Untersuchungen der Mechanismen der RSV
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Untersuchungen der Mechanismen der RSV-induzierten Th2-Zelldifferenzierung in kokultivierten dendritischen Zellen und allogenen naiven T-Zellen Dissertation zur Erlangung des Grades eines Doktors der Naturwissenschaften der Fakultät für Chemie der Ruhr-Universität Bochum vorgelegt von Özlem Türkel aus Bochum Bochum, Dezember 2000 Diese Arbeit wurde von Mai 1998 bis August 2000 an den Abteilungen für Immunolgie des Universitätsklinikums St. Josef-Hospital Bochum (Leiter der Immunologie: Priv.-Doz. Dr. med. U. Schauer) und der Medizinischen Mikrobiologie und Virologie der Ruhr-Universität Bochum (Leiter: Prof. Dr. med. H. Werchau) angefertigt. eingereicht am: 1. 12. 2000 Tag der Disputation: 2.02.2001 Prüfungskommission: Prof. Dr. Wöll (Prüfungsvorsitz) Prof. Dr. Werchau (Referent) Prof. Dr. Hovemann (Korreferent) Prof. Dr. Wöll (Prüfer) Danksagung Herrn Prof. Dr. Werchau und Herrn Priv.-Doz. Dr. Schauer danke ich für die Überlassung des interessanten Themas, die Betreuung meiner Doktorarbeit und die Bereitstellung eines Arbeitsplatzes. Herrn Priv.-Doz. Dr. Schauer danke ich ganz besonders für seine anregenden Gespräche und hilfreichen Diskussionen in immunologischen Fragen. Für die praktische Betreuung danke ich den Mitarbeitern des immunologischen Labors der Kinderklinik und des virologischen Labors der Ruhr-Universität. Mein besonderer Dank gilt auch allen freiwilligen Blutspendern. Und ich danke meinem Freund Nils für seine Geduld und die seelische Unterstützung. Abkürzungsverzeichnis Abb. Abbildung AEC 3-amino-9-ethylcarbazol AK Antikörper APS Ammoniumperoxodisulfat ATCC American Type Culture Collection ATP Adenosintriphosphat BCIP 5-Bromo-4-Chloro-Idolylphosphat bp Basenpaare CBMC cord blood mononuclear cells CD cluster of differentiation CSF stem cell factor DC dendritic cells dS Doppelstrang DTT Dithiothreitol EDTA Ethylendiamintetraessigsäure FACS fluorescence-activated cell sorting FKS fötales Kälberserum FITC Fluorisothiocyanat GAS gamma activating sequence GM-CSF granulocyte-macrophage colony stimulating factor h Stunde Hep-2 human epithelial cell Hepes 2-(N-Hydroxyethylpiperazin)-2´-Ethansulfonsäure HLA human leucocyte antigen IFN Interferon Ig Immunglobulin IL Interleukin ISRE interpheron-stimulated response element JAK Janus-Kinase LPS Lipopolysaccharid mA Milliampere M-CSF macrophage colony stimulating factor MHC major histocompatibility complex mCi Millicurie MFI mittlere Fluoreszenzintensität min Minute MOI multiplicity of infection NCBI national center for biotechnology information NBT Nitroblau, Tetrazoliumsalz NFAT nuclear factor of transcription NK natural killer nm Nanometer PBMC periphere blood mononuclear cells pfu plaque forming units PMA Phorbol-12-myristat-13-acetat PSN Penicillin-Streptomycin-Neomycin RSV Respiratory Syncytial Virus RT Raumtemperatur SDS Natriumdodekylsulfat STAT signal transducer and activator of transcription TEMED N,N,N´, N´-Tetramethylendiamin TGF transforming growth factor Th T-Helferzelle TNF tumor necrosis factor Inhaltsverzeichnis 1. Einleitung 1 1.1 Die Bedeutung von RSV-Infektionen im Säuglingsund Kleinkindesalter 1 1.2 Das Th1/Th2-Paradigma 2 1.3 Dendritische Zellen als Mediatoren der Immunantwort 5 1.4 Transkriptionsfaktoren der Th2-vermittelten Immunantwort 6 1.5 Die Regulation des IL-4-Gens 9 1.6 Fragestellung 11 2. Material und Methoden 12 2.1 Material 12 2.1.1 Geräte 12 2.1.2 Chemikalien 2.1.3 Kits 13 2.1.4 Antikörper 13 2.1.4.1 Antikörper für Western-Blot-Analysen 13 2.1.4.2 Antikörper für durchflußzytomterische Messungen 14 2.1.4.3 Mikrobeads 14 2.1.5 Oligonukleotide 14 2.1.6. Primerpaare für die RT-PCR 16 2.1.7 Puffer, Lösungen und Medien 17 2.1.8 Virusstamm 17 2.1.9 RSV-spezifische Antikörper 17 2.1.10 Sekundäre Antikörper 18 2.2 Methoden 19 2.2.1 Methoden der Wirtszell- und Viruskultivierung 19 2.2.1.1 Zellzucht 19 2.2.1.2 Viruskultivierung 19 2.2.1.3 Bestimmung des Virustiters 19 2.2.2 Anzucht von dendritischen Zellen aus Nabelschnurblut 2.2.2.1 Isolierung von CBMCs über Ficoll-Gradienten 20 20 2.2.2.2 Sortierung von Stammzellen 21 2.2.2.3 Anzucht der dendritischen Zellen 21 2.2.3 Sortierung von dendritischen Zellen nach CD1a- und CD14negativen Zellen 2.2.4 Isolierung von naiven T-Zellen 21 22 2.2.5 Kokultivierung von stimulierten dendritischen Zellen und allogenen naiven T-Zellen 22 2.2.6 Molekularbiologische Methoden 23 2.2.6.1 RT-PCR 23 2.2.6.1.1 Isolierung von RNA 23 2.2.6.1.2 Polymerase-Kettenreaktion 23 2.2.6.1.3 Elektrophorese von DNA in Agarosegelen 25 2.2.7 Darstellung von Proteinen durch Western-Blot 25 2.2.7.1 Isolierung von Kern- und zytoplasmatischen Proteinen 25 2.2.7.2 SDS-Polyacrylamidgelelektrophorese 26 2.2.7.3 Western Blot 27 2.2.7.4 Ponceau-Rot-Färbung 27 2.2.7.5 Immundetektion der transferierten Proteine 28 2.2.8 Gel-Shift-Assay 28 2.2.8.1 Radioaktive Phosphorylierung von Oligonukleotiden 28 2.2.8.2 DNA-Bindungsreaktion 29 2.2.8.3 Elektrophorese der DNA-Protein-Komplexe 29 2.2.9 Zellphysiologische Methoden 30 2.2.9.1 Messung der Proliferation von T-Zellen in vitro 30 2.2.9.2 Messung der Apoptose von T-Zellen in vitro 30 2.2.9.3 Messung der Phagozytoseaktivität 31 2.2.10 Fluoreszenzmikroskopie 31 2.2.10.1 Herstellung der Präparate 31 2.2.10.2 Färben der Präparate 31 2.2.11 Intrazelluläre Zytokinmessung im Durchflußzytometer 32 3. Ergebnisse 33 3.1 Charakterisierung der dendritischen Zellen 33 3.1.1 Einteilung in Subpopulationen anhand von spezifischen Oberflächenmarkern 33 3.1.2 Phagozytose 34 3.1.3 Nachweis der Infektion von dendritischen Zellen mit RSV 36 3.1.3.1 Nachweis der Infektion in der Gesamtkultur 36 3.1.3.2 Nachweis der Infektion in den einzelnen Subpopulationen 37 3.1.4 Expression von kostimulatorischen Oberflächenantigenen und Ausreifungsmarkern nach RSV-Infektion 40 3.1.5 Apoptosemessung von infizierten dendritischen Zellen 44 3.1.6 Zytokine in dendritischen Zellen 45 3.1.6.1 PCR-Analysen 45 3.1.6.2 Ergebnisse aus der Durchflußzytometrie 47 3.2 Kokulturen von dendritischen Zellen und naiven T-Zellen 48 3.2.1 Etablierung eines humanen in-vitro-Modells 48 3.2.2 Zytokinproduktion in T-Zellen nach RSV-Infektion 50 3.2.3 Induktion von IFN-γ 52 3.2.4 Induktion von IFN-γ mit PMA und Ionomycin 53 3.2.5 Proliferation und Apoptose von T-Zellen 54 3.2.6 Nachweis von Zytokinen und Zytokinrezeptoren in Kokulturen mittels PCR 57 3.2.7 Untersuchung von Transkriptionsfaktoren 61 3.2.8 Aktivität von STAT-Proteinen 64 4. Diskussion 66 4.1. Zelluläre Immunologie der RSV-Infektion 66 4.2 Modulation der Signaltransduktionswege durch RSV 72 5. Zusammenfassung 76 6. Literatur 77 7. Anhang Einleitung ____________________________________________________________________________ 1. Einleitung 1.1 Die Bedeutung von RSV-Infektionen im Säuglings- und Kleinkindesalter Infektionen mit dem Respiratory Syncytial Virus (RSV) stellen in den Industrienationen die Hauptursache für Erkrankungen des unteren Respirationstraktes bei Kleinkindern und Säuglingen dar (Kimman, 1990). RSV hinterläßt eine unzureichende Immunität und häufige Reinfektionen in den ersten Lebensmonaten des Neugeborenen sind trotz hoher Menge maternaler Antikörper nicht unüblich (Beem, 1969), (Henderson, 1979), (Hall, 1991). In klinischen Studien wurde der Zusammenhang von viralen Infektionen, Bronchiolitis und Asthma diskutiert. Insbesondere Infektionen mit RSV stehen im Verdacht, über die Erkrankung einer schweren Bronchiolitis in frühester Kindheit die Entstehung von Asthma zu begünstigen (Kimpen, 2000), (Sly, 1989), (Sigurs, 1995). In der Studie von Sigurs und Mitarbeitern wurden Kinder mit einer durch RSV verursachten Bronchiolitis bei einem Durchschnittsalter von 3,5 Monaten untersucht. 23% dieser Kinder entwickelten in einem Alter von 3 Jahren Asthma, verglichen mit 1% der Kinder aus der Kontrollgruppe. Zu diesem Zeitpunkt wurden auch bei 32% der Kinder IgE-Antikörper im Serum gemessen, hingegen nur 9% bei der Gruppe der Kontrollkinder. Tierexperimente unterstützen die Hypothese, daß ein kausaler Zusammenhang zwischen viraler Bronchiolitis und Asthma existiert. RSV-infizierte Meerschweinchen reagieren mit höherer Empfindlichkeit auf Histamine bis zu sechs Wochen nach Infektion, assoziiert mit einer Persistenz des Virus in der Lunge (Robinson, 1997). Im Mausmodell wurde gefunden, daß RSV eine verstärkte T-Zellantwort induziert und diese assoziiert ist mit dem Schweregrad der Erkrankung (Openshaw, 1995). Schwarze und Mitarbeiter konnten im Mausmodell zeigen, daß durch eine RSV-Infektion der Einfluß von inhalierten Antigenen wie Ovalbumin verstärkt wird und somit zu Atemwegsentzündungen und Atopie führt (Schwarze, 1999). Die Signifikanz des RSV bei der Entwicklung oder Exazerbation von atopischem Asthma wurde über die klinischen Studien und Tierversuchsmodelle erkannt, jedoch sind genauere Zusammenhänge und Mechanismen nicht untersucht, da ein humanes Modell für die Untersuchungen der Entwicklung des unreifen Immunsystems des Säuglings fehlt. 1 Einleitung ____________________________________________________________________________ 1.2 Das Th1/Th2-Paradigma Das Immunsystem hält unterschiedliche Strategien bereit, um gegen eingedrungene Erreger und ihre Vermehrung im befallenen Organismus vorzugehen. Dabei handelt es sich um die zelluläre und die humorale Immunantwort. Welche Immunantwort induziert wird, hängt vom Repertoire der Zytokine ab, die von vielen beteiligten Zellen, wie vor allem der CD4+-THelferzellen, produziert und sezerniert werden (O'Garra, 1998). Dabei wirken freigesetzte Zytokine auch als autokrine Wachstums- und Differenzierungsfaktoren. Als Konsequenz daraus proliferieren naive T-Zellen und differenzieren zu Effektor-Zellen. CD4+-T-Zellen lassen sich in unterschiedliche Subtypen unterteilen. Typ1-Zellen (Th1Zellen) , die IL-2, IFN-γ und TNF-α produzieren, unterstützen die zelluläre Immunantwort zur Bekämpfung von intrazellulären Pathogenen wie Viren, Bakterien, Pilzen und Protozoen, und Typ 2-Zellen , die IL-4, IL-5, IL-6, IL-10 und IL-13 sezernieren, induzieren eher eine humorale Immunität zur Verteidigung gegen extrazelluläre Pathogene. Aus der Gruppe der Typ 2-Zytokine spielt das IL-4 eine zentrale und entscheidende Rolle (Choi, 1998). Das humane IL-4 ist ein 18-20 kD-Glykoprotein aus 153 Aminosäuren, das neben T-Zellen auch von Basophilen und Mastzellen produziert wird (Brown, 1997). Während IL-12, das von antigenpräsentierenden Zellen wie dendritischen Zellen als Antwort auf bestimmte Pathogene freigesetzt wird, die Th1-Immunantwort fördert, induziert IL-4 als Gegenspieler die Differenzierung der T-Zellen in Richtung Th2. Dabei bewirkt es die Suppression der zellulären Immunantwort und eine Inhibierung der Synthese und Effekte von IFN-γ. IL-4 induziert ein Umschalten der Immunglobulinproduktion in B-Zellen von IgM nach IgE, das bei der Induzierung von allergischen Symptomen eine Schlüsselrolle spielt (Ryan, 1997). Es bindet an hochaffine IgE-Rezeptoren auf Mastzellen, basophilen Zellen und aktivierten eosinophilen Zellen, die wiederum Entzündungsreaktionen auslösen können. IL-4 verstärkt auch die Expression des IL-4-Rezeptors auf T-Zellen, so daß eine weitere Polarisierung der TZellen in Richtung einer Th2-Immunantwort stattfindet. Rezeptoren für Th1-induzierende Zytokine werden dabei herunterreguliert. 2 Einleitung ____________________________________________________________________________ Nach Aktivierung des IL-4-Rezeptorkomplexes durch IL-4 werden die beiden Proteine JAK1 und JAK2 aus der Familie der Januskinasen, die mit dem Rezeptor assoziiert sind, aktiviert (Briscoe, 1996). Anschließend wird u.a. STAT-6 phosphoryliert, das direkt über eine dafür spezifische DNA-Bindungsstelle auf IL-4-gesteuerte Gene wirkt (Curiel, 1997), (Kotanides, 1996). IFN-γ kann dieser Entwicklung entgegenwirken. Freigesetztes IFN-γ hat einerseits einen direkten antiviralen Effekt und andererseits einen indirekten, der sich durch die Aktivierung von NK-Zellen, Makrophagen und zytotoxischen CD8+-T-Zellen auswirkt. Diese Zellen spielen bei der Viruseliminierung eine entscheidende Rolle. Weiter reguliert IFN-γ die Th1/Th2-Balance, verstärkt die Antigenpräsentation und kontrolliert Proliferation und Apoptose (Boehm, 1997), (Billiau, 1996). IL-12 IL-18 IL-4 IL-11 TGF-β Th 0 IL-4 IL-10 Th1 Inhibitorische Gegenregulation Th2 IFN-γ Th1-Zytokine Th1- und Th2-Zytokine Th2-Zytokine IL-2 IFN-γ TNF-β zelluläre Immunität IL-3 IL-6 IL-4 IL-5 IL-10 IL-13 GM-CSF humorale Immunität Abb. A: Schema zum Modell der Th1/Th2-Differenzierung durch Einfluß von Zytokinen 3 Einleitung ____________________________________________________________________________ Naive T-Zellen besitzen auf ihren Oberflächen noch keine Rezeptoren für Zytokine. Im Laufe der Ausreifung und Differenzierung bilden sich Rezeptoren für diejenigen Zytokine aus, die Einfluß auf die weitere Entwicklung und Polarisierung der T-Zellen haben. Da IL-12 ein wichtiges Zytokin zur Induzierung und Ausprägung von Th1-Zellen ist (McDyer, 1998), findet man auf diesen Zellen vermehrt den IL-12-Rezeptor. Die β2-Untereinheit des heterodimeren IL-12-Rezeptors ist für die Regulation der Immunantwort durch IL-12 verantwortlich und befindet sich vorwiegend auf Th1-Zellen, so daß von dendritischen oder anderen Zellen freigesetztes IL-12 dort wirken und die IFN-γ-Synthese induzieren kann (Sinigaglia, 1999). Auf differenzierten Th2-Zellen wird IL-12-R β2 hingegen herunterreguliert. Ähnlich verhält es sich mit dem heterodimeren IFN-γ-Rezeptor, dessen regulatorische Untereinheit R2 (oder auch β2) auf Th1-Zellen zu finden ist und auf Th2Zellen herunterreguliert wird (Tau, 1999). Wie zu Anfang erläutert, hängt eine RSV-Infektion in frühester Kindheit mit der Entstehung von allergischen Reaktionen und Asthma zu späteren Zeitpunkten zusammen. Dieses wird vor allem der oben beschriebenen Th2-Immunreaktion zugeschrieben. Im Vergleich zu anderen Viren findet man bei RSV-Infektionen recht niedrige Mengen an IFN-γ (Chonmaitree, 1981). Eine zelluläre zytotoxische Immunantwort wurde demzufolge seltener gefunden (Isaacs, 1987), stattdessen treten erhöhte IgE-Spiegel vor allem bei Kindern mit atopischer genetischer Predisposition auf (Roman, 1997). Für das Immunsystem des Neugeborenen bedeutet dieses eine Th1/Th2-Imbalance, die schon früh zu allergiefördernden Th2-polarisierten Memory-TZellen führt. Eine prädominante Th2-Immunantwort wurde in neuesten Studien mit RSVinfizierten Kindern detektiert. Dabei fand man bei durchflußzytometrischen Messungen erhöhte IL-4-produzierende T-Zellen im Vergleich zu gesunden Kontrollkindern (Bendelja, 2000). Hochpolarisierte Th2-Zellen mit der Produktion von nicht nur IL-4, sondern auch IL-5 und IL-13, aber ohne gleichzeitige Synthese von IFN-γ, begünstigen somit atopische Allergien gegen harmlose Proteine. IL-5 fördert die Ausreifung, Rekrutierung und Aktivierung von Eosinophilen, die lokale Gewebsschädigungen hervorrufen. Bei in-vitro-Versuchen mit mononukleären Zellen aus humanen Spendern, die RSV-infiziert wurden, fand man eine Erhöhung der IL-5-produzierenden T-Zellen (Thurau, 1998). 