1 Einleitung - Freie Universität Berlin

Aus dem Institut für Experimentelle Pädiatrische Endokrinologie
der Medizinischen Fakultät Charité – Universitätsmedizin Berlin
DISSERTATION
Dreidimensionale Darstellung der Schilddrüse und
benachbarter arterieller Gefäße während der
Embryogenese:
Vergleich von Wildtyp- und Sonic-hedgehog-defizienten
Mausembryonen
zur Erlangung des akademischen Grades
Doctor medicinae (Dr. med.)
vorgelegt der Medizinischen Fakultät
Charité – Universitätsmedizin Berlin
von
Pamela Schrumpf
aus Berlin
Gutachter/in:
1. Prof. Dr. med. H. Krude
2. Prof. Dr. med. T. Schöneberg
3. Prof. Dr. L. Schomburg
Datum der Promotion: 16. Mai 2010
Inhaltsverzeichnis
I
INHALTSVERZEICHNIS
1
EINLEITUNG ................................................................................................................................................. 1
1.1
KONGENITALE HYPOTHYREOSE ............................................................................................................................... 1
1.2
DIE SCHILDDRÜSE UND IHRE EMBRYONALE ENTWICKLUNG ........................................................................................... 3
1.3
DIE FRÜHE ORGANOGENESE DER ENDODERMALEN ORGANE LEBER UND PANKREAS........................................................... 6
1.4
ENTWICKLUNG DER KIEMENBOGENARTERIEN............................................................................................................. 9
1.5
SONIC HEDGEHOG-DEFIZIENZ ............................................................................................................................... 10
1.5.1
Sonic hedgehog-Signalweg .................................................................................................................. 10
1.5.2
Die Mausmutante Short Digits (Dsh) ................................................................................................... 12
1.6
2
ZIELSETZUNG DER ARBEIT .................................................................................................................................... 12
MATERIAL UND METHODEN .......................................................................................................................14
2.1
MATERIAL ........................................................................................................................................................ 14
2.1.1
Geräte.................................................................................................................................................. 14
2.1.2
Chemikalien und Substanzen .............................................................................................................. 15
2.1.3
Verwendete Kits .................................................................................................................................. 16
2.1.4
Verwendete Enzyme ........................................................................................................................... 16
2.1.5
Verwendete Primer ............................................................................................................................. 16
2.1.6
Häufig verwendete Puffer und Lösungen ............................................................................................ 17
2.1.7
Sonstiges verwendetes Material ......................................................................................................... 17
2.2
METHODEN ...................................................................................................................................................... 18
2.2.1
Mausarbeiten ...................................................................................................................................... 18
2.2.1.1
Maushaltung und –zucht ............................................................................................................................18
2.2.1.2
Mauspräparation ........................................................................................................................................18
2.2.1.3
Genotypisierung .........................................................................................................................................19
2.2.2
Histologie ............................................................................................................................................ 20
2.2.2.1
Herstellung silanisierter Objektträger ........................................................................................................20
2.2.2.2
Entwässerung der Embryonen für die Einbettung in Paraffin ....................................................................20
2.2.2.3
Herstellung von Paraffin-Gewebeschnitten ...............................................................................................21
2.2.2.4
Hämatoxylin-Eosin-Färbung .......................................................................................................................21
2.2.2.5
NKX2.1-Antikörperfärbung .........................................................................................................................21
2.2.3
Molekularbiologische Methoden ........................................................................................................ 22
2.2.3.1
Isolierung genomischer DNA aus Mausgewebe .........................................................................................22
2.2.3.2
Isolation von Gesamt-RNA aus Mausgewebe .............................................................................................22
2.2.3.3
Herstellung von cDNA ................................................................................................................................22
2.2.3.4
Polymerasekettenreaktion (PCR) ...............................................................................................................23
2.2.3.5
Agarose-Gel-Elektrophorese ......................................................................................................................23
2.2.3.6
Aufreinigung von PCR-Produkten ...............................................................................................................24
Inhaltsverzeichnis
2.2.3.7
Isolierung von DNA-Fragmenten aus Agarose-Gel .....................................................................................24
2.2.3.8
TOPO-Klonierung ........................................................................................................................................24
2.2.3.9
Transformation und Bakterienanzucht.......................................................................................................24
2.2.3.10
Plasmidpräparation ....................................................................................................................................25
2.2.3.11
Plasmidverdau mit Restriktionsenzymen ...................................................................................................26
2.2.3.12
Sequenzierung ............................................................................................................................................27
2.2.4
In-situ-Hybridisierungen ...................................................................................................................... 28
2.2.4.1
Verwendete Sonden ...................................................................................................................................28
2.2.4.2
Whole-mount in-situ-Hybridisierung ..........................................................................................................29
2.2.4.3
Radioaktive in-situ-Hybridisierung .............................................................................................................31
2.2.5
3
II
Sonstige verwendete Methoden ......................................................................................................... 33
2.2.5.1
Photodokumentation .................................................................................................................................33
2.2.5.2
3-dimensionale Rekonstruktion .................................................................................................................33
ERGEBNISSE ................................................................................................................................................35
3.1
DIE SCHILDDRÜSENENTWICKLUNG IN WILDTYPEMBRYONEN DER MAUS........................................................................ 35
3.1.1
3.1.1.1
Stadium E9.5...............................................................................................................................................35
3.1.1.2
Stadium E10.5.............................................................................................................................................36
3.1.1.3
Stadium E11.5.............................................................................................................................................37
3.1.1.4
Stadium E12.5.............................................................................................................................................38
3.1.1.5
Stadium E13.5.............................................................................................................................................38
3.1.1.6
Stadium E14.5.............................................................................................................................................39
3.1.2
3.2
Histologische Darstellung .................................................................................................................... 35
3-dimensionale Rekonstruktion .......................................................................................................... 40
3.1.2.1
Stadium E9.5...............................................................................................................................................40
3.1.2.2
Stadium E11.5.............................................................................................................................................40
3.1.2.3
Stadium E12.5.............................................................................................................................................41
3.1.2.4
Stadium E13.5.............................................................................................................................................42
3.1.2.5
Stadium E14.5.............................................................................................................................................43
DIE ENTWICKLUNG DER SCHILDDRÜSE IN HOMOZYGOTEN DSH/DSH-EMBRYONEN.......................................................... 44
3.2.1
Histologie ............................................................................................................................................ 44
3.2.1.1
Stadium E11.5.............................................................................................................................................44
3.2.1.2
Stadium E12.5.............................................................................................................................................45
3.2.1.3
Stadium E13.5.............................................................................................................................................46
3.2.1.4
Stadium E14.5.............................................................................................................................................46
3.2.2
3-dimensionale Rekonstruktion .......................................................................................................... 47
3.2.2.1
Stadium E11.5.............................................................................................................................................47
3.2.2.2
Stadium E12.5.............................................................................................................................................48
3.2.2.3
Stadium E13.5.............................................................................................................................................49
3.2.2.4
Stadium E14.5.............................................................................................................................................49
Inhaltsverzeichnis
3.3
J
J
DIE MORPHOLOGIE DER SCHILDDRÜSE IN DSH/DSH XT /XT DOPPELT HOMOZYGOTEN EMBRYONEN IM STADIUM E13.5 ...... 51
3.3.1
Phänotyp der doppelt homozygoten Mausembryonen ...................................................................... 51
3.3.2
Histologie ............................................................................................................................................ 53
3.3.3
3-dimensionale Rekonstruktion .......................................................................................................... 54
3.4
4
III
DIE EXPRESSION SCHILDDRÜSENSPEZIFISCHER TRANSKRIPTIONSFAKTOREN IN DSH/DSH-EMBRYONEN ................................ 56
3.4.1
Shh und Ptch1 ..................................................................................................................................... 56
3.4.2
Nkx2.1 ................................................................................................................................................. 57
3.4.3
Pax8 ..................................................................................................................................................... 59
3.4.4
FoxE1 ................................................................................................................................................... 62
DISKUSSION ................................................................................................................................................63
4.1
DIE GEMEINSAME ENTWICKLUNG VON SCHILDDRÜSENANLAGE UND ARTERIELLEN GEFÄßEN.............................................. 64
4.2
EINE GESTÖRTE ENTWICKLUNG DER ZERVIKALEN GEFÄßE FÜHRT ZU EINER STÖRUNG DER SCHILDDRÜSENMORPHOGENESE...... 67
4.3
NEUE ASPEKTE FÜR DIE ÄTIOLOGIE DER SCHILDDRÜSENDYSGENESIE ............................................................................. 72
5
ZUSAMMENFASSUNG .................................................................................................................................78
6
LITERATUR ..................................................................................................................................................80
7
ANHANG .....................................................................................................................................................87
7.1
ABKÜRZUNGSVERZEICHNIS ................................................................................................................................... 87
7.2
HERSTELLERVERZEICHNIS ..................................................................................................................................... 90
7.3
ABBILDUNGSVERZEICHNIS .................................................................................................................................... 92
1 Einleitung
1
1
Einleitung
1.1
Kongenitale Hypothyreose
Die kongenitale Hypothyreose (CH) stellt mit einer Inzidenz von 1:3000 bis 1:4000 die
häufigste angeborene endokrine Erkrankung des Neugeborenen dar [1]. Ohne
Substitution von Schilddrüsenhormonen führt die kongenitale Hypothyreose zu einer
eingeschränkten körperlichen und geistigen Entwicklung, mit der Folge des schweren
Kretinismus mit Kleinwuchs und mentaler Retardierung [2].
Die Ätiologie der Erkrankung ist vielfältig. Neben den seltenen Fällen, bei denen die
Einschränkung
der
Schilddrüsenfunktion
sekundär
aus
maternalen
Schilddrüsenautoantikörpern oder zentralnervösen Störungen resultiert, kann die
überwiegende Mehrheit der Fälle zwei Entitäten zugeordnet werden: Defekte in der
Hormonbiosynthese einerseits sowie Störungen der Organogenese andererseits [3-5].
In ca. 15-20% der Patienten beruht die CH auf einer Störung der Hormonbiosynthese.
In diesen Fällen ist häufig ein familiäres Auftreten zu beobachten. Insbesondere werden
hierbei
autosomal-rezessiv
Mutationen
vererbt,
die
an
der
Biosynthese
der
Schilddrüsenhormone Tetra- (T4) und Triiodthyronin (T3) beteiligte Proteine betreffen
[4]. Für die Schilddrüsenhormonsynthese wird Iodid über den Natrium-Iodid-Symporter
(NIS) in die Thyreozyten aufgenommen. Im Follikellumen wird das Iodid durch die
Schilddrüsenperoxidase (TPO) oxidiert, an die Tyrosinreste des Thyroglobulin (TG)
gebunden und die iodierten Tyrosinreste verknüpft. Schließlich werden T3 und T4 aus
dem TG-Molekül durch Proteolyse freigesetzt und in den Blutkreislauf abgegeben [6].
Die Schilddrüse der Patienten mit Störungen der Hormonbiosynthese ist orthotop
lokalisiert und vom Volumen normal bis vergrößert (Struma). In der Szintigraphie zeigt
sich häufig eine gestörte Iodidaufnahme bzw. -speicherung. Abhängig von der
Patientenauswahl konnten in derartigen Patientenkollektiven am häufigsten Mutationen
im NIS (ca. 40% der betroffenen Familien) und der TPO (22 – 76% der betroffenen
Familien) nachgewiesen werden [7-9].
In 80 - 85% der Patienten kann die CH auf eine Störung der Organogenese
zurückgeführt werden. Dabei werden verschiedene Ausprägungen der Dysgenesie
beobachtet:
1 Einleitung
2
o Athyreose: das vollständige Fehlen von Schilddrüsengewebe (15 - 48%)
o Ektopie: Fehllokalisation der Schilddrüse (18 - 61%) , zumeist im Bereich des
Zungengrundes (Thyreoidea lingualis)
o Hypoplasie: orthotop lokalisiertes Schilddrüsengewebe mit verringertem Volumen
(5 – 17%)
Die relativen Anteile dieser 3 Entitäten sind abhängig von der zur Klassifizierung
verwendeten Untersuchungsmethode: Die
99
Tc-Szintigraphie ist sensitiver im Nachweis
von Schilddrüsengewebe, jedoch abhängig von dessen metabolischer Aktivität. Dies
führt einerseits zu einem besseren Nachweis ektopen Schilddrüsengewebes,
andererseits jedoch zu einer Einordnung metabolisch inaktiven Gewebes als Athyreose
und zur Unterschätzung der Hypoplasien. Die Sonographie hingegen hat eine geringere
Sensitivität bezüglich des ektopen Schilddrüsengewebes, weist jedoch besser
Hypoplasien und metabolisch inaktives Gewebe nach. Studien auf der Basis von
Szintigraphien unterschätzen daher v.a. den Anteil der Hypoplasien, die auf
Sonographie basierenden Studien eher den Anteil der Ektopien [10-12].
Desweiteren kann zur Gruppe der Schilddrüsendysgenesien auch die Hemithyroidea
gerechnet werden, die mit einer Häufigkeit von bis zu 1:2000 die am weitesten
verbreitete Störung der Schilddrüsenorganogenese darstellt. Sie ist zwar mit tendenziell
etwas höheren, aber noch im Normalbereich gelegenen TSH-Werten verbunden, die
Schilddrüsenfunktion ist jedoch nur in Einzelfällen eingeschränkt [13, 14].
Abbildung 1.1: Entitäten der Schilddrüsendysgenesie
Störungen der Organogenese führen zur Schilddrüsendysgenesie, die morphologisch in 4 Entitäten
unterschieden werden kann. Abhängig von der Form der Schilddrüsendysgenesie kann eine Restfunktion
der Schilddrüse vorhanden sein (farbiger Pfeil).
Im
Gegensatz
zu
Störungen
der
Schilddrüsenhormonbiosynthese
treten
Schilddrüsendysgenesien überwiegend sporadisch auf. Bislang gelang nur in einzelnen
Patienten der Nachweis einer Mutation in einem der derzeit bekannten Kandidatengene
PAX8, NKX2.1 oder FOXE1[15]. Diese Gene sind während der Embryonalentwicklung
1 Einleitung
3
in der Schilddrüse exprimiert, zusätzlich jedoch auch in anderen Geweben, so dass
Mutationen bei den Patienten häufig auch zu Störungen weiterer Organe führen [10].
FOXE1 ist embryonal neben der Schilddrüse im gesamten Vorderdarm und den
Haarfollikeln exprimiert. FOXE1-Mutationen führen zum Bamforth-Syndrom, bei dem
neben
einer
Athyreose
zusätzlich
Gaumenspalten,
Choanalatresien
und
Haarauffälligkeiten auftreten [16, 17]. Entsprechend dem Expressionsmuster von
NKX2.1 in Schilddrüse, Basalganglien und Lunge zeigen Patienten mit NKX2.1Mutationen besonders häufig gleichzeitig neurologisch Auffälligkeiten sowie Anomalien
im Bereich der Lungen [10, 18]. PAX8 ist embryonal insbesondere an der Entwicklung
von Schilddrüse und Nieren beteiligt. Mutationen im PAX8-Gen führen autosomal
dominant überwiegend zur Hypoplasie der Schilddrüse, das kombinierte Auftreten mit
einer unilateralen Nierenagenesie ist beschrieben [19]. Eine erhöhte Prävalenz
zusätzlicher kongenitaler Malformationen bei CH ist bekannt. Bei bis zu 50% der
Patienten mit assoziierten Malformationen, was etwa 5% der Patienten mit CH
entspricht, betreffen diese das Herz bzw. die großen Gefäße, gefolgt vom
muskoloskeletalen und zentralnervösen Anomalien [12, 14, 20].
1.2
Die Schilddrüse und ihre embryonale Entwicklung
Trotz der hier angeführten Mutationen in bekannten Kandidatengenen ist bei der großen
Mehrheit der Patienten die Ursache der Schilddrüsendysgenesie derzeit unbekannt. Ein
gutes Verständnis der embryonalen Schilddrüsenentwicklung bildet die Grundlage für
die weitere ätiologische Aufklärung der Schilddrüsendysgenesie.
Die Schilddrüse ist ventrolateral der Trachea knapp unterhalb des Larynx lokalisiert und
besteht aus zwei Lappen, die im distalen Anteil über einen schmalen Isthmus
verbunden sind. Das Parenchym ist aus 2 endokrin aktiven Zelltypen aufgebaut, den CZellen und den Thyreozyten. Die parafollikulär lokalisierten C-Zellen produzieren
Calcitonin, das auf den Kalzium- und Knochenstoffwechsel einwirkt. Die Thyreozyten
sind zu Schilddrüsenfollikeln zusammengelagert, in denen die Synthese der
Schilddrüsenhormone Tetrajodthyronin (Thyroxin, T4) und dessen biologisch aktiven
Derivats Trijodthyronin (T3) stattfindet. T4 bzw. T3 beeinflussen eine Vielzahl
physiologischer Prozesse des Stoffwechsels. Desweiteren haben sie eine zentrale
Bedeutung für entwicklungsbiologische Prozesse wie pränatale Entwicklung, Wachstum
und Gehirnentwicklung [6]. Der Phänotyp der kongenitalen Hypothyreose beruht auf
einem Mangel an Schilddrüsenhormon auf Grund eines Defektes der Thyreozyten.
1 Einleitung
4
Thyreozyten und C-Zellen gehen aus unterschiedlichen embryonalen Anlagen hervor.
Die Thyreozyten entwickeln sich aus den Zellen der medianen Schilddrüsenanlage,
wohingegen die C-Zellen dem 4. Kiemenbogen entstammen, von wo sie in den
Ultimobronchialkörpern zur Schilddrüse wandern. Im Verlauf der Embryonalentwicklung
verschmelzen Schilddrüsenanlage und Ultimobronchialkörper und die C-Zellen verteilen
sich interfollikulär [6].
Aufgrund der relativ nahen Verwandtschaft von Mensch und Maus und dem hohen
Grad der Konservierung der an der Entwicklung beteiligten Gene und Signalwege bietet
die Maus die Möglichkeit, die Bedeutung von Genen für die Embryonalentwicklung
durch
ihr
gezieltes
Ausschalten
(Knockout)
zu
untersuchen.
Bezüglich
der
Schilddrüsenentwicklung konnte gezeigt werden, dass die Prinzipien des Aufbaus, der
Funktion und der Entwicklung zwischen Mensch und Maus hoch konserviert sind.
Darauf basierend sind die wesentlichen Erkenntnisse über die Schilddrüsenentwicklung
und deren molekulare Grundlagen in der Maus erarbeitet worden [10].
In der Maus beginnt die Entwicklung der Schilddrüse im Stadium E8.5 mit der Induktion
und Bildung des Schilddrüsenprimordiums, einer Verdickung des endodermalen
Epithels in der Mittellinie des ventralen Pharynx knapp unterhalb des 1. Kiemenbogens.
Dieses entwickelt sich zum Schilddrüsendivertikel, welches sich relativ zur Umgebung
nach kaudal verlagert und den Ductus thyroglossus bildet. Ungefähr im Stadium E11
verliert der Ductus thyroglossus den Kontakt zum Pharynx. Im Stadium E12.5 kommt es
zur Bifurkation in 2 Schilddrüsenlappen, die seitlich des primitiven Larynx gelegen sind,
von wo aus sie sich nach kaudal bis zum Schild- und Ringknorpel ausdehnen [21]. Etwa
im Stadium E14.5 verschmelzen die Schilddrüsenanlage und die Ultimobronchialkörper,
denen
die
C-Zellen
entstammen
[22].
Gleichzeitig
beginnt
die
funktionelle
Differenzierung der Schilddrüse. Histologisch bilden sich kolloidgefüllte Follikel, die die
schilddrüsenspezifischen Funktionsproteine TSH-Rezeptor (Tshr), Thyroglobulin (Tg),
Schilddrüsenperoxidase (Tpo) und Natrium-Iodid-Symporter (Nis) exprimieren [10].
1 Einleitung
5
Abbildung 1.2: Schematische Übersicht über die Schilddrüsenentwicklung in der Maus.
Der Balken gibt den Zeitpunkt der Embryonalentwicklung an (d=dpc). Die schwarzen Pfeile markieren
den Zeitraum von Größenwachstum und Differenzierung der Schilddrüse, die blauen Pfeile die
Expression von Genen der Schilddrüsenentwicklung [10], der rote Pfeil die T4-Produktion. (a) Bildung des
Schilddrüsenprimordiums in der Mittellinie des Pharynx, (b)Evagination und Relokalisation, (c) Bifurkation
des Primordiums, (d) Größenwachstum, (e) Follikelbildung. Abbildung abgewandelt aus [23]
Die
frühe
Schilddrüsenanlage
ist
durch
die
gleichzeitige
Expression
der
Transkriptionsfaktoren Nkx2.1, Pax8, FoxE1 und Hhex charakterisiert. Diese Gene sind
bereits im Stadium E8.5 nachweisbar und essentiell für die regelgerechte Entwicklung
der Schilddrüse.
Nkx2.1 (früher Titf1, thyroid transcription factor 1) ist insbesondere für das Überleben
des Schilddrüsenprimordiums von Bedeutung: Die gezielte Inaktivierung (knockout) von
Nkx2.1 in Mäusen führt im homozygoten Zustand (Nkx2.1 -/-) zu einer Störung der
Schilddrüsenentwicklung.
Nkx2.1-/--Embryonen
bilden
zwar
initial
ein
Schilddrüsenprimordium aus, dieses bleibt jedoch bereits im Stadium E10.5 im
Größenwachstum zurück und zeigt Apoptose. Im Stadium E13 und auch in
neugeborenen Mäusen zeigt sich histologisch eine Athyreose [24].
Pax8 beeinflusst sowohl das Überleben der Schilddrüsenzellen wie auch deren
Differenzierung. Zwar ist in Pax8-/--Embryonen morphologisch eine verkleinerte
Schilddrüse nachweisbar, diese ist jedoch vollständig aus C-Zellen aufgebaut.
Vorläuferzellen der Thyreozyten sind nur bis zum Stadium E11.5 nachweisbar [25]. In
der Zellkultur konnte gezeigt werden, dass Pax8 an die Promotorregionen von
Funktionsproteinen, z.B. Tg, Tpo und Nis, bindet und deren Transkription aktiviert [26].
Foxe1 (früher Titf2, thyroid transcription factor 2) hingegen ist sowohl für das Überleben
der Schilddrüsenzellen als auch für die Migration des Schilddrüsenprimordiums wichtig.
Bei den Foxe1-/--Embryonen treten Ektopie und Athyreose in einem Verhältnis von 1:1
auf [27].
1 Einleitung
6
Hhex wird während der Embryonalentwicklung in mehreren Organen endodermalen
Ursprungs, z.B. Lunge, Leber und Pankreas exprimiert, am stärksten jedoch in der
Schilddrüse. Der Knockout von Hhex ist im homozygoten Zustand intrauterin ab E11.5
letal.
Hhex-/--Embryonen
zeigen
an
E9
eine
regelrechte
Spezifizierung
der
Schilddrüsenanlage mit Expression von Nkx2.1, Pax8 und Foxe1. Kurz darauf an E10
jedoch ist eine starke Beeinträchtigung der Schilddrüse mit Hypoplasie bzw. Athyreose
zu beobachten, gleichzeitig ist die Expression von Nkx2.1, Pax8 und Foxe1 in der
Schilddrüsenanlage gestört. Die Bedeutung von Hhex für die Entwicklung der
Schilddrüse scheint also weniger in der Spezifikation, sondern vielmehr in der
Proliferation der Zellen und der Aufrechterhaltung der Expression von Nkx2.1, Pax8 und
Foxe1 zu bestehen [28, 29].
Das Wissen über die Funktion der in der Schilddrüsenanlage exprimierten
Transkriptionsfaktoren Nkx2.1, Pax8, Foxe1 und Hhex beschreibt die zellautonome
Regulation der Morphogenese der Schilddrüse bereits recht gut. Jedoch ist wenig
bekannt über Faktoren, die parakrin auf die Entwicklung und Morphogenese der
Schilddrüse einwirken. Darüber hinaus ist unklar, welche Faktoren zur Induktion der
Schilddrüsenanlage führen.
1.3
Die frühe Organogenese der endodermalen Organe Leber und
Pankreas
Wie die Schilddrüse sind auch Leber und Pankreas Organe endodermalen Ursprungs.
Sie entstammen dem kaudal der Schilddrüse gelegenem primitiven Darmrohr und sind
hinsichtlich der frühen Organogenese besser untersucht als die Schilddrüse.
Die Leber entwickelt sich auf der Höhe des Übergangs des Vorderdarms in den
Mitteldarm [30]. Als erstes morphologisch sichtbares Merkmal der Organogenese bildet
sich im Stadium E8.5 eine Epithelverdickung, die Leberknospe [31]. Schon die Zellen
der Leberknospe sind bezüglich ihrer weiteren Entwicklung hin zu Leberzellen
spezifiziert. Auf Ebene der mRNA ist es bereits in diesem Stadium gelungen, die
Expression leberspezifischer Gene wie Albumin und α-Fetoprotein nachzuweisen.
Versuche, bei denen der ventrale Vorderdarm vor dem Zeitpunkt der ersten Expression
von Albumin explantiert und in vitro kultiviert wurde, haben gezeigt, das die Expression
von Albumin in den Endodermzellen und somit die Spezifizierung der Endodermzellen
zu primitiven Leberzellen von einem engem Kontakt zum kardiogenen Mesoderm und
aus diesem stammenden Faktoren, z.B. Fibroblast growth factors (Fgf), abhängig ist
1 Einleitung
7
[32]. Im weiteren Verlauf der Leberentwicklung migrieren die Zellen der Leberknospe in
das Mesenchym des Septum transversum (siehe Abbildung 1.3). Die Migration der
Zellen ist abhängig von der Anwesenheit endothelialer Zellen. Ein Knockout von Flk1
(Vegf-Rezeptor 2) in der Maus führt im homozygoten Zustand zu einer gestörten
Reifung und Migration der Angioblasten und daraus resultierend zu Defekten in der
embryonalen Gefäßentwicklung; im Septum transversum der homozygoten Embryonen
sind weder Endothelzellen noch ihre Vorläufer nachweisbar. Die Entstehung der
Leberknospe erscheint unauffällig, die Migration der primitiven Leberzellen in das
Septum transversum hingegen bleibt aus. Weitergehende Versuche mit GewebeExplantaten haben gezeigt, dass die Endothelzellen selbst und nicht im Blut
zirkulierende Faktoren für die Migration notwendig sind [31, 33].
