Untitled - TiHo Bibliothek elib - Stiftung Tierärztliche Hochschule

Bibliografische Informationen der Deutschen Bibliothek
Die Deutsche Bibliothek verzeichnet diese Publikation in der Deutschen Nationalbibliografie;
Detaillierte bibliografische Daten sind im Internet über http://dnb.ddb.de abrufbar.
1. Auflage 2009
© 2009 by Verlag: Deutsche Veterinärmedizinische Gesellschaft Service GmbH, Gießen
Printed in Germany
ISBN 978-3-941703-50-6
Verlag: DVG Service GmbH
Friedrichstraße 17
35392 Gießen
0641/24466
[email protected]
www.dvg.net
Institut für Pharmakologie, Toxikologie und Pharmazie
Tierärztliche Hochschule Hannover
Untersuchungen zu Verhaltensänderungen
und Lern- und Gedächtnisdefiziten
im Pilocarpinmodell für chronische Epilepsie
bei der NMRI- und C57BL/6-Maus
THESE
Zur Erlangung des Grades eines
DOCTOR OF PHILOSOPHY (Ph.D.)
im Fachgebiet Pharmakologie
durch die Tierärztliche Hochschule Hannover
und dem Zentrum für Systemische Neurowissenschaften (ZSN)
vorgelegt von
Christine Julia Müller
aus Köln
Hannover 2009
Supervisor: Univ.-Prof. Dr. W. Löscher
Wissenschaftliche Betreuung:
Univ.-Prof. Dr. W. Löscher
Univ.-Prof. Dr. D. Dietrich
Univ.-Prof. Dr. H. Hildebrandt
1. Gutachter: Univ.-Prof. Dr. W. Löscher (Institut für Pharmakologie, Toxikologie
und Pharmazie der Stiftung Tierärztliche Hochschule Hannover)
2. Gutachter: Univ.-Prof. Dr. D. Dietrich (Abteilung Klinische Psychiatrie und
Psychotherapie der Medizinischen Hochschule Hannover)
3. Gutachter: Univ.-Prof. Dr. H. Hildebrandt (Institut für Zelluläre Chemie der
Medizinischen Hochschule Hannover)
4. Gutachter: Univ.-Prof. Dr. A. Richter (Institut für Pharmakologie und Toxikologie
des Fachbereichs Veterinärmedizin der Freien Universität Berlin)
Tag der mündlichen Prüfung: 24.10.2009
Gefördert durch ein Promotionsstipendium der Konrad-Adenauer-Stiftung, Sankt Augustin.
Für meine Mama
Inhaltsverzeichnis
1. Einleitung……………………..…...…………………………...………........... S. 1
2. Literaturübersicht……….……………….…………………………………… S. 3
2.1 Epilepsien……………………………………………………………………… S. 3
2.2 Einordnung der Epilepsien……………………………………………...…… S. 4
2.3 Temporallappenepilepsie……………………………………………...…….. S. 7
2.4 Epilepsie-assoziierte Komorbiditäten………………………………...…….. S. 9
2.4.1 Depressionen……………………………………………………………….. S. 11
2.4.2 Angsterkrankungen………………………………………………...………. S. 14
2.4.3 Psychosen…………………………………………………………………… S. 15
2.4.4 Kognitive Defizite…………………………………………………………… S. 16
2.4.5 Weitere Epilepsie-assoziierte Komorbiditäten………...………………… S. 17
2.5 Tiermodelle für Epilepsien…………………………………………………… S. 18
2.5.1 Pilocarpin…………………………………………………………...……….. S. 19
2.5.2 Weitere Epilepsiemodelle………………………………………………….. S. 26
2.5.2.1 Kainat………………………………………………………...……………. S. 26
2.5.2.2 Elektroschock…………………………………………...………………... S. 26
2.5.2.3 Elektrische Stimulierung…………………………………………………. S. 27
2.5.2.4 Kindling…………………………………………………………………….. S. 27
2.5.2.5 Genetische Epilepsiemodelle…………………………………………… S. 27
2.6 Verhaltenstests für psychische und kognitive Veränderungen………….. S. 28
2.6.1 Eingangscharakterisierung und Überprüfung von Katalepsie…………. S. 28
2.6.2 Überprüfung von Exploration, Lokomotion und Angst-assoziiertem
Verhalten………………………….……………………………………………….. S. 29
2.6.3 Überprüfung der motorischen Fähigkeiten………………………………. S. 31
2.6.4 Überprüfung der räumlichen Lern- und Gedächtnisleistung…………… S. 32
2.6.5 Untersuchung von Depressions-assoziiertem Verhalten………………. S. 33
2.6.6 Verhaltensphysiologische Charakterisierung von chronisch
epileptischen Mäusen…………………………………….………………………. S. 34
2.6.7 Bedeutung der verwendeten Mausstämme……………………………… S. 35
3. Zielsetzung…………………………………………………………………….. S. 37
V
4. Material und Methoden………………………………………………………. S. 39
4.1 Haltung und Zucht der Versuchstiere……………………………………… S. 39
4.2 Dauerhafte Kennzeichnung der Versuchstiere……………………………. S. 42
4.3 Klassifizierung der Krampfintensität………………………………...……… S. 42
4.4 Chronisches Epilepsiemodell: Pilocarpin (Studien 1-3)………………….. S. 43
4.5 Akutes Epilepsiemodell: Elektroschock (Studie 2)……………………….. S. 44
4.6 Implantation corticaler Elektroden zur EEG-Ableitung…………………… S. 45
4.7 EEG-Ableitungen während Pilocarpin-Applikation………………………… S. 48
4.8 Überwachung spontaner epileptischer Anfälle……………………………. S. 48
4.9 Verhaltensbatterie……………………………………………………………. S. 50
4.9.1 Eingangscharakterisierung und Überprüfung von Katalepsie………… S. 52
4.9.2 Überprüfung von Exploration, Lokomotion und Angst-assoziiertem
Verhalten…………………………………………………………………………… S. 54
4.9.3 Überprüfung der motorischen Fähigkeiten………………………………. S. 60
4.9.4 Überprüfung der räumlichen Lern- und Gedächtnisleistung…………… S. 63
4.9.5 Untersuchung von Depressions-assoziiertem Verhalten………………. S. 67
4.10 Histologie…………………………………………………………………….. S. 70
4.10.1 Gewinnung und Aufarbeitung der Gehirne…………………………….. S. 70
4.10.2 Thionin-Färbung…………………………………………………………… S. 71
4.10.3 Fluoro-Jade-C-Färbung………………………………………………….. S. 72
4.10.4 GFAP-Färbung……………………………………………………………. S. 72
4.10.5 Histologische Auswertung……………………………………………….. S. 73
4.10.5.1 Bewertung nach Scoring-System……………………………………... S. 73
4.10.5.2 Auswertung des Hilus des Gyrus dentatus….……………………….. S. 73
4.10.5.3 Auszählen von Neuronen innerhalb definierter Fenster……………. S. 74
4.11 Korrelationen zwischen Neurodegeneration und Verhaltensauffälligkeiten………………………………………………………...……………. S. 75
4.12 Statistische Berechnungen……………………………………………….... S. 75
5. Ergebnisse……………………………………………………………………... S. 77
5.1 Verhaltenscharakterisierung und histologische Untersuchung von
(LiCl)-Pilocarpin-behandelten NMRI-Mäusen (Studie 1)……………………. S. 77
VI
5.1.1 Konsequenzen der Applikation von Pilocarpin, sowohl mit als auch
ohne LiCl-Vorbehandlung………………………………………………………… S. 77
5.1.2 Detektion von spontanen Anfällen………………………………………... S. 79
5.1.3 Resultate der Verhaltensbatterie………….....…………………….……... S. 79
5.1.3.1 Überprüfung von Katalepsie…………………………………………….. S. 80
5.1.3.2 Überprüfung von Exploration, Lokomotion und Angst-assoziiertem
Verhalten…………………………………………………………………………… S. 80
5.1.3.3 Überprüfung der räumlichen Lern- und Gedächtnisleistung………… S. 84
5.1.3.4 Untersuchung von Depressions-assoziiertem Verhalten…………….. S. 87
5.1.4 Resultate der histologischen Auswertung……………………………….. S. 88
5.1.4.1 Histologische Auswertung in Thionin-Färbung……………………….. S. 89
5.1.4.2 Histologische Auswertung von repräsentativen Tieren in FJC………. S. 93
5.1.4.3 Auswertung in FJC- und GFAP-Markierung…………………………… S. 95
5.1.5 Korrelationen zwischen Neurodegeneration und
Verhaltensauffälligkeiten…………………………………………………………. S. 98
5.2 Etablierung des Pilocarpin-Modells sowie Unterschiede in der
Sensitivität bei Substämmen und Sublinien von B6-Mäusen (Studie 2)…….. S. 100
5.2.1.1 Etablierung des Pilocarpin-Modells für die B6-Maus………………… S. 100
5.2.1.2 EEG-Aufzeichnungen während Pilocarpin-Applikation.…...………… S. 102
5.2.2 Untersuchung von Tieren der Barrieren 8 und 9 im Pilocarpin-Modell.. S. 103
5.2.2.1 Reproduzierung der Sensitivitätsunterschiede im Pilocarpin-Modell.. S. 103
5.2.2.2 Absolvierung des Open-Fields von Tieren der Barrieren 8 und 9….. S. 107
5.2.2.3 Untersuchung von Tieren aus Barriere 8 und 9 im MEST….…….…. S. 107
5.2.3 Untersuchung weiterer B6-Barrieren im Pilocarpin-Modell.……...…….. S. 108
5.2.4 Überprüfung der F1-Generation im Pilocarpin-Modell………………….. S. 109
5.2.5 Detektion von spontanen Anfällen bei der F1-Generation……………... S. 110
5.2.6 Erneute Untersuchung von Tieren aus Barriere 9 sowie von B6J
im Pilocarpin-Modell…………………………………………………………...…. S. 111
5.2.7 Generierung der F2-Generation………………………………………….. S. 112
5.2.8 Untersuchung der F3-Generation im Pilocarpin-Modell……………….. S. 112
VII
5.3 Verhaltenscharakterisierung und histologische Untersuchung von
Pilocarpin-behandelten B6-Mäusen (Studie 3)…..…………………………….. S. 114
5.3.1 Detektion von spontanen Anfällen………….…………………………….. S. 114
5.3.2 Resultate der Verhaltensbatterie………….………………………………. S. 115
5.3.2.1 Eingangscharakterisierung………………………………………………. S. 115
5.3.2.2 Überprüfungen von Exploration, Lokomotion und Angst-assoziiertem
Verhalten…………………………………………………………………………… S. 116
5.3.2.3 Überprüfung der motorischen Fähigkeiten…………………………….. S. 123
5.3.2.4 Überprüfung der räumlichen Lern- und Gedächtnisleistung…………. S. 124
5.3.2.5 Untersuchung von Depressions-assoziiertem Verhalten…………….. S. 127
5.3.3 Resultate der histologischen Auswertung………………………………... S. 127
5.3.3.1 Histologische Auswertung 4 Wochen nach SE……………………….. S. 128
5.3.3.2 Histologische Auswertung 9 Monate nach SE………………………… S. 130
5.3.3.3 Vergleich der Zeitpunkte – 4 Wochen versus 9 Monate nach SE…... S. 133
5.3.3.4 Histologische Auswertung in FJC- und GFAP-Markierung…………... S. 134
6. Diskussion……………………………………………………………………… S. 137
6.1 Vergleich des LiCl-Pilocarpin- mit dem Pilocarpin-Modell (Studie 1).…... S. 137
6.2 Verhaltensphysiologische und histologische Charakterisierung von
(LiCl-) Pilocarpin-behandelten NMRI- (Studie 1) sowie B6-Mäusen
(Studie 3) ohne SE….……………………………………………………….. S. 139
6.3 FJC-Färbung der histologischen Schnitte der Pilocarpin-behandelten
NMRI- (Studie 1) sowie B6-Mäuse (Studie 3) mit SE…………………….. S. 141
6.4 Bewertung der histologischen Schnitte der chronisch epileptischen
NMRI- (Studie 1) sowie B6-Mäusen (Studie 3) in Thionin-Färbung…….. S. 143
6.5 Detektierung von spontanen Anfällen……………….……………………… S. 144
6.6 Vergleich der Verhaltensabweichungen von epileptischen B6- (Studie 3)
zu NMRI-Mäusen aus Studie 1 sowie aus GRÖTICKE et al. (2007).…… S. 144
6.7 Substammes- sowie Sublinienunterschiede bei B6-Mäusen im
Pilocarpin-Modell (Studie 2)………………………………………..……….. S. 152
7. Zusammenfassung…………………………………………………………… S. 159
8. Summary……………………………………………………………………….. S. 163
VIII
9. Literaturverzeichnis………………………………………………………….. S. 166
10. Anhang………………………………………………………………………… S. 183
10.1 Untersuchungsgang des Irwin-Tests..…………………………………….. S. 183
10.2 Protokoll der Thionin-Färbung……………………………………………… S. 189
10.3 Protokoll der FJC-Färbung…………………………………………………. S. 190
10.4 Protokoll der GFAP-Färbung……………………………………………….. S. 191
IX
Abkürzungsverzeichnis:
Abb. = Abbildung
ANOVA = Analysis of variance (Varianzanalyse)
Aqua dest. = Aqua destillata
bzw. = beziehungsweise
B6 = C57BL/6
CA = Cornu Ammonis (Ammonshorn des Hippocampus)
CC50 = Convulsive Current bei 50% der Tiere
cm = Zentimeter
CV = Cued-Version des Morris-Water-Maze
DAB = 3,3'-Diaminobenzidin
d.h. = das heißt
EEG = Elektroencephalogramm
EPM = Elevated-Plus-Maze
FJC = Fluoro-Jade-C
GABA = Gamma-Amino-Buttersäure
GFAP = Glial fibrillary acidic protein
HB = Hole-Board-Test
Hz = Hertz
i.m. = intramuskulär
i.p. = intraperitoneal
JAX = Jackson Laboratory
kg = Kilogramm
LiCl = Lithiumchlorid
LDB = Light-Dark-Box
log = Logarithmus
m = männlich
mA = Milliampere
mEq = Milliequivalent
MEST = Maximal electroshock seizure threshold
mg = Milligramm
X
Min. = Minute(n)
ml = Milliliter
mm = Millimeter
MWM = Morris-Water-Maze
µl = Mikroliter
M1 = Subtyp muscarinerger Rezeptoren
M1P = Myo-Inositol-1-Phosphat
N = Norden
NaCl = Natriumchlorid
NMDA = N-Methyl-D-Aspartat
NOE = Novel-Object-Exploration-Test
O = Osten
OP = Operation
OF = Open-Field
Pilo = Pilocarpin
QTL = Quantitative Trait Loci
RT = Retention-Test des Morris-Water-Maze
s = Sekunden
S = Süden
s.c. = subcutan
SE = Status epilepticus
SEM = Standard error of the mean (Mittelwertfehler)
SNP = Single Nucleotid Polymorphismen
Tab. = Tabelle
TLE = Temporallappenepilepsie
w = weiblich
W = Westen
z. B. = zum Beispiel
°C = Grad Celsius
% = Prozent
# = Barriere
XI
XII
Einleitung
1. Einleitung
Epilepsien zählen zu den häufigsten neurologischen Erkrankungen. Sie stellen eine
Gruppe von heterogenen Syndromen dar und betreffen mehr als fünfzig Millionen
Menschen weltweit (STABLES et al. 2002). Epilepsien werden als Krankheiten des
Gehirns definiert, welche sich durch eine bestehende Prädisposition, spontan
epileptische Krampfanfälle entstehen zu lassen, sowie durch neurobiologische,
kognitive sowie psychosoziale Folgen dieser Anfallsgeschehen auszeichnen
(FISHER et al. 2005). Die Definition Epilepsie erfordert die Ausprägung von mehr als
einem epileptischen Anfall (FISHER et al. 2005).
Jedoch schränken nicht nur die direkten klinischen Auswirkungen der Krampfanfälle
die Lebensqualität der Epilepsiepatienten erheblich ein. Etwa 28 bis 58% der
Epilepsiekranken sind zusätzlich von Epilepsie-assoziierten Komorbiditäten betroffen
(POHLMANN-EDEN 2000). Die höchste Prävalenz haben die psychischen
Begleiterkrankungen,
insbesondere
Depressionen,
Angsterkrankungen
und
Psychosen (BORO u. HAUT 2003). Zudem erleiden 70% der Patienten mit
Temporallappenepilepsie
(TLE)
erhebliche
Einbußen
im
Lern-
und
Gedächtnisvermögen (HELMSTAEDTER u. KOCKELMANN 2006).
Infolgedessen ergibt sich die Notwendigkeit, Tiermodelle zu generieren, welche nicht
nur ein Modell für chronische Epilepsie darstellen, sondern auch psychische sowie
kognitive Verhaltensänderungen zeigen, welche sich in einer Verhaltensbatterie
detektieren lassen. Denn bislang werden die Mechanismen, die der Assoziation
Epilepsie/psychische Störungen zugrunde liegen, noch nicht hinreichend verstanden
(HERMANN et al. 2000).
In der Arbeitsgruppe Löscher konnte anhand von zwei Studien (GRÖTICKE et al.
2007,
2008)
dargestellt
Auszuchtstammes
NMRI
werden,
dass
in
Epilepsiemodellen
zwei
chronisch
epileptische
(Pilocarpin,
Mäuse
Kainat)
des
in
verhaltensphysiologischen Untersuchungen im Vergleich zu gesunden Kontrolltieren
Abweichungen zeigen. Als Untersuchungsparameter sind eine Überprüfung von
Exploration und Lokomotion, von Angst-assoziiertem Verhalten, von motorischen
Fähigkeiten, von Depressions-assoziiertem Verhalten sowie von räumlicher Lernund Gedächtnisleistung zu nennen.
1
Einleitung
Im
Rahmen
der
Auszuchtmausstamm
PhD-Arbeit
NMRI
wurde
weitergehend
das
Pilocarpin-Modell
charakterisiert
sowie
für
den
für
den
Inzuchtmausstamm C57BL/6 (B6) etabliert. Der Mausstamm B6 wurde in der
vorliegenden Arbeit – analog zu GRÖTICKE et al. (2007) – im Pilocarpin-Modell
verhaltensphysiologisch sowie histologisch untersucht. Das Ziel der Studie bildet die
Erfassung von Verhaltensänderungen bei epileptischen B6-Mäusen, um dieses
Modell anschließend langfristig gesehen zur Untersuchung der Mechanismen von
Komorbiditäten einsetzen zu können.
2
Literaturübersicht
2. Literaturübersicht
2.1. Epilepsien
Der Begriff Epilepsie leitet sich vom griechischen Wort epilambánein (anfassen,
befallen) ab und stellt hiermit bereits sprachlich das offensichtlichste klinische
Merkmal dieser Erkrankung dar: den epileptischen Krampfanfall (ELGER 2002). Von
epileptischen Anfällen können alle Funktionssysteme im Gehirn betroffen sein. Als
klinische Symptome sind Zuckungen, Krämpfe oder Stürze zu nennen, aber auch
Sinnessysteme können betroffen sein. Letzteres spiegelt sich in der Wahrnehmung
von epigastrischen oder olfaktorischen Auren sowie visuellen Halluzinationen wider.
Ferner
können
während
eines
epileptischen
Anfalls
Veränderungen
des
Bewusstseins, der Sprache, des Gedächtnisses oder auch der Befindlichkeit
existieren. Bisweilen werden komplexe Handlungen wie automatisch weitergeführt
(ELGER 2002).
Das Risiko, einmal im Leben einen epileptischen Anfall zu erleiden, ist nicht gering:
10% der 80-jährigen erleiden während ihres Lebens einen einzelnen Krampfanfall
(ELGER 2002). Von der Erkrankung Epilepsie spricht man jedoch erst, wenn mehr
als ein epileptischer Anfall auftritt (FISHER et al. 2005). Je nach geographischer
Lokalisation haben Epilepsien eine Prävalenz zwischen 0,5 und 1 %, die Inzidenz
beträgt 40 bis 200 pro 100000 Menschen (SANDER u. SHORVON 1996). In
Minnesota (USA) betrug die Inzidenz von Epilepsien in den Jahren 1935 bis 1984
44 pro 100000 Personen, von welchen signifikant mehr Männer als Frauen betroffen
waren (HAUSER et al. 1993). In der Bundesrepublik Deutschland liegt die Prävalenz
von Epilepsien bei etwa 800000 Betroffenen, jährlich erkranken 40000 Menschen
neu (ELGER 2002). Bei Säuglingen unter 12 Monaten ergibt sich eine Inzidenz von
145,8 Neuerkrankungen pro 100000 Kindern (FREITAG et al. 2001). Epilepsien
zählen infolgedessen zu den häufigsten neurologischen Erkrankungen (ELGER
2002).
Auch bei verschiedenen Tierarten, vor allem bei Hund und Katze, gelten Epilepsien
als häufig, wobei sie hinsichtlich Symptomatik und Häufigkeit vergleichbar mit denen
des Menschen sind (LÖSCHER 2003). Epilepsien stellen in der Veterinärmedizin die
3
Literaturübersicht
wichtigste chronische Hirnerkrankung dar, welche pharmakotherapeutisch behandelt
wird (LÖSCHER 2003).
2.2 Einordnung der Epilepsien
In der Humanmedizin werden epileptische Anfälle und Epilepsien nach der
„Kommission der Internationalen Liga gegen Epilepsie“ (ILAE) international
klassifiziert. Wie SCHMIDT (1992a) ausführt, werden epileptische Anfälle in fokale
(partielle) und generalisierte Anfälle unterteilt. Fokale Anfälle haben ihren Ursprung in
einer umschriebenen Hirnregion, von welcher sie sich über weitere Gehirnareale
ausbreiten können. Infolge der Ausbreitung können schließlich beide Hemisphären
betroffen sein, dies bezeichnet man als sekundäre Generalisierung. Als besonders
epileptogen gelten der motorische Cortex sowie die Hippocampus-Amygdala-Region.
Bei fokalen Anfällen werden einfach fokale (ohne Bewusstseinsstörung) und komplex
fokale (mit Bewusstseinsstörung) unterschieden (SCHMIDT 1992a). Bei primär
generalisierten Anfällen sind von Beginn an beide Hemisphären des Gehirns von
epileptischer Aktivität betroffen, infolgedessen kann das Bewusstsein gestört sein.
Motorische Erscheinungen treten bilateral auf (INTERNATIONALE LIGA GEGEN
EPILEPSIE). Diagnose und Klassifikation von epileptischen Anfällen und Epilepsien
werden üblicherweise anhand eines Elektroencephalogramms (EEG) ermittelt. Das
EEG zeichnet im Zeitverlauf Differenzen zwischen den elektrischen Potenzialen an
Lokalisationen des Schädels auf, welche gepaart angeordnet sind (FISHER 1989).
Iktale (während des Anfalls) Veränderungen im EEG bei primär generalisierten
Anfällen
sind
bilateral
zu
beobachten
(INTERNATIONALE
LIGA
GEGEN
EPILEPSIE). Eine Übersicht über die EEG-Veränderungen bei verschiedenen
Anfallstypen stellt Tabelle 2.1 dar:
4
Literaturübersicht
Klinischer Anfallstyp
Iktale EEG-Charakteristik
A. 1. Absencen
a) mit Bewusstseinsstörung
b) mit milden
Komponenten
myoklonischen
c) mit atonischen Komponenten
Gewöhnlich reguläre und
symmetrische 3/sec oder
auch 2-4/sec Spike-andslow-wave-Komplexe, evtl.
Poly-spike-and-slow-waveKomplexe.
Die
Abnormitäten sind bilateral.
d) mit tonischen Komponenten
Interiktale
Charakteristik
EEG-
Gewöhnlich
normale
Hintergrundaktivität, wobei
paroxysmale
Aktivität
auftreten kann (wie Spikes
oder Spike-and-slow-waveKomplexe).
Diese
Aktivität
ist
gewöhnlich regelmässig und
symmetrisch.
e) mit Automatismen
f) mit vegetativen Komponenten
(b bis f können allein oder in
Kombination auftreten)
2. Atypische Absencen
Stärker heterogenes EEG;
es kann irreguläre Spikeand-slow-wave-Komplexe
einschliessen,
schnelle
Aktivität
oder
andere
paroxysmale Aktivität. Die
Abnormitäten
sind
beidseitig, aber oft irregulär
und asymmetrisch.
Gewöhnlich
abnorme
Hintergrundaktivität;
die
paroxysmale Aktivität (z.B.
Spikes und Spike-and-slowwave-Komplexe) ist häufig
irregulär und asymmetrisch.
Poly-spikes-and-wavesKomplexe,
in
anderen
Fällen
Spikes-and-waves
oder
Sharp-and-slowwaves.
Wie iktal.
C. Klonische Anfälle
Schnelle Aktivität (10/sec
oder schneller, sharp wave)
und
langsame
Wellen
(wave); gelegentlich Spikeand-wave-Muster.
Spike-and-wave- oder Polyspike-and-waveEntladungen
D. Tonische Anfälle
Kleinamplitudige
schnelle
Aktivität oder ein schneller
Rhythmus von 9-10/sec
(sharp wave) oder darüber,
der
in
der
Frequenz
abnimmt
und
in
der
Amplitude zunimmt.
Mehr
oder
weniger
rhythmische
Entladungen
von Sharp-and-slow-waves
manchmal
asymmetrisch.
Die Hintergrundaktivität ist
oft nicht altersentsprechend.
Möglich sind:
a) ausgeprägtere
Tonusveränderungen als in A.1.
b) kein
Schluss
abrupter
Anfang
oder
B. Myoklonische Anfälle
Myoklonische Zuckungen (einzeln
oder multipel)
5
Literaturübersicht
E. Tonisch-klonische Anfälle
Rhythmus
von
10/sec
(sharp wave) oder schneller,
der während der tonischen
Phase in der Frequenz abund in der Amplitude
zunimmt und während der
klonischen Phase durch
langsame Wellen (wave)
unterbrochen wird.
Poly-spikes-and-waves oder
Spike-and-waveoder
manchmal Sharp-and-slowwave-Entladungen.
F. Atonische (astatische) Anfälle
Poly-spikes-and-waves oder
Abflachung
oder
kleinamplitudige
schnelle
Aktivität.
Poly-spikes-and-slowwaves.
(Kombinationen sind möglich, z.B. B und F, B und D)
Tab. 2.1: Übersicht über EEG-Veränderungen bei verschiedenen klinischen Anfallstypen (modifiziert
nach der INTERNATIONALEN LIGA GEGEN EPILEPSIE)
Laut SCHMIDT (1992b) werden Epilepsien und epileptische Syndrome vier Klassen
zugeordnet:
1. Fokale (lokalisationsbezogene, lokale, partielle) Epilepsien und Syndrome
2. Generalisierte Epilepsien
3. Epilepsien und Syndrome, die nicht als fokal oder generalisiert bestimmt werden
können (z.B. Neugeborenenkrämpfe)
4. Spezielle Syndrome (z.B. Fieberkrämpfe, akuter metabolischer oder toxischer
Anlass wie Alkohol, Medikamente, Eklampsie oder nichtketonische Hyperglykämie)
In der Veterinärmedizin wird üblicherweise nur zwischen generalisierten und fokalen
Epilepsien differenziert. Generalisierte Anfälle werden lediglich als generalisierte,
tonisch-klonische (Grand mal) Anfälle diagnostiziert. Diese können die einzige
Anfallsform einer generalisierten Epilepsie darstellen, oder sekundär nach fokalen
Anfällen bei einer partiellen Epilepsie auftreten. In der Humanmedizin gelten komplex
fokale Anfälle als die mit Abstand häufigste Epilepsieform (rund 40% aller
Epilepsiepatienten). Bei Haustieren scheinen fokale Anfälle (häufig in Kombination
mit sekundär generalisierten tonisch-klonischen
Anfällen)
ebenfalls
häufiger
aufzutreten als rein primär generalisierte Anfälle, wenn auch zu sagen ist, dass der
fokale Anfallsbeginn oft nicht erkannt oder diagnostiziert wird (LÖSCHER 2003).
6
Literaturübersicht
Nach SCHMIDT (1992b) wird in ätiologischer Hinsicht zwischen idiopathischen,
symptomatischen sowie kryptogenen Epilepsien differenziert. Der Begriff idiopathisch
bedeutet, dass keine andere Grunderkrankung der Epilepsie vorangeht oder diese
auslöst. Der Beginn idiopathischer Epilepsien ist üblicherweise altersgebunden,
ferner zeichnen sie sich durch klinische Symptome und charakteristische EEGVeränderungen sowie eine vermutete genetische Ätiologie aus. Symptomatische
Epilepsien treten als Folge einer bekannten oder vermuteten Erkrankung des
zentralen Nervensystems auf. Sie haben in der Regel keinen altersgebundenen
Beginn, ihr Verlauf, sowie die elektroklinischen Charakteristika werden von der
Grunderkrankung mitbestimmt. Alle übrigen Epilepsien, deren Ursache verborgen
oder nicht zu ergründen ist, werden mit dem Begriff kryptogen bezeichnet.
Kryptogene Epilepsien werden zwar als symptomatisch angesehen, ihre Ätiologie ist
jedoch nicht bekannt. Sie haben häufig einen altersgebundenen Beginn, jedoch sind
keine charakteristischen EEG-Veränderungen und klinischen Symptome vorhanden
(SCHMIDT 1992b).
Nach NOE und MANNO (2005) wird ein Status epilepticus (SE) als Zustand
anhaltender oder wiederkehrender Anfallsaktivität für mindestens 30 Minuten (Min.)
definiert und stellt einen medizinischen Notfall dar. Betroffene Patienten müssen
unmittelbar notärztlich behandelt werden, dennoch sterben 20% der sich im SE
befindenden Patienten, da der SE medikamentös nicht beendet werden kann. Ein SE
kann spontan auftreten oder durch Absetzen von antikonvulsiven Medikamenten
ausgelöst werden. Dies geschieht oft in Kombination mit Schlafentzug, Fieber,
Alkohol oder Alkoholentzug und tritt bei jedem zehnten Patienten mit Epilepsie auf
(SCHMIDT 1992b).
2.3 Temporallappenepilepsie
Die Temporallappenepilepsie (TLE) gilt als die häufigste Epilepsieform beim
Menschen (ENGEL 2001). Fokale Epilepsien treten bei 58,3% der Epilepsiepatienten
auf; der Anteil der Temporal-, Frontal-, Parietal- und Okzipitallappenepilepsien
beträgt bei den symptomatischen Epilepsien 11,1% sowie bei den kryptogenen
Epilepsien 25% (FREITAG et al. 2001).
7
Literaturübersicht
Als Hauptcharakeristika der TLE sind folgende zu nennen: Die Lokalisation der
Anfallsfoki befindet sich im limbischen System, insbesondere im Hippocampus, im
entorhinalen Cortex sowie in der Amygdala (CURIA et al. 2008). Die Darstellung des
Ablaufs der Epileptogenese findet sich in Abbildung 2.1 wieder (LÖSCHER et al.
2008). Häufig geht der Entwicklung einer chronischen Epilepsie ein initialer
Gehirninsult voraus, beispielsweise Fieberkrämpfe im Kindesalter, ein Gehirntumor,
ein Schlaganfall, eine Entzündung des Gehirns oder ein SE. An diesen Insult schließt
sich eine beim Menschen Jahre dauernde Latenzzeit an, in welcher keine klinischen
Symptome zu beobachten sind. Es folgt schließlich die chronische Phase der
Epilepsie mit dem spontanen und wiederkehrenden Auftreten von epileptischen
Anfällen. Ein hoher Prozentsatz der Epilepsiepatienten ist von einer mesialen oder
Cornu-Ammonis (CA)-Sklerose betroffen. Dies bedeutet, dass eine unilaterale Läsion
des Hippocampus zu Atrophie führt, typischerweise verursacht aufgrund eines
Verlusts an Neuronen wie auch einer Gliose im sogenannten Sommer’s-Sektor (die
Subiculum-CA 1-Übergangszone) und im Hilus des Gyrus dentatus (CURIA et al.
2008).
Abb. 2.1: Darstellung des Ablaufs der Epileptogenese (LÖSCHER et al. 2008).
8
Literaturübersicht
2.4. Epilepsie-assoziierte Komorbiditäten
Mehr als 50% aller erwachsenen Epilepsiepatienten sind von psychischen
Komorbiditäten betroffen (MACHLEIDT 2004). Bei der nicht-epileptischen USamerikanischen Bevölkerung lag im Jahre 2008 der Anteil von psychisch erkrankten
Personen bei 26,2% (NIMH 2008), also deutlich niedriger als bei Epilepsiepatienten.
Eine hohe Anfallsfrequenz bei Therapieresistenz geht häufig einher mit einem
geringeren
Ausbildungs-
und
beruflichen
Leistungsniveau,
weniger
guten
Ergebnissen in neuropsychologischen Tests sowie einem vermehrten Bestehen von
Schwierigkeiten im psychischen und sozialen Bereich (MACHLEIDT 2004). Ferner
besteht auch in heutiger Zeit eine gewisse gesellschaftliche Neigung zur
Stigmatisierung Epilepsiekranker, so dass eine Behinderung bei der beruflichen und
sozialen Eingliederung in die Gesellschaft zu diversen Verstimmungszuständen
führen kann (MACHLEIDT 2004).
Diskutiert wird eine Wechselbeziehung zwischen Epilepsie und psychischen
Komorbiditäten
(POHLMANN-EDEN
2000).
Treten
epileptische
Anfälle
als
Komplikation einer psychiatrischen Erkrankung auf, oder gelten psychische
Störungen als Komplikation eines epileptischen Geschehens? Für die erste Aussage
spricht, dass epileptische Anfälle den Verlauf psychischer Grunderkrankungen
komplizieren
können
und
gehäuft
bei
älteren
Patienten
mit
demenzieller
Grunderkrankung auftreten (MCAREAVEY et al. 1992). 9,1 % der Patienten mit einer
Demenzerkrankung sind von epileptischen Anfällen betroffen (MCAREAVEY et al.
1992). Nicht selten können epileptische Anfälle zudem bei psychopharmakologisch
behandelten
Patienten
mit
Schizophrenien
und
affektiven
Psychosen
als
Komplikation einer Neuro- bzw. Thymoleptikagabe beobachtet werden (POHLMANNEDEN 2000). Die zweite Hypothese befürwortend, lässt sich sagen, dass psychische
Auffälligkeiten bei Epilepsiepatienten infolge der epileptischen Anfälle selbst, der
cerebralen Grunderkrankung, der antikonvulsiven Medikation, der psychosozialen
Reaktionsmuster, oder infolge einer Kombination aus diesen Faktoren entstehen
können (POHLMANN-EDEN 2000). In einer Studie (THAPAR et al. 2005) konnte
gezeigt werden, dass depressive Symptome die Anfallshäufigkeit beeinflussen
9
Literaturübersicht
können und umgekehrt, so dass auf eine bidirektionale Korrelation zwischen dem
Auftreten von Depressionen und Epilepsien geschlossen wurde.
Grundsätzlich
lässt
sich
also
feststellen, dass die Grundlagen für
diese
Funktionsstörungen sehr vielfältig sind. Aufgrund eines Fehlens an Kontrolle über
potenziell signifikante Variable, wie den fokalen Ursprung des Anfalls und der
unterschiedlichen Anamnese der Patienten (beispielsweise Vorbehandlung mit
Medikamenten), ist es schwierig, diese Grundlagen in den Patienten selbst zu
untersuchen. Infolgedessen wird ein passendes Tiermodell benötigt, um mögliche
Grundlagen für Verhaltensänderungen bei der TLE zu identifizieren (HANNESSON
et al. 2005).
Derzeit besteht lediglich ein präliminäres Verständnis über die zusätzlichen
Belastungen, welche durch psychische Komorbiditäten bei chronischer Epilepsie
entstehen, obwohl die Prävalenz der Komorbiditäten signifikant erhöht ist
(HERMANN et al. 2000). Es gibt in der gegenwärtigen Literatur lediglich rudimentäre
Informationen bezüglich der Anwendung von Therapeutika bei depressiv erkrankten
Epilepsiepatienten, sowie bezüglich der generellen Folgen einer Depression, welche
als Komorbidität auftritt (HERMANN et al. 2000).
Weitere Forschung ist notwendig, um das Verständnis über die Mechanismen der
psychiatrischen Erkrankungen bei Epilepsien zu steigern. Ein Zuwachs an Wissen
und Erkenntnis der nachteiligen Wirkungen der Komorbiditäten hat das Ziel, die
mechanismen- und patientenorientierte Forschung sowie die klinische Behandlung
zu verbessern (GILLIAM et al. 2003).
Der Fokus der Forschung richtete sich in der Vergangenheit vorwiegend auf die
klinischen Folgen der Anfälle (beispielsweise Dauer der Erkrankung, Frequenz und
Schwere der Anfälle) oder auf die Wirkungsweise der Behandlung (wie Medikation,
operative Behandlung, Stimulation des Vagusnervs) und deren Auswirkungen auf die
Lebensqualität der Epilepsiepatienten (JOHNSON et al. 2004). Demgegenüber sind
der Grad, in welchem Komorbiditäten die Lebensqualität beeinflussen und die
relative Bedeutung der psychiatrischen Morbidität verglichen mit traditionellen
klinischen
Parametern
der
Epilepsie
neu
(JOHNSON et al. 2004).
10
aufkommende
Forschungsgebiete
Literaturübersicht
Es wurde eine Studie an Patienten durchgeführt, welche in den letzten sechs
Monaten mindestens einen epileptischen Anfall erlitten (GILLIAM et al. 2003).
Abbildung 2.2 verdeutlicht anhand der Ergebnisse der Studie, welch immense
Auswirkungen Epilepsie auf das tägliche Leben der Patienten hat, denn über 60%
der untersuchten Patienten fürchten um ihren Führerschein, 55% um ihre
Unabhängigkeit sowie über 50% der Epilepsiepatienten sorgen sich um ihren
Arbeitsplatz.
Abb. 2.2: Besorgnisse von Epilepsiepatienten (GILLIAM et al. 2003)
2.4.1 Depressionen
Die höchste Prävalenz der psychischen Komorbiditäten bei Epilepsiepatienten haben
depressive Symptome (GILLIAM u. KANNER 2002). So beträgt die Häufigkeit von
Depressionen bei Patienten mit TLE je nach Studie 30 (VICTOROFF et al. 1994) bis
39% (ALTSHULER et al. 1999), bei Epilepsiepatienten mit komplex partiellen
Anfällen sogar 57% (BLUMER et al. 1998). In einer weiteren Studie (THAPAR et al.
2005) galten 11,6% der Epilepsiepatienten als depressiv, 50,7% der untersuchten
Patienten waren mehr als ein Jahr anfallsfrei. Analog galten in der USamerikanischen Bevölkerung im Jahre 2008 9,5% der Erwachsenen als depressiv
erkrankt (NIMH 2008).
In einer weiteren Studie (LEHRNER et al. 1999) unternahmen 36% der Patienten
Aktivitäten mit der Familie zu Hause, jedoch nur 13% berichteten von sozialen und
nur 7% von kulturellen Aktivitäten außerhalb der eigenen Wohnung. 44,6% der
untersuchten TLE-Patienten galten als depressiv erkrankt, zwischen der Lokalisation
11
Literaturübersicht
des Anfallsursprungs im Gehirn und dem Auftreten von Depressionen konnte kein
signifikanter Unterschied detektiert werden (LEHRNER et al. 1999).
Depressionen werden unterteilt in schwere depressive Episoden mit psychotischen
Symptomen (einschließlich majorer Depressionen), Dysthymien sowie leichte
depressive Episoden aufgrund von Anzahl, Schwere und Chronizität der folgenden
Symptome: Deprimiertheit, Anhedonie, Wortlosigkeit, Schuldgefühle, herabgesetzte
Konzentrationsfähigkeit, wiederkehrende Todesgedanken wie auch neurovegetative
Symptome, insbesondere Gewichtsverlust oder Schlaflosigkeit (KANNER 2003). TLE
stellt einen Risikofaktor für das Auftreten von Depressionen bei Epilepsiepatienten
dar (BORO u. HAUT 2003).
Es werden gemeinsame pathogenetische Mechanismen zwischen Epilepsien, Suizid
und Depressionen vermutet (KANNER 2006). Eine Studie (HESDORFFER et al.
2000) stellt dar, dass majore Depressionen mit einem um den Faktor 6 erhöhten
Risiko
zur
Ausprägung
epidemiologischen
Studie
von
Krampfanfällen
von
FORSGREN
assoziiert
und
sind.
NYSTRÖM
Nach
einer
(1990)
treten
Depressionen signifikant häufiger bei Epilepsiepatienten im Vergleich zu gesunden
Kontrollen auf. Überdies zeigt eine weitere Studie (HESDORFFER et al. 2006), dass
eine Anamnese von majoren Depressionen oder versuchtem Suizid unabhängig
voneinander das Risiko von unprovozierten Anfällen und Epilepsie steigert.
Strukturelle und funktionelle Abnormalitäten und abnormale Gehirnsekretion von
Neurotransmittern, wie beispielsweise Serotonin, zählen zu den gemeinsamen
pathogenetischen Mechanismen von Epilepsien, Suizid sowie majore Depressionen
(KANNER 2006). So wird auf eine Beziehung zwischen abnormaler Serotoninaktivität
und
suizidalem
Verhalten
zu
verschiedenen
psychiatrischen
Erkrankungen
geschlossen (KANNER 2006). Bei depressiv erkrankten Patienten können
strukturelle Abnormalitäten oder Volumenverlust der Temporal- und Frontallappen
nachgewiesen werden (SHELINE 2003). Diskutiert werden als Ursachen die
neurotoxische Wirkung von Glukokortikoiden, eine geringere Konzentration des
Brain-derived-growth-factors, eine verminderte Neurogenese sowie ein Verlust der
neuronalen
Plastizität
(SHELINE
2003).
Ferner
dokumentiert
eine
neuropathologische Studie, dass an majoren Depressionen erkrankte Patienten im
12
Literaturübersicht
präfrontalen Cortex eine verminderte Dichte und Größe von Neuronen sowie von
Gliazellen aufweisen (RAJKOWSKA et al. 1999). Aufgrund dieser Daten ist es nicht
überraschend, dass Depressionen häufiger bei Patienten mit TLE auftreten als bei
gesunden Individuen (KANNER 2006). Die Hypothese, welche es für die Zukunft zu
klären gilt, lautet, dass eine rechtzeitige Behandlung der Depression das Risiko der
Entwicklung von unprovozierten epileptischen Anfällen oder sogar von Epilepsien
mindert (KANNER 2006).
Die Suizidrate liegt bei Epilepsiepatienten etwa um das Drei- bis Fünffache höher als
in der Normalbevölkerung (1,5-2%) (MACHLEIDT 2004). Nach einer Fallkontrollierten Studie (FUKUCHI et al. 2002) tritt Suizid bei 14% der verstorbenen
TLE-Patienten auf. Die Korrelation zwischen Suizid und TLE ist statistisch signifikant
(FUKUCHI et al. 2002). MAINIO et al. (2007) setzen in ihrer Studie die Daten des
Zeitpunkts der Diagnose Epilepsie, die Prävalenz von Depressionen sowie von
Suizid in Verhältnis zueinander (Abb. 2.3).
13
Literaturübersicht
Abb. 2.3: Korrelation zwischen der Komorbidität Depression, dem Auftreten von Suizid sowie dem
Zeitpunkt der Diagnose Epilepsie in einer Studie, welche im Norden Finnlands durchgeführt wurde
(MAINIO et al. 2007).
2.4.2 Angsterkrankungen
Auch Angsterkrankungen stellen eine nicht zu unterschätzende Komorbidität bei
Epilepsiepatienten dar. Nach einer epidemiologischen Studie ist die Anfallshäufigkeit
mit dem Auftreten von Angstzuständen positiv korreliert, denn nur 13% der Patienten
ohne derzeitige Anfallsaktivität, jedoch 29% mit weniger als einem Krampfanfall
14
Literaturübersicht
sowie 44% mit mehr als einem Krampfanfall pro Monat litten an Angstzuständen
(JACOBY et al. 1996). In einer weiteren Studie (PIAZZINI et al. 2001) konnte ein
signifikanter
Unterschied
zwischen
dem
Auftreten
von
Angststörungen
bei
Epilepsiepatienten zu gesunden Kontrollen festgestellt werden. Ferner ergab sich
eine erhöhte Prävalenz von Angsterkrankungen bei Patienten mit fokalen Anfällen im
Vergleich zu Patienten mit idiopathischer generalisierter Epilepsie. Patienten der TLE
waren am häufigsten von Angststörungen betroffen, insbesondere solche mit einem
Anfallsfokus im linken Temporallappen (PIAZZINI et al. 2001).
In der nicht-epileptischen Bevölkerung lag im Jahre 2008 die Prävalenz von
Angsterkrankungen bei 18,1% der erwachsenen US-Amerikaner (NIMH 2008).
Angsterkrankungen können präiktal (mehrere Stunden bis Tage vor dem Anfall),
iktal, interiktal (zwischen den Anfällen) sowie postiktal (Stunden bis Tage nach dem
Anfall
andauernd)
auftreten
(VAZQUEZ
u.
DEVINSKY
2003).
Die
iktalen
Angststörungen stellen sich üblicherweise als Angst, Furcht oder Besorgnis dar. Sie
treten bei Patienten mit TLE am häufigsten auf (VAZQUEZ u. DEVINSKY 2003).
Innerhalb
der
iktalen
Angsterkrankungen
wird
zwischen
Panikstörungen
(wiederkehrende unerwartete Panikattacken), generalisierten Angsterkrankungen
(fast täglich ausgeprägte Angst und Besorgnis über viele Angelegenheiten seit
mindestens 6 Monaten), Zwangsstörungen (wiederkehrende Zwangshandlungen,
treten nur selten bei Epilepsie auf) oder posttraumatischen Belastungsstörungen
(wiederkehrendes Trauma in Träumen oder Gedanken, emotionale Betäubung,
autonome Übererregung) differenziert. Letztere treten am häufigsten bei Patienten
mit limbischer Epilepsie auf, hierzu zählt auch TLE (VAZQUEZ u. DEVINSKY 2003).
2.4.3 Psychosen
Schließlich möchte ich an dieser Stelle auf eine weitere bedeutende Komorbidität,
die
Psychosen,
hinweisen,
welche
gleichfalls
die
Lebensqualität
der
Epilepsiepatienten stark beeinträchtigen.
Analog zu Angsterkrankungen können auch Psychosen in allen drei Stadien
auftreten: iktal (d.h. ein Ausdruck der Anfallsaktivität), postiktal (Auftreten innerhalb
von 7 Tagen nach dem Anfall) sowie interiktal (Vorkommen von Psychosen
15
Literaturübersicht
unabhängig von Anfällen) (KANNER 2000). Die interiktalen Psychosen haben bei
Epilepsiepatienten eine Häufigkeit von 9% (MENDEZ et al. 1993), die postiktalen
Psychosen eine Prävalenz von 6% (KANNER et al. 1996). Klinische Beobachtungen
zeigen bei TLE-Patienten einen erhöhten prozentualen Anteil an interiktalen
Psychosen, auch das Volumen der Amygdala bei Patienten mit TLE und Psychosen
ist erhöht (TRIMBLE u. VAN ELST 2003). Bei TLE-Patienten sowohl mit interiktalen,
als auch postiktalen Psychosen können psychomotorische Erregung, Feindlichkeit,
Misstrauen sowie Halluzinationen beobachtet werden (ADACHI et al. 2000). Eine
weitere Studie (KANEMOTO et al. 2001) stellt die enge Korrelation zwischen TLE
und interiktalen Psychosen dar. Es ergibt sich eine signifikante Korrelation zwischen
einem frühen Beginn der Epilepsie sowie einer Anamnese von anhaltenden
Fieberkrämpfen mit interiktalen Psychosen (KANEMOTO et al. 2001). Insbesondere
bei medialer TLE treten Psychosen häufig auf (KANEMOTO et al. 2001). Sowohl
Frontal- als auch Temporallappen können in die Pathophysiologie von postiktalen
Psychosen involviert sein (BORO u. HAUT 2003).
2.4.4 Kognitive Defizite
Zu
den
weitreichenden
Konsequenzen
von
Epilepsien
zählen
auch
Beeinträchtigungen von Lern- und Gedächtnisvermögen, denn das Gedächtnis ist
eine Funktion, welche unmittelbar von Temporallappenläsionen und funktionalen
Störungen
beeinflusst
wird
(MOTAMEDI
u.
MEADOR
2003).
TLE
betrifft
typischerweise das deklarative Gedächtnis (HELMSTAEDTER 2002), infolgedessen
haben fast 70% der TLE-Patienten große Schwierigkeiten, sich an Ereignisse und
persönliche Erfahrungen zu erinnern, es ist also insbesondere das episodische
Gedächtnis beeinträchtigt (HELMSTAEDTER u. KOCKELMANN 2006). Ferner
weisen etwa 30% der Patienten eine niedrige Intelligenz auf, welche sich in einem
Intelligenzquotienten
von
unter
85
widerspiegelt
(HELMSTAEDTER
u.
