Aus dem Institut für Medizinische Mikrobiologie, Immunologie und

Aus dem Institut für Medizinische Mikrobiologie, Immunologie und Hygiene
der Universität zu Köln
Direktor: Universitätsprofessor Dr. med. M. Krönke
TH17-Zellen und Interleukin-17 in der Genese intraperitonealer Abzesse durch das
zwitterionische Polysaccharid Sp1 von Streptococcus pneumoniae
Inauguraldissertation zur Erlangung der Doktorwürde
der Hohen Medizinischen Fakultät
der Universität zu Köln
vorgelegt von
Thomas Gamstätter
aus Mainz
Promoviert am 27. Juni 2012
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Aus dem Institut für Medizinische Mikrobiologie, Immunologie und Hygiene
der Universität zu Köln
Direktor: Universitätsprofessor Dr. med. M. Krönke
TH17-Zellen und Interleukin-17 in der Genese intraperitonealer Abzesse durch das
zwitterionische Polysaccharid Sp1 von Streptococcus pneumoniae
Inauguraldissertation zur Erlangung der Doktorwürde
der Hohen Medizinischen Fakultät
der Universität zu Köln
vorgelegt von
Thomas Gamstätter
aus Mainz
Promoviert am 27. Juni 2012
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Druck: Copy Print, Mainz
Gedruckt mit Genehmigung der Medizinischen Fakultät der Universität zu Köln, 2012
3
Dekan:
Universitätsprofessor Dr. med. Dr. h. c. Th. Krieg
1. Berichterstatter:
2. Berichterstatter:
Privatdozentin Dr. med. W. M. Kalka-Moll
Universitätsprofessor Dr. med. G. Fätkenheuer
Erklärung:
Ich erkläre hiermit, dass ich die vorliegende Dissertationsschrift ohne unzulässige Hilfe Dritter und
ohne Benutzung anderer als der angegebenen Hilfsmittel angefertigt habe; die aus fremden Quellen
direkt oder indirekt übernommenen Gedanken sind als solche kenntlich gemacht.
Bei der Auswahl und Auswertung des Materials sowie bei der Herstellung des Manuskriptes habe
ich keine Unterstützungsleistungen erhalten.
Weitere Personen waren an der geistigen Herstellung der vorliegenden Arbeit nicht beteiligt.
Insbesondere habe ich nicht die Hilfe einer Promotionsberaterin/eines Promotionsberaters in
Anspruch genommen. Dritte haben von mir weder unmittelbar noch mittelbar geldwerte Leistungen
für Arbeiten erhalten, die im Zusammenhang mit dem Inhalt der vorgelegten Dissertationsschrift
stehen.
Die Dissertationsschrift wurde von mir bisher weder im Inland noch im Ausland in gleicher oder
ähnlicher Form einer anderen Prüfungsbehörde vorgelegt.
Mainz, 05. Januar 2012
4
Die dieser Arbeit zugrunde liegenden Experimente sind nach entsprechender Anleitung durch Frau
Privatdozentin Dr. med. Wiltrud Kalka-Moll von mir selbst geplant und ausgeführt worden.
Erklärungen zur Anwendung der Verfahren und Einarbeitung in die entsprechenden Abläufe der
einzelnen Experimente habe ich erhalten durch Frau Sonja Meemboor und Frau Martina Bessler,
beide vormals Institut für Medizinische Mikrobiologie, Immunologie und Hygiene der Universität
zu Köln.
Die letztliche Ausführung der Experimente, die den Ergebnissen dieser Arbeit zugrunde liegen,
oblag voll und ganz mir.
5
Danksagung
Mein herzlicher Dank für die Fertigstellung dieser Arbeit gilt Frau Privatdozentin Dr. med. Wiltrud
Kalka-Moll. Ihre Expertise und ihr tiefgehendes Interesse am wissenschaftlichen Arbeiten haben
mich stets tief beeindruckt und bleibend geprägt. Ohne ihr offenes Entgegenkommen, ihre Geduld
und ihr Engagement und nicht zuletzt ohne ihr Vertrauen in meine Fähigkeiten, wäre diese Arbeit
nicht zustande gekommen.
Mein weiterer Dank gilt Herrn Universitätsprofessor Dr. med. Martin Krönke für die Erlaubnis der
Nutzung der Räumlichkeiten und Installationen seines Instituts und für die großzügigen Freiräume,
die ich dort zur Fertigstellung dieser Arbeit genießen konnte.
Im Besonderen danke ich Frau Sonja Meemboor, deren Unterstützung während der gemeinsamen
Laborzeit für mich von größtem Wert gewesen ist, in praktisch-experimenteller, wissenschaftlicher,
aber auch in menschlicher Hinsicht.
Bedanken möchte ich mich außerdem bei Martina Bessler, Janina Mertens, Torsten Kubacki sowie
Frau Privatdozentin Dr. med. Pia Hartmann und ihrer Arbeitsgruppe für die gut funktionierende
gemeinsame Zeit im Labor.
6
Meiner Familie
7
Inhaltsverzeichnis
Abkürzungsverzeichnis
1. Einleitung
1.1 Das Immunsystem
1.2 Antigenpräsentation und T-Zell-Aktivierung
1.3 CD4+ T-Zellen
1.3.1 Das TH1-/TH2-Paradigma
1.3.2 TH17-Zellen und regulatorische T-Zellen
1.4 Zytokine
1.4.1 Allgemeines
1.4.2 Interleukin-17
1.4.3 Interleukin-6
1.4.4 Transforming Growth Factor
1.5 Bakterielle kapsuläre Polysaccharide
1.5.1 Allgemeines
1.5.2 Zwitterionische Polysaccharide
1.5.3 T-Zell-Aktivierung durch zwitterionische Polysaccharide
1.5.4 Bedeutung der T-Zell-Aktivierung durch zwitterionische Polysaccharide
1.6 Fragestellung
2. Materialien
2.1 Geräte
2.2 Verbrauchsmaterial
2.3 Puffer und Lösungen
2.4 Medien und Zusätze
2.5 Antikörper
2.5.1 FACS
2.5.2 CD4+ T-Zell-Isolations-Kit
2.5.3 T-Zell-Stimulation
2.6 Software
8
3. Methoden
3.1 Tierversuche
3.2 Versuchstierzucht
3.3 Injektionen
3.3.1 Allgemeines
3.3.2 Intraperitoneale Injektionen
3.3.3 Intravenöse Injektionen
3.4 Abszessmodell
3.5 Peritoneallavage
3.6 Herstellung einer Zellsuspension aus der Milz
3.7 Erythrozytenlyse
3.8 Zellzählung
3.9 Durchflusszytometrie
3.9.1 Hintergrund
3.9.2 Allgemeine Prinzipien
3.10 Magnetische Zellseparation
3.11 Gewinnung von dendritischen Zellen aus dem Knochenmark
3.12 Intrazelluläre Zytokinfärbung
3.13 ELISA
3.13.1 Allgemeine Prinzipien
3.13.2 IL-17-ELISA
3.13.3 TGFβ1-ELISA
3.14 Nachweis von TH17-Zellen
3.15 Messung freier Zytokinspiegel in der Peritonealflüssigkeit
3.16 Messung der Zytokinproduktion von Zellen aus der Peritoneallavage
3.17 Messung der Zytokinproduktion in der Milz
4. Ergebnisse
4.1 Abszessmodell
4.1.1 Abhängigkeit der Sp1-induzierten Abszessbildung im Mausmodell
4.2 ELISA
4.2.1 Ausschüttung von IL-17 und TGFβ1 durch peritoneale Zellen nach
9
intraperitonealer Injektion von Sp1
4.2.2 IL-17-Produktion in der Milz nach intraperitonealer Sp1-Injektion
4.2.3 Zusammenfassung der ELISA-Analysen
4.3 FACS
4.3.1 Anteil der CD4+ Zellen an der intraperitonealen Gesamtzellpopulation
4.3.2 Expression von TGFβ1 in BMDC durch Sp1
4.3.3 Produktion von IL-6 in BMDC durch Sp1
4.3.4 IL-6-abhängiges Auftreten von peritonealen T H17-Zellen nach intraperitonealer
Sp1-Injektion
4.3.5 IL-6-abhängiges Auftreten von TH17-Zellen in der Milz nach intraperitonealer Sp1Injektion
4.3.6 Auftreten von TH17-Zellen in der Milz nach intravenöser Sp1-Injektion
4.3.7 Sp1-induzierte Entwicklung von TH17-Zellen in vitro
4.3.8 Zusammenfassung der FACS-Analysen
5. Diskussion
5.1 IL-17 und die Abszessbildung durch ZPS
5.2 Quellen von IL-17 nach intraperitonealer Injektion von Sp1
5.3 Systemische Immunreaktion durch TH17-Zellen nach Injektion von Sp1
5.4 IL-6 und die Entwicklung von TH17-Zellen
5.5 TGFβ1, APC und TH17-Zellen
5.6 Makrophagen
6. Zusammenfassung
7. Literaturverzeichnis
8. Lebenslauf
10
Abkürzungsverzeichnis
APC
Allophycocyanin
APC
engl., antigen-presenting cells
BMDC
engl., bone-marrow derived dendritic cell
BSA
bovines Serum-Albumin
BV
variable Domäne der β-Kette des TCR
CD
engl., cluster of differentiation
CFA
engl., Complete Freund's Adjuvant
CLIP
engl., class-II associated invariant chain peptide
CP5
Staphylococcus aureus Serotyp 5 Kapsel-Polysaccharid
CP8
Staphylococcus aureus Serotyp 8 Kapsel-Polysaccharid
D
Dalton
DC
engl., dendritic cell
EAE
engl., experimental autoimmune/allergic encephalitis
ER
endoplasmatisches Retikulum
FACS
engl., Fluorescence-Activated Cell Sorter
FBS
fetales bovines Serum
FCS
engl., fetal calve serum
FITC
Fluorescein-5-Isothiocyanat
FOX
engl., forkhead-winged helix transcription factor
FSC
engl., forward scatter
GMCSF
engl., granulocyte-macrophage colony stimulating factor
HLA
engl., human leucocyte antigen
HLA-DM
engl., human leucocyte antigen DM
HLA-DR
engl., human leucocyte antigen DR
i.p.
intraperitoneal
i.v.
intravenös
IBD
engl., inflammatory bowel disease
ICAM
engl., intercellular adhesion molecule
IFN
Interferon
Ii
engl., invariant chain
Ig
Immunglobulin
IL
Interleukin
11
IMMIH
Institut für Medizinische Mikrobiologie, Immunologie und Hygiene
ISD
engl., inflammatory skin disease
kD
Kilodalton
LAP
engl., latency associated peptide
LPS
Lipopolysaccharid
M
molar
MACS
Magnetic Activated Cell Sorting
MHC
engl., major histocompatibility complex
MIIC
engl., MHC class II compartment
MS
multiple Sklerose
NOD
engl., nuclear oligomerization domain
PAMP
engl., pathogen-associated molecular pattern
PBS
engl., phosphate buffered saline
PCR
engl., polymerase chain reaction
PDGF
engl., platelet-derived growth factor
PE
Phycoerythrin
PRR
engl., pattern-recognition receptor
ROR
engl., retinoic acid related orphan receptor
s.c.
subcutan
SD
engl., standard deviation
SCCA
engl., sterile cecal content adjuvant
SEA
Staphylococcus aureus Enterotoxin A
siRNA
engl., small interfering ribonucleic acid
SMAC
engl., supramolecular activation cluster
SP1
Streptococcus pneumoniae Serotyp 1 Kapsel-Polysaccharid
SSC
engl., sideward scatter
STAT
engl., signal transducer and activator of transcription
TCR
engl., T cell receptor
TGF
engl., transforming growth factor
TH
T-Helferzelle
TLR
engl., TOLL-like receptor
TNF
Tumornekrosefaktor
Treg
regulatorische T-Zelle
ZPS
zwitterionische Polysaccharide
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1. Einleitung
1.1 Das Immunsystem
Der menschliche Organismus steht in permanenter Auseinandersetzung mit Pathogenen (Parkin et
al. 2001). Als Pathogen wird ein krankheitsförderndes Agens verstanden, welches belebten (Viren,
Bakterien, Protozoen, Parasiten) oder unbelebten Ursprungs (peptidische Pathogene, nichtpeptidische Pathogene) sein kann. Das Immunsystem beschreibt die Summe aller Mechanismen, die
sich im Laufe der Evolution durch diese Auseinandersetzung entwickelt haben, um schadbringende
Einflüsse auf den Organismus zu kontrollieren. Die Grundprinzipien des Immunsystems sind
hierbei Erkennung und Unterscheidung von Fremd und Selbst, Einsatz von Effektormechanismen
zur Pathogenabwehr, Ausbildung eines immunologischen Gedächtnisses sowie Kontrolle und
gezielte Unterdrückung von überschießenden Abwehrreaktionen (Murphy et al. 2008).
Das Immunsystem lässt sich untergliedern in angeborene und erworbene respektive adaptive
Abwehr, wobei zwischen diesen beiden Armen eine enge Kommunikation und Interaktion besteht
(Alam 1998).
Die angeborene Immunität umfasst phylogenetisch ältere Mechanismen, die als erste
Verteidigungslinie auf die Infiltration von Krankheitserregern reagieren. Ihrem Wesen nach
funktionieren diese Abwehrmechanismen schnell und unmittelbar, wenig spezifisch und ohne
Ausbildung eines bleibendes Gedächtnisses. Zum System der angeborenen Immunität werden unter
anderem
chemische
und
enzymatische
Abwehrsubstanzen
in
Körpersekreten,
das
Komplementsystem sowie Phagozyten gerechnet (Chaplin 2010).
Die meisten Pathogene werden durch die angeborene Immunität erkannt und lösen eine Kaskade
der Immunabwehr aus, die oftmals in einer überlappenden und integrierenden Aktivierung der
erworbenen Immunität mündet. Die Erkennung durch das angeborene Immunsystem erfolgt anhand
spezieller Pathogen-assoziierter molekularer Muster (engl., pathogen-associated molecular pattern,
PAMP) durch Erkennungsmoleküle und Rezeptoren, die zwar exklusiv auf eine jeweilige Gruppe
von PAMP reagieren, innerhalb dieser Gruppe im Einzelnen gleichwohl eine breite Variation der
Muster zulassen. Die Rezeptoren für Pathogen-assoziierte molekulare Muster werden unter der
Abkürzung PRR (engl., pattern-recognition receptor, PRR) zusammengefasst. Zu den PRR gehören
unter anderem die Rezeptoren der TLR-Gruppe (engl., TOLL-like receptor, TLR) und der NOD-
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Gruppe (engl., nuclear oligomerization domain, NOD). Beispiele für PAMP sind unter anderem
Bausteine bakterieller Zellwände wie Lipopolysaccharid (LPS) oder unmethylierte CpG-DNA
(Diacovich et al. 2010).
Die erworbene oder auch adaptive Immunabwehr entwickelt Mechanismen, die Pathogene effizient
und nachhaltig kontrolliert. Nach Konfrontation mit einem Pathogen folgt sie der angeborenen
Immunabwehr mit einiger Latenz und im Gegensatz zu jener unter Ausbildung eines
immunologischen Gedächtnisses. Ihr Hauptprinzip ist die klonale Selektionierung von
Abwehrzellen, die nunmehr spezifische Rezeptoren für eine ganz bestimmte Antigenstruktur
besitzen. Zu den Hauptakteuren der erworbenen Immunität gehören aktivierte B-Zellen sowie die
verschiedenen Linien Antigen-spezifischer T-Zellen (Murphy et al. 2008).
1.2 Antigenpräsentation und T-Zell-Aktivierung
Professionelle Antigen-präsentierende Zellen (engl., Antigen-presenting cell, APC), zu denen
dendritische Zellen (engl., dendritic cell, DC), Makrophagen und B-Zellen gerechnet werden,
nehmen eine Vermittlerrolle zwischen angeborener und erworbener Immunität ein. Unter anderem
aktivieren sie CD4+ T-Zellen durch Präsentation spezieller Antigenfragmente auf ihrer
Zelloberfläche. Diese Fragmente sind an MHC Klasse II-Moleküle (engl., major histocompatibility
complex, MHC) gebunden (Coquerelle et al. 2010).
Das MHC Klasse II-Molekül (MHC-II) besteht aus zwei Polypeptidketten, α und β, von 34kD bzw.
29kD Größe, von denen jede wiederum aus zwei Domänen, α1 und α2 respektive β1 und β2,
aufgebaut ist. Die α2- und β2-Domänen verankern MHC-II transmembranär. α1 und β1 bilden
nicht-kovalent den Antigen-bindenden Spalt. Dieser Spalt ist sterisch zu beiden Enden hin offen, so
dass theoretisch keine Obergrenze für die Größe des zu bindenden Antigens besteht und die Enden
des gebundenen Peptids die Molekülgrenzen von MHC-II überschreiten können (Watts 2004).
Gebundene Peptide zeigen eine Länge von minimal dreizehn Aminosäuren. Die Bindung erfolgt in
linearer Konformation über Wasserstoffbrückenbindungen zwischen MHC-II und Antigenfragment.
Die Bindung von Peptiden innerhalb des Antigen-bindenden Spalts ist notwendig zu Stabilisierung
des MHC-II-Multimers. Im endoplasmatischen Retikulum tritt das MHC-II-Molekül in Bindung mit
der invariant chain Ii, welche das Molekül stabilisiert und unspezifische Bindungen zellulärer
Proteine an MHC-II verhindert. Darüber hinaus geleitet Ii die MHC-II-Moleküle in die Membranen
des endosomalen Kompartiments (McFarland et al. 2002).
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APC nehmen Antigene über Endozytose, Phagozytose oder Makropinozytose auf, so dass sich
zunächst das komplette Antigenmolekül intrazellulär im Kompartiment früher Endosomen befindet.
Neben dem Antigen enthalten Endosomen eine Reihe inaktiver proteolytischer und degradativer
Enzyme wie Kathepsine oder Thiolreduktasen. Azidifizierung der frühen Endosomen führt zur
Aktivierung der Enzyme, welche nicht nur Peptid- und Disulfidbrückenbindungen im
Antigenholopeptid spalten, sondern auch Ii degradieren. Es verbleibt zunächst das Fragment CLIP
(engl., class II-associated invariant-chain peptide, CLIP) von Ii in Bindung an den Antigenbindenden Spalt von MHC-II. Die Endosomen werden nunmehr als MIIC (engl., MHC class II
compartment, MIIC) bezeichnet (Murphy et al. 2008) (Watts 1997).
Die Trennung von CLIP vom Antigen-bindenden Spalt des MHC-II-Moleküls und die Bindung
passender Antigenfragmente wird katalysiert durch das MHC-II-Homolog HLA-DM (engl., human
leucocyte antigen DM, HLA-DM) (Kelly et al. 1991). HLA-DM garantiert die Bindung hochaffiner Fragmente, die für ein ausreichendes Zeitkontingent zur Aktivierung von T-Zellen quasi
irreversibel an MHC-II verbleiben. Dieser Prozess wird als peptide editing bezeichnet (Busch et al.
2000). HLA-DM wiederum wird negativ reguliert durch HLA-DO (Kropshofer et al. 1999).
Die Aufnahme von Antigenen durch dendritische Zellen veranlasst diese zur Migration in sekundäre
lymphatische Organe, wo sie auf Antigen-spezifische, naive CD4+ T-Zellen treffen. Dabei
durchlaufen dendritische Zellen morphologische und funktionelle Änderungen wie die Expression
von kostimulatorischen Signalen auf der Zelloberfläche (Murphy et al. 2008). Reife dendritische
Zellen exprimieren in hohem Maße CD11c:CD18 (Liu et al. 2010.) Naive CD4+ T-Zellen binden
mit Hilfe ihres T-Zell-Rezeptors (engl., T cell receptor, TCR) an Epitope des präsentierten
Antigenfragments. Hierbei tritt der TCR sowohl in Bindung mit dem Antigen als auch mit MHC-II.
Ohne zusätzliches kostimulatorisches Signal führt diese Bindung zur funktionellen Ausschaltung
der T-Zelle (Schwartz 2003). Kostimulatorische Signale werden unter anderem vermittelt über B7Moleküle wie CD86, das in hoher Dichte auf aktivierten DC exprimiert wird und in
Wechselwirkung mit CD28 auf naiven CD4+ T-Zellen tritt. Wird das primäre MHC-II-TCR-Signal
durch Antigen-unspezifische sekundäre Kosignale durch Rezeptor-Liganden-Interaktion zwischen
DC und T-Zelle ergänzt, resultiert eine funktionelle Aktivierung der T-Zelle und deren Ausreifung
und klonale Expansion zu einem jeweiligen Effektor-T-Zelltypus. Dieser Prozess wird als priming
bezeichnet (Murphy et al. 2008).
15
Die initiale Bindung von naiven T-Zellen an APC in sekundären lymphatischen Organen wird durch
nieder-affine Bindung zwischen Adhäsionsmolekülen wie LFA-1 auf T-Zellen und ICAM-1 und -2
auf DC bewirkt. Die Bindung zwischen TCR und MHC-II intensiviert diese Zelladhäsion durch
konformationelle Änderungen von LFA und ICAM (Bromley et al. 2001). Polarisierungen des
Zytoskeletts führen zur lokalen Rekrutierung von weiteren Kofaktoren und der Ausbildung einer
immunologischen Synapse (engl., supramolecular activation cluster, SMAC) (Monks et al. 1998).
1.3 CD4+ T-Zellen
1.3.1 Das TH1/TH2-Paradigma
Die
naive,
postthymische
CD4+
T-Zelle
ist
eine
multipotente
Vorläuferzelle,
deren
Entwicklungsschicksal durch spezifische Zytokin-vermittelte Signale der angeborenen Immunität
bestimmt wird (Murphy et al. 2002). Ende der 1980er Jahre definierten Mosmann und Coffman das
Paradigma, dass sich naive CD4+ T-Zellen in Richtung zweier unabhängiger und weitgehend
aussschließlicher Linien, TH1 oder TH2, differenzieren können (Mosmann et al. 1986) (Mosmann et
al. 1989).
Die Entwicklung von TH1-Zellen wird initiiert über die Aktivierung des T-Zell-Rezeptors (engl., T
cell receptor, TCR) und mit dem Signalmolekül STAT1-assoziierter Zytokinrezeptoren (Weaver et
al. 2006). Typ I und Typ II Interferone und IL-27 aus der IL-12-Familie bewirken eine STAT1Signalgebung über ihre entsprechenden Rezeptoren (Hibbert et al. 2003). Diese Zytokine werden
durch pathogen-aktivierte Zellen der angeborenen Immunität geliefert, so z.B. IFNγ durch NKZellen und IFNα durch dendritische Zellen. STAT1 führt zur Aktivierung des Transkriptionsfaktors
T-bet, dem Hauptregulator der TH1-Zelllinie (Szabo et al. 2000). T-bet führt zur Expression von
Faktoren wie IFNγ, IL-12R und anderen, die in einer Rückkopplungsschleife die Zellentwicklung in
TH1-Richtung befördern und im Gegenzug TH2-assoziierte Faktoren unterdrücken (Weaver et al.
2006). Daneben scheinen auch T-Zellaktivierungswege unabhängig von T-bet zu existieren (Way et
al. 2004).
TH2-Zellen entwickeln sich über die gemeinsame Aktivierung des TCR zusammen mit dem IL-4Rezeptor IL-4R via Signalgebung durch STAT6. Dies resultiert in Aktivierung des TH2Hauptregulators GATA-3 (Zheng 1997). GATA-3 programmiert die T-Zelle in Richtung eines
Produzenten von IL-4, IL-5 und IL-13 und unterdrückt Faktoren wie STAT4, die kritisch sind für
16
die Entwicklung in Richtung TH1. Beispielhaft für die Ausschließlichkeit der T-HelferzellRichtungen hemmt IL-4 die Kolokalisierung des TCR und IFNγ-Rezeptors an der immunologischen
Synapse zwischen naiven CD4+ Zellen und aktivierten APC und überführt die Zelle damit in
Richtung TH2 (Maldonado et al. 2004).
TH1-Zellen gelten als kritisch für die Elimination intrazellulärer Mikroorganismen, wohingegen
TH2-Zellen eine wichtige Rolle in der Abwehr extrazellulärer Pathogene, unter anderem
Helminthen, zukommt. TH2-Zellen gelten überdies als wichtige Zellen in der Entstehung
allergischer
Erkrankungen.
Dysregulierten
Reaktionen
von
TH1-Zellen
wurden
viele
autoimmunologische Phänomene zugeordnet (Zhu et al. 2008). Beide Zellen sind entscheidend
beteiligt an der Aktivierung von B-Zellen und an der Induktion des Klassenwechsels zwischen den
verschiedenen Immunglobulin-Familien (engl., T-helper cells, T H) (Murphy et al. 2008).