Abbildung 1.3: Überblick über die frühe Leberentwicklung
(A) Im kompetenten Endoderm werden durch aus dem kardiogenen Mesoderm sezernierte Fgfs die
Leberzellen spezifiziert. (B) Im Septum transversum entwickeln sich in enger Nachbarschaft zur
Leberanlage Endothelzellen. (C) Migration der Leberanlage in das Septum-transversum-Mesenchym.
Abbildung abgewandelt aus [34]
Das Pankreas besteht aus verschiedenen endokrin und exokrin aktiven Zelltypen.
Ebenso wie die Leber ist auch das Pankreas endodermalen Ursprungs und entwickelt
sich auf Höhe des Übergangs des Vorder- in den Mitteldarm. Während der frühen
Organogenese bilden sich zunächst 3 Anlagen, die im weiteren Verlauf verschmelzen
[30]. Dorsal, im Bereich des direkten Kontaktes zwischen den fusionierenden dorsalen
Aorten und dorsalem Endoderm, bildet sich eine Pankreasknospe, ventrolateral treten
symmetrisch in Nachbarschaft zu den beiden Vv. omphaloenterici zwei Knospen auf.
Die
Pankreasanlagen
sind
charakterisiert
durch
die
Expression
des
Transkriptionsfaktors Pdx1. Die Expressionsdomänen von Pdx1 sind in diesem Stadium
auf die Kontaktbereiche mit den benachbarten Gefäßen begrenzt. Gleichzeitig mit der
1 Einleitung
Umgestaltung
8
des
symmetrischen
embryonalen
Gefäßsystems
zu
einem
asymmetrischen Gefäßsystem vollzieht sich auch eine Wandlung der Pankreasanlagen:
die links-ventrale Pankreasanlage sowie die linke V. omphaloentericus degenerieren,
die rechts-ventrale Anlage bildet den späteren ventralen Pankreasanteil und die
singuläre dorsale Anlage entwickelt sich zum dorsalen Pankreasanteil weiter (siehe
Abbildung 1.4) [33, 35].
Die Bedeutung des Kontaktes zwischen dem Endothel der dorsalen Aorta und dem
Endoderm des Vorderdarms für die Differenzierung der Endodermzellen zu endokrin
aktiven Pankreaszellen konnte in mehreren Experimenten nachgewiesen werden.
Insbesondere die Expression von Insulin sowie die Proliferation der Zellen können nur
durch das vaskuläre Endothel induziert werden [33, 36].
Abbildung 1.4: Koinzidenz der Entwicklung von Pankreas und Gefäßen.
Die Pankreasentwicklung beginnt mit der Ausbildung dreier Knospen in engem Kontakt zur dorsalen
Aorta bzw. den Vv. omphaloenterici. Mit der sich entwickelnden Asymmetrie der Venen geht eine
asymmetrische Entwicklung der beiden ventralen Pankreasanlagen einher. Die Abbildung zeigt eine
schematische Darstellung der Interaktionen von Blutgefäßen und primitivem Darm in den
Embryonalstadien (A) E8.5, (B) E9.5 und (C) 10.5. Gelb = Darm, rot = Blutgefäßendothel, blau =
Pankreasanlage. Aus [37]
Anhand der Beispiele von Leber und Pankreas ist es gelungen, die Bedeutung des
vaskulären Endothels für die Organogenese endodermaler Organe nachzuweisen. Die
Spezifizierung der Leberzellen ist vom Kontakt zum kardiogenen Mesoderm abhängig,
die des Pankreas erfolgt im engen Kontakt zu vaskulärem Endothel. Auch die weitere
Organogenese ist bei beiden Organen eng mit dem Kontakt zu Blutgefäßen bzw.
dessen Endothel verbunden [31, 33, 36].
1 Einleitung
1.4
9
Entwicklung der Kiemenbogenarterien
Die Schilddrüsenanlage entsteht weiter kranial als Leber und Pankreas im Bereich der
Kiemenbögen und Schlundtaschen [10]. Die 6 Kiemenbögen sind eine in der
Wirbeltierentwicklung phylogenetisch konservierte Struktur. Im Fisch bilden sie den
Ursprung der Kiemen. In höheren Wirbeltieren dienen sie nicht länger respiratorischen
Funktionen, sondern stellen transiente Strukturen während der Embryonalentwicklung
dar. Alle Kiemenbögen enthalten knorpelige, muskuläre, nervale und vaskuläre
Komponenten, aus denen sich verschiedenste Derivate wie Kieferknochen, mimische
Muskulatur, Gehirnnerven und Aa. carotideae entwickeln [35].
Die arteriellen Komponenten der Kiemenbögen bilden die Kiemenbogenarterien, aus
denen sich im Laufe der Embryonalentwicklung höherer Wirbeltiere wie der Maus Teile
des arteriellen Gefäßsystem, z.B. Aorta und Aa. carotideae, entwickeln. Primär formt
sich ein transientes, symmetrisch organisiertes arterielles Gefäßsystem, das im
Wesentlichen aus der ventralen Aorta, die aus dem Herzschlauch entspringt, sowie den
beiden dorsalen Aorten besteht. Die ventrale und die dorsalen Aorten sind bis zum
Stadium E8.5 symmetrisch über die primitiven Aortenbögen miteinander verbunden, die
sich im weiteren Verlauf in die 1. Kiemenbogenarterien (pharyngeal arch arteries, PAA)
umwandeln. Dies wird gefolgt vom sequentiellen Auftreten der 2 - 6. PAA; eine 5. PAA
ist in Mausembryonen zu keinem Zeitpunkt der Entwicklung nachweisbar [38]. Durch
die folgende Umgestaltung der Kiemenbogenarterien entwickelt sich bis zum Stadium
E12.5 ein asymmetrisches arterielles Gefäßsystem. Hierbei bildet die 3. PAA Anteile
der A. carotis communis und ihrer Äste. Aus der linken 4. PAA geht der Aortenbogen
hervor und die linke dorsale Aorta bildet die Aorta descendens. Die rechte 4. PAA
hingegen wandelt sich in den Truncus brachiocephalicus um. Aus den 6. PAA
entwickeln sich die Aa. pulmonales und links zusätzlich der Ductus arteriosus. Ab dem
Stadium E13.5 entspricht das nun vorliegende Gefäßsystem der Mausembryonen
annähernd dem bei Geburt (siehe Abbildung 1.5) [38, 39].
1 Einleitung
10
Abbildung 1.5: Schematische Darstellung der Entwicklung der Kiemenbogenarterien.
Die symmetrisch angelegten Kiemenbogenarterien wandeln sich in Aorta, Ductus arteriosus, Aa.
carotideae, Truncus brachiocephalicus und A. subclavia um und bilden ein asymmetrisches Gefäßsystem
aus.
Die Ziffern 1 - 6 bezeichnen die Kiemenbogenarterien, d = dorsale Aorta, o = Derivat der ventralen Aorta
bzw. Aorta ascendens, p = A. pulmonalis, s = A. subclavia, t = Trachea. Aus [39]
Anhand der Entwicklung von Leber und Pankreas konnte die Bedeutung vaskulärer
Strukturen für die Spezifizierung und weitere embryonale Entwicklung endodermaler
Organe gezeigt werden. Eine Störung der Gefäßentwicklung führt hierbei sekundär zu
einer Störung der Organogenese von Leber und Pankreas (siehe Kapitel 1.3). Unter
diesem
Aspekt
stellen
insbesondere
Mausmodelle,
die
sowohl
mit
Entwicklungsstörungen endodermaler Organe als auch der Kiemenbogenarterien
einhergehen, interessante Modelle auch in Bezug auf die Schilddrüsenentwicklung dar.
1.5
Sonic hedgehog-Defizienz
Die Shh-Defizienz stellt ein Mausmodell dar, für das eine Kombination aus gestörter
Entwicklung endodermaler Organe und Anomalien der Gefäße, insbesondere eine
gestörte Entwicklung der Kiemenbogenarterien, beschrieben ist [40, 41].
1.5.1
Sonic hedgehog-Signalweg
Sonic hedgehog (Shh) ist eines der drei in Säugetieren identifizierten homologen Gene
des ´hedgehog´-Gens der Drosophila. In Drosophila wurde 'hedgehog' erstmals im
Zusammenhang mit der Polarität der Larvensegmente beschrieben. Knockout-Studien
in Mäusen haben die Bedeutung von Shh für das „Patterning“ verschiedener
Organsysteme wie ZNS und Vorderdarm gezeigt [42].
Shh ist ein extrazelluläres Signalmolekül, das an den Rezeptor Patched (Ptch) bindet.
In Abwesenheit von Shh inhibiert Ptch die Aktivität des G-Protein-gekoppelten
1 Einleitung
11
Rezeptors Smoothened (Smo). Die Bindung von Shh führt über die Aktivierung von
Smo und die Transkriptionsfaktoren Gli1 – Gli3 indirekt zur Beeinflussung von
Zielgenen. Der Effekt der Gli-Wirkung ergibt sich aus der Summe der partiellen
Aktivierung und Repression von Zielgenen. Die proteolytische Spaltung der Gli-Proteine
kann hierbei einen Übergang von aktivierenden in repressive Varianten herbeiführen. In
Folge dessen ist für jedes Zielgen eine spezifische Wirkung der Shh-Signalkaskade zu
erwarten (siehe Abbildung 1.6) [43].
Abbildung 1.6: Schematische Darstellung des Shh-Signalwegs.
Durch die Bindung von Shh an den Rezeptor Ptch1 wird der inhibitorische Effekt von Ptch1 auf Smo
aufgehoben. Über die Transkriptionsfaktoren Gli1-3 kommt es zur Aktivierung und Repression von
Zielgenen. Aus [43]
Auch die verschiedenen Knockout-Modelle der Shh-Signalkaskade zeigen einen
spezifischen Phänotyp und liefern Hinweise auf sich überlagernde Effekte der ShhWirkung. Während der Entwicklung der Extremitäten führt eine Shh-Defizienz (Shh-/-)
zum Fehlen der Finger, wohingegen die homozygoten Gli3-knockout-Mäuse (Gli3-/-)
eine Polydaktylie zeigen. Bei Verkreuzung dieser beiden Mausstämme führt der Shh -/Gli3-/--Genotyp zu einer Polydaktylie. Die Autoren postulieren, dass der Shh-/--Phänotyp
aus einer erhöhten Konzentration von repressiv wirkendem Gli3 (Gli3R) resultiert. In der
Shh-/- Gli3
-/-
Konstellation wird dieser Effekt durch den Mangel an Gli3 aufgehoben und
es kommt zu einem partiellen 'Rescue' des Shh-Phänotyps [44].
1 Einleitung
1.5.2
12
Die Mausmutante Short Digits (Dsh)
'Short Digits' (Dsh) ist eine durch Bestrahlung induzierte Mausmutante, bei der eine
intrachromosomale Inversion zu einer Trennung des Shh-Gens von seinen EnhancerElementen geführt hat [45]. Dadurch tritt bei Homozygotie für die Mutation eine ShhDefizienz auf. Im homozygoten Zustand (Dsh/Dsh) ist die Mutation intrauterin oder
unmittelbar postnatal letal und die Dsh/Dsh-Embryonen sind durch einen ausgeprägten
Phänotyp charakterisiert. Sie zeichnen sich durch ein geringere Größe und ausgeprägte
Mittelliniendefekte, z.B. eine singuläre Hirnblase und Zyklopie, aus. Charakteristisch ist
der von der rostralen Mittellinie entspringende Rüssel (Probioscis). Im Bereich der
Extremitäten besteht eine deutliche Fehlbildung v.a. der distalen Anteile, so werden
Radius und Ulna durch einen einzelnen, mit dem Humerus fusionierten Knochen
ersetzt, die Finger bzw. Zehen fehlen nahezu vollständig. Insgesamt ist der Dsh/Dsh
nahezu identisch mit dem von Shh-/--Embryonen [45].
Shh-defiziente Embryonen weisen außerdem multiple innere Fehlbildungen auf. Auf
Grund einer gestörten Entwicklung des Vorderdarms treten Ösophagusstenosen,
ösophagotracheale Fisteln und Fehlbildungen der Lunge auf [40, 46]. Des Weiteren
sind auch die arteriellen Gefäße sowie der kardiale Ausflusstrakt von Fehlbildungen
betroffen. Die Entwicklung der Kiemenbogenarterien ist gestört: 1. und 2. PAA sind
hypoplastisch, 4. und 6. PAA sind nicht nachweisbar. Der Aortenbogen entstammt der
3. PAA, nicht der 4. PAA, und ist auf der rechten Seite lokalisiert. Der Ausflusstrakt des
Herzens besteht nur aus einem einzelnen Gefäß [41]. Die Dsh-Mausmutante stellt ein
in der AG Mundlos, Max-Planck-Institut für molekulare Genetik, Berlin, etabliertes
Mausmodell der Shh-Defizienz dar. Vorarbeiten der Arbeitsgruppe haben ergeben, dass
bei der Dsh-Mausmutante wahrscheinlich eine Störung der Schilddrüsenentwicklung
vorliegt [47].
1.6
Zielsetzung der Arbeit
Die Schilddrüsendysgenesie in ihren unterschiedlichen Ausprägungen (Athyreose,
Hypoplasie, Ektopie) stellt eine häufige Fehlbildung dar. Bisher ist es nur bei einem
kleinen Anteil der Patienten gelungen, durch einen Mutationsnachweis in den bisher
bekannten
Kandidatengenen
(NKX2.1,
Schilddrüsendysgenesie zu klären [15].
PAX8,
FOXE1)
die
Ätiologie
der
1 Einleitung
13
Ein besseres Verständnis der Organo- und Morphogenese der Schilddrüse stellt eine
wichtige Voraussetzung für die Klärung der Pathogenese der Schilddrüsendysgenesie
dar. Diesbezüglich können Leber und Pankreas, ebenfalls Organe endodermalen
Ursprungs, wichtige Hinweise auf entwicklungsrelevante Strukturen und Signalwege
liefern, die die frühe Organogenese beeinflussen.
Studien in verschiedenen Modellorganismen der Entwicklungsbiologie haben gezeigt,
dass Herz- und Gefäßanlagen einen entscheidenden Einfluss auf die Leber- und
Pankreasentwicklung ausüben [37]. Außerdem machen Fehlbildungen des Herzens und
der großen Gefäße ca. die Hälfte der assoziierten Fehlbildung bei CH aus [12, 14, 20].
Daher
kann
postuliert
werden,
dass
Herz
und
Gefäße
auch
die
Schilddrüsenentwicklung beeinflussen. Vor diesem Hintergrund wurden im Rahmen
dieser Arbeit folgende Hypothesen untersucht.
 Es besteht eine Ko-Entwicklung der arteriellen zervikalen Gefäße und der
Schilddrüse
Zur Überprüfung dieser Hypothese wurde die Entwicklung der Schilddrüse
und
benachbarter
Gefäßstrukturen,
insbesondere
der
Kiemenbogenarterien, in verschiedenen embryonalen Stadien mittels
3-dimensionaler Rekonstruktionen dargestellt.
 Eine gestörte Entwicklung der Gefäße führt zu einer Schilddrüsendysgenesie.
Diese Hypothese wurde in der Shh-defizienten Dsh-Mausmutante
untersucht, bei der sowohl eine Asymmetrie der Schilddrüse als auch der
Halsgefäße besteht. Hierzu wurde die Entwicklung der Schilddrüse und
der Gefäße 3-dimensional rekonstruiert.
 Eine Shh-Defizienz führt zu einer
zellautonomen
Störung des Expressionsprofils der
Transkriptionsfaktoren
Nkx2.1,
Pax8,
Foxe1
der
Schilddrüsenanlage.
Dies
wurde
durch
in-situ-Hybridisierungen
homozygoten Embryonen überprüft.
in
Wildtyp-
und
Dsh-
2 Material und Methoden
2
14
Material und Methoden
2.1
Material
2.1.1
Geräte
Im Rahmen dieser Arbeit wurden folgende Geräte verwendet:
Gerät
Hersteller
Biophotometer 6131
Eppendorf
Brutschrank B 6120
Heraeus
Digitalkameras HRc, MRc5
Zeiss
Eismaschine AF-30
Scotsman
Geldokumentationssystem E.A.S.Y. Win 32
Heraeus
Gelkammern und Spannungsquellen
Biometra, peqlab
Gewebeprozessor TP 1020
Leica
Heizblock DB 3
Techne
Heizplatte HI 1220
Leica
Hybridisierungsofen OV2
Biometra
Kaltlichtquelle KL1500 LCD
Leica
Mikroskope:
Axiostar plus
Zeiss
Leica DMR HC
Leica
Stereomikroskope MZ 6, MZ 12.5
Leica
Mikrotom 2050 Supercut
Reichert-Jung
Paraffindispenser EG 1120
Leica
Paraffinstreckbad Typ 1052
Gesellschaft für Labortechnik
pH-Meter MP 220
Mettler-Toledo
Pipetten Eppendorf research
Eppendorf
Sequenzer ABI 3130 Genetic Analyzer
Applied Biosystems
Software
Digitalphotographie Axiovision 4.5
Zeiss
3-dimensionale Rekonstruktion SURFdriver 3.5
Moody/Lozanoff
Thermocycler
Gene Amp PCR System 2400, 2700, 9600
MasterCycler Gradient
Applied Biosystems
Eppendorf
Thermomixer compact
Eppendorf
Trockenschränke B15, T 6060
Heraeus
Vortexer K550 GE
Bender & Hobin
2 Material und Methoden
15
Gerät
Hersteller
Waagen
FI 1500
Fischer
PM 200
Mettler
Wärmeschrank ULM 400
Memmert
Wasserbad W13 mit Erhitzer D6
Haake
Wipptisch WT 15
Biometra
Zentrifugen
2.1.2
Biofuge A
Heraeus
Sorval
Heraeus
Typ 5415 C, 5415 D, 5415 M, 5417 R
Eppendorf
Chemikalien und Substanzen
Folgende Substanzen und Chemikalien wurden verwendet:
Hersteller
Chemikalien und Substanzen
Fermentas
10x PCR-Puffer (KCl, 15 mM MgCl2), 10x Y+/Tango-Restriktionspuffer, 6x Ladepuffer,
dNTPs, Gene Ruler 100 bp DNA ladder plus
Fluka
Betain, Nonidet 40
Invitrogen
50x Denhardt´s, Agarose, RNaseOUT
Kodak
Photoemulsion, Photo-Entwickler, Photo-Fixierer
Merck
3-(Triethoxsilyl)-propylamin, 30% Wasserstoffperoxid (H2O2), Aceton, Chloroform,
TM
®
(40 U/µl), TRIZOL -Reagent
Entellan , Ethanol p.a., Ethidiumbromid, Extran MA 01 alkalisch, Formamid, Glycerin,
Glycin,
HPLC-H20,
Isopropanol,
Kaliumchlorid
(KCl),
Kaliumdihydrogenphosphat
(KH2PO4), konzentrierte Essigsäure, Methanol p.a , Dinatriumhydrogenphosphat
(Na2HPO4),
Natriumhydroxid
Natriumcitratdihydrat,
(NaOH),
Paraformaldehyd
(hydroxymethyl)-aminomethanacetat
(PFA),
Natriumacetat,
Phenol,
(Tris-Acetat),
Salzsäure
Natriumcitrat,
(HCl),
Tris-
Tris-(hydroxymethyl)-
aminomethanhydrochlorid (Tris-HCl), Zitronensäure
Roche
Glycogen, NTPs, RNase Inhibitor (40 U/µl), 10x Transkriptionspuffer
Roth
Agar-Agar, Hefeextrakt, Isoamylalkohol, NaCl, 20% SDS, Xylol
Sigma
Ampicillin, Betain, Diethylpyrocarbonat (DEPC), Dextran, EDTA, Eosin Y-Färbelösung,
Glutaraldehyd, Harris Hämatoxylin-Färbelösung, Heparin, Levamisol, Lithiumchlorid
(LiCl2), Maleinsäure, Magnesiumchlorid (MgCl2), Natrium-Deoxycholat, RNA Typ III von
Saccharomyces cerevisiae, Toluidine Blue O, Tween 20, 5-Bromo-4-chloro-3-indolyl ßD-Galactopyranosid (X-Gal)
2 Material und Methoden
16
Hersteller
Chemikalien und Substanzen
Sonstige
33
P-UTP (Amersham), Agarose (Gibco RBL) , Bacto
TM
Yeast extract (DIFCO), BigDye®-
Terminator v3.1-Sequenzier-Mix (Applied Biosystems), Paraffin (Leica), PE-Puffer
®
(Qiagen), RNAlater (Qiagen), Röntgenfilmentwickler (Agfa), Röntgenfilmfixierer (Agfa),
Tryptone Pepton (Becton Dickinson),
2.1.3
Verwendete Kits
Folgende vorgefertigte Reaktionssysteme (Kits) wurden verwendet:
Kit
Hersteller
BigDye® Terminator v3.1 Cycle Sequencing Kit
Applied Biosystems
DIG Nucleic Acid Detection Kit
Roche
DIG RNA Labeling Kit (SP6/T7)
Roche
Omniscript™ RT Kit
Qiagen
Qiagen Plasmid Mini/Maxi Kit
Qiagen
QIAquick Gel Extraction Kit
Qiagen
QIAquick PCR Purification Kit
Qiagen
®
®
TOPO TA Cloning Kit (pCR 2.1-TOPO-Vektor)
2.1.4
Invitrogen
Verwendete Enzyme
Folgende Enzyme wurden verwendet:
Enzym
Hersteller
DNase I, RNase-frei (10 U/µl)
Roche
EcoRI-Restriktionsenzym und Puffer
New England Biolabs
Proteinase K (20 mg/ml)
Boehringer
RNase A (10 mg/ml)
Sigma
SpeI-Restriktionsenzym
Fermentas
T7 RNA-Polymerase
Roche
TAQ-Polymerase und Puffer
MPI für molekulare Genetik , Berlin
Bioline
2.1.5
Verwendete Primer
Soweit nicht anders genannt, wurden die Oligonukleotide von Thermo Hybaid oder
MWG Biotech AG bezogen. Folgende Oligonukleotide wurden im Rahmen dieser Arbeit
verwendet:
2 Material und Methoden
2.1.6
17
Primer
Sequenz bzw. Hersteller
D5Mit 72 F3
5´- TTC AAA CAC CCA GAA GAG TGG – 3
D5Mit 72 R
5´- GGT CTG CAA CTG GGA CTT GT – 3´
mFoxe1-F
5´- GCA AGG AGC GAG CAG TGC GC - 3´
mFoxe1-3´UTR-R
5´- GCA AGA CAC CGA GCC TCC ACG - 3´
mNkx2.1-3´UTR-F
5´- GTG TCT TTC TGG TAG TTC AAA TGG - 3´
mNkx2.1-3´UTR-R
5´- GAT TGG TGC TGC AAA TAC CAA AC - 3´
mPax8-5-F
5´- CAT CCG GAC CAA AGT GCA GC - 3´
mPax8-7-R
5´- GCA TAG GCC TCC GGG TAA TG - 3´
M13 Forward
5´- GTA AAA CGA CGG CCA G - 3´ , Invitrogen
M13 Reverse
5´- CAG GAA ACA GCT ATG AC - 3´, Invitrogen
Xt C3 for
5´ - GGC CCA AAC ATC TAC CAA CAC ATA G - 3´
Xt C3 rev
5´ - GGT GGC TGC TGC ATG AAG ACT GAC - 3´
XtJ 580 for
5´ - TAC CCC AGC AGG AGA CTC AGA TTA G - 3´
XtJ 580 rev
5´ - AAA CCC GTG GCT CAG CAC AAG - 3´
Oligo-dT-Primer
Qiagen
Häufig verwendete Puffer und Lösungen
Folgende Puffer und Lösungen wurden häufiger eingesetzt:
Lösung/Puffer
Zusammensetzung
DEPC-H2O
0,1% DEPC in ddH2O, ü/N bei 37 C inkubieren,
autoklavieren
1x PBS, pH 7,4
3 mM KCl, 2 mM KH2PO4, 10 mM Na2HPO4, 137 mM
NaCl in ddH2O; 0,1% DEPC, ü/N bei 37 °C inkubieren,
autoklavieren
2.1.7
PBST
0,1% Tween 20 in 1x PBS
4% PFA, pH 7,4
4% Paraformaldehyd in 1x PBS
20x SSC, pH 7,0
3 M NaCl, 0,3 M NaCitrat
Sonstiges verwendetes Material
Außerdem wurden folgende Materialien verwendet:
Material
Hersteller
Deckgläser für Objektträger
Roth
Einbettkassetten ohne Deckel
Roth
Mikrotom-Klingen
Leica
Objekträger
Marienfeld
2 Material und Methoden
2.2
2.2.1
2.2.1.1
18
Material
Hersteller
Petrischalen
Falcon
Pipettenspitzen
Gilson, Biozym, Eppendorf
Reagenzgefäße
Eppendorf, Applied Biosystems
Röntgenfilm Biomax
Kodak
Tissue Loc Kassetten Histo Screen
Richard-Allan Scientific
Methoden
Mausarbeiten
Maushaltung und –zucht
Die Maushaltung erfolgte im institutseigenen Maushaus des Max-Planck-Institutes für
molekulare Genetik, Berlin unter weitgehend sterilen Bedingungen in einem 12/12Stunden Hell-/Dunkelrhythmus. Ein bei der täglichen Untersuchung der Weibchen
vorhandener Vaginalpropf (Plug) zeigte eine stattgehabte Kohabitation an. Aufgrund
des vorwiegend nachtaktiven Verhaltens der Mäuse wurde als Kohabitationszeitpunkt
0 Uhr der vergangenen Nacht angenommen, somit war am Mittag des Plugtages der
Tag 0,5 p.c. Da dies aber nur eine ungefähre Angabe darstellte, wurde bei der
Präparation der Embryonen das Embryonalstadium erneut überprüft und bei Bedarf
korrigiert (siehe Abschnitt 2.2.1.2).
