Dokument_20.

Intrinsische Immunität gegen das humane Cytomegalovirus –
Charakterisierung der Rolle zellulärer Restriktionsfaktoren und
Analyse viraler antagonistischer Mechanismen
Der Naturwissenschaftlichen Fakultät
der Friedrich-Alexander-Universität Erlangen-Nürnberg
zur
Erlangung des Doktorgrades Dr. rer. nat.
vorgelegt von
Martina Adler
aus Nürnberg
Als Dissertation genehmigt von der Naturwissenschaftlichen Fakultät
der Friedrich-Alexander-Universität Erlangen-Nürnberg
Tag der mündlichen Prüfung:
30.08.2011
Vorsitzender der Promotionskommission:
Prof. Dr. Rainer Fink
Erstberichterstatter:
Prof. Dr. Andreas Burkovski
Zweitberichterstatter:
Prof. Dr. Michael Mach
Inhaltsverzeichnis
Inhaltsverzeichnis
A. ZUSAMMENFASSUNG................................................................................................................................ 1
A. SUMMARY.................................................................................................................................................... 2
B. EINLEITUNG ................................................................................................................................................ 3
C. ZIELSETZUNG ........................................................................................................................................... 13
D. MATERIAL UND METHODEN ................................................................................................................... 14
1. BIOLOGISCHES MATERIAL........................................................................................................................... 14
1.1 Bakterienstämme .............................................................................................................................. 14
1.2 Hefezellen ......................................................................................................................................... 14
1.3 Zelllinien ............................................................................................................................................ 14
1.4 Virusstämme ..................................................................................................................................... 14
1.5 Antikörper.......................................................................................................................................... 15
1.5.1 Monoklonale Antikörper ............................................................................................................................. 15
1.5.2 Polyklonale Antikörper ............................................................................................................................... 16
1.5.3 Sekundärantikörper.................................................................................................................................... 16
2. ENZYME, CHEMIKALIEN UND MEDIEN........................................................................................................... 17
2.1 Enzyme ............................................................................................................................................. 17
2.2 Chemikalien und Standard-Puffer..................................................................................................... 17
2.3 Medien .............................................................................................................................................. 19
2.3.1 Bakterienmedien ........................................................................................................................................ 19
2.3.2 Hefemedien................................................................................................................................................ 19
2.3.3 Zellkulturmedium........................................................................................................................................ 19
3. NUKLEINSÄUREN........................................................................................................................................ 20
3.1 Oligonukleotide ................................................................................................................................. 20
3.1.1 Sequenzierprimer....................................................................................................................................... 20
3.1.2 Primer für PCR-Klonierungen .................................................................................................................... 20
3.1.3 Primer für shRNA-Konstrukte..................................................................................................................... 21
3.2 Vektoren und Plasmide..................................................................................................................... 22
3.2.1 Ausgangsvektoren ..................................................................................................................................... 22
3.2.2 Zur Verfügung gestellte Plasmide .............................................................................................................. 22
3.2.3 Neue Plasmidkonstrukte ............................................................................................................................ 25
3.3 Weitere Nukleinsäuren...................................................................................................................... 28
4. MOLEKULARBIOLOGISCHE STANDARDMETHODEN......................................................................................... 28
5. METHODEN................................................................................................................................................ 29
5.1 Zellkulturtechniken ............................................................................................................................ 29
5.1.1 Hefekulturen............................................................................................................................................... 29
5.1.1.1 Hefetransformation............................................................................................................................. 29
5.1.2 Zelllinien..................................................................................................................................................... 30
5.1.2.1 Transfektionsmethoden...................................................................................................................... 30
5.1.2.2 Herstellung von Sp100-, SPOP- und Roc1-depletierten Zellen.......................................................... 32
5.1.2.3 Infektion von HFF-Zellen .................................................................................................................... 33
5.1.2.4 Virustiterbestimmung.......................................................................................................................... 33
5.1.2.5 GFP-Reporter Versuch....................................................................................................................... 34
5.1.2.6 Plaque-Analyse .................................................................................................................................. 34
5.1.2.7 Bestimmung der Zelltoxizität .............................................................................................................. 34
5.2 Indirekte Immunofluoreszenzanalyse ............................................................................................... 35
5.3 Durchflusszytometrie ........................................................................................................................ 35
5.5 Analyse von Protein/Protein-Interaktionen ....................................................................................... 36
5.5.1 Filterlift-Analyse ......................................................................................................................................... 36
5.5.2 Ko-Immunpräzipitation ............................................................................................................................... 37
5.6 RNA-Methoden ................................................................................................................................. 37
5.6.1 RNA-Isolation über Kieselgel-Säulen......................................................................................................... 37
5.6.2 Affymetrix Microarray Analyse ................................................................................................................... 38
5.6.3 RNA-Agarosegelelektrophorese ................................................................................................................ 38
®
5.6.4 RNA Isolierung mit TRIzol ........................................................................................................................ 39
5.6.5 RT-PCR ..................................................................................................................................................... 40
5.7 Dephosphorylierung von Proteinen .................................................................................................. 40
5.8 Gateway-Klonierung ......................................................................................................................... 40
5.9 Computer-Analysen .......................................................................................................................... 41
Inhaltsverzeichnis
E. ERGEBNISSE............................................................................................................................................. 42
1. ANALYSE DES EINFLUSSES DER ND10 KOMPONENTEN SP100, PML UND DAXX AUF CYTOMEGALOVIRUSINFEKTIONEN ................................................................................................................................................. 42
1.1 Herstellung von Sp100-depletierten Zellen....................................................................................... 42
1.1.1 Analyse der HCMV Replikation in Sp100-depletierten Zellen .................................................................... 44
1.1.2 Bestimmung der IE1-Genexpression in Zellen mit einer Sp100-Depletion ................................................ 44
1.1.3 Vergleich der HCMV-Genexpression in Sp100-kd Zellen nach Infektion ................................................... 46
1.1.4 Analyse der IE-Genexpression in Sp100-kd Zellen nach Infektion mit einem IE1-Deletionsvirus.............. 48
1.2 Einfluss von PML, Daxx und Sp100 auf die HCMV-Infektion ........................................................... 49
1.2.1 Lokalisation der ND10-Komponenten in Doppel-kd Zellen ........................................................................ 51
1.2.2 Immunfluoreszenz Analyse von siSp100+siPML Doppel-kd Zellen nach Infektion .................................... 52
1.2.3 Einfluss von Histon-Deacetylasen nach Infektion mit HCMV ..................................................................... 53
1.3 Klonierung der Sp100-Isoformen und Herstellung von Sp100-kd Zellen, die stabil je eine der
Isoformen exprimieren ............................................................................................................................ 55
1.3.1 Untersuchung der Lokalisation der verschiedenen Sp100-Isoformen........................................................ 57
1.3.2 Analyse der IE1 Genexpression nach Infektion der Sp100-Isoformen Zelllinien........................................ 58
1.3.3 Bestimmung der Plaquebildung in Sp100-exprimierenden Zellinien .......................................................... 59
2. UNTERSUCHUNG DER PP71-VERMITTELTEN DAXX-DEGRADATION NACH INFEKTION MIT HCMV...................... 59
2.1 Interaktionsuntersuchung von pp71 mit SPOP im Hefesystem........................................................ 60
2.2 Untersuchung von pp71-Proteininteraktionen durch Ko-Immunpräzipitation ................................... 61
2.2.1 Kotransfektionsanalyse von SPOP und pp71 ............................................................................................ 63
2.3 Klonierung von Roc1 Deletionsmutanten ......................................................................................... 64
2.3.1 Analyse der Interaktion von Roc1 mit pp71 im Filterlifttest......................................................................... 65
2.3.2 Analyse der Interaktion von Roc1 mit pp71 nach Ko-Immunpräzipitation .................................................. 66
2.3.2.1 Phosphorylierung von Roc1 ............................................................................................................... 66
2.3.2.2 Analyse der Interaktion von Roc1 mit pp71 durch Koimmunpräzipitation........................................... 67
2.4 Untersuchung der zellulären Lokalisation von SPOP, Roc1 und Cul3 ............................................. 68
2.5 Kolokalisation von SPOP mit ND10-Proteinen ................................................................................. 70
2.6 Analyse der SPOP-Expression zu unterschiedlichen Zeiten der HCMV Infektion ........................... 70
2.7 Herstellung von SPOP- und Roc1-depletierten Zelllinien................................................................. 72
2.7.1 Analyse der HCMV-Replikation in SPOP-kd Zellen ................................................................................... 75
2.7.2 Bestimmung der IE1-Genexpression und der Plaquebildung in siSPOP- bzw. siRoc1-Zellen................... 76
2.8 Untersuchung des Mechanismus der Daxx-Degradation ................................................................. 76
2.8.1 Analyse der Daxx-Degradation nach Infektion der SPOP-kd Zellen .......................................................... 78
3. EINFLUSS DER PML-DEPLETION AUF DIE GENEXPRESSION IN PRIMÄREN HUMANEN VORHAUTFIBROBLASTEN . 80
3.1 Nachweis der PML-Depletion in siPML-transduzierten humanen Vorhautfibroblasten.................... 80
3.2 Einfluss der PML Depletion auf die zelluläre Genexpression........................................................... 81
3.3 Analyse der PML-Expression nach Interferon-Induktion .................................................................. 85
3.4 Regulierung von Genen nach Induktion mit Interferon γ in Abhängigkeit von PML ......................... 87
F. DISKUSSION .............................................................................................................................................. 90
G. ABKÜRZUNGSVERZEICHNIS ................................................................................................................ 102
H. LITERATURVERZEICHNIS ..................................................................................................................... 104
I. ANHANG .................................................................................................................................................... 119
1
A. Zusammenfassung
A. Zusammenfassung
Das humane Cytomegalovirus (HCMV) ist ein weitverbreitetes humanes Pathogen,
welches bei immunsupprimierten Personen schwere Erkrankungen auslösen kann. Es
wurde beobachtet, dass nach Infektion virale Genome und Regulatorproteine wie pp71 an
einer als nukleäre Domäne 10 (ND10) bezeichneten subnukleären Struktur akkumulieren,
die die drei Hauptbestandteile PML, hDaxx und Sp100 beinhaltet. Durch RNA-Interferenz
wurden stabile Zelllinien generiert, die eine Depletion (knockdown, kd) dieser Proteine
besitzen. Vorangegangene Studien haben die Komponenten PML und hDaxx als zelluläre
Restriktionsfaktoren identifiziert, die unabhängig voneinander die HCMV-Infektion
antagonisieren können, indem sie die sehr frühe (IE) Genexpression unterdrücken. Nach
Infektion von Sp100-kd Zellen konnte gezeigt werden, dass auch Sp100 einen
repressorischen Effekt auf die HCMV-Infektion ausübt. Bei Infektionsexperimenten in
Doppel-kd Zellen, die eine Depletion von entweder Sp100 und PML oder Sp100 und Daxx
aufwiesen, wurde gezeigt, dass die drei ND10-Hauptbestandteile als voneinander
unabhängige
Faktoren
der
zellulären
Restriktion
der
HCMV-Replikation
wirken.
Interessanterweise wurde beobachtet, daß Histon-Deacetylasen auch bei Abwesenheit
von ND10-Proteinen die IE-Genexpression antagonisieren können. Durch die Analyse der
Genexpression in PML-kd Zellen mit Hilfe der Affymetrix Microarray-Technologie konnte
gezeigt werden, dass eine Vielzahl von Genen in Abhängigkeit von PML reguliert werden.
Beispielsweise wurde die nicht-kodierende RNA MALAT1 und ebenso weitere nichtkodierende RNA-Transkripte in PML-depletierten Zellen im Vergleich zu Kontrollzellen
hoch reguliert. In weiteren Analysen wurde beobachtet, dass PML einen regulatorischen
Einfluss auf Interferon-γ induzierte Signalwege ausübt. Während Infektion hat HCMV
verschiedene Strategien entwickelt, der ND10-vermittelten Repression zu entgehen. Für
hDaxx wurde beschrieben, dass es direkt nach Infektion an das virale Tegumentprotein
pp71 bindet, welches anschließend die Degradation von Daxx initiiert. ProteinInteraktionsexperimente zeigten, dass sowohl Daxx als auch pp71 mit einer Ubiquitin-E3Ligase, bestehend aus SPOP, Cullin3 und Roc1, interagieren. Diese Befunde weisen auf
einen ubiquitin-abhängigen Degradationsmechanismus des Daxx durch pp71 hin.
Konsequenterweise konnte beobachtet werden, daß nach Infektion von SPOP- und Roc1kd Zellen mit HCMV weniger Zellen die IE-Genexpression initiieren. Insgesamt deuten
diese Analysen auf eine wichtige Rolle von SPOP und Roc1 für die Antagonisierung
intrinsischer Immunmechanismen durch virale Regulatorproteine hin.
A. Summary
2
A. Summary
Human Cytomegalovirus (HCMV) is a widespread human pathogen, which causes severe
disease in immunosuppressed individuals. Recently, it was observed, that, after infection,
viral genomes and also the regulatory protein pp71 directly associate with a cellular
subnuclear structure known as nuclear domain 10 (ND10), that contains the three major
protein components PML, hDaxx and Sp100. Primary human cell lines were generated
with an siRNA-mediated stable knockdown of PML, hDaxx or Sp100. Previous studies
identified the ND10 components PML and hDaxx as cellular restriction factors that
independently counteract human cytomegalovirus infection via the repression of viral
immediate-early (IE) gene expression. Infection analysis of Sp100-knockdown (kd) cells
with HCMV could show, that Sp100 is likewise involved in this repressive activity. Further
studies in double-kd cell-lines, lacking either both, Sp100 and PML or Sp100 and hDaxx,
revealed, that the three major ND10-components independently contribute to the cellular
restriction of HCMV replication. Interestingly, current data indicate, that histone
deacetylases still contribute to IE gene repression in the absence of ND10. Gene
expression analysis in PML-kd cells via the Affymetrix Microarray Technology revealed,
that a multitude of genes is regulated in a PML-dependent manner. For instance, the noncoding RNA MALAT1 and also many other non-coding RNA transcripts were up-regulated
in PML-depleted cells in comparison to control cells. Further analysis revealed a regulatory
effect of PML in signal cascades, which are induced by interferon-γ. During infection with
HCMV, the virus developed several strategies to overcome the ND10-mediated repression
of its replication. Recent studies observed a direct interaction between the cellular hDaxx
protein and the incoming viral tegument-protein pp71. Subsequently, pp71 induces the
degradation of hDaxx. Experiments analysing protein-protein interactions indicated an
association between pp71 and hDaxx with a ubiquitin-E3-ligase, consisting of SPOP,
Cullin3 and Roc1. Consequently, this study postulated that the pp71-mediated hDaxx
degradation occurs in a ubiquitin-dependent manner. Infection of SPOP- and Roc1depleted cells with HCMV revealed fewer cells, which were able to initiate the immediateearly gene expression. Thus, this suggests an important role of SPOP and Roc1 for the
antagonization of intrinsic immunity by viral regulatory proteins.
B. Einleitung
3
B. Einleitung
Das Humane Cytomegalovirus
Die Mitglieder der Familie der Herpesviridae sind bei beim Menschen und bei
Wirbeltieren weit verbreitet und werden in die Unterfamilien der alpha-, beta- und gammaHerpesviren unterteilt (Roizman et al., 1981). Gemeinsam ist dabei allen Viren die
Morphologie mit ikosaedrischem Kapsid, Tegument, Hülle und einem doppelsträngigen
DNA-Genom. Nach Erstinfektion persistieren die Viren im Wirt lebenslang, wobei Phasen
latenter und produktiver (auch reaktivierter) Infektion wechseln (Roizman et al., 1992). Zu
den α-Herpesviren zählen beispielsweise das Herpes simplex-Virus Typ 1 (HSV-1) und
das Varizella zoster-Virus (VZV), das Epstein Barr-Virus (EBV) wurde als γ-Herpesvirus
klassifiziert. Als typischer Vertreter der Gruppe der β-Herpesviren gilt das Cytomegalovirus
(HCMV), auch bekannt als Humanes Herpesvirus Typ 5 (HHV-5). Der Name des HCMV
leitet sich aus charakteristischen zytopathischen Veränderungen der Zellmorphologie nach
Infektion ab, gekennzeichnet durch Abrundung und Zellvergrößerung (Zytomegalie).
Typisch ist außerdem die Bildung von Einschlusskörperchen im Kern und im Zytoplasma.
Epidemiologie und Pathogenese
HCMV ist ein weit verbreitetes humanes Pathogen mit einer hohen Seroprävalenz
in der Bevölkerung, welche von 40-60% in Europa und USA bis hin zu 100% in
Entwicklungsländern reicht (Krech, 1973). HCMV kann über eine Vielzahl von
Transmissionswegen übertragen werden: hierzu zählen direkter Kontakt mit Infizierten,
sexueller Kontakt, Stillen, Bluttransfusion und Organtransplantation. Weiter konnte gezeigt
werden, dass eine Ansteckung von Mutter zu Kind bereits während der Schwangerschaft
erfolgen kann (Fisher et al., 2000;Reynolds et al., 1973). Diese intrauterine Transmission
erfolgt bei Primärinfektion der Mutter nur in ca. 30-40% der Fälle, weshalb eine Barriere
angenommen werden kann, die die vertikale Transmission teilweise verhindert (Demmler,
1991;Griffiths & Baboonian, 1984). Der Nachweis einer HCMV-Infektion kann auf
verschiedenen Wegen erfolgen, z.B. über eine Virusisolierung aus Urin, Blut, Speichel,
Cervixsekret oder Muttermilch; ein positiver CMV-IgM-Antikörpernachweis mittels ELISA
kann auf eine aktive primäre oder reaktivierte Infektion hinweisen.
Die Primärinfektion mit HCMV bzw. eine Reaktivierung verläuft in immunkompetenten
Individuen häufig asymptomatisch, seltene Symptome sind eine Mononukleose mit Fieber,
eine milde Hepatitis oder eine Polyneuritis (Cohen & Corey, 1985;Jordan et al., 1973).
Jedoch kann eine Infektion in immunsupprimierten Personen, wie nach einer
4
B. Einleitung
Transplantation oder bei Tumor- oder AIDS-Patienten, zu schweren Erkrankungen wie
Pneumonie, Hepatitis, Enzephalitis oder Gastroenteritis führen (Drew, 1992;Vancikova &
Dvorak, 2001). Nach Primärinfektion der Mutter während der Schwangerschaft kann es bei
einer Ansteckung des Kindes zu schweren Geburtsdefekten wie geistiger Retardierung,
Fehlbildungen an Skelett oder Hörverlust kommen (Revello & Gerna, 2002). Weiter wurde
diskutiert, ob HCMV eine Rolle bei Arteriosklerose und koronaren Verengungen spielt
(Melnick et al., 1983;Speir et al., 1994).
Morphologie und Replikation
Mit einer Größe von ca. 150-250nm zeigt HCMV die für Herpesviren typische
Morphologie.
Das
lineare,
doppelsträngige
Genom
(~240kb)
ist
das
größte
Herpesvirusgenom und kodiert für ungefähr 200 Gene (Chee et al., 1990). Das Genom
liegt im Inneren des Virions vor und wird umgeben von einem ikosaedrischen Kapsid,
welches aus mehreren verschiedenen Strukturproteinen besteht. Zwischen Kapsid und
Hüllmembran befindet sich das Tegument, welches unterschiedliche, regulatorisch aktive
Proteine enthält, beispielsweise die viralen Proteine pp71, pUL69, pUL97 und das am
häufigsten vorkommende pp65. Die verschiedenen Tegumentproteine spielen besonders
in der frühen Phase der Infektion eine wichtige Rolle. Die Hüllmembran besteht aus
verschiedenen Glykoproteinen wie gB, gH und gL. Zusätzlich wurden eine Reihe von
zellulären und viralen mRNAs beschrieben, die im Viruspartikel eingebunden sind, deren
Funktion jedoch noch ungeklärt ist und weiter analysiert werden muss (Bresnahan &
Shenk, 2000a;Greijer et al., 2000). HCMV besitzt ein enges Spektrum an infizierbaren
Zellen, die Züchtung im Labor gelingt nur in menschlichen oder in Schimpansenzellen,
wobei embryonale Lungenfibroblasten und Vorhautzellen von Neugeborenen am besten
geeignet sind. Der relativ langsame Vermehrungszyklus ist kaskadenartig aufgebaut und
gliedert sich in drei Phasen: i) sehr frühe Phase (IE; immediate-early), ii) frühe Phase (E;
early) und iii) späte Phase (L; late) (Demarchi, 1981;McDonough & Spector, 1983;Wathen
& Stinski, 1982). Während des Beginns der Infektion wird in der initialen IE-Phase die für
die viralen Regulatorproteine IE1 und IE2 kodierende Genregion transkribiert (Stenberg et
al., 1989). Diese beiden Proteine entstehen durch Translation von RNAs, die durch
alternatives Spleißen einer Primär-RNA zustande kommen; somit besitzen beide Proteine
ein gleiches N-terminales Ende, aber unterscheiden sich am C-Terminus (Stenberg et al.,
1985).
Eine
HCMV-Mutante
mit
einer
IE1-Deletion
zeigt
einen
ausgeprägten
Replikationsdefekt bei Infektion unter niedrigen MOI (multiplicity of infection)-Bedingungen,
was auf die Wichtigkeit des IE1-Proteins für die virale Replikation schließen lässt (Greaves
B. Einleitung
5
& Mocarski, 1998). IE2, zusammen mit IE1, kann frühe virale Promotoren aktivieren und
ist damit essenziell für die Aktivierung der frühen Genexpressions-Phase (Malone et al.,
1990). Das Tegumentprotein pp71 erhöht zusammen mit pUL69, pUL35 und pUL26 die
Expression der IE1/2-Proteine über die Aktivierung des sogenannten major immediate
early enhancer promoter (MIEP) (Liu & Stinski, 1992;Schierling et al., 2004;Stamminger et
al., 2002;Winkler et al., 1995). Ganz besonders wichtig für die Initiierung des viralen
Zyklus ist hierbei das pp71-Protein, da gezeigt werden konnte, dass Viren mit einer pp71Deletion nach Infektion unter niedrigen MOI-Bedingungen stark ineffizient die Replikation
starten können (Bresnahan & Shenk, 2000b;Cantrell & Bresnahan, 2005). Die Expression
der IE-Gene ist eine Voraussetzung für das Fortschreiten des Replikationszyklus in die
frühe und die späte Phase. Darüber hinaus induzieren die Proteine IE2 und pUL69 einen
Zellzyklus-Arrest in G1 (Lu & Shenk, 1996;Murphy et al., 2000). Während in der frühen
Phase Proteine synthetisiert werden, welche für die virale DNA-Replikation nötig sind (z.B.
UL44), werden in der späten Phase Kapsidproteine, Glykoproteine und Tegumentproteine
gebildet (Mocarski et al., 2007). Der Zusammenbau (virus assembly) des viralen Partikels
erfolgt im Zellkern (Gibson, 1996). Anschließend verlässt das Virus den Kern über den
nukleären Egresskomplex (NEC) (Marschall et al., 2005;Milbradt et al., 2009) und erhält
seine endgültige Hülle (Tooze et al., 1993), reift aus und wird schließlich zur Zelloberfläche
transportiert, um diese über einen Exozytose-ähnlichen Weg zu verlassen (Mettenleiter,
2002).
Nach Primärinfektion initiiert HCMV eine latente Infektion, die lebenslang im Wirt verbleibt
und immer wieder neu reaktiviert werden kann (Drew & Lalezari, 1999). Während der
Latenz befindet sich die virale DNA im Nukleoplasma und wird durch die zelluläre DNAPolymerase vermehrt. Als Zellen, die latent mit HCMV infiziert sind, werden beispielsweise
hematopoietische Vorläuferzellen betrachtet (Khaiboullina et al., 2004;Mendelson et al.,
1996;Sindre et al., 1996), jedoch ist weiterhin unklar, welche Mechanismen für die
Aufrechterhaltung der Latenz und die Reaktivierung der lytischen Phase zuständig sind.
Prophylaxe und Therapie
Auf Grund der weltweiten Verbreitung von HCMV ist eine generelle Prophylaxe
beinahe unmöglich. Die Therapie einer HCMV-Infektion wird mit Ganciclovir oder
Foscarnet durchgeführt, wobei dies zwar eine Unterdrückung der Virusvermehrung
ermöglicht, jedoch keine Elimination des Viruses aus dem Wirt erfolgt, weshalb eine
erneute Reaktivierung jederzeit möglich ist. Als Nachteile sind außerdem die nicht
unerheblichen Nebenwirkungen der beiden Medikamente zu erwähnen: so kommt es
6
B. Einleitung
beispielsweise nach Gabe von Ganciclovir zu Veränderungen des Blutbildes; ebenso
wurde eine krebserregende und fruchtschädigende Wirkung beschrieben, weshalb die
Forschung nach therapeutisch wirksamen Medikamenten weiterhin von essentieller
Bedeutung ist. Bis heute besteht außerdem keine Impfmöglichkeit, doch es befinden sich
mehrere Stoffe dafür in der klinischen Entwicklung (Schleiss, 2008).
Die nukleäre Domäne 10
Der
viralen
Infektion
sind
verschiedene
zelluläre
Abwehrmechanismen
gegenüberzustellen, die sich in die intrinsische, die angeborene (innate) und die adaptive
Immunität einteilen lassen. Während die letzten beiden erst durch viral-induzierte
Signalwege gestartet werden müssen, kann die intrinsische Immunität als erste
Abwehrreaktion der Zelle betrachtet werden, da sie durch dauerhaft exprimierte Proteine
charakterisiert ist, die aber zusätzlich nach Infektion noch weiter hoch reguliert werden
können (Bieniasz, 2004). Für einige DNA-Viren, darunter auch HCMV, wurde gezeigt,
dass das virale Genom und die Replikation in direkter Assoziation mit einer zellulären
subnukleären Struktur erfolgt, welche als nukleäre Domäne 10 (ND10; auch PML nuclear
bodies – PML-NB’s; PML oncogenic domains – POD’s) bekannt ist (Ishov & Maul,
1996;Maul et al., 1996). Kürzlich konnte gezeigt werden, dass über diese Struktur die
intrinsische Immunität gegenüber Herpesviren vermittelt wird (Everett & Chelbi-Alix,
2007;Tavalai et al., 2006;Tavalai & Stamminger, 2010). Die ND10 werden als subnukleäre
Struktur im Zellkern definiert und stellen eine Ansammlung von mehr als 70 verschiedenen
Proteinen dar, die sowohl permanent (wie PML, Sp100 und Daxx) als auch gelegentlich
(wie BRCA1) mit dieser Domäne assoziiert sind (Negorev & Maul, 2001;Van et al., 2010).
Viele ND10-Bestandteile, darunter PML und Sp100 sind durch Interferon induzierbar
(Chelbi-Alix et al., 1995;Guldner et al., 1992); daraus resultiert eine Erhöhung der Anzahl
und der Größe der ND10 Domänen (Grotzinger et al., 1996). Während Infektion mit HCMV
antagonisiert das virale IE1 Protein die Wirkung der ND10, indem es für die Auflösung der
Strukturen verantwortlich ist (Ahn & Hayward, 1997;Korioth et al., 1996;Wilkinson et al.,
1998), da es die SUMOylierung von PML aufhebt und dadurch die übrigen Bestandteile
nicht mehr an PML konjugieren und sich von der Domäne lösen können (Ahn et al.,
1998;Lee et al., 2004).
B. Einleitung
7
PML
Als strukturdefinierende Komponente wurde das promyelozytische Leukämie
Protein PML definiert, da es als eine Art Gerüstprotein für ND10 fungiert (Ishov et al.,
1999;Zhong et al., 2000). PML, auch bekannt als Trim19, wurde zuerst bei Patienten
erforscht, welche unter einer akuten promyelozytischen Leukämie (APL) leiden. Bei dieser
Erkrankung führt eine chromosomale Translokation zu einer Fusion der beiden Gene für
PML und für den Retinolsäure-Rezeptor α, wodurch das entstandene Fusionsprotein eine
dauerhafte Unterdrückung der sonst durch den Rezeptor α regulierten Gene zur Folge hat
(Kakizuka et al., 1991). Somit kommt es zu einer gestörten Promyelozytenreifung. Als zur
Trim-Proteinfamilie (TRIM = tri-partite motif) gehörendes Protein beinhaltet PML eine ZinkFinger RING-Domäne, ein oder zwei B-Box Motive (Cystein/Histidin-reiches Motiv) und
eine α-helikale coiled-coil-Domäne (Jensen et al., 2001). Durch unterschiedliches Spleißen
werden 7 verschiedene PML-Isoformen gebildet, die sich lediglich im C-terminalen Ende
unterscheiden und deren einzelne Funktionen noch genauer untersucht werden müssen,
jedoch wird derzeit eine unterschiedliche Rolle der einzelnen Isoformen während der
viralen Replikation angenommen. Die verschiedenen Isoformen variieren in ihrer Größe
von 48 – 97kDa und werden nach Translation durch SUMOylierung (Konjugation an
SUMO, ein zu Ubiquitin homologes Protein) und Phosphorylierung modifiziert (Everett et
al., 1999;Muller et al., 1998). SUMO-Modifikationen sind für die Funktion von PML und
somit für die ND10-Bildung von großer Bedeutung, da über SUMO andere ND10Bestandteile wie Daxx und Sp100 an ND10 rekrutiert werden (Shen et al., 2006). Nach
Depletion von PML in primären humanen Zellen konnte gezeigt werde, dass mehr Zellen
die sehr frühe (IE) Genexpression starten können, da PML als zellulärer Restriktionsfaktor
gegen die HCMV-Infektion wirkt (Tavalai et al., 2006). Eine IE1-Deletionsmutante von
HCMV zeigt dagegen einen ausgeprägten Wachstumsdefekt in normalen HFF nach
Infektion unter geringen MOI (multiplicity of infection)-Bedingungen, der jedoch nach
Infektion von PML-kd Zellen wieder ausgeglichen werden kann. Daher konnte IE1 als
viraler Gegenpart zu PML identifiziert werden (Greaves & Mocarski, 1998). Weiteren
Aufschluss über die Funktion von PML liefern DNA-Microarrays, welche Erkenntnisse über
Genfunktionen sowie Interaktionen zwischen und innerhalb von Zell-Signalwegen
ermöglichen (Brown & Botstein, 1999;Lockhart & Winzeler, 2000;Young, 2000).
Daxx
Daxx, welches die zweite wichtige Komponente der ND10 darstellt, wurde
zusammen mit PML als Restriktionsfaktor identifiziert, welches der HCMV-Infektion
8
B. Einleitung
entgegenwirken kann (Preston & Nicholl, 2006;Saffert & Kalejta, 2006;Tavalai et al.,
2006;Tavalai et al., 2008;Woodhall et al., 2006). Bei Daxx handelt es sich um ein hoch
konserviertes zelluläres Protein, welches im Zellkern lokalisiert ist und verschiedene
Domänen enthält, darunter eine coiled-coil Region und eine Prolin/Threonin-reiche Region
(Kiriakidou et al., 1997). Daxx spielt eine Rolle in der Regulation der Genexpression und
Apoptose (Salomoni & Khelifi, 2006). Weiter wurde gezeigt, dass dieses Protein als
transkriptioneller
Korepressor
agiert,
indem
es
die
Aktivität
verschiedener
Transkriptionsfaktoren, wie Mitglieder der p53-Familie, unterbindet (Kim et al., 2003).
Kürzlich wurde außerdem gezeigt, dass Daxx über sein SUMO-Interaktionsmotif (SIM) mit
SUMOylierten DNA-bindenden Transkriptionsfaktoren interagieren kann (Lin et al., 2006),
wie beispielsweise mit Histon-Deacetylasen Typ 1 (HDAC1) (Li et al., 2000). Virale DNA
ist zu bestimmten Zeiten der Infektion, ebenso wie zelluläre DNA, mit Histonen assoziiert,
welche durch Acetylierung und Deacetylierung mittels entsprechender Enzyme die
Transkription beeinflussen. Durch die Anwesenheit von Daxx und die damit Histoninduzierte Regulierung, kann Daxx als Repressionsfaktor der HCMV-Replikation betrachtet
werden. Dieser Repression kann beispielsweise in Zellkultur eine Zugabe von Trichostatin
A (TSA), einem HDAC-Inhibitor der HDAC-Typen I und II, entgegenwirken. In vivo hat
HCMV eine eigene Strategie entwickelt, um sich der Daxx-vermittelten Repression zu
entziehen. Das Tegumentprotein pp71 wird direkt nach Infektion in den Zellkern
transportiert, kolokalisiert dort mit den ND10-Domänen, interagiert mit Daxx (Hofmann et
al., 2002) und vermittelt die Degradation des zellulären Proteins. Ein Depletion von Daxx
über stabil integrierte shRNA resultiert in einer gesteigerten Anzahl an Zellen, die die sehr
frühe (IE) Genexpression starten können; dies lässt den Schluss zu, dass Daxx als
Repressor der IE-Genexpression wirkt (Tavalai et al., 2008). Demzufolge konnte gezeigt
werden, dass eine Mutante von HCMV mit einer pp71-Deletion schlecht die virale
Replikation starten kann (Bresnahan & Shenk, 2000b;Cantrell & Bresnahan, 2006). Weiter
wird ein Replikationsdefekt eines pp71-Deletionsvirus bei Infektion dieser Daxx-kd Zellen
ausgeglichen, der sonst bei Infektion normaler humaner Fibroblasten (HFF) besteht
(Preston & Nicholl, 2006;Saffert & Kalejta, 2006). Die pp71-vermittelte Daxx-Degradation
wurde bereits als proteasom-abhängiger, aber ubiquitin-unabhängiger Mechanismus
beschrieben (Hwang & Kalejta, 2007). Bereits zuvor wurde die pp71-vermittelte
Degradation von Proteinen der Rb (retinoblastoma protein) Familie beschrieben (Kalejta &
Shenk, 2003). Der Ubiquitin–Proteasom Signalweg der Zellen ist zuständig für die
Eliminierung von nicht korrekt gefalteten Proteinen und für die generelle Regulierung der
intrazellulären Proteinmenge (Glickman & Ciechanover, 2002), wobei bereits gezeigt
B. Einleitung
9
werden konnte, dass ein Abbau über den Weg des Proteasoms nicht zwingend eine
Beteiligung des Ubiquitinwegs erfordert (Orlowski & Wilk, 2003). Jedoch wurde ebenso
gezeigt, dass ohne Einwirkung einer HCMV-Infektion Daxx zunächst ubiquitinyliert und
anschließend über das Proteasom abgebaut wird (Kwon et al., 2006). Obwohl diese
Studie nicht auf die Degradation von Daxx während HCMV-Infektion eingeht, stellte sich
die Frage, ob es zwei verschiedene Abbauwege von Daxx gibt, oder ob auch bei Infektion
mit HCMV eine Markierung von Daxx mit Ubiquitin (Ub) erfolgt.
Der Ubiquitin-Signalweg
Die ubiquitin-abhängige Regulierung von Proteinmengen spielt insgesamt eine
bedeutende Rolle in verschiedenen Zellprozessen, wie Zellproliferation, Differenzierung
und Apoptose (Hershko & Ciechanover, 1998;Hochstrasser, 1996;King et al., 1996). Das
Ubiquitin wird bei diesem Signalweg über ein dreistufiges Kaskadensystem auf das
Zielprotein übertragen. In Schritt 1 erfolgt eine Aktivierung des Ub-Moleküls, welches
anschließend auf Ub-konjugierende Enzyme (E2) übertragen wird, um im letzten Schritt an
die Ub-E3-Ligaseenzyme zu binden (Scheffner et al., 1995). Bei den Enzymen E1 und E2
handelt es sich um bereits gut charakterisierte Enzyme, die kaum zur Zielerkennung
beitragen. Die E3-Ligase jedoch erfüllt gleich zwei verschiedene Aufgaben, einerseits die
Ub-Ligaseaktivität, um die Isopeptidbindung zu Ub zu katalysieren, und andererseits die
exakte Zielerkennung, um Ligase, Ubiquitin und Substrat in direkten Kontakt zu bringen.
Der Ablauf des dreistufigen Mechanismus ist in Abbildung IA dargestellt. Dieser Signalweg
kann in vitro in Zellkultur durch die Zugabe von Inhibitoren unterbunden werden.
Abbildung
I:
Schematische
Darstellung des Ub-Signalweges.
A) Vor dem Abbau eines Proteins im
Proteasom wird dies meist durch
mehrere
Ubiquitinmoleküle
(Ub)
markiert. Diese Reaktion erfolgt
ATP-abhängig in einem dreistufigen
Prozess und wird durch die Enzyme
E1, E2 und E3 katalysiert. Nach der
Aktivierung des Ub an E1 wird
Ubiquitin
an
das
E2-Enyzm
übertragen. Diese Reaktion kann
durch Iodoaceticacid (IAA; C)
unterbunden werden. Als letztes wird
Ub durch die E3-Ligase an das
Zielprotein übertragen. Durch die
Verknüpfung mehrerer Ub-Moleküle
Bild modifiziert von: http://en.wikipedia.org/wiki/Ubiquitin; Original von Roger B. Dodd
über Lysin 48 wird der Abbau des
Zielproteins beschleunigt. Die so
markierten Proteine werden im
Proteasomkomplex
endgültig
abgebaut. Dieser Schritt kann durch
MG132 (B) gehemmt werden.
