ZIP - FreiDok - Albert-Ludwigs

Aus dem Institut für Anatomie und Zellbiologie (Lehrstuhl II)
Der Albert-Ludwigs-Universität Freiburg i. Br.
- Eine Studie zur Segmentidentität des paraxialen Mesoderms
bei VogelembryonenAlle Zellen eines Somiten enthalten dieselben
Informationen zur Segmentidentität
INAUGURAL - DISSERTATION
zur
Erlangung des Medizinischen Doktorgrades
der Medizinischen Fakultät
der Albert–Ludwigs-Universität
Freiburg i. Br.
Vorgelegt im Jahre 2005
von Marlyse Dieuguie Fomenou
geboren in Jaunde, Kamerun
Allen gewidmet, mit denen ich ein Stück meines Lebenswegs gehen durfte, denn nur durch
ihre Präsenz, in guten wie in schlechten Erfahrungen, in Freude wie in Traurigkeit, im Lachen
wie im Weinen, durfte ich lernen, lernen und lernen.
„Alles können wir nicht sein. Deswegen brauchen wir einander als Bereicherung!“
Norbert Aufrecht
Dekan
Prof. Dr. med. Ch. Peters
1. Gutachter
Prof. Dr. med. Dr. h. c. B. Christ
2. Gutachter
Privatdozent Dr. med. C. Erggelet
Jahr der Promotion
2006
I
INHALTSVERZEICHNIS
1
EINLEITUNG .................................................................................................................. 1
1.1
GASTRULATION UND SOMITENBILDUNG ............................................................ 1
1.1.1
1.1.2
Segmentierung: Morphologie und molekulare Mechanismen ........................... 2
Epithelialisierung ............................................................................................... 3
1.2 SOMITENKOMPARTIMENTIERUNG ........................................................................ 3
1.2.1
Kranio-kaudale Kompartimentierung ................................................................ 3
1.2.2
Dorso-ventrale Kompartimentierung ................................................................. 3
1.2.2.1 Dorsale Somitenhälfte .................................................................................... 4
1.2.2.2 Ventrale Somitenhälfte................................................................................... 4
1.3 SEGMENTIDENTITÄT UND REGIONALE IDENTITÄT ........................................... 5
1.3.1
Definition............................................................................................................ 5
1.3.2
Festlegung der Segmentidentität........................................................................ 8
1.3.2.1 Segmentidentität der Sklerotomderivate ........................................................ 8
1.3.2.2 Segmentidentität der Dermomyotomderivate ................................................ 8
1.3.3
Molekulare Festlegung der Segmentidentität: Die Hox-Gene ......................... 10
1.3.4
Regulation der Hox-Genexpression ................................................................. 12
1.3.5
Plastizität der Segmentidentität und der Hox-Gene......................................... 13
1.3.5.1 Plastizität der Segmentidentität.................................................................... 13
2
FRAGESTELLUNG UND VORGEHENSWEISE..................................................... 15
3
EXPERIMENTELLE ANSÄTZE UND METHODEN.............................................. 17
3.1
3.1.1
MATERIAL .............................................................................................................. 17
Tiere ................................................................................................................. 17
3.2 MIKROCHIRURGISCHE TECHNIK ........................................................................ 17
3.2.1
Instrumentarium ............................................................................................... 17
3.2.2
Allgemeine Operationstechniken...................................................................... 18
3.2.3
Spezielle experimentelle Ansätze und Methoden.............................................. 19
3.2.3.1 Rotation der kaudalen Segmentplatte........................................................... 19
3.2.3.2 Rotation der kranialen Segmentplatte .......................................................... 20
3.2.3.3 Rotation der epithelialen Somiten ................................................................ 20
3.2.3.4 Transplantation der ventralen Somitenhälfte ............................................... 20
3.2.3.5 Transplantation der dorsalen Somitenhälften............................................... 21
3.2.3.6 Analyse des Expressionsmusters der HOX-Gene in den epithelialen Somiten
21
3.3 ANALYSE DES SKELETT-MUSTERS ................................................................... 24
3.3.1
Knorpel- Knochenfärbung mit Gewebeverdauung .......................................... 24
3.3.2
Knorpelfärbung für weitere histologische Aufarbeitung ................................. 25
3.4 HISTOLOGIE UND FÄRBEMETHODEN................................................................. 25
3.4.1
Whole-mount in situ-Hybridisierung................................................................ 25
3.4.2
Herstellung der Paraffinschnitte für die histologische Untersuchung............. 27
3.4.3
Immunhistochemische Färbung an Wachtel-Huhn-Chimären......................... 27
3.5 METHODEN DER ECHTZEIT-PCR ....................................................................... 28
3.5.1
RNA-Isolierung................................................................................................. 28
3.5.2
Echtzeit-PCR .................................................................................................... 29
3.6 FOTOGRAFIE UND ZEICHNUNGEN ...................................................................... 30
II
3.7 CHEMISCHE REAGENZIEN UND ZUSAMMENSETZUNG DER VERWENDETEN
LÖSUNGEN.......................................................................................................................... 31
3.7.1
Lösungen für die Operationen.......................................................................... 31
3.7.2
Lösungen für die Skelettanalyse....................................................................... 31
3.7.3
Lösungen für die Whole-mount in situ-Hybridisierung und die
Immunhistochemie............................................................................................................ 32
3.7.4
Fixierlösung für die RT-PCR: .......................................................................... 34
4
ERGEBNISSE ................................................................................................................ 35
4.1
ROTATION DER SEGMENTPLATTE UND DER SOMITEN UM DIE LÄNGSACHSE
35
4.1.1
4.1.2
4.1.3
Rotation des kaudalen Abschnitts der Segmentplatte ...................................... 35
Rotation des kranialen Abschnitts der Segmentplatte...................................... 37
Rotation der zuletzt gebildeten Somiten ........................................................... 38
4.2 TRANSPLANTATION DORSALER UND VENTRALER SOMITENHÄLFTEN ........ 40
4.2.1
Transplantation ventraler Somitenhälften in die Position der dorsalen
Somitenhälften.................................................................................................................. 40
4.2.2
Transplantation der dorsalen Somitenhälften in die Position der ventralen
Somitenhälften.................................................................................................................. 44
4.3 ANALYSE DES HOX-GENEXPRESSIONSMUSTERS ............................................ 47
4.3.1
Hox-Genexpressionsmuster der Somiten ......................................................... 47
4.3.2
Echtzeit-PCR:................................................................................................... 49
5
DISKUSSION ................................................................................................................. 55
5.1
MUSTERBILDUNG NACH ROTATION DER SEGMENTPLATTENABSCHNITTE
UND DER EPITHELIALEN SOMITEN ................................................................................. 55
5.1.1
5.1.2
Segmentidentität des dorsalen und ventralen Somitenkompartiments ............. 55
Segmentidentität des medialen und lateralen Kompartiments......................... 57
5.2
MUSTERBILDUNG NACH TRANSPLANTATIONEN DER DORSALEN UND
VENTRALEN SOMITENHÄLFTEN ..................................................................................... 58
5.2.1
Segmentidentität der in die Position der dorsalen Somitenhälften verlagerten
ventralen Somitenhälften.................................................................................................. 58
5.2.2
Segmentidentität der in die Position der ventralen Somitenhälften verlagerten
dorsalen Somitenhälften................................................................................................... 59
5.3 HOX-GENEXPRESSION DER SOMITENHÄLFTEN ............................................... 60
5.3.1
Analyse der Hox-Genexpression in den Somiten ............................................. 60
5.3.1.1 Analyse der Hoxc-6-Genexpression in den Somiten mittels der in situHybridisierung.............................................................................................................. 60
5.3.1.2 Quantitative Analyse des Hox-Genexpressionsmusters in den dorsalen und
ventralen Somitenhälften.............................................................................................. 61
5.3.2
Hoxc-6-Genexpression nach heterotopischen Transplantationen der
Somitenhälften.................................................................................................................. 62
5.3.2.1 Hoxc-6-Genexpession nach Transplantation der dorsalen Somitenhälften in
die Position der ventralen Somitenhälften ................................................................... 62
5.3.2.2 Hoxc-6-Genexpession nach Transplantation der ventralen Somitenhälfte in
die Position von dorsalen Somitenhälften.................................................................... 63
5.4 ALLE ZELLEN EINES EPITHELIALEN SOMITEN ENTHALTEN DIESELBEN
INFORMATIONEN ZUR SEGMENTIDENTITÄT................................................................. 64
6
ZUSAMMENFASSUNG ............................................................................................... 66
III
7
LITERATUR .................................................................................................................. 67
8
LEBENSLAUF ............................................................................................................... 78
9
DANKSAGUNG ............................................................................................................. 80
10
EIGENE VORTRÄGE UND PUBLIKATIONEN ..................................................... 81
11
ERKLÄRUNG................................................................................................................ 82
1
Einleitung
1 Einleitung
1.1 Gastrulation und Somitenbildung
Die Gastrulation stellt einen Prozess dar, bei dem aus der oberen Zellschicht (Epiblast) des
Primitivstreifens Zellen auswandern, die das Mesoderm und das Entoderm bilden. Während
das Mesoderm als mittleres Keimblatt entsteht, ersetzt das Entoderm die bereits bestehende
untere Zellschicht (Hypoblast). Der Epiblast wird dann zum Ektoderm. Die Gastrulation führt
also zur Bildung der dreiblättrigen Keimscheibe, die das definitive Anlagematerial des
Embryos darstellt, weswegen sie als wichtigstes Ereignis im Leben eines Menschen
bezeichnet wird: “It is not birth or death, but gastrulation which is truly the most important
event in your life“ (Lewis Wolpert).
Das aus dem Primitivstreifen neu entstandene Mesoderm gliedert sich in vier verschiedene
Abschnitte, die auch unterschiedliche Funktionen aufweisen:
•
Das axiale Mesoderm, das aus der Chorda dorsalis besteht, organisiert das
Achsenskelett.
•
Das paraxiale Mesoderm, das die Fähigkeit zur Segmentierung besitzt, prägt die
Körpermetamerie.
•
Das intermediäre Mesoderm stellt den Vorläufer des Urogenitaltraktes dar.
•
Das Seitenplattenmesoderm, das aus einem somatischen (Somatopleura) und einem
viszeralen Anteil (Splanchnopleura) besteht, begrenzt die Leibeshöhle nach außen als
Körperwand und nach innen als bindegewebige und muskuläre Darmwand.
Das paraxiale Mesoderm setzt sich aus zwei Abschnitten zusammen, dem präotischen und
dem postotischen Abschnitt. Der präotische Abschnitt wird auch als Kopfmesoderm
bezeichnet und aus ihm gehen Schädelknochen und Skelettmuskeln des Gesichtes hervor. Die
Besonderheit des postotischen Anteils ist die Fähigkeit zur Segmentierung und zur
Epithelialisierung, wobei Somiten gebildet werden. Der noch nicht segmentierte Abschnitt
des paraxialen Mesoderms wird als Segmentplatte bezeichnet. Die Somitenbildung erfolgt in
kranio-kaudaler Richtung, während neue Mesenchymzellen am kaudalen Ende des paraxialen
Mesoderms als Konsequenz der Gastrulation eingegliedert werden. Man kann zwei Phasen
der Gastrulation unterscheiden: die primäre Gastrulation führt zur Bildung der ersten 28
Einleitung
2
Somitenpaare aus dem Primitivstreifen, und im Verlauf der sekundären Gastrulation
entwickeln sich die posterioren Somiten aus der Schwanzknospe (Christ et al., 2000). Am
Ende des Segmentierungsprozesses sind 52 Somitenpaare bei Vogelembryonen vorhanden.
Die Somitenbildung lässt sich in zwei Prozesse untergliedern: Die Segmentierung und die
Epithelialisierung.
1.1.1 Segmentierung: Morphologie und molekulare Mechanismen
Die
Segmentierung
wird
durch
molekulare
Mechanismen
kontrolliert,
die
als
Segmentierungsuhr (Palmeirim et al., 1997) bezeichnet werden. Diese ist definiert durch die
periodische Expression von oszillierenden Genen, wie c-hairy1, c-hairy2, und lunatic fringe,
deren Expression in einem zeitlichen und räumlichen Rhythmus ansteigt und fällt (Aulehla
und Johnson, 1999; McGrew et al., 1998; Fosberg et al., 1998) und die Notch-Delta1Signalweg kontrolliert werden. Jede Oszillation dieser Gene beginnt kaudal und schreitet nach
kranial durch die Segmentplatte fort und führt beim Hühnerembryo alle 90 Minuten zur
Bildung von je einem Somitenpaar (Packard und Jacobson, 1979). Im kaudalen Abschnitt der
Segmentplatte ist FGF-8 stark exprimiert (Packard et al., 1993) und kranial davon FGFR-1
(Yamaguchi et al., 1994). Es wird angenommen, dass die Segmentierungsuhr festlegt, wann
die Somitengrenzen fixiert werden, wobei der FGF-8-Gradient beteiligt ist (Tabin et al.,
2001). Der Wachstumsfaktor Fgf-8 spielt auch eine Rolle bei der Festlegung der
Somitengröße, da eine Überexpression zur Bildung von kleinen Somiten und eine
Unterexpression zur Bildung größerer Somiten führt (Dubrulle et al., 2001). Die Familie der
Eph-Gene ist an der Festlegung der Somitengrenzen beteiligt (Bergemann et., 1995).
Vor der Somitogenese kann eine metamere Anordnung der Mesenchymzellen in der
Segmentplatte beobachtet werden, die als Somitomerie bezeichnet wird. Die Somitomere sind
bei einzelnen Spezies konstant; so wurden 10 bis 12 Somitomere bei Hühner- und
Wachtelembryonen
beschrieben
(Packard
et
al.,
1978,
1983).
Sie
stellen
das
Segmentierungsmuster der Segmentplatte dar (Jacobson et al., 1992). Die aus ihnen
entstehenden Blöcke entsprechen den prospektiven Somiten. Die Segmentierung kann durch
umgebende Strukturen moduliert werden, unter denen Wachstumsfaktoren eine wichtige
Rolle spielen. Das dorsale Neuralrohr, das Ektoderm (Currie und Ingham, 1998), das laterale
Mesoderm sowie die Chorda dorsalis und die Bodenplatte des Neurahlrohrs haben einen
Einfluss auf die Proliferation und das Überleben der Zellen dieser Somitomere (Teillet und Le
Douarin 1983).
Einleitung
3
1.1.2 Epithelialisierung
Die nach dem Segmentierungsprozess entstandenen Somitomere werden epithelialisiert.
Wichtig dafür ist die Expression von Paraxis, einem bHLH-Gen, das für einen
Transkriptionsfaktor kodiert, der mit einem Helix-loop-Helix-Motiv ausgestattet ist (Burgess
et al., 1996). Bei Paraxis-null mutanten Mäusen ist die Epithelialisierung der Segmentplatte
gestört. Diese Mäuse entwickeln eine Wirbelsäule, deren Segmentgrenzen nicht klar definiert
sind. Eine Missbildung der Rippen und der Wirbel sowie eine Störung des Muskelmusters
werden beobachtet (Burgess et al., 1996). Sosic et al. (1997) haben gezeigt, dass die
Expression
von
Paraxis
und
damit
die
Somitenbildung
an
Signale
aus
dem
Oberflächenektoderm und dem Neuralrohr geknüpft ist.
Nach der Segmentierung und der Epithelialisierung der Segmentplatte werden die Somiten
auf beiden Seiten der Axialorgane am kranialen Ende der Segmentplatte gebildet (Palmeirim
et al., 1997). Die neu gebildeten Somiten werden entlang verschiedener Achsen
kompartimentiert.
1.2 Somitenkompartimentierung
1.2.1 Kranio-kaudale Kompartimentierung
Die neugebildeten Somiten sind morphologisch ähnlich und werden zuerst in kranio-kaudaler
Richtung kompartimentiert. Die Polarität, die sie dabei erwerben, prägt die metamere
Anordnung ihrer Abkömmlinge. Diese kranio-kaudale Kompartimentierung ist die
Voraussetzung für das segmentale Muster des peripheren Nervensystems, der Wirbel und
Rippen, deren Grenzen nach dem Konzept der Neugliederung von Remak (1850) um ein
halbes Segment verschoben werden. Die Wirbel, die aus ihnen hervorgehen, bestehen je aus
der kaudalen Somitenhälfte eines Somiten und der kranialen Hälfte des nächst kaudal
liegenden Somiten (Huang et al., 2000). Die kranio-kaudale Polarität wird vor der
Somitenbildung determiniert (Keynes und Stern, 1988) und hängt vom Notch-DeltaSignalweg ab (Review: Gossler und Hrabe de Angelis, 1998). Sie kann durch molekulare
Marker dargestellt werden. So ist die Expression von Delta1, Mesp 1, Mesp 2, Uncx-1, und
EphA4 auf Halbsomiten begrenzt (Hrabé de Angelis et al., 1997; Christ et al., 2000).
1.2.2 Dorso-ventrale Kompartimentierung
4
Einleitung
Die Somitenkompartimentierung erfolgt auch in dorso-ventraler Richtung, wobei das dorsale
Dermomyotom und das ventrale Sklerotom entstehen (Abb. 1A und 1B). Der erste molekulare
Nachweis für die dorso-ventrale Gliederung ist die Suppression der Pax-3-Genexpression in
der ventralen Somitenhälfte der neugebildeten epithelialen Somiten (Williams und Ordahl,
1994). Morphologisch wird die Kompartimentierung dadurch deutlich, dass die ventrale
Somitenhälfte eine epithelio-mesenchymale Transition erfährt und das Sklerotom bildet. Die
bei der dorso-ventralen Somitenkompartimentierung entstandenen dorsalen und ventralen
Abschnitte weisen Unterschiede in ihren Entwicklungen, Abkömmlingen und molekularen
Markern auf.
1.2.2.1 Dorsale Somitenhälfte
Der dorsale Abschnitt des Somiten behält nach der Kompartimentierung seine epitheliale
Struktur bei und bildet das Dermomyotom (Abb. 1B). Dieses exprimiert Gene der Paired
Box-Genfamilie, wie Pax-3 und Pax-7. Es wird durch Wnt-Proteine, die vom Neuralrohr und
Oberflächenektoderm sezerniert werden, induziert und aufrechterhalten (Fan und TessierLavigne, 1994; Marcelle et al., 1997; Sosic et al., 1997; Ikeya und Takada, 1998; Schmidt et
al., 1998; Amthor et al., 1999). Das Dermomyotom enthält viele verschiedene
Vorläuferzelllinien. Es liefert das Baumaterial für die Skelettmuskulatur des Rückens, der
Körperwand (Christ und Ordahl, 1995), der Zunge (Couly et al., 1993; Huang et al., 1999)
und der Extremitäten (Christ et al., 1974, 1977; Zhi et al., 1996), für die Scapula (Huang et
al., 2000b) und die Dermis der Rückenhaut (Mauger, 1972; Christ et al., 1983) und
Angioblasten (Wilting et al., 1995).
1.2.2.2 Ventrale Somitenhälfte
Der ventrale Abschnitt des Somiten deepithelialisiert zu einem mesenchymalen Zellverband,
der zusammen mit den Somitozölzellen das Sklerotom bildet (Abb. 1B). Die von der Chorda
dorsalis abgegebenen Signalmoleküle, Sonic hedgehog (shh) und Noggin, initiieren die
Sklerotombildung und erhalten das Sklerotom aufrecht; sie schalten Pax-1 und Pax-9 im
Sklerotom an (Fan und Tessier-Lavigne, 1994; Johnson et al., 1994; Fan et al., 1995; Müller
et al., 1996; McMahon et al., 1998). Das Sklerotom kann in drei Subkompartimente unterteilt
werden, die auch unterschiedliche Abkömmlinge aufweisen (Christ et al., 2000, 2004): das
zentrale Sklerotom bildet die Laminae und Pediculae des Neuralbogens, sowie die Rippen;
5
Einleitung
das ventrale Sklerotom bildet die Wirbelkörper und Bandscheiben. Die Zellen beider
Subkompartimente exprimieren Pax-1 unter dem Einfluss von Signalen der Chorda dorsalis.
Aus dem dorsalen Sklerotom entstehen der dorsale Anteil des Neuralbogens und der
Dornfortsatz dank der Expression von Msx1 und Msx2. Die Wnt-Gene, die im dorsalen
Neuralrohr und im Ektoderm exprimiert werden, hemmen die Sklerotomentwicklung
(Capdevilla et al., 1998, Christ et al., 2000).
1.3 Segmentidentität und regionale Identität
1.3.1 Definition
Obwohl sich die Somiten in ihrer Morphologie sehr ähneln, zeigen sie dennoch Unterschiede
in der Größe, Form und Funktion ihrer Abkömmlinge. Die aus ihnen hervorgegangenen
Wirbel unterscheiden sich nicht nur in ihrem Aussehen sondern auch in ihrer Funktion. Die
zuerst gebildeten zervikalen Wirbel, z.B. der Atlas und der Axis, weisen bemerkenswerte
Unterschiede auf: während der erste Halswirbel, der Atlas, keinen Wirbelkörper besitzt, trägt
der zweite Halswirbel zusätzlich zu seinem Wirbelkörper einen Zapfen, der als Dens axis
bezeichnet wird. Der siebte Halswirbel hat einen ausgeprägteren Dornfortsatz und ist nicht,
wie die anderen Halswirbeldornfortsätze, gespalten. Die Rippen sind kurz oder lang; Ein Teil
von ihnen hat eine Verbindung zum Brustbein (echte Rippen) und ein anderer Teil endet frei.
