVALLVPTCVFLVVLL hs
712 ALGIVYCTRCGSHAPNKRITDCYRWVTHAGNKSSTEPMPPRGSLTGVQTCRTSV
||||||||||| |||||||||||||| ||| || ||||||||||||||||||||
704 ALGIVYCTRCGPHAPNKRITDCYRWVIHAGSKSPTEPMPPRGSLTGVQTCRTSV
mm
hs
Abb. 4.15: Vergleich der Aminosäuresequenz des murinen Endosialinhomologs (mm) mit
humanem Endosialin (hs). Die Identität zwischen beiden Proteinen beträgt 77,4 %.
68
Wie der Abb. 4.14 zu entnehmen ist, wird das Endosialin Maushomolog bei einer
Anlagerungstemperatur von 60°C in den embryonalen Mausfibroblasten nachgewiesen. Die
Bandengröße entspricht ungefähr der Größe der humanen Endosialin-cDNS (ca. 2600 bp). Zur
weiteren Identifizierung wurde die murine Endosialin-cDNS in den Vektor pCRblunt
(Invitrogen) kloniert und sequenziert. Bei dieser Sequenzierung wurde ein aus 765 Aminosäuren
bestehendes Protein mit einem theoretischen Molekulargewicht von 81,8 kDa identifiziert. Die
Sequenz ist ab Basenpaar 634 der murinen Endosialin-cDNS durch ESTs aus verschiedenen
Datenbanken bestätigt (BLAST). Das korrespondierende Protein weist eine 77,4 %ige Identität
zum humanen Endosialin auf, die zwischen den globulären Domänen (C-Typ Lectin, Sushi und
EGF-Domänen; Aminosäure 1-360 im humanen Endosialin), sowie der Transmenbrandomäne
und dem zytoplasmatischen Teil (Aminosäure 686-757 im humanen Endosialin) besonders groß
ist. In der Mucin-Domäne weisen beide Proteine auf Aminosäureebene große Unterschiede auf
(Homologie nur noch 51 %). Bioinformatische Analysen zeigen, daß das murine Endosialin
Homolog die gleichen funktionellen Domänen (eine C-Typ Lectin, eine Sushi, drei EGFDomänen, eine Mucin-Domäne, eine Transmembrandomäne) wie das humane Endosialin
beinhaltet.
4.11.2 Expression von rekombinantem murinen Endosialin
Um zu überprüfen, ob es sich bei der in embryonalen Mausfibroblasten isolierten cDNS
tatsächlich um ein vollständiges für ein Protein kodierendes offenes Leseraster handelt, sollte die
murine Endosialin-cDNS transient in HeLa-S3 Zellen exprimiert werden. Zum Nachweis der
Expression sollte das Protein als Fusionsprotein mit influenza virus hemagglutinin (HA)
exprimiert werden und dann mit einem Antikörper gegen HA nachgewiesen werden (HA.11,
Covance). Dazu wurde dem kompletten für Aminosäuren codierenden Bereich der murinen
Endosialin-cDNS in einer PCR-Reaktion eine KspI Schnittstelle eingefügt (Primer
M_ES_pMH_DN1; siehe Kapitel 3.6). Dieses Konstrukt konnte dann im gleichen Leseraster wie
der HA-tag in den eukaryontischen Expressionsvektor pMH (Boehringer Mannheim) kloniert
und in HeLa-S3 Zellen transfiziert werden. Als Negativkontrolle wurde der Expressionvektor
pMH ohne Insert transfiziert. Beide Transfektanten wurden nach 24 Stunden mit dem
monoklonalen Antikörper HA.11 (Covance) immunzytochemisch untersucht (Abb. 4.16).
Während in den kontroll-transfizierten HeLa-S3 Zellen keine HA.11 Bindung nachweisbar ist,
zeigen die mit der murinen Endosialin-cDNS transfizierten Zellen eine starke Färbung mit dem
69
monoklonalen Antikörper HA.11. Somit wurde gezeigt, daß die vollständige murine
Endosialin–cDNS isoliert wurde.
A
B
Abb. 4.16: Indirekte Immunfluoreszensfärbung von rekombinantem murinem Endosialin.
HeLa-S3 Zellen transfiziert mit A, einem Vektor, welcher die komplette cDNS des murinen
Endosialins inklusive eines C-terminalen HA-Epitops enthält, oder B, einem Kontrollvektor.
Expressionsnachweis des murinen Endosialin-Fusionsproteins nach Inkubation mit dem
monoklonalen Antikörper HA.11 durch Alexa 488-konjugiertem Ziege anti-Maus IgG. Die
Zellkerne wurden mit DAPI gefärbt.
4.12 Konstruktion, Expression und Aufreingung eines Endosialin-hIgG1 Fusionsproteins
Zur funktionellen Untersuchung des Endosialinproteins wurde ein Fusionsprotein aus dem
globulären Teil von Endosialin und dem konstanten Teil eines humanen IgG1 (hindge, CH2,
CH3) hergestellt. Dieses sollte dann wie natürliche Immunglobuline über Cysteinbrücken
Dimere bilden (Abb. 4.17), die im weiteren Verlauf dazu eingesetzt werden, ähnlich wie mit
Antikörpern, an den globulären Teil des Endosialins bindende Interaktionspartner zu
charakterisieren (Steegmaier et al, 1997). Außerdem kann das Fusionsprotein für
Bindungsstudien an Zellen oder Geweben eingesetzt werden.
70
hIgG-Fc
hIgG-Fc
Abb. 4.17: Schematische Darstellung des humanen Endosialin-hIgG1–Fusionproteins. Das
Fusionprotein besteht aus dem N-terminalen globulären Teil von Endosialin (Signalsequenz=
gelb, C-Typ Lektin Domäne= dunkelblau, Sushi-Domäne= grün, sowie drei EGF-Domänen= rot)
und dem FC-Teil der schweren Kette des humanen IgG1.
4.12.1 Konstruktion des humanen Endosialin-hIgG1 Fusionsproteins
Zur Herstellung des Fusionsproteins wurde der für den globulären Teil des humanen Endosialins
kodierende Bereich (Basenpaar 1-1068) in einer PCR-Reaktion mit den beiden Primern
Endo5'_HindIII_UP1 und EGF3_BspEI_DN1 vervielfältigt (siehe Kapitel 3.6). Dabei wurden
der vervielfältigten DNS eine HindIII-Schnittstelle am 5' Ende und eine BspEI-Schnittstelle am
3' Ende angefügt. Mit Hilfe dieser beiden Schnittstellen wurde das Fragment dann in den Vektor
pINPEP (IDEC) kloniert, so daß das Endosialin Fragment als ein Polypeptid mit dem konstanten
Teil des humanen IgG1 (Aminosäure 104-330) exprimiert werden konnte. Dadurch sollte ein
Protein mit einem theoretischen Molekulargewicht von 63 kDa gebildet werden, welches zu
einem 126 kDa Protein dimerisieren sollte.
71
4.12.2 Expression und Aufreinigung des humanen Endosialin-hIgG Fusionsproteins
Zur Expression des Endosialin-hIgG Fusionsproteins wurden 293 Zellen mit dem oben
beschriebenen Konstrukt transfiziert. 24 h nach der Transfektion wurden sie mit 200 µg/ml G418
(BioRad) selektioniert. Die nach ca. einer Woche herangewachsenen Zellklone wurden
vereinzelt und zur Expression des Fusionsproteins in serumfreien UltraCulture Medium (Bio
Whittaker) kultiviert.