4 Einleitung ____________________________________________________________________________ Jedoch war hier kein direkter Zusammenhang von RSV-Infektion der T-Zelle und IL-5Produktion zu erkennen, denn IL-5-produzierende T-Zellen waren nicht RSV-infiziert. Es wird deshalb davon ausgegangen, daß andere Zellen, wie die antigenpräsentierenden Zellen, die Aktivierung und Prägung der T-Zellen vermittelt haben. 1.3 Dendritische Zellen als Mediatoren der Immunantwort T-Zellen werden erst durch antigenpräsentierende Zellen aktiviert (Rescigno, 1997). Bei Virusinfektionen spielt antigenpräsentierende vor Zelle allem neben die B-Zellen dendritische und Zelle Makrophagen als die professionelle Hauprolle. Die dendritische Zelle (DC) wurde erstmals 1868 in der Epidermis identifiziert und nach ihrem Entdecker als Langerhans-Zelle benannt. Fast hundert Jahre später wurden dendritische Zellen auch in anderen Geweben entdeckt und als wichtige Zellen des Immunsystems erkannt (Steinman, 1973). Dendritische Zellen sind in den meisten Geweben und Organen wie Lunge und Haut vorhanden und liegen als unreife Zellen vor, die noch nicht fähig sind, T-Zellen zu stimulieren (Steinman, 1991). Erst nach Antigenaufnahme oder Stimulation durch das umliegende Zytokinmilieu des jeweiligen infizierten Gewebes oder Organs reifen sie aus und sind in der Lage, T-Zellen zur Aktivierung und Proliferation anzuregen, wobei eine einzige dendritische Zelle hunderte von naiven T-Zellen stimulieren kann. Dieses geschieht in den TZell-Regionen der Lymphknoten, wohin die dendritischen Zellen über das afferente Lymphsystem nach Stimulation als interdigitierende dendritische Zellen wandern. Reife dendritische Zellen unterscheiden sich von unreifen durch spezifische Oberflächenmoleküle, die u.a. als akzessorische Moleküle für die T-Zell-Aktivierung notwendig sind (Cella, 1997). Dazu gehören u.a. das CD80 und CD86, die zum B7-Komplex gehören und mit CD28 auf den T-Zellen interagieren. Wichtig für die T-Zellstimulierung ist die Präsentation von Antigenen auf MHC I- und MHC II-Molekülen, über die die Erkennung durch den spezifischen T-Zellrezeptor verläuft. Deshalb exprimieren stimulierte und ausgereifte dendritische Zellen vermehrt diese Moleküle auf ihren Oberflächen. 5 Einleitung ____________________________________________________________________________ Weitere Oberflächenmoleküle, die hochreguliert werden, sind das CD83, ein spezifischer Marker für reife dendritische Zellen (Zhou, 1995), CD1a, das strukturelle Ähnlichkeiten zu MHC-Proteinen hat und ebenfalls antigenpräsentierende Funktion, und CD40, das mit dem CD40-Liganden auf T-Zellen interagiert und die IL-12-Synthese, wichtig für eine Th1Immunantwort, in den dendritischen Zellen induzieren kann. Reife dendritische Zellen exprimieren auch die Oberflächenmarker CD54 (ICAM I) und CD123 (IL-3-Rezeptor) vermehrt, andere Moleküle wie das CD 115 (M-CSF-Rezeptor), der vorwiegend auf Monozyten und Makrophagen zu finden ist, werden herunterreguliert (Bell, 1999). Weiter lassen sich reife dendritische Zellen über ihre Phagozytoseaktivität, die nach Antigenaufnahme abnimmt, charakterisieren (Banchereau, 1998). 1.4 Transkriptionsfaktoren der Th2-vermittelten Immunantwort Mehrere Familien von Transkriptionsfaktoren wurden identifiziert, die wichtige Regulatoren für die Ausbildung von Th1- oder Th2-Zellen sind. Dabei nehmen zwei Mitglieder der STATProteine ( Signal Transducers and Activators of Transcription) entgegengesetzte Rollen bei der Immunantwort ein. STAT-6 wird für eine IL-4-übermittelte Th2-Differenzierung benötigt (Takeda, 1996) und STAT-4 für eine IL-12-übermittelte Th1-Differenzierung von T-Zellen (Thierfelder, 1996). STAT-Proteine haben strukturelle Ähnlichkeiten in ihren SH2- und SH3Bindungsdomänen (Darnell, Wechselwirkungen 1994). angeschaltet Bevor wird, die liegen Signalkaskade die über STAT-Proteine im Zytokin-RezeptorZytoplasma in hypophosphorylierter inaktiver Form vor. Nach Aktivierung der Signalkaskade werden sie durch Janus-Kinasen (Jaks) phosphoryliert (Leonard, 1998) und dimerisieren über ihre SH2Bindungsdomänen. Danach werden die jeweiligen Homo- oder Heterodimere in den Zellkern transportiert, wo sie an Gene binden, die die GAS-Sequenz beinhalten (Gamma-Activated Sequence) und diese somit aktivieren. Die Phosphorylierung und Aktivierung von STAT-4 erfolgt über IL-12, das von dendritischen Zellen und Makrophagen produziert und sezerniert wird, und die Differenzierung von Th1-Zellen fördert. STAT-4-defiziente Mäuse zeigen Defekte bei der IFN-γ-Produktion, T-Zellproliferation und NK-Zellfunktion (Kaplan, 1996, Nature, 382:174-77). 6 Einleitung ____________________________________________________________________________ STAT-6 hingegen wird über die Bindung des IL-4-Rezeptors von Jak1 und Jak2 phosphoryliert und aktiviert IL-4-regulierte Gene wie IgE, IL-4-Rezeptor, Fc-Rezeptor und MHC Klasse II, die alle GAS-Sequenzen beinhalten (Patel, 1998). Naive, STAT-6-defiziente T-Zellen differenzieren nicht in Th2-Zellen aus, wenn sie in vitro mit IL-4 oder IL-13 stimuliert werden, was die Bedeutung von STAT-6 für die Th2-Immunantwort demonstriert (Kaplan, 1996). Das Zinkfingerprotein GATA-3 spielt eine wichtige Rolle bei der Entwicklung von Th2Zellen. Dieser Transkriptionsfaktor aus der Familie der GATA-Proteine mit insgesamt sechs Mitgliedern ist ein bedeutender Faktor der frühen T-Zell-Entwicklung. Es reguliert zum einen die Expression von Th2-Zytokinen und zum anderen die Differenzierung von naiven T-Zellen zu Th2-Zellen (Lee, 2000), (Ferber, 1999). Naive CD4+-Zellen exprimieren geringe Mengen an GATA-3-mRNA (Ouyang, 1998). In T-Zellen, die sich in Richtung Th2 entwickeln wird jedoch GATA-3 aufreguliert, während es bei Th1-Zellen herunterreguliert wird. In Experimenten mit transfizierten Zellen wurde gezeigt, daß GATA-3-Überexpression in Th1Zellen nicht die IFN-γ-Genexpression inhibiert (Ouyang, 1998), sondern indirekt durch die Aktivierung von Th2-spezifischen Genen die Th1/Th2-Balance beeinflußt. Direkte Verknüpfungen von GATA-3-Expression und Asthma wurden ebenfalls hergestellt. Ein signifikanter Anstieg der GATA-3-Expression ist bei Personen mit Asthma im Vergleich zu gesunden Kontrollen gemessen worden (Nakamura, 1999). Aus der NFAT-Familie (Nuclear Factor of Activated T cells), die als Aktivatoren sämtlicher Gene von Zytokinen fungieren, gehen speziell die beiden Faktoren NFAT-c1 (auch NFAT-c oder NFAT-2) und NFAT-c2 (auch NFAT-p oder NFAT-1) mit in die Transkription von IL-4 und die Entwicklung von Th2-Zellen ein (Rao, 1997), (Cron, 1999). Dabei kann NFAT-c2 auch inhibierend auf die IL-4-Produktion zu späteren Zeitpunkten der Immunantwort wirken. Somit entscheidet die Menge an NFAT-c2, das auch in Th1-Zellen exprimiert wird, die weitere Differenzierung und Zytokinproduktion der T-Zelle (Wierenga, 1999). 7 Einleitung ____________________________________________________________________________ Zuletzt ist noch der Faktor c-Maf aus der Familie der b-ZIP-Proteine (basic region leucine zipper), zu erwähnen, der in frühen Phasen der IL-4-Produktion und Th2-Zelldifferenzierung auftaucht. Es transaktiviviert als Homo- oder Heterodimer mit NFAT-c2 den IL-4-Promotor. C-Maf fördert nicht nur die Entstehung von Th2-Zellen, sondern beeinflußt die Th1Zelldifferenzierung durch IL-4-unabhängige Mechanismen (Ho, 1998). STAT-4 Th1Zelle Naive T-Zelle STAT-6 GATA-3 NFAT c-Maf Th2Zelle Abb. B: Übersicht der wichtigsten Transkriptionsfaktoren der Th1- bzw. Th2-T-Zelldifferenzierung 8 Einleitung ____________________________________________________________________________ 1.5 Die Regulation des IL-4-Gens Die Regulation der Transkription des IL-4-Gens ist noch nicht vollständig geklärt, jedoch haben Daten aus Untersuchungen in Mäusen im Vergleich zu humanen Genen gezeigt, daß neben anderen wichtigen Faktoren die oben erwähnten eine entscheidende Rolle dabei spielen. Es sind zwei intrazelluläre Wege der IL-4-induzierenden Signalkaskade bekannt, der Proteinkinase C-abhängige (PKC) Weg, der zur Synthese der AP-1-Proteine (Activator Protein) führt und der Calcium-abhängige, der die Calcineurin-vermittelte Dephosphorylierung und Translocation von NFAT-Proteinen in den Zellkern induziert (Wierenga, 2000). Der Promotor des humanen und murinen IL-4-Gens beinhaltet fünf Bindungselemente (P0 bis P4), an die NFAT-Proteine binden können. Das P0-Element befindet sich direkt oberhalb der Transkriptionsstartstelle und das P4-Element ungefähr –250 bp in der 5´-grenzenden Region (Szabo, 1993). Obwohl alle fünf Elemente an der Regulation des IL-4-Gens beteiligt sind, scheinen die Elemente P0 und P4 die positiven Hauptregulatoren zu sein (Abe, 1992). Wie P2 und P3 werden P1 und P4 direkt von Sequenzen umgeben, die eine Affinität der Familie der AP-1-Proteine haben, so daß kooperative Bindungen mit NFAT-Proteinen möglich sind (Rao, 1994). Bei der Th2-spezifischen IL-4-Genkontrolle spielen zusätzliche Faktoren eine Rolle. Das oben erwähnte c-Maf besitzt eine Teilbindungsstelle, die als MARE bezeichnet wird und sich unterhalb der P0/NFAT-Stelle befindet. Wahrscheinlich transaktiviert c-Maf mit NFAT den als Minimal-Promotor bezeichneten P0/P1-Ort mit der Transkriptionsstartstelle (Ho, 1996). Bekannt ist auch, daß an dieser Stelle zusätzliche Faktoren wie JunB, das an die als OAP 40 bezeichnete Stelle bindet, die Wirkung von c-Maf erst ermöglichen (Ho, 1998). Neben AP-1 binden eine Reihe von weiteren Proteinen an die P4-Region. Fos und c-Jun mit NFAT ermöglichen die benachbarte Bindung von C/EBP-Proteinen, die ebenfalls an der Regulation der IL-4-Synthese in T-Zellen beteiligt sind (Li-Weber, 1997). 9 Einleitung ____________________________________________________________________________ Der IL-4-Promotor weist zwei mögliche Bindungstellen für GATA-3 auf, das,wie oben erwähnt, spezifisch bei Th2-Zellen zu finden ist (Rooney, 1995). Jedoch ist noch nicht vollständig geklärt, wie die Wirkungsmechanismen dieses Transkriptionsfaktors bei der IL-4Regulation sind (Ranganath, 1998). Abb. C: Schematische Darstellung des IL-4-Promotors mit Th2-spezifischen Transkriptionsfaktoren und ihren Bindungsstellen (Wierenga, 2000) 10 Einleitung ____________________________________________________________________________ 1.6 Fragestellung Daten aus klinischen Tierexperimenten lassen Studien einen mit RSV-erkrankten Zusammenhang von Kindern und RSV-induzierter Ergebnisse aus Th2-Immunantwort beim Neugeborenen und später auftretenden atopischen Erkrankungen vermuten. Jedoch existierte kein humanes in-vitro-Modell der T-Zellausreifung durch dendritische Zellen beim Neugeborenen, dessen Immunsystem sich durch unreife im Vergleich zum ausgereiften Immunsystem des Erwachsenen auszeichnet. Aus diesem Grund sollte zunächst ein solches Modell entwickelt werden, an dem vor allem die Auswirkungen einer RSV-Infektion auf das entstehende Zytokinmuster untersucht werden konnten. Daraus ergab sich die Frage, ob dendritische Zellen mit RSV infizierbar sind und wie sich die Infektion auf Ausreifung und Funktion dieser Zellen auswirkt. Die Anzucht von dendritischen Zellen aus Stammzellen wurde bereits in unserem Labor etabliert, so daß zunächst eine Charakterisierung der Zellen über die Expression spezifischer Oberflächenmarker und Zytokine mit und ohne RSVInfektion im Vordergrund stand. Weiter ergab sich die Fragestellung, ob und auf welcher Ebene sich die Ausbildung einer Th2-Immunanwort in RSV-infizierten Kokulturen von dendritischen Zellen und naiven TZellen auswirkt. Durchflußzytometer Hierzu sollten neben intrazellulären Zytokinmessungen im auch in der PCR Zytokine und Zytokinrezeptoren auf T-Zellen untersucht und spezifische Transkriptionsfaktoren der Th2-Signalkaskade durch die WesternBlot-Technik analysiert werden. 11 Material und Methoden ____________________________________________________________________________ 2. Material und Methoden 2.1 Material 2.1.1 Geräte Durchflußzytometer FACScan, Becton Dickinson Magnetsortierungssysteme, Miltenyii Lambda 3 UV/VIS Spectrophotometer, Perkin Elmer UNO-Thermoblock, Biomtra Gel Dryer SGD 2000, Savant Slab Kühlzentrifugen Biofuge fresco bzw. Omnifuge 2.0 RS, Heraeus 2.1.2 Chemikalien Acrylamid Fluka Agarose Serva APS Biometra BCIP Sigma Borsäure Merck Bromphenolblau Serva Dextran-FITC Molecular Probes EDTA Sigma Ethanol Merck Ethidiumbromid GIBCO BRL Glycerin Merck Hepes Biochrom ß-Mercaptoethanol Sigma NBT Sigma Paraformaldehyd Riedel-de Haën Saponin Riedel-de Haën 12 Material und Methoden ____________________________________________________________________________ SDS Merck Tween 20 Sigma 2.1.3 Kits AnnexinV-Apoptose-Kit Immunotech AC133-Isolation Miltenyii CD45RA-Isolation Miltenyii Rneasy Mini Kit Qiagen Thermoscript RT-PCR Gibco Nuclei EZ Prep Nuclei Isolaion-Kit Sigma 2.1.4 Antikörper 2.1.4.1 Antikörper für Western-Blot-Analysen Alle primären Antikörper für die Western-Blot-Färbungen wurden über die Firma Santa Cruz bezogen. STAT-1 p84/p91 monoklonaler AK, Maus-IgG1 STAT-2 polyklonaler AK, Kaninchen-IgG c-Maf monoklonaler AK, Maus-IgG1 STAT-4 polyklonaler AK, Kaninchen-IgG STAT-5 monoklonaler AK, Maus-IgG1 STAT-6 monoklonaler AK, Maus-IgG1 NFATc1 monoklonaler AK, Maus-IgG1 NFATc2 monoklonaler AK, Maus-IgG2a GATA-3 monoklonaler AK, Maus-IgG1 Lamin A/C monoklonaler AK, Maus-IgM 13 Material und Methoden ____________________________________________________________________________ 2.1.4.2 Antikörper für durchflußzytometrische Messungen Die direkt Fluorochrom-gekoppelten Antikörper für die Oberflächenmarker wurden bei der Firma Pharmingen bezogen. Der Antikörper für IFN-γ-FITC stammt von der Firma Häusser, Basel (Klon 45/15) und wurde selbst mit dem Fluorochrom konjugiert. Tricolor-konjugierte Antikörper stammen von der Firma Medac. 2.1.4.3 Mikrobeads Alle Mikrobeads für magnetische Zellsortierungen stammen von der Firma Miltenyii. 