Aus dem Institut für Medizinische Mikrobiologie, Immunologie und Hygiene der Universität zu Köln Direktor: Universitätsprofessor Dr. med. M. Krönke TH17-Zellen und Interleukin-17 in der Genese intraperitonealer Abzesse durch das zwitterionische Polysaccharid Sp1 von Streptococcus pneumoniae Inauguraldissertation zur Erlangung der Doktorwürde der Hohen Medizinischen Fakultät der Universität zu Köln vorgelegt von Thomas Gamstätter aus Mainz Promoviert am 27. Juni 2012 1 Aus dem Institut für Medizinische Mikrobiologie, Immunologie und Hygiene der Universität zu Köln Direktor: Universitätsprofessor Dr. med. M. Krönke TH17-Zellen und Interleukin-17 in der Genese intraperitonealer Abzesse durch das zwitterionische Polysaccharid Sp1 von Streptococcus pneumoniae Inauguraldissertation zur Erlangung der Doktorwürde der Hohen Medizinischen Fakultät der Universität zu Köln vorgelegt von Thomas Gamstätter aus Mainz Promoviert am 27. Juni 2012 2 Druck: Copy Print, Mainz Gedruckt mit Genehmigung der Medizinischen Fakultät der Universität zu Köln, 2012 3 Dekan: Universitätsprofessor Dr. med. Dr. h. c. Th. Krieg 1. Berichterstatter: 2. Berichterstatter: Privatdozentin Dr. med. W. M. Kalka-Moll Universitätsprofessor Dr. med. G. Fätkenheuer Erklärung: Ich erkläre hiermit, dass ich die vorliegende Dissertationsschrift ohne unzulässige Hilfe Dritter und ohne Benutzung anderer als der angegebenen Hilfsmittel angefertigt habe; die aus fremden Quellen direkt oder indirekt übernommenen Gedanken sind als solche kenntlich gemacht. Bei der Auswahl und Auswertung des Materials sowie bei der Herstellung des Manuskriptes habe ich keine Unterstützungsleistungen erhalten. Weitere Personen waren an der geistigen Herstellung der vorliegenden Arbeit nicht beteiligt. Insbesondere habe ich nicht die Hilfe einer Promotionsberaterin/eines Promotionsberaters in Anspruch genommen. Dritte haben von mir weder unmittelbar noch mittelbar geldwerte Leistungen für Arbeiten erhalten, die im Zusammenhang mit dem Inhalt der vorgelegten Dissertationsschrift stehen. Die Dissertationsschrift wurde von mir bisher weder im Inland noch im Ausland in gleicher oder ähnlicher Form einer anderen Prüfungsbehörde vorgelegt. Mainz, 05. Januar 2012 4 Die dieser Arbeit zugrunde liegenden Experimente sind nach entsprechender Anleitung durch Frau Privatdozentin Dr. med. Wiltrud Kalka-Moll von mir selbst geplant und ausgeführt worden. Erklärungen zur Anwendung der Verfahren und Einarbeitung in die entsprechenden Abläufe der einzelnen Experimente habe ich erhalten durch Frau Sonja Meemboor und Frau Martina Bessler, beide vormals Institut für Medizinische Mikrobiologie, Immunologie und Hygiene der Universität zu Köln. Die letztliche Ausführung der Experimente, die den Ergebnissen dieser Arbeit zugrunde liegen, oblag voll und ganz mir. 5 Danksagung Mein herzlicher Dank für die Fertigstellung dieser Arbeit gilt Frau Privatdozentin Dr. med. Wiltrud Kalka-Moll. Ihre Expertise und ihr tiefgehendes Interesse am wissenschaftlichen Arbeiten haben mich stets tief beeindruckt und bleibend geprägt. Ohne ihr offenes Entgegenkommen, ihre Geduld und ihr Engagement und nicht zuletzt ohne ihr Vertrauen in meine Fähigkeiten, wäre diese Arbeit nicht zustande gekommen. Mein weiterer Dank gilt Herrn Universitätsprofessor Dr. med. Martin Krönke für die Erlaubnis der Nutzung der Räumlichkeiten und Installationen seines Instituts und für die großzügigen Freiräume, die ich dort zur Fertigstellung dieser Arbeit genießen konnte. Im Besonderen danke ich Frau Sonja Meemboor, deren Unterstützung während der gemeinsamen Laborzeit für mich von größtem Wert gewesen ist, in praktisch-experimenteller, wissenschaftlicher, aber auch in menschlicher Hinsicht. Bedanken möchte ich mich außerdem bei Martina Bessler, Janina Mertens, Torsten Kubacki sowie Frau Privatdozentin Dr. med. Pia Hartmann und ihrer Arbeitsgruppe für die gut funktionierende gemeinsame Zeit im Labor. 6 Meiner Familie 7 Inhaltsverzeichnis Abkürzungsverzeichnis 1. Einleitung 1.1 Das Immunsystem 1.2 Antigenpräsentation und T-Zell-Aktivierung 1.3 CD4+ T-Zellen 1.3.1 Das TH1-/TH2-Paradigma 1.3.2 TH17-Zellen und regulatorische T-Zellen 1.4 Zytokine 1.4.1 Allgemeines 1.4.2 Interleukin-17 1.4.3 Interleukin-6 1.4.4 Transforming Growth Factor 1.5 Bakterielle kapsuläre Polysaccharide 1.5.1 Allgemeines 1.5.2 Zwitterionische Polysaccharide 1.5.3 T-Zell-Aktivierung durch zwitterionische Polysaccharide 1.5.4 Bedeutung der T-Zell-Aktivierung durch zwitterionische Polysaccharide 1.6 Fragestellung 2. Materialien 2.1 Geräte 2.2 Verbrauchsmaterial 2.3 Puffer und Lösungen 2.4 Medien und Zusätze 2.5 Antikörper 2.5.1 FACS 2.5.2 CD4+ T-Zell-Isolations-Kit 2.5.3 T-Zell-Stimulation 2.6 Software 8 3. Methoden 3.1 Tierversuche 3.2 Versuchstierzucht 3.3 Injektionen 3.3.1 Allgemeines 3.3.2 Intraperitoneale Injektionen 3.3.3 Intravenöse Injektionen 3.4 Abszessmodell 3.5 Peritoneallavage 3.6 Herstellung einer Zellsuspension aus der Milz 3.7 Erythrozytenlyse 3.8 Zellzählung 3.9 Durchflusszytometrie 3.9.1 Hintergrund 3.9.2 Allgemeine Prinzipien 3.10 Magnetische Zellseparation 3.11 Gewinnung von dendritischen Zellen aus dem Knochenmark 3.12 Intrazelluläre Zytokinfärbung 3.13 ELISA 3.13.1 Allgemeine Prinzipien 3.13.2 IL-17-ELISA 3.13.3 TGFβ1-ELISA 3.14 Nachweis von TH17-Zellen 3.15 Messung freier Zytokinspiegel in der Peritonealflüssigkeit 3.16 Messung der Zytokinproduktion von Zellen aus der Peritoneallavage 3.17 Messung der Zytokinproduktion in der Milz 4. Ergebnisse 4.1 Abszessmodell 4.1.1 Abhängigkeit der Sp1-induzierten Abszessbildung im Mausmodell 4.2 ELISA 4.2.1 Ausschüttung von IL-17 und TGFβ1 durch peritoneale Zellen nach 9 intraperitonealer Injektion von Sp1 4.2.2 IL-17-Produktion in der Milz nach intraperitonealer Sp1-Injektion 4.2.3 Zusammenfassung der ELISA-Analysen 4.3 FACS 4.3.1 Anteil der CD4+ Zellen an der intraperitonealen Gesamtzellpopulation 4.3.2 Expression von TGFβ1 in BMDC durch Sp1 4.3.3 Produktion von IL-6 in BMDC durch Sp1 4.3.4 IL-6-abhängiges Auftreten von peritonealen T H17-Zellen nach intraperitonealer Sp1-Injektion 4.3.5 IL-6-abhängiges Auftreten von TH17-Zellen in der Milz nach intraperitonealer Sp1Injektion 4.3.6 Auftreten von TH17-Zellen in der Milz nach intravenöser Sp1-Injektion 4.3.7 Sp1-induzierte Entwicklung von TH17-Zellen in vitro 4.3.8 Zusammenfassung der FACS-Analysen 5. Diskussion 5.1 IL-17 und die Abszessbildung durch ZPS 5.2 Quellen von IL-17 nach intraperitonealer Injektion von Sp1 5.3 Systemische Immunreaktion durch TH17-Zellen nach Injektion von Sp1 5.4 IL-6 und die Entwicklung von TH17-Zellen 5.5 TGFβ1, APC und TH17-Zellen 5.6 Makrophagen 6. Zusammenfassung 7. Literaturverzeichnis 8. Lebenslauf 10 Abkürzungsverzeichnis APC Allophycocyanin APC engl., antigen-presenting cells BMDC engl., bone-marrow derived dendritic cell BSA bovines Serum-Albumin BV variable Domäne der β-Kette des TCR CD engl., cluster of differentiation CFA engl., Complete Freund's Adjuvant CLIP engl., class-II associated invariant chain peptide CP5 Staphylococcus aureus Serotyp 5 Kapsel-Polysaccharid CP8 Staphylococcus aureus Serotyp 8 Kapsel-Polysaccharid D Dalton DC engl., dendritic cell EAE engl., experimental autoimmune/allergic encephalitis ER endoplasmatisches Retikulum FACS engl., Fluorescence-Activated Cell Sorter FBS fetales bovines Serum FCS engl., fetal calve serum FITC Fluorescein-5-Isothiocyanat FOX engl., forkhead-winged helix transcription factor FSC engl., forward scatter GMCSF engl., granulocyte-macrophage colony stimulating factor HLA engl., human leucocyte antigen HLA-DM engl., human leucocyte antigen DM HLA-DR engl., human leucocyte antigen DR i.p. intraperitoneal i.v. intravenös IBD engl., inflammatory bowel disease ICAM engl., intercellular adhesion molecule IFN Interferon Ii engl., invariant chain Ig Immunglobulin IL Interleukin 11 IMMIH Institut für Medizinische Mikrobiologie, Immunologie und Hygiene ISD engl., inflammatory skin disease kD Kilodalton LAP engl., latency associated peptide LPS Lipopolysaccharid M molar MACS Magnetic Activated Cell Sorting MHC engl., major histocompatibility complex MIIC engl., MHC class II compartment MS multiple Sklerose NOD engl., nuclear oligomerization domain PAMP engl., pathogen-associated molecular pattern PBS engl., phosphate buffered saline PCR engl., polymerase chain reaction PDGF engl., platelet-derived growth factor PE Phycoerythrin PRR engl., pattern-recognition receptor ROR engl., retinoic acid related orphan receptor s.c. subcutan SD engl., standard deviation SCCA engl., sterile cecal content adjuvant SEA Staphylococcus aureus Enterotoxin A siRNA engl., small interfering ribonucleic acid SMAC engl., supramolecular activation cluster SP1 Streptococcus pneumoniae Serotyp 1 Kapsel-Polysaccharid SSC engl., sideward scatter STAT engl., signal transducer and activator of transcription TCR engl., T cell receptor TGF engl., transforming growth factor TH T-Helferzelle TLR engl., TOLL-like receptor TNF Tumornekrosefaktor Treg regulatorische T-Zelle ZPS zwitterionische Polysaccharide 12 1. Einleitung 1.1 Das Immunsystem Der menschliche Organismus steht in permanenter Auseinandersetzung mit Pathogenen (Parkin et al. 2001). Als Pathogen wird ein krankheitsförderndes Agens verstanden, welches belebten (Viren, Bakterien, Protozoen, Parasiten) oder unbelebten Ursprungs (peptidische Pathogene, nichtpeptidische Pathogene) sein kann. Das Immunsystem beschreibt die Summe aller Mechanismen, die sich im Laufe der Evolution durch diese Auseinandersetzung entwickelt haben, um schadbringende Einflüsse auf den Organismus zu kontrollieren. Die Grundprinzipien des Immunsystems sind hierbei Erkennung und Unterscheidung von Fremd und Selbst, Einsatz von Effektormechanismen zur Pathogenabwehr, Ausbildung eines immunologischen Gedächtnisses sowie Kontrolle und gezielte Unterdrückung von überschießenden Abwehrreaktionen (Murphy et al. 2008). Das Immunsystem lässt sich untergliedern in angeborene und erworbene respektive adaptive Abwehr, wobei zwischen diesen beiden Armen eine enge Kommunikation und Interaktion besteht (Alam 1998). Die angeborene Immunität umfasst phylogenetisch ältere Mechanismen, die als erste Verteidigungslinie auf die Infiltration von Krankheitserregern reagieren. Ihrem Wesen nach funktionieren diese Abwehrmechanismen schnell und unmittelbar, wenig spezifisch und ohne Ausbildung eines bleibendes Gedächtnisses. Zum System der angeborenen Immunität werden unter anderem chemische und enzymatische Abwehrsubstanzen in Körpersekreten, das Komplementsystem sowie Phagozyten gerechnet (Chaplin 2010). Die meisten Pathogene werden durch die angeborene Immunität erkannt und lösen eine Kaskade der Immunabwehr aus, die oftmals in einer überlappenden und integrierenden Aktivierung der erworbenen Immunität mündet. Die Erkennung durch das angeborene Immunsystem erfolgt anhand spezieller Pathogen-assoziierter molekularer Muster (engl., pathogen-associated molecular pattern, PAMP) durch Erkennungsmoleküle und Rezeptoren, die zwar exklusiv auf eine jeweilige Gruppe von PAMP reagieren, innerhalb dieser Gruppe im Einzelnen gleichwohl eine breite Variation der Muster zulassen. Die Rezeptoren für Pathogen-assoziierte molekulare Muster werden unter der Abkürzung PRR (engl., pattern-recognition receptor, PRR) zusammengefasst. Zu den PRR gehören unter anderem die Rezeptoren der TLR-Gruppe (engl., TOLL-like receptor, TLR) und der NOD- 13 Gruppe (engl., nuclear oligomerization domain, NOD). Beispiele für PAMP sind unter anderem Bausteine bakterieller Zellwände wie Lipopolysaccharid (LPS) oder unmethylierte CpG-DNA (Diacovich et al. 2010). Die erworbene oder auch adaptive Immunabwehr entwickelt Mechanismen, die Pathogene effizient und nachhaltig kontrolliert. Nach Konfrontation mit einem Pathogen folgt sie der angeborenen Immunabwehr mit einiger Latenz und im Gegensatz zu jener unter Ausbildung eines immunologischen Gedächtnisses. Ihr Hauptprinzip ist die klonale Selektionierung von Abwehrzellen, die nunmehr spezifische Rezeptoren für eine ganz bestimmte Antigenstruktur besitzen. Zu den Hauptakteuren der erworbenen Immunität gehören aktivierte B-Zellen sowie die verschiedenen Linien Antigen-spezifischer T-Zellen (Murphy et al. 2008). 1.2 Antigenpräsentation und T-Zell-Aktivierung Professionelle Antigen-präsentierende Zellen (engl., Antigen-presenting cell, APC), zu denen dendritische Zellen (engl., dendritic cell, DC), Makrophagen und B-Zellen gerechnet werden, nehmen eine Vermittlerrolle zwischen angeborener und erworbener Immunität ein. Unter anderem aktivieren sie CD4+ T-Zellen durch Präsentation spezieller Antigenfragmente auf ihrer Zelloberfläche. Diese Fragmente sind an MHC Klasse II-Moleküle (engl., major histocompatibility complex, MHC) gebunden (Coquerelle et al. 2010). Das MHC Klasse II-Molekül (MHC-II) besteht aus zwei Polypeptidketten, α und β, von 34kD bzw. 29kD Größe, von denen jede wiederum aus zwei Domänen, α1 und α2 respektive β1 und β2, aufgebaut ist. Die α2- und β2-Domänen verankern MHC-II transmembranär. α1 und β1 bilden nicht-kovalent den Antigen-bindenden Spalt. Dieser Spalt ist sterisch zu beiden Enden hin offen, so dass theoretisch keine Obergrenze für die Größe des zu bindenden Antigens besteht und die Enden des gebundenen Peptids die Molekülgrenzen von MHC-II überschreiten können (Watts 2004). Gebundene Peptide zeigen eine Länge von minimal dreizehn Aminosäuren. Die Bindung erfolgt in linearer Konformation über Wasserstoffbrückenbindungen zwischen MHC-II und Antigenfragment. Die Bindung von Peptiden innerhalb des Antigen-bindenden Spalts ist notwendig zu Stabilisierung des MHC-II-Multimers. Im endoplasmatischen Retikulum tritt das MHC-II-Molekül in Bindung mit der invariant chain Ii, welche das Molekül stabilisiert und unspezifische Bindungen zellulärer Proteine an MHC-II verhindert. Darüber hinaus geleitet Ii die MHC-II-Moleküle in die Membranen des endosomalen Kompartiments (McFarland et al. 2002). 14 APC nehmen Antigene über Endozytose, Phagozytose oder Makropinozytose auf, so dass sich zunächst das komplette Antigenmolekül intrazellulär im Kompartiment früher Endosomen befindet. Neben dem Antigen enthalten Endosomen eine Reihe inaktiver proteolytischer und degradativer Enzyme wie Kathepsine oder Thiolreduktasen. Azidifizierung der frühen Endosomen führt zur Aktivierung der Enzyme, welche nicht nur Peptid- und Disulfidbrückenbindungen im Antigenholopeptid spalten, sondern auch Ii degradieren. Es verbleibt zunächst das Fragment CLIP (engl., class II-associated invariant-chain peptide, CLIP) von Ii in Bindung an den Antigenbindenden Spalt von MHC-II. Die Endosomen werden nunmehr als MIIC (engl., MHC class II compartment, MIIC) bezeichnet (Murphy et al. 2008) (Watts 1997). Die Trennung von CLIP vom Antigen-bindenden Spalt des MHC-II-Moleküls und die Bindung passender Antigenfragmente wird katalysiert durch das MHC-II-Homolog HLA-DM (engl., human leucocyte antigen DM, HLA-DM) (Kelly et al. 1991). HLA-DM garantiert die Bindung hochaffiner Fragmente, die für ein ausreichendes Zeitkontingent zur Aktivierung von T-Zellen quasi irreversibel an MHC-II verbleiben. Dieser Prozess wird als peptide editing bezeichnet (Busch et al. 2000). HLA-DM wiederum wird negativ reguliert durch HLA-DO (Kropshofer et al. 1999). Die Aufnahme von Antigenen durch dendritische Zellen veranlasst diese zur Migration in sekundäre lymphatische Organe, wo sie auf Antigen-spezifische, naive CD4+ T-Zellen treffen. Dabei durchlaufen dendritische Zellen morphologische und funktionelle Änderungen wie die Expression von kostimulatorischen Signalen auf der Zelloberfläche (Murphy et al. 2008). Reife dendritische Zellen exprimieren in hohem Maße CD11c:CD18 (Liu et al. 2010.) Naive CD4+ T-Zellen binden mit Hilfe ihres T-Zell-Rezeptors (engl., T cell receptor, TCR) an Epitope des präsentierten Antigenfragments. Hierbei tritt der TCR sowohl in Bindung mit dem Antigen als auch mit MHC-II. Ohne zusätzliches kostimulatorisches Signal führt diese Bindung zur funktionellen Ausschaltung der T-Zelle (Schwartz 2003). Kostimulatorische Signale werden unter anderem vermittelt über B7Moleküle wie CD86, das in hoher Dichte auf aktivierten DC exprimiert wird und in Wechselwirkung mit CD28 auf naiven CD4+ T-Zellen tritt. Wird das primäre MHC-II-TCR-Signal durch Antigen-unspezifische sekundäre Kosignale durch Rezeptor-Liganden-Interaktion zwischen DC und T-Zelle ergänzt, resultiert eine funktionelle Aktivierung der T-Zelle und deren Ausreifung und klonale Expansion zu einem jeweiligen Effektor-T-Zelltypus. Dieser Prozess wird als priming bezeichnet (Murphy et al. 2008). 15 Die initiale Bindung von naiven T-Zellen an APC in sekundären lymphatischen Organen wird durch nieder-affine Bindung zwischen Adhäsionsmolekülen wie LFA-1 auf T-Zellen und ICAM-1 und -2 auf DC bewirkt. Die Bindung zwischen TCR und MHC-II intensiviert diese Zelladhäsion durch konformationelle Änderungen von LFA und ICAM (Bromley et al. 2001). Polarisierungen des Zytoskeletts führen zur lokalen Rekrutierung von weiteren Kofaktoren und der Ausbildung einer immunologischen Synapse (engl., supramolecular activation cluster, SMAC) (Monks et al. 1998). 1.3 CD4+ T-Zellen 1.3.1 Das TH1/TH2-Paradigma Die naive, postthymische CD4+ T-Zelle ist eine multipotente Vorläuferzelle, deren Entwicklungsschicksal durch spezifische Zytokin-vermittelte Signale der angeborenen Immunität bestimmt wird (Murphy et al. 2002). Ende der 1980er Jahre definierten Mosmann und Coffman das Paradigma, dass sich naive CD4+ T-Zellen in Richtung zweier unabhängiger und weitgehend aussschließlicher Linien, TH1 oder TH2, differenzieren können (Mosmann et al. 1986) (Mosmann et al. 1989). Die Entwicklung von TH1-Zellen wird initiiert über die Aktivierung des T-Zell-Rezeptors (engl., T cell receptor, TCR) und mit dem Signalmolekül STAT1-assoziierter Zytokinrezeptoren (Weaver et al. 2006). Typ I und Typ II Interferone und IL-27 aus der IL-12-Familie bewirken eine STAT1Signalgebung über ihre entsprechenden Rezeptoren (Hibbert et al. 2003). Diese Zytokine werden durch pathogen-aktivierte Zellen der angeborenen Immunität geliefert, so z.B. IFNγ durch NKZellen und IFNα durch dendritische Zellen. STAT1 führt zur Aktivierung des Transkriptionsfaktors T-bet, dem Hauptregulator der TH1-Zelllinie (Szabo et al. 2000). T-bet führt zur Expression von Faktoren wie IFNγ, IL-12R und anderen, die in einer Rückkopplungsschleife die Zellentwicklung in TH1-Richtung befördern und im Gegenzug TH2-assoziierte Faktoren unterdrücken (Weaver et al. 2006). Daneben scheinen auch T-Zellaktivierungswege unabhängig von T-bet zu existieren (Way et al. 2004). TH2-Zellen entwickeln sich über die gemeinsame Aktivierung des TCR zusammen mit dem IL-4Rezeptor IL-4R via Signalgebung durch STAT6. Dies resultiert in Aktivierung des TH2Hauptregulators GATA-3 (Zheng 1997). GATA-3 programmiert die T-Zelle in Richtung eines Produzenten von IL-4, IL-5 und IL-13 und unterdrückt Faktoren wie STAT4, die kritisch sind für 16 die Entwicklung in Richtung TH1. Beispielhaft für die Ausschließlichkeit der T-HelferzellRichtungen hemmt IL-4 die Kolokalisierung des TCR und IFNγ-Rezeptors an der immunologischen Synapse zwischen naiven CD4+ Zellen und aktivierten APC und überführt die Zelle damit in Richtung TH2 (Maldonado et al. 2004). TH1-Zellen gelten als kritisch für die Elimination intrazellulärer Mikroorganismen, wohingegen TH2-Zellen eine wichtige Rolle in der Abwehr extrazellulärer Pathogene, unter anderem Helminthen, zukommt. TH2-Zellen gelten überdies als wichtige Zellen in der Entstehung allergischer Erkrankungen. Dysregulierten Reaktionen von TH1-Zellen wurden viele autoimmunologische Phänomene zugeordnet (Zhu et al. 2008). Beide Zellen sind entscheidend beteiligt an der Aktivierung von B-Zellen und an der Induktion des Klassenwechsels zwischen den verschiedenen Immunglobulin-Familien (engl., T-helper cells, T H) (Murphy et al. 2008). 1.3.2 TH17-Zellen und regulatorische T-Zellen Das TH1/TH2-Paradigma wurde zunehmend erweitert durch die Entdeckung zusätzlicher Entwicklungswege für naive, postthymische CD4+ Zellen, zum einen IL-17-produzierende TH17Zellen, zum anderen eine Reihe CD4+FOXP3+ Zellen, die regulatorisch und suppressiv auf die Funktionen von Effektor-T-Zellen wirken (Sakaguchi 2000). Diese letzteren Zellen exprimieren konstant die hochaffine Komponente des IL-2-Rezeptors CD25. Das Fehlen dieser regulatorischen T-Zellen ist assoziiert mit der Ausbildung schwerer Autoimmunerkrankungen wie dem IPEXSyndrom des Menschen (Immundysregulation, Polyendokrinopathie, Enteropathie, x-chromosomal) (Bennett et al. 2001). Regulatorische T-Zellen, die ihre Zelllinien-spezifische Ausreifung adaptiv postthymisch erhalten, werden unter der Bezeichnung iTreg (engl., inducible regulatory T cells, iTreg) zusammengefasst. Sie werden von denjenigen regulatorischen T-Zellen abgegrenzt, die sich bereits intrathymisch entwickeln (engl., natural regulatory T cells, nTreg) (Weaver et al. 2006). nTreg scheinen bevorzugt in T-Zellzonen sekundärer lymphatischer Organe zu wirken, wo sie die Ausreifung naiver CD4+ T-Zellen in eine jeweilige Effektorzelllinie vorab unterbinden. Ihr Erhalt ist abhängig vom Angebot an IL-2 (Chen et al. 2008). iTreg entwickeln sich aus naiven CD4+ T-Zellen in der Peripherie des Organismus parallel zur 17 Entwicklung von Effektor-T-Zellen. Mindestens zwei Zelllinien werden heute zu den iTreg gerechnet. Tr1-Zellen zeichnen sich durch hohe Produktion von IL-10 aus. Ihnen fehlt die Expression des Transkriptionsfaktors FOXP3. FOXP3+ iTreg unterscheiden sich kaum in ihren Effektorfunktionen von nTreg (Bettelli et al. 2006). Ob weitere Treg-Linien existieren oder einzelne Zelltypen unterschiedliche Aktivierungsstadien eines gemeinsamen Vorläufers darstellen, ist Gegenstand aktueller Diskussion (Korn et al. 2009). TGFβ1 induziert den für Treg spezifischen Transkriptionsfaktor FOXP3 und ist notwendig für den Erhalt von peripheren iTreg. IL-6, welches im Rahmen akuter entzündlicher Prozesse freigesetzt wird, unterbindet die Differenzierung von iTreg und befördert stattdessen die Polarisierung in Richtung TH17 (Korn et al. 2009). Die Differenzierung von TH17-Zellen geschieht in großem Maße exklusiv und in Abgrenzung zu den Differenzierungswegen von TH1- respektive TH2-Zellen sowie von Treg. Wohingegen alle drei vorgenannten Zelltypen in ihrem peripheren Erhalt abhängig sind von IL-2, gilt dies nicht für TH17-Zellen; vielmehr inhibiert IL-2 die Expression von IL-17A. IL-2-/-, IL-2Rα-/- und IL-2Rβ-/Mäuse zeigen eine Prädisposition zu Autoimmunerkrankungen bei erhöhter IL-17-Aktivität und reduzierter Anzahl an Treg (Fontenot et al. 2005). IL-2 bewirkt via STAT5 eine direkte Aktivierung der Genexpression von FOXP3 (Yao et al. 2007) (Burchill et al. 2007). Die Effektorzytokine der TH1 und TH2-Zelllinien, IFNγ, IL-12 und IL-4, sowie IL-2, IL-27 und Retinolsäure inhibieren die Entwicklung von TH17-Zellen (Harrington et al. 2005). RORγt ist der Zelllinien-definierende Transkriptionsfaktor für TH17-Zellen (Ivanov et al. 2007). RORγt-defiziente Mäuse zeigen reduzierte Ausdifferenzierung von TH17-Zellen und eine reduzierte Krankheitslast im Modell der EAE (engl. experimental autoimmune encephalitis, EAE) (Ivanov et al. 2006). Interessanterweise zeigen Mäuse, denen die Expression von T-bet, dem liniendefinierenden Transkriptionsfaktor für TH1-Zellen fehlt, eine verstärkte Polarisierung naiver CD4+ T-Zellen in Richtung von IL-17-Produzenten. Neben RORγt ist STAT3 unabdingbar für die Entwicklung von TH17-Zellen. Selektive Ausschaltung von STAT3 in T-Zellen verhindert die Ausbildung von TH17-Zellantworten und die Überexpression eines konstitutiv aktiven STAT3 fördert die Differenzierung von TH17-Zellen (Acosta-Rodriguez et al. 2007). Deletion von STAT3 verhindert darüber hinaus die Entwicklung von Autoimmunpathologie in einer Reihe experimenteller Modelle (Harris et al. 2007). STAT3 18 entfaltet seine Wirkung über direkte Interaktion mit dem IL-17A-Genlokus sowie mit der IL-21Promotorregion (Wei et al. 2007). SOCS3 dient als negativer Regulator von STAT3 (Chen et al. 2006). IL-6, IL-21 und IL-23 führen zur Aktivierung von STAT3 in T-Zellen. Die Expression des IL-23-Rezeptors IL-23R, die durch IL-6 und IL-23 gefördert wird, ist abhängig von STAT3(Nurieva et al. 2007) (Zhou et al. 2007). IRF4 ist ein positiver Regulator der Differenzierung von TH17Zellen. IRF4-/- Mäuse zeigen sich resistent gegen die Ausbildung von EAE. Der Einsatz von IRF4 siRNA reduziert die Wirksamkeit von TGFβ1 und IL-6 in Bezug auf die IL-17-Produktion (Brüstle et al. 2007). Neuere Arbeiten zeigen darüber hinaus die besondere Rolle des Signalmoleküls SMAD2 in der differenzierten Entwicklung von TH17-Zellen aus einem naiven CD4+ T-Zell-Pool nach Wirkung von TGFβ1 (Martinez et al. 2010) (Malhotra et al. 2010). Abb. 1: Differenzierung von CD4+ T-Zellen. Naive CD4+CD25- T-Zellen sind multipotente Vorläuferzellen, die sich unter dem Einfluss jeweiliger Zytokine in Richtung T H1, TH2, Treg oder TH17 polarisieren können. Gezeigt sind im Übrigen Zelllinien-definierende Transkriptionsfaktoren und Effektorzytokine von TH17. 