Diese Eigenschaft, dass jedes einzelne definitive Segment (Wirbel und Rippe, bzw.
rippenhomologe Strukturen) individuell ist und seine eigene Identität aufweist, wird als
Segmentidentität bezeichnet. Spricht man von der Information zur Segmentidentität, so
bedeutet dies die Information, nach der aus einem bestimmten Segment z.B. eine Rippe, ein
Halswirbel oder ein Muskel gebildet wird.
Diese Segmentidentität beschränkt sich nicht nur auf die Wirbelsäule, sondern prägt sich
weiter im Rückenmark, in der Scapula, den Muskeln, und auch in der Rückenhaut aus. Ein
Dermatom beschreibt zum Beispiel ein von einem Rückenmarksegment innerviertes Hautfeld.
Jedem Dermatom ist ein Spinalganglion zugeordnet.
Benachbarte, ähnlich aufgebaute Segmente, können einer spezifischen Wirbelsäulenregion
zugeordnet werden. Man unterscheidet eine zervikale, thorakale, lumbale und sakrale Region
(Abb.1C). Die Ähnlichkeiten der Merkmale in einer Region bezeichnet man als regionale
Identität. Die Wirbel der Halsregion weisen z.B. kurze und gegabelte Dornfortsätze auf,
während die gleichen in der Brustregion eher lang und ungespalten sind. Die Wirbelkörper
der Lendenregion sind größer als die der Halsregion. Die Brustwirbel werden durch die
6
Einleitung
Bildung von Rippen charakterisiert. Die Halswirbelsäule ist beweglicher als die übrigen
Regionen (Brust- und Lendenwirbelsäule).
Diese regionale Identität bezieht auch die Muskulatur ein. Die kurzen Nackenmuskeln weisen
ein komplexeres Muster als die Muskeln der Thorax- und Lumbalregion auf, und ihre
segmentale Anordnung wird zur Regulation der Feineinstellung in den Kopfgelenken
herangezogen. Sie weisen z.B. drei Muskelschichten auf, eine dorsale, eine ventrale und eine
laterale Muskelmasse. Während die Muskeln der Lumbalregion eher ein grobes Muster
haben, dienen die ersteren der feinen Bewegung der Halsregion.
Auch die Dermis lässt diese regionale Identität erkennen. Sie weist viele regionale
Unterschiede in ihrer Dicke und Struktur auf.
Die segmentspezifische Bildung der einzelnen Strukturen ist von der axialen Position der
Somiten abhängig. Aus den okzipitalen Somiten entstehen zum Beispiel u.a. Zungenmuskeln
und Hinterhauptsknochen (Christ et al., 1998), und aus den thorakalen Somiten gehen neben
den Wirbeln die Rippen, die Scapula und die Interkostal- und Bauchmuskeln hervor.
Einleitung
7
Ek
NT
Som
SoPl
D
SC
V
CD
IM
AO
SpPl
Ent
DM
Zervikale Somiten
Skl
Thorakale Somiten
Lumbale Somiten
B
Sakrale Somiten
C
(A) + (B)
Schematische Darstellung eines Transversalschnittes durch einen
Vogelembryo. Der Somit ist bereits dorso-ventral kompartimentiert. Im Bild (A) ist er noch
epithelial (plastisch), und im Bild (B) hat er sich weiterentwickelt. Während die dorsale
Hälfte epithelial bleibt und das Dermomyotom (DM) bildet, erfährt die ventrale Hälfte eine
epithelio- zu mesenchymale Transition und bildet das Sklerotom (Skl). (AO: Aorta; CD:
Chorda dorsalis; D: dorsale Hälfte; Ek: Ektoderm; Ent: Entoderm; IM: intermediäres
Mesoderm; SoPl: Somatopleura; SC: Somitozöl; SpPl: Splanchnopleura; V: ventrale
Somitenhälfte).
(C)
Darstellung der axialen Formel beim Vogelembryo: Obwohl sich die Somiten
sehr ähnlich in ihrer Form aussehen, gehören sie jedoch zu verschiedenen Regionen, die
später zur Bildung der Wirbelsäule, der Rippen, der Rückenhaut und der Muskeln beitragen
werden. Diese Somiten dienen auch zur Orientierung, denn am zerviko-thorakalen Übergang
werden die oberen Extremitäten entstehen und am thorako-lumbalen Übergang die unteren
Extremitäten.
Einleitung
8
1.3.2 Festlegung der Segmentidentität
1.3.2.1 Segmentidentität der Sklerotomderivate
Nach heterotoper Transplantation der Segmentplatte aus der prospektiven Thoraxregion in die
Halsregion konnten Kieny et al. (1972) beobachten, dass Wirbel thorakaler Identität mit
zusätzlichen Rippen in der zervikalen Region gebildet werden. Nach Transplantation
zervikaler Somiten in die thorakale Region entwickelten sich dort zervikale Wirbel ohne
Rippen. Jacob et al. (1975) haben gezeigt, dass sich zusätzliche Rippen nach Transplantation
thorakaler Segmentplattenabschnitte in die Lumbalregion aus dem Transplantat entwickeln.
Diese Untersuchungen deuten darauf hin, dass die Segmentidentität zur Bildung der Wirbel
und der Rippen bereits in der Segmentplatte festgelegt wird. Da die Wirbel und die Rippen
aus dem Sklerotom hervorgehen, kann diese Regel nur für die Zellen als gültig angesehen
werden, die der ventralen Hälfte der epithelialen Somiten und dem Somitozöl entstammen.
1.3.2.2 Segmentidentität der Dermomyotomderivate
a) Segmentidentität dermogener Abkömmlinge
Mauger (1972) erhielt nach Transplantation des zervikalen präsomitischen oder somitischen
paraxialen Mesoderms in die Thoraxregion eine Schmälerung der spinalen Pteryla (definierter
Ort der Vogelhaut, wo Federn wachsen), wie es für den Hals typisch ist. Die umgekehrte
Transplantation führte zur Verbreiterung der Pteryla, wie dies für die Thoraxregion
charakteristisch ist. Daraus kann der Schluss gezogen werden, dass die Information der
Segmentidentität für die Musterbildung der Rückenhaut bereits in den Somiten bzw. in der
Segmentplatte festgelegt ist.
b) Segmentidentität myogener Abkömmlinge
Die myogenen Zellen differenzieren sich aus den Dermomyotomen. Sie gliedern sich aus den
Kanten des Dermomyotoms ab (Christ und Ordahl, 1995). Zellen aus der medialen Kante
beteiligen sich an der Bildung der autochthonen (= ortständigen) Rückenmuskeln, die als
epaxiale Muskeln bezeichnet und von den Rami posteriores der Spinalnerven innerviert
werden.
Diese
autochthonen
Rückenmuskeln
bilden
topographisch
die
tiefe
Rückenmuskulatur. Epaxiale Muskelzellen sind die ersten differenzierten Myozyten, die im
Somiten vorkommen (Ordahl und Williams, 1998). Zellen aus der lateralen Kante bilden die
hypaxiale Muskulatur (Christ et al., 1974, 1977; Ordahl und Le Douarin, 1992, Huang und
Einleitung
9
Christ 2000a) und werden von den Rami anteriores der Spinalnerven innerviert. Zur
hypaxialen Muskulatur zählt man die Muskulatur der ventrolateralen Körperwand, der Zunge,
der Extremitäten und des Zwerchfells. Die Muskelvorläuferzellen wandern aus der lateralen
Kante der Dermomyotome der Somiten aus und differenzieren sich am Zielort zu Myoblasten
(Noden, 1983a; Lance-Jones, 1988; Couly et al., 1993; Zhi et al., 1996; Huang et al., 1999).
In der Extremität bilden die eingewanderten Myoblasten zusammen mit den ortständigen
Bindegewebszellen, die aus der Somatopleura hervorgehen, die Extremitätenmuskulatur.
Wenn zervikale Somiten in die brachiale Region transplantiert werden, entwickeln sich aus
ihnen normale Flügelmuskeln (Christ et al., 1978; Chevallier et al., 1977). Wenn die
brachialen Somiten durch Thoraxsomiten ersetzt werden, entwickelt sich ebenfalls eine
normale Extremitätenmuskulatur (Übersicht bei Gumpel-Pinot, 1984). Ihr Innervationsmuster
ist danach nicht verändert (Keynes et al., 1987). Nach heterotoper Transplantation von
Dermomyotomen der brachialen Region in die okzipitale Region, gehen normale
Zungenmuskeln aus dem Transplantat hervor (Christ et al., 1978). Daraus kann geschlossen
werden, dass die Musterbildung der Zungen- und Extremitätenmuskulatur durch das
Bindegewebe, das der Somatopleura entstammt, determiniert wird. Die Muskelvorläuferzellen
haben bei der Auswanderung keine Information hinsichtlich der segmentspezifischen
Musterbildung aus den Somiten mitgenommen.
Demgegenüber haben Murakami und Nakamura (1991) nach ähnlichen Transplantationen
gezeigt, dass die segmentspezifische Individualisierung der epaxialen Muskeln bereits in den
Somiten determiniert wird. Sie beobachteten nach Transplantation der zervikalen Somiten in
die Thorax- oder die Lumbalregion die Bildung einer ektopischen ventralen Muskelmasse, die
normalerweise in der Halsregion vorkommt.
Die räumliche Verteilung der langsamen und der schnellen Muskelfasern in den einzelnen
Muskeln der Extremität wird vor der funktionellen Innervation der Muskeln durch die
eingewanderten Muskelvorläuferzellen determiniert. Nach homotoper Transplantation von
brachialen Somiten zwischen Hühnchen und Wachtel konnte gezeigt werden, dass die
Differenzierung der Muskelfasern des M. pectoralis nicht extrinsisch durch Signale von den
umliegenden
Mesenchymzellen
abhängig
ist,
sondern
intrinsisch
durch
die
Muskelvorläuferzellen, die aus den Somiten hervorgehen, determiniert wird (Nikovits et al.,
2001).
Einleitung
10
c) Segmentidentität chondrogener Abkömmlinge
Während die erste Gruppe chondrogener Vorläuferzellen aus dem Sklerotom entsteht und sich
an der Bildung der Hinterhauptsknochen, der Wirbelsäule und der Rippen beteiligt, entsteht
eine andere Gruppe chondrogener Vorläuferzellen aus dem Dermomyotom und nimmt an der
Bildung der Scapula teil, die dorsal von den Rippen liegt (Huang et al., 2000a). Die Scapula
ist durch Muskelzüge mit der Wirbelsäule verbunden und bildet zusammen mit dem
Schlüsselbein den Schultergürtel. Frühere Ergebnisse haben gezeigt, dass der kraniale
Abschnitt der Scapula ("Extremitas cranialis scapulae"), der das Acromion, Caput und Collum
einschließt, ein Derivat der Somatopleura ist, während der Scapula-Körper („Corpus
scapulae“) aus dem Dermomyotom der brachialen und oberen thorakalen Somiten (Somiten
17-24) entsteht. Die aus den Somiten stammenden Scapulazellen behalten dabei ihren
Segmentbezug bei (Huang et al., 2000a). Nach Transplantation der prospektiven
Dermomyotome der brachialen und der oberen thorakalen Somiten in die prospektive
Halsregion wird ein zusätzlicher Scapulaabschnitt in Höhe der Halswirbelsäule gebildet
(Ehehalt et al., 2004). Diese Ergebnisse sind ein Beleg dafür, dass auch die aus dem
Dermomyotom stammenden Chondroblasten bereits vor der Somitenbildung in ihrer
Segmentidentität festgelegt sind.
d) Segmentidentität angiogener Abkömmlinge
Alle Abschnitte des epithelialen Somiten einschließlich der mesenchymalen Somitozölzellen
haben eine angiogene Potenz (Wilting et al., 1995). Aus den Somiten hervorgegangene
Endothelzellen können kranial- und kaudalwärts über mehrere Segmente auswandern und sich
an der Bildung der Blutgefäße des Rückenmarks, der Wirbelsäule und der Körperwand
beteiligen. Danach könnte man vermuten, dass Endothelzellen, die sich an der Bildung von
Gefäßen beteiligen, keine Information zur Segmentidentität aus den Somiten benötigen.
1.3.3 Molekulare Festlegung der Segmentidentität: Die Hox-Gene
Jeder Somit besitzt genetische Informationen zur Ausprägung der Segmentidentität. Diese
genetischen
Informationen
kontrollieren
die
Proliferation
und
Spezifizierung
der
Somitenzellen, wodurch die segmentspezifische Musterbildung der Somitenderivate gesteuert
wird (Duboule 1995). Diese genetische Information ist in den Hox-Genen kodiert.
Die Hox-Gene sind Entwicklungskontrollgene, die für Transkriptionsfaktoren kodieren und
für den Bauplan des Körpers von Bedeutung sind. Sie gehören zur Familie der
Homeoboxgene. Der Name Homeobox bezeichnet dabei eine hochgradig konservierte
11
Einleitung
Protein-kodierende Sequenz von 183 Basenpaaren und 61 Aminosäuren (McGinnis et al.
1984; Holland und Hogan 1988). In dem Genom von Menschen, Mäusen und Vögeln sind sie
in Gruppen („Cluster“) angeordnet (Hart et al. 1987; Hauser et al. 1985; Duboule et al. 1986).
Bei Wirbeltieren sind vier Cluster A, B, C, und D, sowie 13 paraloge Gruppen vorhanden.
Eine wichtige Eigenschaft dieser Hox-Gene ist das Phänomen der Kolinearität: sie zeigen eine
kranio-kaudale Expressionssequenz entlang der embryonalen Achse, die ihrer Position auf
den Chromosomen entspricht (Lewis, 1978; Duboule und Dollé, 1989; Graham et al., 1989).
Diese kolineare Expression wurde im ZNS, paraxialen Mesoderm und Magen festgestellt
(Krumlauf, 1994; Roberts et al., 1995; Yokouchi et al., 1995). Die Zeitspanne, die für ihre
komplette Aktivierung erforderlich ist, beträgt bei Mäusen ungefähr zwei Tage (Duboule,
1995). Die Tatsache, dass sie nur eine bestimmte Zeit lang und an einem bestimmten Ort
exprimiert werden, spricht für eine zeitliche und räumliche Einschränkung ihrer Expression.
Eine mögliche Funktion dieser Gene ist die Übersetzung der örtlichen Information der Zellen
in eine Segmentidentität oder eine regionale Identität entlang der kranio-kaudalen
Körperachse (Boncinelli und Mallamaci, 1995). Sie prägen die Proliferation und
Musterbildung der Sklerotom- und Dermomyotomzellen. Obwohl sich die axiale Formel
(Zahl der Somiten oder Wirbel) der Wirbelsäule bei den verschiedenen Wirbeltieren
unterscheidet, und das Expressionsmuster der Hox-Gene entsprechend unterschiedlich ist,
kann man bei bestimmten Übergängen der Körperregionen die gleichen Gene nachweisen. So
beginnt zum Beispiel die Hoxc-6-Genexpression in der Anlage der ersten Brustwirbel von
Mäusen im 12. Somiten, bei Hühnern im 19. Somiten und bei Gänsen im 21. Somiten (Burke
et al., 1995). Dieses Phänomen wird als Transposition bezeichnet und wurde zum ersten Mal
von Goodrich (1906) beschrieben. Ein Segment kann aber Hox-Gene verschiedener Cluster
und paraloger Gruppen gleichzeizig exprimieren. Bei der Maus z.B., wird der Atlas durch die
Expression von Hoxa-1, Hoxa-3 und Hoxb-1 charakterisiert. Solche Kombination von
mehreren aktiven Hox-Genen wird als Hox-Code bezeichnet und gibt einem Wirbelsegment
seine Identität (Kessel und Gruss, 1991). Eine Störung der Hox-Genexpression durch
Retinsäure führt zu Änderungen des Hox-Codes, die erheblich sein können. Bei trächtigen
Mäusen führte die experimentelle Zugabe von Retinsäure zu einer Exenzephalie und zur
Nicht-Schließung des Neuralrohrs („Spina bifida“) in der zervikalen Region (Kessel und
Gruss, 1991). Die gleichen Autoren beobachteten nach Veränderung der Hoxa-1-Expression
bei transgenen Mäusen die Entwicklung von einem Proatlas und einem Atlas, die beide einen
Wirbelkörper besaßen (Kessel et al., 1990).
Einleitung
12
1.3.4 Regulation der Hox-Genexpression
Viele
Signale
regulieren
die
Hox-Genexpression:
das
sind
Signale
aus
dem
Oberflächenektoderm, dem Entoderm und dem paraxialen Mesoderm entlang der
anteroposterioren Achse des ZNS und der Neuralleiste (Trainor und Krumlauf, 2000).
Zusätzlich applizierte Retinsäure oder Vitamin A (Gale et al., 1999) führten zu einer
fehlerhaften Hox-Genexpression im Hirn (Neiderreither et al., 2000) oder zu einer
Verschiebung der Expressionsgrenzen. Dieses Phänomen wird als Homeosis (Bateson, 1894)
und die daraus entstehende Transformation als homeotische Transformation bezeichnet. Eine
homeotische Transformation kann dazu führen, dass ein Segment einer bestimmten Region
seine Eigenschaften verliert und den Charakter eines Segments der nächst kranial oder kaudal
gelegenen Region übernimmt. Die Atlasassimilation, die Sakralisation des 5. Lendenwirbels
oder die Lumbalisation des 1. Sakralwirbels sind Beispiele derartiger homeotischer
Transformationen. In Mausmutanten können vielfältige homeotische Transformationen der
Wirbelsäule beobachtet werden. Eine Null-Mutante von Hoxa-4 verändert den Hox-Code in
der Weise, dass die Hox-Genexpression, die normalerweise die Entwicklung des dritten
Halswirbels determiniert, in Höhe des zweiten Halswirbels auftritt (Kostic und Capecchi,
1994; Ramirez-Solis et al., 1993).
Wie oben bereits erwähnt, reguliert die Retinsäure die Hox-Expression, indem sie die
Transkription von Hox-Genen regelt (Conlon und Rossant, 1993, Review: Conlon, 1995) und
indem sie die Hox-Expression induziert. Es sind noch andere Gene analysiert worden, die
einen Einfluss auf die Expression dieser Gene ausüben können. Die Mll-Gene (mixed lineage
leukaemia genes) stimulieren die Hox-Gene bei Säugetieren. Eine Insuffizienz dieser Gene
führt zu Aberrationen in der Segmentidentität und verschiebt die kraniale Grenze der HoxGenexpression (Yu et al., 1995). Die Expression dieser Mll-Gene ist bei chromosomaler
Translokation gestört und führt zur akuten lympho-myeloiden Leukämie bei Kindern. Diese
Beobachtung läßt auch eine mögliche Funktion der Hox-Gene bei der normalen
Hämatopoiese vermuten (Lawrence et al., 1993). Andere gute Kandidaten, die Hox-Gene
modulieren, sind die Zink-Finger-Proteine, kodiert durch Spalt (sal) und sal-verwandte (sal-r)
Gene (Kühnlein et al., 1994;). Bei Drosophila sind es die Segmentspolaritätsgene, die an der
lokalen Modulation der Hox-Gene beteiligt sind. In der Mutante von engrailed (en), einem
Segmentspolaritätsgen, wurde die Hochregulation der Expression von Ultrabithorax (Ubx),
einem Hox-Gen für die Thorax-Identität, beobachtet. Aber eine zusätzliche en-Expression
13
Einleitung
führt zu einer Herunterregulation von Ubx (Mann, 1994). Bei der Maus wurde beobachtet,
dass Veränderungen der Säuger-homologen Drosophila-polycomb (Pc-G)- und Trithorax
(trx)-Gene die Grenze der Hox-Genexpression verschieben und somit auch eine homeotische
Transformation von Wirbeln hervorrufen können (Van der Lugt et al., 1996; Schumacher et
al., 1997; Yu et al., 1995). Nach den Ergebnissen von Kieny et al. (1972) und von Goldstein
und Kalcheim (1992) wird die Segmentidentität der Somiten bereits in der Segmentplatte
festgelegt. Demgegenüber werden nach neueren Untersuchungen (Dubrulle et al., 2001;
Zákány et al., 2001) die Hox-Gene erst in den Somiten exprimiert. Ihre Expression wird durch
den Notch-Delta-Signalweg und und den Fibroblastenwachstumsfaktor FGF-8, die auch in
die Kontrolle der Somitenbildung involviert sind, gesteuert. Notch und Delta werden in der
Segmentplatte exprimiert, und eine Blockierung ihres Signalweges führt zu einer Störung der
Somitenbildung und zu einer Herunterregulierung der Hox-Genexpression in den Somiten
(Zákány et al., 2001). FGF-8 wird in der kaudalen Segmentplatte und in den neugebildeten
Somiten exprimiert (Stolte et al., 2002). Eine quantitative Veränderung der Konzentration des
FGF8-Signalmoleküls in der Segmentplatte kann auch eine Verschiebung der Grenze der
Hox-Genexpression hervorrufen. Diese Kontrollmechanismen deuten darauf hin, dass die
Segmentidentität während der Somitenbildung durch die Hox-Genexpression in den Somiten
festgelegt wird. Nach den Befunden von Tabin et al. (2001) wirkt die Segmentierungsuhr über
den Notch-Signalweg und determiniert die Somitengrenzen; über den FGF-8-Gradienten wird
die Lokalisation der Somitengrenzen festgelegt. Die Segmentidentität dieser Somiten wird
durch die Hox-Gene kontrolliert.