KOCKELMANN 2006). Eine weitere Studie (BEGHI et al. 2006) stellt dar, dass die
Prävalenz von Lerndefiziten in der gesunden Bevölkerung 2-10% sowie bei
Epilepsiepatienten 25% beträgt.
16
Literaturübersicht
Nach BROWN (2006) werden folgende Ursachen für die Defizite bei Lern- und
Gedächtnisvermögen von Epilepsiepatienten diskutiert: Die Grunderkrankung,
welche der Epilepsie zugrunde liegt, die direkten Auswirkungen der Krampfanfälle
sowie der paroxysmalen EEG-Veränderungen selbst, der Einfluss von Antiepileptika
oder auch die psychosozialen Folgen der Diagnose Epilepsie.
Epilepsiechirurgische Eingriffe haben oft einen erheblichen Einfluss auf die kognitive
Leistung (HELMSTAEDTER 2002). Während nach Resektion eines Teiles des
Temporallappens als Ursprungsort für die Krampfanfälle die epileptischen Anfälle
sehr erfolgreich kontrolliert werden können, erfolgt eine Verschlechterung der
Gedächtnisleistung,
wenn
Gehirngewebe
entfernt
wird,
welches
in
Gedächtnisfunktionen involviert ist (HELMSTAEDTER u. KURTHEN 2001). Ferner
gibt es Hinweise, dass bei Patienten nach einer linken Amygdalo-Hippocampektomie
rechte mesiale Strukturen verbale Gedächtnisfunktionen kompensieren können,
welche vor der Durchführung des chirurgischen Eingriffs mit dem linken mesialen
Gehirnlappen assoziiert waren (GRUNWALD et al. 1998).
Vermutlich liegt eine positive Korrelation zwischen der Anfallshäufigkeit und dem
Auftreten von Gedächtnisschwierigkeiten vor, denn nur 17% der anfallsfreien
Epilepsiepatienten zeigen im Gegensatz zu 21% mit 2-12 Anfällen pro Jahr, sowie zu
38% mit mehr als 12 Anfällen pro Jahr eine signifikante Verschlechterung der
Gedächtnisleistung (HELMSTAEDTER 2002).
2.4.5 Weitere Epilepsie-assoziierte Komorbiditäten
Sowohl Migräne als auch Epilepsien stellen chronische Erkrankungen dar, welche
sich aufgrund von wiederkehrenden neurologischen Attacken (Kopfschmerzen bzw.
Krampfanfällen) charakterisieren lassen (BIGAL et al. 2003). Die Prävalenz von
Migräne ist bei Epilepsiepatienten um den Faktor 2,4 höher als bei nichtepileptischen Personen (BIGAL et al. 2003). Als Risikofaktoren für das Auftreten von
Migräne bei Epilepsiepatienten gelten eine familiäre Anamnese von Migräne
(Erhöhung des Risikos um den Faktor 1,5) oder Epilepsien sowie weibliches
Geschlecht (OTTMAN u. LIPTON 1996).
17
Literaturübersicht
Als weitere Komorbidität von Epilepsien gelten Schlafstörungen (BAZIL 2003). Sie
können sowohl aufgrund der Krampfanfälle selbst als auch durch Antiepileptika
induziert werden (BAZIL 2003).
Etwa ein Drittel bis 50% der Patienten, welche von Epilepsien mit schwerem und
langwierigem Verlauf betroffen sind, zeigen charakteristische Persönlichkeitsveränderungen (POHLMANN-EDEN 2000). Insbesondere bei Patienten der
treten
eine
labile
Emotionalität
oder
Tendenzen
zum
Haftenden
TLE
(penible
Ordentlichkeit, Starrigkeit, Detailverliebtheit, Umständlichkeit) sowie Hyposexualität
auf (POHLMANN-EDEN 2000). Zu letzterem führt eine Unterbrechung von
Funktionssystemen, welche das Sexualverhalten steuern. Hier ist insbesondere das
limbische System zu nennen. Als Ursachen gelten epileptiforme Entladungen wie
auch hypothalamisch-hypophysäre Dysbalancen, welche teilweise aufgrund von
Antiepileptika
induziert
werden
können
(POHLMANN-EDEN
2000).
Die
Fruchtbarkeitsrate bei Frauen mit Epilepsien beträgt 60-80% im Vergleich zu
gesunden Frauen, bei Männern ist die Fruchtbarkeit nach einem Anfall reduziert,
insbesondere wenn es sich um eine komplex-partielle Epilepsie handelt (PENOVICH
2000).
2.5 Tiermodelle für Epilepsien
In der präklinischen Forschung von Epilepsien spielen Tiermodelle bei der Suche
nach neuen antiepileptischen Medikamenten, bei der Einschätzung von möglichen
spezifischen Wirksamkeiten von Substanzen gegen verschiedene Typen von
Anfällen oder Epilepsien, sowie schließlich bei der Definition der präklinischen
Wirksamkeit von neuen Antiepileptika während chronischer Anwendung eine
wichtige Rolle.
Ein ideales Tiermodell für Epilepsie sollte laut LÖSCHER (1999) folgende
Voraussetzungen erfüllen:
(1) Entwicklung von spontanen wiederkehrenden Anfällen
(2) Anfallstyp(en), die in der klinischen Ausprägung denen beim Menschen ähneln
(3) Paroxysmale EEG-Veränderungen ähnlich zu denen beim Menschen
18
Literaturübersicht
(4) Eine hohe Anfallsfrequenz für akute wie auch chronische Medikamentenwirksamkeitsstudien
(5) Die Phamakokinetik der Antiepileptika (v. a. die Eliminationsrate) sollte eine
Aufrechterhaltung von wirksamen Medikamentenspiegeln während chronischer
Behandlung gewährleisten.
(6) Wirksame Plasma- (und Gehirn-) Konzentrationen von Antiepileptika ähnlich zu
denen beim Menschen
2.5.1 Pilocarpin
Pilocarpin, ein Alkaloid, welches in den Blättern des Jaborandistrauches vorkommt
(AVANCINI et al. 2003), stellt einen Agonisten des Acetylcholinrezeptors dar,
welcher den M1-Muscarinrezeptorsubtyp aktiviert (HAMILTON et al. 1997). Dass
dieser maßgeblich an der Entwicklung von Anfallsgeschehen beteiligt ist, zeigt eine
Studie (HAMILTON et al. 1997), nach welcher M1-Rezeptor-knock-out-Mäuse auch
nach hohen Dosen von Pilocarpin keine Anfälle entwickeln, dagegen alle getesteten
Wildtyp-Mäuse. Es lässt sich ableiten, dass die M1-Rezeptor-knock-out-Mäuse
gegenüber Pilocarpin-induzierten Anfällen resistent sind. Dies verdeutlicht die
Bedeutung der M1-Rezeptoren für die Induzierung von Anfällen mittels Pilocarpin.
Ein Pilocarpin-induzierter SE kann ferner nach vorheriger systemischer Applikation
von Atropin, einem muscarinergen Antagonisten, unterdrückt werden (CLIFFORD et
al. 1987). Sind Anfälle allerdings bereits erfolgt, vermag Atropin diese nicht zu
beenden (CLIFFORD et al. 1987).
Eine in-vitro-Studie (PRIEL u. ALBUQUERQUE 2002) verdeutlicht, dass Pilocarpin
bei kultivierten hippocampalen Neuronen eine Imbalance zwischen exzitatorischer
und inhibitorischer Transmission verursacht, welche in der Generierung eines SE bei
Nagern
resultieren
kann.
Mittels
einer
in-vivo-Mikrodialyse-Studie
zeigen
SMOLDERS et al. (1997), dass Pilocarpin initial zu einem Absinken der
extrazellulären hippocampalen Glutamat- und Gammaaminobuttersäure- (GABA-)
Konzentration führt. Während der Anfälle jedoch steigen die extrazellulären
Glutamat-, GABA- und Dopaminkonzentrationen signifikant an. Diese Studie
verstärkt die Vermutung, dass Pilocarpin-induzierte Anfälle nach Initiation durch M1-
19
Literaturübersicht
Rezeptoren
im
Folgenden
über
N-Methyl-D-Aspartat
(NMDA)-Rezeptoren
aufrechterhalten werden. Auch GOODMAN (1998) stellt dar, dass die Initiation des
Anfalls auf der Aktivierung des cholinergen Systems beruht, während die
histopathologischen Veränderungen, Neuronenverlust und spontane wiederkehrende
Anfälle sekundär zur anfallsinduzierten Glutamatfreisetzung auftreten.
Das Pilocarpin-Modell wird bereits seit den achtziger Jahren bei Ratten (TURSKI et
al. 1983a; TURSKI et al. 1983b) wie auch Mäusen (TURSKI et al. 1984) als
Epilepsiemodell eingesetzt. Nach CURIA et al. (2008) stellen sich die wichtigsten
Eigenschaften
des
Pilocarpin-Modells
wie
folgt
dar:
Mittels
systemischer,
üblicherweise intraperitonealer (i.p.) Applikation wird in kurzer Zeit ein akuter SE
induziert. Anschließend erfolgt eine mehrwöchige Latenzzeit, nach welcher sich das
Auftreten von spontanen wiederkehrenden Anfällen anschließt, welche die
chronische Phase der Epilepsie markieren. Ferner treten weitläufige Läsionen im
Gehirn auf, von welchen einige in den gleichen Gehirnregionen lokalisiert sind wie
bei TLE-Patienten. Diese Läsionen sind assoziiert mit einer Reorganisation des
neuronalen Netzwerks in hippocampalen und parahippocampalen Regionen,
beispielsweise Mossy-Fiber-Sprouting, Verlust an Interneuronen sowie ektopische
Zellproliferation des Gyrus dentatus, welche Charakteristika sowohl für TLEPatienten als auch für Pilocarpin-behandelte epileptische Nager darstellen (WIESER
2004).
TURSKI et al. (1984) beschrieben bei Mäusen, dass konvulsive Dosierungen von
Pilocarpin (300 und 325 mg/kg) zu verschiedenen Verhaltensauffälligkeiten führen:
Initial treten eine Akinesie, Tremor am gesamten Körper, ein taumelnder, ataktischer
Gang sowie limbische, gustatorische Automatismen mit Salivation auf. Dieses
präkonvulsive Verhalten zeigt sich 5-10 Min. nach Pilocarpin-Injektion und leitet in
motorische limbische Anfälle mit Vorderextremitätenklonus, Aufrichten, teilweise mit
Umfallen und starker Salivation über. Während dieser Periode von motorischen
limbischen Anfällen weisen die Tiere zusätzlich stereotype Verhaltensweisen, wie
beispielsweise wiederholtes Kopfzucken, Putzen und Aufrichten, sowie bisweilen
Hochspringen auf. Motorische limbische Anfälle beginnen nach 10-18 Min., kehren
etwa alle 5-10 Min. wieder und erreichen ein maximales Auftreten von 6-8
20
Literaturübersicht
Krampfanfällen pro 30 Min. Die Periode limbischer Konvulsionen dauert bis zu 30-45
Min. nach Pilocarpinapplikation an und leitet rasch in einen SE über, welcher
manchmal jedoch zum Tode des Tieres führt (TURSKI et al. 1984)
Wie CURIA et al. (2008) darstellt, zeigen EEG-Aufzeichnungen während eines
Pilocarpin-induzierten SE, dass Pilocarpin sowohl iktale, als auch interiktale
epileptische Veränderungen auslösen kann. Ferner scheinen paroxysmale EEGVeränderungen mit Verhaltensänderungen korreliert zu sein. Zu beobachten sind zu
Beginn der EEG-Aufzeichnungen eine niedrige Amplitude sowie eine hohe Frequenz
in Neocortex und Amygdala. Ein deutliches Theta-Rhythmus-Muster ist im
Hippocampus zu erkennen. Mit zunehmender Ausprägung der Krampfanfälle ist die
elektrographische Anfallsaktivität durch hohe Spannung, schnelle EEG-Aktivität und
hervortretender Hoch-Spannungs-Spikes charaktierisiert, welche den Krampfanfällen
vorangehen (CURIA et al. 2008). Pilocarpin-injizierte Mäuse lassen im EEG für etwa
10 Stunden eine hohe Frequenz sowie hohe Amplitudenspikes erkennen. Das EEGMuster normalisiert sich erst nach bis zu drei Tagen wieder (BORGES et al. 2003).
In der Latenzphase nach dem SE, welche zwischen 5 und 54 Tagen andauert,
zeigen die Tiere ihr arttypisches Normalverhalten, ohne dass spontane Anfälle
auftreten (SHIBLEY u. SMITH 2002).
In der sich bei den Versuchstieren analog zur Epileptogenese beim Menschen
anschließenden chronischen Phase treten spontane wiederkehrende Anfälle auf
(CURIA et al. 2008). So kann das Pilocarpin-Modell aufgrund der Existenz der für die
Epileptogenese charakteristischen drei Phasen (akuter SE, Latenzphase, sowie das
Auftreten von spontanen wiederkehrenden Anfällen) als chronisches Epilepsiemodell
eingesetzt werden (CAVALHEIRO et al. 2006).
Üblicherweise
wird
für
das
Pilocarpin-Modell
ein
Bolus-Applikationsregime
verwendet, um einen SE auszulösen. Ferner werden üblicherweise männliche Tiere
eingesetzt. Tabelle 2.1 stellt eine Literaturübersicht über das Pilocarpin-Modell bei
verschiedenen Mausstämmen sowie über die unterschiedlichen verwendeten
Pilocarpin-Dosierungen
wie
auch
der
prozentualen
SE-Induktions-
und
Mortalitätsrate dar, sofern diese Werte angegeben wurden. Auch wenn zwei
Arbeitsgruppen (CHEN et al. 2005; TU et al. 2006) für B6-Mäuse eine hohe SE-
21
Literaturübersicht
Induktionsrate von über 80% angeben, ist die Auslösung eines SE bei B6-Mäusen
mittels Pilocarpin nicht trivial. Bei anderen Arbeitsgruppen liegt sie zwischen 12-58%
(SHIBLEY u. SMITH 2002; BORGES et al. 2003) bei einer Mortalitätsrate bis zu 64%
(BORGES et al. 2003). Oft wird die SE-Induktionsrate in der Literatur nicht genannt.
Auch die Definition eines SE in den verschiedenen Arbeitsgruppen stellt sich sehr
unterschiedlich dar. Bei TU et al. (2006), welche eine SE-Induktionsrate von über
90% bei B6-Mäusen beschreiben, wird ein SE als kontinuierliche motorische
Krampfaktivität ab Stadium 2 (RACINE 1972) gewertet. BORGES et al. (2003)
beschreiben eine SE-Induktionsrate von 12-58% bei B6-Mäusen und definierten
einen SE erst ab Stadium 3,5 (RACINE 1972).
In der Arbeitsgruppe Löscher ergaben Vorversuche mit verschiedenen Dosierungen
von Pilocarpin bei B6-Mäusen, welche vor Jahren von Frau Prof. H. Potschka sowie
von der ehemaligen PhD-Studentin Ina Gröticke durchgeführt wurden, eine nur
geringe SE-Induktions- und hohe Mortalitätsrate.
22
Nicht angegeben (Albino)
CD-1 (Harlan)
B6 (Harlan)
CF1 (Charles River, CR)
B6 (Jackson Laboratory,
JAX)
B6 (CR)
CD-1 (Harlan)
B6NHsd (Harlan)
CF1 (CR)
B6 (Harlan)
B6 (JAX)
FVB/N (JAX)
B6 (CR)
CD1 (CR)
FVB/N (CR)
B6 (Harlan)
Swiss
129Sv
B6
B6 (Harlan)
CF1
129(AB2.1)
129/SvTac
B6 (Harlan)
NMRI (HarlanWinkelmann)
CAVALHEIRO et al. 1996
SHIBLEY u. SMITH 2002
ZHANG et al. 2007
GRÖTICKE et al. 2007
320-340 mg/kg
200 mg/kg (Swiss)
250 mg/kg (129Sv)
300 mg/kg (B6)
265 mg/kg
275-310 mg/kg (CF1)
270-310 mg/kg
(129(AB2.1))
240 mg/kg (129/SvTac)
340 mg/kg
100 mg/kg fraktioniert
272-340 mg/kg
254-290 mg/kg
320-340 mg/kg
270-300 mg/kg
280-290 mg/kg
254-290 mg/kg (CF1)
247-335 mg/kg (B6JAX)
300-315 mg/kg (B6CR)
340 mg/kg
280-290 mg/kg
Pilocarpin-dosis
100, 200, 300, 325, 350
und 400 mg/kg
Nicht angegeben
89 %
> 90%
30% (CF1)
91% (129(AB2.1))
38% (129/SvTac)
Nicht angegeben
Nicht angegeben
> 80% in jedem
Stamm
30%
Nicht angegeben
Nicht angegeben
Nicht angegeben
Nicht angegeben
38% (CD-1)
53% (B6)
33% (CF1)
12% (B6JAX)
58% (B6CR)
SE-Induktionsrate
75% (325 mg/kg)
Nicht angegeben
36 %
Nicht angegeben
Nicht angegeben
Nicht angegeben
Nicht angegeben
Nicht angegeben
(bei B6 „höher“)
19%
29,4%
59,3%
Nicht angegeben
Nicht angegeben
26% (CF1)
64% (B6JAX)
Für B6CR nicht
angegeben
Nicht angegeben
Mortalitätsrate
25% (325 mg/kg)
> 50% (350 mg/kg)
93% (400 mg/kg)
36%
21% (beide Stämme)
23
Tab. 2.1: Literaturübersicht über verschiedene Dosierungen sowie über die SE-Induktions- und Mortalitätsraten im Pilocarpin-Modell bei der Maus.
TU et al. 2006
BORGES et al. 2006
PENG u. HOUSER 2005
CARNEVALLI et al. 2006
CHEN et al. 2005
BORGES et al. 2004
PENG et al. 2004
SHIKHANOV et al. 2005
WINOKUR et al. 2004
BORGES et al. 2003
Mausstamm
Swiss
Literaturzitat
TURSKI et al. 1984
Literaturübersicht
Literaturübersicht
GLIEN et al. (2001) entwickelten in der Arbeitsgruppe Löscher ein fraktioniertes
Applikationsregime von Pilocarpin (10 mg/kg in 30-minütigen Intervallen) für Ratten
mit der Intention, die Mortalitätsrate zu senken sowie die SE-Induktionsrate zu
erhöhen. Der Prozentsatz an Ratten, welche einen SE entwickeln, unterscheidet sich
im fraktionierten Modell nicht signifikant von Ratten, welche Pilocarpin als Bolus
erhalten (GLIEN et al. 2001). Die Mortalität jedoch kann laut GLIEN et al. (2001) bei
einem 90-minütigen SE mittels fraktionierter Applikation von 45% (Bolus) auf 10%
gesenkt werden. GRÖTICKE et al. (2007) etablierten in der Arbeitsgruppe Löscher
das fraktionierte Applikationsregime von Pilocarpin für die NMRI-Maus. Die
Dosierung von Pilocarpin beträgt 100 mg/kg. In Vorversuchen konnte gezeigt
werden, dass es für die Entwicklung eines SE nicht ausreicht, bis zum 1.
Krampfanfall Pilocarpin zu applizieren. Pilocarpin muss in 20-minütigen Intervallen
bis zur Erlangung eines SE injiziert werden.
Bei Ratten wird Pilocarpin häufig in Kombination mit Lithiumchlorid (LiCl) eingesetzt
(CLIFFORD et al. 1987), welches üblicherweise in einer Konzentration von 3 mEq/kg
12-24 Stunden vor Injektion von Pilocarpin appliziert wird. Eine Vorbehandlung mit
LiCl resultiert bei Ratten in einer fast 20-fachen Verschiebung der Pilocarpin-DosisWirkungskurve, um Krampfanfälle auszulösen (CLIFFORD et al. 1987). JOPE et al.
(1986) merken an, dass eine Verabreichung von LiCl den prokonvulsiven Effekt von
Pilocarpin potenziert, so dass die erforderliche Dosis an Pilocarpin, um Anfälle
auszulösen,
verringert
werden
kann.
Hierfür
könnten
sich
folgende
Wirkungsmechanismen von LiCl als bedeutsam zeigen: LiCl verringert die
Freisetzung von Noradrenalin und Dopamin an stimulierten Nervenendigungen
(CLIFFORD et al. 1987). Eine Studie von ARNOLD et al. (1973) stellt dar, dass den
permanenten Veränderungen in der Anfallsempfindlichkeit nach wiederholter
elektrischer Stimulierung im limbischen System cholinerge und catecholaminerge
neuronale Netzwerke zugrunde liegen. So wird vermutet, dass cholinerge Netzwerke
im limbischen System eine wichtige Rolle bei der Ausbreitung von epileptiformen
Entladungen innerhalb des limbischen Systems spielen und die Wahrscheinlichkeit
erhöhen, dass noradrenerge oder dopaminerge Netzwerke antagonstisch zu
cholinerg induzierten Krampfanfällen wirken (ARNOLD et al. 1973). LiCl scheint
24
Literaturübersicht
ebenso einen direkten Einfluss auf die cholinerge Funktion zu haben: Es steigert die
Freisetzung von Acetylcholin in-vitro, jedoch nicht in-vivo bei Ratten nach 35minütigem SE (JOPE u. MORRISETT 1986). Ferner kann LiCl Veränderungen in der
muscarinergen Bindung hervorrufen (CLIFFORD et al. 1987) sowie Wirkungen auf
die Konzentrationen von Myo-Inositol im frontalen cerebralen Cortex, im Cerebellum
sowie im Corpus callosum bei Ratten haben (ALLISON et al. 1980). In das InositolPhospholipid-Second-Messenger-System vermag es einzugreifen, indem es die freie
Inositol-Konzentration
verringert
und
das
Myo-Inositol-1-Phosphat
(M1P)
im
cerebralen Cortex von Ratten steigert. Letzteres geschieht vermutlich aufgrund von
einer Inhibition der Myo-Inositol-1-Phosphatase (CLIFFORD et al. 1987). Pilocarpin
alleine führt lediglich zu einem vierfachen Anstieg von M1P, die Kombination aus LiCl
und Pilocarpin dagegen verursacht einen 40-fachen Anstieg von M1P (CLIFFORD et
al. 1987).
Bei Mäusen wird die Kombination aus LiCl und Pilocarpin nur selten verwendet.
MAZARATI
(2004)
injizierten
Galanin-Rezeptor-knock-out-Mäusen
mit
B6-
Hintergrund zur SE-Induzierung 3 mEq/kg LiCl sowie 16-24 Stunden später
Pilocarpin in einer Dosierung von 150 mg/kg. In einer weiteren Studie (LI et al. 2008)
wurde Balb/c-Mäusen ebenfalls 3 mEq/kg LiCl bei einer 24 Stunden später folgenden
Pilocarpin-Dosierung von 280-340 mg/kg verabreicht. SHALDUBINA et al. (2007)
applizierten knock-out-Mäusen 3 oder 10 mEq/kg LiCl bei einer Pilocarpin-Dosierung
von 100 mg/kg. Limbische Krampfaktivität entstand nur bei Mäusen, welche die
höhere Dosierung von LiCl erhielten. Die Sensitivität hinsichtlich der Wirkungen von
Pilocarpin scheint bei Mäusen im Vergleich zu Ratten höher zu sein, denn die
konvulsive Pilocarpindosis liegt nah an der letalen Dosis (TURSKI et al. 1983a;
TURSKI et al. 1984).
Um die peripheren Wirkungen von Pilocarpin zu unterbinden, wird üblicherweise
30
Min.
vor
Pilocarpin-Injektion
die
antimuscarinerg
wirkende
Substanz
Methylscopolamin appliziert, da diese die Blut-Hirn-Schranke nicht passiert und
infolgedessen mit den zentralen Wirkungen Pilocarpins nicht interferieren kann.
Ohne diese Vorbehandlung mit Methylscopolamin zeigen die Tiere nach Injektion
von Pilocarpin klassische Zeichen einer peripheren cholinergen Stimulation,
25
Literaturübersicht
einschließlich Piloerection, Salivation, Tremor, Chromodacryorrhoe (Sekretion aus
den Harderschen Drüsen bei Nagern) und Diarrhoe (CLIFFORD et al. 1987).
2.5.2 Weitere Epilepsiemodelle
2.5.2.1 Kainat
Kainat wurde ursprünglich aus dem Seetang Digenea simplex extrahiert (GOODMAN
1998). Es ist ein Analogon des Glutamat, einem exzitatorischen Neurotransmitter,
und bindet an einen Teil der Glutamatrezeptoren (GOODMAN 1998). Ähnlich zum
Pilocarpin-Modell stellt das Kainat-Modell ebenfalls sowohl ein akutes (SE) als auch
ein chronisches Modell für Epilepsie dar, indem es gleichfalls zu spontanen
wiederkehrenden Anfällen (WILLIAMS et al. 2007) sowie Neuronenverlust führt
(FISHER 1989). Nach systemischer Applikation von Kainat tritt Neurodegeneration
bei Mäusen der Stämme FVB/N sowie 129/SvEMS, jedoch nicht bei B6- oder
BALB/c-Mäusen auf (SCHAUWECKER u. STEWARD 1997). Im Gegensatz hierzu
tritt nach fokaler intrahippocampaler Kainat-Applikation auch bei B6-Mäusen
Neuronenverlust auf (SCHAUWECKER 2002b). In der Arbeitsgruppe Löscher wurde
das intrahippocampale Kainat-Modell für die NMRI-Maus etabliert (GRÖTICKE et al.
2008).
2.5.2.2 Elektroschock
Als Elektroschock wird die generalisierte elektrische Stimulation des Gehirns
bezeichnet (PETERSON 1998). Experimentelle Techniken, welche bei Nagern
verwendet werden, leiten elektrischen Strom zwischen den Augen oder den Ohren
von der rechten zur linken Seite in kürzester Zeitdauer (YANG et al. 2003). Diese
generalisierte Stimulation induziert Neuronen, wiederholt und synchronisiert zu
feuern, welches das Charakteristikum von Neuronen im epileptischen Netzwerk
sowie von Epilepsien bildet (PETERSON 1998). Das Tier entwickelt motorische
Konvulsionen, dessen Stärke abhängig von der Intensität des elektrischen
Stimulationsstromes ist (PETERSON 1998). Niedrige Stromstärken (unter 20 mA bei
Ratten bzw. unter 5 mA bei Mäusen) aktivieren lediglich das Vorderhirn und
verursachen ein ausschließlich klonisches Anfallsgeschehen, höhere corneale
26
Literaturübersicht
Elektroschock-Ströme hingegen aktivieren Mechanismen des Hirnstammes und
führen beim Versuchstier zu tonisch-klonischen Konvulsionen (PETERSON 1998).
2.5.2.3 Elektrische Stimulierung
Der Tractus perforans enthält Axone von glutamatergen Neuronen und verbindet im
Gehirn den entorhinalen Cortex mit dem Gyrus dentatus im Hippocampus.
Elektrische Stimulierung des Tractus perforans mittels bipolarer Elektroden kann
hippocampale Anfälle induzieren (GOODMAN 1998).
Die Amygdala liegt im medialen Teil des Temporallappens im Gehirn. Versuche der
Arbeitsgruppe Löscher bei Ratten zeigen, dass anhaltende elektrische Stimulation
der basolateralen Amygdala zur Ausprägung eines SE sowie darauf folgenden
spontanen Anfällen führt (BRANDT et al. 2003).
2.5.2.4 Kindling
Beim Kindling führt eine wiederholte elektrische Stimulierung in verschiedenen
Gehirnarealen zu einer gesteigerten elektrischen Erregung im Gehirn (FISHER
1989). Nach einigen Tagen der Stimulation ergeben sich aus den Stimulierungen
elektrische Nachentladungen, welche stufenweise mit jedem Kindlingstimulus
komplexer und anhaltender werden. Zu diesem Zeitpunkt bezeichnet man das Tier
als „gekindelt“ (FISHER 1989). Wenn dies für einige Wochen fortgesetzt wird,
entwickeln die Tiere spontane wiederkehrende Anfälle und infolgedessen eine
chronische Epilepsie (PINEL u. ROVNER 1978).
2.5.2.5 Genetische Epilepsiemodelle
Es gibt verschiedene Epilepsie-anfällige Mausstämme, welche aus spontanen
Mutationen entstanden sind. Einige dieser Syndrome sind einzelnen Genmutationen
zuzuordnen, einschließlich der Tottering-, Stargazer- und Lethargic-Stämme
(NOEBELS 2001). Im Gegensatz hierzu unterliegen den audiogenen Krämpfen der
DBA/2-Mäuse und den Handling-induzierten Anfällen der EL-Mäuse komplexe
Erbgänge (TECOTT 1998). Anhand von genetischen Epilepsiemodellen können
antikonvulsive Substanzen getestet werden (TECOTT 1998). Ferner bieten sie die
27
Literaturübersicht
Möglichkeit, Mechanismen zu untersuchen, worüber Gene Anfallsempfänglichkeit
verursachen können (TECOTT 1998).
2.6 Verhaltenstests für psychische und kognitive Veränderungen
Diverse verhaltensphysiologische Untersuchungsmethoden dienen der Messung von
psychischen und kognitiven Verhaltensweisen bei Nagern. Nachfolgend werden alle
Verhaltenstests beschrieben, welche in dieser Arbeit eingesetzt werden. Die
Gesamtheit der Verhaltenstests wird als Verhaltensbatterie bezeichnet. Die
Verhaltensbatterie umfasst eine Eingangscharakterisierung, Tests zur Überprüfung
von Katalepsie, von Exploration und Lokomotion, von Angst-assoziiertem Verhalten,
von motorischen Fähigkeiten, von räumlicher Lern- und Gedächtnisleistung sowie
von Depressions-assoziiertem Verhalten.
2.6.1 Eingangscharakterisierung und Überprüfung von Katalepsie
Eingangscharakterisierung: Irwin-Test
IRWIN
(1968)
entwickelte
eine
systematische
Beobachtungsmethode
zur
umfassenden Bewertung und Quantifizierung von Verhaltensmerkmalen sowie des
physiologischen Status einer Maus. Ferner dient der Irwin-Test der Erfassung der
Reaktionen von Mäusen auf verschiedene Substanzen. Irwin brachte die Prozedur in
eine standardisierte Form, so dass definierte Scores für bestimmte Verhaltensweisen
vergeben werden. Es erfolgt eine Messung von verhaltensphysiologischen
Parametern wie der Spontanaktivität sowie von motorisch-emotionalen Reaktionen
der Tiere. Ferner werden neurologische Untersuchungsparameter wie Haltung,
Gang, Gleichgewicht oder ZNS-Exzitation bewertet. Einen weiteren Parameter stellt
die mögliche Toxizität der applizierten Substanzen dar, hier ist insbesondere die
Mortalität zu nennen.
Überprüfung von Katalepsie: Bar-Test
Mittels des Bar-Tests wird Katalepsie von Nagern überprüft (SANBERG 1980;
JOHNSON u. STEVENS 1983). Wird ein gesundes Labortier in eine unnatürliche
Haltung verbracht, so korrigiert es seine Position innerhalb von wenigen Sekunden.
28
Literaturübersicht
Ein kataleptisches Tier hingegen verbleibt in dieser Haltung für einige Min. oder
sogar länger (SANBERG et al. 1988). Induziert werden kann Katalepsie durch
dopaminerge Antagonisten, wie beispielsweise den D2-Antagonisten Haloperidol
(SANBERG 1980). Nach Applikation von Haloperidol verharren Tiere nach
Platzierung der Vorderpfoten auf einem erhöht liegenden Gegenstand (SILVA et al.
1995).
2.6.2 Überprüfung von Exploration, Lokomotion und Angst-assoziiertem
Verhalten
Open-Field
Seitdem das Open-Field vor 70 Jahren entwickelt wurde (HALL u. BALLECHEY
1932), hat es den Status eines der am meisten benutzten Tests in der
psychologischen Überprüfung von Tieren erreicht (WALSH u. CUMMINS 1976).
Seine Popularität entstammt größtenteils aus der Einfachheit der Versuchsapparatur,
der leichten und schnellen Messung von klar definierten Verhaltensmerkmalen sowie
einer generell akzeptierten Interpretation dieser Verhaltensweisen. Ferner reagieren
die meisten dieser messbaren Verhaltensmerkmale hinsichtlich vieler genetischer,
physiologischer und pharmakologischer Beeinflussungen sensitiv (WALSH u.
CUMMINS 1976). Es wird Explorations- und Lokomotionsverhalten sowie nach heller
Beleuchtung der Apparatur Angst-assoziiertes Verhalten gemessen, da aufgrund der
stärkeren Lichtintensität die Aversivität der offenen Arena erhöht wird (WALSH u.
CUMMINS 1976).
Im Open-Field wird das Allgemeinverhalten der Tiere bewertet. Das Open-Field
besteht aus einer quadratischen oder runden Arena mit hohen umgebenden
Wänden, so dass die Tiere aus dieser nicht entfliehen können. Die Tiere werden
behutsam in die Mitte der für sie neuen Arena gesetzt und über einige Min.
beobachtet (WLÁZ 1998).
Novel-Object-Exploration-Test
Um sich auf eine stetig verändernde Umwelt einzustellen, ist es für Nager essenziell,
neue Stimuli zu erkunden (POWELL et al. 2004). Infolgedessen erzeugen neue
29
Literaturübersicht
Stimulationsparameter einen Konflikt zwischen der Annäherung an sowie der
Vermeidung von neuen Objekten bei Nagetieren, indem sowohl die Exploration
stimuliert
wird,
welche
notwendig
Nahrungsbeschaffungsverhalten),
als
zum
auch
Überleben
die
ist
Vermeidung
(beispielsweise
von
potenziell
bedrohlichen Situationen (POWELL et al. 2004). Gewöhnung entweder an das
Objekt
oder
den
Experimentator
aufgrund
von
Handling
verringert
das
Meidungsverhalten und steigert die Exploration von neuen Stimuli (POWELL et al.
2004). Verschiedene Mausstämme reagieren in unterschiedlicher Art auf die
Präsentation eines neuen Objektes (VAN GAALEN u. STECKLER 2000). Die
Reaktion variiert von Vermeidungsverhalten (A/J-Stamm) bis hin zur Annäherung an
das unbekannte Objekt (SW/J-Stamm). Zwei B6-Stämme von unterschiedlichen
Züchtern (Harlan-Winkelmann und Charles River) differieren ebenfalls in ihrer
Reaktion auf die Präsentation eines neuen Objekts (VAN GAALEN u. STECKLER
2000).
Hole-Board-Test
Der Hole-Board-Test wurde zu Beginn der sechziger Jahre entwickelt (BOISSIER
1964) und bietet eine einfache Möglichkeit, die Reaktion eines Nagetieres auf eine
unbekannte Umgebung zu untersuchen. Mittels der Frequenz des Erkundens der
Löcher der Apparatur (Head-Dips) wird bei den Tieren Exploration und Lokomotion
gemessen (FILE u. WARDILL 1975). Einen Vorteil bietet, dass diese Reaktionen
nicht nur beobachtet, sondern auch quantifiziert werden können (TAKEDA et al.
1998). Die Versuchsapparatur besteht aus einer Box mit einer definierten Anzahl von
Löchern in der Bodenfläche, welche die Tiere über eine definierte Versuchsdauer
erkunden können (TAKEDA et al. 1998).
Elevated-Plus-Maze
Das Elevated-Plus-Maze basiert auf dem natürlichen Konflikt von Nagern, einerseits
eine
neue
Umwelt
zu
explorieren
(Suche
nach
Futter,
Lebensräumen,
Sexualpartnern), andererseits aber auch offene, helle Flächen zu meiden, da diese
für Nager aufgrund der Angst vor Beutegreifern eine Gefahr darstellen (LAMBERTY
30
Literaturübersicht
u. GOWER 1996). Mittels der Versuchsapparatur wird diese Situation nachgeahmt,
da sie aus zwei offenen, erhöht gelegenen Armen und zwei rechtwinklig
angeschlossenen, von Wänden umrandeten, geschlossenen Armen besteht, welche
die Tiere über eine definierte Versuchsdauer frei explorieren können (HOLMES et al.
2003). Anxiolytisch wirkende Substanzen erhöhen die in den offenen Armen
verbrachte Zeitdauer, anxiogene Substanzen haben den gegenteiligen Effekt
(LISTER 1987).
Light-Dark-Box
CRAWLEY und GOODWIN (1980) entwickelten die Light-Dark-Box als einfaches
System, mit welchem sie gesteigertes Explorationsverhalten bei Nagern als Reaktion
auf die anxiolytische Wirkung von Benzodiazepinen nachweisen konnten. Die LightDark-Box stellt infolgedessen einen wichtigen Test dar, um Angst-assoziiertes
Spontanverhalten zu untersuchen. Ähnlich zum Elevated-Plus-Maze bietet sich
Nagern in der Light-Dark-Box einerseits die Möglichkeit, eine neue Umwelt zu
explorieren, andererseits jedoch haben offene, helle Flächen für die Tiere aversive
Eigenschaften. Die Light-Dark-Box besteht aus zwei Kompartments, von welchen
eines offen und hell, sowie das andere dunkel und geschlossen ist (CRAWLEY u.
GOODWIN
1980).
Verschiedene
anxiolytische
Substanzen
steigern
das
Explorationsverhalten von Mäusen in der Light-Dark-Box, anxiogene Substanzen
dagegen vermindern dies (COSTALL et al. 1989).
2.6.3 Überprüfung der motorischen Fähigkeiten
Rotarod-Test
DUNHAM und MIYA (1957) entwickelten das Rotarod als Neurotoxizitätstest. Im
Rotarod-Test wird bei Mäusen die Fähigkeit bewertet, auf einem rotierenden Stab zu
balancieren (BARLOW et al. 1996). Mäuse mit intakter motorischer Koordination
können diesen Test über eine Versuchsdauer von 60 s erfolgreich absolvieren
(CARTER et al. 1999). Um Unterschiede in Motivation und Lernvermögen bei den
Tieren auszuschließen, absolvieren die Tiere vor der Versuchsdurchführung mehrere
Probedurchläufe (KARL et al. 2003). Mäuse mit ausgeprägtem Defizit bezüglich
31
Literaturübersicht
motorischer Koordinationsfähigkeit haben Schwierigkeiten, auf dem rotierenden Stab
zu verbleiben (KARL et al. 2003).
Hanging-Wire-Test
Der Hanging-Wire-Test wurde von COUGHENOUR (1977) in den siebziger Jahren
entwickelt. Gemessen wird die neuromuskuläre Kraft von Mäusen (PAYLOR et al.
1998; MIYAKAWA et al. 2001a; MIYAKAWA et al. 2001b). Die Maus wird auf ein
Drahtgitter platziert, welches angehoben und umgedreht wird, so dass das Tier sich
am Gitter festhalten muss (KARL et al. 2003). Einen Vorteil des Hanging-Wire-Tests
stellt die Zeitersparnis dar, da der Test im Gegensatz zum Rotarod-Test an
untrainierten Mäusen durchgeführt werden kann. Ferner ist der Anteil an
Kontrolltieren, welche im Test versagen, geringer und der Hanging-Wire-Test zeigt
eine geringere Variabilität als der Rotarod-Test (COUGHENOUR et al. 1977). Häufig
wird der Test für Substanz-Screeningverfahren verwendet (WLÁZ 1998).
Chimney-Test
Beim Chimney-Test wird die Fähigkeit eines Tieres ermittelt, in einer Plastik- oder
Glasröhre innerhalb einer definierten Zeit rückwärts hochzuklettern. Kann ein Tier
diese Aufgabe nicht bewältigen, wird dies als Indikation für neurologische Defizite
gewertet. Ein gesundes Tier braucht üblicherweise 10 bis 20 s für die Absolvierung
des Chimney-Tests und benötigt hierfür kein vorangegangenes Training (WLÁZ
1998). Die hohe Variabilität der Zeitdauer, in welcher die Tiere das obere Ende der
Röhre erklettern, ermöglicht keine quantitative Messung der Zeit. Es wird lediglich
bewertet, ob das Tier innerhalb der vorgegebenen Zeit (z. B. 60 s) den Test besteht
oder nicht (WLÁZ 1998).
2.6.4. Überprüfung der räumlichen Lern- und Gedächtnisleistung: MorrisWater-Maze
Der Morris-Water-Maze-Test wurde zu Beginn der achtziger Jahre von MORRIS
(1984) entwickelt, um bei Ratten räumliche Lern- und Gedächtnisleistungen zu
überprüfen. Der Test ist für die Untersuchung von Arbeits- (veränderliche Inhalte) wie
32
Literaturübersicht
auch Referenzgedächtnis (feste Inhalte) geeignet. Erforderlich für eine erfolgreiche
Absolvierung des Morris-Water-Mazes ist die Integrität eines intakten Hippocampus
(STAFSTROM 2002). Ratten (EICHENBAUM et al. 1990) sowie Mäuse (LOGUE et
al. 1997) mit hippocampalen Läsionen absolvieren den Morris-Water-Maze
schlechter als Kontrolltiere. Dies verdeutlicht die Sensitivität des Tests hinsichtlich
hippocampaler Schädigung. Der Hippocampus scheint für Akquisition (Lernen von
neuen Inhalten) und Retrieval (Wiederabrufen von gelernten Inhalten) von räumlicher
Information sowie für Konsolidierung und Speicherung notwendig zu sein (D'HOOGE
u. DE DEYN 2001).
Im Morris-Water-Maze nutzt das Tier außerhalb eines Beckens befindliche
Hinweisreize, um schwimmend die Lokalisation einer Plattform zu orten, welche unter
der Wasseroberfläche versteckt liegt. Die Latenzzeit, welche das Tier benötigt, um
die Plattform aufzufinden, wird als Parameter für die erfolgreiche Absolvierung des
Tests gewertet (STAFSTROM 2002). Mäuse lernen im Morris-Water-Maze-Test
langsamer als Ratten, obwohl sie im Radial-Arm-Maze, einer Lernaufgabe, welche
nicht im Wasser stattfindet, zu Ratten vergleichbare Testergebnisse aufweisen
(WHISHAW u. TOMIE 1996).
2.6.5 Untersuchung von Depressions-assoziiertem Verhalten
Tail-Suspension-Test
Der Tail-Suspension-Test existiert seit den achtziger Jahren (TRULLAS et al. 1989).
Er wurde entwickelt, um mögliche antidepressive Verhaltensmerkmale von Nagern
zu messen. Der unausweichliche Stress, welchem die Tiere in diesem Test
ausgesetzt sind, gibt Auskünfte darüber, wie die Fähigkeit des Tieres ausgeprägt ist,
eine stressige Situation zu bewältigen (CRYAN et al. 2005). Dies kann mittels
pharmakologischer oder genetischer Manipulationen verändert werden (CRYAN et
al. 2005). Der Tail-Suspension-Test basiert auf der Beobachtung, dass Nager nach
Verbringung in eine Stresssituation, von welcher sie nicht entfliehen können, nach
initialen Fluchtbewegungen eine regungslose Körperhaltung einnehmen, welche als
Immobilität gewertet wird. Vorher applizierte antidepressiv wirkende Substanzen
33
Literaturübersicht
induzieren eine Verlängerung der aktiven Fluchtphase der Tiere (RIPOLL et al. 2003;
BOURIN et al. 2005).
Porsolt-Test
PORSOLT et al. (1977) entwickelten einen weiteren Screening-Test für antidepressiv
wirkende Substanzen bei Mäusen. Die Tiere werden in ein Behältnis mit Wasser
verbracht, aus welchem sie nicht entkommen können. Wie bereits beim TailSuspension-Test beschrieben, zeigen die Tiere in dieser unausweichlichen Situation
zunächst initiale Fluchtbewegungen. Nach einiger Zeit jedoch nehmen sie eine
regungslose Körperhaltung ein, welche analog zum Tail-Suspension-Test als
Immobilität beurteilt wird (PORSOLT et al. 1977, 1978). Eine Vorbehandlung mit
antidepressiv wirkenden Substanzen führt zu einer Verlängerung der Aktivitätsphase
der Tiere (PORSOLT et al. 1977, 1978; BAI et al. 2001; BOURIN et al. 2005; CERVO
et al. 2005). Mäuse zeigen bereits nach einmaligem Durchlauf des Porsolt-Test eine
stabile
immobile
Körperhaltung,
Ratten
hingegen
benötigen
hierfür
zwei
Versuchsdurchgänge (CRYAN et al. 2005).
2.6.6 Verhaltensphysiologische Charakterisierung von chronisch epileptischen
Mäusen
Es existieren nur wenige Literaturangaben zu Verhaltenscharakterisierungen von
Mäusen in Epilepsiemodellen. IKEGAYA et al. (2000) verabreichten juvenilen
Mäusen an Tag 14 Pilocarpin und stellen dar, dass Pilocarpin-behandelte Tiere in
einem an Tag 40 begonnenem Morris-Water-Maze-Test eine signifikant schlechtere
Lern- und Gedächtnisleistung präsentieren als gesunde Kontrolltiere.
In zwei Studien von MOHAJERI et al. (2003; 2004) wurden adulte B6-Mäuse bzw.
die adulte F1-Generation aus B6 x FVB-Hybriden 14 Tage nach Pilocarpin-Injektion
im Morris-Water-Maze getestet, in welchem sie gleichfalls eine schlechtere
Lernleistung als Kontrollen zeigten. Ferner präsentierte die Pilocarpin-injizierte
Gruppe im Open-Field-Test eine geringer ausgeprägte Exploration im Vergleich zu
Kontrollen (MOHAJERI et al. 2004).
34
Literaturübersicht
Eine umfassende verhaltensphysiologische Charakterisierung von NMRI-Mäusen in
der chronischen Phase ihrer Epilepsie fertigten in der Arbeitsgruppe Löscher
GRÖTICKE
et
al.
im
Pilocarpin-
(2007),
sowie
im
Kainat-Modell
mit
intrahippocampaler Kainat-Applikation (2008) an. Im Pilocarpin-Modell ergaben sich
für
die
untersuchten
epileptischen
NMRI-Mäuse
verschiedene
Verhaltensauffälligkeiten im Vergleich zu gesunden Kontrolltieren. Zu nennen ist
Angst-assoziiertes Verhalten im Irwin-Test, im Open-Field, im Hole-Board-Test, im
Novel-Object-Exploration-Test sowie in der Light-Dark-Box. Ferner zeigte sich eine
reduzierte Lokomotion im Irwin-Screen und in der Light-Dark-Box sowie ein
reduziertes Explorationsverhalten im Irwin-Screen, im Open-Field, im Hole-BoardTest, im Novel-Object-Exploration-Test und in der Light-Dark-Box. Im TailSuspension-Test sowie im Porsolt-Test war die kumulative Immobilitätszeit bei
epileptischen NMRI-Mäusen im Vergleich zu den Kontrollen reduziert. Im MorrisWater-Maze waren bei den epileptischen NMRI-Mäusen räumliche Lern- und
Gedächtnisdefizite nachzuweisen. Histologisch zeigten die epileptischen Tiere eine
ausgeprägte Neurodegeneration (GRÖTICKE et al. 2007).
Im Kainat-Modell ergaben sich für die untersuchten epileptischen NMRI-Mäuse
lediglich
diskrete
Verhaltensänderungen,
wie
beispielsweise
eine
geringere
Immobilitätszeit im Porsolt-Test, oder Lern- und Gedächtniseinbußen im Probe-Trial,
im Retention-Test sowie an Tag 2 der Cued-Version im Morris-Water-Maze.
Histologisch weist die ipsilaterale Seite des Gehirns in den Regionen CA 1, CA 3c
sowie im Hilus bei den Kainat-injizierten Tieren Neurodegeneration auf (GRÖTICKE
et al. 2008).
2.6.7 Bedeutung der verwendeten Mausstämme
Die Maus gewinnt als Tiermodell zunehmend an Bedeutung, da sie im Gegensatz
zur Ratte leicht gentechnisch manipuliert werden kann (DENNIS 2005). Es ist
wichtig, die Frage zu klären, warum Versuchstiere, bei denen als gesunde Individuen
Epilepsie
ausgelöst
wird,
Verhaltensstörungen
entwickeln,
während
bei
Epilepsiepatienten nur rund 50% von Komorbiditäten betroffen sind (MACHLEIDT
2004). In der Vergangenheit konnten einige Gene identifiziert werden, welche mit
35
Literaturübersicht
Epilepsien assoziiert sind (NOEBELS 2001), die genetische Prädisposition für
Epilepsien stellt sich jedoch komplex dar (SCHAUWECKER 2002a).
Die NMRI-Maus gilt als weit verbreiteter Auszuchtstamm mit einer großen Streuung
des genetischen Hintergrundes. B6-Mäuse dagegen bilden einen Inzuchtstamm.
Inzucht bedeutet, dass über mindestens 20 Generationen jeweils Vollgeschwister
miteinander verpaart werden, so dass dieser Stamm als genetisch identisch
(isogenetisch) bezeichnet werden kann (WOLFER et al. 2002).