19 1.4 Zytokine 1.4.1 Allgemeines Zytokine sind lösliche Proteine, die von einer breiten Vielfalt an Zellen auch außerhalb des Immunsystems sezerniert werden können und mannigfaltige Wirkungen an umgebenden oder entfernten Zellen entfalten. Manche Zytokine wirken in autokriner Schleife auf die produzierende Zelle selbst zurück. Viele Zytokine, die Prozesse von Zellen des Immunsystems beeinflussen, sind unter der Bezeichnung Interleukine zusammengefasst. Interleukine sind unter anderem entscheidend in die Polarisierung und den Erhalt von T-Zelllinien involviert (Murphy et al. 2008). 1.4.2 Interleukin-17 Interleukin-17 (IL-17) wurde zuerst 1993 von Rouvier et al. unter der Bezeichnung CTLA8 beschrieben (Rouvier et al. 1993). In der Folge wurde IL-17 als Teil einer in weiten Teilen homologen, sechsköpfigen Familie von Zytokinen erkannt und ergänzend in IL-17A, in Abgrenzung zu IL-17B-F, umbenannt. Murines und humanes IL-17 sind sowohl genetisch als auch strukturell signifikant konserviert (Moseley 2003). IL-17A ist Prototyp der IL-17-Familie und tritt auf in Form eines Disulfidbrücken-verbundenen, homodimeren Glykoproteins von 155 Aminosäuren Länge (Yao, Painter, et al. 1995). Es entfaltet seine Wirkung maßgeblich über den Rezeptor IL-17R (Untertypen IL-17RA und IL-17RC), ein transmembranöses Protein mit einer 293 Aminosäuren-langen extrazellulären Domäne, einem 21 Aminosäuren-langen Transmembranabschnitt und einem intrazytoplasmatischen Schwanz von 525 Aminosäuren Länge (Yao, Fanslow, et al. 1995). Dieser Rezeptor besitzt weite Verbreitung auf Lymphozyten, Gefäßendothelien, Epithelien, Fibroblasten, Osteoblasten, Mesothelzellen und Zellen des Knochenmarks (Kolls et al. 2004). IL-17 besitzt weite genetische Homologie mit der Sequenz des T-lymphozytotrophen Herpesvirus Saimirii (HSV13), dessen Genprodukt deshalb als virales IL-17 (vIL-17) bezeichnet wird (Yao, Fanslow, et al. 1995). IL-17 führt zwar zur Aktivierung von NF-κB via TRAF-6 und der MAPK (engl., mitogen-activated Proteinkinase, MAPK) und interagiert mit dem Adapterprotein Act1, die genaue Kaskade der Signalgebung durch IL-17R ist jedoch bisher noch nicht bekannt (Korn et al. 2009). IL-17, zunächst exklusiv als Produkt aktivierter T-Zellen aufgefasst (Moseley 2003), wird in der Tat neben CD4+ T-Zellen auch von einer Reihe weiterer Zellen exprimiert. Zu diesen Zellen gehören 20 CD8+CD45RO+ Gedächtnis-T-Zellen, neutrophile und eosinophile Granulozyten, Monozyten und Macrophagen sowie NKT-Zellen, NK-Zellen und γδ-T-Zellen (Molet et al. 2001) (Ferretti et al. 2003) (Liu et al. 2007) (Lockhart et al. 2006) (Zhou et al. 2005). Damit wird IL-17 sowohl von Zellen der angeborenen wie auch der erworbenen Immunität produziert, was verbindende Funktion dieser beiden Bereiche des Immunsystems durch IL-17 nahe legt (Korn et al. 2009). Die Entdeckung von IL-17 legte die Grundlage der Definition von CD4 + TH17-Zellen als eigenständiger Zelllinie unabhängig von T H1- und TH2-Zellen. IL-17A ist ein proinflammatorisches Zytokin, dass in seinen Zielzellen die Expression unterschiedlicher inflammatorischer Zytokine wie TNF, IL-1β, IL-6, GM-CSF, G-CSF, Chemokine wie CXCL1, CXCL8, CXCL10 und Metalloproteinasen bewirkt (Korn et al. 2009). IL-17 bewirkt die Aktivierung, Rekrutierung und Migration von Neutrophilen und trägt zur strukurellen und funktionellen Ausformung von Keimzentren in Lymphfollikeln bei (Kolls et al. 2004) (Korn et al. 2009). IL-17F steht IL-17A innerhalb der IL-17-Familie strukturell und funktionell am nächsten. IL-17F existiert in zwei Isoformen mit einer Homologie von 55% respektive 40% zu IL-17A (Kolls et al. 2004). Im Unterschied zu den anderen Mitgliedern der IL-17-Familie liegen die Gene von IL-17A und IL-17F gemeinsam mit einem Abstand von 46050 Basenpaaren auf dem murinen Chromosom 1 respektive Chromosom 6 beim Menschen. IL-17F wird von denselben Zellen exprimiert, die auch zur Expression von IL-17A befähigt sind und führt zu vergleichbaren Reaktionen bei seinen Zielzellen. Auch IL-17F bindet den Zielrezeptor IL-17RA, jedoch mit geringerer Affinität als IL17A (Moseley 2003). Im Unterschied zu den vorgenannten IL-17A und IL-17F besitzen die übrigen Mitglieder der IL-17Familie nicht nur zunehmende Variation ihrer Proteinstruktur, sondern unterscheiden sich ebenfalls deutlich in den jeweiligen Ursprungszellen und der Wirkung auf entsprechende IL-17-Rezeptoren (Kolls et al. 2004). IL-17A wirkt protektiv besonders an mucosalen Grenzflächen und gegen Pathogene, gegenüber welchen TH1- und TH2-Antworten alleine nicht suffizient erscheinen (Korn et al. 2009). IL-17A bewirkt die Rekrutierung von Neutrophilen gegen Infektionen mit Klebsiella pneumoniae (Aujla et al. 2008). IL-17A verstärkt die bakterizide Aktivität von Makrophagen im Rahmen einer Infektion mit Bordetella pertussis (Higgins et al. 2006). IL-17A und F tragen über die Rekrutierung von 21 Neutrophilen zur Abwehr der Infektion mit Mycoplasma pneumoniae in Mäusen bei (Wu et al. 2007). Während der Infektion mit Mycobakterium tuberculosis fördert IL-17 über die Expression von Chemokinen die Infiltration protektiver IFN-γ-produzierender TH1-Zellen (Khader et al. 2007). IL-17A-defiziente Mäuse zeigen eine Prädisposition zur Infektion mit Candida albicans und die Injektion von IL-17A führt im Gegenzug zum Schutz vor letalen Dosen dieses Pathogens (Huang et al. 2004). Innerhalb eines humanen T-Gedächtniszell-Pools findet sich eine hohe Dichte an Zellen mit Candida-spezifischen TCR. In vielen Szenarien führt IL-17 jedoch zu überschießender Inflammation und Autoimmunpathologie. Im Rahmen der experimentellen autoimmunen Enzephalomyelitis (engl., experimental autoimmune encephalomyelitis, EAE), welche als murines Modell der menschlichen multiple Sklerose (MS) dient, zeigen IL-17A-defiziente Mäuse mit erhaltener IL-17F-Produktion eine mildere Krankheitsausprägung (Komiyama et al. 2006). Antikörper spezifisch gegen IL-17A schwächen EAE ab, beseitigen sie jedoch nicht vollständig (Hofstetter et al. 2005). IL-17 findet sich hochgradig in chronischen Multiple-Sklerose-Herden des Menschen und wird dort exprimiert durch CD4+ und CD8+ T-Zellen sowie Astrozyten (Tzartos et al. 2008). Als Folge der Produktion von IL-17 und IL-22 sind menschliche TH17-Zellen in der Lage, die Blut-Hirn-Schranke zu überqueren, um in der Folge intrazerebralen Neuronenuntergang und Entzündung zu fördern (Kebir et al. 2007). Mäuse mit einem kombinierten Defizit in der Produktion von IL-17A und IL-17F zeigen eine signifikant reduzierte Schwere der EAE (Yang, Chang, et al. 2008). IL-17F-defiziente Mäuse mit normaler Expression von IL-17A zeigen eine dezent mildere Form der EAE. Jedoch findet sich in diesen Tieren bei einem Modell bronchialer Hyperreagibilität eine vermehrte Infiltration von Eosinophilen bei ausgeprägt reduzierter Einwanderung von Neutrophilen (Yang, Chang, et al. 2008). Die inflammatorische Hauterkrankung von Mäusen, ein experimentelles Modell der menschlichen Psoriasis vulgaris, stellt ein weiteres Beispiel für pathologische Reaktionen von TH17-ZellEffektorfunktionen dar. In psoriatischen Läsionen finden sich höhere Zahlen an T H17-Zellen als an TH1-Zellen (Lowes et al. 2008). Zielgerichtete anti-TNF-Therapie der Psoriasis wirkt über die Verminderung der Anzahl an TH17-Zellen (Lowes et al. 2008). Am Beispiel chronisch-entzündlicher Darmerkrankungen (engl., inflammatory bowel disease, IBD) 22 ist die Rolle von IL-17 weniger klar. TH17-Zellen haben größere Potenz zur Initiierung von IBD als TH1-Zellen (Elson et al. 2007). Die Blockade von IL-17A in IBD IL-10-defizienter Mäuse verhindert nicht die Krankheitsentwicklung, es sei denn auch IL-6 wird ausgeschaltet (Yen et al. 2006). Therapie mit einem anti-IL-17A-Antikörper führt jedoch zu einer Verstärkung der DSSinduzierten Colitis, einem experimentellen murinen Modell zum Studium menschlicher IBD (Ogawa et al. 2004). In diesem Fall scheint IL-17A eine protektive Rolle zuzukommen, wohingegen IL-17F die Krankheitsausprägung verstärkt. 1.4.3. Interleukin-6 Interleukin-6 (IL-6) wurde 1986 als Faktor zur Regulation von B-Zell-Funktionen entdeckt (Yang, Chang, et al. 2008). Jedoch ist es ein pleiotropes Zytokin, dass von einer Reihe Zellen des Immunsystems wie DC und Makrophagen sowie non-hämatopoietischen Zellen wie Fibroblasten produziert wird (Kamimura et al. 2003). IL-6 gilt als proinflammatorisches Zytokin, dem eine entscheidende Rolle in der Pathogenabwehr während Infektionen sowie im Rahmen von Gewebsschädigungen bei entzündlichen und autoimmunologischen Erkrankungen wie MS zukommt (Dienz et al. 2009). In jüngerer Zeit wurde IL-6 als Faktor in der Regulation von T-ZellAntworten definiert (Dienz et al. 2009). Die Produktion von IL-6 wird induziert als Antwort auf eine Reihe von Stimuli wie TNFα, IL-1, LPS und PDGF (Kamimura et al. 2003). Es entfaltet seine Wirkungen einerseits über den membranständigen Rezeptor IL-6R, der einen Komplex mit gp130 bildet, andererseits über Bindung an den löslichen IL-6-Rezeptor sIL-6R – ein Prozess, der als trans signaling bekannt ist (Scheller et al. 2006). Nachgeschaltet ist eine Kaskade von Kinasen wie JAK1, JAK2 und TYK2, die unter anderem zu einer Aktivierung des Transkritionsfaktors STAT3 führen (Heinrich et al. 2003). IL-6 bewirkt die hepatische Produktion von akute Phase Proteinen und reguliert Proliferation, Funktion Überleben von T-Zellen (Dienz et al. 2009). Es ist involviert in die Ausreifung naiver CD4+ T-Zellen, indem es einerseits den TH2-Differenzierungsweg befördert (Rincon 1997). In jüngerer Zeit wurde die zentrale Rolle von IL-6 in der Ausdifferenzierung von T H17-Zellen sowie ein potentieller Beitrag zur Polarisierung eines neuen Zelltyps Tfh (engl., T follicular helper cells, Tfh) erkannt (Zhou et al. 2007) (King et al. 2008). 23 1.4.4 Transforming Growth Factor Die TGF-Familie umfasst eine Reihe von Zytokinen, unter ihnen die TGFβ-Gruppe, zu der wiederum TGFβ1, TGFβ2 und TGFβ3 gerechnet werden (Massagué 1990). Die einzelnen Vertreter dieser Familie sind strukturell eng miteinander verwandt und bestehen in ihrer aktiven Form aus einem 12kD Polypeptid, das aus jeweils größeren Vorläuferpeptiden prozessiert wurde (Massagué 1990). TGFβ1 ist ein 25kD großes, Disulfidbrücken-verbundenes, dimeres Peptid, dass nach Sekretion in Bindung an das Peptid LAP (engl., latency-associated peptide, LAP) innerhalb der extrazellulären Matrix vorliegt (Roberts 1981). TGFβ1 entfaltet seine Wirkung nach Abspaltung von LAP an einem breiten Spektrum an Vorläuferzellen, Stammzellen sowie ausdifferenzierten Zelltypen. TGFβ1 wirkt über die Aktivierung eines heteromeren, Serin-Threonin-Kinasen-gekoppelten Zelloberflächenrezeptors, der sich aus dem TGFβ-Rezeptor Typ I, Typ II und Typ III zusammensetzt. CD105 wirkt als Ko-Rezeptor (Feng et al. 2005). TGFβ1 ist ein pleiotroper, pluripotenter Wachstumsfaktor, der in Prozesse des Zellwachstums und der Zelldifferenzierung, in Apoptose, Zellmobilität, Produktion extrazellulärer Matrix, Angiogenese und zelluläre Immunität involviert ist (Dumont et al. 2003). Neuere Arbeiten demonstrieren die Rolle von TGFβ1 in der Tumorgenese sowie als immunsuppressives Zytokin in entzündlichen Vorgängen (Kelly et al. 2010). TGFβ1 kann die Aktivität von NK-Zellen unterdrücken, die Proliferation von T-Lymphozyten sowie deren Differenzierung und Funktion inhibieren, die Produktion von Zytokinen reduzieren und die Reifung von dendritischen Zellen blockieren (Mulé et al. 1988). Die immunsuppressive Rolle von TGFβ1 wird dadurch unterstrichen, dass der Wachstumsfaktor entscheidend ist für die Polarisierung von regulatorischen T-Zellen (Sakaguchi 2000). Umso erstaunlicher erscheint, dass TGFβ1 zusammen mit IL-6, welches ein nahezu oppositionelles Wirkprofil zu TGFβ1 besitzt, für die Generierung des proinflammatorischen Zelltyps der TH17-Zellen verantwortlich ist (Mangan et al. 2006). 24 1.5 Bakterielle kapsuläre Polysaccharide 1.5.1 Allgemeines Die meisten pathogenen Bakterien exprimieren hochmolekulare Polysaccharide, die ihre Oberfläche in Form einer Kapsel ummanteln. Für das Bakterium Streptococcus pneumoniae wurden allein mehr als 90 unterschiedliche Kapsel-Polysaccharide identifiziert (Avci et al. 2010). Polysaccharidkapseln gewähren pathogenen Bakterien Schutz vor der Phagozytose durch Zellen der angeborenen Immunität, zum Beispiel durch eine erschwerte Bindung von Opsoninen des Komplementsystems (Murphy et al. 2008). Entscheidend für die Elimination von kapseltragenden Bakterien sind demnach Effektormechanismen des adaptiven Immunsystems, namentlich die Ausbildung Polysaccharid-spezifischer Antikörper (Kindt et al. 2007). Strukturelle Unterschiede der jeweiligen Polysaccharide wie Unterschiede in der Abfolge der Kohlenhydrate, räumliche Konformation und elektrostatische Ladung können in unterschiedlichen Antworten des Immunsystems resultieren (Ovodov 2006). Impfung mit bakteriellen Polysacchariden ist ein lange praktiziertes Verfahren, um protektive Immunantworten präventiv zu vermitteln (Macleod et al. 1945). Die meisten bakteriellen Polysaccharide sind T-Zell-unabhängige Antigene, die die Produktion von IgM-Antikörpern mit nur geringem Klassenübergang zu IgG induzieren. Sie versagen in der Erzeugung einer langanhaltenden Immunantwort, wenn sie in purer Form appliziert werden, da sie es nicht vermögen, den adaptiven Arm des Immunsystems entsprechend zu aktivieren (Lesinski et al. 2001). Dies gilt in besonderem Maße im Falle von Kleinkindern und geriatrischen Patienten sowie Mäusen (Barrett 1985). Auf der Basis des Hapten-Carrier-Modells wird die Immunogenität bakterieller Polysaccharide dadurch erhöht, indem sie in sogenannten Glykokonjugatimpfstoffen an Peptide gekoppelt werden (Mitchison 1971). Über die Vermittlung dieser Peptide induzieren diese Polysaccharide eine ausreichende T-Zellantwort sowie ein lang anhaltendes immunologisches Gedächtnis mit IgGAntikörpern und T-Gedächtniszellen (Trotter et al. 2008). 1.5.2 Zwitterionische Polysaccharide Wohingegen die meisten bakteriellen Polysaccharide entweder positive oder negative Ladungsmuster tragen, existiert eine Gruppe von Polysacchariden, die sich durch das parallele Vorhandensein von positiven (freie Aminogruppen) und negativen Ladungen (Carboxyl- oder 25 Phosphatgruppen) innerhalb der repetitiven Struktur des Gesamtmolekül auszeichnen (Cobb et al. 2005). Diese Polysaccharide werden als zwitterionische Polysaccharide (engl., zwitterionic polysaccharides, ZPS) bezeichnet. Zu den ZPS zählen die Polysaccharide Typ 5 und Typ 8 (CP5 und CP8) von Staphylococcus aureus (Tzianabos et al. 2001), PSA von Bacteroides fragilis 638R und NCTC 9343 (Wang et al. 2006)(Tzianobos et al. 1993) und das Typ 1 Polysaccharid Sp1 von Streptococcus pneumoniae (Velez et al. 2009). Abb. 2: Struktur von Sp1, modifiziert nach (Avci et al. 2010). Trisaccharid-Einheiten aus zwei Galakturonsäuren und einer Galaktose (2-Acetamid-4-Amino-2,4,6- Tridesoxygalaktose) in sich wiederholender Abfolge bilden das Grundgerüst. Jede Trisaccharid-Einheit mit einer positiv geladene Aminogruppe und zwei negativ geladenen Carboxylgruppen hat ein Molekulargewicht von 537 D (Stroop 2002). Das exklusive Ladungsmuster der ZPS ist maßgeblich verantwortlich für ihre besondere immunologische Aktivität, nämlich die Fähigkeit, T-Zellen in Abwesenheit von Trägerproteinen über Bindung an MHC-II zu aktivieren (Tzianabos et al. 1993) (Cobb et al. 2004) (Duan et al. 2008). Versuche, die nach Einfügung zwitterionischer Ladungsmotive in anionische Polysaccharide für diese so modifizierten Polysaccharide ein ähnliches Reaktionsmuster wie für natürlich vorkommende ZPS nachweisen konnten, unterstreichen diese Bedeutung (Gallorini et al. 2007). ZPS werden in Endosomen von APC in Moleküle einer Größe von 10 bis 15 kD depolymerisiert und in dieser Form an MHC-II transferiert (Velez et al. 2009). Ausschaltung entweder der positiven, z.B. mittels N-Acetylierung, oder negativen Ladungsfraktion, wie z.B. durch CarbodiimidReduktion, führt zum Ausbleiben der T-Zell-Aktivierung via MHC-II (Tzianabos et al. 1993) (Cobb et al. 2004). Die so chemisch modifizierten ZPS werden zwar noch durch APC in Endosomen aufgenommen, jedoch nicht mehr an der Zelloberfläche präsentiert (Cobb et al. 2008). Noch ist 26 unklar, ob das zwitterionische Ladungsmotiv notwendig ist allein für die elektrostatische Bindung an MHC-II oder ob die dreidimensionale Struktur die MHC-II-Bindung bedingt (Avci et al. 2010). Bisherige Untersuchungen zur dreidimensionalen Struktur von ZPS zeigen, dass Sp1 und PSA trotz ihrer Primärstruktur aus unterschiedlichen Monosacchariden beinahe identische räumliche Konformation besitzen (Choi et al. 2002) (Wang et al. 2000). Diese Struktur ist eine ausgedehnte, rechts gedrehte Helix mit einem Windungsabstand von 20Ǻ. Eine Drehung wird durch die Abfolge von acht Monosacchariden gebildet. Positive und negative Ladungen alternieren in der Abfolge und sind exponiert auf der äußersten Oberfläche der Helix. Sp1 und PSA tragen beide ihre positiven Ladungen in Form der Aminogruppen in äquidistantem Abstand von 15Ǻ (Choi et al. 2002). Rein positiv geladene ZPS wie auch rein negative oder neutrale zeigen alle keine Ausbildung einer helikalen Grundstruktur (Kreisman et al. 2007). Diese dreidimensionale Form erscheint zunehmend zentral im Verständnis der Bindung von ZPS an MHC-II (Avci et al. 2010). Fragmente von ZPS zeigen dann optimale Bindung, wenn sie prozessiert mit einem Molekulargewicht von 3 bis 30kD vorliegen (Kreisman et al. 2007). Darüber hinaus scheint das zwitterionische Ladungsmotiv wesentlich über elektrostatische Wechselwirkungen zur Bindung an MHC-II beizutragen. Cobb et al. konnten zeigen, dass diese Wechselwirkungen durch Zugabe von NaCl und Änderungen des pH-Wertes beeinflussbar sind (Cobb et al. 2008). Dies impliziert, dass die Prozessierung und Bindung von ZPS an MHC-II im Endosom pH-abhängig in saurem Milieu erfolgt. 27 Abb. 3: Dreidimensionale Konformation von ZPS. Sp1 (dunkel) und PSA (hell) wurden anhand ihrer Aminogruppen übereinander projiziert. Kugeln stellen positive Ladungen dar. Beide ZPS zeigen eine ähnliche Konformation mit einem Abstand von 15Ǻ zwischen den Ladungen (modifiziert nach (Avci et al. 2010) 28 1.5.3 T-Zell-Aktivierung durch ZPS Sogenannte Superantigene viralen oder bakteriellen Ursprungs wie die StaphylokokkenEnterotoxine (SE) sind in der Lage eine Aktivierung von T-Zellen herbeizuführen, ohne in APC zu Peptidfragmenten in MHC-Bindung prozessiert zu werden. In der Tat zerstört eine biochemische Modifikation die immunologische Aktivität von Superantigenen. Superantigene binden nicht innerhalb des Antigen-bindenden Spalts, sondern vielmehr unabhängig an die äußere Oberfläche von TCR und MHC-II und führen über diesen andersartigen Mechanismus zu einer Aktivierung von bis zu 20% des gesamten T-Zellpools (Murphy et al. 2008). ZPS wirken nicht als Superantigene (Avci et al. 2010). Für das ZPS PSA beispielsweise konnte gezeigt werden, dass es entsprechend einem Peptidantigen in einem stöchiometrischen Verhältnis von 1:1 in Bindung mit HLA-DR2 tritt, wohingegen das Superantigen SE-A ein Bindungsverhältnis von 1-2:1 aufweist (Cobb et al. 2008). Hierbei ist nicht geklärt, ob PSA sowohl innerhalb als auch außerhalb des Antigen-bindenden Spalts an MHC-II bindet oder ob die Bindungen Änderungen der Konformation von MHC-II auslösen. Klärende kristallografische Untersuchungen hierzu konnten bislang aufgrund technischer Schwierigkeiten nicht durchgeführt werden (Avci et al. 2010). Die Prozessierung von ZPS ähnelt in weiten Teilen derjenigen von Peptidantigenen (Cobb et al. 2004). ZPS werden hierzu durch professionelle Antigen-präsentierende Zellen (APC) wie dendritischen Zellen, Makrophagen oder B-Zellen endozytotisch aufgenommen (Duan et al. 2008) (Mazmanian et al. 2005). Es wird vermutet, dass diesem Prozess ein Rezeptor-unabhängiger Mechanismus vergleichbar der Makropinozytose zugrunde liegt (Avci et al. 2010). Im Endosom erfolgt eine Fragmentierung des Polysaccharids (Velez et al. 2009) (Duan et al. 2008). Diese chemische Degradation erfolgt jedoch in Ermangelung spezifischer depolymerisierender Enzyme und Resistenz gegenüber eukaryotischen Glucosidasen Enzym-unabhängig. Es konnte gezeigt werden, dass die Prozessierung im Endosom über die Vermittlung reaktiver Stickstoffspezies wie NO erfolgt (Duan et al. 2008). Hierzu bedarf es freier Aminogruppen im ZPS-Molekül. NAcetylierung der Aminogruppen verhindert die Desaminierung und damit die Prozessierung (Vilar et al. 1997). iNOS-/- Mäuse, denen das Enzym zur Produktion von NO fehlt, zeigen nach intraperitonealer Injektion von PSA keine Ausbildung von Abszessen und keine DC-vermittelte TZell-Aktivierung (Duan et al. 2008). Im Anschluss verschmelzen die Endosomen, die die prozessierten ZPS-Fragmente von circa 15 kD 29 Größe enthalten, mit Lysosomen und exozytotischen Vesikeln aus dem Golgi-Apparat. Diese so geformten sogenannten MIIC-Vesikel enthalten freies ZPS, Kathepsin sowie membrangebunden HLA-DR, HLA-DM und lysosome-associated membrane proteine 1 (LAMP1). Unter Vermittlung von HLA-DM kommt es zur Dissoziation von HLA-DR und CLIP und der Bindung des ZPS an den MHC-II-Komplex. Dieser Vorgang verlangt ein saures Milieu. HLA-DM stabilisiert vorübergehend das von CLIP getrennte MHC-II-Molekül, welches ansonsten dissoziieren würde. HLA-DM ist für den Ablauf der Prozessierung von ZPS essentiell. So zeigen beispielsweise HLA-DM-/- Mäuse reduzierte Entwicklung von Abszessen nach intraperitonealer Injektion von ZPS (Stephen et al. 2006) (Cobb et al. 2008). ZPS gebunden an MHC-II werden auf der Oberfläche von APC präsentiert (Stephen et al. 2006) (Duan et al. 2008). Dort tritt der ZPS-MHC-II-Komplex in Bindung mit dem αβ-TCR auf T-Zellen. ZPS-spezifische T-Zell-Klone scheinen Kreuzreaktivität zwischen unterschiedlichen ZPS zu zeigen (Stingele et al. 2004). Sie führen darüber hinaus zu einer nachweisbaren Induktion von GedächtnisT-Zellen sowie zu einer oligoklonalen Expansion von T-Zellen mit einem nicht-restringierten Repertoire an Vβ-Ketten des TCR. Superantigene im Gegenzug würden zu einer polyklonalen Antwort innerhalb einer limitierten Anzahl bestimmter TCR BV Familien führen (Groneck et al. 2009). 