Wirkung von Endotoxin auf Kulturmakrophagen nach Inkubation mit

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Aus dem Pathologischen Institut
der Albert-Ludwigs-Universität Freiburg im Breisgau
Wirkung von Endotoxin auf Kulturmakrophagen nach
Inkubation mit einem Apoptose induzierenden Faktor
des LEWIS-Lung-Karzinoms
INAUGURAL-DISSERTATION
zur
Erlangung des Medizinischen Doktorgrades
der Medizinischen Fakultät
der Albert-Ludwigs-Universität Freiburg im Breisgau
vorgelegt
von
geboren in
2003
Nele Raiss
Karlsruhe
Dekan
1. Gutachter
2. Gutachter
Jahr der Promotion
Prof. Dr. med. J. Zentner
Prof. Dr. med. Dr. h. c. N. Freudenberg
Prof. Dr. med. U. Schöffel
2005
Meinen Eltern
4
Inhaltsverzeichnis
___________________________________________________________________________
1
EINLEITUNG
7
1.1 Apoptose
7
1.1.1
1.1.2
1.1.3
1.1.4
Physiologische Rolle der Apoptose
Historischer Hintergrund
Definition
Ablauf
1.1.4.1
1.1.4.2
1.1.4.3
Apoptose-Rezeptoren: das Fas/FasL-System
Genetische Regulierung: die bcl2-Familie
Ausführende Mechanismen: die Caspasen
1.2 Makrophagen
1.2.1
1.2.2
1.2.3
1.2.4
2
Die Morphologie der Makrophagen
Die Herkunft der Makrophagen
Funktion und Lokalisation der Makrophagen
Wechselwirkungen zwischen Tumoren und Makrophagen
7
7
8
9
10
11
13
14
14
14
15
17
1.3 Endotoxin
18
1.4 Lewis-Lung-Karzinom
19
1.5 Fragestellung
20
MATERIAL UND METHODEN
2.1 Übersicht der Versuchsanordnungen
2.1.1
Apoptoseinduktion bei Makrophagen
2.1.2 Endotoxinwirkung
2.2 3-LL Tumorzellen
2.2.1
Gewinnung des Tumorzellüberstands
2.3 Makrophagen
2.3.1
2.3.2
2.3.3
2.3.4
2.3.5
Gewinnung
GM-CSF
Inkubation mit Endotoxin aus Salmonella abortus equi
Inkubation mit 3-LL-Überstand
Ernte und Fixierung
2.4 Immunzytochemische Färbung
2.4.1. Antikörper
2.4.2 ABC-Methode
2.4.3 Tyramidverstärkung
2.5 Auswertung
21
21
21
21
22
22
23
23
23
24
24
25
26
26
27
29
31
5
Inhaltsverzeichnis
___________________________________________________________________________
2.5.1 Kontrollen
31
2.5.2 Auszählung und Statistik
31
3
2.6 Reagenzien
32
ERGEBNISSE
36
3.1 Immuncytochemischer Nachweis des antiapoptotischen bcl2Proteins an Makrophagen zu verschiedenen Kulturzeiten
36
3.1.1
10. Kulturtag
36
3.1.2
12. Kulturtag
39
3.1.1.1
3.1.1.2
Vergleich Kontrolle / Inkubation mit LPS
Vergleich Tumorzellüberstand / Tumorzellüberstand und LPS
3.1.2.1
3.1.2.2
Vergleich Kontrolle / Inkubation mit LPS
Vergleich Tumorzellüberstand / Tumorzellüberstand und LPS
3.2 Immuncytochemischer Nachweis des antiapoptotischen bclxProteins an Makrophagen zu verschiedenen Kulturzeiten
36
38
39
41
43
3.2.1
10. Kulturtag
43
3.2.2
12. Kulturtag
46
3.2.1.1
3.2.1.2
Vergleich Kontrolle / Inkubation mit LPS
Vergleich Tumorzellüberstand / Tumorzellüberstand und LPS
3.2.2.1
3.2.2.2
Vergleich Kontrolle / Inkubation mit LPS
Vergleich Tumorzellüberstand / Tumorzellüberstand und LPS
43
45
46
48
3.3 Immuncytochemischer Nachweis des apoptotischen bax-Proteins
an Makrophagen zu verschiedenen Kulturzeiten
50
4
3.3.1
10. Kulturtag
50
3.3.2
12. Kulturtag
53
3.3.1.1
3.3.1.2
Vergleich Kontrolle / Inkubation mit LPS
Vergleich Tumorzellüberstand / Tumorzellüberstand und LPS
3.3.2.1
3.3.2.2
Vergleich Kontrolle / Inkubation mit LPS
Vergleich Tumorzellüberstand / Tumorzellüberstand und LPS
DISKUSSION
4.1 Diskussion der Methoden
4.1.1
Versuchsaufbau
4.1.1.1
4.1.1.2
Makrophagenkultur
Inkubation
4.1.1.3
Färbemethoden
4.1.1.2.1
4.1.1.2.2
4.1.1.3.1
4.1.1.3.2
mit Endotoxin
mit Tumorzellüberstand
Wahl der Apoptosemarker
Bross-Methode
4.2 Diskussion der Ergebnisse
4.2.1
Bcl2
50
52
53
54
56
56
56
56
57
57
57
58
58
58
60
60
6
Inhaltsverzeichnis
___________________________________________________________________________
4.2.2
Bclx
60
4.2.3
Bax
60
4.2.4
Vergleich der Färbungen mit verschiedenen Apoptosemarkern
61
4.2.4.1
4.2.4.2
Bcl2 / bclx
Bcl2 / bax
61
65
4.3 Überblick über die Literatur
69
4.2.5
Makrophagenreife
68
4.3.1
Aktivierung der Makrophagen in vivo
69
4.3.2
Interaktion mit Tumorzellen
70
4.3.3
Stimulation durch Endotoxin und Signalvermittlung
70
4.3.4
Gemeinsame Wege der Regulationsmechanismen von Apoptose, tumorvermittelter
Immunabwehr und LPS-Stimulation
71
4.3.5
Diskussion der eigenen Ergebnisse in Bezug auf Literaturangaben
72
5
ZUSAMMENFASSUNG
74
6
LITERATURVERZEICHNIS
75
7
LEBENSLAUF
83
8
DANKSAGUNG
84
7
Einleitung
___________________________________________________________________________
1 EINLEITUNG
1.1 Apoptose
1.1.1 Physiologische Rolle der Apoptose
Die Apoptose spielt eine essentielle Rolle bei zahlreichen physiologischen Vorgängen von der
embryologischen Entwicklung über die regelrechte Ausbildung und Reaktionen des
Immunsystems87 und des zentralen Nervensystems bis zur tagtäglichen Zellmauserung22;89.
Sobald jedoch ihr Ablauf trotz der zahlreichen Regulierungsmechanismen nicht mehr adäquat
funktioniert, können daraus einige schwerwiegende Krankheiten resultieren.
Bakterien und Viren haben sich den Zugang zur Immunabwehr zunutze gemacht, indem sie
in die Apoptoseregulation eingreifen und beispielsweise immunkompetente Zellen zum
Selbstmord veranlassen. Dieser Mechanismus kann im Zusammenhang mit Infektionen mit
dem HIV-Virus beobachtet werden, da für AIDS eine vermehrte Aktivierung der Apoptose
charakteristisch ist. Auch in Verbindung mit Alzheimer und Chorea Huntington konnte ein
überschießendes Maß an Apoptose nachgewiesen werden3;22.
Jedoch auch eine unzureichende Aktivierung kann verheerende Auswirkungen auf die
physiologische
Zellhomöostase
haben22:
Eine
ungenügende
Selektion
der
immunkompetenten Zellen durch selbst induzierten Zelltod kann Autoimmunkrankheiten
verursachen und die ungehemmte Ausbreitung von Zellklonen Tumorwachstum fördern27;62.
Das folgende Kapitel soll einen Überblick über Entdeckung, Namensgebung und vor allem
den komplexen und an vielen Schaltstellen regulierten Ablauf dieses lebensnotwendigen
Vorgangs ermöglichen.
1.1.2 Historischer Hintergrund
Die Apoptose, oftmals auch wenig exakt als programmierter Zelltod bezeichnet67;89, wurde
lang nicht als ein von den anderen Arten des Zelltodes deutlich abzugrenzender
Mechanismus erkannt. Zwar wurde schon im zweiten Jahrhundert vor Christus von Galen die
Regression von larvalen und fetalen Strukturen entdeckt, und 1851 beschrieb auch
Glücksmann apoptotische Vorgänge bei der ontogenetischen Entwicklung von Embryonen35,
ohne jedoch diese Form des Zelltodes als eine bislang unerkannte Entität einordnen zu
können.
8
Einleitung
___________________________________________________________________________
Erstmals wurde die Apoptose 1885 als eigenes Konzept unter dem Namen Chromatolyse von
Walther Flemming in einem Artikel über den Untergang Graaf’scher Follikel beim Hasen
erwähnt33. Bis zur Erkenntnis, dass es sich hierbei um die Beschreibung eines bis dato völlig
unbekannten Ablaufs des Zelluntergangs handelte, der sich in vielen Aspekten von der
bereits bekannten Nekrose unterscheidet, sollten noch einmal fast 100 Jahre vergehen: 1971
veröffentlichte Kerr das ausschlaggebende Experiment und prägte ein Jahr später den Begriff
der Apoptose52.
Dieser Begriff ist von den griechischen Wörtern apό (=von) und ptόsis (=fallen) hergeleitet
und vergleicht den Prozess des ja zumeist bei einzelnen Zellen zu beobachtenden
apoptotischen Zelltodes treffend mit dem Fallen von Blättern im Wind.
1.1.3 Definition
Die Apoptose ist also schon durch die Namensgebung deutlich von dem Konzept der Nekrose
abgegrenzt, da es sich bei der letzteren ja um einen massenhaften Zelluntergang handelt.
Beide Begriffe als gegenteilige Mechanismen des Zelltods zu bezeichnen ist jedoch
irreführend
und
unverständlich29;49,
da
die
Nekrose
lediglich
die
morphologischen
Veränderungen nach Eintritt des Zelltodes z.B. durch Ischaemie, die Apoptose aber
außerdem die auslösenden und regulatorischen Abläufe beschreibt. Es gibt Arten des
Zelltodes, bei denen apoptotisch geschädigte Zellen ebenfalls im Anschluss Nekrose zur
Folge haben können, wie bei von einem Sonnenbrand geschädigten Epidermiszellen114 oder
bei den Councilman-Körperchen in der Leber. Majno et al schlagen deshalb die Einführung
des Begriffs der Onkose (griechisch für „Schwellung“) als Gegenspieler zur Apoptose vor und
erläutern ihr Konzept mit folgender Abbildung:
9
Einleitung
___________________________________________________________________________
Abbildung 1: Zwei Wege des Zelltodes führen zur Nekrose ( nach67; oben eine normale Zelle,
1A: Anschwellen der Zelle 2A: Vakuolenbildung, „blebbing“, erhöhte Permeabilität 3A:
nekrotische Veränderungen mit Karyolyse und Schrumpfen 1B: Schrumpfen und Pyknose 2B:
„budding“51 und Karyorhexis 3B: nekrotische Veränderungen mit Bildung von apoptotischen
Körperchen)
1.1.4 Ablauf
Die morphologischen Einzelheiten im Ablauf der Apoptose konnten erst mit der Nutzung der
Elektronenmikroskopie im Detail beschrieben werden und zeichnen sich vor allem durch
folgende Charakteristika aus: Verlust der Zellkontakte, Kondensation von Nukleus und
Zytoplasma, Zellschrumpfung, Ablagerung des verdichteten Chromatins in randständigen
Halbmondformationen, Karyorhexis, Membranausstülpungen (sogenanntes „budding“51) mit
Entstehen der apoptotischen Körperchen, welche schlussendlich von phagozytierenden Zellen
abgeräumt werden52;67 (siehe auch Abbildung 1).
Doch von Interesse an der Apoptose sind nicht nur ihre morphologischen Besonderheiten,
sondern vor allem die biochemischen Regulierungsmechanismen, welche im Detail zu
10
Einleitung
___________________________________________________________________________
erkunden den Einstieg in ein weites Forschungsfeld eröffnen. Die Signaltransduktionswege
der Apoptose können in verschiedene Abschnitte eingeteilt werden:
1.
die
Initiation
(durch
verschiedene
Auslöser,
die
entsprechende
„Apoptoserezeptoren“ aktivieren, wie z.B. das Fas/FasL-System)
die genetische Regulierung (durch Interaktion mit verschieden pro- und
2.
anti-apoptotischen Genen wie bcl2 oder p53)
die ausführenden Mechanismen (proteolytische Spaltung durch die
3.
Caspasen)
In der folgenden Abbildung wird der biochemische Weg von der Auslösung bis zum Zelltod
vereinfacht dargestellt86. Eine genauere Erläuterung der einzelnen Komponenten unter
Berücksichtigung besonderer Schwerpunkte erfolgt unter 1.1.4.1 - 1.1.4.3.
MITOCHONDRIALER WEG
FAS-VERMITTELTER WEG
FAS-L
ZELLMEMBRAN
FAS-R
MITOCHONDRIUM
FADD
proapoptotisch:
BAX/BID
CASPASE 8
antiapoptotisch:
BCL2/BCLX
CYTOCHROM C-Freisetzung
CASPASE 8
APAF-1
APOPTOSOM
P 53
APOPTOSE-INHIBITOREN
CASPASE 3 und
andere
exekutierende
CASPASEN
DNA-FRAGMENTIERUNG
ZELLTOD
Abbildung 2: apoptotische Mechanismen in einer menschlichen Zelle (nach84;86)
1.1.4.1
Apoptose-Rezeptoren: das Fas/FasL-System
Der Fas- oder auch CD95-/Apo-1-Rezeptor ist ein glykosyliertes Membranprotein vom Typ II,
welches
aus der TNF-Rezeptoren-Familie stammt und sich als einer der wichtigsten
Apoptoserezeptoren, vor allem während des apoptotischen Selektionsprozesses der TLymphozyten im Immunsystem erwiesen hat63. Er ist jedoch nicht nur dort von Bedeutung,
11
Einleitung
___________________________________________________________________________
sondern wird in allen Geweben des menschlichen Körpers wie auch von soliden Tumoren
exprimiert87. Die Expression von FasL wiederum ist in der Hauptsache auf aktivierte T-Zellen,
natürliche Killerzellen und Zellen in immunprivilegierten Organsystemen wie Hoden und Auge
-aber auch Tumoren- limitiert39;63;101.
Apoptoseinduktion erfolgt bei Ligation mit FasL in gebundener oder löslicher Form95, wobei
die
trimerische
lösliche
Form
(sFasL),
welche
durch
Metalloproteinasen
vom
membranständigen FasL abgespalten wird, eine 1000fach verringerte Bindungskapazität für
den Fas-Rezeptor aufweist96.
Die Bedeutung des Fas/FasL-Systems für die Apoptose wird durch folgende Beispiele
eindrücklich: lpr- und gld-Mutationen, bei welchen respektive das Fas- bzw. FasL-Gen
ausgeschaltet wurde, bewirkten bei Mäusen durch in nicht ausreichendem Maße ausgelöste
Apoptose die Vergrößerung von Milz und Lymphknoten sowie Autoimmunreaktionen77. Ein
weiterer wichtiger Punkt ist die Tatsache, dass Tumoren FasL exprimieren, um sich vor sie
bekämpfenden Leukozyten schützen zu können, indem sie bei ihnen Apoptose auslösen, die
sogenannte „Gegenattacke“63;81;112(siehe 1.2.4).
1.1.4.2
Genetische Regulierung: die bcl2-Familie
Die bcl2-Familie wurde 1985 erstmals wegen seines gehäuften Auftretens bei der
chromosomalen Translokation t(14;18) in follikulären B-Zell-Lymphomen (daher der Name
„bcl2“) entdeckt und als potentielles Onkogen identifiziert40;57;59. Sie ist die bisher am
genauesten untersuchte Einheit der Apoptose regulierenden Gene: Ihre Mitglieder, von
welchen zur Zeit 20 bekannt sind, können zum einen Teil pro-apoptotische (wie bax, bak, bid
und bad), zum anderen aber auch anti-apoptotische (wie bcl2, bclx, bclw und mcl1) Wirkung
haben3;16;59.