1.3.2 TH17-Zellen und regulatorische T-Zellen
Das TH1/TH2-Paradigma wurde zunehmend erweitert durch die Entdeckung zusätzlicher
Entwicklungswege für naive, postthymische CD4+ Zellen, zum einen IL-17-produzierende TH17Zellen, zum anderen eine Reihe CD4+FOXP3+ Zellen, die regulatorisch und suppressiv auf die
Funktionen von Effektor-T-Zellen wirken (Sakaguchi 2000). Diese letzteren Zellen exprimieren
konstant die hochaffine Komponente des IL-2-Rezeptors CD25. Das Fehlen dieser regulatorischen
T-Zellen ist assoziiert mit der Ausbildung schwerer Autoimmunerkrankungen wie dem IPEXSyndrom des Menschen (Immundysregulation, Polyendokrinopathie, Enteropathie, x-chromosomal)
(Bennett et al. 2001).
Regulatorische T-Zellen, die ihre Zelllinien-spezifische Ausreifung adaptiv postthymisch erhalten,
werden unter der Bezeichnung iTreg (engl., inducible regulatory T cells, iTreg) zusammengefasst.
Sie werden von denjenigen regulatorischen T-Zellen abgegrenzt, die sich bereits intrathymisch
entwickeln (engl., natural regulatory T cells, nTreg) (Weaver et al. 2006).
nTreg scheinen bevorzugt in T-Zellzonen sekundärer lymphatischer Organe zu wirken, wo sie die
Ausreifung naiver CD4+ T-Zellen in eine jeweilige Effektorzelllinie vorab unterbinden. Ihr Erhalt ist
abhängig vom Angebot an IL-2 (Chen et al. 2008).
iTreg entwickeln sich aus naiven CD4+ T-Zellen in der Peripherie des Organismus parallel zur
17
Entwicklung von Effektor-T-Zellen. Mindestens zwei Zelllinien werden heute zu den iTreg
gerechnet. Tr1-Zellen zeichnen sich durch hohe Produktion von IL-10 aus. Ihnen fehlt die
Expression des Transkriptionsfaktors FOXP3. FOXP3+ iTreg unterscheiden sich kaum in ihren
Effektorfunktionen von nTreg (Bettelli et al. 2006). Ob weitere Treg-Linien existieren oder einzelne
Zelltypen unterschiedliche Aktivierungsstadien eines gemeinsamen Vorläufers darstellen, ist
Gegenstand aktueller Diskussion (Korn et al. 2009).
TGFβ1 induziert den für Treg spezifischen Transkriptionsfaktor FOXP3 und ist notwendig für den
Erhalt von peripheren iTreg. IL-6, welches im Rahmen akuter entzündlicher Prozesse freigesetzt
wird, unterbindet die Differenzierung von iTreg und befördert stattdessen die Polarisierung in
Richtung TH17 (Korn et al. 2009).
Die Differenzierung von TH17-Zellen geschieht in großem Maße exklusiv und in Abgrenzung zu
den Differenzierungswegen von TH1- respektive TH2-Zellen sowie von Treg. Wohingegen alle drei
vorgenannten Zelltypen in ihrem peripheren Erhalt abhängig sind von IL-2, gilt dies nicht für
TH17-Zellen; vielmehr inhibiert IL-2 die Expression von IL-17A. IL-2-/-, IL-2Rα-/- und IL-2Rβ-/Mäuse zeigen eine Prädisposition zu Autoimmunerkrankungen bei erhöhter IL-17-Aktivität und
reduzierter Anzahl an Treg (Fontenot et al. 2005). IL-2 bewirkt via STAT5 eine direkte Aktivierung
der Genexpression von FOXP3 (Yao et al. 2007) (Burchill et al. 2007). Die Effektorzytokine der
TH1 und TH2-Zelllinien, IFNγ, IL-12 und IL-4, sowie IL-2, IL-27 und Retinolsäure inhibieren die
Entwicklung von TH17-Zellen (Harrington et al. 2005).
RORγt ist der Zelllinien-definierende Transkriptionsfaktor für TH17-Zellen (Ivanov et al. 2007).
RORγt-defiziente Mäuse zeigen reduzierte Ausdifferenzierung von TH17-Zellen und eine reduzierte
Krankheitslast im Modell der EAE (engl. experimental autoimmune encephalitis, EAE) (Ivanov et
al.
2006).
Interessanterweise
zeigen
Mäuse,
denen
die
Expression
von T-bet,
dem
liniendefinierenden Transkriptionsfaktor für TH1-Zellen fehlt, eine verstärkte Polarisierung naiver
CD4+ T-Zellen in Richtung von IL-17-Produzenten.
Neben RORγt ist STAT3 unabdingbar für die Entwicklung von TH17-Zellen. Selektive
Ausschaltung von STAT3 in T-Zellen verhindert die Ausbildung von TH17-Zellantworten und die
Überexpression eines konstitutiv aktiven STAT3 fördert die Differenzierung von TH17-Zellen
(Acosta-Rodriguez et al. 2007). Deletion von STAT3 verhindert darüber hinaus die Entwicklung
von Autoimmunpathologie in einer Reihe experimenteller Modelle (Harris et al. 2007). STAT3
18
entfaltet seine Wirkung über direkte Interaktion mit dem IL-17A-Genlokus sowie mit der IL-21Promotorregion (Wei et al. 2007). SOCS3 dient als negativer Regulator von STAT3 (Chen et al.
2006). IL-6, IL-21 und IL-23 führen zur Aktivierung von STAT3 in T-Zellen. Die Expression des
IL-23-Rezeptors IL-23R, die durch IL-6 und IL-23 gefördert wird, ist abhängig von STAT3(Nurieva
et al. 2007) (Zhou et al. 2007). IRF4 ist ein positiver Regulator der Differenzierung von TH17Zellen. IRF4-/- Mäuse zeigen sich resistent gegen die Ausbildung von EAE. Der Einsatz von IRF4
siRNA reduziert die Wirksamkeit von TGFβ1 und IL-6 in Bezug auf die IL-17-Produktion (Brüstle
et al. 2007). Neuere Arbeiten zeigen darüber hinaus die besondere Rolle des Signalmoleküls
SMAD2 in der differenzierten Entwicklung von TH17-Zellen aus einem naiven CD4+ T-Zell-Pool
nach Wirkung von TGFβ1 (Martinez et al. 2010) (Malhotra et al. 2010).
Abb. 1: Differenzierung von CD4+ T-Zellen. Naive CD4+CD25- T-Zellen sind multipotente Vorläuferzellen,
die sich unter dem Einfluss jeweiliger Zytokine in Richtung T H1, TH2, Treg oder TH17 polarisieren können.
Gezeigt sind im Übrigen Zelllinien-definierende Transkriptionsfaktoren und Effektorzytokine von TH17.
19
1.4 Zytokine
1.4.1 Allgemeines
Zytokine sind lösliche Proteine, die von einer breiten Vielfalt an Zellen auch außerhalb des
Immunsystems sezerniert werden können und mannigfaltige Wirkungen an umgebenden oder
entfernten Zellen entfalten. Manche Zytokine wirken in autokriner Schleife auf die produzierende
Zelle selbst zurück. Viele Zytokine, die Prozesse von Zellen des Immunsystems beeinflussen, sind
unter der Bezeichnung Interleukine zusammengefasst. Interleukine sind unter anderem entscheidend
in die Polarisierung und den Erhalt von T-Zelllinien involviert (Murphy et al. 2008).
1.4.2 Interleukin-17
Interleukin-17 (IL-17) wurde zuerst 1993 von Rouvier et al. unter der Bezeichnung CTLA8
beschrieben (Rouvier et al. 1993). In der Folge wurde IL-17 als Teil einer in weiten Teilen
homologen, sechsköpfigen Familie von Zytokinen erkannt und ergänzend in IL-17A, in
Abgrenzung zu IL-17B-F, umbenannt. Murines und humanes IL-17 sind sowohl genetisch als auch
strukturell signifikant konserviert (Moseley 2003). IL-17A ist Prototyp der IL-17-Familie und tritt
auf in Form eines Disulfidbrücken-verbundenen, homodimeren Glykoproteins von 155
Aminosäuren Länge (Yao, Painter, et al. 1995). Es entfaltet seine Wirkung maßgeblich über den
Rezeptor IL-17R (Untertypen IL-17RA und IL-17RC), ein transmembranöses Protein mit einer 293
Aminosäuren-langen
extrazellulären
Domäne,
einem
21
Aminosäuren-langen
Transmembranabschnitt und einem intrazytoplasmatischen Schwanz von 525 Aminosäuren Länge
(Yao, Fanslow, et al. 1995). Dieser Rezeptor besitzt weite Verbreitung auf Lymphozyten,
Gefäßendothelien, Epithelien, Fibroblasten, Osteoblasten, Mesothelzellen und Zellen des
Knochenmarks (Kolls et al. 2004). IL-17 besitzt weite genetische Homologie mit der Sequenz des
T-lymphozytotrophen Herpesvirus Saimirii (HSV13), dessen Genprodukt deshalb als virales IL-17
(vIL-17) bezeichnet wird (Yao, Fanslow, et al. 1995). IL-17 führt zwar zur Aktivierung von NF-κB
via TRAF-6 und der MAPK (engl., mitogen-activated Proteinkinase, MAPK) und interagiert mit
dem Adapterprotein Act1, die genaue Kaskade der Signalgebung durch IL-17R ist jedoch bisher
noch nicht bekannt (Korn et al. 2009).
IL-17, zunächst exklusiv als Produkt aktivierter T-Zellen aufgefasst (Moseley 2003), wird in der Tat
neben CD4+ T-Zellen auch von einer Reihe weiterer Zellen exprimiert. Zu diesen Zellen gehören
20
CD8+CD45RO+ Gedächtnis-T-Zellen, neutrophile und eosinophile Granulozyten, Monozyten und
Macrophagen sowie NKT-Zellen, NK-Zellen und γδ-T-Zellen (Molet et al. 2001) (Ferretti et al.
2003) (Liu et al. 2007) (Lockhart et al. 2006) (Zhou et al. 2005). Damit wird IL-17 sowohl von
Zellen der angeborenen wie auch der erworbenen Immunität produziert, was verbindende Funktion
dieser beiden Bereiche des Immunsystems durch IL-17 nahe legt (Korn et al. 2009). Die
Entdeckung von IL-17 legte die Grundlage der Definition von CD4 + TH17-Zellen als eigenständiger
Zelllinie unabhängig von T H1- und TH2-Zellen.
IL-17A ist ein proinflammatorisches Zytokin, dass in seinen Zielzellen die Expression
unterschiedlicher inflammatorischer Zytokine wie TNF, IL-1β, IL-6, GM-CSF, G-CSF, Chemokine
wie CXCL1, CXCL8, CXCL10 und Metalloproteinasen bewirkt (Korn et al. 2009). IL-17 bewirkt
die Aktivierung, Rekrutierung und Migration von Neutrophilen und trägt zur strukurellen und
funktionellen Ausformung von Keimzentren in Lymphfollikeln bei (Kolls et al. 2004) (Korn et al.
2009).
IL-17F steht IL-17A innerhalb der IL-17-Familie strukturell und funktionell am nächsten. IL-17F
existiert in zwei Isoformen mit einer Homologie von 55% respektive 40% zu IL-17A (Kolls et al.
2004). Im Unterschied zu den anderen Mitgliedern der IL-17-Familie liegen die Gene von IL-17A
und IL-17F gemeinsam mit einem Abstand von 46050 Basenpaaren auf dem murinen Chromosom 1
respektive Chromosom 6 beim Menschen. IL-17F wird von denselben Zellen exprimiert, die auch
zur Expression von IL-17A befähigt sind und führt zu vergleichbaren Reaktionen bei seinen
Zielzellen. Auch IL-17F bindet den Zielrezeptor IL-17RA, jedoch mit geringerer Affinität als IL17A (Moseley 2003).
Im Unterschied zu den vorgenannten IL-17A und IL-17F besitzen die übrigen Mitglieder der IL-17Familie nicht nur zunehmende Variation ihrer Proteinstruktur, sondern unterscheiden sich ebenfalls
deutlich in den jeweiligen Ursprungszellen und der Wirkung auf entsprechende IL-17-Rezeptoren
(Kolls et al. 2004).
IL-17A wirkt protektiv besonders an mucosalen Grenzflächen und gegen Pathogene, gegenüber
welchen TH1- und TH2-Antworten alleine nicht suffizient erscheinen (Korn et al. 2009). IL-17A
bewirkt die Rekrutierung von Neutrophilen gegen Infektionen mit Klebsiella pneumoniae (Aujla et
al. 2008). IL-17A verstärkt die bakterizide Aktivität von Makrophagen im Rahmen einer Infektion
mit Bordetella pertussis (Higgins et al. 2006). IL-17A und F tragen über die Rekrutierung von
21
Neutrophilen zur Abwehr der Infektion mit Mycoplasma pneumoniae in Mäusen bei (Wu et al.
2007). Während der Infektion mit Mycobakterium tuberculosis fördert IL-17 über die Expression
von Chemokinen die Infiltration protektiver IFN-γ-produzierender TH1-Zellen (Khader et al. 2007).
IL-17A-defiziente Mäuse zeigen eine Prädisposition zur Infektion mit Candida albicans und die
Injektion von IL-17A führt im Gegenzug zum Schutz vor letalen Dosen dieses Pathogens (Huang et
al. 2004). Innerhalb eines humanen T-Gedächtniszell-Pools findet sich eine hohe Dichte an Zellen
mit Candida-spezifischen TCR.
In
vielen
Szenarien
führt
IL-17
jedoch
zu
überschießender
Inflammation
und
Autoimmunpathologie.
Im Rahmen der experimentellen autoimmunen Enzephalomyelitis (engl., experimental autoimmune
encephalomyelitis, EAE), welche als murines Modell der menschlichen multiple Sklerose (MS)
dient, zeigen IL-17A-defiziente Mäuse mit erhaltener IL-17F-Produktion eine mildere
Krankheitsausprägung (Komiyama et al. 2006). Antikörper spezifisch gegen IL-17A schwächen
EAE ab, beseitigen sie jedoch nicht vollständig (Hofstetter et al. 2005). IL-17 findet sich
hochgradig in chronischen Multiple-Sklerose-Herden des Menschen und wird dort exprimiert
durch CD4+ und CD8+ T-Zellen sowie Astrozyten (Tzartos et al. 2008). Als Folge der Produktion
von IL-17 und IL-22 sind menschliche TH17-Zellen in der Lage, die Blut-Hirn-Schranke zu
überqueren, um in der Folge intrazerebralen Neuronenuntergang und Entzündung zu fördern (Kebir
et al. 2007). Mäuse mit einem kombinierten Defizit in der Produktion von IL-17A und IL-17F
zeigen eine signifikant reduzierte Schwere der EAE (Yang, Chang, et al. 2008). IL-17F-defiziente
Mäuse mit normaler Expression von IL-17A zeigen eine dezent mildere Form der EAE. Jedoch
findet sich in diesen Tieren bei einem Modell bronchialer Hyperreagibilität eine vermehrte
Infiltration von Eosinophilen bei ausgeprägt reduzierter Einwanderung von Neutrophilen (Yang,
Chang, et al. 2008).
Die inflammatorische Hauterkrankung von Mäusen, ein experimentelles Modell der menschlichen
Psoriasis vulgaris, stellt ein weiteres Beispiel für pathologische Reaktionen von TH17-ZellEffektorfunktionen dar. In psoriatischen Läsionen finden sich höhere Zahlen an T H17-Zellen als an
TH1-Zellen (Lowes et al. 2008). Zielgerichtete anti-TNF-Therapie der Psoriasis wirkt über die
Verminderung der Anzahl an TH17-Zellen (Lowes et al. 2008).
Am Beispiel chronisch-entzündlicher Darmerkrankungen (engl., inflammatory bowel disease, IBD)
22
ist die Rolle von IL-17 weniger klar. TH17-Zellen haben größere Potenz zur Initiierung von IBD als
TH1-Zellen (Elson et al. 2007). Die Blockade von IL-17A in IBD IL-10-defizienter Mäuse
verhindert nicht die Krankheitsentwicklung, es sei denn auch IL-6 wird ausgeschaltet (Yen et al.
2006). Therapie mit einem anti-IL-17A-Antikörper führt jedoch zu einer Verstärkung der DSSinduzierten Colitis, einem experimentellen murinen Modell zum Studium menschlicher IBD
(Ogawa et al. 2004). In diesem Fall scheint IL-17A eine protektive Rolle zuzukommen, wohingegen
IL-17F die Krankheitsausprägung verstärkt.
1.4.3. Interleukin-6
Interleukin-6 (IL-6) wurde 1986 als Faktor zur Regulation von B-Zell-Funktionen entdeckt (Yang,
Chang, et al. 2008). Jedoch ist es ein pleiotropes Zytokin, dass von einer Reihe Zellen des
Immunsystems wie DC und Makrophagen sowie non-hämatopoietischen Zellen wie Fibroblasten
produziert wird (Kamimura et al. 2003). IL-6 gilt als proinflammatorisches Zytokin, dem eine
entscheidende Rolle in der Pathogenabwehr während Infektionen sowie im Rahmen von
Gewebsschädigungen bei entzündlichen und autoimmunologischen Erkrankungen wie MS
zukommt (Dienz et al. 2009). In jüngerer Zeit wurde IL-6 als Faktor in der Regulation von T-ZellAntworten definiert (Dienz et al. 2009).
Die Produktion von IL-6 wird induziert als Antwort auf eine Reihe von Stimuli wie TNFα, IL-1,
LPS und PDGF (Kamimura et al. 2003). Es entfaltet seine Wirkungen einerseits über den
membranständigen Rezeptor IL-6R, der einen Komplex mit gp130 bildet, andererseits über
Bindung an den löslichen IL-6-Rezeptor sIL-6R – ein Prozess, der als trans signaling bekannt ist
(Scheller et al. 2006). Nachgeschaltet ist eine Kaskade von Kinasen wie JAK1, JAK2 und TYK2,
die unter anderem zu einer Aktivierung des Transkritionsfaktors STAT3 führen (Heinrich et al.
2003).
IL-6 bewirkt die hepatische Produktion von akute Phase Proteinen und reguliert Proliferation,
Funktion Überleben von T-Zellen (Dienz et al. 2009). Es ist involviert in die Ausreifung naiver
CD4+ T-Zellen, indem es einerseits den TH2-Differenzierungsweg befördert (Rincon 1997). In
jüngerer Zeit wurde die zentrale Rolle von IL-6 in der Ausdifferenzierung von T H17-Zellen sowie
ein potentieller Beitrag zur Polarisierung eines neuen Zelltyps Tfh (engl., T follicular helper cells,
Tfh) erkannt (Zhou et al. 2007) (King et al. 2008).
23
1.4.4 Transforming Growth Factor
Die TGF-Familie umfasst eine Reihe von Zytokinen, unter ihnen die TGFβ-Gruppe, zu der
wiederum TGFβ1, TGFβ2 und TGFβ3 gerechnet werden (Massagué 1990). Die einzelnen Vertreter
dieser Familie sind strukturell eng miteinander verwandt und bestehen in ihrer aktiven Form aus
einem 12kD Polypeptid, das aus jeweils größeren Vorläuferpeptiden prozessiert wurde (Massagué
1990).
TGFβ1 ist ein 25kD großes, Disulfidbrücken-verbundenes, dimeres Peptid, dass nach Sekretion in
Bindung an das Peptid LAP (engl., latency-associated peptide, LAP) innerhalb der extrazellulären
Matrix vorliegt (Roberts 1981). TGFβ1 entfaltet seine Wirkung nach Abspaltung von LAP an einem
breiten Spektrum an Vorläuferzellen, Stammzellen sowie ausdifferenzierten Zelltypen. TGFβ1 wirkt
über die Aktivierung eines heteromeren, Serin-Threonin-Kinasen-gekoppelten Zelloberflächenrezeptors, der sich aus dem TGFβ-Rezeptor Typ I, Typ II und Typ III zusammensetzt. CD105 wirkt
als Ko-Rezeptor (Feng et al. 2005).
TGFβ1 ist ein pleiotroper, pluripotenter Wachstumsfaktor, der in Prozesse des Zellwachstums und
der Zelldifferenzierung, in Apoptose, Zellmobilität, Produktion extrazellulärer Matrix, Angiogenese
und zelluläre Immunität involviert ist (Dumont et al. 2003). Neuere Arbeiten demonstrieren die
Rolle von TGFβ1 in der Tumorgenese sowie als immunsuppressives Zytokin in entzündlichen
Vorgängen (Kelly et al. 2010). TGFβ1 kann die Aktivität von NK-Zellen unterdrücken, die
Proliferation von T-Lymphozyten sowie deren Differenzierung und Funktion inhibieren, die
Produktion von Zytokinen reduzieren und die Reifung von dendritischen Zellen blockieren (Mulé et
al. 1988). Die immunsuppressive Rolle von TGFβ1 wird dadurch unterstrichen, dass der
Wachstumsfaktor entscheidend ist für die Polarisierung von regulatorischen T-Zellen (Sakaguchi
2000). Umso erstaunlicher erscheint, dass TGFβ1 zusammen mit IL-6, welches ein nahezu
oppositionelles Wirkprofil zu TGFβ1 besitzt, für die Generierung des proinflammatorischen
Zelltyps der TH17-Zellen verantwortlich ist (Mangan et al. 2006).
24
1.5 Bakterielle kapsuläre Polysaccharide
1.5.1 Allgemeines
Die meisten pathogenen Bakterien exprimieren hochmolekulare Polysaccharide, die ihre Oberfläche
in Form einer Kapsel ummanteln. Für das Bakterium Streptococcus pneumoniae wurden allein mehr
als 90 unterschiedliche Kapsel-Polysaccharide identifiziert (Avci et al. 2010). Polysaccharidkapseln
gewähren pathogenen Bakterien Schutz vor der Phagozytose durch Zellen der angeborenen
Immunität, zum Beispiel durch eine erschwerte Bindung von Opsoninen des Komplementsystems
(Murphy et al. 2008). Entscheidend für die Elimination von kapseltragenden Bakterien sind
demnach Effektormechanismen des adaptiven Immunsystems, namentlich die Ausbildung
Polysaccharid-spezifischer Antikörper (Kindt et al. 2007). Strukturelle Unterschiede der jeweiligen
Polysaccharide wie Unterschiede in der Abfolge der Kohlenhydrate, räumliche Konformation und
elektrostatische Ladung können in unterschiedlichen Antworten des Immunsystems resultieren
(Ovodov 2006).
Impfung mit bakteriellen Polysacchariden ist ein lange praktiziertes Verfahren, um protektive
Immunantworten präventiv zu vermitteln (Macleod et al. 1945). Die meisten bakteriellen
Polysaccharide sind T-Zell-unabhängige Antigene, die die Produktion von IgM-Antikörpern mit nur
geringem Klassenübergang zu IgG induzieren. Sie versagen in der Erzeugung einer langanhaltenden
Immunantwort, wenn sie in purer Form appliziert werden, da sie es nicht vermögen, den adaptiven
Arm des Immunsystems entsprechend zu aktivieren (Lesinski et al. 2001). Dies gilt in besonderem
Maße im Falle von Kleinkindern und geriatrischen Patienten sowie Mäusen (Barrett 1985). Auf der
Basis des Hapten-Carrier-Modells wird die Immunogenität bakterieller Polysaccharide dadurch
erhöht, indem sie in sogenannten Glykokonjugatimpfstoffen an Peptide gekoppelt werden
(Mitchison 1971). Über die Vermittlung dieser Peptide induzieren diese Polysaccharide eine
ausreichende T-Zellantwort sowie ein lang anhaltendes immunologisches Gedächtnis mit IgGAntikörpern und T-Gedächtniszellen (Trotter et al. 2008).
1.5.2 Zwitterionische Polysaccharide
Wohingegen
die
meisten
bakteriellen
Polysaccharide
entweder
positive
oder
negative
Ladungsmuster tragen, existiert eine Gruppe von Polysacchariden, die sich durch das parallele
Vorhandensein von positiven (freie Aminogruppen) und negativen Ladungen (Carboxyl- oder
25
Phosphatgruppen) innerhalb der repetitiven Struktur des Gesamtmolekül auszeichnen (Cobb et al.
