Vorlesung zu den Biochemischen Übungen 2
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Kohlenhydrate spielen in der Natur eine sehr wichtige Rolle dienen als Energiespeicher: Stärke, Glykogen sind Bestandteile von DNA bzw. RNA, Zellwänden, ... gebunden an Proteine und Lipide Einteilung der Kohlenhydrate •Zahl der Kohlenstoffatome: Triosen, Tetrosen, Pentosen, Hexosen,... •Aldosen oder Ketosen •Konfiguration der Asymmetriezentren: D- oder L- Zucker •Ersatz von OH-Gruppen durch H (Desoxyzucker) •Reduktionsvermögen Aldosen oder Ketosen Aldehydgruppe Ketogruppe Glycerinaldehyd eine Aldose Dihydroxyaceton eine Ketose Monosaccharide Monosaccharide gehören zu den Kohlenhydraten. Es handelt sich um Aldehyde oder Ketone, die zwei oder mehr Hydroxylgruppen tragen. Viele Monosaccharide haben die Summenformel (CH2O)n. Monosaccharide haben entweder eine Aldehyd-Gruppe (Aldosen) oder eine Keto-Gruppe (Ketosen). Sie haben mindestens 3 C-Atome. Glycerinaldehyd und Dihydroxyaceton sind Triosen. Diastereoisomere Stereoisomere die nicht Bild und Spiegelbild sind unterschiedliche physikalische und chemische Eigenschaften D-Aldosen D-Ketosen D- oder L- Zucker Die meisten Zucker sind chiral. Chirale Moleküle enthalten ein Atom, an das vier verschiede Substituenten gebunden sind. asymmetrisches C-Atom Der einfachste chirale Zucker ist Glycerinaldehyd mit einem asymmetrischen Kohlenstoff kommt daher in 2 spiegelbildlichen Formen vor (= Entantiomere) Entantiomere haben gleiche physikalische Eigenschaften (SchmelzPunkt, Siedepunkt), unterscheiden sich aber in der Drehbarkeit des linear polarisierten Lichtes. (+) (-) D- und L-Zucker Die D- und L-Reihen der Zucker sind wie bei den Aminosäuren definiert nach ihrer Strukturhomologie zu D- und L-Glycerinaldehyd (Emil Fischer, 1891). Bei grösseren Zuckern richtet sich die Einteilung nach D oder L nach demjenigen Asymmetriezentrum, das am weitesten von der Aldehyd- oder Ketogruppe entfernt ist. Ringform, offenkettige Form Zucker liegen weit überwiegend als Ringe vor, sie können aber auch offenkettige Strukturen annehmen. In diesem Zustand haben sie freie Aldehyd- oder Keto-Gruppen. Sie weisen im Versuch mit einem Aldehydspezifischen Agens (Purpald) nach, daß Glucose eine Aldose ist. Dazu wird eine Glucoselösung erhitzt, weil dabei verstärkt Ringöffnung eintritt. Bei Reaktion mit einem Aldehyd bildet das Purpald-Reagenz farbige Produkte. Anomere Durch die Ringschliessung entsteht ein weiteres Asymmetriezentrum. Entsprechend gibt es zwei Varianten der Ringform, α und ß. Zucker die sich nur in diesem ringschliessenden C-Atom unterscheiden nennt man Anomere. Glucose enthält in Lösung ca. 2/3 ß Anomer, ca. 1/3 α Anomer und <1% von der offenkettigen Form. Der Purpald-Versuch beweist daß die offenkettige Form tatsächlich auftaucht, und die α und β Formen nicht etwa durch Rotation der OHGruppe am Ring entstehen. Glycosidische Binding Zucker binden an Alkohole und Amine über glycosidische Bindungen O-glycosidische Bindung N-glycosidische Bindung Da Zucker selber Alkohole sind, können sie sich über O-glycosidische Bindungen auch untereinander verbinden. Auf diese Weise entstehen Disaccharide, Oligosaccharide und Polysaccharide. Über glycosidische Bindungen können Lipide gebunden werden (Glycolipide). Glycosidische Bindungen mit Proteinen ergeben Glycoproteine. Di-, Oligo- und Polysaccharide Disaccharide: aus 2 Monomeren gebildet Oligosaccharide: aus 3-9 Monomeren gebildet, oft Glykolipide oder Glykoproteine Polysaccharide: sind Polymere aus Monosacchariden, die 3 häufigsten Polysaccharide sind Cellulose, Stärke und Glykogen, sind alle drei aus Glucose aufgebaut. Glykogen Glucose-Bestimmung Bestimmung des Glucosegehaltes einer Serumprobe. 