2.1.5 Oligonukleotide Alle Oligonukleotide (dS) für die Gel-Shift-Assays wurden über die Firma Santa Cruz bezogen. GAS/ISRE 5´-AAG TAC TTT CAG TTT CAT ATT ACT CTA-3´ STAT4 5´-GAG CCT GAT TTC CCC GAA ATG ATG AGC-3´ STAT5/6 5´-GTA TTT CCC AGA AAA GGA AC-3´ 14 Material und Methoden ____________________________________________________________________________ 2.1.6. Primerpaare für die RT-PCR Die Primersequenzen wurden aus den kompletten mRNA-Sequenzen der NBCI-Datenbanken bestimmt und die Synthese bei den Firmen Sigma-Genosys oder GIBCO BRL in Auftrag gegeben. Primersequenzen von Rezeptoren: IL12-R-ß1 5` ATGGAGCCGCTGGTGACCTG 3` 3` TTGACAGCCTTCTGGAAGCT 3` IL12-R-ß2 5` ATGGCACATACTTTTAGAGG 3` 5` GCCTCACTATGTCCAAGAAT 3` IFN-γ-R1 5` AACTATGGTGTTAAGAATTC 3` 5` GACTTTTGAGTTGTAACACC 3` IFN-γ-R2 5` GTGCAGTTTAAATACACCGA 3` 5` TCAGGACCAGGAAGAAACAG 3` IFN-α,ß-R 5` CCGGTCCATCTTATCATGGG 3` 5` TTCCTGGCCAGGTGGAAGGA 3` IFN-α,ß,ω-R 5` TGATTACACAGATGAATCTT 3` 5` CTAAATAAACAGATACACAG 3` 15 Material und Methoden ____________________________________________________________________________ Primersequenzen von Cytokinen: IL-4 5` CTTCCCCCTCTGTTCTTCCT 3` 5` TTCCTGTCGAGCCGTTTCAG 3` IL-10 5` TTGTTGTTAAAGGAGTCCTT 3` 5` TTTCGTATCTTCATTGTCAT 3` IL-11 5` ACTGTGTTTGCCGCCTGGTC 3` 5` GGCCCAGTCAAGTGTCAGGT 3` IL-12 p35 5` CAGGAATGTTCCCATGCCTT 3` 5` TGTCAATAGTCACTGCCCGA 3` IL-12 p40 5` TGTCACCAGCAGTTGGTGAT 3` 5` CAGGTTTGATGATGTCCCTG 3` IL-18 5` AACTTTGTGGCAATGAAATT 3` 5` TTTAAAAAGGTCTCTCTCTT 3` IFN-γ 5` ATGTAAAAGAAGCAGAAAAC 3` 5` TTTTTCGCTTCCCTGTTTTA 3` TGF-ß1 5` GGTGGAAACCCACAACGAAA 3` 5` CGGGTTATGCTGGTTGTACA 3` sonstige Primersequenzen: ß2 -Mikroglobulin 5` CTATCCAGCGTACTCCAAAG 3` 5` AAGTCACATGGTTCACACGG 3` 16 Material und Methoden ____________________________________________________________________________ 2.1.7 Puffer, Lösungen und Medien AP-Färbepuffer 50 mM Tris-HCl pH 9,6 100 mM NaCl 50 mM MgCl2 Hanks´balanced salt solution (HBSS) als sterile Lösung von der Firma Biochrom bezogen PBS(-T) 10 mM NaH2 PO4 /Na2 HPO4 pH 7,4 150 mM NaCl (0,05% Tween 20) Trypsin/EDTA (0,5%/0,2%, w/v) als 10fach Konzentrat von der Firma Biochrom Saponinpuffer HBSS mit 0,01M Hepes und 0,1% Saponin TAE-Puffer 40 mM Tris 5 mM NaOAc 1 mM EDTA TBE-Puffer 90 mM Tris-HCl 90 mM Borsäure 1 mM EDTA TE-Puffer 1% (v/v) 1 M Tris-HCl pH 8,0 1 mM EDTA DNA-Auftragspuffer 0,25% (w/v) Bromphenolblau 0,25% (w/v) Xylencyanol FP 30% (v/v) Glycerin Ethidiumbromid-Stammlösung 5 mg/ml Ethidiumbromid 17 Material und Methoden ____________________________________________________________________________ Kulturmedium für dendritische Zellen VLE RPMI 1640 10% FKS 1% Penicillin (100 IU/ml) + Streptomycin (100 µg/ml) 200 mM N-Glutamin 100 mM Natriumpyruvat 1% Nichtessentielle Aminosäuren 2.1.8 Virusstamm Der hier in allen Versuchen verwendete RSV-Stamm ist der Long Strain von der ATCC. 2.1.9 RSV-spezifische Antikörper 3C4 (Maus-anti-P-Protein) monoklonaler AK Med. Mikrobiol. u. Virol., Bochum anti-RSV polyklonaler AK, Biodesign 2.1.10 Sekundäre Antikörper anti-Kaninchen-IgG-alkalische Phosphatase Sigma anti-Ziege-IgG-alkalische Phosphatase Sigma anti-Maus-IgG-alkalische Phosphatase Dako anti-Maus-IgG-Peroxidase Dako 18 Material und Methoden ____________________________________________________________________________ 2.2 Methoden 2.2.1 Methoden der Wirtszell- und Viruskultivierung 2.2.1.1 Zellzucht Die Wirtszellinie Hep-2 für das RSV wurde in HEPES-gepuffertem Dulbecco´s Modified Eagle Medium (DMEM) mit 1% v/v PSN und 5% FKS kultiviert. Die Zellen wurden in einem Zwei-Tage-Rhythmus 1:3 geteilt und subkultiviert. Das Ablösen der Zellen erfolgte mit Trypsin/EDTA. 2.2.1.2 Viruskultivierung Subkonfluente Hep-2 Zellen wurden 2-3 h in 5 ml serumfreien Medium pro 75 cm2 Flasche mit 106 pfu RSV inkubiert. Anschließend wurden weitere 5 ml Medium mit 2% PSN und 1% FKS zugegeben. Nach einer Inkubationszeit von ca. 60 h bei 37°C wurden die noch nicht abgelösten Zellen mittels eines Zellschabers abgelöst und der gesamte Überstand bei 900g zentrifugiert. Die geklärten Überstände mit dem Virus wurden aliquotiert und bei –80°C gelagert. 2.2.1.3 Bestimmung des Virustiters 104 Hep-2 Zellen in 100 µl Hepes-gepuffertem DMEM mit 1% PSN und 1% FKS und 100 µl einer dekadischen Verdünnung des aufgetauten Virus wurden in Depots einer Mikrotiterplatte gegeben. Nach einer Inkubation von ca. 48 h bei 37°C wurden die Überstände entfernt und die Zellen mit 200 µl 80% (v/v) Ethanol pro Depot 10 min fixiert. Anschließend wurden sie an der Luft getrocknet. 19 Material und Methoden ____________________________________________________________________________ Für die immunzytochemische Färbung wurden die Zellen 5 min in 200 µl PBS-T rehydriert und 1 h mit dem primären AK, hier ein monoklonaler AK gegen ein RS-Virusprotein wie der 3C4, mit einer Verdünnung von 1:100 in PBS-T, inkubiert. Nach dreimaligem Waschen in PBS-T wurde 45 min mit dem sekundären AK, hier anti-Maus-Peroxidase, inkubiert. Nach erneutem dreimaligem Waschen wurde 30 min mit der Substratlösung aus 2µg/µl AEC, 0,03% (v/v) H2 O2 in Phosphat-Citrat-Puffer inkubiert. Danach wurden die Zellen gewässert und mikroskopisch untersucht. Infizierte Zellen zeigten braune Färbungen des Zytoplasmas. Die Verdünnungsstufe, bei der noch eine Färbung angezeigt war, wurde als Virustiter bestimmt. 2.2.2 Anzucht von dendritischen Zellen aus Nabelschnurblut 2.2.2.1 Isolierung von CBMCs über Ficoll-Gradienten Das gewonnene Nabelschnurblut, in Citrat-Phoshat-Dextrose-Lösung mit 20 mM Hepes, 2 IU/ml Penicillin, 2µg/ml Streptomycin und 50 µg/ml Amphotericin bis 24 h haltbar, wurde mit HANKS-Puffer verdünnt und auf 50 ml sterile Falcon-Röhrchen verteilt (max. Volumenmenge 35 ml). 15 ml Ficoll wurden durch Unterschichten mit einer 10 ml-Pipette hinzugegeben und 20 min bei 660g zentrifugiert (bei ausgeschalteter Bremse der Zentrifuge). Danach wurde vorsichtig mit der 10 ml-Pipette der in der Mitte liegende trübe Gradient mit den CBMCs abgenommen und in frischen 50 ml Falcon-Röhrchen gesammelt. Die Zellen wurden 10 min bei 300g abzentrifugiert und anschließend in HANKs-Puffer resuspendiert. Nach weiteren 15 min Zentrifugation bei 200g wurden die Zellen ein letztes Mal in HANKsPuffer gewaschen und wieder 10 min bei 300 g pelletiert. Nach dem zweiten Waschschritt wurden 10 µl der Zellsuspension abgenommen und zur Bestimmung der Zellzahl verwendet. Zum Schluß wurden die Zellen in 300 µl Puffer pro 108 Zellen resuspendiert. 20 Material und Methoden ____________________________________________________________________________ 2.2.2.2 Sortierung von Stammzellen Die Stammzellen wurden aus den CBMCs über das spezifische Oberflächenantigen AC133 positiv selektioniert. Hierfür wurden die in 2.2.2.1 isolierten Zellen mit 100 µl FcRBlockingreagenz und 100 µl AC133-Microbeads pro 108 Zellen 30 min bei 4 °C inkubiert. Danach wurden sie mit dem 10- bis 20-fachem Volumen mit HANKS-Puffer gewaschen und nach 10 min Zentrifugation bei 300 g in 500 µl Puffer pro 108 Zellen resuspendiert. AC133gebundene Zellen wurden durch zweimalge Separation über MS+/RS+-Säulen isoliert und schließlich gezählt. 2.2.2.3 Anzucht der dendritischen Zellen (Caux, 1992) Die unter 2.2.2.2 isolierten Stammzellen wurden in einer Konzentration von 1,5 105 Zellen/ml in 96er-Mikrotiterplatten (200 µl pro Vertiefung) ausplattiert. Nach dem Absiedeln der Zellen am Boden wurden sie mit 100 ng/ml C-SF, 2,5 ng/ml TNF-α und 100 ng/ml GM-CSF stimuliert. In den nächsten Tagen wurden die proliferierenden und ausreifenden Zellen nach Bedarf geteilt und in 24er Mikrotiterplatten überführt. Am siebten Tag wurden die Zellen mit 2,5 ng/ml TNF-α und 100 ng/ml GM-CSF nachstimuliert. Nach 12-14 Tagen wurden die Zellen entweder direkt verwendet oder bei –80°C eingefroren. 2.2.3 Sortierung von dendritischen Zellen nach CD1a- und CD14-negativen Zellen 12 Tage alte dendritische Zellen wurden entweder frisch aus der Kultur verwendet oder aufgetaut. Da die Verteilung der CD1a- und CD14-tragenden Zellen je nach Spender variiert, wurde durch eine durchflußzytometrische Messung der prozentuale Anteil der Subpopulationen bestimmt. Pro 107 Zellen wurden 40 µl FCR-Blockingreagenz und 40 µl CD14- oder CD1aMikrobeads zugegeben und es wurde für 15 min bei 4°C inkubiert. Bei weniger als 107 Zellen wurden ebenfalls 40 µl eingesetzt. Danach wurden die Ansätze mit 2 ml HANKS-Puffer gewaschen und 10 min bei 300 g abzentrifugiert. 21 Material und Methoden ____________________________________________________________________________ Die Überstande wurden sorgfältig mit einer Eppendorfpipette entfernt und die Zellpellets in 1 ml HANKS-Puffer resuspendiert. Zwischendurch wurden BS-Säulen mit G23-Kanülen vorbereitet und mit 3 ml Puffer voreluiert. Die Zellsuspensionen wurden auf die Säulen gegeben und vollständig einsickern gelassen. Danach wurde mit 3 Säulenfüllungen eluiert und der Durchlauf mit den erwünschten Zellen aufgefangen. Die Zellen wurden gezählt und im Durchflußzytometer wurde die Reinheit bestimmt. 2.2.4 Isolierung von naiven T-Zellen CBMCs bzw. PBMCs wurden wie unter 2.2.2.1 beschrieben aus Nabelschnurblut oder Spenderblut von Erwachsenen isoliert. Dann wurden sie in 80 µl HANKS-Puffer pro 107 Zellen resuspendiert und mit 20 µl CD45RA-Mikrobeads pro 107 Zellen für 15 min bei 4°C inkubiert. Nach Waschen mit dem 20-fachen Volumen wurden die Zellen bei 300 g abzentrifugiert und in 1 ml HANKS-Puffer resuspendiert. Eine VS/LS MACS-Säule wurde mit 3 ml Puffer voreluiert und anschließend wurden die Zellen auf die Säule gegeben. Nach fünfmaligem Waschen mit jeweils 3 ml Puffer wurden die in der Säule magnetisch gebundenen Zellen mit 3 ml Puffer mit einem Stempel herausgedrückt. Die CD45RA positivsortierten Zellen konnten entweder direkt in der Zellkultur eingesetzt oder bei –80°C eingefroren werden. 2.2.5 Kokultivierung von stimulierten dendritischen Zellen und allogenen naiven T-Zellen Dendritische Zellen wurden aufgetaut, dreimal mit HANKS-Puffer gewaschen und in 96erTiterplatten ausplattiert. Sie wurden RSV-infiziert bzw nicht infiziert (Kontrolle) oder mit anderen Reagenzien wie Poly (IC) (12,5 µg/ml), LPS (10 µg/ml) und GM-CSF (100 ng/ml) stimuliert. Die Überstände der virusinfizierten Zellen wurden nach 2-3 h vorsichtig entfernt. Danach wurden zu jedem Ansatz 50.000 CD45RA-sortierte T-Zellen gegeben und die Kulturen bis zu 10 Tagen bei 37°C und 5% CO2 im Brutschrank inkubiert. 22 Material und Methoden ____________________________________________________________________________ 2.2.6 Molekularbiologische Methoden 2.2.6.1 RT-PCR 2.2.6.1.1 Isolierung von RNA Zur RNA-Isolierung wurde das Rneasy Mini-Kit von Qiagen eingesetzt. Hierzu wurden die Zellen aus 96er (Kokulturen) bzw. 24er (dendritische Zellen allein) Mikrotiterplatten geerntet und bei 300g abzentrifugiert. Die Überstände wurden entfernt und die Zellen in Lysis-Puffer aus dem Kit über Qia-Shredder zerkleinert. Desweiteren wurde nach der Vorschrift des Herstellers verfahren, unter Anwendung der Methode für Zellen in Suspension. Anschließend wurde die Konzentration der erhaltenen RNA im Photometer bei 280 nm bestimmt. 2.2.6.1.2 Polymerase-Kettenreaktion Für die Durchführung der PCR-Analysen wurde das Kit ThermoScriptT M RT-PCR System von GibcoBRL eingesetzt. Zuerst wurde die RNA in cDNA umgeschrieben. Dazu wurden jeweils 2 µg RNA mit 1 µl Oligo(dT)20 (50 pmol) versetzt und mit DEPC-behandeltem Wasser auf 10 µl aufgefüllt. Dieser Ansatz wurde 5 min bei 65°C denaturiert und anschließend 5 min bei 0°C gehalten. Danach wurde folgender Ansatz (alle Komponenten waren aus dem Kit) zu jeder Probe gegeben und 45 min bei 55°C im Cycler inkubiert: 4 µl 5 x cDNA-Puffer 1 µl 0,1 M DTT 1 µl RnaseOUT (40U/µl) 1 µl DEPC-behandeltes Wasser 2 µl 10 mM dNTP Mix 1 µl Thermoscript RT (15 units/µl) 23 Material und Methoden ____________________________________________________________________________ Anschließend wurde die Reaktion durch Inkubation 5 min bei 85°C beendet und weitere 20 min bei 37°C mit jeweils 1 µl RNase H inkubiert, um die komplementäre RNA zu entfernen. Die erhaltene cDNA konnte entweder direkt weiter eingesetzt oder bei –20°C aufbewahrt werden. Für die DNA-Amplifizierung wurde folgender Ansatz pro Probe zusammengegeben: 5 µl 1,5 µl 10x PCR-Puffer 50 mM MgCl2 1 µl 10 mM dNTP Mix 1 µl 10 µM sense Primer 1 µl 10 µM antisense Primer 0,4 µl 2 µl 38,1 µl PLATINUM Taq DNA-Polymerase (5U/µl) cDNA DEPC-behandeltes Wasser _________________________________________________ 50 µl Gesamtvolumen Dieser Ansatz wurde nach folgendem Programm im Cycler inkubiert: Schritt1: 2 min bei 94°C Schritt2: 30 s bei 94°C Schritt3: 30 s bei jeweiliger Annealing-Temperatur der spezifischen Primerpaare Schritt4: 1 min pro kb Primer bei 72°C 35 Cyclen von Schritt 4 nach 2 Schritt5: 10 min bei 72°C Schritt6: Pause bei 4°C Ende des Programms 24 Material und Methoden ____________________________________________________________________________ Die Annealing-Temperatur wurde nach Vorkommen der Basen in den Primersequenzen nach folgender Formel errechnet: TM[°C]= 2(A+T)+ 4(G+C). Die Amplifikate wurden bis zur Analyse bei 4°C aufbewahrt. 2.2.6.1.3 Elektrophorese von DNA in Agarosegelen Die Auftrennung von DNA-Fragmenten erfolgte durch eine Horizontal-Elektrophorese in 1%igen und 1,5%igen Agarosegelen. Die Agarose wurde durch aufkochen in TAE-Puffer gelöst und vor dem Gießen der Gele 0,5 µg/µl Ethidiumbromid zugegeben. Die DNA-Proben wurden mit 1/10 Volumen Auftragspuffer versetzt und in die Taschen des erstarrten Gels geladen. Die Elektrophorese erfolgte bei ca. 100 V. 2.2.7 Darstellung von Proteinen durch Western-Blot 2.2.7.1 Isolierung von Kern- und zytoplasmatischen Proteinen Hierfür wurde das Nuclei EZ Prep Nuclei Isolation Kit von Sigma verwendet. Die Isolierung erfolgte nach Resuspension der Zellen entsprechend der Anleitung für Zellsuspensionen aus dem Kit. Nur die Puffermengen wurden entsprechend der Anwendung der isolierten Proteine variiert. Für Gel-Shift-Essays wurden die Zellen statt in 4 ml in 500 µl Lysys-Puffer resuspendiert und statt in 200 µl Storage-Puffer in 20 µl. Für die Western-Blots wurden beide Male 500 µl Puffer verwendet. 25 Material und Methoden ____________________________________________________________________________ 2.2.7.2 SDS-Polyacrylamidgelelektrophorese nach Laemmli (1970), modifiziert Die SDS-PAGE wurde mit dem Minigel System der Firma Biometra durchgeführt. Die Gele hatten eine Trenngröße von 70 mm x 90 mm x 1 mm. Sie wurden nach Herstellerangaben in folgender Zusammensetzung gegossen: Sammelgel: 3% (w/v) Acrylamid-Stammlösung (40% (w/v); Verhältnis Acrylamid:Bisacrylamid 37,5:1) 125 mM Tris-HCl, pH 6,8 0,1% (w/v) SDS Trenngel: # % (w/v) Acrylamid-Stammlösung (40% (w/v); Verhältnis Acrylamid:Bisacrylamid 37,5:1) 350 mM Tris-HCl, pH 8,8 0,1% (w/v) SDS Laufpuffer: 25 mM Tris 192 mM Glycin 0,1% (w/v) SDS 2 x Probenpuffer: 55 mM Tris/HCl pH 6,8 4% (w/v) SDS 40% (v/v) Glycerin 4,3% (v/v) ß-Mercaptoethanol 0,1% (w/v) Bromphenolblau 26 Material und Methoden ____________________________________________________________________________ Vor dem Auftragen der Proben auf das Gel wurden sie 1:1 mit Probenpuffer versetzt und 3 min aufgekocht. Je nach Taschengröße konnten 12µl bis 400 µl der vorbereiteten Proben aufgetragen werden. Für die hier verwendeten Streifenblots wurden Gele mit einer großen Tasche, passend für 400 µl, für die Probe und einer kleinen für den Marker verwendet. Die Elektrophorese erfolgte bis zum Eintritt der Bromphenolbande in das Trenngel bei einer Stromstärke von 10 mA. Danach wurde die Stromstärke auf 25 mA erhöht und die Elektrophorese bis zum Austreten der Bromphenolbande aus dem Gel durchgeführt. 