B. Einleitung
10
Während der Proteasom-Inhibitor MG132 (Abb. IB) die Reaktionskaskade kurz vor der
Proteindegradation unterbindet, greift der unspezifische E1/E2 Inhibitor Iodoaceticacid
(IAA) (Abb. IC) bei der Übertragung des Ubiquitins von E1 auf E2 in die Reaktion ein,
indem es die SH-Gruppe modifiziert und somit die Formierung der nötigen Disulfit-Brücke
verhindert (Knap & Pratt, 1991). Ub-E3-Ligasen vermitteln die Spezifität zum Zielprotein,
wobei eine der am besten untersuchten E3-Ligasen der Skp1/Cul1/F-box Proteinkomplex
darstellt. Hier dient Cullin1 (Cul1) als Gerüstprotein, welches mit Skp1 und dem kleinen
Ring-Fingerprotein Roc1 (auch Rbx1) interagiert (Kamura et al., 1999b). Cullin 1 gehört zu
einer Proteinfamilie bestehend aus 6 Mitgliedern (Cul 1-6), von denen zum Beispiel für
Cullin3 (Cul3) kürzlich gezeigt wurde, dass es an der Degradation einer Reihe von
zellulären Proteinen beteiligt ist (Singer et al., 1999). Mit Cullin3 interagieren wiederum
eine Vielzahl von Proteinen, welche eine BTB Domäne (Bric-a-brac/Tramtrack/Broad
complex) enthalten (Furukawa et al., 2003), zu denen das kürzlich identifizierte SPOPProtein gehört (Nagai et al., 1997). SPOP (speckle-type POZ protein) ist ein nukleäres
Protein, welches als Autoantigen in Patienten mit Sklerodermie identifiziert wurde
(Haustein, 2002). Es besitzt zwei gut konservierte Domänen, die TNF (tumor necrosis
factor)-Rezeptor assoziierte Domäne (TRAF; TD) am N-Terminus von SPOP (as 33-164)
und direkt im Anschluss die BTB/POZ Domäne (as 190-289), welche beide zwischen den
Spezies mit hoher Sequenzähnlichkeit erhalten sind (Takahashi et al., 2002). Kürzlich
konnte für SPOP eine proapoptotische Funktion in Zellkultur (HeLa Zellen) nachgewiesen
werden (Byun et al., 2007). Weiter wurde gezeigt, dass SPOP die Ubiquitinylierung von
zellulären Proteinen vermittelt: zum Beispiel bildet SPOP mit Cul3 eine Ub-E3-Ligase und
erwirkt durch direkte Interaktion den Abbau von MacroH2A (Hernandez-Munoz et al.,
2005) und Daxx, wobei für Daxx eine Interaktion mit SPOP bereits mehrfach gezeigt
werden konnte (Kwon et al., 2006;La et al., 2004). Als dritter Bestandteil der Cul3-SPOP
E3 Ligase wurde das Roc1 (Rbx1) Protein beschrieben. Roc1, ein Homolog zu APC11,
repräsentiert eine Familie von Cullin Reaktionspartnern mit essentieller UbiquitinLigaseaktivität (Ohta et al., 1999). Roc1 besteht aus 109as mit einer Molekülmasse von
~13kDa und ist sowohl im Kern als auch im Zytoplasma lokalisiert (Furukawa et al., 2000).
Es enthält zwei charakteristische Domänen, einerseits eine RING-Fingerdomäne (as 5398), welche bereits in vielen eukaryoten Proteinen als Protein/Protein-Interaktionsdomäne
identifiziert wurde und andererseits 6 hoch konservierte Thryptophanreste, gefolgt von
sauren Aminosäuren, welche ebenfalls Protein/Protein-Interaktionen vermitteln sollen
(Borden & Freemont, 1996). Es wurde beschrieben, dass die RING-Domäne die E2Enzyme zum E3-Komplex rekrutieren kann (vlg. Abb. I) und so die Übertragung des
11
B. Einleitung
Ubiquitins auf das Zielprotein ermöglicht (Furukawa et al., 2000;Kamura et al., 1999a). Als
weitere Funktion in der Zelle wurde ein Zusammenhang von Roc1 mit Tumorbildung und
maligner Entartung beschrieben. Es konnte gezeigt werden, dass in primären humanen
Tumorzellen Roc1 ubiquitär über-exprimiert wird und dass bei einer Deletion von Roc1
über siRNA-Wechselwirkung das Wachstum von verschiedenen Krebszelllinien gehemmt
werden kann, indem Seneszenz, Apoptose und ein Zellzyklusarrest in G(2)-M induziert
wird. Inwieweit Roc1 in Zusammenhang mit der Cul3-SPOP E3-Ligase nun an der pp71vermitteltenden Daxx Degradation nach Infektion mit HCMV beteiligt ist, ist aktuell nicht
vollständig geklärt.
Sp100
Neben Daxx und PML gilt Sp100 (speckle protein of 100kDa) als die dritte wichtige
ND10-Komponente, welche im Zellkern lokalisiert ist und dort direkt mit den anderen
Bestandteilen
von
ND10
assoziiert.
Sp100
wurde
zuerst
als
Antigen
bei
Autoimmunerkrankungen beschrieben (Szostecki et al., 1990). Durch alternatives
Spleißen ausgehend von einem Gen entstehen vier verschiedene Sp100-Isoformen,
Sp100-A, -B, -C und –HMG (Andreoni et al., 1989;Dent et al., 1996;Guldner et al.,
1999;Seeler et al., 2001;Szostecki et al., 1990), die ein gleiches N-terminales Ende
besitzen und sich im C-Terminus unterscheiden. Im N-Terminus befindet sich das HSR
(homogeneously staining region)-Motiv, welches für die Homo-Oligomerisierung von
Sp100 verantwortlich ist und sowohl als Verknüpfung zu den ND10, als auch als
Bindestelle für das HP1 (heterchromatin protein 1)-Protein fungiert. Letzteres lässt eine
Rolle von Sp100 in der Regulation der Transkription vermuten. Diese Funktion konnte
bereits für Sp100B gezeigt werden, da diese Isoform zumindest nach transienter
Expression zelluläre und virale Promotoren hemmen kann (Wilcox et al., 2005). In den
Sp100-Isoformen B, C und HMG befinden sich noch weitere funktionelle Motive, wie die
SAND-Domäne, eine PHD-Finger Bromodomäne und eine HMG-Box, wobei es sich bei
allen Motiven um mögliche DNA-bindende Domänen handelt, welche bereits häufiger in
Proteinen gefunden wurden und die durch ihre Funktion einen Einfluss auf die
Chromatinstruktur vermitteln (Bottomley et al., 2001). Genau wie auch PML, kann durch
Zugabe von Interferon die Sp100-Proteinmenge in der Zelle hoch reguliert werden
(Guldner et al., 1992;Lavau et al., 1995;Stadler et al., 1995), weshalb eine Rolle von
Sp100 in der Abwehr von Pathogenen wie HCMV vermutet wurde. Ebenso wird Sp100,
wie auch Daxx und PML durch SUMO post-translational modifiziert (Sternsdorf et al.,
1997), obwohl, im Gegensatz zu PML, die SUMOylierung von Sp100 nicht für die
B. Einleitung
12
Lokalisation an ND10 nötig scheint (Sternsdorf et al., 1999). In jüngeren Studien wurde
beobachtet, dass sowohl die Menge der SUMOylierten Sp100-Formen, als auch
insgesamt das Expressionsniveau aller Sp100-Formen von PML reguliert zu werden
scheint (Everett et al., 2006a), doch es ist noch nicht klar, ob es sich hierbei um einen
direkten oder indirekten Effekt handelt. Ein Indiz für eine PML-vermittelte Regulierung von
Sp100 ist der Nachweis von Sp100 im Western Blot aus Zelllysaten, die eine RNAiinduzierte Depletion von PML aufweisen. Hier werden die langsamer wandernden
Isoformen wie Sp100HMG in geringerer Menge detektiert, ebenso scheint Sp100A-SUMO
zu Gunsten von Sp100A reduziert vorzuliegen (Everett et al., 2006b). Zusammenfassend
muss geschlussfolgert werden, dass die Rolle von Sp100 während der HCMV-Infektion
weiterer Studien bedarf.
C. Zielsetzung
13
C. Zielsetzung
Das humane Cytomegalovirus (HCMV) ist nach wie vor von hoher klinischer Bedeutung.
Die Basis für die Entwicklung neuer Medikamente und Impfstoffe bildet daher das
Verständnis der regulatorischen viralen Prozesse während der lytischen Replikation des
Virus. HCMV repliziert in direkter Assoziation zu einer zellulären subnukleären Struktur,
bekannt als nukleäre Domäne 10 (ND10), wobei die Proteine PML, Sp100 und hDaxx die
drei wichtigsten Komponenten darstellen. Dabei wurde die Funktion der Domäne noch vor
einiger Zeit kontrovers diskutiert. Es konnte gezeigt werden, dass nur ND10-assoziierte
Genome die sehr frühe (IE) Genexpression starten können, weshalb eine aktivierende
Rolle der Domäne für die HCMV-Infektion angenommen wurde. Jedoch sind
beispielsweise die ND10-Proteine PML und Sp100 durch Interferone induzierbar. Zudem
wurde gezeigt, dass viele DNA-Viren, darunter auch HCMV, eine Strategie entwickelt
haben, um ND10-Proteine zu degradieren. Kürzlich wurde schließlich gezeigt, dass PML
und hDaxx als zelluläre Restriktionsfaktoren eine HCMV-Infektion antagonisieren, weshalb
die ND10-Domänen nun als Faktoren der intrinsischen zellulären Immunabwehr betrachtet
werden.
Das Ziel dieser Studie war es daher, die Funktion von Sp100, dem dritten wichtigen
Bestandteil der ND10, weiter zu charakterisieren. Dies wurde durch die Herstellung von
Zellen mit einer Sp100-Depletion (knockdown; kd) und anschließender Infektion mit HCMV
analysiert. Weiter sollte untersucht werden, ob dabei Sp100 in direkter Wechselbeziehung
zu PML und hDaxx seine Funktion ausübt. Daher wurde die Replikation von HCMV in
Doppel-kd Zellen untersucht, die stabil eine Depletion von entweder Sp100 und PML, oder
Sp100 und Daxx aufwiesen. Schließlich sollte der Einfluss der vier unterschiedlichen
Sp100 Isoformen auf die HCMV-Infektion bestimmt werden.
Der Hauptbestandteil der ND10-Domäne ist das PML-Protein, da gezeigt werden konnte,
dass ein Fehlen zu einer Auflösung der Struktur führt. In PML-depletierten Zellen sollte
nun untersucht werden, welchen Einfluss diese Depletion auf die zelluläre Genexpression
hat. Um dies zu analysieren, sollte eine Affymetrix Microarray-Analyse durchgeführt
werden. Weiter sollte damit der Einfluss der Induktion mit Interferon-γ auf die
Genexpression in An- und Abwesenheit von PML verglichen werden.
Mit dem viralen Tegumentprotein pp71 hat HCMV ein Strategie entwickelt der durch ND10
vermittelten Immunabwehr zu entgehen, indem es das Daxx-Protein degradiert. Der
Mechanismus der Daxx-Degradation sollte daher näher charakterisiert werden, um die
Wechselbeziehung zwischen Zelle und Virus besser zu verstehen.
D. Material und Methoden
14
D. Material und Methoden
1. Biologisches Material
1.1 Bakterienstämme
Escherichia coli: DH10B: F- araD139 ∆(ara,leu)7697 ∆lacX74 galU galK rpsL deoRΦ80lac
∆M15 endA1 nupG recA1 mcrA ∆mrr hsdRMS mcrBC (Grant et al., 1990)
Escherichia coli: DH5α: F- endA hsdR17(rK-,mK+) supE44 thi-1 λ-recA1 gyrA96 relA1 deoR
∆(lacZYA- argF)-U169 Φ80lac ∆M15 (Grant et al., 1990)
1.2 Hefezellen
Saccharomyces cerevisiae: Y153: MATa leu2-3, 112 ura3-52 trp1-901 his3-∆200 ade2101 lys2-801 gal4-542 gal80-538 URA3::GAL-lacZ LYS2::GAL-HIS3 can1r (Durfee et al.,
1993)
1.3 Zelllinien
HFF: Humane Vorhaut-Fibroblasten (human foreskin fibroblasts)
HEK293T: Durch Adenovirus 5 (Ad5) transformierte humane Nierenepithelzelllinie, mit
einem stabil ins Genom integrierten SV40 T-Antigen (Pear et al., 1993)
Vector: Mit dem Leervektor pSirenRetroQ stabil transduzierte HFF, diente als
Kontrollzelllinie (Rechter, 2004;Tavalai et al., 2006)
siC: Mit einer nicht funktionellen shRNA stabil transduzierte HFF, diente als
Kontrollzelllinie (Rechter, 2004;Tavalai et al., 2006)
siDaxx: Mit einer shRNA gegen Daxx stabil transduzierte HFF (Rechter, 2004;Tavalai et
al., 2006)
siPML: Zelllinie mit einer Depletion aller PML-Isoformen nach stabiler Transduktion von
HFF mit einer shRNA gegen PML (Rechter, 2004;Tavalai et al., 2006)
1.4 Virusstämme
HCMV AD169: HCMV-Laborstamm (ROWE et al., 1956)
D. Material und Methoden
15
CR208: Towne-Stamm von HCMV mit einer IE1-Deletion (Greaves & Mocarski, 1998)
AD169/del-pp71: AD169-Stamm von HCMV mit einer pp71-Depletion (Tavalai, 2005)
AD169-GFP: Rekombinanter AD169-Stamm von HCMV mit integrierter kodierender
Sequenz des GFP (green fluorescent protein) unter der Kontrolle des HCMV-IE
Promotor/Enhancers (Marschall et al., 2000)
1.5 Antikörper
1.5.1 Monoklonale Antikörper
BS510: monoklonaler Maus-Antikörper gegen UL44, wurde freundlicherweise von Prof. B.
Plachter zur Verfügung gestellt (Plachter et al., 1992)
AC-15: monoklonaler Maus-Antikörper gegen das zelluläre β-actin (Sigma-Aldrich,
Deisendorf, Deutschland)
M2: monoklonaler Maus-Antikörper gegen das Flag-Epitop (DYKDDDDK) (Sigma-Aldrich,
Deisendorf, Deutschland)
PG-M3: monoklonaler Maus-Antikörper gegen PML (Santa Cruz Biotechnology, Santa
Cruz, USA)
5E10: monoklonaler Maus-Antikörper gegen PML, freundlicherweise von Roel v. Driel zur
Verfügung gestellt (Stuurman et al., 1992)
MCA2143: monoklonaler Maus-Antikörper gegen zelluläres hDaxx (Serotec, Oxford,
England)
Anti-hDaxx: monoklonaler Kaninchen-Antikörper gegen hDaxx (Epitomics, Burlingam,
USA)
mAb 63-27: monoklonaler Maus-Antikörper für den Nachweis von IE1 (Andreoni et al.,
1989)
mAb 65-33: monoklonaler Maus-Antikörper gegen pp65, freundlicherweise zur Verfügung
gestellt von Dr. W. Britt (Birmimgham, USA)
mAb 69-66: monoklonaler Maus-Antikörper gegen UL69 (Winkler et al., 1994)
mAb 41-18: monoklonaler Maus-Antikörper gegen pp28 (Sanchez et al., 2000)
mAb 28-4: monoklonaler Maus-Antikörper gegen MCP (Waldo et al., 1989)
9E10: monoklonaler Maus-Antikörper gegen das myc-Epitop (MEQKLISEDL)
D01: monoklonaler Maus-Antikörper gegen p53 (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz,
USA)
16
D. Material und Methoden
1.5.2 Polyklonale Antikörper
B01: polyklonaler Maus-Antikörper gegen Sp100 (Abnova, Heidelberg, Deutschland)
H-60: polyklonaler Kaninchen-Antikörper gegen Sp100 (Santa Cruz Biotechnology, Santa
Cruz, USA)
Anti-pHM178: polyklonaler Kaninchen-Antikörper zum Nachweis des viralen IE2-Proteins
H-238: polyklonaler Kaninchen-Antikörper gegen PML (Santa Cruz Biotechnology, Santa
Cruz, USA)
M-117:
polyklonaler
Kaninchen-Antikörper
gegen
zelluläres
hDaxx
(Santa
Cruz
Biotechnology, Santa Cruz, USA)
Anti-SPOP: polyklonaler Ziege-Antikörper gegen den C-terminale Ende von SPOP (Santa
Cruz Biotechnology, Santa Cruz, USA)
Anti-HA.11:
Kaninchen-Serum,
gerichtet gegen
das Epitop
(YPYDVPDYA)
des
Hämaglutinin-Proteins des humanen Influenza Virus (HISS Diagnostics GmbH, Freiburg,
Deutschland)
1.5.3 Sekundärantikörper
Alle Sekundärantikörper für Nachweise im Western Blot sind HRP- (horseradish
peroxidase) gekoppelt und wurden von Dianova (Hamburg, Deutschland) bezogen.
-
HRP Ziege anti-Maus IgG (H+L)
-
HRP Ziege anti-Kaninchen IgG (H+L)
Für Immunofluoreszenz-Analysen wurden fluoreszenz-konjugierte (Alexa 488, Alexa 555)
Antikörper verwendet (Invitrogen, Molecular Probes, Karlsruhe, Deutschland)
-
Alexa 488- bzw. Alexa 555- konjugierte Ziege anti Maus IgG (H+L)
-
Alexa 488- bzw. Alexa 555- konjugierte Ziege anti Kaninchen IgG (H+L)
-
Alexa 488- bzw. Alexa 555- konjugierte Esel anti Ziege IgG (H+L)
Für die Analyse mittels Durchflusszytometrie wurde ein APC gekoppelter Antikörper
verwendet (Dianova, Hamburg, Deutschland)
-
APC Ziege anti-Maus IgG (H+L)
D. Material und Methoden
17
2. Enzyme, Chemikalien und Medien
2.1 Enzyme
Restriktionsenzyme wurden von New England Biolabs (Frankfurt, Deutschland) und von
Roche (Mannheim, Deutschland) bezogen und nach den Herstellerangaben mit den
dazugehörigen Puffern verwendet.
Sonstige Enzyme:
-
Alkalische Shrimps-Phosphatase: MBI, Fermentas, St.Leon-Rot, Deutschland
-
T4 DNA Ligase: Invitrogen, Karlsruhe, Deutschland
-
DNase I: New England Biolabs, Frankfurt, Deutschland
-
DNA-Ligase: New England Biolabs, Frankfurt, Deutschland
-
Vent-DNA Polymerase: New England Biolabs, Frankfurt, Deutschland
2.2 Chemikalien und Standard-Puffer
a) Chemikalien
Alle Chemikalien wurden von folgenden Firmen bezogen: Biomol (Hamburg, Deutschland),
Boehringer (Mannheim, Deutschland), Merck (Darmstadt, Deutschland), Roth (Karlsruhe,
Deutschland), Sigma-Aldrich (Deisendorf, Deutschland), Bayer (Leverkusen, Deutschland)
b) Puffer und Lösungen
Puffer Z: 10,6g Na2HPO4*2H20; 5,8g NaH2PO4+H2O; 0,75g KCl; 0,246g MgSO4+7H20
einwiegen und bis zu einem Endvolumen von 1l mit H2O auffüllen; anschließend den pHWert auf 7,0 einstellen
X-Gal-Lösung: 500ml Puffer Z; 135µl β-Mercaptoethanol, 835µl X-Gal (20mg/ml) in
Dimethylformamid
LP-Mix: 400g PEG; 10,2g Lithiumacetat, 10ml 1M Tris/HCL (pH 7,5); 2ml 0,5M EDTA
(pH 8); auf 1l mit H20 auffüllen und autoklavieren
Li-Acetat: 0.2M Lithium-Acetat in H2O, steril filtriert
Agarose-Lösung: 1% (bzw. 2%) Agarose in 1x TE Puffer
1x TE Puffer: 10mM Tris/HCl (pH 6,8); 1mM EDTA
6x DNA Auftragepuffer: 30% Glycerol; 0,25% Bromphenolblau; 0,25% Xylencyanol
D. Material und Methoden
18
PBSo: (Phosphat-gepufferte Saline ohne CaCl2 und MgCl2)138mM NaCl; 2,7mM KCl;
6,5mM Na2HPO4; 1,5mM KH2PO4
PBSo/Tween: 0,1% Tween® 20 werden in PBSo gelöst
4xSDS Auftragepuffer: 125mM Tris/HCl (pH 6,8); 2mM EDTA; 20% Glycerol; 4% SDS;
10% β-Mercaptoethanol; 0,01% Bromphenolblau
Western Blot Puffer: 15,1g Tris; 75g Glycin; 1l Ethanol; mit H2O auf 5l auffüllen
ECL-Lösung A: 50mg Luminol gelöst in 200ml 0,1M Tris/HCl (pH 8,6)
ECL-Lösung B: 11mg p-Hydroxycoumarinsäure gelöst in 10ml DMSO
10x SDS-PAGE Puffer: 286g Glycin; 60,6g Tris; 20g SDS; mit H2O auf 2l auffüllen
4% Paraformaldeyd-Lösung: 8g PFA in 100ml H2O unter Wärmeeinwirkung und einigen
Tropfen 1N NaOH lösen; nach dem Abkühlen 100ml 2xPBSo zugeben
TritonX-100-Lösung: 0,2% TritonX-100 in PBSo lösen
Kristallviolett-Lösung: 1% Kristallviolett in 20%igem Ethanol lösen
Phenol:Chloroform:Isoamylalkohol-Lösung: die drei Chemikalen werden im Verhältnis
25:24:1 miteinander gemischt
10x DNase Puffer: 400mM Tris-HCl; 50mM NaCl; 2mM MgCl2; 10mM CaCl2; pH 7,9
RNA-Ladepuffer: 0,72ml Formamid; 0,16ml 10xMOPS; 0,26ml 37% Formaldeyd; 0,18ml
H2O; 0,1ml 80% Glycerol; 0,08ml 0,25% Bromphenolblau; Lagerung bei 4°C für 1-2
Wochen
10xMOPS: 200mM MOPS; 50mM Natriumacetat (pH 7,0); 10mM EDTA (pH 8,0) in H2O;
Lösung im Dunkeln lagern und verwerfen, sobald eine Gelbfärbung eintritt
HEPES/MgCl2-Puffer: 50mM Hepes (pH 7,5); 1mM MgCl2
Plaque-Overlay-Medium: Lösung 1 (2xMEM; Glutamin, Gentamycin, 20%FKS) und
Lösung 2 (0,6% Agarose in H2O, autoklaviert) im Verhältnis 1:1 mischen und auf 37°Grad
temperieren
2x GFP-Lysepuffer: 62,5ml 100mM Tris (pH 7,8); 500µl 1M DTT; 0,173g DCTA (Diaminocyclohexantetraessigsäure); 2,5ml TritonX-100; 25ml Gylcerol; mit H20 auf 125ml
auffüllen. Vor dem Gebrauch mit H2O 1:1 verdünnen.
CaCl2-Lösung: 2,5M CaCl2 in H2O, steril filtriert
2xBES: (BES-gepufferte Saline) 50mM BES, 280mM NaCl, 1,5mM Na2HPO4 lösen;
anschließend wurde der pH-Wert auf 6,95 eingestellt
Saponin-Puffer: 0,5% Saponin in PBSo lösen, bei 4°C lagern
Ko-IP Lyse-Puffer: 7,5ml 1M Tris-HCl, 4,5ml 5M NaCl, 1,5ml 0,5M EDTA, 0,75ml NP-40,
auf 150ml mit H2O auffüllen
D. Material und Methoden
19
2.3 Medien
2.3.1 Bakterienmedien
SOC-Medium: 20g/l Bacto/Trypton; 5g/l Bacto-Hefeextrakt; 2,5mM NaCl, 10mM MgCl2;
20mM Glukose; in H2O lösen und steril filtrieren
Luria-Bertani-Medium (LB-Medium): 10g Bacto-Trypton; 5g Bacto-Hefeextrakt; 8g
NaCl; 1g Glukose in 1l H2O (pH 7,2); autoklaviert. Bei Bedarf Zugabe von
Ampicillin (100 µg/ml) zur Selektion positiver Klone.
Luria-Bertani-Agarplatten (LB-Platten): 15g Agar in 1l LB-Medium; autoklaviert. Nach
Abkühlen der Lösung Zugabe von 1ml Ampicillin (50 mg/ml). Anschließend wurde das
Medium in sterile 10 cm-Schalen gegossen.
2.3.2 Hefemedien
YAPD (Hefe-Vollmedium): 10g Bacto Hefe-Extract, 20g Bacto-Pepton auf 450ml H2O
aufgefüllt; nach dem Autoklavieren wurden 50ml 20% Glukose zugegeben.
20x Aminosäuremix UHWL-: 0,9g Adenin; 0,43g Arginin; 2,16g Asparaginsäure; 2,16g
Glutaminsäure; 0,65g Isoleucin; 0,65g Lysin; 0,43g Methionin; 1,08g Phenylalanin; 7,92g
Serin; 4,32g Threonin; 0,65g Tyrosin; 3,24g Valin; gelöst in 900 ml H2O und sterilfiltriert
Hefe-Minimalmedium WL-: 50ml 10x YNB; 50ml 20% Glukose; 25ml 20x Aminosäuremix
UHWL-; 5ml 100x Uracil; 2,5ml 200x Histidin wurden mit sterilem H2O auf 500 ml
aufgefüllt. Für Plattenmedien wurden 10g Bacto Agar in etwa 300 ml H2O autoklaviert.
Nach dem Abkühlen auf ca. 60°C erfolgte die Zugabe der Nährstoffe und die Lösung
wurde mit sterilem H2O auf 500ml aufgefüllt sowie in sterile 10cm-Schalen gegossen.
Hefeselektionsmedium WLU-: Analog zum WL- Medium, aber ohne Zugabe von Uracil.
2.3.3 Zellkulturmedium
MEM & DMEM: (Eagle´s minimal essential medium & Dulbecco´s modified Eagle
medium). Diese Medien wurden von Invitrogen (Karlsruhe, Deutschland) bezogen, in
sterilem H2O gelöst und der pH-Wert auf 7,0 eingestellt.
FKS (Fötales Kälberserum): FKS wurde von Cambrex (Verviers, Belgien) bezogen.
Trypsin/EDTA: 140mM NaCl; 5mM KCl; 0,56mM Na2HPO4; 5mM D(+)-Glukose, 25mM
Tris/HCl; 0,01% EDTA in 0,25%-iger Trypsin-Lösung, pH 7,0.
D. Material und Methoden
20
Einfriermedium: 6g Glukose wurden in 20ml DMSO und 30ml 1640 Medium gelöst,
steril filtriert und bei -20°C gelagert.
3. Nukleinsäuren
3.1 Oligonukleotide
Alle folgenden Oligonukleotide wurden von der Firma Biomers.net (Ulm, Deutschland)
bezogen. Die Sequenzen wurden in 5’-3’ Richtung notiert und Schnittstellen für
Restriktionsenzyme wurden unterstrichen.
3.1.1 Sequenzierprimer
Nr.:
6-36:
7-36:
7-35:
34-10:
34-11:
33-94:
28-98:
28-99:
29-00:
29-01:
Name:
T7
GAL4-AD
GAL4-BD
SPOP-fw
SPOP-rev
Sp100 200
Sp100 850
Sp100 1400
Sp100 2000
Sp100 2600
Sequenez:
TAATACGACTCACTATAGGG
GCGTTTGGAATCACTACAGGG
TCTAACATTGAGACAGCATAG
ATGTCAAGGGTTCCAAGTCC
AGGATTGCTTCAGGCGTTTG
GGTGGAGATTTCAAATGCAATAAAAAAGACATTTCC
ATGCCCTGCCCGTTGCCCTGTGA
ACCTGAGTAATGGAGAAGAGCTT
GAGACCGCGGAGCATCCAAGAACT
TCAAGTACAGGACATCTTTGAGAA
3.1.2 Primer für PCR-Klonierungen
a) Für Gateway-Klonierungen der Sp100 Isoformen
28-69:
5’attB1_FLAG
GGGGACAAGTTTGTACAAAAAAGCAGGCTATGGACTACAAAGACGATGA
33-53:
3'Sp100A-attB2
GGGACCACTTTGTACAAGAAAGCTGGGTCCTACTAATCTTCTTTACCTGACCC
33-54:
3'Sp100B-attB2
GGGACCACTTTGTACAAGAAAGCTGGGTCCTATCACTTGATCGTCACCTTTTTTCTTG
TG
33-55:
3'Sp100C-attB2
GGGACCACTTTGTACAAGAAAGCTGGGTCCTATCACTTGATCGTCACCTTTTTCTTGT
G
33-56:
3'Sp100HMG-attB2
GGGACCACTTTGTACAAGAAAGCTGGGTCCTATTATTTATCATCATCTTCTTC
D. Material und Methoden
21
b) Primer für PCR-Klonierungen
26-01: 5'Sp100-EcoRV
CATAGATATCCATGGCAGGTGGGGGCGGCGACCTG
26-02: 3'Sp100A-Not1
CATAGCGGCCGCGATCTGAAGTTTTTATTTCTG
34-26: Roc1-5-aa1-Hefe
GCATGGATCCGTATGGCGGCAGCGATGGATGTGGATACC
34-27: Roc1-5-aa30-Hefe GCATGGATCCGTGTAGCCCTCTGGGCCTGGGATATTGTG
34-28: Roc1-5-aa53-Hefe
GCATGGATCCGTTGCATAGAATGTCAAGCTAACCAGGCGTCC
34-29: Roc1-5-aa75-Hefe
GCATGGATCCGTTGTAACCATGCTTTTCACTTCCACTGCATC
34-30: Roc1-5-aa1-neu
GCATGGATCCATGGCGGCAGCGATGGATGTGGATACC
34-31: Roc1-5-aa30-neu
GCATGGATCCGTAGCCCTCTGGGCCTGGGATATTGTG
34-32: Roc1-5-aa53-neu
GCATGGATCCTGCATAGAATGTCAAGCTAACCAGGCGTCC
34-33: Roc1-5-aa75-neu
GCATGGATCCTGTAACCATGCTTTTCACTTCCACTGCATC
34-34: Roc1-3-aa109
GCATGTCGACCTAGTGCCCATACTTTTGGAATTCCCACTC
34-35: Roc1-3-aa98
GCATGTCGACGAGCCAGCGAGAGATGCAGTGGAAGTG
34-36: Roc1-3-aa53
GCATGTCGACGCAAAGATCCATAATGTGGTTCCTGCAGAT
3.1.3 Primer für shRNA-Konstrukte
Die folgenden Oligonukleotid-Paare wurden nach der Annealing-Reaktion über die BamH1
und EcoR1 Restriktionsschnittstellen in den linearisierten Vektor pSirenRetroQ eingefügt.
Die siRNA Erkennungssequenz wurde unterstrichen.
34-39:
5'siSPOP-2-neu
GATCCGGATTTCATCAACTATCATGCCGAAGCATGATAGTTGATGAAATCCTTTTTTAC
GCGTG
34-40:
3'siSPOP-2-neu
AATTCACGCGTAAAAAAGGATTTCATCAACTATCATGCTTCGGCATGATAGTTGATGA
AATCCG
34-43:
5'siRoc1-2
GATCCGCATAGAATGTCAAGCTAACCCGAAGGTTAGCTTGACATTCTATGCTTTTTTA
CGCGTG
34-44:
3'siRoc1-2
AATTCACGCGTAAAAAAGCATAGAATGTCAAGCTAACCTTCGGGTTAGCTTGACATTC
TATGCG
22
D. Material und Methoden
26-63
5'siSp100-3
GATCCGGAAGCACTGTTCAGCGATGTCGAAACATCGCTGAACAGTGCTTCCTTTTTTA
CGCGTG
26-64
3'siSp100-3
AATTCACGCGTAAAAAAGGAAGCACTGTTCAGCGATGTTTCGACATCGCTGAACAGT
GCTTCCG
3.2 Vektoren und Plasmide
3.2.1 Ausgangsvektoren
pHM971: Eukaryoter Expressionsvektor auf der Basis des pcDNA3-Vektors, zur
Expression von Proteinen in Fusion mit dem Flag-Epitop. Nach der Insertion von Genen in
die multiple Klonierungsstelle (MCS) ist das Flag-Epitop N-terminal.
pHM1580: Eukaryoter Expressionsvektor auf der Basis des pcDNA3-Vektors, zur
Expression von Proteinen in Fusion mit dem myc-Epitop. Nach der Insertion von Genen in
die multiple Klonierungsstelle (MCS) ist das myc-Epitop N-terminal.
pACT1: Hefe-Expressionsvektor für die Herstellung von Fusionsproteinen mit der GAL4
Aktivierungsdomäne. Enthält das Leu2 Gen für die Wachstumsselektion in Minimalmedium
und das ampr Gen für die Selektion in Bakterien (Durfee et al., 1993).
pGAD424: Hefe-Expressionsvektor für die Herstellung von Fusionsproteinen mit der GAL4
Aktivierungsdomäne. Enthält das Leu2 Gen für die Wachstumsselektion in Minimalmedium
und das ampr Gen für die Selektion in Bakterien (BD Biosciences Clontech, Palo Alto,
USA).
pGBT9: Hefe-Expressionsvektor für die Herstellung von Fusionsproteinen mit der GAL4
DNA-Bindedomäne. Enthält das TRP1-Gen für die Selektion in Minimalmedium und das
ampr Gen für die Selektion in Bakterien (BD Biosciences Clontech, Palo Alto, USA).
3.2.2 Zur Verfügung gestellte Plasmide
pHM300: Hefe-Expressionsvektor, kodiert für UL69, fusioniert an die GAL4-Bindedomäne
(Winkler, 1997).
pHM301:
Hefe-Expressionsvektor,
kodiert
für
UL69
fusioniert
an
die
GAL4-
Aktivierungsdomäne (Winkler, 1997).
pTD1: Großes T-Antigen (AS 84-708) des SV40, fusioniert mit GAL4-AD in pGAD3F
(Chien et al., 1991).
23
D. Material und Methoden
pVA3: Humanes p53 (AS 72-390), fusioniert an die GAL4-BD in pGBT9 (Iwabuchi et al.,
1993).
pHM869: Hefe-Expressionsvektor, kodiert für zelluläres Daxx, fusioniert an die GAL4Aktivierungsdomäne.
pHM2586:
Hefe-Expressionsvektor,
kodiert
für
SPOP
fusioniert
an
die
GAL4-
Aktivierungsdomäne.
pHM677: Hefe-Expressionsvektor, kodiert für das virale Tegumentprotein pp71 fusioniert
an die GAL4-Bindedomäne.
pHIT60: Eukaryoter Expressionsvektor, der für das Gag und Pol Protein des Murinen
Leukämievirus (MLV) unter der Kontrolle des HCMV-Promotors kodiert. Das Plasmid
wurde freundlicherweise von Prof. K. Überla (Bochum, Deutschland) zur Verfügung
gestellt.
pVSV-G: Eukaryoter Expressionsvektor der für das Glycoprotein G des Vesikulären
Stomatitis Virus (VSV) kodiert (Invitrogen, Karlsruhe, Deutschland). Die Expression
ermöglicht die Herstellung von Retroviren mit einem breiten Wirtsspektrum (Burns et al.,
1993).
pSirenRetroQ: (sileer, vector) Selbst-inaktivierender retroviraler Vektor, zur Expression
doppelsträngiger shRNA’s (short hairpin RNAs) unter der Kontrolle des U6 Promotors (BD
Biosciences Clontech, Palto Alto, USA).
siC: Selbst-inaktivierender retroviraler Vektor auf Basis des pSirenRetroQ, zur Expression
einer nicht funktionellen shRNA, da die komplementierende Sequenz fehlt.
siDaxx: Selbst-inaktivierender retroviraler Vektor auf Basis des pSirenRetroQ, zur
Expression einer shRNA gegen das zelluläre Daxx Protein.
siPML: Selbst-inaktivierender retroviraler Vektor auf Basis des pSirenRetroQ, zur
Expression einer shRNA gegen alle Isoformen des PML Protein.
pHM2236: myc PML → Eukaryoter Expressionsvektor der für die Isoform IV von PML,
fusioniert an ein myc-Epitop, kodiert.
pHM1011: Eukaryoter Expressionsvektor für Sp100A mit einem N-terminalen Flag-Epitop.
pF869: Eukaryoter Expressionvektor, der für das zelluläre SPOP-Protein kodiert, fusioniert
an ein N-terminales Flag-Epitop unter der Kontrolle des HCMV-Promotors. Das Plasmid
wurde freundlicherweise von E. Verhoeven zur Verfügung gestellt (Hernandez-Munoz et
al., 2005).
pF870: Eukaryoter Expressionsvektor auf der Basis von pMT2SM-myc, durch den das
Fusionsprotein myc-SPOP exprimiert wird. Das Plasmid wurde freundlicherweise von E.
Verhoeven zur Verfügung gestellt (Hernandez-Munoz et al., 2005).
24
D. Material und Methoden
pF871: Eukaryoter Expressionsvektor für Cullin3 in Fusion mit einem N-terminalen FlagEpitop. Das Plasmid wurde freundlicherweise von E. Verhoeven zur Verfügung gestellt
(Hernandez-Munoz et al., 2005).
pF872: Eukaryoter Expressionsvektor für Roc1 mit einem N-terminalen Myc-Epitop unter
der Kontrolle des CMV-Promotors. Das Plasmid wurde freundlicherweise von E.
Verhoeven zur Verfügung gestellt (Hernandez-Munoz et al., 2005).
pF875: Eukaryoter Expressionsvektor auf der Basis von pcDNA3.1(+), der für SPOP
kodiert, welches N-terminal mit einem HA-Epitop fusioniert ist. Das Plasmid wurde
freundlicherweise von JE. Kwon zur Verfügung gestellt (Kwon et al., 2006).
pF877: Eukaryoter Expressionsvektor auf der Basis von pcDNA3.1(+), der für das zelluläre
Roc1 Protein kodiert, welches N-terminal an ein Flag-Epitop fusioniert ist. Das Plasmid
wurde freundlicherweise von JE. Kwon zur Verfügung gestellt (Kwon et al., 2006).
pF883 Eukaryoter Expressionsvektor, kodiert für die Isoform A von Sp100 in Fusion mit
einem N-terminalen HA-Epitop. Das Plasmid wurde freundlicherweise von Prof. G. Maul
zur Verfügung gestellt (Negorev et al., 2006).
pF884: Eukaryoter Expressionsvektor, kodiert für die Isoform B von Sp100 in Fusion mit
einem N-terminalen HA-Epitop. Das Plasmid wurde freundlicherweise von Prof. G. Maul
zur Verfügung gestellt (Negorev et al., 2006).
pF885: Eukaryoter Expressionsvektor, kodiert für die Isoform C von Sp100 in Fusion mit
einem N-terminalen HA-Epitop. Das Plasmid wurde freundlicherweise von Prof. G. Maul
zur Verfügung gestellt (Negorev et al., 2006).
pF886: Eukaryoter Expressionsvektor, kodiert für die Isoform HMG von Sp100 in Fusion
mit einem N-terminalen HA-Epitop. Das Plasmid wurde freundlicherweise von Prof. G.