Die Dsh-Maus ist der AG Mundlos von Dr. P.B. Selby, Oakridge, TN, USA, überlassen
worden. Es handelt sich um eine röntgenstrahlinduzierte Mausmutante, die erstmals in
Nachfahren von (101 x C3H)F1-Hybridböcken aufgetreten ist und im Verlauf in den
C57BL/10-Inzuchtstamm eingekreuzt wurde [45, 48].
Die XtJ-Mausmutante ist ein Mausmodell für das Greig-CephaloploysyndactylieSyndrom (GCPS). Sie beruht auf einer Deletion von Teilen des Gli3-Gens auf
Chromosom 13. Das resultierende Fusionstranskript ist nicht funktionell, da ihm für
DNA-Bindungselemente kodierende Sequenzen fehlen [49].
2.2.1.2
Mauspräparation
Bei Erreichen der gewünschten Tragezeit wurde das Weibchen mittels Genickbruch
getötet. Der Bauch wurde mit 70% Ethanol befeuchtet, die Bauchdecke sowie das
Peritoneum eröffnet, der Uterus als Ganzes entnommen und in 1x PBS überführt. Unter
dem Stereomikroskop erfolgte die Eröffnung der einzelnen Uterusabschnitte und die
Trennung des Embryos mitsamt der ihn umgebenden Eihäute von der Plazenta.
2 Material und Methoden
19
Handelte es sich um Verpaarungen mutanter Mäusstämme, wurden für eine spätere
Genotypisierung die Eihäute des Embryos bei -20 °C konserviert. Für eine eindeutige
Zuordnung wurden die Embryonen und Eihäute nummeriert und einzeln aufbewahrt.
Während der Präparation erfolgte die Überprüfung des Entwicklungsstadiums der
Embryonen anhand morphologischer Merkmale unter Zuhilfenahme des „Atlas of
mouse development“ [50]. Als besonders geeignet erwies sich hierbei die Entwicklung
der
Extremitäten,
die
zwischen
den
Stadien
E9.5
bis
E14.5
ausgeprägten
morphologischen Veränderungen unterliegen. Bereits bei der Präparation konnten Dshhomozygote Embryonen auf Grund ihres Phänotyps identifiziert werden [45, 51]. Dies
wurde zusätzlich durch Genotypisierung überprüft (siehe Abschnitt 2.2.1.3).
2.2.1.3
Die
Genotypisierung
Genotypisierung
der
Dsh-Mausmutante
erfolgte
anhand
des
D5Mit72
Mikrosatelliten-Markers, welcher sich zwischen den Mausstämmen C57BL/10, in dem
die Mutante gehalten wird, und 101, in dem die Mutante generiert worden ist,
unterscheidet und zur Dsh-Mutation gelinkt ist [45].
Für die Genotypisierung der XtJ-Mutante wurden 2 Primerpaare verwendet, wobei das
C3-Primerpaar innerhalb der Deletion lokalisiert ist, das XtJ 580-Primerpaar hingegen
beidseits des Deletionsbruchpunktes bindet. Hierdurch ist es mittels zweier PCRs
möglich, homozygote, heterozygote sowie Wildtyp-Individuen zu unterscheiden [49].
Tabelle 2.1: Primer und PCR-Bedingungen der Genotypisierungen
DshGenotypisierung
J
Xt -WildtypGenotypisierung
J
Xt -MutationsGenotypisierung
F-Primer
D5Mit 72 F3
Xt C3 for
XtJ 580-for
R-Primer
D5Mit 72 R
Xt C3 rev
XtJ 580-rev
Annealing-Temperatur
53 ºC
60 ºC
60 ºC
Zyklen
35
30
35
Agarose-Gel
4%
1,5%
1,5%
Die mittels PCR (siehe Tabelle 2.1 sowie Abschnitt 2.2.3.4) aus genomischer DNA
(siehe Abschnitt 2.2.3.1) amplifizierten PCR-Produkte wurden durch Agarose-GelElektrophorese aufgetrennt und der Genotyp anhand der Bandenlänge bestimmt (siehe
Abbildung 2.1).
2 Material und Methoden
20
Abbildung 2.1: 4% Agarosegel einer Dsh-Genotypisierungs-PCR
Der rote Rahmen markiert die Position der Banden des D5Mit72-Mikrosatelliten-Markers. Von den hier
genotypisierten Mäusen entsprechen die Mäuse 237, 238, 239, 242, 244, 245, 251, 253, 256 und 258
dem Wildtyp, 236, 240, 241, 243, 250, 252, 254, 255 und 257 dem Dsh/+ heterozygoten Genotyp.
2.2.2
2.2.2.1
Histologie
Herstellung silanisierter Objektträger
Für eine bessere Haftung der Gewebedünnschnitte wurden die Objektträger silanisiert.
Zur Reinigung wurden die Objektträger über Nacht in 15% Extran -Lösung eingeweicht
und gründlich mit Leitungswasser sowie Aqua dem. gespült. Eine Inaktivierung von
RNasen wurde durch Backen (3 Std., 180 °C) der Objektträger erreicht. Der eigentliche
Vorgang der Silanisierung beinhaltete das Tauchen der Objektträger in 2% 3(Triethoxysilyl)-propylamin/Aceton (5 min), Aceton (2 x 5 min) und ddH20 (5 min).
Abschließend wurden sie getrocknet (ü/N, 45 °C).
2.2.2.2
Entwässerung der Embryonen für die Einbettung in Paraffin
Für die Einbettung in Paraffin wurden die Embryonen nach der Präparation in 4% PFALösung (ü/N, 4 °C) fixiert. Auf einem Wipptisch wurden die fixierten Embryonen mit
1x PBS (2 x 10 min, rt) gewaschen und mit 70% Ethanol/DEPC-H2O (60 min, Rt)
entwässert. In frischem 70% Ethanol/DEPC-H2O konnten die Embryonen bei 4 °C bis
zu 4 Wochen aufbewahrt werden.
Abhängig von der Größe durchliefen die Embryonen im Gewebeprozessor vor der
Einbettung in Paraffin zunächst eine aufsteigende Ethanolreihe (90%, 95%, 3 x 100%;
je 60-120 min; 100% Ethanol unter Vakuum). Danach wurden sie in Xylol (2 x 15 min,
2 Material und Methoden
21
1 x 30 min, Vakuum), in 50% Xylol/Paraffin (3 Std., 58 °C, Vakuum) und in Paraffin (2 x
3 Std., 58 °C, Vakuum) inkubiert. Die Einbettung erfolgte mit 58 °C warmem Paraffin in
vorgewärmten Einbettformen aus Metall. Während das Paraffin abkühlte und
aushärtete, wurden die Embryonen ausgerichtet. Die Paraffinblöcke wurden bei 4 °C
aufbewahrt.
2.2.2.3
Herstellung von Paraffin-Gewebeschnitten
Mit einem Mikrotom wurden 7 µm dicke Gewebedünnschnitte der in Paraffin
eingebetteten Embryonen angefertigt. Zur Glättung wurden die Schnitte kurz in ddH2O
(40 °C) überführt und auf vorgewärmte, silanisierte Objektträger aufgezogen. Diese
wurden über Nacht bei 37 °C getrocknet und bis zur weiteren Verwendung dunkel bei rt
gelagert.
2.2.2.4
Hämatoxylin-Eosin-Färbung
Die Hämatoxylin-Eosin-Färbung gehört zu den Standardmethoden zur Anfärbung von
Gewebedünnschnitten. Insbesondere die Verwendung in Paraffin eingebetteter
Embryonen ermöglicht hierbei eine gute morphologische Darstellung der verschiedenen
Gewebe.
Das Paraffin wurde durch Erhitzen der Objektträger (10-15 min, 58 °C) aufgeweicht und
mit Xylol (2 x 10 min) entfernt sowie die Schnitte in einer absteigenden Ethanolreihe
(100%, 90%, 70%, ddH2O; je 5 min) rehydriert. Als Erstes erfolgte die Färbung mit
Hämatoxylin (3 min). Die Schnitte wurden kurz mit ddH2O gespült und mit
Leitungswasser gebläut (ca. 10 min). Als Zweites erfolgte nach erneuter Spülung mit
ddH2O die Färbung mit frisch angesäuerter Eosin-Lösung (0,5% konzentrierte
Essigsäure; 4 min). Es folgte eine kurze Spülung in ddH2O und 70% Ethanol sowie die
Dehydrierung in Ethanol (90%, 100%; je 5 min) sowie Xylol (2 x 5 min). Für die
Eindeckelung wurde Entellan verwendet.
2.2.2.5
NKX2.1-Antikörperfärbung
Die NKX2.1-Antikörperfärbung wurde vom Institut für Neuropathologie der Charité –
Universitätsmedizin in Berlin, Campus Virchow Klinikum unter der Leitung von Dr. van
Landeghem durchgeführt. Es wurde dabei das Standardprotokoll des Instituts unter
Verwendung eines Antikörpers gegen humanes NKX2.1 angewendet.
2 Material und Methoden
2.2.3
22
Molekularbiologische Methoden
2.2.3.1
Isolierung genomischer DNA aus Mausgewebe
Als Gewebe zur DNA-Isolation diente bei Embryonen die Eihaut, bei Jungtieren im Alter
von wenigen Wochen gewonnene Schwanzspitzenbiopsien.
Zunächst wurde das Gewebe mit Proteinase K (20 µg/ml; ü/N, 55 °C) verdaut und die
Zelltrümmer mit ½ Volumen 5 M NaCl gefällt. Nach je 10 min bei rt auf einem Wipptisch
sowie auf Eis wurden die Proben zentrifugiert (10 min, 7000 rpm, 4 °C) und der
Überstand in ein neues Reaktionsgefäß überführt. Die DNA wurde mit dem doppeltem
Volumen eiskaltem 100% Ethanol p.a. und Zentrifugation (10 min, 13000 rpm, 4 °C)
gefällt und das DNA-Pellet mit 300 µl 70% Ethanol gewaschen. Nach erneuter
Zentrifugation (5 min, 13000 rpm, 4 °C) wurde das Pellet getrocknet und in 100 µl 1x TE
gelöst. Die Aufbewahrung der DNA erfolgte bei 4 °C.
Lösung/Puffer
Zusammensetzung
PK-SDS-Puffer, pH 7,5
17 mM Tris-HCl, 17 mM EDTA, 170 mM NaCl,
0,846% (w/v) SDS in ddH2O
1x TE, pH 8,0
2.2.3.2
10 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA in ddH2O
Isolation von Gesamt-RNA aus Mausgewebe
Zur Isolierung der Gesamt-RNA eines Embryos wurde dieser nach der Präparation
sofort in RNAlater® überführt und bei –80 °C eingefroren.
Die Isolation der Gesamt-RNA erfolgte mit dem TRIZOL -Reagent entsprechend dem
Standardprotokoll [52]. Die RNA wurde in 10-15 µl DEPC-H2O gelöst und bei –80 °C
gelagert.
2.2.3.3
Herstellung von cDNA
Unter cDNA versteht man eine zur mRNA komplementäre DNA. Durch Verwendung
eines oligo-dT-Primers und einer Reversen Transkriptase kann cDNA aus Gesamt-RNA
generiert werden. Hierzu wurde der Omniscript™ RT Kit eingesetzt und das
Standardprotokoll angewendet [53].
Die Aufbewahrung der cDNA erfolgte bei –20 °C. Für die PCR wurde ein Aliqout des
Reaktionsgemisches eingesetzt.
2 Material und Methoden
2.2.3.4
23
Polymerasekettenreaktion (PCR)
Die Polymerasekettenreaktion (PCR) ermöglicht die exponentielle Amplifikation
ausgewählter
DNA-Fragmente
durch
Verwendung
zweier
sequenzspezifischer
Oligonukleotid-Primer sowie einer thermostabilen DNA-Polymerase (TAQ) [54].
Sondenherstellung
Genotypisierungs-PCR
10x PCR-Puffer
2,5 µl
10x PCR-Puffer
5,0 µl
dNTPs (je 1,25 mM)
2,0 µl
dNTPs (je 2,5 mM)
0,5 µl
Forward-Primer (10 µM)
1,0 µl
Forward-Primer (25 µM)
1,0 µl
Reverse-Primer (10 µM)
1,0 µl
Reverse-Primer (25 µM)
1,0 µl
TAQ-Polymerase
0,5 µl
TAQ-Polymerase
0,5 µl
H2O
17,0 µl
H2O
41,0 µl
DNA
1,0 µl
DNA
1,0 µl
Gesamtvolumen
25 µl
Gesamtvolumen
50 µl
Bei der PCR wurde die Doppelstrang-DNA zunächst denaturiert (5 min, 95 °C). Es
folgten 30-40 Zyklen mit 3 Schritten:
▪ Denaturierung (1 min, 95 C)
▪ Annealing der Primer (1 min, Temperatur abhängig vom Primer)
▪ Elongation durch die TAQ-Polymerase ( ~1 min pro 1000 bp, 72 °C).
Abschließend folgte eine finale Elongation für 8-10 min.
Bei der PCR für die Sonden Foxe1und Pax8 wurde zusätzlich Betain (Endkonzentration
5 mM) eingesetzt. Die Tabelle 2.1 und Tabelle 2.2 geben einen Überblick über die PCRBedingungen.
2.2.3.5
Agarose-Gel-Elektrophorese
Die Agarose-Gel-Elektrophorese (1-4% Agarose in 1x TAE-Puffer) diente der
Auftrennung von Nukleinsäure-Fragmenten in Abhängigkeit von ihrer Länge. Zur
Darstellung der Fragmente wurde den Gelen Ethidiumbromid (0,4 µg/ml) zugesetzt, das
mit Nukleinsäuren interagiert und unter UV-Licht fluoresziert. Das erhärtete Gel wurde
in mit 1x TAE-Puffer gefüllte Horizontalkammern überführt. 5–10 µl des PCR-Produktes
wurden mit 6x-Ladepuffer vermischt in die Geltaschen eingebracht. Es wurde eine
Spannung von 80–120 V angebracht. Als Größenstandard wurde eine 100 bp-DNALeiter mitgeführt.
2 Material und Methoden
24
Die Auswertung der Gele erfolgte auf einem UV-Transluminator. Das Ergebnis wurde
mit dem Geldokumentationssystem E.A.S.Y. Win 32 festgehalten.
2.2.3.6
Lösung/Puffer
Zusammensetzung
1x TAE, pH 8,3
40 mM Tris-Acetat, 1 mM EDTA, pH 8,3 in ddH2O
Aufreinigung von PCR-Produkten
Die Aufreinigung von PCR-Produkten vor der weiteren Verarbeitung erfolgte mit dem
QIAquick
PCR-Purification Kit. Es wurde dabei das Standardprotokoll [55] mit
folgenden Änderungen verwendet:
▪
Die Zentrifugationszeit in den Schritten 3 und 5 wurde auf 2 min, die in
Schritt 6 auf 5 min verlängert.
▪
2.2.3.7
Die DNA wurde mit 30 µl dH2O eluiert.
Isolierung von DNA-Fragmenten aus Agarose-Gel
Für die Isolierung und Aufreinigung von DNA-Fragmenten aus Agarose-Gelen wurde
der QIAquick Gel Extraction Kit verwendet. Es wurde das Standardprotokoll [56] mit
folgenden Änderungen verwendet:
▪
Die Zentrifugationszeit der Schritte 7, 9, 10 wurde auf 2 min, die des
Schrittes 11 auf 5 min verlängert.
2.2.3.8
▪
Im Schritt 10 wurde zweimal mit je 500 µl QG-Puffer gewaschen.
▪
Die DNA wurde mit 20 µl dH2O eluiert.
TOPO-Klonierung
Für die spätere Transkription und Markierung der Sonden wurden die PCR-Fragmente
in den pCR 2.1-TOPO-Vektor kloniert, der einen T7-Promoter enthält. Für die
Klonierungsreaktion wurden 2 µl aufgereinigtes PCR-Produkt (siehe Abschnitt 2.2.3.6
bzw. 2.2.3.7) eingesetzt und das Standardprotokoll des TOPO-TA-Cloning-Kit
verwendet [57].
2.2.3.9
Transformation und Bakterienanzucht
Für die Transformation wurden E.coli-Bakterien des Stammes DH5
(Invitrogen)
verwendet. Die Transformation der Bakterien erfolgte nach Protokoll [57].
Die Selektion der Bakterien erfolgte auf mit X-gal (40 µl à 40 mg/ml) bestrichenen,
Ampicillin-haltigen LB-Agar-Platten (LBamp). Nur transformierte Bakterienklone können
2 Material und Methoden
25
auf Grund der auf dem pCR 2.1-TOPO-Vektor kodierten Ampicillin-Resistenz wachsen.
Bei orthotoper Klonierung wird das LacZ-Gen des Plasmids zerstört, die Bakterien
können X-gal nicht mehr verstoffwechseln und die Kolonien erscheinen weiß.
Durch Animpfen von LBamp-Medium mit einem Bakterienklon und Inkubation im
Brutschrank (ü/N, 37 °C, 220 rpm) wurde eine Amplifikation des Plasmides erreicht. Je
nach zu erzielender Plasmidmenge wurden 4 ml (Mini) bzw. 250 ml (Maxi) LBampMedium verwendet.
Zum Anlegen eines Glycerolstocks wurde ein Aliquot der Bakterienkultur im Verhältnis
1:1 mit Glycerol vermischt und bei –80 C gelagert.
Lösung/Puffer
Zusammensetzung
LB-Medium nach Miller, 1% Tryptone, 0,5% Hefe-Extrakt, 1% NaCl in
pH 7.0
Aqua dem, autoklavieren
LBamp-Medium
LB-Medium, mit 50 µg/ml Ampicillin versetzt
LB-Agar-Platten
1,5% Agar in LB-Medium, in Petrischalen
gegossen, Lagerung bei 4 C
2.2.3.10 Plasmidpräparation
Mini-Präparation
Zur Gewinnung kleinerer Mengen Plasmid-DNA wurde ein 4 ml-Kulturansatz verwendet.
Die Bakterienkultur wurde zunächst zentrifugiert (10 min, 4 000 rpm) und der Überstand
verworfen. Des Weiteren wurde das Standardprotokoll [58] des QIAprep Miniprep Kit
mit folgenden Änderungen verwendet:
▪
Die Zentrifugationszeit in Schritt 6, 8 und 10 wurde auf 2 min, in Schritt 9
auf 5 min verlängert
▪
Schritt 8 wurde wiederholt.
Maxi-Präparation
Zur Gewinnung größerer Mengen Plasmid-DNA wurde ein 250 ml Kulturansatz
verwendet. Die Präparation der Plasmid-DNA erfolgte mit dem Qiagen Plasmid Maxi
Kit entsprechend dem Standardprotokoll [59].
2 Material und Methoden
26
2.2.3.11 Plasmidverdau mit Restriktionsenzymen
Überprüfen der Insertlänge
Die
„cloning
site“
des
pCR 2.1-TOPO-Vektors
wird
beidseits
von
EcoRI-
Restriktionsstellen flankiert. Ein Restriktionsverdau mit EcoRI-Enzym (1 Std., 37 °C)
führte
zum
Ausschneiden
des
orthotop
inserierten
DNA-Fragmentes.
Die
Fragmentlänge wurde durch Agarose-Gel-Elektrophorese überprüft (siehe Abschnitt
2.2.3.5).
Eco-R1-Restriktionsverdau
10x EcoRI-Puffer
2 µl
EcoRI-Restriktionsenzym (20 U/µl)
1 µl
Plasmid-DNA
17 µl
Gesamtvolumen
20 µl
Linearisierung
Um in der nachfolgenden Transkription eine einzelsträngige antisense-RNA zu erhalten,
wurde zunächst das Plasmid linearisiert. Hierbei war sicherzustellen, dass das
inserierte
DNA-Fragment
keine
Restriktionsstellen
des
verwendeten
Restriktionsenzyms enthielt. Der Restriktionsverdau erfolgte für mindestens 3 Std. bei
37 °C.
Linearisierung
10x Restriktionspuffer Y+/Tango
10 µl
Restriktionsenzym SpeI (10 U/µl)
5 µl
Plasmid-DNA: 30 µg
x µl
(85 – x) µl
dH2O
Gesamtvolumen
100 µl
Zur Inaktivierung von Restriktionsenzym und RNasen schloss sich ein Proteinase KVerdau an (0,2 µg/µl; 1 Std., 37 °C).
Die Aufreinigung der DNA erfolgte mittels Phenol/Chloroform-Schüttelextraktion. Hierzu
wurde
das
Probenvolumen
mit
DEPC-H2O
auf
aufeinanderfolgenden Schritten je 500 µl
▪
Phenol
▪
Phenol-Chloroform-Isoamylalkohol (25:24:1)
▪
Chloroform-Isoamylalkohol (24:1)
500
µl
aufgefüllt
und
in
2 Material und Methoden
27
hinzugefügt, kräftig geschüttelt, zentrifugiert (15 min, 13000 rpm, 4 °C) und die obere
Phase in ein neues Reagenzgefäß überführt. Es folgte die Fällung der DNA mit
1
/10 Volumen 3 M Na-Acetat, pH 5,2 und doppeltem Volumen 100% Ethanol p.a.
(30 min, -20 °C) und Zentrifugation (20 min, 13000 rpm, 4 °C). Das DNA-Pellet wurde
zweimal mit 70% Ethanol/DEPC-H2O gewaschen und zentrifugiert (10 min, 13000 rpm,
4 °C). Das luftgetrocknete Pellet wurde in 25 µl DEPC-H2O gelöst und bei –20 °C
aufbewahrt.
Zur Kontrolle
werden
jeweils 1
µg unverdautes Plasmid sowie
1
µl des
Linearisierungsproduktes auf ein 1% Agarosegel aufgetragen.
2.2.3.12 Sequenzierung
Um die Orientierung des inserierten DNA-Fragmentes im Plasmid zu bestimmen, wurde
dieses mit den Standardprimern M13 Forward bzw. Reverse sequenziert.
Sequenzierung
5x BigDye sequencing buffer
2 µl
BigDye®-Sequenziermix
1 µl
Primer (5 µM)
1 µl
Plasmid-DNA
1-5 µl
dH2O
0-4 µl
Gesamtvolumen
10 µl
Die Sequenzreaktion erfolgt einer 30-Zyklen-Reaktion:
▪
Denaturierung: 95 C, 30 s (initial 1 min)
▪
Annealing: 55 C , 15 s
▪
Elongation: 60 C, 4 min (final 8 min)
Das Produkt wurde mit 1/5 Volumen 1,5 M Natriumacetat (pH 5,5) und doppeltem
Volumen 100% Ethanol gefällt und zentrifugiert (30 min, maximale Geschwindigkeit,
4 °C). Das Pellet wurde mit 200 µl 70% Ethanol gewaschen und zentrifugiert (15 min,
maximale Geschwindigkeit) und 30 min bei 50 °C getrocknet. Die Resuspension
erfolgte in 10 µl HPLC-H2O.
Die Erstellung der Sequenzen erfolgte mit dem ABI 3130 Genetic Analyzer mittels
Kapillargelelektrophorese.
2 Material und Methoden
2.2.4
28
In-situ-Hybridisierungen
Die in-situ-Hybridisierung ermöglicht es, die Expression eines Gens in bestimmten
Geweben und Organen auf Ebene der mRNA nachzuweisen.
Abbildung 2.2: Schematischer Überblick über die Arbeitsschritte der in-situ-Hybridisierungen
Das Flussdiagramm gibt einen Überblick über die Arbeitsschritte der beiden verwendeten in-situHybridisierungsprotokolle. Beiden Protokollen gemeinsame Schritte sind in gelb dargestellt. Grün
repräsentiert Arbeitsschritte der whole-mount in-situ-Hybridisierung, blau/lila der radioaktiven in-situHybridisierung, magenta der Sondenherstellung und orange/lila der Embryonenverarbeitung.
2.2.4.1
Verwendete Sonden
Tabelle 2.2: Sonden für die in-situ-Hybridisierungen
Pax8
Nkx2.1
Foxe1
F-Primer
mPax8-5-F
mNkx2.1-3´UTR-F
mFoxe1-F
R-Primer
mPax8-7-R
mNkx2.1-3´UTR-R
mFoxe1-3´UTR-R
Annealing-Temperatur
58.5 °C
60.6 °C
61,5 °C
Template
cDNA, E10.5/11.5
genomische DNA
genomische DNA
Zyklen
40
30
30
Produktlänge
341 bp
499 bp
417 bp
Tabelle 2.2 gibt einen Überblick über die für die in-situ-Hybridisierungen generierten
Sonden, Abbildung 2.3 über deren Lage.
2 Material und Methoden
29
Abbildung 2.3: Schematischer Überblick über die Lage der Sonden
(A) Pax8, (B) Nkx2.1, (C) Foxe1. Untranslatierte Regionen sind gelb, translatierte Exons blau bzw. lila
dargestellt. Die antisense-Sonde wird durch einen rosafarbenen Pfeil in entsprechender Orientierung
dargestellt.
Die Sonden Shh und Ptch1 wurden von der AG Mundlos, Max-Planck-Institut für
molekulare Genetik (Berlin), zur Verfügung gestellt.
2.2.4.2
Whole-mount in-situ-Hybridisierung
In den frühen Embryonalstadien E10.5 und E11.5 wurde das Expressionsmuster in
ganzen Embryonen mittels whole-mount in-situ-Hybridisierung dargestellt.
Digoxigenin(DIG)-Markierung der Sonden
Für die Markierung der Sonden wurde der DIG RNA Labeling Kit verwendet. Die
Transkription wurde entsprechend dem Standardprotokoll durchgeführt [60]. Die
markierte RNA wurde mit LiCl2 und Ethanol gefällt, in 100 µl DEPC-H2O gelöst und bei
-80 °C gelagert.