Nach einer Woche wurde der Zellüberstand abgenommen, um die genaue Menge des
exprimierten Fusionsproteins zu bestimmen. Dazu sollte das rekombinant exprimierte Protein
über Protein A Sepharose aufgereinigt und über SDS-Polyacrylamidgelelektrophorese analysiert
werden. Außerdem konnte so überprüft werden, ob das Konstrukt in der Lage ist, über den
A
111.4
Klon 5 ÜS
Klon 3 ÜS
Medium
Klon 5 ÜS
Klon 3 ÜS
Medium
konstanten Teil des humanen IgG Dimere auszubilden.
B
79.6
61.3
49.0
36.4
172.6
24.7
111.4
Nicht-Reduzierend
Reduzierend
Abb. 4.18: Biochemische Analyse des humanen Endosialin-IgG1-Fusionsproteins. SDSPAGE Protein A Sepharose-gereinigter Zellüberstände. Aufgereinigt wurden jeweils 2 ml
Zellüberstand der transfizierten 293-Zellklone 3 und 5 (Klon 3 ÜS, Klon 5 ÜS). Als Kontrolle
wurde die gleiche Menge Kulturmedium aufgereinigt (Medium). A, eine Hälfte des Eluats wurde
unter nicht-reduzierenden Bedingungen im 6 %igen Polyacrylamidgel aufgetrennt; B, die andere
Hälfte unter reduzierenden Bedingungen im 12 %igen Gel. Die Detektion erfolgte durch
Coomassiefärbung. Die Position der Molekulargewichtsmarker ist in kDa angegeben.
72
Dazu wurden pro Klon 2 ml Zellüberstand über Nacht mit Protein A Sepharose inkubiert,
anschließend mit PBS gewaschen und gebundenes Konstrukt durch pH-Shift mit 0,1 M Glycin
pH 2.8 eluiert. Das Eluat wurde sofort mit 1 M Tris pH 8,0 neutralisiert. Als Negativkontrolle
wurden 2 ml Kulturmedium behandelt wie oben beschrieben. Nach der Auftrennung einer Hälfte
des Eluats im SDS-Gel unter reduzierenden Bedingungen und der andere Hälfte unter nichtreduzierenden Bedingungen wurde das Protein in der Comassiefärbung nachgewiesen (Abb.
4.18).
Nach den Aufreinigungen der Zellüberstände beider Zellklone (Klon 3 und 5) detektiert man
nach einer Färbung mit Coomassie Blau unter reduzierenden Bedingungen eine hauptsächliche
Bande bei ca. 65 kDa. Dieses stimmt mit dem theoretischen Molekulargewicht von 63 kDa
überein. Unter nicht-reduzierenden Bedingungen läßt sich nach der Aufreinigung ein Protein mit
einem Molekulargewicht von ca. 125 kDa im CoomassieBlau gefärbten Gel nachweisen. Somit
werden die Konstrukte als Monomer mit dem erwarteten Molekulargewicht von 63 kDa
exprimiert. Außerdem sind die Konstrukte wie natürliches humanes IgG in der Lage über den
IgG-Anteil des Fusionproteins Dimere auszubilden. Durch einen Vergleich der Protein
Markerbanden mit dem aufgereinigten Fusionprotein ließ sich die Menge auf ca. 5 µg/ml
abschätzen. Die Zellklone exprimieren somit ca. 5 µg/ml Endosialin-hIgG 1-Fusionsprotein.
73
5 Diskussion
5.1 Endosialin ist TEM1
Neben dieser Doktorarbeit und den beiden Publikationen Christian et al., 2001 und Rettig et al.,
1992 gibt es noch eine weitere Arbeit, die Endosialin mit dem Tumorendothelium in Verbindung
bringt (St. Croix et al., 2000). In der publizierten Arbeit vergleicht die Arbeitsgruppe um Kinzler
das Expressionsmuster von Tumorendothelzellen mit Endothelzellen aus normalen Geweben.
Dazu wurde das Gewebe eines Darmtumors und normales Darmgewebe parallel mit Kollagenase
A behandelt. Anschließend wurden epitheliale Zellen, Leukozyten, Makrophagen und
Monozyten durch eine negative Selektion mit Antikörpern gegen die entsprechenden Zellmarker
(anti BerEP4, CD45, CD64, CD14) entfernt. Die übrig gebliebenen Zellen wurden schließlich
einer positiven Selektion unterzogen, indem die Endothelzellen mit dem endothelspezifischen
Antikörper P1H12 (Solovey et al., 1997) markiert und mit einer magnetischen Anti-Maus-IgG
Matrix isoliert wurden. Sowohl aus den Tumorendothelzellen als auch aus den Endothelzellen
aus normalem Gewebe wurde die RNS isoliert, um die "serial analysis of gene expression
(SAGE)"-Technik anzuwenden (Virlon et al., 1999; Velculescu et al., 1999). Dabei isolierten
St.Croix et al. 46 tumorendothel–spezifische Transkripte, welche im Tumorendothel mehr als
10 x höher exprimiert werden als im Endothel des normalen Darmgewebes. Das am stärksten
hochregulierte Transkript ist ein bis zu diesem Zeitpunkt nicht charakterisiertes Gen, welches in
der Datenbank als EST mit unbekannter Funktion eingetragen ist und von St. Croix et al. "tumor
endothelial marker 1 (TEM1)" genannt wurde. Ein Sequenzvergleich zeigt, daß TEM1 und
Endosialin identisch sind.
Zur weiteren Untersuchung wurde von der Arbeitsgruppe um Kinzler eine 'in situ'
Hybridisierung mit einer TEM1/Endosialin-Sonde durchgeführt und dabei die spezifische
Expression des Transkripts des TEM1/Endosialin-Gens bestätigt. In den getesteten
neoplastischen Geweben (Darm, Lunge, Gehirn und Leber) beschränkte sich die Expression
ausschließlich auf die endothelialen Zellen. In den getesteten normalen Geweben wurde in
keinem Fall ein positives Signal detektiert. Schließlich wurde auch eine Expression des
TEM1/Endosialin-Gens in Endothelzellen vermutet, die in dem Prozeß der Wundheilung
involviert sind.
Zusammenfassend läßt sich sagen, daß durch die Untersuchungen von St.Croix et al. zur
Expression des TEM1/Endosialin-Gens auf mRNS-Ebene die Daten zur Expression des FB5-
74
Antigens bestätigt werden und die Untersuchungen somit einen weiteren Hinweis für die
spezifische Expression von Endosialin liefern.
