Funktionelle Bedeutung des endothelialenen P
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Aus dem Institut für Pathologie der Tierärztlichen Hochschule Hannover und dem Zentrum der Dermatologie und Venerologie des Klinikums der Johann Wolfgang Goethe-Universität Frankfurt Funktionelle Bedeutung des endothelialenen P-Selektins und der VEGF-Rezeptoren VEGFR1 und VEGFR2 bei der hämatogenen Metastasierung im LungenmelanomModell der Maus INAUGURAL-DISSERTATION Zur Erlangung des Grades einer Doktorin der Veterinärmedizin (Dr. med. vet.) durch die Tierärztliche Hochschule Hannover Vorgelegt von Beatrice Böhme aus Weinheim a.d. Bergstrasse Hannover 2004 Wissenschaftliche Betreuung: Prof.Dr.med.vet. Achim Gruber, PhD 1.Gutachter: Prof.Dr.med.vet. Achim Gruber, PhD Prof.Dr.med. Jens Gille 2.Gutachter: Prof.Dr.med.vet. Hans-Joachim Schuberth Tag der mündlichen Prüfung: 24.11.2004 Teile dieser Arbeit wurden bereits veröffentlicht: Ludwig, R.; Boehme,B.; Podda, M.; Tandi,C.; Jager, E.; Henschler, R.; Boehncke, W.H.; Zollner, T.M.; Kaufmann, R. & Gille, J. Endothelial P-selectin as a target of heparine action in experimental melanoma lung metastasis. Cancer Res. 64:2743-50, 2004. Inhaltsverzeichnis I. II. III. Verzeichnis der Abkürzungen Verzeichnis der Abbildungen Verzeichnis der Tabellen 1. Einleitung 2. 2.1 2.1.1 2.1.2 2.2 2.2.1 2.2.2 2.2.3 2.2.4 2.2.5 2.2.6 2.2.7 2.3 2.3.1 2.3.2 2.3.3 2.3.4 Literaturübersicht Das Kreislaufsystem Aufbau des Kreislaufsystems bei Säugetieren Embryogenese und Entwicklung des Blutgefäßsystems Tumormetastasen und die Bedeutung experimenteller Metastasierungsmodelle Etablierung hämatogener Metastasen Organpräferenz Intravasation und Zirkulation von Tumorzellen im Blutgefäßsystem Tumorzellinteraktionen im Kapillarbett und Zelladhäsion Invasion von Tumorzellen im Sekundärorgan Entwicklung manifester Metastasen Tumorzellproliferation und deren Modulation durch das umgebende Milieu Inflammatorische Vorgänge und deren Bedeutung im Tumorgeschehen Entzündungen als Triggermechanismus der Transformation Entzündungsprodukte dienen als Vermittler der malignen Transformation Beteiligung inflammatorischer Zellen an der Tumorprogression Inflammatorische Zytokine, Wachstumsfaktoren und Chemokine im Rahmen der Tumorprogression Lokale Inflammation und systemische Unterdrückung von Entzündungsvorgängen Neovaskularisierung von Tumoren und deren Regulationsmechanismen Postnatale Angiogenese und Vaskulogenese Vaskularisierung von Tumoren Der angiogene Switch Wachstumsfaktoren als Vermittler angiogener Prozesse Der vaskuläre endotheliale Wachstumsfaktor und seine Rezeptoren Hämatopoetische und endotheliale Zellen Hämatopoetische Zellen Funktion und Ursprung der Endothelzellen Endothelvorläuferzellen Bedeutung CD133+ Zellen als Endothelvorläuferzellen Bedeutung CD34+ Zellen als Endothelvorläuferzellen Bedeutung CD34- Zellen als Endothelvorläuferzellen Bedeutung monozytärer Zellen als Endothelvorläuferzellen Mobilisierung von Endothelvorläuferzellen und hämatopoetischen Vorläuferzellen aus dem Knochenmark Antiangiogene Tumortherapie Gentherapeutischer Ansatz Aktive Immunisierung Bestrahlung 2.3.5 2.4 2.4.1 2.4.2 2.4.3 2.4.4 2.4.5 2.5 2.5.1 2.5.2 2.5.3 2.5.3.1 2.5.3.2 2.5.3.3 2.5.3.4 2.5.4 2.6 2.6.1 2.6.2 2.6.3 VII X XI 1 4 4 4 5 7 8 11 13 14 17 21 23 25 25 26 27 31 32 34 34 37 38 39 44 49 49 50 52 54 54 55 55 56 59 59 59 60 2.6.4 Angiogenese-Inhibitoren Ribozym-Therapie Monoklonale Antikörper blockieren angiogene Vorgänge 1. Anti-VEGF-Antikörper 2. Anti-VEGFR2-Antikörper 3. Anti-VEGFR1-Antikörper 4. Kombination eines Angiogenesehemmers mit niedrigdosierter Chemotherapie oder Bestrahlung 60 62 62 63 63 64 64 3. Eigene Untersuchungen 65 3.1 3.2 3.2.1 3.2.2 3.2.3 3.2.4 3.2.5 3.2.6 3.2.7 3.2.8 3.2.9 3.2.10 3.2.11 3.2.12 3.2.12.1 3.2.12.2 3.2.13 Ziel der Studie und Fragestellung Material und Methoden Geräte Verbrauchsmaterialien Verwendete Lösungen Antikörper in der Immunhistochemie und Durchflusszytometrie Pharmazeutika und Antikörper der in vivo Studien Zelllinien Kultivierung von Melanomzellen Langzeitlagerung von Melanomzellen Mauslinien Gewinnung und Aktivierung muriner Thrombozyten PCR-Ready-Lysis für Mäuseschwänze Knochenmarkstransplantation Bestrahlung der Transplantatempfänger Gewinnung des Knochenmarks und Transplantation Experimentelles Lungenmetastasenmodell Software, Auswertung und Dokumentation Immunhistochemische Analysen und LacZ-Färbung Prinzip der Immunhistochemie LacZ/ CD11b-, LacZ/VEGFR2- und LacZ/Pecam-Doppelfärbungen CD45-Einzelfärbung Auswertung und Dokumentation Durchflusszytometrie Direkte Färbung Indirekte Färbung Durchführung der Färbungen Analyse der P-Selektin-Expression Nachweis VEGFR2+ Endothelvorläuferzellen im peripheren Blut Nachweis VEGFR1+ hämatopoetischer Zellen im peripheren Blut Nachweis VEGFR1+ und VEGFR2+ Vorläuferzellen im Knochenmark Auswertung und Dokumentation Statistische Auswertung 65 66 66 66 67 68 69 69 69 70 71 73 73 73 74 75 76 79 79 79 80 81 82 82 83 83 84 85 85 85 86 86 88 Ergebnisse Bedeutung der P-Selektin-Expression für die Ausbildung von hämatogenen Melanommetastasen der Lunge Transplantation von P-Selektin defizientem Knochenmark hemmt die Ausbildung von B16F10- Melanommetastasen der Lunge 89 3.2.14 3.2.14.1 3.2.14.2 3.2.14.3 3.2.14.4 3.2.15 3.2.15.1 3.2.15.2 3.2.15.3 V1 V2 V3 V4 3.2.15.4 3.2.15.5 3.3 3.3.1 3.3.1.1 89 89 3.3.1.2 3.3.2 3.3.2.1 3.3.2.2 3.3.2.3 Heparin hemmt die Etablierung, nicht jedoch die Aufrechterhaltung und das Wachstum von experimentell induzierten Melanommetastasen 93 Bedeutung des VEGFR1 und VEGFR2 für die Ausbildung von hämatogenen 95 Lungenmelanommetastasen Mobilisierung VEGFR1+ und VEGFR2+ Vorläuferzellpopulationen in das periphere Blut infolge der Etablierung von Melanommetastasen 95 Inkorporierung von myelomonozytären Zellen aus dem Knochenmark in B16-Melanom98 metastasen der Lunge Die kombinierte Hemmung von VEGFR1 und VEGFR2 unterdrückt die MelanomLungenmetastasierung 100 4. Diskussion 105 5. Zusammenfassung 112 6. Abstract 115 7. Literaturverzeichnis 117 8. Danksagung 154 VII I. Verzeichnis der Abkürzungen Abkürzungen allgemein Abkürzung Bedeutung AG Antigen AK Antikörper APC Allophycocyanin Aqua dest. Aqua destillata BSA Bovine serum albumin, bovines Serumalbumin CD cluster of differentiation, Zelldifferenzierungsantigen CEC circulating endothelial cell, zirkulierende Endothelzelle DMSO Dimethylsulfoxid DNA desoxyribonuclein acid (DNA), Desoxyribonukleinsäure (DNS) EPC endothelial precursor cell, Endothelvorläuferzelle et al. et alii, und andere FACS fluorescence activated cell sorter, Durchflusszytometer FITC Fluoreszeinisothiocyanat FSC forward scatter, Vorwärtsscatter GAR goat anti rabbit, Ziegen IgG gegen Epitope von Kaninchenantikörpern gerichtet GAM goat anti mouse, Ziegen IgG gegen Epitope von Mausantikörper gerichtet HPC hematopoetic progenitor cell, hämatopoetische Vorläuferzelle IgG Immunglobulin G kDA kiloDalton MAPC multipotent adult progenitor cell, multipotente adulte Progenitorzellen MHC major histocompatibility complex, Haupthistokompatibilitätskomplex MMP Matrix-Metalloproteinase NO Sickstoffmonoxid NK natürliche Killerzellen mAK monoklonaler Antikörper PBS phosphate-buffered saline, Phoshat gepufferte Salzlösung PCR polymerase chain reaction, Polymerasekettenreaktion PE Phycoerythrin PFA Paraformaldehyd RNA Ribonuclein acid (RNA), Ribonukleinsäure (RNS) TADC tumor-associated dendritic cells, Tumor-assoziierte dendritische Zellen TAI tumor-associated inflammatory cells, Tumor-assoziierte inflammatorische Zellen TAM tumor-associated macrophages, Tumor-assoziierte Makrophagen SSC side scatter, Seitwärtsscatter x-Gal Beta-Galaktosidase VIII . Abkürzungen für Wachstumsfaktoren, Zytokine und Chemokine Abkürzung Bedeutung Ang Angiopoetin ATX Autotaxin CSF colony stimulating factor, Kolonie-stimulierender Faktor EGF epidermal growth factor, epidermaler Wachstumsfaktor Eph Ephrin FGF fibroblast growth factor, Fibroblastenwachstumsfaktor granulocyte-monocyte-colony stimulating factor, Granulozyten-Monozyten-Koloniestimulierender Faktor GM-CSF HGF hepatocyte growth factor, Hepatozyten-Wachstumsfaktor HIF hypoxia inducible factor, Hypoxie-induzierter Faktor IL Interleukin IFN Interferon IGF insuline like growth factor, Insulin-artiger Wachstumsfaktor MCP monocyte chemotactic protein, Monozyten-anlockendes Protein MIF migration inhibitory factor, Migrations-inhibierender Faktor MMP Matrix-Metalloproteinnase PDGF platelet derived growth factor, Plättchen-gereifter Wachstumsfaktor PlGF placental growth factor, Plazentawachstumsfaktor SCF stem cell factor, Stammzellfaktor SDF-1 stroma derived growth factor, Stroma-gereifter Wachstumsfaktor TGF transforming growth factor, Transformierender Wachstumsfaktor TNF Tumornekrosefaktor TSP Thrombospondin VEGF vascular endothelial growth factor, vaskulärer endothelialer Wachstumsfaktor VRP/ VEGF-C VEGF-related factor, VEGF-verwandter Faktor vWF von Willebrandt Faktor Abkürzungen Oberflächenmarker Abkürzung Synonym Bedeutung Flt-1 VEGFR1 fms-like-tyrosinekinase-receptor, Rezeptor des VEGF Flk-1 KDR, VEGFR2 fetal liver kinase-1, Rezeptor des VEGF KDR Flk-1, VEGFR-2 siehe unter VEGFR Mel-CAM MUC18, CD146 melanocytic cell adhesion molecule, Melanozyten-Zelladhäsionsmolekül ICAM intercellular cell adhesion molecule, interzelluläres Zelladhäsionsmolekül N-CAM Pecam-1 neuronal cell adhesion molecule, neuronales Zelladhäsionsmolekül CD31 platelet endothelial cell adhesion molecule, Plättchen-Endothelzell-Adhäsionsmolekül P-sel P-Selektin Tie-1/ -2 Tyrosinkinaserezeptor für Angiopoetin VCAM vascular cell adhesion molecule, vaskuläres Zelladhäsionsmolekül VEGFR VEGF-Rezeptor VE-Cadherin VLA CD144 vascular endothelial cadherin, vaskuläres endotheliales Cadherin Vaskuläres Leukozyten-Adhäsionsmolekül (vascular leucocyte adhesion molecule) IX C57BL/6: Wildtyp-Mäuse C57BL/6-R: Mäusen vom Wildtyp wird nach Destruktion des Knochenmarks durch Bestrahlung Knochenmark der ROSA26-Maus transplantiert. C57BL/6-F: Mäuse vom Wildtyp erhalten nach Destruktion des Knochenmarks durch Bestrahlung Knochenmark der VEGFR2-Knock-In-Mäuse. C57BLl/6-Psel-/-: Mäusen vom Wildtyp wird nach Destruktion des Knochenmarks durch Bestrahlung Knochenmark der Psel-/- Knock-out-Linie transplantiert. C57BL/6-wt: Mäusen vom Wildtyp wird nach Destruktion des Knochenmarks durch Bestrahlung Knochenmark vom Wildtyp als Kontrolle transplantiert. X II. Verzeichnis der Abbildungen 2. Abb. 2.1 Abb. 2.2 Abb. 2.3 Abb. 2.4 Abb. 2.5 Abb. 2.6 Abb. 2.7 Abb. 2.8 Abb. 2.9 Abb. 2.10 Abb. 2.11 Abb. 2.12 Abb. 2.13 Abb. 2.14 Abb. 2.15 Abb. 2.16 Literaturübersicht Grundaufbau des Blutgefäßsystems Aufbau der Gefäßwände Bildung von Angioblasten und Hämangioblasten im Dottersack Sequenzen zur Ausbildung hämatogener Lungenmetastasen Verschleppung tumoröser Zellen über das Kreislaufsystem Adhäsionsmoleküle vermitteln Endothel-Tumorzell-Interaktionen Mögliches Schicksal solitärer Tumorzellen im Sekundärorgan Parakrine und autokrine Wachstumsfaktoren Effektorfunktionen der Th1- und Th2- Lymphozyten Tumorwachstum im Zusammenhang mit Entzündungsprozessen Postnatale Angiogenese Angiogenese und postnatale Vaskulogenese Angiogener Switch VEGF und seine Rezeptoren Modell über die Funktion VEGFR2+ endothelialer und VEGFR1+ hämatopoetischer Vorläuferzellen Expression des VEGFR1 und VEGFR2 als charakteristische Oberflächenmoleküle von Zellen des peripheren Blutes. 3.2 Abb. 3.2.1 Abb. 3.2.2 Abb. 3.2.3 Abb. 3.2.4 Material und Methoden VEGFR2+/-transgene Mäuse: genetische Grundlage Anordnung der Bestrahlungsbox im Strahlengang des Betatron Murines Knochenmarkstransplantationsmodell Murines Lungenmelanommodell Abb. 3.2.5 Abb. 3.2.6 Prinzip der indirekten immunhistochemischen Färbung Schematische Abbildung der direkten Markierung zellulärer Oberflächenantigene Schematische Abbildung der indirekten Markierung von zellulären Oberflächenantigenen Darstellung doppelt positiver Zellen am Beispiel der P-Selektin-Expression aktivierter Thrombozyten Darstellung der Zellpopulationen im peripheren Blut Beispiele der zweidimensionalen Darstellungen der Kontrollfärbung (B) und der gewonnen Daten (A,C) im Punktdiagramm (FACS-Analysen peripheres Blut) Zweidimensionale Darstellung und Charakterisierung der im FACS analysierten Knochenmarkszellen anhand von Vorwärts- und Seitwärtsscatter FACS-Auswertung der Knochenmarkszellen Abb. 3.2.7 Abb. 3.2.8 Abb. 3.2.9 Abb.3.2.10 Abb. 3.2.11 Abb. 3.2.12 XI 3.3 Abb. 3.3.1 Abb. 3.3.2 Abb. 3.3.3 Abb. 3.3.4 Abb. 3.3.5 Abb. 3.3.6 Abb. 3.3.7 Abb. 3.3.8 III. Ergebnisse Bedeutung der mangelnden P-Selektin-Expression auf experimentell induzierten B16F10 Lungen-Melanommetastasen Repräsentative FACS- Analysen zur Darstellung thrombozytären PSelektins vor und nach erfolgter Plättchenaktivierung Effekte verschiedener Heparin-Behandlungsschemata auf die Enstehung und Entwicklung experimenteller Lungenmetastasen des B16-Melanoms Effekte experimenteller Melanommetastasen der Lungen auf die Proliferation und Mobilisierung von Stamm- und Progenitorzellen Nachweis Knochenmark-abstammender myelomonozytärer und megakaryozytärer Zellen in experimentellen Lungenmelanommetastasen Effekte der Behandlung mit anti-VEGFR1 und anti-VEGFR2-Antikörpern auf die Entwicklung experimenteller Lungenmelanommetastasen Auswirkungen der Behandlung mit anti-VEGFR1 und anti-VEGFR2Antikörpern auf das entzündliche Infiltrat in Lungenmelanommetastasen Effekte der Behandlung mit anti-VEGFR1 und anti-VEGFR2- Antikörpern auf die Mobilisierung von Progenitor-Zellpopulationen durch Etablierung von Lungenmelanommetastasen Verzeichnis der Tabellen 2. Tab. 2.1 Tab. 2.2 Tab. 2.3 Tab. 2.4 Tab. 2.5 Tab. 2.6 Tab. 2.7 Tab. 2.8 Literaturübersicht Sequenzielle Einzelschritte der Metastasierung Oberflächenrezeptoren aktivierter Endothelzellen und Melanomzellen Beteiligung der Tumor- und Gewebezellen an der Tumorzellinvasion Wachstumsfaktoren der Angiogenese Angiogene und antiangiogene Wachstumsfaktoren: eine Auswahl Wirkung von VEGF über spezifische Rezeptoren Expression von VEGF-Rezeptoren Oberflächenmoleküle endothelial differenzierter Zellen 3. Tab. 3.1 Tab. 3.2 Tab. 3.3 Tab. 3.4 Eigene Untersuchungen Verwendete monoklonale Antikörper- Immunhistochemie Monoklonale Antikörper der FACS-Analysen Primer zum Nachweis des LacZ-Reportergen Fluoreszeinfarbstoffe 1 1. Einleitung Morbidität und Mortalität von Tumorerkrankungen werden vor allem durch die Ausbildung von Metastasen bestimmt (Chambers et al. 2002). Die limitierte Wirksamkeit derzeit verfügbarer Therapieansätze im Falle metastasierter Stadien tumoröser Erkrankungen ist zumeist für die ungünstige Prognose der betroffenen Patienten verantwortlich. Zur Verbesserung der therapeutischen Möglichkeiten sind daher zusätzliche Erkenntnisse bezüglich der Ausbildung und des Wachstums von Metastasen in Sekundärorganen von essentieller Bedeutung. Die Fähigkeit von Tumorzellen zur Ausbildung weiterer Zellkolonien in Sekundärorganen ist von einer Vielzahl verschiedener Faktoren abhängig. Neben der Lokalisation des Primärtumors (Wyckoff et al. 2000), den Strömungsverhältnissen des Blutes im Zielorgan und dem Lumendurchmesser kapillärer Blutgefäße (Liotta et al. 1976; Fidler 1994; Orr & Wang 2001), haben die Eigenschaften der Tumorzellen und der unmittelbaren Umgebung, sowie Interaktionen der Tumorzellen untereinander und mit benachbarten Zellen (z.B. Stroma-, Endothel-, und Entzündungszellen) auf Überleben und Proliferation entarteter Zellen im Zielorgan Einfluss (Paget 1989; Cheresh 1991; Radinsky 1995; Ahmad et al. 2002). Dem Adhäsionsmolekül P-Selektin scheint bei der Interaktion von Tumorzellen mit Thrombozyten und Endothelzellen im Rahmen der hämatogenen Metastasierung eine besondere Bedeutung zuzukommen (Mannori et al. 1995; Vestweber & Blanks 1999; Borsig et al. 2002; Ludwig et al. 2004). Adhäsive Interaktionen zwischen Tumorzellen und Endothel, die durch P-Selektine vermittelt werden (Kaytes & Geng 1998; Ma & Geng 2000), könnten ein kritisches Signal darstellen, welches Überleben und Proliferation nach Extravasation begünstigt (Ludwig et al. 2004). Während die Rolle des thrombozytären P-Selektins bekannt ist, war es bisher nicht möglich, die Frage nach der funktionellen Bedeutung der endothelialen P-Selektin-Expression zu beantworten. Es war Ziel dieser Arbeit, die funktionelle Bedeutung der endothelialen P-Selektin-Expression auf die Ausbildung hämatogener Metastasen im Lungenmelanommodell zu untersuchen. Im Mausmodell konnten nach Transplantation PSelektin-defizienten Knochenmarks in C57BL/6 (C57BL/6-Psel) die Auswirkungen des thrombozytären P-Selektin-Mangels auf die Etablierung hämatogener Lungenmelanommetastasen dargestellt werden. Mit Hilfe P-Selektin-blockierender Antikörper (anti-Psel; αCD62P) war es möglich, die Etablierung von Lungenmetastasen durch Beeinflussung des endothelialen P-Selektins zu untersuchen. So konnte gezeigt werden, dass endotheliales PSelektin an der hämatogenen Metastasierung von Melanomzellen beteiligt ist. In 2 verschiedenen Einleitung experimentellen Modellen wurde bereits nachgewiesen, dass das Antikoagulans Heparin die Entwicklung von Tumormetastasen zu hemmen vermag. Im Rahmen dieser Arbeit sollte nun geklärt werden, ob die hemmenden Effekte des Heparins auch im Falle des metastasierenden Melanoms auf der Blockierung P-Selektin-abhängiger Bindungen (Nelson et al. 1993; Koenig et al. 1998; Wang et al. 2002; Borsig et al. 2002; Ludwig et al. 2004) beruhen könnten und in welchen Phasen der Metastasierung P-Selektine von Bedeutung sind. Zu diesem Zweck erfolgte die Etablierung eines Mausmodells mit unterschiedlichen Behandlungsgruppen, denen Heparin zu verschiedenen Zeitpunkten vor und nach intravenöser Inokulation der Melanomzellen injiziert wurde. Im Zusammenhang therapeutischer Interventionen wird immer deutlicher, dass sich Monotherapien nicht für die Tumortherapie eignen. Vielmehr sollten additive Angriffspunkte in die Therapie einbezogen werden (Klement et al. 2000; Browder et al. 2000a; Lyden et al. 2001; Rofstad & Graff 2001). VEGF und seine Rezeptoren haben als wichtige therapeutische Zielstrukturen im Rahmen der pathologischen Angiogenese zunehmend an Bedeutung gewonnen (Ferrara et al. 2003). Ziel dieser Arbeit war es, darzulegen, ob VEGFR1+ hämatopoetischen und VEGFR2+ endothelialen Vorläuferzellen und ihren Rezeptoren bei der Etablierung und dem Wachstum von Fernmetastasen eine funktionelle Bedeutung zukommt. Durchflusszytometrische Analysen des Knochenmarks und peripheren Blutes von Mäusen mit Lungenmetastasen (C57BL/6-MM) und gesunden Kontrollgruppen sollten klären, ob eine Mobilisierung VEGFR1+/VEGFR2+ Zellen aus dem Knochenmark denkbar wäre. Nach Transplantation von Knochenmark (ROSA26, VEGFR2+/--Knock-In) in C57BL/6 ließen sich Zellen, die postnatal aus dem Knochenmark mobilisiert und in Lungenmelanome integriert wurden durch eine LacZ-Färbung im Gefrierschnitt darstellen. In Kombination mit immunhistologischen Techniken konnte dargestellt werden, ob inflammatorische Zellen und Endothelzellen als Vorläuferzellen aus dem Knochenmark mobilisiert werden und sich in Gebiete mit Metastasenwachstum integrieren, oder ob davon ausgegangen werden kann, dass Zellen der Umgebung diese Aufgabe übernehmen. In verschiedenen murinen Modellen mit lokal wachsenden Tumoren konnte durch selektive Blockierung des VEGFR2 eine verminderte Tumorangiogenese und reduziertes Tumorwachstum erzielt werden (Prewett et al. 1999; Izumi et al. 2003). Kürzlich wurde zudem gezeigt, dass Angiogenese im Rahmen entzündlicher Erkrankungen und maligner Prozesse auch durch blockierende anti-VEGFR1-Antikörper wirkungsvoll gehemmt wird (Luttun et al. 2002b). Der Einsatz VEGFR1- und VEGFR2-blockierender Antikörper Einleitung ermöglichte 3 es der Fragestellung nachzugehen, ob jene Antikörper auch im Lungenmelanommodell therapeutisches Potential besitzen. Anhand von Transplantations- und Lungenmelanom-Modellen der Maus soll gezeigt werden, dass nicht nur thrombozytäre, sondern auch endotheliale P-Selektine an der Etablierung hämatogener Metastasen beteiligt sind und Heparin während der Adhäsionsphase wahrscheinlich über endotheliale P-Selektine wirkt. Weiterhin soll dargelegt werden, inwieweit VEGFR1+ und VEGFR2+ Zellen aus dem Knochenmark am Metastasenwachstum beteiligt sind, und ob sie in Tumormetastasen inkorporiert werden. Die funktionelle Bedeutung des VEGFR1 und VEGFR2 im Rahmen des Metastasierungsprozesses soll im Verlauf der Studie mittels VEGFR1/VEGFR2-blockierenden Antikörpern analysiert werden. 4 . 