Aus dem Pathologischen Institut der Albert-Ludwigs-Universität Freiburg im Breisgau Wirkung von Endotoxin auf Kulturmakrophagen nach Inkubation mit einem Apoptose induzierenden Faktor des LEWIS-Lung-Karzinoms INAUGURAL-DISSERTATION zur Erlangung des Medizinischen Doktorgrades der Medizinischen Fakultät der Albert-Ludwigs-Universität Freiburg im Breisgau vorgelegt von geboren in 2003 Nele Raiss Karlsruhe Dekan 1. Gutachter 2. Gutachter Jahr der Promotion Prof. Dr. med. J. Zentner Prof. Dr. med. Dr. h. c. N. Freudenberg Prof. Dr. med. U. Schöffel 2005 Meinen Eltern 4 Inhaltsverzeichnis ___________________________________________________________________________ 1 EINLEITUNG 7 1.1 Apoptose 7 1.1.1 1.1.2 1.1.3 1.1.4 Physiologische Rolle der Apoptose Historischer Hintergrund Definition Ablauf 1.1.4.1 1.1.4.2 1.1.4.3 Apoptose-Rezeptoren: das Fas/FasL-System Genetische Regulierung: die bcl2-Familie Ausführende Mechanismen: die Caspasen 1.2 Makrophagen 1.2.1 1.2.2 1.2.3 1.2.4 2 Die Morphologie der Makrophagen Die Herkunft der Makrophagen Funktion und Lokalisation der Makrophagen Wechselwirkungen zwischen Tumoren und Makrophagen 7 7 8 9 10 11 13 14 14 14 15 17 1.3 Endotoxin 18 1.4 Lewis-Lung-Karzinom 19 1.5 Fragestellung 20 MATERIAL UND METHODEN 2.1 Übersicht der Versuchsanordnungen 2.1.1 Apoptoseinduktion bei Makrophagen 2.1.2 Endotoxinwirkung 2.2 3-LL Tumorzellen 2.2.1 Gewinnung des Tumorzellüberstands 2.3 Makrophagen 2.3.1 2.3.2 2.3.3 2.3.4 2.3.5 Gewinnung GM-CSF Inkubation mit Endotoxin aus Salmonella abortus equi Inkubation mit 3-LL-Überstand Ernte und Fixierung 2.4 Immunzytochemische Färbung 2.4.1. Antikörper 2.4.2 ABC-Methode 2.4.3 Tyramidverstärkung 2.5 Auswertung 21 21 21 21 22 22 23 23 23 24 24 25 26 26 27 29 31 5 Inhaltsverzeichnis ___________________________________________________________________________ 2.5.1 Kontrollen 31 2.5.2 Auszählung und Statistik 31 3 2.6 Reagenzien 32 ERGEBNISSE 36 3.1 Immuncytochemischer Nachweis des antiapoptotischen bcl2Proteins an Makrophagen zu verschiedenen Kulturzeiten 36 3.1.1 10. Kulturtag 36 3.1.2 12. Kulturtag 39 3.1.1.1 3.1.1.2 Vergleich Kontrolle / Inkubation mit LPS Vergleich Tumorzellüberstand / Tumorzellüberstand und LPS 3.1.2.1 3.1.2.2 Vergleich Kontrolle / Inkubation mit LPS Vergleich Tumorzellüberstand / Tumorzellüberstand und LPS 3.2 Immuncytochemischer Nachweis des antiapoptotischen bclxProteins an Makrophagen zu verschiedenen Kulturzeiten 36 38 39 41 43 3.2.1 10. Kulturtag 43 3.2.2 12. Kulturtag 46 3.2.1.1 3.2.1.2 Vergleich Kontrolle / Inkubation mit LPS Vergleich Tumorzellüberstand / Tumorzellüberstand und LPS 3.2.2.1 3.2.2.2 Vergleich Kontrolle / Inkubation mit LPS Vergleich Tumorzellüberstand / Tumorzellüberstand und LPS 43 45 46 48 3.3 Immuncytochemischer Nachweis des apoptotischen bax-Proteins an Makrophagen zu verschiedenen Kulturzeiten 50 4 3.3.1 10. Kulturtag 50 3.3.2 12. Kulturtag 53 3.3.1.1 3.3.1.2 Vergleich Kontrolle / Inkubation mit LPS Vergleich Tumorzellüberstand / Tumorzellüberstand und LPS 3.3.2.1 3.3.2.2 Vergleich Kontrolle / Inkubation mit LPS Vergleich Tumorzellüberstand / Tumorzellüberstand und LPS DISKUSSION 4.1 Diskussion der Methoden 4.1.1 Versuchsaufbau 4.1.1.1 4.1.1.2 Makrophagenkultur Inkubation 4.1.1.3 Färbemethoden 4.1.1.2.1 4.1.1.2.2 4.1.1.3.1 4.1.1.3.2 mit Endotoxin mit Tumorzellüberstand Wahl der Apoptosemarker Bross-Methode 4.2 Diskussion der Ergebnisse 4.2.1 Bcl2 50 52 53 54 56 56 56 56 57 57 57 58 58 58 60 60 6 Inhaltsverzeichnis ___________________________________________________________________________ 4.2.2 Bclx 60 4.2.3 Bax 60 4.2.4 Vergleich der Färbungen mit verschiedenen Apoptosemarkern 61 4.2.4.1 4.2.4.2 Bcl2 / bclx Bcl2 / bax 61 65 4.3 Überblick über die Literatur 69 4.2.5 Makrophagenreife 68 4.3.1 Aktivierung der Makrophagen in vivo 69 4.3.2 Interaktion mit Tumorzellen 70 4.3.3 Stimulation durch Endotoxin und Signalvermittlung 70 4.3.4 Gemeinsame Wege der Regulationsmechanismen von Apoptose, tumorvermittelter Immunabwehr und LPS-Stimulation 71 4.3.5 Diskussion der eigenen Ergebnisse in Bezug auf Literaturangaben 72 5 ZUSAMMENFASSUNG 74 6 LITERATURVERZEICHNIS 75 7 LEBENSLAUF 83 8 DANKSAGUNG 84 7 Einleitung ___________________________________________________________________________ 1 EINLEITUNG 1.1 Apoptose 1.1.1 Physiologische Rolle der Apoptose Die Apoptose spielt eine essentielle Rolle bei zahlreichen physiologischen Vorgängen von der embryologischen Entwicklung über die regelrechte Ausbildung und Reaktionen des Immunsystems87 und des zentralen Nervensystems bis zur tagtäglichen Zellmauserung22;89. Sobald jedoch ihr Ablauf trotz der zahlreichen Regulierungsmechanismen nicht mehr adäquat funktioniert, können daraus einige schwerwiegende Krankheiten resultieren. Bakterien und Viren haben sich den Zugang zur Immunabwehr zunutze gemacht, indem sie in die Apoptoseregulation eingreifen und beispielsweise immunkompetente Zellen zum Selbstmord veranlassen. Dieser Mechanismus kann im Zusammenhang mit Infektionen mit dem HIV-Virus beobachtet werden, da für AIDS eine vermehrte Aktivierung der Apoptose charakteristisch ist. Auch in Verbindung mit Alzheimer und Chorea Huntington konnte ein überschießendes Maß an Apoptose nachgewiesen werden3;22. Jedoch auch eine unzureichende Aktivierung kann verheerende Auswirkungen auf die physiologische Zellhomöostase haben22: Eine ungenügende Selektion der immunkompetenten Zellen durch selbst induzierten Zelltod kann Autoimmunkrankheiten verursachen und die ungehemmte Ausbreitung von Zellklonen Tumorwachstum fördern27;62. Das folgende Kapitel soll einen Überblick über Entdeckung, Namensgebung und vor allem den komplexen und an vielen Schaltstellen regulierten Ablauf dieses lebensnotwendigen Vorgangs ermöglichen. 1.1.2 Historischer Hintergrund Die Apoptose, oftmals auch wenig exakt als programmierter Zelltod bezeichnet67;89, wurde lang nicht als ein von den anderen Arten des Zelltodes deutlich abzugrenzender Mechanismus erkannt. Zwar wurde schon im zweiten Jahrhundert vor Christus von Galen die Regression von larvalen und fetalen Strukturen entdeckt, und 1851 beschrieb auch Glücksmann apoptotische Vorgänge bei der ontogenetischen Entwicklung von Embryonen35, ohne jedoch diese Form des Zelltodes als eine bislang unerkannte Entität einordnen zu können. 8 Einleitung ___________________________________________________________________________ Erstmals wurde die Apoptose 1885 als eigenes Konzept unter dem Namen Chromatolyse von Walther Flemming in einem Artikel über den Untergang Graaf’scher Follikel beim Hasen erwähnt33. Bis zur Erkenntnis, dass es sich hierbei um die Beschreibung eines bis dato völlig unbekannten Ablaufs des Zelluntergangs handelte, der sich in vielen Aspekten von der bereits bekannten Nekrose unterscheidet, sollten noch einmal fast 100 Jahre vergehen: 1971 veröffentlichte Kerr das ausschlaggebende Experiment und prägte ein Jahr später den Begriff der Apoptose52. Dieser Begriff ist von den griechischen Wörtern apό (=von) und ptόsis (=fallen) hergeleitet und vergleicht den Prozess des ja zumeist bei einzelnen Zellen zu beobachtenden apoptotischen Zelltodes treffend mit dem Fallen von Blättern im Wind. 1.1.3 Definition Die Apoptose ist also schon durch die Namensgebung deutlich von dem Konzept der Nekrose abgegrenzt, da es sich bei der letzteren ja um einen massenhaften Zelluntergang handelt. Beide Begriffe als gegenteilige Mechanismen des Zelltods zu bezeichnen ist jedoch irreführend und unverständlich29;49, da die Nekrose lediglich die morphologischen Veränderungen nach Eintritt des Zelltodes z.B. durch Ischaemie, die Apoptose aber außerdem die auslösenden und regulatorischen Abläufe beschreibt. Es gibt Arten des Zelltodes, bei denen apoptotisch geschädigte Zellen ebenfalls im Anschluss Nekrose zur Folge haben können, wie bei von einem Sonnenbrand geschädigten Epidermiszellen114 oder bei den Councilman-Körperchen in der Leber. Majno et al schlagen deshalb die Einführung des Begriffs der Onkose (griechisch für „Schwellung“) als Gegenspieler zur Apoptose vor und erläutern ihr Konzept mit folgender Abbildung: 9 Einleitung ___________________________________________________________________________ Abbildung 1: Zwei Wege des Zelltodes führen zur Nekrose ( nach67; oben eine normale Zelle, 1A: Anschwellen der Zelle 2A: Vakuolenbildung, „blebbing“, erhöhte Permeabilität 3A: nekrotische Veränderungen mit Karyolyse und Schrumpfen 1B: Schrumpfen und Pyknose 2B: „budding“51 und Karyorhexis 3B: nekrotische Veränderungen mit Bildung von apoptotischen Körperchen) 1.1.4 Ablauf Die morphologischen Einzelheiten im Ablauf der Apoptose konnten erst mit der Nutzung der Elektronenmikroskopie im Detail beschrieben werden und zeichnen sich vor allem durch folgende Charakteristika aus: Verlust der Zellkontakte, Kondensation von Nukleus und Zytoplasma, Zellschrumpfung, Ablagerung des verdichteten Chromatins in randständigen Halbmondformationen, Karyorhexis, Membranausstülpungen (sogenanntes „budding“51) mit Entstehen der apoptotischen Körperchen, welche schlussendlich von phagozytierenden Zellen abgeräumt werden52;67 (siehe auch Abbildung 1). Doch von Interesse an der Apoptose sind nicht nur ihre morphologischen Besonderheiten, sondern vor allem die biochemischen Regulierungsmechanismen, welche im Detail zu 10 Einleitung ___________________________________________________________________________ erkunden den Einstieg in ein weites Forschungsfeld eröffnen. Die Signaltransduktionswege der Apoptose können in verschiedene Abschnitte eingeteilt werden: 1. die Initiation (durch verschiedene Auslöser, die entsprechende „Apoptoserezeptoren“ aktivieren, wie z.B. das Fas/FasL-System) die genetische Regulierung (durch Interaktion mit verschieden pro- und 2. anti-apoptotischen Genen wie bcl2 oder p53) die ausführenden Mechanismen (proteolytische Spaltung durch die 3. Caspasen) In der folgenden Abbildung wird der biochemische Weg von der Auslösung bis zum Zelltod vereinfacht dargestellt86. Eine genauere Erläuterung der einzelnen Komponenten unter Berücksichtigung besonderer Schwerpunkte erfolgt unter 1.1.4.1 - 1.1.4.3. MITOCHONDRIALER WEG FAS-VERMITTELTER WEG FAS-L ZELLMEMBRAN FAS-R MITOCHONDRIUM FADD proapoptotisch: BAX/BID CASPASE 8 antiapoptotisch: BCL2/BCLX CYTOCHROM C-Freisetzung CASPASE 8 APAF-1 APOPTOSOM P 53 APOPTOSE-INHIBITOREN CASPASE 3 und andere exekutierende CASPASEN DNA-FRAGMENTIERUNG ZELLTOD Abbildung 2: apoptotische Mechanismen in einer menschlichen Zelle (nach84;86) 1.1.4.1 Apoptose-Rezeptoren: das Fas/FasL-System Der Fas- oder auch CD95-/Apo-1-Rezeptor ist ein glykosyliertes Membranprotein vom Typ II, welches aus der TNF-Rezeptoren-Familie stammt und sich als einer der wichtigsten Apoptoserezeptoren, vor allem während des apoptotischen Selektionsprozesses der TLymphozyten im Immunsystem erwiesen hat63. Er ist jedoch nicht nur dort von Bedeutung, 11 Einleitung ___________________________________________________________________________ sondern wird in allen Geweben des menschlichen Körpers wie auch von soliden Tumoren exprimiert87. Die Expression von FasL wiederum ist in der Hauptsache auf aktivierte T-Zellen, natürliche Killerzellen und Zellen in immunprivilegierten Organsystemen wie Hoden und Auge -aber auch Tumoren- limitiert39;63;101. Apoptoseinduktion erfolgt bei Ligation mit FasL in gebundener oder löslicher Form95, wobei die trimerische lösliche Form (sFasL), welche durch Metalloproteinasen vom membranständigen FasL abgespalten wird, eine 1000fach verringerte Bindungskapazität für den Fas-Rezeptor aufweist96. Die Bedeutung des Fas/FasL-Systems für die Apoptose wird durch folgende Beispiele eindrücklich: lpr- und gld-Mutationen, bei welchen respektive das Fas- bzw. FasL-Gen ausgeschaltet wurde, bewirkten bei Mäusen durch in nicht ausreichendem Maße ausgelöste Apoptose die Vergrößerung von Milz und Lymphknoten sowie Autoimmunreaktionen77. Ein weiterer wichtiger Punkt ist die Tatsache, dass Tumoren FasL exprimieren, um sich vor sie bekämpfenden Leukozyten schützen zu können, indem sie bei ihnen Apoptose auslösen, die sogenannte „Gegenattacke“63;81;112(siehe 1.2.4). 