Allerdings geht die Arbeitsgruppe um Kinzler dabei nicht auf die Heterogenität im
Expressionsmuster des TEM1/Endosialin-Gens, wie bei Gewebsfärbungen mit dem mAk FB5
beobachtet wurde, ein (siehe 2.5). Dafür gibt es verschiedene Erklärungen: 1) Die
TEM1/Endosialin-mRNS ist in allen Tumorblutgefäßen gleichmäßig exprimiert, der mAk FB5
erkennt aber nur ein bestimmtes modifiziertes Epitop auf einem Teil der gesammten Endosialin
Population. Es gibt Beispiele, bei denen das Expressionsmuster zwischen diesen beiden
Methoden stark variiert. Dieses liegt zum einen daran, daß ein Epitop auf dem Polypeptid durch
verschiedene Glykosylierungen verdeckt sein kann und zum anderen daran, daß Epitope auf dem
Glykoanteil auch auf anderen ähnlich glykosylierten Proteinen erkannt werden können. 2) Der
Nachweis von mRNS durch 'in situ' Hybridisierung ist sensitiver als der Nachweis des Protein
über Antikörperfärbungen. Deshalb könnte das vom mAk FB5 detektierte Verteilungsmuster nur
die Bereiche mit der stärksten TEM1/Endosialin-Konzentration nachweisen, während die 'in situ'
Hybridisierung TEM1/Endosialin sensitiver und damit vollständiger nachweist und 3) könnten
einfache Unterschiede im Design der verschiedenen Ansätze zu unterschiedlichen Ergebnissen
führen. Gegen die erste Möglichkeit sprechen die Ergebnisse, die im Rahmen dieser Arbeit durch
Transfektions-Experimente erlangt wurden. Verschiedene Zellinien wie Hela-S3 oder Cos-7
Zellen, die mit der rekombinanten Endosialin-cDNS transfiziert wurden, zeigten eine sehr
homogene Glykosylierung des exprimierten Proteins, welches in allen Fällen von dem mAk FB5
erkannt wurde. Außerdem zeigen Western Blot Experimente, daß der mAK in diesem
Versuchsansatz ein Protein mit einem Molekulargewicht von 95 kDa erkennt, wobei es sich sehr
wahrscheinlich um das nicht glykosylierte Endosialinpolypeptid handelt. Die Erkennung von
Endosialin durch FB5 scheint somit nicht glykosylierungsabhängig zu sein.
Beide Untersuchungen zum Expressionsmuster des TEM1/Endosialin-Proteins widersprechen
jedoch den Ergebnissen der Northern Blot Analysen, die im Rahmen dieser Doktorarbeit
durchgeführt wurden. Dabei wurde die Endosialin-mRNS in vielen getesteten Geweben
nachgewiesen, was für eine breite Gewebeverteilung sprechen würde. In diesem Zusammenhang
ist nicht klar, aus welchen Geweben die von der Firma "Clontech" bezogene mRNS isoliert
wurde. Da humanes Gewebe häufig im pathogenen Zustand entfernt wird, ist anzunehmen, daß
auch die von Clontech isolierte mRNS aus pathogenem Gewebe oder aus normalem Gewebe mit
75
Anteilen pathogenen Gewebes isoliert wurde. Somit würde man die Endosialin-mRNS in diesen
pathogenen Geweben (Tumore, entzündliches Gewebe, Wundheilung) nachweisen.
Zur endgültigen Klärung dieser Expressionsunterschiede sind sicherlich weitere Untersuchungen
zum Verteilungsmuster notwendig, zum Beispiel durch immunhistochemische Versuche mit
Antikörpern gegen andere Endosialin Epitope als der mAk FB5.
5.2 Funktion des Endosialin Proteins
Bisher liegen keinerlei Daten zur Funktion des Endosialin Proteins vor. Hinweise für eine
mögliche Funktion liefern zum einen die Homologievergleiche des Endosialin Proteins mit
verwandten Proteinen bekannter Funktion sowie zum anderen die Domänenstruktur des
Endosialin Proteins.
5.2.1 Homologievergleich von Endosialin mit Thrombomodulin und dem Komplementrezeptor
C1qR
Wie bereits beschrieben, besitzt Endosialin im N-terminalen globulären Teil eine 39 %ige
Homologie mit Thrombomodulin und eine 33% ige Homologie zum Komplementrezeptor C1qR.
Dieser Bereich umfaßt vom N-terminus gesehen eine C-Typ-Lectin Domäne, gefolgt von einer
putativen Sushi Domäne, sowie drei EGF-ähnlichen Domänen.
Thrombomodulin ist ein Typ I Membranglykoprotein mit breiter Verteilung im Gewebe. Es wird
sowohl auf Endothelzellen (Maruyama et al., 1985), als auch auf Blutplättchen (Suzuki et al.,
1989), Megakaryozyten (Ogura et al., 1990), Monozyten (McCachren et al., 1991), glatten
Muskelzellen (Soff et al., 1991), Keratinozyten (Raife et al., 1994) und Tumorzellen der Haut
exprimiert. (Jackson et al., 1995). Thrombomodulin besitzt im extrazellulären Teil wie
Endosialin eine C-Typ-Lectin Domäne, jedoch sechs EGF-ähnliche Domänen sowie eine
Serin/Threonin-reiche Domäne. Endotheliales Thrombomodulin bildet einen 1:1 Komplex mit
Thrombin. Durch diesen Komplex wird Protein C aktiviert, welches als aktive Protease die
prokoagulativen Faktoren V und VIII spaltet und inaktiviert. Diese Aktivität macht
Thrombomodulin
zu
einem
wichtigen
Gegenregulator
der
Blutgerinnung.
Durch
Deletionsstudien mit sekretiertem (Zushi et al., 1989) und Membran-gebundenem humanen
Thrombomodulin (Tsiang et al.,1992) konnte gezeigt werden, daß Thrombomodulin Thrombin
über die EGF-ähnlichen Domänen 5 und 6 komplexiert. Diese Domänen sind in Endosialin nicht
76
vorhanden. Es ist daher fraglich, ob Endosialin eine ähnliche Funktion für das Tumorendothel
hat. Dieses wird in zukünftigen Versuchen adressiert werden.
Hinweise dafür, daß Thrombomodulin neben der oben beschriebenen Funktion noch weitere
Aufgaben erfüllt, zeigen initiale Untersuchungen mit homozygoten Thrombomodulin-defizienten
Mäusen. Die Mausembryos sterben vor dem Tag E 9,5, noch bevor sich ein kardiovaskuläres
System gebildet hat. Dieses ist ein Hinweis für einen bisher unbekannten, Thrombinunabhängigen Mechanismus (Rosenberg, 1995). Untersuchungen zur Expression des
Endosialinhomologs in der Maus könnten Aufschluß darüber geben, ob auch Endosialin in der
Embryogenese eine wichtige Rolle spielt.
Anhaltspunkte über Funktionen von Thrombomodulin, die über die zum Endosialin homologe
Lectin Domäne vermittelt werden, liefern verschiedene Arbeiten (Zhang et al., 1998 und
Conway et al., 1997). Zhang et al. zeigten, daß Tumorzellinien in ihrem Wachstum durch
transfiziertes Thrombomodulin gehemmt werden. Dabei zeigten sie in weiteren Deletionsstudien,
daß der wachstumshemmende Effekt von dem Vorhandensein der N-terminalen Lectin sowie der
zytoplasmatischen Domäne abhängig ist.
Conway et al. zeigen die Induktion von Endocytose durch die Zugabe von Thrombomodulin
Antikörpern bzw. von Thrombin, in Abhängigkeit der N-terminalen Lectin Domäne von
Thrombomodulin.
Aufgrund der starken Homologie von Thrombomodulin und Endosialin in der C-Typ-Lectin
Domäne, vor allem in der dreidimensionalen Struktur durch eine fast 100 %ige Homologie der
Aminosöure Cystein zwischen beiden Proteinen, sind die oben beschriebenen Funktionen auch
für Endosialin nicht auszuschließen. Außerdem weisen beide Proteine das sogenannte "WIGL"
Motiv auf, welches vermutlich eine Rolle in der Phagocytose spielt. Für eine genauere Klärung
dieser Fragen sind allerdings nachfolgende Untersuchungen notwendig.