2. Literaturübersicht 2.1 2.1.1 Das Kreislaufsystem Aufbau des Kreislaufsystems bei Säugetieren Das Kreislaufsystem führt den Körperzellen Nährstoffe, Sauerstoff, Enzyme und Hormone zu und dient dem Abtransport von Wärme, Kohlendioxid und anderen Stoffwechselendprodukten. Diese Aufgabe kann nur erfüllt werden, wenn das Blut ständig in Bewegung bleibt. Bei Säugetieren findet sich stets ein geschlossenes Blutgefäßsystem mit zentralem Herzen, einem muskulösen Hohlorgan aus je zwei Vorkammern (Vorhof, Atrium) und zwei Hauptkammern (Ventrikel), das als Verbindung zwischen Lungen- und Körperkreislauf fungiert. Durch rhythmische Kontraktionen (Systole und Diastole) pumpt das Herz oxygeniertes Blut aus dem Lungenkreislauf über die Aorta in den Körperkreislauf. Die vom Herzen zentrifugal verlaufenden Arterien verzweigen sich in kleinere Arterien und Arteriolen, welche als Leitungsgefäße für den Transport des Blutes und darin gelöster Stoffe dienen. Der eigentliche Gas- und Stoffaustausch erfolgt allerdings erst in der kapillären Endstrombahn. Aus den Kapillaren gehen Venolen hervor, die sich zu größeren Venen vereinigen und das Blut dem Herzen zuführen. Lungen Aorta A. carotis communis Vena portae Kapillaren der Organe und Hintergliedmaßen Kapillaren des Kopfes V. cava cranialis Herz Lebersinusoide/ Kapillarsystem V. cava caudalis Abb. 2.1: Grundaufbau des Kreislaufsystems am Beispiel eines Hundes (in Anlehnung an (Zietschmann & Krölling 1955; Schnorr 1996). Literaturübersicht 5 Aufgrund der unterschiedlichen kreislaufdynamischen Anforderungen an die Gefäße variiert ihr Wandaufbau entsprechend. Grundsätzlich besteht die Wand größerer Gefäße aus drei Schichten. Die innere Schicht, Tunica intima, umfasst ein einschichtiges Endothel (Angiothel), welches das Lumen vollständig auskleidet und sich der Basalmembran auflagert. Endothelzellen kleinster Gefäße sind meist flach, langgestreckt und fenestriert, während jene der großen Arterien durch polygonale Struktur und fehlende Fenestrierung gekennzeichnet sind. Eine schmale Bindegewebsschicht grenzt die Intima zur mittleren Schicht, der Tunica media, ab. Jene besteht aus glatten Muskelzellen und elastischen Fasern. Die äußere Tunica externa wird auch als Adventitia bezeichnet. Als Bindegewebsschicht integriert sie das Gefäß ins umliegende Gewebe und führt Nerven, sowie in Gefäßen mit dicker Wand, zusätzlich kleine Blutgefäße (Vasa vasorum). Im Kapillarbereich beschränkt sich der Aufbau der Gefäße auf das lumenauskleidende Endothel und einer kontinuierlich oder diskontinuierlich ausgebildeten Basalmembran (Intima). Dieser lagern sich Perizyten an, welche als undifferenzierte Mesenchymzellen noch einen hohen Grad funktioneller Transformationsfähigkeit besitzen. Perizyt Endothel Endothel Stratum subendotheliale Bindegewebe Adventitia Tunica media Grundaufbau eines großen Gefäßes Grundaufbau einer Kapillare Abb.2.2: Schematische Darstellung des Aufbaus einer Gefäßwand: Grundbauplan eines großen Gefäßes und einer Kapillare im Vergleich 2.1.2 Embryogenese und Entwicklung des Blutgefäßsystems Zu Beginn der Embryogenese wird der sich entwickelnde Organismus zunächst durch Diffusion ernährt (Noden 1989). Innerhalb kürzester Zeit bildet er dann aber ein komplexes Netzwerk aus Kapillaren und Blutgefäßen. Das Blutgefäßsystem ist das erste sich differenzierende Organ der Ontogenese und geht aus Stammzellen im Dottersack hervor, die als Hämangioblasten sowohl Ausgangspunkt hämatopoetischer Zellen, als auch der Endothelzellen sind (Risau 1997). 6 Literaturübersicht Erste Anzeichen für die Entwicklung von Blutgefäßen lassen sich außerhalb des Embryos, im Dottersack, als fokale Aggregationen mesenchymaler Zellen nachweisen. Solche Zellansammlungen werden auch als Blutinseln („blood islands“) bezeichnet. Peripher gelegene Angioblasten liefern Endothelvorläuferzellen, während aus den zentral gelegenen Bereichen Hämangioblasten, gemeinsame Stammzellen für Endothelzellen und hämatopoetische Zellen, hervorgehen (Conway et al. 2001). Ob sich Endothelzellen aber aus Angioblasten (endotheliale Linie) oder Hämangioblasten (hämatopoetische Stammzellen) entwickeln, ist von der Lokalisation im Embryo abhängig (Carmeliet & Luttun 2001). Blutinsel Keimblase Hämozytoblasten Amnionhöhle Mesenchymzellen Angioblasten DottersackEntoderm Keimling Hämozytoblasten Dottersack Mesenchymzellen Angiothelrohr Allantois Angioblasten Abb. 2.3: Bildung von Angioblasten und Hämozytoblasten im Dottersack (in Anlehnung an (Bonnet & Peter 1929; Schnorr 1996). Durch Fusion endothelialer Zellen entwickelt sich ein erstes Netzwerk mit primären Plexus in Lunge, Pankreas, Milz, Herz und Dottersack (Wilting & Christ 1996). Da die Vaskularisierung bei Mäuseembryonen circa 7,5 Tage post coitum erfolgt, sind Angioblasten zu diesem Zeitpunkt bereits in das paraxiale Mesoderm eingewandert, aggregieren, proliferieren und differenzieren schließlich unter Ausbildung eines endokardialen Plexus. Dieser Plexus liefert die Grundlage der dorsalen Aorta, der Kardinalvenen, embryonaler Dottersackarterien und -venen (Carmeliet 2000). Das eigentliche Lumen entsteht durch Vakuolisierung (intrazelluläre Lumenbildung) oder durch Fortsetzung eines bestehenden Lumens, indem sich bereits etablierte Gefäße durch die Invagination von Perizyten und extrazellulärer Matrix in zwei Tochtergefäße teilen. Schließlich entsteht ein komplex organisiertes Netzwerk (Carmeliet & Collen 1998), das Blutgefäßsystem. Literaturübersicht 2.2 7 Tumormetastasen und die Bedeutung experimenteller Metastasierungsmodelle Trotz guter Fortschritte in Diagnostik, chirurgischer Therapie, Patientennachsorge und adjuvanter Therapie bleibt die Metastasenbildung, insbesondere jener Tumorarten, die auf konventionelle Therapien nicht ansprechen, einer der Hauptgründe von Morbidität und Mortalität im Zusammenhang mit Tumorerkrankungen (Fidler 1990). Die Verschleppung tumoröser Zellen ist ein Charakteristikum maligner Tumoren, wobei sich Sekundärtumoren z.T. an weit vom Primärtumor entfernten Lokalisationen entwickeln. Solche Metastasierungsvorgänge erfolgen meist nach Einbruch des Tumorgewebes in kleine Lymph- oder Blutgefässe, oder über bereits vorgebildete Gangsysteme. Seltener entstehen Abklatschmetastasen durch direkten Kontakt der Neoplasie mit benachbarten Organen, der Brust-, oder Bauchwand. Werden Tumorzellen über organeigene epithelial ausgekleidete Hohlraumsysteme weiterverbreitet, bezeichnet man diese Form der Verschleppung biologischen Materials als kanalikuläre Metastasierung. Im Rahmen der lymphogenen Metastasierung, nach Lymphknotenmetastasen Einbruch und neoplastischer Lymphangiosis Zellen in sarcomatosa. Lymphgefäße, Durch die entstehen hämatogene Verschleppung über das Gefäßsystem bilden sich v.a. in Herz, Lunge und Leber Metastasen aus. Maligne Tumoren metastasieren meist auf lymphogenem und hämatogenen Weg. Experimentelle Metastasierungsmodelle haben geholfen, die Mechanismen und Faktoren des Metastasierungsprozesses besser zu verstehen und neue therapeutische Ansätze zu entwickeln (Welch 1997). In vivo wurden spontane Metastasierungsmodelle etabliert, indem Tumorzellen in ein Organsystem des Empfängertieres injiziert wurden (beispielsweise subkutan) und zunächst einen Primärtumor ausbildeten. Anschließend wurde die Metastasierung in andere Organsysteme, wie beispielsweise der Lunge untersucht. Alternativ besteht die Möglichkeit, die hämatogene Metastasierung durch intravenöse Injektion der Tumorzellen zu simulieren. Beide Modelle stellen jedoch Endpunkt- Analysen dar, da die Anzahl injizierter Zellen und die daraus resultierende Metastasenzahl zwar bekannt sind, die eigentlichen Vorgänge der Metastasierung allerdings nicht weiter untersucht werden können. Eine direkte Beobachtung der Metastasierungsschritte in vivo wurde erst durch die Etablierung der Videomikroskopie möglich (Chambers et al. 1995; Chambers et al. 1998; Chambers 1999; Chambers et al. 2000a): Hierbei werden Fluoreszenzfarbstoff-gekoppelte Zellen intravenös injiziert und ihre Interaktionen mit Gefäßendothelien und Gewebezellen beobachtet (Ludwig et al. 2004). 8 2.2.1 Literaturübersicht Etablierung hämatogener Metastasen Die Etablierung hämatogener Metastasen beruht auf zahlreichen sequenziellen Einzelchritten, in denen Tumorzllen mit Stromazellen interagieren. Jeder Schritt stellt einen limitierenden Faktor dar und kann die Ursache für eine insuffiziente Metastasierung sein. Ausgangspunkt der Metastasierung ist ein Primärtumor, der sich aus verschiedenen Subpopulationen maligner Zellen zusammensetzt. Aufgrund von Unterschieden in Phänotyp und biologischen Eigenschaften (Heppner 1984; Fidler 1990), sind nicht alle Subpopulationen zur Metastasierung befähigt. Während des Wachstums und innerhalb bestimmter Perioden können ursprünglich gutartige Tumoren in maligne Formen transformieren (Foulds 1954) und metastasieren (Fidler 1973; Fidler 1981; Nicolson 1988a; Fabra et al. 1992). Zur Etablierung klinisch sichtbarer Metastasen, bedarf es zahlreicher selektiver Einzelschritte, die nach initialer Transformation, Proliferation und Ausbildung eines vaskulären Netzwerkes (durch Angiogenese und Vaskulogenese), zur Entwicklung eines Primärtumors führen (Fidler 1990). Nach Intravasation in das Lymph-, oder Blutgefäßsystem sind die Tumorzellen zunächst dem Immunsystem, Turbulenzen des Blutstromes und Barrieren des Organismus ausgesetzt, bevor sie im Kapillarbett der Zielorgane zurückgehalten werden (Arrest), z.T. bereits intravasal proliferieren und ins Organparenchym migrieren. Für die lokale Invasion ins umgebende Gewebe bedarf es der Bereitstellung verschiedener Faktoren (z.B. Enzyme, Zytokine, Chemokine und Motilitätsfaktoren), sowie einem geeigneten Milieu. Es entstehen nach initialer Proliferation zunächst nicht vaskularisierte Metastasen, die später ans Blutgefäßsystem angebunden werden. Synthese und Sekretion verschiedener proangiogener Faktoren durch Tumor- und Gewebezellen der Umgebung, und die Abwesenheit antiangiogener Faktoren übernehmen eine Schlüsselrolle bei der Etablierung eines kapillaren Netzwerks im Zielgewebe (Fidler 2002a; Fidler 2002b). Die Eigenschaften des Organparenchyms können Tumorwachstum, Angiogenese und Metastasierung entscheidend beeinflussen (Fidler 2002a; Fidler 2002b). Abb. 2.4: Sequenzen zur Ausbildung hämatogener Lungenmetastasen (nach Steeg 2003). Literaturübersicht Einzelschritte der Metastasierung Übertritt ins Blutgefäßsystem (A) Überleben der Zellen während der Zirkulation (B) Festsetzung im Organ (C) Extravasation (D) Überleben der Tumorzellen nach Extravasation (E) Initiales Wachstum im Sekundärorgan (F) Weiteres Wachstum (G) 9 beeinflussende Fakoren betrifft nur wenige Zellen; abhängig von Invasivität des Tumors, Anzahl und Beschaffenheit der intratumoralen Blutgefäße, Zell-Zell-Interaktionen der Tumorzellen immunologische Vorgänge, Überlebensfähigkeit der Tumorzellen bestimmt durch mechanische Faktoren, Chemotaxis, Haptotaxis, TumorzellZell- Interaktionen abhängig von Tumorzell- ZellInteraktionen, Tumorzell- MatrixInteraktionen, Motilität der Tumorzellen beeinflusst von den Bedingungen im Sekundärgewebe, der Fähigkeit von Tumorzellen „Survival“- Faktoren zu produzieren abhängig von Tumorzell-Zell-Interaktionen, Tumorzell-Matrix-Interaktionen, Wachstumsfaktoren, immunologischen Vorgängen, Eigenschaften der Tumorzellen und des umgebenden Gewebes; Angiogenese und Vaskulogenese Bedeutung Kritischer Faktor Kritischer Faktor Tab. 2.1 : Sequenzielle Einzelschritte der Metastasierung. (A) Ausgehend vom Primärtumor durchbrechen einzelne Zellen die Blut-Gewebe-Schranke, dringen in Gefäße ein und zirkulieren im Blut (B). (C) Tumorzellen bleiben in bestimmten Geweben hängen (z.B. Lunge, Leber). (D) Die Adhäsion der Zellen und ihre Interaktion mit dem Gefäßendothel führt zur Extravasation. (E) Nach der Extravasation ist das Überleben der Tumorzellen eine wichtige Voraussetzung. (F) Aber auch nach initialer Proliferation entwickeln sich nicht alle Mikrometastasen zu (G) makroskopisch sichtbaren Metastasen; (nach (Chambers et al. 2001; Steeg 2003). Hämatogene Metastasierung an sich ist kein effizienter Prozess, so dass zahlreiche Tumorzellen notwendig sind, um wenige Metastasen zu entwickeln. Verschiedene Studien haben gezeigt, dass nur ~0,01% (Fidler & Lieber 1972), bzw. 0,02% (Luzzi et al. 1998a)/ 12,7% (Cameron et al. 2000) intravenös injizierter syngener Tumorzellen Lungenmetastasen ausbilden. Nach intravenöser Injektion von B16-Melanomzellen, überleben circa 80% der Zellen die Initialphase der Blutzirkulation und schließen die Extravasation an Tag 3 p.i. ab (Luzzi et al. 1998a; Qiu et al. 2003). Nur wenige Zellen führen wirklich zur Ausbildung von Kolonien: 2,5% solitärer Zellen entwickeln Mikrometastasen und nur eine von 100 Mikrometastasen nimmt an Umfang so weit zu, dass sie makroskopisch sichtbar wird (Luzzi et al. 1998a). Ähnliche Ergebnisse erzielten Cameron et al., wobei eine Präferenz zu Arterien, Venen und der Lungenoberfläche, weniger eine gleichmäßige Verteilung im Gesamtorgan zu beobachten war (Cameron et al. 2000). Frühe immunologische Reaktionen spielen ebenfalls eine wichtige Rolle bei der Etablierung von Metastasen, aber viele initiale Schritte der Immunabwehr sind immer noch nicht ausreichend erforscht. Es zeigen sich zahlreiche Parallelen zu Entzündungsvorgängen und 10 Literaturübersicht Prozessen der Wundheilung (Coussens & Werb 2002). Innerhalb der ersten Stunden p.i. erreichen Tumorzellen die Lunge, wo zunächst eine unspezifische „Clearance“ stattfindet, wie Fidler et al. 1970 erstmals beschrieben hat (Fidler 1970). Unspezifisch ins Lungenparenchym eingewanderte Zellen werden innerhalb der ersten 5 Tage eliminiert, bis nur noch jene Tumorzellen vorliegen, die zur Ausbildung von Metastasen befähigt sind (Fidler 1970; Fidler et al. 1978). Neben unspezifischer Clearance und der Abhängigkeit von bestimmten Adhäsionsmolekülen (Carlos 2001), scheinen auch zellvermittelte Prozesse eine Rolle bei der initialen Clearance-Rate im Zielorgan zu besitzen. Insbesondere für B16-, und MADB-106Zelllinien konnte eine enge Verbindung zwischen der Aktivität natürlicher Killerzellen während der ersten 24 Stunden der Immunabwehr und der Ansiedlung von Tumorzellen demonstriert werden. In vivo wurden mindestens 70% der MADB-106-Tumorzellen innerhalb der ersten ein bis fünf Stunden p.i. elminiert (Ben Eliyahu & Page 1992; Ben Eliyahu et al. 1996). Stresshormone, wie Adrenalin, beeinflussen die MADB-106-Zellretention in den ersten Minuten (von Horsten et al. 2000). Der zweite Schritt der Immunabwehr, die Rekrutierung von Leukozyten aus dem Blut in die unmittelbare Umgebung der Metastasen, erfolgt innerhalb mehrerer Stunden bis Tage (Carlos 2001). Shingu et al. dagegen wiesen nach, dass Granulozyten, natürliche Killerzellen, TZellen und Monozyten innerhalb von Minuten in den Bereich von Mikrometastasen der Lunge infiltrieren (Shingu et al. 2002). Granulozyten scheinen die Invasion und Durchbrechung der Basalmembran zu unterstützen, wobei kinetische Untersuchungen neutrophiler Granulozyten darauf hin weisen, dass die beobachteten zellulären Veränderungen spezifische Veränderungen der Tumorzell-Zielorgan-Interaktionen darstellen, was jedoch nicht immer einen schützenden Einfluss auf das Zielorgan hat (Musiani et al. 1996). So können Granulozyten-vermittelte Schädigungen des Lungenendothels die Ansiedlung zirkulierender Tumorzellen erleichtern (Orr & Warner 1987). Tumorzellen sind infolge eingeschränkter Immunogenität, Immuntoleranz, verminderter MHC-Expression, Antigenmodulation, Fehlen kostimulatorischer Moleküle und Sekretion immunsuppressiver Moleküle (Marincola et al. 2003) in der Lage, dem Immunsystem zu entgehen. Thrombozyten beispielsweise interagieren mit Tumorzellen, stabilisieren so deren Adhäsion und setzen bei Aktivierung wichtige stimulierende Wachstumsfaktoren und Zytokine frei (Browder et al. 2000b; Varki & Varki 2002). Durch die Ausbildung von Konglomeraten verhindern die Blutplättchen eine Erkennung der entarteten Zellen durch das körpereigene Immunsystem (Nieswandt et al. 1999). Ein weiterer Mechanismus der Tumorzell-“Maskierung“ ist in diesem Zusammenhang die Polarisierung der T-Lymphozyten Literaturübersicht 11 in Richtung CD4-T-Helferzellen, die primär an der Aktivierung von B-Lymphozyten beteiligt sind (TH2-Zellen) und die Eliminierung von Tumorzellen somit kaum beeinflussen. Induziert wird jene Polarisation durch Typ-II-Makrophagen in humanen und murinen Tumoren, die spontan große Mengen an immunsuppressiv wirkenden Interleukin-10 (IL-10) und „transforming growth factor-β“ (TGF-β) freisetzen können (Sica et al. 2000). Außerdem produzieren Typ-II-Makrophagen Chemokine, die auf TH2-Lymphozyten wirken, während Interferon-aktivierte (Typ-I-)Makrophagen proinflammatorische Zytokine und Chemokine produzieren, die TH1-Lymphozyten anlocken. 2.2.2 Organpräferenz Die Suche nach Faktoren, die die Metastasierung, regulieren begann bereits 1889, als Paget bei seinen Untersuchungen zu dem Ergebnis kam, das Organmetastasen nur dann entstehen, wenn bestimmte Tumorzellen mit metastatischen Eigenschaften („seed“, Samenkorn) eine Affinität zu spezifischen Organen („soil“, Erde) besitzen, die geeignete Wachstumsbedingungen bereitstellen (Paget 1989). 40 Jahre später wurde diese These von Ewing zunächst verworfen. Er favorisierte die Hypothese, dass allein mechanische Faktoren, nämlich die anatomische Struktur des vaskulären Systems bestimmt, in welchen Organen sich Metastasen ausbilden (Ewing 1928). In den 1970er Jahren erkannte man die Selektivität der Metastasierung, als detaillierte Analysen zeigten, dass mechanische Grundlagen (Anatomie des Kapillarbettes, Lumendurchmesser, Strömungseigenschaften des Blutes) und zahlreiche weitere Faktoren den Prozess beeinflussen können (Hart & Fidler 1980). Es ist bekannt, dass Tumoren bevorzugt in bestimmte Organe metastasieren (Paget 1989; Poste & Paruch 1989; Radinsky 1995). Tumorzellen werden vom Primärtumor ausgehend, mit dem Blutstrom transportiert und bleiben meist im ersten Kapillarbett, das sie passieren, hängen. Einige Zellen wiederum werden abhängig von Zellgröße, Lumen der Kapillaren und dem Druckgradienten des Organsystems hindurchgeschleust und in weiter entfernt liegenden Organen abgefangen (Chambers et al. 2002). Beispielsweise metastasieren Mammakarzinome bevorzugt in Leber-, Lungen-, und Knochengewebe. Die Entstehung solcher Fernmetastasen lässt sich nicht mehr allein über die Eigenschaften des Blutflusses erklären. Jene Mechanismen, die zur Ausbildung von Knochenmetastasen der Mamma-, Prostata-, und Lungentumore führen, wurden durch den Begriff des selektiven „Homings“ beschrieben. Man unterscheidet drei wichtige „Homing“-Mechanismen: 12 Literaturübersicht • Selektive Chemotaxis: Zirkulierende Tumorzellen werden chemotaktisch über lösliche Faktoren zum Zielorgan gelockt (Muller et al. 2001). Zusätzlich wird die Organpräferenz durch die Möglichkeiten zu Migration und Invasion bestimmt (Nicolson 1993; Yeatman & Nicolson 1993). Für die Invasion neoplastischer Zellen ins umgebende Gewebe ist die Lyse von Matrixproteinen durch spezifische Proteasen notwendig. Viele Faktoren, auch Matrixkomponenten, stimulieren Chemotaxis und Tumorzell-Migration. Die von Primärtumoren über VEGFR1 vermittelte MMP-9Induktion der Lungenendothelien und Makrophagen verstärken beispielsweise die Tumorzellinvasion ins Lungengewebe (Hiratsuka et al. 2002). Das Zytokin Interleukin-1 (IL-1) vermittelt dagegen eher eine Kolonisation der Leber (VidalVanaclocha et al. 2000). • Selektive Adhäsion: Die Adhäsion der Tumorzellen an endotheliale Strukturen, Matrixkomponenten und andere Zellen erfolgt nur im Zielorgan. Vermittelt wird dies durch verschiedene Adhäsionsmoleküle (siehe 2.2.4). • Selektives Wachstum: Tumorzellen dringen in verschiedene Gewebe ein, proliferieren aber nur in spezifischen Organen mit entsprechenden Wachstumsfaktoren und Matrixkomponenten (Chambers et al. 2000a; Chambers et al. 2000b) (siehe 2.4). Alle drei Mechanismen haben sich in experimentellen Metastasierungsmodellen als wichtige Komponenten der Metastasenbildung erwiesen (Hart & Fidler 1980; Nicolson 1988b). Chambers et al. zeigten jedoch, dass das Metastasenwachstum nach Extravasation den eigentlichen limitierenden Faktor darstellt (Chambers 1999; Naumov et al. 2001), da nicht alle Tumorzellen, die in andere Gewebe eindringen, proliferieren und Metastasen bilden. Neben einer gewissen Organspezifität entwickeln sich Metastasen auch bevorzugt an bestimmten Lokalisationen innerhalb des Organs. Rhabdomyosarkomzellen migrieren im Mausmodell beispielsweise in die subkapsulären Regionen der Leber, bevor sie proliferieren. Eine Hemmung der Migration inhibiert auch die Ausbildung von Metastasen (Radinsky 1995). Weitere Studien berichten, dass sich Lungenmetastasen meist im Bereich der pleuralen Oberfläche und inneren Lungenstrukturen, v.a. im Bereich der arteriellen und venösen Gefäße entwickeln (Cameron et al. 2000). Während die initiale Extravasation und Proliferation keine Präferenz aufweisen, erfolgt das weitere Wachstum bevorzugt im Bereich der Lungenoberfläche und entlang der Gefäße (Dingemans et al. 1985; Dingemans 1988; Orr et al. 1988; Cameron et al. 2000). Literaturübersicht 2.2.3 13 Intravasation und Zirkulation von Tumorzellen im Blutgefäßsystem Durch Wachstum des Primärtumors und die Etablierung neuer Blutgefäße erhöht sich die Wahrscheinlichkeit, dass Tumorzellen in Blutgefäße einbrechen, abgeschwemmt werden und an anderen Lokalisationen Metastasen bilden. Die Intravasation der Tumorzellen ins Gefäßsystem ist ein essentieller Schritt der Metastasierung, allerdings ist über den Prozess der Intravasation nur wenig bekannt. Die Tumorzellen des Primärtumors scheinen sich in vivo jedoch aktiv in Richtung der Blutgefäße zu orientieren und als Einzelzelle in die Zirkulation überzutreten. Nicht-metastasierende Zelllinien zeigen diese Eigenschaft nicht, wodurch eine entsprechende Intravasation ausbleibt (Dingemans 1988; Wyckoff et al. 2000). Eine weitere Studie zeigte, dass die vom Primärtumor abgeschilferten Zellen im Kolonkarzinom-Modell ein geringeres metastatisches Potential aufweisen als Zellen der Ursprungslinie (Swartz et al. 1999). Diese Daten lassen darauf schließen, dass die Fähigkeit zur Intravasation mit Malignitätsgrad und Metastasierungspotential zusammenhängt. Verschiedene Autoren haben nachgewiesen, dass ein hoher Prozentsatz der in die Blutzirkulation eingetretenen Tumorzellen überlebt (>80%) (Koop et al. 1995; Luzzi et al. 1998a; Luzzi et al. 1998b; Cameron et al. 2000), während nur wenige der zirkulierenden Zellen wirklich Metastasen ausbilden. In keiner dieser Arbeiten konnte bisher ein Zusammenhang zwischen Überlebensrate der Zellen und deren Malignitätsgrad gezeigt werden. Die Lokalisation des Primärtumors im Organismus bestimmt aufgrund des Blutabflusses und den Strömungseigenschaften des Blutes die Verbreitung der Tumorzellen. Werden abgeschilferte neoplastische Zellen über die Vena portae zunächst ins Kapillarsystem der Leber transportiert, ist die Etablierung von Lebermetastasen wahrscheinlich, da die Tumorzellen im Kapillarbett der Lebersinusoide langsam entlang des Endothels transportiert werden und mit den Endothelzellen in Kontakt treten. Erfolgt dagegen zunächst eine Abschwemmung über die Vena cava ins Herz und in die Lunge, verbleiben viele Zellen im Lungengewebe (siehe Abb 2.5). 