Dokument_22.

Analyse der Rolle von kreuzreaktiven
T-Zellen und Antikörpern bei der HIV-1Infektion
Der Naturwissenschaftlichen Fakultät
der Friedrich-Alexander-Universität Erlangen-Nürnberg
zur
Erlangung des Doktorgrades Dr. rer. nat.
vorgelegt von
Angela Hückelhoven
aus Stuttgart Bad Cannstatt
Als Dissertation genehmigt von der Naturwissenschaftlichen
Fakultät der Friedrich-Alexander-Universität
Erlangen-Nürnberg
Tag der mündlichen Prüfung:
01.03.2013
Vorsitzender der
Prüfungskommission:
Prof. Dr. Johannes Barth
Erstberichterstatter:
Prof. Dr. Lars Nitschke
Zweitberichterstatter:
Prof. Dr. Thomas Harrer
Inhaltsverzeichnis
1. Zusammenfassung ............................................................................................................ 1
2. Einleitung ........................................................................................................................... 6
2.1 Retroviren .................................................................................................................... 6
2.1.1 Einteilung und Vertreter ......................................................................................... 6
2.1.2 Aufbau ................................................................................................................... 7
2.1.3 Proteine ................................................................................................................. 8
2.1.4 Replikation am Beispiel von HIV .......................................................................... 10
2.1.5 Humanes Immundefizienz-Virus (HIV) ................................................................. 10
2.1.6 Humane endogene Retroviren (HERV) ................................................................ 15
2.2 Influenzaviren ............................................................................................................. 17
2.2.1 Einteilung und charakteristische Vertreter ............................................................ 17
2.2.2 Aufbau ................................................................................................................. 17
2.2.3 Replikation ........................................................................................................... 18
2.2.4 Epidemiologie und Übertragung ........................................................................... 19
2.2.5 Klinik und Pathogenese ....................................................................................... 20
2.2.6 Immunantwort ...................................................................................................... 21
2.2.7 Therapie .............................................................................................................. 21
2.3 Epstein-Barr-Virus (EBV)............................................................................................ 22
2.3.1 Einteilung und charakteristische Vertreter ............................................................ 22
2.3.2 Aufbau ................................................................................................................. 22
2.3.3 Proteine ............................................................................................................... 23
2.3.4 Replikation ........................................................................................................... 24
2.3.5 Epidemiologie und Übertragung ........................................................................... 25
2.3.6 Klinik und Pathogenese ....................................................................................... 25
2.3.7 Immunantwort ...................................................................................................... 26
2.4 Chlamydien ................................................................................................................ 26
2.4.1 Einteilung und charakteristische Vertreter ............................................................ 26
2.4.2 Aufbau und Vermehrungszyklus .......................................................................... 27
2.4.3 Symptome, Diagnose und Behandlung ................................................................ 27
2.5 Immunsystem und Immunabwehr............................................................................... 28
2.5.1 Übersicht über die Immunantwort ........................................................................ 28
2.5.2 Entwicklung der T-Zellrezeptoren (TCR) .............................................................. 29
2.5.3 Der Haupthistokompatibilitätskomplex (MHC) ...................................................... 31
2.5.4 Präsentation und Aktivierung der CD8+ T-Zelle .................................................... 33
2.5.5 CD8+ T Zellen in der HIV-1-Infektion .................................................................... 34
2.5.6 HIV-1-spezifische Antikörper................................................................................ 36
3. Zielsetzung ...................................................................................................................... 37
I
Inhaltsverzeichnis
4. Ergebnisse ...................................................................................................................... 38
4.1. Analyse der Kreuzreaktivität von HLA-B13-restringierten Nef-spezifischen CTL-Linien
zu Chlamydophila pneumoniae ........................................................................................ 38
4.1.1 Erkennung von Nef-RI9 und CP-YI9 in HIV-1-infizierten HLA-B13-positiven
Patienten ...................................................................................................................... 38
4.1.2 Kreuzreaktivität der Nef-RI9- und CP-YI9-spezifischen CTL-Linien ..................... 39
4.1.3 Die Rolle von Nef-RI9- und CP-YI9-spezifischen kreuzreaktiven CTL für den
Verlauf der HIV-1-Infektion ........................................................................................... 40
4.1.4 Erkennung von C. pneumoniae-infizierten Zelllinien durch Nef-RI9- und CP-YI9spezifische CTL-Linien ................................................................................................. 42
4.1.5 Analyse der Erkennung von PBP2-Konstrukten durch NefRI9- und CP-YI9spezifische CTL-Linien ................................................................................................. 47
4.2 Analyse der Kreuzreaktivität von CTL zwischen dem HIV-1-p17-Protein und dem
Influenza M1 Matrix-Protein ............................................................................................. 50
4.2.1 Erkennung von HIV-1-SL9- und IMP-GL9-Peptiden in HIV-1-infizierten Patienten 50
4.2.2 Kreuzreaktivität der HIV-1-SL9 und IMP-GL9-spezifischen CTL-Linien ............... 52
4.2.3 Kreuzerkennung von elf verschiedenen SL9-Varianten durch SL9- und IMP-GL9spezifische CTL-Linien ................................................................................................. 55
4.2.4 Analyse der funktionalen Peptid-Avidität .............................................................. 57
4.2.5 Die Rolle der SL9- und IMP-GL9-spezifischen sowie der kreuzreaktiven CTL für
die Kontrolle der HIV-1-Infektion ................................................................................... 58
4.2.6 Erkennung von SL9- und IMP-GL9-Peptiden in HIV-1-negativen Personen......... 62
4.3 Analyse der Kreuzreaktivität zwischen dem HIV-1-SL9-, dem IMP-GL9- und dem EBVGL9-Peptid in HIV-1-infizierten Patienten......................................................................... 63
4.3.1 Erkennung von EBV-GL9 in HIV-1-infizierten Patienten....................................... 64
4.3.2 Kreuzreaktivität der HIV-1-SL9-, IMP-GL9 und EBV-GL9-spezifischen CTL-Linien
..................................................................................................................................... 65
4.3.3 Die Rolle der EBV-GL9-kreuzreaktiven CTL-Linien für die Kontrolle der HIV-1Infektion ....................................................................................................................... 68
4.4. Herstellung und Analyse von HIV-1-SL9, IMP-GL9 und EBV-GL9 spezifischen TCR 69
4.4.1 Identifizierung, Herstellung und Charakterisierung von IMP-GL9-spezifischen TCRKetten........................................................................................................................... 70
4.4.2 Identifizierung, Herstellung und Charakterisierung von SL9 und EBV-GL9spezifischen TCR-Ketten .............................................................................................. 76
4.5 Analyse der Kreuzreaktionen zwischen dem hoch konservierten YMDD-Motiv der RT
von HIV-1 zu HERV ......................................................................................................... 84
4.5.1 Erkennung verschiedener RT-Epitope in HIV-1-infizierten Patienten ................... 84
II
Inhaltsverzeichnis
4.5.2 Die Rolle der Erkennung von RT-VL9 und RT-VL9M/V für die Kontrolle der HIV-1Infektion ........................................................................................................................ 85
4.5.3 Kreuzreaktionen der RT-VL9- und RT-VL9 V/M-spezifischen CTL-Linien zu
Epitopen aus HERV ...................................................................................................... 86
4.5.4 Herstellung und Analyse von RT-spezifischen TCR ............................................. 87
4.6 Erkennung und Kreuzreaktion zwischen den HERV-spezifischen und HIV-1spezifischen Epitopen ...................................................................................................... 92
4.6.1 Erkennung verschiedener HERV-spezifischer RT-Epitope in HIV-1-infizierten
Patienten ...................................................................................................................... 93
4.6.2 Die Rolle der HERV-spezifischen CTL für die Kontrolle der HIV-1-Infektion ......... 94
4.6.3 Kreuzreaktionen der HERV-spezifischen CTL-Linien zu RT-Epitopen aus HIV-1 . 97
4.6.4 Herstellung und Analyse von HERV-spezifischen TCR ........................................ 99
4.7 Erkennung und Kreuzreaktion von XMRV-spezifischen RT-Epitopen in HIV-1-infizierten
Patienten ........................................................................................................................ 100
4.7.1 Erkennung eines HLA-A2-restringierten und eines HLA-B35-restringierten Epitops
aus XMRV .................................................................................................................. 101
4.7.2 Die Rolle der Erkennung von XM-LL12, RT-TY9 und XM-TF9 für die Kontrolle der
HIV-1-Infektion............................................................................................................ 101
4.7.3 Die Kreuzreaktion zwischen XM-LL12-spezifischen CTL-Linien und anderen
HERV-spezifischen und HIV-1-spezifischen RT-Epitopen .......................................... 103
4.7.4 Kreuzreaktion des HLA-B35-restringierten Epitops aus XMRV in HIV-1-infizierten
Personen .................................................................................................................... 104
4.8 Detektion von HIV-1-spezifischen Antikörpern im Serum von Patienten mit
unterschiedlichen Erkrankungen .................................................................................... 105
4.8.1 Untersuchung von Seren aus verschiedenen Patientengruppen hinsichtlich der
Reaktivität gegenüber HIV-1-p24 und HERV-Peptiden im ELISA ............................... 105
4.9 Untersuchung von exponierten seronegativen Personen hinsichtlich ihrer Reaktivität
gegenüber HIV-1 ............................................................................................................ 110
4.9.1 Untersuchung des Vorkommens der CCR5Δ32-Mutation .................................. 111
4.9.2 Stimulation der HIV-1-exponierten seronegativen Spender mit HIV-1- und HERVspezifischen Peptiden ................................................................................................. 112
5. Diskussion ..................................................................................................................... 115
5.1 Kreuzreaktivität von HLA-B13-restringierten Nef-spezifischen CTL zu Chlamydophila
pneumoniae ................................................................................................................... 115
5.1.1 Erkennung und Kreuzreaktion zwischen den HLA-B13-restringierten Nef-RI9- und
CP-YI9-Peptiden aus HIV-1 und C. pneumoniae ........................................................ 116
III
Inhaltsverzeichnis
5.1.2 Erkennung von C. pneumoniae-infizierten Zelllinien durch Nef-RI9- und CP-YI9spezifische CTL-Linien ............................................................................................... 116
5.1.3 Erkennung von PBP2-Konstrukten durch Nef-RI9- und CP-YI9-spezifische CTLLinien ......................................................................................................................... 117
5.2 Kreuzreaktivität von CTL zwischen dem HIV-1-p17-Protein und dem Influenza-M1Matrix-Protein ................................................................................................................ 118
5.2.1 Erkennung von SL9- und IMP-GL9-spezifischen CTL-Linien und ihre Rolle für die
HIV-1-Infektion ........................................................................................................... 119
5.2.2 Kreuzreaktivität der SL9- und IMP-GL9-spezifischen CTL-Linien und ihre Rolle für
die HIV-1-Infektion...................................................................................................... 120
5.2.3 Kreuzerkennung von elf verschiedenen SL9-Varianten durch SL9- und IMP-GL9spezifische CTL-Linien ............................................................................................... 121
5.2.4 Erkennung und Kreuzreaktion von SL9 und IMP-GL9 in HIV-1-negativen Personen
................................................................................................................................... 122
5.3 Kreuzreaktivität zwischen dem HIV-1-SL9-, dem IMP-GL9- und dem EBV-GL9-Peptid
in HIV-1 infizierten Patienten .......................................................................................... 123
5.4 HIV-1-SL9, IMP-GL9- und EBV-GL9-spezifische TCR ............................................. 125
5.4.1 Der IMP-GL9-spezifische TCR .......................................................................... 125
5.4.2 SL9- und EBV-GL9-spezifische TCR ................................................................. 127
5.5 Erkennung von RT-spezifischen Epitopen und Kreuzreaktionen zwischen dem hoch
konservierten YMDD-Motiv der RT von HIV-1 zu HERV ................................................ 129
5.5.1 Kreuzreaktion gegenüber Varianten der RT-spezifischen Epitope ..................... 130
5.5.2 Kreuzreaktion der RT-spezifischen CTL-Linien gegenüber HERV-angeleiteten
Peptiden ..................................................................................................................... 131
5.5.3 Der RT-YV9-spezifische TCR von Patient 647 .................................................. 131
5.6 Erkennung und Kreuzreaktion zwischen den HERV- und HIV-1-spezifischen RTEpitopen ........................................................................................................................ 132
5.6.1 Erkennung von HERV-spezifischen Peptiden durch HIV-1-Patienten ................ 133
5.6.2 Die Rolle der HERV-spezifischen T-Zellen für die Kontrolle der HIV-1-Infektion 134
5.6.3 Kreuzreaktion der HERV-spezifischen T-Zellen gegenüber HIV-1-spezifischen RTVarianten .................................................................................................................... 135
5.7 Erkennung und Kreuzreaktion von XMRV-spezifischen RT-Epitopen in HIV-1-infizierten
Patienten ....................................................................................................................... 136
5.8 Detektion von HIV-1-spezifischen Antikörpern im Serum von Patienten mit
unterschiedlichen Erkrankungen .................................................................................... 138
5.9 Untersuchung von exponierten seronegativen Personen hinsichtlich ihrer Reaktivität
gegenüber HIV-1 ........................................................................................................... 140
IV
Inhaltsverzeichnis
6. Material und Methoden .................................................................................................. 142
6.1 Material .................................................................................................................... 142
6.1.1 Verbrauchsmaterial ............................................................................................ 142
6.1.2 Laborgeräte ....................................................................................................... 143
6.1.3 Chemikalien ....................................................................................................... 144
6.1.4 Zellkulturmedien und Zusätze ............................................................................ 147
6.1.5 Antikörper und Dextramere ................................................................................ 147
6.1.6 Kommerziell erhältliche Kits ............................................................................... 148
6.1.7 Enzyme.............................................................................................................. 148
6.1.8 Peptide .............................................................................................................. 148
6.1.9 Längenstandards ............................................................................................... 149
6.1.10 Vektoren .......................................................................................................... 149
6.1.11 Bakterien, Zellen und Zelllinien ........................................................................ 149
6.1.12 Zellkulturmedien .............................................................................................. 150
6.1.13 Medien und Puffer für molekularbiologische Methoden .................................... 151
6.1.14 Oligonukleotidprimer ........................................................................................ 152
6.1.15 Patienten ......................................................................................................... 156
6.2 Methoden ................................................................................................................. 157
6.2.1 Molekularbiologische Methoden ......................................................................... 157
6.2.2 Zellbiologische Methoden .................................................................................. 168
6.2.3 Immunologische Methoden ................................................................................ 178
6.2.4 Statistische Analysen ......................................................................................... 179
7. Literaturverzeichnis ........................................................................................................ 180
8. Abkürzungsverzeichnis .................................................................................................. 196
9. Lebenslauf ..................................................................................................................... 203
10. Eigene Publikationen und wissenschaftliche Vorträge ................................................. 204
11. Danksagung ................................................................................................................ 206
V
1. Zusammenfassung
1. Zusammenfassung
HIV-1-spezifische T-Zellen spielen eine wichtige Rolle bei der Kontrolle der HIV-1-Infektion,
dennoch können sie bei den meisten Patienten die Entwicklung eines Immundefekts nicht
verhindern. Auch in HIV-1-exponierten seronegativen Personen konnten HIV-1-spezifische
T-Zellen nachgewiesen werden, wobei vermutet wurde, dass diese Zellen durch abortive
Infektionen induziert wurden. In der vorliegenden Arbeit sollte nun als alternative Hypothese
untersucht werden, ob HIV-1-spezifische zytotoxische T-Zellen (CTL) durch kreuzreaktive
Peptide aus anderen Mikroorganismen und Viren induziert werden können. Untersuchungen
zeigten, dass tatsächlich eine Reihe von HIV-1-Epitopen starke Sequenzhomologien zu anderen Mikroorganismen aufweisen. In meiner Promotion wurden daher, basierend auf Vorarbeiten der Arbeitsgruppe, verschiedene CTL-Epitope hinsichtlich ihrer Kreuzreaktivität zwischen HIV-1 und anderen Mikroorganismen untersucht. Bei einem dieser Epitope handelte
es sich um das immundominante Nef-RI9-Epitop (RQDILDLWI, AS 106-114) aus dem HIV-1Nef-Protein, das mit einer guten Kontrolle von HIV-1 assoziiert ist. Eine Analyse zeigte eine
ähnliche Sequenz im PBP2-Protein von Chlamydophila pneumoniae und es konnte anschließend eine Kreuzreaktion zwischen dem Nef-RI9 aus HIV-1 und dem CP-YI9 aus C.
pneumoniae in verschiedenen Patienten gezeigt werden. Die Erkennung von Chlamydieninfizierten Zelllinien oder PBP2-transfizierten Zelllinien konnte jedoch nicht nachgewiesen
werden, was darauf hindeutet, dass das optimale CP-YI9-Peptid nicht aus dem PBP2Protein prozessiert wird. Im Rahmen dieses Projektes gelang es mir außerdem einen NefRI9-spezifischen CTL-Klon aus einem langzeitüberlebenden Patienten so rein zu isolieren,
dass mein Kollege Christian Hofmann den T-Zellrezeptor (TCR) klonieren konnte.
Ein weiteres interessantes Epitop ist das IMP-GL9-Epitop (GILGFVFTL, FLU-M1:58-66) aus
dem Matrix-Protein des Influenza-A-Virus, bei dem eine Kreuzreaktion zum HIV-1spezifischen SL9-Epitop (SLYNTVATL, Gag AS 77-85) schon gezeigt wurde. In einer Analyse einer großen Kohorte mit 174 HIV-1-infizierten Patienten konnte hier nun gezeigt werden,
dass solche IMP-GL9/SL9-kreuzreaktiven CTL häufig (43,1%) bei HIV-1-infizierten Patienten
gefunden werden. Ich fand zwar klare Hinweise, dass die Erkennung von SL9 an sich, mit
einem besseren Ansprechen auf die antiretrovirale Therapie assoziiert ist, jedoch fand ich
keine Hinweise, dass SL9-spezifische IMP-GL9-kreuzreaktive CTL einen günstigen Effekt
auf die Kontrolle von HIV-1 aufweisen. Unter den HIV-1-negativen Blutspendern konnten
IMP-GL9-spezifische CTL nur selten nachgewiesen werden, obwohl das IMP-GL9 als ein
dominantes Epitop publiziert wurde. Es konnten auch keine IMP-GL9/SL9-kreuzreaktive TZellen bei HIV-1-negativen Spendern beobachtet werden. Dies weist darauf hin, dass die in
den HIV-1-infizierten Patienten detektierten SL9/IMP-GL9-kreuzreaktiven CTL nicht durch
Influenza, sondern durch HIV-1 selbst induziert wurden, was damit auch erklären könnte,
1
1. Zusammenfassung
dass diese kreuzreaktiven CTL keinen günstigen Effekt auf die HIV-1 Kontrolle hatten. Unklar ist, ob diese kreuzreaktiven CTL einen vorteilhaften Einfluss auf den Verlauf der Influenza-Infektion bei HIV-1-infizierten Patienten haben könnten.
Ein weiteres interessantes Epitop ist das EBV-GL9 (GLCTLVAML, AS 280-288) von EBV,
das kreuzreaktiv gegenüber dem IMP-GL9-Epitop ist. In meiner Arbeit konnte ich zeigen,
dass auch SL9/EBV-GL9-spezifische kreuzreaktive T-Zellen unter den 157 getesteten HIV-1infizierten Patienten gefunden werden können. Diese SL9/EBV-GL9-kreuzreaktiven T-Zellen
werden jedoch deutlich seltener detektiert (16 %) als IMP-GL9/SL9-kreuzreaktive CTL. Ob
solche SL9/EBV-GL9-kreuzreaktiven T-Zellen eine Rolle bei der Kontrolle der HIV-1-Infektion
spielen konnte nicht eindeutig geklärt werden, da die Zahl der Patienten mit kreuzreagierenden CTL dafür zu gering war. Ich konnte weiterhin einige sehr interessante TCR klonieren
und funktionell charakterisieren; einen TCR mit Erkennung des IMP-GL9-Epitops und zwei
TCR mit Erkennung des SL9-Epitops in HIV-1-p17. Diese TCRs zeigten eine eindeutige Peptid-Spezifität für das Peptid, mit dem die jeweilige ursprüngliche CTL-Linie generiert wurde,
jedoch keine Kreuzreaktion. Der klonierte IMP-GL9 spezifische TCR zeigte zwar keine
Kreuzreaktivität zu HIV-1, ist jedoch, aufgrund des hohen Konservierungsgrad des Epitops
unter verschiedenen Influenzavirusvarianten ein äußerst interessanter TCR, der zur Entwicklung von T-zellbasierten Immuntherapien der Influenza geeignet wäre.
Weitere potenzielle kreuzreaktive Epitope sind in der Sequenz der Reversen Transkriptase
(RT) von HIV-1 zu finden, die im katalytischen Zentrum eine Sequenzhomologie mit humanen endogenen Retroviren (HERV) aufweist. Ich analysierte daher in mehr als 150 Patienten
die CTL-Antwort gegen HIV-1 und verschiedene HERVs und ich konnte eine Reihe von CTLLinien generieren, die eine Spezifität gegen die RT von HIV-1 bzw. HERV aufweisen. Einige
dieser CTL-Linien zeigten auch eine Kreuzreaktivität zwischen HIV-1 und HERV. Ich konnte
dabei einen HIV-1-RT-spezifischen TCR, der ein sehr konserviertes in der HIV-1 RT erkennt,
klonieren und nach Transfektion TCR-kodierter mRNA in PBMC funktionell charakterisieren.
Da dieser TCR keine Kreuzreaktion gegenüber den vorhandenen HERV-spezifischen Peptiden zeigte, wäre er sehr geeignet für die Immuntherapie der HIV-1-Infektion.
Von unserer Arbeitsgruppe konnte auch ein kreuzreaktives Antikörper-Epitop aus dem HIV-1
Gag p24-Protein identifiziert werden. Auch hierbei finden sich in verschiedenen HERVSequenzen Übereinstimmungen. In einer groß angelegten Analyse von 336 Seren aus Patientengruppen mit verschiedenen Erkrankungen konnte bei einigen Patienten eine Reaktion
gegenüber diesem Peptid im ELISA nachgewiesen werden. Dies deutet auf das Vorhandensein von kreuzreaktiven Antikörpern hin, sodass vermutet werden könnte, dass HERV oder
andere Retroviren an der Pathogenese von Autoimmunkrankheiten beteiligt sein könnten.
Auch HIV-1-exponierte seronegative Patienten wurden auf das Vorhandensein von HIV-1spezifischen bzw. kreuzreaktiven CTL-Antworten untersucht. In zwei Patienten konnten HIV2
1. Zusammenfassung
1-spezifische CTL-Linien gegen zwei verschiedene HIV-1-spezifische Epitope generiert werden. Bei dem einen handelte es sich um eine RT-spezifische CTL-Linie die keine Kreuzreaktion gegen eins der vorhandenen HERV-spezifischen Peptide zeigte, während der andere
Patient eine IV9-spezifische CTL-Linie generierte.
Somit konnten in der Promotionsarbeit CTL und Antikörper nachgewiesen werden, welche
mit unterschiedlichen Epitopen aus Influenza, EBV und HERV kreuzreagieren. Die Klonierung und funktionelle Expression von T-Zellrezeptoren gegen konservierte CTL-Epitope in
HIV-1 und Influenza könnte neue therapeutische Optionen durch eine genetische Immunisierung eröffnen.
1. Summary
HIV-1-specific CTLs (cytotoxic T-lymphocytes) play an important role in controlling HIV-1infections; however, they cannot prevent the development of an immunodeficiency in most
patients. HIV-1-specific T-cells were also detected in HIV-1-exposed seronegative persons
and it was suggested that those cells were induced by abortive infections. In the work at
hand, the alternative hypothesis is investigated; whether HIV-1-specific CTL come from
cross-reactive peptides induced by other microorganisms and viruses. Investigations have
demonstrated that some HIV-1-specific epitopes exhibit sequence homology to other microorganisms. In my PhD-thesis, I investigated different CTL epitopes concerning their crossreactivity between HIV-1 and other pathogens based on preliminary studies of the work
group. One of these epitopes was the immunodominant Nef-RI9 (RQDILDLWI, AA 106-114)
of HIV-1 Nef-protein, which is associated with a better control of HIV-1. A sequence analysis
showed a similar sequence in the PBP2-protein of Chlamydophila pneumoniae and, afterwards, a cross-reaction between HIV-1 Nef-RI9 and C. pneumoniae CP-YI9 was shown in
different patients. The recognition of cell-lines infected with C. pneumoniae or PBP2 transfected cell-lines was not established. This is probably due to the non-processing of optimal
CP-YI9 epitope from the PBP2-protein. In the context of this project, I isolated a Nef-RI9specific CTL-clone from a long-term non-progressor, from which my colleague Christian
Hofmann was able to generate the T-cell receptor (TCR).
Another interesting epitope is the IMP-GL9 epitope (GILGFVFTL, FLU-M1:58-66) of the matrix protein of influenza A virus, in which a cross-reaction to HIV-1 specific SL9 epitope
(SLYNTVATL Gag AA 77-85) was previously shown. In my analysis of a huge cohort of 174
HIV-1-infected patients, it was shown, that such an IMP-GL9/SL9-cross-reactive CTL-line
was frequently detected (43,1 %). I found clear evidence for a better response onto the antiretroviral therapy associated with the recognition of SL9, but there is no evidence of a positive effect of such SL9-specific IMP-GL9-cross-reactive CTL on the course of the HIV-13
1. Zusammenfassung
infection. HIV-1-negative blood donors rarely generated IMP-GL9-specific CTL; although the
IMP-GL9 epitope has been published as being a dominant influenza epitope. IMP-GL9/SL9
cross-reactive T-cells weren´t observed among HIV-1-negative donors. This indicated that
the detected SL9/IMP-GL9-cross-reactive CTL in HIV-1-infected patients weren´t induced by
Influenza, but rather by HIV-1 itself, which could also elucidate that this cross-reactive CTL
had no favorable effect on the HIV-1 control. It´s ambiguous whether cross-reactive CTL had
a better influence on the course of the influenza infection in HIV-1-infected patients.
A further interesting epitope is the EBV-GL9 (GLCTLVAML, AA 280-288) from EBV, which is
cross-reactive to IMP-GL9. In my work, I showed that SL9/EBV-GL9-specific cross-reactive
T-cells were found among 157 tested HIV-1-infected patients. These SL9/EBV-GL9 crossreactive T-cells were more rarely found (16 %) as IMP-GL9/SL9 cross-reactive T-cells.
Whether such SL9/EBV-GL9 cross-reactive T-cells play a role for the control of the HIV-1infection was not clarified because the number of patients with cross-reactive CTL was very
low. Furthermore, I could generate and characterize very interesting TCRs; one TCR with
recognition of the IMP-GL9 epitope and two TCR with recognition of the SL9 epitope. The
TCRs showed clear peptide specificity for the peptide with which the original T-cell line was
stimulated, but without cross-reaction. Although the cloned IMP-GL9-specific TCR showed
no cross-reaction to HIV-1, it is, because of the high conservation degree of the epitope
among different influenza virus variants, a very interesting TCR for the development of a Tcell based immunotherapy for influenza.
More potential cross-reactive epitope are in the sequence of the reverse transcriptase (RT)
of HIV-1 found. The catalytic center exhibit sequence homology with human endogenous
retroviruses (HERV). I analyzed in more than 150 patients the CTL-answer against HIV-1
and different HERVS and I generated different CTL-lines with a specificity for HIV-1 and
HERV, respectively. Some of these CTL-lines showed a cross-reactivity between HIV-1 and
HERV. Additionally, an RT-specific TCR, which recognizes a highly conserved epitope in the
HIV-1 RT, was generated, and after transfection of TCR-encoded mRNA in PBMC, functionally characterized. Since this TCR showed no cross-reaction to available HERV-specific peptides, this is a potential agent for immunotherapy of the HIV-1-infection.
Our work group also identified a cross-reactive antibody epitope in HIV-1 Gag p24 protein.
Moreover, there is compliance with different HERV sequences. In a large analysis of 336
sera from patient groups with different disease patterns, a reaction with this peptide was detected in some of the patients in the ELISA. This pointed to the existence of cross-reactive
antibodies, so that it was assumed that HERV or other retroviruses could play a role in the
pathogenesis of autoimmune diseases.
Furthermore HIV-1-exposed seronegative persons were analyzed for the existence of HIV-1specific and cross-reactive CTL-responses, respectively. In two patients, HIV-specific CTL4
1. Zusammenfassung
lines to different HIV-specific epitopes were generated. One patient had an RT-specific CTLline without cross-reaction to one of the present HERV-specific peptides; while the other patients generated an IV9-specific CTL-line.
In this PhD-thesis CTL and antibody which cross-react with different epitopes from influenza,
EBV and HERV were established. The generation and functional expression of TCR against
conserved CTL-epitopes in HIV-1 and influenza could open new therapeutic options though
genetic immunization.
5
2. Einleitung
2. Einleitung
Im Jahr 1981 gab es die ersten Berichte über die erworbene Immunschwäche AIDS (Aquired
Immune Deficiency Syndrome). Dabei zeigte sich eine ungewöhnliche Häufung seltener Erkrankungen wie dem Kaposi-Sarkom und der Pneumocystis-Pneumonie bei bislang gesunden, jungen Menschen [1-3]. Bei allen Patienten waren die CD4+ T-Zellzahlen erniedrigt und
das Virus konnte über Sexualkontakte und Blut bzw. Blutprodukte übertragen werden [1-5].
Zuerst wurde als Auslöser von AIDS eine Variante des T-lymphotrophen Retrovirus (HTLV-I)
vermutet. Sowohl die Mitarbeiter um Luc Montagnier am Pasteur-Institut in Paris als auch die
Arbeitsgruppe von Robert Gallo am NIH in Bethesda konnten 1983 erstmals Virusmaterial
aus einem Patienten isolieren und den Erreger identifizieren, der für die erworbene Immunschwäche AIDS verantwortlich war [6, 7]. Dieses Retrovirus wurde 1986 als humanes Immundefizienz-Virus (HIV) bezeichnet; zuvor wurden die Bezeichnungen Lymphadenopathieassoziiertes Retrovirus (LAV) oder HTLV-III verwendet [8, 9]. 2008 erhielten Luc Montagnier
und Françoise Barré-Sinoussi für diese Arbeiten den Nobelpreis für Medizin. Seit der Entdeckung von HIV bemüht man sich weltweit darum, wirkungsvolle Therapiestrategien zu entwickeln und das Virus sowie seine Wirkungsweise zu verstehen. Durch die Einführung und
Entwicklung verschiedener antiretroviraler Medikamente und einer Kombinationstherapie
gelingt es in den meisten Fällen, die Virusvermehrung zu unterdrücken und ein Voranschreiten der Erkrankung zu verhindern. Doch eine Eliminierung des Virus kann bisher nicht erreicht werden. Dies ist vor allem auf die große Anpassungsfähigkeit von HIV zurückzuführen.
Viele Faktoren spielen bei der Progression der HIV-Erkrankung eine Rolle, u. a. auch genetische Faktoren wie HLA-Allele. Neben den zytotoxischen T-Lymphozyten (cytotoxic Tlymphocytes, CTL) sind auch CD4+ T-Helferzellen und neutralisierende Antikörper wichtig.
2.1 Retroviren
Die Retroviren wurden 1911 zum ersten Mal von Reyton Rous beschrieben, als er Tumorerkrankungen durch Extrakte aus Geflügelsarkomen auf gesunde Hühner übertrug [10]. Von
Howard M. Temin und S. Mituzami sowie David Baltimore wurde 1970 das Enzym Reverse
Transkriptase (RT) entdeckt, welches RNA in doppelsträngige DNA (dsDNA) umzuschreiben
kann [10, 11]. 1980 beschrieb Robert C. Gallo mit HTLV-I das erste Retrovirus, das beim
erwachsenen Menschen T-Zellleukämien verursachen kann [12, 13].
2.1.1 Einteilung und Vertreter
Die Familie der Retroviridae ist in sieben Genera eingeteilt, die α, β, γ, δ und ε-Retroviren,
sowie die Lentiviren und Spumaviren [10, 14]. HIV-1 und HIV-2 gehören zu den Lentiviren.
Retrovirusinfektionen kommen v. a. in Wirbeltieren vor, wo sie viele verschiedene Symptome
auslösen können. Man kann zwischen exogenen und endogenen Viren unterscheiden [10].
6
2. Einleitung
2.1.2 Aufbau
Die infektiösen Partikel der verschiedenen Retroviren haben einen ähnlichen Aufbau mit einem Durchmesser von ca. 100 nm. Das Kapsid ist von einer Hüllmembran umgeben, in die
Env-Glykoproteinkomplexe eingelagert sind [10, 15]. Bei HIV-1 besitzt das externe Protein
ein Molekulargewicht von 120 kDa (gp120) und das transmembrane 41 kDa (gp41). Das
p17-Matrix-Protein ist an der Innenseite der Virushülle verankert [15]. Im Partikelinneren findet man das Viruskapsid oder Core, das je nach dem Virustyp sphärisch-ikosaedrisch ist (bei
α-, β-, γ- und δ-Retroviren sowie Spumaviren) oder eine konische Form (Lentiviren und einige β-Retroviren) hat [10]. Im Kapsid sind zwei identische Moleküle einzelsträngige RNA
(ssRNA) als Virusgenom enthalten. Die RNA ist bei HIV-1 an das Nukleoprotein und die Reverse Transkriptase (RT) gebunden [15].
Abb. 2.1: Schematischer Aufbau eines HIV-1 Viruspartikel
Erklärung siehe Text.
Abb. von Wikipedia: HIV_Virion.svg:*MHC_Class_1.svg: User atropos235, Zionlion77, und Furfur,
Schematic representation of an HIV-Virion, URL: http://de.wikipedia.org/w/index.php?title=Datei:HIV_
Virion_de.svg&page=1&filetimestamp=20101130203445 (Stand: 30.11.2010)
Das Genom besteht aus zwei Kopien ssRNA, die mit der 5´-Cap-Struktur und der 3´Polyadenylierung alle Charakteristika einer eukaryotischen mRNA (messenger RNA) hat [10]
und bei HIV-1 neun kb (Kilobasen) groß ist [16]. Alle infektiösen Retroviren kodieren für die
Produkte gag (group antigen), pol (polymerase) und env (envelope) [16-18]. Die vier GagProteine MA (Matrix), CA (Kapsid), NC (Nukleokapsid) und p6 sowie die beiden Env-Proteine
gp120 und gp41 sind die strukturellen Komponenten von HIV-1, welche den Kern der Virionen und die äußere Hülle bilden [16]. Die drei Pol-Proteine Protease (PR), RT und Integrase
(IN) sind die Enzyme und auch im Kapsid enthalten [16]. Komplexe Retroviren wie die Lentiviren haben weitere Gene, die für akzessorische und regulatorische Proteine kodieren. Bei
HIV-1 gibt es die vier akzessorischen Gene nef, vif, vpr und vpu, von denen die Vif-, Vpr- und
Nef-Proteine auch im Viruspartikel gefunden werden [16, 19]. Tat und Rev sind regulatorische Proteine, die im Zellkern akkumulieren und an bestimmte Stellen in der viralen DNA
binden [15, 16]. Die Virusgene werden von den LTRs (long terminal repeats) flankiert, die
7
2. Einleitung
Sequenzen wie Promotoren und Enhancer-Elemente enthalten, welche die retrovirale Genexpression kontrollieren [10]. Dem pol-Gen fehlt das Startcodon, weswegen es teilweise mit
gag überlappt und als Gag-Pol-Fusionsprotein synthetisiert wird [17]. Der Gag-Pol-Vorläufer
wird in deutlich geringerem Maße als der Gag-Vorläufer synthetisiert, da seine Synthese
durch eine selten vorkommende Leserasterverschiebung erfolgt [17, 18].
Abb. 2.2: Schematischer Aufbau des Genoms von HIV-1
Detaillierte Erklärung siehe Text. Adaptiert von Freed, 1998 [20].
2.1.3 Proteine
Das gag-Gen wird als 55 kDa großer Vorläufer exprimiert und kodiert für die Matrix-, Kapsidund Nukleokapsidproteine der infektiösen Virionen [17]. Außerdem gehören neben dem p6Linkerprotein zwei Spacer-Peptide (SP1 und SP2) zu den gag-Produkten [18, 21, 22]. Die
Proteine werden als gemeinsames Vorläuferprodukt synthetisiert und in die einzelnen Komponenten aufgespalten [18, 22]. Die Immunantwort ist häufig gegen verschiedene Epitope
aus Gag aktiv, da die Sequenz sehr konserviert ist.
Das pol-Gen trägt die Information für die Enzyme PR, RT und IN, die das Virus u. a. für die
Replikation und Integration benötigt [22]. Die PR ist für die Prozessierung der Gag und der
Gag/Pol-Vorläuferproteine in die einzelnen Komponenten verantwortlich [10, 17]. Die RT
kann als RNA- und DNA-abhängige DNA-Polymerase wirken und hat die Aktivität einer
RNAse H, welche den RNA-Anteil der DNA/RNA-Hybriddoppelstränge abbaut [16, 17]. Da
die RT keinen Mechanismus zur Kontrolle der Lesegenauigkeit hat, wird ca. ein falsches
Nukleotid auf 10.000 Basen eingebaut [10, 23, 24]. Damit entstehen sehr schnell viele nah
verwandte, aber genetisch unterschiedliche HIV-Varianten (Quasispezies) [15]. Die IN wirkt
als Endonuklease, d. h. sie kann dsDNA schneiden, und als Ligase [16, 17]. Sie bindet sich
an die Enden des linearen, in dsDNA übersetzten Virusgenoms und ist für die Integration in
das Zellgenom verantwortlich [16].
Für die in die Membran eingelagerten Glykoproteine kodiert das env-Gen. Die beiden Proteine werden als ein gemeinsames Vorläuferprodukt translatiert. Bei HIV-1 ist dies gp160, welches in das externe gp120 und das transmembrane gp41 gespalten wird [22]. Diese beiden
Komponenten bilden einen heterotrimeren Glykoprotein Spike [25]. Gp120 besitzt in ver8
2. Einleitung
schiedenen Bereichen eine hohe Variabilität (V1 bis V5). Diese Bereiche sind durch Abschnitte mit hohem Konservierungsgrad getrennt (C1 bis C6) und unterscheiden sich nicht
nur bei HIV-Isolaten aus verschiedenen Patienten, sondern auch bei Folgeisolaten aus demselben Patienten zeigen sich im Verlauf der Erkrankung signifikante Unterschiede der Aminosäuren [10]. Die V-Regionen sind für die Bildung von gp120-spezifischen Antikörpern verantwortlich, von denen einige in der Lage sind, das Virus zu neutralisieren [10]. Der Selektionsdruck, den diese Antikörper ausüben, führt in Verbindung mit der hohen genetischen Variabilität der Retroviren, die auf der hohen Fehlerrate der Transkriptionsprozesse beruht, zur
kontinuierlichen Bildung neuer HIV-Varianten [10].
Das Tat-Protein (transactivator of transcription) wurde nur bei den Lentiviren identifiziert und
ist essentiell für die Virusreplikation [15, 26]. Zusammen mit Rev stimuliert es die Transkription von HIV-DNA in RNA und deren Elongation, fördert den Transport von HIV-RNA vom
Zellkern ins Zytoplasma und ist wichtig bei der Translation [15, 27]. Das Rev-Protein (regulator of expression of virion proteins) wird früh während der Infektion gebildet und sammelt sich
im Zellkern an. Es bindet an das RRE (rev response element) in der neu synthetisierten viralen RNA und einen zellulären Exportrezeptor, um den Kernexport der viralen RNA zu fördern
[16, 22]. Das Vif-Protein (viral infectivity factor) bildet einen Komplex mit APOBEC3G [28].
Dadurch wird verhindert, dass APOBEC3G G-zu-A-Hypermutationen in die provirale DNA
einführt [10]. Vif wird spät in großen Mengen synthetisiert und ist unter den Lentiviren konserviert [18, 29]. Es wird für die HIV-1-Replikation in primären T-Lymphozyten und Monozyten oder Makrophagen benötigt [29]. Das Vpr-Protein (viral rapid protein) wird mit in den entstehenden Viruspartikel eingebaut und kann eine Reihe von zellulären und viralen Promotoren stimulieren [10, 15, 30]. Es ist unter HIV-1, HIV-2 und SIV (simian immunodeficiency virus, Affen Immundefizienz-Virus) stark konserviert und hilft beim Transport des
Präintegrationskomplexes in den Zellkern [19, 30]. Außerdem blockiert es den Zellzyklus in
der G2-Phase [18, 30, 31]. Das Vpu-Protein (viral protein out) wird im Genom von HIV-1 und
dem SIV der Schimpansen (SIVcpz) kodiert [31]. Es fördert v. a. in ruhenden Zellen die Freisetzung von Nachkommenviren, bindet an die zytoplasmatische Domäne des CD4Rezeptors und veranlasst dessen Ubiquitinilierung und nachfolgenden Abbau [18, 25]. Außerdem verstärkt Vpu die Abgabe der Viruspartikel [18]. Das Nef-Protein (negative factor)
wurde nur bei den Lentiviren gefunden und trägt zur Pathogenität des Virus bei [18, 32]. Es
weist eine hohe Variabilität in der Aminosäuresequenz auf und beeinflusst die Aktivierung
von T-Zellen durch die Wechselwirkung mit verschiedenen Proteinen, die an intrazellulären
Signalwegen beteiligt sind [15, 32]. Außerdem induziert Nef eine Herabregulation von CD4
und HLA-Klasse-I-Antigenen [16, 18, 31, 33] auf der Oberfläche der infizierten Zellen und
ermöglicht ein besseres Entkommen vor dem Angriff durch CTL [34].
9
2. Einleitung
2.1.4 Replikation am Beispiel von HIV
Das gp120 vermittelt die Adsorption an die Zielzellen. Bei HIV-1 ist der zelluläre Rezeptor
das CD4-Protein [18, 22, 35, 36]. Der CD4-Rezeptor ist auf der Oberfläche von THelferzellen, Makrophagen und Monozyten vorhanden. CCR5 und CXCR4 dienen als KoRezeptoren für den Eintritt der HIV-1-Varianten in Monozyten und Makrophagen bzw. TZellen [18, 37-39]. Es kommt zu einer Konformationsänderung in gp120 und die Bindestelle
für den Ko-Rezeptor wird zugänglich [16, 18, 25]. Danach verschmelzen Virushülle und Zytoplasmamembran und das Kapsid mit dem Genom sowie den Enzymen gelangt ins Zytoplasma [22, 25, 40, 41]. Dort wird die ssRNA durch die RT in dsDNA umgeschrieben [18,
25]. Diese provirale DNA wird in einem Präintegrationskomplex in den Zellkern transportiert
[20] und nach der Aktivierung der Zelle wird die provirale DNA durch die virale IN in die DNA
des Wirtes eingefügt [22, 25]. Zelluläre Transkriptionsfaktoren können die Expression der
viralen Gene initiieren, indem sie an den LTR-Bereich der integrierten, proviralen DNA binden. Die neu synthetisierte virale RNA wird ins Zytoplasma transportiert [20]. Die Translation
aller Vorläuferproteine findet an den Ribosomen im Zytoplasma statt. Am endoplasmatischen
Retikulum (ER) werden die Env-Proteine glykosiliert [16] und im Verlauf des Transportes
über den Golgi-Apparat zur Zelloberfläche werden die gp120- und gp41-Komponenten gespalten und bilden die Spikes auf der Oberfläche [15, 18, 25]. Die Pol- und GagProteinvorläufer bilden mit der viralen RNA das Nukleokapsid. Aus dem Vorläufer spaltet
sich autokatalytisch die Protease ab und schneidet die einzelnen Pol- und GagKomponenten im unreifen Viruspartikel [10, 22, 25]. Dieser Schritt ist für das folgende Ausknospen („Budding“) der reifen Viruspartikel aus der Zelle notwendig und findet währenddessen oder kurz danach statt [15, 16, 20]. Durch die Virusvermehrung sterben die Zellen ab.
2.1.5 Humanes Immundefizienz-Virus (HIV)
Epidemiologie und Übertragung
Das HI-Virus ist wahrscheinlich zu Beginn des vergangenen Jahrhunderts durch den Übergang des SIV vom Schimpansen auf den Menschen entstanden [15, 23, 24, 42]. Seit Beginn
der 1980er-Jahre hat sich die HIV-Epidemie über die ganze Welt ausgebreitet. Am schwersten betroffen ist die Region Subsahara-Afrika, wo ca. 22 Millionen HIV-infizierte Menschen
leben [15]. Wegen Sequenzunterschieden teilt man HIV-1 heute in vier Subtypen M (Major,
Haupt) mit den Genotypen (clades) A bis K, O (outlier, Ausnahme), N (new, neu) sowie P ein
[10, 23, 24]. HIV-1 M kommt weltweit vor. In Westeuropa und den USA ist der Genotyp B am
häufigsten verbreitet [10, 23]. HIV-1 O kommt v. a. in West-Zentralafrika vor, während N nur
in einer Handvoll Menschen in Kamerun gefunden wurde und P erst kürzlich in zwei Personen aus Kamerun identifiziert wurde [24]. HIV-1 M und N stammen von SIVcpz
10
2. Einleitung
(Chimpanzee, Schimpanse) während HIV-1 O und P wahrscheinlich von SIVgor (Gorilla)
abstammen [24]. HIV-2 wurde 1986 erstmals aus einem AIDS-Patienten isoliert und kommt
v. a. in Westafrika vor, wo es durch Mangaben übertragen wurde [23]. Man kennt heute verschiedene vermutlich unabhängig voneinander entstandene Genotypen (A bis H) [10, 23,
24]. HIV-2 zeigt ein AIDS-ähnliches Krankheitsbild, aber die Virulenz von HIV-2 ist deutlich
geringer als die von HIV-1 [23].
Bei HIV kann man die R5- und X4-Stämme unterscheiden. Die R5-Stämme verwenden
CCR5 als Ko-Rezeptor und infizieren Makrophagen und Lymphozyten [25, 38, 39, 43]. Sie
kommen v. a. in den frühen Stadien der Erkrankung vor, können keine Synzytien bilden und
zeigen eine langsamere Replikationsrate [19]. Deswegen werden sie auch als NSI(nonsyncytium-inducing)- bzw. M(Makrophagen)-trope Stämme bezeichnet [40]. Menschen mit
einer 32 bp Deletion im CCR5-Protein kodierenden Gen produzieren diesen Chemokinrezeptor nicht und können nicht mit der R5-Variante infiziert werden [44-47]. Die X4-Stämme binden dagegen CXCR4 als Ko-Rezeptor und infizieren insbesondere T-Zellen [18, 25, 37]. Sie
kommen v. a. in den späteren Krankheitsstadien vor, können Synzytien bilden und zeigen
schnelle Replikationsraten [19]. Daher werden sie auch als SI(syncytium-inducing)- oder T(TZellen)-trope Stämme bezeichnet [40]. Sie entwickeln sich im Infektionsverlauf durch kontinuierliche Mutationen aus dem ursprünglichen M-tropen Virus. Außerdem gibt es auch sog.
dual-trope Stämme, die entweder CCR5 oder CXCR4 als Ko-Rezeptor nutzen können [25].
Beim Menschen werden die HI-Viren durch kontaminiertes Blut und Blutprodukte sowie
durch Samen- und Vaginalflüssigkeit übertragen und gelangen direkt oder über Verletzungen
der Schleimhaut ins Blut [15]. Das Virus kann sowohl vor der Geburt als auch bei der Geburt
sowie beim Stillen von infizierten Frauen an ihre Kinder weitergegen werden [15]. Am häufigsten wird die Infektion aber durch Sexualkontakt übertragen [48]. Die Übertragung durch
Blut oder Blutprodukte tritt v. a. bei Menschen auf, die intravenös drogenabhängig sind und
untereinander die Spritzen austauschen [15].
Klinik und Pathogenese
Der Verlauf der HIV-Infektion lässt sich im Patienten in drei Phasen einteilen. Die 1. Phase
(Primärinfektion) verläuft meist inapparent. Einige Tage bis wenigen Wochen nach der HIVExposition manifestiert sich meist eine akute, grippeähnliche Erkrankung [49]. Diese akute
Phase dauert selten länger als vier Wochen [15, 41]. Die Patienten sind in dieser Phase virämisch und man findet z. T. große Virusmengen im Blut. Ein bis zwei Wochen nach der Infektion tauchen auch die ersten HIV-1-spezifischen CD8+ T-Zellen auf [50] und die Viruslast
sinkt ab. Daran schließt sich mit dem meist symptomfreien Latenzstadium die 2. Phase an,
die über mehrere Jahre anhalten kann [41]. In dieser Zeit sinkt die Zahl der CD4+ T-Zellen
als Folge der fortschreitenden Virusreplikation langsam ab. Über die Lymphbahnen werden
11
2. Einleitung
infizierte Zellen zu den Lymphknoten (und auch zu anderen Organen) transportiert, wo sie
weitere Zellen für die Vermehrung finden und gleichzeitig die Immunantwort stimulieren [48].
An die Latenzphase schließt sich die 3. Phase der Infektion an, in der die klinischen Symptome von AIDS auftreten [41]. Die Viruskonzentration im peripheren Blut nimmt wieder zu,
während die CD4+ T-Zellzahlen immer weiter abnehmen. Die fortschreitende Schädigung der
CD4+ T-Lymphozyten, Makrophagen und dendritischen Zellen (DC) führt zum Ausfall vieler
immunologischer Funktionen [22]. Davon sind auch die Zytokinproduktion und -sekretion
betroffen und indirekt werden die CD8+ T-Lymphozyten nicht aktiviert [40]. Außerdem werden
häufig auch nicht infizierte CD4+ und CD8+ T-Zellen durch Fas-vermittelte Apoptose abgetötet [51]. Durch das Fehlen der HIV-1-spezifischen Immunzellen ist das Immunsystem nicht
mehr in der Lage, die freigesetzten Viren abzufangen oder virusproduzierende Zellen zu eliminieren. In diesem letzten Stadium AIDS leiden die Patienten an mindestens einer Erkrankung, die in der CDC-Klassifikation der Kategorie C zugeordnet ist. Dies können u. a. opportunistische Infektionen wie z. B. ösophageale Candidadias, CMV-assoziierte Retinitis, Herpes Zoster oder das mit HHV8 (humanes Herpesvirus 8) assoziierte Kaposi-Sarkom sein
[41].
Nach der CDC-Klassifikation wird die HIV-Infektion in drei klinische Kategorien einteilt [15].
Die Kategorie A umfasst dabei das asymptomatische Stadium der Infektion mit > 500 CD4+
T-Zellen/µl. In Kategorie B werden symptomatischen Patienten ohne AIDS und 200-499
CD4+ T-Zellen/µl zusammengefasst und in der letzte Kategorie C sind Patienten mit Vollbild
AIDS und < 200 CD4+ T-Zellen/µl eingeteilt [15].
Abb. 2.3: Verlauf der HIV-1-Infektion
+
Dem Anstieg der Viruslast der primären HIV-1-Infektion folgt eine Zunahme der CD8 CTL, die in der
+
Lage sind, die Viruslast unter Kontrolle zu bringen. Die CD4 T-Zellzahlen nehmen zu Beginn ab und
+
bleiben während der asymptomatischen Latenzphase relativ stabil, bevor die wie sie CD8 TZellzahlen im AIDS-Stadium absinken Adaptiert von Sewell, 2000 [52].
12
2. Einleitung
Da das HIV-Genom durch die Fehlerrate bei den Transkriptionsvorgängen eine hohe Mutationsrate hat und gleichzeitig das Immunsystem einen Selektionsdruck auf das Virus ausübt,
verändert das Virus kontinuierlich die Epitope für die humorale und zelluläre Immunantwort
und kann den Abwehrmechanismen entgehen [10].
Immunreaktion und Diagnose
HIV-1-spezifische Antikörper können einige Wochen nach der Infektion detektiert werden.
IgM gegen Gag- und Env-Proteine sind ca. drei bis vier Wochen nach der Infektion im ELISA
und Western Blot (WB) nachweisbar [10]. Ihnen folgen dann IgG-Antikörper gegen Strukturproteine, die während der Latenzphase in konstanten Konzentrationen erhalten bleiben und
bei der Verschlechterung der klinischen Situation abnehmen [10].
HIV-1-spezifische CTL spielen nicht nur eine wichtige Rolle bei der Kontrolle der primären
HIV-1-Infektion [53], sondern auch in der chronischen Phase der Infektion [54]. HIV-1spezifische CD8+ T-Zellen gegen verschiedene HIV-1-Proteine erscheinen innerhalb von ein
bis zwei Wochen nach der Infektion [50]. Man findet große Unterschiede in der HIV-1spezifischen T-Zellantwort zwischen HIV-1-infizierten Langzeitüberlebenden und Progressoren hinsichtlich der Erkennung bestimmter Epitope und der Frequenz von CTL gegen bestimmte Epitope. Eine starke CTL-Antwort wurde in Langzeitüberlebenden (long-term nonprogressors, LTNP) beobachtet [55-57].
Zur Sicherstellung der HIV-1-Diagnose wird zuerst ein ELISA verwendet, der sehr sensitiv ist
und in dem neben HIV-1-spezifischen Antikörpern auch p24-Kapsidproteine nachgewiesen
werden. Da es aber zu falsch positiven Ergebnissen kommen kann, muss als Bestätigung
ein Western Blot mit einer neuen Blutprobe durchgeführt werden [41]. Der direkte Nachweis
von HIV-1 erfolgt durch die Detektion von HIV-1-RNA im Plasma mit Hilfe der PCR (Polymerase-Ketten-Reaktion) [15]. Für die Verlaufsbeurteilung der HIV-1-Infektion wird die quantitative Bestimmung der CD4+-T-Lymphozyten und die Viruslast durch die Messung der Anzahl
an HIV-1-RNA-Kopien/ml Blut durch PCR herangezogen und es werden Resistenzbestimmungen zur Therapiesteuerung durchgeführt [41].
Therapie
Seit 1996 wird die hochaktive antiretrovirale Therapie (HAART) bei der Eindämmung der
HIV-Infektion eingesetzt. Die vorhandenen Medikamente werden in fünf Gruppen unterteilt:
die Nukleosidischen Reverse Transkriptase-Inhibitoren (NRTI), die Nicht-Nukleosidischen
Reverse Transkriptase-Inhibitoren (NNRTI), die Protease-Inhibitoren (PI), die IntegraseInhibitoren und die Eintritts- oder Fusionshemmer. Die NRTI sind Analoge der Desoxyribonukleotide, denen eine 3´-OH-Gruppe fehlt [58, 59]. Sie konkurrieren mit den natürlichen
13
2. Einleitung
Nukleotiden um das aktive Zentrum der RT und können in DNA-Stränge eingebaut werden,
was zum Kettenabbruch führt [41]. Beispiele für NRTI sind u. a. Zidovudin (Azitothymidin,
AZT, Retrovir®), Lamivudin (3TC, Epivir®), Abacavir (ABC, Ziagen®) oder Tenofovir (TDF,
Viread®) [41, 60-62]. Die NNRTI binden nicht-kompetitiv an die RT wodurch die katalytisch
aktive Bindungsstelle blockiert wird. Zu ihnen zählen Nevirapin (NVP, Viramune®) und
Efavirenz (EFV, Sustiva®) [41, 60, 63]. PI sind Peptidanaloga, die an das aktive Zentrum der
Protease binden und so die Prozessierung von viralen Proteinen verhindern. Dazu gehören
z. B. Saquinavir (SQV, INV, Invirase®), Indinavir (IDV, Crixivan®), Nelfinavir (NFV, Viracept®),
Ritonavir (RTV, Norvi®), Darunavir (DRV, Prezista®) und Lopinavir (LPV/r, Kaletra®) [41, 60,
64, 65]. Seit 2007 sind auch Integrase-Inhibitoren auf dem Markt [66, 67]. Dazu gehört
Raltegravir (RAL, Isentress®), welches die Integration der viralen Nukleinsäure in das Wirtsgenom hemmt [66, 68]. Ebenfalls erst seit kurzem gibt es Eintritts- bzw. Fusionshemmer.
Diese bestehen aus Ko-Rezeptor-Antagonisten und Fusionsinhibitoren, welche die Verschmelzung zwischen Virus und Zellen verhindern. Für beide Gruppen steht bis jetzt nur ein
Medikament zur Verfügung mit Maraviroc (MVC, Selzentry®, Celsentri®), einem CCR5Antagonisten, und dem Fusionshemmer Enfuvirtid (T-20, Fuzeon®) [41, 59, 69]. Bei der antiretroviralen Therapie wird eine Kombinationstherapie, meistens bestehend aus zwei NRTI
und einem NNRTI oder PI, angewendet [70]. Dadurch soll sichergestellt werden, dass verschiedene Funktionen des Virus unterdrückt werden und Resistenzen gegen die Medikamente weniger häufig auftreten [29, 71]. Das Ziel der antiretroviralen Therapie ist die Unterdrückung der viralen Replikation sowie eine Erhöhung der CD4+ T-Zellzahlen. Die Viruskonzentration im peripheren Blut kann man bis unter die Nachweisgrenze von < 20 Kopien/ml
absenken und damit den Eintritt in das Vollbild AIDS verhindern [41]. Eine Heilung ist durch
die Therapie allerdings nicht möglich und die HAART ist mit starken Nebenwirkungen belastet. Eine Folge der Therapie können u. a. Lipodystrophie, Leberschäden und Herzinfarkte
sein [41]. Als problematisch erweist sich auch das rasche Auftreten von resistenten HIVVarianten, deren Replikation durch die Hemmstoffe nicht mehr beeinflusst werden kann.
Daher wird seit vielen Jahren intensiv an einem Impfstoff gegen HIV-1 geforscht und es wurden unterschiedliche Strategien verfolgt, die bisher noch zu keinem zugelassenen effizienten
Impfstoff geführt haben. Das Hauptproblem bei der Entwicklung eines effizienten Vakzins
liegt v. a. in der Fähigkeit des Virus, sich dem Immunsystem durch Mutationen zu entziehen.
Ein Ansatzpunkt liegt in der Suche nach neutralisierenden Antikörpern. Da die Oberflächenproteine von HIV-1, die geeignete Angriffspunkte für neutralisierende Antikörper darstellen
können, sehr variabel sind, gestaltete sich die Suche nach geeigneten breit neutralisierenden
Antikörpern schwierig. Daher richtet sich das Hauptaugenmerk vermehrt auf HIV-Impfstoffe,
welche in der Lage sind, eine T-Zell-Antwort zu induzieren. Hierbei werden häufig rekombinante Viren oder Proteine eingesetzt, welche die Immunantwort weiter erhöhen können. Ein
14
2. Einleitung
Beispiel stellt das modifizierte Vaccinia-Virus Ankara (MVA) dar, welches zusammen mit
HIV-Antigenen wie dem nef verwendet wurde und eine erhöhte CTL-Antwort induzierte [72].
Ein anderer Vektor wurde in der STEP-Studie, einer klinischen Studie Phase II von Merck,
verwendet. Dabei handelt es sich um das humane Adenovirus Serotyp 5 (Ad5). Diese Studie
wurde jedoch abgebrochen, da es in der immunisierten Gruppe im Vergleich zur PlaceboGruppe zu einer erhöhten Anzahl von HIV-Infektionen kam [73]. Eine zumindest teilweise
erfolgversprechende Studie wurde dagegen in Thailand durchgeführt, nämlich die RV144Studie, an der 16.402 Freiwillige teilnahmen [74]. Dabei wurden zwei verschiedene Vakzine
in einer Kombination verwendet. Bei dem ALVAC-HIV (vCP1521) handelt es sich um ein
rekombinantes Kanarienpockenvirus mit Spezifität gegen HIV-1 Gag, PR und gp120/gp41,
während AIDSVAX B/E rekombinante gp120-Moleküle enthält. Es zeigte sich, dass 31,2 %
weniger HIV-1-Infektionen in der immunisierten Gruppe – im Vergleich zur Placebo-Gruppe –
detektiert werden konnten und somit ein gewisser Schutz gegen die HIV-1-Infektion induziert
werden konnte [74].
2.1.6 Humane endogene Retroviren (HERV)
Etwa acht Prozent des humanen Genoms bestehen aus endogenen Retroviren, von denen
viele letale Mutationen angesammelt haben [75-77]. Diese retroviralen Sequenzen sind
Überreste früherer Retrovirusinfektionen, die sich im Laufe der Evolution im Genom angesammelt haben [78]. Die Keimbahnzellen unserer Vorfahren wurden vor ca. 40-70 Millionen
Jahren von Retroviren infiziert, welche sich im Genom weiter vermehrt haben und z. T. wichtige Funktionen für die Wirtszelle übernommen haben [78]. Seitdem kam es immer wieder
dazu, dass sich Retroviren über eine Infektion der Keimbahnzellen in das menschliche Genom eingefügt haben. Dieser hohe Anteil an retroviralen Sequenzen im Genom rührt daher,
dass die Viren ihr Genom zur Vermehrung in das Erbgut der Wirtszelle einbauen müssen.
Erfolgt diese Integration nun in einer Keimzelle des Wirtes, wird das integrierte Provirus zu
einem endogenen Retrovirus (ERV) und das virale Genom wird auf die Nachkommen des
Wirtes vererbt [78]. 26 verschiedene HERV-Familien wurden bisher beschrieben [14]. Sie
sind in unterschiedlichen Kopienzahlen im menschlichen Genom verteilt und können zwischen einer Kopie (HERV-R) und bis zu 103-104 Kopien (HERV-H) pro Genom variieren [79].
Die Einteilung erfolgt zuerst aufgrund der Ähnlichkeit zu exogenen Retroviren in drei Klassen. Klasse I HERV weisen Ähnlichkeit mit den γ-Retroviren auf, Klasse II HERV haben Ähnlichkeit mit β-Retroviren, während Klasse III HERV mit den Spumaviren verwandt sind [80,
81]. Die drei Klassen werden aufgrund der Primerbindestellen (Primer binding site, PBS),
welche die tRNA (transfer RNA) definiert, die für die reverse Transkription bevorzugt wird,
weiter unterteilt. Danach werden die Unterklassen der HERV benannt, z. B. werden diejenigen, welche eine Tryptophan tRNA benutzen, als HERV-W bezeichnet [80]. In der Klasse I
15
2. Einleitung
sind 18 HERV-Familien zu finden, während jeweils vier Familien in Klasse II und III eingeordnet sind [14]. Von den sechs HERV-Superfamilien, die bekannt sind, scheint HERV-K
(HML-2; human MMTV-like) die jüngste Familie zu sein [82] und ist auch die biologisch aktivste Form der bisher bekannten retroviralen Elemente, mit ca. 30-50 Kopien im humanen
Genom. Viele haben einen Leserahmen (Open reading frame, ORF) der für Gag-, Pol- und
Env-Proteine kodiert [83]. Bisher ist HERV-K die einzige Familie, bei der die Fähigkeit, virale
Partikel zu produzieren, noch vorhanden ist [84]. Diese Partikel sind aber nicht infektiös [85].
Die meisten HERV-K (HML-2) Viren haben eine oder mehrere Mutationen, welche die viralen
Gene unterbrechen. Eine Ausnahme ist eine Variante, welche auf Chromosom 7 liegt und
nur eine Punktmutation trägt, die zu einer Aminosäuresubstitution führt [81, 86]. Manche der
integrierten retroviralen Gene haben wichtige Funktionen im menschlichen Organismus
übernommen und kodieren für Proteine wie das Synzytin [87, 88], das bei der menschlichen
Fortpflanzung eine Rolle spielt. Es hat sich herausgestellt, dass das Env-Protein von HERVW mit dem Protein Synzytin identisch ist, welches für den Aufbau der menschlichen Plazenta
benötigt wird [89]. Synzytin 1 wird von den fetalen Zellen synthetisiert und ist für die Bildung
einer Zellschicht (der Synzytiothrophoblast) in der Plazenta verantwortlich, die durch Zellfusion entsteht [90]. Während der Differenzierung der Trophoblasten zu Synzytiotrophoblasten
kommt es zu einer kontinuierlich ansteigenden Expression einiger HERV, v. a. ERV3 (HERVR) [90, 91]. Gerade der Expression von ERV3 in der Plazenta wurden viele Rollen zugeschrieben, u. a. die Bereitstellung des immunologischen Schutzes des Embryos, die Regulation des Trophoblasten-Wachstums und der Schutz gegen Infektionen durch verwandte exogene Retroviren, genauso wie HERV-W [90, 91]. Auch von HERV-FRD wird das Env-Protein,
genannt Synzytin 2, in der Plazenta exprimiert [92].
Ein gutes Beispiel dafür, wie eine HERV-LTR die Gewebespezifität beeinflussen kann, ist
das Verdauungsenzym Amylase. Der Mensch hat fünf Amylase-Gene, von denen zwei in der
Bauchspeicheldrüse (Pankreas) und drei in der Speicheldrüse des Mundes aktiv sind. Die
Fähigkeit zur Speichelbildung verdankt der Mensch der Insertion eines HERV-Elements, das
den Pankreas-spezifischen Promotor eines Amylase-Gens in einen Speicheldrüsenspezifischen umwandelte [93].
Einige HERV werden auch mit verschiedenen Autoimmunerkrankungen in Verbindung gebracht [94]. Eine anormale Expression von endogenen retroviralen Sequenzen wurde in verschiedenen Erkrankungen wie Multipler Sklerose (MS), Schizophrenie, rheumatoider Arthritis
(RA), systemischer Lupus Erythematoses (SLE), Sjögren-Syndrom (SS) und Psoriasis beschrieben [95-101].
Es konnte auch gezeigt werden, dass die HERV-K Expression in HIV-1-infizierten Personen
erhöht war [85, 102] und eine T-Zellantwort gegen HERV wurde in HIV-1-infizierten Personen detektiert [103]. Außerdem wurde kürzlich veröffentlicht, dass eine starke HERV spezifi16
2. Einleitung
sche T-Zellantwort mit der Kontrolle der HIV-1-Infektion in der chronischen Infektion in Verbindung gebracht werden kann [82]. Hierbei konnten HERV-spezifische CTL gegen ein Epitop mit großer Homologie gegenüber einem HIV-1-spezifischen HLA-B51-restringierten Epitop detektiert werden [82].
2.2 Influenzaviren
Die Influenzaviren gehören zur Familie der Orthomyxoviren [104]. Die Familie der
Orthomyxoviridae gehört zusammen mit den Bunyaviridae und den Arenaviridae zu den Viren mit einem einzelsträngigen (single stranded, ss), segmentierten RNA-Genom in Negativstrangorientierung [10]. Sie benötigen für die Synthese der mRNA und für die Replikation die
RNA-abhängige RNA-Polymerase, die zusammen mit weiteren Viruskomponenten bei der
Infektion in die Zelle gelangt [10]. 1933 wurde das erste humanpathogene Influenza-A-Virus
durch Smith, Andrew und Laidlaw isoliert [105]. Die Influenzaviren werden aufgrund der Expression von 16 Hämagglutinin (HA) und neun Neuraminidase (NA) in Subtypen eingeteilt
[104, 106].