Maul zur Verfügung gestellt (Negorev et al., 2006).
pDONR221: Vektor von Invitrogen (Karlsruhe, Deutschland) mit flankierenden attP1 und
attP2 Stellen, über die eine Gateway-Rekombinationsreaktion mit einem PCR Produkt mit
entsprechenden attB1 und attB2 Stellen möglich ist. Das entsprechende Endprodukt kann
für weiterführende Rekombinationsreaktionen eingesetzt werden, um beispielsweise einen
lentiviralen Expressionsvektor zu generieren.
pLenti6.4/R4R2/V5-Dest:
Lentiviraler
Zielvektor
mit
attR4/attR2
Rekombinations-
Erkennungssequenzen für Gateway-Klonierungen (Invitrogen, Karlsruhe, Deutschland).
Der Vektor enthält das ampr Gen für die Selektion in Bakterien und das Blasticidinr Gen für
die anschließende Selektion in stabil transduzierten Zellen. Die über die Rekombination
eingefügte kodierende Sequenz wird über einen Promotor nach Wahl exprimiert.
25
D. Material und Methoden
pENTR-5-EF1α:
Dieser
Vektor
enthält
die
attL4/attR1
Rekombinations-
Erkennungssequenzen und gibt über die Rekombination den EF1α-Promotor an den
Endvektor weiter (Gateway-Klonierung). Damit kann eine hohe Expressionsrate in einer
großen Anzahl an verschiedenen Zelltypen erreichet werden.
pENTR-5-CMV:
Dieser
Vektor
enthält
die
attL4/attR1
Rekombinations-
Erkennungssequenzen und gibt über die Rekombination den CMV-Promotor an den
Endvektor weiter (Gateway Klonierung).
3.2.3 Neue Plasmidkonstrukte
a) shRNA-Konstrukte zur Herstellung stabiler Zelllinien
pHM2940: Expressionsvektor auf der Basis des pSirenRetroQ, der eine shRNA gegen alle
vier Sp100 Isoformen exprimiert. → siSp100 Zelllinie
pHM3416: Expressionsvektor auf der Basis des pSirenRetroQ, der eine shRNA gegen das
zelluläre SPOP Protein exprimiert. → siSPOP Zelllinie
pHM3417: Expressionsvektor auf der Basis des pSirenRetroQ, der eine shRNA gegen das
zelluläre Roc1 Protein exprimiert. → siRoc1 Zelllinie
b) Sp100-Isoformen in Fusion mit einem N-terminalen Flag-Epitop
pHM3355: Sp100A wurde mit den Oligonukleotiden 26-01 und 26-02 mittels PCR aus
pHM1011 amplifiziert und über die EcoRV und NotI
Restriktionsschnittstellen in den
Vektor pHM971 eingefügt. → Flag-Sp100A
pHM3418: Sp100B wurde mit den Oligonukleotiden 26-01 und 26-03 mittels PCR aus
pF884 amplifiziert und über die EcoRV und NotI Restriktionsschnittstellen in den Vektor
pHM971 eingefügt. → Flag-Sp100B
pHM3419: Sp100C wurde mit den Oligonukleotiden 26-01 und 26-04 mittels PCR aus
pF885 amplifiziert und über die EcoRV und NotI Restriktionsschnittstellen in den Vektor
pHM971 eingefügt. → Flag-Sp100C
pHM3420: Sp100HMG wurde mit den Oligonukleotiden 26-01 und 26-05 mittels PCR aus
pF886 amplifiziert und über die EcoRV und NotI Restriktionsschnittstellen in den Vektor
pHM971 eingefügt. → Flag-Sp100HMG
26
D. Material und Methoden
c) Sp100-Isoformen im Gateway-Klonierungssystem von Invitrogen zur Herstellung
von stabil exprimierenden Zelllinien
pHM3421: Das Produkt der PCR-Reaktion aus pHM3355 mit den Oligonukleotiden 28-69
+ 33-53 (= attB1-Sp100A-attB2) wurde über eine BP-Rekombinationsreaktion in den
Vektor pDONR221 eingefügt und anschließend für weitere Reaktionen verwendet.
pHM3422: Das Produkt der PCR-Reaktion aus pHM3418 mit den Oligonukleotiden 28-69
+ 33-54 (= attB1-Sp100B-attB2) wurde über eine BP-Rekombinationsreaktion in den
Vektor pDONR221 eingefügt und anschließend für weitere Reaktionen verwendet.
pHM3423: Das Produkt der PCR-Reaktion aus pHM3420 mit den Oligonukleotiden 28-69
+ 33-56 (= attB1-Sp100HMG-attB2) wurde über eine BP-Rekombinationsreaktion in den
Vektor pDONR221 eingefügt und anschließend für weitere Reaktionen verwendet.
pHM3424: LR-Rekombinationsreaktion zwischen den Vektoren pLenti6.4/R4R2/V5-Dest,
pENTR-5-EF1α und pHM3421. Der resultierende lentivirale Expressionsvektor kodiert für
Sp100A in Fusion mit einem N-terminalen Flag-Epitop unter der Kontrolle des EF1αPromotors.
pHM3425: LR-Rekombinationsreaktion zwischen den Vektoren pLenti6.4/R4R2/V5-Dest,
pENTR-5-EF1α und pHM3422. Der resultierende lentivirale Expressionsvektor kodiert für
Sp100B in Fusion mit einem N-terminalen Flag-Epitop unter der Kontrolle des EF1αPromotors.
pHM3426:
Kombinierte
pLenti6.4/R4R2/V5-Dest,
BP/LR-Reaktion
pENTR-5-EF1α
zwischen
und
dem
den
Vektoren
PCR-Produkt
pDONR221,
ausgehend
von
pHM3419 mit den Oligonukleotiden 28-69 + 33-55. Der resultierende lentivirale
Expressionsvektor kodiert für Sp100C in Fusion mit einem N-terminalen Flag-Epitop unter
der Kontrolle des EF1α-Promotors.
pHM3427: LR-Rekombinationsreaktion zwischen den Vektoren pLenti6.4/R4R2/V5-Dest,
pENTR-5-EF1α und pHM3423. Der resultierende lentivirale Expressionsvektor kodiert für
Sp100HMG in Fusion mit einem N-terminalen Flag-Epitop unter der Kontrolle des EF1αPromotors.
pHM3428: LR-Rekombinationsreaktion zwischen den Vektoren pLenti6.4/R4R2/V5-Dest,
pENTR-5-CMV und pHM3421. Der resultierende lentivirale Expressionsvektor kodiert für
Sp100A in Fusion mit einem N-terminalen Flag-Epitop unter der Kontrolle des CMVPromotors.
pHM3429: LR-Rekombinationsreaktion zwischen den Vektoren pLenti6.4/R4R2/V5-Dest,
pENTR-5-CMV und pHM3422. Der resultierende lentivirale Expressionsvektor kodiert für
27
D. Material und Methoden
Sp100B in Fusion mit einem N-terminalen Flag-Epitop unter der Kontrolle des CMVPromotors.
pHM3430:
Kombinierte
pLenti6.4/R4R2/V5-Dest,
BP/LR-Reaktion
pENTR-5-CMV
zwischen
und
dem
den
Vektoren
PCR-Produkt
pDONR221,
ausgehend
von
pHM3419 mit den Oligonukleotiden 28-69 + 33-55. Der resultierende lentivirale
Expressionsvektor kodiert für Sp100C in Fusion mit einem N-terminalen Flag-Epitop unter
der Kontrolle des CMV-Promotors.
pHM3431: LR-Rekombinationsreaktion zwischen den Vektoren pLenti6.4/R4R2/V5-Dest,
pENTR-5-CMV und pHM3423. Der resultierende lentivirale Expressionsvektor kodiert für
Sp100HMG in Fusion mit einem N-terminalen Flag-Epitop unter der Kontrolle des CMVPromotors.
d) Roc1-Konstrukte in Hefe-Expressionsvektoren
Mittels einer PCR-Reaktion ausgehend von pF872 wurden Roc1-Volllängen und
Deletionskonstrukte hergestellt und über die Schnittstellen BamHI und SalI in die
Hefevektoren pGBT9 bzw. pGAD424 eingefügt.
Neues Plasmid:
pHM3371
pHM3372
pHM3373
pHM3374
pHM3375
pHM3376
pHM3377
pHM3378
pHM3379
pHM3380
pHM3381
pHM3382
Vektor:
pGBT9
pGBT9
pGBT9
pGBT9
pGBT9
pGBT9
pGAD424
pGAD424
pGAD424
pGAD424
pGAD424
pGAD424
Oligos:
34-26 + 34-34
34-26 + 34-36
34-26 + 34-35
34-28 + 34-35
34-29 + 34-34
34-27 + 34-34
34-26 + 34-34
34-26 + 34-36
34-26 + 34-35
34-28 + 34-35
34-29 + 34-34
34-27 + 34-34
Roc1 as:
as1-109
as1-53
as1-98
as53-98
as75-109
as30-109
as1-109
as1-53
as1-98
as53-98
as75-109
as30-109
e) Roc1-Konstrukte in eukaryoten Expressionsvektoren
Mittels
einer
PCR
ausgehend
von
pF872
wurden
Roc1-Volllängen
und
Deletionskonstrukte hergestellt und über die Schnittstellen BamHI und XhoI in die
Expressionsvektoren pHM971 bzw. pHM1580 eingefügt. Die XhoI Restriktionsschnittstelle
geht dabei verloren. Zur Bestätigung von positiven Klonen wurden bei einer
Verdaureaktion die Restriktionsenzyme BamH1 und XbaI verwendet.
Neues Plasmid:
pHM3384
pHM3385
Vektor:
pHM971
pHM971
Oligos:
34-30 + 34-34
34-30 + 34-36
Roc1 as:
as1-109
as1-53
28
D. Material und Methoden
pHM3386
pHM3387
pHM3388
pHM3389
pHM3390
pHM3391
pHM3392
pHM3393
pHM3394
pHM3395
pHM971
pHM971
pHM971
pHM971
pHM1580
pHM1580
pHM1580
pHM1580
pHM1580
pHM1580
34-30 + 34-35
34-32 + 34-35
34-33 + 34-34
34-31 + 34-34
34-30 + 34-34
34-30 + 34-36
34-30 + 34-35
34-32 + 34-35
34-33 + 34-34
34-31 + 34-34
as1-98
as53-98
as75-109
as30-109
as1-109
as1-53
as1-98
as53-98
as75-109
as30-109
3.3 Weitere Nukleinsäuren
Der DNA Ladder Gene RulerTM (DNA- Größenstandard) und der RNA-Standard für die
Bestimmung der Größe und der möglichen Menge von DNA bzw. RNA wurde von
Fermentas
(St.
Leon
Roth,
Deutschland)
bezogen.
Lachsperma-DNA
für
die
Hefetransformation wurde von Sigma-Aldrich (Deisendorf, Deutschland) erhalten.
4. Molekularbiologische Standardmethoden
Es wurden folgende molekularbiologische Standardmethoden durchgeführt:
-
Anzucht, Transformation und Lagerung von Bakterien (Sambrook et al. 1989)
-
Kleine Plasmidpräparation (Zagursky et al., 1985)
-
Große Plasmidpräparation unter Verwendung von Maxiprep und Midiprep Kits der
Firma Invitrogen (Karlsruhe, Deutschland) nach Angaben des Herstellers
-
Polymerase Ketten-Reaktion (PCR: polymerase chain reaction), zur Amplifikation
von DNA Fragmenten (Sambrook et al., 1989). DMSO oder Betaine wurden zu der
PCR, falls nötig, zugegeben, um die Reaktionseffizienz zu verbessern.
-
Elution von DNA-Fragmenten aus Agarosegelen und Aufreinigung von DNAFragmenten nach PCR mit Kits der Firma Quiagen (Hilden, Deutschland) nach
Angaben des Herstellers (QIAquick Gel Extraktion-Kit und QIAquick PCR
Purification-Kit)
-
Ethanol- und Isopropanolfällung von Nukleinsäuren, Phenol- und
Chloroformextraktion, Restriktionsspaltung, Klenow-Reaktion, Ligation und
Dephosphorylierung von DNA, Agarose Gel-Elektrophorese (Sambrook et al., 1989)
-
Photometrische Konzentrationsbestimmung von DNA (Sambrook & Russell, 2001)
29
D. Material und Methoden
-
Automatische DNA-Sequenzierung mittels eines Fluoreszenz-basierenden
ABIPrism 2000 Kapillar-Sequenzierautomats (ABI, Weiterstadt, Deutschland)
-
Trennung von Proteinen durch Polyacrylamid-Gelelektrophorese (SDS-PAGE:
sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis) (Laemmli, 1970)
-
Nachweis von Proteinen über Chemilumineszenz-Reaktion (ECL-Reaktion:
enhanced chemiluminescence immunodetection) (Amersham, Braunschweig,
Deutschland)
5. Methoden
5.1 Zellkulturtechniken
5.1.1 Hefekulturen
Noch nicht transformierte Hefezellen wurden entweder auf YAPD-Agarplatten oder in
YAPD–Flüssigmedium bei 30°C kultiviert. Nach der Transformation wurden Hefezellen auf
entsprechenden Mangelagarplatten kultiviert, um positiv transformierte Hefen zu
selektionieren.
5.1.1.1 Hefetransformation
Zur Analyse von Protein-Protein Interaktion wurde zuerst eine Hefetransformation
durchgeführt. In 5ml YAPD-Vollmedium wurden 50µl des Hefestammes Y153 angeimpft
und über Nacht bei 30°C mit 200rpm geschüttelt. Die Kultur wurde bei 1000rpm 3 min
sedimentiert, mit 5ml H2O gewaschen und nochmals zentrifugiert, um Reste des Mediums
zu entfernen. Das Pellet wurde in 500µl einer 0,2M Li-Acetat Lösung resuspendiert und in
ein Eppendorfgefäß überführt. Die Zellen wurden bei 30°C für 60min in einem Heizblock
inkubiert
und
dabei
gelegentlich
gemischt.
In
der
Zwischenzeit
wurden
die
Transformationsansätze angesetzt. Als Trägersubstanz diente zuvor für 5min bei 95°C
denaturierte und auf Eis abgekühlte, gescherte Lachssperma-DNA (10mg/ml). Davon
wurden pro Ansatz 10µl mit 2µg DNA gemischt. Zu jedem Transformationsansatz wurden
140µl der Hefezellen gegeben, gemischt und bei 30°C für 30min in einem Heizblock
inkubiert. Nach dieser Inkubation wurden 350µl 50% PEG zugegeben und die Ansätze für
weitere 60min bei 30°C inkubiert. Nun erfolgte ein Hitzeschock bei 42°C für 5min,
anschließend wurden die Hefen wieder auf Raumtemperatur abgekühlt. Zu jedem Ansatz
wurden 500µl H2O zugegeben, gemischt und die Hefezellen bei 200rpm für 2min
D. Material und Methoden
30
sedimentiert. Anschließend wurde das Pellet noch einmal mit 1ml H2O gewaschen, erneut
zentrifugiert, der Überstand entfernt und die Zellen in 100µl H2O resuspendiert. Die Zellen
wurden auf WL- Agarplatten ausgekugelt und für 2-3 Tage bei 30°C inkubiert. Durch den
Selektionsdruck auf WL-–Mangelmedium wurden Hefen selektioniert, die beide Plasmide
aufgenommen hatten.
5.1.2 Zelllinien
Eukaryote Zelllinien wurden in Plastik-Zellkulturflaschen (Nunc, Roskilde, Dänemark) bei
37°C, 5% CO2 und 80% Feuchtigkeit kultiviert. Als Medium wurde bei HEK293T Zellen
DMEM-Medium unter Zugabe von 10% (v/v) FKS, 350µg/ml Glutamin und 10µg/ml
Gentamycin verwendet. Bei HFF-Zellen wurde MEM-Medium unter Zugabe von 5% (v/v)
FKS, 350µg/ml Glutamin und 10µg/ml Gentamycin verwendet. Nach Transduktion von
HFF zur Generierung stabil exprimierender Zelllinien wurden die Zellen in DMEM, 10%
(v/v) FKS, 350µg/ml Glutamin und 10µg/ml Gentamycin, plus Zugabe von 5µg/ml
Puromycin kultiviert. Zur Weiterkultivierung wurden die Zellen mit wenigen ml
Trypsin/EDTA vom Boden der Zellkulturflasche gelöst und mit frischem Medium auf neue
Flaschen verteilt.
5.1.2.1 Transfektionsmethoden
a) Calzium-Phosphattransfektion
Zur Bestimmung der Proteinexpression oder für die Analyse von Protein-Protein
Interaktionen wurden HEK293T-Zellen mit der Calcium-Phosphat Transfektionsmethode
transfiziert (Ausubel et al., 1989). Hierfür wurden einen Tag vor der Transfektion 4,5x105
Zellen in einer Sechsloch-Platte ausgesät und für 24h bei 37°C inkubiert. Am Tag der
Transfektion sollten die Zellen etwa zu 70% dicht gewachsen sein. Eine Stunde vor der
Transfektion wurde das alte Medium von den Zellen abgenommen und durch 2ml frisches
Medium ersetzt. Pro Ansatz wurden 1µg DNA/Plasmid, 25µl 2,5M CaCl2-Lösung gemischt
und mit H2O auf 250µl aufgefüllt. In einem Falcon-Röhrchen wurden 250µl 2xBES
vorgelegt und dann der DNA/CaCl2-Mix langsam unter mischen zugetropft. Die CalciumPhosphat-Präzipitate wurden anschließend tropfenweise über die Zellen gegeben und
durch vorsichtiges Schwenken der Sechslochplatte gut verteilt. Nach einer Inkubation über
Nacht wurden die Zellen 2x vorsichtig mit je 1ml PBSo gewaschen und mit 2ml frischem
Medium für weitere 24h inkubiert. Für die Ernte der Zellen wurde zuerst das Medium
D. Material und Methoden
31
abgenommen und die Zellen mit je 1ml PBSo vom Boden der Sechslochplatte gespült, in
ein Eppendorfgefäß gegeben und bei 2500rpm für 5min sedimentiert. Das Zellpellet kann
nun direkt für die Zelllyse weiterverwendet werden oder bei -20oC bis zu einer späteren
Verwendung gelagert werden.
b) Lipofectamin-Transfektion
Die Transfektion mit Lipofectamin 2000 wurde für die Herstellung von lentiviralen bzw.
retroviralen Überständen verwendet. Hierfür wurden zunächst 5,0x106 HEK293T-Zellen in
eine 10cm Kulturschale ausgesät. Am nächsten Tag wurde vier Stunden vor der
Transfektion das alte Medium (DMEM, 10% (v/v) FKS, 350µg/ml Glutamin und 10µg/ml
Gentamycin) abgenommen und durch neues Medium (DMEM, 10% (v/v) FKS, 350µg/ml
Glutamin) ersetzt. Der Transfektionsmix setzte sich aus den Ansätzen A und B
zusammen. Für den Ansatz A wurden 4,5µg des Plasmids pVSV-G, 4,5µg des Plasmids
pHIT60 und 3µg des Lenti-Expressionsplasmids in 1,5ml Medium (DMEM, 350µg/ml
Glutamin) gemischt. Der Ansatz B bestand aus 36µl Lipofectamin 2000 in 1,5ml Medium
(DMEM, 350µg/ml Glutamin). Nach einer Inkubation von 5min bei Raumtemperatur des
Ansatzes B, wurde der DNA-Ansatz zu dem Lipofectamin-Ansatz gegeben, gemischt und
für 20min bei Raumtemperatur inkubiert. Anschließend wurde der Transfektionsmix
tropfenweise auf die Zellen gegeben und die 10cm-Schalen leicht geschwenkt und für 24h
bei 37°C inkubiert. Am nächsten Tag wurde das Medium von den Zellen abgenommen
und durch frisches Vollmedium (DMEM, 10% (v/v) FKS, 350µg/ml Glutamin und 10µg/ml
Gentamycin) ersetzt. Nach einer Inkubation von 24h bei 37°C wurden die lentiviralen
Überstände geerntet. Die Zellreste wurden über Zentrifugation bei 300rpm für 15min
entfernt und der Überstand anschließend steril filtriert (Filter: 0,45µm) und in 1ml Aliquots
bei -80°C weggefroren oder direkt für die Transduktion von HFF verwendet. Für die
Herstellung der lentiviralen Überstände der Sp100-Isoformen Expressionsplasmide
(pHM3424 – pHM3431) wurde bei sonst gleichem Protokoll statt der Plasmide pVSV-G
und pHIT60, 9µl eines kommerziellen Packaging Mixes (Invitrogen, Karlsruhe,
Deutschland) verwendet.
c) FuGENE® HD-Transfektion
Für die Analyse der Expression von Proteinen durch indirekte Immunofluoreszenz wurden
HFF-Zellen mit FuGENE® HD (Roche, Mannheim, Deutschland) transfiziert. Es wurden
3,0x105 Zellen auf Deckgläsern ausgesät und für 24h bei 37°C inkubiert. Als
Transfektionsmix wurden 4µl FuGENE® HD und 2µg DNA in 100µl Medium ohne FKS
32
D. Material und Methoden
gemischt und für 15min bei Raumtemperatur inkubiert. Der Transfektionskomplex wurde
tropfenweise auf die Zellen gegeben, die Sechsloch-Platte kurz geschwenkt und für 48h
bei 37°C inkubiert.
5.1.2.2 Herstellung von Sp100-, SPOP- und Roc1-depletierten Zellen
Für die Herstellung von HFF, die stabil einen bestimmten siRNA-Vektor enthalten, wurde,
wie beschrieben, ein replikationsdefizientes Retrovirus hergestellt, welches nach Infektion
von Zellen eine RNAi-vermittelten Depletion (knockdown; kd) des Zielproteins ermöglicht.
Die vom Vektor exprimierte shRNA wird intrazellulär zu einer siRNA prozessiert, welche
Komplementarität zur jeweiligen Ziel-mRNA aufweist. Dadurch wird die Ziel-mRNA
gespalten und durch intrazelluläre Nukleasen abgebaut.
a) Klonierung der shRNA-exprimierenden Vektoren
Die Sequenzen der für diese Studie verwendeten shRNAs wurden mit Hilfe eines
webbasierten
Programms
der
Firma
Invitrogen
erstellt
(http://rnaidesigner.invitrogen.com/rnaiexpress/). Die Synthese der korrespondierenden
Oligonukleotide erfolgte durch die Firma Biomers (Ulm). Die Klonierung der shRNAOligonukleotide in den lentiviralen Vektor pSirenRetroQ erfolgte nach Angaben des
Herstellers (Knockout RNAi System, BD Biosciences Clontech, Palo Alto, USA)
b) Bestätigung der Funktion der siRNA-Vektoren
Für die Bestätigung der Funktion der siRNA-Vektoren wurden 4,5x105 HEK293T-Zellen in
Sechslochplatten ausgesät und mittels der Calcium-Phosphatmethode transfiziert. Die
siRNA-Vektoren wurden mit einem Expressionsplasmid, welches für das Zielprotein
kodierte, kotransfiziert. Die Zellen wurden in 2xSDS-Auftragspuffer lysiert und die Probe
bei 95°C für 10min im Heizblock denaturiert. Danach wurde die Funktionalität der siRNA
durch SDS-PAGE und anschließende Western Blot-Detektion des Zielproteins verifiziert.
c) Herstellung von stabilen siRNA-exprimierenden Zelllinien
Um Zellen herzustellen, die entweder stabil eine shRNA oder stabil ein bestimmtes Protein
(Isoformen von Sp100) exprimierten, wurden lentivirale bzw. retrovirale Virusüberstände
generiert. Es wurden 8,0x104 frisch isolierte HFF-Zellen (Passagezahl ca. 7) in einer
Sechslochplatte in 2ml Medium ausgesät und für 24h bei 37°C kultiviert. Nun wurde 1ml
des Mediums entfernt und durch je 1ml des viralen Überstands ersetzt. Nach Zugabe von
33
D. Material und Methoden
15µl
Polybrene
(1mg/ml,
Sigma-Aldrich,
Deisendorf,
Deutschland),
welches
die
Infektionsrate erhöht, wurden die Zellen für 24h bei 37°C inkubiert. Am folgenden Tag
wurde das infektiöse Medium durch 2ml frisches Medium (DMEM, 10% (v/v) FKS,
350µg/ml Glutamin und 10µg/ml Gentamycin) ersetzt. Nach der Kultivierung der Zellen für
weitere 24h wurde mit der Selektion der positiv transduzierten Zellen begonnen, indem
das bisherige Medium durch das Selektionsmedium (DMEM, 10% (v/v) FKS, 350µg/ml
Glutamin, 10µg/ml Gentamycin, plus 5mg/ml Puromycin, für die KD-Zellen bzw. plus
2µg/ml Blasticidin, für die Sp100 Isoformen Zellen) ausgetauscht wurde.
5.1.2.3 Infektion von HFF-Zellen
Für die Herstellung eines Virusstocks wurden HFF-Zellen in großen Zellkulturflaschen mit
hoher MOI (multiplicity of infection) infiziert und für 2h Stunden bei 37°C inkubiert. Nach
der Virusadsorption wurden ca. 15ml Medium zu den Zellen gegeben, die Flaschen fest
verschraubt und für ca. 7-10 Tage bei 37°C inkubiert, bis ein erkennbarer zytopathischer
Effekt (CPE) auftrat und die Zellen zu ca. 70% vom Flaschenboden abgelöst waren. Der
virale Überstand wurde durch Zentrifugation bei 200rpm für 5min von Zellresten befreit
und in Aliquots bei -80°C weggefroren.
5.1.2.4 Virustiterbestimmung
Zur Bestimmung des Virustiters wurden 24h vor Infektion 8,0x104 HFF-Zellen in einer 24Lochplatte ausgesät und anschließend mit verdünnten (1:5, 1:25, 1:125, 1:625. 1:3125,
1:15625) Viruslösungen im Doppelansatz infiziert. Die Infektion erfolgte mit 300µl der
Virus-Verdünnung. Nach einer Inkubation von 2h bei 37°C wurde 500µl Medium zu den
Zellen gegeben und für weiter 48h bei 37°C kultiviert. Für die Titerbestimmung wurde nun
eine Analyse der viralen IE1-Genexpression mittels indirekter Immunfluoreszenz
durchgeführt. Hierfür wurden die Zellen zweimal mit PBSo gewaschen, mit eiskaltem
Methanol fixiert und permeabilisiert. Nach Absaugen des Methanols wurden die Zellen für
10-15min getrocknet und wieder mit PBSo rehydriert. Jetzt wurden 200µl des
monoklonalen IE1 Antikörpers zugegeben und bei 37°C für 30min inkubiert, anschließend
zweimal mit PBSo gewaschen und für weitere 30min bei 37°C mit 200µl des
Sekundärantikörpers inkubiert. Der fluoreszenz-gekoppelte Sekundärantikörper wurde
1:400 in 1%FKS in PBSo verdünnt. Nach erneutem 2-maligen Waschen mit PBSo wurden
am Mikroskop die Anzahl der IE1-positiven Zellen bei derjenigen Verdünnung bestimmt,
bei der noch ca. 10-50 IE1-positive Zellen vorhanden waren. Dieser Wert wurde mit dem
D. Material und Methoden
34
entsprechenden Verdünnungsfaktor und dem Faktor 3,333 multipliziert und der Titer in
IEU (immediate early units) pro ml angegeben.
5.1.2.5 GFP-Reporter Versuch
Für die quantitative Bestimmung der Virusreplikation über GFP-Fluoreszenzmessung
wurde ein GFP-Reporter Assay verwendet. Hierfür wurden 3,0x105 HFF oder stabil
exprimierende HFF (depletierte HFF oder Sp100-Isoformen HFF) in einer Sechslochplatte
bzw. 1,5x105 Zellen in einer 12-Lochplatte ausgesät und einen Tag später mit dem
rekombinanten HCMV-Stamm AD169-GFP mit der bei den Ergebnissen angegebenen
Virusmenge als 3fach Bestimmung infiziert. Zwei Stunden nach Infektion wurde je 1ml
frisches Medium zugegeben. Sieben Tage nach Infektion wurden die Zellen zweimal mit
PBSo gewaschen und für 10min bei 37°C mit 1x Lysepuffer inkubiert. Anschließend
wurden die Zellen durch 30-minütiges starkes Schütteln im Zellkulturgefäß lysiert, welches
durch Alufolie vor Lichteinwirkung geschützt wurde. Das Lysat wurde in ein
Eppendorfgefäß überführt und die Zellreste bei 14000rpm für 15min sedimentiert. Je 80µl
des Überstandes wurden in eine schwarze 96-Lochplatte überführt und direkt im
Anschluss die GFP-Fluoreszenz bei 488nm an einem Fluorometer (Victor, 1420 Multilabel
Counter, PerkinElmer, Boston, USA) bestimmt.
5.1.2.6 Plaque-Analyse
Als dreifach Ansätze wurden 3,0x105 HFF-Zellen oder retroviral transduzierte Zellen in
einer Sechslochplatte ausgesät und für 24h bei 37°C kultiviert. Die Zellen wurden mit je
1ml einer entsprechenden Virusmenge infiziert. Nach 2-stündiger Virusadsorption wurde
das infektiöse Medium abgenommen und durch 4ml des sogenannten Plaque-OverlayMediums ersetzt. Dieses besteht zu einem Teil aus einer 0,6%igen Agaroselösung und
zum anderen Teil aus 2xMEM Medium im Verhältnis 1:1. Die Zellen wurden nun für 7
Tage bei 37°C inkubiert, die Plaques mittels einer 1%igen Kristallviolettlösung angefärbt
und unter dem Mikroskop gezählt.
5.1.2.7 Bestimmung der Zelltoxizität
Dieser Versuch wurde mit einem Kit von Promega (Heidelberg, Deutschland) nach den
Angaben des Herstellers durchgeführt (CellTiter 96® AQueous One Solution Cell
Proliferation Assay), um die Anzahl der lebenden Zellen in Proliferation zu bestimmen.
Das zu den Zellen zugegebene MTS Tetrazolium-Reagenz ( [3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-
D. Material und Methoden
35
5-(3-carboxymethoxyphenyl)-2-(4-sulfophenyl)-2H-tetrazolium, inner salt] wird von den
Zellen zu einem farbigen, löslichen Formazan-Produkt reduziert. Die Menge des
Formazans kann quantitativ über die Absorption bei 490nm bestimmt werden und ist direkt
proportional zu der Anzahl der lebenden Zellen in der Kultur.
5.2 Indirekte Immunofluoreszenzanalyse
Die Expression und die Lokalisation bestimmter Proteine wurden endogen oder nach
Transfektion oder Infektion über indirekte Immunofluoreszenzanalyse unter Verwendung
eines konfokalen Mikroskops bestimmt. Dafür wurden Zellen auf Glasdeckgläschen
ausgesät und entsprechend des Versuchs (Infektion, Transfektion) verwendet. Zur
Analyse wurden die Zellen mittels einer 4%igen Paraformaldeydlösung für 10min fixiert.
Diese Lösung wurde abgenommen, die Zellen zweimal mit PBSo gewaschen und mit einer
0,2%igen TritonX-100 Lösung 20min bei 4°C permeabilisiert. Nach erneutem Waschen mit
PBSo erfolgte die Inkubation der Zellen für 30min bei 37°C mit den Primärantikörpern
entsprechend ihrer zu verwendenden Konzentration, verdünnt in 1%FKS in PBSo.
Anschließend wurden die Zellen dreimal mit PBSo gewaschen und mit den fluoreszenzgekoppelten Sekundärantikörpern entsprechend ihrer zu verwendenden Konzentration,
verdünnt in 1%FKS in PBSo, für 30min bei 37°C inkubiert. Schließlich wurden die
Präparate auf Deckgläschen mit Eindeckmedium fixiert. Dieses Medium (Vectashield
mounting medium; Alexis, Grünberg, Deutschland) enthält den DNA-interkalierenden
Farbstoff DAPI (4,6-Diamidino-2-phenylindol). Die Analyse und Dokumentation der
Präparate erfolgte mit einem inversen Fluoreszenzmikroskop der Firma Leica (Leica TCS
SP5), wobei jeder Kanal (488nm und 543nm Laser) einzeln das Präparat scannte, um
Kanalüberlagerungen zu vermeiden. Die als TIFF-Dateien importierten Bilder wurden
anschließend weiter in Photoshop bzw. Corel Draw verwaltet.
5.3 Durchflusszytometrie
Für die quantitative Bestimmung von Zellen, die intrazellulär ein bestimmtes Protein nach
Infektion exprimierten, wurde eine durchflusszytometrische Analyse durchgeführt. Hierfür
wurden 3,0x105 HFF bzw. stabile Depletions-HFF in einer Sechslochplatte im
Doppelansatz ausgesät und für 24h bei 37°C kultiviert. Nach Infektion mit je 1ml mit
Virusüberständen unterschiedlicher Konzentration wurden die Zellen für 2h bei 37°C
inkubiert und anschließend je 1ml frisches Medium zugegeben. 48h nach der Infektion
D. Material und Methoden
36
wurden die Zellen mit Trypsin/EDTA gelöst und in eiskaltem PBSo aufgenommen und in
ein FACS (fluorescence activated cell sorting)-Röhrchen pipettiert. Alle folgenden Schritte
wurden, soweit nicht anders angegeben, bei 4°C ausgeführt. Die Zellen wurden für 5min
bei 2000rpm sedimentiert und zweimal mit eiskaltem PBSo gewaschen. Es erfolgte eine
Fixierung der Zellen in 2%igem Paraformaldeyd bei Raumtemperatur, mit anschließendem
zweimaligem Waschen der Zellen mit eiskaltem PBSo. Jetzt wurden die Zellen auf Eis im
Dunkeln in je 1ml Saponin-Puffer für 10min inkubiert und danach bei 2000rpm für 5min
sedimentiert. Die Zellen wurden in 100µl Primärantikörper (IE1-Hybridomüberstand) für
20min auf Eis im Dunkeln inkubiert und im Anschluss 3-mal mit Saponin-Puffer
gewaschen. Der APC-gekoppelte Sekundärantikörper wurde 1:100 in Saponin-Puffer
verdünnt und die Zellen mit je 100µl für 20min auf Eis im Dunkeln inkubiert. Nach
erneutem 2-maligem Waschen in Saponin-Puffer wurden die Zellen zuletzt in 300µl
eiskaltem PBSo aufgenommen und mittels Durchflusszytometrie unter Verwendung eines
FACScalibur Flow Cytometer (BD Biosciences, Heidelberg, Deutschland) die Anzahl der
IE1-positiven Zellen bestimmt. Die Ergebnisse wurden computergestützt mit der Software
FCS Express V3 (De Novo Software, Los Angeles, USA) ausgewertet und weiter mit
Microsoft Excel 2003 bearbeitet.
5.5 Analyse von Protein/Protein-Interaktionen
5.5.1 Filterlift-Analyse
Für den Nachweis von Protein/Protein-Interaktionen im Hefesystem wurde die FilterliftAnalyse verwendet, die die Enzymaktivität des Reportergens β-Galaktosidase nachweist
(Breeden & Nasmyth, 1985). Die nach der Hefetransfektion auf WL- - Mangelagarplatten
gewachsenen Hefekolonien wurden dafür auf eine Nylonmembran gespottet (HybondTM-CExtra, Amersham, Freiburg, Deutschland) und durch Einfrieren in flüssigem Stickstoff und
erneutem Auftauen permeabilisiert. Auf ein zuvor mit X-Gal Lösung getränktes Filterpapier
wurde die Membran mit den Zellen nach oben gelegt und bei 30°C inkubiert. Aufgrund
auftretender Protein/Protein-Interaktionen zwischen den GAL4-Fusionsproteinen der
beiden kotransformierten Plasmide, färbten sich die Zellen aufgrund der β-Galaktosidase
induzierten Spaltung des X-Gal-Substrats blau. Eine eventuelle positive Reaktion wurde
alle 30min kontrolliert und protokolliert. Nach 4h wurde die Nylonmembran getrocknet und
dokumentiert.
37
D. Material und Methoden
5.5.2 Ko-Immunpräzipitation
Für die Ko-Immunpräzipitation (Ko-IP) wurden HEK293T Zellen ausgesät und die zu
untersuchenden
Expressionsplasmide
mit
der
Calcium-Phosphat
Methode
im
Doppelansatz transfiziert. Am Tag vor der Ko-IP wurden 50mg Protein A-Sepharose in
Lysepuffer für 30min auf dem Überkopftaumler bei 4°C gequollen. Pro Ansatz wurde der
ensprechende Antikörper vorgelegt, mit 500µl Lysepuffer verdünnt und anschließend die
gequollene Sepharose zugegeben. Dieser Protein-A Sepharosemix wurde über Nacht bei
4°C getaumelt. Die transfizierten Zellen wurden einmal mit kaltem PBSo gewaschen und
anschließend die Doppelansätze mit PBSo vereinigt, in ein Eppendorfgefäß überführt und
bei 4°C, bei 14000rpm für 5min sedimentiert. Zum Lysepuffer wurden jeweils frisch die
Proteinase-Inhibitoren PMSF, Aprotinin, Leupeptin und Pepstatin gegeben und die Zellen
für 20min auf Eis in 800µl Lysepuffer lysiert. Danach erfolgte ein Zentrifugationsschritt für
10min, 4°C, 14000rpm und vom Überstand wurden 2-mal 22µl als Lysatkontrollen
abgenommen. Der verbliebene Überstand (ca. 800µl) wurde zur Präzipitation zu dem
vorbereiteten Sepharose-Antikörpergemisch gegeben und für 2h auf dem Überkopftaumler
bei 4°C inkubiert. Zu den Lysatkontrollen wurden 8µl 4x SDS-Auftragspuffer gegeben und
die Proben wurden bei 95°C für 10min erhitzt. Nach der Inkubation der ProteinSepharose/Antikörperproben wurden sie fünfmal mit je 1ml Lysepuffer gewaschen, mit
14µl 4x SDS-Auftragepuffer versetzt und für 10min bei 95°C denaturiert. Anschließend
wurden die Ko-IP Proben und die Lysatkontrollen durch SDS-PAGE getrennt und die
Proteine im Western Blot durch spezifische Antikörper nachgewiesen.