1.3.5 Plastizität der Segmentidentität und der Hox-Gene
1.3.5.1 Plastizität der Segmentidentität
Die Plastizität der Segmentidentität der Somiten wurde von Kant und Goldstein (1999) durch
Transplantation zweier kranialer Somiten in die Halsregion untersucht. Kraniale Somiten, die
normalerweise zu einem Os occipitale fusionieren und keine Wirbel bilden (Couly et
al.,1993), können in der Halsregion einen Wirbelkörper und eine Bandscheibe bilden. Das
heißt, dass die kranialen Somiten die eigene Segmentidentität durch Einflüsse der
umliegenden Strukturen (z.B. Neuralrohr und Ektoderm) in der Halsregion verlieren und eine
neue Identität bekommen können. Strukturen mit besonders deutlicher Segmentidentität sind
die Rhombomeren. Die aus ihnen auswandernden Neuralleistenzellen bilden auch nach
heterotoper Transplantation die ursprünglichen segmentspezifischen Strukturen aus (Noden,
14
Einleitung
1983). Andererseits besteht auch eine gewisse Plastizität der Segmentidentität der
Rhombomeren, die nach Interaktionen mit segmentfremdem Mesoderm beobachtet werden
kann (Grapin-Botton et al., 1995; Itasaki et al., 1996; Gould et al., 1998). Es gibt Hinweise,
dass die Plastizität der Segmentidentität der Somiten von der Größe und vom Stadium des
Transplantates abhängig ist. Lange Transplantate aus der Segmentplatte (Kieny et al., 1972)
oder aus mehreren Somitenhälften (Goldstein und Kalcheim, 1992) können dem Einfluss der
umliegenden Strukturen offenbar besser widerstehen und dadurch ihre eigene Identität
bewahren. Wenn die Größe des Transplantates reduziert ist und es z.B. nur aus zwei Somiten
besteht, ist das transplantierte Gewebe offenbar nicht mehr in der Lage, die ursprüngliche
Identität zu konservieren (Kant und Goldstein, 1999).
Die Plastizität der Hox-Genexpression und der Zelldifferenzierung in den Rhombomeren und
der Kopfneuralleiste wurde im Zebrafisch untersucht (Schilling et al., 2001). Dabei wurde
gezeigt, dass einzelne Zellen eine größere Plastizität besitzen als Zellen, die innerhalb eines
größeren Zellverbandes gelegen sind. Diese in ihrer Hox-Genexpression veränderten
einzelnen Zellen können ihr Differenzierungsschicksal verändern. Grapin-Botton et al. (1995)
beobachteten nach Transplantation der Rhombomersegmente r7 und r8 der Wachtel an Stelle
von r5/6 bei Hühnerembryonen eine ektopische Hoxb-4-Expression. Demgegenüber führte die
umgekehrte Transplantation von r5/6-Rhombomersegmenten in Höhe von r7/8 zur normalen
Hoxb-4 anstatt von Hoxb-3-Expression. Daher kann angenommen werden, dass die Induktion
der neuen Hox-Genexpression von dem umliegenden Gewebe durch Zell-Zell-Signale
vermittelt wird.
Castelli-Gair (1998) hat gezeigt, dass die frühe Expression der Hox-Gene bei Drosophila sehr
dynamisch ist, d.h., dass die Hox-Gene immer wieder ein- und ausgeschaltet werden. In der
Segmentplatte von Wirbeltieren werden die Hox-Gene während der Somitenbildung im
Zusammenhang mit der Segmentierungsuhr zyklisch exprimiert. Die Hox-Genexpression wird
anschließend in den neu gebildeten Somiten festgelegt (Zákány et al., 2001). Diese
Expression im Neuralgewebe ist im frühen Stadium immer noch plastisch. Erst im späteren
Stadium scheint sie nicht mehr verändert werden zu können.
15
Fragestellung und Vorgehensweise
2 Fragestellung und Vorgehensweise
In der vorliegenden Arbeit habe ich mich mit der Frage auseinandergesetzt, ob alle in der
gleichen axialen Höhe gelegenen Zellverbände des paraxialen Mesoderms eine identische
Information zur Segmentidentität besitzen. Ich wollte herausfinden, ob die in der dorsalen
Somitenhälfte gelegenen Zellen dieselbe Information zur Segmentidentität besitzen, wie die
Zellen der ventralen Somitenhälfte der gleichen Höhe. Die Scapula und die Rippen dienten als
Marker der Segmentidentität der Thoraxregion. Um meine Frage zu beantworten, bediente ich
mich drei verschiedener Serien von Experimenten.
In der ersten Serie meiner Arbeit wurde zunächst untersucht, ob die Entwicklung von
Sklerotom- und Dermomyotomderivaten durch experimentelle Rotation des paraxialen
Mesoderms verändert wird. Nach Aoyama und Asamoto (1988) sowie Christ et al. (1992)
sollen sich nach Drehung des paraxialen Mesoderms die Zellen der ursprünglich dorsalen
Somitenhälfte zum Sklerotom und die der ursprünglich ventralen Somitenhälfte zum
Dermomyotom entwickeln. Es sollte in Erfahrung gebracht werden, ob das Sklerotom, dass
aus der ursprünglich dorsalen Somitenhälfte hervorgeht, Rippen bilden kann. Dies würde
bedeuten, dass dieses neu gebildete Sklerotom die Information zur Segmentidentität besitzt,
die für die ventralen Somitenhälften spezifisch ist. Des Weiteren interessierte mich die Frage,
ob das Dermomyotom, das aus der ursprünglich ventralen Somitenhälfte hervorgeht, noch zur
Bildung des Scapula-Körpers fähig ist. Um diese Fragen zu beantworten, wurden kraniale und
kaudale Abschnitte der Segmentplatte, sowie Somiten I-III (Somitenstadien nach Christ und
Ordahl, 1995) aus der prospektiven Thoraxregion isoliert und nach Rotation um die
Längsachse um 180° in die prospektive Halsregion des Wirtsembryos implantiert. Für den
Fall, dass alle Zellverbände der Segmentplatte und der epithelialen Somiten identische
Informationen zur Segmentidentität besitzen, wäre zu erwarten gewesen, dass sich Rippen aus
dem Transplantat in der Halsregion entwickeln; des Weiteren hätte sich ein ektopischer
Scapulaabschnitt aus diesem Transplantat entwickeln sollen. Eine Analyse der Hoxc-6-und
Hoxc-8-Expression und eine Knochen- bzw. Knorpelfärbung sollten Auskunft über die
Segmentidentität geben.
In der zweiten Serie sollte festgestellt werden, ob die Scapula tatsächlich aus dem
Dermomyotom hervorgeht, das ursprünglich die ventrale Somitenhälfte darstellte. Dazu
wurden die ventralen Somitenhälften aus der prospektiven Thoraxregion der Wachtel an
16
Fragestellung und Vorgehensweise
Stelle der dorsalen Somitenhälften in die Halsregion transplantiert. Demgegenüber wurden
die ventralen Somitenhälften der prospektiven Halsregion durch dorsale Somitenhälften der
prospektiven Thoraxregion ersetzt, um herauszufinden, ob sich ektopische Rippen aus dem
Sklerotom bilden, das aus der ursprünglich dorsalen Somitenhälfte hervorgegangen ist. Eine
Analyse der Hoxc-6-Expression und eine Knochen- bzw. eine Knorpelfärbung sowie die
Immunhistochemie mit dem Nachweis von Wachtelzellkernen sollten zur Analyse der
Entwicklungsprozesse beitragen.
Die dritte Serie war dem Expressionsmuster der Hox-Gene in den dorsalen und den ventralen
Somitenhälften gewidmet. Es sollte untersucht werden, wie stark diese Expression in den
Somitenhälften ist. Um dieses Ziel zu erreichen, wurde das Expressionsmuster der Hox-Gene
sowohl in der dorsalen als auch in der ventralen Somitenhälfte anhand von Vibratomschnitten
nach
in
situ-Hybridisierung
analysiert.
Des
Weiteren
Expressionsmusteranalyse mittels der Echtzeit-PCR durchgeführt.
wurde
eine
quantitative
17
Experimentelle Ansätze und Methoden
3 Experimentelle Ansätze und Methoden
3.1 Material
3.1.1 Tiere
Die befruchteten Vogel-Eier der Rasse „Weisse Leghorn“ (Gallus gallus) von Hühnern und
der Wachtelrasse aus Japan (Coturnix coturnix japonica) wurden vom Hühnerhof der Firma
Bronner in Freiburg/Tiengen bezogen und bei 18°C im Kühlschrank aufbewahrt. Zwecks der
mikrochirurgischen Bearbeitungen wurden sie dann bei 37,8°C und 80% Luftfeuchtigkeit in
einem Brutschrank bebrütet, bis das angestrebte Entwicklungsstadium erreicht war.
Die Bestimmung des Entwicklungsstadiums vor der Operationen und bei Fixierungen erfolgte
entsprechend den Maßgaben von Hamburger und Hamilton (1951). Die Somitenstadien
wurden nach der Einteilung von Christ und Ordahl (1995) festgelegt (und zwar, Somiten I-III
für die zuletzt gebildeten Somiten, die römische Zahl I für den jüngsten Somiten;
Dementsprechend wurden die Somiten IV-VI als ältere Somiten angesehen). Für die
Operationen der vorliegenden Arbeit wurden Embryonen der HH-Stadien 11-15 verwendet.
3.2 Mikrochirurgische Technik
3.2.1 Instrumentarium
Zur Fensterung der Eierschale wurden Einstichsägen aus Metall (Haushaltsbedarf) benutzt.
Dumont-Pinzetten wurden bei der Entfernung der ausgesägten Kalkschalen und der
darrunterliegenden Schalenmembran des Eies eingesetzt.
Mit Spezialscheren (Iridektomie- oder Federscheren) konnten die Embryonen vom Dottersack
und Eihäuten getrennt und mit Hilfe von kleinen gelöcherten Sieblöffeln für die Fixierung
transportiert werden, sei es für die Transplantatentnahme vor der Operation oder für die
Weiterbearbeitung nach der Operation. Zur Minderung der Keimverschleppung wurden diese
Instrumente nach jeder Operation bei 180°C zwei Stunden lang sterilisiert.
Zur kontrastreichen Darstellung des Gewebes unter dem Mikroskop wurden Farbstifte
benutzt. Das sind Glasstäbchen mit feinen Kugeln an der Spitze, die mit einer Farblösung aus
Agarose und Nilblausulfat- überzogen wurden.
Für die exakte Schnittführung im embryonalen Gewebe kamen elektrolytisch geschärfte
Wolfram-Nadeln zum Einsatz. Diese wurden zum Zweck der Säuberung und der
Nachschärfung intraoperativ mehrmals über die Flamme einer Alkohollampe gehalten.
18
Experimentelle Ansätze und Methoden
Die Spenderembryonen von Wachtel- oder von Hühnereiern wurden isoliert, in Petrischalen
in Locke-Lösung gewaschen und von Dottersackresten befreit und auf Agarschälchen fixiert.
Diese Lösung (nach Locke und Rosenheim, 1907) ist eine physiologische Nährlösung, die
auch zum Befeuchten der Embryonen intraoperativ diente. Zur Infektionsprophylaxe wurde
diese Lösung autoklaviert und mit Penicillin (100 000 I.U./1) versetzt. Mit Glaspipetten
wurde sie den Empfängerembryonen tropfenweise zugegeben.
Selbst hergestellte Saugkapillaren mit feinem Durchmesser aus Pasteur-Pipetten halfen der
schonenden Entfernung vom überstehenden Gewebe, das bei der Manipulation durch
Wolframnadeln übrig blieb und zur Störung des Transplantationsprozesses hätte führen
können. Diese Saugkapillaren dienten außerdem der schonenden Transplantatentnahme und –
Transport vom Spender zum Empfänger.
Die Manipulationen erfolgten unter binokularen Mikroskopen (Leica M10 oder M3Z).
3.2.2 Allgemeine Operationstechniken
Alle mikrochirurgischen Arbeiten wurden in einem speziellen Operationsraum durchgeführt,
der durch UV-Licht über Nacht keimarm gehalten wurde. Die Arbeitsfläche und die Hände
wurden vor Operationsbeginn mit 70%igem Ethanol desinfiziert.
Nach dem Inkubieren, im allgemeinen nach zwei Tagen, wurde die Position der Embryonen
und der Luftkammer sowie die Alterseinschätzung der Embryonen mittels eines
Leuchtkastens bestimmt und mit Bleistift auf der Eischale markiert. Danach wurden sie in
kleine dafür vorgesehene Nestchen gelegt, die aus gefalteten Alufolien und Zellstofftupfer
bestehen, und dann in den Operationsraum transportiert.
Die Spenderembryonen wurden dann nach vorheriger Desinfektion der Eischale in einer
sterilisierten kleinen Schüssel, die Locke-Lösung enthielt, mit der markierten Seite nach oben
aufgeschlagen, und mit Hilfe einer Federschere wurde der Embryo vom Dottersack getrennt.
Mit dem Sieblöffel wurde der Embryo in ein mit Locke-Lösung gefülltes Agarschälchen
überführt und mit Hilfe von Wolfram-Nadeln fixiert.
Nach vorheriger Desinfektion der Empfängerembryonen wurde zuerst an der zuvor
markierten Stelle der Kalkschale über der Luftkammer ein Strich angesägt. An der markierten
Stelle, wo der Embryo positioniert war, wurde ein kleines Fenster herausgesägt und mit einer
Dumont-Pinzette entfernt. Die darrunterliegende Eihaut wurde mit Locke-Lösung betropft.
Mit einer feinen Pinzette wurde die Luftblase der Luftkammer angestochen. Die Eihaut im
Operationsfenster wurde dann vorsichtig entfernt und der darrunterliegende Embryo sank
19
Experimentelle Ansätze und Methoden
dann aufgrund des abgelassenen Druckes herunter. Durch Hinzutropfen von Locke-Lösung
wurde der Embryo auf Schalenniveau angehoben, was eine Sichtbarmachung der einzelnen
Strukturen durch schräge Einstellung der Beleuchtung und möglich machte. Am gewünschten
Operationsgebiet wurde mittels der Wolfram-Nadel die Vitellinmembran geschlitzt und auf
die Seite geklappt, wodurch der Embryo mit dem Oberflächenektoderm für die angestrebte
Manipulation zugänglich wurde.
Nach der Operation wurden an der angesägten Luftkammerseite ca. 2ml Eiweiß mit einer
großlumigen Injektionskanüle (Braun Sterican Gr.2) abgesaugt, um den Embryo abzusenken.
Dann wurden sowohl diese Luftblasenseite wie auch das Operationsfenster mit LeukosilkKlebeband verschlossen und das Ei zur Weiterentwicklung in den Brutschrank zurückgestellt.
Die Reinkubationsdauer betrug zwischen 24 Stunden und 6 Tagen. Von jeder Operation
wurde ein Operationsprotokoll erstellt, welches die Inkubations- und Reinkubationszeiten des
Embryos, das HH-Stadium sowie die Somitenhöhe zum Zeitpunkt der Operation und Fixation
und eine Operationsskizze enthielt.
Am Ende der gewünschten Reinkubationszeit wurden die Embryonen mit dem Sieblöffel aus
dem Ei entnommen und in physiologischen (PBS oder NaCl) Lösungen von den umgebenden
Eihäuten und Eingeweiden befreit. Danach wurden sie in die dafür vorgesehenen Fixier- oder
Farblösungen überführt.
3.2.3 Spezielle experimentelle Ansätze und Methoden
3.2.3.1 Rotation der kaudalen Segmentplatte
Die Spenderembryonen des Hühnchens im Stadium HH-12 wurden zuerst isoliert und auf
Agarschälchen fixiert. Nach der Ektodermentfernung wurde der kaudale Abschnitt der linken
Segmentplatte in der Länge von ca. 3 Somiten entnommen, der der prospektiven
Thoraxregion entspricht (Abb. 2A und 2A’). Zur Orientierung wurde die mediale Seite durch
Keilform markiert und die dorsale Seite mit einem Farbstift gefärbt.
Bei Wirtsembryonen des Hühnchens im Stadium HH-11 bis -12 wurde auch das Ektoderm in
Höhe vom 12. bis zum 14. Somiten von medial mobilisiert und zur Seite geklappt. Diese
Höhe entspricht der künftigen Halsregion. Danach wurde das somitische Material mit der
Wolfram-Nadel entfernt und das restliche Gewebe aufgesaugt. Das Transplantat wurde dann
mittels der Saugkapillare auf dem Embryo deponiert.
Das Transplantatgewebe wurde dann nach Rotation um 180° um die Längsachse in die dafür
vorbereitete prospektive Halsregion implantiert.
20
Experimentelle Ansätze und Methoden
3.2.3.2 Rotation der kranialen Segmentplatte
Die Spenderembryonen des Hühnchens im Stadium HH-13 wurden isoliert und auf
Agarschälchen fixiert. Nach der Ektodermentfernung wurde der kraniale Abschnitt der
rechten Segmentplatte isoliert, der etwa den zukünftigen Somitenstadien -I, -II, und -III
(Stadieneinteilung nach Christ und Ordahl, 1995) entspricht und die prospektive
Thoraxregion darstellt.
Die Präparation des Hühnchenwirtes erfolgte, wie sie bei der ersten Operationsserie
beschrieben ist. Es erfolgte nicht nur eine dorso-ventrale Rotation, sondern auch eine mediolaterale. Wiederrum wurde das Transplantat in Höhe der zukünftigen Halsregion implantiert
(Abb. 3A und 3A’).
3.2.3.3 Rotation der epithelialen Somiten
Die Spenderembryonen des Hühnchens im Stadium HH-14 wurden isoliert und auf
Agarschälchen fixiert. Nach Ektodermentfernung wurden die rechten epithelialen Somiten IIII (Somitenstadieneinteilung nach Christ und Ordahl, 1995, entsprechend der Somitenhöhe
20-22) gefärbt und markiert. Diese Somiten stellen die prospektive Thoraxregion dar.
Bei Wirtsembryonen des Hühnchens im Stadium HH-12 wurden die gleichen Schritte wie
oben verfolgt. Das Transplantat wurde aufgelegt, und mit Hilfe der Markierungen sowohl um
seine dorso-ventrale Achse als auch um seine kranio-kaudale Achse gedreht und in die
prospektive Halsregion implantiert (Abb. 4A und 4A’)
3.2.3.4 Transplantation der ventralen Somitenhälfte
Die Spenderembryonen der Wachtel im Stadium HH 14-15 wurden mit der dorsalen Seite auf
Agarschälchen fixiert, sodass die ventrale Seite einer Bearbeitung zugänglich war. Von der
medialen Seite aus wurde das Entoderm mobilisiert und nach lateral geklappt. Die ventrale
Somitenhälfte wurde von den zuletzt gebildeten Somiten I-III, oder III-V (entsprechend der
Somitenhöhe 22-26) isoliert und gefärbt.
Beim Empfängerembryo des Hühnchens im Stadium HH-11 bis 12 wurde in Höhe der
Halsregion zuerst das Ektoderm zur Seite geklappt. Danach wurde die dorsale Hälfte der
Somiten 12-14 vorsichtig angehoben und entfernt, die ventrale Somitenhälfte wurde hingegen
in situ belassen. Das Transplantat, das aus ventralen Somitenhälften der Wachtel bestand,
21
Experimentelle Ansätze und Methoden
wurde dann implantiert. Das seitlich aufgeklappte Ektoderm wurde zurückgelegt, um das
Transplantat zu fixieren (Abb. 5A).
Das Prinzip der Huhn-Wachtel-Chimärisation besteht darin, dass ein gewisser Zellverband
vom Huhn entnommen und durch einen anderen von der Wachtel ersetzt wird. Das Huhn
entwickelt sich dann mit dem implantierten Wachtelgewebe ganz normal weiter. Nach der
Fixierung können die Wachtelzellen von Hühnerzellen durch den Nachweis mit einem
bestimmten Antikörper unterschieden werden. Die Verteilung der Wachtelzellen und die
Form des sichtbar gemachten Transplantates geben Aufschluss auf das Schicksal des
transplantierten Gewebes.
3.2.3.5 Transplantation der dorsalen Somitenhälften
Die Spenderembryonen wurden aus den Wachteleiern im Stadium HH 14-15 isoliert und mit
der ventralen Seite auf dem Agarschälchen fixiert. Von der medialen Seite aus wurde das
Ektoderm zur Seite geklappt. Die dorsale Somitenhälfte der Somiten I-II oder III-IV
(Somitenhöhe 25-26 bzw. 23-24) wurde dann angehoben, isoliert und gefärbt.
Bei Wirtsembryonen des Hühnchens im Stadium HH-12 wurde im Halsbereich, in Höhe von
Somiten 12-14, das Ektoderm zur Seite geklappt. Dann wurden die ganzen Somiten entfernt,
sowohl die dorsale als auch die ventrale Somitenhälfte. In diese entstandene Lücke wurde das
Transplantat implantiert (Abb. 6A).
Die so operierten Embryonen wurden für 24 Stunden zum Zweck des Nachweises der Hoxc6-Genexpression mit der in situ-Hybridisierung oder für 6 Tage zum Zweck der
Skelettanalyse mit einer Knorpel- und Knochenfärbung reinkubiert.
3.2.3.6 Analyse des Expressionsmusters der HOX-Gene in den epithelialen Somiten
Bei Hühnerembryonen im Stadium HH-14 bis 15, wurde eine in situ-Hybridisierung mit einer
Hoxc-6-Sonde
durchgeführt,
und
das
Expressionsmuster
in
den
Somiten
nach
Vibratomschnitten analysiert.
Die Echtzeit-PCR sollte uns dabei helfen, die Stärke der Expression dieser Gene zu
analysieren. Dafür wurden in zwei verschiedenen Bechern die Somitenhälften isoliert und in
einer dafür vorgesehenen Lösung fixiert.
22
Experimentelle Ansätze und Methoden
a) Isolierung der ventralen Somitenhälften
Die Hühnerembryonen der Stadien HH 13-15 wurden mit der dorsalen Seite auf
Agarschälchen fixiert. Nach Entodermentfernung wurden dann die ventralen Hälften der
epithelialen Somiten zwischen dem 17. und dem 26. Somiten je nach Stadien sowohl links als
auch rechts des Neuralrohrs von der dorsalen Hälfte getrennt und in die Fixierlösung gegeben.