2.2.1 Einteilung und charakteristische Vertreter
Man unterscheidet bei den Influenzaviren drei Gattungen A, B und C. Influenza-A- und -BViren haben acht Genomsegmente, die für elf verschiedene Proteine kodieren [104, 107],
während Influenza-C-Viren sieben Genomsegmente haben [10]. Influenza-A- und -B-Viren
kodieren für ein Hämagglutinin (HA) und eine Neuraminidase (NA) als Oberflächenproteine,
während Influenza-C-Viren beide Eigenschaften im Hämagglutinin-Esterase-Fusionsprotein
(HEF) vereinigen [10]. Das natürliche Reservoir der Influenza-A-Viren sind Wasservögel
[104, 106], aber sie können auch eine Reihe von Säugetieren und den Menschen infizieren
[106]. Die Influenza-B-Viren wurden dagegen bisher nur aus dem Menschen und Robben
isoliert, während Influenza-C-Viren bei Menschen und Schweinen gefunden wurde [10].
2.2.2 Aufbau
Die Viruspartikel der Orthomyxoviren sind pleomorph [107], d. h. sie unterscheiden sich hinsichtlich ihrer Größe und Form stark. Man findet v. a. sphärische Formen mit einem Durchmesser von 120 nm, aber auch filamentöse Virionen [10, 107-109]. Sie bestehen aus segmentierten Nukleokapsiden, die von einer Hüllmembran umgeben sind. In diese sind bei Influenza-A- und -B-Viren die glykosylierten Oberflächenproteinen HA und NA eingelagert. Das
HA-Protein vermittelt den Viruseintritt in Zellen, bindet an Rezeptoren und kann Membranen
fusionieren [107, 110]. Bei den Influenza-A-Viren sind 16 verschiedene Varianten bekannt
(H1-H16) [104, 106]. Das NA-Protein vermittelt die enzymatische Spaltung des viralen Rezeptors in den späten Stadien der Infektion und erlaubt die Abgabe von Nachkommenviren
17
2. Einleitung
[107, 110]. Es gibt neun verschiedene Subtypen N1-N9 [104, 106], gegen die neutralisierende Antikörper gebildet werden. Sie hemmen zwar nicht die Bindung der Viren an den Rezeptor verhindern aber bis zu einem gewissen Grad die Ausbreitung des Virus im Organismus.
Ein drittes integrales Membranprotein ist das M2-Protein, das zusammen mit dem M1Protein kodiert wird. Das M2-Protein ist ein Protonenkanal, der eine Rolle beim Viruseintritt
spielt, genauso wie beim Zusammenbau und beim Budding [107]. Das Matrix-Protein M1
befindet sich in der viralen Hülle und vermittelt bei Interaktionen zwischen der viralen
Lipidmembran und dem Nukleokapsid [107]. Es liegt in hoher Kopienzahl vor und wird auch
mit dem Nukleoprotein (NP) des Nukleokapsids in den entstehenden Viruspartikeln verbunden [10]. Die RNA-Segmente sind über die gesamte Länge mit Nukleoproteinen komplexiert
[104], welche die Bindung und Verpackung des viralen Genoms vermitteln [107]. Das NP
vermittelt den Transport in den Zellkern und ist während des Replikationszykluses in freier,
nicht RNA-gebundener Form für den korrekten Ablauf der Genomreplikation notwendig. Zusätzlich zum NP sind v. a. an den Enden der Genomsegmente die P-Proteine aus den Komponenten PB1, PB2 und PA assoziiert [104, 107]. Diese Proteine haben die Aktivität einer
RNA-abhängigen RNA-Polymerase. PB1 ist verantwortlich für die gesamte RNA-Synthese,
während PB2 und PA bei der RNA-Replikation und Transkription mitwirken [104]. Dabei werden drei andere Proteine exprimiert, die nicht in das reife Virion aufgenommen werden. Dazu
zählt das Nichtstrukturprotein 1 (NS1), welches u. a. eine wichtige Rolle bei der Verteidigung
gegen das Immunsystem des Wirtes spielt [107]. Außerdem das NS2-Protein (NEP nuclear
export protein), welches eine wichtige Rolle beim Export der viralen Nukleokapsidsegmente
aus dem Zellkern ins Zytoplasma spielt, sowie das PB1-F2-Protein, welches bei der Einleitung der Apoptose der Wirtszelle mitwirkt [107].
2.2.3 Replikation
Die Influenzaviren binden sich über das HA-Protein an N-Acetylneuraminsäuren oder 9-OAcetyl-N-Acetylneuraminsäure auf der Zelloberfläche der Zielzelle und dringen durch Rezeptor vermittelte Endozytose in die Zelle ein [104]. Dabei umschließt die Zellmembran das gebundene Viruspartikel und nimmt sie in Vesikeln auf. Durch eine Ansäuerung des Endosomenvesikels verändert das HA-Protein seine Konformation und es kommt zur Verschmelzung der beiden Lipiddoppelschichten sowie zur Aktivierung des M2-Protonenkanals [107,
111]. Die Nukleokapside dissoziieren vom M1-Protein und werden durch die Kernporen in
den Zellkern transportiert, wo die Transkriptions- und Replikationsschritte ablaufen [107]. Die
anschließende Translation erfolgt an der Membran des ER. Über den Golgi-Apparat und
über Golgi-Vesikel werden die Proteine nicht nur zur Zelloberfläche transportiert und interagieren zu Komplexen sondern werden auch glykosiliert [10]. Die Synthese von neuen VirusProteinen wird benötigt, damit die Replikation ablaufen kann [112]. An das Nukleokapsid
18
2. Einleitung
binden sich M1-Proteine und die Komplexe werden durch die Exportfunktion der NS2/NEPProteine aus dem Zellkern ins Zytoplasma transportiert. Die Membran, in die HA-, NA- und
M2-Proteine eingelagert sind stülpt sich aus, umschließt das Nukleokapsid und dieser Partikel werden durch Knospung an die Oberfläche abgegeben [10].
2.2.4 Epidemiologie und Übertragung
Die Influenzaviren werden v. a. durch virushaltige Aerosole und Tröpfcheninfektion übertragen und verursachen beim Menschen die Grippe (Influenza), eine schwere Erkrankung der
Atemwege und des gesamten Organismus [113]. Die Krankheitsverläufe bei den InfluenzaA- und -B-Viren ähneln sich, Infektionen mit dem Influenza-C-Virus rufen beim Menschen
keine Symptome hervor [10]. Alle Influenzaviren haben zoonotisches Potential. Die Übertragung der Viren von Hühnern oder Schweinen auf den Menschen kommt vor und ist z. T. Ursache für große Influenzaepidemien [10]. Influenza-B-Viren rufen häufig die saisonale Influenza hervor, können aber im Gegensatz zu Influenza-A-Viren keine Pandemie auslösen
[110]. Influenza-A-Virusinfektionen treten in der menschlichen Bevölkerung in relativ regelmäßigen Abständen als Pandemie auf. Die größte Pandemie war 1918-1920 die Spanische
Grippe mit einem Influenza-A/H1N1-Virus, der eine ungewöhnlich hohe Mortalität v. a. unter
jungen Erwachsenen aufwies [106, 114-117]. Die Spanische Grippe forderte mindestens 20
Millionen Todesopfer [118]. 1957/1958 folgte die Asiatische Grippe mit einem H2N2-Virus,
hervorgerufen durch eine Reassortante aus einem humanen und einem aviären Virus [106,
117]. Die nächste größere Pandemie war 1968/69 die Hongkong-Grippe mit einem H3N2Virus [106, 117]. Diese beiden Pandemien verursachten schätzungsweise 500.000 bis 2 Millionen Todesopfer [117]. Zuletzt kam 2009/10 die Neue Grippe („Schweinegrippe“) mit dem
H1N1-Subtyp auf [113, 115, 119]. Sie wurde in Mexiko und den USA beschrieben und verbreitete sich über die gesamte Welt [117]. Dieser H1N1-Subtyp unterschied sich deutlich in
verschiedenen Gensequenzen vom saisonalen H1N1-Subtyp [117].
Ähnlich wie beim Menschen verursachen Influenza-A-Viren bei Schweinen und Pferden Infektionen des Respirationstraktes [10]. Bei Vögeln sind die Influenzaviren praktisch weltweit
in Wassergeflügel wie Enten, Gänsen und Möwen verbreitet und die Infektionen verlaufen
subklinisch [104, 106]. Die Viren vermehren sich hier im Gastrointestinaltrakt und werden mit
dem Kot der Vögel ins Wasser ausgeschieden. In kalten Gewässern können die Viren über
Tage und Wochen infektiös bleiben [10]. Bestimmte Subtypen verursachen bei Vögeln eine
systemische Infektion und schwere Erkrankungen [10]. Gelegentlich kann es vorkommen,
dass sich Menschen mit aviären Influenzaviren anstecken. Die ersten Infektionen mit dem
hoch pathogenen aviären H5N1-Subtyp tauchten 1997 in Hongkong auf [106, 120, 121].
2003 kam es erneut zu einem größeren Ausbruch, der bis nach Europa und Afrika schwappte und tödlich für Geflügel war [106].
19
2. Einleitung
Die Evolution des Genoms der Influenza-A-Viren beruht auf einem komplexen Zusammenspiel von Mutationen und der Bildung von Reassortanten, ermöglicht durch das in Segmenten vorliegende Genom [106, 110]. Der Austausch einzelner Genomsegmente wird als Antigenshift bezeichnet. Die Voraussetzung dafür ist, dass Virusstämme mit verschiedenen HAund NA-Subtypen zugleich in einem Organismus und in derselben Zelle vorliegen [122]. Dadurch entsteht eine Kombination aus den verschiedenen HA- und NA-Subtypen der beiden
Viren in den Nachkommen. Beim Antigendrift verändern sich im Verlauf einer Pandemie oder
danach die Oberflächenproteine, v. a. in Bereichen der HA- und NA-Proteine, die für die Bindung neutralisierender Antikörper verantwortlich sind. Sie beruhen auf Punktmutationen in
den für sie kodierenden Genabschnitten, da die RNA-abhängige RNA-Polymerase eine Fehlerrate beim Einbau der komplementären Basen im Replikationsprozess hat [110, 122]. Die
Antikörper üben einen Selektionsdruck aus und somit Viren werden bevorzugt, bei denen
oberflächenexponierte Bereiche der Proteine verändert sind, welche die Bildung neutralisierender Antikörper induzieren. Das Virus kann so längere Zeit in der Bevölkerung persistieren
[10].
Abb.2.4: Darstellung von Genomsegmentaustausch bei Antigenshift und Veränderung der
Oberflächenstrukturen bei Antigendrift
Bei Antigendrift verändern sich durch Punktmutationen in den entsprechenden Genen die HA- und
NA-Proteine. Beim Antigenshift werden einzelne Gensegmente ausgetauscht, wenn zwei verschiedene Virusstämme in einem gemeinsamen Wirt zur gleichen Zeit vorkommen.
Abb. von Wikipedia: U.S. Food and Drug Administration Description (2006), Diagram of antigenic shift
vs. antigenic drift in influenza virus, URL: http://commons.wikimedia.org/wiki/File:Antigenic_drift_
vs_shift.png (Stand: 23.10.2006)
2.2.5 Klinik und Pathogenese
Die Influenzaviren gelangen beim Menschen und bei Säugetieren über Tröpfcheninfektion in
den Organismus und infizieren Epithelzellen der Mund-, Nasen- und Rachenschleimhaut
[110]. Von hier aus breiten sich die Viren in den unteren Respirationstrakt aus. Eine virämische Phase, in der das Virus im Blut vorhanden ist, kommt nicht vor. Die Inkubationszeit der
Influenza beträgt vier bis fünf Tage [113]. Die Erkrankung beginnt mit dem plötzlichen Einsetzen von Kopfschmerzen, Kältegefühl, Schüttelfrost und Husten. Bis zu 41 °C hohes Fieber, Muskelschmerzen, Appetitlosigkeit und ein allgemeines Schwächegefühl folgen [113].
20
2. Einleitung
Diese Phase dauert ca. drei Tage, dann geht das Fieber zurück und nach sechs Tagen normalisieren sich die Werte; das Virus ist aus dem Körper eliminiert. Schwere Verläufe kommen beim erstmaligen Kontakt mit einem Pandemievirus auch bei gesunden Kindern und
Jugendlichen vor [10]. Eine schwere, lebensbedrohliche Grippe tritt auf, wenn sich im Anschluss eine Lungenentzündung (primäre virale interstitielle Pneumonie, oft hämorrhagisch)
entwickelt [113]. Diese kann auch sekundär durch bakterielle Überinfektion (z. B. durch
Streptococcus pneumoniae) entstehen [113]. Influenza-B-Infektionen im Menschen verlaufen
sehr ähnlich. Tödliche Erkrankungen mit primärer viraler Lungenentzündung gibt es allerdings nicht [10].
2.2.6 Immunantwort
Die Eliminierung des Virus aus dem Organismus geschieht v. a. durch CTL, welche Epitope
im NP-Protein erkennen [123]. NP-Proteine sind relativ hoch konserviert, deswegen liegen
nach einer Erstinfektion CD8+ T-Gedächtniszellen vor, die bei Folgeinfektionen schnell reaktiviert werden können und zu einer schnellen Eliminierung der virusinfizierten Zellen beitragen [10]. Virusspezifische CD4+ T-Helferzellen sind für die Induktion und Verstärkung der
humoralen Immunantwort wichtig und nicht für die direkte Eliminierung infizierter Zellen. Sie
sezernieren, wie auch schon die zu Infektionsbeginn vorhandenen aktivierten Makrophagen
und NK-Zellen (Natürliche Killerzellen), Interferone und Zytokine [10]. Dies fördert die Einwanderung weiterer T-Zellen und Makrophagen in das infizierte Gewebe. Im Infektionsverlauf werden IgM-, IgA- und IgG-Antikörper gebildet [10]. Die Influenza induziert lebenslang
anhaltende Antikörperreaktionen, die vor der Reinfektion mit dem gleichen Virussubtyp relativ effektiv schützen. Neutralisierende IgG- und IgA-Antikörper sind gegen HA-Proteine gerichtet [10].
2.2.7 Therapie
Es gibt zurzeit zwei Klassen an antiviralen Medikamenten zur Behandlung von InfluenzaInfektionen. Adamantane wie Amantadin und Rimantadin (Flumadine®), blockieren den Protonenkanal des M2-Proteins und hemmen so die Virusreplikation auf der Stufe der PartikelAufnahme und der Freisetzung der Nukleokapside im Zytoplasma [106]. Allerdings sind die
meisten humanen H1N1-, H3N2- und manche H5N1-Subtypen resistent gegen diese Medikamente [106]. Außerdem sind zwei Neuraminidase-Hemmstoffe, Oseltamivir (Tamiflu®) und
Zanamivir (Relenza®), auf dem Markt, welche die Aktivität der Neuraminidase blockieren und
damit die Freisetzung von neugebildeten Viren unterbinden [106, 113].
Impfstoffe sind gegen Influenza-A- und -B-Viren vorhanden. Abgetötete Viren, die in bebrüteten Hühnereiern gezüchtet werden, werden dafür verwendet. Wegen der hohen Variabilität
21
2. Einleitung
werden die Impfstoffe jährlich an die aktuell zirkulierenden Virustypen bzw. Subtypenvarianten angepasst [10, 113, 124].
2.3 Epstein-Barr-Virus (EBV)
Das Epstein-Barr-Virus (EBV) oder auch humanes Herpesvirus 4 (HHV4) gehört zu der Familie der Herpesviridae [125], die zusammen mit den Hepadnaviridae, Polyomaviridae,
Papillomaviridae, Adenoviridae und den Poxviridae zu den Virusfamilien mit einem doppelsträngigen (ds) DNA-Genom zählen [10]. Herpesvirusinfektionen kommen beim Menschen
und bei vielen Wirbeltieren wie z. B. Pferden, Schweinen und Hühnern vor [125]. Die Vermehrung des dsDNA-Genoms sowie die ersten Schritte der Morphogenese erfolgen im Zellkern [125]. Die Wirtszellen, in denen sich die Herpesviren lytisch vermehren, sterben bei der
Produktion der Nachkommenviren ab [125]. Ein weiteres charakteristisches Merkmal ist,
dass diese Viren nach der Erstinfektion latent im Organismus verbleiben können [125]. Dabei
ist die Produktion von infektiösen Partikeln unterbunden und die Zellen überleben. Das Virus
kann aber aus der Latenz in den lytischen Infektionszyklus reaktiviert werden [126].
2.3.1 Einteilung und charakteristische Vertreter
Die Vertreter der Herpesviridae lassen sich drei Unterfamilien zuordnen; es sind acht humane Herpesviren bekannt [125, 127]. α-Herpesviren haben ein breites Zellspektrum und replizieren schnell. Dazu zählen die Herpes-Simplex-Viren (HSV-1 und -2) sowie das VarizellaZoster-Virus (VZV), die beim Menschen einen bläschenartigen Hautausschlag verursachen
[125]. β-Herpesviren replizieren sehr langsam und haben ein enges Wirtsspektrum [125].
Dazu gehören neben dem Cytomegalievirus (CMV) das humane Herpes-Virus 6 (HHV-6)
und HHV-7, welche beide ein Drei-Tage-Fieber als Krankheitsbild haben. CMV kann bei präoder perinatalen Infektionen zu Schädigungen der Embryonen oder neugeborener Kinder
führen [128]. γ-Herpesviren haben ein sehr enges Wirtsspektrum, sie infizieren entweder Boder T-Zellen und induzieren in ihnen Viruslatenz [125]. Dazu gehören EBV, der Erreger des
Pfeifferschen Drüsenfiebers und das HHV-8, das mit dem Kaposi-Sarkom und bestimmten
Lymphomen assoziiert ist [125].
2.3.2 Aufbau
Die Viren haben einen Durchmesser von 150-180 nm [127] und bestehen aus mehr als 30
Strukturproteinen. Im Inneren des Partikels befindet sich das Virus-Core, eine fibrilläre Proteinmatrix, mit der das lineare dsDNA-Genom assoziiert ist [125, 127]. Dieses Core ist von
einem ikosaedrischen Kapsid umgeben und besteht aus 162 Capsomeren [125]. Die Kapside sind von einer Hüllmembran umgeben, in die virale Glykoproteine eingelagert sind [125].
22
2. Einleitung
Zwischen den Kapsiden und der Membran liegt das Tegument, eine unstrukturierte Proteinmatrix, die bis zu 20 Virus-Proteine enthält und bei der Infektion mit in die Zelle gelangt [10].
Die beiden DNA-Stränge kodieren für insgesamt über 100 Genprodukte [125], die z. T. von
miteinander überlappenden Leserahmen exprimiert werden. Die Expression der meisten Gene wird von spezifischen, dem Leserahmen vorgelagerten Promotoren kontrolliert. Der Promotorbereich hat neben den Erkennungsstellen für die eukaryotische RNA-Polymerase II
Bindungsstellen für zelluläre und virale Transaktivatoren, die bestimmen, zu welchem Zeitpunkt des Infektionszyklus das entsprechende Gen aktiviert und exprimiert wird [10].
2.3.3 Proteine
Virus-Proteine des lytischen Zyklus
Bei EBV gibt es drei immediate-early-Gene (BZLF1, BRLF1 und BMLF1) [129], die transaktivierende Funktionen haben. BZLF1 spielt eine wichtige Rolle bei der Unterbrechung der Latenz sowie der Aktivierung der viralen Replikation und stimuliert die Aktivität verschiedener
EBV-Promotoren, darunter auch den BMLF1-Promotor [129]. Zuerst erfolgt die Aktvierung
der early (frühen) Genexpression, gefolgt von der lytischen viralen Genomreplikation und der
late (späten) Genexpression [130]. Das BMLF1-Genprodukt scheint auch verschiedene
Promotoren zu transaktivieren, wahrscheinlich durch einen posttranskriptionalen Mechanismus [129].
Das vom Leseraster BCRF1 kodierte Produkt ist ein IL-10-Homolog und induziert die Synthese von IFN-γ sowie die CTL-Antworten und die Hochregulation der MHC-I-Expression
[126, 131]. Das von BHRF1 kodierte EA/R (restricted early antigen) ist ein virales Bcl-2
Homolog und schützt infizierte B-Zellen und Epithelzellen vor Apoptose [126, 132].
Virus-Proteine der Latenz
EBV synthetisiert während der latenten Infektion nur zehn verschiedene Proteine. EBNA1
(EBV nuclear antigen), EBNA2, EBNA3A, EBNA3B und EBNA3C, EBNA-LP (leader protein)
sind Kernproteine und zusammen mit den latenten Membranproteine LMP1, LMP-2a, LMP2b sowie BHRF1 in vitro für die Etablierung des nicht produktiven Zyklus der B-Zellen nötig
[133, 134]. Die B-Lymphozyten werden durch die Aktivität dieser Proteine immortalisiert.
EBNA1 wird in jeder transformierten Zelle gebildet und ist für die Aufrechterhaltung des
immortalisierten Zustands und der Viruslatenz nötig [133]. Es stellt die Verbindung zwischen
der DNA von EBV und der Zelle her; so ist gewährleistet, dass die virale Erbinformation während der Mitose zusammen mit den Chromosomen auf die Tochterzellen verteilt wird [135137]. Unter bestimmten Bedingungen kann EBNA1 die Apoptose hemmen [133, 138, 139].
EBNA2 ist für die Etablierung der Latenz und des immortalisierten Stadiums essentiell. Es
blockiert die lytische Replikation in der Mehrheit der EBV-infizierten Zellen und verhindert die
23
2. Einleitung
Eliminierung von EBV durch das Immunsystem [126]. EBNA3, EBNA4 und EBNA6
(EBNA3A, 3B und 3C) werden in tandemartigen Genen kodiert, haben eine ähnliche Organisation und sind vermutlich mit der transkriptionellen Regulation assoziiert [133]. EBNA5
(EBNA-LP) wird in B-Zellen schon acht bis zwölf Stunden nach der Infektion zusammen mit
EBNA2 exprimiert und verstärkt die Transaktivierung von EBNA2 [133]. LMP1 hat Eigenschaften, die es als potenzielles Onkogen ausweisen und inhibiert die Differenzierung von
Epithelzellen [10]. LMP1 und LMP2A wirken als Überlebenssignale der infizierten B-Zelle
[126].
2.3.4 Replikation
Lytischer Infektionszyklus
Bei EBV findet eine Interaktion zwischen gp350 und dem zellulären CD21-Protein zur Adsorption statt [126, 127, 130]. Danach verschmelzen die Membranen der Viruspartikel und
der Zelle miteinander; das Kapsid gelangt mit dem Tegument ins Zytoplasma und das Genom wie auch die viralen Proteine werden in den Kern transportiert [127, 130]. Das DNAGenom zirkuliert und liegt als Episom im Kernplasma vor [10]. Zuerst werden immediateearly-Proteine wie BZLF1 und BRLF1 synthetisiert [126, 127, 130], die Transkriptionsfaktoren kodieren, welche essentiell für die Einleitung der Replikation sind. Sie aktivieren die
Promotoren der early-Gene, bestehend aus sechs viralen Genprodukten. Dazu gehören u.a.
Gene, welche für die virale DNA-Polymerase, eine Primase und eine Helikase kodieren [126,
140-143]. Die Replikation der Virus-DNA während des lytischen Vermehrungszyklus folgt
dem Prinzip des rolling cycle [10]. Zeitgleich mit der DNA-Synthese werden die späten Virusgene exprimiert. Die Bildung der Glykoproteine erfolgt an der Membran des ER. Ein Teil
der Glykoproteine wird zur Zelloberfläche transportiert und in die Zytoplasmamembran eingelagert [10]. Im Zellkern werden die Strukturproteine zu Partikelvorläufern zusammengebaut.
Die Membran stülpt sich aus und umhüllt die Kapside, die sich im Bereich zwischen innerer
und äußerer Kernmembran ansammeln [10]. Von hier werden sie ins ER transportiert. Durch
die Verschmelzung der Kern- und der ER-Membran werden die tegumenthaltigen Nukleokapside ins Zytoplasma entlassen und mit der endgültigen Hüllmembran umgeben [10]. Abschließend reifen die Partikel zu infektiösen Virionen und werden zur Zelloberfläche transportiert, wo die Freilassung erfolgt [10].
Latenter Infektionszyklus
Das Ergebnis der primären EBV-Infektion sind viele EBV-infizierte B-Zellen, die ständig proliferieren und in denen die Apoptose unterdrückt wird. Die Zellen differenzieren sich zu
immortalisierten ruhenden Gedächtnis-B-Zellen [10]. Sie können in den Tonsillen vorkommen, in die periphere Blutzirkulation eindringen und ein Leben lang persistieren [126]. Das
24
2. Einleitung
EBV-Genom zirkuliert und die Virus-DNA liegt während der Latenz als extrachomosomales
Episom vor [125, 130]. Es wird parallel mit dem Zellgenom durch die zelluläre DNAPolymerase repliziert und an die Tochterzellen weitergegeben [127]. Die Expression der
immediate-early-Gene wird durch zellspezifische Faktoren inhibiert [10].
2.3.5 Epidemiologie und Übertragung
1958 beschrieb Dennis Burkitt ein Lymphom, das in Ost- und Zentralafrika bei Kindern und
Jugendlichen die häufigste Tumorerkrankung ist [133, 144]. Der Erreger ist EBV. Das Virus
ist weltweit verbreitet und ca. 95 % aller Erwachsenen sind seropositiv [133]. Alle Infizierten
haben nach der Primärinfektion lebenslang EBV-positive B-Zellen im Blut [134]. Außerdem
spielt EBV eine Rolle bei Krankheiten wie dem Hodgkin-Lymphom, dem Burkitt-Lymphom
sowie weiteren Lymphomen, bei der posttransplantativen lymphoproliferativen Erkrankung
(PTLD, post-transplant lymphoproliferative disorder) [134, 145, 146] und bei Tumoren der
Nase oder des Kehlkopfes (Nasopharynxkarzinom) [134, 147]. Es gehört damit zusammen
mit dem Hepatitis-B-Virus (HBV), dem Hepatitis-C-Virus (HCV), dem humanen Papillomvirus
(HPV), dem HTLV-1 und dem HHV8 (auch Kaposi-Sarkom-Herpesvirus KSHV) zu einer
Gruppe von humanen Viren, die weltweit für 10-15 % aller Krebserkrankungen verantwortlich
sind [148]. Des Weiteren wird es auch in Zusammenhang mit einer Reihe von Autoimmunerkrankungen gebracht wie z. B. Multiple Sklerose (MS), systemischer Lupus Erythematodes
(SLE) und rheumatoide Arthritis (RA) [149-154].
Die Übertragung erfolgt über Tröpfcheninfektion oder eine Kontakt- bzw. Schmierinfektion
[10]. EBV wird nach der Primärinfektion lebenslang in unterschiedlichen Mengen über den
Speichel ausgeschieden, weswegen sie oft auch als „Kissing Disease“ bezeichnet wird [10].
2.3.6 Klinik und Pathogenese
Bei der Primärinfektion beträgt die Inkubationszeit vier bis sechs Wochen. Die Infektion mit
dem Virus erfolgt meist im Kindesalter und ist asymptomatisch [127, 133, 155]. Bei Jugendlichen oder Erwachsenen gibt es oft Anzeichen einer infektiösen Mononukleose (Pfeiffersches
Drüsenfieber) [127, 133, 155]. Die Erkrankung geht mit Halsschmerzen, Fieber und geschwollenen Lymphknoten einher [127]. Die Viren befallen die Lymphknoten und die Organe
des lymphatischen Rachenringes, aber auch Leber, Milz und Herz. Die Symptome klingen
nach ca. einer Woche ab, das Virus bleibt im Organismus und wird lebenslang mit dem
Speichel ausgeschieden [10]. Außerdem ist in den B-Zellen im Blut das Virus-Genom in latenter Form vorhanden und kann B-Zellen in vitro immortalisieren [133, 156]. In seltenen Fällen klingen die Symptome nicht ganz ab und es entwickelt sich eine chronisch-persistierende
Infektion, bei der sich das Virus auch lytisch vermehrt [10]. Die Symptome dieser chronischaktiven Infektion sind Müdigkeit, Abgeschlagenheit und Lymphknotenschwellungen. Sie kön25
2. Einleitung
nen über Monate bis Jahre andauern [10]. EBV-assoziierte, polyklonale B-Zell-Lymphome
findet man v. a. bei AIDS-Patienten und Empfängern von Organtransplantaten, deren zelluläres Immunsystem beeinträchtigt ist, welches normalerweise die unkontrollierte Proliferation
der B-Zellen verhindert [10].
2.3.7 Immunantwort
Die Verbreitung von EBV-infizierten B-Zellen während dem lytischen Zyklus wird v. a. durch
CD8+ zytotoxische T-Zellen kontrolliert, welche die infizierten B-Zellen abtöten und das latente Stadium in den verbleibenden EBV-infizierten B-Zellen induzieren [10]. Auch die zellvermittelte Immunität ist wichtig, um zu verhindern, dass die latente Infektion zur lytischen Replikation übergeht [10]. IFN-γ nimmt eine wichtige Vermittlerrolle bei der Immunantwort gegen
EBV ein, da die IFN-γ-Level in Patienten mit infektiöser Mononukleose stark angestiegen
sind [126]. In den frühen Stadien der primären Infektion werden auch Antikörper gegen EBVVCA und EBV-EA/D gebildet, während EBNA1-Antikörper später gebildet werden [126].
2.4 Chlamydien
Die Chlamydien stellen ein eigenes abgegrenztes Phylum innerhalb der Eubakteria dar. Zu
dieser Familie gehören die beiden Gattungen Chlamydia und Chlamydophila. Sie sind obligat
parasitär lebende Bakterien und haben daher schlecht entwickelte Stoffwechselfähigkeiten
[157]. In ihrer Replikation sind sie von der Wirtszelle abhängig [158]. Nach der Infektion mischen sich die Chlamydien in verschiedene zelluläre Funktionen ein, u. a. können sie die
zelluläre Apoptose-Maschinerie steuern [158]. Sie gehören zu den wenigen Prokaryoten,
deren Zellwand nicht aus Peptidoglykan besteht, aber es gibt ähnliche Verbindungen in ihrer
Zellwand [159].
2.4.1 Einteilung und charakteristische Vertreter
Neben Chlamydophila pneumoniae, dem Erreger einer Anzahl von Atemwegssyndromen,
zählt Chlamydia trachomatis, der Auslöser des Trachoms, zu den humanpathogenen Arten
dieser Familie [157]. Von C. trachomatis gibt es mehrere Untergruppen, die sich durch ihre
Oberflächenstruktur unterscheiden und in Serovare eingeteilt werden, die sich in drei Gruppen einordnen lassen [157]. Einige dieser Serovare zählen zu den am häufigsten sexuell
übertragenen Pathogenen weltweit [160]. C. pneumoniae ist weit verbreitet und infiziert die
Schleimhäute der Atemwege. Die Durchseuchung wird auf 50 % geschätzt [161]. C. psittaci
verursacht die Psittakose (Ornithose, Papageienkrankheit) bei Vögeln, die gelegentlich auch
auf den Menschen übertragen werden und grippeähnliche Symptome auslösen kann [157].
26
2. Einleitung
2.4.2 Aufbau und Vermehrungszyklus
Chlamydien besitzen einen gramnegativen Zellwandtyp und enthalten DNA und RNA. Sie
teilen sich durch Binärspaltung [157]. Man findet im Vermehrungszyklus zwei unterscheidbare Zelltypen, zum einen eine kleine dichte Zelle, das sog. Elementarkörperchen (EB). Dieses
ist relativ widerstandsfähig gegen Austrocknung, es ist nicht vermehrungsfähig und dient der
Ausbreitung des Erregers [159]; zum anderen das Initialkörperchen (Retikularkörperchen,
RB), welches größer ist und einen weniger dichten Inhalt hat. Es stellt die vegetative Form
des Krankheitserregers dar, ist nicht infektiös und kommt nur innerhalb der infizierten Wirtszellen vor, wo es DNA, RNA und Proteine synthetisiert [159]. Das EB wird durch die Atemwege übertragen und durch Phagozytose in die Zelle aufgenommen. Nach der Aufnahme
verbleibt es in einer Vakuole, in der die Umwandlung zum RB erfolgt [159]. Die RB fangen
an, sich zu teilen und zu vermehren. Abschließend erfolgt die Umwandlung in EB, die freigesetzt werden und weitere Zellen befallen können. Der komplette Entwicklungszyklus dauert
48 bis 72 Stunden [159]. Unter suboptimalen Wachstumsbedingungen unterbleibt der Entwicklungsschritt vom RB zum EB und die Chlamydien entwickeln ein chronisches persistierendes Stadium. Dabei weisen die Chlamydien eine anormale Morphologie und eine modifizierte metabolische Aktivität auf [162]. Werden die Bedingungen wieder besser, können die
persistierenden Chlamydien reaktiviert werden und ihren Wachstumszyklus abschließen
[162].
Abb.2.5: Schematische Darstellung des Lebenszyklus von Chlamydien
Das EB heftet sich an die Zelle an und wird durch Endozytose aufgenommen. Es erfolgt die Umwandlung vom EB zum RB. Die RB vermehren sich und wandeln sich dann wieder in die EB um, welche
dann von der Zelle durch Exozytose freigesetzt werden können. Adaptiert von Beatty, 1994 [159].
2.4.3 Symptome, Diagnose und Behandlung
C. pneumoniae sind weltweit ein häufiger Grund für Lungenentzündungen bei abwehrgeschwächten Menschen. Man schätzt, dass ca. zehn Prozent aller Pneumonien und fünf Prozent aller Bronchitis- und Sinusitis-Fälle auf Infektionen mit C. pneumoniae zurückzuführen
sind [160, 163]. Das Bakterium wird über die Luft übertragen und die Infektionen verlaufen
oft ohne Beschwerden oder sind nur mit leichten Halsschmerzen verbunden. Bei geschwächten Personen kann es zu Lungenentzündungen kommen, deren Symptome mit Fieber, Husten und Kurzatmigkeit nicht von einer anderen Lungenentzündung zu unterscheiden sind
[157]. Die Bakterien sind auch mit chronischen Erkrankungen wie z. B. Arteriosklerose,
27
2. Einleitung
Asthma oder chronischer obstruktiver Lungenerkrankung (COPD, chronic obstructive
pulmonary disease) assoziiert [162-164].
Die Diagnose von C. pneumoniae kann durch die Untersuchung des Sputums oder von Sekreten aus dem Rachenraum gestellt werden. Mit einer Blutuntersuchung kann man Antikörper oder auch Proteine durch ELISA oder PCR nachweisen [163]. Eine Infektion mit Chlamydien kann mit Antibiotika behandelt werden. Dazu werden v. a. Makrolide und
Tetracycline verwendet.
2.5 Immunsystem und Immunabwehr
2.5.1 Übersicht über die Immunantwort
Das Immunsystem kann Fremdsubstanzen, die von Pathogenen stammen und in den Körper
eingedrungen sind, erkennen. Dabei spielt die angeborene (unspezifische) und die adaptive
(spezifische) Immunantwort eine Rolle. Bei beidem wirken Zellen mit, die im Blut und der
Lymphflüssigkeit zirkulieren. Alle Zellen der Immunabwehr entwickeln sich aus einer gemeinsamen Vorläuferzelle im Knochenmark [157]. Aus dieser pluripotenten Stammzelle gehen myeloide und lymphoide Vorläuferzellen hervor. Aus den myeloiden Zellen entwickeln
sich die Mastzellen, die Monozyten und polymorphkernige Leukozyten [157]. Die Monozyten
können sich später weiter zu DC und Makrophagen differenzieren, die als antigenpräsentierende Zellen (APC) dienen können [157]. Aus den lymphoiden Vorläuferzellen entwickeln
sich die T- und B-Zellen [157]. Die T-Zellen reifen im Gegensatz zu den B-Zellen nicht im
Knochenmark, sondern im Thymus [165]. Die B-Zellen sind die Vorläufer der antikörperproduzierenden Plasmazellen, während die T-Zellen sich zu den CTL und T-Helferzellen differenzieren [157].
Wenn es einem Pathogen gelingt, die physikalischen und chemischen Barrieren der Haut
und der Schleimhäute zu durchdringen, schaltet sich zuerst die angeborene Immunantwort
ein [157]. Zu Beginn steht dabei der Kontakt einer körperfremden Substanz mit einem Phagozyten (Makrophagen, Monozyten, Neutrophile und DC), der die Substanz aufnimmt und
zerstört [166, 167]. Durch die Erkennung von Strukturen (PAMP, pathogen associated
molecular pattern) auf dem Pathogen durch spezifische Rezeptoren wird das Immunsystem
aktiviert und eine Entzündung ausgelöst [166]. Diese PAMP werden durch Mustererkennungsmoleküle (PRM, pattern recognition molecules), die auch TLR (Toll-like-Rezeptoren)
genannt werden, erkannt [168]. Jeder TLR registriert ein spezifisches PAMP, z. B. detektiert
TLR-4 das Lipopolysaccharid (LPS), das in der Zellwand aller gramnegativen Bakterien enthalten ist [166]. Die angeborene Immunantwort wird innerhalb von Stunden in Gang gesetzt
[157]. Die Mikroorganismen werden mit Blutkomponenten wie den Komplementproteinen
bedeckt, welche die Eindringlinge lysieren oder die Freisetzung lytischer Enzyme induzieren
[157].
28
2. Einleitung
Nehmen die Phagozyten wie Makrophagen, DC und auch B-Zellen die Pathogene auf, verdauen diese und präsentieren die Antigene als Peptide den T-Zellen, wird die adaptive Immunantwort eingeleitet [167]. Die T-Zellen erkennen das Peptid durch den antigenspezifische T-Zellrezeptor (TCR), der sich auf der Oberfläche der T-Zellen befindet [165, 169]. Die
TCRs einer bestimmten T-Zelle reagieren mit hoher Spezifität nur mit einem einzigen Antigen [165]. Die CTL greifen anschließend die Zellen, welche das passende Antigen tragen,
direkt an und zerstören sie. Andere antigenaktivierte T-Zellen, die TH1-Zellen (T-Helferzellen
Typ 1), wirken indirekt, indem sie Zytokine (wie IL-2 [Interleukin], TNF-α [Tumor-NekroseFaktor] und IFN-γ [Interferon]) freisetzen, durch die andere Zellen wie Makrophagen aktiviert
werden, um die antigentragende Zelle zu zerstören [167]. Die TH2-Zellen treten mit antigenspezifischen B-Lymphozyten in Wechselwirkung und regen die B-Zellen durch die Produktion
von IL-4, IL-5, IL-10 und IL-13 zur Bildung von Antikörpern an [167]. Jede B-Zelle und ihr
Antikörperprodukt ist spezifisch für ein einziges Antigen. Die antikörpervermittelte Immunität
ist besonders wirkungsvoll gegen Bakterien oder Viren, die sich im Blut oder der Lymphe
aufhalten, sowie gegen lösliche Produkte der Pathogene wie Toxine [157]. Die Antikörper
treten mit dem Antigen in Wechselwirkung, neutralisieren es dadurch oder markieren es für
die folgende Zerstörung [157]. Im Gegensatz zu den angeborenen Abwehrmechanismen, die
sehr unspezifisch fast alle einfallenden Mikroorganismen angreifen, ist die Reaktion einer
Antigen/Antikörper- oder Antigen/T-Zellwechselwirkung sehr spezifisch [157]. Aufgrund der
geringen Vorläuferfrequenz von Antigen-spezifischen Zellen benötigt die adaptive Immunantwort Tage bis Wochen bis sich die Antigen-spezifischen Zellen soweit vermehrt haben,
dass eine effektive spezifische Immunantwort ablaufen kann [157]. Wurde die adaptive Immunantwort einmal ausgelöst, richtet sie sich ausschließlich und spezifisch gegen das auslösende Pathogen und ein erneuter Kontakt mit demselben Erreger kann sehr schnell die Produktion von großen Mengen an antigenreaktiven T-Zellen und Antikörpern durch das Immungedächtnis anregen [170].
2.5.2 Entwicklung der T-Zellrezeptoren (TCR)
Für eine wirkungsvolle Immunantwort müssen die T-Zellen zwischen gefährlichen Nichtselbst-Antigenen und nicht gefährlichen Selbst-Antigenen unterscheiden und eine Toleranz
gegen Selbst-Antigene aufweisen [171]. Der erste Schritt der T-Zellreifung im Thymus ist die
positive Selektion. Dabei binden die T-Zellen mit ihrem neu gebildeten TCR an MHCProteine einer Thymuszelle, entwickeln sich weiter und durchlaufen im zweiten Reifungsschritt die negative Selektion, während T-Zellen, die nicht binden durch Apoptose getötet
werden [165]. Bei der negativen Selektion binden T-Zellen, die mit Selbst-Antigenen im
Thymus reagieren können, fest an die Thymuszelle und sterben ab; sie stellen eine Gefahr
als potenzielle autoreaktive T-Zellen dar [165]. T-Zellen, die an Fremd-Antigene binden, bin29
2. Einleitung
den nicht so stark an die Thymusepithelzelle, verlassen den Thymus und wandern zur Milz
und den Lymphknoten, wo sie mit Fremd-Antigenen in Kontakt kommen.
Der TCR ist ein integrales Membranprotein, das sich auf der Oberfläche der T-Zelle in die
extrazelluläre Umgebung erstreckt und aus einer α- und einer β-Kette besteht. Jede dieser
beiden Polypeptidketten hat eine variable (V-) und eine konstante (C-) Domäne; bei der βKette gibt es zwei verschiedene C-Domänen (TRBC) [165, 172]. Die CDR3-Region der αund β-Kette stellen die Kontaktstellen für das Peptid bereit und durch sie erhält der TCR seine Spezifität [165, 173-175], während die CDR1- und CDR2-Regionen in Kontakt mit dem
MHC-Protein treten [175]. Die TCR-α- und -β-Ketten werden von unterschiedlichen Gensegmenten der konstanten und variablen Domänen kodiert. Für die α-Kette sind ca. 43 variable
V-Gene (TRAV) und 58-61 J-Segmente (TRAJ) bekannt, für die β-Kette dagegen ca. 42 VGen- (TRBV), zwei D-Gen- (TRBD) und zwölf J-Gensegmente (TRBJ) [165, 172]. Die Gene
für die α-Kette sind auf Chromosom 14 zu finden, während die für die β-Kette auf Chromosom 7 liegen. Die V- und J-Gene der α-Kette sowie die V-, D- und J-Gene der β-Kette durchlaufen eine Rekombination zur Bildung funktioneller V-Regionen und durch die verschiedenen Gene kann eine große Vielfalt an unterschiedlichen α- und β-Ketten geschaffen werden
[165]. Zusätzlich wird durch das zufällige Hinzufügen von ein bis sechs Nukleotiden zwischen den V- und J-Gensegmenten der α-Kette und den D- und J-Gensegmenten der βKette die Diversität weiter erhöht, die CDR3-Region gebildet und die D-Region der β-Kette
kann in allen drei Leserastern transkribiert werden, wodurch die Diversität weiter erhöht wird
[165]. Beliebige individuelle α- und β-Ketten können von jeder T-Zelle gebildet und zu vollständigen α/β-Heterodimeren des fertigen TCR zusammengefügt werden [165].
Die Verbindung zwischen dem TCR und dem im MHC-Molekül gebundenen Peptid ist der
erste Schritt für den Zusammenbau eines Komplexes, der als immunologische Synapse bezeichnet wird. In diesem Komplex interagiert der TCR zusätzlich noch mit seinem KoRezeptor (dem CD8-Molekül bei den CTL und dem CD4-Molekül bei den TH-Zellen) und dem
CD3-Signalmolekül, um die Expression und Funktionalität zu gewährleisten [175]. Der KoRezeptor bindet auch an das MHC-Protein, verstärkt die Wechselwirkung und stabilisiert die
Bindung [175]. Beim CD8-Molekül gibt es zwei verschiedene Moleküle, zum einen das
CD8αα-Homodimer, welches v. a. auf T-Zellen im Darm gefunden wird, und das CD8αβHeterodimer [175]. Das CD3-Molekül besteht aus den Untereinheiten δ, ε, γ und ζ. Diese
Untereinheiten sind nicht kovalent miteinander assoziiert und bilden CD3ζζ-Homodimere
sowie CD3εδ- und CD3εγ-Heterodimere [175]. Die TCR α-Kette bindet an CD3εδ, während
die TCR β-Kette an CD3εγ bindet. Die TCR α-Kette steht außerdem noch mit dem CD3ζζHomodimer in Kontakt [175].
30
2. Einleitung
Abb. 2.6: Schematische Darstellung des TCR im Komplex mit dem CD3-Molekül
Erklärung siehe Text. Adaptiert von Govers et al., 2009 [176].
2.5.3 Der Haupthistokompatibilitätskomplex (MHC)
Die MHC-Proteine werden von dem Haupthistokompatibilitätskomplex kodiert, den man bei
allen Wirbeltieren finden kann. Beim Menschen werden die Gene in diesem Komplex als
Humane Leukozyten-Antigene (HLA) bezeichnet und liegen auf dem kurzen Arm von Chromosom 6 [177]. Von den MHC-Genen werden MHC-Proteine der Klasse I und II kodiert. Die
Klasse-I-MHC-Proteine findet man auf den Oberflächen aller kernhaltiger Zellen des Körpers
[169], während man Klasse II nur auf den Oberflächen von B-Zellen, Makrophagen und DC
findet [170]. Die MHC-I-Proteine bestehen aus zwei Polypeptiden, einer in die Membran eingebetteten α-Kette, die von Genen der chromosomalen MHC-Region kodiert werden, und
einem kleineren Protein, dem β2-Mikroglobulin (β2m), das von einem nicht zum MHC gehörenden Gen kodiert wird [174, 175]. Die MHC-I-Proteine können gleichzeitig mit einem Antigenpeptid und dem TCR in Wechselwirkung stehen. Die α-Kette faltet sich, so dass eine
breite Furche zwischen der α1- und α2-Domäne entsteht, in welcher das Antigen bindet
[178]. Die Furche ist an beiden Enden verschlossen, wodurch die Größe des Peptids auf
acht bis zehn AS beschränkt wird [174, 179]. Die MHC-II-Proteine bestehen aus zwei nichtkovalent miteinander verknüpften integralen Membranpolypeptiden, α und β. Die α1- und β1Domänen interagieren bei der Ausbildung der antigenbindenden Stelle, ähnlich wie bei MHCI-Proteinen. Die Furche ist offen, wodurch längere Peptide gebunden werden können [175].
Die MHC-II-Proteine präsentieren v. a. Peptide, die aus aufgenommenen extrazellulären Pathogenen stammen, durch Rezeptor-vermittelte Endozytose oder Phagozytose aufgenommen und in endosomalen Vesikeln weitergeleitet wurden [180]. In diesen Endosomen nimmt
der pH-Wert ab und die aufgenommenen Proteine werden durch Cystein-Proteasen verdaut
[157]. Die Endosomen fusionieren mit Vesikeln, welche MHC-II-Moleküle enthalten und die
11-15 Aminosäuren langen Fremdantigene werden in die Antigenbindestelle der MHC-II31
2. Einleitung
Proteine gebunden [157]. Der Komplex wandert in Vesikeln zur Zytoplasmamembran und
wird den TH-Zellen präsentiert. Die Wechselwirkung regt die TH-Zellen zur Ausschüttung von
Zytokinen an, die entweder Antikörperbildung durch bestimmte B-Zellklone anstoßen oder
eine Entzündungsreaktion auslösen [157].
Die MHC-Proteine sind nicht strukturidentisch, sondern zeigen oft Unterschiede in der ASSequenz. Beim Menschen kennt man mehrere hundert polymorphe MHC-Gene [177]. Man
unterscheidet drei Haupt-MHC-Gene der Klasse I, HLA-A, -B und -C. Alle weisen einen hohen Grad an Polymorphismus auf. Es sind ca. 486 HLA-A-, 817 HLA-B- und 263 HLA-CAllele bekannt [177]. Jedes Individuum trägt je zwei Allele (je ein mütterliches und ein väterliches), die beide mit der gleichen Stärke exprimiert werden. In gleicher Art und Weise kodieren hoch polymorphe Genorte für die Klasse-II-Proteine HLA-DR, HLA-DP und HLA-DQ
[181].
Abb. 2.7: Schematische Darstellung der MHC-Moleküle auf der Oberfläche einer APC
(a) Darstellung eines MHC-Klasse-I-Moleküls, (b) Darstellung eines MHC-Klasse-II-Moleküls
Erklärung siehe Text. Adaptiert aus Andersen et al., 2006 [170].
Personen, die homozygot in den HLA-A-, -B- und -C-Loci sind, können nur eine begrenzte
Vielfalt an Epitopen präsentieren können, im Vergleich zu Personen, die zumindest in einem
Gen heterozygot sind. Bei der HIV-1-Infektion sind diese homozygoten HLA-Loci mit einer
schnelleren Progression zu AIDS verbunden [182]. Der vorteilhafte Effekt von heterozygoten
HLA-Klasse-I-Allelen wird auf die Erkennung eines größeren Repertoires an Epitopen des
Virus zurückgeführt [183]. Verschiedene HLA-Allele wurden bei der HIV-1-Infektion mit einem schnelleren oder einem langsameren Verlauf der Infektion in Zusammenhang gebracht
oder sogar mit einer Resistenz gegen den Erwerb einer HIV-1-Infektion [184]. Mit einer
schnelleren AIDS-Progression wurden z. B. HLA-A2, -B8, verschiedene B35-Subtypen verknüpft, während HLA-A32, -B27, -B51 und -B57 mit einer langsameren Progression zu AIDS
verbunden sind [185-187]. Der Vorteil durch HLA-Allele wie HLA-B57 ist teilweise auf die
Erkennung von viralen Epitopen zurückzuführen, die stark konserviert sind und bei denen
Fluchtmutationen einen schweren Fitnessverlust für das Virus bedeuten [183]. Beispiele da32
2. Einleitung
für sind zum einen das HLA-B27-restringierte KK10-Epitop (KRWIILGLNK, Gag AS 131-140)
[188] aus dem p24 Gag von HIV-1, oder zum anderen das HLA-B57-restringierte KF11Epitop (KAFSPEVIPMF, Gag AS 30-40) aus dem p24 Gag von HIV-1 [189-193]. Gerade die
CTL-Antwort gegen HLA-B-restringierte Epitope ist bei HIV-1 mit einer effektiven viralen Kontrolle assoziiert [194-196]. Von besonderer Bedeutung sind dabei die CTL-Antworten gegen
Gag-Epitope, da die Gag-Proteine früh in der Replikation in der Zelle exprimiert, prozessiert
und präsentiert werden und verschiedene Fluchtmutationen in diesen Epitopen einen Fitnessverlust für das Virus bedeuten [183]. Altfeld et al. konnten zeigen, dass HLA-Allele, die
mit einer langsamen Krankheitsprogression assoziiert sind, diejenigen sind, die mit starken
CTL-Antworten früh im Krankheitsverlauf verbunden sind [197]. Gerade unter den EliteKontrollern (EC) sind die HLA-Allele B57 und 27 häufiger vertreten [198].
2.5.4 Präsentation und Aktivierung der CD8+ T-Zelle
Das abgebaute und prozessierte Antigen wird den T-Zellen auf der Oberfläche von APC oder
Zielzellen vorgeführt. Der TCR einer T-Zelle bindet nur an MHC-Moleküle, die ein passendes
Fremdantigen in ihrer MHC-Struktur eingebettet haben [174]. Die Wirtszelle prozessiert das
Antigen und belädt das MHC-Protein mit dem Antigenpeptid. Der Peptid/MHC-Komplex wird
zur Zelloberfläche gebracht und in die Zytoplasmamembran eingelagert, sodass er zur Erkennung zur Verfügung steht [174]. Die auf den MHC-I-Proteinen präsentierten Peptide
stammen von zellulären, viralen oder tumorassoziierten Proteinen sowie von fehlgefalteten
Proteinen ab. Die Proteine, welche für den Abbau vorgesehen sind, werden durch Ubiquitin
markiert und können durch das Proteasom abgebaut werden [174]. Dabei entstehen Peptide
mit einer Länge von acht bis zehn Aminosäuren, die durch die TAP-Proteine (transporters
associated with antigen processing) ins ER gebracht werden und an neu synthetisierte MHCProteine gebunden werden [174, 179, 181, 199]. Der Peptid/MHC-Komplex wird dann zur
Zelloberfläche geleitet. Die naiven CD8+ T-Zellen werden nach dieser Antigenerkennung
aktiviert und differenzieren sich zu antigenspezifischen CTL. Diese Aktivierung kann auf zwei
Wegen vonstattengehen. Beim ersten Weg ist die Antigenerkennung durch den TCR das
erste Aktivierungssignal. Das 2. Signal besteht in der ko-stimulatorischen Wechselwirkung
von dem B7-Molekül auf der APC mit dem CD28-Molekül auf der T-Zelle [170]. Durch diese
beiden Signale wird die T-Zelle aktiviert und zur Produktion von IL-2 angeregt. Dies begünstigt die klonale Proliferation und Differenzierung der T-Zellen zu CTL [170]. Ohne Signal 2
wird die T-Zelle anergisiert und kann nicht aktiviert werden. Beim zweiten Weg wird die APC
bei der Aktivierung der CD8+ T-Zelle durch die CD4+ T-Zelle unterstützt. Dabei müssen sowohl die CD8+ T-Zelle als auch die CD4+ T-Zelle das gleiche Antigen auf der gleichen APC
erkennen [200]. Nach der Erkennung des MHC/Peptid-Komplexes auf der APC durch den
TCR erfolgt die Ko-Stimulation durch den CD40-Liganden auf der CD4+ T-Zelle, der an das
33
2. Einleitung
CD40-Molekül auf der APC bindet [200]. Durch diese Interaktion kommt es u. a. zu einer
Verstärkung der Zytokinproduktion und zur Aktivierung und Differenzierung der CD4+ T-Zelle
sowie der effizienten Aktivierung und Differenzierung der CD8+ T-Zelle zu CTL [200].
Die CTL vermitteln anschließend die Zerstörung von Zellen, welche ihnen fremde Antigene
gebunden an MHC-Klasse-I-Proteine präsentieren [201]. Es gibt mindestens drei verschiedene Wege, auf denen die CTL den Tod der Zielzellen herbeiführen können. Der eine Weg
wird durch Zytokine wie IFN-γ und TNF-α vermittelt [170]. IFN-γ kann zu einer Hemmung der
viralen Replikation führen. Außerdem verstärkt die Sekretion von IFN-γ die Präsentation von
Peptiden durch MHC-Klasse-I-Proteine und steigert die Fas-vermittelte Lyse der Zielzellen
[170]. TNF-α bindet dagegen an den TNF-α-Rezeptor auf der Zielzelle und steuert eine Caspase-Kaskade, die zur Apoptose in der Zielzelle führt [170]. Bei den anderen Wegen wird ein
direkter Kontakt zwischen den CTL und der Zielzelle benötigt. Dabei induzieren die T-Zellen
die Lyse der infizierten Zielzelle durch zwei unterschiedliche molekulare Wege: zum einen
durch den Exozytose-Weg mithilfe von Perforin enthaltenden Granula oder zum anderen
durch die erhöhte Regulation des Fas-Liganden (FasL, CD95L), der Apoptose über die Aggregation von Fas (CD95) auf der Zielzelle auslösen kann [52, 169]. Beim ersten Weg löst die
Abgabe von Perforin die direkte Lyse der Zielzelle aus [202]. Perforin bildet dabei Poren in
der Membran der Zielzelle und führt zur osmotischen Lyse. Zusammen mit Perforin werden
auch Proteasen abgegeben, die in die Zielzelle eindringen und die Apoptose induzieren [52,
170]. Bei diesen Proteasen handelt es sich um Serinproteasen, die sog. Granzyme, von denen beim Menschen fünf verschiedene, Granzym A, B, H, K und M, zusammen mit Perforin
abgesondert werden [202]. Dieser Prozess ist kalziumabhängig. Ein kalziumunabhängiger
Prozess ist dagegen die Einleitung der Apoptose über den FasL-Weg [52]. Es kommt durch
die Bindung von FasL (CD95L) auf der CTL an den Fas-Rezeptor auf der Zielzelle zur Einleitung der Apoptose über eine Caspase-Kaskade [170].
2.5.5 CD8+ T Zellen in der HIV-1-Infektion
HIV-1-spezifische CTL sind nicht nur wichtig für die Kontrolle von HIV-1 in der primären Infektion [53], sondern auch in der chronischen Phase [54]. Virus-spezifische CD8+ T-Zellen
erscheinen, wenn die Virämie abzufallen beginnt. Es kann durch den Selektionsdruck des
Immunsystems auf HIV-1 zu Fluchtmutationen in den CTL-Epitopen kommen [51]. Dabei
werden Mutationen ausgewählt, durch die das MHC-Protein oder der TCR nicht mehr an das
Peptid binden können [203, 204]. Dies kann zu einem fortschreitenden Anstieg der Viruslast
führen [183]. Eine starke CTL-Antwort wurde in LTNP [55-57] und auch in gesunden seronegativen Menschen [205, 206] beobachtet. Als LTNP bezeichnet man HIV-1-positive Patienten, die über viele Jahre hinweg keine Anzeichen der fortschreitenden Krankheit zeigen. Diese haben meist eine recht niedrige Viruslast, normale CD4+-T-Zellzahlen und eine starke
34
2. Einleitung
polyfunktionale CD8+ T-Zellantwort [207]. Ein kleiner Teil (ca. ein Prozent) zählt außerdem zu
den EC [208]. Diese Patientengruppe ist in der Lage, über mehrere Jahre konstant niedrige
Viruslasten unter 50 Kopien/ml zu erhalten [208].
Der Nachweis von HIV-1-spezifischen Immunantworten in gesunden HIV-1-exponierten seronegativen Personen [206, 209-211] ließ vermuten, dass in ihnen der Kontakt mit HIV-1
eine HIV-1-spezifische Immunantwort induzierte, welche die Etablierung einer persistierenden Infektion verhindern konnten [205]. Diese Beobachtungen waren ein wichtiger Stimulus
für die Entwicklung von T-Zell-basierten HIV-1-Vakzinen, da sie die Möglichkeiten eines
Schutzes durch die Induktion von HIV-1-spezifischen T-Zellen andeuteten. Der Nachweis
von CTL gegen virale Peptide in einem HIV-1-exponierten seronegativen Menschen kann ein
Hinweis sein, dass in dem Betroffenen eine abortive Infektion stattgefunden hat. Eine weitere
Möglichkeit ist, dass manche der HIV-1-spezifischen CTL nicht durch einen Kontakt mit
HIV-1 selbst stimuliert und vermehrt wurden, sondern durch HIV-1-kreuzreaktive Peptide aus
anderen Mikroorganismen und Viren induziert wurden. Tatsächlich weisen eine Reihe von
HIV-1-Epitopen starke Sequenzhomologien zu anderen Mikroorganismen auf. U. a. gibt es
große Sequenzhomologien zwischen einem Epitop aus der RT von HIV-1 und HERV. Dabei
handelt es sich um das stark konservierte YMDD-Motiv aus dem aktiven Zentrum der Reversen Transkriptase (RT) von HIV-1, welches bei vielen Retroviren vorkommt. Zwei verschiedene HLA-A2-restringierte Epitope liegen in diesem Bereich. Ein sehr interessantes kreuzreaktives Epitop existiert im Matrix-Protein des Influenza-A-Virus. Acierno et al. entdeckten
Kreuzreaktionen zwischen dem dominanten HLA-A2-restringierten CTL-Epitop SLYNVATL
(SL9) und dem Influenza-A-Epitop GILGFVFTL (IMP-GL9) [212]. Vor kurzem konnte auch
eine kreuzreaktive CTL-Antwort zwischen dem SL9-Epitop aus HIV-1 und einem Epitop des
Hepatitis-C-Virus (HCV) Protein HCV-NS5b (ALYDVVSKL; AL9) in Menschen, die mit HIV-1
und HCV infiziert sind, gefunden werden [213]. Ein weiteres interessantes Epitop ist das
HLA-B13-restringierte RI9-Epitop (RQDILDLWI, AS 106-114) im Nef-Protein von HIV-1, das
mit einer besseren Kontrolle der HIV-1 Replikation assoziiert ist [214]. Die meisten Patienten
entwickeln eine starke CTL-Antwort gegen das Nef-RI9-Epitop und haben einen guten
Krankheitsverlauf. Die Suche nach homologen Sequenzen in einer Datenbankanalyse ergab
eine Homologie zu einer Sequenz im Penicillin-binding Protein 2 (PBP2) von Chlamydophila
pneumoniae (YYDILDLWI, CP-YI9). Es konnte gezeigt werden, dass Nef-RI9-spezifische
CTL in der Lage waren, das CP-YI9-Peptid zu erkennen.
Das Vorhandensein von solchen mit HIV-1 kreuzreaktiven CTL zum Zeitpunkt der Übertragung von HIV-1 könnte zur Abwehr von HIV-1 beitragen oder durch eine schnellere Gegenwehr zu einem besseren Verlauf der HIV-1-Infektion führen.
35
2. Einleitung
2.5.6 HIV-1-spezifische Antikörper
Die Entwicklung der B-Zellen findet im Knochenmark statt. Dabei finden ähnlich wie bei TZellen somatische Rekombinationen statt, um die Vielfalt zu erhöhen [157]. B-Zellen durchlaufen auch eine positive und eine negative Selektion wie die T-Zellen, bevor sie das Knochenmark als naive B-Zellen verlassen. Wenn eine naive B-Zelle dann ein Signal von einer
passenden T-Zelle erhält, reift sie und wird eine Plasmazelle, die Antikörper produziert und
abgibt [215].
Die HIV-1-Infektion ist charakterisiert durch eine Produktion großer Mengen an virusspezifischen Antikörpern; aber diese sind nicht fähig, die Virusproduktion zu kontrollieren [216].
Das kann v. a. dadurch erklärt werden, dass HIV-1 Strategien entwickelt hat, um der Kontrolle durch das Immunsystem des Wirtes auszuweichen.
Die ersten HIV-1-spezifischen Antikörper sind nicht neutralisierende anti-gp41 IgM, gefolgt
von IgG und IgA, die Immunkomplexe bilden [217, 218]. Den anti-gp41-Antikörpern folgen
später anti-gp120-spezifische [217]. IgG gegen Gag erscheinen im Durchschnitt nach ca. 18
Tagen [218]. Neutralisierende Antikörper tauchen erst Monate nach der Infektion auf [215].
Breit neutralisierende Antikörperantworten werden nur in einer Minderheit der Patienten gefunden und sind mit der Kontrolle der Virämie assoziiert. Durch den Selektionsdruck, den die
Antikörper auf das Virus ausüben, kommt es zu Fluchtmutationen in verschiedenen Bereichen in gp120 und gp41, durch die das Virus der humoralen Immunantwort zu entgehen versucht. Die neutralisierenden Antikörper entwickeln sich immer einen Schritt nach den Mutationen und haben wenig Chancen, die virale Replikation zu kontrollieren [215, 217]. Mehrere
neutralisierende HIV-1-spezifische Antikörper wurden bisher beschrieben (z. B. b12, 2F5,
4E10 und 2G12) [219]. 2F5 und 4E10 sind Epitope aus gp41 gerichtet, während b12 und
2G12 Epitope aus gp120 von HIV-1 erkennen [219].
36
3. Zielsetzung
3. Zielsetzung
Das Ziel der vorliegenden Dissertation war die Untersuchung der Hypothese, ob ein präexistierendes kreuzreaktives T-Zellrepertoire gegen mikrobielle Antigene sowohl zu einer Resistenz als auch zu einer besseren Kontrolle von HIV-1 beitragen kann. Dabei sollte v. a. die
Kreuzreaktivität von HIV-1-spezifischen T-Zelllinien aus HIV-1-infizierten Patienten und
LTNP untersucht werden. Ein wichtiger Fokus lag auf der Analyse der HIV-1-spezifischen
CTL-Antwort, die durch verschiedene Mikroorganismen wie Influenza, HERV und Chlamydien, hervorgerufen wurde. Zur Definition der T-Zellepitope, welche eine deutliche Homologie
zu anderen Mikroorganismen zeigen, wurden die PBMC von HIV-1-infizierten Patienten mit
synthetischen Peptiden stimuliert. Die auswachsenden T-Zellen wurden im IFN-γ-ELISpot
auf die Erkennung der Peptide und die Kreuzreaktivität gegenüber anderen Peptiden analysiert. Um zu überprüfen, ob solche kreuzreaktiven T-Zellen eine Relevanz für einen besseren
Krankheitsverlauf bei der HIV-1-Infektion haben, sollte in epidemiologischen Studien der
Nachweis von kreuzreaktiven T-Zellen in einer größeren Kohorte von HIV-1-infizierten Personen untersucht und die Rolle der kreuzreaktiven CTL bei der Kontrolle der HIV-1-Infektion
anhand der Viruslasten und CD4+-Zellzahlen der Patienten analysiert werden. Vielversprechende CTL-Linien sollten hinsichtlich der vorhandenen T-Zellrezeptoren (TCR) untersucht
werden. Dazu wurden deren TCR α- und β-Ketten identifiziert und generiert; ihre Funktionalität wurde mittels reprogrammierter T-Zellen im IFN-γ-ELISpot analysiert. Die TCR-α- und -βKetten wurden als mRNA durch Elektroporation in die T-Zellen eingebracht.
Auch HIV-1-exponierte seronegative Personen sollten hinsichtlich der Erkennung und Kreuzreaktion verschiedener synthetischer Peptide untersucht werden, um zu ermitteln, ob eine
HIV-1-spezifische Antwort nachgewiesen werden konnte, die möglicherweise durch kreuzreaktive T-Zellen hervorgerufen wurde.
Ein weiterer Aspekt sollte neben der Untersuchung von kreuzreaktiven T-Zellen die Analyse
von kreuzreaktiven Antikörpern sein. Immer wieder kann es zu falsch positiven HIV-1-Tests
kommen, und in verschiedenen Erkrankungen wurden HIV-1-spezifische Antikörper gefunden. Ein vielversprechendes Epitop konnte von einem Mitarbeiter der Arbeitsgruppe im p24
Gag von HIV-1 identifiziert werden. Seren verschiedener Patientengruppen sollten nun auf
das Vorhandensein von kreuzreaktiven Antikörpern gegen das Epitop aus p24 Gag untersucht werden.
Letztendlich war das übergeordnete Ziel des Projekts, verschiedene T-Zellrezeptoren zu
identifizieren, mit denen sich in der Zukunft ein Testsystem entwickeln lässt, mit dem man
Patientenzellen sehr einfach auf das Vorliegen verschiedener retroviraler Infektionen untersuchen kann.
37
4. Ergebnisse
4. Ergebnisse
4.1. Analyse der Kreuzreaktivität von HLA-B13-restringierten Nefspezifischen CTL-Linien zu Chlamydophila pneumoniae
Das HLA-B13-Allel ist ein HLA-Allel, welches mit einer besseren Kontrolle der HIV-1Replikation und sogar mit einer Resistenz gegen eine HIV-1-Infektion assoziiert ist [220-222].
Die Frequenz des HLA-B13-Allels beträgt ca. zwei Prozent in der gesamten Bevölkerung
[223]. Ein interessantes, dominantes HLA-B13-Epitop ist das RI9 (RQDILDLWI, AS 106-114)
im HIV-1-Nef-Protein das zum ersten Mal in Langzeitüberlebenden und später auch in anderen Patienten mit gutem Krankheitsverlauf definiert wurde [214]. Die meisten Patienten entwickelten eine sehr starke CTL-Antwort gegen das Nef-RI9-Epitop.