2.2.7.3 Western-Blot nach Towbin et al. (1979), modifiziert Für das Transferieren der aufgetrennten Proteine auf Nitrozellulose wurde das Fast-Blot-Gerät der Firma Biometra verwendet.Das Gel und zwei Stücke Watman-Papier wurden in BjerrumSchäfer-Nielson-Puffer (48 mM Tris, 39 mM Glycin, 20% (w/v) Methanol, 0,0375% (w/v) SDS, pH 9,3) 5 min eingelegt, die Nitrozellulose und zwei weitere Stücke Watman-Papier in Towbin-Puffer (25 mM Tris, 192 mM Glycin, 10% (w/v) Methanol, pH 8,3). Die Kathode der Blotting-Apparatur wurde mit Bjerrum-Schäfer-Nielsen-Puffer benetzt und die entsprechenden zwei Lagen Watman-Papier daraufgelegt. Als nächstes wurde zuerst das Gel und danach die Nitrozellulose darauf plaziert. Zum Schluß kamen die 2 Lagen WatmanPapier, getränkt mit Towbin-Puffer, hinzu. Anschließend wurde die Anode mit Towbin-Puffer benetzt und die Kammer geschlossen. Die Blotting-Zeit betrug 20 min bei 5 mA/cm2 Gel. 2.2.7.4 Ponceau-Rot-Färbung Die transferierten Proteine auf der Nitrozellulose-Membran wurden durch 10 minütiges Färben in Ponceau-Rot-Lösung (0,2% (w/v) Ponceau-Rot, 3% (w/v) Trichloressigsäure) angefärbt. Nach anschließendem Wässern konnten die Proteinbanden sichtbar gemacht werden. Um den Nachweis der verschiedenen Proteine mittels Antikörpern zu erbringen, wurden aus dem großen Blot einzelne Streifen geschnitten. 27 Material und Methoden ____________________________________________________________________________ 2.2.7.5 Immundetektion der transferierten Proteine Die einzelnen Streifenblots wurden durch Waschen in PBS-T entfärbt und anschließend 30 min in 1% (w/v) Magermilchpulver in PBS-T zur Absättigung unspezifischer Bindungsstellen inkubiert. Danach wurde über Nacht bei RT mit den jeweiligen primären Antikörpern, verdünnt in PBS-T mit 0,5% (w/v) Magermilchpulver, inkubiert. Es folgte ein dreimaliges Waschen in PBS-T, bevor 1 h mit den mit alkalischer Phosphatase gekoppelten sekundären Antikörpern, ebenfalls verdünnt in PBS-T mit 0,5% (w/v) Magermilchpulver, bei RT inkubiert wurde. Nach weiterem dreimaligem Waschen wurde die Subtratlösung aus 0,1 mg/ml NBT, 0,05 mg/ml BCIP, 40 mM MgCl2 und 150 mM Tris-HCl, pH 9,6 hinzugegeben und bis zum Erscheinen der Banden inkubiert. Anschließend wurden die Streifen gewaschen, getrocknet und dokumentiert. 2.2.8 Gel-Shift-Assay 2.2.8.1 Radioaktive Phosphorylierung von Oligonukleotiden Folgender Ansatz wurde in ein Eppendorf-Reaktionsgefäß pipettiert und 10 min bei 37°C inkubiert: Konsensus-Oligonukleotid 2 µl T4 Polynucleotid-Kinase-Puffer (10x) 1 µl [γ- 32 P]ATP (10 mCi/ml) 1 µl Nuclease-freies Wasser 5 µl T4 Polynucleotid-Kinase 1 µl Gesamtvolumen 10 µl Danach wurde die Reaktion durch Zugabe von 1 µl 0,5 µl EDTA gestoppt und anschließend mit 89 µl TE-Puffer verdünnt. 28 Material und Methoden ____________________________________________________________________________ 2.2.8.2 DNA-Bindungsreaktion Kernproteine, isoliert wie unter 2.2.6.1. beschrieben, wurden zuerst nach folgendem Schema mit dem Gel-Shift-Bindungspuffer von Promega zusammenpipettiert und 5-10 min bei RT inkubiert: 5 µl Nuclease-freies Wasser 2 µl Gel-Shift-Bindungspuffer (5x) 2 µl Kernproteinextrakt ___________________________________ 9 µl Gesamtvolumen Als positive Kontrolle wurde ein Kernproteinextrakt von HeLa-Zellen eingesetzt, als negative Kontrolle die Kernproteine weggelassen und das fehlende Volumen durch Wasser ersetzt. Nun wurde zu jedem Ansatz 1 µl der jeweiligen radioaktiv markierten Oligonukleotide zugegeben und 20 min bei RT inkubiert. Nach Zugabe von 1 µl Probenpuffer (10x) zu jedem Ansatz, konnten die Proben für die Elektrophorese eingesetzt werden. 2.2.8.3 Elektrophorese der DNA-Protein-Komplexe Die Analyse der DNA-Protein-Komplexe erfolgte mit einem nichtdenaturierendem, 4% Acrylymidgel. Die Gele setzten sich folgendermaßen zusammen: TBE-Puffer (10x) 1,0 ml 2% Bisacrylymid 500 µl 40% Acrylamid 2,0 ml 80% Glycerin 625 µl Wasser bidest. 15,9 ml TEMED 10 µl 10% APS 150 µl 29 Material und Methoden ____________________________________________________________________________ Die Gele wurden über Nacht zum Auspolymerisieren bei RT stehen und 30 min in 0,5% TBEPuffer bei 100 V vorlaufen gelassen. Danach wurden die Taschen mit den Proben geladen und die Gele bis zum Auftreffen der Farbfront des Probenpuffers an den unteren Gelrand bei 100 V gefahren. Schließlich wurden sie auf einem Gel-Dryer ca. 30 min bei 80°C unter Vakuum getrocknet und einem Röntgenfilm in einer Filmcassette mit einem intensivierenden Schirm bei –80°C exponiert. 2.2.9 Zellphysiologische Methoden 2.2.9.1 Messung der Proliferation von T-Zellen in vitro Kokulturen, wie unter 2.2.5 beschrieben, wurden RSV-infiziert bzw. nicht infiziert (Kontrolle). Als weitere Kontrolle wurden naive T-Zellen allein eingesetzt. Am dritten, fünften und siebten Tag wurde zu jedem Ansatz der Mikrotiterplatte 10 µCi/ml 3 H-Thymidin (37 MBq, entsprechend 1 mCi/ml, Amersham) gegeben und für 6 h bei 37°C inkubiert. Anschließend wurden die Zellen mit einem Zellerntegerät auf Filterpapiere überführt und diese in Szintillationsröhrchen mit Szintillationsflüssigkeit gegeben. In einem Beta-Counter der Firma Beckmann wurden die radioaktiven Zerfälle pro Minute (Cpm) gemessen. 2.2.9.2 Messung der Apoptose von T-Zellen in vitro Für die durchflußzytometrische Messung der zeitabhängigen Apoptose in infizierten und Kontrollkulturen wurde das Annexin V-FITC-Kit der Firma Immunotech eingesetzt. Als Meßwert für den Tag 0 und als Referenz wurden die entweder frisch isolierten oder aufgetauten T-Zellen benutzt. Zu den anderen Zeitpunkten der Kinetik wurden die Zellen aus den Mikrotiterplatten resuspendiert, mit eiskaltem HBSS gewaschen und 5 min bei 500 g und 4°C pelletiert. Die Zellen wurden anschließend in 490 µl eiskaltem 1:10 verdünntem Bindungspuffer resuspendiert. Nach Zugabe von 5 µl mit 1:10 mit Bindungspuffer verdünntem Annexin V-FITC und 5 µl Propidiumiodid-Lösung wurde 10 min auf Eis im Dunkeln inkubiert. Die nun gefärbten Zellen konnten nun direkt für die durchflußzytometrische Messung verwendet werden. 30 Material und Methoden ____________________________________________________________________________ 2.2.9.3 Messung der Phagozytoseaktivität Über 14 Tage angezüchtete dendritische Zellen wurden für 24 h RSV-infiziert bzw. nicht infiziert (Kontrolle) oder unstimuliert eingesetzt. Die Zellen wurden, falls notwendig, resuspendiert und mit 37°C warmem PBS mit 0,5 mM EDTA gewaschen. Danach wurde jeweils eine Konzentration von 106 Zellen/ml in komplettem Kulturmedium für dendritische Zellen mit 0,01 M Hepes eingestellt. 200 µl dieser Zellsuspension wurden in FACS-Röhrchen aus Polypropylen gegeben und 1 min im schüttelnden 37°C warmen Wasserbad vorinkubiert. Die Kontrollzellen wurden auf Eis gesetzt. Danach wurden 20 µl der Dextran-FITC-Lösung mit einer Konzentration von 1 mg/ml zu jeder Probe hinzugegeben und die Röhrchen 15 bzw. 30 min im Wasserbad bzw. auf Eis inkubiert. Nach Zugabe von 4 ml kaltem PBS mit 1% FKS und 0,01% NaN 3 wurden die Zellen in der vorgekühlten Zentrifuge bei 300 g gewaschen. Dieser Schritt wurde 4 mal wiederholt. Anschließend wurden die Zellen in 250 µl PBS aufgenommen und inkorporiertes Dextran-FITC wurde im Durchflußzytometer gemessen. 2.2.10 Fluoreszenzmikroskopie 2.2.10.1 Herstellung der Präparate RSV-infizierte und nicht infizierte dendritische Zellen bzw. nach CD1a und CD14 sortierte Subpopulationen wurden aus den Vertiefungen der Mikrotiterplatten geerntet und gezählt. Die Zellen wurden 10 min bei 300 g abzentrifugiert und auf eine Konzentration von 50.000 Zellen/ml eingestellt. Mit 200 µl dieser Zellsuspension wurden pro Objektträger Zytospinpräparate hergestellt. 2.2.10.2 Färben der Präparate Die auf den Objektträgern anzentrifugierten Zellen wurden sofort einmal mit PBS gewaschen und 5 min mit 80% (v/v) Methanol fixiert. Danach wurde ein weiteres mal mit PBS gewaschen und anschließend 1 h bei 37°C mit dem primären Antikörper, hier der monoklonale AK 18F12 gegen das RSV-F-Protein, inkubiert. 31 Material und Methoden ____________________________________________________________________________ Nach dreimaligem Waschen mit PBS wurden die Zellen eine halbe Stunde mit dem sekundären AK, anti-Maus-Alexa 488 (Molecular Probes) inkubiert. Zum Schluß wurde nichtgebundener sekundärer AK abgewaschen und die Zellen in Einbettungsmedium eingedeckelt. Die Präparate konnten nun im Fluoreszenzmikroskop bei 480 nm betrachtet werden. 2.2.11 Intrazelluläre Zytokinmessung im Durchflußzytometer (Jung, 1993) Für die intrazelluläre Zytokinmessung wurde am sechsten Tag der Kokultur 18 h 10 µg/ml Brefeldin A oder für 5 h an Tag 7 10 ng/ml PMA, 1 µM Ionomycin und 10 µg/ml Brefeldin A zugeben. Die Zellen wurden aus den Vertiefungen der Mikrotiterplatten geerntet und 10 min bei 300 g abzentrifugiert. Danach wurden die Zellen zur Fixierung in 4% (w/v) Paraformaldehyd in HBSS-Puffer resuspendiert und 10 min inkubiert. Anschließend wurden sie zweimal mit HBSS-Puffer gewaschen und in Saponinpuffer resuspendiert. Die Zellsuspensionen wurden je nach Färbungen auf FACS-Röhrchen verteilt, wobei für jede Messung mindestens 5x105 Zellen benötigt wurden. Schließlich wurden die direkt Fluorochrom-konjugierten AK für die Zytokine und Oberflächenantigene hinzugegeben und es wurde bei 4°C für 15 min inkubiert. Danach wurde jeder Ansatz mit 1 ml Saponinpuffer gewaschen und die in den FACS-Röhrchen abzentrifugierten Zellen in 250 µl HBSS für die Messung im Durchflußzytometer resuspendiert. 32 Ergebnisse ____________________________________________________________________________ 3. Ergebnisse 3.1 Charakterisierung der dendritischen Zellen 3.1.1 Einteilung in Subpopulationen anhand von spezifischen Oberflächenmarkern Die aus dem Nabelschnurblut mit SCF, GM-CSF und TNF-α nach der Methode von Caux et al. gezüchteten dendritischen Zellen konnten durch die Expression der Oberflächenmarker CD1a und CD14 in vier Subpopulationen eingeteilt werden (Abb.1). CD1a ist eine Form aus der multigenen Familie der CD1-Gene mit insgesamt fünf Formen beim Menschen. Es hat strukturelle Ähnlichkeiten mit dem MHC I-Molekül und spielt eine Rolle bei der Antigenpräsentation (Melian, 1996), (Blumberg, 1995). Das CD14-Molekül ist ein Phospholipid-verankertes Protein und ist vorwiegend auf Monozyten und polymorphkernigen Leukozyten zu finden (Simmons, 1989). Die Subpopulationen sind die doppelt negativen undifferenzierten Zellen (CD14-/CD1a-), monozytäre Zellen (CD14+/CD1a-), die doppelt positive Mischpopulation (CD14+/CD1a+) und die dendritische Form (CD14-/CD1a+). Reife dendritische Zellen, die in der Lage sind, T-Zellen zu aktivieren, verlieren das CD14-Antigen und tragen zunächst verstärkt CD1a. Die vollständige Ausreifung der dendritischen Zellen findet erst in Kontakt mit T-Zellen statt, wobei die CD1a-Expression wieder rückläufig ist (Blumberg, 1995). 33 Ergebnisse ____________________________________________________________________________ CD14+/CD 1a- CD14/CD1aA Abb. 1 (A/B): CD14+/CD 1a+ CD14/CD1a+ B Subpopulationen der dendritischen Zellen, gemessen im Durchflußzytometer Über 14 Tage angezüchtete dendritische Zellen wurden geerntet, gewaschen und mit Fluorochrom-gekoppelten Antikörpern gefärbt. Mit den Eigenschaften des SSC und FSC wurde zunächst eine Region für vitale Zellen, die im Durchflußzytometer aufgenommen wurden, gelegt (Abb.1/A). Für diese Region wurden mit CD14-Antikörpern und/oder CD1a-Antikörpern gefärbte Zellen im Dot-Plot dargestellt (Abb. 1/B). Die Position der Quadranten erfolgte anhand der Isotypkontrolle des jeweiligen Antikörpers. 3.1.2 Phagozytose Die Eigenschaften der Phagozytose der einzelnen dendritischen Subpopulationen wurde durch die Aufnahme von Dextran-FITC im Durchflußzytometer bestimmt. Dextrane, hydrophile Polysaccharide, sind hochmolekular, gut wasserlöslich und inert, so daß sie keine toxischen Einflüsse auf die Zellen haben. Zusätzlich wurden die Zellen mit Antikörpern gegen die Oberflächenmarker CD1a und CD14 gefärbt, um die Phagozytoseaktivität den Subpopulationen zuordnen zu können. Dabei wurden zwei Zeitpunkte aufgenommen, nach 15 und nach 30 min Inkubation. Als Kontrolle wurden Zellen nach 30 min Inkubation ohne Zugabe von Dextran-FITC betrachtet bzw. mit Dextran-FITC, aber auf Eis inkubiert. Diese Zellen zeigten wie erwartet keine Phagozytoseaktivität. 34 Ergebnisse ____________________________________________________________________________ Die Auswertung der Dextran-FITC-Aufnahme erfolgte über die MFI (mittlere Fluoreszenzintensität) in Histogrammen, die für jede einzelne Subpopulation angefertigt wurden (siehe Abb. 1/B). Ein deutlicher Anstieg der MFI war in den CD14+/CD1a+ -Zellen schon nach 15 min erkennbar. Nach 30 min verdoppelte sich die MFI in diesen Zellen nochmals, während sie in den anderen Zellen unverändert blieb. Dextran-FITC (MFI) 150 CD14-/CD1aCD14+/CD1aCD14+/CD1a+ CD14-/CD1a+ 100 50 0 Kontrolle 15 min 30 min Abb. 2: Phagozytoseeigenschaften der Subpopulationen Über 14 Tage angezüchtete dendritische Zellen wurden geerntet, gewaschen und mit Dextran-FITC bzw. den Fluorochrom-gekoppelten Antikörpern gegen CD14 und CD1a für die jeweilige Zeit inkubiert. Anschließend wurde die Aufnahme von Dextran-FITC und die Färbung der Oberflächenmarker im Durchflußzytometer gemessen. In diesem Diagramm sind die Ergebnisse aus drei verschiedenen Messungen mit Zellen aus unterschiedlichen Spendern dargestellt. Die Bestimmung der MFI erfolgte in Histogrammen, die für jede Subpopulation angefertigt wurden. 35 Ergebnisse ____________________________________________________________________________ 3.1.3.Nachweis der Infektion von dendritischen Zellen mit RSV 3.1.3.1 Nachweis der Infektion in der Gesamtkultur Zur Klärung der Frage, ob dendritische Zellen mit RSV infizierbar sind, wurden über 14 Tage angezüchtete dendritische Zellen mit RSV (MOI=1) infiziert bzw. nicht infiziert. Die Kulturen wurden für 24 h inkubiert und anschließend mit einem polyklonalem AK gefärbt, um die exprimierten Virusproteine im Durchflußzytometer zu messen. Die Bestimmung der optimalen Konzentration des Antikörpers für die intrazelluläre Färbung erfolgte an infizierten HEp-2-Zellen ebenfalls im Durchflußzytometer. Abb.3 zeigt das Overlay-Histogramm aus den Ergebnissen der infizierten und nicht infizierten Kulturen, die als Kontrolle bezeichnet wurden. Die Infektionsrate variierte mit den Zellen der unterschiedlichen Spender. Abb. 3: Histogramm der RSV-infizierten und nicht infizierten dendritischen Zellen Über 14 Tage angezüchtete dendritische Zellen wurden für 24 h mit und ohne RSV inkubiert. Anschließend wurden exprimierte RSV-Proteine mit einem RSV-spezifischen polyklonalen Antikörper in den Zellen angefärbt. Die Färbung wurde im Durchflußzytometer gemessen und in einem OverlayHistogramm dargestellt. 