1.5.4 Bedeutung der T-Zell-Aktivierung durch ZPS In Interaktion mit dem Immunsystem kommt ZPS einerseits eine proinflammatorische, unter besonderen Bedingungen aber auch eine immunomodulatorische-immunsuppressive Rolle zu. Die Grundlage dieses sich scheinbar widersprechenden Verhaltens ist bislang noch nicht vollends verstanden (Tzianabos 2003) (Avci et al. 2010) (Mertens et al. 2009). In einem Modell peritonealer Sepsis führen ZPS nach intraperitonealer Injektion zusammen mit dem Adjuvans SCCA zur Ausbildung intraabdomineller Abszesse (Onderdonk et al. 1977). SCCA imitiert den Übertritt von Darminhalt wie er im Rahmen einer sekundären Peritonitis angetroffen wird und schafft ein proinflammatorisches Milieu über die Ausschüttung von TNFα und IL-1b durch ortsständige Macrophagen (Gibson 1997) (Tzianabos, Chandraker, et al. 2000). Dies resultiert in einer vermehrten Expression von ICAM-I auf Mesothelzellen, was die Adhäsion von polymorphonukleären Zellen (engl., polymorphonuclear cells, PMN) verbessert. SCCA führt nicht 30 zu einer vermehrten Ausschüttung von IFNγ. T-Zellen sind entscheidend für die Abszessentwicklung (Shapiro et al. 1986). CD4+-defiziente Mäuse bilden keine Abszesse aus. In diesem Modell kommt dem ko-stimulatorischen Signalpfad CD28-CD86 (B7.2) eine zentrale Rolle zu (Tzianabos, Chandraker, et al. 2000) (Stephen et al. 2005). Dieser Pfad führt zu T-Zellproliferation und Sekretion von IL-2. Selektive Stimulation von CD28 mit Hilfe eines monoklonalen Antikörpers führt zu verstärkter Ausbildung von Abszessen. Dennoch wird IL-2 zusammen mit IL-10 und IFNγ auch eine Rolle im ZPS-induzierten Schutz vor Abszessentwicklung zugeschrieben (Tzianabos et al. 1999). Die subkutane Vorab-Injektion des Vollkeimes Bacteroides fragilis oder eines aufgereinigten ZPS ohne zusätzliches Adjuvans vermittelt Schutz vor der Induktion intraabdomineller Abszesse (Tzianabos, Chandraker, et al. 2000). Dieser Schutz erscheint T-Zell- und IL-10-vermittelt (Tzianabos et al. 1999). In einem Fibrosemodell konnte gezeigt werden, dass ZPS zur Induktion von IL-10-produzierenden CD4+CD45RBlo Zellen führen, die die Schwere der Fibrose reduzieren (Ruiz-Perez et al. 2005). Dieser IL-10-vermittelte immunologische Schutz durch ZPS erstreckt sich auch auf ein Modell chronisch-entzündlicher Darmerkrankung (Mazmanian et al. 2008). Weitere Untersuchungen weisen auf eine Rolle von ZPS in der Entwicklung lymphatischer Organe hin und zeigen, dass ZPS eine T H1/TH2-Dysbalance korrigieren und systemische T-Zell-Defizienz beeinflussen können (Avci et al. 2010). 31 1.6 Fragestellung Die Ausbildung intraperitonealer Abszesse im Rahmen einer sekundären Peritonitis ist behaftet mit hoher Morbidität und Mortalität. Zwitterionische Polysaccharide wie Sp1 gehören zu einer neuen Klasse MHC-II-abhängiger Antigene und führen in einem Mausmodell zusammen mit Adjuvans zur Ausbildung von intraperitonealen Abszessen. CD4+ T-Zellen sind die zentralen Vermittler der Abszessentstehung, wobei hierbei bisher die jeweiligen Rollen unterschiedlicher CD4 + T-Zelltypen nicht eindeutig geklärt sind. Neben T H1- und TH2-Zellen wurde innerhalb der letzten Jahre eine neue Untergruppe von IL-17-produzierenden CD4+ T-Zellen als eigenständige TH17-Zelllinie definiert. TH17-Zellen sind involviert in einem breiten Spektrum inflammatorischer und autoimmunologischer Prozesse. Verständnis der Mechanismen, die zu IL-17-vermittelter Pathologie führen, kann zu potentiellen neuen therapeutischen Optionen in der spezifischen Behandlung und Prävention von Entzündungen, Sepsis und Autoimmunerkrankungen führen. Wir wollen in dieser Arbeit untersuchen, welche Bedeutung IL-17 und TH17-Zellen in der Abszessgenese durch Sp1 zukommt und welche Mechanismen zur Ausdifferenzierung einer Sp1-spezifischen T H17Effektorantwort führen. 32 2. Materialien 2.1 Geräte Durchflusszytometer FACSCalibur Becton Dickinson, Heidelberg, D Pipettierhilfe acu IBS Integra Biosiences, Fernwald, D Schublehre Vernier Caliper Asimeto Germany GmbH, Weißbach, D ELISA Reader MRXtc Dynex Technologies, Denkendorf, D Microskop Axiovert 25 Carl Zeiss AG, Jena, D Work-Bench Safe 2010 1,8 IBS Integra Biosciences, Fernwald, D Work-Bench LaminAir HB 2448 Heraeus Instruments GmbH, Osterode, D Pipetten Finipipette Thermo Labsystems, Egelsbach, D Vortexer Vortex Genie 2 Scientific Industries, New York City, USA Zentrifuge Multifuge 3 S-R Kendro Laboratory Products GmbH, Langenselbold, D Zentrifuge Heraeus Fresco 21 Thermo Electron Corporation, Egelsbach, D Brutschrank Steri-Cycle CO2-Inkubator ThermoLife Sciences, Egelsbach, D Magnet MidiMACS Separator Miltenyi Biotec GmbH, Bergisch-Gladbach 2.2 Verbrauchsmaterial Kanülen Sterican 20G, 27G B. Braun Melsungen AG, Melsungen, D Zellscraper BD Falcon Cell scraper BD Biosciences, Franklin Lakes, USA Reagenzröhrchen BD Falcon Concical Tubes BD Biosciences, Franklin Lakes, USA Reagenzröhrchen Greiner bio one GmbH, Frickenhausen, D FACS Tubes Sarstedt, Nümbrecht, D Spritzen Discardit BD Biosciences, Franklin Lakes, USA Pipettenspitzen TipOne StarLab, Ahrensburg, D Pipettenspitzen Sarstedt, Nümbrecht, D Pasteurpipetten Sarstedt, Nümbrecht, D Zellkulturplatte Multidish 12 Nunc GmbH & Co. KG, Langenselbold, D Elisa 96-Well-Plate MaxiSorb Nunc GmbH & Co. KG, Langenselbold, D Microliter-Aliquot-Gefäße SafeLock Eppendorf GmbH, Wesseling-Berzdorf, D MACS CD4+ T Cell Isolation Kit Miltenyi Biotec GmbH, Bergisch-Gladbach, D 33 Trennsäule MACS Column LS Miltenyi Biotec GmbH, Bergisch-Gladbach, D TGF-beta1-ELISA eBioscience, San Diego, USA human/mouse TGF-beta1ELISA Ready-SET-Go! IL-17-ELISA eBioscience, San Diego, USA mouse IL-17A ELISA Ready-SET-Go! Zellsiebe Sarstedt, Nümbrecht, D 2.3 Puffer und Lösungen Wasser zu Injektionszwecken Aqua ad Delta-Pharma GmbH, Pfullingen, D injectabilia Phosphate Buffered Saline (PBS), pH 7,2 Biochrom, Berlin, D MACS-Puffer PBS, 0,5% Bovine Serum Albumin (BSA), 2mM EDTA Zellwasch-Puffer PBS, 1mM EDTA, 1% LPS-free Fetal Bovine Serum (FBS) Histopaque-Puffer PBS, 1mM EDTA EasySep-Puffer PBS, 1mM EDTA, 2% LPS-free Fetal Bovine Serum (FBS) FACS-Puffer PBS, 10% Fetal Calf Serum (FCS) Fixations-/Permeabilisationslösung BD Biosciences, Franklin Lakes, USA Cytofix/Cytoperm Perm/Wash Puffer BD Biosciences, Franklin Lakes, USA Elisa Waschpuffer eBioscience, San Diego, USA PBS, 0,05% Tween-20 Trypan Blue Solution 0,4% Sigma-Aldrich, Saint Louis, USA 34 2.4 Medien und Zusätze Histopaque 1083 Sigma-Aldrich, Saint Louis, USA RPMI 1640 Life-Technologies, Karlsruhe, D Penicillin/Streptomycin (Pen/Strep) Life-Technologies, Karlsruhe, D Fetal Calf Serum (FCS) Life-Technologies, Karlsruhe, D Fetal Bovine Serum (FBS) Life-Technologies, Karlsruhe, D Bovine Serum Albumin (BSA) Life-Technologies, Karlsruhe, D murine Granulocyte-Macrophage-Colony- Life-Technologies, Karlsruhe, D Stimulating-Factor (mGMCSF) BMDC-Medium RPMI 1640, 5% FBS, 50µl betaMercaptoethanol, 10% Pen/Strep T-Zell-Medium RPMI 1640, 10% Fetal Calf Serum (FCS), 1% Pen/Strep Phorbol 12-Myristat 13-Acetat (PMA) Sigma-Aldrich, Saint Louis, USA Ionomycin Sigma-Aldrich, Saint Louis, USA Proteintransportinhibitor GolgiStop BD Biosciences, Franklin Lakes, USA Proteintransportinhibitor GolgiPlug BD Biosciences, Franklin Lakes, USA Lyophilisat der kapsulären Bestandteil von S. American Type Culture Collection, Manassas, pneumoniae Serotyp 1 (Sp1) USA Sterile Coecal Content Adjuvant (SCCA) Eigenproduktion 35 2.5 Antikörper 2.5.1 FACS Spezifität Klon anti-mouse CD11c HL3 Konjugat Isotyp Hersteller PE Ar Ham IgG1 BD Pharmingen, (Integrin αxChain) Franklin Lakes, USA anti-mouse IL-6 MP520F3 FITC Rat IgG1 R&D Systems, Minneapolis, USA anti-mouse IL-17 TC11-18H10 PE Rat IgG1 BD Pharmingen, Franklin Lakes, USA anti-mouse CD4 RM4-5 APC Rat IgG2a (L3T4) BD Pharmingen, Franklin Lakes, USA anti-human LAP 27232 PE Mouse IgG1 (TGF-β1) anti-mouse R&D Systems, Minneapolis, USA 2.4G2 purified Rat IgG2b BD Pharmingen, CD16/CD32 (Fc- Franklin Lakes, Block) USA anti-rat IgG1 FITC Rat IgG1 isotype control anti-mouse IgG1 isotype control Serotec, Düsseldorf, D PE Rat IgG1 BD Pharmingen, Franklin Lakes, USA 36 2.5.2 CD4+ T-Zell-Isolations-Kit Spezifität Konjugat Isotyp Hersteller anti-CD8a Biotin Rat IgG2a Miltenyi Biotec GmbH, Bergisch-Gladbach, D anti-CD11b/Mac-1 Biotin Rat IgG2b Miltenyi Biotec GmbH, Bergisch-Gladbach, D anti-CD45R/B220 Biotin Rat IgG2a Miltenyi Biotec GmbH, Bergisch-Gladbach, D anti-DX5 Biotin Rat IgM Miltenyi Biotec GmbH, Bergisch-Gladbach, D anti-Ter-119 Biotin Rat IgG2b Miltenyi Biotec GmbH, Bergisch-Gladbach, D anti-biotin (Bio3-18E7.2) MicroBeads Mouse IgG1 Miltenyi Biotec GmbH, Bergisch-Gladbach, D 2.5.3 T-Zell-Stimulation Spezifität Klon Konjugat Isotyp Hersteller anti-mouse CD3 17A2 purified Rat IgG2b R&D Systems, Minneapolis, USA anti-mouse CD28 61109 purified IgG2c R&D Systems, Minneapolis, USA 2.6 Software CellQuest Pro BD Biosciences, Franklin Lakes, USA OpenOffice.org Oracle, München, D PASW Statistics 18 SPSS, Chicago, USA Inkscape Free Software Foundation, Boston, USA Mendeley Research Networks beta 0.9 Mendeley Ltd., London, GB 37 3. Methoden 3.1 Tierversuche Alle Tierversuche erfolgten gemäß geltender Tierschutzgesetzgebung (Lizenznummer K07/05 und K16.5/06) unter Genehmigung der Bezirksregierung Köln. Alle Experimente standen stets unter der Prämisse, schonende, keimarme, für das Tier schmerz- und stressarme Bedingungen zur Gewinnung valider und reliabler Ergebnisse zu schaffen. Wir führten alle Experimente in vivo in den Stallungen des Instituts für Pathologie der Uniklinik Köln bzw. im Tierschall des Instituts für Medizinische Mikrobiologie, Immunologie und Hygiene der Uniklinik Köln (IMMIH) durch. Verwendung fanden C57BL/6 Wildtyp-Mäuse, welche vom Institut für Physiologie der Uniklinik Köln und von Charles River Laboratories (Frankfurt/Main) bezogen wurden, homozygot IL-6-defiziente (IL-6-/-) Mäuse, welche großzügigerweise von Herrn Prof. Bluethmann (Basel, CH) zur Verfügung gestellt wurden, sowie homozygot IL-17-defiziente (IL-17-/-) Mäuse (Hintergrund BALB/c und C57BL/6). Die Haltung der Tiere in den Stallungen des Instituts für Physiologie und des Instituts für Pathologie der Uniklinik Köln erfolgte unter spezifisch pathogen-freien Bedingungen (engl., specific pathogen free, SPF). Im Tierstall des IMMIH wurden die Mäuse unter keimarmen Bedingungen gehalten. Bis zu fünf Tiere gleichen Geschlechts und Wurfs fanden Aufnahme in Käfigen des Typs II europäischer Norm (Coren Inc., Louisville, USA) bei freiem Zugang zu Standardfutter 13/24 (Altromin, Lage-Lippe) und Tränke. Ein Käfigwechsel fand wöchentlich statt. Es wurde ein automatisierter Hell-Dunkel-Rhythmus im zwölf Stundentakt eingehalten. Die Umgebungstemperatur betrug 21° Celsius (±1°) bei einer mittleren Luftfeuchtigkeit von 30 bis 50%. 3.2 Versuchstierzucht Die Versuchstiere des IL-17-/- Stammes gewannen wir aus eigenständiger Zucht. Hierzu wurden drei getrennte Zuchtreihen angesetzt. Die Zucht erfolgte in 1:1 Verpaarung nach einer Akklimatisationszeit von zwei Wochen, die die Tiere zunächst nach Geschlechtern getrennt im Tierstall des IMMIH verbrachten. Geschlechtsspezifisches Absetzen der Würfe erfolgte 19 bis 21 Tage postnatal. Es wurden nur Würfe der ursprünglichen Elterngeneration verwendet; eine konsanguine Verpaarung der Nachkommenschaft fand nicht statt. Würfe fanden regelmäßig im Abstand von 21 bis 24 Tagen statt, wobei der initiale Wurf nach einer Zeit von 28 Tagen erfolgte. 38 Die Würfe besaßen eine Größe von fünf bis sieben Nachkommen. Über den parallelen Ansatz dreier Zuchtreihen wurde gewährleistet, dass die Würfe zeitlich eng zusammenfielen. Verwendung der Tiere für die Versuche erfolgte im Alter von sechs bis acht Wochen. 3.3 Injektionen 3.3.1 Allgemeines Für die beschriebenen Experimente erfolgten intraperitoneale und intravenöse Injektionen (engl., challenge) an lebenden Versuchstieren. Um die Traumatisierung zu minimieren, wurden feine 27 G Kanülen (B. Braun Melsungen AG, Melsungen, D) verwendet. Alle Prozeduren wurden vor Durchführung der Experimente eingehend theoretisch und praktisch geübt. Die Herstellung aller Injektionslösungen erfolgte unter sterilen Kautelen. 3.3.2 Intraperitoneale Injektionen Alle intraperitonealen Injektionen erfolgten unter keimarmen Bedingungen am anästhesierten Tier. Hierzu erfolgte eine Inhalationsnarkose mit Diethylether in abgeschlossenem Behältnis. Die Injektion erfolgte erst dreißig Sekunden nach sicherem Einsetzen der Bewusstlosigkeit des Tieres. Injiziert wurde zügig, linksversetzt in Höhe des Mittelbauches unter Anhebung der ventralen Bauchmuskulatur, um eine versehentliche Traumatisierung von Leber und Darm zu vermeiden. Nach Entfernung der Injektionsnadel erfolgte eine schonende Massage des Bauchraumes, um das Injektat ausreichend zu verteilen und das Abklingen der Narkose zu befördern. Die Wiederkehr des Bewusstseins wurde abgewartet und überprüft. Kein Tier starb im Zuge des angewendeten Narkoseverfahrens. 3.3.3 Intravenöse Injektionen Alle intravenösen Injektionen erfolgten in eine Schwanzvene nach Immobilisation des Tieres im Injektionsblock. Hierdurch wurde ein schonender und sicherer Zugang zum Schwanz des Tieres ermöglicht. In Einzelfällen ging der Injektion eine kurz dauernde Exposition des Tieres gegenüber Rotlicht bei Temperaturen bis 40° Celsius voraus, um die Venenfüllung zu befördern. Wiederholte Venenkanülierung sowie Blutverluste wurde vermieden. Kein Tier starb im Zuge des angewendeten Injektionsverfahrens. 39 3.4 Abszessmodell Für die Induktion intraperitonealer Abszesse durch Sp1 wurde einem etablierten Protokoll gefolgt (Stephen et al. 2007) (Groneck et al., 2009). Eingesetzt wurden C57BL/6 Mäuse und IL-17-/Mäuse. Für eine jeweilige Versuchskohorte wurden nur Tiere gleichen Geschlechts im Alter von sechs bis acht Wochen verwendet. Die Tiere hatten ein Gewicht von 19 bis 22 g. Gemäß des beschriebenen Vorgehens für Injektionen wurden den Tieren 100 µg Sp1 gelöst in PBS in 1:1 Verhältnis mit SCCA (engl., Sterile Cecal Content Adjuvant, SCCA) in einem Gesamtvolumen von 0,2 ml injiziert. Zur Herstellung von SCCA wurde der Darminhalt eingesetzter Wildtyp-Mäuse nach Suspendierung in PBS durch Nylon-Zellsiebe mit einer Porengröße von 100 µm und 70 µm (Falcon BD, Franklin Lakes, USA) filtriert, autoklaviert und bei -20° Celsius bis zur Verwendung verwahrt. Kontrollgruppen erhielten Injektionen von 0,68 µl/g Körpergewicht SCCA in PBS, reines PBS jeweils zu einem Gesamtvolumen von 0,2 ml oder keine Injektion. Wir verwendeten unterschiedliche Chargen Sp1, um Unterschiede der Antigenität auszuschließen. Es fanden sich keine signifikanten Unterschiede hinsichtlich der Abszessinduktion zwischen den verschiedenen Chargen. Alle Versuche wurden unabhängig voneinander dreimal wiederholt. Für jede Versuchsgruppe wurden jeweils fünf Tiere eingesetzt. Die dargestellten Ergebnisse stellen eine repräsentative Abbildung aus allen Versuchsreihen dar. Sechs Tage nach Injektion wurden die Tiere per zervikaler Dissektion unter Ether-Narkose getötet. Die Bauchhöhle wurde makroskopisch auf das Vorliegen von Abszessen untersucht. Abszesse wurden isoliert und mit Hilfe einer Präzisionsschublehre (Asimeto Germany GmbH, Weißbach, D) vermessen. Kein Tier starb vorzeitig im Zuge der Versuche. 3.5 Peritoneallavage Die Lavagierung der Bauchhöhle erfolgte im Anschluss an intraperitoneale Injektionen und diente der Gewinnung von Lavageflüssigkeit und der darin enthaltenen Zellen und Zytokine. Einsatz in den Experimenten fand sie erst nach ausgiebiger theoretischer und praktischer Übung. Nach Tötung des Tieres durch zervikale Dissektion, Kurzimmersion in Ethanol und Fixierung des toten Tieres auf einer Präparationsplatte erfolgte die Freilegung des Peritoneum parietale unter sterilen Bedingungen. Hierbei wurde die ventrale Bauchmuskulatur mit abgerundeter Schere stets schonend durchtrennt, um eine vorzeitige Perforation der Peritoneums zu vermeiden. Nach Freilegung des Bauchfells erfolgte ein Wechsel des sterilen Bestecks. Lavagiert wurde zur Gewinnung von Zellen mit 5 ml PBS; bei Versuchen zur Detektion von Zytokinen wurde das Volumen auf 2 ml reduziert, 40 um Verdünnungseffekte zu reduzieren. Aus Gründen chemischer Stabilität wurden die Injektionslösungen bis zur Injektion auf Eis gelagert. Die Injektion des Lavagevolumens erfolgte von einer sicheren Punktionsstelle im inferioren Abschnitt des Peritoneums. Mehrfachpunktionen sowie Traumatisierung von Leber oder Darm wurde vermieden. Das Injektat verblieb für mindestens eine Minute unter kontinuierlicher manueller Durchmischung im Bauchraum. Bei Reaspiration wurde ein Rückgewinn von mindestens 4 ml respektive 1 ml gewährleistet. Makroskopisch blutig tingiertes Aspirat wurde nicht verwendet. Es erfolgte ein Pooling des Aspirats innerhalb der jeweiligen Versuchsgruppen. Falls nicht anders beschrieben, folgte eine Zentrifugation des Aspirats bei 1500 rpm für fünf Minuten bei 4° Celcius. Für den Nachweis von Zytokinen mittels ELISA wurde anschließend der zellfreie Überstand in Fraktionen von je 1ml aliquotiert und unmittelbar bei -80° Celsius tiefgefroren. Aufgetaute Proben wurden direkt verwendet; wiederholte Zyklen des Einfrierens und Auftauens wurden vermieden. Die gewonnenen Zellen wurden wie jeweils beschrieben weiterverwendet. 3.6 Herstellung einer Zellsuspension aus der Milz Die Herstellung einer Zellsuspension aus der Milz erfolgte zur Bestimmung freier Zytokinkonzentrationen und zur Isolation von T-Helfer-Zellpopulationen an naiven Mäusen sowie nach intraperitonealer und intravenöser Injektion. Nach Tötung des Tieres durch zervikale Dissektion, Kurzimmersion in Ethanol und Lagerung des toten Tieres auf die rechte Seite erfolgte die Freilegung des linken Oberbauches unter sterilen Bedingungen. Die Milz wurde von umgebendem Fettgewebe isoliert. Auf schonendes Vorgehen wurde geachtet. Teilinfarzierte Milzen wurden nicht verwendet; ein Riss des Milzgewebes im Zuge der Isolation fand nicht statt.Nach Entfernung wurde die Milz direkt in ein 15 ml Röhrchen mit 5 ml PBS und Kühlung auf Eis überführt. Die gesamte Milz wurde im Anschluss mit Hilfe des Stempels einer 2 ml Spritze durch ein 100 µl Nylon-Zellsieb passiert. Nicht filtrierter Detritus wurde verworfen. Das kolliquierte Milzgewebe wurde in einem 50ml Röhrchen gewonnen. Durch wiederholtes Ausspülen des Siebes mit PBS sollte die Zellausbeute erhöht werden. Die Lösung wurde anschließend bei 1500 rpm und 4° Celsius für sechs Minuten zentrifugiert, der Überstand verworfen und das Zellpellet einer Erythrozytenlyse mit 0,2% Natriumchlorid-Lösung unterzogen. Nach erneuter Zentrifugation wurden die Zellen in zwei weiteren Zyklen mit 5 ml PBS versetzt und zentrifugiert bis das Zellpellet farblos erschien. Die Zellen wurden gezählt und in entsprechender Anzahl den jeweiligen Versuchen zugeführt. 41 3.7 Erythrozyten-Lyse Erythrozyten zeichnen sich im Vergleich zu Lymphozyten und dendritischen Zellen durch eine geringere osmotische Resistenz aus (Fujii 1997). Zellsuspensionen aus der Milz wiesen stets einen hohen Anteil von Erythrozyten auf. Zur Negativselektion von Erythrozyten unterzogen wir diese Lösungen daher einer kurzzeitigen Exposition gegenüber hypotoner Natriumchlorid-Lösung. Überstandsfreie Zellpellets wurden in 10 ml NaCl 0,2% resuspendiert. Nach exakt dreißig Sekunden wurde diese Lösung mit 10 ml 1,6% Natriumchlorid-Lösung neutralisiert. Im Anschluss wurde die Lösung bei 1500 rpm und 4° Celsius für sechs Minuten zentrifugiert. Zelllösungen aus der Peritoneallavage wurden, wenn nicht anders beschrieben, keiner Erythrozyten-Lyse unterzogen. 3.8 Zellzählung Zellen wurden manuell polarisationsmikroskopisch an der Neubauer Zählkammer (0,1 mm Tiefe, 0,0025 mm²) gezählt. Hierzu wurden je 10 µl Zelllösung mit 90 µl Trypanblau für ein Verdünnungsverhältnis von 1:10 versetzt. Aus dieser Verdünnungslösung heraus wurden parallel zwei weitere Verdünnungsansätze im Verhältnis 1:100 und 1:1000 erstellt, indem je 10 µl der höher konzentrierten Lösung in 90 µl Trypanblau überführt wurden. Je 10 µl aller Verdünnungsansätze wurden im Anschluss in den Kapillarspalt der Zählkammer überführt. Alle Ansätze wurden unter dem Polarisationsmikroskop analysiert und die Zellen in allen vier Quadranten anhand ihres makroskopischen Aspekts unter Verwendung einer Zählhilfe erfasst. Die Bestimmung der effektiven Zellzahl erfolgte nach folgender Formel: Zellzahl [n/µl] = ∑(n/Quadrant) x Verdünnungsfaktor x 10-4/µl Die Zeit der Exposition gegenüber Trypanblau bis zur Erhebung der effektiven Zellzahl lag stets unter fünf Minuten. 42 3.9 Durchflusszytometrie 3.9.1 Hintergrund Durchflusszytometrie beschreibt ein apparatives Verfahren zur automatisierten Zellzählung. Moderne Durchflusszytometer sind darüber hinaus in der Lage, Zellgröße, Zellstruktur, Oberflächeneigenschaften und intrazelluläre Komponenten zu erfassen sowie Zellen entlang bestimmter Eigenschaften zu sortieren (engl., fluorescence-activated cell sorting, FACS). In dieser Arbeit werden die Begriffe Durchflusszytometrie und FACS synonym verwendet. Das Prinzip des FACS-Geräts geht auf Arbeiten von Bonner, Sweet, Hullett, Herzenberg et al. Ende der 1960er Jahre zurück (Herzenberg et al. 2002). 3.9.2 Allgemeine Prinzipien Durchflusszytometer leiten Zellen in laminarem Strom bei hohem Zelldurchsatz durch ein komplexes System von Lasern und Fotodetektoren, wobei jede Zelle einzeln auf ihre Eigenschaften hin untersucht wird. Laser emittieren monochromatisches Licht einer bestimmten Wellenlänge. Bei Exposition der Einzelzelle gegenüber dem Laserstrahl kommt es zur Streuung des Lichts, wodurch sich Zellgröße (engl., forward scatter, FSC) und Zellgranularität (engl., sideward scatter, SSC) erfassen lassen. Werden Antikörper, die mit Fluoreszenzfarbstoffen konjugiert sind, zur selektiven Markierung von Zellstrukturen eingesetzt, so erfahren diese Farbstoffe nach Passage eines Laserstrahls mit farbentsprechendem Emissionsspektrum eine elektromagnetische Anregung. Angeregte Fluoreszenzfarbstoffe emittieren Licht eines bestimmten Wellenbandes, welches nach, Bündelung, Amplifikation und Filtration durch geräteeigene Fotodetektoren (engl., photomultiplier) erfasst werden kann. In unseren Versuchen kamen die Fluoreszenzfarbstoffe FluoresceinIsothiocyanat (FITC) mit einem Absorptionsmaximum von 495 nm und einem Emissionsmaximum von 519 nm für den Detektor FL1, Phycoerythrin (PE) mit einem Absorptionsmaximum von 480 nm und einem Emissionsmaximum von 578 nm für den Detektorkanal FL2 und Allophycocyanin (APC) mit einem Absorptionsmaximum von 650 nm und einem Emissionsmaximum von 785 nm für den Detektorkanal FL4 zum Einsatz. Um eine Ausbleichen der eingesetzten Farbstoffe zu vermeiden, fand der Einsatz Fluoreszenz-konjugierter Antikörper stets unter Lichtabschluss statt. Die entsprechenden Laser zur Anregung der Fluorochrome waren ein Argonionenlaser mit einer Wellenlänge von 488 nm für PE und FITC sowie ein Helium-Neon-Laser mit einer Wellenlänge von 633 nm für APC. Den Detektoren sind im eingesetzten Durchflusszytometer Bandpassfilter (für 43 FL1 530/30, für FL2 585/42, für FL4 661/16) vorgeschaltet, so dass nur Licht eines jeweilig definierten Wellenbereichs zur Auswertung gelangt. Zur Vermeidung falsch positiver Signaldetektion wurden in der Mehrzahl der Versuche Farbstoffkombinationen ohne signifikanten spektralen Emissions-Überlappungsbereich gewählt, z.B. PE und APC, beziehungsweise Mehrfachfärbungen im Versuchsansatz vermieden. Bei parallelem Einsatz von FITC und PE wurden die überlappenden Abschnitte des emittierten Wellenbandes kompensiert. Signale durch Autofluoreszenz wurden durch Einsatz entsprechender Isotypenkontrollen ausgeglichen. 