Die geschichtliche Entwicklung von Inzuchtstämmen ist eng mit der Entwicklung von
Krebs-
sowie
immunologischer
Forschung
verbunden.
Ursprünglich
wurden
Inzuchtmausstämme entwickelt, um die genetische Basis für verschiedene Formen
von Krebs nachzuweisen. Inzuchtstämme spielen eine entscheidende Rolle in allen
Bereichen der biomedizinischen Forschung, da sie Forschern aus aller Welt
ermöglichen, reproduzierbare Experimente mit demselben genetischen Material
durchzuführen (MEKADA et al. 2009).
Transgene Mäuse, welchen ein endogenes Gen entfernt (knock-out-Mäuse) oder ein
exogenes Gen hinzugefügt wird, bieten vielfältige Möglichkeiten für die Untersuchung
von biologischen Funktionen (CRAWLEY et al. 1997). Mäuse des Stammes B6
stellen für die Genetik eine sehr große Bedeutung dar, da sie häufig für Verpaarung
und als Hintergrundstamm für spontane Mutationen verwendet werden (CRAWLEY
et al. 1997). Als Quantitative-Trait-Loci (QTL) werden Abschnitte eines Chromosoms
bezeichnet, welche Einfluss auf die Ausprägung eines quantitativen phänotypischen
Merkmals des betreffenden Organismus haben (FERRARO et al. 2004). Mittels des
Einsatzes von rekombinanten Inzuchtstämmen können Assoziationen zwischen
Verhaltensmerkmalen und QTL identifiziert werden (PLOMIN et al. 1991)
36
Zielsetzung
3. Zielsetzung
Bis zu 60% der Epilepsiepatienten leiden an mindestens zwei chronischen
Komorbiditäten,
ein
Drittel
der
Epilepsiekranken
ist
von
mindestens
drei
Komorbiditäten betroffen (WIEBE u. HESDORFFER 2007). Die Diagnose Epilepsie
bedeutet ein erhöhtes Risiko für Störungen der Emotionalität, des Verhaltens, der
kognitiven sowie der Wahrnehmungsfunktionen (DEVINSKY 2003). Doch trotz der
hohen Prävalenz von Epilepsie-assoziierten psychischen Begleiterkrankungen, fehlt
es derzeit an systematischer Forschung in diesem Gebiet (DEVINSKY 2003).
Infolgedessen besteht die Notwendigkeit, ein Tiermodell zu generieren, welches nicht
nur
ein
Modell
für
chronische
Epilepsie
darstellt,
sondern
auch
Verhaltensänderungen aufweist, welche sich in einer Verhaltensbatterie detektieren
lassen und Analogien zu epileptischen Patienten bilden.
In
der
Arbeitsgruppe
Löscher
wurden
am
Auszuchtmausstamm
NMRI
verhaltensphysiologische Untersuchungen in zwei chronischen Epilepsiemodellen
(Pilocarpin und Kainat) durchgeführt, welche die Hypothese bestätigen konnten, dass
sich für chronisch epileptische Tiere in einer Verhaltensbatterie zur Untersuchung
von psychischen Merkmalen und kognitiven Fähigkeiten Abweichungen von
gesunden Kontrolltieren ergeben (GRÖTICKE et al. 2007, 2008). In der vorliegenden
Arbeit soll nun ebenfalls das Pilocarpin-Modell für chronische Epilepsie verwendet
werden.
In der ersten Studie sollen Pilocarpin-behandelte Mäuse des Auszuchtmausstammes
NMRI, bei welchen mit Pilocarpin oder LiCl-Pilocarpin ein SE induziert wurde,
weitergehend verhaltensphysiologisch sowie histologisch untersucht werden, um
herauszufinden,
ob
die
Vorbehandlung
mit
LiCl
einen
Einfluss
auf
Verhaltensmerkmale oder histologische Veränderungen hat. Es ist bekannt, dass
LiCl unmittelbar mit Pilocarpin interagiert, wenn diese beiden Substanzen in
Kombination
als
SE-Modell
verwendet
werden
(CLIFFORD
et
al.
1987).
Insbesondere die Depletion von Inositol aufgrund von LiCl ist hier zu nennen
(O'DONNELL u. GOULD 2007). Ferner verursacht LiCl einen raschen Anstieg der
Permeabilität der Blut-Hirnschranke und hat pro-inflammatorische Wirkungen,
beispielsweise aufgrund eines Anstiegs von Interleukin-1β (MARCHI et al. 2009).
37
Zielsetzung
Doch ob LiCl in Kombination mit Pilocarpin als Modell für TLE auch Langzeiteffekte
aufweist und ob es sich bezüglich verhaltensphysiologischer Untersuchungen sowie
neuropathologischer
Veränderungen
von
Pilocarpin
alleine
als
SE-Auslöser
unterscheidet, wurde bisher noch nicht untersucht.
Ferner ist neu in meiner Arbeit, dass Mäuse sowohl in einer Verhaltensbatterie, als
auch histologisch charakterisiert werden sollen, welche Pilocarpin erhalten haben,
jedoch keinen akuten SE erreichten. Es soll ermittelt werden, ob Pilocarpin per se
schon einen Einfluss auf Verhaltensmerkmale oder histologische Veränderungen hat
oder ob ein SE hierfür erforderlich ist. Bei Ratten ist bekannt, dass sich das LiClPilocarpin-Modell
vom
Pilocarpin-Modell
in
höherer
Dosierung
weder
verhaltensphysiologisch, noch metabolisch, im EEG oder neuropathologisch
unterscheiden lässt (CLIFFORD et al. 1987). Bei Mäusen existiert dieser Vergleich
unseres Wissens nicht.
In einer zweiten Studie soll das Pilocarpin-Modell für B6-Mäuse etabliert werden. B6
ist ein Inzuchtmausstamm, welcher für genetische Untersuchungen eine große
Bedeutung darstellt, da er häufig für Verpaarungen sowie als Hintergrundstamm für
spontane Mutationen eingesetzt wird (CRAWLEY et al. 1997). Epileptische Mäuse
des
Stammes
B6
sowie
Pilocarpin-behandelte
Tiere
ohne
SE
sollen
verhaltensphysiologisch wie auch histologisch charakterisiert werden und die
Resultate mit den Ergebnissen der NMRI-Mäuse verglichen werden. Langfristig
gesehen soll mittels des Pilocarpin-Modells der B6-Maus ein Modell für die
Untersuchung von Epilepsie-assoziierten Komorbiditäten entstehen.
38
Material und Methoden
4. Material und Methoden
Es wurden in der vorliegenden Arbeit drei Studien durchgeführt: In Studie 1 wurden
NMRI-Mäuse sowohl im LiCl-Pilocarpin-, als auch im Pilocarpin-Modell mittels
verhaltensphysiologischer Untersuchungen charakterisiert sowie auf histologische
Veränderungen im Gehirn überprüft. In Studie 2 wurde das Pilocarpin-Modell für die
B6-Maus etabliert, sowie Unterschiede zwischen zwei Barrieren des Züchters
Charles
River
detektiert.
Die
verhaltensphysiologische
sowie
histologische
Charakterisierung von B6-Mäusen erfolgte in Studie 3.
4.1 Haltung und Zucht der Versuchstiere
Eine Übersicht über die verwendeten Tiere für die einzelnen Studien gibt Tabelle 4.1.
Für Studie 1 wurden Mäuse des Auszuchtstammes NMRI verwendet. Sie waren
weiblichen Geschlechts und wurden im Alter von 5 Wochen mit einem Gewicht von
26-30 g von Harlan/Winkelmann (Borchen, Deutschland) angeliefert.
Für die Studien 2 und 3 wurden Mäuse des Inzuchtstammes B6 eingesetzt. Sie
waren ebenfalls weiblichen Geschlechts mit Ausnahme der männlichen Mäuse aus
Barriere 9 in Studie 2 und wurden im Alter von 5 Wochen mit einem Gewicht von 1517 g angeliefert. Für die Vorversuche (Studie 2) wurden die Sublinien B6JOlaHsd
sowie B6NHsd verwendet, welche wir von Harlan/Winkelmann bezogen. Von Charles
River (Sulzfeld, Deutschland) stammten die Sublinien B6NCrl sowie B6J, welche in
den Studien 2 bzw. 3 verwendet wurden.
Die eigene Zucht, welche in Studie 2 von Parentalzuchtpaaren aus den Barrieren 8
und 9 des Stammes B6 des Züchters Charles River ausging, erfolgte im Institut für
Pharmakologie, Toxikologie und Pharmazie der Tierärztlichen Hochschule Hannover
in einem separaten Maushaltungsraum. Wie Abbildung 4.1 darstellt, erfolgte
zunächst die Generierung einer F1-Generation aus Barriere 8-Weibchen mit Barriere
9-Männchen. Dieselben Barriere 8-Weibchen wurden mit den Männchen aus der F1Generation verpaart, um eine F2-Generation zu erzeugen. Die beiden Zuchtpaare
aus der F2-Generation wurden verpaart, um eine F3-Generation entstehen zu
lassen.
39
Material und Methoden
Übersicht über den Ablauf der B6NCrl-Zucht
B6NCrl # 8 ♀ x B6NCrl # 9 ♂ → F1-Generation
B6NCrl # 8 ♀ x B6NCrl F1 ♂ → F2-Generation
B6NCrl F2 ♀ x B6NCrl F2 ♂ → F3-Generation
Abb. 4.1: Übersicht über den Ablauf der eigenen B6NCrl-Zucht.
Die Haltung der angelieferten Mäuse erfolgte ebenfalls in einem separaten
Tierhaltungsraum, welcher ausschließlich für Mäuse verwendet wird. Die Tiere lebten
in Gruppen in einer Größenordnung von maximal 10 Mäusen, welche in
Makrolonkäfigen des Typs III gehalten wurden. Es bestand ein 12 Stunden HellDunkel-Lichtzyklus mit einer Lichtphase von 06:00-18:00 Uhr (Leuchtstärke in den
Makrolonkäfigen 19-30 Lux). Die Lufttemperatur betrug 23°C und es herrschte eine
Luftfeuchtigkeit von 50-60 Prozent.
Als Einstreu wurde Weichholzgranulat (Rettenmaier+Söhne GmbH und Co KG,
Rosenberg, Deutschland) verwendet. Den Tieren stand als Futter eine pelletierte
Alleindiät (Altromin 1324 Standarddiät, Altromin GmbH, Lage, Deutschland) sowie
Leitungswasser ad libitum zur Verfügung.
Die Mäuse wurden mindestens einmal wöchentlich in einen frischen Käfig umgesetzt.
Zu diesem Zeitpunkt erfolgte ferner auch ein Auswechseln von Futter und Wasser.
Dies geschah jedoch immer in Absprache mit den Tierpflegern, um Unruhe und
Stress der Tiere unmittelbar vor den Experimenten zu vermeiden.
Nach Anlieferung wurde den Tieren eine Eingewöhnungszeit von mindestens 7
Tagen gewährt, bis mit den Experimenten begonnen wurde.
40
Herkunft
Harlan-Winkelmann
Harlan-Winkelmann
Harlan-Winkelmann
Harlan-Winkelmann
Charles River
Charles River
Charles River
Charles River
Charles River
Charles River
Charles River
Charles River
Charles River
Eigene Zucht
Eigene Zucht
Charles River
Charles River
Charles River
(Jackson Laboratories)
Eigene Zucht
Eigene Zucht
18
14
Anzahl (n)
52
17
54
32
30
23
17
17
20
20
20
20
20
28
32
20
20
20
w
m
Geschlecht
w
w
w
w
w
w
w
w
w
w
w
m
w
w
m
w
m
w
7-8 Wochen
7-8 Wochen
Alter bei Pilocarpin-Applikation
6-7 Wochen
6 Wochen
7-8 Wochen
7-8 Wochen
7-8 Wochen
8 Wochen
6 Wochen
6 Wochen
7 Wochen
7 Wochen
7 Wochen
7 Wochen
6 Wochen
7-8 Wochen
7-8 Wochen
6 Wochen
6 Wochen
7 Wochen
41
Tab. 4.1: Übersicht über die eingesetzten Mäuse in der Reihenfolge der Verwendung in den Studien. w = weiblich, m = männlich
B6NCrl, F3-Generation
B6NCrl, F3-Generation
Studie Stamm
1
NMRI
NMRI
2
B6JOlaHsd
B6NHsd
2, 3
B6NCrl, Barriere 8
B6NCrl, Barriere 9
2
B6NCrl, Barriere 8
B6NCrl, Barriere 9
B6NCrl, Barriere 4
B6NCrl, Barriere 7
B6NCrl, Barriere 9
B6NCrl, Barriere 9
B6NCrl, Barriere 11
B6NCrl, F1-Generation
B6NCrl, F1-Generation
B6NCrl, Barriere 9
B6NCrl, Barriere 9
B6J
Material und Methoden
Material und Methoden
4.2 Dauerhafte Kennzeichnung der Versuchstiere
Die Ohren der Versuchstiere wurden mittels Lochzange (Faust Medizintechnik,
Berlin,
Deutschland)
markiert,
um
die
Tiere
auch
über
einen
langen
Versuchszeitraum eindeutig identifizieren zu können. Verwendet wurde ein Schema,
welches Abbildung 4.2 darstellt.
Kennzeichnung von Mäusen durch Ohrlochung
ohne Loch
Maus-Nr. 1
links ein Loch
Maus-Nr. 2
rechts 1 Loch
Maus-Nr. 3
beide 1 Loch
Maus-Nr. 4
links 2 Löcher
Maus-Nr. 5
rechts 2 Löcher
Maus-Nr. 6
links 2 Löcher, rechts 1 Loch
Maus-Nr. 7
links 1 Loch, rechts 2 Löcher
Maus-Nr. 8
beide 2 Löcher
Maus-Nr. 9
links 3 Löcher
Maus-Nr. 10
rechts 3 Löcher
Maus-Nr. 11
links/rechts
Abb. 4.2: Dauerhafte Kennzeichnung von Mäusen durch Ohrlochung
4.3 Klassifizierung der Krampfintensität
Die Einteilung der Krämpfe, welche sowohl unmittelbar nach Pilocarpin-Applikation,
als auch in den nachfolgenden Wochen und Monaten spontan auftraten, erfolgte in
Stadien 1-5 nach RACINE (1972). Ursprünglich wurde diese Klassifizierung
entwickelt, um die Krampfintensität von Ratten beim Kindling zu bewerten, sie wird
jedoch üblicherweise auch bei anderen Epilepsiemodellen sowie bei Mäusen
verwendet. Die Stadien 1-3 beschreiben fokale Krampfaktivität. Stadium 1
bezeichnet das Auftreten von Immobilität und schwachem Fazialklonus, welcher sich
im Schließen von einem oder beiden Augen, Zittern der Tasthaare oder stereotypem
Schnüffeln widerspiegeln kann. Schwere Fazialklonien in Form von klonischen
Kaubewegungen sowie Nicken des Kopfes werden mit Stadium 2 beschrieben. In
Stadium 3 zeigen die Tiere einen unilateralen Klonus der Vorderextremität. Ab
42
Material und Methoden
Stadium 4 präsentieren die Tiere ein generalisiertes klonisches Anfallsgeschehen:
Stadium 4 wird vergeben, wenn die Tiere sich aufrichten und einen bilateralen
Vorderextremitätenklonus aufweisen. Stadium 5 entspricht dem Stadium 4 mit einem
zusätzlichen Verlust der Stellreflexe, infolgedessen die Tiere nach hinten oder zur
Seite überfallen. Abruptes Renn- und Hochspringverhalten kann ebenfalls eintreten
und wurde in dieser Arbeit gleichfalls Stadium 5 zugeordnet. In anderen
Arbeitsgruppen
wird
das
abrupte
Hochspringen
von
Tieren
nach
Pilocarpinapplikation teilweise als zusätzliches Stadium 6 bewertet (BORGES et al.
2003).
4.4 Chronisches Epilepsiemodell: Pilocarpin (Studien 1-3)
Die Mäuse waren 6-8 Wochen alt, als die Pilocarpinapplikation erfolgte. Am Abend
vor der Versuchsdurchführung wurden die Tiere gewogen und die Schwänze der
Tiere zur temporären Kennzeichnung mit einer Nummerierung versehen. Mindestens
eine Stunde vor Injektion von Pilocarpin wurden die Tiere in den Vorraum des
Mausverhaltenslabors verbracht, in welchem der Versuch stattfand. Für die
Pilocarpin-Applikation wurden die Tiere einzeln in Makrolonkäfige des Typs II
gesetzt.
Das Applikationsvolumen für alle verwendeten Substanzen betrug 10 ml/kg. Für
Studie 1 wurde einem Teil der Tiere 15-19 Stunden vor Pilocarpin-Applikation in
Natriumchlorid (NaCl) gelöstes LiCl (Sigma-Aldrich, München, Deutschland) in einer
Dosierung von 3 mEq, dies entspricht 127 mg/kg, i.p. injiziert. Die i.p.-Applikation von
Methylscopolamin (Sigma-Aldrich, München, Deutschland), welches in Aqua
destillata (Aqua dest.) gelöst wurde, erfolgte in einer Dosierung von 1 mg/kg 30 Min.
vor Injektion von Pilocarpin. Pilocarpin (Sigma-Aldrich, München, Deutschland)
wurde in der je nach Studie angegebenen Dosierung in Aqua ad injectabilia gelöst,
sowie entweder als Bolus oder fraktioniert in 20-minütigen Intervallen bis zum
Erreichen eines SE i.p. appliziert. Nach Ablauf eines SE von 90 Min. bzw. bei
überlebenden Tieren ohne SE etwa 2 Stunden nach Bolus-Applikation oder
üblicherweise nach der maximal 10. Pilocarpin-Injektion bei Einsatz des fraktionierten
Applikationsregimes wurde Diazepam in einer Dosierung von 10 mg/kg i.p. zur
43
Material und Methoden
Unterbrechung des SE verabreicht. Diazepam wurde als Fertigampullen (Faustan®,
Temmler
Pharma,
Marburg,
Deutschland)
in
einer
Menge
von
5
mg/ml
Injektionslösung bezogen und in einem Verhältnis von 1:5 mit einer Stammlösung
(6,56 ml unvergälltes Ethanol mit NaCl auf 50 ml aufgefüllt) vermischt. Tiere, welche
einen SE erlangten, erhielten eine Flüssigkeitssubstitution von 0,5 ml NaCl subcutan
(s.c.) am Tag des Versuchs, sowie je nach Verfassung des Tieres am
darauffolgenden Tag erneut.
4.5 Akutes Epilepsiemodell: Elektroschock (Studie 2)
Die Anfallsempfindlichkeit von B6-Mäusen der Barrieren 8 und 9 des Züchters
Charles River wurde für Studie 2 hinsichtlich ihrer maximalen elektrischen
Krampfschwelle (Maximal-Elektroshock-Seizure-Threshold, MEST) verglichen und
nach der in einer vorherigen Studie (LÖSCHER u. LEHMANN 1996) beschriebenen
Weise durchgeführt. Es wurden Cornea-Kupferelektroden verwendet, welche mit
Leder bezogen und mit NaCl angefeuchtet wurden. Der Stimulator (Witt GmbH,
Berlin, Deutschland) lieferte einen konstanten Stromfluss, welcher von 1-200 mA
regulierbar war. Die Stimulationsspannung betrug maximal 7000 Volt. Der konstante
Stromfluss lieferte sinusoidale Impulse (50/s) über 0,2 s. Während des Momentes der
Stimulation über die Cornea-Elektroden wurde das Tier lediglich per Hand
festgehalten und unmittelbar nach der Stimulation losgelassen, um beobachten zu
können, ob das Tier eine positive Reaktion zeigt, welche aus einem tonischen
Krampf mit vollständig durchgestreckten Hinterbeinen bestand. Aufgrund der
Erfahrungswerte von vorherigen Versuchen an NMRI-Mäusen wurde mit der
Stromstärke 20,0 mA begonnen. Zeigte die Maus einen Streckkrampf, wurde der
Logarithmus (log) der Stromstärke um 0,06 Einheiten für das nächste getestete Tier
verringert. Erlangte das Tier keinen Streckkrampf, so wurde in umgekehrter Weise
verfahren, d.h. der Logarithmus der Stromstärke wurde für das folgende Tier um 0,06
Einheiten erhöht. Dieses „up-and-down“-Verfahren wurde nach KIMBALL et al.
(1957) modifiziert.
Pro Barriere 8 und 9 wurden jeweils 8 naive Mäuse verwendet, wobei jede Maus nur
einmal für die Schwellenbestimmung verwendet wurde. Zusätzlich wurden 13
44
Material und Methoden
Pilocarpin-behandelte Mäuse aus Barriere 8 (12 Tiere mit SE, 1 Tier ohne SE) sowie
8 Pilocarpin-behandelte Mäuse aus Barriere 9 (5 Tiere mit SE, 3 Tiere ohne SE)
bezüglich ihrer Krampfempfindlichkeit getestet.
Es wurde die Krampfschwelle errechnet, nach welcher 50% der untersuchten Mäuse
einen vollständigen tonischen Streckkrampf der Hinterextremitäten zeigten. Dieser
Wert wird als Convulsive Current bei 50% der Mäuse (CC50) bezeichnet. CC50 wurde
nach der Methode von KIMBALL et al. (1957) berechnet: CC50 = antilog m. Dabei gilt
m = y + [d (A/N ± ½)]. Der Wert y bezeichnete den niedrigsten mA-Wert bei welchem
die Tiere ein positives Resultat (Streckkrampf), bzw. den höchsten mA-Wert, bei
welchem die Tiere ein negatives Resultat (keinen Streckkrampf) zeigten. Der Wert d
maß das Intervall zwischen den Logarithmen. Der Wert ½ wurde addiert, wenn mit
einem negativen Resultat gerechnet wurde bzw. subtrahiert, wenn mit positivem
Resultat bezüglich des tonischen Streckkrampfes der Hinterextremitäten gerechnet
wurde.
Die Bestimmung der maximalen elektrischen Krampfschwelle mittels Elektroschock
diente in Studie 2 dem Vergleich der Krampfemfindlichkeit der Barrieren 8 und 9 des
Stammes B6NCrl des Züchters Charles River in einem weiteren Anfallsmodell.
4.6 Implantation corticaler Elektroden zur EEG-Ableitung (Studie 2)
Um bei Mäusen ein EEG ableiten zu können, wurden drei kleine rostfreie
Stahlschrauben in den frontalen Cortex des Tieres implantiert. Für die Implantation
wurden die Mäuse des Stammes B6 mit einer Initialdosierung von 350-400 mg/kg
Chloralhydrat (Roth®, Karlsruhe, Deutschland) i.p., welches in 0,9% NaCl gelöst
wurde, narkotisiert. Das Applikationsvolumen betrug 10 ml/kg. Die Tiefe der Narkose
wurde anhand des Zwischenzehenreflexes überprüft. Je nach Erforderlichkeit
erfolgten während der Operation eine oder mehrere Nachdosierungen von jeweils
1,5 mg Chloralhydrat pro Maus.
Vor Beginn der eigentlichen Operation (OP) wurde am Stereotakten (Kopf, Tujunga,
Kalifornien, USA oder Stölting, Illinois, USA) Interaural-Null bestimmt und die Werte
notiert. Beim zu operierenden Tier wurde mit einer Schere die Kopfhaut geschoren
und die über der Schädelkalotte liegende Haut mit 70% Ethanol desinfiziert. Die
45
Material und Methoden
Maus wurde anhand von zwei Ohrstiften sowie mittels eines Schneidezahnbalkens in
den Stereotakten eingespannt, so dass das Schädelplateau gerade lag und die Maus
nach lateral keinen Bewegungsspielraum mehr zeigte. Die OP der Tiere im
Stereotakten diente einer exakten Platzierung der Corticalschrauben. Für die OP
wurde die Maus auf ein Wärmepad (Fine Science Tools Inc., Vancouver, Kanada)
gelegt, welches sich durch Absinken der Körpertemperatur der Maus erwärmt, so
dass die Maus über die Dauer der OP nicht auskühlte.
Mittels eines Skalpells erfolgte entlang der Medianen der Kopfoberfläche ein
Hautschnitt in der Länge der Oberfläche des Mausschädels. Die entstehenden
Lappen der Kopfhaut wurden von den darunter liegenden Faszien abgehoben und
mit vier Klemmen jeweils seitlich des Kopfes fixiert. Das Periost des Schädels wurde
mittels Schaber manuell entfernt. Um die Knochennähte des Schädels deutlicher
darzustellen, erfolgte eine Nachbehandlung des Periost des Schädels mit 35%
Wasserstoffperoxid-Lösung. Wie Abbildung 4.3 darstellt, wurde nach PAXINOS und
FRANKLIN (2001) Bregma als Referenzpunkt mittels einer am Stereotakten fixierten
Nadel bestimmt, auf dem Schädel farbig markiert, und die Werte notiert. Die
Bohrpunkte lagen jeweils lateral von Bregma bei +2 mm und -2 mm, der
rostrocaudale Wert betrug jeweils -2 mm. Für die Erdungsschraube wurde caudal
vom zuerst markierten Bohrloch noch eine weitere Stelle für die Bohrung farbig
markiert.
Abb. 4.3: Aufsicht auf einen Mausschädel. Dargestellt sind die Knochennähte sowie die Lokalisation
von Bregma (PAXINOS u. FRANKLIN 2001).
46
Material und Methoden
Die Bohrung durch das Schädeldach erfolgte mittels eines Zahnbohrers (Dremel,
Wisconsin, USA). Die Dura mater wurde bei der Bohrung intakt gelassen, um eine
Schonung des darunter liegenden Gewebes zu gewährleisten, und mit einer Pinzette
eröffnet. Mit vier halben Umdrehungen wurden die Schrauben in den Bohrlöchern
versenkt, so dass diese fest verankert waren. Eine Elektrode mit drei Drähten von
jeweils 2 cm-Länge wurde für den Elektrodenaufbau verwendet. Jeder Draht der
Elektrode wurde um jeweils eine Schraube gewickelt, so dass jede Schraube zu dem
verbundenen Draht einen guten Kontakt hatte, sich jedoch die Drähte untereinander
nicht berührten. Der linke Draht wurde um die Erdungsschraube gewickelt. Um die
Schrauben sowie die Elektrode zu fixieren, wurde eine erste Schicht Dentalzement
(Kunststoff, Kaltpolymerisat, Heraeus Kulzer GmbH, Wehrheim, Deutschland) direkt
auf den Schädelknochen bis zur Höhe der Schraubenköpfe aufgetragen, so dass die
Schrauben von allen Seiten von Dentalzement bedeckt waren. Um einer
Wundinfektion vorzubeugen, wurde dem direkt auf den Schädel aufgetragenen
Dentalzement
zuvor
2,1%
Gentamicinsulfat
zugegeben.
Es
wurde
eine
Trocknungsphase von 10 Min. gewährt, nach deren Ablauf das Elektrodenkonstrukt
um ca. 45° nach caudal abgeknickt wurde. Eine zweite Schicht Dentalzement
erfolgte, um eine Art Hutaufsatz auf dem Kopf des Tieres zu modellieren und die
Schrauben sowie den Elektrodenstecker vollständig zu bedecken. Wieder erfolgte
eine Trocknungsphase von 10 Min. Anschließend wurde das Tier aus dem
Stereotakten ausgespannt, die Hautklemmen entfernt, die Wundränder mit
Ethacridinlactat-Lösung (Konzentration 0,1%, Chinosol, Hannover, Deutschland)
gereinigt und die rostral und caudal der Implantationsstelle befindliche Hautwunde
mit 2-3 Knopfheften genäht.
Als postoperative Schmerztherapie wurde den Mäusen Buprenorphinhydrochlorid
intramusculär (i.m.) appliziert, welches als Fertigampullen (Temgesic® Ampullen,
Essex Pharma, München) bezogen wurde. Die Dosierung betrug 0,1 mg/kg bei
einem Applikationsvolumen von 10 ml/kg, d.h. 167 µl der Fertigampulle wurden mit 5
ml NaCl vermischt. Um einer Atemdepression durch Buprenorphin vorzubeugen,
erfolgte die Injektion erst, wenn die Tiere sich bereits in der Aufwachphase befanden.
47
Material und Methoden
Nach der Operation wurden die Tiere in mit Zellstoff ausgelegte Käfige verbracht, in
denen sich nur Tiere befanden, welche am gleichen Tag operiert wurden.
4.7 EEG-Ableitungen während Pilocarpin-Applikation (Studie 2, Kapitel 5.2.1.2)
Um detektieren zu können, ob die beobachtete epileptische Krampfaktivität mit EEGVeränderungen korreliert, erhielten in Studie 2 vier Mäuse des Stammes B6JOlaHsd
sowie vier Mäuse des Stammes B6NCrl in der nach Kapitel 4.5 beschriebenen Weise
Corticalelektroden. Während der fraktionierten Injektion von Pilocarpin wurde ein
EEG abgeleitet.
Zur
EEG-Anlage
Instruments
Inc.,
zählten
Foster
acht
City,
Ein-Kanal-Verstärker
Kalifornien,
USA),
(Cyber-Amp-380,
ein
Axon
Analog-Digitalwandler
(PowerLab/8s, ADInstruments Ltd, Hastings, England) sowie ein angeschlossener
Computer (Dell GmbH, Frankfurt am Main, Deutschland) mit der Software Chart4.
Die Aufzeichnung erfolgte in einer Rate von 200 Hz. Die Einstellungen des LowPass-Filters betrugen 60 Hz, die des High-Pass-Filters 0,1 Hz. Ein Notch-Filter diente
dem Ausschluss von Störsignalen innerhalb des Frequenzbereichs des Netzstroms
von 50 Hz. Die Verbindung vom Tier zu einem der Ein-Kanal-Verstärker erfolgte
mittels EEG-Aufzeichnungskabel, welche von der ehemaligen PhD-Studentin Ina
Gröticke angefertigt wurden und aus einem zweiadrigen abgeschirmten ummantelten
Kabel bestanden. Jedes Kabel wurde mittels einer Krokodilklemme geerdet, um
etwaiges Hintergrundrauschen zu reduzieren.
4.8 Überwachung spontaner epileptischer Anfälle
Alle Mäuse aus Studie 1 wurden über die Dauer von 6 Wochen der
verhaltensphysiologischen Tests auf das Auftreten von spontanen Krampfanfällen
beobachtet, um zu ermitteln, wie viele der Pilocarpin-behandelten Tiere eine
chronische Epilepsie entwickelten. Tiere, bei welchen während der Absolvierung der
Verhaltensbatterie keine spontanen Anfälle notiert wurden, wurden 13-14 Wochen
nach SE über 4-7 aufeinanderfolgende Tage 24 Stunden pro Tag mittels einer
Schwarz-Weiß-Kamera
(CCD-Kamera-Modul,
Conrad
Elektronik,
Hannover,
Deutschland) videoüberwacht, bis jedes Tier mit SE mindestens einen spontanen
48
Material und Methoden
Anfall zeigte. Es wurden insgesamt 8 Tiere gleichzeitig überwacht, jeweils 2 Tiere
von einer Kamera aufgenommen. Für die Nachtaufnahmen wurden Infrarotstrahler
(Conrad Electronic GmbH, Hannover, Deutschland) verwendet. Insgesamt 4
Kameras wurden mit einem Multiplexer (EcoLine Quad, Conrad Electronic GmbH,
Hannover, Deutschland) verbunden und an einen Langzeitvideorecorder (Sanyo
TLS-9924P,
Monacor,
Bremen,
Deutschland)
sowie
einen
Fernsehmonitor
(Mitsubishi, Deutschland) angeschlossen. Die Aufzeichnung der Videos erfolgte in
einer um den Faktor 12 erhöhten Aufnahmegeschwindigkeit. Infolgedessen war es
möglich, handelsübliche Videokassetten (Kodak HS E-240, Kodak GmbH, Stuttgart,
Deutschland)
mit
vierstündiger
Laufzeit
einzusetzen,
welche
an
den
Überwachungstagen jeweils morgens und abends ausgewechselt wurden. Während
der Videoüberwachung erfolgte die Haltung der Mäuse einzeln in Makrolonkäfigen
des Typs II. Für die Überwachung der Mäuse des Stammes NMRI aus Studie 1
wurde jeder Käfig an den Seitenwänden sowie der Rückwand mit schwarzem Papier
versehen, um einen besseren Bildkontrast der weißen Mäuse zur Umgebung zu
gewährleisten. Für die schwarzen B6-Mäuse aus den Studien 2 und 3 war eine
Verstärkung des Kontrastes nicht notwendig. Die Auswertung der Videobänder
erfolgte in vierfacher Abspielgeschwindigkeit. Bei Bedarf konnten einzelne Abschnitte
der Videoaufzeichnung verlangsamt abgespielt werden.
Aus Studie 2 wurden 12 weibliche Tiere über 6-9 Tage sowie alle männlichen Tiere
der F1-Generation über 2-9 Tage zu einem Zeitpunkt von etwa 6 Monaten nach SE
videoüberwacht. Das Ziel war, alle Tiere, welche spontane Anfälle zeigten, mittels
Videoüberwachung zu detektieren.
Alle Mäuse aus Studie 3 wurden über 4 Monate beobachtet, um nachzuweisen, dass
alle Tiere, welche einen SE erlangten, auch eine chronische Epilepsie entwickelten.
Zusätzlich wurden die Tiere zu einem Zeitpunkt von 7-11 Wochen nach SE über 48
Stunden durchgängig videoüberwacht, um nachzuweisen, dass die Entwicklung von
spontanen Anfällen bereits vor Beginn der Absolvierung der Verhaltensbatterie
eingesetzt hat. Tiere, welche während dieser Videoaufzeichnung sowie während der
verhaltensphysiologischen Untersuchungen keine spontanen Anfälle zeigten, wurden
analog zu den Tieren aus Studie 1 zu einem Zeitpunkt von 26-29 Wochen nach SE
49
Material und Methoden
über bis zu 14 fortlaufende Tage videoüberwacht. Zwei Mäusen, welche in dieser
Zeit keine spontanen Anfälle zeigten, wurden Corticalschrauben in der in Kapitel 4.6
beschriebenen Weise implantiert und diese Tiere ein- bis zweimal über 2-3 Tage
EEG- und videoüberwacht, bis auch diese Tiere mindestens einen spontanen
epileptischen Krampfanfall zeigten.
Die Pilocarpin-behandelten Tiere aus den Studien 1 und 3, welche keinen SE
erlangten,
wurden
während
des
Handlings
der
verhaltensphysiologischen
Untersuchungen beobachtet, ob sie spontane Anfälle entwickelten. Die Pilocarpinbehandelten Mäuse ohne SE aus Studie 3 wurden ferner analog zu den chronisch
epileptischen Tieren zum gleichen Zeitpunkt über 48 Stunden durchgängig
videoüberwacht.
4.9 Verhaltensbatterie
Es existiert eine Reihe an Verhaltenstests, welche üblicherweise eingesetzt werden,
um verhaltensphysiologische Auffälligkeiten bei Versuchstieren darzustellen. Für die
Studien 1 und 3 wurde die in Tabelle 4.2 dargestellte Verhaltensbatterie verwendet,
um etwaige Verhaltensabweichungen bei Pilocarpin-behandelten Tieren sowohl mit,
als auch ohne SE, zu detektieren. Die Verhaltensbatterie umfasste eine
Eingangscharakterisierung der Mäuse, sowie Tests zur Überprüfung von Exploration
und Lokomotion, von Angst-assoziiertem Verhalten, von motorischen Fähigkeiten,
von
Depressions-assoziiertem
Verhalten
sowie
der
räumlichen
Lern-
und
Gedächtnisleistung.
Eingangs-
Irwin-Test
Charakterisierung
Open-Field-Test
Hole-Board-Test
Angst-assoziiertes
Elevated-
Black-White-Box
Verhalten
Plus-Maze
Gleichgewicht,
Rotarod-Test
Exploration, Lokomotion
(Angst-assoz. Verhalten)
Novel-ObjectExploration-Test
Hanging-Wire-Test Chimney-Test
motorische Fähigkeiten
50
Material und Methoden
Depressions-assoziiertes Porsolt-Test
Tail-Suspension-
Verhalten
Test
Räumliche Lern- und
Morris-
Gedächtnisleistung
Water-Maze
Tab. 4.2: Einzelne Testdomänen der Verhaltensbatterie.
Verhaltensexperimente mit der höchsten Belastung für die Tiere (die Depressionsassoziierten Tests) wurden am Ende der Verhaltensbatterie durchgeführt. Die
Gesamtheit der durchgeführten Verhaltenstests wurde in Studie 1 (nur Durchführung
des Open-Field-Tests, des Elevated-Plus-Mazes, des Morris-Water-Mazes, des TailSuspension-Tests sowie des Porsolt-Tests) über 6 Wochen, in Studie 3 (die gesamte
Verhaltensbatterie) über 17 Wochen absolviert. Zwischen den einzelnen Tests
bestand üblicherweise ein Intervall von 1 Woche.
Sämtliche verhaltensphysiologischen Untersuchungen fanden in einem Labor statt,
welches ausschließlich für Mäuse verwendet wurde. Im Verhaltenslabor existierten
kontrollierte Bedingungen hinsichtlich Temperatur (22 ± 0,5°C) sowie Luftfeuchtigkeit
(55 ± 5%). Um eine ausreichende Adaptation der Tiere an die Umgebung vor der
Absolvierung der Verhaltenstests zu gewährleisten, wurden die Tiere mindestens
eine Stunde vor Beginn der Experimente in den Vorraum des Verhaltenslabors
verbracht. Ferner wurden die Tiere am Versuchstag vor Beginn der Experimente
nicht in neue Käfige umgesetzt, um etwaigen Stress aufgrund des Umsetzens zu
vermeiden. Mit Ausnahme der Versuche zur Überprüfung von Depressionsassoziiertem Verhalten, fanden die Verhaltenstests innerhalb eines quadratischen,
mit einem weißen Vorhang von der Umgebung abgetrennten Areals statt. Dies diente
zur Minimierung der Aversivität und des Ablenkungspotenzials des großen
Verhaltenslaborraumes während der Absolvierung der Versuche.
Um die Tiere durch die Anwesenheit eines Experimentators bei der Durchführung der
Verhaltenstests nicht zu beeinflussen, befand sich die Experimentatorin während der
Versuche im Vorraum des Verhaltenslabors. Die Tiere wurden mit einer SchwarzWeiß-Kamera (Panasonic digital, Panasonic, Hamburg, Deutschland), welche an der
Zimmerdecke befestigt wurde, gefilmt. Die Datenerhebung erfolgte mit Hilfe einer
Software, welche speziell für Verhaltensversuche entwickelt wurde (EthoVision®,
51
Material und Methoden
Noldus, Wageningen, Niederlande). Eine Ausnahme bildeten die Versuche zur
Überprüfung von Depressions-assoziiertem Verhalten, welche frontal per SchwarzWeiß-Kamera
(CCD-Kameramodul,
Conrad
Electronic
GmbH,
Hannover,
Deutschland) aufgenommen und mittels Videorecorder (Thomson Chroma Pro II
VCR, Deutschland; Samsung Fernseher, Schwalbach, Deutschland) manuell
ausgewertet wurden.
Bei allen lichtsensitiven Verhaltensversuchen sowie in Studie 3 beim Morris-WaterMaze wurden Stehlampen mit Deckenfluter (Halogenlampen, 300 Watt) eingesetzt,
um eine gleichmäßige indirekte Beleuchtung der jeweiligen Versuchsapparatur
gewährleisten zu können.
Die Versuchsaufbauten wurden jedes Mal zwischen den Durchgängen von einzelnen
Tieren gründlich von Kot und Urin gesäubert sowie mit Essigsäurelösung in einer
Konzentration von 0,1% behandelt, um etwaige Geruchsspuren zu standardisieren.
Während der Verhaltensversuche wurden die Tiere von einem technischen
Mitarbeiter auf das Auftreten von spontanen epileptischen Anfällen beobachtet.
Entwickelte ein Tier einen Krampfanfall, so wurde mindestens eine Stunde
abgewartet, bevor das Tier den jeweiligen Verhaltensversuch absolvierte. Das Ziel
war, eine anfallsfreie Zeit von mindestens 60 Min. zu gewähren, so dass die
Ausprägung von spontanen Anfällen die Resultate der verhaltensphysiologischen
Untersuchungen möglichst nicht beeinflusste.
4.9.1 Eingangscharakterisierung und Überprüfung von Katalepsie
Eingangscharakterisierung: Irwin-Test
Es erfolgte eine Adaptierung der von IRWIN (1968) empfohlenen und von CRAWLEY
(1997) modifizierten Tests an hiesige Laborbedingungen. Zu Beginn wurden die
Tiernummern der Mäuse verblindet, so dass der Experimentatorin nicht bekannt war,
zu welcher Versuchsgruppe das jeweilige zu untersuchende Tier zuzuordnen war.
Mindestens 30 Min. vor Beginn der Versuche wurden die Tiere in den
Vorbereitungsraum des Mausverhaltenslabors verbracht. Zuerst wurde die Maus
gewogen und das Gewicht notiert.
52
Material und Methoden
Für den ersten Abschnitt des Irwin-Tests, der Allgemeinuntersuchung, wurden 3 Min.
eingeplant, um zu gewährleisten, dass jedes Tier über dieselbe Zeitdauer beurteilt
wurde. Zu Beginn der Allgemeinuntersuchung wurde beobachtet, ob die Maus nach
Hochheben am Schwanz versuchte, zu flüchten und wie ihr Platzierungsverhalten
beim Absetzen aussah. Die Tiere wurden einzeln in einen Makrolonkäfig des Typs II
gesetzt und während der Allgemeinuntersuchung lediglich von außen betrachtet. Für
jedes Tier wurde ein sauberer Untersuchungskäfig verwendet. Es wurden
Körperhaltung, Schwanztonus, Atmung, Piloerektion, Hautdurchblutung sowie die
Sauberkeit des Fells beurteilt. Ferner wurde auf das mögliche Auftreten von
Exophtalmus, Ptosis sowie Tränen- und Speichelfluss geachtet. Die Schnelligkeit des
Bewegungsablaufs wie auch die Fortbewegung der Tiere im Untersuchungskäfig
wurden bewertet. Mittels eines Klickers wurde die Schreckhaftigkeit sowie anhand
eines Schlüssels das Hörvermögen der Tiere getestet.
Im zweiten Abschnitt des Irwin-Tests erfolgte eine Manipulation bzw. Fixierung der
Tiere. Zuerst wurde das Ausmaß des Urinabsatzes sowie die Anzahl der Kotboli
notiert. Mittels leichter Bewegung des Untersuchungskäfigs von rechts nach links
wurde das Gleichgewicht der Tiere überprüft. Ein Gegenstand wurde den Tieren
gezeigt und beurteilt, ob sich die Mäuse dem Objekt annäherten. Mittels eines
Pinsels erfolgte eine Berührung am Rücken der Tiere und es wurde bewertet, wie
intensiv sich die Ausweichbewegung der Mäuse darstellte. Nach Reizung des Auges
mittels einer Borste wurde der Cornealreflex sowie nach Reizung der Barthaare der
Barthaarreflex überprüft. Die Experimentatorin maß die Rektaltemperatur der Tiere.
Die Mäuse wurden an den Rand des umgedrehten Untersuchungskäfigs gesetzt und
das Explorationsverhalten der Tiere an der Kante des Käfigs beurteilt. Durch Kneifen
in die Schwanzwurzel der Mäuse mittels einer Pinzette wurde der Haffner-Reflex
getestet. Anhand von einer kleinen Taschenlampe überprüfte die Experimentatorin
den Pupillen-Reflex der Tiere. Bauchdeckenspannung sowie Muskeltonus der
Extremitäten wurden nach Tasten mit dem Zeigefinger der Experimentatorin
bewertet. Der Aufrichtreflex der Tiere wurde getestet, indem die Tiere mit ihrem
Rücken zur Wand des umgedrehten Untersuchungskäfigs an ihrem Schwanz über
die Kante gehoben wurden. Die Experimentatorin beurteilte, wie schnell die Mäuse
53
Material und Methoden
ihre Lage korrigierten. Zum Schluss des Irwin-Test erfolgte eine abermalige rektale
Messung der Körpertemperatur der Tiere.
Der Beurteilung dienten je nach Untersuchungsparameter Scores zwischen 0 und 5.
Die möglichen zu vergebenen Zahlen für jeden Parameter finden sich im Anhang
10.1 wieder. Mit Ausnahme des Parameters Pupillenreflex wurde Normalverhalten
mittels eines Scores von 2 bewertet.
Überprüfung von Katalepsie: Bar-Test (Studie 1)
Mit dem Bar-Test (SANBERG et al. 1988) wird bei Nagern Katalepsie überprüft. Es
wurde eine 3,5 cm hohe Zellkulturflasche (Greiner Bio-one, Frickenhausen,
Deutschland) verwendet, auf welcher die Maus mit beiden Vorderbeinen platziert
wurde. Der Bar-Test wurde 15-16 Wochen nach SE durchgeführt.
Die Experimentatorin maß die Zeitdauer, welche die Maus ohne Korrektur ihrer Lage
auf dem Podest verblieb. Nach maximal 120 s wurde der Test abgebrochen. Jedem
Tier wurden drei Versuchsdurchläufe gewährt, welche unmittelbar hintereinander
durchgeführt
wurden.
Veränderte
die
Maus
in
mindestens
einem
der
Versuchsdurchläufe innerhalb von 120 s ihre Lage, so galt der Test als bestanden,
und das Tier wurde infolgedessen als nicht kataleptisch bewertet.
4.9.2 Überprüfung von Exploration, Lokomotion und Angst-assoziiertem
Verhalten
Open-Field-Test
Die Spontanaktivität von Nagern wird überprüft, indem sie in eine neue, offene Arena
(das Open-Field) platziert werden, aus welcher sie aufgrund von umgebenden
Wänden nicht entkommen können (WALSH u. CUMMINS 1976).
Der Open-Field-Test wurde 5-6 Wochen (Studie 1) bzw. 10-13 Wochen nach SE
(Studie 3) durchgeführt. In Studie 1, in welcher eine verhaltensphysiologische
Charakterisierung von (LiCl-) Pilocarpin-behandelten NMRI-Mäusen erfolgte, wurde
ein schwarzes, sowie in den Studien 2 und 3, in welcher Pilocarpin-behandelte B6Mäuse untersucht wurden, ein weißes Open-Field mit einer Grundfläche von 60 x 60
cm² und einer Höhe von 40 cm verwendet, um einen guten Kontrast zwischen
54
Material und Methoden
Fellfarbe der Maus und der Versuchsapparatur für die Kameraaufzeichnung zu
gewährleisten.
Wie Abbildung 4.4 darstellt, wurde das Open-Field virtuell in drei (Studien 1, 2 und 3)
bzw. zwei Zonen (Studie 3) unterteilt. Bei der Drei-Zonen-Einteilung wiesen äußerer
und innerer Randbereich der Arena jeweils eine Breite von 10 cm auf, die Fläche des
Zentrums betrug 20 x 20 cm². Bei der Zwei-Zonen-Einteilung war der Rand der Arena
15 cm breit und das Zentrum hatte eine Fläche von 28 x 28 cm².
B
A
Zentrum
Zentrum
Innerer Randbereich
Randbereich
Äußerer Randbereich
Abb. 4.4: Schematische Darstellung der virtuellen Zoneneinteilung des Open-Fields. A: Drei-ZonenEinteilung (Studien 1 und 2), B: Zwei-Zonen-Einteilung (Studie 3).
In Studie 1 betrugen die Lichtstärken im äußeren Randbereich 10-15 Lux sowie im
Zentrum 25 Lux. In Studie 2 lagen die Werte in den Ecken der Arena bei 160 Lux und
im Zentrum bei 200 Lux. In Studie 3 wurden Lichtstärken von 180 Lux in den Ecken
der Arena sowie 220 Lux im Zentrum verwendet. Die höheren Luxwerte in den
Studien 2 und 3 wurden gewählt, um eine Vergleichbarkeit zur Studie von
GRÖTICKE et al. (2007) zu gewährleisten. Alle Lichtstärken wurden mittels eines
Luxmeters exakt eingestellt.
Das Einsetzen der Tiere in das Open-Field erfolgte im Zentrum mit stets derselben
Blickrichtung. Die Versuchsdauer betrug 5 Min. in Studie 1 sowie 10 Min. in den
Studien 2 und 3. In Studie 3 wurden die ersten 10 Min. des Novel-Object-ExplorationTests (wird im nachfolgenden Kapitel beschrieben) als absolviertes Open-Field
ausgewertet.
55
Material und Methoden
Gemessene Parameter stellten die Aufenthaltsdauer in den einzelnen Zonen (s), die
zurückgelegte Gesamtwegstrecke (cm), die Bewegungsgeschwindigkeit (cm/s) und
die Anzahl des Aufrichtens der Tiere (n) dar.