36 Ergebnisse ____________________________________________________________________________ 3.1.3.2 Nachweis der Infektion in den einzelnen Subpopulationen Der Nachweis der Infektion der unterschiedlichen Subpopulationen erfolgte zum einen über die intrazelluläre Messung von RSV-Antigenen im Durchflußzytometer. Die Messung erfolgte 24 h nach Infektion von Zellen, die über 14 Tage angezüchtet worden waren, mit einer MOI von 1. Neben den beiden Oberflächenmarkern CD14 und CD1a zur Charakterisierung der Subpopulationen wurde im dritten Kanal die Expression von RSVProteinen mit einem polyklonalen Antikörper (Biodesign) gemessen. Auch hier zeigte sich eine unterschiedliche Verteilung der MFI hinsichtlich der RSVInfektion in den Subpopulationen. In den CD14-tragenden Zellen, wie den monozytären Zellen (CD14+/CD1a-) und den dendritischen Zellen (CD14+/CD1a+) stieg die MFI nach RSV-Infektion stärker an als bei den anderen beiden Populationen (Abb.4). RSV (MFI) 75 Kontrolle RSV 50 25 0 CD1a-CD14- CD1a-CD14+ CD1a+CD14+ CD1a+CD14- Abb. 4: Infektion der Subpopulationen mit RSV Über 14 Tage angezüchtete dendritische Zellen wurden für 24 h mit RSV (MOI=1) bzw. ohne (Kontrolle) inkubiert. Anschließend wurden neben der Expression von RSV-Proteinen die beiden Oberflächenmarker CD14 und CD1a zur Identifizierung der Subpopulationen mitgefärbt. In diesem Diagramm sind die Ergebnisse aus drei verschiedenen Messungen mit Zellen von unterschiedlichen Spendern dargestellt. Die Bestimmung der MFI erfolgte in Histogrammen, die für jede Subpopulation angefertigt wurden. 37 Ergebnisse ____________________________________________________________________________ Zum anderen wurde die Expression von Virusproteinen im Fluoreszenzmikroskop nachgewiesen. Dafür wurden die dendritischen Zellen zunächst so sortiert, daß nur CD14tragende oder CD1a-tragende Zellen erhalten wurden (siehe 2.2.3 bzw. Abb. 7/A und B). Als Nachweis für infizierte Zellen wurde mit einem monoklonalen Antikörper gegen das RSV-PProtein aus der Maus gefärbt. Als Sekundärantikörper wurde der anti-Maus-Alexa 488 (Molecular Probes), der im Vergleich zu den Fluorochromfarbstoffen FITC oder TRITC eine höhere Stabilität aufweist, verwendet. Es zeigte sich, daß dendritische Zellen (CD14-/CD1a+) im Vergleich zu den monozytären Zellen (CD14+/CD1a-) Virusproteine schwächer exprimieren (Abb.5/A und B), weshalb auch die MFI in den CD14-/CD1a+-Zellen entsprechend schwächer ausfiel. Zusätzlich war der Anteil der infizierten Zellen bei dieser sortierten Population allgemein niedriger. In Abb. 6/A und B sind zur Verdeutlichung und zum Vergleich die Histogramme der unterschiedlichen infizierten Subpopulationen dargestellt. Abb. 5/A: Infektion CD1a-positiver Zellen Abb. 5/B: Infektion CD14-positiver Zellen Fluoreszenzmikroskopische Aufnahme RSV infizierter CD1a- und CD14-sortierter Zellen mit zugehörigen FACS-Bildern und Overlay-Histogrammen der magnetisch sortierten Zellen. Nach Separierung der beiden Subpopulationen wurden die Zellen für 24 h mit RSV bzw. ohne (Kontrolle) infiziert. Anschließend wurden die Zellen mit einer Zytospin auf Objektträger fixiert und die Expression des RSV-P-Proteins mit einem monoklonalen Antikörper detektiert. Als sekundärer Antikörper wurde der antiMaus-Alexa 488 verwendet. Die fluoreszenzmikroskopischen Bilder wurden mit dem Gerät Leica CLSM mit 50facher Ve rgrößerung von Dr. Olaf Anhenn aus der Pathologie/Ruhr-Universität Bochum aufgenommen. 38 Ergebnisse ____________________________________________________________________________ Abb. 6/A: Overlay-Histogramm der CD1a-positiven Zellen Abb. 6/B: Overlay-Histogramm der CD14-positiven Zellen Die Regionen für die jeweilige Subpopulation wurde anhand der Dot-Plots (Abb.7/A und B) bestimmt und als Overlay-Histogramm dargestellt. Die graue Kurve stellt die MFI der nicht infizierten Zellen der Kontrollkultur dar, die schwarze Kurve die MFI der RSV-infizierten Zellen. Verwendet wurde der polyklonale Antikörper gegen RSV der Firma Biodesign. Als Sekundärantikörper kam der anti-Maus-Tricolor zum Einsatz. Abb. 7/A: Ergebnis der Sortierung von CD1a-positiven Zellen über magnetische Säulen Abb. 7/B: Ergebnis der Sortierung von CD14-positiven Zellen über magnetische Säulen Über 14 Tage angezüchtete dendritische Zellen wurden jeweils mit Antikörpern gegen CD1a und CD14 inkubiert, die mit paramagnetischen Teilchen gekoppelt waren. Anschließend wurden die Zellen auf magnetische Säulen gegeben und jeweils der Durchfluß mit nicht markierten Zellen gesammelt. 39 Ergebnisse ____________________________________________________________________________ 3.1.4 Expression von kostimulatorischen Oberflächenantigenen und Ausreifungsmarkern nach RSV-Infektion Der Einfluß einer RSV-Infektion auf die Subpopulationen wurde über die Expression diverser Oberflächenantigene untersucht. Über 14 Tage angezüchtete Zellen wurden für 24 h mit RSV (MOI=1) infiziert bzw. nicht infiziert (Kontrolle) und anschließend nach Fixierung und Permeabilisierung zusätzlich zu den beiden Oberflächenantigenen CD14 und CD1a gegen ein drittes Protein gefärbt. Nach durchflußzytometrischen Messungen folgte die Auswertung ebenfalls über die mittlere Fluoreszenzintensität (MFI), bezogen auf die jeweilige Subpopulation (siehe 3.2.1). In den Abbildungen 8 bis 16 sind die Ergebnisse von jeweils drei Messungen mit Zellen von unterschiedlichen Spendern dargestellt. Nicht alle Moleküle wurden im Vergleich zu den Kontrollen durch eine RSV-Infektion beeinflußt. Die CD54- (ICAM-1) und CD115- (M-CSF-Rezeptor) Expression veränderte sich in allen Subpopulationen nicht, jedoch war die sie von vornherein auf monozytären Zellen (CD14+/CD1a-) und den dendritischen Zellen (CD14+/CD1a+) höher als bei den anderen beiden Populationen. CD54 (MFI) 200 Kontrolle RSV 100 0 CD1a-CD14- CD1a-CD14+ CD1a+CD14+ CD1a+CD14- Abb. 8: CD54-Expression in dendritischen Subpopulationen 40 Ergebnisse ____________________________________________________________________________ CD 115 (MFI) 150 Kontrolle RSV 100 50 0 CD1a-CD14- CD1a-CD14+ CD1a+CD14+ CD1a+CD14- Abb. 9: CD115-Expression in dendritischen Subpopulationen Typische Ausreifungsmarker für dendritische Zellen wie CD80/CD86 (B7-Komplex) und das HLA-DR (MHC II) wurden bei der gemischten Population (CD14+/CD1a+) und der dendritischen Population (CD14-/CD1a+) durch die RSV-Infektion erhöht exprimiert, wobei der Grad an HLA-DR-Expression schon in den reifen Kontroll-Zellen hoch war. Das HLAA,B,C (MHC I) war auf den dendritischen Zellen auch vorhanden, jedoch war der stärkste Anstieg der Expression durch RSV auf den monozytären Zellen und bei der Mischpopulation zu finden. CD80 (MFI) 100 Kontrolle RSV 75 50 25 0 CD1a-CD14- CD1a-CD14+ CD1a+CD14+ CD1a+CD14- Abb. 10: CD80-Expression in dendritischen Subpopulationen 41 Ergebnisse ____________________________________________________________________________ CD86 (MFI) 300 Kontrolle RSV 200 100 0 CD1a-CD14- CD1a-CD14+ CD1a+CD14+ CD1a+CD14- Abb. 11: CD86-Expression in dendritischen Subpopulationen HLA-DR (MFI) 2000 Kontrolle RSV 1000 0 CD1a-CD14- CD1a-CD14+ CD1a+CD14+ CD1a+CD14- Abb. 12: HLA-DR-Expression in dendritischen Subpopulationen HLA-A,B,C (MFI) 1000 Kontrolle RSV 750 500 250 0 CD1a-CD14- CD1a-CD14+ CD1a+CD14+ CD1a+CD14- Abb. 13: HLA -A,B,C-Expression in dendritischen Subpopulationen 42 Ergebnisse ____________________________________________________________________________ Das CD83-Molekül war hauptsächlich auf den dendritischen Zellen zu finden und wurde durch RSV hochreguliert, wohingegen das CD123-(IL3-Rezeptor) Molekül bei diesen Zellen im Gegensatz zu den übrigen Polulationen schwach exprimiert wurde. CD83 (MFI) 750 Kontrolle RSV 500 250 0 CD1a-CD14- CD1a-CD14+ CD1a+CD14+ CD1a+CD14- Abb. 14: CD83-Expression in dendritischen Subpopulationen CD123 (MFI) 300 Kontrolle RSV 200 100 0 CD1a-CD14- CD1a-CD14+ CD1a+CD14+ CD1a+CD14- Abb. 15: CD123-Expression in dendritischen Subpopulationen 43 Ergebnisse ____________________________________________________________________________ Während die übrigen gemessenen Oberflächenantigene unverändert blieben oder durch die Infektion mit RSV hochreguliert wurden, wurde die Expression des CD40 in den CD1a+/CD14+ und CD1a+/CD14- Zellen nach Infektion herrunterreguliert. Lediglich die monozytären Zellen zeigten eine Steigerung der MFI des CD40 mit RSV. CD40 (MFI) 150 Kontrolle RSV 100 50 0 CD1a-CD14- CD1a-CD14+ CD1a+CD14+ CD1a+CD14- Abb. 16: CD40-Expression in dendritischen Subpopulationen 3.1.5 Apoptosemessung von infizierten dendritischen Zellen Das Überleben der dendritischen Zellen nach einer Infektion ist von entscheidender Bedeutung, um eine effektive Immunantwort gegen den Erreger auszulösen. Zur Bestimmung der Apoptoserate in RSV-infizierten und nicht infizierten Zellen wurde 24 h nach Infektion der Anteil Annexin V-tragender Zellen im Durchflußzytometer bestimmt. In frühen Stadien der Apoptose wird das Membranpospholipid Phosphatidylserin von der inneren zur äußeren Seite der Plasmamembran transportiert. Annexin V, ein 35-36 kDProtein, zeigt eine hohe Affinität zu Phosphatidylserin und kann mit Fluorochromgekoppelten spezifischen Antikörpern detektiert werden. Bei der Messung dieser Annexin V-tragenden Zellen zeigte sich eine deutliche Zunahme apoptotischer dendritischer Zellen nach RSV-Infektion im Vergleich zu den nicht infizierten Kulturen (Kontrolle). 44 Ergebnisse ____________________________________________________________________________ % Annexin V-positive Zellen 30 Kontrolle RSV 20 10 0 Kontrolle RSV Abb. 17: Apoptose in dendritischen Zellen Über 14 Tage angezüchtete dendritische Zellen wurden mit RSV (MOI=1) infiziert bzw. nicht infiziert. Nach 24 h wurde durch die Färbung mit einem Antikörper gegen Annexin V und Propidiumiodid der Anteil apoptotischer Zellen im Durchflußzytometer gemessen. Der prozentuale Anteil apoptotischer Zellen wurde in Dot-Plots bestimmt und ist in diesem Diagramm zusammengefaßt. 3.1.6 Zytokine in dendritischen Zellen 3.1.6.1 PCR-Analysen Dendritische Zellen dirigieren und beinflussen durch die Produktion von Zytokinen die Immunantwort durch T-Zellen, die sie stimulieren und aktivieren . Deshalb wurde zuerst in dendritischen Zellen auf mRNA-Ebene die Bildung Th1- und Th2-Zellen fördernder Zytokine untersucht. Dabei standen die Zytokine IL-12 als Th1-Induktor und IL-10 bzw. IL-4 als Th2Induktoren im Vordergrund. Weiterhin wurden die Zellen auch auf das pleiotrope Zytokin TGF-ß1, das ebenfalls eine Th1-unterdrückende Immunantwort bewirken kann, untersucht. Über 14 Tage angezüchtete dendritische Zellen wurden für 24 h mit RSV (MOI=1) infiziert bzw. nicht infiziert (Kontrolle) und die Gesamt-RNA isoliert. Nach Umschreiben der RNA in cDNA wurden die jeweiligen Sequenzen mittels spezifischer Primer für die Zytokine amplifiziert und in einem Agarosegel aufgetrennt. Sowohl die mRNA für IL-10, als auch die der beiden Untereinheiten p35 und p40 des IL-12 wurden durch die Infektion der dendritischen Zellen stärker synthetisiert. 45 Ergebnisse ____________________________________________________________________________ Die starken Banden der TGF-ß1-Amplifikate weisen keine Unterschiede auf. Auch mRNA für IL-4 ist in den Zellen zu finden, wenn auch die Banden im Vergleich zu den übrigen recht schwach ausgeprägt sind. M 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 Abb. 18: Zytokine in dendritischen Zellen Über 14 Tage angezüchtete denritische Zellen wurden RSV-infiziert bzw. nicht infiziert (Kontrolle) und anschließend über Qiagen-Säulen die RNA isoliert. Diese wurde in cDNA umgeschrieben und mit jeweiligen spezifischen Primerpaaren die Sequenzen für die Zytokine amplifiziert. Die erhaltenen Nukleinsäuren wurden über ein 1% Agarosegel aufgetrennt. Legende: M Marker 1 Kontrolle 2 RSV 3 Kontrolle 4 RSV 5 Kontrolle 6 RSV 7 Kontrolle 8 RSV 9 Kontrolle 10 RSV IL-12 p35 IL-12 p40 TGF-ß1 IL-4 IL-10 46 Ergebnisse ____________________________________________________________________________ 3.1.6.2 Ergebnisse aus der Durchflußzytometrie Neben den Daten der PCR-Analysen wurden die Zytokine IL-10 und IL-12 direkt in den dendritischen Zellen im Durchflußzytometer ermittelt. Nach Fixierung und Permeabilisierung wurde mit direkt Fluorochrom-gekoppelten monoklonalen Antikörpern die jeweiligen exprimierten Proteine gefärbt und gemessen. Bei der Auswertung wurde der prozentuale Anteil der Zytokin-produzierenden Zellen bestimmt. Es wurden prozentual wenig Zellen gemessen, die IL-10 bzw. IL-12 exprimiert hatten. Der Anstieg der Zytokin-produzierenden Zellen war nach der RSV-Infektion ebenfalls sehr gering. Anteil IL-10-positiver Zellen (%) 4 Kontrolle RSV 3 2 1 0 Kontrolle RSV Abb. 19: IL-10-Produktion in dendritische Zellen Über 14 Tage angezüchtete dendritische Zellen wurden RSV (MOI=1) infiziert bzw. nicht infiziert (Kontrolle), nach 24 h wurde intrazellulär mit einem monoklonalen Fluorochrom-gekoppelten Antikörper die IL-10- (IL-12)-Produktion im Durchflußzytometer gemessen. Der prozentuale Anteil der IL-10 exprimierenden Zellen wurde über Dot-Plots bestimmt. Die Ergebnisse daraus wurden in diesem Diagramm zusammengefaßt. Anteil IL-12-positiver Zellen (%) 2 Kontrolle RSV 1 0 Kontrolle RSV Abb. 20: IL-12-Produktion in dendritischen Zellen. ( Erläuterungen siehe Abb. 19) 47 Ergebnisse ____________________________________________________________________________ 3.2 Kokulturen von dendritischen Zellen und allogenen T-Zellen 3.2.1 Etablierung eines humanen in-vitro-Modells Für die Untersuchungen äußerer Einflüsse wie Bakterien- und Virusinfektionen auf das unreife Immunsystem des Neugeborenen wurde in Vorversuchen ein humanes in-vitro-Modell entwickelt. Dabei standen die dendritischen Zellen als professionelle antigenpräsentierende Zellen, die für die Ausreifung und Proliferation von ungeprägten naiven T-Zellen zuständig sind, im Vordergrund. Es wurde getestet, ob die nach der Methode von Caux et al. gezüchteten Zellen aus Nabelschnurblut naive T-Zellen zur Ausreifung und Zytokinproduktion stimulieren können. 500 bzw. 5000 dendritische Zellen wurden dafür mit 50.000 allogenen naiven T-Zellen, isoliert aus Nabelschnurblut, kultiviert. Nach 1, 2, 4, 7 bzw. 10 Tagen wurde im Durchflußzytometer intrazellulär die Produktion der beiden Leitzytokine für eine Th1- (IFNγ) bzw. Th2-Immunantwort (IL-4) gemessen. Um Proteine intrazellulär messen zu können, wurde jeweils 16 h vorher Brefeldin A den Kulturen zugegeben, das eine Anreicherung der Proteine im Golgi-Apparat der Zelle bewirkt und die Sekretion verhindert. Abb. 21 bzw. Abb. 22 zeigen den zeitlichen Verlauf der spontanen IL-4- und IFN-γ Produktion in den T-Zellen. Während der Anteil IL-4-produzierender Zellen im Laufe der Kokultur zunimmt und an Tag 7 ein Maximum erreicht, ist die spontane IFN-γ-Produktion im allgemeinen trotz eines geringen Anstiegs recht niedrig. 