Die Suche nach homologen Sequenzen zeigte eine relativ homologe Sequenz in dem Penicillin-binding Protein 2 (PBP2) von Chlamydophila pneumoniae (YYDILDLWI, CP-YI9). Die
PBP-Proteine katalysieren die Polymerisierung der Peptidoglykan-Untereinheiten, obwohl
Chlamydien kein Peptidoglykan in ihrer Zellwand enthalten [224]. Dennoch besitzen die
Chlamydien die PBP-Proteine und sind empfindlich gegenüber Penicillin. Bei der Sequenzierung des ersten Chlamydien-Genoms konnte ein Weg für die Peptidoglykan-Synthese identifiziert werden und es wurde vermutet, dass die PBP-Proteine eine Rolle bei der normalen
Zellteilung spielen [225, 226]. Die Funktion von PBP2 in C. pneumoniae war lange unklar,
doch nun konnte gezeigt werden, dass sowohl PBP2 als auch PBP3 eine Rolle bei der Zellteilung in Chlamydien spielt [226].
Nachdem diese Nef-RI9 homologe Sequenz im PBP2-Protein von C. pneumoniae gefunden
wurde, konnte gezeigt werden, dass Nef-RI9-spezifische CTL in der Lage sind, ein synthetisches Peptid mit der Sequenz aus dem PBP2-Protein von C. pneumoniae, zu erkennen. Nun
sollte die Häufigkeit der Erkennung der beiden Epitope sowie die Kreuzreaktion zwischen
den beiden Epitopen in einer Kohorte von HIV-1-infizierten HLA-B13-positiven Patienten untersucht werden. Außerdem sollte untersucht werden, ob Chlamydien direkt durch Nef-RI9spezifische CTL erkannt werden können.
4.1.1 Erkennung von Nef-RI9 und CP-YI9 in HIV-1-infizierten HLA-B13-positiven
Patienten
Es wurden insgesamt 27 HIV-1-infizierte HLA-B13-positive Patienten auf die Erkennung des
Nef-RI9-Peptids getestet. Da fast alle Patienten bis auf zwei eine antiretrovirale Therapie
erhielten, wurden die isolierten PBMC durch Nef-RI9- bzw. CP-YI9-Peptid stimuliert, und die
auswachsenden CTL-Linien wurden im IFN-γ-ELISpot auf die Erkennung des jeweiligen
Peptids getestet. 22 der 27 getesteten Patienten generierten eine Nef-RI9-spezifische CTLLinie (81,5 %). Außerdem wurden 24 dieser HIV-1-infizierten HLA-B13-positiven Patienten
38
4. Ergebnisse
auf die Erkennung des CP-YI9-Peptids getestet. 16 (66,7 %) dieser 24 getesteten Patienten
generierten eine CP-YI9-spezifische CTL-Linie. Eine Nef-RI9-spezifische CTL-Linie wurde
von dem Mitarbeiter Christian Hofmann zur Identifizierung und Generierung eines Nefspezifischen TCR verwendet und konnte erfolgreich hinsichtlich seiner Funktionalität analysiert werden [227, 228].
4.1.2 Kreuzreaktivität der Nef-RI9- und CP-YI9-spezifischen CTL-Linien
Die ausgewachsenen Nef-RI9- und CP-YI9-spezifischen CTL-Linien wurden auch auf ihre
Kreuzreaktivität gegenüber dem anderen Peptid im IFN-γ-ELISpot getestet. Von den 22 NefRI9-spezifischen CTL-Linien zeigten 11 (50 %) eine Kreuzreaktion gegenüber dem CP-YI9Peptid, während 10 (62,5 %) der 16 CP-YI9-spezifischen CTL-Linien eine Kreuzreaktion gegenüber dem Nef-RI9-Peptid zeigten. Eine CTL-Linie wurde als kreuzreaktiv bezeichnet,
wenn die Frequenz der T-Zellen, welche mit Nef-RI9 oder CP-YI9 kreuzreaktiv waren, mindestens 30 % der Frequenz der T-Zellen betrug, mit der die T-Zellen das Peptid erkannten,
mit dem sie stimuliert wurden. In Abb. 4.1 sind beispielhaft die Ergebnisse verschiedener
IFN-γ-ELISpot-Analysen von Nef-RI9- und CP-YI9-spezifischen CTL-Linien gezeigt.
Abb. 4.1: Kreuzreaktivität der Nef-RI9- und CP-YI9-spezifischen CTL-Linien
Die CTL-Linien wurden durch Stimulation mit den synthetischen Peptiden generiert und im ELISpot
auf IFN-γ-Sekretion mit beiden Peptiden getestet. Angegeben sind die SFU (Spot Forming Units) von
50.000 eingesetzten Zellen. Patient 114 (a) generierte eine Nef-RI9-spezifische nicht kreuzreaktive
CTL-Linie. Patient 345 (b) generierte eine Nef-RI9-spezifische CP-YI9-kreurzeaktive CTL-Linie. Patient 347 (c) generierte eine CP-YI9-spezifische nicht kreuzreaktive CTL-Linie. Patient 519 (h) generierte eine CP-YI9-spezifische Nef-RI9-kreuzreaktive CTL-Linie.
Zur Analyse der Peptid-Affinität wurden sieben Nef-RI9-spezifische CTL-Linien im IFN-γELISpot mit Peptidkonzentrationen zwischen 20 µg/ml und 0,1 ng/ml getestet. Dabei zeigte
sich ein Unterschied in der Peptid-Affinität der beiden Peptide bei Nef-RI9-spezifischen CTL39
4. Ergebnisse
Linien. Die halbmaximale Peptidsensibilisierungskonzentration lag beim Nef-RI9-Peptid bei
einem Median von 100 ng/ml mit einem Range von 1 µg/ml bis 100 ng/ml, während der Median beim CP-YI9-Peptid bei 1 µg/ml lag, mit einem Range von 10 µg/ml bis zu 1 µg/ml. Beispiele für Titrationen von Nef-RI9-spezifischen CTL-Linie mit Nef-RI9 und CP-YI9 sind in
Abb. 4.2a + b zu sehen. Zum Vergleich der Peptid-Affinität wurde ein weiteres HLA-B13restringiertes Peptid, das p15-RI9 (RQANFLGKI, AS 429-437) aus dem Gag-Protein von
HIV-1, verwendet. Dieses Peptid weist eine ähnlich hohe Affinität auf wie Nef-RI9 (Abb.
4.2c). Des Weiteren wurde auch eine CP-YI9 spezifische CTL-Linie auf ihre Peptid-Affinität
hinsichtlich beider Peptide im Vergleich mit einer Nef-RI9-spezifischen CTL-Linie aus dem
gleichen Patienten getestet. Dabei stellte sich heraus, dass bei beiden CTL-Linien die Affinität für das Nef-RI9-Peptid deutlich höher war als für das CP-YI9-Peptid (Abb. 4.2d).
Abb. 4.2: Titration Nef-RI9-, CP-YI9- und p15-RI9-spezifischer CTL-Linien
Die CTL-Linien wurden durch Stimulation mit dem Nef-RI9-Peptid generiert und im ELISpot auf IFN-γSekretion mit beiden Peptiden Nef-RI9 und CP-YI9 in unterschiedlichen Konzentrationen von 20 µg/ml
bis 0,1 ng/ml getestet. Angegeben sind die SFU (Spot Forming Units) von 50.000 eingesetzten Zellen.
Nef-RI9-spezifische CTL-Linien von Patient 048 (a) und Patient 519 (b) wurden mit Nef-RI9 und CPYI9 getestet. (c) Nef-RI9- und p15-RI9-spezifische CTL-Linien von Patient 609 wurden mit Nef-RI9
und CP-YI9 bzw. p15-RI9 getestet. (d) Nef-RI9- und CP-YI9-spezifische CTL-Linien von Patient 609
wurden mit Nef-RI9 und CP-YI9 getestet.
4.1.3 Die Rolle von Nef-RI9- und CP-YI9-spezifischen kreuzreaktiven CTL für
den Verlauf der HIV-1-Infektion
Um zu analysieren, welche Rolle diese Nef-RI9- und CP-YI9-kreuzreaktiven CTL für die Kontrolle der HIV-1-Infektion spielen, wurden die Viruslasten und CD4+-Helferzellzahlen vor Therapiebeginn und zum Zeitpunkt des IFN-γ-ELISpot-Testes untersucht. Zum Testzeitpunkt
erhielten alle Patienten bis auf zwei eine ART. Es zeigten sich hierbei keine signifikanten
40
4. Ergebnisse
Unterschiede hinsichtlich der CD4+-Zellzahlen (Tab. 4.1) und der Viruslasten (Tab. 4.2) der
Patienten mit einer Nef-RI9- oder CP-YI9-spezifischen bzw. kreuzreaktiven CTL-Linie im
Vergleich mit Patienten ohne eine solche CTL-Linie.
Tabelle 4.1: CD4+-Zellzahlen der Patienten
CD4+-Zellzahlen/µl
vor ART
zum Testzeitpunkt
Median
Range
n=
Median
Range
n=
Nef-RI9 +
272
3 – 928
21
461
280 – 826
22
Nef-RI9 -
165
123 – 314
3
518
158 – 680
5
CP-YI9 +
262
3 – 928
15
514,5
158 – 816
16
CP-YI9 -
271
26 – 738
8
613
358 – 823
8
Kreuzreaktion
262
3 – 928
13
434,5
280 – 816
14
Keine Kreuzreaktion
254
26 – 441
6
653
314 – 928
7
Angegeben ist der Median und der Range der CD4+-Zellzahlen vor dem Start der Therapie
und zum Testzeitpunkt sowie die Anzahl (n) der Patienten, die bei den Berechnungen mit
einbezogen wurden, da nicht bei allen Patienten die Werte vor dem Start der Therapie vorhanden waren.
Tabelle 4.2: Viruslasten der Patienten
Viruslast Kopien/ml
zum Testzeitpunkt*
vor ART
Median
Range
n=
Median
Range
n=
Nef-RI9 +
38.500
440 – 920.000
21
15
< 20 – 30
22
Nef-RI9 -
28.150
22.000 – 180.000
3
15
< 20 – 250.000
5
CP-YI9 +
22.000
440 – 920.000
15
15
< 20 – 3.400
16
CP-YI9 -
100.000
9.900 – 350.000
8
15
< 20 – 30
8
Kreuzreaktion
50.000
440 – 920.000
13
15
< 20 – 3.400
14
Keine Kreuzreaktion
56.650
1400 – 350.000
6
15
< 20 – 20
7
16
3
12
6
12
5
Angegeben ist der Median und der Range der Viruslast vor dem Start der Therapie und zum
Testzeitpunkt sowie die Anzahl (n) der Patienten, die bei den Berechnungen mit einbezogen
wurden, da nicht bei allen Patienten die Werte vor dem Start der Therapie vorhanden waren.
*
Viele der Patienten erhielten zum Testzeitpunkt eine ART. Deswegen hatten viele Patienten
eine Viruslast unterhalb der Nachweisgrenze von < 20 Kopien/ml.
XX
Angegeben ist die Anzahl der Patienten mit einer Viruslast von < 20 Kopien/ml
41
4. Ergebnisse
4.1.4 Erkennung von C. pneumoniae-infizierten Zelllinien durch Nef-RI9- und
CP-YI9-spezifische CTL-Linien
Als nächstes stellte sich nun die Frage, ob die Nef-RI9-spezifischen CP-YI9-kreuzreaktiven
CTL-Linien in der Lage sind, Zelllinien, die mit C. pneumoniae infiziert wurden, zu erkennen.
Hierfür wurden verschiedene Zelllinien mit unterschiedlichen MOI (Multiplicity of Infection)
der C. pneumoniae infiziert. Eine Zelllinie, die sich sehr gut mit C. pneumoniae infizieren
lässt, ist die adhärente HEp2-Zelllinie (eine humanen Larynx-Epithelioma Zelllinie), welche
als Positivkontrolle verwendet wurde. Nach der Testung verschiedener Infektionsprotokolle
konnte die Infektion von immortalisierten B-Zellen mit einer MOI von 1.000 etabliert werden.
Die Färbung erfolgte bei den HEp2-Zellen mit Propidiumiodid (PI) zur Färbung des Zellkerns
und dem FITC-Reagent aus dem ImagenTM-Chlamydia-Detektionskit nach Anleitung. Die BZelllinien wurden mit CD19-PE und dem FITC-Reagent aus dem Chlamydien-Kit gefärbt.
Beispielbilder für die Immunfluoreszenz nach der Färbung sind in Abb. 4.3a für HEp2-Zellen
und in Abb. 4.3b für B-Zellen zu sehen.
Abb. 4.3: Immunfluoreszenzbilder der mit C. pneumoniae-infizierten Zelllinien
Die Zellen wurden mit PI zur Färbung des Kerns bzw. mit CD19-PE zur Färbung der Zellen, sowie mit
Reagent-FITC zur Färbung der Chlamydien inkubiert. In Rot sieht man den Zellkern der HEp2-Zellen
(a) sowie die B-Zellen (b). Die Chlamydien fluoreszieren grün.
Zur Klärung, wie lange die B-Zellen mit den Chlamydien infiziert sind und zu welchem Zeitpunkt die B-Zellen am stärksten infiziert sind, wurde die Infektion der B-Zellen mit C. pneumoniae über elf Tage verfolgt. Man sieht, dass nach 48 Stunden die meisten B-Zellen mit C.
pneumoniae infiziert wurden. Danach nimmt die Anzahl an infizierten B-Zellen langsam ab
(Abb. 4.4). Hierfür wurden die gefärbten Zellen im Durchflusszytometer analysiert.
42
4. Ergebnisse
Abb. 4.4: Infektionsverlauf der B-Zelllinie 347 mit C. pneumoniae
(a) Zu sehen ist der prozentuale Anteil an C. pneumoniae-infizierten Zellen im Verlauf von elf Tagen
bei verschiedenen MOIs. Die Messung erfolgt alle 24 Stunden. (b) Färbung der B-Zelllinie mit dem
Kontrollantikörper Iso-PE. (c) Doppelfärbung der B-Zelllinie mit CD19-PE und Reagent-FITC.
In weiteren Versuchen konnte nun getestet werden, ob Nef-RI9-spezifische CTL-Linien in der
Lage sind, C. pneumoniae-infizierte B-Zellen über das CP-YI9-Epitop zu erkennen. Hierzu
wurden die generierten Nef-RI9- und CP-YI9-spezifischen CTL-Linien im IFN-γ-ELISpot mit
C. pneumoniae-infizierten HLA-B13-positiven B-Zellen inkubiert und die IFN-γ-Sekretion
wurde analysiert. Als Positivkontrolle wurden die B-Zellen mit den beiden Peptiden als APC
zugegeben. Mehrere CTL-Linien von neun verschiedenen HIV-1-infizierten HLA-B13positiven Patienten wurden im IFN-γ-ELISpot getestet. In den meisten Fällen waren die CTLLinien nicht in der Lage, die C. pneumoniae-infizierten B-Zellen zu erkennen, während die
Erkennung des Peptids sehr stark war (Abb. 4.5).
43
4. Ergebnisse
Abb. 4.5: Keine Erkennung der C. pneumoniae-infizierten B-Zellen
Die Nef-RI9- und CP-YI9-spezifischen CTL-Linien wurden mit C. pneumoniae-infizierten B-Zellen im
IFN-γ-ELISpot inkubiert. Die CTL-Linien waren nicht in der Lage, die infizierten B-Zellen allein zu erkennen. Waren die B-Zellen mit dem Nef-RI9- oder dem CP-YI9-Peptide inkubiert worden, wurden
diese Peptide von den CTL-Linien erkannt. Angegeben sind die SFU (Spot Forming Units) von 50.000
eingesetzten Zellen. Nef-RI9-spezifische CTL-Linie von Patient 243 mit HLA-B13-positiver B-Zelle 519
(a) und HLA-B13-negativer B-Zelle 039 (b) CP-YI9-spezifische CTL-Linie von Patient 243 mit HLAB13-positiver B-Zelle 519 (c) und HLA-B13-negativer B-Zelle 039 (d).
Bei den meisten Patienten ergab sich ein ähnliches Bild wie in Abb. 4.5 für Patient 243. Die
CTL-Linien erkannten die synthetischen Peptide allein oder wenn sie durch die HLA-B13positive B-Zelllinie präsentiert wurden, aber die mit C. pneumoniae-infizierte HLA-B13positive B-Zelllinie wurde nicht erkannt.
Auch die frisch isolierten PBMC wurden auf das Vorhandensein von Nef-RI9- und CP-YI9spezifischen CTL untersucht. Insgesamt wurden die frisch isolierten PBMC von sechs Patienten im IFN-γ-ELISpot eingesetzt. Allerdings waren fünf dieser Patienten unter antiretrovira44
4. Ergebnisse
ler Therapie und zeigten keine Reaktion mehr im IFN-γ-ELISpot. Bei dem einen Patienten
ohne Therapie handelte es sich um einen LTNP, der sowohl Nef-RI9- als auch CP-YI9spezifische CTL hatte. Außerdem war er in der Lage, die infizierte B-Zelle zu erkennen (Abb.
4.6). Daraus kann jedoch nicht geschlossen werden, dass die Nef-RI9-bzw. CP-YI9spezifischen CTL für die Erkennung der infizierten B-Zellen verantwortlich waren, da bei einem häufigen Erreger wie C. pneumoniae der Patient eine Reihe von CTL-Spezifitäten gegen C. pneumoniae aufweisen könnte.
Abb. 4.6: Frequenz der Nef-RI9- und CP-YI9-spezifischen CTL im Blut
Frisch isolierte PBMC von Patient 609 wurden im IFN-γ-ELISpot getestet. Die synthetischen Peptide
Nef-RI9, CP-YI9 und p15-RI9 werden gut durch im Blut zirkulierende CTL erkannt. Auch die mit C.
pneumoniae infizierte HLA-B13-positive B-Zelle wird erkannt. Angegeben sind die SFU (Spot Forming
Units) von 200.000 eingesetzten Zellen.
In weiteren Versuchen wurden Nef-RI9-spezifische CTL Linien auf die Erkennung von C.
pneumoniae-infizierten B-Zellen in Chrom-Freisetzungstest getestet. Dabei konnte teilweise
eine
Lyse
von
C.
pneumoniae-infizierten
B-Zellen
gezeigt
werden.
Die
Chrom-
Freisetzungstests von fünf verschiedenen Nef-RI9-spezifischen CTL-Linien zeigten angemessene Spontanwerte von weniger als 30 %. Von diesen fünf CTL-Linien zeigten drei eine
Lyse der C. pneumoniae-infizierten B-Zellen (Abb. 4.7). Dies stützt weiter die Hypothese,
dass dieses CP-YI9-Peptid tatsächlich aus dem PBP2-Protein der Chlamydien in einer C.
pneumoniae-infizierten Zelle generiert und im HLA-B13-Molekül den CTL präsentiert werden
kann. Es kann aber weiterhin nicht ausgeschlossen werden, dass die vermehrte Lyse der
Chlamydien-infizierten Zellen durch eine stärkere Ko-Stimulation der T-Zellen durch infizierte
B-Zellen bewirkt wurde.
45
4. Ergebnisse
Abb. 4.7: Lyse der C. pneumoniae-infizierten Zellen durch Nef-RI9-spezifische CTL
51
HLA-B13-positive (B13+) und HLA-B13-negative (B13-) B-Zellen wurden zuerst mit Cr inkubiert, um
als Target-Zellen zu dienen. Danach wurden die Target-Zellen mit dem synthetischen Nef-RI9-Peptid
oder ohne das Peptid inkubiert. Anschließend erfolgte die Zugabe der Nef-RI9-spezifischen CTLLinien als Effektor-Zellen in einem Verhältnis von 50:1 E:T. Die Zellen wurden für vier Stunden inku51
biert und am nächsten Tag wurde die Cr-Abgabe gemessen. Als Positivkontrolle dienten die BZellen, welche mit dem Nef-RI9-Peptid inkubiert wurden. Die Lyse der HLA-B13-positiven B-Zellen
durch Nef-RI9-spezifische CTL-Linien von Patient 243 (a), Patient 519 (b) und Patient 092 (c) ist deutlich stärker als die unspezifische Lyse der HLA-B13-negativen infizierten B-Zelle.
46
4. Ergebnisse
4.1.5 Analyse der Erkennung von PBP2-Konstrukten durch NefRI9- und CP-YI9spezifische CTL-Linien
Ein weiterer Ansatz, in dem geklärt werden sollte, ob das PBP2-Protein wirklich so geschnitten wird, damit das CP-YI9-Peptid entsteht und durch Nef-RI9-spezifische kreuzreaktive CTL
erkannt werden kann, beinhaltete die Klonierung verschiedener Konstrukte des PBP2Proteins aus C. pneumoniae. Zu Beginn wurde ein ca. 700 bp großes Fragment des PBP2Proteins generiert, in dem der Abschnitt mit dem CP-YI9-Peptid enthalten war, da das gesamte PBP2-Protein mit ca. 3,3 kb sehr groß ist. Dieses Fragment wurde mit einem Flag-Tag
zur Kontrolle der Expression versehen und in den pcDNA3-Vektor kloniert. Bei Transfektionsversuchen in HEK293- und HEK293T-Zellen stellte sich heraus, dass dieses Fragment
nicht exprimiert wurde. Auch die Transfektion durch Elektroporation in B-Zellen erbrachte
keine Expression des PBP2-Kontruktes.
In einem weiteren Versuch wurde nun das gesamte PBP2-Protein kloniert. Dazu wurde ein
PCR-Protokoll etabliert, das es ermöglichte, dieses große Fragment erfolgreich zu amplifizieren. Auch dieses Protein wurde mit einem Flag-Tag am Beginn des Proteins versehen, um
eine Expressionskontrolle über einen Flag-spezifischen Antikörper zu gewährleisten. Hierbei
konnte ein erfolgreiches Transfektionsprotokoll in HEK293T- und HEK293-Zellen etabliert
werden. Es wurde eine Expression zwischen 10-25 % gemessen (Abb. 4.8c). Als Positivkontrolle wurde der pDsRed-Vektor verwendet (Abb. 4.8a).
Abb. 4.8: Expression von pDsRed und PBP2-Flag in HEK293T-Zellen nach Transfektion
Die HEK293T-Zellen wurden mit pDsRed- bzw. PBP2-Flag-DNA transfiziert und 48 Stunden nach der
Transfektion wurden die PBP2-Flag-transfizierten Zellen mit einem Flag-Antikörper intrazellulär angefärbt und im Durchflusszytometer analysiert. (a) pDsRed transfizierte HEK293T-Zellen wurden fixiert
und im Durchflusszytometer analysiert. (b + c) PBP2-Flag transfizierte HEK293T-Zellen wurden nach
der Permeabilisierung mit einem Flag-Antikörper gefärbt. Als sekundärer Antikörper wurde ein PEkonjugierter Anti-Mouse-IgG1-Antikörper verwendet. Abschließend wurden die Zellen fixiert. (b) PBP2Flag transfizierte HEK293T-Zellen nur mit dem IgG1-PE-Antikörper gefärbt. (c) PBP2-Flag-gefärbte
HEK293T-Zellen mit Flag-Antikörper und IgG1-PE-Antikörper gefärbt.
Da die HEK293- und die HEK293T-Zellen HLA-B13-negativ sind, konnten diese Zellen so
nicht für die weiteren Versuche verwendet werden. Außerdem war die Transfektionseffizienz
nicht hoch genug. Die Umklonierung des kompletten PBP2 in den mRNA-Produktionsvektor
wäre zum einen sehr aufwendig gewesen und zum anderen wäre die mRNA mit dem kom47
4. Ergebnisse
pletten PBP2-Protein zu groß für die in-vitro-Transkription der mRNA gewesen, sodass eine
effiziente Elektroporation nicht gewährleistet gewesen wäre. Deswegen wurde eine KoTransfektion der HEK293-Zellen mit dem PBP2-Flag-Vektor und einem HLA-B13-Vektor
durchgeführt. Durch die Selektion mit verschiedenen Antibiotika im Wachstumsmedium, für
welche das jeweilige Resistenzgen in der Plasmid-DNA vorhanden ist, lassen sich positiv
transfizierte Zellen ausselektionieren. Das PBP2-Flag-Konstrukt war im pcDNA3-Vektor generiert worden, welcher ein Resistenzgen für G418 trägt. Das HLA-B13-Gen wurde in den
pBabe-Vektor kloniert, welcher das Resistenzgen für Puromycin trägt. HEK293-Zellen wurden zuerst mit der PBP2-Flag-DNA transfiziert und unter Zugabe von G418 erfolgte die Selektion der transfizierten Zellen. Diese wurden anschließend mit der pBabeHLA-B13-DNA
transfiziert und unter Zugabe von G418 und Puromycin wurden die doppelt positiven
HEK293-Zellen selektioniert.
Nun konnten die HEK293PBP2-Flag+/HLA-B13+-Zellen im IFN-γ-ELISpot als APC verwendet werden. Es wurden Nef-RI9- und CP-YI9-spezifische CTL-Linien im IFN-γ-ELISpot auf
die Erkennung von PBP2 über HLA-B13 getestet. Als Kontrolle dienten p15-RI9-spezifische
CTL-Linien, welche auch HLA-B13 restringiert sind. Man sieht in Abb. 4.9a, dass die NefRI9-spezifische Zelllinie das Nef-RI9-Peptid, präsentiert durch die HLA-B13-positive B-Zelle,
sehr gut erkennt. Allerdings zeigt sie nur eine sehr schwache Kreuzreaktion zu CP-YI9 und
erkennt auch die C. pneumoniae-infizierte B-Zelle nicht. Auch wenn das Peptid über das
transfizierte HLA-B13 in den HEK293-Zellen präsentiert wird, wird es durch die Zelllinie erkannt (Abb. 4.9c). Die CP-YI9-spezifische CTL-Linie ist auch nicht in der Lage, das PBP2Protein in den doppelt transfizierten HEK293-Zellen (PBP2-Flag+/HLA-B13+) zu erkennen
(Abb. 4.9f), genauso wenig wie in den mit C. pneumoniae infizierte doppelt transfizierte
HEK293-Zellen. Möglicherweise wird das PBP2-Protein in zu geringen Mengen exprimiert
und/oder das CP-YI9-Peptid wird durch das Proteasom nicht in ausreichender Menge aus
dem PBP2-Protein geschnitten. Als Negativkontrolle dienten HEK293-Zellen, welche mit
pcDNA3 transfiziert wurden (Abb. 4.9 b + e).
48
4. Ergebnisse
Abb. 4.9: Analyse der Erkennung von PBP2-Flag/HLA-B13-transfizierten HEK293-Zelllinien
Die Nef-RI9-, CP-YI9- (beide von Patient 519) und p15-RI9-spezifischen (von Patient 243) CTL-Linien
wurden im IFN-γ-ELISpot zusammen mit einer HLA-B13-positiven B-Zelllinie, HEK293 transfiziert mit
HLA-B13 und pcDNA3 sowie HEK293 transfiziert mit PBP2-Flag und HLA-B13, inkubiert. Angegeben
sind die SFU (Spot Forming Units) von 50.000 eingesetzten Zellen. (a) Nef-RI9-spezifische CTL-Linie
mit HLA-B13-positiver B-Zelllinie inkubiert. (b) Nef-RI9-spezifische CTL-Linie mit HEK293-pcDNA3
inkubiert. (c) Nef-RI9-spezifische CTL-Linie mit HEK293-HLA-B13/PBP2-Flag inkubiert. (d) CP-YI9spezifische CTL-Linie mit HLA-B13-positiver B-Zelllinie inkubiert. (e) CP-YI9-spezifische CTL-Linie mit
HEK293 pcDNA3 inkubiert. (f) CP-YI9-spezifische CTL-Linie mit HEK293-HLA-B13/PBP2-Flag inkubiert. (g) p15-RI9-spezifische CTL-Linie mit HLA-B13-positiver B-Zelllinie inkubiert. (h) p15-RI9spezifische CTL-Linie mit HEK293-HLA-B13/PBP2-Flag inkubiert.
49
4. Ergebnisse
4.2 Analyse der Kreuzreaktivität von CTL zwischen dem HIV-1-p17Protein und dem Influenza M1 Matrix-Protein
Vor Kurzem konnte von Acierno et al. gezeigt werden, dass HLA-A2-restringierte CTL mit
einer Spezifität gegen das SLYNTVATL (SL9, HIV-1 Stamm B Gag AS 77-85 [50]) Epitop
aus dem p17-Matrix-Protein von HIV-1 mit dem GILGFVFTL (IMP-GL9, FLU-M1:58-66 [229,
230]) Epitop aus dem Matrix-Protein des Influenza-A-Virus kreuzreagieren können. Diese
CTL-Linien waren zur HLA-A2-restringierten Lyse von Zielzellen in der Lage, die mit SL9
oder IMP-GL9 beladen waren [212]. Dabei konnten nicht nur SL9-spezifische IMP-GL9kreuzreaktive CTL-Linien aus HIV-1-Patienten generiert werden, sondern auch IMP-GL9spezifische SL9-kreuzreaktive CTL-Linien aus HIV-1-negativen Spendern [212].
Das SL9-Epitop ist ein immundominantes HLA-A2-restringiertes HIV-1-spezifisches Epitop
[231-234], das von bis zu 75 % der HLA-A2-positiven Erwachsenen mit einer chronischen
HIV-1-Infektion erkannt wird [54, 231, 235-239]. Das IMP-GL9-Epitop ist ein immundominantes HLA-A2-restringiertes Epitop und besitzt eine starke Peptid-Affinität [240]. Während das
IMP-GL9-Epitop unter allen Influenza-A-Virusstämmen hoch konserviert ist [123], zeigt das
HIV-1-SL9-Epitop eine gewisse Variabilität an Aminosäurepositionen innerhalb der Erkennungsstelle für den TCR, während die Ankerpositionen hoch konserviert sind [232, 233, 241243]. Mutationen innerhalb des SL9-Epitops zeigen einen Selektionsdruck durch die CTL des
Wirtsimmunsystems, da sie die CTL-Erkennung beeinträchtigen können [235]. Dennoch wird
die immunologische Reaktivität gegen autologe Varianten bei vielen Patienten bewahrt [231,
244-246], möglicherweise durch die Rekrutierung neuer CTL-Spezifitäten, welche mutierte
Epitope erkennen können. Bisher ist die Prävalenz von HIV-1-spezifischen IMP-GL9kreuzreaktiven CTL in größeren Kohorten von HIV-1-infizierten Patienten und HIV-1exponierten seronegativen Personen unbekannt. Außerdem gibt es keine Daten darüber, ob
solche SL9/IMP-GL9-kreuzreaktiven CTL den Verlauf der HIV-1-Infektion beeinflussen können oder ob sie einen gewissen Schutz vor einer HIV-1-Infektion bieten können. Zu diesem
Zweck wurde eine epidemiologische Untersuchung hinsichtlich der Erkennung von HIV-1SL9 und IMP-GL9 in HLA-A2-positiven HIV-1-infizierten Patienten und HIV-1-negativen Personen durchgeführt.
4.2.1 Erkennung von HIV-1-SL9- und IMP-GL9-Peptiden in HIV-1-infizierten Patienten
Zuerst wurde die T-Zellerkennung der beiden Peptide in 174 HIV-1-infizierten HLA-A2positiven Patienten untersucht. Da die Mehrheit der Patienten (146/174) eine antiretrovirale
Therapie bekam, die normalerweise mit einer starken Abnahme der zirkulierenden HIV-1spezifischen CTL assoziiert ist [246-248], wurde die Prävalenz der SL9- und IMP-GL950
4. Ergebnisse
spezifischen T-Zellerkennung durch Stimulation der PBMC mit synthetischen SL9- und IMPGL9-Peptiden und der anschließenden Analyse der Peptiderkennung durch die auswachsenden T-Zellen in IFN-γ-ELISpot-Tests ermittelt. Es wurden SL9-spezifische CTL-Linien in
92 (52,9 %) getesteten Patienten gefunden sowie IMP-GL9-spezifische CTL-Linien in 94
(54 %) Patienten. 70 Patienten generierten sowohl eine SL9-spezifische als auch eine IMPGL9-spezifische CTL-Linie. Insgesamt wurden CTL gegen SL9 oder IMP-GL9 in 115 (66 %)
Patienten gefunden, während 59 Patienten nicht in der Lage waren, eine SL9- oder IMPGL9-spezifische CTL-Linie nach der Peptidstimulation zu generieren.
In Analysen mit anti-CD4- und anti-CD8-Antikörpern konnte im IFN-γ-ELISpot gezeigt werden, dass alle getesteten Zelllinien (drei SL9-spezifische und fünf IMP-GL9-spezifische CTLLinien) CD8+ T-Zellen waren. Beispiele für diese Block-Experimente sind in Abb. 4.10 zu
sehen.
Abb. 4.10: SL9- und IMP-GL9-spezifische CTL-Linien können durch den anti-CD8-Antikörper
geblockt werden
Die CTL-Linien wurden durch Stimulation mit den synthetischen Peptiden generiert und im ELISpot
auf IFN-γ-Sekretion getestet. Die Zellen wurden gleichzeitig mit einem anti-CD8- und einem anti-CD4Antikörper für eine Stunde geblockt und anschließend wurde das Peptid zugegeben. Angegeben sind
die SFU (Spot Forming Units) von 50.000 eingesetzten Zellen. Die IMP-GL9-spezifische CTL-Linie
von Patient 594 (a) sowie die SL9-spezifische CTL-Linie von Patient 594 (b) lassen sich gut durch den
anti-CD8-Antikörper blocken, aber nicht durch anti-CD4.
Außerdem wurde die Frequenz von SL9- und IMP-GL9-spezifischen CTL im Blut von HIV-1infizierten HLA-A2-positiven Patienten untersucht. Es wurden die frisch isolierten PBMC von
32 HIV-1-infizierten HLA-A2-positiven Patienten im IFN-γ-ELISpot analysiert. 30 dieser Patienten waren zum Testzeitpunkt unter antiretroviraler Therapie. Die zwei Patienten, die zum
Testzeitpunkt keine Therapie hatten, zeigten keine SL9- oder IMP-GL9 spezifischen CTL.
Von den 30 Patienten unter ART zeigten fünf Patienten CTL sowohl gegen SL9 als auch
gegen IMP-GL9 (Abb. 4.11 c-g). Zwei weitere Patienten zeigten CTL gegen SL9 (Abb. 4.11a
+ b).
51
4. Ergebnisse
Abb. 4.11: Frequenz der SL9- und/oder IMP-GL9-spezifischen CTL im Blut von HIV-1-infizierten
Patienten
Die frisch isolierten PBMC wurden im IFN-γ-ELISpot mit den beiden synthetischen Peptiden inkubiert
und die IFN-γ-Abgabe wurde analysiert. Angegeben sind die SFU (Spot Forming Units) von 100.000
eingesetzten Zellen. Patient 009 (a) und Patient 012 (b) haben SL9-spezifische CTL, Patient 227 (c),
Patient 232 (d), Patient 258 (e), Patient 485 (f) und Patient 644 (g) haben SL9- und IMP-GL9spezifische CTL.
4.2.2 Kreuzreaktivität der HIV-1-SL9 und IMP-GL9-spezifischen CTL-Linien
Im nächsten Schritt wurden die SL9- und IMP-GL9 stimulierten CTL-Linien jeweils auf die
Kreuzerkennung von IMP-GL9 und SL9 im IFN-γ-ELISpot getestet. Eine CTL-Linie wurde als
kreuzreaktiv bezeichnet, wenn die Frequenz der T-Zellen, welche mit SL9 oder IMP-GL9
kreuzreaktiv waren, mindestens 30 % der Frequenz der T-Zellen betrug, mit der die T-Zellen
das Peptid erkannten, mit dem sie stimuliert wurden. Dabei zeigte sich, dass 60 der 92 SL9spezifischen CTL-Linien (65,2 %) auch das IMP-GL9-Peptid mit einer Frequenz von 30 % bis
223,1 % der Frequenz der SL9-spezifischen T-Zellen (Median 85,1 %, Abb. 4.12) erkannten.
Von den 94 IMP-GL9-spezifischen CTL-Linien zeigten 62 (66 %) eine Kreuzreaktion zum
SL9-Peptid mit einer Frequenz von 32,1 % bis zu 253,9 % der Frequenz der IMP-GL9spezifischen T-Zellen. Der Median betrug 99,7 % (Abb. 4.12).
52
4. Ergebnisse
Abb. 4.12: Prozentzahlen der kreuzreaktiven IMP-GL9 und SL9-spezifischen Antworten
Angegeben sind die Prozentzahlen der kreuzreaktiven T-Zellen aller getesteten IMP-GL9- und SL9spezifischer CTL-Linien.
Insgesamt wurden Kreuzreaktionen zwischen SL9 und IMP-GL9 in 75 der 174 getesteten
Patienten (43,1 %) gefunden. Beispiele von verschiedenen CTL-Linien mit unterschiedlichen
Erkennungsmustern der Peptide und Kreuzreaktivität sind in Abb. 4.13 zu sehen.
Abb. 4.13: IFN-γ-ELISpot-Analysen verschiedener mit SL9 und IMP-GL9 stimulierter CTL-Linien
Die PBMC wurden mit den synthetischen Peptiden inkubiert und nach 14 Tagen hinsichtlich ihrer
Kreuzreaktivität im IFN-γ-ELISpot getestet. Angegeben sind die SFU (Spot Forming Units) von 50.000
eingesetzten Zellen. (a) Patient 430 generierte eine IMP-GL9-spezifische Zelllinie, die keine Kreuzreaktivität gegenüber dem SL9-Peptid zeigte, während die SL9-spezifische CTL-Linie eine Kreuzreaktion zu IMP-GL9 zeigte. (b) Patient 647 generierte eine IMP-GL9- und eine SL9-spezifische kreuzreaktive CTL-Linie. (c) Patient 267 generierte nur eine SL9-spezifische CTL-Linie, die keine Kreuzreaktion
gegenüber IMP-GL9 zeigte. (d) Patient 007 generierte sowohl eine IMP-GL9- als auch eine SL9spezifische CTL-Linie. Beide waren aber nicht kreuzreaktiv.
53
4. Ergebnisse
Neben der vermuteten Kreuzreaktivität des TCRs besteht bei der Detektion von SL9- und
IMP-GL9-spezifischen T-Zellen in den stimulierten PBMC die Möglichkeit, dass diese TZellen aufgrund unspezifischen Wachstums von nicht-kreuzreaktiven SL9- oder IMP-GL9spezifischen T-Zellen durch das im Medium enthaltende IL-2 oder HIV-1 Antigene, die in den
PBMC der Patienten vorhanden sind, stimuliert worden sind. Um die Möglichkeit eines unspezifischen Wachstums von T-Zellen aufgrund von Bestandteilen des IL-2 enthaltenden
Kulturmediums auszuschließen, wurden die PBMC von 44 Patienten parallel zur Peptidstimulation auch mit dem Kulturmedium ohne Peptid-Zusatz kultiviert. Nur in drei dieser 44 Patienten konnte eine schwache Reaktion gegen das SL9- oder das IMP-GL9-Peptid im IFN-γELISpot-Test gemessen werden. Dabei lagen die Werte mit jeweils 12,2 %, 14 % und 26 %
unter dem festgesetzten Schwellenwert von 30 % Erkennung.
Zur weiteren Überprüfung, ob die in den IFN-γ-ELISpot-Tests beobachtete Kreuzreaktivität
der SL9- und IMP-GL9-spezifischen T-Zellen wirklich von kreuzreaktiven T-Zellen hervorgerufen wurde, wurden eine SL9- und drei IMP-GL9-spezifische T-Zelllinien im IFN-γ-ELISpot
Test nicht nur mit den einzelnen SL9- und IMP-GL9-Peptiden inkubiert, sondern auch mit
einer Mischung aus beiden Peptiden. In allen Fällen steigerte die Zugabe einer Peptidmischung nicht die Anzahl der IFN-γ-sekretorischen Zellen im Vergleich zu den Zellen, die nur
mit einem einzelnen Peptid inkubiert worden waren (Abb. 4.14).
Abb. 4.14: IFN-γ-ELISpot-Analysen von SL9- und IMP-GL9-spezifischen CTL-Linien hinsichtlich
ihrer Erkennung einer Peptid-Kombination aus SL9 und IMP-GL9
Die PBMC wurden mit den synthetischen Peptiden inkubiert und nach 14 Tagen hinsichtlich der Peptiderkennung, der Kreuzreaktivität und der Erkennung der IMP-GL9/SL9-Peptidmischung im IFN-γELISpot getestet. Angegeben sind die SFU (Spot Forming Units) von 50.000 eingesetzten Zellen. Die
IMP-GL9-spezifischen CTL-Linien von Patient 480 (a), Patient 564 (c) und Patient 647 (d) sowie die
SL9-spezifische CTL-Linie von Patient 525 (b) zeigen eine deutliche Kreuzreaktion zwischen beiden
Peptiden und keine Steigerung der IFN-γ-Sekretion bei der IMP-GL9/SL9-Peptidmischung mit 20
µg/ml je Peptid.
54
4. Ergebnisse
Diese Ergebnisse deuten weiterhin darauf hin, dass die parallele Messung von SL9- und
IMP-GL9-spezifischen T-Zellen in SL9- oder IMP-GL9-stimulierten PBMC-Kulturen durch
kreuzreaktive T-Zellen hervorgerufen wird.
4.2.3 Kreuzerkennung von elf verschiedenen SL9-Varianten durch SL9- und
IMP-GL9-spezifische CTL-Linien
Das SL9-Epitop ist ein variables Epitop und zeigt Sequenzvariation innerhalb der TCRErkennungsstelle, während die Aminosäuren an den Ankerpositionen 2 und 9 hoch konserviert sind [232, 233, 241-243]. Um das Ausmaß der Erkennung der Mutationen innerhalb des
SL9-Epitops zu messen, wurden die auswachsenden CTL-Linien auf die Kreuzerkennung
von elf SL9-Varianten getestet. Diese SL9-Mutationen wurden in einer früheren Studie mit
einer anderen Kohorte von HLA-A2-positiven Patienten beobachtet (unpublizierte Daten von
Thomas Harrer). Alle getesteten Varianten können als CTL-Fluchtmutationen wirken und
viele der SL9/IMP-GL9-kreuzreaktiven CTL-Linien zeigen eine Kreuzerkennung zu mindestens einer der elf getesteten SL9-Varianten (Tab. 4.3).
Tabelle 4.3: Erkennung von SL9-Varianten durch SL9- und IMP-GL9-spezifische CTLLinien
Kreuzreaktion zu
SL9-stimulierte T-Zellen
IMP-GL9-stimulierte T-Zellen
SL9+,GL9+
SL9+, GL9-
GL9+, SL9+
GL9+,SL9-
+ SLYNTVATL
66
6
69
0
+ GILGF-F--
66
0
69
2
+ --F------
12
4
6
1
+ --F-A----
2
0
6
1
+ --Y-A----
2
0
4
2
+ -------Y-
7
0
9
0
+ ----A--V-
3
1
2
0
+ ----A--A-
3
0
7
0
+ -------V-
11
5
7
0
+ --F--I---
7
2
8
0
+ --F----V-
10
5
5
0
+ ------SA-
4
1
5
0
+ ----A--S2
0
3
0
Angegeben sind die Kreuzreaktionen von elf SL9-Varianten durch 66 SL9-spezifische IMPGL9-keuzreaktive T-Zelllinien (SL9+, GL9+), sechs SL9-spezifischen nicht-kreuzreaktive
CTL-Linien (SL9+, GL9-) sowie 69 IMP-GL9-spezifische SL9-kreuzreaktive CTL-Linien
(GL9+, SL9+) und zwei IMP-GL9-spezifischen nicht-kreuzreaktiven CTL-Linien (GL9+, SL9-).
Angegeben sind die Anzahl der T-Zelllinien mit der Erkennung der individuellen Peptide.
55
4. Ergebnisse
Eine CTL-Linie wurde hierbei als kreuzreaktiv bezeichnet, wenn die Frequenz der T-Zellen,
die mit den SL9-Varianten kreuzreagierten, mindestens 30 % der Frequenz der T-Zellen betrug, welche das Peptid, das für die Stimulation benutzt wurde, erkannten.
24 der 72 analysierten SL9-stimulierten T-Zelllinien (33,3 %) erkannten mindestens eine der
SL9-Varianten mit einer Frequenz von 30,4 % bis 240 % (Median 65,4 %). 19 der 71 getesteten IMP-GL9-stimulierten T-Zelllinien (26,8 %) erkannten mindestens eine der SL9Varianten mit einer Frequenz von 30,4 % bis 186,9 % (Median 78,8 %). Interessanterweise
gab es zwei IMP-GL9-spezifische CTL-Linien, die keine Kreuzreaktion zu SL9 zeigten, aber
mindestens eine der SL9-Varianten erkannten (Tab. 4.3). Beispiele der Erkennungs- und
Kreuzerkennungsmuster verschiedener SL9- und IMP-GL9-stimulierten T-Zelllinien zeigt
Abb. 4.15. Insgesamt generierten 35 verschiedene Patienten CTL-Linien, die eine Kreuzreaktion zu mindestens einer der elf SL9-Varianten zeigten.
56
4. Ergebnisse
Abb. 4.15: IFN-γ-ELISpot Analysen von SL9- und IMP-GL9-spezifischen CTL-Linien hinsichtlich
der Kreuzreaktivität gegenüber elf SL9-Varianten
Gezeigt werden verschiedene Erkennungsmuster von SL9- und IMP-GL9-stimulierten CTL-Linien in
Bezug auf ihre Kreuzerkennung von SL9, IMP-GL9 und den elf SL9-Varianten. Die CTL-Linien wurden
durch Stimulation der PBMC aus HIV-1-infizierten Patienten mit SL9- und IMP-GL9-Peptiden generiert. Angegeben sind die SFU (Spot Forming Units) von 50.000 eingesetzten Zellen. (a) Patient 003
generierte eine IMP-GL9-spezifische CTL-Linie, die zwar eine Kreuzreaktion zu SL9 zeigte, jedoch
keine der SL9-Varianten erkannte. (b) Patient 102 generierte eine IMP-GL9-spezifische CTL-Linie, die
außer dem SL9-Peptid noch eine der SL9-Varianten erkannte. (c) Patient 143 generierte eine IMPGL9-spezifische CTL-Linie, die eine Kreuzreaktion zu SL9 und zu acht SL9-Varianten zeigte. (d) Patient 480 generierte eine IMP-GL9-spezifische CTL-Linie die weder eine Kreuzreaktion zu SL9 noch zu
einer der SL9-Varianten zeigte. (e) Patient 346 generierte eine SL9-spezifische CTL-Linie, die keine
Kreuzreaktion gegenüber IMP-GL9 zeigte, aber drei der SL9-Varianten erkannte. (f) Patient 523 generierte eine SL9-spezifische CTL-Linie, die eine Kreuzreaktion zu IMP-GL9 zeigte und zu sieben SL9Varianten. (g) Patient 647 generierte eine SL9-spezifische CTL-Linie, die nur das IMP-GL9-Peptid
erkannte und keine der SL9-Varianten. (h) Patient 082 generierte eine SL9-spezifische CTL-Linie, die
keine Kreuzreaktion gegenüber IMP-GL9 zeigte, aber drei SL9-Varianten erkannte.
4.2.4 Analyse der funktionalen Peptid-Avidität
Um die Affinität der beiden Peptide zu vergleichen, wurden 26 SL9/IMP-GL9-kreuzreaktive
T-Zelllinien in Titrationsexperimenten mit Verdünnungen von 20 µg/ml bis zu 0,1 ng/ml im
IFN-γ-ELISpot getestet. Zehn der getesteten T-Zelllinien waren SL9-spezifisch, während 16
IMP-GL9-spezifisch waren. Die beiden Peptide zeigten in allen Titrationsexperimenten ein
ähnliches Muster. Die halbmaximale Peptidsensibilisierungskonzentration in den IFN-γELISpot-Tests für die individuellen CTL-Linien lag zwischen 1 µg/ml und 100 ng/ml mit einem
Median von 100 ng/ml für beide Peptide. Beispiele werden in Abb. 4.16 gezeigt.
57
4. Ergebnisse
Abb. 4.16: IFN-γ-ELISpot-Analysen von SL9- und IMP-GL9-spezifischen CTL-Linien mit unterschiedlichen Peptidkonzentrationen
Die CTL-Linien wurden mit den synthetischen SL9- und IMP-GL9-Peptiden stimuliert und nach 14
Tagen hinsichtlich der Peptid-Affinität im IFN-γ-ELISpot-Test untersucht. Die Peptide wurden in verschiedenen Verdünnungen von 20 µg/ml bis zu 0,1 ng/ml verwendet. Angegeben sind die SFU (Spot
Forming Units) von 50.000 eingesetzten Zellen. Patient 503 (a), Patient 346 (c) und Patient 616 (d)
generierten jeweils SL9- und IMP-GL9-spezifische kreuzreaktive CTL-Linien, welche die gleiche Peptid-Affinität für beide Peptide zeigten. Patient 003 (b) generierte eine IMP-GL9-spezifische SL9kreuzreaktive CTL-Linie, welche die gleiche Peptid-Affinität für beide Peptide zeigte.
4.2.5 Die Rolle der SL9- und IMP-GL9-spezifischen sowie der kreuzreaktiven
CTL für die Kontrolle der HIV-1-Infektion
In einem nächsten Schritt wurde nun die Rolle der kreuzreaktiven CTL hinsichtlich eines Einflusses auf den Verlauf der HIV-1-Infektion analysiert. Dafür wurden die Viruslast und die
CD4+-Zellzahlen vor dem Start der Therapie und zum jeweiligen Testzeitpunkt untersucht
(Tab. 4.4 + 4.5). Die Patienten mit einer Erkennung von SL9 und auch die Patienten mit der
Erkennung von IMP-GL9 hatten signifikant niedrigere Viruslasten zum Testzeitpunkt (Tab.
4.5). Dies kann erklärt werden durch den höheren Anteil an behandelten Patienten innerhalb
der Gruppe der SL9- oder IMP-GL9-erkennenden Patienten im Vergleich zu den Patienten
ohne Erkennung dieser beiden Peptide.
58
4. Ergebnisse
Tabelle 4.4: CD4+-Zellzahlen der Patienten
CD4+-Zellzahlen/µl
vor ART
zum Testzeitpunkt
Median
Range
n=
Median
Range
n=
GL9+
293
1 – 941
92
516
66 – 1.702
94
GL9-
264
5 – 1.154
72
468
36 – 1.858
80
*
54 – 1.858
92
SL9+
291
4 – 941
86
540
SL9-
270
1 – 1.154
78
468
*
46 – 1.702
82
Kreuzreaktion
297
4 – 941
73
512
70 – 1.702
75
Keine Kreuzreaktion
278
1 – 879
35
531
66 – 1.858
40
Angegeben ist der Median und der Range der CD4+-Zellzahlen vor dem Start der Therapie
und zum Testzeitpunkt sowie die Anzahl (n) der Patienten, die bei den Berechnungen mit
einbezogen wurden, da nicht bei allen Patienten die Werte vor dem Start der Therapie vorhanden waren.
*
Vergleich der Erkennung von SL9 mit keiner Erkennung, Mann-Whitney-U-Test p = 0,0285
Tabelle 4.5: Viruslasten der Patienten
Viruslast Kopien/ml
zum Testzeitpunkt*
vor ART
Median
Range
n=
Median
GL9+
60.000
760 – 44.000.000
88
15
GL9-
46.500
110 – 44.000.000
70
30
SL9+
60.000
760 – 44.000.000
83
15
SL9-
55.000
110 – 2.100.000
75
Kreuzreaktion
63.250
810 – 44.000.000
Keine Kreuzreaktion
38.000
760 – 44.000.000
Range
n=
**
< 20 – 340.000
94
21
**
< 20 – 310.000
80
#
< 20 – 340.000
92
30
#
< 20 – 310.000
82
72
15
< 20 – 340.000
75
32
35
< 20 – 110.000
40
29
19
30
44
24
Angegeben ist der Median und der Range der Viruslast vor dem Start der Therapie und zum
Testzeitpunkt sowie die Anzahl (n) der Patienten, die bei den Berechnungen mit einbezogen
wurden, da nicht bei allen Patienten die Werte vor dem Start der Therapie vorhanden waren.
*
Viele der Patienten erhielten zum Testzeitpunkt eine ART. Deswegen hatten viele Patienten
eine Viruslast unterhalb der Nachweisgrenze von < 20 Kopien/ml.
XX
Angegeben ist die Anzahl der Patienten mit einer Viruslast von < 20 Kopien/ml
**
Vergleich der Erkennung von IMP-GL9 mit keiner IMP-GL9 Erkennung, Mann-Whitney-UTest p = 0,0008
#
Vergleich der Erkennung von SL9 mit keiner SL9 Erkennung, Mann-Whitney-U-Test p =
0,0038
Die Patienten mit Therapie wurden anschließend auch mit den Patienten ohne Therapie hinsichtlich der Erkennung von IMP-GL9 und SL9 verglichen. Die Patienten, welche eine antiretrovirale Therapie erhielten, generierten häufiger SL9- genauso wie IMP-GL9-spezifische
CTL-Linien als unbehandelte Patienten (Tab. 4.6 + 4.7).
59
4. Ergebnisse
Tabelle 4.6: Erkennung von IMP-GL9 in Korrelation mit der Therapie
Anzahl
Therapie
0
1
Gesamt
Erkennung
0
21
53
74
GL9
1
9
82
91
30
135
165
Gesamt
Fisher`s exact p = 0,004
Angegeben ist die Anzahl der Patienten mit (=1) und ohne (=0) Therapie und die Erkennung
von IMP-GL9 (=1) versus keine Erkennung von IMP-GL9 (=0).
Tabelle 4.7: Erkennung von SL9 in Korrelation mit der Therapie
Anzahl
Therapie
0
1
Gesamt
Erkennung
0
19
58
77
SL9
1
10
78
88
29
136
165
Gesamt
Fisher`s exact p = 0,039
Angegeben ist die Anzahl der Patienten mit (=1) und ohne (=0) Therapie und die Erkennung
von SL9 (=1) versus keine Erkennung von SL9 (=0).
Da die Mehrheit der Patienten, die untersucht wurden, eine antiretrovirale Therapie erhielt,
wurden die Patienten bezüglich der Viruslast zum Testzeitpunkt in Patienten ohne antiretrovirale Therapie (ART) und Patienten mit ART unterteilt. Die 136 Patienten mit Therapie, die in
diese Analyse mit eingeschlossen wurden, wurden weiter unterteilt in Patienten mit niedriger
Virämie (Blips zwischen 20 und 880 Kopien/ml) und Patienten mit supprimierter Viruslast
(< 20 Kopien/ml, Tab. 4.8). Innerhalb der Gruppe der Patienten mit niedriger Virämie hatten
diejenigen Patienten, welche eine SL9-spezifische IMP-GL9-kreuzreaktive CTL-Linie generierten, signifikant höhere Viruslasten (Tab. 4.8). Alle anderen Gruppen zeigten keine signifikanten Unterschiede.
60
4. Ergebnisse
Tabelle 4.8: Vergleich der Patienten mit Therapie versus Patienten ohne Therapie
Mit Therapie
Ohne Therapie
Anzahl
Blips
Median Virus-
Anzahl
last Kopien/ml
supprimiert
Median Viruslast Kopien /ml
Anzahl
Erkennung GL9
9
5.600
26
40
56
Keine Erkennung GL9
21
19.000
24
45
29
Kreuzreaktion zu SL9
6
17.800
18
40
35
3
5.200
8
30
21
Erkennung SL9
10
7.450
22
50
56
Keine Erkennung SL9
19
19.700
28
30
30
Kreuzreaktion zu GL9
7
9.300
17
90*
33
3
1.300
5
20*
23
Kreuzreaktion
7
9.300
21
60
42
Keine Kreuzreaktion
5
5.200
10
30
26
Keine Kreuzreaktion
zu SL9
Keine Kreuzreaktion
zu GL9
Angegeben ist die Anzahl der Patienten mit Therapie versus die Anzahl der Patienten ohne
Therapie betreffend die Viruslast zum Testzeitpunkt. Die Patienten mit Therapie wurden in
zwei Gruppen unterteilt: Patienten mit niedriger Virämie (Blips 20-880 Kopien/ml) und Patienten mit supprimierter Virämie (< 20 Kopien/ml).
*
Kreuzreaktion von SL9-spezifischen CTL zu IMP-GL9, Mann-Whitney-U-Test p = 0,039
Patienten mit supprimierten Viruslasten während der Therapie generierten signifikant häufiger SL9-spezifische CTL-Linien (56 von 86) als behandelte Patienten mit niedriger Virämie
(22 von 50; Fisher`s exact p = 0,02; Tab. 4.9).
Tabelle 4.9: Korrelation der Patienten mit niedriger Virämie mit der Erkennung von SL9
Anzahl
Blips
Gesamt
0
1
Erkennung
0
30
28
58
SL9
1
56
22
78
86
50
136
Gesamt
Fisher`s exact p = 0,020
Angegeben ist die Anzahl der Patienten mit niedriger Virämie (Blips =1) gegen Patienten
ohne Blips (=0) und der Erkennung von SL9 (=1) versus keine Erkennung von SL9 (=0).
Patienten mit Therapie generierten signifikant häufiger SL9/IMP-GL9-kreuzreaktive TZelllinien (65 von 109) im Vergleich zu unbehandelten Patienten (7 von 19). Aber dieser Unterschied war nur grenzwertig signifikant (Fisher´s exact p = 0,081, Tab. 4.10).
61
4. Ergebnisse
Tabelle 4.10: Korrelation der ART mit der Messung von SL9/IMP-GL9-kreuzreaktiven
CTL
Anzahl
Therapie
Kreuzreaktion
Gesamt
Gesamt
0
1
0
12
44
56
1
7
65
72
19
109
128
Fisher`s exact= 0,081
Angegeben ist die Anzahl der Patienten mit Therapie (=1) und der Patienten ohne Therapie
(=0), sowie die Kreuzreaktion (=1) versus keine Kreuzreaktion (=0).
4.2.6 Erkennung von SL9- und IMP-GL9-Peptiden in HIV-1-negativen Personen
Auch HIV-1-negative Personen wurden auf das Vorhandensein von IMP-GL9- und SL9spezifischen CTL-Antworten untersucht. Zu diesem Zweck wurden die PBMC von 18 HIV-1negativen HLA-A2-positiven Blutspendern und von sieben HLA-A2-positiven HIV-1exponierten seronegativen Personen mit den synthetischen SL9- und IMP-GL9-Peptiden
stimuliert und die auswachsenden CTL-Linien wurden im IFN-γ-ELISpot-Test auf die Erkennung sowie die Kreuzreaktion getestet. Obwohl das IMP-GL9-Epitop als dominantes Influenza-Epitop beschrieben wurde, generierten nur zwei der 18 gesunden Blutspender CTL gegen
das IMP-GL9 Epitop. Diese zeigten keine Kreuzreaktion gegenüber dem SL9-Peptid (Abb.
4.17 b + c). Nur ein HIV-1-exponierter seronegativer Blutspender generierte eine IMP-GL9und eine SL9-spezifische CTL-Linie. Diese beiden CTL-Linien zeigten aber auch keine
Kreuzreaktion gegenüber dem anderen Peptid (Abb. 4.17 a). Insgesamt war die Reaktion
gegen die beiden Peptide sehr schwach ausgeprägt, was auf eine sehr geringe Frequenz an
IFN-γ-sekretorischen T-Zellen schließen lässt. Auch mit Hilfe des IMP-GL9-spezifischen
Dextramers konnten die IMP-GL9-spezifischen T-Zellen nachgewiesen werden (Abb. 4.17
d).
62
4. Ergebnisse
Abb. 4.17: IFN-γ-ELISpot-Analyse der Erkennung und Kreuzreaktion sowie Dextramer-Färbung
von IMP-GL9- und SL9-spezifischen CTL-Linien von HIV-1-negativen Blutspendern
Die PBMC wurden mit den synthetischen Peptiden stimuliert und nach 14 Tagen im IFN-γ-ELISpot
hinsichtlich der Erkennung und der Kreuzreaktion der beiden Peptide getestet. Angegeben sind die
SFU (Spot Forming Units) von 50.000 eingesetzten Zellen. (a) Der HIV-1-exponierte seronegative
Spender 639 generierte sowohl eine IMP-GL9-spezifische, als auch eine SL9-spezifische CTL-Linie,
die jedoch beide keine Kreuzreaktion zeigten. Die HIV-1-negativen Spender 314 (b) und Spender
1007 (c) generierten eine IMP-GL9-spezifische CTL-Linie ohne Kreuzreaktion zu SL9. (d) DextramerFärbung der IMP-GL9-spezifischen CTL-Linie von Spender 1007 mit einem CD8-PE-Antikörper und
dem IMP-GL9-FITC-Dextramer.
4.3 Analyse der Kreuzreaktivität zwischen dem HIV-1-SL9-, dem IMP-GL9und dem EBV-GL9-Peptid in HIV-1-infizierten Patienten
Vor Kurzem wurde von Clute et al. veröffentlicht, dass eine Kreuzreaktivität zwischen dem
IMP-GL9-Epitop und dem EBV-GL9-Epitop (GLCTLVAML, AS 280-288) aus dem BMLF1Protein des Epstein-Barr-Virus besteht. Diese Kreuzreaktivität ist auf einen TCR zurückzuführen, der in der Lage ist, die beiden Peptide zu erkennen [249]. Das EBV-GL9-Epitop ist
wie auch SL9 und IMP-GL9 ein HLA-A2-restringiertes Epitop [249, 250]. Daher stellte sich
die Frage, ob es auch eine Kreuzreaktivität zwischen dem EBV-GL9- und dem SL9-Epitop
aus HIV-1 gibt. Hierfür wurden die HIV-1-infizierten HLA-A2-positiven Patienten mit dem
EBV-GL9-Peptid stimuliert und die auswachsenden CTL-Linien wurden auf die Erkennung
und Kreuzreaktion gegenüber IMP-GL9 und SL9 getestet. Auch die SL9- und IMP-GL9spezifischen CTL-Linien wurden auf die Kreuzreaktion gegenüber EBV-GL9 im IFN-γELISpot untersucht.
63
4. Ergebnisse
4.3.1 Erkennung von EBV-GL9 in HIV-1-infizierten Patienten
Zuerst wurde die T-Zellerkennung des EBV-GL9-Peptids in 157 HIV-1-infizierten HLA-A2positiven Patienten untersucht. Die Mehrheit dieser Patienten (148/159) bekam eine antiretrovirale Therapie. Die Prävalenz der EBV-GL9-spezifischen T-Zellerkennung wurde durch
die Stimulation mit dem synthetischen EBV-GL9-Peptid und anschließender Analyse der
Peptiderkennung durch die auswachsenden T-Zellen in IFN-γ-ELISpot-Tests ermittelt. Dabei
konnte festgestellt werden, dass 97 der getesteten Patienten (61,8 %) EBV-GL9-spezifische
CTL-Linien generierten. Außerdem wurden zwei HIV-1-negative HLA-A2-positive Spender
auf die Erkennung des EBV-GL9-Peptids im IFN-γ-ELISpot getestet. Beide Spender generierten eine EBV-GL9-spezifische CTL-Linie. In Experimenten mit anti-CD4- und anti-CD8Antikörpern konnte im IFN-γ-ELISpot gezeigt werden, dass fast alle der 14 getesteten EBVGL9-spezifischen Zelllinien CD8+ T-Zellen waren. Zwei der getesteten EBV-GL9-spezifischen
CTL-Linien ließen sich weder durch den anti-CD8- noch durch den anti-CD4-Antikörper blocken. Dies könnte auf eine besonders hohe Avidität der CTL für EBV-GL9 hinweisen, sodass
der T-Zellrezeptor nicht auf die ko-stimulatorische Wirkung von CD8 abhängig ist. Beispiele
für diese Block-Experimente sind in Abb. 4.18 zu sehen.
Abb. 4.18: EBV-GL9-spezifische CTL-Linien können durch den anti-CD8-Antikörper geblockt
werden
Die CTL-Linien wurden durch Stimulation mit den synthetischen Peptiden generiert und im ELISpot
auf IFN-γ-Sekretion getestet. Die Zellen wurden jeweils mit einem anti-CD8- und einem anti-CD4Antikörper für eine Stunde geblockt und dann wurde das Peptid zugegeben. Angegeben sind die SFU
(Spot Forming Units) von 50.000 eingesetzten Zellen. Beide EBV-GL9-spezifischen CTL-Linien von
Patient 969 (a) und Spender 1242 (b) lassen sich durch den anti-CD8-Antikörper blocken, wobei sich
die Zellen von Spender 1242 nur schwach blocken lassen.
Um die Peptid-Affinität zu bestimmen, wurden acht EBV-GL9-spezifische CTL-Linien in IFNγ-ELISpot-Tests mit Peptid-Verdünnungen von 20 µg/ml bis zu 0,1 ng/ml untersucht. Alle
Zelllinien
zeigten
ein
ähnliches
Erkennungsmuster.
Dabei
lag
die
halbmaximale
Peptidsensibilisierungskonzentration für die individuellen CTL-Linien zwischen 10 µg/ml und
100 ng/ml mit einem Median von 100 ng/ml für das EBV-GL9 Peptid. Beispiele werden in
Abb. 4.19 gezeigt.
64
4. Ergebnisse
Abb. 4.19: IFN-γ-ELISpot-Analysen von EBV-GL9-spezifischen CTL-Linien mit unterschiedlichen Peptidkonzentrationen
Die CTL-Linien wurden mit dem synthetischen EBV-GL9-Peptid stimuliert und nach 14 Tagen hinsichtlich der Peptid-Affinität im IFN-γ-ELISpot-Test untersucht. Das Peptid wurde in verschiedenen Verdünnungen von 20 µg/ml bis zu 0,1 ng/ml verwendet. Angegeben sind die SFU (Spot Forming Units)
von 50.000 eingesetzten Zellen. Alle CTL-Linien zeigen eine ähnliche Peptid-Affinität. Spender 1242
(a), Patient 223 (b).