3.10 Magnetische Zellseparation Magnetische Zellseparation beschreibt ein Verfahren zur hoch selektiven Anreicherung Antikörpermarkierter Zellen. Die hierbei verwendeten Antikörper, die spezifische Affinität für ausgewählte Oberflächenstrukturen auf der Zellmembran aufweisen, werden direkt oder indirekt in Kopplung mit superparamagnetischen Micropartikeln (MACS MicroBeads, Miltenyi Biotec GmbH, BergischGladbach, D) gebracht. Wohingegen beim direkten Verfahren industriell vorgefertige AntikörperMicroBead-Aggregate zum Einsatz kommen, die unmittelbar die jeweilige Zielstruktur magnetisch erfassen, wird in Ermangelung einsatzfähiger Antikörper zur Direktmarkierung beim indirekten Verfahren die gewünschte Oberflächenstruktur zunächst mit Hilfe unmarkierter oder Biotin-, Streptavidin- oder Fluoreszenz-gekoppelter Antikörper markiert. In einem Folgeschritt kommen nun Antikörper mit MicroBead-Kopplung zum Einsatz, die sich gegen eine Zielstruktur des vorab eingesetzten Antikörpers, also zum Beispiel Biotin, richten. Eine spezielle Trennsäule (MACS Column, Miltenyi Biotec GmbH, Bergisch-Gladbach, D), die mit Stahlwolle oder Stahlpartikeln angefüllt ist, schafft die Bedingungen eines starken magnetischen Gradientenfeldes, wenn sie in einen speziell konfigurierten Hochleistungspermanentmagneten (MACS Separator, Miltenyi Biotec GmbH, Bergisch-Gladbach, D) verbracht wird. Zellen, die zuvor mit Hilfe der Mikropartikel markiert worden sind, werden bei Passage der Trennsäule im Magneten retiniert; unmarkierte Zellen passieren das Magnetfeld. Auf diese Weise lässt sich positive Selektion (Anreicherung) und negative Selektion (Depletion) einer Zelllösung erzielen. Die Fraktion der Zelllösung, die die Trennsäule im Magneten frei passiert, ist weitgehend befreit von denjenigen Zellen, die die jeweilig magnetisch erfassten Oberflächenmerkmale aufweisen. Der markierte Zelltyp ist hingegen angereichert im Eluat der Trennsäule, sobald die Wirkung des Magnetfelds aufgehoben wird. Magnetische Zellseparation mit MACS MicroBeads gewährleistet hohe Reinheit, geringe metabolische Beeinflussung der Zellen und interferiert minimal mit Anschlussuntersuchungen wie der Durchflusszytometrie. Wir haben die magnetische Zellseparation gemäß des firmeneigenen 44 Protokolls (Miltenyi Biotec GmbH, Bergisch-Gladbach, D) angewandt zur positiven Selektionierung von CD4+ Zellen aus der Gesamtzellpopulation der Milz sowie zur Gewinnung von dendritischen Zellen aus dem Knochenmark. 45 Abb. 4: Magnetische Zellseparation am Beispiel CD4+ T-Zellen, schematische Darstellung. 46 3.11 Gewinnung von dendritischen Zellen aus dem Knochenmark Für die Isolation und Vermehrung von CD11c + dendritischen Zellen aus dem Knochenmark (engl., bone marrow derived dendritic cells, BMDC) folgten wir der Modifikation eines etablierten Protokolls (Inaba et al. 1992). Die Expansion der dendritischen Zellen erfolgte unter Einsatz von murinem Granulocyten-Makrophagen-Kolonie-stimulierendem Faktor (engl., murine granulocytemacrophage colony stimulating factor, mGM-CSF). GM-CSF führt jedoch auch zur Vermehrung von neutrophilen Granulozyten und von Makrophagen. Zur Optimierung der Zellisolation setzten wir ein Separationsverfahren mit Hilfe von magnetisch konjugierten anti-CD11c-Antikörpern (Miltenyi Biotec GmbH, Bergisch-Gladbach, D) ein. Verwendet wurden C57BL/6 Mäuse gleichen Geschlechts im Alter von sechs bis acht Wochen. Nach Tötung der Tiere durch zervikale Dissektion und Kurzimmersion in 70% Ethanol erfolgte unter sterilen Bedingungen die Freipräparation von Tibiae und Femura. Die Hinterläufe wurden behutsam von sämtlichem adhärenten Muskel- und Bindegewebe befreit, in Hüft- und Kniegelenk exartikuliert und auf Eis gekühlt. Die Knochen wurden durch Abtrennung der Endbereiche der distalen und proximalen Metaphysen eröffnet und der Markraum mittels einer 26 G Kanüle leicht angebohrt. Mit je 4 ml Zellwasch-Puffer wurden die Knochen antegrad sowie retrograd wiederholt ausgespült und die Spüllösung in Falcon-Tubes aufgefangen. Diese Zelllösung wurde anschließend zur Trennung von Debris durch ein 100 µm Nylonsieb gefiltert und bei 1500 rpm, 4° Celsius für fünf Minuten zentrifugiert. Der Überstand wurde verworfen und das Zellpellet in 8 ml raumtemperiertem Histopaque-Puffer resuspendiert. 5 ml raumtemperiertes Histopaque 1083 wurden anschließend separat in einem 15 ml Falcon-Tube vorgelegt und die Zellsuspension hierauf langsam und kontrolliert mittels Pipette aufgeschichtet. Es folgte die Zentrifugation bei 450 g, Raumtemperatur für dreißig Minuten, wobei die Zentrifugation ohne Einsatz der maschinellen Bremse nach Ablauf der Zeit auslief. Anschließend wurde die trübe Zellschicht zwischen den Phasen des Zentrifugats (engl., buffycoat) sowie am Rand des Behältnis anhaftende Zellen mit steriler Pasteurpipette entnommen und in 20 ml kalten Histopaque-Puffer transferiert. Es folgte erneute Zentrifugation bei 800 g für zehn Minuten. Der Überstand wurde verworfen und das Zellpellet in 1 ml kaltem EasySep-Puffer resuspendiert. Die in der Folge angegebenen Volumina beziehen sich auf 1x108 Zellen/ml und wurden entsprechend angepasst. Die Zellen wurden gezählt und bei 1500 rpm, 4° Celsius für fünf Minuten zentrifugiert und das Pellet in 1 ml EasySep-Puffer suspendiert. Zur Lösung wurden 10 µl Fc-Block und 15 µl muriner 47 anti-CD34 Biotin-Konjugat-Antikörper gegeben und für 15 Minuten unter wiederholter Durchmischung inkubiert. Anschließend wurden 10 ml kalter EasySep-Puffer ergänzt und für sieben Minuten bei 1000 rpm, 4° Celsius zentrifugiert. Das Pellet wurde in 700 µl EasySep-Puffer resuspendiert und durch ein 70 µl Nylonsieb in ein FACS-Tube filtriert. Zum Filtrat wurden 100 µl anti-Biotin Cocktail aus dem EasySep-Kit hinzugefügt, für 15 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert und anschließend 50 µl der Microbeads-Lösung ergänzt. Nach zehnminütiger Inkubation mit wiederholter Durchmischung alle zwei Minuten wurde die Lösung mit EasySep-Puffer auf ein Gesamtvolumen von 2,5 ml versetzt. Das FACS-Tube wurde dann für fünf Minuten in den EasySep-Magneten verbracht, so dass nach Abgießen nur eine definierte Restmenge inklusive der markierten Zellen im Tube verbleibt. Die Restlösung wurde mit 1 ml EasySep-Puffer in ein 15 ml Falcon-Tube transferiert und für sieben Minuten bei 1200 rpm, 4° Celsius zentrifugiert. Resuspendiert in 1 ml BMDC-Kulturmedium wurden die Zellen gezählt und zu je 0,5x106 Zellen in 2 ml auf Wells einer Nunc-Wellplate verteilt. Zu den Wells wurden je 500 IE mGM-CSF/ml pipettiert. Es folgte die Kultur bei 37° Celsius, 5% CO 2 im Brutschrank für eine Gesamtdauer von sechs Tagen. Alle zwei Tage erfolgte die microskopische Kontrolle der Zellkultur und der Ersatz von 50% der Kulturlösung durch frisches Medium mit 1000 IE mGM-CSF. Zur Verwendung wurden die Zellen sechs Tage nach Beginn der Kultur mit Hilfe der Zellscraper vom Boden der Wellplate gelöst und in Kulturmedium in ein 15 ml Falcontube transferiert. Die vollständige Lösung der Zellen vom Plattenboden wurde microskopisch überprüft. Im Anschluss wurde die Zelllösung bei 1500 rpm, 4° Celsius für fünf Minuten zentrifugiert. Nach Zählen wurden die Zellen entsprechend verwendet. Wir bestimmten die Reinheit der Zelllösung an dendritischen Zellen über den Anteil der Expression von CD11c mittels Durchflusszytometrie. Hierzu färbten wir die Zellen mit 0,65 µg anti-CD11cFITC/1x106 Zellen. Die Inkubationszeit betrug dreißig Minuten und fand bei 4° Celsius unter Lichtabschluss statt. In den Versuchen zeigten sowohl in den naiven Kontrollgruppen als auch in den Interventionsgruppen stets >80% der Zellen Expression von CD11c (Abb. 5). 48 Abb. 5: Anteil CD11c+ Zellen in den Versuchen an BMDC. Dargestellt sind repräsentative Ergebnisse aus einer Kontrollgruppe (obere Zeile) und einer Interventionsgruppe nach Inkubation mit Sp1 (untere Zeile). Die Zellen der linken Spalte sind ungefärbt und dienen als Referenz. Die rechte Spalte zeigt die Zellen nach Färbung mit anti-CD11c FITC. 3.12 Intrazelluläre Zytokinfärbung Nach Fixierung und Permeabilisierung von Zellen können intrazelluläre Substanzen spezifisch mittels Fluoreszenz-gekoppelten Antikörpern angefärbt werden. Zur Fixierung werden Lösungen mit 4% Paraformaldehyd eingesetzt (Denisov 1977) (Sander et al. 1991). Durch Permeabilisierung wird die Penetration der Antikörper durch die Zellmembran ermöglicht. Durch den Einsatz von Inhibitoren intrazellulärer Transportprozesse können Zytokine im Zellinneren angereichert werden. So führt der Einsatz von Monensin (GolgiStop™) oder Brefeldin A (GolgiPlug™) durch Interferenz mit Verarbeitungsprozessen im Golgi-Apparat zur unselektiven Hemmung des Exozytosemechanismus für Zytokine und damit zu verbesserter Signalgebung in der Durchflusszytometrie nach Antikörperfärbung. Wir führten intrazelluläre Zytokinfärbungen an CD4 + Zellen aus der Milz und aus der 49 Peritoneallavage sowie an CD11c+ dendritischen Zellen aus dem Knochenmark gemäß eines offiziellen, firmeneigenen Protokolls (BD Biosciences, Franklin Lakes, USA) durch. Die Zellen wurden aus C57BL/6 Wildtyp-Mäusen oder IL-6-/- und IL-17-/- Stämmen gewonnen. Es wurden je Versuchskohorte nur Tiere gleichen Geschlechts im Alter zwischen sechs und acht Wochen verwendet. Das durchschnittliche Gewicht der Tiere lag zwischen 19 und 22 Gramm. Nach Herstellung jeweiliger Zelllösungen erfolgte die Färbung von Oberflächenmerkmalen auf der Zellmembran. Hierbei wurden zunächst mit Hilfe von 2.4G2 Antikörpern (BD Fc-Block™), welche spezifisch für den FcγII/III Rezeptor sind, unspezifische Bindungsstellen auf der Zellmembran besetzt, um Färbeartefakte nach Einsatz Fluoreszenz-markierter Oberflächen-Antikörper zu verhindern. Es wurden je 1x106 Zellen mit 1µg Fc-Block™ in 100 µl PBS für 15 Minuten auf Eis inkubiert. Im Anschluss wurden die Lösungen mit 0,5 µg anti-CD4 APC/ 1x106 Zellen respektive 1 µg anti-CD11c PE/1x106 Zellen versetzt und für 30 Minuten auf Eis inkubiert. Die Inkubation erfolgte unter Lichtabschluss, um Verluste des Farbsignals der eingesetzten Antikörper zu vermeiden. Eine Kontrollreihe verblieb jeweils ungefärbt. Nach zweimaliger Waschung aller Zellreihen mit 3 ml FACS-Puffer erfolgten Fixierung und Permeabilisierung. Hierzu wurden je 1x106 Zellen mit 250 µl Cytofix/Cytoperm™ versetzt und für zwanzig Minuten auf Eis inkubiert. Nach zweimaligem Waschen mit 2 ml BD Perm/Wash™ in 1:10 Verdünnung erfolgte die eigentliche intrazelluläre Zytokinfärbung mit 0,2 µg anti-IL-17 PE/ 1x10 6 Zellen. Die Isotypenkontrolle wurde mit 0,2 µg IgG1 PE/ 1x10 6 Zellen gefärbt. BD Perm/Wash™ diente als Pufferlösung während der Färbung, um die Permeabilisierung der Zellen über den Zeitverlauf der Inkubation zu gewährleisten. Die Lösungen wurden für 30 Minuten auf Eis unter Lichtabschluss inkubiert und im Anschluss zweimalig mit 1 ml BD Perm/Wash™, dann zweimalig mit 3 ml FACSPuffer gewaschen. Die Auswertung erfolgte mittels Durchflusszytometrie. 50 3.13 ELISA 3.13.1 Allgemeine Prinzipien Geringe Mengen freier Zytokine in Lösungen können quantitativ oder semiquantitativ mit Hilfe eines enzyme-linked immunosorbent assays (ELISA) bestimmt werden. Hierunter wird ein immunologisches Nachweisverfahren verstanden, das den Einsatz von Antikörpern zur spezifischen Erfassung molekularer Strukturen des jeweiligen Antigens mit einer enzymvermittelten Farbreaktion verbindet. Das Verfahren wurde erstmals 1971 von Engvall und Perlmann, Avrameas und Guilbert sowie von Schuurs und van Weemen unabhängig voneinander beschrieben (Engvall et al. 1971) (Avrameas et al. 1971) (Van Weemen et al. 1971). Im sogenannten „Sandwich-Verfahren“ werden die zu bestimmenden Antigene zunächst durch stationär fixierte Antikörper (engl., capture antibodies) aus der Lösung gefällt. Die Antikörper müssen hierzu in einem separaten Arbeitsschritt an die Bodenfläche einer 96-Wellplate adsorbiert werden (engl., coating), wobei die Fc-Fragmente in hydrophobe Wechselwirkung mit dem Polystyrol der Kunststoffplatte treten. Diese Bindung ist relativ pH-unabhängig und ermöglicht den Einsatz von PBS (pH 7,4) oder Natriumcarbonat (pH 9,6) als Pufferlösungen. Das im Anschluss hinzugegebene Antigen wird über die Fab-Fragmente der Antikörper erfasst und somit über die Mittlung der Antikörper stationär fixiert. Diese Fixierung des gesuchten Antigens erlaubt die Abtrennung nicht zu untersuchender Stoffe durch einfaches Waschen der Wellplate mit Pufferlösung. Hintergrundrauschen durch unspezifische Bindungen an freien Antikörper-Bindestellen wird durch Einsatz von Blockreagenzien entgegengewirkt. Proportional zur Menge des Antigens in der untersuchten Lösung findet sich nun also der Boden der Platte mit Antigen ausgekleidet. Hinzugabe eines weiteren spezifischen Antikörpers (engl., detection antibody) führt zur Markierung der freien Oberfläche des gebundenden Antigens und liegt der metaphorischen Titulierung „Sandwich-Verfahren“ zu Grunde. Werden diese zweiten Antikörper an ein Enzym gekoppelt, dessen Reaktion ein Substrat in ein farbgebendes Produkt überführt, lässt sich die Menge gebundenen Antigens (semi-)quantitativ über die Extinktion Lichts bestimmter Wellenlängen durch die jeweilige Konzentration des entstandenen Produkts gegenüber einem Standard rückermitteln. Als Enzym hat sich beispielsweise Meerrettich-Peroxidase (engl., Horseradish perioxidase, HRP) mit dem Substrat H 2O2/Tetramethylbenzidin (TMB) durchgesetzt. Die Enzymaktivität wird zu definiertem Zeitpunkt durch pH-Verschiebung, z.B. durch Zugabe von H2SO4, gestoppt. Je höher die Konzentration des Antigens in der ursprünglichen Lösung, desto höher ist letztlich der Umsatz von Substrat zu farbgebenden Produkt. Der Standard besteht in bekannten, absteigenden Konzentrationen des Antigens. Die Extinktion der jeweiligen 51 Standardkonzentrationen lässt sich grafisch in der Standardkurve zusammenfassen. Abgleich der für die jeweiligen Proben gemessenen Extinktion gegen die Standardkurve erlaubt die Rückbestimmung der Antigenkonzentration. Abb. 6: Enzyme-linked Immunosorbent Assay (ELISA). Schematischer Ablauf. Die Auswertung der Farbreaktion erfolgt automatisiert. 3.13.2 IL-17-ELISA Wir folgten in unseren Versuchen einem offiziellen Firmenprotokoll (eBioscience Inc., San Diego, USA). Verwendet wurde ein industriell zusammengestelltes IL-17-ELISA-Paket (Mouse IL-17A ELISA Ready-Set-Go!, eBioscience, San Diego, USA). Vorbereitend wurde der Capture-Antikörper (purified anti-mouse IL-17A, Klon eBio17CK15A5) im Verhältnis 1:250 in Coating-Puffer (ELISA/ELISPOT Coating Buffer Pulver, eBioscience, San Diego, USA, gelöst in 1l Aqua dest.) gelöst. Die Wells einer 96-Well-Plate (Nunc Maxisorb, Nunc, Langenselbold, D) wurden mit 100 52 µl/Well gelöstem Capture-Antikörper versetzt. Die Platte wurde im Anschluss mit adhäsiver Folie versiegelt und über Nacht bei 4° Celsius inkubiert. Die Wells wurden von überschüssiger Flüssigkeit befreit, indem die gesamte Platte wiederholt auf Zellstoff ausgeschlagen wurde. Alle Wells wurden im Anschluss fünf Waschdurchgängen mit 300 µl/Well Waschpuffer (0,05% Tween20 in PBS, pH 7,4) unterzogen. Der Waschpuffer verblieb jeweils länger als eine Minute in den Wells und wurde danach restlos ausgeschlagen. Die Wells wurden anschließend mit 200 µl/Well Assay Diluent (eBioscience, San Diego, USA) in 1:5 Verdünnung versetzt und bei Raumtemperatur für eine Stunde inkubiert. Es folgten erneut fünf Waschdurchgänge mit 300 µl Waschpuffer/Well. Die Standardlösung (recombinant mouse IL-17A, 1 µg/ml, eBioscience, San Diego, USA) wurde auf 500 pg/ml mit Assay Diluent verdünnt. Es wurden zwei Verdünnungsreihen der Standardlösung von 500 pg/ml bis 0,06 pg/ml in halbierenden Konzentrationsschritten angelegt. 100 µl der zu untersuchenden Proben wurden auf entsprechende freie Wells verteilt und die Platte mit adhäsiver Folie bedeckt über Nacht bei 4° Celsius inkubiert. Die untersuchten Proben wurden zweimal je Ansatz auf unterschiedliche Wells aufgetragen. In die Auswertung floss der Mittelwert der Extinktion der entsprechenden Wells ein. Der Detection-Antikörper (biotin-conjugate anti-mouse IL-17A, Klon eBio17B7) wurde mit Assay Diluent auf eine Verdünnung von 1:250 gebracht. Je 100 µl dieses verdünnten Antikörpers wurden auf die Wells verteilt und die versiegelte Platte bei Raumtemperatur für eine Stunde inkubiert. Es folgten erneut fünf Waschdurchgänge. Im Anschluss wurden 100 µl Avidin-HRP (eBioscience, San Diego, USA) in 1:250 Verdünnung mit Assay Diluent auf die Wells gegeben und die Platte versiegelt für dreißig Minuten bei Raumtemperatur inkubiert. Nach folgenden sieben Waschdurchgängen wurden 100 µl Substrat (TMB Solution, eBioscience, San Diego, USA)/Well verteilt und die Platte bei Raumtemperatur für 15 Minuten inkubiert. Anschließend wurden 50 µl 2M H2SO4/Well hinzugegeben und die Farbreaktion der Wells am Spektrometer analysiert. Für die Auswertung nutzten wir das Ergebnis der Subtraktion der Extinktionswerte bei 570 nm von denjenigen bei 450 nm. 53 2,5 2,0 Extinktion f(x) = 0,94x - 0,76 1,5 1,0 0,5 0,0 IL-17 pg/ml (log10) Abb. 7: Standardkurve IL-17-ELISA. Gezeigt ist eine repräsentative Kurve, die in den entsprechenden Versuchen als Grundlage der quantitativen Bestimmung der IL-17-Konzentrationen diente. Die Konzentrationen wurden mit Hilfe der Gleichung der Regressionsgraden errechnet. 3.13.3 TGFβ-1-ELISA Wir folgten in unseren Versuchen einem offiziellen Firmenprotokoll (eBioscience Inc., San Diego, USA). Verwendet wurde ein industriell zusammengestelltes TGFβ1-ELISA-Paket (human/mouse TGFβ1 ELISA Ready-Set-Go!, eBioscience, San Diego, USA). Vorbereitend wurde der CaptureAntikörper (purified anti-human/mouse TGFβ1, Klon eBioTB2F) im Verhältnis 1:250 in CoatingPuffer (ELISA/ELISPOT Coating Buffer Pulver, eBioscience, San Diego, USA, gelöst in 1 l Aqua dest.) gelöst. Die Wells einer 96-Well-Plate (Nunc Maxisorb, Nunc, Langenselbold, D) wurden mit 100 µl/Well gelöstem Capture-Antikörper versetzt. Die Platte wurde im Anschluss mit adhäsiver Folie versiegelt und über Nacht bei 4° Celsius inkubiert. Die Wells wurden von überschüssiger Flüssigkeit befreit, indem die gesamte Platte wiederholt auf Zellstoff ausgeschlagen wurde. Alle Wells wurden im Anschluss fünf Waschdurchgängen mit 300 µl/Well Waschpuffer (0,05% Tween20 in PBS, pH 7,4) unterzogen. Der Waschpuffer verblieb jeweils länger als eine Minute in den Wells und wurde danach restlos ausgeschlagen. Die Wells wurden anschließend mit 200 µl/Well Assay Diluent (eBioscience, San Diego, USA) in 1:5 Verdünnung versetzt und bei Raumtemperatur 54 für eine Stunden inkubiert. Es folgten erneut fünf Waschdurchgänge mit 300 µl Waschpuffer/Well. Zur Aktivierung von latentem TGFβ1 zur immunreaktiven Form mussten die Proben azidifiziert und reneutralisiert werden. Tierisches Serum, welches in Kulturmedien Verwendung findet, kann hohe Konzentrationen latenten TGFβ1-Zytokins enthalten (Massagué 1990). Wir bestimmten deshalb die basale TGFβ1-Konzentration im Kulturmedium. 100 µl der jeweiligen Proben wurden mit 20 µl 1 M HCl versetzt und bei Raumtemperatur für zehn Minuten inkubiert. Zur Neutralisation wurden 20 µl 1 M NaOH hinzugegeben. Bei der Berechnung der endgültigen Konzentrationen von TGFβ1 in den Proben ließen wir einen im offiziellen Protokoll empfohlenen Korrektionsfaktor von 1.4 für die Verdünnung einfließen. Die Standardlösung (recombinant human TGFβ1, 1 µg/ml, eBioscience, San Diego, USA) wurde auf 500 pg/ml mit Assay Diluent verdünnt. Es wurden zwei Verdünnungsreihen der Standardlösung von 8000 pg/ml bis 31,25 pg/ml in halbierenden Konzentrationsschritten angelegt. 100 µl der zu untersuchenden Proben wurden auf entsprechende freie Wells verteilt und die Platte mit adhäsiver Folie bedeckt über Nacht bei 4° Celsius inkubiert. Die untersuchten Proben wurden zweimal je Ansatz auf unterschiedliche Wells aufgetragen. In die Auswertung floss der Mittelwert der Extinktion der entsprechenden Wells ein. Der DetectionAntikörper (biotin-conjugate anti-human/mouse TGFβ1, Klon eBio16TFB) wurde mit Assay Diluent auf eine Verdünnung von 1:250 gebracht. Je 100 µl dieses verdünnten Antikörpers wurden auf die Wells verteilt und die versiegelte Platte bei Raumtemperatur für eine Stunde inkubiert. Es folgten erneut fünf Waschdurchgänge. Im Anschluss wurden 100 µl Avidin-HRP (eBioscience, San Diego, USA) in 1:250 Verdünnung mit Assay Diluent auf die Wells gegeben und die Platte versiegelt für dreißig Minuten bei Raumtemperatur inkubiert. Nach folgenden sieben Waschdurchgängen wurden 100 µl Substrat (TMB Solution, eBioscience, San Diego, USA)/Well verteilt und die Platte bei Raumtemperatur für 15 Minuten inkubiert. Anschließend wurden 50 µl 2 M H2SO4/Well hinzugegeben und die Farbreaktion der Wells am Spektrometer analysiert. Für die Auswertung nutzten wir das Ergebnis der Subtraktion der Extinktionswerte bei 570 nm von denjenigen bei 450 nm. 55 2,5 f(x) = 0,8x - 1,51 2,0 Extinktion 1,5 1,0 0,5 0,0 TGFβ1 pg/ml (log10) Abb. 8: Standardkurve TGFβ1-ELISA. Gezeigt ist eine repräsentative Kurve, die in den entsprechenden Versuchen als Grundlage der quantitativen Bestimmung der TGFβ1-Konzentrationen diente. Die Konzentrationen wurden mit Hilfe der Gleichung der Regressionsgraden errechnet. 3.14 Nachweis von TH17-Zellen Produktion von IL-17 gilt als Marker für TH17-Zellen, ist jedoch nicht für diese spezifisch. Nachweis der Produktion von IL-17 durch CD4 + T-Zellen gilt jedoch neben der PCR des Transkriptionsfaktors RORγt als etablierte Methode zum Nachweis von T H17-Zellen (Sakaguchi, 2000). 3.15 Messung freier Zytokinspiegel in Peritonealflüssigkeit In unterschiedlichen Versuchsansätzen wurden IL-17 und TGFβ1 quantitativ in Peritonealflüssigkeit erfasst. Die beschriebenen Experimente wurden zwei Mal wiederholt. Die dargestellten Ergebnisse sind repräsentativ für die durchgeführten Einzelexperimente. Für jede Versuchsgruppe wurden 56 jeweils vier C57BL/6 Wildtyp-Mäuse gleichen Geschlechts im Alter von sechs bis acht Wochen verwendet. Das Gewicht der eingesetzten Tiere betrug zwischen 19 und 22 Gramm. Nach intraperitonealer Injektion von Sp1 sollten die freien Konzentration von IL-17 und TGFβ1 zu unterschiedlichen Zeitpunkten quantitativ in der Peritonealflüssigkeit bestimmt werden. Kontrollgruppen bezeichneten naive Mäuse beziehungsweise Mäuse, denen 0,68 µl/g Körpergewicht SCCA aufgefüllt mit PBS auf ein Gesamtvolumen von 200 µl injiziert wurden, zur Überprüfung der isolierten Auswirkungen von SCCA auf die jeweiligen intraperitonealen ZytokinKonzentrationen. An den Interventionsgruppen erfolgte die intraperitoneale Injektion von 100 µl Sp1 und 0,68 µl/g Körpergewicht SCCA, aufgefüllt mit PBS auf ein Gesamtinjektionsvolumen von 200 µl. Die Peritoneallavage erfolgte vier und acht Stunden sowie zu einem späten Zeitpunkt achtzehn Stunden post injectionem. 3.16 Messung der Zytokinproduktion von Zellen aus der Peritoneallavage Nach dem quantitativen Nachweis der freien intraperitonealen Zytokinkonzentrationen in vivo, sollte die Produktion von IL-17 und TGFβ1 durch die jeweilige intraperitoneale Zellpopulation quantitativ in vitro analysiert werden. Hierzu mussten Zellen durch Peritoneallavage gewonnen werden. Für jede Versuchsgruppe wurden jeweils vier C57BL/6 Wildtyp-Mäuse gleichen Geschlechts im Alter von sechs bis acht Wochen verwendet. Das Gewicht der eingesetzten Tiere betrug zwischen 19 und 22 Gramm. Als erste Kontrollgruppe dienten naive Mäuse; an einer zweiten Kontrollgruppe erfolgte die intraperitoneale Injektion von 0,68 µl/g Körpergewicht SCCA aufgefüllt mit PBS auf ein Gesamtvolumen von 200 µl. Der Interventionsgruppe wurden 100 µl Sp1 und 0,68 µl/g Körpergewicht SCCA aufgefüllt mit PBS auf ein Gesamtinjektionsvolumen von 200 µl injiziert. Die Peritoneallavage erfolgte achtzehn Stunden post injectionem. Nach Erythrozytenlyse erfolgte die Verteilung von je 1,5x106 Zellen auf 1 Well einer 24 Well-Plate (NUNC Multidish, Nunc GmbH & Co KG, Langenselbold, D). Die Wells wurden auf ein Gesamtvolumen von 1 ml mit Medium aufgefüllt. Zur spezifischen Stimulation wurden 1 µl antiCD3 und 2,5 µl anti-CD28 hinzugegeben und bei 36° Celsius und 5% CO 2 für achtzehn Stunden inkubiert. Anschließend wurden die Well-Plates bei 1500 rpm für 10 min zentrifugiert und die zellfreien Überstände gewonnen. 