14 Literaturübersicht Lungen Aorta A. carotis communis Vena portae Kapillaren der Organe und Hintergliedmaßen Kapillaren des Kopfes V. cava cranialis Herz Lebersinusoide/ Kapillarsystem V. cava caudalis Abb. 2.5: Verschleppung tumoröser Zellen über das Kreislaufsystem. Die Zellen bleiben in den Endstromgebieten, v.a. der Leber und Lungen hängen, wo es zu ersten Kontaktaufnahmen mit dem umliegenden Gewebe kommt (in Anlehnung an Schnorr 1996). 2.2.4 Tumorzellinteraktionen im Kapillarbett und Zelladhäsion In vivo-Modelle haben gezeigt, dass der Großteil zirkulierender Tumorzellen aufgrund des verminderten Lumendurchmessers im Kapillarbett des ersten Organs festgehalten wird (Arrest), in das sie durch die Strömungseigenschaften des Blutes eintreten. Sowohl mikrovaskuläre Strukturen, als auch Tumorzellen können im Durchmesser variieren und bestimmen die Lokalisation der Adhäsionsvorgänge. Während Einzelzellen im Bereich der Kapillaren hängen bleiben, können sich bildende Tumoremboli bereits in größeren Gefäßen arretieren (Liotta et al. 1976; Orr & Wang 2001). Allerdings lassen sich weit vom Primärtumor entfernte Metastasen und besondere Organpräferenzen nicht über mechanische Faktoren allein erklären. Endothelzellen sind dafür bekannt, dass sie eine wichtige Rolle in Homöostase und pathophysiologischen Mechanismen einnehmen und u.a. die Extravasation von Zellen regulieren (Hill & Whitten 1997). Interaktionen zwischen zirkulierenden Tumorzellen und Endothelzellen der Blutgefäße beeinflussen in signifikanter Weise die Entwicklung von Organmetastasen. Das Gefäßsystem wird von einer heterogenen Population an Endothelzellen ausgekleidet. Es gibt Unterschiede im Endothel verschiedener Spezies, im Aufbau kleiner und großer Gefäße und zwischen den Endothelzellen, welche die Eigenschaften des mikrovaskulären endothelialen Bettes bestimmen. Diese Unterschiede spiegeln sich im ultrastrukturellen Aufbau, der Funktion, Antigenexpression, Lektin-Bindung, Proteinsynthese und Sekretion wieder (Page et al. 1992; Petzelbauer et al. 1993; To et al. 1996). Literaturübersicht 15 Die Passage entlang des Endothels wird über einen Plasmafilm zwischen Tumorzelloberfläche und der Gefäßwand vermittelt, bis Strömungseigenschaften und Lumendurchmesser eine Abstandsreduktion auf unter 2 nm zulassen und direkte Adhäsionsvorgänge stattfinden können. Wahrscheinlich kommt es aber bereits ab 20 nm zu einer Brückenbildung zwischen interzellulären Adhäsionsmolekülen (Orr & Wang 2001). Adhäsionsmoleküle spielen bei der organspezifischen Metastasierung daher eine wichtige Rolle und die Interaktionen können bei aktivierten Endothel durch Zytokine beeinflusst werden, was zu vorzeitigen Zell-Tumorzell-Interaktionen führt, wie Orr et al. nachwiesen (Scherbarth & Orr 1997; Orr et al. 2000). Die Adhäsion der Tumorzellen an andere Zellen wird durch verschiedene Adhäsionsmoleküle, wie Selektine und Integrine vermittelt, wobei Selektine für die initiale Kontaktaufnahme zuständig sind, während Integrine spätere Adhäsionen und Invasionsvorgänge vermitteln (Orr & Wang 2001). Integrine binden an Moleküle der Matrixkomponenten Laminin, Fibronektin, Vitronektin und Kollagen (Danen et al. 1995). Integin α4β1 vermittelt beispielsweise Zell-Zell-Interaktionen über das vaskuläre Zelladhäsions-Molekül („vascular cell adhesion molecule“, VCAM, CD106) und Fibonektin (Matsuura et al. 1996). Die Expression der Oberflächenmoleküle kann über spezielle Faktoren reguliert und verstärkt werden. Interleukin-1β (IL-1β) und Tumornekrosefaktor TNF-α sind dafür bekannt, die Zahl der Metastasen des Mausmelanoms B16M zu potenzieren, indem sie die VCAM-Expression der Lungenendothelien erhöhen (Vidal-Vanaclocha et al. 2000). Melanomzellen, nicht aber normale Melanozyten, teilen sich mit den Endothelzellen wichtige Oberflächenmarker, so dass angenommen werden kann, dass Melanomzellen und Endothelzellen die gleichen Oberflächenmoleküle bei Adhäsion, Invasion und Wachstum verwenden (Velazquez & Herlyn 2003). Alle diese Rezeptoren können Melanomzell-EndothelzellInteraktionen vermitteln und übernehmen neben ihrer Fähigkeit zur Adhäsion verschiedene Funktionen (Velazquez & Herlyn 2003) (siehe Tab. 2.5). Mit Ausnahme des MelanomzellAdhäsionsmoleküls („melanoma cell adhesion molecule“, Mel-CAM) werden melanomspezifische Marker aggressiver Melanomzellen herunterreguliert, während andere, z.B. an Angiogenese und Vaskulogenese beteiligte Gene, stärker exprimiert werden (VE-Cadherin, Ephrin-A1 u.a.) (Hendrix et al. 2003). 16 Literaturübersicht Familie Rezeptor Bemerkung Integrine αVβ3, VitronektinRezeptor CAM (cell adhesion molecule) Mel-CAM (MUC18, CD146) (melanocytic cell adhesion molecule) spezifischster Invasionsmarker der Melanomzellen, seine Überexpression auf Melanomzellen resultiert in verstärkter Invasion und Produktion von Matrix-Proteinen (St Croix et al. 2000) auf humanen Endothelvorläuferzellen und allen humanen Gefäßendothelien inkl. Lymphendothelien, bei der Melanomzellinvasion und Metastasierung bedeutend; beteiligt an endothelialer Reifung und Differenzierung (Hendrix et al. 2003), Bestandteil der Immunglobulinfamilie auf Melanomzellen und Endothelzellen, Ligand des Integrin α4β1 Oberflächenantigen aktivierter B-Zellen; wird durch TNF-α / IL-1/ IFN-α induziert; Ligand des LFA-1 (lymphocytefunction associated antigen) Adhäsionsmolekül aus der Immunglobulin- Familie, interagiert mit CEA (carcinoembryonic antigen) VCAM (vascular cell adhesion molecule) ICAM-1 (intercellular adhesion molecule) CEA-1-CAM (carcinoembryonic antigen- related cell adhesion molecule-1) N-CAM (neural cell adhesion molecule-1) ALCAM (activated leukocyte cell adhesion molecule) PECAM (plateled endothelial adhesion molecule; CD31) Bestandteil der Immunglobulin- Familie, vermittelt die Adhäsion zwischen Neuronen und Neuronen und Muskelzellen ALCAM ist ein CD6 Ligand, der auf T- Lymphozyten exprimiert wird und an der Zelladhäsion beteiligt ist Endothelzellmarker, sichert den endothelialen Zellverband, dient der Interaktion von Zellen mit Endothelzellen (Conway et al. 2001), ist z.B. bei inflammatorischen und angiogenen Vorgängen an der leukozytären Diapedese beteiligt (Vecchi et al. 1994; DeLisser et al. 1994; Vanzulli et al. 1997) auch auf Fibroblasten nachgewiesen Cadherine N-Cadherin VE-Cadherin (vascular interzelluläres Molekül, das den Zellverband sichert, endothelzellspezifisch; ermöglicht das Überleben der endothelial cadherin) Endothelzellen Eph A2 (Ephrin A2), Ephrin A1 und A2 wirken angiogen (Carmeliet 2003) Ephrine Eph A1 Rezeptoren verschiedener z.B. VEGFR1, Tie-1, FGF-R1, PDGF-Rα1, IGF-Rezeptor-1 Wachstumsfaktoren Tab. 2.2: Oberflächenrezeptoren aktivierter Endothelzellen und maligner Melanomzellen. Keiner dieser Rezeptoren ist auf normalen Melanozyten nachzuweisen (nach Velazquez & Herlyn 2003). P-Selektin, ein Adhäsionsmolekül aus der Familie der Selektine, hat seine Bedeutung bei der Interaktion von Tumorzellen mit Thrombozyten und Endothelzellen (Mannori et al. 1995; Borsig et al. 2002; Ludwig et al. 2004). P-Selektin wird in den α-Granula der Plättchen und den Weibel-Palade Körperchen endothelialer Zellen konstitutiv exprimiert und kann zur Unterstützung adhäsiver Interaktionen rasch an die Oberfläche transportiert werden (Bevilacqua & Nelson 1993). Die Bedeutung des P-Selektins bei Plättchen-TumorzellInteraktionen und Metastasierungsprozessen wurde über P-Selektin-Mutanten ermittelt. In Mäusen mit P-Selektin-Defizienz waren Tumorzell-Plättchen-Aggregationen und die Literaturübersicht Entwicklung 17 experimenteller Lungenmetastasen nach intravenöser Injektion von Kolonkarzinomzellen signifikant reduziert (Kim et al. 1999; Borsig et al. 2001). Diese Befunde deuten darauf hin, dass P-Selektin ein wichtiger Faktor bei der Lungenkolonisation hämatogener Metastasen ist und unterstützt die Annahme, dass P-Selektin-vermittelte Tumorzell-Plättchen-Interaktionen den Metastasierungsprozess beeinflussen. Um die Rolle des endothelialen P-Selektins in Melanommetastasen detaillierter untersuchen zu können, wurden unlängst von Ludwig et al. intravitalmikroskopische Untersuchungen durchgeführt, in denen die direkten Interaktionen der Tumorzellen mit murinen Endothelzellen in vivo sichtbar gemacht wurden (Ludwig et al. 2004). Ohrrand- Kapillare Basalmembran Endothelzelle P-Selektin Tumorzelle E- Selektin VCAM-1 ICAM-1 Lebersinosoid Abb. 2.6: Adhäsionmoleküle vermitteln Endothel-Tumorzell-Interaktionen. Durch Intravitalmikroskopie konnte nachgewiesen werden, dass B16-Melanomzellen in Lebersinusoiden aufgrund der reduzierten Lumendurchmesser hängen bleiben und Adhäsionsmoleküle spezifische Bindungen vermitteln. E-Seklektine (Brodt et al. 1997), VCAM-1 (Orosz et al. 1995) oder ICAM-1/ VCAM-1 und αv-Integrine (Scherbarth & Orr 1997) sind an Adhäsionsprozessen im Kapillarbett beteiligt (nach Orr & Wang 2001). Ludwig et al. sehen in P- Selektinen den kritischen Faktor für Tumorzellinteraktionen mit dem Gefäßendothel (Ludwig et al. 2004). 2.2.5 Invasion von Tumorzellen im Sekundärorgan Die Invasion von Tumorzellen in Organgewebe erfolgt aktiv und bedarf der Proteolyse extrazellulärer Matrix, sowie der Zellmigration (Liotta & Kohn 2001). Biochemisch ähneln die Mechanismen der Tumorzellinvasion jenen Prozessen, die nichtmaligne Zellen unter physiologischen Bedingungen verwenden, um Gewebebarrieren zu durchdringen. Angiogenese (Folkman 1971; Weidner 1993), Embryogenese, Morphogenese (Talhouk et al. 1992) und Trophoblastenimplantation (Lala & Graham 1990) sind Beispiele für 18 Literaturübersicht physiologische Invasionsvorgänge. Im Gegensatz zur malignen Invasion sind physiologische Invasionsprozesse streng reguliert und werden gehemmt, wenn der Stimulus entfällt (Folkman 1971; Schirrmacher 1985; Lala & Graham 1990; Liotta et al. 1991; Wu & Goldberg 1993). Basalmembran und interstitielles Stroma spielen bei der Regulation der Tumorzellinvasion eine entscheidende Rolle. Neben ihrer Barrierewirkung enthalten diese Strukturen latente Zytokine und Proteasen, wie beispielsweise Matrix-Metalloproteinasen (MMPs), die als Proenzyme sezerniert werden und extrazellulären Aktivierungsmechanismen unterliegen. Metalloproteinasen und Adamalysin-verwandte Membranproteasen, BMP-1 („bone-morphogenic protein-1“)-Metalloproteinasen und Gewebe-Serinproteasen, sowie GewebeplasminAktivatoren, Urokinase, Thrombin und Plasmin sind an der Degradation beteiligt (Werb 1997). Die meisten Enzyme und Inhibitoren werden dabei vom Stroma, nicht von den eindringenden Tumorzellen bereitgestellt (Nakahara et al. 1997; Sternlicht et al. 1999; Bowden et al. 1999; Coussens et al. 2000) (siehe Tab. 2.6). Matrix-Metalloproteinasen sind eine Gruppe degradierender Zinkenzyme, die gemeinsam alle Komponenten der extrazellulären Matrix abbauen können (Matrisian 1992). Sie spielen eine wichtige Rolle bei Umbauvorgängen und pathologischen Prozessen, z.B. bei inflammatorischen Vorgängen, Reparation, Tumorinvasion und Metastasierung (Stetler-Stevenson 1999; Egeblad & Werb 2002; Fidler 2002b). Matrix-Remodeling über Metalloproteinasen wird als ein wichtiger Faktor der Tumorinvasion, Metastasierung und Progression angesehen, da der Abbau umgebender Barrieren (Gefäßwände, Basalmembran, Matrix) die Migration maligner Zellen erst ermöglicht (Egeblad & Werb 2002), und MMPs angiogene und mitogene Faktoren aus der Matrix freisetzen, die Tumorzellen und andere Zellen der Umgebung stimulieren (Dano et al. 1999; Egeblad & Werb 2002). Die meisten Zellen der Bindegewebe, wie Fibroblasten, Chondrozyten und Endothelzellen sind in der Lage, MMPs zu sezernieren (Docherty et al. 1992). Hauptquelle der MMPs in Tumoren sind Mastzellen, Makrophagen und neutrophile Granulozyten, die im Rahmen der Degranulation neben MMP9 (Fang et al. 1997; Coussens et al. 1999; Kanbe et al. 1999), auch MMP12 (Shapiro et al. 1993) und MMP8 (Hasty et al. 1990) freisetzen und Zytokine sezernieren (z.B. IL-1β, TNFα), die wiederum Fibroblasten zur MMP-Synthese veranlassen (Westermarck & Kahari 1999). Entzündungszellen, v.a. Monozyten unterstützen somit die Tumorzellinvasion, indem sie Tumorzellen den Weg ebnen und chemotaktische, sowie haptotaktische Faktoren bereitstellen („countercurrent invasion theory“) (Opdenakker & Van Damme 1992). Matrix-Metalloproteinasen können in vier Untergruppen untergliedert werden (Fessler et al. 1984; Wilhelm et al. 1989; Matrisian 1990) : Literaturübersicht 19 • Kollagenasen: bauen fibrilläres Kollagen Typ I, II, III, VII, VIII und X ab. • Stromelysine: Stromelysin-1/-2/-3 und Matrilysin spalten Fibronektin, Proteoglykane und nicht-helikale Regionen des Typ IV-Kollagens. • Gelatinasen: Gelatinasen sind Typ IV-Kollagenasen. MMP-2 (Gelatinase A; 92kDa) und MMP9 (Gelatinase B; 92 kDa) bauen denaturiertes Kollagen (Gelatin) und Typ IV Kollagen ab (Sato et al. 1994) • Matrixartige Metalloproteinasen Die MMP-Aktivität wird komplex und streng auf mindestens drei Ebenen kontrolliert. Einerseits werden die Enzyme als Proenzyme sezerniert und müssen anschließend aktiviert werden, andererseits wird ihre Aktivität direkt und enzymatisch über spezifische MMPGewebeinhibitoren („tissue inhibitors“, TIMPs) reguliert (MacDougall et al. 1999). Unter den Metalloproteinasen gilt MMP9 besonderes Interesse, da es sich um einen tumorangiogenen Faktor handelt, der vermutlich über das VEGF-VEGFR-System agiert (Bergers et al. 2000). Verschiedene Autoren führen MMP9, MMP7 und MMP2 als wichtige Regulatoren von Angiogenese und Tumorprogression an (Brooks et al. 1996; Wilson et al. 1997; Cockett et al. 1998; Itoh et al. 1998; Sternlicht et al. 1999; Coussens et al. 2000). Bestimmte Faktoren sind in der Lage, im Zielgewebe die Sekretion der Metalloproteinasen zu fördern. Beispielsweise induziert die subkutane Implantation von Melanomen einen VEGFvermittelten Anstieg von pro-MMP9, einer proenzymatischen Form von MMP9, in der Lunge (Hiratsuka et al. 2002). VEGF wirkt dabei über das VEGFR1-Signalweg, während eine Stimulation von VEGFR2 keinen Effekt auf die MMP9-Sekretion zeigt (Hiratsuka et al. 2002). MMP9 wird in der Lunge von Endothelzellen und Makrophagen exprimiert, so dass angenommen werden kann, dass eine verstärkte Infiltration mit Makrophagen die Vaskularisierung von Tumoren fördert (Fidler 2002b). Die über Primärtumoren stimulierte, verstärkte Expression von MMP9 durch Endothelzellen und Alveolarmakrophagen übernimmt eine Schlüsselrolle bei der Entstehung von Lungenmetastasen (Itoh et al. 1999; Hiratsuka et al. 2002). In vitro hängt die Invasion der Tumorzellen ins Lungengewebe von der Menge an MMP9 ab, das in der Lunge gebildet wird (Hiratsuka et al. 2002). In vivo ist die Anzahl metastatischer Foci der Lunge nach intravenöser Inokulation von B16-Bl6Melanomzellen bei MMP9-defizienten Mäusen auf 45% im Vergleich zur Kontrollgruppe reduziert (Hiratsuka et al. 2002). Somit könnte eine Blockade der MMP9-Induktion durch VEGFR1-Hemmung bei der Prävention von Lungenmetastasen hilfreich sein. Die metastatische Aktivität humaner Kolonkarzinomzellen korreliert ebenfalls mit der Menge an aktivierter Typ-IV-Kollagenase (Stetler-Stevenson 1990). Dabei spielen organspezifische 20 Literaturübersicht Fibroblasten eine wichtige Rolle. Tumoren, die mit Lungen- oder Kolonfibroblasten kokultiviert wurden, sezernierten deutlich mehr Kollagenasen als solche, die in der Umgebung von Hautfibroblasten wuchsen (Fabra et al. 1992). Letztere produzieren IFN-β, das die Expression und Aktivität der Kollagenasen signifikant hemmt (Fabra et al. 1992). Jede Zellinvasion bedarf weiterhin der Ausbildung von Pseudopodien, bevor die gesamte Zelle durch die Barriere geschleust werden kann (Condeelis 1993; Stossel 1993). Hierfür ist das Zytoskelett und dessen mechanischen Grundlage (v.a. Aktinfilamente) bedeutend, da sie die Motilität der Zellen und Ausbildung von Pseudopodien in jene Freiräume ermöglichen, die durch die Bindung migrationsfördernder Liganden geschaffen werden (Stossel 1993; Dong et al. 1994). Durch ein Wechselspiel lokaler Proteolyse mit anschließender Zelladhäsion am vorderen Zellende, sowie Lösen von Bindungen nach dem Vorschieben, arbeitet sich die Zelle ins umgebende Gewebe vor (Liotta et al. 1991; Damsky & Werb 1992). Verschiedene Faktoren unterstützen die Metastasierung, indem sie die Motilität der Tumorzellen durch Veränderungen der Zellform, des Zytoskeletts, der Zelladhäsion oder der MembranDurchlässigkeit, fördern. Die erste Gruppe wird durch Faktoren repräsentiert, die von den Tumorzellen selbst gebildet werden. Zu diesen autokrinen Motilitätsfaktoren zählen der Hepatozytenwachstumsfaktor („hepatocyte growth factor“, HGF) (Naldini et al. 1991; Bottaro et al. 1991; Santos et al. 1993), insulinartiger Wachstumsfaktor-II („insuline-like growth factor-II“, IGF-II) (El Badry et al. 1990) und Autotaxin (ATX) (Stracke et al. 1992). Die zweite Gruppe der Motilitätsfaktoren entspricht extrazellulären Matrix-Komponenten: Hierzu zählen Vitronektin (Basara et al. 1985), Fibronektin (McCarthy & Furcht 1984), Laminin (McCarthy & Furcht 1984), Typ IV-Kollagen (Klominek et al. 1993) und Thrombospondin (Taraboletti et al. 1987). Diese Proteine stimulieren Chemotaxis (Motilität in Richtung eines chemischen Gradienten) und Haptotaxis (Motilität in Richtung auf ein gebundenes Substrat). Viele der Eiweiße entfalten ihre Wirkung über Integrin-Rezeptoren (Leavesley et al. 1992). Durch Kopplung der Matrix-Degradation mit der Freisetzung von Motilitätsfaktoren ist ein wichtiger Grundstein der Metastasierung gelegt, da Matrix-Proteine die Tumorzellen umgeben und bei tumorzellbedingter Exkretion von Enzymen abgebaut werden. Somit können intakte extrazelluläre Matrixproteine, wie beispielsweise Kollagen Typ I, das 90% der Knochensubstanz darstellt und als Motilitätsfaktor wirkt, Tumorzellen haptotaktisch leiten (Mundy et al. 1981). Auch einige Produkte der Osteolyse wirken gleichzeitig als Chemokine (TGF-β und Osteocalcin) (Mundy et al. 1981; Mundy & Poser 1983; Orr et al. 1990). Parakrin wirkende Motilitätsfaktoren, wie IGF-I (Stracke et al. 1988), IL-8 (z.B. von neutrophilen Granulozyten freigesetzt) (Wang et al. 1990) und Histamin (Tilly et al. 1990) Literaturübersicht 21 werden vom Zielgewebe bereitgestellt und wirken ebenfalls als sogenannte „Homing“Faktoren der selektiven Chemotaxis, da sie die Tumorzellen dazu veranlassen, in Richtung des Gewebes zu wandern, in dem die Faktoren produziert werden. Viele dieser Faktoren wirken zusätzlich als Mitogene (selektives Wachstum). Basalmembran, interstitielles Stroma Degradation extrazellulärer Matrix • Tumorzellen Mastzellen, Makrophagen, neutrophile Granulozyten, • Fibroblasten sezernieren Metalloproteinasen als Proenzyme, die im Stroma verbleiben • Gewebe- Serinproteasen • Plasminaktivatoren, Urokinase • Thrombin, Plasmin Komponenten der extrazellulären Matrix vermitteln Motilität, • Ausbildung von Chemotaxis und Haptotaxis: Pseudopodien • Vitronektin, Fibronektin, Laminin, Typ IV- Kollagen, • Thrombospondin • Kollagen Typ I (Knochengewebe) • • TGF-β, Osteocalcin (Produkte der Osteolyse) • IL-8, IGF-I, Histamin u.a. Zytokine der Zielgewebe wirken als Homing- Faktoren und Motilitätsfaktoren Expression verschiedener Oberflächenrezeptoren zur interzellulären Kontaktaufnahme Ausbildung von Pseudopodien Produktion von Motilitätsfaktoren- HGF, IGF, ATX Ausbildung von Integrinen Tab. 2.3: Beteiligung der Tumor- und Gewebezellen an der Tumorzellinvasion. Freisetzung von Motilitätsfaktoren und die Degradation extrazellulärer Matrix sind Voraussetzungen einer erfolgreichen Tumorzellinvasion: Die Invasion der Tumorzellen ins umliegende Gewebe wird von Mechanismen bestimmt, die zur Degradation des umliegenden Gewebes führen und die Motilität der Tumorzellen fördern. Die Tumorzellen übernehmen tendentiell eine passive Funktion. 