48 Ergebnisse Anteil IL4-produzierender Zellen (%) ____________________________________________________________________________ 40 Tag 1 Tag 2 Tag 4 Tag 7 Tag 10 30 20 10 0 5000.0 500.0 Ansatz (DC-Zahl) Abb. 21: Kinetik der IL-4-produzierenden T-Zellen Die IL-4-Expression wurde in Kokulturen aus dendritischen Zellen und T-Zellen intrazellulär mit einem monoklonalen Fluorochrom-gekoppelten Antikörper im Durchflußzytometer am jeweiligen Tag gemessen. Der prozentuale Anteil der IL-4-produzierenden Zellen wurde im Dot-Plot bestimmt und die Messungen aus drei verschiedenen Ansätzen im Diagramm zusammengefaßt. Anteil IFN-γ -produzierender Zellen (%) 7.5 Tag 1 Tag 2 Tag 4 Tag 7 Tag 10 5.0 2.5 0.0 5000.0 500.0 Ansatz (DC-Zahl) Abb. 22: Kinetik der IFN-γ-produzierenden T-Zellen Die IFN-γ-Expression wurde in Kokulturen aus dendritischen Zellen und T-Zellen intrazellulär mit einem monoklonalen Fluorochrom-gekoppelten Antikörper im Durchflußzytometer am jeweiligen Tag gemessen. Der prozentuale Anteil der IFN-γ-produzierenden Zellen wurde im Dot-Plot bestimmt und die Mesungen aus drei verschiedenen Ansätzen im Diagramm zusammengefaßt. 49 Ergebnisse ____________________________________________________________________________ 3.2.2 Zytokinproduktion in T-Zellen nach RSV-Infektion Mit der Methode der intrazellulären Zytokinmessung im Durchflußzytometer (Jung, 1993) war es möglich, auf Einzelzellebene in den RSV-infizierten und nicht infizierten Kokulturen relevante Zytokine zu messen und darzustellen. Mit den Eigenschaften des FSC und SSC konnte die Region R1 der T-Zellen identifiziert (Abb. 23/A und 24/A) und für die Messung der beiden Leitzytokine IFN-γ (Th1-Immunantwort) (Abb. 23/B und 24/B) und IL-4 (Th2Immunantwort) (Abb.23/C und 24/C) spezifiziert werden. Zusätzlich wurde im dritten Kanal das T-Zell-spezifische Antigen CD3 gemessen, so daß in der festgelegten Region R1 liegende Zellen, die keine T-Zellen sind, nicht in die Messung miteinbezogen wurden. Abb. 23/A Durchflußzytometrische Abb.23/B Messung der IFN-γ- und Abb.23/C IL-4-produzierenden T-Zellen in nicht infizierten Kontrollkulturen. An Tag 7 der Kokultivierung von dendritischen Zellen und T-Zellen wurden nach Inkubation mit Brefeldin A intrazellulär die Zytokine IFN-γ und IL-4 durchflußzytometrisch in den T-Zellen gemessen. 50 Ergebnisse ____________________________________________________________________________ Abb.24/A Abb.24/B Abb.24/C Durchflußzytometrische Messung der der IFN-γ- und IL-4-produzierenden T-Zellen in RSV-infizierten Kulturen. An Tag 7 der Kokultivierung von dendritischen Zellen und T-Zellen wurden nach Inkubation mit Berfeldin A intrazellulär die Zytokine IFN-γ durchflußzytometrisch in den T-Zellen gemessen. In Abb. 25 sind die Ergebnisse aus Versuchen mit unterschiedlichen Spendern von dendritischen Zellen und T-Zellen zusammengefaßt. In RSV-infizierten Kokulturen wurde eine signifikante Steigerung der IL-4-produzierenden Zellen im Vergleich zu nicht infizierten Anteil zytokinproduzierender Zellen (%) Kulturen gemessen, während IFN-γ nicht gebildet wurde. 20 Kontrolle RSV 10 0 IFN- γ IL-4 Abb. 25: Diagramm der IFN-γ- und IL-4-produzierenden T-Zellen Die Ergebnisse aus drei Unterschiedlichen Ansätzen von Kokulturen mit unterschiedlichen Spendern von dendritischen Zellen und T-Zellen sind hier graphisch zusammengefaßt. Die Messung der Zytokine erfolgte intrazellulär auf Einzelzellebene im Durchflußzytometer. Für die intrazelluläre Zytokinmessung wurde für 16 h Brefeldin A zu den Kulturen zugegeben, um eine Anreicherung der Proteine im GolgiApparat der Zellen zu gewährleisten. 51 Ergebnisse ____________________________________________________________________________ 3.2.3 Induktion von IFN-γ Da in dem etablierten humanen in-vitro-System, das ein Modell für das unreife Immunsystem des Neugeborenen darstellt, ein Th2-Zytokinmilieu vorherrscht, wurde mit verschiedenen Stimuli versucht, eine IFN-γ-Produktion zu induzieren. Dafür wurden Kokulturen aus dendritischen Zellen und naiven T-Zellen mit IFN-α, GM-CSF mit TNF-α, GM-CSF/LPS und IFN-γ/LPS stimuliert. Als Kontrolle wurden unstimulierte Kulturen untersucht. Die intrazelluläre Zytokinproduktion erfolgte nach vorheriger Brefeldin A-Zugabe am siebten Tag. Naive T-Zellen (CD45RA-positiv), die nicht mit dendritischen Zellen kokultiviert wurden, zeigten keine Zytokinproduktion. Eine höhere spontane IFN-γ-Produktion in den T-Zellen wurde in Kokulturen mit 5000 dendritischen Zellen erreicht, jedoch bewirkte erst die Zugabe von IFN-γ selbst mit LPS höhere Raten an IFN-γ-produzierenden Zellen. Anzahl IFN-γ -produzierender Zellen (%) 15 Kontrolle IFN-α GM-CSF+TNF-α GM-CSF+LPS 10 IFN-γ+LPS 5 0 nur T-Zellen 500 DC 5000 DC Anzahl DC in Kokultur Abb. 26: Induktion von IFN-γ in T-Zellen im humanen in-vitro-Modell 500 und 5000 über 14 Tage angezüchtete dendritische Zellen wurden mit IFN-α, GM-CSF+TNF-α, GM-CSF+LPS und IFN-γ+LPS versetzt oder nicht stimuliert (Kontrolle). Es wurden jeweils 50.000 allogene T-Zellen hinzugegeben und die Kulturen für 7 Tage inkubiert. Anschließend wurde intrazellulär die IFN-γ-Produktion in den T-Zellen durchflußzytometrisch ermittelt. Als weitere Kontrolle wurden T-Zellen allein betrachtet. 52 Ergebnisse ____________________________________________________________________________ 3.2.4 Induktion von IFN-γ mit PMA und Ionomycin PMA und Ionomycin sind starke IFN-γ-induzierende Stimuli in T-Zellen. PMA aktiviert die Proteinkinase C, die wiederum in die Signalkaskade der IFN-γ-Induktion eingreift, und Ionomycin wirkt auf die Ionenkanäle der äußeren Zellmembranen, wodurch verstärkt Calcium-Ionen eindringen und somit die Wirkung von Calcium-abhängigen Enzymen wie der Proteinkinase C verstärken (Nishizuka, 1984). Beide Reagenzien wurden am siebten Tag der Kokultur für 5 h hinzugegeben und mit Brefeldin A zusammen inkubiert. In Abb. 27 ist zu erkennen, daß in RSV-infizierten Kokulturen die Induktion von IFN-γ wesentlicher schwächer ausgeprägt war als in den nicht infizierten Kulturen. Sogar eine Steigerung der IL-4-produzierenden Zellen war trotz dieser starken IFN-γ-fördernden Stimuli Anteil zytokinproduzierender Zellen (%) in den RSV-infizierten Kulturen induziert worden. 40 Kontrolle RSV 30 20 10 0 IFN- γ IL-4 Abb. 27: Zytokinproduktion in T-Zellen nach Stimulation mit PMA und Ionomy cin Infizierte und nicht infizierte dendritische Zellen wurden mit T-Zellen 7 Tage kultiviert. Es wurde für 5 h mit PMA/Ionomycin und Brefeldin A inkubiert. Anschließend wurden intrazellulär die Zytokine IFN-γ und IL-4 im Durchflußzytometer gemessen. 53 Ergebnisse ____________________________________________________________________________ 3.2.5 Proliferation und Apoptose von T-Zellen Um die zellphysiologischen Vorgänge während der Kokultivierung von dendritischen Zellen mit T-Zellen in infizierten und nichtinfizierten Kulturen zu untersuchen, wurde zum einen das Proliferationsverhalten der T-Zellen mittels Einbau von radioaktivem Thymidin untersucht. Dazu wurde an Tag 1, 3, 4, 5, 6 und 7 für ca 6 h radioaktiv markiertes Thymidin zugesetzt und anschließend in die Zellen eingebaute Radioaktivität im Counter gemessen (Abb.28). Eine meßbare Proliferation setzt bei den Kokulturen am dritten Tag ein, während T-Zellen allein wie erwartet nicht proliferierten. Jedoch zeigten sich Unterschiede hinsichtlich des Proliferationsverhaltens der stimulierten T-Zellen in RSV-infizierten und nicht infizierten Kulturen. Während die Proliferationsrate in den Kontrollkulturen kontinuierlich stieg, blieb sie in den infizierten Kulturen ab dem vierten Tag auf einem gleichbleibenden Niveau. Kontrolle RSV 10000 1000 3 ( H-Thymidin)Cpm 100000 100 Tag3 Tag4 Tag5 Tag6 Tag7 Abb.28: Proliferationsrate von T-Zellen in Kokultur Für die Messung der T-Zell-Proliferation wurde für 7-8 h am jeweiligen Tag der Messung 3 H- 3 Thymidin zu den Kulturen zugegeben. Daraufhin wurden die Zellen geerntet und eingebautes HThymidin im Counter gemessen. 54 Ergebnisse ____________________________________________________________________________ Zum anderen wurde die Apoptoserate in den Kokulturen mittels Annexin V-Messung im Durchflußzytometer bestimmt. Abb. 29 zeigt im Dot-Plot die Fluoreszenz der Annexin VFITC-gefärbten Zellen. Propidiumiodid-gefärbte Zellen, die eher eine Zellnekrose beschreiben würden, waren kaum vorhanden. Abb. 29: Dot-Plot der Apoptosemessung von T-Zellen (siehe Abb. 28) In Abb. 30 sind die Ergebnisse aus den Messungen der apoptotischen T-Zellen in der Kokultur graphisch zusammengefaßt. Interessant ist, daß bis zum vierten Tag die Apoptoserate in den infizierten Kulturen niedriger war als bei den nicht infizierten Zellen. Erst am siebten Tag lag die Apoptoserate in den infizierten Kulturen über der Rate der nicht infizierten 55 Ergebnisse ____________________________________________________________________________ Kontrolle RSV Anteil Annexin V-pos. Zellen (%) 30 20 10 0 Tag 3 Tag 4 Tag 5 Tag 6 Tag 7 Abb. 30: Kinetik der Apoptose von T-Zellen in Kokulturen Der Anteil der apoptotischen Zellen wurde über die Annexin V-Färbung durchflußzytometrisch ermittelt. Die Auswertung erfolgte anhand von Dot-Plots (Abb. 29). 56 Ergebnisse ____________________________________________________________________________ 3.2.6 Nachweis von Zytokinen und Zytokinrezeptoren in Kokulturen mittels PCR Auf RNA-Ebene wurde hier die Expression von sowohl Th1- und Th2-spezifischen Zytokinen als auch Zytokinrezeptoren, die sich auf den aktivierten T-Zellen ausbilden, gemessen. Neben RSV-infizierten und Kontrollkulturen wurde auch der Einfluß von LPS, einem bakteriellen Stimulus, und Poly(IC), einer synthetischen doppelsträngigen RNA, die wie die gebildete RNA bei Virusreplikation gebildet wird und immunstimulierend wirkt (Cella, 1999), untersucht. Da die hier durchgeführte RT-PCR semiquantitativ ist (als Standard wurden Amplifikate von ß2-Mikroglobulin verwendet: Abb. 31, Gel A, Spur 1-4), können nur deutliche Unterschiede bei der Bandenstärke gewertet werden. Als Zytokine wurden IL-4, IL-11, IL-12 mit den beiden Untereinheiten p35 und p40, IL-10, IL-18 und IFN-γ untersucht. IL-4 und IL-10 sind Th2-Zytokine, die bei allen Kokulturen nachgewiesen wurden. Die IL-10-Bande der RSV-infizierten Kokultur war etwas stärker ausgeprägt als bei den übrigen drei Kulturen (Abb. 31, Gel B, Spur 9-12). Weiter war auffällig, daß die Bande von IL-12 p35 nur bei LPS/GM-CSF-Kulturen deutlich ausgeprägt war (Abb. 31, Gel C, Spur 17-20), während bei den anderen drei Kulturen kaum mRNA für IL-12 p35 nachweisbar war. Auch IL-12 p40 wurde erst durch Stimulation induziert und ist in den unbehandelten Kontrollkulturen schwächer ausgeprägt (Abb. 31, Gel C, Spur 13-16). Ähnliche Ergebnisse wurden bei IFN-γ erhalten (Abb. 31, Gel B, Spur 1-4). Für alle anderen Zytokine wurden Banden bei allen Ansätzen detektiert, die sich nicht unterschieden. Aktivierte T-Zellen bilden Rezeptoren für Zytokine an ihren Oberflächen aus, die für eine Polarisierung der Zellen in Th1- oder Th2-Zellen führen können. Deshalb wurde neben Zytokinen die Expression spezifischer Zytokinrezeptoren auf den T-Zellen untersucht. Am auffälligsten war hier, daß die mRNA für die beiden Untereinheiten ß1 und ß2 des IL-12Rezeptors erst durch Stimulation mit Poly(IC), LPS/GM-CSF bzw. RSV gebildet wurde. Die übrigen untersuchten Rezeptoren zeigten auch Banden, ohne wesentliche Unterschiede in den unterschiedlich behandelten Kulturen. 57 Ergebnisse ____________________________________________________________________________ M 1 2 Abb.31/Gel A: 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 Ergebnisse der RT-PCR Die Amplifikate wurden über 1% (w/w) Agarosegele aufgetrennt Legende zu Gel A: M Marker 1 LPS+GM-CSF 2 Poly(IC) 3 Kontrolle 4 RSV 5 LPS+GM-CSF 6 Poly(IC) 7 Kontrolle 8 RSV 9 LPS+GM-CSF 10 Poly(IC) 11 Kontrolle 12 RSV 13 LPS+GM-CSF 14 Poly(IC) 15 Kontrolle 16 RSV 17 LPS+GM-CSF 18 Poly(IC) 19 Kontrolle 20 RSV β2-Mikroglobulin IL-11 IL-4 IFN-α,β R IL-12 R-β1 58 Ergebnisse ____________________________________________________________________________ M Abb.31/Gel B: 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 Ergebnisse der RT-PCR Die Amplifikate wurden über 1% (w/w) Agarosegele aufgetrennt Legende zu Gel B: M Marker 1 LPS+GM-CSF 2 Poly(IC) 3 Kontrolle 4 RSV 5 LPS+GM-CSF 6 Poly(IC) 7 Kontrolle 8 RSV 9 LPS+GM-CSF 10 Poly(IC) 11 Kontrolle 12 RSV 13 LPS+GM-CSF 14 Poly(IC) 15 Kontrolle 16 RSV IFN-γ IL-18 IL-10 IFN-α,β,ω-R2 59 Ergebnisse ____________________________________________________________________________ M 1 Abb.31/Gel C: 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 Ergebnisse der RT-PCR Die Amplifikate wurden über 1% (w/w) Agarosegele aufgetrennt Legende zu Gel C: M Marker 1 LPS+GM-CSF 2 Poly(IC) 3 Kontrolle 4 RSV 5 LPS+GM-CSF 6 Poly(IC) 7 Kontrolle 8 RSV 9 LPS+GM-CSF 10 Poly(IC) 11 Kontrolle 12 RSV 13 LPS+GM-CSF 14 Poly(IC) 15 Kontrolle 16 RSV 17 LPS+GM-CSF 18 Poly(IC) 19 Kontrolle 20 RSV IFN-γ R2 IFN-γ R1 IL-12 R-β2 IL-12 p40 IL-12 p35 60 Ergebnisse ____________________________________________________________________________ 3.2.7 Untersuchung von Transkriptionsfaktoren Stimulierte und somit aktivierte T-Zellen haben Gene der jeweiligen Zytokine, die sie exprimieren, angeschaltet und weisen Transkriptionsfaktoren, die für die Übertragung der Signale verantwortlich sind, u.a. im Zellkern auf. Zur Untersuchung der Expression von Transkriptionsfaktoren in T-Zellen, die mit RSVinfizierten dendritischen Zellen kokultiviert wurden, wurden Proteine des Zytoplasmas und der Zellkerne getrennt aufgearbeitet und in Western-Blot-Analysen mittels monoklonaler Antikörper bestimmt. Dabei wurde zum einen ein früher Zeitpunkt der Kokultivierung, nach 3 Tagen, und zum anderen nach 7 Tagen gewählt, an dem auch der signifikante Unterschied der IL-4-produzierenden Zellen zwischen infizierten und nicht infizierten Kulturen gemessen wurde. Untersucht wurden die STAT-Proteine 1, 2, 4, 5 und 6, NFATc-1 und NFATc-2, c-Maf und GATA-3. Lamin A/C wurde als Positivkontrolle für die Kernfärbung eingesetzt. Die Ergebnisse aus den Western-Blot-Analysen sind in Tabelle 1 und 2 dargestellt. RSVinfizierte und nicht infizierte Kontrollkulturen zeigen an beiden betrachteten Zeitpunkten Unterschiede bezüglich der Ausprägung und Verlagerung der relevanten Transkriptionsfaktoren in den Zellkern. Am dritten Tag der Kokultivierung waren vor allem die STAT-Proteine 1, 6 und 5 bei RSVinfizierten Kulturen im Kern zu finden, während die nicht infizierten Kulturen nur ein mittelstarkes Signal bei STAT-1 zeigten. Auch NFATc1 war im Kern der infizierten Kulturen lokalisiert, während bei den Kontrollen keine Bande vorhanden war. Die Transkripionsfaktoren NFATc2, c-Maf und GATA-3 wurden zu diesem Zeitpunkt noch nicht exprimiert. Stärkere Banden waren bei den nicht infizierten Kulturen für STAT-2 und STAT4 im Kern vorhanden, waren aber auch in etwas schwächerer Form bei den RSV-infizierten Kulturen zu finden. Am siebten Tag der Kokultivierung wurden neben den STAT-Proteinen auch die Transkriptionsfaktoren NFATc1 und NFATc2 bzw. GATA-3 und c-Maf im Kern bei den RSV-infizierten Kulturen lokalisiert. Banden für NFATc2, c-Maf und GATA-3 wurden sogar ausschließlich bei den RSV-infizierten Kulturen im Kern detektiert, während NFATc1 auch im Kern der nicht infizierten Kulturen noch nachweisbar war. Dahingegen wurden die STATProteine 6 und 5 zu diesem Zeitpunkt eher schwächer im Kern nachgewiesen. 