Wir verwendeten dafür 25 Embryonen.
b) Isolierung der dorsalen Somitenhälften
Die Hühnerembryonen der Stadien HH 13-15 wurden mit der ventralen Somitenhälfte auf
Agarschälchen fixiert und von ihrem Oberflächenektoderm befreit. Dann wurden die dorsalen
Somitenhälften zwischen dem 17. und dem 26. epithelialen Somiten von den ventralen
Hälften getrennt und fixiert
RNA-Isolierung und Quantifizierung
Die zu bearbeitenden Embryonen wurden in einem stark denaturierenden Puffer aus
Guanidiniumisothiocyanat und 10µl/ml ß-Mercaptoethanon (RLT-Puffer) fixiert. Darin
werden die RNA präzipitiert und die RNasen inaktiviert. Die RNA wurde mit Hilfe des
Rneasy Minni Kit nach Qiagen (Firma Qiagen) isoliert, das nach der klassischen Methode von
Chomczynski und Sacchi (1987) arbeitet. Nach mehreren Waschschritten ließ sich die
gebundene RNA mit RNase-freiem H20 eluieren. Um DNA-Spuren zu entfernen, wurde auf
der Säule ein zusätzlicher DNase-Verdau-Mittel zugegeben.
Quantifiziert
wurde
die
isolierte
Gesamt-RNA
mittels
einer
A260-A280-
Absorptionsspektroskopie. Diese Methode beruht auf der relativ spezifischen Absorption von
Nukleinsäuren bei 260 nm. Multipliziert man den A260-Absorptionswert mit dem
Multiplikator 40 und berücksichtigt den Verdünnungsfaktor, ergibt sich der ssRNA-Gehalt
der Probe. Die Messungen wurden in einem 100 µl-Volumen OD-Puffer (pH 7.5) in 1:100Verdünnnung durchgeführt.
Reverse Transkription
Diese dient der Synthese einer cDNA aus der RNA. In dieser Arbeit erfolgte die Reverse
Transkription (RT) routinegemäß im 20 µl-Ansatz. Die Arbeitsschritte werden in der
folgenden Tabelle zusammengefasst:
Experimentelle Ansätze und Methoden
23
3,33 µl der isolierten RNA
1,17 µl DEPC-Wasser
0,50 µl Random-Primers (Invitrogen)
bei 65°C für 10 Min
zur Denaturierung
Dazu
6,4 µl DEPC-H20
4 µl 5x Powerscript Reaction Buffer (Clontech)
bei 37 °C für 1h
2 µl 0,1 M DTT (Clontech)
und
1,6 µl dNTP-Mix als Master-Mix
bei 95°C für 5 Min
1 µl Superscript II (Reverse Transkriptase von (Clontech)
Echtzeit-PCR:
Es gibt unterschiedliche Verfahren für den Ansatz der Echtzeit-PCR. Für die vorliegende
Arbeit benutzten wir eine komparative Quantifizierungsmethode der RNA. Sie beruht auf
dem Vergleich der Amplifikationskurve des Ziel- mit der eines Kontroll-Gens (der sog.
internen Referenz). Das von uns benutzte Kontroll-Gen war 60S rRNA. Als komparative
Methode gibt sie am Ende an, um wie viel mehr oder weniger das Ziel-Gen im Vergleich zum
Referenz-Gen in der untersuchten Probe vorhanden ist.
Für die Echtzeit-PCR wurde die im RT-Schritt erhaltene cDNA standardmäßig 1:100
verdünnt (im Falle 60S-Proben 1:104) und jeweils 20,5 µg dieser Verdünnung in jede zweite
Vertiefung einer 96-well PCR-Platte pipettiert. Als Master-Mix dienten pro Amplifikation
eine Mischung aus SYBR-Green Master-Mix (Applied Biosystems) und der PrimerVerdünnung (1:20 verdünnt). Diese 28,8 µl hergestellte Volumen wurde zur vorgelegten
cDNA zugegeben (Gesamtprobevolumen: 49,3 µl/well). Mit einer Pipette, erfolgte dann eine
Duplikation der Proben zu je 24 µl auf eine endgültige 96-well-PCR-Platte; der Rest von 1,3
µl wurde verworfen. Die Platte wurde zur Messung im ABI PRISM 7700 Sequence Detector
gegeben. Nach 10-minutigem Denaturierungsschritt bei 95°C folgten 40 Zyklen von jeweils
einminütiger Denaturierung bei 95°C und Extension bei 60°C. Nach Abschluss der PCR
wurden die Amplifikationsblots am Rechner auf ihre typische Konfiguration überprüft. Die
Spezifität der amplifizierten Produkte wurde stichprobenartig durch die SchmelzkurvenAnalyse kontrolliert. Hierbei wird während einer kontinuierlichen Temperaturerhöhung von
0,2°C/s das emittierte Fluoreszenzsignal aufgezeichnet. Nach Blot der Fluoreszenzänderung
24
Experimentelle Ansätze und Methoden
dF/dt gegen die Temperatur erhält man die sog. Schmelzkurven. Die Schmelzkurven
spezifischer Produkte haben ein relativ schmales Maximum an der theoretisch errechenbaren
Schmelztemperatur des Amplifikates (ca. 59°C bei einer Länge von 80 bp).
3.3 Analyse des Skelett-Musters
Die
Skelettanlage
und
die
Scapula
ossifizieren
indirekt,
d.h.,
der
endgültigen
Gewebsverknöcherung geht eine knorpelige Phase voraus. Das führt dazu, dass man durch
das Anfärben des Knorpelgewebes den Skelett-Status eines Embryos sichtbar machen kann.
Die Wirbelkörper, die Rippen und die Scapula sind am 8.Tag (StadiumHH 30-35) ihrer
Entwicklung vollkommen knorpelig angelegt. Deswegen wurden die Embryonen nach einer
totalen Bebrütungszeit von 8 Tagen fixiert.
Alcian-Blau ist ein Farbstoff, der zur Färbung von Knorpel- und Knochengewebe eingesetzt
wird. Er besitzt kationische Eigenschaften, die an anionische Proteoglykane binden können
(z.B. Heparansulfat). Diese Proteoglykane kommen in großen Mengen in hyalinem Knorpel
vor (Rohrbach, 1999).
Um das in der Tiefe liegende Skelett darzustellen, musste nach der Färbung das umliegende
Gewebe durchsichtig gemacht werden. Zwei Methoden kamen dabei zur Anwendung.
3.3.1 Knorpel- Knochenfärbung mit Gewebeverdauung
Zuerst wurden die Embryonen fixiert und bei 4°C in 100% Ethanol aufbewahrt. Dann wurden
sie zur Erhöhung der Gewebspermeabilität für 24 Stunden in eine 100%ige Acetonlösung bei
Raumtemperatur überführt. Die Färbung erfolgte für 3-4 Tage bei Raumtemperatur in
Farblösung I (erwähnte Lösung wird unten beschrieben). Dann wurde die Gewebe mit einer
KOH-Lösung mit aufsteigender Glyzerinmenge verdaut, bis das Skelett gut sichtbar wurde.
Anschließend wurden die Embryonen zur Stabilisierung des Skeletts in 100% Glyzerin
beurteilt, fotografiert und gelagert.
Die Verdauung des Weichteilgewebes führte zu einer guten Übersicht des Skelettmusters bei
völlig verlorenen Weichteilen.
25
Experimentelle Ansätze und Methoden
3.3.2 Knorpelfärbung für weitere histologische Aufarbeitung
Die Embryonen wurden in 100% Ethanol fixiert und zur Dehydrierung bei 4°C aufbewahrt.
Es erfolgte dann die Färbung in der Farblösung nach Kant und Goldstein (1999) bei
Raumtemperatur für 7-9 Tage. Danach wurden die Embryonen in einer 100%igen
Methylsalicylatlösung (Sigma) aufgehellt, weiterverarbeitet und aufbewahrt.
Nach neuerer Methode kann man die Embryonen direkt in die Farblösung nach Kant und
Goldstein (1999) für 24 Stunden aufführen; danach werden sie für mindestens 6 Stunden
(besser länger) in 100% Ethanol dehydriert und dann mit Methylsalicylat aufgehellt. Diese
Methode benötigt eine kürzere Zeit und zeigt die gleiche Effizienz.
Das Problem dieser zweiten Färbemethode ist, dass die Sicht nicht so scharf ist, weil das
Weichteilgewebe nicht verdaut wird. Vorteilhaft ist aber die mögliche Anfertigung von
histologischen Schnitten
3.4 Histologie und Färbemethoden
3.4.1 Whole-mount in situ-Hybridisierung
Die whole mount in situ-Hybridisierung ermöglicht die Detektion von mRNA eines
bestimmten Gens in einem intakten Embryo. Damit kann ein Bild über die Expression des
Gens im Bezug auf seine kraniale Grenze gewonnen werden.
Diese Methode beruht auf der Eigenschaft von Nukleinsäuren, doppelsträngige Moleküle zu
bilden, wenn die Nukleinsäureabfolge zueinander passt. Gibt man einen markierten
gegensinnigen Strang eines bestimmten Gens hinzu, so bildet dieser mit der entsprechenden
mRNA einen Doppelstrang. Somit wird der markierte Strang in dieser Zelle fixiert , was
durch eine enzymatisch katalysierte Farbreaktion sichtbar gemacht wird.
Das hier verwendete Protokoll für die Hoxc-6 und Hoxc-8 in situ-Hybridisierung entspricht
dem von Nieto et al. (1996). Die Arbeitsschritte werden in der folgenden Tabelle
zusammengefasst:
Arbeitsschritte
Frequenz Temp.
I-Vorbehandlung der Embryonen
Präparation der Embryonen in PBT
Fixierung in 4% PFA (inaktiviert alle Proteine)
Über Nacht 4°C
Waschen in PBT
15min.
4°C
26
Experimentelle Ansätze und Methoden
Dehydrierung mit 100%Methanol (mögliche Aufbewahrung bei –20°C)
2x 15min
4°C
Rehydrierung mit PBT
10 min
4°C
Enzymverdau mit Proteinase K (20µ g/µl) in PBT
variabel
18°C
Waschen in PBT
10min
4°C
Fixierung 1% Glutaraldehyde in 4% PFA in PBT
20min
4°C
Waschen in PBT
10min
4°C
Prähybridisierung in Hybridisierungspuffer
90min
65°C
Mit frischer Hybridisierungspufferlösung ersetzen.
Über Nacht 65°C
II. Hybridisierung
Hinzufügen der RNA-Sonde zum Hybridisierungspuffer
2 Tage
65°C
Waschen in 2fach SSC ohne CHAPS
20min
65°C
Waschen in 2fach SSC mit CHAPS (CHAPS:SSC= 1:50)
2x 20min
65°C
Waschen in 0,2fach SSC mit CHAPS (CHAPS:SSC= 1:50)
2x 20min
65°C
Wechsel in KTBT
5min
18°C
4 Stunden
18°C
III-Posthybridisierungswaschen
IV-Immunozytochemischer Sonden-Nachweis
Präblockierung mit 10% Pferdeserum in KTBT
Inkubation
mit
Antikörper-Lösung(anti-DIG)(1:2000
in
10%
Über Nacht 4°C
Serum/KTBT)
Waschen mit KTBT
6x2h
Waschen mit KTBT
Über Nacht 4°C
Waschen in AP-Puffer
2x15min
18°C
Inkubation mit der Färbe-Lösung (im Dunkeln) und stark schütteln
variabel
18°C
Im AP-Puffer waschen
Über Nacht 18°C
Refixierung in 4% PFA in PBT
18°C
4°C
Je nachdem, was zu untersuchen war, wurden die Embryonen in 4%iger wässriger
Agarlösung eingebettet. Es wurden dann Vibratomschnitte mit einer Dicke von 35-40µm in
der Transversalebene angefertigt. Die Schnitte wurden in Aqua dest. gewaschen und auf
Glycerin-Gelatine bedeckte Objektträger aufgezogen und mit Glycerin eingedeckelt.
27
Experimentelle Ansätze und Methoden
3.4.2 Herstellung der Paraffinschnitte für die histologische Untersuchung
Die in der Kant und Goldstein-Färbelösung gefärbten Embryonen wurden im vollkommen
dehydrierten Zustand in Rotihistol (Roth) überführt. Dann kamen sie für ein paar Stunden ins
Paraffinöl im Wärmeschrank bei 65°C, wonach sie in Paraffin eingebettet wurden. Die
interessierenden Abschnitte wurden mit einem Mikrotom in der Transversalebene lückenlos
in 8µm dicke Scheiben geschnitten. Diese Serienschnitte wurden auf mit Glyzerin-Gelatine
bedeckte Objektträger aufgezogen und in einem Wärmeschrank (40°C) getrocknet.
3.4.3 Immunhistochemische Färbung an Wachtel-Huhn-Chimären
Nach der Beurteilung des Skelett-Musters mittels der Kant und Goldstein Färbemethode
(1999) wurden die Transplantatgebiete zuerst sorgfältig inspiziert , dann isoliert und in
Paraffin so eingebettet, dass in der Transversalebene Schnitte angefertigt werden konnten. Zur
immunhistochemischen Detektion von bestimmten Zelltypen werden Antikörper verwendet,
die zellspezifische Antigene binden. Muskelzellen exprimieren das muskelspezifische
Antigen Desmin. Möchte man nur das Muskelgewebe untersuchen, so findet ein
monoklonaler Antikörper Verwendung. Für eine Doppelmarkierung mit zusätzlicher
Detektion der Wachtelkerne wird ein polyklonaler Antikörper eingesetzt, der wie der
monoklonale käuflich zu erwerben ist (Sigma).
Im ersten Inkubationsschritt der Markierung erkennt ein polyklonaler, aus Kaninchen
gewonnener Anti-Desmin-Antikörper das Desmin (Verdünnung in PBS 1:400).Ein muriner,
monoklonaler QCPN-Antikörper (Quail Cell Nuclei, Hybridoma Bank, Iowa, Überstand der
Zellkultur) erkennt die Wachtelzellen. Im zweiten Schritt bindet ein zweiter Ziegen-AntiKaninchen-Antikörper, mit Peroxidase konjugiert, (GarPO) an den ersten Anti-DesminAntikörper. Ein Ziegen-Anti-Maus-Antikörper, mit alkalischer Phosphatase konjugiert
(GamAP), erkennt den QCPN-Antikörper und bindet auch an diesen. Die einzelnen
Arbeitsschritte werden in der folgenden Tabelle beschrieben:
28
Experimentelle Ansätze und Methoden
Arbeitsschritte
Frequenz/Zeit
Entparaffinierung in Rotihistol
Dehydrieren in 100% Ethanol
200ml Methanol + 600µl H2O2
Waschen in Aqua dest
Waschen in PBS-Tween (0,5%)
Waschen in PBS
Präinkubation mit 1% BSA (Rinderserumalbumin)
Erster Antikörper (Anti-Qail-Überstand 1:5; Desmin polyklonal 1:400)
Waschen in PBS
2x5min
Zweiter Antikörper (GamAP 1:1000; GarPO 1:250)
60min
Waschen in PBS
5min
DAB-Reaktion ohne Nickelzusatz mit Zusatz von 40µl H2O2
10min
Waschen in Aqua dest
2xkurz
Waschen in AP-Puffer
5min
AP-Farblösung aufragen (Färbereaktion im Dunkeln)
10min bis 1h
Waschen im AP-Puffer
10min
Gegenfärbung der Kerne in Kernechtrot
10sec
Aufsteigende Ethanol-Reihe
kurz
Rotihistol
2x3min
Eindeckeln mit Entellan
3.5 Methoden der Echtzeit-PCR
Die isolierten Somitenhälften wurden zuerst bei Raumtemperatur belassen, damit sich das
Gewebe in der Lösung auflösen konnte. Danach wurden sie bei –80°C aufbewahrt.
Im Folgenden werden die wichtigen Arbeitsschritte zusammengefasst:
3.5.1 RNA-Isolierung
•
Proben bei 37°C auftauen lassen für ca. 15min
•
Zentrifugieren
•
Genaues Volumen bestimmen
29
Experimentelle Ansätze und Methoden
•
Gleiches Ethanolvolumen zugeben
•
Auf Säulen übertragen
•
Waschschritte nach der Rneasy Mini Kit von Qiagen
•
In neue Säulen übertragen
•
30µl DEPC-Wasser für ca. 30 min zugeben, um die Ausbeute zu erhöhen
•
RNA-Menge mittels der Absorptionsspektoskopie messen. (Man braucht mind. 0,5µg)
3.5.2 Echtzeit-PCR
Die Entwicklung von PCR-Methoden (Mullis et al., 1986) und die Kombination mit der
Reversen Transkription zur RT-PCR (Rappolee et al., 1988) eröffneten neue Horizonte für
quantitative Expressionsstudien. Für die Quantifizierung von PCR-Reaktionen gibt es zwei
Techniken: Die Endpunkt- und die Echtzeit-Methode. Bei einer Endpunkt-Messung erfolgt
die Quantifizierung nach Abschluss der PCR mittels Fluoreszenz, Lumineszenz oder
Kapillarelektrophorese (Freeman et al., 1999). Im Gegensatz dazu ermöglichen EchtzeitTechniken die Beobachtung der Amplifikation in ihrem Verlauf. Der Rückschluss auf die
Ausgangsmenge des Ziel-Gens erfolgt schon während der log-Phase der Amplifikation. Zur
Analyse der Amplifikation haben wir in der vorliegenden Arbeit Oligonukleotide benutzt.
Dabei werden Farbstoffe wie Ethidiumbromid (Ririe et al., 1997) oder SYBR Green I
(Morrison et al., 1998) dem PCR-Gemisch zugefügt, die zwischen die zu doppelsträngige
Helices aggregierenden Amplifikationsprodukte interkalieren und dabei fluorogen werden.
Diese Technik kann heutzutage in wenigen Stunden einen kompletten Überblick über die
relative und absolute Genexpression einer individuellen Genauswahl liefern (Shih et al.,
2002) und ist , verglichen mit der Endpunkt-Methode, billiger.
•
0,5µg RNA-RT für 20µl Ansatz
•
cDNA 1:100 verdünnen
•
cDNA 1:10 000 verdünnen für 60S
•
24 µl SYBR-Green-Master-Mix (applied Biosystem)
•
2,4µl Primer reverse (1:20 verdünnt)
•
2,4 µl Primer forward (1:20 verdünnt)
Gesamtprobenvolumen: 20,5 µl+28,8 µl = 49,3 µl
Proben duplizieren. Zudecken.
30
Zyklen-Protokoll:
Experimentelle Ansätze und Methoden
10 Min 95°C
1 Min 60°C
40 Zyklen
1 Min 95°C
Für die Analyse brauchten wir in der vorliegenden Arbeit verschiedene Primer, die für die
HoxA-6, HoxB-7 und HoxA-8-Expression bestimmt waren. Zur Sicherung der Ergebnisse,
benutzten wir für manche Primer unterschiedliche Sequenzen., sodass z.B. für den Primer von
HoxA-6 zwei Sequenzen vorhanden waren: HoxA-6.02 und HoxA-6.03, und für HoxB-7 drei
Proben hatten: HoxB-7.01, HoxB-7.02 und HoxB-7.03. Als Kontroll-Gen wurde 60S benutzt.
Dieses diente auch dem Vergleich mit den verschiedenen Ergebnissen.
Im Folgenden werden die Gensequenzen der verschiedenen Primer angegeben
(von der Firma MWG Biotech in Anzingen):
HOXA-6.02
fwd
5’-GAC TCC TTC CTC GGG CAG AT-3’
HOXA-6.02
rev
5’-CAA GCA ATG ACG GTG TTG GA-3’
HOXA-6.03
fwd
5’-TCC AAV ACC GTC ATT GCT TG-3’
HOXA-6.03
rev
5’-GCT CGG GAG AAA AGT GCA GA-3’
HOXB-7.02 forward (fwd) 5’-GAC TTC TCC GCT CCC TTC ATC-3’
HOXB-7.02 reverse (rev) 5’-TGC CTT TGT GCC CTT TCT CT-3’
HOXB-7.01
fwd
5’-CCG CTC CCT TCA TCC AGAC-3’
HOXB-7.01
rev
5’-GCT GCC TTT GTG CCC TTTC-3’
HOXA-8
fwd
5’-GCT TCG GTC AAA TCG GAG AAC-3’
HOXA-8
rev
5’-GCT GTA GGG CTC AGG TGT CTTG-3’
60S
fwd
5’-GTT GGC ACG CAG GCT TCT-3’
60S
rev
5’-GTT GGC ACG CAG GCT TCT-3’
3.6 Fotografie und Zeichnungen
Gefärbte Embryonen wurden mit einem Leica M10 Stereomikroskop fotografiert. An einer
Digitalkamera der Firma Leica wurden sowohl die in situ-hybridisierten Embryonen als auch
die Serienschnitte fotografiert. Als Filmmaterial diente Kodak Ektachrom 64T. die Diafilme
wurden von der Firma Vario in Freiburg entwickelt. An einem Scanngerät der Firma Nikon
Experimentelle Ansätze und Methoden
31
wurden die Diapositive eingescannt. Die Bearbeitung der Abbildungen erfolgte mit der
Bildbearbeitungssoftware „Adobe Photoshop 7.0“. Die Zeichnungen wurden mit dem
Zeichenprogramm „CORELDRAW 10“ angefertigt.