Bcl2 und bclx besitzen eine homologe Struktur, die in einem ersten Schritt in eine
regulatorische und eine Dimerisierungsdomäne unterteilt werden kann. Diese wiederum sind
aus 7 α-Helices, den „Homology Domains“ BH1-4, einer „LOOP“- und einer carboxyterminalen hydrophoben transmembranären Sequenz aufgebaut, welche außerdem
das
Andocken von anderen Proteinen ermöglichen und eine Kanal-/Poren-Funktion aufweisen,
wie in folgender Abbildung dargestellt:
12
Einleitung
___________________________________________________________________________
regulatorische
α1
BH4
Dimerisierungsdomäne
α2
LOOP
D34
ProteinBindungsstelle
α3
BH3
S70
α4
α3 α3
α5
α6
BH1
α7
BH2
TM
Kanal/Pore
Abbildung 3: Schematische Darstellung des bcl2-Gens (nach91)
Auch bax als „multi-domain“-Mitglied der proapoptotischen bcl2-Gene besitzt eine sehr
ähnliche Struktur, bei der im Vergleich zu bcl2 nur die BH4-Domäne fehlt86, was jedoch
gleichzeitig eine Erklärung –„Freilegung“ der für den Ionenkanal kodierenden Gensequenzfür die antagonistische Wirkung der beiden Gegenspieler sein könnte.47
Zwar ist die Funktionsweise der bcl2-Proteine noch nicht restlos aufgeklärt50;54, doch sowohl
die genetische Konformität im Kanal-/Porenbereich als auch die intrazelluläre Lokalisation der
Proteine unterstützen die These des mitochondrialen Apoptosewegs31: Bcl2 und bclx sind an
den zytoplasmatischen Membranen von Mitochondrien, endoplasmatischem Retikulum und
der Kerne gebunden50, und auch bax interagiert mit mitochondrialen Strukturen, indem es
nach apoptotischer Stimulation vom Cytosol zum Mitochondrium transloziert31;44. Der durch
oben dargestellte Gensequenz kodierte Ionenkanal, welcher den Porinen bakterieller Toxine
ähnelt94, wird in die Mitochondrienmembran integriert. Dies führt zu einer Änderung des
Membranpotentials30;91 und bewirkt dann wahrscheinlich die weitere Regulierung des
Apoptoseprozesses über die Freisetzung von Cytochrom C9;44;74;94 und Auslösung der
Protease-Kaskade86;87;100 bei Aktivierung durch proapoptotische Moleküle wie bax, während
die antiapoptotischen Proteine bcl2 und bclx darauf abzielen, die Cytochrom C-Ausschüttung
(durch Stabilisierung der Membran8) zu unterbinden1;31;55;88.
13
Einleitung
___________________________________________________________________________
Eine weitere These für den Wirkungsmechanismus der bcl2-Familie wird ebenfalls durch
eines ihrer homologen strukturellen Merkmale unterstützt: die Proteinbindungsstelle. Diese
ermöglicht die Homo- und Heterodimerisierung zwischen den verschiedenen bcl2Molekülen24;117. So können sich zwei bax-Proteine aneinander anlagern und Apoptose
induzieren5;83. Jedoch hat sowohl die Homodimerisierung von bcl2 als auch die
Heterodimerisierung von bcl2 und bax eine gegensätzliche Wirkung, nämlich die
Unterstützung der Überlebensfunktionen der Zelle40;91.
Zusätzlich zu den oben postulierten Wirkmechanismen der bcl2-Familie spielt auch die
Regulierung
durch
Phosphorylierung
eine
große
Rolle:
Anscheinend
kann
die
Phosphorylierung der bcl2-Proteine an Serin 70 die funktionelle Stabilisierung des
heterodimeren Zustands von bcl2 und bax bewirken20 und somit die pro-apoptotische
Wirkung von bcl2 unterstützen, aber auch zu anderen molekularen Modifizierungen führen91.
1.1.4.3
Ausführende Mechanismen: die Caspasen
Bis jetzt wurden 15 Caspasen bei Säugetieren identifiziert86. Die Nomenklatur weist auf ihre
Zugehörigkeit zur Familie der Cysteinproteasen hin, welche spezifisch an Aspartatgruppen
schneiden (“cysteine dependent aspartat specific protease“)79;92.
Es werden zwei Untergruppen unterschieden, da die Initiator- und die Effektor-Caspasen zu
verschieden Zeiten in die Signalkaskade eingreifen: Procaspase 8 und 9 spielen in Interaktion
mit anderen Molekülen wie Fadd70;75 und Apaf1 bei der initiatorischen Phase eine Rolle86.
Caspase 3, 6 und 7 sind hauptverantwortlich für die Ausführung des Zelltodes indem sie die
sogenannte „Protease-Kaskade“ mit Zerstörung und Inaktivierung der zur Aufrechterhaltung
der Zellfunktionen unverzichtbaren Schlüsselproteine auslösen. Dieser Mechanismus ist
irreversibel und führt zu einer schnellen Exekution der Zelle86;92.
So effektiv diese Mechanismen bewiesenermaßen funktionieren, so komplex ist das
Zusammenspiel der Caspasen, welches durch viele Regulationsmechanismen gesteuert wird:
Zum Beispiel bewirkt die Eliminierung von bestimmten Caspasen in vivo die Aktivierung
anderer Caspasen an ihrer statt, um die Ausführung der Apoptose zu gewährleisten121.
Caspase 3 jedoch hat einen besonderen Status116: Die klassischen morphologischen
Kennzeichen der Apoptose wie „budding“51 und die Fragmentation der DNA bleiben in ihrer
Abwesenheit aus, was ihre Wesentlichkeit für den regulären Ablauf der Apoptose
beweist86;122.
14
Einleitung
___________________________________________________________________________
1.2 Makrophagen
1.2.1 Die Morphologie der Makrophagen
Die Morphologie der Makrophagen wird durch folgende Merkmale charakterisiert: Die Zellen
messen im Durchschnitt 25-50µm, sind unregelmäßig geformt und haben einen großen,
exzentrisch platzierten rundlichen Nukleus, welcher einen oder zwei prominente Nukleoli und
feines, gleichmäßiges Chromatin beinhaltet. Typisch sind außerdem die vielen kleinen sowie
unzählige große basophile Granula und das gehäufte Vorkommen von Vakuolen im
Zytoplasma21.
1.2.2 Die Herkunft der Makrophagen
Makrophagen stammen aus dem Knochenmark, wo sie aus derselben Stammzelle
heranreifen wie neutrophile Granulozyten:
aus der „colony-forming-unit granulocyte-
macrophage“ (CSU-GM)71. Die Regulation der Monozytopoese erfolgt über komplizierte
Regelkreise: So können beispielsweise verschiedene Bedingungen wie das Vorhandensein
externer Stimuli (z.B. Endotoxin) oder zu phagozytierender Partikel die Ausschüttung von
Wachstumsfaktoren (M-CSF/ GM-CSF) aus Makrophagen32;85, Fibroblasten und Endothelzellen
stimulieren12.
Ausgehend von der Stammzelle reifen die mononukleären Phagozyten über Monoblasten und
Promonozyten zu Monozyten heran, welche schon nach ca. 24h in die Peripherie
ausgeschwemmt werden72;107. Die Zirkulationszeit beim Menschen beträgt bis zu 70h115, dann
beginnt die Migration zu ihren Gewebsstandorten mit Adhärenz an die Endothelzellen sowie
Diapedese zwischen diesen hindurch, bevor sie zuletzt die subendothelialen Strukturen
passieren. Zytokine wie Interleukin-1 und Interferon-γ erleichtern diese Wanderung zu den
Entzündungsherden, z.B. indem sie die Expression von CD54 auf Endothelzellen erhöhen und
somit die Adhäsion von Makrophagen an die Endothelien erleichtern23. Ist der Monozyt am
Ziel angekommen, findet seine Differenzierung zum Makrophagen statt, welcher schließlich
einige Monate im jeweiligen Gewebe verbringt, ohne es wieder zu verlassen108.
Nachfolgend soll eine Grafik die beschriebenen Abläufe in der Entwicklung der Makrophagen
verdeutlichen:
15
Einleitung
___________________________________________________________________________
KNOCHENMARK
Monoblast
BLUT
Promonozyt
Monozyt
GEWEBE
Monozyt
Makrophage
= Diapedese
DNA-Synthese
Phagozytose
Lysosome
Abbildung 4: Entwicklung und einige Charakteristika der Makrophagen(nach90)
1.2.3
Funktion und Lokalisation der Makrophagen
Die Makrophagen wurden 1924 von Aschoff dem retikuloendothelialen System (RES)
zugeordnet,
ein
breitgefächertes
System
aus
Fibroblasten,
Histiozyten, Monozyten,
retikulären und endothelialen Zellen4, welches zwar funktionelle Gemeinsamkeiten, nicht
aber die verschiedene Herkunft der Zellen berücksichtigt. Diese Ungenauigkeit wurde mit der
seit 1969 durch van Furth geprägten neuen Bezeichnung „mononukleäres PhagozytoseSystem“ (MPS) ausgeräumt109.
Die
Hauptaufgabe
der
Makrophagen
ist
demnach
zweifelsohne
die
Phagozytose
verschiedenster Substanzen. So können sowohl Mikroorganismen als auch Partikel anhand
ihrer Oberflächenstruktur als körperfremd identifiziert werden, aber auch spezielle
Markierungsprozesse, wie die Opsonisierung durch Proteine des Komplementsystems
erleichtern ihre Erkennung60. Außerdem hilft ein zunehmender Gradient chemotakischer
Stoffe bei der Versammlung der Makrophagen am Einsatzort48.
Die Phagozytose an sich
geschieht in Phagolysosomen, welche aus primären Lysosomen und Phagosomen
fusionieren76 und die für das eventuelle Abtöten und die Verdauung der aufgenommenen
Substanzen notwendigen cytotoxischen Systeme und Enzyme beinhalten66;78.
16
Einleitung
___________________________________________________________________________
Aber auch die Interaktion mit den anderen Zellen der Immunabwehr ist von immenser
Bedeutung. Der Makrophage übernimmt zum einen Teil regulierende Funktionen, indem er
Zytokine produziert, welche Funktion, Wachstum und Differenzierung sämtlicher Leukozyten
beeinflussen90. Zudem sind Prozessierung und Präsentation der Antigene durch den
Makrophagen sehr wichtig für die spezifischen Immunreaktionen von B- und TLymphozyten60.
Von
besonderem
Interesse
ist
die
Tatsache,
dass
sämtliche
ausdifferenzierten
mononukleären Phagozyten im Prinzip zu allen erwähnten Aktionen befähigt sind, aber je
nach Lokalisation in den verschiedenen Organsystemen des Körpers andere Hauptaufgaben
übernehmen. Nachfolgend sind einige dieser heterogenen Makrophagen-Populationen mit
ihrer Funktion beschrieben90:
1.
Die Alveolarmakrophagen, die dominierenden Zellen der Immunabwehr in der
gesunden, aber auch chronisch entzündlichen Lunge99, sind in der
Hauptsache
für
die
lokale
Verteidigung
gegen
eingedrungene
Mikroorganismen verantwortlich, phagozytieren aber auch Staubpartikel.
2.
Die KUPFFER-Zellen räumen die massenhaft in der Leber anfallenden
gelösten und festen Giftstoffe ab. Da sie verschiedene Rezeptoren wie Fc-,
Mannosyl-Fucosyl-Rezptor, CD14 und CD33 exprimieren, wird vermutet, dass
Stimuli aus dem Darm (z.B. LPS) Reaktionen wie die Interaktion mit
Hepatozyten provozieren. Außerdem spielen aktivierte Kupffer-Zellen durch
Sezernierung verschiedener Botenstoffe (TNF-a, IL-1, IL-6, Prostaglandine,
NO) eine wichtige Rolle in entzündlichen Prozessen, wobei IL-6 für die
Auslösung
der
Akuten-Phase-Reaktion
sogar
die
Schlüsselposition
einzunehmen scheint42. Trotz ihrer funktionellen Heterogenität können
sämtliche Makrophagen der Leber durch entsprechende Stimulation zur
Tumorabwehr
aktiviert
werden,
was
ihre
besondere
Rolle
in
der
Auseinandersetzung der Immunabwehr mit Neoplasien unterstreicht19.
3.
In der Milz findet man auch phänotypisch sehr heterogene MakrophagenPopulationen11 mit folgenden Aufgaben: In der Randzone spüren sie Antigene
auf und prozessieren diese, in den Keimzentren interagieren sie mit T- und BZellen und in der roten Pulpa sind sie am Abbau der Erythrozyten maßgeblich
beteiligt.
4.
Das Knochenmark ist nicht nur die Geburtsstätte der mononukleären
Phagozyten, ihnen fallen dort so wesentliche Aufgaben wie die Überwachung
des Wachstums und der Differenzierung sämtlicher Zelllinien mit Hilfe von
adhäsiven Molekülen sowie sezernierten Botenstoffen zu41.
17
Einleitung
___________________________________________________________________________
5.
Man kann zahlreiche Makrophagen in der Lamina propria sowohl des Dick- als
auch des Dünndarms73 und außerdem im Mukosa-assoziierten lymphoiden
Gewebe (MALT) der Darmwand beobachten45.
1.2.4 Wechselwirkungen zwischen Tumoren und Makrophagen
Untersuchungen haben ergeben, dass in den Leukozyteninfiltraten der meisten malignen
Tumoren unzählige Makrophagen nachzuweisen sind110, welche einen von anderen
Makrophagen-Populationen differierenden Phänotypen haben65. Diese Tumor-assoziierten
Makrophagen (TAMs) sind überdurchschnittlich häufig aktiviert106, haben eine anderes
Muster der Antigenexpression oder eine alterierte Zytokinsekretion als andere Populationen.
Da TAMs jedoch wie sämtliche heterogene Makrophagen-Populationen von im Blut
zirkulierenden Monozyten abstammen, scheint dieser abweichende Phänotyp von der
jeweiligen interagierenden Tumorzelllinie beeinflusst zu werden61.
Jedoch sind diese besonderen Aktivitätszustände der TAMs nicht unbedingt von Vorteil für
die Tumorbekämpfung. Das kann sogar so weit gehen, dass manche Tumorzellen in
bestimmten Stadien der Tumorprogression die TAMs insofern umzuerziehen vermögen, dass
sie Proliferation und Metastasierung durch unterschiedliche Mechanismen wie Ausschüttung
von Zytokinen oder Induktion der Angiogenese unterstützen25;69;123. Diese durch den Tumor
zu dessen Gunsten manipulierten Makrophagen werden auch als der „symbiontische“ Typ
bezeichnet. Es gibt aber auch Subtypen, die ihrer Aufgabe als Zellen der Immunabwehr trotz
dieser
Beeinflussung durch den Tumor gerecht werden und diesen bekämpfen: die
„cytotoxischen“ TAMs61. Durch die Ausprägung der gegensätzlichen Untergruppen hat das
Ausmaß des Makrophageninfiltrats somit in der Literatur für die Prognose eine äußerst
unterschiedliche Bedeutung24;64;103.
Eine weitere Variante der Interaktion zwischen neoplastischen Zellen und den TAMs ist in
Hinsicht auf die Rolle der Apoptose von besonderem Interesse: Tumorzellen exprimieren
FasL, welcher bei den Makrophagen Apoptose auslöst und sie somit „aus dem Verkehr
zieht“- die sogenannte „Tumor-Gegenattacke“63.
18
Einleitung
___________________________________________________________________________
1.3 Endotoxin
Die Lipopolysaccharide (LPS) oder auch Endotoxine sind ein natürlicher Bestandteil der
Zellwand gram-negativer Bakterien. Sie sind aus einer Kernzone mit einer bei allen
Salmonellen
übereinstimmenden
Polysaccharidzusammensetzung,
einer
O-spezifischen
Seitenkette, welche als antigene Determinante fungiert und dem Phospholipidanker, dem
toxischen Lipid-A, aufgebaut.