5.6 RNA-Methoden
5.6.1 RNA-Isolation über Kieselgel-Säulen
Für die Isolierung von RNA aus HFF- bzw. stabil transduzierten Zellen wurden je 3,0x105
Zellen in einer Sechslochplatte ausgesät und für eine Isolation drei Ansätze vereinigt. Die
RNA-Isolation über Kieselgel-Säulen erfolgte über ein Kit-System (SV Total RNA Isolation
System) der Firma Promega (Heidelberg, Deutschland) nach Angaben des Herstellers.
Wichtig war es hierbei, die Zellen nach dem Ablösen vom Zellkultur-Schalenboden in
eiskaltem PBSo aufzunehmen und zusätzlich zur Lyse mit dem RNA-Lysepuffer die
Proben mehrmals mit einer 20-Gauge Kanüle zu scheren. Die Konzentration der isolierten
RNA wurde photometrisch bestimmt. Die RNA wurde bis zur Weiterverwendung bei -80°C
38
D. Material und Methoden
gelagert und schließlich nach Überprüfung der Integrität durch RNA Agarosegele für die
Affymetrix Microarray Analyse verwendet.
5.6.2 Affymetrix Microarray Analyse
Eine
Expressionsanalyse
Kompetenzzentrum
für
mit
dem
Fluoreszente
Affymetrix
GeneChip®
Bioanalytik
System
Microarray
wurde
Technology
vom
(KFB,
Regensburg, Deutschland) durchgeführt.
Für die Probenherstellung wurden PML-depletierte Zellen und Kontrollzellen (siC, vector)
in einer Sechslochplatte ausgesät und entweder nicht weiter behandelt (mock) oder mit
Interferon stimuliert. Hierfür wurden die Interferone alpha, beta bzw. gamma mit einer
Endkonzentration von 1000U/µl eingesetzt. Die Zellen wurden für 18h bei 37°C inkubiert
und anschließend daraus die Gesamt-RNA über Kieselgel-Säulen isoliert. 10µl der
erhaltenen RNA-Menge wurden zur Überprüfung der RNA-Integrität durch RNAAgarosegelelektrophorese verwendet; die restlichen 80µl wurden zur Durchführung der
Affymetrix
GeneChip®-Analyse
eingesetzt.
Synthese
und
Reinigung
der
cDNA,
Qualitätskontrolle der ssDNA, Markierung der ssDNA, Hybridisierung an den Microarray
Chip, Durchführung der Microarray GeneChip Analyse und eine Vorab-Daten Analyse
mittels Affymetrix Command Console und Expression Console wurden von der Firma KFB
(Regensburg) durchgeführt. Die differentielle Genexpression innerhalb der verschiedenen
Proben wurde anschließend weiter untersucht.
5.6.3 RNA-Agarosegelelektrophorese
Um die Integrität der RNA-Proben, die für die Affymetrix Microarray Analyse verwendet
wurden, zu bestimmen, wurde ein RNA-Minigel verwendet. Hierfür wurden zunächst die
RNA-Proben, wie auch der RNA-Größenstandard, lyophilisiert, anschließend in 20µl RNA
Ladepuffer aufgenommen, für 5min bei 65°C im Heizblock erhitzt und bis zur Verwendung
kurz auf Eis gelagert. Die Minigelkammer wurde vor dem Gellauf für 2h in 2%SDS in
Ethanol inkubiert und anschließend mit Aqua dest. dreimal gespült. Für das Agarosegel
wurde 1g Agarose in 10ml 10xMOPS und 90ml Aqua dest. aufgekocht und nach dem
Abkühlen mit 7,5µl Ethidiumbromid (10mg/ml) versetzt. Als Laufpuffer wurde 1x MOPS
verwendet, die Auftrennung der Proben erfolgte bei konstanten 60V für ca. drei Stunden.
39
D. Material und Methoden
5.6.4 RNA Isolierung mit TRIzol®
Für die Verwendung von RNA für RT-PCR Analysen, wurde die RNA aus SPOP-, Roc1depletierten Zellen und Kontrollzellen mittels TRIzol® (Invitrogen) isoliert.
a) Isolierung von Gesamt-RNA
Es wurden 3,0x105 Zellen in einer Sechslochplatte ausgesät, nach einer Kultivierung von
24h mittels Trypsin/EDTA abgelöst und in 1ml eiskaltem PBSo aufgenommen. Das
Zellpellet (2500rpm, 5min, 4°C) wurde in 1ml Trizol resuspendiert und für 5min bei
Raumtemperatur inkubiert. Nach einer Zugabe von 200µl Chloroform wurden die Proben
für 15s sehr stark geschüttelt (Vortex) und erneut für 10min bei Raumtemperatur inkubiert.
Nach dem Zentrifugieren bei 14000rpm, für 10min bei 4°C wurde die obere wässrige
Phase in ein neues Eppendorfgefäß zu 600µl vorgelegtem Isopropanol überführt und
dieses Gemisch für 10min bei Raumtemperatur inkubiert. Die RNA wurde bei 14000rpm
für 10min bei 4°C sedimentiert, der Überstand verworfen und das Pellet mit 1ml 70%igem
Ethanol gewaschen. Zuletzt wurde die RNA durch Trocknen an der Luft von Ethanolresten
befreit und in 10µl DNase- und RNase-freiem H2O aufgenommen.
b) DNase-Verdau
Um bei der RT-PCR DNA-Kontaminationen auszuschließen, wurde nach der Isolierung ein
DNase-Verdau durchgeführt. Die 10µl RNA aus der Isolierung wurden mit 10µl 10xDNasePuffer, 79µl DNase- und RNase-freiem H2O und 1µl DNase-I gemischt und für 2h bei 37°C
in einem Heizblock inkubiert.
c) Phenol/Chloroform-Reinigung
Nach
dem
Verdau
wurde
eine
Phenol/Chloroformreinigung
mit
anschließender
Ethanolfällung durchgeführt. Die 100µl des DNase-Verdaus wurden 1:1 mit einem
Phenol:Chloroform:Isoamylalkohol Gemisch (25:24:1) versetzt, für 30s sehr stark
geschüttelt (Vortex) und für 5min bei 4°C und 14000rpm sedimentiert. Die obere wässrige
Phase wurde in ein neues Eppendorfgefäß überführt, welches 1µl Glycogen, 5µl 4M LiCl
und 125µl 100% Ethanol enthielt. Die Proben wurden für 5min in flüssigem Stickstoff
gefroren und bei 14000rpm für 15min bei Raumtemperatur zentrifugiert. Der Überstand
wurde verworfen und die RNA mit 150µl 70%igem Ethanol gewaschen. Nach 5min bei
14000rpm und Raumtemperatur wurde der Überstand entfernt und die RNA kurz an der
40
D. Material und Methoden
Luft getrocknet. Die in 50µl DNase- und RNase-freiem H2O aufgenommene RNA wurde
nun für die RT-PCR weiterverwendet oder bei -80°C gelagert.
5.6.5 RT-PCR
Um eine SPOP- bzw. Roc1-Depletion in Zellen nachzuweisen wurde eine RT-PCR mit
einem Kit (Transcriptor One-Step RT-PCR Kit) der Firma Roche (Mannheim, Deutschland)
nach Angaben des Herstellers durchgeführt. Nach der RT-Reaktion bei 50°C für 30min
und der Denaturierung für 7min bei 94°C, erfolgte ein Standard PCR-Protokoll mit 15
Zyklen (10s 94°C / 30s 52°C / 90s 68°C), gefolgt von weiteren 38 Zyklen (10s 94°C / 30s
52°C / 60s 68°C) und einer abschließenden Verlängerung von 7min bei 68°C. Die Proben
wurden anschließend mittels Agarosegel-Elektrophorese getrennt und dokumentiert.
5.7 Dephosphorylierung von Proteinen
HEK293T-Zellen wurden ausgesät und wie beschrieben mit Hilfe der Calcium-Phosphat
Methode transfiziert. Zur Vorbereitung wurde Protein A-Sepharose in Ko-IP Lysepuffer für
30min auf dem Überkopftaumler bei 4°C gequollen und anschließend zu einem Gemisch
aus 500µl Lysepuffer und 1µl Antikörper gegen das Flag-Epitop des exprimierten
Phosphoproteins gegeben und für eine weitere Stunde bei 4°C getaumelt. Die Zellen
wurden in 800µl Ko-IP Puffer für 20min auf Eis lysiert und anschließend für 10min bei
14000rpm und 4°C sedimentiert. Vom Überstand wurden die Lysatkontrollen entnommen
und mit 4xSDS-Auftragspuffer für 10min bei 95°C erhitzt. Der restliche Überstand wurde
zu dem vorbereiteten Sepharose-Antikörpergemisch gegeben und für 2h bei 4°C im
Überkopftaumler inkubiert. Das an die Sepharose gebundene Protein wurde dreimal mit
Ko-IP Puffer, danach dreimal mit HEPES/MgCl2-Puffer gewaschen und zuletzt mit 30U
Phosphatase (intestine alkaline phosphate – CIP) für 15min bei 30°C inkubiert. Durch
Zugabe von 4x SDS-Auftragspuffer wurde die Dephosphorylierung gestoppt. Die Proben
wurden anschließend 10min bei 95°C erhitzt, durch SDS-PAGE getrennt und mittels
Antikörpernachweis analysiert.
5.8 Gateway-Klonierung
Für die Herstellung von Zelllinien, die stabil eine bestimmte Isoform eines Proteins
(Sp100) exprimieren, wurden die Isoformen mittels der Gateway-Klonierung von Invitrogen
(Karlsruhe,
Deutschland)
nach
Angaben
des
Herstellers
in
einen
lentiviralen
D. Material und Methoden
41
Expressionsvektor eingebracht (Gateway Technology with Clonase II, A universal
technology to clone DNA sequences for functional analysis and expression in multiple
systems; Nr. 12535-029).
Ausgehend von den Plasmiden pHM3355 und pHM3418-3420 wurden die Isoformen über
Standard-PCR mit den Oligonukleotiden 28-69 (5’) und 33-53 bis 33-56 (3’) synthetisiert
und über die BP- und LR-Rekombinationsreaktionen nach Angaben des Herstellers in den
Endvektor eingebracht. Wie beschrieben, wurden lentivirale Überstände generiert und
damit Sp100-depletierte Zellen transduziert, die nun nach Selektion mit Blasticidin eine
bestimmte Sp100-Isoform, entweder unter der Kontrolle des EF1α-Promotors oder des
CMV-Promotors, exprimierten.
5.9 Computer-Analysen
a) AIDA
Für die densitometrische, quantitative Auswertung von Western Blot-Dokumentationen
wurde mittels „AIDA Image-Analyser Software“ die Intensität der Banden bestimmt und
anschließend mit Microsoft Excel 2003 ausgewertet.
b) Konfokale Mikroskopie
Um die vorhandene Menge einzelner Proteine in der indirekten Immunfluoreszenz zu
bestimmen, wurde die Fluoreszenzintensität eines bestimmten Wellenlängenbereichs in
vorher definierten Bereichen des Präparats mit der Software TCS SP5 LASAF von Leica
gemessen und danach mit Microsoft Excel 2003 ausgewertet.
c) Statistische Auswertungen
Für die statistische Auswertung von Ergebnissen wurde ein Programm zur t-TestBerechnung der Website http://faculty.vassar.edu/lowry/VassarStats.html verwendet. Die
Werte wurden hier als voneinander unabhängig und zweiseitig (two-tailed) bewertet.
d) Affymetrix-Analyse
Für die Analyse der Affymetrix Microarray Daten wurde ein 2-wöchiges Testprogramm
(IPA) der Firma Ingenuity (Redwood City, California, USA) verwendet. Weitere
Auswertungen erfolgten mit Microsoft Excel 2003.
42
E. Ergebnisse
E. Ergebnisse
1. Analyse des Einflusses der ND10 Komponenten Sp100, PML und Daxx auf
Cytomegalovirus-Infektionen
In früheren Studien konnte gezeigt werden, dass eine subnukleäre zelluläre Struktur,
bekannt als nukleäre Domäne 10 (ND10, oder PML nuclear bodies), intrinsische Immunität
gegen Herpesviren vermittelt (Everett & Chelbi-Alix, 2007;Tavalai et al., 2008;Tavalai &
Stamminger,
2010).
Die
drei
Proteine
PML,
Sp100
und
Daxx
werden
als
Hauptkomponenten dieser Struktur betrachtet, wobei PML als strukturdefinierender
Bestandteil gilt, da ein Fehlen dieses Proteins zu einer Auflösung von ND10 führt (Tavalai
et al., 2006). Weiterhin war gezeigt worden, dass nach einer Depletion (knockdown; kd)
der Proteine Daxx und PML eine gesteigerte IE1-Genexpression nach CytomegalovirusInfektion zu beobachten ist; folglich können PML und Daxx als Restriktionsfaktoren für die
HCMV-Infektion angesehen werden (Preston & Nicholl, 2006;Saffert & Kalejta,
2006;Tavalai et al., 2006;Tavalai et al., 2008;Woodhall et al., 2006).
1.1 Herstellung von Sp100-depletierten Zellen
Das Sp100-Protein (speckle protein of 100kDa) stellt eine weitere wichtige Komponente
der ND10 dar. Wie auch PML, wird Sp100 durch Stimulation von Zellen mit Interferonen
hoch reguliert (Guldner et al., 1992;Lavau et al., 1995;Stadler et al., 1995), weshalb eine
antivirale Funktion des Proteins postuliert wurde. Um dies zu untersuchen, wurden
humane Vorhautfibroblasten (HFF) generiert, die über RNAi-Wechselwirkung eine Sp100Depletion aufwiesen. Durch alternatives Spleißen liegen vier verschiedene Isoformen von
Sp100 (Sp100A, B, C, HMG) (Andreoni et al., 1989;Dent et al., 1996;Guldner et al.,
1999;Seeler et al., 2001;Szostecki et al., 1990) vor, folglich musste die verwendete shRNA
gegen alle Isoformen gerichtet sein (Abb. 1).
Abb. 1: Lokalisation der shRNA-Zielsequenz innerhalb der vier Sp100 Isoformen.
Schematische Darstellung der vier Sp100 Isoformen A, B, C, und HMG. Die vier Isoformen besitzen ein
gleiches N-terminales Ende, aber sie unterscheiden sich in den verschiedenen Domänen des C-Terminus
Die Position der Erkennungssequenz der verwendeten shRNA (GGAAGCACTGTTCAGCGATGT) ist mit
einem Pfeil gekennzeichnet.
E. Ergebnisse
43
Die shRNA wurde in den selbst-inaktivierenden retroviralen Vektor pSirenRetroQ
eingebracht und retrovirale Überstände wurden generiert. Um Zellen herzustellen, die
einen stabilen Sp100-kd aufweisen, wurden primäre humane Vorhautfibroblasten (HFF)
mit den Überständen transduziert und anschließend über die eingebrachte Puromycin
Resistenz selektioniert (siSp100). Als Kontrollzelllinien dienten HFF, in die parallel zu den
siSp100-Zellen entweder allein der Leervektor (vector) oder eine nicht funktionelle shRNA
integriert wurde (siC).
Abb. 2: Bestätigung der Sp100-Depletion
in
Western
Blotund
indirekter
Immunofluoreszenz-Analyse A) Western
Blot Analyse der endogenen Sp100Proteinmenge
in
den
Sp100-kd
(3)
Zelllysaten (siSp100)
im Vergleich zu
Kontrolllysaten (vector bzw. siC; 1,2). Sp100Detektion erfolgte mit einem anti-Sp100
maus-monoklonalen Antikörper. Der β-actin
Nachweis erfolgte mit einem mausmonoklonalen Antikörper und diente als
Ladekontrolle.
B)
Computergestützte
Quantifizierung der Sp100-Proteinmenge des
in A gezeigten Western Blots. Die jeweiligen
Actinmengen dienen als Referenz. Die
Menge an Sp100 in vector-Zellen wurde als
100%
gesetzt.
C)
Indirekte
Immunofluoreszenz-Analyse der zellulären
Lokalisation von Sp100 und Bestätigung der
stabilen Depletion von Sp100. a-d: vectortransduzierte
Kontrollzellen.
e-h:
siCtransduzierte Kontrollzellen. In beiden
Kontrollzelllinien zeigen PML und Sp100
typische, punktartige Strukturen im Kern, die
miteinander kolokalisieren (vgl. d und h). i-m:
HFF mit einer stabilen Sp100 Depletion.
Das Fehlen von endogenem Sp100 wurde durch Western Blot und indirekte
Immunfluoreszenz nachgewiesen. In Abb. 2A wurde in Zelllysaten der Kontrollzellen und
siSp100-Zellen mittels Western Blot mit einem Sp100-spezifischen Antikörper auf das
Vorhandensein des Proteins geprüft. In den Kontrollzellen wurde ein deutliches Signal von
Sp100 detektiert (Abb. 2A, Spur 1 und 2), während in den siSp100-Zellen (Abb. 2A, Spur
3) eine deutliche Depletion zu beobachten war. Das zelluläre Protein β-Actin diente dabei
als Ladekontrolle. Um den Effekt der eingebrachten siRNA zu quantifizieren, wurde der
Western Blot mittels „AIDA Image Analyser Software“ densitometrisch quantifiziert, was in
einer Sp100-kd Effizienz, bezogen auf die β-Actin Menge, von ~99% resultiert (Abb. 2B).
Weiter wurde untersucht, ob das Fehlen von Sp100 einen Einfluss auf die Anzahl und
44
E. Ergebnisse
Form von ND10 hat. Hierfür wurden vector-, siC- und siSp100-Zellen auf Deckgläschen
ausgesät und mittels indirekter Immunofluoreszenz die Proteine Sp100 und PML
untersucht. Die Abbildung 2C zeigt in den Reihen 1 und 2 (vector bzw. siC; a-h) die für
ND10 typischen punktartige Strukturen im Kern, welche hier durch die Proteine PML und
Sp100 repräsentiert werden und die miteinander kolokalisieren. In Reihe 3, siSp100, ist
deutlich der vorhandene Sp100-kd zu erkennen. Des Weiteren sind jedoch weder Anzahl
noch Form der ND10 Strukturen verändert (Reihe 3, k).
1.1.1 Analyse der HCMV Replikation in Sp100-depletierten Zellen
Um zu untersuchen, ob eine Depletion von Sp100 einen Einfluss auf die Replikation von
HCMV hat, wurde ein GFP-Reporter Assay durchgeführt. Hierfür wurden Kontrollzellen
zusammen mit Sp100-kd Zellen mit dem rekombinanten HCMV-Stamm AD169-GFP
infiziert, welcher für das grüne Fluoreszenzprotein GFP (green fluorescence protein)
kodiert (Marschall et al., 2000). Jeweils 7 Tage und 10 Tage nach Infektion unter sehr
niedrigen MOI-Bedingungen (MOI 0,002), wurde die Menge des GFP fluorimetrisch
quantifiziert. Wie in Abb. 3 gezeigt, wurde in siSp100-Zellen 7 Tage nach Infektion eine
signifikant höhere GFP-Fluoreszenz gemessen, was eine erhöhte-HCMV Replikation in
der Abwesenheit von Sp100 hinweist. Zu erwähnen ist hierbei, dass der Effekt 10 Tage
nach Infektion nicht mehr deutlich ausgeprägt ist.
Abb.
3:
Quantifizierung
der
HCMV
Replikation in Sp100-kd Zellen im Vergleich
zu Kontrollen 7 Tage und 10 Tage nach
Infektion. siSp100, vector bzw. siC wurden mit
AD169-GFP, welches das Grüne-FluoreszenzProtein exprimiert, mit einer MOI von 0,002
infiziert. Gezeigt wird die fluorimetrische
Quantifizierung der GFP-Expression 7 Tage
und 10 Tage nach der Infektion. Es wurden 3fach Bestimmungen durchgeführt und die
Standardabweichung der einzelnen Proben
wird angezeigt.
1.1.2 Bestimmung der IE1-Genexpression in Zellen mit einer Sp100-Depletion
Zunächst sollte untersucht werden, ob das Fehlen von Sp100 einen Effekt auf andere
ND10-Komponenten wie Daxx und PML ausübt. Zellen, in denen mittels RNAi-Interferenz
eine Depletion von PML bzw. Daxx vorhanden war, wurden bereits beschrieben (Tavalai
et al. 2006) und parallel zu den neu generierten Sp100-kd Zellen hergestellt. Zelllysate der
E. Ergebnisse
45
Zelllinien (vector, siC, siDaxx, siPML, siSp100) wurden parallel im Western Blot analysiert
und die Proteinexpression der einzelnen Komponenten mit spezifischen Antikörpern
untersucht. In Abb. 4A, Spur 1 und 2, ist das typische endogene Expressionsmuster von
PML, Daxx und Sp100 gezeigt (vector bzw. siC). Weiter ist in Spur 3 deutlich der Sp100kd zu erkennen. Dies führt jedoch nicht zu einem veränderten Expressionsverhalten von
PML und Daxx. In den Zelllysaten von siDaxx (Spur 5) und siPML (Spur 4) ist die jeweilige
Depletion gut zu erkennen. Interessanterweise führt ein Fehlen von PML zu einem
veränderten Expressionsverhalten von Sp100 (Abb. 4A, Spur 4), welches in einer
erhöhten Expression der untersten Bande und einer verminderten Expression der oberen
Isoformen resultiert. Dieses Ergebnis ist übereinstimmend mit früheren Beobachtungen
(Cuchet et al., 2011;Everett & Chelbi-Alix, 2007).
Abb. 4: Erhöhte HCMV-Replikation in Sp100-, PML- und Daxx-kd HFF
A) Nachweis von Sp100, Daxx und PML (wie angegeben) im Western Blot ausgehend von Zelllysaten der
verschiedenen Zelllinien. 1, vector-transduzierte Zellen; 2. siC-transduzierte Zellen; 3, siSp100-transduzierte
Zellen (Sp100-kd); 4, siPML-transduzierte Zellen (PML-kd); 5, siDaxx-transduzierte Zellen (Daxx-kd). Der βactin Nachweis diente als Ladekontrolle. Sp100 und Daxx wurden detektiert durch Antikörper der Firmen
Abnova (Heidelberg, Deutschland) (Sp100, MaxPab, B01) bzw. Sigma-Aldrich (Deisendorf, Deutschland)
(anti-Daxx Kaninchen Antiserum). B) Erhöhte Initiierung der IE1-Genexpression in PML-kd, Daxx-kd, wie
auch Sp100-kd Zellen. Retroviral transduzierte HFF wurden mit 50IEU/Vertiefung mit AD169 infiziert. 24h
nach Infektion wurden die Zellen fixiert und die Anzahl der IE1-positiven Zellen mittels indirekter
Immunofluoreszenz-Analyse bestimmt. C) Quantifizierung der Plaquezahl 7 Tage nach Infektion mit 50pfu
AD169. Daten von drei unabhängigen Experimenten wurden gemittelt und die Standardabweichung
errechnet. Die statistische Signifikanz wurde mit dem Students-t-test ermittelt.
E. Ergebnisse
46
Von früheren Studien ist bekannt, dass ein PML- bzw. Daxx-kd zu einer erhöhten IE1
Genexpression führt. Daher sollte bestimmt werden, ob eine Sp100 Depletion einen
ähnlichen Effekt bei Infektion mit HCMV ausübt. Die hergestellten kd-Zellen wurden unter
sehr niedrigen MOI Bedingungen mit AD169 infiziert und 24h nach Infektion wurde die
Anzahl der IE1-positiven Zellen ausgezählt. Ähnlich wie bei PML-kd bzw. Daxx-kd wurde
eine 4-5fach erhöhte IE1-Genexpression (Abb. 4B) im Vergleich zu den Kontrollzellen in
siSp100 festgestellt. Um zu testen, ob ausgehend von der erhöhten IE1-Genexpression,
die Infektion im Replikationszyklus weiter fortschreitet, wurde eine Plaque-Analyse (Abb.
4C) durchgeführt. Erneut wurde ein klarer Unterschied zwischen der Plaquebildung in
Kontrollen im Vergleich zu den PML-, Daxx- bzw. Sp100-depletierten Zellen festgestellt.
Der Unterschied war nicht so ausgeprägt wie zuvor bei der IE1-Genexpression, jedoch
stellte die Differenz noch ein Erhöhung der Plaquezahl um den Wert 3 dar.
1.1.3 Vergleich der HCMV-Genexpression in Sp100-kd Zellen nach Infektion
Die Bewertung der HCMV-Replikation erfolgte bisher nur durch den Nachweis der sehr
frühen Phase der Genexpression über IE1-Detektion. Konsequenterweise sollten
zusätzlich nun verschiedene virale Proteine aus der frühen und späten Phase untersucht
werden. Kontrollzellen und Sp100-kd Zellen wurden ausgesät und mit MOI 1 und MOI 0,01
mit AD169 infiziert und zu verschiedenen Zeitpunkten der Infektion wie in Abb. 5
angegeben als Zelllysate geerntet. Der Nachweis der einzelnen Proteine erfolgte durch
spezifische Antikörperdetektion im Western Blot. Deutlich erkennt man in Abb. 5A, dass
zusätzlich zu der erhöhten IE1-Genexpression in den Sp100-depletierten Zellen auch alle
weiteren viralen Proteine verstärkt exprimiert werden. Dies ist als Konsequenz der zu
Beginn gesteigerten sehr frühen Genexpression zu betrachten. Bei Infektion mit höherer
MOI (Abb. 5B) sieht man keinen Unterschied zwischen der Genexpression in den
Kontrollzellen im Vergleich zu siSp100.
47
E. Ergebnisse
Abb. 5: Western Blot Analyse nach Infektion mit AD169 und Vergleich der Protein-ExpressionsKinetik
A) Kontrollzellen und Sp100-kd Zellen wurden mit AD169 mit einer MOI von 0,01 infiziert. Zu den
angegebenen Zeitpunkten wurden Zelllysate generiert und sehr frühe (IE1), frühe (UL69, UL44) und
späte (MCP) Proteine im Western Blot analysiert. MCP-Nachweis: mAB 28-4, maus-monoklonaler
Antikörper; UL69-Nachweis: mAb 69-66, maus-monoklonaler Antikörper; UL44-Nachweis: BS510,
maus-monoklonaler Antikörper; IE1-Nachweis: mAb 63-27, maus-monoklonaler Antikörper; pp28Nachweis: mAb 41-18, maus-monoklonaler Antikörper. Der Nachweis von β-actin mit AC-15, mausmonoklonalem Antikörper, diente als Ladekontrolle. B) Infektion von vector-, siC-, und siSp100transduzierten HFF mit AD169 unter hohen MOI Bedingungen (MOI 1). Herstellung der Zelllysate und
Nachweis der Proteine erfolgte wie unter A beschrieben.
Diese Beobachtung wurde mit Hilfe einer durchflusszytometrischen Analyse bestätigt.
Vector-transduzierte bzw. siSp100-transduzierte HFF wurden ausgesät und mit AD169 mit
ansteigender Virusmenge infiziert (MOI 0,01 / MOI 0,1 / MOI 0,5). Die Zellen wurden 24h
nach
Infektion
geerntet,
mit
Paraformaldehyd
fixiert
und
mit
Saponin-Puffer
permeabilisiert. Intrazelluläres IE1 wurde mit dem maus-monoklonalen Antikörper Mab 6327
detektiert
und
anschließend
über
den
APC-gekoppelten
Ziege-anti-Maus
Sekundärantikörper im FACS gezählt.
Abb. 6: Erhöhte IE1 Genexpression in
siSp100-transduzierten Zellen ist MOI
abhängig
FACS-Analyse von vector- bzw. siSp100transduzierten Zellen nach Infektion mit
AD169 mit MOI 0,01; MOI 0,1 und MOI 0,5.
Zellen wurden mit 2%iger ParaformaldeydLösung fixiert und IE1-positive Zellen
mittels Durchflusszytometrie quantifiziert.
Der prozentuale Anteil an IE1-positiven
Zellen wurde relativ zur Ausgangszellzahl
angeben.
E. Ergebnisse
48
Der Effekt, dass mehr Zellen die IE-Genexpression initiieren können, wurde jedoch nur bei
sehr geringer MOI beobachtet (Abb. 6). Bereits bei einer MOI von 0,5 wurde kein
Unterschied mehr zwischen den vector-transduzierten und den siSp100-transduzierten
Zellen festgestellt.
1.1.4 Analyse der IE-Genexpression in Sp100-kd Zellen nach Infektion mit einem IE1Deletionsvirus
Das virale Tegumentprotein pp71 vermittelt die Daxx-Degradation direkt nach Infektion. Im
weiteren Infektionsverlauf kann nun das neu gebildete IE1 Protein die ND10 Strukturen
auflösen; dies wird durch die deSUMOylierung von PML initiiert. In früheren Studien war
bereits gezeigt worden, dass der Replikationsdefekt eines AD169-Stammes mit einer
pp71-Deletion in Daxx-kd Zellen aufgehoben ist. Des Weiteren konnte gezeigt werden,
dass eine IE1-Deletionsmutante (CR208) in PML-kd Zellen eine signifikant höhere IEGenexpression aufweist als in entsprechenden Kontrollzellen (Tavalai et al., 2008).
Welches virale Protein nach Infektion den repressiven Effekt des Sp100 antagonisiert, ist
jedoch nach wie vor unbekannt. Es sollte daher untersucht werden, welchen Effekt ein
Sp100-kd auf die Replikation nach Infektion mit CR208 ausübt. Um diese Frage zu
beantworten, wurden vector-, siC-, siPML- und siSp100-transduzierte HFF mit CR208
infiziert und 24h nach Infektion die Anzahl der Zellen bestimmt, die die frühe IEGenexpression initiieren konnten (Abb. 7).
Abb. 7: Der Replikationsdefekt von CR208 kann
in Sp100-depletierten
Zellen aufgehoben
werden. vector-, siC-, siPML- und siSp100transduzierte HFF wurden mit dem IE1Deletionsvirus CR208 infiziert und die Anzahl an
IE2 positiven Zellen wurde 24h nach Infektion
durch indirekte Immunofluoreszenz über den
Nachweis von IE2 (anti-pHM178) bestimmt. Der
Replikationsdefekt dieser Mutante konnte in
Sp100-depletierten Zellen nahezu ebenso gut
ausgeglichen werden, wie in PML-kd Zellen.
Nach Infektion wurde beobachtet, dass der Wachstumsdefekt von CR208 in den Sp100-kd
Zellen ähnlich gut ausgeglichen werden kann, wie dies bereits in PML-depletierten Zellen
E. Ergebnisse
49
analysiert wurde. Möglicherweise übt daher IE1 nicht nur auf PML, sondern auch auf
Sp100 einen antagonistischen Effekt aus.
1.2 Einfluss von PML, Daxx und Sp100 auf die HCMV-Infektion
Kürzlich konnte gezeigt werden, das Daxx und PML als voneinander unabhängige
Restriktionsfaktoren der HCMV-Infektion betrachtet werden können (Tavalai et al., 2008).
Folglich stellte sich die Fragen, ob Sp100 in enger Assoziation mit PML oder Daxx agiert,
oder ob diese ND10-Komponente ebenfalls einen unabhängigen Restriktionsfaktor
darstellt. Um dies zu beantworten, wurden Doppel-kd Zellen hergestellt, die entweder über
kein Daxx und Sp100 oder über kein Sp100 und PML verfügten. Für die erstgenannte
Kombination wurden zunächst HFF mit einer shRNA gegen das Daxx-Protein transduziert.
Nach Bestätigung des Daxx-kd, wurden diese Zellen mit siSp100 ein zweites Mal
transduziert. In der resultierenden Doppel-kd Linie siDaxx+siSp100 waren beide
Proteinmengen, Daxx bzw. Sp100, stark vermindert. In Abbildung 8A wurden Zelllysate
von siDaxx+siSp100, die dazugehörigen Einzel-kd Zellen und die Kontrollzellen im
Western Blot analysiert. Man erkennt deutlich einen nahezu vollständigen Verlust der
Sp100-Proteinmenge in siSp100 (Abb. 8A, Spur 4) und siDaxx+siSp100 (Abb. 8A, Spur 5).
Ebenso ist die endogene Daxx-Proteinmenge, durch die eingebrachte siRNA gegen das
Daxx-Protein, in den Zellen siDaxx (Abb. 8A, Spur 3) und siDaxx+siSp100 (Abb. 8A, Spur
5) stark vermindert. Weiter wurde hier gezeigt, dass die Depletion von zwei wichtigen
ND10-Komponenten keinen erkennbaren Einfluss auf die Expression des PML zu haben
scheint. Für die zweite Kombination bestehend aus Sp100- und PML-kd wurden zunächst
mit siSp100-transduzierte HFF hergestellt, bei denen dann im zweiten Schritt eine shRNA
gegen PML integriert wurde. Abbildung 8B zeigt ein nahezu komplettes Fehlen von Sp100
(Abb. 8B, Spur 4 bzw. 5) in beiden Zelllinien, die mit siSp100 transduziert worden waren.
In der PML-kd Zelllinie ist der Effekt der eingebrachten siRNA gegen PML sehr stark
ausgeprägt (Abb. 8B, Spur 3), es muss jedoch erwähnt werden, dass in der Doppel-kd
Situation siSp100+siPML das PML-Protein lediglich stark reduziert ist, aber nicht komplett
verschwindet (Abb. 8B, Spur 5). Auch hier hat die Depletion von zwei Proteinen keinen
Einfluss auf das Expressionsniveau weiterer ND10-Komponenten, wie dem Daxx-Protein.
Der Daxx-Nachweis in Abb. 8B zeigt ein gleiches Daxx-Expressionsniveau in allen
verwendeten Zelllinien. Der β-actin Nachweis diente wiederum als Ladekontrolle. Um zu
überprüfen, ob die drei ND10-Bestandteile Daxx, PML und Sp100 unabhängig
50
E. Ergebnisse
voneinander wirken, wurden die verschiedenen Zelllinien als 3-fach Ansatz auf
Deckgläschen ausgesät und mit 50IEU/Vertiefung mit AD169 infiziert. 24h nach Infektion
wurden
die
Zellen
fixiert
und
IE1-positive
Zellen
wurden
mittels
indirekter
Immunofluoreszenz Analyse quantifiziert. Wie Abbildung 8C und 8E zeigen, wurde in
Doppel-kd Zellen im Vergleich zu den jeweiligen Einzel-kd Zellen eine erneute Erhöhung
der IE1 Genexpression um den Faktor 2 festgestellt. Identische Ergebnisse konnten in
Plaque-Analysen erzielt werden (Abb. 8, D und F). Diese Ergebnisse legen nahe, dass die
ND10-Proteine PML, Daxx und Sp100 unabhängig voneinander an der antiviralen Wirkung
gegen HCMV beteiligt sind.
Abb. 8: Sp100, PML und
Daxx
als
voneinander
unabhängige
Restriktionsfaktoren der HCMV Infektion
A) Analyse der Sp100- und
Daxx Einfach-kd Zellen (Spur 3
und 4) und der Doppel-kd
Kombination im Western Blot.
Vectorbzw.
siC-Zellen
dienten als Kontrollen. Oberes
Feld:
Nachweis
der
verschiedenen
Sp100
Isoformen; mittlere Felder:
Nachweis von Daxx bzw. PML
Proteinmengen. B) Analyse
von PML (Spur 3) und Sp100
(Spur 4) Einfach-kd Zellen und
der
Doppel-kd Kombination
(Spur
5).
Oben:
Sp100
Isoformen; Mitte: Detektion der
verschiedenen PML Isoformen
bzw. Daxx. Unteres Feld (A
und B): Der β-actin Nachweis
diente als Ladekontrolle. C und
E) Retroviral transduzierte HFF
wurden
mit
HCMV
wie
angegeben infiziert und die
Zahl der IE1-positiven Zellen
wurde
mittels
indirekter
Immunofluoreszenz bestimmt.
D und F) Quantifizierung der
Plaquezahl mit einem Plaque
Reduktionsversuch 7 Tage
nach Infektion mit AD169 wie
angegeben.
E. Ergebnisse
51
1.2.1 Lokalisation der ND10-Komponenten in Doppel-kd Zellen
Wie bereits durch Western Blot-Analyse gezeigt werden konnte (Abb. 8), hat eine
Depletion einzelner ND10-Komponenten bzw. eine kombinierte Depletion die GesamtProteinmenge der jeweils anderen ND10-Bestandteile nicht bzw. kaum beeinflusst. Nur für
PML, welches das strukturbildende Protein der ND10 darstellt, ist bekannt, dass bei
Fehlen dieser wichtigen Komponente die anderen Bestandteile nicht mehr in den
punktartigen ND10-Strukturen vorliegen, sondern diffus im Zellkern verteilt sind (Tavalai et
al., 2006). Weiter beeinflusst ein PML-kd das Expressionsmuster der Sp100-Isoformen,
was umgekehrt jedoch nicht der Fall zu sein scheint. Nun sollte geprüft werden, ob eine
kombinierte Depletion von ND10-Faktoren zu einer Veränderung der Morphologie oder
Zahl dieser Proteinakkumulationen führt. Hierfür wurden die drei Einfach-kd Zelllinien,
siDaxx, siPML und siSp100 zusammen mit den entsprechenden Doppel-kd Kombinationen
auf Deckgläsern ausgesät.
Abb. 9: Analyse der ND10-Strukturen in den neu generierten KD- und Doppel-kd Zellen
A) Sp100- und PML-Nachweis mittels spezifischer Antikörper (H-60, Kaninchen anti-Sp100; PG-M3, Maus
anti-PML, beide Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, USA) in siDaxx- bzw. siSp100-transduzierten HFF
im Vergleich zur Doppel-kd Kombination und den Kontrollen (vector, siC) mittels indirekter
Immunofluoreszenz-Analyse. Es wurde keine Veränderung an Anzahl oder Erscheinung der ND10
Domänen bei den verschiedenen KD Linien im Vergleich zu Kontrollen (k-u vgl. b-h) festgestellt. B) In PML-,
Sp100- und Sp100+PML-kd Zellen wurde endogenes Sp100 (H-60, Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz,
USA) und Daxx (MCA2143, Serotec, Oxford, England) mittels indirekter Immunofluoreszenz-Analyse
nachgewiesen. Wie bereits bekannt, ergibt ein Fehlen von PML eine Auflösung der ND10-Strukturen,
weshalb andere Komponenten diffus im Zellkern verteilt vorliegen (k+l). Derselbe Effekt ist auch bei der
Sp100+PML Doppel-KD-Linie zu beobachten (t).