3.7 Chemische Reagenzien und Zusammensetzung der verwendeten
Lösungen
3.7.1 Lösungen für die Operationen
Farbstofflösung für Farbstifte
1% Nil-Sulfat-Blau in 2% Agarrose in Aqua dest. Lösung erhitzen und die
Farbstiftspitze hinein tunken.
Locke-Lösung
Stammlösung A: 94,270g NaCl auf 1000ml Aqua bidest.
Stammlösung B: 12,0253g KCl auf 1000ml Aqua bidest.
Stammlösung C: 15,8092 CaCl*H2O auf 1000ml Aqua bidest
100 ml A +37 ml B + 21 ml C + 0,03 g Penicillin G Natriumsalz zusammen auf
1000ml mit Aqua bidest auffüllen.
3.7.2 Lösungen für die Skelettanalyse
Farblösung I für Knorpel-/Knochenfärbung
0,017 g% Alcian-Blau (Sigma)
0,006 g% Alcian-Rot (Sigma).
in Aqua dest
68 Vol% Ethanol
5 Vol% Eisessig
KOH-Lösung für den Gewebe-Verdau
1 g% KOH-Tabletten
20 Vol% Glyzerin
in Aqua dest
Experimentelle Ansätze und Methoden
32
Farblösung nach Kant und Goldstein(1999)
0,015 g% Alcian-Blau (Sigma)
in reinem Ethanol
20% Vol Eisessig
3.7.3 Lösungen für die Whole-mount in situ-Hybridisierung und die
Immunhistochemie
Paraformaldehyde (PFA) (Sigma)
10fach PBS-Stammlösung:
72 g NaCl + 4,3 g KH2HPO4 + 14,8 g Na2HPO4*12H2O auf 2000 ml mit Aqua
bidest auffüllen.
PBT:
0,1% Triton X-100 (Sigma) in PBS
Proteinase K-Stammlösung:
20 mg/ml Proteinase K (Sigma) in PBT
Glutaraldehyde-Stammlösung:
25% Glutaraldehyde (Sigma)
Hybridisierungspuffer:
2% Blockierungspuffer (Boehringer)
0,1% Triton X-100
0,1% CHAPS (Sigma)
in
1 mg/ml tRNA
Formamid: 5fach SSC
5 mM EDTA
50µg/ml Heparin
20fache SSC-Stammlösung:
3M NaCl + 0,3M Natrium-Citrat; pH 7.0
1:1
33
Experimentelle Ansätze und Methoden
KTBT-Lösung:
50mM Tris-Hcl, pH 7.5 + 150mM NaCl + 10nM KCl + 1% Triton X-100
AP-Puffer:
5 ml 1M Tris-Puffer pH 9.5
2,5 ml 1M MgCl2
mit destilliertem wasser
1 ml 5M NaCl
auf 50ml auffüllen
2 ml Triton X-100
Färbe-Lösung:
4,5 µl/ml NBT (Boehringer)
in AP-Puffer
3,5 µl/ml BCIP (Boehringer)
CHAPS-Lösung:
10 g Trockensubstanz in 100 m Aqua bidest.
1M Tris-Puffer-Stammlösung:
121,1 g Tris-Base in 800 ml Aqua bidest. Auflösen, pH einstellen mit konzentrierter
HCl, auf 1000 ml mit Aqua bidest. auffüllen.
Hoxc-6-Sonde:
Die Hoxc-6-sonde ist als ein 1,4 kb Insert und die Hoxc-8-Sonde als ein 1,2 kb Insert
in den Vektor pBluescript II KS Ebensperger et al. 1995) einkloniert.
Sie wird durch in vitro-Transkription mit Digoxigenin-UTP nach dem Protokoll der
Firma Roche (DIG RNA Labelingmix) markiert.
PBS-Tween:
500 µl Tween in 1000ml PBS
BSA: Bovine Serum Albumine (Rinderserumalbumin) (Serva)
34
Experimentelle Ansätze und Methoden
DAB-Lösung ohne Ammoniumnickelsulfatzusatz:
200 ml Tris-Hcl Puffer pH 7.6 + 80 mg DAB + 40 µl H202
80 mg DAB-Portionen:
Diaminobenzidin (DAB) 5g in 62,5 ml Aqua bidest. lösen und in 1 ml portionieren
ergibt eine eine Endkonzentration von 80 mg/ml. Lagerung bei –20°C
Kernecht-Rot-Lösung:
1 g Kernecht-Rot in 1000 ml 5 %iger Aluminiumsulfatlösung lösen und filtrieren.
3.7.4 Fixierlösung für die RT-PCR:
10 µl/ml ß-Mercaptoethanon in RLT-Puffer
35
Ergebnisse
4 Ergebnisse
4.1 Rotation der Segmentplatte und der Somiten um die Längsachse
Kieny et al. (1972) haben gezeigt, dass sich nach Transplantation der Segmentplatte und der
Somiten aus der prospektiven Thoraxregion in die zukünftige Halsregion Wirbel mit
thorakaler Identität und ektopische Rippen bilden. Dies war der Beweis dafür, dass die
ventrale Somitenhälfte schon in ihrer Segmentidentität festgelegt ist. Nach dorso-ventraler
Umdrehung der jüngsten Somiten konnten Aoyama und Asamoto (1988), sowie Christ et al.
(1992) den Nachweis führen, dass sich aus der ursprünglich ventralen Somitenhälfte ein
Dermomyotom differenziert und aus der ursprünglich dorsalen Somitenhälfte ein Sklerotom.
Um herauszufinden, ob das Sklerotom, das nach experimenteller Drehung des paraxialen
Mesoderms aus der ursprünglich dorsalen Somitenhälfte hervorgegangen ist, die Information
der Segmentidentität enthält, d.h., ob dieses Sklerotom noch in der Lage ist, Rippen zu bilden,
habe ich die Segmentplatte sowie die neu gebildeten Somiten um 180° um die Längsachse
gedreht. Das gleiche Experiment sollte auch Hinweise dafür geben, ob das Dermomyotom,
das aus der ursprünglich ventralen Hälfte stammt, dieselbe Information enthält. Da sich der
kraniale und der kaudale Abschnitt der Segmentplatte bei der Somitenbildung unterschiedlich
verhalten (Dubrulle et al., 2001), wurde die Segmentplatte bei dieser Untersuchung in einen
kranialen und einen kaudalen Abschnitt unterteilt.
4.1.1 Rotation des kaudalen Abschnitts der Segmentplatte
Bei Hühnerembryonen wurde der kaudale Abschnitt der Segmentplatte im HH-Stadium 12,
der die zukünftige Thoraxregion darstellt, entnommen und um 180° um die Längsachse rotiert
und danach in die Halsregion von Hühnchenempfängern implantiert. (Abb. 2A und 2A'). Acht
derartige Transplantationen wurden durchgeführt. Nach 6-tägiger Reinkubationszeit wurden
die Embryonen fixiert. Die Analyse des Skelett-Musters sollte Hinweise auf morphologische
Veränderungen geben. Sie ergab bei sechs von acht operierten Embryonen in Höhe vom
siebten bis zum neunten Halssegment Wirbel, die die Morphologie von Thoraxwirbeln
aufwiesen. Sie waren breiter als die in der übrigen Halsregion. Diese Wirbel trugen
zusätzliche Knorpelstücke, die, obwohl sie nicht genauso lang waren wie die Rippen der
Thoraxregion, an Rippen erinnerten. Wahrscheinlich kam die Verkürzung der Rippen dadurch
zustande, dass der zur Verfügung stehende Raum in der Halsregion enger war als der Raum in
Ergebnisse
36
der Thoraxregion. Zusätzlich zu den Rippen wurde ein weiteres Knorpelstück beobachtet,
dessen Längsachse parallel zur Körperachse ausgerichtet war. Dieses Knorpelstück hatte
keine gelenkige Verbindung mit der Wirbelsäule und lag unter der Haut, und wurde als
ektopischer Scapula-Körperabschnitt interpretiert (Abb. 2B).
Die anderen zwei Embryonen aus dieser Operationsserie zeigten keine morphologischen
Veränderungen im Operationsgebiet und wurden daher nicht ausgewertet. Wahrscheinlich
war das Transplantatgewebe nach der Operation verloren gegangen.
12
16
A
A’
B
Abb. 2
Rotation des kaudalen Segmentplattenabschnitts
(A) + (A’)
Operationsschema:
(A)
Isolierung
des
linken
kaudalen
Segmentplattenabschnittes bei einem HH-Stadium 12 Hühnchen in Höhe der prospektiven
Thoraxregion. Implantation des Transplantatsgewebes nach vorheriger dorso-ventraler
Umdrehung um die Längsachse in die prospektive Halsregion eines anderen Hühnchens. (A’)
Der Transversalschnitt zeigt die gleiche Manipulation und hebt nochmals die dorso-ventrale
Rotation der Längsachse hervor.
(B)
Skelett-Muster der in (A) und (A’) Operation nach sechs Tagen
Reinkubationszeit. Die linke Seite stellt die Kontrollseite dar. Auf der operierten Seite können
die Rippen und die Scapula in der Thoraxregion beobachtet werden. Im operierten
Halsbereich sind die Wirbel der Höhe etwas breiter als die übrigen Halswirbel. Außerdem
wird die Anwesenheit von drei zusätzlichen Rippen festgestellt (grüne Pfeile), sowie von
einem Fragment des Scapula-Körpers (Pfeilkopf).
Ergebnisse
37
4.1.2 Rotation des kranialen Abschnitts der Segmentplatte
Bei Hühnerembryonen des HH-Stadiums 13 wurde der kraniale Abschnitt der Segmentplatte
isoliert und bei der Implantation in die Halsregion eines Hühnchenempfängers dorso-ventral
um 180° gedreht, sodass der ursprüngliche mediale Anteil der Segmentplatte lateral zu liegen
kam (Abb. 3A und 3A’). Die Zahl der untersuchten Embryonen betrug vier. Nach 6-tägiger
Reinkubation wurden die Embryonen fixiert. Ihr Skelett-Muster wurde analysiert. Bei drei
Embryonen zeigten die Wirbel im operierten Gebiet der Halsregion vom sechsten bis zum
achten Segment die Morphologie von Thoraxwirbeln. Ihre Wirbelkörper waren größer als die
der übrigen Halswirbel. Sie waren jeweils mit Knorpelstücken verbunden, die zum Teil
miteinander fusioniert waren. Diese Knorpelstücke wurden als ektopische Rippen
interpretiert. Außerdem war ein zusätzlicher kleiner Knorpelabschnitt vorhanden, der keine
Verbindung zur Wirbelsäule aufwies, jedoch den zusätzlichen Rippen anlag. Dieses
Knorpelstück wurde als Abschnitt des Scapula-Körpers aufgefasst (Abb. 3B).
Bei einem Embryo war keine morphologische Veränderung festzustellen. Im operierten
Gebiet sahen die Wirbel genauso wie die übrigen Halswirbel aus, und es waren keine
zusätzlichen Knorpelstücke vorhanden. Wahrscheinlich war das Transplantat nach der
Operation verloren gegangen.
12
19
A
Abb. 3
A’
B
38
Ergebnisse
Rotation des kranialen Abschnitts der Segmentplatte
(A) + (A’)
Operationsschema: (A) Isolierung des rechten kranialen Abschnitts der
Segmentplatte an einem 2 Tage alten Hühnchen im HH-Stadium 13. Umstellung der mediolateralen Achse nach Rotation der dorso-ventralen Längsachse. Implantation des
Transplantatsgewebes in die prospektive Halsregion eines anderen Hühnerembryos. (A’)
Transversalschnitt des gleichen Operationsschemas: Isolierung des Transplantats nach
Ektodermentfernung Das krumme grüne Pfeil weist auf die zusätzliche Umstellung der
medio-lateralen Achse hin.
(B)
Skelett-Muster nach der in (A) und (A’) beschriebenen Operation und sechs
Tagen Reinkubationszeit. Die linke Seite gilt als Kontrollseite. Auf der rechten operierten
Seite markiert ein grünes Pfeil die 3 ektopischen Rippen in der Halsregion, wobei sich 2
Rippen zu einem dickeren Knorpelstück fusioniert haben. Die orange Pfeilspitze weist auf
den ektopischen Scapula-Körperabschnitt auf.
4.1.3 Rotation der zuletzt gebildeten Somiten
Bei Hühnerembryonen des HH-Stadiums 14 wurden die neu gebildeten Somiten I-III
(Stadieneinteilung nach Christ und Ordahl, 1995), die den Somiten 20-22 entsprechen, der
prospektiven Thoraxregion entnommen. Sie wurden dorso-ventral um ihre Längsachse
gedreht, wobei das kraniale Ende nach kaudal zu liegen kam. Die Transplantation der
Somiten erfolgte in die Halsregion eines Hühnchenempfängers, der sich im HH-Stadium 12
befand (Abb. 4A und 4A’). Die Zahl der erfolgreich durchgeführten Transplantationen betrug
zwei. Nach einer Reinkubationszeit von 6 Tagen wurden die Embryonen fixiert, und ihr
Skelettmuster wurde untersucht. Bei den zwei Empfängerembryonen wurden wiederum im
Operationsgebiet Wirbel mit der Morphologie von Thoraxwirbeln beobachtet. Von ihnen
gingen drei zusätzliche Knorpelstücke aus, die an ihrem distalen Abschnitt zu einem dickeren
Knorpelabschnitt fusioniert waren. Diese Knorpelstücke wurden als zusätzliche Rippen
identifiziert. Dazu wurde noch ein weiterer Knorpelabschnitt festgestellt, der keine
Verbindung zur Wirbelsäule aufwies, und daher als ein ektopisches Scapula-Körperfragment
gedeutet wurde (Abb. 4B).
Ergebnisse
39
19
22
A
A’
B
Abb. 4
Rotation der epithelialen Somiten
(A) + (A’)
Operationsschema: (A) Isolierung beim 2 Tage bebrüteten Hühnchen (HHStadium 14) der zuletzt gebildeten Somiten (Somiten I-III). Nach Rotation um die Längsachse
wurde die kranio-kaudale Achse invertiert. Implantation des Transplantatsgewebes in die
prospektive Halsregion eines anderen Hühnerembryos. (A’) Transversalschnitt des
Operationsschemas.
(B)
Skelett-Muster nach der in (A) und (A’) beschriebenen Operation und sechs
Tagen Reinkubationszeit. Die linke Seite gilt als Kontrollseite. Im Halsregion der rechten
operierten Seite haben sich aus dem Transplantatgewebe 3 ektopische Rippen entwickelt, die
zu einem dickeren Knorpelabschnitt fusioniert sind (grünes Pfeil). Dazu hat sich ein
ektopisches Fragment des Corpus scapulae aus dem gleichen Transplantat gebildet (orange
Pfeilspitze). Dieses Fragment weist keine gelenkige Verbindung mit der Wirbelsäule auf.
Zusammenfassung der Operationsserie 4.1.
In den ersten drei Operationsserien wurden kaudale und kraniale Abschnitte der
Segmentplatte, sowie die neu gebildeten Somiten aus der prospektiven Thoraxregion von
Hühnerembryonen entnommen und um 180° um die Längsachse rotiert. Dabei wurden
zwangsläufig auch die kranio-kaudale oder die medio-laterale Achse umgestellt. Die
Transplantationen erfolgten in die prospektive Halsregion eines Hühnchenempfängers. Es
wurde jeweils die Bildung von Wirbeln im Operationsgebiet beobachtet, die die Morphologie
von Thoraxwirbeln aufwiesen. Es hatten sich weiterhin ektopische Rippen aus den
Sklerotomen gebildet, die aus der ursprünglich dorsalen Somitenhälfte hervorgegangen
waren. Außerdem konnte die Bildung von Fragmenten des Scapula-Körpers beobachtet
40
Ergebnisse
werden. Diese müssen sich aus den Dermomyotomen entwickelt haben, die den ursprünglich
ventralen Somitenhälften entstammen.
4.2 Transplantation dorsaler und ventraler Somitenhälften
Nach der dorso-ventralen Umdrehung der Segmentplattenabschnitte oder der jüngsten
Somiten konnte die Bildung von ektopischen Rippen sowie von einem ektopischen
Scapulaabschnitt beobachtet werden. Um festzustellen, ob diese ektopischen Rippen aus der
ursprünglich dorsalen Somitenhälfte und der Scapulaabschnitt aus der ursprünglich ventralen
Somitenhälfte hervorgehen, wurden interspezifische Transplantationen der Somitenhälften
durchgeführt.
4.2.1 Transplantation ventraler Somitenhälften in die Position der dorsalen
Somitenhälften
Zur Klärung der Frage, ob sich Scapulaabschnitte tatsächlich aus dem Dermomyotom
entwickeln, das aus der ursprünglich ventralen Somitenhälfte hervorgegangen ist, wurden die
ventralen Somitenhälften der prospektiven Thoraxregion von der Wachtel an Stelle der
dorsalen Somitenhälften in die zervikale Region des Hühnchens transplantiert. Die HuhnWachtel-Transplantationen wurden durchgeführt, um Informationen über das Schicksal des
transplantierten Gewebes zu gewinnen. Anhand einer immunhistochemischen Markierung der
Transversalschnitte der Huhn-Wachtel-Chimären mit Anti-Desmin- und Anti-WachtelAntikörper konnte das Transplantatgewebe identifiziert und analysiert werden.
Bei Wachtelembryonen im HH-Stadium 13-14 wurden die ventralen Somitenhälften der
Somiten I-III (Stadieneinteilung nach Christ und Ordahl, 1995), die den Somiten 17-19 oder
20-22 entsprechen, isoliert. Dieses Transplantatgewebe wurde in die Halsregion von
Hühnerembryonen in Höhe vom 13. bis zum 16. Somiten an Stelle der dorsalen
Somitenhälften implantiert (Abb. 5A). Nach einer Reinkubationszeit von 6 Tagen wurden die
Embryonen fixiert und das knorpelige Skelett gefärbt. Fünfzig derartige Wachtel-HühnchenChimären wurden untersucht. Im operierten Bereich, der der Höhe vom sechsten bis zum
zehnten Halssegment entspricht, waren keine morphologischen Veränderungen der Wirbel zu
beobachten. Bei sechsundzwanzig Empfängerembryonen wurde das Vorkommen eines
zusätzlichen kleinen und ovalen Knorpelabschnitts in der Halsregion festgestellt, der keine
gelenkige Verbindung mit der Wirbelsäule aufwies. Dieser Knorpelabschnitt wurde als
Ergebnisse
41
zusätzlicher Scapulaabschnitt identifiziert (Abb.5B und Kontrolle in 5B’). Um diesen
Knorpelabschnitt
näher
zu
charakterisieren,
wurden
histologische
Untersuchungen
durchgeführt. Es erfolgte eine Doppelmarkierung der Schnitte mit Anti-Desmin- und AntiWachtel-Antikörper. Auf der operierten Seite war dieser Knorpel durch das Vorkommen von
Zellkernen des Wachteltyps gekennzeichnet (Abb. 5C). In den Wirbeln konnten keine
Zellkerne des Wachteltyps nachgewiesen werden, als Hinweis darauf, dass keine Verbindung
zwischen dem transplantierten Gewebe und dem des Empfängerembryos stattgefunden hatte.
Dagegen war die nicht-operierte Seite unauffällig.
Bei vier der untersuchten Embryonen trugen die Wirbel im operierten Halsbereich zusätzliche
Knorpelabschnitte, die eine Verbindung mit der Wirbelsäule aufwiesen und eine andere
Morphologie hatten. Sie waren länger als die Knorpelstücke, die als Scapulaabschnitte
identifiziert wurden. Es handelte sich um ektopische Rippen. Bei der Doppelmarkierung der
histologischen Schnitte mit Anti-Desmin- und Anti-Wachtel-Antikörper konnte das
Vorkommen der Zellkerne des Wachteltyps in den Wirbeln festgestellt werden. Dies lag
wahrscheinlich an der Schwierigkeit der Operationen, da die Trennung der ventralen von der
dorsalen Somitenhälfte in solchen frühen Stadien außerordentlich schwierig ist. Das
Vorkommen von Rippen anstatt der Scapula-Anlage konnte dadurch erklärt werden, dass ein
Teil des Transplantatgewebes die ventrale Position erreicht und Signale für die Rippenbildung
erhalten hatte.
Bei zwanzig Embryonen konnte im transplantierten Bereich keine Veränderung beobachtet
werden und die histologischen Schnitte zeigten auf der operierten Seite ein von
Mesenchymzellen gebildetes Gewebe. Es waren keine Zellkerne des Wachteltyps vorhanden.
Dies deutet darauf hin, dass das Transplantatgewebe nach der Operation verloren gegangen
war.
Die Transplantation der ventralen Somitenhälften nach dorsal in die Halsregion wurde an
einundzwanzig weiteren Hühnerembryonen mit dem Zweck der Analyse der HoxGenexpression durchgeführt. Hierbei wurde anstelle des Wachtelembryos ein Hühnerembryo
als Spender benutzt. Der Grund dafür war, dass die benutzte Hoxc-6-Sonde einen molekularen
Marker darstellt, der für das Hühnchen spezifisch ist. Die operierten Embryonen wurden
einen Tag nach der Operation fixiert und es erfolgte die Markierung der Expressionsdomäne
mittels in situ-Hybridisierung. Zunächst wurde die normale kraniale Expressionsgrenze dieses
Hoxc-6-Gens in Höhe der Somiten 19-20 nachgewiesen, wie bereits von Burke et al. (1995)
gezeigt wurde. Zusätzlich zu dieser normalen Expression wurde eine ektopische Expression
dieses Hox-Gens am transplantierten Ort im Halsbereich bei siebzehn Embryonen festgestellt
Ergebnisse
42
(Abb. 5D). Von dieser ektopischen Expressionshöhe wurden Vibratomschnitte angefertigt.