1.1.4.2 Genetische Regulierung: die bcl2-Familie Die bcl2-Familie wurde 1985 erstmals wegen seines gehäuften Auftretens bei der chromosomalen Translokation t(14;18) in follikulären B-Zell-Lymphomen (daher der Name „bcl2“) entdeckt und als potentielles Onkogen identifiziert40;57;59. Sie ist die bisher am genauesten untersuchte Einheit der Apoptose regulierenden Gene: Ihre Mitglieder, von welchen zur Zeit 20 bekannt sind, können zum einen Teil pro-apoptotische (wie bax, bak, bid und bad), zum anderen aber auch anti-apoptotische (wie bcl2, bclx, bclw und mcl1) Wirkung haben3;16;59. Bcl2 und bclx besitzen eine homologe Struktur, die in einem ersten Schritt in eine regulatorische und eine Dimerisierungsdomäne unterteilt werden kann. Diese wiederum sind aus 7 α-Helices, den „Homology Domains“ BH1-4, einer „LOOP“- und einer carboxyterminalen hydrophoben transmembranären Sequenz aufgebaut, welche außerdem das Andocken von anderen Proteinen ermöglichen und eine Kanal-/Poren-Funktion aufweisen, wie in folgender Abbildung dargestellt: 12 Einleitung ___________________________________________________________________________ regulatorische α1 BH4 Dimerisierungsdomäne α2 LOOP D34 ProteinBindungsstelle α3 BH3 S70 α4 α3 α3 α5 α6 BH1 α7 BH2 TM Kanal/Pore Abbildung 3: Schematische Darstellung des bcl2-Gens (nach91) Auch bax als „multi-domain“-Mitglied der proapoptotischen bcl2-Gene besitzt eine sehr ähnliche Struktur, bei der im Vergleich zu bcl2 nur die BH4-Domäne fehlt86, was jedoch gleichzeitig eine Erklärung –„Freilegung“ der für den Ionenkanal kodierenden Gensequenzfür die antagonistische Wirkung der beiden Gegenspieler sein könnte.47 Zwar ist die Funktionsweise der bcl2-Proteine noch nicht restlos aufgeklärt50;54, doch sowohl die genetische Konformität im Kanal-/Porenbereich als auch die intrazelluläre Lokalisation der Proteine unterstützen die These des mitochondrialen Apoptosewegs31: Bcl2 und bclx sind an den zytoplasmatischen Membranen von Mitochondrien, endoplasmatischem Retikulum und der Kerne gebunden50, und auch bax interagiert mit mitochondrialen Strukturen, indem es nach apoptotischer Stimulation vom Cytosol zum Mitochondrium transloziert31;44. Der durch oben dargestellte Gensequenz kodierte Ionenkanal, welcher den Porinen bakterieller Toxine ähnelt94, wird in die Mitochondrienmembran integriert. Dies führt zu einer Änderung des Membranpotentials30;91 und bewirkt dann wahrscheinlich die weitere Regulierung des Apoptoseprozesses über die Freisetzung von Cytochrom C9;44;74;94 und Auslösung der Protease-Kaskade86;87;100 bei Aktivierung durch proapoptotische Moleküle wie bax, während die antiapoptotischen Proteine bcl2 und bclx darauf abzielen, die Cytochrom C-Ausschüttung (durch Stabilisierung der Membran8) zu unterbinden1;31;55;88. 13 Einleitung ___________________________________________________________________________ Eine weitere These für den Wirkungsmechanismus der bcl2-Familie wird ebenfalls durch eines ihrer homologen strukturellen Merkmale unterstützt: die Proteinbindungsstelle. Diese ermöglicht die Homo- und Heterodimerisierung zwischen den verschiedenen bcl2Molekülen24;117. So können sich zwei bax-Proteine aneinander anlagern und Apoptose induzieren5;83. Jedoch hat sowohl die Homodimerisierung von bcl2 als auch die Heterodimerisierung von bcl2 und bax eine gegensätzliche Wirkung, nämlich die Unterstützung der Überlebensfunktionen der Zelle40;91. Zusätzlich zu den oben postulierten Wirkmechanismen der bcl2-Familie spielt auch die Regulierung durch Phosphorylierung eine große Rolle: Anscheinend kann die Phosphorylierung der bcl2-Proteine an Serin 70 die funktionelle Stabilisierung des heterodimeren Zustands von bcl2 und bax bewirken20 und somit die pro-apoptotische Wirkung von bcl2 unterstützen, aber auch zu anderen molekularen Modifizierungen führen91. 1.1.4.3 Ausführende Mechanismen: die Caspasen Bis jetzt wurden 15 Caspasen bei Säugetieren identifiziert86. Die Nomenklatur weist auf ihre Zugehörigkeit zur Familie der Cysteinproteasen hin, welche spezifisch an Aspartatgruppen schneiden (“cysteine dependent aspartat specific protease“)79;92. Es werden zwei Untergruppen unterschieden, da die Initiator- und die Effektor-Caspasen zu verschieden Zeiten in die Signalkaskade eingreifen: Procaspase 8 und 9 spielen in Interaktion mit anderen Molekülen wie Fadd70;75 und Apaf1 bei der initiatorischen Phase eine Rolle86. Caspase 3, 6 und 7 sind hauptverantwortlich für die Ausführung des Zelltodes indem sie die sogenannte „Protease-Kaskade“ mit Zerstörung und Inaktivierung der zur Aufrechterhaltung der Zellfunktionen unverzichtbaren Schlüsselproteine auslösen. Dieser Mechanismus ist irreversibel und führt zu einer schnellen Exekution der Zelle86;92. So effektiv diese Mechanismen bewiesenermaßen funktionieren, so komplex ist das Zusammenspiel der Caspasen, welches durch viele Regulationsmechanismen gesteuert wird: Zum Beispiel bewirkt die Eliminierung von bestimmten Caspasen in vivo die Aktivierung anderer Caspasen an ihrer statt, um die Ausführung der Apoptose zu gewährleisten121. Caspase 3 jedoch hat einen besonderen Status116: Die klassischen morphologischen Kennzeichen der Apoptose wie „budding“51 und die Fragmentation der DNA bleiben in ihrer Abwesenheit aus, was ihre Wesentlichkeit für den regulären Ablauf der Apoptose beweist86;122. 14 Einleitung ___________________________________________________________________________ 1.2 Makrophagen 1.2.1 Die Morphologie der Makrophagen Die Morphologie der Makrophagen wird durch folgende Merkmale charakterisiert: Die Zellen messen im Durchschnitt 25-50µm, sind unregelmäßig geformt und haben einen großen, exzentrisch platzierten rundlichen Nukleus, welcher einen oder zwei prominente Nukleoli und feines, gleichmäßiges Chromatin beinhaltet. Typisch sind außerdem die vielen kleinen sowie unzählige große basophile Granula und das gehäufte Vorkommen von Vakuolen im Zytoplasma21. 1.2.2 Die Herkunft der Makrophagen Makrophagen stammen aus dem Knochenmark, wo sie aus derselben Stammzelle heranreifen wie neutrophile Granulozyten: aus der „colony-forming-unit granulocyte- macrophage“ (CSU-GM)71. Die Regulation der Monozytopoese erfolgt über komplizierte Regelkreise: So können beispielsweise verschiedene Bedingungen wie das Vorhandensein externer Stimuli (z.B. Endotoxin) oder zu phagozytierender Partikel die Ausschüttung von Wachstumsfaktoren (M-CSF/ GM-CSF) aus Makrophagen32;85, Fibroblasten und Endothelzellen stimulieren12. Ausgehend von der Stammzelle reifen die mononukleären Phagozyten über Monoblasten und Promonozyten zu Monozyten heran, welche schon nach ca. 24h in die Peripherie ausgeschwemmt werden72;107. Die Zirkulationszeit beim Menschen beträgt bis zu 70h115, dann beginnt die Migration zu ihren Gewebsstandorten mit Adhärenz an die Endothelzellen sowie Diapedese zwischen diesen hindurch, bevor sie zuletzt die subendothelialen Strukturen passieren. Zytokine wie Interleukin-1 und Interferon-γ erleichtern diese Wanderung zu den Entzündungsherden, z.B. indem sie die Expression von CD54 auf Endothelzellen erhöhen und somit die Adhäsion von Makrophagen an die Endothelien erleichtern23. Ist der Monozyt am Ziel angekommen, findet seine Differenzierung zum Makrophagen statt, welcher schließlich einige Monate im jeweiligen Gewebe verbringt, ohne es wieder zu verlassen108. Nachfolgend soll eine Grafik die beschriebenen Abläufe in der Entwicklung der Makrophagen verdeutlichen: 15 Einleitung ___________________________________________________________________________ KNOCHENMARK Monoblast BLUT Promonozyt Monozyt GEWEBE Monozyt Makrophage = Diapedese DNA-Synthese Phagozytose Lysosome Abbildung 4: Entwicklung und einige Charakteristika der Makrophagen(nach90) 1.2.3 Funktion und Lokalisation der Makrophagen Die Makrophagen wurden 1924 von Aschoff dem retikuloendothelialen System (RES) zugeordnet, ein breitgefächertes System aus Fibroblasten, Histiozyten, Monozyten, retikulären und endothelialen Zellen4, welches zwar funktionelle Gemeinsamkeiten, nicht aber die verschiedene Herkunft der Zellen berücksichtigt. Diese Ungenauigkeit wurde mit der seit 1969 durch van Furth geprägten neuen Bezeichnung „mononukleäres PhagozytoseSystem“ (MPS) ausgeräumt109. Die Hauptaufgabe der Makrophagen ist demnach zweifelsohne die Phagozytose verschiedenster Substanzen. So können sowohl Mikroorganismen als auch Partikel anhand ihrer Oberflächenstruktur als körperfremd identifiziert werden, aber auch spezielle Markierungsprozesse, wie die Opsonisierung durch Proteine des Komplementsystems erleichtern ihre Erkennung60. Außerdem hilft ein zunehmender Gradient chemotakischer Stoffe bei der Versammlung der Makrophagen am Einsatzort48. Die Phagozytose an sich geschieht in Phagolysosomen, welche aus primären Lysosomen und Phagosomen fusionieren76 und die für das eventuelle Abtöten und die Verdauung der aufgenommenen Substanzen notwendigen cytotoxischen Systeme und Enzyme beinhalten66;78. 16 Einleitung ___________________________________________________________________________ Aber auch die Interaktion mit den anderen Zellen der Immunabwehr ist von immenser Bedeutung. Der Makrophage übernimmt zum einen Teil regulierende Funktionen, indem er Zytokine produziert, welche Funktion, Wachstum und Differenzierung sämtlicher Leukozyten beeinflussen90. Zudem sind Prozessierung und Präsentation der Antigene durch den Makrophagen sehr wichtig für die spezifischen Immunreaktionen von B- und TLymphozyten60. Von besonderem Interesse ist die Tatsache, dass sämtliche ausdifferenzierten mononukleären Phagozyten im Prinzip zu allen erwähnten Aktionen befähigt sind, aber je nach Lokalisation in den verschiedenen Organsystemen des Körpers andere Hauptaufgaben übernehmen. Nachfolgend sind einige dieser heterogenen Makrophagen-Populationen mit ihrer Funktion beschrieben90: 1. Die Alveolarmakrophagen, die dominierenden Zellen der Immunabwehr in der gesunden, aber auch chronisch entzündlichen Lunge99, sind in der Hauptsache für die lokale Verteidigung gegen eingedrungene Mikroorganismen verantwortlich, phagozytieren aber auch Staubpartikel. 2. Die KUPFFER-Zellen räumen die massenhaft in der Leber anfallenden gelösten und festen Giftstoffe ab. Da sie verschiedene Rezeptoren wie Fc-, Mannosyl-Fucosyl-Rezptor, CD14 und CD33 exprimieren, wird vermutet, dass Stimuli aus dem Darm (z.B. LPS) Reaktionen wie die Interaktion mit Hepatozyten provozieren. Außerdem spielen aktivierte Kupffer-Zellen durch Sezernierung verschiedener Botenstoffe (TNF-a, IL-1, IL-6, Prostaglandine, NO) eine wichtige Rolle in entzündlichen Prozessen, wobei IL-6 für die Auslösung der Akuten-Phase-Reaktion sogar die Schlüsselposition einzunehmen scheint42. Trotz ihrer funktionellen Heterogenität können sämtliche Makrophagen der Leber durch entsprechende Stimulation zur Tumorabwehr aktiviert werden, was ihre besondere Rolle in der Auseinandersetzung der Immunabwehr mit Neoplasien unterstreicht19. 3. In der Milz findet man auch phänotypisch sehr heterogene MakrophagenPopulationen11 mit folgenden Aufgaben: In der Randzone spüren sie Antigene auf und prozessieren diese, in den Keimzentren interagieren sie mit T- und BZellen und in der roten Pulpa sind sie am Abbau der Erythrozyten maßgeblich beteiligt. 4. Das Knochenmark ist nicht nur die Geburtsstätte der mononukleären Phagozyten, ihnen fallen dort so wesentliche Aufgaben wie die Überwachung des Wachstums und der Differenzierung sämtlicher Zelllinien mit Hilfe von adhäsiven Molekülen sowie sezernierten Botenstoffen zu41. 17 Einleitung ___________________________________________________________________________ 5. Man kann zahlreiche Makrophagen in der Lamina propria sowohl des Dick- als auch des Dünndarms73 und außerdem im Mukosa-assoziierten lymphoiden Gewebe (MALT) der Darmwand beobachten45. 1.2.4 Wechselwirkungen zwischen Tumoren und Makrophagen Untersuchungen haben ergeben, dass in den Leukozyteninfiltraten der meisten malignen Tumoren unzählige Makrophagen nachzuweisen sind110, welche einen von anderen Makrophagen-Populationen differierenden Phänotypen haben65. Diese Tumor-assoziierten Makrophagen (TAMs) sind überdurchschnittlich häufig aktiviert106, haben eine anderes Muster der Antigenexpression oder eine alterierte Zytokinsekretion als andere Populationen. Da TAMs jedoch wie sämtliche heterogene Makrophagen-Populationen von im Blut zirkulierenden Monozyten abstammen, scheint dieser abweichende Phänotyp von der jeweiligen interagierenden Tumorzelllinie beeinflusst zu werden61. Jedoch sind diese besonderen Aktivitätszustände der TAMs nicht unbedingt von Vorteil für die Tumorbekämpfung. Das kann sogar so weit gehen, dass manche Tumorzellen in bestimmten Stadien der Tumorprogression die TAMs insofern umzuerziehen vermögen, dass sie Proliferation und Metastasierung durch unterschiedliche Mechanismen wie Ausschüttung von Zytokinen oder Induktion der Angiogenese unterstützen25;69;123. Diese durch den Tumor zu dessen Gunsten manipulierten Makrophagen werden auch als der „symbiontische“ Typ bezeichnet. Es gibt aber auch Subtypen, die ihrer Aufgabe als Zellen der Immunabwehr trotz dieser Beeinflussung durch den Tumor gerecht werden und diesen bekämpfen: die „cytotoxischen“ TAMs61. Durch die Ausprägung der gegensätzlichen Untergruppen hat das Ausmaß des Makrophageninfiltrats somit in der Literatur für die Prognose eine äußerst unterschiedliche Bedeutung24;64;103. Eine weitere Variante der Interaktion zwischen neoplastischen Zellen und den TAMs ist in Hinsicht auf die Rolle der Apoptose von besonderem Interesse: Tumorzellen exprimieren FasL, welcher bei den Makrophagen Apoptose auslöst und sie somit „aus dem Verkehr zieht“- die sogenannte „Tumor-Gegenattacke“63. 