52
E. Ergebnisse
Anschließend wurden die Zellen fixiert und durch Nachweis der ND10-Komponenten
Daxx, PML und Sp100 die Anzahl und die Form der ND10-Domänen überprüft. Die
Depletion von Daxx und Sp100 hat keinen Einfluss auf die ND10-Strukturen: nach wie vor
ist die typische punktartige Erscheinung der Domänen zu beobachten (Abb. 9A, vgl. k-u
und b-h). Wie in früheren Studien gezeigt, liegen Sp100 und Daxx (Abb. 9B, k+l) diffus im
Zellkern vor, sobald PML nicht mehr vorhanden ist, ohne dass sie direkt miteinander
kolokalisieren (Abb. 9B, m). Diese diffuse Verteilung in Abwesenheit von PML ist auch bei
der Doppel-kd Zelllinie Sp100+PML zu beobachten (Abb. 9B, t).
1.2.2 Immunfluoreszenz Analyse von siSp100+siPML Doppel-kd Zellen nach
Infektion
Es konnte bereits gezeigt werden, dass in Abwesenheit von PML, welches die
strukturbildende Komponente von ND10-Domänen ist, die anderen Bestandteile Daxx und
Sp100 diffus im Zellkern vorliegen. Jedoch wurde beobachtet, dass direkt nach
Abb. 10: Neuorganisation von Daxx in ND10ähnliche
Strukturen
in
PML-kd
und
Sp100+PML doppel-kd Zellen nach Infektion.
A+B) Analyse der zellulären Lokalisation von
Daxx (MCA2143, maus-monoklonaler Antikörper)
und IE2 (anti-pHM178, polyklonaler Kaninchen
Antikörper) zu frühen Zeitpunkten nach Infektion
mit AD169, wie angegeben. A) PML-kd Zellen. B)
Sp100+PML doppel-kd Zellen. A+B) Vier
Stunden nach Infektion wurde eine Assoziation
von IE2 mit Daxx beobachtet (A, m / B, d), die
durch eine Pfeil gekennzeichnet ist.
Infektion von PML-kd Zellen mit HCMV die verbliebenen ND10-Proteine zu ND10ähnlichen Strukturen reorganisiert werden. Interessanterweise wurde für IE2 eine direkte
Assoziation zu diesen neu geformten Strukturen beobachtet (Tavalai et al., 2006). Ob
53
E. Ergebnisse
diese Reaktion ebenfalls in den neu hergestellten siSp100+siPML Doppel-kd Zellen
auftritt, wurde nun mittels indirekter Immunofluoreszenz-Analyse überprüft. siPMLtransduzierte
Zellen
wurden
parallel
zu
siSp100+siPML-transduzierten
HFF
auf
Deckgläschen ausgesät, mit einer MOI von 1 mit AD169 infiziert und zu den angegeben
Zeitpunkten (Abb. 10) fixiert. Über spezifische Antikörper wurden die Proteine IE2 und
Daxx nachgewiesen und ihre Lokalisation im Zellkern überprüft. Deutlich zu erkennen ist,
dass zu Beginn der Infektion (IE2 noch nicht detektierbar) Daxx noch diffus im Kern verteilt
ist (Abb. 10A, c). Mit beginnender Infektion (IE2 detektierbar 3hpi, Abb. 10A, f) erfolgt eine
Umorganisierung von Daxx zu ND10-ähnlichen, punktartigen Strukturen, die mit IE2
assoziiert vorliegen (Abb. 10A, k-m; durch Pfeil gekennzeichnet). Dies ist auch in den
Sp100+PML-depletierten Zellen zu beobachten (Abb. 10B, b-d). Trotz des Fehlens von
PML und Sp100 ist Daxx alleine in der Lage mit viralem IE2 zu assoziieren.
1.2.3 Einfluss von Histon-Deacetylasen nach Infektion mit HCMV
Verschiedene Studien haben Histon-Deacetylasen (HDAC’s) mit dem Mechanismus der
Daxx vermittelten Repression der HCMV-Genexpression in Verbindung gebracht (Saffert
& Kalejta, 2006;Woodhall et al., 2006). Daher wurde der Effekt von Trichostatin A (TSA),
ein spezifischer Inhibitor der Klasse I und II von HDAC’s, auf die HCMV IE-Genexpression
in Sp100-kd- und Kontrollzellen untersucht. In einem Vorversuch wurden zunächst HFF
mit AD169 mit 50IEU/Vertiefung infiziert und entweder unbehandelt belassen (mock) oder
2h vor Infektion mit TSA (Endkonzentration 100ng/ml) inkubiert. Die Zugabe von
ausschließlich DMSO diente hierbei als Lösemittelkontrolle. 24h nach Infektion wurden die
Zellen mit Paraformaldeyd fixiert und die Anzahl der IE1 positiven Zellen am Mikroskop
bestimmt. Wie in Abb. 11A zu erkennen, resultiert aus einer TSA Zugabe eine deutlich
höhere Anzahl IE1-positiver Zellen, da mehr Zellen in der Lage sind, die sehr frühe
Genexpression zu initiieren. HDAC’s werden für gewöhnlich von Daxx rekrutiert, was zu
einer Transkriptionsverminderung viraler DNA führt. Durch die Hemmung der HDAC’s mit
TSA ist dies nicht möglich, was in der gesteigerten IE1-Genexpression resultiert. Nun
wurden Daxx-, PML- und Sp100- transduzierte HFF zusammen mit Kontrollzellen (vector
bzw. siC) ausgesät und wie oben beschrieben bezüglich ihrer IE1-Genexpression
untersucht (Abb. 11B). Trotz des Fehlens einzelner ND10 Komponenten führte eine
Zugabe von TSA erneut zur Erhöhung der Zahl der Zellen, die die IE1-Genexpression
initiieren. Dies legt nahe, dass HDAC’s keinen Einfluss auf die Sp100-vermittelte HCMV
E. Ergebnisse
54
Repression hat. Außerdem wurden die generierten Doppel-kd Zellen nach Infektion und
TSA Zugabe mit ihren entsprechenden Einzel-kd Zellen und den Kontrollen verglichen
(Abb. 11C). Auch hier wurde eine erneute Erhöhung der IE1-positiven Zellen jeweils im
Vergleich zu den zwar infizierten, aber unbehandelten Zellen beobachtet. Dies legt die
Vermutung nahe, dass auch bei Fehlen von ND10 Komponenten HDAC’s noch an die
virale DNA rekrutiert werden. Es müssen daher noch weitere Studien erfolgen, die den
Mechanismus der Sp100-vermittelten HCMV Repression genauer untersuchen.
Abb. 11: Analyse der IE1-Genexpression nach Infektion von verschiedenen siRNAtransduzierten HFF und Inhibition der HDAC’s mit Trichostatin A (TSA). A) Primäre humane
Vorhautfibroblasten (HFF) wurden unbehandelt (mock) belassen oder zwei Stunden vor Infektion mit
DMSO bzw. TSA inkubiert. 24h nach Infektion wurden die Zellen fixiert und die Anzahl IE1-positiver
Zellen über den Nachweis mit dem monoklonalen Antikörper Mab 63-27 mittels indirekter
Immunofluoreszenz Analyse bestimmt. Nach Inkubation mit TSA konnte eine 3-fach höhere IE1Genexpression beobachtet werden, als bei unbehandelten bzw. DMSO inkubierten Kontrollzellen. B
und C) Die verschiedenen, mit unterschiedlichen shRNA-transduzierten, Zelllinien (wie angegeben),
wurden wie unter A beschrieben auf die IE1-Genexpression untersucht. Auch nach Doppel-kd von
zwei ND10 Komponenten ist nach TSA Zugabe noch eine höhere Zahl an IE1-positiven Zellen zu
beobachten. A-C) Die Zugabe von DMSO diente als Lösemittelkontrolle.
55
E. Ergebnisse
1.3 Klonierung der Sp100-Isoformen und Herstellung von Sp100-kd Zellen, die stabil
je eine der Isoformen exprimieren
Durch alternatives Spleißen entstehen vier unterschiedliche Isoformen von Sp100
(Sp100A, B, C, HMG), deren Funktion in der Zelle und während Infektion mit HCMV
untersucht
werden
sollten.
Die
kodierenden
cDNAs
wurden
in
eukaryote
Expressionsvektoren eingebracht. Anschließend wurden HEK293T Zellen transfiziert, um
die jeweilige Expression der Sp100-Isoformen zu untersuchen. Zusätzlich zum Nachweis
über spezifische Sp100-Antikörper wurde ein Flag-Epitop in das Plasmid eingebracht,
welches einen Nachweis mit dem M2 maus-anti-Flag Antikörper erlaubt. In Abbildung 12
wurde nun das endogene Expressionsniveau von Sp100 in HFF mit dem in den
transfizierten HEK293T Zellen verglichen.
Abb. 12: Expressionsanalyse von endogenem Sp100 und transfizierten Sp100-Isoformen. A)
Aus einem HFF-Zelllysat wurde endogenes Sp100 mit einem polyklonalen maus-anti-Sp100
Antikörper (B01, Abnova, Heidelberg, Deutschland) nachgewiesen. B) HEK293T Zellen wurden mit
Expressionskonstrukten für die vier Sp100-Isoformen transfiziert, Zelllysate generiert und im
Western Blot analysiert. Die jeweils langsamer wandernde Bande stellt vermutlich die
entsprechende SUMOylierte Sp100 Isoform dar.
Die genaue Identität der endogenen Sp100-Isoformen, die durch Western Blot detektiert
werden können, steht noch nicht eindeutig fest (Abb. 12A). Sie wurden in früheren Studien
als die Isoformen Sp100A, B, C und HMG gekennzeichnet. Eine aktuelle Studie konnte
jedoch zeigen, dass selbst nach einer Depletion der Isoformen B, C, und HMG das im
Western Blot gezeigte Expressionsniveau genau wie bei den Kontrollen war (Negorev et
al., 2009). So könnte es sein, dass die im Western Blot detektierten Sp100 Banden
SUMOylierte bzw. anderweitig modifizierte Formen von Sp100A darstellen. In Abbildung
12A wurde das Expressionsniveau von endogenem Sp100 mit einem Sp100-spezifischen
Antikörper nachgewiesen. Nach Transfektion der verschiedenen Sp100-Isoformen in
E. Ergebnisse
56
HEK293T Zellen wurden Zelllysate hergestellt und die Expression im Western Blot
untersucht (Abb. 12B). Deutlich sind pro Isoform zwei unterschiedliche Banden erkennbar,
wobei die jeweils größere wahrscheinlich die SUMOylierte Form der entsprechenden
Isoform darstellt.
Mittels „Gateway Klonierung“ (Invitrogen, Karlsruhe, Deutschland) wurden lentivirale
Expressionsvektoren hergestellt, die für die einzelnen Sp100-Isoformen entweder unter
der Kontrolle des EF1α-Promotors oder des CMV-Promotors, kodieren. Mit den daraus
generierten lentiviralen Überständen wurden Sp100-kd Zellen transduziert, so dass die
resultierenden Zellen genau eine Sp100-Isoform exprimieren. Die Effizienz der
Transduktion wurde mit indirekter Immunofluoreszenz Analyse überprüft (Abb. 13). Die
Zellen wurden auf Deckgläsern ausgesät und die Isoformen mit einem Sp100-spezifischen
Antikörper nachgewiesen. Obwohl die Isoformen in den Zellen mit einem Flag-Epitop als
Fusionsprotein vorliegen, war ein Nachweis über das Epitop nur schwer möglich. Deutlich
weniger positive Zellen konnten bei diesem Nachweis detektiert werden, als bei der
Verwendung des spezifischen Antikörpers.
Abb. 13: Transduktion von Sp100-kd
Zellen mit lentiviralen Überständen zur
Herstellung von Zellen, die stabil eine
Sp100-Isoform exprimieren. Die vier
Isoformen
wurden
in
lentivirale
Expressionsvektoren
eingebracht
und
stabil transduzierte Zellen wurden mit
Blasticidin selektioniert. Nach Aussäen der
Zellen, die die Isoformen unter der
Kontrolle des CMV-Promotors exprimieren,
wurden Sp100-positive Zellen mit einem
Sp100 spezifischen Antikörper (B01,
Abnova) nachgewiesen und ausgezählt.
Die Isoformen sind alle im Kern lokalisiert,
jedoch teils diffus, teils punktartig verteilt
(Abb. 14). Das Expressionsverhalten in
Zellen, die die Isoformen unter EF1αPromotorkontrolle
exprimieren,
wurde
ebenso untersucht (Abb. nicht gezeigt) und
die Lokalisation war entsprechend der hier
gezeigten Daten.
57
E. Ergebnisse
Die Transduktionseffizienz wurde bestimmt durch Auszählen der Sp100-positiven Zellen
im Verhältnis zur Zahl durch Dapi gefärbte Zellkerne. Sie war unterschiedlich hoch und lag
zwischen 40% (für Sp100HMG) bis 70% (für Sp100A).
1.3.1 Untersuchung der Lokalisation der verschiedenen Sp100-Isoformen
Ausgehend von Sp100-kd Zellen wurden Zellen generiert, die stabil eine bestimmte
Sp100-Isoform exprimieren. Von früheren Studien ist bekannt, dass Sp100 mit PML in den
ND10 Domänen kolokalisiert und in punktartigen Strukturen im Zellkern vorliegt. Folglich
wurde überprüft, welche der einzelnen Isoformen noch mit PML assoziieren kann. Nach
Fixierung der Zellen erfolgte ein Nachweis von PML (H-238, polyklonaler Kaninchen antiPML Antikörper) und Sp100 (B01, polyklonaler Maus anti-Sp100 Antikörper) mit
spezifischen Antikörpern.
Abb.
14:
Lokalisation
der
Sp100
Isoformen
und
Untersuchung
der
Kolokalisation mit PML mit der indirekten
Immunofluoreszenz Analyse. Die Sp100Isoformen sind alle im Zellkern lokalisiert,
jedoch findet sich nur für Sp100A die
typische punktartige Verteilung (b). Sp100 B
und HMG liegen diffus im Kern verteilt vor (f,
o), während Sp100C sowohl diffus im Kern
als auch in größeren Komplexen zu finden ist
(k). Ausschließlich Sp100A kolokalisiert mit
PML (vgl. d, h, m, q), wobei auffällt, dass
nach Expression der Isoformen B, C, HMG
PML nicht mehr in so deutlichen Dots vorliegt
(vgl. g ,l, p mit c).
Deutlich zu erkennen ist die unterschiedliche Lokalisation der Sp100-Isoformen (Abb. 14).
Während Sp100A in den für ND10 typischen punktartigen Strukturen im Kern vorliegt
(Abb. 14b), sind die Isoformen B und HMG diffus im Zellkern verteilt (Abb. 14, f und o).
Sp100C dagegen stellt eine Mischform dar, da sowohl eine diffuse Verteilung, als auch
eine punktartige Komplexbildung zu beobachten war (Abb. 14k). Lediglich mit Sp100A
wurde ein Assoziation zu PML beobachtet (Abb. 14d). Interessanterweise wurde keine
Kolokalisation mit den Strukturen bei Sp100C mit PML gefunden. Die hier vorhandenen
Aggregate sind somit wahrscheinlich nicht mit den ND10 Domänen assoziiert. Die hier
58
E. Ergebnisse
gefundenen Lokalisationen der Isoformen sind konform zu einer kürzlich gezeigten
Analyse, in der Hep-2 Zellen mit Expressionskonstrukten für die Sp100-Isoformen
transfiziert wurden (Negorev et al., 2006).
1.3.2 Analyse der IE1 Genexpression nach Infektion der Sp100-Isoformen Zelllinien
Bei einer Depletion von Sp100 konnte gezeigt werden, dass nach Infektion eine signifikant
höhere Zahl an Zellen die sehr frühe Genexpression initiieren kann (vgl. Abb. 4). Es wurde
folglich untersucht, welchen Einfluss einzelne Isoformen auf die HCMV Infektion haben.
Ausgehend von siSp100-transduzierten Zellen wurden acht verschiedene Zelllinien
generiert, die je eine der vier Isoformen exprimieren und entweder unter der Kontrolle des
EF1α-Promotors oder des CMV-Promotors standen. Alle hergestellten Zelllinien wurden
parallel erzeugt, um Effekte bedingt durch eine unterschiedlich hohe Passagenzahl
möglichst auszuschließen. Die Zellen wurden als 3-fach Ansatz ausgesät und mit
100IEU/Vertiefung mit AD169 infiziert. 24h nach der Infektion wurde die Zahl der IE1positiven Zellen mikroskopisch bestimmt. Wie schon gezeigt, wurde in den siSp100-Zellen
eine deutlich erhöhte IE1-Genexpression im Vergleich zu den Kontrollzellen (vector bzw.
siC) beobachtet (Abb. 15). Bei den Sp100-kd Zellen, die eine Isoform exprimieren, wurde
eine um bis 2-fach erhöhte IE1-Genexpression im Vergleich zu den Ausgangs-Sp100-kd
Zellen festgestellt, was folglich eine bis zu 20-fache Erhöhung zu den Kontrollzellen
darstellt (Abb. 15). Diese Beobachtung steht im direkten Kontrast zu bereits gezeigten
Studien, die einen repressorischen Effekt für die Sp100-Isoformen B, C, HMG postulieren,
hier jedoch gezeigt für eine Expression ausgehend von dem ICP0-Promotor nach
transienter Transfektion (Negorev et al., 2006;Negorev et al., 2009).
Abb. 15: Stark erhöhte IE1-Genexpression in
Sp100-kd Zellen, die für einzelne Sp100Isoformen kodieren. Parallel hergestellte Zelllinien
wurden mit 100IEU/Vertiefung mit AD169 infiziert
und 24hpi fixiert. Der Nachweis der IE1-positiven
Zellen erfolgte mit dem monoklonalen maus antiIE1 (Mab 63-27) Antikörper über indirekte
Immunofluoreszenz. Die Zahl der IE1-positiven
Zellen in den Isoformen exprimierenden Zellen war
um das bis zu 20-fache erhöht im Vergleich zu den
Kontrollzellen vector bzw. siC. Es wurden nur
minimale Unterschiede beobachtet, ob die
Isoformen unter Kontrolle des EF1α-Promotors
(EF) oder des CMV-Promotors (CMV) standen.
59
E. Ergebnisse
1.3.3 Bestimmung der Plaquebildung in Sp100-exprimierenden Zellinien
Um zu überprüfen, ob nach der erhöhten Initiierung der sehr frühen Genexpression der
HCMV-Replikationszyklus
weiter
fortschreiten
kann,
wurde
eine
Plaqueanalyse
durchgeführt. Die neu generierten Zelllinien wurden parallel mit 100pfu/Vertiefung mit
AD169 infiziert und 7 Tage nach Infektion die entstandenen Plaques mit 1% Kristallviolett
in 20% Ethanol angefärbt und ausgezählt. Erneut wurde festgestellt, dass in siSp100Zellen im Vergleich zu den Kontrollzellen vector bzw. siC die Anzahl der Plaques um den
Faktor 3-4 zunimmt (Abb. 16). Weiter wurde gezeigt, dass die Isoformen-exprimierenden
Zellen eine weitere Erhöhung der Plaquezahl um bis zu 2 im Vergleich zu den Sp100-kd
Zellen aufweisen.
Abb. 16: Erhöhte Plaquebildung in Sp100Isoformen Zelllinien. Die verschiedenen
Zellen wurden als 3-fach Ansatz mit
100pfu/Vertiefung mit AD169 infiziert und
7dpi die Anzahl der Plaques nach Färbung
mit Kristallviolett mikroskopisch ausgezählt.
Es wurden nur minimale Unterschiede
beobachtet, ob die Isoformen unter Kontrolle
des EF1α-Promotors (EF) oder des CMVPromotors (CMV) standen.
2. Untersuchung der pp71-vermittelten Daxx-Degradation nach Infektion mit HCMV
In verschiedenen Studien konnte gezeigt werden, dass ND10-Domänen, mit den drei
wichtigsten Komponenten PML, Sp100 und Daxx, eine wichtige Rolle während der HCMVInfektion spielen (Everett & Chelbi-Alix, 2007;Regad & Chelbi-Alix, 2001). Das virale
Tegumentprotein pp71 ist sofort nach Infektion an ND10 lokalisiert und interagiert direkt
mit dem Daxx-Protein (Hofmann et al., 2002;Ishov et al., 2002). Dabei konnte bereits
gezeigt werden, dass Daxx repressorisch auf die HCMV-Infektion wirkt, da nach einer
siRNA vermittelten Daxx- Eliminierung in den entstandenen Daxx-kd Zellen eine signifikant
höhere IE1-Genexpression beobachtet wurde als in entsprechenden Kontrollzellen
(Tavalai et al., 2008). Nur durch die pp71-vermittelte Daxx-Degradation kann das Virus die
lytische Infektion starten (Cantrell & Bresnahan, 2006;Woodhall et al., 2006). Die durch
das Virus vermittelte Daxx-Degradation wurde in vorhergehenden Studien als ein
E. Ergebnisse
60
proteasomen-abhängiger (Woodhall et al., 2006), aber von Ubiquitin unabhängiger
(Hwang & Kalejta, 2007) Prozess beschrieben. Im Gegensatz dazu wurde in nicht
infizierten Zellen gezeigt, dass ein Daxx-Abbau in der Zelle mit einer Ubiquitinylierung von
Daxx durch die Ubiquitin E3-Ligase SPOP/Cullin3 startet und Daxx anschließend
proteasomal abgebaut wird (Kwon et al., 2006). Somit wurde die Hypothese aufgestellt,
dass diese SPOP/Cullin3 E3-Ligase auch einen Einfluss auf die pp71-vermittelte Daxx
Degradation während der HCMV- Infektion haben könnte.
2.1 Interaktionsuntersuchung von pp71 mit SPOP im Hefesystem
Um den genauen Mechanismus der pp71-vermittelten Daxx-Degradation aufzuklären,
wurde durch Hefeinteraktionsklonierung (yeast two-hybrid) nach möglichen pp71Interaktionspartnern gesucht. Daraus resultierte der Nachweis einer Interaktion von pp71
mit zellulärem SPOP, welches ein Bestandteil von E3-Ligasen des Ubiquitinsystems ist.
Der E3-Ligasekomplex ist in Abbildung 17A schematisch dargestellt. Die E3-Ligase ist ein
Multiprotein-Komplex, bestehend aus einem Gerüstprotein aus der Cullin-Familie (hier:
Cullin3/Cul3), einem RING-Motiv enthaltenden Protein (hier: Roc1), welches die
Ubiquitinylierung des Zielproteins ermöglicht und einer dritten Komponente (hier: SPOP),
die direkt an das Zielprotein bindet und so dieses an die E3-Ligase rekrutiert. SPOP ist
somit der für das Zielprotein spezifische Teil der E3-Ligase. Bereits bekannte Interaktionen
sind einerseits zwischen SPOP + Daxx und andererseits zwischen Daxx + pp71 durch
einen zweiseitigen Pfeil dargestellt (Abb. 17A). Die noch zu bestätigende Interaktion
zwischen SPOP + pp71 kennzeichnet ein gestrichelter Pfeil. Weiter sind die
verschiedenen Interaktionsdomänen der einzelnen Proteine dargestellt (Abb. 17B).
Kürzlich wurde eine große Gruppe von Proteinen, mit einem BTB (Bric-a-brac/Tramtrack/
Broad complex) Motiv, als Cullin3 Interaktionspartner identifiziert (Furukawa et al., 2003).
Zu dieser Gruppe zählt das SPOP-Protein, welches als Interaktionspartner von Cullin3
identifiziert wurde. Weiter wurde gezeigt, dass SPOP über das Proteininteraktionsmotiv
MATH mit Daxx interagieren kann (Kwon et al., 2006). Das Cullin3-Protein wiederum
interagiert mit seinem N-Terminus mit BTB-Motiv enthaltenden Proteinen wie SPOP (Abb.
17B) und mit dem C-Terminus mit RING-Motivproteinen wie Roc1 (Pintard et al., 2004).
Mit einem Filterlifttest wurden nun die Interaktionen zwischen pp71 + Daxx und pp71 +
SPOP bestätigt (Abb. 17C). Die Kotransformation der beiden Leervektoren pGAD und
pGBT dienten hier als Negativkontrolle, die Interaktion zwischen dem großen T-Antigen
E. Ergebnisse
61
des SV40 (pTD1) mit p53 (pVA3) fungierte als Positivkontrolle. Die Kotransformation der
zu untersuchenden Vektoren mit Leervektoren schließt eine Eigenaktivierung aus (Abb.
17C, 3-5). Zuletzt wurden die Interaktionen zwischen pp71 (pHM677) mit Daxx (pHM869)
(Abb. 17C, 6) und mit SPOP (pHM2586) (Abb. 17C, 7) bestätigt. Zusätzlich zur Selektion
auf HWL-Platten, wurden je 5 Kolonien auf HWL-Platten plus 20mM des Substratinhibitors
Aminotriazol (AT) ausgestrichen, um eine geringe Basalaktivität des HIS-Gens zu
unterbinden.
Abb. 17: Darstellung der Proteinkomplexe und Interaktion von pp71 mit SPOP im Hefesystem. A)
Schema der E3-Ligase mit Cullin3 als Gerüstprotein, SPOP als Zielprotein-spezifische Komponente und
Roc1 als Überträger des Ubiquitin von der E2 Ligase zum Zielprotein. Bekannte Interaktionen sind mit
doppelseitigem, noch zu bestätigende Interaktionen sind mit gestricheltem Pfeil gekennzeichnet. B)
Darstellung der Lokalisation der Interaktionen zwischen den einzelnen Proteinen. SPOP:
Aminosäurelänge 1-375; MATH-Domäne (as1-161): Proteininteraktionsmotiv. BTB (as:161-296):
Interaktionsmotiv von Proteinen mit Komponenten der Cullin-Familie. Cullin3: (767 Aminosäuren) fungiert
als Gerüstprotein und bindet an SPOP und Roc1. C) Filterlifttest und Wachstumsselektion nach
Hefetransformation. 1: Negativkontrolle; 2: Positivkontrolle; 3-5: Kontrolle, die eine Eigenaktivierung
ausschließt; 6: Interaktion zwischen pp71 (pHM677) und Daxx (pHM869); 7: Interaktion zwischen pp71
und SPOP (pHM2586); AD: Aktivierungsdomäne; BD: Bindedomäne
2.2 Untersuchung von pp71-Proteininteraktionen durch Ko-Immunpräzipitation
Nach dem Nachweis der einzelnen Proteininteraktionen im Hefesystem sollte eine
Bestätigung über Ko-Immunpräzipitation erfolgen. Hierfür wurden HEK293T-Zellen mit
Hilfe der Calcium-Phosphatmethode transfiziert und die präzipitierten Proteinkomplexe
E. Ergebnisse
62
nach Auftrennung durch SDS-Gel unter Verwendung von Epitop-spezifischen Antikörpern
im Western Blot nachgewiesen. Bereits bekannte Interaktionen konnten für Daxx+SPOP,
Daxx+pp71, Cul3+SPOP und Cul3+Roc1 nachgewiesen werden (Abb. 18A, Spur 1-4). Zu
erwähnen ist hier, dass eine Kotransfektion von Cullin3 mit SPOP (Abb. 18A, Spur 3 / Abb.
18B, Spur 7) zu einer Expressionserhöhung von SPOP führte; die Ursache hierfür muss
jedoch noch weiter analysiert werden.
Abb. 18: Nachweis von pp71-Proteininteraktionen mittels Ko-Immunpräzipitation. A+B) KoImmunpräzipitationsanalyse nach Transfektion von HEK293T-Zellen. Expressionsplasmide für die, mit
dem myc-Epitop (m-) oder dem Flag-Epitop (f-) fusionierten, angezeigten Proteine wurden transfiziert
und die Zellen zwei Tage nach Transfektion geerntet. Die Menge an eingebrachtem Protein wurde in
den Lysatblots (A+B, jeweils Oben und Mitte) über den Nachweis mit dem monoklonalen anti-myc
Antikörper bzw. dem monoklonalen M2 anti-Flag Antikörper überprüft. Die Immunpräzipitation wurde mit
dem M2 anti-Flag Antikörper durchgeführt und die gefällten Proteine mit dem anti-myc Antikörper
nachgewiesen.
Trotz mehrmaliger Wiederholung des Experiments (Daten nicht gezeigt) konnte eine
Interaktion zwischen SPOP und pp71 unter den verwendeten Versuchsbedingungen nicht
nachgewiesen werden (Abb. 18A, Spur 10). Bei den Lysatkontrollen ist zu erkennen, dass
SPOP nicht bzw. nur sehr schwach detektiert werden konnte (Abb. 18A, Spur 10). Jedoch
63
E. Ergebnisse
wurde hier eine vorher noch unbekannte Interaktion zwischen pp71 und Roc1 (Abb. 18A.
Spur 7) beobachtet. Weiter wurde die pp71+Roc1 Interaktion noch einmal bestätigt (Abb.
18B, Spur 4) und gezeigt, dass pp71 nur mit Roc1, nicht jedoch mit Cullin3 interagiert
(Abb. 18B, Spur 3). Die Interaktionen zwischen Daxx und SPOP (Abb. 18B, Spur 6, hier
sehr schwach) und Cullin3 mit SPOP (Abb. 18B, Spur 7) fungierten hier als
Positivkontrollen, während die Interaktion von Roc1 mit SPOP wie zu erwarten negativ
ausfiel. Zusammenfassend konnte bisher die in Hefe gefundene SPOP+pp71 Bindung
nicht bestätigt werden. Dafür ergaben diese Versuche einen Hinweis darauf, dass pp71
statt mit SPOP mit einem anderen Bestandteil der E3-Ligase, Roc1, interagiert.
2.2.1 Kotransfektionsanalyse von SPOP und pp71
Zuvor wurde gezeigt (Abb. 18), dass bei Kotransfektion von SPOP mit pp71 in HEK293T
Zellen und Lyse der Zellen mit Ko-IP Lysatpuffer kein SPOP mehr nachweisbar war.
Folglich sollte nun überprüft werden, ob eine Kotransfektion dieser Proteine generell nicht
möglich ist, da möglicherweise eine Koexpression die Degradation induziert. Hierfür
wurden HEK293T-Zellen ausgesät und mit einem pp71-Expressionsplasmid zusammen
mit einer steigenden Menge eines SPOP-Expressionsplasmids transfiziert. Zwei Tage
nach Transfektion wurden die Zellen in PBSo aufgenommen, sedimentiert, in 2xSDS
Auftragspuffer lysiert und anschließend durch Western Blot analysiert (Abb. 19).
Abb. 19: Kotransfektion eines pp71Expressionsplasmids
mit
ansteigender Menge eines SPOPPlasmids. HEK293T-Zellen wurden mit
unterschiedlichen Mengen (1, 2, 4, 8µg)
von SPOP alleine (Spur 1-4) bzw.
zusammen mit pp71 (Spur 6-9)
transfiziert. Spur 5: Transfektion von
pp71 allein. Der Nachweis erfolgte über
Detektion des myc-Epitops, welches an
beide Proteine fusioniert ist, mit einem
monoklonalen
anti-myc
Antikörper.
SPOP wurde zunächst alleine und anschließend gemeinsam mit pp71 in steigender
Konzentration transfiziert. Wie deutlich zu erkennen ist (Abb. 19), hat eine Koexpression
von pp71 keinen detektierbaren Einfluss auf SPOP. Somit ist es weiter möglich, dass ein
SPOP/pp71 Komplex existiert, er jedoch über die Ko-IP mit den verwendeten
Testbedingungen nicht nachweisbar war.
64
E. Ergebnisse
2.3 Klonierung von Roc1 Deletionsmutanten
Für eine weitere Analyse der neu beobachteten Interaktion zwischen Roc1 und dem
viralen pp71 Protein sollte zunächst das Interaktionsmotiv identifiziert werden. Hierfür
wurden unterschiedliche Deletionskonstrukte von Roc1 in verschiedene Vektorsysteme
eingebracht, um dann über den Filterlifttest in der Hefe bzw. die Ko-IP in HEK293T-Zellen
die Interaktion zu untersuchen. Webbasierte 2D-Strukturvorhersagen (http://npsapbil.ibcp.fr) wurden als Basis für die Konstruktion der Deletionsmutanten verwendet.
Abb. 20: 2D Strukturvorhersage von
Roc1 und schematische Darstellung
der
neu
generierten
Roc1
Konstrukte. A) Aminosäuresequenz
von Volllängen Roc1 (as 1-109) mit
darunter
farbig
dargestellten
Strukturvorhersagen
unter
Verwendung der Algorithmen SOPMA,
HNN (Hierarchical Neural Network)
und GOR4. Gelb: Random Coil, Blau:
α-Helices, Rot: Erweiterter Strang,
Grün: β-Faltblatt. B) Schematische
Darstellung von Roc1 Volllänge (1) und
fünf Deletionskonstrukten (2-6). Start
und Endpunkt der Klone werden durch
die
Aminosäurenummer
gekennzeichnet.
In Abbildung 20A ist zunächst die Aminosäuresequenz von Roc1 dargestellt, darunter die
Strukturvorhersage unter Verwendung von drei verschiedenen Vorhersagealgorithmen,
SOPMA: (Geourjon & Deleage, 1995); HNN-Hierarchical Neural Network: (Guermeur et
al., 1999); GOR4: (Garnier et al., 1996), deren Analyse weitgehend übereinstimmte.
Daraus wurden die Grenzen der Roc1-Deletionsmutanten (Abb. 10B, 2-6) festgelegt.
Ausgehend vom Vektor pF872 wurde mittels PCR sowohl Volllängen-Roc1 (Abb. 10B, 1,
as 1-109), als auch die verschiedenen Deletionen in die Vektoren pGAD424 und pHM971
eingebracht. Daraus resultierten die Vektoren pHM3377-pHM3382, die die Roc1
Konstrukte 1-6 (Abb. 20B) in pGAD424 als Fusion an die Aktivierungsdomäne enthalten
und für Studien im Hefesystem verwendet werden konnten. Zusätzlich entstanden die
Vektoren pHM3384-pHM3389, die für die Roc1-Konstrukte 1-6 (Abb. 20B) in pHM971 als
Fusion an das Flag-Epitop kodieren und für Ko-IP Studien eingesetzt wurden.
65
E. Ergebnisse
2.3.1 Analyse der Interaktion von Roc1 mit pp71 im Filterlifttest
Um die Wechselbeziehung von Roc1 mit pp71 weiter zu bestätigen und um den
Interaktionsbereich
einzugrenzen,
wurde
eine
Hefeinteraktionsanalyse
mit
anschließendem Filterlifttest durchgeführt. Hierfür wurden die Roc1-Konstrukte zusammen
mit dem Hefevektor, der für pp71, fusioniert an die GAL4 DNA-Bindedomäne kodiert, in
Hefen transformiert und auf HWL-Mangelagarplatten ausplattiert. Die entstandenen
Hefekolonien wurden im Filterlifttest auf die Enzymaktivität des Reportergens βGalaktosidase untersucht. Zum Nachweis bereits bekannter Interaktionen wurden die
Vektoren pTD1 und pVA3 (siehe Abb. 17, Abb. 21A, 2), pHM869 und pHM677 (siehe Abb.
17, Abb. 21A, 6), sowie die Kombination pHM300 und pHM301 (Abb. 21A, 10;
Dimerisierung von UL69) verwendet. Als Negativkontrolle diente die Kotransfektion der
Leervektoren pGAD424 mit pGBT9 (Abb. 21A, 1). Weiter konnte erneut eine Interaktion
zwischen SPOP mit pp71 festgestellt werden (Abb. 21A, 7).
Abb.
21:
Filterlifttest
zum
Nachweis der pp71 + Roc1
Interaktion und Eingrenzung der
Interaktionsdomäne. A) Filterlifttest
zur Überprüfung der Wechselwirkung
zwischen Roc1 und pp71. 1:
Negativkontrolle; 2: Positivkontrolle;
3-5 und 8-9: Kotransformation mit
entsprechendem
Leervektor;
6:
Interaktion zwischen pp71 (pHM677)
und Daxx (pHM869); 7: Interaktion
zwischen pp71 und SPOP (pHM
2586); 10: Interaktion zwischen UL69
mit UL69 (Dimerisierung); 11-16:
Kotransformation
der
Roc1
Konstrukte 1-6 mit entsprechendem
Leervektor; 17-22: Kotransformation
der Roc1 Konstrukte 1-6 mit UL69
(pHM300); 23-28: Nachweis der
pp71+Roc1
Interaktion.
AD:
Aktivierungsdomäne,
BD:
Bindedomäne. B) Schematische
Darstellung
der
sechs
Roc1
Konstrukte und Eingrenzung des
Interaktionsbereichs mit pp71.
66
E. Ergebnisse
Als weitere Kontrollen wurden die Roc1 Konstrukte pHM3377-pHM3382 zusammen mit
dem Leervektor pGBT9 kotransformiert (Abb. 21A, 11-16), um sicher zu stellen, dass die
beobachtete Reaktion keine Eigenaktivierung darstellt. Ebenso wurde geprüft, ob es sich
hierbei um eine spezifische Reaktion zwischen Roc1 und pp71 handelt oder ob Roc1 auch
anderweitig im Hefesystem interagiert. Dazu wurden die Roc1-Konstrukte pHM3377pHM3382 mit pHM300 (Abb. 21A, 17-22), welches für UL69 kodiert, kotransformiert. Im
Filterlift konnte gezeigt werden, dass pp71 sowohl mit Roc1 Volllänge (Abb. 21A, 23), als
auch mit den Konstrukten 3-6 (Abb. 21A, 25-28) interagieren kann. Die Aminosäuren 1-53
(Abb. 21A, 24) scheinen keine Rolle zu spielen. Somit konnte die pp71/Roc1
Wechselwirkung in der Hefe bestätigt werden und der Interaktionsbereich eingegrenzt
werden (Abb. 21B, rote Umrandung).