Bei dem C1q-Rezeptor handelt es sich um ein Zelloberflächenglykoprotein, daß auf myeloiden
Zellen, Endothelzellen und Blutplättchen exprimiert ist (Nepomuceno und Tenner, 1998). Neben
der 33 %igen Identität zu Endosialin auf Aminosäureebene in der globulären Region weisen
C1qR und Endosialin eine sehr ähnliche Domänenstruktur auf. Beide Moleküle besitzen eine CTyp Lektin-Domäne, gefolgt von EGF-Repeats (drei im Falle von Endosialin und fünf im Falle
von C1qR) eine Mucin-Domäne, sowie eine Transmembrandomäne und ein kurzer
intrazellulärer Anteil. Außerdem zeigt die Arbeitsgruppe von Tenner, daß das entsprechende
77
C1q-Maushomolog die gleiche Domänenstruktur aufweist, wobei die Identität zwischen Maus
und Mensch außerhalb der Mucin-Domäne zwischen 70 und 90 % beträgt, in der Mucin-Domäne
selbst jedoch nur bei 30 % liegt. (Kim et al., 2000). Bei Endosialin liegt die Identität zwischen
Maus und Mensch außerhalb der Mucin-Domäne ebenfalls zwischen 70 und 90 %, in der MucinDomäne selbst aber nur bei 51 %. Somit scheinen sowohl bei C1qR als auch bei Endosialin diese
höher konservierten Regionen für die Funktion wichtig zu sein. Die Mucin-Domäne scheint
aufgrund der O-Glykosylierung wichtig zu sein, nicht jedoch aufgrund der primären
Aminosäurestruktur.
Der Rezeptor bindet den Komplementfaktor C1q (Nepomuceno et al, 1997) und vermittelt
Phagozytose. Die Funktion des Rezeptors auf endothelialen Zellen ist weitgehend unbekannt,
allerdings wird diskutiert (Kim et al., 2000), daß C1qR auf diesen Zellen möglicherweise eine
Rolle in der Phagocytose apoptotischer Zellen aus dem Blut spielt. Es wurde gezeigt, daß
endotheliale Zellen in der Lage sind, apoptotische Lymphozyten aufzunehmen. Für diese
Tatsache spricht, daß die Expression des C1q-Rezeptorliganden C1q in vielen verschiedenen
Zelltypen nach Verletzungen, zum Beispiel des Gehirns (Goldsmith et al., 1997) oder
Infektionen (Dietzschold et al., 1995) hochreguliert wird.
Aufgrund der hohen Homologie des Moleküls zu Endosialin läßt sich auch eine ähnliche
Funktion für dieses Protein diskutieren. Da auch im Tumor eine Vielzahl apoptotischer Zellen
auftreten, müssen diese aus dem Blut entfernt werden. Diese Aufgabe könnte von einem
Tumorendothel spezifischen Molekül wie Endosialin übernommen werden.
5.2.2 Homologievergleich von Endosialin aufgrund der Domänenstruktur
Weitere Aufschlüsse über die Funktion von Endosialin könnte ein Vergleich mit Proteinen
ähnlicher Domänenstruktur erbringen. Dabei sind insbesondere die C-Typ-Lectin Domäne, die
Sushi Domäne, sowie die Mucin Domäne zu erwähnen.
C-Typ-Lektine sind Zucker-bindende Proteine, die Oligosaccharide auf Zelloberflächen in der
extrazellulären Matix oder auf sekretierten Glykoproteinen erkennen und somit in der Zelle sehr
unterschiedliche Aufgaben übernehmen. So gibt es zum Beispiel Lektine wie Calnexin und
Calreticulin, die die Synthese von neu synthetisierten Glykoproteinen im ER kontrollieren und
für den Weitertransport der korrekt prozessierten Proteine verantwortlich sind (Yamashita et al.,
1999). Außerdem spielen Lektine bei der Abwehr von Mikroorganismen eine Rolle. So aktiviert
das Lektin Mannose-binding lectin (MBL) nach Bindung an ein entsprechendes Kohlenhydrat
78
auf Bakterien die beiden assoziierten Proteasen MASP-1 und MASP-2, die daraufhin durch
Spaltung von C2 und C4 das klassische Komplement System aktivieren (Turner, 1998).
Bei einer weiteren Klasse der Lektine ist die Bindung des Proteins an eine Kohlenhydrat-Kette
Ca++-Abhängig, weshalb man sie C-Typ Lektine nennt (Drickamer, 1999). Neben Endosialin und
MBL gehören zu dieser Klasse die sogenannten Selektine. Hierbei handelt es sich um eine
Klasse von Transmembran Proteinen, die aus drei Mitgliedern besteht: P-Selektin, L-Selektin
und E-Selektin. Die Expression dieser Moleküle beschränkt sich auf das LeukozytenBlutgefäßsystem, L-Selektin wird auf Leukozyten exprimiert, E-Selektin auf aktiviertem
Endothel und P-Selektin auf Megakaryozyten und in den Speichergranula von Blutplättchen und
Endothelzellen. Selektine besitzen die gleichen Domänen wie Endosialin, allerdings in anderer
Anordnung und Anzahl. Sie bestehen aus einer N-terminalen C-Typ-Lectin Domäne, einem
EGF-Repeat und mehreren Sushi-Domänen. Daraufhin folgt eine Transmembrandomäne und ein
zytoplasmatischer Abschnitt (Vestweber und Blanks, 1999). Durch die Bindung der Selektine
über die C-Typ-Lectin Domäne an Kohlenhydrat-Ketten ihrer Rezeptoren vermitteln sie ZellZell Adhäsion zwischen den Endothelzellen und Leukozyten und spielen somit eine wichtige
Rolle bei der Rekrutierung der Leukozyten in entzündetes Gewebe, sowie im Rahmen der
Immunüberwachung beim Übertritt zwischen Blut- und Lymphsystem. L–Selektin war das erste
Selektin bei dem durch Experimente mit dem inhibitorischen Effekt des monoklonalen
Antikörpers MEL 14 gezeigt wurde, daß es für die Wanderung von Neutrophilen in entzündetes
Gewebe verantwortlich ist (Lewinsohn et al., 1987). E-Selektin ist nicht-konstitutiv auf
Endothelzellen exprimiert und wird erst 3-4 h nach Induktion mit Cytokinen wie TNFα,
Interleukin-1β und Lipopolysacchariden gebildet (Bevilacqua et al., 1987) und vermittelt
daraufhin die Bindung zu den entsprechenden Liganden auf den Leukozyten. Liganden der
Selektine sind für P-Selektin der P-Selektin ligand-1 (Levinovitz et al., 1993), für E-Selektin
ESL-1(Lenter et al., 1994) und P-Selektin ligand-1 und für L-Selektin GlyCAM-1 (Lasky et al.,
1992) und CD34.