3.17 Messung der Zytokinproduktion in der Milz 57 In mehreren unterschiedlichen Versuchsansätzen sollte die Auswirkung der intraperitonealen Injektion von Sp1 auf die Produktion von IL-17 und TGFβ1 in der Milz quantitativ und im zeitlichen Verlauf erfasst werden. Alle Versuche wurden wiederholt. Je Auswertung wurde jeweils nur eine Milz verwendet; ein Pooling fand nicht statt. Die dargestellten Ergebnisse sind repräsentativ für die einzelnen Versuchsdurchgänge. C57BL/6 Wildtyp-Mäuse gleichen Geschlechts im Alter von sechs bis acht Wochen und mit einem Gewicht von 19 bis 22 Gramm wurden je einer Kontroll- und zwei Interventionsgruppen zugeteilt. Die Kontrollgruppe verblieb naiv; an den Interventionsgruppen erfolgte die intraperitoneale Injektion von 100 µl Sp1 und 0,68 µl/g Körpergewicht SCCA, aufgefüllt mit PBS auf ein Gesamtinjektionsvolumen von 200 µl. Die Inkubationszeit in den Interventionsgruppen wurde nach vier respektive acht Stunden beendet. Um die Auswirkungen auf die Zytokinspiegel zu einem späten Zeitpunkt erfassen zu können, wurde eine weitere Versuchsreihe angelegt, deren Einwirkzeit in vivo 18 Stunden betrug. Als Kontrollgruppe dienten naive Wildtyp-Mäuse sowie Wildtyp-Mäuse, denen 0,68 µl/g Körpergewicht SCCA aufgefüllt mit PBS auf ein Gesamtvolumen von 200 µl injiziert wurde; die Interventionsgruppe erhielt 100 µl Sp1 und 0,68 µl/g Körpergewicht SCCA, aufgefüllt mit PBS auf ein Gesamtinjektionsvolumen von 200 µl. Nach Herstellung einer Milzsuspension erfolgte die Aliquotierung des zellfreien Überstandes. Die Aliquots wurden mittels ELISA auf die Konzentration an freiem IL-17 analysiert. Das verbleibende Zellpellet wurde einer Erythrozytenlyse unterzogen und im Anschluss je 3x10 6 Zellen in 1 ml Medium auf je 1 FACS-Tube verteilt. Zur Lösung wurden jeweils 1 µl anti-CD3 und 2,5 µl antiCD28 hinzugegeben und bei 36° Celsius und 5% CO 2 für sechs Stunden inkubiert. Nach Zentrifugation wurden die Überstände gewonnen und mittels ELISA auf IL-17 untersucht. Desweiteren wurden CD4+ T-Helferzellen aus der Zelllösung mit Hilfe des MACS CD4 T-Cell Isolation Kit gemäß Protokoll isoliert, entsprechend vorgenanntem Vorgehen verteilt, stimuliert und inkubiert und im Anschluss die zellfreien Überstände mittels ELISA auf IL-17 untersucht. Weiterhin wurden zwei getrennten Ansätzen jeweils isolierte CD4 + T-Helferzellen aus der Milz beziehungsweise unselektionierte Milzzellen aus nativen C57BL/6 Wildtyp-Mäusen zu je 3x10 6 Zellen in 1 ml Medium auf je 1 FACS-Tube verteilt. Diese Zelllösung wurde im Anschluss in vitro entweder mit 100 µl Sp1 (1 mg/ml) oder allein mit 100 µl Medium (Kontrollgruppe) versetzt und bei 36° Celsius und 5% CO 2 für achtzehn Stunden inkubiert. Die zellfreien Überstände der isolierten CD4+ Zellen wurden mittels ELISA aus ökonomischen Gründen allein auf IL-17, die Überstände der unselektionierten Lösung auf IL-17 und TGFβ1 untersucht. 58 4. Ergebnisse 4.1 Abszessmodell 4.1.1 Abhängigkeit der Sp1-induzierten Abszessbildung von IL-17 Zwitterionische Polysaccharide induzieren in Mäusen und Ratten nach Injektion in das Cavum peritonei die Ausbildung intraperitonealer Abszesse (Tzianabos, Onderdonk, Rosner, Cisneros, & Kasper, 1993) (Tzianabos et al. 1994). Die Abszessbildung wird mediiert von CD4+ Zellen (Tzianabos, Wang, & Lee, 2001). Für die zwitterionischen Kapselpolysaccharide von Bacteroides fragilis konnte gezeigt werden, dass IL-17 für die Entstehung der Abszesse eine entscheidende Rolle spielt (Chung et al. 2003). Tiere, die mit einem blockierenden Antikörper gegen IL-17 intraperitoneal behandelt wurden, bildeten signifikant weniger Abszesse aus. Auch das kapsuläre Polysaccharid Sp1 aus Streptococcus pneumoniae ist in der Lage, intraperitoneale Abszesse zu induzieren (Tzianabos, Onderdonk, Rosner, Cisneros, & Kasper, 1993). Die Bedeutung von IL-17 in der Abszessgenese durch Sp1 ist bisher unklar (Meemboor et al. 2009). Wir untersuchten die Abszessbildung durch Sp1 in Wildtyp- und IL-17-/- Mäusen. SCCA dient der Abszessbildung durch Sp1 als Adjuvans, indem es den peritonealen Übertritt intestinaler Microflora simuliert wie er sich beispielsweise im Rahmen einer peritonealen Sepsis findet (Stephen et al. 2007) (Onderdonk, Kasper, Cisneros, & Bartlett, 1977). Injektion von SCCA alleine führt nicht zu regelhaftem Nachweis einer Abszessbildung in Wildtyp- oder IL-17 -/Mäusen. Die intraperitoneale Injektion von Sp1 zusammen mit dem Adjuvans SCCA führte zur Ausbildung von Abszessen in der Bauchhöhle von Wildtyp-Mäusen (Tab 1). In der Mehrheit der Fälle fand sich je ein Abszess pro Tier mit einem mittleren Durchmesser von 3,6 mm (Abb. 9). Nur in drei Fällen wurden zwei bis drei Abszesse pro Tier identifiziert, wobei die begleitenden Abszesse eine Größe von 1,5 mm nicht überschritten. Es floss nur jeweils der größte Abszess in die Auswertung ein. Insgesamt fanden sich nach Injektion von Sp1 in 14 von 15 Fällen (93,3%) Abszesse (Tab. 1). Unsere Messungen liegen innerhalb der Streubreite der Abszessbildung wie sie für das Modell in der Literatur vorgefunden wird (Chung et al. 2003) (Meemboor et al. 2009) (Mertens et al. 2009) (Groneck et al. 2009). 59 Abb. 9: Abszessbildung nach intraperitonealer Injektion von Sp1 in Wildtyp-Mäusen. Punkte markieren den größten Abszessdurchmesser des Versuchstieres, Querbalken den mittleren Abszessdurchmesser der Versuchskohorte. Im Vergleich zum Wildtyp zeigen Mäuse, denen das Gen zur Expression von IL-17 fehlt, eine geringere Ausbildung von Abszessen nach Injektion von Sp1. Der mittlere Durchmesser der Abszesse lag bei 0,8 mm; der Durchmesser des größten gefundenen Abszesses bei 2 mm. Auch fand sich nicht mehr als jeweils ein Abszess pro Tier. Insgesamt fanden sich in 9 von 15 Fällen (60%) Abszesse (Abb. 10). 60 61 Anzahl der Mäuse mit Gruppe Wildtyp IL-17-/- Challenge Abszess/Gesamtzahl Mäuse (%) p-Wert naiv 0/15 (0) PBS 1/15 (6,6) 1,0 SCCA + PBS 1/15 (6,6) 1,0 Sp1 + SCCA + PBS 14/15 (93,3) 0,0000002 naiv 0/15 (0) PBS 0/15 (0) 1,0 SCCA + PBS 2/15 (13,3) 0,48275 Sp1 + SCCA + PBS 9/15 (60) 0,0007 Tab. 1: Abszessformation in Wildtyp- und IL-17-/- Mäusen nach intraperitonealer Injektion von Sp1. Die Berechnung der P-Werte erfolgte mittels zweiseitigem exaktem Fisher-Test gegenüber den entsprechenden naiven Kontrollen. 4.2 ELISA 4.2.1 Ausschüttung von IL-17 und TGFβ1 durch peritoneale Zellen nach Injektion von Sp1 Wir untersuchten mittels ELISA, wie sich die freien Spiegel von IL-17 und TGFβ1 in der Peritonealflüssigkeit zu unterschiedlichen Zeitintervallen nach Injektion von Sp1 im Vergleich zu Kontrollgruppen verhielten. Für die ausgewählten Zeitintervalle zur Bestimmung der Konzentrationen von IL-17 und TGFβ1 in der Lavageflüssigkeit orientierten wir uns an Erkenntnissen aus entsprechenden Untersuchungen zu IL-6 (Meemboor et al. 2009): Intraperitoneale Injektion von Sp1 zusammen mit dem Adjuvans SCCA führt zu signifikanter Ausschüttung von Interleukin-6 in die Peritonealflüssigkeit. Mittels ELISA zeigt die Kinetik der IL6-Ausschüttung ihr Maximum vier bis acht Stunden nach Injektion. Die IL-6-Spiegel bleiben auch 48 Stunden nach Injektion gegenüber der Kontrolle erhöht. IL-6 besitzt zusammen mit TGFβ1 eine entscheidende Rolle in der Differenzierung von T H-17 Zellen, einem kürzlich neu definierten Zelltyp, benannt nach der Produktion und Ausschüttung von IL-17 (Veldhoen et al. 2006) (Mangan et al. 2006) (Stockinger and Veldhoen 2007) (Stockinger, Veldhoen, et al. 2007) (Xu et al. 2007) (de Jong et al. 2010). 62 Vier und acht Stunden nach intraperitonealer Injektion von Sp1 fand sich gegenüber der Kontrolle ein Trend in Richtung erhöhter Spiegel von IL-17 in der Lavage. Ihr Maximum zeigte die Erhöhung hierbei nach vier Stunden (Abb. 11). IL-17 in Flüssigkeit aus Peritoneallavage [pg/ml] 10 6,823 6,653 5,546 5 0 Kontrolle naiv SCCA + Sp1 4h SCCA + Sp1 8h Achtzehn Stunden nach intraperitonealer Injektion von Sp1 fand sich für die kombinierte Injektion von Sp1 und SCCA ein geringgradig erhöhter Nachweis von IL-17 im Vergleich zur naiven Kontrolle oder der Injektion von SCCA alleine (Abb. 12). Somit blieben die IL-17-Spiegel auch zum späteren Messzeitpunkt nach achtzehn Stunden noch erhöht. Es ließ sich jeweils auch in den naiven Kontrollgruppen ein Nachweis eines Basalspiegels von IL-17 erbringen. 63 IL-17 in der Lavageflüssigkeit [pg/ml] 10 7,87 7,56 8 6,54 5 Kontrolle naiv SCCA SCCA + Sp1 Ein Direktvergleich der Absolutmengen von IL-17 in den dargestellten Ergebnissen ist kritisch zu sehen, da auf zwei unterschiedliche Kohorten an Versuchstieren zurückgegriffen wurde. Auch ist die Bestimmung freier Zytokinkonzentrationen in der Lavageflüssigkeit aufgrund eines größeren Einflusses von Verdünnungseffekten mit höheren Schwankungen zwischen verschiedenen Messreihen behaftet. Die erfassten Zytokinmengen lagen jeweils sicher oberhalb der Grenze der testdiagnostischen Sensitivität des eingesetzten ELISA-Kits (4 pg/ml). TGFβ1 ist neben IL-6 ein entscheidender Kofaktor in der Ausdifferenzierung von TH-17 Zellen (Veldhoen et al. 2006) (Mangan et al. 2006) (Bettelli et al. 2006) (Li et al. 2007) (Yang, Anderson, et al. 2008) (McGeachy et al. 2007). Wir untersuchten die Konzentrationen an TGFβ1 nach intraperitonealer Injektion von Sp1 in der Lavageflüssigkeit. Nach achtzehn Stunden Inkubationszeit führte die kombinierte Injektion von Sp1 und SCCA zu erhöhten Messwerten im Vergleich zur Injektion von SCCA alleine (Abb. 13). In der naiven Kontrollgruppe ließ sich TGFβ1 sicher nachweisen, jedoch lagen die Spiegel unterhalb der Spiegel in den Interventionsgruppen. Alle Messwerte lagen oberhalb der Sensitivitätsgrenze des eingesetzten ELISA-Kits (60 pg/ml). 64 TGFbeta in Flüssigkeit der Peritoneallavage [pg/ml] 110 105,633 100,577 100 97,724 90 Kontrolle naiv SCCA SCCA + Sp1 Abb. 13: TGFβ1 in der Peritoneallavage 18 Stunden nach intraperitonealer Injektion von Sp1 + SCCA. In vivo finden sich demnach leicht erhöhte Spiegel von IL-17 und TGFβ1 in der Peritonealflüssigkeit nach intraperitonealer Injektion von Sp1. In der Folge sollten diese empirisch nachgewiesenen Trends in mehreren Versuchsansätzen in vitro analysiert und die beteiligten Zellpopulationen definiert werden. Hierzu gewannen wir Zellen aus der Lavageflüssigkeit und unterzogen sie in vitro einer T-Zell-spezifischen Stimulation mit anti-CD3 und anti-CD28, um TZellen zu einer vermehrten Produktion des spezifischen Zytokinprofils zu veranlassen. Ein quantitativer Vergleich der IL-17- und TGFβ1-Konzentrationen im Überstand der in vitro-Kultur sollte als indirekter Parameter für die Anzahl jeweilig differenzierter, IL-17- respektive TGFβ1produzierender Zellen innerhalb der intraperitonealen Gesamtpopulation dienen. Analyse der Interventionsgruppe achtzehn Stunden nach intraperitonealer Injektion von Sp1 zeigte einen deutlichen Anstieg von IL-17. Auch in der Kontrollgruppe, in der SCCA alleine intraperitoneal injiziert wurde, fand sich gegenüber der naiven Kontrolle eine erhöhte IL-17-Konzentration. In der naiven Kontrollgruppe ist IL-17 mit merklich geringerem Spiegel nachweisbar (Abb. 14, Abb. 15). 65 1200 IL-17 im Überstand restimulierter Zellen aus der Peritoneallavage [pg/ml] 1026,12 600 265,09 10,05 0 Kontrolle naiv SCCA SCCA + Sp1 Abb. 14: IL-17 aus Zellen der Peritoneallavage nach Stimulation mit anti-CD3 und anti-CD28 in vitro. Kontroll- und Interventionsgruppen stellen ein Pooling von je vier verwendeten Versuchstieren dar. 66 IL-17 im Überstand restimulierter Zellen aus der Peritoneallavage [pg/ml (log10)] 10000 1026,12 1000 265,09 100 10 10,05 1 Kontrolle naiv SCCA SCCA + Sp1 Auch für TGFβ1 zeigt sich eine geringgradig gesteigerte Produktion unter Sp1 im Vergleich zu SCCA alleine oder der naiven Kontrolle. Auch SCCA alleine vermag die TGFβ1-Produktion zu steigern, jedoch ist unter Einsatz von Sp1 die TGFβ1-Produktion höher (Abb. 16). 67 TGFbeta im Überstand restimulierter Zellen aus der Peritoneallavage [pg/ml] 110 100,577 100 96,895 93,068 90 Kontrolle naiv SCCA SCCA + Sp1 Abb. 16: TGFβ1 aus Zellen der Peritoneallavage nach Stimulation in vitro. Kontroll- und Interventionsgruppen stellen ein Pooling von je vier verwendeten Versuchstieren dar. 4.2.2 IL-17-Produktion in der Milz nach intraperitonealer Injektion von Sp1 Wir konnten zeigen, dass peritoneale Zellen nach intraperitonealer Injektion von Sp1 und anschließender Restimulation mit anti-CD3 und anti-CD28 in vitro zu einer vermehrten Sekretion von IL-17 befähigt sind. In der Folge sollte untersucht werden, ob nach intraperitonealer Sp1Injektion eine systemisch messbare IL-17-Antwort folgt. Wir untersuchten die Ausschüttung von IL-17 und TGFβ1 durch Zellpopulationen der Milz nach intraperitonealer Injektion von Sp1. Das Zytokinmuster in der Milz diente hierbei als stellvertretender Marker einer systemischen Immunreaktion auf den lokalisierten intraperitonealen immunologischen Reiz. Nach Injektion von Sp1 fand sich im zellfreien Überstand der Zellsuspension einer vier Stunden nach Challenge entnommenen Milz eine geringere Gesamtkonzentration an IL-17 als in der naiven Kontrollgruppe ( Abb. 17). IL-17 im Überstand der Milzsuspension [pg/ml] 68 30 17,298 15 12,417 0 Kontrolle naiv SCCA + Sp1 Wurden diese unselektionierten Zellen der vier Stunden nach Injektion entnommenen Milz einer Stimulation in vitro unterzogen, fanden sich nahezu identische Konzentrationen an IL-17 zwischen naiver Kontrolle und Interventionsgruppe. Wurde die Milz acht Stunden nach Injektion entnommen, fanden sich nach Stimulation mit anti-CD3 und anti-CD28 in vitro geringgradig erhöhte IL-17 im Überstand restimulierter Milzzellen [pg/ml] Konzentrationen an IL-17 im Vergleich zur Kontrolle (Abb. 18). 10 6,436 5,603 5,644 5,493 Kontrolle naiv SCCA + Sp1 Kontrolle naiv 5 0 4h Inkubation SCCA + Sp1 8h Inkubation Abb. 18: IL-17 aus Zellen der Milz nach Stimulation mit antiCD3/anti-CD28 in vitro. Die Milzen wurden vier bzw. acht Stunden nach intraperitonealer Challenge entnommen. 69 Achtzehn Stunden nach Injektion und anschließender Stimulation fand sich eine gering erhöhte IL17 Konzentration in der Interventionsgruppe (Abb. 19). Die Konzentration von TGFβ1 achtzehn Stunden nach Entnahme der Milz und Stimulation in vitro war jedoch unter Sp1 geringer als in der Kontrollgruppe (Abb. 20). IL17 im Überstand restimulierter Milzzellen [pg/ml] 10,0 8,60 8,06 7,5 5,0 Kontrolle naiv Sp1 Abb. 19: IL-17 aus Zellen der Milz nach Stimulation mit anti-CD3/anti-CD28 in vitro. Die Milzen wurden 18 Stunden nach intraperitonealer Challenge entnommen. TGFbeta im Überstand restimulierter Milzzellen [pg/ml] 70 110 104,858 105,172 99,724 100 90 Kontrolle naiv SCCA SCCA + Sp1 Abb. 20: TGFβ1 aus Zellen der Milz nach Stimulation mit antiCD3/anti-CD28 in vitro. Die Zellen wurden 18 Stunden nach intraperitonealer Challenge gewonnen. CD4+ TH-17 Zellen gelten als zentrale Quelle einer spezifischen IL-17 Ausschüttung nach Konfrontation des Organismus mit extrazellulären Pathogenen (Liu, Yadav, et al. 2009) (Bettelli et al. 2008). Allerdings gilt IL-17 auch als Produkt weiterer Zellen aus dem Rahmen der angeborenen Immunität, z.B. Makrophagen (Song et al. 2008) (Gu et al. 2008) oder Neutrophile (Ferretti et al. 2003b), und erworbenen Immunität, z.B. CD8+CD45RO+ Zellen (Kolls & Lindén, 2004). Zur Beantwortung der Frage, ob die Messungen der IL-17 Konzentration innerhalb der Milz durch die Reaktion spezifischer CD4+ TH-17 Zellen bedingt sind, führten wir eine Isolation von CD4 + Zellen aus einer Milzsuspension durch. Die Zellisolation erfolgte vier und acht Stunden nach intraperitonealer Injektion von Sp1 mittels MACS Isolations-Kit. Als Kontrollgruppe dienten Zellen aus naiven Wildtyp-Mäusen. Die Absolutkonzentrationen von IL-17 im Überstand stimulierter CD4 + Zellen glichen denjenigen, die zuvor im Überstand der gesamten Milzzellpopulation gefunden wurden. Es zeigte sich kein Unterschied zwischen Kontrolle und Interventionsgruppe, wenn die Zellen vier oder acht Stunden nach Injektion von Sp1 gewonnen wurden. Der zuvor in der undifferenzierten Zelllösung 71 beobachtete, dezente Anstieg der IL-17 Konzentration nach acht Stunden Inkubation entfiel für die IL-17 in CD4+ Milzzellen nach Restimulation [pg/ml] isolierten CD4+ Zellen (Abb. 21). 10 5,465 5,644 5,479 5,493 Kontrolle naiv SCCA + Sp1 Kontrolle naiv SCCA + Sp1 5 0 4h Inkubation 8h Inkubation Abb. 21: IL-17-Produktion durch isolierte CD4+ Zellen aus der Milz. Die Zellen wurden vier und acht Stunden nach Challenge gewonnen. Die Beobachtungen der Zytokinkonzentrationen in der Milz bleiben an dieser Stelle in ihrer Bedeutung letztlich nicht abschließend und eindeutig zu interpretieren. Dennoch erlauben sie die Hypothese, dass sich unter den CD4 + Zellen der Milz eine Population von Zellen befindet, die zur Produktion von IL-17 befähigt ist. Die intraperitoneale Injektion von Sp1 führt jedoch nach kurzem Zeitabstand nicht zu einer wesentlichen Vermehrung IL-17 produzierender CD4 + Zellen in der Milz. In diesem Zusammenhang könnte man die Milz als Ort einer späteren, systemischen Immunreaktion sehen. IL-17 und TH-17 Zellen gelten bislang besonders als Vermittler rapider Immunantworten gegenüber extrazellulären Pathogenen an mucosalen Oberflächen (Bettelli et al. 2008) (Khader et al., 2007). Ein beobachteter, geringgradiger Anstieg von IL-17 in der undifferenzierten Zelllösung später als acht Stunden nach Injektion von Sp1 erregt den Verdacht, dass möglicherweise weitere Zelltypen in die Ausbildung einer IL-17 Antwort in der Milz involviert sind. Diese Zellpopulationen dienen 72 entweder selbst als Quelle für IL-17 oder sie könnten die Produktion von IL-17 durch CD4 + TH-17 Zellen auf an dieser Stelle nicht geklärte Art und Weise stimulieren. Im Zeitverlauf kann der Anstieg der IL-17 Konzentration eine Einwanderung IL-17 produzierender Zellen darstellen oder durch Ausdifferenzierung autochthoner Milzzellen zu IL-17 Produzenten bewirkt sein. Um die Auswirkungen von Sp1 auf autochthone Milzzellen darzustellen, unterzogen wir Milzzellen naiver Wildtyp-Mäuse einer Kultur mit Sp1 in vitro. Nach achtzehn Stunden Inkubation mit Sp1 lagen die IL-17-Konzentrationen der naiven Kontrolle bei rund 5 pg/ml. Damit lagen die Konzentrationen in der Größenordnung derjenigen, die die Untersuchungen an Milzzellen nach Konfrontation mit Sp1 in vivo erbracht haben. Kultur mit Sp1 zeigte einen Trend in Richtung einer vermehrten Ausschüttung von IL-17 (Abb. 22). IL-17 in Milzzellen in vitro [pg/ml] 10 6,581 5,385 5 0 Kontrolle naiv Sp1 Abb. 22: IL-17-Ausschüttung 18 Stunden nach Inkubation unselektionierter Milzzellen mit Sp1 in vitro. Die direkte Konfrontation naiver Milzzellen mit Sp1 in vitro führt demnach zu messbarer IL-17Antwort. Es zeigt sich ein Trend in Richtung der Fähigkeit der autochthonen Milzzellpopulation, IL-17-produzierende Zellen aus ihren Reihen zu generieren. Dieser Prozess könnte in Abhängigkeit von TGFβ1 erfolgen. Parallel zur Ausschüttung von IL-17 war die Ausschüttung von TGFβ1 durch die Zellen der Milz nach achtzehn Stunden Inkubation mit Sp1 in vitro gegenüber der naiven Kontrolle erhöht (Abb. 23). TGFbeta im Überstand der Milzzellen in vitro [pg/ml] 73 Abb. 110 101,298 100 98,288 90 Kontrolle naiv 23: Ausschüttung Sp1 von TGFβ1 durch unselektionierte Zellen der Milz nach 18h Inkubation mit Sp1 in vitro. 4.2.3. Zusammenfassung der ELISA-Analysen Die gezeigten Ergebnisse der ELISA-Versuchsreihen können an dieser Stelle insofern zusammengefasst werden, als dass sich nach intraperitonealer Injektion von Sp1 eine geringgradige lokale IL-17- und TGFβ1-Produktion nachweisen lässt. Unter Restimulation mit anti-CD3/antiCD28 ex vivo lässt sich die peritoneale Zellpopulation deutlich zur Produktion von IL-17 anregen. In der Milz sind zu den untersuchten Versuchszeitpunkten allenfalls nur geringe Trends zur Produktion von IL-17 und TGFβ1 nachweisbar. 4.3 FACS 4.3.1 Anteil der CD4+ Zellen an der intraperitonealen Gesamtzellpopulation Rund 40% aller Zellen in der Peritonealflüssigkeit nach Injektion von Sp1 sind Makrophagen und etwa 7% CD11c+ dendritische Zellen (Stephen et al. 2007). Die Angaben der Literatur für den Anteil CD4+ Zellen an der intraperitonealen Gesamtpopulation belaufen sich auf circa 1% (Meemboor et al. 2009) (Stephen et al. 2007). Wir fanden einen Influx von CD4+ Zellen in Wildtypund IL-17 -/- Mäusen von anteilig circa 1,7% bei geringer Schwankungsbreite (Abb. 24). Es fanden sich keine größeren Unterschiede zwischen Kontrollgruppen und nach Injektion von Sp1. 74 Abb. 24: Anteil der CD4+ Zellen an allen registrierten Zellen in der Peritonealflüssigkeit. Dargestellt sind die Mittelwerte aus drei unabhängigen Versuchen. Fehlerbalken geben die Maxima wieder. Es fanden sich keine signifikanten Unterschiede zwischen Interventions- und Kontrollgruppen. 4.3.2 Expression von TGFβ1 in BMDC durch Sp1 Dendritischen Zellen aus dem Knochenmark (engl., bone marrow derived dendritic cells, BMDC) kommt als Antigen-präsentierenden Zellen neben Makrophagen (Gibson et al. 1998) in der Entstehung intraperitonealer Abszesse durch Sp1 eine bedeutende Rolle zu (Stephen et al. 2007). BMDC führen nach Aufnahme von Sp1 zu MHC-II-abhängiger Induktion reaktiver CD4 + Zellen. Darüber hinaus produzieren BMDC proinflammatorische Zytokine wie IL-6 (Meemboor et al. 2009). BMDC zeigen nach Konfrontation mit Sp1 in vitro eine Zunahme der Expression von LAP (Abb. 25). 75 Abb. 25: LAP-Expression durch CD11c+ BMDC nach unterschiedlichen Inkubationszeiten mit Sp1. Die linke Spalte zeigt die Kontrollgruppe, rechts nach Inkubation mit Sp1. Von oben nach unten nach 8, 24, 33 und 48 Stunden Inkubation. Die Marker wurden gegen die jeweiligen Isotypkontrollen (nicht gezeigt) gesetzt. 76 Die Expression von LAP ist ein spezifischer Marker für die Produktion von TGFβ1. Wir konnten zeigen, dass die Expression von LAP ein Maximum nach 24 Stunden Inkubation mit Sp1 zeigt (Abb. 26). 50 39,2 Anteil von BMDC mit Expression von LAP [%] 40 33,5 32,3 30 26,4 25 23 20 19,8 18,3 10 0 8 24 33 48 Inkubationszeit [h] Abb. 26: Kinetik der LAP-Expression in BMDC. Gezeigt sind die Anteile LAP-exprimierender BMDC nach unterschiedlichen Kontrollgruppe (Quadrate). Inkubationszeiten mit Sp1 (Rauten) gegenüber der 77 4.3.3 Expression von IL-6 in BMDC durch Sp1 Meemboor et al. konnten mittels ELISA-Untersuchungen zeigen, dass Sp1 zur Freisetzung von IL-6 durch BMDC in vitro führt (Meemboor et al. 2009). Wir konnten mit Hilfe intrazellulärer Zytokinfärbungen allenfalls einen geringen Trend aufzeigen, dass BMDC nach Konfrontation mit Sp1 in vitro vermehrt zur Produktion von IL-6 angeregt werden (Abb. 27). Die BMDC der Interventionsgruppe zeigen sich qualitativ höher positiv auf IL-6 (Abb. 28). Abb. 27: IL-6 Produktion durch CD11c+ BMDC. Nach Konfrontation mit Sp1 in vitro (rechts) zeigen BDMC vermehrte intrazelluläre Akkumulation von IL-6 gegenüber der Kontrolle (links). Die Quadrantenmarker wurden gegen die entsprechenden Isotypkontrollen (nicht gezeigt) eingestellt. Abb. 28: IL-6 Produktion in BMDC nach Gabe von Sp1 in vitro (schwarze Linie) gegenüber der naiven Kontrolle (graue Linie). Die gepunktete Linie stellt die Isotypenkontrolle der Kontrollgruppe dar. 78 IL-6 besitzt eine entscheidende Rolle in der Differenzierung IL-17 produzierender Zellen. Neben TH17-Zellen wurde auch für eine Reihe weiterer Zelllinien, unter diesen auch Antigenpräsentierende Zellen wie Makrophagen, Produktion von IL-17 nachgewiesen (Kolls & Lindén, 2004) (Song et al. 2008) (Gu et al. 2008). BMDC zeigten in unseren Versuchen keine Produktion von IL-17. Auch nach unabhängiger selektiver Stimulation der jeweiligen BMDC mit mGM-CSF konnte keine Produktion von IL-17 befördert werden. 