Bei Zerstörung der Zellwand eines Bakteriums werden die Endotoxine freigesetzt und können
ihre toxische Wirkung entfalten: Zum Beispiel können Makrophagen durch die Assoziation
von CD14-Rezeptoren und dem Toll-Like Receptor 4 (TLR4) auf ihrer Oberfläche die LPSAntigenstruktur
als
körperfremd
erkennen,
werden
aktiviert
Entzündungsreaktion durch Zytokine wie IL 1, IL 6 oder TNF-α aus
und
Die Toxizität des LPS ist jedoch stark konzentrations- und zeitabhängig
lebensnotwendige
Funktion
von
LPS
sowie
anderen
eine
.
105
eine
lösen
60;104
, und es wird sogar
mikrobiellen
Produkten
angenommen, welche durch die Erkennung von konservierten Pathogen-assoziierten
molekularen Strukturen Einfluss auf die Entwicklung des „angeborenen“ Immunsystems
nehmen2.
Für
die
Identifizierung
solcher
möglicherweise
pathogenen
Strukturen
sind
Zelloberflächenrezeptoren unerlässlich. Die Annahme, dass für die Signaltransduktion von
LPS ausschließlich über CD14 vermittelt wird, wurde erst 1998 widerlegt, und durch ein weit
komplexeres Modell ersetzt: Zwar bleibt, wie schon zuvor bekannt, die Bindung des LPS/LPSBinding-Protein-Komplexes an den CD14-Rezeptor bestehen, jedoch folgt daraufhin eine
Annäherung des CD14-Rezeptors an den TLR4-Rezeptor, und erst dieser vermag dank seiner
transmembranären Domäne die Weiterleitung des LPS-Signals zu induzieren104. Außerdem
sind zusätzliche Moleküle wie MD-2 in noch ungeklärter Weise am Ablauf beteiligt, der
letztendlich über die Aktivierung von Nuklear-Faktor κB (NFκB) zu einer adäquaten Reaktion
der Zelle auf Endotoxin führt.
Die Bindung von Liganden an den TLR4-Rezeptor ist jedoch keineswegs LPS-spezifisch, es
binden noch mehrere weitere Moleküle wie HSP60 und -70 sowie Fibrinogen und
verschiedene Poly- und Oligosaccharide. Und auch für die Wirkung von LPS auf die jeweilige
Zelle scheint TLR4 nicht der einzige Signalvermittler zu sein: LPS bindet auch an andere
Zelloberflächenmarker und vermittelt nach Translokation ins Zytoplasma seine Wirkung über
Nod1 und -2104.
19
Einleitung
___________________________________________________________________________
1.4 Lewis-Lung-Karzinom
Das Lewis-Lung-Karzinom ist ein erstmals bei Mäusen beobachteter hochmaligner
Lungentumor,
welcher
für
seine
Fähigkeit,
die
wirtseigene
Immunsuppression
zu
unterdrücken, bekannt ist56. Zwar wird die Migration von Makrophagen gefördert, aber ihre
chemotaktische und tumorizide Aktivität wie auch die Proliferation von Lymphozyten wird
gehemmt120. Interessant ist die Fragestellung, wie diese Interaktion zustande kommtwerden die Immun- von den Karzinomzellen direkt induziert, oder spielen auch lösliche
Faktoren eine Rolle?
Die Förderung der Tumorausbreitung durch Prostaglandin E2118 sowie die Hemmung der
Aktivität von Lymphozyten und NK-Zellen scheint von den Karzinomzellen durch die
Sekretion löslicher Faktoren bewerkstelligt zu werden: die Makrophagen werden zur
Produktion von Prostaglandin E2 angeregt, welches sie selbst rückwirkend hemmt. Durch
diese Mechanismen erreicht das Lewis-Lung-Karzinom die Förderung von eigenem Wachstum
(Verdopplungszeit: ca. 21 h6) und Metastasierung119.
20
Einleitung
___________________________________________________________________________
1.5 Fragestellung
Mit der Einleitung wurde versucht, dem Leser einen Überblick über so komplexe Themen wie
die Apoptose und die Rolle des mononukleären Phagozytosesystems in der Immunabwehr zu
verschaffen. Ein besonderer Augenmerk wurde hierbei auf die Interaktionen zwischen
Makrophagen und Tumorzellen gerichtet: So sind für die Fragestellung unserer Arbeit vor
allem die Strategien des Immunsystems zur Beeinflussung von Tumorwachstum von
Interesse, da sich bei der „Manipulation“ von Makrophagen offenbar um einen bedeutsamen
Angriffspunkt der Tumorzellen zur Optimierung ihres Wachstums und ihrer Metastasierung
zu handeln scheint.
Dieser Thematik wird schon seit 1996 im Labor Freudenberg mithilfe von in vitro- und in
vivo-Versuchen mit den folgenden Ergebnissen nachgegangen: Als Ausgangssituation ergab
sich die Beobachtung, dass LEWIS-Lung-Tumorzellinjektion in die Milz von C57/BL6-Mäusen
bei den KUPFFER-Zellen der Leber eine Steigerung der Apoptoserate auslöste, welche mit
Hilfe von bcl2 und bax aufgezeigt werden konnte.
Des Weiteren erfolgte der Nachweis, dass die Apoptose von löslichem Tumorzellüberstand
ausging, der später über indirekte Methoden von M. Woisetschläger als FasL identifiziert
wurde34.
Da durch diese Experimente schon Einsichten in den Ablauf der Apoptose sowie die
Interaktion zwischen den Tumor- und Abwehrzellen gewonnen werden konnten, stellt sich
nun die Frage, mit welchen Mitteln die Makrophagen vor einem solchen Angriff der
Tumorzellen geschützt werden können.
Empirische Beobachtungen zeigten, dass sich bei Krebspatienten nach bakteriellen
Infektionen teilweise Regression der Tumoren nachweisen ließ, die auf die Wirkung von LPS
zurückzuführen war18. Die vorliegende Arbeit befasst sich mit der Frage, ob auch unter den
Bedingungen des bereits im Labor Freudenberg etablierten in vitro-Modells eine Änderung
des Apoptoseverhaltens der Makrophagen nach Stimulation mit LPS erfasst werden kann.
21
Material und Methoden
__________________________________________________________________________
2 MATERIAL UND METHODEN
2.1 Übersicht der Versuchsanordnungen
2.1.1 Apoptoseinduktion bei Makrophagen
In der Literatur sind viele Hinweise zu finden, die eine apoptoseinduzierende Wirkung von
Fas auf Makrophagen beweisen. Diese grundlegende Aussage wurde in folgender Art und
Weise als Ausgangspunkt für den vorliegenden Versuchsaufbau übernommen:
Es wurde ein in vitro Modell mit C57/BL6 Mausstammzellen verwendet, welche durch ein
selektives
Verfahren
bis
zu
einer
annähernden
Reinkultur
von
ausdifferenzierten
Makrophagen kultiviert werden konnten. Analog der im Labor des Pathologischen Instituts
von Prof. Freudenberg etablierten Methode wurden die Makrophagen an zwei verschiedenen
Kulturtagen mit Tumorzellüberstand aus 3-LL-Tumorzellen respektive als Kontrollversuch mit
dem Kulturmedium der Tumorzellen für jeweils zwölf Stunden inkubiert. Im Anschluss wurde
der Effekt dieser Behandlung anhand einer immunzytochemischen Färbung mit den
bekannten Apoptoseantigenen (bcl2, bclx, bax) ausgewertet. Hierbei wurden sowohl der
zeitliche Verlauf durch die unterschiedliche Kulturdauer als auch die Quantität der Expression
berücksichtigt, um den Apoptosevorgang adäquat beschreiben zu können.
2.1.2 Endotoxinwirkung
Im Besonderen wurde hier die Wirkung des Endotoxins aus dem Bakterienstamm Salmonella
abortus equi auf die Makrophagen untersucht. Das Endotoxin bzw. das Kontrollmedium
DMEM wurden schon eine Stunde vor der Inkubation mit Tumorzellüberstand zugegeben, so
dass eine eventuelle vorzeitige Interaktion des Toxins mit den apoptoseinduzierenden
Faktoren ausgeschlossen werden konnte.
Um den Effekt des Lipopolysaccharids (LPS, 1µg/ml Makrophagensuspension) auf die
apoptotische Wirkung des Tumorzellüberstands genau definieren zu können, wurden
folgende vier Versuchsansätze verwendet.
-Kontrollversuch: Makrophagenmedium + Medium zur Tumorzellkultur
-Kontrollversuch für Tumorzellüberstand: Makrophagenmedium + Tumorzellüberstand
-Kontrollversuch für LPS: Endotoxin + Medium zur Tumorzellkultur
-Versuch: Endotoxin + Tumorzellüberstand
Der genaue Versuchsablauf wird unter 2.3 beschrieben.
22
Material und Methoden
__________________________________________________________________________
2.2 3-LL Tumorzellen
2.2.1 Gewinnung des Tumorzellüberstands
Die 3-LL Tumorzellen wurden von der Firma Cell Line Services Heidelberg Deutschland
bezogen. In einem Cryotube auf Trockeneis geliefert, wurden die Zellen (Zelldichte: 1×107
/ml) bei 37° C aufgetaut, mit 20 ml Kulturmedium (ISCOVE’S basal Medium, s. 2.6, Tab. 6)
in
einer
Kulturflasche
(Tab.
6)
suspendiert
und
für
24
h
bei
37°
C
und
feuchtigkeitsgesättigter Atmosphäre mit 8% CO2 bebrütet. Am Folgetag wurden die Zellen
mehrere Male gewaschen (Zentrifugation bei 300 g, 4° C für 8 min, Überstand verwerfen,
Resuspension mit DMEM (Tab. 4)), um Rückstände des toxischen Einfriermediums DMSO
(10% in Ursprungslösung) zu beseitigen. Am jeweils fünften Kulturtag wurden die Zellen nun
im Verhältnis 1:4 umgesetzt, d.h. 25% Volumenanteil Tumorzellsuspension mit 75%
Kulturmedium. Nach zehnmaligem Passagieren der Tumorzellen wurde die Zelllösung durch
Zentrifugieren (300g bei 4° C für 8 min, Auffangen des Überstands, Verwerfen der Zellen,
weitere Zentrifugation bei 4000g bei 4° C für 30 min) von allen festen Bestandteilen befreit.
Der gewonnene Tumorzellüberstand (TZÜ) wurde sterilfiltriert (Sterilfilter 22µm, Tab. 6), in
Blue-Cap-Röhrchen (Tab. 6) abgefüllt und bei –80° C bis zum weiteren Gebrauch
tiefgefroren.
23
Material und Methoden
__________________________________________________________________________
2.3 Makrophagen
2.3.1 Gewinnung
Die Mausmakrophagen, welche die Grundlage für die in vitro Versuche lieferten, stammten
aus 6-8 Wochen alten C57/BL6 Mäusen, und wurden uns freundlicherweise von Herrn Dr.
Galanos, wissenschaftlicher Leiter am Max-Planck-Institut für Immunbiologie in Freiburg, zur
Verfügung gestellt. Zur Isolierung der Makrophagen wurden die Knochenmarksstammzellen
der Mäuse wie folgt gewonnen: Unter Isoflurannarkose erfolgte die Luxation der
Halswirbelsäule, damit nach Desinfektion
beide Femurknochen freipräpariert werden
konnten. Diese wurden an den Epiphysen abgetrennt, so dass das Knochenmark mit den
Stammzellen durch Ausspülen des Markkanals mit DMEM als Zellsuspension aufgefangen
werden konnten. Nun wurde bei 300g und 4° C für 8 min zentrifugiert, der Überstand
verworfen und das Sediment mit DMEM resuspendiert. Nach Wiederholung dieses Vorgangs
wurden durch Zusatz von Zap-o-Globin (Tab. 5) unerwünschte Erythrothrozyten lysiert. Die
Konzentration der Zellen wurde mithilfe des Coulter-counters auf 1×106 /ml Kulturmedium
eingestellt und die Suspension in sterile Teflonbeutel eingebracht. Auf Eis wurden diese
anschließend
ins
Pathologische
Institut
Freiburg
transportiert
und
bei
37°C
und
feuchtigkeitsgesättigter Atmosphäre mit 8% CO2 kultiviert. Der im Kulturmedium enthaltene
Granulocyte-Macrophage-colony-stimulating-factor (GM-CSF) ermöglichte den Erhalt einer
nahezu reinen Makrophagenkultur.
2.3.2 GM-CSF
GM-CSF ist der Hauptbestandteil des vom MPI IB Freiburg zur Verfügung gestellten LConditioned-Medium, welches dort folgendermaßen hergestellt wurde:
In hydrophoben Teflonbeuteln erfolgte die Kultivierung von L-Zellen -einer Tumorlinie aus L
929 S Maus-Fibroblasten- in einer Konzentration von 2×105 Zellen/ml DMEM mit 10% fetalem
Kälberserum (FCS, Tab.4). Nach einer Woche wurde der Überstand abgenommen, mehrmals
zentrifugiert und sterilfiltriert, um eine maximale Reinigung zu erreichen. Das so gewonnene
L-Conditioned-Medium wurde aliquotiert und bis zur Verwendung bei -80° C gelagert.
24
Material und Methoden
__________________________________________________________________________
2.3.3 Inkubation mit Endotoxin aus Salmonella abortus equi
Am 10. und 12. Kulturtag wurden 20 ml der Makrophagensuspension unter sterilen
Bedingungen aus dem Teflonbeutel entnommen und jeweils 10 ml in zwei Blue-CapRöhrchen (Tab.5) verschiedenen Prozeduren unterworfen: Dem Versuchsansatz wurden 10
µl LPS-Lösung aus Salmonella abortus equi (Stimulierung: 1mg/ml in PBS) und 90 µl DMEM
hinzugefügt. Dem Kontrollversuch wurden 100 µl DMEM beigegeben, anschließend wurden
beide Ansätze für eine Stunde im Brutschrank inkubiert.
2.3.4 Inkubation mit 3-LL-Überstand
Nach abgelaufener Inkubationszeit wurden die beiden Ansätze zu 10 ml in je zwei zu 5 ml
überführt: Je ein LPS- sowie ein LPS-Kontrollversuch wurde mit 0,5 ml (10% Volumen) des
Tumorzellüberstands, die beiden anderen Ansätze als TZÜ-Kontrollversuch mit 0,5 ml
ISCOVE’S (Tab. 6) für 12 h im Brutschrank inkubiert (Abb. 5).
20ml Makrophagensuspension
10ml MØ + 10µl LPS + 90µl DMEM
10ml MØ + 100µl DMEM
1 h Inkubation
1
4
5ml MØ inkl.LPS + 0,5ml TZÜ
2
1
2
3
4
5ml MØ inkl.LPS + 0,5ml ISC
3
5ml MØ + 0,5ml TZÜ
5ml MØ + 0,5ml ISC
Versuch: Endotoxin + Tumorzellüberstand
TZÜ-Kontrollversuch: Endotoxin + Medium zur Tumorzellkultur
Kontrollversuch: Makrophagenmedium + Medium zur Tumorzellkultur
LPS-Kontrollversuch: Makrophagenmedium +Tumorzellüberstand
MØ= Makrophagensuspension
LPS= Endotoxin aus Salmonella abortus equi/ Lipopolysaccharid
TZÜ= Tumorzellüberstand
DMEM= Makrophagenmedium (Tab. 6)
ISC= Medium zur Tumorzellkultur
Abbildung 5: Versuchsaufbau
25
Material und Methoden
__________________________________________________________________________
2.3.5 Ernte und Fixierung
Nach zwölfstündiger Inkubation wurden die Zelluspensionen zweimal gewaschen: Die BlueCap-Röhrchen mit den vier oben beschriebenen Ansätzen wurden bei 300g und 4° C für 8
min zentrifugiert und mit DMEM resuspendiert. Die Zellkonzentration der Lösung wurde nun
mit Hilfe einer Zählkammer auf 1×106 Zellen/ml eingestellt und mit je 15 µl pro Reaktionsfeld
auf vorbereitete Adhäsionsobjektträger (Fa.