Aufgrund der ähnlichen Domänenstruktur Endosialins, welches ebenfalls aus einer N-terminalen
C-Typ-Lectin Domäne, einer Sushi Domäne und EGF-Repeats, einer Transmembrandomäne und
einem zytoplasmatischen Teil besteht, als auch aufgrund der Expression auf Endothelzellen
kommt auch für Endosialin eine Funktion bei der Zell-Zell Bindung in Frage. Da das Endothel
im Tumor dem im entzündeten Gewebe in Bezug auf Durchlässigkeit und Expression von
Zelladhäsionsmolekülen (VCAM-1) nicht unähnlich ist, könnte die Expression von Endosialin
79
durch einen bisher nicht identifizierten Faktor induziert werden und daraufhin die Bindung zu
Leukozyten oder anderen Blutzellen vermittelt werden.
Mucine sind große Glykoproteine (ca. 200 kDa) mit einem hohen Kohlenhydrat-Anteil (um die
50 %). Die Funktion vieler Mucine ist bisher wenig charakterisiert, allerdings kommen sie
natürlich als Interaktionspartner der oben beschriebenen C-Typ-Lectine in Frage und tatsächlich
gehören viele der Interaktionspartner der Selektine zur Klasse der Mucine (z.B. P-Selektin
ligand-1). Somit spielen sie auch eine wichtige Rolle bei der Zell-Zell Adhäsion und damit bei
der Rekrutierung von Leukozyten zum Endothel. Zusätzlich scheinen sie aber auch bei der
Kontrolle das Wachstums verschiedener Gewebe beteiligt zu sein. So wurde gezeigt, daß
Proteoglykane in der Lage sind Wachstumsfaktoren zu binden und den entsprechenden
Rezeptoren auf der Zelloberfläche zu präsentieren (Goretzki et al., 1999). Dadurch könnten
Sialomucine Prozesse wie die Bildung neuer Blutgefäße (Angiogenese) regulieren.
Sushi Domänen sind kurze Module aus weniger als 60 Aminosäuren (54 Aminosäuren im Falle
von Endosialin), die Protein-Protein Interaktionen vermitteln. Ihre genaue Funktion ist
weitgehend unbekannt, allerdings findet man diese Domänen vor allem in Proteinen des
Komplement Systems.
EGF-Repeats vermittlen Protein-Protein Interaktionen und ohne genauere Kenntnisse über die
Art dieser Interaktionpartner geben sie wenig Aufschlüsse über die Funktion des Endosialin
Proteins.
Letztlich kann der kurze zytoplasmatische Teil des Endosialin Proteins einige Anhaltspunkte für
mögliche Funktionen liefern. Mit 51 Aminosäuren ist der intrazelluläre Anteil des Proteins
relativ kurz. Desweiteren zeigt er keinerlei Homologien zu anderen bekannten Proteinen.
Allerdings verspricht die Homologie von 92 % in diesem Bereich zwischen dem humanen und
murinen Endosialin, daß dieser Teil des Proteins eine wichtige Funktion vermittelt. Diese könnte
darin bestehen die Bindung extrazellulärer Liganden an das Zellinnere zu signalisieren, zum
einem durch Kinasen, die Endosialin an potentiell vorhandenen spezifischen Stellen
phosphorylieren und zum anderen durch die Bindung eines Proteins mit einer sogenannten PDZDomäne. Hierbei handelt es sich um eine Protein Domäne, die in mehr als 40 Proteinen des
Zytosols identifiziert wurden, die oft in Regionen lokalisiert sind, in denen Zell-Zell-Kontakte
stattfinden (Songyang et al., 1997) und die in die Transduktion von verschiedenen Signalen
involviert sind. Der Name PDZ leitet sich von drei Molekülen ab, die diese Domäne beinhalten,
nämlich postsynaptic density protein PSD-95, disc large tumor supressor aus Drosophila und
80
ZO-1. Proteine mit dieser Domäne binden an die fünf letzten C-terminalen Aminosäuren ihrer
Interaktionspartner, wobei die letzte Aminosäure ein Valin, Leucin oder Isoleucin sein muß
(Saras und Heldin, 1996). Außerdem haben Studien gezeigt, daß ein Threonin an Position 3 vom
C-terminus aus bei vielen PDZ-bindenden Proteinen für die Interaktion wichtig ist (Kim et al.,
1995). Da in der Aminosäure-Sequenz des Endosialin beide Kriterien erfüllt sind (C-terminale
Aminosäure ist Valin und an Position 3 vom C-terminus ist Threonin), handelt es sich um ein
potentiel PDZ-bindendes Protein, welches möglicherweise in der Organisation von Zell-Zell
Kontakten beteiligt ist.
5.3 Ist Endosialin ein Tumorendothel-spezifisches Antigen?
Sowohl Ergebnisse in immunhistologischen Experimenten mit dem monoklonalen Antikörper
FB5 (Rettig et al., 1992), als auch 'In situ' Hybridisierungen mit Sonden, die Endosialin-mRNS
detektieren, zeigen (StCroix et al., 2000), daß es sich bei diesem Protein um ein Antigen handelt,
welches sehr spezifisch auf Tumorendothel exprimiert ist. Die einzige Ausnahme stellt dabei die
von StCroix et al. angedeutete Expression in der Wundheilung dar. Dabei ist jedoch die
Wahrscheinlichkeit sehr hoch, daß Endosialin noch andere vom Tumor unabhängige Funktionen
hat, da nicht anzunehmen ist, daß die Expression des Endosialingens nur während der
Tumorentwicklung stattfindet.
Der Grund dafür, daß beide Ansätze zur Untersuchung der Gewebeverteilung von Endosialin
ausschließlich eine Expression in Tumorgewebe nachweisen, könnte zum einen daran liegen, daß
sich die Expression von Endosialin tatsächlich auf sehr spezialisiertes Gewebe oder Prozesse wie
Wundheilung oder Entzündungen beschränkt, zum anderen könnte Endosialin während der
Embryonalentwicklung eine wichtige Rolle spielen. Diese Tatsache kann nun durch die
Identifizierung des Endosialin Maushomologs im Detail untersucht werden. Für die erste
Tatsache spricht neben den Ergebnissen der Arbeitsgruppe um Kinzler, die wie oben beschrieben
eine Expression in der Wundheilung andeuten, bisher nicht veröffentliche Ergebnisse von Rettig
und Garin-Chesa. Sie zeigen nicht nur, daß einige Fibroblasten Zellinien in der
Immunzytochemie positiv mit dem monoklonalen Antikörper FB5 reagieren, sondern auch
Fibroblasten des Endometriums (Abb. 5.1 Bild A) und in Zellen des juxtaglomerularen
Apparates (Abb. 5.1 Bild B), einer hoch spezialisierten Region der Nieren, die eine wichtige
Rolle bei der Regulation des Blutdrucks spielt.
81
Hierbei handelt es sich um drei Beispiele für eine nicht-Tumor-assoziierte Expression des
Endosialinantigens, die die Verwendung des Proteins als Target für eine Anti-Tumor-Therapie,
wie in Kapitel 2.3 beschrieben, in Frage stellen mag. Dazu muß allerdings besonders im Fall der
Expression im juxtaglomerularen Apparat die Zugänglichkeit dieser Region für einen im Blut
zirkulierenden Antikörper nachgewiesen werden. Sollten diese Untersuchungen eine schlechte
Zugänglichkeit für einen konjugierten Antikörper ergeben, ist ein Molekül mit einer hoch
spezifischen Expression im Tumorendothel ein interessantes Target in der Entwicklung einer
Anti-Tumor Therapie.
A
B
Abb.: 5.1 Expression von humanen Endosialin in nicht-endothelialen Geweben.
