ZIP - FreiDok - Albert-Ludwigs
Werbung
Max-Planck-Institut für Immunbiologie Freiburg im Breisgau Effektorfunktionen von Makrophagen nach Aktivierung mit Borrelia burgdorferi Inaugural-Dissertation zur Erlangung der Doktorwürde der Fakultät für Biologie der Albert-Ludwigs-Universität Freiburg im Breisgau vorgelegt von Nicole Justies aus Freiburg im Breisgau Mai 2003 A good scientist is a person in whom the childhood quality of perennial curiosity linkers on. Once he gets an answer, He has other questions. Frederick Seitz für meine Eltern Dekan der Fakultät: Prof. Dr. Hans Kleinig Promotionsvorsitzender: Prof. Dr. Karl-Friedrich Fischbach Leiter der Arbeit und Referent: Prof. Dr. Hans-Ulrich Weltzien Koreferent: Prof. Dr. Klaus Eichmann Tag der Verkündigung der Prüfungsergebnisse: 15. Juli 2003 Inhaltsverzeichnis I Inhaltsverzeichnis Abkürzungsverzeichnis…………………………………...……………………………I 1 Einleitung……………………………………………………………………..1 1.1 Lyme Borreliose 1 1.1.1 Der Erreger Borrelia burgdorferi 1 1.1.3 Übertragung und Manifestation 5 1.1.4 Klinik und Therapie der Lyme Borreliose 6 1.2 Das Immunsystem 11 1.3 Rezeptoren der angeborenen Immunität 13 1.4 Entwicklung und Funktion von Makrophagen 18 1.5 Entwicklung einer chronischen Entzündung 20 1.6 Mediatoren der Pathologie 22 1.6.1 NO-Synthasen und Stickstoffmonoxid (NO) 22 1.6.2 Argininase 23 1.6.3 Interleukin-12 24 1.6.4 Caspasen und Caspasen-Substrate 27 1.6.5 Interleukin-18 28 1.6.6 IFN-γ 29 1.7 Zielsetzung der Arbeit 31 2 Material und Methoden…………………………………………………….33 2.1 Material 33 2.1.1 Reagenzien, Gebrauchswaren und Geräte 33 2.1.1.1 Reagenzien 33 2.1.1.2 Kulturmedien 34 2.1.1.3 Puffer und Stammlösungen 34 2.1.1.4 Verwendete Kits 35 2.1.1.5 Gebrauchswaren 36 2.1.1.6 Geräte 36 2.1.2 Tiere 36 2.1.3 Zellen 37 Inhaltsverzeichnis II 2.1.4 Bakterien 37 2.1.5 Oligonukleotid-Primer 37 2.2 Methoden 38 2.2.1 Differenzierung von Knochenmarks-Makrophagen (KMMø) 38 2.2.2 Kultivierung der Hybridomazellen 38 2.2.3 Bestimmung der Zellzahl und Vitalität der Zellen 38 2.2.4 Kultivierung von B. burgdorferi 39 2.2.5 Opsonisieren von Zymosan (C3b-Beschichtung von Zymosan) 39 2.2.6 Nitritbestimmung 40 2.2.7 Arginase-Bestimmung 40 2.2.8 Lucigenin abhängige Chemilumineszenz 41 2.2.9 Zytokin-Bestimmung mittels ELISA 41 2.2.10 Bestimmung von TNF-α auf Proteinebene mittels Bioassay 46 2.2.11 Caspase-1 Assay 43 2.2.12 Alkalische Phosphatase 44 2.2.13 RNA-Präparation 44 2.2.14 Konzentrationsbestimmung von Nukleinsäuren 45 2.2.15 Reverse Transkription (RT) 46 2.2.16 Die Polymerase-Kettenreaktion (PCR) 46 2.2.17 Agarose-Gelelektrophorese 47 2.2.18 Affinitätschromatographie 48 2.2.19 Dialyse 49 2.2.20 Analyse des Arginin-Metabolismus von KMMø 49 2.2.21 MTT-Test zum Nachweis der mitochondrialen MTT-Dehydrogenase 51 3 Ergebnisse………………….………………………………………………..52 3.1 Bildung reaktiver Sauerstoffradikale nach Aktivierung mit Bb oder Zymosan. 52 3.2 Synthese von NO nach Aktivierung mit Bb, LipOspA oder LPS. 53 3.3 Induktion von TNF-α nach Aktivierung mit LPS oder Bb. 54 3.3.1 Transkriptioneller Nachweis von TNF-α nach Aktivierung mit LPS oder Bb. 54 Inhaltsverzeichnis III 3.3.2 Sezernierung von TNF-α nach Aktivierung mit LPS oder Bb. 55 3.4 Induktion von IL-12 nach Aktivierung mit LPS und Bb. 56 3.4.1 Transkriptioneller Nachweis von IL-12p40 nach Aktivierung mit LPS oder Bb nach 6 h. 56 3.4.2 Sezernierung von IL-12p40 und IL-12p75 nach Aktivierung mit Bb. 57 3.5 Sezernierung von IFN-γ nach Aktivierung mit B.b und Zytokinen. 58 3.6 Caspase-1 Aktivität nach Aktivierung mit Bb. 59 3.7 Die Rolle von NO auf die Sezernierung von IFN-γ durch KMMø. 63 3.8 Der Arginin-Metabolismus nach Aktivierung mit Bb. 66 3.9 Untersuchungen zum Energie-Metabolismus der Makrophagen. 70 3.10 Differenzierung der KMMø in Gegenwart von LPS, Bb oder lipOspA. 73 3.10.1 Modulation der Makrophagen abhängigen Zytotoxizität. 74 3.10.2 Induktion von TNF-α. 76 3.10.3 Synthese von NO. 78 3.10.4 Induktion der Arginase. 79 3.11 Differenzierung von KMMø aus immmundefizienten Bb infizierten CB17scid Mäusen. 3.12 Differenzierung von KMMø von mit Bb infizierten immmundefizienten Mäusen des Mausstammes CB17scid. 3.13 80 83 Entwicklung der Lyme Arthritis bei immmundefizienten Mäusen des Mausstammes CB17scid, die während der Infektion mit anti-IFNγAntikörpern behandelt wurden. 3.14 Infektion von NOS2-defizienten CB17scid und Rag2-/-GammaC/Balb-c Mäusen. 4 85 86 Diskussion…………………………………………………………………...91 4.1 Vergleich der Effektorfunktionen von KMMø der Mausstämme CB17 und C57Bl/6. 91 4.2 Die Rolle von NO auf die Entwicklung der Bb induzierten Arthritis in vivo. 96 4.3 Die Rolle von NOS2 und Arginase. 97 4.4 Effekt der Lyme Borreliose der Maus auf die Funktion von KMMø. 99 5 Zusammenfassung der Arbeit………………………………………………...104 Inhaltsverzeichnis IV 6 Literaturverzeichnis…………………………………………………………...105 7 Veröffentlichungen…………………………………………………………….113 7.1 Tagungen, Abstracts und Vorträge 113 7.2 Veröffentlichung 113 8 Tabellarischer Lebenslauf…………………………………………………….114 9 Danksagungen………………………………………………………………….115 Abkürzungsverzeichnis Abkürzungsverzeichnis A260 APC ALPH APS AS Bidest Bb bp BSA bzw. CD cDNA Ci CpG cpm DC DEPC DMEM DMSO DNA dNTP DTT EDTA ELISA E FAD FCS FMN g GM-CSF HBSS HEPES HRP ICAM ICE Absorption bei 260 nm Antigenpräsentierende Zelle (antigen presenting cell) Alkalische Phosphatse Ammoniumpersulfat Aminosäure bidestilliert Borrelia burgdorferi Basenpaare Rinderserum (Bovine Serum Albumin) beziehungsweise Differenzierungcluster (Cluster of Differentiation) komplementäre Desoxyribonukleinsäure (complementary desoxyribonucleic acid) Curie Cytosine-phosphate Guanosin counts per minute Dendritische Zelle (Dendritic Cell) Diethylpyrocarbonat Dulbecco modifiziertes Eagles Medium Dimethylsulfoxid Desoxyribonukleinsäure (desoxyribonucleic acid) Desoxyribonukleosidtriphosphat Dithiothreitol Ethylendiamintetraacetat Enzyme-Linked Immunosorbent Assay Einheit Flavinadenindinukleotid Fötales Kälberserum (fetal calf serum) Flavinmononukleotid relative Zentrifugalkraft Granulocyte Macrophage Colony Stimulating Factor Hanks balanced solution N-2-Hydroxyethylpiperazin-N´-2-Ethansulfonsäure Horseradish Peroxidase (Meerrettich-Peroxidase) interzelluläres Adhäsionsmolekül(Intercellular Adhesion Molecule) Caspase-1 (Interleukin-1 converting enzyme) V Abkürzungsverzeichnis IFN IL INOS IP i.p. i.v. kbp kDa KMMø KO LipOsp L-NMMA LPS µ Interferon Interleukin induzierbare NO-Synthase Immunpräzipitation intraperetoneal intravenös Kilo-Basenpaar Kilodalton Knochenmarksmakrophage Knock-out Oberflächenlipoprotein (outer surface lipoprotein) N-Monomethyl-L-Arginin Lipopolysaccharid micro M Mø MAK M-CSF MHC Molarität Makrophage monoklonaler Antikörper Macrophage-Colony Stimulating Faktor Haupthistokompatipilitätskomplex (Major Histocompatibility Complex) Minute Milliliter Boten-RNA (messenger RNA) 3-(4,5-Dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazoliumbromid Nicotinamid-adenin-dinucleotid-phosphat natürliche Killerzelle (natural killer cell) Stickstoffmonoxid Optische Dichte Phosphatgepufferte Kochsalzlösung (Phosphate Buffered Saline) Polymerase-Kettenreaktion (Polymerase Chain Reaction) Phenylmethylsulfonylfluorid (Pprotease-Inhibitor) relative Lichteinheit (relative light unit) Ribonukleinsäure (ribonucleic acid) Ribonuklease Umdrehungen pro Minute (rounds per minute) Standardmedium entwickelt im Roswell Park Memorial Institut min ml mRNA MTT NADP NK NO OD PBS PCR PMSF RLU RNA RNAse rpm RPMI VI Abkürzungsverzeichnis rRNA RT R R-/s.c. scid SDS sec STAT STF SOCS TBE TCR ribosomale RNA Reverse Transkription Rezeptor Rezeptor Knock-out subcutan schwerer kombinierter Immundefekt (severe combined immunodeficiency) Natriumdodecylsulfat Sekunde Signal Transducer and Activator of Transcription soluble tuberculosis factor (löslicher Tuberkulosefaktor) suppressor of cytokine signaling Tris-Borat-EDTA T-Zellrezeptor (T-Cell Receptor) TEMED TH TLR TNF Tris TWEEN 20 v/v w/v N,N,N`,N`-Tetramethylethylendiamin T-Helfer Zelle Rezeptor der toll-Familie (Toll like Receptor) Tumor Necrose Faktor Tris(hydroxymethyl)aminomethan Polyoxeethylen-Sorbitan-Monolaurat Volumen pro Volumen Gewicht pro Volumen (weight per volume) VII Einleitung 1. Einleitung 1.1 Lyme Borreliose 1 Die Lyme Borreliose ist die häufigste von Zecken übertragene Infektionskrankheit in den gemässigten Breiten. Allein in Deutschland erkranken schätzungsweise 40.000 bis 80.000 Menschen jedes Jahr neu an dieser vektoriell übertragenen, durch Borrelia burgdorferi ausgelösten Krankheit. Die Übertragung, bzw. Infektion erfolgt praktisch immer über Zecken, in Europa von Ixodes ricinus, in Nordamerika von Ixodes pacificus und in Ostasien von Ixodes persulcatus. Der Holzbock (ixodes ricinus) hat ein vergleichsweise breites Wirtsspektrum, er befällt über 50 Säugerarten, daneben auch Reptilien und Vögel. Weltweit kennt man etwa 800 Zeckenarten, 25 Arten kommen bei uns in Mitteleuropa vor, doch nur 8 Arten sind medizinisch bedeutsam. Andere Übertragungswege – also nicht über den Vektor Zecke - wurden zwar öfters diskutiert, beispielsweise durch eine stechende Fliegenart, sind aber sehr unwahrscheinlich, da das Insekt zuvor eine mit Borrelien infizierte Maus und dann anschliessend den Menschen stechen müsste. Eine sexuelle Übertragung wie bei der erregerverwandten Syphilis Treponema pallidum, existiert nicht. Eine Erregerübertragung bei einer Bluttransfusion ist eher unwahrscheinlich (wenn auch nicht völlig auszuschliessen), da die Borrelien bei einer in vitro Infektion von Bluttransfusionen zwar nach 6 Tagen noch lebend in Konzentrat von weissen Blutkörperchen (bei 20˚C gelagert) und noch nach 45 Tagen im Plasma (bei –18˚C gelagert) und roten Blutkörperchen (bei 4˚C gelagert) nachgewiesen werden konnten, jedoch wurde eine für die Realität völlig überhöhte Konzentration von Borrelien zur Infektion eingesetzt (zwischen 200 und 3000 Borrelien je ml Blutprodukt) (SJ Badon et al., 1989). Es ging bei diesem Experiment primär um das Überleben der Erreger, nicht um die Infektiösität der Blutprodukte. Theoretisch können die Erreger jedoch über Blutkonserven übertragen werden, da Borrelien eine Kühlschranklagerung gut überstehen. Da die Bakteriämie, die Zeit mit hoher Erregerzahl im Blut, bei der Borreliose aber nur sehr kurz auftritt, ist eine derartige Übertragung sehr selten (Edly SJ, 1990). Wie MacDonald bereits 1989 beschreibt, ist eine Übertragung auf das ungeborene Kind während der Schwangerschaft nur dann möglich, wenn die Schwangere frisch mit Borrelien infiziert ist und noch keine Antikörper besitzt, es Einleitung 2 können syphilisähnliche Missbildungen induziert werden. Bei einer Infektion in der Frühschwangerschaft kommt es vermehrt zu Fehlgeburten. Handelt es sich bei der Schwangeren um eine bereits chronisch kranke Borreliosepatientin, bei der kaum noch Erreger im Blut zu finden sind, ist das Übertragungsrisiko deutlich geringer. Seit Ende des 19. Jahrhunderts wurden bereits verschiedene Symptome in Zusammenhang mit einem vorausgegangenen Zeckenstich beobachtet. Dazu gehörte beispielsweise das Erythema chronicum migrans, eine sich um die Einstichstelle herum ausbreitende Wanderröte. Sie wurde bereits von dem schwedischen Arzt Arvis Afzelius 1909 am Fall einer Patientin kurz geschildert und auch von dem Wiener Dermatologen Benjamin Lipschütz 1912 beobachtet und dokumentiert. Auffallend war, dass nach einer Penicillinbehandlung des Patienten häufig eine Besserung des Krankheitsbildes auftrat, was auf eine bakterielle Erkrankung hindeutete. Erstmals aufmerksam wurde man auf die Krankheit 1975 in Lyme im US-Bundesstaat Connecticut, nachdem bei einer Vielzahl von Kindern in dieser Region zunächst juvenile rheumatische Arthritis diagnostiziert wurde. Normalerweise handelt es sich bei dieser Form der rheumatischen Arthritis um eine sehr seltene Krankheit, doch in diesem, auf eine bestimmte geographische Lage begrenzten Gebiet, wurde die Krankheit einhundertmal häufiger diagnostiziert als im Mittel des Landes. In weiteren Studien konnte belegt werden, dass das Auftreten der Krankheit mit dem Verbreitungsgebiet einer Zeckenart (Ixodes dammini) übereinstimmte (AC Steere et al., 1978). Es zeigte sich, dass die von W. Burgdorfer identifizierten Borrelien im weiteren in mindestens zehn Unterarten eingeteilt werden können, von denen aber nur drei für den Menschen pathogen sind: Borrelia burgdorferi sensu strictu, in Amerika und in Europa, aber nicht in Russland oder Asien; Borrelia afzelii (benannt nach dem schwesischen Arzt Arvis Afzelius) in Mitteleuropa, Skandinavien und Asien und Borrelia garinii (benannt nach den französischen Medizinprofessor Charles Garin) in Westeuropa und Asien. 1.1.2 Der Erreger Borrelia burgdorferi Die Spirochäte, Borrelia burgdorferi, ist der Erreger der durch Zecken übertragenen Lyme Borreliose. Der Biologe Willy Burgdorfer von den Rocky-Mountains- Einleitung 3 Laboratorien identifizierte 1982 den Erreger in Zecken, der dann schliesslich nach ihm – Borrelia burgdorferi - benannt wurde. Der Gattungsname Borrelien stammte von dem französischen Mikrobiologen Amédée Borrel (1867-1936), der die korkenzieherartigen Bakterien erstmals beschrieb. Die Spirochäten (Ordnung: Spirochaetales) sind eine Gruppe einzelliger chemoheterotropher Schraubenbakterien von charakteristischer Gestalt. Durch ihren Zellaufbau und ihre Bewegungsweise unterscheiden sie sich von allen anderen Bakterienarten. Eine typische Spirochäte zeichnet sich durch ihre korkenzieherartige Struktur und eine hohe Motilität aus. Ihre Gestalt ist helikoid und ausserordentlich flexibel. Im Vergleich zu ihrer Länge (5500µm) ist ihr Durchmesser (0.1-0.6µm) ungewöhnlich gering, so dass sie viele Bakterienfilter passieren können, die eigentlich Mikroorganismen zurückhalten sollen. Wie alle Bakterien der Ordnung Spirochaetales, besitzen auch Borrelien drei wesentlich Bestandteile: einen Protoplasmazylinder, eine äussere Hüllmembran (outer envelope) und dazwischen liegende Achsialfibrillen (Endoflagellen), die den Bakterien eine ausgeprägte Eigenbeweglichkeit ermöglichen. Der längliche Protoplasmazylinder wird von der Zellmembran umgeben. Periplasmatisch liegen mehrere, meist 7 oder 11 Fibrillen, die jeweils an einem der Pole inseriert sind und sich um den Protoplasmazylinder winden, wobei sie sich in der Zylindermitte überlappen. Der Hauptbestandteil der Fibrillen ist das Flagellin, ein 41 kDa-Protein. Die äussere Hüllmembran, die den Protoplasmazylinder lose umschliesst, besitzt die charakteristischen bakteriellen Lipoproteine (outer surface protein lipOsp), die wie auch das Flagellin stark immunogen sind. Die bakteriellen Lipoproteine (Osp) lassen sich aufgrund ihres Molekulargewichts in mehrere Gruppen unterteilen (OspAOspG), von denen OspA (31kDa), OspB (34kDa), und OspC (23kDa) die immunologisch wichtigsten darstellen. Abhängig vom Mikromilieu (pH-Wert, Zelldichte, Temperatur) verändern Borrelien das Expressionsmuster ihrer Oberflächenantigene (Osp). Untersuchungen haben ergeben, dass B. burgdorferi im Mitteldarm der Zecke hauptsächlich OspA-Moleküle exprimiert, diese gehen aber im Zuge der Blutmahlzeit verloren und werden durch OspC-Moleküle ersetzt. Bei Borreliose-Patienten findet man aus diesem Grund vorallem Antikörper gegen das Oberflächenantigen OspC. In den USA wurde LYMERix, ein Impfstoff auf Basis von OspA, an über 10.000 Personen getestet und bietet den geimpften Personen einen Schutz vor einer Übertragung von Borrelien während des Zeckenbisses. Der Impfstoff Einleitung 4 besteht aus 30 Mikrogramm gentechnisch hergestellten Oberflächenprotein OspA, das im menschlichen Immunsystem die Bildung von Antikörpern anregt. Das Interessante ist, dass die Antikörper nicht im menschlichen Körper wirken, sondern im während der Blutmahlzeit eingesaugten Blut im Mitteldarm der Zecke die Borrelien eliminieren (M. Simon et al., 1999). Allerdings heilt der Impfstoff weder eine bereits bestehende Erkrankung, noch lindert er Symptome die im Krankheitsverlauf auftreten, da OspA nur von Borrelien exprimiert wird, solange sie in der Zecke leben, nicht aber sobald sie in einen Vertebraten übertragen wurden. Das Genom von B. burgdorferi wurde 1997 von Fraser und seinen Mitarbeitern vollständig sequenziert. Es ist einzigartig unter den Bakteriengenomen. Es besteht aus einem linearen Chromosom (910725 bp), neun zirkulären Plasmiden (249330 bp) und zwölf linearen Plasmiden (361364), die Gesamtgrösse des Genoms ist 1521419 bp, also etwa 1.5 Mbp gross. Das Chromosom enthält 853 Gene, welche die bakteriellen Membranproteine (Osp), Proteine für DNA-Replikation, Transkription, Translation, Stofftransport und Energiestoffwechsel kodieren. Gene für biosynthetische Stoffwechselwege konnten bis jetzt noch nicht identifiziert werden, sie sind wahrscheinlich nicht vorhanden, was erklärt, warum sich B. burgdorferi in vitro nur in serumsupplementiertem Kulturmedium vermehrt. Die auf den Plasmiden kodierten Gene spielen wahrscheinlich vorallem für die Virulenz der Bakterien und ihrer Antigenvariation eine Rolle. Das natürliche Vorkommen von Borrelien ist immer an einen Wirt gekoppelt. Borrelia burgdorferi Spirochäten werden in einem zoonotischen Zyklus übertragen, bei dem die Zecken als Vektoren und kleine Wirbeltiere (z.B. Mäuse) als Wirte für Zecken und Spirochäten fungieren. Das Immunsystem von Säugetieren ist gegenüber dem Erreger tolerant, so kommt es zu einer lebenslangen Bakteriämie mit ständig präsenten Erregern im peripheren Blut. Der Zustand der Bakteriämie stellt ein wichtiges Borrelien-Reservoir dar, so dass ständig ein Infektionszyklus aufrechterhalten werden kann. Der Mensch und andere Grosssäuger spielen beim Lebenszyklus der Zecke keine Rolle, können aber bei einer obligatorischen Blutmahlzeit der Zecke infiziert werden. Im Gegensatz zur Maus, ist der Mensch allerdings eine infektionsepidemiologische Sackgasse, da der Erreger nur eine relativ Einleitung 5 kurze Bakteriämie verursacht, so dass eine Weiterverbreitung der Spirochäten im Allgemeinen kaum stattfindet. Borrelien stellen komplexe Ansprüche an ihre Umgebung was sich auch bei ihrer Kultivierung in vitro zeigt. Einige energieaufwendigen Biosynthesen können von den Bakterien vermieden werden, da die Wachstumsstoffe vom Wirt bereitgestellt werden. Untersuchungen zeigten, dass Borrelien für ihr Wachstum ein mikroaerophiles Milieu benötigen, und dass ihre Beweglichkeit in einem glukosesubstituierten Medium besser ist. Borrelien bauen Glukose über den Emden-Meyerhof Weg (Glykolyse) ab, wodurch hohe Laktatkonzentrationen entstehen. Durch die Supplementierung des Mediums mit Kaninchen- oder Pferdeserum und Albumin, bzw. frischen organischen Gewebeextrakt, werden den Borrelien langkettige Fettsäuren bereitgestellt, die sie nicht selbst synthetisieren können. 1971 fügte Kelly bei seinen Forschungen NAcetylglukosamin (ein Aminozucker, der ein Hauptbestandteil der bakteriellen Zellwand darstellt) dem Medium bei und verbesserte zudem das Puffersystem des Mediums durch Zugabe von verschiedenen Salzen, Natriumbicarbonat und Gelatine (Kelly 1971). Stoenner fügte dem Kulturmedium 1974 noch Aminosäuren, Vitamine und Wachstumsfaktoren für die Borrelien hinzu, es entstand das sogenannte BSK-IMedium. Diesem Medium wurden im weiteren Verlauf noch Hefeextrakt und 6% Kaninchenserum hinzugefügt, dieses BSK-II-Medium ist heute die Grundlage für die erfolgreiche Anzucht von Borrelien in vitro, die aber immer noch als sehr anspruchsvoll einzuschätzen ist. 1.1.3 Übertragung und Manifestation In Europa gilt der Holzbock Ixodes ricinus aus der Gattung der Schildzecken (Iodes) als der Hauptvektor bei der Übertragung von B. burgdorferi. Die Voraussetzung für die Übertragung des Erregers ist, dass sich eine infizierte Zecke lange genug (36 bis 48 Stunden) in die Haut des Opfers verbeisst. Sobald die Zecke Blut aufnimmt, beginnen sich in ihrem Mitteldarm die Spirochäten zu vermehren, treten dann in die Hämolymphe der Zecke über, von wo aus sie über die Speicheldrüsen und schliesslich den Speichel in das Blut des Opfers übertragen werden. Da die Zecke zusätzlich auch eine anti-inflammatorische Substanz im Speichel absondert, verursacht der Biss keine Beschwerden und wird häufig gar nicht bemerkt. In vivo findet wohl zumindest in den Einleitung 6 ersten 6 Stunden keine Erregerübertragung statt, einen direkten Zusammenhang zwischen Infektionswahrscheinlichkeit und Dauer der Blutmahlzeit wurde in Kaninchen nachgewiesen. Den Tieren wurden mit B. burgdorferi infizierte Nymphen aufgesetzt und nach verschiedenen Zeitintervallen wieder abgenommen (J Piesman et al., 1991). In den USA und Europa gibt es zahlreiche endemische Herde. Je nach Region sind bis zu 30%, in manchen Gebieten sogar 50% der Zecken mit B. burgdorferi infiziert. Befällt eine infizierte Zecke den Menschen, kommt es bei 30% zu einer Erregerübertragung, und 75% der infizierten Personen entwickeln nachfolgend eine Lyme Borreliose. Ohne Therapie gehen etwa 60% in ein Spätstadium der Borreliose bzw. in einen chronischen Verlauf der Krankheit über. Bis zu 15% der gesunden Bevölkerung weisen Antikörper gegen B. burgdorferi auf, was auf eine Infektion hinweist, ein Ausbrechen der Krankheit aber noch nicht stattgefunden hat, oder aber bei diesen Personen gar nicht stattfinden wird. Ganz Mitteleuropa gehört mehr oder minder zum Verbreitungsgebiet der Borreliose, wobei klare regionale Schwerpunkte bestehen. In einem gut untersuchten Gebiet in Nordbaden, im Kraichgau, sind etwa 17% der Bevölkerung seropositiv, die meisten der seropositiven Patienten haben charakteristische Beschwerden. Durch prospektive Untersuchungen über 10 Jahre in diesem Gebiet konnte gezeigt werden, dass die jährliche Rate der Neuerkrankungen bei 0.5% liegt. 1.1.4 Klinik und Therapie der Lyme Borreliose Der Verlauf einer Borrelieninfektion lässt sich in drei Stadien einteilen, die einerseits durch den zeitlichen Abstand zum Zeckenstich und andererseits durch die damit verbundenen Organmanifestationen charakterisiert sind. Beim Menschen kann eine Infektion mit B. burgdorferi zu einer multisystemischen Erkrankung mit verschiedenen Krankheitsbildern führen. Jedoch ist zu bedenken, dass sich Stadien überschneiden können, oder aber sogar übersprungen werden. Viele an Borreliose erkrankte Personen erinnern sich nicht an einen Zeckenstich. Das liegt zum Teil daran, dass der Infektionsbeginn lange zurückliegen kann, oder dass der Stich unbemerkt blieb. Bereits die 0.8-1mm grosse Zeckenlarve kann Borrelien übertragen, da sie selbst schon transovariell infiziert werden kann. Einleitung 7 Stadium I. Zwischen Zeckenbiss und den ersten Krankheitszeichen vergehen 3 Tage bis maximal 12 Wochen. Die beim Stich übertragenen Borrelien vermehren sich in der Haut und wandern langsam von der Stichstelle aus annähernd kreisförmig. Wenn nun nach etwa 10 bis 14 Tagen die Immunreaktion des Menschen einsetzt, wandern Abwehrzellen in die Haut ein, das Erythema migrans, die Wanderröte wird sichtbar. Ein klassisches Erythema migrans wird allerdings nur in etwa 60% der Fälle beobachtet, es verschwindet mitunter ohne Therapie, kann aber auch über Monate persistieren. Die meisten Patienten leiden in diesem Frühstadium zusätzlich unter Grippesymptomen, Fieber (41°C), Schweissausbrüchen (Nachtschweiss), Schüttelfrost, Übelkeit, Herzklopfen, Gelenk- , Rücken- und Kopfschmerzen, Lymphknotenschwellung, Milzund Leberschwellung, Müdigkeit und allgemeiner Abgeschlagenheit. Manche Patienten bleiben in diesem Stadium allerdings auch völlig symptomfrei, und die Krankheit zunächst unerkannt. Treten die Allgemeinsymptome auf, ist dies als Zeichen der Erregerstreuung zu werten und markiert den Übergang ins nächste klinische Stadium. Stadium II. Das klinische Stadium II wird als das Stadium der frühen Dissemination (Streuung des Pathogens) bezeichnet. Es setzt nach einer Latenzzeit von bis zu 10 Wochen ein und ist durch neurologische Komplikationen, Schmerzen in der Skelettmuskulatur und Herzbeschwerden gekennzeichnet. In besonders gravierenden Fällen können sich Entzündungen von Herzmuskel und Hirnhäuten mit Herzrythmusstörungen und Lähmungen besonders von Gesichtsnerven zeigen. Nach der Erregerstreuung (Generalisation) kann es zu einer unglaublichen Symptomvielfalt kommen. Entzündliche Vorgänge an peripheren Nerven verursachen oft unerträgliche Schmerzen, wobei der Schmerzcharakter und die neurologischen Defizite einen Bandscheibenvorfall imitieren können. Das Schmerzmaximum sowie die schon beschriebenen Allgemeinsymptome ( siehe Stadium I) sind meist nachts. Desweiteren kommt es zu sensorischen Störungen („Ameisenlaufen“, Temperatursensationen mit Hitze- oder Kältegefühl). Typisch für das Stadium II sind kappenförmige, vom Nacken ausstrahlende Kopfschmerzen, Schwindelattacken und Sehstörungen. Ferner können Gelenkbeschwerden auftreten und eine Lyme-Karditis kann manifestieren. Einleitung 8 Dieses Stadium der Krankheit dauert unbehandelt wenige Wochen bis mehrere Monate. Stadium III. Nach mehreren Monaten bis Jahren kommt es zum dritten Stadium. Chronische Gelenkbeschwerden, neurologische Veränderungen (z.B. Polyneuropathie), Muskelentzündungen (Myositis), chronische Herzmuskelentzündung (Kardiomyopathie), Knochenschmerzen, Weichteilschmerzen (Fibromyalgien), entzündliche Hautveränderungen (Acrodermatitis chronica atropicans) und Gewichtsverlust setzen ein. Ein klassisches Symptom der chronischen Borreliose ist die Lyme-Arthritis. Betroffen sind meist die grossen Gelenke, am häufigsten das Knie, die Sprunggelenke und die Handwurzelgelenke. Die Arthritisanfälle dauern gewöhnlich Tage bis Wochen. In Deutschland ist das Bannwarth-Syndrom, eine Erkrankung der Hirnnerven oder der spinalen Wurzeln, eine der häufigsten Manifestationen der Borreliose. Durch das Bannwarth-Syndrom leiden die Patienten an Schmerzen, Schwächung oder leichten Lähmungen eines Muskels oder einer Muskelgruppe. Die durch die Borrelien induzierten Symptome entstehen durch die hohe Affinität dieser Bakterien zu kollagenen Fasern. So kommt es vor allem im Bindegewebe (Kollagen) zu chronischen Entzündungsprozessen. In der Folge kommt es zu Gefässverschlüssen durch Infiltrate von aktivierten Lymphozyten und Plasmazellen. Kapillarverschlüsse führen zu Störungen der Energieversorgung in den betroffenen Geweben, z.B. von nervenversorgenden Gefässen. Borrelien können sich im Kollagen vermutlich teilweise dem Zugriff des Immunsystems entziehen, und sind dort auch für Antibiotika schlecht erreichbar. Die Allgemeinsymptome im Verlauf der Infektion werden durch Reaktionen des Immunsystems auf die Borrelien bedingt, es handelt sich um eine infektionsbedingte Produktion von TNF-α und anderen proinflammatorischen Interleukinen durch Makrophagen. Die Stärke der Allgemeinsymptome scheint mit der Erregerzahl zu korrelieren. Durch die Einnahme von Breitbandantibiotika wie Penicillin, Tetracyclin und Erythromycin lässt sich die Lyme-Borreliose in jedem Stadium der Krankheit behandeln. Allerdings vermindert eine frühe Behandlung stark das Risiko neurologischer, kardiologischer und Einleitung 9 arthritischer Komplikationen (GS Habicht et al., 1987; F Kantor et al., 1994). Im Frühstadium (Stadium I) gibt es noch keine vaskulitischen Prozesse, die die Penetration des Antibiotikums behindern würden. Daher ist hier eine orale Therapie oft noch ausreichend. Ferner ist zu berücksichtigen, dass die Erreger nur in der Teilungsphase für ein Antibiotikum empfindlich sind. Ruhende Keime (Persister) können also unter Umständen eine Therapie überdauern. Daher dürfte anstatt einer längeren Therapiedauer eher eine Wiederholung der Therapie erfolgsversprechend sein. Bei einer Therapieplanung muss unbedingt berücksichtigt werden, dass es sich um eine systemische Infektion handelt, d. h. das Verschwinden eines Symptoms bedeutet noch lange nicht die Heilung der Krankheit. Eine Gefahr besteht vor allem darin, dass Bakterien trotz Antibiotikatherapie in Gewebenischen (zentrales Nervensystem, Sehnen) überleben können, da diese Bereiche für das Immunsystem und Pharmaka nur schwer zugänglich sind. Grundsätzlich besteht die Möglichkeit, dass die Krankheit trotz prinzipiell wirksamer Therapie rezividiert, also in unregelmässigen Abständen wiederkehren kann. Die Lyme-Borreliose kann in jedem Stadium spontan ausheilen oder chronische Beschwerden hinterlassen. Es muss noch geklärt werden, ob die Erreger auch intrazellulär persistieren können, d.h. es ist bis jetzt nicht bewiesen, ob phagozytierte Borrelien tatsächlich abgetötet werden, oder intrazellulär in einer Art „Überdauerungs-Stadium“ überleben können, in einem solchen phagozytierten Stadium wären sie aber für das Immunsystem bereits nicht mehr erkennbar. Kein infizierter Säuger ist in der Lage die Borrelien-Spirochäten, unabhängig davon ob eine Borreliose bzw. Pathogenese auftritt oder nicht, mit Hilfe des Immunsystems vollständig zu eliminieren. Die Pathogenese kann nur mit einer Antibiotikatherapie behandelt werden, doch einen Schutz könnte nur eine erfolgreiche Pre-Immunisierung (Impfung) gegen die Bakterien bieten. Die Krankheit erzeugt keine dauerhafte Immunität. Eine Reinfektion (neuerliche Ansteckung) ist möglich. Allerdings sollte nun noch erwähnt werden, dass es mit Borrelien infizierte Personen gibt, die nie an Lyme-Borreliose erkranken. Diese Menschen sind zwar Träger des Erregers, es manifestiert sich aber keine Pathogenese. Die Gründe für dieses Phänomen sind höchstwahrscheinlich genotypische Unterschiede, die das Auftreten von resistenten und empfindlichen Typen erklären könnten. Diese Erkenntnis hat man sich auch für die Erforschung der Krankheit im Mausmodell zu nutze gemacht, denn in Untersuchungen konnte gezeigt werden, dass die Entwicklung von Lyme-Arthritis Einleitung 10 mit Genen des MHC assoziiert ist. Immunkompetente Mäuse mit dem MHCk Haplotypen H-2 (z.B. AKR/N) sind suszeptibel für Lyme-Arthritis, während immunkompetente Mäuse mit dem MHC-Haplotypen H-2d resistent gegenüber einer Erkrankung sind (UE Schaible et al., 1991). Desweiteren gibt es Studien im Mausmodell, die belegen, dass bei einem resistenten Genotypen die Eliminierung der erworbenen Immunität dazu führt, dass sich die Pathogenese der Lyme-Borreliose entwickeln kann. Vermutlich ist die adaptive Immunantwort des Wildtypes nötig um die Erkrankung unter Kontrolle zu halten. Der Verlust von B- und T-Zellen führt bei dem Mausstamm CB17scid zum Ausbruch der Arthritis (UE Schaible et al., 1990). Andererseits sind C57Bl/6/Rag2-/- Mäuse resistent gegen eine Infektion mit Borrelien und es kommt bei diesem T-und B-Zell defekten Mausstamm nicht zum Ausbruch einer Arthritis. Die Schlussfolgerung ist, dass sich die Reaktionen des angeborenen Immunsystems bei diesen beiden T-und B-Zell defizienten Mausstämmen unterscheiden. Es handelt sich also um eine stammspezifische Ausbildung einer Pathogenese, die sich auf die Zellen der angeborenen Immunantwort beschränkt, denn bereits 1990 konnte U. E. Schaible et al. zeigen, dass Zellinfiltrate arthritischer Läsionen bei CB17scid Mäusen Mac1+ sind und dass es sich nach morphologischen Kriterien bei diesen markierten Zellen um Makrophagen handeln muss. Es ist allerdings zu erwähnen, dass kein Wirt – unabhängig von Mausstamm und Immunstatus – in der Lage ist, das Bakterium Borrelia burgdorferi zu eliminieren, jedoch ist die Ausbildung einer Borrreliose stammspezifisch (Tab. 1). Es war für diese Arbeit besonders interessant, ein in vivo Mausmodell zur Verfügung zu haben, bei dem zwei immundefiziente Mausstämme (CB17scid und C57Bl/6/Rag-/) ohne erworbene Immunität verglichen werden konnten. Die Wechselwirkungen zwischen Makrophagen und Borrelien in vitro konnten an den Wildtypstämmen untersucht werden. Mausstamm H-2 Haplotyp Arthritis B.b.