Zusammenfassung Stunde 1

Zusammenfassung Stunde 1
Die Bedeutung der Chromatinstruktur für Chromosomensegregation
und Regulation der Genexpression.
Nukleosomen haben 147 bp ds DNA um ein Oktamer aus Core Histonen
(2 H2A/H2B Dimeren und ein H3/H4Tetramer) als Superhelix gewunden.
zusätzlich findet man Linker Histone (z.B. H1) die an der Kondensation
beteiligt sind.
spezielle Histonvatianten könnengegen die 4 Core Histone ausgetauscht
werden um spezielle Chromatinbereiche mit speziellen Funktionen zu
definieren. H2AX z.B. für Recombiniation oder CENPA für die
Kinetochorefunktion.
Nukleosomen sind dynamische Strukturen und werden dadurch für nicht
Histonproteine zugänglich.
Histon Chaperone vermitteln die Beladung der DNA mit Histonen bei der
Replikation und den Austausch von Histonen in der Interphase.
Histone sind konservierte Proteine mit N-terminalen, ungeordneten Regionen,
(talis) wo die meisten kovalenten Modifikationen zu finden sind.
29
Beginn Stunde 3
Klausur zum
Kernmodul:
Fr. 13.2.09 10 Uhr,
Hörsaal G.
30
genetische Identifizierung von Chromatinkomponenten
31
ade2-
Chromosomenverlust
ADE2+
ade2-
32
SMC1 / SMC3 / SCC1 / SCC3 sind Komponenten eines Multiproteinkomplexes
der Schwesterchromatiden zusammenhält: Cohesine
SMC1 /SMC3
„Cohesine“
SCC1 /SCC3
Cohesine bilden höchstewahrscheinlich
einen Ring
um die Schwesterchromatiden
33
Cohesion von Schwesterchromatiden
wird bei der Replikation etabliert.
34
Eines der Modelle für die ATP- abhängige Öffnung
des Proteinrings bei
Ausbildung der Cohesion
zusätzliche Faktoren,
sogenannte Adherine (SCC2; nibbed-B)
werden benötigt, um Cohesin Moleküle
an DNA zu binden.
Shintom and Hirano, (2007) TIBS, 32, pp154ff
Cohesine binden entlang der Chromosomenarme und
an den Centromerregionen
Wie wird die Cohesion aufgehoben?
36
SCC1 (Kleisin) wird proteolytisch durch das Separin Esp1
gespalten
SMC1 /SMC3
Separin
Securin (Pds1)
SCC1 /SCC3
Securin-Degradation
Ubiquitinylierung
Die Aktivität von Securin und damit der Beginn der Anaphase wird
durch die Ubiquitin-Protein-Ligase (E3) APC ( Anaphase-promoting factor)
37
reguliert.
Cohesine beeinflussen auch die Genexpression
Cohesine findet man auch an Insulator Elementen die Gene von
der Wirkung von Enhancern ander Genloci isolieren.
Der Verlust von Cohesinen kann zum Überlesen solcher Insulator
Elemente führen.
38
Proteine in Heterochromatin
39
Proteine in Heterochromatin wurden biochemisch und genetisch identifiziert:
Das HP1 Protein (Sarah Elgin
1986)
Ein „non-histon“ Protein, dass aus
Chromatin von Drosophila isoliert
wurde. Der Su(var) 2-5 Lokus
codiert für HP1.
Polycomb Gruppe von Proteinen
(PcG)
Ein holologer Bereiche in diesen
Proteinen wird als
Chromodomäne bezeichnet
(„chromatin organisation modifier“
erkennt Histonmodifikationen s.
später)
40
Ist die Struktur von Chromatin wichtig für die Regulation der Gen-Expression?
Es gibt lokale und globale Unterschiede in der Chromatinstruktur.
Die Modifikation von Histonen ist dabei von großer Bedeutung.
Histon Chaperone (beladen DNA mit Histonen) Chromatin Remodelling Komplexe (verschieben Nukleosomen auf der DNA) Histon – Acetyltransferasen
Histon – Deacetylasen Histon – Methylasen Histon – Demethylasen
Acetylierung von Histonen entfernt positive Ladung, schwächt die Histon-DNA Wechselwirkung – DNA wird zugänglicher.
41
Histon – Acetyltransferasen und Deacetylen (HAT und HDACs)
Die Bedeutung der Histonmodifikation für die Genregulation
wurde früh postuliert, aber erst 30 Jahre später bewiesen.
Histonacetylierung: DM Philips (1963) Biochem J. Vol. 87, 258ff
Allfrey et al. (1964), PNAS Vol.51, 786ff
42
Die Bedeutung der Histonacetylasen und Deacetaylasen
Histonacetylasen : HATs
Histondeactylasen: HDACs
wichtige Entdeckungen:
1. Es stellte sich heraus, dass
Gene für biochemisch charakterisierte Histon modifizierende
Enzyme homologie zu Genregulatoren der Bäckerhefe haben.
2. Es stellte sich heraus, dass biochemisch als „Coaktivatoren“ identifzierte
Protein ( CBP) Histonactetyltransferaseaktivität hatten.
43
Isolierung des ersten Gens für eine Histonacetyltransferase 1995
R. Sternglanz: HAT1 in Hefe.
250 ts-Mutanten – Ganzzellextrakte – Ionenaustauscher – Acetylierungsassay
mit H3 - AcetylCoA und Histone H4 Peptid (Aminosäuren 1-28 )
eine Mutante hatte nur 50% Aktivität.
(die ts- Mutation war allerdings nicht mit der Mutation in HAT1 gekoppelt.)
44
Ja das hat funktioniert !