18 Einleitung ___________________________________________________________________________ 1.3 Endotoxin Die Lipopolysaccharide (LPS) oder auch Endotoxine sind ein natürlicher Bestandteil der Zellwand gram-negativer Bakterien. Sie sind aus einer Kernzone mit einer bei allen Salmonellen übereinstimmenden Polysaccharidzusammensetzung, einer O-spezifischen Seitenkette, welche als antigene Determinante fungiert und dem Phospholipidanker, dem toxischen Lipid-A, aufgebaut. Bei Zerstörung der Zellwand eines Bakteriums werden die Endotoxine freigesetzt und können ihre toxische Wirkung entfalten: Zum Beispiel können Makrophagen durch die Assoziation von CD14-Rezeptoren und dem Toll-Like Receptor 4 (TLR4) auf ihrer Oberfläche die LPSAntigenstruktur als körperfremd erkennen, werden aktiviert Entzündungsreaktion durch Zytokine wie IL 1, IL 6 oder TNF-α aus und Die Toxizität des LPS ist jedoch stark konzentrations- und zeitabhängig lebensnotwendige Funktion von LPS sowie anderen eine . 105 eine lösen 60;104 , und es wird sogar mikrobiellen Produkten angenommen, welche durch die Erkennung von konservierten Pathogen-assoziierten molekularen Strukturen Einfluss auf die Entwicklung des „angeborenen“ Immunsystems nehmen2. Für die Identifizierung solcher möglicherweise pathogenen Strukturen sind Zelloberflächenrezeptoren unerlässlich. Die Annahme, dass für die Signaltransduktion von LPS ausschließlich über CD14 vermittelt wird, wurde erst 1998 widerlegt, und durch ein weit komplexeres Modell ersetzt: Zwar bleibt, wie schon zuvor bekannt, die Bindung des LPS/LPSBinding-Protein-Komplexes an den CD14-Rezeptor bestehen, jedoch folgt daraufhin eine Annäherung des CD14-Rezeptors an den TLR4-Rezeptor, und erst dieser vermag dank seiner transmembranären Domäne die Weiterleitung des LPS-Signals zu induzieren104. Außerdem sind zusätzliche Moleküle wie MD-2 in noch ungeklärter Weise am Ablauf beteiligt, der letztendlich über die Aktivierung von Nuklear-Faktor κB (NFκB) zu einer adäquaten Reaktion der Zelle auf Endotoxin führt. Die Bindung von Liganden an den TLR4-Rezeptor ist jedoch keineswegs LPS-spezifisch, es binden noch mehrere weitere Moleküle wie HSP60 und -70 sowie Fibrinogen und verschiedene Poly- und Oligosaccharide. Und auch für die Wirkung von LPS auf die jeweilige Zelle scheint TLR4 nicht der einzige Signalvermittler zu sein: LPS bindet auch an andere Zelloberflächenmarker und vermittelt nach Translokation ins Zytoplasma seine Wirkung über Nod1 und -2104. 19 Einleitung ___________________________________________________________________________ 1.4 Lewis-Lung-Karzinom Das Lewis-Lung-Karzinom ist ein erstmals bei Mäusen beobachteter hochmaligner Lungentumor, welcher für seine Fähigkeit, die wirtseigene Immunsuppression zu unterdrücken, bekannt ist56. Zwar wird die Migration von Makrophagen gefördert, aber ihre chemotaktische und tumorizide Aktivität wie auch die Proliferation von Lymphozyten wird gehemmt120. Interessant ist die Fragestellung, wie diese Interaktion zustande kommtwerden die Immun- von den Karzinomzellen direkt induziert, oder spielen auch lösliche Faktoren eine Rolle? Die Förderung der Tumorausbreitung durch Prostaglandin E2118 sowie die Hemmung der Aktivität von Lymphozyten und NK-Zellen scheint von den Karzinomzellen durch die Sekretion löslicher Faktoren bewerkstelligt zu werden: die Makrophagen werden zur Produktion von Prostaglandin E2 angeregt, welches sie selbst rückwirkend hemmt. Durch diese Mechanismen erreicht das Lewis-Lung-Karzinom die Förderung von eigenem Wachstum (Verdopplungszeit: ca. 21 h6) und Metastasierung119. 20 Einleitung ___________________________________________________________________________ 1.5 Fragestellung Mit der Einleitung wurde versucht, dem Leser einen Überblick über so komplexe Themen wie die Apoptose und die Rolle des mononukleären Phagozytosesystems in der Immunabwehr zu verschaffen. Ein besonderer Augenmerk wurde hierbei auf die Interaktionen zwischen Makrophagen und Tumorzellen gerichtet: So sind für die Fragestellung unserer Arbeit vor allem die Strategien des Immunsystems zur Beeinflussung von Tumorwachstum von Interesse, da sich bei der „Manipulation“ von Makrophagen offenbar um einen bedeutsamen Angriffspunkt der Tumorzellen zur Optimierung ihres Wachstums und ihrer Metastasierung zu handeln scheint. Dieser Thematik wird schon seit 1996 im Labor Freudenberg mithilfe von in vitro- und in vivo-Versuchen mit den folgenden Ergebnissen nachgegangen: Als Ausgangssituation ergab sich die Beobachtung, dass LEWIS-Lung-Tumorzellinjektion in die Milz von C57/BL6-Mäusen bei den KUPFFER-Zellen der Leber eine Steigerung der Apoptoserate auslöste, welche mit Hilfe von bcl2 und bax aufgezeigt werden konnte. Des Weiteren erfolgte der Nachweis, dass die Apoptose von löslichem Tumorzellüberstand ausging, der später über indirekte Methoden von M. Woisetschläger als FasL identifiziert wurde34. Da durch diese Experimente schon Einsichten in den Ablauf der Apoptose sowie die Interaktion zwischen den Tumor- und Abwehrzellen gewonnen werden konnten, stellt sich nun die Frage, mit welchen Mitteln die Makrophagen vor einem solchen Angriff der Tumorzellen geschützt werden können. Empirische Beobachtungen zeigten, dass sich bei Krebspatienten nach bakteriellen Infektionen teilweise Regression der Tumoren nachweisen ließ, die auf die Wirkung von LPS zurückzuführen war18. Die vorliegende Arbeit befasst sich mit der Frage, ob auch unter den Bedingungen des bereits im Labor Freudenberg etablierten in vitro-Modells eine Änderung des Apoptoseverhaltens der Makrophagen nach Stimulation mit LPS erfasst werden kann. 21 Material und Methoden __________________________________________________________________________ 2 MATERIAL UND METHODEN 2.1 Übersicht der Versuchsanordnungen 2.1.1 Apoptoseinduktion bei Makrophagen In der Literatur sind viele Hinweise zu finden, die eine apoptoseinduzierende Wirkung von Fas auf Makrophagen beweisen. Diese grundlegende Aussage wurde in folgender Art und Weise als Ausgangspunkt für den vorliegenden Versuchsaufbau übernommen: Es wurde ein in vitro Modell mit C57/BL6 Mausstammzellen verwendet, welche durch ein selektives Verfahren bis zu einer annähernden Reinkultur von ausdifferenzierten Makrophagen kultiviert werden konnten. Analog der im Labor des Pathologischen Instituts von Prof. Freudenberg etablierten Methode wurden die Makrophagen an zwei verschiedenen Kulturtagen mit Tumorzellüberstand aus 3-LL-Tumorzellen respektive als Kontrollversuch mit dem Kulturmedium der Tumorzellen für jeweils zwölf Stunden inkubiert. Im Anschluss wurde der Effekt dieser Behandlung anhand einer immunzytochemischen Färbung mit den bekannten Apoptoseantigenen (bcl2, bclx, bax) ausgewertet. Hierbei wurden sowohl der zeitliche Verlauf durch die unterschiedliche Kulturdauer als auch die Quantität der Expression berücksichtigt, um den Apoptosevorgang adäquat beschreiben zu können. 2.1.2 Endotoxinwirkung Im Besonderen wurde hier die Wirkung des Endotoxins aus dem Bakterienstamm Salmonella abortus equi auf die Makrophagen untersucht. Das Endotoxin bzw. das Kontrollmedium DMEM wurden schon eine Stunde vor der Inkubation mit Tumorzellüberstand zugegeben, so dass eine eventuelle vorzeitige Interaktion des Toxins mit den apoptoseinduzierenden Faktoren ausgeschlossen werden konnte. Um den Effekt des Lipopolysaccharids (LPS, 1µg/ml Makrophagensuspension) auf die apoptotische Wirkung des Tumorzellüberstands genau definieren zu können, wurden folgende vier Versuchsansätze verwendet. -Kontrollversuch: Makrophagenmedium + Medium zur Tumorzellkultur -Kontrollversuch für Tumorzellüberstand: Makrophagenmedium + Tumorzellüberstand -Kontrollversuch für LPS: Endotoxin + Medium zur Tumorzellkultur -Versuch: Endotoxin + Tumorzellüberstand Der genaue Versuchsablauf wird unter 2.3 beschrieben. 22 Material und Methoden __________________________________________________________________________ 2.2 3-LL Tumorzellen 2.2.1 Gewinnung des Tumorzellüberstands Die 3-LL Tumorzellen wurden von der Firma Cell Line Services Heidelberg Deutschland bezogen. In einem Cryotube auf Trockeneis geliefert, wurden die Zellen (Zelldichte: 1×107 /ml) bei 37° C aufgetaut, mit 20 ml Kulturmedium (ISCOVE’S basal Medium, s. 2.6, Tab. 6) in einer Kulturflasche (Tab. 6) suspendiert und für 24 h bei 37° C und feuchtigkeitsgesättigter Atmosphäre mit 8% CO2 bebrütet. Am Folgetag wurden die Zellen mehrere Male gewaschen (Zentrifugation bei 300 g, 4° C für 8 min, Überstand verwerfen, Resuspension mit DMEM (Tab. 4)), um Rückstände des toxischen Einfriermediums DMSO (10% in Ursprungslösung) zu beseitigen. Am jeweils fünften Kulturtag wurden die Zellen nun im Verhältnis 1:4 umgesetzt, d.h. 25% Volumenanteil Tumorzellsuspension mit 75% Kulturmedium. Nach zehnmaligem Passagieren der Tumorzellen wurde die Zelllösung durch Zentrifugieren (300g bei 4° C für 8 min, Auffangen des Überstands, Verwerfen der Zellen, weitere Zentrifugation bei 4000g bei 4° C für 30 min) von allen festen Bestandteilen befreit. Der gewonnene Tumorzellüberstand (TZÜ) wurde sterilfiltriert (Sterilfilter 22µm, Tab. 6), in Blue-Cap-Röhrchen (Tab. 6) abgefüllt und bei –80° C bis zum weiteren Gebrauch tiefgefroren. 23 Material und Methoden __________________________________________________________________________ 2.3 Makrophagen 2.3.1 Gewinnung Die Mausmakrophagen, welche die Grundlage für die in vitro Versuche lieferten, stammten aus 6-8 Wochen alten C57/BL6 Mäusen, und wurden uns freundlicherweise von Herrn Dr. Galanos, wissenschaftlicher Leiter am Max-Planck-Institut für Immunbiologie in Freiburg, zur Verfügung gestellt. Zur Isolierung der Makrophagen wurden die Knochenmarksstammzellen der Mäuse wie folgt gewonnen: Unter Isoflurannarkose erfolgte die Luxation der Halswirbelsäule, damit nach Desinfektion beide Femurknochen freipräpariert werden konnten. Diese wurden an den Epiphysen abgetrennt, so dass das Knochenmark mit den Stammzellen durch Ausspülen des Markkanals mit DMEM als Zellsuspension aufgefangen werden konnten. Nun wurde bei 300g und 4° C für 8 min zentrifugiert, der Überstand verworfen und das Sediment mit DMEM resuspendiert. Nach Wiederholung dieses Vorgangs wurden durch Zusatz von Zap-o-Globin (Tab. 5) unerwünschte Erythrothrozyten lysiert. Die Konzentration der Zellen wurde mithilfe des Coulter-counters auf 1×106 /ml Kulturmedium eingestellt und die Suspension in sterile Teflonbeutel eingebracht. Auf Eis wurden diese anschließend ins Pathologische Institut Freiburg transportiert und bei 37°C und feuchtigkeitsgesättigter Atmosphäre mit 8% CO2 kultiviert. Der im Kulturmedium enthaltene Granulocyte-Macrophage-colony-stimulating-factor (GM-CSF) ermöglichte den Erhalt einer nahezu reinen Makrophagenkultur. 2.3.2 GM-CSF GM-CSF ist der Hauptbestandteil des vom MPI IB Freiburg zur Verfügung gestellten LConditioned-Medium, welches dort folgendermaßen hergestellt wurde: In hydrophoben Teflonbeuteln erfolgte die Kultivierung von L-Zellen -einer Tumorlinie aus L 929 S Maus-Fibroblasten- in einer Konzentration von 2×105 Zellen/ml DMEM mit 10% fetalem Kälberserum (FCS, Tab.4). Nach einer Woche wurde der Überstand abgenommen, mehrmals zentrifugiert und sterilfiltriert, um eine maximale Reinigung zu erreichen. Das so gewonnene L-Conditioned-Medium wurde aliquotiert und bis zur Verwendung bei -80° C gelagert. 24 Material und Methoden __________________________________________________________________________ 2.3.3 Inkubation mit Endotoxin aus Salmonella abortus equi Am 10. und 12. Kulturtag wurden 20 ml der Makrophagensuspension unter sterilen Bedingungen aus dem Teflonbeutel entnommen und jeweils 10 ml in zwei Blue-CapRöhrchen (Tab.5) verschiedenen Prozeduren unterworfen: Dem Versuchsansatz wurden 10 µl LPS-Lösung aus Salmonella abortus equi (Stimulierung: 1mg/ml in PBS) und 90 µl DMEM hinzugefügt. Dem Kontrollversuch wurden 100 µl DMEM beigegeben, anschließend wurden beide Ansätze für eine Stunde im Brutschrank inkubiert. 2.3.4 Inkubation mit 3-LL-Überstand Nach abgelaufener Inkubationszeit wurden die beiden Ansätze zu 10 ml in je zwei zu 5 ml überführt: Je ein LPS- sowie ein LPS-Kontrollversuch wurde mit 0,5 ml (10% Volumen) des Tumorzellüberstands, die beiden anderen Ansätze als TZÜ-Kontrollversuch mit 0,5 ml ISCOVE’S (Tab. 6) für 12 h im Brutschrank inkubiert (Abb. 5). 