-Reisolierung Immunstatus CB17 d negativ positiv immunkompetent C57Bl/6 b negativ positiv immunkompetent d positiv positiv immundefizient b negativ positiv immundefizient CB17scid -/- C57Bl/l6/Rag2 Tab. 1 Entwicklung der Arthritis bei immunkompetenten und immundefizienten Mausstämmen. Einleitung 1.2 11 Das Immunsystem Das Immunsystem von Vertebraten ist ein komplexes, aus humoralen und zellulären Komponenten bestehendes Netzwerk. Die Vielzeller haben im Verlauf der Evolution einfache Methoden entwickelt, um fremd von körpereigen sicher zu unterscheiden, und auf diese Weise Krankheitserreger rechtzeitig zu erkennen und zu eliminieren. Je spezifischer die Erkennung der einzelnen Erreger funktioniert, desto schneller und effektiver kann das Immunsystem Massnahmen zur Eliminierung ergreifen und die Invasoren unter möglichst geringer Schädigung körpereigener Strukturen bekämpfen. Eine weitere wichtige Eigenschaft ist der Besitz eines sogenannten "immunologischen Gedächtnisses", das es dem Immunsystem ermöglicht, auf wiederkehrende Attacken gleicher Art schneller und wirkungsvoller zu reagieren. Doch durch die permanente Koevolution zwischen Erreger und Wirt, entwickelten sich auf beiden Seiten immer raffiniertere Systeme zur Invasion bzw. deren Abwehr. Bei den Vertebraten kann das Immunsystem in zwei sich ergänzende Systeme unterteilt werden. Das eine System ist die erworbene (adaptive) Immunität, dabei handelt es sich um eine spezifische Immunantwort, die sowohl zellvermittelt über T- und B-Zellen erfolgt, als auch humoral über spezifische Antikörper, die Toxine neutralisieren können oder Erreger opsonisieren und somit für die Phagozytose durch Makrophagen vorbereiten. Ein wichtiges Merkmal der erworbenen Immunität ist die Fähigkeit zur klonalen Selektion von Lymphozyten mit spezifischen Rezeptoren. Die polymorphen Rezeptoren der Bund T-Lymphozyten unterscheiden sich in ihrer Art und Weise bei der Antigenerkennung. B-Zellrezeptoren erkennen native Antigene, während die Rezeptoren der T-Zellen nur Peptide erkennen, welche an der Oberfläche von antigenpräsentierenden Zellen (APC), an MHC (major histocompatibility complex) gebunden, präsentiert werden. Das phylogenetisch wesentlich ältere System ist die sogenannte angeborene oder natürliche Immunität. Sie ermöglicht eine sofortige Abwehr gegen eingedrungene Pathogene, lösliche Faktoren und Zellen. Die angeborene Immunität beinhaltet verschiedene effektive Barrieren (mechanische, physikalische und chemische), die eine Invasion vieler Mikroorganismen verhindern können. Zusätzlich beeinhaltet die angeborene Immunität zelluläre Elemente. Dies sind Granulozyten, Mastzellen, Eosinophile, NK-Zellen, Thrombozyten, verschiedene Differenzierungsarten der Makrophagen und Dendritische Zellen, die alle an der Einleitung 12 Erkennung und Eliminierung von Fremdmaterial eine Rolle spielen. Die angeborenen Abwehrsysteme basieren auf der Erkennung von allgemein vorkommenden charakteristischen Strukturen (konservierte Merkmale) der Pathogene. Sie bieten nur einen begrenzten Schutz gegen die Krankheitserreger und führen unter Umständen nicht zu einer vollständigen Eliminierung des Erregers. Das angeborene Immunsystem kann, im Gegensatz zur erworbenen Immunantwort, kein immunologisches Gedächtnis etablieren. Die Zellen des angeborenen Immunsystems spielen bei der Auslösung und der anschliessenden Steuerung des adaptiven Immunsystems eine entscheidende Rolle, da sie zum Teil als antigenpräsentierende Zellen fungieren. Desweiteren hat die angeborene Immunität die wichtige Aufgabe, eine Infektion bis zum Einsetzen der adaptiven Immunität (3-7 Tage verzögert) unter Kontrolle zu halten. Ausser den zellulären Bestandteilen beeinhaltet das angeborene Immunsystem auch noch Proteine wie das Lysozym und das Defensin, Enzyme, die Strukturen der bakterieller Zellhüllen angreifen. Ein weiterer Komplex aus Serumproteinen der angeborenen Immunität ist das Komplementsystem. Die besondere Bedeutung des Komplementsystems besteht im Schutz vor extrazellulären Bakterien. Das Komplementsystem ist ein kaskadenartig organisiertes System, das aus etwa 20 Plasmaproteinen besteht. Nach einer Aktivierung des Komplements, werden auf der Oberfläche der Krankheitserreger aktive Komponenten mit verschiedenen Effektorfunktionen erzeugt. Es gibt drei Arten von Komplementaktivierung: den klassischen, antiköpervermittelten Weg, den Lektinaktivierten Weg und den alternativen Weg, der eine Verstärkerfunktion des klassischen darstellt. Die letzten beiden Wege können unabhängig von Antikörpern ausgelöst werden und zählen deshalb zu wichtigen Mechanismen der angeborenen Immunität. Die auf der Pathogenoberfläche gebundenen Komplementkomponenten werden von Phagozyten über deren Komplementrezeptoren erkannt und das Pathogen daraufhin eliminiert. Ein System von regulatorischen Proteinen kontrolliert die Aktivität der Komplementkomponenten. Die klassische, Antikörper vermittelte Komplementaktivierung verdeutlicht die Zusammenarbeit zwischen der angeborenen und der erworbenen Immunität. Die grundsätzlichen Unterschiede zwischen der erworbenen und natürlichen Immunität bestehen in ihrer Flexibilität und Geschwindigkeit auf eingedrungenen Pathogene zu reagieren. Einleitung 1.3 13 Rezeptoren der angeborenen Immunität Im Unterschied zu den Rezeptoren der angeborenen Immunität, zeichnen sich die Rezeptoren der erworbene Immunität durch eine ausserordentliche Spezifität gegenüber der Zielstruktur aus, allerdings ist dieser adaptive Prozess zeitaufwendig. Im Gegensatz hierzu sind die Rezeptoren der angeborenen Immunität bei einer Infektion sofort vorhanden, wobei ihre Rezeptor-Spezifität begrenzt ist. Trotzdem können die meisten Infektionen, denen ein Organismus im Zeitraum seines Lebens ausgesetzt ist, eliminiert werden, bevor sich die ersten Anzeichen einer Erkrankung zeigen. Die Zellen der angeborenen Immunität besitzen nur eine geringe Anzahl genetisch festgelegter Rezeptoren im Hinblick auf die unermesslich grosse Heterogenität und Variabilität der Pathogene. Aus diesem Grund erkennen die Rezeptoren der Zellen der angeborenen Immunität ein allgemein vorkommendes Muster (pattern) einer Gruppe von Zielstrukturen der Mikroorganismen. Derartige Muster werden als PAMP (pathogen associated molecular pattern) bezeichnet. Bei den PAMPs handelt es sich um konservierte Antigenstrukturen, die viele verschiedene Mikroorganismen gemeinsam haben, die aber Wirtszellen nicht besitzen und deshalb von der angeborenen Immunität als fremd erkannt werden. Man bezeichnet diese Rezeptoren deshalb als Mustererkennungs-Rezeptoren (PRR pattern recognition receptor). Beispiele für diese Muster sind Bestandteile von Pilzen, Bakterien oder Viren, wie das Lipopolysaccharid (LPS) gramnegativer Bakterien, Peptidoglykan (PGN) von gramnegativen, grampositiven und Mycobakterien, Lipoteichonsäuren (LTA) von grampositiven Bakterien, Lipoproteine, Flagellin, unmethylierte Cytosinphosphatguanin Motive der Pathogene (CpG), doppelsträngige RNA von RNA-Viren (dsRNA), sowie Mannan aus der Zellwamd von Hefen. Die Mustererkennungs-Rezeptoren repräsentieren drei Rezeptorklassen: 1.) endozytische Rezeptoren, 2.) sekretierte Proteine und 3.) Signalrezeptoren (S Uthaisangsook et al., 2002). Die endozytischen Rezeptoren beinhalten die auf Makrophagen vorkommenden Mannose- und Scavenger-Rezeptoren (SR). Zu den sekretierten Proteinen wird das Mannosebindeprotein/Lektin (MBP/MBL), das Komplementprotein C1q sowie das Creaktive Protein (CRP) gezählt. Die sekretierten Proteine fördern die Opsonisierung und die Komplementkaskade und verstärken somit die Eliminierung der Einleitung 14 proteinmarkierten Mikroorganismen. Die Signalrezeptorklasse der MustererkennungsRezeptoren wird durch die Toll-like Rezeptoren (TLR) vertreten. Diese neue Rezeptorfamilie wurde nach dem Protein aus der Fruchtfliege Drosophila als Tollähnliche Rezeptorfamilie bezeichnet. Das Gen des Drosophila Toll-Proteins wurde in den frühen 1980er Jahren sequenziert und das Toll-Protein als notwenige Komponente für die Bildung der dorsoventral Achse während der Embryonalentwicklung der Fruchtfliege beschrieben. Erst einige Jahre später, im Jahr 1995, wurde das Toll-Protein bei der Fruchtfliege zusätzlich als wichtige Komponente der Immunantwort des Insekts identifiziert, denn obwohl die Fruchtfliege kein erworbenes Immunsystem besitzt, ist sie relativ resistent gegenüber mikrobiellen Infektionen. Ihr Immunsystem produziert nach Aktivierung von dToll (DrosophilaToll) das Fungizid Drosomycin, und nach Aktivierung von 18-wheeler (einem anderen Toll-Protein) das antibakterielle Peptid Attacin (A. Aderem et al., 2000). In den letzten Jahren konnten 9 Drosophila-Toll-Proteine und 10 homologe Vertebraten Toll-Proteine identifiziert werden, wobei deren Funktion noch nicht in allen Fällen geklärt ist. Bei den TLRs handelt es sich um Typ I Transmembranproteine mit einem extrazellulär repetitiven Sequenzmuster, einer Leucin-reichen Wiederholungssequenz (LRR leucin-rich repeat). Dieses Sequenzmuster (LRR) kommt in über 60 Proteinen mit bedeutender zellulärer Funktion vor. Da die unterschiedlichsten Organismen LRR-Proteine Funktionen in der Pathogenerkennung und Pathogenabwehr besitzen, muss es sich bei den LRRs um ein sehr altes Motiv handeln. Zu den Organismen, bei denen LRR-Proteine ermittelt werden konnten, gehören neben den Vertebraten und der Fruchtfliege auch Pflanzen. Der zytoplasmatische Bereich des TLR ist homolog zu dem zytoplasmatischen Bereich des Interleukin-Rezeptors-1 (IL-1R). Die Aktivierung eines TLRs durch mikrobielle Antigene führt überwiegend zur Aktivierung des Tanskriptionsfaktors Nuklearfaktor-κB (NF-κ B), welcher dann im Kern die Expression verschiedener Gene induzieren kann. Einleitung 15 Schema 1: Toll like Rezeptoren mit ihren putativen Liganden und ihrer Signaltransduktion am Beispiel von TLR4. Entnommen von D. Werling et al. (2003). PGN: Pedtidglykan; LTA: Lipoteichonsäure; RSV: respiratory syncytical virus; MyD88: myeloid differentiation primary response gen 88; TIRAP: TIR-domain containing adaptor protein; IRAK: IL-1 receptor associated kinase; IRF: Interleukin regulatory factor; TRAF: TNF receptor associated factor; MAPK: Mitogen activated protein kinase; Iκκ: Ikappa B kinase. Es konnte gezeigt werden, dass die Toll-like Rezeptoren, diese besonderen Mustererkennungs-Rezeptoren, durch Heterodimerizierung oder durch Assoziation mit anderen Adaptorproteinen eine enorme Vielzahl von verschiedenen molekularen Mustern von verschiedenen Pathogenen erkennen können. Die Aktivierung eines TLRs induziert immer eine Immunantwort. Im Fall der Fruchtfliege werden antimikrobielle oder fungizide Effektormoleküle gebildet, die das Pathogen direkt angreifen, im Fall der Vertebraten, induziert die Aktivierung eines TLRs die Einleitung 16 Produktion von Zytokinen (z. B. IL-1, IL-6, IL-8) und Coaktivatormolekülen (B7.1), die dann wiederum eine wichtige Rolle bei der Aktivierung der adaptiven Immunantwort spielen (R. Medzhitov et al., 1997). Medzhitov et al.; zeigten 1997 erstmals, dass ein menschliches Homolog zu dem bereits bekannten Drosophila TollProtein den NF-κB Signalweg induziert (R. Medzhitov et al., 1997). Doch erst 1998 konnte der erste Vertebraten TLR identifiziert werden. TLR-4 der spezifische Erkennungsrezeptor für LPS. Die chemische Struktur von LPS sowie wichtige Interaktionspartner des LPS waren schon seit längerem bekannt, doch blieb die Identität des Gens, dessen Produkt für die LPS-abhängige Signaltransduktion verantwortlich ist, lange Zeit ungeklärt. Poltorak et al. konnten das bei der Maus auf Chromosom 4 lokalisierte TLR-4 als das Lps-Gen identifizieren. Eine Mutation des TLR-4 Gens hat zur Folge, dass keine Antwort mehr auf ein LPS Signal erfolgt. Es konnte gezeigt werden, dass Mutationen im TLR-4 Gen für die LPSUnempfindlichkeit des Lps-Gen defizienten Mausstammes (LPSd ) verantwortlich sind (A. Poltorak et al., 1998). Bei dem LPS-unempfindlichen Mausstamm C3H/HeJ konnte eine einzige Punktmutation im dritten Exon des TLR-4 Gens für die Unempfindlichkeit gegenüber LPS lokalisiert werden. Es handelt sich um den Austausch einer einzigen Aminosäure (Prolin in Histidin an Position 712). Die Makrophagen von Nullmutanten des TLR-4 Gens (TLR-4-/-) zeigen in vitro die gleiche Unempfindlichkeit gegenüber LPS wie der LPS-unempfindliche Mausstamm C3H/HeJ in vivo (K. Hoshino et al., 1999). Weitere wichtige Interaktionspartner bei der Vermittlung des LPS Signals sind die beiden Proteine LBP (LPS binding protein) und CD14. Desweiteren konnten auch den anderen Toll-like Rezeptoren Liganden zugeordnet werden. TLR-2 erkennt bakterielle Lipoproteine z. B. von Borrelia burgdorferi, LTA sowie PGN; dem TLR-5 wird die Erkennung von Flagellin von grampositiven und gramnegativen Bakterien zugeschrieben, TLR-3, TLR-7 und TLR9 erkennen virale dsRNA, bakterielle DNA und Oligonukleotide, wenn diese unmethylierte CpG-Motive enthalten (Tab. 2). Einleitung 17 TLR Pathogen Ligand TLR1 grampositive Bakterien Modulin, Lipopeptide TLR2 grampositive Bakterien Lipoproteine, Peptidoglykan, Lipoteichonsäuren, Hefen Zymosan Listerien hitzegetötete Bakterein Trypanosoma cruzei GPI-Ankerproteine TLR3 Viren dsRNA TLR4 gramnegative LPS Bakterien TLR5 grampositive Bakterien Lipoteichonsäuren Pflanzen Taxol Wirt HSP60, HSP70 grampositive Bakterien Flagellin gramnegative Bakterien TLR6 grampositive Bakterien Modulin, STF, Lipoproteine TLR7 Viren kleine virale Bestandteile TLR8 Viren kleine virale Bestandteile TLR9 Bakterien unmethylierte CpG- DNA Tab. 2 Toll like Rezeptoren und ihre Liganden. Entnommen von D. Werling et al. (2003). Die mögliche Kooperation von zwei oder mehreren Toll-like Rezeptoren erhöht zudem die Spezifität und die Vielfalt der Mustererkennung. Es ist bereits bewiesen, dass Toll-like Rezeptoren Heterodimere bilden können und so die Ligandenspezifität neu definieren. TLR-6 kann nur zusammen mit TLR-2 (also als Heterodimer TLR-6TLR-2) mykoplasmatische Lipoprotein (MALP-2 macrophage activating lipopeptide–2 kDa, ein diacyliertes Lipopeptid) erkennen. TLR-6 defiziente Mäusen sind nicht in der Lage, anti-inflammatorische Zytokine nach Aktivierung mit MALP-2 zu produzieren, sie reagieren aber auf andere Lipopeptide (z.B. triacylierte Lipopeptide) normal. TLR-2 defiziente Mäuse reagieren überhaupt nicht auf eine Aktivierung mit Lipopeptiden (egal welche Acylierungsart), d.h. für die Erkennung Einleitung 18 von MALP-2 sind beide Rezeptoren, TLR-2 und TLR-6 gleichzeitig nötig (O. Takeuchi et al., 2002). Ein ähnliches Muster gibt es auch für den TLR-1, der eine starke Ähnlichkeit mit dem TLR-4 hat. Die Produktion von anti-inflammatorischen Zytokinen bei TLR-1 defizienten Mäusen nach einer Aktivierung mit dem mykobakteriellen 19 kDa Lipoprotein sowie einem synthetischen triacylierten Lipoprotein ist stark beeinträchtigt, obwohl TLR-2 als der Mustererkennungrezeptor für Lipoproteine gilt. Man geht deshalb davon aus, dass sowohl das 19 kDa Lipoprotein der Mykobakterien als auch das synthetische Lipoprotein nur von dem Heterodimer TLR-1-TLR-2 erkannt werden. Ozinsky und Mitarbeiter konnten zeigen, dass nicht alle zytoplasmatischen Bereiche der Toll-like Rezeptoren funktionell gleichwertig sind. Es scheint, dass die zytoplasmatischen Bereiche von TLR-1, TLR2, und TLR-6 einen Partner benötigen um anti-inflammatorische Zytokine (z.B. TNFα) in Makrophagen zu bilden. Die Bildung von Heterodimeren ist eine gute Möglichkeit das zu erkennende Repertoire an natürlich vorkommenden Mustern zu erhöhen. Weitere genetische und pharmakologische Studien an Toll-Like Rezeptoren könnten neue Möglichkeiten bieten, um effektivere Adjuvantien für Impfstoffe zu entwickeln sowie unser Verständnis erweitern, mit welchen Strategien Mikroorganismen versuchen in Wirte einzudringen und wie das Immunsystem damit umgehen kann. 1.4 Entwicklung und Funktion von Makrophagen Alle zellulären Bestandteile des Blutes, und somit auch die Zellen des Immunsystems, stammen von den selben Vorläuferzellen ab; den hämatopoetischen Stammzellen im Knochenmark. Es handelt sich hierbei um pluripotnete Zellen, da sich aus ihnen alle Blutzelltypen entwickeln können. Bei der myeloiden Vorläuferzelle handelt es sich um eine Stammzelle mit eingeschränktem Potential, sie ist die Vorstufe der professionellen Phagozyten des Immunsystems, den Granulozyten und Makrophagen. Die myeloid-monozytische Vorläuferzelle (Monoblast) proliferiert und differenziert im Knochenmark, wenn sie das Stadium des Monozyten erreicht hat, wandert sie über das Blut in verschiedene Körperhöhlen und Gewebe, wo sie dann weiter zu reifen Makrophagen ausdifferenziert. Werden diese reifen Makrophagen nun beispielsweise durch ein Pathogen stimuliert, werden sie als aktivierte Makrophagen bezeichnet und Einleitung 19 sind fähig alle erforderlichen Effektorfunktionen auszuführen. Zu den wichtigen Transkriptionsfaktoren, die bei der Entwicklung, Regulierung und Reifung der Makrophagen eine Rolle spielen, gehören PU.1 (myeloid master regulator transcription factor), c-fos und Egr-1 (early growth response-1). Wie alle hämatopoetischen Zellen besitzen auch Makrophagen nur eine begrenzte Lebenszeit, ist diese beendet, werden sie durch den programmierten Zelltod (Apoptose) aus dem System entfernt. Makrophagen bilden eine heterogene Familie von Zellen, die ortsständigen Gewebsmakrophagen, zu ihnen zählen die Histiozyten, die Kupfferschen Sternzellen der Leber, Alveloarmakrophagen in der Lunge, Milzmakrophagen, Lymphknotenmakrophagen, Osteoklasten im Knochengewebe, Mikrogliazellen im zentralen Nervensystem und die beweglichen Zellen des monozytären Systems. Je nach Aktivierungszustand unterliegen die Makrophagen funktionell und morphologisch einer grossen Variabilität. Als antigenpräsentierende Zellen (APC) haben Makrophagen eine Schlüsselfunktion bei der humoralen Immunantwort. Makrophagen haften an Oberflächen mit elektrischer Ladung, sie werden deshalb auch als adhärente Zellen bezeichnet. Sie können Pseudopodien (“Scheinfüsschen”) ausbilden, besitzen die Fähigkeit zur Phagozytose (aktive Aufnahmen unbelebter oder belebter Partikel in das Innere der Zelle) und Pinozytose (Aufnahme von Flüssigkeiten oder gelösten Molekülen), in deren Folge Phagosomen und Lysosmen verschmelzen, Phagolysosomen gebildet werden, und die bakterizide Aktivität des Phagozyten verstärkt wird. Aktivierte Makrophagen bilden eine Reihe toxischer Substanzen, die antimikrobiell wirken. Die wichtigsten davon sind - Sauerstoffradikale, wie das Superoxidanion (O2 ) und das Wasserstoffperoxid (H2O2). Hierbei handelt es sich um eine sofortige Reaktion. Der Prozess, der zur Bildung dieser toxischen Produkte führt, wird als respiratory burst (Steigerung der Zellatmung) bezeichnet. Die Makrophagen, schützen sich vor den eigenen toxischen Metaboliten durch das Enzym Superoxiddismutase, welches das Superoxidanion in Wasserstoffperoxid umwandelt und das Enzym Katalase, welches das Wasserstoffperoxid schliesslich abbaut. Aus diesem Grund beschränkt sich die bakterizide Wirkung nur auf die Pathogene innerhalb der Phagolysosomen. Eine weitere wichtige toxische Substanz ist das Stickstoffoxid (NO), das aber erst nach der Induktion des Enzyms NOS2 durch bakterielle Produkte oder Zytokine entsteht. Makrophagen übernehmen als APC die Aufnahme, Verarbeitung und Präsentation Einleitung 20 von Antigenen (antigen processing) für die immunkompetenten Lymphozyten. Ausserdem transportieren sie Antigene in die sekundären lymphatischen Organe (Lymphknoten, Milz, mucosaassoziiertes lymphatisches Gewebe und Peyersche Plaques). Makrophagen sind unter anderem beteiligt an der Regulation des Komplementsystems, der Thrombolyse und Fibrinolyse. Vor allem aber stellen Makrophagen eine zentrale zelluläre Komponente im komplexen Zytokin-Netzwerk des Immunsystems dar: sie sind nicht nur wichtige Zielzellen verschiedener Zytokine (IFN-γ, IL-4, IL-10), sondern bilden auch selbst nach Aktivierung durch Pathogene oder deren Komponenten ein breites Spektrum der interzellulären Botenstoffen. Neben pro-inflammatorischen Zytokinen (IL-1α, IL-1β, IL-6, TNF-α, IL-12, IL-15, IL-18, IFN-γ) sezernieren sie auch anti-inflammatorische Zytokine ( IL-10, TGF-β), hämatopoetische Wachstumsfaktoren (GM-CSF, G-CSF, M-CSF), Chemokine (IL-8, MCP-1, MIP-1α, MIP-1β) sowie das antivirale Zytokin IFN-α. ( Janeway C., Travers P.; 2. Auflg. 1997). Nach der Sezernierung der Zytokine Il-1, Il-8 oder TNF-α kommt es zur Ausbildung von Adhäsionsmolekülen an der Oberfläche von Gefässendothel und Leukozyten, die eine nachfolgende Auswanderung der Zellen aus der Blutbahn hin zum Infektionsort ermöglichen. Darüberhinaus sezernieren Phagozyten weitere Proteine mit starker lokaler Wirkung wie die Enzyme Plasminogenaktivator und Phospholipasen. Zu weiteren wichtigen Mediatoren, die von Phagozyten als Antwort auf infektiöse Agentien abgegeben werden, gehören die Prostaglandine, Sauerstoffradikale, Peroxide, Stickstoffmonoxid (NO), Leukotriene (speziell Leukotrien B4), sowie der plättchenaktivierende Faktor (PAF). Insgesamt ergibt die lokale Wirkung all dieser Mediatoren eine Entzündungsreaktion, die normalerweise eine der sofortigen Antworten auf eine Infektion ist. 1.5 Entwicklung einer chronischen Entzündung Eine Entzündung wird klassisch durch vier lateinische Begriffe, den sogenannten „Kardinalsymptomen“ nach Celsus und Galen (2. Jahrhundert nach Christus) definiert, nämlich durch Rötung (rubor), Wärme (calor), Schwellung (Tumor) und Schmerz (dolor). Auslöser für eine Entzündung können mechanische Reize (Fremdkörper, Druck, Verletzung), physikalische Faktoren (ionisierende Strahlung, Einleitung 21 UV-Licht, Wärme, Kälte), chemische Stoffe (Säuren, Laugen, Allergene, Toxine) sowie Erreger (Mikroorganismen, Würmer) sein. Grundsätzlich ist eine Entzündung eine Abwehrreaktion des Organismus und seiner Gewebe gegen schädigende Reize. Das Ziel einer Entzündung ist es in erster Linie das schädigende Agens und seine Folgen so schnell wie möglich zu beseitigen. Der Verlauf einer Entzündung hängt von Art, Stärke, Ort und Dauer des Reizes ab, sowie von der allgemeinen Reaktionsfähigkeit des Organismus. Entweder es kommt zur vollständigen Eliminierung des Agens und einer damit verbundenen Auflösung der Entzündung und Wiederherstellung des geschädigten Gewebes, oder aber es bildet sich eine chronische Entzündung, bei der häufig ein Infektionsherd zum Ausgangspunkt und Weiterschwelen des Reizes verantwortlich ist. Bei chronischem Verlauf kann es zu Erkrankungen wie Arthritis oder Morbus Crohn kommen. Charakteristisch für eine chronische Entzündung ist die dauernde Aktivierung von Zellen des Immunsystems durch Zytokine (z.B. IL-12, TNF-α, IFN-γ), deren Wirkung im Einzelfall zu autokrinen Aktivierungszuständen führen kann (M. Munder et al. 1998) beziehungsweise zu einer nicht mehr zu regulierenden Aktivierungsschleife. parakrine Akt ivierung + IFN-γ Pat hogen T IL12 Mø + IL18 NK + aut okrine Akt ivierung IFN-γ Schema 2 Modell der para- und autokrinen Aktivierung von Makrophagen durch IFN-γ. Einleitung 22 1.6 Mediatoren der Pathologie 1.6.1 NO-Synthasen und Stickstoffmonoxid (NO) NO-Synthasen sind Homodimere, die nur als Homodimer aktiv sind. Die monomeren Untereinheiten (130-160 kDa) bestehen aus zwei Enzymen, einer CytochromReduktase und einem Cytochrom. Zudem werden drei Kosubstrate (L-Arginin, NADPH, und O2) und fünf Kofaktoren (Flavinadenindinukleotid FAD, Flavinmononukleotid FMN, Calmodulin, Tetrahydrobiopterin HB4 und Häm) benötigt. Die inaktiven Monomere können nur dimerisieren, wenn L-Arginin, BH4 und Häm an der N-terminalen Oxygenase Domäne der monomeren Struktur gebunden sind. Es folgt eine sogenannte „Kopf-Schwanz-Bindung“ zwischen zwei Monomeren, so dass schliesslich ein aktives Homodimer entsteht (C. Nathan et al., 1994).Während der Umsetzung von L-Arginin findet eine mehrstufige Oxidation bis zu den Endprodukten Stickstoffmonoxid (NO) und L-Citrullin statt. NADPH überträgt dabei zuerst zwei Elektronen auf Häm-gebundenes L-Arginin, wobei das Zwischenprodukt Nω-hydroxy-L-Arginin entsteht. Durch eine weitere Oxidation entstehen die beiden Endprodukte NO und L-Citrullin. Die NOS-katalysierte NO-Produktion kann mit folgender Gleichung dargestellt werden: L-Arginin + 2 O2 + 1.5 NADPH L-Citrullin + NO + 1.5 NADPH+ + 2 H2O Man unterscheidet drei Isotypen der NO-Synthasen, die sich in ihrer Primärsequenz, chromosomalen Lokalisation, Regulation und der Expression unterscheiden. Sie haben aber alle drei den gleichen katalytischen Mechanismus. Die einzelnen Isoenzyme sind zudem gewebe-, zell- und artspezifisch. Aufgrund ihrer Expression unterscheidet man die konstitutiven (cNOS) von der induzierbaren (iNOS oder NOS2). Permanent exprimiert werden zum einen die endotheliale (eNOS oder NOS3) und die neuronale (nNOS oder NOS1) NO-Synthasen. Die induzierbare NO-Synthase (iNOS) bindet Calmodulin konstitutiv selbst bei geringen Ca2+-Konzentrationen und synthetisiert NO somit Ca2+-unabhängig. Die beiden anderen Isoformen, nNOS und eNOS binden den Kofaktor Calmodulin strikt Ca2+abhängig und werden so reguliert. Die Regulation von NOS2 erfolgt auf transkriptioneller Ebene über inflammatorische Zytokine und/oder bakterielle Produkte (z. B. Endotoxin). Desweiteren bestehen zwischen den drei Isoformen auch Unterschiede in der Aktivierungszeit sowie in der Einleitung 23 Synthesemenge von NO. Die beiden konstitutiv exprimierten NO-Synthasen (nNOS und eNOS) geben nach einer Aktivierung für kurze Zeit (Minuten) geringe Mengen von NO ab, die induzierbare NO-Synthase (iNOS) dagegen katalysiert nach einer transkriptionellen Induktion über lange Zeiträume (Tage) hinweg grosse Mengen an NO (N. Miyasaka et al., 1997). Stickstoffmonoxid (NO) wurde ursprünglich als EDRF (endothelium relaxing factor) identifiziert, es handelt sich um ein labiles, kurzlebiges, gasförmiges Molekül mit radikalischen Charakter. NO spielt bei vielen physiologischen Prozessen wie bei der Vasoregualtion, Neurotransmission, Apoptose sowie bei der zellvermittelten Immunantwort als intra- und interzellulärer Botenstoff eine wichtige Rolle (S. Moncada et al., 1993). Hinzu kommt die Wirkung als zelluläres Toxin gegenüber eingedrungenen Pathogenen (Bakterien, Viren und Parasiten), Tumorzellen oder geschädigten Zellen. Neben Protektion vermag NO allerdings auch destruktive Wirkung zu entfalten und zur Pathogenese verschiedener Infektionen oder Autoimmunerkrankungen beitragen (Nathan et. al.; 1997). - NO reagiert in biologischen Systemen mit Sauerstoff (O2), Superoxidanion (O2 ) und Übergangsmetallen. Das auf diese Weise entstandene hochreaktive Peroxinitrit - (OONO ) ist in der Lage metall- und schwefelhaltige Proteine (z.B. nukleophile Zentren von Enzymen) zu nitrieren und somit zu inaktivieren. Desweiteren kann Peroxinitrit unter geeigneten Bedingungen DNA nitrieren und Tyrosinreste kovalent verändern, so dass Nitrotyrosin-Derivate entstehen, die weitere Zellschädigungen auslösen können. 