Danach konnte auf der operierten Seite eine Hoxc-6-Genexpression beobachtet werden, die
auf das Dermomyotom beschränkt war (Abb. 5E).
Zusammenfassend lässt sich sagen, dass nach Transplantation der ventralen Somitenhälften
nach dorsal ein zusätzlicher Scapula-Körper sowie eine ektopische Hoxc-6-Genexpression im
operierten Halsbereich beobachtet werden können.
(b)
(c)
A
B
C
Abb. 5
B’
D
E
43
Ergebnisse
Interspezifische Transplantation der ventralen Somitenhälften in die Position der dorsalen
Somitenhälften
(A)
Mehrschritt-Operationsschema: (a) Entnahme des Transplantatgewebes
bestehend aus den ventralen Somitenhälften von 2-3 epithelialen Somiten der prospektiven
Thoraxregion (Somiten I-III) bei einem HH-Stadium 14 Wachtelembryo (grün). (b)
Vorbereitung des Empfängers (Hühnchenembryo; orange, HH-Stadium 12): Entfernung von
2-3 dorsalen Somitenhälften in der prospektiven Halsregion. (c) Transfer des Transplantates
im Empfänger: die dorsalen Hälften der Hals-Somiten sind durch ventrale Somitenhälften der
Thoraxregion Hälften der Wachtel ersetzt.
(B) +(B’)
Skelettmuster des Operierten Hühnerembryos nach sechs Tagen
Reinkubationszeit. In Höhe des Transplantationsgebiet in der Halsregion ist ein zusätzliches
ovales Knorpelstück zu sehen, das keine gelenkige Verbindung mit der Wirbelsäule aufweist,
und als ektopischer Scapula-Körperabschnitt identifiziert wird (B). Auf der Kontrollseite ist
keine Veränderung festzustellen (B’).
(C)
Histologischer Transversalschnitt durch den in (B) mit einem roten Strich
gekennzeichneten ektopischen Knorpel. Immunhistochemische Doppelmarkierung der HuhnWachtel-Chimäre mit Anti-Desmin- (hellbraunes Farbsignal) und Anti-Wachtel-Antikörper
(blaues Farbsignal). Auf der operierten Seite ist der zusätzliche Knorpelabschnitt durch das
vorkommen der Zellkerne des Wachteltyps zu sehen (Orange Pfeile). Außer ein paar
zerstreute Wachtelkerne im Neuralrohr und im Wirbelkörper sind keine weiteren Zellen
dieses Typs vorhanden, als Hinweis darauf, dass keine Verbindung zwischen dem neu
gebildeten Scapula-Körperabschnitt und der Wirbelsäule besteht. Im Gegensatz zur operierten
Seite weist die nicht operierte Seite keine Veränderung auf.
(D)
Mit dem gleichen Operationsschema (A) wurden weitere Transplantationen
durchgeführt, aber mit Hühnchen als Spenderembryonen, zwecks der in situ-Hybridisierung
mit dem Hoxc-6-Gen. Die normale kraniale Expressionsgrenze dieses Gens kann in Höhe des
zerviko-thorakalen Überganges gesehen werden, beim Somiten 19/20. Dazu wird im
operierten Gebiet der Halsregion eine ektopische Hoxc-6-Genexpression festgestellt.
(E)
Transversalschnitt in Höhe der ektopischen Hoxc-6-Genexpression. Das
Transplantatsgewebe ist auf dem Dermomyotom der operierten Seite beschränkt orange
Pfeilspitzen). Die Gegenseite ist dabei unauffällig. (NR: Neuralrohr; Ek: Ektoderm; DM:
Dermomyotom; Skl: Sklerotom; CD: Chorda dorsalis)
44
Ergebnisse
4.2.2 Transplantation der dorsalen Somitenhälften in die Position der
ventralen Somitenhälften
Zur Klärung der Frage, ob die ektopischen Rippen, die nach der Rotation des paraxialen
Mesoderms entstehen tatsächlich dem aus der ursprünglich dorsalen Somitenhälfte
hervorgegangenen Sklerotom entstammen, wurden die ventralen Somitenhälften der
prospektiven Halsregion durch dorsale Somitenhälften der prospektiven Thoraxregion ersetzt.
Im ersten Schritt wurden bei Wachtelembryonen der HH-Stadien 14-15 die dorsalen
Somitenhälften der epithelialen Somitenstadien I-III oder II-IV der Somitenhöhen 20-22, bzw.
24-26 isoliert. Bei Hühnerwirtsembryonen wurden in der Halsregion ventrale Somitenhälften
entfernt und an ihrer Stelle wurden die isolierten dorsalen Somitenhälften der Wachtel
implantiert (Abb. 6A). Diese Operationen waren mit einer hohen Sterblichkeitsrate der
Embryonen behaftet, was darauf zurückzuführen ist, dass bei der Entfernung der ventralen
Somitenhälfte die darunter liegenden Blutgefäße leicht verletzt wurden. Nach einer
Wiederbebrütungszeit von 6 Tagen wurde das Skelettmuster bei vierzehn Wachtel-HühnerChimären analysiert. Im operierten Gebiet der Halsregion konnten bei sieben Embryonen
keine morphologische Veränderung festgestellt werden. Die immunhistologische Färbung der
Schnitte erbrachte auf der operierten Seite lediglich ein ungeordnetes, von Mesenchymzellen
gebildetes Gewebe. Bei den anderen sieben Embryonen konnten im operierten Gebiet Wirbel
mit der Morphologie von Thoraxwirbeln nachgewiesen werden. Ihre Wirbelkörper waren
größer und ihre Dornfortsätze waren nicht gegabelt. Bei sechs von diesen Chimären wurden
zusätzliche knorpelige Strukturen an den Wirbeln gefunden, die länglich waren und an
Rippen erinnerten (Abb. 6B und 6B’). Von diesem Bereich wurden Schnitte angefertigt und
mit einer Doppelmarkierung mit Anti-Desmin- und Anti-Wachtel-Antikörpern angefärbt. Ein
Teil des knorpeligen Wirbels bestand aus Zellkernen des Wachteltyps. Daneben war ein
weiteres Knorpelstück vorhanden, das ebenfalls aus den Wachtelzellkernen bestand. Diese
aus Wachtelgewebe aufgebauten zusätzlichen Knorpelstücke im operierten Gebiet wurden als
ektopische Rippen aufgefasst, die aus dem Transplantat hervorgegangen sind (Abb. 6C).
Bei einem Embryo wurde im operierten Bereich ein zusätzlicher Knorpelabschnitt beobachtet,
der keine Verbindung mit den Wirbeln aufwies. Die Doppelmarkierung der histologischen
Schnitte ließ einen direkt unter der Haut gelegenen Knorpel aus Wachtelzellen erkennen.
Dabei handelte sich möglicherweise um einen Scapulaabschnitt, der sich aus dem
Transplantat entwickelt hatte. Dies könnte durch die Komplexität der Operationen erklärt
werden. Es ist denkbar, dass das Transplantatgewebe so groß war, dass ein Teil davon die
dorsale Position erreicht und Signale für die Scapulabildung erhalten hatte.
Ergebnisse
45
Im zweiten Schritt wurde das gleiche Experiment an sechzehn weiteren Embryonen zwecks
Analyse des Expressionsmusters der Hox-Gene durchgeführt. Der dafür benutzte molekulare
Marker war das Hoxc-6-Gen. Hühnerembryonen wurden als Spender benutzt. Die operierten
Embryonen wurden 24 Stunden nach der Operation weiterbebrütet und für die in situHybridisierung mit der Hoxc-6-Sonde bearbeitet. Die kraniale Expressionsgrenze des Hoxc-6Gens war in Höhe der Somiten 19-20, wo sich der zerviko-thorakale Übergang befindet.
Zusätzlich wurde bei elf Embryonen eine ektopische Hoxc-6-Expression im operierten Gebiet
der Halsregion festgestellt (Abb. 6D). Von diesen Bereich wurden Vibratomschnitte
angefertigt. Die Expression des Hoxc-6-Gens war auf die ventrale Somitenhälfte der
operierten Seite beschränkt. Die nicht-operierte Seite war unauffällig (Abb. 6E).
(a)
(b)
(c)
A
B
B’
D
E
C
Abb. 6
46
Ergebnisse
Interspezifische Transplantation der dorsalen Somitenhälften in die Position der ventralen
Hälften
(A)
Mehrschritt-Operationsschema: (a) Herstellung des Transplantates durch
Entnahme von 2-3 dorsalen Somitenhälften (Somiten I-III) der prospektiven Thoraxregion
vom Wachtelembryo (hellblau, HH-Stadium 14-15). (b) Vorbereitung des Empfängers
(Hühnchen: grün, HH-Stadium 12) durch Resektion von 2-3 Hälften der ventralen Somiten
der prospektiven Halsregion und Transfer des Transplantatsgewebes. (c) Zustand nach der
Transplantation: die ventralen Hälften der Hals-Somiten sind durch dorsale Somitenhälften
der Wachtel ersetzt.
(B) +(B’)
Skelettmuster des Operierten Hühnerembryos nach sechs Tagen
Reinkubationszeit. In Höhe des Transplantationsgebiets in der Halsregion sind zusätzliche
Knorpelabschnitte zu sehen, die eine Verbindung mit der Wirbelsäule aufweisen, und als
ektopische Rippen identifiziert werden (B). Auf der Kontrollseite ist keine Veränderung
festzustellen (B’).
(C)
Histologischer Transversalschnitt durch den in (B) mit einem roten Strich
gekennzeichneten ektopischen Knorpel. Immunhistochemische Doppelmarkierung der HuhnWachtel-Chimäre mit Anti-Desmin- (hellbraunes Farbsignal) und Anti-Wachtel-Antikörper
(blaues Farbsignal). Auf der operierten Seite ist der zusätzliche Knorpelabschnitt durch das
vorkommen der Zellkerne des Wachteltyps zu sehen. Ein Teil des knorpeligen Wirbels
besteht aus diesem Zelltyp, als Hinweis darauf, dass eine Verbindung mit der Wirbelsäule
vorhanden ist. Daneben ist ein weiteres Knorpelstück, das ebenfalls aus Wachtelgewebe
besteht (Pfeilspitzen).
(D)
Mit dem gleichen Operationsschema (A) wurden weitere Transplantationen
durchgeführt, aber mit Hühnchen als Spenderembryonen, zwecks der in situ-Hybridisierung
mit dem Hoxc-6-Gen. Die normale kraniale Expressionsgrenze dieses Gens kann in Höhe des
zerviko-thorakalen Überganges gesehen werden, beim Somiten 19/20. Dazu wird im
operierten Gebiet der Halsregion eine ektopische Hoxc-6-Genexpression festgestellt.
(E)
Transversalschnitt in Höhe der ektopischen Hoxc-6-Genexpression. Das
Transplantatsgewebe ist auf dem Sklerotom der operierten Seite beschränkt. Die Gegenseite
ist dabei unauffällig. (NR: Neuralrohr; Ek: Ektoderm; DM: Dermomyotom; Skl: Sklerotom;
CD: Chorda dorsalis)
Zusammenfassung zur Operationsserie 4.2.
Bei den ersten Transplantationsserien wurden zunächst ventrale Somitenhälften an Stelle der
dorsalen Somitenhälfte in die Halsregion implantiert. Daraus entwickelte sich ein zusätzlicher
Scapulaabschnitt. Dann wurden dorsale Somitenhälften an Stelle der ventralen Somitenhälften
in die Halsregion implantiert. Daraus entwickelten sich ektopische Rippen.
Die Analyse des Expressionsmusters des Hoxc-6-Gens anhand der in situ-Hybridisierung und
der Transversalschnitte ließ bei der Transplantation ventraler Somitenhälften in eine dorsale
Position eine ektopische Hoxc-6-Genexpression erkennen, die auf das Dermomyotom
47
Ergebnisse
beschränkt war. Bei der Transplantation dorsaler Somitenhälften nach ventral wurde eine auf
das Sklerotom beschränkte Hoxc-6-Genexpression im operierten Gebiet festgestellt.
4.3 Analyse des Hox-Genexpressionsmusters
4.3.1 Hox-Genexpressionsmuster der Somiten
Um das normale Expressionsmuster der Hox-Gene bei Hühnerembryonen zu untersuchen,
wurden bei Hühnerembryonen der HH-Stadien 14-16 in situ-Hybridisierungen mit der Hoxc6-Sonde durchgeführt (Abb. 7A und 7A’). Deren kraniale Expressionsgrenze liegt am
zerviko-thorakalen Übergang der Somiten 19/20 (Burke et al., 1995).
Die Analyse des ganzen Embryos nach der in situ-Hybridisierung liefert zwar Informationen
darüber, ab welcher Höhe des paraxialen Mesoderms die Hoxc-6-Expression anfängt, und wie
sie sich von kranial nach kaudal fortsetzt. Doch sie erlaubt keine Rückschlüsse auf die Hoxc6-Genexpression in den beiden Somitenhälften. Deswegen wurden Vibratomschnitte der
hybridisierten Embryonen in der Transversalebene angefertigt, um das Expressionsmuster der
Hox-Gene der dorsalen und der den ventralen Somitenhälften zuordnen zu können.
Im noch nicht segmentierten paraxialen Mesoderm war die Hoxc-6-Genexpression auf einen
Teil des lateralen Mesoderms und das intermediäre Mesoderm beschränkt. Es war keine
Expression im paraxialen Mesoderm zu sehen (Abb. 7B).
In Höhe des Somiten -I wurde ein langsamer Übergang der Hox-Genexpression in Richtung
auf das paraxiale Mesoderm beobachtet. Diese Expression schien sich aber nur auf die dorsale
Hälfte zu beschränken (Abb. 7C). Sie bestand jedoch weiterhin im intermediären und
lateralen Mesoderm.
Bei den ersten epithelialen Somiten, den Somiten I-III wurde festgestellt, dass sich diese
Expression auf die dorsale Somitenhälfte fortgesetzt hatte (Abb. 7D). Weitere Strukturen
waren von dieser Expression nicht erfasst, außer der schon bestehenden Expression im
intermediären und lateralen Mesoderm.
In Höhe der Somiten IV bis VI (Abb. 7E und 7F), schritt die Hoxc-6-Genexpression in die
ventrale Somitenhälfte fort. Sie schien jedoch im Dermomyotom stärker als im Sklerotom
ausgeprägt zu sein.
Ab dem Somiten VII und weiter kranial hatte die Hoxc-6-Genexpression den ganzen Somiten
sowie das Neuralrohr erfasst, wobei sie im Sklerotom stärker als im Dermomyotom
ausgeprägt zu sein schien (Abb. 7G).
Ergebnisse
48
Es wird eine dynamische Expression des Hoxc-6-Gens angenommen, die im lateralen und
intermediären Mesoderm beginnt, sich zuerst in die dorsale Somitenhälfte fortsetzt und
ausprägt, bevor sie die ventrale Somitenhälfte ergreift. Wenn der ganze Somit erfasst ist,
entsteht der Eindruck der Herunterregulierung dieser Hox-Genexpression im Dermomyotom,
wobei sie im Sklerotom stärker wird.
G
F
E
D
C
B
A
A’
B
C
D
E
F
G
Abb.7
49
Ergebnisse
Analyse des Hox-Genexpressionsmusters der Somiten
(A) und (A’) Hoxc-6-Genexpression bei Hühnerembryonen. Normale Expression des Hoxc6-Gens bei einem HH-Stadium 14 (A) und bei einem HH-Stadium 15 (A') alten Embryo. Die
kraniale Expressionsgrenze befindet sich in Höhe des 19.-20. Somiten. Von dieser
Expressionshöhe werden Transversalschnitte angefertigt (durch Striche gekennzeichnet).
(B)
Schnitt durch die Segmentplatte: die Hoxc-6-Genexpression beginnt im
intermediären und lateralen Mesoderm.
(C)
Schnitt durch die epithelialen Somiten I-III: Langsames Fortschreiten der
Expression in Richtung des paraxialen Mesoderms. Diese Expression ist aber nur auf die
dorsale Somitenhälfte beschränkt (D).
(E) - (G)
Schnitt durch ältere Somiten (Somiten IV-VIII): Langsam wird das Sklerotom
von der Hoxc-6-Genexpression erfasst. Diese Expression ist aber zuerst im Dermomyotom
stärker als im Sklerotom (E), dann ist die Verteilung gleichmäßig (F). Bei den noch älteren
Somiten scheint sich die Expression im Dermomyotom abzuschwächen, während sie im
Sklerotom verstärkt wird (G).
4.3.2 Echtzeit-PCR:
Die Frage, ob die Hox-Genexpression in der ventralen und in der dorsalen Somitenhälfte
unterschiedlich stark ist, wurde durch die Echtzeit-PCR untersucht. Dabei wurde die
Expression von den Hoxa-6-, Hoxb7- und Hoxa-8-Genen quantitativ bestimmt. Für manche
dieser Gene wurden verschiedene Primersequenzen benutzt.
Bei Hühnerembryonen in den HH-Stadien 13-15 wurden die ventralen Somitenhälften und die
dorsalen Somitenhälften isoliert und fixiert (Abb. 8A und 8B). Mindestens 0,5 µg RNA waren
für die Durchführung dieses Experimentes notwendig. Für die ventralen Hälften wurden 23
Embryonen verwendet. Daraus wurden 1,1µg/25µl RNA gewonnen. Für die dorsalen Hälften
wurden 25 Embryonen benutzt und die RNA-Menge betrug 1,2µg/25µl. Die Auswertung der
Ergebnisse geschah mittels eines dafür spezialisierten Computer-Programms, das die
Ergebnisse als Zyklenzahlen und Schmelzkurven angab. Wegen des zu stark abweichenden
Ergebnisses der Hoxb-7.03-Primersequenz, wurden die daraus gewonnenen Werte in der
Endauswertung nicht berücksichtigt. Ansonsten wurde der Mittelwert aus den Zyklenzahlen
der verschiedenen Primersequenzen eines Gens errechnet, und es erfolgte ein Vergleich mit
dem Kontrollgen. Die Tabelle 1 im Anhang zeigt die Ergebnisse.
50
Ergebnisse
Beim Hoxa-6-Gen, dessen kraniale Expressionsgrenze in Höhe des 15. Somiten liegt (Burke
et al., 1995), lagen die Schmelzkurven der dorsalen und ventralen Somitenhälften beieinander
(Abb. 8C). Die beiden Hälften verbrauchten ungefähr die gleiche Zahl an Zyklen. Nach dem
Vergleich des Gens in diesen Hälften mit dem Kontrollgen wurde ein Verhältnis von dorsal
zu ventral von knapp 1:1 errechnet; die Hoxa-6-Genexpression in den dorsalen Hälften war
im Vergleich zu der in der ventralen Hälfte nur leicht erhöht (s. Tab. 1). Somit war eine fast
gleiche Hoxa-6-Genexpression dorsal und ventral festzustellen.
Für die Hoxb-7-Expression lagen die Schmelzkurven der dorsalen Somitenhälften vor der der
ventralen Hälften, d.h., dass die ventralen Somitenhälften mehr Zyklen verbrauchten als die
dorsalen Hälften (Abb. 8D). Nach dem Vergleich mit dem Kontroll-Gen betrug das Verhältnis
dorsal:ventral von 2,3:1 im Mittelwert (s. Tab. 1). Somit war die Hoxb-7-Expression dorsal
quantitativ zwei mal stärker als ventral. Bei diesen Genen liegt die kraniale
Expressionsgrenze bei Hühnerembryonen noch nicht fest. Es kann jedoch aufgrund der
kolinearen Expression der Hox-Gene eine kraniale Expressionsgrenze angenommen werden,
die im Vergleich zu der kranialen Hoxc-6-Expressionsgrenze weiter kaudal liegt.
Für das Hoxa-8-Gen, dessen kraniale Expressionsgrenze in Höhe der Somiten 22/23 liegt
(Burke et al., 1995), lag die Schmelzkurve der dorsalen Somitenhälften deutlich vor der der
ventralen Hälften; d.h., dass auch hier die ventralen Hälften mehr Zyklen verbrauchten als die
dorsalen Somitenhälften (Abb. 8E). Der Vergleich mit dem Kontrollgen ergab im Mittelwert
ein Verhältnis von knapp 3:1 zugunsten der dorsalen Somitenhälften (s. Tab. 1). Die
Expression der Hoxa-8-Gene war dorsal dreimal stärker als ventral.
Ergebnisse
51
A
B
Rn vs Zyklenzahlen
100
D
Hoxa-6
10
V
R
n
1
C
0,1
D
Hoxb-7
V
D
D
Hoxa-8
V
E
Abb.8
Zyklenzahlen
52
Ergebnisse
Quantitative Analyse der Hox-Genexpression in den Somitenhälften
(A) + (B) Isolierung des Somitenmaterials: Isolierung der dorsalen (A) Hälften der 19.- 26.
Somiten in HH-Stadien 13-15 bei Hühnchen (hellgrün) nach Ektodermentfernung. (B) bei
gleichaltrigen Hühnerembryonen wurden nach Entodermentfernung die ventralen
Somitenhälften aus der gleichen Höhen isoliert (lila).
(C) – (E) Schmelzkurven der Hox-Genexpressionen der dorsalen und ventralen
Somitenhälften nach der Echtzeit-PCR. Die Y-Achse gibt das logarithmische Wachstum der
Amplifikate an, während die X-Achse die Zyklenzahlen angibt, die für die beiden
Somitenhälften verbraucht wurden. Die grünen Kurven repräsentieren die dorsalen
Somitenhälften, und die Kurven mit der lila Farbe die ventralen Hälften.
(C) Schmelzkurven der Hoxa-6-Genexpression: Die dorsalen und ventralen Hälften liegen
nahezu in gleicher Höhe und es besteht keinen nennenswerten Unterschied in den
Zyklenzahlen.