Novel-Object-Exploration-Test
Mittels des Novel-Object-Exploration-Tests wird bei Nagern das Annäherungs- oder
Vermeidungsverhalten von einem neuen Objekt überprüft, welches in eine bekannte
Umgebung verbracht wird (VAN GAALEN u. STECKLER 2000).
In Studie 3 wurde das weiße Open-Field eingesetzt, welches die Mäuse während der
30-minütigen Habituationsphase frei explorieren konnten. Nach Abschluss der
Habituationsphase wurden die Tiere kurz aus der Arena herausgenommen und ein
Objekt (blaue, wassergefüllte Plastikflasche: 0,5 Liter, 6 x 22,5 cm), welches den
Tieren unbekannt war, in das Zentrum des Open-Fields platziert (Abbildung 4.5). Für
die 15-minütige Objektphase, in welcher die Tiere die Möglichkeit hatten, das Objekt
frei zu erkunden, wurden die Tiere am Rand der Arena eingesetzt.
Abb. 4.5: Darstellung der Objektphase des Novel-Object-Exploration-Tests: Versuchsapparatur des
Open-Field mit Präsentation des Objekts (Wasserflasche im Zentrum der Arena).
Als Untersuchungsparameter sind die gleichen wie bei der Absolvierung des im
vorherigen Kapitel beschriebenen Open-Field-Tests zu nennen: Aufenthaltsdauer im
Zentrum bzw. Rand der Arena (s), Gesamtwegstrecke (cm) sowie Bewegungsgeschwindigkeit (cm/s). Alle Parameter wurden jeweils für die Habituations- sowie für
56
Material und Methoden
die Objektphase ermittelt. Da die ersten 10 Min. der Habituation als Open-Field-Test
ausgewertet wurden, galten die letzten 15 Min. der Habituation als untersuchte
Habituationsphase des Novel-Object-Exploration-Tests. Die gesamten 15 Min., in
welcher die Tiere das Objekt explorieren konnten, wurden als Objektphase
ausgewertet.
Hole-Board-Test
Der Hole-Board-Test wird verwendet, um Aktivität sowie Explorationsverhalten von
Nagern zu überprüfen (FILE u. WARDILL 1975). Als Apparatur für den Hole-BoardTest diente eine graue, 70 cm erhöht über dem Boden stehende Plastikplatte (36 x
36 cm), welche mit 16 Löchern (Durchmesser 2,5 cm) durchsetzt und von einer 0,3
cm hohen Kante umgeben ist. Die Lichtintensität wurde auf 150 Lux sowohl am
Rand, als auch im Zentrum der Versuchsapparatur eingestellt.
Für den Versuchsablauf, 16 bis 19 Wochen nach SE durchgeführt, wurde eine Maus
in das Zentrum des Hole-Boards gesetzt. Sie konnte über 5 Min. die Apparatur samt
ihrer Löcher frei explorieren. Die Apparatur des Hole-Board-Tests ist mit
Lichtschranken ausgestattet, welche registrieren, ob eine Maus mit ihrer Nase die
Löcher erkundet (Head-Dip, Abbildung 4.6) und diese Information an eine externe
Zähleinheit weitergeben. So konnte nach Beendigung des Tests an der
automatischen Zähleinheit die Anzahl der Head-Dips abgelesen werden.
Abb.4.6: Darstellung eines Head-Dips einer Maus bei der Absolvierung des Hole-Board-Tests.
57
Material und Methoden
Die Anzahl der Edge-Dips, welche bedeuten, dass eine Maus über den Rand der
Versuchsapparatur herabschaut, wurden manuell mittels Beobachten der Tiere auf
dem Computermonitor gezählt. Als Untersuchungsparameter wurden beim HoleBoard-Test außer der Anzahl der Head-Dips (n) sowie der Edge-Dips (n) auch die
zurückgelegte Wegstrecke (cm) sowie die Bewegungsgeschwindigkeit (cm/s)
herangezogen.
Elevated-Plus-Maze
Das Elevated-Plus-Maze stellt die natürliche Aversion von Nagern vor offenen
Flächen dar und überprüft infolgedessen Angst-assoziiertes Verhalten (LISTER
1987). Der Test wurde 6-7 Wochen (Studie 1) bzw. 14-17 Wochen nach SE (Studie
3) durchgeführt. Wie Abbildung 4.7 darstellt, besteht die Versuchsapparatur des
Elevated-Plus-Mazes aus grauem Plastik sowie aus vier plusförmig angeordneten
Armen (jeweils 30 x 5 cm²). Der Abstand zwischen den Armen und der Bodenfläche
des Labors beträgt 68 cm. Zwei dieser Arme waren von Wänden in einer Höhe von
15 cm umschlossen. Die anderen zwei Arme wurden als offene Arme gestaltet und
lediglich von einer 0,3 cm hohen Kante umgeben, um ein versehentliches
Abrutschen der Tiere von den offenen Armen zu verhindern. Die Maße des
Zentrums, welches den Verbindungspunkt aller vier Arme darstellt, betragen 5 x 5
cm. In Studie 1 wurde die Lichtstärke auf folgende Luxwerte eingestellt: In den
offenen Armen auf 200 Lux, am Anfangsbereich der geschlossenen Arme auf 80 Lux
sowie am Ende der geschlossenen Arme auf 20 Lux. In Studie 3 betrugen die
Lichtstärken analog zur Studie von GRÖTICKE et al. (2007) im Zentrum 27 Lux, am
Ende der offenen Arme 33 Lux sowie am Ende der geschlossenen Arme 15 Lux.
58
Material und Methoden
Geschlossener Arm
Offener Arm
Abb. 4.7: Versuchsapparatur des Elevated-Plus-Mazes.
Die Tiere wurden mit stets derselben Blickrichtung zum offenen Arm in das Zentrum
der
Versuchsapparatur
platziert
und
konnten
sich
auf
dieser
über
eine
Versuchsdauer von 5 Min. frei bewegen. Als Untersuchungsparameter galten die
Aufenthaltsdauer auf den offenen und geschlossenen Armen (s), das Verhältnis des
Aufenthalts auf den offenen zu den geschlossenen Armen, die Gesamtwegstrecke
(cm) sowie die Bewegungsgeschwindigkeit (cm/s). Sprangen Mäuse von der
Versuchsapparatur, so wurde das Tier von der Experimentatorin so schnell wie
möglich erneut in das Zentrum des Elevated-Plus-Maze platziert und die Anzahl der
Absprünge (n) notiert.
Light-Dark-Box
Die Light-Dark-Box wurde von CRAWLEY und GOODWIN (1980) als Verhaltenstest
zur
Überprüfung
von
Angst-assoziiertem
Verhalten
eingeführt.
Die
Mäuse
absolvierten den Test 15-18 Wochen nach SE. Wie Abbildung 4.8 darstellt, besteht
die Versuchsapparatur aus einer Plastikkammer mit einem Deckel für den dunklen
Bereich. Das größere, helle, offene Kompartment misst 33 x 26 x 29 cm³. Die
Lichtstärke betrug 360 Lux im Zentrum, 300 Lux in den beiden Ecken nah des
dunklen Kompartments sowie 350 Lux in den äußeren Ecken. Das kleinere,
schwarze, bedeckte Kompartment trägt die Maße 14 x 26 x 29 cm³. Die Lichtstärke
wurde auf 22 Lux im Durchgangsbereich sowie 6 Lux an der Wand gegenüber des
59
Material und Methoden
Durchgangs eingestellt. Der Durchgang, welcher Maße von 6 x 5 cm² aufweist,
verbindet beide Kompartments miteinander.
Geschlossenes & offenes Kompartment
Abb. 4.8: Versuchsapparatur der Light-Dark-Box.
Für die Absolvierung des Tests wurde jede Maus mit Blickrichtung zur weißen Wand
gegenüber dem Durchgang ins Zentrum des weißen Kompartments platziert. Über
die Dauer von 5 Min. konnte die Maus die Versuchsapparatur frei explorieren.
Folgende Parameter wurden ausgewertet: Aufenthaltsdauer (s) im hellen und
dunklen
Kompartment,
die
zurückgelegte
Gesamtstrecke
(cm),
die
Bewegungsgeschwindigkeit (cm/s) sowie die Anzahl der Kreuzungen zwischen
weißem und schwarzen Kompartment (n).
4.9.3 Überprüfung der motorischen Fähigkeiten
Rotarod-Test
Der Rotarod-Test überprüft die Fähigkeiten von Nagern, auf einem rotierenden Stab
zu balancieren (COUGHENOUR et al. 1977). Das Rotarod für Mäuse (Abb. 4.9,
Treadmill 7600; Ugo Basile, Comerio, Italien) wurde auf eine Drehgeschwindigkeit
von 6 Umdrehungen pro Min. eingestellt.
60
Material und Methoden
Abb. 4.9: Rotarod für Mäuse.
Der Versuch bestand aus einem Trainingstag und einem darauffolgenden Testtag.
Die Tiere wurden mit Laufrichtung nach vorne auf das Rotarod eingesetzt. Am
Trainingstag wurden die Tiere so oft auf dem Rotarod platziert, bis sie kumulativ 60 s
auf dem sich drehenden Zylinder (Durchmesser 4 cm) balancierten. Es wurde die
Anzahl der Absprünge pro Tier notiert. Am Testtag fanden pro Tier drei
Versuchsdurchläufe von maximal 60 s statt. Der Test galt als bestanden, wenn die
Maus in mindestens einem von drei Versuchen 60 s auf dem sich drehenden Stab
die Balance halten konnte. Bei Mäusen, welche vor Ablauf der 60 s herunterfielen,
wurde die Latenzzeit bis zum Fall (s) notiert.
Hanging-Wire-Test
Eine weitere Überprüfung der motorischen Fähigkeiten erfolgte mittels des HangingWire-Tests (COUGHENOUR et al. 1977). Es wurde ein ebenes Gitter mit einer
Maschenweite von 1,5 cm² verwendet, dessen Seitenränder mit Alufolie umspannt
waren, so dass ein Erklettern der Oberfläche für die Tiere nicht möglich war.
Die Mäuse wurden von oben auf das Metallgitter gesetzt, welches von der
Experimentatorin horizontal in einer Höhe von etwa 50 cm bis 1 m über einer freien
Arbeitsfläche gehalten wurde. Um zu gewährleisten, dass die Tiere festen Halt am
Gitter suchten, wurde das Gitter mehrmals kurz nach rechts und links bewegt. Nach
61
Material und Methoden
der Drehung des Gitters um 180° mussten sich die Tiere kopfüber hängend
mindestens 60 s am Gitter festhalten (Abb. 4.10).
Abb. 4.10: Durchführung des Hanging-Wire-Tests.
Bewertet wurde, ob sich die Maus 60 s am Gitter festhalten konnte. Falls dies nicht
der Fall war, wurde die Latenzzeit (s) bis zum Fall notiert. Jede Maus absolvierte den
Versuch lediglich einmal.
Chimney-Test
Mittels des Chimney-Tests wird die motorische Fähigkeit eines Tieres überprüft,
rückwärts aus einer Röhre herauszuklettern (WLÁZ 1998). Für den Test wurde eine
durchsichtige Kunststoffröhre mit einem Durchmesser von 2,5 cm bei einer Länge
von 21 cm verwendet. Die Röhre wurde horizontal auf eine Arbeitsplatte gelegt und
die Maus vorsichtig hineingeleitet. Kletterte das Tier in die Röhre und erreichte das
hintere Ende, setzte die Experimentatorin die Röhre sofort senkrecht auf die
Arbeitsfläche, so dass die Maus rückwärts aus der Röhre klettern musste (Abb.
4.11).
62
Material und Methoden
Abb. 4.11: Absolvierung des Chimney-Tests.
Da die Zeitdauer, welche die Tiere benötigen, um aus der Röhre zu klettern, sehr
variabel ist, wurde lediglich als Ja-Nein-Antwort bewertet, ob die Tiere in der Lage
waren, rückwärts aus der Röhre zu klettern oder nicht. Nach maximal 60 s wurde der
Test abgebrochen. Jedes Tier erhielt nur einen Versuchsdurchlauf. Zwischen den
Testdurchgängen der einzelnen Tiere wurde die Röhre von Kot- und Urinspuren
gereinigt.
4.9.4 Überprüfung der räumlichen Lern- und Gedächtnisleistung: Morris-WaterMaze
Mittels des Morris-Water-Mazes werden räumliche Lern- und Gedächtnisfähigkeiten
von Nagern getestet (MORRIS 1984).
63
Material und Methoden
A
A
N
B
O
W
Plattform
S
C
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
H
20 21
RT
Akquisitionstage
30 31
CV
Abb. 4.12: Darstellung der Versuchsapparatur des Morris-Water-Mazes (A), einer schematischen
Zeichnung der Aufsicht auf das Becken des Morris-Water-Maze (B) sowie der Zeitachse des
Versuchsablaufs (C). Abb. B: N = Norden, O = Osten, W = Westen und S = Süden. Abb. C: Anhand
der angegebenen Zahlen wurden die Versuchstage nummeriert. H = Habituation, RT = RetentionTest, CV = Cued-Version. Absolvierung von Retention-Test und Cued-Version nur in Studie 3.
Die Durchführung des Morris-Water-Mazes begann 7-9 Wochen (Studie 1) bzw. 1922 Wochen (Studie 3) nach SE. Das in Abbildung 4.12 A dargestellte schwarze
64
Material und Methoden
Becken des Morris-Water-Maze weist eine Höhe von 50 cm sowie einen
Durchmesser von 1 m auf. Die Maße der bei NMRI-Mäusen schwarzen, sowie bei
B6-Mäusen durchsichtigen Plattform betrugen 10 x 10 cm. Die Plattform wurde in
einer Höhe 18-20 cm im Becken befestigt. Die Wasserhöhe über der Plattform maß 1
cm, so dass die Plattform für die Tiere versteckt unter der Wasseroberfläche lag.
Als Hinweisreize dienlich befanden sich 3 Schilder mit einfachen geometrischen
Formen außerhalb des Beckens. Das erste Schild wies eine Größe von 20 x 20 cm
auf, hatte eine quadratische Form, war blau mit einem weißen Kreis in der Mitte und
befand sich am Standort Nord. Die Maße des zweiten Schildes betrugen 20 x 37 cm,
es beinhaltete ein Rechteck, war blau/weiß gestreift und wurde am Standort West
eingesetzt. Das dritte Schild hatte eine Größe von 20 x 20 cm, eine dreidimensionale
Form, eine weiße Farbe mit einem schwarzen Kreuz und befand sich am Standort
Südost. Die exakte Position wurde aufgrund von Markierungen auf dem Boden
gewährleistet. Für Studie 3 wurde das Wasser mit 3 Litern Vollmilch pro
Beckenfüllung eingetrübt, um eine Detektierung der schwarzen Mäuse mittels
Kamera im schwarzen Becken zu ermöglichen. In Studie 1 wurde die normale
Deckenbeleuchtung eingeschaltet, in Studie 3 dagegen das Becken mit Stehlampen
gleichmäßig ausgeleuchtet. Das Becken wurde für jeden Versuchstag neu mit
Wasser gefüllt, wobei die Wassertemperatur in Studie 1 23°C sowie in Studie 3 24°C
betrug.
An Tag 0 erfolgte die Habituationsphase des Versuchs. Die Mäuse wurden drei Mal
hintereinander für jeweils 10 s auf die für sie unsichtbare Plattform gesetzt, so dass
sie lernten, dass sich im wassergefüllten Becken eine Plattform befindet. Sprangen
die Tiere von der Plattform, so wurden sie erneut auf dieser platziert, bis sie
kumulativ drei Mal 10 s auf der Plattform verbrachten.
In der Akquisitionsphase (Abb. 4.12 C)
erfolgten 10 aufeinanderfolgende
Trainingstage, an welchen jede Maus viermal pro Tag mit Blickrichtung zur Wand in
das
Becken
eingesetzt
wurde.
Als
die
vier
Einsatzpunkte
galten
die
Himmelsrichtungen Ost, Nord, West und Süd, welche am Becken markiert waren. In
Studie 1 wurden die Tiere an jedem Tag der Akquisition im Osten beginnend, dann
reihum in der Richtung gegen den Uhrzeigersinn in den anderen Himmelsrichtungen
65
Material und Methoden
eingesetzt. In Studie 3 wurde ferner die Himmelsrichtung, an welcher die Tiere als
erstes eingesetzt wurden, von Versuchstag zu Versuchstag gegen den Uhrzeigersinn
gewechselt. Die Plattform befand sich in Studie 1 im Südwesten sowie in Studie 3 im
Südosten des Beckens.
Konnte die Maus innerhalb der maximalen Versuchsdauer von 1 Min. die Plattform
auffinden, so wurde sie 20 s auf dieser sitzen gelassen und bis zum Beginn des
nächsten Versuchsdurchlaufs in den Transportkäfig verbracht. Vermochte die Maus
die Plattform innerhalb von 1 Min. nicht zu finden, leitete die Experimentatorin die
Maus vorsichtig zur Plattform hin und gewährte ihr gleichfalls eine Verweildauer von
20 s auf der Plattform, welche der Maus zur Orientierung diente. Zwischen den
Versuchsdurchläufen der Tiere wurde das Wasser oberflächlich mit der Hand der
Experimentatorin durchgerührt, um etwaige Geruchsspuren zu reduzieren.
Als Hauptparameter galt während der Akquisitionsphase die gemessene Latenzzeit
(s, Mittelwert pro Tier pro Trainingstag), welche die Tiere benötigten, um die
Plattform aufzufinden. Ferner wurde in Studie 3 die mittlere Schwimmgeschwindigkeit
der Tiere (cm/s) ermittelt.
An Akquisitionstag 10 wurde lediglich aus den ersten drei Versuchsdurchläufen der
Mittelwert der Latenzzeit für diesen Tag gebildet. Der vierte Durchgang wurde als
Probe-Trial durchgeführt. Dies bedeutet, dass die Plattform aus dem Becken entfernt
wurde und infolgedessen dem Tier die Möglichkeit gegeben wurde, 60 s im Becken
zu schwimmen. Hier zeigte sich, ob die Maus in der Akquisitionsphase gelernt hatte,
an welcher Stelle sich die Plattform befand, da die Zeitdauer gemessen wurde, die
das Tier im Quadraten mit der ehemaligen Plattformposition verbrachte (Studie 1)
bzw. die Kreuzungspunkte mit der ehemaligen Plattformposition ermittelt wurden
(Studie 3). In Studie 1 lag der Startpunkt für den Probe-Trial im Osten, in Studie 3 im
Norden.
Nach einem trainingsfreien Intervall von 9 Tagen wurde in Studie 3 ferner ein
Retentionstest (Abbildung 4.12 C) durchgeführt, um die Langzeitgedächtnisleistung
der
Tiere
zu
überprüfen.
Für
den
Retentionstest
wurden
an
zwei
aufeinanderfolgenden Tagen (Tag 20 und 21) analog zur Akquisitionsphase vier
66
Material und Methoden
Versuchsdurchläufe pro Tier pro Tag durchgeführt. Die Plattform befand sich an
derselben Stelle wie in der Trainingsphase.
Nach einem weiteren trainingsfreien Intervall von 9 Tagen absolvierten die Tiere in
Studie 3 zudem an Tag 30 und 31 eine Cued-Version des Morris-Water-Maze
(OWEN et al. 1997), um sicherzustellen, dass etwaige Lern- und Gedächtniseinbußen nicht auf visuellen Defiziten oder Motivationsunterschieden beruhten. Für
die Cued-Version wurde die Plattform mittels eines bunt beklebten, 10 cm langen
Lineals, welches mit einem Gummiring an der Plattform befestigt wurde, sichtbar
gemacht. Ferner befand sich die Plattform für die Tiere gut zu sehen 0,5 cm über der
Wasseroberfläche. Die Plattform wurde in ihrer Position verändert und befand sich in
der Cued-Version am Standort Nordwest. Analog zur Akquisitionsphase wurden
wieder vier Versuchsdurchläufe pro Tier pro Tag durchgeführt. Im Retentionstest
sowie in der Cued-Version wurde gleichfalls die Latenzzeit (s) ermittelt, welche die
Tiere benötigten, um die Plattform aufzufinden.
Nach Absolvierung der Versuche wurden die Tiere unter eine Wärmelampe gesetzt,
so dass ihr Fell trocknete, bevor sie in den Heimkäfig zurückgesetzt wurden.
4.9.5 Überprüfung von Depressions-assoziiertem Verhalten
Die Tests zu Untersuchung von Depressions-assoziiertem Verhalten wurden 9-11
Wochen (Studie 1) bzw. 25-28 Wochen (Studie 3) nach SE durchgeführt.
Tail-Suspension-Test
Mittels des Tail-Suspension-Tests wird überprüft, wie die Fähigkeit von Nagern
ausgeprägt ist, auf eine stressauslösende Situation zu reagieren (CRYAN et al.
2005). Er wird verwendet, um die Reaktionen von Nagern auf antidepressiv wirkende
Substanzen zu überprüfen (MAYORGA u. LUCKI 2001). Für die Durchführung des
Tail-Suspension-Tests wurde ein kontrastreicher Hintergrund in Form einer
schwarzen Pappe gewählt, vor welcher eine Stange in einer Höhe von 30 cm an
einem Stativ angebracht wurde. Da jeweils zwei Mäuse zur gleichen Zeit den
Versuch absolvierten, wurde eine Trennwand verwendet, so dass sich die beiden
Mäuse nicht sehen und infolgedessen nicht gegenseitig beeinflussen konnten. Bei
67
Material und Methoden
jeder Maus wurde der gerade Schenkel einer aufgebogenen Büroklammer mittels
Textilklebeband etwa zu Beginn des letzten Drittels an den Schwanz des Tieres
geklebt. Anhand der Büroklammer wurde die Maus kopfüber an der Stange
aufgehängt (Abb. 4.13), über die Versuchsdauer von 6 Min. in dieser Art und Weise
hängen gelassen und währenddessen von frontal gefilmt.
Abb. 4.13: Eine Maus wurde für die Absolvierung des Tail-Suspension-Tests kopfüber an ihrem
Schwanz aufgehängt.
Die Experimentatorin beobachtete die Tiere während des Versuchsablaufs, befand
sich aber versteckt im Raum, so dass die Tiere nicht durch die Anwesenheit der
Experimentatorin beeinflusst wurden, während sie den Versuch absolvierten. Die
Auswertung erfolgte anhand der aufgezeichneten Videos, wobei die Tiernummern
verblindet wurden, so dass der Experimentatorin bei der Auswertung nicht bekannt
war, welcher Gruppe das jeweilige Tier angehörte. Den Hauptparameter stellte die
kumulative Immobilisationszeit (s) dar, welche mit Hilfe einer Stoppuhr bei der
Auswertung anhand der aufgezeichneten Videos ermittelt wurde.
Porsolt-Test
Einen weiteren Screening-Test, um die Reaktion von Mäusen auf antidepressivwirkende Substanzen zu überprüfen, stellt der Porsolt-Test dar (PORSOLT et al.
1977). Für die Durchführung des Versuchs wurden zwei durchsichtige Bechergläser
68
Material und Methoden
mit einer Höhe von 26,5 cm sowie einem Durchmesser von 16,5 cm vor einem
kontrastreichen Hintergrund platziert. Analog zum Tail-Suspension-Test wurde eine
Trennwand verwendet, so dass zwei Tiere gleichzeitig den Versuch absolvieren
konnten. Jedes Becherglas wurde bis zu einer Höhe von 15 cm mit Wasser in einer
Temperatur von 22°C gefüllt. Für den Versuchsdurchlauf wurde eine Maus vorsichtig
in die Mitte des Gefäßes eingesetzt und für 6 Min. schwimmen gelassen (Abb. 4.14).
Abb. 4.14: Absolvierung des Porsolt-Tests. Die Maus zeigt eine unbewegliche Körperhaltung, welche
als Immobilität des Tieres gewertet wird.
Wie bereits für den Tail-Suspension-Test beschrieben, beobachtete auch hier die
Experimentatorin die Mäuse während des Versuchsablaufs, befand sich jedoch von
den Tieren unbemerkt versteckt im Raum. Es wurde insbesondere auf das Auftreten
von
spontanen
epileptischen
Anfällen
der
Mäuse
geachtet,
welche
die
Schwimmfähigkeit der Tiere beeinträchtigen können. Nach Absolvierung des
Versuchs bekamen die Tiere die Möglichkeit, unter einer Wärmelampe zu trocknen,
bevor die Rückkehr in ihren Heimkäfig erfolgte.
Als Hauptparameter galt auch beim zweiten Test zur Überprüfung von Depressionsassoziiertem Verhalten die kumulative Immobilitätszeit (s), jedoch wurden beim
Porsolt-Test lediglich die letzten vier Min. eines sechsminütigen Versuchsdurchlaufs
ausgewertet. Die Ermittlung der Immobilitätszeit erfolgte analog zum TailSuspension-Test anhand der frontal aufgezeichneten Videos unter verblindeten
Bedingungen. Die Körperhaltung der Tiere wurde als immobil gewertet, wenn sich
69
Material und Methoden
die Mäuse reglos im Wasser treiben ließen und lediglich minimale Bewegungen einer
Gliedmaße ausführten, um sich über der Wasseroberfläche halten zu können.
4.10 Histologie
4.10.1 Gewinnung und Aufarbeitung der Gehirne
Die Mäuse aus Studie 1 wurden 5 Monate nach Pilocarpin- bzw. Vehikelinjektion
dekapitiert. Bei den Tieren aus Studie 3 wurden jeweils 5 Pilocarpin-behandelte
Mäuse, sowohl mit als auch ohne SE, nach 4 Wochen sowie die Versuchsgruppen
aus der Verhaltensbatterie 9 Monate nach Pilocarpin- bzw. Vehikelapplikation mittels
cervicaler Dislokation getötet. Die Nackenmuskulatur sowie die Kopfhaut wurden
mittels einer Schere entfernt. Ausgehend vom freigelegten Magnum okcipitale wurde
die Schädelkalotte unter Schonung des unfixierten Gehirngewebes in der Medianen
eröffnet. Vorsichtig wurde mittels einer Knochenzange der dorsale Anteil des
Schädelknochens entfernt und das Gehirn nach Durchtrennung der Bulbi olfactorii
sowie der Gehirnnerven entnommen. Das entnommene Gehirn wurde unmittelbar in
ein Behältnis aus Alufolie (Durchmesser 1,8 cm, Höhe 2,2 cm) gelegt, welches zuvor
mit Einbettmedium (Tissue Freezing Medium®, Jung, Nussloch, Deutschland) befüllt
wurde. Ein Behältnis mit flüssigem Stickstoff diente der Kühlung von 2-Methylbutan,
in welchem das in Einbettmedium befindliche Gehirn über die Dauer von 2-3 Min.
eingefroren wurde. Die eingefrorenen Gehirne wurden bei -20°C gelagert. Mittels
eines Kryostaten (HM 560 M, Microm, Walldorf, Deutschland) wurden coronale
Schnitte in einer Schnittdicke von 14 µm angefertigt. Es wurden die Ebenen
-1,94 mm, -2,54 mm und -3,16 mm sowie in Studie 3 zusätzlich -1,46 mm zu Bregma
(PAXINOS u. FRANKLIN 2001) ausgewählt. Die Gehirnschnitte wurden auf
Objektträger
aufgezogen,
welche
mit
Siliciumwasserstoff
beschichtet
sind
(Histobond, Marienfeld, Lauda-Königshofen). Die Lagerung der Kryostatschnitte
erfolgte gleichfalls bei -20°C.
70
Material und Methoden
B
A
D
C
Abb. 4.15: Darstellung der ausgewerteten Schnittebenen, -1,46 mm (A, nur Studie 3), -1,94 mm (B), 2,54 mm (C) sowie -3,16 mm (D) zu Bregma (PAXINOS u. FRANKLIN 2001)
4.10.2 Thionin-Färbung
Für die histologischen Schnitte der Studien 1 und 3 erfolgte eine Nissl-Färbung. Da
sich Nissl-Substanz insbesondere in den Somata von Neuronen befindet, stellen sich
diese nach Färbung mittels einer Thionin-Lösung deutlich dar. In Nissl-Färbung
wurden die Bewertungen mittels Scoring-System (dargestellt in Kapitel 4.10.5) sowie
das Auszählen von Neuronen (Kapitel 4.10.6) vorgenommen.
Vor Beginn der Färbung wurden die Kryostatschnitte 10 Min. in 4% Paraformaldehyd
fixiert und jeweils 3 Min. mit Ethanol in absteigenden Konzentrationen behandelt.
Nach dreiminütiger Waschung in Aqua dest. erfolgte die Färbung in Thionin-Lösung
über eine Dauer von 90 s. Nach erneuter Behandlung von jeweils 3 Min. mit Ethanol
in denselben Konzentrationen (diesmal in aufsteigender Reihenfolge) wurden die
Kryostatschnitte mit Terpineol/Xylol-Ersatzmedium (Mischverhältnis 1:1) sowie in
Xylol-Ersatzmedium
behandelt.
Die
Schnitte
wurden
sofort
mit
einem
Eindeckmedium (Entellan®, Merck, Darmstadt, Deutschland) und Deckgläschen
71
Material und Methoden
direkt auf den Objektträgern eingedeckt und über Nacht unter dem Abzug trocknen
gelassen. Das exakte Protokoll der Färbung sowie eine Beschreibung der
Zusammensetzung der Thionin-Lösung befinden sich in Anhang 10.2.
4.10.3 Fluoro-Jade-C-Färbung
Gehirnschnitte von jeweils 2 Tieren pro Gruppe aus den Studien 1 und 3 wurden
mittels Fluoro-Jade-C (FJC), einem hochselektiven, fluoreszierenden Marker für
degenerierende Neuronen (SCHMUED et al. 1997; SCHMUED et al. 2005) gefärbt.
Vor Beginn der Färbung erfolgte eine Post-Fixierung der Kryostatschnitte in 4%
Paraformaldehyd. Nach Behandlung der Gehirnschnitte mit 80% sowie anschließend
70% Ethanol, Waschung in Aqua dest. sowie 0,06% Kalium-Permanganatlösung,
wurden die Kryostatschnitte unter Lichtausschluss mittels FJC-Lösung gefärbt. Nach
einer mehrstündigen Trocknungsphase wurden die Schnitte mit Xylene-Lösung
behandelt, mit einem Eindeckmedium (DPX-Mounting-Medium) und Deckgläschen
direkt auf den Objektträgern eingedeckt und über Nacht unter dem Abzug trocknen
gelassen.
Das
Protokoll
der
FJC-Färbung
und
eine
Beschreibung
der
Zusammensetzung der FJC-Lösung liegen in Anhang 10.3.
4.10.4 GFAP-Färbung
1 repräsentatives Tier pro Versuchsgruppe aus den Studien 1 und 3 wurde mittels
Glial-fibrillary-acidic-protein (GFAP), einem Astroglia-spezifischem Intermediärfilament-Protein markiert (STEWARD et al. 1992). Hierbei handelt es sich um einen
immunhistochemischen Nachweis. Nach Fixierung der Gefrierschnitte in 4%
Paraformaldehyd erfolgte eine Hemmung der endogenen Peroxidase mittels 0,5%
H2O2. Über Nacht wurden die Kryostatschnitte mit dem primären Antikörper
(polyclonaler Rabbit-anti-Cow-GFAP [DAKO, Hamburg, Deutschland]) inkubiert. Am
darauffolgenden Tag erfolgte die 90-minütige Inkubation mit dem sekundären
Antikörper (biotinillierter Pig-anti-rabbit-Antikörper, DAKO, Hamburg, Deutschland).
Als
Färbung
wurde
Vectastain-Lösung
(Biozol,
München)
sowie
3,3'-
Diaminobenzidin-Lösung (DAB) eingesetzt. Die histologischen Schnitte wurden am
darauffolgenden Tag mit Eindeckmedium (Entellan®) und Deckgläschen direkt auf
72
Material und Methoden
den Objektträgern eingedeckt. Das Protokoll für die GFAP-Färbung sowie der
verwendeten Lösungen befindet sich in Anhang 10.4.
4.10.5 Histologische Auswertung
Die histologische Auswertung erfolgte an einem Mikroskop (Leica, Solms,
Deutschland), welches eine digitale Kamera (CCD, Axiocam, Zeiss, Göttingen,
Deutschland) besitzt und mit einem Computer verbunden ist, auf welchem eine
Bildanalysesoftware (Axiovision®) installiert ist. Die Bewertung der Schnitte erfolgte
stets unter verblindeten Bedingungen, so dass der untersuchenden Person die
Gruppenzugehörigkeit der Tiere nicht bekannt war.
4.10.5.1 Bewertung nach Scoring-System
Die Bewertung nach Scoring-System (BRANDT et al. 2003) wurde in 25- sowie 100facher Vergrößerung durchgeführt. Score 0 bezeichnete keinen sichtbaren
Neuronenverlust, Score 1 einen möglichen Neuronenverlust in einem Ausmaß bis zu
20%, Score 2 einen Neuronenverlust von 20-50% sowie Score 3 einen
Neuronenverlust in einem Ausmaß von über 50%. Es wurde jeweils der Mittelwert
aus den Ergebnissen für den rechten und linken Hippocampus pro Schnittebene und
anschließend aus diesem ermittelten Wert der Mittelwert aus den bewerteten
Schnittebenen (-1,46 mm [nur Studie 3], -1,94 mm, -2,54 mm sowie
-3,16 mm zu
Bregma) gebildet. Die untersuchten Subregionen stellten CA 1 und CA 3 des
Hippocampus sowie Hilus und Körnerzellschicht des Gyrus dentatus dar. Als
Neuronen wurden polymorphe Zellen mit einem Durchmesser von mindestens 8 µm
gewertet.
4.10.5.2 Auswertung des Hilus des Gyrus dentatus
Zusätzlich zur Bewertung nach Scoring-System (Kapitel 4.10.5.1) wurde in Studie 3
die Fläche des Hilus des Gyrus dentatus ausgemessen, indem der Umriss des Hilus
umfahren sowie zwei Hilfslinien von der Spitze der CA 3c-Subregion zu beiden
Enden des Gyrus dentatus gezogen wurden, analog zu den Arbeiten von GRÖTICKE
et al. (2007; 2008). Es wurde die Dichte an Neuronen berechnet, indem der Quotient
73
Material und Methoden
aus Anzahl an Neuronen pro ausgemessene Fläche in µm ermittelt wurde. In Studie
1 konnte die Dichte im Hilus des Gyrus dentatus nicht ausgewertet werden, da
aufgrund des ausgeprägten Neuronenverlusts in der Körnerzellschicht des Gyrus
dentatus sowie in der CA 3c-Subregion des Hippocampus ein Ausmessen der
Hilusfläche nicht möglich war.
4.10.5.3 Auszählen von Neuronen innerhalb definierter Fenster
Das Auszählen von Neuronen erfolgte für die Subregionen CA 1 und CA 3 des
Hippocampus sowie in Studie 1 für den Hilus des Gyrus dentatus und für die
Amygdala innerhalb definierter Fenster, welche eine Größe von 265 x 355 µm²
hatten. Es wurde in 400-facher Vergrößerung gezählt. Für die Subregion CA 1
wurden jeweils die Neuronen von 3 definierten Fenstern ausgezählt (in der Steigung
am Anfang, in der Mitte, sowie in der Absenkung zum Ende der Körnerzellschicht der
CA 1-Subregion), für die Subregion CA 3a wurden zwei Fenster (im steilsten Punkt
der Steigung sowie in der Gerade der Körnerzellschicht) sowie in der Region CA 3c
zu Beginn der Körnerzellschicht und inmitten des Hilus jeweils ein Fenster
ausgezählt. Es wurde zunächst der Mittelwert aus den ausgezählten Neuronen der
definierten Fenster gebildet, sowie anschließend der Mittelwert aus den Ergebnissen
für den rechten und linken Hippocampus ermittelt. In den Subregionen CA 1 und CA
3 wurde die Schnittebene -1,94 mm zu Bregma ausgezählt. Für den Hilus wurde ein
Mittelwert aus den Ergebnissen der Schnittebenen -1,94 mm und -2,54 mm zu
Bregma gebildet. Bei der Auswertung der Amygdala wurde ein Fenster inmitten der
Kerngebiete ausgezählt. Es wurden nur Gehirnschnitte verwendet, bei welchen die
Amygdala eine hinlängliche Größe (Schnittebene auf Ebene der Amygdala -1,94 mm
zu Bregma) aufwies. Da dies bei nicht allen Tieren der Fall war, wurden die
Pilocarpin-behandelten Tiere bei der Amygdala-Auswertung nicht nach LiClVorbehandlung aufgetrennt, um eine ausreichende Anzahl an Tieren pro Gruppe
gewährleisten zu können.
74
Material und Methoden
4.11 Korrelationen zwischen Neurodegeneration und Verhaltensauffälligkeiten
(Studie 1)
Es wurden für Studie 1 Korrelationen zwischen der Neurodegeneration für die
ausgewerteten Subregionen CA 1 und CA 3c des Hippocampus sowie für den Hilus
des Gyrus dentatus und den Abweichungen in den verhaltensphysiologischen
Untersuchungen berechnet. Als Parameter aus den Verhaltenstests dienten die
Aufenthaltsdauer im Zentrum des Open-Field sowie auf den offenen Armen des
Elevated-Plus-Maze und die Immobilitätsdauer im Tail-Suspension- und Porsolt-Test.
Beim Morris-Water-Maze-Test wurde ein Quotient aus der Latenzzeit von Tag 8 zu
Tag 1 gebildet. Für die Berechnungen wurde der jeweilige Wert der Kontrollen (im
Falle der histologischen Auswertungen die Anzahl der Neuronen sowie im Falle der
Verhaltenstests die Zeitdauer in s) als 100% gesetzt. Über Dreisatzberechnungen
wurde der prozentuale Verlust an Neuronen bzw. an Aufenthaltszeit für die
epileptischen Tiere ermittelt. Beim Morris-Water-Maze wurden die errechneten
Quotienten aus der Latenzzeit von Tag 8 zu Tag 1 verwendet. Die jeweils
berechneten Verhaltensparameter wurden mit den histologischen Abweichungen in
Korrelation gesetzt.
4.12 Statistische Berechnungen
Sämtlichen statistischen Berechnungen diente das Programm GraphPad Prism 5 für
Windows. Die Daten wurden als Mittelwert ± Standard Error of the Mean (SEM)
angegeben. War die Gruppengröße ausreichend, so wurde zunächst nach
D’Agostino & Pearson berechnet, ob sich die Daten entsprechend der Gauss’schen
Normalverteilung verhielten. Bei zu geringer Gruppengröße wurde wie bei nichtparametrischen Daten verfahren.
Bei Vergleichen von zwei Versuchsgruppen wurde für parametrische Daten ein
ungepaarter t-Test sowie für nicht-parametrische Daten der Mann-Whitney-Test
durchgeführt. Wurden mindestens drei Versuchsgruppen miteinander verglichen und
lagen parametrische Daten vor, wurde eine einfaktorielle Varianzanalyse (One-WayANOVA) eingesetzt. Waren die Daten nicht-parametrisch, so wurde der KruskalWallis-Test verwendet. Die statistischen Berechnungen beim Morris-Water-Maze-
75
Material und Methoden
Test erfolgten mittels zweifaktorieller Varianzanalyse
(Two-Way-ANOVA). Das
Signifikanzniveau wurde auf < 0,05 festgesetzt. Lag ein signifikantes Ergebnis vor,
wurde im Falle von Berechnungen nach ANOVA als post hoc-Test für parametrische
Daten der Bonferroni’s-Multiple-Comparison-Test sowie für nicht-parametrische
Daten der Dunn’s-Multiple-Comparison-Test eingesetzt. Statistische Daten in einer
Kontingenztafel wurden mittels Fisher’s-Exakt-Test berechnet. Für die Berechnungen
von Korrelationen zwischen dem Ausmaß des Neuronenverlusts im Hippocampus
und
den
Verhaltensabweichungen
der
epileptischen
Tiere
wurden
nicht-
parametrische Korrelationen nach Spearman verwendet (Studie 1).
Die im Einzelnen verwendeten Tests werden bei der jeweiligen Berechnung im
Ergebnisteil angegeben.
76
Ergebnisse
5. Ergebnisse
5.1 Verhaltenscharakterisierung und histologische Untersuchung von (LiCl-)
Pilocarpin-behandelten NMRI-Mäusen (Studie 1)
Insgesamt wurden 52 Mäuse des Stammes NMRI in der PhD-Arbeit von Frau
Gröticke für den Vergleich von Pilocarpin-behandelten-Tieren sowohl mit als auch
ohne LiCl-Vorbehandlung verwendet (dargestellt in Tabelle 5.1). Diese Mäuse
wurden in meiner Arbeit in Studie 1 weitergehend verhaltensphysiologisch sowie
histologisch charakterisiert, um etwaige Unterschiede zwischen LiCl-vorbehandelten
und nicht vorbehandelten Tieren aufzuzeigen, wie auch Pilocarpin-behandelte Tiere
ohne SE zu untersuchen.
5.1.1 Konsequenzen der Applikation von Pilocarpin mit oder ohne LiClVorbehandlung
Wie Tabelle 5.1 darstellt, wurden in Vorversuchen verschiedene Dosierungen von
Pilocarpin sowohl mit als auch ohne LiCl-Vorbehandlung getestet. Die höchste SEInduktionsrate erlangten Tiere, welche nicht mit LiCl vorbehandelt wurden und
Pilocarpin in einer Dosierung von 300 mg/kg erhielten (83%). Demgegenüber
entwickelten bei dergleichen Pilocarpin-Dosierung nur 40 % der LiCl-vorbehandelten
Tiere einen SE. Mittels LiCl-Vorbehandlung konnte die konvulsive Dosis von
Pilocarpin nicht gesenkt werden, denn bei LiCl-vorbehandelten Tieren entwickelten
bei einer Pilocarpin-Dosierung von 200 mg/kg nur 1/5 Tieren einen SE, bei einer
Pilocarpin-Dosierung von 150 und 200 mg/kg keines der getesteten 5 Tiere einen
SE.
77
Ergebnisse
Dosis
(mg/kg)
Vorbehandlung mit
Li-Cl
Anzahl
Mäuse
(n)
Mäuse mit
Einzelanfällen,
aber ohne SE
Mäuse
mit SE
Überlebende
Mäuse mit
SE
Gesamtmortalität
250
Nein
5
3 (60%)
2 (40%)
2 (40%)
0
300
Nein
12
2 (17%)
10 (83%)
9 (75%)
1 (8%)
350
Nein
5
4 (80%)
1 (20%)
1 (20%)
4 (80%)
150
Ja
5
0
0
0
0
200
Ja
5
1 (20%)
0
0
0
250
Ja
5
0
2 (40%)
2 (40%)
0
300
Ja
10
6 (60%)
3 (30%)*
3 (30%)*
1 (10%)
350
Ja
5
2 (40%)
2 (40%)
1 (20%)
3 (60%)
Tab. 5.1: Vergleich der Wirkungen von Pilocarpin alleine mit der Wirkung von LiCl-Pilocarpin in
Kombination. Pilocarpin wurde als Bolus in verschiedenen Dosierungen mit oder ohne Vorbehandlung
mit LiCl (15-19 Stunden vor Pilocarpinapplikation) injiziert. SE wurde bei allen Mäusen nach 90 Min.
mit Diazepam (10 mg/kg) abgebrochen. * = Pilocarpin-behandelte Tiere ohne LiCl-Vorbehandlung
signifikant zu Pilocarpin-behandelten Tieren mit LiCl-Vorbehandlung (Kontingenztafel und Fisher’sExakt-Test, p = 0,0274)
Aus diesen Tieren wurden die vier Versuchsgruppen für die Absolvierung der
Verhaltensbatterie sowie für die histologische Auswertung gebildet: Aus der Gruppe
„LiCl/Pilocarpin ohne SE“ (n = 10) erhielten jeweils 5 Tiere 150 mg/kg und 5 Tiere
200 mg/kg Pilocarpin nach einer Vorbehandlung mit LiCl. Lediglich ein Tier erlangte
einen Einzelanfall nach Pilocarpin-Applikation. In der Gruppe „Pilocarpin ohne SE“ (n
= 5) bekamen 3 Tiere 250 mg/kg und 2 Tiere 300 mg/kg Pilocarpin. Die Tiere dieser
Versuchsgruppe erreichten 1-5 einzelne Anfälle nach Pilocarpin-Injektion. Der
Gruppe „LiCl/Pilocarpin mit SE“ (n = 5) wurden 2 Tiere zugeordnet, welche 250
mg/kg, sowie 3 Tiere, welche 300 mg/kg Pilocarpin erhalten haben. Die Gruppe
„Pilocarpin mit SE“ (n = 11) bestand aus 2 Tieren mit einer Dosierung von 250 mg/kg
und 9 Tieren mit einer Dosierung von 300 mg/kg Pilocarpin.
Hinzugefügt wurde als fünfte Gruppe eine altersentsprechende Kontrollgruppe (n =
10), welche dieselbe Dosierung an Methylscopolamin und Diazepam erhalten haben,
jedoch anstelle von Pilocarpin eine NaCl-Vehikelinjektion.
78
Ergebnisse
5.1.2 Detektion von spontanen Anfällen
Alle Pilocarpin-behandelten Mäuse wurden genau beobachtet, um nachzuweisen,
dass Tiere, welche einen SE erlangten, auch spontane wiederkehrende Anfälle, und
infolgedessen eine chronische Epilepsie entwickelten. 8 von 16 Tieren mit SE mit
oder ohne LiCl-Vorbehandlung zeigten mindestens einen spontanen Anfall während
der sechswöchigen Absolvierung der Verhaltensbatterie.
Mäuse, welche während des Handlings bei den Verhaltensversuchen keinen
spontanen Anfall detektieren ließen, wurden über 3-7 aufeinanderfolgende Tage
videoüberwacht, bis jedes Tier, welches unmittelbar nach Pilocarpin-Applikation
einen SE erlangte, mindestens einen spontanen Anfall zeigte.
Der Phänotyp der detektierten spontanen Anfälle erwies sich als vergleichbar zu den
unmittelbaren Krampfanfällen nach Pilocarpinapplikation, so dass erneut die Skala
nach RACINE (1972) verwendet wurde. Üblicherweise zählten die detektierten
spontanen epileptischen Anfälle der Tiere zu Stadium 4 oder 5 (Kapitel 4.3).
Zusammengefasst lässt sich sagen, dass alle (LiCl-) Pilocarpin behandelten Tiere mit
SE mindestens einen spontanen Anfall entwickelten, so dass für diese Tiere die
Entwicklung von chronischer Epilepsie bestätigt werden kann. Bei (LiCl-) Pilocarpin
behandelten Tieren ohne SE konnten keine spontanen Anfälle beobachtet werden.
5.1.3 Resultate der Verhaltensbatterie
In Studie 1 absolvierten die Versuchstiere lediglich eine Auswahl von fünf
Verhaltensversuchen zur Überprüfung von Exploration und Lokomotion, von Angstassoziiertem Verhalten, von räumlicher Lern- und Gedächtnisleistung sowie von
Depressions-assoziiertem
Verhalten,
da
eine
ausführliche
Verhaltens-
charakterisierung von epileptischen NMRI-Mäusen im Pilocarpin-Modell bereits in der
genannten These von Frau Gröticke angefertigt wurde. Neu in meiner These ist die
Verhaltenscharakterisierung
sowie
histologische
Untersuchung
von
LiCl-
vorbehandelten Mäusen sowie Tieren, welche Pilocarpin erhalten haben, jedoch
keinen SE erreichten (Gruppen „LiCl-Pilocarpin- und Pilocarpin ohne SE“).
79
Ergebnisse
5.1.3.1 Überprüfung von Katalepsie: Bar-Test
Es absolvierten lediglich die chronisch epileptischen Mäuse den Bar-Test, da nur bei
ihnen aufgrund von geringerer Spontanaktivität im Vergleich zu Kontrolltieren ein
mögliches kataleptisches Verhalten vermutet werden konnte. Von insgesamt 15
Tieren bestand jedoch nur ein epileptisches Tier den Bar-Test nicht, bei den übrigen
14 epileptischen Mäusen konnte keine Katalepsie nachgewiesen werden. Auffällig
war, dass zwei weitere epileptische Mäuse aus dieser Versuchsgruppe in einem bzw.
zwei Versuchsdurchläufen über die gesamte Versuchsdauer von 120 s ihre Lage
nicht veränderten.
Bar-Test
Anzahl Tiere (n)
15
nicht bestanden
bestanden
10
5
0
Pilo mit SE
Abb. 5.1: Bar-Test zur Überprüfung von Katalepsie. Pilo mit SE: n = 15. Lediglich ein Tier bestand den
Bar-Test nicht.