1.6.2 Argininase L-Arginin, C6H15N4O2 wird wie auch Lysin und Histidin zur Gruppe der Diaminomonocarbonsäuren gezählt. Es handelt sich um eine nicht-essentielle, kationische Aminosäure. Sie ist leicht wasserlöslich, hat glukoplastische Eigenschaften und wird von den meisten Vertebraten selbst synthetisiert. L-Arginin ist ein Produkt des Harnstoffwechsels und wird aus L-Ornithin über L-Citrullin und Argininosuccinat gebildet. Ausserdem entsteht die Aminosäure auch aus der hydrolytischen Spaltung Arginin-haltiger Peptide bzw. Proteine. L-Arginin kann über unterschiedliche Transportsysteme in die Zelle gelangen, die Kontrolle der Einleitung 24 Transportaktivität erfolgt jedoch immer über eine Hyperpolarisation der Zellmembran, die durch die Öffnung von Calzium-abhängigien Kaliumkanälen erreicht wird. Intrazellulär kann L-Arginin nun als Substrat für unterschiedliche Enzyme dienen. Zum einen wird die Aminosäure von NOS2 über verschiedene Oxidationsschritte zu Stickstoffmonoxid umgewandelt, zum anderen wird sie vom Enzym Arginase zu Harnstoff und L-Ornithin metabolisiert. L-Ornithin dient im weiteren Verlauf als Vorstufe für Prolin, das in die Collagensynthese einfliesst, und für Polyamine (Putrescin, Spermin, Spermidin), die wichtige Faktoren des Zellwachstums, der Proliferation, Wundheilung und Zelldifferenzierung darstellen. Ausserdem ist L-Arginin eine bedeutende Stickstoffquelle für die Proteinbiosynthese und stellt einen essentiellen Kofaktor der Pyrimidinsynthese dar. 1.6.3 Interleukin-12 IL-12, das ursprünglich NKSF (natural killer cell stimulating factor) genannt wurde, ist ein heterodimeres Zytokin von 75 kDa, sezerniert wird es hauptsächlich von Phagozyten (Makrophagen und Neutrophilen) und von Dendritischen Zellen nach einem mirkobiellen Stimulus. Die beiden glykosylierten Untereinheiten des Zytokins (p35 mit 35 kDa und p40 mit 40 kDa) sind über eine Disulfidbrücke kovalent miteinander verbunden. Die Gene der Untereinheiten sind auf unterschiedlichen Chromosomen lokalisiert (p35 auf Chromosom 3 und p40 auf Chromosom 5). Die mRNA von p35 wird konstitutiv in einer Vielzahl von Zellen exprimiert, doch die Expression der p40-Untereinheit findet nur bei Phagozyten, B-Zellen und T-Zellen nach einer Aktivierung statt. Weder die p40 noch die p35 Untereinheit alleine besitzen eine IL-12 ähnliche Aktivität, ein aktives Heterodimer kann nur in den Zellen entstehen, die beide Untereinheiten exprimieren können. Interessanterweise sezernieren stimulierte APC parallel zu IL-12p75 in 10-1000-fachen Überschuss auch freies p40, welches unteranderem als Homodimer IL-12(p40)2 vorliegt. Lange Zeit wurde das p40-Homodimer für einen Rezeptorantagonisten von IL-12p75 gehalten, doch konnte verschiedene Experimente in letzter Zeit zeigen, dass das p40Homodimer unter bestimmten Umständen auch agonistisch zu IL-12p75 wirken kann (J. Lehmann et al., 2002). Oppmann und Kollegen konnten noch ein weiteres Mitglied der p40-Zytokinfamilie identifizieren. IL-23, ein Heterodimer aus der p40- Einleitung 25 Untereinheit und der neu entdeckten 19 kDa-Polypeptidkette. Oppmann et al. konnten zeigen, dass IL-23 in der Immunantwort zum Teil ähnliche Funktionen wie das bioaktive IL-12p75 ausübt ( z.B. IFN-γ Produktion), andererseits aber auch von IL12p75 abweichende Funktionen (z.B. Aktivierung von T-Gedächtniszellen) hat (B. Oppmann et al., 2000). Der IL-12 Rezeptor besteht aus zwei β-Ketten (β1 und β2). Für eine effektive affine Bindung des Zytokins am Rezeptor sind beide Ketten notwendig, doch nur die β 2-Kette besitzt eine intrazelluläre Domäne mit drei Thyrosinresten, deren Phosphorylierung die Aktivierung von STAT-4 und damit die Transkription bestimmter Gene, beispielsweise IFN-γ in Gang setzt (JGI Rietschoten van et al., 2000). Werden die beiden β -Ketten unabhängig voneinander in COS-7 Zellen exprimiert, zeigt sich, dass beide Ketten eine geringe Affinität zu IL-12p75 besitzen, doch nur der heterodimere Rezeptor (bestehend aus der β1 und der β 2-Kette) bindet das Zytokin mit hoher Affinität (DH Presky et al., 1996). Das Unvermögen von TH2Zellen auf IL-12 zu antworten, liegt in ihrer fehlenden Expression der β2-Kette, so dass eine effektive Bindung des Zytokins an den Rezeptor, bzw. eine intrazelluläre Signalweitergabe nicht möglich ist (L. Adorini et al., 1999). Einleitung 26 Schema 3 IL-12 Rezeptor und dessen Signaltransduktion. Entnommen von G. Trinchieri et al. (2003) Bioaktives IL-12p75 fördert die Proliferation und die zytolytische Aktivität von Natürlichen Killerzellen (NK) und T-Zellen und bewirkt die IFN-γ Produktion dieser Zellen. IL-12 ist ein wichtiges Zytokin, das eine bedeutende regulatorische Verbindung zwischen der angeborenen und der erworbenen Immunantwort spielt. IL12 besitzt eine Schlüsselrolle in der Bildung des Th1 Phänotypes. Aufgrund dieses enormen Potentials benötigt das Zytokin eine strenge Kontrolle, die einerseits von den APCs über die Menge der weiteren IL-12 Produktion sowie über die regulierte Expression des IL-12 Rezeptors auf T-Zellen überwacht wird. Allerdings stellt IL-12 auch ein Schlüsselzytokin in der Entwicklung von TH1-vermittelten Autoimmunerkrankungen dar. So verstärkt beispielsweise die IL-12 Gabe signifikant das Ausmass bei EAE (Experimental Allergic Encephalomyelitis) und IDDM (Insulin-dependent Diabetes Mellitus). Desweiteren verschlimmert die Gabe von IL12 auch in hohem Masse die Autoimmunantwort bei CIA (Collagen Induced Arthritis), wobei gleichzeitig eine erhöhte Anzahl von IFN-γ produzierenden TH1- Einleitung 27 Zellen zu finden ist, die entscheidend an dieser Form der Arthritis beteiligt sind (S. Trembleau et al., 1995). Um die Rolle des Zytokins IL-12 weiter zu überprüfen, wurde die Entwicklung von induzierten organspezifischen Autoimmunerkrankungen an IL-12 defizienten Mäusen untersucht. Das Ergebnis war eindeutig, denn entweder wurden die Tiere überhaupt nicht krank, oder aber die Autoimmunerkrankung trat nur in einer abgeschwächten Form auf. 1.6.4 Caspasen und Caspasen-Substrate Caspasen (Cystein Aspartate specific Proteases) sind hochaktive Cystein-Proteasen, die im Zytoplasma fertig synthetisiert in inaktiven Vorstufen (Pro-Caspasen) vorliegen und durch limitierende Proteolyse autokatalytisch durch andere Caspasen, Calpaine und Cathepsine aktiviert werden. Die Aktivierung erfolgt durch eine proteolytische Spaltung zwischen den Untereinheiten und einer nachfolgenden Abspaltung der Prodomäne (NA Thornberry et al., 1998). Man unterscheidet zwei verschiedene Typen der Caspasen, zum einen die Initiator-Caspasen und zum anderen die Exekutier-Caspasen, erstere stehen am Anfang, letztere am Ende der Aktivierungskaskade. Caspasen werden als etwa 35 kDa grosses Proenzym synthetisiert und sind in der aktiven Konformation heterotetramere Proteine ( zwei 10 kDa und zwei 20 kDa Untereinheiten) (ES Almneri et al., 1997). Die erste Caspase, die durch Klonierung des ced-3 Gens von Caenorhabditis elegans eine Homolgie zu dem humanen Protein ICE aufweist, wurde Caspase-1 (ICE, interleukin-1β converting enzyme) bezeichnet. Nachdem die erste Caspase (Caspase-1) noch als Zytokin prozessierendes Enzym identifiziert wurde, konnten in den letzten Jahren insgesamt 14 strukturhomologe Caspasen identifiziert werden. Es gibt zwei Caspase-Gruppen, die aufgrund ihrer Funktion, bzw. durch phylogenetische Analysen voneinander unterschieden werden. Zum einen Zytokin-Prozessierungs-Caspasen (Caspase-1, -4, 5, -11, -13, -14) und zum anderen die Gruppe der Zelltod-Caspasen (Caspase-2, -3, -6, -7, -8, -9, -10). Die Aktivierung von Caspasen kann auf drei verschieden Arten eingeleitet werden: über membranständige Todesrezeptoren, Granula von zytotoxischen T-Zellen oder NK Zellen, sowie durch allgemeinen Zellstress (wie Hitze, oxidativen Stress, Bestrahlung, Zytostatika oder DNA-Schäden). Die Substrate der Caspase-1 (ICE) sind die Proformen der Zytokine IL-1β und IL-18. Einleitung 1.6.5 28 Interleukin-18 Das Zytokin Interleukin-18 (IL-18) wurde früher als IGIF (Interferon-gamma inducing factor) bezeichnet, erstmals 1989 von Okamura et al. beschrieben und von der gleichen Gruppe 1995 endgültig identifiziert (H. Okamura et al., 1995). Das murine IL-18 Gen liegt auf Chromosom 9 und codiert für 192 Aminosäuren. Dabei handelt es sich um eine biologisch nicht aktive 24 Kda Vorläuferform des Zytokins. Die Produktion von aktivem IL-18 findet statt, sobald die Vorläuferform (pro-IL-18) durch die intrazelluläre Cysteinproteinase ICE (interleukin-1-β converting enzyme), oder Caspase-1, in die aktive 18 KDa Form gespalten wird. Im Gegensatz zur spezifischen Expression vieler Zytokine in spezifischen Zelltypen, kann IL-18 mRNA und ICE mRNA in einer Vielzahl von Zelltypen inklusive Makrophagen konstitutiv nachgewiesen werden (M. Tone et al., 1997). Caspase-3, eine wichtige Caspase während des programmierten Zelltods (Apoptosis), spaltet das inaktive Vorläuferprotein (pro-IL-18) sowie die aktive Form (IL-18) in biologisch inaktive Produkte, so dass Caspase-3 als ein möglicher Negativregulator für IL-18 betrachtet werden kann (K. Akita et al., 1997). Ein natürlicher Antagonist von IL-18 ist das IL18 Bindeprotein (IL-18Bp), welches IL-18 mit hoher Affinität bindet und so dessen Effektorfunktion neutralisiert. Der IL-18-Rezeptorkomplex besteht aus einer Liganden-bindenden Rezeptorkette (IL-18Rα) mit einer geringen IL-18 Affinität und einer nicht-IL-18-bindenden Rezeptorkette (IL-18Rβ). Zuerst bildet sich ein Dimer aus IL-18Rα und IL-18, daran bindet nun IL-18Rβ, wodurch sich ein hochaffines IL18-Rezeptor Heterodimer bildet. IL-18Rα stimmt mit dem IL-1RrP (Interleukin-1 receptor related protein) überein. Die Rezeptorkette IL-18Rβ hat Ähnlichkeit mit dem IL-1Rezeptor –Zusatzprotein (IL-1 receptor accessory protein) und wird deshalb als AcPl (accessory protein like) bezeichnet. Die Signalübertragung erfolgt als Kaskade. Die Bildung des IL-18 Rezeptorheterodimers (was eine Ligandenbindung voraussetzt) rekrutiert die IL-1R aktivierende Kinase (IRAK), die mit Hilfe des intrazellulären Adaptermoleküls MyD88 phosphoryliert wird, und über weitere Zwischenstufen schliesslich den Transkriptionsfaktor NFκB aktiviert (TL Born et al., 1998). Abgesehen von seiner dominanten Funktion IFN-γ zu induzieren, ist das proinflammatorische Zytokin IL-18 auch für die Induktion von IL-2, GM-CSF, TNF-α, Prostaglandin E2 und NOS2 verantwortlich (CA Dinarello et al., 1998). IL-18 scheint Einleitung bei der 29 Pathogenese von chronischen Entzündungsvorgängen bei Autoimmunerkrankungen wie beispielsweise Rheumatoider Arthritis oder Morbus Crohn eine wichtige Rolle zu spielen (IB McInnes et al., 2000). Das ausgeschüttete IL-18 bewirkt synergistisch mit IL-12 die IFN-γ Bildung bei CD4-positiven, inflammatorische T-Zellen (TH1), B-Zellen, NK-Zellen sowie Makrophagen (HJ Ahn et al., 1997; T. Yoshimoto et al., 1998 und M. Munder et al., 1998). Die Synergie zwischen IL-12 und IL-18 kann mit Hilfe zweier unterschiedlicher sich ergänzenden Aktivierungsmechanismen beschrieben werden. IL-12 induziert die Expression der IL-18Rα Kette, und IL-18 Bindung an den IL-18 Rezeptor induziert die Expression des IL-12 Rezeptors. Es findet also eine reziproke Regulation der Expression der beiden Rezeptoren statt. Die IL-12 abhängige IFN-γ Induktion erfolgt über die beiden Moleküle AP-1 und STAT-4, wohingegen die IL-18 abhängige IFN-γ Induktion über NFκB und AP-1 erfolgt. Die kombinierte Aktivierung verschiedener Transkriptionsfaktoren (Stat-4, NFκB und AP-1) durch IL-12 und IL-18, werden für die synergistische Aktivierung des IFN-γ Promotors bei TH1 Zellen verantwortlich gemacht (D. Xu et al., 1998). Untersuchungen mit IL-18 defizienten Mausstämmen zeigen eine erhöhte Infektanfälligkeit gegenüber den Wildstämmen. Eine Verabreichung von IL-18 schützt die IL-18 defizienten Mäuse vor einer Erkrankung, Wildtyp-Mäuse denen anti-IL-18 Antikörper zugeführt wurden, zeigten einen plötzlichen Krankheitsausbruch. In diesen Fällen hatte IL-18 eine protektive Wirkung. Die Rolle von IL-18 bei der Rheumatoiden Arthritis (RA) wurde ebenfalls untersucht. In der Synovia-Membran von RA-Patienten wurde vorherrschend IL-18 festgestellt, so dass diesem pro-inflammatorischen Zytokin erhöhte Aufmerksamkeit bei dieser Erkrankung gilt (JA Gracie et al. 1999). Diese Untersuchungen weisen ausserdem daraufhin, dass IL-18 bei Arthritis und chronischen Entzündung eine entscheidende Rolle spielt und damit auch bei der Borreliose ein wichtiger Pathogenitätsfaktor sein könnte. 1.6.6 IFN-γγ Man unterscheidet drei Typen von Interferonen (IFN): IFN-α, das ursprünglich als das Produkt von Leukozyten entdeckt wurde und deshalb auch als Leukozyten-Interferon (LeIF) bezeichnet wird. Interferon-β (IFN-β ) wurde als ein Produkt von Virus- Einleitung 30 infizierten Fibroblasten entdeckt und deshalb als Fibroblasten-Interferon (FIF) bezeichnet. Schliesslich Interferon-γ (IFN-γ), das sogenannte Immun-Interferon Typ II, wurde 1965 als antivirale Substanz identifiziert (EF Wheelock et al., 1965). Es handelt sich um ein homodimeres Glykoproteinmit pleiotroper immunologischer Wirkung. Es wird von Mitogen- oder Antigen-stimulierten T-Zellen, NK-Zellen und auch von entsprechend aktivierten Makrophagen (M. Munder et al., 1998) produziert. IFN-γ unterscheidet sich von den beiden anderen Interferonen dadurch, dass es bei pH 2 labil ist Es fördert die Aktivierung von Makrophagen, vermittelt antivirale und antibakterielle Immunität, verstärkt die Antigenpräsentation, vermittelt die Aktivierung des nativen Immunsystems, koordiniert Lymphozyt-EndothelInteraktionen, reguliert das Th1/Th2 Gleichgewicht und kontrolliert die Proliferation und Apoptose der Zellen. Ausserdem induziert IFN-γ auf allen kernahltigen Zellen, besonders den Zellen des lymphatischen Gewebes, die Expression von MHC-I und MHC-II Molekülen, sowie eine vermehrte Expression von TNF-α Rezeptoren auf der Zelloberfläche von Makrophagen und T-Zellen. Die Wirkung von IFN-γ spielt bei der Aktivierung von Makrophagen eine wichtige Rolle, wenn diese mit intrazellulären Pathogenen infiziert sind. Die Makrophagen werden in diesem Fall zu antimikrobiellen Effektorzellen, denn IFN-γ bewirkt bei Makrophagen eine Aktivierung von NOS2 (induzierbare NO-Synthase) und IDO (Indolamin-2,3,dioxygenase). IDO katabolisiert Indol-Derivate (z.B. Tryptophan), so dass intrazelluläre Pathogene (z.B. Toxoplasma gondii) in ihrem weiteren Wachstum gehindert werden. Der IFN-γ Rezeptor besteht aus zwei α-Ketten (auch CD119 oder IFN-γR1 bezeichnet ein Glykoprotein mit 90 KDa), die IFN-γ mit hoher Affinität binden, jedoch alleine nicht in der Lage sind, intrazellulär ein Signal weiterzuleiten. Weitere Untersuchungen konnten zeigen, dass die beiden α-Ketten noch durch zwei βKetten (auch AF-1, acessory factor-1 oder IFN-γR2 bezeichnet, ein Glykoprotein mit 67 KDa) umgeben sind, die dem Rezeptorkomplex vorallem Stabilität vermitteln, und die Signaltransduktion ermöglichen. IFN-γ bewirkt eine Gruppierung der Rezeptorketten, es kommt zu einer Auto- und Transphosphorylierung von JAK1 und Jak2 der α/β-Ketten (JAK Janus family of protein tyrosine kinase) und schliesslich zur Phosphorylierung von STAT-1 (Tau G. et al, 1999). STAT-1 ist unter anderem an der Induktion von MHC-I, MHC-II, RANTES, NOS2, Caspasen sowie der Apoptose beteiligt. Einleitung 1.7 31 Zielsetzung der Arbeit Ausgehend von der Tatsache, dass immundefiziente Mäuse (ohne T- und B-Zellen) je nach genetischem Hintergrund entweder suszeptibel oder resistent bezüglich einer Bb-Infektion sind, sollten Unterschiede der Effektorfunktionen bzw. -moleküle von den an der Pathologie beteiligten Makrophagen dieser Mausstämme untersucht werden. Der suszeptible Mausstamm CB17scid zeigt die gleichen pathologischen Symptome der Arthritis, wie sie auch bei Menschen vorkommen, die an Borreliose erkrankt sind. Es gibt bis heute noch keine ausreichende Erklärung, warum die Pathologie der Krankheit nicht bei allen infizierten Menschen (bzw. Mäusen) ausgebildet wird. Bei den charakteristischen Kennzeichen der Pathologie handelt es sich bei Mensch und Maus gleichermassen um eine multisystemische Erkrankung, bei der Arthritis, Carditis und Hepatitis auftreten können. Die Infiltrate arthritischer Läsionen bestehen vorwiegend aus Makrophagen (UE Schaible et al., 1990). Aus diesem Grund wurden vergleichende Untersuchungen bezüglich der Wechselwirkungen zwischen den Makrophagen der beiden Mausstämme und Borrelia burgdorferi gemacht. Es sollte nach Effektorfunktionen der Makrophagen gesucht werden, die entscheidend an der Entstehung einer Arthritis beteiligt sind. Die Analyse erstreckte sich über folgende Funktionen: 1 . Die Radikalbildung: Superoxidanion und Stickstoffoxid nach verschiedenen pathogenabhängigen (z.B. lipOspA) und für KMMø klassische Referenzagonisten (z.B. LPS) sowie deren Einfluss auf andere Funktionen der KMMø. 2. Die Produktion von pro-inflammatorischen Zytokinen (TNF-α, IL-12, IL-18, IFN-γ). 3. Der Arginin-Metabolismus der KMMø. 4. Die Rolle einer Bb-Infektion von Spendermäusen auf die Effektorfunktionen der KMMø. 5 . Die Beeinflussung der Arthritis in vivo durch Veränderung der angeborenen Immunantwort. Makrophagen sezernieren IL-12 und IL-18, Zytokine, die in vitro zu einer autokrinen Aktivierung via IFN-γ führen können (M. Munder et al., 1998). Von diesem Ausgangspunkt sollte nun untersucht werden, ob eine autokrine Aktivierungsschleife auch in vivo vorkommen kann. Der Versuchsansatz zur Klärung dieser Frage wurde durch B.b.-Infektion und Einleitung 32 gleichzeitiger Gabe von anti-IFN-γ Antikörpern bei einem immundefizienten B.b.suszeptiblen Mausstamm überprüft. 6 . Rolle der NOS2 bei der Entstehung der Pathologie im Mausmodell. Immundefiziente Bb-suszeptible und gleichzeitig NOS2-defiziente Mäuse (CB17scid/NOS2-/-) wurden generiert und infiziert. Das zur Immundefizienz hinzukommende Fehlen der NOS2 sollte Aufschluss geben, ob das Fehlen der induzierbaren NO-Synthase Auswirkungen auf die Pathogenese der Lyme Borreliose hat. Es wurde auch die Generation des immundefizienten Bbresistenten NOS2-defizienten Mausstammes (C57Bl/6/Rag2-/-/NOS2-/-) angestrebt, doch war es nicht möglich, für einen Infektionsversuch genügend gesunde Tiere dieses Stammes zu erhalten. Meist starben die Mäuse dieses Mausstammes bereits im jungen Alter, was wahrscheinlich an ihrem Unvermögen liegt, mit ihrem abgeschwächten Immunsystem zu überleben. Material und Methoden 2. Material und Methoden 2.1 Material 2.1.1 Reagenzien, Gebrauchswaren und Geräte 33 2.1.1.1 Reagenzien Alle eingesetzten Standard Chemikalien waren, soweit nicht anders angegeben, in p.A.- Qualität von Merck (Darmstadt), Roth (Karlsruhe) oder Sigma (Deisenhofen). LPS aus Salmonella abortus equi wurde freundlicherweise von Dr. C. Galanos (MaxPlanck-Institut für Immunbiologie, Freiburg) zur Verfügung gestellt. Fötales Kälberserum (FCS) und Pferdeserum wurden chargenweise auf Eignung für die Mø-Zellkulturen getestet und von Biochrom KG (Berlin, Deutschland) bezogen. Rekombinantes IFN-γ wurde von Genentech (South San Francisco, USA) bezogen. IL12 von R&D Systems (Abingdon, GB) und IL-18 von BioConcept (Umkirch, Deutschland). Infektiöse Borrelien des Stammes ZS7 sowie lipOspA (ZS7; S&K OPA 152) wurde freundlicherweise von Prof. Dr. Markus Simon (Max-Planck Institut für Immunbiologie, Freiburg) zur Verfügung gestellt. Lucigenin (Boehringer Mannheim GmbH, Mannheim) Zymosan A von Saccharomyces cerevisiae Sigma (Deisenhofen). L-Arginin, L-Glutamat, L-Prolin, L-Ornithin und Putrescin Sigma (Deisenhofen). Spermin, Spermidin, Hydroxyarginin, L-Monomethyl-L-Arginin (L-NMMA) und DetaNONOate (Alexis Corp., San Diego, USA) Accutrend Glukose-Teststreifen (Boehringer Mannheim GmbH, Mannheim) Material und Methoden 34 2.1.1.2 Kulturmedien Zellkulturvollmedium (VM) DMEM-Kulturmedium wurde ergänzt durch den Zusatz von 10% FCS (30 min. bei 56°C inaktiviert), 2 mM L-Glutamin, 60 µM 2-Mercaptoethanol, 1mM Natriumpyruvat und nicht-essentielle Aminosäuren (alle Zusätze von Gibco BRL). Konditionierter L929-Überstand Adhärent wachsende L929/C6-Fibroblasten (1 x 105/ml) wurden in 200 ml Kulturflaschen in Zellkulturvollmedium bis zur Konfluenz kultiviert. Der Überstand (M-CSF enthaltend) wurde dekantiert, für 20 min. bei 2500 rpm zentrifugiert, sterilfiltriert und in Aliquots bei -20°C eingefroren. Makrophagen-Differenzierungsmedium Zellkulturvollmedium wurde zusätzlich mit 5% Pferdeserum und 15% konditioniertem Überstand von L929/C6-Zellen versetzt. Kulturmedium für C5F6 Fibroblasten RPMI Kulturmedium wurde ergänzt durch den Zusatz von 10% FCS (30 min. bei 56°C inaktiviert), 2 mM L-Glutamin, 60 µM 2-Mercaptoethanol, 5 mM Hepes, 100 E/ml Penicillin und 100 µg/ml Streptomycin (alle Zusätze von Gibco BRL). Kulturmedium für AN-18 Hybridomazellen RPMI Kulturmedium wurde ergänzt durch den Zusatz von 10% FCS (30 min. bei 56°C inaktiviert), 60 µM 2-Mercaptoethanol, 100 E/ml Penicillin und 100 µg/ml Streptomycin (alle Zusätze von Gibco BRL). 2.1.1.3 Puffer und Stammlösungen Sofern nicht anders angegeben, wurden die folgenden Lösungen und Puffer in Aqua bidest. angesetzt. PBS (Phosphatgepufferte Kochsalzlösung) 0,1 M KH2PO4; 0,1 M K2HPO4; pH 7,2-7,4; autoklaviert Material und Methoden 35 TBE-Puffer 90 mM Tris-Borat; 2 mM EDTA DEPC-Wasser 1 l H2O bidest. wurde mit 1 ml DEPC versetzt und Übernacht bei Zimmertemperatur gerührt, anschließend autoklaviert. DNA-Gel-Ladepuffer (6x) 0.25% Bromphenolblau (w/v); 0.25% Xylencyanol (w/v); 30% Glycerol (v/v) Trypanblau-Lösung 0.16% (w/v) Trypanblau in PBS; steril filtiert Griess-Reagenz 1% Sulfanilamid; 0.1% N-(1-Naphtyl)Ethylendiamindihydrochlorid; 2.5% Phosphorsäure ELISA-Puffer Beschichtungspuffer für IL-12: 11.8 g Na2HPO4 ; 16.1 g NaH2PO4 ; pH 6.5 Beschichtungspuffer für IFN-γ: 8.4 g NaHCO3 ; 3.56 g Na2CO3 ; pH 9.5 Blockpuffer: Rothi-Block Verdünnungspuffer: Blockpuffer Waschpuffer (50x): 10 mM Na2 HPO4; 10 mM KH2 PO4; 0.05% 10 x Konzentrat (Roth) Tween-20 (v/v); pH 7.2 Substrat-Lösung: 1.9 ml NaHCOOH (10x); 3.8 µl H2O2; 15 mg oPhenylendiamin (Sigma, Steinheim) 17.1 ml Aqua bidest. 2.1.1.4 Verwendete Kits OPT EIATM Mouse IL-12p40 Set, Pharmingen, San Diego/USA OPT EIATM Mouse IL-12p70 Set, Pharmingen, San Diego/USA OPT EIATM Mouse IFN-γ Set, Pharmingen, San Diego/USA Material und Methoden 36 2.1.1.5 Gebrauchswaren Sämtliche Kunststoffartikel für die Zellkultur, Plastikröhrchen und Einmalpipettenspitzen stammten von Greiner (Frickenhausen), Falcon (Heidelberg), Costar (Cambridge, USA), Eppendorf (Hamburg) oder Nunc (Roskilde, Dänemark). 2.1.1.6 Geräte Reinluftsterilbank, Heraeus (Hanau) Begasungsfeuchtraumbrutschrank, Heraeus (Hanau) Biofuge 15, Megafuge 1.0R, Labofuge GL, Minifuge RF Heraeus (Hanau) Mikroskope, Photomikroskop-Axioskop, Zeiss (Oberkochen) DNA Thermal Cycler Perkin Elmer Cetus (Norwalk, USA) T3 Thermocycler, Biometra® (Göttingen) Heizblöcke, Thermomixer 5436, Eppendorf (Hamburg) DNA-Elektrophorese Kammer, BioRad UV-Spektrometer DU®640, Beckman (Fullerton, USA) ELISA Reader, Molecular Devices (Ismaning) Mikroplattenluminometer (MicroLumat LB 96 P, Berthold, Wildbad) Accutrend® Glukose (Boehringer Mannheim GmbH, Mannheim) 2.1.2 Tiere Alle in dieser Arbeit eingesetzten Mäuse der Stämme CB17, C57Bl/6, CB17/INOS-/(backround CB17), C57Bl/6/INOS-/- (background C57Bl/6), CB17scid/NOS2-/- und Rag2-/-//GammaC/Balb-c stammten aus der institutseigenen SPF (specific pathogen free)-Anlage und wurden im Alter von 6-8 Wochen in Experimenten verwandt. CB17scid Mäuse wurden für alle in vivo Experimente von Harlan-Winkelmann (Harlan-Winkelmann Headquarters, Indianapolis, USA) bezogen. CB17scid Mäuse wurden im Alter von 6 bis 8 Wochen entweder s.c. an der Schwanzwurzel oder direkt durch infizierte Zecken mit B.b. infiziert und 27 bis 47 Tage später getötet. Material und Methoden 2.1.3 37 Zellen Die L929/C6 Fibroblasten wurden freundlicherweise von Dr. Lloyd Old, SloanKettering Institute for Cancer Research (New York, USA) zur Verfügung gestellt. Die C5F6 (L929-TNF-α sensitiv) Fibroblasten wurden freundlicherweise von Dr.Chris Galanos (Max Planck Institut für Immunbiologie, Freiburg) zur Verfügung gestellt. Die Abelson-Lymphomzellen ABLS-8.1.wurden freundlicherweise von A. W. Harris (Walter and Eliza Hall Institute of medical research, Melbourne, Australien) zur Verfügung gestellt. Die AN-18 Hybridomazellen (Produzenten des anti-IFN-γ Antikörpers) wurden freundlicherweise von Prof. Dr. Markus Simon (Max Planck Institut für Immunbiologie, Freiburg) zur Verfügung gestellt, und stammten aus einer Kooperation mit Santo Landolfo, Turin, Italien. 2.1.4 Bakterien Zur Aktivierung der Knochenmarks-Makrophagen wurde der B. burgdorferi Stamm ZS7 benutzt, der aus einer Zecke aus der Umgebung Freiburgs isoliert wurde (UE Schaible et al., 1989 a). Um die Infektiosität der Borrelien zu gewährleisten, wurde immer eine frühe Passage verwandt. 2.1.5 Oligonukleotid-Primer Die folgenden Primer sind in 5`zu 3`Richtung angegeben. 1. β-Aktin: Sense: TGG AAT CCT GTG GCA TCC ATG AAA C Antisense: TAA AAC GCA GCT CAG TAA CAG TCC G Bindungstemperatur: 60°C 2. TNF-α: Sense: TCT CAT CAG TTC TAT GGC CC Antisense: GGG AGT AGA CAA GGT ACA AC Bindungstemperatur: 56°C Material und Methoden 38 3. IL-12p40: Sense: CGT GCT CAT GGC TGG TGC AAA G Antisense: GAA CAC ATG CCC ACT TGC TG Bindungstemperatur: 54°C 2.2 Methoden 2.2.1 Differenzierung von Knochenmarks-Makrophagen (KMMø) Die Oberschenkelknochen der durch CO2 Anoxia getöteten Mäuse wurden mit Hepesgepuffertem Eagles Medium durchspült. Nach zweimaligem Waschen in Eagles Medium wurden jeweils 6x106 der gewonnenen Knochenmarkzellen in 50 ml Makrophagen-Differenzierungsmedium aufgenommen, in hydrophobe Teflonbeutel (FEP-Film 100C, Dupont Nemours, USA) einpipettiert und in diesen kultiviert (G. Munder et al. 1971). Die im Differenzierungsmedium enthaltenen Wachstumsfaktoren ( v.a. M-CSF) lassen die Knochenmark-Vorläuferzellen zu einer homogenen Population von Makrophagen ausdifferenzieren, die nach 8 Tagen geerntet und für Experimente verwendet wurden. 2.2.2 Kultivierung der Hybridomazellen Die Hybridomazellen (AN-18) wurden in Zellkulturflaschen mit 5 x 105 Zellen/ml expandiert. Nach 2-3 Tagen, wurde das Medium entfernt, der Zellrasen mit PBS gewaschen, die Zellen trypsiniert und passagiert. Für den anti-IFN-γ-Antikörperhaltigen Überstand wurden 1 x 105 Zellen/ml eingesetzt und nach 5-7 Tagen Kultur entnommen. Der Überstand wurde 10 min bei 2000 rpm zentrifugiert und bis zur Affinitätschromatographie bei – 20°C gelagert. 2.2.3 Bestimmung der Zellzahl und Vitalität der Zellen Die Zellen wurden bei 20 facher Vergrösserung unter dem Mikroskop gezählt. 100 µl der Zellsuspension wurden mit der gleichen Menge einer 0.16%-igen TrypanblauLösung versetzt und in einer Bürker-Zählkammer im Mikroskop gezählt. Da der Material und Methoden 39 Farbstoff ausschliesslich von membranpermeablen Zellen aufgenommen wird, können die intakten Zellen im Phasenkontrast gut an ihrer Doppelbrechung erkannt werden. Anhand folgender Gleichung wurde die Zellzahl bestimmt: Zellzahl (Zellen/ml) = Z x f x 104 Z = ermittelter Zählwert in einem 25er Feld f = Verdünnungsfaktor 2.2.4 Kultivierung von B. burgdorferi Der B. burgdorferi Stamm ZS7 wurden bei einer Konzentration von 5x107 bis 1x108 Zellen/ml bei -80°C in BSK-H Medium (Sigma, Deisenhofen) aufbewahrt. Um die Borrelien wieder in Kultur zu bringen, wurden sie bei Raumtemperatur aufgetaut und in vorgewärmtes Medium gebracht. Anschliessend wachsen die Bakterien bei 33°C und 5% CO2 im Brutschrank. Die Bakterienzellzahl der kultivierten Borrelien wird in einer Neubauerkammer im Dunkelfeldmikroskop bestimmt und auf die jeweils benötigte Zahl eingestellt. Wurden die Borrelien nicht sofort im Experiment eingesetzt, wurden sie bei 4°C aufbewahrt und vor Gebrauch für 30 min. in einem Heizblock (Thermomixer 5436, Eppendorf) bei 37°C re-aktiviert. Um eine etwaige Aktivierung der Knochenmarks-Makrophagen durch Bestandteile des Bakterienmediums zu vermeiden, wurden die Borrelien vor Gebrauch in Zellkulturvollmedium (DMEM) gewaschen. 2.2.5 Opsonisieren von Zymosan (C3b-Beschichtung von Zymosan) Frisch entnommenes Blut von Kaninchen wurde für 1 h bei 37°C inkubiert und danach 1 h auf Eis inkubiert. Anschliessend wurde zuerst bei 4°C für10 min. bei 700 x g und danach 10 min. bei 2500 x g zentrifugiert. Das Kaninchenserum wurde dann vorsichtig abgenommen. Das Zymosan wurde zweimal in PBS bei 4°C für 5 min. bei 280 x g sedimentiert und einmal durch Zentrifugation für 5 min. bei 1000 x g gewaschen. Zur Herstellung von C3b-beschichtetem Zymosan wurden 25 mg Zymosan in 1 ml frisch gewonnenem Serum für 45 min. bei 37°C unter kontinuierlichem Rotieren inkubiert. Das nun opsonisierte Zymosan wurde je zweimal Material und Methoden 40 in PBS und 2 M NaCl und schliesslich nochmals mit PBS gewaschen. Es wurde anschliessend in einer Konzentration von 12.5 mg/ml in PBS resuspendiert und bei – 80°C bis zum Gebrauch gelagert. 2.2.6 Nitritbestimmung Zur Bestimmung des von den KMMø in das Medium sezernierten Stickstoffoxides (NO) dient allgemein der Nachweiss seines relativ stabilen Oxidationsproduktes Nitrit mit Hilfe der Griess Reagenz. Dazu wurden 50 µl des Kulturüberstandes bzw. NitritStandard (5-100 µM) und Aqua bidest (als Negativkontrolle) mit Griess Reagenz in einer Flachboden Mikrotiterplatte für 10 min. bei Raumtemperatur gerüttelt. Die Absorptionen bei 540 nm (Referenzwellenlänge: 690 nm) wurden in einem ELISAReader gemessen. 2.2.7 Arginase-Bestimmung Die Arginase Aktivität wurde in den Zell-Lysaten bestimmt (IM Corraliza et al., 1994). Die Zellkultur-Mikrotiterplatten wurden 10 min. bei 1800 rpm bei Raumtemperatur zentrifugiert, die Überstande entnommen und die Zellen einmal mit PBS gewaschen. Zu den Zellen wurden 100 µl Triton X-100 (0.1 %, w/v) gegeben, die Platten wurden 10 min. bei RT geschüttelt und anschliessend 100 µl Tris-HCl (50mM, pH 7.5) und 10 µl MnCl2 (20mM) zupipettiert. 100 µl des Lysats wurden in ein 1.5 ml Reaktionsgefäss überführt. Durch Erhitzen auf 56°C für 7 min. in einem Heizblock wurde die Arginase durch Anbindung des Mn2+ an das Enzym aktiviert. Nachdem zu diesem Lysat 100 µl L-Arginin (0.5 M, pH 9.7) gegeben wurde, erfolgte die Arginin-Hydrolyse bei 37°C für 15-120 min. in einem Heizblock. Die Reaktion wurde dann mit 800 µl eines Säuregemischs aus H2SO4 (96%) : H3PO4 (85%) : H2O (1:3:7 v/v/v) gestoppt. Als Standard wurde eine Eichkurve im Bereich von 7.5 µg bis 60 µg Harnstoff vorbereitet. Zu den Proben und zu den Harnstoff-Standards wurden 40 µl α-Isonitrosopropiophenon (6% in 100% Ethanol, w/v) zugegeben, 30 sec. gut gemischt und dann für 30 min. bei 95°C inkubiert. Je nach Harnstoffkonzentration bildet sich in diesem Reaktionsschritt eine violette Farbreaktion unterschiedlicher Intensität. Nach weiteren 30 min. bei 4°C im Dunkeln wurden 200 µl aus den 1.5 ml Material und Methoden 41 Reaktionsgefässen in eine Flachboden-Mikrotiterplatte überführt. Die Absorption bei 540 nm (Referenzwellenlänge 690 nm) wurde in einem MikrotiterplattenSpektralphotometer gemessen. Eine Einheit an Enzym-Aktivität ist definiert durch die Bildung von 1 µmol Harnstoff/min. Da die erzielten Werte bei KMMø gering sind, werden sie in mE/1x106 Zellen angegeben. 