Immunohistochemische Färbung von Endosialin mit dem monoklonalen anti-Endosialin
Antikörper FB5 zeigt A, eine Expression in Fibroblasten im Endometrium humaner Plazenta
und B, im Juxtaglomerulären Apparat der normalen Niere. Avidin-biotin Komplex Methode
(braun) und Hematoxylin Gegenfärbung (blau).
5.4 Ausblick
Nach Identifizierung der cDNS von Endosialin, eines Tumorendothel-spezifischen Antigens,
wird die Charakterisierung der Funktion dieses Rezeptors Hauptbestandteil weiterer
Untersuchungen sein. Desweiteren werden die im Rahmen dieser Arbeit identifizierte cDNS des
Maushomologs, sowie die Konstruktion, Expression und Aufreinigung eines humanen
Endosialin-hIgG Fusionsproteins dabei wichtige Grundlagen für weitere Untersuchungen
darstellen.
82
Wie in Kapitel 5.3 beschrieben, ermöglicht die Identifizierung der murinen Endosialin-cDNS
Untersuchungen der Endosialinexpression während der Embryonalentwicklung, zum einen durch
'in situ' Hybridisierungen zur Detektion der mRNS-Expression oder durch Kaninchen-Antiseren
gegen Peptide oder Fusionsproteine des murinen Endosialin Proteins. Desweiteren kann die
cDNS-Sequenz Information dazu benutzt werden, den chromosomalen Aufbau des Gens zu
identifizieren und durch homologe Rekombination eine Endosialin Knock-out Maus zu
generieren. Diese könnte dann weitere Aufschlüsse über die Funktion des Proteins in der
Angiogenese in normalen und malignen Geweben liefern.
Ein weiterer wichtiger Schritt in der Charakterisierung der Endosialinfunktion ist die
Identifizierung von Endosialin Interaktionspartnern. Zu diesem Zweck können die EndosialinhIgG1-Fusionsproteine eingesetzt werden, die wie Antikörper dazu benutzt werden können, auf
Zellinien und Geweben nach Endosialin Interaktionspartnern zu suchen. Potentielle Liganden
könnten nach Zell-/Gewebelyse über eine aus immobilisierten Fusionsproteinen bestehende
Matrix aufgereinigt und identifiziert werden. Desweiteren könnten diese Konstrukte in
Zelladhäsions Assays oder im Phage Display eingesetzt werden.
Ein letzter wichtiger Ausblick ist die Charakterisierung des Endosialin-Antigens für eine
mögliche Anti-Tumor Therapie. Neben den bereits oben beschriebenen Untersuchungen zur
Zugänglichkeit des Antigens für verschiedene Antikörperderivate müßte dazu eine humanisierte
Form des monoklonalen Antikörpers FB5 eingesetzt werden. Außerdem müßte der Einfluß
verschiedener Antikörper Fusionsproteine, z.B. mit dem koagulativ wirkenden tissue factor (s.
Kapitel 2.3) auf das Wachstum des Tumors untersucht werden. Dieses könnte im Maustiermodel
(Xenographed) getestet werden, wenn die vom Mausendothel vaskularisierten Tumore ebenfalls
Endosialin exprimieren.
83
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90
7 Summary
During the transition of an epithelial cell from a normal into a neoplastic malignant phenotype a
series of somatic cell changes occur (e.g. expression of oncogenes and tumor supressor genes),
allowing the transformed cells to grow to a tumor nodule of 1 - 2 mm in size. At this diameter
the tumor is dependent on the formation of a supporting stroma consisting of stromal fibroblasts,
lymphoid and phagocytic infiltrates, extracellular matrix proteins and of new formed tumor
blood vessels established by a process called angiogenesis. These cells of the tumor stroma are
not transformed, but differ from corresponding cells in other tissues in their protein expression
pattern (e.g. of matrix metalloproteases and growth factors like vascular endothelial growth
factor) . Consequently antigens of the tumor stroma are potentiel targets for anti-tumor therapies.
Targeting of the tumor stroma, instead of tumor cells, has a number of advantages in case of the
tumor vascular endothelial cells. (I) Antigens on endothelial cells are accessible to targeting
agents applied via the blood stream. (II) Endothelial cells are not transfomed and so it is unlikely
that they develop resistance against the therapy. (III) The destruction of tumor blood vessels
could lead to widespread necrosis in solid tumors.
Endosialin was originally identified as an antigen of mAb FB5 (Rettig et al, 1992). This antibody
was used in immunohistochemical analysis of different normal and malignant tissues. FB5
immunostaining was found primarily in tumor blood vessels, whereas no antigen was detected in
malignent cells themselves or in normal tissues. Even in FB5-positive endothelial cells of
malignent tissues, the antigen was detected with a heterogeneous pattern in the vascular bed.
Such a mixed pattern might be expected for a molecule involved in the reorganization of blood
91
vessels in tissues such as cancers, in which areas of stable blood supply are juxtaposed to regions
of necrosis, hypoxia, excessive growth, tissue invasion and remodeling.
The expression of the FB5 antigen by cultured normal and tumor cells was also investigated,
revealing that most of the cultured epithelial, neuroectodermal, mesenchymal and hematopoetic
cell types tested were FB5-negative, except of short term cultures of normal fibroblasts and
neuroblastoma cell lines, which consistently express the antigen in tissue culture.
One of these neuroblastoma cell lines, LA1-5s, was used for the chromosomal assignment of the
endosialin gene to human chromosome 11q13 by serologic analysis of generated mouse-human
neuroblastoma cell hybrids, which were analyzed for endosialin expression.
In LA1-5s cells, the FB5 antigen is a unique 165 kDa glycoprotein, comprised of a core protein
migrating as a 95 kDa protein on SDS polyacrylamide gels which bears the mAb FB5-defined
epitope and is substituted by highly sialylated O-linked carbohydrate moieties.
In order to provide probes and structural information to explore the endosialin function, we
aimed to identify the endosialin cDNA. Therefore we used the endosialin-expressing
neuroblastoma cell line LA1-5s to purify the antigen via a FB5 immunoaffinity matrix. 6 x 109
cells were subjected to a detergent lysis to purify the antigen using mAb FB5 coupled to CNBrSepharose. The purified material was separated on a 6 % SDS-polyacrylamide gel and yielded
about 10 pmol of the specific 165 kDa protein species as determined by Coomassie staining. The
Coomassie stained gel was sent to Dr. Horst Ahorn, Boehringer Ingelheim Austria GmbH, for
Edman-based sequence analysis. Endosialin-containg gel fragments were digested with trypsin
and resulting peptides were separated by HPLC. Analysis of selected peptides was performed by
a combination of Edman degradation and matrix-assisted laser desorption ionization-time of
92
flight (MALDI-TOF), resulting in the identification of six unique peptide sequences. Performing
a prosite pattern search with these six identified peptides we found that five out of six matched
with the deduced amino acid sequence of expressed sequence tag (EST) clone AI371224. Full
length sequencing of the EST revealed a single open reading frame of 1394 bp without a
potential start or stop codon, prompting us to conduct an iterative database search. In this
iterative database search we identified two additional ESTs (H19258 and AA595199)
overlapping with the 3' end of the yet identified endosialin cDNA. Sequencing of these ESTs
extended the open reading frame to 2239 bp, including a potential stop codon and
polyadenylation signal at the 3' end. Furthermore these results were verified by sequence
information of two additional ESTs (H12800 and H12557). To isolate the 5' end of the
endosialin cDNA we performed a 5' RACE (rapid amplification of cDNA ends) and extended the
cDNA by 53 bp, including a putative start ATG. Thus, the complete endosialin cDNA comprises
an open reading frame of 2274 bp that codes for a protein of 757 amino acid with a theoretical
molecular mass of 80.9 kDa. To prove that we really isolated the full length cDNA of the antigen
recognized by mAB FB5, we used the transfection technique and subsequent FB5-staining of
endosialin-transfected and mock-transfected HeLa-S3 cells. The mock-transfected HeLa-S3 cells
grown in plastic chamber slides show no detectable binding of mAB FB5 in indirect
immunofluorescence tests. Human endosialin transfectants generated with an expression vector
containing full-length endosialin cDNA show a strong membrane staining and a staining of a
perinuclear compartiment similar to that of endogenous endosialin in LA1-5s and MF-SH cells.