Quantität und Qualität der Sonde wurden durch Agarose-Gel-Elektrophorese beurteilt.
Fixierung und Entwässerung der Embryonen
Die Embryonen wurden in 4% PFA (ü/N, 4 °C) fixiert und auf einem Wipptisch in PBST
(2 x 10 min, rt) gewaschen. Die Entwässerung erfolgte mit 50% Methanol/PBST (2 x
10 min, rt) und 100% Methanol (10 min, rt). Bis zur weiteren Verwendung wurden die
Embryonen bei –20 °C in frischem 100% Methanol gelagert.
2 Material und Methoden
30
1. Tag: Vorbereitung der Embryonen und Hybridisierung
Die Embryonen wurden in einer absteigenden Methanol-Reihe (75%, 50%, 25% in
PBST; je 10 min, auf Eis) rehydriert, in PBST gewaschen (2 x 10 min) und mit 6% H 2O2
gebleicht (1 Std., rt). Danach wurden sie erneut in PBST gewaschen (3 x 10 min) und
durch Proteinase-K-Verdau (10 µg/ml; 3 min) permeabilisiert. Sie wurden in 0,2%
Glycin/PBST, PBST, RIPA-Puffer und nochmals PBST gewaschen (je 2 x 5 min) und in
0,2% Glutaraldehyd/PFA fixiert (20 min). Es folgte das erneute Waschen mit PBST (3 x
10 min), 50% WM-Hyb/PBST und WM-Hyb.
Zur Prähybridisierung wurden die
Embryonen zunächst in WM-Hyb inkubiert (1-3 Std., 65 °C).
Die DIG-markierte Sonde wurde 1:100 in WM-Hyb + RNA verdünnt, denaturiert (5 min,
85 °C) und dieser Sondenmix für die Hybridisierung (ü/N, 65 °C) verwendet.
2. Tag: Waschen und Antikörperinkubation
Die Embryonen wurden mit WM-Hyb (2 x 30 min, 65 °C) und 50% WM-Hyb/RNasePuffer (5 min, rt) gewaschen. Danach folgte der RNase-A-Verdau (100 µg/ml; 2 x
30 min, 37 °C) und das Waschen mit 50% (SSC/FA/T)/RNase-Puffer (5 min, rt). Die
Embryonen wurden in SSC/FA/T auf 65 °C erwärmt, mit SSC/FA/T (2 x 5 min, 3 x 10
min, 6 x 30 min, 65 °C), 50% (SSC/FA/T)/MABT (10 min, rt) und MABT (2 x 10 min, rt)
gewaschen. Die Embryonen wurden mit 10% Blocking Reagent/MABT präinkubiert. Die
Antikörperinkubation erfolgte mit Anti-DIG-AP-Konjugat (1:5000 in MABT; ü/N, 4 °C).
3. Tag: Waschen und Färbung
Ungebundene Antikörper wurden durch Waschen mit 0,05% Levamisol/PBST (3 x
5 min, 8 x 30-60 min, rt sowie ü/N, 4 °C) entfernt. Die Embryonen wurden in AP-Puffer
gewaschen (3 x 20 min). Die Farbreaktion erfolgte lichtgeschützt in AP-Färbelösung,
wobei der Erfolg regelmäßig unter dem Stereomikroskop überprüft wurde.
x. Tag: Abstoppen der Farbreaktion und Fixierung
Zum Abstoppen der Farbreaktion wurden die Embryonen in AP-Puffer gewaschen (3 x
20 min) und in 0,2% Glutaraldehyd/PFA fixiert (1 Std., rt) Danach wurden sie in 60100% Glycerin überführt und bei 4 °C gelagert.
2 Material und Methoden
31
Lösung/Puffer
Zusammensetzung
Proteinase-K-Puffer,
20 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA in DEPC-H2O
pH 7,0
RIPA-Puffer, pH 8,0
0,05% SDS, 150 mM NaCl, 1% Nonidet 40, 0,5%
(nicht autoklavierbar)
Natrium-Deoxycholat, 1 mM EDTA, 50 mM TrisHCl, in DEPC-H2O, bei 4 °C lagern
WM-Hyb
50% Formamid, 5 x SSC, 0,005% Heparin, 0,1%
Tween 20 in DEPC-H2O
WM-Hyb + RNA
100 µg/ml RNA Typ III in WM-Hyb
RNase-Puffer, pH 7,5
500 mM NaCl, 10 mM Tris-HCl, 0,1% Tween 20
in DEPC-H2O
SSC/FA/T
2x SSC, 50% Formamid, 0,1% Tween 20 in
DEPC-H2O
MABT, pH 7,5
100 mM Maleinsäure, 150 mM NaCl, 0,1%
Tween 20 in DEPC-H2O,
AP-Puffer, pH 9,5
100 mM Tris-HCl, 100 mM NaCl, 50 mM MgCl2,
0,1% Tween 20, 0,05% Levamisole in DEPCH20
AP-Farbelösung
2.2.4.3
0,045% NBT, 0,0175% BCIP in AP-Puffer
Radioaktive in-situ-Hybridisierung
In der späteren Embryonalentwicklung ist die whole-mount in-situ-Hybridisierung zur
Darstellung der Genexpression auf Grund der Größe der Embryonen insbesondere zur
Darstellung innerer Organe nicht mehr geeignet. Daher wurde ab dem Stadium E12.5
eine radioaktive in-situ-Hybridisierung auf Gewebedünnschnitten durchgeführt.
1. Tag: Vorbereitung der Gewebeschnitte
Die Gewebedünnschnitte wurden mit Xylol (2 x 5 min) vom Paraffin befreit und die
Schnitte in einer absteigenden Ethanolreihe (2 x 100%, 90%, 70%, 50%, 30%, 2 x
1x PBS; je 2 min) rehydriert. Um die Gewebepermeabilität zu verbessern, wurden die
Schnitte mit Proteinase K (10 µg/ml in 1x PBS; 3 min) verdaut und anschließend in 4%
PFA fixiert (10 min). In einer aufsteigenden Ethanolreihe (2 x 1x PBS, 30%, 50%, 70%,
90%, 2 x 100%) wurden die Schnitte erneut dehydriert.
2 Material und Methoden
32
1. Tag: Radioaktive Markierung der Sonden und Hybridisierung
Die radioaktive Markierung der Sonde wurde am 1. Tag der radioaktiven in-situHybridisierung durchgeführt.
Radioaktive Markierung
linearisierte Plasmid-DNA (1 µg)
x µl
10x Transkriptionspuffer
2 µl
NTPs (C,A,G) (je 250 pM)
2 µl
RNase-Inhibitor (40 U/µl)
1 µl
33
4 µl
RNA-Polymerase (20 U/µl)
2 µl
P-UTP (10 mCi/ml)
DEPC-H2O
Gesamtvolumen
(9-x) µl
20 µl
Im Anschluss an die Transkription (1 Std., 40 °C) wurde die Template-DNA mit 20 U
DNase I verdaut (20 min, 37 °C) und die markierte RNA mit LiCl2, Glycogen und
Ethanol gefällt (30 min, -20 °C). Die Probe wurde zentrifugiert (15 min, 15000 rpm,
4 °C), das Pellet mit 80% Ethanol gewaschen, luftgetrocknet und in 50 µl DEPC-H2O
gelöst.
Die radioaktiv markierte RNA-Sonde wurde mit 1 ml Hybridisierungsmix gemischt,
denaturiert (5 min, 90 °C) und pro Objektträger 50-70 µl des Sondenmixes aufgetragen.
Die Proben wurden mit Folien bedeckt und in einer mit 50% Formamid/5x SSC
angefeuchteten Kammer inkubiert (ü/N, 70 °C).
2. Tag: Waschen und Test-Exposition
Die Objekträger wurden mit 5x SSC und 2x SSC (je 30 min, 55 °C) gewaschen und die
Folien entfernt. Es folgte ein RNase-A-Verdau (10 µg/ml; 30 min, 37 °C) sowie weitere
Waschschritte mit 50% Formamid/2x SSC und zweimalig 2x SSC (je 30 min, 55 °C).
Die Gewebedünnschnitte wurden in einer aufsteigenden Ethanolreihe dehydriert (30%,
50%, 70%, 90%, 2 x 100%; je 1 min). Die Testexposition eines Röntgenfilmes erfolgte
über Nacht in Röntgenplatten.
3. Tag: Test-Entwicklung und Exposition
Der Röntgenfilm wurde entwickelt. In der Dunkelkammer wurden die Objektträger in
Photoemulsion (42 °C) gedippt und in Dunkelkästen gelagert (4 °C). Die Dauer der
Exposition wurde abhängig von der Signalstärke der Testexposition festgelegt.
2 Material und Methoden
33
x. Tag: Entwicklung und Gegenfärbung
In der Dunkelkammer wurden die Objektträger entwickelt (10 min, 14 °C), mit Aqua
dem. gespült und fixiert (20 min, rt). Die Schnitte wurden in Leitungswasser gelagert
(ü/N, rt) und die Photoemulsion mit einer Klinge von der Rückseite der Objekträger
entfernt. Die Gegenfärbung erfolgte mit 0,5% Toluidinblau/H2O (5 min), danach wurden
die Gewebedünnschnitte in einer aufsteigenden Ethanolreihe (30%, 50%, 70%, 90%,
2x100%; kurz) dehydriert. Die Schnitte wurden kurz mit Xylol gespült, in frischem Xylol
inkubiert (ü/N) und mit Entellan
eingedeckelt. Die Beurteilung der Signalintensität
erfolgte im Hell- und Dunkelfeld des Durchlichtmikroskopes.
Lösung/Puffer
Zusammensetzung
Hybridisierungsmix,
50% Formamid, 300 mM NaCl, 20 mM Tris-HCl,
pH 7,4
5 mM EDTA, 10% Dextran, 1x Denhardt´s,
0,05% RNA (Saccharomyces cerevisiae), 10 mM
NaH2PO4 in DEPC-H2O
RNase-Puffer, pH 7,5
400 mM NaCl, 10 mM Tris-HCl, 5 mM EDTA in
ddH2O
2.2.5
2.2.5.1
Sonstige verwendete Methoden
Photodokumentation
Die Photodokumentation der histologischen Schnitte erfolgte unter dem Leica DM R HC
Durchlichtmikroskop, die ganzer Embryonen in 60-100% Glycerin unter dem
Stereomikroskop MZ12.5, wobei die Digitalkamera über einen 0,63x Adapter am
jeweiligen Mikroskop befestigt wurde. Es wurde die Axiovision 4.5-Software verwendet.
2.2.5.2
3-dimensionale Rekonstruktion
Die 3-dimensionale Rekonstruktionen wurden mit SURFdriver 3.5 erstellt, einer
Software für die morphologische Rekonstruktion anatomischer Strukturen, basierend
auf der Rekonstruktion von Oberflächen [61]. Serielle, HE-gefärbte Paraffinschnitte der
Embryonen wurden photodokumentiert, in das Bitmap-Dateiformat konvertiert sowie
fortlaufend nummeriert. Im Arbeitsbereich des Rekonstruktionssoftware wurden manuell
die Konturen der entsprechenden Objekte markiert. Verschiebungen und Verdrehungen
der Schnitte konnten durch die „Adjust“-Funktion ausgeglichen werden (siehe Abbildung
2.4). Basierend auf den Markierungen, angegebener Schnittdicke und Schnittabstand
2 Material und Methoden
34
wurde durch die Software das Oberflächenbild generiert. Dieses konnte im
Ansichtsmodus geglättet sowie in allen 3 Achsen frei gedreht werden.
Abbildung 2.4: SURFdriver 3.5
(A) Arbeitsfläche zum Erstellen der Objekte: Es wird das Photo des histologischen Schnittes angezeigt,
auf dem die Struktur identifiziert und markiert wird. (B) Arbeitsbereich zum Ausrichten der Markierungen:
Durch Verschieben und Drehen der Konturen können bei der Verarbeitung der Schnitte entstandene
Unterschiede zwischen den Ebenen ausgeglichen werden. Im rechten Abschnitt sind jeweils die weiteren
Achsen abgebildet.
3 Ergebnisse
3
35
Ergebnisse
Entsprechend der Fragestellung wurden im Rahmen dieser Arbeit folgende Hypothesen
untersucht:
 Es besteht eine Ko-Entwicklung der arteriellen zervikalen Gefäße und der
Schilddrüse.
Zur Überprüfung dieser Hypothese wurde die Entwicklung der Schilddrüse
und der Kiemenbogenarterien in verschiedenen embryonalen Stadien
mittels
3-dimensionaler
Rekonstruktionen
histologischer
Schnitte
beschrieben.
 Eine gestörte Entwicklung der Gefäße führt zu einer Schilddrüsendysgenesie.
Dieser Aspekt wurde durch die Verwendung der Dsh-Mausmutante
untersucht. Dabei wurde der Einfluss der Gefäßvariante auf die
Schilddrüsenentwicklung dargestellt.
 Eine Shh-Defizienz führt zu einer Störung des Expressionsprofils der
zellautonomen Transkriptionsfaktoren der Schilddrüsenanlage.
Hierzu wurde mittels in-situ-Hybridisierungen die Expression von Nkx2.1,
Pax8 und Foxe1 in der Schilddrüsenanlage Dsh-homozygoter Embryonen
untersucht.
3.1
3.1.1
Die Schilddrüsenentwicklung in Wildtypembryonen der Maus
Histologische Darstellung
Um die Entwicklung der Schilddrüse und Gefäße in der Maus zu untersuchen, erfolgte
zunächst
die
histologische
Transversalschnitten
in
Paraffin
Darstellung
der
eingebetteter
Schilddrüse
Embryonen
in
anhand
von
verschiedenen
Embryonalstadien. Durch eine NKX2.1-Antikörperfärbung wurde bestätigt, dass es sich
bei der identifizierten Struktur um Schilddrüsengewebe handelt. Gefäße sind aufgrund
des Lumens und ihres charakteristischen Wandaufbaus histologisch gut zu erkennen.
3.1.1.1
Stadium E9.5
Im Stadium E9.5 ist das Schilddrüsenprimordium auf Höhe des 2. Kiemenbogens
lokalisiert. Es stellt sich in diesem frühen Stadium seiner Entwicklung als eine
Verdickung des ventralen Pharynxepithels mit kugeliger Form dar. Vom umgebenden
3 Ergebnisse
36
Mesenchym unterscheiden sich die Zellen in der HE-Färbung durch eine kompaktere
Anordnung sowie eine abgerundete Form, teilweise ist außerdem ein minimaler Spalt
erkennbar. In der NKX2.1-Antikörper-Färbung ist eine deutlich positive Färbung des
Schilddrüsenprimordiums zu erkennen. Etwas ventral des Schilddrüsenprimordiums ist
der Ausflusstrakt des Herzens lokalisiert, lateroventral der Schilddrüse verlaufen
Gefäße, streckenweise in direktem Kontakt zur Schilddrüse (siehe Abbildung 3.1).
Abbildung 3.1: Die Schilddrüse im Stadium E9.5.
(A) Schematische Kennzeichnung der Schilddrüsenposition im Embryo [50, 62], (B) HE bzw. (C) NKX2.1Antikörperfärbung von Transversalschnitten der Schilddrüsenregion, (D) bzw. (E) stellen
Ausschnittsvergrößerungen aus (B) bzw. (C) dar. Oben entspricht im Embryo dorsal, links entspricht
anatomisch rechts. Schwarzer Pfeil: Schilddrüse, rote Pfeilspitze: Gefäß, 1st/2nd: 1./2. Kiemenbogen, He:
Herz, Kb: Kiemenbogen, Ph: Pharynx; der schwarze Balken entspricht 500 µm, der weiße 100 µm
3.1.1.2
Stadium E10.5
Die Lage des Schilddrüsenprimordium im Stadium E10.5 entspricht dem Stadium E9.5.
Im Querschnitt ist das Primordium rund und grenzt sich von der Umgebung
morphologisch durch eine größere Zelldichte und eine abgerundete Form der Zellen
deutlich ab. Am kranialen Pol ist das Primordium mit dem Pharynx verbunden, der dort
eine kleine Ausbuchtung aufweist. Gegenüber dem Stadium E9.5 ist vor allem ein
vertikal gerichtetes Größenwachstum zu erkennen. Lateral des Primordium sind
symmetrisch die Kiemenbogenarterien lokalisiert. Ventrokaudal des Primordium ist
weiterhin der Ausflusstrakt des Herzens benachbart, beide Strukturen sind nur durch
eine dünne Mesenchymzellschicht getrennt (siehe Abbildung 3.2).
3 Ergebnisse
37
Abbildung 3.2: Die Schilddrüse im Stadium E10.5.
(A) Schematische Kennzeichnung der Schilddrüsenposition im Embryo [50, 62], (B) HE bzw. (C) NKX2.1Antikörperfärbung von Transversalschnitten der Schilddrüsenregion. (B) ist kranial von (C) gelegen. Oben
entspricht im Embryo dorsal, links entspricht anatomisch rechts. Schwarzer Pfeil: Schilddrüse, rote
Pfeilspitze: Gefäß, 1st/2nd: 1./2. Kiemenbogen, Ad: Aorta dorsalis, Nc: Notochord, He: Herz
Ph: Pharynx. Der schwarze Balken entspricht 1000 µm, der weiße 100 µm.
3.1.1.3
Stadium E11.5
Im Stadium E11.5 ist das Schilddrüsenprimordium in Höhe des 2. Kiemenbogens
gelegen. Das Primordium stellt sich als quer-ovale, Nkx2.1-positive Zellmasse ventral
des spaltförmigen Pharynx dar. Verglichen mit dem Stadium E10.5 hat insbesondere
ein kraniokaudal, aber auch laterale gerichtetes Wachstum stattgefunden. Das
Schilddrüsenprimordium ist in der Mittellinie zwischen den symmetrisch angeordneten
Kiemenbogenarterien positioniert, am kaudalen Pol des Primordiums beträgt der
Abstand der beiden Strukturen nur wenige µm (siehe Abbildung 3.3).
Abbildung 3.3: Die Schilddrüse im Stadium E11.5.
(A) Schematische Kennzeichnung der Schilddrüsenposition im Embryo [50, 62], (B) HE bzw. (C) NKX2.1Antikörperfärbung von Transversalschnitten der Schilddrüsenregion. (B) ist kaudal von (C) gelegen. Oben
entspricht im Embryo dorsal, links entspricht anatomisch rechts. Schwarzer Pfeil: Schilddrüse, rote
Pfeilspitze: Gefäß, 2nd: 2. Kiemenbogen, Ad: Aorta dorsalis, Kb: Kiemenbogen, He: Herz, Mb: Processus
mandibularis des 1. Kiemenbogens, Mx: Processus maxillaris des 1. Kiemenbogens, Nv : Ganglion
inferius des N. vagus, Ph: Pharynx. Der weiße Balken entspricht 100 µm, der schwarze 1000 µm
3 Ergebnisse
3.1.1.4
38
Stadium E12.5
Histologisch
zeigt
sich
eine
deutliche
morphologische
Veränderung
der
Schilddrüsenanlage. Im Vergleich zum Stadium E11.5 ist jetzt deutlich eine Ausbreitung
nach lateral nachweisbar. Im kranialen Anteil der Schilddrüsenanlage sind bereits
Ansätze zweier Lappen zu erkennen. Dorsal zur Schilddrüse liegen der sich
entwickelnde Larynx sowie der Ösophagus. Lateral sind in direktem Kontakt rechts der
Truncus brachiocephalicus bzw. links die A. carotis lokalisiert. Kaudal ist der sich
entwickelnde Aortenbogen positioniert. Weiter lateral befinden sich die Thymusprimordia, die dem 3. Kiemenbogen entstammen. In der NKX2.1-Anktikörperfärbung
stellen sich neben der Schilddrüse die Ultimobronchialkörper positiv dar (siehe
Abbildung 3.4).
Abbildung 3.4: Die Schilddrüse im Stadium E12.5.
(A) Schematische Kennzeichnung der Schilddrüsenposition im Embryo [50, 62], (B) HE bzw. (C) NKX2.1Antikörperfärbung von Transversalschnitten der Schilddrüsenregion. (C) ist kranial von (B) gelegen. Oben
entspricht im Embryo dorsal, links entspricht anatomisch rechts. Schwarzer Pfeil: Schilddrüse, rote
Pfeilspitze: Gefäß, La: Larynx, Tm: Thymusprimordium. Der weiße Balken entspricht 100 µm, der
schwarze 1500 µm
3.1.1.5
Stadium E13.5
Im Stadium E13.5 ist nun im Vergleich zum Stadium E12.5 ein deutliches Wachstum
der Schilddrüse nach dorsolateral und kranial zu beobachten. Morphologisch besteht
die Schilddrüse jetzt aus 2 Lappen, die kaudal über einen Isthmus verbunden sind. Der
Isthmus ist ventral, die Lappen symmetrisch beidseits der Trachea gelegen. Weiter
lateral ist der Thymus positioniert. Dorsolateral der Schilddrüse ist der GefäßNervenstrang des Halses mit Aa. carotideae, Nn. vagi und Vv. jugulares positioniert. Die
Aa. carotideae befinden sich hierbei in sehr enger Nachbarschaft zu den
Schilddrüsenlappen (siehe Abbildung 3.5).
3 Ergebnisse
39
Abbildung 3.5: Die Schilddrüse im Stadium E13.5.
(A) Schematische Kennzeichnung der Schilddrüsenposition im Embryo [50, 62], (B) HE bzw. (C) NKX2.1Antikörperfärbung von Transversalschnitten der Schilddrüsenregion. (B) ist kaudal von (C) gelegen. Oben
entspricht im Embryo dorsal, links entspricht anatomisch rechts. Schwarzer Pfeil: Schilddrüse, rote
Pfeilspitze: A. carotidea, Oe: Ösophagus, Tm: Thymus, Tr: Trachea. Der weiße Balken entspricht
100 µm, der schwarze 2000 µm
3.1.1.6
Stadium E14.5
Im Stadium E14.5 ist im Vergleich zum vorangehenden Embryonalstadium vor allem
eine Größenzunahme der beiden Schilddrüsenlappen auffällig. Kaudal sind die beiden
Schilddrüsenlappen weiterhin über den Isthmus verbunden, welchem der Thymus
benachbart ist. Nach kranial erstreckt sie die Schilddrüse bis dorsal des Larynx. Die Aa.
carotideae sind dorsolateral der Schilddrüse im Gefäß-Nerven-Strang des Halses
gelegen (siehe Abbildung 3.6).
Abbildung 3.6: Die Schilddrüse im Stadium E14.5.
(A) Schematische Kennzeichnung der Schilddrüsenposition im Embryo [50, 62], (B) HE bzw. (C) NKX2.1Antikörperfärbung von Transversalschnitten der Schilddrüsenregion. (C) ist kranial von (B) gelegen. Oben
entspricht im Embryo dorsal, links entspricht anatomisch rechts. Schwarzer Pfeil: Schilddrüse, rote
Pfeilspitze: A. carotidea, Oe: Ösophagus, Tm: Thymus; Tr: Trachea, Der weiße Balken entspricht
100 µm, der schwarze 2000 µm
3 Ergebnisse
3.1.2
40
3-dimensionale Rekonstruktion
Zur anschaulicheren Darstellung der räumlichen Beziehung von Schilddrüse und
arteriellen Gefäßen in unterschiedlichen Stadien der Embryonalentwicklung erfolgte
ausgehend von transversalen Gewebedünnschnitten die 3-dimensionale Rekonstruktion
dieser Strukturen. Die Gefäße sind rot und die Schilddrüse grau dargestellt. Der
Pharynx bzw. Ösophagus als Mittellinienstruktur dient der Orientierung und ist grün
dargestellt.
3.1.2.1
Stadium E9.5
Im Stadium E9.5 zeigt die 3-dimensionale Rekonstruktion den symmetrischen Aufbau
des embryonalen arteriellen Gefäßsystems. Aus dem Ausflusstrakt des primitiven
Herzschlauches entspringen die 1. und 2. Kiemenbogenarterien, die den Pharynx
beidseits lateral passieren und in die symmetrisch angelegten dorsalen Aorten münden.
Die Schilddrüsenanlage bildet ein ellipsoides Primordium, welches in der Mittellinie
ventral des Pharynx gelegen ist. Kaudal besteht eine enge Nachbarschaft zum
Ausflusstrakt des Herzens, lateral zu den 1. Kiemenbogenarterien (siehe Abbildung
3.7).
Abbildung 3.7: 3-dimensionale Rekonstruktion der Schilddrüse im Stadium E9.5.
Das Schilddrüsenprimordium liegt in der Mittellinie am Ausflusstrakt des Herzens. Grau: Schilddrüse, rot:
arterielle Gefäße bzw. Ausflusstrakt des Herzens, grün: Pharynx, 1st/2nd: 1./2. Kiemenbogenarterie, va:
ventrale Aorta. Der graue Balken entspricht 140 µm.
3.1.2.2
Stadium E11.5
Im Stadium E11.5 besteht das arterielle Gefäßsystem aus der mittig gelegenen
ventralen Aorta, aus der die 3., 4. und 6. Kiemenbogenarterien entspringen. Diese
3 Ergebnisse
41
münden beidseitig in die dorsalen Aorten. Der kraniale Anteil des Vorderdarms stellt
sich breit und flach dar, kaudalwärts verjüngt er sich zum späteren Ösophagus.Das
ellipsoide Schilddrüsenprimordium ist ventral des Pharynx in enger Nachbarschaft zum
Übergang der ventralen Aorta in die 3. Kiemenbogenarterien lokalisiert (siehe Abbildung
3.8).
Abbildung 3.8: 3-dimensionale Rekonstruktion der Schilddrüse im Stadium E11.5.
Das Schilddrüsenprimordium liegt in der Mittellinie am Ausflusstrakt des Herzens. Grau: Schilddrüse, rot:
arterielle Gefäße, grün: Pharynx, 3rd/4th/6th: 3./4./6. Kiemenbogenarterie, Ad: Aorta dorsalis, va: ventrale
Aorta. Der graue Balken entspricht 140 µm.
3.1.2.3
Stadium E12.5
Im Stadium E12.5 beginnt der asymmetrische Umbau des arteriellen Gefäßsystems.