4.3.4 IL-6-abhängiges Auftreten von peritonealen TH17-Zellen nach intraperitonealer Sp1Injektion Nach intraperitonealer Injektion von Sp1 zeigen Wildtyp-Mäuse einen messbaren Influx von IL17+CD4+ Zellen in die Peritonealflüssigkeit (Abb. 29). Nach Stimulation mit anti-CD3/anti-CD28 in vitro finden sich mit 24,2% aller CD4+ Zellen in der Lavage erhöhte Zellzahlen gegenüber der Kontrollgruppe mit 4,5%. In IL-6 -/- Mäusen ist dieser Influx reduziert. Es finden sich unter Gabe von Sp1 nur 6% TH17-Zellen an allen CD4+ Zellen in der Lavage. Die Kontrolle zeigt hier 5,5%. 79 Abb. 29: TH-17 Zellen in der Peritoneallavage. Gezeigt ist der prozentuale Anteil IL-17 +CD4+ Zellen an allen CD4+ Zellen in Wildtyp-Mäusen (oben) sowie in IL-6 -/- Mäusen (unten). Dargestellt sind die Interventionsgruppen nach Injektion von Sp1 (schwarze Linien) gegenüber den Kontrollgruppen (hellgraue Linien). Die Marker wurden gegen die jeweiligen Isotypkontrollen (gepunktete Linien) gesetzt. 80 4.3.5 IL-6-abhängiges Auftreten von TH17-Zellen in der Milz nach intraperitonealer Sp1Injektion Nach intraperitonealer Injektion von Sp1 an Wildtyp-Mäusen untersuchten wir die Anzahl von T H17 Zellen in der Milz über die intrazelluläre Färbung von IL-17 in CD4+ Zellen (Abb. 30). Achtzehn Stunden nach Injektion zeigten 43,8% aller CD4+ Zellen in der Milz Expression von IL-17. Dagegen fanden sich bei der Kontrollgruppe zum gleichen Zeitpunkt nur 26,7% IL-17 +CD4+ Zellen. Wurden die Zellen einer Stimulation in vitro mit anti-CD3 und anti-CD28 unterzogen, fanden sich 60,3% TH17-Zellen. Der Anteil von TH17-Zellen in der Kontrollgruppe betrug hier 19,9%. IL-6 -/Mäuse zeigen gegenüber dem Wildtyp eine geringere Anzahl an TH17-Zellen in der Milz. In naiven Tieren betrug der Anteil IL-17+CD4+ Zellen an der Gesamtpopulation alles CD4+ Zellen lediglich 3,5%. Nach Injektion von Sp1 erhöhte sich dieser Anteil auf 6,7%. Die Bestimmung der Zellzahlen in IL-6 -/- Mäusen erfolgte jeweils nur nach Stimulation mit anti-CD3/anti-CD28 in vitro. 81 Abb. 30: TH17-Zellen in der Milz nach intraperitonealer Injektion von Sp1. Gezeigt sind Kontrollen (graue Linien), Interventionsgruppen mit Injektion von Sp1 (schwarze Linien) von unstimulierten CD4 + Zellen aus Wildtypmäusen (oben), Zellen aus Wildtypmäusen nach Stimulation mit antiCD3/antiCD28 sowie Zellen aus IL-6 -/- Mäusen nach Stimulation mit antiCD3/antiCD28. Die Marker wurden gegen die jeweiligen Isotypenkontrollen (gepunktete Linien) gesetzt. 82 4.3.6 Auftreten von TH17-Zellen in der Milz nach intravenöser Sp1-Injektion Um die Auswirkungen einer unmittelbar systemischen Konfrontation mit Sp1 zu erfassen, untersuchten wir die Anzahl von TH17-Zellen in der Milz nach intravenöser Injektion von Sp1 über die intrazelluläre Färbung von IL-17 in CD4 + Zellen (Abb. 31). Nach in vitro Stimulation der gewonnenen Zellen aus der Milz fanden sich nach Injektion von Sp1 signifikant mehr TH17-Zellen anteilig am Gesamtpool aller CD4+ Milzzellen als dies in der Kontrollgruppe der Fall war. Mit 19,3% finden sich jedoch weniger TH17 anteilig am Gesamtpool aller Zellen der Milz als nach intraperitonealer Injektion von Sp1. Abb. 31: TH17-Zellen in der Milz nach intravenöser Injektion von Sp1. Gezeigt sind die Kontrollgruppe (graue Linie) sowie die Interventionsgruppe (schwarze Linie) nach Stimulation mit anti-CD3/anti-CD28 in vitro. Die gepunktete Linie zeigt die Isotypenkontrolle der Kontrollgruppe. 83 4.3.7 Sp1-induzierte Entwicklung von TH17-Zellen in vitro Um zu untersuchen, ob Sp1 die Entwicklung von TH17-Zellen aus einem Pool naiver Milzzellen induziert, inkubierten wir Milzzellkulturen mit Sp1 in vitro (Abb. 32). Vier Stunden nach Inkubation und Stimulation mit PMA/Ionomycin fanden sich mit 13% gegenüber der Kontrolle mit 7,3% erhöhte Zahlen von IL-17+CD4+ Zellen in der Kulturlösung. Abb. 32: Induktion von TH17-Zellen durch Sp1. In-vitro-Kultur und Restimulation (PMA/Ionomycin) naiver Milzzellen mit Sp1 (schwarze Linie) sowie die entsprechende Kontrolle (graue Linie). Die gepunktete Linie stellt die Isotypenkontrolle der Kontrollgruppe dar. 4.3.8. Zusammenfassung der FACS-Analysen Zusammengefasst zeigen die Ergebnisse der FACS-Analysen, dass Sp1 im murinen Modell nach Injektion in vivo zu einer nachweisbaren Induktion von TH17-Zellen intraperitoneal sowie in der Milz führt. Die Induktion von TH17-Zellen durch Sp1 fällt in IL-6-defizienten Mäusen geringer aus. Nach ex vivo Restimulation von isolierten Zellen aus Milz und Peritoneallavage mit anti-CD3/antiCD28 lässt sich die Rate an IL-17+CD4+ Zellen steigern. Sp1 induziert darüberhinaus in vitro in einem unselektionierten Pool von Milzzellen nach T-Zell-spezifischer Restimulation das Auftreten von TH17-Zellen. Nach in vitro Kultur mit Sp1 lässt sich in BMDC die Expression von LAP sowie ein Trend zur Produktion von IL-6 nachweisen. 84 5. Diskussion 5.1 IL-17 und die Abszessbildung durch ZPS Die Entstehung von intraabdominellen Abszessen ist ein komplexer, fein regulierter immunologischer Prozess. Einerseits gilt sie als kontrolliert verlaufende Entzündung mit immunsuppressiven Anteilen zur Verhinderung einer Sepsis. Andererseits gilt die Entstehung von Abszessen als spezifische inflammatorische und destruktive Reaktion auf Pathogene (Groneck et al. 2009). IL-17 gilt als hochgradig proinflammatorischer Mediator in der Abwehr einer Vielzahl an Pathogenen sowie in unterschiedlichen autoimmunologischen Prozessen (Steinman 2007). Von TH1Zellen produzierte Zytokine wie IFNγ und TNF sind verantwortlich für Gewebsschädigungen in vielen Immunphänomenen (Murphy et al. 2008). Vor dem Hintergrund des TH1/TH2-Paradigmas (Mosmann & Coffman, 1989) blieben einzelne widersprüchliche Erkenntnisse aus Untersuchungen diverser etablierter Entzündungsmodelle ungeklärt. So galten TH1-Zellen lange Zeit exklusiv als Motor autoimmunologischer Erkrankungen wie beispielsweise der experimentellen autoimmunen Encephalomyelitis (engl., experimental autoimmune encephalitis, EAE), einem murinen Modell multipler Sklerose (Steinman 2007). Die Vorstellung von TH1-Zellen als alleinige Mediatoren von Autoimmunität hinterlässt jedoch viele offene Fragen. Unter anderem blieb hier nicht erklärlich, weshalb Blockade des TH1Effektorzytokins IFNγ zu einer Verschlechterung des Bilds der EAE führt (Billiau et al. 1988) . Ebenso sind Fragen in Bezug auf die Effektor-Zytokine, die an der Abszessbildung durch ZPS beteiligt sind, bislang offen. CD4+ T-Zellen sind entscheidend involviert in die Entwicklung von intraabdominellen Abszessen nach Injektion von Sp1. Es finden sich signifikante Zahlen von CD4 + T-Zellen in der Abszesswand, was darauf hinweist, dass diese Zellen teilhaben an der Organisation der fibrinösen Abszesskapsel (Chung et al. 2003). CD4+ T-Zellen tragen über die Produktion von TNFα, IFNγ und IL-1β, dem charakteristischen TH1-Zytokinprofil, zur Abszessbildung bei. Versuche an STAT4 und STAT6 defizienten Mäusen belegen die Bedeutung von TH1-Zellen an der Abszessbildung. STAT4-/- Mäuse mit einer gestörten Ausbildung von TH1-vermittelten Immunantworten zeigen deutlich beeinträchtigte Ausbildung von Abszessen nach Injektion von ZPS. Chung et al. richteten vor der formalen Definition von TH17-Zellen als eigenständige Zelllinie 85 erstmals die Aufmerksamkeit auf die Rolle von IL-17 in der Abszessgenese durch ZPS (Chung et al. 2003). Die Entdeckung der TH17-Zellen schloss viele Lücken im Verständnis chronischer und autoimmunologischer Entzündungen (Bettelli et al. 2007). TH17-Zellen und IL-17 gelten heute unter anderem als zentrale pathogenetische Mediatoren bei EAE/multipler Sklerose, inflammatorischer Hauterkrankung Darmerkrankungen (engl., (engl., inflammatory inflammatory skin bowel disease, disease, ISD)/Psoriasis, IBD) und entzündlichen experimenteller Arthritis/rheumatoider Arthritis (Lock et al. 2002) (Lowes et al., 2008) (Elson et al., 2007) (Nakae et al. 2003). Dennoch zeigen Untersuchungen, dass die Genese immunologischer Erkrankungen komplex ist und TH17-Zellen häufig nicht als alleinige Urheber erfasst werden können. Oftmals scheint vielmehr ein Akkord von TH1 und TH17-Zellreaktionen pathogenetisch verantwortlich zu sein (Steinman 2008). Auch wurde gezeigt, dass sich in Patienten mit IBD Zellen mit dualer Produktion von IFNγ und IL17 finden (Steinman 2008). Die Plastizität von TH17-Zellen und ihr möglicher Übergang in einen anderen T-Helferzelltyp sowie verschiedene Aktivierungsstadien von TH17-Zellen, die in unterschiedliche Zytokin- und Transkriptionsfaktor-Profile münden könnten, sind bis heute ungeklärt (Korn et al. 2009). Chung et al. konnten am Modell ZPS-induzierter Abszesse zeigen, dass die Applikation eines neutralisierenden anti-IL-17-Antikörpers zusätzlich zur intraperitonealen Injektion von ZPS zu einer mehr als 80-prozentigen Reduktion in der Ausbildung intraperitonealer Abszesse führt. Für IL-17 wurde hierbei eine Rolle in der Vermittlung der Immunreaktion durch PMN vermutet (Chung et al. 2003). Wir führten erstmals Untersuchungen zur ZPS-vermittelten Abszessbildung an IL-17A-defizienten Mäusen durch und demonstrieren hierbei eine beeinträchtigte Ausbildung der Abszesse. Es finden sich weniger und im Durchschnitt kleinere Abszesse als an Wildtyp-Mäusen. Zukünftige Untersuchungen sollten unter anderem immunhistologisch untersuchen, inwieweit Feinstruktur und Organisation der ZPS-induzierten Abszesse in Abwesenheit von IL-17 im Gegensatz zu Abszessen an Wildtyp-Mäusen variieren. Angesichts der zentralen Rolle von IL-17 in der Rekrutierung und Etablierung der Immunantwort durch Neutrophile vermuten wir eine gestörte 86 Organisation der Abszesse IL-17-defizienter Mäuse auf mikroskopischer Ebene. TH17-Zellen selbst produzieren neben IL-17A (weitläufig als IL-17 sui generis bezeichnet) auch IL- 17F, IL-21, IL-22, GM-CSF und wahrscheinlich TNFα und IL-6 (Korn et al. 2009). Unsere Untersuchungen an IL-17-/- Mäusen schlossen allein die immunologischen Effekte von IL-17A nach Injektion von ZPS aus. Wir vermuten eine, wenn auch augenscheinlich weniger gewichtige Rolle von IL-17F und anderen TH17-Effektorzytokinen in der von uns beobachteten Abszessentwicklung an IL-17A-defizienten Mäusen nach Injektion von Sp1. Zukünftige Studien sollten einen Fokus auf die nachfolgenden Signalkaskaden der diversen TH1/TH17-Zytokine legen und an Kreuzungen und Mündungen dieser Signalwege sowie gemeinsamen Signalendstrecken Antworten auf bisher verwirrend anmutende Phänomene finden. 5.2 Quellen von IL-17 nach intraperitonealer Injektion von Sp1 An der Formierung intraperitonealer Abszesse durch ZPS sind eine Vielzahl von Zellen involviert, unter ihnen Neutrophile, die im Zentrum der Abszess lokalisiert sind, Makrophagen, die Hauptpopulation der Abszesswand, DC sowie CD4 + und CD8+ T-Zellen. Unterschiedlichste Zelltypen der angeborenen und erworbenen Immunität zeigen sich zur Produktion von IL-17 befähigt (Kolls & Lindén, 2004). Wir konnten zeigen, dass CD4+ T-Zellen vermutlich die Lieferanten für IL-17 in der Peritonealflüssigkeit innerhalb der ersten Stunden nach Injektion von Sp1 darstellen. Dennoch schließen wir einen ins Gewicht fallenden Beitrag von Zellen der angeborenen Immunität wie NKTZellen oder Neutrophilen an der gemessenen Produktion freier IL-17-Spiegel durch ELISA nicht aus (Stockinger, Veldhoen, et al. 2007). Khader et al. konnten zeigen, dass periphere IL-17-produzierende CD4 + Zellen früh auf Antigeninvasion reagieren und ihnen eine Überwachungs- und Frühwarnfunktion zukommt, insofern sie die rapide Mobilisierung weiterer Effektorzellen, z.B. von Neutrophilen, bewirken (Khader et al. 2007). Wir vermuten, dass ein intraperitonealer Pool antigenspezifischer, naiver CD4 + Zellen früh auf die Injektion von ZPS reagiert und über die Sekretion von IL-17 rapide Antworten der angeborenen und erworbenen Immunität induziert. 87 Groneck et al. zeigten, dass auf die intraperitoneale Injektion von Sp1 eine Kolokalisation von T H1Zellen mit CD4+CD44+ TH17-Gedächtniszellen in die Peritonealflüssigkeit erfolgt (Groneck et al. 2009). Wir konnten zeigen, dass auch zu späterem Zeitpunkt als achtzehn Stunden nach Injektion von Sp1 die Konzentration an freiem IL-17 in der Lavageflüssigkeit erhöht bleibt und vermuten eine Rolle von IL-17 in späterer Phase der spezifischen, durch Sp1 induzierten Immunantwort und der Abszessgenese. Genauere Untersuchungen zur Kinetik des Angebots an IL-17 in der Peritonealflüssigkeit nach intraperitonealer Injektion von Sp1 könnten des weiteren Einblicke in die regulatorischen Mechanismen geben, die die breite entzündliche Aktivität von IL-17 kontrollieren, autoaggressive Schädigung vermeiden und zur Eindämmung des Pathogens in Form der Abszessbildung führen. Neuere Untersuchungen sprechen IL-27, einem Mitglied der IL-12-Familie, die Funktion eines negativen Regulators TH17-zellvermittelter Effektorfunktionen zu (Batten et al. 2006) (Stumhofer et al. 2006). IL-27 wird produziert durch Zellen der angeborenen Immunität und inhibiert TH17--Zellen unabhängig von seinem ebenfalls vorhandenen fördernden Einfluss auf TH1-vermittelte Immunreaktionen. Diese Wirkung scheint vermittelt über die Induktion IL-10-produzierender Tr1Zellen durch IL-27 und TGFβ1 (Stumhofer et al. 2007) (Awasthi et al. 2007) (Fitzgerald et al. 2007). Wir vermuten, dass IL-27 auch in der Entstehung von Abszessen durch ZPS eine wichtige Rolle spielen könnte, indem es früh regulierend in die Induktion von TH17-Zellen eingreift und die Entwicklung autoaggressiver Reaktionen unterbindet. Diese Vermutungen stehen nicht im Widerspruch zu Erkenntnissen, dass die suppressiven Wirkungen von IL-27 vor allem auf die de novo Generation von TH17-Zellen beschränkt scheinen und TH17-Gedächtniszellen unbeeinflusst lassen (El-behi et al. 2009). 5.3 Systemische Immunreaktion durch TH17-Zellen nach Injektion von Sp1 Injektion von Sp1 in die Peritonealhöhle führt zu einer lokalen Immunreaktion vermittelt durch TH17-Zellen. Unsere Untersuchungen zur Dichte IL-17-produzierender T-Zellen in der Milz nach intraperitonealer Injektion von Sp1 zeigen jedoch, dass auf den lokalisierten Prozess auch eine systemische Reaktion folgt. Mit einiger Latenz treten in der Milz vermehrt IL-17-produzierende Zellpopulationen auf. 88 Wir stellen die Hypothese auf, dass CD4+ T-Helferzellen eine mögliche Quelle der Produktion von IL-17 in der Milz nach Injektion von ZPS darstellen. Diese Zellpopulation sezerniert IL-17 innerhalb der Milz. Wie unsere quantitativen Messungen der IL-17-Konzentrationen in Lavage und Milz jedoch zeigen, ist die Sekretion freien Zytokins in der Milz geringer als dies in der Peritonealhöhle der Fall ist. Wir vermuten, dass diese Ergebnisse durch die Rolle von IL-17 in der Koordinierung der Immunabwehr an Grenzflächen des Organismus bedingt sind. Die Rolle von IL17 im Zusammenhang der systemischen Immunantwort ist bis heute noch in weiten Teilen ungeklärt (Korn et al. 2009). Interessanterweise konnten wir zeigen, dass die systemische Injektion von ZPS ebenfalls zu einem Auftreten von IL-17 innerhalb der Milz führt. Unsere Untersuchungen könnten demnach auf eine Rolle von IL-17 nicht nur in der unmittelbaren Immunabwehr an der mesothelialen Grenzfläche des Peritoneums, sondern auch auf eine Beteiligung an der systemischen Immunreaktion auf ZPS hinweisen. Inwieweit die systemische und in einzelnen Organen nachweisbare Aktivität von IL-17 durch Zellen der angeborenen Immunität respektive mögliche zelluläre Quellen außerhalb des Immunsystems sui generis beeinflusst wird, müssen weitergehende Untersuchungen zeigen. An dieser Stelle sei unter anderem auf aktuelle Arbeiten zur Rolle von intestinalen Paneth-Zellen an der Ausschüttung von IL-17 in einem Modell hepatischer Ischämie und Reperfusion sowie in einem Modell TNFinduzierten Schocks hingewiesen (S. W. Park et al. 2011) (Takahashi et al. 2008). Wir zeigen, dass dem Auftreten von TH17-Zellen in der Milz nach intraperitonealer Injektion von Sp1 nicht in entsprechendem Maße ein Anstieg der TGFβ1-Konzentration in der Milz vorangeht. Es scheint sich folglich innerhalb der Milz selbst nur bedingt ein Zytokinmilieu zu entwickeln, welches die de novo Generation von TH17-Zellen befördert. Vielmehr vermuten wir, dass es sich bei den auftretenden TH17-Zellen um einwandernde Zellen handelt, deren Differenzierung an der mesothelialen Grenzschicht des Peritoneums stattgefunden hat. Von dort aus könnten diese Zellen ein Kontingent an immunologischen Informationsträgern bilden, die zentrale Kompartimente des Immunsystems wie die Milz und andere entferntere Abwehrstationen mit in den Immunprozess einbeziehen und gegebenenfalls zu T-Effektorzellen mit Gedächtnisfunktion ausreifen. Die Mehrheit mucosaler Effektorzellen verbleibt in mucosalen Geweben (Murphy et al. 2008). Unsere Vermutungen zur Generierung spezifischer TH17-memory-cells sollten durch nachfolgende Versuche hinterfragt werden, die selektiv die Vermehrung IL-17-produzierender CD4 +CD44+ T-Zellen mit 89 Gedächtnisfunktion in der Milz nach Injektion von ZPS untersuchen (Korn et al. 2009). In vitro konnten wir zeigen, dass Sp1 die Entwicklung spezifischer TH17-Zellen aus einer naiven Zellpopulation der Milz induzieren kann. Residente dendritische Zellen kommen weit verbreitet in peripheren lymphatischen Organen vor (Murphy et al. 2008). Wir schließen nicht aus, dass auch in vivo TH17-Zellen mit Spezifität gegen ZPS erst sekundär in der Milz entstehen und dieser Prozess nicht allein auf die mesotheliale Grenzfläche reduziert ist. Unsere Versuche zeigen außerdem, dass auch in Abwesenheit von ZPS stets eine basale Aktivität von TGFβ1 und IL-17 in Peritonealflüssigkeit und Milz vorhanden ist. Untersuchungen an Modellen chronisch-entzündlicher Darmerkrankungen (engl., inflammatory bowel disease, IBD) zeigen, dass auch gesunder Darm eine basale Produktion von IL-17 zeigt (Zheng et al. 2008). Über diese modulierende Immunfunktion von IL-17 unabhängig von spezifisch-inflammatorischen Prozessen herrscht heute noch keine ausreichende Erkenntnis (Korn et al. 2009). 5.4 IL-6 und die Entwicklung von TH17-Zellen TH17-Zellen wurden als eine eigenständige Zelllinie definiert, da sie sich durch zellspezifische Differenzierungs- und Transkriptionsfaktoren auszeichnen. TGFβ1 und IL-6 sind sowohl in Maus wie auch im Menschen die entscheidenden Faktoren zur Ausdifferenzierung naiver CD4 + T-Zellen in Richtung TH17-Zellen (Veldhoen et al. 2006) (Weaver, Harrington, Mangan, Gavrieli, & Murphy, 2006). IL-6 bestimmt hierbei die Entwicklung weg vom CD4 +FOXP3+ Phänotyp regulatorischer TZellen (Treg) hin zum IL-17 produzierenden TH17-Phänotyp. In vivo könnte IL-6 folglich einen molekularen „Schalter“ darstellen, der einen dominanten Zustand der Immunkontrolle durch Treg in Richtung einer breiten Immunantwort durch TH17-Zellen verlagert (Korn et al. 2009). Weiterhin scheinen CD4+CD25+FOXP3+ Treg die Fähigkeit zu besitzen, sich unter dem Einfluss von IL-6 zu TH17-Zellen umzuwandeln (Xu et al. 2007). Untersuchungen an einem Modell experimenteller autoimmuner Enzephalomyelitis (engl., experimental autoimmune encephalitis, EAE) zeigen, dass die Immunantwort in IL-6-/- Mäusen von Treg dominiert wird. Dennoch sind IL-6-/- Mäuse in Abwesenheit von Treg über die Vermittlung von IL-21 zur Amplifikation von TH17-Zellen und TH17-zellvermittelter Pathologie befähigt (Korn et al. 2007). IL-6 ist essentiell für die Entwicklung intraperitonealer Abszesse durch zwitterionische Polysaccharide (Meemboor et al. 2009). In Abwesenheit von IL-6 ist die Abszessentwicklung 90 gestört. Wir konnten erstmals demonstrieren, dass IL-17-defiziente Mäuse ebenfalls eine beeinträchtigte Ausbildung von Abszessen nach Injektion von Sp1 zeigen. Im Vergleich der Abszessbildung von IL-6-/- Mäusen und IL-17-/- Mäusen zeigt sich ein Trend zu geringerer Abszessbildung im IL-17-defizienten Stamm, in welchem der maximal erreichte Abszessdurchmesser 2mm betrug. Sp1 führte in IL-6-/- Mäusen tendenziell zur Ausbildung von größeren Abszessen mit einem Durchmesser bis 3mm (Meemboor et al. 2009). Unsere Untersuchungen legen nahe, dass TH17-Zellen als Vermittler der Abszessentwicklung fungieren und die Induktion von reaktiven TH17-Zellen die Endstrecke der Wirkungen von IL-6 darstellen könnte. Wir konnten zeigen, dass IL-6-defiziente Mäuse nach Injektion von Sp1 ein Auftreten von TH17-Zellen am intraperitonealen Fokus zeigen. Der funktionelle Erhalt von CD4+ Zellen wird unter anderem entscheidend durch die Wirkungen von Zytokinen beeinflusst. IL-6 besitzt eine kritisch diskutierte Rolle als Überlebensfaktor für CD4 + T-Zellen (Teague et al. 1997) (Jones et al. 2010) (Vivien 2001). Neben Signalen des membranständigen Rezeptors IL-6R, die unter dem Einfluss von TGFβ1 die Ausdifferenzierung von TH17-Zellen aus einem naiven CD4+ Zellpool bewirken, fördert IL-6 über seinen löslichen Rezeptor sIL-6R (engl., trans signaling) den lokalen Erhalt von differenzierten TH17-Zellen (Jones et al. 2010). Unterbrechung des trans signaling Pfads über Blockade des IL-6-sIL-6R-Komplexes induziert die Apoptose mucosaler CD4+ Effektor-T-Zellen bei Morbus Crohn (Atreya et al. 2000). Die verminderte Ausbildung von Abszessen durch Sp1 in IL-6-defizienten Mäusen könnte durch ein reduziertes Angebot an wichtigen, IL-6-vermittelten Überlebenssignalen für die spezifische TH17Zellpopulation bedingt sein. IL-23 erhält und amplifiziert die Aktivität von TH17-Zellen, auch wenn IL-23 durch fehlende Expression von IL-23R auf naiven CD4+ Zellen nicht involviert ist in deren initiale Ausdifferenzierung (Korn, Bettelli, Oukka, & Kuchroo, 2009). Jüngere Untersuchungen haben gezeigt, dass die Expression des IL-23-Rezeptors IL-23R abhängig ist von der Signalgebung durch STAT3 und RORγt (Zhou et al. 2007) (Nurieva et al. 2007). IL-6 ist zusammen mit IL-21 und TGFβ1 notwendig für die Aktivierung von STAT3 und RORγt in TH17-Zellen. In unseren Versuchen könnten die verringerten Zahlen von TH17-Zellen in IL-6-/- Mäusen so letztlich Folge einer reduzierten Ansprechbarkeit dieser TH17-Zellen auf IL-23 sein. Dennoch zeigen unsere Versuche, dass auch IL-6-/- Mäuse zur Generierung einer TH17-Zellantwort 91 befähigt bleiben. 