20ml Makrophagensuspension 10ml MØ + 10µl LPS + 90µl DMEM 10ml MØ + 100µl DMEM 1 h Inkubation 1 4 5ml MØ inkl.LPS + 0,5ml TZÜ 2 1 2 3 4 5ml MØ inkl.LPS + 0,5ml ISC 3 5ml MØ + 0,5ml TZÜ 5ml MØ + 0,5ml ISC Versuch: Endotoxin + Tumorzellüberstand TZÜ-Kontrollversuch: Endotoxin + Medium zur Tumorzellkultur Kontrollversuch: Makrophagenmedium + Medium zur Tumorzellkultur LPS-Kontrollversuch: Makrophagenmedium +Tumorzellüberstand MØ= Makrophagensuspension LPS= Endotoxin aus Salmonella abortus equi/ Lipopolysaccharid TZÜ= Tumorzellüberstand DMEM= Makrophagenmedium (Tab. 6) ISC= Medium zur Tumorzellkultur Abbildung 5: Versuchsaufbau 25 Material und Methoden __________________________________________________________________________ 2.3.5 Ernte und Fixierung Nach zwölfstündiger Inkubation wurden die Zelluspensionen zweimal gewaschen: Die BlueCap-Röhrchen mit den vier oben beschriebenen Ansätzen wurden bei 300g und 4° C für 8 min zentrifugiert und mit DMEM resuspendiert. Die Zellkonzentration der Lösung wurde nun mit Hilfe einer Zählkammer auf 1×106 Zellen/ml eingestellt und mit je 15 µl pro Reaktionsfeld auf vorbereitete Adhäsionsobjektträger (Fa. Marienfels) aufgebracht. Nach zehnminütiger Sedimentation auf der Schwenkplatte wurde die Flüssigkeit abgesaugt und die Zellen mit GDA (Glutardialdehyd, Tab. 7) fixiert (15 min bei Zimmertemperatur). Danach wurden die Objektträger in Küvetten 3×5 min gewaschen und mit NAG-Medium (Tab. 9) konserviert bis zur weiteren Verarbeitung bei 4° C in der feuchten Kammer aufbewahrt. Die verwendeten Adhäsionsobjektträger wurden nach einem Verfahren hergestellt10, welches folgende methodische Vorzüge gewährleistet: 12 Einzelfelder, welche durch hydrophobe Anteile voneinander abgegrenzt sind, ermöglichen die Durchführung mehrerer immunzytochemischer Versuche auf einem Objektträger. Der Boden der Reaktionsfelder besteht aus einer hydrophilen Schicht, auf der die Zellen durch elektrostatische Kräfte haften (siehe auch 4.1.1.3.2). 26 Material und Methoden __________________________________________________________________________ 2.4 Immunzytochemische Färbung 2.4.1. Antikörper Die immunzytochemische Färbung zur Detektion und zahlenmäßigen Bestimmung der Zellen mit Expression der Apoptose-assoziierten Antigene bcl-2, bcl-x und bax ist primär von der Bindung durch die jeweiligen Antikörper abhängig. Hierfür wurden polyklonale Erst- und Zweitantikörper verwendet; die Reaktion wurde durch die nachfolgend beschriebene ABCMethode (2.4.2) für die Auszählung unter dem Lichtmikroskop sichtbar gemacht. Eine Übersicht über die Antikörper ist in Tab. 1 dargestellt. Tabelle 1: Übersicht über Erst- und Zweitantikörper Antigen 1. Antikörper 2. Antikörper Methode bcl-2 Polyclonal, Rabbit Goat anti Rabbit ABC + TyramidVerstärkung Zu bcl-x Polyclonal, Rabbit Goat anti Rabbit ABC bax Polyclonal, Rabbit Goat anti Rabbit ABC Beginn der Versuche wurden in Verdünnungsreihen und Testfärbungen die Konzentrationen der benötigten Erstantikörper optimiert. Die Ergebnisse hiervon und die Hersteller der Antikörper sind aus Tab. 2 ersichtlich. Tabelle 2: Konzentration des Erstantikörpers Antikörper Verdünnung Hersteller bcl-2 aus Rabbit 1: 200 Fa. Oncogene bcl-x aus Rabbit 1: 200 Fa. Pharmingen bax aus Rabbit 1: 200 Fa. Pharmingen 27 Material und Methoden __________________________________________________________________________ Die Bestimmung der verschiedenen Zweitantikörperkonzentrationen unterlag einem analogen Auswahlverfahren. Die ermittelten Verdünnungen verstehen sich inklusive des 10%igen Ziegenserums, welches eine Stunde vor der Reaktion mit dem Zweitantikörper zugegeben wurde, um unspezifische Bindungen desselben zu verhindern (Tab. 3). Tabelle 3: Konzentration des Zweitantikörpers Antikörper Verdünnung Hersteller Goat anti Rabbit (bcl-2) 1:600 incl. 10 % Serum Fa. Vector Goat anti Rabbit (bcl-x) 1:400 incl. 10 % Serum Fa. Vector Goat anti Rabbit (bax) 1:300 incl. 10 % Serum Fa. Vector 2.4.2 ABC-Methode Diese immunhistochemische Standardmethode wurde für alle Färbungen -bcl2, bclx und baxverwendet. Die spezifische Anfärbung beruht auf einer chemischen Reaktion zwischen dem biotinylierten Zweitantikörper, dem Biotin-gekoppelten Enzym (Peroxidase) und dem Farbsubstrat Äthylaminocarbazol (EAC, Tab. 10) mit einer zusätzlichen Verstärkung durch Osmiumtetroxid, welches nach abgelaufener Kopplungsreaktion zuletzt hinzugefügt wurde (Abb.6). Bei der bcl-2 Färbung wurde zusätzlich zur Verbesserung des Färbeergebnisses die Tyramidverstärkung angewandt (2.4.3) 28 Material und Methoden __________________________________________________________________________ Peroxidase/EAC/Osmium Biotin-Avidin-Komplex Zweitantikörper Erstantikörper Antigen Abbildung 6: Prinzip der ABC-Methode Die genaue Vorgehensweise der ABC-Methode wurde nach dem folgenden Protokoll durchgeführt: 1. Waschen der mit NAG bedeckten Objektträger mit PBS (Tab. 8) in Küvetten: 3×5 min 2. Auftragen von 10%igem Bovinem Serumalbumin (BSA, Tab. 9) zur Abdeckung unspezifischer Bindungsstellen: 30 min 3. Absaugen des Serums 4. Auftragen des Erstantikörpers (15 µl) und Inkubation in der feuchten Kammer: 12h 5. Absaugen und Waschen mit PBS in Küvetten: 3×5 min 6. Hemmung der endogenen Peroxidase durch Einstellen der Objektträger in Küvetten mit Perhydrollösung (Methanol mit 1% Wasserstoffperoxid, Tab. 10): 30 min 7. Waschen mit PBS (s.o.) 8. Auftragen des biotinylierten Zweitantikörpers: 30 min 9. Waschen mit PBS 10. Auftragen der ABC-Lösung (Verdünnungslösung A:B:C für bclx und bax =1:1:500, analog für bcl2 =5:5:500, 30 min vorher ansetzen): 30 min 29 Material und Methoden __________________________________________________________________________ 11. Waschen mit PBS 12. Auftragen der Äthylaminocarbazol-Lösung (EAC, Tab. 10): 10 min 13. Absaugen des EAC und Waschen mit PBS 14. Auftragen von Osmiumtetroxid (Tab. 10) zur Verstärkung der Farbreaktion (auf Eis, da Osmium stark flüchtig): 5 min 15. Absaugen des Osmiums und Waschen mit PBS 16. Eindecken der Objektträger mit Glyceringelatine (Tab. 10) Beim Umgang mit EAC und Osmium wurde unter dem Abzug gearbeitet und die Substanzen entsprechend entsorgt, um gesundheitliche Risiken zu minimieren. 2.4.3 Tyramidverstärkung Da das Färberesultat beim bcl2-Antigen nach der ABC-Standardmethode schwach ausfiel, wurde die Tyramidverstärkung zusätzlich in das Protokoll aufgenommen. Sie basiert auf einer weiteren Verzweigung der durch den Avidin-Biotin-Komplex angebotenen Bindungsstellen für das Farbsubstrat durch biotinylierte Tyramidmoleküle wie aus Abb. 7 ersichtlich. Das Färbeprotokoll für bcl-2 unterscheidet sich somit von der Standardmethode durch folgende Arbeitsschritte, die nach 8. eingefügt wurden: a. Nach Entfernung des überschüssigen Zweitantikörpers durch Waschen mit PBS (s.o.) wurde mittels TNB-Puffer (Tab. 11) ein Biotin-Block durchgeführt: 30 min b. Waschen, Auftragen der ABC-Lösung (bcl2 =5:5:500): 30 min c. Waschen, Auftragen der Tyramidverstärkung (24 µl Biotin-Tyramid, 588 µl Amplification Diluent, 588 µl Aqua dest., Tab. 11): 10 min d. Waschen, weiteres Verfahren laut Standardprotokoll siehe oben ab 10. 30 Material und Methoden __________________________________________________________________________ Peroxidase/EAC/Osmium Tyramid Biotin Avidin Zweitantikörper Erstantikörper Antigen Abbildung 7: Prinzip der Tyramidverstärkung 31 Material und Methoden __________________________________________________________________________ 2.5 Auswertung 2.5.1 Kontrollen Es wurde für jedes Reaktionsfeld ein zugehöriges Kontrollfeld angelegt. Bei dieser sogenannten Negativkontrolle wurde während der Färbung nicht-immunogenes Serum aus dem Tier, aus welchem der Erstantikörper stammte, in der dem Antikörper entsprechenden Proteinkonzentration aufgetragen. Sämtliche anderen Arbeitsschritte wurden entsprechend dem Protokoll ausgeführt. Durch diese Methode konnten unerwünschte unspezifische Bindungen des Zweitantikörpers ausgeschlossen werden. 2.5.2 Auszählung und Statistik Zuerst wurden die jeweiligen Kontrollfelder zu Sicherung der Ergebnisse hinsichtlich unspezifischer Anfärbung begutachtet. Konnte diese ausgeschlossen werden, wurde folgendermaßen weiter verfahren: Mit Zufallszahlen wurden Sichtfelder ausgewählt und mit Okularen, welche eine zusätzliche Abgrenzung des Sichtfeldes erlaubten, positive und negative Zellen ausgezählt. Hierbei wurden nur diejenigen berücksichtigt, die eine eindeutige Anfärbung aufwiesen und morphologisch intakt waren; die Zählmethode wurde durch einen Zweituntersucher bestätigt. Pro Färbung wurden so 2000 Zellen ausgezählt und die verschiedenen Versuchsansätze mittels Standardabweichung und dem Zwei-Stichproben-tTest für unverbundene Stichproben miteinander verglichen. 32 Material und Methoden __________________________________________________________________________ 2.6 Reagenzien Tabelle 4: Für die Herstellung des Makrophagen-Kulturmediums benötigte Materialien Substanz Menge Hersteller DMEM (Dulbecco’s Modified 260 ml Fa. CC pro 150 ml Am MPI IB Freiburg hergestellt 50 ml Fa. Sigma Horse Serum 25 ml Fa. Seromed Penicillin 50 5 ml Fa. Gibco L-Glutamin 5 ml Fa. Gibco Na-Pyruvat 5 ml Fa. Gibco Mercaptoethanol 1 ml Fa. Roth Eagle Medium) GM-CSF (GranulocyteMacrophage-colonystimulating-factor) FCS (Fetal Calf Serum); vor Gebrauch 30 min bei 4°C (komplement-) inaktiviert I.E./Streptamycin 50 µg Tabelle 5: Weitere zur Kultivierung der Makrophagen benötigte Materialien Substanz Menge/Größe Zap-o-Globin 3 Tropfen Fa. Coulter Electronics Teflonbeutel 60-120 ml Fa. Heraeus Zähler Coulter-Counter Blue-CapZentrifugationsröhrchen Hersteller Fa. Coulter Electronics 50 ml Fa. Becton Dickinson 33 Material und Methoden __________________________________________________________________________ Tabelle 6: Materialien, die zur Herstellung von TZÜ benötigt wurden; wobei aus den nicht kursiv gedruckten Substanzen das Kulturmedium hergestellt wurde Substanz/Artikel Menge/Größe Hersteller Sterilfilter 22 µm Fa. Millipore Kulturflaschen 50-600 ml Fa. Greiner Iscoves basal Medium 450 ml Fa. Biomedia FCS (Fetal Calf Serum) 50 ml Fa. Sigma L-Glutamin 5 ml Fa. Sigma Tabelle 7: Für die Fixierung der Makrophagen auf Marienfeld-Objektträgern benötigte Materialien Substanz Hersteller Glutardialdehyd, 25% Fa. Merck Äthanol-Fixans BrdU-Kit, Fa- Boehringer Mannheim Tabelle 8: Zur Herstellung von PBS benötigte Materialien Substanz Menge NaCl 8g Na2HPO4 1,4625 g KH2PO4 0,245 g Alle Substanzen wurden in 1000 ml Aqua bidest gegeben und mit 1N HCL auf pH 7,5 eingestellt. Tabelle 9: Zur Herstellung von Natrium-Acetat-Puffer benötigte Materialien Substanz Menge Stammlösung für Natrium-Acetat-Puffer 1:9 Die Stammlösung wird im Verhältnis 1:9 mit Acqua bidest aufgefüllt. 34 Material und Methoden __________________________________________________________________________ Tabelle 10: Zur Herstellung von NAG-Medium benötigte Materialien Substanz Menge Hersteller NaN3, 10% in Aqua bidest 250 µl Fa. Merck Hepes Puffer, 1M, pH 8 2 ml Fa. CC pro Gelatine, 5%, vorgewärmt 1 ml Fa. Riedel-de-Haen BSA 250 µl Fa. Biotest Alle Substanzen wurden in 25 ml PBS gegeben. Tabelle 11: Für die ABC-Methode benötigte Materialien Substanz Menge Größe/Form Hersteller Seren Goat Serum Fa. Sigma Sheep Serum Fa. Sigma Perhydrollösung: H2O2 1 ml 1% Fa. Merck Methanol 99 ml 99% Fa. Merck ABC-Lösung Avidin 2 µl wird 30 min vor Biotin 2 µl Gebrauch angesetzt Fa. Vector PBS 1 ml Fa. Vector Äthylaminocarbazol-Lösung Äthylaminocarbazol 3 mg DMSO/Triton 2 ml Natrium-Acetat-Puffer 98 ml Perhydrollösung, 30% 10 µl Zuerst Äthylaminocarbazol in DMSO/Triton lösen, ad 100ml mit Natrium-Acetat-Puffer auffüllen. Das Perhydrol wird erst unmittelbar vor Gebrauch hinzugefügt. Osmiumlösung, 0,5% Osmiumtetroxid, 2% 5 ml Aqua bidest 15 ml Fa. Sigma Eindeckmedium Glyceringelatine Fa. Kaiser 35 Material und Methoden __________________________________________________________________________ Tabelle 12: Für die Tyramidverstärkung verwendeten Substanzen Substanz Menge Hersteller Biotin-Tyramid 24 µl Fa. Dako Amplification Diluent 588 µl Fa. Dako Aqua bidest 588 µl Fa. Dako TNB-Puffer TRIS-HCl, pH 7,5 0,1 M NaCl 0,15 M Blocking Reagent aus Kit 0,5 % Auf 60°C erwärmen, Blocking Reagent darin auflösen. Fa. Dako 36 Ergebnisse ___________________________________________________________________________ 3 ERGEBNISSE 3.1 Immuncytochemischer Nachweis des antiapoptotischen bcl2Proteins an Makrophagen zu verschiedenen Kulturzeiten Abbildung 8: Expression des bcl2-Proteins bei positivem Makrophagen (Pfeil, Vergrößerung 1000fach) 3.1.1 10. Kulturtag 3.1.1.1 Vergleich Kontrolle / Inkubation mit LPS Abbildung 9 zeigt den Vergleich zwischen den zwei verschiedenen Versuchansätzen anhand drei Kurven, welche die Versuche zu unterschiedlichen Zeitpunkten repräsentieren. Die nahezu parallele Steigung um etwa 3% bedeutet, dass die Makrophagen der Kontrollgruppe am 10. Kulturtag in der Tendenz eine geringere Expression des bcl2-Proteins aufweisen als die mit LPS behandelten Makrophagen. Aus der nachfolgenden Tabelle 13 wird ersichtlich, dass die mittels Student-t-Test ermittelte Prüfgröße das Signifikanzniveau nicht erreicht. Des Weiteren sind die Einzelwerte der verschiedenen Versuche im Detail aufgelistet. 