Marienfels) aufgebracht. Nach zehnminütiger
Sedimentation auf der Schwenkplatte wurde die Flüssigkeit abgesaugt und die Zellen mit
GDA (Glutardialdehyd, Tab. 7) fixiert (15 min bei Zimmertemperatur). Danach wurden die
Objektträger in Küvetten 3×5 min gewaschen und mit NAG-Medium (Tab. 9) konserviert bis
zur weiteren Verarbeitung bei 4° C in der feuchten Kammer aufbewahrt.
Die verwendeten Adhäsionsobjektträger wurden nach einem Verfahren hergestellt10, welches
folgende methodische Vorzüge gewährleistet: 12 Einzelfelder, welche durch hydrophobe
Anteile
voneinander
abgegrenzt
sind,
ermöglichen
die
Durchführung
mehrerer
immunzytochemischer Versuche auf einem Objektträger. Der Boden der Reaktionsfelder
besteht aus einer hydrophilen Schicht, auf der die Zellen durch elektrostatische Kräfte haften
(siehe auch 4.1.1.3.2).
26
Material und Methoden
__________________________________________________________________________
2.4 Immunzytochemische Färbung
2.4.1. Antikörper
Die immunzytochemische Färbung zur Detektion und zahlenmäßigen Bestimmung der Zellen
mit Expression der Apoptose-assoziierten Antigene bcl-2, bcl-x und bax ist primär von der
Bindung durch die jeweiligen Antikörper abhängig. Hierfür wurden polyklonale Erst- und
Zweitantikörper verwendet; die Reaktion wurde durch die nachfolgend beschriebene ABCMethode (2.4.2) für die Auszählung unter dem Lichtmikroskop sichtbar gemacht. Eine
Übersicht über die Antikörper ist in Tab. 1 dargestellt.
Tabelle 1: Übersicht über Erst- und Zweitantikörper
Antigen
1. Antikörper
2. Antikörper
Methode
bcl-2
Polyclonal, Rabbit
Goat anti Rabbit
ABC + TyramidVerstärkung
Zu
bcl-x
Polyclonal, Rabbit
Goat anti Rabbit
ABC
bax
Polyclonal, Rabbit
Goat anti Rabbit
ABC
Beginn
der
Versuche
wurden
in
Verdünnungsreihen
und
Testfärbungen
die
Konzentrationen der benötigten Erstantikörper optimiert. Die Ergebnisse hiervon und die
Hersteller der Antikörper sind aus Tab. 2 ersichtlich.
Tabelle 2: Konzentration des Erstantikörpers
Antikörper
Verdünnung
Hersteller
bcl-2 aus Rabbit
1: 200
Fa. Oncogene
bcl-x aus Rabbit
1: 200
Fa. Pharmingen
bax aus Rabbit
1: 200
Fa. Pharmingen
27
Material und Methoden
__________________________________________________________________________
Die Bestimmung der verschiedenen Zweitantikörperkonzentrationen unterlag einem analogen
Auswahlverfahren. Die ermittelten Verdünnungen verstehen sich inklusive des 10%igen
Ziegenserums, welches eine Stunde vor der Reaktion mit dem Zweitantikörper zugegeben
wurde, um unspezifische Bindungen desselben zu verhindern (Tab. 3).
Tabelle 3: Konzentration des Zweitantikörpers
Antikörper
Verdünnung
Hersteller
Goat anti Rabbit (bcl-2)
1:600 incl. 10 % Serum
Fa. Vector
Goat anti Rabbit (bcl-x)
1:400 incl. 10 % Serum
Fa. Vector
Goat anti Rabbit (bax)
1:300 incl. 10 % Serum
Fa. Vector
2.4.2 ABC-Methode
Diese immunhistochemische Standardmethode wurde für alle Färbungen -bcl2, bclx und baxverwendet. Die spezifische Anfärbung beruht auf einer chemischen Reaktion zwischen dem
biotinylierten Zweitantikörper, dem Biotin-gekoppelten Enzym (Peroxidase) und dem
Farbsubstrat Äthylaminocarbazol (EAC, Tab. 10) mit einer zusätzlichen Verstärkung durch
Osmiumtetroxid, welches nach abgelaufener Kopplungsreaktion zuletzt hinzugefügt wurde
(Abb.6). Bei der bcl-2 Färbung wurde zusätzlich zur Verbesserung des Färbeergebnisses die
Tyramidverstärkung angewandt (2.4.3)
28
Material und Methoden
__________________________________________________________________________
Peroxidase/EAC/Osmium
Biotin-Avidin-Komplex
Zweitantikörper
Erstantikörper
Antigen
Abbildung 6: Prinzip der ABC-Methode
Die genaue Vorgehensweise der ABC-Methode wurde nach dem folgenden Protokoll
durchgeführt:
1. Waschen der mit NAG bedeckten Objektträger mit PBS (Tab. 8) in Küvetten: 3×5 min
2. Auftragen von 10%igem Bovinem Serumalbumin (BSA, Tab. 9) zur Abdeckung
unspezifischer Bindungsstellen: 30 min
3. Absaugen des Serums
4. Auftragen des Erstantikörpers (15 µl) und Inkubation in der feuchten Kammer: 12h
5. Absaugen und Waschen mit PBS in Küvetten: 3×5 min
6. Hemmung der endogenen Peroxidase durch Einstellen der Objektträger in Küvetten
mit Perhydrollösung (Methanol mit 1% Wasserstoffperoxid, Tab. 10): 30 min
7. Waschen mit PBS (s.o.)
8. Auftragen des biotinylierten Zweitantikörpers: 30 min
9. Waschen mit PBS
10. Auftragen der ABC-Lösung (Verdünnungslösung A:B:C für bclx und bax =1:1:500,
analog für bcl2 =5:5:500, 30 min vorher ansetzen): 30 min
29
Material und Methoden
__________________________________________________________________________
11. Waschen mit PBS
12. Auftragen der Äthylaminocarbazol-Lösung (EAC, Tab. 10): 10 min
13. Absaugen des EAC und Waschen mit PBS
14. Auftragen von Osmiumtetroxid (Tab. 10) zur Verstärkung der Farbreaktion (auf Eis,
da Osmium stark flüchtig): 5 min
15. Absaugen des Osmiums und Waschen mit PBS
16. Eindecken der Objektträger mit Glyceringelatine (Tab. 10)
Beim Umgang mit EAC und Osmium wurde unter dem Abzug gearbeitet und die Substanzen
entsprechend entsorgt, um gesundheitliche Risiken zu minimieren.
2.4.3 Tyramidverstärkung
Da das Färberesultat beim bcl2-Antigen nach der ABC-Standardmethode schwach ausfiel,
wurde die Tyramidverstärkung zusätzlich in das Protokoll aufgenommen. Sie basiert auf einer
weiteren Verzweigung der durch den Avidin-Biotin-Komplex angebotenen Bindungsstellen für
das Farbsubstrat durch biotinylierte Tyramidmoleküle wie aus Abb. 7 ersichtlich. Das
Färbeprotokoll für bcl-2 unterscheidet sich somit von der Standardmethode durch folgende
Arbeitsschritte, die nach 8. eingefügt wurden:
a. Nach Entfernung des überschüssigen Zweitantikörpers durch Waschen mit PBS (s.o.)
wurde mittels TNB-Puffer (Tab. 11) ein Biotin-Block durchgeführt: 30 min
b. Waschen, Auftragen der ABC-Lösung (bcl2 =5:5:500): 30 min
c. Waschen, Auftragen der Tyramidverstärkung (24 µl Biotin-Tyramid, 588 µl
Amplification Diluent, 588 µl Aqua dest., Tab. 11): 10 min
d. Waschen, weiteres Verfahren laut Standardprotokoll siehe oben ab 10.
30
Material und Methoden
__________________________________________________________________________
Peroxidase/EAC/Osmium
Tyramid
Biotin
Avidin
Zweitantikörper
Erstantikörper
Antigen
Abbildung 7: Prinzip der Tyramidverstärkung
31
Material und Methoden
__________________________________________________________________________
2.5 Auswertung
2.5.1 Kontrollen
Es wurde für jedes Reaktionsfeld ein zugehöriges Kontrollfeld angelegt. Bei dieser
sogenannten Negativkontrolle wurde während der Färbung nicht-immunogenes Serum aus
dem Tier, aus welchem der Erstantikörper stammte, in der dem Antikörper entsprechenden
Proteinkonzentration aufgetragen. Sämtliche anderen Arbeitsschritte wurden entsprechend
dem Protokoll ausgeführt. Durch diese Methode konnten unerwünschte unspezifische
Bindungen des Zweitantikörpers ausgeschlossen werden.
2.5.2 Auszählung und Statistik
Zuerst wurden die jeweiligen Kontrollfelder zu Sicherung der Ergebnisse hinsichtlich
unspezifischer Anfärbung begutachtet. Konnte diese ausgeschlossen werden, wurde
folgendermaßen weiter verfahren: Mit Zufallszahlen wurden Sichtfelder ausgewählt und mit
Okularen, welche eine zusätzliche Abgrenzung des Sichtfeldes erlaubten, positive und
negative Zellen ausgezählt. Hierbei wurden nur diejenigen berücksichtigt, die eine eindeutige
Anfärbung aufwiesen und morphologisch intakt waren; die Zählmethode wurde durch einen
Zweituntersucher bestätigt. Pro Färbung wurden so 2000 Zellen ausgezählt und die
verschiedenen Versuchsansätze mittels Standardabweichung und dem Zwei-Stichproben-tTest für unverbundene Stichproben miteinander verglichen.
32
Material und Methoden
__________________________________________________________________________
2.6 Reagenzien
Tabelle 4: Für die Herstellung des Makrophagen-Kulturmediums benötigte Materialien
Substanz
Menge
Hersteller
DMEM (Dulbecco’s Modified
260 ml
Fa. CC pro
150 ml
Am MPI IB Freiburg hergestellt
50 ml
Fa. Sigma
Horse Serum
25 ml
Fa. Seromed
Penicillin 50
5 ml
Fa. Gibco
L-Glutamin
5 ml
Fa. Gibco
Na-Pyruvat
5 ml
Fa. Gibco
Mercaptoethanol
1 ml
Fa. Roth
Eagle Medium)
GM-CSF (GranulocyteMacrophage-colonystimulating-factor)
FCS (Fetal Calf Serum); vor
Gebrauch 30 min bei 4°C
(komplement-) inaktiviert
I.E./Streptamycin 50 µg
Tabelle 5: Weitere zur Kultivierung der Makrophagen benötigte Materialien
Substanz
Menge/Größe
Zap-o-Globin
3 Tropfen
Fa. Coulter Electronics
Teflonbeutel
60-120 ml
Fa. Heraeus
Zähler Coulter-Counter
Blue-CapZentrifugationsröhrchen
Hersteller
Fa. Coulter Electronics
50 ml
Fa. Becton Dickinson
33
Material und Methoden
__________________________________________________________________________
Tabelle 6: Materialien, die zur Herstellung von TZÜ benötigt wurden; wobei aus den nicht kursiv
gedruckten Substanzen das Kulturmedium hergestellt wurde
Substanz/Artikel
Menge/Größe
Hersteller
Sterilfilter
22 µm
Fa. Millipore
Kulturflaschen
50-600 ml
Fa. Greiner
Iscoves basal Medium
450 ml
Fa. Biomedia
FCS (Fetal Calf Serum)
50 ml
Fa. Sigma
L-Glutamin
5 ml
Fa. Sigma
Tabelle 7: Für die Fixierung der Makrophagen auf Marienfeld-Objektträgern benötigte
Materialien
Substanz
Hersteller
Glutardialdehyd, 25%
Fa. Merck
Äthanol-Fixans
BrdU-Kit, Fa- Boehringer Mannheim
Tabelle 8: Zur Herstellung von PBS benötigte Materialien
Substanz
Menge
NaCl
8g
Na2HPO4
1,4625 g
KH2PO4
0,245 g
Alle Substanzen wurden in 1000 ml Aqua bidest gegeben und mit 1N HCL auf pH 7,5 eingestellt.
Tabelle 9: Zur Herstellung von Natrium-Acetat-Puffer benötigte Materialien
Substanz
Menge
Stammlösung für Natrium-Acetat-Puffer
1:9
Die Stammlösung wird im Verhältnis 1:9 mit Acqua bidest aufgefüllt.
34
Material und Methoden
__________________________________________________________________________
Tabelle 10: Zur Herstellung von NAG-Medium benötigte Materialien
Substanz
Menge
Hersteller
NaN3, 10% in Aqua bidest
250 µl
Fa. Merck
Hepes Puffer, 1M, pH 8
2 ml
Fa. CC pro
Gelatine, 5%, vorgewärmt
1 ml
Fa. Riedel-de-Haen
BSA
250 µl
Fa. Biotest
Alle Substanzen wurden in 25 ml PBS gegeben.
Tabelle 11: Für die ABC-Methode benötigte Materialien
Substanz
Menge
Größe/Form
Hersteller
Seren
Goat Serum
Fa. Sigma
Sheep Serum
Fa. Sigma
Perhydrollösung:
H2O2
1 ml
1%
Fa. Merck
Methanol
99 ml
99%
Fa. Merck
ABC-Lösung
Avidin
2 µl
wird 30 min vor
Biotin
2 µl
Gebrauch angesetzt Fa. Vector
PBS
1 ml
Fa. Vector
Äthylaminocarbazol-Lösung
Äthylaminocarbazol
3 mg
DMSO/Triton
2 ml
Natrium-Acetat-Puffer
98 ml
Perhydrollösung, 30%
10 µl
Zuerst Äthylaminocarbazol in DMSO/Triton lösen, ad 100ml mit Natrium-Acetat-Puffer auffüllen.
Das Perhydrol wird erst unmittelbar vor Gebrauch hinzugefügt.
Osmiumlösung, 0,5%
Osmiumtetroxid, 2%
5 ml
Aqua bidest
15 ml
Fa. Sigma
Eindeckmedium
Glyceringelatine
Fa. Kaiser
35
Material und Methoden
__________________________________________________________________________
Tabelle 12: Für die Tyramidverstärkung verwendeten Substanzen
Substanz
Menge
Hersteller
Biotin-Tyramid
24 µl
Fa. Dako
Amplification Diluent
588 µl
Fa. Dako
Aqua bidest
588 µl
Fa. Dako
TNB-Puffer
TRIS-HCl, pH 7,5
0,1 M
NaCl
0,15 M
Blocking Reagent aus Kit
0,5 %
Auf 60°C erwärmen, Blocking Reagent darin auflösen.
Fa. Dako
36
Ergebnisse
___________________________________________________________________________
3 ERGEBNISSE
3.1 Immuncytochemischer Nachweis des antiapoptotischen bcl2Proteins an Makrophagen zu verschiedenen Kulturzeiten
Abbildung 8: Expression des bcl2-Proteins bei positivem Makrophagen (Pfeil, Vergrößerung
1000fach)
3.1.1 10. Kulturtag
3.1.1.1
Vergleich Kontrolle / Inkubation mit LPS
Abbildung 9 zeigt den Vergleich zwischen den zwei verschiedenen Versuchansätzen anhand
drei Kurven, welche die Versuche zu unterschiedlichen Zeitpunkten repräsentieren. Die
nahezu parallele Steigung um etwa 3% bedeutet, dass die Makrophagen der Kontrollgruppe
am 10. Kulturtag in der Tendenz eine geringere Expression des bcl2-Proteins aufweisen als
die mit LPS behandelten Makrophagen. Aus der nachfolgenden Tabelle 13 wird ersichtlich,
dass die mittels Student-t-Test ermittelte Prüfgröße das Signifikanzniveau nicht erreicht. Des
Weiteren sind die Einzelwerte der verschiedenen Versuche im Detail aufgelistet.