2005). Diese Polysaccharide werden als zwitterionische Polysaccharide (engl., zwitterionic
polysaccharides, ZPS) bezeichnet. Zu den ZPS zählen die Polysaccharide Typ 5 und Typ 8 (CP5
und CP8) von Staphylococcus aureus (Tzianabos et al. 2001), PSA von Bacteroides fragilis 638R
und NCTC 9343 (Wang et al. 2006)(Tzianobos et al. 1993) und das Typ 1 Polysaccharid Sp1 von
Streptococcus pneumoniae (Velez et al. 2009).
Abb. 2: Struktur von Sp1, modifiziert nach (Avci et al. 2010). Trisaccharid-Einheiten aus
zwei
Galakturonsäuren
und
einer
Galaktose
(2-Acetamid-4-Amino-2,4,6-
Tridesoxygalaktose) in sich wiederholender Abfolge bilden das Grundgerüst. Jede
Trisaccharid-Einheit mit einer positiv geladene Aminogruppe und zwei negativ geladenen
Carboxylgruppen hat ein Molekulargewicht von 537 D (Stroop 2002).
Das exklusive Ladungsmuster der ZPS ist maßgeblich verantwortlich für ihre besondere
immunologische Aktivität, nämlich die Fähigkeit, T-Zellen in Abwesenheit von Trägerproteinen
über Bindung an MHC-II zu aktivieren (Tzianabos et al. 1993) (Cobb et al. 2004) (Duan et al.
2008). Versuche, die nach Einfügung zwitterionischer Ladungsmotive in anionische Polysaccharide
für diese so modifizierten Polysaccharide ein ähnliches Reaktionsmuster wie für natürlich
vorkommende ZPS nachweisen konnten, unterstreichen diese Bedeutung (Gallorini et al. 2007).
ZPS werden in Endosomen von APC in Moleküle einer Größe von 10 bis 15 kD depolymerisiert
und in dieser Form an MHC-II transferiert (Velez et al. 2009). Ausschaltung entweder der positiven,
z.B. mittels N-Acetylierung, oder negativen Ladungsfraktion, wie z.B. durch CarbodiimidReduktion, führt zum Ausbleiben der T-Zell-Aktivierung via MHC-II (Tzianabos et al. 1993) (Cobb
et al. 2004). Die so chemisch modifizierten ZPS werden zwar noch durch APC in Endosomen
aufgenommen, jedoch nicht mehr an der Zelloberfläche präsentiert (Cobb et al. 2008). Noch ist
26
unklar, ob das zwitterionische Ladungsmotiv notwendig ist allein für die elektrostatische Bindung
an MHC-II oder ob die dreidimensionale Struktur die MHC-II-Bindung bedingt (Avci et al. 2010).
Bisherige Untersuchungen zur dreidimensionalen Struktur von ZPS zeigen, dass Sp1 und PSA trotz
ihrer Primärstruktur aus unterschiedlichen Monosacchariden beinahe identische räumliche
Konformation besitzen (Choi et al. 2002) (Wang et al. 2000). Diese Struktur ist eine ausgedehnte,
rechts gedrehte Helix mit einem Windungsabstand von 20Ǻ. Eine Drehung wird durch die Abfolge
von acht Monosacchariden gebildet. Positive und negative Ladungen alternieren in der Abfolge und
sind exponiert auf der äußersten Oberfläche der Helix. Sp1 und PSA tragen beide ihre positiven
Ladungen in Form der Aminogruppen in äquidistantem Abstand von 15Ǻ (Choi et al. 2002). Rein
positiv geladene ZPS wie auch rein negative oder neutrale zeigen alle keine Ausbildung einer
helikalen Grundstruktur (Kreisman et al. 2007). Diese dreidimensionale Form erscheint zunehmend
zentral im Verständnis der Bindung von ZPS an MHC-II (Avci et al. 2010). Fragmente von ZPS
zeigen dann optimale Bindung, wenn sie prozessiert mit einem Molekulargewicht von 3 bis 30kD
vorliegen (Kreisman et al. 2007).
Darüber hinaus scheint das zwitterionische Ladungsmotiv wesentlich über elektrostatische
Wechselwirkungen zur Bindung an MHC-II beizutragen. Cobb et al. konnten zeigen, dass diese
Wechselwirkungen durch Zugabe von NaCl und Änderungen des pH-Wertes beeinflussbar sind
(Cobb et al. 2008). Dies impliziert, dass die Prozessierung und Bindung von ZPS an MHC-II im
Endosom pH-abhängig in saurem Milieu erfolgt.
27
Abb.
3:
Dreidimensionale
Konformation von ZPS. Sp1 (dunkel)
und PSA (hell) wurden anhand ihrer
Aminogruppen
übereinander
projiziert. Kugeln stellen positive
Ladungen dar. Beide ZPS zeigen eine
ähnliche Konformation mit einem
Abstand von 15Ǻ zwischen den
Ladungen (modifiziert nach (Avci et
al. 2010)
28
1.5.3 T-Zell-Aktivierung durch ZPS
Sogenannte Superantigene viralen oder bakteriellen Ursprungs wie die StaphylokokkenEnterotoxine (SE) sind in der Lage eine Aktivierung von T-Zellen herbeizuführen, ohne in APC zu
Peptidfragmenten in MHC-Bindung prozessiert zu werden. In der Tat zerstört eine biochemische
Modifikation die immunologische Aktivität von Superantigenen. Superantigene binden nicht
innerhalb des Antigen-bindenden Spalts, sondern vielmehr unabhängig an die äußere Oberfläche
von TCR und MHC-II und führen über diesen andersartigen Mechanismus zu einer Aktivierung von
bis zu 20% des gesamten T-Zellpools (Murphy et al. 2008).
ZPS wirken nicht als Superantigene (Avci et al. 2010). Für das ZPS PSA beispielsweise konnte
gezeigt werden, dass es entsprechend einem Peptidantigen in einem stöchiometrischen Verhältnis
von 1:1 in Bindung mit HLA-DR2 tritt, wohingegen das Superantigen SE-A ein Bindungsverhältnis
von 1-2:1 aufweist (Cobb et al. 2008). Hierbei ist nicht geklärt, ob PSA sowohl innerhalb als auch
außerhalb des Antigen-bindenden Spalts an MHC-II bindet oder ob die Bindungen Änderungen der
Konformation von MHC-II auslösen. Klärende kristallografische Untersuchungen hierzu konnten
bislang aufgrund technischer Schwierigkeiten nicht durchgeführt werden (Avci et al. 2010).
Die Prozessierung von ZPS ähnelt in weiten Teilen derjenigen von Peptidantigenen (Cobb et al.
2004). ZPS werden hierzu durch professionelle Antigen-präsentierende Zellen (APC) wie
dendritischen Zellen, Makrophagen oder B-Zellen endozytotisch aufgenommen (Duan et al. 2008)
(Mazmanian et al. 2005). Es wird vermutet, dass diesem Prozess ein Rezeptor-unabhängiger
Mechanismus vergleichbar der Makropinozytose zugrunde liegt (Avci et al. 2010). Im Endosom
erfolgt eine Fragmentierung des Polysaccharids (Velez et al. 2009) (Duan et al. 2008). Diese
chemische Degradation erfolgt jedoch in Ermangelung spezifischer depolymerisierender Enzyme
und Resistenz gegenüber eukaryotischen Glucosidasen Enzym-unabhängig. Es konnte gezeigt
werden, dass die Prozessierung im Endosom über die Vermittlung reaktiver Stickstoffspezies wie
NO erfolgt (Duan et al. 2008). Hierzu bedarf es freier Aminogruppen im ZPS-Molekül. NAcetylierung der Aminogruppen verhindert die Desaminierung und damit die Prozessierung (Vilar
et al. 1997). iNOS-/- Mäuse, denen das Enzym zur Produktion von NO fehlt, zeigen nach
intraperitonealer Injektion von PSA keine Ausbildung von Abszessen und keine DC-vermittelte TZell-Aktivierung (Duan et al. 2008).
Im Anschluss verschmelzen die Endosomen, die die prozessierten ZPS-Fragmente von circa 15 kD
29
Größe enthalten, mit Lysosomen und exozytotischen Vesikeln aus dem Golgi-Apparat. Diese so
geformten sogenannten MIIC-Vesikel enthalten freies ZPS, Kathepsin sowie membrangebunden
HLA-DR, HLA-DM und lysosome-associated membrane proteine 1 (LAMP1). Unter Vermittlung
von HLA-DM kommt es zur Dissoziation von HLA-DR und CLIP und der Bindung des ZPS an den
MHC-II-Komplex. Dieser Vorgang verlangt ein saures Milieu. HLA-DM stabilisiert vorübergehend
das von CLIP getrennte MHC-II-Molekül, welches ansonsten dissoziieren würde. HLA-DM ist für
den Ablauf der Prozessierung von ZPS essentiell. So zeigen beispielsweise HLA-DM-/- Mäuse
reduzierte Entwicklung von Abszessen nach intraperitonealer Injektion von ZPS (Stephen et al.
2006) (Cobb et al. 2008). ZPS gebunden an MHC-II werden auf der Oberfläche von APC
präsentiert (Stephen et al. 2006) (Duan et al. 2008). Dort tritt der ZPS-MHC-II-Komplex in
Bindung mit dem αβ-TCR auf T-Zellen.
ZPS-spezifische T-Zell-Klone scheinen Kreuzreaktivität zwischen unterschiedlichen ZPS zu zeigen
(Stingele et al. 2004). Sie führen darüber hinaus zu einer nachweisbaren Induktion von GedächtnisT-Zellen sowie zu einer oligoklonalen Expansion von T-Zellen mit einem nicht-restringierten
Repertoire an Vβ-Ketten des TCR. Superantigene im Gegenzug würden zu einer polyklonalen
Antwort innerhalb einer limitierten Anzahl bestimmter TCR BV Familien führen (Groneck et al.
2009).
1.5.4 Bedeutung der T-Zell-Aktivierung durch ZPS
In Interaktion mit dem Immunsystem kommt ZPS einerseits eine proinflammatorische, unter
besonderen Bedingungen aber auch eine immunomodulatorische-immunsuppressive Rolle zu. Die
Grundlage dieses sich scheinbar widersprechenden Verhaltens ist bislang noch nicht vollends
verstanden (Tzianabos 2003) (Avci et al. 2010) (Mertens et al. 2009).
In einem Modell peritonealer Sepsis führen ZPS nach intraperitonealer Injektion zusammen mit
dem Adjuvans SCCA zur Ausbildung intraabdomineller Abszesse (Onderdonk et al. 1977).
SCCA imitiert den Übertritt von Darminhalt wie er im Rahmen einer sekundären Peritonitis
angetroffen wird und schafft ein proinflammatorisches Milieu über die Ausschüttung von TNFα und
IL-1b durch ortsständige Macrophagen (Gibson 1997) (Tzianabos, Chandraker, et al. 2000). Dies
resultiert in einer vermehrten Expression von ICAM-I auf Mesothelzellen, was die Adhäsion von
polymorphonukleären Zellen (engl., polymorphonuclear cells, PMN) verbessert. SCCA führt nicht
30
zu einer vermehrten Ausschüttung von IFNγ.
T-Zellen sind entscheidend für die Abszessentwicklung (Shapiro et al. 1986). CD4+-defiziente
Mäuse bilden keine Abszesse aus. In diesem Modell kommt dem ko-stimulatorischen Signalpfad
CD28-CD86 (B7.2) eine zentrale Rolle zu (Tzianabos, Chandraker, et al. 2000) (Stephen et al.
2005). Dieser Pfad führt zu T-Zellproliferation und Sekretion von IL-2. Selektive Stimulation von
CD28 mit Hilfe eines monoklonalen Antikörpers führt zu verstärkter Ausbildung von Abszessen.
Dennoch wird IL-2 zusammen mit IL-10 und IFNγ auch eine Rolle im ZPS-induzierten Schutz vor
Abszessentwicklung zugeschrieben (Tzianabos et al. 1999).
Die subkutane Vorab-Injektion des Vollkeimes Bacteroides fragilis oder eines aufgereinigten ZPS
ohne zusätzliches Adjuvans vermittelt Schutz vor der Induktion intraabdomineller Abszesse
(Tzianabos, Chandraker, et al. 2000). Dieser Schutz erscheint T-Zell- und IL-10-vermittelt
(Tzianabos et al. 1999). In einem Fibrosemodell konnte gezeigt werden, dass ZPS zur Induktion
von IL-10-produzierenden CD4+CD45RBlo Zellen führen, die die Schwere der Fibrose reduzieren
(Ruiz-Perez et al. 2005). Dieser IL-10-vermittelte immunologische Schutz durch ZPS erstreckt sich
auch auf ein Modell chronisch-entzündlicher Darmerkrankung (Mazmanian et al. 2008).
Weitere Untersuchungen weisen auf eine Rolle von ZPS in der Entwicklung lymphatischer Organe
hin und zeigen, dass ZPS eine T H1/TH2-Dysbalance korrigieren und systemische T-Zell-Defizienz
beeinflussen können (Avci et al. 2010).
31
1.6 Fragestellung
Die Ausbildung intraperitonealer Abszesse im Rahmen einer sekundären Peritonitis ist behaftet mit
hoher Morbidität und Mortalität. Zwitterionische Polysaccharide wie Sp1 gehören zu einer neuen
Klasse MHC-II-abhängiger Antigene und führen in einem Mausmodell zusammen mit Adjuvans zur
Ausbildung von intraperitonealen Abszessen. CD4+ T-Zellen sind die zentralen Vermittler der
Abszessentstehung, wobei hierbei bisher die jeweiligen Rollen unterschiedlicher CD4 + T-Zelltypen
nicht eindeutig geklärt sind. Neben T H1- und TH2-Zellen wurde innerhalb der letzten Jahre eine neue
Untergruppe von IL-17-produzierenden CD4+ T-Zellen als eigenständige TH17-Zelllinie definiert.
TH17-Zellen
sind
involviert
in
einem
breiten
Spektrum
inflammatorischer
und
autoimmunologischer Prozesse. Verständnis der Mechanismen, die zu IL-17-vermittelter Pathologie
führen, kann zu potentiellen neuen therapeutischen Optionen in der spezifischen Behandlung und
Prävention von Entzündungen, Sepsis und Autoimmunerkrankungen führen. Wir wollen in dieser
Arbeit untersuchen, welche Bedeutung IL-17 und TH17-Zellen in der Abszessgenese durch Sp1
zukommt und welche Mechanismen zur Ausdifferenzierung einer Sp1-spezifischen T H17Effektorantwort führen.
32
2. Materialien
2.1 Geräte
Durchflusszytometer FACSCalibur
Becton Dickinson, Heidelberg, D
Pipettierhilfe acu
IBS Integra Biosiences, Fernwald, D
Schublehre Vernier Caliper
Asimeto Germany GmbH, Weißbach, D
ELISA Reader MRXtc
Dynex Technologies, Denkendorf, D
Microskop Axiovert 25
Carl Zeiss AG, Jena, D
Work-Bench Safe 2010 1,8
IBS Integra Biosciences, Fernwald, D
Work-Bench LaminAir HB 2448
Heraeus Instruments GmbH, Osterode, D
Pipetten Finipipette
Thermo Labsystems, Egelsbach, D
Vortexer Vortex Genie 2
Scientific Industries, New York City, USA
Zentrifuge Multifuge 3 S-R
Kendro Laboratory Products GmbH,
Langenselbold, D
Zentrifuge Heraeus Fresco 21
Thermo Electron Corporation, Egelsbach, D
Brutschrank Steri-Cycle CO2-Inkubator
ThermoLife Sciences, Egelsbach, D
Magnet MidiMACS Separator
Miltenyi Biotec GmbH, Bergisch-Gladbach
2.2 Verbrauchsmaterial
Kanülen Sterican 20G, 27G
B. Braun Melsungen AG, Melsungen, D
Zellscraper BD Falcon Cell scraper
BD Biosciences, Franklin Lakes, USA
Reagenzröhrchen BD Falcon Concical Tubes
BD Biosciences, Franklin Lakes, USA
Reagenzröhrchen
Greiner bio one GmbH, Frickenhausen, D
FACS Tubes
Sarstedt, Nümbrecht, D
Spritzen Discardit
BD Biosciences, Franklin Lakes, USA
Pipettenspitzen TipOne
StarLab, Ahrensburg, D
Pipettenspitzen
Sarstedt, Nümbrecht, D
Pasteurpipetten
Sarstedt, Nümbrecht, D
Zellkulturplatte Multidish 12
Nunc GmbH & Co. KG, Langenselbold, D
Elisa 96-Well-Plate MaxiSorb
Nunc GmbH & Co. KG, Langenselbold, D
Microliter-Aliquot-Gefäße SafeLock
Eppendorf GmbH, Wesseling-Berzdorf, D
MACS CD4+ T Cell Isolation Kit
Miltenyi Biotec GmbH, Bergisch-Gladbach, D
33
Trennsäule MACS Column LS
Miltenyi Biotec GmbH, Bergisch-Gladbach, D
TGF-beta1-ELISA
eBioscience, San Diego, USA
human/mouse TGF-beta1ELISA Ready-SET-Go!
IL-17-ELISA
eBioscience, San Diego, USA
mouse IL-17A ELISA Ready-SET-Go!
Zellsiebe
Sarstedt, Nümbrecht, D
2.3 Puffer und Lösungen
Wasser zu Injektionszwecken Aqua ad
Delta-Pharma GmbH, Pfullingen, D
injectabilia
Phosphate Buffered Saline (PBS), pH 7,2
Biochrom, Berlin, D
MACS-Puffer
PBS, 0,5% Bovine Serum Albumin (BSA),
2mM EDTA
Zellwasch-Puffer
PBS, 1mM EDTA, 1% LPS-free Fetal Bovine
Serum (FBS)
Histopaque-Puffer
PBS, 1mM EDTA
EasySep-Puffer
PBS, 1mM EDTA, 2% LPS-free Fetal Bovine
Serum (FBS)
FACS-Puffer
PBS, 10% Fetal Calf Serum (FCS)
Fixations-/Permeabilisationslösung
BD Biosciences, Franklin Lakes, USA
Cytofix/Cytoperm
Perm/Wash Puffer
BD Biosciences, Franklin Lakes, USA
Elisa Waschpuffer
eBioscience, San Diego, USA
PBS, 0,05% Tween-20
Trypan Blue Solution 0,4%
Sigma-Aldrich, Saint Louis, USA
34
2.4 Medien und Zusätze
Histopaque 1083
Sigma-Aldrich, Saint Louis, USA
RPMI 1640
Life-Technologies, Karlsruhe, D
Penicillin/Streptomycin (Pen/Strep)
Life-Technologies, Karlsruhe, D
Fetal Calf Serum (FCS)
Life-Technologies, Karlsruhe, D
Fetal Bovine Serum (FBS)
Life-Technologies, Karlsruhe, D
Bovine Serum Albumin (BSA)
Life-Technologies, Karlsruhe, D
murine Granulocyte-Macrophage-Colony-
Life-Technologies, Karlsruhe, D
Stimulating-Factor (mGMCSF)
BMDC-Medium
RPMI 1640, 5% FBS, 50µl betaMercaptoethanol, 10% Pen/Strep
T-Zell-Medium
RPMI 1640, 10% Fetal Calf Serum (FCS), 1%
Pen/Strep
Phorbol 12-Myristat 13-Acetat (PMA)
Sigma-Aldrich, Saint Louis, USA
Ionomycin
Sigma-Aldrich, Saint Louis, USA
Proteintransportinhibitor GolgiStop
BD Biosciences, Franklin Lakes, USA
Proteintransportinhibitor GolgiPlug
BD Biosciences, Franklin Lakes, USA
Lyophilisat der kapsulären Bestandteil von S.
American Type Culture Collection, Manassas,
pneumoniae Serotyp 1 (Sp1)
USA
Sterile Coecal Content Adjuvant (SCCA)
Eigenproduktion
35
2.5 Antikörper
2.5.1 FACS
Spezifität
Klon
anti-mouse CD11c HL3
Konjugat
Isotyp
Hersteller
PE
Ar Ham IgG1
BD Pharmingen,
(Integrin αxChain)
Franklin Lakes,
USA
anti-mouse IL-6
MP520F3
FITC
Rat IgG1
R&D Systems,
Minneapolis, USA
anti-mouse IL-17
TC11-18H10
PE
Rat IgG1
BD Pharmingen,
Franklin Lakes,
USA
anti-mouse CD4
RM4-5
APC
Rat IgG2a
(L3T4)
BD Pharmingen,
Franklin Lakes,
USA
anti-human LAP
27232
PE
Mouse IgG1
(TGF-β1)
anti-mouse
R&D Systems,
Minneapolis, USA
2.4G2
purified
Rat IgG2b
BD Pharmingen,
CD16/CD32 (Fc-
Franklin Lakes,
Block)
USA
anti-rat IgG1
FITC
Rat IgG1
isotype control
anti-mouse IgG1
isotype control
Serotec,
Düsseldorf, D
PE
Rat IgG1
BD Pharmingen,
Franklin Lakes,
USA
36
2.5.2 CD4+ T-Zell-Isolations-Kit
Spezifität
Konjugat
Isotyp
Hersteller
anti-CD8a
Biotin
Rat IgG2a
Miltenyi Biotec GmbH,
Bergisch-Gladbach, D
anti-CD11b/Mac-1
Biotin
Rat IgG2b
Miltenyi Biotec GmbH,
Bergisch-Gladbach, D
anti-CD45R/B220
Biotin
Rat IgG2a
Miltenyi Biotec GmbH,
Bergisch-Gladbach, D
anti-DX5
Biotin
Rat IgM
Miltenyi Biotec GmbH,
Bergisch-Gladbach, D
anti-Ter-119
Biotin
Rat IgG2b
Miltenyi Biotec GmbH,
Bergisch-Gladbach, D
anti-biotin (Bio3-18E7.2)
MicroBeads
Mouse IgG1
Miltenyi Biotec GmbH,
Bergisch-Gladbach, D
2.5.3 T-Zell-Stimulation
Spezifität
Klon
Konjugat
Isotyp
Hersteller
anti-mouse CD3
17A2
purified
Rat IgG2b
R&D Systems,
Minneapolis, USA
anti-mouse CD28 61109
purified
IgG2c
R&D Systems,
Minneapolis, USA
2.6 Software
CellQuest Pro
BD Biosciences, Franklin Lakes, USA
OpenOffice.org
Oracle, München, D
PASW Statistics 18
SPSS, Chicago, USA
Inkscape
Free Software Foundation, Boston, USA
Mendeley Research Networks beta 0.9
Mendeley Ltd., London, GB
37
3. Methoden
3.1 Tierversuche
Alle Tierversuche erfolgten gemäß geltender Tierschutzgesetzgebung (Lizenznummer K07/05 und
K16.5/06) unter Genehmigung der Bezirksregierung Köln. Alle Experimente standen stets unter der
Prämisse, schonende, keimarme, für das Tier schmerz- und stressarme Bedingungen zur Gewinnung
valider und reliabler Ergebnisse zu schaffen.
Wir führten alle Experimente in vivo in den Stallungen des Instituts für Pathologie der Uniklinik
Köln bzw. im Tierschall des Instituts für Medizinische Mikrobiologie, Immunologie und Hygiene
der Uniklinik Köln (IMMIH) durch. Verwendung fanden C57BL/6 Wildtyp-Mäuse, welche vom
Institut für Physiologie der Uniklinik Köln und von Charles River Laboratories (Frankfurt/Main)
bezogen wurden, homozygot IL-6-defiziente (IL-6-/-) Mäuse, welche großzügigerweise von Herrn
Prof. Bluethmann (Basel, CH) zur Verfügung gestellt wurden, sowie homozygot IL-17-defiziente
(IL-17-/-) Mäuse (Hintergrund BALB/c und C57BL/6). Die Haltung der Tiere in den Stallungen
des Instituts für Physiologie und des Instituts für Pathologie der Uniklinik Köln erfolgte unter
spezifisch pathogen-freien Bedingungen (engl., specific pathogen free, SPF). Im Tierstall des
IMMIH wurden die Mäuse unter keimarmen Bedingungen gehalten. Bis zu fünf Tiere gleichen
Geschlechts und Wurfs fanden Aufnahme in Käfigen des Typs II europäischer Norm (Coren Inc.,
Louisville, USA) bei freiem Zugang zu Standardfutter 13/24 (Altromin, Lage-Lippe) und Tränke.
Ein Käfigwechsel fand wöchentlich statt. Es wurde ein automatisierter Hell-Dunkel-Rhythmus im
zwölf Stundentakt eingehalten. Die Umgebungstemperatur betrug 21° Celsius (±1°) bei einer
mittleren Luftfeuchtigkeit von 30 bis 50%.