2.3.2 Analyse der Interaktion von Roc1 mit pp71 nach Ko-Immunpräzipitation
2.3.2.1 Phosphorylierung von Roc1
Wie beschrieben (siehe 2.3) wurden parallel zu den Roc1-Hefeplasmiden auch eukaryote
Expressionsplasmide
zur
Durchführung
von
Koimmunpräzipitationsexperimenten
generiert. Zum Expressionsnachweis wurden diese neu generierten Roc1-Konstrukte
zunächst in HEK293T-Zellen transfiziert und im Western Blot über den Nachweis des
eingebrachten Flag-Epitops mit einem spezifischen anti-Flag Antikörper detektiert. Dabei
wurde beobachtet, dass im Vergleich zu Roc1, das unter Verwendung des Plasmids
pF872 exprimiert wurde (siehe Abb. 18), nun eine Roc1-Doppelbande vorhanden war
(Abb. 22A). Dies ist jedoch nur für die Konstrukte 1 und 3 der Fall (Abb. 21A, Spur 1, 3 as
1-109 und as 1-98), nicht jedoch für die Deletionsmutante 6 (Abb. 21A, Spur 6, as 30-109).
Die Mutanten 2, 4 und 5 wurden nicht exprimiert. Es sollte überprüft werden, ob die
beobachtete Doppelbande durch eine Phosphorylierung bewirkt wird, die an Roc1, das
nach Transfektion des Originalplasmids pF872 exprimiert wird, nicht stattfindet. Dies
wurde getestet, indem eine Dephosphorylierung (wie in Methoden beschrieben) der nach
Transfektion exprimierten Proteine durchgeführt wurde. Als Vergleich und Positivkontrolle
diente virales UL69. Im Vergleich zu den Lysatkontrollen sind nach dem enzymatischen
Verdau die Doppelbanden komplett verschwunden. Aus diesem Experiment (Abb. 22B)
lässt sich schlussfolgern, dass in den neu generierten Roc1-Konstrukten eine artifizielle
Phosphorylierungstelle entstanden sein muss.
67
E. Ergebnisse
Abb. 22: Doppelbanden in neu generierten
Roc1
Konstrukten
resultieren
aus
eingebrachter Phosphorylierungsstelle. A)
Expression der Roc1 Deletionsmutanten in
Fusion an das Flag-Epitop nach Transfektion in
HEK283T Zellen. Nachweis über M2 anti-Flag
Antikörper im Western Blot. as: Aminosäure.
B) Vergleich von Lysaten aus transfizierten
HEK293T Zellen vor (Spur 1-3) und nach (Spur
5-7)
einer
Dephosporylierungs-Reaktion.
Nachweis über M2 anti-Flag Antikörper im
Western Blot. f-: Flag-Epitop
2.3.2.2 Analyse der Interaktion von Roc1 mit pp71 durch Koimmunpräzipitation
Es stellte sich nun die Frage, ob mit den neu generierten Roc1-Mutanten ein
Interaktionsnachweis
durch
Koimmunpräzipitation
möglich
ist,
um
den
durch
Hefeexperimente gefundenen Interaktionsbereich zu bestätigen. Hierfür wurden HEK293T
Zellen, wie in Abbildung 23 angezeigt, kotransfiziert. Nach Entnahme der Lysatkontrollen
wurde mit M2 anti-Flag Antikörper präzipitiert und die ko-präzipitierten Proteine durch
Western Blot nachgewiesen. Als Positivkontrolle diente die Interaktion zwischen Daxx und
pp71 (Abb. 23, Spur 7) sowie die zuvor schon gezeigte (Abb. 18) Interaktion zwischen
Roc1 (pF872) mit pp71 (Abb. 23, Spur 8). Die neu generierten Roc1-Konstrukte waren
trotz Phosphorylierung noch in der Lage mit pp71 zu interagieren (Abb. 23, Spur 9-11). Für
Roc1 as 30-109 (Abb. 23, Spur 11) wurde nur eine sehr schwache Interaktion
nachgewiesen, was jedoch vermutlich aus der schwachen Expression dieser Mutante
resultierte. Somit konnte bestätigt werden, dass, wie in Hefeexperimenten, die Roc1Konstrukte 1 (as 1-109), 3 (as 1-98) und 6 (as 30-109) mit pp71 interagieren und der
Bereich für diese Wechselwirkung zwischen den Aminosäuren 30-98 liegen muss. Weitere
Deletionsmutanten sind für eine exaktere Eingrenzung nötig.
68
E. Ergebnisse
Abb. 23: Nachweis der Wechselwirkung zwischen
pp71- und Roc1-Konstrukten. Analyse mittels KoImmunpräzipitation nach Transfektion von HEK293T
Zellen. Expressionsplasmide für die mit dem mycEpitop (m-) oder dem Flag-Epitop (f-) fusionierten,
angezeigten Proteine wurden transfiziert und die
Zellen zwei Tage nach Transfektion geerntet. Die
Menge an eingebrachtem Protein wurde in den
Lysatblots über den Nachweis mit dem monoklonalen
anti-myc Antikörper bzw. dem monoklonalen M2 antiFlag Antikörper überprüft. Die Immunpräzipitation
wurde mit dem M2 anti-Flag Antikörper durchgeführt
und die gefällten Proteine mit dem anti-myc
Antikörper nachgewiesen.
2.4 Untersuchung der zellulären Lokalisation von SPOP, Roc1 und Cul3
Um den Proteinkomplex, bestehend aus SPOP, Roc1 und Cul3 nun weiter zu
untersuchen, wurde die intrazelluläre Lokalisation der Proteine überprüft. Hierfür wurden
HFF-Zellen auf Deckgläsern ausgesät und mit 4% Paraformaldeyd fixiert. Die Lokalisation
von SPOP konnte mit einem spezifischen anti-SPOP Antikörper in der indirekten
Immunofluoreszenz nachgewiesen werden (Abb. 24A). Deutlich ist zu erkennen, dass
SPOP in punktartigen Strukturen im Zellkern lokalisiert ist. Da für Roc1 bzw. Cul3 keine
spezifischen Antikörper vorhanden waren, wurden Epitop-markierte Fusionsproteine
mittels FuGene® HD Transfektion in HFF-Zellen nachgewiesen. Humane Primärzellen
(HFF) wurden auf Deckgläsern ausgesät, wie angezeigt (Abb. 24B) transfiziert und die
Expression und Lokalisation 48h nach Transfektion mittels Epitop-spezifischer Antikörper
detektiert.
69
E. Ergebnisse
Abb. 24: Zelluläre Lokalisation von SPOP, Roc1 und
Cul3. A) Endogenes SPOP ist in punktartigen Strukturen
im Zellkern lokalisiert (b). B) Fugene HD Transfektion von
HFF mit Plasmiden die für SPOP (b), Roc1 (e) bzw. Cul3
(h), fusioniert an das Flag-Epitop, kodieren. Nachweis in
der indirekten Immunofluoreszenz mit dem monoklonalen
M2 anti-Flag Antikörper. C) Fugene HD Kotransfektion
von unterschiedlich markiertem SPOP, Cul3, Roc1 und
Nachweis über den Epitop spezifischen Antikörper. a-d:
Flag-Cul3 + myc-Roc1; e-h: Flag-Cul3 + HA-SPOP; i-m:
Flag-SPOP + myc-Roc1.
Transfiziertes SPOP zeigte erneut die punktartigen Strukturen im Kern (Abb. 24B, b),
während bei Roc1 eine im Zellkern diffuse Verteilung beobachtet wurde (Abb. 24B, e). Im
Gegensatz dazu lag Cullin3 diffus über die gesamte Zelle verteilt vor (Abb. 24B, h). Je
nach Expressionsmenge wurden verschiedene Ausprägungen beobachtet; einerseits
wurde eine Verteilung, konzentriert im Zytoplasma (Abb. 24B, h), andererseits auch eine
komplett diffuse Verteilung sowohl im Zytoplasma als auch im Zellkern beobachtet (Abb.
24C, b). Weiter sollte untersucht werden, ob in der Zelle auch eine Kolokalisation zu
beobachten ist. Hierfür wurden HFF Zellen mittels FuGene® HD kotransfiziert und die
Expression und Lokalisation erneut über Epitop-spezifische Antikörper nachgewiesen. Die
bekannten Interaktionen zwischen Cul3+Roc1 (Abb. 20C, a-d) und Cul3+SPOP (Abb.
24C, e-h) konnten über die indirekte Immunofluoreszenz bestätigt werden. Zu erwähnen
ist hierbei, dass zumindest ein Teil der exprimierten Cullin3-Menge seine Lokalisation bei
Kotransfektion mit SPOP (Abb. 24C, f) verändert und in punktartigen Strukturen vorliegt,
die nun mit exprimiertem SPOP kolokalisieren. Wie zu erwarten, wurde keine Interaktion
zwischen SPOP und Roc1 (Abb. 24C, i-m) gefunden.
70
E. Ergebnisse
2.5 Kolokalisation von SPOP mit ND10-Proteinen
Da für SPOP sowohl nach Transfektion also auch endogen eine punktartige Lokalisation
im Zellkern festgestellt wurden, stellte sich die Frage, ob es sich bei diesen Strukturen um
ND10-Domänen handelt. Dies wurde über indirekte Immunofluoreszenz analysiert,
nachdem HFF auf Deckgläschen fixiert wurden und endogenes Protein über den
Nachweis mit spezifischen Antikörpern detektiert wurde.
Abb. 25: SPOP kolokalisiert mit den ND10
Komponenten PML, Daxx und Sp100.
Nachweis von endogenem Daxx (b), PML (f),
Sp100 (k) und SPOP (c, g, l) unter Verwendung
der spezifischen Antikörper: SPOP: polyklonaler
Ziege anti-SPOP; Daxx: polyklonaler Kaninchen
anti-Daxx (M-117); PML: polyklonaler Kaninchen
anti-PML
(H-238);
Sp100:
polyklonaler
Kaninchen anti-Sp100 (H-60); alle Santa Cruz
Biotechnology (Santa Cruz, USA). SPOP
kolokalisiert mit allen drei ND10-Proteinen (d, h,
m).
Wie schon zuvor gezeigt, sind die drei ND10-Hauptkomponenten Daxx, PML und Sp100 in
den punktartigen Strukturen in Zellkern lokalisiert, die die ND10 Domänen repräsentieren
(Abb. 25, b, f, k). Endogenes SPOP kolokalisiert mit allen drei Proteinen in diesen
Strukturen (Abb. 25, d, h, m), weshalb über eine Funktion von SPOP innerhalb der ND10
spekuliert werden kann.
2.6 Analyse der SPOP-Expression zu unterschiedlichen Zeiten der HCMV Infektion
Aufgrund der Interaktion zwischen pp71 und Roc1 und der direkten Lokalisation von
SPOP an den ND10 Domänen, sollte nun untersucht werden, ob es während Infektion zu
einer
Veränderung
der
SPOP-Expression
kommt.
Hierfür
wurden
humane
Vorhautfibroblasten (HFF) mit AD169-wt unter hohen MOI Bedingungen infiziert, zu den
angegebenen Zeitpunkten Zelllysate erstellt und im Western Blot analysiert (Abb. 26,
A+B).
E. Ergebnisse
71
Abb. 26: Expression von SPOP während Infektion mit AD169-wt und AD169 delta-pp71. A+B)
Infektion von HFF Zellen mit AD169-wt (links) und AD169 delta-pp71 (rechts) mit MOI 3 und Analyse der
Zelllysate zu den angegebenen Zeiten nach Infektion. Nachweis der Proteinexpression im Western Blot
mit spezifischen Antikörpern. SPOP: polyklonaler Ziege Antikörper (Santa Cruz Biotechnology, Santa
Cruz, USA); IE2 und pp65: Hybridoma mAb 63-27 bzw. mAb 65-33. Der Nachweis von β-actin mit
monoklonalen Maus Antikörper AC-15 diente als Ladekontrolle.
Neben der Infektion mit Wildtyp-AD169 wurde parallel ein Infekt mit AD169 delta-pp71
durchgeführt, um zu prüfen, ob ein Fehlen von pp71 einen Effekt auf SPOP ausübt. Zu
frühen Zeiten der Infektion (Abb. 26A) lässt sich bei Infektion mit beiden Viren keine
Veränderung der SPOP Expression im Vergleich zu mock-infizierten Zellen feststellen.
Zwischen 24hpi und 96hpi jedoch wurde sowohl bei der Infektion mit Wildtyp als auch bei
Infektion mit der Deletionsmutante eine erhöhte Expression von SPOP jeweils im
Vergleich zu mock beobachtet (Abb. 26B). Diese verstärkte Expression startet bereits ab
24hpi (Abb. 26B, Spur 2, 10). Eine weitere Beobachtung ist, dass im Gegensatz zum
SPOP-Nachweis zu frühen Zeiten der Infektion, ab 24 Stunden eine weitere SPOP-Bande
im Western Blot detektiert wurde, deren Expression im weiteren Verlauf ebenfalls
72
E. Ergebnisse
zunimmt. (Abb. 26, vlg. A+B). Zu klären bleibt jedoch noch die Ursache der SPOP
Doppelbande und welchen Einfluss eine späte Infektion auf die SPOP-Expression hat. Die
Vermutung, dass eine Veränderung von SPOP während der Anfangsphase der Infektion
auftritt, konnte durch diese Experimente nicht bestätigt werden.
2.7 Herstellung von SPOP- und Roc1-depletierten Zelllinien
Um eine mögliche Funktion von SPOP und Roc1 während der HCMV-Infektion weiter zu
untersuchen, wurden Zelllinien generiert, die stabil eine über RNAi-Wechselwirkung
vermittelte
Depletion
(Knockdown;
kd)
aufweisen.
Hierfür
wurden
webbasiert
(http://rnaidesigner.invitrogen.com/rnaiexpress/) shRNA-Oligonukleotide ausgewählt und
in den Vektor pSirenRetroQ eingebracht. Die Sequenz und die Position der funktionellen
siRNA wurden in Abbildung 27A für die Proteine SPOP und Roc1 angezeigt. Die Funktion
wurde nun zunächst mittels transienter Transfektion in HEK293T-Zellen nachgewiesen.
Die Zellen wurden, wie angegeben, mit unterschiedlichen Expressionsvektoren mittels
Calcium-Phosphat transfiziert und anschließend im Western Blot analysiert (Abb. 27B).
Die Kotransfektion von markiertem UL69 diente hierbei als Transfektionskontrolle, der
Nachweis von β-actin als Ladekontrolle. Bei Kotransfektion von myc-SPOP bzw. mycRoc1 zusammen mit dem Leervektor (vector, Abb. 27B, Spur 4,9) bzw. dem Kontrollvektor
siC (Abb. 27B, Spur 5,10) wurde keine Veränderung der jeweiligen Proteinmengen
beobachtet. Erst die Kotransfektion von Expressionsvektoren für SPOP bzw. Roc1
zusammen mit den entsprechenden shRNA-exprimierenden Vektoren (siSPOP bzw.
siRoc1) resultierte in einer deutlichen Abnahme der Proteinmengen im Western Blot (Abb.
27B, Spur 6, 11). Nach Überprüfung der Funktion der siRNA wurden nun retrovirale
Überstände generiert, damit junge primäre Vorhautfibroblasten transduziert und
anschließend über die Zugabe von Puromycin selektioniert. Parallel dazu wurden KontrollZelllinien hergestellt, die entweder mit dem Leervektor (vector) oder mit dem Vektor siC,
welcher eine nicht funktionelle shRNA exprimiert, transduziert worden waren. Ausgehend
von den stabil transduzierten Zellen wurden Zelllysate erstellt und die endogene
Proteinmenge von SPOP im Western Blot überprüft (Abb. 27C). Im Vergleich zu den
Kontrollen konnte eine deutliche Abnahme der SPOP-Proteinmenge in siSPOPtransduzierten Zellen festgestellt werden.
73
E. Ergebnisse
Abb. 27: Herstellung von SPOP-kd bzw. Roc1-kd
Zelllinien. A) Schematische Darstellung von SPOP (as
1-375) und Roc1 (as 1-109) und Anzeige von
verschiedenen Motiven innerhalb der Proteine. Die
Erkennungssequenz der eingebrachten siRNA ist jeweils
darunter angezeigt und die Position durch einen Pfeil
gekennzeichnet. B) Funktionsnachweis der siRNA nach
transienter Transfektion von Expressionsplasmiden, wie
angezeigt. Links: Nachweis von SPOP über einen mycspezifischen Antikörper (Hybridoma mAB 9E10) und
UL69 mit dem M2 Maus anti-Flag Antikörper. Rechts:
Nachweis von Roc1 und UL69 mit den mAB 9E10
Hybridomüberstand. Der Nachweis von β-actin diente
jeweils als Ladekontrolle. C) Endogener SPOP Nachweis
über
einen
SPOP-spezifischen
Antikörper
in
Kontrollzellen (vector, siC) im Vergleich zu SPOP-kd
Zellen (siSPOP).
Da für den Nachweis von Roc1 kein funktioneller spezifischer Antikörper zur Verfügung
stand, wurde die Überprüfung der Roc1-Depletion mittels RT-PCR durchgeführt. Aus
vector-transduzierten Kontrollzellen und Roc1-kd Zellen wurde mit Trizol die Gesamt-RNA
isoliert und daraus 100ng für die RT-PCR eingesetzt. Parallel dazu wurde als Kontrolle auf
DNA-Kontaminationen eine PCR durchgeführt. Zur Bestätigung der SPOP-Depletion
wurde ebenso eine RT-PCR mit RNA aus siSPOP-transduzierten Zellen durchgeführt. Als
weitere Kontrolle für die Gesamtfunktion der RT-PCR diente der Nachweis von GAPDH.
Wie zu erkennen (Abb. 28, A: Spur 1-4; B: Spur 9-12) sind die PCR Kontrollen sowohl für
den GAPDH-, als auch den SPOP- bzw. Roc1-Nachweis negativ; dies zeigt an, dass in
der isolierten RNA-Probe keine DNA-Kontamination vorhanden war. Weiter wurde in der
RT-PCR in der RNA aus den Kontrollzellen (vector) sowohl GAPDH, also auch SPOP
bzw. Roc1 (Abb. 28, A 5+6; B 13+14) positiv nachgewiesen. Wie schon im Western Blot
E. Ergebnisse
74
gezeigt, konnte in den SPOP-kd Zellen kein SPOP mehr nachgewiesen werden (Abb.
28A, Spur 8). In siRoc1-transduzierten Zellen wurde noch eine geringe Roc1-Menge
detektiert (Abb. 28B, 16). Nach einer Analyse des RT-PCR Ergebnisses der Roc1-Menge
in siRoc1 im Vergleich zur Kontrollmenge von Roc1 in Vektorzellen (Abb. 28B, Spur 14
vgl. 16) mit der „AIDA Image Analyser Software“ wurde für Roc1 eine Effizienz der
Depletion von 62% errechnet (Daten nicht gezeigt).
Abb. 28: Nachweis der SPOP- bzw. Roc1-Depletion via RT-PCR. A+B) Aus vector, siSPOP bzw.
siRoc1 transduzierten Zellen wurde RNA isoliert und 100ng in der RT-PCR und der Kontroll-PCR
eingesetzt. Anschließend wurden die Proben auf einem 1%igen Agarosegel aufgetrennt und
dokumentiert. Während in vector-transduzierten Zellen sowohl der GAPDH-, als auch der SPOP
bzw. Roc1 Nachweis positiv ist (A: Spur 5,6; B: Spur 13,14), so ist in den neu generierten Zelllinien
siSPOP bzw. siRoc1 eine deutliche SPOP bzw. Roc1 Abnahme zu sehen (A8, B16).
Die neuen Zelllinien siSPOP und siRoc1 wurden zuerst auf ihre Proliferationsfähigkeit
untersucht, um zu prüfen, ob die Transduktion mit vector, siC, siSPOP bzw. siRoc1 einen
Einfluss auf das Wachstum ausübt. Dafür wurde der „Cell Titer 96® AQueous One Solution
Cell Proliferation Assay“ der Firma Promega nach Angaben des Herstellers verwendet.
Pro Zelllinie (vector, siC, siSPOP und siRoc1) wurden 5000 Zellen ausgesät und die
Anzahl noch lebender Zellen nach 72h und 96h Inkubation bestimmt. Zu den
angegebenen Zeitpunkten wurde MTS zu den Zellen gegeben, welches von lebenden
Zellen in ein farbiges Formazan-Produkt metabolisiert wird und dessen Absorption bei
490nm bestimmt werden kann. Die angegebene Formazanmenge ist somit direkt
proportional zu der Anzahl lebender Zellen in der Kultur (Abb. 29). Parallel dazu dienten
HFF als Kontrolllinie, der erhaltene Wert wurde auf 100% gesetzt; Medium ohne Zellen
fungierte als mock Kontrolle. In den Kontrollzelllinien vector und siC sind zwar bereits
weniger lebende Zellen in Kultur als bei HFF, jedoch liegen die beiden neu generierten
Depletions-Linien siSPOP und siRoc1 nur minimal darunter.
75
E. Ergebnisse
Abb. 29: Proliferationsanalyse von SPOPund Roc1 kd-Zellen. Messung der Menge
des metabolisierten Produkts Formazan 72h
und 96h nach Aussäen von HFF Zellen,
vector-, siC-, siSPOP- bzw. siRoc1transduzierten Zellen. Der Versuch wurde als
Doppelbestimmung
im
3-fach
Ansatz
durchgeführt, die Standardabweichung ist
angezeigt.
2.7.1 Analyse der HCMV-Replikation in SPOP-kd Zellen
Um zu prüfen, welchen Einfluss eine Depletion von SPOP auf die Replikation von HCMV
hat, wurde eine GFP-Reporteranalyse durchgeführt. Hierfür wurden Kontrollzellen
zusammen mit SPOP-kd Zellen mit dem rekombinanten HCMV Stamm AD169-GFP
infiziert, welcher für das Grüne Fluoreszenz Protein (GFP, green fluorescence protein)
kodiert (Marschall et al., 2000). Je 7 Tage und 10 Tage nach der Infektion mit 1000pfu
AD169-GFP, wurde die Menge des GFP fluorimetrisch quantifiziert.
Wie in Abb. 30
gezeigt, wurde in siSPOP-Zellen 7 und 10 Tage nach Infektion eine signifikant niedrigere
GFP-Fluoreszenz gemessen, was eine verminderte HCMV Replikation in der Abwesenheit
von SPOP anzeigt. Die gemessene GFP-Fluoreszenz in siSPOP-Zellen ist an beiden
Messtagen um die Hälfte geringer als in den beiden Kontrollen, was auf einen möglichen
aktivierenden Effekt
Abb. 30: GFP-Reporter Assay nach Infektion
von SPOP-kd Zellen im Vergleich zu
Kontrolllinien. siSPOP, vector bzw. siC
wurden mit 1000pfu AD169-GFP, welcher das
Grüne-Fluoreszenz-Protein exprimiert, infiziert.
Gezeigt wird die fluorimetrische Quantifizierung
der GFP-Expression 7 Tage und 10 Tage nach
der Infektion. Es wurden 3-fach Bestimmungen
durchgeführt und die Standardabweichung der
einzelnen Proben wurde errechnet.
von SPOP auf die HCMV-Infektion schließen lässt, da in der Abwesenheit des Proteins
eine deutlich geringere Virusreplikation vorhanden war.
E. Ergebnisse
76
2.7.2 Bestimmung der IE1-Genexpression und der Plaquebildung in siSPOP- bzw.
siRoc1-Zellen
Um zu prüfen, zu welchem Zeitpunkt nach Infektion der SPOP-kd Zellen das Virus
gehemmt wird, wurde 24h nach Infektion die Zahl der IE1-positiven Zellen (Abb. 31A) und
7 Tage nach Infektion die Anzahl der Plaques (Abb. 31B) bestimmt. Hierfür wurden
siSPOP-transduzierte Zellen parallel zu den Kontrollzelllinien (vector, siC) ausgesät und
mit AD169 wie angegeben infiziert. Als weitere Zelllinie wurden Roc-kd Zellen analysiert.
Abb. 31: Verringerte Zahl an IE1-positiven Zellen und geringere Plaquezahl in siSPOP und
siRoc1 Zellen. A) 24hpi nach Infektion mit 100IEU AD169 wurde die Anzahl der IE1-positiven
Zellen in der indirekten Immunofluoreszenz über den Nachweis von IE1 mit dem monoklonalen
Maus anti-IE1 (mAb 63-27) bestimmt. Die Zahl der IE1 positiven Zellen war in SPOP- bzw. Roc1verminderten Zellen im Vergleich zu Kontrollzellen um den Faktor 3-4 reduziert. B) Bestimmung
der Zahl der Plaques 7 Tage nach Infektion mit 100pfu AD169 und Anfärben der Plaques mit
Kristallviolett.
In den SPOP- und Roc1-verminderten Zelllinien wurde eine 3-4fach verringerte Zahl der
Zellen beobachtet, die die IE-Genexpression starten können und somit IE1 exprimieren.
Die Depletion dieser beiden Proteine beeinflusst die HCMV Infektion bereits zu Beginn der
Infektion. Als Folge der geringeren Zahl der Zellen, die in die lytische Infektion übergehen,
wurde 7 Tage nach Infektion eine deutlich geringere Anzahl an Plaques in SPOP- bzw.
Roc1-kd Zellen detektiert.
2.8 Untersuchung des Mechanismus der Daxx-Degradation
Wie von Woodhall und Kollegen gezeigt, ist während einer Infektion das virale Tegumentprotein pp71 für die Daxx-Degradation verantwortlich (Woodhall et al., 2006). Die
Degradation erfolgt hierbei in Abhängigkeit von proteasomaler Aktivität. Dass dies der Fall
77
E. Ergebnisse
ist, wurde im Western Blot bestätigt. Hierfür wurden HFF-Zellen mit AD169 mit MOI 3
infiziert und daraus 6h nach Infektion Zelllysate erstellt. Zu den Infektionsansätzen wurde
zum Zeitpunkt der Infektion der Proteasomen-Inhibitor MG132 (Endkonzentration: 20µM)
zugesetzt. Die Zugabe von DMSO diente als Lösemittelkontrolle. In Abbildung 32 wurde
gezeigt, dass nach Infektion (Spur 2) die Daxx Proteinmenge deutlich abnimmt, während
bei der Zugabe von MG132 (Abb. 32, Spur 3) Daxx wieder in gleicher Menge wie bei der
uninfizierten Probe (mock) detektiert werden kann.
Abb. 32: Proteasom- und ubiquitin-abhängige
Daxx Degradation nach Infektion. 6h nach
Infektion von HFF mit AD169 mit einer MOI von 3
wurden die erstellten Zelllysate im Western Blot auf
die Proteinmengen von Daxx, p53 und IE1
untersucht. Daxx: monoklonaler Kaninchen antiDaxx Antikörper; p53: monoklonaler Maus anti-p53
Antikörper D01; IE1: Hybridoma mAB 63-27.
Nachweis von IE1 nach Infekt (Spur 2,3 + 6,7). Die
Daxx und p53 Proteinmengen wurde in
Abhängigkeit von Infektion und Zugabe von DMSO
(2), MG132 (3) oder IAA (4,7) bestimmt. Der
Nachweis von β-actin diente als Ladekontrolle.
Ob die pp71-vermittelte Daxx-Degradation über den Ubiquitin-Signalweg erfolgt, wurde
überprüft, indem dieser Signalweg mit dem unspezifischen E1/E2 Enzyminhibitor
Iodoaceticacid (IAA) gehemmt wurde. Somit kann kein Ubiquitin mehr an die E3-Ligase
übertragen werden, was dazu führt, dass Proteine, die sonst ubiquitin-abhängig reguliert
werden, nicht mehr ubiquitinyliert und folglich abgebaut werden. Als mögliche E3-Ligase
im Falle der Daxx-Degradation ist nach dieser bisherigen Studie der Proteinkomplex
SPOP-Cul3-Roc1 anzusehen. Nach Infektion ist deutlich der Daxx-Abbau zu erkennen
(Abb. 32, Spur 6), bei einer zusätzlichen Zugabe von IAA nach Infektion (Abb. 32, Spur 7)
scheint der Daxx-Abbau teilweise aufgehoben zu sein, was auf eine Beteiligung des
Ubiquitin-Signalweges hinweist. Zusätzlich muss jedoch erwähnt werden, dass nach
Zugabe von IAA zum Infekt eine geringere Menge an IE1 detektiert wurde. Dies ist
möglicherweise deshalb der Fall, da eine erhöhte Daxx-Konzentration die HCMV-Infektion
78
E. Ergebnisse
hemmt. Die Regulierung von p53 durch das Proteasom und den Ubiquitin-Signalweg
diente hier als Positivkontrolle der Funktion der verwendeten Inhibitoren MG132 und IAA.
2.8.1 Analyse der Daxx-Degradation nach Infektion der SPOP-kd Zellen
Es war zuvor (Punkt 2.7.2) gezeigt worden, dass SPOP und Roc1 zu frühen Zeiten eine
Rolle während der HCMV-Infektion spielen. Nach Infektion von SPOP- und Roc1-kd Zellen
wurde eine geringere Anzahl an IE1-positiven Zellen im Vergleich zu Kontrollzellen
beobachtet. Da SPOP und Roc1 teilweise als Proteinkomplex mit Cullin3 vorliegen, der für
die Ubiquitinylierung von Proteinen in der Zelle verantwortlich ist, wurde in Punkt 2.8
untersucht, ob nach einer Hemmung des Ubiquitinsignalwegs durch den Inhibitor IAA der
Daxx-Degradation bei Infektion teilweise oder ganz entgegen gewirkt werden kann. Hier
wurde beobachtet, dass nach Hemmung des Signalwegs der Daxx-Abbau inhibiert war.
Folglich müsste bei einer vollständigen Abwesenheit von SPOP nach Infektion kein DaxxAbbau stattfinden können. Um diese Hypothese zu prüfen, wurden die zuvor generierten
SPOP-kd Zellen parallel zu Kontrollen infiziert und 6h nach Infektion die geernteten
Zelllysate im Western Blot auf ihr Daxx-Expressionsniveau hin überprüft (Abb. 33A).
Abb. 33: Weniger Daxx-Abbau in siSPOP im
Vergleich zu Kontrollen (vector bzw. siC) nach
Infektion. Zellen, wie angegeben, wurden mit AD169
mit MOI3 infiziert und die erstellten Zelllysate im
Western Blot analysiert. A+B: Daxx: monoklonaler
Kaninchen anti-Daxx Antikörper (Epitomics). A: IE1:
Hybridoma mAb 63-24; β-actin Nachweis mit
monoklonalem Maus-Antikörper AC-15 diente als
Ladekontrolle. B) Um die Daxx Expression exakter zu
bestimmen wurden die unter A generierten Zelllysate
auf einem großen (20cm) 6%igen SDS-Gel für 16h
bei konstanten 10mA stärker aufgetrennt und
anschließend über Detektion im Western Blot
dokumentiert.
Die detektierte Daxx-Proteinmenge 6h nach Infektion war in SPOP-kd Zellen erhöht im
Vergleich zu den Kontrollzellen vector bzw. siC (Abb. 33A, vgl. Spur 4 mit 2 bzw. 6).
79
E. Ergebnisse
Daraus lässt sich schließen, dass bei einem Fehlen von SPOP der durch das virale
Tegumentprotein pp71 vermittelte Daxx-Abbau nicht in gleichem Maße stattfinden kann
wie bei Anwesenheit von SPOP. Die detektierte Daxx-Menge in siSPOP-Zellen erreichte
jedoch nicht das gleiche Niveau wie bei uninfizierten Zellen (Abb. 33A, Spur 3), weshalb
spekuliert werden kann, ob einerseits in SPOP-kd Zellen per se schon mehr Daxx
vorhanden ist, weil die Daxx-Regulation durch fehlendes SPOP behindert ist, oder ob
andererseits bei einem Fehlen von SPOP der pp71-vermittelte Daxx Abbau auch über
einen alternativen Weg stattfinden kann. Weiter ist zu erkennen (Abb. 33A), dass nach
Infektion die im Western Blot detektierte Daxx-Proteinmenge als langsamer wandernde
Bande nachgewiesen wurde. Um dies näher zu betrachten, wurden die Zelllysate von Abb.
33A auf einem großen (20cm) 6%igen SDS-Gel erneut aufgetrennt und im Western Blot
mit einem Daxx-spezifischen Antikörper analysiert. Hier wurde beobachtet, dass Daxx als
drei unterschiedliche Banden detektiert wird, wobei die oberste auch nach Infektion
bestehen bleibt (Abb. 33B, Spur 2). In SPOP-kd Zellen ist erneut deutlich zu erkennen,
dass nach Infektion mehr Daxx vorhanden ist und zwar als Expression der oberen und der
mittleren detektierten Daxx Bande. Weiter sieht es minimal so aus, als würde in siSPOPZellen mehr Daxx exprimiert, als in Kontrollen (Abb. 33B, vlg. 1,3). Ob dies tatsächlich der
Fall ist wurde über indirekte Immunofluoreszenz Analyse überprüft. Hierfür wurden
Kontrollzellen (vector) zusammen mit SPOP-kd Zellen (siSPOP) auf Deckgläschen
ausgesät und die Menge an exprimierten Daxx über die fluorimetrische Intensität mittels
Software ermittelt.
Abb. 34: Fluorimetrischer Vergleich der
Daxxmenge in vector- bzw. siSPOP
transduzierten HFF. Endogene Daxx
Proteinmenge
wurde
über
indirekte
Immunofluoreszenz detektiert und die
Intensität als Pixelanzahl über die Software
TCS SP5 LASAF von Leica bestimmt.
Angezeigt wurde die Auswertung von 20
Proben
und
deren
ermittelte
Standardabweichung. Der Signifikanzwert
wurde als t-test für unabhängige Proben
errechnet.
In 20 verschiedenen Zellen pro Probe wurde die Daxxmenge in einem definierten
Abschnitt im Zellkern gemessen (Abb. 34). Dabei wurde beobachtet, dass die in SPOP-kd
Zellen gemessene Daxxmenge nur um 2,7% höher lag, als in Kontrollzellen. Dieser
80
E. Ergebnisse
Unterschied scheint nicht ausreichend zu sein, um die höhere Daxxmenge nach Infektion
in siSPOP-Zellen zu erklären (Abb. 33).
Zusammenfassend
wurde
gezeigt,
dass
das
virale
Tegumentprotein
pp71
mit
Bestandteilen der E3 Ligase SPOP-Cul3-Roc1 interagiert und möglicherweise dadurch
nach Infektion den Daxx-Abbau ermöglicht. Bei Abwesenheit von SPOP und Roc1 konnte
bei Infektion mit AD169 eine verringerte Effizienz, die IE1-Genexpression zu starten,
beobachtet werden. Weiter wurde zu frühen Zeiten der Infektion ein verminderter DaxxAbbau in siSPOP-transduzierten Zellen festgestellt.
3. Einfluss der PML-Depletion auf die Genexpression in primären humanen
Vorhautfibroblasten
3.1
Nachweis
der
PML-Depletion
in
siPML-transduzierten
humanen
Vorhautfibroblasten
Während der aktuellen Studie wurden durch RNAi-Wechselwirkung die drei ND10Hauptkomponenten PML, Sp100 und Daxx in primären humanen Fibroblasten depletiert.
Da es sich bei PML um das strukturdefinierende Protein der nukleären Domäne 10
handelt, sollte untersucht werden, inwieweit der Verlust von PML die zelluläre
Genexpression verändert. Dies sollte über eine Expressionsanalyse mittels eines
Affymetrix
Microarrays
(Chip:
Human
Gene
1.0
ST
Array,
Durchführung:
Kompetenzzentrum für Fluoreszente Bioanalytik Microarray Technology, Regensburg,
Deutschland) erfolgen. PML-kd (knockdown; kd) Zellen wurden, wie in vorangehenden
Studien beschrieben (Tavalai et al., 2006), generiert und nach der Herstellung von
Zelllysaten die Effizienz der Depletion durch Western Blot-Analyse überprüft.
Abb. 35: Nachweis der PML-Depletion durch
Western Blot. Zelllysate aus vector-, siC- und
siPML-transduzierten Zellen wurden bezüglich
ihrer endogenen PML-Menge mit einem
spezifischen Antikörper untersucht. PML:
monoklonaler Maus anti-PML Antikörper 5E10,
freundlicherweise zur Verfügung gestellt von
R.v.Driel. β-actin Nachweis diente als
Ladekontrolle. In siPML (3) ist im Vergleich zu
Kontrollen (vector, Spur 1; siC, Spur2) kein
endogenes PML mehr nachweisbar.
81
E. Ergebnisse
Kontrollzellen (vector, siC) wurden parallel zu PML-kd Zellen ausgesät und nach einer
Inkubation von 24h auf das Vorhandensein von endogenem PML, mittels Detektion im
Western Blot unter Verwendung eines spezifischen anti-PML Antikörpers, überprüft. Es ist
zu erkennen (Abb. 35), dass nach induzierter RNAi-Wechselwirkung in siPML-Zellen (Spur
3) im Vergleich zu den Kontrollzellen (Spur 1,2) kein endogenes PML mehr nachgewiesen
werden kann.
3.2 Einfluss der PML Depletion auf die zelluläre Genexpression
Aus den generierten PML-kd Zellen (siPML) und Kontrollzellen (vector) wurde GesamtRNA isoliert und durch Affymetrix Microarray-Analyse die Genexpression untersucht.
Abbildung 36B zeigt die Summe der hoch- bzw. herunter regulierten Gene in PMLdepletierten Zellen im Vergleich zu Kontrollzellen. Die Veränderung der Genexpression in
den PML-kd Zellen im Vergleich zu der Expression des entsprechenden Gens in den
Kontrollzellen wird berechnet als das Verhältnis der unterschiedlichen Expression eines
Gens in den beiden Zelllinien (Fold Change). Beispielsweise ist ein Ergebnis von -2 eine
um das 2fach verringerte Expression, ein Wert von +3 bedeutet, dass das Gen in siPMLZellen im Vergleich zur Kontrolle um das 3-fache hoch reguliert ist. Die Werte zwischen
-1,95 und +1.95 sind nicht dargestellt, da sie als nicht signifikant betrachtet wurden (Abb.