4.3.2 Kreuzreaktivität der HIV-1-SL9-, IMP-GL9 und EBV-GL9-spezifischen CTLLinien
Im nächsten Schritt wurden die EBV-GL9-spezifischen CTL-Linien auf die Kreuzerkennung
von IMP-GL9 und SL9 im IFN-γ-ELISpot getestet, genauso wie IMP-GL9- und SL9spezifische CTL-Linien hinsichtlich ihrer Kreuzreaktion gegenüber EBV-GL9 analysiert wurden. Eine CTL-Linie wurde als kreuzreaktiv bezeichnet, wenn die Frequenz der T-Zellen,
welche kreuzreaktiv waren, mindestens 30 % der Frequenz der T-Zellen betrug, mit der die
T-Zellen das Peptid erkannten, mit dem sie stimuliert wurden. Dabei zeigte sich, dass vier
der 97 EBV-GL9-spezifischen CTL-Linien (4,1 %) auch das IMP-GL9-Peptid mit einer Frequenz von 34,7 % bis 227,3 % der EBV-GL9-spezifischen T-Zellen erkannten (Median
59,6 %). 13 der 97 EBV-GL9-spezifischen CTL-Linien (13,4 %) zeigten eine Kreuzreaktion
gegenüber dem SL9-Peptid mit einer Frequenz von 30,1 % bis zu 195 % der Frequenz der
EBV-GL9-spezifischen T-Zellen. Der Median betrug 48,3 %. 34 IMP-GL9-spezifische CTLLinien wurden auf die Kreuzreaktion gegenüber EBV-GL9 untersucht. Von diesen 34 IMPGL9-spezifischen CTL-Linien zeigten drei T-Zelllinien (8,8 %) eine Kreuzreaktion gegenüber
dem EBV-GL9-Peptid mit einer Frequenz von 31,5 % bis zu 409,3 % der Frequenz der IMPGL9-spezifischen T Zellen. Der Median der Kreuzreaktion betrug 182,3 %. 31 Patienten mit
einer SL9-spezifischen CTL-Linie wurden auf die Kreuzreaktion gegen das EBV-GL9-Peptid
untersucht. Von den 31 SL9-spezifischen CTL-Linien zeigten fünf Zelllinien (16,1 %) eine
Kreuzreaktion gegenüber dem EBV-GL9-Peptid mit einer Frequenz von 46,4 % bis zu
198,2 % der Frequenz der SL9-spezifischen T-Zellen. Der Median betrug hierbei 63,8 %.
Beispiele für kreuzreaktive CTL-Linien in der IFN-γ-ELISpot-Analyse sind in Abb. 4.20 zu
sehen. Insgesamt waren sieben CTL-Linien aus 107 spezifisch für IMP-GL9 und EBV-GL9
(6,5 %), während 16 CTL-Linien aus 100 spezifisch für SL9 und EBV-GL9 (16 %) waren.
65
4. Ergebnisse
Abb. 4.20: IFN-γ-ELISpot-Analysen verschiedener Peptid-stimulierter CTL-Linien
Die PBMC wurden mit dem synthetischen Peptid inkubiert und nach 14 Tagen hinsichtlich ihrer Kreuzreaktivität im IFN-γ-ELISpot getestet. Angegeben sind die SFU (Spot Forming Units) von 50.000 eingesetzten Zellen. (a) Patient 007 generiert eine EBV-GL9-spezifische SL9-kreuzreaktive CTL-Linie
genauso wie die EBV-GL9-spezifische CTL-Linie von Patient 285 (b). Patient 968 (c) generierte eine
EBV-GL9-spezifische nicht-kreuzreaktive CTL-Linie. Patient 007 (d) generierte eine SL9-spezifische
EBV-GL9-kreuzreaktive.
Auch hier besteht neben der vermuteten Kreuzreaktivität des TCRs die Möglichkeit, dass
diese T-Zellen aufgrund eines unspezifischen Wachstums von nicht-kreuzreaktiven SL9-,
IMP-GL9- oder EBV-GL9-spezifischen T-Zellen durch das im Medium enthaltene IL-2 und
HIV-1-Antigene, die in den PBMC der Patienten vorhanden sind, stimuliert wurden. Um die
Möglichkeit eines unspezifischen Wachstums aufgrund von Bestandteilen des IL-2 enthaltenden Kulturmediums auszuschließen, wurden die PBMC von 62 Patienten parallel zur Peptidstimulation auch mit dem Medium ohne Peptid-Zusatz kultiviert. In drei dieser 62 Patienten
konnte eine Reaktion gegen das EBV-GL9-Peptid im IFN-γ-ELISpot-Test gemessen werden.
Die Kreuzreaktivität lag jeweils bei 38,1 %, 67,5 % und 71,2 %. Fünf dieser 62 Patienten
zeigten eine schwache Reaktion gegenüber dem EBV-GL9-Peptid. Dabei lagen die Werte
unter dem festgesetzten Schwellenwert von 30 % Erkennung, nämlich zwischen 12 % bis
17,7 %. Alle anderen Patienten zeigten keine nennenswerte Erkennung.
Des Weiteren wurden drei der fünf EBV-GL9-spezifischen SL9-kreuzreaktiven CTL-Linien
mit dem SL9-Dextramer gefärbt, um die Theorie der Kreuzreaktivität weiter zu unterstreichen. Alle drei EBV-GL9-spezifischen CTL-Linien ließen sich mit dem SL9-Dextramer anfärben, wobei eine Linie nur sehr wenige SL9-spezifische Zellen zeigte. Die Ergebnisse der
Färbung zweier EBV-GL9-spezifischer T-Zelllinien sind in Abb. 4.21 zu sehen.
66
4. Ergebnisse
Abb. 4.21: Dextramer-Färbung von EBV-GL9-spezifischen CTL-Linien mit dem SL9-Dextramer
Die EBV-GL9-spezifischen SL9-kreuzreaktiven CTL-Linien von Patient 285 (a-c) und Patient 267 (d-f)
wurden mit dem SL9-PE-Dextramer, sowie einem CD8-FITC-Antikörper gefärbt und im Durchflusszytometer analysiert. (a + d) Färbung der Zellen mit Iso-FITC + Iso-PE. (b + e) Färbung der Zellen mit
CD8-FITC. (c + f) Färbung der Zellen mit CD8-FITC + SL9-PE.
Die interessante Frage war, ob eine CTL-Linie in der Lage ist, alle drei Peptide zu erkennen.
Insgesamt generierten vier Patienten eine CTL-Linie, die alle drei Peptide erkannten. Dabei
waren jeweils eine Zelllinie mit IMP-GL9 und EBV-GL9 generiert worden und zwei Zelllinien
mit SL9 (Abb.4.22).
Abb. 4.22: IFN-γ-ELISpot-Analysen verschiedener mit SL9, IMP-GL9 und EBV-GL9 stimulierter
CTL-Linien
Die PBMC wurden mit den synthetischen Peptiden inkubiert und nach 14 Tagen hinsichtlich ihrer
Kreuzreaktivität im IFN-γ-ELISpot getestet. Angegeben sind die SFU (Spot Forming Units) von 50.000
eingesetzten Zellen. (a) Patient 087 generierte eine IMP-GL9-spezifische SL9- und EBV-GL9kreuzreaktive T-Zelllinie. Patient 920 (b) und Patient 525 (c) generierten SL9-spezifische IMP-GL9und EBV-GL9-kreuzreaktive CTL-Linien. (d) Patient 331 generierte eine EBV-GL9-spezifische SL9und IMP-GL9-kreuzreaktive CTL-Linie.
67
4. Ergebnisse
4.3.3 Die Rolle der EBV-GL9-kreuzreaktiven CTL-Linien für die Kontrolle der
HIV-1-Infektion
Des Weiteren wurde untersucht, ob diese SL9/IMP-GL9/EBV-GL9-kreuzreaktiven CTL einen
Einfluss auf den Verlauf der HIV-1-Infektion haben. Dafür wurden die Viruslast und die CD4+Zellzahlen vor dem Start der Therapie und zum jeweiligen Testzeitpunkt untersucht (Tab.
4.11 + Tab. 4.12).
Tabelle 4.11: CD4+-Zellzahlen der Patienten
CD4+-Zellzahlen/µl
vor ART
zum Testzeitpunkt
Median
Range
n=
Median
Range
n=
EBV-GL9+
300
1 – 879
90
537
89 – 1.782
97
EBV-GL9-
260
5 – 1.120
53
524
51 – 2.120
62
EBV-GL9+, SL9+
238
56 – 558
15
474
139 – 887
16
309
1 – 879
79
542
89 – 1.782
84
15 – 469
7
480
163 – 581
7
300
1 – 911
93
542
66 – 1.782
100
160,5
61 – 331
4
514,5
188 – 718
4
299,5
1 – 911
98
541,5
66 – 1.782
105
Keine Kreuzreaktion
EBV-GL9/SL9
EBV-GL9+,
IMP-GL9+
Keine Kreuzreaktion
EBV-GL9/IMP-GL9
SL9+, EBV-GL9+,
IMP-GL9+
Keine Kreuzreaktion
*
82
*
+
Angegeben ist der Median und der Range der CD4 -Zellzahlen vor dem Start der Therapie
und zum Testzeitpunkt sowie die Anzahl (n) der Patienten, die bei den Berechnungen mit
einbezogen wurden, da nicht bei allen Patienten die Werte vor dem Start der Therapie vorhanden waren.
*
Vergleich von EBVGL9/IMP-GL9-spezifischen kreuzreaktiven CTL-Linien mit dem Fehlen
einer kreuzreaktiven Antwort, Mann-Whitney-U-Test p = 0,031
68
4. Ergebnisse
Tabelle 4.12: Viruslasten der Patienten
Viruslast Kopien/ml
zum Testzeitpunkt*
vor ART
Median
EBV-GL9+
56.600
EBV-GL9-
120.000
EBV-GL9+, SL9+
49.000
Keine Kreuzreaktion
EBV-GL9/SL9
EBV-GL9+,
IMP-GL9+
Keine Kreuzreaktion
IMP-GL9/EBV-GL9
SL9+, EBV-GL9+,
IMP-GL9+
Keine Kreuzreaktion
60.000
73.000
52.000
106.500
55.000
Range
810 –
44.000.000
600 –
29.000.000
1.100 –
560.000
810 –
4.400.0000
26.000 –
2.100.000
810 –
44.000.000
35.000 –
560.000
810 –
44.000.000
n=
Median
Range
85
516
66 – 1.702
97
53
468
36 – 1.858
62
15
15
< 20 – 760
16
73
15
7
15
88
15
4
15
93
15
< 20 –
260.000
< 20 – 80
< 20 –
260.000
< 20 – 220
< 20 –
260.000
n=
57
35
11
60
84
5
7
71
100
3
4
72
105
Angegeben ist der Median und der Range der Viruslast vor dem Start der Therapie und zum
Testzeitpunkt sowie die Anzahl (n) der Patienten, die bei den Berechnungen mit einbezogen
wurden, da nicht bei allen Patienten die Werte vor dem Start der Therapie vorhanden waren.
*
Viele der Patienten erhielten zum Testzeitpunkt eine ART. Deswegen hatten viele Patienten
eine Viruslast unterhalb der Nachweisgrenze von < 20 Kopien/ml.
XX
Angegeben ist die Anzahl der Patienten mit einer Viruslast von < 20 Kopien/ml
Patienten mit EBV-GL9/IMP-GL9-spezifischer kreuzreaktiver CTL-Linie hatten signifikant
niedrigere CD4+-Zellzahlen vor dem Start der Therapie (Tab. 4.9). Alle anderen Patientengruppen zeigten keine signifikanten Unterschiede.
4.4. Herstellung und Analyse von HIV-1-SL9, IMP-GL9 und EBV-GL9 spezifischen TCR
Da vor Kurzem gezeigt werden konnte, dass ein kreuzreaktiver TCR in der Lage ist, sowohl
ein Epitop aus dem Influenza-A-Virus Matrix-Protein (IMP-GL9) als auch aus dem BMLF1Protein des EBV (EBV-GL9) zu erkennen [249], sollten die TCRs verschiedener SL9-, IMPGL9- und EBV-GL9-spezifischer CTL-Linien charakterisiert werden, um zu ermittelt, ob ein
TCR in der Lage ist, alle drei Epitope zu erkennen. Zu diesem Zweck wurde ein Protokoll zur
TCR-Ketten-Identifizierung verwendet, das in unserem Labor etabliert und getestet wurde
69
4. Ergebnisse
[228, 251, 252]. Zur Optimierung der TCR-Klonierung wurde eine Spectratyping-PCR etabliert und als weiterer Schritt zur Identifizierung der TCR-Ketten genutzt. Dadurch konnten die
dominanten TCR-Ketten identifiziert und anschließend generiert werden. Für die Identifizierung der TCR-α- und -β-Ketten wurden verschiedene CTL-Linien ausgewählt, die im IFN-γELISpot eine starke Reaktion auf die jeweiligen Peptide zeigten. Diese Zelllinien wurden mit
Hilfe spezifischer Dextramere oder dem IFN-γ-spezifischen Antikörper und CD8-Antikörpern
gefärbt und im Durchflusszytometer (FACS-Aria II) sortiert. Von diesen Zellen wurde die
mRNA mit Hilfe des NucleoSpin® RNA II Kits von Machery-Nagel isoliert. Danach erfolgte die
cDNA-Synthese und anschließend die PCR zur Identifizierung der TCR-Ketten. Hierfür wurde zum einen das Protokoll mit der Erststrangsynthese, nachfolgender TCR-spezifischerPCR und Sequenzierung des erhaltenen Produkts (Protokoll 1) [228, 251, 252] sowie das
neu etablierte Protokoll der Spectratyping-PCR mit anschließender Analyse der positiven
PCR-Produkte im 3130 Genetic Analyzer (Protokoll 2) verwendet.
4.4.1
Identifizierung,
Herstellung
und
Charakterisierung
von
IMP-GL9-
spezifischen TCR-Ketten
Zuerst wurde eine IMP-GL9-spezifischen CTL-Linie von Patient 048, die eine gute Reaktion
im IFN-γ-ELISpot zeigte, untersucht. Die T-Zelllinie wurde mit dem IMP-GL9-spezifischen
FITC-gekoppelten Dextramer und einem CD8-PE-Antikörper gefärbt und die Identifizierung
der
TCR-Ketten
erfolgte
mit
Protokoll
1.
Dabei
konnte
eine
variable
α-Kette
(AV16s1_TRAV3) und eine variable β-Kette (BV17s1_TRBV19) identifiziert werden. Die Namen der TCR-Ketten, die von mir verwendet wurden, leiten sich zum einen durch die von
Arden entwickelte Nomenklatur [253] (AV16s1 bzw. BV17s1) und zum anderen durch die
ImMunoGeneTics(IMGT)-HLA-Datenbank (TRAV3 bzw. TRBV19) her [172].
Die β-Kette BV17s1_TRBV19 wurde schon früher als dominante β-Kette für das IMP-GL9Epitop beschrieben [254, 255] und war auch als die dominante β-Kette beim EBV-GL9kreuzreaktiven TCR identifiziert worden [249]. Die α-Kette AV16s1_TRAV3 wurde bisher
nicht als dominante Kette beim IMP-GL9-Epitop beschrieben. Auch die CDR3-Region der αKette (TRAJ27) war bisher noch nicht in Erscheinung getreten, während die CDR3-Region
der β-Kette (TRBJ1-1) bekannt ist [249]. Dennoch unterschied sich die TRBJ1-1-Sequenz
aufgrund der zufälligen Rekombinationen der TCR-Ketten in einigen Aminosäuren von den
bisher veröffentlichten Sequenzen.
Die
beiden
identifizierten
TCR-Ketten
wurden
generiert
und
in
einen
mRNA-
Produktionsvektor kloniert. Dadurch konnte von den generierten TCR-α- und -β-Ketten durch
in-vitro-Transkription mRNA hergestellt werden. Diese mRNA wurde in PBMC eines HIV-1negativen Blutspenders durch Elektroporation transfiziert, um die Funktionalität der so rep70
4. Ergebnisse
rogrammierten T-Zellen im IFN-γ-ELISpot zu analysieren. In einem ersten Test konnte gezeigt werden, dass die mit der TCR-mRNA reprogrammierten T-Zellen in der Lage sind, das
IMP-GL9-Peptid, präsentiert über das HLA-A2-Molekül der T2-Zellen, zu erkennen (Abb.
4.23a). Die T2-Zelle wurde als APC verwendet. Dabei handelt es sich um eine TAPdefiziente humane Zelllinie, die ein Hybrid aus einer T-Zellleukämie Zelllinie (T-LCL) und
einer B-lymphoblastoiden Zelllinie (B-LCL) mit dem HLA-Typ A2, A2, B51, B51, Cw1 und
Cw1 darstellt.
Bei diesem Test wurden jeweils 15 µg mRNA jeder TCR-Kette zusammen elektroporiert. Die
Reaktion gegen das IMP-GL9-Peptid war sehr schwach. Außerdem zeigten die TCRelektroporierten PBMC keine Kreuzreaktion gegenüber dem SL9- und dem EBV-GL9-Peptid
(Abb. 4.26a). Als Negativkontrolle wurden in allen Versuchen die T2-Zellen mit dem IV9Peptid (ILKEPVHGV, AS 309-317) inkubiert. Bei dem IV9-Peptid handelt es sich um ein
HLA-A2-restringiertes Epitop aus dem Pol-Protein von HIV-1 [239].
In einem weiteren Versuch wurde getestet, ob die Erhöhung der mRNA-Menge auf 20 µg pro
TCR-Kette eine bessere Expression des TCRs bewirken kann. Außerdem wurden zur KoStimulation IL-2 (10 U/ml) und IL-7 (10 ng/µl) zugegeben. Damit konnte eine deutliche Steigerung der funktionellen Aktivität des transferierten TCRs erreicht werden (Abb. 4.23b). Da
in diesem Test die PBMC eines HLA-A2-positiven Spenders verwendet wurden, konnte gezeigt werden, dass die mit dem IMP-GL9-spezifischen TCR reprogrammierten T-Zellen das
IMP-GL9-Peptid ohne Ko-Stimulation durch die T2-Zellen erkennen (Abb. 4.23b).
Ein weiterer Test, in dem die Funktionalität der reprogrammierten T-Zellen analysiert wurde,
war der Chrom-Freisetzungstest. Dafür wurden 24 Stunden nach der Elektroporation T2Zellen als Target-Zellen mit
51
Cr und dem IMP-GL9-Peptid inkubiert. Danach erfolgte die
Zugabe der reprogrammierten T-Zellen als Effektor-Zellen in einem Verhältnis von 50:1 (E:T)
und nach einer Inkubationszeit konnte die spezifische Lyse durch die Chromabgabe gemessen und analysiert werden. Hierbei konnten keine eindeutigen Ergebnisse gewonnen werden. Da auch die Reaktion im IFN-γ-ELISpot sehr schwach war, ist zu vermuten, dass die
Frequenz der TCR-transfizierten T-Zellen und die Expression des TCRs nicht ausgereicht
haben, um eine spezifische Lyse der Target-Zellen zu erreichen.
In weiteren Versuchen wurde getestet, ob man mit 30 µg mRNA pro TCR-Kette nochmals ein
besseres Resultat erhält. Zu diesem Zweck wurden die T-Zellen von einem HLA-A2positiven Spender mit 15 µg und 30 µg mRNA pro TCR-Kette reprogrammiert. Zusätzlich
wurden IL-2 (10 U/ml) und IL-7 (10 ng/µl) zur Ko-Stimulation im IFN-γ-ELISpot-Test zugegeben (Abb. 4.23c + d). Man sieht hier deutlich, dass die Zugabe von IL-2 und IL-7 die Reaktion auf das Peptid verstärkt. Die Reaktion war in diesem Test allerdings nicht so stark wie bei
dem Test in Abb. 4.23b, obwohl die PBMC vom gleichen Spender stammten. Mit 30 µg
71
4. Ergebnisse
mRNA pro TCR-Kette sah man eine stärkere Erkennung des Peptids über die T2-Zellen, die
jedoch mit der Zugabe von IL-2 und IL-7 schwächer wurde.
Abb. 4.23: IFN-γ-ELISpot-Analyse der mit TCR-mRNA elektroporierten T-Zellen aus HIV-1negativen Spendern
Die PBMC wurden mit der TCR-mRNA reprogrammiert und nach vier Stunden auf den IFN-γ-ELISpot
aufgetragen. Die T2-Zellen wurden mit dem Peptid inkubiert und dienten als APC. Angegeben sind die
SFU (Spot Forming Units) von 150.000 (a + b) bzw. 100.000 (c + d) eingesetzten reprogrammierten TZellen. (a) Die mit 15 µg mRNA pro TCR-Kette elektroporierten PBMC des HLA-A2-negativen HIV-1negativen Spenders 119 sind in der Lage, das IMP-GL9-Peptid über das HLA-A2-Molekül der T2Zellen zu erkennen. (b) Die Erhöhung der mRNA-Menge auf 20 µg pro TCR-Kette sowie die Zugabe
von IL-2 (10 U/ml) und IL-7 (10 ng/µl) im IFN-γ-ELISpot bei der Elektroporation des HLA-A2-positiven
Spenders 238 zeigen eine stärkere Reaktion auf das IMP-GL9-Peptid präsentiert durch die T2-Zellen.
Das IMP-GL9 Peptid wird auch ohne Ko-Stimulation durch die T2-Zellen erkannt. (c) Die mit 15 µg
mRNA pro TCR-Kette elektroporierten PBMC des HLA-A2-positiven HIV-1-negativen Spenders 238
sind in der Lage, das IMP-GL9-Peptid über das HLA-A2-Molekül der T2-Zellen zu erkennen und die
Erkennung wird verstärkt durch die Zugabe von IL-2 (10 U/ml) und IL-7 (10 ng/µl). (d) Die mit 30 µg
mRNA pro TCR-Kette elektroporierten PBMC des HLA-A2-positiven HIV-1-negativen Spender 238
sind in der Lage, das IMP-GL9-Peptid über das HLA-A2-Molekül der T2-Zellen zu erkennen. Die Reaktion ist stärker als bei der Verwendung von 15 µg mRNA. Durch die Zugabe von IL-2 und IL-7 wird
die Reaktion eher schwächer.
Die Elektroporation mit 30 µg mRNA pro TCR-Kette zeigte in weiteren Experimenten mit den
PBMCs des gleichen Spenders nur eine sehr geringe Verstärkung der Reaktion auf die T2Zellen, welche das IMP-GL9-Peptid präsentierten. Auch bei diesen beiden Tests mit jeweils
72
4. Ergebnisse
15 und 30 µg mRNA wurden Chrom-Freisetzungstests durchgeführt. Obwohl die Reaktion im
IFN-γ-ELISpot etwas stärker war, reichte die Reaktion nicht für eine spezifische Lyse der
Target-Zellen im Chrom-Freisetzungstest.
Bei allen Elektroporationen wurden die reprogrammierten Zellen vier Stunden nach der
Elektroporation nicht nur hinsichtlich ihrer Funktionalität im IFN-γ-ELISpot getestet, sondern
die Expression auf der Oberfläche sollte auch durch die Färbung mit dem IMP-GL9spezifischen Dextramer im Durchflusszytometer nachgewiesen und analysiert werden. In
allen Fällen konnte keine Färbung nachgewiesen werden. Womöglich wird der TCR gar nicht
auf der Zelloberfläche exprimiert. Es ist auch denkbar, dass der TCR nur in sehr geringen
Konzentrationen auf der Zelloberfläche exprimiert wird oder die Affinität des TCRs ist zu gering um ein spezifisches Dextramer zu binden.
In weiteren Versuchen wurden nun die PBMC von HIV-1-infizierten Patienten mit der mRNA
der IMP-GL9-spezifischen TCR-Ketten reprogrammiert. Hierbei sah man deutlich, dass eine
viel stärkere Reaktion auf die IMP-GL9-präsentierenden T2-Zellen nachgewiesen werden
konnte (Abb. 4.24).
Abb. 4.24: IFN-γ-ELISpot-Analyse der mit TCR-mRNA elektroporierten PBMC aus einem HIV-1infizierten Spender
Die PBMC von Spender 010 wurden mit der TCR-mRNA elektroporiert und nach vier Stunden auf den
IFN-γ-ELISpot aufgetragen. Die T2-Zellen wurden mit dem Peptid inkubiert und dienten als APC. Angegeben sind die SFU (Spot Forming Units) von 100.000 eingesetzten Zellen. Die TCRelektroporierten PBMC des HLA-A2-negativen HIV-1-positiven Spenders 010 sind in der Lage, das
IMP-GL9-Peptid, präsentiert durch das HLA-A2-Molekül der T2-Zellen, zu erkennen.
Anschließend wurden die PBMC von drei weiteren HIV-1-infizierten Patienten elektroporiert,
wobei eine ähnlich starke Reaktion gegen das IMP-GL9-Peptid detektiert werden konnte.
Hierbei wurde auch bei einer Peptid-Titration die Peptid-Affinität der reprogrammierten T73
4. Ergebnisse
Zellen analysiert (Abb. 4.25). Man sieht, dass die reprogrammierten T-Zellen noch in der
Lage sind, das Peptid in einer Konzentration von 50 ng/ml zu erkennen.
Abb. 4.25: IFN-γ-ELISpot-Analyse der mit TCR-mRNA elektroporierten PBMC aus einem HIV-1infizierten Spender
Die PBMC von Spender 1026 wurden mit der TCR-mRNA elektroporiert und nach vier Stunden auf
den IFN-γ-ELISpot aufgetragen. Die T2-Zellen wurden mit dem Peptid inkubiert und dienten als APC.
Angegeben sind die SFU (Spot Forming Units) von 100.000 eingesetzten Zellen. Die TCRelektroporierten PBMC des HLA-A2-positiven HIV-1-positiven Spenders 1026 sind in der Lage, das
IMP-GL9-Peptid, präsentiert durch die T2-Zellen, bis zu einer Konzentration von 50 ng/ml zu erkennen.
Da die Reaktion der mit der IMP-GL9-spezifischen mRNA der TCR-Ketten reprogrammierten
T-Zellen in HIV-1-negativen Spendern relativ schwach war, sollte versucht werden, die Expression des TCRs zu verstärken. Es konnte festgestellt werden, dass durch die Murinisierung der TCR-Ketten eine verstärkte Bindung an den CD3-Komplex erreicht werden kann
und außerdem somit auch Fehlpaarungen mit dem endogenen TCR verhindert werden können [176, 228, 256]. Daher sollte dieser Ansatz durch die Verwendung einer murinen kon74
4. Ergebnisse
stanten Kette weiter verfolgt werden. Dazu wurden die α- und β-Ketten des IMP-GL9spezifischen TCR modifiziert und der konstante Teil der TCR-Ketten wurde jeweils durch den
konstanten Teil der murinen TCR-Ketten ersetzt. In einem ersten Versuch konnte nachgewiesen werden, dass die Reaktion dieses murinisierten TCR im IFN-γ-ELISpot stärker ausfiel
(Abb. 4.26). V. a. die Erkennung des IMP-GL9-Peptids ohne die Ko-Stimulation durch die T2Zellen zeigt eine starke Reaktion im IFN-γ-ELISpot.
Abb. 4.26: IFN-γ-ELISpot-Analyse der mit TCR-mRNA elektroporierten PBMC aus einem HIV-1negativen Spender
Die PBMC von Spender 238 wurden mit der mRNA mit den murinisierten TCR-Ketten elektroporiert
und nach vier Stunden auf den IFN-γ-ELISpot aufgetragen. Die T2-Zellen wurden mit dem Peptid inkubiert und dienten als APC. Angegeben sind die SFU (Spot Forming Units) von 100.000 eingesetzten
Zellen. Die TCR-elektroporierten PBMC des HLA-A2-positiven Spenders 238 sind in der Lage, das
IMP-GL9-Peptid präsentiert über das HLA-A2-Molekül der T2-Zellen und alleine zu erkennen.
Neben dem IMP-GL9-spezifischen TCR von Patient 048 wurde weitere IMP-GL9-spezifisch
CTL-Linien analysiert. Einige dieser identifzierten TCR-Ketten zeigten jedoch keine Funktionalität im IFN-γ-ELISpot. Von zwei HIV-1-negativen HLA-A2-positiven Spendern (Spender
1007 und Spender 1010) wurden die IMP-GL9-spezifische CTL-Linien hinsichtlich der TCRKetten charakterisiert. Beide T-Zelllinien wurden mit dem Protokoll 2 analysiert. Bei Spender
1007 konnten beide Varianten der variablen α-Kette AV14_TRAV38 und die variable β-Kette
BV17s1_TRBV19, die auch bei Patient 048 gefunden wurde, identifiziert und generiert werden. Bisher konnte die Funktionalität dieser TCR-Ketten aber noch nicht analysiert werden.
Die TCR-Ketten von Patient 1010 wurden nur identifiziert. Da sich beim Spectratyping acht
75
4. Ergebnisse
variable α-Ketten und zwei β-Ketten zeigten, wurde auf die Klonierung dieser Ketten verzichtet. Allerdings tauchte unter den variablen β-Ketten wieder die BV17s1_TRBV19 Kette auf.
4.4.2 Identifizierung, Herstellung und Charakterisierung von SL9 und EBV-GL9spezifischen TCR-Ketten
In einem weiteren Schritt wurden die TCR-Ketten von Patienten identifiziert, welche eine
starke Reaktion gegenüber dem SL9 und dem EBV-GL9-Peptid zeigten. Die Frage ist hierbei, ob beide Peptide durch den gleichen TCR erkannt werden oder ob zwei verschiedene
TCR für die Erkennung jedes einzelnen Peptids verantwortlich sind. Kreuzreaktive TCR wurden schon für das IMP-GL9 und das EBV-GL9-Epitop beschrieben [249].
Die kreuzreaktiven CTL-Linien von zwei HIV-1-infizierten Patienten wurden mit dem SL9spezifischen Dextramer und einem CD8-Antikörper gefärbt. Patient 285 generierten eine
EBV-GL9-spezifische SL9-kreuzreaktive CTL-Linie, während Patient 258 eine SL9spezifische EBV-GL9-kreuzreaktive CTL-Linie generierte. Bei der Analyse mit Protokoll 2
konnten bei jedem Patienten zwei verschiedene zwei α- und zwei β-Ketten identifiziert werden (Tab. 4.13).
Tabelle 4.13: Übersicht über die bei Patient 258 und Patient 285 identifizierten TCR αund β-Ketten mit den hypervariablen CDR3-Regionen
TCR-Kette
CDR3
Sequenz
Patient
258
285
Arden et al. [253]
IMGT [172]
AV2s1
TRAV12-2
TRAJ29
RTNSGNTPLVFGKGTRLSVIA
AV2s3
TRAV12-1
TRAJ34
NLNTDKLIFGTGTRLQVFP
AV8s1
TRAV13-1
TRAJ3
NFRYSSASKIIFGSGTRLSIRP
BV4s1
TRBV29
TRBJ2-7
KSQGSAYEQYFGPGTRLTVT
BV5s1
TRBV5-1
TRBJ2-1
DSEQFFGPGTRLTVL
AV22s1
TRAV9-2
TRAJ23
DPDNQGGKLIFGQGTELSVKP
AV2s3
TRAV12-1
TRAJ34
NRNTDKLIFGTGTRLQVFP
BV22s1
TRBV2
TRBJ1-6
PWTGGESPLHFGNGTRLTVT
BV12s1
TRBV10-3
TRBJ1-1
AGSNTEAFFGQGTRLTVV
Angegeben sind die variablen Ketten nach der Nomenklatur von Arden et al. [253] und IMGT
[172] sowie die hypervariablen CDR3-Regionen der entsprechenden variablen Ketten mit der
Aminosäuresequenz.
Sowohl bei AV2_TRAV12, AV8_TRAV13, als auch bei AV22_TRAV9 gibt es mehrere unterschiedliche Varianten [172], die anhand der Spectratyping-Analysen nicht zu unterscheiden
sind. Genauso wie es bei der BV12_TRBV10-β-Kette drei verschiedene Varianten gibt. Welche der Varianten bei den beiden Patienten gefunden wurde ist in Tab. 4.13 angegebenen.
76
4. Ergebnisse
Die hypervariablen CDR3-Regionen aller Ketten unterschieden sich bis auf CDR3-Region
der AV2s3_TRAV12-1-α-Kette, die bei beiden Patienten gefunden wurde. Dabei handelte es
sich um die TRAJ34-CDR3-Region. Beide Sequenzen unterschieden sich nur in einer Aminosäure. Teilweise wurden diese Ketten schon für SL9-spezifische TCR-Ketten, u. a. von
unserer Arbeitsgruppe identifiziert. Hofmann et al. fanden bei einem SL9-spezifischen TCR
die α-Kette AV2s1_TRAV12-2 mit TRAJ29 und die β-Kette BV5s1_TRBV5-1 mit der CDR3Region TRBJ1-1 [227]. Diese hypervariablen Bereiche zeigten auch große Ähnlichkeit mit
SL9-spezifischen TCR-Sequenzen die schon vorher publiziert wurden [227, 257]. Ein anderer publizierter SL9-spezifische TCR hatte die α-Kette AV2s3_TRAV12-1 mit der CDR3Region TRAJ34 sowie die β-Kette BV22s1_TRBV2 mit der TRBJ2-2-CDR3-Region [227].
Nach der Herstellung der mRNA wurden die PBMC eines HIV-1-negativen HLA-A2-positiven
Spenders mit den verschiedenen Kombinationen der α- und β-Ketten des jeweiligen TCRs
elektroporiert und die reprogrammierten T-Zellen wurden anschließend im IFN-γ-ELISpot auf
ihre Funktionalität untersucht. Beim TCR von Patient 258 zeigte die Kombination der
AV2s1_TRAV12-2- und der BV5s1_TRBV5-1-Ketten die stärkste Erkennung des SL9Peptids sowie eine schwache Erkennung des EBV-GL9-Peptids, die beide über das HLA-A2Molekül der T2-Zellen präsentiert wurden (Abb. 4.27b). Alle anderen Kombinationen zeigten
nur eine schwache Erkennung des EBV-GL9-Peptids (Abb. 4.27a + c-f). Außerdem wurde
eine Oberflächenfärbung mit dem SL9-spezifischen Dextramer durchgeführt, um die Oberflächenexpression des SL9-spezifischen TCR zu analysieren. Dabei konnte keine Oberflächenfärbung durch das SL9-Dextramer nachgewiesen werden.
77
4. Ergebnisse
Abb. 4.27: IFN-γ-ELISpot-Analyse der mit TCR-mRNA (von Spender 258) elektroporierten PBMC
aus einem HIV-1-negativen Spender
Die PBMC von dem Spender 238 wurden mit den verschiedenen TCR-mRNA Kombinationen elektroporiert und nach vier Stunden auf den IFN-γ-ELISpot aufgetragen. Die T2-Zellen wurden mit dem Peptid inkubiert und dienten als APC. Angegeben sind die SFU (Spot Forming Units) von 150.000 eingesetzten Zellen. (a) AV2s1_TRAV12-2 und BV4s1_TRBV29 (b) AV2s1_TRAV12-2 und BV5s1_TRBV51 (c) AV2s3_TRAV12-1 und BV4s1_TRBV29 (d) AV2s3_TRAV12-1 und BV5s1_TRBV5-1 (e)
AV8s1_TRAV13-1 und BV4s1_TRBV29 (f) AV8s1_TRAV13-1 und BV5s1_TRBV5-1
78
4. Ergebnisse
Auch beim TCR von Patient 285 zeigte die Kombination aus AV2s3_TRAV12-1 und
BV22s1_TRBV2 eine sehr starke Erkennung des SL9-Peptids, präsentiert über T2-Zellen
(Abb. 4.28c). Diese TCR-Kettenkombination schien auch das EBV-GL9-Peptid zu erkennen.
Alle anderen TCR-Kettenkombinationen zeigten nur eine schwächere Erkennung des EBVGL9-Peptids, präsentiert über die T2-Zellen (Abb. 4.28a + b + d). Auch hier wurden Oberflächenfärbungen mit dem SL9-spezifischen Dextramer durchgeführt. Nur bei der TCRKombination aus den AV2s3_TRAV12-1- und BV22s1_TRBV2-Ketten konnten SL9-positive
CD8+ T-Zellen nachgewiesen werden. Ein Beispiel für solch eine Färbung ist in Abb. 4.30 zu
sehen.
Abb. 4.28: IFN-γ-ELISpot-Analyse der mit TCR-mRNA (von Patient 285) elektroporierten PBMC
aus einem HIV-1-negativen Spender
Die PBMC von Spender 238 wurden mit den verschiedenen TCR-mRNA Kombinationen elektroporiert
und nach vier Stunden auf den IFN-γ-ELISpot aufgetragen. Die T2-Zellen wurden mit dem Peptid inkubiert und dienten als APC. Angegeben sind die SFU (Spot Forming Units) von 150.000 eingesetzten
Zellen. (a) AV22s1_TRAV9-2 und BV22s1_TRBV2 (b) AV22s1_TRAV9-2 und BV12s1_TRBV10-3 (c)
AV2s3_TRAV12-1 und BV22s1_TRBV2 (d) AV2s3_TRAV12-1 und BV12s1_TRBV10-3.
79
4. Ergebnisse
In den folgenden Versuchen wurden die beiden SL9-spezifischen TCR-Kombinationen
AV2s1_TRAV12-2 und BV5s1_TRBV5-1 von Patient 258 und AV2s3_TRAV12-1 und
BV22s1_TRBV2 von Patient 285 genauer analysiert. Die PBMC von Spender 238 wurden
mit beiden Kombinationen der TCR-spezifischen mRNA elektroporiert und die reprogrammierten T-Zellen im IFN-γ-ELISpot analysiert. Hierbei zeigte sich eine sehr starke Erkennung
des SL9-Peptids präsentiert über die T2-Zellen, während das EBV-GL9-Peptid nicht erkannt
wurde. Die Reaktion gegen das EBV-GL9-Peptid war nur ein wenig stärker als die gegenüber dem Hintergrund der Mock elektroporierten Zellen. Diese schwache Reaktion könnte
auf das Vorhandensein von EBV-GL9-spezifischen T-Zellen unter den PBMC des Spenders
zurückzuführen sein.
Außerdem wurde die Peptid-Affinität des SL9-Peptids durch Peptid-Titrationen analysiert.
Man kann sehen, dass die Peptid-Affinität bei 50 ng/ml deutlich nachlässt (Abb. 4.29b).
Abb. 4.29: IFN-γ-ELISpot-Analyse der mit TCR-mRNA elektroporierten PBMC aus einem HIV-1negativen Spender
Die PBMC von Spender 238 wurden mit der TCR-mRNA elektroporiert und nach vier Stunden auf den
IFN-γ-ELISpot aufgetragen. Die T2-Zellen wurden mit dem Peptid inkubiert und dienten als APC. Angegeben sind die SFU (Spot Forming Units) von 100.000 eingesetzten Zellen. (a) PBMC von Spender
238 wurden mit der TCR-Kombination aus AV2s1_TRAV12-2 und BV5s1_TRBV5-1 von Patient 258
reprogrammiert. (b) PBMC von Spender 238 wurden mit der TCR-Kombination aus AV2s3_TRAV12-1
und BV22s1_TRBV2 von Patient 285 reprogrammiert. Die reprogrammierten T-Zellen erkennen das
IMP-GL9-Peptid noch in einer Konzentration von 50 ng/ml, wobei hier die Erkennung deutlich nachlässt.
80
4. Ergebnisse
Abb. 4.30: SL9-spezifische Dextramer-Färbung von elektroporierten PBMC
Die durch die Elektroporation mit der SL9-spezifischen TCR-mRNA (AV2s3_TRAV12-1 und
BV22s1_TRBV2) reprogrammierten T-Zellen wurden vier Stunden nach der Elektroporation mit dem
SL9-PE-Dextramer und einem CD8-FITC-Antikörper gefärbt. (a-c) Färbung der Mock elektroporierten
T-Zellen und (d-f) Färbung der TCR elektroporierten T-Zellen. (a + d) Iso-Kontrolle (b + e) CD8-FITC
(c + f) CD8-FITC + SL9-PE. Nur die mit dem TCR elektroporierten T-Zellen lassen sich auch mit dem
SL9-spezifischen Dextramer anfärben.
Eine weitere Elektroporation wurde mit den PBMC eines anderen HLA-A2-positiven HIV-1negativen Spenders durchgeführt. Auch hier zeigte sich für beide TCR-Kombinationen eine
starke Erkennung des SL9-Peptids präsentiert durch die T2-Zellen, jedoch nur eine sehr
schwache Erkennung des EBV-GL9-Peptids (Daten nicht gezeigt). Die Reaktion gegenüber
dem EBV-GL9-Peptid kann wiederum auf das Vorhandensein von EBV-GL9-spezifischen
CTL in diesem Spender zurückzuführen sein. Um nun auszuschließen, dass die schwache
Reaktion gegenüber dem EBV-GL9-Peptid in den beiden HLA-A2-positiven Spendern auf
eine Reaktion der EBV-GL9-spezifischen CTL der Spender herrührt, wurden in einem weiteren Versuch die PBMC eines HLA-A2-negativen HIV-1-negativen Spenders mit den beiden
TCR-Kettenkombinationen elektroporiert und im IFN-γ-ELISpot analysiert. In diesem Test
zeigte sich, dass TCR-reprogrammierte T-Zellen nur in der Lage waren, T2-Zellen, welche
das SL9-Peptid präsentieren, zu erkennen (Abb. 4.31). Die T2-Zellen, welche das EBV-GL9Peptid präsentierten, wurden überhaupt nicht erkannt.
81
4. Ergebnisse
Abb. 4.31: IFN-γ-ELISpot-Analyse der mit TCR-mRNA elektroporierten PBMC aus einem HIV-1negativen Spender
Die PBMC von Spender 204 wurden mit der TCR-mRNA elektroporiert und nach vier Stunden auf den
IFN-γ-ELISpot aufgetragen. Die T2-Zellen wurden mit dem Peptid inkubiert und dienten als APC. Angegeben sind die SFU (Spot Forming Units) von 100.000 eingesetzten Zellen. (a) PBMC von Spender
204 wurden mit der TCR-Kombination aus AV2s1_TRAV12-2 und BV5s1_TRBV5-1 reprogrammiert.
(b) PBMC von Spender 204 wurden mit der TCR-Kombination aus AV2s3_TRAV12-1 und
BV22s1_TRBV2 reprogrammiert. Beide TCR-Kombinationen erkennen nur das über T2-Zellen präsentierte SL9-Peptid.
Außerdem wurde die Breite der Erkennung der SL9-spezifischen TCR-Kettenkombination
AV2s3_TRAV12-1 und BV22s1_TRBV2 von Patient 285 mit Hilfe der elf vorhandenen SL9Varianten untersucht. Dabei zeigte sich, dass dieser TCR in der Lage ist, mehrere dieser
SL9-Varianten zu erkennen (Abb. 4.32). Insgesamt sieben der SL9-Varianten werden durch
die TCR-reprogrammierten T-Zellen erkannt.
82
4. Ergebnisse
Abb. 4.32: IFN-γ-ELISpot-Analyse der mit TCR-mRNA elektroporierten PBMC aus einem HIV-1negativen Spender
Die PBMC von Spender 238 wurden mit der TCR-mRNA elektroporiert und nach vier Stunden auf den
IFN-γ-ELISpot aufgetragen. Die T2-Zellen wurden mit den Peptid-Varianten inkubiert und dienten als
APC. Angegeben sind die SFU (Spot Forming Units) von 89.000 eingesetzten Zellen. Die TCRKettenkombination AV2s3_TRAV12-1 und BV22s1_TRBV2 (von Patient 285) erkennt neben dem
SL9-Peptid noch sieben verschiedene Varianten.
83
4. Ergebnisse
4.5 Analyse der Kreuzreaktionen zwischen dem hoch konservierten
YMDD-Motiv der RT von HIV-1 zu HERV
Das YMDD-Motiv liegt im aktiven Zentrum der RT und ist unter den verschiedenen Retroviren hoch konserviert [258]. In manchen Fällen kommt eine Aminosäuresubstitution vor, bei
der das M durch ein V ersetzt wird [259-261]. Diese M184V-Mutation ist bei HIV-1 mit einer
Resistenz gegen Lamivudin und Emtricitabine assoziiert [262-267].
In der RT von HIV-1 sind in diesem Bereich zwei unterschiedliche HLA-A2-restringierte überlappende Epitope bekannt. Das eine ist das RT-VL9 (VIYQYMDDL; RT 179-187) und das
zweite ist das RT-YV9 (YQYMDDLYV; RT 181-189), das um zwei Aminosäuren verschoben
ist [264, 268-270]. Von der Arbeitsgruppe von Thomas Harrer wurde bereits gezeigt, dass
kreuzreaktive CTL vorkommen, welche sowohl die HIV-1 RT als auch Sequenzen von HERV
erkennen, die in diesem Bereich unter verschiedenen HERV konserviert sind. HERVspezifische CTL gegen dieses Epitop aus HERV (ILVHYIDDI) wurden auch von anderen
Arbeitsgruppen in HIV-1-infizierten Patienten gefunden [103]. Ziel der Arbeit war es nun, in
einer systematischen Analyse in einer Kohorte von HIV-1-infizierten Patienten nach HIV-1und HERV-kreuzreaktiven CTL zu fahnden und die potenzielle Rolle dieser Zellen für die
Kontrolle der HIV-1-Infektion zu analysieren. Zu diesem Zweck wurden die HIV-1-infizierten
Patienten mit den verschiedenen HLA-A2-restringierten Peptiden aus der RT stimuliert und
die auswachsenden CTL-Linien hinsichtlich der Erkennung und Kreuzreaktion getestet.
4.5.1 Erkennung verschiedener RT-Epitope in HIV-1-infizierten Patienten
Da die M-zu-V-Variante des RT-VL9-Epitops bei verschiedenen Retroviren vorkommt, wurden die PBMC der HIV-1-infizierten HLA-A2-positiven Patienten mit beiden Peptidvarianten
stimuliert. Insgesamt wurden 172 HIV-1-infizierte HLA-A2-positive Patienten, von denen 156
unter ART waren, auf die Erkennung von RT-VL9 und RT-VL9M/V untersucht. Dabei stellte
sich heraus, dass 47 (27,3 %) eine RT-VL9-spezifische CTL-Linie generierten, während 27
(15,7 %) eine RT-VL9M/V-spezifische CTL-Linie generieren konnten. 21 Patienten generierten sowohl eine RT-VL9 als auch eine RT-VL9M/V-spezifische CTL-Linie. Außerdem wurden
114 HIV-1-infizierte Patienten (108 mit Therapie) mit dem RT-YV9-Peptid stimuliert und 51
Patienten (44,7 %) generierten eine RT-YV9-spezifische CTL-Linie. Damit generieren mehr
Patienten eine RT-YV9-spezifische CTL-Linie als eine RT-VL9-spezifische. 19 Patienten generierten sowohl eine RT-VL9- als auch eine RT-YV9-spezifische CTL-Linie.
Ob RT-YV9 oder RT-VL9 das immundominante Epitop ist, konnte lange nicht gezeigt werden. Vor Kurzem wurde jedoch von einer kooperierenden Arbeitsgruppe veröffentlicht, dass
anscheinend das RT-YV9-Epitop das immundominante dieser beiden ist [268]. Dabei konnte
gezeigt werden, dass Substitutionen in den Bereichen, welche ein Epitop flankieren, einen
84
4. Ergebnisse
Einfluss auf subdominante HIV-1-Epitope haben können. Es wurde festgestellt, dass Patienten, welche die 177D-Wildtyp(WT)-Sequenz tragen, eher eine RT-VL9-spezifische CTL-Linie
generieren, während Patienten mit einer D-zu-E-Substitution an Position 177 eine Antwort
gegen RT-YV9 generieren [268]. Auch in meiner Untersuchung der Erlanger Kohorte konnte
dieses Ergebnis bestätigt werden, allerdings zeigten mehr Patienten ohne 177E-Substitution
die Erkennung von RT-YV9 [268].
4.5.2 Die Rolle der Erkennung von RT-VL9 und RT-VL9M/V für die Kontrolle der
HIV-1-Infektion
In einem nächsten Schritt wurde untersucht, ob die Erkennung dieser drei Peptide einen Einfluss auf den Verlauf der HIV-1-Infektion hat. Zu diesem Zweck wurden die CD4+-Zellzahlen
(Tab. 4.14) und die Viruslasten (Tab. 4.15) der Patienten vor dem Start der Therapie und
zum jeweiligen Testzeitpunkt hinsichtlich der Erkennung der unterschiedlichen Peptide analysiert. Dabei zeigten sich keine signifikanten Unterschiede.
Tabelle 4.14: CD4+-Zellzahlen der Patienten
CD4+-Zellzahlen/µl
vor ART
Erkennung RT-VL9
Keine Erkennung
RT-VL9
Erkennung
RT-VL9M/V
Keine Erkennung
RT-VL9M/V
Erkennung RT-YV9
Keine Erkennung
RT-YV9
zum Testzeitpunkt
Median
Range
n=
Median
Range
n=
297
15 – 593
44
498
101 – 1.858
47
290,5
1 – 1.120
113
491
46 – 2.124
125
288
11 – 593
23
488
46 – 1.166
27
293,5
1 – 1.120
135
511
51 – 2.124
145
307
1 – 539
45
524
102 – 662
51
291
11 – 789
61
500
35 – 1.282
63
Angegeben ist der Median und der Range der CD4+-Zellzahlen vor dem Start der Therapie
und zum Testzeitpunkt sowie die Anzahl (n) der Patienten, die bei den Berechnungen mit
einbezogen wurden, da nicht bei allen Patienten die Werte vor dem Start der Therapie vorhanden waren.
85
4. Ergebnisse
Tabelle 4.15: Viruslasten der Patienten
Viruslast Kopien/ml
zum Testzeitpunkt*
vor ART
Median
Erkennung RT-VL9
Keine Erkennung
RT-VL9
Erkennung
RT-VL9M/V
Keine Erkennung
RT-VL9M/V
Erkennung RT-YV9
Keine Erkennung
RT-YV9
62.500
61.000
35.500
62.250
51.000
63.000
Range
1.500 –
29.000.000
30 –
44.000.000
1.500 –
2.100.000
30 –
44.000.000
810 – 410.000
300 –
44.000.000
n=
Median
42
15
108
20
22
140
129
20
45
15
59
15
Range
< 20 –
340.000
< 20 –
33.000
< 20 –
340.000
< 20 –
3.300.000
< 20 – 42000
< 20 –
280.000
n=
25
47
60
125
12
27
71
145
34
51
37
63
Angegeben ist der Median und der Range der Viruslast vor dem Start der Therapie und zum
Testzeitpunkt sowie die Anzahl (n) der Patienten, die bei den Berechnungen mit einbezogen
wurden, da nicht bei allen Patienten die Werte vor dem Start der Therapie vorhanden waren.
*
Viele der Patienten erhielten zum Testzeitpunkt eine ART. Deswegen hatten viele Patienten
eine Viruslast unterhalb der Nachweisgrenze von < 20 Kopien/ml.
XX
Angegeben ist die Anzahl der Patienten mit einer Viruslast von < 20 Kopien/ml
4.5.3 Kreuzreaktionen der RT-VL9- und RT-VL9 V/M-spezifischen CTL-Linien zu
Epitopen aus HERV
Die RT-spezifischen CTL-Linien wurden im IFN-γ-ELISpot auf die Kreuzreaktivität gegenüber
verschiedenen RT-Varianten und HERV-spezifischen Peptiden getestet. Dabei konnte festgestellt werden, dass Kreuzreaktionen gegenüber HERV-spezifischen Peptiden eine Ausnahme darstellten. Nur das VHL9-Peptid wurde häufiger erkannt (Tab. 4.16). Eine CTL-Linie
wurde als kreuzreaktiv bezeichnet, wenn die Frequenz der T-Zellen, welche mit den verschiedenen Peptiden kreuzreaktiv war, mindestens 30 % der Frequenz der T-Zellen betrug,
mit der die T-Zellen das Peptid erkannten, mit dem sie stimuliert wurden.
86
4. Ergebnisse
Tabelle 4.16: Erkennung von RT-Varianten und HERV-Peptide durch RT-stimulierte
CTL-Linien
RT-VL9-stimulierte RT-VL9M/V stimulierte RT-YV9-stimulierte
Kreuzreaktion zu
T-Zellen
T-Zellen
T-Zellen
+ RT-VL9
16/21
VIYQYMDDL
+ RT-VL9M/V
20**/30*
VIYQYVDDL
+ RT-VL9M/I
11/19
12/17
VIYQYIDDL
+ RT-YV9M/V
12/27
YQYVDDLYV
+ IV13
0/4
0/3
0/25
ITLVHYIDDIMLV
+ KL11
0/4
0/3
0/23
KVQILHYMDDL
+ IL12
2/6
0/23
ILVLQYVDDLLL
+ YL10I
0/23
1/14
YIIHYIDDIL
+ VHL9
8/25
5/16
VIYHYVDDL
+ YL10V
1/24
1/16
YIIHYVDDIL
Angegeben sind die Kreuzreaktionen von verschiedenen RT-Varianten und HERVspezifischen RT-Peptiden durch RT-spezifische T-Zelllinien hinsichtlich der Anzahl der getesteten Linien und der daraus resultierenden kreuzreaktiven T-Zelllinien.
*
Anzahl der jeweiligen Peptid-spezifischen CTL-Linien
**
Anzahl der kreuzreaktiven CTL-Linien
Damit die M184V-Mutation etabliert werden kann, wird zuerst das M zu einem I mutiert. Diese Mutation hat aber einen Fitnessverlust für das Virus zur Folge, wodurch das I schnell zu
einem V mutiert wird [271]. Von 19 getesteten Patienten waren elf in der Lage, auch das RTVL9M/I-Peptid zu erkennen (57,9 %). Ebenso wurde die Kreuzreaktion gegenüber verschiedenen HERV-spezifischen Peptiden getestet. Das VHL9-Peptid wurden in acht von 25 getesteten RT-VL9-spezifischen CTL-Linien erkannt (32 %) (Tab. 4.16). Auch bei den RT-VL9M/Vspezifischen CTL-Linien wurde das VHL9-Peptid am häufigsten erkannt (31,2 %).
4.5.4 Herstellung und Analyse von RT-spezifischen TCR
Um festzustellen, ob ein TCR in der Lage ist, mehrere RT-spezifische Peptid-Varianten zu
erkennen, wurden von verschiedenen Patienten die generierten CTL-Linien mit dem IFN-γSekretionsassay gefärbt und sortiert. Insgesamt wurden verschiedene RT-stimulierte CTLLinien von fünf Patienten analysiert. Mit dem Protokoll 1 konnten für zwei RT-VL9spezifische CTL-Linien, die von den Patienten 325 und 335 stammten sowohl die α- als auch
die β-Kette identifiziert und generiert werden (Tab. 4.17).
87
4. Ergebnisse
Tabelle 4.17: Übersicht über die bei Patient 325 und Patient 335 identifizierten TCR αund β-Ketten mit den hypervariablen CDR3-Regionen
TCR-Kette
CDR3
Sequenz
Patient
325
335
Arden et al. [253]
IMGT [172]
AV30s1
TRAV20
TRAJ10
GGGNKLTFGTGTQLKVEL
BV1s1
TRBV9
TRBJ2-3
SLAGPASSTDTQYFGPGTRLTVL
AV30s1
TRAV20
TRAJ20
YKLSFGAGTTVTVRA
AV23s1
TRAV21
TRAJ17
KAAGNKLTFGGGTRVLVKP
BV1s1
TRBV9
TRBJ2-3
RGGLAGGTDTQYFGPGTRLTVL
Angegeben sind die variablen Ketten nach der Nomenklatur von Arden et al. [253] und IMGT
[172] sowie die hypervariablen CDR3-Regionen der entsprechenden variablen Ketten mit der
Aminosäuresequenz.
Beide TCR-Kombinationen wurden auf ihre Funktionalität getestet und erwiesen sich als
nicht funktionell, somit ist unklar, ob es sich hier um RT-spezifische oder um kontaminierende TCRs handelt. Für eine Analyse mit Protokoll 2 reichte die isolierte RNA nicht mehr aus.
Zu einem späteren Zeitpunkt wurden von Patient 335 vier verschiedene CTL-Linien generiert, eine RT-VL9-, eine RT-VL9M/V, eine RT-VL9M/I und eine RTVL9V/I+M/V-spezifische
CTL-Linie, die alle untereinander kreuzreaktiv waren. Diese CTL-Linien wurden mit dem IFNγ-Sekretionsassay gefärbt, sortiert und mit Protokoll 2 analysiert. Dabei wurden mehrere αund β-Ketten identifiziert, die teilweise bei allen CTL-Linien vorkamen und auch die gleiche
CDR3-Region zeigten (Tab. 4.18). Diese wurden generiert und sollen in der Zukunft hinsichtlich ihrer Funktionalität und Kreuzreaktivität untersucht werden.
Tabelle 4.17: Übersicht über die bei Patient 335 identifizierten TCR α- und β-Ketten mit
den hypervariablen CDR3-Regionen der vier untereinander kreuzreaktiven CTL-Linien
(RT-VL9, RT-VL9M/V, RT-VL9M/I und RT-VL9V/I+M/V)
TCR-Kette
CDR3
Sequenz
Patient
335
Arden et al. [253]
IMGT [172]
AV27s1
TRAV39
TRAJ49
LTGNQFYFGTGTSLTVIP
AV2s3
TRAV12-1
TRAJ34
LNTDKLIFGTGTRLQVFP
AV8s1
TRAV13-1
TRAJ15
GNQAGTALIFGKGTTLSVSS
AV8s2
TRAV13-2
TRAJ50
KTSYDKVIFGPGTSLSVIP
AV30s1
TRAV20
TRAJ20
YKLSFGAGTTVTVRA
BV22s1
TRBV2
TRBJ2-2
WTSGEGELFFGEGSRLTVL
BV21s3
RBV11-2
TRBJ2-1
EHEQFFGPGTRLTVL
BV1s1
TRBV9
TRBJ2-3
RGGLAGGTDTQYFGPGTRLTVL
Angegeben sind die variablen Ketten nach der Nomenklatur von Arden et al. [253] und IMGT
[172] sowie die hypervariablen CDR3-Regionen der entsprechenden variablen Ketten mit der
Aminosäuresequenz.
88
4. Ergebnisse
Durch Peptidstimulation konnte bei Patient 647 eine RT-YV9-spezifische CTL-Linie generiert
werden, die kaum Kreuzreaktionen gegenüber HERV-spezifischen Peptiden zeigte. Die CTLLinie wurde mit dem IFN-γ-Sekretionsassay gefärbt und sortiert. Mit dem Protokoll 1 wurden
die variable α-Kette AV12s1_TRAV19 mit der hypervariablen CDR3-Region TRAJ39 und die
variable β-Kette BV1s1_TRBV9 mit TRBJ2-2 identifiziert und kloniert. In einem ersten Funktionalitätstest wurden die PBMC eines HIV-1-negativen HLA-A2-positiven Spenders, mit der
generierten mRNA elektroporiert. Die TCR-reprogrammierten T-Zellen wurden im IFN-γELISpot untersucht. Dabei zeigte sich eine starke Erkennung des RT-YV9-Peptids, präsentiert über die T2-Zellen, sowie des Peptids alleine. Auch die RT-YV9M/V-Variante, präsentiert durch T2-Zellen, wurde durch die reprogrammierten T-Zellen erkannt (Abb. 4.34a). In
einem zweiten Elektroporationsexperiment, bei dem die PBMC von einem weiteren HIV-1negativen HLA-A2-positiven Spender verwendetet wurden, zeigte sich eine sehr starke Erkennung des RT-YV9-Peptids, präsentiert über die T2-Zellen (Abb. 4.34b).
Abb. 4.34: IFN-γ-ELISpot-Analyse der mit TCR-mRNA elektroporierten PBMC aus einem HIV-1negativen Spender
Die PBMC wurden mit der RT-YV9-spezifischen TCR-mRNA elektroporiert und nach vier Stunden auf
den IFN-γ-ELISpot aufgetragen. Die mit Peptid inkubierte T2-Zelle diente als APC. Angegeben sind
die SFU (Spot Forming Units) von 100.000 eingesetzten Zellen. (a) Die reprogrammierten T-Zellen
von Spender 238 erkennen das durch die T2-Zelllinie präsentierte RT-YV9 sowie das RT-YV9 M/VPeptid und das RT-YV9-Peptid alleine. (b) Die reprogrammierten T-Zellen von Spender 1010 erkennen das durch die T2-Zelllinie präsentierte RT-YV9 während das HERV-spezifische Peptid YL10I nicht
erkannt wird.
Die reprogrammierten T-Zellen wurden außerdem in einem Chrom-Freisetzungstest als Effektor-Zellen verwendet. Als Zielzellen dienten T2-Zellen, die mit
89
51
Cr inkubiert wurden. Es
4. Ergebnisse
konnte gezeigt werden, dass die reprogrammierten T-Zellen als Effektor-Zellen in der Lage
sind, mit RT-YV9-Peptid beladene Target-Zellen zu lysieren (Abb. 4.35).
Abb. 4.35: Lyse der peptidbeladenen Target-Zellen durch die mit der TCR-mRNA reprogrammierten T-Zellen
Die T2-Zellen und die HLA-A2-negative Kontroll-B-Zelle 991 wurden zuerst mit Chrom inkubiert, um
als Target-Zellen zu dienen. Danach wurden die Target-Zellen mit bzw. ohne dem RT-YV9-Peptid
inkubiert. Anschließend erfolgte die Zugabe der TCR-reprogrammierten T-Zellen von Spender 238 als
Effektor-Zellen in einem Verhältnis von 50:1 (E:T). Die Zellen wurden für vier Stunden inkubiert; am
nächsten Tag wurde die Chromabgabe gemessen. Die Effektor-Zellen sind in der Lage, mit RT-YV9Peptid beladene Target-Zellen zu lysieren.
Nur die T2-Zellen wurden lysiert, da sie das Peptid über HLA-A2 präsentieren, während bei
den HLA-A2-negativen B-Zellen keine Lyse zu erkennen war.
Auch die Peptid-Affinität des RT-YV9-spezifischen TCR wurde untersucht. Dabei wurden von
dem RT-YV9-Peptid Verdünnungen von 100 µg/ml bis 50 ng/ml eingesetzt. Bis zu einer Konzentration von 50 ng/ml wird das RT-YV9-Peptid durch die mit dem TCR reprogrammierten
T-Zellen hervorragend erkannt (Abb. 4.36).
90
4. Ergebnisse
Abb. 4.36: IFN-γ-ELISpot-Analyse der mit TCR-mRNA elektroporierten PBMC aus einem HIV-1negativen Spender
Die PBMC von Spender 238 wurden mit der TCR-mRNA elektroporiert und nach vier Stunden auf den
IFN-γ-ELISpot aufgetragen. Die mit Peptid inkubierte T2-Zelle diente als APC. Es wurden Peptidkonzentrationen von 100 µg/ml bis zu 50 ng/ml verwendet. Angegeben sind die SFU (Spot Forming Units)
von 100.000 eingesetzten Zellen. Die reprogrammierten T-Zellen erkennen das durch die T2-Zelllinie
präsentierte RT-YV9-Peptid sehr gut bis zur niedrigsten Konzentration von 50 ng/ml.
Da die Affinität des RT-YV9-Peptids sehr hoch zu sein schien, wurde in einem weiteren Versuch die Peptid-Konzentration weiter verringert. Dabei wurden Konzentrationen zwischen 50
ng/ml und 0,5 ng/ml eingesetzt. Außerdem wurde in diesem Versuch analysiert, ob der TCR
verschiedene HERV-spezifische Peptide erkennen kann (Abb. 4.36). Man sieht, dass die
letzte erkennbare Peptid-Konzentration des RT-YV9-Peptids bei 50 ng/ml liegt, da niedrigere
Konzentrationen nicht mehr durch die mit dem TCR reprogrammierten T2-Zellen erkannt
91
4. Ergebnisse
werden. Von den verwendeten HERV-spezifischen Peptiden wurde keins erkannt (Abb.
4.37).
Abb. 4.37: IFN-γ-ELISpot-Analyse der mit TCR-mRNA elektroporierten PBMC aus einem HIV-1negativen Spender
Die PBMC von Spender 238 wurden mit der TCR-mRNA elektroporiert und nach vier Stunden auf den
IFN-γ-ELISpot aufgetragen. Die mit Peptid inkubierten T2-Zellen dienten als APC. Angegeben sind die
SFU (Spot Forming Units) von 100.000 eingesetzten Zellen. Die reprogrammierten T-Zellen erkennen
das durch die T2-Zelllinie präsentierte RT-YV9-Peptid bis zu einer Konzentration von 50 ng/ml. Danach nimmt die Erkennung stark ab. Die HERV-Peptide IV13, KL11 und IL12 werden nicht erkannt.
4.6 Erkennung und Kreuzreaktion zwischen den HERV-spezifischen und
HIV-1-spezifischen Epitopen
Da das YMDD-Motiv unter verschiedenen Retroviren stark konserviert ist, sollte auch die
Erkennung von HERV-spezifischen Peptiden untersucht werden. Es wurden verschiedene
aus HERV-Proteinen abgeleitete Peptide verwendet. Darunter befanden sich Sequenzen von
ERV-L (IV13, ITLVHYIDDIMLV), ERV-H (KL11, KVQILHYMDDL) und dem MS assoziierten
Retrovirus (IL12, ILVLQYVDDLLL) sowie kürzere Formen dieser Peptide. Außerdem wurden
92
4. Ergebnisse
die HERV-K-spezifischen Peptide YL10I (YIIHYIDDIL), YL10V (YIIHYVDDIL) und VHL9
(VIYHYVDDL), ein PERV-spezifisches Peptid TL11 (TLLQYVDDLLL) und ein Peptid aus
dem HCML-ARV (feliner Leukämie-Virus) VL11 (VLLQYVDDLLL) verwendet. Die PBMC von
den HIV-1-infizierten HLA-A2-positiven Patienten wurden mit den verschiedenen Peptiden
stimuliert und die auswachsenden CTL-Linien wurden im IFN-γ-ELISpot analysiert.
4.6.1 Erkennung verschiedener HERV-spezifischer RT-Epitope in HIV-1infizierten Patienten
Insgesamt wurde die Erkennung von neun HERV-spezifischen Peptiden getestet. 148 HIV-1infizierte Patienten (sieben ohne Therapie) wurden mit dem IV13-Peptid stimuliert. 18 generierten eine IV13-spezifische CTL-Linie (12,2 %). Mit dem IL12-Peptid wurden 160 Patienten
(neun ohne Therapie) stimuliert und insgesamt 32 generierten eine IL12-spezifische CTLLinie (20 %). Von 160 Patienten (neun ohne Therapie), die mit KL11 stimuliert wurden, waren 19 in der Lage, eine KL11-spezifische CTL-Linie zu induzieren (11,9 %). Mit dem TL11Peptid wurden 150 Patienten (neun ohne Therapie) stimuliert, von denen 17 eine TL11spezifische CTL-Linie generierten (11,3 %). Mit YL10I wurden 121 Patienten (sieben ohne
Therapie) und mit YL10V 125 Patienten (sieben ohne Therapie) stimuliert; 11 induzierten
eine YL10I-spezifische CTL-Linie (9,1 %), während acht eine YL10V-spezifische CTL-Linie
(6,4 %) generierten. Von 146 mit VL11 stimulierten Patienten (12 ohne Therapie) bildeten 23
eine VL11-spezifische CTL-Linie (15,8 %). 145 Patienten (12 ohne Therapie) wurden mit
dem VHL9-Peptid stimuliert. 28 dieser Patienten generierten eine VHL9-spezifische CTLLinie (19,3 %).
Bei verschiedenen HERV-spezifischen CTL-Linien wurde auch getestet, ob diese HLA-A2restringiert sind. Am besten konnte dies bei den VHL9-spezifischen CTL-Linien gezeigt werden. Von sechs getesteten VHL9-spezifischen CTL-Linien zeigten vier eine eindeutige HLAA2-Restriktion. Bei den beiden Zelllinien ohne eindeutiges Ergebnis war die CTL-Linie nur
sehr schwach positiv. Ein Beispiel für eine solche HLA-Restriktion ist in Abb. 4.38 zu sehen.