Verglichen mit der linken dorsalen Aorta ist der Durchmesser der rechten deutlich
geringer. Aus der linken Aorta dorsalis geht die Aorta descendens hervor, die über den
Aortenbogen mit der Aorta ascendens verbunden ist. Der Aortenbogen hat sich aus der
linken 4. Kiemenbogenarterie entwickelt, wohingegen die rechte 4. Kiemenbogenarterie
den Truncus brachiocephalicus bildet. Die rechte und linke A. carotis, die aus dem
Aortenbogen bzw. Truncus brachiocephalicus abgehen, stammen von den 3.
Kiemenbogenarterien ab.
Die Schilddrüse hat sich nach lateral ausgebreitet und weist nun die Form einer Sichel
auf, deren Basis dem Aortenbogen aufsitzt und deren Spitzen sich entlang der
Karotiden erstrecken (siehe Abbildung 3.9).
3 Ergebnisse
42
Abbildung 3.9: 3-dimensionale Rekonstruktion der Schilddrüse im Stadium E12.5.
Die Schilddrüse breitet sich nach lateral entlang der Karotiden aus. Grau: Schilddrüse, rot: Gefäße, grün:
Pharynx. Ao: Aorta ascendens, lc: linke A. carotis, rc: rechte A. carotis. Der graue Balken entspricht
140 µm.
3.1.2.4
Stadium E13.5
Im Stadium E13.5 hat sich das asymmetrische Gefäßsystem etabliert. Der Aortenbogen
ist voll ausgebildet und verbindet die Aorta ascendens mit der Aorta descendens und
kreuzt hierbei die Mittellinie. Die rechte A. carotis entspringt dem Truncus
brachiocephalicus, die linke dem Aortenbogen (siehe Abbildung 3.10).
Abbildung 3.10: 3-dimensionale Rekonstruktion der Schilddrüse im Stadium E13.5.
Die Schilddrüse ist aus 2 über den Isthmus verbundenen Lappen aufgebaut. Grau: Schilddrüse, rot:
Gefäße, grün: Pharynx, Ao: Aorta ascendens, lc: linke A. carotis, rc: rechte A. carotis. Der graue Balken
entspricht 140 µm.
3 Ergebnisse
43
Die Schilddrüsenmorphologie hat im Vergleich zu Stadium E12.5 einen deutlichen
Wandel durchlaufen. Sie ist nun aus 2 deutlich ausgebildeten Lappen aufgebaut, die
kaudal über den Isthmus verbunden sind. Dieser hat nun den Kontakt zum Aortenbogen
verloren, gleichzeitig erstrecken sich die Schilddrüsenlappen symmetrisch entlang der
Karotiden (siehe Abbildung 3.10).
3.1.2.5
Stadium E14.5
Im Stadium E14.5 sind nur wenige morphologische Veränderungen gegenüber dem
Stadium E13.5 zu beobachten. Das Gefäßsystem ist asymmetrisch aufgebaut, die
Schilddrüse besteht aus 2 kaudal über einen Isthmus verbundene, langgestreckte
Lappen. Die Schilddrüse zeigt im Vergleich zum Stadium E13.5 ein deutliches
Größenwachstum mit einer Ausdehnung der Schilddrüsenlappen nach weiter kranial
(siehe Abbildung 3.11).
Abbildung 3.11: 3-dimensionale Rekonstruktion der Schilddrüse im Stadium E14.5.
Die Schilddrüse als zweilappiges Organ spannt sich symmetrisch zwischen den Karotiden auf. Grau:
Schilddrüse, rot: Gefäße, grün: Pharynx Ao: Aorta ascendens, lc: linke A. carotis, rc: rechte A. carotis.
der graue Balken dient als Maßstab (140 µm).
3 Ergebnisse
3.2
44
Die Entwicklung der Schilddrüse in homozygoten Dsh/DshEmbryonen
Der Dsh-Mausstamm ist eine durch Bestrahlung induzierte Mausmutante, bei der auf
Grund einer den Shh-Genlokus betreffenden Inversion im homozygoten Zustand eine
Defizienz für Shh besteht [45]. In Untersuchungen der Arbeitsgruppe von Prof. Mundlos
(Max-Planck-Institut für molekulare Genetik, Berlin) ist eine Hemiagenesie der
Schilddrüse in den homozygoten Embryonen beobachtet worden.
Im Rahmen dieser Arbeit wurde untersucht, wie die Schilddrüsenentwicklung in Dshhomozygoten Embryonen verläuft und zu welchem Zeitpunkt während der Entwicklung
die Dysgenesie auftritt.
3.2.1
Histologie
3.2.1.1
Stadium E11.5
Auf Transversalschnitten von Dsh/Dsh-Embryonen stellt sich die Schilddrüse im
Stadium E11.5 als rundlich-ovale Struktur dar, die sich auf Grund der größeren
Zelldichte und abgerundeten Zellform deutlich vom Umgebungsgewebe abgrenzt und in
der
Nkx2.1-Antikörperfärbung
positiv
reagiert.
Im
kaudalen
Anteil
steht
das
Schilddrüsenprimordium in engem Kontakt zu den symmetrisch angeordneten
Kiemenbogenarterien sowie der ventralen Aorta.
Außerdem zeigt sich histologisch im Vergleich mit Wildtyp-Embryonen eine veränderte
Morphologie des Vorderdarms: Die im Vergleich zum Wildtyp-Embryo schmale
Ausdehnung und das hohe Epithel des Pharynx vermittelt einen ösophagus-ähnlichen
Charakter. Dorsal des Pharynx und der Kiemenbogenarterien stellen sich große, mit
Erythrozyten gefüllte Hohlräume dar, die den Vv. jugulares der Wildtypembryonen
entsprechen (siehe Abbildung 3.12).
3 Ergebnisse
45
Abbildung 3.12: Histologie der Schilddrüse in Dsh/Dsh-Embryonen des Stadium E11.5.
Die Schilddrüse der Dsh/Dsh-Embryonen im Stadium E12.5 ist in der Mittellinie positioniert. (A), (B) HEFärbung bzw. (C) Nkx2.1-Antikörperfärbung der Schilddrüsenregion. Oben entspricht im Embryo dorsal,
links entspricht anatomisch rechts. Schwarzer Pfeil: Schilddrüse, rote Pfeilspitze: Gefäß, ph: Pharynx,
der weiße Balken entspricht 100 µm
3.2.1.2
Stadium E12.5
Im Stadium E12.5 ist in der Schilddrüsenmorphologie ein deutlicher Unterschied
zwischen Wildtyp- und Dsh/Dsh-Embryonen nachweisbar. Im Gegensatz zur WildtypSchilddrüse, die sich nach lateral ausbreitet, bildet die Schilddrüse der Dsh/Dsh–
Embryonen weiterhin eine kompakte rundliche Masse, die lateral der Mittellinie
positioniert
ist,
ventrolateral
zu
Bronchen
und
Ösophagus.
In
der
Nkx2.1-
Antikörperfärbung stellen sich neben der Schilddrüse auch die Ultimobronchialkörper
positiv dar. Im Vergleich zum Wildtyp weist die Schilddrüse eine in der rechts-links
Achse, wie auch anterior-posterioren Achse veränderte Position im Embryo auf.
Histologisch auffällig ist des Weiteren der gestörte Wandaufbau von Bronchen und
Ösophagus ohne bzw. mit minimalem Lumen. Der Aortenbogen liegt auf der rechten
Seite des Embryos (siehe Abbildung 3.13).
Abbildung 3.13: Histologie der Schilddrüse im Dsh/Dsh-Embryo des Stadium E12.5.
Die Schilddrüse der Dsh/Dsh-Embryonen im Stadium E12.5 ist asymmetrisch aufgebaut und rechts der
Mittellinie positioniert. (A), (B) HE-Färbung bzw. (C) Nkx2.1-Antikörperfärbung der Schilddrüsenregion.
Oben entspricht im Embryo dorsal, links entspricht anatomisch rechts. Schwarzer Pfeil: Schilddrüse, rote
Pfeilspitze: Gefäß, br: Bronchen, la: Larynx, oe: Ösophagus, der weiße Balken entspricht 100 µm.
3 Ergebnisse
3.2.1.3
46
Stadium E13.5
Die Schilddrüse der Dsh/Dsh-Embryonen im Stadium E13.5 ist im Vergleich mit dem
vorangegangenen Stadium weiter kranial im Embryo positioniert. Sie besteht aus nur
einem Lappen und ist ventrolateral der Trachea und des Ösophagus lokalisiert.
Histologisch sind deutlich follikuläre Strukturen erkennbar.
Trachea und Ösophagus sind verbunden, der Wandaufbau beider Strukturen ist im
Vergleich zu Wildtypembryonen deutlich gestört. Die Aa. carotideae sind asymmetrisch
angeordnet und ventromedial sowie dorsal der Schilddrüse lokalisiert (siehe Abbildung
3.14).
Abbildung 3.14: Histologie der Schilddrüse im Dsh/Dsh-Embryo des Stadium E13.5.
Die Schilddrüse der Dsh/Dsh-Embryonen im Stadium E13.5 ist asymmetrisch aufgebaut und rechts der
Mittellinie positioniert. (A), (B) HE-Färbung bzw. (C) Nkx2.1-Antikörperfärbung der Schilddrüsenregion.
Oben entspricht im Embryo dorsal, links entspricht anatomisch rechts. Schwarzer Pfeil: Schilddrüse, rote
Pfeilspitze: Gefäß, ph: Pharynx, der weiße Balken entspricht 100 µm
3.2.1.4
Stadium E14.5
Wie auch in der Schilddrüsenentwicklung in Wildtypembryonen sind in Dsh/DshEmbryonen histologisch nur wenige morphologische Veränderungen zwischen den
Stadien E13.5 und E14.5 nachweisbar. Die Schilddrüse ist weiterhin aus nur einem
Lappen aufgebaut, der lateral der Mittellinie lokalisiert ist. Bei insgesamt 8 untersuchten
Embryonen der Stadien E13.5 und E14.5 war die Schilddrüse insgesamt 7-mal
rechtsseitig und einmal linksseitig positioniert.
Ösophagus
und
Trachea
sind
nicht
als
getrennte
Strukturen
nachweisbar,
möglicherweise besteht wie in den Shh-/--Embryonen eine Verschmelzung der beiden
Strukturen [40]. Das Epithel dieser gemeinsamen Röhre ähnelt morphologisch dem der
Trachea in Wildtyp-Embryonen. Ventromedial sowie dorsal der Schilddrüse sind
wiederum 2 arterielle Gefäße lokalisiert, zusätzlich jedoch ist in den Embryonen ein im
3 Ergebnisse
47
Durchmesser kleineres 3. Gefäß nachweisbar, das durch das Schilddrüsenparenchym
verläuft (siehe Abbildung 3.15).
Abbildung 3.15: Histologie der Schilddrüse im Dsh/Dsh-Embryo des Stadium E14.5.
Die Schilddrüse der Dsh/Dsh-Embryonen im Stadium E14.5 ist asymmetrisch aufgebaut und lateral der
Mittellinie positioniert. (C) In einem der untersuchten Embryonen war die Schilddrüse linksseitig
positioniert. (A), (B) HE-Färbung bzw. (C) Nkx2.1-Antikörperfärbung der Schilddrüsenregion. Oben
entspricht im Embryo dorsal, links entspricht anatomisch rechts. Schwarzer Pfeil: Schilddrüse, rote
Pfeilspitze: Gefäß, ph: Pharynx, der weiße Balken entspricht 100 µm
3.2.2
3-dimensionale Rekonstruktion
Zur besseren Anschaulichkeit und Darstellung der räumlichen Beziehung von
Schilddrüse und arteriellen Gefäßen in den Dsh/Dsh–Embryonen erfolgte die
3-dimensionale Rekonstruktion in den Stadien E11.5 bis E14.5. Der Pharynx bzw.
Ösophagus dient hierbei als Mittellinienstruktur zur Orientierung und ist grün dargestellt,
die Gefäße sind rot und die Schilddrüse grau dargestellt.
3.2.2.1
Stadium E11.5
Abbildung 3.16: 3-dimensionale Rekonstruktion der Schilddrüse der Dsh/Dsh–Embryonen im
Stadium E11.5.
Das Schilddrüsenprimordium liegt in der Mittellinie am Ausflusstrakt des Herzens. Grau: Schilddrüse, rot:
Gefäße, grün: Pharynx, 3rd/,4th/6th: 3./4./6. Kiemenbogenarterie, Ad: Aorta dorsalis,, va: ventrale Aorta.
Der graue Balken dient als Maßstab (140 µm).
3 Ergebnisse
48
Im Vergleich des Gefäßsystems von Dsh/Dsh- und Wildtyp-Embryonen fällt
insbesondere die unterschiedliche Anzahl der Kiemenbogenarterien auf. Im Dsh/DshEmbryo verbindet pro Seite nur 1 Kiemenbogenarterie die ventrale Aorta mit den
symmetrisch angeordneten dorsalen Aorten. Auf Grund von Erkenntnissen aus Shh-/-Embryonen kann davon ausgegangen werden, dass es sich hierbei um die
3. Kiemenbogenarterien handelt [41]. Die Schilddrüse als ellipsenförmige Struktur ist in
der Mittellinie ventral des Ösophagus lokalisiert und steht in Kontakt mit dem
Ausflusstrakt des Herzens (siehe Abbildung 3.16).
3.2.2.2
Stadium E12.5
Abbildung 3.17: 3-dimensionale Rekonstruktion der Schilddrüse der Dsh/Dsh–Embryonen im
Stadium E12.5.
Das Schilddrüsenprimordium liegt lateral der Mittellinie am Aortenbogen zwischen den fehllokalisierten
Karotiden. Grau: Schilddrüse, rot: Gefäße, grün: Pharynx, Ao: Aorta ascendens, lc: linke A. carotis, rc:
rechte A. carotis. Der graue Balken dient als Maßstab (140 µm).
Im
Stadium
E12.5
beginnt
in
den
Wildtyp-Embryonen
die
Ausbildung
des
asymmetrischen Gefäßsystems mit Ausbildung des Aortenbogens und des Truncus
brachiocephalicus. In den Dsh/Dsh-Embryonen erscheint diese Umwandlung verändert.
Der Aortenbogen ist rechtsseitig lokalisiert und kreuzt nicht die Mittellinie. Da im
Stadium E11.5 keine 4 Kiemenbogenarterie ausgebildet worden ist, geht der
Aortenbogen, wie auch für die Shh-/--Embryonen beschrieben, aus der rechten 3.
Kiemenbogenarterie hervor [41]. Die Schilddrüse zeigt kein Wachstum nach lateral mit
Ausbildung zweier Lappen, sondern ihre Position im Embryo erfährt eine Veränderung
aus der Mittellinie nach lateral. Dort liegt die Schilddrüse als noch immer einlappiges,
3 Ergebnisse
49
kompaktes Organ zwischen den beiden Karotiden, die im Vergleich mit dem Wildtyp
fehllokalisiert und asymmetrisch angeordnet sind (siehe Abbildung 3.17).
3.2.2.3
Stadium E13.5
Abbildung 3.18: 3-dimensionale Rekonstruktion der Schilddrüse der Dsh/Dsh–Embryonen im
Stadium E13.5.
Das Schilddrüsenprimordium liegt lateral der Mittellinie zwischen den fehllokalisierten Karotiden. Grau:
Schilddrüse, rot: Gefäße, grün: Pharynx, Ao: Aorta ascendens, lc: linke A. carotis, rc: rechte A. carotis.
Der graue Balken dient als Maßstab (140 µm).
Wie im Stadium E12.5 ist die Schilddrüse im Stadium E13.5 ein einlappiges Organ, das
aus der Mittellinie nach lateral verlagert ist. Es liegt in enger Nachbarschaft zu den
beiden Karotiden. Gegenüber dem Stadium E12.5 hat sie den Kontakt zum
Aortenbogen verloren und ist nun weiter kranial positioniert.
Der Aufbau des Gefäßsystems ist wie auch im Vorstadium gestört. Der Aortenbogen
geht
aus
dem
Truncus
arteriosus
hervor,
kreuzt
im
Gegensatz
zu
den
Wildtypembryonen jedoch nicht die Mittellinie, sondern mündet in eine rechtsseitig
verlaufende Aorta descendens (siehe Abbildung 3.18).
3.2.2.4
Stadium E14.5
Die Morphologie und Position der Schilddrüse im Stadium E14.5 entspricht weitgehend
den Verhältnissen im Vorstadium. Allerdings hat sich ein weiteres, kleinlumiges
arterielles Gefäß entwickelt, das das Schilddrüsenparenchym durchdringt.
3 Ergebnisse
50
Abbildung 3.19: 3-dimensionale Rekonstruktion der Schilddrüse der Dsh/Dsh–Embryonen im
Stadium E14.5.
Gefäße, grün: Pharynx, Ao: Aorta ascendens, schwarzer Pfeil: neu aufgetretenes, 3. Gefäß. lc: linke
A. carotis, rc: rechte A. carotis. Der graue Balken dient als Maßstab (140 µm).
Bei insgesamt 8 untersuchten Dsh/Dsh - Embryonen der Stadien E13.5 und E14.5 war
die Schilddrüse in 7 Embryonen rechtsseitig und in 1 Embryo linksseitig lokalisiert.
3 Ergebnisse
3.3
51
Die Morphologie der Schilddrüse in Dsh/Dsh XtJ/XtJ doppelt
homozygoten Embryonen im Stadium E13.5
Homozygote Dsh-Embryonen sind ebenso wie die Shh-knockout-Mäuse Shh-defizient
und die Embryonen zeigen einen nahezu identischen Phänotyp, der unter anderem
schwerwiegende Fehlbildungen der Extremitäten, aber auch von Trachea und
Ösophagus umfasst [40, 45]. Die Verkreuzung der Shh-knockout-Mäusen mit Gli3defizienten Mäusen (XtJ) konnte den Phänotyp der Shh-/- Embryonen in Teilaspekten
kompensieren. Bezüglich der Entwicklung von Extremitäten und ZNS konnte eine
Morphologie erreicht werden, die entweder der Situation im Wildtyp oder der von
Gli3-/--Embryonen entspricht [44, 63].
Basierend auf diesen Erkenntnissen wurde im Rahmen der vorliegenden Arbeit der
Dsh-Stamm mit dem XtJ-Stamm verkreuzt. Durch Verkreuzung von Dsh/+, XtJ/+ Individuen wurden doppelt homozygote Embryonen (Dsh/Dsh XtJ/XtJ) generiert und im
Stadium E13.5 untersucht. Dieses Stadium wurde gewählt, da zu diesem Zeitpunkt die
Entwicklung des asymmetrischen Gefäßsystems nahezu abgeschlossen ist und die
Schilddrüse in Wildtyp-Embryonen bereits eine Morphologie und Position ähnlich der
adulten
Schilddrüse
zeigt
(siehe
Kapitel
3.1).
Außerdem
war
in
Entwicklungsstadium der gestörte Aufbau des arteriellen Gefäßsystems
diesem
und die
Asymmetrie von Schilddrüse in allen untersuchten Dsh-homozygoten Embryonen
nachweisbar (siehe Kapitel 3.2). Eine Untersuchung der Embryonen in älteren Stadien
war aufgrund einer erhöhten intrauterinen Letalität nicht möglich.
3.3.1
Phänotyp der doppelt homozygoten Mausembryonen
Bei der phänotypischen Betrachtung der Mausembryonen im Stadium E13.5 waren die
Dsh/Dsh XtJ/XtJ-Embryonen deutlich größer als die Dsh/Dsh-Embryonen und
entsprachen in ihrer Größe annähernd der XtJ/XtJ-Embryonen.
Im Bereich des Kopfes besteht ein Defekt der Schädeldecke. Der für die Dsh/DshMäuse charakteristische Rüssel (Probiscis) ist nicht vorhanden. Stattdessen sind Maul
sowie Nase identifizierbar. Zwar sind die Augenanlagen deutlich kleiner als in Wildtypund XtJ/XtJ-Embryonen, aber im Gegensatz zur Zyklopie der Dsh/Dsh-Embryonen sind
die Augenanlagen symmetrisch vorhanden und orthotop positioniert. Wie in der Literatur
beschrieben, zeigen die Dsh/Dsh-Embryonen im Bereich der Extremitäten deutliche
Fehlbildungen, vor allem der distalen Anteile (Unterarm bzw. –schenkel und Hand bzw.
3 Ergebnisse
52
Fuß) [45]. Dsh/Dsh XtJ/XtJ-Embryonen hingegen haben komplette Extremitäten, die im
Bereich von Hand und Fuß eine Polydaktylie ähnlich der der Xt J/XtJ-Embryonen
aufweisen (siehe Abbildung 3.20).
Analog zu den oben beschriebenen Beispielen der Shh -/- Gli3-/--Verkreuzungen scheint
der ausgeprägte Phänotyp der Dsh/Dsh Embryonen durch das Einkreuzen der
Gli3-Defizienz kompensiert zu werden.
J
J
J
J
Abbildung 3.20: Phänotyp der Dsh/Dsh, Dsh/Dsh Xt /Xt und Xt /Xt –Embryonen im Stadium E13.5
(A,C und E): laterale Ansicht bei 1-facher Vergrößerung, (B,D und F): laterale Ansicht der Extremitäten
J
J
bei 2-facher Vergrößerung. (C, D) Die Dsh/Dsh Xt /Xt –Embryonen zeigen einen Defekt der
Schädeldecke, eine annähernd normale Gesichtsmorphologie sowie eine Polydaktylie der vorderen und
hinteren Extremität. Die weißen Pfeilspitzen markieren die einzelnen Finger bzw. Zehen.
3 Ergebnisse
3.3.2
53
Histologie
Zur Beurteilung der Schilddrüsenmorphologie wurden transversale Gewebeschnitte in
Paraffin eingebetteter Embryonen des Stadium E13.5 angefertigt, die im Anschluss mit
Hämatoxylin-Eosin angefärbt wurden.
Dsh/+ XtJ/+ sowie XtJ/XtJ -Embryonen zeigen histologisch eine dem Wildtyp
entsprechende Schilddrüsenmorphologie. Die Schilddrüse ist orthotop im Bereich des
Halses lokalisiert und besteht aus 2 symmetrisch angeordneten Lappen, die lateral der
Trachea in Nachbarschaft zu den Karotiden lokalisiert sind. Kaudal sind die
Schilddrüsenlappen über den Isthmus verbunden.
Abbildung 3.21: Histologische Darstellung der Schilddrüse im Stadium E13.5 in WildtypJ
Embryonen sowie doppelten Verkreuzungen von Dsh mit Xt .
J
J
HE-gefärbte Transversalschnitte der Schilddrüsenregion. Die Schilddrüse der Dsh/Dsh Xt /Xt Embryonen ist symmetrisch aufgebaut und in Nachbarschaft der Karotiden gelegen. (A) Wildtyp-, (B)
J
J
J
J
J
Dsh/Xt , (C) Xt /Xt , (D) Dsh/Dsh, (E) Dsh/Dsh Xt /Xt -Embryo Oben ist im Embryo dorsal, links entspricht
anatomisch rechts. Schwarzer Pfeil: Schilddrüse, rote Pfeilspitzen: A. carotis, oe: Ösophagus, tr:
Trachea.
Wie bereits in Kapitel 3.2 dargestellt, besteht die Schilddrüse der Dsh/Dsh
homozygoten Embryonen aus nur einem Lappen, welcher dystop lateral der Mittellinie
positioniert ist, in engem Kontakt zu den ebenfalls fehllokalisierten Karotiden. Im
Vergleich mit dem Dsh/Dsh-Phänotyp wird deutlich, dass die bei Shh-Defizienz
gleichzeitig bestehende Defizienz für Gli3 zu einer Wiederherstellung der Symmetrie in
der Schilddrüsenregion führt. Der Ösophagus ist in der Mittellinie lokalisiert und die
3 Ergebnisse
54
Schilddrüse symmetrisch angelegt. Sie besteht aus 2 Lappen, die kaudal über einen
breiten
Isthmus
verbunden
sind.
Gegenüber
Wildtyp-Embryonen
sind
die
Schilddrüsenlappen verkleinert. Die Schilddrüse liegt in enger Nachbarschaft zu den
symmetrisch lokalisierten Karotiden. Die doppelt homozygoten Embryonen weisen
weiterhin Defekte im Bereich der Trachea auf.
Insgesamt wurden 4 Dsh/Dsh XtJ/XtJ Embryonen untersucht, die alle eine identische
Schilddrüsenmorphologie zeigten.
3.3.3
3-dimensionale Rekonstruktion
Zur besseren Veranschaulichung der Morphologie der Schilddrüse sowie des Aufbaus
des arteriellen Gefäßsystems erfolgte die 3-dimensionale Rekonstruktion anhand
transversaler Gewebedünnschnitte von Dsh/Dsh XtJ/XtJ-Embryonen.
Abbildung 3.22: 3-dimensionale Darstellung der Schilddrüsenmorphologie sowie der Gefäße im
J
J
Stadium E13.5 im Dsh/Dsh Xt /Xt -Embryonen.
Die gleichzeitige Defizienz für Shh und Gli3 führt zu einer Wiederherstellung einer symmetrisch
ausgebildeten Schilddrüse in Nachbarschaft zu symmetrisch angeordneten Aa. carotideae. (A) Wildtyp-,
J
J(B) Dsh/Dsh-, (C) Dsh/Dsh Xt /Xt Embryo Grau: Schilddrüse, rot: Gefäße, grün: Ösophagus, der graue
Balken entspricht 140µm.
Die 3-dimensionale Darstellung der großen arteriellen Gefäße, des Ösophagus und der
Schilddrüse der Dsh/Dsh XtJ/XtJ-Embryonen bestätigt den auf Grund der histologischen
Darstellung gewonnen Eindruck einer erhaltenen Symmetrie im Bereich der Halsregion.