2.2.6 Entwicklung manifester Metastasen Mehrere Studien haben gezeigt, dass die Regulation der Zellproliferation im Sekundärorgan ein Schlüsselfaktor bei der erfolgreichen Etablierung von Metastasen ist. Man unterscheidet im Rahmen der Wachstumsregulation derzeit drei Stadien, die schlussendlich zur erfolgreichen Etablierung der Metastasen führen (Luzzi et al. 1998a; Cameron et al. 2000; Chambers et al. 2001): • Initiales Überleben einer Subpopulation einzelner Zellen im Sekundärorgan • Initiation der Zellteilung weniger vitaler Zellen • Fortschreitendes Wachstum entstandener Mikrometastasen Wie bereits erwähnt, überleben circa 80% der in das Blutsystem injizierten Zellen Zirkulation, Zelladhäsion und Extravasation (Luzzi et al. 1998a). Allerdings proliferieren nur wenige Einzelzellen und bilden Mikrometastasen (1 von 40), und ein noch kleinerer Anteil dieser Mikrometastasen entwickelt sich zu makroskopisch sichtbaren Metastasen (1 von 100). Zirka 22 Literaturübersicht 36% der Zellen bleiben als Ruhezellen teilungsfähig, proliferieren aber zunächst nicht (Koop et al. 1995). Ähnliche Zellen wurden auch in anderen Metastasierungsmodellen nachgewiesen (Morris et al. 1994; Luzzi et al. 1998a; Cameron et al. 2000; Chambers et al. 2001). Jene solitären Zellen können die Ursache dafür sein, dass sich Jahre nach einem erfolgreich therapierten Primärtumor Metastasen entwickeln. Einzelzellen, die im Sekundärorgan vorliegen und nach Aktivierung, z.B. infolge immunsuppressiver Vorgänge oder systemischen Stresses, proliferieren, bilden zunächst Mikrometastasen aus. Diese fallen der Apoptose anheim, werden vom Immunsystem zerstört, harren im Ruhestadium aus oder proliferieren und entwickeln sich schließlich zu Makrometastasen, die Gefäße etablieren. Folkman et al. beschreiben präangiogene Mikrometastasen, in denen Apoptose und Proliferation in einem Gleichgewicht zueinander auftreten, so dass klinisch keine Tumoren nachzuweisen sind (Holmgren et al. 1995; Murray 1995). Sobald die Mikrometastasen allerdings die Fähigkeit zur Vaskularisierung entwickeln, wachsen sie rasch zu klinisch relevanten Metastasen heran. Die Ausbildung von Blutgefäßen ist in diesem Zusammenhang somit ein kritischer Faktor (Folkman 1990; Fidler & Ellis 1994; Folkman 1995; Pluda 1997; Rayson et al. 1999; Chambers et al. 2001). Ruhestadium Ruhestadium Apoptose Apoptose Ruhestadium Ruhestadium Zirkulation im Blut gefäßsystem und Zelladhäsion Extravasation Zirkulation und Intravasation solitäre Tumorzelle präangiogene Metastase Abb.2.7: Mögliche Schicksale solitärer Tumorzellen im Sekundärorgan: 1. Überleben einzelner Zellen, 2. Proliferation und Ausbildung präangiogener Mikrometastasen, 3. Proliferation und Ausbildung vaskularisierter Makrometastasen. Erst Makrometastasen lassen sich klinisch darstellen. Einzelzellen und Mikrometastasen können über Jahre in Wartestellung verbleiben oder jederzeit durch Apoptose oder immunologische Vorgänge absterben. Literaturübersicht 2.2.7 23 Tumorzellproliferation und deren Modulation durch das umgebende Milieu Die Entwicklung von Tumormetastasen beruht auf zahlreichen Interaktionen der Tumorzellen mit dem Zielgewebe (Fidler 2001) und ist von verfügbaren Adhäsionsmolekülen (Carlos 2001), Chemokinen (Muller et al. 2001), hydrodynamischen Effekten (Haier & Nicolson 2001) und vielen anderen Faktoren (Engers & Gabbert 2000) abhängig. Tumoren beinhalten nicht nur proliferierende Tumorzellen, sondern stellen komplexe Gewebe aus neoplastischen Zellen, Matrix-Proteinen und zellulären Bestandteilen (z.B. tumorassoziierte Fibroblasten, kapillar-assoziierte und inflammatorische Zellen) dar. Die Hauptkomponenten der extrazellulären Matrix sind Glykoproteine: Fibronektin, Laminin, Tenascin, Vitronektin und Kollagen. Tumorzellen interagieren mit Matrixkomponenten durch Transmembranrezeptoren (Integrine), die strukturelle Verknüpfungen der Matrix mit dem Zytoskelett aufbauen, sowie Zelladhäsion und Migration vermitteln. Das Integrin αvβ3 bindet verschiedene Matrixkomponenten und wird während Angiogenese und vaskulären Umbauvorgängen auf vaskulären Zellen exprimiert. Das Integrin bindet MMP2 auf der Zelloberfläche und vermittelt auf diese Weise Degradation und Umbauvorgänge der extrazellulären Matrix während der Invasion (Brooks et al. 1994). Es findet sich gewöhnlich auf der Oberfläche von Endothelzellen, Leukozyten und Makrophagen (Cheresh 1991; Ahmad et al. 2002). Verstärkte Expressionslevel wurden auf aktivierten Endothelzellen, v.a. in Granulationsgeweben und Tumoren (Glioblastom, Brust-, Kolon-, Lungen-, Pankreaskarzinomen) nachgewiesen (Enenstein et al. 1992; Brooks et al. 1994; Max et al. 1997). Die Expression von αvβ3 durch Tumorendothelien korreliert mit der Aggressivität (Neuroblastome) und Progression (primäre Melanome) von Tumorne (Erdreich-Epstein et al. 2000; Kageshita et al. 2000). Im Zusammenhang mit Tumorzell-Zell-Interaktionen beeinflussen positive und negative Faktoren über autokrine, parakrine und endokrine Signalwege die Tumorzellproliferation (Fidler 1990). Unterschiede in Hormonkonzentrationen, in der Expression lokaler Faktoren oder parakrinen Wachstumsfaktoren regulieren das Tumorwachstum im jeweiligen Organparenchym (Plowman et al. 1981; Radinsky 1991). Spezifische Wachstumsfaktoren liegen in den einzelnen Organparenchymen in unterschiedlichen Konzentrationen vor. Beispielsweise wird IGF-I in den meisten Geweben produziert, weist aber in der Leber die höchste Konzentration auf (Zarrilli et al. 1994). Das Wachstum metastasierter Karzinomzellen in der Leber wird in Abhängigkeit von deren IGF-I-Rezeptor-Expression durch hepatisches IGF-I stimuliert (Long et al. 1994). 24 Literaturübersicht Mit dem Fortschreiten der Malignität entwickeln einige Tumoren die Fähigkeit, Wachstumsfaktoren zu produzieren und sind dadurch von exogenen Einflüssen mehr oder weniger unabhängig. Viele transformierte Zellen sind beispielsweise in der Lage, TGF-β in verstärktem Maße zu produzieren und entwickeln gleichzeitig eine gewisse Resistenz gegenüber seinen wachstumshemmenden Eigenschaften (Roberts et al. 1986). Diverse humane Melanomzelllinien produzieren im Gegensatz zu Melanozyten unterschiedliche angiogene Faktoren (Edward & MacKie 1993). Hierzu gehören VEGF, „basic fibroblast growth factor“ (bFGF) (Halaban et al. 1988; Becker et al. 1989; Rodeck et al. 1991a), IL-8 (Schadendorf et al. 1994), „platelet derived growth factor“ (PDGF) und „placental growth factor“ (PlGF). Parakrin wirksame Wachstumsfaktoren sind IGF-I (Blat et al. 1989; Kurtz et al. 1990) und “epidermal growth factor” (EGF) (de Wit et al. 1992). Mit Tumorprogression und dem Übergang von der radialen zur vertikalen Wachstumsphase produzieren Melanozyten insbesondere zwei angiogene Wachstumsfaktoren: bFGF und VEGF (GitayGoren et al. 1993; Vacca et al. 2000). Allerdings kann kein Zusammenhang zwischen VEGFProduktion und der Malignität des Tumors festgestellt werden (Weninger et al. 1996). Angiostatin Endostatin Integrine bFGF IGF EGF IL-8 TGF-β MMP 2 VEGF PlGF PDGF TGF-β Abb. 2.7. Parakrine und autokrine Wachstumsfaktorn: Tumorzellen sind in der Lage, durch Integrine und Zytokine mit der Umgebung zu kommunizieren. Autokrine Wachstumsfaktoren (gelb) werden von den Tumorzellen selbst gebildet, während parakrine Wachstumsfaktoren (orange) von Zellen der Umgebung bereitgestellt werden. Angiostatin, Endostatin und TGF-β inhibieren das Wachstum entfernter Metastasen. TGF wird von Tumorzellen produziert, die gegenüber der hemmenden Wirkung immun werden. VEGF, bFGF, IL-8, PDGF und PlGF sind als autokrine Wachstumsfaktoren wirksam, während IGF und EGF vom umgebenden Geweben gebildet werden. Obwohl Primärtumoren einerseits die eigene Blutgefäßversorgung fördern, schaffen sie sich einen Überlebensvorteil, indem sie andererseits die Entwicklung entfernter Metastasen hemmen. Nach Exzision des Primärtumors kann es dann zu verstärktem Wachstum der Metastasen kommen (Sugarbaker et al. 1977). So sind beispielsweise Zytokine, wie Literaturübersicht 25 Angiostatin (O'Reilly et al. 1994), Endostatin (O'Reilly et al. 1997) und TGF-β (Gohongi et al. 1999), die von Primärtumoren sezerniert werden, durchaus in der Lage Metastasenwachstum unspezifisch zu inhibieren. Auch Matrix-Metalloproteinase-Inhibitoren, die über Desintegration interzellulärer Kontakte wirken, sind antiangiogen wirksam (Carmeliet & Jain 2000). 2.3 2.3.1 Inflammatorische Vorgänge und deren Bedeutung im Tumorgeschehen Entzündungen als Triggermechanismus der Transformation Die Entstehung maligner Tumoren setzt die Transformation benigner hyperproliferativer Läsionen in lokal expandierende Tumoren mit metastatischem Potential voraus. Bereits 1863 vermutete Virchow, dass der Ursprung der Tumorbildung bei chronischen Entzündungen liegt, da bestimmte Reize in Verbindung mit Gewebeschäden und der daraus resultierenden Entzündungsreaktion zu Zellproliferationen führen (Balkwill & Mantovani 2001). Obwohl heutzutage bekannt ist, dass die Proliferation von Zellen nicht unmittelbar zur Entwicklung von Tumoren führt, erhöht sich das Risiko der Transformation in der Umgebung von Entzündungszellen, Wachstumsfaktoren, aktiviertem Stroma und DNA-schädigenden Agens (Ekbom et al. 1990; Vesterinen et al. 1993; Bansal & Sonnenberg 1995; Ness & Cottreau 1999; Coussens & Werb 2002). Die Transfomation von Zellen erfolgt über mehrere Schritte. Nach der Initiation, bei der virale oder chemische Karzinogene irreversible DNASchädigungen hervorrufen (Rous & Kidd 1941; Mackenzie & Rous 1941), können die betroffenen Zellen zunächst im normalen Gewebe persistieren. Erst mit der zweiten Stimulation, der sogenannten Promotion, ist die Transformation erfolgreich. Als Promoteren dienen neben chemischen Stoffen (z.B Benzol), verschiedene Faktoren, die bei der Wundheilung, Organresektion, chronischer Irritation oder Entzündung freigesetzt werden. Sie beeinflussen direkt oder indirekt die Zellproliferation, rekrutieren inflammatorische Zellen, verstärken die Produktion reaktiven Sauerstoffs und führen so zu oxidativen Zellschäden, oder verhindern DNA-Reparaturmechanismen (Coussens & Werb 2002). Dies kann zur Entstehung und Proliferation von Zellen führen, die nicht mehr auf die Regulationsmechanismen des Organismus ansprechen. 26 Literaturübersicht 2.3.2 Entzündungsprodukte dienen als Vermittler der malignen Transformation Zytokine und Chemokine fördern die Infiltration inflammatorischer Zellen in entzündlich verändertes Gewebe. Granulozyten sezernieren im Rahmen ihrer Abwehrmechanismen chemisch reaktive Substanzen, wie Oxidantien, Radikale und elektrophile Mediatoren, die mutagenes Potential besitzen und bei Freisetzung mit Stroma und Epithel konfrontiert werden (Lewis & Adams 1987; Jackson et al. 1989; Weitzman & Gordon 1990; Tamatani et al. 1999). Granulozyten und andere Leukozyten bilden Mutagene drei verschiedener Gruppen: o Hydrogenperoxid und Sauerstoffradikale (Kasai et al. 1986; Olson 1988; Muehlematter et al. 1988; Radosevich & Weitzman 1989; Moraes et al. 1990; Beehler et al. 1992; Cerutti 1994; Lin et al. 2000a): Sauerstoffradikale wirken direkt mutagen, indem sie zu DNA-Strangbrüchen führen (Feig et al. 1994; Burcham 1998), oder indirekt mutagen durch modifizierende Gentranskription (Du et al. 1994), bzw. Suppression genomischer Reparaturmechanismen (Hu et al. 1995; Ghosh & Mitchell 1999). o Stickoxid (NO): NO führt zu DNA-Schäden infolge Oxidierung und kann ebenfalls zur Inaktivierung von Reparaturproteinen führen (Wink et al. 1991; Nguyen et al. 1992; Calmels et al. 1997; Felley-Bosco 1998; Burney et al. 1999; Balkwill & Mantovani 2001; Chazotte-Aubert et al. 2001). o Malondialdehyd (Fischer et al. 1983; Basu et al. 1988; Ji et al. 1998; Marnett 1999) und 4-Hydroxy-2-Nonenal (Douki & Ames 1994; Lee et al. 2000) bewirken eine Alkylierung der DNA und interagieren direkt mit Nukleotiden der DNA bzw. dem p53 Transkriptionsfaktor (Fitzpatrick 2001). Sie entstehen als Nebenprodukte der Lipidperoxidation (Burcham 1998). Obwohl in seiner Struktur unverändert, ist das Tumor-Suppressor-Gen p53 in Tumoren oft inaktiviert. Betroffene Zellen zeigen eine verstärkte Proliferation, verlängerte Lebensspannen und verminderte Reparaturen im Falle genomischer Schäden (Hudson et al. 1999), da das p53-Suppressor-Gen in seiner Funktion eng mit den DNA-Reparaturmechanismen gekoppelt ist. In normalen Zellen kommt es nach genomischen Schäden zu einer Akkumulation p53Proteins in der Zelle, was zu einer Unterbrechung im Zellzyklus und zu einer Aktivierung von DNA-Reparaturmechanismen führt. Mutationen betreffen die DNA-Bindungsfähigkeit (Kontaktmutanten) oder die Beschaffenheit (Bildungsmutanten) des p53-Proteins. Beide Mutationen unterbrechen den Zellzyklus und führen zur Akkumulation mutierten p53Proteins (Oliner et al. 1992). Literaturübersicht 27 Hemmung des p53-Gens oder Inaktivierung des p53-Proteins kann über zwei Mechanismen erfolgen: Einerseits durch Mutation, Inaktivierung oder Verlust des p53-Allels oder andererseits durch Bindung von Ubiquitin-Ligase-Onkoproteinen an p53-Proteine (Reich & Levine 1982; Oliner et al. 1992; Vousden 1993; Kubbutat & Vousden 1998). In manchen Tumoren binden Onkoproteine (z.B. virale Onkoproteine des humanen Papillomavirus-E6) p53-Proteine direkt und beschleunigen dessen Abbau (Haupt et al. 1997; Rodriguez et al. 2000). Die Folge sind niedrige p53-Basalwerte und die Unfähigkeit, die intrazelluläre Konzentration des p53-Proteins im Falle von DNA-Schäden zu erhöhen. Oxidierende Agenzien (Diamid, Pyrrolidin, Dithiocarbamate, H2O2,) und NO-Lieferanten stören Struktur und DNA-Bindungseigenschaften des isolierten p53-Proteins (Calmels et al. 1997; Parks et al. 1997). Als ein Inhibitor des p53-Gens wurde der Migrations-hemmende-Faktor („migration inhibitory factor“, MIF) beschrieben (Hudson et al. 1999). 2.3.3 Beteiligung inflammatorischer Zellen an der Tumorprogression Aufgrund ähnlicher Charakteristika zwischen entzündlichen Vorgängen und dem Tumorgeschehen, bezeichnete Dvorak Tumoren bereits 1986 als nicht heilende Wunden (Dvorak 1986). Während die Wundheilung in der Regel selbstlimitierend ist, sezernieren Tumorzellen Faktoren, die weiter stimulierend wirken (Burke et al. 1996). Tumoren produzieren eine Reihe von Zytokinen und Chemokinen, die Leukozyten anlocken; letztere beinhalten verschiedene Leukozytenpopulationen, wie beispielsweise neutrophile Granulozyten, dendritische Zellen, Makrophagen, Mastzellen und eosinophile Granulozyten, sowie Lymphozyten. Diese Zellen bilden wiederum zahlreiche Zytokine, zytotoxische Mediatoren, Serin- und Cysteinproteasen, MMPs und membranperforierende Substanzen, TNFα, Interleukine und Interferone (Wahl & Kleinman 1998; Kuper et al. 2000). VEGF beispielsweise wird von vielen Tumoren sezerniert und wirkt als Permeabilitätsfaktor, der zu einer persistierenden Extravasation von Fibrin, Fibronektin und kontinuierlicher Produktion extrazellulärer Matrix führt. Stromazellen, d.h. Tumor-assoziierte inflammatorische Zellen (TAICs) und Fibroblasten modulieren das Milieu im Tumor und sind an der neoplastischen Progression beteiligt (siehe 2.4). Aber auch lymphoide Zellen, wie T-Lymphozyten, Makrophagen und Mastzellen fördern angiogene Vorgänge (Polverini & Leibovich 1984; Leek et al. 1994; Gutman et al. 1994; Sunderkotter et al. 1994; Polverini 1996). Während der Wundheilung erreichen Mastzellen, neutrophile Granulozyten und Monozyten/ Makrophagen als erste Entzündungszellen das betroffene Gewebe. Diese Zellen sind dann 28 Literaturübersicht auch die Hauptquelle für Mitogene, Zytokine und Proteinasen. Sie beeinflussen die Proliferation kapillär-assoziierter Zellen, Epithelzellen und mesenchymaler Zellen, sowie Matrixremodeling und Freisetzung proteolytischer Enzyme und unterstützen so Wachstum und Angiogenese. Auch Thrombozyten sind eine wichtige Quelle solcher Zytokine, vor allem für VEGF und TGF-β, die ebenfalls für die Tumorangiogenese bedeutend sind (Pinedo et al. 1998). In Abhängigkeit von Lokalisation und Organmilieu können verschiedene inflammatorische Zellen im Tumorgewebe nachgewiesen werden, die nachfolgend beschrieben werden sollen: • Mastzellen: Mastzellen sind beispielsweise in kutanen Melanomen und Plattenepithelkarzinomen aufgrund verschiedener, vom Tumor gebildeter Wachstumsfaktoren, (Stammzellfaktor, VEGF, EGF, bFGF und PDGF (Hiromatsu & Toda 2003) die ersten infiltrierenden Zellen. Sie spielen in der frühen Phase der Tumorentwicklung eine wichtige Rolle bei der Bereitstellung angiogener Wachstumsfaktoren und MMP9. Durch Degranulation werden VEGF (Norrby 2002), Serinproteasen (Yong 1997) und MMP9 (Fang et al. 1997; Norrby 2002) freigesetzt, die zum Remodeling der Matrix beitragen. MMP9 setzt wiederum Matrix-gebundenes VEGF frei (Bergers et al. 2000) und unterstützt so angiogene Vorgänge, die das Tumorwachstum fördern. In einem transgenen Mausmodell waren knochenmarksgereifte Entzündungszellen die Hauptquelle von MMP9 während des Tumorwachstums (Coussens et al. 1999). Dass Mastzellen wichtige MMP-9-Lieferanten während der Tumorentwicklung sind, deckt sich mit der Beobachtung, dass eine peritumorale Akkumulation von Mastzellen mit Gefäßdichte und metastatischen Potential der Plattenepithelkarzinome (Coussens et al. 1999; Elpek et al. 2001; Iamaroon et al. 2003) und Melanome (Toth-Jakatics et al. 2000) korrelieren. • Makrophagen: Makrophagen sind häufige Infiltratzellen in Tumoren (Mantovani et al. 1992a) und differenzieren u.a. aus zirkulierenden knochenmarksgereiften monozytären Vorläuferzellen, die über Chemokine („monocyte chemotactic protein-1“; MCP-1 (Mantovani et al. 2002)) und Wachstumsfaktoren (Riches et al. 1996) angelockt werden. Dabei ist die Makrophageninfiltration von der Konzentration des MCP-1, welches von neoplastischen Zellen sezerniert wird, abhängig (Nesbit et al. 2001). Viele Tumorzellen produzieren außerdem Kolonie-stimulierende Faktoren („colony stimulating factors“, CSF), die das Überleben Tumor-assoziierter Makrophagen (TAMs) sichern. Makrophagen stellen eine wichtige Quelle für Wachstumsfaktoren, Enzyme und Zytokine dar, die endotheliale, epitheliale und mesenchymale Zellen lokal beeinflussen (Coussens et al. 2000; Balkwill & Mantovani 2001; Coussens & Werb 2002) und angiogene Vorgänge stimulieren (Sica et al. Literaturübersicht 29 2002; Bingle et al. 2002). Sie sind nach Aktivierung (über TGF-β1) in der Lage, TNFα, Interleukine (IL-1, IL-6, IL-8), VEGF und bFGF zu sezernieren (Ono et al. 1999; Varney et al. 2002), die u.a. Endothelzellproliferation, Migration und Differenzierung vermitteln (Polverini & Leibovich 1984; Polverini 1996). Monozyten sind in der Lage, die Apoptose neoplastischer Zellen zu vermitteln und sind an gewebeabbauenden Reaktionen beteiligt, da sie durch die Produktion extrazellulärer Komponenten und Proteasen die Zusammensetzung der extrazellulären Matrix beeinflussen (Sunderkotter et al. 1994). Somit stimulieren Makrophagen auch die Tumorzellproliferation, vermitteln Angiogenese und unterstützen Invasion und Metastasierung (Mantovani et al. 1992b). Auf der anderen Seite beteiligen sich aber auch neoplastische Zellen selbst an der Umstrukturierung, indem sie IL-8, bFGF und VEGF sezernieren (Yoshida et al. 1997; Nesbit et al. 2001). Monozyten können über TNFα und IL-1α die Produktion von IL-8 und VEGF duch Melanomzellen noch verstärken (Torisu et al. 2000). Makrophagen sezernieren zusätzlich Substanzen, die antiangiogen wirken (z.B. Thrombospondin) und nehmen somit am negativen Feedback der physiologischen Angiogenese teil (Tartakovsky et al. 1986). • Dendritische Zellen: Dendritische Zellen spielen bei der Aktivierung antigen-spezifischer Immunität und Toleranz eine Rolle. Monozyten differenzieren in Anwesenheit von Granulozyten-Monozyten-CSF und IL-4 in unreife dendritische Zellen (Talmor et al. 1998), die in entzündlich veränderte Gebiete einwandern, wo sie Antigene binden, um dann als gereifte Zellen in Lymphknoten zu migrieren und T-Lymphozyten zu aktivieren. IL-6 und CSF-1 neoplastischer Zellen beeinflussen myeloische Vorläuferzellen in Richtung eines makrophagenartigen Phänotyps (Allavena et al. 2000). Im Gegensatz zur herkömmlichen Funktion sind Tumor-assoziierte dendritische Zellen (TADC) unreife Zellen und es fehlt ihnen die Fähigkeit zur T-Zell-Stimulation (Allavena et al. 2000). Es finden sich praktisch keine reifen dendritischen Zellen in neoplastischen Läsionen, was auf einer mangelnden Ansprechbarkeit auf stimulierende Reifungssignale, sofortiger Migration reifer Zellen oder der Anwesenheit hemmender Faktoren beruhen könnte (Balkwill & Mantovani 2001). TADC sind somit nur schlechte Vermittler effektiver zellulärer Abwehrmechanismen (Balkwill & Mantovani 2001) und sind nicht in der Lage, Tumorzellen abzutöten. • Lymphozyten: Die vorherrschende Lymphozytenart im Tumor sind T-Helferzellen (CD4bzw. TH2-Lymphozyten), die durch Tumor-assoziierte Makrophagen (Typ II) aktiviert werden (Sica et al. 2000) und in erster Linie Interleukine (IL-4, IL-5) produzieren (van den Berg A. et al. 1999). Während die Interferon-γ-Sekretion zytotoxischer T-Zellen mit TH1(zytotox.)Immunantworten und der Aktivierung von Makrophagen assoziiert ist, beeinflussen IL-4 und 30 Literaturübersicht IL-5 in erster Linie B-Lymphozyten (Coussens & Werb 2002) (siehe Abb. 2.9). Diese Polarisierung führt zu einseitigen TH2-Aktivitäten der Lymphozyten, die bei der immunologischen Abwehr entarteter Zellen ineffizient sind. Zusätzlich wird die Ineffizienz lokaler Abwehrmechanismen noch durch eine fehlerhafte Signaltransduktion des T-ZellRezeptors in Tumor-assoziierten-T-Lymphozyten vervollständigt (Mizoguchi et al. 1992). Typ I Makrophage Typ II Makrophage TH1- Helferzelle Zytokine TNF-β TNFα GM-CSF IFN-γ IL-2, IL-3 TH2- Helferzelle Zytokine IL-2 IL-4 IL-5, IL-6, IL- 10 GM-CSF, TGF-β Makrophage Antigenspezifische B-Zelle Abb. 2.9: Die Effektorfunktionen der T-Zellen sind von dem Spektrum an Effektormolekülen abhängig, die sie erzeugen. TH1-Zellen sind auf die Aktivierung von Makrophagen spezialisiert, die Pathogene phagozytieren. Sie sezernieren IFN-γ und andere Effektormoleküle. TH2-Zellen sind auf die B-Zell-Aktivierung spezialisiert und sezernieren die Wachstumsfaktoren IL-4 und IL-5 der B-Zelle. Sie exprimieren den CD40Liganden, der an das Oberflächenmolekül CD40 der B- Zelle bindet (nach Janeway & Travers 1997). • Natürliche Killerzellen (NK) sind nur selten im Tumorgewebe zu finden (Negus et al. 1997), während sie die Entwicklung verschiedener experimenteller Tumoren scheinbar kontrollieren (Gorelik et al. 1982; Barlozzari et al. 1985). Frühe Studien durch van den Brink et al. zeigten eine spezifische Infiltration natürlicher Killerzellen in neoplastisches Gewebe 10-15 Tage p.i. (van den Brink et al. 1991). Neuere Erkenntnisse demonstrieren, dass NKZellen bereits innerhalb der ersten 5-15 min nach Tumorinokulation in vivo spezifisch reagieren und die Anzahl der Tumorzellen, die sich innerhalb der ersten Stunden in der Lunge Literaturübersicht 31 ansiedeln bei einem Mangel an natürlichen Killerzellen drastisch erhöht ist (Shingu et al. 2002). Diese Tatsache verdeutlicht den Einfluss der NK auf die Ansiedlung und Metastasierung neoplastischer Zellen. Natürliche Killerzellen sezernieren diverse Zytokine, die Rekrutierung und Aktivierung der Monozyten hemmen (Shingu et al. 2002), während CD4+-T-Lymphozyten chemotaktisch angelockt werden (Shingu et al. 2002). An der Rekrutierung inflammatorischer Zellen mit starker Monozyteninfiltration im Tumorgewebe sind somit nicht nur Tumorzellen, sondern auch Entzündungszellen beteiligt. 