61 Ergebnisse ____________________________________________________________________________ Tag 3 der Kontrolle RSV Kokultur Kern Zytoplasma Kern Zytoplasma STAT-1 ++ ++ +++ ++ STAT-6 − ++ + ++ NFATc-1 − ++ ++ +++ c-Maf − − − − STAT-5 − +++ +++ +++ NFATc-2 − − − − GATA-3 − − − − Lamin A/C ++ − ++ − STAT-2 +++ − ++ + STAT-4 +++ ++ ++ + Tabelle1: Ergebnisse der untersuchten Transkriptionsfaktoren aus Western-BlotAnalysen am dritten Tag der Kokultur aus dendritischen Zellen und T-Zellen Proteine des Zytoplasmas und der Zellkerne wurden getrennt is oliert und über ein 8% (w/w) Acrylamidgel aufgetrennt. Nach Überführung der Proteine auf eine Nitrozellulosemembran wurde mit Antikörpern gegen relevante Proteine der Signaltransduktion inkubiert (siehe auch Anhang). − = kein Signal + = schwaches Signal ++ = mittelstarkes Signal +++ = starkes Signal 62 Ergebnisse ____________________________________________________________________________ Tag 7 der Kontrolle RSV Kokultur Kern Zytoplasma Kern Zytoplasma STAT-1 − +++ − +++ STAT-6 + +++ + +++ NFATc-1 ++ + +++ +++ c-Maf − + + − STAT-5 + ++ ++ + NFATc-2 − − ++ − GATA-3 − − + − Lamin A/C ++ − ++ − STAT-2 ++ ++ +++ +++ STAT-4 + ++ + ++ Tabelle 2: Ergebnisse der untersuchten Transkriptionsfaktoren aus Western-Blot-Analysen Am siebten Tag der Kokultivierung von dendritischen Zellen und T-Zellen (siehe auch Anhang) (Erläuterungen siehe Tabelle 1) − = kein Signal + = schwaches Signal ++ = mittelstarkes Signal +++ = starkes Signal 63 Ergebnisse ____________________________________________________________________________ 3.2.8 Aktivität von STAT-Proteinen Mit DNA-Bindungsassays wurde untersucht, ob relevante, in den Zellkernen nachgewiesene STAT-Proteine innerhalb einer Signalkaskade aktiviert wurden. STAT-Proteine (signal transducers and activators of transcription) werden von Jak-Kinasen (Janus-Kinasen) phosphoryliert und damit aktiviert. Die phosphorylierten STAT-Proteine bilden Homo- oder Heterodimer-Komplexe und werden als solche in den Kern transportiert. Im Kern haben die STAT-Proteine eine stimulierende Wirkung auf die Expression von Genen, die ihnen zugeordnete DNA-Elemente tragen. Von Interesse war hier die Aktivierung von STAT1/2, STAT4 und STAT5/6. Spezifische Oligonukleotidsequenzen der DNA-Elemente wurden radioaktiv markiert und mit den isolierten Kernproteinen inkubiert. Anschließend wurden die Protein-DNA-Komplexe über Acrylamidgele aufgetrennt. Durch die Bindung der radioaktiv-markierten Oligonukleotidsequenzen an die aktivierten Proteine wurden Banden auf den Röntgenfilmen, die mit den getrockneten Gelen inkubiert wurden, erhalten. Die Ergebnisse aus den Untersuchungen von fünf verschiedenen Ansätzen von stimulierten Kokulturen sind in Abb. 32 dargestellt. Als Positivkontrolle wurden Kernextrakte von HelaZellen verwendet. Für die Negativkontrolle wurden die radioaktiven Oligosequenzen ohne Protein inkubiert. Neben RSV-infizierten und nicht infizierten Kulturen wurden auch Poly(IC)- und LPS/GM-CSF-stimulierte Kulturen am siebten Tag untersucht. Die Hela-Extrakte führten wie erwartet zu starken Banden und der Kontrollansatz ohne Protein zu keinen Benden. Positive Signale wurden mit Kernproteinen aus RSV-infizierten Kulturen für alle drei eingesetzten DNA-Sequenzen gefunden, jedoch war die Intensität der Bande für STAT 1/2 im Vergleich zu den Banden von Poly(IC)- und LPS mit GM-CSFstimulierten Kulturen viel geringer. Die unbehandelten Kulturen (als Kontrolle bezeichnet), zeigten mit allen drei Oligonukleotidsequenzen keine Banden. Mit den spezifischen Bindungssequenzen für STAT5/6 wurde bei den RSV-infizierten Kulturen und bei LPS/GMCSF-stimulierten Zellen eine Bande detektiert. 64 Ergebnisse ____________________________________________________________________________ A B Hela-Kontrolle A B A Negativkontrolle B A RSV B A unstimuliert B Poly (IC) A B LPS+GM -CSF (Kontrolle) C C Hela-Kontrolle C Negativkontrolle C RSV unstimuliert C C LPS+GM -CSF Poly(IC) (Kontrolle) Legende: A STAT4 B STAT1/STAT2 C STAT5/STAT6 Abb.32: Gel-Shift-Assay Isolierte Kernproteine von unterschiedlich stimulierten Kokulturen wurden am siebten Tag aufgearbeitet inkubiert. und mit Anschließend spezifischen, wurden die radioaktiv-markierten Oligonukleotidsequenzen DNA-Protein-Komplexe über Acrylamidgele aufgetrennt. Die Signale wurden durch das Auflegen von Röntgenfilmen erhalten. 65 Diskussion ____________________________________________________________________________ 4. Diskussion Säuglinge, die mit RSV infiziert werden, können an einer Bronchiolitis erkranken. Klinische Studien legen nahe, daß die Erkrankung mit einer erhöhten Frequenz an Th2-Zellen einhergeht (s.o. 1.1). Th2-Zellen produzieren das allergiefördernde Zytokin IL-4 in verstärktem Maße, jedoch nicht das antiviral wirkende IFN-γ. Die Ausreifung von Th2-Zellen unter dem Einfluß von RSV wurde in einem etablierten humanen in-vitro-System aus dendritischen Zellen und allogenen naiven T-Zellen untersucht. Anhand dieses Modells wurden mehrere neue Befunde erhoben. Es konnte die Infizierbarkeit der dendritischen Zellen mit RSV nachgewiesen werden, wodurch eine Ausreifung dieser Zellen induziert wurde. Durch die RSV-Infektion wurden in kokultivierten naiven T-Zellen vermehrt IL-4-produzierende T-Zellen gemessen, die Th2-spezifische und damit Th1hemmende Transkriptionsfaktoren wie STAT-6, GATA-3 und c-Maf aufwiesen. Durch RSVEinfluß konnten somit selbst mit PMA/Ionomycin nur wenig IFN-γ-produzierende T-Zellen erhalten werden, was auf eine Polarisierung der T-Zellen in Richtung Th2 deutet. 4.1. Zelluläre Immunologie der RSV-Infektion In dem humanen in-vitro-System stellten die aus den Stammzellen des Nabelschnurblutes angezüchteten dendritischen Zellen die Zellen dar, die als professionell antigenpräsentierende Zellen die Aktivierung der naiven T-Zellen bewirkten, jedoch noch nicht mit Antigenen in Kontakt gekommen waren. Dabei zeigte sich, daß die proliferierten T-Zellen vorwiegend IL-4 produzierten (s.o. 3.2.1). Die prädominante Th2-Immunantwort beim Neugeborenen wird als biologisch sinnvoll angesehen, weil sonst der Fetus im Mutterleib als fremd erkannt und abgestoßen würde (Raghupathy, 1997). Das schon vorherrschende Th2-Zytokinmuster in dem System wurde durch die Infektion der dendritischen Zellen mit RSV signifikant verstärkt, d.h. es wurden prozentual mehr T-Zellen gemessen, die IL-4 produzierten, wohingegen die IFN-γ-Produktion von einem kaum meßbaren Niveau auf Null absank (s.o. 3.2.2). 66 Diskussion ____________________________________________________________________________ Wie in klinischen Studien gezeigt werden konnte, muß das nach der Geburt vorherrschende Th2-Zytokinmuster unter massivem Einfluß Th1-induzierender Stimuli stehen, um die Produktion von Th1-Zytokinen und somit eine zelluläre Immunantwort zu gewährleisten. Ist dieses nicht der Fall, führt unterdrückte IFN-γ-Produktion zu der Ausbildung einer Atopie (Prescott, 1999). Zu Anfang der Kokultivierung wurden T-Zellen eingesetzt, die den Marker für naive T-Zellen (CD45RA) trugen. Nur solche Zellen, die mit den dendritischen Zellen in Kontakt kamen und diese über ihren T-Zellrezeptor als fremd erkannten (allogenes System) konnten expandieren. Wie die Messungen zeigten, wurden die übrigen T-Zellen apoptotisch (s.o. 3.2.5). Durch die RSV-Infektion wurde das Apoptose- und Proliferationsverhalten der T-Zellen deutlich verändert. Während bei den nicht infizierten Kulturen bis zum sechsten Tag die Proliferation anstieg, blieb sie bei den RSV-infizierten Kulturen auf einem fast gleichbleibenden Niveau. Dahingegen war die Apoptoserate in den infizierten Kulturen bis zum vierten Tag deutlich niedriger als in den Kontrollen, was durch die Ausreifung der dendritischen Zellen durch die RSV-Infektion bedingt sein kann, da über die stärkere Expression der kostimulatorischen Moleküle die T-Zellen zuerst besser am Leben erhalten werden konnten (s.o. 3.1.4). Bei der Charakterisierung der aus Stammzellen des Nabelschnurblutes angezüchteten dendritischen Zellen wurde durch die Färbung und Messung mit dem Monozytenmarker CD14 und dem Marker für dendritische Zellen CD1a eine heterogene Mischpopulation identifiziert (s.o. 3.1.1). Neben der doppelt negativen, undifferenzierten Population wurden eine monozytäre, nur CD14-tragende, eine dendritische, nur CD1a-tragende und eine Mischform mit beiden Markern gefunden. 67 Diskussion ____________________________________________________________________________ Hinsichtlich der Infektion mit RSV zeigten sich bei dieser Unterteilung Unterschiede (s.o. 3.1.3.2). Die beiden CD14-tragenden Zelltypen wurden stärker infiziert als die anderen beiden Populationen. Kurt-Jones und Mitarbeiter beschrieben in ihrer Arbeit das CD14-Molekül als Bindungsmolekül für das RSV-Fusionsprotein (F-Protein), wodurch eine proinflammatorische Immunantwort in PBMCs ausgelöst wurde (Kurt-Jones, 2000). Dieser Befund würde erklären, warum CD14-tragende Zellen besser infiziert wurden, denn CD14 könnte als ein möglicher Rezeptor für das F-Protein des Virus wirken. Die Fluoreszenzintensität bezüglich der Infektion fiel bei der CD14+/CD1a+-Population deutlich stärker aus. Hierfür gibt es zwei Gründe: erstens haben CD14-einfachpositive Zellen mehr Virusproteine exprimiert und zweitens war die Intensität der Virusproteine höher als bei den nur CD1a-einfachpositiven Zellen, was in fluoreszenzmikroskopischen Untersuchungen in den sortierten Zellen gezeigt wurde (s.o. 3.1.3.2). Jedoch konnte diese Mischpopulation der CD14+/CD1a+-Zellen aus technischen Gründen nicht isoliert werden, um die gleichen Untersuchungen durchzuführen. Eine weiterer Mechanismus hängt mit der hohen Phagozytoseaktivität dieser Zellen zusammen (s.o. 3.1.2). Das bedeutet, daß die Zellen gut infizierbar sind und auch stark phagozytieren, z.B. Teile von apoptotischen Zellen aufnehmen, aber auch Viren, die über die Bindung des CD14 an den dendritischen Zellen haften bleiben. Die virusbedingte Apoptose der dendritischen Zellen wurde ebenfalls in dieser Arbeit in durchflußzytometrischen Messungen über die Annexin V-Färbung nachgewiesen (s.o. 3.1.5). Neben den beiden Oberflächenmarkern CD1a und CD14 wurden die aus Stammzellen des Nabelschnurblutes angezüchteten dendritischen Zellen über die Expression weiterer spezifischer Marker wie CD 54, 115, 80, 86, 123, 83, HLA-A,B,C und HLA-DR charakterisiert (s.o. 3.1.4). Infizierte dendritische Zellen zeigten eine erhöhte Expression der für die T-Zellaktivierung wichtigen kostimulatorischen Moleküle CD80/CD86 (B7- Komplex), HLA-DR (MHC Klasse II), HLA-A,B,C (MHC Klasse I) und CD83, was auf eine Ausreifung der Zellen durch RSV-Einfluß hinweist. Jedoch waren Unterschiede hinsichtlich der Subpopulationen zu erkennen. 68 Diskussion ____________________________________________________________________________ Die Population der CD14-/CD1a+- Zellen zeigte den stärksten Anstieg bezüglich der Oberflächenproteine CD80/CD86 (Caux, 1994b), HLA-DR und CD83, obwohl hier nur eine schwache Infektion und Virusexpression nachweisbar war. Das könnte daran liegen, daß diese Zellen apoptotische Zellen phagozytieren und durch freigesetztes TNF-α ausreifen (Rovere, 1998), (Steinman, 1999). Eine sogenannte Kreuzinfektion wurde auch von Albert und Mitarbeitern beschrieben (Albert, 1998b), (Albert, 1998a). Das HLA-A,B,C hingegen wurde hauptsächlich auf den CD14-tragenden Zellen aufreguliert, während das HLA-DR eher auf den CD1a-tragenden Zellen durch die Infektion vermehrt exprimiert wurde. Hieraus sind schon die Unterschiede hinsichtlich der Antigenpräsentation der Subpopulationen und der damit induzierbaren T-Zellart zu erkennen. Über MHC I werden vorwiegend CD8-positive zytotoxische T-Zellen aktiviert und über MHC II CD4-positive T-Helferzellen (Delves, 2000a), (Delves, 2000b). Da die CD14positiven Zellen durch RSV infiziert werden, werden die Virusproteine im Zytosol exprimiert und zum endoplasmatischen Retikulum zur Prozessierung transportiert. Dort können nun MHC I-Proteine mit Viruspeptiden beladen werden und sie an der Zelloberfläche präsentieren. Die CD1a-positiven Zellen hingegen lassen sich aufgrund des fehlenden CD14 nicht infizieren, sondern nehmen das Virus oder infizierte apoptotische Zellen wahrscheinlich über Phagozytose auf. Virusproteine befinden sich somit in Vesikeln, wo sie zu Peptidfragmenten abgebaut werden und an MHC II-Proteine binden. Bei den CD14+/CD1a+Zellen, die beide MHC-Moleküle aufregulieren, sind wahrscheinlich beide Mechanismen aktiv. Die Oberflächenmarker CD54 (ICAM I) und CD115 (M-CSF-Rezeptor) wurden bei keiner Subpopulation durch die Infektion beeinflusst. Es ist aber nicht auszuschließen, daß die Aufregulierung des Adhäsionsmoleküls ICAM-I, das für die immunologische Synapse zwischen antigenpräsentierender Zelle und T-Zelle wichtig ist, erst bei erstem Kontakt der infizierten dendritischen Zelle mit T-Zellen geschieht (McCarthy, 1997), (Lanzavecchia, 2000). 69 Diskussion ____________________________________________________________________________ Das Vorhandensein des M-CSF-Rezeptors hingegen auf beiden CD14-tragenden Zellen macht deutlich, daß es sich bei diesen Populationen um plastische Zellen handelt, die durch Zugabe von M-CSF in eine Makrophagenzellinie umgewandelt werden können (Peters, 1996). Hierdurch ist zu erkennen, daß es sich um unreife dendritische Zellen handelt, die noch monozytären Charakter besitzen und auch deshalb nicht in dem Ausmaß die typischen Oberflächenantigene tragen, wie man sie auf reifen dendritischen Zellen findet (Lanzavecchia, 1999). Auffällig war, daß die CD40-Expression auf den CD1a-tragenden Zellen durch die RSVInfektion herrunterreguliert wurde. Normalerweise exprimieren reife dendritische Zellen vermehrt CD40 auf ihren Oberflächen, das mit dem CD40-Liganden auf T-Zellen interagiert (Caux, 1994a). Über diese Wechselwirkung werden T-Zellen aktiviert und über die Induktion des Th1-Zytokins IL-12 beeinflußt (McLellan, 1996). Da in der PCR vermehrt RNA für die beiden Untereinheiten des IL-12 p35 und p40 nach RSV-Infektion in den dendritischen Zellen allein nachgewiesen wurde (s.o. 3.1.6.1), müßte dieses von den monozytären Zellen (CD14+/CD1a-) stammen, denn hier wurde auch eine erhöhte Fluoreszenz für das CD40-Molekül nach RSV-Infektion gemessen. Somit scheinen die beiden CD1a-tragenden Subpopulationen nicht in der Lage, nach einer RSV-Infektion IL12 und somit eine Th1-Immunantwort zu induzieren. Um das genauer zu klären müßte man auch hier jede Population hinsichtlich der Expression von IL-12 einzeln untersuchen. Dieses wurde über die Durchflußzytometrie versucht, jedoch war die gleichzeitige Färbung von CD1a und CD14 mit dem jeweiligen Zytokin nicht möglich. Genauso konnte nicht die Frage geklärt werden, von welchen Populationen das über RSV induzierte IL-10 stammt, das in der PCR gemessen wurde (s.o. 3.1.6.1). IL-10 gehört zu der Gruppe der Th2-Zytokine und wirkt als Gegenregulator zu IL-12 und fördert somit eine Th2-Immunantwort (De Smedt, 1997). Bont und Mitarbeiter lieferten in ihrerer Studie einen klinischen Hinweis auf die Beteiligung von IL-10 bei wiederkehrenden Atemwegsbeschwerden bei Kindern mit RSV-Infektion (Bont, 2000). Die intrazelluläre Zytokinmessung konnte nur für die gesamte Population durchgeführt werden und stimmte mit den Messungen in der PCR überein (s.o. 3.1.6.2). 