37
Ergebnisse
___________________________________________________________________________
22
20
18
16
%
Versuch 1
Versuch 2
14
Versuch 3
Versuch 4
12
10
8
6
Kontrolle
LPS
Abbildung 9: Dargestellt ist die Expression von Kulturmakrophagen für das bcl2-Antigen am 10.
Kulturtag ohne Vorbehandlung (Kontrolle) und nach LPS-Zusatz (LPS)
Tabelle 13: Ergebnisse der bcl2-Färbung nach Inkubation mit LPS sowie der Kontrollgruppe am
10. Kulturtag
Kontrolle
LPS + ISC
Differenz
% positiv
Versuch 1
Versuch 2
Versuch 3
Versuch 4*
Mittelwert
Standardabweichung
Prüfgröße
10,929
13,916
-2,987
9,803
12,919
-3,116
16,312
18,075
-3,797
(15,871)
(9,234)
(6,637)
16,18
17,782
-3,3
0,268
0,41
1,938
-3,405
Signifikanz für t2;0,975
(=4,3)
nein
*Aufgrund stark abweichender Werte wurde der vierte Versuch nicht in die Auswertung mit
einbezogen
38
Ergebnisse
___________________________________________________________________________
3.1.1.2
Vergleich Tumorzellüberstand / Tumorzellüberstand und LPS
Wie aus den gegenläufigen Kurven der Abbildung 10 sowie den zugehörigen Werten in
Tabelle 14 hervorgeht, ist zwischen den ausschließlich mit TZÜ vorbehandelten
Versuchsansätzen und den zusätzlich mit LPS inkubierten Ansätzen kein signifikanter
Unterschied nachzuweisen.
20
18
16
14
%
Versuch 1
Versuch 2
12
Versuch 3
Versuch 4
10
8
6
4
KontrolleTZÜ
LPS+TZÜ
Abbildung 10: Dargestellt ist die Expression von Kulturmakrophagen für das bcl2-Antigen am
10. Kulturtag nach Behandlung mit Tumorzellüberstand von Kontrollzellen (TZÜ) und nach LPSZusatz (LPS+TZÜ)
39
Ergebnisse
___________________________________________________________________________
Tabelle 14: Ergebnisse der bcl2-Färbung nach Inkubation mit TZÜ bzw. TZÜ und LPS am 10.
Kulturtag
TZÜ
LPS + TZÜ
Differenz
% positiv
Versuch 1*
(14,545)
(12,39)
(2,155)
Versuch 2
7,578
9,56
-1,982
Versuch 3
13,798
18,854
-5,056
Versuch 4
17,504
18,269
-0,765
Mittelwert
12,96
15,561
-2,601
Standardabweichung
5,016
5,205
2,348
Prüfgröße
-2,215
Signifikanz t2;0,975
(=4,3)
nein
*Aufgrund stark abweichender Werte wurde der erste Versuch nicht in die Auswertung mit
einbezogen
3.1.2 12. Kulturtag
3.1.2.1
Vergleich Kontrolle / Inkubation mit LPS
In Abbildung 11 kann am zwölften Kulturtag ein Anstieg der bcl2-Expression bei den mit
LPS behandelten Ansätzen beobachtet werden. Aus Tabelle 15 wird jedoch ersichtlich, dass
der Unterschied zwischen den mit LPS inkubierten und den Makrophagen der Kontrollgruppe
nicht signifikant ist.
40
Ergebnisse
___________________________________________________________________________
19
18
17
16
Versuch 1
15
%
Versuch 2
Versuch 3
14
Versuch 4
13
12
11
10
Kontrolle
LPS
Abbildung 11: Dargestellt ist die Expression von Kulturmakrophagen für das bcl2-Antigen am
12. Kulturtag ohne Vorbehandlung (Kontrolle) und nach LPS-Zusatz (LPS)
Tabelle 15: Ergebnisse der bcl2-Färbung nach Inkubation mit LPS sowie der Kontrollgruppe am
12. Kulturtag
Kontrolle
LPS + ISC
Differenz
% positiv
Versuch 1
12,83
15,968
-3,138
Versuch 2
12,581
14,634
-2,053
Versuch 3
16,934
18,209
-1,275
(17,4)
(14,328)
(3,072)
14,115
16,27
-2,155
2,444
1,807
2,723
Versuch 4*
Mittelwert
Standardabweichung
Prüfgröße
-2,952
Signifikanz für t2;0,975
(=4,3)
nein
*Aufgrund stark abweichender Werte wurde der vierte Versuch nicht in die Auswertung mit
einbezogen
41
Ergebnisse
___________________________________________________________________________
3.1.2.2
Vergleich Tumorzellüberstand / Tumorzellüberstand und LPS
Aus Abbildung 12 wird deutlich, dass die mit LPS vorbehandelten und dann erst mit TZÜ
versetzten Makrophagenkulturen einen größeren Prozentsatz an bcl2-positiven Zellen
aufweisen als die ausschließlich mit TZÜ behandelten Ansätze. Die errechnete Prüfgröße
beweist
die
Signifikanz
dieser
Aussage,
was
-wie
auch
die
entsprechenden
Einzeleregebnisse- aus Tabelle 16 zu entnehmen ist.
25
20
15
Reihe1
%
Reihe2
Reihe3
Reihe4
10
5
0
KontrolleTZÜ
LPS+TZÜ
Abbildung 12: Dargestellt ist die Expression von Kulturmakrophagen für das bcl2-Antigen am
12. Kulturtag nach Behandlung mit Tumorzellüberstand von Kontrollzellen (TZÜ) und nach LPSZusatz (LPS+TZÜ)
42
Ergebnisse
___________________________________________________________________________
Tabelle 16: Ergebnisse der bcl2-Färbung nach Inkubation mit TZÜ bzw. TZÜ und LPS am 12.
Kulturtag
TZÜ
LPS + TZÜ
Differenz
% positiv
Versuch 1
11,266
16,648
-5,382
Versuch 2
10,418
11,99
-1,572
Versuch 3
14,359
20,528
-6,169
Versuch 4
13,805
20,551
-6,746
12,462
17,429
-4,967
1,916
4,064
2,332
Mittelwert
Standardabweichung
Prüfgröße
-4,261
Signifikanz t3;0,975
(=3,18)
ja
43
Ergebnisse
___________________________________________________________________________
3.2 Immuncytochemischer Nachweis des antiapoptotischen bclxProteins an Makrophagen zu verschiedenen Kulturzeiten
Abbildung 13: Expression des bclx-Proteins bei positiven Makrophagen (Pfeile, Vergrößerung
1000fach)
3.2.1 10. Kulturtag
3.2.1.1
Vergleich Kontrolle / Inkubation mit LPS
Abbildung 14 zeigt anhand der abfallenden Kurven, dass die bclx-Expression bei den mit
LPS inkubierten Ansätzen niedriger ist als bei den entsprechenden Kontrollgruppen, wobei
dieser Unterschied nicht signifikant ist. Die Einzelergebnisse, auf welchen diese Aussage
basiert, können in Tabelle 17 eingesehen werden.
44
Ergebnisse
___________________________________________________________________________
70
65
60
55
%
Versuch 1
Versuch 2
50
Versuch 3
Versuch 4
45
40
35
30
Kontrolle
LPS
Abbildung 14: Dargestellt ist die Expression von Kulturmakrophagen für das bclx-Antigen am
10. Kulturtag ohne Vorbehandlung (Kontrolle) und nach LPS-Zusatz (LPS)
Tabelle 17: Ergebnisse der bclx-Färbung nach Inkubation mit LPS sowie der Kontrollgruppe am
10. Kulturtag
Kontrolle
LPS + ISC
Differenz
% positiv
Versuch 1
44,025
39,274
4,751
Versuch 2
61,026
59,476
1,55
Versuch 3
59,084
48,951
10,133
Versuch 4
63,381
53,703
9,678
56,879
50,351
6,528
8,748
8,547
4,117
Mittelwert
Standardabweichung
Prüfgröße
3,171
Signifikanz für t3;0,975
(=3,18)
nein
45
Ergebnisse
___________________________________________________________________________
3.2.1.2
Vergleich Tumorzellüberstand / Tumorzellüberstand und LPS
Die Behandlung der Zellkulturen mit TZÜ und LPS ruft in der Tendenz eine höhere
Expression des bclx-Antigens hervor als bei der ausschließlich mit TZÜ behandelten Gruppe,
wie in Abbildung 15 dargestellt. Eine Signifikanz konnte mittels der Tabelle 18 zu
entnehmenden Differenzen, Standardabweichungen und der Prüfgröße nicht nachgewiesen
werden. Außerdem sind nachfolgend die genauen Daten der einzelnen Versuche aufgelistet.
60
55
50
%
Versuch 1
Versuch 2
45
Versuch 3
Versuch 4
40
35
30
KontrolleTZÜ
LPS+TZÜ
Abbildung 15: Dargestellt ist die Expression von Kulturmakrophagen für das bclx-Antigen am
10. Kulturtag nach Behandlung mit Tumorzellüberstand von Kontrollzellen (TZÜ) und nach LPSZusatz (LPS+TZÜ)
46
Ergebnisse
___________________________________________________________________________
Tabelle 18: Ergebnisse der bclx-Färbung nach Inkubation mit TZÜ bzw. TZÜ und LPS am 10.
Kulturtag
TZÜ
LPS + TZÜ
Differenz
% positiv
Versuch 1
32,299
39,798
-7,499
Versuch 2
50,759
56,657
-5,898
Versuch 3
36,307
46,75
-10,443
(50,269)
(41,573)
(8,696)
39,788
47,735
-7,947
9,71
8,473
4,959
Versuch 4*
Mittelwert
Standardabweichung
Prüfgröße
-3,205
Signifikanz t2;0,975
(=4,3)
nein
*Aufgrund stark abweichender Werte wurde der vierte Versuch nicht in die Auswertung mit
einbezogen
3.2.2 12. Kulturtag
3.2.2.1
Vergleich Kontrolle / Inkubation mit LPS
Am zwölften Kulturtag zeigt die Kontrollgruppe einen größeren Anteil an bclx-positiv
angefärbten Zellen als die mit LPS behandelten Versuchsansätze, wie aus Abbildung 16
hervorgeht, wobei dieser Unterschied laut der in Tabelle 19 aufgeführten Werte als nicht
signifikant zu beurteilen ist.
47
Ergebnisse
___________________________________________________________________________
60
55
50
Versuch 1
45
%
Versuch 2
Versuch 3
40
Versuch 4
35
30
25
Kontrolle
LPS
Abbildung 16: Dargestellt ist die Expression von Kulturmakrophagen für das bclx-Antigen am
12. Kulturtag ohne Vorbehandlung (Kontrolle) und nach LPS-Zusatz (LPS)
Tabelle 19: Ergebnisse der bclx-Färbung nach Inkubation mit LPS sowie der Kontrollgruppe am
12. Kulturtag
Kontrolle
LPS + ISC
Differenz
% positiv
Versuch 1
44,157
39,277
4,88
Versuch 2
50,163
36,782
13,381
Versuch 3
32,457
30,372
2,085
Versuch 4
57,136
49,75
7,386
Mittelwert
45,978
39,045
6,933
Standardabweichung
10,459
8,062
4,813
Prüfgröße
2,881
Signifikanz für t3;0,975
(=3,18)
nein
48
Ergebnisse
___________________________________________________________________________
3.2.2.2
Vergleich Tumorzellüberstand / Tumorzellüberstand und LPS
Am zwölften Kulturtag kann kein Unterschied zwischen den verschiedenen Versuchsansätzen
nachgewiesen werden, da die in Abbildung 17 dargestellten Kurvenverläufe gegensätzlich
sind. Weitere Einzelheiten sind in Tabelle 20 aufgeführt.
55
50
45
40
%
Versuch 1
Versuch 2
35
Versuch 3
Versuch 4
30
25
20
15
KontrolleTZÜ
LPS+TZÜ
Abbildung 17: Dargestellt ist die Expression von Kulturmakrophagen für das bclx-Antigen am
12. Kulturtag nach Behandlung mit Tumorzellüberstand von Kontrollzellen (TZÜ) und nach LPSZusatz (LPS+TZÜ)
49
Ergebnisse
___________________________________________________________________________
Tabelle 20: Ergebnisse der bclx-Färbung nach Inkubation mit TZÜ bzw. TZÜ und LPS am 12.
Kulturtag
TZÜ
LPS + TZÜ
Differenz
% positiv
Versuch 1
47,514
53,348
-5,834
Versuch 2
21,422
16,207
5,215
Versuch 3
33,259
24,707
8,552
Versuch 4
31,105
31,571
-0,466
33,325
31,458
1,867
10,77
15,889
6,342
Mittelwert
Standardabweichung
Prüfgröße
0,589
Signifikanz t3;0,975
(=3,18)
nein
50
Ergebnisse
___________________________________________________________________________
3.3 Immuncytochemischer Nachweis des apoptotischen baxProteins an Makrophagen zu verschiedenen Kulturzeiten
Abbildung 11: Expression des bax-Proteins bei positiven Makrophagen (Pfeile, Vergrößerung
400fach)
3.3.1 10. Kulturtag
3.3.1.1
Vergleich Kontrolle / Inkubation mit LPS
Bei der bax-Färbung zeigt sich am 10. Kulturtag laut Abbildung 19 und Tabelle 21
folgendes Ergebnis: Die mit LPS behandelten Makrophagen weisen einen größeren Mittelwert
an Zellen, welche das bax-Protein exprimieren, auf als die Kontrollgruppe, jedoch ist diese
Differenz nicht signifikant.
51
Ergebnisse
___________________________________________________________________________
80
70
60
%
Versuch 1
Versuch 2
50
Versuch 3
Versuch 4
40
30
20
Kontrolle
LPS
Abbildung 19: Dargestellt ist die Expression von Kulturmakrophagen für das bax-Antigen am
10. Kulturtag ohne Vorbehandlung (Kontrolle) und nach LPS-Zusatz (LPS)
Tabelle 21: Ergebnisse der bax-Färbung nach Inkubation mit LPS sowie der Kontrollgruppe am
10. Kulturtag
Kontrolle
LPS + ISC
Differenz
% positiv
Versuch 1
64,499
72,095
-7,596
(45,759)
(43,806)
(1,953)
Versuch 3
34,799
47,361
-12,562
Versuch 4
48,588
50,997
-2,409
Mittelwert
49,295
56,818
-7,522
Standardabweichung
14,863
13,355
6,004
Versuch 2*
Prüfgröße
-2,506
Signifikanz für t2;0,975
(=4,3)
nein
*Aufgrund stark abweichender Werte wurde der zweite Versuch nicht in die Auswertung mit
einbezogen
52
Ergebnisse
___________________________________________________________________________
3.3.1.2
Vergleich Tumorzellüberstand / Tumorzellüberstand und LPS
Aus Abbildung 20 wird ersichtlich, dass zwischen den mit LPS und TZÜ behandelten und als
TZÜ-Kontrolle verwendeten Zellkulturen mit dargestellten gegenläufigen Kurven und den
korrespondierenden Differenzen, Standardabweichungen sowie der Prüfgröße (Tab. 22) kein
signifikanter Unterschied hinsichtlich der Expression des bax-Antigens besteht.
90
80
70
Versuch 1
60
%
Versuch 2
Versuch 3
50
Versuch 4
40
30
20
KontrolleTZÜ
LPS+TZÜ
Abbildung 20: Dargestellt ist die Expression von Kulturmakrophagen für das bax-Antigen am
10. Kulturtag nach Behandlung mit Tumorzellüberstand von Kontrollzellen (TZÜ) und nach LPSZusatz (LPS+TZÜ)
53
Ergebnisse
___________________________________________________________________________
Tabelle 22: Ergebnisse der bax-Färbung nach Inkubation mit TZÜ bzw. TZÜ und LPS am 10.