To receive more information about the putative function of the protein we used the cDNA
sequence of endosialin for bioinformatic analysis. This identified endosialin as a typical
93
precursor sequence for a eukaryotic cell surface protein. The endosialin protein displays a
considerable number of disparate functional segments. First there is a N-terminal sequence of
about 20 amino acids that is similar to a signal leader peptide for the export of the protein to the
endoplasmatic reticulum. Next, there are two major segments, a more N-terminal globular
portion with five distinct domains comprising amino acids 30-360, and a more C-terminal
portion comprising amino acids 361-757, classified almost exclusively as low complexity region
by the SEG program. A more detailed analysis of domain structure in the N-terminal globular
portion is accomplished by comparison with hidden Markov models in libraries of described
sequence domains, such as PFAM and SMART, as well as sequence similarity searches in
databases with the BLAST and PSI-BLAST tools, that rely on the concept of a common
evolutionary ancestor among sequentially homologous sequences. By this approach, we found
statistically significant hits for a C-type lectin domain (residues 29-157, E<10-5 with PFAM) and
three EGF-like domains (residues 235-271, E<10-5 with PFAM; residues 274-311, E<10-2 with
SMART; residues 316-350, E<10 -3 with PFAM). ). In accordance with SMART assignments, the
latter two EGF repeats may be Ca++-binding. The region 176-230 is probably a Sushi/SCR/CCP
domain. Although the E-value in a PFAM search is only 0.72, the typical motifs in the Sushiseed alignment with the endosialin segment are well conserved, including all necessary cysteines
for disulfide bridges and a number of critical prolines, glycines and a tryptophane.
A more detailed analysis of the C-terminal, low complexity portion of endosialin,
covering amino acids 361-757, showed that the local amino acid composition is dominated by
the preferential occurrence or absence of certain residue types. In accordance with analyses of
known three-dimensional protein structures, there is little reason to expect such polypeptide
segments to assume stable tertiary structures with sterically predefined binding or catalytic
94
activity. It is not surprising that secondary structure tools predict almost exclusively coil
preferences for this region. Segment 363-378 is highly negatively charged, with 6 glutamate and
7 aspartate residues, and it may serve a non-specific role in facilitating a binding contact with a
charged ligand molecule. Using the software tools DAS and TOPPRED2, the existence of a
single hydrophobic transmembrane region (amino acids 686-706) can be detected with strong
significance; thus, endosialin appears to be a type I membrane protein. The extracellular region
spanning amino acids 391-660 is much richer than the database average in prolines (21.9 %),
threonines (9.3 %) and serines (9.3 %), but it contains surprisingly few charged residues (DEKR
total only 9.6 %), glycines (2.2 %), asparagines (1.1 %) and phenylalanines (1.5 %). There is no
truly sequentially similar protein sequence in the database. The small intracellular portion 707757 is compositionally rich in proline (11.8 %) but depleted of phenylalanine (none) and
hydrophobic residues in general (LVIFM total only 17.6 %). This sequence region is also unique
compared with other known protein sequences.
Although the prediction of O-glycosylation sites is not very reliable even with the most
advanced algorithms, we supplied the endosialin sequence to the NetOGlyc 2.0 server offered by
J.E. Hansen (http://www.cbs.dtu.dk/services/NetOGlyc/). This program predicts as probable Oglycosylation sites Thr-60 (in the C-type lectin domain) and a series of 33 serine and threonine
residues located in segment 400-668, which probably does not have a globular structure.
The N-terminal endosialin segment between amino acids 1 and 360 shares 39 % sequence
identity with the corresponding region in the precursor protein of human thrombomodulin (also
referred to as fetomodulin, CD141, or emb:CAA29045.1) and 33 % sequence identity with the
human complement receptor C1qRp (also known as lymphocyte antigen 68, antigen AA4, or
emb:CAC00597.1), respectively. The matching region encompasses the C-type lectin domain,
95
the putative sushi domain, and the three EGF-like repeats. Moreover, the positions of cysteine
residues critical for disulfide bridges are highly conserved among the three proteins, consistent
with a shared three-dimensional structure in this segment. Finally, the three proteins show a
conserved WIGL consensus motif, a feature found in several additional cell surface proteins that
modulate endocytosis.
In several human cell types, endosialin shows a high degree of O-glycosylation and sialic acid
content, and we have examined the glycosylation pattern of recombinant endosialin in transiently
transfected HeLa-S3 cells. When tested by immunoprecipitation with mAb FB5 immobilized to
CNBr-Sepharose, a 165-kDa protein is detected in these cells, but not in mock-transfected HeLaS3 cells. Pretreatment of matrix-bound antigen with O–glycosidase or sialidase led to a marked
reduction in the size of the endosialin band on SDS-gels, with a pattern identical to endogenous
endosialin in LA1-5s cells. Thus, sialidase treatment alone yields a 120-kDa protein species, and
combined treatment with sialidase and O-glycosidase generates the putative 95-kDa core protein.
No shift in the mobility of endosialin on SDS-gels was observed after PNGase F treatment,
consistent with the notion that minor, if any, N-linked sugar moieties are present at the single
Asn-X-Ser/Thr consensus site at position Asn-628. It is noteworthy that endogenous endosialin
in LA1-5s cells does not show the marked heterogeneity in glycosylation, revealed by broad
bands on SDS-gels, that is typical for a number of other glycoproteins with abundant Oglycosylation. The appearance of two closely spaced endosialin bands in the HeLa-S3
transfectants may be indicative of limited heterogeneity of O-glycosylation in this particular cell
type, since the two bands merge into a single band after deglycosylation.
96
Since O-sialoglycoprotein endopeptidase (OSGE) has been shown to cleave specifically highly
O-glycosylated mucin-like molecules, we examined whether endosialin is susceptible to this
enzyme. To this end, detergent extracts of metabolically labeled LA1-5s cells were purified with
mAb FB5 and treated with OSGE for 1 h at 37 oC prior to SDS-PAGE. We found that OSGE
completely degraded endosialin, whereas a control glycoprotein, ß1-integrin, was largely
insensitive to OSGE under these conditions, indicating that endosialin belongs to the family of
sialimucins.