Im Bereich der Gefäße ist ein Aortenbogen zu sehen, der die Mittellinie kreuzt und in
eine linksseitig gelegene Aorta descendens übergeht. Dies entspricht der Situation im
3 Ergebnisse
55
Wildtyp-Embryo. Auch stellen sich 2 symmetrisch gelegene zervikale Gefäße, die
Karotiden, dar, die im Vergleich zum Wildtyp-Embryo jedoch weiter medial gelegen
sind. Die Schilddrüse ist symmetrisch aufgebaut, aber nicht normal wie in WildtypEmbryonen lateralisiert. Sie befindet sich dennoch in engem Kontakt zu den beiden
Karotiden und spannt sich zwischen diesen auf (siehe Abbildung 3.22).
3 Ergebnisse
3.4
56
Die Expression schilddrüsenspezifischer Transkriptionsfaktoren
in Dsh/Dsh-Embryonen
Dsh/Dsh-Embryonen sind defizient für Shh. Die Asymmetrie und somit dystope Position
der Schilddrüse zeigt sich erstmals im Stadium E12.5. Um zu überprüfen, ob Shh oder
sein Rezeptor Ptch1 zu dem Zeitpunkt in der Schilddrüse exprimiert sind, wurde die
Expression im Stadium E12.5 überprüft. Um außerdem zu klären, ob in Folge der ShhDefizienz die zellautonome Regulation der Morphogenese durch eine veränderte
Expression der Transkriptionsfaktoren Nkx2.1, Pax8 oder Foxe1 gestört ist, wurde
deren Expression in den Stadien E10.5 -12.5 untersucht.
Ein Standardverfahren, um die Expression eines Genes in Geweben nachzuweisen, ist
der Nachweis der mRNA im Embryo mittels in-situ-Hybridisierung. Im Stadium E10.5
und E11.5 erfolgte diese in ganzen Embryonen (whole-mount) mit DIG-markierten
Sonden, ab dem Stadium E12.5 auf Gewebedünnschnitten von in Paraffin
eingebetteten Embryonen mit radioaktiv markierten Sonden.
In der whole-mount
in-situ-Hybridisierung kommt es methodisch bedingt bei der Mehrheit der Sonden, auch
sense-orientierten Proben, zu einer unspezifischen Anfärbung des IV. Ventrikels. Dies
kann durch manuelles Eröffnen vor Beginn der Hybridisierung vermieden werden. Um
die Morphologie der Dsh-homozygoten Embryonen zu bewahren, wurde im Rahmen
der vorliegenden Arbeit nur bei Wildtypembryonen der IV. Ventrikel eröffnet.
Die Auswertung der radioaktiven in-situ-Hybridisierung erfolgt mittels Hell- und
Dunkelfeldmikroskopie. Die Gegenfärbung der Schnitte mit Toluidinblau ermöglicht im
Hellfeld die Identifikation anatomischer Strukturen. Im Dunkelfeld stellt sich ein positives
Signal als dichte, weiße Körnung dar.
3.4.1
Shh und Ptch1
Die Expression von Shh und Ptch wurde im Stadium E12.5, in dem erstmalig die
gestörte Morphogenese der Schilddrüse nachweisbar ist, mittels radioaktiver in-situHybridisierung überprüft.
Wie in Literatur und Datenbanken beschrieben, zeigen sich sowohl eine ShhExpression im Epithel des Larynx als auch eine Ptch1-Expression im angrenzenden
Mesenchym und dienen daher als Positivkontrolle für die Sonden [64].
3 Ergebnisse
57
In der Schilddrüse ist weder eine Expression von Shh noch von Ptch1 im Stadium
E12.5 nachweisbar.
Abbildung 3.23: Expression von Shh und Ptch1 in der Schilddrüsenregion im Stadium E12.5.
Weder Shh noch Ptch1 sind in der Schilddrüse exprimiert. (A,D) Foxe1, (B,E) Shh, (C,F), Ptch1, (A) –
(C) Dunkelfeldaufnahme, (D) – (F) Hellfeldaufnahme. Schwarzer Pfeil: Schilddrüse
3.4.2
Nkx2.1
Nkx2.1 ist während der gesamten Entwicklung in der Schilddrüse exprimiert. Außerdem
ist Nkx2.1 während der Embryonalentwicklung im Bereich der Lunge und des
Vorderhirns exprimiert [65].
Die Sonde für Nkx2.1 wurde im Rahmen der vorliegenden Arbeit neu generiert. Die
whole-mount in-situ-Hybridisierung in Wildtypembryonen der Stadien E10.5 und E11.5
zeigt das erwartete Expressionsmuster von Nkx2.1 in der Schilddrüsenanlage, der
Lungenanlage und im Bereich des Vorderhirns und dient damit einerseits dem
Nachweis der Sensitivität und Spezifität der Sonde und andererseits dem Vergleich mit
den Dsh-homozygoten Embryonen.
Die Dsh-homozygoten Embryonen unterscheiden sich in den Stadien E10.5 und E11.5
phänotypisch deutlich von den Wildtyp-Embryonen. Sie sind kleiner als die Wildtypen,
haben keine bzw. stark reduzierte Extremitäten und im Kopfbereich ist der sich
entwickelnde Probiscis und eine Zyklopie erkennbar.
Das Gehirn ist in der Größe
reduziert. Das Telencephalon besteht aus einem einzelnen, in der Mittellinie gelegenen
3 Ergebnisse
58
Großhirnbläschen, wohingegen in Wildtypembryonen in diesem Stadium bereits zwei
lateral gelegene Großhirnbläschen angelegt sind [35].
Abbildung 3.24: Nkx2.1-Expression in Dsh/Dsh–Embryonen in den Stadien E10.5 und E11.5
Nkx2.1 ist im Stadium E10.5 und E11.5 in der Lungenanlage, im Telencephalon und der Schilddrüse der
Dsh/Dsh–Embryonen exprimiert. (A, C) Wildtypembryonen, (B, D) Dsh-homozygote Embryonen. Grauer
Pfeil: Schilddrüse, weißer Pfeilkopf: Lunge, leerer Pfeilkopf: IV. Ventrikel, Stern: Telencephalon, weißer
Balken: relativer Maßstab.
Mittels whole-mount in-situ-Hybridisierung ist eine Expression von Nkx2.1 in den
homozygoten Dsh-Embryonen in diesen Stadien in mehreren Bereichen des Embryos
nachweisbar:
o Im Bereich des Gehirns sind das Großhirnbläschen und der IV. Ventrikel positiv
gefärbt. Im Stadium E10.5 ist die Färbung im Telencephalon nur schwach, im
Stadium E11.5 hingegen stark. Die Färbung im Bereich des IV. Ventrikel ist
unspezifisch (siehe oben).
o Die positiv gefärbte Struktur im Bereich des sich entwickelnden Vorderdarms, die
kaudo-dorsal des Herzens gelegen ist, entspricht der Lungenanlage.
o Sowohl im Stadium E10.5 als auch E11.5 stellt sich eine Struktur im Bereich der
Kiemenbögen, kranio-dorsal des Herzens gelegene Struktur deutlich positiv dar.
Diese entspricht der Schilddrüse.
Im Stadium E13.5 wurde die Expression von Nkx2.1 in der Schilddrüse auf
transversalen Gewebedünnschnitten überprüft. In der Hellfeldaufnahme ist die
3 Ergebnisse
59
Schilddrüse als einlappige, ventrolateral des Ösophagus gelegene Struktur mit sich
entwickelndem follikulärem Aufbau zu erkennen. Im Dunkelfeld stellt sich eine deutliche
Anreicherung des Signals im Bereich der Schilddrüse dar. Nkx2.1 ist also in der
Schilddrüse im Stadium E13.5 exprimiert.
Abbildung 3.25: Nkx2.1-Expression in der Schilddrüse der Dsh/Dsh-Embryonen im Stadium E13.5.
Die Pfeile markieren die Schilddrüse.
Zusätzlich zum Nachweis der Expression auf mRNA-Ebene erfolgte für Nkx2.1
außerdem ein Nachweis des Proteins mittels Immunhistochemie auf transversalen
Gewebedünnschnitten der Schilddrüsenregion. Diese zeigt eine positive Färbung der
Schilddrüse in den untersuchten Stadien E11.5 bis E14.5 (siehe auch Kapitel 3.1.1 und
3.2.1).
Die Nkx2.1-Expression in der Schilddrüse der Dsh/Dsh – Embryonen entspricht dem
Wildtyp.
3.4.3
Pax8
Pax8 ist während der gesamten Embryonalentwicklung in der Schilddrüse exprimiert.
Außerdem ist Pax8 im Stadium E10.5 im nephrogenen Mesenchym der Urniere
(Mesonephros) exprimiert. Im Bereich des Nervensystems ist für das Stadium E11.5
eine Expression im Bereich des Myelencephalon und des Neuralrohrs beschrieben
[10, 66].
Die Sonde für Pax8 wurde im Rahmen der vorliegenden Arbeit neu generiert. Die
whole-mount in-situ-Hybridisierung in Widtypembryonen der Stadien E10.5 und E11.5
zeigt das erwartete Expressionsmuster von Pax8 in der Schilddrüsenanlage, im
3 Ergebnisse
60
nephrogenen Mesenchym und dem Neuralrohr. Des Weiteren zeigt sich insbesondere
im Stadium E10.5 eine deutliche Expression im Bereich des otischen Vesikel.
o Abbildung 3.26: Pax8 Expression in Dsh/Dsh–Embryonen der Stadien E10.5 und E11.5.
Pax8 ist im Stadium E10.5 und E11.5 in der Nierenanlage, dem zentralen Nervensystem und der
Schilddrüse der Dsh-homozygoten Embryonen exprimiert. (A, C) Wildtypembryonen, (B, D) Dshhomozygote Embryonen. Grauer Pfeil: Schilddrüse, weißer Pfeilkopf: Nierenanlage, leerer Pfeilkopf: ZNS,
Stern: Ohrbläschen, weißer Balken: relativer Maßstab.
Die whole-mount in-situ-Hybridisierung zeigt in den Dsh-homozygoten Embryonen die
Expression von Pax8 in mehreren Regionen des Embryos:
o Im kaudalen Anteil des Embryos färbt sich im Stadium E10.5 eine längliche Region
positiv an, die ventral des Neuralrohres gelegen ist. Diese entspricht dem
nephrogenen Mesenchym der Nachniere.
o Dorsal, auf Höhe der Kiemenbögen gelegen, ist im Stadium E10.5 eine runde
Struktur positiv. Diese entspricht dem Ohrbläschen.
o Im Bereich des Nervensystems ist im Stadium E10.5 keine Expression nachweisbar.
Jedoch kann aufgrund einer Schädigung des Embryos im kranialen Bereich des
Kopfes keine Aussage über eine Expression in dieser Region gemacht werden. Im
Stadium E11.5 ist im Neuralrohr eine leichte, gegenüber dem Wildtyp deutlich
verminderte Expression nachweisbar. Die Anfärbung im Bereich des IV. Ventrikel ist
unspezifisch.
3 Ergebnisse
61
o Im Bereich der Kiemenbögen stellt sich im Stadium E10.5 und E11.5 eine kleine,
runde Struktur dar, die am Ausflusstrakt des Herzens lokalisiert ist. Diese entspricht
der Schilddrüsenanlage.
Im Stadium E13.5 wurde die Expression von Pax8 in der Schilddrüse Dsh-homozygoter
Embryonen auf transversalen Gewebedünnschnitten überprüft. In der Hellfeldaufnahme
ist die Schilddrüse einlappig und deutlich lateral der Mittellinie positioniert. Im
Dunkelfeld stellt sich eine deutliche Anreicherung des Signals im Bereich der
Schilddrüse dar. Pax8 ist also im Stadium E13.5 in der Schilddrüse Dsh-homozygoter
Embryonen exprimiert.
Eine weitere Signalanhebung ist über dem Lumen eines zur Schilddrüse benachbarten
arteriellen Gefäßes zu beobachten. Dieses Signal wird durch dort gelegene
Erythrozyten hervorgerufen und ist unspezifisch.
Abbildung 3.27: Pax8 ist in der Schilddrüse der Dsh/Dsh-Embryonen im Stadium E13.5 exprimiert.
(A), (B) Dunkelfeldaufnahmen, (C), (D) dazugehörige Hellfeldaufnahmen. Die Pfeile markieren die
Schilddrüse. Der Asterix markiert eine Arterie mit darin gelegenen Erythrozyten, die aufgrund ihrer
Brechungseigenschaften ein falsch positives Signal verursachen.
Die Pax8-Expression in der Schilddrüse der Dsh/Dsh–Embryonen entspricht dem
Wildtyp.
3 Ergebnisse
3.4.4
62
FoxE1
Die Expression von Foxe1 in der Schilddrüse Dsh-homozygoter Embryonen wurde Im
Stadium
E13.5
auf
transversalen
Hellfeldaufnahme ist die Schilddrüse
Gewebedünnschnitten
einlappig und
überprüft.
In
der
deutlich lateral der Mittellinie
positioniert. Im Dunkelfeld stellt sich eine deutliche Anreicherung des Signals im
Bereich der Schilddrüse dar. Foxe1 ist also im Stadium E13.5
in der Schilddrüse
Dsh-homozygoter Embryonen exprimiert.
Eine weitere Signalanhebung ist über dem Lumen eines zur Schilddrüse benachbarten
arteriellen Gefäßes zu beobachten. Dieses Signal wird durch dort gelegene
Erythrozyten hervorgerufen und ist unspezifisch.
Abbildung 3.28: FoxE1 ist in der Schilddrüse der Dsh/Dsh-Embryonen im Stadium E13.5
exprimiert.
(A), (B) Dunkelfeldaufnahmen, (C), (D) dazugehörige Hellfeldaufnahmen. Die Pfeile markieren die
Schilddrüse. Der Asterix markiert eine Arterie mit darin gelegenen Erythrozyten, die aufgrund ihrer
Brechungseigenschaften ein falsch positives Signal verursachen.
Die Foxe1-Expression in der Schilddrüse der Dsh/Dsh – Embryonen entspricht dem
Wildtyp.
4 Diskussion
4
63
Diskussion
Die Schilddrüsendysgenesie stellt eine häufige Fehlbildung dar, deren Ätiologie in den
meisten Fällen unklar ist [15]. Um die Ursachen der Schilddrüsendysgenesie weiter
aufzuklären, ist ein besseres Verständnis der Schilddrüsenorganogenese notwendig.
Aus der Entwicklung von Leber und Pankreas ist die Bedeutung der Gefäße für die
Organogenese endodermaler Organe bekannt [33]. Daher wurden im Rahmen der
vorliegenden Arbeit zur Entwicklung der Schilddrüse folgende Hypothesen geprüft:
 Es besteht eine Ko-Entwicklung der arteriellen zervikalen Gefäße und der
Schilddrüse.
Dies wurde durch die 3-dimensionale Rekonstruktion der Schilddrüse und benachbarter arterieller Gefäßstrukturen, insbesondere der Kiemenbogenarterien,
in verschiedenen embryonalen Stadien überprüft (siehe Kapitel 3.1).
 Eine gestörte Entwicklung der Gefäße führt zu einer Schilddrüsendysgenesie.
Diese Hypothese wurde in der Shh-defizienten Dsh-Mausmutante, bei der sowohl
eine Asymmetrie der Schilddrüse als auch der Halsgefäße besteht, überprüft,
indem die Entwicklung der Schilddrüse und der Gefäße 3-dimensional
rekonstruiert wurde (siehe Kapitel 3.2 und 3.3).
 Eine Shh-Defizienz führt zu einer Störung des Expressionsprofils der
zellautonomen
Transkriptionsfaktoren
Nkx2.1,
Pax8,
Foxe1
der
Schilddrüsenanlage.
Dies wurde durch in-situ-Hybridisierungen in Wildtyp- und Dsh-homozygoten
Embryonen überprüft (siehe Kapitel 3.4).
4 Diskussion
4.1
64
Die gemeinsame Entwicklung von Schilddrüsenanlage und
arteriellen Gefäßen
Im Rahmen dieser Arbeit wurde die embryonale Entwicklung der Schilddrüse in der
Maus in den Stadien E9.5 bis E14.5 untersucht und ihre Beziehung zur den arteriellen
Gefäßen
während
der
Entwicklung
anhand
3-dimensionaler
Rekonstruktionen
dargestellt. Die Untersuchung der physiologischen Schilddrüsenentwicklung in WildtypEmbryonen
hat
hierbei
gezeigt,
dass
der
Beginn
der
morphologischen
Schilddrüsenentwicklung im Stadium E9.5, gekennzeichnet durch die Bildung des
Schilddrüsenprimordiums im Pharynxepithel, in enger Nachbarschaft zur ventralen
Aorta stattfindet. Der enge Kontakt zwischen Schilddrüse und dem Ausflusstrakt des
Herzens bleibt während der darauffolgenden Evagination des Primordiums und der
Relokalisation entlang der anterior-posterioren Achse nach kaudal erhalten. Im weiteren
Verlauf kommt es durch das laterale Auswachsen der Schilddrüsenanlage zur
Ausbildung der beiden Schilddrüsenlappen. Diese morphologische Wandlung der
Schilddrüse erfolgt in engem Kontakt zu den sich entwickelnden Aa. carotideae, der
Kontakt zum Ausflusstrakt des Herzens hingegen geht verloren und die Schilddrüse
erfährt eine Relokalisation nach kranial, so dass sie schließlich auf Höhe des Larynx
lokalisiert ist (siehe Kapitel 3.1).
Mit Hilfe der 3-dimensionalen Rekonstruktion der Schilddrüsenentwicklung ist es
gelungen, neue Erkenntnisse über die Morphogenese der Schilddrüse zu erlangen. Die
Interpretation
der
3-dimensionalen
Darstellungen
legt
eine
Gliederung
der
Entwicklungsprozesse in zwei Phasen nahe:
1. Phase: Diese setzt sich aus der Bildung des Schilddrüsenprimordiums sowie
dessen Evagination und Relokalisation nach kaudal zusammen. Während dieser
Phase besteht ein enger Kontakt zwischen dem Primordium und der ventralen
Aorta bzw. dem Ausflusstrakt des Herzens (E9.5 – E12.5).
2. Phase: Diese umfasst die Ausbildung der Schilddrüsenlappen und die
Relokalisation der Schilddrüse nach kranial. Hierbei geht der Kontakt der
Schilddrüsenanlage zum Ausflusstrakt des Herzens bzw. dem Aortenbogen
verloren, indes besteht ein enger Kontakt zu den beidseitig lokalisierten Aa.
carotideae (ab E12.5).
In Folge der 2-phasigen morphologischen Entwicklung der Schilddrüse kommt es zur
charakteristischen Form und Position der Schilddrüse mit 2 Lappen, die kaudal über
4 Diskussion
65
einen schmalen Isthmus verbunden und ventral von Trachea und Larynx gelegen sind.
In der bisherigen Darstellung der Schilddrüsenentwicklung wurde davon ausgegangen,
dass die beiden Schilddrüsenlappen durch eine Bifurkation der Schilddrüsenanlage
während ihres Deszensus entstehen [6, 35]. Dieser Darstellung widerspricht jedoch die
Tatsache, dass der Isthmus nicht im kranialen, sondern im kaudalen Anteil der
Schilddrüse positioniert ist. Durch die Erkenntnis, dass die Schilddrüsenlappen in der
2. Phase der morphologischen Schilddrüsenentwicklung durch ein Auswachsen der
Schilddrüsenanlage nach kranial entstehen, ist es gelungen, diese Diskrepanz zu
erklären.
Insbesondere durch die 3-dimensionalen Rekonstruktionen konnte im Rahmen der
vorliegenden
Arbeit
die
enge
Nachbarschaft
der
Schilddrüse
zu
arteriellen
Gefäßstrukturen während ihrer Entwicklung gezeigt werden. Eine ähnliche Darstellung
der Ko-Entwicklung gelang kürzlich der Arbeitsgruppe um Fagman et al., die anhand
von Immunfluoreszenzen für die 1. Phase der Entwicklung gezeigt haben, dass das
Schilddrüsenprimordium und die Aorta zu Beginn der Schilddrüsenentwicklung in
direktem Kontakt stehen [67]. Trotz des Auftretens einer dünnen, aus Mesenchymzellen
aufgebauten Schicht zwischen dem Schilddüsenprimordium und der Aorta während der
anschließenden Relokalisation, bleiben diese weiterhin eng benachbart. In Bezug auf
die 2. Phase der morphologischen Schilddrüsenentwicklung konnten sie im Stadium
E12.5 einen engen Kontakt der Schilddrüsenanlage zu den 3. Kiemenbogenarterien,
aus denen sich im Verlauf die Aa. carotideae entwickeln, nachweisen. Außerdem
konnten sie zeigen, dass sich die mediale Schilddrüsenanlage entlang eines Pfades,
der parallel zu den Gefäßen verläuft, nach lateral ausbreitet [67]. Die von Fagman et al.
publizierten Ergebnisse bestätigen somit die im Rahmen der vorliegenden Arbeit
gewonnenen Erkenntnisse über die enge Nachbarschaft der Schilddrüsenanlage zum
Ausflusstrakt des Herzens in der 1. Phase und den Aa. carotideae in der 2. Phase der
Morphogenese.
Weitere wichtige Erkenntnisse über die Schilddrüsenentwicklung konnten durch
Untersuchungen im Zebrafisch (Danio rerio), der in den letzten Jahren zunehmend an
Bedeutung als Modellorganismus für die Entwicklungsbiologie gewonnen hat, erlangt
werden. Ebenso wie die Maus besitzt der Zebrafisch hormonproduzierende
Schilddrüsenfollikel,
jedoch
sind
diese
nicht
zu
einem
kompakten
Organ
4 Diskussion
66
zusammengelagert, sondern einzeln entlang der ventralen Aorta im Bereich der Kiemen
verteilt (siehe Abbildung 4.1) [68].
Abbildung 4.1: Die Distribution der Schilddrüsenfollikel im Zebrafisch
Die Schilddrüsenfollikel (blau) sind im adulten Zebrafisch entlang der ventralen Aorta (rot) lokalisiert. Sie
verteilen sich vom Bulbus arteriosus (rot) ausgehend im Bereich der Kiemen (gelb) [68].
Trotz der morphologischen Unterschiede der adulten Schilddrüse des Zebrafisches im
Vergleich mit der Maus besteht auf molekularer Ebene eine starke Konservierung der
an der Schilddrüsenentwicklung beteiligten Gene. Während der Entwicklung der
Schilddrüsenanlage werden im Zebrafisch nkx2.1a, pax8, pax2 und hhex exprimiert, die
Homo- und Paraloga der entwicklungsrelevanten Gene Nkx2.1, Pax8 und Hhex der
Schilddrüse von Maus und Mensch darstellen. Eine Inaktivierung der Gene mittels
Morpholino-Technik oder in Mutanten resultiert in Zebrafischembryonen in einem Defekt
der Schilddrüsenorganogenese [23, 68]. Auch im Hinblick auf die Beziehung der
Schilddrüsenanlage zum Herzens und arteriellen Gefäßstrukturen während der
physiologischen Schilddrüsenentwicklung kann der Zebrafisch wichtige Erkenntnisse
beitragen. Untersuchungen zum Zeitpunkt der Induktion haben gezeigt, dass auch im
Zebrafisch die Schilddrüsenanlage zu Beginn der Entwicklung dem Ausflusstrakt des
Herzens benachbart ist. Diese Nachbarschaft bleibt während der Evagination und
Relokalisation
des Schilddrüsenprimordiums
erhalten. Während
der folgenden
Proliferation breiten sich die Schilddrüsenfollikel im Kontakt zur ventralen Aorta entlang
der anterior-posterioren Achse aus und sind schließlich im Bereich der Kiemen
lokalisiert [69].
Der Vergleich der beiden Spezies zeigt, dass die Morphogenese der Schilddrüse im
Zebrafisch und der Maus grundsätzliche Ähnlichkeiten aufweist. Insbesondere die
1. Phase, charakterisiert durch die Nachbarschaft des Schilddrüsenprimordiums zum
Ausflusstrakt des Herzens, scheint in beiden Spezies sehr ähnlich zu verlaufen. Zwar
besteht auch im Zebrafisch ähnlich wie in der Maus in der 2. Phase der Kontakt zu
4 Diskussion
67
einem arteriellen, den Kopfbereich versorgenden Gefäß, jedoch ist die ventrale Aorta im
Gegensatz zu den paarig angelegten Aa. carotideae nur ein singuläres Gefäß. Die
Unterschiede in der 2. Phase der morphologischen Schilddrüsenentwicklung resultieren
schließlich in der speziesspezifischen Morphologie der Schilddrüse.
Auch
der
Vergleich
weiterer
Spezies
zeigt
ausgeprägte
Unterschiede
der
Schilddrüsenmorphologie. So bildet die Schilddrüse des Schnabeligels (Echidna) aus
der Ordnung der Monotremen ein kompaktes, einlappiges Organ aus, das intrathorakal
am Ausflusstrakt des Herzens lokalisiert ist [70]. Mit Hinblick auf die neuen
Erkenntnisse
über
die
Morphogenese
der
Schilddrüse
ist
dies
durch
eine
morphologische Entwicklung zu erklären, bei der die 1. Phase ähnlich der Entwicklung
in Maus und Zebrafisch in Nachbarschaft zum Ausflusstrakt des Herzens verläuft, bei
der jedoch die 2. Phase im Sinne einer Relokalisation nach kranial und der Ausbildung
zweier
Lappen
ausbleibt.
Eine
systematische
Zusammenstellung
der
Schilddrüsenmorphologie und der Organisation der zervikalen Gefäße in verschiedenen
Spezies könnte weitere interessante Einblicke in die morphologische Ko-Entwicklung
von Schilddrüse und Halsgefäßen ermöglichen.
Anhand der 3-dimensionalen Rekonstruktion der Schilddrüsenanlage und der
benachbarten arteriellen Gefäßstrukturen ist es gelungen, die Nachbarschaft der
Schilddrüse zum Ausflusstrakt des Herzens und den Aa. carotideae während der
Embryonalentwicklung in einer bisher nicht bekannten detaillierten räumlichen
Auflösung darzustellen. Darauf basierend konnte die Morphogenese der Schilddrüse in
2 Phasen unterteilt werden, wobei sich insbesondere die 2. Phase zwischen den
Spezies unterscheidet und zur speziesspezifischen Morphologie der Schilddrüse führt.