Bei anderen HERV-spezifischen CTL-Linien ergab sich bei den meisten kein eindeutiges
Ergebnis. Dies kann zum einen daran liegen, dass eine Mischung aus verschiedenen TZelllinien aufgrund einer unspezifischen Stimulation durch das IL-2 im Medium vorlag. Zum
anderen könnte durch die Länge der Peptide von 12-13 Aminosäuren auch eine HLA-KlasseII-restringierte T-Zelllinie ausgewachsen sein.
93
4. Ergebnisse
Abb. 4.38: HLA-Klasse-I-Restriktion einer VHL9-spezifischen CTL-Linie von Patient 156
B-Zellen, die in genau einem HLA-Klasse-I-Molekül mit dem Patienten 156 übereinstimmen, wurden
ausgewählt und einmal mit dem VHL9-Peptid und einmal ohne das VHL9-Peptid inkubiert. Nach dreimaligem Waschen wurden 50.000 B-Zellen als APC eingesetzt. Zu diesen B-Zellen wurden 50.000
Zellen der VHL9-spezifischen Zelllinie zugegeben. Als Positivkontrolle diente die Linie mit dem Peptid.
Man kann sehen, dass das VHL9-Peptid nur durch die Präsentation über HLA-A2 erkannt werden
kann.
4.6.2 Die Rolle der HERV-spezifischen CTL für die Kontrolle der HIV-1-Infektion
Um die Rolle dieser HERV-spezifischen CTL-Linien für die Kontrolle der HIV-1-Infektion zu
analysieren, wurden die CD4+-Zellzahlen und die Viruslast vor dem Start der Therapie und
dem jeweiligen Testzeitpunkt der Patienten mit und ohne Erkennung des jeweiligen Peptids
untersucht (Tab. 4.18 + 4.19).
94
4. Ergebnisse
Tabelle 4.18: CD4+-Zellzahlen der Patienten
CD4+-Zellzahlen/µl
vor ART
zum Testzeitpunkt
Median
Range
n=
Median
Range
n=
Erkennung IV13
300
16 – 1.120
18
532,5
54 – 2.238
18
Keine Erkennung
IV13
292
1 – 911
123
522,5
29 – 1.858
130
Erkennung IL12
300
11 – 724
29
460
139 – 1.012
32
Keine Erkennung
IL12
292
1 – 1.120
123
537,5
*
51 – 2.238
128
Erkennung KL11
272
16 – 642
18
542,5
92 – 2.238
19
Keine Erkennung
KL11
300
1 – 1.378
134
524
51 – 1.921
141
Erkennung TL11
288
11 – 597
16
502
51 – 1.066
17
Keine Erkennung
TL11
300
1 – 1.120
128
532,5
70 – 2.124
133
Erkennung VHL9
223
**
15 – 625
27
429
***
54 – 919
28
Keine Erkennung
VHL9
295
**
1 – 1.120
114
529
***
46 – 2.238
117
Erkennung VL11
163
#
11 – 431
22
513
82 – 925
23
Keine Erkennung
VL11
314
#
1 – 1.120
116
554
59 – 2.027
123
Erkennung YL10I
319
55 – 724
11
444
109 – 800
11
Keine Erkennung
YL10I
294,5
1 – 1.120
106
560
92 – 2.120
110
Erkennung YL10V
302
16 – 697
8
674,5
517 – 748
8
Keine Erkennung
YL10V
300
1 – 1.120
112
544
82 – 2.120
117
*
Angegeben ist der Median und der Range der CD4+-Zellzahlen vor dem Start der Therapie
und zum Testzeitpunkt sowie die Anzahl (n) der Patienten, die bei den Berechnungen mit
einbezogen wurden, da nicht bei allen Patienten die Werte vor dem Start der Therapie vorhanden waren.
*
Vergleich Erkennung IL12 gegen keine Erkennung im Man-Whitney-U-Test p=0,079
**
Vergleich Erkennung VHL9 gegen keine Erkennung im Man-Whitney-U-Test p=0,068
***
Vergleich Erkennung VHL9 gegen keine Erkennung im Man-Whitney-U-Test p=0,033
#
Vergleich Erkennung VL11 gegen keine Erkennung im Man-Whitney-U-Test p=0,0014
95
4. Ergebnisse
Tabelle 4.19: Viruslasten der Patienten
Viruslast Kopien/ml
zum Testzeitpunkt*
vor ART
Median
Range
n=
Median
Range
n=
Erkennung IV13
60.000
800 – 910.000
18
20
< 20 –
340.000
18
Keine Erkennung
IV13
60.500
600 –
44.000.000
118
15
< 20 –
310.000
130
Erkennung IL12
70.000
800 –
44.000.000
28
25
#
< 20 –
180.000
32
Keine Erkennung
IL12
60.500
320 –
29.000.000
119
15
#
< 20 –
330.000
128
Erkennung KL11
16.000
810 – 610.000
18
45
< 20 –
23.000
19
Keine Erkennung
KL11
64.000
600 –
44.000.000
146
20
< 20 –
330.000
141
Erkennung TL11
100.000
800 –
29.000.000
15
30
< 20 –
25.000
17
Keine Erkennung
TL11
58.200**
30 –
44.000.000
126
15
< 20 –
340.000
133
Erkennung VHL9
76.500
810 –
2.100.000
27
30
< 20 –
80.000
28
Keine Erkennung
VHL9
60.500
600 –
44.000.000
109
15
< 20 –
310.000
117
Erkennung VL11
155.000
5.200 –
1.200.000
22
15
< 20 –
340.000
23
Keine Erkennung
VL11
52.600
30 –
44.000.000
113
15
< 20 –
300.000
123
**
***
***
6
69
12
69
5
70
7
82
8
61
13
80
Erkennung YL10I
28.700
810 – 410.000
11
20
< 20 –
270.000
11
Keine Erkennung
7
YL10I
62.250
300 –
44.000.000
101
15
< 20 –
310.000
110
Erkennung YL10V
42.100
810 – 310.000
8
20
< 20 – 1.700
8
Keine Erkennung
YL10V
61.250
30 –
44.000.000
107
15
< 20 –
310.000
117
4
65
4
71
Angegeben ist der Median und der Range der Viruslast vor dem Start der Therapie und zum
Testzeitpunkt sowie die Anzahl (n) der Patienten, die bei den Berechnungen mit einbezogen
wurden, da nicht bei allen Patienten die Werte vor dem Start der Therapie vorhanden waren.
*
Viele der Patienten erhielten zum Testzeitpunkt eine ART. Deswegen hatten viele Patienten
eine Viruslast unterhalb der Nachweisgrenze von < 20 Kopien/ml.
XX
Angegeben ist die Anzahl der Patienten mit einer Viruslast von < 20 Kopien/ml
#
Vergleich Erkennung IL12 gegen keine Erkennung im Man-Whitney-U-Test p=0,059
**
Vergleich Erkennung VHL9 gegen keine Erkennung im Man-Whitney-U-Test p=0,057
***
Vergleich Erkennung VL11 gegen keine Erkennung im Man-Whitney- U-Test p=0,005
96
4. Ergebnisse
Bei Patienten mit VHL9-spezifischer CTL-Linie waren die CD4+-Zellzahlen vor dem Start der
Therapie annähernd signifikant niedriger als bei Patienten ohne VHL9-spezifischer CTL-Linie
(p=0,068), während sie bei Patienten mit VL11-spezifischer CTL-Linie signifikant niedriger
als bei Patienten ohne VL11-spezifische CTL-Linie (p=0,0014) waren. Patienten mit IL12spezifischer CTL-Linie hatten annähernd signifikant niedrigere CD4+-Zellzahlen zum Testzeitpunkt als Patienten ohne IL12-spezifische CTL-Linie (p=0,079), während bei Patienten
mit einer VHL9-spezifischen CTL-Linie die CD4+-Zellzahlen zum Testzeitpunkt signifikant
niedriger waren als bei Patienten ohne VHL9-spezifische CTL-Linie (p=0,033). Patienten mit
TL11-spezifischer CTL-Linie hatten fast signifikant höhere Viruslasten als Patienten ohne
TL11-spezifische CTL-Linie (p=0,057), während Patienten, die eine VL11-spezifische CTLLinie generierten signifikant höhere Viruslasten vor dem Start der Therapie aufwiesen als
Patienten die keine VL11-spezifische CTL-Linie generierten (p=0,005).
4.6.3 Kreuzreaktionen der HERV-spezifischen CTL-Linien zu RT-Epitopen aus
HIV-1
In weiteren Versuchen wurden die generierten HERV-spezifischen CTL-Linien hinsichtlich
ihrer Kreuzreaktivität gegenüber anderen HERV-Peptiden getestet, um das optimale Epitop
zu ermitteln. Außerdem wurde die Kreuzreaktivität gegenüber verschiedenen RT-Peptiden
getestet. Eine CTL-Linie wurde als kreuzreaktiv bezeichnet, wenn die Frequenz der T-Zellen,
welche mit den verschiedenen Peptiden kreuzreaktiv waren, mindestens 30 % der Frequenz
betrug, mit der die T-Zellen das Peptid erkannten, mit dem sie stimuliert wurden. Insgesamt
konnten keine eindeutigen Ergebnisse gewonnen werden, da verschiedene Zelllinien mit
sehr unterschiedlichen Peptiden kreuzreagierten. Außerdem konnte meist nicht ausgeschlossen werden, dass einige durch das IL-2 im Medium unspezifisch stimulierte T-Zellen
das Ergebnis verfälschten. Da einige Peptide mit 12-13 Aminosäuren sehr lang waren, besteht auch die Möglichkeit eines HLA-Klasse-II-Epitops. Manche der Zelllinien zeigten CD8Spezifität, während das Ergebnis bei anderen nicht eindeutig war. Eine Auswahl von Ergebnissen der Kreuzreaktionen ist in Tabelle 4.20 zu sehen.
97
4. Ergebnisse
Tabelle 4.20: Erkennung RT-spezifischer Peptide durch HERV-stimulierte CTL-Linien
Kreuzreaktion
IL12KL11TL11VHL9VL11zu
stimulierte T-
stimulierte T-
stimulierte T-
stimulierte T-
stimulierte T-
Zelllinie
Zelllinie
Zelllinie
Zelllinie
Zelllinie
+ IL12
3/4
2/7
2/3
10/17
ILVLQYVDDLLL
+ IL10P
1**/17*
1/3
¼
0/7
ILVLQYVDDL
+ IL10P1
2/14
1/3
1/3
2/6
LVLQYVDDL
+ IL10P2
2/12
2/3
1/3
1/6
LVLQYMDDL
+ IL10P3
3/10
2/3
0/6
ILVLQYMDDL
+ VL10
6/10
4/7
3/11
VLQYVDDLLL
+ VL9ER
6/9
1/7
VLQYVDDLL
+ LL9
1/3
2/6
LQYVDDLLL
+ TL10
1/7
4/7
5/12
TLVLQYVDDL
+ TL11
7/15
10/18
TLLQYVDDLLL
+ KL11
1/5
2/2
KVQILHYMDDL
+ QL9
3/4
6/11
2/9
QILHYMDDL
+ IL9
1/8
ILHYMDDLL
+ QLL9
3/3
2/5
1/7
QLLHYMDDL
+ YL10I
4/19
YIIHYIDDIL
+ VHL9
2/4
2/5
VIYHYVDDL
+ Yl10V
3/19
YIIHYVDDIL
+ VL11
4/9
2/7
VLLQYVDDLLL
+ RT-VL9
6/11
4/6
5/18
2/9
VIYQYMDDL
+ RT-VL9M/V
6/11
3/4
7/20
2/9
VIYQYVDDL
+ RT-VL9M/I
6/13
VIYQYIDDL
+ XM-LL12
3/9
3/5
5/15
LILLQYVDDLLL
Angegeben sind die Kreuzreaktionen von verschiedenen RT-Varianten und HERVspezifischen RT-Peptiden durch HERV-spezifische T-Zelllinien hinsichtlich der Anzahl der
getesteten Linien und der daraus resultierenden kreuzreaktiven T-Zelllinien.
*
Anzahl der jeweiligen Peptid-spezifischen CTL-Linien
**
Anzahl der kreuzreaktiven CTL-Linien
98
4. Ergebnisse
Die IV13-spezifischen T-Zelllinien wurden besonders hinsichtlich ihrer Kreuzreaktion gegenüber kürzeren IV13-Varianten getestet. Insgesamt wurden zehn Linien auf ihre Kreuzreaktion
gegenüber fünf IV13-Varianten getestet. Neun erkannten IV13-1 (ITLVHYIDD), sieben erkannten IV13-2 (TLVHYIDDI) genauso wie IV13-3 (LVHYIDDIM). Drei der IV13-spezifischen
T-Zelllinien erkannten IV13-4 (LVHYIDDIML) und sechs erkannten IV13-5 (HYIDDIMLV).
Auch einige YL10I-spezifische CTL-Linien wurden auf ihre Kreuzreaktivität getestet. Drei von
sechs YL10I-spezifischen CTL-Linien erkannten auch YL10V und VHL9. Drei von fünf getesteten YL10I-spezifischen CTL-Linien erkannten RT-VL9, während nur eine von fünf RTVL9M/V erkannte.
4.6.4 Herstellung und Analyse von HERV-spezifischen TCR
Ein weiterer Aspekt war auch hierbei, das Vorhandensein eines kreuzreaktiven TCR zu klären. Fünf VHL9-spezifische CTL-Linien und zwei VL11-spezifische CTL-Linien wurden analysiert. Nur bei der VHL9-spezifischen CTL-Linie von Patient 156 (Abb. 4.39) konnte mit Protokoll 1 eine variable α-Kette identifiziert werden. Mit Protokoll 2 wurden noch zwei weitere αKetten und zwei β-Ketten identifiziert und konnten teilweise schon kloniert werden. Eine Analyse der Funktionalität dieser Ketten wurde noch nicht durchgeführt. Mit Protokoll 2 wurden
bei Patient 048 eine variable α-Kette AV2s3_TRAV12-1 mit der TRAJ15 CDR3-Region und
zwei variable β-Ketten BV2s1_TRBV20 sowie BV16s1_TRBV14 identifiziert und generiert.
Die beiden variablen β-Ketten hatten mit TRBJ1-2 die gleiche hypervariable CDR3-Region,
die sich nur in der ersten Aminosäure unterschied. Bei der VL11-spezifischen CTL-Linie von
Patient 594 wurde die variable α-Kette AV25s1_TRAV35 mit der TRAJ49 hypervariablen
CDR3-Region sowie die variable β-Kette BV2s1_TRBV20 mit der TRBJ1-2 hypervariablen
CDR3-Region identifiziert. Die CDR3-Region TRBJ1-2 von Patient 594 unterschied sich in
den ersten Aminosäuren von TRBJ1-2 von Patient 048. Die TCR-Ketten wurde in Form von
mRNA in PBMC eines HIV-1-negativen Spenders elektroporiert und die mit dem TCR reprogrammierten T-Zellen wurden im IFN-γ-ELISpot auf ihre Funktionalität untersucht. Keine
der verschiedenen Kombinationen der TCR-Ketten von Patient 048 zeigte eine eindeutige
Erkennung des VL11-Peptids, das über T2-Zellen präsentiert wurde, genauso wenig wie die
α/β-Ketten von Patient 594. Damit ist unklar, ob es sich hier um VL11-spezifische oder um
kontaminierende TCRs handelt.
99
4. Ergebnisse
Abb. 4.39: IFN-γ-ELISpot-Analyse der VHL9-spezifischen CTL-Linie von Patient 156
Die PBMC wurden mit dem synthetischen Peptid inkubiert und nach 14 Tagen hinsichtlich ihrer Kreuzreaktivität im IFN-γ-ELISpot getestet. Angegeben sind die SFU (Spot Forming Units) von 50.000 eingesetzten Zellen. Es wurden verschiedene RT- und HERV-spezifische Peptide getestet. Die VHL9spezifische CTL-Linie erkennt neben dem VHL9-Peptid noch das IV13- und das VL11-Peptid.
4.7 Erkennung und Kreuzreaktion von XMRV-spezifischen RT-Epitopen
in HIV-1-infizierten Patienten
Ein interessantes Virus, das in den letzten Jahren ausgiebig charakterisiert wurde, ist das
XMRV-Virus (Xenotropic murine leukemia virus-related virus). Dieses Virus wurde mit verschiedenen Erkrankungen in Verbindung gebracht, wobei in verschiedenen Untersuchungen
sehr widersprüchliche Ergebnisse gefunden wurden. Zuerst wurde es in Tumorproben von
Patienten mit Prostatakrebs gefunden, die homozygot für die R462Q-Mutation in der
RNAseL sind [272]. In einer anderen Studie mit Prostatakrebspatienten konnte das Virus
nicht nachgewiesen werden [273]. Auch in Zelllinien wie der 22Rv1-ProstatakarzinomZelllinie konnte die Abgabe des Virus nachgewiesen werden [274, 275]. Als nächstes wurde
die Anwesenheit von XMRV in Patienten mit CFS (chronic fatigue syndrome) nachgewiesen
[276]. Diese Ergebnisse konnten in verschiedenen anderen Kohorten mit CFS-Patienten
nicht bestätigt werden [277-279]. Danach tauchten einige Berichte auf, dass der Nachweis
von XMRV in verschiedenen Untersuchungen auf die Kontamination mit einem murinen Vi100
4. Ergebnisse
rus zurückzuführen sein könnte [280-282]. Letztendlich konnte die Herkunft von XMRV geklärt werden. Dieses Virus ist durch eine Rekombination zweier verschiedener Mäuseviren in
einer Krebszelllinie entstanden [283, 284]. Mittlerweile wurden einige der Untersuchungen
auf Verunreinigungen der verwendeten Zelllinien mit dem XMRV zurückgeführt [280-282,
285] sowie auf Manipulationen der Untersuchungsergebnisse. Als diese Ergebnisse noch
nicht bekannt waren, führte ich eine Sequenzanalyse der XMRV-RT- und der HIV-1-RTSequenz durch. Dabei wurden zwei HIV-1-spezifische RT-Epitope entdeckt, deren Sequenz
im XMRV sehr große Ähnlichkeit aufwies. Bei dem einen Epitop handelte es sich um das
YMDD-Motiv aus dem RT-VL9-Epitop, welches über HLA-A2 präsentiert wird. Bei dem anderen Epitop handelte es sich um ein HLA-B35-restringiertes Epitop, dem RT-TY9
(TVLDVGDAY, AS 107-115) [286, 287]. Daher wurden HIV-1-infizierten Patienten mit den
verschiedenen Peptiden stimuliert und die auswachsenden CTL-Linien wurden hinsichtlich
der Peptid-Spezifität und Kreuzreaktivität im IFN-γ-ELISpot analysiert.
4.7.1 Erkennung eines HLA-A2-restringierten und eines HLA-B35-restringierten
Epitops aus XMRV
Die PBMC von HIV-1-infizierten HLA-A2-positiven Patienten wurden mit dem XM-LL12Peptid (LILLQYVDDLLL) stimuliert. Dabei zeigte sich, dass von 159 getesteten Patienten (12
ohne Therapie) 22 eine XM-LL12-spezifische CTL-Linie (13,8 %) generierten. Außerdem
wurden die PBMC von HIV-1-infizierten HLA-B35-positiven Patienten sowohl mit dem RTTY9- als auch mit XM-TF9-Peptid (TVLDLKDAF) stimuliert, und im IFN-γ-ELISpot wurden die
auswachsenden CTL-Linien hinsichtlich der Erkennung der Peptide getestet. Hierbei zeigte
sich, dass von 40 Patienten, die mit RT-TY9 stimuliert wurden, 14 eine RT-TY9-spezifische
CTL-Linie (35 %) generierten, während sechs (15 %) dieser 40 Patienten eine XM-TF9spezifische CTL-Linie generieren konnten.
4.7.2 Die Rolle der Erkennung von XM-LL12, RT-TY9 und XM-TF9 für die Kontrolle der HIV-1-Infektion
Um die Rolle dieser XMRV-spezifischen CTL-Linien für die Kontrolle der HIV-1-Infektion zu
analysieren, wurden die CD4+-Zellzahlen und die Viruslast vor dem Start der Therapie und
dem jeweiligen Testzeitpunkt der Patienten mit und ohne Erkennung des jeweiligen Peptids
untersucht (Tab. 4.21 + 4.22).
101
4. Ergebnisse
Tabelle 4.21: CD4+-Zellzahlen der Patienten
CD4+-Zellzahlen/µl
vor ART
Erkennung XM-LL12
Keine Erkennung
XM-LL12
Erkennung RT-TY9
Keine Erkennung
RT-TY9
Erkennung XM-TF9
Keine Erkennung
XM-TF9
zum Testzeitpunkt
Median
Range
n=
Median
Range
n=
274
10 – 828
21
523,5
101 – 1.062
22
293,5
1 – 1378
132
522
35 – 2.027
137
356,5
37 – 704
10
570
193 – 1.125
14
204,5
0 – 1.120
20
579
223 – 1.713
26
130
37 – 416
4
426,4
101 – 704
6
304
0 – 1.120
27
570
223 – 1.713
34
Angegeben ist der Median und der Range der CD4+-Zellzahlen vor dem Start der Therapie
und zum Testzeitpunkt sowie die Anzahl (n) der Patienten, die bei den Berechnungen mit
einbezogen wurden, da nicht bei allen Patienten die Werte vor dem Start der Therapie vorhanden waren.
Tabelle 4.22: Viruslasten der Patienten
Viruslast Kopien/ml
zum Testzeitpunkt*
vor ART
Median
Erkennung XM-LL12
Keine Erkennung
XM-LL12
Erkennung RT -TY9
Keine Erkennung
RT-TY9
Erkennung XM-TF9
Keine Erkennung
XM-TF9
70.000
60.000
100.350
262.750
93.500
180.000
Range
1.100 –
1.200.000
80 –
44.000.000
7.500 –
580.000
1.700 –
920.000
32.100 –
580.000
1.700 –
920.000
n=
Median
Range
21
15
129
15
10
15
20
15
< 20 – 3.100
26
4
17,5
< 20 – 790
6
27
15
< 20 –
53.000
< 20 –
340.000
< 20 –
19.000
< 20 –
19.000
n=
12
22
82
137
8
14
17
3
21
34
Angegeben ist der Median und der Range der Viruslast vor dem Start der Therapie und zum
Testzeitpunkt sowie die Anzahl (n) der Patienten, die bei den Berechnungen mit einbezogen
wurden, da nicht bei allen Patienten die Werte vor dem Start der Therapie vorhanden waren.
*
Viele der Patienten erhielten zum Testzeitpunkt eine ART. Deswegen hatten viele Patienten
eine Viruslast unterhalb der Nachweisgrenze von < 20 Kopien/ml.
XX
Angegeben ist die Anzahl der Patienten mit einer Viruslast von < 20 Kopien/ml
102
4. Ergebnisse
4.7.3 Die Kreuzreaktion zwischen XM-LL12-spezifischen CTL-Linien und anderen HERV-spezifischen und HIV-1-spezifischen RT-Epitopen
Die XM-LL12-spezifischen CTL-Linien wurden auf Kreuzreaktivität gegenüber RT- und
HERV-spezifischen Peptiden getestet. Eine CTL-Linie wurde als kreuzreaktiv bezeichnet,
wenn die Frequenz der T-Zellen, welche mit den verschiedenen Peptiden kreuzreaktiv waren, mindestens 30 % der Frequenz betrug, mit der die T-Zellen das XM-LL12-Peptid erkannten, mit dem sie stimuliert wurden. Hierbei wurden vor allem die längeren HERVPeptide von vielen Zelllinien erkannt (Tab. 4.23). Man sieht, dass v. a. die längeren Peptide
IL12, TL11 und VL11 von vielen XM-LL12-spezifischen CTL-Linien auch erkannt werden. Bei
vielen der kürzeren Peptide ist keine Erkennung mehr zu sehen. Am wahrscheinlichsten liegt
die ideale Peptid-Sequenz im VL10-Peptid, da dieses Peptid von 50 % der getesteten XMLL12-spezifischen CTL-Linien erkannt wurde. Eine Kreuzreaktivität gegenüber dem HIV-1spezifischen RT-VL9 sowie dem RT-VL9M/V wurde in den seltensten Fällen beobachtet
(Tab. 4.23).
Tabelle 4.23: Erkennung von RT-Varianten und HERV-Peptiden durch XM-LL12stimulierte CTL-Linien
Kreuzreaktion zu
XM-LL12-stimulierte T-Zelllinie
IL12 ILVLQYVDDLLL
12**/14*
IL10P ILVLQYVDDL
0/6
IL10P1 LVLQYVDDL
0/4
IL10P2 LVLQYMDDL
0/4
IL10P3 ILVLQYMDDL
0/4
VL10 VLQYVDDLLL
4/8
VL9ER VLQYVDDLL
0/5
LL9 LQYVDDLLL
2/5
TL10 TLVLQYVDDL
2/10
TL11 TLLQYVDDLLL
9/14
VL11 VLLQYVDDLLL
10/14
RT-VL9 VIYQYMDDL
1/5
RT-VL9M/V VIYQYVDDL
1/4
Angegeben sind die Kreuzreaktionen von verschiedenen RT-Varianten und HERVabgeleiteten RT-Peptiden durch XM-LL12-spezifische T-Zelllinien hinsichtlich der Anzahl der
getesteten Linien und der daraus resultierenden kreuzreaktiven T-Zelllinien.
*
Anzahl der jeweiligen Peptid-spezifischen CTL-Linien
**
Anzahl der kreuzreaktiven CTL-Linien
103
4. Ergebnisse
In verschiedenen Experimenten wurde auch die CD8-Spezifität der XM-LL12-spezifischen
CTL-Linien untersucht, da durch die Länge von 12 Aminosäuren auch ein HLA-Klasse-IIspezifisches Epitop möglich ist. Elf von 17 getesteten XM LL12-spezifischen CTL-Linien ließen sich mit einem CD8-Antikörper blocken, was auf CD8-Spezifität schließen lässt.
4.7.4 Kreuzreaktion des HLA-B35-restringierten Epitops aus XMRV in HIV-1infizierten Personen
Die RT-TY9- und XM-TF9-spezifischen CTL-Linien, welche aus den HIV1-infizierten Patienten generiert werden konnten, wurden hinsichtlich der Kreuzreaktion untersucht. Eine CTLLinie wurde als kreuzreaktiv bezeichnet, wenn die Frequenz der T-Zellen, welche kreuzreaktiv waren, mindestens 30 % der Frequenz betrug, mit der die T-Zellen das Peptid erkannten,
mit dem sie stimuliert wurden. Dabei konnte festgestellt werden, dass eine der 14 RT-TY9spezifischen CTL-Linien (7,1 %) in der Lage war, auch das XM-TF9-Peptid zu erkennen
(Abb. 4.40b). Von den sechs XM-TF9-spezifischen CTL-Linien waren zwei Zelllinien (33,3 %)
in der Lage, auch das RT-TY9-Peptid zu erkennen (Abb. 4.40c + d).
Abb. 4.40: IFN-γ-ELISpot-Analysen verschiedener mit RT-TY9- und XM-TF9-stimulierter CTLLinien
Die PBMC wurden mit den synthetischen Peptiden inkubiert und nach 14 Tagen hinsichtlich ihrer
Kreuzreaktivität im IFN-γ-ELISpot getestet. Angegeben sind die SFU (Spot Forming Units) von 50.000
eingesetzten Zellen. (a) Patient 081 generierte eine RT-TY9-spezifische Zelllinie ohne Kreuzreaktivität
zu XM-TF9, (b) Patient eine 545 RT-TY9-spezifische XM-TF9-kreuzreaktive CTL-Linie, die sich gut
durch den CD8-Antikörper blocken ließ. Patient 081 (c) und Patient 594 (d) generierten eine XM-TF9spezifische RT-TY9-kreuzreaktive CTL-Linie. Auch die XM-TF9-spezifische RT-kreuzreaktive CTLLinie ließ sich durch den CD8-Antikörper blocken.
104
4. Ergebnisse
4.8 Detektion von HIV-1-spezifischen Antikörpern im Serum von Patienten mit unterschiedlichen Erkrankungen
Eine HIV-1-Infektion wird durch HIV-1-spezifische Antikörper im Serum der Patienten mit
einem ELISA nachgewiesen. Zur Verifizierung des Ergebnisses wird ein Western Blot (WB)
durchgeführt. Dieser ist sensitiver als der ELISA und wird bei der Detektion von zwei HIV-1spezifischen Banden als positiv angesehen. Immer wieder kommt es sowohl beim ELISA als
auch beim WB bei Personen mit einem hohem HIV-1-Ansteckungsrisiko zu falsch positiven
Ergebnissen [288-291]. In der Literatur wurde auch beschrieben, dass Patienten mit manchen Erkrankungen HIV-1-spezifische Antikörper aufweisen, obwohl sie nicht HIV-1-infiziert
sind. Bei manchen dieser Erkrankungen wie dem Sjögren-Syndrom (SS) wird angenommen,
dass ein Retrovirus eine Rolle spielen kann [100, 101, 292, 293].
Von einem früheren Mitarbeiter der Arbeitsgruppe, Arthur Mortha, konnte in einem ELISA ein
Peptid aus dem HIV-1-Gag-p24 identifiziert werden, das von Antikörpern im Serum von einem HIV-1-negativen Patienten mit einer nicht klassifizierten Autoimmunerkrankung erkannt
wurde. Sehr ähnliche Epitope konnten auch in HERV-Sequenzen gefunden werden. In früheren Untersuchungen sollte das ideale Epitop identifiziert werden. Da diese Untersuchungen
nicht durchgeführt werden konnten, sollte im Rahmen meiner Arbeit die Fertigstellung dieses
Projekts erfolgen. Zu diesem Zweck wurde das Protokoll des ELISA-Tests verbessert und
eine Untersuchung mit Seren von Patientengruppen mit unterschiedlichen Krankheitsbildern
und verschiedenen Peptiden durchgeführt.
4.8.1 Untersuchung von Seren aus verschiedenen Patientengruppen hinsichtlich der Reaktivität gegenüber HIV-1-p24 und HERV-Peptiden im ELISA
In einem ersten Schritt wurde das ELISA-Protokoll hinsichtlich der optimalen Durchführung
modifiziert. In Tabelle 4.24 sind alle Peptid-Sequenzen zu sehen, die verwendet wurden. Das
Epitop ist in p24-19 komplett enthalten und umfasst wahrscheinlich den Bereich mit den
Aminosäuren NANP. Die Peptide p24-18 bis p24-20 sind HIV-1-spezifische Peptide, die vom
AIDS Reagent Project of the Medical Research Council stammen. Gag07-80 ist ein HIV-1spezifisches Peptid mit der Sequenz von HIV-1 Subtyp B, das aus einem Peptidsatz vom
NIH AIDS Research and Reference Reagent Program stammt. Die anderen Peptide wurden
bei der Firma EMC bestellt. Das FS13-Peptid wurde genauso wie das IS13-Peptid vom GagProtein von HERV-K abgeleitet. Die Peptide YS10, YC8, NS8 und NE7 stellen kürzere Peptide der HERV-spezifischen Peptide dar, während LT12, LT11, TT13, TD10 und VT10 kürzere HIV-1-spezifische Peptide darstellen.
105
4. Ergebnisse
Tabelle 4.24: Aminosäuresequenzen der im ELISA verwendeten Peptide
Peptid
Sequenz
p24-18
TLRAEQASQDVKNWMTETLL
p24-19
VKNWMTETLLVQNANPDCKT
VQNANPDCKTILKALGPAAT
p24-20
MTETLLVQNANPDCK
Gag07-80
TT13
TLLVQNANPDCKT
LT12
LLVQNANPDCKT
LT11
LVQNANPDCKT
TLLVQNANPD
TD10
VT10
VQNANPDCKT
FS13
FLAYENANPDCQS
IS13
IMAYQNANPECQS
YS10
YQNANPECQS
YC8
YQNANPEC
NANPECQS
NS8
YQNANPE
NE7
Angegeben sind die Aminosäuresequenzen der verschiedenen Peptide, deren Erkennung im
ELISA getestet wurde.
Außerdem wurde die ideale Serumverdünnung zur Verwendung ermittelt. Zu diesem Zweck
wurde ein Serum von einem HIV-1-infizierten Patienten verwendet, der das p24-19-Peptid, in
dem das potenzielle Epitop enthalten ist, sowie kürzere Varianten gut erkannte. Vom Serum
dieses Patienten 021 wurden verschiedene Verdünnungen mit PBS hergestellt und die Erkennung der Peptide im ELISA getestet (Abb. 4.41a + b). Man sieht, dass die 1:10Verdünnung die optimale Serumverdünnung darstellt. Teilweise wurde auch eine 1:5Verdünnung der Seren verwendet. Diese wurden jedoch auch mit einer 1:10-Verdünnung
getestet und die Ergebnisse konnten bestätigt werden. Zu Beginn wurden die Patienten auf
die Erkennung der drei p24-Peptide p24-18 bis p24-20 getestet (beispielhaft in Abb. 4.41c +
d). Von 42 mit p24-18 getesteten Seren wies eines eine Reaktion gegenüber p24-18 auf
(2,3%). Fünf von 110 Seren zeigten Antikörper gegen p24-20 (4,5%). Von 336 Seren, welche
mit p24-19 getestet wurden zeigten 51 (15,2%) eine Antikörperreaktion gegen p24-19. Verschiedene Seren zeigten eine Antikörperreaktion gegenüber dem p24-19-Peptid, z. B. Patient 076 ein weiterer HIV-1-infizierter Patient; Patient v6182 der eine HIV-2-Infektion hat; Patient 120207 mit Sjögren-Syndrom (SS) oder Patient 151796 mit Sarkoidose. Patient v5412
mit einer positiven p24-Banden im HIV-Westernblot ohne HIV-1-Infektion zeigte als Einziger
eine Reaktion gegen das p24-18-Peptid.
106
4. Ergebnisse
Abb. 4.41: Analyse verschiedener Serumverdünnungen von Patient 021 im ELISA mit unterschiedlichen Peptiden und Analyse der Seren von verschiedenen Patienten mit unterschiedlichen Erkrankungen im ELISA auf das Vorhandensein von p24-spezifischen Antikörpern
Die Serumverdünnungen wurden auf die mit Peptid beschichtete Platte gegeben. Nach dem Abwaschen des Serums wurde der gekoppelte Antikörper zugegeben und nach Waschen des Antikörpers
erfolgte die Zugabe des Substrates. Der Farbumschlag wurde bei der Absorption bei 405 nm gemessen. Als Positivkontrolle diente das Serum von Patient 021. Als Negativkontrolle wurde zum einen die
Adsorption ohne Peptid gemessen sowie die Reaktion von PBS auf die Peptide (Blank).
(a) Serumverdünnungen 1:5 bis 1:100 von Patient 021. (b) Serumverdünnungen 1:10 bis 1:1.000 von
Patient 021. (c + d) Analyse verschiedener Seren auf Erkennung von p24-18, p24-19 und p24-20.
In weiteren ELISA-Tests wurde auch das Vorhandensein von Antikörpern gegen die anderen
Peptide untersucht (beispielhaft in Abb. 4.42 zu sehen). Auch hierbei zeigte sich, dass einige
Patienten Antikörper gegen verschiedene Peptide im Serum aufwiesen.
107
4. Ergebnisse
Abb. 4.42: Analyse der Seren von verschiedenen Patienten mit unterschiedlichen Erkrankungen im ELISA auf das Vorhandensein von Antikörpern gegen HIV-1- und HERV-spezifische
Peptide
Die Serumverdünnungen wurden auf die mit Peptid beschichtete Platte gegeben. Nach dem Abwaschen des Serums wurde der gekoppelte Antikörper zugegeben und nach Abwaschen des Antikörpers
erfolgte die Zugabe des Substrates. Der Farbumschlag wurde bei der Absorption bei 405 nm gemessen. Als Positivkontrolle diente das Serum von Patient 021. Als Negativkontrolle wurde zum einen die
Adsorption ohne Peptid gemessen sowie die Reaktion von PBS auf die Peptide (Blank).
108
4. Ergebnisse
Man sieht, dass einige Patienten Antikörper gegen HIV-1- und HERV-spezifische Peptide
hatten wie z. B. die Patienten 101581, 101536 und 101596, die an SLE erkrankt sind, oder
die Patienten 55, 76 und 85, die an einer Form von Psoriasis leiden. Besonders häufig wurde
das TT13-Peptid erkannt, welches von HIV-1 stammt. Insgesamt wurden 335 Patienten mit
unterschiedlichen Erkrankungen auf das Vorhandensein von TT13-spezifischen Antikörpern
untersucht, von denen 40 eine TT13-spezifische Reaktion im ELISA zeigten. Die beiden
HERV-spezifischen Peptide FS13 und IS13 wurden bei 278 Seren getestet. Vier Seren zeigten Antikörper gegen FS13 und sechs gegen IS13 (Tab. 4.25). Damit werden HIV-1spezifische Peptide häufiger erkannt als HERV-spezifische. Es ist bemerkenswert, dass sehr
viele verschiedene Krankheitsbilder offensichtlich Antikörper etablieren, die eine Kreuzreaktivität gegenüber HIV-1-spezifischen Peptiden besitzen.
Tabelle 4.25: Angabe der verschiedenen Patientengruppen hinsichtlich der Diagnose
und der Reaktion gegen ein HIV-1- oder HERV-spezifisches Peptid im ELISA
Peptide /
Gag07p24-18 p24-19 p24-20
TT13
LT12
FS13
IS13
Diagnose
80
Arthritis
0**/1*
1/5
0/2
0/1
1/5
0/1
0/5
0/5
CFS
0/1
1/5
0/3
1/1
1/5
1/1
1/5
0/5
CP
-
1/5
-
0/4
1/5
0/1
0/4
0/4
HIV-1
0/17
11/69
4/39
2/39
8/69
2/17
2/69
2/69
HIV-2
0/2
1/2
0/2
-
1/2
0/2
0/2
0/2
Exponiert
0/3
4/17
1/6
1/11
5/17
2/9
1/14
1/14
M. Behçet
-
0/4
-
0/2
1/4
0/2
0/2
0/2
M. Wegener
0/1
0/5
0/1
0/5
0/5
-
0/5
0/5
Negativspender
0/2
0/16
0/2
0/12
0/16
0/15
0/13
0/13
p24-Bande
im WB
0/2
2/3
0/2
-
1/4
0/3
0/4
0/4
Psoriasis
-
7/58
0/29
-
9/58
4/31
0/43
1/43
RA
-
0/3
0/1
0/1
0/3
-
0/3
0/3
Raynoud
-
0/4
-
0/4
0/4
-
0/4
0/4
Sarkoidose
0/1
2/8
0/2
0/6
1/8
0/4
0/7
0/7
SS
0/2
4/9
0/3
0/8
2/9
0/3
0/9
0/9
Sklerodermie
0/1
0/7
0/1
0/5
0/7
-
0/7
0/7
SLE
0/4
9/71
0/2
0/34
6/71
4/32
0/49
1/49
Angegeben sind die Anzahl der Seren der jeweiligen Patientengruppe, die getestet wurden,
und die Anzahl der Seren, die eine positive Reaktion im ELISA zeigten.
*
Anzahl der getesteten Seren
**
Anzahl der Seren mit positiver Reaktion
109
4. Ergebnisse
Neben den längeren Peptiden wurden auch verschiedene kürzere Versionen verwendet.
Antikörper gegen eins oder mehrere dieser Peptide wurden nur selten detektiert (Tab. 4.26).
Am häufigsten wurde das HIV-spezifische VT10-Peptid erkannt (17,6 %).
Tabelle 4.26: Angabe der verschiedenen Patientengruppen hinsichtlich der Diagnose
und der Reaktion gegen ein HIV-1- oder HERV-spezifisches Peptid im ELISA
Peptide /
LT11
TD10
VT10
YS10
YC8
NS8
NE7
Diagnose
Arthritis
0**/1*
0/1
0/1
0/1
0/1
0/1
0/1
CFS
0/1
0/1
0/1
0/1
0/1
0/1
0/1
CP
0/1
0/1
-
-
-
-
-
HIV-1
2/14
1/17
5/28
3/23
1/25
1/25
0/25
HIV-2
0/2
0/2
-
-
-
-
-
Exponiert
0/7
0/9
3/10
0/6
0/7
0/6
0/6
M. Behçet
0/2
0/2
0/1
-
-
-
-
0/5
0/3
0/4
0/4
0/4
0/4
0/4
0/3
0/3
-
-
-
-
-
Psoriasis
4/31
1/21
4/33
-
0/10
-
-
Sarkoidose
0/4
0/3
0/2
-
-
-
-
SS
0/3
0/3
-
-
-
-
-
SLE
4/31
0/17
1/36
0/4
1/8
0/4
0/4
Negativspender
p24-Bande
im WB
Angegeben sind die Anzahl der Seren der jeweiligen Patientengruppe, die getestet wurden,
und die Anzahl der Seren, die eine positive Reaktion im ELISA zeigten.
*
Anzahl der getesteten Seren
**
Anzahl der Seren mit positiver Reaktion
4.9 Untersuchung von exponierten seronegativen Personen hinsichtlich
ihrer Reaktivität gegenüber HIV-1
Es wurde festgestellt, dass manche Personen sich nicht mit HIV-1 infizieren, obwohl sie einer Hochrisikogruppe angehören [294]. Dazu zählt z. B. eine Kohorte von Prostituierten in
Gambia, die trotz wiederholtem Verkehr mit HIV-1-infizierten Männern nicht infiziert wurde
und bei denen HIV-1-spezifische CTL nachgewiesen werden konnten [205, 210, 295]. Auch
in anderen Studien konnten immer wieder HIV-1-spezifische CTL in exponierten seronegativen Personen nachgewiesen werden [209, 296-300]. Eine Vermutung war, dass der Kontakt
mit HIV-1 selbst die HIV-1-spezifische Immunantwort in exponierten seronegativen Personen
induzierte und so die Etablierung einer persistierenden Infektion verhindern konnte [205].
110
4. Ergebnisse
Eine andere Möglichkeit ergibt sich auch durch kreuzreaktive T-Zellen, die durch ein anderes
Pathogen induziert wurden. Diese CTL könnten mit HIV-1 kreuzreagieren und die Infektion
unterdrücken. Einige Hinweise auf solche kreuzreaktive CTL konnten in dieser Arbeit schon
gewonnen werden, da Epitope identifiziert und analysiert werden konnten, die ein kreuzreaktives Potential aufweisen. Nun sollten auch die exponierten seronegativen Personen auf die
Erkennung verschiedener HIV-1- und HERV-spezifischer Epitope untersucht werden. Alle
exponierten seronegativen Personen, die bei dieser Untersuchung mit eingeschlossen wurden, leben teilweise seit vielen Jahren mit einem HIV-1-infizierten Partner zusammen und
haben sich nicht infiziert.
4.9.1 Untersuchung des Vorkommens der CCR5Δ32-Mutation
Die erste Untersuchung der exponierten seronegativen Personen war die Analyse des
CCR5-Gens auf das Vorhandensein der CCRΔ32-Mutation. Es konnte gezeigt werden, dass
Personen, die homozygot für eine 32 bp Deletion im CCR5-Gen sind, sich nicht mit M-tropen
HIV-1-Isolaten infizieren können, die den CCR5-Rezeptor als Ko-Rezeptor bei der Infektion
nutzen [44, 46, 47, 301]. Aufgrund der Deletion entsteht ein verkürztes CCR5-Protein, das
nicht auf die Oberfläche der Zelle gelangt und somit nicht als Ko-Rezeptor für den Eintritt von
HIV-1 in die entsprechende Zelle bereitsteht. Diese homozygote CCR5Δ32-Deletion wird in
einem Prozent der kaukasischen Bevölkerung gefunden und kommt in der afrikanischen Bevölkerung nicht vor [44-46]. Menschen, die heterozygot für die CCR5Δ32-Mutation sind, zeigen eine verringerte Oberflächenexpression des CCR5-Rezeptors [44, 45, 47]. Insgesamt 16
exponierte seronegative Personen wurden in einer PCR auf das Vorkommen der CCR5Δ32Mutation untersucht sowie HIV-1-negative Personen. Eine von 16 getesteten exponierten
seronegativen Personen (6,25 %) und sieben von 35 HIV-1-negativen Personen (20 %) waren heterozygot für die CCR5Δ32-Mutation. Keine der untersuchten Personen wies die
homozygote CCR5Δ32-Mutation auf. In Abb. 4.43 sind beispielhaft die Ergebnisse zweier
PCR-Analysen zu sehen.
111
4. Ergebnisse
Abb. 4.43: Agarosegelbild von zwei verschiedenen CCR5-spezifischen PCR-Analysen
Die DNA wurde aus dem Blut oder den PBMC der Personen isoliert; in einer PCR mit CCR5spezifischen Oligonukleotid-Primern, welche die Region der CCR5Δ32-Mutation umfassen, wurde
dieses DNA-Fragment amplifiziert. Die Analyse erfolgte in einem 1,5 %igen Agarosegel. Als Marker
wurde der 100 bp Ladder von NEB verwendet.
(a) Analyse von drei verschiedenen exponierten seronegativen Personen und einem HIV-1-infizierten
Spender; die Proben 1 bis 4 dienten als Kontrollen:
1 = Negativkontrolle
2 = Patient 322 heterozygot für CCR5Δ32
3 = Patient 143 homozygot für die CCR5-WT-Sequenz
4 = Spender 234 homozygot für CCR5Δ32
5 = Spender 558 (exponiert) homozygot für die CCR5-WT-Sequenz
6 = Spender 188 (exponiert) homozygot für die CCR5-WT-Sequenz
7 = Spender 563 (exponiert) homozygot für die CCR5-WT-Sequenz
8 = Patient 091 homozygot für die CCR5-WT-Sequenz
(b) Analyse verschiedener HIV-1-negativer Spender:
1 = Spender 234 homozygot für CCR5Δ32
2 = Patient 322 heterozygot für CCR5Δ32
3 = Spender 1010 homozygot für die CCR5-WT-Sequenz
4 = Spender 1009 homozygot für die CCR5-WT-Sequenz
5 = Spender 1008 homozygot für die CCR5-WT-Sequenz
6 = Spender 1007 homozygot für die CCR5-WT-Sequenz
7 = Spender 1006 heterozygot für CCR5Δ32
8 = Negativkontrolle
9 = Spender SE heterozygot für CCR5Δ32
10 = Spender 203 homozygot für die CCR5-WT-Sequenz
11 = Spender 027 homozygot für die CCR5-WT-Sequenz
4.9.2 Stimulation der HIV-1-exponierten seronegativen Spender mit HIV-1- und
HERV-spezifischen Peptiden
Ein weiterer Schritt bestand in der Untersuchung der exponierten seronegativen Patienten
hinsichtlich ihrer Reaktion gegenüber HIV-1- und HERV-spezifischen Epitopen. Zu diesem
Zweck wurden die PBMC aus den Spendern isoliert und mit HIV-1-spezifischen Peptiden
stimuliert, die den bisher für die entsprechenden HLA-Allele des Spenders beschriebenen
Epitopen entsprachen. Sieben exponierte und sieben HIV-1-negative Personen wurden auch
auf die Erkennung verschiedener HERV-spezifischer Peptide (IV13, IL12, KL11) untersucht.
Keine dieser getesteten Personen erkannte eines dieser Peptide. Außerdem wurden sieben
112
4. Ergebnisse
exponierte seronegative Personen auf die Erkennung HIV-1-spezifischer Epitope aus verschiedenen HIV-1-Proteinen untersucht. Hierbei konnte wiederum keine Erkennung festgestellt werden. Sieben wurden auf die Erkennung von RT-VL9 und RT-VL9M/V getestet, und
eine dieser exponierten seronegativen Personen (Spender 1242) zeigte CTL gegenüber RTVL9. In einer Analyse der Kreuzreaktion dieser RT-VL9-spezifischen CTL-Linie im IFN-γELISpot konnte festgestellt werden, dass diese CTL-Linie keine Kreuzreaktivität gegenüber
vorhandenen HERV-spezifischen Peptiden zeigte (Abb. 4.44). Anscheinend hat dieser
HIV-1-exponierte seronegative Spender eine HIV-1-spezifische CTL-Antwort induziert, nachdem er mit HIV-1 in Kontakt gekommen war. Eine Übertragung von HIV-1-spezifischen TZellen durch die HIV-1-infizierte Partnerin scheint unwahrscheinlich, da sie kein HLA-A2-Allel
trägt und somit keine HLA-A2-restringierte CTL-Antwort hat.
Abb. 4.44: IFN-γ-ELISpot-Analyse der RT-VL9-spezifischen CTL-Linie von Spender 1242
Die PBMC wurden mit den synthetischen Peptiden inkubiert und nach 14 Tagen hinsichtlich ihrer
Kreuzreaktivität im IFN-γ-ELISpot getestet. Angegeben sind die SFU (Spot Forming Units) von 50.000
eingesetzten Zellen. Man sieht, dass die RT-VL9-spezifische CTL-Linie keine Kreuzreaktivität gegenüber den anderen Peptiden zeigt.
Ein weiteres Epitop, das bei zwei HIV-1-exponierten seronegativen Spendern untersucht
wurde, war IV9 (ILKEPVHGV, AS 309-317) aus HIV-1 Pol. Dieses Epitop ist ein immundominantes HLA-A2-restringiertes Epitop, von dem verschiedene Varianten vorkommen [239].
Spender 909 zeigte eine starke Reaktion gegenüber dem IV9-Peptid sowie eine starke
Kreuzreaktion gegenüber einer der Varianten (Abb. 4.45). Diese IV9-spezifische CTL-Linie
konnte allerdings nur einmal generiert werden. In nachfolgenden Untersuchungen wuchsen
nach der Stimulation mit dem IV9-Peptid keine IV9-spezifischen CTL-Linien aus.
113
4. Ergebnisse
Abb. 4.45: IFN-γ-ELISpot-Analyse der IV9-spezifischen CTL-Linie von Spender 909
Die PBMC wurden mit den synthetischen Peptiden inkubiert und nach 14 Tagen hinsichtlich ihrer
Kreuzreaktivität im IFN-γ-ELISpot getestet. Angegeben sind die SFU (Spot Forming Units) von 50.000
eingesetzten Zellen. Man sieht eine sehr starke Reaktion gegen das IV9-Peptid und auch eine starke
Kreuzreaktion gegen die IV9-V/A-Variante. Eine schwächere Reaktion wird gegen die IV9-G/RVariante ausgebildet.
114
5. Diskussion
5. Diskussion
HIV-1-spezifische CTL spielen eine wichtige Rolle bei der Kontrolle der HIV-1-Infektion [53,
54]. Die HIV-1-spezifischen CTL können aber dennoch in den meisten Patienten die Entwicklung eines Immundefekts nicht verhindern. Nur wenige Menschen, die EC und die LTNP,
sind in der Lage, die HIV-1-Replikation über mehrere Jahre hinweg unter Kontrolle zu halten
[207, 208]. Die meisten dieser Patienten zeigen eine starke CTL-Antwort gegen bestimmte
HLA-restringierte konservierte Epitope [55-57]. Viele dieser Epitope sind in der Sequenz des
Gag-Proteins von HIV-1 zu finden [302]. HIV-1-spezifische T-Zellen konnten auch in exponierten seronegativen Personen nachgewiesen werden. Dies unterstützt die Hypothese,
dass eine HLA-restringierte T-Zellantwort eine schützende Rolle in der HIV-1-Infektion spielt
[206, 210, 211]. Bisher wurde vermutet, dass diese HIV-1-spezifischen T-Zellen von HIV-1
selbst induziert wurden [205]. Der Nachweis von CTL gegen HIV-1-spezifische Peptide in
einem exponierten seronegativen Menschen kann auf eine abortive HIV-1-Infektion hindeuten oder auf eine Übertragung von HLA-restringierten CTL durch sexuellen Kontakt mit einem HIV-1-infizierten Menschen. Die Voraussetzung dafür ist, dass diese Personen mindestens ein HLA-Allel teilen. Eine weitere Möglichkeit ist, dass manche HIV-1-spezifische CTL
nicht durch den Kontakt mit HIV-1 selbst stimuliert, sondern durch kreuzreaktive Peptide aus
anderen Mikroorganismen und Viren induziert wurden. Eine Reihe von Untersuchungen zeigte starke Sequenzhomologien zwischen HIV-1 und verschiedenen anderen Mikroorganismen. Das Vorhandensein von HIV-1-kreuzreaktiven CTL zum Zeitpunkt der Übertragung von
HIV-1, die durch andere Pathogene induziert wurden, könnte somit zur Abwehr von HIV-1
beitragen oder durch eine schnellere Gegenwehr und bessere Unterdrückung der HIV-1Replikation, zu einem besseren Verlauf der HIV-1-Infektion führen. Ein wichtiges Ziel der
vorliegenden Arbeit war daher eine umfassende Analyse von Epitopen in HIV-1, welche
Homologien zu bakteriellen und viralen Epitopen aufweisen.
5.1 Kreuzreaktivität von HLA-B13-restringierten Nef-spezifischen CTL zu
Chlamydophila pneumoniae
Ein HLA-Allel, das mit einer besseren Kontrolle der HIV-1-Replikation und sogar mit einer
Resistenz gegen eine HIV-1-Infektion assoziiert ist, ist das HLA-B13-Allel [220-222]. Ein dominantes HLA-B13-restringiertes Epitop stellt das RI9 (RQDILDLWI, AS 106-114) aus dem
Nef-Protein von HIV-1 dar. Dieses Epitop wurde zum ersten Mal in Langzeitüberlebenden
und auch in Patienten definiert, die einen guten Krankheitsverlauf der HIV-1-Infektion zeigten
[214]. Dabei war aufgefallen, dass die Frequenz der Nef-RI9-spezifischen CTL die Frequenz
von CTL gegen andere Epitope deutlich überstieg. Daher wurde nach kreuzreaktiven homologen Sequenzen in anderen Mikroben gesucht und es wurde eine Sequenz im PBP2115
5. Diskussion
Protein von C. pneumoniae (YYDILDILWI, CP-YI9) gefunden. Erste Untersuchungen hatten
gezeigt, dass Nef-RI9-spezifische CTL-Linien das synthetische CP-YI9-Peptid erkennen.
Bisher war jedoch unklar, ob das CP-YI9-Peptid tatsächlich in Chlamydien-infizierten Zellen
prozessiert und auf dem HLA-B13-Molekül auf der Oberfläche präsentiert werden kann.
5.1.1 Erkennung und Kreuzreaktion zwischen den HLA-B13-restringierten NefRI9- und CP-YI9-Peptiden aus HIV-1 und C. pneumoniae
Bei der Untersuchung einer Kohorte von HIV-1-infizierten Patienten zeigte sich, dass ein
Großteil der Patienten in der Lage war, eine Nef-RI9-spezifische CTL-Linie zu generieren.
Außerdem wurde auch das CP-YI9-Peptid von 66,7 % der HIV-1-infizierten HLA-B13positiven Patienten durch eine CP-YI9-spezifische CTL-Linie erkannt. Die Analyse der
Kreuzreaktivität dieser CTL-Linien ergab, dass mindestens die Hälfte der CTL-Linien in der
Lage war, beide Peptide zu erkennen. Solche kreuzreaktiven CTL-Linien hatten jedoch keinen Einfluss auf den Verlauf der HIV-1-Infektion.
Die Affinität der beiden Peptide unterschied sich allerdings bei den Nef-RI9-spezifischen
CTL-Linien deutlich. Die Affinität des Nef-RI9-Peptids war deutlich höher als die des CP-YI9Peptids in den Nef-RI9-spezifischen CTL-Linien oder der des Kontrollpeptids p15-RI9
(RQANFLGKI, AS 429-437) aus dem HIV-1-Gag. Auch dieses Epitop ist HLA-B13restringiert, und eine Kontrolle der HIV-1-Replikation sowie eine niedrige Virämie sind mit
diesem und anderen Gag-spezifischen Epitopen assoziiert [195, 222]. Auch bei CP-YI9spezifischen T-Zelllinien war die Affinität von Nef-RI9 höher als die von CP-YI9. Möglicherweise ist das Y beim CP-YI9-Peptid an Position 2 kein so guter Anker wie das Q bei Nef-RI9
oder p15-RI9 an Position 2, welches eine bevorzugte Ankeraminosäure für HLA-B13 darstellt
[303]. Dadurch besteht die Möglichkeit, dass das CP-YI9-Peptid nicht so gut an das HLAB13-Allel binden kann wie die beiden anderen Peptide.
5.1.2 Erkennung von C. pneumoniae-infizierten Zelllinien durch Nef-RI9- und
CP-YI9-spezifische CTL-Linien
Da die Erkennung des synthetischen CP-YI9-Peptid kein Beweis ist, dass das PBP2-Protein
tatsächlich von einer C. pneumoniae-infizierten Zelle über das HLA-B13-Molekül präsentiert
wird ist, wurde die Erkennung von infizierten B-Zellen durch Peptid-stimulierte CTL-Linien
analysiert. Die Mehrheit der Nef-RI9- und CP-YI9-spezifischen CTL-Linien keine Erkennung
von C. pneumoniae-infizierten B-Zellen (Abb. 4.5). Bei einigen wenigen CTL-Linien konnte
scheinbar eine Erkennung von C. pneumoniae infizierten B-Zellen im IFN-γ-ELISpot nachgewiesen werden (Daten nicht gezeigt), doch dabei konnte ein unspezifischer aktivierender
Effekt der C. pneumoniae-infizierten B-Zellen nicht ausgeschlossen werden. Im Chrom116
5. Diskussion
Freisetzungstests konnte die spezifische Lyse von C. pneumoniae-infizierten B-Zellen gezeigt werden (Abb. 4.7). Die Erkennung von C. pneumoniae-infizierten B-Zellen im Vergleich
zu nicht-infizierten B-Zellen beweist jedoch noch nicht eine spezifische Erkennung von infizierten B-Zellen über die Erkennung des im HLA-B13 präsentierten CP-YI9-Peptids, da infizierte Zellen eine stärkere Ko-Stimulation von T-Zellen und damit eine stärkere TZellaktivierung bewirken könnte, die unabhängig von der Erkennung des CP-YI9-Peptides
wäre. Die fehlende Erkennung der C. pneumoniae-infizierten B-Zellen durch die Mehrzahl
der untersuchten CTL-Linien schließt jedoch nicht aus, dass die Nef-RI9-spezifischen CTL
durch C. pneumoniae induziert wurden. So könnten C. pneumoniae die Prozessierung von
Antigenen in infizierten B-Zellen abhängig von der individuellen Zelllinie und der Kinetik der
Infektion möglicherweise negativ beeinflussen, wohingegen DC über Aufnahme von infizierten Zellen über Kreuzpräsentation von Chlamydien-Peptiden CTL stimulieren könnten.
5.1.3 Erkennung von PBP2-Konstrukten durch Nef-RI9- und CP-YI9-spezifische
CTL-Linien
Da mit Hilfe der C. pneumoniae-infizierten B-Zellen die Hypothese, dass das CP-YI9-Peptid
aus dem PBP2-Protein der Chlamydien prozessiert und über das HLA-B13-Molekül präsentiert wird, nicht eindeutig bewiesen werden konnte, wurde in einem weiteren Schritt die Klonierung von verschiedenen PBP2-Konstrukten unternommen. Verschiedene Nef-RI9- und
CP-YI9-spezifische CTL-Linien wurden auf die Erkennung von PBP2 durch die transfizierten
HEK293-Zellen untersucht. Weder CP-YI9- noch Nef-RI9-spezifische CTL-Linien konnten die
PBP2- und HLA B13-transfizierten Zellen erkennen (Abb. 4.9). Die fehlende Erkennung der
transfizierten Zellen spricht gegen eine Prozessierung von CP-YI9 und damit gegen eine
Induktion von Nef-RI9-spezifischen CTL durch C. pneumoniae.
Insgesamt stellt sich anhand der gewonnenen Ergebnisse die Frage, ob das PBP2-Protein
so prozessiert wird, damit das CP-YI9-Peptid geschnitten wird und zur Präsentation im HLAB13-Molekül bereitsteht. Eine Proteasomanalyse des PBP2-Proteins aus C. pneumoniae mit
verschiedenen Analyseprogrammen (Paproc, http://www.paproc.de/ [304, 305] und NetShop
3.1 Server, http://www.cbs.dtu.dk/services/NetChop/ [306, 307]) zeigte, dass auch im CPYI9-Epitop Schnittstellen liegen, die vom Proteasom bevorzugt werden können und es ist
nicht gewährleistet, dass das CP-YI9-Peptid prozessiert wird. Z. B. stellen das D an Position
3 und auch das I an Position 4 hervorragende Schnittstellen für das Proteasom dar. Wird das
PBP2-Protein nun an einer dieser Stellen geschnitten, kann das CP-YI9-Peptid nicht prozessiert und präsentiert werden. Möglicherweise wird das CP-YI9-Peptid beim Proteasomverdau
des gesamten PBP2-Proteins häufiger zerschnitten, sodass das CP-YI9-Peptid nicht prozessiert wird. Im Gegensatz dazu stellen das D an Position 3 und das I an Position 4 aus dem
117
5. Diskussion
RI9-Eptiop des Nef-Proteins nur schwache Schnittstellen dar, während eine sehr gute
Schnittstelle direkt vor dem Nef-RI9-Epitop liegt. Dadurch ist die Wahrscheinlichkeit dafür,
dass das Nef-RI9-Epitop bei der Prozessierung des Nef-Proteins nicht zerschnitten wird
deutlich höher.
Zusammenfassend kann aus den Versuchen geschlossen werden, dass Nef-RI9-spezifische
CTL zwar ein homologes Peptid aus C. pneumoniae erkennen können, aber dass bisher kein
ausreichender Anhalt dafür besteht, dass dieses CP-YI9-Peptid tatsächlich aus dem PBP2Protein prozessiert wird. Damit konnte die ursprünglich verfolgte Hypothese einer Induktion
von Nef-RI9-spezifischen CTL durch C. pneumoniae nicht belegt werden.
5.2 Kreuzreaktivität von CTL zwischen dem HIV-1-p17-Protein und dem
Influenza-M1-Matrix-Protein
Das SL9-Epitop (SLYNTVATL, Gag AS 77-85) [50] von HIV-1 ist ein immundominantes Epitop, das von bis zu 75 % der chronisch HIV-1-infizierten Patienten erkannt wird [54, 231,
235-237]. SL9-spezifische CTL werden dagegen kaum in Patienten mit einer akuten HIV-1Infektion gefunden, sondern tauchen erst später im Verlauf der Infektion auf [308, 309]. Auch
das IMP-GL9-Epitop (GILGFVFTL FLU-M1:58-66) [229, 230], ein Epitop aus dem MatrixProtein des Influenza-A-Virus, ist ein immundominantes Epitop, das eine hohe PeptidAffinität besitzt [240]. Dieses IMP-GL9-Epitop ist hoch konserviert unter den Influenza-AVirusstämmen [123], während das HIV-1-SL9-Epitop eine gewisse Variabilität an den Aminosäurepositionen innerhalb der Erkennungsstelle für den TCR zeigt. Die Aminosäuren an
den Ankerpositionen sind dagegen hoch konserviert [232, 233, 241-243]. Die Mutationen
innerhalb des SL9-Epitops sind Folge eines starken Selektionsdrucks durch die CTL des
Wirtsimmunsystems, da diese Mutationen die CTL-Erkennung beeinträchtigen können [235],
jedoch zeigte sich, dass viele Patienten die autologen SL9-Varianten erkennen [231, 244246]. Dies weist darauf hin, dass die Patienten in der Lage sind, neue CTL-Spezifitäten zu
generieren, welche die mutierten SL9-Varianten erkennen können. Vor Kurzem konnte gezeigt werden, dass HLA-A2-restringierte SL9-spezifische CTL, die aus HIV-1-infizierten Patienten generiert wurden, mit dem IMP-GL9-Epitop kreuzreagieren können, obwohl beide Epitope nur in den Ankeraminosäuren fast identisch sind [212]. Auch IMP-GL9-spezifische CTLLinien aus HLA-A2-positiven HIV-1-negativen Personen zeigten eine Kreuzreaktivität gegenüber dem SL9-Peptid [212]. Bisher war allerdings die Prävalenz von solchen HIV-1spezifischen IMP-GL9/SL9-kreuzreaktiven CTL in einer größeren Kohorte von HIV-1infizierten Patienten und HIV-1-exponierten seronegativen Personen nicht bekannt. Es war
auch nicht klar, ob solche kreuzreaktiven CTL den Verlauf der HIV-1-Infektion durch eine
bessere Kontrolle der HIV-1-Replikation beeinflussen oder sogar einen gewissen Schutz vor
118
5. Diskussion
einer HIV-1-Infektion bieten können. Daher wurde im Rahmen der vorliegenden Promotionsarbeit eine systematische Analyse der Kreuzreaktivität zwischen SL9 und IMP-GL9 durchgeführt.
5.2.1 Erkennung von SL9- und IMP-GL9-spezifischen CTL-Linien und ihre Rolle
für die HIV-1-Infektion
Die Studie in meiner Doktorarbeit umfasste eine Kohorte von 174 HIV-1-infizierten HLA-A2positiven Patienten, von denen die meisten unter antiretroviraler Therapie waren. Etwa die
Hälfte aller untersuchten Patienten war in der Lage, sowohl SL9- als auch IMP-GL9spezifische CTL-Linien zu generieren. Diese Ergebnisse bestätigen die früheren Beobachtungen, dass SL9 ein immundominantes Epitop ist, welches v. a. von chronisch infizierten
HIV-1-Patienten erkannt wird [54, 231, 235-237]. Bei der Analyse der Frequenz der SL9- und
IMP-GL9-spezifischen CTL in unstimulierten PBMC im IFN-γ-ELISpot-Test konnten nur bei
sieben Patienten zirkulierende CTL gegen SL9 und/oder IMP-GL9 nachgewiesen werden,
was vermutlich daran liegt, dass 30 der 32 hierbei getesteten Patienten antiretroviral therapiert wurden. Eine effektive ART geht in der Regel mit einer Reduktion von zirkulierenden
HIV-1-spezifischen CTL im Blut einher [236, 246-248, 310, 311]. Die Erkennung des SL9Epitops war in dieser Studie auch mit einer signifikant höheren CD4+-Zellzahl und mit einer
niedrigeren Viruslast zum Testzeitpunkt assoziiert. Dies könnte darauf hinweisen, dass eine
CTL-Antwort gegen dieses Epitop an der Kontrolle der HIV-1-Replikation beteiligt ist und
bestätigt andere Untersuchungen, welche ebenfalls eine Kontrolle der HIV-1-Replikation
durch SL9-spezifische CTL demonstriert haben [54]. Für die Tatsache, dass bei Patienten
mit einer SL9-Erkennung nur zum Testzeitpunkt, nicht jedoch vor Beginn der antiretroviralen
Therapie die Viruslast niedriger und die CD4+-Zellzahlen höher waren als bei Patienten ohne
SL9-Erkennung, kommen verschiedene Erklärungen in Frage: Ein Progress der HIV-1Infektion mit steigender Virämie ist häufig mit dem Auftreten von Fluchtmutationen assoziiert,
welche die CTL-Erkennung aufheben [203, 312-314]. Unter einer antiviralen Therapie ist es
jedoch möglich, dass Patienten neue CTL-Spezifitäten generieren, welche mutierte Viren
erkennen, solange die Mutationen nur in der TCR-Erkennungsregion der Peptide auftreten,
sodass die Peptide weiter über die HLA-Moleküle präsentiert werden [315]. Eine solche
Nachreifung der SL9-spezifischen CTL-Antwort könnte zu einem besseren Ansprechen auf
die antivirale Therapie beitragen. Da keine Sequenzdaten der Viren vorlagen, kann diese
Annahme jedoch nicht bewiesen werden. Eine alternative Erklärung wäre, dass die Progression der HIV-1-Virämie mit einer funktionellen Anergie der CTL einherging und dass die beobachtete SL9-spezifische CTL-Antwort Folge einer stärkeren Immunrekonstitution bei einem
besseren Ansprechen auf die ART ist. Dafür würde die Beobachtung sprechen, dass auch
119
5. Diskussion
der Nachweis von IMP-GL9-spezifischen CTL mit einer niedrigeren Virämie zum Testzeitpunkt assoziiert war.