5.1.3.2 Überprüfung von Exploration, Lokomotion und Angst-assoziiertem
Verhalten
Open-Field
Im Open-Field (Abb. 5.2), einem Test zur Überprüfung von Exploration, Lokomotion
und Angst-assoziiertem Verhalten, ergab sich für die epileptischen Mäuse im
Vergleich
zur
Gruppe
„LiCl/Pilo
ohne
SE“
eine
signifikant
verringerte
Aufenthaltsdauer im Zentrum (p < 0,0001) sowie eine erhöhte Aufenthaltsdauer im
Randbereich der Arena (p = 0,0002). Auch ein Vergleich der Tiere mit zu ohne SE
innerhalb der LiCl-vorbehandelten Gruppen stellte sich bezüglich Aufenthaltsdauer
im Zentrum bzw. am Rand signifikant unterschiedlich dar (p < 0,05). Verglichen zur
Kontrolle verbrachte die Gruppe „LiCl/Pilo mit SE“ signifikant weniger Zeitdauer im
Zentrum (p < 0,05) sowie mehr Zeitdauer am Rand der Arena (p = 0,0002). Die
80
Ergebnisse
Parameter Gesamtstrecke (p = 0,0150) und Laufgeschwindigkeit (p = 0,0155) waren
bei der Gruppe „Pilo mit SE“ im Vergleich zur Kontrolle erhöht.
B OF: Aufenthaltsdauer am Rand
300
30
Zeitdauer (s)
Zeitdauer (s)
A OF: Aufenthaltsdauer
im Zentrum
40
20
*
10
200
100
0
K
Li
on
C
tr
l/P
ol
ilo
le
oh
ne
Pi
SE
lo
oh
Li
ne
C
SE
l/P
ilo
m
it
SE
Pi
lo
m
it
SE
K
Li
on
C
tr
l/P
ol
ilo
le
oh
ne
Pi
SE
lo
oh
Li
ne
C
SE
l/P
ilo
m
it
SE
Pi
lo
m
it
SE
0
C OF: Zurückgelegte
Gesamtstrecke
D OF: Laufgeschwindigkeit
*
Geschwindigkeit (cm/s)
5000
Strecke (cm)
*
4000
3000
2000
1000
15
*
10
5
0
K
on
Li
C
tr
l/P
ol
le
ilo
oh
ne
Pi
SE
lo
oh
ne
Li
C
S
l/P
E
ilo
m
it
SE
Pi
lo
m
it
S
E
K
Li
on
C
tr
l/P
ol
ilo
le
oh
ne
Pi
SE
lo
oh
Li
ne
C
SE
l/P
ilo
m
it
SE
Pi
lo
m
it
SE
0
20
Abb. 5.2: Darstellung der Parameter Aufenthaltsdauer im Zentrum (s) bzw. am Rand der Arena (s),
der zurückgelegten Gesamtstrecke (cm) sowie der Laufgeschwindigkeit (cm/s) im Open-Field. OF =
Open-Field, LiCl = Lithiumchlorid-Vorbehandlung, Pilo = Pilocarpin, Kontrolle: n = 10, LiCl/Pilo ohne
SE: n = 10, Pilo ohne SE: n = 5, LiCl/Pilo mit SE: n = 5, Pilo mit SE: n = 11, A-D: 1-way ANOVA
nonparametrisch (Kruskal-Wallis-Test), Posthoc: Dunn's-Multiple-Comparison-Test, * = Pilo mit SE
signifikant zur Kontrolle, Signifikanzniveau: p < 0,05
Ein Blick auf die zurückgelegten Gesamtstrecken der Mäuse stellt dar, dass die
Versuchsgruppen auch hier voneinander differieren. Die Kontrollen sowie die
Pilocarpin-behandelten Tiere ohne SE (mit oder ohne LiCl-Vorbehandlung)
explorierten die gesamte Arena (Abb. 5.3 A, B, C). Die epileptischen Tiere (Abb. 5.3
81
Ergebnisse
D, E) hingegen bewegten sich insbesondere entlang der Wand, präsentierten also
Thigmotaxis, welche als Maß für Angst-assoziiertes Verhalten gilt (SIMON et al.
1994).
A
B
D
E
C
Abb. 5.3: Aufsicht auf das Open-Field mit Markierung der zurückgelegten Wegstrecken der Mäuse.
Abb. A bezeichnet ein Kontrolltier, Abb. B ein Tier aus der Gruppe „LiCl/Pilo ohne SE“ sowie Abb. C
ein Tier aus der Gruppe „Pilo ohne SE“. Die Tiere aus den Gruppen „LiCl/Pilo mit SE“ (D) sowie „Pilo
mit SE“ (E) zeigten Thigmotaxis.
Elevated-Plus-Maze
In einem weiteren Test zur Untersuchung von Angst-assoziiertem Verhalten, dem
Elevated-Plus-Maze (Abb. 5.4), ließen sich keine signifikanten Unterschiede
zwischen den Versuchsgruppen bei den Parametern Aufenthaltsdauer auf den offen
bzw. geschlossenen Armen (s), bei der zurückgelegten Wegstrecke (cm), sowie bei
dem Verhältnis des Eintritts in die offenen/geschlossenen Arme feststellen. Lediglich
das Absprungverhalten (Abb. 5.4 E) von der Versuchsapparatur war bei den
epileptischen Tieren im Vergleich zu den übrigen Gruppen signifikant erhöht (p =
0,0094).
82
Ergebnisse
B EPM: Aufenthaltsdauer auf
den geschlossenen Armen
A EPM: Aufenthaltsdauer
auf den offenen Armen
200
Zeitdauer (s)
150
100
50
150
100
50
0
K
Li
on
C
tr
l/P
ol
ilo
le
oh
ne
Pi
SE
lo
oh
Li
ne
C
SE
l/P
ilo
m
it
SE
Pi
lo
m
it
SE
K
Li
on
C
tr
l/P
ol
ilo
le
oh
ne
Pi
SE
lo
oh
Li
ne
C
SE
l/P
ilo
m
it
SE
Pi
lo
m
it
SE
0
D EPM: Verhältnis der Eintritte in die
offenen/geschlossenen Arme
4
2000
Offene:
geschlossene Arme
1500
1000
500
3
2
1
Anzahl Absprünge (n)
Versuchsapparatur
*
Kontrolle/Pilo ohne SE
Pilo mit SE
20
10
0
Absprung
ohne Absprung
83
E
m
it
S
Pi
lo
it
S
SE
C
l/P
i
lo
m
ne
oh
Li
ne
Pi
lo
l/P
Li
C
SE
lle
K
on
tr
o
K
Li
on
C
tr
l/P
ol
ilo
le
oh
ne
Pi
SE
lo
oh
Li
ne
C
SE
l/P
ilo
m
it
SE
Pi
lo
m
it
SE
E EPM: Absprünge von der
30
E
0
0
ilo
Gesamtstrecke (cm)
C EPM: Zurückgelegte
Gesamtstrecke
oh
Zeitdauer (s)
200
Ergebnisse
Abb. 5.4: Darstellung der Ergebnisse im Elevated-Plus-Maze: Aufenthaltsdauer auf den offenen bzw.
geschlossenen Armen (s), der zurückgelegten Gesamtstrecke (cm), des Verhältnisses der Eintritte in
die offenen/geschlossenen Arme sowie der Anzahl der Absprünge von der Versuchsapparatur. EPM =
Elevated-Plus-Maze, LiCl = Lithiumchlorid-Vorbehandlung, Pilo = Pilocarpin, Kontrolle: n = 10,
LiCl/Pilo ohne SE: n = 10, Pilo ohne SE: n = 5, LiCl/Pilo mit SE: n = 5, Pilo mit SE: n = 11. In Abb. E
wurden die Gruppen nicht nach LiCl-Vorbehandlung aufgetrennt. A-D: 1-way-ANOVA
nonparametrisch (Kruskal-Wallis-Test), Posthoc: Dunn's-Multiple-Comparison-Test, E: Kontingenztafel
und Fisher’s-Exakt-Test, Signifikanzniveau: p < 0,05
5.1.3.3 Überprüfung der räumlichen Lern- und Gedächtnisleistung: MorrisWater-Maze
Eine Überprüfung der räumlichen Lern- und Gedächtnisleistung der Tiere erfolgte im
Morris-Water-Maze. Wie Abbildung 5.5 A darstellt, ergab ein Vergleich der Latenzzeit
bis zum Erreichen der Plattform eine signifikante Verbesserung der Kontrolltiere von
Tag 1 zu Tag 6, 7 und 8 (Abb. 5.5 A, p = 0,0062). Die Gruppe „LiCl/Pilocarpin ohne
SE“ verbesserte ihre Latenzzeit, um die Plattform aufzufinden, von Tag 1 zu Tag 9 (p
= 0,0165). Abbildung 5.5 A stellt ferner dar, dass die Pilocarpin-behandelten Tiere
ohne SE (mit oder ohne LiCl-Vorbehandlung) nicht von den Kontrolltieren differierten.
Beide Gruppen von epileptischen Tieren zeigten über die Akquisitionsstage keine
signifikante Verbesserung ihrer Lernleistung. Für die Gruppe „Pilo mit SE“ ergab sich
daher am Akquisitionsstag 8 eine signifikant schlechtere Lernleistung als bei den
Kontrolltiere (Abb. 5.5 B, p < 0,05). Bei der Auswertung des Probe-Trials
unterschieden sich die Versuchsgruppen nicht voneinander, es gibt lediglich eine
Tendenz, dass die epileptischen Tiere weniger Zeit im Quadranten der ehemaligen
Plattformposition verbrachten (Abb. 5.5 C).
84
Ergebnisse
A MWM: Latenzzeit bis zum
Erreichen der Plattform
Latenzzeit (s)
40
Kontrolle
LiCl/Pilo ohne SE
Pilo ohne SE
*
30
20
10
#
0
1
B
2
3
4
5
6
7
8
9
MWM: Latenzzeit bis zum
Erreichen der Plattform
40
Latenz (s)
30
Kontrolle
LiCl/Pilo mit SE
Pilo mit SE
*
20
10
0
1
2
3
4
5
6
7
8
9
85
Ergebnisse
C Probe T rial: Quadrant
der ehemaligen Plattformposition
Zeitdauer (s)
25
20
15
10
5
it
SE
m
Pi
lo
Li
C
l/P
ilo
m
it
SE
SE
SE
Pi
lo
oh
ne
oh
ne
Li
C
l/P
ilo
K
on
tr
ol
le
0
Abb. 5.5: Darstellung der Latenzzeit bis zum Auffinden der Plattform im Morris-Water-Maze der
Pilocarpin-behandelten Tiere ohne SE (5.5 A) sowie der epileptischen Tiere (5.5 B), jeweils im
Vergleich zu den Kontrolltieren. Abb. C stellt die Zeitdauer da, welche die Mäuse im Quadranten der
ehemaligen Plattformposition verbrachten. MWM = Morris-Water-Maze; LiCl = LithiumchloridVorbehandlung, Pilo = Pilocarpin, Kontrolle: n = 10, LiCl/Pilo ohne SE: n = 10, Pilo ohne SE: n = 5,
LiCl/Pilo mit SE: n = 5, Pilo mit SE: n = 11. A+B: 2-way-Repeated-Measures-ANOVA und BonferroniPosttests, Abb. A: * = signifikante Verbesserung der Lernleistung im Vergleich zu Tag 1 bei den
Kontrollen sowie # = bei den LiCl/Pilo-behandelten Tieren ohne SE. Abb. B: * = Pilo mit SE signifikant
zu den Kontrollen. Signifikanzniveau: p < 0,05
Die
Auswertung
der
Schwimmstrecken
veranschaulicht
an
repräsentativen
Abbildungen an Akquisitionstag 9, wie ein Kontrolltier sowie jeweils ein Pilocarpinbehandeltes Tier mit bzw. ohne LiCl-Vorbehandlung eine Lernstrategie entwickelten
und direkt zur Plattform schwammen (Abb. 5.6 A-C). Die epileptischen Tiere beider
Gruppen (Abb. 5.6 D-F) dagegen entwickelten keinerlei Suchstrategie nach der
verborgenen Plattform. Meist schwammen sie entweder direkt an der Wand entlang,
präsentierten also Thigmotaxis (Abb. 5.6 D, E) oder bisweilen zeigten sie ein
sogenanntes „Floating“-Verhalten (Abb. 5.6 F) (LANG et al. 2003). Letzteres
bedeutet, dass sie in einer sehr langsamen Geschwindigkeit lediglich kleine Kreise
schwammen und infolgedessen die Plattform nicht auffinden konnten.
86
Ergebnisse
A
B
C
D
E
F
Abb. 5.6: Aufsicht auf das Morris-Water-Maze mit Darstellung von repräsentativen Schwimmstrecken
der Mäuse. A bezeichnet ein Kontrolltier, B ein Tier aus der Gruppe „LiCl/Pilo ohne SE“ sowie C ein
Tier aus der Gruppe „Pilo ohne SE“. Tiere dieser drei Gruppen lernten, wo sich die Plattform befand
und schwammen direkt auf sie zu. Die Tiere aus den Gruppen „LiCl/Pilo mit SE“ (D) sowie „Pilo mit
SE“ (E) zeigten Thigmotaxis bzw. „Floating“ (F).
5.1.3.4 Überprüfung von Depressions-assoziiertem Verhalten
Bei beiden Tests, mit welchen Depressions-assoziiertes Verhalten von Nagern
untersucht wird, ließen sich ähnliche Resultate feststellen: Die Zeitdauer, in welcher
die Tiere eine immobile Körperhaltung präsentierten, war bei den epileptischen
Tieren im Vergleich zur Kontrollgruppe und zu den beiden Pilocarpin-behandelten
Gruppen ohne SE signifikant herabgesetzt. Im Tail-Suspension-Test (Abb. 5.7 A)
zeigte die Gruppe „Pilo mit SE“ eine höhere Aktivität im Vergleich zu den Kontrollen
sowie zu den Gruppen „LiCl/Pilo mit SE“ und „Pilo mit SE“ (p = 0,0010). Im PorsoltTest (Abb. 5.7 B) zeigten beide Gruppen von epileptischen Tieren eine signifikant
verringerte Immobilitätszeit im Vergleich zu den Kontrollen. Ferner ergab sich für die
Gruppe „LiCl/Pilo mit SE“ eine reduzierte Schwimmaktivität im Vergleich zu den
Gruppen „LiCl/Pilo ohne SE“ sowie „Pilo ohne SE“ (p < 0,0001).
87
Ergebnisse
A Tail-Suspension-Test:
B
Immobilitätsverhalten
150
60
40
20
*
Zeitdauer (s)
Zeitdauer (s)
80
100
50
0
*
*
K
on
Li
C
tr
l/P
ol
le
ilo
oh
ne
SE
Pi
lo
oh
ne
Li
C
SE
l/P
ilo
m
it
SE
Pi
lo
m
it
SE
SE
m
m
it
it
Pi
lo
ilo
l/P
lo
SE
SE
ne
SE
Li
C
Pi
ilo
oh
oh
ne
tr
o
lle
0
l/P
K
on
C
Li
Porsolt-Test:
Immobilitätsverhalten
Abb. 5.7: Darstellung des Immobilitätsverhaltens im Tail-Suspension-Test (A) sowie im Porsolt-Test
(B). LiCl = Lithiumchlorid-Vorbehandlung, Pilo = Pilocarpin, Kontrolle: n = 10, LiCl/Pilo ohne SE: n =
10, Pilo ohne SE: n = 5, LiCl/Pilo mit SE: n = 5, Pilo mit SE: n = 10; Besonderheit des TailSuspension-Tests für die Gruppen Kontrolle: n = 9 sowie Pilo mit SE: n = 8 (wegen wiederholten
Hochkletterns aus dem Versuch ausgeschlossen); A+B: 1-way ANOVA Kruskal-Wallis-Test, Posthoc:
Dunn's-Multiple-Comparison-Test, * = (LiCl-) Pilo mit SE signifikant zur Kontrolle, Signifikanzniveau: p
< 0,05
5.1.4 Resultate der histologischen Auswertung
Um neurodegenerative Veränderungen untersuchen zu können, wurden die Gehirne
der Tiere nach der in Kapitel 4.10.1 beschriebenen Weise entnommen und die
histologischen Schnitte mittels der Nisslfärbung (Kapitel 4.10.2) angefärbt. Abbildung
5.8 zeigt repräsentativ den Verlust an Neuronen im gesamten Hippocampus (Abb.
5.8 E) sowie im Hilus des Gyrus dentatus (Abb. 5.8 F) bei einem epileptischen Tier
im Vergleich zu einem Kontrolltier (Abb. 5.8 A, B) wie auch einem Pilocarpinbehandelten Tier ohne SE (Abb. 5.8 C, D).
88
Ergebnisse
A
B
C
D
E
F
Abb. 5.8: Übersicht über den Hippocampus (A, C, E) sowie einem Ausschnitt aus dem Hilus des
Gyrus dentatus (B, D, F) eines Kontrolltieres (A, B), eines Tieres aus der Gruppe Pilo ohne SE (C, D)
und eines epileptischen Tieres (E, F). Die Schnittebene beträgt -1,94 mm zu Bregma (PAXINOS u.
FRANKLIN 2001). Die Darstellung erfolgte mittels Nissl-Färbung (Kapitel 4.10.2). Der Maßstabbalken
entspricht 500 µm für die Abb. A, C und E sowie 100 µm für die Abb. B, D und F.
5.1.4.1 Histologische Auswertung in Thionin-Färbung
In allen bewerteten Subregionen des Hippocampus ergaben sich signifikante
Unterschiede hinsichtlich der Neurodegeneration zwischen den epileptischen Tieren
und der Kontrollgruppe.
Die Gehirnschnitte der Mäuse beider epileptischer Versuchsgruppen zeigten bei der
Bewertung nach Scoring-System in der CA 1-Subregion (Abb. 5.9 A) eine
ausgeprägte Neurodegeneration im Vergleich zu Kontrollen (p < 0,01) sowie zu
beiden Pilocarpin-behandelten Gruppen ohne SE (p < 0,05). Bezüglich der Zählung
von Neuronen (Abb. 5.9 B) ergaben sich bei den histologischen Schnitten der
epileptischen Tiere ohne LiCl-Vorbehandlung eine signifikant verringerte Anzahl an
Neuronen als bei den Kontrollen und der Gruppe „LiCl/Pilo ohne SE“ (p = 0,0035).
89
Ergebnisse
In der Subregion CA 3a (Abb. 5.9 C) zeigte sich bei den Gehirnschnitten beider
epileptischer Gruppen ein nach Scoring-System bewerteter signifikanter Verlust von
Neuronen im Vergleich zu den Kontrolltieren, zur Gruppe „LiCl/Pilo ohne SE“ sowie
teilweise im Vergleich zur Gruppe „Pilo ohne SE“ (p < 0,0001). Mittels Auszählen von
Neuronen (Abb. 5.9 D) konnte eine verringerte Anzahl bei den histologischen
Schnitten der Pilocarpin-behandelten Tieren mit SE zu denen ohne SE (beide
Gruppen ohne LiCl-Vorbehandlung) festgestellt werden (p = 0,0033).
Die Gehirnschnitte beider epileptischen Gruppen wiesen in der Subregion CA 3c
(Abb. 5.9 E) einen nach Scoring-System bewerteten signifikant höheren Verlust an
Neuronen als die Kontrollen auf. Die histologischen Schnitte der epileptischen Mäuse
ohne LiCl-Vorbehandlung ergaben auch zu beiden Pilocarpin-behandelten Gruppen
ohne SE eine signifikante Neurodegeneration (p < 0,0001). Bei den Gehirnschnitten
der Gruppe „Pilo mit SE“ ließ sich ferner nach Auszählen von Neuronen (Abb. 5.9 F)
eine verringerte Neuronenanzahl im Vergleich zu den Kontrollen sowie zur Gruppe
„LiCl/Pilo ohne SE“ (p = 0,0008) detektieren.
Auch im Hilus des Gyrus dentatus (Abb. 5.9 G) zeigte sich bei der Auswertung der
Gehirnschnitte beider epileptischer Gruppen nach Bewertung mittels Scoring-System
ein signifikant verringerter Score, verglichen zu den Kontrollen sowie den Pilocarpinbehandelten Gruppen ohne SE. Ähnlich stellte sich die Situation nach Auszählen von
Neuronen dar (jeweils p < 0,0001).
Die Bewertung der Körnerzellschicht des Gyrus dentatus ergab eine signifikante
Neurodegeneration bei beiden epileptischen Versuchsgruppen im Vergleich zur
Kontrolle sowie teilweise zu den Pilocarpin-behandelten Gruppen ohne SE (Abb. 5.9
I, p < 0,0001). Ferner trat bei nahezu allen epileptischen Tieren (14 von 16) eine
Dispersion der Körnerzellschicht des Gyrus dentatus auf.
Auszählen von Neuronen innerhalb eines definierten Fensters inmitten der Amygdala
ergab eine signifikant verringerte Anzahl an Neuronen bei den histologischen
Schnitten der epileptischen Tiere, verglichen zu den Kontrolltieren (Abb. 5.9 J, p =
0,0505).
90
Score
2.5
3.0
2.5
*
C
*
K
Li
on
C
tr
l/P
ol
ilo
le
oh
ne
Pi
SE
lo
oh
Li
ne
C
SE
l/P
ilo
m
it
SE
Pi
lo
m
it
SE
Score
3.0
*
2.0
1.5
1.0
0.5
Anzahl Neuronen (n)
K
Li
on
C
tr
l/P
ol
ilo
le
oh
ne
Pi
SE
lo
oh
Li
ne
C
SE
l/P
ilo
m
it
SE
Pi
lo
m
it
SE
2.0
*
1.5
1.0
0.5
Anzahl Neuronen (n)
A
K
Li
on
C
tr
l/P
ol
ilo
le
oh
ne
Pi
SE
lo
oh
Li
ne
C
SE
l/P
ilo
m
it
SE
Pi
lo
m
it
SE
K
Li
on
C
tr
l/P
ol
ilo
le
oh
ne
Pi
SE
lo
oh
Li
ne
C
SE
l/P
ilo
m
it
SE
Pi
lo
m
it
SE
Ergebnisse
CA 1
(Scoring)
B
0.0
CA 3a
(Scoring)
D
0.0
91
CA 1
(Neuronenzählung)
100
80
60
40
20
*
0
CA 3a
(Neuronenzählung)
100
80
60
40
20
0
Score
2.5
G
3.0
2.5
*
Hilus
(Scoring)
*
K
Li
on
C
tr
l/P
ol
ilo
le
oh
ne
Pi
SE
lo
oh
Li
ne
C
SE
l/P
ilo
m
it
SE
Pi
lo
m
it
SE
Score
3.0
*
2.0
1.5
1.0
0.5
Anzahl Neuronen (n)
K
Li
on
C
tr
l/P
ol
ilo
le
oh
ne
Pi
SE
lo
oh
Li
ne
C
SE
l/P
ilo
m
it
SE
Pi
lo
m
it
SE
*
2.0
1.5
1.0
0.5
Anzahl Neuronen (n)
E
K
Li
on
C
tr
l/P
ol
ilo
le
oh
ne
Pi
SE
lo
oh
Li
ne
C
SE
l/P
ilo
m
it
SE
Pi
lo
m
it
SE
K
Li
on
C
tr
l/P
ol
ilo
le
oh
ne
Pi
SE
lo
oh
Li
ne
C
SE
l/P
ilo
m
it
SE
Pi
lo
m
it
SE
Ergebnisse
CA 3c
(Scoring)
F
0.0
0.0
92
CA 3c
(Neuronenzählung)
80
60
40
20
*
0
H
5
0
Hilus
(Neuronenzählung)
25
20
15
10
*
*
Ergebnisse
Gyrus dentatus
(Scoring)
J
Anzahl Neuronen (n)
3.0
2.0
*
1.5
1.0
*
0.5
0.0
100
80
*
60
40
20
SE
Pi
lo
m
it
SE
(L
iC
l-)
(L
iC
l-)
K
on
tr
ol
le
K
Li
on
C
tr
l/P
ol
ilo
le
oh
ne
Pi
SE
lo
oh
Li
ne
C
SE
l/P
ilo
m
it
SE
Pi
lo
m
it
SE
0
oh
ne
Score
2.5
Amygdala
(Neuronenzählung)
Pi
lo
I
Abb. 5.9: Ergebnisse der Bewertung der CA 1-Subregion (A), der CA 3a-Subregion (C) und der CA
3c-Subregion (E) des Hippocampus sowie des Hilus (G) und der Körnerzellschicht des Gyrus dentatus
(I) anhand eines Scoring-Systems. Score 0 = kein Neuronenverlust, Score 1 < 20 % Neuronenverlust,
Score 2 < 50 % Neuronenverlust, Score 3 > 50 % Neuronenverlust vorhanden. Auszählen von
Neuronen innerhalb von definierten Fenstern (355 x 265 µm) in der CA 1-Subregion (B), in der CA 3aSubregion (D) sowie in der CA 3c-Subregion des Hippocampus, ferner im Hilus des Gyrus dentatus
(F, H) sowie in der Amygdala (J). Alle statistischen Berechnungen erfolgten mittels 1-way-ANOVA
nonparametrisch (Kruskal-Wallis-Test) und Dunnet’s-Multiple-Comparison-Test als Posthoc-Test. * =
(LiCl-) Pilo mit SE signifikant zur Kontrolle, Signifikanzniveau: p < 0,05
5.1.4.2 Histologische Untersuchung von repräsentativen Tieren in FJC
Es
wurden
histologische
Schnitte
von
repräsentativen
Tieren
aus
allen
Versuchsgruppen 5 Monate nach SE, sowie Gehirnschnitte von 17 zusätzlichen
Tieren 5, 24, 48 Stunden sowie 7 Tage nach SE bzw. Pilocarpin-/Vehikelinjektion
(Bolusdosierungen von 250 bzw. 300 mg/kg Pilocarpin) mit FJC, einem spezifischen
Marker für degenerierende Neuronen, gefärbt. Die Ergebnisse der Bewertung nach
FJC-Markierung sind vergleichbar mit denen aus der Thionin-Färbung. Bei den
Gehirnschnitten der Kontrollen (Abb. 5.10 A, B) sowie der Pilocarpin-behandelten
Tiere ohne SE (Abb. 5.10 G, H) sind keine angefärbten, d.h. degenerierenden
Neuronen sichtbar.
Bei den histologischen Schnitten der epileptischen Tiere waren bereits 5 Stunden
nach SE (Abb. 5.10 C, D) vereinzelt degenerierende, nach FJC-Markierung hellgrün
leuchtende Neuronen im Hilus des Gyrus dentatus sowie in der amygdalohippocampalen-Area zu beobachten. In der Schnittebene -3,16 mm zu Bregma
konnten auch einzelne FJC-markierte Neuronen in den Subregionen CA 1 und 3
93
Ergebnisse
detektiert werden. Ferner waren in den Gehirnschnitten einer Maus vereinzelt
degenerierende Neuronen im entorhinalen Cortex zu sehen. Der Höhepunkt der
Neurodegeneration lag bei 24 (Abb. 5.11 A, B) bis 48 Stunden nach SE (Abb. 5.10 E,
F).
Es
konnten
zahlreiche
FJC-markierte
Neuronen
über
den
gesamten
Hippocampus, über thalamische Kerngebiete sowie über den Cortex verteilt
detektiert werden. 7 Tage nach SE (Abb. 5.11 C, D) fanden sich nur noch vereinzelt
degenerierende,
FJC-markierte
Neuronen
Bereichen.
A
B
C
D
94
in
corticalen
sowie
thalamischen
Ergebnisse
E
e
F
G
H
Abb. 5.10: Auf den Abb. A, C, E, G ist die CA 1-Subregion sowie auf den Abb. B, D, F, H der Gyrus
dentatus des Hippocampus zu sehen. Ausschnitte eines Gehirnschnittes eines Kontrolltieres stellen
die Abb. A und B, eines Tieres 5 Stunden nach Pilocarpin-induziertem SE die Abb. C und D, eines
Tieres 48 Stunden nach Pilocarpin-induziertem SE die Abb. E und F sowie eines Pilocarpinbehandelten Tieres ohne SE die Abb. G und H dar. Der Maßstabbalken bezeichnet 50 µm für die CA
1-Subregion sowie 100 µm für den Gyrus dentatus.
5.1.4.3 Auswertung in FJC- und GFAP-Markierung
Bei der Auswertung der Gehirnschnitte in FJC-Färbung bemerkten wir bei den
epileptischen Tieren nicht nur die Präsenz von fluoreszierenden Neuronen (Abb. 5.11
A, B, markiert mittels eines Pfeils), sondern ab 7 Tagen nach SE auch die Anfärbung
von Zellen, welche eine nicht-neuronale Morphologie aufwiesen. Es wurden
einerseits langestreckte Zellen (morphologisch ähnlich radialer Glia, Abb. 5.11 C, D),
sowie andererseits sternförmige Zellen mit vielen Fortsätzen (mit Astrozytenähnlicher Morphologie, Abb. 5.11 E, F) detektiert. Radiale Glia stellen unter anderem
neuronale Progenitorzellen dar und können sich entweder zu Neuronen oder zu
Gliazellen entwickeln (CORBIN et al. 2008). Auch SCHMUED et al. (2005)
95
Ergebnisse
beschreiben, dass sich in Gehirnschnitten von Tieren nach Kainat-Behandlung in
einigen Regionen mit ausgeprägter Neurodegeneration, wie beispielsweise dem
Hippocampus, teilweise Zellen mit einer Morphologie von hypertrophierten
Astrozyten anfärben lassen. Analog zur Beobachtung von SCHMUED et al. (2005)
ließen sich auch die oben beschriebenen Zelltypen, welche wir in der vorliegenden
Arbeit detektierten, weniger intensiv mit FJC anfärben als degenerierende Neuronen.
Nachfolgend wurden die Gehirnschnitte mittels des Astrozytenmarkers GFAP
gefärbt. Bei den histologischen Schnitten der epileptischen Tiere ließ sich eine
vermehrte Anzahl von GFAP-markierten Astrozyten darstellen. Auch Zellen mit der
oben beschriebenen nicht-neuronalen Morphologie ließen sich mittels GFAP
markieren (Abb. 5.11 G, H), infolgedessen konnte als Schlussfolgerung zugelassen
werden, dass es sich um radiale Glia sowie hypertrophierte Astrozyten handelt.
Beide Zelltypen wurden in einer Studie von BORGES et al. (2006) mit GFAPFärbung nach einem Pilocarpin-induziertem SE beschrieben. In dieser PhD-Arbeit
traten radiale Glia und hypertrophierte Astrozyten insbesondere im späteren Verlauf
der Epileptogenese, also 7 Tage (Abb. 5.11 C, D) sowie 5 Monate nach SE (Abb.
5.11 E, F), auf. Zum Zeitpunkt von 7 Tagen nach SE traten hypertrophierte
Astrozyten insbesondere im Hilus des Gyrus dentatus, dem Stratum radiatum sowie
im Molecular layer des Hippocampus auf. In der Schnittebene -3,16 mm zu Bregma
traten hypertrophierte Astrozyten auch vereinzelt im dorsalen Cortex sowie im
Subiculum des Hippocampus auf. 5 Monate nach SE wiesen vor allem der Hilus des
Gyrus dentatus sowie zum Teil auch thalamische Kerngebiete hypertrophierte
Astrozyten auf.
96
Ergebnisse
A
B
C
D
E
F
97
Ergebnisse
G
H
Abb. 5.11: Darstellung des Gyrus dentatus nach FJC- (Abb. A-F) bzw. GFAP-Markierung (Abb. G, H)
zu verschiedenen Zeitpunkten nach Pilocarpin-induziertem SE in zwei verschiedenen
Vergrößerungsstadien. 24 Stunden nach SE (A, B) zeigen FCJ-angefärbte Zellen die typische Form
von Neuronen (gezeigt durch einen Pfeil in Abb. B). 7 Tage nach SE (C, D) werden nur noch wenige
Neuronen durch FJC angefärbt. Zusätzlich färbten sich Zellen mit radial verlaufenden Fortsätzen
(bezeichnet durch den Pfeil in Abbildung D) sowie langgezogene Zellen an. Der zuletzt genannte
Zelltyp dominierte 5 Monate nach SE (E, F; Pfeil in Abbildung F). In den Abb. G (5 Monate nach SE)
und H (7 Tage nach SE) ist zu sehen, dass sich einige der beiden zuletzt beschriebenen Zelltypen,
welche sich 7 Tage und 5 Monate nach SE durch FJC anfärben lassen, mittels des Gliazellmarkers
GFAP anfärben lassen. Der Maßstabbalken repräsentiert 50 µm für die Abbildungen A, E, C und G
sowie 20 µm für die Abbildungen B, D, F und H.
5.1.5 Korrelationen zwischen Neurodegeneration und Verhaltensauffälligkeiten
Bei den Korrelationsberechnungen zwischen einzelnen bewerteten Parametern der
histologischen
Ergebnisse
zu
ausgewählten
Untersuchungsparametern
der
Verhaltensänderungen der epileptischen Tiere (Kapitel 4.11), ergab sich lediglich
eine signifikante Korrelation zwischen der Neurodegeneration in der CA 3cSubregion zur Aufenthaltsdauer im Zentrum des Open-Fields (Tab. 5.2, p = 0,0206).
98
LiCl/Pilo
mit SE
Histologische
Auswertung
Ergebnisse von Untersuchungsparametern der Verhaltensbatterie
CA 1
CA 3c* Hilus
OF - Zentrum EPM – Offene Arme MWM Tag 8 zu Tag 1 Tail-Suspension Porsolt-Test
0,00
0,00 80,61
81,82
98,01
0,85
91,59
100
85,38 100,00 92,73
0
68,13
0,59
76,45
100
59,94
66,85 84,25
85,45
0
0,58
59,62
98,08
47,57
49,92 76,96
83,03
0
1,00
61,31
98,08
43,06 100,00 87,88
40,61
0
0,76
86,54
100
75,47 100,00 93,94
79,39
0
0,33
83,18
89,44
72,55
89,42 79,40
70,91
43,66
0,83
100
95,95 100,00 86,67
56,36
0
0,66
100
92,34
90,83 93,94
72,12
0
0,25
91,59
0,00
6,88 75,76
66,06
26,59
0,63
66,35
66,41
77,28 100,00 91,52
0
68,13
0,82
94,95
89,44
12,23
77,43 80,61
45,45
39,72
0,81
93,27
100
19,21
31,57 74,55
81,82
97,69
1,00
100,00
46,26
68,04
99,29 98,79
79,39
85,7
1,00
78,13
91,36
56,79
81,66 95,15
23,64
24,61
0,39
88,22
100
98,65
93,65 92,73
23,64
0
1,00
65,45
Ergebnisse
99
Tab. 5.2: Übersicht über die Daten zur Korrelationsberechnung zwischen Neuronenverlust (%) zu Verlust der Zeitdauer in den untersuchten
Parametern der Verhaltenstests (%) (mit Ausnahme des MWM: Quotient der Latenzzeit (s) von Tag 8 zu Tag 1 der Akquisition) bei den
epileptischen Mäusen im Vergleich zu den Kontrollen. Jede Zeile entspricht den Ergebnissen einer Maus. Im Tail-Suspension-Test wurden 3
Mäuse aufgrund von wiederholten Kletterns auf die Versuchsapparatur sowie im Porsolt-Test 1 Tier wegen wiederholter Krampfanfälle aus der
Auswertung der Tests herausgenommen. OF = Open-Field, EPM = Elevated-Plus-Maze, MWM = Morris-Water-Maze. Statistik: Non-parametrische
Korrelation nach Spearman. Signifikanzniveau: p < 0,05. * = Korrelation zwischen CA 3c und OF – Zentrum signifikant.
Pilo mit SE
Ergebnisse
5.2 Etablierung des Pilocarpin-Modells sowie Unterschiede in der Sensitivität
bei Substämmen und Sublinien von B6 Mäusen (Studie 2)
5.2.1.1 Etablierung des Pilocarpin-Modells für die B6-Maus
Wie in Kapitel 2.5.1 erläutert, ist die Etablierung des Pilocarpin-Modells bei der B6Maus aufgrund einer häufig geringen SE-Induktions- sowie hohen Mortalitätsrate
keineswegs trivial. Wir testeten drei verschiedene Substämme (B6JOlaHsd und
B6NHsd von Harlan-Winkelmann sowie B6NCrl von Charles River) hinsichtlich ihrer
Sensitivität auf Pilocarpin (Tabelle 5.3), um einen B6-Substamm mit möglichst hoher
SE-Induktionsrate und niedriger Mortalitätsrate zu detektieren. Ferner variierten wir
das Applikationsregime (Bolus oder fraktionierte Applikation) sowie die Dosis von
Pilocarpin. Verstarben Tiere während des Pilocarpin-Versuchs, so erlangten diese
üblicherweise nach Pilocarpin-Applikation solch heftige Einzelkrämpfe, dass sie in
diesen vermutlich aufgrund von Atemversagen verstarben, bevor sie einen SE
erreichen konnten.
Tabelle 5.3 verdeutlicht, dass die beiden Substämme von Harlan-Winkelmann eine
nur geringe SE-Induktions- und eine hohe Mortalitätsrate aufwiesen. Der Substamm
von Charles River (B6NCrl) jedoch erreichte bei den Bolusdosierungen (300 m/kg, p
= 0,0037) sowie bei fraktionierter Applikation (100 mg/kg, p = 0,0002) eine signifikant
höhere SE-Induktionsrate verglichen mit dem Substamm B6JOlaHsd. B6NCrl zeigten
ferner eine signifikant höhere SE-Induktionsrate sowie geringere Mortalitätsrate im
Applikationsprotokoll 100 mg/kg fraktioniert verglichen mit dem Substamm B6NHsd
(p = 0,0003). Diese Ergebnisse zeigen, dass das Pilocarpin-Modell sowohl mittels
Bolusdosierung (300 mg/kg), als auch mittels fraktionierter Applikation ähnlich zu
NMRI-Mäusen beim Substamm B6NCrl eine hohe SE-Induktionsrate hervorbringt.
Da ein fraktioniertes Applikationsregime eine individuellere Dosierung pro Maus
ermöglicht, setzten wir diese Applikationsform beim Substamm B6NCrl für den
Hauptversuch ein. Wie Tabelle 5.3 darstellt, entwickelten überraschenderweise nur 7
von 23 Tieren (30%) einen SE, die Gesamtmortalität hingegen erreichte einen Wert
von 74%. Diese Ergebnisse waren signifikant schlechter (p = 0,0024) als in den
Vorversuchen, welche mit demselben Substamm (B6NCrl) desselben Züchters
Charles River absolviert wurden. Den hauptsächlichen Unterschied stellte dar, dass
100
Ergebnisse
die B6NCrl des Hauptversuchs mit der geringeren SE-Induktionsrate aus Barriere 9,
sowie die Tiere aus den Vorversuchen mit der höheren SE-Induktionsrate aus
Barriere 8 des Züchters Charles River stammten.
Substamm
B6
Applikations
-regime (i.p.)
Dosis
(mg/kg)
Anzahl
Mäuse
(n)
Mäuse
mit SE
Überlebende
Mäuse mit
SE
Gesamtmortalität
B6JOlaHsd
Bolus
300
10
0
-
1 (10%)
B6JOlaHsd
Bolus
325
5
0
-
0
B6JOlaHsd
Bolus
350
10
0
0
4 (40%)
B6JOlaHsd
Bolus
400
5
2 (40%)
1 (20%)
4 (80%)
B6JOlaHsd
Fraktioniert
(50 mg/kg)
Fraktioniert
(100 mg/kg)
400-550
5
0
-
5 (100%)
300-1000
19
3 (16%)
0
16 (84%)
B6NHsd
Bolus
300
5
1 (20%)
1 (20%)
1 (20%)
B6NHsd
Bolus
325
5
1 (20%)
1 (20%)
0
B6JOlaHsd
B6NHsd
Bolus
350
6
2 (33%)
2 (33%)
3 (50%)
B6NHsd
Fraktioniert
(50 mg/kg)
Fraktioniert
(100 mg/kg)
500-550
5
0
-
1 (20%)
300-1000
11
1 (9%)
0
10 (91%)
Bolus
300
5
4 (80%)*
4 (80%)*
0
Bolus
325
10
7 (70%)*
6 (60%)*
3 (30%)
Fraktioniert
(50 mg/kg)
Fraktioniert
(100 mg/kg)
Fraktioniert
100 mg/kg
300-550
5
3 (60%)
2 (40%)
1* (20%)
300-1000
10
8 (80%)*,+
1 (10%)*,+
300-1400
23
9
(90%)*,+
7 (30%)
6 (26%)
17 (74%)
B6NHsd
B6NCrl
Barriere 8
B6NCrl
Barriere 8
B6NCrl
Barriere 8
B6NCrl
Barriere 8
B6NCrl
Barriere 9
Tab. 5.3: Übersicht über die Wirkungen von Pilocarpin bei verschiedenen Substämmen von B6Mäusen. SE wurde nach 90 Min. mit Diazepam abgebrochen (außer bei 5 Mäusen, die vor Ende der
90 Min. verstarben). * = B6NCrl signifikant zu B6JOlaHsd, + = B6NCrl signifikant zu B6NHsd,
Signifikanzniveau: p < 0,05
101
Ergebnisse
5.2.1.2 EEG-Aufzeichnungen während Pilocarpin-Applikation
Es wurde für vier Tiere des Stammes B6JOlaHsd sowie für vier Tiere des Stammes
B6NCrl während einer fraktionierten Injektion von Pilocarpin jeweils ein EEG
abgeleitet. Abbildung 5.12 stellt repräsentative Ausschnitte der EEG-Aufzeichnungen
für den Stamm B6NCrl dar. In Abbildung 5.12 A ist die Basislinie eines naiven Tieres
vor der ersten Pilocarpin-Applikation zu sehen. Abbildungen 5.12 B und C zeigen
einen Einzelkrampf nach der 3. Pilocarpin-Injektion, zu Beginn (B) sowie im weiteren
Verlauf des Anfallsgeschehens (C). Abbildung 5.12 D stellt kontinuierliche
paroxysmale EEG-Veränderungen während eines SE dar. Die EEG-Veränderungen
korrelierten mit den Verhaltensbeobachtungen, d.h. Krampfanfälle waren mit
paroxysmalen EEG-Veränderungen assoziiert.
C h a rt W
A
2 3 .0 5 . 2 0 0 8
in d o w
9 : 0 0 :5 4 ,5 9 1
0,5 mV
5 0
EPM_EEG 2 (mV)
1s
0
-5 0
9 : 0 0 :5 5
9 :0 0 : 5 6
9 :0 0 : 5 7
C h a rt W
2 3 .0 5 . 2 0 0 8
B
9 : 0 0 :5 8
9 :0 0 : 5 9
in d o w
9 : 4 6 :2 7 ,6 4 1
0,5 mV
5 0
EPM_EEG 1 (mV)
1s
0
-5 0
9 :4 6 : 2 8
9 : 4 6 :2 9
9 :4 6 : 3 0
102
9 : 4 6 :3 1
9 : 4 6 :3 2
9 :4 6
Ergebnisse
C h a rt W
C
2 3 .0 5 . 2 0 0 8
in d o w
9 : 4 8 :0 1 ,6 4 1
0,5 mV
5 0
EPM_EEG 1 (mV)
1s
0
-5 0
9 :4 8 : 0 2
9 : 4 8 :0 3
9 : 4 8 :0 4
C h a r t W
D
2 3 .0 5 . 2 0 0 8
9 : 4 8 :0 5
9 :4 8 : 0 6
in d o w
1 0 : 3 8 :2 3 ,7 8 1
0,5 mV
5 0
EPM_EEG 1 (mV)
1s
0
- 5 0
- 1 0 0
1 0 : 3 8 :2 4
1 0 : 3 8 :2 5
1 0 : 3 8 :2 6
1 0 : 3 8 :2 7
1 0 : 3 8 :2 8
1 0 : 3 8 :2 9
Abb. 5.12: EEG-Aufzeichnungen einer Basislinie vor Pilocarpin-Applikation (A), zu Beginn (B) sowie
im weiteren Verlauf (C) eines Einzelkrampfes nach Pilocarpin und kontinuierliche EEGVeränderungen eines SE (D) beim Mausstamm B6NCrl
5.2.2 Untersuchung von Tieren der Barrieren 8 und 9
5.2.2.1 Reproduzierung der Sensitivitätsunterschiede im Pilocarpin-Modell
Um zu eruieren, ob die Sensitivitätsunterschiede hinsichtlich Pilocarpin bei dem
Mausstamm B6NCrl zwischen Barriere 8 und 9 reproduzierbar sind, testeten wir
jeweils 17 Tiere aus beiden Barrieren hinsichtlich ihrer Pilocarpinsensitivität (Abb.
5.13). Ein Vergleich der SE-Induktionsrate zeigte einen signifikanten Unterschied (p
= 0,0366) zwischen den Barrieren 8 und 9. Bei allen Tieren aus Vorversuch,
Hauptversuch und Reproduzierungsversuch zusammengenommen, ergaben sich
signifikante Unterschiede hinsichtlich der SE-Induktions- (p = 0,0001) und der
Mortalitätsrate (p = 0,0002).
103
Ergebnisse
A SE-Induktionsrate
15
Anzahl Tiere (n)
10
5
#8
5
0
be
rl e
be
nd
Ve
rs
to
rb
en
nd
rs
to
rb
en
be
Ü
C SE-Induktionsrate
Ü
rl e
be
SE
SE
O
hn
e
O
hn
e
SE
SE
0
D Gesamtmortalität
*
*
30
Anzahl Tiere (n)
30
20
10
20
10
be
r
Ü
Ü
SE
e
SE
O
hn
SE
e
SE
hn
O
be
rle
be
nd
Ve
rs
to
rb
en
0
0
le
be
nd
Ve
rs
to
rb
en
Anzahl Tiere (n)
#9
10
Ve
Anzahl Tiere (n)
B Gesamtmortalität
*
15
Abb. 5.13: Vergleich der SE-Induktions- (A, C) sowie Mortalitätsrate (B, D) in den Barrieren 8
(schwarze Balken) und 9 (schraffierte Balken) beim Substamm B6NCrl. Abb. A und B:
Reproduzierungsversuch der Sensitivitätsunterschiede (jeweils n = 17). Abb. C und D: alle Tiere aus
Vorversuchen, Hauptversuch sowie des Reproduzierungsversuchs zusammengenommen (# 8 =
Barriere 8: n = 27, # 9 = Barriere 9: n = 40). A-D: Kontingenztafel und Fisher's-Exakt-Test;
Signifikanzniveau: p < 0,05
Um herauszufinden, ob sich die Barrieren 8 und 9 des Substammes B6NCrl auch in
einzelnen Untersuchungsparametern unterscheiden, wurden die Pilocarpin-Dosis
und die Latenzzeit bis zum Auftreten des 1. Krampfes sowie bis zum Erreichen eines
SE aufgeschlüsselt (Abb. 5.14). Es ergaben sich signifikante Unterschiede bei der
Pilocarpindosis zwischen den beiden Barrieren sowohl bis zum Auftreten des 1.
Krampfes (Abb. 5.14 A, p = 0,0180), als auch bis zum Erlangen eines SE (Abb. 5.14
C, p = 0,0425). Hinsichtlich der Latenzzeit (Abb. 5.14 B und D) konnten keine
signifikanten Unterschiede detektiert werden.
104
Ergebnisse
A Dosis an Pilocarpin bis zum
Auftreten des 1. Krampfes
B Latenzzeit bis zum
Auftreten des 1. Krampfes
400
100
Latenz (Min.)
Dosis (mg)
600
*
200
0
#8
20
#8
#9
Latenzzeit bis zum
Erreichen eines SE
150
Latenz (Min.)
Dosis (mg)
40
D
800
600
*
200
0
60
0
#9
C Dosis an Pilocarpin bis
zum Erreichen eines SE
400
80
#8
100
50
0
#9
#8
#9
Abb. 5.14: Darstellung der Dosis von Pilocarpin bis zum Auftreten des 1. Krampfes (A) bzw. SE (C)
sowie der Latenzzeit bis zum Auftreten des 1. Krampfes (B) bzw. SE (D). # 8 = Barriere 8, # 9 =
Barriere 9 des Substammes B6NCrl, A+B: # 8: n = 26, # 9: n = 40; C+D: # 8: n = 22; # 9: n = 13; A-D:
t-Test und Mann-Whitney-Test, Signifikanzniveau: p < 0,05
Bis zur 4. Pilocarpin-Injektion ergab sich ein signifikanter Unterschied zwischen den
Barrieren 8 und 9 bezüglich des Auftretens eines SE (Abb. 5.19 C, p < 0.0001). Bis
zur
5.
Injektion
waren
die
folgenden
dargestellten
Parameter
signifikant
unterschiedlich: Auftreten des 1. Krampfes (Abb. 5.15 B, p = 0,0329), Erlangung
eines SE (Abb. 5.15 D, p < 0.0001) sowie die Gesamtmortalität (Abb. 5.15 F, p =
0,0176).