36A).
-5,73
-4,66
-4,00
-3,96
-3,91
-3,89
----NR_031741
-------
----MIR1977
-------
----microRNA 1977
-------
mRNA Accession
Gene Description
Gene Symbol
Gene Accession
Fold Change
Abb. 36: Affymetrix-Analyse von PML-kd
Zellen im Vergleich zu Kontrollzellen. A)
Darstellung des verwendeten Farbcodes für
das Heat Map und Zuordnung einer Farbe zu
einem definierten Fold Change-Wert. B)
Tabellarische Auflistung aller signifikant
regulierten Gene in PML-kd Zellen im
Unterschied zu vector-transduzierten HFF.
NC_001807
ENST00000365552
NR_031741
ENST00000365118
ENST00000391167
ENST00000384685
82
E. Ergebnisse
-3,65
-3,63
-3,63
-3,63
-3,41
-3,21
-3,21
-2,82
-2,77
NM_018487
------NM_001144958
--XM_002346094
NM_173812
---
TMEM176A
------EFCAB4B
--LOC100293539
DPY19L2
---
-2,75
-2,73
-2,69
-2,66
-2,58
-2,51
-2,50
NM_181353
--------NR_002756
---
-2,48
-2,48
-2,45
-2,44
-2,44
-2,42
-2,40
-2,38
-2,37
-2,36
-2,33
-2,27
-2,24
-2,23
-2,22
-2,21
NR_002755
NM_033240
--NM_000782
NM_000668
NM_000014
NM_033468
--NM_003539
NM_002038
NM_015507
NM_003535
--NM_014020
--NM_033655
ID1
--------RNU5A
--RNU5D //
RNU5D
PML
--CYP24A1
ADH1B
A2M
ZNF257
--HIST1H4D
IFI6
EGFL6
HIST1H3J
--TMEM176B
--CNTNAP3
-2,20 NM_002167
-2,20 ---
ID3
---
-2,20
-2,19
-2,18
-2,17
-2,16
-2,16
-2,15
-2,15
-2,11
-2,10
-2,10
-2,10
-2,10
-2,09
-2,08
-2,07
-2,07
-2,06
-2,06
-2,05
-2,04
-2,04
-2,03
-2,03
-2,03
IGKC // IGKC
LY6E
----METTL1
ADH1A
----CNTNAP3
--HLA-DPA1
--RQCD1
--SNORD13
IL1R1
HEPH
MYPN
LGALS9C
ACTC1
--BGN
IGSF9B
-----
BC073772
NM_002346
----NM_005371
NM_000667
----NM_033655
--NM_033554
--NM_005444
--NR_003041
NM_000877
NM_138737
NM_032578
NM_001040078
NM_005159
--NM_001711
NM_014987
-----
transmembrane protein 176A
------EF-hand calcium binding domain 4B
--similar to ribosomal protein 10
dpy-19-like 2 (C. elegans)
--inhibitor of DNA binding 1, dominant negative helix-loophelix protein
--------RNA, U5A small nuclear
---
NM_018487
NC_001807
NC_001807
NC_001807
NM_001144958
ENST00000364233
XM_002346094
NM_173812
ENST00000365142
RNA, U5D small nuclear // RNA, U5D small nuclear
promyelocytic leukemia
--cytochrome P450, family 24, subfamily A, polypeptide 1
alcohol dehydrogenase 1B (class I), beta polypeptide
alpha-2-macroglobulin
zinc finger protein 257
--histone cluster 1, H4d
interferon, alpha-inducible protein 6
EGF-like-domain, multiple 6
histone cluster 1, H3j
--transmembrane protein 176B
--contactin associated protein-like 3
inhibitor of DNA binding 3, dominant negative helix-loophelix protein
--immunoglobulin kappa constant // immunoglobulin kappa
constant
lymphocyte antigen 6 complex, locus E
----methyltransferase like 1
alcohol dehydrogenase 1A (class I), alpha polypeptide
----contactin associated protein-like 3
--major histocompatibility complex, class II, DP alpha 1
--RCD1 required for cell differentiation1 homolog (S. pombe)
--small nucleolar RNA, C/D box 13
interleukin 1 receptor, type I
hephaestin
myopalladin
lectin, galactoside-binding, soluble, 9C
actin, alpha, cardiac muscle 1
--biglycan
immunoglobulin superfamily, member 9B
-----
NR_002755
NM_033240
ENST00000384283
NM_000782
NM_000668
NM_000014
NM_033468
ENST00000363231
NM_003539
NM_002038
NM_015507
NM_003535
ENST00000364251
NM_014020
ENST00000365359
NM_033655
NM_181353
ENST00000383864
ENST00000410255
ENST00000363283
ENST00000410926
NR_002756
ENST00000362935
NM_002167
ENST00000384480
BC073772
NM_002346
ENST00000451403
ENST00000384237
NM_005371
NM_000667
ENST00000384313
ENST00000362381
NM_033655
ENST00000384074
NM_033554
ENST00000364678
NM_005444
AK125816
NR_003041
NM_000877
NM_138737
NM_032578
NM_001040078
NM_005159
ENST00000364716
NM_001711
NM_014987
ENST00000410480
ENST00000383975
83
E. Ergebnisse
-2,02
-2,01
-2,01
-2,01
-2,01
-2,00
-2,00
-2,00
-1,98
-1,98
NM_007243
NM_001928
NM_174942
NR_006880
NM_022909
NM_002404
----NM_003546
NM_021062
NRM
CFD
GAS2L3
SNORD3A
CENPH
MFAP4
----HIST1H4L
HIST1H2BB
-1,98
-1,98
-1,98
-1,97
-1,97
-1,96
-1,96
-1,96
-1,95
1,97
1,98
1,98
1,99
1,99
1,99
2,01
2,01
2,02
2,02
2,02
2,03
2,03
2,04
NM_012244
--------NM_138820
NM_033014
NM_005545
NR_033423
NM_000362
--NM_001004738
NM_021007
--NM_030663
--NR_003198
NM_001013732
--NM_001993
--NR_003666
---
SLC7A8
--------HIGD2A
OGN
ISLR
LOC1720
TIMP3
--OR5L1
SCN2A
--SMCP
--SNORD114-6
C6orf138
--F3
--SPDYE7P
---
2,04
2,04
2,04
2,06
2,06
2,06
2,07
2,07
2,08
2,08
2,08
2,09
NM_020949
NM_002010
NM_002421
NM_014932
NM_004297
--AF284753
NM_003012
--NM_206943
AK024162
NM_004289
SLC7A14
FGF9
MMP1
NLGN1
GNA14
--UIMC1
SFRP1
--LTBP1
FLJ14100
NFE2L3
2,10
2,14
2,14
2,14
2,15
2,18
NM_022731
------NM_032558
---
NUCKS1
------HIATL1
---
2,18
2,19
2,19
2,19
2,20
2,21
2,23
2,29
NM_021822
--NM_001135599
--NM_004093
NM_173512
NM_152753
NM_002982
APOBEC3G
--TGFB2
--EFNB2
SLC38A11
SCUBE3
CCL2
nurim (nuclear envelope membrane protein)
complement factor D (adipsin)
growth arrest-specific 2 like 3
small nucleolar RNA, C/D box 3A
centromere protein H
microfibrillar-associated protein 4
----histone cluster 1, H4l
histone cluster 1, H2bb
solute carrier family 7 (amino acid transporter, L-type),
member 8
--------HIG1 hypoxia inducible domain family, member 2A
osteoglycin
immunoglobulin superfamily containing leucine-rich repeat
dihydrofolate reductase pseudogene
TIMP metallopeptidase inhibitor 3
--olfactory receptor, family 5, subfamily L, member 1
sodium channel, voltage-gated, type II, alpha subunit
--sperm mitochondria-associated cysteine-rich protein
--small nucleolar RNA, C/D box 114-6
chromosome 6 open reading frame 138
--coagulation factor III (thromboplastin, tissue factor)
--speedy homolog E7 (Xenopus laevis), pseudogene
--solute carrier family 7 (cationic amino acid transporter, y+
system), member 14
fibroblast growth factor 9 (glia-activating factor)
matrix metallopeptidase 1 (interstitial collagenase)
neuroligin 1
guanine nucleotide binding protein (G protein), alpha 14
--ubiquitin interaction motif containing 1
secreted frizzled-related protein 1
--latent transforming growth factor beta binding protein 1
hypothetical protein FLJ14100
nuclear factor (erythroid-derived 2)-like 3
nuclear casein kinase and cyclin-dependent kinase
substrate 1
------hippocampus abundant transcript-like 1
--apolipoprotein B mRNA editing enzyme, catalytic
polypeptide-like 3G
--transforming growth factor, beta 2
--ephrin-B2
solute carrier family 38, member 11
signal peptide, CUB domain, EGF-like 3
chemokine (C-C motif) ligand 2
NM_007243
NM_001928
NM_174942
NR_006880
NM_022909
NM_002404
ENST00000365131
ENST00000384717
NM_003546
NM_021062
NM_012244
ENST00000364571
ENST00000459359
ENST00000391116
ENST00000391272
NM_138820
NM_033014
NM_005545
NR_033423
NM_000362
AK092450
NM_001004738
NM_021007
ENST00000364606
NM_030663
ENST00000383863
NR_003198
NM_001013732
ENST00000428356
NM_001993
NC_001807
NR_003666
ENST00000458931
NM_020949
NM_002010
NM_002421
NM_014932
NM_004297
ENST00000362996
AF284753
NM_003012
NC_001807
NM_206943
AK024162
NM_004289
NM_022731
ENST00000363444
ENST00000363442
ENST00000363759
NM_032558
ENST00000365274
NM_021822
ENST00000362448
NM_001135599
ENST00000411224
NM_004093
NM_173512
NM_152753
NM_002982
84
E. Ergebnisse
2,32
2,32
2,35
--NM_020768
NM_000601
--KCTD16
HGF
2,36
2,38
2,39
2,40
2,40
2,42
2,44
2,45
NM_001128588
NM_014391
NM_002977
NR_029779
----NM_004099
NM_004637
SLC14A1
ANKRD1
SCN9A
MIR200C
----STOM
RAB7A
2,46
2,46
NM_021614
NM_006547
KCNN2
IGF2BP3
2,48
2,54
2,54
NM_000862
NM_001099660
NM_005639
HSD3B1
LRRN3
SYT1
2,55
2,56
2,57
2,61
2,63
2,68
2,69
2,73
2,74
2,79
2,79
2,83
2,87
3,09
NM_012281
NM_001146
----NM_178429
NM_005063
NM_001850
NM_004065
BC013044
NM_021963
----NM_001373
NM_001417
KCND2
ANGPT1
----LCE2C
SCD
COL8A1
CDR1
DNAJA2
NAP1L2
----DNAH14
EIF4B
3,13
3,13
NM_012431
NM_001112706
SEMA3E
SCIN
3,24
3,44
3,80
3,83
3,97
BC018448
NM_178428
NM_001025231
NM_005711
---
MALAT1
LCE2A
KPRP
EDIL3
---
4,83
ENST00000307248 FAM115A
--potassium channel tetramerisation domain containing 16
hepatocyte growth factor (hepapoietin A; scatter factor)
solute carrier family 14 (urea transporter), member 1 (Kidd
blood group)
ankyrin repeat domain 1 (cardiac muscle)
sodium channel, voltage-gated, type IX, alpha subunit
microRNA 200c
----stomatin
RAB7A, member RAS oncogene family
potassium intermediate/small conductance calciumactivated channel
insulin-like growth factor 2 mRNA binding protein 3
hydroxy-delta-5-steroid dehydrogenase, 3 beta- and
steroid delta-isomerase 1
leucine rich repeat neuronal 3
synaptotagmin I
potassium voltage-gated channel, Shal-related subfamily,
member 2
angiopoietin 1
----late cornified envelope 2C
stearoyl-CoA desaturase (delta-9-desaturase)
collagen, type VIII, alpha 1
cerebellar degeneration-related protein 1, 34kDa
DnaJ (Hsp40) homolog, subfamily A, member 2
nucleosome assembly protein 1-like 2
----dynein, axonemal, heavy chain 14
eukaryotic translation initiation factor 4B
sema domain, immunoglobulin domain (Ig), short basic
domain, secreted,
scinderin
metastasis associated lung adenocarcinoma transcript 1
(non-protein coding)
late cornified envelope 2A
keratinocyte proline-rich protein
EGF-like repeats and discoidin I-like domains 3
---
ENST00000330957
NM_020768
NM_000601
family with sequence similarity 115, member A
ENST00000307248
NM_001128588
NM_014391
NM_002977
NR_029779
ENST00000362806
ENST00000384467
NM_004099
NM_004637
NM_021614
NM_006547
NM_000862
NM_001099660
NM_005639
NM_012281
NM_001146
ENST00000366226
ENST00000384361
NM_178429
NM_005063
NM_001850
NM_004065
BC013044
NM_021963
ENST00000442408
ENST00000363844
NM_001373
NM_001417
NM_012431
NM_001112706
BC018448
NM_178428
NM_001025231
NM_005711
ENST00000364986
Bei der Analyse der Genexpression in den PML-depletierten Zellen im Vergleich zu
Kontrollzellen konnte mit Hilfe der Software IPA der Firma Ingenuity und einer Analyse der
Daten unter Verwendung des Programms Excel die Expression der detektierten Proteine
verschiedenen Signalwegen und Funktionen der Zelle zugeordnet werden. Die folgende
Tabelle (Abb. 37) listet die Haupt-Netzwerke auf, benennt die Funktionen innerhalb der
Signalwege und zeigt auf, wie die Gene im Netzwerk reguliert sind.
E. Ergebnisse
85
Abb. 37: Zuordnung der in PML-kd Zellen differentiell regulierten Gene zu Funktionen innerhalb
der Zellen. Tabellarische Auflistung einiger Gene, die in PML-kd Zellen hoch- bzw. herunter reguliert
sind und Benennung der Funktion innerhalb der Zelle bzw. Aufgabe für das System. Die Regulierung
der Gene in PML-kd Zellen im Vergleich zur Kontrolle (vector) ist durch unterschiedliche Pfeilfarben
dargestellt (grün: verminderte Expression; rot: erhöhte Expression).
3.3 Analyse der PML-Expression nach Interferon-Induktion
Es war bereits gezeigt worden, dass die ND10-Komponente PML bei Anwesenheit von
Interferonen stark hoch reguliert wird (Stadler et al., 1995). Dies gilt sowohl für Typ I
Interferone (IFN-α und IFN-β) als auch für Interferon γ (Typ II). Da es Hinweise darauf gibt,
dass PML möglicherweise selbst eine Rolle für die Interferon-Signaltransduktion spielt,
sollte durch Affymetrix Microarray-Analyse nach Genen gesucht werden, deren InterferonInduktion in Abwesenheit von PML verändert ist (El et al., 2011). Zunächst musste
sichergestellt werden, dass die siRNA-vermittelte Depletion von PML auch nach
Interferon-Induktion noch bestehen blieb. Hierfür wurden die generierten Zelllinien (siehe
3.1) in Zellkulturschalen ausgesät, 18h vor der Erstellung der Zelllysate wurden je
1000U/µl der Interferone α, β bzw. γ zu den Zellen gegeben und bei 37°C inkubiert.
Anschließend wurde die PML-Expression durch Western Blot nachgewiesen (Abb. 38A).
In den Kontrolllinien (vector und siC) (Abb. 38A, 1-8) ist die Hochregulierung durch
86
E. Ergebnisse
Interferone im Vergleich zu mock-behandelten Zellen (Spur 1 und 5) deutlich zu erkennen,
wobei zwischen den verschiedenen Interferonen kein signifikanter Unterschied bezüglich
der Induktionsstärke zu beobachten war. Die Depletion von PML wurde in diesem
Experiment bestätigt (Abb. 38A, Spur 9) und auch nach Zugabe der Interferone war kein
PML nachweisbar (Spur 10-12). Nachdem durch dieses Experiment eindeutig gezeigt
werden konnte, dass nach Interferonbehandlung in siPML-Zellen kein PML detektierbar
ist, wurde gesamtzelluläre RNA von mock-behandelten und Interferon-stimulierten Zellen
isoliert. Die RNA-Integrität wurde durch denaturierende Agarose-Gelelektrophorese
überprüft, da bei intakter RNA zwei deutlich getrennte Banden, die 28S und die 18S
Bande ribosomaler RNA, zu erkennen sein musste. In allen RNA-Proben, die für die
Genexpressionsanalyse verwendet werden sollten, ist eine deutliche Trennung der beiden
Banden im Agarosegel zu erkennen (Abb. 38B). Die RNA aus vector- und siPMLtransduzierten Zellen wurde schließlich für die Analyse der Genexpression verwendet
(Affymetrix Chip: Human Gene 1.0 ST Array; Durchführung: Kompetenzzentrum für
Fluoreszente Bioanalytik Micorarray Technology, Regensburg, Deutschland).
Abb. 38: Nachweis der Induktion von
PML nach Interferon-Zugabe und
Überprüfung der RNA-Integrität. A)
Western Blot-Analyse von endogenem
PML nach Detektion mit einem
spezifischen Antikörper (monoklonaler
Maus anti-PML 5E10, freundlicherweise
zur Verfügung gestellt von R. v. Driel).
Der Nachweis von β-actin diente als
Ladekontrolle. Vector, siC bzw. siPML
Zellen wurden für 18h bei 37°C mit je
1000U/µl IFN-α, IFN-β, IFN-γ inkubiert
und die erstellten Zelllysate im SDS-Gel
aufgetrennt. B) vector-, siC- bzw. siPML
transduzierte
HFF
wurden
mit
Interferonen inkubiert (siehe A) und die
Gesamt-RNA mit einem kommerziellen
Kit (Promega) isoliert. Die Integrität der
RNA wurde in einem Agarosegel
überprüft, die Proben aus vector (Spur 14) und siPML (Spur 9-12) für die
Genexpressionsanalyse verwendet.
87
E. Ergebnisse
3.4 Regulierung von Genen nach Induktion mit Interferon γ in Abhängigkeit von PML
Durch den Vergleich der Daten untereinander lässt sich feststellen, welche Gene nach
Induktion mit IFN-γ in Abhängigkeit von PML reguliert werden (Abb. 39). Dieser Vergleich
ist dadurch möglich, dass zunächst die Gene betrachtet wurden, die in den mitgeführten
Kontrollzellen (vector) nach der Zugabe von IFN-γ stark vermindert und stark erhöht
exprimiert wurden (Abb. 39, Spalte 1). Erneut wurden nur die Gene als signifikant reguliert
betrachtet, deren Fold Change kleiner als -1,95 oder größer als 1,95 war; die farbliche
Markierung des Heat Map wurde analog zu Abbildung 36A definiert. Der Genexpression in
den Kontrollzellen nach IFN-γ Induktion kann nun direkt die Expression derselben Gene
nach IFN-γ Induktion in PML-kd Zellen gegenüber gestellt werden. Dabei ist durch den
Farbcode deutlich die unterschiedliche Expression der Gene nach Induktion mit IFN-γ in
-3,63 -2,65 NM_001102445 RGS4
-2,9 1,969 NR_002756
RNU5A
Gene Description
Gene Symbol
Gene Accession
siPML gamma vs siPML mock
vector gamma vs vector mock
Abhängigkeit von PML zu erkennen.
regulator of G-protein signaling 4
RNA, U5A small nuclear
aldo-keto reductase family 1, member C2
-2,83 -1,99 NM_001354
AKR1C2
(dihydrodiol dehydrogenase 2;
-2,73 2,93 NM_001144958 EFCAB4B
EF-hand calcium binding domain 4B
-2,41 -1,99 NM_183376
ARRDC4
arrestin domain containing 4
-1,98 -2,82 AL136588
MMP16
matrix metallopeptidase 16 (membrane-inserted)
1,957 2,129 NM_001710
CFB
complement factor B
1,966 2,162 NM_006084
IRF9
interferon regulatory factor 9
1,966 2,845 NM_001012631 IL32
interleukin 32
1,989 2,516 NM_198584
CA13
carbonic anhydrase XIII
1,991 2,37 NM_004669
CLIC3
chloride intracellular channel 3
1,992 2,239 NM_001113756 TYMP
thymidine phosphorylase
1,994 2,16 NM_014656
KIAA0040
KIAA0040
1,995 2,106 NM_002117
HLA-C
major histocompatibility complex, class I, C
2,01 1,97 NM_002120
HLA-DOB
major histocompatibility complex, class II, DO beta
2,03 1,966 AK023614
LOC100128988 similar to hCG2018847
2,051 1,956 NM_021160
BAT5
HLA-B associated transcript 5
2,161 1,951 NM_017918
CCDC109B
coiled-coil domain containing 109B
2,211 1,962 NM_001005463 EBF3
early B-cell factor 3
2,311 1,963 NM_001031749 LYPD5
LY6/PLAUR domain containing 5
2,359 1,951 NM_017993
ENOX1
ecto-NOX disulfide-thiol exchanger 1
88
E. Ergebnisse
2,438
2,813
2,991
3,058
3,653
5,327
4,215
4,174
NM_003335
NM_001042685
NM_024119
NM_198474
UBA7
LGALS9B
DHX58
OLFML1
3,315 3,745 NM_004159
3,512 2,978 NM_014314
3,547 2,559 NM_017414
PSMB8
DDX58
USP18
3,548
3,581
3,601
3,655
3,661
3,774
3,842
3,871
3,885
3,907
4,08
4,098
5,164
2,217
3,228
7,574
2,814
2,851
5,339
2,623
2,559
2,615
3,123
2,769
NM_002801
NM_006074
NM_153341
NM_002038
NM_002119
NM_016582
NM_003641
NM_021127
NM_018950
NM_001098479
NM_020914
NM_021105
PSMB10
TRIM22
RNF19B
IFI6
HLA-DOA
SLC15A3
IFITM1
PMAIP1
HLA-F
HLA-F
RNF213
PLSCR1
4,132
4,25
4,25
4,318
4,349
4,677
4,712
4,762
2,736
2,936
3,241
5,111
3,127
2,61
5,271
3,393
NM_033292
NM_004163
NM_138456
NM_022750
NM_022350
NM_002982
NM_007047
NM_002119
CASP1
RAB27B
BATF2
PARP12
ERAP2
CCL2
BTN3A2
HLA-DOA
4,892
4,902
4,987
5,263
5,291
3,272
3,19
3,366
3,443
7,017
NM_007315
NM_002121
NM_004833
NM_017912
NM_022147
STAT1
HLA-DPB1
AIM2
HERC6
RTP4
5,364
5,367
5,475
5,543
5,871
6,002
6,071
3,922
3,456
4,758
3,081
7,059
6,649
4,825
NM_002818
NM_006994
NM_030641
NM_018284
NM_015907
NM_003265
NM_000201
PSME2
BTN3A3
APOL6
GBP3
LAP3
TLR3
ICAM1
6,223
6,412
6,442
6,512
4,328
6,949
3,995
2,822
NM_006573
NR_027833
AF284753
NM_000186
TNFSF13B
APOL3
UIMC1
CFH
6,53
6,573
6,718
7,149
7,297
7,41
6,37
5,398
5,381
4,153
6,467
5,592
NM_000544
NM_002463
NM_006417
NM_002121
NM_015474
NM_017631
TAP2
MX2
IFI44
HLA-DPB1
SAMHD1
DDX60
ubiquitin-like modifier activating enzyme 7
lectin, galactoside-binding, soluble, 9B
DEXH (Asp-Glu-X-His) box polypeptide 58
olfactomedin-like 1
proteasome (prosome, macropain) subunit, beta
type, 8 (large multifunctional peptidase 7)
DEAD (Asp-Glu-Ala-Asp) box polypeptide 58
ubiquitin specific peptidase 18
proteasome (prosome, macropain) subunit, beta
type, 10
tripartite motif-containing 22
ring finger protein 19B
interferon, alpha-inducible protein 6
major histocompatibility complex, class II, DO alpha
solute carrier family 15, member 3
interferon induced transmembrane protein 1 (9-27)
phorbol-12-myristate-13-acetate-induced protein 1
major histocompatibility complex, class I, F
major histocompatibility complex, class I, F
ring finger protein 213
phospholipid scramblase 1
caspase 1, apoptosis-related cysteine peptidase
(interleukin 1, beta, convertase)
RAB27B, member RAS oncogene family
basic leucine zipper transcription factor, ATF-like 2
poly (ADP-ribose) polymerase family, member 12
endoplasmic reticulum aminopeptidase 2
chemokine (C-C motif) ligand 2
butyrophilin, subfamily 3, member A2
major histocompatibility complex, class II, DO alpha
signal transducer and activator of transcription 1,
91kDa
major histocompatibility complex, class II, DP beta 1
absent in melanoma 2
hect domain and RLD 6
receptor (chemosensory) transporter protein 4
proteasome (prosome, macropain) activator subunit
2 (PA28 beta)
butyrophilin, subfamily 3, member A3
apolipoprotein L, 6
guanylate binding protein 3
leucine aminopeptidase 3
toll-like receptor 3
intercellular adhesion molecule 1
tumor necrosis factor (ligand) superfamily, member
13b
apolipoprotein L, 3
ubiquitin interaction motif containing 1
complement factor H
transporter 2, ATP-binding cassette, sub-family B
(MDR/TAP)
myxovirus (influenza virus) resistance 2 (mouse)
interferon-induced protein 44
major histocompatibility complex, class II, DP beta 1
SAM domain and HD domain 1
DEAD (Asp-Glu-Ala-Asp) box polypeptide 60
89
E. Ergebnisse
7,5
7,731
8,824
8,914
10,43
10,73
5,676
3,961
5,71
4,663
3,025
6,14
NM_152703
NM_022168
NM_001002264
NM_016135
NM_005623
NM_022555
16,09 5,682 NM_003810
SAMD9L
IFIH1
EPSTI1
ETV7
CCL8
HLA-DRB3
TNFSF10
sterile alpha motif domain containing 9-like
interferon induced with helicase C domain 1
epithelial stromal interaction 1 (breast)
ets variant 7
chemokine (C-C motif) ligand 8
major histocompatibility complex, class II, DR beta 3
tumor necrosis factor (ligand) superfamily, member
10
Abb. 39: Vergleich der Expression von Genen nach Induktion mit Interferon γ in
Abhängigkeit von PML. Nach Induktion durch Interferon γ in den Kontrollzellen vector werden
verschieden Gene hoch- bzw. herunter reguliert. Ein Teil dieser Gene (hier dargestellt), werden
nach einer Depletion von PML nach Interferon γ Zugabe anderes reguliert, das heißt die Induktion
erfolgt in Anhängigkeit von PML. Spalte 1: Unterschied der Expression der Gene nach IFN-γ
Induktion in vector Zellen im Vergleich zu uninduzierten vector Zellen. Spalte 2: Unterschied der
Expression der Gene nach IFN-γ Induktion in PML-kd Zellen im Vergleich zu uninduzierten PMLkd Zellen.
Die hier dargestellten Unterschiede in der Genexpression müssen nun in weiteren Tests
bestätigt werden, beispielsweise durch RT-PCR. Diese Aufgabe wurde im Rahmen der
vorliegenden Arbeit nicht mehr durchgeführt und ist nun Gegenstand weiterer Studien, um
abschließend den Einfluss einer PML-Depletion auf die zelluläre Genexpression
aufzuklären.
90
F. Diskussion
F. Diskussion
Das humane Cytomegalovirus und intrinsische Immunität
Beim humanen Cytomegalovirus (HCMV) handelt es sich um ein sehr weit verbreitetes
humanes Pathogen mit nicht zu unterschätzender klinischer Bedeutung. Die virale
Infektion kann durch verschiedene zelluläre Abwehrmechanismen antagonisiert werden,
wobei die Kontrolle der viralen Infektion durch die gemeinsame Aktivität der angeborenen
(innate) und der adaptiven Immunität erfolgt. Verschiedene Rezeptoren wurden kürzlich
identifiziert, welche nach Aktivierung durch das Pathogen antagonistische Signalkaskaden
starten, darunter Toll-like Rezeptoren (TLRs), Nod-like Rezeptoren (NLRs), RIG-I-like
Rezeptoren (RLRs) und AIM2-like Rezeptoren (ALRs) (Rathinam & Fitzgerald, 2011). Im
Fall des humanen Cytomegalovirus erkennt ein Komplex aus TLR2-TLR1 die CMV
Glykoproteine gB und gH, welche die Bindung des Virus an die Zelle vermitteln und
schließlich zu einer Aktivierung des NF-κB Signalweges führen (Boehme et al., 2006). Als
Mechanismus der frühen antiviralen Abwehr wird außerdem die Interferon Typ IProduktion der Zellen betrachtet, als weitere Abwehrstrategie werden zusätzlich Zytokine,
wie Interleukin 1 (IL-1), IL-12 und IL-18 produziert. Zu erwähnen ist jedoch, dass die
angeborenen Immunmechanismen nur nach direkter Aktivierung durch das Pathogen ihre
volle Wirkung entwickeln, während die virale Replikation bereits stattfindet. Als weitere
zelluläre Strategie im Kampf gegen virale Infektionen wurden im Laufe der letzten Jahre
mehrere Proteine identifiziert, die als sogenannte Restriktionsfaktoren verschiedene Viren
antagonisieren. Diese sogenannte intrinsische Immunität wird definiert aus konstitutiv
exprimierten zellulären Proteinen, die zwar bei Infektion durch Interferone weiter hoch
reguliert werden können, die aber prinzipiell bereits vor Infektion vorliegen und daher keine
virus-induzierten Signale für ihre Aktivität benötigen. Diese Immunität kann als erste
antivirale Strategie der Zelle betrachtet werden, da sie aktiv ist, bevor das Virus in die
Zelle eintritt (Bieniasz, 2004). Ein Beispiel für intrinsische Immunität ist das zelluläre
APOBEC3G (apolipoprotein editing complex 3 G) Protein. Hierbei handelt es sich um eine
Cytidin-Deaminase, welche Mutationen in das HI-Virus (HIV; Humanes Immundefizienz
Virus)-Genom während der reversen Transkription einfügt, da es Cytidinbasen zu Uracil
ersetzt und somit die HIV1-Infektion antagonisiert
(Sheehy et al., 2002). Das am
häufigsten untersuchte Protein der intrinsischen Immunität ist das TRIM5α (tripartite
interaction motif five, splice variant α) Protein, welches HIV und das eng verwandte SIVirus (SIV; simian immunodeficiency virus) antagonisiert, indem es das Kapsidprotein
nach Infektion erkennt und schließlich über einen noch unbekannten Mechanismus die
91
F. Diskussion
reverse Transkription hemmt (Stremlau et al., 2004). Trim5α gehört zu einer großen
Proteinfamilie (tripartite motif family), wobei für viele Mitglieder bekannt ist, dass sie durch
Interferone induzierbar sind und Teil der zellulären Restriktion von viralen Infektionen
darstellen (Ozato et al., 2008). Neben Trim5α ist ein weiterer wichtiger Vertreter dieser
Proteinfamilie das TRIM19 Protein, auch bekannt als PML (Promyelozytisches Leukämie
Protein)-Protein (Nisole et al., 2005). PML ist der strukturgebende Bestandteil einer
zellulären subnukleären Struktur, bekannt als nukleäre Domäne 10 (ND10). ND10s stellen
dynamische,
makromolekulare
Strukturen
im
Zellkern
dar,
welche
über
das
Vorhandensein der wichtigsten Komponenten PML, Sp100 und Daxx, die untereinander
interagieren, definiert werden (Bernardi & Pandolfi, 2007). ND10s wurden mit einer Reihe
von verschiedenen zellulären Prozessen in Verbindung gebracht, darunter Onkogenese,
Stressantwort und Apoptose (Bernardi & Pandolfi, 2003), Seneszenz (Bischof et al., 2002),
dem Ubiquitin-Signalweg (Anton et al., 1999;Lallemand-Breitenbach et al., 2001), viralen
Infektionen und der Interferon (IFN)-Antwort (Regad & Chelbi-Alix, 2001). Verschiedene
DNA-, als auch RNA-Viren assoziieren mit ND10, weshalb zunächst vermutet wurde, dass
diese Strukturen eine provirale Funktion ausüben könnten. Es konnte jedoch in weiteren
Studien gezeigt werden, dass ND10 intrinsische Immunität gegen eine Reihe von Viren
vermitteln, darunter auch gegen HCMV. Während der Evolution entwickelten allerdings
Viren unterschiedliche Strategien, um der durch ND10-Komponenten vermittelten
zellulären Repression zu entgehen. Dies wurde zuerst für das Herpes Simplex Virus Typ I
(HSV-1) gezeigt. Es wurde beobachtet, dass die Domäne nach Infektion mit viralem ICP0
kolokalisierte und durch dieses aufgelöst wurde (Everett & Maul, 1994;Maul & Everett,
1994), während ein ICP0-depletiertes Virus diesen Effekt nicht mehr aufwies (Maul et al.,
1993). Die Auflösung der Domänen erfolgte durch die Degradation der SUMOylierten
Formen von PML und Sp100, was zu einer Umverteilung der restlichen ND10-Bestandteile
innerhalb des Zellkerns führte (Chelbi-Alix & de The, 1999;Everett et al., 1998;Muller &
Dejean, 1999). Der Verlust des Sp100-Proteins wird hierbei als Konsequenz der ICP0induzierten PML-Degradation angesehen (Everett et al., 2006b). Ähnlich wie HSV-1, wird
auch eine Infektion mit VZV (Varicella Zoster Virus) durch Komponenten der ND10
antagonisiert, wobei hier eine entscheidende Rolle das virale Protein ORF61p, ein
Homolog zu ICP0, zu spielen scheint (Kyratsous & Silverstein, 2009). Für weitere Viren,
wie das Epstein-Barr Virus (EBV) (Adamson & Kenney, 2001), das Kaposi-Sarkom
assoziierte Herpesvirus (KSHV) (Marcos-Villar et al., 2009) und für das BK-Virus, ein
Vertreter der Polyomaviren (Jiang et al., 2011), wurde ebenso beschrieben, dass sie durch
ND10 antagonisiert werden.
92
F. Diskussion
Analyse des Einflusses von Sp100 auf die HCMV Infektion
Verschiedene Studien konnten bereits zeigen, dass die ND10-Komponenten PML und
Daxx Restriktionsfaktoren der HCMV-Replikation darstellen (Cantrell & Bresnahan,
2006;Preston & Nicholl, 2006;Saffert & Kalejta, 2006;Tavalai et al., 2006;Tavalai et al.,
2008). Eine wesentliche Frage dieser Studie war nun, ob auch Sp100 (speckle protein of
100kDa), welches der dritte wichtige Bestandteil der ND10 ist, zur intrinsischen Immunität
der Domäne beiträgt.
Um dies zu untersuchen, wurden primäre humane Vorhautfibroblasten mit einer stabilen
Depletion (knockdown, kd) von Sp100 über siRNA-Wechselwirkung generiert, wobei in der
Analyse im Western Blot und in der indirekten Immunofluoreszenz gezeigt werden konnte,
dass die Depletion von Sp100 nahezu vollständig war. Es wurde beobachtet, dass in den
Sp100-kd Zellen die sehr frühe (IE; immediate-early) Genexpression nach Infektion mit
HCMV vergleichbar gesteigert war, wie es schon für PML-depletierte und Daxx-depletierte
Zellen beobachtet worden war. Ebenso war die Anzahl an Plaques in den generierten
Zelllinien mit Depletion einer der ND10 Komponenten annährend gleich hoch. Hier konnte
gezeigt werden, dass der Effekt, dass in Abwesenheit von Sp100 mehr Zellen die sehr
frühe Phase der Genexpression initiieren können, abhängig von der Infektionsdosis war,
da dies nur unter sehr niedrigen MOI (multiplicity of infection) Bedingungen beobachtet
wurde und bereits bei einer MOI von 0,5 kein Unterschied mehr zwischen Sp100-kd Zellen
und Kontrollzellen festgestellt werden konnte. Es besteht entweder die Möglichkeit, dass
die repressorischen Eigenschaften von Sp100 mit einer steigenden Infektionsdosis
antagonisiert
werden
können,
oder
dass
eine
Sättigung
des
repressorischen
Mechanismus von Sp100 zu beobachten ist. Im Gegensatz dazu konnte nach Infektion
von PML-kd und Sp100-kd Zellen mit einem Wildtyp-HSV1 kein Effekt auf die virale
Replikation beobachtet werden (Everett et al., 2006b;Everett et al., 2007). Nach Infektion
mit Wildtyp-HCMV kann jedoch eindeutig beobachtet werden, dass Sp100, ebenso wie
PML und Daxx, als zellulärer Restriktionsfaktor die Infektion antagonisiert. Es wurde
beschrieben, dass eine Depletion von PML die Sp100-Proteinmenge beeinflusst und dass
das SUMOyierungsmuster von Sp100 von dem Vorhandensein von PML abhängig ist
(Cuchet et al., 2011;Everett et al., 2006b;Everett et al., 2007). Daraus ergibt sich die
Möglichkeit, dass bei Depletion von PML die beobachtete gesteigerte HCMV-Replikation
eine Folge des Verlusts von SUMOyliertem Sp100 darstellt. Umgekehrt wurde in dieser
Studie festgestellt, dass eine Depletion von Sp100 keinen Einfluss auf PML und Daxx
ausübt, weder auf die Lokalisation in der Zelle, noch auf das Expressionsmuster.
F. Diskussion
93
Eine weitere Fragestellung der vorliegenden Studie war die Charakterisierung des
restriktiven Wirkmechanismus von Sp100. Für die antagonisierenden Eigenschaften von
PML und Daxx war beschrieben worden, dass beide Proteine unabhängig voneinander
diese Funktion erfüllen (Tavalai et al., 2008). Daher sollte untersucht werden, ob Sp100
ebenfalls als eigenständiger Restriktionsfaktor agiert oder in direkter Wechselwirkung mit
PML und Daxx wirkt. Ausgehend von bestehenden Einzel-kd Zellen, die eine Depletion
einer der ND10-Bestandteile Sp100, PML und Daxx hatten, wurden Zellen generiert, die
entweder eine Doppeldepletion von Sp100 und Daxx oder von Sp100 und PML aufwiesen.