37 Ergebnisse ___________________________________________________________________________ 22 20 18 16 % Versuch 1 Versuch 2 14 Versuch 3 Versuch 4 12 10 8 6 Kontrolle LPS Abbildung 9: Dargestellt ist die Expression von Kulturmakrophagen für das bcl2-Antigen am 10. Kulturtag ohne Vorbehandlung (Kontrolle) und nach LPS-Zusatz (LPS) Tabelle 13: Ergebnisse der bcl2-Färbung nach Inkubation mit LPS sowie der Kontrollgruppe am 10. Kulturtag Kontrolle LPS + ISC Differenz % positiv Versuch 1 Versuch 2 Versuch 3 Versuch 4* Mittelwert Standardabweichung Prüfgröße 10,929 13,916 -2,987 9,803 12,919 -3,116 16,312 18,075 -3,797 (15,871) (9,234) (6,637) 16,18 17,782 -3,3 0,268 0,41 1,938 -3,405 Signifikanz für t2;0,975 (=4,3) nein *Aufgrund stark abweichender Werte wurde der vierte Versuch nicht in die Auswertung mit einbezogen 38 Ergebnisse ___________________________________________________________________________ 3.1.1.2 Vergleich Tumorzellüberstand / Tumorzellüberstand und LPS Wie aus den gegenläufigen Kurven der Abbildung 10 sowie den zugehörigen Werten in Tabelle 14 hervorgeht, ist zwischen den ausschließlich mit TZÜ vorbehandelten Versuchsansätzen und den zusätzlich mit LPS inkubierten Ansätzen kein signifikanter Unterschied nachzuweisen. 20 18 16 14 % Versuch 1 Versuch 2 12 Versuch 3 Versuch 4 10 8 6 4 KontrolleTZÜ LPS+TZÜ Abbildung 10: Dargestellt ist die Expression von Kulturmakrophagen für das bcl2-Antigen am 10. Kulturtag nach Behandlung mit Tumorzellüberstand von Kontrollzellen (TZÜ) und nach LPSZusatz (LPS+TZÜ) 39 Ergebnisse ___________________________________________________________________________ Tabelle 14: Ergebnisse der bcl2-Färbung nach Inkubation mit TZÜ bzw. TZÜ und LPS am 10. Kulturtag TZÜ LPS + TZÜ Differenz % positiv Versuch 1* (14,545) (12,39) (2,155) Versuch 2 7,578 9,56 -1,982 Versuch 3 13,798 18,854 -5,056 Versuch 4 17,504 18,269 -0,765 Mittelwert 12,96 15,561 -2,601 Standardabweichung 5,016 5,205 2,348 Prüfgröße -2,215 Signifikanz t2;0,975 (=4,3) nein *Aufgrund stark abweichender Werte wurde der erste Versuch nicht in die Auswertung mit einbezogen 3.1.2 12. Kulturtag 3.1.2.1 Vergleich Kontrolle / Inkubation mit LPS In Abbildung 11 kann am zwölften Kulturtag ein Anstieg der bcl2-Expression bei den mit LPS behandelten Ansätzen beobachtet werden. Aus Tabelle 15 wird jedoch ersichtlich, dass der Unterschied zwischen den mit LPS inkubierten und den Makrophagen der Kontrollgruppe nicht signifikant ist. 40 Ergebnisse ___________________________________________________________________________ 19 18 17 16 Versuch 1 15 % Versuch 2 Versuch 3 14 Versuch 4 13 12 11 10 Kontrolle LPS Abbildung 11: Dargestellt ist die Expression von Kulturmakrophagen für das bcl2-Antigen am 12. Kulturtag ohne Vorbehandlung (Kontrolle) und nach LPS-Zusatz (LPS) Tabelle 15: Ergebnisse der bcl2-Färbung nach Inkubation mit LPS sowie der Kontrollgruppe am 12. Kulturtag Kontrolle LPS + ISC Differenz % positiv Versuch 1 12,83 15,968 -3,138 Versuch 2 12,581 14,634 -2,053 Versuch 3 16,934 18,209 -1,275 (17,4) (14,328) (3,072) 14,115 16,27 -2,155 2,444 1,807 2,723 Versuch 4* Mittelwert Standardabweichung Prüfgröße -2,952 Signifikanz für t2;0,975 (=4,3) nein *Aufgrund stark abweichender Werte wurde der vierte Versuch nicht in die Auswertung mit einbezogen 41 Ergebnisse ___________________________________________________________________________ 3.1.2.2 Vergleich Tumorzellüberstand / Tumorzellüberstand und LPS Aus Abbildung 12 wird deutlich, dass die mit LPS vorbehandelten und dann erst mit TZÜ versetzten Makrophagenkulturen einen größeren Prozentsatz an bcl2-positiven Zellen aufweisen als die ausschließlich mit TZÜ behandelten Ansätze. Die errechnete Prüfgröße beweist die Signifikanz dieser Aussage, was -wie auch die entsprechenden Einzeleregebnisse- aus Tabelle 16 zu entnehmen ist. 25 20 15 Reihe1 % Reihe2 Reihe3 Reihe4 10 5 0 KontrolleTZÜ LPS+TZÜ Abbildung 12: Dargestellt ist die Expression von Kulturmakrophagen für das bcl2-Antigen am 12. Kulturtag nach Behandlung mit Tumorzellüberstand von Kontrollzellen (TZÜ) und nach LPSZusatz (LPS+TZÜ) 42 Ergebnisse ___________________________________________________________________________ Tabelle 16: Ergebnisse der bcl2-Färbung nach Inkubation mit TZÜ bzw. TZÜ und LPS am 12. Kulturtag TZÜ LPS + TZÜ Differenz % positiv Versuch 1 11,266 16,648 -5,382 Versuch 2 10,418 11,99 -1,572 Versuch 3 14,359 20,528 -6,169 Versuch 4 13,805 20,551 -6,746 12,462 17,429 -4,967 1,916 4,064 2,332 Mittelwert Standardabweichung Prüfgröße -4,261 Signifikanz t3;0,975 (=3,18) ja 43 Ergebnisse ___________________________________________________________________________ 3.2 Immuncytochemischer Nachweis des antiapoptotischen bclxProteins an Makrophagen zu verschiedenen Kulturzeiten Abbildung 13: Expression des bclx-Proteins bei positiven Makrophagen (Pfeile, Vergrößerung 1000fach) 3.2.1 10. Kulturtag 3.2.1.1 Vergleich Kontrolle / Inkubation mit LPS Abbildung 14 zeigt anhand der abfallenden Kurven, dass die bclx-Expression bei den mit LPS inkubierten Ansätzen niedriger ist als bei den entsprechenden Kontrollgruppen, wobei dieser Unterschied nicht signifikant ist. Die Einzelergebnisse, auf welchen diese Aussage basiert, können in Tabelle 17 eingesehen werden. 44 Ergebnisse ___________________________________________________________________________ 70 65 60 55 % Versuch 1 Versuch 2 50 Versuch 3 Versuch 4 45 40 35 30 Kontrolle LPS Abbildung 14: Dargestellt ist die Expression von Kulturmakrophagen für das bclx-Antigen am 10. Kulturtag ohne Vorbehandlung (Kontrolle) und nach LPS-Zusatz (LPS) Tabelle 17: Ergebnisse der bclx-Färbung nach Inkubation mit LPS sowie der Kontrollgruppe am 10. Kulturtag Kontrolle LPS + ISC Differenz % positiv Versuch 1 44,025 39,274 4,751 Versuch 2 61,026 59,476 1,55 Versuch 3 59,084 48,951 10,133 Versuch 4 63,381 53,703 9,678 56,879 50,351 6,528 8,748 8,547 4,117 Mittelwert Standardabweichung Prüfgröße 3,171 Signifikanz für t3;0,975 (=3,18) nein 45 Ergebnisse ___________________________________________________________________________ 3.2.1.2 Vergleich Tumorzellüberstand / Tumorzellüberstand und LPS Die Behandlung der Zellkulturen mit TZÜ und LPS ruft in der Tendenz eine höhere Expression des bclx-Antigens hervor als bei der ausschließlich mit TZÜ behandelten Gruppe, wie in Abbildung 15 dargestellt. Eine Signifikanz konnte mittels der Tabelle 18 zu entnehmenden Differenzen, Standardabweichungen und der Prüfgröße nicht nachgewiesen werden. Außerdem sind nachfolgend die genauen Daten der einzelnen Versuche aufgelistet. 60 55 50 % Versuch 1 Versuch 2 45 Versuch 3 Versuch 4 40 35 30 KontrolleTZÜ LPS+TZÜ Abbildung 15: Dargestellt ist die Expression von Kulturmakrophagen für das bclx-Antigen am 10. Kulturtag nach Behandlung mit Tumorzellüberstand von Kontrollzellen (TZÜ) und nach LPSZusatz (LPS+TZÜ) 46 Ergebnisse ___________________________________________________________________________ Tabelle 18: Ergebnisse der bclx-Färbung nach Inkubation mit TZÜ bzw. TZÜ und LPS am 10. Kulturtag TZÜ LPS + TZÜ Differenz % positiv Versuch 1 32,299 39,798 -7,499 Versuch 2 50,759 56,657 -5,898 Versuch 3 36,307 46,75 -10,443 (50,269) (41,573) (8,696) 39,788 47,735 -7,947 9,71 8,473 4,959 Versuch 4* Mittelwert Standardabweichung Prüfgröße -3,205 Signifikanz t2;0,975 (=4,3) nein *Aufgrund stark abweichender Werte wurde der vierte Versuch nicht in die Auswertung mit einbezogen 3.2.2 12. Kulturtag 3.2.2.1 Vergleich Kontrolle / Inkubation mit LPS Am zwölften Kulturtag zeigt die Kontrollgruppe einen größeren Anteil an bclx-positiv angefärbten Zellen als die mit LPS behandelten Versuchsansätze, wie aus Abbildung 16 hervorgeht, wobei dieser Unterschied laut der in Tabelle 19 aufgeführten Werte als nicht signifikant zu beurteilen ist. 47 Ergebnisse ___________________________________________________________________________ 60 55 50 Versuch 1 45 % Versuch 2 Versuch 3 40 Versuch 4 35 30 25 Kontrolle LPS Abbildung 16: Dargestellt ist die Expression von Kulturmakrophagen für das bclx-Antigen am 12. Kulturtag ohne Vorbehandlung (Kontrolle) und nach LPS-Zusatz (LPS) Tabelle 19: Ergebnisse der bclx-Färbung nach Inkubation mit LPS sowie der Kontrollgruppe am 12. Kulturtag Kontrolle LPS + ISC Differenz % positiv Versuch 1 44,157 39,277 4,88 Versuch 2 50,163 36,782 13,381 Versuch 3 32,457 30,372 2,085 Versuch 4 57,136 49,75 7,386 Mittelwert 45,978 39,045 6,933 Standardabweichung 10,459 8,062 4,813 Prüfgröße 2,881 Signifikanz für t3;0,975 (=3,18) nein 48 Ergebnisse ___________________________________________________________________________ 3.2.2.2 Vergleich Tumorzellüberstand / Tumorzellüberstand und LPS Am zwölften Kulturtag kann kein Unterschied zwischen den verschiedenen Versuchsansätzen nachgewiesen werden, da die in Abbildung 17 dargestellten Kurvenverläufe gegensätzlich sind. Weitere Einzelheiten sind in Tabelle 20 aufgeführt. 55 50 45 40 % Versuch 1 Versuch 2 35 Versuch 3 Versuch 4 30 25 20 15 KontrolleTZÜ LPS+TZÜ Abbildung 17: Dargestellt ist die Expression von Kulturmakrophagen für das bclx-Antigen am 12. Kulturtag nach Behandlung mit Tumorzellüberstand von Kontrollzellen (TZÜ) und nach LPSZusatz (LPS+TZÜ) 49 Ergebnisse ___________________________________________________________________________ Tabelle 20: Ergebnisse der bclx-Färbung nach Inkubation mit TZÜ bzw. TZÜ und LPS am 12. Kulturtag TZÜ LPS + TZÜ Differenz % positiv Versuch 1 47,514 53,348 -5,834 Versuch 2 21,422 16,207 5,215 Versuch 3 33,259 24,707 8,552 Versuch 4 31,105 31,571 -0,466 33,325 31,458 1,867 10,77 15,889 6,342 Mittelwert Standardabweichung Prüfgröße 0,589 Signifikanz t3;0,975 (=3,18) nein 50 Ergebnisse ___________________________________________________________________________ 3.3 Immuncytochemischer Nachweis des apoptotischen baxProteins an Makrophagen zu verschiedenen Kulturzeiten Abbildung 11: Expression des bax-Proteins bei positiven Makrophagen (Pfeile, Vergrößerung 400fach) 3.3.1 10. Kulturtag 3.3.1.1 Vergleich Kontrolle / Inkubation mit LPS Bei der bax-Färbung zeigt sich am 10. Kulturtag laut Abbildung 19 und Tabelle 21 folgendes Ergebnis: Die mit LPS behandelten Makrophagen weisen einen größeren Mittelwert an Zellen, welche das bax-Protein exprimieren, auf als die Kontrollgruppe, jedoch ist diese Differenz nicht signifikant. 51 Ergebnisse ___________________________________________________________________________ 80 70 60 % Versuch 1 Versuch 2 50 Versuch 3 Versuch 4 40 30 20 Kontrolle LPS Abbildung 19: Dargestellt ist die Expression von Kulturmakrophagen für das bax-Antigen am 10. Kulturtag ohne Vorbehandlung (Kontrolle) und nach LPS-Zusatz (LPS) Tabelle 21: Ergebnisse der bax-Färbung nach Inkubation mit LPS sowie der Kontrollgruppe am 10. Kulturtag Kontrolle LPS + ISC Differenz % positiv Versuch 1 64,499 72,095 -7,596 (45,759) (43,806) (1,953) Versuch 3 34,799 47,361 -12,562 Versuch 4 48,588 50,997 -2,409 Mittelwert 49,295 56,818 -7,522 Standardabweichung 14,863 13,355 6,004 Versuch 2* Prüfgröße -2,506 Signifikanz für t2;0,975 (=4,3) nein *Aufgrund stark abweichender Werte wurde der zweite Versuch nicht in die Auswertung mit einbezogen 52 Ergebnisse ___________________________________________________________________________ 3.3.1.2 Vergleich Tumorzellüberstand / Tumorzellüberstand und LPS Aus Abbildung 20 wird ersichtlich, dass zwischen den mit LPS und TZÜ behandelten und als TZÜ-Kontrolle verwendeten Zellkulturen mit dargestellten gegenläufigen Kurven und den korrespondierenden Differenzen, Standardabweichungen sowie der Prüfgröße (Tab. 22) kein signifikanter Unterschied hinsichtlich der Expression des bax-Antigens besteht. 90 80 70 Versuch 1 60 % Versuch 2 Versuch 3 50 Versuch 4 40 30 20 KontrolleTZÜ LPS+TZÜ Abbildung 20: Dargestellt ist die Expression von Kulturmakrophagen für das bax-Antigen am 10. Kulturtag nach Behandlung mit Tumorzellüberstand von Kontrollzellen (TZÜ) und nach LPSZusatz (LPS+TZÜ) 53 Ergebnisse ___________________________________________________________________________ Tabelle 22: Ergebnisse der bax-Färbung nach Inkubation mit TZÜ bzw. TZÜ und LPS am 10. Kulturtag TZÜ LPS + TZÜ Differenz % positiv Versuch 1 73,677 85,886 -12,209 Versuch 2 35,949 32,85 3,099 Versuch 3 29,237 25,871 3,366 Versuch 4 39,835 47,28 -7,445 Mittelwert 44,675 47,972 -3,297 Standardabweichung 19,824 26,802 7,787 Prüfgröße -0,847 Signifikanz t3;0,975 (=3,18) nein 3.3.2 12. Kulturtag 3.3.2.1 Vergleich Kontrolle / Inkubation mit LPS Abbildung 21 zeigt, dass am zwölften Kulturtag zwischen den beiden Versuchsansätzen hinsichtlich der Anzahl apoptotische Antigene exprimierender Makrophagen kein signifikanter Unterschied besteht. Aus Tabelle 23 wiederum werden die gemessenen Einzelwerte ersichtlich. 