With the knowledge about the endosialin cDNA sequence we were able to develop tools to
detect endosialin mRNA expression in various human cell lines (like the neuroblastoma cell line
LA1-5s or the sarcoma cell line MF-SH) and in different human tissues. Using several
endosialin-specific 32P-labelled cDNA probes we were able to detect in Northern Blot analysis
only one single transcript of about 2600 bp in the endosialin expressing cell lines. This is
consistent with the identified cDNA sequence and indicates that there are no endosialin mRNA
variants detectable which result from differential splicing of the pre-mRNA. Repeating this
experiment with mRNA from different human tissues we detected the endosialin-mRNA of
about 2600 bp in various tested tissues with variable intensity. The highest endosialin mRNA
expression was detected in placenta, heart and fetal tissues, like fetal lung or kidney. The
differences between the endosialin mRNA expression and protein expression as detected with
mAb FB5 might be due to different sensitivities of the two methods, even because the detected
endosialin mRNA signal is in some cases extremely weak compared to that obtained with a
probe against human ubiquitin. The publication by St.Croix et al., 2000 confirms previous
observed expression pattern with mAb FB5 (see below). Therefore it is conceivable that the
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endosialin mRNA detected in the Northern blot analysis of a panel of human tissues (MTN,
Clontech) might be particularly due to a pathogenic origin of the tissue specimen used for
mRNA isolation.
To further charactarise the endosialin expression in embryonic tissues we succesfully isolated the
mouse homolog of endosialin. To this end, we used primary mouse embryonic fibroblasts to
amplify the mouse homolog with primer pairs matching the human endosialin sequence. At an
annealing temperature of 60°C we succesfully amplified the cDNA of a potential candidate of a
mouse endosialin homolog. The isolated cDNA codes for a protein of 765 amino acids with a
theoretical molecular weight of 81.8 kDa. The protein shows an overall identity to human
endosialin of 77.4 % on amino acid level and an over 90 % homology in the globular part (the Ctype lectin domain, the sushi domain and the three EGF-repeats), the transmembrane region and
the cytoplasmic tail. The identity in the mucin-like domain is with 51 % relatively low. The
protein consists of the same domain structure than the human counterpart and is therefore the
potential endosialin mouse homolog. The mouse endosialin was transiently expressed as a HAtagged version in HeLa-S3 cells, which was detectable in a immunocytochemical analysis with a
monoclonal anti-HA antibody.
An additional tool to study endosialin function was provided by the construction of a fusion
protein composed of the globular part of human endosialin and the FC region of human IgG1
(amino acid 104-330 of the human IgG1 heavy chain). An expression vector containing the
cDNA coding for the endosialin-hIgG1 fusion protein was transfected in 293 cells and after
selection with 200 µg/µl G418, supernatants of selected cell clones were tested in an ELISA for
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their expression of the endosialin-hIgG1-fusion protein. All tested clones produced the fusion
protein with a specific expression of more than 1 µg per ml per week. This fusion protein will be
used in future experiments as an antibody to precipitate endosialin interaction partners.
This work reveals the identification of the human endosialin cDNA, a tumor endothelium
specific antigen recognized by mAb FB5. Furthermore this work provides tools for further
functional characterization of the endosialin protein by the isolation of the cDNA of the
endosialin mouse homolog and by the construction and expression of endosialin–hIgG1 fusion
proteins. First hints about the endosialin function might be the homology to thrombomodulin and
C1qR and the domain structure of the endosialin protein.
During the preparation of this work the group of Kinzler and Vogelstein used a SAGE- approach
(serial analysis of gene expression) to compare the mRNAs expressed in colon tumor
endothelium versus normal colon endothelium (St.Croix et al, 2000). In this approach they
identified 46 transcripts that were more than 10-fold up-regulated in tumor endothelium. The
most consistently upregulated gene of tumor vessels in this study was a homolog to
thrombomodulin named TEM1 (tumor endothelial marker 1). In this work we show that
endosialin is identical to TEM1. Kinzler and Vogelstein confirmed their results by 'in situ'
hybridization experiments that proved the specific expression of endosialin/TEM1 in tumor
endothelial cells. Additional expression of endosialin outside of tumors was not only detected by
mAb FB5 on normal cultured fibroblasts, it is also readily found in stromal fibroblasts of the
endometrium and in the juxtaglomerular apparatus, a highly specialized structure at the vascular
pole of the kidney glomerulus. Thus the use of the endosialin antigen to design anti-cancer
therapies may be limited.
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Danksagung
Herrn Dr. Lenter möchte ich ganz besonders danken für die hevorragende Betreuung während
der gesamten Doktorarbeit, für die Unterstützung bei der Erstellung dieser Arbeit, sowie für die
unfangreiche Mühe und Arbeit beim Zustandekommen von Christian et al., 2000.
Herrn Prof. Dr. Pfizenmaier gilt mein Dank für die Übernahme der Betreuung an der Universität
Stuttgart, sowie Herrn Prof. Dr. Scheurich für die Übernahme der Aufgabe des Mitberichters.
Mein ganz besonderer Dank gilt Hans-Peter Rodi, der durch seine ausgezeichneten
labortechnischen Fähigkeiten zum Gelingen dieser Arbeit beigetragen hat.
Dr. Ahorn danke ich für die Analyse und Sequenzierung des aufgereinigten Proteins.
Dr. Eisenhaber und Dr. Köhler möchte ich dafür danken, daß sie duch ihre umfangreichen
bioinformatischen Analysen zum Fortkommen des Projekts beigetragen haben.
Dr. Park danke ich für die Hilfe in allen wissenschaftlichen Fragen, sowie beim elektronischen
Einreichen der Veröffentlichung Christian et al, 2000.
Dr. Rettig und Dr. Garin-Chesa möchte ich für die Unterstützung während der Doktorarbeit
danken, sowie für die Überlassung der immunhistologischen Bilder.
Meinen Laborkolleginnen Claudia Eiberle, Petra Lahm, Christine Pischzan, Alexandra Schlegel
und Gerda Weber für die Hilfsbereitschaft im Laboralltag, sowie für die freundliche Aufnahme
in Biberach.
Allen Mitarbeitern und Mitarbeiterinnen der Abteilung Onkologische Forschung danke ich für
die gute Atmosphäre während den letzten drei Jahren.
Meinen Eltern möchte ich danken, daß sie mir das Studium ermöglicht haben und durch ihre
Unterstützung maßgeblich am Gelingen der Doktorarbeit beteiligt waren.
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Lebenslauf
Persönliche Angaben
Name:
Sven Christian
geboren am:
29.01.1973
geboren in:
Neheim-Hüsten
Staatsangehörigkeit: deutsch
Familienstand:
ledig
Adresse:
Freiherr-von-Schadstr.17, 88447 Warthausen
Schulbildung
1979-1983
Rodentelgen Grundschule / Arnsberg-Bruchhausen
1983-1992
Franz-Stock Gymnasium / Arnsberg-Neheim
Studium
1992-1997
Diplomstudiengang Biologie an der Rheinischen Friedrich-Wilhelm
Universität Bonn
Diplom
Hauptfach: Genetik, Nebenfächer: Cytologie und Physik
Diplomarbeit
1997-1998
Prof. Scheidtmann, Institut für Genetik, Rheinische Friedrich-Wilhelm
Universität Bonn
Promotion
seit 1998
Onkologische Abteilung, Boehringer Ingelheim Pharma KG, Biberach bei
Dr. Lenter mit Betreuung durch Prof. Pfizenmaier am Institut für
Zellbiologie und Immunologie, Universität Stuttgart.
Sven Christian