Nach Infektion dieser Doppel-kd Zellen konnte gezeigt werden, dass im Vergleich zu den
jeweiligen Einzel-kd Zellen die Initiierung der sehr frühen Genexpression erneut gesteigert
war und ebenso die HCMV-Replikation erhöht war. Dies lässt schlussfolgern, dass die drei
wichtigsten ND10-Proteine PML, Daxx und Sp100 unabhängig an der Restriktion von
HCMV beteiligt sind. HCMV hat dabei Strategien entwickelt, die ND10-vermittelte
intrinsische Immunität durch virale Proteine zu antagonisieren. Für Daxx ist bekannt, dass
das virale Tegumentprotein pp71 direkt nach Infektion die repressorische Aktivität von
Daxx unterdrückt, indem es Daxx degradiert (Hwang & Kalejta, 2007;Saffert & Kalejta,
2006). Nach Initiierung der sehr frühen Genexpression lokalisiert neu synthetisiertes
virales IE1 an den ND10-Domänen und bewirkt die Auflösung der Struktur, indem es die
SUMOylierung von PML unterbindet. Inwieweit Sp100 direkt durch ein virales Protein
antagonisiert wird, ist noch nicht vollständig geklärt. In dieser Arbeit wurde analysiert, ob
IE1 möglicherweise einen Effekt auf die Sp100-Restriktion hat, indem Sp100-kd Zellen mit
einem IE1-Deletionsvirus infiziert wurden. Es konnte gezeigt werden, dass der
Wachstumsdefekt des IE1-Deletionsvirus CR208 in Sp100-kd Zellen ähnlich gut
ausgeglichen werden konnte wie in PML-kd Zellen. Dies entspricht Ergebnissen einer
Studie von Everett und Kollegen, die zeigen konnten, dass ein ICP0-deletiertes HSV-1,
welches als Homolog des IE1-Proteins des HCMV gilt, bei Infektion von PML- und auch
Sp100-depletierten Zellen im Wachstum komplementiert wird (Everett et al., 2007). Somit
scheint IE1 nicht nur auf PML, sondern auch auf Sp100 einen antagonistischen Effekt
auszuüben (Tavalai et al., 2011; in Revision). Einige Studien hatten zudem einen Einfluss
von Histon-Deacetylasen (HDACs) auf die restriktive Aktivität von Daxx nahegelegt,
weshalb der Einfluss des HDAC-Inhibitors Trichostatin A (TSA) auf die generierten
Depletionszelllinien untersucht wurde. Es konnte beobachtet werden, dass HCMV nach
Zugabe von TSA verstärkt die IE-Genexpression initiieren kann, weshalb angenommen
werden muss, dass auch in Abwesenheit einzelner ND10-Komponenten bzw. der
Depletion von zwei ND10-Proteinen die repressorische Eigenschaft von HDACs immer
94
F. Diskussion
noch bestehen bleibt. Daher bedarf es weiterer Studien, um den antagonistischen Effekt
von Sp100 auf die HCMV Replikation besser zu verstehen.
Weiter sollte in dieser Studie untersucht werden, welchen unterschiedlichen
Einfluss die vier verschiedenen Sp100-Isoformen auf die HCMV Infektion haben. Die
Identität der Isoformen in der Western Blot-Analyse ist nicht eindeutig, da endogen
exprimiertes Sp100 in verschiedenen Banden detektiert wird, von denen die am stärksten
exprimierte Form Sp100A ist, die zudem noch SUMOyliert wird, während die genaue
Identität der übrigen Banden nicht abschließend geklärt ist. Wie von Negorev und Kollegen
gezeigt wurde, ist das Expressionsmuster der Sp100-Isoformen stark abhängig vom
verwendeten Zelltyp. So konnte gezeigt werden, dass unbehandelte HEp-2 (humane
Epithelzellen) Zellen hauptsächlich Sp100A exprimieren und dass nach Interferon
Induktion
dieser
Zellen
alle
Isoformen
hoch
reguliert
werden.
In
humanen
Vorhautfibroblasten ist Sp100A die am stärksten exprimierte Isoform; interessanterweise
werden
nach
Interferon-β
Induktion
die
Isoformen
C und
HMG
in
humanen
Vorhautfibroblasten jedoch nicht verstärkt exprimiert (Negorev et al., 2006). Dies ist ein
Indiz dafür, dass das Spleißen von Sp100 und die Expression der Isoformen je nach
Zelltyp unterschiedlich reguliert wird und dass die Isoformen möglicherweise zelltypspezifische Funktionen ausüben. Die Analyse von Expressionskonstrukten der einzelnen
Isoformen zeigte hier, dass jede Form für sich in zwei unterschiedlich starken Banden
detektiert werden kann, von denen möglicherweise jeweils die oberste die SUMOylierte
Form ihrer selbst darstellt. Es wurden Zellen generiert, in die nach Sp100-Depletion aller
Isoformen die Formen einzeln wieder eingebracht worden waren und stabil exprimiert
wurden. Im Gegensatz zu vorangegangenen Studien (Negorev et al., 2006) war es hier
möglich auch nach Selektion der Sp100-exprimierenden Zellen lebende Zellkulturen zu
erhalten, die in ihrer Morphologie und in ihrem Wachstum mit normalen HFF bzw. Sp100kd Zellen vergleichbar waren (Daten nicht gezeigt). Konform mit früheren Studien ist die
hier beobachtete unterschiedliche Lokalisation der Isoformen im Zellkern (Negorev et al.,
2006). So liegt lediglich Sp100A in punktförmigen Strukturen im Kern vor und kolokalisiert
dabei mit PML und somit den ND10-Domänen. Die übrigen drei Isoformen sind diffus im
Kern verteilt und zeigen keinerlei Assoziation zu ND10. Dies ist ein Hinweis darauf, dass
möglicherweise nur Sp100A an der repressorischen Aktivität der ND10-Domänen gegen
HCMV-Infektionen beteiligt ist. Dem widersprechen Untersuchungen, wonach für Sp100B
eine repressorische Funktion nachgewiesen werden konnte (Isaac et al., 2006;Wilcox et
al., 2005). Zusätzlich wurde postuliert, dass nur diejenigen Sp100-Isoformen, die eine
SAND-Domäne enthalten (B, C, HMG), restriktiv auf die IE-Genexpression wirken
F. Diskussion
95
(Negorev et al., 2009). Konsequenterweise inhibierte eine Überexpression von Sp100B,
nicht jedoch von Sp100A, die HSV-1 Genexpression. Weiter wurde nach Depletion der
Isoformen B, C und HMG gezeigt, dass diese essentiell sind für die Inhibierung der HSV-1
Replikation (Negorev et al., 2006). Im Gegensatz dazu konnte nach Infektion der in dieser
Arbeit generierten Sp100-exprimierenden Zelllinien mit HCMV bei keiner der Isoformen
eine antagonisierende Wirkung gezeigt werden. Vielmehr schien die Initiation der sehr
frühen Genexpression von HCMV durch die Expression einzelner Sp100-Isoformen
verstärkt zu werden. Daher ist nicht auszuschließen, dass die einzelnen Sp100-Isoformen
synergistisch wirken müssen, um einen repressorische Effekt auf die HCMV-Infektion
ausüben zu können.
Der Einfluss von PML auf die zelluläre Genexpression
Die ND10-Domänen werden durch das Vorhandensein des PML-Proteins definiert. Es
fungiert als eine Art Gerüstprotein der Domänen, welches die anderen Proteine wie Daxx
und Sp100 an ND10 rekrutiert (Guo et al., 2000;Ishov et al., 1999;Zhong et al., 2000). Ein
Fehlen dieser wichtigen Komponente führt zu einem Auflösen und einer Umstrukturierung
der übrigen ND10-Bestandteile in humanen PML-depletierten Fibroblasten (Everett et al.,
2006b;Tavalai et al., 2006). Somit stellte sich die Frage, welchen Einfluss dieses wichtige
ND10-Protein auf Mechanismen der Zelle, speziell die Genexpression, ausübt. Für diese
Analyse der Funktion von PML wurden primäre humane Zellen generiert, die durch den
Effekt einer eingebrachten siRNA gegen PML eine nahezu komplette Depletion
(knockdown, kd) von PML aufwiesen. Die zelluläre Genexpression in Anwesenheit und
Abwesenheit von PML konnte nun mittels Affymetrix Microarray (Matrix) Analyse
untersucht werden, was Rückschlüsse auf zelluläre Funktionen und biochemische
Signalwege ermöglicht. Die Analyse der Gesamtheit der Genexpression, im Gegensatz
zur Analyse einzelner mRNA-Transkripte, ist besonders wichtig, da dadurch mögliche
Effekte besser erkannt werden können. Beispielsweise wurde gezeigt, dass eine sichere
Vorhersage eines malignen Phänotyps nicht auf der Basis der Expression eines Gens
möglich ist, sondern dass erst das Genexpressionsmuster aus mehr als 50 Genen, aus
den 6000 gemessenen Genen im verwendeten Microarray, eine korrekte Aussage lieferte
(Golub et al., 1999).
In den untersuchten PML-depletierten Zellen waren im Vergleich zu den Kontrollzellen 162
Gene verschieden exprimiert; davon waren insgesamt 79 signifikant hoch reguliert und
entsprechend 83 Gene herunter reguliert. Dabei fiel auf, dass mehrere der differentiell
regulierten Gene nicht-kodierende RNAs oder regulatorische snRNAs darstellten.
F. Diskussion
96
Beispielsweise ist die im Zellkern zurückbehaltene nicht-kodierende RNA MALAT1 in
PML-kd Zellen im Vergleich zu Kontrollzellen hoch reguliert. Für MALAT1 (metastasisassociated lung adenocarcinoma transcript 1) wurde kürzlich gezeigt, dass es einen
Einfluss auf die Phosphorylierung von Spleiß-Faktoren (SR) ausübt und dadurch das
alternative Spleißen reguliert (Tripathi et al., 2010). MALAT1 interagiert mit SR-Proteinen
und beeinflusst dadurch die Verteilung dieser Faktoren im Zellkern in sogenannten
nukleären Speckles. Der Zellkern ist unterteilt in verschiedene Bereiche, darunter CajalKörper, ND10-Domänen, Nukleoli und nukleäre Speckles; diese Bereiche wiederum
stellen eine Ansammlung von Proteinen und RNAs dar (Matera et al., 2009;Spector,
2006). Nukleäre Speckles sind hoch dynamische Strukturen, die eine Akkumulation
insbesondere von prä-mRNA Spleißfaktoren und Faktoren zur Weiterverarbeitung
darstellen, dabei aber kein direkter Ort der Transkription oder des Spleißens sind, sondern
lediglich als eine Art Lager für Komponenten des Spleißens dienen und bei Aufbau und
ersten Modifikationen beteiligt sind (Hall et al., 2006;Lamond & Spector, 2003). Eine
verstärkte Expression von MALAT1 in PML-kd Zellen im Vergleich zu Kontrollzellen wirft
nun die Frage auf, ob PML einen regulatorischen Einfluss auf das alternative Spleißen
ausübt und ob es somit eine Wechselbeziehung zwischen den ND10-Domänen und den
nukleären Speckles gibt.
Neben der Analyse der Genexpression in PML-kd Zellen wurde zudem der Einfluss einer
Interferon-Induktion mit Interferon-γ (IFN-γ) in PML-depletierten Zellen im Vergleich zu
Kontrollzellen untersucht. Dabei fiel auf, dass viele Bestandteile des Ubiquitin-Signalwegs,
wie UIMC1, UBA7, USP18, und des Proteasoms, wie PSMB10 und PSME2 (auch: P28)
nach Induktion mit IFN-γ in Abhängigkeit von PML in PML-depletierten Zellen im Vergleich
zu Kontrollzellen reguliert wurden. PML und allgemein ND10-Domänen wurden schon
früher mit dem Ubiquitin-Signalweg und der Proteolyse in Verbindung gebracht; weiter
wurde gezeigt, dass RING-Finger Proteine, zu denen auch PML gehört, möglicherweise
als E3-Ubiquitin-Ligasen agieren und daher Teil der Protein-Degradation sind (Freemont,
2000;Lallemand-Breitenbach et al., 2001). Daher kann spekuliert werden, dass ND10Domänen möglicherweise mit Bestandteilen des Proteasoms interagieren und als Orte der
Proteindegradation dienen. Speziell PA28, ein ringförmiges Molekül, bestehend aus αund β-Untereinheiten, ist durch IFN-γ Induktion aktivierbar und nötig, um bestimmte MHCAntigene (major histocompatibility class 1) zu präsentieren (Fabunmi et al., 2001;Song et
al., 1996). Es wurde zudem gezeigt, dass PA28 Bestandteil der ND10 zu sein scheint und
in Abhängigkeit zu IFN-γ Induktion an diese Domänen rekrutiert wird (Fabunmi et al.,
2001). Die Bindung von PA28 an beiden Enden des Proteasoms aktiviert die Hydrolyse
F. Diskussion
97
von kurzen Peptiden, nicht jedoch von Proteinen (Dubiel et al., 1992). Übereinstimmend
mit der hier vorliegenden Studie wurde gezeigt, dass eine IFN-γ Induktion PA28 in
Abhängigkeit von PML hoch reguliert, da nach PML-Depletion PA28 deutlich geringer
exprimiert wird (Realini et al., 1994;Rechsteiner et al., 2000). Zusammenfassend lässt sich
aufgrund des Zusammenspiels zwischen IFN-γ, PA28, Proteasom und PML eine Rolle von
ND10 bei der Regulation der Antigenpräsentation annehmen (Rock & Goldberg, 1999).
Während Infektion mit HCMV werden ND10 durch das virale Protein IE1 aufgelöst,
wodurch die übrigen Bestandteile, darunter auch PA28 von den Strukturen dissoziieren
(Ahn & Hayward, 1997). Dies stellt daher möglicherweise einen Mechanismus dar, der
dem Virus erlaubt die Immunantwort zu modulieren und die eigene Entdeckung durch das
Immunsystem zu beeinflussen.
Weiter konnte hier gezeigt werden, dass in den Kontrollzellen in Anwesenheit von
PML nach IFN-γ Induktion STAT1 (signal transducer and activators of transcription 1) stark
hoch reguliert wird. Dies ist in PML-kd Zellen deutlich abgeschwächt und lässt somit auf
eine PML-vermittelte Positivregulation der IFN-γ induzierten Expression schließen. Drei
verschiedene Typen von Interferonen sind bekannt (i) Typ 1 Interferone (IFN-α / IFN-β /
IFN-κ / IFN-ω) (ii) Typ 2 Interferone (IFN-γ) und (iii) Typ 3 Interferone (IFN-λ). Nach
Freisetzung der Interferone binden diese an ihre entsprechenden Rezeptoren und
aktivieren dadurch STAT-Proteine via Phosphorylierung mit Janus-Kinasen (Jaks), was
schließlich zu ihrer Homo- und Heterodimerisierung führt und letztendlich in der
Transkription der IFN-stimulierten Gene (ISGs) resultiert. Aktuell sind drei verschiedene
Protein-Gruppen bekannt, die die IFN-Signalwege über verschiedene Mechanismen
negativ modulieren, darunter Phosphotyrosin-Phosphatasen (z.B. SHPs; CD45), welche
aktive Rezeptoren wieder dephosphorylieren, Protein-Inhibitoren von bereits aktiviertem
STAT (PIAS), die die Bindung von aktiviertem STAT an DNA inhibieren und Unterdrücker
des Cytokin-Signalwegs (SOCS), die an Rezeptoren binden und daher weitere Aktivierung
von STAT unterbinden (Wormald & Hilton, 2004). Von Youn-Hee Choi und Kollegen wurde
kürzlich gezeigt, dass auch PML als negativer Regulator des IFN-γ Signalwegs agieren
kann, da PML direkt mit STAT1α in Abhängigkeit von Interferon-γ interagiert (Choi et al.,
2006). Weiter wurde in PML-depletierten embryonalen Mausfibroblasten (MEF) eine
erhöhte STAT1α Transkription nach IFN-γ Induktion im Vergleich zu Kontrollzellen
beobachtet. Gleichzeitig wird in der Studie die Möglichkeit diskutiert, dass PML einen
bidirektionalen Einfluss auf Signal-Transduktionen zu haben scheint, da es einerseits
einen positiven Effekt auf den TGF-β Signalweg ausübt und andererseits die
Signalkaskaden von STAT, NF-κB und p38 negativ zu regulieren scheint. Im Gegensatz
98
F. Diskussion
zu der Analyse von Choi und Kollegen steht eine aktuelle Studie von El Bougrini und
Kollegen, die zeigen, dass PML als positiver Regulator des Interferon-γ Signalwegs agiert
(El et al., 2011). In PML-depletierten MEFs konnte nach IFN-γ Induktion eine geringere
STAT-Phosphorylierung und damit eine geringere Aktivierung von ISGs beobachtet
werden, weshalb die Vermutung aufgestellt wurde, dass ein Fehlen von PML die
Aktivierung von STAT inhibiert. Zusammenfassend wurde gezeigt, dass PML keinen
Einfluss auf Interferon Typ 1 Signale ausübt, wohl aber Interferon Typ 2 Signalkaskaden
positiv zu regulieren scheint. Dafür ist sowohl eine intakte RING-Finger Domäne, als auch
die SUMOylierung von PML und die damit verbundene Lokalisation von PML an ND10 von
wichtiger Bedeutung. Die in der vorliegenden Studie gezeigten Daten lassen sich jedoch
nicht eindeutig einer der genannten Regulationen von PML nach Interferon-γ Induktion
zuordnen. Eine geringere STAT1 Expression in PML-kd Zellen nach IFN-γ im Vergleich zu
Kontrollen lässt den Schluss zu, dass PML eine positive regulatorische Wirkung auf IFN-γ
induzierte Signalwege ausübt. Jedoch sind insgesamt in PML-kd Zellen nach InterferonZugabe deutlich mehr Gene hoch reguliert (654 hoch regulierte Gene, 343 herunter
regulierte Gene) als nach IFN-γ Induktion von Kontrollzellen (333 hoch regulierte Gene, 67
herunter regulierte Gene). Somit kann auch ein negativer Einfluss von PML auf IFN-γ
induzierte Gene nicht ausgeschlossen werden. Insgesamt läßt sich damit die Rolle von
PML
für
die
IFN-γ
induzierte
Genexpression
aufgrund
der
durchgeführten
Genexpressionsanalyse nicht einheitlich beurteilen.
Die pp71-vermittelte Daxx-Degradation nach HCMV-Infektion
Neben PML ist das humane Daxx-Protein (hDaxx, Daxx) eine wichtige Komponente der
ND10-Strukturen im Kern, wobei bereits gezeigt werden konnte, dass Daxx repressorisch
an der antiviralen Funktion der Domäne beteiligt ist. Während Infektion hat HCMV
verschiedene Strategien entwickelt, um der ND10-vermittelten Repression zu entgehen.
Für virales IE1 wurde gezeigt, dass es die Auflösung der Struktur induziert, indem es die
SUMOylierung von PML unterbindet (Ahn et al., 1998;Korioth et al., 1996;Lee et al., 2004).
Neben IE1 lokalisiert das virale Tegumentprotein pp71 direkt nach Infektion an ND10
(Hofmann et al., 2002;Marshall et al., 2002), wobei gezeigt werden konnte, dass die
direkte Interaktion zwischen pp71 und Daxx für diese Lokalisation verantwortlich ist (Ishov
et al., 2002). Nach Überexpression von Daxx kam es zu einer Repression der HCMVInfektion, wohingegen bei einer siRNA-vermittelten Depletion von Daxx eine gesteigerte
Genexpression
und
Virusreplikation
beobachtet
wurde
(Cantrell
&
Bresnahan,
2006;Preston & Nicholl, 2006;Saffert & Kalejta, 2006;Tavalai et al., 2008). HCMV hat
F. Diskussion
99
konsequenterweise mit dem Tegumentprotein pp71 eine wirksame Möglichkeit entwickelt,
der Daxx-vermittelten Repression zu entgehen, indem es das zelluläre Protein degradiert.
Bisher war beschrieben worden, daß dieser pp71-vermittelte Abbau von Daxx über einen
proteasom-abhängigen (Saffert & Kalejta, 2006) und ubiquitin-unabhängigen (Hwang &
Kalejta, 2007) Mechanismus erfolgt. Allgemein ist der Ubiquitin-Proteasom Signalweg
zellulär nötig, um falsch gefaltete oder nicht korrekt synthetisierte Proteine zu degradieren
(Glickman & Ciechanover, 2002). Dieser dreistufige Prozess ist ATP-abhängig und über
die Enzyme E1, E2 und E3 kaskadenartig aufgebaut, wobei letztendlich die Ub-E3Ligasen die Spezifität zum abbauenden Protein vermitteln (Hershko & Ciechanover,
1998;Scheffner et al., 1995). In der Studie von Kalejta und Kollegen wurden murine ts20Zellen verwendet, um den Mechanismus der Daxx-Degradation zu untersuchen. Die ts20Zellen besitzen temperatur-sensitive E1-Enzyme des Ubiquitin-Signalwegs, weshalb sie
bisher schon häufig verwendet wurden, wenn bestimmt werden sollte, ob ein Proteinabbau
in der Zelle mittels Polyubiquitinylierung erfolgt (Chowdary et al., 1994). Bei einer
Temperatur von 39°C können, im Gegensatz zur Kultivierung der Zellen bei 35°C, die
Ubiquitin-Monomere nicht mehr aktiviert werden, was zur Folge hat, dass keine
Polyubiquitinketten mehr gebildet werden können und somit Proteine wie p53, die
normalerweise ubiquitin-abhängig abgebaut werden, in den Zellen stabilisiert vorliegen.
Jedoch konnte gezeigt werden, dass auch bei Verwendung der restriktiven Temperatur
von 39°C immer noch ein Rest von aktivem E1 in den Zellen verbleibt, der weiter die
Ubiquitinylierung von Substraten ermöglicht (Salvat et al., 2000). Weiter wurde
beschrieben, dass verschiedene Ub-Substrate die Aktivität von unterschiedlich großen
Mengen an aktivem E1 benötigen (Chowdary et al., 1994;Salvat et al., 1998). So konnte
beispielsweise c-Fos nicht stabilisiert werden, da das noch vorhandene E1-Enzym
ausreichend war, um eine ubiquitin-abhängige Degradation zu vermitteln (Salvat et al.,
1998). Konsequenterweise ist eine Degradation von Daxx in ts20-Zellen nicht
notwendigerweise ein Indiz für einen ub-unabhängigen Mechanismus. Daher wurde in
verschiedenen Studien spekuliert, dass nicht E1, sondern E2-Ub-Enzyme bzw. am
wahrscheinlichsten E3-Ub-Enzyme der limitierende Faktor für das Ubiquitin-System
darstellen (Peters et al., 1998;Salvat et al., 2000). Es konnte kürzlich gezeigt werden, dass
zelluläres Daxx mit Bestandteilen von Ub-E3-Ligasen interagiert und dass diese auch für
den Abbau von Daxx verantwortlich sind (Kwon et al., 2006). Die hier analysierte E3Ligase stellt einen Multiproteinkomplex dar, bestehend aus SPOP (speckle-type POZ
protein), Roc1 (regulator of cullins 1, Rbx1) und Cullin3 (Cul3). Es konnte gezeigt werden,
100
F. Diskussion
dass das zelluläre SPOP-Protein als Adaptor für Daxx agiert, dieses an die Cul3-E3Ligase rekrutiert und Daxx anschließend im Proteasom abgebaut wird.
Somit sollte in der vorliegenden Studie der pp71-vermittelte Daxx-Abbau weiter
charakterisiert werden. Es wurde beobachtet, dass virales pp71 mit Bestandteilen der von
Kwon und Kollegen untersuchten E3-Ligase interagiert. Es konnte gezeigt werden, dass
virales pp71 in Hefe mit SPOP und Roc1, in höheren Eukaryoten (HEK293T Zellen) mit
Roc1 interagiert. Daher lag die Vermutung nahe, dass pp71 die zelluläre E3-Ligase für
den Abbau von Daxx rekrutiert und dass der pp71-vermittelte Daxx-Abbau möglicherweise
ubiquitin-abhängig erfolgt. Daher sollte nun untersucht werden, ob nach Infektion ein
Daxx-Abbau weiter stattfindet, wenn der Ubiquitin-Signalweg inhibiert wird. Dies erfolgte
durch Zugabe des E1 / E2 Inhibitors Jodoaceticacid (IAA), der die Weitergabe des aktiven
Ubiquitin von Enzym E1 an E2 verhindert und somit den Ub-Signalweg antagonisiert. Hier
konnte gezeigt werden, dass nach Infektion von HFF nach IAA-Zugabe Daxx stabilisiert
wurde, weshalb eine Beteiligung des Ub-Signalweges an der Daxx-Degradation vermutet
werden muss.
Die E3-Ligasenbestandteile SPOP und Roc1 sollten nun weiter untersucht werden. Nach
Depletion von SPOP und Roc1 mittels siRNA-Wechselwirkung konnte nach Infektion mit
HCMV gezeigt werden, dass deutlich weniger Zellen, im Vergleich zu Kontrollzellen, die
sehr frühe Genexpression initiierten und dass die Virusreplikation stark vermindert war.
Dies legte nahe, dass HCMV die zellulären Proteine SPOP und Roc1 für eine erfolgreiche
Infektion benötigt und diese aktivierende Funktion der Ub-E3-Ligasenbestandteile SPOP
und Roc1 bereits zu Beginn der Infektion eine wichtige Funktion erfüllt. Nach Infektion von
SPOP-kd Zellen mit HCMV konnte zudem gezeigt werden, dass die Degradation von Daxx
teilweise aufgehoben ist, was jedoch bei Infektion von Roc-1-depletierten Zellen nicht der
Fall war. Bereits von Kwon und Kollegen wurde beschrieben, dass SPOP den substratspezifischen Teil der Ub-E3-Ligase darstellt (Kwon et al., 2006). Daher kann
geschlussfolgert werden, dass eine Depletion von SPOP den pp71-vermittelten DaxxAbbau nach Infektion verhindert, ein Roc1-kd jedoch nicht den gleichen Effekt bewirkt, da
möglicherweise pp71 nun die E3-Ligase über einen noch unbekannten Mechanismus zu
Daxx rekrutiert.
Zu erwähnen sei hier noch, dass SPOP je nach Experiment, als Doppelbande oder
Einzelbande über Western Blot-Analyse detektiert wurde. Nach Transfektion von Zellen
und Überexpression von SPOP war meist eine Doppelbande zu erkennen, ebenso beim
Nachweis
des
endogenen
SPOP-Proteins
in
Zelllysaten
aus
humanen
Vorhautfibroblasten. Jedoch fiel auf, dass nach Kopräzipitation von Cul3 und SPOP die
F. Diskussion
101
obere, also im Western Blot langsamer wandernde Bande, stärker erschien, weshalb
bereits vermutet wurde, dass diese Form von SPOP mit Cul3 interagiert (Kwon et al.,
2006). Interessanterweise ist es auch die obere Bande, die in den SPOP-depletierten
Zellen, nach Interferenz mit der spezifisch eingebrachten siRNA, nicht mehr nachgewiesen
werden kann. Möglichweise handelt es sich daher bei der unteren Bande um eine
unspezifische Antikörper-Reaktion. Dies muss jedoch zukünftig noch weiter charakterisiert
werden.
Weiter wurde beobachtet, dass bei der Detektion von Daxx in der Western Blot-Analyse
drei unterschiedliche Formen nachgewiesen wurden, wobei bei Infektion die oberste DaxxBande immer detektierbar zu bleiben scheint und nach Inhibierung des Daxx-Abbaus zwei
Banden (die oberste und mittlere) erschienen. Die verschiedenen Banden sind vermutlich
unterschiedlich phosphorylierte Formen von Daxx (Ecsedy et al., 2003). Hollenbach und
Kollegen konnten zeigen, dass die Interaktion von Daxx mit Chromatin-modulierenden
Proteinen, wie beispielsweise HDACs II von der Phosphorylierung von Daxx abhängt
(Hollenbach et al., 2002). Daher kann angenommen werden, dass HCMV lediglich die
repressorischen Formen von Daxx degradiert.
Zusammenfassend lässt sich sagen, dass die drei wichtigsten Bestandteile der ND10Domänen, PML, Daxx und Sp100, sowohl für die zelluläre Genexpression, als auch für die
Infektion mit dem humanen Cytomegalovirus eine wichtige Rolle spielen. Die Methode der
siRNA-vermittelten Depletion ist hierbei eine wirksame Methode um die Eigenschaften
dieser Proteine zu untersuchen. Es wurde bewiesen, dass Sp100 ein wichtiger Bestandteil
der ND10-vermittelten antiviralen Abwehr darstellt und dass diese Eigenschaft als
unabhängig von den Proteinen PML und Daxx angesehen werden kann. Die Rolle der
einzelnen Sp100-Isoformen konnte nicht abschließend charakterisiert werden und wird
daher Gegenstand zukünftiger Studien sein. Weiter wurde gezeigt, dass PML einen
Einfluss auf unterschiedliche Funktionen in der Zelle besitzt, wie beispielsweise der
Regulierung von IFN-induzierter Genexpression. Zudem wurde ein Hinweis gefunden,
dass möglicherweise die pp71-vermittelte Daxx-Degradation über die Beteiligung des
Ubiquitin-Signalwegs erfolgt und die Ub-E3-Ligase SPOP-Cul3-Roc1 dabei eine Rolle zu
spielen scheint.
G. Abkürzungsverzeichnis
102
G. Abkürzungsverzeichnis
a
Abb.
as
bp
CPE
C-Terminus
DAPI
delta
DMEM
DNA
dpi
E
E. Coli
EBV
EGFP
FGAPDH
GFP
h
HCMV
HDAC
hDaxx
HEK
Hep-2
HFF
HIV-1
hpi
HRP
HSV
IAA
IE
IEU
IFN
IP
ISG
kb
kd
kDa
KFB
Ko-IP
L
LB
µl
M
MMab
MALAT1
MCP
MEF
anti
Abbildung
Aminosäure
Basenpaar
Zytopathischer Effekt (cytopathic effect)
Carboxy-Terminus eines Proteins
4´,6-diamidino-2-phenylindole
delta (Deletionsmutante)
Dulbecco's Minimalmedium (Dulbecco's modified Eagle medium)
Desoxyribonukleinsäure
Tage nach Infektion (days post infektion)
früh (early)
Escherichia Coli
Epstein-Barr Virus
verstärktes grün fluoreszierendes Protein (enhanced green fluorescent
protein)
Flag-Epitop
Glycerinaldehyd-3-phosphat-Dehydrogenase
grün fluoreszierendes Protein
Stunde (hour)
humanes Cytomegalovirus
Histon Deacetylasen
humanes Daxx Protein
humane embryonale Nierenzelllinie (human embryonic kidney)
humane Epithelzellen
humane Vorhaut-Fibroblasten (human foreskin fibroblasts)
humanes Immundefizienz-Virus Typ I
Stunden nach Infektion (hours post infection)
Meerrettichperoxidase (horse raddish peroxidase)
Herpes simplex-Virus
Iodoacticacid
sehr-früh (immediate-early)
IE-bildende Einheiten (immediate-early protein-forming units)
Interferon
Immunpräzipitation
Interferon stimulierte Gene
Kilobasenpaare (kilo base pair)
knockdown
kilo Dalton
Kompetenzzentrum für Fluoreszente Bioanalytik Microarray
Technology
Ko-Immunpräzipitation
spät (late)
Luria-Bertani
Mikroliter
Molar
myc-Epitop
monoklonaler Antikörper
metastasis-associated lung adenocarcinoma transcript 1
major capsid protein
embryonale Maus-Fibroblasten
G. Abkürzungsverzeichnis
MEM
MIEP
min
ml
MOI
mRNA
ND10
NEC
nt
N-Terminus
PCR
PFA
PFU
PML
RNA
RNAi
Roc1
rpm
RT
SDS-Page
shRNA
siRNA
SPOP
Sp100
STAT1
SV40
u
VZV
WB
wt
Y2H
z.B.
Minimalmedium (Eagle's minimal essential medium)
major immediate early enhancer promoter
Minuten
Milliliter
Multiplizität der Infektion (multiplicity of infection)
messenger Ribonukleinsäure
Nukleäre Domaine 10
nukleärer Egress-Komplex (nuclear egress complex)
Nukleotide (nukleotides)
Amino-Terminus eines Proteins
Polymerase Kettenreaktion (polymerase chain reaction)
Paraformaldehyd
Plaque-bildende Einheiten (plaque forming unit)
Promyelozytisches Leukämie Protein
Ribonukleinsäure
RNA Interferenz
regulator of cullins 1
Umdrehung pro Minute (revolution per minute)
Raumtemperatur
Natriumdodecylsulfat-Polyacrylamid Gelelektrophorese
short hairpin RNA
short interfering RNA
speckle-type POZ protein
speckle protein of 100kDa
signal transducer and activators of transcription 1
Simian Virus 40
Enzymeinheit (units)
Varizella Zoster Virus
Western Blot
Wildtyp (wild-type)
Yeast-two hybrid
zum Beispiel
103
H. Literaturverzeichnis
104
H. Literaturverzeichnis
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I. Anhang
119
I. Anhang
Eigene Publikationen
1)
Tavalai N., Adler M., Scherer M., Riedl Y., Stamminger Th. (2011) Evidence for a
dual antiviral role of the major ND10 component Sp100 during the immediate-early
and late phase of cytomegalovirus replication cycle. J. Virol. In Revision
2)
Adler M., Tavalai N., Müller R., Stamminger Th. (2011) Human cytomegalovirus
immediate-early gene expression is restricted by the ND10 component Sp100. J
Gen Virol. 2011 Apr 6.
3)
Tavalai N., Kraiger M., Kaiser N., Stamminger Th. (2008) Insertion of an EYFPpp71 (UL82) coding sequence into the human cytomegalovirus genome results in a
recombinant virus with enhanced viral growth. J Virol. 82: 10543-55
Beiträge zu nationalen und internationalen Konferenzen
1) 13th International CMV / Betaherpesvirusworkshop, Nürnberg, Deutschland, Mai 2011
Replication of Human Cytomegalovirus is restricted by the three major ND10 components
PML, hDaxx, and Sp100
Poster Präsentation
2) 4th European Congress of Virology, Cernobbio, Lake Como, Italien, April 2010
The three major ND10 components PML, hDaxx and Sp100 independently contribute to
the restriction of human cytomegalovirus replication
Poster Präsentation
3) Internationales IZKF Symposium, Kloster Banz, Bamberg, Deutschland, Mai 2009
Role of the cellular protein TRIM6 for intrinsic immunity against cytomegalovirus infections
Poster Präsentation
4) Gesellschaft für Virologie Annual Meeting, Deutschland, März 2008
Replication of Human Cytomegalovirus is restricted by all three major ND10 components
PML, hDaxx and Sp100
Poster Präsentation
5) Third European Congress of Virology, Nürnberg, Deutschland, September 2007
Teilnahme
120
I. Anhang
Lebenslauf
Persönlich Daten
Name:
Martina Adler
Geburtsdatum:
20. Juli 1981
Geburtsort:
Nürnberg
Schulausbildung
1988-1992
Grundschule Nürnberg-Katzwang
1992-2001
Sigmund-Schuckert-Gymnasium Nürnberg-Eibach
Abschluss: Allgemeine Hochschulreife
Studium
2001-2006
Friedrich-Alexander Universität Erlangen-Nürnberg
Studium: Molecular Life Science
2004
Abschluss: Bachelor of Science
2006
Abschluss: Master of Science
2005-2006
Masterarbeit: „Detection of thermopilic Campylobacter spp. with RTPCR and real-time PCR”
Bundesforschungsanstalt für Lebensmittel und Ernährung, Kulmbach
Promotion
2007-2011
Promotion an der Friedrich-Alexander Universität Erlangen-Nürnberg;
Institut für Klinische und Molekulare Virologie
Thema: Intrinsische Immunität gegen das humane Cytomegalovirus –
Charakterisierung der Rolle zellulärer Restriktionsfaktoren und
Analyse viraler antagonistischer Mechanismen
Betreuer:
Prof. Dr. A. Burkovski, Lehrstuhl für Mikrobiologie,
Erlangen
Prof. Dr. Th. Stamminger, Institut für Klinische und
Molekulare Virologie, Erlangen
Prof. Dr. M. Pischetsrieder, Henriette Schmidt-Burkhardt
Lehrstuhl für Lebensmittelchemie, Erlangen
I. Anhang
121
Danksagung
Ich möchte mich sehr herzlich bei Herrn Prof. B. Fleckenstein für die Möglichkeit
bedanken, die vorliegende Arbeit am Institut für Klinische und Molekulare Virologie,
Universitätsklinikum, Friedrich-Alexander Universität Erlangen-Nürnberg, durchzuführen.
Mein besonderer Dank gilt Herrn Prof. Th. Stamminger für die Möglichkeit, an diesem
interessanten Thema zu arbeiten. Für seine engagierte Betreuung, seine Unterstützung
und seinen Rat zu jeder Zeit möchte ich mich herzlich bedanken.
Herrn Prof. A. Burkovski möchte ich für die Bereitschaft besonders danken, diese Arbeit zu
betreuen und von Seiten der Naturwissenschaftlichen Fakultät zu vertreten. Ich bedanke
mich herzlich bei Herrn Prof. A. Burkovski und Herrn Prof. M. Mach, dass sie sich die Zeit
genommen haben, diese Arbeit zu begutachten.
Allen früheren und aktuellen Mitgliedern der Arbeitsgruppen Stamminger / Marschall
möchte ich für die wunderbare und herzliche Arbeitsatmosphäre danken, für die Hilfe bei
allen Fragen rund ums Labor und für die vielen fachlichen und auch privaten Gespräche.
Mein besonderer Dank gilt dabei Barbara, Regina, Nadine und Marco für die wunderbare
Zeit in „unserer“ Spange und die tolle Hood-Kooperation.
Nicht zuletzt möchte ich meiner Familie und meinen Freunden für ihre ausdauernde und
noch andauernde Unterstützung während dieser Arbeit besonders herzlich danken. Sie
haben mich immer wieder in meinem Vorhaben bestärkt und an mich geglaubt, selbst
wenn ich dies nicht mehr getan habe. Ich möchte daher meinen Eltern, meiner Schwester
und meinem Mann diese Arbeit widmen.