54 Ergebnisse ___________________________________________________________________________ 85 75 65 % Versuch 1 Versuch 2 55 Versuch 3 Versuch 4 45 35 25 Kontrolle LPS Abbildung 21: Dargestellt ist die Expression von Kulturmakrophagen für das bax-Antigen am 12. Kulturtag ohne Vorbehandlung (Kontrolle) und nach LPS-Zusatz (LPS) Tabelle 23: Ergebnisse der bax-Färbung nach Inkubation mit LPS sowie der Kontrollgruppe am 12. Kulturtag Kontrolle LPS + ISC Differenz % positiv Versuch 1 63,112 77,93 -14,818 Versuch 2 45,7 40,864 4,836 Versuch 3 35,4 47,361 -11,961 Versuch 4 50,475 47,261 3,214 48,672 53,354 -4,682 11,5 16,664 10,143 Mittelwert Standardabweichung Prüfgröße -0,923 Signifikanz für t3;0,975 (=3,18) 3.3.2.2 nein Vergleich Tumorzellüberstand / Tumorzellüberstand und LPS Die bax-Färbung der Versuche nach Behandlung mit TZÜ und LPS beweist, wie in Abbildung 22 aufgezeigt, eine niedrigere Expression des Antigens als nach ausschließlicher Inkubation 55 Ergebnisse ___________________________________________________________________________ mit TZÜ. Dieser Unterschied ist statistisch signifikant, was aus der in Tabelle 24 aufgeführten Prüfgröße ersichtlich wird. 75 70 65 60 % 55 Versuch 1 Versuch 2 50 Versuch 3 Versuch 4 45 40 35 30 25 KontrolleTZÜ LPS+TZÜ Abbildung 22: Dargestellt ist die Expression von Kulturmakrophagen für das bax-Antigen am 12. Kulturtag nach Behandlung mit Tumorzellüberstand von Kontrollzellen (TZÜ) und nach LPSZusatz (LPS+TZÜ) Tabelle 24: Ergebnisse der bax-Färbung nach Inkubation mit TZÜ bzw. TZÜ und LPS am 12. Kulturtag TZÜ LPS + TZÜ Differenz % positiv Versuch 1 69,773 65,292 4,481 Versuch 2 59,019 43,493 15,526 Versuch 3 40,119 35,533 4,586 Versuch 4 57,088 46,544 10,544 56,5 47,716 8,784 12,264 12,604 5,313 Mittelwert Standardabweichung Prüfgröße 3,307 Signifikanz für t3;0,975 (=3,18) ja 56 Diskussion ___________________________________________________________________________ 4 DISKUSSION 4.1 Diskussion der Methoden Die vorliegende Arbeit zeigt die Ergebnisse eines in vitro-Modells mit Mausmakrophagen, welches unterschiedliches Apoptoseverhalten nach Stimulation nachweisen soll. Dieses Modell wurde, um die Reproduktion der Experimente und quantitative Aussagen zu ermöglichen, auf der Grundlage von Kulturmakrophagen, Tumorzellüberstand von LEWISLung-Karzinomzellen als Apoptose auslösendem Agens und LPS als Stimulans (1µg/ml Makrophagenmedium) etabliert. Nachfolgend sollen Vorzüge und Nachteile dieses Versuchsaufbaus sowie die Resultate auch hinsichtlich der zu diesem Thema bereits veröffentlichten Literatur besprochen werden. 4.1.1 Versuchsaufbau 4.1.1.1 Makrophagenkultur Wie schon in der Einleitung erwähnt, sind Makrophagenpopulationen sowohl bezüglich ihrer Verteilung im Körper als auch ihrer Funktion sehr heterogen(90). Die Ausbildung verschiedener Phänotypen unterliegt dabei unzähligen Faktoren, die die Eigenschaften der Subpopulation dem jeweiligen Standort oder auch der jeweiligen Aufgabe entsprechend beeinflussen. Um diese Wechselwirkungen genauer untersuchen zu können, wurden verschiedene Arten der Makrophagenkultivierung etabliert: Zum Beispiel entwickelten Goud et al. und Summer et al. ein Modell zur Züchtung von Makrophagen aus Knochenmarksstammzellen in flüssigem Medium(36). So wie viele erweiterte Kulturmethoden basiert auch der Versuchsaufbau der vorliegenden Arbeit auf diesem bereits bekannten Modell, wobei Einzelheiten den besonderen Begebenheiten angepasst wurden. Eine Besonderheit bei der Kultivierung von Makrophagen ergibt sich aus deren Fähigkeit zur Adhärenz an vielen in der Forschung verwendeten Materialien. Um dies zu verhindern und ein problemloses Entnehmen der Zellen aus dem Kulturgefäß zu gewährleisten, wurde mit Teflonbeuteln gearbeitet. Als Kulturmedium hat sich das auch im MPI Freiburg standardmäßig benutzte Plutznik-Medium bewährt, welches ideale Wachstumsbedingungen schafft und durch einen hohen Gehalt an GM-CSF (L-Conditioned-Medium, s. 2.3.2) hilft, eine 57 Diskussion ___________________________________________________________________________ reine Makrophagenkultur zu erhalten: GM-CSF unterstützt die Differenzierung und unterdrückt apoptotische Vorgänge bei Makrophagen -nicht jedoch bei Granulozyten(93)durch Hochregulation von bcl2 und bclx und Herunterregulation von bax(53, 98). Die Kulturdauer von 10 bzw. 12 Tagen wurde vom Labor Freudenberg nach Bestimmung der Zellvitalität, Proliferation, Phagozytoseaktivität und Reife gewählt: Vor allem die abnehmende Anzahl von vitalen Zellen ab dem 12. Tag bei gleichbleibend geringer Proliferationsrate und nahezu 100%igem Anteil an reifen, zur Phagozytose befähigten Makrophagen hat zur Wahl des 10. und 12. Kulturtages bewogen. 4.1.1.2 Inkubation 4.1.1.2.1 mit Endotoxin Wie schon in der Einleitung angedeutet, ist die Wirkung von LPS stark konzentrations- und zeitabhängig. Deshalb wurden die zugegebene LPS-Dosis sowie die Dauer der Vorinkubation nach den im MPI-IB in Freiburg für die Stimulation von Makrophagen angewandten Verfahren gewählt. Eine Aktivitätssteigerung durch LPS wie die erhöhte Ausschüttung von IL1β und IL6 konnte auch schon im Besonderen bei tumorassoziierten Makrophagen mit antitumoröser zytotoxischer Wirkung beschrieben werden(15);(61). Es stellt sich jedoch die Frage, ob nicht in vivo sogar eine primär nicht toxische LPS-Dosis, die aber ausreicht, um Makrophagen zu stimulieren, sie nicht sekundär über Feedback-Mechanismen zur Apoptose bringen kann. Für die Regulation physiologischer Abläufe wäre eine derartige Regulation durchaus von Nutzen zur Eindämmung entzündlicher Immunvorgänge. 4.1.1.2.2 mit Tumorzellüberstand Die bekannten Wechselwirkungen zwischen Tumoren und Makrophagen sind in Kapitel 1.2.4 bereits ausführlich erläutert worden. Um das Apoptoseverhalten der Makrophagen bezüglich ihrer Tumorinteraktionen gut beobachten zu können, eignet sich die Tumorzelllinie des LEWIS-Lung-Karzinoms ausgezeichnet, da Freudenberg et al. bereits durch in vivo Versuche Erkenntnisse über das Metastasierungsverhalten der hochmalignen LLK-Zellen und ihre Auswirkungen auf die Makrophagenpopulationen gewinnen konnten. So nahm der Anteil der KUPFFER-Zellen an den Nicht-Parenchymzellen des hepatischen Microenvironments bei Metastasierung des Karzinoms in die Leber signifikant ab. Außerdem beschreibt das von H. 58 Diskussion ___________________________________________________________________________ Axt, M. Woisetschläger und J. Wolff im Labor Freudenberg etablierte in vitro-Modell analog den hier vorgestellten Versuchsmethoden eine signifikante Zunahme der Apoptoserate nach Inkubation der Makrophagen mit dem von LLK-Zellen gewonnenen Überstand(34). Die Verwendung des Tumorzellüberstands (TZÜ) anstelle von Zellkulturen wurde u. a. aufgrund der Annahme gewählt, dass die Makrophagen am Zielort der Metastasierung durch in gelöster Form vorliegende Faktoren beeinflusst werden. Die Inkubationszeit mit TZÜ von 12 h ergab sich ebenfalls aus den oben erwähnten in vitro Versuchen, bei denen sich nach 12 h bei den unterschiedlichen Apoptosemarkern insgesamt die besten Ergebnisse zeigten. 4.1.1.3 Färbemethoden 4.1.1.3.1 Wahl der Apoptosemarker Die komplexen Regulationsmechanismen der Apoptose sind im ersten Kapitel dieser Arbeit (1.1.4) bereits beschrieben. Durch intensive Forschung auf dem Gebiet der bcl2-Familie konnten Erkenntnisse über die Proteinstruktur Wirkmechanismus gewonnen werden. Dieses und Ansätze im Verständnis des Wissen und die Vergleichsmöglichkeit mit anderen Studien über Apoptosevorgänge in Kulturmakrophagen hat die Entscheidung für bcl2, bclx und bax als Indikatoren positiv beeinflusst. Vor allem die Tatsache, dass die ausgewählten Proteine an verschiedenen Stellen der genetischen Regulation eingreifen, erlaubt prinzipiell sehr interessante Aussagen, da sie zusätzlich Hypothesen über den Ablauf der Apoptose selbst ermöglicht. Auch die gegensätzlichen Regulationsvorgänge, die durch bcl2 und bclx als Vertreter der antiapoptotischen Subfamilie auf der einen Seite und bax als Proapoptosemarker auf der anderen gesteuert werden, sind insofern wichtig, als dass sie als zusätzliche Bestätigung der Teilaussagen der anderen Marker herangezogen werden können. Nicht zuletzt bot auch die kommerzielle Verfügbarkeit Gründe für die Wahl der verwendeten Vertreter der bcl2-Familie. 4.1.1.3.2 Bross-Methode Es bestehen zahlreiche immunzytochemischen Vorteile Verfahren(10): der Bross-Methode Zunächst einmal gegenüber ist die herkömmlichen Verwendung von Adhäsionsobjektträgern zur Bearbeitung von Zelllösungen von Bedeutung, da diese zum einen eine vereinfachte Handhabung der Zellen bei der Aufbereitung und Fixierung und zum 59 Diskussion ___________________________________________________________________________ anderen material- und kostensparendes Arbeiten ermöglichen. Außerdem können mehrere Versuchsansätze oder Reaktionen zeitgleich auf einem Objektträger erfolgen und letztendlich besser verglichen werden. Es stellte sich jedoch bei unseren Versuchen als problematisch heraus, dass bei gleichen Verdünnungen der Antikörper zum Teil unterschiedlich intensive Anfärbungen der Zellen resultierten und die Auswertung erschwerten. Dies kann durch die Tatsache, dass die hier angewandte Bross-Technik besonders für Oberflächenmarker, jedoch weniger für intrazytoplasmatische Antigendarstellung geeignet ist, erklärt werden. 60 Diskussion ___________________________________________________________________________ 4.2 Diskussion der Ergebnisse 4.2.1 Bcl2 Am 10. und 12. Kulturtag zeigten sich beim Vergleich von Kontrolle und Inkubation mit LPS aber ohne Zugabe von TZÜ eine ähnliche Tendenz: Die bcl2-Expression war bei den mit LPS behandelten Ansätzen am 10. Tag im Durchschnitt um 3,3%, am 12. Tag um 2,2% höher (kein signifikanter Unterschied). Dieser Trend lässt somit eine geringgradige Verminderung der Apoptoserate als mögliche Folge der LPS-Zugabe vermuten. Auch bei den Versuchsansätzen mit TZÜ fällt ein ähnlicher Trend zwischen den Färbungen am 10. Tag auf. Hier war ein nicht signifikanter Anstieg der antiapoptotischen Makrophagen nach Vorinkubation mit LPS um 2,6% zu vermerken, der 12. Tag hingegen zeigte eine signifikante Mehrexpression von 5% des „Überlebens“-Markers beim TZÜ-Versuch. 4.2.2 Bclx Der Vergleich zwischen 10. und 12. Tag zeigte bei der bclx-Färbung folgende Ergebnisse: Die Behandlung mit LPS führte zu einem nicht signifikanten Abfall der Expression des antiapoptotischen Proteins um durchschnittlich 6,5% am 10. und um 6,9 % am 12.Tag. Bei den TZÜ-Versuchen hingegen konnte kein gleichsinniger Trend bei den beiden Versuchstagen nachgewiesen werden: Während am 10. Tag eine ansteigende Tendenz von 7,9% bei LPS-Zugabe bestand, war bei den am 12. Kulturtag beobachteten gegensätzlichen Kurvenverläufen keine Aussage möglich. Zusammenfassend ist die Aussagekraft des immunzytochemischen Nachweises der Apoptose mit dem bclx-Antigen sehr gering, da kein Effekt von TZÜ oder LPS auf das Verhalten der Makrophagen nachgewiesen werden kann. 4.2.3 Bax Die am 10. Kulturtag geernteten Makrophagen reagierten auf ausschließliche Inkubation mit LPS mit einem nicht signifikanten Anstieg des Apoptoseproteins von durchschnittlich 7%, am 12. Tag hingegen sind die Reaktionen der Makrophagen auf die Inkubation mit LPS bei den einzelnen Versuchen untereinander gegensätzlich, ohne dass deutliche Tendenzen beobachtet werden konnten.Die Versuche mit TZÜ brachten am 10. Tag kein eindeutiges 61 Diskussion ___________________________________________________________________________ Ergebnis, am 12. Tag jedoch fand sich bei gleichzeitiger Inkubation von LPS und TZÜ ein signifikanter Abfall der Expression des proapoptotischen Markers von im Mittel 8,8% im Gegensatz zur Kontrolle. Die Hauptaussage, die bei der bax-Färbung getroffen werden kann, ist demnach eine mögliche Schutzwirkung von LPS in Gegenwart von TZÜ bei zwölf Tage alten Makrophagen. 4.2.4 Vergleich der Färbungen mit verschiedenen Apoptosemarkern Der zusätzlich Vergleich zwischen den Ergebnissen der einzelnen Apoptosemarker schien so komplex, dass in diesem Kaptitel zusätzliche Abbildungen zur Verdeutlichung des Sachverhalts eingebracht wurden. Auch wurde die Reihenfolge der Darstellungen samt Erläuterungen zwecks besserer Übersichtlichkeit so gewählt, dass die signifikanten Ergebnisse vorangestellt wurden, der zeitliche Verlauf ist hier nur zweitrangig. 4.2.4.1 Bcl2 / bclx Beim Vergleich der Färbeergebnisse der Makrophagen am 12. Kulturtag (Abbildung 23) zeigt sich ein ambivalentes Bild, da zwar bei den bcl2-Färbungen ein signifikanter Anstieg der Proteinexpression zu verzeichnen ist, die bclx- Färbung aber bei den Ergebnissen der vier Einzelversuche konträre Ergebnisse lieferte, so dass hier nur eine minimale Veränderung im Kurvenverlauf erkennbar ist. Die signifikante Hochregulierung des bcl2-Gens bei zwölf Tage alten Kulturmakrophagen nach Inkubation mit LPS und TZÜ steht somit für sich und kann durch die gleich- oder geringgradig gegensinnige Veränderung der bclx-Expression unter denselben Bedingungen weder bekräftigt noch in Frage gestellt werden. 