2.2.8 Lucigenin abhängige Chemilumineszenz Die Produktion von Superoxid-Anionen (O2-) wurde als Lucigenin-abhängige Chemilumineszenz in einem Mikroplattenluminometer (MicroLumat LB 96 P, Berthold, Wildbad) bestimmt (I. Minkenberg et al., 1984; M. Modolell et al., 1994). Lucigenin reagiert mit dem von den KMMø produzierten Superoxisanionen. Während dieser Reaktion werden vom Lucigenin Photonen emittiert, die zur Quantifizierung des Superoxisanions dienen. Ausgereifte Knochenmarks-Makrophagen wurden 2x in 5 Hepes gepuffertem EAGLE’s Medium ohne Phenolrot-Indikator gewaschen. 2x10 Zellen wurden für 1 h bei 37°C im MicroLumat inkubiert. Anschliessend wurde Lucigenin (250 µM gelöst in PBS) zugegeben und weitere 5 min. bei 37°C inkubiert. Nun wurden die Borrelien hinzugefügt und die Mikrotiterplatte (Polystyrol. Flachboden, weiss, LUMITRAC, Greiner Bio-one GmbH, Frickenhausen) für 5 min. bei 1000 x g zentrifugiert und zur Messung in das Luminometer eingesetzt. Die Messung verlief im Zeitraum einer Stunde in Intervallen von 2 min.. Die Ergebnisse werden als die Summe der emittierten Photonen während der Messzeit in RLU (relaive light unit) angegeben. 2.2.9 Zytokin-Bestimmung mittels ELISA Zur Bestimmung der Zytokine IFN-γ und IL-12 wurden Antikörper der Firma Pharmingen verwendet. Maxisorb®-Mikrotiterplatten (Nunc, Dänemark) wurden mit anti-Zytokin-Antikörpern in einer Verdünnung von 1:250 in Beschichtungspuffer (50 µl/Loch) über Nacht bei 4°C inkubiert. Nach mehrmaligem Waschen mit ELISAWaschpuffer wurden die Platten mit Blockpuffer für 1 h bei Raumtemperatur inkubiert (250µl/Loch). Wieder wurde gründlich gewaschen und pro Loch 50 µl des zu untersuchenden Kulturüberstandes einpipettiert. Auf jeder Platte wurde ausserdem Material und Methoden 42 eine Verdünnungsreihe (1:3 in Verdünnungspuffer für den IFN-γ ELISA und 1:2 in Verdünnungspuffer für den IL-12 ELISA) des jeweils zu bestimmenden rekombinanten murinen Zytokins als Standard (je 50 µl) pipettiert. Nach einer weiteren Inkubation von mindestens 2 h bei Raumtemperatur wurden die Platten gewaschen und mit dem entsprechenden biotinylierten Zweitantikörpern (1:250 in Verdünnungspuffer für IL-12 ELISA und 1:500 in Verdünnungspuffer für IFN-γ ELISA) und der Avidin-Meerrettich Peroxidase (1:250 in Verdünnungspuffer) für 1 h bei Raumtemperatur auf einem Schüttler inkubiert (50 µl/Loch). Nun wurde erneut gründlich gewaschen und 50 µl/Loch der Substratlösung hinzugegeben. Diese Lösung wurde zuvor jeweils lichtgeschützt frisch hergestellt. Die Ansätzen wurden für 10-30 min. im Dunkeln inkubiert und dann mit (50µl/Loch) 0,1 M H2SO4 gestoppt. Anschliessend wurde die Extinktion bei 490 nm im ELISA Reader gemessen. α auf Proteinebene mittels Bioassay 2.2.10 Bestimmung von TNF-α Zur Bestimmung der TNF-α Konzentration im Überstand von Zellkulturen wurde ein Zytotoxizitätstest mittels TNF-α sensitiven L929 (C5F6) Mausfibroblasten als Detektionssystem verwendet. L929 Zellen (5 x 104 Zellen/Vertiefung einer 96Flachboden-Mikrotiterplatte (Nunclon, Nunc) in 100µl RPMI) wurden ausgesät und die Platten zur Adhäsion der Zellen für 3 h bei 37°C und 5% CO2- Begasung in einem Brutschrank inkubiert. Um das Zellwachstum zu beenden und die Sensitivität der L929 Zellen gegenüber TNF-α zu erhöhen, wurden die Zellen mit 50µl Aktinomycin D-Mannitol (4µg/ml) (Sigma) behandelt. Die zu untersuchenden Zellüberstände wurden 1:10, 1:100 und 1:300 in RPMI Medium verdünnt. 50µl der verdünnten Zellüberstande wurden zu den L929 Zellen gegeben. Als Standard bzw. Referenz diente sezerniertes murines TNF-α, von KMMø welche für 90 min. mit 1 µg/ml LPS aktiviert wurden. Die Ansätze wurden 20 h bei bei 37°C und 5% CO2-Begasung weiterkultiviert. Anschliessend wurden die adhärenten Zellen zweimal mit HBSS (Hanks balanced solution ohne Indikator) gewaschen und pro Vertiefung der 96Mikrotiterplatte 50µl Kristallviolett-Lösung (0.25 g Kristallviolett, 60 ml Formalin, 50 ml Ethanol 100%, 360 ml H2O bidest.) für 15 min. zugesetzt. Die Platten wurden im Anschluss daran zweimal mit Leitungswasser gewaschen, getrocknet und und die Vertiefung der Mikrotiterplatte mit 50µl Elutionslösung (0.1M Ka2HPO4, 50% (v/v) Material und Methoden 43 Ethanol) versetzt. Zur Lösung des Farbstoffs wurden die Platten 3 min. leicht geschüttelt. Die TNF-α Konzentration der Proben wurde durch die Bestimmung der Extinktionswerte bei einer Wellenlänge von 550 nm gegen eine Referenzwellenlänge von 690 nm mittels eines Mikrotiterplatten-Spektralphotometers bestimmt. Die Detektionsgrenze des Bioassays lag bei 10pg/ml TNF-α. 2.2.11 Caspase-1 Assay Die Bestimmung der Caspase-1(ICE) Aktivität der Knochenmarksmakrophagen wurde mit Hilfe eines spezifischen Substrates (Z-YVAD-AFC, Alexis Biochemicals, San Diego, USA) gemessen (K. Young-Myeong et al., 1998). Die Zellen (1x106) wurden für 24 h in Mikrotiterplatten mit 24 Vertiefungen aktiviert. Dann wurden die Kulturplatten für 10 min. bei 1000 rpm zentrifugiert, der Kulturüberstand entnommen, die sedimentierten Makrophagen drei mal mit kaltem PBS gewaschen und schliesslich mit 250 µl Lysepuffer lysiert. Dem Lysepuffer (mit 100 mM Hepes pH 7.4 und 0.05% Tween) wurden vor Gebrauch Protease-Inhibitoren (5 µg/ml Aprotinin, 5 µg/ml Leupeptin, 10 µg/ml Pepstatin A, 0.5 mM PMSF) zugesetzt um eine unspezifische Spaltung des Caspase-Substrates zu vermeiden. Nach einer Inkubation von 15 min. bei RT auf einem Platten-Schüttler, wurden die Lysate in 1.5 ml Eppendorf-Gefässe überführt und bei 4°C, 5 min. bei 13000 rpm zentrifugiert. Für die Bestimmung der Enzymaktivität wurden nun 30µl Glyzerin, 90µl der Probe und 30 µl des Substrates (200 µM) in eine schwarze Mikrotiterplatte (Costar) pipetiert. Die Umsetzung des synthetischen Substrates wurde über die Dauer von 3 h bei 37°C mit einem Fluoreszenz-Photometer Ismaning/München, (Spectra Deutschland) Max Gemini, mit den Molecular Wellenlängen devices 400 nm (Anregungswellenlänge) und 505 nm (Emissionswellenlänge) gemessen. Die einzelnen Messungen wurden die erste Stunde alle 5 min. durchgeführt, danach alle 15 min. um die Aktivität des cytosolischen Ezymes (ICE) an der Umsetzung des Substrates zu verfolgen. Material und Methoden 44 2.2.12 Alkalische Phosphatase Zur Bestimmung der Makrophagen abhängigen Zytotoxizität wurde die TumorzellLinie (Abelson-Lymphomzellen ABLS-8.1) mit Knochenmarksmakrophagen kokultiviert. Das Proliferationsverhalten von Abelson-Lymphomzellen kann durch Messung der für die Zell-Linie spezifischen alkalischen Phosphatase, die in Makrophagen nicht vorhanden ist, verfolgt werden. Während in der Kokultur mit KMMø allein keine Zytotoxizität ausgelöst wird, bewirkt die Aktivierung der KMMø durch einen Stimulus (z.B. LPS) eine Zerstörung der Tumorzellen durch die KMMø (JG Culvenor et al., 1981; M. Modolell et al., 1994). Für das Assay wurden je Vertiefung in einer Flachboden 96-Mikrotiterplatte 1 x 105 KMMø mit 1 x 103 Tumorzellen in DMEM für 24 h bzw. 48 h bei 37°C und 10% CO2- Begasung in einem Brutschrank kokultiviert. Nach der Inkubationszeit von 24 h bzw. 48 h wurden die Mikrotiterplatten für 10 min. mit 2000 rpm bei RT zentrifugiert und der Kulturüberstand entfernt. Je Ansatz wurden 100 µl Substratpuffer (200 mM Diethanolamin, 2 mM MgCl2, 10 mM p-Nitrophenylphosphat und 1% Triton X-100; pH 10.2) zugegeben. Nach 1 h Inkubation bei RT auf einem Schüttler wurde die enzymatische Reaktion mit 100 µl 0.5 M NaOH gestoppt. Die optische Dichte der Proben wurde durch die Bestimmung der Extinktionswerte bei einer Wellenlänge von 405nm gegen eine Referenzwellenlänge von 495 nm mittels eines MikrotiterplattenSpektralphotometers bestimmt. Proben deren optische Dichte >1.3 war, wurden in einer neuen Mikrotiterplatte mit 0.5 M NaOH verdünnt. Die Extinktion der Tumorzellen allein wurde zur Berechnung der Zytotoxizität 100% gesetzt. 2.2.13 RNA-Präparation Alle Lösungen wurden mit DEPC-Wasser angesetzt, die verwendeten Pipettenspitzen mit Aerosolfilter (Roth) und Eppendorf-Röhrchen (Eppendorf) waren laut Hersteller RNAse frei. Die Extraktion zellulärer RNA erfolgte nach der Guanidin-PhenolChloroform-Methode (P. Chomczynski et al., 1987) ausgehend von 6x106 KMMø (2x106/ml während der Kultivierung). Die Zellkulturplatten mit je 6 Vertiefungen (Costar, New York, USA) wurden 10 min. bei 1800 rpm zentrifugiert, das Kulturmedium entfernt und die adhärenten Zellen mit 1 ml Extraktionspuffer Material und Methoden 45 (peqGold TriFastTM, peqLab Biotechnologie GmbH, Erlangen, Deutschland) lysiert. Die Ansätze wurden bei RT für 5 min. inkubiert und dann in 1.5 ml Eppendorf Gefässe übertragen. Die Lysate wurden mit 200 µl Chloroform vermischt und 10 min bei RT stehen gelassen. Nach Zentrifugation (20 min, 13000 rpm, 4°C) wurde die obere Phase in ein neues Röhrchen überführt und die darin enthaltene RNA durch Zugabe von 500 µl eiskaltem Isopropanol gefällt. Nach Zentrifugation (20 min, 13000 rpm, 4°C) wurde das RNA-Pellet mit eiskaltem 75 % Ethanol zweimal gewaschen, luftgetrocknet und in 40 µl DEPC-Wasser resuspendiert. Um eventuelle DNARückstände zu eliminieren, wurde die RNA für 20 min. bei 37°C mit 60 µl DNAseMischung inkubiert. DNAse-Mischung 56 µl DEPC-H2O (60 µl) 0.5 µl MgCl2 (1 M) 1 µl 10 mM Tris-HCl; pH 7.5 2 µl DNAse I (Boehringer) (10 U/ml) 0.5 µl RNasin (Promega, Madison, USA) (40 U/ml) Es folgte eine erneute Phenol/Chloroform Trennung (100 µl Phenol:Chloroform:Isoamylalkohol im Verhältnis 25:24:1), eine Präzipitation (10 µl Na-Acetat 3 M, 1 µl Glycogen, 200 µl Ethanol 100%) und schliesslich das Waschen des RNA-Pellets mit 70 % Ethanol. Das RNA-Pellet wurde wiederum luftgetrocknet und in 40 µl DEPC-Wasser aufgenommen. Mit 2 µl dieser Lösung erfolgte eine photometrische Konzentrationsbestimmung der RNA, weitere 2 µl wurden in einem 1 % Agarose-Gel auf mögliche Degradation der RNA untersucht, wobei bei intakter RNA im Gel nur die zwei Banden der 18S und 26S rRNA zu erkennen sind. Für die Reverse Transkription wurden 2 µg der RNA-Lösung eingesetzt. 2.2.14 Konzentrationsbestimmung von Nukleinsäuren Die Konzentration der RNA wurde photometrisch durch Messung der optischen Dichte bei 260 nm im UV-Spektrometer bestimmt. Die Konzentration wurde nach folgender Formel errechnet: c (µg/ml) = OD260 x Verdünnung x 40 Material und Methoden 46 2.2.15 Reverse Transkription (RT) Die Reversen Transkription der isolierten RNA in cDNA wurde jeweils mit 2 µg (2 µg/20 µl) der isolierten RNA in einem Volumen von 30 µl durchgeführt. Die RNA und die RT-Mischung (10 µl) wurden für 5 min bei 70°C inkubiert. RT-Mischung 6 µl 5×Puffer (250 mM Tris, pH 8,3; 15 mM MgCl2; 375 mM KCl; Gibco BRL) 1,3 µl 10 mM dNTP (Promega) 2,4 µl 0,02 E/µl Random Hexamers (Promega) 0,3 µl 100 mM DTT Die Ansätze wurden dann auf Eis gekühlt und jeweils 1 µl MMLV Reverse Transkriptase (200 E/µl) (Gibco BRL) und 1µl RNAse-Inhibitor (40 E/µl) (Promega) zugegeben, dann wurden sie bei 37°C für 60 min. und abschließend bei 95°C für 1 min. inkubiert. Zur Amplifizierung spezifischer cDNA-Sequenzen wurde die PCRMischung auf Eis pipettiert, und in einem DNA Thermal Cycler unter den angegebenen Bedingungen zur Reaktion gebracht. 2.2.16 Die Polymerase-Kettenreaktion (PCR) Die PCR dient zur in vitro Amplifikation eines DNA-Segmentes, das zwischen zwei bekannten Sequenzen liegt (RK Saiki et al., 1885 und 1988). Spezifische Primer, kurze DNA-Einzelstränge, binden an die DNA-Matrize (Template), damit die Polymerase die Synthese des neuen Stranges beginnen kann. Durch Erhitzen auf 94°C wird die DNA in Einzelstränge denaturiert, so dass die Primer nach Abkühlung des Reaktionsansatzes auf eine für den Primer spezifische Temperatur (Ta) binden können. Für eine PCR setzt man Primer für beide Einzelstränge ein, die die zu amplifizierende Region der DNA-Matrize flankieren. Ein typischer Primer ist 18-22 Basen lang und weist einen 50 %igen G/C-Gehalt auf. Die in einer Reaktion verwendeten Primer weisen im Idealfall auch den gleichen Schmelzpunkt (Tm) auf. Material und Methoden 47 Die spezifische Temperatur für die Bindung der Primer an der DNA-Matrize (Ta = annealing temperature) wurde mit folgender Berechnung bestimmt: Tm = 69,3°C + 0.41x(GC %) - (650/Anzahl der Basen des Primers) Ta = Tm - 3°C Zur Amplifizierung spezifischer cDNA-Sequenzen wurde die PCR-Mischung auf Eis pipettiert und in einem Thermocycler (Biometra, Göttingen) unter den angegebenen Bedingungen zur Reaktion gebracht. PCR-Mischung: 28.98 µl Wasser 5 µl 10 x PCR-Puffer (HT Biotechnology LTD, Cambridge, UK) 10 µl 1 mM dNTP (Promega) 2 µl sense Primer (5 µM) 2 µl antisense Primer (5 µM) 0,02 µl 15 E/µl SuperTaq DNA-Polymerase (HTBiotechnology LTD, Cambridge, UK) 1 µl cDNA PCR-Bedingung: 1 Zyklus 95°C, 4 min. 30 Zyklen 94°C, 1 min. Ta , 30 sec. 72°C, 1 min. 10°C, unbegrenzt Die erhaltenen PCR-Produkte wurden schliesslich mittels Agarose-Gelelektrophorese aufgetrennt. 2.2.17 Agarose-Gelelektrophorese Amplifizierte Reaktionsprodukte wurden in ethidiumbromidhaltigen 1.5%igen Agarosegelen nachgewiesen, wobei die Agarose in 1 x TBE-Puffer in der Mikrowelle Material und Methoden 48 gelöst und nach Zugabe von Ethidiumbromid in eine durch Plastikeinsätze (Begrenzung und Kämme) vorbereitete Gelkammer gegossen wurde. Aus dem erstarrten Gel wurden dann die Plastikeinsätze entfernt und das Gel mit 1 x TBEPuffer überschichtet. Die Geltaschen wurden mit 10 µl Probe (Vorbereitung: 10 µl Probe + 2 µl 6 x Gel-Ladepuffer) beladen. Als Molekulargewichts-Standard dienten 2 µl einer 100-bp DNA Ladder (Gibco/BRL). Die Elektrophorese wurde bei 70 Volt/min. (30 - 40 min.) durchgeführt. Aufgrund der negativen Ladung wandert die DNA durch das Gel in Richtung Anode, wobei die Wandergeschwindigkeit der DNAFragmente im Gel umgekehrt proportional zum log10 der Anzahl der Basenpaare ist, d.h. kleinere Fragmente wandern schneller als grosse (RB Helling et al., 1974). Ethidiumbromid ist ein Fluoreszenzfarbstoff, der in der DNA interkaliert, so dass man die aufgetrennten Fragmente unter UV-Beleuchtung (366 nm) sichtbar machen kann. Mit einer CCD-Kamera wurde das Gel dann bei UV-Licht photographiert. 2.2.18 Affinitätschromatographie Die murinen anti-IFN-γ Antikörper wurden aus den Kulturüberständen der Hybridomazellen AN-18 (von M. Simon, MPI Freiburg zur Verfügung gestellt) mittels Affinitätschromatographie gereinigt. Zu den filtrierten Überstände der Hybridomazellen wurden Glycin (1.5 M) und NaCl (3 M) zugegeben um die gleiche Molarität wie im Bindungspuffer zu erhalten, ausserdem wurde der pH-Wert der Überstände mit NaOH auf 8.9 eingestellt. Die Protein A Sepharose-Säule (Roche Diagnostics GmbH, Mannheim) wurde vor jeder Affinitätschromatographie mit 20 ml Waschpuffer (0.1 M Natriumcitrat pH 3) gewaschen und dann mit Bindungspuffer (1.5 M Glycin, 3 M NaCl pH 8.9) solange gespült, bis der ph-Wert 8.9 war. Auf die nun equilibrierte Säule wurde jeweils 1 Liter des Hybridomazellüberstands gegeben. Dann wurden mit dem Bindungspuffer alle nicht spezifisch an der Protein A Sepharose-Säule gebundenen Proteine eluiert. Mit dem Elutionspuffer (0.1 M Natriumcitrat pH 4) wurden dann die anti-IFN-γ Antikörper von der Protein A Sepharose der Säule abgelöst und das Eluat aufgefangen. Die Fraktionen des Eluats wurden auf pH 8 eingestellt und dann dialysiert. Material und Methoden 49 2.2.19 Dialyse Dialyseschläuche (Roth, Karlsruhe, Deutschland) wurden in PBS gewaschen, vor Gebrauch mit 1% Polyethylenglykol 4000 (SERVA, Heidelberg) und anschliessend mit aqua bidest. gespült. Alle Dialyseschritte wurden für 12-20 h in PBS in einem Volumen von 3-5 l bei 4°C durchgeführt. Die Eluatfraktionen wurden durch Zentrifugation mit Zentrifugalfiltern (Centricon Plus-20 Biomax-100, AMICON, Millipore) eingeengt. Die Konzentration der erhaltenen eingeengten Antikörperlösung wurde mit, für die Hybridomazellenspezifischen IgG-ELISA, festgestellt. Primär Antikörper goat-anti-rat IgG, Fc-Fragment spezifisch (Jackson Lab./dianova, Hamburg, Deutschland) Sekundär Antikörper goat-anti-rat IgG-ALPH (Southern Biotechnology/BIOZOL, Eching, Deutschland) Standard rat IgG (Jackson Lab./dianova, Hamburg, Deutschland) Sustrat Phosphatase-Substrat (Sigma, Deisenhofen, Deutschland) Die Antikörperlösung wurde unter UV-Licht (3 min. auf Eis) in einer offenen Petrischale sterilisiert, auf eine Konzentration von 0.3 mg/ml eingestellt und bei –20°C bis zur Injektion aufbewahrt. 2.2.20 Analyse des Arginin-Metabolismus von KMMø Die KMMø (1x105/100 µl) wurden in Zellkulturvollmedium in einer Mikrotiterplatte (z.B. mit Borrelia burgdorferi) aktiviert. Nach 24 h wurden die Platten 10 min bei 1000 rpm zentrifugiert, das Medium entfernt und die Zellen einmal mit Argininfreiem Zellkulturmedium (mit 2%FCS) gewaschen. Schliesslich wurden die KMMø nochmals 8 h bis 24 h mit 100 µl Arginin-freiem Zellkulturmedium und 0.1 µCi L[U- 1 4 C] Arginin-monohydrochlorid ( Amersham plc, Buckinghamshire, UK) (entsprechend 100.000 cpm pro 100 µl Ansatz) im Brutschrank bei 37°C und 10% CO2 inkubiert. Danach wurde zu jeder Probe 10 µl eines definierten Substanzgemischs aus Arginin-Metaboliten (Abb.13) bestehend aus: 2.5 mg/ml folgender Substanzen: L-Citrullin, L-Glutamat, L-Prolin, L-Ornithin, L-Arginin, Material und Methoden 50 Putrescin, Spermidin und Spermin zur Standardisierung hinzupipettiert. Um die Zellen zu zerstören und das radiaktivmarkierte Aginin in den, von den Zellen gebildeten Produkten nachweisen zu können, wurden die Mikrotiterplatten zweimal bei –80°C eingefroren und im Wärmeschrank wieder aufgetaut, nun wurden jeweils 20 µl der Proben aufgetragen. Die Auftragstelle auf der Kieselgel-Platte (DC-Platte, 20x20 Kieselgel 60 F254, Merck, Darmstadt, Deutschland) war etwa 2 cm vom unteren Rand entfernt, der Abstand zwischen den einzelnen Proben sollte etwa 2 cm betragen. Bevor die Platten nun in eine gut gesättigte Chromatographierkammer (DESAGA, Heidelberg, Deutschland) gestellt wurden, mussten die Proben gut auf dem Kieselgel getrocknet sein. Die Sättigung in der Kammer wurde durch Filterpapiere erreicht, an denen das Laufmittel (Chloroform:Methanol:Ammoniak:Wasser 0.5:4.5:2:1 (vol/vol)) hochsteigt und verdampft (WC Sessa et al., 1990). Die Kieselgel-Platten wurden nun für 2.5 h bis 3 h in die dicht verschlossenen Kammern gestellt. Durch die Kapillarkräfte der Lösungsmittel steigt die mobile Phase (Laufmittel) in der stationären Phase (Kieselgel-Matrix) nach oben. Die unterschiedlichen Wandergeschwindigkeiten der im Probengemisch enthaltenen Komponenten, führt zur Auftrennung des Stoffgemischs. Der Entwicklungsprozess wurde beendet, sobald die Laufmittelfront eine vorgegebene Grenze etwa 2 cm unter dem oberen Rand der Platte erreicht hatte (Wanderstrecke der Lösungsmittelfront war 15 cm). Die Platten wurden entnommen und im Abzug getrocknet. Zur weiteren Auswertung wurden die aufgetrennten Substanzen mit einer Ninhydrin-Sprühlösung (Merck, Darmstadt, Deutschland) gleichmässig besprüht und bei 120°C für 5 min in einem Trockenschrank inkubiert. Die nun rötlich angefärbten, aufgetrennten Metaboliten wurden mit Hilfe des Standards identifiziert und auf der Kieselgelplatte mit einem weichen Bleichstift markiert. Nun wurde jede Bande mit Hilfe eines Spatels von der DC-Platte gekratzt und in ein Szintillationsröhrchen (Roth, Karlsruhe, Deutschland) überführt. Vor der Messung der Proben mit einem Flüssigkeits-Szintillationszähler (Beckman coulter LS-1801, USA) wurde in jedes Szintillationsröhrchen 5 ml Szintillationslösung (Ecoscint A, national diagnostics, Atlanta, Georgia, USA) gegeben. Die prozentuale Verteilung der Radioaktivität wurde auf Grund der cpm je Probe ermittelt. Material und Methoden 51 2.2.21 MTT-Test zum Nachweis der mitochondrialen MTT_Dehydrogenase Die Grundlage dieses kolorimetrischen Tests ist die Fähigkeit vitaler Zellen zur Reduktion von MTT (3-4,5-Dimethyl-thiazol-2-yl-2,5-diphenyl-tetrazoliumbromid). Lebende Zellen nehmen das schwach gelbe Tetrazolium-Salz auf und setzen es mit Hilfe mitochondrialer und mikrosomaler Dehydrogenasen zu einem stark blauen, wasserunlösichen Farbstoff (Formazan) um (T. Mosmann 1983). Die Intensität der Blaufärbung korreliert mit der Zellzahl bzw. der Stoffwechselaktivität der Zellen. Zur Untersuchung wurden in einer Flachboden Mikrotiterplatte pro Vertiefung 1 x 105 KMMø in 200 µl mit den entsprechenden Agonisten für 24 h im Brutschrank bei 37°C und 10% CO2 inkubiert. Danach wurden zu jedem Ansatz 10 µl MTT (5 mg/ml in PBS) pipettiert und die Kulturen nochmals für 1 h im Brutschank inkubiert. Die Platten wurden anschliessend 10 min. bei 2000 rpm zentrifugiert, der Überstand entfernt und die entstandenen Farbstoffkristalle durch Zugabe von 100 µl Isopropanol/0.04 M HCl gelöst. Die Intensität der Blaufärbung wurde mittels Mikrotiterplatten-Spektralphotometers bei einer Wellenlänge von 570 nm (Referenzwellenlänge 620 nm) bestimmt. Ergebnisse 3. 52 Ergebnisse 3.1 Bildung reaktiver Sauerstoffradikale nach Aktivierung mit Bb oder Zymosan. Als einer der ersten Indikatoren zur Untersuchung der unterschiedlichen Reaktivität der KMMø der beiden Mausstämme C57Bl/6 und CB17 wurde die Lucigenin abhängige Chemilumineszenz bestimmt (2.2.8). Die Bildung von reaktiven Superoxidanionen (O2-) nach der Aktivierung der NADPH-Oxidase in KMMø weist auf die Fähigkeit der KMMø hin, Pathogene oder deren Bestandteile zu erkennen, zu phagozytieren und zu zerstören. Es handelt sich dabei um einen sehr schnellen Vorgang, der innerhalb von wenigen Minuten aktiviert wird. Dieser für KMMø typische Prozess zur Beseitigung von eingedrungenem Fremdmaterial wird als Respiratory burst bezeichnet, womit die Steigerung der Zellatmung der KMMø beschrieben wird. Bei der Lucigenin abhängigen Chemilumineszenz werden die emittierten Photonen des Lucigenins detektiert, welche zuvor durch die gebildeten Superoxidanionen angeregt wurden. A B Kontrolle Kontrolle 5 Bb/Mø Zymosan 10 Bb/Mø opson. Zymosan 0 5 10 5 RLU x 10 15 20 0 50 100 5 RLU x 10 Abb. 1 Lucigenin abhängige Chemilumineszenz von KMMø der Mausstämme CB17 150 200 und C57Bl/6 . Die Messung reaktiver Sauerstoffradikale nach Aktivierung mit 5 bzw. 10 Bb je KMMø A), und mit Zymosan bzw. opsonisiertem Zymosan B). 2 x 105 KMMø wurden für 1 h bei 37°C inkubiert, anschliessend wurde Lucigenin (250 µM) zugegeben und aktiviert. Die Messung lief über den Zeitraum einer Stunde in Intervallen von 2 min, die Summe der emittierten Photonen während der Messzeit wird in RLU (relative light unit) angegeben. Die Messung der Reaktivität der KMMø nach der Aktivierung mit Bb oder Zymosan in Abb. 1 A und Abb. 1 B zeigte, dass CB17 KMMø deutlich reaktiver auf eine Aktivierung antworten als die KMMø des C57Bl/6 Mausstammes. Zuerst sollte untersucht werden, ob auch Bb in der Lage sind, KMMø zur Steigerung ihrer Ergebnisse 53 Zellatmung anzuregen. Abb. 1 A zeigt bei beiden Mausstämmen ein Dosisantwortverhalten der produzierten Photonen in Abhängigkeit der Konzentration der Bb je KMMø ( von 5 auf 10 Bb/Mø). Für die Aktivierung in Abb. 1 B wurde der klassische Aktivator von Superoxidanionen, das Zymosan, genutzt um zu überprüfen, ob es sich bei den Mausstamm spezifischen Unterschieden in Abb. 1 A um ein Bb abhängiges Phänomen handelte oder ob die C57Bl/6 KMMø generell weniger Superoxidanionen bilden als KMMø des Mausstammes CB17. Desweiteren sollte ein Maximum an Superoxidanionen durch opsonisiertes Zymosan erreicht werden. Tatsächlich erzielte die Vorbehandlung des Zymosans (2.2.5) eine deutliche Steigerung der Superoxidanion-Produktion (um den Faktor zwei bei beiden Mausstämmen). Zusammenfassend zeigen Abb. 1 A und Abb. 1 B, dass die KMMø der CB17 Mäuse immer grössere Mengen an Superoxidanionen produzierten als die KMMø des C57Bl/6 Mausstammes, unabhängig ob mit Bb, Zymosan oder opsonisiertem Zymosan aktiviert wurde. 3.2 Synthese von NO nach Aktivierung mit Bb, lipOspA oder LPS. Ein weiteres Radikal, das eine entscheidende Bedeutung bei der Bekämpfung und Zerstörung intrazellulärer Pathogene hat, ist das Stickstoffmonoxid (NO). Als indirekter Parameter der Induktion des Enzyms NOS2 diente die Bestimmung von Nitrit, des stabilen Abbauproduktes von Stickstoffmonoxid, im Kulturüberstand (2.2.6). CB17 Kontrolle C57Bl/6 0.1µg/ml LPS 1Bb/Mø 5 Bb/Mø 10Bb/Mø 5 µg/ml lipOsp A 0 10 20 30 Nitrit (µM) 40 50 Abb. 2 Die Synthese von NO bei KMMø der Mausstämme CB17 und C57Bl/6 nach Aktivierung mit unterschiedlichen Konzentrationen von LPS, mit 1, 5 oder 10 Bb/Mø und mit dem Oberflächenprotein der Borrelia burgdorferi Spirochäte lipOspA. Die Stimulationszeit war 72h, die NOS2-Induktion wurde durch die Bildung von Nitriten im Kulturüberstand nachgewiesen. Ergebnisse 54 Die KMMø der beiden untersuchten Mausstämme synthetisierten NO nach einer Aktivierung mit LPS, Bb oder dem Lipoprotein lipOspA. Die CB17 KMMø produzierten jeweils deutlich mehr NO. Die gebildeten Mengen an Nitrit im Kulturüberstand nach Stimulation mit Bb sind bei beiden Mausstämmen konzentrationsabhängig, d.h. sie nahmen mit der Anzahl der Bb je Mø zu. Allerdings deuteten die geringen NO-Mengen nach einer Aktivierung mit 1 oder 5 Bb/KMMø bei den C57BL/6 KMMø auf eine Toleranz bzw. niedriges Antwortverhalten dieses Mausstammes gegenüber einer Aktivierung mit geringer Pathogenkonzentration hin. Die Menge an Nitrit nach einer Aktivierung mit dem Referenzagonisten LPS war bei CB17 KMMø etwa doppelt so hoch wie bei den C57Bl/6 KMMø. Die Aktivierung mit lipOspA ergab keinen Unterschied in der NO-Produktion der beiden Mausstämme. α nach Aktivierung mit LPS oder Bb. 3.3 Induktion von TNF-α 3.3.1 α nach Aktivierung mit LPS oder Transkriptioneller Nachweis von TNF-α Bb. Bevor die Menge an TNF-α auf Proteinebene im Kulturüberstand untersucht wurde, sollte zunächst die Expression des pro-inflammatorischen Zytokins TNF-α 6 h nach der Aktivierung mit LPS bzw. Bb durch eine RT-PCR bestimmt werden (2.2.15). Die Zeitspanne 6 h wurde gewählt, da sich diese Aktivierungszeit bei dem Nachweis anderer pro-inflammatorischer Zytokine bereits als gut herausgestellt hatte. A B Abb. 3 RT-PCR von TNF-α und β-Aktin aktivierter KMMø der Mausstämme CB17 A) und C57Bl/6 B). 6 x 106 KMMø wurden mit Medium (ø), LPS (0.1 µg/ml) bzw. 1 Bb/Mø inkubiert. Nach 6 h wurden die RNA isoliert und in cDNA umgeschreiben. Die resultierenden PCR-Produkte wurden in einem 1.5% Agarose Gel (+Ethidiumbromid) unter UV-Licht photographiert. Da es sich bei der Nachweismethode für das Zytokin in diesem Fall nicht um eine quantitative PCR handelte, kann nur qualitativ gezeigt werden, dass nach einer Aktivierungszeit von 6 h bei beiden Mausstämmen TNF-α sowohl nach Stimulation Ergebnisse 55 mit LPS als auch nach einer Stimulation mit Bb exprimiert wird. Die gebildete Proteinmenge des Zytokins sollte nun im folgenden nach 2 h und 4 h mittels Bioassay untersucht werden (2.2.10). 3.3.2 α nach Aktivierung mit LPS oder Bb. Sezernierung von TNF-α Makrophagen setzten eine ganze Reihe von Mediatoren und Zytokinen nach adäquater Aktivierung frei. Das pro-inflammatorische Zytokin TNF-α ist dabei von zentraler Bedeutung, da es bei systemischen Entzündungs- und Immunreaktionen eine wichtige Rolle bei der Rekrutierung einer Anzahl von Zielzellen spielt. Geringe Konzentrationen des Zytokins dienen der physiologischen Abwehr einer Vielzahl von Infektionen, die durch Bakterien oder Viren ausgelöst werden. Grössere Mengen des Zytokins können einen septischen Schock und hohes Fieber auslösen und sogar zum Tod führen. Eine unkontrollierte Synthese von TNF-α wird zudem für chronische Enzündungen wie Morbus Crohn verantwortlich gemacht. Im folgenden sollte untersucht werden, in wie weit sich die beiden Mausstämme bei der Sezernierung von TNF-α nach der Aktivierung mit LPS oder Bb unterscheiden. A B Kontrolle Kontrolle 0.1µg/ml LPS 0.1µg/ml LPS 5µg/ml lipOSPA 5µg/ml lipOSPA 1Bb/Mø 1Bb/Mø 5Bb/Mø 5Bb/Mø 0 2000 4000 TNF-α (pg/ml) 6000 8000 Abb. 4 TNF-α Sezernierung von KMMø der Mausstämme CB17 0 2000 4000 TNF-α (pg/ml) und C57Bl/6 6000 nach A) 2 h und B) 4h. Die TNF-α Konzentration im Kulturüberstand wurde mittels Bioassay detektiert. Sowohl nach 2 h (Abb. 4 A) als auch nach 4 h (Abb. 4 B) produzierten die KMMø des CB17 Mausstammes deutlich grössere Mengen des Zytokins TNF-α als die KMMø des Mausstammes C57Bl/6. Nach 2 h (A) waren die durch Bb induzierten Mengen an TNF-α bei C57Bl/6 kaum detektierbar, doch im Gegensatz dazu bei CB17 konzentrationsabhängig zur Pathogenmenge klar nachweisbar. C57Bl/6 KMMø benötigten (wie bereits in Abb. 2) hohe Pathogenkonzentrationen, um ausreichend 8000 Ergebnisse 56 aktiviert zu werden. Wurden sie mit nur 1 oder 5 Bb/Mø stimuliert, führte dies (nach 2h) nicht zu einem ausreichenden Impuls für die Synthese von TNF-α. Es deutet wiederum auf eine Toleranz gegenüber geringen Pathogenkonzentrationen bei diesem Mausstamm hin. Die Mengen an TNF-α nach einer Aktivierung mit lipOspA oder unterschiedlichen Dosen von Bb je Makrophage waren bei beiden Mausstämmen nach 4 h im Vergleich zu den Mengen nach 2 h gesteigert. Im drastischen Gegensatz hierzu stehen die Mengen an TNF-α nach einer Aktivierung der KMMø beider Stämme mit dem Referenzagonisten LPS. Die Aktivierung mit LPS induzierte bei beiden Mausstämmen eine sehr hohe Menge von TNF-α nach 2 h im Kulturüberstand, doch nach 4 h nahmen die Mengen bei beiden Mausstämmen wieder ab, es kam zu keiner Akkumulation von TNF-α nach der Aktivierung mit LPS. Die Kinetik der TNF-α Produktion unterschied sich zwischen den unterschiedlichen Agonisten. Eine Aktivierung mit Bb steigerte die Sezernierungsmenge in Abhängigkeit zur Aktivierungszeit, im Gegensatz dazu fand bei einer Aktivierung mit der Kontrollsubstanz LPS eine negative Regulation der Sezernierung statt. Eine mögliche Erklärung für diese Verhalten ist die Rezyklisierung grosser Mengen des gebildeten Zytokins durch die Makrophagen. 