2.3.4 Inflammatorische Zytokine, Wachstumsfaktoren und Chemokine im Rahmen der Tumorprogression Seit einiger Zeit ist bekannt, dass Zytokine und Chemokine, die an Entzündungsreaktionen beteiligt sind und von Tumorzellen oder Tumor-assoziierten Leukozyten und Thrombozyten gebildet werden, direkt an malignen und angiogenen Progressionsvorgängen mitwirken (Balkwill & Mantovani 2001). Das inflammatorische Zellinfiltrat, insbesondere Tumorassoziierte-Makrophagen, sezerniert Zytokine wie TNF und Interleukine (IL-1 und IL-6), die auch die Produktion angiogener Faktoren (z.B. VEGF) vermitteln. Makrophagen produzieren außerdem TGF-β, ein Molekül, das selbst angiogene Wirkung besitzt und die VEGFExpression induziert (Balkwill & Mantovani 2001). Viele Zytokine und Chemokine (z.B. TNF, IL-1 und IL-6) werden auch bei Hypoxie freigesetzt, einem typischen Merkmal von Tumorgeweben (Koong et al. 2000). Zytokine sind Entzündungsmediatoren, die Überleben, Wachstum, Mutation, Proliferation, Differenzierung und Motilität von Tumorzellen und Stromazellen beeinflussen (Balkwill & Mantovani 2001). Darüber hinaus vermitteln sie den Informationsaustausch zwischen verschiedenen Zelltypen, sowie Interaktionen der Tumorzellen untereinander (Balkwill & Mantovani 2001). Zu diesen Mediatoren zählen Tumornekrosefaktoren, die einerseits an der Regeneration von Geweben beteiligt sind und andererseits Gewebeschäden verursachen (Balkwill & Mantovani 2001). In Tumoren induziert TNF, wenn es in hohen Konzentrationen vorliegt, die Regression von Blutgefäßen (Lejeune et al. 1998), wirkt aber bei chronischer Produktion durch die Freisetzung angiogener Faktoren (Kollias et al. 1999) als endogener Promotor des Tumorwachstums. Es vermittelt strukturelle Veränderungen und Umbauvorgänge der Gewebe, die für das weitere Wachstum und die Ausbreitung von Tumoren wichtig sind (Balkwill & Mantovani 2001). TNF-Rezeptoren sind auf Tumorzellen, Stromazellen und Tumor-assoziierten Leukozyten lokalisiert (P55-TNF-Rezeptor) (Naylor et al. 1993). Indem TNF die Apoptose geschädigter Zellen vermittelt, stimuliert es das 32 Literaturübersicht Wachstum der Fibroblasten. TNF erhöht die Expression von Adhäsionsmolekülen auf Endothelzellen (Ekbom et al. 1990; Mantovani et al. 1992a; Negus et al. 1997; Gulumian 1999) und induziert die Bildung von MCP-1, einem Chemokin, das die Infiltration von Makrophagen und Lymphozyten, sowie Freisetzung von MMP9 (Naylor et al. 1993) reguliert. Makrophagen sind wiederum eine Hauptquelle für TNF (Ono et al. 1999; Varney et al. 2002). Chemokine sind inflammatorische Zytokine, die bei der Rekrutierung von Leukozyten und deren Infiltration in entzündliches Gewebe beteiligt sind. Die meisten Tumoren produzieren Chemokine zweier Gruppen: α (oder CXC) und β (CC) (Mantovani et al. 1992a; Negus et al. 1995; Luboshits et al. 1999). Neutrophile Granulozyten und Lymphozyten sprechen auf CXC (z.B. IL-8) an, wobei neutrophile Granulozyten nur selten in Tumorgewebe infiltrieren (Negus et al. 1997). CC-Chemokine haben dagegen Einfluss auf verschiedene Leukozyten (Monozyten, dendritische Zellen, Lymphozyten und natürliche Killerzellen) mit Ausnahme neutrophiler Granulozyten (Mantovani et al. 1992a; Negus et al. 1995; Luboshits et al. 1999). IL-1 und IL-6 sind beispielsweise an der Entwicklung von Metastasen beteiligt (VidalVanaclocha et al. 2000), indem IL-1 Expression von Adhäsionsmolekülen auf Endothelzellen fördert (Ekbom et al. 1990; Mantovani et al. 1992a; Negus et al. 1997; Gulumian 1999). IL-6 agiert u.a. als Wachstumsfaktor hämatogener Tumore (Tricot 2000) und IL-1 stimuliert das Wachstum von Magenkarzinomen und myeloiden Leukämien (El Omar et al. 2000). Melanomprogression wird dagegen eher durch IL-8 unterstützt (Haghnegahdar et al. 2000). 2.3.5 Lokale Inflammation und systemische Unterdrückung von Entzündungsvorgängen Während lokale Tumoren mit Entzündungsvorgängen assoziiert sind, kann es systemisch zu einer Unterdrückung von Entzündungsreaktionen kommen, die auf drei Grundmechanismen beruht: • Chemokine, die ins Gefäßsystem übertreten, desensibilisieren zirkulierende Leukozyten (Rutledge et al. 1995). • Eine verstärkte Expression von TNF-Rezeptoren wirkt als Pufferung (Balkwill & Mantovani 2001), indem TNF abgefangen wird. • Tumoren produzieren antiinflammatorische Zytokine (Sica et al. 2000) und antiangiogene Wachstumsfaktoren (Angiostatin, Endostatin, TGF-β ) (O'Reilly et al. 1994; O'Reilly et al. 1996; O'Reilly et al. 1997; Gohongi et al. 1999), die das Metastasenwachstum unspezifisch inhibieren. Literaturübersicht 33 TH1- Helferzelle TH2- Helferzelle pro-inflammatorische Zytokine anti-inflammatorische Zytokine IL-1, TNF-α , IFN-γ etc. IL-1, IL-10, IL-13 etc. geringe ChemokinProduktion bzw. Produktion anti-inflammator.Zytokine mäßiger Entzündungsprozess eingeschränkte Vaskularisierung Langsames Tumorwachstum massive Produktion proinflammatorischer Zytokine Entzündung Produktion antiangiogener/ anti-inflammatorischer Zytokine Entzündungsprozess mit Infiltration von Monzyten/ neutrophilen Granulozyten (zielgerichtet) Neovaskularisierung Angiostase Rasches Tumorwachstum Tumorregression Abb. 2.10: Tumorwachstum im Zusammenhang mit Entzündungsprozessen: Je nach Zytokinproduktion (pro-/ anti-inflammatorische Zytokine und Chemokine) werden Entzündungsvorgänge induziert, die für Tumorwachstum und Tumorprogression entscheidend sind. Tumoren, die nur geringe Mengen proinflammatorischer Zytokine bilden, bzw. beim Überwiegen antiinflammatorischer Faktoren, wachsen langsam. Überwiegen dagegen inflammatorische und angiogene Faktoren, kann die Neoplasie rasch an Umfang zunehmen. Gezielte Entzündungsrektionen (Monozyten-/Neutrophileninvasion, Produkion antinflammatorischer und antiangiogener Faktoren) bedingen dagegen die Regression des Tumors (nach Coussens & Werb 2002). 34 2.4 2.4.1 Literaturübersicht Neovaskularisierung von Tumoren und deren Regulationsmechanismen Postnatale Angiogenese und Vaskulogenese Neoplasien sind in Wachstum, Invasion und Metastasenbildung von Gefäßneubildungen abhängig, denn ohne eine ausreichende Blutgefäßversorgung können Tumoren nicht über eine kritische Größe hinaus wachsen oder in andere Organe metastasieren (Folkman 1985; Carmeliet & Jain 2000; Folkman 2000). Virchow war der erste, der 1863 in seiner Publikation „Die krankhaften Geschwülste“ eine verstärkte Vaskularisierung bei Tumoren feststellte (Griffioen & Molema 2000; Balkwill & Mantovani 2001). Grundlage dieser Überlegungen ist, dass Zellen zur Sicherstellung ihrer Vitalfunktionen Sauerstoff und Nährstoffe benötigen, die über den Blutstrom ins Kapillargebiet transportiert werden und dort ins umliegende Gewebe diffundieren. Da die Diffusionsstrecke von Sauerstoff nur 100-200 µm beträgt und außerdem der Abtransport der Stoffwechselendprodukte gewährleistet sein muss, ist die Ausbildung von Gefäßen in progressiv wachsenden, neoplastischen Geweben unabkömmlich (Folkman 1985; Carmeliet & Jain 2000; Kerbel 2000). Studien zeigen, dass das Tumorwachstum vor der Vaskularisierung langsam und linear vonstatten geht, dass es jedoch nach der Ausbildung von Gefäßen schnell und exponentiell erfolgt (Folkman 1990). Einige Tumoren, wie Astrozytome, bedürfen keiner Neovaskularisierung, da sie bestehende Blutgefäße in die Neoplasie integrieren und entlang dieser Versorgungsquelle wachsen (Bergers & Benjamin 2003). Derzeit werden zwei Formen der postnatalen Gefäßneubildung diskutiert, die nicht strikt voneinander zu trennen und für die Entwicklung eines funktionsfähigen vaskulären Systems verantwortlich sind (Risau & Flamme 1995; Hanahan & Folkman 1996). Unter dem Begriff der Angiogenese wird die Bildung von Kapillaren aus bereits bestehenden Blutgefäßen verstanden. Sie erfolgt durch Sprossung oder longitudinale Teilung der Kapillaren mit Hilfe periendothelialer Zellen (Intussuszeption) (siehe Abb. 2.11). Vaskulogenese bezeichnet dagegen die Neubildung von Kapillaren aus Endothelvorläuferzellen, die bei Bedarf aus dem Knochenmark rekrutiert werden können, in zu vaskularisierende Bereiche migrieren und zu Endothelzellen differenzieren (Risau & Flamme 1995; Akeson et al. 2001; Conway et al. 2001) (siehe Abb. 2.12). Angiogenese: Die postnatale Angiogenese ist im Rahmen physiologischer und pathologischer Prozesse immer dann notwendig, wenn die Versorgung des Gewebes mit Nährstoffen und Sauerstoff, sowie der Abtransport von Stoffwechselendprodukten (CO2 und NO) durch Literaturübersicht 35 Diffusion oder Regulation der herkömmlichen Durchblutung nicht mehr gewährleistet werden kann. In Tumoren geht man davon aus, dass die Vaskularisierung ab einem Durchmesser von 1-2 mm beginnt, wenn es zur Ausbildung einer lokalen Ischämie kommt (Folkman 1985; Kerbel 2000). Verschiedene Faktoren (CO2, Pyruvat, Laktat, Kalium, Entzündungsmediatoren usw.) setzen den kontraktilen Ruhetonus der Arteriolen außer Kraft, so dass die Angiogenese durch die Dilatation der Blutgefäße eingeleitet wird (Conway et al. 2001). Infolge erhöhter Stickstoffmonoxid-Konzentrationen (NO aus Endothelzellen) im Gewebe, steigt die Expression des Wachstumsfaktors VEGF, der über Rezeptoren die Integrität von Membranstrukturen und die Expression von Pecam-1 („platelet endothelial adhesion molecule“) und VE-Cadherin („vascular endothelial cadherin“) beeinflusst, und so eine Steigerung der Permeabilität mit vermehrten Austritt von Plasmaproteinen induziert (Conway et al. 2001). Der Abbau benachbarter Barrieren, wie extrazellulärer Matrix und Basalmembran, erfolgt mit Hilfe von Proteinasen, die Platz schaffen und den aktivierten und proliferierenden Endothelzellen die Migration ermöglichen (Egeblad & Werb 2002; Kalluri 2003). Außerdem werden Wachstumsfaktoren wie VEGF, bFGF und IGF-1 freigesetzt, die in die extrazelluläre Matrix eingebunden sind und angiogen wirken (Dano et al. 1999; Egeblad & Werb 2002; Kalluri 2003). Nach dem Abbau physiologischer Barrieren, migrieren proliferierende Endothelzellen in die Peripherie und formen zunächst solide Stränge, die sich nach peripher vorschieben und unter Einfluss angiogener Faktoren Lumina ausbilden (Conway et al. 2001) (siehe Abb 2.12, Tab 2.4). Mit der Ausreifung des Gefäßnetzes werden weitere physiologische Anforderungen umgesetzt, beispielweise die Ausbildung verschiedener Lumendurchmesser, unterschiedliche Wanddicke, sowie strukturelle Anpassungen an die Anforderungen verschiedener Gewebe, wie die Ausprägung der Blut-HirnSchranke und die Ausbildung des Endothels endokriner Drüsen (Conway et al. 2001). Bei der Ausreifung von Gefäßen spielen VEGF und Interaktionen mit dem umgebenden Gewebe eine entscheidende Rolle. Welche Faktoren bestimmen, ob der Gefäßspross sich zu einer Vene, Arterie oder Kapillare entwickelt, ist allerdings weitgehend unbekannt. Ephrine (Conway et al. 2001; Carmeliet 2003), Angiopoetin-1 und Tie-1-Rezeptoren (Loughna & Sato 2001), der TGF-β-Rezeptor, die Activinkinase-1 (Luttun et al. 2002a) und der Transkriptionsfaktor Gridlock A (Luttun et al. 2002a) scheinen hier eine gewisse Bedeutung zu besitzen. 36 Literaturübersicht Abb. 2.11: Postnatale Angiogenese. (I) Bei der Ausbildung eines Gefäßsprosses schieben sich Endothelzellen vor, die proliferieren und später durch Ausbildung eines Lumens an die Blutzirkulation angeschlossen werden. (II) Intussuszeption beschreibt die Verzweigung oder Teilung eines Gefäßes. Periendotheliale Zellen schieben sich ins Lumen vor und bilden zwei Gefäße mit geringerem Durchmesser. Das Lumen beider Strukturen wird einem geschlossenen Endothelverband ausgekleidet. Postnatale Vaskulogenese: Ursprünglich wurde der Begriff der Vaskulogenese nur auf Vorgänge während der Embryonalentwicklung bezogen (Folkman & Klagsbrun 1987). Unter dem Begriff der Vaskulogenese wird die Neubildung von Kapillaren aus mesodermalen Zellen verstanden, die im Verlauf der Embryogenese als endotheliale Vorläuferzellen (endotheliale Progenitorzellen oder Angioblasten) in zu vaskularisierende Bereiche migrieren und zu Endothelzellen differenzieren (Risau & Flamme 1995; Akeson et al. 2001; Conway et al. 2001). In den letzten Jahren häufen sich jedoch die Hinweise, dass die postnatale Gefäßbildung nicht allein durch Angiogenese bestimmt wird (Hanahan & Folkman 1996). Neben lokalen Endothelzellen scheinen auch Endothelvorläuferzellen aus dem Knochenmark entscheidend an der postnatalen Neovaskularisierung beteiligt zu sein (Conway et al. 2001). Erste Hinweise liefern die zahlreichen Berichte über zirkulierende Endothelvorläuferzellen im peripheren Blut (Asahara et al. 1997; Asahara et al. 1999a; Kalka et al. 2000a; Dimmeler et al. 2001; Shintani et al. 2001a; Heeschen et al. 2003). Obwohl allgemein anerkannt ist, dass eine Vielzahl von Wachstumsfaktoren (z.B. VEGF, GM-CSF u.a), Zytokine und deren Rezeptoren an der Vaskulogenese beteiligt sind, ist noch nicht geklärt, unter welchen Bedingungen und in welchem Umfang Endothelvorläuferzellen aus dem Knochenmark rekrutiert werden und in Areale verstärkter postnataler Neovaskularisierung integriert werden. Während der Embryognese differenzieren Endothelzellen aus Angioblasten, postnatal gehen sie aus Endothelvorläuferzellen, Mesangioblasten, multipotenten Vorläuferzellen (multipotent adult progenitor cells; MAPCs) oder Reservestammzellen hervor (Reyes et al. 2002; Luttun et al. 2002a; Carmeliet 2003). Da ausgereifte Endothelzellen nur limitierte Möglichkeiten zur Proliferation besitzen, werden endotheliale Vorläuferzellen aus dem Knochenmark rekrutiert und nehmen an der Gefäßbildung teil. Aber auch monozytäre Zellen Literaturübersicht 37 sind vielleicht als Reservestammzellen in der Lage, zu endothelartigen Zellen zu differenzieren (Schmeisser & Strasser 2002; Rehman et al. 2003; Rafii & Lyden 2003). Endothelvorläuferzellen können derzeit aus dem peripherem Blut, Knochenmark und Blut der Nabelvenen isoliert werden (Lyden et al. 2001; Murohara 2001) (siehe auch unter 2.5.2 Endothelvorläuferzellen). A B C D E Abb. 2.12: Angiogenese und postnatale Vaskulogenese. Neue Blutgefäße entstehen aus der Wand und dem Ende bestehender Kapillaren (A). (B) Zunächst kommt es zur Dilatation der Kapillaren mit Erweiterung der Zellzwischenräume und Lösung periendothelialer Perizyten. (C) Nach Degradation der Basalmembran und Abbau extrazellulärer Matrix migrieren Endothelzellen in die Peripherie und proliferieren (Angiogenese). (D) Endothelvorläuferzellen aus dem Knochenmark können aus dem Blutstrom über die erweiterten Zellzwischenräume in die Region einwandern und beteiligen sich an der Gefäßbildung. (E) Ausgereifte Endothelzellen werden wieder von Perizyten begleitet und liegen der neuen Basalmembran an. 2.4.2 Vaskularisierung von Tumoren Tumoren bilden strukturell und funktionell abnormale Gefäße mit mehrschichtigem Endothel und unzureichenden interzellulären Verbindungen (Conway et al. 2001). Ihre Gefäße sind desorganisiert, gewunden, dilatiert und weisen variierende Lumina, zahlreiche Verzweigungen und Shuntbildungen auf. Öffnungen wie Endothelfenster, Vesikel, transzelluläre Tunnel, erweiterte Interzellularräume und diskontinuierliche, bzw. fehlende Basalmembranen haben eine erhöhte Permeabilität zur Folge (Carmeliet & Jain 2000). Infolgedessen ist der Blutfluss im Tumorgewebe chaotisch, er wechselt ständig von einer Lokalisation zur nächsten. Das führt in bestimmten Bereichen zu Hypoxie und Ansäuerung (Carmeliet & Jain 2000). Solche Fehlentwicklungen scheinen durch ein Ungleichgewicht bei der Expression angiogener Faktoren (z.B. VEGF, bFGF, aFGF, Angiopoetine) oder durch fehlerhafte Signaltransduktion auf molekularer Ebene zu entstehen (Hanahan & Folkman 1996; Conway et al. 2001). Neuere Forschungsarbeiten geben Grund zu der Annahme, dass Tumorzellen sogar selbst an der Gefäßbildung beteiligt sind (Maniotis 1999; Conway et al. 2001; Hendrix et al. 2003): Chang et al. fanden Hinweise darauf, dass die Lumenauskleidung der Tumorgefäße aus einem Mosaik endothelialer Zellen und Tumorzellen besteht (Chang et al. 38 Literaturübersicht 2000; Folkman 2001). Diese Gefäße transportieren Blut und sind an die Blutversorgung angeschlossen (Folberg et al. 2000). Im Falle des Melanoms wird die Bedeutung der Neovaskularisierung kontrovers diskutiert (Streit & Detmar 2003). Aus einigen humanmedizinischen Patientenstudien wird berichtet, dass Angiogenese und Tumordicke bzw. Tumorprogression korrelieren (Fallowfield & Cook 1991; Neitzel et al. 1999), andere Autoren erhielten abweichende Ergebnisse (Ribatti et al. 1992; Barnhill et al. 1992; Vacca et al. 1993; Busam et al. 1995). Eine kürzlich veröffentlichte Studie unterstützt wiederum die Annahme, dass Tumorvaskularisierung mit einer schlechten Überlebensrate gleichzusetzten ist (Kashani-Sabet et al. 2002; Streit & Detmar 2003). Korrelationen zwischen Vaskularisierung und Malignität des Melanoms (benigne, prämaligne, maligne) bestehen allerdings nicht (Weninger et al. 1996; Hawighorst et al. 2001; Hawighorst et al. 2002; Streit & Detmar 2003). Neovaskularisierung wird zwar seit langem mit der Progression von Melanomen in Zusammenhang gebracht, die Rolle bei der Metastasierung ist allerdings noch unklar. 2.4.3 Der angiogene Switch Neovaskularisierung beginnt, wenn ein Ungleichgewicht zwischen angiogenen (fördernden) und antiangiogenen (hemmenden) Einflüssen entsteht. Dieser Schaltermechanismus mit seinen Gleichgewichtsverschiebungen wird als „angiogenic switch“ bezeichnet. Stehen proangiogene Faktoren mit anti-angiogenen Molekülen im Gleichgewicht, ist er ausgeschaltet. Sobald es aber zum Überhang angiogener Substanzen kommt, wird die Gefäßbildung forciert (Hanahan & Folkman 1996; Carmeliet & Jain 2000; Bergers & Benjamin 2003). Als proangiogene Faktoren zählen neben zahlreichen Zytokinen, metabolischer Stress (z.B. Sauerstoffmangel, niedriger pH, Hypoglykämie), mechanischer Stress (z.B. Druck durch proliferierende Zellen), Immunreaktionen (z.B. infiltrierende immunologische und inflammatorische Zellen) und Mutationen (z.B. Aktivierung von Onkogenen, Inaktivierung von Tumorsuppressorgenen) (Carmeliet & Jain 2000; Bergers & Benjamin 2003). Wie Umweltaspekte und genetische Grundlagen ineinander spielen, ist komplex und noch weitgehend ungeklärt (Carmeliet & Jain 2000). Jener Schaltermechanismus kann, abhängig von Tumortyp und umgebenden Milieu, zu unterschiedlichen Zeitpunkten im Verlauf der Tumorprogression aktiviert werden (Bergers & Benjamin 2003). Pro- und antiangiogene Substanzen werden von Tumorzellen, Endothelzellen und Stromazellen sezerniert, entstammen dem Blut oder der extrazellulären Matrix (Carmeliet & Jain 2000). Endothelzellen beispielsweise können mindestens 20 mitogene und antiapoptotische Literaturübersicht 39 Faktoren produzieren (Rak et al. 1995). Dass Tumorzellen in der Lage sind, angiogene Proteine zu sezernieren, welche wiederum Endothelzellen stimulieren, wiesen Li et al. (2000) nach. Antiangiogene Faktoren Angiogene Faktoren Abb. 2.13 Angiogener Switch Angiogenese wird durch eine Vielzahl aktivierender und hemmender Faktoren beherrscht (siehe Auswahl in Tab. 2.7 und 2.8). Ein Überangebot angiogener Faktoren setzt die Kaskade der Gefäßneubildung in Gang, während ein Überangebot hemmender Einflüsse die Angiogenese inhibiert. In diversen Studien mit humanen Melanomzelllinien, konnte festgestellt werden, dass Melanomzellen unterschiedliche angiogene Faktoren sezernieren. Hierzu gehören VEGF, bFGF, Il-8, PDGF und PlGF. Mit Progession und dem Übergang von der radialen zur vertikalen Wachstumsphase produzieren Melanozyten insbesondere zwei angiogene Wachstumsfaktoren, bFGF und VEGF (Vacca et al. 2000), während Melanozyten kein VEGF produzieren (Gitay-Goren et al. 1993). Allerdings kann kein Zusammenhang zwischen VEGF-Produktion und der Malignität des Tumors festgestellt werden (Weninger et al. 1996). 