Kulturtag
TZÜ
LPS + TZÜ
Differenz
% positiv
Versuch 1
73,677
85,886
-12,209
Versuch 2
35,949
32,85
3,099
Versuch 3
29,237
25,871
3,366
Versuch 4
39,835
47,28
-7,445
Mittelwert
44,675
47,972
-3,297
Standardabweichung
19,824
26,802
7,787
Prüfgröße
-0,847
Signifikanz t3;0,975
(=3,18)
nein
3.3.2 12. Kulturtag
3.3.2.1
Vergleich Kontrolle / Inkubation mit LPS
Abbildung 21 zeigt, dass am zwölften Kulturtag zwischen den beiden Versuchsansätzen
hinsichtlich der Anzahl apoptotische Antigene exprimierender Makrophagen kein signifikanter
Unterschied besteht. Aus Tabelle 23 wiederum werden die gemessenen Einzelwerte
ersichtlich.
54
Ergebnisse
___________________________________________________________________________
85
75
65
%
Versuch 1
Versuch 2
55
Versuch 3
Versuch 4
45
35
25
Kontrolle
LPS
Abbildung 21: Dargestellt ist die Expression von Kulturmakrophagen für das bax-Antigen am
12. Kulturtag ohne Vorbehandlung (Kontrolle) und nach LPS-Zusatz (LPS)
Tabelle 23: Ergebnisse der bax-Färbung nach Inkubation mit LPS sowie der Kontrollgruppe am
12. Kulturtag
Kontrolle
LPS + ISC
Differenz
% positiv
Versuch 1
63,112
77,93
-14,818
Versuch 2
45,7
40,864
4,836
Versuch 3
35,4
47,361
-11,961
Versuch 4
50,475
47,261
3,214
48,672
53,354
-4,682
11,5
16,664
10,143
Mittelwert
Standardabweichung
Prüfgröße
-0,923
Signifikanz für t3;0,975
(=3,18)
3.3.2.2
nein
Vergleich Tumorzellüberstand / Tumorzellüberstand und LPS
Die bax-Färbung der Versuche nach Behandlung mit TZÜ und LPS beweist, wie in Abbildung
22 aufgezeigt, eine niedrigere Expression des Antigens als nach ausschließlicher Inkubation
55
Ergebnisse
___________________________________________________________________________
mit TZÜ. Dieser Unterschied ist statistisch signifikant, was aus der in Tabelle 24
aufgeführten Prüfgröße ersichtlich wird.
75
70
65
60
%
55
Versuch 1
Versuch 2
50
Versuch 3
Versuch 4
45
40
35
30
25
KontrolleTZÜ
LPS+TZÜ
Abbildung 22: Dargestellt ist die Expression von Kulturmakrophagen für das bax-Antigen am
12. Kulturtag nach Behandlung mit Tumorzellüberstand von Kontrollzellen (TZÜ) und nach LPSZusatz (LPS+TZÜ)
Tabelle 24: Ergebnisse der bax-Färbung nach Inkubation mit TZÜ bzw. TZÜ und LPS am 12.
Kulturtag
TZÜ
LPS + TZÜ
Differenz
% positiv
Versuch 1
69,773
65,292
4,481
Versuch 2
59,019
43,493
15,526
Versuch 3
40,119
35,533
4,586
Versuch 4
57,088
46,544
10,544
56,5
47,716
8,784
12,264
12,604
5,313
Mittelwert
Standardabweichung
Prüfgröße
3,307
Signifikanz für t3;0,975
(=3,18)
ja
56
Diskussion
___________________________________________________________________________
4 DISKUSSION
4.1 Diskussion der Methoden
Die vorliegende Arbeit zeigt die Ergebnisse eines in vitro-Modells mit Mausmakrophagen,
welches unterschiedliches Apoptoseverhalten nach Stimulation nachweisen soll.
Dieses Modell wurde, um die Reproduktion der Experimente und quantitative Aussagen zu
ermöglichen, auf der Grundlage von Kulturmakrophagen, Tumorzellüberstand von LEWISLung-Karzinomzellen als Apoptose auslösendem Agens und LPS als Stimulans (1µg/ml
Makrophagenmedium) etabliert.
Nachfolgend sollen Vorzüge und Nachteile dieses Versuchsaufbaus sowie die Resultate auch
hinsichtlich der zu diesem Thema bereits veröffentlichten Literatur besprochen werden.
4.1.1 Versuchsaufbau
4.1.1.1
Makrophagenkultur
Wie schon in der Einleitung erwähnt, sind Makrophagenpopulationen sowohl bezüglich ihrer
Verteilung im Körper als auch ihrer Funktion sehr heterogen(90). Die Ausbildung
verschiedener Phänotypen unterliegt dabei unzähligen Faktoren, die die Eigenschaften der
Subpopulation dem jeweiligen Standort oder auch der jeweiligen Aufgabe entsprechend
beeinflussen. Um diese Wechselwirkungen genauer untersuchen zu können, wurden
verschiedene Arten der Makrophagenkultivierung etabliert: Zum Beispiel entwickelten Goud
et
al.
und
Summer
et
al.
ein
Modell
zur
Züchtung
von
Makrophagen
aus
Knochenmarksstammzellen in flüssigem Medium(36). So wie viele erweiterte Kulturmethoden
basiert auch der Versuchsaufbau der vorliegenden Arbeit auf diesem bereits bekannten
Modell, wobei Einzelheiten den besonderen Begebenheiten angepasst wurden.
Eine Besonderheit bei der Kultivierung von Makrophagen ergibt sich aus deren Fähigkeit zur
Adhärenz an vielen in der Forschung verwendeten Materialien. Um dies zu verhindern und
ein problemloses Entnehmen der Zellen aus dem Kulturgefäß zu gewährleisten, wurde mit
Teflonbeuteln gearbeitet. Als Kulturmedium hat sich das auch im MPI Freiburg
standardmäßig benutzte Plutznik-Medium bewährt, welches ideale Wachstumsbedingungen
schafft und durch einen hohen Gehalt an GM-CSF (L-Conditioned-Medium, s. 2.3.2) hilft, eine
57
Diskussion
___________________________________________________________________________
reine Makrophagenkultur zu erhalten: GM-CSF unterstützt die Differenzierung und
unterdrückt apoptotische Vorgänge bei Makrophagen -nicht jedoch bei Granulozyten(93)durch Hochregulation von bcl2 und bclx und Herunterregulation von bax(53, 98).
Die Kulturdauer von 10 bzw. 12 Tagen wurde vom Labor Freudenberg nach Bestimmung
der Zellvitalität, Proliferation, Phagozytoseaktivität und Reife gewählt: Vor allem die
abnehmende Anzahl von vitalen Zellen ab dem 12. Tag bei gleichbleibend geringer
Proliferationsrate und nahezu 100%igem Anteil an reifen, zur Phagozytose befähigten
Makrophagen hat zur Wahl des 10. und 12. Kulturtages bewogen.
4.1.1.2
Inkubation
4.1.1.2.1 mit Endotoxin
Wie schon in der Einleitung angedeutet, ist die Wirkung von LPS stark konzentrations- und
zeitabhängig. Deshalb wurden die zugegebene LPS-Dosis sowie die Dauer der Vorinkubation
nach den im MPI-IB in Freiburg für die Stimulation von Makrophagen angewandten
Verfahren gewählt. Eine Aktivitätssteigerung durch LPS wie die erhöhte Ausschüttung von IL1β und IL6 konnte auch schon im Besonderen bei tumorassoziierten Makrophagen mit
antitumoröser zytotoxischer Wirkung beschrieben werden(15);(61). Es stellt sich jedoch die
Frage, ob nicht in vivo sogar eine primär nicht toxische LPS-Dosis, die aber ausreicht, um
Makrophagen zu stimulieren, sie nicht sekundär über Feedback-Mechanismen zur Apoptose
bringen kann. Für die Regulation physiologischer Abläufe wäre eine derartige Regulation
durchaus von Nutzen zur Eindämmung entzündlicher Immunvorgänge.
4.1.1.2.2 mit Tumorzellüberstand
Die bekannten Wechselwirkungen zwischen Tumoren und Makrophagen sind in Kapitel 1.2.4
bereits ausführlich erläutert worden. Um das Apoptoseverhalten der Makrophagen bezüglich
ihrer Tumorinteraktionen gut beobachten zu können, eignet sich die Tumorzelllinie des
LEWIS-Lung-Karzinoms ausgezeichnet, da Freudenberg et al. bereits durch in vivo Versuche
Erkenntnisse über das Metastasierungsverhalten der hochmalignen LLK-Zellen und ihre
Auswirkungen auf die Makrophagenpopulationen gewinnen konnten. So nahm der Anteil der
KUPFFER-Zellen an den Nicht-Parenchymzellen des hepatischen Microenvironments bei
Metastasierung des Karzinoms in die Leber signifikant ab. Außerdem beschreibt das von H.
58
Diskussion
___________________________________________________________________________
Axt, M. Woisetschläger und J. Wolff im Labor Freudenberg etablierte in vitro-Modell analog
den hier vorgestellten Versuchsmethoden eine signifikante Zunahme der Apoptoserate nach
Inkubation der Makrophagen mit dem von LLK-Zellen gewonnenen Überstand(34). Die
Verwendung des Tumorzellüberstands (TZÜ) anstelle von Zellkulturen wurde u. a. aufgrund
der Annahme gewählt, dass die Makrophagen am Zielort der Metastasierung durch in
gelöster Form vorliegende Faktoren beeinflusst werden.
Die Inkubationszeit mit TZÜ von 12 h ergab sich ebenfalls aus den oben erwähnten in vitro
Versuchen, bei denen sich nach 12 h bei den unterschiedlichen Apoptosemarkern insgesamt
die besten Ergebnisse zeigten.
4.1.1.3
Färbemethoden
4.1.1.3.1 Wahl der Apoptosemarker
Die komplexen Regulationsmechanismen der Apoptose sind im ersten Kapitel dieser Arbeit
(1.1.4) bereits beschrieben. Durch intensive Forschung auf dem Gebiet der bcl2-Familie
konnten
Erkenntnisse
über
die
Proteinstruktur
Wirkmechanismus gewonnen werden. Dieses
und
Ansätze
im
Verständnis
des
Wissen und die Vergleichsmöglichkeit mit
anderen Studien über Apoptosevorgänge in Kulturmakrophagen hat die Entscheidung für
bcl2, bclx und bax als Indikatoren positiv beeinflusst. Vor allem die Tatsache, dass die
ausgewählten Proteine an verschiedenen Stellen der genetischen Regulation eingreifen,
erlaubt prinzipiell sehr interessante Aussagen, da sie zusätzlich Hypothesen über den Ablauf
der Apoptose selbst ermöglicht.
Auch die gegensätzlichen Regulationsvorgänge, die durch bcl2 und bclx als Vertreter der
antiapoptotischen Subfamilie auf der einen Seite und bax als Proapoptosemarker auf der
anderen gesteuert werden, sind insofern wichtig, als dass sie als zusätzliche Bestätigung der
Teilaussagen der anderen Marker herangezogen werden können.
Nicht zuletzt bot auch die kommerzielle Verfügbarkeit Gründe für die Wahl der verwendeten
Vertreter der bcl2-Familie.
4.1.1.3.2 Bross-Methode
Es
bestehen
zahlreiche
immunzytochemischen
Vorteile
Verfahren(10):
der
Bross-Methode
Zunächst
einmal
gegenüber
ist
die
herkömmlichen
Verwendung
von
Adhäsionsobjektträgern zur Bearbeitung von Zelllösungen von Bedeutung, da diese zum
einen eine vereinfachte Handhabung der Zellen bei der Aufbereitung und Fixierung und zum
59
Diskussion
___________________________________________________________________________
anderen material- und kostensparendes Arbeiten ermöglichen. Außerdem können mehrere
Versuchsansätze oder Reaktionen zeitgleich auf einem Objektträger erfolgen und letztendlich
besser verglichen werden. Es stellte sich jedoch bei unseren Versuchen als problematisch
heraus, dass bei gleichen Verdünnungen der Antikörper zum Teil unterschiedlich intensive
Anfärbungen der Zellen resultierten und die Auswertung erschwerten. Dies kann durch die
Tatsache, dass die hier angewandte Bross-Technik besonders für Oberflächenmarker, jedoch
weniger für intrazytoplasmatische Antigendarstellung geeignet ist, erklärt werden.
60
Diskussion
___________________________________________________________________________
4.2 Diskussion der Ergebnisse
4.2.1 Bcl2
Am 10. und 12. Kulturtag zeigten sich beim Vergleich von Kontrolle und Inkubation mit LPS
aber ohne Zugabe von TZÜ eine ähnliche Tendenz: Die bcl2-Expression war bei den mit LPS
behandelten Ansätzen am 10. Tag im Durchschnitt um 3,3%, am 12. Tag um 2,2% höher
(kein signifikanter Unterschied). Dieser Trend lässt somit eine geringgradige Verminderung
der Apoptoserate als mögliche Folge der LPS-Zugabe vermuten.
Auch bei den Versuchsansätzen mit TZÜ fällt ein ähnlicher Trend zwischen den Färbungen
am 10. Tag auf. Hier war ein nicht signifikanter Anstieg der antiapoptotischen Makrophagen
nach Vorinkubation mit LPS um 2,6% zu vermerken, der 12. Tag
hingegen zeigte eine
signifikante Mehrexpression von 5% des „Überlebens“-Markers beim TZÜ-Versuch.
4.2.2 Bclx
Der Vergleich zwischen 10. und 12. Tag zeigte bei der bclx-Färbung folgende Ergebnisse: Die
Behandlung mit LPS führte zu einem nicht signifikanten Abfall der Expression des
antiapoptotischen Proteins um durchschnittlich 6,5% am 10. und um 6,9 % am 12.Tag.
Bei den TZÜ-Versuchen hingegen konnte kein gleichsinniger Trend bei den beiden
Versuchstagen nachgewiesen werden: Während am 10. Tag eine ansteigende Tendenz von
7,9% bei LPS-Zugabe bestand, war bei den am 12. Kulturtag beobachteten gegensätzlichen
Kurvenverläufen keine Aussage möglich.
Zusammenfassend ist die Aussagekraft des immunzytochemischen Nachweises der Apoptose
mit dem bclx-Antigen sehr gering, da kein Effekt von TZÜ oder LPS auf das Verhalten der
Makrophagen nachgewiesen werden kann.
4.2.3 Bax
Die am 10. Kulturtag geernteten Makrophagen reagierten auf ausschließliche Inkubation mit
LPS mit einem nicht signifikanten Anstieg des Apoptoseproteins von durchschnittlich 7%, am
12. Tag hingegen sind die Reaktionen der Makrophagen auf die Inkubation mit LPS bei den
einzelnen
Versuchen
untereinander
gegensätzlich,
ohne
dass
deutliche
Tendenzen
beobachtet werden konnten.Die Versuche mit TZÜ brachten am 10. Tag kein eindeutiges
61
Diskussion
___________________________________________________________________________
Ergebnis, am 12. Tag jedoch fand sich bei gleichzeitiger Inkubation von LPS und TZÜ ein
signifikanter Abfall der Expression des proapoptotischen Markers von im Mittel 8,8% im
Gegensatz zur Kontrolle.
Die Hauptaussage, die bei der bax-Färbung getroffen werden kann, ist demnach eine
mögliche Schutzwirkung von LPS in Gegenwart von TZÜ bei zwölf Tage alten Makrophagen.
4.2.4 Vergleich der Färbungen mit verschiedenen Apoptosemarkern
Der zusätzlich Vergleich zwischen den Ergebnissen der einzelnen Apoptosemarker schien so
komplex, dass in diesem Kaptitel zusätzliche Abbildungen zur Verdeutlichung des
Sachverhalts eingebracht wurden. Auch wurde die Reihenfolge der Darstellungen samt
Erläuterungen zwecks besserer Übersichtlichkeit so gewählt, dass die signifikanten
Ergebnisse vorangestellt wurden, der zeitliche Verlauf ist hier nur zweitrangig.