3.2 Versuchstierzucht
Die Versuchstiere des IL-17-/- Stammes gewannen wir aus eigenständiger Zucht. Hierzu wurden
drei getrennte Zuchtreihen angesetzt. Die Zucht erfolgte in 1:1 Verpaarung nach einer
Akklimatisationszeit von zwei Wochen, die die Tiere zunächst nach Geschlechtern getrennt im
Tierstall des IMMIH verbrachten. Geschlechtsspezifisches Absetzen der Würfe erfolgte 19 bis 21
Tage postnatal. Es wurden nur Würfe der ursprünglichen Elterngeneration verwendet; eine
konsanguine Verpaarung der Nachkommenschaft fand nicht statt. Würfe fanden regelmäßig im
Abstand von 21 bis 24 Tagen statt, wobei der initiale Wurf nach einer Zeit von 28 Tagen erfolgte.
38
Die Würfe besaßen eine Größe von fünf bis sieben Nachkommen. Über den parallelen Ansatz dreier
Zuchtreihen wurde gewährleistet, dass die Würfe zeitlich eng zusammenfielen. Verwendung der
Tiere für die Versuche erfolgte im Alter von sechs bis acht Wochen.
3.3 Injektionen
3.3.1 Allgemeines
Für die beschriebenen Experimente erfolgten intraperitoneale und intravenöse Injektionen (engl.,
challenge) an lebenden Versuchstieren. Um die Traumatisierung zu minimieren, wurden feine 27 G
Kanülen (B. Braun Melsungen AG, Melsungen, D) verwendet. Alle Prozeduren wurden vor
Durchführung der Experimente eingehend theoretisch und praktisch geübt. Die Herstellung aller
Injektionslösungen erfolgte unter sterilen Kautelen.
3.3.2 Intraperitoneale Injektionen
Alle intraperitonealen Injektionen erfolgten unter keimarmen Bedingungen am anästhesierten Tier.
Hierzu erfolgte eine Inhalationsnarkose mit Diethylether in abgeschlossenem Behältnis. Die
Injektion erfolgte erst dreißig Sekunden nach sicherem Einsetzen der Bewusstlosigkeit des Tieres.
Injiziert wurde zügig, linksversetzt in Höhe des Mittelbauches unter Anhebung der ventralen
Bauchmuskulatur, um eine versehentliche Traumatisierung von Leber und Darm zu vermeiden.
Nach Entfernung der Injektionsnadel erfolgte eine schonende Massage des Bauchraumes, um das
Injektat ausreichend zu verteilen und das Abklingen der Narkose zu befördern. Die Wiederkehr des
Bewusstseins wurde abgewartet und überprüft. Kein Tier starb im Zuge des angewendeten
Narkoseverfahrens.
3.3.3 Intravenöse Injektionen
Alle intravenösen Injektionen erfolgten in eine Schwanzvene nach Immobilisation des Tieres im
Injektionsblock. Hierdurch wurde ein schonender und sicherer Zugang zum Schwanz des Tieres
ermöglicht. In Einzelfällen ging der Injektion eine kurz dauernde Exposition des Tieres gegenüber
Rotlicht bei Temperaturen bis 40° Celsius voraus, um die Venenfüllung zu befördern. Wiederholte
Venenkanülierung sowie Blutverluste wurde vermieden. Kein Tier starb im Zuge des angewendeten
Injektionsverfahrens.
39
3.4 Abszessmodell
Für die Induktion intraperitonealer Abszesse durch Sp1 wurde einem etablierten Protokoll gefolgt
(Stephen et al. 2007) (Groneck et al., 2009). Eingesetzt wurden C57BL/6 Mäuse und IL-17-/Mäuse. Für eine jeweilige Versuchskohorte wurden nur Tiere gleichen Geschlechts im Alter von
sechs bis acht Wochen verwendet. Die Tiere hatten ein Gewicht von 19 bis 22 g. Gemäß des
beschriebenen Vorgehens für Injektionen wurden den Tieren 100 µg Sp1 gelöst in PBS in 1:1
Verhältnis mit SCCA (engl., Sterile Cecal Content Adjuvant, SCCA) in einem Gesamtvolumen von
0,2 ml injiziert. Zur Herstellung von SCCA wurde der Darminhalt eingesetzter Wildtyp-Mäuse nach
Suspendierung in PBS durch Nylon-Zellsiebe mit einer Porengröße von 100 µm und 70 µm (Falcon
BD, Franklin Lakes, USA) filtriert, autoklaviert und bei -20° Celsius bis zur Verwendung verwahrt.
Kontrollgruppen erhielten Injektionen von 0,68 µl/g Körpergewicht SCCA in PBS, reines PBS
jeweils zu einem Gesamtvolumen von 0,2 ml oder keine Injektion. Wir verwendeten
unterschiedliche Chargen Sp1, um Unterschiede der Antigenität auszuschließen. Es fanden sich
keine signifikanten Unterschiede hinsichtlich der Abszessinduktion zwischen den verschiedenen
Chargen. Alle Versuche wurden unabhängig voneinander dreimal wiederholt. Für jede
Versuchsgruppe wurden jeweils fünf Tiere eingesetzt. Die dargestellten Ergebnisse stellen eine
repräsentative Abbildung aus allen Versuchsreihen dar. Sechs Tage nach Injektion wurden die Tiere
per zervikaler Dissektion unter Ether-Narkose getötet. Die Bauchhöhle wurde makroskopisch auf
das Vorliegen von Abszessen untersucht. Abszesse wurden isoliert und mit Hilfe einer
Präzisionsschublehre (Asimeto Germany GmbH, Weißbach, D) vermessen. Kein Tier starb vorzeitig
im Zuge der Versuche.
3.5 Peritoneallavage
Die Lavagierung der Bauchhöhle erfolgte im Anschluss an intraperitoneale Injektionen und diente
der Gewinnung von Lavageflüssigkeit und der darin enthaltenen Zellen und Zytokine. Einsatz in
den Experimenten fand sie erst nach ausgiebiger theoretischer und praktischer Übung. Nach Tötung
des Tieres durch zervikale Dissektion, Kurzimmersion in Ethanol und Fixierung des toten Tieres auf
einer Präparationsplatte erfolgte die Freilegung des Peritoneum parietale unter sterilen
Bedingungen. Hierbei wurde die ventrale Bauchmuskulatur mit abgerundeter Schere stets schonend
durchtrennt, um eine vorzeitige Perforation der Peritoneums zu vermeiden. Nach Freilegung des
Bauchfells erfolgte ein Wechsel des sterilen Bestecks. Lavagiert wurde zur Gewinnung von Zellen
mit 5 ml PBS; bei Versuchen zur Detektion von Zytokinen wurde das Volumen auf 2 ml reduziert,
40
um Verdünnungseffekte zu reduzieren. Aus Gründen chemischer Stabilität wurden die
Injektionslösungen bis zur Injektion auf Eis gelagert. Die Injektion des Lavagevolumens erfolgte
von einer sicheren Punktionsstelle im inferioren Abschnitt des Peritoneums. Mehrfachpunktionen
sowie Traumatisierung von Leber oder Darm wurde vermieden. Das Injektat verblieb für
mindestens eine Minute unter kontinuierlicher manueller Durchmischung im Bauchraum. Bei
Reaspiration wurde ein Rückgewinn von mindestens 4 ml respektive 1 ml gewährleistet.
Makroskopisch blutig tingiertes Aspirat wurde nicht verwendet. Es erfolgte ein Pooling des Aspirats
innerhalb der jeweiligen Versuchsgruppen. Falls nicht anders beschrieben, folgte eine
Zentrifugation des Aspirats bei 1500 rpm für fünf Minuten bei 4° Celcius. Für den Nachweis von
Zytokinen mittels ELISA wurde anschließend der zellfreie Überstand in Fraktionen von je 1ml
aliquotiert und unmittelbar bei -80° Celsius tiefgefroren. Aufgetaute Proben wurden direkt
verwendet; wiederholte Zyklen des Einfrierens und Auftauens wurden vermieden. Die gewonnenen
Zellen wurden wie jeweils beschrieben weiterverwendet.
3.6 Herstellung einer Zellsuspension aus der Milz
Die Herstellung einer Zellsuspension aus der Milz erfolgte zur Bestimmung freier
Zytokinkonzentrationen und zur Isolation von T-Helfer-Zellpopulationen an naiven Mäusen sowie
nach intraperitonealer und intravenöser Injektion. Nach Tötung des Tieres durch zervikale
Dissektion, Kurzimmersion in Ethanol und Lagerung des toten Tieres auf die rechte Seite erfolgte
die Freilegung des linken Oberbauches unter sterilen Bedingungen. Die Milz wurde von
umgebendem Fettgewebe isoliert. Auf schonendes Vorgehen wurde geachtet. Teilinfarzierte Milzen
wurden nicht verwendet; ein Riss des Milzgewebes im Zuge der Isolation fand nicht statt.Nach
Entfernung wurde die Milz direkt in ein 15 ml Röhrchen mit 5 ml PBS und Kühlung auf Eis
überführt. Die gesamte Milz wurde im Anschluss mit Hilfe des Stempels einer 2 ml Spritze durch
ein 100 µl Nylon-Zellsieb passiert. Nicht filtrierter Detritus wurde verworfen. Das kolliquierte
Milzgewebe wurde in einem 50ml Röhrchen gewonnen. Durch wiederholtes Ausspülen des Siebes
mit PBS sollte die Zellausbeute erhöht werden. Die Lösung wurde anschließend bei 1500 rpm und
4° Celsius für sechs Minuten zentrifugiert, der Überstand verworfen und das Zellpellet einer
Erythrozytenlyse mit 0,2% Natriumchlorid-Lösung unterzogen. Nach erneuter Zentrifugation
wurden die Zellen in zwei weiteren Zyklen mit 5 ml PBS versetzt und zentrifugiert bis das
Zellpellet farblos erschien. Die Zellen wurden gezählt und in entsprechender Anzahl den jeweiligen
Versuchen zugeführt.
41
3.7 Erythrozyten-Lyse
Erythrozyten zeichnen sich im Vergleich zu Lymphozyten und dendritischen Zellen durch eine
geringere osmotische Resistenz aus (Fujii 1997). Zellsuspensionen aus der Milz wiesen stets einen
hohen Anteil von Erythrozyten auf. Zur Negativselektion von Erythrozyten unterzogen wir diese
Lösungen daher einer kurzzeitigen Exposition gegenüber hypotoner Natriumchlorid-Lösung.
Überstandsfreie Zellpellets wurden in 10 ml NaCl 0,2% resuspendiert. Nach exakt dreißig
Sekunden wurde diese Lösung mit 10 ml 1,6% Natriumchlorid-Lösung neutralisiert. Im Anschluss
wurde die Lösung bei 1500 rpm und 4° Celsius für sechs Minuten zentrifugiert. Zelllösungen aus
der Peritoneallavage wurden, wenn nicht anders beschrieben, keiner Erythrozyten-Lyse unterzogen.
3.8 Zellzählung
Zellen wurden manuell polarisationsmikroskopisch an der Neubauer Zählkammer (0,1 mm Tiefe,
0,0025 mm²) gezählt. Hierzu wurden je 10 µl Zelllösung mit 90 µl Trypanblau für ein
Verdünnungsverhältnis von 1:10 versetzt. Aus dieser Verdünnungslösung heraus wurden parallel
zwei weitere Verdünnungsansätze im Verhältnis 1:100 und 1:1000 erstellt, indem je 10 µl der höher
konzentrierten Lösung in 90 µl Trypanblau überführt wurden. Je 10 µl aller Verdünnungsansätze
wurden im Anschluss in den Kapillarspalt der Zählkammer überführt. Alle Ansätze wurden unter
dem Polarisationsmikroskop analysiert und die Zellen in allen vier Quadranten anhand ihres
makroskopischen Aspekts unter Verwendung einer Zählhilfe erfasst. Die Bestimmung der effektiven
Zellzahl erfolgte nach folgender Formel:
Zellzahl [n/µl] = ∑(n/Quadrant) x Verdünnungsfaktor x 10-4/µl
Die Zeit der Exposition gegenüber Trypanblau bis zur Erhebung der effektiven Zellzahl lag stets
unter fünf Minuten.
42
3.9 Durchflusszytometrie
3.9.1 Hintergrund
Durchflusszytometrie beschreibt ein apparatives Verfahren zur automatisierten Zellzählung.
Moderne Durchflusszytometer sind darüber hinaus in der Lage, Zellgröße, Zellstruktur,
Oberflächeneigenschaften und intrazelluläre Komponenten zu erfassen sowie Zellen entlang
bestimmter Eigenschaften zu sortieren (engl., fluorescence-activated cell sorting, FACS). In dieser
Arbeit werden die Begriffe Durchflusszytometrie und FACS synonym verwendet. Das Prinzip des
FACS-Geräts geht auf Arbeiten von Bonner, Sweet, Hullett, Herzenberg et al. Ende der 1960er
Jahre zurück (Herzenberg et al. 2002).
3.9.2 Allgemeine Prinzipien
Durchflusszytometer leiten Zellen in laminarem Strom bei hohem Zelldurchsatz durch ein
komplexes System von Lasern und Fotodetektoren, wobei jede Zelle einzeln auf ihre Eigenschaften
hin untersucht wird. Laser emittieren monochromatisches Licht einer bestimmten Wellenlänge. Bei
Exposition der Einzelzelle gegenüber dem Laserstrahl kommt es zur Streuung des Lichts, wodurch
sich Zellgröße (engl., forward scatter, FSC) und Zellgranularität (engl., sideward scatter, SSC)
erfassen lassen. Werden Antikörper, die mit Fluoreszenzfarbstoffen konjugiert sind, zur selektiven
Markierung von Zellstrukturen eingesetzt, so erfahren diese Farbstoffe nach Passage eines
Laserstrahls mit farbentsprechendem Emissionsspektrum eine elektromagnetische Anregung.
Angeregte Fluoreszenzfarbstoffe emittieren Licht eines bestimmten Wellenbandes, welches nach,
Bündelung, Amplifikation und Filtration durch geräteeigene Fotodetektoren (engl., photomultiplier)
erfasst werden kann. In unseren Versuchen kamen die Fluoreszenzfarbstoffe FluoresceinIsothiocyanat (FITC) mit einem Absorptionsmaximum von 495 nm und einem Emissionsmaximum
von 519 nm für den Detektor FL1, Phycoerythrin (PE) mit einem Absorptionsmaximum von 480
nm und einem Emissionsmaximum von 578 nm für den Detektorkanal FL2 und Allophycocyanin
(APC) mit einem Absorptionsmaximum von 650 nm und einem Emissionsmaximum von 785 nm
für den Detektorkanal FL4 zum Einsatz. Um eine Ausbleichen der eingesetzten Farbstoffe zu
vermeiden, fand der Einsatz Fluoreszenz-konjugierter Antikörper stets unter Lichtabschluss statt.
Die entsprechenden Laser zur Anregung der Fluorochrome waren ein Argonionenlaser mit einer
Wellenlänge von 488 nm für PE und FITC sowie ein Helium-Neon-Laser mit einer Wellenlänge von
633 nm für APC. Den Detektoren sind im eingesetzten Durchflusszytometer Bandpassfilter (für
43
FL1 530/30, für FL2 585/42, für FL4 661/16) vorgeschaltet, so dass nur Licht eines jeweilig
definierten Wellenbereichs
zur Auswertung
gelangt.
Zur
Vermeidung
falsch
positiver
Signaldetektion wurden in der Mehrzahl der Versuche Farbstoffkombinationen ohne signifikanten
spektralen Emissions-Überlappungsbereich gewählt, z.B. PE und APC, beziehungsweise
Mehrfachfärbungen im Versuchsansatz vermieden. Bei parallelem Einsatz von FITC und PE
wurden die überlappenden Abschnitte des emittierten Wellenbandes kompensiert. Signale durch
Autofluoreszenz wurden durch Einsatz entsprechender Isotypenkontrollen ausgeglichen.
3.10 Magnetische Zellseparation
Magnetische Zellseparation beschreibt ein Verfahren zur hoch selektiven Anreicherung Antikörpermarkierter Zellen. Die hierbei verwendeten Antikörper, die spezifische Affinität für ausgewählte
Oberflächenstrukturen auf der Zellmembran aufweisen, werden direkt oder indirekt in Kopplung
mit superparamagnetischen Micropartikeln (MACS MicroBeads, Miltenyi Biotec GmbH, BergischGladbach, D) gebracht. Wohingegen beim direkten Verfahren industriell vorgefertige AntikörperMicroBead-Aggregate zum Einsatz kommen, die unmittelbar die jeweilige Zielstruktur magnetisch
erfassen, wird in Ermangelung einsatzfähiger Antikörper zur Direktmarkierung beim indirekten
Verfahren die gewünschte Oberflächenstruktur zunächst mit Hilfe unmarkierter oder Biotin-,
Streptavidin- oder Fluoreszenz-gekoppelter Antikörper markiert. In einem Folgeschritt kommen nun
Antikörper mit MicroBead-Kopplung zum Einsatz, die sich gegen eine Zielstruktur des vorab
eingesetzten Antikörpers, also zum Beispiel Biotin, richten. Eine spezielle Trennsäule (MACS
Column, Miltenyi Biotec GmbH, Bergisch-Gladbach, D), die mit Stahlwolle oder Stahlpartikeln
angefüllt ist, schafft die Bedingungen eines starken magnetischen Gradientenfeldes, wenn sie in
einen speziell konfigurierten Hochleistungspermanentmagneten (MACS Separator, Miltenyi Biotec
GmbH, Bergisch-Gladbach, D) verbracht wird. Zellen, die zuvor mit Hilfe der Mikropartikel
markiert worden sind, werden bei Passage der Trennsäule im Magneten retiniert; unmarkierte
Zellen passieren das Magnetfeld. Auf diese Weise lässt sich positive Selektion (Anreicherung) und
negative Selektion (Depletion) einer Zelllösung erzielen. Die Fraktion der Zelllösung, die die
Trennsäule im Magneten frei passiert, ist weitgehend befreit von denjenigen Zellen, die die jeweilig
magnetisch erfassten Oberflächenmerkmale aufweisen. Der markierte Zelltyp ist hingegen
angereichert im Eluat der Trennsäule, sobald die Wirkung des Magnetfelds aufgehoben wird.
Magnetische Zellseparation mit MACS MicroBeads gewährleistet hohe Reinheit, geringe
metabolische Beeinflussung der Zellen und interferiert minimal mit Anschlussuntersuchungen wie
der Durchflusszytometrie. Wir haben die magnetische Zellseparation gemäß des firmeneigenen
44
Protokolls
(Miltenyi
Biotec
GmbH,
Bergisch-Gladbach,
D)
angewandt
zur
positiven
Selektionierung von CD4+ Zellen aus der Gesamtzellpopulation der Milz sowie zur Gewinnung von
dendritischen Zellen aus dem Knochenmark.
45
Abb. 4: Magnetische Zellseparation am Beispiel CD4+ T-Zellen, schematische Darstellung.
46
3.11 Gewinnung von dendritischen Zellen aus dem Knochenmark
Für die Isolation und Vermehrung von CD11c + dendritischen Zellen aus dem Knochenmark (engl.,
bone marrow derived dendritic cells, BMDC) folgten wir der Modifikation eines etablierten
Protokolls (Inaba et al. 1992). Die Expansion der dendritischen Zellen erfolgte unter Einsatz von
murinem Granulocyten-Makrophagen-Kolonie-stimulierendem Faktor (engl., murine granulocytemacrophage colony stimulating factor, mGM-CSF). GM-CSF führt jedoch auch zur Vermehrung
von neutrophilen Granulozyten und von Makrophagen. Zur Optimierung der Zellisolation setzten
wir ein Separationsverfahren mit Hilfe von magnetisch konjugierten anti-CD11c-Antikörpern
(Miltenyi Biotec GmbH, Bergisch-Gladbach, D) ein.
Verwendet wurden C57BL/6 Mäuse gleichen Geschlechts im Alter von sechs bis acht Wochen.
Nach Tötung der Tiere durch zervikale Dissektion und Kurzimmersion in 70% Ethanol erfolgte
unter sterilen Bedingungen die Freipräparation von Tibiae und Femura. Die Hinterläufe wurden
behutsam von sämtlichem adhärenten Muskel- und Bindegewebe befreit, in Hüft- und Kniegelenk
exartikuliert und auf Eis gekühlt. Die Knochen wurden durch Abtrennung der Endbereiche der
distalen und proximalen Metaphysen eröffnet und der Markraum mittels einer 26 G Kanüle leicht
angebohrt. Mit je 4 ml Zellwasch-Puffer wurden die Knochen antegrad sowie retrograd wiederholt
ausgespült und die Spüllösung in Falcon-Tubes aufgefangen. Diese Zelllösung wurde anschließend
zur Trennung von Debris durch ein 100 µm Nylonsieb gefiltert und bei 1500 rpm, 4° Celsius für
fünf Minuten zentrifugiert. Der Überstand wurde verworfen und das Zellpellet in 8 ml
raumtemperiertem Histopaque-Puffer resuspendiert. 5 ml raumtemperiertes Histopaque 1083
wurden anschließend separat in einem 15 ml Falcon-Tube vorgelegt und die Zellsuspension hierauf
langsam und kontrolliert mittels Pipette aufgeschichtet. Es folgte die Zentrifugation bei 450 g,
Raumtemperatur für dreißig Minuten, wobei die Zentrifugation ohne Einsatz der maschinellen
Bremse nach Ablauf der Zeit auslief. Anschließend wurde die trübe Zellschicht zwischen den
Phasen des Zentrifugats (engl., buffycoat) sowie am Rand des Behältnis anhaftende Zellen mit
steriler Pasteurpipette entnommen und in 20 ml kalten Histopaque-Puffer transferiert. Es folgte
erneute Zentrifugation bei 800 g für zehn Minuten. Der Überstand wurde verworfen und das
Zellpellet in 1 ml kaltem EasySep-Puffer resuspendiert. Die in der Folge angegebenen Volumina
beziehen sich auf 1x108 Zellen/ml und wurden entsprechend angepasst.
Die Zellen wurden gezählt und bei 1500 rpm, 4° Celsius für fünf Minuten zentrifugiert und das
Pellet in 1 ml EasySep-Puffer suspendiert. Zur Lösung wurden 10 µl Fc-Block und 15 µl muriner
47
anti-CD34 Biotin-Konjugat-Antikörper gegeben und für 15 Minuten unter wiederholter
Durchmischung inkubiert. Anschließend wurden 10 ml kalter EasySep-Puffer ergänzt und für
sieben Minuten bei 1000 rpm, 4° Celsius zentrifugiert. Das Pellet wurde in 700 µl EasySep-Puffer
resuspendiert und durch ein 70 µl Nylonsieb in ein FACS-Tube filtriert. Zum Filtrat wurden 100 µl
anti-Biotin Cocktail aus dem EasySep-Kit hinzugefügt, für 15 Minuten bei Raumtemperatur
inkubiert und anschließend 50 µl der Microbeads-Lösung ergänzt. Nach zehnminütiger Inkubation
mit wiederholter Durchmischung alle zwei Minuten wurde die Lösung mit EasySep-Puffer auf ein
Gesamtvolumen von 2,5 ml versetzt. Das FACS-Tube wurde dann für fünf Minuten in den
EasySep-Magneten verbracht, so dass nach Abgießen nur eine definierte Restmenge inklusive der
markierten Zellen im Tube verbleibt. Die Restlösung wurde mit 1 ml EasySep-Puffer in ein 15 ml
Falcon-Tube transferiert und für sieben Minuten bei 1200 rpm, 4° Celsius zentrifugiert.
Resuspendiert in 1 ml BMDC-Kulturmedium wurden die Zellen gezählt und zu je 0,5x106 Zellen in
2 ml auf Wells einer Nunc-Wellplate verteilt. Zu den Wells wurden je 500 IE mGM-CSF/ml
pipettiert. Es folgte die Kultur bei 37° Celsius, 5% CO 2 im Brutschrank für eine Gesamtdauer von
sechs Tagen. Alle zwei Tage erfolgte die microskopische Kontrolle der Zellkultur und der Ersatz
von 50% der Kulturlösung durch frisches Medium mit 1000 IE mGM-CSF.
Zur Verwendung wurden die Zellen sechs Tage nach Beginn der Kultur mit Hilfe der Zellscraper
vom Boden der Wellplate gelöst und in Kulturmedium in ein 15 ml Falcontube transferiert. Die
vollständige Lösung der Zellen vom Plattenboden wurde microskopisch überprüft. Im Anschluss
wurde die Zelllösung bei 1500 rpm, 4° Celsius für fünf Minuten zentrifugiert. Nach Zählen wurden
die Zellen entsprechend verwendet.