105
Ergebnisse
Mortalität
bis zur 4. Pilo-Injektion
SE
SE
hn
e
O
O
hn
e
hn
e
Mortalität
bis zur 5. Pilo-Injektion
F
40
35
30
25
20
15
10
5
0
Ve
rs
to
rb
Ü
en
be
rle
be
nd
Ve
rs
to
rb
Ü
en
be
rle
be
nd
Anzahl Tiere (n)
40
35
30
25
20
15
10
5
0
106
*
Ve
rs
to
rb
Ü
en
be
rle
be
nd
SE
SE
SE
Anzahl Tiere (n)
*
O
SE
O
hn
e
SE
Anzahl Tiere (n)
*
40
35
30
25
20
15
10
5
0
E
Anzahl Tiere (n)
1.
K
ra
m
hn
pf
e
K
ra
m
pf
1.
K
ra
O
m
hn
pf
e
K
ra
m
pf
bis zur 5. Pilo-Injektion
bis zur 4. Pilo-Injektion
Ve
rs
to
rb
Ü
en
be
rle
be
nd
*
D Erreichen eines SE
C Erreichen eines SE
40
35
30
25
20
15
10
5
0
40
35
30
25
20
15
10
5
0
O
Anzahl Tiere (n)
Barriere 9
SE
Barriere 8
B Auftreten des 1. Krampfes
bis zur 5. Pilo-Injektion
1.
K
ra
O
m
hn
pf
e
K
ra
m
pf
40
35
30
25
20
15
10
5
0
1.
K
ra
O
m
hn
pf
e
K
ra
m
pf
Anzahl Tiere (n)
A Auftreten des 1. Krampfes
bis zur 4. Pilo-Injektion
Ergebnisse
Abb. 5.15: Darstellung des Vorhandensein des 1. Krampfes (A, B) bzw. eines SE (C, D) und der
Mortalität (E, F) bis zur 4. (A, C, E) bzw. 5. Injektion (B, D, F). Pilo = Pilocarpin, # 8 = Barriere 8, # 9 =
Barriere 9 des Substammes B6NCrl, # 8: n = 27, # 9: n = 40, Kontingenztafel und Fisher's-Exakt-Test,
Signifikanzniveau: p < 0,05
5.2.2.2 Absolvierung des Open-Field von Tieren der Barrieren 8 und 9
Um zu untersuchen, ob die detektierten Unterschiede zwischen Barriere 8 und 9 des
Substammes B6NCrl lediglich die Sensitivität hinsichtlich Pilocarpin betreffen, oder
sich zudem naive Tiere beider Barrieren in Verhaltensparametern unterscheiden,
wurden unbehandelte Tiere im Open-Field-Test überprüft. Hier ließen sich jedoch
keine signifikanten Unterschiede darstellen (Abb. 5.16 A-D).
B OF: Aufenthaltsdauer im Zentrum
500
125
400
100
Zeitdauer (s)
Zeitdauer (s)
A OF: Aufenthaltsdauer am Rand
300
200
100
0
50
25
0
#8
#9
#8
C OF: Zurückgelegte Gesamtstrecke
Geschwindigkeit (cm/s)
4000
3000
2000
1000
0
#8
#9
D OF: Bewegungsgeschwindigkeit
5000
Wegstrecke (cm)
75
#9
10
8
6
4
2
0
#8
#9
Abb. 5.16: OF = Open-Field; # 8 = Barriere 8, # 9 = Barriere 9 des Substammes B6NCrl, # 8: n = 5, #
9: n = 8, A+B: Mann-Whitney-Test, C+D: Ungepaarter t-Test. Signifikanzniveau: p < 0,05
5.2.2.3 Untersuchung von Tieren aus Barriere 8 und 9 im MEST (Kapitel 4.5)
Die naiven Tiere aus beiden Barrieren, welche lediglich das Open-Field absolvierten
(Kapitel 5.2.2.2), wurden hinsichtlich ihrer maximalen elektrischen Krampfschwelle
(MEST-Test) getestet. Wie Abbildung 5.17 darstellt, zeigte sich hinsichtlich der CC50
107
Ergebnisse
kein signifikanter Unterschied bei den naiven Tieren (A), jedoch bei solchen, welche
mit Pilocarpin vorbehandelt waren (B, p = 0,0110).
A
B
MEST-Test
(naive Tiere)
1.5
CC 50 (log)
CC 50 (log)
1.5
MEST-Test
(Pilo-vorbehandelte Tiere)
1.0
0.5
*
1.0
*
0.5
0.0
0.0
#8
#8
#9
#9
Abb. 5.17: Untersuchung der maximalen elektrischen Krampfschwelle bei Tieren der Barrieren 8 und
9. MEST = Maximal-Elektroshock-Seizure-Threshold (maximale elektrische Krampfschwelle). Pilo =
Pilocarpin. # 8 = Barriere 8 und # 9 = Barriere 9, jeweils n = 8. Statistische Berechnungen:
Ungepaarter t-Test. * = Barriere 8 signifikant unterschiedlich zu Barriere 9. Signifikanzniveau: p < 0,05
5.2.3 Untersuchung weiterer B6-Barrieren im Pilocarpin-Modell
Im nächsten Schritt wurde die Pilocarpin-Sensitivität von drei weiteren B6-Barrieren
des Züchters Charles River (Barriere 4, 7, 11) überprüft, sowie aus Barriere 9
männliche und weibliche Tiere miteinander verglichen (Abb. 5.18). Es zeigte sich,
dass sich die Barrieren 4, 7 und 11 nicht signifikant von Barriere 9 unterschieden. Die
männlichen Tiere aus Barriere 9 zeigten eine signifikant geringere SE-Induktionsrate
(p = 0,0384) im Vergleich zu den weiblichen Tieren aus Barriere 9. Die Mortalitätsrate
hingegen erwies sich zwischen den Tieren beider Geschlechter aus Barriere 9 als
nicht signifikant unterschiedlich.
108
Ergebnisse
Testen weiterer Barrieren im Pilocarpin-Modell
Anzahl Tiere (n)
20
#4
#7
#9w
#9m
# 11
15
*
10
5
0
SE
Mortalität
Abb. 5.18: Überprüfung von verschiedenen Barrieren des Züchters Charles River hinsichtlich ihrer
Sensitivität auf Pilocarpin. # = Barriere, w = weiblich, m = männlich, # 4, 7 und 11 nur weibliche Tiere;
Anzahl jeweils n = 20; Kontingenztafel und Fisher’s-Exakt-Test, Signifikanzniveau: p < 0,05.
5.2.4 Überprüfung der F1-Generation im Pilocarpin-Modell
Um
aufzuzeigen,
ob
eine
vererbbare
Mutation
oder
unterschiedliche
Umweltbedingungen zwischen den Barrieren 8 und 9 zu den detektierten Differenzen
hinsichtlich der Pilocarpin-Sensitivität führte, züchteten wir aus Barriere 8-Weibchen
und Barriere 9-Männchen eine Hybrid-F1-Generation (Zuchtschema in Kapitel 4.1).
Diese F1-Generation wurde hinsichtlich ihrer Pilocarpin-Sensitivität getestet. Es ließ
sich kein signifikanter Unterschied zwischen den F1-Weibchen und der weiblichen
Barriere 9-Parentalgeneration darstellen (Abb. 5.19 A), jedoch konnte eine signifikant
schlechtere SE-Induktionsrate zu allen getesteten Tieren aus Barriere 8 festgestellt
werden (Abb. 5.19 B, p = 0,0227). Bei F1-Männchen hingegen ergab sich eine
signifikant
bessere
SE-Induktionsrate
als
Parentalgeneration (Abb. 5.19 C, p = 0,0083).
109
bei
der
männlichen
Barriere
9-
Ergebnisse
A
100
80
Prozent (%)
Prozent (%)
100
60
40
B
80
*
60
40
20
20
0
0
Barriere 9 w
Barriere 8 w
Hybrid F1 w
Prozent (%)
100
Hybrid F1 w
C
80
*
60
40
20
0
Barriere 9 m
Hybrid F1 m
Abb. 5.19: SE-Induktionsrate der Tiere aus der Parentalgeneration (Barriere 8 w, Barriere 9 m) sowie
der F1-Generation (weiblich und männlich) aus der Hybridzucht der Barriere 8 w x Barriere 9 m; w =
weiblich, m = männlich, F1 w: n = 28, F1 m: n = 32, Kontingenztafel und Fisher’s-Exakt-Test,
Signifikanzniveau: p < 0,05
5.2.5 Detektion von spontanen Anfällen bei der F1-Generation
Es wurden 14 weibliche Pilocarpin-behandelte Tiere mit SE in der F1-Generation
generiert. Um zu überprüfen, ob diese auch eine chronische Epilepsie entwickeln,
wurden 12 dieser Tiere über 6-9 Tage 24 Stunden täglich videoüberwacht. 7 dieser
Tiere zeigten mindestens einen spontanen Anfall. Bei 3 Tieren traten Anfallscluster
mit einer maximalen Anzahl von 9-14 Krampfanfällen pro Tag auf.
Von 13 männlichen Pilocarpin-behandelten Mäusen in der F1-Generation mit SE
entwickelten 6 Tiere nach 1-9 Tagen Videoüberwachung mindestens einen
spontanen Anfall. Für 4 Tiere ergaben sich Anfallscluster mit bis zu 11 epileptischen
Anfällen pro Tag.
Insgesamt betrachtet traten bei der gezüchteten F1-Generation analog zu den
charakterisierten NMRI- (Studie 1) sowie zu den kommerziell erworbenen B6-
110
Ergebnisse
Mäusen (Studie 3) sowohl bei weiblichen, als auch bei männlichen Tieren spontane
wiederkehrende Anfälle auf.
5.2.6 Erneute Untersuchung von Tieren aus Barriere 9 sowie Testen von B6J im
Pilocarpin-Modell
Es wurde ein weiterer Substamm, B6J aus dem Jackson Laboratory, USA (zur
Verfügung gestellt von Charles River, Sulzfeld), hinsichtlich seiner Sensitivität auf
Pilocarpin getestet. Um mit Tieren vergleichen zu können, welche in demselben Jahr
wie die gezüchteten Tiere geboren wurden, erfolgte erneut eine Überprüfung von
männlichen sowie weiblichen Mäusen aus Barriere 9 des Substammes B6NCrl
hinsichtlich ihrer Pilocarpinsensitivität. Wir konnten bei den Tieren der Barriere 9 die
prozentuale SE-Induktionsrate exakt reproduzieren (vgl. Abb. 5.18), d.h. die
weiblichen Tiere entwickelten wieder zu 45 % sowie die männlichen Tiere wieder zu
15 % einen SE (Abb. 5.20 A). Bezüglich der Gesamtmortalität konnten keine
signifikanten Unterschiede detektiert werden (Abb. 5.20 B). Die weiblichen Tiere der
Barriere 9 zeigen ferner eine signifikant höhere SE-Induktionsrate als der Substamm
B6J (p = 0,0057). Beim Substamm B6J entwickelten zwar 2 von 20 Mäusen einen
SE, dieser jedoch endete nach etwa 45 bzw. 70 Min. spontan.
SE-Induktionsrate
A
40
*
B
Prozent % Mortalität
Anzahl Tiere (n)
50
30
20
10
0
Gesamtmortalität
100
80
60
40
20
0
#9w
#9m
B6J
#9w
#9m
B6J
Abb. 5.20: Darstellung der SE-Induktions- sowie Mortalitätsrate; # 9 = Barriere 9 des Substammes
B6NCrl, w = weibliche, m = männliche Tiere; B6J = Substamm aus den Jackson Laboratories,
Kontingenztafel und Fisher’s-Exakt-Test, * = # 9 w signifikant zu Kontrolle, Signifikanzniveau: p < 0,05
111
Ergebnisse
5.2.7 Generierung der F2-Generation
Da
eine
spontane
Mutation
in
Barriere
8
Ursache
für
die
detektierten
Verhaltensänderungen sein könnte (Diskussion, Kapitel 6.7), wurde eine F2Generation zwischen den Parentalweibchen aus Barriere 8 mit den Männchen aus
der F1-Generation erzeugt (Zuchtschema in Kapitel 4.1). Es entstand lediglich ein
Wurf mit überlebenden Tieren, da die Tiere aus Barriere 8 zum Zeitpunkt der Zucht
bereits über 1 Jahr alt waren und die Muttertiere mehrfach verwarfen. Weitere
Zuchtweibchen aus Barriere 8 konnten nicht erworben werden, da der Züchter
Charles River diese Barriere geschlossen hatte. Aufgrund der infolgedessen
geringen Anzahl an Tieren der F2-Generation, wurden diese vier Tiere (zwei
Weibchen und zwei Männchen) lediglich zum Weiterzüchten verwendet und nicht
hinsichtlich ihrer Pilocarpin-Sensitivität untersucht.
5.2.8 Überprüfung der F3-Generation im Pilocarpin-Modell
Aus den zwei Zuchtpaaren der F2-Generation generierten wir eine F3-Generation,
welche wir hinsichtlich ihrer Pilocarpin-Sensitivität testeten. Bei den weiblichen Tieren
der F3-Generation entwickelten 13 von 18 untersuchten Tieren einen SE (72%). Die
SE-Induktionsrate unterschied sich wie auch schon bei der F1-Generation nicht
signifikant von der weiblichen Parentalgeneration aus Barriere 9 (Abb. 5.21 A).
Jedoch differierte die weibliche F3-Generation im Gegensatz zur F1-Generation nun
nicht mehr signifikant zur Pilocarpin-sensitiven Parentalgeneration aus Barriere 8
(Abb. 5.21 B).
Bei den männlichen Tieren der F3-Generation erreichten 12 von 14 Tieren einen SE.
Infolgedessen lag die SE-Induktionsrate bei 86%. Dies ist signifikant höher als bei
der männlichen Parentalgeneration aus Barriere 9 (Abb. 5.21 C, p < 0,0001).
Sowohl die weiblichen, als auch die männlichen Mäuse der F3-Generation, welche
keinen SE erlangten, verstarben während des Pilocarpin-Versuchs.
112
Ergebnisse
B
Anzahl T iere mit SE (n)
Anzahl T iere mit SE (n)
A
15
#9w
F3 w
10
5
0
SE
25
#8w
F3 w
20
15
10
5
0
Ohne SE
SE
Ohne SE
Anzahl Tiere mit SE (n)
C
*
20
#9m
F3 m
15
10
5
0
SE
Ohne SE
Abb. 5.21: Vergleich der SE-Induktionsrate von der F3-Generation mit der Parentalgeneration; # 8 =
Barriere 8 w: n = 27 , # 9 = Barriere 9 m: n = 20, F3 w: n = 18, F3 m: n = 14, Kontingenztafel und
Fisher’s-Exakt-Test, Signifikanzniveau: p < 0,05
113
Ergebnisse
5.3
Verhaltenscharakterisierung
und
histologische
Untersuchung
von
Pilocarpin-behandelten B6-Mäusen (Studie 3)
Aus den Vorversuchen wurden 14 Mäuse, welche mittels des fraktionierten
Applikationsregimes von 100 mg/kg Pilocarpin einen SE erlangten, als Gruppe „Pilo
mit SE“ definiert. 5 Pilocarpin behandelte Tiere ohne SE (jeweils ein Tier aus den
Bolus-Applikationsregimes 300 mg/kg und 325 mg/kg, zwei Tiere aus dem
fraktionierten Applikationsregime mit 50 mg/kg sowie ein Tier mit 100 mg/kg) bildeten
die Gruppe „Pilo ohne SE“. Hinzugefügt wurden 12 altersentsprechende Tiere,
welche Methylscopolamin, fünf NaCl-Injektionen anstelle von Pilocarpin, sowie
Diazepam erhielten, als Kontrollgruppe.
5.3.1 Detektion von spontanen Anfällen
Alle Pilocarpin-behandelten Mäuse sowohl mit als auch ohne SE wurden vor Beginn
der Verhaltensbatterie (7-10 Wochen nach SE) über 48 Stunden durchgehend
videoüberwacht. 6 von 14 Tieren aus der Gruppe „Pilo mit SE“ zeigten hier bereits
mindestens einen spontanen Anfall. Ferner notierten wir alle Anfälle, welche während
des Handlings bei der Absolvierung der Verhaltensbatterie beobachtet wurden.
Mäuse aus der Gruppe „Pilo mit SE“, welche nach dieser Prozedur noch keinen
spontanen Anfall zeigten, wurden nach Absolvierung der Verhaltensbatterie erneut
Video- sowie zwei Tiere zusätzlich EEG-überwacht. Einen spontanen Anfall im EEG
stellt Abbildung 5.22 dar.
Chart W indow
100
14.04.2008 22:02:2 8,915
0,5 mV
50
1s
0
-50
Abb. 5.22: Spontaner Anfall im EEG.
114
Ergebnisse
Nach dieser Methode konnte bei allen 14 Tieren aus der Gruppe „Pilo mit SE“
mindestens ein spontaner Anfall detektiert und infolgedessen die Entwicklung von
chronischer Epilepsie nachgewiesen werden.
Bei den Pilocarpin-behandelten Tieren ohne SE konnten keine spontanen Anfälle
beobachtet werden.
5.3.2 Resultate der Verhaltensbatterie
5.3.2.1 Eingangscharakterisierung: Irwin-Test
Um einen ersten Eindruck von Verhalten, Haltung und Gesundheitszustand der Tiere
zu gewinnen, wurde der IRWIN-Test (1968) zu Beginn der Verhaltensbatterie (9-12
Wochen nach SE) durchgeführt. Folgende bewertete Parameter zeigten sich bei
allen drei Versuchsgruppen unverändert: Körperhaltung, Piloerektion, Hautfarbe,
Exophtalmus, Ptosis, Lakrimation, Salivation, Hörvermögen, Balance, Cornea-Reflex,
Barthaar-Reflex,
Haffner-Reflex,
Pupillen-Reflex
sowie
der
Muskeltonus.
Verhaltensauffälligkeiten sind in Tabelle 5.3 dargestellt. Über ein Drittel der
epileptischen Tiere zeigte einen erhöhten Schwanztonus, Fortbewegung und
Schnelligkeit des Bewegungsablaufs waren bei fast der Hälfte der epileptischen Tiere
reduziert, und 36 % zeigten eine erhöhte Schreckhaftigkeit bei Reaktion auf
Berührung, welche sich durch starkes Zusammenzucken sowie plötzliches
Hochspringen manifestierte. Für 50% der Kontrollen sowie der epileptischen Tiere
ergab sich ein erhöhtes Explorationsverhalten.
115
Ergebnisse
Veränderungen:
Pilo mit SE
Schwanztonus
-
↓
Pilo ohne SE
↑
5 (36 %)
Kontrolle
↓
↑
↓
↑
-
-
-
-
Atmung
-
3 (21 %)
-
-
-
-
Fellsauberkeit
-
1 (7 %)
-
-
-
-
Fortbewegung
6 (43 %)
1 (7 %)
-
-
1 (8 %)
-
Schnelligkeit des
6 (43 %)
1 (7 %)
-
-
1 (8 %)
-
-
5 (36 %)
-
-
Bewegungsablaufes
Schreckhaftigkeit
-
Anzahl Kotboli (n)
0-3
1-3
0-5
Anzahl Urin (n)
0-4
0-2
0-5
-
Abnormales Verhalten:
Neugierverhalten
Reaktion auf Berührung
Explorationsverhalten
Aufricht-Reflex
3 (21 %)
2 (14 %)
-
-
-
5 (36 %)
-
-
-
7 (50 %)
-
6 (43 %)
-
-
1 (20 %)
-
2 (17 %)
-
6 (50%)
-
Tabelle 5.3: Darstellung der Parameter im Irwin-Test, welche bei mindestens einem Tier vom
Normalverhalten abweichen. Kontrolle: n = 12, Pilo ohne SE: n = 5, Pilo mit SE: n = 14. - = keine
Abweichung vom Normalverhalten, ↑ = Untersuchungsparameter erhöht, ↓ = Parameter verringert
5.3.2.2 Überprüfungen von Exploration, Lokomotion sowie Angst-assoziiertem
Verhalten
Open-Field
Wie in Abbildung 5.23 dargestellt, ergab sich für die epileptischen Tiere im OpenField im Vergleich zu den Kontrollen und zur Gruppe „Pilo ohne SE“ eine signifikant
kürzere Aufenthaltsdauer im Zentrum (jeweils p = 0,0042) und infolgedessen eine
verlängerte Aufenthaltsdauer im Randbereich der Arena (jeweils p = 0,0042). Die
zurückgelegte Gesamtstrecke der epileptischen Tiere war im Vergleich zu den
Kontrollen signifikant erhöht (p < 0,0001). Die epileptischen Tiere wiesen ein im
Vergleich zur Gruppe „Pilo ohne SE“ verringertes Aufrichtverhalten auf (p = 0,0246).
116
Ergebnisse
Zeitdauer (s)
OF: Aufenthaltsdauer
im Zentrum
150
100
*+
50
750
Zeitdauer (s)
A
200
0
*
500
250
Kontrolle Pilo ohne SE Pilo mit SE
C OF: Zurückgelegte Gesamtstrecke
*
#
2500
0
D
Anzahl Aufrichten (n)
Strecke (cm)
5000
OF: Aufenthaltsdauer
am Rand
+
0
Kontrolle Pilo ohne SE Pilo mit SE
7500
B
OF: Aufrichtverhalten
12.5
10.0
7.5
+
5.0
2.5
0.0
Kontrolle Pilo ohne SE Pilo mit SE
Kontrolle Pilo ohne SE Pilo mit SE
Abb. 5.23: Darstellung der Parameter Aufenthaltsdauer im Zentrum und am Rand der Arena (s, Abb.
A und B), der zurückgelegten Gesamtstrecke (cm, Abb. C) sowie des Aufrichtverhaltens (Abb. D) im
Open-Field. OF = Open-Field; Kontrolle: n = 12, Pilo ohne SE: n = 5, Pilo mit SE: n = 14; Statistik: A
und B mit 1-way-ANOVA nonparametrisch (Kruskal-Wallis-Test) und Posthoc Dunn's-MultipleComparison-Test; Gesamtstrecke und Aufrichtverhalten mit 1-way-ANOVA und Posthoc Bonferroni'sMultiple-Comparison-Test; * = „Pilo mit SE“ signifikant zur Kontrolle; + = „Pilo mit SE“ signifikant zu
„Pilo ohne SE“; # = „Pilo ohne SE signifikant zur Kontrolle, Signifikanzniveau: p < 0,05
Novel-Object-Exploration-Test
Wie Abbildung 5.24 darstellt, ergab sich für die epileptischen Tiere - ähnlich wie im
Open-Field - in der Habituationsphase des Novel-Object-Exploration-Test eine
verglichen zu den Kontrollen und der Gruppe „Pilo ohne SE“ verringerte
Aufenthaltsdauer im Zentrum der Arena (p = 0,0005), sowie eine erhöhte
zurückgelegte Gesamtstrecke im Vergleich zu den Kontrollen (p = 0,0016). Die
signifikant erhöhte Gesamtstrecke der epileptischen Tiere, verglichen mit den
Kontrollen, findet sich auch in der Objektphase wieder (p = 0,0001). Für die
epileptischen Tiere ergab sich in der Objektphase im Vergleich zu den Kontrolltieren
eine signifikant erhöhte Aufenthaltsdauer im Zentrum (p = 0,0003).
117
Ergebnisse
A NOE: Habituationsphase
Aufenthaltsdauer im Zentrum
B NOE: Habituationsphase
Gesamtstrecke
150
50
*+
Wegstrecke (cm)
Zeitdauer (s)
200
100
*
10000
250
8000
6000
4000
2000
0
0
Kontrolle Pilo ohne SE Pilo mit SE
Kontrolle Pilo ohne SE Pilo mit SE
NOE: Objektphase
C
Aufenthaltsdauer im Zentrum
*
200
150
100
50
NOE: Objektphase
Gesamtstrecke
12500
Wegstrecke (cm)
Zeitdauer (s)
250
D
10000
*
7500
5000
2500
0
0
Kontrolle Pilo ohne SE Pilo mit SE
Kontrolle Pilo ohne SE Pilo mit SE
Abb. 5.24: Darstellung der Ergebnisse der Untersuchungsparameter Aufenthaltsdauer im Zentrum in
der Habituations- (A) sowie Objektphase (C), sowie der Gesamtstrecke während der Habituation (B)
und der Objektphase (D) im Novel-Object-Exploration-Test. NOE = Novel-Object-Exploration-Test; 1way-ANOVA nonparametrisch (Kruskal-Wallis-Test) und Posthoc Dunn's-Multiple-Comparison-Test;
* = Pilo mit SE signifikant zu Kontrolle; + = Pilo mit SE signifikant zu Pilo ohne SE, Signifikanzniveau:
p < 0,05
Die Auswertung der zurückgelegten Wegstrecken der Mäuse im Novel-ObjectExploration-Test veranschaulicht, dass die Kontrollen sowie die Pilocarpinbehandelten Tiere ohne SE sowohl in der Absolvierung des Open-Fields (Abb. 5.25
A, B), als auch in der Habituationsphase des Novel-Object-Exploration-Tests die
gesamte Arena erkundeten. In der Objektphase jedoch verblieben sie vorwiegend
am Rand des Open-Fields (Abb. 5.25 D, E). Viele epileptische Tiere bewegten sich
während der Absolvierung des Open-Fields sowie in der Habituationsphase des
Novel-Object-Exploration-Tests nahezu ausschließlich am Rand entlang, zeigten
also Thigmotaxis (Abb. 5.25 C). In der Objektphase dagegen ergab sich für die
118
Ergebnisse
epileptischen Mäuse das exakt gegenteilige Verhalten, d.h. sie näherten sich
ausgesprochen häufig dem Objekt an (Abb. 5.25 F).
A
B
C
D
E
F
Abb. 5.25: Aufsicht auf das Open-Field mit Darstellung der zurückgelegten Wegstrecken der Mäuse
(A-C) sowie in der Objektphase des Novel-Object-Exploration-Tests (D-F). In den Abb. A+D ist ein
Kontrolltier, in den Abb. B+E ein Pilocarpin-behandeltes Tier ohne SE sowie in den Abb. C+F ein
epileptisches Tier zu sehen. Die Maus in Abb. C zeigte Thigmotaxis.
Hole-Board-Test
Für die Pilocarpin-behandelten Mäuse ohne SE ergab sich im Vergleich zu den
beiden übrigen Versuchsgruppen eine signifikante Steigerung der Frequenz der
Head-Dips im Hole-Board-Test (Abb. 5.26 A, p = 0,0090). Die epileptischen Tiere
zeigten verglichen mit den Pilocarpin-behandelten Tieren ohne SE und den
Kontrollen eine erhöhte Frequenz der Edge-Dips (Abb. 5.26 B, p = 0,0022) sowie
eine erhöhte zurückgelegte Gesamtstrecke (Abb. 5.26 C, p = 0,0114). Neun von 14
epileptischen Mäusen sprangen einmal bis mehrfach von der Versuchsapparatur des
Hole-Boards ab. Eine Maus musste aufgrund von wiederholten Abspringens aus dem
Versuch genommen werden. Dies ergab ein signifikant erhöhtes Absprungverhalten
verglichen zu den Kontrollen und den Pilocarpin-behandelten Tieren ohne SE (Abb.
5.26 D, p = 0,0012).
119
Ergebnisse
A
HB: Head-Dips
#+
60
40
20
0
HB: Gesamtstrecke
*
Strecke (cm )
1200
1000
800
600
400
200
0
4
2
Kontrolle Pilo ohne SE Pilo mit SE
D
Anzahl Absprünge (n)
C
*+
6
0
Kontrolle Pilo ohne SE Pilo mit SE
1400
HB: Edge-Dips
B
8
Anzahl (n)
Anzahl (n)
80
HB: Absprünge
*
16
14
12
10
Kontrolle/
Pilo ohne SE
Pilo mit SE
8
6
4
2
0
Absprung
Kontrolle Pilo ohne SE Pilo mit SE
ohne Absprung
Abb. 5.26: Ergebnisse der Parameter Head-Dips (A), Edge-Dips (B), Gesamtstrecke (C) sowie
Absprünge von der Versuchsapparatur (D) im Hole-Board-Test. HB = Hole-Board-Test; Kontrolle: n =
12, Pilo ohne SE: n = 5, Pilo mit SE: n = 13 (ein Tier sprang wiederholt von der Apparatur ab);
Statistik: A und C mit 1-way-ANOVA nonparametrisch (Kruskal-Wallis test) und post hoc Dunn's
Multiple Comparison Test; B mit 1-way-ANOVA und Posthoc Bonferroni's-Multiple-Comparison-Test
sowie Abb. D mit Kontingenztafel und Fisher's-Exakt-Test; * = Pilo mit SE signifikant zur Kontrolle; + =
Pilo mit SE signifikant zu Pilo ohne SE; # = Pilo ohne SE signifikant zur Kontrolle, Signifikanzniveau: p
< 0,05
Elevated-Plus-Maze
Bezüglich der Parameter der Aufenthaltsdauer auf den offenen Armen (Abb. 5.27 A)
sowie des Verhältnisses der Eintritte in die offenen/geschlossenen Arme (Abb. 5.27
B) ließen sich keine signifikanten Unterschiede zwischen den Versuchsgruppen
detektieren. Bei der zurückgelegten Wegstrecke jedoch ergab sich für die
epileptischen Tiere im Vergleich zu den Kontrollen sowie zu den Pilocarpinbehandelten Tieren ohne SE analog zu den vorangegangenen Tests eine
signifikante Erhöhung (Abb. 5.27 C, p < 0,0001). Wie bereits im Hole-Board-Test
beobachtet, zeigten die epileptischen Tiere verglichen mit den übrigen beiden
120
Ergebnisse
Versuchsgruppen auch im Elevated-Plus-Maze ein erhöhtes Absprungverhalten
(Abb. 5.27 D, p < 0,0001).
EPM: Aufenthaltsdauer
auf den offenen Armen
A
B
25
Verhältnis
offen:geschlossen
150
Zeitdauer (s)
EPM: Verhältnis der Eintritte in die
offenen/geschlossenen Arme
100
50
20
15
10
5
0
0
Kontrolle Pilo ohne SE Pilo mit SE
Kontrolle Pilo ohne SE Pilo mit SE
Wegstrecke (cm)
D EPM: Absprünge von der
Versuchsapparatur
EPM: Gesamtstrecke
*+
Anzahl der T iere (n)
C
2000
1500
1000
500
0
20
*
15
Pilo ohne SE/
Kontrolle
Pilo mit SE
10
5
0
Kontrolle Pilo ohne SE Pilo mit SE
Absprung
ohne Absprung
Abb. 5.27: Auswertung der Parameter Aufenthaltsdauer auf den offenen (A) und geschlossenen
Armen (B), der zurückgelegten Gesamtstrecke (C) sowie der Absprünge von der Versuchsapparatur
(D) im Elevated-Plus-Maze. EPM = Elevated-Plus-Maze, Kontrolle: n = 12, Pilo ohne SE: n = 5, Pilo
mit SE: n = 14; Statistik: A, B und C mit 1-way-ANOVA nonparametrisch (Kruskal-Wallis-Test) und
Posthoc Dunns-Multiple-Comparison-Test sowie Abb. D mit Kontingenztafel und Fisher's-Exakt-Test;
Signifikanzniveau: p < 0,05 ; * = Pilo mit SE signifikant zur Kontrolle; + = Pilo mit SE signifikant zu Pilo
ohne SE.
Light-Dark-Box
Wie Abbildung 5.28 darstellt, zeigten die epileptischen Tiere im Vergleich zu den
übrigen beiden Gruppen in der Light-Dark-Box eine signifikant verringerte
Aufenthaltsdauer im aversiven hellen Bereich (Abb. 5.28 A, p = 0,0032) sowie eine
sigifikant erhöhte Aufenthaltsdauer im geschützten dunklen Bereich (Abb. 5.28 B, p =
0,0032). Ferner wiesen die epileptischen Mäuse eine signifikant reduzierte Anzahl
von Übertritten zwischen dem hellen und dem dunklen Kompartment auf (p =
0,0008). Im Gegensatz zu den vorangegangen Tests, Open-Field, Novel-Object-
121
Ergebnisse
Exploration-Test, Hole-Board-Test sowie zum Elevated-Plus-Maze, ergab sich für die
epileptischen Tiere verglichen zu den Kontrollen und zu den Pilocarpin-behandelten
Tieren ohne SE in der Light-Dark-Box eine verringerte zurückgelegte Wegstrecke (p
= 0,0003).
A
*+
300
200
Zeitdauer (s)
Zeitdauer (s)
250
150
100
LDB: Aufenthaltsdauer
im dunklen Bereich
B
LDB: Aufenthaltsdauer
im hellen Bereich
*+
50
200
100
0
0
Kontrolle Pilo ohne SE Pilo mit SE
Kontrolle Pilo ohne SE Pilo mit SE
D
20
15
10
LDB: Gesamtstrecke
1500
25
Wegstrecke (cm)
Anzahl der Übertritte (n)
C LDB: Übertritte zwischen dem
hellen und dunklen Kompartment
*+
5
1000
500
*+
0
0
Kontrolle Pilo ohne SE Pilo mit SE
Kontrolle Pilo ohne SE Pilo mit SE
Abb. 5.28: Ergebnisse der Aufenthaltsdauer im hellen Bereich (A), im dunklen Bereich (B), der
Übertritte zwischen dem hellen und dunklen Kompartment (C) sowie der Gesamtstrecke (D) in der
Light-Dark-Box. LDB = Light-Dark-Box, Kontrolle: n = 12, Pilo ohne SE: n = 5, Pilo mit SE: n = 14;
Statistik: 1-way-ANOVA nonparametrisch (Kruskal-Wallis-Test) und Posthoc Dunn's-MultipleComparison-Test; * = Pilo mit SE signifikant zur Kontrolle; + = Pilo mit SE signifikant zu Pilo ohne SE,
Signifikanzniveau: p < 0,05
Die zurückgelegten Wegstrecken der Tiere in der Light-Dark-Box stellen dar, dass
die Kontrollen sowie die Pilocarpin-behandelten Tiere ohne SE den gesamten
offenen, hellen Bereich explorierten (Abb. 5.29 A, B), die epileptischen Tiere sich
dagegen üblicherweise schnell vom Einsatzpunkt im hellen Bereich in das dunkle,
geschützte Kompartment begaben, aus welchem sie, wenn dies der Fall war, nur
selten wieder hervortraten (Abb. 5.29 C).
122
Ergebnisse
A
C
B
Abb. 5.29: Aufsicht auf die Light-Dark-Box und Darstellung der zurückgelegten Wegstrecken eines
Kontrolltieres (A) sowie eines Pilocarpin-behandelten Tieres ohne (B) bzw. mit (C) SE.
5.3.2.3 Überprüfung der motorischen Fähigkeiten
Die Versuchsgruppen absolvierten drei Tests, welche die Motorik von Nagern
überprüfen. Das Balancieren auf einem rotierenden Stab (Rotarod-Test, 17 bis 20
Wochen nach SE) stellte für die Tiere aller drei Versuchsgruppen kein Problem dar
(Abb. 5.30 A). Den Hanging-Wire-Test (Abb. 5.30 B, 18-21 Wochen nach SE)
bestanden 10 von 14 epileptischen Mäusen nicht. Für die epileptischen Mäuse ergab
sich also ein signifikanter Unterschied zu den Kontrollen (p = 0,001) sowie zu den
Pilocarpin-behandelten Tieren ohne SE (p = 0,0018). Das rückwärtige Klettern aus
einer Röhre (Chimney-Test, Abb. 5.30 C, ebenfalls 18-21 Wochen nach SE) stellte
für die Mäuse des Stammes B6 eine außerordentliche Schwierigkeit dar, denn aus
allen drei Versuchsgruppen bestanden die meisten Tiere diesen Test nicht.
A
B
Rotarod
Anzahl Tiere (n)
Anzahl Tiere (n)
Hanging-Wire
15
15
10
5
0
*+
10
5
0
bestanden
nicht bestanden
bestanden
123
nicht bestanden
Ergebnisse
Chimney-Test
C
Kontrolle
Pilo ohne SE
Pilo mit SE
Anzahl Tiere (n)
15
10
5
0
bestanden
nicht bestanden
Abb. 5.30: Darstellung der Ergebnisse aus Rotarod, Hanging-Wire und Chimney-Test; Kontrolle: n =
12, Pilo ohne SE: n = 5, Pilo mit SE: n = 14; Statistik: Kontingenztafel und Fisher’s-Exakt-Test, * = Pilo
mit SE signifikant zur Kontrolle; + = Pilo mit SE signifikant zu Pilo ohne SE, Signifikanzniveau: p <
0,05
5.3.2.4 Überprüfung der räumlichen Lern- und Gedächtnisleistung: MorrisWater-Maze
Bei der Überprüfung von räumlicher Lern- und Gedächtnisleistung, zeigten die
epileptischen Tiere deutliche Defizite (Abb. 5.31 A), welche sich in einer signifikant
schlechteren Lernleistung an den Trainingstagen 1 und 5 (jeweils p < 0,05), 6 (p <
0,01) sowie 7 bis 10 (jeweils p < 0,001) im Vergleich zu den Kontrollen
widerspiegelten. Verglichen mit den Pilocarpin-behandelten Tieren ohne SE
manifestierte sich eine signifikant schlechtere Lernleistung bei den epileptischen
Tieren an den Trainingstagen 1, 4 (jeweils p < 0,01), 6 (p < 0,05), 7 (p < 0,01), 8 (p
< 0,001), 9 (p < 0,01) und 10 (p < 0,001). Die Schwimmgeschwindigkeiten der
epileptischen Tiere waren an den Trainingstagen 9 und 10 verglichen zu den
Kontrollen reduziert (Abb. 5.31 B, p < 0,05).
Die mittlere Latenzzeit, welche die Mäuse benötigten, um die Plattform aufzufinden,
betrug für die Kontrollen 30 s an Tag 1 sowie nur noch 10 s an Tag 10. Dies stellt für
die Kontrolltiere eine signifikante Verbesserung der räumlichen Lern- und
Gedächtnisleistung dar (p < 0,0001). Epileptische Mäuse hingegen benötigten
durchschnittlich 45 s an Tag 1, um zur Plattform zu gelangen, sowie 38 s an Tag 10.
Infolgedessen ergab sich für die epileptischen Tiere keine signifikante Verbesserung
der Latenzzeit.
124
Ergebnisse
An Tag 10, dem Probe-Trial, kreuzten die epileptischen Tiere die Position der
ehemaligen Plattform seltener als die Kontrolltiere (Abb. 5.31 C, p = 0,0019). Bei der
Überprüfung der Langzeitgedächtnisleistung mittels Retention-Test (Abb. 5.31 D),
welchen die Tiere an Tag 20 und 21 absolvierten, ergab sich für die epileptischen
Tiere im Vergleich zu den Kontrollen eine signifikant schlechtere Lernleistung (an
beiden Tagen jeweils p < 0,001). Die Lern- und Gedächtnisleistung der epileptischen
Mäuse stellte sich auch im Vergleich zu den Pilocarpin-behandelten Tieren ohne SE
signifikant schlechter dar (Tag 20: p < 0,001, Tag 21: p < 0,01).
Bei der Variante mit sichtbarer Plattform (Cued-Version, Abb. 5.31 E) waren keine
signifikanten Unterschiede zwischen den drei Versuchsgruppen ermittelbar. Im
Gegensatz zu den Pilocarpin-behandelten Tieren zeigten die Kontrollen allerdings
eine signifikant bessere Lernleistung von Tag 1 zu Tag 2 der Cued-Version (p =
0,0043).
MWM: Lernkurve
A
Latenzzeit (s)
60
*+
40
+
*
Kontrolle
Pilo ohne SE
Pilo mit SE
*+ *+ *+ *+ *+
20
0
1
2
3
4 5 6 7
Trainingstage
8
9 10
C
22
5
20
4
Anzahl (n)
Geschwindigkeit (cm/s)
B MWM: Schwimmgeschwindigkeit
18
16
**
14
1
2
3
4 5 6 7
Trainingstage
8
9
3
2
1
12
MWM: Kreuzungen der
ehemaligen Plattformposition
*
0
10
Kontrolle Pilo ohne SE Pilo mit SE
125
Ergebnisse
Latenzzeit (s)
30
MWM: Retention-Test
*+
40
*+
Latenzzeit (s)
D
40
20
10
30
E
MWM: Cued-Version
*
20
10
0
0
Tag 21
Tag 31
Tag 22
Tag 32
Abb. 5.31: Darstellung der Ergebnisse der Lernkurve (A), der Schwimmgeschwindigkeit (B), der
Kreuzungen der ehemaligen Plattformposition im Probe trial (C), des Retention-Test (D) sowie der
Cued-Version (E). MWM = Morris-Water-Maze; Kontrolle: n = 12, Pilo ohne SE: n = 5, Pilo mit SE: n =
14; Statistik: A, B, D, E: 2-way-Repeated-Measures-ANOVA und Bonferroni-Posttests, C: 1-wayANOVA Kruskal-Wallis-Test und Dunn's-Multiple-Comparison-Test; * = Pilo mit SE signifikant zur
Kontrolle, + = Pilo mit SE signifikant zu Pilo ohne SE, Signifikanzniveau: p < 0,05
Interessante Aufschlüsse bietet ferner
die
Auswertung
der
zurückgelegten
Wegstrecken der Mäuse über die Tage der Akquisition im Morris-Water-Maze.
Abbildung 5.32 stellt repräsentative Abbildungen der Wegstrecken an Trainingstag 9
bei Tieren von allen drei Versuchsgruppen dar. Das Kontrolltier (Abb. 5.32 A) sowie
die Pilocarpin-behandelte Maus ohne SE (Abb. 5.32 B) hatten keine Schwierigkeiten,
die Plattform aufzufinden, denn sie hatten gelernt, eine Strategie zu entwickeln, die
versteckte Plattform zu erreichen. Das epileptische Tier (Abb. 5.32 C) jedoch
entwickelte keine aktive Suchstrategie nach der verborgenen Plattform. Es schwamm
vorwiegend entlang des Beckenrandes, zeigte also Thigmotaxis, und konnte
infolgedessen die Plattform innerhalb der vorgegebenen Zeit nicht auffinden.
A
C
B
Abb. 5.32: Aufsicht auf das Morris-Water-Maze. Zurückgelegte Wegstrecken an Trainingstag 9 eines
Kontrolltieres (A), eines Pilocarpin-behandelten Tieres ohne SE (B) sowie eines epileptischen Tieres
(C). Die Tiere auf den Abb. A und B hatten gelernt, wo sich die Plattform befindet. Das epileptische
Tier auf Abb. C zeigt Thigmotaxis, ein charakteristisches Verhalten für die Pilocarpin-behandelten
Tiere mit SE, welches als Angst-assoziiert gilt.
126
Ergebnisse
5.3.2.5 Überprüfung von Depressions-assoziiertem Verhalten
In beiden Tests, welche Depressions-assoziiertes Verhalten überprüfen, ergab sich
für die epileptischen Tiere eine verringerte Dauer der Immobilität. Im TailSuspension-Test (Abb. 5.33 A) erwies sich diese bei den epileptischen Tiere im
Vergleich zu den Kontrollen sowie zu den Pilocarpin-behandelten Tieren ohne SE als
reduziert (p = 0,0082). Im Porsolt-Test (Abb. 5.33 B) zeigte sich im Vergleich zu den
Kontrolltieren ein ähnliches Resultat (p = 0,0031). Ein Problem des Tail-SuspensionTests stellte dar, dass es einigen Tieren gelang, wiederholt auf die horizontale
Stange der Versuchsapparatur zu klettern. Dies betraf alle Gruppen, insbesondere
jedoch die Kontrolltiere. Aus diesem Grund ist die Anzahl der Tiere im TailSuspension-Test verringert, da nicht jede Maus diesen Test zu absolvieren
A
Tail-Suspension-Test
150
100
50
*+
0
Kontrolle Pilo ohne SE Pilo mit SE
Dauer der Immobilität (s)
Dauer der Immobilität (s)
vermochte.
150
Porsolt-Test
B
100
*
50
0
Kontrolle Pilo ohne SE Pilo mit SE
Abb. 5.33: Darstellung der Dauer der Immobilität im Tail-Suspension-Test (A, Kontrolle: n = 6, Pilo
ohne SE: n = 3, Pilo mit SE: n = 11) und Porsolt-Test (B, Kontrolle: n = 12, Pilo ohne SE: n = 5, Pilo
mit SE: n = 14); Statistik: 1-way-ANOVA nonparametrisch (Kruskal-Wallis-Test) und Posthoc Dunn'sMultiple-Comparison-Test; * = Pilo mit SE signifikant zur Kontrolle, + = Pilo mit SE signifikant zu Pilo
ohne SE, Signifikanzniveau: p < 0,05
5.3.3 Resultate der histologischen Auswertung
Abbildung 5.34 stellt den Hippocampus (A, C, E) sowie den Hilus des Gyrus dentatus
(B, D, F) in Thionin-Färbung dar. Bei den epileptischen Tieren ist ein Verlust an
Neuronen, insbesondere im Hilus des Gyrus dentatus, erkennbar (Abb. 5.34 F).
127
Ergebnisse
A
B
C
D
E
F
Abb.5.34: Übersicht über den Hippocampus (A, C, E) sowie eines Ausschnitts aus dem Gyrus
dentatus des Hippocampus (B, D, F) eines Kontrolltieres (A, B), eines Tieres aus der Gruppe „Pilo
ohne SE“ (C, D) sowie eines epileptischen Tieres (E, F). Die Anfärbung erfolgte mittels Thioninlösung.
Der Maßstabbalken entspricht 500 µm für die Abbildungen A, C und E sowie 100 µm für die
Abbildungen B, D und F.
5.3.3.1 Histologische Auswertung 4 Wochen nach SE
Um die Auswirkungen von Pilocarpin zu verschiedenen Zeitpunkten zu vergleichen,
wurden zunächst die histologischen Schnitte von jeweils 5 Tieren pro Gruppe (Pilo
mit und ohne SE) 4 Wochen nach Pilocarpin-Applikation mittels eines ScoringSystems bewertet (Kapitel 4.10.5.1) sowie die Anzahl an Neuronen ausgezählt
(Kapitel 4.10.5.3). Es erschien zunächst ausreichend, die Wirkungen von Pilocarpin 4
Wochen nach SE bzw. Injektion zu bewerten. Die Auswertung von histologischen
Schnitten von Kontrolltieren wurde nur zum Zeitpunkt von 9 Monaten nach
Vehikelinjektion vorgenommen.
Wie Abbildung 5.35 darstellt, ergaben sich für die Pilocarpin-behandelten Tiere mit
SE in den Subregionen CA 1 und CA 3 des Hippocampus sowie in der
Körnerzellschicht des Gyrus dentatus keine signifikanten Unterschiede zu den
128
Ergebnisse
Pilocarpin-behandelten Tieren ohne SE. Im Hilus des Gyrus dentatus jedoch ließ sich
bei
den
Gehirnschnitten
der
epileptischen
Mäuse
ein
signifikant
höherer
Neuronenverlust mittels der Bewertung nach Scoring-System (Abb. 5.35 E, p =
0,0112) sowie eine verringerte Dichte an Neuronen (Abb. 5.35 F, p = 0,0079)
nachweisen.
Score
2.0
1.5
1.0
0.5
0.0
Pilo ohne SE
C
2.5
CA 3a
(Scoring)
1.5
1.0
0.5
80
60
40
20
D
100
Pilo mit SE
CA 3a
(Neuronenzählung)
80
60
40
20
0
E
CA 3c
(Scoring)
2.0
1.5
1.0
0.5
0.0
Pilo ohne SE
Pilo ohne SE
Pilo mit SE
F
Anzahl Neuronen (n)
Pilo ohne SE
Score
CA 1
(Neuronenzählung)
Pilo ohne SE
0.0
2.5
100
0
Pilo mit SE
2.0
Score
B
Anzahl Neuronen (n)
CA 1
(Scoring)
Anzahl Neuronen (n)
A
2.5
100
Pilo mit SE
CA 3c
(Neuronenzählung)
80
60
40
20
0
Pilo mit SE
Pilo ohne SE
129
Pilo mit SE
Ergebnisse
Hilus
(Scoring)
2.5
*
Score
2.0
1.5
1.0
0.5
0.0
Pilo ohne SE
I
2.5
Hilus
(Dichte)
H
Anzahl Neuronen/mm²
G
500
400
300
*
200
100
0
Pilo ohne SE
Pilo mit SE
Pilo mit SE
Gyrus dentatus
(Scoring)
Score
2.0
1.5
1.0
0.5
0.0
Pilo ohne SE
Pilo mit SE
Abb. 5.35: Bewertung der Subregionen CA 1 (a, b), CA 3a (c, d) und CA 3c (E, F) des Hippocampus
sowie des Hilus (G, H) und der Körnerzellschicht des Gyrus dentatus (I) 4 Wochen nach Injektion von
Pilocarpin. Beide Gruppen jeweils n = 5. Statistische Berechnungen mittels t-Test (Mann-WhitneyTest). * = Pilo mit SE signifikant zu Pilo ohne SE. Signifikanzniveau: p < 0,05
5.3.3.2 Histologische Auswertung 9 Monate nach SE
Die Gehirnschnitte der Mäuse, welche die Verhaltensbatterie absolviert hatten
(Kapitel 5.3.2), wurden ebenfalls histologisch mittels eines Scoring-Systems (Kapitel
4.10.5.1) bewertet, sowie die Anzahl von Neuronen innerhalb definierter Fenster
ausgezählt (Kapitel 4.10.5.3).