4.2.4.1
Bcl2 / bclx
Beim Vergleich der Färbeergebnisse der Makrophagen am 12. Kulturtag (Abbildung 23)
zeigt sich ein ambivalentes Bild, da zwar bei den bcl2-Färbungen ein signifikanter Anstieg der
Proteinexpression zu verzeichnen ist, die bclx- Färbung aber bei den Ergebnissen der vier
Einzelversuche konträre Ergebnisse lieferte, so dass hier nur eine minimale Veränderung im
Kurvenverlauf erkennbar ist. Die signifikante Hochregulierung des bcl2-Gens bei zwölf Tage
alten Kulturmakrophagen nach Inkubation mit LPS und TZÜ steht somit für sich und kann
durch die gleich- oder geringgradig gegensinnige Veränderung der bclx-Expression unter
denselben Bedingungen weder bekräftigt noch in Frage gestellt werden.
18
% bcl2
16
14
12
10
TZÜ
LPS+TZÜ
40
38
36
34
32
30
28
26
24
22
20
% bclx
62
Diskussion
___________________________________________________________________________
Mittelwert
positiv bcl2
12,462
17,42925
positiv bclx
33,325
31,45825
Abbildung 23: Vergleich der Reaktionen von bcl2 und bclx nach Inkubation mit TZÜ-Zusatz und
LPS am 12. Kulturtag: positiv bcl2 = Prozentsatz der in der bcl2-Reaktion angefärbten Zellen,
positiv bclx = Prozentsatz der in der bclx-Reaktion angefärbten Zellen
Die weiteren Vergleiche, die in diesem Kapitel gezogen werden, beruhen auf nicht
signifikanten Aussagen. Nichtsdestotrotz erfolgte der Versuch einer Interpretation, wenn
deutliche Trends zu erkennen waren:
Beim Vergleich der LPS-Versuche vom 10. Tag zeigt sich eine gegenläufige Tendenz der
Reaktionen der beiden antiapoptotischen Proteine, wie auch aus Abbildung 24 zu ersehen:
Die antiapoptotischen bcl2-Antigene wurden unter dem Einfluss von LPS bei mehr
Makrophagen exprimiert, die ebenfalls antiapoptotischen bclx-Proteine jedoch bei weniger.
Dieses Phänomen darf aber keinesfalls zu stark gewichtet werden, auf der einen Seite, da es
bei beiden Versuchsreihen nur um Tendenzen, nicht aber um signifikante Aussagen geht.
Zweitens liefert der Artikel von Chao et al. einen möglichen Erklärungsansatz für das
gegensätzliche Verhalten der beiden Überlebensgene: Dort sind bei T-Zellen unter Apoptose
induzierenden Bedingungen ähnliche Ergebnisse in Bezug auf gegengerichtete Regulation
von bcl2 und bclx berichtet(14) und insofern erklärt worden, dass die reziproke Expression
der beiden Überlebensfaktoren durch ihre redundante Wirkungsweise bedingt wird. Auch
sind die funktionellen Aminosäuregruppen von bcl2 und bclx nicht identisch, was ein weiterer
Hinweis auf ihre unterschiedliche Interaktion mit potentiellen Signalmolekülen und dadurch
verschieden hohe Expression unter unseren Versuchsbedingungen sein könnte14.
16
58
15
56
54
14
52
13
50
12
11
% bclx
% bcl2
63
Diskussion
___________________________________________________________________________
48
Kontrolle
LPS+ISC
46
Mittelwert
positiv bcl2
12,348
15,6479426
positiv bclx
56,879
50,351
Abbildung 24: Vergleich der Reaktionen von bcl2 und bclx nach ausschließlicher Inkubation mit
LPS (ohne TZÜ-Zusatz) am 10. Kulturtag: positiv bcl2 = Prozentsatz der in der bcl2-Reaktion
angefärbten Zellen, positiv bclx = Prozentsatz der in der bclx-Reaktion angefärbten Zellen
Am 12. Kulturtag bei ausschließlicher Inkubation mit LPS wiederholt sich der für den 10. Tag
bereits beschriebene entgegengesetzte Kurvenverlauf (Abbildung 25): Die bcl2-Expression
steigt bei Behandlung mit LPS an, die bclx-Expression hingegen nimmt ab, was mit
17
48
16
44
15
40
14
36
13
Kontrolle
LPS+ISC
% bclx
% bcl2
demselben Mechanismus begründet werden kann.
32
Mittelwert
positiv bcl2
14,115
16,27033333
positiv bclx
45,97825
39,04525
Abbildung 25: Vergleich der Reaktionen von bcl2 und bclx nach ausschließlicher Inkubation mit
LPS (ohne TZÜ-Zusatz) am 12. Kulturtag: positiv bcl2 = Prozentsatz der in der bcl2-Reaktion
angefärbten Zellen, positiv bclx = Prozentsatz der in der bclx-Reaktion angefärbten Zellen
64
Diskussion
___________________________________________________________________________
Bezüglich des TZÜ-Versuchs vom 10. Tag greift diese Argumentation jedoch nicht mehr, da
hier die Expression bei beiden Markern in der Tendenz ansteigt (Abbildung 26). Diese
gleichsinnige Aktivierung beider antiapoptotisch wirkender
Proteine könnte in dem zuvor
geschilderten Modell jedoch ebenfalls Sinn machen, wenn man die „Doppelaktivierung“ durch
zwei potentiell schädigende Agenzien in Betracht zieht. Denkbar wäre demnach eine
% bcl2
16
15
14
13
TZÜ
LPS+TZÜ
50
48
46
44
42
40
38
36
34
% bclx
vermehrte Aktivierung mit konsekutiv stärkerer antiapoptotischer Antwort.
Mittelwert
positiv bcl2
13,35625
14,76815597
positiv bclx
39,78833333
47,735
Abbildung 26: Vergleich der Reaktionen von bcl2 und bclx nach Inkubation mit TZÜ-Zusatz und
LPS am 10. Kulturtag: positiv bcl2 = Prozentsatz der in der bcl2-Reaktion angefärbten Zellen,
positiv bclx = Prozentsatz der in der bclx-Reaktion angefärbten Zellen
65
Diskussion
___________________________________________________________________________
4.2.4.2
Bcl2 / bax
Bei der Beurteilung von bax- und bcl2-Expression wurde der besseren Vergleichbarkeit
wegen jeweils der prozentuale Anteil der bax-negativen Makrophagen berücksichtigt, so dass
bei beiden Versuchen die nicht-apoptotischen Zellen miteinander verglichen werden konnten.
In dieser Darstellung entspricht also ein gleichgerichteter Kurvenverlauf beider Färbungen
der gleichen Funktion bezüglich der Apoptose. Auch hier erfolgte die Auflistung nach
Gesichtspunkten der Signifikanz und nicht chronologisch.
Beim TZÜ-Versuch mit 12 Tage alten Makrophagen jedoch sind die Kurvenverläufe parallel
bei signifikanten Zahlen (Abbildung 27): Die bcl2-Expression wird hochreguliert bei
gleichzeitigem Absinken der Anzahl bax-positiver Makrophagen, was von zwei Seiten für eine
Aktivierung der Überlebensfunktionen der Zellen spricht. Warum nur in diesem einen Fall bei
sonst eher gegensätzlichem Verhalten? Hier kommen zwei Argumente zum Tragen: Erstens
die schon beim bclx/bcl2-Vergleich angebrachte Erklärung, dass nur eine Doppelaktivierung
mit zwei potentiell schädigenden Agenzien die Auslösung mehrerer Überlebensmechanismen
in
den
Zellen
vermag.
Zum
Zweiten
könnte
die
Reife
der
Makrophagen
ein
% bcl2
18
16
14
12
10
TZÜ
LPS+TZÜ
59
57
55
53
51
49
47
45
% bax
ausschlaggebender Faktor sein, worauf unter 4.2.5 noch näher eingegangen wird.
Mittelwert
positiv
bcl2
12,462
17,42925
negativ
bax
47,92466667
58,14333333
Abbildung 27: Vergleich der Reaktionen von bcl2 und bax nach Inkubation mit TZÜ-Zusatz und
LPS am 12. Kulturtag: positiv bcl2 = Prozentsatz der in der bcl2-Reaktion angefärbten Zellen,
negativ bax = Prozentsatz der in der bax-Reaktion nicht angefärbten Zellen
66
Diskussion
___________________________________________________________________________
Die LPS-Kontrolle am 10. Kulturtag zeigt eine kontroverse Situation: Während die bcl2-
Überlebensproteine nach LPS-Zugabe bei mehr Makrophagen exprimiert wurden, fiel die
Anzahl der bax-negativen und damit nicht zur Apoptose bereiten Zellen unter denselben
Umständen ab. Diese Tatsache lässt sich durch die von Knudson et al.(58) postulierte
16
% bcl2
15
14
13
12
11
Kontrolle
LPS+ISC
52
50
48
46
44
42
40
38
% bax
unterschiedlich Regulation der beiden Proteine erklären.
Mittelwert
positiv bcl2
12,348
15,6479426
negativ bax
50,70466667
43,18233333
Abbildung 28: Vergleich der Reaktionen von bcl2 und bax nach ausschließlicher Inkubation mit
LPS (ohne TZÜ-Zusatz) am 10. Kulturtag: positiv bcl2 = Prozentsatz der in der bcl2-Reaktion
angefärbten Zellen, negativ bax = Prozentsatz der in der bax-Reaktion nicht angefärbten Zellen
Diese Gegenläufigkeit zwischen bcl2-positiven und bax-negativen Zellen tritt am 10. Tag bei
beiden Versuchsansätzen (Abbildungen 28 und 29) und am 12. Tag beim LPS-Ansatz
(Abbildung 30) auf, wobei keinerlei Signifikanzen bestehen und die Aussagekraft dieses
Vergleichs nicht zu hoch bewertet werden darf; auch sind die Kurvenverläufe der baxFärbung beim TZÜ- vom 10. sowie dem LPS-Versuch vom 12. Tag gegenläufig ausgefallen
und stellen somit nur einen minimalen Trend dar.
15
56
14,5
55
54
14
53
13,5
52
13
12,5
% bax
% bcl2
67
Diskussion
___________________________________________________________________________
51
TZÜ
LPS+TZÜ
50
Mittelwert
positiv bcl2
13,35625
14,76815597
negativ bax
55,3255
52,02825
Abbildung 29: Vergleich der Reaktionen von bcl2 und bax nach Inkubation mit TZÜ-Zusatz und
LPS am 10. Kulturtag: positiv bcl2 = Prozentsatz der in der bcl2-Reaktion angefärbten Zellen,
17
56,5
16
56
55,5
15
55
14
13
% bax
% bcl2
negativ bax = Prozentsatz der in der bax-Reaktion nicht angefärbten Zellen
54,5
Kontrolle
LPS+ISC
54
Mittelwert
positiv bcl2
14,115
16,27033333
negativ bax
56,14166667
54,838
Abbildung 30: Vergleich der Reaktionen von bcl2 und bax nach ausschließlicher Inkubation mit
LPS (ohne TZÜ-Zusatz) am 12. Kulturtag: positiv bcl2 = Prozentsatz der in der bcl2-Reaktion
angefärbten Zellen, negativ bax = Prozentsatz der in der bax-Reaktion nicht angefärbten
ZellenVergleich der bcl2- und der bax-Färbung Vergleich der bcl2- und der bax-Färbung
68
Diskussion
___________________________________________________________________________
4.2.5 Makrophagenreife
Die Kultivierungsdauer der Makrophagen wurde -wie in Kapitel 4.1.1.1 beschriebenentsprechend ihrer Vitalität, Proliferationsrate, Phagozytoseaktivität und Reife gewählt. Aus
diesen Parametern lassen sich Rückschlüsse auf den Differenzierungsgrad der Makrophagen
und mit großer Wahrscheinlichkeit auch auf ihr Verhalten bezüglich der Aktivierung durch
LPS ziehen.
Die genannten Parameter konnten anhand von Trypanblautest, BrdU-, Latexphagozytoseund bm8-Versuchen im Labor Freudenberg nachgewiesen werden, wobei die Ergebnisse eine
auch nach dem 12. Tag zunehmende Reife und Differenzierung der Makrophagen zeigten
(Tabelle 25). Allerdings nahm der Prozentsatz der trypanblau-positiven, d.h. abgestorbenen
Zellen nach dem 12. Tag nährstoff- und platzmangelbedingt zu, was die Versuchsausführung
am 10. und 12. Kulturtag hinsichtlich der Zellvitalität und der Reduktion möglicher
zusätzlicher apoptotischer Stimuli rechtfertigt. Die in dieser Arbeit aufgezeigten Ergebnisse
der LPS-Versuche hingegen werden erst mit dem 12. Kulturtag signifikant, wie in 4.2.1 -
4.2.4 dargestellt, was durch die ab dem 10. Tag noch deutlich zunehmende Reife der
Makrophagen bedingt sein könnte (10. Kulturtag: 90,4% reife Makrophagen, 14. Kulturtag:
98,8% reife Makrophagen). Vorstellbar wäre beispielsweise eine stärkere Aktivierung durch
LPS nur bei völlig ausdifferenzierten Makrophagen. Hier wären weitere Versuche mit länger
kultivierten Zellen hinsichtlich der Aktivierung und des Apoptoseverhaltens von Interesse
gewesen.
Tabelle 25: Übersicht über Wachstumsparameter bei Makrophagen
10. Tag
Trypanbautest BrdU
LatexBm8
(→Vitalität)
(→Proliferation) Phagozytose
(→Reifemarker)
2,9 %
4,5 %
95,3 %
90,4 %
11. Tag
3,2 %
3,2 %
97,3 %
95,8 %
12. Tag
3,2 %
1,8 %
98,5 %
97,3 %
13. Tag
4,2 %
1,9 %
89,9 %
98,3 %
14. Tag
5,5 %
1,3 %
97,8 %
98,9 %
Nach J. Wolff
69
Diskussion
___________________________________________________________________________
4.3 Überblick über die Literatur
4.3.1 Aktivierung der Makrophagen in vivo
Die Apoptose ist ein Vorgang, der im Gegensatz zum Zelltod der Nekrose normalerweise
nicht mit entzündlichen Begleiterscheinungen assoziiert ist(38). Erstaunlich ist daher die
Verbindung zwischen „inflammatorischer“ Aktivierung und apoptotischen Vorgängen bei
Makrophagen: In vivo-Studien haben ergeben, dass auf LPS-Stimulation, welche mit einer
CD14/TLR4-vermittelten
Entzündungsreaktion
vergleichbar
ist
(siehe
auch
4.3.4.1),
Makrophagen vermehrt mit Apoptose reagieren. Es könnte sich hierbei um einen
Regulationsmechanismus handeln, der durch die Eliminierung aktivierter Makrophagen eine
überschießende Immunreaktion zu verhindern sucht(105).
Eine destruierende Entzündung kann in bestimmten Organen besonders verheerende
Auswirkungen haben, welche durch Fas-vermittelte Apoptose bei immunkompetenten Zellen
z. B. im Auge verhindert werden, so dass durch im Rahmen der oben vorgestellten
Gegenregulation ein immunpriviligierter Zustand aufrechterhalten werden kann(39): Durch
die Anwesenheit von FasL in den zu schützenden Organen wird hier bei Bedarf eine
Fas/FasL-Interaktion ausgelöst, die eine Elimination der geschädigten Zellen mithilfe der
Apoptose
ermöglicht,
um
die
möglicherweise
organzerstörenden
Folgen
einer
Entzündungsreaktion zu verhindern(39).
Untersuchungen zum Thema der Immunregulation mit Verhinderung von zu starken
Entzündungsreaktionen haben einen möglichen Mechanismus für die negative FeedbackRegulierung des monozytären Phagozytose-Systems aufgezeigt: Es ist bekannt, dass
Makrophagen über die Produktion von NO bakterizide und tumorizide Eigenschaften
ausbilden. Jedoch ist NO auch für sie selbst toxisch und stimuliert sie zur Einleitung von Fasvermittelter Apoptose(82). Auf der einen Seite lässt sich dieses Phänomen durch die oben
erwähnte Selbstregulation zur Verhinderung übermäßiger Immunaktivierung erklären(80).