Wir bestimmten die Reinheit der Zelllösung an dendritischen Zellen über den Anteil der Expression
von CD11c mittels Durchflusszytometrie. Hierzu färbten wir die Zellen mit 0,65 µg anti-CD11cFITC/1x106 Zellen. Die Inkubationszeit betrug dreißig Minuten und fand bei 4° Celsius unter
Lichtabschluss statt. In den Versuchen zeigten sowohl in den naiven Kontrollgruppen als auch in
den Interventionsgruppen stets >80% der Zellen Expression von CD11c (Abb. 5).
48
Abb. 5: Anteil CD11c+ Zellen in den Versuchen an BMDC. Dargestellt sind repräsentative Ergebnisse aus
einer Kontrollgruppe (obere Zeile) und einer Interventionsgruppe nach Inkubation mit Sp1 (untere Zeile).
Die Zellen der linken Spalte sind ungefärbt und dienen als Referenz. Die rechte Spalte zeigt die Zellen nach
Färbung mit anti-CD11c FITC.
3.12 Intrazelluläre Zytokinfärbung
Nach Fixierung und Permeabilisierung von Zellen können intrazelluläre Substanzen spezifisch
mittels Fluoreszenz-gekoppelten Antikörpern angefärbt werden. Zur Fixierung werden Lösungen
mit 4% Paraformaldehyd eingesetzt (Denisov 1977) (Sander et al. 1991). Durch Permeabilisierung
wird die Penetration der Antikörper durch die Zellmembran ermöglicht. Durch den Einsatz von
Inhibitoren intrazellulärer Transportprozesse können Zytokine im Zellinneren angereichert werden.
So führt der Einsatz von Monensin (GolgiStop™) oder Brefeldin A (GolgiPlug™) durch Interferenz
mit
Verarbeitungsprozessen
im
Golgi-Apparat
zur
unselektiven
Hemmung
des
Exozytosemechanismus für Zytokine und damit zu verbesserter Signalgebung in der
Durchflusszytometrie nach Antikörperfärbung.
Wir führten intrazelluläre Zytokinfärbungen an CD4 + Zellen aus der Milz und aus der
49
Peritoneallavage sowie an CD11c+ dendritischen Zellen aus dem Knochenmark gemäß eines
offiziellen, firmeneigenen Protokolls (BD Biosciences, Franklin Lakes, USA) durch. Die Zellen
wurden aus C57BL/6 Wildtyp-Mäusen oder IL-6-/- und IL-17-/- Stämmen gewonnen. Es wurden je
Versuchskohorte nur Tiere gleichen Geschlechts im Alter zwischen sechs und acht Wochen
verwendet. Das durchschnittliche Gewicht der Tiere lag zwischen 19 und 22 Gramm.
Nach Herstellung jeweiliger Zelllösungen erfolgte die Färbung von Oberflächenmerkmalen auf der
Zellmembran. Hierbei wurden zunächst mit Hilfe von 2.4G2 Antikörpern (BD Fc-Block™), welche
spezifisch für den FcγII/III Rezeptor sind, unspezifische Bindungsstellen auf der Zellmembran
besetzt, um Färbeartefakte nach Einsatz Fluoreszenz-markierter Oberflächen-Antikörper zu
verhindern. Es wurden je 1x106 Zellen mit 1µg Fc-Block™ in 100 µl PBS für 15 Minuten auf Eis
inkubiert. Im Anschluss wurden die Lösungen mit 0,5 µg anti-CD4 APC/ 1x106 Zellen respektive 1
µg anti-CD11c PE/1x106 Zellen versetzt und für 30 Minuten auf Eis inkubiert. Die Inkubation
erfolgte unter Lichtabschluss, um Verluste des Farbsignals der eingesetzten Antikörper zu
vermeiden. Eine Kontrollreihe verblieb jeweils ungefärbt. Nach zweimaliger Waschung aller
Zellreihen mit 3 ml FACS-Puffer erfolgten Fixierung und Permeabilisierung. Hierzu wurden je
1x106 Zellen mit 250 µl Cytofix/Cytoperm™ versetzt und für zwanzig Minuten auf Eis inkubiert.
Nach zweimaligem Waschen mit 2 ml BD Perm/Wash™ in 1:10 Verdünnung erfolgte die
eigentliche intrazelluläre Zytokinfärbung mit 0,2 µg anti-IL-17 PE/ 1x10 6 Zellen. Die
Isotypenkontrolle wurde mit 0,2 µg IgG1 PE/ 1x10 6 Zellen gefärbt. BD Perm/Wash™ diente als
Pufferlösung während der Färbung, um die Permeabilisierung der Zellen über den Zeitverlauf der
Inkubation zu gewährleisten. Die Lösungen wurden für 30 Minuten auf Eis unter Lichtabschluss
inkubiert und im Anschluss zweimalig mit 1 ml BD Perm/Wash™, dann zweimalig mit 3 ml FACSPuffer gewaschen. Die Auswertung erfolgte mittels Durchflusszytometrie.
50
3.13 ELISA
3.13.1 Allgemeine Prinzipien
Geringe Mengen freier Zytokine in Lösungen können quantitativ oder semiquantitativ mit Hilfe
eines enzyme-linked immunosorbent assays (ELISA) bestimmt werden. Hierunter wird ein
immunologisches Nachweisverfahren verstanden, das den Einsatz von Antikörpern zur spezifischen
Erfassung molekularer Strukturen des jeweiligen Antigens mit einer enzymvermittelten
Farbreaktion verbindet. Das Verfahren wurde erstmals 1971 von Engvall und Perlmann, Avrameas
und Guilbert sowie von Schuurs und van Weemen unabhängig voneinander beschrieben (Engvall et
al. 1971) (Avrameas et al. 1971) (Van Weemen et al. 1971). Im sogenannten „Sandwich-Verfahren“
werden die zu bestimmenden Antigene zunächst durch stationär fixierte Antikörper (engl., capture
antibodies) aus der Lösung gefällt. Die Antikörper müssen hierzu in einem separaten Arbeitsschritt
an die Bodenfläche einer 96-Wellplate adsorbiert werden (engl., coating), wobei die Fc-Fragmente
in hydrophobe Wechselwirkung mit dem Polystyrol der Kunststoffplatte treten. Diese Bindung ist
relativ pH-unabhängig und ermöglicht den Einsatz von PBS (pH 7,4) oder Natriumcarbonat (pH
9,6) als Pufferlösungen. Das im Anschluss hinzugegebene Antigen wird über die Fab-Fragmente der
Antikörper erfasst und somit über die Mittlung der Antikörper stationär fixiert. Diese Fixierung des
gesuchten Antigens erlaubt die Abtrennung nicht zu untersuchender Stoffe durch einfaches Waschen
der Wellplate mit Pufferlösung. Hintergrundrauschen durch unspezifische Bindungen an freien
Antikörper-Bindestellen wird durch Einsatz von Blockreagenzien entgegengewirkt. Proportional
zur Menge des Antigens in der untersuchten Lösung findet sich nun also der Boden der Platte mit
Antigen ausgekleidet. Hinzugabe eines weiteren spezifischen Antikörpers (engl., detection
antibody) führt zur Markierung der freien Oberfläche des gebundenden Antigens und liegt der
metaphorischen Titulierung „Sandwich-Verfahren“ zu Grunde. Werden diese zweiten Antikörper an
ein Enzym gekoppelt, dessen Reaktion ein Substrat in ein farbgebendes Produkt überführt, lässt sich
die Menge gebundenen Antigens (semi-)quantitativ über die Extinktion Lichts bestimmter
Wellenlängen durch die jeweilige Konzentration des entstandenen Produkts gegenüber einem
Standard rückermitteln. Als Enzym hat sich beispielsweise Meerrettich-Peroxidase (engl.,
Horseradish perioxidase, HRP) mit dem Substrat H 2O2/Tetramethylbenzidin (TMB) durchgesetzt.
Die Enzymaktivität wird zu definiertem Zeitpunkt durch pH-Verschiebung, z.B. durch Zugabe von
H2SO4, gestoppt. Je höher die Konzentration des Antigens in der ursprünglichen Lösung, desto
höher ist letztlich der Umsatz von Substrat zu farbgebenden Produkt. Der Standard besteht in
bekannten, absteigenden Konzentrationen des Antigens. Die Extinktion der jeweiligen
51
Standardkonzentrationen lässt sich grafisch in der Standardkurve zusammenfassen. Abgleich der für
die
jeweiligen
Proben
gemessenen
Extinktion
gegen
die
Standardkurve
erlaubt
die
Rückbestimmung der Antigenkonzentration.
Abb. 6: Enzyme-linked Immunosorbent Assay (ELISA). Schematischer Ablauf. Die Auswertung der
Farbreaktion erfolgt automatisiert.
3.13.2 IL-17-ELISA
Wir folgten in unseren Versuchen einem offiziellen Firmenprotokoll (eBioscience Inc., San Diego,
USA). Verwendet wurde ein industriell zusammengestelltes IL-17-ELISA-Paket (Mouse IL-17A
ELISA Ready-Set-Go!, eBioscience, San Diego, USA). Vorbereitend wurde der Capture-Antikörper
(purified anti-mouse IL-17A, Klon eBio17CK15A5) im Verhältnis 1:250 in Coating-Puffer
(ELISA/ELISPOT Coating Buffer Pulver, eBioscience, San Diego, USA, gelöst in 1l Aqua dest.)
gelöst. Die Wells einer 96-Well-Plate (Nunc Maxisorb, Nunc, Langenselbold, D) wurden mit 100
52
µl/Well gelöstem Capture-Antikörper versetzt. Die Platte wurde im Anschluss mit adhäsiver Folie
versiegelt und über Nacht bei 4° Celsius inkubiert. Die Wells wurden von überschüssiger
Flüssigkeit befreit, indem die gesamte Platte wiederholt auf Zellstoff ausgeschlagen wurde. Alle
Wells wurden im Anschluss fünf Waschdurchgängen mit 300 µl/Well Waschpuffer (0,05% Tween20 in PBS, pH 7,4) unterzogen. Der Waschpuffer verblieb jeweils länger als eine Minute in den
Wells und wurde danach restlos ausgeschlagen. Die Wells wurden anschließend mit 200 µl/Well
Assay Diluent (eBioscience, San Diego, USA) in 1:5 Verdünnung versetzt und bei Raumtemperatur
für eine Stunde inkubiert. Es folgten erneut fünf Waschdurchgänge mit 300 µl Waschpuffer/Well.
Die Standardlösung (recombinant mouse IL-17A, 1 µg/ml, eBioscience, San Diego, USA) wurde
auf 500 pg/ml mit Assay Diluent verdünnt. Es wurden zwei Verdünnungsreihen der Standardlösung
von 500 pg/ml bis 0,06 pg/ml in halbierenden Konzentrationsschritten angelegt. 100 µl der zu
untersuchenden Proben wurden auf entsprechende freie Wells verteilt und die Platte mit adhäsiver
Folie bedeckt über Nacht bei 4° Celsius inkubiert. Die untersuchten Proben wurden zweimal je
Ansatz auf unterschiedliche Wells aufgetragen. In die Auswertung floss der Mittelwert der
Extinktion der entsprechenden Wells ein. Der Detection-Antikörper (biotin-conjugate anti-mouse
IL-17A, Klon eBio17B7) wurde mit Assay Diluent auf eine Verdünnung von 1:250 gebracht. Je 100
µl dieses verdünnten Antikörpers wurden auf die Wells verteilt und die versiegelte Platte bei
Raumtemperatur für eine Stunde inkubiert. Es folgten erneut fünf Waschdurchgänge. Im Anschluss
wurden 100 µl Avidin-HRP (eBioscience, San Diego, USA) in 1:250 Verdünnung mit Assay Diluent
auf die Wells gegeben und die Platte versiegelt für dreißig Minuten bei Raumtemperatur inkubiert.
Nach folgenden sieben Waschdurchgängen wurden 100 µl Substrat (TMB Solution, eBioscience,
San Diego, USA)/Well verteilt und die Platte bei Raumtemperatur für 15 Minuten inkubiert.
Anschließend wurden 50 µl 2M H2SO4/Well hinzugegeben und die Farbreaktion der Wells am
Spektrometer analysiert. Für die Auswertung nutzten wir das Ergebnis der Subtraktion der
Extinktionswerte bei 570 nm von denjenigen bei 450 nm.
53
2,5
2,0
Extinktion
f(x) = 0,94x - 0,76
1,5
1,0
0,5
0,0
IL-17 pg/ml (log10)
Abb. 7: Standardkurve IL-17-ELISA. Gezeigt ist eine repräsentative Kurve, die in den entsprechenden
Versuchen als Grundlage der quantitativen Bestimmung der IL-17-Konzentrationen diente. Die
Konzentrationen wurden mit Hilfe der Gleichung der Regressionsgraden errechnet.
3.13.3 TGFβ-1-ELISA
Wir folgten in unseren Versuchen einem offiziellen Firmenprotokoll (eBioscience Inc., San Diego,
USA). Verwendet wurde ein industriell zusammengestelltes TGFβ1-ELISA-Paket (human/mouse
TGFβ1 ELISA Ready-Set-Go!, eBioscience, San Diego, USA). Vorbereitend wurde der CaptureAntikörper (purified anti-human/mouse TGFβ1, Klon eBioTB2F) im Verhältnis 1:250 in CoatingPuffer (ELISA/ELISPOT Coating Buffer Pulver, eBioscience, San Diego, USA, gelöst in 1 l Aqua
dest.) gelöst. Die Wells einer 96-Well-Plate (Nunc Maxisorb, Nunc, Langenselbold, D) wurden mit
100 µl/Well gelöstem Capture-Antikörper versetzt. Die Platte wurde im Anschluss mit adhäsiver
Folie versiegelt und über Nacht bei 4° Celsius inkubiert. Die Wells wurden von überschüssiger
Flüssigkeit befreit, indem die gesamte Platte wiederholt auf Zellstoff ausgeschlagen wurde. Alle
Wells wurden im Anschluss fünf Waschdurchgängen mit 300 µl/Well Waschpuffer (0,05% Tween20 in PBS, pH 7,4) unterzogen. Der Waschpuffer verblieb jeweils länger als eine Minute in den
Wells und wurde danach restlos ausgeschlagen. Die Wells wurden anschließend mit 200 µl/Well
Assay Diluent (eBioscience, San Diego, USA) in 1:5 Verdünnung versetzt und bei Raumtemperatur
54
für eine Stunden inkubiert. Es folgten erneut fünf Waschdurchgänge mit 300 µl Waschpuffer/Well.
Zur Aktivierung von latentem TGFβ1 zur immunreaktiven Form mussten die Proben azidifiziert
und reneutralisiert werden. Tierisches Serum, welches in Kulturmedien Verwendung findet, kann
hohe Konzentrationen latenten TGFβ1-Zytokins enthalten (Massagué 1990). Wir bestimmten
deshalb die basale TGFβ1-Konzentration im Kulturmedium. 100 µl der jeweiligen Proben wurden
mit 20 µl 1 M HCl versetzt und bei Raumtemperatur für zehn Minuten inkubiert. Zur Neutralisation
wurden 20 µl 1 M NaOH hinzugegeben. Bei der Berechnung der endgültigen Konzentrationen von
TGFβ1 in den Proben ließen wir einen im offiziellen Protokoll empfohlenen Korrektionsfaktor von
1.4 für die Verdünnung einfließen. Die Standardlösung (recombinant human TGFβ1, 1 µg/ml,
eBioscience, San Diego, USA) wurde auf 500 pg/ml mit Assay Diluent verdünnt. Es wurden zwei
Verdünnungsreihen der Standardlösung von 8000 pg/ml bis 31,25 pg/ml in halbierenden
Konzentrationsschritten angelegt. 100 µl der zu untersuchenden Proben wurden auf entsprechende
freie Wells verteilt und die Platte mit adhäsiver Folie bedeckt über Nacht bei 4° Celsius inkubiert.
Die untersuchten Proben wurden zweimal je Ansatz auf unterschiedliche Wells aufgetragen. In die
Auswertung floss der Mittelwert der Extinktion der entsprechenden Wells ein. Der DetectionAntikörper (biotin-conjugate anti-human/mouse TGFβ1, Klon eBio16TFB) wurde mit Assay
Diluent auf eine Verdünnung von 1:250 gebracht. Je 100 µl dieses verdünnten Antikörpers wurden
auf die Wells verteilt und die versiegelte Platte bei Raumtemperatur für eine Stunde inkubiert. Es
folgten erneut fünf Waschdurchgänge. Im Anschluss wurden 100 µl Avidin-HRP (eBioscience, San
Diego, USA) in 1:250 Verdünnung mit Assay Diluent auf die Wells gegeben und die Platte
versiegelt für dreißig Minuten bei Raumtemperatur inkubiert. Nach folgenden sieben
Waschdurchgängen wurden 100 µl Substrat (TMB Solution, eBioscience, San Diego, USA)/Well
verteilt und die Platte bei Raumtemperatur für 15 Minuten inkubiert. Anschließend wurden 50 µl 2
M H2SO4/Well hinzugegeben und die Farbreaktion der Wells am Spektrometer analysiert. Für die
Auswertung nutzten wir das Ergebnis der Subtraktion der Extinktionswerte bei 570 nm von
denjenigen bei 450 nm.
55
2,5
f(x) = 0,8x - 1,51
2,0
Extinktion
1,5
1,0
0,5
0,0
TGFβ1 pg/ml (log10)
Abb. 8: Standardkurve TGFβ1-ELISA. Gezeigt ist eine repräsentative Kurve, die in den entsprechenden
Versuchen als Grundlage der quantitativen Bestimmung der TGFβ1-Konzentrationen diente. Die
Konzentrationen wurden mit Hilfe der Gleichung der Regressionsgraden errechnet.
3.14 Nachweis von TH17-Zellen
Produktion von IL-17 gilt als Marker für TH17-Zellen, ist jedoch nicht für diese spezifisch.
Nachweis der Produktion von IL-17 durch CD4 + T-Zellen gilt jedoch neben der PCR des
Transkriptionsfaktors RORγt als etablierte Methode zum Nachweis von T H17-Zellen (Sakaguchi,
2000).
3.15 Messung freier Zytokinspiegel in Peritonealflüssigkeit
In unterschiedlichen Versuchsansätzen wurden IL-17 und TGFβ1 quantitativ in Peritonealflüssigkeit
erfasst. Die beschriebenen Experimente wurden zwei Mal wiederholt. Die dargestellten Ergebnisse
sind repräsentativ für die durchgeführten Einzelexperimente. Für jede Versuchsgruppe wurden
56
jeweils vier C57BL/6 Wildtyp-Mäuse gleichen Geschlechts im Alter von sechs bis acht Wochen
verwendet. Das Gewicht der eingesetzten Tiere betrug zwischen 19 und 22 Gramm.
Nach intraperitonealer Injektion von Sp1 sollten die freien Konzentration von IL-17 und TGFβ1 zu
unterschiedlichen Zeitpunkten quantitativ in der Peritonealflüssigkeit bestimmt werden.
Kontrollgruppen bezeichneten naive Mäuse beziehungsweise Mäuse, denen 0,68 µl/g
Körpergewicht SCCA aufgefüllt mit PBS auf ein Gesamtvolumen von 200 µl injiziert wurden, zur
Überprüfung der isolierten Auswirkungen von SCCA auf die jeweiligen intraperitonealen ZytokinKonzentrationen. An den Interventionsgruppen erfolgte die intraperitoneale Injektion von 100 µl
Sp1 und 0,68 µl/g Körpergewicht SCCA, aufgefüllt mit PBS auf ein Gesamtinjektionsvolumen von
200 µl. Die Peritoneallavage erfolgte vier und acht Stunden sowie zu einem späten Zeitpunkt
achtzehn Stunden post injectionem.
3.16 Messung der Zytokinproduktion von Zellen aus der Peritoneallavage
Nach dem quantitativen Nachweis der freien intraperitonealen Zytokinkonzentrationen in vivo,
sollte die Produktion von IL-17 und TGFβ1 durch die jeweilige intraperitoneale Zellpopulation
quantitativ in vitro analysiert werden. Hierzu mussten Zellen durch Peritoneallavage gewonnen
werden. Für jede Versuchsgruppe wurden jeweils vier C57BL/6 Wildtyp-Mäuse gleichen
Geschlechts im Alter von sechs bis acht Wochen verwendet. Das Gewicht der eingesetzten Tiere
betrug zwischen 19 und 22 Gramm. Als erste Kontrollgruppe dienten naive Mäuse; an einer zweiten
Kontrollgruppe erfolgte die intraperitoneale Injektion von 0,68 µl/g Körpergewicht SCCA
aufgefüllt mit PBS auf ein Gesamtvolumen von 200 µl. Der Interventionsgruppe wurden 100 µl Sp1
und 0,68 µl/g Körpergewicht SCCA aufgefüllt mit PBS auf ein Gesamtinjektionsvolumen von 200
µl
injiziert.
Die
Peritoneallavage
erfolgte
achtzehn
Stunden
post
injectionem.
Nach
Erythrozytenlyse erfolgte die Verteilung von je 1,5x106 Zellen auf 1 Well einer 24 Well-Plate
(NUNC Multidish, Nunc GmbH & Co KG, Langenselbold, D). Die Wells wurden auf ein
Gesamtvolumen von 1 ml mit Medium aufgefüllt. Zur spezifischen Stimulation wurden 1 µl antiCD3 und 2,5 µl anti-CD28 hinzugegeben und bei 36° Celsius und 5% CO 2 für achtzehn Stunden
inkubiert. Anschließend wurden die Well-Plates bei 1500 rpm für 10 min zentrifugiert und die
zellfreien Überstände gewonnen.
3.17 Messung der Zytokinproduktion in der Milz
57
In mehreren unterschiedlichen Versuchsansätzen sollte die Auswirkung der intraperitonealen
Injektion von Sp1 auf die Produktion von IL-17 und TGFβ1 in der Milz quantitativ und im
zeitlichen Verlauf erfasst werden. Alle Versuche wurden wiederholt. Je Auswertung wurde jeweils
nur eine Milz verwendet; ein Pooling fand nicht statt. Die dargestellten Ergebnisse sind
repräsentativ für die einzelnen Versuchsdurchgänge.
C57BL/6 Wildtyp-Mäuse gleichen Geschlechts im Alter von sechs bis acht Wochen und mit einem
Gewicht von 19 bis 22 Gramm wurden je einer Kontroll- und zwei Interventionsgruppen zugeteilt.
Die Kontrollgruppe verblieb naiv; an den Interventionsgruppen erfolgte die intraperitoneale
Injektion von 100 µl Sp1 und 0,68 µl/g Körpergewicht SCCA, aufgefüllt mit PBS auf ein
Gesamtinjektionsvolumen von 200 µl. Die Inkubationszeit in den Interventionsgruppen wurde nach
vier respektive acht Stunden beendet. Um die Auswirkungen auf die Zytokinspiegel zu einem
späten Zeitpunkt erfassen zu können, wurde eine weitere Versuchsreihe angelegt, deren Einwirkzeit
in vivo 18 Stunden betrug. Als Kontrollgruppe dienten naive Wildtyp-Mäuse sowie Wildtyp-Mäuse,
denen 0,68 µl/g Körpergewicht SCCA aufgefüllt mit PBS auf ein Gesamtvolumen von 200 µl
injiziert wurde; die Interventionsgruppe erhielt 100 µl Sp1 und 0,68 µl/g Körpergewicht SCCA,
aufgefüllt mit PBS auf ein Gesamtinjektionsvolumen von 200 µl.
Nach Herstellung einer Milzsuspension erfolgte die Aliquotierung des zellfreien Überstandes. Die
Aliquots wurden mittels ELISA auf die Konzentration an freiem IL-17 analysiert. Das verbleibende
Zellpellet wurde einer Erythrozytenlyse unterzogen und im Anschluss je 3x10 6 Zellen in 1 ml
Medium auf je 1 FACS-Tube verteilt. Zur Lösung wurden jeweils 1 µl anti-CD3 und 2,5 µl antiCD28 hinzugegeben und bei 36° Celsius und 5% CO 2 für sechs Stunden inkubiert. Nach
Zentrifugation wurden die Überstände gewonnen und mittels ELISA auf IL-17 untersucht.