3.4 Induktion von IL-12 nach Aktivierung mit LPS und Bb. 3.4.1 Transkriptioneller Nachweis von IL-12p40 nach Aktivierung mit LPS oder Bb nach 6 h. Bevor die Menge an IL-12p40 und IL-12p75 auf Proteinebene im Kulturüberstand untersucht wurde, wurde zunächst die Expression der induzierbaren Untereinheit p40 des Zytokins IL-12 (6 h) nach der Aktivierung mit LPS bzw. Bb durch eine PCR bestimmt. Die Zeitspanne 6 h wurde gewählt, da sich diese Aktivierungszeit bei dem Nachweis anderer pro-inflammatorischer Zytokine bereits als gut herausgestellt hatte. Ergebnisse 57 Abb. 5 RT-PCR der Zytokinuntereinheit IL-12p40 und des konstitutiv exprimierten Gens β-Aktin von aktivierten KMMø der Mausstämme CB17 A) und C57Bl/6 B). 6 x 106 KMMø wurden mit Medium (ø), LPS (0.1 µg/ml) bzw. 1 Bb/Mø inkubiert. Nach 6 h wurden die RNA isoliert und in cDNA umgeschrieben. Die resultierenden PCR-Produkte wurden in einem 1.5% Agarose Gel (+Ethidiumbromid) unter UV-Licht photographiert. Da es sich bei der Nachweismethode für das Zytokin in diesem Fall ebenfalls nicht um eine quantitative PCR handelte, kann nur qualitativ gezeigt werden, dass nach einer Aktivierungszeit von 6 h bei beiden Mausstämmen IL-12p40 sowohl nach Stimulation mit LPS als auch nach der Stimulation mit Bb exprimiert wurde. Die gebildete Proteinmenge der Untereinheit p40 und des bioaktiven Zytokins IL-12p75 wurde dann in Kulturüberständen zu unterschiedlichen Zeitpunkten analysiert. Die Untereinheit p35 wird konstitutiv exprimiert, aber nur in Verbindung mit p40 sezerniert und deshalb nicht überprüft. 3.4.2 Sezernierung von IL-12p40 und IL-12p75 nach Aktivierung mit Bb. A B 8h Kontrolle Kontrolle 1 Bb/Mø 1 Bb/Mø 5 Bb/Mø 5 Bb/Mø 10 Bb/Mø 10 Bb/Mø 0 50 C 100 IL-12p40 (pg/ml)) 150 24 h 0 200 200 400 600 IL-12p40 (pg/ml) 800 72 h Kontrolle 1 Bb/Mø 5 Bb/Mø 10 Bb/Mø 0 50 100 150 IL-12p75 (pg/ml) 200 250 Abb. 6 Sezernierung von IL-12p40 nach 8h A), 24 h B) und IL-12p75 nach 72 h C) von KMMø der Mausstämme CB17 und C57Bl/6 . Die IL-12p40 und IL-12p75 Konzentrationen im Kulturüberstand wurden mittels ELISA detektiert. Ergebnisse 58 Die Kinetik der Synthese von IL12p40 verhält sich bei den KMMø der beiden untersuchten Mausstämmen unterschiedlich. In Abb. 6 A) sezernierten die KMMø beider Mausstämme 8 h nach einer Aktivierung mit 5 Bb/Mø bereits IL-12p40, wobei die Proteinmenge bei den C57Bl/6 KMMø etwa doppelt so hoch war wie bei gleicher Stimulation bei den CB17 KMMø. Nach 24 h (Abb. 6 B) produzierten beide Mausstämme IL-12p40, doch war kein Unterschied mehr in der Menge des Proteins zwischen den beiden Stämmen erkennbar. Die Aktivierung mit einer geringen Pathogendosis je KMMø (1 Bb/Mø) erzielte eine etwas grössere Menge des Proteins als die Stimulation mit 5 bzw. 10 Bb/Mø. Entscheidend ist allerdings die Synthese des bioaktiven Heterodimers IL-12p75. Hierin unterschieden sich die beiden Mausstämme sehr auffällig (Abb. 6 C), denn im Gegensatz zu den KMMø des CB17 Mausstammes, die IL-12p75 nach Aktivierung mit 5 Bb/Mø und 10 Bb/Mø produzierten, war in den Kulturüberständen der C57Bl/6 KMMø kein bioaktives IL-12p75 nachweisbar. 3.5 Sezernierung von IFN-γ nach Aktivierung mit Bb und Zytokinen. Ausgangspunkt für die folgenden Versuchsansätze war der Befund, dass die Kombination der beiden Zytokine IL-12 und IL-18 bei murinen KMMø die Expression sowie die Proteinsezernierung von IFN-γ induzieren können (M. Munder et al., 1998). Aktiviert man KMMø des Mausstammes CB17 für 72 h mit IL-12 + IL18 erzielt man 5628 u/ml IFN-γ im Vergleichsmausstamm C57Bl/6 erreicht man bei gleicher Aktivierung 3866 u/ml IFN-γ (Daten nicht gezeigt). Mit dem folgenden Versuchsansatz sollte geprüft werden, ob Bb die Synthese von IFN-γ induziert oder ob zusätzliche Zytokine nötig sind um die Produktion von IFN-γ zu erreichen. Nachdem bereits in Abb. 5 und Abb. 6 gezeigt werden konnte, dass eine Aktivierung mit Spirochäten die IL-12p40 Untereinheit exprimieren und induzieren konnten und IL12p40 nach 24 h bei beiden Mausstämmen nachweisbar war, sollte nun mittels ELISA IFN-γ im Kulturüberstand aktivierter KMMø gemessen werden (2.2.9). Ergebnisse 59 Kontrolle IL-12 IL-18 1 B.b / Mø 1 B.b / Mø + IL-12 1 B.b / Mø + IL-18 5 B.b / Mø 5 B.b / Mø + IL-12 5 B.b / Mø + IL-18 10 B.b / Mø 10 B.b / Mø + IL-12 10 B.b / Mø + IL-18 CB17 C57Bl/6 0 500 1000 1500 2000 2500 IFN-γ (u/ml) Abb. 7 Sezernierung von IFN-γ von KMMø der Mausstämme CB17 und C57Bl/6 nach 72 h. IL12: 10 ng/ml; IL-18: 100 ng/ml. Die IFN-γ Konzentrationen im Kulturüberstand wurden mittels ELISA detektiert. Bei keinem der beiden Mausstämme konnte nur durch die Aktivierung mit Bb oder einem der beiden Zytokinen (IL-12 oder IL-18 alleine) eine nachweisbare IFN-γ Produktion detektiert werden. Desgleichen bewirkte die Aktivierung der KMMø mit einer Kombination aus IL-12 und Bb keine nennenswerten Proteinmengen im Kulturüberstand. Ausschliesslich eine Kombination von IL-18 und Bb zeigte eine Aktivierungsmöglichkeit der KMMø zur IFN-γ Synthese. Die KMMø des Mausstammes CB17 produzierten bei geringen sowie bei hohen Pathogenkonzentrationen (5 Bb/Mø und 10 Bb/Mø) grosse Mengen an IFN-γ. Auch in diesem Fall zeigte sich ein Unterschied zwischen den KMMø der beiden Mausstämme, denn die C57Bl/6 Mø produzierten nur bei der geringster Bb-Menge (1 Bb/Mø) in Kombination mit IL-18 eine hohe Synthesemenge an IFN-γ. 3.6 Caspase-1 Aktivität nach Aktivierung mit Bb. Im weiteren sollte die Rolle des Zytokins IL-18 untersucht werden, doch war es nicht möglich, das Zytokin im Kulturüberstand mit im Handel erhältlichen Antikörpern bzw. ELISA-Sets nachzuweisen. Da es sich bei IL-18 um ein konstitutiv exprimiertes Gen handelt, konnte keine qualitative Aussage mit Hilfe einer PCR gemacht werden. Desweiteren wäre auch ein Westernblot qualitativ nicht aussagekräftig gewesen, da das Protein bei Mø ständig in einer Proform vorliegt. Schliesslich wurde die Aktivität der Caspase-1 bestimmt, das Enzym, welches nötig ist, um IL-18 von der Proform in Ergebnisse 60 die aktive, sezernierbare Form zu verwandeln. Es handelt sich um einen Nachweis mit dem die Fähigkeit der KMMø bestimmt wird, das Zytokin IL-18 in die aktive Form umwandeln zu können (2.2.11). Es muss allerdings erwähnt werden, dass die Caspase-1 nicht ausschliesslich IL-18 in die aktive Zytokinform bringt, sondern dass das Enzym auch bei der Aktivierung von IL-1 eine Rolle spielt. 6000 CB17 5:1 Caspase-1 Aktivität 5000 CB17 10:1 C57Bl/6 5:1 4000 C57Bl/6 10:1 3000 2000 1000 0 0 20 40 60 Zeit (min) 80 100 120 Abb. 8 Caspase-1 Aktivität von 1x106 KMMø der Mausstämme CB17 (rot) und C57Bl/6 (blau) nach 24 h Aktivierung mit 5 Bb (Quadrat) bzw. 10 Bb (Dreieck) pro Mø. Die Umsetzung des spezifischen Substrates (Z-YVAD-AFC) wurde 120 min in Intervallen von 5 min bis 30 min gemessen. Die Caspase-1 Aktivitität wird in relativen Fluoreszenz Einheiten angegeben. Bei den in Abb. 8 gezeigten Werten wurde die Grundaktivität der Caspase-1 der KMMø bereits abgezogen (Grundaktivität bei CB17: 224 ; Grundaktivität bei C57Bl/6: 303 zum Zeitpunkt 0 min. in relativen Fluoreszenz Einheiten). Die Aktivität des Enzymes Caspase-1 war, unabhängig von der Anzahl der Bb je Mø, bei KMMø des Maustammes C57Bl/6 immer höher als bei KMMø des Vergleichsmausstammes CB17. Die KMMø beider Mausstämme steigern gleichermassen nach Aktivierung mit Bb die Caspase-1 Aktivität während der Messzeit von 120 min. Auffällig war, dass die Aktivierung mit 10 Bb pro Mø bei beiden Mausstämmen zu einer geringeren Caspase-1 Aktivität führte als die Aktivierung mit einer niedrigeren (5Bb/Mø) Pathogenanzahl pro Mø. Eine Stimulation mit 5 Bb/Mø erzielt nach 120 min bei den KMMø des Mausstammes CB17 nur 3528 relative Fluoreszenz Einheiten, wohingegen die KMMø des Mausstammes C57Bl/6 nach 120 min den Wert von 5235 relative Fluoreszenz Einheiten erreichten. Diese Ergebnisse stehen im Einklang mit den Veröffentlichungen von Florian Obermeier (F. Obermeier et al., 1999) und Ergebnisse 61 Young-Myeong Kim (Y. Kim et al., 1998), die gezeigt haben, dass NO die Caspase-1 inhibiert, indem die durch Caspase-1 gebildeten Zytokine (IL-1 und IL-18) NOS2 induzieren. Es handelt sich hierbei also um eine Gegenregulation, d.h. um einen regulierten Mechanismus, um pro-inflammatorischen Zytokine während einer Entzündungsreaktion zu kontrollieren. Aus diesem Grund sollte nun im folgenden mit weiteren Experimenten untersucht werden, wie NOS2 -/- KMMø der beiden Mausstämme (CB17 und C57Bl/6) im Gegensatz zu den KMMø der Wiltypmausstämme reagieren. Bereits in Abb. 2 war deutlich zu erkennen, dass die KMMø des Mausstammes CB17 nach Aktivierung mit Bb wesentlich grössere Mengen an NO synthetisieren als die KMMø des Mausstammes C57Bl/6. Zusätzlich zur Aktivierung mit Bb wurde im folgenden Versuch noch das Zytokin IL-18 (welches eigentlich durch die Caspase-1 in die aktive Form gespalten wird) bereits exogen während der Aktivierung der KMMø hinzugegeben. 5000 CB17 5Bb/Mø + IL-18 Caspase-1 Aktivität 4000 CB17/NOS2-/- 5Bb/Mø + IL-18 C57Bl/6 5Bb/Mo + IL-18 C57Bl/6/NOS2-/- 5Bb/Mø + IL-18 3000 2000 1000 0 0 20 40 60 Zeit (min) 80 100 120 Abb. 9 Caspase-1 Aktivität von 1x106 KMMø der Mausstämme CB17, CB17/NOS2-/-, C57Bl/6 und C57Bl/6/NOS2-/- nach 24 h Aktivierung mit 5 Bb pro Mø in Kombination mit IL-18. Die Umsetzung des spezifischen Substrates (Z-YVAD-AFC) wurde 120 min in Intervallen von 5 min bis 30 min gemessen. Die Caspase-1 Aktivitität wird in relativen Fluoreszenz Einheiten angegeben. IL-18: 100ng/ml Bei den in Abb. 9 gezeigten Werten wurde die Grundaktivität der Caspase-1 der KMMø bereits abgezogen. Die Caspase-1 Aktivität war bei den NOS2-defizienten KMMø nach Aktivierung mit 5 Bb/Mø + IL-18 beider Mausstämme höher als die der KMMø der Wildtypmäuse. Die Aktivität der C57Bl/6/NOS2-/- war höher als die der CB17/NOS2-/- KMMø, wie auch die Caspase-1 Aktivität der C57Bl/6 höher als die der CB17 Mø war. Vergleicht man die relativen Fluoreszenz Einheiten, so wird deutlich, dass die Zugabe des Zytokins IL-18 die Aktivität des Enzyms Caspase-1 erniedrigt. Betrachtet man die relative Fluoreszenz von C57Bl/6 aktiviert mit Ergebnisse 62 5Bb/Mø, handelt es sich nach 120 min bei einer Stimulationszeit von 24 h, um eine relative Fluoreszenz von 5235 Einheiten (Abb. 8). Wird mit 5 Bb + IL-18 stimuliert, erzielt man nur noch 2685 Einheiten. Bei den CB17 KMMø ist ebenfalls eine Erniedrigung der relativen Fluoreszenz von 1917 Einheiten gegenüber 3528 Einheiten zu verzeichnen, die erreicht wurden, wenn CB17 Mø für 24 h mit 5 Bb/Mø stimuliert wurden (Abb. 8). Zusammenfassend lässt sich sagen, dass die KMMø der Wildtypmäuse (CB17 und C57Bl/6) eine niedrigere Caspase-1 Aktivität besitzen als die NOS2-defizienten Vergleichsmausstämme. Ausserdem sind die Caspase-1 Werte der C57Bl/6/NOS2-/- KMMø höher als die der KMMø des Mausstammes CB17/NOS2-/-, d.h. der C57Bl/6 Mausstamm ist betreffend der Caspase-1 Aktivität reaktiver bzw. reagiert stärker nach Akivierung mit Bb. Um die Rolle von NOS2 bzw. NO nochmals zu verdeutlichen, soll Abb. 10 in direktem Zusammenhang mit Abb. 9 betrachtet werden. CB17 Kontrolle C57Bl/6 CB17/NOS2-/- 5Bb/Mø C57Bl/6/NOS2-/5Bb/Mø + IL-18 LPS + IFN-g 0 20 Nitrit (µM) 40 60 Abb. 10 Die Synthese von NO bei KMMø der Mausstämme CB17, C57Bl/6, CB17/NOS2-/- und C57Bl/6/NOS2-/- nach Aktivierung mit 5 Bb/Mø, 5Bb/Mø in Kombination mit IL-18 oder LPS in Kombination mit IFN-γ. Die Stimulationszeit war 24h, die NOS2-Induktion wurde durch die Bildung von Nitriten im Kulturüberstand nachgewiesen. Eine Stimulation mit 5 Bb/Mø induziert bereits nach 24 h CB17 KMMø zur NOSynthese, C57Bl/6 KMMø produzieren im Gegensatz dazu nur sehr geringe Mengen an NO. Die Aktivität des Enzyms NOS2 erzeugt durch Zugabe des Zytokins IL-18 bei beiden Mausstämmen eine Steigerung der Nitritmengen im Kulturüberstand. Beide NOS2-defizienten Mausstämme lassen sich, wie zu erwarten, weder durch Bb, noch durch die Kombination von Bb mit einem Zytokin noch durch LPS zur Bildung von NO anregen. Unabhängig von der Aktivierung produzieren die KMMø des Ergebnisse 63 Mausstammes CB17 immer grössere NO-Mengen als die KMMø des Mausstammes C57Bl/6. 3.7 Die Rolle von NO bei der Sezernierung von IFN-γ durch KMMø Als weiteres wichtiges Effektormolekül dieser Arbeit sollte im folgenden exemplarisch die Synthesemenge des Zytokins IFN-γ nach adäquater Aktivierung im Kulturüberstand von C57Bl/6/NOS2-defizienten KMMø mit der Synthesemenge des zugehörigen Wildtyp Mausstamm (C57Bl/6) verglichen werden. (Ergebnisse des Konterparts CB17/NOS2-/- und CB17 sind nicht gezeigt, es ist jedoch das gleiche Phänomen zu erkennen). Da bereits in 3.5 eine Abhängigkeit der Caspase-1 Aktivität von der synthetisierten NO Menge zu erkennen war, sollte nun untersucht werde, ob NO auch Auswirkungen auf die Synthesemengen des Zytokins IFN-γ haben kann. Kontrolle C57Bl/6 1 B.b/Mø C57Bl/6/NOS2-/- 1 B.b/Mø + IL-12 1 B.b/Mø + IL-18 5 B.b/Mø 5 B.b/Mø + IL-12 5 B.b/Mø + IL-18 10 B.b/Mø 10 B.b/ Mø + IL-12 10 B.b/Mø + IL-18 0 2000 4000 IFN-γ (u/ml) 6000 8000 Abb. 11 Sezernierung von IFN-γ durch KMMø der Mausstämme C57Bl/6 (blau) und C57Bl/6/NOS2-/(blau gestreift) nach 72 h. IL-12: 10 ng/ml; IL-18: 100 ng/ml. Die IFN-γ Konzentrationen im Kulturüberstand wurden mittels ELISA detektiert. Durch die Aktivierung der KMMø mit einer Kombination aus Bb und dem Zytokin IL-18 erzeugten diese, wie bereits in Abb. 7 gezeigt, grosse Mengen an IFN-γ. Die sezernierte Proteinmenge von IFN-γ nimmt bei den C57Bl/6 KMMø zu, wenn die Anzahl der zugesetzten Bb pro Mø abnimmt. Diese Beobachtung kann nun folgendermassen erklärt werden: Hohe NO-Syntheseraten, die mit der ansteigenden Anzahl von Bb pro Mø zunehmen, regulieren oder inhibieren zu einem gewissen Grad die Synthese von IFN-γ. Aus diesem Grund sind auch die Proteinmengen der NOS2- Ergebnisse 64 defizienten KMMø, die ja überhaupt kein NO bilden können, immer wesentlich höher als die der C57Bl/6 KMMø bei gleicher Aktivierung. Ein interessantes Phänomen war zusätzlich bei C57Bl6/NOS2-/- zu erkennen, denn die KMMø dieses Mausstammes, die kein NO produzieren können, steigern ihre ohnehin schon hohen IFN-γ Synthesemengen mit ansteigender Pathogenmenge, d.h. hier unterscheiden sich C57Bl/6 Wildtyp KMMø und korrespondierende NOS2-defiziente KMMø deutlich in ihrem Verhalten. In einem weiteren Versuchsansatz wurden die Einwirkungen von NO-Donoren, NOInhibitoren und Produkten der NO-Synthase auf die Synthese des Zytokins IFN-γ untersucht. Die Menge des im Überstand gebildeten Proteins IFN-γ kann bei C57Bl/6 sowie bei CB17 KMMø durch die gleichzeitige in vitro Inhibierung des Enzyms NOS2 durch NOS2-Inhibitoren (wie z. B. L-NMMA) oder aber durch den Defekt von NOS2 (Abb. 11) gesteigert werden. Es stellte sich nun die Frage, ob NO direkt die IFN-γ-Synthese inhibiert, oder ob eines der durch NOS2 gebildeten Produkte (neben NO) Einfluss auf die IFN-γ-Synthese hat, oder aber ob das IFN-γ Protein im Kulturüberstand verändert wird, d.h. dass evt. eine Konformationsänderung des Proteins stattfindet, so dass die Detektion durch den ELISA nicht mehr aussagekräftig ist. Im weiteren Verlauf sollte diese Frage durch die Zugabe der durch NOS2 synthetisierten Zwischenprodukte bzw. durch NO-Inhibitoren und NO-Donoren geklärt werden. In Abb. 12 A sind Zwischen- und Endprodukte gezeigt, die bei der Oxidation von Arginin durch das Enzym NOS2 entstehen (Abb. 13). Bei der Aktivierung mit 5 Bb je Mø in Kombination mit IL-18 und den verschiedenen Reaktionsprodukten der NOS2 (Abb. 12 B) sollte der Einfluss dieser Substanzen einerseits auf die NO-Bildung (links) und andererseits auf die Synthesemenge von IFN-γ (rechts) untersucht werden. Es wurde zur Aktivierung die mittlere Menge von 5 Bb/Mø benutzt, um sowohl Stimulation als auch Hemmung simulieren zu können. Wie bereits in Abb. 2 zeigte sich auch bei der Aktivierung mit 5 Bb/Mø + IL-18, dass die KMMø des Mausstammes C57Bl/6 immer weniger reaktiv, d.h. mit nur geringen NO-Mengen reagieren. Betrachtet man die IFN-γ-Synthesemengen, so wird deutlich, dass weder der Zusatz von Nitrit, Nitrat, Citrullin noch Hydroxyarginin einen Einfluss auf die Proteinmenge beider Mausstämme im Kulturüberstand hatte. Im Gegensatz dazu steigerte die Hemmung von NOS2 durch den NO-Inhibitor NMMA deutlich die IFN- Ergebnisse 65 γ-Synthese bei CB17 wie auch bei C57BL/6 Mø. Dieser Befund bestätigte die Daten der NOS2-defizienten KMMø (Abb. 11). Interessanterweise inhibierte der NO-Donor DetaNONO bei CB17 KMMø kaum (Hemmung um 36%), jedoch bei den C57Bl/6 KMMø (Hemmung um 71%) deutlich die IFN-γ-Synthese. Diese Unterschiede in der Hemmung durch NO kann bei den reaktiven CB17 KMMø als ein Fehlen der effektiven Regulation der IFN-γ-Synthese gedeutet werden, was als Folge unter Umständen zu einem unkontrollierten Zustand führen könnte. Zusammenfassend bedeuten die Ergebnisse, dass NOS2 direkt Einfluss auf die IFN-γ-Synthese nimmt und nicht eines der gebildeten Reaktionsprodukten bei der Oxidation des Arginins. Die Aktivierung von NOS2 stellt also einen negativen, vom Mausstamm abhängigen Regulationsmechanismus bei der IFN-γ-Synthese dar. A NOS2 Arginin Ci t r u l l i n Hydr oxy - Arg inin NO Nit rit N it r a t B Kontrolle 5 B.b. je Mø + IL-18 5 B.b. je Mø + IL-18 + 500µM NMMA ** 5 B.b. je Mø + IL-18 + 100µM Nitrit * 5 B.b. je Mø + IL-18 + 100µM Nitrat 5 B.b. je Mø + IL-18 + 100µM DetaNONO 5 B.b. je Mø + IL-18 + 100 µM Citrullin *** 5 B.b. je Mø + IL-18 + 50 µM OH-Arg. 100 80 60 40 Nitrit (µM) 20 0 0 500 1000 IFN-γ (u/ml) 1500 2000 Abb. 12 Zwischen- und Endprodukte beim Abbau von Arginin durch NOS2 A). Die Synthese von NO (links) bei KMMø der Mausstämme CB17 und C57Bl/6 nach einer Aktivierung mit 5 Bb/Mø in Kombination mit IL-18 und zusätzlich NMMA, Nitrit, Nitrat, DetaNONO, Citrullin sowie HydroxyArginin. Gleichzeitig die Sezernierung von IFN-γ bei gleicher Aktivierung von KMMø der Mausstämme C57Bl/6 und CB17 (rechts). Die Stimulationszeit war 72 h, die NOS2-Induktion wurde durch die Bildung von Nitriten im Kulturüberstand nachgewiesen, die IFN-γ Konzentrationen im Kulturüberstand wurden mittels ELISA detektiert. NMMA: NOS2-Inhibitor; DetaNONO: NO-Donor; IL-18: 100 ng/ml. Die Signifikanz wurde mit dem students-t-Test errechnet und bezieht sich immer auf die 5 Bb/Mø + IL-18 Aktivierung des jeweiligen Mausstammes. *: p < 0.01 **: p < 0.01 ***: p < 0.05 Ergebnisse 3.8 66 Der Arginin-Metabolismus nach Aktivierung mit Bb. Eine Aktivierung von KMMø mit Bb induziert nicht nur NOS2, sondern aktiviert auch den alternativen Reaktionsweg via das Enzym Arginase. Im weiteren Verlauf der Arbeit war nun die Frage zu klären, in wie weit sich das angeborene Immunsystem, die Makrophagen im Besonderen, der beiden Mausstämme CB17 und C57Bl/6 in ihrem Arginin-Metabolismus unterscheiden, so dass sich die in vivo auftretende Pathologie der Lyme Borreliose im Fall der CB17scid Mäuse im Gegensatz zu den resistenten C57Bl/6/Rag2-/- Mäusen erklären lässt. In den vorausgegangen Versuchen konnten bereits Unterschiede in der Zytokinproduktion sowie in der Bildung der Radikale Superoxidanion und Stickstoffoxid gezeigt werden. Da das Substrat Arginin von zwei Enzymen des Makrophagen – Arginase und NOS2 umgesetzt wird, sollte nun untersucht werden, ob sich evt. die beiden Mausstämme in der Aktivität der beiden Enzyme nach Stimulation mit Bb unterscheiden. Aus diesem Grund wurden KMMø von CB17 und C57Bl/6 mit steigenden Mengen an Spirochäten aktiviert. Im ersten Versuchsansatz wurden nach 48 h Inkubationszeit die Makrophagen lysiert und die Arginaseaktivität unter optimalen Bedingungen (pH, Substratkonzentration, Manganionen) bestimmt. Wie in Abb. 14 zu sehen ist, war die Enzymaktivität bei den KMMø des empfindlichen CB17 Mausstammes höher, allerdings wurde der Unterschied zwischen den beiden Mausstämmen geringer, wenn hohe Spirochätenzahlen zur Aktivierung benutzt wurden. Bei der Verwendung von lipOspA als Agonist wurde zwischen den KMMø der beiden Mausstämme kein nennenswerter Unterschied mehr gefunden. Auch die Grundaktivität der Arginase war bei den empfindlichen CB17 KMMø deutlich höher. Da bei der Bestimmung der Arginaseaktivität keine zelluläre Leistung erfasst wurde, sondern nur die Menge des Enzyms in der Zelle bestimmt wurde, sollte in einem zusätzlichen Versuchsansatz der gesamte Arginin-Metabolismus bestimmt werden. In diesem Fall wurden die enzymatisch entstandenen Metaboliten der beiden Enzyme NOS2 und Arginase erfasst. Hierfür wurde radioaktives Arginin für 8 h zugegeben. Ein Aliquot von der Gesamtkultur wurde dann mit Hilfe der Dünnschicht-Chromatographie analysiert und quantitativ erfasst (2.2.19). Zur übersichtlichen Verdeutlichung Abb. 13. Sowohl das Substrat Arginin als auch die Produkte Citrullin, Ornithin und Spermin wurden untersucht. Der Wert für Arginin gab Auskunft über die Umsetzung des Substrates durch die Enzyme Arginase bzw. NOS2, d.h. wie gut sich die Mø durch Bb aktivieren Ergebnisse 67 lassen. Die Menge an produziertem Citrullin gab Aufschluss über die NOS2 Aktivität, wohingegen Ornithin wiederum auf die Aktivität der Arginase zurückzuführen ist. Von den verschiedenen durch den Mø synthetisierten Polyaminen wurde das Spermin ausgesucht, da Spermin in diesem Fall das Polyamin darstellt, dass die höchste Syntheserate besitzt und von den KMMø akkumuliert wird. Alle anderen Polyamine (Putrescin und Spermidin) wurden auch gemessen (Daten nicht gezeigt), doch Spermin wurde als aussagekräftigster Repräsentant der Polyaminsynthese ausgewählt. Es soll an dieser Stelle betont werden, dass der Vorteil dieser Methode darin besteht, dass der tatsächliche metabolische Umsatz der Zelle inklusive des Transportes des Arginins in die Zelle und nicht nur die Enzym-Aktivität bestimmt werden konnte. Po l y a m i n e Spe r min A m in o sä u r e n Pr o l in e Glut amat Sp e r midin Put r escin Glut amat semialdehyd OAT ODC Or nit hin Carbamylphosphat H ar nst o f f A r g ina se OCT NOS2 A r g i n in Ci t r u l l i n Hy dr oxy - Arg inin Aspart at NO Fumarat H a r n s t o f f - Zy k l u s AL AS Su ccin y l- A r g inin AL: Argininosuccinat -Lyase OAT : Ornit hinamino- T ransf erase AS: Argininosuccinat - Synt het ase ODC: Ornit hin- Decarboxylase OCT: Ornit hin- Carbamyl- Transf erase NOS2: induzierbare NO-Synt hase Abb. 13 Arginin-Metabolismus schematisch. Ergebnisse 68 Kontrolle C57Bl/6 CB17 0.5 Bb/Mø 1 Bb/Mø 2 Bb/Mø 5 Bb/Mø 10 Bb/Mø 5 µg/ml lipOspA 0 25 50 75 Arginase (mE/ 106Mø) 100 Abb. 14. Die Induktion der Arginase bei KMMø der Mausstämme CB17 Stimulationszeit war 48h. und C57Bl/6 Die Der Arginin-Metabolismus von KMMø nach Aktivierung mit Bb im einzelnen. 30 Arginin Citrullin Relative Radioaktivität (%) Relative Radioaktivität (%) 100 80 60 40 20 0 10 0 0 1 2 3 B.b/MØ-Ratio 4 5 0 1 2 3 B.b/MØ-Ratio 4 5 2 3 B.b/MØ-Ratio 4 5 30 12 Ornithin Spermin Relative Radioaktivität (%) Relative Radioaktivität (%) 20 10 8 6 4 2 20 10 0 0 0 1 2 3 B.b/MØ-Ratio 4 5 0 1 Abb. 15 Arginin-Metabolismus der KMMø der Mausstämme CB17 und C57Bl/6 Aktivierung mit 0.5, 1, 2 oder 5 Bb je Mø. Der Einbau von 14C-Arginin betrug 8 h. nach Mit Hilfe der Dünschicht-Chromatographie konnte durch die Inkubation (8 h) mit 14CArginin bei einer gleichzeitigen Aktivierung der KMMø beider Mausstämme mit Bb geprüft werden, welche Zwischen- und Endprodukte die jeweiligen KMMø bilden, bzw. welche Mengen. Indirekt kann auf diese Weise die Aktivität der beiden Arginin Ergebnisse 69 metabolisierenden Enzyme Arginase und NOS2 festgestellt werden. Betrachtet man zu allererst die Menge des umgesetzten Arginins, wurde deutlich, dass C57Bl/6 KMMø nach einer Aktivierung mit Bb nur einen geringen Umsatz aufweisen konnten. Im nicht stimulierten Zustand betrug die relative Radioaktivität bei C57Bl/6 KMMø 92% und wurde dann durch die Zugabe von 5 Bb je KMMø auf 73% gesenkt. Im Gegensatz dazu stehen die wesentlich stärker metabolisierenden CB17 KMMø. Die KMMø dieses Maustammes hatten im nicht aktivierten Zustand eine relative Radioaktivität von Arginin von 84% und senkten diese durch Aktivierung mit 5 Bb je KMMø auf 36% ab. Mit geringen Pathogenmengen liessen sich die KMMø des CB17 Mausstammes bereits sehr gut aktivieren, so dass bei der Bildung von Ornithin und Spermin bereits mit 2 Bb/Mø ein Optimum erreicht werden konnte. Die KMMø des Mausstammes C57Bl/6 dagegen zeigten generell eine schwächere Reaktivität und liessen sich erst durch hohe Pathogendosen von 2 bis 5 Spirochäten/Mø aktivieren. Die einzelne Betrachtung des Argininabbaus liess aber noch nicht definitiv auf NOS2 oder Arginase zurück schliessen, sondern beinhaltete den Argininabbau durch beide Enzyme. Aus diesem Grund soll nun als nächstes Stoffwechselprodukt das Citrullin behandelt werden. Citrullin ist einerseits ein direktes Nebenprodukt von NOS2, kann aber auch über die Ornithin-Carbamyl-Transferase aus Ornithin entstehen, das wiederum als ein Zwischenprodukt des Harnstoffzyklus durch das Enzyme Arginase synthetisiert wird (Abb. 13). Zusätzlich sollte bemerkt werden, dass das Enzym Arginase durch Hydroxy-Arginin (das bei hoher NOS2 Aktivität entsteht) inhibiert werden kann, so dass der bevorzugte Syntheseweg von Citrullin eher über NOS2 verläuft als über den Harnstoffzyklus. Ein sehr deutlicher Unterschied bei der Citrullinmenge besteht zwischen den beiden Mausstämmen CB17 und C57Bl/6, wenn die KMMø mit 5 Bb je Mø aktiviert wurden. Die Relative Radioaktivität bei den C57Bl/6 KMMø betrug in diesem Fall nur 3.6%, wohingegen die relative Radioaktivität der CB17 KMMø 26 % betrug, also 7 mal soviel wie bei den KMMø des Mausstammes C57Bl/6. Bringt man nun diese Werte in Zusammenhang mit den gemessenen NO-Mengen im Kulturüberstand der KMMø, zeigt sich, dass die niedrigen NO-Mengen der C57Bl/6 KMMø aus Abb. 2 mit den niedrigen Citrullinmengen von Abb. 15 in Einklang stehen. Aktiviert man die KMMø aber mit dem löslichen Bb-Oberflächenprotein lipOspA (1µg/ml), wird die Citrullinmenge gesteigert und gleichzeitig verringern sich die grossen Unterschiede zwischen den Ergebnisse 70 beiden Mausstämmen zu Werten von 72% Citrullin bei CB17 KMMø und 58% Citrullin bei C57Bl/6 KMMø . Die KMMø des Mausstammes C57Bl/6 sind nach Aktivierung mit Bb-Spirochäten schlechte Umsetzer des NOS2 Reaktionsweges. Im folgenden sollte auf die Bildung von Ornithin eingegangen werden. Ornithin wird ausschliesslich durch den Abbau des Arginins über das Enzym Arginase gebildet. Auch hier war die relative Radioaktivität der CB17 KMMø nach einer Aktivierung mit 5 Bb pro Mø deutlich höher (9.1%) als bei den KMMø des Mausstammes C57Bl/6 (5.6 %). Als letztes Stoffwechselprodukt sollte Spermidin Aufschluss über die Bedeutung der Polyaminsynthese bei KMMø nach einer Aktivierung mit Bb geben. Bei beiden Mausstämmen war eine Steigerung der Spermin-Bildung bei Steigerung der Bb-Konzentration pro KMMø zu erkennen. Allerdings schien keine weitere Steigerung mehr von 2 Bb pro KMMø zu 5 Bb pro KMMø erreichbar. Bei der Aktivierung mit 2 Bb pro KMMø wurden bei CB17 KMMø 22% relative Radioaktivität erreicht, bei C57Bl/6 KMMø nur 13.3%. Zusammenfassend lässt sich sagen, dass die KMMø des Mausstammes C57Bl/6 eine deutlich geringere Metabolisierung von Arginin nach Aktivierung mit Bb aufweisen. Desweiteren ist zu bemerken, dass die KMMø des Mausstammes CB17 bereits im nichtaktivierten Zustand höhere Metabolisierungswerte bei Arginin, Ornithin und Spermin aufweisen. Die Unterschiede im Grundumsatz bei CB17 KMMø im Gegensatz zu den Grundumssatzwerten von C57Bl/6 weisen bei CB17 auf eine Prädisposition in Richtung Arginase hin. 3.9 Untersuchung zum Energie-Metabolismus der Makrophagen. Aufgrund des immer wiederkehrenden Phänomens, dass KMMø des Mausstammes CB 17 eine wesentlich höhere Reaktivität nach der Phagozytose von Spirochäten aufwiesen, wie die Unterschiede in der Radikalproduktion (O2 -, NO) und Proteinsynthese (TNF-a, IL-12p75, IFN-γ, Arginase) zeigten, wurden einige Versuche durchgeführt um den gesamten Energiestoffwechsel der Makrophagen weiter zu analysieren. Zunächst, als Hauptenergielieferant in den Zellen, wurde der GlukoseVerbrauch im Kulturüberstand gemessen. 