Ein zweiter wichtiger Punkt bei der Regulation dieser Immunvorgänge ist aber auch der
Nachweis der Expression antiapoptotischer bclx-Proteine bei Makrophagen nach Stimulation
mit LPS und IFN-γ(82). Diese könnte der proapoptotischen NO-Stimulation entgegensteuern
und das Überleben der Makrophagen somit zusätzlich beeinflussen.
70
Diskussion
___________________________________________________________________________
4.3.2 Interaktion mit Tumorzellen
Im vorherigen Kaptitel wurden die Mechanismen der Immunabwehr beschrieben, über Fasvermittelte Apoptose die Immunantwort zu regulieren. Da auch Tumorzellen mit Fas
interagieren (s. Kapitel 1.1.4.1) und sich durch eine Gegenattacke gegen tumorassoziierte
Makrophagen zu wehren wissen, liegt die Vermutung nahe, dass die Tumorzellen in die
beschriebenen Apoptosemechanismen über Fas eingreifen, um eine gegen sie gerichtete
entzündliche Reaktion zu verhindern.
4.3.3 Stimulation durch Endotoxin und Signalvermittlung
Die unter 4.2.1-4.2.4 vorgestellten Ergebnisse lassen eine vermehrte Immunkompetenz
reifer Makrophagen nach LPS-Stimulation annehmen, so dass auch ein Eingreifen von LPS in
die Fas-vermittelten Apoptosevorgänge vermutet werden kann.
LPS könnte in vivo auf mehreren Ebenen in die Signalwege aktivierter Makrophagen
eingreifen: erstens auf dem direkten Wege über Enzymaktivierung oder Signaltransduktion
mit Hilfe von Rezeptoren (CD14- und TLR4-Rezeptor, siehe 4.3.2.1) und zweitens über die
Regulierung der Genexpression und Transkription weiterer Faktoren (NFκB, s.4.3.4)(2).
Eine interessante Fragestellung ist auch die nach der Signalübertragung der LPS-Antwort von
Makrophagen. Diese können mit Hilfe von CD14-Rezeptoren die Antigenstruktur von LPS
erkennen und eine entzündliche Immunabwehr einleiten. Jedoch zeigen neuere Erkenntnisse
der Forschung zusätzlich eine anti-inflammatorische Signalübertragung über CD14Rezeptoren, welche in vitro die Phagozytoseaktivität bei Makrophagen zu induzieren
scheint(38). Die Liganden, welche über diesen Weg in einem späten Stadium in die Apoptose
eingreifen, sind noch nicht identifiziert(37). Eine dosisabhängige Wirkung von LPS, das ja
bekannterweise mit CD14-Rezeptoren interagiert, und außerdem in niedriger Konzentration
über die anti-inflammatorische Aktivierung die apoptotischen Abräumprozesse unterstützen
könnte, wäre somit in vivo auch eine mögliche Erklärung für die schon empirisch untersuchte
antitumoröse Wirkung von LPS(68) (siehe 1.5), welche hier allerdings erst später im
apoptotischen Prozess auftreten würden als bei den anderen vorgestellten Hypothesen.
Jedoch ist nicht nur CD14 von Belang für die LPS-vermittelte Immunantwort, auch der TLR4Rezeptor sowie andere primär LPS-unspezifische Zelloberflächenstrukturen können für die
Signalübertragung verantwortlich sein (s. Kapitel 1.3). Bei der TLR4-vermitellelten Reaktion
71
Diskussion
___________________________________________________________________________
sind sowohl MyD88-abhängige als auch unabhängige Wege bekannt, was wiederum
hinsichtlich der Apoptosevermittlung interessant ist, da MyD88 auch hier eine Rolle spielt(2,
113). Aber auch bei der intrazytoplasmatisch übertragenen LPS-Antwort spielen Moleküle
eine Rolle, welche strukturell auch in der Apoptose von Bedeutung sein könnten.
4.3.4 Gemeinsame Wege der Regulationsmechanismen von Apoptose, tumorvermittelter
Immunabwehr und LPS-Stimulation
MyD88 hat in der LPS-Signalvermittlung eine Adaptorfunktion zur Aktivierung des nuklearen
Faktors κB (NF-κB), ein für mannigfaltige Aspekte der Immun- und Entzündungsantwort
verantwortlicher
Transkriptionsfaktor(104).
Außerdem
scheint
MyD88
auch
in
der
Apoptosereaktion unabdingbar zu sein(113), was eine direkte Wirkung von LPS auf die
Apoptoseregulation erklären könnte, z. B. durch eine „Blockierung“ des MyD88-Moleküls für
die apoptotische Funktion durch LPS. Aber auch eine Regulation über NF-κB, auf welche
weiter unten eingegangen wird, scheint möglich.
Die LPS-induzierte intrazytoplasmatische Signaltransduktion ist von den Molekülen Nod1 und
-2 abhängig, welche eine strukturelle Ähnlichkeit mit dem Apoptoseadaptor Apaf-1
aufweisen(104). Auch hier ist also prinzipiell eine Interaktion denkbar.
LPS stimuliert in höheren Dosen die induzierbare NO-Synthase (iNOS)(2);(105) und
verursacht über eine erhöhte NO-Ausschüttung Apoptose. Da auch Fas über eine erhöhte
NO-Ausschüttung wirkt(82), ist hier der ein weiterer potenzieller Verknüpfungspunkt von TZÜ
und LPS, der eine Schutzwirkung von LPS vermitteln könnte.
Auch die Proteinkinase C (PKC) ist nicht nur in die Aktivierung von Makrophagen und der
Signaltransduktion von LPS involviert(13), sondern wurde schon als direkte Kinase des bcl2Proteins identifiziert und stellt somit ein mögliches Bindeglied zwischen den drei von uns
untersuchten Parametern dar(91). Außerdem bewirkt die PKC zusätzlich eine Aktivierung von
NF-κB sowie eine wahrscheinlich dadurch bedingte NOS-Induktion mit konsekutiver
Erhöhung der NO-Ausschüttung, welche die vermehrte Apoptose von Makrophagen nach sich
zieht(26).
Auch die LPS-Wirkung wird letztendlich über die Aktivierung von NF-κB vermittelt und
induziert nach Rezeptorbindung die Produktion inflammatorischer Zytokine.
Die Regulierung der NO-vermittelten Apoptose ist somit möglicherweise auch von der
Expression und anderen Regulierungsmechanismen des NF-κB wie DNA-Bindung oder
Translokation zum Nukleus abhängig, welche auch durch die Applikation von LPS beinflusst
werden. Welche Veränderungen NF-κB in der Apoptoseregulation bewirkt, ist jedoch unklar:
72
Diskussion
___________________________________________________________________________
Mehrere experimentelle Studien weisen auf eine gleichsinnige Steigerung der Apoptoserate
mit der Aktivität des NF-κB hin(7, 97), wohingegen andere Autoren gar von einer Protektion
durch NF-κB vor Apoptose sprechen(17, 18, 111).
Weitere Moleküle, die in dem Zusammenhang der Regulierung von Apoptose, Interaktion mit
Tumorzellen und Einfluss von LPS von Interesse sind, wobei eine genauere Ausführung aber
zu weit führen würde, sind PGE2 und TNF(18, 28, 46, 68).
Schließlich sind noch die Genlokalisationen von NF-κB und FasL zu erwähnen, welche sich in
räumlicher Nähe auf Chromosom 1q23 befinden und dadurch vielleicht ebenfalls den
gleichen Regulierungsmechanismen wie z. B. Promotoren unterliegen(102).
4.3.5 Diskussion der eigenen Ergebnisse in Bezug auf Literaturangaben
Das vorhergehende Kapitel hat im Rahmen des Möglichen versucht, mögliche Ansätze zur
Erklärung des Ineinandergreifens der Regulation von apoptotischen Vorgängen mit der
Wirkungsweise von LPS aufzuzeigen. Welcher dieser verschiedenen angesprochenen
Regulationsmechanismen letzten Endes die Erklärung für unsere Ergebnisse liefern kann,
bleibt jedoch weitgehend unklar.
Von besonderem Interesse für diese Arbeit sind die Ergebnisse der bax- und bcl2-Färbung
nach Inkubation mit LPS und TZÜ am 12. Kulturtag. Beiden kann die gleichsinnige Aussage
entnommen werden, dass nur nach LPS-Zugabe ein signifikanter Anstieg von Makrophagen
stattfand, welche antiapoptotische Proteine exprimierten, jedoch einen Abfall derer mit
proapoptotischen Markern.
Als Grund dafür, dass diese Beobachtung nur am 12. Kulturtag der Zellen gemacht werden
konnte, muss man die Frage der Makrophagenreife in Betracht ziehen, wie unter 4.2.5
ausführlich erläutert. Eine mögliche Begründung für das ausschließlich auf die Behandlung
mit LPS und TZÜ hin gesteigerte Apoptoseverhalten wurde ebenfalls schon mit der
Hypothese einer Aktivierung der Makrophagen nur bei ausreichend starkem Reiz angeführt.
Des Weiteren ist die Frage, ob LPS-Aktivierung eine verstärkte Apoptosereaktion oder aber
möglicherweise sogar eine Schutzfunktion vor dieser Art des Zelltodes zur Folge hat, in der
Literatur kontrovers diskutiert worden. Die auf den ersten Blick gegensätzlichen Aussagen
der von Hortelano et al. beobachteten vermehrten Apoptose nach Stimulation mit LPS (nach
24 Stunden)(43) wird durch den von Okada et al. erbrachten Nachweis erhöhter Expression
antiapoptotischer Proteine (nach drei Stunden)(82) – welcher sich mit den hier gezeigten
Ergebnissen deckt - bei Betrachtung der zeitlich versetzten Reaktionen keineswegs
ausgeschlossen: Eine Immunreaktion gegen bestimmte Noxen – in unserem Fall TZÜ - ist ja
73
Diskussion
___________________________________________________________________________
primär durchaus wünschenswert und lässt die vermehrte antiapoptotische Regulation sehr
plausibel erscheinen. Nachfolgend, um übermäßige Immunreaktionen zu verhindern, wird
Apoptose eingeleitet, ein Phänomen, was bei unserem Versuchsaufbau aufgrund der Wahl
der zeitlichen Abfolge von nur zwölf Stunden nicht mehr erfasst werden konnte.
Die unter 4.3.3 bezüglich des sowohl in der LPS- als auch in der Apoptosevermittlung eine
Rolle
spielende
Molekül
molekularbiologische
MyD88
Korrelat
für
unterbreitete
unsere
Hypothese
Ergebnisse
könnte
darstellen:
durchaus
Eine
durch
das
in
Tumorzellüberstand enthaltenes FasL ausgelöste Apoptosekaskade könnte auf Höhe des
Adaptorproteins in Anwesenheit von LPS blockiert werden, z. B. durch eine vorangegangene
LPS-Reaktion mit „Verbrauch“ des Moleküls.
Diese Hypothese ist jedoch, ebenso wenig wie die anderen Literaturzitate, welche in Kapitel
4.3 diskutiert wurden, in Bezug auf unsere Ergebnisse verifizierbar. So kann hier über die
den Ergebnissen zugrunde liegenden Mechanismen leider keine genauere Erklärungen
geliefert werden. Aber eben jene zu erforschen, wird die Forschung auf dem Gebiet der
molekularbiologischen Hintergründe der Apoptose sowie der Einsatz der Immunabwehr
gegen Neoplasien mit Sicherheit das Thema vieler weiterer wissenschaftlicher Arbeiten sein.
74
Zusammenfassung
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5 ZUSAMMENFASSUNG
Verschiedene Forschungsgruppen haben sich schon mit unterschiedlichen Versuchsansätzen
zur Erforschung der Interaktionen von Tumorzellen und Immunabwehr auseinandergesetzt.
Auch dass die Apoptose in diesem Zusammenhang eine wichtige Rolle spielt, ist bekannt. Ob
sich jedoch die empirischen Beobachtungen einer Regression von Tumoren nach LPSWirkung durch unser in vitro-Modell bestätigen lassen, sollte hier Gegenstand der
experimentellen Untersuchung sein.
Als Maßstab zur quantitativen Beschreibung der Apoptose unter dem Einfluss von
Tumorzellüberstand und LPS wurden Apoptosemarker aus der bcl2-Familie herangezogen,
und zwar bcl2 und bclx als antiapoptotische, sowie bax als proapoptotischer Vertreter dieser
Proteingruppe.
Mit
Hilfe
von
immuncytochemischen
Verfahren
konnten
mit
vier
verschiedenen
Versuchsansätzen jeweils die Kontrollgruppe mit der LPS-behandelten Gruppe mit und ohne
TZÜ-Zusatz am 10. und 12. Kulturtag verglichen werden. Die ausschließlich mit TZÜ
behandelten Versuchsansätze und die mit TZÜ und LPS inkubierten Ansätze vom 12. Tag
stellten sich als signifikant unterschiedliche Apoptoseraten aufweisend heraus: Sowohl die
bcl2- als auch die bax-Färbung zeigte einen signifikanten Abfall der Apoptoserate bei
zusätzlicher Behandlung mit LPS.
Diese Ergebnisse lassen verschiedene Hypothesen im Zusammenhang mit der Bedeutung der
Makrophagenreife sowie den verschiedenen möglichen Signalvermittlungen zwischen
Tumorzellen und Makrophagen auf der einen und LPS auf der anderen Seite interessant
erscheinen, wobei die Aufdeckung der biomolekularen Hintergründe auch weiterhin Priorität
in der Erforschung dieser Thematik haben muss.
Der von uns beobachtete signifikante Abfall der Apoptosebereitschaft der Makrophagen nach
LPS-Stimulation weist zumindest auf eine gewisse Schutzwirkung dieses Moleküls bei
Vorhandensein eines apoptotischen Stimulus hin, ohne dass der zu Grunde liegende
Mechanismus nachgewiesen werden konnte.
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Lebenslauf
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7 LEBENSLAUF
Personalien
Name:
Nele Raiss
Adresse:
Erwinstr. 124
79102 Freiburg
Geburtsdatum:
02.01.1979
Geburtsort:
Karlsruhe
Eltern
Ingeborg Raiss-Hilgert
Geburtsdatum:
15.04.1950
Geburtsort:
Traben-Trarbach/Mosel
Beruf:
Heilpraktikerin
Dieter Raiss
Geburtsdatum:
19.07.1946
Geburtsort:
Marburg/Lahn
Beruf:
Firmenberater
Ausbildung
Grundschule:
Grund- und Hauptschule Grötzingen
Gymnasium:
Französisches Gymnasium Berlin
Abschlüsse: Abitur, Baccalauréat
Studium der Humanmedizin:
seit 1997 in Freiburg, jetzt 12. Fachsemester
Physikum:
Herbst 1999
1. Staatsexamen:
Herbst 2000
2. Staatsexamen:
Herbst 2003
84
Danksagung
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8 DANKSAGUNG
Meinen herzlichsten Dank möchte ich Herrn Prof. Dr. N. Freudenberg zum Einen für die
Überlassung des Doktorarbeitsthemas und zum Anderen für die freundliche und hilfsbereite
Unterstützung bei ihrer Fertigstellung aussprechen.
Auch den Mitarbeitern des Max-Planck-Instituts für Immunbiologie, Freiburg, Frau Prof. M.
Freudenberg, Herrn Dr. C. Galanos und Frau H. Stübig, gebührt mein herzlicher Dank für die
geduldige und freundliche Beratung und Hilfe.
Außerdem standen mir Herr Dr. E. Wellens und viele andere Mitarbeiter des Pathologischen
Instituts der Universitätsklinik Freiburg bei vielen Fragen und Problemen mit Rat und Tat zur
Seite. Hier muss ich noch besonders meinem Mitdoktoranden Sven Griesbaum für seine
fortwährende Geduld und Freundlichkeit sowie die Einweisung in den experimentellen Teil
danken. Auch Kiran Majer und Peter Flacker, die mich in fachlichen und formellen Fragen
beraten haben, sollen an dieser Stelle dankend erwähnt werden.
Nicht zuletzt möchte ich noch meiner Familie und meinen Freunden für ihre ständige
Unterstützung und Zuwendung während der Fertigstellung der Doktorarbeit danken.
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