Desweiteren wurden CD4+ T-Helferzellen aus der Zelllösung mit Hilfe des MACS CD4 T-Cell
Isolation Kit gemäß Protokoll isoliert, entsprechend vorgenanntem Vorgehen verteilt, stimuliert und
inkubiert und im Anschluss die zellfreien Überstände mittels ELISA auf IL-17 untersucht. Weiterhin
wurden zwei getrennten Ansätzen jeweils isolierte CD4 + T-Helferzellen aus der Milz
beziehungsweise unselektionierte Milzzellen aus nativen C57BL/6 Wildtyp-Mäusen zu je 3x10 6
Zellen in 1 ml Medium auf je 1 FACS-Tube verteilt. Diese Zelllösung wurde im Anschluss in vitro
entweder mit 100 µl Sp1 (1 mg/ml) oder allein mit 100 µl Medium (Kontrollgruppe) versetzt und
bei 36° Celsius und 5% CO 2 für achtzehn Stunden inkubiert. Die zellfreien Überstände der
isolierten CD4+ Zellen wurden mittels ELISA aus ökonomischen Gründen allein auf IL-17, die
Überstände der unselektionierten Lösung auf IL-17 und TGFβ1 untersucht.
58
4. Ergebnisse
4.1 Abszessmodell
4.1.1 Abhängigkeit der Sp1-induzierten Abszessbildung von IL-17
Zwitterionische Polysaccharide induzieren in Mäusen und Ratten nach Injektion in das Cavum
peritonei die Ausbildung intraperitonealer Abszesse (Tzianabos, Onderdonk, Rosner, Cisneros, &
Kasper, 1993) (Tzianabos et al. 1994). Die Abszessbildung wird mediiert von CD4+ Zellen
(Tzianabos, Wang, & Lee, 2001). Für die zwitterionischen Kapselpolysaccharide von Bacteroides
fragilis konnte gezeigt werden, dass IL-17 für die Entstehung der Abszesse eine entscheidende
Rolle spielt (Chung et al. 2003). Tiere, die mit einem blockierenden Antikörper gegen IL-17
intraperitoneal behandelt wurden, bildeten signifikant weniger Abszesse aus. Auch das kapsuläre
Polysaccharid Sp1 aus Streptococcus pneumoniae ist in der Lage, intraperitoneale Abszesse zu
induzieren (Tzianabos, Onderdonk, Rosner, Cisneros, & Kasper, 1993). Die Bedeutung von IL-17
in der Abszessgenese durch Sp1 ist bisher unklar (Meemboor et al. 2009). Wir untersuchten die
Abszessbildung durch Sp1 in Wildtyp- und IL-17-/- Mäusen.
SCCA dient der Abszessbildung durch Sp1 als Adjuvans, indem es den peritonealen Übertritt
intestinaler Microflora simuliert wie er sich beispielsweise im Rahmen einer peritonealen Sepsis
findet (Stephen et al. 2007) (Onderdonk, Kasper, Cisneros, & Bartlett, 1977). Injektion von SCCA
alleine führt nicht zu regelhaftem Nachweis einer Abszessbildung in Wildtyp- oder IL-17 -/Mäusen.
Die intraperitoneale Injektion von Sp1 zusammen mit dem Adjuvans SCCA führte zur Ausbildung
von Abszessen in der Bauchhöhle von Wildtyp-Mäusen (Tab 1). In der Mehrheit der Fälle fand sich
je ein Abszess pro Tier mit einem mittleren Durchmesser von 3,6 mm (Abb. 9). Nur in drei Fällen
wurden zwei bis drei Abszesse pro Tier identifiziert, wobei die begleitenden Abszesse eine Größe
von 1,5 mm nicht überschritten. Es floss nur jeweils der größte Abszess in die Auswertung ein.
Insgesamt fanden sich nach Injektion von Sp1 in 14 von 15 Fällen (93,3%) Abszesse (Tab. 1).
Unsere Messungen liegen innerhalb der Streubreite der Abszessbildung wie sie für das Modell in
der Literatur vorgefunden wird (Chung et al. 2003) (Meemboor et al. 2009) (Mertens et al. 2009)
(Groneck et al. 2009).
59
Abb. 9: Abszessbildung nach intraperitonealer Injektion von Sp1 in Wildtyp-Mäusen. Punkte
markieren den größten Abszessdurchmesser des Versuchstieres, Querbalken den mittleren
Abszessdurchmesser der Versuchskohorte.
Im Vergleich zum Wildtyp zeigen Mäuse, denen das Gen zur Expression von IL-17 fehlt, eine
geringere Ausbildung von Abszessen nach Injektion von Sp1. Der mittlere Durchmesser der
Abszesse lag bei 0,8 mm; der Durchmesser des größten gefundenen Abszesses bei 2 mm. Auch fand
sich nicht mehr als jeweils ein Abszess pro Tier. Insgesamt fanden sich in 9 von 15 Fällen (60%)
Abszesse (Abb. 10).
60
61
Anzahl der Mäuse mit
Gruppe
Wildtyp
IL-17-/-
Challenge
Abszess/Gesamtzahl Mäuse (%)
p-Wert
naiv
0/15 (0)
PBS
1/15 (6,6)
1,0
SCCA + PBS
1/15 (6,6)
1,0
Sp1 + SCCA + PBS
14/15 (93,3)
0,0000002
naiv
0/15 (0)
PBS
0/15 (0)
1,0
SCCA + PBS
2/15 (13,3)
0,48275
Sp1 + SCCA + PBS
9/15 (60)
0,0007
Tab. 1: Abszessformation in Wildtyp- und IL-17-/- Mäusen nach intraperitonealer Injektion von Sp1. Die
Berechnung der P-Werte erfolgte mittels zweiseitigem exaktem Fisher-Test gegenüber den entsprechenden
naiven Kontrollen.
4.2 ELISA
4.2.1 Ausschüttung von IL-17 und TGFβ1 durch peritoneale Zellen nach Injektion von Sp1
Wir untersuchten mittels ELISA, wie sich die freien Spiegel von IL-17 und TGFβ1 in der
Peritonealflüssigkeit zu unterschiedlichen Zeitintervallen nach Injektion von Sp1 im Vergleich zu
Kontrollgruppen
verhielten.
Für
die
ausgewählten
Zeitintervalle
zur
Bestimmung
der
Konzentrationen von IL-17 und TGFβ1 in der Lavageflüssigkeit orientierten wir uns an
Erkenntnissen aus entsprechenden Untersuchungen zu IL-6 (Meemboor et al. 2009):
Intraperitoneale Injektion von Sp1 zusammen mit dem Adjuvans SCCA führt zu signifikanter
Ausschüttung von Interleukin-6 in die Peritonealflüssigkeit. Mittels ELISA zeigt die Kinetik der IL6-Ausschüttung ihr Maximum vier bis acht Stunden nach Injektion. Die IL-6-Spiegel bleiben auch
48 Stunden nach Injektion gegenüber der Kontrolle erhöht. IL-6 besitzt zusammen mit TGFβ1 eine
entscheidende Rolle in der Differenzierung von T H-17 Zellen, einem kürzlich neu definierten
Zelltyp, benannt nach der Produktion und Ausschüttung von IL-17 (Veldhoen et al. 2006) (Mangan
et al. 2006) (Stockinger and Veldhoen 2007) (Stockinger, Veldhoen, et al. 2007) (Xu et al. 2007) (de
Jong et al. 2010).
62
Vier und acht Stunden nach intraperitonealer Injektion von Sp1 fand sich gegenüber der Kontrolle
ein Trend in Richtung erhöhter Spiegel von IL-17 in der Lavage. Ihr Maximum zeigte die Erhöhung
hierbei nach vier Stunden (Abb. 11).
IL-17 in Flüssigkeit aus Peritoneallavage [pg/ml]
10
6,823
6,653
5,546
5
0
Kontrolle naiv
SCCA + Sp1
4h
SCCA + Sp1
8h
Achtzehn Stunden nach intraperitonealer Injektion von Sp1 fand sich für die kombinierte Injektion
von Sp1 und SCCA ein geringgradig erhöhter Nachweis von IL-17 im Vergleich zur naiven
Kontrolle oder der Injektion von SCCA alleine (Abb. 12). Somit blieben die IL-17-Spiegel auch
zum späteren Messzeitpunkt nach achtzehn Stunden noch erhöht. Es ließ sich jeweils auch in den
naiven Kontrollgruppen ein Nachweis eines Basalspiegels von IL-17 erbringen.
63
IL-17 in der Lavageflüssigkeit [pg/ml]
10
7,87
7,56
8
6,54
5
Kontrolle naiv
SCCA
SCCA + Sp1
Ein Direktvergleich der Absolutmengen von IL-17 in den dargestellten Ergebnissen ist kritisch zu
sehen, da auf zwei unterschiedliche Kohorten an Versuchstieren zurückgegriffen wurde. Auch ist
die Bestimmung freier Zytokinkonzentrationen in der Lavageflüssigkeit aufgrund eines größeren
Einflusses von Verdünnungseffekten mit höheren Schwankungen zwischen verschiedenen
Messreihen behaftet. Die erfassten Zytokinmengen lagen jeweils sicher oberhalb der Grenze der
testdiagnostischen Sensitivität des eingesetzten ELISA-Kits (4 pg/ml).
TGFβ1 ist neben IL-6 ein entscheidender Kofaktor in der Ausdifferenzierung von TH-17 Zellen
(Veldhoen et al. 2006) (Mangan et al. 2006) (Bettelli et al. 2006) (Li et al. 2007) (Yang, Anderson,
et al. 2008) (McGeachy et al. 2007). Wir untersuchten die Konzentrationen an TGFβ1 nach
intraperitonealer Injektion von Sp1 in der Lavageflüssigkeit. Nach achtzehn Stunden
Inkubationszeit führte die kombinierte Injektion von Sp1 und SCCA zu erhöhten Messwerten im
Vergleich zur Injektion von SCCA alleine (Abb. 13). In der naiven Kontrollgruppe ließ sich TGFβ1
sicher nachweisen, jedoch lagen die Spiegel unterhalb der Spiegel in den Interventionsgruppen. Alle
Messwerte lagen oberhalb der Sensitivitätsgrenze des eingesetzten ELISA-Kits (60 pg/ml).
64
TGFbeta in Flüssigkeit der Peritoneallavage [pg/ml]
110
105,633
100,577
100
97,724
90
Kontrolle naiv
SCCA
SCCA + Sp1
Abb. 13: TGFβ1 in der Peritoneallavage 18 Stunden nach
intraperitonealer Injektion von Sp1 + SCCA.
In vivo finden sich demnach leicht erhöhte Spiegel von IL-17 und TGFβ1 in der
Peritonealflüssigkeit nach intraperitonealer Injektion von Sp1. In der Folge sollten diese empirisch
nachgewiesenen Trends in mehreren Versuchsansätzen in vitro analysiert und die beteiligten
Zellpopulationen definiert werden. Hierzu gewannen wir Zellen aus der Lavageflüssigkeit und
unterzogen sie in vitro einer T-Zell-spezifischen Stimulation mit anti-CD3 und anti-CD28, um TZellen zu einer vermehrten Produktion des spezifischen Zytokinprofils zu veranlassen. Ein
quantitativer Vergleich der IL-17- und TGFβ1-Konzentrationen im Überstand der in vitro-Kultur
sollte als indirekter Parameter für die Anzahl jeweilig differenzierter, IL-17- respektive TGFβ1produzierender Zellen innerhalb der intraperitonealen Gesamtpopulation dienen. Analyse der
Interventionsgruppe achtzehn Stunden nach intraperitonealer Injektion von Sp1 zeigte einen
deutlichen Anstieg von IL-17. Auch in der Kontrollgruppe, in der SCCA alleine intraperitoneal
injiziert wurde, fand sich gegenüber der naiven Kontrolle eine erhöhte IL-17-Konzentration. In der
naiven Kontrollgruppe ist IL-17 mit merklich geringerem Spiegel nachweisbar (Abb. 14, Abb. 15).
65
1200
IL-17 im Überstand restimulierter Zellen
aus der Peritoneallavage [pg/ml]
1026,12
600
265,09
10,05
0
Kontrolle naiv
SCCA
SCCA + Sp1
Abb. 14: IL-17 aus Zellen der Peritoneallavage nach Stimulation mit
anti-CD3 und anti-CD28 in vitro. Kontroll- und Interventionsgruppen
stellen ein Pooling von je vier verwendeten Versuchstieren dar.
66
IL-17 im Überstand restimulierter Zellen
aus der Peritoneallavage [pg/ml (log10)]
10000
1026,12
1000
265,09
100
10
10,05
1
Kontrolle naiv
SCCA
SCCA + Sp1
Auch für TGFβ1 zeigt sich eine geringgradig gesteigerte Produktion unter Sp1 im Vergleich zu
SCCA alleine oder der naiven Kontrolle. Auch SCCA alleine vermag die TGFβ1-Produktion zu
steigern, jedoch ist unter Einsatz von Sp1 die TGFβ1-Produktion höher (Abb. 16).
67
TGFbeta im Überstand restimulierter Zellen
aus der Peritoneallavage [pg/ml]
110
100,577
100
96,895
93,068
90
Kontrolle naiv
SCCA
SCCA + Sp1
Abb. 16: TGFβ1 aus Zellen der Peritoneallavage nach
Stimulation in vitro. Kontroll- und Interventionsgruppen
stellen ein Pooling von je vier verwendeten Versuchstieren dar.
4.2.2 IL-17-Produktion in der Milz nach intraperitonealer Injektion von Sp1
Wir konnten zeigen, dass peritoneale Zellen nach intraperitonealer Injektion von Sp1 und
anschließender Restimulation mit anti-CD3 und anti-CD28 in vitro zu einer vermehrten Sekretion
von IL-17 befähigt sind. In der Folge sollte untersucht werden, ob nach intraperitonealer Sp1Injektion eine systemisch messbare IL-17-Antwort folgt. Wir untersuchten die Ausschüttung von
IL-17 und TGFβ1 durch Zellpopulationen der Milz nach intraperitonealer Injektion von Sp1. Das
Zytokinmuster in der Milz diente hierbei als stellvertretender Marker einer systemischen
Immunreaktion auf den lokalisierten intraperitonealen immunologischen Reiz.
Nach Injektion von Sp1 fand sich im zellfreien Überstand der Zellsuspension einer vier Stunden
nach Challenge entnommenen Milz eine geringere Gesamtkonzentration an IL-17 als in der naiven
Kontrollgruppe ( Abb. 17).
IL-17 im Überstand der Milzsuspension [pg/ml]
68
30
17,298
15
12,417
0
Kontrolle naiv
SCCA + Sp1
Wurden diese unselektionierten Zellen der vier Stunden nach Injektion entnommenen Milz einer
Stimulation in vitro unterzogen, fanden sich nahezu identische Konzentrationen an IL-17 zwischen
naiver Kontrolle und Interventionsgruppe. Wurde die Milz acht Stunden nach Injektion entnommen,
fanden sich nach Stimulation mit anti-CD3 und anti-CD28 in vitro geringgradig erhöhte
IL-17 im Überstand restimulierter Milzzellen [pg/ml]
Konzentrationen an IL-17 im Vergleich zur Kontrolle (Abb. 18).
10
6,436
5,603
5,644
5,493
Kontrolle naiv
SCCA + Sp1
Kontrolle naiv
5
0
4h Inkubation
SCCA + Sp1
8h Inkubation
Abb. 18: IL-17 aus Zellen der Milz nach Stimulation mit antiCD3/anti-CD28 in vitro. Die Milzen wurden vier bzw. acht
Stunden nach intraperitonealer Challenge entnommen.
69
Achtzehn Stunden nach Injektion und anschließender Stimulation fand sich eine gering erhöhte IL17 Konzentration in der Interventionsgruppe (Abb. 19). Die Konzentration von TGFβ1 achtzehn
Stunden nach Entnahme der Milz und Stimulation in vitro war jedoch unter Sp1 geringer als in der
Kontrollgruppe (Abb. 20).
IL17 im Überstand
restimulierter Milzzellen [pg/ml]
10,0
8,60
8,06
7,5
5,0
Kontrolle naiv
Sp1
Abb. 19: IL-17 aus Zellen der Milz nach
Stimulation mit anti-CD3/anti-CD28 in vitro. Die
Milzen wurden 18 Stunden nach intraperitonealer
Challenge entnommen.
TGFbeta im Überstand restimulierter Milzzellen [pg/ml]
70
110
104,858
105,172
99,724
100
90
Kontrolle naiv
SCCA
SCCA + Sp1
Abb. 20: TGFβ1 aus Zellen der Milz nach Stimulation mit antiCD3/anti-CD28 in vitro. Die Zellen wurden 18 Stunden nach
intraperitonealer Challenge gewonnen.
CD4+ TH-17 Zellen gelten als zentrale Quelle einer spezifischen IL-17 Ausschüttung nach
Konfrontation des Organismus mit extrazellulären Pathogenen (Liu, Yadav, et al. 2009) (Bettelli et
al. 2008). Allerdings gilt IL-17 auch als Produkt weiterer Zellen aus dem Rahmen der angeborenen
Immunität, z.B. Makrophagen (Song et al. 2008) (Gu et al. 2008) oder Neutrophile (Ferretti et al.
2003b), und erworbenen Immunität, z.B. CD8+CD45RO+ Zellen (Kolls & Lindén, 2004).
Zur Beantwortung der Frage, ob die Messungen der IL-17 Konzentration innerhalb der Milz durch
die Reaktion spezifischer CD4+ TH-17 Zellen bedingt sind, führten wir eine Isolation von CD4 +
Zellen aus einer Milzsuspension durch. Die Zellisolation erfolgte vier und acht Stunden nach
intraperitonealer Injektion von Sp1 mittels MACS Isolations-Kit. Als Kontrollgruppe dienten Zellen
aus naiven Wildtyp-Mäusen.
Die Absolutkonzentrationen von IL-17 im Überstand stimulierter CD4 + Zellen glichen denjenigen,
die zuvor im Überstand der gesamten Milzzellpopulation gefunden wurden. Es zeigte sich kein
Unterschied zwischen Kontrolle und Interventionsgruppe, wenn die Zellen vier oder acht Stunden
nach Injektion von Sp1 gewonnen wurden. Der zuvor in der undifferenzierten Zelllösung
71
beobachtete, dezente Anstieg der IL-17 Konzentration nach acht Stunden Inkubation entfiel für die
IL-17 in CD4+ Milzzellen nach Restimulation [pg/ml]
isolierten CD4+ Zellen (Abb. 21).
10
5,465
5,644
5,479
5,493
Kontrolle naiv
SCCA + Sp1
Kontrolle naiv
SCCA + Sp1
5
0
4h Inkubation
8h Inkubation
Abb. 21: IL-17-Produktion durch isolierte CD4+ Zellen aus der
Milz. Die Zellen wurden vier und acht Stunden nach Challenge
gewonnen.
Die Beobachtungen der Zytokinkonzentrationen in der Milz bleiben an dieser Stelle in ihrer
Bedeutung letztlich nicht abschließend und eindeutig zu interpretieren. Dennoch erlauben sie die
Hypothese, dass sich unter den CD4 + Zellen der Milz eine Population von Zellen befindet, die zur
Produktion von IL-17 befähigt ist. Die intraperitoneale Injektion von Sp1 führt jedoch nach kurzem
Zeitabstand nicht zu einer wesentlichen Vermehrung IL-17 produzierender CD4 + Zellen in der Milz.
In diesem Zusammenhang könnte man die Milz als Ort einer späteren, systemischen Immunreaktion
sehen. IL-17 und TH-17 Zellen gelten bislang besonders als Vermittler rapider Immunantworten
gegenüber extrazellulären Pathogenen an mucosalen Oberflächen (Bettelli et al. 2008) (Khader et
al., 2007).
Ein beobachteter, geringgradiger Anstieg von IL-17 in der undifferenzierten Zelllösung später als
acht Stunden nach Injektion von Sp1 erregt den Verdacht, dass möglicherweise weitere Zelltypen in
die Ausbildung einer IL-17 Antwort in der Milz involviert sind. Diese Zellpopulationen dienen
72
entweder selbst als Quelle für IL-17 oder sie könnten die Produktion von IL-17 durch CD4 + TH-17
Zellen auf an dieser Stelle nicht geklärte Art und Weise stimulieren. Im Zeitverlauf kann der
Anstieg der IL-17 Konzentration eine Einwanderung IL-17 produzierender Zellen darstellen oder
durch Ausdifferenzierung autochthoner Milzzellen zu IL-17 Produzenten bewirkt sein.
Um die Auswirkungen von Sp1 auf autochthone Milzzellen darzustellen, unterzogen wir Milzzellen
naiver Wildtyp-Mäuse einer Kultur mit Sp1 in vitro. Nach achtzehn Stunden Inkubation mit Sp1
lagen die IL-17-Konzentrationen der naiven Kontrolle bei rund 5 pg/ml. Damit lagen die
Konzentrationen in der Größenordnung derjenigen, die die Untersuchungen an Milzzellen nach
Konfrontation mit Sp1 in vivo erbracht haben. Kultur mit Sp1 zeigte einen Trend in Richtung einer
vermehrten Ausschüttung von IL-17 (Abb. 22).
IL-17 in Milzzellen in vitro [pg/ml]
10
6,581
5,385
5
0
Kontrolle naiv
Sp1
Abb. 22: IL-17-Ausschüttung 18 Stunden nach Inkubation
unselektionierter Milzzellen mit Sp1 in vitro.
Die direkte Konfrontation naiver Milzzellen mit Sp1 in vitro führt demnach zu messbarer IL-17Antwort. Es zeigt sich ein Trend in Richtung der Fähigkeit der autochthonen Milzzellpopulation,
IL-17-produzierende Zellen aus ihren Reihen zu generieren. Dieser Prozess könnte in Abhängigkeit
von TGFβ1 erfolgen. Parallel zur Ausschüttung von IL-17 war die Ausschüttung von TGFβ1 durch
die Zellen der Milz nach achtzehn Stunden Inkubation mit Sp1 in vitro gegenüber der naiven
Kontrolle erhöht (Abb. 23).
TGFbeta im Überstand der Milzzellen in vitro [pg/ml]
73
Abb.
110
101,298
100
98,288
90
Kontrolle naiv
23:
Ausschüttung
Sp1
von
TGFβ1
durch
unselektionierte Zellen der Milz nach 18h Inkubation
mit Sp1 in vitro.
4.2.3. Zusammenfassung der ELISA-Analysen
Die gezeigten Ergebnisse der ELISA-Versuchsreihen können an dieser Stelle insofern
zusammengefasst werden, als dass sich nach intraperitonealer Injektion von Sp1 eine geringgradige
lokale IL-17- und TGFβ1-Produktion nachweisen lässt. Unter Restimulation mit anti-CD3/antiCD28 ex vivo lässt sich die peritoneale Zellpopulation deutlich zur Produktion von IL-17 anregen.
In der Milz sind zu den untersuchten Versuchszeitpunkten allenfalls nur geringe Trends zur
Produktion von IL-17 und TGFβ1 nachweisbar.
4.3 FACS
4.3.1 Anteil der CD4+ Zellen an der intraperitonealen Gesamtzellpopulation
Rund 40% aller Zellen in der Peritonealflüssigkeit nach Injektion von Sp1 sind Makrophagen und
etwa 7% CD11c+ dendritische Zellen (Stephen et al. 2007). Die Angaben der Literatur für den
Anteil CD4+ Zellen an der intraperitonealen Gesamtpopulation belaufen sich auf circa 1%
(Meemboor et al. 2009) (Stephen et al. 2007). Wir fanden einen Influx von CD4+ Zellen in Wildtypund IL-17 -/- Mäusen von anteilig circa 1,7% bei geringer Schwankungsbreite (Abb. 24). Es fanden
sich keine größeren Unterschiede zwischen Kontrollgruppen und nach Injektion von Sp1.
74
Abb. 24: Anteil der CD4+ Zellen an allen registrierten Zellen in der
Peritonealflüssigkeit. Dargestellt sind die Mittelwerte aus drei unabhängigen
Versuchen. Fehlerbalken geben die Maxima wieder. Es fanden sich keine
signifikanten Unterschiede zwischen Interventions- und Kontrollgruppen.
4.3.2 Expression von TGFβ1 in BMDC durch Sp1
Dendritischen Zellen aus dem Knochenmark (engl., bone marrow derived dendritic cells, BMDC)
kommt als Antigen-präsentierenden Zellen neben Makrophagen (Gibson et al. 1998) in der
Entstehung intraperitonealer Abszesse durch Sp1 eine bedeutende Rolle zu (Stephen et al. 2007).
BMDC führen nach Aufnahme von Sp1 zu MHC-II-abhängiger Induktion reaktiver CD4 + Zellen.
Darüber hinaus produzieren BMDC proinflammatorische Zytokine wie IL-6 (Meemboor et al.
2009).
BMDC zeigen nach Konfrontation mit Sp1 in vitro eine Zunahme der Expression von LAP (Abb.
25).
75
Abb.