18 % bcl2 16 14 12 10 TZÜ LPS+TZÜ 40 38 36 34 32 30 28 26 24 22 20 % bclx 62 Diskussion ___________________________________________________________________________ Mittelwert positiv bcl2 12,462 17,42925 positiv bclx 33,325 31,45825 Abbildung 23: Vergleich der Reaktionen von bcl2 und bclx nach Inkubation mit TZÜ-Zusatz und LPS am 12. Kulturtag: positiv bcl2 = Prozentsatz der in der bcl2-Reaktion angefärbten Zellen, positiv bclx = Prozentsatz der in der bclx-Reaktion angefärbten Zellen Die weiteren Vergleiche, die in diesem Kapitel gezogen werden, beruhen auf nicht signifikanten Aussagen. Nichtsdestotrotz erfolgte der Versuch einer Interpretation, wenn deutliche Trends zu erkennen waren: Beim Vergleich der LPS-Versuche vom 10. Tag zeigt sich eine gegenläufige Tendenz der Reaktionen der beiden antiapoptotischen Proteine, wie auch aus Abbildung 24 zu ersehen: Die antiapoptotischen bcl2-Antigene wurden unter dem Einfluss von LPS bei mehr Makrophagen exprimiert, die ebenfalls antiapoptotischen bclx-Proteine jedoch bei weniger. Dieses Phänomen darf aber keinesfalls zu stark gewichtet werden, auf der einen Seite, da es bei beiden Versuchsreihen nur um Tendenzen, nicht aber um signifikante Aussagen geht. Zweitens liefert der Artikel von Chao et al. einen möglichen Erklärungsansatz für das gegensätzliche Verhalten der beiden Überlebensgene: Dort sind bei T-Zellen unter Apoptose induzierenden Bedingungen ähnliche Ergebnisse in Bezug auf gegengerichtete Regulation von bcl2 und bclx berichtet(14) und insofern erklärt worden, dass die reziproke Expression der beiden Überlebensfaktoren durch ihre redundante Wirkungsweise bedingt wird. Auch sind die funktionellen Aminosäuregruppen von bcl2 und bclx nicht identisch, was ein weiterer Hinweis auf ihre unterschiedliche Interaktion mit potentiellen Signalmolekülen und dadurch verschieden hohe Expression unter unseren Versuchsbedingungen sein könnte14. 16 58 15 56 54 14 52 13 50 12 11 % bclx % bcl2 63 Diskussion ___________________________________________________________________________ 48 Kontrolle LPS+ISC 46 Mittelwert positiv bcl2 12,348 15,6479426 positiv bclx 56,879 50,351 Abbildung 24: Vergleich der Reaktionen von bcl2 und bclx nach ausschließlicher Inkubation mit LPS (ohne TZÜ-Zusatz) am 10. Kulturtag: positiv bcl2 = Prozentsatz der in der bcl2-Reaktion angefärbten Zellen, positiv bclx = Prozentsatz der in der bclx-Reaktion angefärbten Zellen Am 12. Kulturtag bei ausschließlicher Inkubation mit LPS wiederholt sich der für den 10. Tag bereits beschriebene entgegengesetzte Kurvenverlauf (Abbildung 25): Die bcl2-Expression steigt bei Behandlung mit LPS an, die bclx-Expression hingegen nimmt ab, was mit 17 48 16 44 15 40 14 36 13 Kontrolle LPS+ISC % bclx % bcl2 demselben Mechanismus begründet werden kann. 32 Mittelwert positiv bcl2 14,115 16,27033333 positiv bclx 45,97825 39,04525 Abbildung 25: Vergleich der Reaktionen von bcl2 und bclx nach ausschließlicher Inkubation mit LPS (ohne TZÜ-Zusatz) am 12. Kulturtag: positiv bcl2 = Prozentsatz der in der bcl2-Reaktion angefärbten Zellen, positiv bclx = Prozentsatz der in der bclx-Reaktion angefärbten Zellen 64 Diskussion ___________________________________________________________________________ Bezüglich des TZÜ-Versuchs vom 10. Tag greift diese Argumentation jedoch nicht mehr, da hier die Expression bei beiden Markern in der Tendenz ansteigt (Abbildung 26). Diese gleichsinnige Aktivierung beider antiapoptotisch wirkender Proteine könnte in dem zuvor geschilderten Modell jedoch ebenfalls Sinn machen, wenn man die „Doppelaktivierung“ durch zwei potentiell schädigende Agenzien in Betracht zieht. Denkbar wäre demnach eine % bcl2 16 15 14 13 TZÜ LPS+TZÜ 50 48 46 44 42 40 38 36 34 % bclx vermehrte Aktivierung mit konsekutiv stärkerer antiapoptotischer Antwort. Mittelwert positiv bcl2 13,35625 14,76815597 positiv bclx 39,78833333 47,735 Abbildung 26: Vergleich der Reaktionen von bcl2 und bclx nach Inkubation mit TZÜ-Zusatz und LPS am 10. Kulturtag: positiv bcl2 = Prozentsatz der in der bcl2-Reaktion angefärbten Zellen, positiv bclx = Prozentsatz der in der bclx-Reaktion angefärbten Zellen 65 Diskussion ___________________________________________________________________________ 4.2.4.2 Bcl2 / bax Bei der Beurteilung von bax- und bcl2-Expression wurde der besseren Vergleichbarkeit wegen jeweils der prozentuale Anteil der bax-negativen Makrophagen berücksichtigt, so dass bei beiden Versuchen die nicht-apoptotischen Zellen miteinander verglichen werden konnten. In dieser Darstellung entspricht also ein gleichgerichteter Kurvenverlauf beider Färbungen der gleichen Funktion bezüglich der Apoptose. Auch hier erfolgte die Auflistung nach Gesichtspunkten der Signifikanz und nicht chronologisch. Beim TZÜ-Versuch mit 12 Tage alten Makrophagen jedoch sind die Kurvenverläufe parallel bei signifikanten Zahlen (Abbildung 27): Die bcl2-Expression wird hochreguliert bei gleichzeitigem Absinken der Anzahl bax-positiver Makrophagen, was von zwei Seiten für eine Aktivierung der Überlebensfunktionen der Zellen spricht. Warum nur in diesem einen Fall bei sonst eher gegensätzlichem Verhalten? Hier kommen zwei Argumente zum Tragen: Erstens die schon beim bclx/bcl2-Vergleich angebrachte Erklärung, dass nur eine Doppelaktivierung mit zwei potentiell schädigenden Agenzien die Auslösung mehrerer Überlebensmechanismen in den Zellen vermag. Zum Zweiten könnte die Reife der Makrophagen ein % bcl2 18 16 14 12 10 TZÜ LPS+TZÜ 59 57 55 53 51 49 47 45 % bax ausschlaggebender Faktor sein, worauf unter 4.2.5 noch näher eingegangen wird. Mittelwert positiv bcl2 12,462 17,42925 negativ bax 47,92466667 58,14333333 Abbildung 27: Vergleich der Reaktionen von bcl2 und bax nach Inkubation mit TZÜ-Zusatz und LPS am 12. Kulturtag: positiv bcl2 = Prozentsatz der in der bcl2-Reaktion angefärbten Zellen, negativ bax = Prozentsatz der in der bax-Reaktion nicht angefärbten Zellen 66 Diskussion ___________________________________________________________________________ Die LPS-Kontrolle am 10. Kulturtag zeigt eine kontroverse Situation: Während die bcl2- Überlebensproteine nach LPS-Zugabe bei mehr Makrophagen exprimiert wurden, fiel die Anzahl der bax-negativen und damit nicht zur Apoptose bereiten Zellen unter denselben Umständen ab. Diese Tatsache lässt sich durch die von Knudson et al.(58) postulierte 16 % bcl2 15 14 13 12 11 Kontrolle LPS+ISC 52 50 48 46 44 42 40 38 % bax unterschiedlich Regulation der beiden Proteine erklären. Mittelwert positiv bcl2 12,348 15,6479426 negativ bax 50,70466667 43,18233333 Abbildung 28: Vergleich der Reaktionen von bcl2 und bax nach ausschließlicher Inkubation mit LPS (ohne TZÜ-Zusatz) am 10. Kulturtag: positiv bcl2 = Prozentsatz der in der bcl2-Reaktion angefärbten Zellen, negativ bax = Prozentsatz der in der bax-Reaktion nicht angefärbten Zellen Diese Gegenläufigkeit zwischen bcl2-positiven und bax-negativen Zellen tritt am 10. Tag bei beiden Versuchsansätzen (Abbildungen 28 und 29) und am 12. Tag beim LPS-Ansatz (Abbildung 30) auf, wobei keinerlei Signifikanzen bestehen und die Aussagekraft dieses Vergleichs nicht zu hoch bewertet werden darf; auch sind die Kurvenverläufe der baxFärbung beim TZÜ- vom 10. sowie dem LPS-Versuch vom 12. Tag gegenläufig ausgefallen und stellen somit nur einen minimalen Trend dar. 15 56 14,5 55 54 14 53 13,5 52 13 12,5 % bax % bcl2 67 Diskussion ___________________________________________________________________________ 51 TZÜ LPS+TZÜ 50 Mittelwert positiv bcl2 13,35625 14,76815597 negativ bax 55,3255 52,02825 Abbildung 29: Vergleich der Reaktionen von bcl2 und bax nach Inkubation mit TZÜ-Zusatz und LPS am 10. Kulturtag: positiv bcl2 = Prozentsatz der in der bcl2-Reaktion angefärbten Zellen, 17 56,5 16 56 55,5 15 55 14 13 % bax % bcl2 negativ bax = Prozentsatz der in der bax-Reaktion nicht angefärbten Zellen 54,5 Kontrolle LPS+ISC 54 Mittelwert positiv bcl2 14,115 16,27033333 negativ bax 56,14166667 54,838 Abbildung 30: Vergleich der Reaktionen von bcl2 und bax nach ausschließlicher Inkubation mit LPS (ohne TZÜ-Zusatz) am 12. Kulturtag: positiv bcl2 = Prozentsatz der in der bcl2-Reaktion angefärbten Zellen, negativ bax = Prozentsatz der in der bax-Reaktion nicht angefärbten ZellenVergleich der bcl2- und der bax-Färbung Vergleich der bcl2- und der bax-Färbung 68 Diskussion ___________________________________________________________________________ 4.2.5 Makrophagenreife Die Kultivierungsdauer der Makrophagen wurde -wie in Kapitel 4.1.1.1 beschriebenentsprechend ihrer Vitalität, Proliferationsrate, Phagozytoseaktivität und Reife gewählt. Aus diesen Parametern lassen sich Rückschlüsse auf den Differenzierungsgrad der Makrophagen und mit großer Wahrscheinlichkeit auch auf ihr Verhalten bezüglich der Aktivierung durch LPS ziehen. Die genannten Parameter konnten anhand von Trypanblautest, BrdU-, Latexphagozytoseund bm8-Versuchen im Labor Freudenberg nachgewiesen werden, wobei die Ergebnisse eine auch nach dem 12. Tag zunehmende Reife und Differenzierung der Makrophagen zeigten (Tabelle 25). Allerdings nahm der Prozentsatz der trypanblau-positiven, d.h. abgestorbenen Zellen nach dem 12. Tag nährstoff- und platzmangelbedingt zu, was die Versuchsausführung am 10. und 12. Kulturtag hinsichtlich der Zellvitalität und der Reduktion möglicher zusätzlicher apoptotischer Stimuli rechtfertigt. Die in dieser Arbeit aufgezeigten Ergebnisse der LPS-Versuche hingegen werden erst mit dem 12. Kulturtag signifikant, wie in 4.2.1 - 4.2.4 dargestellt, was durch die ab dem 10. Tag noch deutlich zunehmende Reife der Makrophagen bedingt sein könnte (10. Kulturtag: 90,4% reife Makrophagen, 14. Kulturtag: 98,8% reife Makrophagen). Vorstellbar wäre beispielsweise eine stärkere Aktivierung durch LPS nur bei völlig ausdifferenzierten Makrophagen. Hier wären weitere Versuche mit länger kultivierten Zellen hinsichtlich der Aktivierung und des Apoptoseverhaltens von Interesse gewesen. Tabelle 25: Übersicht über Wachstumsparameter bei Makrophagen 10. Tag Trypanbautest BrdU LatexBm8 (→Vitalität) (→Proliferation) Phagozytose (→Reifemarker) 2,9 % 4,5 % 95,3 % 90,4 % 11. Tag 3,2 % 3,2 % 97,3 % 95,8 % 12. Tag 3,2 % 1,8 % 98,5 % 97,3 % 13. Tag 4,2 % 1,9 % 89,9 % 98,3 % 14. Tag 5,5 % 1,3 % 97,8 % 98,9 % Nach J. Wolff 69 Diskussion ___________________________________________________________________________ 4.3 Überblick über die Literatur 4.3.1 Aktivierung der Makrophagen in vivo Die Apoptose ist ein Vorgang, der im Gegensatz zum Zelltod der Nekrose normalerweise nicht mit entzündlichen Begleiterscheinungen assoziiert ist(38). Erstaunlich ist daher die Verbindung zwischen „inflammatorischer“ Aktivierung und apoptotischen Vorgängen bei Makrophagen: In vivo-Studien haben ergeben, dass auf LPS-Stimulation, welche mit einer CD14/TLR4-vermittelten Entzündungsreaktion vergleichbar ist (siehe auch 4.3.4.1), Makrophagen vermehrt mit Apoptose reagieren. Es könnte sich hierbei um einen Regulationsmechanismus handeln, der durch die Eliminierung aktivierter Makrophagen eine überschießende Immunreaktion zu verhindern sucht(105). Eine destruierende Entzündung kann in bestimmten Organen besonders verheerende Auswirkungen haben, welche durch Fas-vermittelte Apoptose bei immunkompetenten Zellen z. B. im Auge verhindert werden, so dass durch im Rahmen der oben vorgestellten Gegenregulation ein immunpriviligierter Zustand aufrechterhalten werden kann(39): Durch die Anwesenheit von FasL in den zu schützenden Organen wird hier bei Bedarf eine Fas/FasL-Interaktion ausgelöst, die eine Elimination der geschädigten Zellen mithilfe der Apoptose ermöglicht, um die möglicherweise organzerstörenden Folgen einer Entzündungsreaktion zu verhindern(39). Untersuchungen zum Thema der Immunregulation mit Verhinderung von zu starken Entzündungsreaktionen haben einen möglichen Mechanismus für die negative FeedbackRegulierung des monozytären Phagozytose-Systems aufgezeigt: Es ist bekannt, dass Makrophagen über die Produktion von NO bakterizide und tumorizide Eigenschaften ausbilden. Jedoch ist NO auch für sie selbst toxisch und stimuliert sie zur Einleitung von Fasvermittelter Apoptose(82). Auf der einen Seite lässt sich dieses Phänomen durch die oben erwähnte Selbstregulation zur Verhinderung übermäßiger Immunaktivierung erklären(80). Ein zweiter wichtiger Punkt bei der Regulation dieser Immunvorgänge ist aber auch der Nachweis der Expression antiapoptotischer bclx-Proteine bei Makrophagen nach Stimulation mit LPS und IFN-γ(82). Diese könnte der proapoptotischen NO-Stimulation entgegensteuern und das Überleben der Makrophagen somit zusätzlich beeinflussen. 