In der CA 1-Subregion des Hippocampus zeigte sich bei den histologischen
Schnitten sowohl nach Bewertung mittels eines Scoring-Systems (Abb. 5.36 A, p =
0,0009), als auch nach Auszählen von Neuronen (Abb. 5.36 B, p = 0,0004) ein
signifikanter Unterschied zwischen den Kontrollen und den epileptischen Tieren. Die
Pilocarpin-behandelten Tiere ohne SE differierten von den Kontrolltieren hinsichtlich
der Auswertung der CA 1-Subregion nur nach Beurteilung mittels Scoring-Systems
signifikant (Abb. 5.36 A, p < 0,05).
130
Ergebnisse
In der CA 3-Subregion ließ sich ebenfalls ein signifikanter Unterschied bei den
Gehirnschnitten zwischen den Kontrollen und den epileptischen Tieren nach
Bewertung mittels Scoring-Systems (Abb. 5.36 C: Region CA 3a, p = 0,0028, Abb.
5.36 E: Region CA 3c: p = 0,0008) wie auch mittels Auszählen von Neuronen (Abb.
5.36 D: CA 3a, p = 0,0004, Abb. 5.36 E: CA 3c, p = 0,0018) detektieren. Für die
Pilocarpin-behandelten Tiere ohne SE ergab sich in der Auswertung der
histologischen Schnitte bei der CA 3-Subregion nach Auszählen von Neuronen eine
höhere Anzahl als bei den epileptischen Tieren (Abb. 5.36 D: CA 3a, p = 0,0004;
Abb. 5.36 F: CA 3c, p < 0,05).
Bei den Ergebnissen der Beurteilung des Hilus des Gyrus dentatus (Abb. 5.36 G, H)
differierten die epileptischen Tiere sowohl von den Kontrollen (nach Scoring-System
und Dichte, p < 0.0001), als auch von den Pilocarpin-behandelten Tieren ohne SE
(nach Bewertung mittels Scoring-Systems und Auswertung der Dichte: p < 0,05). Die
Bewertung der Körnerzellschicht des Gyrus dentatus (Abb. 5.36 I) nach ScoringSystem
zeigte
einen
signifikanten
Unterschied
für
die
Gehirnschnitte
der
epileptischen Tiere im Vergleich zu den Pilocarpin-behandelten Tieren ohne SE
sowie zu den Kontrolltieren (p = 0,0004). Im Gegensatz zu den NMRI-Mäusen in
Studie 1 entwickelten nur 3 von 14 epileptischen B6-Mäusen eine Dispersion der
Körnerzellschicht des Gyrus dentatus.
B
CA 1
(Scoring)
Score
2.0
1.5
1.0
0.5
#
*
Anzahl Neuronen (n)
A
2.5
CA 1
(Neuronenzählung)
100
80
60
*
40
20
0
0.0
Kontrolle Pilo ohne SE Pilo mit SE
Kontrolle Pilo ohne SE Pilo mit SE
131
Ergebnisse
C
CA 3a
(Scoring)
Anzahl Neuronen (n)
2.5
Score
2.0
1.5
1.0
*
0.5
0.0
100
CA 3c
(Scoring)
Score
1.5
*
0.5
40
20
F
2.0
1.0
60
Kontrolle Pilo ohne SE Pilo mit SE
Anzahl an Neuronen (n)
E
0.0
100
Score
Hilus
(Scoring)
40
20
0
H
*+
2.0
1.5
1.0
0.5
0.0
500
I
300
200
Score
*+
100
0
Kontrolle Pilo ohne SE Pilo mit SE
Gyrus dentatus
(Scoring)
2.0
1.5
1.0
0.5
Hilus
(Dichte)
400
Kontrolle Pilo ohne SE Pilo mit SE
2.5
*+
60
Kontrolle Pilo ohne SE Pilo mit SE
Anzahl Neuronen/mm²
2.5
CA 3c
(Neuronenzählung)
80
Kontrolle Pilo ohne SE Pilo mit SE
G
*+
80
0
Kontrolle Pilo ohne SE Pilo mit SE
2.5
CA 3a
(Neuronenzählung)
D
*+
0.0
Kontrolle Pilo ohne SE Pilo mit SE
132
Ergebnisse
Abb. 5.36: Histologische Auswertung 9 Monate nach SE der Subregionen CA 1 (a, b), CA 3a (c, d)
und CA 3c (e, f) des Hippocampus sowie des Hilus (g, h) und der Körnerzellschicht des Gyrus
dentatus (i) nach Scoring-System (a, c, e, g, i) bzw. Auszählen von Neuronen (b, d, f, h). Kontrolle: n =
12, Pilo ohne SE: n = 5, Pilo mit SE: n = 14. Statistische Berechnungen mittels nicht-parametrischer 1way-ANOVA (Kruskal-Wallis-Test) und post hoc Dunn's-Multiple-Comparison-Test. * = Pilo mit SE
signifikant zur Kontrolle, + = Pilo mit SE signifikant zu Pilo ohne SE, # = Pilo ohne SE signifikant zur
Kontrolle. Signifikanzniveau: p < 0,05
5.3.3.3 Vergleich der Zeitpunkte – 4 Wochen versus 9 Monate nach SE
Um verschiedene zeitliche Abstände zum SE zu untersuchen, wurden die
Ergebnisse der epileptischen Mäuse für die Zeitpunkte 4 Wochen sowie 9 Monate
nach SE aus den Abbildungen 5.35 und 5.36 miteinander verglichen.
Nach Vergleich dieser Zeitpunkte zeigte sich bei den histologischen Schnitten der
epileptischen Tiere in den Subregionen CA 1 und CA 3 des Hippocampus sowie im
Hilus und in der Körnerzellschicht des Gyrus dentatus sowohl nach Bewertung
mittels Scoring-Systems, als auch mittels Auszählen von Neuronen (nur CA 1 und
CA 3) bzw. Berechnung der neuronalen Dichte (nur Hilus) kein signifikanter
Unterschied (Two-way ANOVA).
5.3.3.4 Histologische Auswertung in FJC- sowie GFAP-Markierung
Um das Vorhandensein von degenerierenden Neuronen zu detektieren, wurde eine
FJC-Färbung durchgeführt. Vier Wochen sowie 9 Monate nach SE ließen sich nur
vereinzelt FJC-markierte Neuronen in thalamischen Kerngebieten sowie dem
endopiriformen Cortex detektieren, jedoch nicht im Hippocampus, in der Amygdala
oder im cerebralen Cortex.
Insbesondere zum Zeitpunkt 4 Wochen nach SE traten viele, mittels FJC schwächer
als Neuronen angefärbte Zellen mit vielen sternförmig verlaufenden Fortsätzen auf,
analog zu den bei NMRI entdeckten Zellen (Studie 1, Kapitel 5.1.4.3). Sie konnten im
Gyrus dentatus sowie vereinzelt in der CA 1-Subregion des Hippocampus
beobachtet werden. 9 Monate nach SE trat dieser Zelltyp ebenfalls auf, jedoch
weniger häufig als zum Zeitpunkt von 4 Wochen nach SE. Analog zu den
histologischen Schnitten der NMRI-Mäuse in Studie 1, ließen sich Zellen dieser
Morphologie in Studie 3 bei den Gehirnschnitten der B6-Mäuse mittels GFAPMarkierung anfärben (Abb. 5.37 E, Abb. 5.38 B, D). Einen zweiten, schwächer als
133
Ergebnisse
Neuronen angefärbten Zelltyp, stellen langgezogene Zellen dar, welche gleichfalls 4
Wochen nach SE häufiger auftraten als 9 Monate nach SE. Zellen mit derselben
Morphologie ließen sich mittels GFAP markieren (Abb. 5.37 F, H), infolgedessen
kann von einem Auftreten von hypertrophierten Astrozyten sowie von radialer Glia
ausgegangen werden. Die histologischen Schnitte der epileptischen Tiere wiesen
ferner eine vermehrte Anzahl mittels GFAP markierter Astrozyten im Vergleich zu
den Kontrollen auf.
Bei den Kontrollen (Abb. 5.37 A, B) sowie bei den Pilocarpin-behandelten Tieren
ohne SE (Abb. 5.38 E, F) ließen sich keine Zellen mittels FJC anfärben. Die
Gehirnschnitte der Pilocarpin-behandelten Tiere ohne SE differierten auch in der
GFAP-Färbung (Abb. 5.38 G, H) nicht von den Kontrollen (Abb. 5.37 C, D).
A
B
C
D
134
Ergebnisse
E
F
G
H
Abb. 5.37: Ausschnitte aus dem Gyrus dentatus, gefärbt mittels FJC (A, B, E, F) oder GFAP (C, D, G,
H) in Kontrolltieren (A-D) bzw. 4 Wochen nach SE (E-H). Der Maßstabbalken steht für 50 µm in den
Abbildungen A, C, E und G sowie für 20 µm in den Abbildungen B, D, F und H. In Kontrollgewebe sind
keine Zellen mit FJC angefärbt (A, B). Vier Wochen nach SE sieht man zwei angefärbte Zelltypen:
Sternförmige Zellen mit vielen Fortsätzen (bezeichnet mittels Pfeil in Abbildung F) sowie
langgezogene Zellen (bezeichnet mittels Pfeil in Abbildung E). Diese beiden mittels FJC schwächer
angefärbten Zellen sind auch in GFAP-Markierung zu erkennen, zu sehen in Abbildung G und H.
A
B
135
Ergebnisse
C
D
E
F
G
H
Abb. 5.38: Ausschnitte aus dem Gyrus dentatus, gefärbt mittels FJC (A, B, E, F) oder GFAP (C, D, G,
H) bei epileptischen Tieren 9 Monate nach SE (A-D) bzw. bei Mäusen, welche Pilocarpin erhalten
haben, aber keinen SE erreichten, sondern nur einen oder mehrere einzelne Anfälle (E-H). Der
Maßstabbalken bezeichnet 50 µm für die Abbildungen A, C, E und G sowie 20 µm für die Abbildungen
B, D, F und H. Neun Monate nach SE färbt FJC vorwiegend hypertrophierte Astrozyten an (bezeichnet
mittels Pfeil in Abbildung B). Diese Zellen werden ebenfalls vom Gliazellmarker GFAP angefärbt,
dargestellt in den Abbildungen C und D. Gehirnschnitte von Mäusen, bei denen Pilocarpin keinen SE
induzierte, waren nicht unterschiedlich von Kontrolltieren (FJC- [E, F] sowie GFAP- [G, H] Färbung).
136
Diskussion
6. Diskussion
6.1 Vergleich des LiCl-Pilocarpins- mit dem Pilocarpin-Modell (Studie 1)
Die erste Hypothese in Studie 1 besagt, dass eine vorherige Applikation von LiCl bei
Mäusen die Krampfempfindlichkeit steigert, so dass die konvulsiv wirkende
Pilocarpinkonzentration reduziert werden kann. Dieser Fakt ist bei Ratten seit vielen
Jahren bekannt, denn bei Ratten führt eine Vorbehandlung mit 3 mEq LiCl 12-24
Stunden vor Pilocarpin-Applikation zu einer um mehr als den Faktor 13 potenzierten
Wirkung von Pilocarpin (JOPE et al. 1986). Gestützt wird dies durch weitere Studien:
TURSKI et al. (1983a) injizierten Ratten ohne LiCl-Vorbehandlung 400 mg/kg
Pilocarpin, um Krampfanfälle auszulösen. Auch in einer weiteren Studie (CLIFFORD
et al. 1987) wird Ratten ohne LiCl-Vorbehandlung 400 mg/kg Pilocarpin appliziert.
Nach einer vormaligen Injektion von 3 mEq/kg LiCl benötigen die Ratten lediglich 30
mg/kg Pilocarpin, um ein Anfallsgeschehen auszulösen.
Die Wirkung von LiCl, die konvulsive Dosis von Pilocarpin zu verringern, wird auf
eine Inhibition der Inositol-Monophosphatase durch LiCl zurückgeführt, infolgedessen
kann der Phosphatidylinositol-Zyklus nur beeinträchtigt ablaufen (BELMAKER u.
BERSUDSKY
2007).
Zeitpunkt-
und
dosisabhängig
kann
eine
intracerebroventrikuläre Injektion von Inositol ein durch LiCl-Pilocarpin-induziertes
Krampfgeschehen unterbinden (BERSUDSKY et al. 1993).
Die in Studie 1 durchgeführten Experimente jedoch zeigen, dass wir bei den
getesteten Mäusen des Stammes NMRI diese Effekte nicht beobachten konnten. Im
Gegenteil, mit LiCl-Vorbehandlung entwickelten sogar weniger Tiere (30%) einen SE
als nicht mit LiCl vorbehandelte Mäuse (83% bei 300 mg/kg Pilocarpin).
MAZARATI et al. (2004) geben an, dass sie bei Galanin-Rezeptor-knock-out-Mäusen
mit einer Dosierung von 3 mEq/kg LiCl bei einer 16-24 Stunden später folgenden
Applikation von 150 mg/kg Pilocarpin s.c. einen SE induzieren können, nennen
jedoch nicht den prozentualen Anteil der Mäuse, bei welchen nach dieser Prozedur
ein SE entstand.
In einer Studie (LI et al. 2008) wird zwar benannt, dass über 80% der Balb/c-Mäuse
nach einer LiCl-Vorbehandlung von 3 mEq einen SE entwickeln, jedoch liegt die
Dosierung von Pilocarpin in einer Spanne von 280-340 mg/kg. In einer solch hohen
137
Diskussion
Dosierung führt Pilocarpin bereits als Monoinjektion bei einem hohen Prozentsatz an
Mäusen zu einem SE, hier hat LiCl also die konvulsive Dosis von Pilocarpin nicht
reduzieren können.
BERSUDSKY et al. (1994) beschreiben Spezies-Unterschiede hinsichtlich der
Empfänglichkeit bezüglich LiCl-Pilocarpin-induzierter Anfälle. So wird vermutet, dass
Interaktionen zwischen LiCl und Pilocarpin lediglich in Spezies auftreten, welche
einen geringen Basalwert an Inositol im Gehirn aufweisen. Hier sind vor allem Ratten
zu nennen. In der Studie (BERSUDSKY et al. 1994) entwickelten 80-100% der
untersuchten Ratten bei einer Dosierung von 3 mEq/kg LiCl sowie 20 mg/kg
Pilocarpin Krampfanfälle. Bei Mäusen lag der prozentuale Anteil der Tiere mit
epileptischen Anfällen bei 70%, die Dosierung von LiCl wurde jedoch verglichen zu
Ratten höher gewählt und liegt bei 10 mEq/kg bei 100 mg/kg Pilocarpin.
Einen weiteren Hinweis auf die Vermutung, dass eine erhöhte Dosis von 10 mEq/kg
LiCl die konvulsive Dosis von Pilocarpin bei Mäusen verringern könnte, liefert eine
Studie von SHALDUBINA et al. (2007). Nach Applikation von 200 mg/kg Pilocarpin
ohne LiCl-Vorbehandlung entwickelte keine der untersuchten knockout- sowie
Wildtyp-Mäuse (B6-Hintergrund) einen SE. Ebenso konnten keine limbischen Anfälle
nach Injektion von 100 mg/kg Pilocarpin nach einer Vorbehandlung mit 3 mEq/kg
LiCl beobachtet werden. Jedoch präsentieren alle untersuchten Mäuse nach
Applikation von 10 mEq/kg LiCl in Kombination mit 100 mg/kg Pilocarpin
Krampfanfälle. In Studie 1 der vorliegenden Arbeit wurde eine Dosierung von 3
mEq/kg LiCl gewählt, weil dies die übliche Dosierung bei Ratten (JOPE et al. 1986;
CLIFFORD et al. 1987; BERSUDSKY et al. 1993; BERSUDSKY et al. 1994; MARCHI
et al. 2009) sowie bei Mäusen (MAZARATI et al. 2004; LI et al. 2008) darstellt.
Eine weitere mögliche Ursache, welche zu der Tatsache führen könnte, dass eine
Vorbehandlung mit LiCl bei den untersuchten NMRI-Mäusen die konvulsive Dosis
von Pilocarpin nicht verringern konnte, könnte die Wahl des Applikationszeitpunkts
von LiCl 15-19 Stunden vor Pilocarpin-Injektion sein. Eine Studie (O'DONNELL u.
GOULD 2007) stellt dar, dass die Länge der Zeit zwischen LiCl- und PilocarpinApplikation eine bedeutsame Rolle spielt. Bei Ratten kann sogar eine solch geringe
138
Diskussion
Dosis wie 0,5 mEq/kg von LiCl einen SE induzieren, wenn es volle 24 Stunden vor
Pilocarpin-Injektion verabreicht wird.
Hinsichtlich
der
verhaltensphysiologischen
wie
auch
histologischen
Charakterisierung des LiCl-Pilocarpins- zum Pilocarpin-Modell in Studie 1 konnten
keine Unterschiede zwischen LiCl-vorbehandelten und nicht vorbehandelten Tieren
detektiert werden. CLIFFORD et al. (1987) verglichen beide Modelle bei Ratten und
fanden heraus, dass bei Ratten die Syndrome in Bezug auf Verhalten, Metabolismus,
EEG sowie in neuropathologischer Hinsicht sowohl im alleinigen Pilocarpin-, als auch
im LiCl-Pilocarpin-Modell nicht voneinander zu differenzieren sind. Dies geht konform
mit den Beobachtungen in dieser Arbeit. Die Wirkungen von LiCl im LiCl-PilocarpinModell scheinen insbesondere akuter Natur zu sein. Selbst proinflammatorische
Effekte von LiCl oder eine Erhöhung der Permeabilität der Blut-Hirn-Schranke
(MARCHI et al. 2009) scheinen langfristig gesehen auf den Phänotyp des PilocarpinModells keine Auswirkungen zu haben. Nach Applikation von Pilocarpin wird eine
Kaskade in Gang gesetzt, welche bekanntermaßen zu einer weitläufigen
Neurodegeneration im Gehirn führt. Betroffen sind zahlreiche Regionen, wie
beispielsweise
olfaktorischer
Cortex,
Amygdala,
Thalamus,
Hippocampus,
entorhinaler Cortex sowie Neocortex (CURIA et al. 2008). Aus diesem Grund scheint
es nicht verwunderlich, dass die infolge der Pilocarpinapplikation induzierte Kaskade
bereits von sich aus einen ausgeprägten Neuronenverlust ergibt, so dass etwaige
Langzeiteffekte von LiCl vollkommen überlagert werden würden.
6.2 Verhaltensphysiologische und histologische Charakterisierung von (LiCl-)
Pilocarpin-behandelten NMRI- (Studie 1) sowie B6-Mäusen (Studie 3) ohne SE
In
Studie
1
wurden
ferner
Pilocarpin-behandelte
NMRI-Mäuse
ohne
SE
verhaltensphysiologisch wie auch histologisch charakterisiert. Es konnten jedoch
keine signifikanten Unterschiede zu Kontrollen detektiert werden. Eine Ausnahme
bildeten die LiCl-Pilocarpin-behandelten Tiere ohne SE im Open-Field, denn die
Verweildauer im Zentrum stellte sich signifikant erhöht dar. In Studie 3, der
verhaltensphysiologischen
Charakterisierung
von
Pilocarpin-behandelten
B6-
Mäusen, konnten einige wenige Effekte einer Pilocarpin-Behandlung ohne
139
Diskussion
Ausprägung eines SE festgestellt werden. Dies zeigt, dass entweder die Applikation
von Pilocarpin, die Ausprägung von einzelnen Anfällen oder eine Kombination aus
beiden Faktoren leichte Verhaltensauffälligkeiten beim Mausstamm B6 bewirken
kann. So präsentierten Pilocarpin-injizierte B6-Mäuse ohne SE im Open-Field eine im
Vergleich zu Kontrollen signifikant erhöhte Lokomotion. Die epileptischen Mäuse
wiesen allerdings eine noch höhere Aktivität als die Pilocarpin-behandelten Tiere
ohne SE auf. Auch bezüglich des Aufrichtverhaltens im Open-Field zeigten sich
Unterschiede, denn dies war bei den Pilocarpin-behandelten Mäusen ohne SE im
Vergleich zu den epileptischen Tieren erhöht. Analog zur Steigerung des
Aufrichtverhaltens im Open-Field, zeigte sich bei Pilocarpin-injizierten Tieren ohne
SE ein erhöhtes Auftreten von Head-Dips im Hole-Board-Test. Bezüglich der
Absolvierung der übrigen Verhaltenstests konnten die Pilocarpin-behandelten Tiere
ohne SE nicht von den Kontrollen differenziert werden.
Histologisch konnten sowohl bei Pilocarpin-injizierten Mäusen ohne SE des
Stammes NMRI sowie B6 keine Unterschiede zu den Kontrollen detektiert werden.
Eine Ausnahme bildete in Studie 3 eine signifikant erhöhte Bewertung der Subregion
CA 1 nach Beurteilung mittels Scoring-Systems, jedoch ist zu sagen, dass der Score
lediglich einen Wert zwischen 0 und 0,5 aufwies. Ferner konnte dieser Effekt mittels
des Auszählens von Neuronen nicht bestätigt werden.
Wir vermuteten, dass eventuell der Zeitpunkt (5 Monate nach SE bei NMRI- sowie 4
Wochen bzw. 9 Monate nach SE bei B6-Mäusen) zu spät gewählt ist, um subtile
histologische Veränderungen detektieren zu können, welche die alleinige Applikation
von Pilocarpin mit der Ausprägung einzelner Anfälle, jedoch keines SE, verursachen
könnte. Einen Hinweis bildet eine Studie von BENGZON et al. (1997), welche
nachweisen
konnte,
dass
bereits
ein
einzelner
Anfall
Neurodegeneration
verursachen kann. So führte bei Ratten eine einzige elektrische Stimulierung der
hippocampalen CA 1-Subregion, welche lediglich eine fokale epileptiforme Aktivität
von 80 s verursachte, zu einem signifikanten Anstieg von apoptotischen Neuronen im
Gyrus dentatus. Nachgewiesen werden konnte dies mittels TUNEL-Markierung für
apoptotische Zellen. Dieser Effekt konnte nur zu einem Zeitpunkt von 5 Stunden
nach Stimulation gezeigt werden.
140
Diskussion
Aufgrund der Studie von BENGZON et al. (1997), applizierten wir erneut NMRIMäusen Pilocarpin als Bolus in einer Dosierung zwischen 250-350 mg/kg. Es erwies
sich jedoch als schwierig, Tiere mit möglichst vielen Anfällen zu generieren, da diese,
sobald sie mehrere Krampfanfälle entwickelten, auch einen SE erreichten. So ergab
sich lediglich ein Tier mit einem Einzelkrampf nach Pilocarpin. Die übrigen Tiere,
welche
Pilocarpin
erhielten,
aber
keinen
SE
entwickelten,
zeigten
keine
Einzelkrämpfe. Die Mäuse wurden 5 Stunden, 24 Stunden, 48 Stunden sowie 7 Tage
nach SE dekapitiert und die Gehirnschnitte mittels FJC gefärbt. Die histologischen
Schnitte der Pilocarpin-injizierten Tiere ohne SE ließen zu keinem der untersuchten
Zeitpunkte, weder im Gyrus dentatus, noch in übrigen Hirnregionen degenerierende
Neuronen erkennen, d.h. sie differierten nicht von den Kontrollen. Es kann vermutet
werden, dass die Methode der FJC-Färbung nicht sensitiv genug für die Detektierung
solch subtiler Effekte ist, auch wenn eine Studie (WANG et al. 2008) zeigt, dass die
meisten der FJC-positiven Zellen Immunreaktivität hinsichtlich des Cytochrom-C, der
Caspase-9 und vor allem der aktivierten Caspase-3 ausprägen, so dass bei FJCpositiven degenerierenden Neuronen ein apoptotischer Mechanismus angenommen
werden kann. Einen weiteren Unterschied zur Studie von BENGZON et al. (1997)
bildet, dass ein Einzelkrampf nach einem chemischen Konvulsivum wie Pilocarpin
anders vermittelt wird, als eine einmalige elektrische Stimulation mittels Kindling.
6.3 FJC-Färbung der histologischen Schnitte der Pilocarpin-behandelten NMRI(Studie 1) sowie B6-Mäuse (Studie 3) mit SE
Die Gehirnschnitte der untersuchten chronisch epileptischen NMRI-Mäuse wiesen
FJC-gefärbte Zellen in unterschiedlichem Ausmaß auf, je nach Zeitpunkt nach SE. 7
Tage nach SE konnten vereinzelt degenerierende Neuronen detektiert werden, das
Maximum lag bei 24 und 48 Stunden nach SE. Dies lässt sich mit einer Studie von
WANG et al. (2008) vereinbaren, welche einen Zeitverlauf der Degenerierung von
Neuronen mittels FJC nach Pilocarpin-induziertem SE bei Mäusen des Stammes
Kunming darstellen. Sie fanden zwar ein maximales Auftreten von degenerierenden
Neuronen 12 Stunden nach SE, untersuchten danach aber erst wieder den Zeitpunkt
3 Tage nach SE, in welchem der Anteil an degenerierenden Neuronen etwas
141
Diskussion
geringer lag als nach 12 Stunden. Analog zu dieser Studie fanden auch wir bei
Pilocarpin-behandelten Tieren mit SE degenerierende Neuronen im Hippocampus,
im Cortex wie auch in Kernen der Amygdala sowie des Thalamus. Dies repräsentiert
die nach Pilocarpin auftretende weitläufige Degeneration neuronaler Strukturen.
7 Tage nach SE ergaben sich für die histologischen Schnitte der untersuchten NMRIMäuse nur noch vereinzelt degenerierende Neuronen. Auch dies geht konform mit
der Studie von WANG et al. (2008), in welcher gleichfalls ab 7 Tagen die Anzahl der
FJC-markierten Zellen stark abnahm. Ab einem Zeitpunkt von 7 Tagen nach SE
hingegen entdeckten wir sowohl bei NMRI- (Studie 1), als auch bei B6-Mäusen
(Studie 3) zwei Zelltypen, welche mittels FJC schwächer angefärbt wurden als
degenerierende Neuronen. Es konnten einerseits längliche Zellen mit wenigen
Fortsätzen sowie andererseits sternförmige Zellen mit vielen Fortsätzen detektiert
werden. Aufgrund dieser beschriebenen Morphologie sowie der Lokalisation kann
von radialer Glia sowie hypertrophierten Astrozyten ausgegangen werden.
SCHMUED (1997) stellt die FJC-Färbung als selektiven Marker für degenerierende
Neuronen vor. In einer späteren Studie (SCHMUED et al. 2005) jedoch erläutert er,
dass in den Gehirnschnitten von Kainat-behandelten Ratten in einigen Regionen mit
weitläufiger neuronaler Degeneration, wie beispielsweise dem Hippocampus,
hypertrophierte Astrozyten manchmal mit FJC markiert wurden. Diese Anfärbung ist
weniger intensiv als bei degenerierenden Neuronen. Dies trifft exakt unsere
Beobachtungen. Nach Färbung mittels des Astrozytenmarkers GFAP ließen sich
Zellen der oben beschriebenen Morphologie darstellen. BORGES et al. (2006)
beschrieben eine Degeneration sowie Proliferation von Astrozyten im Gyrus dentatus
von Mäusen nach einem Pilocarpin-induziertem SE. Ferner induzierten Pilocarpininduzierte Krampfanfälle eine Überexpression von GFAP in Astrozyten (BORGES et
al. 2006). Eine Hypertrophie von Astrozyten im Kainat-Modell für TLE wurde in
weiteren Studien beschrieben (NADLER et al. 1980; NITECKA et al. 1984; NIQUET
et al. 1994).
Radiale Glia stellen multifunktionale Progenitorzellen dar, die sich zu Neuronen oder
zu Astrozyten entwickeln können (SERI et al. 2001; SERI et al. 2004). Drei Tage
nach Kainat-induziertem SE ließ sich eine Proliferation von radialer Glia mittels
142
Diskussion
GFAP-Markierung darstellen (HÜTTMANN et al. 2003). In einer Studie von BORGES
et al. (2006) wurde radiale Glia mit GFAP nach Pilocarpin-induziertem SE
nachgewiesen. Unserem Wissen nach ist die Detektierung von radialer Glia nach
Pilocarpin-induziertem SE mittels FJC-Färbung, wie sie in dieser PhD-Arbeit
beschrieben wurde, neu.
6.4 Bewertung der histologischen Schnitte der chronisch epileptischen NMRI(Studie 1) sowie B6-Mäuse (Studie 3) in Thionin-Färbung
Wie erwartet ergab sich bei der Bewertung der Gehirnschnitte von epileptischen
NMRI- sowie B6-Mäusen in der Übersichtsfärbung Thionin eine signifikant erhöhte
Neurodegeneration im Vergleich zu den Kontrollen. Auffällig war jedoch die
Tatsache, dass B6-Mäuse zwar im Hilus einen zu NMRI-Mäusen vergleichbaren
Neuronenverlust aufwiesen, in sonstigen Regionen aber wesentlich weniger stark
von Neurodegeneration betroffen waren, als die untersuchten NMRI-Mäuse in Studie
1. Dies könnte auf eine erhöhte Resistenz von B6-Mäusen hinsichtlich experimentell
induzierter Krampfanfälle zurückzuführen sein (FERRARO et al. 2004), wie
beispielsweise im MEST-Test gezeigt wurde (FERRARO et al. 1998; FERRARO et
al. 2002). B6-Mäuse zeigten sich ferner nach systemischer Applikation von Kainat
resistent gegenüber neurodegenerativen Veränderungen (SCHAUWECKER u.
STEWARD 1997). Passend zu unseren Beobachtungen stellt eine weitere Studie
(MOHAJERI et al. 2004) dar, dass B6-Mäuse im Vergleich zu Mäusen des Stammes
FVB auch im Pilocarpin-Modell eine weniger ausgeprägte Neurodegeneration
aufweisen. Insbesondere die Subregionen CA 1 sowie CA 3 des Hippocampus
erwiesen sich bezüglich der Neurodegeneration als relativ resistent. SHIBLEY und
SMITH (2002) hingegen stellen dar, dass sich für B6-Mäuse nach Pilocarpininduziertem SE eine geringere neuronale Dichte im Hilus des Gyrus dentatus, sowie
eine geringere Dichte von Pyramidenzellen in den Subregionen CA 1 und CA 3c des
Hippocampus ergab.
143
Diskussion
6.5 Detektierung von spontanen epileptischen Anfällen bei NMRI- (Studie 1)
sowie B6-Mäusen (Studie 3)
Bei allen Pilocarpin-behandelten Mäusen mit SE aus Studie 1 des Stammes NMRI,
sowie aus Studie 3 des Stammes B6 konnte mindestens ein spontaner Anfall
detektiert werden. Dies lässt als Rückschluss zu, dass ein 90-minütiger SE zu einer
100%-Entwicklung
von
chronischer
Epilepsie
führt.
Konform
zu
unseren
Beobachtungen zeigen auch andere Studien (SHIBLEY u. SMITH 2002; CHEN et al.
2005), dass Mäuse in den folgenden Wochen nach SE spontane wiederkehrende
Anfälle entwickeln.
6.6 Vergleich der Verhaltensabweichungen von epileptischen B6- (Studie 3) zu
NMRI-Mäusen aus Studie 1 sowie aus GRÖTICKE et al. (2007)
Bei den verhaltensphysiologischen Untersuchungen in Studie 1 ergaben sich für die
epileptischen NMRI-Mäuse Auffälligkeiten, welche den Resultaten von GRÖTICKE et
al. (2007) entsprachen: Die epileptischen NMRI-Mäuse präsentierten Angstassoziiertes Verhalten im Open-Field, jedoch nicht im Elevated-Plus-Maze. Im
Morris-Water-Maze zeigten sich Lern- und Gedächtniseinbußen. Auch die bei
epileptischen NMRI-Mäusen signifikant verringerte Immobilitätszeit sowohl im
Porsolt-Test, als auch im Tail-Suspension-Test, konnte in dieser Arbeit reproduziert
werden.
Die Hypothese, dass epileptische Mäuse des Stammes B6 analog zu den
detektierten Verhaltensänderungen bei NMRI Abweichungen aufweisen, welche sich
in einer Verhaltensbatterie darstellen lassen, konnte bestätigt werden. Ein Vergleich
der Gesamtheit aller absolvierten Tests zwischen epileptischen NMRI- (GRÖTICKE
et al. 2007) sowie B6-Mäusen stellt Tabelle 6.1 dar.
Bei der Eingangscharakterisierung, dem Irwin-Test, ergab sich für epileptische B6Mäuse eine reduzierte Lokomotion, welche auch bei NMRI-Mäusen auftrat. Angstassoziiertes Verhalten prägte sich bei den untersuchten zwei Mausstämmen
unterschiedlich aus: Während die epileptischen NMRI-Mäuse aufgrund von FreezingVerhalten auffielen, zeigten epileptische B6-Mäuse eine erhöhte Schreckhaftigkeit,
144
Diskussion
welche sich durch abruptes Hochspringen nach präsentierten Objekten oder
Berührung auszeichnete.
Bei den motorischen Tests konnten bei beiden untersuchten Mausstämmen ähnliche
Resultate detektiert werden. Epileptische Mäuse beider Stämme absolvierten den
Rotarod-Test ohne Schwierigkeiten. Im Hanging-Wire-Test traten bei epileptischen
NMRI- sowie bei epileptischen B6-Mäusen signifikante Defizite auf. Dies verdeutlicht
die Notwendigkeit von mehreren Tests innerhalb einer Verhaltensdomäne. Da die
Gleichgewichtsfähigkeiten und die Koordination bei den epileptischen Tieren
aufgrund der erfolgreichen Absolvierung des Rotarods offenbar gut funktionieren,
scheinen die Einbußen im Hanging-Wire-Test entweder auf motorischen Defiziten
der Greiffunktion (Muskelkraft) oder auf einer verminderten Motivation der
epileptischen Mäuse zu beruhen, sich über 60 s kopfüber an einem Gitter
festzuhalten. Ein weiterer Hinweis könnte sein, dass epileptische Mäuse im ElevatedPlus-Maze sowie im Hole-Board-Test ein erhöhtes Absprungverhalten von der
Versuchsapparatur aufwiesen. Dies wird üblicherweise mit Impulsivreaktionen erklärt
(HOLMES et al. 2000), wie sie auch bei Patienten mit einer Panikstörung vorkommen
können, und in Zusammenhang mit einer verminderten Fähigkeit der Amygdala zu
stehen scheinen, Angst-auslösende Situationen adäquat zu bewerten. Panikattacken
zählen zu den Komorbiditäten bei Epilepsien (ALVAREZ-SILVA et al. 2006). Ferner
wurden bei Patienten der TLE und iktalen Angstsymptomen kleinere Volumina der
Amygdala gefunden (BEYENBURG 2005). So könnte auch ein „Herunterstürzen“
vom Gitter des Hanging-Wire-Tests eine Art Impulsivreaktion darstellen. Der
Chimney-Test, das rückwärtige Herausklettern aus einer Röhre, stellte für nahezu
alle B6-Mäuse, unabhängig davon, welcher Versuchsgruppe sie angehörten, eine
außerordentliche Schwierigkeit dar. Es scheint ein stammspezifisches Problem zu
sein, dass die B6-Mäuse nicht freiwillig in die Versuchsröhre laufen, da die NMRIMäuse diesen Test erfolgreich absolvierten (GRÖTICKE et al. 2007).
Auffällig bei B6- im Gegensatz zu NMRI-Mäusen ist das Auftreten von erhöhter
Aktivität in mehreren Verhaltenstests (Open-Field, Elevated-Plus-Maze, Hole-BoardTest sowie Novel-Object-Exploration-Test). Hier scheint eine Differenz zwischen
verschiedenen
Mausstämmen
vorzuliegen.
145
CRAWLEY
(1997)
stützt
diese
Diskussion
Beobachtung, denn sie beschreibt, dass Mäuse der C57-Inzuchtstämme, hierzu zählt
auch die B6-Maus, generell eine hohe Aktivität im Open-Field präsentieren, so dass
dies die Grundlage für die Hyperaktivität der epileptischen Tiere bilden könnte.
Hyperaktivität stellt insbesondere bei Kindern mit Epilepsien eine bedeutende
Komorbidität dar. Die Prävalenz von Hyperaktivität bei Epilepsie-erkrankten Kindern
liegt um mindestens 20% höher als bei nicht-epileptischen Kindern (KAUFMANN et
al. 2009). Dies stellt einen Vorteil des Pilocarpin-Modells bei der B6- im Vergleich zur
NMRI-Maus dar, welche in der verhaltensphysiologischen Charakterisierung keine
Hyperaktivität aufwies (GRÖTICKE et al. 2007). Auch Ratten präsentierten eine
erhöhte lokomotorische Aktivität in der chronischen Phase ihrer Epilepsie im OpenField-Test sowie im Elevated-Plus-Maze (BRANDT et al. 2006). Lediglich in der
Light-Dark-Box wiesen die epileptischen B6-Mäuse eine reduzierte Aktivität auf. Dies
lässt sich jedoch vermutlich auf die Tatsache zurückführen, dass die Tiere sich zu
Beginn des Versuchs rasch in das dunkle Kompartment der Versuchsapparatur
bewegten, und sich nur selten in den offenen Bereich wagten. Die Kamera kann die
Bewegungen der Tiere im dunklen, geschlossenen Bereich nicht detektieren, so dass
nicht gesagt werden kann, ob sich die Tiere im geschlossenen Kompartment
bewegten, und falls dies der Fall ist, in welchem Ausmaß.
Im Open-Field-Test wiesen epileptische B6-Mäuse ferner Angst-assoziiertes
Verhalten auf, welches sich in einer erhöhten Aufenthaltsdauer am Rand der Arena
sowie durch reduziertes Aufrichtverhalten darstellt. Diese Ergebnisse ergaben sich
auch für die untersuchten NMRI-Mäuse (GRÖTICKE et al. 2007).
Die epileptischen NMRI-Mäuse wiesen im Hole-Board-Test Angst-assoziiertes
Verhalten sowie eine geringere Exploration auf, da ihre Head-Dip-Frequenz im
Vergleich zu den Kontrollen signifikant reduziert war. Epileptische B6-Mäuse zeigten
dieses Verhalten nicht, für sie ergab sich hingegen eine erhöhte Anzahl der EdgeDips, welche bei den epileptischen NMRI-Mäusen nicht detektiert werden konnte.
Dies könnte mit der erhöhten Absprungrate bzw. Klettern von der Versuchsapparatur
des Hole-Board-Tests verbunden sein, welches ein Problem bei der Absolvierung
des Versuchs bei den epileptischen B6-Mäusen darstellte.
146
Diskussion
In der Light-Dark-Box konnte bei den epileptischen B6-Mäusen Angst-assoziiertes
Verhalten nachgewiesen werden, da sie signifikant weniger Zeit im aversiven,
offenen Bereich sowie vermehrt Zeit im dunklen, geschlossenen Kompartment
verbrachten. Ferner zeigte sich eine Reduzierung der Übertritte zwischen beiden
Kompartments, welche ebenso bei den untersuchten NMRI beobachtet werden
konnte (GRÖTICKE et al. 2007).
Im Elevated-Plus-Maze konnte bei keinem der beiden Stämme Angst-assoziiertes
Verhalten nachgewiesen werden. Da dies in den übrigen Angst-assoziierten Tests
der Fall war, liegt hier vermutlich ein testspezifisches Problem des Elevated-PlusMaze vor. KOMADA et al. (2008) äußern, dass Elevated-Plus-Maze und Light-DarkBox zwar beide verwendet werden, um Angst-assoziiertes Verhalten zu bewerten,
jedoch nicht zwingend dieselben Resultate hervorbringen.
Im Novel-Object-Exploration-Test ergaben sich interessante Unterschiede der B6- zu
den NMRI-Mäusen: Während die Habituationsphase bei B6-Mäusen zum Open-Field
vergleichbare Resultate hervorbrachte, d.h. die epileptischen Mäuse zeigten
aufgrund einer erhöhten Aufenthaltsdauer am Rand der Arena Angst-assoziiertes
Verhalten sowie eine Hyperaktivität, ergab sich für die Objektphase das exakte
Gegenteil. Die epileptischen B6 zeigten in der Objektphase eine so häufige
Annäherung an das neue Objekt, dass die Aufenthaltsdauer im Zentrum in der
Objektphase signifikant erhöht war. Die epileptischen NMRI-Mäuse hingegen mieden
ein neu präsentiertes Objekt, da sie in der Objektphase eine längere Zeitdauer am
Rand des Open-Field verbrachten. Hier scheint eine bedeutende Rolle zu spielen,
dass es sich um unterschiedliche Mausstämme handelt. Dass verschiedene
Mausstämme unterschiedlich im Novel-Object-Exploration-Test reagieren, zeigt eine
Studie (VAN GAALEN u. STECKLER 2000), in welcher naive Mäuse des Stammes
A/J ein neues Objekt mieden, wohingegen B6-Mäuse sich dem präsentierten Objekt
annähern. Dies können wir nicht bestätigen, da die Kontrollen sich zwar dem Objekt
näherten, aber bei weitem nicht solch ein großes Interesse zeigten, wie die
epileptischen Tiere. Zu unseren Resultaten passt vielmehr eine Studie von KIM et al.
(2005), welche sich ebenfalls mit Unterschieden in der Annäherung von
verschiedenen Mausstämmen bezüglich neuen Objekten befasst. Es wird zwischen
147
Diskussion
primärer und sekundärer Annäherung an neue Objekte differenziert, letztere wird als
Verspieltheit der Tiere gewertet. Während sich für BALB/cJ und DBA/2J-Mäuse
beide Annäherungsarten ergaben, zeigten die übrigen gestesteten Mausstämme, wie
B6J, lediglich primäres Explorationsverhalten. Dies trifft auf unsere Resultate zu, da
die B6-Kontrolltiere das neue Objekt zwar explorierten, nach einiger Zeit jedoch kein
sonderlich großes Interesse mehr aufwiesen. Lediglich die epileptischen B6-Mäuse
explorierten das Objekt über die gesamte Dauer der Objektphase.
Im Morris-Water-Maze ergab sich für die epileptischen Mäuse beider Stämme eine
reduzierte Lern- und Gedächtnisleistung. Es konnte in einer Studie (LOGUE et al.
1997) gezeigt werden, dass hippocampale Läsionen bei B6-Mäusen zu einer
beeinträchtigten Absolvierung des Morris-Water-Mazes führen können. Gleichfalls
können Lern- und Gedächtnisdefizite im Morris-Water-Maze auch bei nichtepileptischen Tieren, wie z.B. bei P311-knock-out-Mäusen, eines Proteins, welches
insbesondere im Hippocampus exprimiert wird (TAYLOR et al. 2008) oder bei
Adenosin Rezeptor 1-knock-out-Mäusen (WILCOXON et al. 2007) auftreten.
Üblicherweise
gilt
die
aufgrund
des
Pilocarpin-induzierten
SE
massive
Neurodegeneration, unter anderem im Hippocampus, als verantwortlich für die
kognitiven Defizite. Es scheint überraschend, dass bei den epileptischen B6-Mäusen,
deren Gehirnschnitte weniger Neuronenverlust aufweisen als die histologischen
Schnitte der NMRI-Mäuse, eine ähnlich hohe kognitive Beeinträchtigung auftritt. Es
kann infolgedessen angenommen werden, dass weitere Gründe als nur die
Neurodegeneration im Hippocampus eine wichtige Rolle spielen könnten. Gestützt
werden unsere Beobachtungen ferner durch die Ergebnisse der Studie von
GRÖTICKE et al. (2007): Die Gehirnschnitte von NMRI-Mäusen mit einer lediglich
60-minütigen SE-Länge wiesen einen deutlich geringeren Neuronenverlust auf als
Tiere mit einer SE-Länge von 90 oder 120 Min.. Dennoch vermochten auch die
Mäuse mit 60-minütiger SE-Länge den Morris-Water-Maze-Test nicht erfolgreich zu
absolvieren. MOHAJERI et al. (2003) wiesen mittels ihrer Untersuchungen nach,
dass räumliches Lernvermögen im Morris-Water-Maze bei der F1-Generation von
Hybrid-Mäusen (B6 x FVB) mit milden Anfällen nicht beeinträchtigt ist. Mäuse mit
148
Diskussion
schwerem Krampfgeschehen hingegen konnten die Morris-Water-Maze-Aufgabe
nicht erfüllen.
Ein offensichtliches Merkmal bei der Absolvierung des Morris-Water-Mazes sowie
des Open-Fields sowohl bei den untersuchten epileptischen NMRI-Mäusen aus
Studie 1, als auch bei den epileptischen B6-Mäusen aus Studie 3, stellt das Auftreten
von Thigmotaxis dar. Thigmotaxis bedeutet, dass viele epileptische Tiere über die
gesamte Versuchsdauer lediglich entlang des Randes der Versuchsapparatur
schwimmen oder laufen und gilt als Hinweis für Angst-assoziiertes Verhalten bei
Nagern (SIMON et al. 1994; WILCOXON et al. 2007; BONSIGNORE et al. 2008).
Dieses Verhalten kann mittels anxiogener Substanzen induziert, sowie mittels
anxiolytischer Substanzen reduziert werden (SIMON et al. 1994). So scheinen bei
der stark beeinträchtigten Absolvierung des Morris-Water-Maze von epileptischen
Tieren nicht nur Lern- und Gedächtnisdefizite, sondern auch Angst-assoziiertes
Verhalten eine wichtige Rolle zu spielen.
Bei den Verhaltenstests, welche Depressions-assoziiertes Verhalten überprüfen,
ergaben sich sowohl für epileptische NMRI-, als auch für epileptische B6-Mäuse
dieselben Resultate, denn die epileptischen Tiere beider Mausstämme entwickelten
sowohl im Tail-Suspension-Test, als auch im Porsolt-Test eine signifikant verringerte
Immobilitätsdauer. Regulär werden diese beiden Tests als Screening-Tests für
antidepressiv wirkende Substanzen verwendet (PORSOLT et al. 1977), d.h. nach
vorheriger Applikation von Antidepressiva kann die Aktivitätsphase der Tiere im
Verhältnis zur Immobilitätsphase deutlich verlängert werden. Dass die epileptischen
Tiere im Vergleich zu den Kontrollen eine verlängerte Aktivitätsphase aufwiesen,
sollte keineswegs als eine Art „antidepressives Verhalten“ der epileptischen Tiere
gewertet werden. Analog zur Studie von CRYAN et al. (2005) wird in den
Verhaltenstests zur Überprüfung von Depressions-assoziiertem Verhalten bewertet,
wie die Fähigkeit eines Tieres ausgeprägt ist, mit einer ausweglosen Stresssituation
umzugehen. Während die Kontrollen nach einiger Zeit der Fluchtversuche verstehen,
dass sie nicht entkommen können, und infolgedessen eine reglose Körperhaltung
einnehmen, scheinen die epileptischen Tiere den Kontext der Situation nicht zu
begreifen, und vermindern infolgedessen ihre Fluchtbemühungen nicht (GRÖTICKE
149
Diskussion
et al. 2007, 2008). Ursachen hierfür könnten die detektierten Lerndefizite und
erhöhtes Angstverhalten der Mäuse sein.
Ein spezifisches Problem des Tail-Suspension-Tests stellte dar, dass es in Studie 3
nicht wenigen B6-Mäusen gelang, der Testsituation zu entkommen und auf die
horizontale Stange der Versuchsapparatur zu klettern. Dies betraf insbesondere die
Kontrollgruppe, in welcher 50% der B6-Mäuse aus dem Versuch ausgeschlossen
wurden, da sie wiederholt auf die Stange klettern konnten. Eine Studie (MAYORGA
u. LUCKI 2001) beschreibt dieses Verhalten der Tiere im Tail-Suspension-Test als
ein stammspezifisches Problem für B6-Mäuse. Keine der getesteten Mäuse der
Stämme DBA/2J sowie 129-SV-ter zeigte dieses Kletterverhalten. Bei Mäusen des
Stammes A/J betraf es lediglich 18% der untersuchten Tiere. Bei B6N-Mäusen
(Harlan) dagegen kletterten 35%, bei B6J-Mäusen (JAX) sogar 70% entlang ihrer
Schwänze auf die horizontale Stange der Versuchsaufbauten. Dies geht konform mit
unseren Beobachtungen bei B6-Mäusen. Von den untersuchten NMRI aus Studie 1
mussten lediglich eine von 10 Kontrolltieren (10%) sowie 3 von 11 epileptischen
Tieren (27%) aus dem Versuch aufgrund von Hochkletterns ausgeschlossen werden.