2.4.4 Wachstumsfaktoren als Vermittler angiogener Prozesse Vaskulogenese und Angiogenese werden von zahlreichen Faktoren (siehe Tab. 2.4 und 2.5) beeinflusst, die wiederum von der Zusammensetzung des Tumors und dem betroffenen Organgewebe abhängen (Liotta & Kohn 2001). Einerseits bestimmt das Organparenchym, in welcher Zusammensetzung angiogene und antiangiogene Moleküle freigesetzt werden, andererseits sind Tumorzellen und Tumor-assoziierte Zellen Quellen diverser Wachstumsfaktoren (Carmeliet & Luttun 2001; Liotta & Kohn 2001; Coussens & Werb 2002). Die extrazelluläre Matrix übernimmt eine wichtige Rolle, da bei deren Degradation im Rahmen der Invasion angiogene Faktoren freigesetzt werden (van Kempen et al. 2003), und auch Heparansulfat, ein Hauptbestandteil der Basalmembran, fungiert als Speicher und bindet Zytokine und Wachstumsfaktoren wie bFGF, VEGF, HGF und TGF-β (Kalluri 2003). Durch 40 Literaturübersicht Degradation der Basalmembran über Heparanasen (z.B. von invasiven Tumorzellen gebildet) werden die angiogenen Faktoren dann freigesetzt (Kalluri 2003). HGF unterstützt die Endothelzellmigration und -invasion, sowie die Expression von Proteasen (Bussolino et al. 1992) und PDGF (Risau et al. 1992). Auch der PDGF ist angiogen wirksam und fördert einerseits die Sprossung von Endothelzellen, andererseits rekrutiert er als Wachstumsfaktor Perizyten und glatte Muskelzellen der Umgebung (Conway et al. 2001). Weiterhin spielt IL-8, ein Zytokin, das von verschiedenen Geweben und Blutzellen sezerniert wird, eine Rolle (Singh et al. 1994b; Yoneda et al. 1998; Xu et al. 1999; Xu & Fidler 2000). Seine Expression steht in direktem Zusammenhang mit dem metastatischen Potential humaner Melanome (Schadendorf et al. 1994; Gutman et al. 1995). IL-8 induziert Proliferation, Migration und Invasion endothelialer Zellen, sowie Neovaskularisierungsprozesse (Singh et al. 1994a; Singh et al. 1994b; Gutman et al. 1995). Angiopoetin-1 hat über seinen Tie2Rezeptor chemotaktische Wirkung auf endotheliale Zellen und induziert deren Sprossung, sowie Interaktionen mit periendothelialen Zellen. Angiopoetin-2 besitzt unter Einfluss von VEGF zwar angiogene Potenz, kann aber andererseits auch Regression von Blutgefäßen hervorrufen. Der PlGF besitzt vor allem im Rahmen der embryonalen Entwicklung Bedeutung, verstärkt aber postnatal pathologische VEGF-induzierte Vorgänge (Carmeliet et al. 2001) (siehe auch Kapitel 2.4.5). Minderperfusion und Hypoxie bedingen beispielsweise die Expression von VEGF (Levy et al. 1995), einem stark angiogenen Wachstumsfaktor (siehe auch Kapitel 2.4.5). Aufgrund unzureichender Oxygenierung des Gewebes entstehen HIF-1α, HIF-2α und HIF-1β (hypoxiainducible-factors“), die an die Enhancer- Region des VEGF-A-Promoters binden und die Transkription des Wachstumsfaktors verstärken. Außerdem stabilisiert Hypoxie VEGF-AmRNA (Carmeliet & Collen 1998). Aber auch andere Wachstumsfaktoren wie TGF-α, TGFβ, FGF, PDGF und inflammatorische Zytokine wie IL-1α und IL-6 verstärken die VEGFmRNA-Expression (Ferrara & Davis-Smyth 1997; Neufeld et al. 1999; Ferrara et al. 2003). Zahlreiche Zytokine und Wachstumsfaktoren aus der Umgebung, sowie milieubedingte Stimuli, können die Freisetzung angiogener Faktoren durch Tumorzellen veranlassen (Tsai et al. 1995; Akagi et al. 1998; Akagi et al. 1999). Beispielsweise wird die Freisetzung von IL-8 aus Melanomzellen durch Keratinozyten (wahrscheinlich mittels IL-1β) gefördert (Herlyn 1990; Singh et al. 1994b). Melanomzellen produzieren zahlreiche angiogene Zytokine, wie VEGF (Graeven et al. 1999), bFGF (Becker et al. 1989; Becker et al. 1992), PlGF (Graeven et al. 2000), PDGF (Westermark et al. 1986), TGFα und TGFβ (Rodeck et al. 1991b). Insbesondere VEGF wirkt Literaturübersicht 41 über VEGFR2 angiogen. Aber auch PlGF, der bei physiologischer postnataler Neovaskularisierung kaum eine Rolle spielt, entfaltet über VEGFR1 seine Wirksamkeit (Bergers & Benjamin 2003) und rekrutiert monozytäre Zellen aus dem Knochenmark, die an angiogenen Prozessen beteiligt sind (Lyden et al. 2001; Pipp 2003). Tumorzellen produzieren VEGF allerdings unabhängig von ihrem Malignitätsgrad (Weninger et al. 1996). Die Wirkung der von Tumorzellen bereitgestellten Wachstumsfaktoren wird zusätzlich durch das umgebende Milieu modifiziert, wie am Beispiel des bFGF deutlich wird. Der bFGF induziert die Proliferation vieler verschiedener Zelltypen, sowie die Migration endothelialer Zellen und fördert die Produktion von Proteasen und VEGF (Dvorak et al. 1995). Die bFGFExpression der Tumorzellen ist allerdings von Eigenschaften des Organparenchyms abhängig (Singh et al. 1994a): Humane Nierenkarzinomzellen produzierten in murinen Nieren 10-20fach höhere Konzentrationen des Wachstumsfaktors als in subkutanem Gewebe (Singh et al. 1994a). Die Neoplasien der Niere waren auch stärker vaskularisiert. Im Gegensatz dazu konnte Interferon-β (IFN-β), ein bFGF-Inhibitor (Orr et al. 1990), in epithelialen Zellen und Fibroblasten der Subkutis nachgewiesen werden, während im Nierengewebe keine IFN-βProduktion stattfand. Singh et al. wiesen ausserdem nach, dass die bFGF- Expression Dichteabhängig ist (Singh et al. 1996). Unter Betrachtung der zahlreichen Varianten und Einflüsse wird deutlich, wie Komplex Angiogenese und Vaskulogenese sind und dass therapeutische Interventionen, die nur eine Komponente abdecken, langfristig nicht zum Erfolg führen können. 42 Literaturübersicht Wachstumsfaktor Abkürzung VEGF-C Bedeutung und Wirkung erhöht Permeabilität und Extravasation von Plasma, induziert Proliferation und Migration, ist an Reifung beteiligt, stimuliert Lumenbildung und vergrößert den Lumendurchmesser, fördert Sprossung mindert Lumendurchmesser Desintegration der extrazellulären Matrix durch Aktivierung von Plasminogen stimuliert Angiogenese im adulten Organismus FGF stimuliert Wachstum und rekrutiert mesenchymale Zellen VEGF vascular endothelial growth VEGF189 factor VEGF-B fibroblast growth factor Angiopoetin-1 Ang-1 Angiopoetin-2 Ang-2 Angiostatin Thrombospondin-1 TSP-1 Platelet derived growth factor Transforming growth factor Ephrine PDGF Ligand des Tie-2- Rezeptor auf Endothelzellen; ist ein antiPermeabilitätsfaktor, der exzessiven Austritt von Plasma verhindert; wirkt chemotaktisch auf endotheliale Zellen, induziert Sprossung und die Interaktionen zwischen Endothel- und periendothelialen Zellen, stimuliert unter Einfluss von VEGF die Bildung großer Lumina, und wahrscheinlich Intussuszeption, hemmt Angiogenese in Tumoren und im Herzen (Carmeliet 2003)d}. Inhibitor an Tie-2, natürlicher Antagonist von Ang-1, mindert interzelluläre Kontakte und ermöglicht so die Migration der Endothelzellen; in Anwesenheit von VEGF angiogen, sonst aber auch an Gefäßregression beteiligt entsteht aus zirkulierendem Plasminogen und hemmt Proliferation der Endothelzellen emmt die Aktivierung von MMP-2 und 9 und wirkt somit antiangiogen, Inhibitor der Lumenbildung Angiogen für mikrovaskuläre Sprossung, rekrutiert Perizyten und glatte Muskelzellen TGFβ1 unterdrückt Tumorangiogenese Eph regulieren die Spezifikation zu arteriellen/ venösen Gefäßen (Carmeliet 2003), A1 u.A2 sind angiogen; B1 u. B2 induzieren Gefäßsprossung; B2Wirkung ist auf arterielle Gefäße beschränkt, während sein Rezeptor EphB4 in venösen Schenkeln zu finden ist. Tab. 2.4 (1): Wachstumsfaktoren, die auf Endothelzellen wirken und für Permeabilität, Proliferation, Migration und Lumenbildung verantwortlich sind (Conway et al. 2001). Rezeptor Abkürzung Platelet endothelial Pecam-1 adhesion molecule vascular VE-Cadherin endothelial cadherin VitronektinIntegrine αVβ3 Rezeptor Enzym Abkürzung MatrixMMP Metalloproteinasen Bedeutung und Wirkung interzelluläres Molekül, das den Zellverbund sichert, endothelzellspezifisch interzelluläres Molekül, das den Zellverbund sichert, endothelzellspezifisch an der Zellinvasion beteiligt Bedeutung und Wirkung MMP2, MMP3, MMP9 und Suppression von Inhibitoren der Metalloproteinasen, wie TIMP2, fördern Sprossung; MMP-1/3/9 induzieren Angiogenese in neonatalen Knochen und Tumoren; MMP-1/3 hemmen Tumorangiogenese durch Interaktion mit MMP2, das an Integrinen wirkt; MMP7 setzt Angiostatin frei, Wirken durch Degradation extrazellulärer Matrix- ermöglichen die Migration von Endothelzellen und setzen angiogene Faktoren aus der Matrix frei. Tab. 2.4 (2): Wachstumsfaktoren, die auf Endothelzellen wirken und für Permeabilität, Proliferation, Migration und Lumenbildung verantwortlich sind (Conway et al. 2001). Literaturübersicht 43 Aktivierende (angiogene) Wachstumsfaktoren Angiogene Faktoren VEGF, VEGF und Homologe VEGF-C Placental growth PlGF factor Angiopoetin-1 Ang- 1 Angiopoetin-2 Ang- 2 Tie-2- Rezeptor Platelet derived growth factor und Rezeptoren Transforming growth factor Basic Fibroblast growth factor PDGF, PDGF-R Hepatocyte growth factor Integrin αVβ3 und αvβ5 HGF Vascular endothelial Cadherin Platelet endothelial adhesion molecule Ephrine VEcadherin PECAM (CD31) Eph TGF-ß1 bFGF Wirkung stimulieren Angiogenese und Permeabilität, VEGF-C stimuliert Lymphangiogenese stimulieren Angiogenese und Permeabilität, v.a. embryonal von Bedeutung, bildet mit VEGF-A Heterodimere und verstärkt postnatal den Effekt von VEGF unter pathologischen Bedingungen , rekrutiert Monozyten (Luttun et al. 2002b; Pipp 2003) stabilisiert Blutgefäße vor dem Aussprossen, mindert Permeabilität, angiogen, mobilisiert EPC´s und HSC´s, antiangiogen in Tumoren und Herz (Carmeliet 2003). aktiviert oder blockiert den Tie-2 Rezeptor je nach Zelltyp, Antagonist von Angiopoetin-1, löst endo- periendotheliale Kontakte und ist an der Degradation der extrazellulären Matrix beteiligt(Carmeliet 2003), induziert in Abwesenheit angiogener Faktoren Regression von Blutgefäßen (Maisonpierre et al. 1997) Bindet Angiopoetin-1 und -2, stabilisiert Blutgefäße vor dem Aussprossen, mindert Permeabilität rekrutiert glatte Muskelzellen stabilisieren Blutgefäße durch Stimulation der Produktion extrazellulärer Matrix, fördert Kollateralbildung (Carmeliet 2003) stimuliert Angiogenese, wird auch von Melanomzellen produziert (vor allem bei Übertritt in die vertikale Wachstumsphase(Srivastava et al. 2003) ist in die extrazelluläre Matrix und Basalmembran der Blutgefäße eingebunden (Vlodavsky et al. 1987; Folkman et al. 1988; DiMario et al. 1989; Rogelj et al. 1989) stimuliert Angiogenese und Arteriogenese Rezeptoren für Makromoleküle der Matrix und Proteinasen (MMP2), deren Antagonisten hemmend wirken, wahrscheinlich aber antiangiogen durch die Reduktion der VEGF-/ Flk-1- vermittelten Überlebenszeit der Endothelzellen (Carmeliet 2003), sind an der Lumenbildung beteiligt interzelluläres Molekül, das den Zellverbund sichert, Endothelzellspezifisch, fördert das Überleben der Endothelzellen interzelluläres Molekül, das den Zellverbund sichert, endothelzellspezifisch, fördert das Überleben der Endothelzellen regulieren die Spezifikation zu arteriellen/ venösen Gefäßen (Carmeliet 2003), A1 u.A2 sind angiogen; B1 u. B2 induzieren Gefäßsprossung; B2- Wirkung ist auf arterielle Gefäße beschränkt, während sein Rezeptor EphB4 in venösen Schenkeln zu finden ist. MatrixMMP Proteinasen sind bei Migration und Matrix- Remodeling entscheidend Metalloproteinasen Plasminogenaktivatoren, Neuropeptide, Insulin, IGF-1 (insulin growth factor-1), Leptin, EGF (epidermal growth factor) HGF (hepatocyte growth factor), HIF-1 (hypoxia inducible factor-1α), Interleukine etc. Tab. 2.5 (1): Angiogene und antiangiogene Wachstumsfaktoren: eine Auswahl ( nach Conway et al. 2001) 44 Literaturübersicht Hemmende (antiangiogene) Wachstumsfsktoren Antiangiogene Faktoren VEGFR1 und lösliche Varianten Neuropilin-1 Angiopoetin-2 Abkürzung Wirkung VEGFR1 Flt-1 binden VEGF und PlGF Thrombospondin-1 TSP-1 Thrombospondin-2 TSP-2 Ang-2 Angiostatin, Endostatin Vasostatin, Calretikulin Platelet factor-4 PF-4 Antikörper gegen VECadherin/ Pecam-1 Interferon α,β,γ INF α,β,γ Interleukin-10/ -4/ 12/-18 IL binden VEGF und PlGF Antagonist von Angiopoetin-1, induziert in Abwesenheit angiogener Faktoren Regression von Blutgefäßen (Maisonpierre et al. 1997), auch angiogen wirksam: löst endo-periendotheliale Kontakte und ist an der Degradation der extrazellulären Matrix beteiligt(Carmeliet 2003) endogener Angiogenese-Inhibitor, extrazelluläres Matrixprotein, wird von Primärtumoren gebildet, um das Wachstum von Metastasen zu hemmen, hemmt Angiogenese und die Entstehung von Organmetastasen (Rofstad & Graff 2001; Hawighorst et al. 2002) endogener Angiogenese- Inhibitor, der unter Normalbedingungen im mesenchymalen Stroma exprimiert wird; Mangel an TSP-2 beeinflusst den angiogenic switch in Richtung Angiogenese (Hawighorst et al. 2001) Angiostatin wird durch Desintegration von Plasminogen freigesetzt, wird von vielen Melanomzelllinien freigesetzt, hemmt Migration und Überleben endothelialer Zellen (Rafii & Lyden 2003) Endostatin ist ein endogener Angiogeneseinhibitor, interagiert mit Tropomyosin und hammt Zellmotilität, induziert Apoptose und hemmt Tumorwachstum (MacDonald et al. 2001) hemmen das endotheliale Wachstum hemmt Bindung von bFGF und VEGF hemmen Tumorangiogenese Cytokine und Chemokine, die Migration der Endothelzellen hemmen, IFNα mindert bFGF Cytokine und Chemokine, die Migration der Endothelzellen hemmen Tab. 2.5 (2): Angiogene und antiangiogene Wachstumsfaktoren: eine Auswahl (nach Conway et al. 2001). 2.4.5 Der vaskuläre endotheliale Wachstumsfaktor und seine Rezeptoren VEGF und seine Rezeptoren übernehmen bei der physiologischen und pathologischen Vaskularisierung eine Schlüsselfunktion (Ferrara & Davis-Smyth 1997; Risau 1997). Im Rahmen der Tumorangiogenese besitzt VEGF eine entscheidende Bedeutung, da fast alle Tumorzellen VEGF produzieren (Takano et al. 1996; Toi et al. 1996; Ferrara & Davis-Smyth 1997; Ellis et al. 1998; Xiang et al. 2001). VEGF stimuliert Proliferation und Differenzierung der Endothelzellen, (Isner & Asahara 1999), ist ein entscheidender Permeabilitätsfaktor (Ferrara & Davis-Smyth 1997; Carmeliet & Collen 1998; Carmeliet & Collen 2000) hemmt nach Monestiroli et al. die Apoptose zirkulierender Endothelzellen (Monestiroli et al. 2001) und wirkt chemotaktisch auf Monozyten (Clauss et al. 1990). Hattori et al. legten dar, dass VEGF weiterhin einen Effekt auf das Knochenmark hat und die Mobilisierung Literaturübersicht 45 hämatopoetischer Stammzellen und zirkulierender Endothelzellen induziert (Hattori et al. 2001). Anhand seiner Struktur und Wirkung werden verschiedene Klassen unterschieden: • VEGF-A: Unter pathologischen Bedingungen (Ischämie des Herzmuskels, Arteriosklerose, Diabetes, ischämischer Retinopathie, Tumorgenese, Arthritis und Wundheilung) wird VEGF von Makrophagen, T-Lymphozyten, Astrozyten, Osteoblasten, glatten Muskelzellen, Kardiomyozyten, Skelettmuskelzellen, Fibroblasten, Keratinozyten und Endothelzellen gebildet (Carmeliet & Collen 1998), und wirkt als ein potenter Mediator des „angiogenic switch“ (Hattori et al. 2002). Als Wachstumsfaktor induziert VEGF-A auf parakrinem Weg Proliferation und Migration von Endothelzellen, Gefäßsprossung, die Ausbildung von Zellsträngen und eines interagierenden Netzwerkes, hemmt die Apoptose der Endothelzellen (Monestiroli et al. 2001) und ist einer der wichtigsten Permeabilitätsfaktoren (Ferrara & Davis-Smyth 1997; Carmeliet & Collen 1998; Carmeliet & Collen 2000). Er interagiert mit VEGFR2 (Flk-1), VEGFR1 (Flt-1), Neuropilin-1 und –2 (Carmeliet & Collen 2000). VEGF-A wird von einem einzigen Gen codiert. Nach der Transkription entstehen durch alternatives Spleißen Isoformen verschiedener Länge: Die kürzeste Variante VEGF-A121 ist löslich und diffundiert frei im umgebenden Milieu, während längere Isoformen (VEGF-A145, VEGF-A165, VEGF-A189, VEGF-A206) eine höhere Bindungsaffinität zu heparinreicher extrazellulärer Matrix aufweisen (Carmeliet & Collen 1998). Im murinen Tiermodell werden vier Isoforme unterschieden: VEGF115, VEGF-A120, VEGF-A164, VEGF-A188 (Carmeliet & Collen 1998). Bereits die Inaktivierung eines Allels führt aufgrund abnormaler Blutgefäßbildung zu erhöhter embryonaler Letalität (Carmeliet & Collen 1998). Die VEGF- Expression wird in hohem Maße durch die Sauerstoffkonzentration im Gewebe reguliert: Im Falle unzureichender Oxygenierung entstehen Hypoxie-induzierteFaktoren (HIF-1α, HIF-2α, HIF-1β), die an die Enhancer-Region des VEGF-APromoters binden und die Transkription des Wachstumsfaktors verstärken. Aber auch Wachstumsfaktoren wie TGF-α, TGF-β, FGF, PDGF und inflammatorische Zytokine wie IL-1α und IL-6 fördern die VEGF-mRNA-Expression (Ferrara & Davis-Smyth 1997; Neufeld et al. 1999; Ferrara et al. 2003). • PlGF: Bei dem PlGF handelt es sich um ein VEGF-verwandtes Protein, das vor allem embryonal von Bedeutung ist. Es wird in der Plazenta und in geringeren Mengen in Herz, Lunge und Thyreoidea gebildet und wirkt autokrin über VEGFR1 der Endothelzellen und 46 Literaturübersicht Trophoblasten. Während der Hämatopoese vermittelt der Wachstumsfaktor die Rekrutierung VEGFR1+ Zellen aus dem Ruhepool des Knochenmarks, sowie deren Differenzierung und die Mobilisierung ins periphere Blut (Hidaka et al. 1999; Hattori et al. 2002). Postnatal kann der PlGF mit VEGF-A Heterodimere bilden und verstärkt VEGF-induzierte, angiogene Vorgänge vor allem unter pathologischen Bedingungen (Carmeliet & Collen 1998; Carmeliet et al. 2001; Luttun et al. 2002a; Luttun et al. 2002b). • VEGF-B: VEGF-B erscheint meist zell-assoziiert und entspricht in seiner mitogenen Eigenschaft weitgehend VEGF-A. Seine Bedeutung erlangt VEGF-B während der Embryonalentwicklung in Herz, Skelettmuskulatur, Knochen und Pankreas (Osawa et al. 1996). VEGF-B ist in der Lage Heterodimere mit VEGF-A zu bilden und wird in vielen Geweben mit VEGF-A koexprimiert (Carmeliet & Collen 1998). Es wird angenommen, dass VEGF-B eher an chronischen Geschehen beteiligt ist, da es eine relativ hohe Halbwertzeit aufweist (>8h) (Carmeliet & Collen 1998). • VEGF-C: VEGF-C (VEGF-related factor, VRP, VEGF-2) stimuliert Migration und Proliferation endothelialer Zellen, ist allerdings weniger potent als VEGF-A. Im adulten Organismus findet sich VEGF-C meist in Herz, Plazenta, Lunge, Nieren, Skelettmuskel, Ovar und Dünndarm. Es interagiert in erster Linie mit VEGF-Rezeptor-3 (Flt-4) (Carmeliet & Collen 1998). • VEGF-D: VEGF-D ist ein VEGF-Homolog, das aus Fibroblasten der c-fos KnockoutMaus isoliert wurde. Es wird in Lunge, Herz, Dünndarm und fetaler Lunge, Hypophysenvorderlappen, Leber, Niere und Haut exprimiert und induziert Proliferation und morphologische Transformation der Fibroblasten (Carmeliet & Collen 1998; Carmeliet & Collen 2000). Über VEGFR2 und VEGFR3 wirkt VEGF-D als Mitogen der Endothelzellen (Carmeliet & Collen 2000). • VEGF-E: VEGF-E, auch als “endocrine gland-VEGF“ bezeichnet, ist ein gewebespezifisches angiogenes Mitogen, das nur von Drüsen exprimiert wird, die Steroidhormone produzieren. Während seine Funktion dem VEGF-A-Molekül ähnelt (es wirkt auf Endothelzellen des Adrenocortex mitogen), weicht es von diesem strukturell ab und interagiert mit anderen Rezeptoren. Es hat keine Wirkung auf Endothelzellen der Aorta, Nabelvene oder kleiner Hautgefäße (LeCouter 2001; Cleaver & Melton 2003). Literaturübersicht • 47 Weitere Homologe: Im Genom des Orf-Virus, einem Parapoxvirus, wurden Homologe des Wachstumsfaktors mit VEGF-artiger Wirkung nachgewiesen (Ferrara & Davis-Smyth 1997; Neufeld et al. 1999; Ferrara et al. 2003). PlGF VEGF-A Flt-1 VEGFR-1 VEGF-B Flk-1 VEGFR-2 VEGF-C VEGF-D Flt-4 VEGFR-3 Abb.2.14: VEGF und seine Rezeptoren Wachstumsfaktor Rezeptoren VEGF-A VEGFR1 VEGFR2 Neuropilin1/2 VEGF-B VEGF-E VEGFR3 (VEGFR2) VEGFR2 VEGFR3 ? PlGF VEGFR1 VEGF-C VEGF-D Wirkung o Proliferation, Migration, Gefäßsprossung, Bildung von Zellsträngen o fördert die Permeabilität o rekrutiert hämatopoetische Stammzellen o hemmt Apoptose der Endothelzellen o an Chemotaxis der Monozyten beteiligt o ähnlich VEGF-A, bildet Heterodimere mit VEGF-A, meist zellassoziiert o endotheliale Migration und Proliferation o geringere Potenz als VEGF-A o Proliferation und Transformation der Fibroblasten o Mitogen der Endothelzellen o mitogene Wirkung in Steroidhormon- produzierenden Drüsen o rekrutiert VEGFR-1+ Zellen aus dem Knochenmark o Differenzierung, Mobilisierung und Rekonstruktion der Hämatopoese o v.a. embryonal bedeutend, verstärkt postnatal die Wirkung von VEGF Tab.2.6: Wirkung von VEGF über spezifische Rezeptoren VEGFR2 (KDR, Flk-1): Neben Endothelzellen sind Hämangioblasten, die Vorläuferzellen der Angioblasten und hämatopoetischen Stammzellen, sowie frühe hämatopoetische Stammzellen Träger des VEGFR2 (Millauer et al. 1993; Carmeliet & Collen 1998). Verschiedene Untersuchungen zeigen, dass der VEGFR2 bei der Differenzierung von Vorläuferzellen zu Endothelzellen entscheidend ist (Carmeliet & Collen 1997; Carmeliet & Collen 1998; Drake et al. 2000). Auf der Oberfläche der Endothelzellen kontrolliert der Rezeptor die Gefäßpermeabilität und vermittelt die Signale für Proliferation und Migration (Carmeliet & Collen 2000). 