70 Diskussion ___________________________________________________________________________ 4.3.2 Interaktion mit Tumorzellen Im vorherigen Kaptitel wurden die Mechanismen der Immunabwehr beschrieben, über Fasvermittelte Apoptose die Immunantwort zu regulieren. Da auch Tumorzellen mit Fas interagieren (s. Kapitel 1.1.4.1) und sich durch eine Gegenattacke gegen tumorassoziierte Makrophagen zu wehren wissen, liegt die Vermutung nahe, dass die Tumorzellen in die beschriebenen Apoptosemechanismen über Fas eingreifen, um eine gegen sie gerichtete entzündliche Reaktion zu verhindern. 4.3.3 Stimulation durch Endotoxin und Signalvermittlung Die unter 4.2.1-4.2.4 vorgestellten Ergebnisse lassen eine vermehrte Immunkompetenz reifer Makrophagen nach LPS-Stimulation annehmen, so dass auch ein Eingreifen von LPS in die Fas-vermittelten Apoptosevorgänge vermutet werden kann. LPS könnte in vivo auf mehreren Ebenen in die Signalwege aktivierter Makrophagen eingreifen: erstens auf dem direkten Wege über Enzymaktivierung oder Signaltransduktion mit Hilfe von Rezeptoren (CD14- und TLR4-Rezeptor, siehe 4.3.2.1) und zweitens über die Regulierung der Genexpression und Transkription weiterer Faktoren (NFκB, s.4.3.4)(2). Eine interessante Fragestellung ist auch die nach der Signalübertragung der LPS-Antwort von Makrophagen. Diese können mit Hilfe von CD14-Rezeptoren die Antigenstruktur von LPS erkennen und eine entzündliche Immunabwehr einleiten. Jedoch zeigen neuere Erkenntnisse der Forschung zusätzlich eine anti-inflammatorische Signalübertragung über CD14Rezeptoren, welche in vitro die Phagozytoseaktivität bei Makrophagen zu induzieren scheint(38). Die Liganden, welche über diesen Weg in einem späten Stadium in die Apoptose eingreifen, sind noch nicht identifiziert(37). Eine dosisabhängige Wirkung von LPS, das ja bekannterweise mit CD14-Rezeptoren interagiert, und außerdem in niedriger Konzentration über die anti-inflammatorische Aktivierung die apoptotischen Abräumprozesse unterstützen könnte, wäre somit in vivo auch eine mögliche Erklärung für die schon empirisch untersuchte antitumoröse Wirkung von LPS(68) (siehe 1.5), welche hier allerdings erst später im apoptotischen Prozess auftreten würden als bei den anderen vorgestellten Hypothesen. Jedoch ist nicht nur CD14 von Belang für die LPS-vermittelte Immunantwort, auch der TLR4Rezeptor sowie andere primär LPS-unspezifische Zelloberflächenstrukturen können für die Signalübertragung verantwortlich sein (s. Kapitel 1.3). Bei der TLR4-vermitellelten Reaktion 71 Diskussion ___________________________________________________________________________ sind sowohl MyD88-abhängige als auch unabhängige Wege bekannt, was wiederum hinsichtlich der Apoptosevermittlung interessant ist, da MyD88 auch hier eine Rolle spielt(2, 113). Aber auch bei der intrazytoplasmatisch übertragenen LPS-Antwort spielen Moleküle eine Rolle, welche strukturell auch in der Apoptose von Bedeutung sein könnten. 4.3.4 Gemeinsame Wege der Regulationsmechanismen von Apoptose, tumorvermittelter Immunabwehr und LPS-Stimulation MyD88 hat in der LPS-Signalvermittlung eine Adaptorfunktion zur Aktivierung des nuklearen Faktors κB (NF-κB), ein für mannigfaltige Aspekte der Immun- und Entzündungsantwort verantwortlicher Transkriptionsfaktor(104). Außerdem scheint MyD88 auch in der Apoptosereaktion unabdingbar zu sein(113), was eine direkte Wirkung von LPS auf die Apoptoseregulation erklären könnte, z. B. durch eine „Blockierung“ des MyD88-Moleküls für die apoptotische Funktion durch LPS. Aber auch eine Regulation über NF-κB, auf welche weiter unten eingegangen wird, scheint möglich. Die LPS-induzierte intrazytoplasmatische Signaltransduktion ist von den Molekülen Nod1 und -2 abhängig, welche eine strukturelle Ähnlichkeit mit dem Apoptoseadaptor Apaf-1 aufweisen(104). Auch hier ist also prinzipiell eine Interaktion denkbar. LPS stimuliert in höheren Dosen die induzierbare NO-Synthase (iNOS)(2);(105) und verursacht über eine erhöhte NO-Ausschüttung Apoptose. Da auch Fas über eine erhöhte NO-Ausschüttung wirkt(82), ist hier der ein weiterer potenzieller Verknüpfungspunkt von TZÜ und LPS, der eine Schutzwirkung von LPS vermitteln könnte. Auch die Proteinkinase C (PKC) ist nicht nur in die Aktivierung von Makrophagen und der Signaltransduktion von LPS involviert(13), sondern wurde schon als direkte Kinase des bcl2Proteins identifiziert und stellt somit ein mögliches Bindeglied zwischen den drei von uns untersuchten Parametern dar(91). Außerdem bewirkt die PKC zusätzlich eine Aktivierung von NF-κB sowie eine wahrscheinlich dadurch bedingte NOS-Induktion mit konsekutiver Erhöhung der NO-Ausschüttung, welche die vermehrte Apoptose von Makrophagen nach sich zieht(26). Auch die LPS-Wirkung wird letztendlich über die Aktivierung von NF-κB vermittelt und induziert nach Rezeptorbindung die Produktion inflammatorischer Zytokine. Die Regulierung der NO-vermittelten Apoptose ist somit möglicherweise auch von der Expression und anderen Regulierungsmechanismen des NF-κB wie DNA-Bindung oder Translokation zum Nukleus abhängig, welche auch durch die Applikation von LPS beinflusst werden. Welche Veränderungen NF-κB in der Apoptoseregulation bewirkt, ist jedoch unklar: 72 Diskussion ___________________________________________________________________________ Mehrere experimentelle Studien weisen auf eine gleichsinnige Steigerung der Apoptoserate mit der Aktivität des NF-κB hin(7, 97), wohingegen andere Autoren gar von einer Protektion durch NF-κB vor Apoptose sprechen(17, 18, 111). Weitere Moleküle, die in dem Zusammenhang der Regulierung von Apoptose, Interaktion mit Tumorzellen und Einfluss von LPS von Interesse sind, wobei eine genauere Ausführung aber zu weit führen würde, sind PGE2 und TNF(18, 28, 46, 68). Schließlich sind noch die Genlokalisationen von NF-κB und FasL zu erwähnen, welche sich in räumlicher Nähe auf Chromosom 1q23 befinden und dadurch vielleicht ebenfalls den gleichen Regulierungsmechanismen wie z. B. Promotoren unterliegen(102). 4.3.5 Diskussion der eigenen Ergebnisse in Bezug auf Literaturangaben Das vorhergehende Kapitel hat im Rahmen des Möglichen versucht, mögliche Ansätze zur Erklärung des Ineinandergreifens der Regulation von apoptotischen Vorgängen mit der Wirkungsweise von LPS aufzuzeigen. Welcher dieser verschiedenen angesprochenen Regulationsmechanismen letzten Endes die Erklärung für unsere Ergebnisse liefern kann, bleibt jedoch weitgehend unklar. Von besonderem Interesse für diese Arbeit sind die Ergebnisse der bax- und bcl2-Färbung nach Inkubation mit LPS und TZÜ am 12. Kulturtag. Beiden kann die gleichsinnige Aussage entnommen werden, dass nur nach LPS-Zugabe ein signifikanter Anstieg von Makrophagen stattfand, welche antiapoptotische Proteine exprimierten, jedoch einen Abfall derer mit proapoptotischen Markern. Als Grund dafür, dass diese Beobachtung nur am 12. Kulturtag der Zellen gemacht werden konnte, muss man die Frage der Makrophagenreife in Betracht ziehen, wie unter 4.2.5 ausführlich erläutert. Eine mögliche Begründung für das ausschließlich auf die Behandlung mit LPS und TZÜ hin gesteigerte Apoptoseverhalten wurde ebenfalls schon mit der Hypothese einer Aktivierung der Makrophagen nur bei ausreichend starkem Reiz angeführt. Des Weiteren ist die Frage, ob LPS-Aktivierung eine verstärkte Apoptosereaktion oder aber möglicherweise sogar eine Schutzfunktion vor dieser Art des Zelltodes zur Folge hat, in der Literatur kontrovers diskutiert worden. Die auf den ersten Blick gegensätzlichen Aussagen der von Hortelano et al. beobachteten vermehrten Apoptose nach Stimulation mit LPS (nach 24 Stunden)(43) wird durch den von Okada et al. erbrachten Nachweis erhöhter Expression antiapoptotischer Proteine (nach drei Stunden)(82) – welcher sich mit den hier gezeigten Ergebnissen deckt - bei Betrachtung der zeitlich versetzten Reaktionen keineswegs ausgeschlossen: Eine Immunreaktion gegen bestimmte Noxen – in unserem Fall TZÜ - ist ja 73 Diskussion ___________________________________________________________________________ primär durchaus wünschenswert und lässt die vermehrte antiapoptotische Regulation sehr plausibel erscheinen. Nachfolgend, um übermäßige Immunreaktionen zu verhindern, wird Apoptose eingeleitet, ein Phänomen, was bei unserem Versuchsaufbau aufgrund der Wahl der zeitlichen Abfolge von nur zwölf Stunden nicht mehr erfasst werden konnte. Die unter 4.3.3 bezüglich des sowohl in der LPS- als auch in der Apoptosevermittlung eine Rolle spielende Molekül molekularbiologische MyD88 Korrelat für unterbreitete unsere Hypothese Ergebnisse könnte darstellen: durchaus Eine durch das in Tumorzellüberstand enthaltenes FasL ausgelöste Apoptosekaskade könnte auf Höhe des Adaptorproteins in Anwesenheit von LPS blockiert werden, z. B. durch eine vorangegangene LPS-Reaktion mit „Verbrauch“ des Moleküls. Diese Hypothese ist jedoch, ebenso wenig wie die anderen Literaturzitate, welche in Kapitel 4.3 diskutiert wurden, in Bezug auf unsere Ergebnisse verifizierbar. So kann hier über die den Ergebnissen zugrunde liegenden Mechanismen leider keine genauere Erklärungen geliefert werden. Aber eben jene zu erforschen, wird die Forschung auf dem Gebiet der molekularbiologischen Hintergründe der Apoptose sowie der Einsatz der Immunabwehr gegen Neoplasien mit Sicherheit das Thema vieler weiterer wissenschaftlicher Arbeiten sein. 74 Zusammenfassung ___________________________________________________________________________ 5 ZUSAMMENFASSUNG Verschiedene Forschungsgruppen haben sich schon mit unterschiedlichen Versuchsansätzen zur Erforschung der Interaktionen von Tumorzellen und Immunabwehr auseinandergesetzt. Auch dass die Apoptose in diesem Zusammenhang eine wichtige Rolle spielt, ist bekannt. Ob sich jedoch die empirischen Beobachtungen einer Regression von Tumoren nach LPSWirkung durch unser in vitro-Modell bestätigen lassen, sollte hier Gegenstand der experimentellen Untersuchung sein. Als Maßstab zur quantitativen Beschreibung der Apoptose unter dem Einfluss von Tumorzellüberstand und LPS wurden Apoptosemarker aus der bcl2-Familie herangezogen, und zwar bcl2 und bclx als antiapoptotische, sowie bax als proapoptotischer Vertreter dieser Proteingruppe. Mit Hilfe von immuncytochemischen Verfahren konnten mit vier verschiedenen Versuchsansätzen jeweils die Kontrollgruppe mit der LPS-behandelten Gruppe mit und ohne TZÜ-Zusatz am 10. und 12. Kulturtag verglichen werden. Die ausschließlich mit TZÜ behandelten Versuchsansätze und die mit TZÜ und LPS inkubierten Ansätze vom 12. Tag stellten sich als signifikant unterschiedliche Apoptoseraten aufweisend heraus: Sowohl die bcl2- als auch die bax-Färbung zeigte einen signifikanten Abfall der Apoptoserate bei zusätzlicher Behandlung mit LPS. Diese Ergebnisse lassen verschiedene Hypothesen im Zusammenhang mit der Bedeutung der Makrophagenreife sowie den verschiedenen möglichen Signalvermittlungen zwischen Tumorzellen und Makrophagen auf der einen und LPS auf der anderen Seite interessant erscheinen, wobei die Aufdeckung der biomolekularen Hintergründe auch weiterhin Priorität in der Erforschung dieser Thematik haben muss. Der von uns beobachtete signifikante Abfall der Apoptosebereitschaft der Makrophagen nach LPS-Stimulation weist zumindest auf eine gewisse Schutzwirkung dieses Moleküls bei Vorhandensein eines apoptotischen Stimulus hin, ohne dass der zu Grunde liegende Mechanismus nachgewiesen werden konnte. 75 Literaturverzeichnis ___________________________________________________________________________ 6 LITERATURVERZEICHNIS 1. Adams, J. M. and Cory, S. (1998) The Bcl-2 protein family: arbiters of cell survival. Science 281 (5381): 1322-1326 2. Akira, S. and Hemmi, H. 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Freudenberg zum Einen für die Überlassung des Doktorarbeitsthemas und zum Anderen für die freundliche und hilfsbereite Unterstützung bei ihrer Fertigstellung aussprechen. Auch den Mitarbeitern des Max-Planck-Instituts für Immunbiologie, Freiburg, Frau Prof. M. Freudenberg, Herrn Dr. C. Galanos und Frau H. Stübig, gebührt mein herzlicher Dank für die geduldige und freundliche Beratung und Hilfe. Außerdem standen mir Herr Dr. E. Wellens und viele andere Mitarbeiter des Pathologischen Instituts der Universitätsklinik Freiburg bei vielen Fragen und Problemen mit Rat und Tat zur Seite. Hier muss ich noch besonders meinem Mitdoktoranden Sven Griesbaum für seine fortwährende Geduld und Freundlichkeit sowie die Einweisung in den experimentellen Teil danken. Auch Kiran Majer und Peter Flacker, die mich in fachlichen und formellen Fragen beraten haben, sollen an dieser Stelle dankend erwähnt werden. Nicht zuletzt möchte ich noch meiner Familie und meinen Freunden für ihre ständige Unterstützung und Zuwendung während der Fertigstellung der Doktorarbeit danken.