(D) Schmelzkurven für die Hoxb-7-Genexpression: Die Kurve der dorsalen Somitenhälften
liegt hinter der der ventralen Hälften. Die dorsalen Hälften verbrauchen auch weniger
Zyklenzahlen als die ventralen. Dies ist ein Hinweis darauf, dass die Hoxb-7-Genexpression
stärker in der dorsalen Somitenhälften als in den ventralen ist.
(E) Schmelzkurven der Hoxa-8-Genexpression: Die Kurve der dorsalen Somitenhälften liegt
auch hinter der der ventralen Hälften. Die verbrauchten Zyklenzahlen sind weniger in den
dorsalen Hälften als in den ventralen. Auch hier ist die Hoxa-8-Genexpression stärker in den
dorsalen als in den ventralen Somitenhälften.
Datenauswertung der Echtzeit-PCR
Nach der PCR-Theorie ist die Gesamtmenge eines Amplifikates in Abhängigkeit von den
PCR-Zyklen n gegeben durch
X n = X 0 ⋅ (1 + E X )
(1),
Wobei Ex für die Effizienz der PCR steht. Unter Voraussetzung optimal gewählter Primer
(Amplifikate < 150 bp) darf Ex mit 1 angenommen werden. Gleichung 1 vereinfacht sich
damit zu
X n = X 0 ⋅ 2n
(2)
Sie gilt für jedes Amplifikat, also auch für die interne Referenz R: Rn = R0 ≅ 2n. Ersetzt man
in Gleichung (2) n durch CT, so ergibt sich die zum Zeitpunkt CT erreichte Menge an
Amplifikat XT durch
C
X T = X 0 ⋅ 2 T,X .
(3)
Das selbe gilt für die interne Referenz RT:
C
RT = R0 ⋅ 2 T , 60 S
(4)
Um das Verhältnis von Ziel-Gen zu interner Referenz zu bestimmen, teilt man XT durch RT
und erhält:
X
X
XT
C
−C
∆C
= 0 ⋅ 2 T , X T , 60 S = 0 ⋅ 2 T , x
RT
R0
R0
(5)
Da das Ausgangsverhältnis X0/R0 interessiert, wird Gleichung 5 nach X0/R0 zu
Ergebnisse
53
X 0 X T − ∆CT , x
=
⋅2
R0
RT
(6)
aufgelöst. X0/R0 gibt nun für die jeweilige cDNA die Menge des Ziel-Gens gegenüber der
internen Referenz an. Da aber die Mengenverhältnisse gegenüber der unbehandelten KontrollProbe (dem Kalibrator) interessieren, wird X0/R0 der Probe am Ende durch den
korrespondierenden X0/R0-Wert des Kalibrators geteilt. Es ergibt sich:
 X0 

 x
− ∆CT , x
 R0  = 2
= 2 −∆∆CT
− ∆CT , cal
 X0 
2

cal
 R0 
(7)
Wobei gilt:
∆∆CT = ∆CT , x − ∆CT ,cal
(8)
Die Zielgröße gibt an, um das wie vielfache das Ziel-Gen in der interessierenden Probe
gegenüber der 2 − ∆∆C Kontrolle verändert ist. Sie liefert den Steigerungsfaktor (relative
Expression gegenüber der unbehandelten Kontrolle).
T
∆C ventral = C ventral − C Re ferenz
∆C dorsal = C dorsal − C Re ferenz
1
Hoxa-6- 5,725
02
2
5,805
3
6,175
4
5,965
1
5,745
2
5,695
3
5,805
4
5,715
Hoxa-6- 4,495
03
Hoxb-7- 7,135
01
Hoxb-7- 7,145
02
9,885
4,265
4,375
4,455
4,125
4,155
4,085
3,985
7,425
7,045
7,105
5,905
5,955
5,775
5,885
7,185
7,095
7,015
6,005
6,225
5,855
6,015
9,865
10,425
10,395
8,765
8,745
8,675
8,635
Hoxa-8
16,605
16,385
60S
Differenz der Expression zwischen den dorsalen und den ventralen Hälften anhand der
Zyklenzahlen: ))C
∆∆CT = ∆C dorsal − ∆C ventral
1
2
3
4
Hoxa-6-02
-0,02
-0,11
-0,37
-0,25
Hoxa-6-03
-0,37
-0,11
-0,29
-0,47
Hoxb-7-01
-1,23
-1,47
-1,27
-1,22
Hoxb-7-02
-1,14
-0,96
-1,24
-1,0
-1,12
-1,12
-1,75
-1,76
Hoxa-8
Ergebnisse
54
Tab. 1:
Berechnung des dorso-ventralen Verhältnisses
Gene
dorsal/ventral-Verhältnis 2n
Mittelwert
n=- ∆∆CT
Hoxa-6-02
1
1,08
1,29
1,19
Hoxa-6-03
1,29
1,08
1,22
1,39
Hoxb-7-01
2,35
2,77
2,41
2,33
Hoxb-7-02
2,2
1,95
2,36
2
2,29625
2,17
2,17
3,36
3,39
2,7725
Hoxa-8
60S
Standardabweichung
1,1925
16,605
0,73597769
Zusammenfassung zum Abschnitt 4.3.
Mit diesen Untersuchungen sollte das Verhalten der Hox-Genexpression in der ventralen und
in der dorsalen Somitenhälfte analysiert werden. Die Analyse der Transversalschnitte nach
der in situ-Hybridisierung des Embryos ergab den Beginn der Hoxc-6-Genexpression im
intermediären und lateralen Mesoderm. Diese Expression setzt sich dann in die dorsale
Somitenhälfte fort. Viel später ergreift sie die ventrale Somitenhälfte. Danach entsteht der
Eindruck der Herrunterregulierung dieser Expression in der dorsalen Somitenhälfte. Bei der
quantitativen Bestimmung dieser Expression mittels der Echtzeit-PCR wurde festgestellt, dass
die Hox-Genexpression in der dorsalen Somitenhälfte stärker als in der ventralen Hälfte ist, je
weiter kaudal die kraniale Expressionsgrenze liegt.
55
Diskussion
5 Diskussion
Die Segmentidentität stellt die spezifische Information dar, die in jedem Segment enthalten
ist. Es entwickelt sich z.B. aus dem ersten Halssegment ein Wirbel, der Atlas, der keinen
Wirbelkörper besitzt. Aus den Brustsegmenten gehen Wirbel hervor, die mit Rippen versehen
sind, während die Segmente der lumbalen Region Wirbel mit einer anderen Morphologie
entstehen lassen. Die Segmentidentität verleiht jedem Segment die Fähigkeit, sich als Skelett-,
Muskel- oder Hautanlage zu entwickeln. Sie trägt zur segmentspezifischen Musterbildung der
Wirbel und Rippen (Kieny et al., 1972; Jacob et al., 1975), der Dermis der Rückenhaut
(Mauger, 1972), der Muskeln (Murakami und Nakamura, 1991; Nikovits et al., 2001; Alvares
et al., 2003) und der Scapula (Huang et al., 2000a; Ehehalt et al., 2004) bei.
In der vorliegenden Arbeit wurde der Frage nachgegangen, ob alle Zellen des epithelialen
Somiten identische Informationen zur Segmentidentität besitzen. Dafür wurde die
Musterbildung des embryonalen Skelettes nach Rotation von Segmentplattenabschnitten
sowie nach Transplantation von dorsalen Somitenhälften in die ventrale Position und vice
versa untersucht. In dieser Untersuchung dienten die Scapula und Rippen als Marker der
Segmentidentität von dorsalen und ventralen Somitenkompartimenten der Thoraxregion.
Weiterhin wurde das Expressionsmuster der Hox-Gene, die die Informationen zur
Segmentidentität der Somiten übersetzen, in den Somiten analysiert. Die Ergebnisse werden
in den folgenden Abschnitten diskutiert.
5.1 Musterbildung nach Rotation der Segmentplattenabschnitte und der
epithelialen Somiten
5.1.1 Segmentidentität des dorsalen und ventralen Somitenkompartiments
Die Ergebnisse der ersten Operationsserie zeigten, dass sich ektopische Rippen sowie
ektopische Scapulakörperabschnitte aus den Segmentplattenabschnitten und den epithelialen
Somiten entwickelten, die aus der prospektiven Thoraxregion in die Halsregion transplantiert
worden waren. Diese Transplantate haben, wie schon Kieny et al. (1972), Jacob et al. (1975)
und Ehehalt et al. (2004) beobachteten, die Segmentidentität ihrer Herkunftsregion, der
Thoraxregion, beibehalten. Die Unterschiede zwischen den hier vorgelegten Experimenten
und denen von Kieny et al. (1972) und Jacob et al. (1975) bestehen darin, dass hier die
Segmentplattenabschnitte und die epithelialen Somiten bei der Transplantation um 180° um
ihre Längsachse rotiert wurden. Danach lagen die ursprünglich ventralen Somitenhälften in
Diskussion
56
der Position der dorsalen Somitenhälften, während die ursprünglich dorsalen Somitenhälften
in die Position der ventralen Somitenhälften zu liegen kamen. Durch die Rotation wurde die
Segmentidentität
gekennzeichnet
des
ist,
ventralen
und
die
Somitenkompartiments,
des
dorsalen
die
durch
Rippenbildung
Somitenkompartiments,
die
durch
Scapulakörperbildung charakterisiert ist, nicht verändert.
Nach dorso-ventraler Rotation der epithelialen Somiten um die Längsachse gingen aus der
ursprünglich ventralen Somitenhälfte ein Dermomyotom und aus der ursprünglich dorsalen
Somitenhälfte ein Sklerotom hervor (Aoyama und Asamoto, 1988; Christ et al., 1992). In den
hier
vorgestellten
Untersuchungen
entwickeln
sich
nach
Rotation
der
Segmentplattenabschnitte sowie der epithelialen Somiten die ursprünglich ventralen
Segmentplatten- und Somitenhälften in der dorsalen Position zu Dermomyotomen und die
ursprünglich dorsalen Hälften in der ventralen Position zu Sklerotomen. Aus diesen
„sekundären“ Sklerotomen haben sich die ektopischen Rippen in der Halsregion entwickelt,
während der zusätzliche Scapula-Körperabschnitt aus den neu entstandenen Dermomyotomen
hervorgegangen ist.
Unsere Ergebnisse deuten darauf hin, dass Zellen der ventralen Segmentplatten- sowie
Somitenhälften den Scapula-Körper bilden können, wenn diese Zellen durch experimentelle
Rotation in die dorsale Position gelangen und damit Scapula-bildende Signale bekommen.
Zellen der ventralen Segmentplatten- sowie Somitenhälften müssen daher die genetischen
Informationen besitzen, die ihnen die Fähigkeit zur Scapulabildung verleihen. Diese
Informationen sind segmentspezifisch (Ehehalt et al., 2004). Weiterhin zeigen unsere
Ergebnisse, dass Zellen der dorsalen Segmentplatten- sowie Somitenhälften, die in eine
ventrale Position zu liegen kommen, durch ventrale Signale zu Sklerotomzellen transformiert
werden und Rippen bilden können. Diese Befunde lassen den Schluss zu, dass die dorsalen
Segmentplatten- und Somitenhälften der prospektiven Thoraxregion die segmentspezifischen
Informationen
besitzen,
die die Sklerotomzellen
bei
der Rippenbildung steuern.
Zusammenfassend kann daraus abgeleitet werden, dass die dorsalen Segmentplatten- und
Somitenhälften dieselben Informationen zur Segmentidentität wie die ventralen Hälften
besitzen, und vice versa. Das bedeutet, dass die dorsalen und ventralen Segmentplatten- und
Somitenhälften eine identische Segmentidentität haben.
Diskussion
57
5.1.2 Segmentidentität des medialen und lateralen Kompartiments
Die medio-laterale Polarität der Somiten wird durch antagonistische Einflüsse der
Axialstrukturen und des lateralen Mesoderms hergestellt. Die Signalmoleküle Sonic hedgehog
und Noggin aus der Chorda dorsalis und der Bodenplatte wirken medialisierend auf die
Somiten und sind für die Initiierung und die Aufrechterhaltung des Sklerotoms, sowie für die
Bildung des proximalen Rippenanteils verantwortlich (Smith und Harland, 1992; Pourquié et
al., 1993; Brand-Saberi et al., 1993; Fan und Tessier-Lavigne, 1994). Demgegenüber bewirkt
das BMP4- Signalmolekül (Pourquié et al., 1995; 1996; Review: Hirsinger et al., 2000) vom
lateralen Mesoderm her eine Lateralisierung der Somiten und spielt eine Rolle bei der
Entstehung des distalen Rippenanteiles (Sudo et al., 2001).
Nach dorso-ventraler Rotation um die Längsachse kamen der ursprünglich mediale
Segmentplattenabschnitt in die Position des lateralen Segmentplattenabschnitts und der
ursprünglich
laterale
Segmentplattenabschnitt
in
die
Position
des
medialen
Segmentplattenabschnitts zu liegen. Der nach medial verlagerte laterale Abschnitt der
Segmentplatte bildete eine mediale Somitenhälfte, die dann durch umgebende Signale zum
medialen Dermomyotom- und Sklerotomabschnitt kompartimentiert wurde. Ebenso
entwickelten sich aus dem nach lateral verlagerten medialen Segmentplattenabschnitt ein
lateraler Dermomyotom- und Sklerotomabschnitt. Diese Ergebnisse stimmen mit den
Befunden von Ordahl und Le Douarin (1992) überein, bei denen sich eine laterale
Somitenhälfte aus der ursprünglich medialen Somitenhälfte entwickelte, wenn diese in eine
laterale Position zu liegen kam, und vice versa. In unseren Untersuchungen entwickelten sich
die
Wirbel
und
der
proximale
Anteil
der
ektopischen
Rippen
aus
medialen
Sklerotomabschnitten, die in der Segmentplatte ursprünglich lateral gelegen waren. Der
distale Abschnitt der Rippen ging aus dem lateralen Sklerotomabschnitt hervor, der den
ursprünglich medialen Segmentplattenabschnitt darstellte.
Unsere Ergebnisse deuten darauf hin, dass der mediale Segmentplattenabschnitt dieselbe
Segmentidentität wie der laterale Abschnitt besitzt. Dies bedeutet, dass Zellen des medialen
Segmentplattenabschnittes auch distale Rippenanteile bilden können, wenn sie durch die für
die distalen Rippen spezifischen Signale induziert werden. Danach müssen die Zellen des
lateralen Segmentplattenabschnittes die identische Informationen zur Segmentidentität
besitzen wie die des medialen Abschnittes.
Diskussion
58
Der Scapula-Körper entwickelt sich aus dem hypaxialen (lateralen) Dermomyotom (nicht
publizierte Ergebnisse, Ruijin Huang, Freiburg). Nach medio-lateraler Umlagerung des
Segmentplattenabschnittes lag der ektopische Scapula-Abschnitt immer noch in der
hypaxialen Domäne des paraxialen Mesoderms. Daher kann sich dieser Abschnitt lediglich
aus dem lateralen Dermomyotom entwickelt haben, das aus dem ursprünglich medialen
Segmentplattenabschnitt hervorgegangen ist. Das bedeutet, dass Zellen des medialen
Segmentplattenabschnitts auch hypaxiale Derivate bilden können, wenn der Zellverband nach
lateral verlagert wird, und so den für die hypaxiale Domäne spezifischen Signalen angesetzt
wird.
Zusammenfassend
kann
festgestellt
werden,
dass
lateraler
und
medialer
Segmentplattenabschnitt identische Informationen zur Segmentidentität besitzen.
5.2 Musterbildung nach Transplantationen der dorsalen und ventralen
Somitenhälften
In der zweiten Experimentserie wurden interspezifische Transplantationen der dorsalen und
ventralen Somitenhälften zwischen Wachtel und Hühnchen durchgeführt.
5.2.1 Segmentidentität der in die Position der dorsalen Somitenhälften
verlagerten ventralen Somitenhälften
Die ursprünglich ventralen Somitenhälften der prospektiven Thoraxregion wurden in die
Position der dorsalen Somitenhälften der prospektiven Halsregion implantiert. Daraus
entwickelte sich ein ektopischer Scapula-Körperabschnitt. Da die epithelialen Somiten im
Hinblick auf die dorso-ventrale Differenzierung noch plastisch sind (Aoyama und Asamoto,
1988; Christ et al., 1992), kann angenommen werden, dass diese ursprünglich ventralen
Somitenhälften, die dorsal zu liegen kamen, durch Signale aus den umgebenden Strukturen zu
Dermomyotomen umgestimmt wurden. Zu diesen Signalen gehören die Wnt-Proteine aus
dem Neuralrohr und dem Oberflächenektoderm (Fan und Tessier-Lavigne, 1994; Marcelle et
al., 1997; Sosic et al., 1998; Ikeya und Takada, 1998; Schmidt et al., 1998; Amthor et al.,
1999). Die Scapula bildete sich aus den Dermomyotomen unter der Kontrolle von
ektodermalen Signalen (Ehehalt et al., 2004). Da sich auch ein Scapula-Körperabschnitt aus
dieser ursprünglich ventralen Somitenhälfte entwickelte, kann der Schluss gezogen werden,
dass die Scapula-bildenden segmentspezifischen Informationen in diesem Dermomyotom
vorhanden sind.
Diskussion
59
Unsere Ergebnisse deuten darauf hin, dass die ventralen Somitenhälften dieselbe
Segmentidentität wie die dorsalen Hälften aufweisen. Sie sind auch in der Lage, den ScapulaKörper zu bilden, wenn sie in eine dorsale Position verlagert werden.
5.2.2 Segmentidentität der in die Position der ventralen Somitenhälften
verlagerten dorsalen Somitenhälften
Die ursprünglich dorsalen Somitenhälften der prospektiven Thoraxregion wurden in die
Position der ventralen Somitenhälften der Halsregion implantiert. Daraus entwickelten sich
Wirbel thorakaler Identität mit ektopischen Rippen. In der ventralen Position wurden die
ursprünglich dorsalen Zellen durch die Signalmoleküle Noggin und Sonic hedgehog aus der
Bodenplatte und der Chorda dorsalis zum Sklerotom induziert (Fan und Tessier-Lavigne,
1994). Eine Hälfte der Wirbelkörper im Transplantationsgebiet bestand aus Zellen des
Wachteltyps. Dies ist der Beleg dafür, dass sich aus den Sklerotomen, die aus der
ursprünglich dorsalen Somitenhälfte hervorgegangen sind, Wirbelkörper entwickelt haben.
Des Weiteren sind aus diesen Sklerotomen ektopische Rippen entstanden.
Aus diesen Beobachtungen kann der Schluss gezogen werden, dass die dorsalen
Somitenhälften dieselbe Segmentidentität wie die ventralen Somitenhälften besitzen. Diese
Informationen verleihen ihnen die Fähigkeit, sich als segmentspezifische Sklerotomderivate
zu entwickeln, wenn sie sich in einer ventralen Position befinden.
Zusammenfassend kann festgehalten werden, dass die dorsalen und ventralen Somitenhälften
identische Informationen zur Segmentidentität besitzen. Je nachdem, wo sich die Zellen
befinden, entwickeln sie sich unter dem Einfluss der aus der Umgebung stammenden Signale
zu
Sklerotom-
oder
zu
Dermomyotomderivaten.
Durch
Zusammenwirken
von
segmentspezifischen Informationen und induktiven Signalen aus den umgebenden Strukturen
werden Zellen, die sich in den dorsalen und den ventralen Somitenhälften befinden, zu
Scapula- oder Rippenvorläuferzellen determiniert, die sich dann zu Knorpelzellen der Scapula
oder der Rippen differenzieren.
60
Diskussion
5.3 Hox-Genexpression der Somitenhälften
Die segmentspezifische Entwicklung der Somitenzellen wird durch die Hox-Genexpression
kontrolliert (Kessel und Gruss, 1991). In der vorliegenden Arbeit wurde die Hoxc-6Genexpression, deren kraniale Expressionsgrenze sich am zerviko-thorakalen Übergang bei
den Somiten 19-20 (Burke et al., 1995) befindet, in normalen und operierten Embryonen
analysiert.
5.3.1 Analyse der Hox-Genexpression in den Somiten
5.3.1.1 Analyse der Hoxc-6-Genexpression in den Somiten mittels der in situ-Hybridisierung
Aus unseren Ergebnissen geht hervor, dass im Bereich der Segmentplatte in Höhe der
späteren Thoraxregion die Hoxc-6-Expression auf das intermediäre und das laterale
Mesoderm beschränkt blieb. Diese Ergebnisse stimmen mit der Beobachtung von Dubrulle et
al. (2001) überein, dass die Hox-Genexpression im paraxialen Mesoderm erst nach Bildung
der Somiten aktiviert wird. Während der Somitenbildung werden die Hox-Gene in
Abhängigkeit vom Notch-Delta-Signalweg und von der Segmentierungsuhr in der
Segmentplatte zyklisch exprimiert. Der FGF-8-Wachstumsfaktor, der in der kaudalen
Segmentplatte gebildet wird, wirkt bei der Festlegung der Somitengrenzen mit (Zákány et al.,
2001; Dubrulle et al., 2001).
Da die Ergebnisse der Transplantationsserien gezeigt haben, dass die dorsalen und ventralen
Somitenhälften identische Informationen zur Segmentidentität besitzen, stellte sich die Frage,
ob die Hox-Gene die gleiche Expressionsstärke in allen Abschnitten eines epithelialen
Somiten aufweisen.