48 Literaturübersicht VEGFR1 (Flt-1, fms- like- tyrosinekinase-receptor) existiert in zwei Formen, einer löslichen und einer membranfixierten Form (Carmeliet & Collen 2000; Kumar et al. 2002). Die membrangebundene Variante des VEGFR1 wird u.a. auf humanen CD34+Lin-Sca1+c-kit+ Knochenmarkszellen und hämatopoetischen Vorläuferzellen (Hattori et al. 2002), Monozyten und Makrophagen exprimiert (Clauss et al. 1996; Barleon et al. 1996; Luttun et al. 2002b). Die lösliche Variante konnte im Serum gesunder Probanden bisher noch nicht nachgewiesen werden und agiert vermutlich unter pathologischen Bedingungen als einziger direkter und natürlicher Antagonist des VEGF (Kumar et al. 2002). VEGFR1 fungiert somit einerseits als angiogener Faktor, wenn seine spezifischen Liganden in abnorm hoher Konzentration vorliegen (Hiratsuka et al. 2001), weist aber abhängig von Entwicklungsstatus des Tieres (Embryogenese oder postnatal) und der beteiligten Zellpopulation, sowie als frei gelöster Rezeptor, inhibitorische Eigenschaften auf. Der Rezeptor bindet VEGF-A, PlGF und VEGF-B und besitzt eine höhere VEGFBindungsaffinität als VEGFR2, wird im Vergleich zu VEGFR2 aber nur schwach exprimiert (Shihab et al. 2002). Hypoxie führt nicht nur zu einer verstärkten VEGF- Expression, sondern fördert über einen HIF-1-abhängigen Mechanismus auch zu einer verstärkten Expression des VEGFR1 (Gerber et al. 1997). Der Effekt auf das adulte Gefäßsystem ist bisher kaum geklärt. Bekannt ist, dass VEGF über VEGFR1 mitogen auf Endothelzellen wirkt, aber nicht deren Proliferation (Carmeliet & Collen 2000) fördert oder gar die Gefäßpermeabilität beeinflusst. VEGFR1 induziert die Freisetzung von Stickstoffoxid, die Expression von Gewebefaktoren, Chemotaxis und Transmigration (Carmeliet & Collen 2000). Auch an Hämatopoese und Rekrutierung endothelialer Vorläuferzellen und Monozyten aus dem Knochenmark ist VEGF1 beteiligt (Eriksson & Alitalo 2002; Luttun et al. 2002b; Ferrara et al. 2003). Eine Inhibierung des VEGFR1 unterdrückt im Gegensatz zur VEGFR2-Hemmung Stammzellzyklus, Zelldifferenzierung und hämatopoetische Repopulation nach Knochenmarkssuppression (Hattori et al. 2002). Über eine PlGF-induzierte Aktivierung können VEGFR1+ Knochenmarkszellen rekrutiert werden, die in Bereiche verstärkter Vaskularisierung einwandern (Hattori et al. 2002). Wie neue Veröffentlichungen zeigen, vermittelt der Rezeptor auch die MMP-9Freisetzung im Lungengewebe und erleichtert über diesen Mechanismus die Entstehung von Lungenmetastasen (Hiratsuka et al. 2002). Literaturübersicht o 49 VEGFR-3 (Flt-4) bindet VEGF-C und VEGF-D (Carmeliet & Collen 2000), wird in Blutgefäßen während der frühen embryonalen Entwicklung besonders in Venen exprimiert und ist in der Lymphangiogenese (Carmeliet & Collen 2000) und bei der Lumenbildung in großen Gefäßen ein entscheidender Faktor (Dumont et al. 1998). o Neuropilin- 1 und -2 sind Rezeptoren, die an der embryonalen Entwicklung und Tumorangiogenese beteiligt sind (Takashima et al. 2002). Sie besitzen geringe Affinität für VEGF165 und PLGF-2, wobei Neuropilin-1 als VEGFR2- Co-Rezeptor dient und die biologischen Effekte von VEGF165 potentiert (Carmeliet & Collen 2000). Rezeptor Synonym VEGFR2 KDR (human), Flk-1 (Maus) VEGFR1 VEGFR-1 VEGFR-3 Flt-4 Neuropilin-1/-2 Vorkommen o frühe hämatopoetische Stammzellen o frühe Angioblasten o Hämatoblasten o reife Endothelzellen o lösliche Form: Serum o CD34+/ Lin-/Sca+/CD117+ Knochenmarkszellen o Trophoblasten o Hämatopoetische Vorläuferzellen o Monozyten, Makrophagen o Inflammatorische Zellen o embryonale Entwicklung o embryonale Entwicklung o Tumorangiogenese Tab. 2.7: Expression von VEGF-Rezeptoren 2.5 Hämatopoetische und endotheliale Zellen 2.5.1 Hämatopoetische Zellen Der Sammelbegriff „hämatopoetische Zellen“ umfasst pluripotente Stammzellen, Vorläuferzellen der myeloischen, erythroiden, lymphoiden und megakaryozytären Reihe, sowie ausgereifte Zellen (Erythrozyten, Leukozyten, Thrombozyten, Monozyten und Makrophagen). Hämatopoetische Zellen infiltrieren ins Tumorgewebe und sind als inflammatorische Zellen an Angiogenese und Tumorwachstum verschiedener Tumoren beteiligt (Asahara et al. 1999a; Carmeliet & Luttun 2001; Davidoff et al. 2001; Lyden et al. 2001; Marchetti et al. 2002; Reyes et al. 2002) (siehe 2.3). Sie produzieren eine Vielzahl angiogener (und antiangiogener Moleküle). Hierzu gehören VEGF, PlDGF, bFGF, Ang-2, EGF, TGF-β1, verschiedene Interleukine und Proteinasen (Tryptase, Chymase, MMP´s) (Vacca et al. 1998; Norrby 2002). Außerdem induzieren Makrophagen die Freisetzung angiogener Faktoren durch Tumorzellen 50 Literaturübersicht (Sica et al. 2002). Im adulten Organismus exprimieren hämatopoetische Zellen typischerweise den Panleukozytenmarker CD45. Während frühe hämatopoetische Vorläuferzellen zusätzlich VEGFR2 exprimieren, wird der Rezeptor bei der Ausdifferenzierung herunterreguliert (Rafii et al. 2002). Lyden et al. berichten von VEGFR1+ hämatopoetischen Zellen, die gemeinsam mit Endothelvorläuferzellen aus dem Knochenmark rekrutiert werden und ins Tumorgewebe einwandern (Lyden et al. 2001). Die Bedeutung dieser Zellpopulation untersuchten Luttun et al., die zeigten dass VEGFR1 in tumornahen Gefäßen, nicht aber von malignen Tumorzellen exprimiert wird (Luttun et al. 2002b). Außerdem vermittelt VEGFR1 die Mobilisation myeloischer Progenitorzellen ins periphere Blut (Luttun et al. 2002b). Durch die selektive Hemmung des VEGFR1-Signaltransduktionsweges mit anti-VEGFR1-Antikörpern konnten Angiogenese und Wachstum humaner epidermoider A431-Tumoren in Nacktmäusen gehemmt werden. Tumoren, die mit anti-VEGFR1 behandelt wurden, waren blasser und weniger vaskularisiert als die Kontrolltumoren. Außerdem fanden sich starke Nekrosen, geringere Proliferationsraten und vermehrte Apoptose von Tumorzellen. Nach einer Behandlungsdauer von zwei Wochen war die Gefäßdichte zu 45% reduziert. Der antiinflammatorische Effekt von VEGFR1-Antikörpern scheint zumindest zum Teil auf einer reduzierten Mobilisierung myeloider Progenitorzellen aus dem Knochenmark ins periphere Blut zu 75% zu beruhen (Luttun et al. 2002b). 2.5.2 Funktion und Ursprung der Endothelzellen Endothelzellen liefern die lückenlose Auskleidung des Gefäßlumens in Form einer einfachen Lage abgeflachter, spindelförmiger, 50-150 µm langer Zellen, die in Richtung des Gefäßverlaufes ausgerichtet sind. Sie bilden ein Endothelrohr, das je nach Organ und den dortigen Anforderungen, sowie Lumendurchmesser und Alter unterschiedliche Spezifitäten aufweist (beispielsweise lungenspezifische Endothelzellen) (Leonhardt 1990; Rajotte & Ruoslathi 1999; Cleaver & Melton 2003). Endothelzellen stehen einerseits direkt mit dem Blut in Verbindung, andererseits haben sie Kontakt zu Perizyten, glatten Muskelzellen, Fibroblasten, der Basalmembran und der extrazellulären Matrix (Griffioen & Molema 2000). Die semipermeable Barriere wird über transzelluläre und interzelluläre Diffusion, vesikulären Transport und transendotheliale Kanäle vermittelt. Endothelzellen sind an der Blutstillung (Hämostase) beteiligt, dirigieren Immunzellen an ihren Bestimmungsort im Organismus, ermöglichen die Emigration von Leukozyten aus dem Blut ins Gewebe und bilden bei Bedarf Literaturübersicht 51 neue Kapillaren (Angiogenese) (Griffioen & Molema 2000). Um ihre Funktion zu erfüllen, exprimieren Endothelzellen auf der Oberfläche verschiedene Rezeptoren (z.B. für Wachstumsfaktoren, Lipoproteine („low-density lipoproteins“, LDL), Metaboliten wie NO und Serotonin, Hormone wie Endothelin-1 und Rezeptoren für Zell-Zell und Zell-MatrixInteraktionen). Sie werden vor allem durch vaskuläre Traumata von der Gefäßwand abgeschwemmt und gelangen so ins Kreislaufsystem (Rafii et al. 2002), zirkulieren im Blut und sind als zirkulierende Endothelzellen („circulating endothelial cells“; CECs) an Gefäßbildungen beteiligt. Im Gegensatz zu Endothelvorläuferzellen (EPC) sind zirkulierende Endothelzellen ausgereift und ausdifferenziert. Circa 95% der zirkulierenden Endothelzellen im peripheren Blut adulter Menschen entstammen der Gefäßwand, 5% werden als EPCs aus dem Knochenmark mobilisiert (Lin et al. 2000b). Der Referenzwert liegt nach Solovey et al. bei 2,6±1,6 Endothelzellen/m3 Blut (Solovey et al. 1997). Im Patientengut klinischer Studien wurden u.a. bei Sichelzellanämie (Solovey et al. 1997) und Hautwunden (Gill et al. 2001), entzündlichen Veränderungen wie dem systemischen Lupus erythematosus (Clancy et al. 2001) und auch beim akuten Herzinfarkt (Shintani et al. 2001a) erhöhte Endothelzellzahlen/m3 Blut nachgewiesen. Experimentell konnten bei Ischämie der Hintergliedmaßen oder Ligation der Koronararterie (Asahara et al. 1999a; Asahara et al. 1999b), sowie im Zusammenhang mit verschiedenen Tumoren (Monestiroli et al. 2001) ähnliche Nachweise im Mausmodell erbracht werden. Die hohe Korrelation zwischen der Zahl zirkulierender Endothelzellen im peripheren Blut und dem Tumorvolumen weist nach Monestiroli et al. darauf hin, dass diese zirkulierenden Endothelzellen mit dem Tumorwachstum ansteigen und daher als Angiogenese-Marker geeignet sind (Monestiroli et al. 2001). Als Wachstumsfaktoren für Endothelzellen sind u.a. VEGF, FGF-1 und -2, HGF (Isner & Asahara 1999) und GM-CSF (Isner & Asahara 1999) bedeutend, wobei Endothelzellen in hypoxischen Medium in der Lage sind, selbst VEGF zu bilden (Namiki et al. 1995). Neben VEGF und Angiopoetin-1 (Hattori et al. 2001) schreiben Dimmeler et al. den sogenannten Lipidsenkern (HMG- Reduktase- Inhibitoren) eine Wirkung auf die Zahl der zirkulierenden Endothelzellen zu, wobei deren Bedeutung vor allem in der Differenzierung CD34+ hämatopoetischer Vorläuferzellen zu Endothelzellen gesehen wird (Dimmeler et al. 2001). Außerdem scheinen zirkulierende Endothelzellen ein Apoptose Programm zu besitzen, welches durch VEGF gehemmt wird, so dass VEGF als wichtiger Überlebensfaktor der Endothelzellen angesehen werden kann (Bruns et al. 2000; Monestiroli et al. 2001). 52 2.5.3 Literaturübersicht Endothelvorläuferzellen Bis vor einigen Jahren bestand die allgemeine Auffassung, dass Blutgefäße postnatal allein durch Sprossung infolge Proliferation der Endothelzellen bestehender Gefäßen gebildet werden (Angiogenese). Heute liegen zahlreiche Studien über Endothelzellvorläufer aus Blut und Knochenmark vor (postnatale Vaskulogenese). Während der Embryognese differenzieren Endothelzellen aus Angioblasten, postnatal gehen sie aus Endothelvorläuferzellen (EPCs), Mesangioblasten, multipotenten Vorläuferzellen („multipotent adult progenitor cells“) oder Reservestammzellen hervor (Reyes et al. 2002; Luttun et al. 2002a; Carmeliet 2003). Adultes Knochenmark enthält neben pluripotenten hämatopoetischen Stammzellen auch nicht-hämatopoetische stromale Zellen, die unreife mesenchymale Stammzellen, endotheliale Vorläuferzellen, Fibroblasten, Osteoblasten, Endothelzellen und Adipozyten umfassen (Shintani et al. 2001b). Das Knochenmark bietet Endothelvorläuferzellen ein optimales Milieu, aus dem sie nach Stimulation durch angiogene Faktoren aus dem Knochenmark (VEGF der hämatopoetischen Zellen, GM-CSF, Thrombopoetin und Flt-3 der Stromazellen) und/oder extramedullären Faktoren (VEGF, FGF-2, GM-CSF, Angiopoetine, Ischämie) emigrieren (Luttun et al. 2002a). Stammzellen sind aber nicht nur im Knochenmark präsent, sondern auch an Regenerationsvorgängen in verschiedenen Geweben beteiligt: So stellen sie Satellitenzellen der Muskulatur, Chondroblasten im Perichondrium des Knorpels, Leberepithelien, sowie Pankreaszellen und Basalzellen der Epithelien. Außerdem haben Studien gezeigt, dass Reservezellen in bestimmten Organen bei Bedarf auch zu Zellen anderer Gewebetypen differenzieren können. Beispielsweise dienen Reservestammzellen aus dem Knochenmark als Grundlage für neuronale Zellen und Gliazellen, liefern Hepatozyten, stellen Zellen für die Neovaskularisierung bereit und regenerieren Knorpel, Knochen und Fett. Stammzellen aus Neuralgewebe und Muskulatur differenzieren zu Blutzellen und Hautstammzellen, liefern Skelett-, Muskel-, Fett, Knorpel- und Knochenzellen. Die Lokalisation von Stammzellen im Organismus ist somit nicht gleichbedeutend mit der Differenzierung in eine bestimmte Richtung (Young et al. 2001). Als zirkulierende Endothelvorläuferzellen (EPCs) werden endotheliale Zellen bezeichnet, die ein hohes Proliferationspotential besitzen und von Vorläuferzellen aus dem Knochenmark abstammen (Lin et al. 2000b; Rafii & Lyden 2003). Es wird allgemein angenommen, dass Angioblasten und hämatopoetische Vorläuferzellen (Hämatoblasten) den gleichen Ursprung besitzen (Asahara et al. 1997). Ob die gemeinsamen Vorläuferzellen hämatopoetischer und endothelialer Zellen als Hämangioblasten noch im adulten Knochenmark vorliegen und Literaturübersicht 53 Ausgangspunkt der Differenzierung sind, konnte bisher jedoch noch nicht bestätigt werden (Rafii et al. 2002). Da ausgereifte Endothelzellen nur limitierte Möglichkeiten zur Proliferation besitzen, werden endotheliale Vorläuferzellen aus dem Knochenmark rekrutiert und nehmen in neovaskularisierten Bereichen an der Gefäßbildung teil (postnatale Vaskulogenese). Aber auch monozytäre Zellen sind vielleicht als Reservestammzellen in der Lage, zu endothelartigen Zellen zu differenzieren (Schmeisser & Strasser 2002; Rehman et al. 2003; Rafii & Lyden 2003). Angiogenese (VEGF / VEGFR2) Postnatale Vaskulogenese (VEGFR1, VEGFR2) VEGFR1+ Hämatopoetische Vorläuferzellen VEGFR2+ Endotheliale Vorläuferzellen Abb. 2.15: Modell über die Funktion VEGFR2+ endothelialer und VEGFR1+ hämatopoetischer Vorläuferzellen (nach Rafii et al. 2002). Humane Endothelvorläuferzellen werden allgemein als adhärente, Ulex-Lectin-bindende Zellen beschrieben, die zur Aufnahme acetylierter „Light density“-Lipoproteine in der Lage sind (Kalka et al. 2000b; Vasa et al. 2001; Tepper et al. 2002). Sie können derzeit nur aus peripherem Blut, Knochenmark und Blut der Nabelvenen isoliert werden (Lyden et al. 2001; Murohara 2001). Nahezu alle zirkulierenden angiogenen Zellen, die nach den oben genannten Kriterien aus dem peripheren Blut isoliert wurden, exprimieren den Panleukozytenmarker CD45 (99,3%) und Monozyten-/ Makrophagen-Marker wie CD14 (95,7%), CD11c (90,8%) und CD11b (57,7%) (Rehman et al. 2003). Außerdem finden sich Pecam-1 und CD34 in hohem Prozentsatz auf der Zelloberfläche. CD133, ein Oberflächenmolekül, das als Markermolekül humaner Endothelvorläuferzellen gilt, wird aber nur von 0,16% der im 54 Literaturübersicht peripheren Blut vorkommenden angiogenen Zellen exprimiert. Rehman et al. nehmen daher an, dass der Hauptteil der zirkulierenden angiogenen Zellen („circulating angiogenic cells“, CAC´s) aus Monozyten und Makrophagen hervorgeht. Als EPCs sollten seiner Meinung nach nur Zellen bezeichnet werden, die aus Hämangioblasten oder hämatopoetischen Stammzellen differenzieren und im Falle humaner Vorläuferzellen typischerweise CD133 exprimieren (Rehman et al. 2003). 2.5.3.1 Bedeutung CD133+ Zellen als Endothelvorläuferzellen: CD133+ Zellen sind in der Lage unter Einfluss von VEGF und anderen Wachstumsfaktoren in Endothelzellen zu differenzieren (Gehling et al. 2000; Quirici et al. 2001) und werden allgemein als Endothelvorläuferzellen angesehen. Sie exprimieren VEGFR2 und sind VEGFabhängig (Gill et al. 2001). Ein vergleichbarer Marker wurde im murinen Organismus noch nicht entdeckt. 2.5.3.2 Bedeutung CD34+ Zellen als Endothelvorläuferzellen: Es wird allgemein angenommen, dass CD34+ Zellen aus dem Knochenmark mobilisiert werden, im Blut zirkulieren und in der Lage sind, unter bestimmten Bedingungen zu Endothelzellen zu differenzieren (Shi et al. 1998). Heeschen and Aicher et al. definieren murine Endothelvorläuferzellen als CD34+ VEGFR2+ exprimierende Zellen (Heeschen et al. 2003). In vitro Versuche: Kang et al. isolierten embryonale humane CD34+ Stammzellen aus dem - Blut der V.umbilicalis, nahmen sie in Kultur und wiesen endotheliale CD45 CD34+VEGFR2+ VE-Cadherin+ Zellen nach, die sich am Boden der Kulturflaschen anheften (sogenannte „attached cells“) (Kang et al. 2001). Fan et al. belegten, dass im Verlauf der Differenzierung CD34+ Zellen zu endothelialen Vorläuferzellen der Anteil CD133+ Zellen rasch sinkt, während die Expression des vWF+ (von Willebrand Faktor) und VEGFR2+ zunimmt (Fan et - al. 2003). Asahara et al. gelang es, CD34+ und CD34 Zellen aus dem peripherem Blut humaner Probanden zu isolieren, zu separieren und anzuzüchten. Koinkubation CD34+ und CD34- mononukleärer Zellen führte zu einer erhöhten Proliferationsrate, sowie verstärkter Differenzierung CD34+ Zellen mit Vernetzung und Ausbildung gefäßartigen Strukturen. Jene Strukturen bestanden hauptsächlich aus Zellen der CD34+ Population (Asahara et al. 1997). In vivo Versuche: Um diese in vitro Versuche am Tiermodell zu untermauern, injizierten - Asahara et al. humane CD34+ bzw. CD34 Stammzellen in Mäuse mit induzierter Ischämie der Hintergliedmaße. Während CD34+ Zellen in Gefäßwände des betroffenen Beines - integriert wurden, fanden sich CD34 Zellen typischerweise im gefäßnahen Stroma, nicht aber Literaturübersicht 55 als Bestandteil der Gefäßwand (Asahara et al. 1997). Ähnlich verhielt es sich bei der - Transplantation markierter CD34+ bzw. CD34 Zellen transgener Mäuse (VEGFR2+/+) in Wildtyp-Mäuse und bei autologer Transplantation im Rattenmodell (Asahara et al. 1997). Auch andere Untersuchungen stützen die Annahme, dass sich Endothelzellen aus der CD34+ Population rekrutieren (Shi et al. 1998; Harraz et al. 2001; Kang et al. 2001; Lyden et al. 2001; Shintani et al. 2001b). Fan et al. belegten allerdings, dass nur weniger als 2% der Monozyten CD34+ sind. Aufgrund dieser geringen Menge CD34+ Zellen im peripheren Blut scheint der therapeutische Effekt von Asahara et al. seiner Meinung nach eher durch ausdifferenzierte Endothelzellen hervorgerufen zu werden (Fan et al. 2003). - 2.5.3.3 Bedeutung CD34 Zellen als Endothelvorläuferzellen: - Nach früheren Berichten sind CD34+, nicht aber CD34 Zellen in der Lage in vitro und in vivo zu Endothelzellen zu differenzieren. Harraz et al. bestätigten, dass CD34+ Populationen - Angioblasten enthalten, aber legten auch dar, dass CD34 CD14+ Zellen in der Lage sind, - kapillarähnliche Strukturen in vitro zu bilden. In vivo scheinen CD34 Zellen ebenfalls an der Gefäßbildung teilzuhaben; dabei setzen CD34+ Zellen Stimuli, die direkt die Inkorporation - CD34 Zellen ins Blutgefäßsystem induzieren (Harraz et al. 2001). Somit war der Nachweis erbracht, dass CD34- Zellen auch in vivo zu Endothelzellen differenzieren können (Fan et al. 2003). 2.5.3.4 Bedeutung monozytärer Zellen als Endothelvorläuferzellen: Monozyten sind eine weitere Quelle endothelialer Zellen, was in verschiedenen Studien bereits nachgewiesen wurde (Schmeisser & Strasser 2002; Rehman et al. 2003). In vitro Versuche: Die Hypothese, dass endotheliale Progenitorzellen sich in adulten Tieren aus mononukleären Knochenmarkszellen rekrutieren, prüften Shintani et al. (Shintani et al. 2001b). Zu diesem Zweck isolierte die Arbeitsgruppe Knochenmark des Kaninchens, nahm den mononukleären Anteil in Kultur und wies deren Differenzierung zu Endothelzellen anhand des typischen Wachstums (spindelförmige, am Untergrund haftende Zellen, mit linearen schnurartigen Strukturen, multiplen fusionierenden Zellkluster und Netzbildung) nach. Weiterhin war der Nachweis endothelzellspezifischer Marker wie Ulex-Lectin und vWF, sowie die Funktionsprüfung auf Verstoffwechselung von DiI-acLDL (charakteristisch für EC´s) zu NO positiv. Anhand dieser Hinweise definierten Shintani et al. diese „attaching cells“ als Hauptpopulation der Endothelprogenitorzellen. 56 Literaturübersicht In vivo Versuche: Bei der Transplantation mononukleärer Knochenmarkszellen in Kaninchen mit Ischämie der Hintergliedmaßen wurden jene Zellen in Gebiete verstärkter Neovaskularisierung inkorporiert und ins Kapillarnetz integriert (Shintani et al. 2001b). Moore et al. stellten fest, dass Stimulation mit SDF-1 („stroma derived factor-1“, Chemokin aus dem Knochenmark) mit erhöhten VEGF- Werten im Serum einhergeht und zu rascher Mobilisation hämatopoetischer Zellen und deren Vorläuferzellen, sowie einer VEGFR2+ - Subpopulation führt. Jene CD11b VEGFR2+ Zellen umfassen circa 15% der mononukleären Population und entsprechen anscheinend CD34+VEGFR2+CD133+ Zellen des Menschen (Moore et al. 2001). 2.5.4 Mobilisierung von Endothelvorläuferzellen und hämatopoetischen Vorläuferzellen aus dem Knochenmark Neuere Forschungsergebnisse zeigen, dass bestimmte Zellpopulationen, wie hämatopoetische Stammzellen und hämatopoetische Vorläuferzellen, gemeinsam mit Endothelvorläuferzellen über angiogene Faktoren aus dem Knochenmark rekrutiert werden können (Rafii & Lyden 2003). Mit dem Überhang angiogener Faktoren kommt es über den angiogenen Switch zur Mobilisation jener Zellen, die dann im Blut zirkulieren (Hattori et al. 2001; Hattori et al. 2002; Rabbany et al. 2003). Verschiedenene Faktoren sind daran beteiligt: Beispielsweise sezenieren aktivierte Makrophagen TNF-α und Thrombospondin-1. Hämatopoetische Zellen (hämatopoetische Vorläuferzellen, HPCs, hämatopoetische Stammzellen (HSCs), Thombozyten, Monozyten und Erythroblasten) produzieren angiogene Faktoren wie VEGF-A, VEGFC, Angiopoetine und Matrix-Metalloproteinasen (z.B. MMP9) (Rafii & Lyden 2003) (siehe auch 2.2.6). Lyden und Rafii et al. wiesen nach, dass VEGF an der Rekrutierung VEGFR2+Endothelvorläuferzellen und myelomonozytärer VEGFR1+CD11b+ Zellen aus dem Knochenmark beteiligt ist. Circa 24 Stunden nach einem vaskulären Trauma beispielsweise, steigt der Anteil zirkulierender VEGFR2+CD133+ Zellen parallel zu den VEGF-A-Serumwerten deutlich an (Folkman 1998; Gill et al. 2001; Rafii & Lyden 2003; Rabbany et al. 2003). Die Komobilisierung von Endothelvorläuferzellen, zirkulierenden Endothelvorläuferzellen, hämatopoetischen Stammzellen und hämatopoetischen Vorläuferzellen scheint für den Vaskularisierungsprozess bedeutend zu sein (Lyden et al. 2001; Rafii & Lyden 2003), da hämatopoetische Zellen u.U. die Inkoorporation der Endothel(vorläufer)zellen fördern (Lyden et al. 2001; Rafii & Lyden 2003). Literaturübersicht Knochenmark VEGFR2 57 Peripheres Blut Peripheres Blut / Gewebe VEGFR2, CD34, Tie-1, Tie-2, vWF, Pecam-1 Hämangioblast (?) Endothelvorläuferzelle VEGFR1, Tie-1, CD34, VEGFR2 Endothelzellen CD34 VEGFR2 Pecam-1 vWF Lymphozyten CD45 CD11a Hämatopoetische Stammzelle VEGFR1 Monozyten, Granulozyten Myeloide Zellen vWF, CD41a CD45 CD11a CD11b Thrombozyten Megakaryozyten Abb.2.16: Expression des VEGFR1 und VEGFR2 als charakteristische Oberflächenmoleküle von Zellen des peripheren Blutes. Darstellung endothelialer und hämatopoetischer Zellen, sowie ihrer Vorläuferzellen in Anlehnung an (Rafii & Lyden 2003). 