4.2
Eine gestörte Entwicklung der zervikalen Gefäße führt zu einer
Störung der Schilddrüsenmorphogenese
Im Rahmen der vorliegenden Arbeit konnte gezeigt werden, dass die Entwicklung der
Schilddrüse in der Maus in enger Nachbarschaft zu arteriellen Gefäßstrukturen wie dem
Ausflusstrakt des Herzens und der Aa. carotideae stattfindet. Wie aus der Entwicklung
anderer
endodermaler
Organe
bekannt
ist,
kann
eine
gestörte
Entwicklung
benachbarter Gefäßstrukturen sekundär zu einer Störung der Organogenese führen
[33]. Um diesen Aspekt auch bezüglich der Schilddrüse näher zu betrachten, wurde die
4 Diskussion
68
Dsh-Maus untersucht, ein Shh-defizientes Mausmodell, bei dem sowohl eine gestörte
Entwicklung des Herzens und des arteriellen Gefäßsystems als auch der Schilddrüse
bekannt ist [41, 47].
Untersuchungen der Gefäß- und Schilddrüsenentwicklung haben gezeigt, dass die
Entwicklung der ventralen Aorta, der Kiemenbogenarterien und der Aa. carotideae in
der Dsh-Maus gestört ist. Hierbei stell sich bis zum Stadium E11.5 ein symmetrisch
organisiertes Gefäßsystem dar, wobei jedoch im Vergleich mit den Wildtypembryonen
nur 1 anstatt 3 Kiemenbogenarterien vorhanden ist. Während der darauffolgenden
Umgestaltung des Gefäßsystems zeigt sich in den Dsh-homozygoten Embryonen, dass
es zu einer Regression der linken dorsalen Aorta und stattdessen zu einer Umwandlung
der rechten dorsalen Aorta in die Aorta descendens kommt, eine Konstellation
spiegelbildlich zu der im Wildtyp. Außerdem ist der Aortenbogen rechtsseitig lokalisiert
und kreuzt somit nicht die Mittellinie. Dies führt zu einer asymmetrischen Lokalisation
der Aa. carotideae auf einer Seite der Mittellinie, meist rechts.
Bezüglich der Störungen in der Entwicklung der Kiemenbogenarterien und ihrer
Derivate entspricht der Dsh-Phänotyp grundsätzlich dem Shh-/--Phänotyp, in dem die
Ausbildung der 4. und 6. Kiemenbogenarterie nicht stattfindet und der Aortenbogen
rechtsseitig lokalisiert ist. Bei den Shh-/--Embryonen im Stadium E16.5 bildet die A.
carotidea jedoch zunächst ein singuläres Gefäß, das aus dem Aortenbogen entspringt
und sich weiter kranial aufspaltet [41].
Bezüglich
der
Entwicklung
der
Schilddrüse
haben
die
3-dimensionalen
Rekonstruktionen der Dsh-Embryonen gezeigt, dass die 1. Phase der Morphogenese
ungestört zu verlaufen scheint. So entsprachen Morphologie und Position der
Schilddrüsenanlage im Stadium E11.5 prinzipiell der Situation in Wildtypembryonen. In
der 2. Phase hingegen sind insbesondere bezüglich der Lappenbildung und
Lokalisation Auffälligkeiten zu beobachten. Im Stadium E12.5 wird deutlich, dass das
Auswachsen der Schilddrüsenanlage nach lateral unterbleibt und die Schilddrüse
stattdessen asymmetrisch auf eine Seite der Mittellinie verlagert ist. Auch in den
darauffolgenden Stadien weist die Schilddrüse einen 1-lappigen statt des typischen
2-lappigen Aufbaus auf und ist asymmetrisch lokalisiert. Hierbei wurde deutlich, dass in
allen untersuchten homozygoten Dsh-Embryonen die Schilddrüse immer auf derselben
Seite wie die fehllokalisierten Aa. carotideae gelegen ist und sich zwischen ihnen
ausbreitet. Die Relokalisation nach kranial erscheint unbeeinträchtigt, so dass die
4 Diskussion
69
Schilddrüse schließlich im Bereich der oberen Trachea und des Larynx lokalisiert ist
(siehe Kapitel 3.2).
Bei der Untersuchung der Schilddrüsen- und Gefäßentwicklung der Dsh-homozygoten
Embryonen war insbesondere auffällig, dass der Zeitpunkt, zu dem erstmalig eine
Störung der morphologischen Schilddrüsenentwicklung auftritt, zeitlich mit der gestörten
Umwandlung des arteriellen Gefäßsystems zusammenfällt. Außerdem sind zwar sowohl
die Aa. carotideae als auch die Schilddrüse fehllokalisiert, jedoch besteht weiterhin die
in der normalen Schilddrüsenentwicklung beobachtete enge Nachbarschaft.
Die gestörte Entwicklung der Schilddrüse in den Dsh-Embryonen, die in einer
1-lappigen Schilddrüse resultiert, ist mit dem von Fagman et al. beschriebenen
Phänotyp der Shh-/--Embryonen vergleichbar. Fagman et al. haben gezeigt, dass in
Shh-/--Embryonen das Primordium erst verzögert den Kontakt zum Pharynxepithel
verliert, jedoch in Nachbarschaft zum Aortenbogen nach kaudal relokalisiert, so dass
sich die 1. Phase der Morphogenese prinzipiell unbeeinträchtigt darstellt. In der 2.
Phase haben Fagman et al. ebenfalls eine 1-lappige Schilddrüse beschrieben, die im
Gegensatz zur Dsh-Maus jedoch bis zum Stadium E15.5 in der Mittellinie lokalisiert ist
und erst später lateralisiert. Außerdem ist die Schilddrüse in der Mehrheit der Shh -/-Embryonen linksseitig, bei den Dsh-homozygoten Embryonen jedoch rechtsseitig
lokalisiert [71]. Für den Aspekt der Ko-Entwicklung von Schilddrüsen und Aa. carotidea
ist in diesem Zusammenhang insbesondere von Bedeutung, dass trotz der
kontralateralen Lokalisationen der Schilddrüse in den Dsh- und Shh-Embryonen die
Schilddrüse immer mit den jeweiligen Aa. carotideae ko-lokalisiert ist.
Die Unterschiede zwischen dem Phänotyp der Shh -/--Embryonen und den Dshhomozygoten
bedingt
sein,
Embryonen
die
der
könnte
durch
Shh-Defizienz
die
zu
unterschiedlichen
Grunde
liegen.
Mutationen
Während
die
Shh-/--Embryonen auf einem gezielten Knockout des Shh-Gens beruhen, liegt bei der
Dsh-Maus eine Inversion mit einer Trennung des Shh-Gens von Promoteranteilen vor
[45, 46]. Es kann jedoch nicht ausgeschlossen werden, dass durch die Inversion auch
die Funktion weiterer Gene verändert und dadurch der Phänotyp zusätzlich beeinflusst
wird.
Trotz der Unterschiede bezüglich des zeitlichen Auftretens des Schilddrüsenphänotyps
und der kontralateralen Position der Schilddrüse in den Shh -/- Embryonen, untermauern
die Ergebnisse von Fagman et al. und Smoak et al. die in den Dsh-homozygoten
Embryonen gewonnenen Erkenntnisse, dass eine Fehllokalisation der Aa. carotideae
4 Diskussion
70
zusammen mit einer veränderten Morphologie und Position der Schilddrüse auftritt,
wobei Aa. carotideae und Schilddrüse benachbart bleiben.
In-situ-Hybridisierungen haben gezeigt, dass in Wildtyp-Embryonen im Stadium E12.5,
zu einem Zeitpunkt, zu dem sich die Störung der Morphogenese in den Dshhomozygoten Embryonen entwickelt, weder Shh noch sein Rezeptor Ptch in der
Schilddrüsenanlage exprimiert wird (siehe Kapitel 3.4.1). Fagman et al. konnten
ebenfalls in verschiedenen Stadien der Schilddrüsenentwicklung keine Expression von
Shh oder Ptch in der Schilddrüsenanlage nachweisen [71]. In der vorliegenden Arbeit
konnte keine Veränderung der Expression der Transkriptionsfaktoren Nkx2.1, Pax8 und
Foxe1 in der Schilddrüsenanlage als Folge der Shh-Defizienz gezeigt werden (siehe
Kapitel 3.4). Daraus kann geschlussfolgert werden, dass der Schilddrüsenphänotyp der
Dsh-homozygoten Embryonen weder auf zellautonome Störungen der Shh- oder PtchExpression in der Schilddrüsenanlage selbst noch auf eine beeinträchtigte Expression
der zellautonomen Transkriptionsfaktoren zurückzuführen ist. Daher ist anzunehmen,
dass der Defekt in der Schilddrüsenmorphogenese der Dsh-Embryonen sekundär aus
einer gestörten Wirkung des umgebenden Gewebes resultiert.
Basierend auf dem Phänotyp der Dsh-homozygoten Embryonen kann eine reine
Koinzidenz von Gefäß- und Schilddrüsenfehllokalisation nicht ausgeschlossen werden.
Dennoch kann aber vermutet werden, dass die 2. Phase der Morphogenese, die die
Form und Position der Schilddrüse bestimmt, maßgeblich durch die benachbarten Aa.
carotideae beeinflusst wird und die Fehllokalisation der Schilddrüse in den Dshhomozygoten Embryonen sekundär aus der Fehllokalisation der Aa. carotideae
resultiert.
Um diese Hypothese weiter zu untersuchen, wurde im Rahmen der vorliegenden Arbeit
die Dsh-Maus mit Gli3-defizienten XtJ-Mäusen verkreuzt. Für die Shh-knockout-Maus ist
bekannt, dass sowohl der durch die Shh-Defizienz verursachte Extremitäten-Phänotyp
als auch der ZNS-Phänotyp bei gleichzeitig bestehender Gli3-Defizienz aufgehoben
bzw. abgemildert werden kann. Es wird postuliert, dass dies auf den Wegfall der
repressiven
Gli3-Wirkung,
die
infolge
der
Shh-Defizienz
vermehrt
auftritt,
zurückzuführen ist [44, 63].
Die Ergebnisse der vorliegenden Arbeit haben ergeben, dass im Stadium E13.5 die
doppelt-homozygoten Embryonen (Dsh/Dsh XtJ/XtJ) vollständige Extremitätenanlagen
4 Diskussion
71
mit einer Polydaktylie aufweisen. Diese Daten zeigen, dass durch die Verkreuzung der
Dsh- mit der XtJ-Maus die Ergebnisse der Shh/XtJ-Verkreuzungen bezüglich des
Extremitätenphänotyps in Teilaspekten reproduziert werden konnten [44].
Im Bereich der Schilddrüse wurde in den doppelt homozygoten Embryonen eine
Wiederherstellung der Symmetrie erreicht. Die Schilddrüse ist in der Mittellinie lokalisiert
und aus 2 symmetrisch angeordneten Lappen aufgebaut, die kaudal über einen breiten
Isthmus verbunden sind. Auch die Aa. carotideae sind symmetrisch angeordnet, und
befinden sich in enger Nachbarschaft zur Schilddrüse und den beiden „rudimentären“
Lappen. Auch wenn es nicht gelungen ist, den Schilddrüsen- und Gefäßphänotyp der
Dsh-homozygoten Embryonen vollständig aufzuheben, konnte in Bezug auf die
Morphologie und Position der Schilddrüse dennoch eine Symmetrie und eine
Lokalisation der Schilddrüse in der Mittellinie erreicht werden. Parallel ist ebenfalls die
Symmetrie der Aa. carotideae wiederhergestellt worden (siehe Kapitel 3.3). Aufgrund
des gleichartigen Verhaltens der Schilddrüse und der Aa. carotideae bezüglich der
Lokalisation und der Symmetrie und der auch in den doppelt-homozygoten Embryonen
bestehenden engen Nachbarschaft wird die Hypothese, dass Morphologie und Position
der Schilddrüse durch die benachbarten Aa. carotideae beeinflusst wird, weiter gestützt.
Allerdings kann auch auf Basis der Daten aus den Dsh/XtJ-Verkreuzungen nicht
ausgeschlossen werden, dass ein gemeinsamer externer Faktor auf die Entwicklung
und Position sowohl der Schilddrüse als auch der Aa. carotideae einwirkt. Um diese
Frage zu klären, erwies sich der Modellorganismus Zebrafisch in Zusammenarbeit mit
der Arbeitsgruppe von K. Rohr (Institut für Entwicklungsbiologie, Universität zu Köln) als
informativ.
Im Zebrafisch breitet sich die Schilddrüsenanlage während der 2. Phase der
Morphogenese in Nachbarschaft zur ventralen Aorta entlang der anterior-posterioren
Achse aus. Alt et al. konnten zeigen, dass in mehreren Zebrafisch- Mutanten, bei denen
eine veränderte Architektur der Kiemenbogenarterien besteht, zugleich eine veränderte
Morphologie der Schilddrüse nachweisbar ist. In den verschiedenen verwendeten
Mutanten wächst die ventrale Aorta nicht entlang der anterior-posterioren Achse aus,
stattdessen bilden sich am Ausflusstrakt des Herzens irreguläre Gefäßäste. Die
1. Phase der Schilddrüsenmorphogenese stellt sich in den verwendeten Mutanten
unauffällig dar, die Schilddrüsenanlage breitet sich anschließend jedoch nicht entlang
der anterior-posterioren Achse aus, stattdessen ist sie weiterhin am Ausflusstrakt des
4 Diskussion
72
Herzens lokalisiert und breitet sich in Nachbarscharschaft zu den irregulären
Gefäßstrukturen nach lateral aus [69]. Diese Ergebnisse zeigen, dass auch im
Zebrafisch,
analog
Dsh-Mausmodell,
zu
eine
den
in
dieser
Ko-Entwicklung
Arbeit
von
gewonnen
Erkenntnissen
Schilddrüsenanlage
und
im
Gefäßen
nachweisbar ist.
Desweiteren bietet der Zebrafisch die Möglichkeit, gezielt die Gefäßentwicklung der
Embryonen zu manipulieren und den daraus resultierenden Effekt auf die Entwicklung
der
Schilddrüse
zu
untersuchen.
Durch
die
Injektion
der
mRNA
der
Transkriptionsfaktoren scl und lmo2 werden Zellen dazu gezwungen, sich zu
endothelialen Vorläuferzellen zu entwickeln [69]. Durch Transplantation derartiger
endothelialer Vorläuferzellen in normale Zebrafischembryonen konnten Alt et al. ektope
Gefäßstrukturen
im
Zebrafischembryo
induzieren.
In
Embryonen,
in
denen
transplantierte Zellen mittels Antikörperfärbung in direkter Nachbarschaft der medialen
Schilddrüsenanlage nachweisbar waren, konnte gleichzeitig eine Ausbreitung des
Schilddrüsengewebes in Richtung der transplantierten Endothelzellen gezeigt werden
[69]. Diese Daten belegen erstmals, dass nicht nur eine Ko-Entwicklung von
Schilddrüse und Gefäßen besteht, sondern sehr wahrscheinlich die Gefäße die
Morphologie der Schilddrüsenanlage beeinflussen.
4.3
Neue Aspekte für die Ätiologie der Schilddrüsendysgenesie
Die Schilddrüsendysgenesie stellt eine relativ häufige Anomalie dar. Zum einen ist in
80-85 % der Fälle eine Schilddrüsendysgenesie Ursache der CH [3], zusätzlich besteht
bei 0.05-0.2% der Bevölkerung eine Hemiagenesie der Schilddrüse [13, 72]. Im
Rahmen dieser Arbeit wurde gezeigt, dass die morphologische Entwicklung der
Schilddrüse in 2 Phasen unterteilt werden kann. Darauf basierend kann eine Zuordnung
der
verschiedenen
Entitäten
der
Schilddrüsendysgenesie
(Athyreose,
Ektopie,
Hypoplasie und Hemiagenesie) zu Störungen in einer der zwei Phasen der
Morphogenese vorgenommen werden.
Abhängig von der zur Klassifizierung verwendeten Methode stellen Ektopie und
Athyreose die häufigste Form der Schilddrüsendysgenesie dar [10]. Bei der Ektopie
kann Schilddrüsengewebe gewöhnlich in unterschiedlichen Lokalisationen im Bereich
des Kopfes und Halses nachgewiesen werden, wohingegen bei der Athyreose kein
funktionsfähiges Schilddrüsengewebe vorhanden ist. Der Schilddrüsenphänotyp der
4 Diskussion
73
Foxe1-knockout-Maus hat deutlich gemacht, dass diese beiden Entitäten keinesfalls
klar voneinander zu trennen sind, da die Foxe1-/--Embryonen beide Dysgenesieformen
aufweisen können [27]. Darauf basierend sind wahrscheinlich sowohl Athyreose als
auch Ektopie auf eine frühe Störung der Schilddrüsenentwicklung zurückzuführen,
wobei insbesondere bei der Ektopie im Kopf-/Halsbereich von einer gestörten
Relokalisation in der 1. Phase der Morphogenese auszugehen ist. Bei der Thyroidea
lingualis betrifft die Störung die Evagination des Primordiums aus dem Pharynxepithel,
wohingegen in den Fällen, bei denen das Schilddrüsengewebe kranial der normalen
Position im Hals lokalisiert ist, von einer etwas späteren Störung auszugehen ist.
Neben der klassischen Ektopie im Kopf-/Halsbereich sind auch Fälle intrakardial
lokalisierten, ektopen Schilddrüsengewebes beschrieben [73]. Diese Form der Ektopie
ist pathogenetisch aus der im Rahmen dieser Arbeit beschriebenen engen
Nachbarschaft des Schilddrüsenprimordiums zum Herzens während der 1. Phase der
Morphogenese ableitbar und darauf basierend durch eine Störung der Relokalisation in
der 2. Phase der Morphogenese zu erklären. Intrakardiale Ektopien unterscheiden sich
demzufolge bezüglich ihrer Pathogenese von den Ektopien im Kopf-/Halsbereich
Eine Zuordnung der Hypoplasie zu einer der beiden Phasen ist schwierig, da davon
auszugehen ist, dass die Hypoplasie auf eine Störung der Proliferation zurückzuführen
ist, die zu jedem Zeitpunkt der Entwicklung auftreten kann. Es kann postuliert werden,
dass das Ausmaß der Hypoplasie vom Zeitpunkt und der Art der Störung abhängig ist
und die Athyreose daher auch als maximale Form der Hypoplasie verstanden werden
kann.
In Bezug auf die Hemiagenesie konnte in der vorliegenden Arbeit gezeigt werden, dass
die einseitig lokalisierte Schilddrüse bei der Dsh-Maus Folge einer gestörten 2. Phase
der Morphogenese ist. Eine isolierte Betrachtung des Schilddrüsenphänotyps könnte zu
dem Schluss führen, dass die Dsh-Maus ein Modell für die Pathogenese der
Hemiagenesie beim Menschen darstellt. Dazu steht im Widerspruch, dass die DshEmbryonen neben der Asymmetrie der Schilddrüse auch eine gestörte Entwicklung der
Aa. carotideae zeigen, wohingegen eine Assoziation von Schilddrüsenhemiagenesien
mit Anomalien der Aa. carotideae im Menschen nicht beschrieben ist. Daher ist es auf
Basis der Erkenntnisse aus der vorliegenden Arbeit nicht möglich, Aussagen über den
zugrundeliegenden pathogenetischen Mechanismus zu treffen, der zur Entstehung
einer Hemiagenesie im Menschen führt.
4 Diskussion
74
Bisher konnte nur in wenigen Patienten die Ätiologie der Schilddrüsendysgenesie durch
einen Mutationsnachweis in den bisher bekannten Kandidatengenen (NKX2.1, PAX8,
FOXE1)
geklärt
werden.
Schilddrüsendysgenesie
Bei
den
handelt
es
bisher
sich
bekannten
um
Gene,
Kandidatengenen
die
während
der
der
Embryonalentwicklung in der Schilddrüsenanlage selbst exprimiert werden.
Die im Rahmen dieser Arbeit durchgeführten Untersuchungen haben verdeutlicht, dass
eine enge Ko-Entwicklung der Schilddrüse mit benachbarten Gefäßstrukturen besteht.
Zusammen mit den von Alt et al. durchgeführten Arbeiten im Zebrafisch konnte
darüberhinaus gezeigt werden, dass die Gefäße die Position und Morphologie der
Schilddrüse
beeinflussen.
Insbesondere
die
Tatsache,
dass
die
mit
der
Schilddrüsendysgenesie assoziierten Fehlbildungen am häufigsten das Herz und die
großen Gefäße betreffen (3-12%), gewinnt in diesem Zusammenhang besondere
Bedeutung [12, 14, 20]. Aus diesen Erkenntnissen resultiert, dass neben den in der
Schilddrüsenanlage exprimierten Genen weitere Gene als mögliche Kandidaten für die
Entstehung der Schilddrüsendysgenesie in Betracht zu ziehen sind. Diese umfassen
zum einen Gene, die zu einer gestörten Herz- oder Gefäßentwicklung führen und zum
anderen Proteine, die von Herz und Gefäßen sezerniert werden und direkt oder indirekt
auf die Schilddrüsenanlage einwirken.
Für Störungen in der 1. Phase der Morphogenese sind aufgrund der engen
Nachbarschaft des Schilddrüsenprimordiums zum Herzen besonders Gene von
Interesse, die zu Herzfehlbildungen führen und/oder vom Ausflusstrakt des Herzens
sezerniert werden.
Ein mögliches Kandidatengen stellt hierbei Nkx2.5, ein Paralog von Nkx2.1, dar. Dieses
ist insbesondere im Zusammenhang mit der Herzentwicklung bekannt. Neuere Arbeiten
haben zeigen können, dass die Nkx2.5-/--Embryonen neben Herzfehlern auch eine
Schilddrüsendysgenesie in Form einer Hypoplasie der Schilddrüsenanlage in frühen
Stadien der Entwicklung aufweisen. Nkx2.5 war in der frühen Schilddrüsenanlage bis
zum Stadium E11.5 nachweisbar. Es konnten NKX2.5-Mutationen in Patienten mit
Schilddrüsendysgenesie nachgewiesen werden, wobei diese Patienten im Unterschied
zum Mausmodell eine Ektopie oder Athyreose hatten [74, 75]. Die Schilddrüse der
Nkx2.5-/--Embryonen kann aufgrund der embryonalen Letalität jedoch nur in frühen
Stadien der Entwicklung untersucht werden, so dass nicht bekannt ist, ob eine Nkx2.5Defizienz auch zu einer Störung der Evagination und Relokalisation in der 1. Phase der
4 Diskussion
75
Schilddrüsenmorphogenese führt. Nkx2.5 wird sowohl in der Schilddrüse als auch im
Herzen exprimiert. Daher könnte eine gestörte 1. Phase der Morphogenese, die
insbesondere einer Ektopie am wahrscheinlichsten zugrunde liegt, sowohl durch eine
zellautonome Störung als auch sekundär aus einem gestörten Kontakt zwischen
Schilddrüse
und
dem
Herzen
resultieren.
Dies
könnte
anhand
eines
gewebespezifischen Knockout von Nkx2.5 in Herz und Schilddrüse weiter geklärt
werden.
Potentielle Kandidaten für Proteine, die vom Herzen auf die Schilddrüse wirken können,
stellen die Mitglieder der Familie der Fibroblast growth factors (Fgf) dar, die als
sekretorische
Proteine
Zell-Zell-Interaktionen
vermitteln
und
wichtige
Wachstumsfaktoren der frühen Embryonalentwicklung darstellen. Als besonders
interessant hat sich diesbezüglich Fgf10 erwiesen. Zum einen, weil Fgf10 während der
Embryonalentwicklung im Ausflusstrakt des Herzens exprimiert wird und Fgf10-/-Embryonen Defekte in diesem Bereich aufweisen [76, 77], zum anderen, da bei den
Fgf10-/--Embryonen gleichzeitig eine Athyreose besteht [78]. Da bisher keine
Expression von Fgf10 in der Schilddrüsenanlage gezeigt werden konnte, ist davon
auszugehen, dass der Schilddrüsenphänotyp sekundär durch die gestörte Entwicklung
anderer Strukturen, wie z.B. des Herzens, resultiert [79]. Diese Hypothese wird weiter
durch die Tatsache unterstützt, dass auch im Knockout-Mausmodell des FgfRezeptors-2, Isoform IIIb (Fgfr2-IIIb), der in vielen endodermalen Organen als Rezeptor
für Fgf10 exprimiert wird, eine Athyreose auftritt [80]. Desweiteren konnte auch im
Zebrafisch
gezeigt
werden,
dass
Fgfs
entscheidend
an
der
frühen
Schilddrüsenentwicklung beteiligt sind [81].
Als Kandidatengene für eine gestörte 2. Phase der Morphogenese bieten sich
insbesondere Gene an, die an der Entwicklung der Kiemenbogenarterien und den Aa.
carotideae beteiligt sind.
Hoxa3
stellt
diesbezüglich
einen
guten
Kandidaten
dar.
Hoxa3
ist
ein
Transkriptionsfaktor, der in verschiedenen Geweben im Bereich der Kiemenbögen,
nicht jedoch in der Schilddrüsenanlage, exprimiert wird und an der Umwandlung der
Kiemenbogenarterien beteiligt ist. Der Knockout von Hoxa3 im Mausmodell führt zu
Anomalien der Aa. carotideae [82, 83]. Außerdem tritt eine Dysgenesie der Schilddrüse
in Form einer Hemiagenesie auf, wobei der Phänotyp variabel ist und eine
unvollständige
Penetranz
vorliegt
[84].
Bisher
sind
keine
HOXA3-Mutationen
4 Diskussion
76
beschrieben worden, so dass nur spekuliert werden kann, wie HOXA3-Mutationen sich
im Menschen manifestieren würden.