80-120mg/dl (4,4-6,7mM) beim gesunden Menschen (Nüchternblutzucker) Diabetiker >120mg/dl Gekoppelter optischer Test: 1. Schritt: Glucose wird mittels Glucose Oxidase (GOD, aus einem Schimmelpilz) zu Gluconolacton oxidiert, reagiert mit Wasser weiter zu Gluconsäure ß-D-Glucose + O2 Glucose Oxidase Gluconsäure + H2O2 2. Schritt: In einer Indikatorreaktion oxidiert das gebildete H2O2, katalysiert durch eine Peroxidase (POD, aus Meerettich) ein Chromogen, wobei ein Farbumschlag erfolgt. H2O2 + H2 Donator (Chromogen) (farblos) Peroxidase 2 H2O + Donator (färbig) Glycolyse Sie messen im Versuch das Gleichgewicht einer Reaktion aus der Glycolyse, nämlich der Umwandlung von Glucose-6-Phosphat in Fructose-6-Phosphat. Die Reaktion wird durch das Enzym Phosphoglucoseisomerase katalysiert. In vivo liegt hier natürlich ein typisches Fließgleichgewicht vor. Fructose-6-Phosphat reagiert in der Zelle sofort weiter zu Fructose-1,6-bisphosphat. Sie sollen die Frage beantworten, wieweit diese Reaktion auch freiwillig ablaufen würde. Wie wichtig ist hier das Fließgleichgewicht für die Einstellung der Reaktionsrichtung? Bestimmung des Gleichgewichtes der Phosphoglucoseisomerase Reaktion Umsetzung von Glucose-6-Phosphat in Fructose-6-Phosphat und umgekehrt. Ansatz 1: Glucose-6-Phosphat Ansatz 2: Fructose-6-Phosphat +Phosphoglucoseisomerase 30min inkubieren (dabei erfolgt die Gleichgewichtseinstellung) Glucose-6-Phosphat ↔ Fructose-6-Phosphat (Phosphoglucoseisomerase wird durch erhitzen auf 95°C denaturiert und somit inaktiviert) Bestimmung des Gleichgewichtes der Phosphoglucoseisomerase Reaktion 1. Nachweisreaktion Glucose-6-Phosphat ↓ Phosphoglucoseisomerase inactiv Fructose-6-Phosphat ↔ + NADP+ + Glucose-6-P-Dehydrogenase 6-Phospogluconolacton + NADPH + H+ = E1 (Glucose) 2. Nachweisreaktion + Phosphoglucoseisomerase Weil Glucose-6-Phosphat durch die Glucose-6-Phosphat-Dehydrogenase depletiert wird, wird Fructose-6-Phosphat weiter zu Glucose-6-Phosphat umgewandelt. Anstieg der Absorption bis zum Endpunkt verfolgen. Endwert = E2 (Fructose) + NADP /NADPH + + H Wir verwenden diesmal wieder einen gekoppelten Test, bei dem durch Reduktion NADPH entsteht, das sich gut nachweisen lässt. NADH und NADPH absorbieren um 340 nm, NAD+ und NADP+ dagegen nicht. Unser Ansatz: Glucose-6-P + NADP+ → 6-Phosphogluconolacton + NADPH + H+ Diese Reaktion wird von Glucose-6-PhosphatDehydrogenase katalysiert. Da für jedes vorhandene Glucose-6-P Molekül ein Molekül NADP+ reduziert wird, kann man die NADPHKonzentration nach Lambert-Beer bestimmen und die Glucose-6-P Konzentration ist dann identisch. Freie Energie 1 Wenn ein System nicht im Gleichgewicht ist, gibt es eine Triebkraft die auf eine Einstellung des Gleichgewichts hindrängt. Diese Triebkraft ist die Änderung der Gibbs'schen freien Energie, ∆G. Für eine Reaktion A → B lässt sich definieren: [B] ∆G = ∆G° + RT · ln ——— [A] ∆G° ist die Änderung der freien Energie unter Standardbedingungen (1 atm, 25°C, 1 M Konzentration von Substrat und Produkt. R ist die Gaskonstante T ist die absolute Temperatur Für biologische Reaktionen verwendet man ∆G°', dabei ist noch pH = 7 Freie Energie 2 [B] ∆G = ∆G°' + RT · ln ——— [A] bedeutet, man kann ausrechnen, ob eine Reaktion freiwillig abläuft. Bei negativem ∆G (∆G < 0) erniedrigt sich die Energie des Systems und die Reaktion erfolgt freiwillig. Im Gleichgewicht ist die treibende Kraft ∆G = 0, das heisst [B] ∆G = 0 = ∆G°' + RT · ln ——— [A] oder [B] - ∆G°' = RT · ln ——— [A] Sie können ∆G°' der Reaktion also aus den Konzentrationen von Substrat und Produkt berechnen. Im Versuch bestimmen Sie ∆G für die Reaktion Glucose-6-Phosphat → Fructose-6-Phosphat. Ob die Reaktion in vivo tatsächlich abläuft, kann von weiteren Parametern abhängen (Fließgleichgewicht!). Glucoseoxidase-Methode Der Glucosegehalt einer Serumprobe wird mit der Glucoseoxidase (GOD) - Methode bestimmt. Das macht man mit dieser Methode auch in der klinischen Diagnostik, z.B. für Diabetes. Glucoseoxidase setzt spezifisch ß-D-Glucose um, so daß keine "false positives" durch andere Zucker verursacht wird. Wir verwenden eine Glucoseoxidase aus einem Schimmelpilz. Die Konzentrationsbestimmung erfolgt wieder über eine Farbänderung. ß-D-Glucose + FAD-Enzym → Gluconolacton + FADH2-Enzym FADH2-Enzym + O2 → FAD-Enzym + H2O2 H2O2 + farbloses Chromogen → 2 H2O + Farbstoff [B] ∆G°´ = -RT x ln _____ [A] ∆G°´ = -RT x ln K ∆G°´ (kJ/mol) K 17 ,1 0,001 11,4 0,01 5,7 0,1 0 1 -5,7 10 -11,4 100 -17,1 1000 K= Gleichgewichtskonstante