6 Glukoseverbrauch (µM/10 Makrophagen) Ergebnisse 71 12 12 10 10 8 8 6 6 4 4 2 2 0 0 0 1 2 3 Bb/Mø-Ratio 4 5 5 µg/ml lipOspA Abb. 16 Glukoseverbrauch von KMMø der Mausstämme CB17 und C57Bl/6 nach Phagozytose von Bb bzw. Aktivierung mit lipOspA. Die Zellen wurden 24 h in DMEM inkubiert und der Glukoseverbrauch im Überstand bestimmt. Wie in Abb. 16 zu sehen ist, wurde der Glukoseverbrauch bei beiden Mausstämmen durch die Phagozytose Dosis durch Borrelien stimuliert. Auffallend war, dass der Grundumsatz an Glukose von den CB17 KMMø viermal höher lag als bei den KMMø des resistenten C57Bl/6 Mausstammes. Im Gegensatz dazu führte die Aktivierung mit lipOspA zu einer hohen Stimulation, aber keinem Unterschied zwischen den KMMø der beiden Mausstämme. Um diese Beobachtung näher einzugrenzen, und da ein grosser Teil der Energie in der Zelle durch die Mitochondrien geliefert wird, wurde in beiden Makrophagen-Populationen eine mitochondriale Aktivität bestimmt. Hierzu wurde die Fähigkeit der intakten Zellen bestimmt, mit der sie MTT reduzieren und Formazan bilden. Ergebnisse 72 0,5 C57Bl/6 CB17 OD-Werte (570 nm) 0,4 0,3 0,2 0,1 0 0 2 4 6 Bb/Mø-Ratio 8 10 Abb. 17 Nachweis der mitochondrialen MTT-Dehydrogenase in KMMø der Mausstämme CB17 und C57Bl/6 nach Phagozytose von Bb. Die Aktivierungszeit betrug 24h. Die Aktivität der mitochondrialen MTT-Dehydrogenase war wiederum bei den KMMø des Mausstammes CB17 höher als bei den KMMø des C57Bl/6 Mausstammes. Eine Veränderung der Aktivität durch die Phagozytose der Borrelien wie im Fall des Glukose-Verbrauchs wurde nicht festgestellt. Allerdings war ein Unterschied in der Grundaktivität des Enzyms auch zu beobachten, wenn die KMMø unmittelbar zu Beginn der Kultur (ohne Aktivierung) getestet wurden. Dies deutet auf eine höhere konstitutive Aktivität der MTT-Dehydrogenase bei KMMø des CB17 Mausstammes hin. Ergebnisse 3.10 73 Differenzierung der KMMø in Gegenwart von LPS, Bb oder lipOspA. Der nun folgende Teil der Dissertation widmete sich der Frage, in wieweit eine in vitro bzw. eine in vivo Infektion eines Tieres bzw. des Knochenmarks die Reaktivität der KMMø beeinflussen kann. Aus diesem Grund wurde in einem ersten Versuchsansatz Knochenmark von gesunden CB17 bzw. C57Bl/6 Mäusen in Gegenwart von entweder 0.01 µg/ml LPS, 0.1 Bb je Knochenmarkzelle, 0.5 µg/ml lipOspA oder ohne den Zusatz eines Stimulus für 8 Tage in MakrophagenDifferenzierungsmedium zu reifen KMMø kultiviert (Abb. 18 A). LPS Knochenmark von gesunden Tieren Bb lipOspA 8 Tage Dif f erenzierungszeit reife KMMø Akt ivierung LPS Bb lipOspA Zyt okine mit Analyse der Zyt ot oxizit ät Mediat oren Zyt okine Abb. 18 A Experimentelles Aktivierungsschema. Nach den üblichen 8 Tagen Differenzierungszeit von Knochenmarkzellen zu reifen KMMø konnte mikroskopisch kein Unterschied zwischen den Kontroll-Makrophagen (ohne Zusatz von Stimulanz) und den Makrophagen, die in Gegenwart von LPS, Bb oder lipOspA ausgereift waren, bemerkt werden. Auffällig war vor allem die besonders grosse Reduktion der Ausbeute der KMMø, welche mit dem Referenzagonisten LPS gereift waren. Hier betrug die Ausbeute nur 50% von der Ausbeute der Kontroll-Makrophagen, dies jedoch unabhängig von den benutzen Mausstämmen CB17 und C57Bl/6. Bei den Zusätzen Bb bzw. lipOspA war bei beiden Mausstämmen einheitlich eine Reduktion der KMMø-Ausbeute von 10% bis 20% entstanden (Tab. 18 B). Ergebnisse Herkunft des Knochenmarks CB17 CB17 CB17 CB17 C57BL/6 C57BL/6 C57BL/6 C57BL/6 74 Differenzierung in Gegenwart von: LPS 0.01 µg/ml 0.1 Bb/Knochenmarkzelle lipOspA 0.5 µg/ml LPS 0.01 µg/ml 0.1 Bb/Knochenmarkzelle lipOspA 0.5 µg/ml Ausbeute der KMMø nach 8 Tagen 10.2 x 106 4.2 x 106 8.5 x 106 7.7 x 106 14.6 x 106 7.0 x 106 12.6 x 106 9.8 x 106 Tab. 18 B. Ausbeute der KMMø nach 8 Tagen Differenzierungszeit. Es wurden 3 x 106 Knochenmarkszellen pro Versuchsansatz (in 25 ml) eingesetzt. Um den Phänoty der KMMø zu untersuchen, wurden folgende Experimente durchgeführt: Ein Zytotoxizitätstest, die Bestimmung von NO im Kulturüberstand, die Messung der Arginase-Aktivität, sowie die Bestimmung des Zytokins TNF-α. 3.10.1 Modulation der Makrophagen abhängigen Zytotoxizität. Um die Makrophagen abhängige Zytotoxizität zu bestimmen, wurden KMMø für 48 h mit Abelson-Lymphomzellen kokultiviert und anschliessend die für die Zell-Linie spezifische alkalische Phosphatase bestimmt. Eine Kokultivierung von unbehandelten KMMø mit Abelson-Lymphomzellen löst keine Zytotoxizität durch die Makrophagen aus, sondern die von den KMMø abgegebenen Stoffwechselprodukte wie beispielsweise Polyamine, fördern das Wachstum der Tumorzellen. Besonders auffällig war dieses Verhalten in Abb. 19 B und Abb. 19 D zu erkennen. Die Differenzierung zu KMMø in Gegenwart von LPS oder lipOspA stimuliert die KMMø soweit, dass sie das Proliferationsverhalten der Tumorzellen positiv beeinflussten. Im Fall von LPS (Abb. 19 B) konnte das Wachstum der Abelsonzellen sogar verdoppelt werden. Nur aktivierte KMMø sind in der Lage, AbelsonLymphomzellen zu zerstören und somit den Wert der alkalischen Phosphatase zu reduzieren. Ergebnisse 75 A B Mø Mø ø Mø + LPS LPS Mø + LPS Mø + lipOspA Mø + lipOspA 0 50 100 150 200 Abelson Wachstum (% der Kontrolle) 0 250 C 50 100 150 200 250 Abelson Wachstum (% der Kontrolle) D Mø Mø Bb Mø + LPS lipOspA Mø + LPS Mø + lipOspA Mø + lipOspA 0 50 100 150 200 Abelson Wachstum (% der Kontrolle) 250 0 50 100 150 200 250 Abelson Wachstum (% der Kontrolle) Abb. 19 Makrophagen abhängiger Zytotoxizitätstest. Knochenmark welches entweder ohne Zusatz A), oder in Gegenwart von 0.01 µg/ml LPS B), 0.1 Bb je Knochenmarkzelle C) oder 0.5 µg/ml lipOspA D) zu KMMø gereift war. 1 x 105 reife KMMø der Mausstämme CB17 und C57Bl/6 wurden für 48 h mit 1 x 103 Abelson-Lymphomzellen kokultiviert. Aktiviert wurden die Ansätze mit 0.1 µg/ml LPS, bzw. 1 µg/ml lipOspA In Abb. 19 ist ablesbar, dass unaktivierte KMMø (Mø) in der Kokultivierung mit Abelson-Lymphomzellen keine Zytotoxizität auslösen, in Abb. 19 A), B), C), und D) ist das Abelson-Wachstum in diesen Fällen nicht inhibiert, sondern immer über 100%. Wenn die KMMø während der Kokultivierung jedoch gleichzeitig mit LPS aktiviert wurden, fand eine Zerstörung der Tumorzellen statt. CB17 KMMø inhibierten das Wachstum der Abelson-Lymphomzellen auf 14.8%, C57Bl/6 KMMø inhibierten das Wachstum der Abelson-Lymphomzellen nur auf 52% (Abb. 19 A). Die Aktivierung mit 1µg/ml lipOspA löste bei keinen der KMMø der beiden Mausstämme eine Wachstumshemmung aus (Abb. 19 A). Nachfolgend werden die KMMø der beiden Mausstämme, die in Gegenwart von LPS, Bb oder lipOspA gereift waren, jeweils mit den Werten der Kontroll-Makrophagen (Abb. 19 A) verglichen. KMMø beider Mausstämme, die in Gegenwart von LPS gereift sind (Abb. 19 B), können durch LPS und lipOspA aktiviert werden. Es zeigten sich aber deutliche Mausstamm-spezifische Unterschiede. Vergleicht man die LPS Aktivierung der in Gegenwart von LPS gereiften KMMø (Abb. 19 B) mit den Werten der LPS aktivierten KontrollMakrophagen (Abb. 19 A), findet bei den C57Bl/6 durch den „zweiten Kontakt“ mit LPS eine Verstärkung der Zytotoxizität statt. Im Gegensatz dazu reagieren die CB17 KMMø durch den erneuten Stimulus mit LPS anergisch, d.h sie verlieren teilweise Ergebnisse 76 ihre Fähigkeit durch LPS aktiviert zu werden und reagierten schwächer zytotoxisch gegenüber den Abelson-Lymphomzellen. Dieses Verhalten der CB17 KMMø deutet auf Toleranz hin. Als nächstes sollte überprüft werde, ob die Reifung von Knochenmarkzellen in Gegenwart von Bb (Abb. 19 C) einen Einfluss auf die Reaktionsfähigkeit der KMMø nehmen kann. Hierbei konnte gezeigt werden, dass KMMø, die in Gegenwart von Bb gereift waren, eine sehr gute Antwort bzw. Reaktion nach einer LPS-Stimulation auslösten. CB17 KMMø reduzierten in diesem Fall das Wachstum der Abelson-Lymphomzellen nach LPS-Aktivierung auf 6.7%, die Kontroll-Makrophagen des CB17 Mausstammes erzielten bei gleicher Aktivierung mit LPS nur eine Reduktion des Abelson-Lymphomzellenwachstums von 14.8% (Abb. 19 A). Beim Vergleich zwischen Kontroll C57Bl/6 KMMø (Abb. 19 A) mit C57Bl/6 KMMø, die in Gegenwart von Bb gereift waren (Abb. 19 C), konnte gezeigt werden, dass die Reifung mit Bb die Reaktivität nach einer LPS-Aktivierung verstärkt (Kontroll C57Bl/6 52%, C57Bl/6 in Gegenwart von Bb gereift 34% AbelsonWachstum). KMMø beider Mausstämme, die in Gegenwart von lipOspA gereift sind (Abb. 19 D), zeigten ebenfalls eine erhöhte Reaktivität nach einer LPS-Aktivierung, massiver noch als die KMMø, welche in Gegenwart von Bb gereift waren (Abb. 19 C). α. 3.10.2 Induktion von TNF-α Um die Aktivierungsfähigkeit der KMMø zu überprüfen, wurde im folgenden das Zytokin TNF-α nach nach 2 h Aktivierung im Kulturüberstand der KMMø bestimmt. Es sollte untersucht werden, ob der Kontakt mit LPS, Bb oder lipOspA während der Reifung der KMMø einen Einfluss auf die Synthese des pro-inflammatorischen Zytokins TNF-α hat. Ergebnisse 77 A B ø Kontrolle LPS LPS 5Bb/Mø 5Bb/Mø lipOspA lipOspA 0 2000 4000 6000 TNF-α (pg/ml) C 8000 Bb Kontrolle 0 5Bb/Mø 5Bb/Mø lipOspA lipOspA 4000 TNF-α (pg/ml) 6000 8000 4000 TNF-α (pg/ml) 6000 8000 lipOspA Kontrolle LPS 2000 2000 D LPS 0 LPS Kontrolle 0 2000 4000 6000 8000 TNF-α (pg/ml) Abb. 20 TNF-α Sezernierung von KMMø der Mausstämme CB17 und C57Bl/6 nach 2 h. Knochenmark, welches entweder ohne Zusatz A) oder in Gegenwart von 0.01 µg/ml LPS B), 0.1 Bb je Knochenmarkzelle C) oder 0.5 µg/ml lipOspA D) zu KMMø gereift war. Die TNF-α Konzentration im Kulturüberstand wurde mittels Bioassay detektiert. LPS: 0.1 ng/ml; lipOspA: 1 µg/ml Die TNF-α Proteinmengen in den Kulturüberstanden nach 2 h in Abb. 20 A zeigen die bereits in Abb. 4 A gesehenen Unterschiede zwischen den stark produzierenden CB17 KMMø im Gegensatz zu den schwächer antwortenden C57Bl/6 KMMø nach Aktivierung mit LPS, 5 Bb/Mø oder lipOspA. In Abb. 20 B zeigte sich ein wichtiger Unterschied zwischen den beiden Mausstämmen, so führte die Aktivierung mit LPS bei den in Gegenwart von LPS gereiften CB17 KMMø zu einer herabgesetzten Reaktionsfähigkeit, die wiederum (wie bereits in Abb. 19) auf einen anergischen bzw. toleranten Zustand bei einem zweiten Kontakt mit LPS bei CB17 KMMø zurückzuführen ist. Im Gegensatz dazu erhöhten die C57BL/6 KMMø in Abb. 20 B die Menge an sezerniertem TNF-α im Kulturüberstand. Die TNF-α Proteinmengen nach Aktivierung mit 5 Bb je Mø bzw. lipOspA sind in Abb. 20 B ebenfalls erhöht im Vergleich zu den Mengen in Abb. 20 A. Die Reifung der CB17 KMMø in Gegenwart von Bb erhöhte unabhängig von der Aktivierungsart in allen Fällen die Mengen an TNF-α im Vergleich zu den CB17 KMMø in Abb. 20 A. Auf die TNF-α Sezernierung der C57BL/6 KMMø nahm die Reifung in Gegenwart von Bb keinerlei Einfluss. Abb. 20 D beschreibt KMMø, die in Gegenwart von lipOspA gereift waren. CB17 KMMø steigern ihre TNF-α Produktion im Vergleich zu Abb. 20 A. C57Bl/6 KMMø in Abb. 20 D produzieren nach Aktivierung mit 5 Bb je KMMø keine Ergebnisse 78 detektierbaren Mengen an TNF-α, auch die Synthese des TNF-α Proteins nach Aktivierung mit lipOspA ist reduziert im Vergleich zu Abb. 20 A. 3.10.3 Synthese von NO. Im selben Modell wie 3.10.2 wurde der Einfluss der Agonisten LPS, Bb oder lipOspA während der Reifung der Makrophagen auf deren Reaktionsfähigkeit zur NO Synthese untersucht. A ø Kontrolle LPS B LPS IFN-g + TNF-a IFN-g + TNF-a 10 Bb/Mø 10 Bb/Mø 5 Bb/Mø + IL-18 5 Bb/Mø + IL-18 lipOspA lipOspA IL12 + IL-18 IL12 + IL-18 0 C 10 20 30 40 50 Nitrit (µM) 60 LPS 0 70 10 Bb/Mø 10 Bb/Mø 5 Bb/Mø + IL-18 5 Bb/Mø + IL-18 lipOspA lipOspA IL12 + IL-18 IL12 + IL-18 20 30 40 Nitrit (µM) 50 60 70 30 40 50 60 70 lipOspA LPS IFN-g + TNF-a 10 20 Kontrolle IFN-g + TNF-a 0 10 Nitrit (µM) D Bb Kontrolle LPS Kontrolle 0 10 20 30 40 50 60 70 Nitrit (µM) Abb. 21 Die Synthese von NO bei KMMø der Mausstämme CB17 und C57Bl/6 aus Knochenmark, welches entweder ohne Zusatz A) oder in Gegenwart von 0.01 µg/ml LPS B), 0.1 Bb je Knochenmarkzelle C) oder 0.5 µg/ml lipOspA D) zu KMMø gereift war. Die Stimulationszeit war 72h, die NOS2-Induktion wurde durch die Bildung von Nitriten im Kulturüberstand nachgewiesen. LPS: 0.1 ng/ml; lipOspA: 1 µg/ml; IFN-γ: 100 u/ml; TNF-α : 100 u/ml; IL-18: 100 ng/ml; IL-12: 10 ng/ml. Unabhängig von der Art der Aktivierung und gleichzeitig unabhängig von der Art der Stimuli während der Reifung des Knochenmarks zu KMMø produzieren CB17 KMMø immer höhere Mengen an NO, sind also immer reaktiver als die KMMø des Mausstammes C57Bl/6. Die Reifung des Knochenmarks in Gegenwart von LPS, Abb. 21 B, steigerte unabhängig vom Mausstamm die Mengen an Nitriten in den Kulturüberständen aller KMMø. Zusätzlich bewirkte die LPS-Vorbehandlung bei den KMMø beider Mausstämme die Induktion von NOS2 und die Sezernierung von hohen Mengen NO nach Aktivierung mit IL-12 + IL-18 (Abb. 21 B). Dieser Effekt konnte weder durch die Vorbehandlung mit lipOspA noch mit Bb induziert werden (Abb. 21 C, Abb. 21 D). Obwohl die Zugabe der beiden Zytokine IL-12 und IL-18 die Ergebnisse 79 Synthese von IFN-γ induziert, benötigen die Makrophagen unter normalen Umständen in vitro einen zusätzlichen Stimulus (TNF-α) um NOS2 zu induzieren (M. Munder et al., 1998). Es muss also vermutet werden, dass der LPS-Stimulus während der Reifung der KMMø schon als zusätzlicher Aktivator für NOS2 gedient haben muss, denn es konnte keine TNF-α Synthese in LPS vorbehandelten Kulturen detektiert werden (Abb. 20 B). Die Vorbehandlung mit lipOspA (Abb. 21 D) bewirkte aber in beiden Mausstämmen genau das Gegenteil von LPS (Abb. 21 B). Diese KMMø zeigten eine reduzierte Produktion von NO nach Aktivierung mit den klassischen Induktoren von NOS2, LPS oder IFN-γ und TNF-α. Interessanter Weise war die Aktivierung der NOS2 mit Bb oder lipOspA fast komplett blockiert, was auf eine Anergie hindeutet. 3.10.4 Induktion der Arginase. Die Induktion der Arginase wurde als ein Parameter der alternativen Aktivierung in diesen KMMø bestimmt. A Kontrolle BKontrolle ø LPS LPS IFN-g + TNF-a IFN-g + TNF-a 10 Bb/Mø 10 Bb/Mø 5 Bb/Mø + IL-18 5 Bb/Mø + IL-18 lipOspA lipOspA IL12 + IL-18 IL12 + IL-18 0 50 C 100 150 200 6 Arginase (mE/1x10 KMMø) 0 250 IFN-g + TNF-a 10 Bb/Mø 10 Bb/Mø 5 Bb/Mø + IL-18 5 Bb/Mø + IL-18 lipOspA lipOspA IL12 + IL-18 IL12 + IL-18 250 200 250 lipOspA Kontrolle IFN-g + TNF-a 100 150 200 6 Arginase (mE/1x10 KMMø) 150 6 LPS 50 100 Arginase (mE/1x10 KMMø) LPS 0 50 D Bb Kontrolle LPS 0 50 100 150 200 6 Arginase (mE/1x10 KMMø) 250 Abb. 22 Die Induktion der Arginase bei KMMø der Mausstämme CB17 und C57Bl/6 aus Knochenmark, welches entweder ohne Zusatz A) oder in Gegenwart von 0.01 µg/ml LPS B), 0.1 Bb je Knochenmarkzelle C) oder 0.5 µg/ml lipOspA D) zu KMMø gereift war. Die Stimulationszeit war 72h. LPS: 0.1 ng/ml; lipOspA: 1 µg/ml; IFN-γ: 100 u/ml; TNF-α : 100 u/ml; IL-18: 100 ng/ml; IL-12: 10 ng/ml. Ergebnisse 80 Bei der Analyse der Arginase-Aktivität wurde festgestellt, dass die KMMø des Mausstammes CB17 auch eine höhere Antwort gegenüber der verwendeten Agonisten aufweisen als die KMMø des Mausstammes C57Bl/6. In Abb. 22 A bestätigte sich, dass bestimmte Agonisten wie LPS oder IFN-γ in Kombination mit LPS nur eine sehr geringe Arginase-Aktivität induzieren, stattdessen wie in Abb. 21 A zu sehen das Enzym NOS2 induzieren. Die Reifung der KMMø in Gegenwart von LPS (Abb. 22 B) bewirkte eine Arginase-Induktion in diesen Zellen beider Mausstämme. Eine weitere Steigerung der Arginase-Aktivität durch die verwendeten Agonisten war praktisch nur in den CB17 KMMø zu beobachten. Die Vorbehandlung mit Bb (Abb. 22 C) führte erstens zu einer Erhöhung des Arginase-Pegels in den Kontroll-Kulturen beider Mausstämme und zweitens zu einer höheren Reaktivität der CB17 KMMø gegenüber allen Stimuli. Die lipOspA Vorbehandlung (Abb. 22 D) führte ebenfalls zur gesteigerten Grundarginase-Aktivität insbesondere in den CB17 KMMø. Die Reaktivität gegenüber LPS wurde bei beiden Mausstämmen deutlich gesteigert, und die klassischen NOS2 Induktoren IFN-γ in Kombination mit TNF-α induzierten hohe Arginase-Werte in den CB17 KMMø. Das beobachtete anergische Verhalten der CB17 KMMø gegenüber LPS (Abb. 21 B, 17 B und 18 B) kehrte sich im Fall der Arginase-Induktion um (Abb. 22 B). Hier führte der zweite Kontakt der Zellen mit LPS zu einer gesteigerten Aktivität der Arginase. 3.11 Differenzierung von KMMø aus immmundefizienten Bb infizierten CB17scid Mäusen. Im klassischen von UE Schaible et al. (UE Schaible et al., 1990) etablierten Mausmodell der Lyme Borreliose werden CB17scid Mäuse als Infektionsträger benutzt. Diese Mäuse zeigten 21 bis 28 Tagen nach der Infektion deutliche pathologische Anzeichen der Krankheit. In den nächsten Experimenten sollte untersucht werden, in wieweit die in vivo Infektion mit Bb die Reaktivität der in vitro aus dem Knochenmark entstehenden KMMø beeinflussen kann. Um die natürliche Infektion so gut wie möglich experimentell nachzuempfinden, wurden die Mäuse mit Spirochäten tragenden Zecken infiziert. Nach 47 Tagen wurden das Knochenmark entnommen, um KMMø zu generieren. Das experimentelle Protokoll ist im Schema der Abb. 23 dargestellt und die Entwicklung der Arthritis in der entsprechenden Tabelle (Tab. 3) gezeigt. Ergebnisse 81 Bb infiziert e Zecken CB17scid Maus Infekt ionszeit 47 Tage Knochenmark der infiziert en und nicht infiziert en Mäuse reife KMMø 8 Tage Dif f erenzierungszeit Akt ivierung LPS Bb lipOspA Zyt okine mit Analyse der Zyt ot oxizit ät NOS2 Arginase Abb. 23 Experimentelles Protokoll. Stamm Tag 14 Tag 19 Tag 23 Tag 29 Tag 47 CB17scid inf. Nr. 1 -/(±) ±/(±) +/+ ++/++ ++/++ CB17scid inf. Nr. 2 -/(±) +/+ ++/+ ++/++ ++/++ CB17scid inf. Nr. 3 ±/(±) +/+ +/+ ++/++ ++/++ CB17scid ø Nr. 1-3 - - - - - Tab. 3 Entwicklung der Arhtritis am linken/rechten hinteren Sprunggelenk der Mäuse. Zeichenerklärung: -: normal (keine Arthritis-Anzeichen); (±): Rötung; ±: leichte Schwellung; +: starke Schwellung; ++: extreme Schwellung. Ergebnisse 82 A Mø Mø + LPS Mø + lipOspA 0 B 50 100 150 Abelson Wachstum (% der Kontrolle) C Kontrolle LPS LPS+IFN-g LPS+IFN-g 10 B.b./Mø 10 Bb/Mø 5B.b./Mø+IL-18 5B.b./Mø+IL-18 lipOspA lipOspA IL-12 + IL-18 IL-12 + IL-18 20 40 Nitrit (µM) 60 250 Kontrolle LPS 0 200 0 50 6 100 150 Arginase (mE/1x10 KMMø) Abb. 24 Makrophagen abhängiger Zytotoxizitätstest nach 48 h A), Induktion von NOS2 nach 72 h B) und Arginase-Aktivität nach 72 h C). KMMø von nicht infizierten CB17scid Kontrollmäusen und KMMø von (mit Bb) infizierten CB17scid Mäusen . Die Infektionszeit der Mäuse betrug 47 Tage. LPS: 0.1 ng/ml; lipOspA: 1 µg/ml; IFN-γ : 100 E/ml; IL-18: 100 ng/ml; IL-12: 10 ng/ml. Die Experimente wurden mit je 3 infizierten Mäusen bzw. Kontrolltieren durchgeführt. Die Makrophagen wurden für jede Maus getrennt generiert und unabhängig im Versuchsansatz stimuliert. Dargestellt sind die Mittelwerte aus diesen unabhängigen Versuchsansätzen. Makrophagen besitzen die Fähigkeit, nach einer Aktivierung mit bakteriellen Produkten (u.a. LPS, Muramyldipeptide) Tumorzellen anzugreifen und zu zerstören. Im Gegensatz dazu fördern, nicht aktivierte oder mit Wachstumsfaktoren (TGF-β) behandelte KMMø das Wachstum der Tumorzellen. Aus diesem Grund wurde in diesem experimentellen Ansatz ein Test zur Bestimmung der Makrophagen abhängigen Zytotoxizität durchgeführt. Die Ergebnisse in Abb. 24 A zeigten, dass KMMø von nicht infizierten sowie von infizierten Tieren in Kokultur mit AbelsonLymphomzellen (Aktivierungsbezeichnung Mø) ohne eine zusätzliche Aktivierung nicht in der Lage waren, das Wachstum der Tumorzell-Linie zu inhibieren, sondern im Gegenteil das Wachstum der Tumorzellen fördern. Das bedeutet, dass die KMMo der (infizierten sowie der nicht infizierten) Tiere nicht voraktiviert waren, denn ansonsten hätten die KMMø das Potential gehabt, das Abelsonwachstum zu inhibieren. Wurden die KMMø allerdings in Kokultur mit den Tumorzellen mit LPS aktiviert, zeigte sich, dass die KMMø der nicht infizierten Tiere (grün) eine sehr gute Inhibierung des Abelson-Wachstums durchgeführt haben. Dieser Effekt wurde Ergebnisse 83 vermindert, wenn die KMMø von den infizierten Tieren stammten. Im Fall von lipOspA zeigte sich, dass eine Aktivierung dieser Zellzytotoxizität nur bei den nicht infizierten Tieren möglich war. Die KMMø aus infizierten Mäusen haben in Gegenwart von lipOspA weder das Wachstum gefördert noch inhibiert. Die Infektion der Mäuse mit Bb führte zu einer Anergie in der Erkennung der Tumorzellen, wenn die KMMø mit lipOspA aktiviert wurden. Die Analyse der NO Produktion ist in Abb. 24 B dargestellt. Die für NOS2 typischen Aktivierungen mit LPS oder LPS in Kombination mit IFN-γ führten bei den KMMø der infizierten Tiere zu einer Steigerung der NO-Synthese. Wurde aber mit lipOspA aktiviert, produzierten die KMMø der infizierten Tiere nur noch etwa die Hälfte der Menge (8.9 µM Nitrit), die bei gleicher Aktivierung von den KMMø der nicht infizierten Tiere (18.1 µM Nitrit) synthetisiert wurde. Abb. 24 C zeigt die Aktivität des Enzyms Arginase nach Aktivierung der KMMø der infizierten bzw. nicht infizierten Tiere. Grundsätzlich führt die Infektion eines Tieres die KMMø zu einer gesteigerten Arginase-Aktivität, also zu einer gesteigerten alternativen Aktivierung der Makrophagen, unabhängig von den verwendeten Agonisten. Dieses in der Abbildung gezeigte Verhalten der Makrophagen nach Infektion mit Bb zeigt eine Suppression der proinflammatorischen Antwort (Zytotoxizität, NO-Synthese) zugunsten einer geweberegenerierenden gesteigerten Arginase-Expression, die für die Prolin- und Polyaminsynthese verantwortlich ist. Das Arginin metabolisierende Enzym NOS2 ist während Entzündungsreaktionen bzw. bei der Abwehr von Pathogenen induziert. Das andere Arginin metabolisierende Enzym Arginase konkurriert um das gleiche Substrat, wird aber bei Heilungsprozessen, die in der Lyme Arthritis während der Pathologie natürlich stattfinden, evt. favorisiert. 3.12 Differenzierung von KMMø von mit Bb infizierten immmundefizienten Mäusen des Mausstammes CB17scid. Im folgenden wurde der Versuchsansatz (3.11) in soweit verändert, dass anstatt des natürlichen Infektionsweges über mit Bb-infizierte Zecken die Mäuse sc an der Schwanzwurzel mit 1 x 103 Bb je Maus infiziert wurden. Der Infektionsverlauf ist gleich, obwohl der Vektor Zecke ausgelassen wurde. Dass es in allen Fällen zur Ausbildung der für die Lyme Borreliose typischen Arthritis kam, ist in Tab. 4 gezeigt. Ergebnisse 84 Stamm Tag 9 Tag 1 5 Tag 2 1 Tag 2 4 Tag 2 7 Tag 3 5 Tag 4 5 CB17scid inf. Nr.1 CB17scid inf. Nr.2 CB17scid inf. Nr.3 - ±/(±) (±)/(±) ±/(±) +/+ +/+ +/+ ++/+ ++/+ +/+ ++/+ ++/++ ++/++ ++/++ ++/++ ++/++ ++/++ ++/++ ++/++ CB17scid ø Nr.1-3 - - - - - - - Tab. 4 Entwicklung der Arthritis am linken/rechten hinteren Sprunggelenk der Mäuse. Zeichenerklärung: -: normal (keine Arthritis-Anzeichen); (±): Rötung; ±: leichte Schwellung; +: starke Schwellung; ++: extreme Schwellung. A B Mø Kontrolle Mø + LPS 5B.b./Mø+IL-18 Mø + lipOspA IL-12 + IL-18 0 C 50 Abelson Wachstum (% der Kontrolle) 0 100 D LPS LPS+IFN-g LPS+IFN-g 5B.b./Mø+IL-18 5B.b./Mø+IL-18 lipOspA lipOspA IL-12 + IL-18 IL-12 + IL-18 40 Nitrit (µM) 60 300 400 500 Kontrolle LPS 20 200 IFN-γ (u/ml) Kontrolle 0 100 80 0 50 6 100 150 Arginase (mE/1x10 KMMø) Abb. 25 Makrophagen abhängiger Zytotoxizitätstest nach 48 h A), Sezernierung von IFN-γ nach 72 h, Induktion von NOS2 nach 72 h C) und Arginase-Aktivität nach 72 h D) von KMMø des Mausstammes CB17scid. KMMø von nicht infizierten CB17scid Kontrollmäusen und KMMø von (mit Bb) infizierten CB17scid Mäusen . Die Infektionszeit der Mäuse betrug 45 Tage. LPS: 0.1 ng/ml; lipOspA: 1 µg/ml; IFN-γ: 100 u/ml; IL-18: 100 ng/ml; IL-12: 10 ng/ml. Die Experimente wurden mit je 3 infizierten Mäusen bzw. Kontrolltieren durchgeführt. Die Makrophagen wurden für jede Maus getrennt generiert und unabhängig im Versuchsansatz stimuliert. Dargestellt sind die Mittelwerte aus diesen unabhängigen Versuchsansätzen. Vergleicht man die Ergebnisse des Versuchansatzes 3.12 (sc Infektion der Mause mit Bb) mit denen des bereits beschriebenen Versuchs 3.11 (Infektion der Mäuse über den Vektor Zecke), bestätigen sich die grundlegenden Unterschiede zwischen den KMMø infizierter bzw. nicht infizierter Tiere. In Abb. 25 A wiederholte sich (wie bereits für Abb. 24 A beschrieben) das anergische Verhalten der KMMø infizierter Tiere (rot) gegenüber einer Aktivierung mit dem für Bb spezifischen Oberflächenprotein lipOspA. Bei einer Aktivierung der KMMø mit 5 Bb/ Mø + IL18 oder IL-12 + IL 18 (Abb. 25 B) wurde die sezernierte Proteinmenge des Zytokins IFN-γ nach 72 h bestimmt. Die KMMø der nicht infizierten Mäuse bildeten nach beiden Aktivierungen das Zytokin. Die KMMø der infizierten Tiere bildeten nach der Aktivierung mit 5 Bb/Mø in Kombination mit IL-18 keine mit dem ELISA detektierbaren Mengen IFN-γ Ergebnisse 85 im Kulturüberstand, sie liessen sich aber durch die Kombination der Zytokine IL-12 und IL-18 zur Sezernierung des Zytokins IFN-γ anregen. Es handelte sich also nicht um eine generelle Funktionsstörung der IFN-γ-Synthese der KMMø der infizierten Tiere, sondern um eine anergische Reaktion gegenüber Bb. Bei der Bestimmung der Nitrite im Kulturüberstand (Abb. 25 C) fällt auf, dass die Reaktionsfähigkeit der KMMø der infizierten Tiere verglichen mit der der gesunden Tiere sich bei LPS Aktivierungen nicht unterscheidet, sehr wohl aber ist eine Reduktion der NOSynthese nach Aktivierung mit Bb oder dem Oberflächenprotein lipOspA bei den KMMø der infizierten Tiere zu erkennen. Schliesslich in Abb. 25 D wiederholte sich, was schon in Abb. 25 D erläutert wurde, die Arginase-Aktivität nach Aktivierung mit lipOspA war bei KMMø infizierter Tiere (137 mE/106 KMMø) wesentlich höher als bei den KMMø der gesunden Mäuse (68 mE/106 KMMø). 3.13 Entwicklung der Lyme Arthritis bei immmundefizienten Mäusen des Mausstammes CB17scid, die während der Infektion mit anti-IFNγAntikörpern behandelt wurden. In einem weiteren Versuchsansatz sollte überprüft werden, ob die Behandlung mit anti-IFNγ-Antikörpern während der Infektion einen Einfluss auf die Lyme Arthritis nehmen kann und ob die Reaktionsfähigkeit der KMMø dieser Tiere verändert wird. Die CB17scid Mäuse wurden mit 1 x 103 Bb je Maus sc an der Schwanzwurzel infiziert und gleichzeitig alle 3 Tage (beginnend am Tag 0 = Tag der Infektion) mit 100µg anti-IFNγ-Antikörpern bzw. mit 100 µg eines Kontroll-Antikörpers (ChromPure Rat IgG, dianova, Hamburg, Germany) ip behandelt. Die Ergebnisse der in vivo Behandlung sind in Tab. 5 dargestellt. Es zeigte sich, dass die ip-Injektion von anti-IFNγ-Antikörpern während der Infektion keinen Einfluss auf den Verlauf der Pathologie nahm. Sowohl die infizierten Mäuse, die mit PBS, als auch diejenigen, die den Kontroll-Antikörper gespritzt bekamen, unterschieden sich nicht von den Mäusen, die den anti-IFN-γ-Antikörper ip verabreicht bekamen. Alle infizierten Mäuse zeigten unabhängig von der Behandlung am 21. Tag nach der Infektion an beiden Sprunggelenken der Hinterbeine deutliche Schwellungen, die als charakteristisches Zeichen für die Bb-induzierte Arthritis gelten. Allerdings kann nicht ausgeschlossen werden, dass höhere Dosierungen von anti-IFN-γ-Antikörpern einen Effekt auf die Pathologie der Arthritis haben könnten. Ergebnisse Stamm CB17scid inf. Nr. 1 CB17scid inf. Nr. 2 CB17scid inf. Nr. 3 CB17scid inf. Nr. 1 CB17scid inf. Nr. 2 CB17scid inf. Nr. 3 CB17scid inf. Nr. 4 CB17scid inf. Nr. 5 CB17scid inf. Nr. 1 CB17scid inf. Nr. 2 CB17scid inf. Nr. 3 CB17scid inf. Nr. 4 CB17scid ø Nr. 1 CB17scid ø Nr. 2-3 86 Behandlung PBS Tag 9 - Tag 15 ±/(±) Tag 21 +/+ Tag 24 ++/+ Tag 27 ++/+ PBS - (±)/(±) +/+ ++/+ ++/++ PBS - ±/(±) +/+ +/+ ++/++ AntiIFN-γγ ΑΚ AntiIFN-γγ ΑΚ AntiIFN-γγ ΑΚ AntiIFN-γγ ΑΚ AntiIFN-γγ ΑΚ KontrollIgG KontrollIgG KontrollIgG KontrollIgG - -/(±) (±)/± +/+ ++/++ ++/++ - -/(±) +/+ ++/+ ++/++ - (±)/- +/+ ++/++ ++/++ - (±)/- † - (±)/+ +/+ ++/++ ++/++ - ±/± +/+ ++/+ ++/+ - (±)/± +/+ ++/+ ++/++ - (±)/- -/+ +/+ ++/++ - - +/+ ++/+ ++/++ - † - - - - - - Tab. 5 Entwicklung der Arthritis am linken/rechten hinteren Sprunggelenk der Mäuse, rote Beschriftung verdeutlicht das Einsetzen der Arthitis-Charakteristika. Zeichenerklärung: -: normal (keine Arthritis-Anzeichen); (±): Rötung; ±: leichte Schwellung; +: starke Schwellung; ++: extreme Schwellung; †: Maus starb während des Experiments. Kontroll IgG: ChromPure Rat IgG (dianova, Hamburg,Germany). 