Da die meisten Patienten, die untersucht wurden, eine antiretrovirale Therapie erhielten,
wurden sie zusätzlich unterteilt in Personen mit supprimierter Virämie unter 20 Kopien/ml
und Personen mit niedriger Virämie (Blips). Dabei stellte sich heraus, dass Patienten, die
eine antiretrovirale Therapie erhielten, signifikant häufiger SL9- oder IMP-GL9-spezifische
CTL-Linien generierten als unbehandelte Patienten (Tab. 4.6 und 4.7). Auch dieser Aspekt
spricht für die Beobachtung, dass die Fähigkeit zur Generierung einer SL9- bzw. IMP-GL9spezifischen Immunantwort vermutlich wesentlich mit der ART-bedingten Immunrekonstitution assoziiert ist [54, 231, 235-237, 308, 309].
5.2.2 Kreuzreaktivität der SL9- und IMP-GL9-spezifischen CTL-Linien und ihre
Rolle für die HIV-1-Infektion
Die IMP-GL9- und SL9-spezifischen CTL-Linien wurden auch hinsichtlich ihrer Kreuzreaktivität untersucht. Eine Kreuzreaktion zwischen beiden Peptiden konnte in einem großen Teil
der Patienten gefunden werden (43,1 %). Die Reaktivität ist nicht auf unspezifisches Wachstum aufgrund von Bestandteilen wie dem IL-2 aus dem Kulturmedium zurückzuführen, da
Zellen nach der Kultivierung mit dem Medium ohne Peptid-Zugabe keine Peptiderkennung
im IFN-γ-ELISpot zeigten. Dies ist ein weiterer Hinweis darauf, dass es sich bei den TZelllinien, die beide Peptide erkennen können, wirklich um kreuzreaktive T-Zelllinien handelt.
Zur weiteren Unterstützung dieser Hypothese wurden die kreuzreaktiven T-Zelllinien im IFNγ-ELISpot mit einer Peptid-Kombination aus SL9 und IMP-GL9 getestet. Alle getesteten TZelllinien zeigten eine gleichwertige Erkennung der Peptid-Kombination und der einzelnen
Peptide (Abb. 4.14). Wären durch die Stimulation mit einem der Peptide zwei T-Zelllinien mit
unterschiedlichen Peptid-Spezifitäten generiert worden, hätte sich die Anzahl an IFN-γsekretorischen T-Zellen bei der Peptid-Kombination erhöhen müssen. Auch ein Vergleich der
Peptid-Affinität zeigte, dass beide Peptide eine ähnlich gute Affinität aufweisen.
Bei der Untersuchung der Viruslasten und CD4+-Zellzahlen vor dem Start der Therapie und
zum Testzeitpunkt fand sich kein Hinweis, dass die Fähigkeit zur Generierung von SL9/IMPGL9-kreuzreaktiven CTL einen günstigen Einfluss auf die HIV-1-Infektion hatte.
In der Untergruppe der behandelten Patienten mit nicht supprimierter Viruslast zeigten die
Patienten mit einer SL9-spezifischen IMP-GL9-kreuzreaktiven CTL-Antwort sogar signifikant
höhere Viruslasten zum Testzeitpunkt als Patienten ohne kreuzreaktive CTL. Diese überraschende Beobachtung könnte im Prinzip darauf zurückzuführen sein, dass kreuzreagierende
TCRs
eine
geringere
Peptid-Affinität
aufweisen
könnten.
Jedoch
konnte
ich
in
Titrierungsexperimenten mit einigen CTL-Linien zeigen, dass zumindest die untersuchten
120
5. Diskussion
SL9-spezifische CTL-Linien ohne Kreuzreaktivität gegenüber IMP-GL9 die gleiche PeptidAffinität wie die kreuzreaktiven SL9- oder IMP-GL9-spezifischen CTL-Linien aufwiesen. IMPGL9-kreuzreaktive SL9-spezifische CTL-Linien zeigten auch ein ähnliches Erkennungsmuster für mutierte SL9-Varianten, sodass kein Hinweis besteht, dass die höhere Viruslast durch
einen weniger effektiven TCR der IMP GL9-kreuzreaktiven CTL bedingt war.
5.2.3 Kreuzerkennung von elf verschiedenen SL9-Varianten durch SL9- und
IMP-GL9-spezifische CTL-Linien
Da das SL9-Epitop ein sehr variables Epitop ist [232, 233, 241-243], sollte untersucht werden, inwieweit die SL9- und IMP-GL9-spezifischen CTL-Linien in der Lage sind, verschiedene SL9-Varianten zu erkennen. Elf verschiedene SL9-Varianten wurden für diese Analyse
verwendet. Alle getesteten Varianten können als Fluchtmutation wirken und ihre Erkennung
wurde in einer früheren Studie mit einer anderen Kohorte an HLA-A2-positiven Patienten
beobachtet (unpublizierte Daten). Einige der Varianten wurden auch als natürlich vorkommende Fluchtmutationen beschrieben oder auch in anderen Analysen schon verwendet [244,
309, 315-319]. Während die Mehrzahl der untersuchten SL9-spezifischen CTL eine Kreuzreaktion mit dem IMP-GL9-Peptid aufwies, wurden die verschiedenen SL9-Varianten nur von
wenigen CTL-Linien in unterschiedlichem Ausmaß erkannt. Dabei zeigten sich keine wesentlichen Unterschiede im Erkennungsmuster der SL9-Varianten zwischen den SL9spezifischen CTL-Linien mit bzw. ohne IMP-GL9-Kreuzreaktion, wobei einige der nur selten
erkannten SL9-Varianten nur von CTL-Linien mit IMP-GL9-Kreuzreaktion erkannt wurden.
Interessanterweise zeigten auch zwei IMP-GL9-spezifische CTL-Linien eine Erkennung von
einigen SL9-Varianten (Tab. 4.3), obwohl sie das SL9-Peptid nicht erkannten.
Insgesamt wurden von den SL9-spezifischen CTL-Linien relativ wenige SL9-Varianten erkannt. Dies ist insofern verwunderlich, da die Sequenzen der SL9-Varianten eine wesentlich
größere Übereinstimmung mit der SL9-Sequenz zeigen als das IMP-GL9-Epitop. Daher
könnte man annehmen, dass die SL9-Varianten eher als das IMP-GL9-Peptid erkannt werden, v. a. da beschrieben wurde, dass verschiedene Aminosäuremutationen im SL9-Epitop
keinen großen Einfluss auf die Erkennung durch SL9-spezifische CTL haben [244, 315, 316].
Eine Möglichkeit wäre, dass die IMP-GL9/SL9-kreuzreaktiven T-Zellen einen TCR selektionieren, der eine starke Affinität zu diesen beiden Peptiden aufweist, wodurch die Breite der
Antwort auf die SL9-Varianten verloren geht.
121
5. Diskussion
5.2.4 Erkennung und Kreuzreaktion von SL9 und IMP-GL9 in HIV-1-negativen
Personen
Acierno et al. konnten auch IMP-GL9-spezifische SL9-kreuzreaktive T-Zellen aus HIV-1negativen HLA-A2-positiven Influenza-Patienten generieren [212]. In meiner Untersuchung
einer größeren Kohorte von HIV-1-negativen HLA-A2-positiven Patienten konnten keine
kreuzreaktiven T-Zelllinien gefunden werden. Unter den untersuchten Personen waren sowohl HIV-1-exponierte seronegative Personen als auch HIV-1-negative Spender. Obwohl
das IMP-GL9-Epitop als immundominantes Influenza-Epitop beschrieben wurde [123, 240],
konnten nur drei IMP-GL9-spezifische CTL-Linien generiert werden. Zwei dieser IMP-GL9spezifischen CTL-Linien stammten von HIV-1-negativen Blutspendern, während eine IMPGL9-spezifische CTL-Linie aus einem HIV-1-exponierten seronegativen Patienten generiert
werden konnte. Dieser Patient generierte auch eine SL9-spezifische CTL-Linie. Allerdings
waren beide CTL-Linien nicht kreuzreaktiv. Ein Großteil der getesteten Personen war gegen
Influenza geimpft, wobei der verwendete Impfstoff das Matrix-Protein nicht enthält [124].
Durch die Impfung werden jedoch nur Influenza-spezifische Antikörper und CD4-Zellen induziert und keine CTL. Kann durch die Impfung eine Influenza-Infektion effektiv durch die Bildung von Antikörpern verhindert werden, werden auch durch den nachfolgenden Kontakt mit
Influenzaviren keine CTL gegen IMP induziert, was die niedrige Frequenz von IMPspezifischen CTL in den von uns untersuchten Blutspendern erklären könnte.
Zusammenfassend konnte ich bestätigen, dass in HIV-1-infizierten Patienten häufig SL9spezifische CTL generiert werden, welche mit dem Influenza IMP-GL9-Epitop kreuzreagieren. Es fand sich jedoch kein Hinweis darauf, dass SL9/IMP-GL9-spezifische CTL kreuzreaktive CTL einen günstigen Einfluss auf die HIV-1-Infektion haben. In Zusammenschau mit der
Tatsache, dass IMP-GL9-spezifische CTL in HIV-1-negativen Blutspendern nur selten gefunden wurden, vermute ich, dass die kreuzreaktiven CTL nicht durch eine vorangegangene
Influenza-Infektion, sondern durch die HIV-1-Infektion selbst induziert wurden.
Ein protektiver Effekt von kreuzreaktiven CTL wäre nur dann zu erwarten, wenn diese zum
Zeitpunkt der HIV-1-Infektion in ausreichender Menge vorhanden gewesen wären. Da es
sich bei der Influenza-Infektion um eine transiente Infektion handelt, welche nicht wie HIV-1
persistiert, ist zu vermuten, dass nach Überwindung der Influenza-Infektion die Zahl der IMPGL9-spezifischen CTL stark absinkt. Auch wenn durch eine Influenza-Infektion CTL generiert
würden, welche mit HIV-1 kreuzreagieren könnten, wäre diese geringe Frequenz an kreuzreaktiven IMP-GL9-spezifischen CTL vermutlich nicht ausreichend, um durch eine kreuzreaktive Antwort vor einer HIV-1-Infektion zu schützen oder zu einer besseren Kontrolle der HIV1-Infektion beizutragen.
122
5. Diskussion
Umgekehrt wäre es aber sehr gut vorstellbar, dass durch die chronische Stimulation durch
HIV-1 die Frequenz an kreuzreaktiven CTL dauerhaft so hoch sein könnte, dass zumindest
in einigen Patienten die kreuzreaktiven CTL einen günstigen Einfluss auf den Verlauf einer
Influenza-Infektion in nicht geimpften HIV-1-infizierten Patienten haben könnten. Dies konnte
in der vorliegenden Arbeit nicht untersucht werden, da das Auftreten einer Influenza-Infektion
in den Patienten im Untersuchungszeitraum nicht zuverlässig analysiert werden konnte und
dass der Großteil der an der Klinik betreuten HIV-1-infizierten Patienten eine InfluenzaImpfung erhalten hatte, so dass die Inzidenz von Influenza-verdächtigen Erkrankungen sehr
niedrig lag.
5.3 Kreuzreaktivität zwischen dem HIV-1-SL9-, dem IMP-GL9- und dem
EBV-GL9-Peptid in HIV-1 infizierten Patienten
Ein weiteres Epitop das eine Kreuzreaktion zu dem IMP-GL9-Epitop aus dem Matrix-Protein
des Influenza-A-Virus zeigt, ist das EBV-GL9 (GLCTLVAML, AS 280-288) aus dem BMLF1Protein des EBV. Es konnte gezeigt werden, dass zwischen EBV und Influenza eine Kreuzreaktivität besteht, die auf einen kreuzreaktiven TCR zurückzuführen ist [249, 250]. Das
EBV-GL9-Epitop ist auch wie das IMP-GL9 und das HIV-1-SL9 ein HLA-A2-restringiertes
Epitop. Das EBV-GL9-Epitop zeigt eine geringe Sequenzhomologie zum SL9-Epitop aus
HIV-1, aber genauso wie bei dem IMP-GL9-Epitop sind die Ankeraminosäuren gleich. Da
EBV ebenso wie HIV-1 eine persistierende Infektion verursacht, besteht die Möglichkeit,
dass EBV-spezifische CTL in höheren Frequenzen dauerhaft stabil im Körper vorhanden
sind. Dagegen verursacht die Influenza eine transiente Infektion, die nach wenigen Wochen
überwunden ist. Die Influenza-spezifischen CTL zirkulieren demenentsprechend nur über
einen kurzen Zeitraum in sehr hohen Frequenzen im Körper und fallen danach wohl auf ein
Minimum zurück, das nicht ausreichend ist für eine kreuzreaktive schützende Antwort. Solch
eine kreuzreaktive schützende Antwort zwischen EBV-GL9- und HIV-1-spezifischen CTL
wäre möglicherweise vorteilhafter und länger anhaltend aufgrund der persistierenden Infektionen der beiden Erreger. Außerdem ist ein Großteil der Bevölkerung seropositiv für EBV
[133]. Bisher wurde nicht untersucht, ob eine Kreuzreaktion zwischen EBV und HIV-1 vorkommt.
Ich konnte zeigen, dass 61,8 % der getesteten HIV-1-infizierten HLA-A2-positiver Patienten
eine EBV-GL9-spezifische CTL-Linie generieren konnten. Wie auch das IMP-GL9- und das
SL9-Peptid zeigt auch das EBV-GL9-Peptid eine klare CD8-Spezifität. Genauso ist die Affinität des EBV-GL9-Peptids vergleichbar mit der Affinität der beiden Peptide IMP-GL9 und SL9.
Die EBV-GL9-spezifischen CTL-Linien wurden auch hinsichtlich ihrer Kreuzreaktivität gegenüber IMP-GL9 und SL9 untersucht. Gleichzeitig wurde auch untersucht, ob IMP-GL9123
5. Diskussion
bzw. SL9-spezifische CTL-Linien in der Lage sind, das EBV-GL9-Peptid zu erkennen. Dabei
zeigte sich, dass 6,5 % der Patienten eine CTL-Linie generierten, die IMP-GL9 und EBV-GL9
spezifisch war. Diese Ergebnisse bestätigen frühere Untersuchungen, dass es eine Kreuzreaktivität bei diesen beiden Epitopen vorkommt, wobei es sich bei den dabei untersuchten
Personen nicht um HIV-1-infizierte Patienten handelt [249, 250]. In meiner Studie konnte ich
außerdem zeigen, dass auch eine Kreuzreaktion zwischen EBV-GL9 und SL9 bei den untersuchten HIV-1-infizierten Patienten vorkam. Insgesamt 16 % der hier analysierten Patienten
generierten eine kreuzreaktive CTL-Linie mit Erkennung von EBV-GL9 und SL9. Die Reaktivität der T-Zelllinien ist größtenteils nicht auf unspezifisches Wachstum aufgrund von Bestanteilen wie IL-2 aus dem Kulturmedium zurückzuführen, da die meisten Zelllinien nach der
Kultivierung ohne Peptid-Zugabe keine Peptiderkennung im IFN-γ-ELISpot zeigten. Dies
zeigt, dass es sich bei den T-Zelllinien mit Erkennung von EBV-GL9 und SL9 bzw. EBV-GL9
und IMP-GL9 um kreuzreaktive T-Zelllinien handeln könnte. Dennoch lässt sich feststellen,
dass Kreuzreaktionen zwischen SL9 und EBV-GL9 deutlich seltener vorkommen als Kreuzreaktionen zwischen SL9 und IMP-GL9. Eine kreuzreaktive CTL-Linie, mit der Erkennung
von IMP-GL9, EBV-GL9 und HIV-1-SL9 konnte nur 3,8 % der Patienten detektiert werden
(Abb. 4.22).
Bei der Analyse der CD4+-Zellzahlen und der Viruslasten vor dem Start der Therapie und
zum Testzeitpunkt konnte kein Hinweis gefunden werden, dass die kreuzreaktiven CTL einen Einfluss auf den Verlauf der HIV-1-Infektion hatten. Da jedoch die Patientengruppen mit
einer kreuzreaktiven CTL-Linie im Vergleich zu der Gruppe mit nicht-kreuzreaktiven CTLLinien sehr klein war, besteht die Möglichkeit, dass sich durch die Analyse einer größeren
Gruppe von Patienten mit kreuzreaktiven CTL aussagekräftige Ergebnisse aufzeigen lassen.
Zusammenfassend konnte ich zeigen, dass in HIV-1-infizierten Patienten auch teilweise SL9spezifische CTL-Linien generiert werden, die Kreuzreaktivität zum EBV-GL9-Epitop zeigen.
Diese SL9/EBV-GL9-Kreuzreaktivität wurde jedoch seltener nachgewiesen als eine Kreuzreaktion zwischen SL9 und IMP-GL9.
Obwohl die EBV-Infektion genau wie die HIV-1-Infektion eine persistierende Infektion ist und
somit die Möglichkeit besteht, dass eine ausreichende Menge an CTL zum Zeitpunkt der
HIV-1-Infektion vorhanden gewesen wären, konnte kein protektiver Effekt durch EBVGL9/SL9-kreuzreaktive CTL nachgewiesen werden. Da nur zwei HIV-1-negative Spender
hinsichtlich der EBV-GL9-Erkennung untersucht wurden und bisher keine Kreuzreaktion von
EBV-GL9-spezifischen CTL zu SL9 in HIV-1-negativen Personen nachgewiesen wurden,
kann man keine Aussage treffen, ob solche kreuzreaktiven CTL einen Einfluss auf die EBVInfektion haben können. Des Weiteren ist das BMLF1-Protein von EBV ein lytisches Protein,
welches nicht während der Latenz des Virus exprimiert wird. Deswegen ist vermutlich die
Frequenz der EBV-GL9-spezifischen CTL sehr gering bei Personen mit einer persistierenden
124
5. Diskussion
EBV-Infektion. Daher wäre diese geringe Frequenz vermutlich nicht ausreichend, um durch
eine kreuzreaktive Antwort bei einer besseren Kontrolle der HIV-1-Infektion mitzuwirken.
5.4 HIV-1-SL9, IMP-GL9- und EBV-GL9-spezifische TCR
Im Verlauf meiner Doktorarbeit konnten mehrere TCRs aus den CD8+-T-Zellen von HIV-1infizierten Patienten generiert werden. Es wurden unterschiedliche SL9-, IMP-GL9- und EBVGL9-spezifische T-Zelllinien ausgewählt, um die Funktionalität und mögliche Kreuzreaktivität
der TCRs zu analysieren. Alle drei Epitope sind HLA-A2-restringiert. Das HLA-A2-Allel hat
weltweit eine hohe Prävalenz und zählt zu den am häufigsten vorkommenden HLA-Allelen
unter Europäern [320]. Damit wäre ein TCR gegen ein HLA-A2-restringiertes Epitop eine
gute Verwendungsmöglichkeit bei der passiven Immuntherapie, die vielen Menschen
zugutekommen könnte. Verschiedene SL9-spezifische TCRs konnten bisher schon beschrieben und generiert werden [228, 257, 321, 322]. Auch IMP-GL9 und EBV-GL9spezifische TCR sowie IMP-GL9/EBV-GL9-kreuzreaktive TCR wurden schon beschrieben
[249]. Weitere TCR gegen andere IMP- und EBV-spezifische Epitope wurden schon charakterisiert [323-327]. Dennoch konnten hier einige neue Ketten identifiziert werden und auch
die Funktionalität dieser Ketten wurde analysiert.
5.4.1 Der IMP-GL9-spezifische TCR
Es konnte ein IMP-GL9-spezifischer TCR aus einem HIV-1-infizierten Patienten identifiziert
werden. Dieser TCR von Patient 048 hatte die variable α-Kette AV16s1_TRAV3 mit der
CDR3-Region TRAJ27 und die variable β-Kette BV17s1_TRBV19 mit der CDR3-Region
TRBJ1-1. Die β-Kette wurde schon häufiger als die dominante Kette bei diesem Epitop beschrieben, auch bei dem IMP-GL9/EBV-GL9-kreuzreaktiven TCR [249, 254, 255]. Genauso
wurde die TRBJ2-1-CDR3-Region in diesem Zusammenhang schon beschrieben [249]. Die
α-Kette wurde meines Wissens bisher noch nicht in dieser Kombination beschrieben. Die
TCR-Ketten wurden hinsichtlich ihrer Funktionalität im IFN-γ-ELISpot analysiert. Die TCRreprogrammierten T-Zellen konnten das IMP-GL9-Peptid, präsentiert über das HLA-A2Molekül der T2-Zelllinie, erkennen. Insgesamt war die Reaktivität gegen das Peptid aber
schwach. Durch die Zugabe von IL-2 und IL-7 zur Ko-Stimulation und durch die Erhöhung
der mRNA-Menge auf 20 µg pro TCR-Kette konnte die Reaktivität verstärkt werden (Abb.
4.23b). Bei der Reprogrammierung von T-Zellen eines HLA-A2-positiven Spenders konnte
festgestellt werden, dass auch das IMP-GL9-Peptid ohne die Ko-Stimulation durch die T2Zellen erkannt werden kann. In Chrom-Freisetzungstests konnte die spezifische Lyse von
Target-Zellen, welche mit dem IMP-GL9-Peptid beladen wurden, nicht gezeigt werden. Womöglich ist die Frequenz der reprogrammierten T-Zellen zu gering. Diese Theorie wird auch
125
5. Diskussion
durch die schwache IFN-γ-Antwort im ELISpot unterstützt. Die Oberflächenfärbung mit dem
IMP-GL9-Dextramer zeigte keine Expression des IMP-GL9-spezifischen TCR. Dies deutet
darauf hin, dass der IMP-GL9-spezifische TCR gar nicht oder in sehr geringer Dichte auf der
Oberfläche vorhanden ist. Eine andere Möglichkeit wäre, dass die Affinität des TCR für das
IMP-GL9-Peptid zu gering ist, um eine starke Stimulierung der transfizierten T-Zellen zu bewirken. Ein weiterer Punkt ist, dass es zu Fehlpaarungen zwischen den eingebrachten TCRKetten mit den endogenen TCR-Ketten der Spenderzellen kommen kann und falsch gepaarte, nicht funktionelle TCR-Kombinationen entstehen können [176, 228, 328]. Diese TCRs
sind womöglich nicht in der Lage, zur Oberfläche zu gelangen, oder sie können das Peptid
nicht erkennen. Eine weitere Möglichkeit besteht darin, dass die Affinität gegenüber dem
CD3-Molekül zu gering ist. Um diese Affinität zu verstärken und die Konkurrenz um das
CD3-Molekül mit dem endogenen Rezeptor sowie Fehlpaarungen zwischen dem transfizierten und dem endogenen TCR zu vermeiden, wurden die konstanten Ketten der IMP-GL9spezifischen TCR-α-Kette und -β-Kette durch die konstanten Ketten aus einem murinen
TCRs ersetzt. Es konnte schon früher festgestellt werden, dass durch die Murinisierung der
TCR-Ketten eine verstärkte Bindung an den CD3-Komplex erreicht werden kann und außerdem somit auch Fehlpaarungen mit dem endogenen TCR verhindert werden können [176,
228, 256]. Durch die Murinisierung des IMP-GL9-spezifischen TCR konnte in einem ersten
Versuch eine höhere Reaktivität gegenüber dem IMP-GL9-Peptid erreicht werden (Abb.
4.29). Die Oberflächenexpression wurde damit jedoch nicht erhöht, da mit dem IMP-GL9spezifischen Dextramer keine Expression nachgewiesen werden konnte.
In weiteren Versuchen wurden auch Spenderzellen von HIV-1-infizierten Patienten durch die
Elektroporation mit der TCR-mRNA reprogrammiert. Hierbei konnte eine deutlich bessere
Reaktivität gegenüber dem IMP-GL9-Peptid im IFN-γ-ELISpot beobachtet werden (Abb.
4.24). Dies liegt vermutlich daran, dass die CD8+ T-Zellen durch die HIV-1-Infektion stärker
aktiviert sind und schon bei einer geringeren TCR-Expression stimuliert werden können. In
einem Elektroporationsexperiment mit den reprogrammierten T-Zellen aus einem HIV-1infizierten Spender konnte auch die Peptid-Affinität analysiert werden. Die Affinität gegenüber dem IMP-GL9-Peptid war sehr gut, da eine Peptidkonzentration von 50 ng/ml noch
durch die reprogrammierten T-Zellen erkannt werden konnte. Damit ist die Peptid-Affinität
des TCR besser als die der getesteten IMP-GL9-spezifischen CTL-Linien (Abb. 4.25).
Der TCR zeigte keine Kreuzreaktion gegenüber dem SL9-Peptid im IFN-γ-ELISpot-Test.
Weitere TCR-Ketten konnten zwar identifiziert werden, jedoch konnten sie noch nicht hinsichtlich ihrer Funktionalität getestet werden.
Der Influenza-spezifische TCR, der im Rahmen meiner Promotion generiert werden konnte,
stellt ein mögliches Werkzeug für die Influenzatherapie dar, da er gegen ein hoch konserviertes Epitop im Influenza Matrix-Protein gerichtet ist. Diese Sequenz ist unter verschiedenen
126
5. Diskussion
Influenza-A-Virusstämmen stark konserviert. Das Epitop ist nicht nur im Matrix-Protein der
saisonalen Influenza zu finden, sondern auch in der sog. „Schweinegrippe“ oder neuen Grippe, die im Winter 2009/10 die letzte große Pandemiewelle ausgelöst hatte. Auch in verschiedenen H5N1-Vogelgrippestämmen ist dieses Epitop konserviert. Dort ist nur eine Aminosäuresubstitution an Position 2 zu finden, bei der das I durch ein M ersetzt ist. Aber M ist wie I
und L ein sehr guter Anker für HLA-A2 [329], sodass auch dieses Epitop sehr gut präsentiert
werden kann. Ein TCR, der gegen verschiedene Influenzavirusvarianten aktiv ist, könnte
somit ein gutes Werkzeug für die Influenzatherapie oder Gentherapie darstellen. Da ständig
neue Influenzavarianten gerade aus dem Tierreich aufkommen und das Influenzavirus eine
hohe Mutationsrate hat, sind Therapie und Impfstoffe begrenzt. Es sind nur wenige Neuraminidase Hemmstoffe für die Influenzatherapie auf dem Markt und die Influenzaviren entwickeln ständig neue Resistenzen gegen die Medikamente [106]. Mit dem Impfstoff kann jedes
Jahr nur eine Influenzavirusvariante abgedeckt werden und man muss sich jedes Jahr wieder einen neuen Schutz durch eine neue Impfung aufbauen [10, 113, 124]. Außerdem wird
durch den Impfstoff nur die Bildung von Antikörpern induziert, nicht jedoch die von Influenzaspezifischen CTL [124]. Deswegen könnte ein solcher Influenza-spezifischer TCR gegen ein
hoch konserviertes Influenza-Epitop ein gutes therapeutisches Mittel darstellen, um den Verlauf einer Influenza-Infektion abzumildern. Vorstellbar wäre auch eine genetische Immunisierung zum Schutz vor einer Influenza-Infektion. Wenn auch CTL das Eindringen von Influenzaviren in die Zellen nicht verhindern können, könnten sie bei ausreichender Frequenz und
Funktionalität eine schnelle Kontrolle der Infektion ermöglichen. Da HLA-A2 ein sehr häufig
vorkommendes HLA-Allel darstellt [320], könnte bei einer drohenden Pandemie durch eine
genetische Immunisierung mit diesem TCR ein relevanter Anteil der Bevölkerung erfasst
werden.
5.4.2 SL9- und EBV-GL9-spezifische TCR
In einer weiteren Untersuchung wurden auch SL9- und EBV-GL9-spezifische kreuzreaktive
T-Zelllinien hinsichtlich ihres TCR-Repertoires analysiert werden. Erfolgreich konnten dabei
die TCR-Ketten von Patient 258 und Patient 285 identifiziert werden, die beide SL9/EBVGL9-spezifische kreuzreaktive CTL-Linien generiert hatten. Bei Patient 258 wurden die variablen α-Ketten AV2s1_TRAV12-2, AV2s3_TRAV12-1 und AV8s1_TRAV13-1 sowie die variablen β-Ketten BV4s1_TRBV29 und BV5s1_TRBV5-1 identifiziert. Bei Patient 285 wurden
hingegen die variablen α-Ketten AV22s1_TRAV9-2 und AV2s3_TRAV12-1 sowie die beiden
variablen β-Ketten BV22s1_TRBV2 und BV12s1_TRBV10-3 identifiziert. Die beiden
AV2s3_TRAV12-1 variablen α-Ketten hatten mit der TRAJ34-Kette die gleiche Sequenz in
der hypervariablen CDR3-Region, die sich nur in einer Aminosäure unterschied. Die beiden
TCR-Kombinationen aus AV2s1_TRAV12-2 und BV5s1_TRBV5-1 von Patient 258 und
127
5. Diskussion
AV2s3_TRAV12-1 und BV22s1_TRBV2 von Patient 285 zeigten eine starke SL9-Spezifität
(Abb. 4.27b + 4.28c). Alle anderen getesteten Kombinationen zeigten eine schwache Erkennung des EBV-GL9-Peptids, präsentiert über T2-Zellen (Abb. 4.27 + 4.28).
Die TCR-Kettenkombination aus AV2s3_TRAV12-1 und BV22s1_TRBV2, die bei Patient 285
identifiziert wurde zeigte neben der sehr starken Reaktivität gegenüber dem SL9-Peptid auch
eine schwache Erkennung des EBV-GL9-Peptids (Abb. 4.28c). Da jedoch die in diesem Experiment verwendeten T-Zellen von einem HLA-A2-positiven Spender stammten, besteht die
Möglichkeit, dass diese schwache Reaktion auf das Vorhandensein von EBV-GL9spezifischen T-Zellen unter den PBMC des Spenders zurückzuführen sein könnte.
Um nun auszuschließen, dass die schwache Reaktion gegenüber dem EBV-GL9-Peptid in
den beiden HLA-A2-positiven Spendern auf eine Reaktion der EBV-GL9-spezifischen CTL
der Spender herrührt, wurden in einem weiteren Versuch die PBMC eines HLA-A2-negativen
HIV-1-negativen Spenders mit den beiden TCR-Kettenkombinationen elektroporiert und im
IFN-γ-ELISpot analysiert. In diesem Test zeigte sich, dass TCR-reprogrammierten T-Zellen
nur in der Lage waren, T2-Zellen, welche das SL9-Peptid exprimierten, zu erkennen (Abb.
4.31), während das EBV-GL9-Peptid nicht erkannt wurde. Dies deutet darauf hin, dass die
schwache Reaktion, die bei den Tests mit den beiden HLA-A2-positiven Spendern beobachtet wurde, auf das Vorhandensein von EBV-GL9-spezifischen CTL bei den Spendern zurückzuführen ist.
Die Sequenzen der variablen α- und β-Ketten von zwei verschiedenen SL9-spezifischen
TCR, die von unserer Arbeitsgruppe und anderen veröffentlicht wurden finden sich unter den
hier gefundenen Ketten wieder [227, 228, 257]. Die Kombination aus AV2s1_TRAV12-2 und
BV5s1_TRBV5-1
wurde
schon
beschrieben
[227,
257].
Dabei
wurde
bei
allen
AV2s1_TRAV12-2 α-Ketten auch die TRAJ29 CDR3-Region identifiziert, die sich zum einen
nur am Anfang in zwei Aminosäuren unterscheiden und zum anderen keine V-zu-C-Mutation
aufwies, wie die von Bennett et al. identifizierte TRAJ29 CDR3-Region zeigte [227, 257].
Dagegen unterscheiden sich die hypervariablen CDR3-Regionen bei allen drei TCRKombinationen. Die beiden bekannten TCR-Kombinationen zeigten zum einen die TRBJ2-7und die TRBJ1-1 CDR3-Region, während ich die TRBJ2-1-Domäne identifizieren konnte
[227, 257]. Ein anderer bereits publizierter SL9-spezifischer TCR zeigte die α-Kette
AV2s3_TRAV12-1 mit der CDR3-Region TRAJ34 sowie die β-Kette BV22s1_TRBV2 mit der
TRBJ2-2 CDR3-Region [227, 228]. Die hypervariable TRAJ34 CDR3-Region unterscheidet
sich bei beiden α-Ketten nur in einer Aminosäure an Position 2 (R-zu-L) [227]. Im Gegensatz
dazu unterschieden sich die hypervariablen CDR3-Regionen der beiden BV22s1_TRBV2-βKetten mit der TRBJ1-6 und der TRBJ2-2-Region [227]. Diese Ergebnisse lassen vermuten,
dass SL9-spezifische T-Zellen bestimmte α- und β-Ketten sowie CDR3-Regionen bevorzugen. Es konnte bereits festgestellt werden, dass einige TCRs bestimmte variable Sequenzen
128
5. Diskussion
bevorzugen, die in verschiedenen Individuen gefunden werden können [249, 330] und daher
als public repertoire bezeichnet werden [165]. Neben dem public repertoire, bei dem antigenspezifische T-Zellen in allen Individuen die gleiche TCR-Sequenz (entweder α- oder βKette bzw. beide) nutzen, gibt es das private repertoire, bei dem Personen, die das gleiche
Peptid erkennen keine Übereinstimmung bei den TCR-Sequenzen aufweisen [165]. Die hier
identifizierten TCR-Ketten, die eine schwache Erkennung des EBV-GL9-Peptids zeigten und
sich bei beiden Patienten deutlich unterscheiden, könnten dem private repertoire zugeordnet
werden.
Da das SL9-Epitop ein sehr variables Epitop ist [232, 233, 241-243] wurde die Erkennung
von elf SL9-Varianten durch den SL9-spezifischen TCR mit der Kettenkombination aus
AV2s3_TRAV12-1 und BV22s1_TRBV2 analysiert. Es zeigte sich, dass die mit der TCRmRNA reprogrammierten T-Zellen in der Lage waren, sieben der SL9-Varianten zu erkennen. Auch die beiden SL9-spezifischen TCRs, die Christian Hofmann identifiziert und charakterisiert hatte, zeigten ein breites Spektrum der SL9-Variantenerkennung [227]. Für die Kontrolle des Virus ist es sehr vorteilhaft für die Patienten einen TCR zu besitzen, der in der Lage ist, ein breites Spektrum an SL9-Peptidvarianten zu erkennen, wie es bei dem hier identifizierten TCR der Fall ist. Auch für therapeutische Zwecke wäre ein TCR mit vielfältiger Peptiderkennung von Vorteil.
5.5 Erkennung von RT-spezifischen Epitopen und Kreuzreaktionen
zwischen dem hoch konservierten YMDD-Motiv der RT von HIV-1 zu
HERV
Ein stark konserviertes Motiv innerhalb der Retroviren ist das YMDD-Motiv im aktiven Zentrum der RT [258]. Bei manchen Retroviren ist ein V anstelle vom M in der Sequenz vorhanden. Die M184V-Substitution ist bei HIV-1 auch mit einer Resistenz gegen Lamivudin und
Emtricitabine assoziiert [259-267]. Dieses YMDD-Motiv ist in zwei überlappenden HLA-A2restringierten Epitopen in HIV-1 vorhanden, dem RT-VL9 (VIYQYMDDL; AS 179-187) und
dem RT-YV9 (YQYMDDLYV; AS 181-189) [268, 269]. Es wurde auch in HIV-1-infizierten
Patienten u. a. eine Immunantwort gegen das HERV-K-Epitop II9 (ILVHYIDDI) gefunden
[103]. Daher wurde nun untersucht, ob manche Immunantworten gegen die beiden RTEpitope auch durch eine Reaktion gegen endogene Retroviren induziert oder verstärkt werden können. Zu diesem Zweck wurde in einer systematischen Analyse die Erkennung der
RT-spezifischen Epitope RT-VL9, RT-VL9M/V und RT-YV9 in einer Kohorte von HIV-1infizierten HLA-A2-positiven Patienten untersucht. Es stellte sich heraus, dass deutlich mehr
Patienten in der Lage waren, RT-YV9-spezifische CTL-Linien (44,7 %) zu generieren als RTVL9-spezifische (27,3 %). Auch die RT-VL9M/V-Variante wurde nur von 15,7 % der Patien129
5. Diskussion
ten erkannt. In einer kürzlich veröffentlichten Untersuchung konnte auch festgestellt werden,
dass HIV-1-infizierte Patienten eher RT-YV9-spezifische CTL-Linien generieren als RT-VL9spezifische [268]. Damit wird auch die Annahme unterstützt, dass das RT-YV9-Epitop das
immundominante Epitop in diesem Bereich der RT darstellt während das RT-VL9-Epitop ein
subdominantes Epitop ist [268]. Pacheco et al. fokussierten sich in ihrer Untersuchung auf
die Analyse des Einflusses von Mutationen in Bereichen, welche die HIV-1-spezifische Epitope RT-YV9 und RT-VL9 flankieren. Dabei zeigte sich, dass Patienten, welche die 177DWildtyp(WT)-Sequenz tragen, eher eine RT-VL9-spezifische Antwort generieren, während
Patienten mit einer D-zu-E-Substitution an Position 177 eine Antwort gegen RT-YV9 generierten [268]. In meiner Untersuchung der Erlanger Kohorte konnten diese Ergebnisse bestätigt werden, wobei aber ein größerer Anteil an Patienten ohne die 177E-Substitution eine RTYV9-spezifischen Antwort zeigte und außerdem 19 Patienten sowohl eine RT-YV9spezifische als auch eine RT-VL9-spezifische CTL-Antwort ausbildeten [268]. Möglicherweise ist dies auf die unterschiedlichen Testsysteme der beiden Untersuchungen zurückzuführen. Während in Nantes die PBMC direkt im ELISpot eingesetzt wurden, stimulierte ich die
PBMC der Patienten aus der Erlanger Kohorte mit den Peptiden und testete anschließend
die ausgewachsenen CTL-Linien im ELISpot hinsichtlich ihrer Peptidspezifität. Dadurch
könnte eine höhere Sensitivität erreicht worden sein und somit konnten auch CTL-Antworten
in Patienten ohne die 177E-Substitution detektiert werden, die bei der Analyse in Nantes
womöglich nicht detektiert werden konnten [268].
5.5.1 Kreuzreaktion gegenüber Varianten der RT-spezifischen Epitope
Die RT-spezifischen Linien wurden im IFN-γ-ELISpot hinsichtlich ihrer Kreuzreaktivität gegenüber RT-spezifischen Varianten der beiden Epitope getestet. Dabei wurde neben der
Erkennung der RT-VL9M/V-Substitution auch die Erkennung der RT-VL9M/I-Substitution
untersucht, da bei der Entstehung der M-zu-V-Substitution das M zuerst durch ein I ersetzt
wird. Doch diese M-zu-I-Mutation hat einen Fitnessverlust für das Virus zur Folge und das I
wird durch ein V ersetzt [271]. Mehr als die Hälfte der RT-VL9-spezifischen CTL-Linien war
in der Lage, sowohl das RT-VL9M/I als auch das RT-VL9M/V-Peptid zu erkennen. Auch von
den RT-VL9M/V-spezifischen CTL-Linien erkannten mehr als die Hälfte das RT-VL9- und
das RT-VL9M/I-Peptid. 44,4 % der RT-YV9-spezifischen CTL-Linien zeigten eine Kreuzreaktion gegenüber dem RT-YV9M/V-Peptid. Diese Kreuzreaktivität der CTL-Linien könnte auf
einen TCR hindeuten, der in der Lage ist, mehrere Varianten eines Epitops zu erkennen.
Das schnelle Auftauchen von medikamentenresistenten Virusvarianten stellt ein großes
Problem für die HIV-1-Therapie dar [271]. Daher können kreuzreaktive CTL-Linien durch die
Erkennung mehrerer Varianten eines Epitops zu einer besseren Kontrolle der HIV-1-Infektion
beitragen.
130
5. Diskussion
5.5.2
Kreuzreaktion
der
RT-spezifischen
CTL-Linien
gegenüber
HERV-
angeleiteten Peptiden
Die RT-spezifischen CTL-Linien sollten in einem weiteren Schritt auch auf ihre Kreuzreaktivität gegenüber HERV-spezifischen Peptiden untersucht werden. Hierfür wurden verschiedene
HERV-spezifische Peptide verwendet, die von unterschiedlichen Viren abstammen. Es zeigte sich, dass die RT-YV9-spezifischen CTL-Linien kaum in der Lage waren, HERVspezifische Peptide zu erkennen. Anders sah es bei den RT-VL9 und RT-VL9M/Vspezifischen CTL-Linien aus. Hier wurde besonders das HERV-K-spezifisches Peptid VHL9
(VIYHYVDDL), erkannt. 32 % der RT-VL9-spezifischen und 31,25 % der RT-VL9M/Vspezifischen CTL-Linien konnten dieses Peptid erkennen. Neben dem VHL9-Peptid wurden
andere HERV-spezifische Peptide fast nie von den RT-spezifischen CTL-Linien mit erkannt.
Bisher konnte gezeigt werden, dass HIV-1-infizierte Personen eine erhöhte Expression der
HERV-K aufweisen können [85, 102, 331-333]. HERV-spezifische CTL-Antworten konnten
auch verstärkt in HIV-1-infizierten Patienten detektiert werden und sind teilweise auch mit
einer Kontrolle der HIV-1-Infektion assoziiert [82, 103, 334]. Diese HERV-spezifischen CTLAntworten könnten zum einen von HIV-1-spezifischen CTL-Antworten stammen; zum anderen kann auch die HIV-1-Infektion zur Aktivierung von HERV und der Ausbildung einer
HERV-spezifischen
Immunantwort
beitragen.
Solche
HIV-1-spezifischen
HERV-
kreuzreaktiven T-Zellen könnten die Kontrolle der HIV-1-Infektion verbessern, da durch sie
das Repertoire der Epitope, die erkannt werden verbreitert werden könnte. Auch die Beseitigung
von
HIV-1-infizierten
Zellen könnte durch
diese
HIV-1-spezifischen
HERV-
kreuzreaktiven T-Zellen verbessert werden, da sie neben den HIV-1-infizierten Zellen, welche HIV-1-spezifische Antigene präsentieren auch HIV-1-infizierte Zellen erkennen können,
die HERV-spezifische Antigene präsentieren. Gleichzeitig könnten solche HIV-1-spezifischen
HERV-kreuzreaktiven CTL zusätzlich einen Schutz gegen andere Virusinfektionen liefern,
wenn sie in der Lage sind, Epitope dieser Viren auch zu erkennen. Außerdem könnten sie
auch dazu beitragen Krankheiten, bei denen HERV eine Rolle spielen können, besser zu
kontrollieren.
5.5.3 Der RT-YV9-spezifische TCR von Patient 647
Eine sehr interessante CTL-Linie mit Spezifität für das RT-YV9-Peptid wurde aus den PBMC
des Patienten 647 generiert. Ein solcher RT-spezifischer TCR, der keine Kreuzreaktion zu
endogenen retroviralen Sequenzen zeigt, würde für eine therapeutische Anwendung ein hervorragendes Werkzeug darstellen, da die Gefahr der Autoreaktivität deutlich vermindert wäre. Durch die Erkennung von RT-Resistenzmutationen könnte ein solcher TCR auch als therapeutisches Mittel eingesetzt werden, wenn durch diverse erworbene Resistenzmutationen
131
5. Diskussion
keine antiretroviralen Medikamente mehr für die Therapie zur Verfügung stehen. Heutzutage
kommt auch häufig die Übertragung von HI-Viren vor, die schon eine gewisse Resistenz gegen bestimmte Medikamente aufweisen, welche deshalb nicht mehr für die Behandlung dieser Patienten verwendet werden können [335, 336].
Bei Patient 647 konnte mit Protokoll 1 die variable α-Kette AV12s1_TRAV19 mit der TRAJ39
CDR3-Region sowie die variable β-Kette BV1s1_TRBV9 mit der TRBJ2-2 CDR3-Region
kloniert werden. Der TCR war in der Lage, sowohl das RT-YV9- als auch das RT-YV9M/VPeptid zu erkennen (Abb. 4.34). Dabei zeigte er keine Erkennung von HERV-spezifischen
Peptiden (Abb. 4.37).
Dies ist der erste klonierte TCR, der spezifisch für dieses RT-Epitop ist. Einige andere RTspezifische TCR-Sequenzen wurden schon früher beschrieben und teilweise kloniert. Vor
Kurzem wurde ein TCR kloniert, der eine Spezifität gegen das HLA-A2-restringierte IV9Epitop aufwies [227, 251]. Ein weiterer RT-spezifischer TCR, der bisher beschrieben wurde,
ist spezifisch für ein HLA-B35-restringiertes Epitop [337, 338]. Dabei konnte gezeigt werden,
dass primäre humane CD8+ T-Zellen, welche durch die Transduktion von TCR-α- und -βKetten kodierenden Genen dieses Pol-spezifischen TCRs, reprogrammiert wurden, in der
Lage waren die HIV-1-Replikation in vitro zu hemmen [337, 338]. Diese Daten zeigen, dass
die Wiederherstellung von HIV-1-spezifischen immunreaktiven T-Zellen durch den genetischen Transfer von HIV-spezifischen TCRs eine Möglichkeit der immuntherapeutischen Anwendung gegen HIV-1-Infektion bieten [337, 338].
Der hier identifizierte RT-YV9-spezifische TCR stellt eine interessante Möglichkeit zur Therapie bei einer HIV-1-Infektion dar, da er nicht nur ein sehr konserviertes Epitop, sondern
auch die wichtige Resistenzmutation M/V an Position 184 erkennt. Dieser TCR zeigte eine
im Vergleich zu anderen TCRs exzellente Avidität zum Epitop. Der TCR zeigte keine Reaktivität gegen die getesteten HERV-Peptide und die Patientin, die eine hohe Frequenz von RTYV9-spezifischen CTL aufwies, war gesund und zeigte keinerlei Krankheitssymptome. Daher
erscheint das Risiko einer Induktion von Autoimmunreaktionen zu HERV durch einen Transfer dieses TCRs sehr gering.
Da das HLA-A2-Allel ein häufig vorkommendes HLA-Allel ist [320], wäre dieser TCR für die
genetische Immunisierung eines relevanten Anteils der Bevölkerung geeignet.
5.6 Erkennung und Kreuzreaktion zwischen den HERV- und HIV-1spezifischen RT-Epitopen
Da das YMDD-Motiv der RT unter den verschiedenen Retroviren so stark konserviert ist und
auch eine Kreuzreaktion zwischen HIV-1 und dem HERV-spezifischen VHL9 (VIYHYVDDL)
sowie das Vorhandensein von HERV-spezifischen CTL in HIV-1-infizierten Patienten [82,
132
5. Diskussion
103, 334] gezeigt werden konnte, sollte die Erkennung von HERV-spezifischen Peptiden und
deren Kreuzreaktion unter den HIV-1-infizierten HLA-A2-positiven Patienten untersucht werden. Unter den verwendeten Peptiden befanden sich die Sequenzen von ERV-L (IV13,
ITLVHYIDDIMLV), ERV-H (KL11, KVQILHYMDDL) und dem MS-assoziierten Retrovirus
(IL12, ILVLQYVDDLLL) sowie kürzeren Peptiden. Außerdem waren drei HERV-K-Peptide
YL10I (YIIHYIDDIL), YL10V (YIIHYVDDIL) sowie VHL9, ein von PERV-Sequenzen abgeleitetes Peptid TL11 (TLLQYVDDLLL) und ein Peptid aus dem HERV HCML-ARV oder felinen
Leukämie-Virus (VL11, VLLQYVDDLLL) vorhanden.
5.6.1 Erkennung von HERV-spezifischen Peptiden durch HIV-1-Patienten
Es wurden neun HERV-spezifische Peptide verwendet. Insgesamt generierten maximal 20 %
der getesteten Patienten HERV-spezifische CTL-Linien. Bei einigen Peptiden zeigten weniger als 10 % der Patienten eine spezifische CTL-Linie. Dennoch wurden verschiedene Peptide immer wieder erkannt. Dies deutet darauf hin, dass in den HIV-1-Patienten eine gewisse
Aktivität gegenüber endogenen retroviralen Sequenzen zu finden ist. Es konnte auch schon
nachgewiesen werden, dass besonders HERV-K in HIV-1-infizierten Patienten erhöht exprimiert wird [85, 102, 331, 333]. Außerdem konnte gezeigt werden, dass eine HERVspezifische T-Zellantwort gegen verschiedene HERV-spezifische Peptide in HIV-1-infizierten
Patienten generiert werden kann [82, 103, 334]. Dabei wurde demonstriert, dass die HIV-1Infektion zu einer Expression von HERV führen und die Stimulation einer HERV-spezifischen
CD8+ T-Zellantwort auslösen kann, bei der die HERV-spezifischen Zellen in der Lage sind,
Zielzellen, welche das entsprechende Peptid präsentieren, zu lysieren [103]. Garrison et al.
konnten auch zeigen, dass die HERV-spezifischen CD8+ T-Zellen einen Phänotyp haben,
der dem Phänotyp von T-Zellen ähnelt, die eine effektive Kontrolle einer CMV-Infektion erreichen können [103]. Damit können diese HERV-spezifischen T-Zellantworten mit einer besseren Kontrolle der HIV-1-Infektion verbunden sein. In meiner Analyse wurde keine Untersuchung des Phänotyps der HERV-spezifischen T-Zelllinien durchgeführt. Es ist jedoch zu
vermuten, dass diese Zelllinien ähnliche phänotypische Charakteristika aufweisen können,
wie in verschiedenen Untersuchungen gezeigt werden konnte [82, 103, 334]. Die Einleitung
einer anti-HERV-spezifischen Immunantwort könnte einen neuen Ansatz für eine immuntherapeutische Impfung bei der HIV-Infektion darstellen, da endogene retrovirale Sequenzen im
humanen Genom fixiert sind und somit ein stabiles Ziel darstellen [103].
Bei einigen Zelllinien konnte durch eine HLA-Restriktion das HLA-A2-Allel als restringierendes Allel bestimmt werden. Bei anderen fiel die HLA-Restriktion nicht eindeutig aus. Allerdings waren dies oft Zelllinien, die keine eindeutige CD8-Spezifität aufwiesen. Da es sich
dabei außerdem meist um CTL-Linien handelte, die gegen ein Peptid mit einer Länge von
12-13 Aminosäuren spezifisch waren, besteht die Möglichkeit, das es sich bei diesen T133
5. Diskussion
Zelllinien um HLA-Klasse-II-restringierte CD4+ T-Zelllinien handelt. Die HIV-1-Infektion könnte über eine Transaktivierung zu einer vermehrten Expression von endogenen retroviralen
Sequenzen und damit zu einer Induktion von HERV-spezifischen CTL führen [333].
Die HERV-spezifischen T-Zellantworten in HIV-1-infizierten Patienten können einen Schutzmechanismus gegen die HIV-1-Infektion darstellen, da sie für eine verbesserte Kontrolle der
HIV-1-Infektion sorgen können. Durch die große Menge an retroviralen Sequenzen, die im
menschlichen Genom vorhanden ist, könnte eine breite T-Zellantwort gegen viele verschiedene Epitope generiert werden, denn nicht nur vollständige HERV-Proteine sondern auch
HERV-Elemente mit verfrühten Stoppcodons können Peptidfragmente produzieren, die
durch HLA-Moleküle präsentiert werden können [103]. Da es einige Regionen mit großer
Ähnlichkeit zwischen HERV- und HIV-1-spezifischen Sequenzen gibt, könnte es auch zu
einer Kreuzreaktivität bei der Erkennung von ähnlichen Epitopen kommen. Die Daten von
Garrison et al. zeigen dabei, dass es sich bei den von ihnen detektierten T-Zellantworten
nicht um eine kreuzreaktive Reaktion handelt, aber auch, dass HERV-spezifische T-Zellen
eine Rolle bei der Kontrolle der HIV-1-Infektion spielen können [103].
5.6.2 Die Rolle der HERV-spezifischen T-Zellen für die Kontrolle der HIV-1Infektion
Um die Rolle der HERV-spezifischen CTL-Linien für den Verlauf der HIV-1-Infektion zu bestimmen, wurden die CD4+-Zellzahlen und die Viruslast vor dem Start der Therapie und zum
Testzeitpunkt analysiert. Die CD4+-Zellzahlen zum Testzeitpunkt waren annähernd signifikant niedriger bei Patienten mit IL12-spezifischer T-Zelllinie, während die Viruslast zum
Testzeitpunkt annähernd signifikant höher war als bei Patienten ohne IL12-spezifische TZelllinie. Dies würde eher darauf hindeuten, dass eine IL12-spezifische CTL-Antwort nicht
mit einer Kontrolle der HIV-1-Infektion verbunden ist, sondern sich sogar eher ungünstig
auswirken könnte. Auch bei den Patienten, die eine VL11-spezifische CTL-Linie generiert
haben, waren die CD4+-Zellzahlen zum Testzeitpunkt signifikant niedriger als bei Patienten
ohne VL11-spezifische T-Zelllinie. Genauso war die Viruslast vor dem Start der Therapie bei
Patienten mit VL11-spezifischer CTL-Linie signifikant höher als bei Patienten ohne eine solche Zelllinie. Patienten mit VHL9-spezifischer Antwort hatten signifikant niedrigere CD4+Zellzahlen zum Testzeitpunkt als Patienten ohne VHL9-spezifische T-Zellantwort. Es zeigt,
dass einige HERV-spezifische CTL-Antworten durchaus mit einer besseren Kontrolle der
HIV-1-Infektion verbunden sein können, während andere HERV-spezifische Antworten keinen Einfluss oder sogar einen negativen Einfluss auf die HIV-1-Infektion haben. Eine Möglichkeit wäre, dass die HERV-Sequenzen durch die HIV-1-Infektion aktiviert werden, wie es
auch schon durch erhöhte Expression von HERV-K in HIV-1-infizierten Patienten gezeigt
134
5. Diskussion
werden konnte [85, 102, 331-334]. Diese erhöhte Expression kann zum einen für einen
Schutz oder eine Kontrolle der HIV-1-Infektion sorgen, z. B. durch die Induktion einer HERVspezifischen T-Zellantwort, welche eine Kontrolle der HIV-1-Infektion vermitteln könnte. Dies
kann z. B. darüber erreicht werden, dass HERV-spezifische Epitope auch auf HIV-1infizierten Zellen präsentiert werden können und somit durch HERV-spezifische T-Zellen
lysiert werden können [103]. Durch HERV-spezifischen T-Zellen, die zusätzlich noch kreuzreaktiv gegenüber HIV-1-spezifischen Epitopen mit ähnlicher Sequenz sind, könnte das Repertoire der T-Zellen, die in der Lage sind die HIV-1-Replikation zu kontrollieren, erweitert
werden. Zum anderen könnte die erhöhte HERV-Expression auch einen negativen Effekt
ausüben. Möglicherweise werden dadurch weitere CD4+ T-Zellen aktiviert und vom Immunsystem eliminiert, was zu einer noch schnelleren Abnahme der CD4+-Zellzahlen führen könnte. Da HIV-1 HERV-Sequenzen in HIV-negativen CD4-Zellen aktivieren kann, könnten
HERV-spezifische CTL HERV-exprimierende, HIV-1-negative CD4-Zellen zerstören und damit zu einer dauerhaften Depletion von CD4-Zellen führen. Somit könnten sowohl die positiven als auch die negativen Effekte der hier beobachteten HERV-spezifischen CTL-Antworten
in HIV-1-infizierten Patienten erklärt werden.
5.6.3
Kreuzreaktion
der
HERV-spezifischen
T-Zellen
gegenüber
HIV-1-
spezifischen RT-Varianten
Die HERV-spezifischen CTL-Linien wurden auch durch Kreuzreaktion mit anderen kürzeren
HERV-spezifischen Peptiden und unterschiedlichen RT-Varianten im IFN-γ-ELISpot analysiert. Bei früheren Untersuchungen konnte eine Kreuzreaktivität der HERV-spezifischen
CTL-Linien ausgeschlossen werden [82, 103]. In meiner Untersuchung konnten keine eindeutigen Ergebnisse für alle HERV-spezifischen Linien hinsichtlich des optimalen Epitops
erzielt werden, da häufig unterschiedliche Peptide erkannt wurden (Tab. 4.20). Nach meinen
Beobachtungen existieren unterschiedliche TCR-Spezifitäten, die jeweils eine andere Reihe
an Peptiden erkennen können. Da die Peptide teilweise sehr lang sind, besteht auch die
Möglichkeit, dass zwei überlappende Epitope in einem dieser Peptide vorkommen, die, wie
das der Fall bei RT-VL9 und RT-YV9 ist, um einige wenige Aminosäuren verschoben sind.
Außerdem wurden nicht alle CTL-Linien mit sämtlichen vorhandenen HERV-spezifischen
Varianten im IFN-γ-ELISpot getestet. Dennoch zeigten bei einigen HERV-spezifischen CTLLinien mehr als 50 % der Zelllinien eine Kreuzreaktion gegenüber dem RT-VL9- oder dem
RT-VL9M/V-Peptid, z. B. die IL12- und KL11-spezifischen CTL-Linien, während hingegen bei
den VHL9- und VL11-spezifischen CTL-Linien nur wenige eine Kreuzreaktion gegenüber
diesen beiden Peptiden zeigten. Dies deutet daraufhin, dass es durchaus HERV-spezifische
HIV-1-kreuzreaktive T-Zellen geben könnte, während andere Zelllinien nur eine Spezifität für
135
5. Diskussion
das jeweilige HERV Epitop haben. Eine interessante Frage wäre, ob es einen Unterschied
beim Phänotyp der HERV-spezifischen kreuzreaktiven T-Zellen im Vergleich zu HIV-1- oder
HERV-spezifischen ohne Kreuzreaktivität gibt. SenGupta et al. konnten zeigen, dass HERVspezifische CD8+ T-Zellen einen weniger aktivierten und differenzierteren Phänotyp aufwiesen als HIV-1-spezifische T-Zellen, wie es beobachtet wurde bei CMV-spezifischen TZellpopulationen [82]. Sowohl HERV-spezifische nicht-kreuzreaktive als auch kreuzreaktive
T-Zellen könnten zu einer besseren Kontrolle der HIV-1-Infektion beitragen indem sie das
Repertoire der CD8+ T-Zellen erweitern und damit eine breitere Immunreaktion gegen aufkommende Virusvarianten induzieren könnten. Außerdem konnte in der Untersuchung von
SenGupta et al. gezeigt werden, dass unter den HERV-spezifischen T-Zellen häufiger polyfunktionale T-Zellen zu finden waren, die zwei Zytokine produzierten, während die HIV-1spezifischen T-Zellantwort durch monofunktionale T-Zellen dominiert wurde [82]. Auch durch
diese Fähigkeit können die HERV-spezifischen T-Zellen zu einer effektiven Immunantwort
gegen HIV-1 beitragen. Diese HERV-spezifischen Epitope können außerdem auch einen
Ansatzpunkt für die Suche und Herstellung eines HIV-1-spezifischen Impfstoffs für einen
immuntherapeutischen Ansatz bieten.
5.7 Erkennung und Kreuzreaktion von XMRV-spezifischen RT-Epitopen
in HIV-1-infizierten Patienten
Ein weiteres Retrovirus wurde in den letzten Jahren entdeckt und vielfach diskutiert. Dabei
handelt es sich um XMRV, einen Virus aus der Familie der γ-Retroviren. Dieses Virus wurde
zuerst in Proben aus Prostatakarzinomen von Patienten, welche die homozygote R462QVariante der RNAseL trugen, entdeckt [272], während dies in anderen Studien nicht bestätigt
werden konnte wurde [273]. Aber es wurde die Abgabe des Virus in verschiedenen Zelllinien,
u. a. in der 22Rv1-Zelllinie, beobachtet [274, 275]. Eine weitere Erkrankung, welche zunächst mit XMRV in Verbindung gebracht wurde, ist CFS (Chronic fatigue syndrome) [276].
Bei CFS handelt es sich um eine Erkrankung mit vielen anormalen Immunfunktionen, deren
Ursache unklar ist. Verschiedene Viren wie z. B. β-Herpesviren wurden als mögliche Verursacher von CFS vermutet [339]. Lombardi et al. konnten in ihrer Studie zeigen, dass in mehr
als 50 % der CFS-Patienten XMRV-DNA detektiert werden konnte [276]. Weitere Studien mit
anderen Kohorten von CFS-Patienten konnten diese Ergebnisse jedoch nicht bestätigen
[277-279]. Danach wurde in einigen Untersuchungen vermutet und z. T. demonstriert, dass
die Detektion von XMRV-DNA möglicherweise auf eine Kontamination mit murinen Viren
zurückzuführen ist [280-282, 285]. Mittlerweile wurde die genaue Herkunft von XMRV geklärt; einige Untersuchungen beruhen vermutlich auf gefälschten Daten, denn XMRV ist
136
5. Diskussion
durch eine Rekombination zweier verschiedener Mäuseviren in einer Krebszelllinie entstanden und wurde durch diese Zelllinie weiter verbreitet [283, 284].
Vor Beginn dieser Diskussion um gefälschte Ergebnisse und kontaminierte Laborprodukte
oder Zelllinien schien XMRV ein interessanter Kandidat für die Suche nach kreuzreaktiven
Epitopen mit HIV-1 zu sein. Eine Sequenzanalyse erbrachte zwei Sequenzabschnitte im Bereich der RT, in denen HIV-1-spezifische Epitope beschrieben wurden. Bei dem einen Bereich handelt es sich um das aktive Zentrum der RT, in dem die überlappenden HLA-A2restringierten RT-VL9- und RT-YV9-Epitope liegen. Das andere Epitop ist auch in der RTSequenz etwas weiter vorne zu finden. Bei diesem Epitop handelt es sich um ein HLA-B35restringiertes Epitop [286, 287].
Insgesamt generierten weniger als 20 % der getesteten HLA-A2-positiven Patienten eine
XM-LL12-spezifische CTL-Linie, genauso wie nur 15 % der HLA-B35-positiven Patienten
eine XM-TF9-spezifische CTL-Linie generierten. Dagegen wurde eine RT-TY9-spezifische
CTL-Linie von deutlich mehr Patienten (35 %) generiert. Damit konnte gezeigt werden, dass
es durchaus zu einer Erkennung von XMRV-spezifischen Epitopen in HIV-1-infizierten Patienten vorkommen kann, wobei diese Erkennung auch aufgrund von HIV-1-spezifischen
kreuzreaktiven T-Zellen vorkommen könnte. Genauso könnte diese Erkennung aufgrund der
Ähnlichkeit mit HERV- und PERV-spezifischen Sequenzen von kreuzreaktiven ERVspezifischen Sequenzen herrühren. Daher wurden die XMRV-spezifischen CTL-Linien hinsichtlich ihrer Kreuzreaktivität zu HIV-1- und HERV-spezifischen Peptiden getestet. Dabei
zeigte sich, dass von den XM-LL12-spezifischen CTL-Linien v. a. die längeren HERVPeptide IL12, TL11 und VL11 erkannt wurden (Tab. 4.23). Weiter eingegrenzt werden konnte
das optimale Peptid durch kürzere Peptide allerdings nicht, da nur selten eins dieser Peptide
erkannt wurde. Am wahrscheinlichsten scheint das VL10-Peptid die optimale Sequenz zu
enthalten, da 50 % der XM-LL12-spezifischen CTL-Linien auch eine Kreuzreaktion gegenüber diesem Peptid zeigten (Tab. 4.23). Da das XM-LL12-Peptid sehr lang ist, besteht außerdem die Möglichkeit, dass ein CD4-spezifisches HLA-Klasse-II-restringiertes Epitop enthalten ist. Allerdings konnten in Untersuchungen mit einem CD8-Blockantikörper gezeigt
werden, dass ein Großteil der XM-LL12-spezifischen CTL-Linien CD8-spezifisch war. Eine
Kreuzreaktion gegenüber dem RT-VL9- oder dem RT-VL9M/V-Peptid war nur bei sehr wenigen XM-LL12-spezifischen CTL-Linien zu sehen (Tab. 4.23). Dies spricht eher dafür, dass
diese Reaktivität gegenüber XMRV nicht von HIV-1-spezifischen kreuzreaktiven T-Zellen
kommt, da auch einige getestete RT-VL9-, RT-VL9M/V- und RT-YV9-spezifische T-Zelllinien
nicht in der Lage waren, das XM-LL12-Peptid zu erkennen.
Auch die RT-TY9- und die XM-TF9-spezifischen CTL-Linien wurden hinsichtlich ihrer Kreuzreaktion gegenüber dem anderen Peptid untersucht. Dabei stellte sich heraus, dass auch
hier nur wenige CTL-Linien in der Lage waren, mit dem anderen Peptid eine Kreuzreaktion
137
5. Diskussion
einzugehen. Möglicherweise spielt eine Kreuzreaktion zwischen diesen beiden Peptiden keine Rolle bei der HIV-1-Infektion.
Da sich auch die Herkunft von XMRV geklärt hat und einige der bisher veröffentlichten Ergebnisse wohl auf Verunreinigungen oder auch Manipulationen der Daten zurückzuführen
sind, ist nicht davon auszugehen, dass XMRV eine Rolle in der Ätiologie der verschiedenen
Erkrankungen spielt, mit denen es in Verbindung gebracht wurde. Deswegen scheint es weniger sinnvoll, die Untersuchungen, inwieweit XMRV eine Rolle in der HIV-1-Erkrankung
spielen kann, weiterzuführen und auszudehnen. Dennoch sind die Untersuchungen des XMLL12-Epitops relevant, da hier eine große Homologie der Sequenz des XM-LL12-Epitops zu
anderen Retroviren, u. a. zu HERV- und PERV-Sequenzen vorliegt. Es ist zu anzunehmen,
dass die beobachteten Reaktionen nicht XMRV-spezifisch waren, sondern durch andere
Retroviren induziert wurden. Dies weist daraufhin, dass endogene Retroviren oder andere,
noch nicht definierte exogene Retroviren, Pol-Proteine in Menschen exprimieren, welche
diese XM-LL12-erkennenden CTL stimulierten.