Aufgrund des Schilddrüsenphänotyps des Knockout-Mausmodells stellt Tbx1 ein
weiteres Kandidatengen für eine Störung der 2. Phase der Schilddrüsenmorphogenese
dar. Auch Tbx1 ist ein Transkriptionsfaktor und beeinflusst die Entwicklung der
Kiemenbögen und ihrer Derivate, einschließlich der Kiemenbogenarterien. Fagman et
al. konnten keine Expression von Tbx1 in der Schilddrüsenanlage nachweisen, dennoch
weist die Tbx1-/--Maus eine Hemithyroidea auf, wobei die Aa. carotideae jedoch
symmetrisch angeordnet sind. Nähere Untersuchungen
haben gezeigt, dass der
Schilddrüsenphänotyp auf eine kombinierte Störung der 1. und 2. Phase der
Morphogenese zurückzuführen ist. In der 1. Phase verliert die Schilddrüsenanlage in
den Tbx1-/--Embryonen während der Relokalisation den Kontakt zum Ausflusstrakt des
Herzens und ist infolgedessen weiter kranial lokalisiert. In der 2. Phase entwickelt sich
dann jedoch ein Kontakt mit einer der beiden Aa. carotideae und die Schilddrüse
lateralisiert zu der Seite der jeweiligen A. carotideae [85]. In einer weiteren Arbeit
konnte gezeigt werden, dass der Schilddrüsenphänotyp der Tbx1 -/- -Embryonen durch
einen mangelnde Fgf8-Expression infolge der Tbx1-Defizienz in dem die Schilddrüse
umgebenden Mesenchym verursacht wird [86]. Die Tatsache, dass es zur Ausbildung
einer Asymmetrie der Schilddrüse trotz symmetrischer Reduktion der Fgf8-Expression
im Mesenchym und erhaltender Symmetrie der Aa. carotideae kommt, legt nahe, dass
noch weitere, eventuell asymmetrisch exprimierte Faktoren an der Entstehung
des
Phänotyps beteiligt sind.
Die Tbx1-knockout-Maus wird als Modell für das 22q11DS-Syndrom (velo-cardio-facial
syndrome/DiGeorge-Syndrom)
angesehen,
da
die
Tbx1-/--Embryonen
den
menschlichen Phänotyp in vielen Aspekten widerspiegeln und das 22q11DS-Syndrom
zudem häufig durch Mikrodeletionen verursacht wird, die u.a. den TBX1-Genlokus
einschließen. Bei Patienten mit 22q11DS-Syndrom ist eine häufige Koinzidenz (ca.
20%) von Defekten der Schilddrüse und des kardiovaskulären Systems beobachtet
worden [87]. Auch wenn der Einfluss weiterer im Rahmen des 22q11DS-Syndroms
betroffener Gene auf die Schilddrüsenentwicklung nicht bekannt ist, kann aufgrund der
Daten aus dem Tbx-/--Mausmodell davon ausgegangen werden, dass der Tbx1-Mangel
eine Ursache des Schilddrüsenphänotyps der 22q11DS-Patienten darstellt.
4 Diskussion
Bei
der
77
Suche
nach
neuen
Genen
und
Mechanismen,
die
zu
einer
Schilddrüsendysgenesie führen können, ist zu bedenken, dass das Auftreten und die
Ausprägung der Schilddrüsendysgenesie auch durch den genetischen Hintergrund im
Sinne einer polygenen Vererbung beeinflusst werden kann. Darauf deutet zum einen
eine wesentlich niedrigere Inzidenz der kongenitalen Hypothyreose von 1:10 000 in der
afro-amerikanischen Bevölkerung der USA hin [20]. Zum anderen kann bei derselben
Mutation z.B. des Pax8-Gens eine starke Variabilität des Phänotyps beobachtet werden
[88]. Desweiteren ergab eine Studie in Verwandten ersten Grades von Patienten mit
Schilddrüsendysgenesie in ca. 21% der Familien Auffälligkeiten im Bereich der
Schilddrüse wie u.a. Ductus-thyroglossus-Zysten oder Hemiagenesien bei nicht
manifest erkrankten Verwandten [89]. Im Mausmodell konnte in Nkx2.1/Pax8-doppeltheterozygoten Mäusen eine Beeinträchtigung der Schilddrüsenentwicklung gezeigt
werden, die bei den einfach heterozygoten Mäusen nicht bestand. Dieser Phänotyp
konnte jedoch nur in einem bestimmten Mausstamm nachgewiesen werden [90]. In der
Zusammenschau dieser Beobachtungen wird deutlich, dass eine Vielzahl verschiedener
genetischer Einflüsse an der Schilddrüsenentwicklung beteiligt ist, über die derzeit nur
wenig bekannt ist.
Im Rahmen dieser Arbeit ist es gelungen, neue Einblicke in die Morphogenese der
Schilddrüse zu erarbeiten. Die gewonnenen Erkenntnisse über die Phasen der
Morphogenese und den Einfluss arterieller Gefäßstrukturen ermöglichen es, neue
Hypothesen
über
die
Entstehung
der
Schilddrüsendysgenesie
aufzustellen.
Mausmutanten, bei denen sowohl Anomalien des Herzens oder der Gefäße als auch
der
Schilddrüse
bestehen,
können
hierbei
wichtige
Anhaltspunkte
für
neue
Kandidatengene liefern. Diesbezüglich konnten durch die Daten der vorliegenden Arbeit
Mitglieder der Fgf-Familie inkl. ihrer Rezeptoren, aber auch Transkriptionsfaktoren wie
Hoxa3 und Tbx1, die im die Schilddrüsenanlage umgebenden Gewebe exprimiert
werden, als interessante neue Kandidatengene identifiziert werden. Hierbei ist zu
bedenken, dass auch eine Kombination verschiedener, bei isoliertem Auftreten
eventuell nicht pathogener Veränderungen, im Sinne einer polygenen Ätiologie zur
Entstehung der Schilddrüsendysgenesie führen könnte. Mutationssuchen in gut
charakterisierten Patientenkollektiven mit Schilddrüsendysgenesie werden die neu
postulierten Kandidatengene schließlich als solche widerlegen oder bestätigen müssen.
5 Zusammenfassung
5
78
Zusammenfassung
Die kongenitale Hypothyreose stellt mit einer Inzidenz von 1:3000 bis 4000 die
häufigste angeborene endokrine Erkrankung dar [1]. In 80-85% der Fälle ist sie durch
eine Störung der Organogenese mit daraus resultierender Schilddrüsendysgenesie
bedingt [3]. Die Ätiologie der Dysgenesie konnte bisher nur in wenigen Patienten durch
Mutationsnachweise in einem der bekannten, in der Schilddrüsenanlage exprimierten
Kandidatengene NKX2.1, PAX8, FOXE1 geklärt werden [91].
Im Rahmen der vorliegenden Arbeit wurde die Morphogenese der Schilddrüse im
Zusammenhang mit der Entwicklung des kardiovaskulären Systems untersucht.
Zu
diesem Zweck erfolgte die 3-dimensionale Rekonstruktion der Schilddrüsen- und
Gefäßentwicklung sowohl in Wildtyp- als auch in Shh-defizienten Dsh-Mausembryonen.
Die Untersuchung der Wildtyp-Embryonen hat gezeigt, dass die Morphogenese der
Schilddrüse in 2 Phasen unterteilt werden kann. Die 1. Phase umfasst die Bildung und
Evagination am ventralen Pharynx und die Verlagerung des Primordiums nach kaudal,
die 2. Phase die Ausbildung der zwei symmetrischen Schilddrüsenlappen und die
Relokalisation der Schilddrüsenanlage nach kranial. Dabei wurde eine enge
Nachbarschaft der Schilddrüse zum kardiovaskulären System deutlich. In der 1. Phase
besteht ein enger Kontakt zum Ausflusstrakt des Herzens, in der 2. Phase zu den Aa.
carotideae.
In der Dsh-Maus als Modell für eine gestörte, asymmetrische Entwicklung des
kardiovaskulären Systems war eine ebenfalls asymmetrisch verlaufende Entwicklung
der Schilddrüse nachweisbar. Die parallele Veränderung der Entwicklung von
Schilddrüse und Aa. carotideae bestätigte sich auch in Dsh/Dsh Xt J/XtJ-Embryonen, bei
denen eine Wiederherstellung der Symmetrie von Schilddrüse als auch der Karotiden
nachweisbar war.
Untersuchungen des Shh und Ptch sowie Nkx2.1, Pax8 und Foxe1 ergaben keinen
Hinweis, dass die Schilddrüsendysgenesie der Dsh-homozygoten Embryonen auf eine
zellautonome
Störungen
der
Genexpression
der
Schilddrüsenanlage
selbst
zurückzuführen ist, sondern wahrscheinlich aus einer gestörten Expression bisher nicht
identifizierter
Wachstumsfaktoren,
die
Schilddrüsenanlage vermitteln, resultiert.
den
Einfluss
der
Gefäße
auf
die
5 Zusammenfassung
79
Anhand der 3-dimensionalen Rekonstruktionen von Wildtyp- und Shh-defizienten
Embryonen ist es gelungen, die Ko-Entwicklung von Schilddrüse und kardiovaskulärem
System aufzuzeigen. Auf Grundlage dieser Erkenntnis und analoger Ergebnisse aus
dem Zebrafisch ist davon auszugehen, dass sowohl Morphologie als auch Position der
Schilddrüse durch benachbarte Anteile des kardiovaskulären Systems beeinflusst
werden [69]. Dieses neue Verständnis der Schilddrüsenembryogenese weist darauf hin,
dass in der Pathogenese der angeborenen Hypothyreose neue Kandidatengene im
Bereich der Ko-Entwicklung von Schilddrüse und Herz zu suchen sind. Langfristig
können Mutationsnachweise in diesen neuen Kandidatengenen zur ätiologischen
Aufklärung der angeborenen Hypothyreose mit beitragen.
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of
congenital
7 Anhang
7
7.1
87
Anhang
Abkürzungsverzeichnis
Im Abkürzungsverzeichnis sind die im Rahmen der vorliegenden Arbeit verwendeten
Abkürzungen aufgelistet. Auf die Auflistung von allgemein üblichen Abkürzungen wurde
verzichtet. Desweiteren wurde auch die Auflistung von chemischen Elementen und
Summenformeln, Puffernamen (sofern im Methodenteil erläutert) sowie von offiziellen
Symbole von Genen verzichtet.
®
amtlich registrierte Marke
°C
Grad Celsius
µg
Mikrogramm (entspricht 10
-6
g)
µl
Mikroliter (entspricht 10
-6
l)
µm
Mikrometer (entspricht 10
-6
1st bzw. 2nd
1. bzw. 2. Kiemenbogen(arterie)
1x bzw. 10x
1-fach bzw. 10-fach konzentriert
3rd, 4th, 6th
3., 4., 6. Kiemenbogen(arterie)
A. bzw. Aa.
Arteria bzw. Arteriae
Ad
Aorta dorsalis
AG
Arbeitsgruppe
Ao
Aorta ascendens
AP
Alkalische Phosphatase
Aqua dem
Demineralisiertes Wasser
bp
Basenpaar(e)
Br/br
Bronchus
cDNA
< engl. complementary DNA >, komplementäre DNA
CH
< engl. congenital hypothyroidism >, kongenitale Hypothyreose
ddH2O
zweifach destilliertes Wasser
DEPC
Diethylpyrocarbonat
dH2O
destiliertes Wasser
DIG
Digoxigenin
DNA
< engl. Deoxyribonucleic acid >, Desoxyribonukleinsäure
DNase
Desoxyribonuklease
dNTP(s)
Didesoxyribonukleosidtriphosphat(e)
Dsh
< engl. short digits >, Mutationssymbol eines verwendeten Mausstamms
E
Tag der Embryonlaentwicklung (Maus)
EDTA
Ethylendiamintetraacetat
m)
7 Anhang
88
et al.
< lat. et alii >, und andere
F
< engl. forward>, Vorwärts-Primer
Fgf(s)
< engl. fibroblast growth factor>, Fibroblasten Wchstumsfaktor(en)
GCPS
Greig-Cephalo-Polysyndaktylie-Syndrom
H2O
verwendet im Sinne von Wasser
HE
Hämatoxylin-Eosin
He
Herz/Ausflusstrakt des Herzens
HPLC
< engl. high performance liquid chromatography >,
Hochleistungsflüssigkeitschromatographie
kb
Kilobasen
Kb
Kiemenbogen
l
Liter
La/la
Larynx
LBamp
LB-Medium mit Ampicillin versetzt
lc
Linke Arteria carotis
m
Meter
M
molar
Mb
Processus mandibularis
min
Minute(n)
Ml
Milliliter (entpricht 10 l)
mM
Millimolar (entspricht 10-3 molar)
MPI
Max-Planck-Institut
mRNA
< engl. messenger RNA >, Boten-RNA
Mx
Processus maxillaris
N./Nn.
Nervus (Singular)/Nervi (Plural)
Nc
Notochord
NTP(s)
Nukleosidtriphosphat(e)
Nv
Nervus vagus
Oe/oe
Ösophagus
p.a.
< lat. pro analysi > , zur Analyse
p.c.
< lat. post coitum >, nach dem Koitus
PAA
< engl. pharyngeal arch artery >, Kiemenbogenarterie
PBS
< engl. phosphate buffered saline >, Phosphat-gepufferte Salzlösung
PCR
< engl. polymerase chain reaction >, Polymerasekettenreaktion
PFA
Paraformaldehyd
pH
pH-Wert
Ph/ph
Pharynx
R
< engl. reverse >, Rückwärts-Primer
rc
Rechte Arteria carotis
RNA
< engl. Ribonucleic acid >, Ribonukleinsäure
-3
7 Anhang
89
RNase
Ribonuklease
rpm
< engl. rounds per minute >, Umdrehungen pro Minute
RT
Reverse Transkription
rt
< engl. room temperature >, Raumtemperatur
s
Sekunde
SDS
< engl, sodium dodecylsulfate >, Natriumdodecylsulfat
SSC
< engl. standard saline citrate >, Standard Saline Citrat
Std.
Stunde
T3
Triiodthyronin
T4
Tetraiodthyronin, Thyroxin
Taq
Thermus aquaticus, Bakterienstamm
Tm
Thymus(primordium)
Tr/tr
Trachea
TSH
Thyroidea stimulierendes Hormon
™
< engl. trademark >, Marke
U
< engl. unit >, Einheit
ü/N
über Nacht
USA
< engl. United States of America >, Vereinigte Staaten von Amerika
V./Vv.
Vena (Singular)/Venae (Plural)
va
Ventrale Aorta
J
Xt
< engl. extra-toes >, Alleldesignation der verwendeten Gli3-knockout-Maus
ZNS
Zentrales Nervensystem
7 Anhang
7.2
90
Herstellerverzeichnis
Hersteller
Ort
Agfa
Mortsel, Belgien
Amersham Biosciences
Little Chalfont, England
Applied Biosystems Inc.
Foster City, CA, USA
Becton Dickinson (BD)
Heidelberg
inkl. DIFCO
Falcon™
Bender & Hobein GmbH
Bruchsal
Biometra GmbH
Göttingen
Biozym Scientific GmbH
Hess. Oldendorf
Boehringer Ingelheim
Ingelheim am Rhein
Carl Roth GmbH + Co. KG
Karlsruhe
Carl Zeiss Microimaging GmbH
Göttingen
D. Moody/S. Lozanoff
University of Alberta, Canada / University of Hawaii, USA
Eppendorf AG
Hamburg
Fermentas GmbH
St.Leon-Rot
Gesellschaft für Labortechnik GmbH
Burgwedel
Gilson, Inc.
Middleton, WI, USA
Heraeus Holding GmbH
Hanau
Invitrogen
Invitrogen, Karlsruhe
inkl. Gibco®
Kodak Company
Rochester, NY, USA
Leica Microsystems GmbH
Wetzlar
inkl. Reichert-Jung
Memmert GmbH + Co. KG
Schwabach
Merck KG
Darmstadt
Mettler-Toledo GmbH
Giessen
MPI für molekulare Genetik
Berlin
MWG Biotech AG
Ebersberg
New England Biolabs
Schwalbach
Paul Marienfeld GmbH & Co. KG
Lauda-Königshofen
PEQLAB Biotechnologie GmbH
Erlangen
Qiagen
Hilden
Roche Diagnostics – Applied Science
Mannheim
Sartorius AG
Göttingen
Scotsman Ice Systems
Vernon Hills, IL, USA
Sigma-Aldrich
Taufkirchen
inkl. Fluka
7 Anhang
91
Hersteller
Ort
Techne Inc.
Burlington, NJ, USA
Thermo Scientific
Karlsruhe
inkl. Richard-Allan Scientific
Haake GmbH
Thermo Hybaid GmbH
Ulm
7 Anhang
7.3
92
Abbildungsverzeichnis
Abbildung 1.1: Entitäten der Schilddrüsendysgenesie ..................................................... 2
Abbildung 1.2: Schematische Übersicht über die Schilddrüsenentwicklung in der Maus.5
Abbildung 1.3: Überblick über die frühe Leberentwicklung .............................................. 7
Abbildung 1.4: Koinzidenz der Entwicklung von Pankreas und Gefäßen. ....................... 8
Abbildung 1.5: Schematische Darstellung der Entwicklung der Kiemenbogenarterien. . 10
Abbildung 1.6: Schematische Darstellung des Shh-Signalwegs.................................... 11
Abbildung 2.1: 4% Agarosegel einer Dsh-Genotypisierungs-PCR ................................ 20
Abbildung 2.2: Schematischer Überblick über die Arbeitsschritte der in-situHybridisierungen ................................................................................. 28
Abbildung 2.3: Schematischer Überblick über die Lage der Sonden ............................. 29
Abbildung 2.4: SURFdriver 3.5 ...................................................................................... 34
Abbildung 3.1: Die Schilddrüse im Stadium E9.5. ......................................................... 36
Abbildung 3.2: Die Schilddrüse im Stadium E10.5. ....................................................... 37
Abbildung 3.3: Die Schilddrüse im Stadium E11.5. ....................................................... 37
Abbildung 3.4: Die Schilddrüse im Stadium E12.5. ....................................................... 38
Abbildung 3.5: Die Schilddrüse im Stadium E13.5. ....................................................... 39
Abbildung 3.6: Die Schilddrüse im Stadium E14.5. ....................................................... 39
Abbildung 3.7: 3-dimensionale Rekonstruktion der Schilddrüse im Stadium E9.5......... 40
Abbildung 3.8: 3-dimensionale Rekonstruktion der Schilddrüse im Stadium E11.5. ...... 41
Abbildung 3.9: 3-dimensionale Rekonstruktion der Schilddrüse im Stadium E12.5. ...... 42
Abbildung 3.10: 3-dimensionale Rekonstruktion der Schilddrüse im Stadium E13.5. .... 42
Abbildung 3.11: 3-dimensionale Rekonstruktion der Schilddrüse im Stadium E14.5. .... 43
Abbildung 3.12: Histologie der Schilddrüse in Dsh/Dsh-Embryonen des Stadium E11.5.
........................................................................................................... 45
Abbildung 3.13: Histologie der Schilddrüse im Dsh/Dsh-Embryo des Stadium E12.5. .. 45
Abbildung 3.14: Histologie der Schilddrüse im Dsh/Dsh-Embryo des Stadium E13.5. .. 46
Abbildung 3.15: Histologie der Schilddrüse im Dsh/Dsh-Embryo des Stadium E14.5. .. 47
Abbildung 3.16: 3-dimensionale Rekonstruktion der Schilddrüse der Dsh/Dsh–
Embryonen im Stadium E11.5. ........................................................... 47
Abbildung 3.17: 3-dimensionale Rekonstruktion der Schilddrüse der Dsh/Dsh–
Embryonen im Stadium E12.5. ........................................................... 48
7 Anhang
93
Abbildung 3.18: 3-dimensionale Rekonstruktion der Schilddrüse der Dsh/Dsh–
Embryonen im Stadium E13.5. ........................................................... 49
Abbildung 3.19: 3-dimensionale Rekonstruktion der Schilddrüse der Dsh/Dsh–
Embryonen im Stadium E14.5. ........................................................... 50
Abbildung 3.20: Phänotyp der Dsh/Dsh, Dsh/Dsh XtJ/XtJ und XtJ/XtJ –Embryonen im
Stadium E13.5 .................................................................................... 52
Abbildung 3.21: Histologische Darstellung der Schilddrüse im Stadium E13.5 in WildtypEmbryonen sowie doppelten Verkreuzungen von Dsh mit Xt J. ........... 53
Abbildung 3.22: 3-dimensionale Darstellung der Schilddrüsenmorphologie sowie der
Gefäße im Stadium E13.5 im Dsh/Dsh XtJ/XtJ-Embryonen. ............... 54
Abbildung 3.23: Expression von Shh und Ptch1 in der Schilddrüsenregion im Stadium
E12.5. ................................................................................................. 57
Abbildung 3.24: Nkx2.1-Expression in Dsh/Dsh–Embryonen in den Stadien E10.5 und
E11.5 .................................................................................................. 58
Abbildung 3.25: Nkx2.1-Expression in der Schilddrüse der Dsh/Dsh-Embryonen im
Stadium E13.5. ................................................................................... 59
Abbildung 3.26: Pax8 Expression in Dsh/Dsh–Embryonen der Stadien E10.5 und E11.5.
........................................................................................................... 60
Abbildung 3.27: Pax8 ist in der Schilddrüse der Dsh/Dsh-Embryonen im Stadium E13.5
exprimiert. ........................................................................................... 61
Abbildung 3.28: FoxE1 ist in der Schilddrüse der Dsh/Dsh-Embryonen im Stadium
E13.5 exprimiert. ................................................................................ 62
Abbildung 4.1: Die Distribution der Schilddrüsenfollikel im Zebrafisch .......................... 66
Curriculum vitae
Mein Lebenslauf wird aus datenschutzrechtlichen Gründen in der elektronischen Version
meiner Arbeit nicht veröffentlicht.
Publikationsleistungen
Zeitschriftenartikel
Arteries define the position of the thyroid gland during its developmental relocalisation
Alt*, B., O. A. Elsalini*, P. Schrumpf* , N. Haufs, N. D. Lawson, G. C. Schwabe, S. Mundlos, A. Gruters,
H. Krude and K. B. Rohr (2006)
*joint first authors
Development 133(19): 3797-3804.
Vorträge
Dezember 2008
24. Arbeitstagung experimentelle Schilddrüsenforschung, Berlin
Danio rerio - Der Zebrafisch als Modellorganismus der
Schilddrüsenentwicklung
Expression of important embryonic pathways during thyroid development
Dezember 2004
20. Arbeitstagung experimentelle Schilddrüsenforschung, Berlin
Disturbed Co-development of Thyroid Gland and Cervical Arteries as a New
Model for Thyroid Dysgenesis
Oktober 2004
15th European Students conference, Berlin
Session winner
Disturbed Co-development of Thyroid Gland and Cervical Arteries as a New
Model for Thyroid Dysgenesis
September 2004
43rd Annual Meeting European Society for Paediatric Endocrinology (ESPE), Basel
Disturbed Co-development of Thyroid Gland and Cervical Arteries as a New
Model for Thyroid Dysgnesis
Februar 2004
40. Arbeitstagung für pädiatrische Forschung, Göttingen
Koentwicklung von Schilddrüse und Carotiden in der Dsh/Dsh-Maus
Dezember 2003
19. Arbeitstagung experimentelle Schilddrüsenforschung, Halle
Koentwicklung von Schilddrüse und Gefäßen in der sonic hedgehog
defizienten Maus
Poster
Mai 2009
24. Deutscher Kongress für perinatale Medizin / 35. Jahrestagung der Gesellschaft
für Neonatologie und pädiatrische Intensivmedizin, Berlin
Ivanova, A; Schrumpf, P; Dame, C
Expression Patterns of GATA Transcription Factors and their Co-factor
FOG–2 During Development of the Nervous System in the Mouse
Danksagungen
Lieben Dank meinen Freunden und meiner Familie, die mir während dieser Zeit zur Seite
gestanden haben, insbesondere meinen Eltern.
Mein ausdrücklicher Dank gilt Prof. Dr. Stefan Mundlos und seiner Arbeitsgruppe am MaxPlanck-Institut für Molekulare Genetik in Berlin – Dahlem für die Bereitstellung der
Mausmutanten. Ganz besonders möchte ich PD Dr. Georg Schwabe und Norbert Brieske für
die Unterstützung bei den Versuchen danken.
Dr. Klaus Rohr danke ich für die fruchtbare Zusammenarbeit.
Außerdem bedanken möchte ich mich bei allen ehemaligen und derzeitigen Mitarbeitern des
Instituts für experimentelle pädiatrische Endokrinologie für die freundliche Aufnahme in die
Arbeitsgruppe und die gute Atmosphäre, insbesondere auch bei Dr. Nele Haufs für die
Einarbeitung zu Beginn der Arbeit und ihre weitere Unterstützung sowie PD Dr. Heike
Biebermann, die immer ein offenes Ohr hatte. Vielen Dank auch an Dr. Anne Rediger für das
schnelle und ergiebige Feedback beim Vollenden dieser Arbeit.
Mein besonderer Dank gilt Prof. Dr. Heiko Krude für die Bereitstellung des Themas und die
intensive Betreuung, die ständige Diskussionsbereitschaft und für seine unzähligen Ideen und
Anregungen.
`Last but not least` gilt meine tiefste Verbundenheit Prof. Dr. Annette Grüters-Kieslich, ohne
deren langjähriges und großes Engagement für Patienten mit kongenitaler Hypothyreose mir
persönlich die Anfertigung dieser Arbeit nie möglich gewesen wäre.
Erklärung
„Ich,
Pamela Schrumpf, erkläre, dass ich die vorgelegte Dissertation mit dem Thema:
„Dreidimensionale Darstellung der Schilddrüse und benachbarter arterieller Gefäße
während der Embryogenese: Vergleich von Wildtyp- und Sonic-hedgehog-defizienten
Mausembryonen“ selbst verfasst und keine anderen als die angegebenen Quellen
und Hilfsmittel benutzt, ohne die (unzulässige) Hilfe Dritter verfasst und auch in
Teilen keine Kopien anderer Arbeiten dargestellt habe.“
Datum
Unterschrift