25:
LAP-Expression
durch
CD11c+
BMDC
nach
unterschiedlichen
Inkubationszeiten mit Sp1. Die linke Spalte zeigt die Kontrollgruppe, rechts nach
Inkubation mit Sp1. Von oben nach unten nach 8, 24, 33 und 48 Stunden Inkubation.
Die Marker wurden gegen die jeweiligen Isotypkontrollen (nicht gezeigt) gesetzt.
76
Die Expression von LAP ist ein spezifischer Marker für die Produktion von TGFβ1. Wir konnten
zeigen, dass die Expression von LAP ein Maximum nach 24 Stunden Inkubation mit Sp1 zeigt
(Abb. 26).
50
39,2
Anteil von BMDC mit Expression von LAP [%]
40
33,5
32,3
30
26,4
25
23
20
19,8
18,3
10
0
8
24
33
48
Inkubationszeit [h]
Abb. 26: Kinetik der LAP-Expression in BMDC. Gezeigt sind die Anteile LAP-exprimierender
BMDC
nach
unterschiedlichen
Kontrollgruppe (Quadrate).
Inkubationszeiten
mit
Sp1
(Rauten)
gegenüber
der
77
4.3.3 Expression von IL-6 in BMDC durch Sp1
Meemboor et al. konnten mittels ELISA-Untersuchungen zeigen, dass Sp1 zur Freisetzung von IL-6
durch BMDC in vitro führt (Meemboor et al. 2009). Wir konnten mit Hilfe intrazellulärer
Zytokinfärbungen allenfalls einen geringen Trend aufzeigen, dass BMDC nach Konfrontation mit
Sp1 in vitro vermehrt zur Produktion von IL-6 angeregt werden (Abb. 27). Die BMDC der
Interventionsgruppe zeigen sich qualitativ höher positiv auf IL-6 (Abb. 28).
Abb. 27: IL-6 Produktion durch CD11c+ BMDC. Nach Konfrontation mit Sp1 in vitro
(rechts) zeigen BDMC vermehrte intrazelluläre Akkumulation von IL-6 gegenüber der
Kontrolle (links). Die Quadrantenmarker wurden gegen die entsprechenden Isotypkontrollen
(nicht gezeigt) eingestellt.
Abb. 28: IL-6 Produktion in BMDC nach Gabe von Sp1 in vitro (schwarze Linie) gegenüber
der naiven Kontrolle (graue Linie). Die gepunktete Linie stellt die Isotypenkontrolle der
Kontrollgruppe dar.
78
IL-6 besitzt eine entscheidende Rolle in der Differenzierung IL-17 produzierender Zellen. Neben
TH17-Zellen wurde auch für eine Reihe weiterer Zelllinien, unter diesen auch Antigenpräsentierende Zellen wie Makrophagen, Produktion von IL-17 nachgewiesen (Kolls & Lindén,
2004) (Song et al. 2008) (Gu et al. 2008). BMDC zeigten in unseren Versuchen keine Produktion
von IL-17. Auch nach unabhängiger selektiver Stimulation der jeweiligen BMDC mit mGM-CSF
konnte keine Produktion von IL-17 befördert werden.
4.3.4 IL-6-abhängiges Auftreten von peritonealen TH17-Zellen nach intraperitonealer Sp1Injektion
Nach intraperitonealer Injektion von Sp1 zeigen Wildtyp-Mäuse einen messbaren Influx von IL17+CD4+ Zellen in die Peritonealflüssigkeit (Abb. 29). Nach Stimulation mit anti-CD3/anti-CD28 in
vitro finden sich mit 24,2% aller CD4+ Zellen in der Lavage erhöhte Zellzahlen gegenüber der
Kontrollgruppe mit 4,5%. In IL-6 -/- Mäusen ist dieser Influx reduziert. Es finden sich unter Gabe
von Sp1 nur 6% TH17-Zellen an allen CD4+ Zellen in der Lavage. Die Kontrolle zeigt hier 5,5%.
79
Abb. 29: TH-17 Zellen in der Peritoneallavage. Gezeigt ist der prozentuale Anteil IL-17 +CD4+ Zellen an allen
CD4+ Zellen in Wildtyp-Mäusen (oben) sowie in IL-6 -/- Mäusen (unten). Dargestellt sind die
Interventionsgruppen nach Injektion von Sp1 (schwarze Linien) gegenüber den Kontrollgruppen (hellgraue
Linien). Die Marker wurden gegen die jeweiligen Isotypkontrollen (gepunktete Linien) gesetzt.
80
4.3.5 IL-6-abhängiges Auftreten von TH17-Zellen in der Milz nach intraperitonealer Sp1Injektion
Nach intraperitonealer Injektion von Sp1 an Wildtyp-Mäusen untersuchten wir die Anzahl von T H17 Zellen in der Milz über die intrazelluläre Färbung von IL-17 in CD4+ Zellen (Abb. 30). Achtzehn
Stunden nach Injektion zeigten 43,8% aller CD4+ Zellen in der Milz Expression von IL-17.
Dagegen fanden sich bei der Kontrollgruppe zum gleichen Zeitpunkt nur 26,7% IL-17 +CD4+ Zellen.
Wurden die Zellen einer Stimulation in vitro mit anti-CD3 und anti-CD28 unterzogen, fanden sich
60,3% TH17-Zellen. Der Anteil von TH17-Zellen in der Kontrollgruppe betrug hier 19,9%. IL-6 -/Mäuse zeigen gegenüber dem Wildtyp eine geringere Anzahl an TH17-Zellen in der Milz. In naiven
Tieren betrug der Anteil IL-17+CD4+ Zellen an der Gesamtpopulation alles CD4+ Zellen lediglich
3,5%. Nach Injektion von Sp1 erhöhte sich dieser Anteil auf 6,7%. Die Bestimmung der Zellzahlen
in IL-6 -/- Mäusen erfolgte jeweils nur nach Stimulation mit anti-CD3/anti-CD28 in vitro.
81
Abb. 30: TH17-Zellen in der Milz nach intraperitonealer Injektion von Sp1. Gezeigt sind Kontrollen (graue
Linien), Interventionsgruppen mit Injektion von Sp1 (schwarze Linien) von unstimulierten CD4 + Zellen aus
Wildtypmäusen (oben), Zellen aus Wildtypmäusen nach Stimulation mit antiCD3/antiCD28 sowie Zellen aus
IL-6 -/- Mäusen nach Stimulation mit antiCD3/antiCD28. Die Marker wurden gegen die jeweiligen
Isotypenkontrollen (gepunktete Linien) gesetzt.
82
4.3.6 Auftreten von TH17-Zellen in der Milz nach intravenöser Sp1-Injektion
Um die Auswirkungen einer unmittelbar systemischen Konfrontation mit Sp1 zu erfassen,
untersuchten wir die Anzahl von TH17-Zellen in der Milz nach intravenöser Injektion von Sp1 über
die intrazelluläre Färbung von IL-17 in CD4 + Zellen (Abb. 31). Nach in vitro Stimulation der
gewonnenen Zellen aus der Milz fanden sich nach Injektion von Sp1 signifikant mehr TH17-Zellen
anteilig am Gesamtpool aller CD4+ Milzzellen als dies in der Kontrollgruppe der Fall war. Mit
19,3% finden sich jedoch weniger TH17 anteilig am Gesamtpool aller Zellen der Milz als nach
intraperitonealer Injektion von Sp1.
Abb. 31: TH17-Zellen in der Milz nach intravenöser Injektion von Sp1. Gezeigt sind die Kontrollgruppe
(graue Linie) sowie die Interventionsgruppe (schwarze Linie) nach Stimulation mit anti-CD3/anti-CD28 in
vitro. Die gepunktete Linie zeigt die Isotypenkontrolle der Kontrollgruppe.
83
4.3.7 Sp1-induzierte Entwicklung von TH17-Zellen in vitro
Um zu untersuchen, ob Sp1 die Entwicklung von TH17-Zellen aus einem Pool naiver Milzzellen
induziert, inkubierten wir Milzzellkulturen mit Sp1 in vitro (Abb. 32). Vier Stunden nach
Inkubation und Stimulation mit PMA/Ionomycin fanden sich mit 13% gegenüber der Kontrolle mit
7,3% erhöhte Zahlen von IL-17+CD4+ Zellen in der Kulturlösung.
Abb. 32: Induktion von TH17-Zellen durch Sp1. In-vitro-Kultur und Restimulation (PMA/Ionomycin)
naiver Milzzellen mit Sp1 (schwarze Linie) sowie die entsprechende Kontrolle (graue Linie). Die
gepunktete Linie stellt die Isotypenkontrolle der Kontrollgruppe dar.
4.3.8. Zusammenfassung der FACS-Analysen
Zusammengefasst zeigen die Ergebnisse der FACS-Analysen, dass Sp1 im murinen Modell nach
Injektion in vivo zu einer nachweisbaren Induktion von TH17-Zellen intraperitoneal sowie in der
Milz führt. Die Induktion von TH17-Zellen durch Sp1 fällt in IL-6-defizienten Mäusen geringer aus.
Nach ex vivo Restimulation von isolierten Zellen aus Milz und Peritoneallavage mit anti-CD3/antiCD28 lässt sich die Rate an IL-17+CD4+ Zellen steigern. Sp1 induziert darüberhinaus in vitro in
einem unselektionierten Pool von Milzzellen nach T-Zell-spezifischer Restimulation das Auftreten
von TH17-Zellen. Nach in vitro Kultur mit Sp1 lässt sich in BMDC die Expression von LAP sowie
ein Trend zur Produktion von IL-6 nachweisen.
84
5. Diskussion
5.1 IL-17 und die Abszessbildung durch ZPS
Die Entstehung von intraabdominellen Abszessen ist ein komplexer, fein regulierter
immunologischer Prozess. Einerseits gilt sie als kontrolliert verlaufende Entzündung mit
immunsuppressiven Anteilen zur Verhinderung einer Sepsis. Andererseits gilt die Entstehung von
Abszessen als spezifische inflammatorische und destruktive Reaktion auf Pathogene (Groneck et al.
2009).
IL-17 gilt als hochgradig proinflammatorischer Mediator in der Abwehr einer Vielzahl an
Pathogenen sowie in unterschiedlichen autoimmunologischen Prozessen (Steinman 2007). Von TH1Zellen produzierte Zytokine wie IFNγ und TNF sind verantwortlich für Gewebsschädigungen in
vielen Immunphänomenen (Murphy et al. 2008).
Vor dem Hintergrund des TH1/TH2-Paradigmas (Mosmann & Coffman, 1989) blieben einzelne
widersprüchliche Erkenntnisse aus Untersuchungen diverser etablierter Entzündungsmodelle
ungeklärt. So galten TH1-Zellen lange Zeit exklusiv als Motor autoimmunologischer Erkrankungen
wie beispielsweise der experimentellen autoimmunen Encephalomyelitis (engl., experimental
autoimmune encephalitis, EAE), einem murinen Modell multipler Sklerose (Steinman 2007). Die
Vorstellung von TH1-Zellen als alleinige Mediatoren von Autoimmunität hinterlässt jedoch viele
offene Fragen. Unter anderem blieb hier nicht erklärlich, weshalb Blockade des TH1Effektorzytokins IFNγ zu einer Verschlechterung des Bilds der EAE führt (Billiau et al. 1988) .
Ebenso sind Fragen in Bezug auf die Effektor-Zytokine, die an der Abszessbildung durch ZPS
beteiligt sind, bislang offen. CD4+ T-Zellen sind entscheidend involviert in die Entwicklung von
intraabdominellen Abszessen nach Injektion von Sp1. Es finden sich signifikante Zahlen von CD4 +
T-Zellen in der Abszesswand, was darauf hinweist, dass diese Zellen teilhaben an der Organisation
der fibrinösen Abszesskapsel (Chung et al. 2003). CD4+ T-Zellen tragen über die Produktion von
TNFα, IFNγ und IL-1β, dem charakteristischen TH1-Zytokinprofil, zur Abszessbildung bei.
Versuche an STAT4 und STAT6 defizienten Mäusen belegen die Bedeutung von TH1-Zellen an der
Abszessbildung. STAT4-/- Mäuse mit einer gestörten Ausbildung von TH1-vermittelten
Immunantworten zeigen deutlich beeinträchtigte Ausbildung von Abszessen nach Injektion von
ZPS. Chung et al. richteten vor der formalen Definition von TH17-Zellen als eigenständige Zelllinie
85
erstmals die Aufmerksamkeit auf die Rolle von IL-17 in der Abszessgenese durch ZPS (Chung et al.
2003).
Die Entdeckung der TH17-Zellen schloss viele Lücken im Verständnis chronischer und
autoimmunologischer Entzündungen (Bettelli et al. 2007). TH17-Zellen und IL-17 gelten heute unter
anderem als zentrale pathogenetische Mediatoren bei EAE/multipler Sklerose, inflammatorischer
Hauterkrankung
Darmerkrankungen
(engl.,
(engl.,
inflammatory
inflammatory
skin
bowel
disease,
disease,
ISD)/Psoriasis,
IBD)
und
entzündlichen
experimenteller
Arthritis/rheumatoider Arthritis (Lock et al. 2002) (Lowes et al., 2008) (Elson et al., 2007) (Nakae
et al. 2003).
Dennoch zeigen Untersuchungen, dass die Genese immunologischer Erkrankungen komplex ist und
TH17-Zellen häufig nicht als alleinige Urheber erfasst werden können. Oftmals scheint vielmehr ein
Akkord von TH1 und TH17-Zellreaktionen pathogenetisch verantwortlich zu sein (Steinman 2008).
Auch wurde gezeigt, dass sich in Patienten mit IBD Zellen mit dualer Produktion von IFNγ und IL17 finden (Steinman 2008). Die Plastizität von TH17-Zellen und ihr möglicher Übergang in einen
anderen T-Helferzelltyp sowie verschiedene Aktivierungsstadien von TH17-Zellen, die in
unterschiedliche Zytokin- und Transkriptionsfaktor-Profile münden könnten, sind bis heute
ungeklärt (Korn et al. 2009).
Chung et al. konnten am Modell ZPS-induzierter Abszesse zeigen, dass die Applikation eines
neutralisierenden anti-IL-17-Antikörpers zusätzlich zur intraperitonealen Injektion von ZPS zu
einer mehr als 80-prozentigen Reduktion in der Ausbildung intraperitonealer Abszesse führt. Für
IL-17 wurde hierbei eine Rolle in der Vermittlung der Immunreaktion durch PMN vermutet (Chung
et al. 2003).
Wir führten erstmals Untersuchungen zur ZPS-vermittelten Abszessbildung an IL-17A-defizienten
Mäusen durch und demonstrieren hierbei eine beeinträchtigte Ausbildung der Abszesse. Es finden
sich weniger und im Durchschnitt kleinere Abszesse als an Wildtyp-Mäusen.
Zukünftige Untersuchungen sollten unter anderem immunhistologisch untersuchen, inwieweit
Feinstruktur und Organisation der ZPS-induzierten Abszesse in Abwesenheit von IL-17
im
Gegensatz zu Abszessen an Wildtyp-Mäusen variieren. Angesichts der zentralen Rolle von IL-17 in
der Rekrutierung und Etablierung der Immunantwort durch Neutrophile vermuten wir eine gestörte
86
Organisation der Abszesse IL-17-defizienter Mäuse auf mikroskopischer Ebene.
TH17-Zellen selbst produzieren neben IL-17A (weitläufig als IL-17 sui generis bezeichnet) auch IL-
17F, IL-21, IL-22, GM-CSF und wahrscheinlich TNFα und IL-6 (Korn et al. 2009). Unsere
Untersuchungen an IL-17-/- Mäusen schlossen allein die immunologischen Effekte von IL-17A
nach Injektion von ZPS aus. Wir vermuten eine, wenn auch augenscheinlich weniger gewichtige
Rolle von IL-17F und anderen TH17-Effektorzytokinen in der von uns beobachteten
Abszessentwicklung an IL-17A-defizienten Mäusen nach Injektion von Sp1. Zukünftige Studien
sollten einen Fokus auf die nachfolgenden Signalkaskaden der diversen TH1/TH17-Zytokine legen
und an Kreuzungen und Mündungen dieser Signalwege sowie gemeinsamen Signalendstrecken
Antworten auf bisher verwirrend anmutende Phänomene finden.
5.2 Quellen von IL-17 nach intraperitonealer Injektion von Sp1
An der Formierung intraperitonealer Abszesse durch ZPS sind eine Vielzahl von Zellen involviert,
unter ihnen Neutrophile, die im Zentrum der Abszess lokalisiert sind, Makrophagen, die
Hauptpopulation der Abszesswand, DC sowie CD4 + und CD8+ T-Zellen. Unterschiedlichste
Zelltypen der angeborenen und erworbenen Immunität zeigen sich zur Produktion von IL-17
befähigt (Kolls & Lindén, 2004).
Wir konnten zeigen, dass CD4+ T-Zellen vermutlich die Lieferanten für IL-17 in der
Peritonealflüssigkeit innerhalb der ersten Stunden nach Injektion von Sp1 darstellen. Dennoch
schließen wir einen ins Gewicht fallenden Beitrag von Zellen der angeborenen Immunität wie NKTZellen oder Neutrophilen an der gemessenen Produktion freier IL-17-Spiegel durch ELISA nicht
aus (Stockinger, Veldhoen, et al. 2007).
Khader et al. konnten zeigen, dass periphere IL-17-produzierende CD4 + Zellen früh auf
Antigeninvasion reagieren und ihnen eine Überwachungs- und Frühwarnfunktion zukommt,
insofern sie die rapide Mobilisierung weiterer Effektorzellen, z.B. von Neutrophilen, bewirken
(Khader et al. 2007).
Wir vermuten, dass ein intraperitonealer Pool antigenspezifischer, naiver CD4 + Zellen früh auf die
Injektion von ZPS reagiert und über die Sekretion von IL-17 rapide Antworten der angeborenen und
erworbenen Immunität induziert.
87
Groneck et al. zeigten, dass auf die intraperitoneale Injektion von Sp1 eine Kolokalisation von T H1Zellen mit CD4+CD44+ TH17-Gedächtniszellen in die Peritonealflüssigkeit erfolgt (Groneck et al.
2009).
Wir konnten zeigen, dass auch zu späterem Zeitpunkt als achtzehn Stunden nach Injektion von Sp1
die Konzentration an freiem IL-17 in der Lavageflüssigkeit erhöht bleibt und vermuten eine Rolle
von IL-17 in späterer Phase der spezifischen, durch Sp1 induzierten Immunantwort und der
Abszessgenese. Genauere Untersuchungen zur Kinetik des Angebots an IL-17 in der
Peritonealflüssigkeit nach intraperitonealer Injektion von Sp1 könnten des weiteren Einblicke in die
regulatorischen Mechanismen geben, die die breite entzündliche Aktivität von IL-17 kontrollieren,
autoaggressive Schädigung vermeiden und zur Eindämmung des Pathogens in Form der
Abszessbildung führen.
Neuere Untersuchungen sprechen IL-27, einem Mitglied der IL-12-Familie, die Funktion eines
negativen Regulators TH17-zellvermittelter Effektorfunktionen zu (Batten et al. 2006) (Stumhofer et
al. 2006). IL-27 wird produziert durch Zellen der angeborenen Immunität und inhibiert TH17--Zellen
unabhängig von seinem ebenfalls vorhandenen fördernden Einfluss auf TH1-vermittelte
Immunreaktionen. Diese Wirkung scheint vermittelt über die Induktion IL-10-produzierender Tr1Zellen durch IL-27 und TGFβ1 (Stumhofer et al. 2007) (Awasthi et al. 2007) (Fitzgerald et al.
2007). Wir vermuten, dass IL-27 auch in der Entstehung von Abszessen durch ZPS eine wichtige
Rolle spielen könnte, indem es früh regulierend in die Induktion von TH17-Zellen eingreift und die
Entwicklung autoaggressiver Reaktionen unterbindet. Diese Vermutungen stehen nicht im
Widerspruch zu Erkenntnissen, dass die suppressiven Wirkungen von IL-27 vor allem auf die de
novo Generation von TH17-Zellen beschränkt scheinen und TH17-Gedächtniszellen unbeeinflusst
lassen (El-behi et al. 2009).
5.3 Systemische Immunreaktion durch TH17-Zellen nach Injektion von Sp1
Injektion von Sp1 in die Peritonealhöhle führt zu einer lokalen Immunreaktion vermittelt durch
TH17-Zellen. Unsere Untersuchungen zur Dichte IL-17-produzierender T-Zellen in der Milz nach
intraperitonealer Injektion von Sp1 zeigen jedoch, dass auf den lokalisierten Prozess auch eine
systemische Reaktion folgt. Mit einiger Latenz treten in der Milz vermehrt IL-17-produzierende
Zellpopulationen auf.
88
Wir stellen die Hypothese auf, dass CD4+ T-Helferzellen eine mögliche Quelle der Produktion von
IL-17 in der Milz nach Injektion von ZPS darstellen. Diese Zellpopulation sezerniert IL-17
innerhalb der Milz. Wie unsere quantitativen Messungen der IL-17-Konzentrationen in Lavage und
Milz jedoch zeigen, ist die Sekretion freien Zytokins in der Milz geringer als dies in der
Peritonealhöhle der Fall ist. Wir vermuten, dass diese Ergebnisse durch die Rolle von IL-17 in der
Koordinierung der Immunabwehr an Grenzflächen des Organismus bedingt sind. Die Rolle von IL17 im Zusammenhang der systemischen Immunantwort ist bis heute noch in weiten Teilen ungeklärt
(Korn et al. 2009).
Interessanterweise konnten wir zeigen, dass die systemische Injektion von ZPS ebenfalls zu einem
Auftreten von IL-17 innerhalb der Milz führt. Unsere Untersuchungen könnten demnach auf eine
Rolle von IL-17 nicht nur in der unmittelbaren Immunabwehr an der mesothelialen Grenzfläche des
Peritoneums, sondern auch auf eine Beteiligung an der systemischen Immunreaktion auf ZPS
hinweisen.
Inwieweit die systemische und in einzelnen Organen nachweisbare Aktivität von IL-17 durch Zellen
der angeborenen Immunität respektive mögliche zelluläre Quellen außerhalb des Immunsystems sui
generis beeinflusst wird, müssen weitergehende Untersuchungen zeigen. An dieser Stelle sei unter
anderem auf aktuelle Arbeiten zur Rolle von intestinalen Paneth-Zellen an der Ausschüttung von
IL-17 in einem Modell hepatischer Ischämie und Reperfusion sowie in einem Modell TNFinduzierten Schocks hingewiesen (S. W. Park et al. 2011) (Takahashi et al. 2008).
Wir zeigen, dass dem Auftreten von TH17-Zellen in der Milz nach intraperitonealer Injektion von
Sp1 nicht in entsprechendem Maße ein Anstieg der TGFβ1-Konzentration in der Milz vorangeht. Es
scheint sich folglich innerhalb der Milz selbst nur bedingt ein Zytokinmilieu zu entwickeln, welches
die de novo Generation von TH17-Zellen befördert. Vielmehr vermuten wir, dass es sich bei den
auftretenden TH17-Zellen um einwandernde Zellen handelt, deren Differenzierung an der
mesothelialen Grenzschicht des Peritoneums stattgefunden hat. Von dort aus könnten diese Zellen
ein Kontingent an immunologischen Informationsträgern bilden, die zentrale Kompartimente des
Immunsystems wie die Milz und andere entferntere Abwehrstationen mit in den Immunprozess
einbeziehen und gegebenenfalls zu T-Effektorzellen mit Gedächtnisfunktion ausreifen. Die
Mehrheit mucosaler Effektorzellen verbleibt in mucosalen Geweben (Murphy et al. 2008). Unsere
Vermutungen zur Generierung spezifischer TH17-memory-cells sollten durch nachfolgende Versuche
hinterfragt werden, die selektiv die Vermehrung IL-17-produzierender CD4 +CD44+ T-Zellen mit
89
Gedächtnisfunktion in der Milz nach Injektion von ZPS untersuchen (Korn et al. 2009).
In vitro konnten wir zeigen, dass Sp1 die Entwicklung spezifischer TH17-Zellen aus einer naiven
Zellpopulation der Milz induzieren kann. Residente dendritische Zellen kommen weit verbreitet in
peripheren lymphatischen Organen vor (Murphy et al. 2008). Wir schließen nicht aus, dass auch in
vivo TH17-Zellen mit Spezifität gegen ZPS erst sekundär in der Milz entstehen und dieser Prozess
nicht allein auf die mesotheliale Grenzfläche reduziert ist.