5.8 Detektion von HIV-1-spezifischen Antikörpern im Serum von
Patienten mit unterschiedlichen Erkrankungen
Zur Feststellung einer HIV-1-Infektion wird eine Untersuchung nach HIV-1-spezifischen Antikörpern im Serum der jeweiligen Person durchgeführt. Dazu dient im ersten Schritt ein ELISA. Anschließend erfolgt die Verifizierung des Ergebnisses im WB [41]. Werden im WB mindestens zwei HIV-1-spezifische Banden detektiert, wird der Test als positiv angesehen. Immer wieder kann es jedoch sowohl beim ELISA als auch beim WB zu falsch positiven und
unklaren Ergebnissen kommen, v. a. bei Personen mit einer Aktivierung des Immunsystems
durch andere Erkrankungen [288-291, 340]. In der Literatur wurde beschrieben, dass Patienten mit verschiedenen Erkrankungen HIV-1-spezifische Antikörper aufweisen, obwohl sie
nicht mit HIV-1 infiziert sind. Einige dieser Erkrankungen wie das Sjögren-Syndrom (SS)
werden auch mit einem Retrovirus als Ursache in Verbindung gebracht [101, 292, 340].
Von Arthur Mortha, einem ehemaligen Mitarbeiter der Arbeitsgruppe, konnte in einem ELISA
ein Peptid aus dem Gag p24 von HIV-1 identifiziert werden, das von Antikörpern von Patienten mit unterschiedlichen Erkrankungen, von einem Patienten mit einer unklaren Autoimmunopathie, erkannt wurde. Es wurde daher vermutet, dass sich in diesem Peptid ein Epitop mit
kreuzreaktivem Potential zu HERV befinden könnte, so dass eine HERV-spezifische Antikörper-Antwort ein falsch positives Ergebnis beim HIV-1-Test bewirken könnte. Sehr ähnliche
Sequenzen wurden tatsächlich auch in verschiedenen HERV-Sequenzen gefunden. Dies
kann die Hypothese unterstützen, dass falsch positive HIV-1-Testergebnisse durch kreuzreaktive Antikörper hervorgerufen werden können. Zur Klärung dieser Hypothese wurde nun
138
5. Diskussion
ein ELISA-Protokoll optimiert, um kreuzreaktive Antikörper detektieren zu können. Außerdem
wurde untersucht, in welchen Krankheitsgruppen solche HIV-1-kreuzreaktiven Antikörper
gefunden werden können. Die Seren von Patienten mit unterschiedlichen Krankheitsbildern
wurden im ELISA auf die Anwesenheit von Antikörpern gegen das p24-Peptid aus dem HIV1-Gag-Protein und ähnliche HERV-Sequenzen untersucht. Viele der untersuchten Seren
zeigten eine positive Reaktion auf das HIV-1-spezifische p24-19-Peptid. Dies ist ein Hinweis
darauf, dass in diesem Bereich ein solches kreuzreaktives Epitop vorhanden sein kann und
bestätigt die früher gewonnen Ergebnisse, bei denen dieses Peptid häufig erkannt wurde.
Nicht nur HIV-1-infizierte Patienten weisen Antikörper gegen dieses Peptid auf, sondern
auch Patienten aus unterschiedlichen Krankheitsgruppen, z. B. SLE, Psoriasis, SS oder Sarkoidose. Die anderen beiden Peptide, p24-18 und p24-20, werden nur in wenigen Ausnahmen erkannt. Eventuell befinden sich in diesen Bereichen weitere Antikörper-Epitope, die
allerdings kein so starkes kreuzreaktives Potenzial aufweisen wie das Epitop, welches in
p24-19 enthalten ist.
Um das optimale Epitop weiter einzugrenzen, wurden weitere ELISA-Untersuchungen mit
kürzeren HIV-1- und HERV-spezifischen Peptiden durchgeführt (Tab. 4.24). Mit 11,9 % wurde das HIV-spezifische TT13-Peptid am häufigsten unter den untersuchten Patienten mit
unterschiedlichen Erkrankungen erkannt. Die beiden HERV-K-spezifischen Peptide IS13 und
FS13 wurden deutlich seltener erkannt (2,1 % und 1,4 %). Sämtliche kürzeren Peptide wurden nur in Ausnahmefällen erkannt (Tab. 4.25 + 4.26). Damit kann man vermuten, dass im
TT13 das optimale Epitop enthalten ist. Da die beiden HERV-K-abgeleiteten Peptide seltener
erkannt werden als das HIV-1-spezifische Epitop, kann man vermuten, dass die kreuzreaktiven Antikörper nicht nur durch diese beiden Epitope induziert wurden. Außerdem sind noch
wesentlich mehr endogene retrovirale Sequenzen im menschlichen Genom enthalten und
somit könnten noch andere Sequenzen vorhanden sein, die als Auslöser für solche kreuzreaktiven Antikörper dienen können. Eine weitere Möglichkeit besteht aber auch darin, dass
bisher unbekannte exogene Retroviren für diese Erkrankungen verantwortlich sind und die
kreuzreaktiven Antikörper von diesen stammen. Zumal bei einigen der hier untersuchten
Krankheitsgruppen wie beim Sjögren-Syndrom ein exogenes Retrovirus als Ursache vermutet wird [101, 292, 340]. Weitere Untersuchungen sind in jedem Fall notwendig, um die Quelle solcher HIV-1-kreuzreaktiver Antikörper zu identifizieren. Der hier etablierte ELISA stellt
dabei ein schnelles und einfaches Testsystem für das Vorhandensein von solchen HIV-1kreuzreaktiven Antikörpern dar.
139
5. Diskussion
5.9 Untersuchung von exponierten seronegativen Personen hinsichtlich
ihrer Reaktivität gegenüber HIV-1
Es konnte festgestellt werden, dass sich manche Personen trotz häufigem Kontakt mit HIV1-infizierten Menschen nicht anstecken. In vielen Studien konnten dabei immer wieder HIV1-spezifische CTL-Antworten in HIV-1-exponierten seronegativen Personen nachgewiesen
werden [209-211, 296-300].
Einen Grund für die Resistenz gegen HIV-1 kann u. a. eine Mutation im CCR5-Gen darstellen. Bei der CCR5Δ32-Mutation wird nur ein verkürztes CCR5-Protein hergestellt, welches
nicht auf der Oberfläche exprimiert wird. Somit fehlt der für die HIV-1-Aufnahme notwendige
Ko-Rezeptor und diese Zellen können nicht infiziert werden [44, 46, 47, 301]. Auch andere
Mutationen und SNP (single nucleotide polymorphism, Einzelnukleotid-Polymorphismus) im
CCR5-Promotor oder im CCR2-Gen können Einfluss auf die Ansteckung mit HIV-1 haben
[45, 341-347]. Da CCR5Δ32-Mutation nur in einem Prozent der Kaukasier und gar nicht in
Afrikanern vorkommt, kann diese Mutation genauso wie andere Mutationen oder Substitutionen nicht immer für die Resistenz gegenüber HIV-1 verantwortlich sein [44-46, 348]. Auch
das Vorhandensein von HIV-1-spezifischen T-Zellen in HIV-1-exponierten seronegativen
Personen kann damit nicht erklärt werden. Eine Hypothese für das Vorhandensein von HIV1-spezifischen CTL in HIV-1-exponierten seronegativen Personen ist, dass der Kontakt mit
HIV-1 selbst eine HIV-1-spezifische Immunantwort induzierte. Durch diese konnte die Etablierung einer Infektion verhindert werden [205, 297]. Eine andere Möglichkeit besteht darin,
dass solche HIV-1-spezifischen T-Zellen durch kreuzreaktive T-Zellen, die durch ein anderes
Pathogen induziert wurden, hervorgebracht wurden. Einige solche kreuzreaktiven Epitope
konnten schon in der Vergangenheit und in dieser Arbeit identifiziert und analysiert werden
[212]. Daher wurden auch exponierte seronegative Personen hinsichtlich einer HIV-1spezifischen Immunantwort und dem Vorhandensein von kreuzreaktiven T-Zellen untersucht.
Eine erste Untersuchung war die Analyse des CCR5-Gens auf das Vorhandensein der
CCR5Δ32-Mutation. Einer der HIV-1-exponierten seronegativen Patienten und 20 % der getesteten HIV-1-negativen Spender waren heterozygot für die CCR5Δ32-Mutation. Dies entspricht den Ergebnissen früherer Studien, in denen gezeigt werden konnte, dass die Frequenz für die heterozygote CCR5Δ32-Mutation bei etwa 20 % liegt [47].
Keiner der getesteten Personen war homozygot für diese Mutation, was darauf zurückgeführt
werden kann, dass die homozygote Deletion nur bei einem Prozent der westlichen Bevölkerung vorkommt [46, 47]. Damit kann ausgeschlossen werden, dass sich die hier untersuchten HIV-1-negativen Personen wegen dem Vorhandensein der homozygoten CCR5Δ32Deletion nicht infiziert hatten.
140
5. Diskussion
In einem nächsten Schritt wurden die aus den HIV-1-exponierten seronegativen Patienten
isolierten PBMC durch Peptidstimulation auf die Erkennung HERV-spezifischer Peptide untersucht. Keines dieser Peptide wurde dabei erkannt. Auch die Analyse von HIV-1spezifischen Peptiden, die für die jeweiligen HLA-Allele der HIV-1-exponierten seronegativen
Patienten beschrieben wurden, brachte nur in seltenen Fällen eine HIV-1-spezifische CTLLinie hervor. Ein HIV-1-exponierter seronegativer Patient generierte jedoch eine RT-VL9spezifische CTL-Linie. Bei der Analyse dieser CTL-Linie konnte keine Kreuzreaktion gegenüber den vorhandenen HERV-spezifischen Peptiden oder anderen HIV-1-spezifischen RTVarianten nachgewiesen werden (Abb. 4.44). Dies deutet darauf hin, dass der Patient eine
HIV-1-spezifische CTL-Antwort induziert hat, nachdem er mit HIV-1 in Kontakt gekommen
war. Eine Übertragung von HIV-1-spezifischen T-Zellen durch den HIV-1-infizierten Partner
kann ausgeschlossen werden, da der Partner kein HLA-A2-Allel trägt und somit keine HLAA2-restringierte CTL-Antwort etabliert. Außerdem besteht auch die Möglichkeit, dass es sich
bei diesen T-Zellen um kreuzreaktive T-Zellen handelt, die durch ein bisher unbekanntes
HERV oder ein anderes unbekanntes Retrovirus verursacht wurden.
Ein weiteres Epitop, das von einem HIV-1-seronegativen exponierten Spender erkannt wurde, war das IV9-Epitop aus Pol. Dieses Epitop ist ein immundominantes HLA-A2restringiertes Epitop, bei dem verschiedene Varianten vorkommen können [239]. Der Spender zeigte eine starke Reaktion gegenüber dem IV9-Peptid sowie gegenüber der IV9 V/AVariante (Abb. 4.45). Diese IV9-spezifische CTL-Linie konnte jedoch nur einmal generiert
werden. Nachdem die HIV-Exposition durch den Partner beendet wurde, konnten in den
nachfolgenden Untersuchungen keine IV9-spezifische T-Zelllinie mehr in diesem Patienten
generiert werden. Dies weist darauf hin, dass die IV9-spezifischen CTL durch HIV-1 selbst
induziert worden war, so dass ihre Frequenz nach Beendigung der Exposition stark abfiel.
Insgesamt konnte in den untersuchten HIV-1-exponierten seronegativen Patienten nur selten
eine HIV-1-spezifische CTL-Antwort detektiert werden, wobei die Analysen der CTL-Antwort
mit einigen ausgewählten Peptiden durchgeführt wurden. Es kann nicht ausgeschlossen
werden, dass in diesen Patienten CTL-Antworten gegen andere HIV-1-spezifische Epitope
vorhanden waren.
141
6. Material und Methoden
6. Material und Methoden
6.1 Material
6.1.1 Verbrauchsmaterial
Tabelle 6.1: Verwendete Verbrauchsmaterialien
Verbrauchmaterial
Herkunft (Firma, Stadt, Land)
1,5 ml Reaktionsgefäße
Sarstedt, Numbrecht
96-well Platten Maxisorp
Nunc A/S, Roskilde, Dänemark
Autoklavierband
VP SteriClin, Feuchtwangen
Combitips plus 12,5; 5; 2,5 und 0,5 ml
Eppendorf, Hamburg
Deckgläser
Menzel GmbH, Braunschweig
e.p. Tips Standard 0,1-10 µl und 0,5-20 µl
Eppendorf, Hamburg
Elektroporationsküvetten 4 mm
BioRad, München
ELISpot Platte Multi screen Filter plates
Millipore, Molsheim, Frankreich
FACS-Röhrchen 5 ml 75 x 12 mm
Sarstedt, Numbrecht
Falcons 50 und 15 ml
BD, Heidelberg
Filter Tips 1000, 200, 100, 20 und 10 µl
Greiner bio-one, Frickenhausen
Gewebekulturschale 20 mm
Greiner bio-one, Frickenhausen
Handschuhe Sensi Care Ice Powderfree Nitrile exam
gloving
Medline, Mundelein, IL, USA
Kryokonservierungsröhrchen 2 ml
Greiner bio-one, Frickenhausen
Maxisorp 8-er Streifen
Nunc A/S, Roskilde, Dänemark
Minisart Filter 0,45 und 0,2 µm
Satorius Stedim Biotech, Göttingen
Multiplate PCR Platte 96-well
BioRad, Hercules, CA, USA
Waldemar Knittel Glasbearbeitung GmbH,
®
Objektträger Star Frost
Braunschweig
®
Omnifix -F Feindosierungsspritzen 1 ml
Braun, Melsungen
Parafilm
Bemis, Neenah, WI, USA
PCR Tube Streifen
Kisker Biotech GmbH, Steinfurt
Petrischale 92 x 16 mm
Sarstedt, Numbrecht
Photometerküvetten
Eppendorf, Hamburg
®
PipetteTip Gilson Style blue/yellow, steril
Greiner bio-one, Frickenhausen
Reaktionsgefäßständer
Nalgene, Rochester, NY, USA
Röhre 13 ml 100 x 16 mm
Sarstedt, Numbrecht
Serologische Pipette 2, 5, 10 und 25 ml
Sarstedt, Numbrecht
Skalpell
Pfm medical AG, Köln
Spritze 10 und 20 ml
BD, Fraga, Spanien
Stericup Filtrationssystem 0,22 µm 180 und 500 ml
Millipore, Billerica, MA, USA
Vernichtungsbeutel
NeoLab, Heidelberg
Zählkammer Neubauer
Brand, Wertheim
142
6. Material und Methoden
Zellkulturflasche 25, 75 und 175 cm
2
Greiner bio-one, Frickenhausen
Zellkulturplatten 96-, 48-, 24-, 12- und 6-well
Greiner bio-one, Frickenhausen
Zellschaber
Greiner bio-one, Frickenhausen
Zellsieb 70 µm
BD, Heidelberg
6.1.2 Laborgeräte
Tabelle 6.2: Verwendete Laborgeräte
Gerät
Herkunft (Firma, Stadt, Land)
- 20 °C Gefrierschrank
Bosch, Gerlingen; Liebherr, Ochsenhausen
- 80 °C Gefrierschrank
National Lab, Mölln; Haereus, Hanau
AID ELISpot-Reader
Autoimmun Diagnostika GmbH (AID), Strassberg
Autoklaviergerät
Webeco, Selmsdorf
Autoklaviergerät HV-85
Hirayama, Saitama, Japan
Betastrahlenzähler
Liquid Scintillation counter, 1205 Betaplate
Perkin Elmer, Rodgau-Jürgesheim
BioPhotometer 6131
Eppendorf, Hamburg
Brutschrank Galaxy 48S
New Brunswick, Enfield, CT, USA
Brutschrank Hera Cell
Heraeus, Hanau
Durchflusszytometer EPICS XL-MCL
Beckman Coulter, Krefeld
Durchflusszytometer FacsCalibur
BD Bioscience Pharmingen, San Diego, CA, USA
Elektrorührer Variomag
H+P Labortechnik GmbH, Oberschleißheim
ELISA Reader SpectraMax 190
Molecular Devices, Sunnyvale, CA, USA
ELISA-Washer
Tecan, Männedorf, Schweiz
Geldokumentationssystem
Dark Hood DH-50
Geldokumentationssystem
MultiImage light cabinet
Biostep GmbH, Jahnsdorf
Alpha Innotech Cooperation, Randburg, Südafrika
Gelkammer Agagel Mini
Biometra, Göttingen
Gelkammer E-H2 (H2-03-2001)
Febikon Labortechnik GmbH, Wermelskirchen
Gelkammer LKB GNA200
Pharmacia, Freiburg
Genetic Analyzer 3130
Applied Biosystems by life technologies, Darmstadt
Alpha Laboratories, Eastleigh
Heizblock
Hampshire, UK
Heizthermomixer
Inkubationsschüttler
®
CERTOMAT BS-T
Biotech, Bovenden
B. Braun Biotech International GmbH, Melsungen
Klicker
Eppendorf, Hamburg
Kühlschrank
Bosch, Gerlingen; Gorenje, München; Privileg,
143
6. Material und Methoden
Stuttgart; Liebherr, Ochsenhausen
®
Lab Dancer
IKA JK, Staufen
Mikroskop (Auflicht)
Carl Zeiss, Oberkochen
Minifuge Caspule HF-120
Tomy Seiko, Tokio, Japan
®
Minifuge Rotilabo
Carl Roth, Karlsruhe
PCR-Maschine UnoThermoblock
Biometra, Göttingen
PCR-Maschine MyCycler™ thermal cycler
BioRad, München
pH-Meter Checker
®
Pipetboy
®
Hanna Instruments, Woonsocket, USA
IBS Integra Bioscience, Fernwald
Eppendorf, Hamburg; Gilson, Middelton, WI, USA;
Pipetten
Süd-Laborbedarf GmbH, Gauting
Spannungsgerät GPS 200/400
Pharmacia LKB, Freiburg
Spannungsgerät PowerPAC 300
BioRad, München
Spourt Minizentrifuge
Biozym Scientific GmbH, Hessisch Oldendorf
Spülmaschine
Miele, Gütersloh
Sterilbank
Heraeus, Hanau
TQ-Prep Workstation
Beckman Coulter , Krefeld
UV-Tisch
MultiImage™ Light Cabinet
®
Biozym, Oldendorf
Vortexer
Neolab, Heidelberg
Vortexer MS1 Minishaker
IKA JK, Staufen
VXR basic Vibrax
®
®
®
IKA JK, Staufen
Waage EMB 600-2
Kern, Balingen
Wärmeschrank
Heraeus, Hanau
Wasserbad
Memmert, Schwabach
Zentrifuge 5415D
Eppendorf, Hamburg
Zentrifuge Biofuge 25 RS
Haereus, Hanau
Zentrifuge Rotanta 460R
Hettich, Tuttlingen
Zentrifuge Rotina
Hettich, Tuttlingen
Zentrifuge Rotixa IRP
Hettich, Tuttlingen
Zentrifuge Varifuge GL
Hettich, Tuttlingen
6.1.3 Chemikalien
Tabelle 6.3: Verwendete Chemikalien
Chemikalien
Herkunft (Firma, Stadt, Land)
2-Mercaptoethanol
Sigma-Aldrich, Steinheim
2-Propanol
Merck, Darmstadt
3-(N-Morpholino)-Propansulfonsäure (MOPS)
Merck, Darmstadt
3-Amino-9-Ethyl-Carbazole (AEC)
Sigma-Aldrich, Steinheim
144
6. Material und Methoden
Agarose
Carl Roth, Karlsruhe
Albumin Fraktion V (BSA)
Carl Roth, Karlsruhe
Ampicillin
Carl Roth, Karlsruhe
Bacto-Yeast-Extrakt
AG Stürzl
Bis-trimethylsilylacetamid (BSA) (10x)
NEB, Frankfurt a.M.
Borsäure
Merck, Darmstadt
Calciumchlorid (CaCl2)
Merck, Darmstadt
Chloroform
Merck, Darmstadt
51
Chrom-51 ( Cr)
Hartmann Analytik GmbH, Braunschweig
Cycloheximid
Sigma-Aldrich, Steinheim
Di-Butanol
Merck, Darmstadt
Diethanolamin (DEA)
AG Voll
Diethylpyrocarbonat (DEPC)
Carl Roth, Karlsruhe
Dimetyhlsulfoxid (DMSO)
Merck, Darmstadt
Dithiothreitol (DTT)
Sigma-Aldrich, Steinheim
DMSO (Dimethylsulfoxid) (für PCR)
Invitrogen, Karlsruhe
dNTP-Mix (dATP, dCTP, dGTP, dCTP)
Pan Biotech GmbH, Aidenbach
je 100 mM
Essigsäure
Merck, Darmstadt
Ethanol 96 %
Merck, Darmstadt
Ethidiumbromid
Merck, Darmstadt
Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA)
Merck, Darmstadt
Facs Clean
BD Bioscience, San Jose, CA, USA
Facs Rinse
BD Bioscience, San Jose, CA, USA
Fugene6 Transfektionsreagenz
Roche Diagnostics GmbH, Penzberg
FugeneHD Transfektionsreagenz
Roche Diagnostics GmbH, Penzberg
®
Geneticin (G418)
Carl Roth, Karlsruhe
Glucose D+
Merck, Darmstadt
Glycerol
Sigma-Aldrich, Steinheim
Glycerin
Carl Roth, Karlsruhe
Isoton
Beckman Coulter, Krefeld
Kaliumacetat
AG Herrmann
Kaliumchlorid (KCl)
Merck, Darmstadt
Kanamycin
Gibco by life technology, Darmstadt
LB-Agar
Carl Roth, Karlsruhe
LB-Medium
Carl Roth, Karlsruhe
Leucoagglutinin (PHA-L)
Sigma-Aldrich, Steinheim
Luminol
Carl Roth, Karlsruhe
Magnesiumchlorid (MgCl2)
Merck, Darmstadt
Magnesiumchlorid-Hexahydrat
Merck, Darmstadt
145
6. Material und Methoden
Manganchlorid (MnCl2)
Sigma und AG Voll
Methanol
Merck, Darmstadt
N,N-Dimethylformamid (DMF)
Merck, Darmstadt
Natriumacetat
Merck, Darmstadt
Natriumacetat-Trihydrat
Merck, Darmstadt
Natriumazid (NaN3)
Merck, Darmstadt
Natriumchlorid (NaCl)
Merck, Darmstadt
Natriumhydroxid (NaOH)
Carl Roth, Karlsruhe
Natriumlaurylsulfat (Natriumdodecylsulfat, SDS)
Carl Roth, Karlsruhe
NEB-Puffer 1-4 (10x)
NEB, Frankfurt a.M.
Nitrophenylsulfat (NPS)
AG Herrmann
Oligo-dT-Primer
Biomers.net, Ulm
Paraformaldehyd (PFA)
Carl Roth, Karlsruhe
Pfu-Puffer (10x)
Genaxxon GmbH, Ulm
Phenol
Amresco, Solon, OH USA
Phenol-Chloroform-Isoamylalkohol (25:24:1)
Amresco, Solon, OH USA
Propidiumiodid (PI)
Sigma-Aldrich, Steinheim
Proteinase K
Merck, Darmstadt
Puffer S (10x)
Genaxxon GmbH, Ulm
Puromycin Dihydrochlorid
Sigma-Aldrich, Steinheim
RNA Loading Dye
NEB, Frankfurt a.M.
RNasin Plus
Promega, Madison, USA
SAP-Dephosphorylierungspuffer (10x)
Roche, Mannheim
Saponin
Sigma-Aldrich, Steinheim
SOB-Medium
Carl Roth, Karlsruhe
ssRNA Ladder Loading Puffer (2x)
NEB, Frankfurt a.M.
T4-Ligase Puffer (10x)
NEB, Frankfurt a.M.
Tris(hydroxymethyl)aminomethan
Carl Roth, Karlsruhe
Triton X 100
Merck, Darmstadt
Trizol
Gibco, Darmstadt
Trypanblau
Merck, Darmstadt
Tryptophan-Pepton
AG Stürzl
Tween-20 (Polysorbat 20)
Merck, Darmstadt
Wasserstoffperoxid (H2O2)
Merck, Darmstadt
X-tremeGENE9
Roche Diagnostics GmbH, Penzberg
X-treneGENEHP
Roche Diagnostics GmbH, Penzberg
146
6. Material und Methoden
6.1.4 Zellkulturmedien und Zusätze
Tabelle 6.4: Verwendete Zellkulturmedien und deren Zusätze
Zellkulturmedium/Zusatz
Herkunft (Firma, Stadt, Land)
2-(4-(2-Hydroxyethyl)-1-
Merck, Darmstadt
piperazinyl)ethansulfonsäure (HEPES)
DMEM
Gibco by life technology, Darmstadt
DPBS (Phosphat-buffer saline)
Gibco by life technology, Darmstadt
FCS SeraPlus
Pan biotech GmbH, Aidenbach
Ficoll-Hypaque
BioRad, Dreireich
Hanks-Lösung
Uni-Apotheke, Erlangen
Humanes Serum
Sigma-Aldrich, Steinheim
Interleukin-2 (IL-2)
Proleukin, Chiron, LA, USA
L-Glutamin
Merck, Darmstadt
®
Opti-MEM
Gibco by life technology, Darmstadt
Penicillin/Strepamycin
Gibco by life technology, Darmstadt
RPMI 1640
Gibco by life technology, Darmstadt
6.1.5 Antikörper und Dextramere
Tabelle 6.5: Verwendete Antikörper und Dextramere
Antikörper und Dextramere
Herkunft (Firma, Stadt, Land)
Anti-CD4
Acris GmbH, Herford
Anti-human IFNγ mAb7-B6-1-Biotin
Mabtech, Stockholm, Schweden
CD19-FITC
Beckman Coulter, Marseille, Frankreich
CD19-PE
Beckman Coulter, Marseille, Frankreich
CD4-FITC
Beckman Coulter, Marseille, Frankreich
CD4-PE
Beckman Coulter, Marseille, Frankreich
CD8 Pure
BD Bioscience, San Jose, CA, USA
CD8-FITC
Beckman Coulter, Marseille, Frankreich
CD8-PE
Beckman Coulter, Marseille, Frankreich
Goat anti-human IgG-AP Antikörper
Southern Biotech, Birmingham, AL, USA
Goat anti-mouse HRP
Dako, Glostrup, Dänemark
Goat anti-Mouse IgG-FITC human Antikörper
Southern Biotech, Birmingham, AL, USA
HLA-A2-GILGFVFTL-Dextramer
Immudex, Kopenhagen, Dänemark
HLA-A2,A28 IgG2a-FITC
One-Lambda, Canoga Park, CA, USA
HLA-A2-SLYNTVATL-Dextramer
Immudex, Kopenhagen, Dänemark
IgG1(Mouse)-FITC
Beckman Coulter, Marseille, Frankreich
IgG1(Mouse)-PE
Beckman Coulter, Marseille, Frankreich
IgG1-FITC
Beckman Coulter, Marseille, Frankreich
IgG1-PE
Beckman Coulter, Marseille, Frankreich
147
6. Material und Methoden
IgG2a-FITC
Beckman Coulter, Marseille, Frankreich
mAb-1-D1K
Mabtech, Stockholm, Schweden
Monoklonaler Flag M2 Antikörper IgG1
Sigma-Aldrich, Steinheim
PE Rat anti-Mouse IgG1 Antikörper
BD Bioscience, San Jose, CA, USA
6.1.6 Kommerziell erhältliche Kits
Tabelle 6.6: Verwendete Kits
Kommerzielle Kits
Herkunft (Firma, Stadt, Land)
®
Avidin/Peroxidase Substrat Vectastain ABC-Kit
Linaris, Wertheim
IFNγ Secretion assay Detection Kit
Macs Milteny Biotec, Bergisch Gladbach
TM
Imagen
Chlamydia
Oxoid, Ely, UK
Invitrogen Pure Link
TM
PCR Purification Kit
Invitrogen, Darmstadt
Invitrogen Pure Link
TM
Quick Gel Extraction Kit
Invitrogen, Darmstadt
Invitrogen Pure Link
TM
Quick Plasmid Miniprep
Invitrogen, Darmstadt
mMASSAGE mMASCHINE T7 Ultra Kit
Ambion, Austin, Texas, USA
®
NucleoBond PC500
Machery-Nagel, Düren
®
NucleoSpin Blood Quick Pure
Machery-Nagel, Düren
®
NucleoSpin Extract II
Machery-Nagel, Düren
PCR Clean up + Gel Extraction
®
NucleoSpin RNA II
Machery-Nagel, Düren
6.1.7 Enzyme
Tabelle 6.7: Verwendete Enzyme
Enzyme
Herkunft (Firma, Stadt, Land)
Advantage 2 Polymerase
BD Heidelberg
Pfu-Polymerase (2,5U/µl)
Genaxxon, Ulm
Restriktionsenzyme
BamHI/EcoRI/XbaI/XhoI/BglII/NotI/SpeI/AflII/EagI/HindIII/PstI
NEB, Frankfurt am Main
SAP (Shrimp Alkaline Phosphatase) (10U/µl)
Roche, Grenzach-Wyhlen
SuperScript II Reverse Transcriptase
Invitrogen, Darmstadt
T4 DNA Ligase (20.000 Units)
NEB, Frankfurt am Main
Taq-Polymerase (5U/µl)
Genaxxon, Ulm
6.1.8 Peptide
Die meisten Peptide wurden synthetisch als C-terminale Carboxsamide von EMC
microcollections in Tübingen hergestellt. Einige weitere Peptide, die verwendet wurden, wurden vom NIH AIDS Research and Reference Reagent Program sowie vom AIDS Reagent
Project of the Medical Research Council (MRC, Herts, UK) zur Verfügung gestellt.
148
6. Material und Methoden
6.1.9 Längenstandards
Tabelle 6.8: Verwendete Längenstandards
Längenstandard
Herkunft (Firma, Stadt, Land)
DNA Standard 1 kb, 100 bp, Low Molecular Weight
NEB, Frankfurt
DNA Standard ROX500
Ecoli s.r.o., Bratislava, Slowakei
applied biosystems by Life technology,
GeneScan™ 400HD ROX™ DNA Standard
Darmstadt
6.1.10 Vektoren
Tabelle 6.9: Verwendete Vektoren
Verwendete Vektoren
Herkunft (Firma, Stadt, Land)
pBabe
S. Müller-Schmucker Med.3 Erlangen
pcDNA3
Invitrogen, Darmstadt
pDrive Cloning Vector
Qiagen, Hilden
pEGFP-C1
BD, Heidelberg
pGEM4Z-5`UTR-sig-hu-Survivin-DClamp-3`UTR
C. Hofmann Dermatologie Erlangen
6.1.11 Bakterien, Zellen und Zelllinien
Tabelle 6.10: Verwendete Bakterienstämme
Bakterien
Herkunft (Firma, Stadt, Land)
Chlamydophila pneumoniae
Dr. Kern Universitätsklinikum Salzburg, Österreich
E. coli XL-1 Blue
Stratagene, La Jolla, USA
E. coli XL-1 Gold
Stratagene, La Jolla, USA
Tabelle 6.11: Verwendete Zelllinien
Zelllinien/Zellen
Medium
EBV-transformierte lymphoide
Herkunft (Firma, Stadt, Land)
R20
HIV-positive/ -negative Spender
HEK 293
D10
NIH AIDS Reagent Program, Bethesda, USA
HEK 293T
D10
NIH AIDS Reagent Program, Bethesda, USA
HEp2
D10
Dr. Kern Universitätsklinikum Salzburg, Österreich
PBMC
Leu
HIV-positive/ -negative Spender
Peptid-spezifische T-Zelllinien
R10/IL2
HIV-positive/ -negative Spender
T2-M1-Zellen
R20
B-Zelllinien (B-LCL)
149
6. Material und Methoden
6.1.12 Zellkulturmedien
6.1.12.1 Medien für primäre Zellen und Zelllinien
Tabelle 6.12: Verwendete Zellkulturmedien und deren Zusammensetzung
Medium
Zusammensetzung
DMEM
D10-Medium
Penicillin (100 U/ml), Streptomycin (100 µg/ml) 1 % (v/v)
*
Fötales Kälberserum hitzeinaktiviert (FCS) 10 % (v/v)
*
Einfriermedium (EFM)
40 ml Fötales Kälberserum hitzeinaktiviert (FCS) 20% (v/v)
10 ml DMSO
35 g Hepespulver in 100 ml Ampuva
HEPES-Lösung
pH-Wert auf 7,0 einstellen
steril filtrieren, in 5 ml Aliquots abfüllen (bei - 20°C wegfrieren)
RPMI1640
*
Leu-Medium
Humanes AB Serum hitzeinaktiviert 1 % (v/v)
L-Glutamin 200 mM (2mmol/l) 1% (v/v)
Penicillin (100 U/ml), Streptomycin (100 µg/ml) 1 % (v/v)
RPMI 1640
*
Fötales Kälberserum hitzeinaktiviert (FCS) 10% (v/v)
R10-Medium
L-Glutamin 200 mM 1% (v/v)
Penicillin (100 U/ml), Streptomycin (100 µg/ml) 1 % (v/v)
1 M HEPES-Puffer 1% (v/v)
RPMI 1640
*
Fötales Kälberserum hitzeinaktiviert (FCS) 10% (v/v)
R10/IL2-Medium
L-Glutamin 200 mM (2mmol/l) 1% (v/v)
Penicillin (100 U/ml), Streptomycin (100 µg/ml) 1 % (v/v)
1 M HEPES-Puffer 1% (v/v)
Interleukin-2 (IL-2) 10 U/ml
RPMI
*
Fötales Kälberserum hitzeinaktiviert (FCS) 20% (v/v)
R20-Medium
L-Glutamin 200 mM 1% (v/v)
Penicillin (100 U/ml), Streptomycin (100 µg/ml) 1 % (v/v)
1 M HEPES-Puffer 1% (v/v)
RPMI 1640
*
R5AB-Medium
Humanes AB Serum hitzeinaktiviert 5% (v/v)
L-Glutamin 200 mM 1% (v/v)
Penicillin (100 U/ml), Streptomycin (100 µg/ml) 1 % (v/v)
*
Die Inaktivierung des FCS und des humanen AB Serums wurde für 30 Min. bei 56 °C
durchgeführt.
150
6. Material und Methoden
6.1.12.2 Puffer für Zellkulturverfahren
Tabelle 6.13: Verwendete Puffer und deren Zusammensetzung
Puffer
Zusammensetzung
Lsg. A: 13,6 g Natriumacetat-Trihydrat auf 500 ml Wasser
Acetat-Puffer
Lsg. B: 5,75 ml 100 % Essigsäure auf 500 ml Wasser
Lsg. A + Lsg. B 1:1
MACS-Puffer
500 ml DPBS
0,5 % BSA (25 ml 10% BSA)
500 ml DPBS
Permeabilisierungspuffer
1 % BSA (50 ml 10 % BSA)
3 % Saponin
500 ml DPBS
Sekretionstestpuffer
0,5 % BSA (25 ml 10 % BSA)
2 mM EDTA
6.1.13 Medien und Puffer für molekularbiologische Methoden
6.1.13.1 Medien
Tabelle 6.14: Verwendete Medien für die Kultivierung von Bakterien und deren Zusammensetzung
Medium
Zusammensetzung
LB-Medium (nach Lennox)
20 g auf 1 l Wasser
LB-Agar (nach Lennox)
35 g auf 1 l Wasser
36 mg Glucose (20 mM)
SOC-Medium
307 mg SOB-Medium
auf 10 ml Wasser
2 % Trypton-Pepton
Tym-Broth-Medium
0,5 % Bacto-Yeast-Extrakt
0,1 M NaCl
0,01 M MgCl2 oder MgSO4
6.1.13.2 Puffer
Tabelle 6.15: Verwendete Puffer und deren Zusammensetzung
Puffer
Zusammensetzung
MOPS 41,8 g
700 ml RNase freies H2O
10x MOPS Puffer für RNA-Gele
Mit 2 M NaOH auf pH 7 einstellen und lösen lassen
1 M Natriumacetat 20 ml
0,5 M EDTA (pH 8,0) 20 ml
auf 1 l Wasser auffüllen und steril filtrieren
151
6. Material und Methoden
7,5 g EDTA
55 g Borsäure
10x TBE-Laufpuffer
108 g Tris
auf 1 l Wasser
DPBS
1,5 mM MgCl2 x 6H2O
Anti-p24/HERV-Elisa Substrat-Puffer
0,1 M Diethanolamin
1 mg/ml Nitrophenylsulfat immer frisch zugeben
(0,02 % NaN3)
50 mM Tris pH 7,5
Mini-Lösung 1
10 mM EDTA
100 µg/ml RNAse A
1 % SDS
Mini-Lösung 2
0,2 M NaOH
Mini-Lösung 3
1,32 M Kaliumacetat pH 4,8
0,03 M Kaliumacetat
0,05 M MnCl2
TfbI
0,01 M CaCl2
15 % (w/v) Glycerol
0,1 M KCl
0,01 M Natrium MOPS, pH 7
75 mM CaCl2
TfbII
15 % (w/v) Glycerol
0,01 M KCl
6.1.14 Oligonukleotidprimer
Tabelle 6.16: Verwendete Oligonukleotidprimer und deren Verwendung
Name und RichSequenz (5´- 3´) und Schnittstelle
Verwendung
tung
5’64T-Primer
CGATAAAAGCTCCGGGGATAACAGATTTTTTTTTTTTTTTTTTTT
TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTVN-3’
(V= A,C,G; N=A,C,G,T)
ADV14s1_TRAV382/DV8 XbaI
AV12S1_TRAV19
XbaI
AV14S2_TRAV38-1
XbaI
AV15S1_TRAV5
cDNA Synthese,
TCRIdentifizierung
5’-GACTCTAGATGGCATGCCCTGGCTTCCTG-3’
Klonierung
5’-GACTCTAGATGCTGACTGCCAGCCTGT-3’
Klonierung
5’-GACTCTAGATGACACGAGTTAGCTTG-3’
Klonierung
5’-GACTCTAGATGAAGACATTTGCTGGATTTTCG-3’
Klonierung
152
6. Material und Methoden
XbaI
AV16S1-TRAV3 XbaI
5’-GACTCTAGATGGCCTCTGCACCCATC-3’
Klonierung
5’-GACTCTAGATGCTCCTGTTGCTCATACC-3’
Klonierung
5’-GACTCTAGATGCTCCTGCTGCTCGTC-3’
Klonierung
5’-GACTCTAGATGAACTATTCTCCAGGCT-3’
Klonierung
5’-GACTCTAGATGGAGACCCTCTTGGGC-3’
Klonierung
5’-GACTCTAGATGCTCCTTGAACATTTATTA-3’
Klonierung
5’-GACTCTAGATGGAGACTGTTCTGCAAGTAC-3’
Klonierung
5’-GACTCTAGATGATGAAATCCTTGAGAGTTTT-3’
Klonierung
5’-GACTCTAGATGATGATATCCTTGAGAGTTT-3’
Klonierung
5’-GACTCTAGATGTTGGAGTGTGCATTCATA-3’
Klonierung
5’-GACTCTAGATGCTACTCATCACATCAATGTTG-3’
Klonierung
5’-GACTCTAGATGACATCCATTCGAGCTGTATT-3’
Klonierung
5’-GACTCTAGATGGCAGGCATTCGAGCTTT-3’
Klonierung
BC-TCR-r-FAM
5’-AGATCTCTGCTTCTGATGGCT-3’
Spectratyping
BGH-R
5’-CCTCGACTGTGCCTTCTA-3’
Sequenzierung
BV12_TRBV10
5’-CAAAGACAGAGGATTTCCTCCTC-3’
Spectratyping
BV12_TRBV10 XbaI
5’-GACTCTAGATGGGCACAAGGTTGTTCTT-3’
Klonierung
BV13_TRBV6
5’-GTCGGCTGCTCCCTCCC-3’
Spectratyping
BV15_TRBV24_1
5’-CTCGACAGGCACAGGCTAAA-3’
Spectratyping
BV16_TRBV14 XbaI
5’-GACTCTAGATGGTTTCCAGGCTTCTCAGTTTAGTG-3’
Klonierung
BV16-TRBV14
5’-GAACTGGAGGATTGTGGAGTT-3’
Spectratyping
5’-GACTCTAGATGAGCAACCAGGTGCTCT-3’
Klonierung
BV1S1_TRBV9 XbaI
5’-GACTCTAGATGGGCTTCAGGCTCCTCT-3’
Klonierung
BV20_TRBV30
5’-CACACCCCAGGACCGGCAG-3’
Spectratyping
BV20_TRBV30 XbaI
5’-GACTCTAGATGCTCTGCTCTCTCCTTGCCC-3’
Klonierung
BV21_TRBV11
5’-GGCTCAAAGGAGTAGACTCC-3’
Spectratyping
5’-GACTCTAGATGAGCACCAGGCTTCTCT-3’
Klonierung
5’-GACTCTAGATGGGCACCAGGCTCCTCTGC-3’
Klonierung
BV22_TRBV2
5’-GTTGAAAGGCCTGATGGATC-3’
Spectratyping
BV22_TRBV2 XbaI
5’-GACTCTAGATGGATACCTGGCTCGTATGCTG-3’
Klonierung
AV1S1_TRAV8-1
XbaI
AV1S2_TRAV8-2/-4/6 XbaI
AV22S1-TRAV9-2
XbaI
AV23S1_TRAV21
XbaI
AV25s1_TRAV35
XbaI
AV26_TRAV34 XbaI
AV2S1_TRAV12-2
XbaI
AV2S3_TRBV12-1
Xba
AV30S1_TRBV20
XbaI
AV32_TRAV25 XbaI
AV8S1_TRAV13-1
XbaI
AV8S2_TRAV13-2
XbaI
BV17S1-TRVB19
XbaI
BV21s1_TRBV11-1
XbaI
BV21S3_TRBV11
XbaI
153
6. Material und Methoden
BV23_TRBV13
5’-GCAGGGTCCAGGTCAGGACCCCCA-3’
Spectratyping
BV25_TRBV16
5’-TTGATGAAACAGGTATGCCC-3’
Spectratyping
BV26_TRBV17_1
5’-CCAGTACCAAAACATTGCAGT-3’
Spectratyping
5’-GACTCTAGATGCTGCTGCTTCTGCTGCTT-3’
Klonierung
5’-GACTCTAGATGCTGAGTCTTCTGCTC-3’
Klonierung
BV5_TRBV5 XbaI
5’-GACTCTAGATGGGCCCCGGGCTCCTC-3’
Klonierung
BV5_TRBV5-3/-4
5’-CTCGGCCCTGTATCTCTGTG-3’
Spectratyping
5’-GACTCTAGATGGGCTCCAGGCTGCTCTGTT-3’
Klonierung
5’-GACTCTAGATGGGACCCAGGCTCCTC-3’
Klonierung
5’-GATCCAGCGCACACAGC-3’
Spectratyping
5’-GACTCTAGATGGGCACCAGGCTCCTCTG-3’
Klonierung
5’-GACTCTAGATGGGCACCAGCCTCCTCTG-3’
Klonierung
BV7_TRBV4
5’-CCTGAATGCCCCAACAGC-3’
Spectratyping
BV7_TRBV4 XbaI
5’-GACTCTAGATGGGCTGCAGGCTGCTCTG-3’
Klonierung
BV8_TRBV12
5’-CCAGCCCTCAGAACCCAG-3’
Spectratyping
BV9_TRBV3
5’-GGAGCTTGGTGACTCTGCTG-3’
Spectratyping
Calpha near var
5’-TTTAGAGTCTCTCAGCTGGTACACGG-3’
Sequenzierung
Cbeta near var
5’-TTCCCATTCACCCACCAGCTCAG-3’
Sequenzierung
Calpha 3’UTR-XhoI
5’-CTCTCGAGCATCTTGCAGATCTCAGCTGGACCACA-3’
Klonierung
Calpha3’UTR
5’-CTGTCTTACAATCTTGCAGATC-3’
BV2S1_TRBV20
XbaI
BV4S1_TRBV29
XbaI
BV5s1_TRBV5-1
XbaI
BV5s4_TRBV5-8
XbaI
BV-6_TRBV7
BV6s2_TRBV7-8
XbaI
BV6s4_TRBV7-9
XbaI
Capswitch-Block
Primer
Identifizierung
cDNA Synthese,
5’-AAGCAGTGGTAACAACGCAGAGTACGCGG-3’
TCRIdentifizierung
5’Capswitch Primer
TCR-
TTATACGACTCACTATAGGGAGGAAGCAGTGGTAACAACGCAG
AGT-3’
TCRIdentifizierung
Cbeta const1 a
5’-CAAACACAGCGACCTCGGGTG-3’
Cbeta1 3’UTR
5’-CCACTTCCAGGGCTGCCTTC-3’
Cbeta2 3’UTR
5’-TGACCTGGGATGGTTTTGGAGCTA-3’
CCR5 3`982
5’-TCAGGAGAAGGACAATGTTG-3’
Amplifikation
CCR5 5´760
5’-CTGCAGCTCTCATTTTCC-3’
Amplifikation
Gemsig seqa
5’-GTAAAGTGTAAGTTGGTATTATGTA-3’
Sequenzierung
HCbeta1-XhoIEcoRI
HCbeta2-XhoIEcoRI
5’-GGAATTCCTCGAGGGATCCCTGCCTTCAGAAATCCTTTCTC3’
5’-GGAATTCCTCGAGGGATCGCTAGCCTCTGGAATCCTTTCTC-
154
Sequenzierung
TCRIdentifizierung
TCRIdentifizierung
Klonierung
Klonierung
6. Material und Methoden
3’
pBabe 3
5’-GGAATGTGTGTCAGTTAGGGT-3’
Sequenzierung
pBabe5
5’-CTTTATCCAGCCCTCAC-3’
Sequenzierung
PBP2 BamHI1885s
5’-GGCGGATCCAGGTATCCTACACCTTATGTAGATT-3’
Klonierung
PBP2 seq.4a
5’-GTGAGAAATAAGAGGCAGACAGAAC-3’
Sequenzierung
PBP2 seq.4s
5’-CTCTATTAGGCAAATATCCCATCTC-3’
Sequenzierung
PBP2-4BglIIs
5’-GCCAGATCTAAACGACCGAAAAAATTTCCTATTTATC-3’
Klonierung
5’PBP2-Not-1
ACTTGCGGCCGCACCATGAAACGACCGAAAAAATTTCCTATTTA
Klonierung
TC-3’
PBP2-Seq1a
5’-CTGTAGTTCGTCGTCATTATCCTCA-3’
Sequenzierung
PBP2-Seq1s
5’-GATTGGCCTGGATTGCATGTAG-3’
Sequenzierung
PBP2-Seq2a
5’-CATGGCTTCTTCTCCCCGTTATC-3’
Sequenzierung
PBP2-Seq2s
5’-GCGTTAGATCCTAATAACGGAGAG-3’
Sequenzierung
PBP2-Seq3a
5’-CTTAGGCTGATTGTAGATCCAGAG-3’
Sequenzierung
PBP2-Seq3s
5’-GCGAATTACGATAAAATCTTGTATACGG-3’
Sequenzierung
PBP2-Seq5a
5’-CTTTGCAGACAGCAGTGATGTTAG-3’
Sequenzierung
PBP2-Seq5s
5’-CGATTGGACAGCATACTCTTGTTG-3’
Sequenzierung
PBP2-seq-rev282a
5’-CAATACACGAATGGCCCCATAAG-3’
Sequenzierung
PBP2-Xba-3273
5’-CAATCTAGACTATCCCCTTCCCCCCGATTCTCTTTG-3’
Klonierung
pEGFP-C1 seq a
5’-CCTCCCCCTGAACCTGAAACATAAAATG-3’
Sequenzierung
pEGFP-C1 seq s
5’-CCCTGAGCAAAGACCCCAACGAGAAGCGCG-3’
Sequenzierung
pGEM4Z3 seq a
5’-GTTTAGTGGTAACCAGATCCTA-3’
Sequenzierung
pGem4Z4seq M3
5’-GTAAAGTGTAAGTTGGTATTATGTA-3’
Sequenzierung
SMARTarg
5’-AAGCAGTGGTAACAACGCAGAGTACG-3’
T7s
5’-TAATACGACTCACTATAGGG-3’
Sequenzierung
TCRAC-5-Fam
5’-GCAGACAGACTTGTCACTGG-3’
Spectratyping
TCRalpha-mur-EagI
5’-ATCGGCCGGGTCAGGGTTCTGG-3’
Klonierung
TCRbeta-mur-AflII
5’-TATATCTTAAGTCCTCTACAACTGTGAG-3’
Klonierung
TRAV18_1
5’-GCTCAGGACTTGTGATCTTG-3’
Spectratyping
TRAV7_1
5’-CGGAGACCTGTCCTAATTATA-3’
Spectratyping
VA10_TRAV27
5’-AATTCTCCGTGTCCATTCTTTGGA-3’
Spectratyping
VA11_TRAV2
5’-AGAAAGCAAGGACCAAGTGTT-3’
Spectratyping
VA12-TRAV19
5’-CAGAAGGTAACTCAAGCGCAGACT-3’
Spectratyping
VA13_TRAV22
5’-TTCATCAAAACCCTTGGGGACAGC-3’
Spectratyping
VA14_TRAV38
5’-CCCAGCAGGCAGATGATTCTCGTT-3’
Spectratyping
VA15_TRAV5
5’-CAGAGTCTTTTCCTGAGTGTCCGAG-3’
Spectratyping
VA16_TRAV3
5’-GAGTGGGCTGAGAGCTCAGTCAGTG-3’
Spectratyping
VA17_TRAV23
5’-GCTTATGAGAACACTGCGT-3’
Spectratyping
VA18_TRAV24
5’-GCAGCTTCCCTTCCAGCAAT-3’
Spectratyping
VA19_TRAV41
5’-AGAACCTGACTGCCCAGGAA-3’
Spectratyping
5’-TCCACCTGACGAAACCCTCA-3’
Spectratyping
VA1A_TRAV8-2/-4/6/-7
155
TCRIdentifizierung
6. Material und Methoden
VA1B_TRAV8-1/-3
5’-CTGAGGAAACCCTCTGTGCA-3’
Spectratyping
VA2_TRAV12
5’-GATGGAAGGTTTACAGCACAGCTC-3’
Spectratyping
VA20_TRAV4
5’-CATCTCCATGGACTCATATGA-3’
Spectratyping
VA21_TRAV29
5’-GACTATACTAACAGCATGT-3’
Spectratyping
VA22_TRAV9
5’-CTTGGAGAAAGGCTCAGTTC-3’
Spectratyping
VA23_TRAV21
5’-TGCCTCGCTGGATAAATCATCAGG-3’
Spectratyping
VA24_TRAV10
5’-GATCATCCTGGAGGGAAAGA-3’
Spectratyping
VA25_TRAV35
5’-GTCCTGTCCTCTTGATAGCC-3’
Spectratyping
VA26_TRAV34
5’-TCAGTCCTTGATCGTCCAAG-3’
Spectratyping
VA27_TRAV39
5’-TCTGTTCCTGAGCATGCAGG-3’
Spectratyping
VA28_TRAV36
5’-GAACATCACAGCCACCCAGACCGG-3’
Spectratyping
VA29_TRAV30
5’-TCAAGCCGTGATCCTCCGAG-3’
Spectratyping
VA3_TRAV17
5’-GGTGAACAGTCAACAGGGAGA-3’
Spectratyping
VA30_TRAV20
5’-TTTCTGCACAGCACAGCCCC-3’
Spectratyping
VA31_TRAV40
5’-AGCAAAAACTTCGGAGGCGG-3’
Spectratyping
VA32_TRAV25
5’-AAGGAGAGGACTTCACCACG-3’
Spectratyping
VA4_TRAV26-1/-2
5’-AAGACAGAAAGTCCAGTACCTTGATCCTGC-3’
Spectratyping
VA5_TRAV6
5’-TGAAGGTCACCTTTGATACCACCC-3’
Spectratyping
VA6_TRAV14
5’-GTCACTTTCTAGCCTGCTGA-3’
Spectratyping
VA7_TRAV1
5’-AACTGCACGTACCAGACATC-3’
Spectratyping
VA8_TRAV13
5’-ACCCTGAGTGTCCAGGAGGG-3’
Spectratyping
VA9_TRAV16
5’-ATCTCAGTGCTTGTGATAATA-3’
Spectratyping
VB1_TRBV9
5’-AAGAGAGAGCAAAAGGAAACATTCTTGAAC-3’
Spectratyping
VB10_TRBV21
5’-CTTATTCAGAAAGCAGAAATAATCAATGAG-3’
Spectratyping
VB11_TRBV25
5’-TCCACAGAGAAGGGAGATCTTTCCTCTGAG-3’
Spectratyping
VB14_TRBV27
5’-GTGACTGATAAGGGAGATGTTCCTGAAGGG-3’
Spectratyping
VB17_TRBV19
5’-ATAGCTGAAGGGTACAGCGTCTCTCGGGAG-3’
Spectratyping
VB18_TRBV18
5’-CATCTGTCTTCTGGGGGCAGGTCTCTCAAA-3’
Spectratyping
VB19_TRBV23
5’-GCACAAGAAGCGATTCTCATCTCAATGCCC-3’
Spectratyping
VB2_TRBV20
5’-GCTCCAAGGCCACATACGAGCAAGGCGTCG-3’
Spectratyping
VB24_TRBV15
5’-GATTTTAACAATGAAGCAGA-3’
Spectratyping
VB3_TRBV28
5’-AAAATGAAAGAAAAAGGAGATATTCCTGAG-3’
Spectratyping
VB4_TRBV29
5’-CTGAGGCCACATATGAGAGTGGATTTGTCA-3’
Spectratyping
VB5.1+_TRBV5
5’-CAGAGAAACAAAGGAAACTTCCCTGGTCGA-3’
Spectratyping
VB5b+_TRBV5
5’-TTCCCTAACTATAGCTCTGAGCTG-3’
Spectratyping
6.1.15 Patienten
An den hier durchgeführten Untersuchungen nahmen insgesamt 212 HIV-1-infizierte Patienten aus der Ambulanz der Medizinischen Klinik III des Universitätskrankenhauses in Erlangen teil. Die Studien wurden durch die Ethik-Kommission der Medizinischen Fakultät der
Universität Erlangen-Nürnberg überprüft und die Teilnehmer gaben ihre Einverständniserklärung.
156
6. Material und Methoden
Die Viruslasten und CD4+ T-Zellzahlen wurden routinemäßig regelmäßig bei allen Patienten
erhoben. Die Ermittlung der Viruslast erfolgte im Institut für Klinische und Molekulare Virologie Erlangen. Die CD4+ T-Zellzahlen wurden im zellulären Routinelabor der Medizinischen
Klinik 3 bestimmt.
6.2 Methoden
6.2.1 Molekularbiologische Methoden
6.2.1.1 Oligonukleotide
Die Oligonukleotide wurden von der Firma biomers.net GmbH als lyophilisiertes Pulver geliefert und in sterilem, RNase-freiem Wasser gelöst. Die Stocklösungen hatten eine Konzentration von 1 µg/µl bzw. 100 pmol/µl (TCR-Primer) und wurden für die PCR-Reaktionen in einer
1:10 Verdünnung verwendet, sodass die Arbeitslösungen eine Konzentration von 100 ng/µl
bzw. 10 µM (10 pmol/µl; TCR-Primer) aufwiesen. Die Stocklösungen sowie die Verdünnungen wurden bei - 20 °C gelagert.
6.2.1.2 Herstellung von cDNA (Reverse Transkription)
Bei der Reversen Transkription wird aus einer beliebigen RNA-Sequenz eine komplementäre
DNA-Sequenz (complementary DNA, cDNA) synthetisiert. Diese cDNA kann anschließend
als Matrize für eine PCR dienen. Der cDNA-Synthese Schritt wird benötigt, wenn zelluläre
RNA wie die TCR-RNA amplifiziert werden soll.
Die stimulierten CTL-Linien wurden zur Amplifizierung und Identifizierung der TCR-Ketten
entweder mit Dextrameren (SL9 bzw. IMP-GL9/HLA-A2-Dextramer, Immudex) oder einem
IFNγ-Sekretionskit (Miltenyi) markiert und über ein Durchflusszytometer (Aria II, BD) in der
Dermatologie des Universitätsklinikums sortiert. Anschließend wurde die RNA der Zellen mit
Hilfe des NucleoSpin® RNA II Kits von Machery-Nagel nach Anleitung isoliert. Die Umschreibung der RNA in cDNA erfolgte anschließend mit der Reversen Transkriptase Superscript II
von Invitrogen.
Dazu wurden zwei verschiedene Programme verwendet:
Programm 1:
1 µl 64T-Primer
1 µl Capswitch-Block-Primer
5 µl RNA
2 Min. 72 °C
2 µl 5x First-Strand-Puffer (bzw. 98,5 µl 5x FSP + 1,5 µl MgCl2)
1 µl DTT (100 mM)
1 µl 10mM dNTP (each)
157
6. Material und Methoden
1 µl RT Superscript II
1 h 42 °C
Programm 2:
2 µl Oligo-dt
2 µl 10 mM dNTP (each)
23,5 µl RNA + H2O
5 Min. 65 °C
+ 8 µl 5x First Strand-Puffer
+ 2 µl 0,1 M DTT
+ 0,25 µl RNAsin
2 Min. 42°C
+ 2 µl RT Superscript II
50 Min. 42 °C und 15 Min. 72 °C
6.2.1.3 Polymerase-Ketten-Reaktion (PCR)
Mehrschritt-PCR zur Amplifikation der cDNA (TCR-Protokoll 1)
·
1. PCR:
39 µl H2O
5 µl 10x Advantage PCR-Puffer
2 µl 64T Primer
1 µl 10 mM dNTP (each)
1 µl cDNA
1 µl Capswitch Primer
1 µl Advantage 2 Polymerase
PCR-Programm:
60 Sek.
95 °C
5 Sek.
95 °C
5 Sek.
65 °C
6 Min.
68 °C
∞
4°C
·
20x
2. PCR
α-Kette
5 µl cDNA Verdünnung 1:10 bis 1:1.000
5 µl 10x Advantage 2 PCR Puffer
4 µl 2,5 mM dNTP (each)
4 µl SMARTarg
2 µl Cα3’UTR
158
6. Material und Methoden
36 µl H2O
1 µl Advantage 2 Polymerase
PCR-Programm:
5 Min.
95 °C
30 Sek.
95 °C
45 Sek.
62 °C
1 Min. 30 Sek.
72 °C
∞
4 °C
30x
β-Kette
2 µl cDNA Verdünnung 1:10 bis 1:1.000
5 µl 10x Advantage 2 PCR Puffer
1 µl 2,5 mM dNTP (each)
4 µl SMARTarg
2 µl Cb1 3’UTR 63.5 °C
2 µl Cb2 3’UTR ne
34 µl H2O
1 µl Advantage 2 Polymerase
PCR-Programm:
5 Min.
95 °C
30 Sek.
95 °C
45 Sek.
63 °C
1 Min. 30 Sek.
72 °C
∞
4°C
30x
Spectratyping-PCR
2,5 µl 10x Pfu-Puffer
2 µl 2,5 mM dNTP (each)
1 µl FAM antisense Primer 1:10
17,4 µl H2O
0,1 µl Pfu-Polymerase
1 µl cDNA
Programm
5 Min.
95 °C
1 Min.
94 °C
1 Min.
55 °C
2 Min.
72 °C
5 Min.
72 °C
35x
159
6. Material und Methoden
∞
12 °C
PCR zur Klonierung der TCR-Ketten
10 µl 5x Phusion-Puffer
4 µl 2,5 mM dNTP (each)
30,75 µl H2O
2 µl Primer sense
2 µl Primer antisense
1 µl cDNA
0,25 µl Phusion-Polymerase
PCR Programm:
5 Min.
95 °C
30 Sek.
95 °C
45 Sek.
65 °C
1 Min.30 Sek.
72 °C
∞
12 °C
35x
Kolonie-PCR
0,2 µl Primer sense
0,2 µl Primer antisense
1 µl 10x Puffer S
0,25 µl 50 mM MgCl2
1 µl 2,5 mM dNTP (each)
6,25 µl H2O
Jeweils eine Kolonie auf LB-Amp.-Masterplatte mit einem Zahnstocher ausstreichen und zu
10 µl Mix geben.
PCR-Programm:
1 Min.
94 °C
30 Sek.
94 °C
30 Sek.
58 °C
1 Min.
68 °C
10 Min.
68 °C
∞
12°C
35x
CCR5-PCR
2,5 µl 10x Puffer S
1 µl 2,5 mM dNTP (each)
160
6. Material und Methoden
0,75 µl 50 mM MgCl2
1 µl CCR5 760s Primer
1 µl CCR5 982as Primer
16,7 µl H2O
0,2 µl Taq-Polymerase
2 µl DNA
PCR-Programm:
2 Min.
94 °C
20 Sek.
94 °C
50 Sek.
56 °C
1 Min.
72 °C
10 Min.
72 °C
∞
12 °C
35x
PCR zur Klonierung des PBP2-Fragments
4 µl 2,5 mM dNTP (each)
5 µl 10x Pfu-Puffer
0,1 µl Pfu-Polymerase
36-38 µl H2O
1 µl Primer sense
1 µl Primer antisense
1-3 µl DNA
PCR-Programm:
10 Min.
94 °C
30 Sek.
94 °C
30 Sek.
65 °C
30 Sek.
72 °C
10 Min.
72 °C
∞
12 °C
35x
PCR zur Klonierung des gesamten PBP2-Gens
4 µl 2,5 mM dNTP (each)
5 µl 10x Pfu-Puffer
0,4 µl DMSO
34,1 µl H2O
2 µl Primer sense
2 µl Primer antisense
161
6. Material und Methoden
0,1 µl Pfu-Polymerase
2 µl DNA
PCR-Programm:
2 Min.
94 °C
20 Sek.
94 °C
1 Min.
55 °C
4 Min.
72 °C
20 Sek.
94 °C
1 Min.
55 °C + 20 Sek. pro Zyklus
4 Min.
72 °C
10 Min.
72 °C
∞
12°C
10x
20x
Sequenzierung
Für die Sequenzierreaktion wurde folgender Master Mix verwendet
0,5 µl BigDye
0,5 µl Primer
1,75 µl 5x Sequenzierpuffer
x µl DNA
auf 10 µl mit RNAse freiem H2O auffüllen
PCR-Programm:
1 Min.
96 °C
10 Sek.
96 °C
10 Sek.
50 °C
4 Min.
60 °C
∞
12 °C
30x
6.2.1.4 Spectratyping
Zur Analyse der TCR-Ketten wurden die PCR-Proben, welche im Agarosegel eine Bande
zeigten, durch Spectratyping im 3130 Genetic Analyzer untersucht. Dazu wurde die PCRProbe jeweils mit Wasser in einer 96-well PCR-Platte verdünnt, um ein Endvolumen von 2025 µl zu erhalten. Außerdem wurden 0,3 µl ROX400 Standard bzw. 0,25 µl ROX500 Standard zugegeben. ROX (X-Rhodamin) ist ein Farbstoff, der rot fluoresziert und ein Adsorptionsmaximum von 574 nm hat. Die Primer der konstanten α- und β-Kette waren mit 6-FAM
(Fluorescein) markiert. Dies ist ein gelber Farbstoff, der blaues Licht (Absorptionsmaximum
485 nm) absorbiert und blaugrünes Licht abstrahlt (515 nm). Durch die beiden unterschiedlichen Farben lassen sich bei der Auswertung die Peaks der Proben sehr gut vom Standard
162
6. Material und Methoden
unterscheiden. Danach wurden die Proben für 3 Min. bei 95 °C gekocht, abzentrifugiert und
in den Sequenzer zur Analyse gestellt. Die Auswertung erfolgte anschließend in GenMapper
IDV3.2 Programm.
6.2.1.5 Klonierungsmethoden
Kultivierung der Bakterien
Eine Kolonie der Bakterienkultur wurde in 5 ml LB-Medium mit 100 µg/ml Ampicillin inokuliert
und über Nacht bei 37 °C unter Schütteln inkubiert. Bei Bakterien mit einem Plasmid, das
Kanamycin-Resistenz enthält, wurde als Antibiotikum 50 µg/ml Kanamycin dem LB-Medium
zugefügt.
Aufreinigung des PCR-Produktes
Die Aufreinigung des PCR-Produktes erfolgte in der Regel durch die Extraktion aus dem
Agarosegel. Dazu wurde die Bande aus dem Gel ausgeschnitten und mit dem Kit
NucleoSpin® Extract II nach dem Protokoll in der Anleitung isoliert. Das aufgereinigte PCRProdukt wurde abschließend in Wasser eluiert. Wurde das PCR-Produkt ohne Auftrennung
über ein Agarosegel isoliert, wurde das gleiche Kit gemäß Anleitung befolgt und das PCRProdukt wurde auch in Wasser eluiert.
Restriktionsenzymverdau von DNA
Um die DNA mit verschiedenen Restriktionsenzymen zu spalten, wurden jeweils die folgenden Mengen verwendet:
10 µl Ansatz:
1 µl 10x NEB-Puffer
0,5 µl Restriktionsenzym 1
0,5 µl Restriktionsenzym 2
1 µl BSA 1:10 verdünnt
x µl DNA
Mit RNAse freiem Wasser auf 10 µl auffüllen.
Der Verdau erfolgte für 1-2 Stunden bei 37 °C.
Dephosphorylierung des Klonierungsvektors
Um zu verhindern, dass der geschnittene Vektor bei der Ligation ohne das Insert wieder zusammengefügt wird, wurden die Enden des Vektors dephosphoryliert. Dafür wurde die DNA,
welche mit Restriktionsenzymen verdaut wurde, für 15 Min. 65 °C inkubiert, um die Restriktionsenzyme zu inaktivieren. Anschließend wurde zu einem 10 µl Ansatz 1 µl 10x SAP163
6. Material und Methoden
Dephosphorylierungspuffer sowie 1 µl alkalische Phosphatase Shrimp zugegeben und für 10
Min. bei 37 °C inkubiert. Die Phosphatase wurde für 15 Min. bei 65 °C inaktiviert.
DNA-Gelelektrophorese
Für die DNA-Gelelektrophorese wurden 1-1,5 % Agarosegele verwendet. Als Laufpuffer und
als Puffer für die Agarosegele diente der wurde 1x TBE-Puffer.
Je nach Größe der Fragmente wurden 0,5 µg der DNA Längenstandards 1 kb, 100 bp oder
Low molecular weight von NEB verwendet, welche eine Konzentration von 0,1 µg/µl hatten.
Zu den Proben wurde jeweils 3-5 µl 5x Ladepuffer zugegeben und anschließend auf das Gel
aufgetragen. Die Gele wurden bei 70-140 V für 1-2 Stunden zur Auftrennung laufen gelassen, je nachdem wie groß die einzelnen Fragmente waren, die aufgetrennt werden sollten.
DNA-Extraktion aus Agarosegelen
Zur DNA-Extraktion aus Gelen wurde das Kit NucleoSpin® Extract II von Machery-Nagel
verwendet. Die Aufreinigung erfolgte nach dem Protokoll des Kits. Eluiert wurde die DNA
abschließend in Wasser.
Ligation von DNA-Fragmenten
Zur Ligation von DNA-Fragmenten in einen Klonierungsvektor wurde ein Ansatz mit einem
Gesamtvolumen von 20 µl verwendet. Dabei wurden jeweils 2 µl 10x T4-DNA-Ligase-Puffer
und 1 µl T4-DNA-Ligase zu dem Vektor und dem Insert zugegeben und gegebenenfalls wurde das Volumen auf 20 µl mit Wasser aufgefüllt. Die Ligation erfolgte für 1-2 Stunden bei
Raumtemperatur oder für 12-14 Stunden bei 15 °C.