150
Diskussion
Test
Auffälligkeiten von Pilocarpin-behandelten Tieren mit SE vs. Kontrollen
Motorische
Fähigkeiten
Irwin-Test
NMRI
B6
Rotarod-Test
NMRI
B6
Normal
Hanging-Wire
NMRI
B6
Open-Field
NMRI
B6
Beeinträchtigt
Locomotion
Explorationsverhalten
Angstassoziiertes
Verhalten
Ja (freezing)
Reduziert
Reduziert
Reduziert
Normal
Ja (Schreckhaftigkeit)
Reduziert
(rearing)
Reduziert
(rearing)
Reduziert
Ja
Erhöht (EdgeDips)
Nein
Depressionsassoziiertes
Verhalten
Lernen und
Gedächtnis
Normal
Beeinträchtigt
Normal
Erhöht
Hole-Board
NMRI
B6
Reduziert
Erhöht
Normal
Elevated-PlusMaze
NMRI
B6
Light-Dark-Box
NMRI
B6
Novel-ObjectExploration
NMRI
B6
Ja
Ja (Head-Dips)
Nein
Erhöht
Reduziert
Reduziert
Nein
Ja (freezing)
Reduziert
Reduziert
Ja
Normal
Reduziert
Ja
Erhöht
Erhöht
Nein
Normal
Erhöht
Normal
Erhöht
TailSuspension
NMRI
B6
Normal
Erhöht
Normal
Normal
Morris-WaterMaze
NMRI
B6
Normal
Reduziert
? (Thigmotaxis)
Beeinträchtigt
Normal
Reduziert
? (Thigmotaxis)
Beeinträchtigt
Porsolt-Test
NMRI
B6
Nein, aber
reduzierte
Immobilität
Nein, aber
reduzierte
Immobilität
Nein, aber
reduzierte
Immobilität
Nein, aber
reduzierte
Immobilität
151
Diskussion
Tab. 6.1: Übersicht über die Verhaltensauffälligkeiten von chronisch epileptischen Mäusen nach
Pilocarpin-induziertem SE. Die Daten der NMRI-Mäuse stammen aus GRÖTICKE et al. (2007), die B6Daten aus dieser PhD-Arbeit.
6.7 Substammes- sowie Sublinienunterschiede bei B6 im Pilocarpin-Modell
(Studie 2)
Die Resultate der Studie 2 verdeutlichen, dass hinsichtlich des Konvulsivums
Pilocarpin sowohl Substammes-, als auch Sublinienunterschiede innerhalb eines
Substammes bestehen.
Analog zu einer kürzlich veröffentlichten Arbeit von MEKADA et al. (2009) werden
Substämme als Abzweigungen eines Inzuchtstammes definiert, von welchen
entweder bekannt ist oder vermutet wird, dass sie vom ursprünglichen Inzuchtstamm
genetisch differieren. Dies lässt sich auf folgende Gegebenheiten zurückführen: Als
erstes sind Substämme zu nennen, welche nach mindestens 20, jedoch höchstens
40 Generationen einer Inzucht separieren. Zweitens Substämme, welche mehr als
20 Generationen von einem gebräuchlichen Ahnenstamm separieren, sowie drittens
genetische Unterschiede zwischen Substämmen.
Voneinander
differierende
Substämme
eines
Mausstammes
wurden
bereits
bezüglich anderer Parameter beschrieben. Die Absolvierung des Morris-Water-Maze
steht in einem hohen Abhängigkeitsgrad zum genetischen Hintergrund der
Mausstämme sowie des verwendeten Substammes, denn innerhalb der 129-InzuchtMausstämme zeigten beispielsweise die Substämme 129S2/Sv, 129S6/SvEv sowie
129/Ola eine gute, dagegen der Substamm 129X1/SvJ eine schlechte Performance
(SCHIMANSKI u. NGUYEN 2004). Auditorisch-evozierte-Potenziale unterschieden
sich zwischen DBA/2J und DBA/2Hsd-Mäusen (CONNOLLY et al. 2003).
Bezüglich Vergleichen zwischen verschiedenen Substämmen von B6-Mäusen finden
sich folgende Studien in der Literatur: STIEDL et al. (1999) stellen mittels ihrer
Untersuchungen dar, dass sich B6J sowie B6N-Mäuse hinsichtlich Kontext- sowie
Ton-abhängiger Angstkonditionierung voneinander unterschieden. Die Hypothese
von SIEGMUND et al. (2005), dass als Ursache hierfür die Expression des αSynuclein verantwortlich sein könnte, bestätigte sich nicht. Jedoch konnten die
Substammesunterschiede zwischen B6J, B6N sowie einem dritten getesteten
Substamm, B6JOla, reproduziert werden (SIEGMUND et al. 2005). Auch nach
152
Diskussion
RADULOVIC
et
al.
(1998)
differierten
B6J-
und
B6N-Mäuse
bezüglich
Angstkonditionierung. In einer Studie von VAN GAALEN u. STECKLER (2000)
ergaben sich für B6J- (JAX) sowie B6CR-Mäuse (Charles River) keine Unterschiede
hinsichtlich der lokomotorischen Aktivität im Open-Field sowie im Elevated-PlusMaze. Bei der Absolvierung der Light-Dark-Box wiesen B6J im Vergleich zu B6CR
eine erhöhte Anzahl an Eintritten in das helle Kompartment auf. GROTTICK et al.
(2005) fanden signifikante Unterschiede bezüglich Präpulsinhibition zwischen B6Jund B6NHsd-Mäusen. BOTHE et al. (2004) definierten lediglich 12 Mikrosatelliten,
welche sich zwischen B6J- und B6NTac-Mäusen unterschiedlich ausprägten.
Infolgedessen nahmen sie an, dass beide Substämme verhaltensphysiologisch nicht
voneinander
differenzierten,
und
konnten
dies
mittels
der
durchgeführten
Experimente Rotarod, Open-Field sowie Angstkonditionierung nachweisen. BRYANT
et al. (2008) weisen auf die Tatsache hin, dass zwischen B6-Substämmen einfache
Sequenz-Längen-Polymorphismen, Single-Nukleotid-Polymorphismen sowie Copynumber-Variants bestehen. Sie entdeckten Unterschiede zwischen B6J-, B6NCrl-,
B6NTac- und B6NHsd-Mäusen bezüglich motorischer Koordination (Rotarod-Test),
Schmerzsensitivität sowie Angstkonditionierung (BRYANT et al. 2008). Eine Studie
(JAMOT et al. 1994) beschreibt, dass sich B6JNmg-Mäuse vom parentalen Stamm
B6J hinsichtlich ihrer Lernfähigkeit im Radial-Maze unterschieden. Ferner differierten
männliche
Mäuse
der
Sublinien
B6JNmg
und
B6JKun
hinsichtlich
ihres
Aggressionsverhaltens (SLUYTER et al. 1999).
Die B6-Maus ist der bekannteste und am meisten verwendete Inzuchtstamm,
welcher sich vom C57-Stamm ableitet, der von C. C. Little in den zwanziger Jahren
des letzten Jahrhunderts entwickelt wurde. Der Stamm B6 trennte sich nebst B10
vom C57BL-parentalen Stamm in den mittleren dreißiger Jahren des letzten
Jahrhunderts. Schließlich wurden in den siebziger Jahren 9 B6-Substämme etabliert.
Die Substämme B6J (Jackson Laboratory) sowie B6N (National Institut of Health)
gelten als Kernsubstämme von B6, welche sich von der Ahnen-B6-Linie während der
vierziger sowie fünfziger Jahre entwickelten. Charles River erhielt B6N-Mäuse vom
National Institut of Health im Jahre 1974 (MEKADA et al. 2009).
153
Diskussion
Single Nukleotid Polymorphismen (SNP’s) stellen die ergiebigste Klasse von
genetischen Markern im Genom dar. Die Verwendung von SNP’s kann helfen, um
genetisch nah verwandte Stämme sowie auch Substämme innerhalb eines
Stammes, mit potenziell genetischen Unterschieden, voneinander zu differenzieren.
MEKADA et al. (2009) demonstrierten mittels SNP genetische Unterschiede
zwischen B6J- sowie B6N-Mäusen in 11 SNP-Loci und eine Deletion von Exons im
Nnt-Gen.
Auch bei Ratten können Substammes-Unterschiede aufgezeigt werden, wie in einer
Studie der Arbeitsgruppe Löscher (FEDROWITZ et al. 2004) nachgewiesen wurde.
Zwei Substämme von Sprague-Dawley-Ratten differierten hinsichtlich der Wirkungen
einer Magnetfeldbelastung.
Bezüglich Substammesunterschieden hinsichtlich der Wirkungen von Pilocarpin
existiert lediglich eine Arbeit (BORGES et al. 2003), in welcher Unterschiede
zwischen B6J- sowie B6NCrl-Mäusen nachgewiesen werden konnten. Lediglich 12
von 99 untersuchten B6J-Mäusen des Züchters JAX entwickelten und überlebten
einen SE, dies entspricht einem prozentualem Anteil von 12%. 63 Mäuse (64%)
starben während des Versuchs, die übrigen 24 Mäuse erreichten keinen SE. Konträr
zu den Resultaten der B6J stellen sich die Ergebnisse der B6NCrl des Züchters
Charles River dar: 15 von 26 Mäusen, d.h. 58%, erlangten und überlebten einen SE.
Eine weitere Studie (CHEN et al. 2005) verdeutlicht, dass tatsächlich B6-Mäuse des
Züchters Charles River eine bessere Sensitivität hinsichtlich Pilocarpin als die
übrigen B6-Substämme aufzuweisen scheinen, da B6NCrl dieser Studie zu über
80% einen SE entwickelten. Diese Resultate sind vergleichbar mit unseren
Beobachtungen, denn in Studie 2 erreichten 80% der von uns getesteten B6NCrlMäuse (Barriere 8) einen SE, bei den Substämmen B6NHsd sowie B6JOlaHsd nur
20% bzw. keine der untersuchten Mäuse bei einer zu den zwei genannten Studien
vergleichbaren Bolusdosierung von 300 mg/kg.
GLIEN et al. (2001) beschreiben die Vorteile eines fraktionierten Applikationsregimes
von Pilocarpin bei Ratten. In dieser Arbeit entwickelten 70% der eingesetzten Ratten
nach Bolusapplikation von 30 mg/kg einen SE, die Mortalität lag bei 45%. Nach
fraktionierter Applikation von 10 mg/kg Pilocarpin alle 30 Min. stellte sich die SE-
154
Diskussion
Induktionsrate nicht signifikant unterschiedlich dar. Bezüglich der Gesamtmortalität
jedoch konnte eine Verminderung auf 10% verbucht werden.
In Studie 2 entwickelten B6NCrl-Mäuse (Barriere 8) nach Bolusapplikation von 300
mg/kg Pilocarpin zu 80% sowie nach fraktionierter Applikation von 100 mg/kg
Pilocarpin zu einem leicht erhöhten Wert von 90 % einen SE. Wir blieben bei diesem
fraktionierten Applikationsregime, da es eine individuellere Pilocarpindosierung pro
Tier ermöglicht.
Erstaunlicherweise differierten in Studie 2 nicht nur die verschiedenen B6Substämme bezüglich Pilocarpin, sondern ferner zwei Barrieren desselben
Substammes
des
gleichen
Züchters
(Charles
River).
Hinweise
zu
Sublinienunterschieden desselben Substammes existieren in der Literatur nicht.
Drei
verschiedene
Hypothesen
lassen
sich
zu
den
detektierten
Sublinienunterschieden in Studie 2 aufstellen: Die detektierten Unterschiede
zwischen den Substämmen könnten umweltbedingt sein. Dies bedeutet, dass die
unterschiedliche Lage der Barrieren 8 und 9 in den Örtlichkeiten des Züchters
Charles River, oder die Versorgung von unterschiedlichen Tierpflegern zu einem
erhöhten Stresspegel bei den Mäusen in einer der Barrieren führte. Da wir den
Mäusen mindestens 7 Tage Habituation gewährten, bevor wir mit den Versuchen
begannen, sowie die Tierhaltung hier im Institut im gleichen Haltungsraum erfolgt,
müsste dieser Stresspegel schon sehr ausgeprägt sein, um etwaige Wirkungen auf
die Pilocarpinsensitivität zu zeigen. Ferner existiert eine Studie (RAE et al. 1990), in
welcher verglichen wurde, ob das Verbringen von Swiss-Mäusen in eine
Stresssituation unmittelbar vor Pilocarpin-Applikation einen Einfluss auf die
konvulsiven Wirkungen hat. Hinsichtlich der Inzidenz, des Schweregrades, der
Mortalität sowie der Dauer der Pilocarpin-induzierten Krämpfe konnten RAE et al.
(1990) bei gestressten zu nicht-gestressten Mäusen keinen Unterschied aufzeigen.
Dass umweltbedingte Aspekte jedoch nicht zu vernachlässigen sind, zeigt eine
Studie von CRABBE et al. (1999), in welcher 6 Vehaltenstests in drei
unterschiedlichen Laboratorien durchgeführt werden. Es wurde versucht, das
Prozedere zu standardisieren, d.h. es wurde exakt derselbe Mausstamm, die
gleichen Versuchsapparaturen sowie dieselben Versuchsprotokolle verwendet.
155
Diskussion
Ferner wurden die Haltung der Tiere sowie der Zeitpunkt des Versuchsablaufs
standardisiert.
Dennoch
ergeben
sich
lediglich
aus
den
umweltbedingten
Unterschieden zwischen den Laboratorien Differenzen bezüglich der Ergebnisse der
Verhaltensversuche (CRABBE et al. 1999).
Als zweite Hypothese könnte für die von uns detektierten Barrierenunterschiede eine
spontane Mutation verantwortlich sein, welche in einer der Barrieren auftrat, und an
ihre Nachkommen weitervererbt wurde. Als dritte Hypothese wäre eine Kombination
aus umweltbedingten sowie genetischen Faktoren denkbar.
Eine Studie (YANG et al. 2003) stellt dar, dass spontan auftretende Mutationen mit
multiplen, leicht zu beobachtenden Merkmalen zu einem großen Teil zum
molekularen Verständnis von neurologischen Krankheiten beigetragen haben. Diese
Mutationen konnten entdeckt werden, da sie mindestens einen offensichtlichen
Phänotyp hervorbrachten. Weniger offensichtliche, jedoch nicht weniger wichtige,
spontane Mutationen können in Inzuchtmausstämmen entstehen und Mausstämme,
welche
für
Mutagenese-Screens
verwendet
werden
„kontaminieren“.
Viele
Inzuchtstämme, wie die B6-Maus, werden nicht von „clonalen“ Beständen
aufrechterhalten, sondern stammen von verschiedenen unabhängigen reinrassigen
Linien, welche von einigen Generationen separiert wurden. Forschergruppen werden
aus diesen Sublinien beliefert. So kann es geschehen, dass ein Inzuchtstamm,
welcher zu einer Grundlagenstudie beigetragen hat, nur Monate später nicht mehr
exakt dieselbe genetische Zusammensetzung aufweist, da er aus einer anderen
Sublinie stammt. Die Spontanmutationsrate wird als selten mit einem Wert von 2x10-6
Mutationen/Lokus/Generation eingeschätzt (YANG et al. 2003).
Um zu eruieren, wie sich weitere B6-Barrieren des Züchters Charles River bezüglich
ihrer Sensivität auf Pilocarpin verhalten, testeten wir diese ebenfalls. Wir ermittelten
keine signifikanten Unterschiede zwischen den Barrieren 4, 7 und 11 sowie zur
Barriere 9. Infolgedessen müsste eine etwaige Spontanmutation in Barriere 8
stattgefunden haben. Um die Hypothese einer vererbbaren Mutation in Barriere 8 zu
verifizieren, generierten wir eine F1-Generation aus weiblichen Pilocarpin-sensitiven
Mäusen der Barriere 8 mit männlichen Pilocarpin-resistenten Mäusen der Barriere 9.
Bei der F1-Generation entwickelten lediglich die männlichen F1-Hybriden im
156
Diskussion
Vergleich zur resistenten Barriere 9-Parentalsublinie eine signifikant höhere SEInduktionsrate. Weibliche F1-Hybrid-Mäuse unterschieden sich nicht von weiblichen
Pilocarpin-resistenten Tieren aus Barriere 9. Verglichen zu den weiblichen
Pilocarpin-sensitiven Tieren aus Barriere 8 ergab sich jedoch eine signifikant
geringere SE-Induktionsrate. Dies lässt vermuten, dass eine in Barriere 8
aufgetretene Spontanmutation auf dem X-Chromosom aufgetreten ist sowie rezessiv
vererbt wird. Um diese Hypothese weiterzuverfolgen, generierten wir eine F2Generation aus den Pilocarpin-sensitiven Weibchen aus Barriere 8 mit den
männlichen Tieren der F1-Generation. Infolge der geringen Anzahl an F2-Tieren
wurden diese 4 Tiere nicht bezüglich ihrer Pilocarpin-Sensititvität getestet, sondern
lediglich zum Weiterzüchten verwendet. Bei der entstehenden F3-Generation zeigte
sich nach Überprüfung ihrer Pilocarpin-Sensitivität abermals ein signifikanter
Unterschied zwischen männlichen F3-Nachkommen zu den männlichen resistenten
Tieren aus Barriere 9 sowie kein signifikanter Unterschied zwischen weiblichen F3Nachkommen zu den weiblichen resistenten Tieren aus Barriere 9. Zu beachten ist
allerdings, dass die männlichen resistenten Tiere aus Barriere 9 einen besonders
niedrigen Prozentsatz an Tieren mit SE (15%) im Vergleich zu den weiblichen Tieren
(45%) aufwiesen. Ferner ist ein Vergleich der weiblichen F3-Generation zu den
weiblichen Pilocarpin-sensitiven Tieren aus Barriere 8 nun nicht mehr signifikant
unterschiedlich. Zudem konnte die SE-Induktionsrate der F1-Generation (weiblich:
50%, männlich: 53%) auf 72% bei den weiblichen Tieren sowie 86% bei den
männlichen Tieren der F3-Generation gesteigert werden. Dies sind Werte, welche in
im Rahmen der Pilocarpin-sensitiven Tiere aus Barriere 8 liegen.
Mit den Pilocarpin-sensitiven B6-Nachkommen wird in der Arbeitsgruppe Löscher
eine Zucht aufgebaut. Es besteht ein weltweit großes Interesse an Pilocarpinsensitiven
B6-Mäusen,
Inzuchtstamm
sowie
da
das
die
B6-Maus
den
Pilocarpin-Modell
am
eines
häufigsten
der
verwendeten
gebräuchlichsten
Epilepsiemodelle darstellt. Für die Zukunft könnten diese Pilocarpin-sensitiven
Mäuse also anderen Arbeitsgruppen zur Verfügung gestellt werden, um die SEInduktionsrate nach Pilocarpinapplikation zu steigern sowie die Mortalitätsrate bei
157
Diskussion
den Tieren zu senken und der weitergehenden Epilepsieforschung an B6-Mäusen zu
dienen.
158
Zusammenfassung
7. Zusammenfassung
Christine Julia Müller
Untersuchungen zu Verhaltensänderungen und Lern- und Gedächtnisdefiziten
im Pilocarpinmodell für chronische Epilepsie bei der NMRI- und C57BL/6-Maus
Epilepsien zählen zu den häufigsten neurologischen Erkrankungen und zeichnen
sich durch das spontane und wiederholte Auftreten von Krampfanfällen zentralen
Ursprungs aus. Die Temporallappenepilepsie zählt zu den komplex fokalen
Epilepsien und stellt die häufigste Epilepsieform beim Menschen dar. Auch bei
Haustieren, insbesondere Hund und Katze, gelten Epilepsien als häufig, wobei sie
hinsichtlich ihrer Symptomatik vergleichbar zu denen des Menschen sind.
Doch nicht nur die klinischen Auswirkungen der Epilepsie, sprich das Auftreten der
Krämpfe, beeinträchtigen stark die Lebensqualität der Epilepsiepatienten. Bei bis zu
60% der Epilepsiekranken existieren ferner psychisch-kognitive Begleiterkrankungen.
Zu nennen sind insbesondere Depressionen, Angsterkrankungen, Psychosen sowie
Lern- und Gedächtnisdefizite. Obwohl die Prävalenz der psychischen Komorbiditäten
bei Epilepsien so hoch ist, bestehen lediglich Hypothesen bezüglich ihrer Entstehung
wie auch ihrer Zusammenhänge. Auch die Therapiemöglichkeiten sind nicht
hinreichend erforscht. Infolgedessen ist es notwendig, ein Tiermodell zu generieren,
welches nicht nur die Untersuchung von Mechanismen ermöglicht, welche der
Epilepsie zugrunde liegen, sondern auch von Grundlagen der Epilepsie-assoziierten
Komorbiditäten.
Den ersten Schritt bildet die Generierung von epileptischen Mäusen. Hierzu wurde in
dieser PhD-Arbeit das Pilocarpin-Modell verwendet, welches weltweit eines der
gebräuchlichsten chronischen Epilepsiemodelle darstellt, da es ohne hohen
technischen oder zeitlichen Aufwand durchzuführen ist. Als nächsten Schritt sollen
die Mäuse eine Batterie an Verhaltenstests absolvieren, welche für psychische und
kognitive Veränderungen existieren.
159
Zusammenfassung
Dass epileptische NMRI-Mäuse Verhaltensauffälligkeiten präsentieren, welche sich
in einer Verhaltensbatterie detektieren lassen, zeigt eine vorherige PhD-Arbeit von
Frau Gröticke in der Arbeitsgruppe Löscher. Sie etablierte das Pilocarpin-Modell für
die NMRI-Maus mit einer hohen Status-epilepticus-Induktions- und niedrigen
Mortalitätsrate für ein fraktioniertes Applikationsregime. Die chronisch epileptischen
NMRI-Mäuse verhielten sich in der Verhaltensbatterie häufig immobil, präsentierten
Angst-assoziiertes Verhalten, wiesen räumliche Lern- und Gedächtnisdefizite auf und
zeigten eine verlängerte Aktivitätsphase in den Verhaltenstests, welche Depressionsassoziiertes Verhalten überprüfen. Histologisch detektierte Frau Gröticke eine
ausgeprägte Neurodegeneration bei den epileptischen NMRI-Mäusen.
Neu in meiner PhD-Arbeit ist in Studie 1, dass NMRI-Mäuse, welche mit
Lithiumchlorid vorbehandelt wurden, mit nicht-vorbehandelten Tieren im PilocarpinModell verhaltensphysiologisch sowie histologisch verglichen wurden. Es konnten
keine Unterschiede zwischen dem LiCl-Pilocarpin- sowie dem Pilocarpin-Modell
nachgewiesen werden. Ebenfalls neu im Vergleich zur PhD-Arbeit von Frau Gröticke
ist die Untersuchung von Pilocarpin-behandelten NMRI-Mäusen ohne SE. Diese
Tiere
differierten
im
Wesentlichen
Verhaltenscharakterisierungen,
als
auch
sowohl
hinsichtlich
bezüglich
der
der
histologischen
Untersuchung nicht von den Kontrolltieren.
In Studie 2 wurde das Pilocarpin-Modell für die C57BL/6 (B6)-Maus etabliert. Die B6Maus
stellt
einen
beliebten
Inzuchtstamm
dar,
welcher
üblicherweise
als
Hintergrundstamm für transgene Tiere verwendet wird und infolgedessen auch in der
Epilepsieforschung häufig eingesetzt wird. Die Etablierung des Pilocarpin-Modells für
die B6-Maus ist keineswegs trivial: Aus der Literatur ist bekannt, dass die SEInduktionsrate häufig eher gering, und die Mortalitätsrate hoch ist. Auch von
Substammesunterschieden
wird
berichtet.
In
dieser
PhD-Arbeit
wurde
ein
fraktioniertes Applikationsprotokoll für die B6-Maus etabliert, welches bereits von
Frau Gröticke für die NMRI-Maus entwickelt wurde, da es den Vorteil einer
individuelleren Dosierung im Vergleich zur Bolusapplikation bietet. Bei der
Etablierung des Pilocarpin-Modells konnten Substammesunterschiede zwischen
B6NCrl, B6NHsd sowie B6JOla entdeckt werden. Auch innerhalb des Substammes
160
Zusammenfassung
mit
der
höchsten
SE-Induktionsrate
(B6NCrl) konnten überraschenderweise
signifikante Sublinienunterschiede zwischen den Barrieren 8 und 9 des Züchters
Charles River aufgedeckt werden. Wir vermuteten eine Spontanmutation innerhalb
der Pilocarpin-sensitiven Barriere 8, da weitere Barrieren des Züchters sich
hinsichtlich ihrer Pilocarpinsensitivität nicht signifikant unterschiedlich zu den
resistenten Mäusen aus Barriere 9 verhielten. Es wurde eine Hybrid-F1-Generation
aus Pilocarpin-sensitiven-Weibchen aus Barriere 8 mit Pilocarpin-resistentenMännchen aus Barriere 9 gezüchtet. Lediglich die männlichen Nachkommen der F1Generation wiesen eine signifikant höhere Pilocarpin-Sensitivität auf, als die
männliche
Barriere
9-Parentalgeneration.
Die
Hypothese,
dass
eine
Spontanmutation auf dem X-Chromosom der Tiere in Barriere 8 stattgefunden hat,
und einen rezessiven Erbgang aufweist, wurde verifiziert, indem eine Zucht aus
Pilocarpin-sensitiven
B6-Mäusen
aufgebaut
wurde.
Für
die
gezüchteten
Nachkommen der F3-Generation ergab sich eine SE-Induktionsrate, welche nicht zur
SE-Induktionsrate der Pilocarpin-sensitiven Tiere aus Barriere 8 differierte.
In Studie 3 konnten bei der Verhaltenscharakterisierung von chronisch epileptischen
B6-Mäusen viele Ähnlichkeiten zu epileptischen NMRI-Mäusen aufgezeigt werden.
Epileptische B6-Mäuse präsentierten ebenfalls Angst-assoziiertes Verhalten, Lernund
Gedächtnisdefizite
sowie
eine
verringerte
Immobilitätsdauer
in
den
Verhaltenstests, welche Depressions-assoziiertes Verhalten untersuchen. Auffällig
war jedoch eine Hyperaktivität epileptischer B6-Mäuse in mehreren Tests, welche bei
epileptischen NMRI-Mäusen nicht auftrat. Ferner zeigten epileptische B6-Mäuse
konträr zu epileptischen NMRI-Mäusen eine hohe Affinität zu neu präsentierten
Objekten. Pilocarpin-behandelte B6-Mäuse ohne SE wiesen lediglich wenige
Verhaltensauffälligkeiten auf.
Die histologischen Schnitte der Pilocarpin-behandelten B6-Mäuse ohne SE
differierten nicht von den Kontrollen. Für epileptische B6-Mäuse ergab sich eine im
Hilus des Gyrus dentatus ausgeprägte Neurodegeneration. Im Ganzen betrachtet
stellte sich der Neuronenverlust bei epileptischen B6- im Vergleich zu epileptischen
NMRI-Mäusen als wesentlich geringer dar.
161
Zusammenfassung
Es lässt sich schlussfolgern, dass das Pilocarpin-Modell bei der B6-Maus als Modell
für psychische und kognitive Verhaltensänderungen, wie sie beim humanen
Epilepsiepatienten existieren, verwendet werden kann. Langfristig könnte es zu
einem neuen Verständnis der Grundlagen dieser Begleiterkrankungen sowie zu
neuen Therapieansätzen beitragen.
162
Summary
8. Summary
Christine Julia Müller
Investigations of behavioral alterations and learning and memory deficits in the
pilocarpine model of chronic epilepsy in NMRI- and C57BL/6-mice
Epilepsy constitutes one of the most common neurological disorders. It is
characterized by the occurrence of spontaneous and recurrent seizures. Temporal
lobe epilepsy with complex focal seizures is the most frequent type of epilepsy in
humans. Also pets have a high prevalence of epilepsies, especially dogs and cats.
The symptoms in pets are similar to humans.
Up to 60% of epilepsy patients suffer from psychiatric and cognitive comorbidities,
the most common ones are depression, anxiety, psychosis, and learning and
memory deficits. Despite the high prevalence of psychiatric and cognitive
comorbidities, there are as yet only hypotheses about their origins, correlations, and
possibilities of therapies. So it is necessary to generate an animal model which offers
not only the opportunity to investigate epilepsy, but also epilepsy-associated
comorbidities.
In the PhD-thesis we first produced epileptic mice by using the pilocarpine-model,
which is one of the most common models of chronic epilepsy in rodents. Next we
investigated psychiatric and cognitive properties of epileptic mice in behavioral tests.
In Löscher’s working group, Ina Gröticke recently demonstrated in her PhD-thesis
that epileptic NMRI-mice exhibited behavioral alterations which can be detected in a
behavioral test battery. Ina Gröticke established the pilocarpine-model in NMRI-mice.
A repeated low-dose treatment of pilocarpine increased the incidence of status
epilepticus and decreased mortality of animals. In the battery of behavioral tests,
chronic epileptic NMRI-mice were often immobile, exhibited anxiety-like behavior,
learning and memory deficits, and a reduced duration of immobility in tests to
investigate depression-like behavior. Ina Gröticke detected degeneration of neurons
in brain slices of epileptic mice in hippocampus, amygdala, and piriform cortex.
163
Summary
In study 1 we investigated NMRI-mice in behavioral tests and histological analysis,
which received a pre-treatment of lithium-chloride before application of pilocarpine.
There were no differences between the lithium-pilocarpine and the pilocarpine-model.
We also characterized mice in behavioral tests and histologigal investigation, which
received pilocarpine but reached no SE. These animals did not differ from controls in
nearly all parameters.
In study 2 we established the pilocarpine model in C57BL/6- (B6) mice. B6-mice form
a popular inbred strain which is commonly used as a background strain for
transgenic mice. So B6-mice are also often used in epilepsy research. Establishing of
the pilocarpine model in B6-mice is not trivial. From the literature it is known that the
rate of SE-induction is often low, but mortality is high. Furthermore there are
differences reported between substrains of B6-mice. In this PhD-thesis we
established a repeated low-dose treatment of pilocarpine in B6-mice, which was
developed by Ina Gröticke in NMRI-mice. The advantage is more individual dosing of
pilocarpine than with bolus application. During establishing of the pilocarpine model
in B6-mice, we detected substrain differences between B6NCrl, B6NHsd, and
B6JOla. In addition we surprisingly found within the substrain B6NCrl, which was the
only pilocarpine-sensitive strain, differences between barrier 8 and 9 of the same
vendor Charles River. We supposed a spontaneous mutation risen inside of the
pilocarpine-sensitive animals of barrier 8 because all the other tested barriers of the
supplier did not differ from pilocarpine-resistant mice of barrier 9. We generated a
hybrid F1-generation obtained from making of pilocarpine-sensitive female mice of
barrier 8 and pilocarpine-resistant male mice of barrier 9. Only male F1-mice
exhibited a significant higher pilocarpine-sensitivity than male parental generation of
barrier 9. These results strongly indicate that a spontaneous mutation with recessive
inheritance could have risen on the X chromosome. We verified this hypothesis with
breeding of pilocarpine-sensitive B6-mice. The offsprings of B6-mice exhibited a rate
of SE-induction, which did not differ from pilocarpine-sensitive animals of barrier 8 of
the vendor Charles River.
In study 3 on behavioral characterization of chronic epileptic B6-mice, of pilocarpinetreated B6 mice without SE, and controls, we detected many similarities to NMRI-
164
Summary
mice. Epileptic B6-mice exhibited anxiety-like behavior, learning and memory deficits
and a decreased duration of immobility in depression-associated tests. We further
noticed a hyperactivity of B6-mice in several tests, which was not presented in NMRImice. In addition, epileptic B6-mice exhibited a high interest to a novel object, which
is a striking difference to epileptic NMRI-mice. Pilocarpin-treated mice without SE
presented only few behavioral alterations compared to controls.
Investigation of brain sections of pilocarpine-treated B6-mice without SE resulted in
no
differences
to
control
animals.
Epileptic
B6-mice
were
affected
by
neurodegeneration, especially in the hilus of the dentate gyrus. Overall neuronal loss
in B6-mice was less severe than in NMRI-mice.
In conclusion, the pilocarpine model in B6-mice is an appropriate model for
investigation of psychiatric and cognitive disturbances, which also occur in human
epilepsy patients. In the long term it could contribute to further understanding of basic
principles and opportunities for therapies in epilepsy-associated comorbidities.
165
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182
Anhang
10. Anhang
10.1 Untersuchungsgang des Irwin-Tests
Allgemeinuntersuchung (3 Min.):
Hochheben des Tieres am Schwanz
0- kein Fluchtversuch
2- moderater Fluchtversuch
4- starker Fluchtversuch
5- Springen/ Aggressivität
Platzierungsverhalten beim Absetzen der Maus
0- keine Reaktion
2- Ausstrecken der Vorderpfoten
Körperhaltung
0- flach in Bauchlage liegend
1- Seitenlage
2- normale Körperhaltung
3- sitzende Körperhaltung
4- starre oder verkrampfte Haltung
Schwanztonus
0- ohne Tonus, nachschleifend
2- normale Schwanzhaltung
3- 45° Schwanzhaltung
4- 90° Schwanzhaltung
5- über den Körper aufgestellter Schwanz (Straub-Phänomen)
183
Anhang
Atmung
1- verminderte Atemfrequenz
2- normale Atmung
3- erhöhte Atemfrequenz
Piloerection
2- nicht vorhanden
3- leicht vorhanden
4- stark ausgeprägt
Hautdurchblutung
0- bläulich verfärbte Haut
1- weiße Haut mit kaum sichtbaren Gefäßen
2- leicht rosa gefärbte Haut
3- dunkelrosa verfärbte Haut
4- rot verfärbte Haut
Fell
2- sauber
4- schmutzig
Exophtalmus
2- nicht vorhanden
4- vorhanden
Ptosis
2- Augenlider normal geöffnet
3- Augenlider halb geöffnet
4- Augenlider zu einem Viertel geöffnet
5- Augenlider geschlossen
184
Anhang
Tränenfluss
2- nicht vorhanden
5- vorhanden
Speichelfluss
2- nicht vorhanden
5- vorhanden
Schnelligkeit des Bewegungsablaufs
0- unbeweglich
1- langsam
2- aktiv
3- schnell
Fortbewegung im Untersuchungskäfig
1- hypoaktiv
2- aktiv
3- hyperaktiv
Schreckhaftigkeit (Klicker)
0- ohne Schreckreaktion
1- abgeschwächte, verzögerte Schreckreaktion
2- normale Schreckreaktion, kurzes Erstarren
3- starke Schreckreaktion, Flucht, Springen, langes Erstarren
Hörvermögen
0- nicht vorhanden
2- vorhanden
185
Anhang
Abnormales Verhalten:
Urin- und Kotabsatz
Handling
Gleichgewicht (Käfig wird leicht bewegt)
0- vermindert
2- normal
Neugierverhalten (Vorzeigen eines Gegenstandes)
0- keine Reaktion
1- vermindertes Neugierverhalten
2- normales Neugierverhalten, Kontaktaufnahme mit Barthaaren
3- Kontaktaufnahme mit der Nase
4- Aggressivität
Berührungsreaktion (mit einem Gegenstand am Rücken)
0- ohne Reaktion
1- langsame Ausweichbewegung
2- moderate Ausweichbewegung
3- stark ausfallende Ausweichbewegung
5- Flüchten über größere Distanz, Aggressivität auf leichte Berührung
Korneal-Reflex (Reizung des Auges mit einer Borste)
0- keine Reaktion
2- normaler Lidschluss
3- häufiger Lidschluss
4- Reaktion des gesamten Körpers
186
Anhang
Barthaar-Reflex (Reizung der Barthaare)
0- keine Reaktion
2- normale Reaktion
3- Bewegung des Kopfes
4- Bewegung des Körpers
Rektaltemperatur
Explorationsverhalten an einer Kante (einer etwas erhöht liegenden Plattform)
0- keine Reaktion
1- keine Exploration der Kante
2- Exploration der Plattform
3- Exploration und Herunterklettern
4- Abspringen, ohne Exploration
Haffner-Reflex (Schmerzreflex an der Schwanzwurzel)
0- 30 s lang ohne Schmerzreaktion
1- Schmerzreaktion tritt langsamer als 5 s ein
2- Schmerzreaktion tritt schneller als 5 s ein
Pupillen-Reflex
0- nicht vorhanden
1- vorhanden
Bauchdeckenspannung und Muskeltonus der Extremitäten
0- nicht vorhanden
1- verringert
2- moderat
3- erhöht
4- stark erhöht
187
Anhang
Aufrichtereflex (aus Rücken- oder Seitenlage heraus)
0- keine Lagekorrektur
1- Lagekorrektur verzögert
2- sofortige Lagekorrektur
Rektaltemperatur
188
Anhang
10.2 Protokoll der Thionin-Färbung
a) Thioninlösung:
•
100 ml 1 M Essigsäure + 36 ml 1 M Natronlauge
•
auf 1 l mit Aqua destillata auffüllen
•
auf 60-70°C erhitzen
•
darin 1,25 g Thionin lösen
•
1 Stunde auf einem Magnetrührer rühren
•
anschließend heiß filtrieren
•
die Lösung ist bei 60°C ca. 1 Monat haltbar
b) Fixierung mit Paraformaldehyd
Die Kryostat-Schnitte werden 10 Min. in 4 % Paraformaldehydlösung fixiert.
c) Thioninfärbung:
Auf Objektträger aufgezogene Gehirnschnitte werden wie folgt behandelt:
•
3 Min. in 100% Ethanol
•
3 Min. in 95% Ethanol
•
3 Min. in 70% Ethanol
•
3 Min. in 50% Ethanol
•
3 Min. in Aqua destillata
•
90 s in Thioninlösung
•
3 Min. in 50% Ethanol
•
3 Min. in 70% Ethanol
•
3 Min. in 95% Ethanol
•
3 Min. in 100% Ethanol
•
3 Min. in Terpineol/Xylol-Ersatzmedium (Mischverhältnis 1:1)
•
3 Min. in Xylol-Ersatzmedium
•
3 Min. in frisches Xylol-Ersatzmedium
→ sofortiges Eindecken der Schnitte mit Entellan und Trocknen
189
Anhang
10. 3 Protokoll der FJC-Färbung
a) Fluoro-Jade C-Stocklösung:
5 mg Fluoro-Jade C Pulver + 50 ml Aqua destillata
b) Fixierung mit Paraformaldehyd
Die Kryostat-Schnitte werden 10 Min. in 4 % Paraformaldehydlösung fixiert.
c) Fluoro-Jade C-Färbung:
Auf Objektträger aufgezogene Gehirnschnitte werden wie folgt behandelt:
•
5 Min. in 80% Ethanol
•
2 Min. in 70% Ethanol
•
2 Min. in Aqua destillata
•
10 Min. in 0,06% Kalium-Permanganatlösung
•
1-2 Min. spülen mit Aqua demineralisata
Unter Lichtausschluss:
•
30 Min. 0,0001% Fluoro-Jade C-Lösung (1 ml Fluoro-Jade C-Stocklösung +
99 ml 0,1% Essigsäure)
•
3 x 1 Min. Aqua destillata
•
mehrere Stunden trocknen lassen
•
1 Min. Xylene-Lösung
→ Gehirnschnitte mit DPX mounting medium eindecken und trocknen lassen
190
Anhang
10.4 Protokoll der GFAP-Färbung
Überblick
Nachweis von GFAP mittels prim. AK polyclonal rabbit anti Cow-GFAP (DAKO), sek.
AK biotinillierter pig anti rabbit, Färbung: Vectastain-Kit, DAB
Vorgang
1.Tag Fixierung, Demaskierung, prim. AK
• Fixierung: direkt 10 Min. in frischem 4% Paraformaldehyd (+4°C) fixieren
• 3x 5 Min. waschen in TBS
• Hemmung der endogenen Peroxidase: 30 Min. in 0,5% H2O2 (13 µl H2O2 (35%)/1
ml TBS)
• 3x 5 Min. waschen in TBS (Spülen bis keine Blasen mehr vorhanden!!)
• Einspannen in die cover plates und einmal mit TBS (bei RT!!) waschen (2,5 ml)
• Blocking: 60 Min. in block solution (150 µl)
• prim AK: über Nacht mit prim. AK (1:1000) in carrier solution (150 µl) bei 4°C im
Kühlschrank
2. Tag sek. AK; DAB
• 3x waschen in TBS
• sek. AK: 90 Min. in sek. AK (1:500) in carrier solution
• 3x waschen in TBS
• Verstärkung: 90 Min. in Vectastain-Lösung (150 µl), Lösung 30 min vor Gebrauch
ansetzen!
• 3x waschen in TBS, dann 1x waschen in einer Glasküvette mit TBS
• Färbung: 15 Min. in DAB-Lösung
• 3x waschen in TBS
• 1x waschen in Aqua dest., an der Luft trocknen lassen
Am nächsten Tag eindecken.
191
Anhang
Lösungen:
4% Paraformaldehydlösung
100 ml 8% Paraformaldehyd
100 ml 0,2 mol/l Phosphat-gepufferte NaCl-Lösung (PBS)
TBS
TRIS-buffered saline
0,9 % NaCl-Lösung (pH 7,6)
Carrier solution
100 ml TBS
1 ml pig serum
1 g Rinderserumalbumin (BSA)
Blocking solution
4,5 ml carrier solution
0,5 ml pig serum
100 mg BSA
Vectastain-Lösung
5 ml TBS
jeweils 20 µl Lösung A und Lösung B
DAB-Lösung
1125 µl Ansatz (entspricht 123,75 mg 3,3´-DAB)
150 ml TRIS/Ni-Lösung
37,5 µl H2O2
TRIS/Ni-Lösung
0,3 g Nickelammoniumsulfat
50 ml TBS
192
Anhang
Erklärung
Hiermit erkläre ich, dass ich die Dissertation („Untersuchungen zu
Verhaltensänderungen und Lern- und Gedächtnisdefiziten im Pilocarpinmodell für
chronische Epilepsie bei der NMRI- und C57BL/6-Maus“) selbständig verfasst habe.
Bei der Anfertigung wurden folgende Hilfen Dritter in Anspruch genommen:
Frau Doris Pieper-Matriciani (Technische Angestellte) führte mit mir zusammen die
Thionin-Färbungen aus Studie 1 durch.
Herr Tobias Kalair (ehemaliger Auszubildender zum Biologielaboranten) beobachtete
die C57BL/6-Mäuse aus Studie 3 während der Verhaltensversuche auf das
Vorkommen von spontanen Anfällen.
Frau Ina Gröticke (ehemalige PhD-Studentin) fertigte die Kabel für die EEGÜberwachung an.
Ich habe keine entgeltliche Hilfe von Vermittlungs- bzw. Beratungsdiensten
(Promotionsberater oder anderer Personen) in Anspruch genommen. Niemand hat
von mir unmittelbar oder mittelbar entgeltliche Leistungen für Arbeiten erhalten, die
im Zusammenhang mit dem Inhalt der vorgelegten Dissertation stehen.
Ich habe die Dissertation an folgenden Institutionen angefertigt:
Institut für Pharmakologie, Toxikologie und Pharmazie
der Stiftung Tierärztliche Hochschule Hannover
Die Dissertation wurde bisher nicht für eine Prüfung oder Promotion oder für einen
ähnlichen Zweck zur Beurteilung eingereicht.
Ich versichere, dass ich die vorstehenden Angaben nach bestem Wissen vollständig
und der Wahrheit entsprechend gemacht habe.
_______________________________
eigenhändige Unterschrift
193
Anhang
Publikationen
Originalarbeiten
MÜLLER, C. J., GRÖTICKE, I., HOFFMANN, K., SCHUGHART, K., LÖSCHER, W.
(2009):
Differences in sensitivity to the convulsant pilocarpine in substrains and sublines of
C57BL/6 mice. Genes, Brain and Behavior 8, 481-492
MÜLLER, C. J., GRÖTICKE, I., BANKSTAHL, M., LÖSCHER, W. (2009):
Behavioral and cognitive alterations, spontaneous seizures, and neuropathology
developing after a pilocarpine-induced status epilepticus in C57BL/6 mice.
Experimental Neurology 219, 284–297
MÜLLER, C. J., BANKSTAHL, M., GRÖTICKE, I., LÖSCHER, W. (2009):
Pilocarpine vs. lithium-pilocarpine for induction of status epilepticus in mice:
Development of spontaneous seizures, behavioral alterations and neuronal damage.
European Journal of Pharmacology 619 15–24
Zitierfähige Kongressbeiträge
MÜLLER, C. J., GRÖTICKE, I., HOFFMANN, K., SCHUGHART, K., LÖSCHER,
W.(2009):
Differences in sensitivity to the convulsant pilocarpine in substrains and sublines of
C57BL/6 mice, Naunyn-Schmiedeberg’s Archives of Pharmacology, 379:46-46, 213,
Suppl. 1
MÜLLER, C. J., GRÖTICKE, I., LÖSCHER, W. (2008):
Behavioral alterations in the pilocarpine model of temporal lobe epilepsy in C57BL/6
mice
2008. Abstract Viewer. Washington, DC: Society for Neuroscience Program
No.645.20/W11
194
Anhang
Sonstige Beiträge
MÜLLER, C. J., GRÖTICKE, I., LÖSCHER, W. (2008):
Verhaltensänderungen und Lern- und Gedächtnisdefizite im Pilocarpin-Modell für
Temporallappenepilepsie bei der C57BL/6-Maus
18. Symposium VetPharm, Gießen
MÜLLER, C. J., GRÖTICKE, I., LÖSCHER, W. (2008):
Epilepsie-assoziierte Verhaltensänderungen und Lern- und Gedächtnisdefizite im
Pilocarpin-Modell bei verschiedenen Mausstämmen
Epileptologisches Werkstattgespräch, Bielefeld-Bethel
195
Anhang
Danksagung
Mein größter Dank gilt Herrn Prof. Löscher für die Überlassung des Themas, die
Unterstützung bei der Bewerbung um finanzielle Förderung der PhD-These, der
guten wissenschaftlichen Betreuung und Anleitung zur experimentellen Forschung
sowie Hilfe bei der Abfassung der These.
Ich danke Herrn Prof. Dietrich und Herrn Prof. Hildebrandt für die gute Betreuung
während meines PhD-Studiums. Herrn Prof. Hildebrandt danke ich ebenfalls für die
Unterstützung bei der Bewerbung um finanzielle Förderung.
Frau Dr. Marion Bankstahl danke ich für die jederzeit gewährte Hilfestellung, für die
gute Betreuung meiner Dissertation und für die schnelle Korrektur der These.
Mein Dank gilt Frau Ina Gröticke, PhD, für die gute Betreuung meines Projekts
während ihrer Zeit als wissenschaftliche Mitarbeiterin am Institut sowie für ihre
Unterstützung auch über diese Zeit hinaus.
Frau Katrin Hoffmann, PhD, danke ich für die gute Betreuung zu Beginn meiner
Dissertation.
Allen weiteren wissenschaftlichen Mitarbeitern des Instituts möchte ich für ihre
Hilfsbereitschaft danken.
Ich danke allen Doktoranden und Diplomanden des Instituts für die nette
Arbeitsatmosphäre. Insbesondere danke ich meiner Freundin und Büro-Nachbarin
Frau Nadine Polascheck für ihre stetige Hilfe, aber auch für viele Gespräche,
gemeinsames Lachen und positives Denken. Besonderer Dank gilt auch Frau
Stefanie Honndorf sowie Frau Saskia Kücker für ihre Freundschaft.
Mein Dank gilt ferner allen weiteren Mitarbeitern des Institutes für ihre
Hilfsbereitschaft und Unterstützung. Insbesondere danke ich Frau Julia Förster für
ihre stetige Hilfe bei sämtlichen Fragen zur Maus-Video- und EEG-Überwachung
sowie
Frau
Doris
Pieper-Matriciani
und
Herrn
Michael
Weißing
Hilfestellungen bei Fragen zu histologischen Untersuchungsmethoden.
196
für
ihre
Anhang
Ich danke Frau Gorgina Zivkovic für die gute Betreuung der Tierhaltung sowie der
kompetenten Zucht der Mäuse.
Ich danke Frau Dr. Dagmar Esser, Frau Nadja Borsum, Frau Patricia Bock sowie
Frau Manuela Chambers aus dem Koordinationsreferat des Zentrums für
Systemische Neurowissenschaften (ZSN) für die stetige Hilfe bei allen Anliegen rund
um das PhD-Studium. Ferner danke ich dem ZSN für die gewährte dreimonatige
Anschubfinanzierung zu Beginn der These.
Mein Dank gilt meiner Mama Renate und meiner Schwester Lara Müller, meinem
Freund Gérard Fuchs sowie meinen langjährigen Freundinnen aus Köln und
Hannover für die immer gewährte Unterstützung.
Der Konrad-Adenauer-Stiftung, Sankt Augustin, danke ich für das gewährte
Promotionsstipendium, ohne das die Durchführung der PhD-These für mich nicht
möglich gewesen wäre.
197