3.14 Infektion von NOS2-defizienten CB17scid und Rag2-/-/GammaC/Balb-c Mäusen. Um die Rolle von NO bei der Entstehung der Arthritis in diesem Mausmodell zu untersuchen, wurden CB17scid Mäuse mit CB17/NOS2-/- gekreuzt und mit Bb infiziert. Der CB17/NOS2-/- Mausstamm wurde durch Rückkreuzungen des ursprünglichen Mausstammes 129/SvEv x C57Bl/6/NOS2-/- generiert (JD MacMicking et al., 1995). Da die CB17scid/NOS2-/- Tiere sehr anfällig und nicht vermehrungsfähig waren, war es schwierig, genügend Mäuse im gleichen Alter für ein Experiment zu erhalten. Die Infektion wurde sc an der Schwanzwurzel mit 1x103 Bb pro Maus durchgeführt. Im Abstand von 3 bis 5 Tagen wurde die für die Lyme Arthritis typische Schwellung an den Sprunggelenken der Mäuse dokumentiert (Tab. 6). Die Arthritis-Entwicklung wurden in beiden Mausstämmen festgestellt. Allerdings sind die für die durch Bb induzierte Arthritis charakteristischen Schwellungen der Sprunggelenke der infizierten Mäuse bei den CB17scid/NOS2-/- Tieren um wenige Tage verzögert bzw. vermindert aufgetreten (etwa 3 bis 5 Tage). Je eine Maus des Bb suszeptiblen Stammes CB17scid sowie eine Maus des Stammes CB17scid/NOS2-/- Ergebnisse 87 entwickelte keine eindeutige Arthritis. Trotzdem verhinderte die Abwesenheit des Enzymes NOS2 nicht wesentlich die Pathologie der Arthritis. In diesem in vivo Versuch wurden immundefiziente NK-Zellen defiziente Mäuse (Rag2 -/-/GammaC/Balb-c) getestet. Diese Tiere standen nur mit dem genetischen Hintergrund der Balb-c Maus zur Verfügung. Es handelt sich hierbei um einen genetisch sehr nah verwandten Mausstamm von CB17. Diese Mäuse entwickelten nach Bb Infektion eine identische Pathologie wie die CB17scid Tiere. Damit wurde ausgeschlossen, dass NK-Zellen eine wesentliche Rolle bei der Entstehung der Lyme Arthritis spielen. Ergebnisse Stamm 88 Tag 10 Tag 14 Tag 19 Tag 22 Tag 25 Tag 27 Tag 32 - (±)/- +/± +/++ +/++ ++/++ +/++ - (±)/± +/(±) +/+ ++/+ ++/++ ++/++ (±)/- (±)/(±) +/+ ++/+ ++/+ ++/++ ++/+ (±)/- ±/± +/+ ++/+ ++/++ ++/++ +/++ (±)/(±) -/(±) ±/(±) ±/(±) ±/- ±/- +/± - - ±/(±) +/+ ++/+ ++/+ ++/+ - (±)/± +/+ +/+ ++/++ ++/++ ++/++ - - - - - - - CB17scid/ NOS2-/- inf. Nr.1 - -/(±) ±/± +/+ ++/+ ++/++ ++/++ CB17scid/ NOS2-/- inf. Nr.2 - (±)/- - - (±)/- (±)/- (±)/± CB17scid/ NOS2-/- inf. Nr.3 (±)/- - ±/± ++/+ ++/+ ++/+ ++/++ CB17scid/ NOS2-/- inf. Nr.4 - - (±)/- +/- +/- +/- +/+ CB17scid/ NOS2-/- ø Nr.1-3 - - - - - - - CB17scid inf. Nr.1 CB17scid inf Nr.2 CB17scid inf Nr.3 CB17scid inf Nr.4 CB17scid inf Nr.5 CB17scid inf Nr.6 CB17scid inf Nr.7 CB17scid ø Nr.1-3 Rag2-//GammaC/ Balb-c inf. Nr. 1 Rag2-//GammaC/ Balb-c inf. Nr. 2 Rag2-//GammaC/ Balb-c inf. Nr. 3 Rag2-//GammaC/ Balb-c inf. Nr. 4 Rag2-//GammaC/ Balb-c inf. Nr. 5 Rag2-//GammaC/ Balb-c ø (±)/- +/+ ±/+ ++/++ (±)/- (±)/- +/+ ++/++ - (±)/- +/+ +/± - +/+ ±/+ ++/+ - (±)/- ±/± ±/+ - - - - - - - Tab. 6 Entwicklung der Arthritis am linken/rechten hinteren Sprunggelenk der Mäuse, rote Beschriftung verdeutlicht das Einsetzen der Arthitis-Charakteristika. Zeichenerklärung: -: normal (keine Arthritis-Anzeichen); (±): Rötung; ±: leichte Schwellung; +: starke Schwellung; ++: extreme Schwellung. Ergebnisse 89 Wiederum wurde Knochenmark der Tiere nach einer Infektionszeit von 32 Tagen entnommen und zu reifen KMMø ausdifferenziert. Die KMMø der einzelnen infizierten und nicht infizierten Tiere wurden 24 h in Gegenwart von 14C-Arginin kultiviert. Die einzelnen Metaboliten wurden Dünnschichtchromatographisch aufgetrennt. Die Ergebnisse von jeder einzelnen Population ist in Abb. 26 dargestellt. Sie zeigen den Umsatz des Arginins der KMMø ohne einen zusätzlichen Stimulus (Abb. 26). Betrachtet man den Umsatz des Arginins, war die -/- Metabolisierungsaktivität der CB17scid/NOS2 KMMø wesentlich höher als die der CB17scid KMMø. Die erhöhten Werte an Ornithin weisen auf eine gesteigerte Arginase-Aktivität der NOS2-/- KMMø hin. Da diese KMMø auch erhöhte Werte an Citrullin hatten, muss vermutet werden, dass der Harnstoffzyklus eine gesteigerte Aktivität in den NOS2-/- KMMø besitzt. Zusätzlich bewirkte diese erhöhte ArginaseAktivität bzw. Ornithinmenge auch eine höhere Polyamin-Synthese bei den NOS2-/KMMø. Ergebnisse 90 Citrullin Arginin 100 5 80 4 60 3 40 2 20 1 0 0 Spermin Ornithin * p< 0.05 10 30 8 20 6 4 10 2 0 0 Abb. 26 Arginin-Metabolismus von unaktivierten nicht infizierten (Kontr.) und unaktivierten infizierten (inf.) CB17scid (scid) und CB17scid/NOS2-/- KMMø. Die Anzahl der jeweiligen Symbole entspricht der Anzahl der Mäuse je Gruppe. Die Infektionszeit der Mäuse mit Bb betrug 32 Tage. Die Signifikanz wurde mit dem students-t-Test errechnet. Diskussion 91 4. Diskussion 4.1 Vergleich der Effektorfunktionen von KMMø der Mausstämme CB17 und C57Bl/6 Einer der Ausgangspunkte für die vorliegende Dissertationsarbeit war der Befund, dass sich immundefiziente Mäuse je nach ihrem genetischen Hintergrund entweder resistent (C57Bl/6/Rag2-/-) oder aber suszeptibel (CB17scid) bezüglich einer BbInfektion verhalten. Dieses arthritische Mausmodell stellte eine einzigartige Möglichkeit dar, da durch das Fehlen des kompletten lymphatischen Immunsystems die Pathologie oder Resistenz ausschliesslich auf Interaktionen zwischen den Partnern des angeborenen Immunsystems und dem Pathogen zurückzuführen sind. Im Normalfall wird die Funktion der Makrophagen nicht nur durch die eindringenden Pathogene bestimmt, sondern durch Zellen des erworbenen Immunsystems moduliert. Da in den arthritischen Läsionen der suszeptiblen Mäuse grosse Ansammlungen von Mø zu finden sind (UE Schaible et al., 1990), war die logische Schlussfolgerung für diese Arbeit das Verhalten von KMMø der beiden Mausstämme in vitro nach BbAktivierung zu untersuchen. Verschiedene Effektorfunktionen der KMMø, die in inflammatorischen Prozessen beteiligt sind, sollten Aufschluss geben, wieso im einen Fall (CB17scid) die Ausbildung einer chronischen Arthritis stattfindet und warum im anderen Fall (C57Bl/6/Rag2-/-) eine Infektion nicht zur Manifestation einer Arthritis führt. Zunächst wurde die Fähigkeit überprüft mit der KMMø der beiden Mausstämme, in vitro nach Phagozytose der Spirochäten, Superoxidanionen synthetisieren können. Diese Radikale sind in vielen inflammatorischen Prozessen inklusive der Arthritis beteiligt (U. Skaleric et al., 1991). Als Kontrollstimulus für diesen Prozess wurde Zymosan bzw. opsonisiertes Zymosan verwendet um eine optimale Antort zu erzeugen. Die Ergebnisse von Abb. 1 A und Abb. 1 B zeigen, dass die KMMø des empfindlichen Mausstammes eine gesteigerte SuperoxidanionenSynthese gegenüber dem resistenten Mausstamm aufweisen. Da dieses Phänomen für alle Agonisten zutraf, muss man davon ausgehen, dass die NADPH-Oxidase Aktivität der CB17 KMMø höher als die der KMMø des Mausstammes C57Bl/6 ist. Dies war der erste Hinweis auf eine höhere inflammatorische Antwort des suszeptiblen Mausstammes. Ein weiteres Radikal, das bei der Abwehr und bei inflammatorischen Prozessen beteiligt ist und von Maus-Makrophagen in grossen Mengen produziert werden kann, ist das Stickstoffmonoxid (Abb. 2). Diskussion 92 Im Gegensatz zu O2- muss das Enzym welches NO synthetisiert durch einen adäquaten Stimulus induziert werden. Da Borrelien wie auch andere Pathogene diese Fähigkeit besitzen (M. Modolell et al., 1994) wurde die Induktion von NOS2 bzw. die NO-Synthese bei beiden Mausstämmen nach unterschiedlichen Aktivierungen untersucht. Die gemessenen Mengen an Nitrit, dem stabilen Endprodukt von NO, im Kulturüberstand, zeigten deutlich, dass auch bei diesem Effektormolekül KMMø des CB17 Mausstammes deutlich reaktiver waren als die KMMø des Mausstammes C57Bl/6. Die Mengen an gebildetem NO nach Aktivierung mit Bb deuten besonders bei den C57Bl/6 KMMø dauraufhin, dass nur hohe Bb-Konzentrationen (10 Bb/Mø) eine ausreichende Stimulation bewirken. Eine Aktivierung mit 1 oder 5 Bb/Mø erzeugte bei diesem Mausstamm, im Gegensatz zu den KMMø des CB17 Mausstammes, nur ein ungenügendes Signal, was in einer schwachen Induktion von NOS2 sichtbar wurde. Besonders auffällig war, dass die KMMø der resistenten Mäuse im Gegensatz zu den KMMø der suszeptiblen Mäuse, praktisch anergisch gegenüber kleinen Spirochäten-Mengen reagierten (Abb. 2). Dies wird auch in ihrer sehr niedrigen Citrullinsynthese reflektiert (Abb. 15). Dieses Verhalten ist bemerkenswert, da sowohl während der Infektionen als auch während der Entwicklung der Pathologie die Anzahl der Borrelien im Organismus sehr niedrig bleibt. Auch die Teilungsraten der Bb ist sehr niedrig (FR Wallach et al., 1993) , so dass hohe Verhältnisse von Makrophagen zu Spirochäten wie 1:10 in der natürlichen Infektion praktisch nie vorkommen. Dieser Unterschied kann aber nicht allein für die Resistenz bzw. Empfindlichkeit verantwortlich sein, da wie in Tab. 6 gezeigt wurde, NOS2-defiziente CB17scid Mäuse trotz langsamerer Entwicklung nicht vor der Arthritisbildung geschützt waren. Ebenso zeigte CR Brown et al. (1999) dass die Anwesenheit von NOS2 bei immunkompetenten Mäusen für die Entstehung der Lyme Arthritis nicht notwendig war. Ein weiteres Effektormolekül, das im Zusammenhang mit den beiden Radikalen NO und Superoxid steht, ist das Anion Peroxynitirit (ONOO-), das durch eine Reaktion der beiden oben genannten Radikalen entstehen soll. Dieses mehrmals postulierte Effektormolekül der Makrophagen, welches bei inflammatorischen und zytotoxischen Prozessen eine Rolle spielen soll, kann für die Entstehung der Lyme Arthritis aus den oben genannten Gründen ausgeschlossen werden. Makrophagen steuern die entzündlichen bzw. Abwehrprozesse nicht nur durch die Produktion von Effektormolekülen, sondern auch auf indirekte Weise indem sie eine Diskussion 93 ganze Reihe von Botenstoffen (Zytokine, Chemokine) sezernieren. Diese Stoffe aktivieren andere Zellen wie Fibroblasten, Granulozyten etc. um auch diese am entzündlichen Prozess zu beteiligen. Als eines der ersten wichtigen proinflammatorischen Zytokine wurde die Synthese von TNF-α analysiert. Qualitativ unterschieden sich die KMMø der beiden Mausstämme auf transkriptioneller Ebene nicht (Abb. 3). In beiden Zellpopulationen liess sich bereits 6 h nach Phagozytose der Spirochäten TNF-α mRNA nachweisen. Erst durch die quantitative Analyse des sezernierten Proteins konnten Unterschiede zwischen den beiden Mausstämmen festgestellt werden. Die Induktion nach Aktivierung mit lebenden Borrelien war im resistenten Stamm 4 bis 6 mal niedriger (Abb. 4). Diese Unterschiede zeigten sich auch, allerdings in kleinerem Mass (ca. 50%), wenn die KMMø mit den löslichen Agonisten lipOspA oder LPS aktiviert wurden. Da TNF-α ein Ko-Induktor der NOS2 in Makrophagen ist, kann die gesteigerte TNF-α Produktion der CB17 KMMø auch für die gesteigerte NO-Synthese der CB17 Makrophagen nach Borrelien-Phagozytose verantwortlich sein. Auch bei der Sezernierung von TNF-α zeigte sich eine sehr schwache Antwort bei den C57Bl/6 KMMø wenn niedrige Pathogenmengen zur Aktivierung benutzt wurden (Abb. 4). Ein weiteres pro-inflammatorisches Zytokin, welches von Makrophagen nach Aktivierung mit Pathogenen sezerniert wird, ist IL-12. Dieses Zytokin ist für die Aktivierung von NK-Zellen und T-Lymphozyten verantwortlich und polarisiert diese Zellen zu einer zytotoxisch inflammatorischen Immunantwort des Types 1. Die bioaktive Form des IL-12 ist ein Heterodimer aus einer konstitutiven p35 und einer induzierbaren p40 Untereinheit. Untersucht wurde sowohl die IL-12p40 Sezernierung als auch das aktive Heterodimer IL-12p75. Auf der Ebene der mRNA konnten keine Unterschiede zwischen den beiden Mausstämmen festgestellt werden. Bei der Synthese der Untereinheit p40 zeigten die resistenten Mäuse eine schnellere Antwort als die KMMø der suszeptiblen Mäuse. Nach 24 h waren die akkumulierten Mengen nach Aktivierung bei beiden Mausstämmen praktisch identisch (Abb. 6 B). Die höheren Mengen an IL-12p40 bei niedrigen Pathogendosen, können auf die negativ regulierende Wirkung von NO zurück geführt werden (A. Diefenbach et al., 1999). Einen deutlichen qualitativen Unterschied gab es in der Antwort des gebildeten bioaktiven Heterodimers IL-12p75, das erst nach 72 h nachweisbar war (Abb. 6 C). So konnte bei den C57Bl/6 KMMø kein IL-12p75 detektiert werden, wohl aber bei Diskussion 94 den KMMø des empfindlichen CB17 Mausstammes. Hier zeigte sich zum ersten mal ein qualitativer Unterschied zwischen den beiden Mausstämmen. Das nächste Zytokin, das untersucht werden sollte, war IL-18. Da es zusammen mit IL-12 in einer ganzen Reihe von Zellen des Immunsystems wie Lymphozyten, NK aber auch Makrophagen, die Synthese von IFN-γ bewirkt. Die Sezernierung proinflammatorischer Zytokine stellt in der Arhtritis einen zentralen Faktor während der Ausbildung der Pathologie dar, neben IFN-γ (A. Keane-Myers et al., 1995), TNF-α (KP Machold et al., 2003), und IL-12 (S. Trembleau et al., 1995), wird dem Zytokin IL-18 ebenso eine proinflammatorische Rolle bei der rheumatoiden Arhtritis zugeordnet (JA Gracie et al., 1999). IL-18 wird aber konstitutiv als Pro-Zytokin von den Makrophagen synthetisiert. Es war mit den handelsüblichen Testsystemen nicht möglich, das Protein in seiner aktiven Form zu detektieren. Da die posttranslationelle Prozessierung durch die substratspezifische Protease Caspase-1 stellt den entscheidenden Schritt bei der Umwandlung des IL-18 in die aktive Form dar. Aus diesem Grund wurde die Aktivität dieses Enzyms, welches neben IL-18 auch IL-1β in die aktive Form umwandelt, in beiden Makrophagenpopulationen untersucht. Die Makrophagen beider Mausstämme zeigten nach Aktivierung eine gesteigerte Aktivität des Enzyms. Allerdings zum ersten mal, war eine gesteigerte Aktivität bei den KMMø des resistenten Mausstammes zu beobachten. Dieses Phänomen kann anhand der Befunde von F. Obermeier et al. (1999) und Y-M Kim et al. (1998) erklärt werden. Sie zeigten, dass NO die Caspase-1 inhibiert und so die Bildung und Sezernierung von IL-18 und IL-1β unterbunden werden kann. Diese Ergebnisse stimmen mit Abb. 2 und Abb. 8 überein, denn die hohen NO-Werte, die von CB17 KMMø nach einer Aktivierung mit Bb erzielt werden, erniedrigen deutlich die Caspase-Aktivitiät dieser KMMø im Vergleich mit den KMMø des Mausstammes C57Bl/6. Desweiteren zeigt sich in Abb. 9 die Steigerung der Caspase-Aktivität in NOS2-defizienten KMMø der beiden Mausstämme. Somit reguliert die durch die Spirochäten induzierte NOS2 die Caspase-1 Aktivität und damit indirekt auch die Fähigkeit der KMMø IL-18 oder IL1β zu sezernieren. Als letztes pro-inflammatorisches Zytokin wurde schliesslich die Bildung von IFN-γ nach adäquater Aktivierung von KMMø untersucht (Abb. 7; Abb. 11; Abb. 12 B). Diese Untersuchungen, dass KMMø nach einer Aktivierungskombination der beiden Zytokine IL-12 und IL-18 hohe Mengen an IFN-γ sezernieren standen im Kontext mit Diskussion 95 M. Munder et al., 1998, und meiner Diplomarbeit (Diplomarbeit: Untersuchung zur Rolle der Makrophagen bei Lyme Borreliose). In der vorliegenden Arbeit konnte gezeigt werden, dass IL-12 durch die Aktivierung mit Bb substituiert werden kann, nicht aber das Zytokin IL-18 (Abb. 7). Die KMMø des resistenten Mausstammes produzierten deutlich geringere IFN-γ Mengen als die KMMø des suszeptiblen Mausstammes CB17. Desweiteren konnte gezeigt werden, dass geringere Pathogenmengen in Kombination mit IL-18 eine höhere IFN-γ Synthese induzieren als hohe Dosen des Pathogens in Kombination mit IL-18 (Abb. 7). Diese Experimente führten zu dem wichtigen Befund, dass NO die Synthese von IFN-γ hemmt. Die wurde anhand der Experimenten aus Abb. 11 und Abb. 12 dargestellt. Die Blockierung bzw. Defizienz der NOS2 ermöglichte eine gesteigerte Produktion von IFN-γ der KMMø in vitro (Abb. 11; Abb. 12). Wurden dem System mit Hilfe von NO-Donoren zusätzlich NO Mengen zugeführt, wurde im Gegenzug die Synthese von IFN-γ inhibiert (Abb. 12). Die Zugabe von NOS2 abhängigen Metaboliten wie Hydroxyarginin, Citrullin, Nitrit oder Nitrat hatte keine Auswirkungen auf die IFN-γ Sezernierung (Abb. 12). Zusammenfassend lässt sich sagen, dass NO die Produktion von IFN-γ regulieren bzw. inhibieren kann. Das kann als schützender Mechanismus interpretiert werden, da das synthetisierte IFN-γ die NOS2 immer weiter stimuliert und extrem hohe NO Konzentrationen zu Gewebeschäden bzw. Apoptosis führen können (J Xaus et al., 2001 und S Heigold et al., 2002). IFN-γ gehört zu einem der wichtigsten Mediatoren in der Immunität, doch sobald die IFN-γ Produktion unreguliert ist, können zahlreiche Autoimmunerkrankungen wie Morbus Crohn entstehen. Die Möglichkeit einer anti-IFN-γ AK Therapie wurde in verschiedenen TH1 Autoimmunerkrankungen bereits getestet, doch nur teilweise konnten erfolgsversprechende Ergebnisse erzielt werden (B. Skurkovich et al., 2003). Da es sich bei der durch Bb induzierten Arhtritis um eine TH1 (IFN-γ) polarisierte Immunantwort handelt (U. Hurtenbach et al., 1995; F. Ganapamo et al., 2001) und in vitro die Synthese von IFN-γ nach adäquater Aktivierung von KMMø nachweisbar war (Abb. 7), sollte in vivo die Bedeutung von IFN-γ während der Entstehung der Pathologie der Arthritis bei dem immundefizienten Bb-suszeptiblen Mausstamm CB17scid untersucht werden. Bei Infektionsversuchen mit immunkompetenten IFN-γ Rezeptor defizienten Mäusen, konnte kein Unterschied in der Entwicklung der Lyme Arthritis beobachtet werden. L. Glickstein et al. postulierten daraufhin, dass IFN-γ weder für die Bildung der Resistenz gegenüber Arthritis noch für eine effektive Immunantwort gegen Bb benötigt wird (L. Glickstein et al., 2001). Versuche mit Diskussion 96 immunkompetenten Mäusen konnten somit keine eindeutige Rolle für IFN-γ in der Lyme Arthritis zeigen. Da aber andererseits vorläufige Daten existieren, (M Taube et al., 1999) dass die Injektion von IFN-γ in CB17scid Mäusen Arthritis induziert, wurden in den CB17scid Mäuse Versuche durchgeführt, bei denen die infizierten Tiere mit anti-IFN-γ Antikörper behandelt wurden. Kommt es zu einer Verzögerung der Arhtritis, da die Bildung des pro-inflammatorischen Zytokins IFN-γ durch den anti-IFN-γ AK eingeschränkt ist, oder findet eine Beschleunigung der Bildung der pathologischen Anzeichen statt, da auch die Schutzfunktion, die durch IFN-γ gewährleistet ist, dem System genommen wird? Die Arthritisentwicklung (Tab. 5) konnte in diesem Mausmodell, durch die ip Gabe von 100 µg anti-IFN-γ AK (im 3 Tages Rhythmus) nicht beeinflusst werden, obwohl es sich um einen AK handelt, der in vivo wirksam ist (M. Prat et al., 1987). Es ist nicht auszuschliessen, dass eine höhere anti-IFN-γ AK-Dosis eine Veränderung in der Entwicklung der Arthritis auslösen könnte. 4.2 Die Rolle von NO auf die Entwicklung der Bb induzierten Arthritis in vivo Die bisherigen Ergebnisse uber die Rolle von NO in der Lyme Arthritis ist zweideutig. Einerseits wurde beschrieben, dass NO an der Abtötung der Spirochäten durch Makrophagen beteiligt ist (M Modolell et al., 1994b) andererseits in vivo Versuche mit immunkompetenten Mäusen haben ausgeschlossen, dass NOS2 weder an der Entstehung der Arthritis noch für die Resistenzausbildung notwendig ist (CR Brown et al., 1999). Trotzdem blieb die Frage offen, in wie fern diese Aussage für immundefizienten Mäusen gültig ist. Durch Rückkreuzungen wurde die NOS2Defizienz auf C57Bl/6 und CB17 übertragen. Die CB17scidNOS2-/- Mäusen sollten die Rolle von NO bei der Entstehung der Arthritis geben, die C57Bl/6/Rag2-/-NOS2-/sollten eine Aussage über die Resistenz gegenüber einer Bb-Infektion machen. Es tauchten bei diesem Versuchsansatz mehrere schwerwiegende Probleme. Erstens, im Fall der CB17scid, war es nicht möglich vermehrungsfähige Mäuse mit beiden defekten zu erhalten. Die in Tabelle 6 erzielten Ergebnisse wurden aus der Kreuzung zwischen CB17scid mit CB17NOS2-/- selektioniert. Alle Tiere die den doppelten Defekt trugen, wurden im Experiment verwendet. Im Fall von C57Bl/6/Rag2-/- wurde der gleiche Ansatz durchgeführt, also eine Kreuzung von C57Bl/6/Rag2-/- mit C57Bl/6 NOS2-/-. Es wurden ausschliesslich Tiere geboren, die keinen oder nur noch einen der Defekte besassen Die Anzahl der geborenen Tiere mit dem doppelten Diskussion 97 Defekt war weit unter dem erwarteten Prozentsatz (50%), wurde spontan krank und starb nach kurzer Zeit. Aus diesem Grund konnte die Rolle von NO bei der Resistenz gegen Bb in vivo nicht beantwortet werden. So dass die Jungtiere waren selbst im Isolator nur über eine kurze Dauer lebensfähig. Wahrscheinlich war der Grund dafür die ohnehin schon geringe Reaktivität der Wildtyp C57Bl/6 KMMø (Abb. 1; Abb. 2; Abb. 4; Abb. 6 C; Abb. 7) mit der nun zusätzlichen NOS2-Defizienz, so dass die Kombination von Immundefizienz (Rag2-/-), schwächere Reaktivität der KMMø und NOS2 -/- ein Überleben für diesen Mausstamm im höchsten Mass erschweren und selbst in pathogenfreier Umgebung (fast) unmöglich machen. Die Entwicklung der Arthritis von CB17scid/NOS2-/- Mäusen unterscheidet sich nicht wesentlich von den NOS2+/+ Kontrollmäusen (CB17scid). Eine zusätzliche NOS2Defizienz bietet keinen Schutz gegenüber der Ausbildung der für Bb-typischen arthritischen Sprunggelenke. Es deutet sich durch die NOS2-Defizienz eine leichte Verzögerung der optisch erkennbaren Arthritis-Merkmalen von 2-3 Tagen an (an Tag 19), die aber nicht von grosser Bedeutung sein kann, da am Tag 29 kein Unterschied mehr zwischen den beiden Mausstämmen ersichtlich war. Obwohl es viele Veröffentlichungen für andere Pathologien gibt, die den therapeutischen Nutzen von NOS2-Inhibitoren (NOS2-Defizienzen in vivo) hervorheben (N. McCartney-Francis et al., 1993; M. Stefanovic-Racic et al., 1994; JE Ogden et al., 1995) bestätigt das in dieser Arbeit genutzte Mausmodell den Nutzen einer NOS2-Defizienz nicht. Die erzielten Ergebnisse aus Tabelle 6 zeigen, dass NO in immundefizienten Mäusen bei der Entstehung der Lyme Arthritis in diesem Mausmodell keine oder aber höchstens eine untergeordnete Rolle spielt. Auch in immunkompetenten Bb suszeptiblen Tieren des Mausstammes C3H/HeJ konnte die Defizienz von NOS2 die Entwicklung der Lyme Arthritis nicht verhindern. 4.3 Die Rolle von NOS2 und Arginase Seit der Klonierung der induzierbaren NO-Synthase (NOS2) im Jahre 1992 durch Lowenstein et al. und Xie et al., steigerte sich die Bedeutung dieses Effektormoleküls in unterschiedlichen biologischen und medizinischen Disziplinen. Im Jahre 1999 bekam das Molekül NO besondere Beachtung in der immunologischen Forschung. Es war schon seit längerem bekannt, dass NO eine potente antimikrobielle Wirkung hat wie z.B. die Fähigkeit Parasiten wie Schistosoma mansoni zu zerstören, doch war gleichzeitig auch das gewebeschädigende Potenzials des Stickstoffmonoxides nicht zu unterschätzen. Allerdings rückte nun das allgemeine Interesse des Moleküls NO Diskussion 98 immer mehr in Richtung des immuno-modulatorischen Aspektes. Man wollte herausfinden, welche Konzentrationen von NO fördernd bzw. schädigend für den Organismus bzw. entscheidend für den chronischen Verlauf einer Krankheit waren. Ausserdem war immer wieder die Regulation der NOS2 in den Vordergrund gedrungen, denn man fand zwar Zytokine und Agonisten mit denen das Enzym NOS2 induziert werden konnte, doch wusste man nicht wie das aktive Enzym wieder in die nichtinduzierte Form zurück gebracht werden konnte. In der vorliegenden Arbeit wurde deshalb dem Molekül NO als Modulator während einer Infektion eine besondere Bedeutung zugeordnet. Insbesondere mit Experimenten, die Aufschluss über den Arginin-Metabolismus von aktivierten KMMø gaben, konnte die Rolle von NOS2 und der Arginase untersucht werden. Es war bereits seit längerem bekannt, dass es der Arginin-Stoffwechsel muriner über zwei unterschiedliche Wege laufen kann. Eine NOS2 Induktion findet mit TH1 Zytokinen statt, wohingegen TH2 Zytokine zu einer alternativen Makrophagen-Aktivierung führen, dabei ist die Induktion der Arginase-I eines der Hauptmerkmale dieser Aktivierung. Beide Wege werden reziprok reguliert. Die Induktoren der NOS2 (TH1 Zytokine) supprimieren die Arginase und umgekehrt, TH2 Zytokine sind Suppressoren der NOS2. Desweiteren konnte gezeigt werden, dass Produkte des einen Stoffwechselweges zu einer Suppression des anderen führen. So blockiert beispielsweise Hydroxyarginin, ein Produkt des NOS2-Abbauweges die Arginase-Aktivität muriner Makrophagen (JL Boucher et al., 1994). Desweiteren führt auch Nitrit, ein stabiles NO-Produkt, zur Hemmung der Arginase-Aktivität (A. Hrabak et al., 1996) Andererseits hemmt sowohl das Polyamin Spermin wie auch Harnstoff (Produkte des ArginaseMetabolismus) die Induktion von NOS2 (GJ Southan et al., 1994; SS Prabhakar et al., 1997). Zusätzlich findet eine Kompetition um das gemeinsame Substrat Arginin statt. Dies alles bewirkt, dass der Makrophage die Tendenz hat, einen der beiden Wege zu bevorzugen. Andererseits, induzieren bakterielle Produkte, LPS oder ganze Mikroorganismen beide Wege. In Abb. 15 wurde der gesamte Arginin-Stoffwechsel beider Mausstämme nach Bb-Aktivierung näher untersucht. Auffällig war zunächst, dass der Grundumsatz des Arginin-Stoffwechsels bei nicht aktivierten KMMø im suszeptiblen Mausstamm CB17 fast doppelt so hoch wie beim resistenten Mausstamm C57Bl/6 war. Das Enzym, welches für den Grundumsatz zuständig ist, ist die Arginase-II, die konstitutiv in KMMø exprimiert wird (M. Munder et al., 1999) und die für die Synthese von Ornithin und dessen Umwandlung in Polyamine (Spermin) oder Citrullin via Harnstoffzyklus verantwortlich ist (Abb. 13). Die Aktivierung Diskussion 99 dieser Makrophagen-Populationen mit steigenden Mengen an Spirochäten, zeigt ein noch differenzierteres Bild zwischen den beiden Mausstämmen. Der Abbau des Arginins wird im empfindlichen Mausstamm CB17 in viel höherem Mass induziert. Der empfindliche Mausstamm zeigte eine massive Pathogendosis abhängige Bildung von Citrullin, einem der Endprodukte der NOS2, im Gegensatz zu den resistenten KMMo des Mausstammes C57Bl/6, die nur eine sehr schwache Akkumulation dieses Produktes zeigten. Der Unterschied zwischen den beiden Mausstämmen beim alternativen Stoffwechselweg via Arginase war weniger ausgeprägt, obwohl der empfindliche Mausstamm fast immer doppelt soviel der Metaboliten synthetisierte (Ornithin, Polyamine) wie der resistente Mausstamm C57Bl/6. Die Aktivierung der KMMø mit dem löslichen Lipoprotein lipOspA zeigte im Gegensatz zu der Aktivierung mit lebenden Spirochäten eine viel höhere Antwort sowie eine Verkleinerung der Unterschiede in beiden Mausstämmen. Diese unterschiedliche Reaktivität im Fall der Aktivierung mit Spirochäten ist somit nicht auf Unterschiede bei der Erkennung des Pathogens über TLR-2 zurück zu führen. 4.4 Effekt der Lyme Borreliose der Maus auf die Funktion von KMMø In diesem Teil der Dissertationsarbeit sollte untersucht werden, ob die Pathologie Lyme Borreliose bei Mäusen eine Wirkung auf die aus dem Knochenmark heranreifenden KMMø hat. Zu diesem Zweck wurde das Knochenmark ausschliesslich von einzelnen CB17scid Mäuse mit vollständig entwickelten arthrtitischen Läsionen verwendet (Tab. 3, Tab. 4). Beim Vergleich der beiden Makrophagen-Populationen (von infizierten bzw. nicht infizierten Tieren) wurde beobachtet, dass die Infektion zu einer Unterdrückung der zytotoxischen Fähigkeit der KMMø und auch zu einer eingeschränkten NO-Synthese führte, sobald lipOspA als Agonist verwendet wurde. Die Makrophagen der infizierten Tiere hatten aber keine generelle Unterdrückung der Reaktivität, da LPS oder LPS + IFN-γ zu einer gesteigerten NO-Synthese führte (Abb. 24 B). Interessanterweise zeigten die KMMø der infizierten Mäuse eine viel höhere Reaktivität der Antwort in Richtung der Induktion der Arginase. Dieses deutet auf eine Verschiebung des Phänotypes der Makrophagen zugunsten einer alternativen Aktivierung hin. Diese alternative Aktivierung der KMMø wird im Zusammenhang mit anti-inflammatorischen Prozessen. Betrachtet man die Ergebnisse aus Abb. 24 A und Abb. 24 B könnte man die Ausbildung einer Toleranz gegenüber dem Lipoprotein lipOspA vermuten, die Diskussion 100 durch die Herunterregulation des TLR-2 erklärt werden könnte (JH Wang et al., 2002), da aber die Arginase-Aktivität in den KMMø der infizierten Tiere gesteigert war, unabhängig vom Agonisten (Abb. 24 C), kann es sich nicht verminderte Expression des TLR2 handeln. Da die Arginase via cAMP/PKA induziert wird (IM Corraliza et al., 1997), kann vermutet werden, dass die KMMø aus Bb-infizierten Mäusen nach in vitro Aktivierung mit Bb, LPS oder lipOspA eine erhöhte Signalisierung via cAMP aufweisen. Dieser Weg der Signaltransduktion ist in antiinflammatorischen Prozessen der Maus beteiligt. Desweiteren ist die erhöhte Bereitschaft dieser Makrophagen das Enzym Arginase zu exprimieren, ein Zeichen ihrer Fähigkeit Prolin (SN Waddington et al., 1998) zu synthetisieren. Diese Aminosäure ist wiederum einer der wichtigsten Bestandteile des Kollagens was unabdingbar mit Geweberegenerations- und Wundheilungsprozessen (JE Albina et al., 1990) verbunden ist. Die in vivo Polarisierung der Makrophagen durch die Infektion mit Bb wurde versucht in ein in vitro Modell zu übertragen. In diesem Fall wurden die Funktionsfähigkeit von KMMø der beiden Mausstämme CB17 und C57Bl/6 analysiert, deren gesunde Knochenmarkzellen in Gegenwart von kleinen Mengen von LPS, lipOspA oder der gesamte Spirochäte gezüchtet ( 3.9). Die Gegenwart der bakteriellen Produkte führte zu einer Verminderung der Proliferation der KMMø (Tab. 15 B) (J Xaus et al., 2001), und zu einer erhöhten Grundaktivität an Arginase. Insbesondere die lipOspAVorbehandlung erhöhte die Antwort der CB17 KMMø in Richtung Arginase (Abb. 22 D). Bei der NO-Syntheseleistung beider KMMø-Populationen wurden unabhängig vom Mausstamm und Agonisten durch die LipOspA-Vorbehandlung gehemmt (Abb. 21 D). Die Vorbehandlung mit LPS bewirkte das Gegenteil, in beiden Mausstämmen wurden grossen Mengen an NO produziert (Abb. 21 B). Sogar eine Aktivierung mit der Zytokinkombination IL-12 + IL-18 induzierte NOS2. Betrachtet man nun die Bildung des pro-inflammatorischen Zytokins TNF-α in Abb. 20 (A, B, C und D) mit den veröffentlichten Ergebnissen von JH. Wang et al (2003), ist übereinstimmend die LPS-Tolerance in Abb. 20 B bei den KMMø des Mausstammes CB17, doch nicht bei den KMMø des Mausstammes C57Bl/6 erkennbar. Die von Wang et al. postulierte LPS-unabhängige durch bakterielle Lipoproteine (BLP) induzierte LPS-Tolerance kann mit dem Lipoprotein lipOspA von Borrelia burgdorferi nicht erzielt werden (Abb 20 D). Diskussion 101 Ausgangspunkt für einen Versuch dieser Art waren Erkenntnisse über die induzierbare LPS Toleranz bei Mäusen. Greisman et al. (1964) konnten zeigen, dass die Injektion einer geringen (sublethalen) Menge an LPS Mäuse bei einer zweiten lethalen Injektion mit LPS vor dem endotoxischen Schock schützt. Dieses Unvermögen (oder Schutzverhalten) auf die zweite LPS Aktivierung zu antworten, wurde daraufhin als LPS bzw. Endotoxin-Toleranz bezeichnet. Die LPS Toleranz ist eine adaptive Wirtantwort, die höchstwahrscheinlich einen wichtigen regulatorischen Prozess bei Infektionen mit gram-positiven Bakterien darstellt. Es wurde lange Zeit vermutet, dass der Grund für diese Toleranz, die Herunterregulierung des LPSRezeptors (TLR4/MD2) oder eine erniedrigte Aktivierung des Transkriptionsfaktors NF-κB sein könnte (F. Nomura et al., 2000; HW Ziegler-Heitbrock et al., 1994). Doch neue Ergebnisse unterstreichen immer mehr die Bedeutung des Proteins SOCS-1 (suppressor of cytokine signaling) um das Phänomen der LPS-Toleranz zu erklären. SOCS-1 ist unter anderem ein Schlüsselmolekül der durch IFN-γ ausgelösten Signalwege, denn SOCS-1 ist ein negative Regulator der IFN-γ Signalkette (WS Alexander et al., 1999). SOCS-1 blockiert gezielt phosphorylierte Tyrosinreste des IFN-γ Rezeptors und reguliert bzw. inhibiert auf diese Weise den STAT/JAK Signaltransduktionsweg, der durch die Bindung des Zytokins an den Rezeptor ausgelöst wird. Die Expression von SOCS-1 wird durch IFN-γ induziert. Aus diesem Grund spielt SOCS-1 nicht nur eine Rolle bei der LPS-Toleranz, sondern auch in der Verhinderung von STAT-1 induzierter Apoptose. Physiologisch könnte SOCS-1 eine bedeutende Funktion bei der Entwicklung einer chronischen Entzündung haben (H. Yasukawa et al., 2000). Wird die Bildung (pro-) inflammatorischer Zytokine wie TNF-α oder IFN- γ nicht negativ reguliert, kommt es zu fatalen