5,5% aller CD4+ Zellen in der Peritonealflüssigkeit naiver Wildtyp-Mäuse zeigen Expression von IL-17. Nach Injektion von Sp1 erhöht sich dieser Anteil gering auf 6%. Diese Erkenntnisse könnten auf einen möglichen Beitrag anderer Zytokine auf die Entwicklung von TH17Zellen in Abwesenheit von IL-6 hinweisen. IL-21 bewirkt zusammen mit TGFβ1 eigenständig den Erhalt und die Vermehrung von TH17-Zellen, wenn kein ausreichendes IL-6-Angebot gewährleistet ist (Korn et al. 2007) (Yang, Anderson, et al. 2008) (Zhou et al. 2007). Unter diesen Bedingungen kann IL-21 zum Mediator TH17-zellvermittelter Entzündungspathologie werden. In unterschiedlichen Modellen chronisch-entzündlicher Darmerkrankungen (engl., inflammatory bowel disease, IBD) und anderer Autoimmunprozesse zeichnet sich IL-21 verantwortlich für den Entzündungsprozess (Fina et al. 2008) (Liu, Yang, et al. 2009). IL-21 wird in großer Fraktion von TH17-Zellen selbst gebildet und bewirkt unter anderem auch über vermehrte Expression des IL-23- Rezeptors IL-23R deren Erhalt und Expansion in einem autokrinen Zirkel (Korn et al. 2007) (Zhou et al. 2007). Unter ausreichendem Angebot von IL-6 scheint IL-21 nicht notwendig für den Entzündungsprozess. Wir vermuten eine eventuell bedeutsame Rolle von IL-21 in der Immunantwort auf ZPS in Abwesenheit von IL-6, was durch zukünftige Untersuchungen, beispielsweise an kombiniert IL-6/IL-21-defizienten Mäusen, erforscht werden sollte. Über die Plastizität teilweise- und vollständig-differenzierter TH17-Zellen und Treg ist noch vieles unbekannt (Korn, Bettelli, Oukka, & Kuchroo, 2009). Da Treg unter der Wirkung von IL-6 nicht nur zur Generierung von TH17-Zellen aus einem Pool naiver CD4+ T-Zellen befähigt scheinen, sondern augenscheinlich auch die Fähigkeit zum Klassenwechsel hin zu TH17-Zellen selbst besitzen (Xu et al. 2007), vermuten wir, dass Treg eine wichtige Rolle in der Etablierung einer TH17-ZellAnwort nach Injektion von ZPS zufallen könnte. Treg supprimieren bevorzugt TH1- und TH2-vermittelte Immunreaktionen (Chen et al. 2008). TH17Antworten könnten sie nicht nur fördern durch Bereitstellung von TGFβ1, sondern auch durch Verbrauch von IL-2, welches hemmende Wirkung auf den TH17-Differenzierungspfad besitzt (Chen et al. 2008). Zukünftige Studien sollten die Funktion von Treg im Abszessmodell durch ZPS genauer adressieren. 5.5 TGFβ1, APC und TH17-Zellen Drei unabhängige Arbeiten definierten im Jahr 2006 die zentrale Rolle von TGFβ1 als Differenzierungsfaktor für TH17-Zellen (Veldhoen et al. 2006) (Mangan et al. 2006) (Bettelli et al. 92 2006). Obwohl früh die Beteiligung von TGFβ1 an der Entwicklung humaner TH17-Zellen in Frage gestellt wurde (McGeachy et al. 2008), haben jüngere Arbeiten gezeigt, dass TGFβ1 sowohl in Maus wie auch in Mensch unabdingbar für die Entwicklung von TH17-Zellen ist (Torchinsky et al. 2010). Wir konnten zeigen, dass die intraperitoneale Injektion von Sp1 zur Erhöhung des Angebots an TGFβ1 in der Lavageflüssigkeit führt. Da Sp1 überdies auch zu erhöhten Spiegeln an IL-6 im selben zeitlichen Zusammenhang führt (Meemboor et al. 2009), scheinen die Bedingungen zur Ausdifferenzierung von TH17-Zellen gegeben zu sein. Wir zeigen außerdem, dass der Anteil IL-17produzierender CD4+ T-Zellen nach Injektion von Sp1 intraperitoneal in der Tat erhöht ist und das CD11c+ dendritische Zellen, die nach Exposition gegenüber Sp1 zur Produktion von TGFβ1 angeregt werden, als mögliche Lieferanten der notwendigen Differenzierungsfaktoren in Frage kommen. Wir vermuten deshalb, dass dendritische Zellen Sp1 nach intraperitonealer Injektion aufnehmen und als APC durch die Produktion von IL-6 und TGFβ1 die Ausdifferenzierung lokaler, naiver CD4+ Zellen zu TH17-Zellen befördern. Ferner vermuten wir, dass über die Vermittlung von APC, die selektiv Sp1 in der Peritonealflüssigkeit aufgenommen haben, naive CD4+ T-Zellen in der Milz zur Ausdifferenzierung in TH17-Richtung bewegt werden. Untersuchungen zur Dauer der Induktion von Effektor-T-Zellen durch APC beschreiben einen Zeitraum von circa sieben Tagen (Murphy et al. 2008). Die Quellen von TGFβ1 zur Generierung von TH17-Zellen in vivo sind zum heutigen Tag jedoch nicht eindeutig definiert (Korn, Bettelli, Oukka, & Kuchroo, 2009). Es finden sich Hinweise darauf, dass T-Zellen in Form von Effektorzellen und Treg selbst wichtige Produzenten von TGFβ1 sind. Li et al. konnten zeigen, dass die selektive Ausschaltung der Produktion von TGFβ1 in T-Zellen zu gestörter Ausreifung von TH17-Zellen und verminderter Entzündung in einem Modell experimenteller autoimmuner Enzephalomyelitis (EAE) führt (Li et al. 2007). Transfer naiver TZellen zusammen mit Treg induziert in Empfängermäusen die Produktion von IL-17, allerdings nicht von IFNγ, in den transferierten T-Zellen (Lohr et al. 2006). TGFβ1 wird in latenter Form produziert und bedarf der Aktivierung über eine funktionelle Trennung des angebundenen Proteins latency-associated peptide (LAP). LAP unterbindet die biologische Aktivität von TGFβ1, indem es die Bindung des TGFβ1-Homodimers an seinen Rezeptor inhibiert. Die Aktivierung von TGFβ1 geschieht entweder über Änderungen der Konformation von LAP oder 93 über dessen proteolytische Degradation (Massagué 1990) (Korn, Bettelli, Oukka, & Kuchroo, 2009). Die Bindung von LAP an ανβ8-Integrin auf dendritischen Zellen resultiert in einer Prozessierung von LAP und dessen Aktivierung in vivo. In der Zusammenschau dieser Erkenntnisse muss gesagt werden, dass dendritische Zellen unseren Ergebnissen zufolge zwar direkte Lieferanten von TGFβ1 zur Differenzierung von TH17-Zellen nach Injektion von Sp1 sein könnten, aber auch indirekt über die Aktivierung von latentem TGFβ1 zur Entwicklung einer TH17-Antwort beitragen könnten. Wir vermuten überdies einen wichtigen Beitrag von T-Zellen und Treg im Besonderen zur Bereitstellung der notwendigen Mengen an TGFβ1 zur Erzeugung einer nachhaltigen Ausdifferenzierung von TH17-Zellen durch ZPS in vivo. Wohingegen die notwendigen Faktoren zur Differenzierung von TH17-Zellen eindeutig definiert scheinen, sind die genauen Bedingungen und benötigten Antigen-präsentierenden Zellen zur Ausdifferenzierung in vivo noch weitgehend unverstanden. Mehrere Adjuvantia und TLRAktivatoren wie LPS und CpG fördern die Produktion von IL-6 und IL-23 durch dendritische Zellen, allerdings bewirken sie auch eine starke Ausschüttung von IL-12, was die Ausbildung von TH1-Antworten begünstigt und die Ausbildung von TH17-Antworten unterbindet (LeibundGut- Landmann et al. 2007). Zymosan aus der Zellwand von Saccharomyces cerevisiae,das Kation DDA sowie Mykobakterien wie Mycobacterium tuberculosis, das die zentrale Komponente des Adjuvans CFA darstellt, fördern hingegen bevorzugt die Generierung von TH17-Zellen durch dendritische Zellen via IL-6, TGFβ1 und IL-23 (Khader et al. 2007). Bisher finden sich keine Erkenntnisse darüber, ob DC unter dem Einfluss von Sp1 zur Produktion von IL-12 angeregt werden, was eine Polarisierung naiver T-Zellen in Richtung TH1 befördern würde. Künftige Studien sollten diesen Aspekt unter Berücksichtung der besonderen Struktur von IL-12 adressieren. IL-12 besitzt zusammen mit IL-23 die gemeinsame Untereinheit p40. Es sollten Antikörper zum Einsatz kommen, die spezifisch sind für die dem IL-12 eigene Untereinheit p35 (Korn et al. 2007b) Im Falle des von uns untersuchten Abszessmodells zeichnet sich das Adjuvans SCCA alleine nicht für die Ausschüttung größerer Mengen an IL-6 verantwortlich (Meemboor et al. 2009). IL-6 wird erst dann vermehrt durch APC exprimiert, wenn SCCA in Kombination mit dem ZPS Sp1 verabreicht wird. 94 CD103+ dendritische Zellen im Intestinum und drainierenden Lymphknoten sind spezialisiert auf die Generierung von Treg. Über die Produktion von Retinolsäure supprimieren sie die TH17Entwicklung und fördern die Expression von FOXP3. Über α4β7 Integrin und CCR9 werden Treg zur Anreicherung an den mucosalen Grenzflächen des Intestinums bewegt (Chen et al. 2008). Diese DC werden jedoch zu starken Induktoren von TH17-Zellen, wenn die inhibitorische Wirkung von Retinolsäure auf deren Differenzierungspfad entfällt (Kolls et al. 2004). Wir vermuten auch für das Abzessmodell durch ZPS eine Rolle von Retinolsäure als differentiellem Mediator, was durch weitere Studien adressiert werden sollte. Curdlan, ein β-Glucan, via Dectin-1 sowie Muramyldipeptid in Bindung an NOD2 fördern über die Aktivierung von CARD9 die Entwicklung von TH17-Zellen durch dendritische Zellen (McGeachy et al. 2008). Curdlan als selektiver Agonist des PRR Dectin-1 bewirkt in Co-Kultur von CD4+, BMDC und Ovalbumin die Entwicklung von TH17-Zellen unabhängig von Aktivierung von TLR (LeibundGut-Landmann et al. 2007). Die nachgeschaltete Signalkette führt über Syk und CARD9 und resultiert in Aktivierung von NFκB. Durch zukünftige Untersuchungen sollte geklärt werden, ob neben TLR auch Dectin-1 als möglicher PRR für Sp1 fungiert. Hierzu könnten unter anderem in vivo Experimente an MyD88- bzw. TRIF-defizienten Mäusen herangezogen werden. MyD88 und TRIF sind als Signalmolekülen der Aktivierung von TLR nachgeschaltet (LeibundGut-Landmann et al. 2007). 5.6 Makrophagen Makrophagen stellen die größte Population Antigen-präsentierender Zellen in der Wand ZPSinduzierter Abszesse dar, wohingegen dendritische Zellen nur einen geringen Teil ausmachen (Meemboor et al. 2009). IL-17 ist kritisch involviert in die Entwicklung allergischen Asthmas (Song et al. 2008). Die Konzentration von IL-17 in der bronchoalveolären Lavageflüssigkeit von asthmatischen Patienten ist signifikant erhöht. Jedoch ist die Produktion von IL-17 in Asthmatikern das Resultat aktivierter Makrophagen und unterliegt der Kontrolle durch Mastzellmediatoren und nicht TNFα oder IL-23 (Song et al. 2008). IL-10 fungiert als negativer Regulator des Makrophagen-induzierten Entzündungsprozesses und die Exposition gegenüber Allergenen führt zu erhöhten Spiegeln von IL17 durch reduziertes Angebot an IL-10 (Song et al. 2008). Unter Aktivierung des TLR4-Liganden LPS zeigen Makrophagen von IL-10-/- Mäusen exzessive Produktion von IL-17 (Gu et al. 2008). 95 Auch DC von IL-10-/- Mäusen induzieren eine stärkere Differenzierung von TH17-Zellen in CoKultur mit naiven CD4+ Zellen als DC aus Wildtyp-Mäusen. Für ZPS konnte gezeigt werden, dass intraperitoneale Makrophagen nach Injektion von Sp1 hoch quantitativ IL-6 produzieren (Meemboor et al. 2009). Ob Makrophagen nach Konfrontation mit Sp1 zu Produzenten von IL-17 und damit ähnlich der Erkenntnisse zu allergischem Asthma zu Vermittlern des ZPS-induzierten Entzündungsprozesses werden, ist bisher unklar. Makrophagen galt bisher vielmehr die Aufmerksamkeit in ihrer Rolle als APC denn als Entzündungseffektoren. Zukünftige Untersuchungen sollten die Rolle von Makrophagen in der ZPS-vermittelten Immunantwort sowie den Einfluss von IL-10 genauer adressieren. 6. Zusammenfassung Interleukin-17 und TH17-Zellen wurde in den letzten Jahren zunehmende Aufmerksamkeit im Hinblick auf die Entstehung chronischer und autoimmuner Entzündungen geschenkt. Neben seiner pathologischen Rolle erscheint IL-17 jedoch zentral in der Verbindung angeborener und erworbener Immunreaktionen gegenüber einem breiten Spektrum von Pathogenen sowie in der Entwicklung von Immunität nach Impfungen. Zwitterionische Polysaccharide sind eine neue Gruppe MHC-IIabhängiger Antigene, die zur Induktion von Abszessen in einem Modell abdomineller Sepsis befähigt sind. Wir zeigen mit unserer Arbeit, dass Interleukin-17 eine zentrale, vermittelnde Rolle im Rahmen der ZPS-induzierten Abszessbildung zukommen könnte. In unseren Versuchen zeigen sich auf unterschiedlichen Ebenen Trends dahingehend, dass TH17-Zellen nicht nur an der unmittelbaren, lokalen Immunabwehr an der mesothelialen Grenzfläche beteiligt sein könnten, sondern mit zentralen Immunkompartimenten wie der Milz kommunizieren und eine potentielle ZPS-spezifische TH17-Gedächtnisfunktion entwickeln. Wegbereitende Zytokine für die ZPSinduzierte TH17-Antwort sind IL-6 und vermutlich TGFβ1. Ausgehend von unseren Ergebnissen geben wir Ansätze, die durch zukünftige Studien vertieft und durch zusätzliche Methodik wie beispielsweise rt-PCR oder RNAi-Experimente ergänzt werden sollten. Aus einem tieferen Verständnis des Beitrags von IL-17 und TH17-Zellen zur Immunantwort auf ZPS können neue therapeutische Ansätze gegenüber schwerwiegenden entzündlichen Erkrankungen sowie neue Impulse zur Entwicklung Polysaccharid-basierter Impfstoffe resultieren. 96 7. Literaturverzeichnis 1. A B Roberts, M. A. A. (1981). New class of transforming growth factors potentiated by epidermal growth factor: isolation from non-neoplastic tissues. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 78, 5339. 2. Acosta-Rodriguez, E. V., Rivino, L., Geginat, J., Jarrossay, D., Gattorno, M., Lanzavecchia, A., Sallusto, F., and Napolitani, G. (2007). Surface phenotype and antigenic specificity of human interleukin 17-producing T helper memory cells. Nature immunology 8, 639-46. 3. Alam, R. (1998). A brief review of the immune system. Primary care 25, 727-38. 4. Atreya, R. et al. (2000). Blockade of interleukin 6 trans signaling suppresses T-cell resistance against apoptosis in chronic intestinal inflammation: evidence in crohn disease and experimental colitis in vivo. Nature medicine 6, 583-8. 5. Aujla, S. J. et al. (2008). IL-22 mediates mucosal host defense against Gram-negative bacterial pneumonia. Nature medicine 14, 275-81. 6. Avci, F. Y., and Kasper, Dennis L (2010). How bacterial carbohydrates influence the adaptive immune system. Annual review of immunology 28, 107-30. 7. Avrameas, S., and Guilbert, B. (1971). A method for quantitative determination of cellular immunoglobulins by enzyme-labeled antibodies. European journal of immunology 1, 394-6. 8. Awasthi, A., Carrier, Y., Peron, J. P. S., Bettelli, E., Kamanaka, M., Flavell, R. A., Kuchroo, V. K., Oukka, M., and Weiner, H. L. (2007). A dominant function for interleukin 27 in generating interleukin 10-producing anti-inflammatory T cells. Nature immunology 8, 1380-9 9. Barrett, D. J. (1985). Human immune responses to polysaccharide antigens: an analysis of bacterial polysaccharide vaccines in infants. Advances in pediatrics 32, 139-58. 10. Batten, M., Li, J., Yi, S., Kljavin, N. M., Danilenko, D. M., Lucas, S., Lee, J., Sauvage, F. J. de, and Ghilardi, N. (2006). Interleukin 27 limits autoimmune encephalomyelitis by suppressing the development of interleukin 17-producing T cells. Nature immunology 7, 929-36. 11. Bennett, C. L. et al. (2001). The immune dysregulation, polyendocrinopathy, enteropathy, Xlinked syndrome (IPEX) is caused by mutations of FOXP3. Nature genetics 27, 20-1. 12. Bettelli, E., Carrier, Y., Gao, W., Korn, T., Strom, T. B., Oukka, M., Weiner, H. L., and Kuchroo, V. K. (2006). Reciprocal developmental pathways for the generation of pathogenic effector TH17 and regulatory T cells. Nature 441, 235-8. 13. Bettelli, E., Korn, T., Oukka, M., and Kuchroo, V. K. (2008). Induction and effector functions of T(H)17 cells. Nature 453, 1051-7. 14. Bettelli, E., Oukka, M., and Kuchroo, V. K. (2007). T(H)-17 cells in the circle of immunity and autoimmunity. Nature immunology 8, 345-50. 15. Billiau, A., Heremans, H., Vandekerckhove, F., Dijkmans, R., Sobis, H., Meulepas, E., and Carton, H. (1988). Enhancement of experimental allergic encephalomyelitis in mice by antibodies against IFN-gamma. J. Immunol. 140, 1506-1510. 16. Border, W. A., and Ruoslahti, E. (1992). Transforming growth factor-beta in disease: the dark side of tissue repair. The Journal of clinical investigation 90, 1-7. 17. Bromley, S. K., Iaboni, A., Davis, S. J., Whitty, A., Green, J. M., Shaw, A. S., Weiss, A., and Dustin, M. L. (2001). The immunological synapse and CD28-CD80 interactions. Nature 97 immunology 2, 1159-66. 18. Brüstle, A. et al. (2007). The development of inflammatory T(H)-17 cells requires interferonregulatory factor 4. Nature immunology 8, 958-66. 19. Burchill, M. A., Yang, Jianying, Vogtenhuber, C., Blazar, B. R., and Farrar, M. A. (2007). IL-2 Receptor beta-Dependent STAT5 Activation Is Required for the Development of Foxp3+ Regulatory T Cells. J. Immunol. 178, 280-290. 20. Busch, R., Doebele, R. C., Patil, N. S., Pashine, A., and Mellins, E. D. (2000). Accessory molecules for MHC class II peptide loading. Current opinion in immunology 12, 99-106. 21. Chaplin, D. D. (2010). Overview of the immune response. The Journal of allergy and clinical immunology 125, S3-23. 22. Chen, Z., Laurence, A., Kanno, Y., Pacher-Zavisin, M., Zhu, B.-M., Tato, C., Yoshimura, A., Hennighausen, L., and OʼShea, J. J. (2006). Selective regulatory function of Socs3 in the formation of IL-17-secreting T cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 103, 8137-42. 23. Chen, Z., and OʼShea, J. J. (2008). Th17 cells: a new fate for differentiating helper T cells. Immunologic research 41, 87-102. 24. Choi, Y.-H., Roehrl, Michael H., Kasper, Dennis L., and Wang, Julia Y. (2002). A Unique Structural Pattern Shared by T-Cell-Activating and Abscess-Regulating Zwitterionic Polysaccharides †. Biochemistry 41, 15144-15151. 25. Chung, Doo Ryeon, Kasper, Dennis L, Panzo, R. J., Chitnis, T., Grusby, M. J., Sayegh, Mohamed H, Tzianabos, Arthur O, and Chtinis, T. (2003). CD4+ T cells mediate abscess formation in intra-abdominal sepsis by an IL-17-dependent mechanism. Journal of immunology (Baltimore, Md. : 1950) 170, 1958-63. 26. Cobb, B. A., and Kasper, Dennis L (2008). Characteristics of carbohydrate antigen binding to the presentation protein HLA-DR. Glycobiology 18, 707-18. 27. Cobb, B. A., and Kasper, Dennis L (2005). Zwitterionic capsular polysaccharides: the new MHCII-dependent antigens. Cellular microbiology 7, 1398-403. 28. Cobb, B. A., Wang, Q., Tzianabos, Arthur O, and Kasper, Dennis L (2004). Polysaccharide Processing and Presentation by the MHCII Pathway. Cell 117, 677-687. 29. Coquerelle, C., and Moser, M. (2010). DC subsets in positive and negative regulation of immunity. Immunological reviews 234, 317-34. 30. Denisov, V. N. (1977). [Use of fixation of cells with paraformaldehyde for immunofluorescence]. Laboratornoe delo, 164-6. 31. Diacovich, L., and Gorvel, J.-P. (2010). Bacterial manipulation of innate immunity to promote infection. Nature reviews. Microbiology 8, 117-28. 32. Dienz, O., and Rincon, Mercedes (2009). The effects of IL-6 on CD4 T cell responses. Clinical immunology (Orlando, Fla.) 130, 27-33. 33. Duan, J., Avci, F. Y., and Kasper, Dennis L (2008). Microbial carbohydrate depolymerization by antigen-presenting cells: deamination prior to presentation by the MHCII pathway. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 105, 51838. 34. Dumont, N., and Arteaga, C. L. (2003). Targeting the TGFβ signaling network in human neoplasia. Cancer Cell 3, 531-536. 98 35. El-behi, M., Ciric, B., Yu, S., Zhang, G.-X., Fitzgerald, D. C., and Rostami, A. (2009). Differential effect of IL-27 on developing versus committed Th17 cells. Journal of immunology (Baltimore, Md. : 1950) 183, 4957-67. 36. Elson, C. O., Cong, Y., Weaver, C. T., Schoeb, T. R., McClanahan, T. K., Fick, R. B., and Kastelein, R. A. (2007). Monoclonal anti-interleukin 23 reverses active colitis in a T cellmediated model in mice. Gastroenterology 132, 2359-70. 37. Engvall, E., and Perlmann, P. (1971). Enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA). Quantitative assay of immunoglobulin G. Immunochemistry 8, 871-4. 38. Feng, X.-H., and Derynck, R. (2005). Specificity and versatility in tgf-beta signaling through Smads. Annual review of cell and developmental biology 21, 659-93. 39. Ferretti, S., Bonneau, O., Dubois, G. R., Jones, C. E., and Trifilieff, A. (2003). IL-17, Produced by Lymphocytes and Neutrophils, Is Necessary for Lipopolysaccharide-Induced Airway Neutrophilia: IL-15 as a Possible Trigger. J. Immunol. 170, 2106-2112. 40. Fina, D. et al. (2008). Regulation of gut inflammation and th17 cell response by interleukin-21. Gastroenterology 134, 1038-48. 41. Fitzgerald, D. C. et al. (2007). Suppression of autoimmune inflammation of the central nervous system by interleukin 10 secreted by interleukin 27-stimulated T cells. Nature immunology 8, 1372-9. 42. Fontenot, J. D., Rasmussen, J. P., Gavin, M. A., and Rudensky, A. Y. (2005). A function for interleukin 2 in Foxp3-expressing regulatory T cells. Nature immunology 6, 1142-51. 43. Fujii, H. (1997). [Osmotic fragility test]. Nippon rinsho. Japanese journal of clinical medicine 55 Suppl 1, 153-5. 44. Gallorini, S., Berti, F., Parente, P., Baronio, R., Aprea, S., DʼOro, U., Pizza, M., Telford, J. L., and Wack, A. (2007). Introduction of Zwitterionic Motifs into Bacterial Polysaccharides Generates TLR2 Agonists Able to Activate APCs. J. Immunol. 179, 8208-8215. 45. Gibson, F. C., Onderdonk, Andrew B., Kasper, Dennis L., and Tzianabos, Arthur O. (1998). Cellular Mechanism of Intraabdominal Abscess Formation by Bacteroides fragilis. J. Immunol. 160, 5000-5006. 46. Groneck, Laura et al. (2009). Oligoclonal CD4+ T cells promote host memory immune responses to Zwitterionic polysaccharide of Streptococcus pneumoniae. Infection and immunity 77, 3705-12. 47. Gu, Y. et al. (2008). Interleukin 10 suppresses Th17 cytokines secreted by macrophages and T cells. European journal of immunology 38, 1807-13. 48. Harrington, L. E., Hatton, R. D., Mangan, P. R., Turner, H., Murphy, T. L., Murphy, K. M., and Weaver, C. T. (2005). Interleukin 17-producing CD4+ effector T cells develop via a lineage distinct from the T helper type 1 and 2 lineages. Nature immunology 6, 1123-32. 49. Harris, T. J. et al. (2007). Cutting Edge: An In Vivo Requirement for STAT3 Signaling in TH17 Development and TH17-Dependent Autoimmunity. J. Immunol. 179, 4313-4317. 50. Heinrich, P. C., Behrmann, I., Haan, S., Hermanns, H. M., Müller-Newen, G., and Schaper, F. (2003). Principles of interleukin (IL)-6-type cytokine signalling and its regulation. The Biochemical journal 374, 1-20. 51. Herzenberg, Leonard A., Parks, D., Sahaf, B., Perez, O., Roederer, M., and Herzenberg, Leonore A. (2002). The History and Future of the Fluorescence Activated Cell Sorter and Flow 99 Cytometry: A View from Stanford. Clin. Chem. 48, 1819-1827. 52. Hibbert, L., Pflanz, S., De Waal Malefyt, R., and Kastelein, R. A. (2003). IL-27 and IFN-alpha signal via Stat1 and Stat3 and induce T-Bet and IL-12Rbeta2 in naive T cells. Journal of interferon & cytokine research : the official journal of the International Society for Interferon and Cytokine Research 23, 513-22. 53. Higgins, S. C., Jarnicki, A. G., Lavelle, E. C., and Mills, K. H. G. (2006). TLR4 Mediates Vaccine-Induced Protective Cellular Immunity to Bordetella pertussis: Role of IL-17Producing T Cells. J. Immunol. 177, 7980-7989. 54. Hirano, T. et al. (1986). Complementary DNA for a novel human interleukin (BSF-2) that induces B lymphocytes to produce immunoglobulin. Nature 324, 73-6. 55. Hofstetter, H. H., Ibrahim, S. M., Koczan, D., Kruse, N., Weishaupt, A., Toyka, K. V., and Gold, R. (2005). Therapeutic efficacy of IL-17 neutralization in murine experimental autoimmune encephalomyelitis. Cellular immunology 237, 123-30. 56. Huang, W., Na, L., Fidel, P. L., and Schwarzenberger, P. (2004). Requirement of interleukin17A for systemic anti-Candida albicans host defense in mice. The Journal of infectious diseases 190, 624-31. 57. Inaba, K., Inaba, M., Romani, N., Aya, H., Deguchi, M., Ikehara, S., Muramatsu, S., and Steinman, R. M. (1992). Generation of large numbers of dendritic cells from mouse bone marrow cultures supplemented with granulocyte/macrophage colony-stimulating factor. The Journal of experimental medicine 176, 1693-702. 58. Ivanov, I. I., McKenzie, B. S., Zhou, L., Tadokoro, C. E., Lepelley, A., Lafaille, J. J., Cua, D. J., and Littman, D. R. (2006). The orphan nuclear receptor RORgammat directs the differentiation program of proinflammatory IL-17+ T helper cells. Cell 126, 1121-33. 59. Ivanov, I. I., Zhou, L., and Littman, D. R. (2007). Transcriptional regulation of Th17 cell differentiation. Seminars in immunology 19, 409-17. 60. Jones, G. W. et al. (2010). Loss of CD4+ T cell IL-6R expression during inflammation underlines a role for IL-6 trans signaling in the local maintenance of Th17 cells. Journal of immunology (Baltimore, Md. : 1950) 184, 2130-9. 61. Jong, E. de, Suddason, T., and Lord, G. M. (2010). Translational mini-review series on Th17 cells: development of mouse and human T helper 17 cells. Clinical and experimental immunology 159, 148-58. 62. Kamimura, D., Ishihara, K., and Hirano, T. (2003). IL-6 signal transduction and its physiological roles: the signal orchestration model. Reviews of physiology, biochemistry and pharmacology 149, 1-38. 