Die Hoxc-6-Genexpression beginnt zunächst in der dorsalen Hälfte der epithelialen (jüngeren)
Somiten (Somiten I-III). Sie setzt sich erst bei älteren Somiten (Somiten IV-VI) in Richtung
der ventralen Hälfte fort. In Höhe von Somiten VII und VIII nimmt diese Expression im
Dermomyotom ab, während sie im Sklerotom verstärkt wird. In medio-lateraler Richtung
schreitet die Expression von lateral nach medial fort. Die Analyse des normalen HoxExpressionsmusters ist ein erster Beleg dafür, dass das Hoxc-6-Gen zwar in allen Abschnitten
der Somiten exprimiert wird, die Expression jedoch in einer zeitlichen und räumlichen
Abfolge in den verschiedenen Abschnitten erfolgt.
Diskussion
61
5.3.1.2 Quantitative Analyse des Hox-Genexpressionsmusters in den dorsalen und ventralen
Somitenhälften
Die Unterschiede in der Hox-Genexpression zwischen der dorsalen und der ventralen
Somitenhälfte wurden weiter durch die Echtzeit-PCR quantitativ belegt. Zu diesem Zweck
wurden die dorsalen und ventralen Hälften des 19. bis zum 26. Somiten (Somiten I-VIII)
isoliert. Bei Zellen dieser Somiten wurden die Expressionen von Hoxa-8, Hoxb-7, und Hoxa6 analysiert. Der quantitative Vergleich der Expression dieser Hox-Gene in den dorsalen und
ventralen Somitenhälften erfolgte durch die Analyse der Schmelzkurven und der
Zyklenzahlen beider Hälften und wurde durch die Berechnung des dorso-ventralen
Verhältnisses belegt. Dabei wurden unterschiedliche Ergebnisse der Expression in beiden
Hälften festgestellt, die in den folgenden Abschnitten diskutiert werden.
Für die Hoxa-8-Genexpression lagen die Schmelzkurven der dorsalen Somitenhälften hinter
denen der ventralen Somitenhälften; d.h., dass die dorsalen Hälften weniger Zyklen als die
ventralen verbrauchten. Das Verhältnis von dorsal zu ventral betrug 3:1. Die Expression des
Hoxa-8-Gens war daher in der dorsalen Somitenhälfte viel stärker als in der ventralen
Somitenhälfte. Da die Somitenhälften aus den HH-Stadien 13-15 isoliert wurden und sich die
kraniale Hoxa-8-Genexpressionsgrenze bei den Somiten 22/23 befindet, wurden nur die
jüngsten, noch nicht-kompartimentierten Somiten (Somiten I-III) von der Hoxa-8Genexpression erfasst. Diese epithelialen Somiten (Somiten I-III) exprimieren dieses HoxGen stärker in der dorsalen als in der ventralen Somitenhälfte. In Korrelation mit den
Transversalschnitten nach der in situ-Hybridisierung kann geschlossen werden, dass die HoxGene vor der Somitenkompartimentierung hauptsächlich in der dorsalen Somitenhälfte
exprimiert werden.
Die Schmelzkurven der dorsalen Somitenhälften lagen auch bei der Hoxb-7-Genexpression
hinter denen der ventralen Somitenhälften; das Verhältnis dorsal zu ventral betrug jedoch nur
noch 2:1. Für dieses Gen ist die kraniale Expressionsgrenze noch nicht festgelegt; aufgrund
der Kolinearitätseigenschaft der Hox-Gene (Duboule und Dollé, 1989; Graham et al., 1989)
wird jedoch angenommen, dass sich die kraniale Expressionsgrenze des Hoxb-7-Gens
zwischen den kranialen Expressionsgrenzen der Hox6- und Hox8- Gene befindet. Daher
waren die Hoxb-7 exprimierenden Somiten zum Teil noch nicht kompartimentiert (Somiten IIII = jüngere Somiten), zum Teil kompartimentiert (ab Somit IV = ältere Somiten). Die
Anzahl
der
nicht-kompartimentierten
Somiten
ist
jedoch
größer
als
die
der
62
Diskussion
kompartimentierten Somiten. Aus den Ergebnissen der in situ-Hybridisierung geht hervor,
dass sich die Expressionsstärken der dorsalen Somitenhälften der der ventralen
Somitenhälften annähern, je älter die Somiten sind (ab Somit IV). Deshalb betrug bei den
Hoxb-7-Gensequenzen das Verhältnis dorsal zu ventral nur noch 2:1, im Vergleich zu 3:1
beim Hoxa-8-Gen.
Die Schmelzkurven der dorsalen und ventralen Somitenhälften lagen für das Hoxa-6-Gen
ziemlich dicht beieinander. Der Vergleich der Zyklenzahlen dieses Gens ergab nahezu ein
Verhältnis von 1:1 zwischen den dorsalen und ventralen Somitenhälften. Dieses Verhältnis
lässt sich dadurch erklären, dass alle isolierten Somiten das Hoxa-6 exprimieren, dessen
kraniale Expressionsgrenze in Höhe des 15. Somiten liegt (Nowicki und Burke, 2000). Unter
diesen Somiten sind sowohl jüngere (Somiten I-III) als auch ältere Somiten (Somiten IV-VIII)
vorhanden. Bei den älteren (kompartimentierten) Somiten wird das Hoxa-6-Gen nach den
Befunden der in situ-Hybridisierung, stark im Sklerotom und schwach im Dermomyotom
exprimiert, wie in der Abbildung 8G zu sehen ist. In den jüngeren, nicht-kompartimentierten
Somiten (Somiten I-III) beginnt die Hoxa-6-Genexpression in der dorsalen Somitenhälfte, wie
bei den Abbildungen 8C und 8D zu sehen ist. Diese Expression in der dorsalen Hälfte der
jüngeren Somiten gleicht sich der Expression in den Sklerotomen der älteren Somiten an. Es
stellt sich somit ein Gleichgewicht der Hoxa-6-Genexpression zwischen den dorsalen Hälften
der jüngeren, nicht-kompartimentierten Somiten und den ventralen Sklerotomen der älteren,
kompartimentierten Somiten ein; deswegen ist es nicht wunderlich, dass ein nahezu gleiches
dorso-ventrales Verhältnis zwischen den beiden Hälften errechnet werden konnte.
Zusammenfassend kann festgestellt werden, dass bei jüngeren Somiten die HoxGenexpressionen dorsal stärker sind, während die Hox-Gene bei älteren Somiten ventral
stärker aktiv sind als dorsal.
5.3.2 Hoxc-6-Genexpression nach heterotopischen Transplantationen der
Somitenhälften
5.3.2.1 Hoxc-6-Genexpession nach Transplantation der dorsalen Somitenhälften in die
Position der ventralen Somitenhälften
Nach der Transplantation von dorsalen Somitenhälften in die Position der ventralen
Somitenhälften wurde eine ektopische Hoxc-6-Genexpression im Sklerotom der Halsregion
Diskussion
63
beobachtet. Dies deutet darauf hin, dass die ursprünglich dorsale Somitenhälfte in der
ventralen Position ihre ursprüngliche Hox-Genexpression beibehalten hat. Die HoxGenexpression wurde also durch die umgebenden Signale nicht verändert. Diese Beobachtung
stimmt mit der Annahme von Nowicki und Burke (2000) überein, dass der dorsale
Somitenabschnitt seinen ursprünglichen Hox-Code beibehält. Da sich bei den ersten zwei
Operationsserien aus diesen ursprünglich dorsalen Somitenhälften ektopische Rippen
entwickelt haben, kann vermutet werden, dass die ursprüngliche Hox-Genexpression der
dorsalen
Hälfte
auf
das
neu
entstandene
Sklerotom
übertragen
wird
und
die
segmentspezifische Rippenbildung bestimmt. Daher kann vermutet werden, dass die HoxGene die Proliferationsrate der Sklerotomzellen kontrollieren. Danach entscheidet sich, ob
lange oder kurze Rippen oder rippenhomologe Strukturen gebildet werden (Duboule, 1996).
Unsere Ergebnisse weisen darauf hin, dass das Hoxc-6-Gen einen Teil des Hox-Codes in der
Thoraxregion darstellt, der bei der Festlegung der Segmentidentität dieser ursprünglich
dorsalen Somitenhälften, die experimentell in die ventrale Position verlagert wurden, eine
Rolle spielt.
5.3.2.2 Hoxc-6-Genexpession nach Transplantation der ventralen Somitenhälfte in die
Position von dorsalen Somitenhälften
Nach der Transplantation von ventralen Somitenhälften in die Position der dorsalen
Somitenhälften wurde eine zusätzliche Hoxc-6-Genexpression im Dermomyotom der
Halsregion festgestellt. Hieraus kann geschlossen werden, dass die ursprünglich ventrale
Somitenhälfte der Thoraxregion ihre Hox-Genexpression beibehält, selbst wenn sie in eine
dorsale Position kommt. Die spätere Entwicklung eines Scapula-Körpers aus dem neu
entstandenen Dermomyotom lässt vermuten, dass das Hoxc-6-Gen einen Teil des für die
Thoraxregion spezifischen Hox-Codes darstellt, der die Information zur Segmentidentität
übersetzt. Wenn sich die zu determinierenden Zellen im Dermomyotom befinden, dann
entscheidet das Hoxc-6-Gen darüber, dass sich aus diesen Zellen Knorpelzellen für den
Scapula-Körper entwickeln.
Unsere Ergebnisse sind ein Beleg dafür, dass die Hox-Gene sowohl den ventralen als auch
den dorsalen Somitenhälften der Thoraxregion die nötigen Informationen verleihen, die
erforderlich sind, um Scapula oder Rippen hervorzubringen. Die Expression der Hoxc-6-Gene
in beiden Somitenabschnitten nach Transplantationen der Somitenabschnitte spricht dafür,
Diskussion
64
dass identische Informationen zur Segmentidentität in den dorsalen und ventralen
Somitenhälften enthalten sind. Des Weiteren stimmen diese Ergebnisse mit den
Beobachtungen von Nowicki und Burke (2000) überein, dass das Expressionsmuster der HoxGene nach Transplantationen der dorsalen Somitenhälften aus der Thoraxregion in die
Position von ventralen Somitenhälften der prospektiven Halsregion beibehalten wird.
Der Hox-Code legt allerdings nicht nur die Segmentidentität für chondrogene Vorläuferzellen
fest. Aus neueren Untersuchungen geht nämlich hervor, dass der Hox-Code auch ein
intrinsisches Kontrollsystem für die Determinierung der hypaxialen Muskelblasteme darstellt.
Alvares et al. (2003) wiesen nach, dass die Muskelvorläuferzellen nicht naiv sind, wie zuerst
angenommen wurde. Ihren Befunden entsprechend hängt die Kompetenz, entweder
migratorische oder nicht-migratorische Muskelvorläuferzellen zu bilden von der intrinsischen
Fähigkeit der Somiten ab, nämlich von der durch die Hox-Gene festgelegten axialen Identität.
Nach
früheren
Untersuchungen
entwickeln
sich
hypaxiale
Muskelblasteme
nicht
herkunftgemäß sondern ortsgemäß (Chevallier et al., 1977; Christ et al., 1977; Jacob und
Christ, 1980; Hayashi und Ozawa, 1995). Diese Autoren beobachteten die Bildung einer
normalen Flügelmuskulatur, wenn zervikale Somiten nach brachial transplantiert wurden.
Wurden brachiale Somiten durch Thoraxsomiten ersetzt, so entwickelte sich daraus eine
normale Extremitätenmuskulatur. Aus den Untersuchungen von Alvares et al. (2003) kann
geschlossen werden, dass diese Muskelblasteme nach heterotopischer Verlagerung
reprogrammiert werden und dadurch die Identität der neuen Umgebung übernehmen.
5.4 Alle Zellen eines epithelialen Somiten enthalten dieselben
Informationen zur Segmentidentität
Die Ergebnisse der vorgelegten Arbeit erweitern unsere Vorstellung über die Determination
der Segmentidentität des paraxialen Mesoderms bei Vogelembryonen:
1.
Die Zellen des ventralen und dorsalen, sowie des medialen und lateralen
Somitenabschnitts der gleichen Segmenthöhe besitzen identische Informationen zur
Segmentidentität. Diese intrinsischen segmentspezifischen Informationen wirken zusammen
mit den nicht segmentspezifischen extrinsischen Signalen aus den umgebenden Strukturen auf
die Entwicklung der ventralen und der dorsalen Somitenkompartimente. Im ventralen
Kompartiment werden Zellen durch ventrale Signale zu Sklerotomzellen induziert. Die
Musterbildung dieser Sklerotomzellen wird durch die Informationen zur Segmentidentität
gesteuert. Im dorsalen Kompartiment werden Dermomyotomzellen durch Zusammenwirkung
65
Diskussion
von Signalen aus den umliegenden Strukturen und den intrinsischen Informationen zur
Segmentidentität zu Muskel-, Dermis- und Knorpelzellen induziert.
2.
Obwohl der Hox-Code eine identische Segmentidentität in den Somitenabschnitten
festlegt, erfolgt die Expression der Hox-Gene in einer zeitlichen und räumlichen Abfolge, die
vom Reifegrad der Somiten abhängig ist.
Zusammenfassung
66
6 Zusammenfassung
Somiten sind segmental angeordnete Blöcke des Mesoderms, die sich beiderseits der
Axialorgane im jungen Embryo befinden. Durch ihre dorso-ventrale Kompartimentierung
entstehen das dorsale Dermomyotom und das ventrale Sklerotom. Während das
Dermomyotom das Baumaterial für die Bildung der Muskeln, der Rückenhaut, der Gefäße
und des Scapula-Körpers liefert, gehen aus dem Sklerotom der Hinterhauptsknochen, die
Wirbel und die Rippen hervor. Die Individualität jedes definitiven Wirbels wird als
Segmentidentität bezeichnet. Diese Segmentidentität wird in den Somiten durch den HoxCode festgelegt und führt zur segmentspezifischen Entwicklung der Wirbel.
Es wird der Frage nachgegangen, ob alle Zellen eines epithelialen Somiten identische
Informationen
zur
Hühnerembryonen
Segmentidentität
verschiedene
besitzen.
Dafür
Transplantationen
wurden
an
2
Tage
durchgeführt,
alten
wobei
Segmentplattenabschnitte und epitheliale Somiten aus der prospektiven Thoraxregion um
180° um die Längsachse rotiert und in die Halsregion implantiert wurden. Weiterhin wurden
dorsale Somitenhälften des Hühnchens durch ventrale Somitenhälften der Wachtel ersetzt und
umgekehrt. Es erfolgte die Analyse des knorpeligen Skeletts und der Hox-Genexpression des
Wirtsembryos. Die normale Hox-Genexpression der Somitenhälften wurde mittels in situHybridisierung und Echtzeit-PCR untersucht. Die Ergebnisse lassen sich, wie folgt,
zusammenfassen:
(1)
Ektopische Bildungen von Rippen- und Scapulaabschnitten nach den verschiedenen
Transplantationsserien zeigen, dass alle Zellen eines epithelialen Somiten identische
Informationen zur Segmentidentität enthalten, die bereits vor der Somitenbildung festgelegt
werden.
(2)
Die Ergebnisse der in situ-Hybridisierung und die quantitative Bestimmung der Hox-
Genexpression mittels der Echtzeit-PCR zeigen eine räumlich-zeitliche Abfolge des HoxGenexpressionsmusters in den sich entwickelnden Somiten. Ihre Expression beginnt zunächst
in der dorsalen Hälfte des epithelialen Somiten bevor sie in die ventrale Hälfte fortschreitet.
Danach nimmt diese Expression im Dermomyotom ab und wird im Sklerotom verstärkt.
Daraus wird der Schluss gezogen, dass die Hox-Gene identische Informationen zur
Segmentidentität in allen Zellen des epithelialen Somiten vermitteln, obwohl sie in den
Somitenabschnitten in einer räumlichen und zeitlichen Abfolge exprimiert werden.
67
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78
Lebenslauf
8 Lebenslauf
Angaben zur Person
Name
Marlyse, Dieuguie Fomenou
Geburtstag
06.April 1978
Geburtsort
Jaunde, Kamerun
Eltern
Bernard, Fomenou
Julienne Paulette, Djoko geb. Kondjouo (Lehrerin)
Ausbildungsweg
Juni 1996
Abitur im Lycee de Mendong in Jaunde
Aug. 1998
Einreise in Deutschland
Feb. 1999
Sprachprüfung für den Hochschulzugang in Darmstadt
seit Okt. 99
Medizinstudium an der Universität Freiburg
Aug. 01
Ärztliche Vorprüfung
Aug. 02
Erstes Staatsexamen
Praktische Tätigkeiten im Rahmen der Ausbildung
Apr.-Juni 99 Krankenpflegepraktikum im St-Elisabeth Krankenhaus in Darmstadt
Sept.02
Famulatur in der Abteilung der Strahlentherapie der Universitätsklinik in
Freiburg
Juli 03
Teilnahme am AIDS-Präsenzseminar in Würzburg, vom InWent-Programm
organisiert.
Aug./Sept. 03 Famulatur in den Fächern Innere Medizin und Gynäkologie an der
Universitätsklinik in Jaunde
Feb./März 04 Famulatur in der inneren und hausärztlichen Praxis Graf und Genz in Freiburg
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Nebentätigkeiten
Sept. 00-März 02
Sitzwachentätigkeit an der Uniklinik Freiburg
Aug. 00/Aug. 01
wissenschaftliche Hilfskraft in der Anatomie
WS 01/01 und 02/03 Vorpräparandin im Rahmen des anatomischen Unterrichts
Seit Feb. 02
Sitzwachentätigkeit in der Theresienklinik in Bad Krozingen
Lebenslauf
80
Danksagung
9 Danksagung
Ganz herzlich möchte ich mich in Memoriam bei Herrn Dr. Egon Frölich (Im August 2004
verstorben) bedanken. Durch seine Ermunterung, seine Anregung und seinen Einsatz konnte
und durfte ich bei dem Herrn Prof. Dr. Christ meine Erfahrungen in der Forschung sammeln.
Ein tiefer Dank gilt Herrn Prof. Dr. Christ für die Überlassung des Themas und die Erstellung
des Erstgutachtens zur vorliegenden Arbeit. Sein beständiges Interesse am Fortgang der
Arbeit trugen zum Fortschreiten der vorliegenden Arbeit bei. Sein Vertrauen, seine Geduld
und seine Offenheit ermutigten mich, weiterzukommen und mich selbst herauszufordern. Ich
kann mich an einen Satz erinnern, den er mir am Anfang der Arbeit gab, und der mich bis
heute begleitet hat: „Man hört nie auf zu lernen“. Unter vielem Anderen durfte ich von Herrn
Prof. Dr. Christ lernen, wie wissenschaftliches Fragen und Arbeiten vonstatten gehen soll.
Für die Übernahme des Zweit-Gutachtens bedanke ich mich zutiefst bei Herrn PD Dr.
Erggelet.
Von ganzem Herzen möchte ich mich bei Herrn PD Dr. Huang bedanken. Unter seiner
ständigen und umfassenden Betreuung gelang es mir, die verschiedenen Probleme der
vorliegenden Arbeit zu verstehen. Bei allen Fragen war er ein wissenschaftlich vorbildlicher
und fürsorglicher Begleiter. Besonders hervorheben möchte ich die operativen Fertigkeiten
von Herrn PD Huang sowie sein Engagement im Labor. Seine Freude an der Arbeit, seine
moralische Unterstützung, seine Geduld und seine Hilfsbereitschaft werden mich nachhaltig
prägen.
Frau PD Dr. Pröls danke ich herzlich für die Hilfsbereitschaft und die freundliche
Unterstützung sowie das ständige Nachfragen.
Meine methodische Ausbildung im Labor verdanke ich der hervorragenden technischen
Assistenz von Frau Gimbel, Frau Koschny, Frau Schüttoff, Frau Pein und Herrn Frank.
Für das freundliche Verhältnis und die Diskussionsfreudigkeit bedanke ich mich bei Julia
Schrägle, Suresh Nimmagada, Poongodi Geetha, Venupogal Mittapalli und Wolfram Regen.
Herrn Thomas Gotto, Familie Kamdem und Familie Hirche danke ich für die ständige
Unterstützung und das Nachfragen.
Für die moralische und finanzielle Unterstützung bedanke ich mich herzlich bei Frau Sabine
Berg (und der ESG-Freiburg), Familie Hildebrandt und Familie Platzöder.
Meiner Familie danke ich aus vollem Herzen. Ohne ihr Vertrauen, ihre menschliche und
spirituelle Unterstützung wäre diese Arbeit nicht auszuführen gewesen.
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Eigene Vorträge und Publikationen
10 Eigene Vorträge und Publikationen
Dieuguie Fomenou M., Huang R., Nikovits, W., Stockdale, F.E. und Christ, B. (2002). Alle
Teile des präsomitischen Mesoderms besitzen Informationen zur Segmentidentität. Verh.
Anat. Ges., Supplement zum 184. Band des Anat. Anz. (Annals of Anatomy), 2001,
S. 204 (Abstract)
Erklärung
82
11 Erklärung
Ich erkläre hiermit, dass ich die vorliegende arbeit ohne unzulässige Hilfe Dritter und ohne
Benutzung anderer als der angegebenen Hilfsmittel angefertigt habe. Die aus anderen Quellen
direkt oder indirekt übernommenen Daten und Konzepte sind unter Angabe der quelle
gekennzeichnet. Insbesondere habe ich hierfür nicht die entgeltliche Hilfe von Vermittlungsbzw. Beratungsdiensten in Anspruch genommen. Niemand hat von mir unmittelbar oder
mittelbar geldwerte Leistungen für Arbeiten erhalten, die im Zusammenhang mit dem Inhalt
der vorgelegten Dissertation stehen.
Die Arbeit wurde bisher im In- noch im Ausland in gleicher oder ähnlicher Form einer
anderen Prüfungsbehörde vorgelegt.
.................................................
(Datum)
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(Unterschrift)