Unsere Versuche zeigen außerdem, dass auch in Abwesenheit von ZPS stets eine basale Aktivität
von TGFβ1 und IL-17 in Peritonealflüssigkeit und Milz vorhanden ist. Untersuchungen an
Modellen chronisch-entzündlicher Darmerkrankungen (engl., inflammatory bowel disease, IBD)
zeigen, dass auch gesunder Darm eine basale Produktion von IL-17 zeigt (Zheng et al. 2008). Über
diese modulierende Immunfunktion von IL-17 unabhängig von spezifisch-inflammatorischen
Prozessen herrscht heute noch keine ausreichende Erkenntnis (Korn et al. 2009).
5.4 IL-6 und die Entwicklung von TH17-Zellen
TH17-Zellen wurden als eine eigenständige Zelllinie definiert, da sie sich durch zellspezifische
Differenzierungs- und Transkriptionsfaktoren auszeichnen. TGFβ1 und IL-6 sind sowohl in Maus
wie auch im Menschen die entscheidenden Faktoren zur Ausdifferenzierung naiver CD4 + T-Zellen
in Richtung TH17-Zellen (Veldhoen et al. 2006) (Weaver, Harrington, Mangan, Gavrieli, & Murphy,
2006). IL-6 bestimmt hierbei die Entwicklung weg vom CD4 +FOXP3+ Phänotyp regulatorischer TZellen (Treg) hin zum IL-17 produzierenden TH17-Phänotyp. In vivo könnte IL-6 folglich einen
molekularen „Schalter“ darstellen, der einen dominanten Zustand der Immunkontrolle durch Treg in
Richtung einer breiten Immunantwort durch TH17-Zellen verlagert (Korn et al. 2009). Weiterhin
scheinen CD4+CD25+FOXP3+ Treg die Fähigkeit zu besitzen, sich unter dem Einfluss von IL-6 zu
TH17-Zellen umzuwandeln (Xu et al. 2007). Untersuchungen an einem Modell experimenteller
autoimmuner Enzephalomyelitis (engl., experimental autoimmune encephalitis, EAE) zeigen, dass
die Immunantwort in IL-6-/- Mäusen von Treg dominiert wird. Dennoch sind IL-6-/- Mäuse in
Abwesenheit von Treg über die Vermittlung von IL-21 zur Amplifikation von TH17-Zellen und
TH17-zellvermittelter Pathologie befähigt (Korn et al. 2007).
IL-6 ist essentiell für die Entwicklung intraperitonealer Abszesse durch zwitterionische
Polysaccharide (Meemboor et al. 2009). In Abwesenheit von IL-6 ist die Abszessentwicklung
90
gestört. Wir konnten erstmals demonstrieren, dass IL-17-defiziente Mäuse ebenfalls eine
beeinträchtigte Ausbildung von Abszessen nach Injektion von Sp1 zeigen. Im Vergleich der
Abszessbildung von IL-6-/- Mäusen und IL-17-/- Mäusen zeigt sich ein Trend zu geringerer
Abszessbildung
im
IL-17-defizienten
Stamm,
in
welchem
der
maximal
erreichte
Abszessdurchmesser 2mm betrug. Sp1 führte in IL-6-/- Mäusen tendenziell zur Ausbildung von
größeren Abszessen mit einem Durchmesser bis 3mm (Meemboor et al. 2009).
Unsere Untersuchungen legen nahe, dass TH17-Zellen als Vermittler der Abszessentwicklung
fungieren und die Induktion von reaktiven TH17-Zellen die Endstrecke der Wirkungen von IL-6
darstellen könnte. Wir konnten zeigen, dass IL-6-defiziente Mäuse nach Injektion von Sp1 ein
Auftreten von TH17-Zellen am intraperitonealen Fokus zeigen.
Der funktionelle Erhalt von CD4+ Zellen wird unter anderem entscheidend durch die Wirkungen
von Zytokinen beeinflusst. IL-6 besitzt eine kritisch diskutierte Rolle als Überlebensfaktor für CD4 +
T-Zellen (Teague et al. 1997) (Jones et al. 2010) (Vivien 2001). Neben Signalen des
membranständigen Rezeptors IL-6R, die unter dem Einfluss von TGFβ1 die Ausdifferenzierung von
TH17-Zellen aus einem naiven CD4+ Zellpool bewirken, fördert IL-6 über seinen löslichen Rezeptor
sIL-6R (engl., trans signaling) den lokalen Erhalt von differenzierten TH17-Zellen (Jones et al.
2010). Unterbrechung des trans signaling Pfads über Blockade des IL-6-sIL-6R-Komplexes
induziert die Apoptose mucosaler CD4+ Effektor-T-Zellen bei Morbus Crohn (Atreya et al. 2000).
Die verminderte Ausbildung von Abszessen durch Sp1 in IL-6-defizienten Mäusen könnte durch ein
reduziertes Angebot an wichtigen, IL-6-vermittelten Überlebenssignalen für die spezifische TH17Zellpopulation bedingt sein.
IL-23 erhält und amplifiziert die Aktivität von TH17-Zellen, auch wenn IL-23 durch fehlende
Expression von IL-23R auf naiven CD4+ Zellen nicht involviert ist in deren initiale
Ausdifferenzierung (Korn, Bettelli, Oukka, & Kuchroo, 2009). Jüngere Untersuchungen haben
gezeigt, dass die Expression des IL-23-Rezeptors IL-23R abhängig ist von der Signalgebung durch
STAT3 und RORγt (Zhou et al. 2007) (Nurieva et al. 2007). IL-6 ist zusammen mit IL-21 und
TGFβ1 notwendig für die Aktivierung von STAT3 und RORγt in TH17-Zellen. In unseren Versuchen
könnten die verringerten Zahlen von TH17-Zellen in IL-6-/- Mäusen so letztlich Folge einer
reduzierten Ansprechbarkeit dieser TH17-Zellen auf IL-23 sein.
Dennoch zeigen unsere Versuche, dass auch IL-6-/- Mäuse zur Generierung einer TH17-Zellantwort
91
befähigt bleiben. 5,5% aller CD4+ Zellen in der Peritonealflüssigkeit naiver Wildtyp-Mäuse zeigen
Expression von IL-17. Nach Injektion von Sp1 erhöht sich dieser Anteil gering auf 6%. Diese
Erkenntnisse könnten auf einen möglichen Beitrag anderer Zytokine auf die Entwicklung von TH17Zellen in Abwesenheit von IL-6 hinweisen. IL-21 bewirkt zusammen mit TGFβ1 eigenständig den
Erhalt und die Vermehrung von TH17-Zellen, wenn kein ausreichendes IL-6-Angebot gewährleistet
ist (Korn et al. 2007) (Yang, Anderson, et al. 2008) (Zhou et al. 2007). Unter diesen Bedingungen
kann
IL-21
zum
Mediator
TH17-zellvermittelter
Entzündungspathologie
werden.
In
unterschiedlichen Modellen chronisch-entzündlicher Darmerkrankungen (engl., inflammatory
bowel disease, IBD) und anderer Autoimmunprozesse zeichnet sich IL-21 verantwortlich für den
Entzündungsprozess (Fina et al. 2008) (Liu, Yang, et al. 2009). IL-21 wird in großer Fraktion von
TH17-Zellen selbst gebildet und bewirkt unter anderem auch über vermehrte Expression des IL-23-
Rezeptors IL-23R deren Erhalt und Expansion in einem autokrinen Zirkel (Korn et al. 2007) (Zhou
et al. 2007). Unter ausreichendem Angebot von IL-6 scheint IL-21 nicht notwendig für den
Entzündungsprozess. Wir vermuten eine eventuell bedeutsame Rolle von IL-21 in der
Immunantwort auf ZPS in Abwesenheit von IL-6, was durch zukünftige Untersuchungen,
beispielsweise an kombiniert IL-6/IL-21-defizienten Mäusen, erforscht werden sollte.
Über die Plastizität teilweise- und vollständig-differenzierter TH17-Zellen und Treg ist noch vieles
unbekannt (Korn, Bettelli, Oukka, & Kuchroo, 2009). Da Treg unter der Wirkung von IL-6 nicht
nur zur Generierung von TH17-Zellen aus einem Pool naiver CD4+ T-Zellen befähigt scheinen,
sondern augenscheinlich auch die Fähigkeit zum Klassenwechsel hin zu TH17-Zellen selbst besitzen
(Xu et al. 2007), vermuten wir, dass Treg eine wichtige Rolle in der Etablierung einer TH17-ZellAnwort nach Injektion von ZPS zufallen könnte.
Treg supprimieren bevorzugt TH1- und TH2-vermittelte Immunreaktionen (Chen et al. 2008). TH17Antworten könnten sie nicht nur fördern durch Bereitstellung von TGFβ1, sondern auch durch
Verbrauch von IL-2, welches hemmende Wirkung auf den TH17-Differenzierungspfad besitzt (Chen
et al. 2008). Zukünftige Studien sollten die Funktion von Treg im Abszessmodell durch ZPS
genauer adressieren.
5.5 TGFβ1, APC und TH17-Zellen
Drei unabhängige Arbeiten definierten im Jahr 2006 die zentrale Rolle von TGFβ1 als
Differenzierungsfaktor für TH17-Zellen (Veldhoen et al. 2006) (Mangan et al. 2006) (Bettelli et al.
92
2006). Obwohl früh die Beteiligung von TGFβ1 an der Entwicklung humaner TH17-Zellen in Frage
gestellt wurde (McGeachy et al. 2008), haben jüngere Arbeiten gezeigt, dass TGFβ1 sowohl in
Maus wie auch in Mensch unabdingbar für die Entwicklung von TH17-Zellen ist (Torchinsky et al.
2010).
Wir konnten zeigen, dass die intraperitoneale Injektion von Sp1 zur Erhöhung des Angebots an
TGFβ1 in der Lavageflüssigkeit führt. Da Sp1 überdies auch zu erhöhten Spiegeln an IL-6 im
selben zeitlichen Zusammenhang führt (Meemboor et al. 2009), scheinen die Bedingungen zur
Ausdifferenzierung von TH17-Zellen gegeben zu sein. Wir zeigen außerdem, dass der Anteil IL-17produzierender CD4+ T-Zellen nach Injektion von Sp1 intraperitoneal in der Tat erhöht ist und das
CD11c+ dendritische Zellen, die nach Exposition gegenüber Sp1 zur Produktion von TGFβ1
angeregt werden, als mögliche Lieferanten der notwendigen Differenzierungsfaktoren in Frage
kommen. Wir vermuten deshalb, dass dendritische Zellen Sp1 nach intraperitonealer Injektion
aufnehmen und als APC durch die Produktion von IL-6 und TGFβ1 die Ausdifferenzierung lokaler,
naiver CD4+ Zellen zu TH17-Zellen befördern.
Ferner vermuten wir, dass über die Vermittlung von APC, die selektiv Sp1 in der
Peritonealflüssigkeit aufgenommen haben, naive CD4+ T-Zellen in der Milz zur Ausdifferenzierung
in TH17-Richtung bewegt werden. Untersuchungen zur Dauer der Induktion von Effektor-T-Zellen
durch APC beschreiben einen Zeitraum von circa sieben Tagen (Murphy et al. 2008).
Die Quellen von TGFβ1 zur Generierung von TH17-Zellen in vivo sind zum heutigen Tag jedoch
nicht eindeutig definiert (Korn, Bettelli, Oukka, & Kuchroo, 2009). Es finden sich Hinweise darauf,
dass T-Zellen in Form von Effektorzellen und Treg selbst wichtige Produzenten von TGFβ1 sind. Li
et al. konnten zeigen, dass die selektive Ausschaltung der Produktion von TGFβ1 in T-Zellen zu
gestörter Ausreifung von TH17-Zellen und verminderter Entzündung in einem Modell
experimenteller autoimmuner Enzephalomyelitis (EAE) führt (Li et al. 2007). Transfer naiver TZellen zusammen mit Treg induziert in Empfängermäusen die Produktion von IL-17, allerdings
nicht von IFNγ, in den transferierten T-Zellen (Lohr et al. 2006).
TGFβ1 wird in latenter Form produziert und bedarf der Aktivierung über eine funktionelle Trennung
des angebundenen Proteins latency-associated peptide (LAP). LAP unterbindet die biologische
Aktivität von TGFβ1, indem es die Bindung des TGFβ1-Homodimers an seinen Rezeptor inhibiert.
Die Aktivierung von TGFβ1 geschieht entweder über Änderungen der Konformation von LAP oder
93
über dessen proteolytische Degradation (Massagué 1990) (Korn, Bettelli, Oukka, & Kuchroo,
2009). Die Bindung von LAP an ανβ8-Integrin auf dendritischen Zellen resultiert in einer
Prozessierung von LAP und dessen Aktivierung in vivo.
In der Zusammenschau dieser Erkenntnisse muss gesagt werden, dass dendritische Zellen unseren
Ergebnissen zufolge zwar direkte Lieferanten von TGFβ1 zur Differenzierung von TH17-Zellen nach
Injektion von Sp1 sein könnten, aber auch indirekt über die Aktivierung von latentem TGFβ1 zur
Entwicklung einer TH17-Antwort beitragen könnten. Wir vermuten überdies einen wichtigen Beitrag
von T-Zellen und Treg im Besonderen zur Bereitstellung der notwendigen Mengen an TGFβ1 zur
Erzeugung einer nachhaltigen Ausdifferenzierung von TH17-Zellen durch ZPS in vivo.
Wohingegen die notwendigen Faktoren zur Differenzierung von TH17-Zellen eindeutig definiert
scheinen, sind die genauen Bedingungen und benötigten Antigen-präsentierenden Zellen zur
Ausdifferenzierung in vivo noch weitgehend unverstanden. Mehrere Adjuvantia und TLRAktivatoren wie LPS und CpG fördern die Produktion von IL-6 und IL-23 durch dendritische
Zellen, allerdings bewirken sie auch eine starke Ausschüttung von IL-12, was die Ausbildung von
TH1-Antworten begünstigt und die Ausbildung von TH17-Antworten unterbindet (LeibundGut-
Landmann et al. 2007). Zymosan aus der Zellwand von Saccharomyces cerevisiae,das Kation DDA
sowie Mykobakterien wie Mycobacterium tuberculosis, das die zentrale Komponente des Adjuvans
CFA darstellt, fördern hingegen bevorzugt die Generierung von TH17-Zellen durch dendritische
Zellen via IL-6, TGFβ1 und IL-23 (Khader et al. 2007).
Bisher finden sich keine Erkenntnisse darüber, ob DC unter dem Einfluss von Sp1 zur Produktion
von IL-12 angeregt werden, was eine Polarisierung naiver T-Zellen in Richtung TH1 befördern
würde. Künftige Studien sollten diesen Aspekt unter Berücksichtung der besonderen Struktur von
IL-12 adressieren. IL-12 besitzt zusammen mit IL-23 die gemeinsame Untereinheit p40. Es sollten
Antikörper zum Einsatz kommen, die spezifisch sind für die dem IL-12 eigene Untereinheit p35
(Korn et al. 2007b)
Im Falle des von uns untersuchten Abszessmodells zeichnet sich das Adjuvans SCCA alleine nicht
für die Ausschüttung größerer Mengen an IL-6 verantwortlich (Meemboor et al. 2009). IL-6 wird
erst dann vermehrt durch APC exprimiert, wenn SCCA in Kombination mit dem ZPS Sp1
verabreicht wird.
94
CD103+ dendritische Zellen im Intestinum und drainierenden Lymphknoten sind spezialisiert auf
die Generierung von Treg. Über die Produktion von Retinolsäure supprimieren sie die TH17Entwicklung und fördern die Expression von FOXP3. Über α4β7 Integrin und CCR9 werden Treg
zur Anreicherung an den mucosalen Grenzflächen des Intestinums bewegt (Chen et al. 2008). Diese
DC werden jedoch zu starken Induktoren von TH17-Zellen, wenn die inhibitorische Wirkung von
Retinolsäure auf deren Differenzierungspfad entfällt (Kolls et al. 2004). Wir vermuten auch für das
Abzessmodell durch ZPS eine Rolle von Retinolsäure als differentiellem Mediator, was durch
weitere Studien adressiert werden sollte.
Curdlan, ein β-Glucan, via Dectin-1 sowie Muramyldipeptid in Bindung an NOD2 fördern über die
Aktivierung von CARD9 die Entwicklung von TH17-Zellen durch dendritische Zellen (McGeachy et
al. 2008). Curdlan als selektiver Agonist des PRR Dectin-1 bewirkt in Co-Kultur von CD4+,
BMDC und Ovalbumin die Entwicklung von TH17-Zellen unabhängig von Aktivierung von TLR
(LeibundGut-Landmann et al. 2007). Die nachgeschaltete Signalkette führt über Syk und CARD9
und resultiert in Aktivierung von NFκB. Durch zukünftige Untersuchungen sollte geklärt werden,
ob neben TLR auch Dectin-1 als möglicher PRR für Sp1 fungiert. Hierzu könnten unter anderem in
vivo Experimente an MyD88- bzw. TRIF-defizienten Mäusen herangezogen werden. MyD88 und
TRIF sind als Signalmolekülen der Aktivierung von TLR nachgeschaltet (LeibundGut-Landmann et
al. 2007).
5.6 Makrophagen
Makrophagen stellen die größte Population Antigen-präsentierender Zellen in der Wand ZPSinduzierter Abszesse dar, wohingegen dendritische Zellen nur einen geringen Teil ausmachen
(Meemboor et al. 2009).
IL-17 ist kritisch involviert in die Entwicklung allergischen Asthmas (Song et al. 2008). Die
Konzentration von IL-17 in der bronchoalveolären Lavageflüssigkeit von asthmatischen Patienten
ist signifikant erhöht. Jedoch ist die Produktion von IL-17 in Asthmatikern das Resultat aktivierter
Makrophagen und unterliegt der Kontrolle durch Mastzellmediatoren und nicht TNFα oder IL-23
(Song et al. 2008). IL-10 fungiert als negativer Regulator des Makrophagen-induzierten
Entzündungsprozesses und die Exposition gegenüber Allergenen führt zu erhöhten Spiegeln von IL17 durch reduziertes Angebot an IL-10 (Song et al. 2008). Unter Aktivierung des TLR4-Liganden
LPS zeigen Makrophagen von IL-10-/- Mäusen exzessive Produktion von IL-17 (Gu et al. 2008).
95
Auch DC von IL-10-/- Mäusen induzieren eine stärkere Differenzierung von TH17-Zellen in CoKultur mit naiven CD4+ Zellen als DC aus Wildtyp-Mäusen.
Für ZPS konnte gezeigt werden, dass intraperitoneale Makrophagen nach Injektion von Sp1 hoch
quantitativ IL-6 produzieren (Meemboor et al. 2009). Ob Makrophagen nach Konfrontation mit Sp1
zu Produzenten von IL-17 und damit ähnlich der Erkenntnisse zu allergischem Asthma zu
Vermittlern des ZPS-induzierten Entzündungsprozesses werden, ist bisher unklar. Makrophagen galt
bisher vielmehr die Aufmerksamkeit in ihrer Rolle als APC denn als Entzündungseffektoren.
Zukünftige Untersuchungen sollten die Rolle von Makrophagen in der ZPS-vermittelten
Immunantwort sowie den Einfluss von IL-10 genauer adressieren.
6. Zusammenfassung
Interleukin-17 und TH17-Zellen wurde in den letzten Jahren zunehmende Aufmerksamkeit im
Hinblick auf die Entstehung chronischer und autoimmuner Entzündungen geschenkt. Neben seiner
pathologischen Rolle erscheint IL-17 jedoch zentral in der Verbindung angeborener und erworbener
Immunreaktionen gegenüber einem breiten Spektrum von Pathogenen sowie in der Entwicklung
von Immunität nach Impfungen. Zwitterionische Polysaccharide sind eine neue Gruppe MHC-IIabhängiger Antigene, die zur Induktion von Abszessen in einem Modell abdomineller Sepsis
befähigt sind. Wir zeigen mit unserer Arbeit, dass Interleukin-17 eine zentrale, vermittelnde Rolle
im Rahmen der ZPS-induzierten Abszessbildung zukommen könnte. In unseren Versuchen zeigen
sich auf unterschiedlichen Ebenen Trends dahingehend, dass TH17-Zellen nicht nur an der
unmittelbaren, lokalen Immunabwehr an der mesothelialen Grenzfläche beteiligt sein könnten,
sondern mit zentralen Immunkompartimenten wie der Milz kommunizieren und eine potentielle
ZPS-spezifische TH17-Gedächtnisfunktion entwickeln. Wegbereitende Zytokine für die ZPSinduzierte TH17-Antwort sind IL-6 und vermutlich TGFβ1. Ausgehend von unseren Ergebnissen
geben wir Ansätze, die durch zukünftige Studien vertieft und durch zusätzliche Methodik wie
beispielsweise rt-PCR oder RNAi-Experimente ergänzt werden sollten. Aus einem tieferen
Verständnis des Beitrags von IL-17 und TH17-Zellen zur Immunantwort auf ZPS können neue
therapeutische Ansätze gegenüber schwerwiegenden entzündlichen Erkrankungen sowie neue
Impulse zur Entwicklung Polysaccharid-basierter Impfstoffe resultieren.
96
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8. Lebenslauf
Thomas Gamstätter
* 21.04.1984 in Mainz
Staatsangehörigkeit: Deutschland
Familienstand: ledig
Eltern
Dr. med. Gerhard Gamstätter, Gefäßchirurg
Karin Heid-Gamstätter, Zahnärztin
Studium und Ausbildung
Nov 2010 - heute
Anstellung als Assistenzarzt
I. Medizinische Klinik
Universitätsmedizin der Johannes-Gutenberg-Universität, Mainz
Direktor: Universitätsprofessor Dr. med. P. R. Galle
Juli 2010
Approbation als Arzt
Juni 2010
Ärztliche Prüfung Humanmedizin
Okt 2007 - heute
Promotion
Institut für Medizinische Mikrobiologie, Immunologie und Hygiene
Universität zu Köln
Betreuerin: Frau Privatdozentin Dr. med. W. Kalka-Moll
Feb 2009 - Jan 2010
Praktisches Jahr
1. Tertial:
Klinik für Allgemein-, Visceral- und Tumorchirurgie, Uni-Klinik Köln
Klinik für Herz- und Thoraxchirurgie, Uni-Klinik Köln
Klinik für Unfall-, Hand- und Wiederherstellungschirurgie, Uni-Klinik
Köln
2. Tertial:
Klinik für Anästhesiologie und Operative Intensivmedizin, Uni-Klinik
Köln
3. Tertial:
Klinik für Innere Medizin I, Hämatoonkologie, Uni-Klinik Köln
Klinik für Gastroenterologie und Hepatologie, Uni-Klinik Köln
Mär 2006 - Feb 2009
2. Studienabschnitt Humanmedizin, Universität zu Köln
Mär 2006
Ärztliche Basisprüfung (Physikum), Universität zu Köln
Apr 2004 - Mär 2006
1. Studienabschnitt Humanmedizin, Universität zu Köln
Apr 2003 - Feb 2004
Zivildienst
108
Grundausbildung zum Rettungssanitäter
Mär 2003
Allgemeine Hochschulreife (Abitur)
Aug 1994 - Mär 2003
Gymnasium Theresianum Mainz
Famulaturen und Praktika
Aug 2008
Famulatur Angiographie, konventionelle
Computertomographie, Durchleuchtung
RNS Praxisgemeinschaft, Wiesbaden
Röntgendiagnostik,
Jul 2008
Famulatur Hals-Nasen-Ohrenheilkunde
HNO Praxis Dres. Yildiz und Zenev, Köln
Aug 2007 - Okt 2007
Famulatur Intensiv- und Notfallmedizin
Zentrale Intensiv- und Notfallmedizin, Uni-Klinik Köln
Okt 2006
Famulatur Gastroenterologie
Klinik Innere Medizin II, Dr.-Horst-Schmidt-Klinik, Wiesbaden
Sep 2006
Famulatur Kardiologie und Angiologie
Innere Medizin I, Dr.-Horst-Schmidt-Klinik, Wiesbaden
Sep 2004 & Mai 2005
Pflegepraktika operative Intensivmedizin
Zentrale Intensiv- und Notfallmedizin, Uni-Klinik Köln
Jun 2003
Pflegepraktikum Anästhesiologie
St. Vincenz- und Elisabeth-Hospital, Mainz
Berufserfahrung, Ehrenamt, Mitgliedschaften
2003 - 2005
Malteser Hilfsdienst e.V., Mainz
ehrenamtliche Tätigkeit im Rettungs- und Sanitätsdienst
Dez 2000 - Feb 2002
forum! GmbH Marketing & Communications, Mainz
CATI-Programmierung, Datenbankpflege, EDV, Recherche
seit 2010 - heute
American Association for the Advancement of Science (AAAS)
Mitgliedschaft