63. Kebir, H. et al. (2007). Human TH17 lymphocytes promote blood-brain barrier disruption and central nervous system inflammation. Nature medicine 13, 1173-5. 64. Kelly, A. P., Monaco, J. J., Cho, S. G., and Trowsdale, J. (1991). A new human HLA class IIrelated locus, DM. Nature 353, 571-3. 65. Kelly, R. J., and Morris, J. C. (2010). Transforming growth factor-beta: A target for cancer therapy. Journal of Immunotoxicology 7, 15-26. 66. Khader, S. A. et al. (2007). IL-23 and IL-17 in the establishment of protective pulmonary CD4+ T cell responses after vaccination and during Mycobacterium tuberculosis challenge. Nature immunology 8, 369-77. 100 67. Kindt, T. J., Goldsby, R. A., Osborne, B. A., and Kuby, J. (2007). Kuby immunology (W.H. Freeman) 68. King, C., Tangye, S. G., and Mackay, C. R. (2008). T follicular helper (TFH) cells in normal and dysregulated immune responses. Annual review of immunology 26, 741-66. 69. Kolls, J. K., and Lindén, A. (2004). Interleukin-17 family members and inflammation. Immunity 21, 467-76. 70. Komiyama, Y., Nakae, S., Matsuki, T., Nambu, A., Ishigame, H., Kakuta, S., Sudo, K., and Iwakura, Y. (2006). IL-17 Plays an Important Role in the Development of Experimental Autoimmune Encephalomyelitis. J. Immunol. 177, 566-573. 71. Korn, T., Bettelli, E., Gao, W., Awasthi, A., Jäger, A., Strom, T. B., Oukka, M., and Kuchroo, V. K. (2007a). IL-21 initiates an alternative pathway to induce proinflammatory T(H)17 cells. Nature 448, 484-7. 72. Korn, T., Bettelli, E., Oukka, M., and Kuchroo, V. K. (2009). IL-17 and Th17 Cells. Annual review of immunology 27, 485-517. 73. Korn, T., Oukka, M., Kuchroo, V., and Bettelli, E. (2007b). Th17 cells: effector T cells with inflammatory properties. Seminars in immunology 19, 362-71. 74. Kreisman, L. S. C., Friedman, J. H., Neaga, A., and Cobb, B. A. (2007). Structure and function relations with a T-cell-activating polysaccharide antigen using circular dichroism. Glycobiology 17, 46-55. 75. Kropshofer, H, Hämmerling, G. J., and Vogt, A. B. (1999). The impact of the non-classical MHC proteins HLA-DM and HLA-DO on loading of MHC class II molecules. Immunological reviews 172, 267-78. 76. LeibundGut-Landmann, S. et al. (2007). Syk- and CARD9-dependent coupling of innate immunity to the induction of T helper cells that produce interleukin 17. Nature immunology 8, 630-8. 77. Lesinski, G. B., and Julie Westerink, M. A. (2001). Vaccines Against Polysaccharide Antigens. Current Drug Targets - Infectious Disorders 1, 325-334. 78. Li, M. O., Wan, Y. Y., and Flavell, R. A. (2007). T cell-produced transforming growth factorbeta1 controls T cell tolerance and regulates Th1- and Th17-cell differentiation. Immunity 26, 579-91. 79. Liu, K., and Nussenzweig, M. C. (2010). Origin and development of dendritic cells. Immunological reviews 234, 45-54. 80. Liu, S.-J. et al. (2007). Induction of a distinct CD8 Tnc17 subset by transforming growth factor-beta and interleukin-6. Journal of leukocyte biology 82, 354-60. 81. Liu, Z.-J., Yadav, P.-K., Su, J.-L., Wang, J.-S., and Fei, K. (2009). Potential role of Th17 cells in the pathogenesis of inflammatory bowel disease. World journal of gastroenterology : WJG 15, 5784-8. 82. Liu, Zhanju, Yang, L., Cui, Y., Wang, X., Guo, C., Huang, Z., Kan, Q., Liu, Zhangsuo, and Liu, Y. (2009). Il-21 enhances NK cell activation and cytolytic activity and induces Th17 cell differentiation in inflammatory bowel disease. Inflammatory bowel diseases 15, 1133-44. 83. Lock, C. et al. (2002). Gene-microarray analysis of multiple sclerosis lesions yields new targets validated in autoimmune encephalomyelitis. Nature medicine 8, 500-8. 84. Lockhart, E., Green, A. M., and Flynn, J. L. (2006). IL-17 Production Is Dominated by 101 {gamma}{delta} T Cells rather than CD4 T Cells during Mycobacterium tuberculosis Infection. J. Immunol. 177, 4662-4669. 85. Lohr, J., Knoechel, B., Wang, J. J., Villarino, A. V., and Abbas, A. K. (2006). Role of IL-17 and regulatory T lymphocytes in a systemic autoimmune disease. The Journal of experimental medicine 203, 2785-91. 86. Lowes, M. A., Kikuchi, T., Fuentes-Duculan, J., Cardinale, I., Zaba, L. C., Haider, A. S., Bowman, E. P., and Krueger, J. G. (2008). Psoriasis vulgaris lesions contain discrete populations of Th1 and Th17 T cells. The Journal of investigative dermatology 128, 1207-11. 87. Macleod, C. M., Hodges, R. G., Heidelberger, M., and Bernhard, W. G. (1945). Prevention of pneumococcal pneumonia by immunization with specific capsular polysaccharides. The Journal of experimental medicine 82, 445-65. 88. Maldonado, R. A., Irvine, D. J., Schreiber, R., and Glimcher, Laurie H (2004). A role for the immunological synapse in lineage commitment of CD4 lymphocytes. Nature 431, 527-32. 89. Malhotra, N., and Kang, J. (2010). SMAD2 is essential for TGF beta mediated Th17 cell generation. The Journal of biological chemistry. 90. Mangan, P. R. et al. (2006). Transforming growth factor-beta induces development of the T(H)17 lineage. Nature 441, 231-4. 91. Martinez, G. J. et al. (2010). SMAD2 positively regulates the generation of Th17 cells. The Journal of biological chemistry. 92. Massagué, J. (1990). The transforming growth factor-beta family. Annual review of cell biology 6, 597-641. 93. Mazmanian, S. K., Liu, C. H., Tzianabos, Arthur O, and Kasper, Dennis L (2005). An immunomodulatory molecule of symbiotic bacteria directs maturation of the host immune system. Cell 122, 107-18. 94. Mazmanian, S. K., Round, J. L., and Kasper, Dennis L (2008). A microbial symbiosis factor prevents intestinal inflammatory disease. Nature 453, 620-5. 95. McFarland, B. J., and Beeson, C. (2002). Binding interactions between peptides and proteins of the class II major histocompatibility complex. Medicinal research reviews 22, 168-203. 96. McGeachy, M. J., Bak-Jensen, K. S., Chen, Y., Tato, C. M., Blumenschein, W., McClanahan, T., and Cua, D. J. (2007). TGF-beta and IL-6 drive the production of IL-17 and IL-10 by T cells and restrain T(H)-17 cell-mediated pathology. Nature immunology 8, 1390-7. 97. McGeachy, M. J., and Cua, D. J. (2008). Th17 cell differentiation: the long and winding road. Immunity 28, 445-53. 98. Meemboor, S. et al., others (2009). Interleukin-6 is essential for zwitterionic polysaccharidemediated abscess formation. Journal of Endotoxin Research, 1753425909346974v1. 99. Mertens, Janina et al. (2009). Streptococcus pneumoniae serotype 1 capsular polysaccharide induces CD8CD28 regulatory T lymphocytes by TCR crosslinking. PLoS pathogens 5, e1000596. 100. Mitchison, N. A. (1971). The carrier effect in the secondary response to hapten-protein conjugates. II. Cellular cooperation. European journal of immunology 1, 18-27. 101. Molet, S., Hamid, Q., Davoine, F., Nutku, E., Taha, R., Pagé, N., Olivenstein, R., Elias, J., and Chakir, J. (2001). IL-17 is increased in asthmatic airways and induces human bronchial fibroblasts to produce cytokines. The Journal of allergy and clinical immunology 108, 430-8. 102 102. Monks, C. R., Freiberg, B. A., Kupfer, H., Sciaky, N., and Kupfer, A. (1998). Threedimensional segregation of supramolecular activation clusters in T cells. Nature 395, 82-6. 103. Moseley, T. (2003). Interleukin-17 family and IL-17 receptors. Cytokine & Growth Factor Reviews 14, 155-174. 104. Mosmann, T. R., Cherwinski, H., Bond, M. W., Giedlin, M. A., and Coffman, R. L. (1986). Two types of murine helper T cell clone. I. Definition according to profiles of lymphokine activities and secreted proteins. Journal of immunology (Baltimore, Md. : 1950) 136, 2348-57. 105. Mosmann, T. R., and Coffman, R. L. (1989). TH1 and TH2 cells: different patterns of lymphokine secretion lead to different functional properties. Annual review of immunology 7, 145-73. 106. Mulé, J. J., Schwarz, S. L., Roberts, A. B., Sporn, M. B., and Rosenberg, S. A. (1988). Transforming growth factor-beta inhibits the in vitro generation of lymphokine-activated killer cells and cytotoxic T cells. Cancer immunology, immunotherapy : CII 26, 95-100. 107. Murphy, K. M., and Reiner, S. L. (2002). The lineage decisions of helper T cells. Nature reviews. Immunology 2, 933-44. 108. Murphy, K. P., Murphy, K. M., Travers, P., Walport, M., and Janeway, C. (2008). Janewayʼs immunobiology, Volume 978, Issues 0-4129 (Garland Science) 109. Nakae, S., Nambu, A., Sudo, K., and Iwakura, Y. (2003). Suppression of immune induction of collagen-induced arthritis in IL-17-deficient mice. Journal of immunology (Baltimore, Md. : 1950) 171, 6173-7. 110. Nurieva, R. et al. (2007). Essential autocrine regulation by IL-21 in the generation of inflammatory T cells. Nature 448, 480-3. 111. Ogawa, A., Andoh, A., Araki, Y., Bamba, T., and Fujiyama, Y. (2004). Neutralization of interleukin-17 aggravates dextran sulfate sodium-induced colitis in mice. Clinical immunology (Orlando, Fla.) 110, 55-62. 112. Onderdonk, Andrew B., Kasper, Dennis L., Cisneros, Ronald L., and Bartlett, J. G. (1977). The Capsular Polysaccharide of Bacteroides fragilis as a Virulence Factor: Comparison of the Pathogenic Potential of Encapsulated and Unencapsulated Strains. The Journal of Infectious Diseases 136, 82 - 89. 113. Ovodov, Y. S. (2006). Capsular antigens of bacteria. Capsular antigens as the basis of vaccines against pathogenic bacteria. Biochemistry. Biokhimii͡a 71, 955-61. 114. Park, S. W., Kim, M., Brown, K. M., DʼAgati, V. D., and Lee, H. T. (2011). Paneth cell-derived interleukin-17A causes multiorgan dysfunction after hepatic ischemia and reperfusion injury. Hepatology (Baltimore, Md.) 53, 1662-75. 115. Parkin, J., and Cohen, B. (2001). An overview of the immune system. The Lancet 357, 17771789. 116. Rincon, M. (1997). Interleukin (IL)-6 Directs the Differentiation of IL-4-producing CD4+ T Cells. Journal of Experimental Medicine 185, 461-470. 117. Rouvier, E., Luciani, M., Mattei, M., Denizot, F., and Golstein, P. (1993). CTLA-8, cloned from an activated T cell, bearing AU-rich messenger RNA instability sequences, and homologous to a herpesvirus saimiri gene. J. Immunol. 150, 5445-5456. 118. Ruiz-Perez, B., Chung, Doo R, Sharpe, A. H., Yagita, H., Kalka-Moll, Wiltrud M, Sayegh, Mohamed H, Kasper, Dennis L, and Tzianabos, Arthur O (2005). Modulation of surgical 103 fibrosis by microbial zwitterionic polysaccharides. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 102, 16753-8. 119. Sakaguchi, S. (2000). Regulatory T Cells: Key Controllers of Immunologic Self-Tolerance. Cell 101, 455-458. 120. Sander, B., Andersson, J., and Andersson, U. (1991). Assessment of cytokines by immunofluorescence and the paraformaldehyde-saponin procedure. Immunological reviews 119, 65-93. 121. Scheller, J., and Rose-John, Stefan (2006). Interleukin-6 and its receptor: from bench to bedside. Medical microbiology and immunology 195, 173-83. 122. Schwartz, R. H. (2003). T cell anergy. Annual review of immunology 21, 305-34. 123. Shapiro, M., Kasper, D., Zaleznik, D., Spriggs, S., Onderdonk, A., and Finberg, R. (1986). Cellular control of abscess formation: role of T cells in the regulation of abscesses formed in response to Bacteroides fragilis. J. Immunol. 137, 341-346. 124. Song, C. et al. (2008). IL-17-producing alveolar macrophages mediate allergic lung inflammation related to asthma. Journal of immunology (Baltimore, Md. : 1950) 181, 6117-24. 125. Steinman, L. (2007). A brief history of T(H)17, the first major revision in the T(H)1/T(H)2 hypothesis of T cell-mediated tissue damage. Nature medicine 13, 139-45. 126. Steinman, L. (2008). A rush to judgment on Th17. The Journal of experimental medicine 205, 1517-22. 127. Stephen, T. L. et al. (2007). Transport of Streptococcus pneumoniae capsular polysaccharide in MHC Class II tubules. PLoS pathogens 3, e32. 128. Stephen, T. L., Niemeyer, M., Tzianabos, Arthur O, Kroenke, M., Kasper, Dennis L, and Kalka-Moll, Wiltrud M (2005). Effect of B7-2 and CD40 signals from activated antigenpresenting cells on the ability of zwitterionic polysaccharides to induce T-Cell stimulation. Infection and immunity 73, 2184-9. 129. Stingele, Francesca, Corthesy, B., Kusy, N., Porcelli, S. A., Kasper, Dennis L., and Tzianabos, Arthur O. (2004). Zwitterionic Polysaccharides Stimulate T Cells with No Preferential V{beta} Usage and Promote Anergy, Resulting in Protection against Experimental Abscess Formation. J. Immunol. 172, 1483-1490. 130. Stockinger, B., and Veldhoen, M. (2007). Differentiation and function of Th17 T cells. Current opinion in immunology 19, 281-6. 131. Stockinger, B., Veldhoen, M., and Martin, B. (2007). Th17 T cells: linking innate and adaptive immunity. Seminars in immunology 19, 353-61. 132. Stroop, C. (2002). Structural analysis and chemical depolymerization of the capsular polysaccharide of Streptococcus pneumoniae type 1. Carbohydrate Research 337, 335-344. 133. Stumhofer, J. S. et al. (2006). Interleukin 27 negatively regulates the development of interleukin 17-producing T helper cells during chronic inflammation of the central nervous system. Nature immunology 7, 937-45. 134. Stumhofer, J. S. et al. (2007). Interleukins 27 and 6 induce STAT3-mediated T cell production of interleukin 10. Nature immunology 8, 1363-71. 135. Szabo, S. J., Kim, S. T., Costa, G. L., Zhang, X., Fathman, C. G., and Glimcher, L H (2000). A novel transcription factor, T-bet, directs Th1 lineage commitment. Cell 100, 655-69. 104 136. Takahashi, N., Vanlaere, I., Rycke, R. de, Cauwels, A., Joosten, L. A. B., Lubberts, E., Berg, W. B. van den, and Libert, C. (2008). IL-17 produced by Paneth cells drives TNF-induced shock. The Journal of experimental medicine 205, 1755-61. 137. Teague, T., Marrack, P., Kappler, J., and Vella, A. (1997). IL-6 rescues resting mouse T cells from apoptosis. J. Immunol. 158, 5791-5796. 138. Torchinsky, M. B., and Blander, J. M. (2010). T helper 17 cells: discovery, function, and physiological trigger. Cellular and molecular life sciences : CMLS 67, 1407-21. 139. Trotter, C. L., McVernon, J., Ramsay, M. E., Whitney, C. G., Mulholland, E. K., Goldblatt, D., Hombach, J., and Kieny, M.-P. (2008). Optimising the use of conjugate vaccines to prevent disease caused by Haemophilus influenzae type b, Neisseria meningitidis and Streptococcus pneumoniae. Vaccine 26, 4434-45. 140. Tzartos, J. S., Friese, M. A., Craner, M. J., Palace, J., Newcombe, J., Esiri, M. M., and Fugger, L. (2008). Interleukin-17 production in central nervous system-infiltrating T cells and glial cells is associated with active disease in multiple sclerosis. The American journal of pathology 172, 146-55. . 141. Tzianabos, A. (2003). Biological chemistry of immunomodulation by zwitterionic polysaccharides. Carbohydrate Research 338, 2531-2538. 142. Tzianabos, A O, Kasper, D L, Cisneros, R L, Smith, R. S., and Onderdonk, A B (1995). Polysaccharide-mediated protection against abscess formation in experimental intra-abdominal sepsis. The Journal of clinical investigation 96, 2727-31. 143. Tzianabos, A O, Onderdonk, A B, Rosner, B., Cisneros, R L, and Kasper, D L (1993). Structural features of polysaccharides that induce intra-abdominal abscesses. Science (New York, N.Y.) 262, 416-9. 144. Tzianabos, A O, Onderdonk, A B, Smith, R. S., and Kasper, D L (1994). Structure-function relationships for polysaccharide-induced intra-abdominal abscesses. Infection and immunity 62, 3590-3. 145. Tzianabos, A O, Wang, J Y, and Lee, J. C. (2001). Structural rationale for the modulation of abscess formation by Staphylococcus aureus capsular polysaccharides. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 98, 9365-70. 146. Tzianabos, A. O., Chandraker, A., Kalka-Moll, W., Stingele, F., Dong, V. M., Finberg, R. W., Peach, R., and Sayegh, M. H. (2000). Bacterial Pathogens Induce Abscess Formation by CD4+ T-Cell Activation via the CD28-B7-2 Costimulatory Pathway. Infection and Immunity 68, 6650-6655. 147. Tzianabos, Arthur O., Russell, P. R., Onderdonk, Andrew B., Gibson, F. C., Cywes, C., Chan, M., Finberg, Robert W., and Kasper, Dennis L. (1999). IL-2 Mediates Protection Against Abscess Formation in an Experimental Model of Sepsis. J. Immunol. 163, 893-897. 148. Van Weemen, B. K., and Schuurs, A. H. W. M. (1971). Immunoassay using antigen-enzyme conjugates. FEBS letters 15, 232-236. . 149. Veldhoen, M., Hocking, R. J., Atkins, C. J., Locksley, R. M., and Stockinger, B. (2006). TGFbeta in the context of an inflammatory cytokine milieu supports de novo differentiation of IL-17-producing T cells. Immunity 24, 179-89. 150. Velez, C. D., Lewis, C. J., Kasper, Dennis L, and Cobb, B. A. (2009). Type I Streptococcus pneumoniae carbohydrate utilizes a nitric oxide and MHC II-dependent pathway for antigen presentation. Immunology 127, 73-82. 105 151. Vilar, R. E., Ghael, D., Li, M., Bhagat, D. D., Arrigo, L. M., Cowman, M. K., Dweck, H. S., and Rosenfeld, L. (1997). Nitric oxide degradation of heparin and heparan sulphate. The Biochemical journal 324 ( Pt 2, 473-9. 152. Vivien, L. (2001). T lymphocytes need IL-7 but not IL-4 or IL-6 to survive in vivo. International Immunology 13, 763-768. 153. Wang, Q., McLoughlin, R. M., Cobb, B. A., Charrel-Dennis, M., Zaleski, K. J., Golenbock, D., Tzianabos, Arthur O, and Kasper, Dennis L (2006). A bacterial carbohydrate links innate and adaptive responses through Toll-like receptor 2. The Journal of experimental medicine 203, 2853-63. 154. Wang, Y., Kalka-Moll, W M, Roehrl, M H, and Kasper, D L (2000). Structural basis of the abscess-modulating polysaccharide A2 from Bacteroides fragilis. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 97, 13478-83. 155. Watts, C (1997). Capture and processing of exogenous antigens for presentation on MHC molecules. Annual review of immunology 15, 821-50. 156. Watts, Colin (2004). The exogenous pathway for antigen presentation on major histocompatibility complex class II and CD1 molecules. Nature immunology 5, 685-92. 157. Way, S. S., and Wilson, C. B. (2004). Cutting edge: immunity and IFN-gamma production during Listeria monocytogenes infection in the absence of T-bet. Journal of immunology (Baltimore, Md. : 1950) 173, 5918-22. 158. Weaver, C. T., Harrington, L. E., Mangan, P. R., Gavrieli, M., and Murphy, K. M. (2006). Th17: an effector CD4 T cell lineage with regulatory T cell ties. Immunity 24, 677-88. 159. Wei, L., Laurence, A., Elias, K. M., and OʼShea, J. J. (2007). IL-21 is produced by Th17 cells and drives IL-17 production in a STAT3-dependent manner. The Journal of biological chemistry 282, 34605-10. 160. Wu, Q., Martin, R. J., Rino, J. G., Breed, R., Torres, R. M., and Chu, H. W. (2007). IL-23dependent IL-17 production is essential in neutrophil recruitment and activity in mouse lung defense against respiratory Mycoplasma pneumoniae infection. Microbes and infection / Institut Pasteur 9, 78-86. 161. Xu, L., Kitani, A., Fuss, I., and Strober, W. (2007). Cutting edge: regulatory T cells induce CD4+CD25-Foxp3- T cells or are self-induced to become Th17 cells in the absence of exogenous TGF-beta. Journal of immunology (Baltimore, Md. : 1950) 178, 6725-9. 162. Yang, L., Anderson, D. E., Baecher-Allan, C., Hastings, W. D., Bettelli, E., Oukka, M., Kuchroo, V. K., and Hafler, D. A. (2008). IL-21 and TGF-beta are required for differentiation of human T(H)17 cells. Nature 454, 350-2. 163. Yang, X. O. et al. (2008). Regulation of inflammatory responses by IL-17F. The Journal of experimental medicine 205, 1063-75. 164. Yao, Z, Fanslow, W. C., Seldin, M. F., Rousseau, A. M., Painter, S. L., Comeau, M. R., Cohen, J. I., and Spriggs, M. K. (1995). Herpesvirus Saimiri encodes a new cytokine, IL-17, which binds to a novel cytokine receptor. Immunity 3, 811-21. 165. Yao, Z, Painter, S., Fanslow, W., Ulrich, D., Macduff, B., Spriggs, M., and Armitage, R. (1995). Human IL-17: a novel cytokine derived from T cells. J. Immunol. 155, 5483-5486. 166. Yao, Zhengju et al. (2007). Nonredundant roles for Stat5a/b in directly regulating Foxp3. Blood 109, 4368-75. 106 167. Yen, D. et al. (2006). IL-23 is essential for T cell-mediated colitis and promotes inflammation via IL-17 and IL-6. The Journal of clinical investigation 116, 1310-6. 168. Zheng, W. (1997). The Transcription Factor GATA-3 Is Necessary and Sufficient for Th2 Cytokine Gene Expression in CD4 T Cells. Cell 89, 587-596. 169. Zheng, Y. et al. (2008). Interleukin-22 mediates early host defense against attaching and effacing bacterial pathogens. Nature medicine 14, 282-9. 170. Zhou, L., Ivanov, I. I., Spolski, R., Min, R., Shenderov, K., Egawa, T., Levy, D. E., Leonard, W. J., and Littman, D. R. (2007). IL-6 programs T(H)-17 cell differentiation by promoting sequential engagement of the IL-21 and IL-23 pathways. Nature immunology 8, 967-74. 171. Zhou, Q., Desta, T., Fenton, M., Graves, D. T., and Amar, S. (2005). Cytokine profiling of macrophages exposed to Porphyromonas gingivalis, its lipopolysaccharide, or its FimA protein. Infection and immunity 73, 935-43. 172. Zhu, J., and Paul, W. E. (2008). CD4 T cells: fates, functions, and faults. Blood 112, 1557-69. 107 8. Lebenslauf Thomas Gamstätter * 21.04.1984 in Mainz Staatsangehörigkeit: Deutschland Familienstand: ledig Eltern Dr. med. Gerhard Gamstätter, Gefäßchirurg Karin Heid-Gamstätter, Zahnärztin Studium und Ausbildung Nov 2010 - heute Anstellung als Assistenzarzt I. Medizinische Klinik Universitätsmedizin der Johannes-Gutenberg-Universität, Mainz Direktor: Universitätsprofessor Dr. med. P. R. Galle Juli 2010 Approbation als Arzt Juni 2010 Ärztliche Prüfung Humanmedizin Okt 2007 - heute Promotion Institut für Medizinische Mikrobiologie, Immunologie und Hygiene Universität zu Köln Betreuerin: Frau Privatdozentin Dr. med. W. Kalka-Moll Feb 2009 - Jan 2010 Praktisches Jahr 1. Tertial: Klinik für Allgemein-, Visceral- und Tumorchirurgie, Uni-Klinik Köln Klinik für Herz- und Thoraxchirurgie, Uni-Klinik Köln Klinik für Unfall-, Hand- und Wiederherstellungschirurgie, Uni-Klinik Köln 2. Tertial: Klinik für Anästhesiologie und Operative Intensivmedizin, Uni-Klinik Köln 3. Tertial: Klinik für Innere Medizin I, Hämatoonkologie, Uni-Klinik Köln Klinik für Gastroenterologie und Hepatologie, Uni-Klinik Köln Mär 2006 - Feb 2009 2. Studienabschnitt Humanmedizin, Universität zu Köln Mär 2006 Ärztliche Basisprüfung (Physikum), Universität zu Köln Apr 2004 - Mär 2006 1. Studienabschnitt Humanmedizin, Universität zu Köln Apr 2003 - Feb 2004 Zivildienst 108 Grundausbildung zum Rettungssanitäter Mär 2003 Allgemeine Hochschulreife (Abitur) Aug 1994 - Mär 2003 Gymnasium Theresianum Mainz Famulaturen und Praktika Aug 2008 Famulatur Angiographie, konventionelle Computertomographie, Durchleuchtung RNS Praxisgemeinschaft, Wiesbaden Röntgendiagnostik, Jul 2008 Famulatur Hals-Nasen-Ohrenheilkunde HNO Praxis Dres. Yildiz und Zenev, Köln Aug 2007 - Okt 2007 Famulatur Intensiv- und Notfallmedizin Zentrale Intensiv- und Notfallmedizin, Uni-Klinik Köln Okt 2006 Famulatur Gastroenterologie Klinik Innere Medizin II, Dr.-Horst-Schmidt-Klinik, Wiesbaden Sep 2006 Famulatur Kardiologie und Angiologie Innere Medizin I, Dr.-Horst-Schmidt-Klinik, Wiesbaden Sep 2004 & Mai 2005 Pflegepraktika operative Intensivmedizin Zentrale Intensiv- und Notfallmedizin, Uni-Klinik Köln Jun 2003 Pflegepraktikum Anästhesiologie St. Vincenz- und Elisabeth-Hospital, Mainz Berufserfahrung, Ehrenamt, Mitgliedschaften 2003 - 2005 Malteser Hilfsdienst e.V., Mainz ehrenamtliche Tätigkeit im Rettungs- und Sanitätsdienst Dez 2000 - Feb 2002 forum! GmbH Marketing & Communications, Mainz CATI-Programmierung, Datenbankpflege, EDV, Recherche seit 2010 - heute American Association for the Advancement of Science (AAAS) Mitgliedschaft