70 Diskussion ____________________________________________________________________________ Die Induktion von IFN-γ in dem humanen in-vitro-System konnte effektiv durch die Stimulation mit IFN-γ selbst zusammen mit LPS induziert werden, wobei die Anzahl der dendritischen Zellen ebenfalls ausschlaggebend war (s.o. 3.2.3). Bei dem Einsatz von 5000 Zellen wurden im Vergleich zu 500 Zellen doppelt so viele T-zellen mit IFN-γ-Produktion gemessen. Dieses könnte darauf hinweisen, daß die Produktion dieses Th1-Zytokins über die dendritischen Zellen vermittelt wird. IL-12, das von dendritischen Zellen unter bestimmten Stimuli gebildet wird, ist ein Hauptinduktor für die Th1-Zellbildung und IFN-γ-Synthese (Sinigaglia, 1999). Tatsächlich wurde in LPS/IFN-γ-behandelten dendritischen Zellen hohe Mengen an IL-12 gemessen (Daten hier nicht gezeigt). PMA und Ionomycin hingegen, die als starke IFN-γ-induzierende Agenzien eingesetzt wurden, konnten nicht wie in den nicht infizierten Kontrollkulturen hohe Mengen an IFN-γ induzieren (s.o. 3.2.4). Darüberhinaus wurde auch hier nach RSV-Infektion vermehrt IL-4 gemessen. Das läßt vermuten, daß polarisierte T-Zellen aus den RSV-infizierten Kulturen hervorgegangen sind oder eine Beeinflussung der Signaltransduktion von IFN-γ stattgefunden hat. Um der Frage nachzugehen, ob eine Th1-Immunantwort unterdrückt und eine Th2Immunanwort bei RSV-Infektion gefördert wird, wurden mit der Methode der RT-PCR Zytokine und Zytokinrezeptoren auf Transkriptionsebene gemessen (s.o. 3.2.6). Diese Untersuchungen konnten nicht im Durchflußzytometer auf Proteinebene durchgeführt werden, da die spezifischen Antikörper hierfür nicht zur Verfügung standen. Neben RSVinfizierten und nicht infizierten Kulturen wurden auch solche mit LPS/GM-CSF- und Poly(IC)-Stimulation gemessen. Die Überlegungen gingen dabei dahingehend, daß die unzureichende Th1-Immunantwort in dem etablierten System mit dem Fehlen der Rezeptoren für Th1-Zytokine wie IL-12, IFN-γ und/ oder IFN-α auf den T-Zellen bzw. der Zytokine selbst zusammenhängen könnte. 71 Diskussion ____________________________________________________________________________ Es zeigte sich, daß die Rezeptoren vorhanden waren, auch die regulatorischen β2- oder R2Untereinheiten (Szabo, 1997). Das war unabhängig von RSV-Infektion oder LPS/GM-CSFoder Poly(IC)-Stimulation. Heath und Mitarbeiter beschreiben in ihrer Arbeit, daß trotz IL-12Rezeptor und IL-12 polarisierte Th2-Zellen weder die IL-4-Produktion einstellen, noch die IFN-γ-Synthese erhöhen (Heath, 2000). Obwohl STAT-4-Aktivierung nachgewiesen wurde (s.o. 3.2.8), wie es in diesem System bei RSV-Infektion ebenfalls der Fall war, reicht es für eine Induktion von Th1 nicht aus. Die in dem etablierten System direkt nach der Geburt prädominanten Th2-Zellen scheinen sich genauso zu Verhalten wie die transfizierten Zellen von Heath und Mitarbeitern, wobei die Th2-Polarisierung durch die RSV-Infektion weiter gefördert wurde. Nishikomori und Mitarbeiter konnten in IL-12-Rezeptor-β2-transgenen Mäusen zeigen, daß trotz IL-12-Zugabe ein stabiles IL-4-Muster in etablierten Th-2-Klonen erhalten blieb (Nishikomori, 2000). 4.2 Modulation der Signaltransduktionswege durch RSV Untersuchungen der Kulturen auf Signaltransduktionsebene ergaben Hinweise auf mögliche Regulationsmechanismen. Es wurde zuerst eine breites Spektrum an relevanten Proteinen, die in die Signaltransduktionskaskade der T-Zelldifferenzierung eingehen, untersucht (s.o. 3.2.7). An dieser Stelle wurde nun deutlich, daß RSV erst auf Ebene der Signaltransduktion den IFNγ-Weg hemmt und den IL-4-Weg fördert. Zu dieser Schlußfolgerung führen die Ergebnisse, daß schon zu einem frühen Zeitpunkt der Kultivierung untersuchte T-Zellen STAT-6 im Zellkern vorwiesen, was bei der Th2-Zelldifferenzierung eine Rolle spielt. STAT-6 wird durch IL-4 induzierte Signalwege exprimiert (Hou, 1994) und ist für die Entwicklung von Th2-Zellen notwendig (Kaplan, 1996), (Shimoda, 1996). In Gel-Shift-Assays wurde mit spezifischen Oligonukleotidsequenzen nachgewiesen, daß in den Kern translokalisiertes STAT-6 über die Phosphorylierung von Janus-Kinasen aktiviert wurde und somit als Transkriptionsfaktor wirken konnte. Ansonsten hätte es keine Bindung mit den DNA-Bindungssequenzen gegeben. Am siebten Tag der Kultivierung wurde STAT-6 auch im Kern der Zellen der Kontrollkulturen detektiert, jedoch zeigten die Bindungsassays hier kein positives Signal, was auf eine inaktive Form des STAT-6 deutet (s.o. 3.2.8). 72 Diskussion ____________________________________________________________________________ Da aus technischen Gründen nur Oligonukleotidsequenzen für STAT-5 und STAT-6 verwendet werden konnten, müßten noch Super-Shift-Assays durchgeführt werden, bei denen über einen Antikörper gegen STAT-5 oder STAT-6 genauere Aussagen über das aktivierte und somit gebundene Molekül gemacht werden kann. Zum früher gemessen Zeitpunkt der Kultivierung (Tag 3) wurde in den Kernen der Zellen aus infizierten Kulturen neben STAT-6 auch Th2-spezifisches NFAT-c1, aber auch Th1spezifische Faktoren wie STAT-1/STAT-2 und STAT-4 gefunden. Auch am siebten Tag konnte man diese Faktoren in den Kernen der infizierten Zellen finden, teilweise in abgeschwächter Form. Die Gel-Shift-Assays zu diesem Zeitpunkt ergaben eine Aktivierung für STAT-4, daß durch die IL-12-übermittelte Signalkaskade ausgelöst wird und die Th1-Zelldifferenzierung fördert, und ein sehr schwaches Signal für STAT-1/STAT-2, die als Heterodimer die IFN-Synthese und damit auch Th1-Differenzierung induzieren (s.o. 3.2.8). Die Daten aus der PCR belegen, daß das Th1-Zytokin auch auf RNA-Ebene gebildet wird, jedoch kaum als Protein in T-Zellen detektierbar ist (s.o. 3.2.6). Da die Bandenstärke nicht auf die gebildete Proteinmenge hinweist, kann hier keine Aussage bezüglich der Quantität gemacht werden. Hinzu kommt, daß im Gegensatz zum IL-4 die PCR für IFN-γ suboptimal verlaufen sein kann, was mit der Auswahl der Primer zusammenhängen könnte. Durch PMA/Ionomycin-Einfluß, wodurch der PKC-Signalweg verstärkt wird, konnte IFN-γ wiederum intrazellulär gemessen werden. Am siebten Tag der Kokultivierung, an dem eine signifikante Steigerung der IL-4produzierenden Zellen nach RSV-Infektion gemessen wurde, wurden die Th2-spezifischen Transkriptionsfaktoren GATA-3 und c-Maf in den Kernen der T-Zellen detektiert. GATA-3, ein Transkriptionsfaktor, dessen Bedeutung erst im vergangenen Jahr klar wurde, wird einerseits in Th2-Zellen exprimiert und andererseits kann es die Expression von Th2Zytokinen in sich entwickelnden Th1-Zellen induzieren (Lee, 2000). Ouyang beschreibt GATA-3 als Hauptregulator und Induktor von Th2-Zellen (Ouyang, 2000). 73 Diskussion ____________________________________________________________________________ Er konnte zeigen, daß in STAT-6 defizienten T-Zellen GATA-3 gebildet wurde und für die Th2-Zellstabilisierung verantwortlich war. GATA-3 kann die IFN-γ-Synthese in Th1-Zellen inhibieren und die IL-4- und IL-5-Synthese induzieren (Ferber, 1999). GATA-3 wird dirkt im Zusammenhang mit der Induktion von typischen allergischen Symptomen durch Th2-Zellen erwähnt. Zhang und Mitarbeiter zeigten im Mausmodell, daß ein direktes Ausschalten von GATA-3 die Schlüsselmerkmale von Asthma wie Eosinophilie, vermehrte Mucussecretion und IgE-Synthese inhibierte (Zhang, 1999). Ähnlich verhält es sich mit c-Maf, das selektiv in Th2-Zellen exprimiert wird (Kim, 1999), (Ho, 1996) und die IL-4und IgE-Synthese fördert (Ho, 1998). NFAT-Proteine (nuclear factor of activated T cells) werden in Th1- und Th2-Zellen exprimiert, NFAT-c1 (auch NFAT-c oder NFAT-2 genannt) und NFAT-c2 (auch NFAT-p oder NFAT-1 genannt) spielen bei der Regulierung der Th2-Immunantwort vorwiegend eine Rolle. Beide Transkriptionsfaktoren erscheinen bei der frühen Induktion des IL-4-Gens nach T-ZellAktivierung, während NFAT-c2 auch die Herunterregulierung in späteren Phasen der IL-4Genexpression bewirken kann. NFAT-c1, das am dritten Tag der Kokultivierung in den Zellkernen der RSV-infizierten Kulturen als starkes Signal detektiert wurde, ist ausschließlich ein transaktiver positiver Induktor des IL-4-Promotors. Hier stellt sich die Frage, ob NFAT-c2, daß erst am siebten Tag der Kokultivierung in den Zellkernen der RSV-infizierten Kulturen gefunden wurde, eine suprimierende Rolle beim IL-4-Gen spielt. Da jedoch zu diesem induzierende oder Zeitpunkt in der Durchflußzytometrie die höchste Rate an IL-4-produzierenden T-Zellen durch RSV-Infektion gefunden wurde und diese auch mit starken IFN-γ-induzierenden Stimuli wie PMA und Ionomycin nicht zu beeinflussen war, wird das NFAT-c2 zusätzlich zu GATA-3 IL-4fördernd wirken. Die Daten aus den Western-Blot-Analysen legen nun nahe, auch den IL-4-Rezeptor auf den T-Zellen zu untersuchen, der bis jetzt nicht relevant schien, da er auf allen Zellen vorkommt, auf die IL-4 einen Einfluß hat (Nelms, 1999). 74 Diskussion ____________________________________________________________________________ Jedoch wirken die Th2-induzierenden Faktoren auch auf die Transkription des IL-4Rezeptors, so daß dieser eventuell als weiterer Bestandteil des Regulationsmechanismus der Th2-Entwicklung in Betracht zu ziehen ist (Kotanides, 1996). Für die Synthese von IFN-γ und Entwicklung von Th1-Zellen wurde vor kurzem ein neuer Transkriptionsfaktor, T-bet (T-box expresed in t-cells), beschrieben (Szabo, 2000). T-bet funktioniert als Antagonist von GATA-3 und ist in polarisierten Th2-Zellen stark herunterreguliert oder suprimiert (Rengarajan, 2000). Demzufolge wäre die Untersuchung von T-bet ein weiterer interessanter Ansatz, um die T-Zellentwicklung, die durch RSV-infizierte dendritische Zellen beeinflußt wird, weiter zu charakterisieren. 75 Zusammenfassung ____________________________________________________________________________ 5. Zusammenfassung In dieser Arbeit sollte untersucht werden, ob eine Infektion mit RSV ein Th2-Zytokinmuster in T-Zellen induziert, wodurch ein allergieförderndes Milieu geschaffen wird. Hierfür wurde ein humanes in-vitro-Modell etabliert, das das unreife Immunsystem des Neugeborenen nachempfindet. Die Ausreifung der naiven T-Zellen wurde durch die Kokultivierung mit angezüchteten dendritischen Zellen aus Stammzellen des Nabelschnurblutes bewirkt. Es zeigte sich, daß ein Th2-Zytokinmuster mit IL-4-Produktion in diesem System vorherrschend war und nur durch starke IFN-γ-induzierende Stimuli wie PMA/Ionomycin oder IFN-γ selbst durchbrochen werden konnte. Die nach der Methode von Caux et al. angezüchteten dendritischen Zellen erwiesen sich als heterogene Population, die über die Marker CD14 und CD1a in vier Subpopulationen eingeteilt werden konnten. Diese Populationen verhielten sich unterschiedlich bezüglich Infektion mit RSV und Expression von spezifischen Reifungsmarkern vor und nach Infektion. In RSV infizierten Kokulturen wurde ein signifikanter Anstieg der IL-4-produzierenden TZellen gemessen, während IFN-γ-produzierende Zellen nicht gefunden wurden. Selbst nach Stimulation mit PMA/Ionomycin konnten hier nur geringe Mengen an IFN-γ-produzierenden T-Zellen im Vergleich zu den nicht infizierten Kontrollkulturen detektiert werden. Die Vermutung, daß eine Modulation der Immunantwort auf Signaltransduktionsebene stattgefunden hat, bestätigte sich u.a. durch den selektiven Nachweis von Th2-spezifischen Transkriptionsfaktoren wie GATA-3 und c-Maf in den Zellkernen der T-Zellen aus RSV- infizierten Kokulturen. Diese Faktoren begünstigen die Entwicklung von Th2-Zellen und unterdrücken somit die Produktion von IFN-γ, das antiviral wirkt und eine allergiehemmende Th1-Immunantwort fördert. 76 Literatur ___________________________________________________________________________ 6. Literatur Abe, E, R De Waal Malefyt, I Matsuda, K Arai und N Arai (1992). “An 11-base-pair DNA sequence motif apparently unique to the human interleukin 4 gene confers responsiveness to T-cell activation signals.” Proc Natl Acad Sci U S A 89(7): 2864-8. Albert, ML, SF Pearce, LM Francisco, B Sauter, P Roy, RL Silverstein und N Bhardwaj (1998a). “Immature dendritic cells phagocytose apoptotic cells via alphavbeta5 and CD36, and cross-present antigens to cytotoxic T lymphocytes.” J Exp Med 188(7): 1359-68. Albert, ML, B Sauter und N Bhardwaj (1998b). “Dendritic cells acquire antigen from apoptotic cells and induce class I- restricted CTLs.” Nature 392(6671): 86-9. 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Anhang Zytoplasma Kern Zytoplasma KON RSV KON RSV STAT-1 STAT-6 KON p91 p84 Kern RSV KON RSV GATA-3 STAT-2 STAT-4 NFAT-c1 c-Maf STAT-5 NFAT-c2 Abb. 33: Streifenblots der Western-Blot-Analysen (Tag 3 der Kultivierung, siehe Tabelle 1 in 3.2.7) 85 Anhang ___________________________________________________________________________ Zytoplasma Kern Zytoplasma Kern KON RSV KON RSV KON RSV KON RSV STAT-1 STAT-6 p91 p84 NFAT-c2 GATA-3 NFAT-c1 STAT-2 c-Maf STAT-4 STAT-5 Abb. 34: Streifenblots der Western-Blot-Analysen (Tag 7 der Kultivierung, siehe Tabelle 2 in 3.2.7) 86 Anhang ___________________________________________________________________________ Lebenslauf Özlem Türkel Am Steinknapp 19 44795 Bochum geb.: 13.01.1971 in München Familienstand: ledig Ausbildung: 1977-1981: Grundschule Hufeland-Schule in Bochum 1981-1990 Gymnasium Albert-Einstein-Schule in Bochum 1990: Abitur 1990-1996: Studium Chemie an der Ruhr-Universität Bochum (Schwerpunkt: Biochemie) Oktober 1996: Diplom Diplomarbeit am Lehrstuhl für Neurobiochemie, Arbeitsgruppe Molekulare Zellbiochemie (Leiter der AG: Prof. Dr. rer. nat. B. Hovemann) Oktober 1996April 1998: seit Mai 1998: wissenschaftliche Mitarbeiterin an der Abteilung für Medizinische Mikrobiologie und Virologie der Ruhr-Universität Bochum (Leiter: Prof. Dr. med. H. Werchau) wissenschaftliche Mitarbeiterin der Immunologie der Universitätskinderklinik St. Josef-Hospital Bochum (Leiter der Immunologie: Priv.-Doz. Dr. med. U. Schauer) im Rahmen eines BMBF-Forschungsprojektes im Rahmen letztgenannter Tätigkeit Anfertigung der Dissertation 87