D. Allis und Mitarbeiter , (1996) Cell, Vol. 84, p. 843 ff
Tetrahymena Histone
Acetyltransferase A: A Homolog to
Yeast Gcn5p Linking Histone
Acetylation to Gene Activation
Gcn5 : Ein Genregulator des Stickstoffhaushalts des Hefe
45
A mammalian histone deacetylase
related to the yeast transcriptional
regulator Rpd3p.
Science 19 April 1996: 408
Taunton J, Hassig CA,
Schreiber
Taunton J, Hassig CA, Schreiber
SL.Howard Hughes Medical
Institute, Harvard University,
Cambridge, MA 02138,
USA.Trapoxin is a microbially
derived cyclotetrapeptide that
inhibits histone deacetylation in
vivo and causes mammalian cells to
arrest in the cell cycle. A trapoxin
affinity matrix was used to isolate
two nuclear proteins that copurified
with histone deacetylase activity.
Both proteins were identified by
peptide microsequencing, and a
complementary DNA encoding the
histone deacetylase catalytic
subunit (HD1) was cloned from a
human Jurkat T cell library. As the
predicted protein is very similar to
the yeast transcriptional regulator
Rpd3p, these results support a role
for histone deacetylase as a key
regulator of eukaryotic
transcription.
46
Die Entdeckung, dass Transktiptionsfaktoren an Histonmodifizierende Enzyme binden Das Konzept der Co-Aktivatoren /Co-Repressoren
Bindung von Co-Activatoren (Co-Repressoren)
POL II +
gen. TF
Coaktivator
lokale Veränderung der Chromatin-Struktur?
Identifizierung: Identifizierug von Proteinen die and den Thyroid Hormon Rezeptor
(DNA bindendes Protein; Tx-Faktor) binden oder die an den Regulator CREB (cAMP)
binden (s. L. Nitschke)
47
Nature, 1996, Vol 384 pp 641 ff
48
Histon Acetyl-Transferasen (HATs)
oft Multiproteinkomplexe 49
HATs und HDACs werden durch genspezifische Tx- Faktoren an DNA rekrutiert.
Aktivierung durch lokale Histon Acetylierung
Repression durch lokale Histon Deacetylierung
50
Histon Chaperone (Beladen DNA mit Histonen)
Chromatin Remodelling Komplexe (verschieben Nukleosomen auf der DNA)
Histon – Acetyltransferasen
Histon – Deacetylasen
Histon – Methylasen
Histon – Demethylasen
Chromatin Remodelling Faktoren wurden als Genregulatoren entdeckt
SWI/ SNF Gene des Hefe.
(SNF: Sucrose non fermeting)
(SWI: mating type switching)
51
ATP – abhängig werden Nukleosomen lokal auf der DNA verschoben
und von einer DNA auf eine andere transferieren. 52
3d- Reconstruktion eines Nukleosomen /RSC Komplexes
( RSC: Remodelling Structure Chromatin)
Leschziner A. E. et.al. PNAS 2007;104:4913-4918
©2007 by National Academy of Sciences
Fitting of a nucleosome into the open and closed conformations of RSC
Leschziner A. E. et.al. PNAS 2007;104:4913-4918
©2007 by National Academy of Sciences
Remodelling Komplexe helfen Histon-Chaperonen beim Austauch von Histonen
55
ATP-abhängige "Chromatin-Remodelling" Komplexe sind aus vielen Untereinheiten aufgebaut
Pionier: SWI/SNF Komplex)
56
Wie werden die Nukleosomen erkannt, die verschoben werden sollen?
Remodelling Komplexe erkennen
Histonmodifikationen (Acetylierungen )
Chromatin remodelling Faktoren können mit diesen
Domänen spezifische Histonmodifikationen
erkennen.
Bromodomäne: acetylierte Histone
SANT Domäne: unmodifizierte Histone
Chromo- Tudordomänen und PHD- Finger:
unterschiedliche Methylierungen von Histonen
57
Histon-Modifikationen können gelesen werden.
Erkennung unterchiedlicher Methylierungen durch Reader Domänen
58
Der „Histoncode“
Die Kombination spezieller Modifikationen haben
unterschiedliche Bedeutung für die Zelle.
Histon H3
Modifizierende Enzyme selbst, Remodelling Faktoren
und andere „nicht-Histon“ Proteine
lesen und schreiben zusammen diesen Code der Histone.
59
Lesen und Schreiben des Codes:
Modifikationsmuster können sich so ausbreiten und an die Tocherzellen weitergegeben werden. 60
Analyse der Nukleosomendynamik durch FRET
Li and Widom (2004) Nature, vol. 8; pp 763
Keq = 0,1 i.e. teilweise unverpackt 10% der Zeit.
61
Zusammenfassung Stunde 2 +3
Neben Histonen findet man in Chromatin weitere wichtige Komponenten:
Topoisomerasen; Condensine ; Cohesine u.a.
Condensine und Cohesine sind konservierte Strukturproteine mit ATPase Domänen
Cohesine vermitteln Schwesterchromatid Cohesion durch Ausbildung eines
Rings um die Chromatiden. Spaltung der SCC1 Komponente durch Separin
leitet die Anaphase ein. Ubiquitin-abhängiger Proteinabbau eines Separin
Inhibitors reguliert die Auflösung der Cohesion.
Entdeckung von Histonacetylasen und Histondeacetylasen
Funktion von Chromatin Remodelling Faktoren ( SWI/SNF – Komplex)
Der Histoncode: Histonmodifikation werden über konservierte Proteindomänen
gelesen und von Chromatinmodifizierenden Enzymen gechrieben.
62