lethalen pathologischen Zuständen ( endotoxischer Schock bzw. Tod). Betrachtet man nun Abb. 20 B, wird deutlich, dass die (in Gegenwart von LPS gereiften) C57Bl/6 KMMø nicht in der Lage sind die sezernierte TNF-α Menge nach LPS Aktivierung zu regulieren, im Gegensatz dazu sezernieren die in Gegenwart von LPS gereiften CB17 KMMø nach Aktivierung mit LPS deutlich geringere Mengen an TNF-α (als die Kontrolle in Abb. 20 A) was auf ein Toleranzverhalten hindeutet. Es könnte bedeuten, dass die SOCS-1 Wirkung bei C57Bl/6 KMMø nicht ausreichend funktioniert. Vergleicht man die Ergebnisse von Abb. 20 C und Abb. 20 D mit Abb. 20 A, zeigt sich, CB17 KMMø, die in Gegenwart von Bb oder lipOspA gereift waren, die Produktionsmenge von TNF-α nach Aktivierung mit LPS noch steigern, denn es handelt sich um jeweils zwei unterschiedliche Agonisten, deshalb gibt es keinen Diskussion 102 Grund für eine Toleranzausbildung. Auf die KMMø des Mausstammes C57Bl/6 nimmt das Aktivierungsschema mit zwei unterschiedlichen Agonisten keinen Einfluss. Auf die Rolle der unterschiedlichen toll-like Rezeptoren (TLR), die für die Erkennung der Bestandteile von Bb erforderlich sind, wurde in dieser Arbeit nicht eingegangen. Trotzdem kann anhand der vorliegenden Daten eine Beteiligung von TLR2 im Resistenz/Toleranz-System aus folgendem Grund ausgeschlossen werden. TLR2 ist für die Erkennung bakterieller Lipoproteine (z. B. lipOspA) zuständig (M. Hirschfeld et al., 1999). Betrachtet man die Veränderungen des Argininmetabolismus induziert durch lebende Spirochäten oder aber durch lipOspA, fällt auf, dass die grossen Unterschiede bei NO-Synthese (Abb. 2) und Arginin-Umsatz (Abb. 15) zwischen den beiden Mausstämmen nur bei Aktivierung mit Bb auftreten. Bei einer Aktivierung mit lipOspA, die ausschliesslich über TLR2 stattfindet, sind die Unterschiede zwischen den beiden Mausstämmen sehr gering. Beleuchtet man unter diesem Aspekt das in vivo Modell, könnte das Ausbleiben der Pathologie bei der resistenten C57Bl/6/Rag2-/- Maus darauf zurück zu führen sein, dass dieser Mausstamm nur schwach auf die vorhandene Pathogenkonzentration während der Infektion reagiert. Es ist schwierig Bb in infizierten Tieren nachzuweisen, denn es gibt nur selten Bakteriämien, so dass die Ausbildung einer Pathologie nicht davon abhängt wieviele Bakterien den Organismus befallen haben, sondern wie sensitiv (bzw. resistent) der Organismus immunologisch antwortet. Somit bedeutet die reaktive, sehr starke Antwort der CB17 KMMø auf Bb Stimulation evt. eine Überreaktion, die im weiteren Verlauf den Ausgangspunkt für die chronische Entwicklung der Arthritis darstellen könnte. In diesem Fall würde die Entscheidung, ob es zur Entstehung der Pathologie der Lyme Borreliose kommt (oder nicht), grundlegend mit der Reaktionsfähigkeit von Makrophagen zusammenhängen. Die Ausbildung einer Resistenz gegenüber eines persistierenden Pathogens kann beispielsweise in endemischen Malaria-Gebieten beobachtet werden. Erwachsene, die bereits über Jahre ständig mit dem Parasiten in Berührung gekommen sind, zeigen eine Anergie gegen Plasmodium falciparum, d.h. die die Pathologie der malaria Malaria tritt nicht auf, obwohl es immer wieder zu neuen Infektionen kommt. In diesen Gebieten herrscht allerdings eine hohe Kindersterberate an Malaria, da die Makrophagen der infizierten Kinder in hohem Masse TNF-α sezernieren, was Diskussion 103 schliesslich zu der gefürchteten Zerebral-Malaria führt (W. McGuire et al., 1994; G. Turner et al., 1997). Es konnte gezeigt werden, dass anti-Malaria Medikamente (z. B. Chloroquin) nicht nur die Abtötung der Parasiten bewirken, sondern auch die Effektorfunktionen von Monozyten/Makrophagen beeinflussen (JY Jeong et al., 1997). Zusammenfassung der Arbeit 104 5. Zusammenfassung der Arbeit Die Verwendung von immundefizienten Mäusen erlaubte die Rolle der Makrophagen bei der Entstehung der Lyme Arthritis bzw. der Resistenz gegenüber dem Pathogen zu untersuchen. Nachdem im Laufe der Arbeit auch der Mausstamm Rag2 -//GammaC/Balb-c zur Verfügung stand, konnte eine Rolle der NK-Zellen bei der Entstehung der arthritischen Läsionen in diesem Modell ausgeschlossen werden. Wie im Fall der Lyme Arthritis in immunkompetenten Mäusen konnte nicht ein einzelner Parameter für die Ausbildung der Arthritis bzw. Resistenz identifiziert werden. Wahrscheinlich entscheidet sich die Entstehung der Pathologie oder der Resistenz am Zusammenspiel der verschiedenen Komponenten der Antwort, die durch das Pathogen ausgelöst werden. In der vorliegenden Arbeit konnte nachgewiesen werden, dass die KMMø des resistenten Mausstammes nach Phagozytose der Spirochäten eine viel niedrigere Antwort als die KMMø des empfindlichen Mausstammes aufweisen. Dies betrifft sowohl die Radikalbildung O2-, NO als auch die Produktion der proinflammatorischen Zytokine TNF-α, IL-12 und IFN-γ. Besonders auffällig war die Unfähigkeit der resistenten C57Bl/6 KMMø das bioaktive Heterodimer IL-12p75 zu sezernieren. Die Wechselwirkungen zwischen NO und Borrelien und IL18 wurden detaillierter untersucht und dabei festgestellt, dass erstens: Borrelien in Kombination mit IL-18 kann in KMMø des empfindlichen Mausstammes IFN-γ in hohen Mengen induzieren. Zweitens, NO wirkt als Suppressor dieses Prozesses, und NO reguliert zusätzlich die Aktivität der Caspase-1. In diesem Zusammenhang konnte eine Rolle von NO bei der Entstehung der Arthritis in vivo mit Hilfe von CB17scid/NOS2-/ausgeschlossen werden. Untersuchungen des Arginin-Metabolismus der KMMø beider Mausstämme zeigten, eine erhöhte Grundaktivität der Arginase bzw. Polyamin-Synthese in den CB17 Makrophagen, die durch die Phagozytose von Spirochäten weiter gesteigert wurde. Die KMMø des resistenten Mausstammes waren bei gleichen Pathogendosen auffällig anergisch. Wurde allerdings das Bb Oberflächenprotein lipOspA zur Aktivierung verwendet, kam es bei beiden Mausstämmen zu einer ausgeprägten Antwort. Zusammenfassend kann man postulieren, dass die Entstehung der Resistenz gegenüber des Pathogens Borrelia burgdorferi eher durch das Fehlen einer Reaktion der Makrophagen des Wirtes als durch eine gezielte Antwort auf das Pathogen zustande kommt. Die hohe proinflammatorische Abwehrreaktion wäre somit für die Entstehung der verschiedenen Pathologien im empfindlichen Mausstamm (CB17scid) verantwortlich. Literaturverzeichnis 105 6. Literaturverzeichnis Aderem A , and Ulevitch RJ. (2000). Toll-like receptors in the induction of the innate immune response. Nature, Vol. 406, pp. 782-787 Adorini L. (1999). Interleukin-12, a key cytokine in TH1-mediated autoimmune diseases. CMLS, Cell Mol Life Sci 55, pp. 1610-1625 Ahn HJ, Maruo S, Tomura J, Mu T, Hamaoka T, Nakanishi K, Clark S, Kurimoto M, Okamura H, and Fujiwara H. (1997) A mechanism underlying synergy between IL-12 and IFN-gamma inducing factor in enhanced production of IFN-gamma. J Immunol 159, pp. 2125-2131 Akita K, Ohtsuki T, Nukada Y, Tanimoto T, Namba M, Okura T, TakakuraYamamoto R, Torigoe K, Gu Y, Su MSS, Fuji M, Satoh-Itoh M, Yamamoto K, Ikohno K, Ikeda M, and Kurimoto M. (1997) Involvement of Caspase-1 and Caspase3 in the production and processing of mature human Interleukin-18 in monocytic THP.1 cells. J Biol Chem 272, pp. 26595-26606 Albina JE, Mills CD, Henry WL jr., and Caldwell MD. (1990). Temporal expression of different pathways of 1-arginine metabolism in healing wounds. J Immunol 144 (10), pp. 3877-3880 Alexander WS, Starr R, Fenner JE, Scott CL, Handman E, Sprigg NS, Corbin JE, Cornish AL, Darwiche R, Owaczarek CM, Kay TWH, Nicola NA, Hertzog PJ, Metcalf D, and Hilton DJ. (1999). SOCS1 is a critical inhibitor of IFN-γ signaling and prevents the potentially fatal neonatal actions of this cytokine. Cell 98, pp. 597-608 Alnemri ES (1997). Mammalian cell death proreases: a family of highly conserved aspartate specific cysteine proteases. J Cell Biochem 64, pp.33-42 Badon SJ, Fischer RD, and Cable RG (1989). Survival of Borrelia burgdorferi in blood products. Transfusion 29 (7), pp. 581-583 Born TL, Thomassen E, Bird TA, and Sims JE (1998). Cloning of a novel subunit, AcPL, required for IL-18 signaling. J Biol Chem 273, pp. 29445-29450 Boucher JL, Custot J, Vadon S, Delaforge M, Lepoivre M, Tenu JP, Yapo A, and Mansuy D (1994). N-omega-hydroxy-L-arginine, an intermediate in the L-arginine to nitric oxide pathway, is a strong inhibitor of liver and macrophage arginase. Biochem Biophys Res Commun 203, pp. 1614-1621 Brown CR, and Reiner SL (1999). Development of Lyme Arhtritis in mice deficient in inducible nitric oxide synthase. J Infect Dis 179, pp1573-1576 Eder G, Barrett N, Crowe B, Gerencer M, Livey I, Löw-Baselli A and Dorner F. (1999). A candidate OspC Lyme disease vaccine under clinical investigation. Zent.bl. Bakteriol. 289, pp. 688-689 Literaturverzeichnis 106 Chomczynski P, and Sacchi N. (1987). Single-step method of RNA isolation by acid guanidinium thiocyanate-phenol-chlorofrm extraction. Anal Biochem 162, (1), pp. 156-159 Corraliza IM, Campo ML; Fuentes JM, Campos-Portuguez S, and Soler G (1993). Parallel induction of nitric oxide and glucose-6-phosphate dehydrogenase in activated bone marrow macrophages. Biochem Biophsy Res Commun 196 (1), pp. 342-347 Corraliza IM, Campo ML, Soler G, Modolell M. (1994). Determination of arginase activity in macrophages: a micromethod. J Immunol Methods 174(1-2), pp. 231-235. Corraliza IM, Modolell M, Ferber E, and Soler G (1997). Involvement of protein kinase A in the induction of arginase in murine bone marrow—derived macrophages. Biochim Biophys Acta 334, pp. 123-128 Culvenor JG, Harris AW, Mandel TE, Whitelaw A and Ferber E. (1981). Alkaline phosphatase in hematopoietic tumor cell lines of the mouse: High activity in cells of the B lymphoid tissue. J Immunol Vol. 126, no. 5, pp. 1974-1977 Diefenbach A, Schindler H, Röllinghoff M, Yokoyama WM and Bogdan C. (1999). Requirement for type 2 NO Synthase for IL-12 signaling in innate immunity. Science Vol. 284, pp. 951-955 Dinarello CA, Novick D, Puren AJ, Fantuzzi G, Shapiro L, Mühl H, Yoon DY, Reznikov LL, Kim SH, and Rubinstein M. (1998). Overview of Interleukin-18: more than an IFN-g-inducing factor. J Leukoc Biol 63, pp. 658-664 Edly SJ (1990). Lyme disease during pregnancy. New Jersey Medcine, Vol. 87, pp. 557-560 Ganapamo F, Dennis VA, and Phillip MT. (2001). CD19+ cells produce IFN-γ in mice infected with Borrelia burgdorferi. Eur J Immunol 31, pp. 3460-3468 Glickstein L, Edelstein M, and Dong JZ. (2001). Gamma Interferon is not required for arthritis resistance in the murine Lyme disease model. Infect Immun 69 (6), pp. 37373743 Gracie JA, Forsey RJ, and Chan WL. (1999). A proinflammatory role for IL-18 in rheumatoid arthritis. J Clin Invest 104, pp. 1393-1401 Greisman SE, Hornick RB, Carozza FA, and Woosward TE (1964). Endotoxin Tolerance. J Clin Invest 43, pp. 986-990 Habicht SG, Beck G und Benach LJ. (1987). Die Lyme-Krankheit. Spektrum der Wissenschaft, Sept., pp. 54-59 Heigold S, and Bauer G (2002). RAW 264.7 macrophages induce apoptosis selectively in transformed fibroblasts: intracellular signaling based on reactive oxygen and nitrogen species. J Leukoc Biol 72, pp. 554-563 Literaturverzeichnis 107 Helling RB, Goodman HM, and Boyer HW. (1974). Analysis of endonuclease REcoRI fragments of DNA from lambdoid bacteriophages and other viruses by agarose-gel elektrophoresis. J Virol 14 (5), pp. 1235-1244 Hirschfeld M, Kirschning CJ, Schwandner R, Wesche H, Weis JH, Wooten RM, and Weis JJ (1999). Cutting edge: inflammatory signaling by Borrelia burgdorferi lipoproteins is mediated by toll like receptor 2. J Immunol 163 (5), pp. 2382-2386 Hoshino K, Takeuchi O, Kawai T, Sanjo H, Ogawa T, Takeda Y, Takeda K, and Akira S. (1999). Toll like receptor 4 (TLR4)- deficient mice are hyporesonsive to lipopolysaccharide: evidence for the TLR-4 as the LPS gene product. J Immunol 162 (7), pp. 3749-3752 Hrabak A, Bajor T, Temesi A, and Meszaros G (1996). The inhibitory effect of nitrit, a stable product of nitric oxide (NO) formation, on arginase. FEBS Lett 390, pp. 203206 Hurtenbach U, Museteanu C, Gasser J, Schaible UE, and Simon MM (1995). Studies on early events of Borrelia burgdorferi-induced cytokine production in immunodeficient SCID mice by using a tissue chamber model for acute inflammaton. Int J Exp Pathol 76 (2), pp. 111-123 Janeway AC, Travers P.; Immunologie, 2. Aufl. (1997), Spektrum Akademischer Verlag GmbH, Heidelberg Jeong JY, and Jue DM. (1997). Chloroquine inhibits processing of tumor necrosis factor in lipopolysaccharide-stimulated RAW 264.7 macrophages. J Immunol 158, pp. 4901-4907 Kantor FS. (1994). Bekämpfung der Zecken-Borreliose. Spektrum der Wissenschaft, Dez., pp. 48-54 Keane-Myers A, and Nickel SP (1995). Role of IL-4 and IFN-gamma in modulation of immunity to Borrelia burgdorferi in mice. J Immunol 155, pp. 2020-2028 Kelly R. (1971). Cultivation of Borrelia hermsi. Science 173 (995), pp. 443-444 Kim Y-M, Talanian RV, Li J, and Billiar TR (1998). Nitric Oxide prevents IL-1β and IFN-γ-inducing factor (IL-18) release from macrophages by inhibiting Caspase-1 (ICE). J of Immunol 161, pp. 4122-4128 Laemmli UK. (1970). Cleavage of structural proteins during assembly of the head of bacteriophage T4. Nature, 227, pp. 680-685 Lehmann J, and Alber G. (2002). Von IL-12 zur p40-Zytokinfamilie: Bedeutung in der Abwehr intrazellulärer Erreger. Immunologie Aktuell 2 (4), pp. 158-160 Lowenstein CJ, Glatt CS, Bredt DS, Snyder SH (1992). Cloned and expressed macrophage nitric oxide synthase contrasts with the brain synthase. Proc Natl Acad Sci USA 89, pp. 6711-6715 Literaturverzeichnis 108 Machold KP, and Smolen JS (2003). Adalimumab – a new TNF-alpha antibody for treatment of inflammatory joint disease. Expert Opin Biol Ther 2, pp. 351-560 MacDonald AB (1989). Gestational Lyme Borreliosis: Implications for the fetus. Rheum Dis Clin North Am, Vol. 15, pp. 657-677 McGuire W, Hill AVS, Allsopp CEM, Greenwood BM, and Kwjatkowski D. (1994). Variation in the TNF-α promoter region associated with susceptibility to cerebral malaria. Nature 371, pp. 508-511 McInnes IB, Garcia JA, Leung BP, Wei XQ, and Lieuw FY (2000). Interleukin 18: a pleiotropic participant in chronic inflammation. Immunol Today 7, pp. 312.315 MacMicking JD, Nathan C, Hom G, Chartrain N, Fletcher DS, Trumbauer M, Stevens K, Xie Q-W, Sokol K, Hutchinson N, Chen H, and Mudgett JS (1995). Altered responses to bacterial infection and endotoxic shock in mice lacking inducible nitric oxide synthase. Cell, Vol. 81, pp. 641-650 Medzhitov R, Preston-Hurlburt P ,and Janeway CA Jr. (1997). A human homologue of the Drosophila Toll protein signals activation of adaptive immune system. Nature, 388 (6640), pp. 394-397 Minkenberg I, and Ferber E. (1984). Lucigenin-dependent chemiluminescence as a new assay for NAD(P)H-oxidase activity inparticulate fractions of human polymorphonuclear leucocytes. J Immunol Methods 71 (1), pp. 61-67 Miyasaka N, and Hirata Y. (1997). Minireview: Nitric oxide and inflammatory arthritides. Life Sciences, Vol. 61, no. 21, pp. 2073-2081 Modolell M, and Munder PG. (1994). Macrophage mediated tumor cell destruction by an alkaline phosphatase assay. J Immunol Methods 174, pp. 203-208 Modolell M, Schaible UE, Rittig M, and Simon MM (1994b). Killing of Borrelia burgdorferi by macrophages is dependent on oxygen radicals and nitric oxide and can be enhanced by antibodies to outer surface proteins of the spirochete. Immunol Lett 2, pp. 139-146 Moncada S, and Higgs A. (1993). The L-arginine-nitric oxide pathway. N Engl J Med 329, (27), pp. 2002-2012 Mosmann T. (1983). Rapid colorimetric assay for cellular growth and survival: application to proliferation and cytotoxicity assays. J Immunol Methods 65 (1-2), pp. 55-63 Munder M, Mallo M, Eichmann K, and Modolell M. (1998). Murine macrophages secrete Interferon-γ upon combined stimulation with Interleukin-12 and Interleukin18: a novel pathway of autocrine macrophage activation. J Exp Med Vol. 187, no. 12, pp. 2103-2108 Munder M, Eichmann K, Moran JM, Centeno F, Soler G, and Modolell M. (1999). TH1/TH2-regulated expression of arginase isoforms in murine macrophages and dendritic cells. J Immunol 163 (7), pp. 3771-3777 Literaturverzeichnis 109 Munder PG, Modolell M, and Hoelzl Wallach DF. (1971). Cell Propagation on film of polymeric fluorocarbon as a means to regulate pericellular pH and pO2 in cultured monolayers. FEBS Letter, VOL. 15, No. 3, pp. 191-196 Nathan C, and Xie Q. (1994). Nitric oxide synthase: roles, tolls and controls. Cell, 78, pp. 915-918 Nomura F, Akashi S, Sakao Y, Sato S, Kawai T, Matsumoto M, Nakanishi K, Kimoto M, Miyake K, Takeda K and Akira S (2000). Endotoxin tolerance in mouse peritonel macrophages correlates with down-regulation of surface Toll-like receptor expression. J Immunol. 164, pp. 3476-3479 Obermeier F, Gross V, Schölmerich J, and Falk W. (1999). Interleukin-1 production by mouse macrophages is regulated in a feedback fashion by nitric oxide. J Leukoc Biol 66, pp. 829-836 Okamura H, Tsutsui H, Kashiwamura SI, Yoshimoto T, and Nakanishi K. (1995). Interleukin-18: a novel cytokine that augments both innate and aquired immunity. Adv Immunol 70, pp. 281-312 Oppmann B, Lesley R, Blom B, Timans JC, Xu Y, Hunte B, Vega F, Yu N, Wang J, Singh K, Zonin F, Vaisber E, Churakova T, Liu M, Gorman D, Wagner J, Zurawski S, Liu Y, Abrahms JS, Moore KW, Rennick D, Waal-Malefyt R, Hannum C, Bazan JF, and Kastelein RA. (2000).Novel p19 protein engages IL-12p40 to form cytokine, IL-23, with biological activities similar as well as distinct from IL-12. Immunity 13, pp. 715-725 Ozinsky A, Underhill DM, Fontenot JD, Hajjar AM, Smith Kelly D, Wilson CB, Schroeder L, and Aderem A. (2000). The repertoire for pattern recognition of pathogens by the innate immune system is defined by the cooperation between Tolllike receptors. PNAS 97 (25), pp. 13766-13771 Piesman J, Maupin GO, Campos EG, and Happ CM. (1991). Duration of adult female Ixodes dammini attachment and transmission of Borrelia burgdorferi, with description of a needle aspiration isolation method. J Infect Dis 163 (4), pp. 895-897 Poltrak A, He X, Smirnova I, Liu MY, Van Huffel C, Du X, Birdwell D, Alejos E, Silva M, Galanos C, Freudenberg M, Ricciardi-Castagnoli P, Layton B, and Beutler B. (1998). Defective LPS signaling in CH3/HeJ and C57BL/10ScCr mice: Mutations in Tlr4 gene. Science, Vol. 282, pp. 2085-2088 Prabhakar SS, Zeballos GA, Montoya-Zavala M, and Leonard C (1997). Urea inhibits inducible nitric oxide synthase in macrophage cell line. Am J Physiol 273, pp. 18821888 Prat M, Bretti S, Amedeo M, Landolfo S, and Comoglio PM (1987). Monoclonal antibodies agains murine IFN-γ in vivo tumor immunity against RSV-induced murine sarcomas. J Immunol 138, pp. 4530-4533 Literaturverzeichnis 110 Presky DH, Yang H, Minetti LJ, Chua OH, Nabavi N, Wu C, Gately MK, and Gubler U. (1996). A functional Interleukin-12 receptor complex is composed of two β-type cytokine receptor subunits. Proc Natl Acad Sci USA, 93, pp. 14002-14007 Rietschoten van JGI, Smits HH, Westland R, Verweij CL, Hartog den MT, and Wierenga EA. (2000). Genomic organization of the human interleukin-12 receptor β2chain gene. Immunogenetics 51, pp. 30-36 Rothe H, Hartmann B, Geerlings P, and Kolb H. (1996). Interleukin-12 gene expression of macrophages is regulated by nitric oxide. Biochem Biophys Res Communikations 224, pp. 156-163 Saiki RK, Scharf S, Faloona F, Mullis KB, Horn GT, Ehrlich HA and Arnheim N. (1985). Enzymatic amplifikation of _-globin genomic sequences and restriction site analysis for diagnosis of sickle anemia. Science 230, pp. 1350-1354 Saiki RK, Gelfand DH, Stoffel, Scharf SJ, Higuchi R, Horn GT, Mullis KB, and Ehrlich HA. (1988). Primer-directed enzymatic amplification of DNA with thermostable DNA polymerase. Science 239, pp. 487-491 Schaible UE, Gay S, Museteanu C, Kramer MD, Zimmer G, Eichmann K, Museteanu U, and Simon MM. (1990). Lyme Borreliosis in the severe combined immunodeficiency (scid) mouse manifests predominantly in the joint, heart, and liver. AJP Vol. 137, No. 4, pp. 811-820 Schaible UE, Kramer MD, Wallich R, Tran T, and Simon MM. (1991). Experimental Borrelia burgdorferi infection in inbred mouse strains: antibody response and association of H-2 genes with resistance and susceptibility to development of arthritis. Eur J Immunol 21, pp. 2397-2405 Sessa WC, Hecker M, Mitchel JA, and Vane JR. (1990). The metabolism of Larginine and its significance for the biosynthesis of endothelium-derived relaxing facor: L-Glutamine inhibits the generation of L-arginine by cultured endothelial cells. Proc Natl Sci USA, Vol. 87, pp. 8607-8611 Simon MM, Bauer Y, Zhong W, Hofmann H, and Wallich R. (1999). Lyme Disease: Pathogenesis and vaccine development. Zent.bl. Bakteriol. 289, pp. 690-695 Skaleric U, Allen JB, Smith PD, Mergenhagen SE, and Wahl SM (1991). Inhibitors of reactive Oxygen intermediates suppress cell wall-induced arthritis. J Immunol 147 (8), pp. 2559-2564 Skurkovich B, and Skurkovich S. (2003). Anti-interferon-gamma antibodies in the treatment of autoimmun disease. Curr Opin Mol Ther 1, pp. 52-57 Southan GJ, Szabo C, and Thiemermann C (1994). Inhibition of the induction of nitric oxide synthase ba spermin is modulated by aldehyde dehydrogenase. Biochem Biophys Res Commun 203, pp. 1638-1644 Literaturverzeichnis 111 Steere AC, Broderick TF, and Malawista SE. (1978). Erythema chronicum migrans and Lyme arthritis: epidemiologic evidence for a tick vector. Am J Epidemiol 108, (4), pp. 312-321 Stoenner HG. (1974). Biology of Borrelia hermsi in Kelly medium. Appl Microbiol 28 (4), pp. 540-543 Takeuchi O, Sato S, Horiuchi T, Hoshino K, Takeda K, Dong Z, Modlin RL, and Akira S. (2002). Cutting Edge: Role of Toll-like Receptor 1 in Mediating Immune Responseto microbial Lipoproteins. J Immunol Vol. 169, pp. 10-14 Tau G, and Rothman P. (1999). Biologic functions of the IFN-g receptors. Allergy, 54, pp. 1233-1251 Taube M, Carlsten H, and Tarkowski A (1999). Local deposition of Interferon-gamma leads to arthritis in severe combined immunodeficiency (scid) mice. Abstract EMDS Meeting 1999 Krakau/Poland Thornberry NA, and Lazebnik Y. (1998). Caspases: enemies within. Science, 281, no. 5381, pp. 1312 Tone M, Thompson SAJ, Tone Y, Fairchild PJ, and Waldmann H. (1997). Regulation of IL-18 (IFN-g-inducing factor) gene expression. J Immunol 159, pp. 6156-6163 Trembleau S, Germann T, Gately MK, and Adorini L. (1995). The role of IL-12 in the induction of organ-specific autoimmune diseases. Immunology Today Vol. 16, No. 8, pp. 383-386 Turner G. (1997). Cerebral malaria. Brain Pathology 7, pp. 569-582 Uthaisangsook S, Day NK, Bhana SL, Good RA, and Haraguchi S. (2002). Innate immunity and its role against infections. Ann Allergy Asthma Immunol Vol. 88, pp. 253-265 Waddington SN, Mosley K, Cook HT, Tam FM, and Cattell V. (1998). Arginase A1 is upregulated in acute immune complex-induced inflammation. Biochem Biophys Res Commun 247 (1), pp. 84-87 Wang HJ, Doyle M, Mannig BJ, Di Wu Q, Blankson S, and Redmond HP. (2002). Induction of bacterial lipoprotein tolerance is associated with suppression of toll-likereceptor 2 expression. J Biol Chem 277 (39), pp. 36068-36075 Wang HJ, Doyle M, Mannig BJ, Blankson S, Wu QD, Power C, Cahill R, and Redmond HP. (2003). Cutting Edge: Bacterial lipoproteins induces endotoxinindependent tolerance to septic shock. J Immunol 170, pp. 14-18 Wallach FR, Forni AL, Hariprashad J, Stoeckle MY, Steinberg CR, Fisher L, Malawista SE, and Murray HW (1993). Circulating Borrelia burgdorferi in patiens with acute Lyme disease: results in blood cultures and serum DNA analysis. J Infect Dis 6, pp. 1541-1543 Werling D, and Jungi TW (2003). Toll-like receptors linking innate and adaptive immune response. Vet Immunopathol 91, (1), pp. 1-12 Literaturverzeichnis 112 Xaus J, Comalada M, Valledor AF, Cardo M, Herrero C; Soler C, Lloberas J, and Celada A (2001). Molecular mechanismus involved in macrophage survival, proliferation, activation or apoptosis. Immunobiology 5, pp. 543-550 Xie Q-W, Cho HJ, Calaycay J, Mumford RA, Swiderek KM, Lee TD, Ding A, Troso T, and Nathan C (1992). Cloning and characterization of inducible nitric oxide synthase from mouse macrophages. Science 256, pp. 225-228 Xu D, Chan WL, Leung BP, Hunter D, Schulz K, Carter , IB McInnes, Robinson JH, and Liew FY (1998). Selektive expression and funktions of Interleukin-18 receptor on Thelper (TH) type 1but not on TH2 cells. J Exp Med 188, pp. 1485-1492 Yasukawa H, Sasaki A, and Yoshimura A (2000). Negative regulation of cytokine signaling pathways. Ann Rev Immunol 18, pp.143-164 Yoshimoto K, Takeda K, Tanaka K, Ohkusu K, Kashiwamura S, Okamura H, Akira S, and Nakanishi K. (1998). IL-12 up-regulates IL-18 receptor expression on T-cells, TH1 cells, B-cells: synergism with IL-18 for IFN-γ production. J Immunol 161, pp. 3400-3407 Ziegler-Heitbrock HW, Wedel A, Scharaut W, Strobel M, Wendelgass P, Sternsdorf T, Bauerle PA, Haas JG, and Riethmuller G (1994). Tolerance to lipopolysaccharide involves mobilization of nuclear factor kappa B with predominance of p50 homodimers. J Biol Chem 269, pp. 17001-17004 Veröffentlichungen 7. Veröffentlichungen 7.1 Tagungen, Abstracts und Vorträge 113 1. Joint Annual Meeting of Immunology of the Dutch and German Societies (DGfI, NvvI) 29.11.00 – 02.12.00; Düsseldorf, Germany Poster: N. Justies and M. Modolell Nitric Oxide: A negativ regulator of IFN-γ secretion in murine bone marrowderived macrophages. 2. 15th Annual Meeting of The European Macrophage Society (EMS) 30.08.01 – 01.09.01; Vienna, Austria Poster: N. Justies, M. M. Simon, M. Mallo, and M. Modolell Autocrine activation of murine macrophages in Lyme Borreliosis. 3. 32nd Annual Meeting of the German Society of Immunology 26.09.01 – 29.09.01; Dresden, Germany Poster: N. Justies, M. M. Simon, M. Mallo, and M. Modolell Autocrine activation of murine macrophages in Lyme Borreliosis. 4. Freiburger Immunologentag 2001 12.10.01; Hochburg/Emmendingen, Germany Vortrag: N. Justies and M. Modolell. Autocrine activation of mouse macrophages in Lyme Borreliosis 5. Cologne Spring Meeting 2002 IMMUNITY 13.03.02 – 15.03.02; Cologne, Germany 6. European Macrophage and Dendritic Cell Society (EMDS) Meeting 2002 11.10.02 – 12.10.02; Basel, Switzerland Macrophage and Dendritic Cells: Responses to Environment 7. EMBL/EMBO Joint Conference on Science and Society 2002 08.11.02 – 09.11.02; Heidelberg, Germany Infectious Diseases: Challenges, Threats, and Responsibilities 7.2 Veröffentlichung 1. A common polymorphism in the coding part of the CD19 gene is not associated with atopy. Deichmann KA, Justies N, Kruse S, Forster J, and Kuehr J. Pedistr Asthma Allergy Immunol 1998; 12 (2): 123-127. Tabellarischer Lebenslauf 114 8. Tabellarischer Lebenslauf Curriculum Vitae Name Nicole Justies Geburtsdatum: 16.09.1973 Geburtsort: Freiburg im Breisgau Eltern: Reinhard Justies und Heiderose Justies Schulausbildung 1980-1984 Wilhelm August Lay Grundschule, Bötzingen 1984-1993 St. Ursula Gymnasium, Freiburg Mai 1993 Allgemeine Hochschulreife Hochschulausbildung Oktober 1993 Beginn des Studiums, Diplom-Biologie, Albert-LudwigsUniversität Freiburg August 1996 bis Mai 1997 Auslandsstudium an der University of St. Andrews/Scotland Juli 1999 Diplomprüfungen in den Fächern: (HF) Molekulare Immunologie (NF) Zellbiologie (NF) Mikrobiologie (NF) Neuropathologie August 1999 bis Mai 2000 Diplomarbeit: Untersuchung zur Rolle der Makrophagen bei Lyme Borreliose Betreuer: Dr. Manuel Modolell Max-Planck Institut für Immunbiologie, Freiburg Danksagung 115 9. Danksagung: An dieser Stelle möchte ich mich bei allen bedanken, die mir bei der Durchführung und Vollendung dieser Arbeit geholfen haben. Die vorliegende Arbeit wurde in der Zeit vom Mai 2000 bis Mai 2003 in der Arbeitsgruppe von Dr. Manuel Modolell in der Abteilung Zelluläre Immunologie am Max-Planck Institut für Immunbiologie in Freiburg durchgeführt. Für die gewährte finanzielle Unterstützung danke ich der Max-Planck Gesellschaft zur Förderung der Wissenschaften. Mein besonderer Dank gilt: Herrn Prof. Dr. Hans-Ulrich Weltzien für die Betreuung meiner Arbeit. Herrn Dr. Manuel Modolell für die interessante Themenstellung, die Möglichkeit in seinem Labor diese Arbeit durchführen zu können, sowie seine stete Ansprechbarkeit, Unterstützung und Diskussionsbereitschaft. Allen Mitarbeiterinnen im Labor von Dr. Manuel Modolell für ihre Geduld, ihre Hilfsbereitschaft und die angenehme freundschaftliche Arbeitsatmosphäre. Herzlichen Dank: Sibylle Epp-Lubich, Maria Döll, Gitta Kettelsen, Angelika Modolell und Verena Weber ! Der gesamten Laborgruppe von Prof. Dr. Markus Simon, mein besondere Dank gilt Thomas Stehle für seine stete Ansprechbarkeit und fachliche Hilfe bei der Arbeit mit Borrelia burgdorferi. Der Laborgruppe von Dr. Chris Galanos und Dr. Marina Freudenberg für die kompetente Unterstützung und Einführung bei der Arbeit mit TNF-α. Dr. Ian Haidl für viele aufmunternde, wissenschaftliche und freundschaftliche Diskussionen während dieser Arbeit. Den Tierpflegern für ihr Bemühen die beiden Stämme CB17scid/NOS2-/- und C57Bl/6/Rag2-/-/NOS2-/- zu etablieren sowie Dr. Rüdiger Escher für seine Hilfe bei der Genotypisierung der Tiere. Allen Mitarbeitern des Instituts, die im Verlauf der Arbeit mit Anregungen und neuen Ideen zum Gelingen dieser Dissertation beigetragen haben. Christiane, die unermüdlich und wissbegierig Korrektur gelesen hat! Markus, für sein Verständnis in allen Situationen, besonders bei unvorhersehbaren Reaktionen, seine Nachsicht, seine Geduld und seinen Willen meine Arbeit eines Tages zu lesen ;-) Meinen Eltern, die mir das Biologiestudium ermöglicht haben und ohne deren Unterstützung diese Dissertationsarbeit nicht zustande gekommen wäre.