Chemische Transformation von Bakterien
Für die Transformation wurde zunächst für jeden Ligationsansatz 900 µl SOC-Medium auf
42 °C erhitzt. Es wurden anschließend 50 µl kompetente Bakterien (XL Blue oder XL Gold)
mit 3 µl Ligationsansatz vorsichtig gemischt und 30 Min. auf Eis inkubiert. Danach erfolgte
der Hitzeschock für 40 Sek. bei 42 °C. Nach 2 Min. auf Eis wurde der Probe das vorgewärmte SOC-Medium zugegeben und für 1 Stunde bei 37 °C unter Schütteln inkubiert. Die Zellen
wurden anschließend abzentrifugiert, der Überstand verworfen, das Pellet im Rücklauf resuspendiert und auf LB-Platten mit 100 µg/ml Ampicillin bzw. 50 µg/ml Kanamycin ausplattiert. Die Platten wurden über Nacht bei 37 °C inkubiert.
Einfrieren von Bakterien
Für die Einfrierstocks wurde 1 ml der Bakterienkultur mit 1 ml Glycerin in einem
Kryokonservierungsröhrchen gemischt und bei - 80 °C eingefroren.
164
6. Material und Methoden
Maxipräparation und Minipräparation
Maxipräparation
400 ml LB-Medium mit 100 µg/ml Ampicillin wurden mit dem Bakterienstock inokuliert und
über Nacht bei 37 °C unter Schütteln inkubiert.
Die Plasmid-DNA-Isolation aus den Bakterien erfolgte mit dem Kit NucleoBond® PC500 von
Machery-Nagel nach Anleitung. Die Zentrifugationsschritte wurden allerdings bei 4.000 Upm
statt bei 15.000 Upm durchgeführt. Dementsprechend wurde die Zeit der Zentrifugation vervierfacht. Am Ende wurde die getrocknete Plasmid-DNA in 200 µl Wasser eluiert und die
Konzentration photometrisch bestimmt.
Maxipräparation Quick and Dirty
250 ml LB-Medium mit 100 mg/ml Ampicillin wurden mit dem Bakterienstock inokuliert und
über Nacht bei 37 °C unter Schütteln inkubiert.
Die Bakterienkultur wurde bei 3.000 Upm und 4 °C für 10 Min. abzentrifugiert und der Überstand verworfen. Anschließend wurde das Pellet in 12 ml Mini-Lösung 1 resuspendiert. Danach erfolgte die Zugabe von 12 ml Mini-Lösung 2 und es wurde durch Invertieren gemischt.
Nach einer Inkubationszeit von 2-3 Min. wurden 12 ml Mini-Lösung 3 zugegeben, durch Invertieren gemischt und 5 Min. auf Eis inkubiert. Es folgte eine Zentrifugation von 15 Min. bei
3.000 Upm und 4 °C. Der Überstand wurde durch Filterpapier gefiltert und pro 5 ml Lysat
wurden 3,5 ml Isopropanol zugegeben, gemischt und für 1 Stunde bei 4.000 Upm und 4 °C
zentrifugiert. Der Überstand wurde verworfen und das Pellet zweimal mit je 10 ml kaltem
70 % Ethanol gewaschen. Anschließend wurde das Pellet getrocknet und in 200-300 µl
Wasser eluiert. Die Konzentration wurde photometrisch bestimmt.
Minipräparation Quick and Dirty
Eine Bakterienkultur wurde in 5 ml LB-Medium mit einer Konzentration von 100 µg/ml Ampicillin inokuliert und über Nacht bei 37 °C unter Schütteln inkubiert. Die Bakterienkultur wurde
bei 3.000 Upm abzentrifugiert, der Überstand wurde verworfen und das Zellpellet wurde in
250 µl Mini-Lösung 1 aufgenommen. Danach erfolgte die Zugabe von 250 µl Mini-Lösung 2
und die Probe wurde durch Schütteln gemischt. Nach Zugabe von 250 µl Mini-Lösung 3 und
anschließendem Mischen wurde die Probe für 5 Min. bei 4 °C inkubiert. Danach wurde bei
13.000 Upm zentrifugiert und der Überstand wurde in ein neues Eppendorfgefäß überführt.
450 µl Isopropanol wurden der Probe zur Fällung der DNA zugegeben. Nach einer weiteren
Zentrifugation von 15 Min. bei 13.000 Upm wurde der Überstand verworfen und das Pellet
mit 1 ml 70 % Ethanol gewaschen und für 5 Min. bei 13.000 Upm zentrifugiert. Der Überstand wurde abschließend verworfen und das Pellet getrocknet. Anschließend wurde das
Pellet in 30-50 µl Wasser gelöst.
165
6. Material und Methoden
6.2.1.6 Herstellung von mRNA
Linearisierung von Plasmid-DNA
Zur Linearisierung der Plasmid-DNA wurde ein 200 µl Ansatz verwendet, der folgendermaßen zusammengesetzt war:
100 µg Plasmid-DNA
20 µl 10x NEB-Puffer
2 µl 100-fach BSA
10 µl Enzym (10units/µl)
Mit RNAse freiem Wasser auf 200 µl Endvolumen auffüllen
Der Ansatz wurde zusammen pipettiert und nach Mischen über Nacht bei 37 °C verdaut.
Aufreinigung linearisierter Plasmid-DNA
Zu dem 200 µl Ansatz wurden 200 µl Phenol: Chloroform: Isoamylalkohol (25:24:1) zugegeben, die Probe wurde 1 Min. durch Vortexen gemischt, anschließend noch kräftig geschüttelt
und 2 Min. bei 22.000 Upm und 4 °C zentrifugiert. Die obere Phase wurde nach der Zentrifugation vorsichtig abgenommen, in ein neues Reaktionsgefäß überführt und es wurde 1x Volumen Chloroform: Isoamylalkohol (24:1) zugegeben, wiederum 1 Min. durch Vortexen und
Schütteln gemischt und 2 Min. bei 22.000 Upm zentrifugiert. Wieder wurde die obere Phase
vorsichtig abgenommen und in ein neues Reaktionsgefäß überführt. Zur Fällung der DNA
wurde nun 0,1x Volumen 3 M Kaliumacetat Lösung (pH 5,6) und 2,5x Volumen Ethanol absolut zugegeben. Nach 2 Min. Vortexen und kräftigem Schütteln wurde die Probe zur Fällung
der DNA für mindestens 1 Stunde bei - 20 °C inkubiert. Danach wurde die Probe für 30 Min.
bei 22.000 Upm und 4 °C zentrifugiert und der Überstand wurde verworfen. Das DNA-Pellet
wurde zweimal mit jeweils 500 µl 70 % Ethanol gewaschen und bei 22.000 Upm und 4 °C 15
Min. zentrifugiert. Abschließend wurde das Pellet einmal mit 500 µl Ethanol absolut gewaschen und bei 22.000 Upm und 4 °C 5 Min. zentrifugiert. Nach dem Trocknen wurde das
Pellet in 33 µl RNAse freiem Wasser aufgenommen und die Konzentration der linearisierten
DNA photometrisch bestimmt. Durch ein Agarosegel wurde die Linearisierung der DNA
überprüft. Zu diesem Zweck wurde eine 1:10-1:20-fache Verdünnung der unverdauten DNA
und der linearisierten DNA auf ein 1-1,5 %iges Agarosegel aufgetragen und für 2 Stunden
bei 120 V und anschließend eine Stunde bei 100 V zur Auftrennung laufen gelassen.
in-vitro-Transkription
Für die in-vitro-Transkription zur Herstellung der mRNA wurde das Kit mMASSAGE
mMASCHINE T7 Ultra Kit von Ambion verwendet. Das Protokoll wurde gemäß der Anordnung im Kit durchgeführt. Für einen Ansatz mit 1 µg linearisierter Plasmid-DNA wurde folgender Ansatz verwendet:
166
6. Material und Methoden
1 µg Plasmid-DNA
10 µl 2x NTP/ARCA
2 µl T7 10x Rxn-Puffer
2 µl Enzym-Mix
Mit RNAse freiem H2O auf 20 µl Endvolumen auffüllen
Nach dem Mischen wurde die Probe für 2 Stunden bei 37 °C inkubiert. Wurde eine größere
Menge an Plasmid-DNA verwendet, z. B. 2,5 µg Plasmid-DNA, wurden die Reagenzien des
Kits und das Endvolumen entsprechend erhöht und die Probe wurde für 3 Stunden bei 37 °C
inkubiert.
Danach erfolgte die Zugabe von 1 µl Turbo-DNAse und die Inkubation von 30 Min. bei 37 °C.
Proben mit einem größeren Volumen wurden für 1,5 Stunden bei 37 °C mit der
enstprechenden Menge Turbo-DNAse inkubiert.
Anschließend wurde der Poly-A-Schwanz angefügt. Dafür wurden bei einem Ansatz mit 1 µg
Plasmid-DNA folgende Mengen zugegeben:
36 µl nukleasefreies H2O
20 µl 5x E-PAP-Puffer
10 µl 25 mM MnCl2
10 µl ATP-Solution
Diese Probe wurde gemischt und ein 2,5 µl Aliquot wurde für die Gelkontrolle abgenommen.
Danach wurden 4 µl E-PAP zur Probe gegeben und 1 Stunde bei 37 °C inkubiert. Bei größeren Ansätzen wurde dementsprechend mehr der Reagenzien zugegeben, die Menge des
Aliquots und die Zeit blieben gleich.
Die Aufreinigung der so hergestellten mRNA wurde mit dem Kit PureLink mRNA Mini-Kit von
Invitrogen by Ambion life technology nach Protokollangaben für flüssige Proben durchgeführt. Die mRNA wurde in 33 µl Wasser aufgenommen und die Konzentration wurde photometrisch bestimmt.
RNA-Gel
Zur Kontrolle der mRNA wurde ein 1 %iges RNA-Gel hergestellt. Dafür wurden 50 ml 1x
MOPS-Puffer mit 0,5 g Agarose aufgekocht und 5 µl Ethidiumbromid zugegeben. Das Ethidiumbromid interkaliert innerhalb von RNA und DNA und macht sie so unter UV-Licht sichtbar. 1x MOPS-Puffer wurde auch als Laufpuffer verwendet.
Die Proben wurden folgendermaßen vorbereitet:
Das Volumen der Proben wurde auf 5 µl mit Wasser aufgefüllt und es wurden 5 µl Formaldehyd-Ladepuffer aus dem mMASSAGE mMASCHINE T7 Ultra Kit zugeben. Als Marker wurden 3 µl des ssRNA-Ladder mit 3 µl des Sample Puffers gemischt.
167
6. Material und Methoden
Anschließend wurden die Proben und der Marker für 2 Min. auf Eis inkubiert. Nach 3 Min.
Inkubation bei 95 °C folgte ein weiterer Inkubationsschritt für 2 Min. auf Eis. Nun wurden die
Proben auf das RNA-Agarosegel aufgetragen und für eine Stunde bei 100 V aufgetrennt.
6.2.1.7 Herstellung kompetenter Bakterien
Eine Vorkultur wurde in 5 ml Tym-Broth-Medium inokuliert und über Nacht bei 37 °C unter
Schütteln inkubiert. Diese wurde am nächsten Tag zu 250 ml Tym-Broth-Medium gegeben
und bei 37 °C unter Schütteln inkubiert bis eine OD600 (optische Dichte) von 0,5-0,6 erreicht
wurde. Die Bakterienkultur wurde auf Eis gestellt und bei 3.000 Upm 5 Min. bei 4 °C abzentrifugiert. Der Überstand wurde verworfen. Pro 100 ml Bakterienkultur wurden 30 ml TfbIPuffer zum Pellet zugegeben und vorsichtig resuspendiert. Anschließend wurde für mindestens 90 Min. auf Eis inkubiert und 5 Min. bei 4 °C und 3.000 Upm zentrifugiert. Der Überstand wurde wieder verworfen und pro 100 ml Bakterienkultur wurden 4 ml TfbII-Puffer zugegeben. Auf Eis wurden Aliquots (à 200 µl) aufgeteilt und in flüssigem Stickstoff schockgefroren. Somit konnten die Bakterien bei - 80 °C aufbewahrt werden.
6.2.1.8 Konzentrationsbestimmung von Nukleinsäuren
Da die Basen der Nukleinsäuren ultraviolettes Licht bei einem Absorptionsmaximum von 260
nm absorbieren können, kann man die Konzentration von Nukleinsäuren mit Hilfe eines Photometers, das Licht dieser Wellenlänge ausstrahlt, bestimmen. Die Nukleinsäurelösungen
wurden hierfür normalerweise 1:50 mit Wasser verdünnt und in einer Küvette wurde am Photometer die OD gemessen und gleichzeitig die Konzentration errechnet.
6.2.2 Zellbiologische Methoden
6.2.2.1 Kultivierung von Zellen
Die Zellen wurden bei einer Temperatur von 37 °C, einem CO2-Gehalt von 7 % und einer
relativen Luftfeuchtigkeit von 80 % kultiviert. Diese wurden in ihrem jeweiligen Medium (Tabelle 6.11) in Zellkulturflaschen, Platten oder in multi-well Platten bei 37 °C in einem Brutschrank kultiviert. Um ein besseres Wachstum zu gewährleisten, wurden die Zellkulturflaschen der adhärenten Zellen liegend und die der Suspensionszellen stehend inkubiert. Einbis zweimal pro Woche wurden die Suspensionszellen mit frischem Medium versorgt und die
adhärenten Zellen wurden zwei- bis dreimal in der Woche gesplittet (1:5 oder 1:10).
6.2.2.2 Zentrifugation
Beim Arbeiten in der Zellkultur wurden sämtliche Zentrifugationsschritte in der Rotanta 460R
oder der Rotixa IRP durchgeführt. PBMC, T-Zellen und B-Zellen wurden bei 1.600 Upm für
10 Min. bei Raumtemperatur und maximaler Beschleunigung und Abbremsung zentrifugiert.
168
6. Material und Methoden
Bei den Elektroporationsversuchen wurden die PBMC bei 1.000 Upm und die B-Zellen bei
900 Upm zentrifugiert.
6.2.2.3 Zählen von Zellen
Die Zellen wurden in einer Neubauer Zählkammer gezählt. Für die Zählung wurden 10 µl der
Zellsuspension entnommen und mit 90 µl einer 0,1 %igen Tryphanblau-Lösung vermischt.
Aus dieser Mischung wurden 10 µl auf die Zählkammer gegeben. Von den vier Großquadraten wurden mindestens zwei gezählt. Die Anzahl der Zellen wurde mit folgender Rechnung
ermittelt: (Gezählte Zellen/Anzahl gezählter Quadranten) x 10 (Vorverdünnung) x 104 = Zellen/ml
6.2.2.4 HLA-Typisierung
Die HLA-Typisierungen wurden vom HLA-Labor durchgeführt. Dafür wurde die DNADiagnostik rSSO-A/-B/-C/-DQ/-DR/-DP von der Firma One Lambda (Canoga Park, CA, USA)
verwendet.
6.2.2.5 Kryokonservierung von Zellen
Die Zellsuspension wurde abzentrifugiert und der Überstand verworfen. Das Zellpellet wurde
in 500 µl R10 resuspendiert, in ein Kryokonservierungsröhrchen überführt und für 10 Min. bei
4 °C inkubiert. Anschließend wurden vorsichtig 500 µl EFM zugegeben und die Röhrchen mit
den Zellen wurden für 24 Stunden in einer mit Isopropanol gefüllten Kryokonservierungsbox
bei - 80 °C inkubiert, wodurch ein langsames und somit schonenderes Einfrieren gewährleistet ist. Die gefrorenen Zellen wurden dann in den Aufbewahrungsboxen in den - 80 °C Gefrierschränken aufbewahrt.
6.2.2.6 Auftauen von Zellen
Die eingefrorenen Zellen wurden vorsichtig in 10 ml PBS gelöst, abzentrifugiert und das Pellet wurde einmal mit 10 ml PBS gewaschen. Anschließend wurden die Zellen in entsprechendem Medium aufgenommen und kultiviert. Handelte es sich bei den aufgetauten Zellen
um CTL-Linien, mussten diese nach dem Auftauen restimuliert werden (siehe 6.2.2.10).
6.2.2.7 Lösen von Peptiden
Für die Stocklösungen wurden die Peptide in DMSO mit einer Konzentration von 20 mg/ml
gelöst. Für die 2 mg/ml Verdünnungen wurden für 1 ml folgende Mengen verwendet:
100 µl Peptidstocklösung 20 mg/ml
10 µl DTT
890 µl H2O
169
6. Material und Methoden
Weitere Peptid-Verdünnungen wurden aus der 2 mg/ml Lösung durch Verdünnung mit PBS
hergestellt.
6.2.2.8 Zellselektion
Dichtegrad-Zentrifugation durch Verwendung von Lymphoflot
Die PBMC wurden aus dem Vollblut der Spender über eine Auftrennung mit Hilfe einer Dichtegrad-Zentrifugation mit dem Reagenz Lymphoflot isoliert und von den Erythrozyten und
anderen Blutbestandteilen getrennt. Dazu wurden 10-30 ml Blut mit Hanks-Lösung gemischt
und auf ein Volumen von 35 ml eingestellt. Anschließend wurden 15 ml Lymphoflot mit dem
Blutgemisch vorsichtig überschichtet und für 10 Min. bei 1.920 Upm ohne Abbremsung zentrifugiert. Durch diese Zentrifugation kommt es zur Auftrennung der Zellpopulationen. In der
untersten roten Schicht befinden sich die Erythrozyten, dann folgt das Lymphoflot und die
darauffolgende weiße Schicht besteht aus Lymphozyten. Die oberste Schicht bildet das Blutplasma. Die Lymphozytenschicht ist als Ring zu sehen, der vorsichtig mit der Pipette aufgezogen und in ein neues Falcon überführt wurde. Die Zellen wurden mit Hanks auf 50 ml aufgefüllt und bei 1.720 Upm abzentrifugiert und abschließend einmal mit 25 ml Hanks-Lösung
gewaschen und in das zu kultivierende Medium aufgenommen.
6.2.2.9 Anlegen von CTL-Linien
In der Regel wurden ca. 3-5 x 106 PBMC in 1 ml R10/IL2-Medium mit 6 µg des jeweiligen
Peptids stimuliert. Nach 10-14 Tagen wurden die ausgewachsenen T-Zelllinien auf ihre Aktivität gegen das Peptid im IFN-γ-ELISpot getestet.
6.2.2.10 Restimulation von T-Zelllinien
Nach zwei bis drei Wochen wurden die T-Zelllinien restimuliert. Auch die aufgetauten TZelllinien mussten zur erneuten Aktivierung restimuliert werden. Zur Restimulierung konnte
zwei verschiedene Protokolle verwendet werden. Meistens wurde die spezifische Restimulation verwendet, da sie häufiger zum Erfolg führte.
Unspezifische Restimulation
Zur unspezifischen Restimulation wurden 5-10 x 106 PBMC eines gesunden Spenders, welche bei 30 Gray bestrahlt wurden, als Feeder-Zellen verwendet. Diese wurden zu den Zellen
gegeben, die restimuliert werden sollten. Zur Aktivierung wurden 3 µl PHA-L (1 mg/ml) pro ml
Ansatz zugegeben. Nach sieben bis zehn Tagen erfolgte eine erneute Testung der Aktivität
gegen das Peptid im IFN-γ-ELISpot.
170
6. Material und Methoden
Spezifische Restimulation
Zur spezifischen Restimulation der T-Zelllinien wurden 1 x 106 EBV-immortalisierte B-Zellen
mit dem entsprechenden HLA-Typ abzentrifugiert und im Rücklauf resuspendiert. Den Zellen
wurden 5 µl (10 µg) des entsprechenden Peptids zugegeben und für 1 Stunde bei 37 °C inkubiert. Nach einem Waschschritt mit 10 ml R10-Medium wurden die B-Zellen bei 90 Gray
bestrahlt. Die so behandelten B-Zellen wurden dann als APC mit der CTL-Linie gemischt.
Außerdem wurden 5-10 x 106 PBMC eines gesunden Spenders, welche bei 30 Gray bestrahlt wurden, als Feeder-Zellen zugegeben. Nach sieben bis zehn Tagen erfolgte eine erneute Testung der Aktivität gegen das Peptid im IFN-γ-ELISpot.
6.2.2.11 Herstellung EBV-immortalisierter B-Zellen
Zur Herstellung von immortalisierten B-Zellen wurden 1-2 x 107 isolierte PBMC verwendet.
Die PBMC wurden in 3-5 ml gefiltertem Überstand der B95-8-Zelllinie aufgenommen. Die
B95-8-Zelllinie ist eine Marmosetzelllinie, welche transformierendes EBV abgibt. Dazu wurden 2 µl Cyclosporin (50 µg/ml) pro ml des Überstandes zugegeben, um eine Endkonzentration von 10 µg/ml zu erreichen. Nach ein bis zwei Tagen wurden 1-2 ml R20 zugegeben und
wieder 2 µl Cyclosporin pro ml Kultivierungsmedium zugefügt.
6.2.2.12 Dextramer-Färbung zur Sortierung
Die Dextramer-Färbung erfolgte nach Anleitung des Protokolls. Die Zellen wurden bei 1.200
Upm für 5 Min. abzentrifugiert und mit 2 ml PBS + 5 % FCS gewaschen. Anschließend wurden 10 µl des jeweiligen Dextramers zugegeben und für 20 Min. bei Raumtemperatur und
Dunkelheit inkubiert. Danach erfolgte die Zugabe von 5 µl des jeweiligen CD8-Antikörpers,
bei dem IMP-GL9-FITC Dextramer wurde CD8-PE zugegeben und bei dem SL9-PE Dextramer CD8-FITC. Nach einer Inkubationszeit von 20 Min. bei 4 °C wurden die Proben zweimal
mit 2 ml PBS + 5 % FCS gewaschen und in 500 µl PBS aufgenommen.
6.2.2.13 IFN-γ-Sekretions-Test zur Sortierung
Der IFN-γ-Sekretionstest wurde nach Anleitung des Kits durchgeführt.
Für die Sortierung der Zellen wurden diese am ersten Tag nochmals mit 5 µl Peptid stimuliert
und über Nacht bei 37 °C inkubiert. Am nächsten Tag wurden die Zellen durch ein Zellsieb
gefiltert und mit 10 ml Sekretionstestpuffer gewaschen. Die Zentrifugation erfolgte für 10 Min.
bei 1.200 Upm und 4 °C. Der Überstand wurde verworfen und das Zellpellet wurde in 80 µl
kaltem R5AB resuspendiert. Dann wurden 20 µl IFN-γ-Catch Reagenz zugeben, gemischt
und 5 Min. auf Eis inkubiert. Die Zellen wurden auf 1 ml mit warmen R5AB aufgefüllt und für
45 Min. bei 37 C° unter Schütteln inkubiert. Anschließend wurden sie mit 10 ml Sekretionstestpuffer gewaschen, der Überstand wurde verworfen und das Pellet in 80 µl Sekretions171
6. Material und Methoden
testpuffer resuspendiert. Im nächsten Schritt erfolgte die Zugabe von 20 µl PE-markiertem
IFN-γ-Detection-Antikörper und 10 µl CD8-FITC Antikörper. Die Probe wurde gemischt und
für 10-30 Min. auf Eis und dunkel inkubiert. Abschließend wurde zweimal mit 10 ml Sekretionstestpuffer gewaschen und das Pellet wurde in 500 µl PBS aufgenommen.
6.2.2.14 Zellsortierung (FACS)
Einzelne
Zellpopulationen
können auch mit
der
Durchflusszytometrie,
der
FACS
(fluorescence activated cell sorting), sortiert werden. In meinem Fall wurden die Dextramer
bzw. IFN-γ gefärbten T-Zelllinien (siehe Punkt 6.2.2.12 und 13) im Aria II Durchflusszytometer sortiert. Dabei wurden die doppelt positiven Zellen selektioniert.
6.2.2.15 RNA-Elektroporation von PBMC
Am ersten Tag wurden die PBMC mit Lymphoflot nach dem Ficoll-Gradienten isoliert und in
10 ml Leu-Medium aufgenommen. Die Zellen wurden gezählt und ca. 3-4 x 107 Zellen wurden in 10 ml Leu-Medium auf einer Zellkulturplatte (60 mm) ausgesät. Über Nacht wurden
die PBMC im Brutschrank kultiviert. Außerdem wurden für die Elektroporation Zellkulturflaschen (25 cm2) mit jeweils 5 ml Leu-Medium für jeden Elektroporationsansatz vorbereitet und
auch über Nacht bei 37 °C gewärmt.
Am nächsten Tag wurden die Medien (RPMI und Opti-MEM®) auf Raumtemperatur gebracht.
Die PBMC wurden zweimal mit 10 ml RPMI von den Platten gespült und in ein 50 ml Falcon
überführt. PBMC, welche am Boden der Zellkulturplatte kleben, wurden mit dem Zellschaber
abgekratzt und zweimal mit 5 ml RPMI abgespült. Die PBMC wurden nun bei 1.000 Upm für
10 Min. abzentrifugiert und das Pellet in 10 ml RPMI Medium resuspendiert. Die Zellen wurden gezählt und die gewünschte Menge für die Elektroporationsansätze wurde abgenommen. In der Regel wurden zwischen 5 x 106 und 1 x 107 Zellen/Elektroporation verwendet.
Die Zellen wurden abzentrifugiert und das Pellet wurde in 5 ml Opti-MEM® gewaschen, der
restliche Überstand abgesaugt und das Pellet in 100 µl Opti-MEM®/Elektroporationsansatz
aufgenommen.
Das Programm square wave wurde mit folgenden Einstellungen für die Elektroporation verwendet:
500 V
3 ms
1 Intervall
Die RNA (15 µg/Elektroporation, GFP mRNA 5 µg), welche während der Waschschritte aufgetaut wurde, wurde in die 4 mm Küvetten vorgelegt. 100 µl Zellen wurden zugegeben, die
Küvette wurde kurz auf den Boden geklopft. Dadurch sollte gewährleistet werden, dass sich
die Zellen und die RNA mischen und sich am Boden der Küvette sammeln. Danach wurden
172
6. Material und Methoden
die Zellen elektroporiert und anschließend so schnell wie möglich aus der Küvette in das
vorgewärmte Leu-Medium überführt. Die Ansätze wurden für 4 Stunden im Brutschrank inkubiert.
6.2.2.16 DNA-Elektroporation von B-Zellen
Die B-Zellen wurden am ersten Tag gezählt und mit R20-Medium nochmals gefüttert. Am
nächsten Tag wurden 5-10 x 106 B-Zellen/Elektroporationsansatz abgenommen und bei 900
Upm für 10 Min. abzentrifugiert. Das Zellpellet wurde zweimal mit 10 ml RRMI-Medium und
einmal mit 5 ml Opti-MEM® gewaschen und anschließend in 100 µl Opti-MEM®/
Elektroporationsansatz aufgenommen. 10-15 µg DNA (10 µg bei GFP und 15 µg bei anderer
DNA) wurden in die Küvette vorgelegt, anschließend wurden die Zellen dazugegeben und
die Küvette wurde kurz geklopft, damit sich alles am Boden sammelt und gemischt wird. Zur
Elektroporation wurde das gleiche Protokoll wie bei der RNA-Elektroporation (6.2.2.15) verwendet. Die B-Zellen wurden anschließend in 5 ml R20-Medium aufgenommen.
6.2.2.17 Durchflusszytometrische Analyse
Dextramer-Färbung
Die Dextramer-Färbung erfolgte nach Anleitung des Protokolls. 2 x 105 PBMC wurden bei
1.200 Upm für 5 Min. abzentrifugiert und mit 2 ml PBS + 5 % FCS gewaschen. Anschließend
wurden 3 µl des jeweiligen Dextramers zugegeben und für 20 Min. bei Raumtemperatur und
Dunkelheit inkubiert. Danach erfolgte die Zugabe von 5 µl des jeweiligen CD8-Antikörpers,
bei dem IMP-GL9-FITC-Dextramer wurde CD8-PE zugegeben und bei dem SL9-PEDextramer CD8-FITC. Nach einer Inkubationszeit von 20 Min. bei 4 °C wurden die Proben
zweimal mit 2 ml PBS + 5 % FCS gewaschen und in 200 µl 2 % PFA aufgenommen und fixiert. Die Messung der Proben erfolgte am FACS Calibur und die Auswertung der hierbei
gewonnen Rohdaten wurde mit der Software FCS Express V3 durchgeführt.
HLA-A2-Oberflächenfärbung
100 µl Vollblut wurden in ein Facs-Röhrchen überführt. Anschließend wurden 3 µl HLAA2,A28 IgG2a-FITC bzw. 3 µl Iso-IgG2a-FITC zugegeben, gemischt und für 15 Min. bei
Raumtemperatur inkubiert. Anschließend wurden die Proben durch den TQ-Prep fixiert und
im EPICS XL-MCL eingelesen sowie analysiert.
CD-Oberflächenfärbungen
100 µl der stimulierten CTL-Linie wurden mit 5 µl des CD-Antikörpers bzw. mit der IsoKontrolle gemischt und für 15 Min. bei Raumtemperatur inkubiert. Anschließend wurden die
Proben durch den TQ-Prep fixiert und im EPICS XL-MCL eingelesen sowie analysiert.
173
6. Material und Methoden
Intrazelluläre Färbung
Zur Färbung wurden pro Ansatz 2 x 105 Zellen verwendet. Die Zellen wurden durch den TQPrep fixiert und bei 2.000 Upm für 2 Min. abzentrifugiert. Der Überstand wurde verworfen
und das Zellpellet wurde mit 2 ml Permeabilisierungspuffer gewaschen und für 2 Min. bei
2.000 Upm abzentrifugiert. Der Überstand wurde verworfen und die Zellen im Rücklauf resuspendiert. Dazu wurde der erste Antikörper (z. B. Flag M2 1:5.000) zugegeben, gemischt
und für 30 Min. bei Raumtemperatur und Dunkelheit inkubiert. Die Zellen wurden mit 2 ml
Permeabilisierungspuffer gewaschen und bei 2.000 Upm für 2 Min. abzentrifugiert. Der
Überstand wurde wieder verworfen und die Zellen im Rücklauf resuspendiert. Anschließend
wurde der sekundäre Antikörper zugegeben (2 µl aus 1:10 Verdünnung des Anti-Maus IgGFITC- bzw. -PE-Antikörper), gemischt und für 30 Min. bei Raumtemperatur und Dunkelheit
inkubiert. Die Zellen wurden wiederum mit 2 ml Permeabilisierungspuffer gewaschen und für
2 Min. bei 2.000 Upm abzentrifugiert. Der Überstand wurde verworfen und die Zellen wurden
in 200 µl 2 % PFA aufgenommen. Die Messung der Proben erfolgte am FACS Calibur und
die Auswertung der hierbei gewonnen Rohdaten wurde mit der Software FCS Express V3
durchgeführt.
6.2.2.18 Chrom-Freisetzungstest
Für die Chrom-Freisetzungsversuche wurde eine dem HLA-Allel entsprechende B-Zelle als
Target-Zelle verwendet. 1 x 106 B-Zellen wurden abzentrifugiert und in 100 µl R10-Medium
aufgenommen. 100 µl
51
Cr wurden zugegeben und für 1 Stunde bei 37 °C inkubiert. An-
schließend wurden die B-Zellen dreimal mit je 10 ml R10-Medium gewaschen, in R10Medium aufgenommen, gezählt und die gewünschte Konzentration wurde mit R10-Medium
eingestellt, um 50 µl/well verwenden zu können. In der Regel wurden zwischen 1.000 bis
5.000 B-Zellen/well als Target-Zellen eingesetzt.
Für den Test wurde jedes well einer 96-well Platte mit Rundboden folgendermaßen vorbereitet:
50 µl R10-Medium ohne Peptid
50 µl R10-Medium + 2 µl Peptid
Anschließend wurden jeweils 50 µl Target-Zellen/well zugegeben und für 1 Stunde im Brutschrank inkubiert. Danach wurde die entsprechende CTL-Linie als Effektor-Zelle zugegeben.
In der Regel wurde ein Verhältnis von 50:1 (Effektor: Target, E:T) verwendet. Dementsprechend wurden 5 x 104 bis 2,5 x 105 Zellen zugegeben, je nachdem, wie viel B-Zelle als Target eingesetzt wurde, um 100 µl/well des Klons verwenden zu können.
Als Kontrollen dienten die Spontanwerte (Spons), bei denen 50 µl der Target-Zelle mit 100 µl
R10-Medium inkubiert wurden, sowie die Maximal-Werte (Max), bei welchen 50 µl der Tar174
6. Material und Methoden
get-Zelle mit 100 µl 5 % Triton X-Lösung inkubiert wurden, um eine maximale Zelllyse zu
erreichen.
Alle Proben wurden jeweils als Triplikate angesetzt.
Die Platte wurde anschließend für 4 Stunden im Brutschrank inkubiert.
Zur Messung der Zelllyse wurden 25 µl vom Überstand aus jedem well auf Filterpapier übertragen und das Papier wurde bei 60 °C über Nacht getrocknet.
Am nächsten Tag wurde das Papier eingeschweißt und konnte nun am Betastrahlenzähler
eingelesen werden.
6.2.2.19 IFN-γ-ELISpot-Verfahren
Beschichtung und Entwicklung der ELISpot-Platten
Die ELISpot-Platten wurden zuerst mit 20 µl/well 70 % Methanol für 30 Sek. aktiviert. Das
Methanol wurde mit zweimal 200µl/well PBS abgewaschen. Der erste IFN-γ-Antikörper
(mAb-1-D1K; 1 mg/ml) wurde mit PBS auf 10 µg/ml verdünnt und die Platten wurden mit 50
µl/well beschichtet. Nach leichtem Klopfen, damit sich die Antikörperlösung am Boden der
Platte befindet, wurde die Platte über Nacht (mindestens aber 4 Stunden) bei 4 °C inkubiert.
Am nächsten Tag wurden die Platten viermal mit 200 µl/well PBS gewaschen und ausgeklopft. Danach wurden 150 µl/well R5AB zum Blocken zugegeben und für 1 Stunde im Brutschrank bei 37 °C inkubiert. Bis zum Gebrauch konnten die so beschichteten Platten bei
- 20 °C eingefroren werden.
Die Platte wurde zur Verwendung aufgetaut und abgeklopft. Anschließend wurden die Zellen
in 100 µl/well R5AB zugegeben. 1 x 104 Zellen der CTL-Line bzw. 1-2 x 105 PBMC wurden
für die Testung der Frequenz der spezifischen T-Zellen verwendet. Die Peptid-Verdünnung
wurde in einer Endkonzentration von 20 µg/ml zugegeben. Bei Peptid-Titrationen wurden die
Peptide in einer Endkonzentration von 20 µg/ml bis 1 ng/ml zu den Zellen gegeben. Die Platten wurden für 18-48 Stunden bei 37 °C im Brutschrank inkubiert. Wurden PBMC verwendet,
diente PHA-L als Positivkontrolle. Auch von den elektroporierten T-Zellen wurden in der Regel 1 x 105 Zellen/well verwendet.
Zur Entwicklung wurden die Platten sechsmal mit PBS + 0,05 % Tween-20 gewaschen. Danach erfolgte die Zugabe von 100 µl/well des biotinylierten anti-human γ-IFN monoklonalen
Antikörpers (Klon7-B6-1; Endkonzentration 2 µg/ml). Die Platte wurde für 2 Stunden bei
Raumtemperatur inkubiert. Nach sechsmaligem Waschen mit PBS + 0,05 % Tween-20 wurde 100 µl Avidin/Peroxidase Substrat (Vectastain® ABC-Kit, Linaris) zugegeben und für 1-3
Stunden bei Raumtemperatur inkubiert. Die Platte wurde sechsmal mit PBS gewaschen und
zuletzt wurden 100 µl/well AEC-Substrat mit 0,01 % H2O2 zugegeben. Die Platte wurde bei
Raumtemperatur ca. 4 Min. inkubiert, bis die Spots durch eine leichte Rosafärbung sichtbar
wurden. Abschließend wurde die Reaktion durch dreimaliges Waschen mit Wasser abge175
6. Material und Methoden
stoppt, die Platte wurde getrocknet und mit dem ELISpot-Reader (AID, Strassberg) wurden
die Spots gezählt und ausgewertet.
Blocken mit CD4- und CD8-Antikörpern
Die auswachsenden CTL-Linien wurden auch im IFN-γ-ELISpot getestet, ob sie CD8+ spezifische T-Zellen sind. Dafür wurden 5 x 104 Zellen mit 50 µg/ml eines anti-CD4-Antikörpers
oder mit 625 ng/ml eines anti-CD8-Antikörpers für 1 Stunde bei 37 °C im Brutschrank inkubiert. Danach wurden die jeweiligen Peptide in einer Endkonzentration von 20 µg/ml zugegeben und die Platte wurde für 18-48 Stunden bei 37 °C im Brutschrank inkubiert.
HLA-Restriktion
Es wurde für jedes HLA der zu testenden CTL-Linie eine B-Zelle ausgesucht, welche nur ein
HLA-Allel mit der CTL Linie teilt. Von diesen B-Zellen wurden jeweils 1 x 106 B-Zellen abgenommen und abzentrifugiert. 1 x 106 B-Zellen wurden mit 5 µl des entsprechenden Peptids
bzw. ohne Peptid für 1 Stunde bei 37 °C inkubiert. Anschließend wurden die B-Zellen dreimal
mit 10 ml PBS gewaschen und in R5AB aufgenommen. 5 x 104 B-Zellen wurden jeweils mit 5
x 104 Zellen der CTL Linie inkubiert. Als Kontrolle wurde die CTL-Linie jeweils mit und ohne
das entsprechende Peptid aufgetragen. Die B-Zellen wurden jeweils mit und ohne CTL-Linie
inkubiert. Alle Ansätze wurden in Duplikaten aufgetragen. Die ELISpot-Platte wurde anschließend für mindestens 18 Stunden bei 37 °C im Brutschrank inkubiert.
6.2.2.20 Chlamydien Infektionsprotokoll
Infektion von B-Zellen
1,2 x 106 Zellen der HLA-B13 positiven B-Zelle wurden bei 1.600 Upm abzentrifugiert und in
1 ml R20-Medium aufgenommen. Die Chlamydien wurden aufgetaut und mit einer MOI 1.000
(Multiplicity of Infection) zu den B-Zellen zugegeben. Die Zellen wurden anschließend bei
37 °C im Brutschrank inkubiert.
Infektion von HEp-2 Zellen
1,2 x 106 HEp-2 Zellen wurden in 1 ml D10-Medium aufgenommen und auf einer 12-well
Platte, auf deren Boden ein Deckglas lag, ausgesät. Anschließend wurden die Chlamydien
mit MOI 1.000 auf die Zellen gegeben und für 24-72 Stunden bei 37 °C im Brutschrank inkubiert.
176
6. Material und Methoden
6.2.2.21 Färbung der Chlamydien infizierten Zellen
Chlamydien Färbung von B-Zellen
Die Färbung der B-Zellen erfolgte in der Regel nach 24-48 Stunden. Dafür wurden jeweils 12 x 105 B-Zellen/Färbung abgenommen und bei 2.000 Upm abzentrifugiert. Anschließend
wurden 5 µl CD19-PE Antikörper bzw. Iso-Kontrolle zugegeben und für 15 Min. bei Raumtemperatur inkubiert. Durch den TQ-Prep wurden die Zellen fixiert, bei 2.000 Upm abzentrifugiert und 5 µl des Reagent-FITC aus dem Chlamydien Kit wurden zugegeben und gemischt. Die Inkubation erfolgte für 15 Min. bei 37 °C. Abschließend wurde zweimal mit PBS
gewaschen und in 200 µl PBS aufgenommen. Die Messung der Proben erfolgte am FACS
Calibur und die Auswertung der hierbei gewonnen Rohdaten wurde mit der Software FCS
Express V3 durchgeführt.
Chlamydien Färbung von HEp-2 Zellen
Das Deckgläschen mit dem Zellrasen wurde in ein neues well platziert und mit 100 µl Methanol überschichtet. Zur Fixierung wurde es 10 Min. bei - 20 °C inkubiert. Anschließend wurde
das Methanol abgenommen und 15 µl Chlamydien-Reagent-FITC aus dem Kit sowie 100 µl
PI (2 µg/ml) zugegeben und für 15 Min. bei 37 °C inkubiert. Es wurde einmal mit PBS gewaschen. Das Deckgläschen wurde auf einen Objektträger gelegt und mit Nagellack fixiert.
6.2.2.22 Transfektionen
Transfektion mit Xtreme Gene 9 und Xtreme Gene HP
Am ersten Tag wurden die HEK293-Zellen ausgesät. Dafür wurden ca. 5 x 105 Zellen in 1,5
ml D10-Medium auf einer 12-well Platte verwendet. Die Zellen wurden für ein gleichmäßiges
Wachstum der Zellschicht für 16-24 Stunden bei 37 °C und 7 % CO2 im Brutschrank kultiviert. Am nächsten Tag wurden 47 µl Opti-MEM® mit 1 µg DNA gemischt und abzentrifugiert.
Anschließend wurden 3 µl des Transfektionsreagenz zugegeben (Verhältnis 3:1), gemischt
und 25 Min. bei Raumtemperatur inkubiert. Die Transfektionsmischung wurde vorsichtig auf
die Zellen getropft und für 48 Stunden im Brutschrank inkubiert. Anschließend erfolgte die
Färbung, ob die Transfektion funktioniert hatte.
Stabile Transfektion mit Xtreme Gene 9 und Xtreme Gene HP
Am ersten Tag wurden die HEK293-Zellen ausgesät. Dafür wurden ca. 5 x 105 Zellen in
1,5 ml D10-Medium auf einer 12-well Platte verwendet. Die Zellen wurden für ein gleichmäßiges Wachstum der Zellschicht für 16-24 Stunden im Brutschrank kultiviert. Am nächsten
Tag wurden 47 µl Opti-MEM® mit 1 µg DNA gemischt und abzentrifugiert. Anschließend wurden 3 µl des Transfektionsreagenz zugegeben (Verhältnis 3:1), gemischt und 25 Min. bei
Raumtemperatur inkubiert. Die Transfektionsmischung wurde vorsichtig auf die Zellen ge177
6. Material und Methoden
tropft und für 24 Stunden im Brutschrank inkubiert. Dann wurden die Zellen aus der 12-well
Platte in eine 6-well Platte überführt und in 3 ml D10-Medium aufgenommen. Diese Platte
wurde für weitere 24 Stunden inkubiert. Danach wurde das Medium ausgetauscht und der
gewünschte Selektionsmarker wurde mit dem neuen D10-Medium zugegeben. Bei G418
betrug die Konzentration 2 mg/ml, bei Puromycin dagegen 1 mg/ml. Alle drei bis vier Tage
erfolgte ein Medienwechsel mit Selektionsmarker und gegebenenfalls wurden die Zellen
wieder in eine 12-well Platte überführt. Die Zellen ohne die aufgenommene Plasmid-DNA
sterben aufgrund des Selektionsmarkers ab und lösen sich vom Boden. Nach drei bis vier
Wochen sieht man die ersten kleinen Zellanhäufungen, in denen Zellen mit dem aufgenommenen Plasmid wachsen. Diese werden weiter kultiviert und in größeren Mengen angezogen.
Transfektion mit Fugene 6 oder Fugene HD Transfektionsreagenz
Am ersten Tag wurden die HEK293- bzw. HEK293T-Zellen ausgesät. Dafür wurden ca. 5 x
105 Zellen in 1,5 ml D10-Medium auf einer 12-well Platte verwendet. Die Zellen wurden für
ein gleichmäßiges Wachstum der Zellschicht für 16-24 Stunden im Brutschrank kultiviert. Am
nächsten Tag wurden 47 µl DMEM mit 3 µl Fugene 6 bzw. Fugene HD gemischt und 5 Min.
bei Raumtemperatur inkubiert. Anschließend wurde 1 µg DNA zugegeben (Verhältnis 3:1),
gemischt und für 20 Min. bei Raumtemperatur inkubiert. Die Mischung wurde nun auf die
Zellen getropft und für 48 Stunden im Brutschrank inkubiert. Anschließend erfolgte die intrazelluläre Färbung, ob die Transfektion funktioniert hatte.
6.2.3 Immunologische Methoden
6.2.3.1 Anti-p24/HERV-ELISA
Nunc A/S MaxiSorp-Platten oder 8-er Streifen wurden mit 50 µl/well einer 8 µg/µl PeptidVerdünnung (400 ng Peptid gesamt) der jeweiligen Peptide beschichtet und für 2 Stunden
bei Raumtemperatur leicht geschüttelt. Wahlweise kann die Inkubation auch über Nacht bei
4 °C erfolgen. Die Platten bzw. Streifen wurden anschließend dreimal mit PBS + 0,05 %
Tween-20 und dreimal mit PBS gewaschen und mit 200 µl/well PBS + 2 % BSA geblockt.
Dazu erfolgte die Inkubation bei Raumtemperatur unter Schütteln für 2 Stunden oder wahlweise über Nacht bei 4 °C. Danach erfolgte wiederum ein dreimaliges Waschen mit PBS +
0,05 % Tween-20 und ein dreimaliges Waschen mit PBS. Anschließend wurden die Patientenseren mit PBS 1:5 bis 1:10 verdünnt und 50 µl/well in Duplikaten verteilt. Die nachfolgende Inkubation konnte für 2 Stunden bei Raumtemperatur unter Schütteln oder wahlweise
über Nacht bei 4 °C durchgeführt werden. Die Platten wurden wiederum dreimal mit PBS +
0,05 % Tween-20 und dreimal mit PBS gewaschen. Danach wurde der AP-konjugierte Antikörper (anti-human IgG-AP) in einer Endverdünnung von 1:5.000 zugegeben und für 2 Stun178
6. Material und Methoden
den bei Raumtemperatur unter Schütteln oder wahlweise über Nacht bei 4 °C inkubiert. Nach
wiederholtem Waschen (dreimal mit PBS + 0,05 % Tween-20 und dreimal mit PBS) wurden
50 µl/well Substrat-Puffer mit 1 mg/ml NPS zugegeben und für 30-60 Min. bei Raumtemperatur und Dunkelheit entwickelt. Zum Abstoppen der Farbreaktion wurden 50 µl/well 0,1 M
NaOH-Stopplösung zugegeben und die Substratumsetzung wurde durch die Adsorption bei
405 nm am ELISA-Reader gemessen.
6.2.4 Statistische Analysen
Die statistischen Analysen wurden mit dem IBM SPSS Statistics 19 Programm berechnet. Es
wurden der Mann-Whitney-U-Test und Kreuztabellen nach dem Chi-Quadrattest verwendet.
Die Patienten wurden für den Mann-Whitney-U-Test nach ihrer Viruslast bzw. CD4-Zellzahl
vor Therapiebeginn und zum Testzeitpunkt gruppiert und die Gruppen ohne/mit Erkennung
und ohne/mit Kreuzreaktion untereinander verglichen. Für die Kreuztabellen wurden die therapierten Patienten zusätzlich in Patienten mit Blips und Patienten mit unterdrückter Viruslast
bezüglich der Viruslast zum Testzeitpunkt unterteilt. Hierbei wurden die Patienten ohne Therapie und die Patienten mit Blips weiter hinsichtlich der Erkennung bzw. Kreuzreaktion im
Zusammenhang mit der Viruslast zum Testzeitpunkt untersucht.
In allen Analysen wurden ein P-Wert < 0,05 als statistisch signifikant bewertet.
179
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8. Abbkürzungsverzeichnis
8. Abkürzungsverzeichnis
%
3TC
Abb.
ABC
Ad5
AEC
AflII
AIDS
APC
APOBEC3
ART
AS
AZT
BamHI
Bcl-2
BCRF1
BglII
B-LCL
Bp
BSA
BSA
C
C. pneumoniae
C. trachomatis
CA
CaCl2
CCR5
CD
CDC
cDNA
CDR
CFS
CMV
COPD
CP
Cpz
CTL
CXCR4
D
dATP
DC
dCTP
DEA
DEPC
dGTP
DMEM
DMF
DMSO
DNA
dNTP
DPBS
Prozent
Lamivudin
Abbildung
Abacavir
Adenovirus Serotyp 5
3-Amino-9-Ethyl-Carbazole
Restriktionsendonuklease aus Anabaena flos-aquae
Aquired Immune Defiency Syndrome
(erworbenes Immunschwächesyndrom)
Antigenpräsentierende Zellen
apolipoprotein B mRNA editing enzyme catalytic polypeptide 3
Antiretrovirale Therapie
Aminosäure
Azitothymidin (Zidovudin)
Restriktionsendonuklease aus Bacillus amyloliquefaciens
B-cell lymphoma 2
Bam HI C fragment rightward reading frame
Restriktionsendonuklease aus Bacillus globigii
EBV-transformierte lymphoide B-Zelllinie
Basenpaare
Albumin Fraktion V (Rinderserumalbumin; Bovine serum albumine)
Bis-trimethylsilylacetamid
Konstant
Chlamydophila pneumoniae
Chlamydia trachomatis
Kaspid
Calciumchlorid
CC-Motiv-Chemokin-Rezeptor 5
cluster of differentiation
Centers for Disease Control and Prevention
complementary DNA
complementarity determining regions
Chronic fatigue syndrome
Cytomegalie-Virus
chronisch obstruktive Lungenerkrankung
(chronic obstructive pulmonary disease)
C. pneumoniae
Chimpanzees (Schimpanse)
Cytotoxic T-lympocyte, Zytotoxischer T-Lymphozyt
CXC-Motiv-Chemokinrezeptor 4
Diversity
Desoxyadenosintriphosphat
Dendritische Zellen
Desoxycytidintriphosphat
Diethanolamin
Diethylpyrocarbonat
Desoxyguanosintriphosphat
Dulbecco's Modified Eagle's Medium
N,N-Dimethylformamid
Dimetyhlsulfoid
Deoxyribonucleic acid (Desoxyribonukleinsäure)
Desoxyribonukleosidtriphosphat
Dulbecco´s Phosphate Buffered Saline
196
8. Abbkürzungsverzeichnis
DRV
ds
DsRed
DTT
dTTP
Ê
E.coli
EA/R
EagI
EB
EBNA
EBV
EBV-EA/D
EBV-VCA
EC
EcoRI
EDTA
EFV
ELI
ELISA
Env
EP
ER
ERV
et al.
FAM
FCS
FITC
G418
Gag
GFP
Gor
Gp
H2O
H2O2
HA
HAART
HBV
HCV
HEF
HEPES
HERV
HHV
HindIII
HIV
HLA
HPV
HSV
HTLV
IDV
IFN
Ig
IL
IN
INV
Darunavir
Doppelsträngig (dopple stranded)
Discosoma sp. red fluorescent protein
Dithiothreitol
Desoxythymidintriphosphat
Effektor
Escherichia coli
restricted early antigen
Restriktionsendonuklease aus Enterobacter agglomerans
Elementar body (Elementarkörperchen)
EBV nuclear antigen
Ebstein-Barr-Virus
EBV diffuse early antigen
EBV viral capsid Antigen
Elite controller (Elite-Kontroller)
Restriktionsendonuklease aus Escherichia coli
Ethylendiamintetraacetat
Efavirenz
Enzym Linked Immunospot
Enzym Linked Immunosorbent Assay
Envelope (Hülle)
Elektroporation
Endoplasmatisches Retikulum
Endogener Retrovirus
Et alii (und andere)
Fluorescein
Fetal Calf Serum, Fetales Kälberserum
Fluorescin isotheiocyanate
Geneticin®
Group antigen
Grün fluoreszierendes Protein
Gorilla
Glykoprotein
Wasser
Wasserstoffperoxid
Hämagglutinin
Hoch aktive antiretrovirale Therapie
Hepatitis-B-Virus
Hepatitis-C-Virus
Hämagglutinin-Esterase-Fusionsprotein
2-(4-(2-Hydroxyethyl)-1-piperazinyl)ethansulfonsäure
Humane endogene Retroviren
Humanes Herpesvirus
Restriktionsendonuklease aus Haemophilus influenzae
Humanes-Immundefizienz-Virus (Human immunodeficiency virus)
Human Leukocyte Antigen (humanes Leukozyten Antigen)
humanes Papillomvirus
Herpes-Simplex-Virus
humanes T-Zellleukämie-Virus
Indinavir
Interferon
Immunglobulin
Interleukin
Integrase
Saquinavir
197
8. Abbkürzungsverzeichnis
J
KCl
KSHV
L
LAV
LB
LMP
LP
LPS
LPV/r
LTNP
LTR
M
M. Behçet
M. Wegener
MA
MgCl2
MHC
MMTV
MnCl2
MOI
MOPS
mRNA
MS
M-tropen
MVC
N
NA
NaCl
NaN3
NaOH
NC
Nef
NEP
NFV
NIH
NK-Zellen
Nm
NNRTI
NotI
NP
NPS
NRTI
NS
NSI
NVP
O
OD
ORF
PAMP
PBMC
PBP
PBS
PCR
Joining
Kaliumchlorid
Kaposi-Sarkom-Herpesvirus
Ligand
Lymphadenopathie-assoziiertes Retrovirus
Luria-Bertani
latentes Membranprotein
Leader protein
Lipopolysaccharid
Lopinavir
Long-term non-progressors (Langzeitüberlebender)
Long terminal repeats
Major (Haupt)
Morbus Behçet
Morbus Wegener
Matrix-Protein
Magnesiumchlorid
Major Histocompatibility Complex (Haupthistokompatibilitätskomplex)
Maus-Mammatumor-Virus
Manganchlorid
Multiplicity of Infection
3-(N-Morpholino)-Propansulfonsäure
messengerRNA
Multiple Sklerose
Makrophagentropen
Maraviroc
New (neu)
Neuraminidase
Natriumchlorid
Natriumazid
Natriumhydroxid
Nukleokapsid
Negative factor
Nuclear export protein
Nelfinavir
National Institutes of Health
Natürliche Killerzellen
Nanometer
Nicht-Nukleosidischen Reverse Transkriptase-Inhibitoren
Restriktionsendonuklease aus Nocardia otitidis-caviarum
Nukleoprotein
Nitrophenylsulfat
Nukleosidischen Reverse Transkriptase-Inhibitoren
Nichtstrukturprotein
non-syncytium-inducing
Nevirapin
Outlier (Sonderfall)
Optische Dichte
Open reading frame (offener Leserahmen)
pathogen associated molecular pattern
Peripheral blood mononclear cells
(mononukleäre Zellen des peripheren Blutes)
Penicillin-binding protein
Primerbindestellen
Polymerase-Ketten-Reaktion
198
8. Abbkürzungsverzeichnis
PE
PFA
Pfu
pH
PHA-L
PI
PI
Pol
PR
PRM
PstI
PTLD
RA
RAL
RB
Rev
RNA
RNase
ROX
RPMI
RRE
RT
RTV
SAP
SDS
SFU
SI
SIV
SLE
SNP
SOC
SP
SpeI
SQV
ss
SS
T
T2
T-20
TAP
Taq
Tat
TBE
TCR
TDF
TE
Tfb
TH-Zelle
T-LCL
TLR
TNF
Tris
tRNA
T-tropen
Phycoerythrin
Paraformaldehyd
Pyrolobus fumarii
pondus hydrogenii
Leucoagglutinin
Proteaseinhibitoren
Propidiumiodid
Polymerase
Protease
pattern recognition molecules
Restriktionsendonuklease aus Providencia stuartii
post-transplant lymphoproliferative disorder
(Posttransplantations-Lymphoproliferative Erkrankung)
Rheumatoide Arthritis
Raltegravir
Reticular body (Retrikularkörperchen, Intialkörperchen)
regulator of expression of virion proteins
Ribonucleic acid (Ribonukleinsäure)
Ribonuklease
X-Rhodamin
Roswell Park Memorial Institute medium
Rev response element
Reverse Transkriptase
Ritonavir
shrimp alkaline phophatase
Sodium dodecyl sulfate (Natriumdodecylsulfat/ Natriumlaurylsulfat)
Spot Forming Units
syncytium-inducing
Simian Immunodeficiency virus (Affen Immundefizienz-Virus)
Systemischer Lupus Erythematodes
single nucleotide polymorphism (Einzelnukleotid-Polymorphismus)
Super optimal broth and sugar for catablite repression
Spacer-Peptid
Restriktionsendonuklease aus Sphaerotilus species
Saquinavir
Single strand (einzelstränigig)
Sjögren-Syndrom
Target
T2-A1-Zellen
Enfuvirtid
transporters associated with antigen processing
Thermus aquaticus
transactivator of transcription
TRIS-Borat-EDTA-Puffer
T-Zell-Rezeptor
Tenofovir
Tris/ETDA
Transformation buffer
T-Helferzelle
T-Zellleukämie Zelllinie
Toll-like Rezeptoren
Tumor-Nekrose-Faktor
Tris(hydroxymethyl)aminomethan
transferRNA
T-lymphotropen
199
8. Abbkürzungsverzeichnis
Tween-20
u. a.
Upm
UV
V
v. a.
Vif
VL
Vpr
Vpu
VZV
WB
WT
XbaI
XhoI
XMRV
z. B.
β2m
Polysorbat 20
unter anderem
Umdrehung pro Minute
Ultraviolett
Variabel
vor allem
viral infectivity factor
Viruslast
viral rapid protein
viral protein out
Varizella-Zoster-Virus
Western Blot
Wildtyp
Restriktionsendonuklease aus Xanthomonas badrii
Restriktionsendonuklease aus Xanthomonas holcicola
Xenotropic murine leukemia virus-related virus
zum Beispiel
β2-Mikroglobulin
Aminosäure Abbkürzungen:
Name
Alanin
Arginin
Asparagin
Asparaginsäure
Cystein
Glutamin
Glutaminsäure
Glycin
Histidin
Isoleucin
Leucin
Lysin
Methionin
Phenylalanin
Prolin
Serin
Threonin
Tryptophan
Tyrosin
Valin
Einbuchstabencode
A
R
N
D
C
Q
E
G
H
I
L
K
M
F
P
S
T
W
Y
V
Einheiten:
°C
bp
cm2
G
H
Kb
kDa
L
M
mg
Dreibuchstabencode
Ala
Arg
Asn
Asp
Cys
Gln
Glu
Gly
His
Ile
Leu
Lys
Met
Phe
Pro
Ser
Thr
Trp
Tyr
Val
Vorsatzzeichen/Vorsätze:
Grad Celsius
Basenpaar
Quadratzentimeter
Gramm
Stunde
Kilo Basen
Kilo Dalton
Liter
Molar (mol/l)
Milligramm
K
m
µ
n
p
200
Kilo (103)
Milli (10-3)
Mikro (10-6)
Nano (10-9)
Pico (10-12)
8. Abbkürzungsverzeichnis
Min.
ml
mm
mM
ms
µg
µl
µM
ng
nm
pmol
S.
U
V
v/v
w/v
Minute
Milliliter
Millimeter
Millimolar
Millisekunde
Mikrogramm
Mikroliter
Mikromolar
Nanogramm
Nanometer
Picomol
Sekunde
Unit
Volt
volume / volume
weight / volume
Griechische Buchstaben:
α
β
γ
δ/Δ
ε
ζ
µ
201
Alpha
Beta
Gamma
Delta
Epsilon
Zeta
Mikro
202
9. Lebenslauf
9. Lebenslauf
Persönliche Daten
Name
Beruf
Geburtsdatum
Geburtsort
Staatsangehörigkeit
Familienstand
Angela Hückelhoven
Diplom Biologin (Univ.)
10.09.83
Stuttgart-Bad Cannstatt
deutsch
ledig
Promotion
Seit 2009
Promotionsarbeit am Universitätsklinikum der Medizinischen
Klinik III im Bereich der Immunologie, Friedrich-AlexanderUniversität Erlangen-Nürnberg.
Betreuung: Prof. Dr. Thomas Harrer
Betreuung von Seiten der Naturwissenschaftlichen Fakultät:
Prof. Dr. Lars Nitschke, Lehrstuhl der Genetik,
Friedrich-Alexander-Universität Erlangen-Nürnberg
Thema: Analyse der Rolle von kreuzreaktiven T-Zellen und Antikörpern bei der HIV-1-Infektion
Studium
2008
2008
2005
2003 – 2008
Diplomarbeit im Fachgebiet Allgemeine Virologie an der Universität Hohenheim, Lehrstuhl Genetik bei PD Dr. Pfitzner
Thema: Charakterisierung der Wechselwirkung von NPR1,
NIMIN-Proteinen und TGA Faktoren in Hefe
Studienabschluss Diplom Biologie
Diplomprüfung
Vordiplom
Biologiestudium an der Universität Hohenheim mit dem Hauptfach Mikrobiologie
Schulbildung
1994 – 2003
1990 – 1994
Lessing-Gymnasium in Winnenden
Abschluss: Abitur (Allgemeine Hochschulreife)
Nachbarschaftsschule in Berglen-Oppelsbohm
Akademische Förderung
01. – 09.2012
Promotionsabschluss-Stipendium im Rahmen des Programms
zur Förderung der Chancengleichheit für Frauen in Forschung
und Lehre
203
10. Eigene Publikationen und wissenschaftliche Vorträge
10. Eigene Publikationen und wissenschaftliche Vorträge
Eigene Publikationen
Koautorenschaft
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Maier F, Zwicker S, Hückelhoven A, Meissner M, Funk J, Pfitzner AJ, Pfitzner UM
NONEXPRESSOR OF PATHOGENESIS_RELATED PROTEINS1 (NPR1) and some
NPR-1-related proteins are sensitive to salicylic acid
(2011) Mol Plant Pathol. 12(1): p.73-91
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Pacheco Y, Allavena C, Guilloux Y, Mueller-Schmucker SM, Hueckelhoven AG,
André-Garnier E, Cleon F, Ferré V, Rodallec A, Billaud E, Harrer T, Raffi F, McIlroy D.
The Immune Response to the RT 181-189 Epitope in HIV-1-Infected Patients is
Associated with Viral Sequence Polymorphism Flanking the Epitope
(2011) J Clin Immunol. 31(4): 681-9
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Christian Hofmann, Sandra Höfflin, Angela Hückelhoven, Silke Bergmann, Ellen
Harrer, Gerold Schuler, Jan Dörrie, Niels Schaft, Thomas Harrer
Human T cells expressing two additional receptors (TETARs) specific for HIV-1 recognize both epitopes
(2011) blood 118: 5174-5177
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Etschel JK, Hückelhoven AG, Hofmann C, Zitzelsberger K, Maurer K, Bergmann S,
Mueller-Schmucker SM, Wittmann J, Spriewald BM, Dörrie J, Schaft N, Harrer T.
HIV-1 mRNA electroporation of PBMC: a simple and efficient method to monitor Tcell responses against autologous HIV-1 in HIV-1-infected patients
(2012) J. Immunol. Methods 380(1-2):40-55
In Vorbereitung
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Angela G. Hückelhoven, Jennifer K. Etschel, Silke Bergmann, Kathrin Zitzelsberger,
Sandra M. Müller-Schmucker, Ellen G. Harrer, Thomas Harrer.
Cross-reactivity of influenza matrix and HIV-1 p17-specific CTL
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10. Eigene Publikationen und wissenschaftliche Vorträge
Wissenschaftliche Vorträge
April 2010
GK Retreat Schlaifhausen
„Role of cross-reactive CTL for the control of HIV-1”
Mai 2011
GK Retreat Schlaifhausen
„Role of cross-reactive CTL for the control of HIV-1”
März 2012
GK Retreat Schlaifhausen
“Cross-reactivity of virus-specific T-cell receptors”
Konferenzbeiträge
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A. Hückelhoven, S. Bergmann, K. Eismann, S.M. Müller, J. Etschel, E.G. Harrer, T.
Harrer. “Analyse von HIV-1-spezifischen CTL mit Kreuzreaktion zu Influenza A in einer Kohorte von HIV-1-infizierten Patienten“ 10. Kongress für Infektionskrankheiten
und Tropenmedizin KIT 2010 in Köln
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A. Hückelhoven, S. Bergmann, K. Eismann, S.M. Müller, J. Etschel, E.G. Harrer, T.
Harrer. “Analysis of HIV-1-specific CTL cross-reacting with Influenza A virus in a cohort of HIV-1-infected patients” XVIII. Internationale AIDS Konferenz 2010 in Wien,
Österreich
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A. Hückelhoven, J. Etschel, K. Zitzelsberger, S.M. Müller-Schmucker, S. Bergmann,
E.G. Harrer, T. Harrer. „Analyse von HIV-1-spezifischen CTL mit Kreuzreaktion zu Influenza
A
in
einer
Kohorte
von
HIV-1-infizierten
Österreichischen AIDS-Kongress, DÖAK 2011 in Hannover
205
Patienten“
5.
Deutsch-
11. Danksagung
11. Danksagung
Zuallererst möchte ich mich herzlich bei Herrn Prof. Dr. Thomas Harrer für die Möglichkeit
bedanken, meine Dissertation im Rahmen der Bereitstellung dieses sehr interessanten Themas, anfertigen zu können. Außerdem möchte ich mich für seine hervorragende Unterstützung, kompetente Betreuung und sein Engagement während meiner Dissertation bedanken.
Vielen Dank für die Anregungen, Ratschläge, interessanten Gespräche und Diskussionen
sowie dem Erstellen des Zweitgutachtens.
Bedanken möchte ich mich auch bei Herrn Prof. Dr. Lars Nitschke für die Betreuung meiner
Doktorarbeit von Seiten der Naturwissenschaftlichen Fakultät II der Universität ErlangenNürnberg und für die Erstellung des Erstgutachtens.
Außerdem möchte ich mich beim gesamten Laborteam von Prof. Dr. Thomas Harrer für das
hervorragende Arbeitsklima, die gute Zusammenarbeit und die große Unterstützung des Projektes bedanken. Den MTAs Silke Bergmann, Kathrin Zitzelsberger und Melanie Leykauf gilt
dabei mein Dank für die technische Unterstützung, die sie mir während der Anfertigung meiner Doktorarbeit zukommen ließen.
Ein besonderer Dank gilt meinen beiden Doktorandinnen-Kolleginnen Jennifer Etschel und
Christiane Mummert sowie dem ehemaligen Doktoranden Christian Hofmann und dem Diplomanten Andrej Stoll für die Hilfe und Unterstützung während der Erstellung meiner Arbeit,
vor allem wenn diese ins Stocken geriet.
Auch bei unserer Post-Doc Frau Dr. Sandra Müller-Schmucker möchte ich mich herzlich für
ihre Unterstützung und Ratschläge bedanken.
Ich möchte mich bei allen Mitgliedern des Graduiertenkollegs 1071 der Virologie für die vielen Erfahrungen, Ratschläge, Anregungen und Diskussionen während der letzten Jahre bei
den vielen gemeinsamen Unternehmungen und Seminaren bedanken.
Auch bei allen Mitgliedern der Ambulanz der Medizinischen Klinik 3 möchte ich mich für die
Blutabnahme bedanken sowie bei allen freiwilligen Blutspendern und Patienten, ohne die
viele der Untersuchungen nicht möglich gewesen wären.
Natürlich möchte ich mich auch bei meiner Familie, meinem Freund und meinen Freunden
bedanken, die mich während der letzten Jahre immer unterstützt und ermutigt haben und mir
immer großes Verständnis entgegengebracht haben.
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