58 Literaturübersicht Abkürzung Synonym CD11a Integrin α L CD11b CD31 (Pecam-1) CD 34 CD45 CD117 CD133 CD144 Tie-2 Adhäsionsmolekül auf Leukozyten (inklusive B- und T- Lymphozyten, Monozyten, Makrophagen, neutrophi-len, basophilen und eosinophilen Granulozyten), fehlt auf allen nichthämatopoetischen Zellen und Thrombozyten Integrin αM Adhäsionsmolekül auf Monozyten, Granulozyten, natürlichen Killerzellen und vereinzelt auf T-/BZellen platelet auf Endothelzellen, Thrombozyten, endothelial cell Leukozyten und deren Vorläuferadhesion molecule zellen; starke Expression auf kontinuierlichen Endothelien, diffuse Expression auf Monozyten, neutrophilen Granulozyten und natürlichen Killerzellen Glykoprotein auf embryonalen Fibroblasten, allen hämatopoetischen Zellen und dem Gefäßendothel leukocyte intrazytoplasmatische Tyrosinkinase common antigen auf allen hämatopoetischen Zellen (LCA) und Vorläuferzellen c-kit, Rezeptor des Tyrosinkinaserezeptor auf Stammzellfaktors hämatopoetischen Stamm- und Vorläuferzellen, Gewebemastzellen, Melanozyten früher AC133 VEGFR2 LinVCAM (CD 106) vWF MECA-32 Funktion vermittelt interzelluläre Kontakte, vermittelt die interzelluläre Leukozytenadhäsion, sowie Kostimulation www.ncbi.nlm.nih.gov./PROW/guide/772358570 _g.htm) vermittelt die Interaktionen zwischen Neutrohilen und Monozyten mit dem aktivierten Endothel (www.ncbi.nlm.nih.gov./PROW/guide/68055753 6_g.htm) sichert den endothelialen Zellverband, dient der Interaktion von Zellen mit Endothelzellen (Conway et al. 2001) ist bei inflammatorischen und angiogenen Vorgängen an der leukozytären Diapedese beteiligt (Vecchi et al. 1994; DeLisser et al. 1994; Vanzulli et al. 1997) wurde früher als Stammzellmarker verwendet, kommt aber auch auf reifen Endothelzellen vor (Fina et al. 1990; Matsuoka et al. 2001) Regulator der Leukozytenadhäsion, ist für die rezeptorabhängige Aktivierung von T- und BZellen verantwortlich und wahrscheinlich an der Aktivierung anderer Leukozyten beteiligt (Pingel & Thomas 1989) Funktion unbekannt, dient als Marker humaner Endothelvorläuferzellen verantwortlich für interzellulare Kontakte, Permeabilität, Migration und Kontaktinhibition vascular endothelial cadherin, VECadherin CD202b, TEK Adhäsionsmolekül v.a. auf adulten und embryonalen Endothelzellen Tyrosinkinaserezeptor für Angiopoetin-1 auf Gefäßendothelien, frühen hämatopoetischen Zellen Tyrosinkinaserezeptor für Angiopoetin an Reifung und Remodeling der Gefäße beteiligt, Entwicklung Proliferation hämatopoetischer Stammzellen vascular endothelial growth factor receptor-1; Flt-1 Flk-1, KDR wird von CD34+/ Lin-/ Sca1+/ c-kit+ Knochenmarkszellen, hämatopoetischen Vorläuferzellen, Monozyten, Makrophagen, inflammatorische Zellen exprimiert Tyrosinkinase- Rezeptor für VEGF auf hämatopoetischen und endothelialen Vorläuferzellen, Endothelzellen an der Organisation primitiver Blutgefäße, Rekrutierung von Knochenmarkszellen und Angiogenese beteiligt (siehe unter 2.1.2/ 2.4/ 2.5) Tie-1 VEGFR1 Vorkommen lineage Marker negative vascular cell Adhäsionsmolekül adhesion molecule vWF assoziiertes Antigen mouse endothelial cell antigen siehe unter 2.4/ 2.5 Zellen ohne Marker für bestimmte Zelllinien vermittelt die Extravation von Zellen an der Blutstillung (Plättchenaggregation) beteiligt Glykoprotein auf Endothelzellen der unbekannt Maus Tab.2.8: Oberflächenmoleküle differenzierter Zellen. Darstellung einer Auswahl von Oberflächenmolekülen, die zur Unterscheidung muriner Endothelvorläuferzellen und Endothelzellen. Literaturübersicht 2.6 59 Antiangiogene Tumortherapie In der Tumortherapie werden derzeit meist hohe Dosen Chemotherapeutika über kurze Zeiträume eingesetzt, um möglichst viele Zellen zu zerstören. Längere Abstände zwischen den Behandlungsperioden dienen der Regeneration des gesunden Gewebes. Patienten mit metastasierenden Tumorerkrankungen, wie beispielsweise dem malignen Melanom, besitzen eine schlechte Prognose, da die Wirksamkeit derzeit eingesetzter Chemotherapeutika nicht zufriedenstellend ist. Tumormetastasen sind ein Hauptfaktor für das Versagen konventioneller Therapien. Zu den standardisiert angewendeten Behandlungen zählen chirurgische Interventionen, sowie strahlen-, chemo-, und immunotherapeutische Verfahren. Aufgrund hoher Resistenzraten metastasierter Melanome gegenüber zahlreichen Chemotherapeutika werden Chemotherapie und Immunotherapie gewöhnlich in Kombination angewendet. Konventionelle immuntherapeutische Ansätze beziehen sich meist auf Tumorantigene und zielen darauf ab, Tumorzellen durch Aktivierung der direkten und indirekten immunologischen Abwehr zu attackieren und zu vernichten (Wang & Rosenberg 1999). Die engen Grenzen dieser Therapie werden von spezifischen Eigenschaften der Tumorzellen bestimmt. Hierzu zählen eine schwache Immunogenität, Immuntoleranz, verminderte MHC-Expression, Antigen- modulation, Fehlen kostimulatorischer Moleküle und Sekretion immunsuppressiver Moleküle (Marincola et al. 2003). Eine Möglichkeit diese Fähigkeiten der Tumorzellen zu umgehen besteht darin, die Blutversorgung der Tumoren negativ zu beeinflussen. Diese Idee wurde über gentherapeutische Ansätze, aktive Immunisierung und verschiedene Angiogeneseinhibitoren weiter verfolgt. 2.6.1 Gentherapeutischer Ansatz Da die medikamentelle Angiogenese-Hemmung nur zytostatisch wirkt und chronische Applikationen der Substanzen notwendig sind, wird derzeit als Alternative an einem gentherapeutischen Ansatz gearbeitet, durch den eine Langzeitproteinexpression in vivo etabliert werden soll (Davidoff et al. 2001). Nach Davidoff et al. ist der Transfer nackter DNA meist ineffizient und ein Gentransfer über Adenoviren aufgrund von Immunreaktionen des Wirtes gegen transduzierte Zielzellen kompliziert, so dass als sinnvolle Variante nur eine Retrovirus-vermittelte Integration der Transgene in sich vermehrende Stammzellen bleibt, um Langzeitexpression der Gene zu erreichen. Die Tatsache, dass zirkulierende Stammzellen aus dem Knochenmark zur Gefäßbildung in Tumoren rekrutiert werden, bietet die Möglichkeit, solche Zellen als Vektoren ins Tumorgewebe zu nutzen (Davidoff et al. 2001). Seine 60 Literaturübersicht Arbeitsgruppe integrierte auf diesem Weg lösliches VEGFR2 in murine Stammzellen aus dem Knochenmark und konnte nach deren Transplantation in syngene Mauslinien nachweisen, dass Tumore (Neuroblastome) in jenen Mäusen, verglichen mit der Kontrollgruppe, nur auf eine Größe von 50% anwuchsen (Davidoff et al. 2001). 2.6.2 Aktive Immunisierung Li et al. entwickelten eine aktive Immunisierung gegen VEGFR2 mit löslichen VEGFR2Protein aus dendritischen Zellen und umgehen so die immunologische Barriere. Tumorangiogenese und Metastasierung konnten im Mausmodell effektiv gehemmt werden (Li et al. 2002). 2.6.3 Bestrahlung Ionisierende Strahlen mit ihrer antiproliferativen und zytotoxischen Wirkung auf sich teilende Zellen gehören zur Standardtherapie vieler Tumorerkrankungen (50% aller Tumorpatienten werden bestrahlt). Garcia- Barros et al. veröffentlichten eine Studie, aus der hervorgeht, dass der Erfolg nicht nur vom Tumortyp und der Apoptoserate der Tumorzellen abhängt, sondern vielmehr das Ergebnis strahleninduzierter Endothelzellapoptose mit Reduktion der Gefäßversorgung ist (Garcia- Barros et al. 2003). 2.6.4 Angiogenese- Inhibitoren Ein erfolgversprechender Ansatz aus der experimentellen Forschung, besonders im Hinblick auf derzeit therapieresistente Neoplasien, scheint die Entdeckung verschiedener AngiogeneseInhibitoren zu sein. Die Idee beruht auf der Tatsache, dass Tumorwachstum entscheidend auf die Verfügbarkeit von Sauerstoff und Nährstoffen angewiesen ist. Durch die langfristige Gabe eines niedrig dosierten Chemotherapeutikums zusammen mit einem Angiogeneseinhibitor können die Wirkungen beider Pharmaka miteinander kombiniert werden. Angiogenese-Inhibitoren sind Komponenten, die spezifisch in regulatorische Prozesse der Gefäßbildung eingreifen (Griffioen & Molema 2000). Gemeinsames Ziel ist, die Blutversorgung, welche für Wachstum und Überleben tumorösen Gewebes notwendig ist, einzuschränken. Derzeit in der Forschung eingesetzte Substanzen, lassen sich in folgende Gruppen unterteilen (Griffioen & Molema 2000): 1. Substanzen, welche die Proliferation von Endothelzellen hemmen: z.B.TNP-470 2. Substanzen, durch die umgebende Matrix stabilisiert wird: MetalloproteinaseInhibitoren wie z.B. Batimastat (unzureichende Bioverfügbarkeit) oder Marimastat Literaturübersicht 61 3. Substanzen, die endothelspezifisches Integrin und somit antiapoptotische Signale beeinflussen: z.B. Vitaxin, ein gegen αVβ3- Integrin gerichteter monoklonaler Antikörper 4. Substanzen mit nicht- endothelzellspezifischen Wirkungsmechanismus: CAI z.B. hemmt den transmembranen Calcium- Influx und führt so zu einer Destabilisierung der Tumorzellen 5. Substanzen, die Angiogenese- Aktivatoren blockieren: SU5416 beispielsweise bindet selektiv VEGFR2 der Endothelzellen. SU6668 besitzt ein breiteres Wirkungsspektrum, da dieser Angiogenese-Inhibitor mit VEGF-, FGF- und PDGF- Rezeptoren interagiert. Eine Blockade der VEGF-VEGFR-Signaltranduktion ist außerdem mit verschiedenen monoklonalen Antikörpern möglich (DC101. MF-1). Erste Studien mit Angiogeneseinhibitoren stammen aus den 1990er Jahren: TNP-470 reduzierte in 80-90% Anzahl und Größe von B16BL6-Melanomen und M5076-Retikulumzellsarkomen (Yamaoka et al. 1993), indem es Endothelzellproliferation und die Migration glatter Muskelzellen beeinflusst (Bergers & Benjamin 2003). Außerdem besitzen eine Vielzahl der bereits in der Tumortherapie eingesetzten antimitotischen Chemotherapeutika, wie Vincaalkaloide (Vinblastin, Vincristin), Camptothecin, Docetaxel und Paclitaxel antiangiogene Fähigkeiten (Kerbel et al. 2000; Sweeney et al. 2001; Grant et al. 2003). 6Methylmercaptopurin-Riboside hemmen die FGF-2-induzierte Proliferation und Reparatur im Monolayer endothelialer GM7373-Zellkulturen, sowie die Vaskularisierung der Chorioallantoismembran im Hühnerembryo (Presta et al. 1999). Für Paclitaxel und Docetaxel stellten Grant et al. fest, dass deren zytotoxische und antiproliferative Wirkung auf Endothelzellen um das 10-100-fache größer ist, als auf Tumorzellen selbst. Vinblastin, Vincristin und Colchicin beeinflussen ähnlich wie TNF-α die Durchblutung und führen zur Zellnekrose in Kolon-38-Adenokarzinomen (Baguley et al. 1991). Die Angriffspunkte der antiangiogenen Tumortherapie sind variabel. Neben Blockade der VEGF-Wirkung, Hemmung des bFGF (Becker et al. 1989; Becker et al. 1992), der MatrixMetalloproteinasen (Naglich et al. 2001), der Tie-2 Rezeptor-Liganden (Lin et al. 1998) oder Urokinase-artigen-Plasminogen-Aktivatoren (Min et al. 1996) kann durch Applikation endogener Angiogenese-Inhibitoren (Angiostatin (O'Reilly et al. 1994), Endostatin (O'Reilly et al. 1997; Boehm et al. 1997; Monestiroli et al. 2001), Trombospondin-1 (Dameron et al. 1994; Miao et al. 2001; Reiher et al. 2002), Trombospondin-2 (Streit et al. 2002), Interferon α/β (Dvorak & Gresser 1989; Singh et al. 1995) und IL-10 (Huang et al. 1996) das Wachstum 62 Literaturübersicht von Tumoren im Xenograft-Modell verlangsamt werden. Auch Thalidomid besitzt eine antitumorale Wirkung (Singhal et al. 1999; Hwu 2000). Besonderes Interesse gilt der Entwicklung selektiver Medikamente, die gezielt auf Endothelzellen wirken. Eine solche Selektivität besitzt Combretastatin A-4 in neoplastischem Gewebe (Dark et al. 1997). Es wirkt in vitro selektiv zytotoxisch auf proliferierende Endothelzellen und induziert die Rückbildung funktioneller Tumorgefäße in vivo (Iyer et al. 1998). Der Neurotransmitter Dopamin induziert über D2-Dopamin-Rezeptoren selektiv die Endozytose von VEGFR2, und führt so zur Hemmung der VEGF induzierten erhöhten Permeabilität und Angiogenese in vivo, sowie der Endothelzellproliferation, Migration und VEGFR2 Phosphorylierung in vitro. Auch bei diesem Ansatz bleibt der VEGF-Rezeptor wichtigster Angriffspunkt in der Antiangiogenese-Therapie (Basu et al. 2001). Ribozym-Therapie: Ribozyme sind Moleküle, die spezifische RNAs binden und spalten. Auf diese Art und Weise lässt sich auch die Genexpression der VEGFR2- und VEGFR1-Rezeptoren hemmen. Ribozyme gegen VEGFR2 oder VEGFR1 hemmen das Wachstum primärer Tumoren. Allerdings waren nur anti-VEGFR1-Ribozyme in der Lage, auch eine Lungenmetastasierung signifikant zu inhibieren (Pavco et al. 2000). Monoklonale Antikörper blockieren angiogene Vorgänge: Angiogenese umfasst eine Reihe voneinander abhängiger Vorgänge: Migration endothelialer Stammzellen, Migration und Invasion endothelialer Zellen, Proliferation der Endothelzellen, Organisation der Endothelzellen zu tubulären Strukturen, Formation von Anastomosen, Reifung von Gefäßen und Regression von Blutgefäßen. An diesen Vorgängen sind viele Wachstumsfaktoren direkt und indirekt beteiligt, wobei VEGF eine bedeutende Schlüsselrolle einnimmt. Zahlreiche Studien haben gezeigt, dass eine Überexpression von VEGF und VEGFR-2 mit Invasion und Metastasierung humaner maligner Tumore einhergeht. Auch bei Maustumoren und unter hypoxischen Bedingungen hat VEGF seine herausragende Bedeutung bewiesen (Hicklin et al. 2001). Eine potente Wirkung auf humane (A375-Melanom, Calu-6Lungenkarzinom, LNCAP-Prostatakarzinom, SF763T- und SF767T-Gliome) und murine subkutane Tumore (EPH4-VEGF-Mammakarzinom, 3T3HER2 und 488G2M2-Fibrosarkome) im Mausmodell zeigt der selektive VEGFR2-Inhibitor SU 5416 der Firma Sugen (Sugen Inc., Kalifornien) (Fong et al. 1999). Damit sind VEGF und sein Rezeptorsystem entscheidende Angriffspunkte der Angiogenesehemmung (Takano et al. 1996; Toi et al. 1996; Ellis et al. 1998). Literaturübersicht 63 Viele Studien haben sich damit beschäftigt, den VEGF-vermittelten Effekt im Verlauf der pathologischen Angiogenese durch neutralisierende Antikörper zu hemmen. Antikörper repräsentieren aufgrund ihrer hohen Spezifität eine einzigartige Therapieform (Hicklin et al. 2001). Unter Verwendung eines dominant-negativen VEGFR2-Rezeptors (Millauer et al. 1994), durch Neutralisierung von VEGF mit monoklonalen Antikörpern (Kim et al. 1993), Blockade des VEGFR2-Rezeptors mit neutralisierenden monoklonalen anti-VEGFR2Antikörpern (Prewett et al. 1999) oder durch den Einsatz von VEGFR2-Kinase-Inhibitoren (Fong et al. 1999) konnten Angiogenese und Tumorwachstum gehemmt werden. 1. Anti-VEGF-Antikörper: Kim et al. berichteten von einem gegen den humanen Wachstumsfaktor gerichteten murinen anti- VEGF-Antikörper, der das Wachstum humaner Tumoren im Nacktmäusen hemmt (Kim et al. 1993). Eine humanisierte Form des Antikörpers (rhu-Mab anti VEGF) wurde von der Firma Gentech entwickelt und zeigte ähnliche Wirkung (Presta et al. 1997). Die anti-VEGF-Therapie führte im Rattenmodell mit Glioblastomen zu reduzierter Gefäßdichte und ansteigender Apoptoserate, aber verstärkter Integration bereits existierender Blutgefäße (Rubenstein 2000). 2. Anti-VEGFR2-Antikörper: Wissenschaftler bei ImClone entwickelten einen anti-VEGR1Antikörper (DC101) in der Ratte, der gegen die extrazelluläre Domäne des murinen Rezeptors gerichtet ist (Witte et al. 1998). Dieser Antikörper hemmt VEGF kompetitiv und fungiert als potenter Antagonist der VEGF-Bindung. Er blockiert die rezeptorvermittelte Signaltransduktion und die VEGF-induzierte Endothelzellproliferation in vitro. Der Ratte-antiMaus-Antikörper wurde in vivo im Mausmodell getestet und demonstrierte auch hier seine antiangiogene und antitumorale Potenz (Witte et al. 1998; Prewett et al. 1999; Yoshiji et al. 1999). Prewett et al. wiesen an verschiedenen xenogenen und syngenen Tumormodellen nach, dass DC101 durch Blockade des VEGFR2 Metastasierung und Wachstum von Tumoren, sowie die Proliferation und Apoptosevorgänge der Endothelzellen in vivo hemmt (Prewett et al. 1999). Histologische Untersuchungen zeigten, dass Tumoren unter der Behandlung mit DC101 eine reduzierte Gefäßdichte, verstärkte Apoptose, reduzierte Tumorzellproliferation und exzessive Tumornekrose (Prewett et al. 1999; Bruns et al. 2000) aufwiesen. DC101 Behandlung hemmt somit die Endothelzellproliferation und induziert Endothelzellapoptose, was mit einer entsprechenden Gefäßreduktion einhergeht. 64 Literaturübersicht 3. Anti-VEGFR1-Antikörper: Die Rolle des VEGFR1 in der Tumorangiogenese ist sehr unklar. Ein neutralisierender anti-Maus-VEGFR1-Antikörper (MF-1) wurde entwickelt, um herauszufinden ob die Blockade dieses Rezeptors Tumorangiogenese und Tumorwachstum im Mausmodell hemmt. MF-1 hemmt tatsächlich die Neovakularisierung im Matrigel-plug Essay und Corneal-pocket Essay der Maus. Im Xenograft-Modell (humane A431-Tumoren in der Maus) führte anti-VEGFR1-Antikörper zu keiner vollständigen Wachstumshemmung. Allerdings zeigten histologische Schnitte der Tumoren eine reduzierte Gefäßdichte und verstärkte Tumornekrose, die der DC101-Wirkung entsprach (Hicklin et al. 2001). 4. Kombination eines Angiogenesehemmers mit niedrigdosierter Chemotherapie oder Bestrahlung: Kombinationstherapien aus DC101 und einem Chemotherapeutikum oder einer gezielten Bestrahlung könnten wirkungsvolle Verbesserungen therapeutischer Resultate sein. In diesem Zusammenhang wurde DC101 im Mausmodell als potentierendes Agens verschiedener Chemotherapeutika wie Paclitaxel, Cyclophosphamid, Vinblastin und Gemcitabine eingesetzt und war in Xenograft-Modellen bei verschiedenen humanen Tumoren (Witte et al. 1998; Prewett et al. 1999; Klement et al. 2000; Bruns et al. 2002) erfolgreich. Auch in Kombination mit Bestrahlungsprotokollen zeigte DC101 eine Verstärkung der antitumoralen Wirkung (Kozin et al. 2001). Den ersten Nachweis, dass DC101 in Kombination mit Paclitaxel die Entstehung von Tumoren, Angiogenese und Metastasen humaner Tumoren im Mausmodell hemmt, erbrachten Inoue et al. (Inoue et al. 2000). Die Therapie senkte die Gefäßdichte im Tumor, erhöhte die Apoptose der Tumorzellen und Endothelzellen. Interessanterweise wurde die VEGFR2- Expression von der Behandlung nicht beeinflusst. Hemmung der tumorinduzierten Gefäßneubildung, bei der aktivierte, endotheliale Zellen und nicht so sehr Tumorzellen Ziel der Therapie sind, ist ein bedeutender und populär gewordener Ansatz in der Tumortherapie. Der Grund dafür ist, dass alle Tumoren von Angiogenese abhängig sind, normale Endothelzellen nur geringe Mutationsraten aufweisen und daher kaum Therapieresistenz entwickeln (Griffioen & Molema 2000) und, dass aktivierte Endothel-zellen selektiv zu beeinflussen sind (Davidoff et al. 2001). In Kombination mit einem VEGFR-2blockierenden Antikörper sind niedrigere Dosen des Chemotherapeutikums notwendig, so dass weniger schwere Nebenwirkungen wie Myelosuppression, Haarausfall, Übelkeit oder verminderte Resistenzbildung, zu erwarten sind. Der genaue Wirkungsmechanismus ist allerdings noch nicht geklärt (Barinaga 2000). 65 3. Eigene Untersuchungen 3.1 Ziel der Studie und Fragestellung Für die Entwicklung wirksamerer Behandlungsmöglichkeiten metastasierender Tumorerkrankungen sind zusätzliche Erkenntnisse über die Mechanismen der Ausbildung und des Wachstums hämatogener Metastasen von grundlegender Bedeutung. In früheren Untersuchungen konnte gezeigt werden, dass dem Adhäsionsmolekül P-Selektin eine zentrale Rolle bei der hämatogenen Metastasierung und Etablierung von Sekundärtumoren zukommt. Dabei wurde bevorzugt die Bedeutung der thrombozytären P-Selektine und deren Beteiligung an Tumorzell-Thrombozyten-Interaktionen analysiert. Im Gegensatz zu der Funktion thrombozytären P-Selektin, konnte die Bedeutung der endothelialen P-SelektinExpression im Rahmen der hämatogenen Metastasierung bisher noch nicht aufgeklärt werden. Es war daher ein zentrales Ziel dieser Arbeit, den Einfluss der endothelialen P-SelektinExpression auf die Ausbildung hämatogener Metastasen unter Verwendung von murinen Knochenmarktransplantations-Modellen zu klären. Durch die Inhibierung des Adhäsionsmoleküls mittels Heparinen und spezifischen Antikörper sollte gleichzeitig die funktionelle Bedeutung der P-Selektin-Expression in verschiedenen Phasen der hämatogenen Metastasierung aufgezeigt werden. Den endothelialen Tyrosinkinase-Rezeptoren VEGFR1 und VEGFR2 kommt beim Angiogenese-abhängigen Wachstum von Lokaltumoren eine zentrale Bedeutung zu. Daher gelten die VEGF-Rezeptoren und ihre Liganden als wichtige Zielstrukturen für moderne Therapieansätze zur Hemmung von Metastasierung und Tumorwachstum. Die Rezeptoren VEGFR1 und VEGFR2 werden nicht nur von differenzierten Endothelzellen exprimiert, sondern auch von endothelialen und hämatopoetischen Vorläuferzellen des Knochenmarks. Zunehmende Evidenzen deuten darauf hin, dass der Mobilisierung und Rekrutierung VEGFR2+ endothelialer, als auch VEGFR1+ hämatopoetischer Vorläuferzellen aus dem Knochenmark eine funktionelle Bedeutung in lokal wachsenden Metastasen zukommt. Es war ein weiteres Ziel dieser Arbeit, die mögliche Rolle dieser Vorläuferpopulationen bei der Etablierung und dem Wachstum hämatogener Fernmetastasen aufzuklären. Zudem sollte unter Verwendung des murinen B16-Melanom-Metastasen-Modells untersucht werden, ob durch Inhibierung des VEGFR1 und/oder VEGFR2 die Ausbildung experimenteller Metastasen unterdrückt werden kann. 66 . 3.2 Material und Methoden 3.2.1 Geräte Sterilbank: Laminair HA2460GS (Heraeus) Zentrifugen: Tischzentrifuge Eppendorf Centrifuge 5804R (Eppendorf); Tischzentrifuge Eppendorf Centrifuge 5417C (Eppendorf) Brutschränke: CO2 water jacketed incubator Modell 3111 (Forma Scientific); Inkubator Typ B5060E (Heraeus) Wasserbad: Precitherm®PFV (Labora Mannheim) Schüttler: Vortex-Genie2 (Scientific Industries); Eppendorf Thermomixer 5436 (Eppendorf) Mikroskope: Wilovert A (hund, Wetzlar); Wilovert S (hund, Wetzlar); Olympus BX50 Waagen: Feinwaage Sartorius BP110S; Tierwaage Sartorius excellence Kryostat: Kryostat CM 1900 (Leica Instruments) Kreisbeschleuniger: Betatron (42MV, Siemens) Durchflusszytometer: FACScalibur, Becton Dickinson, MountainView, CA Kamera: Digitalkamera Nikon CoolPix 990 (Nikon), Leica S1 Pro (Leica instruments) Bestrahlungbox: 20 cm x 20 cm mit 12 Einzelboxen (Blutspendedienst DRK, Frankfurt) Sonstiges: feuchte Kammer, Pinzetten, Schere, Neubauer-Kammer, Pipetten (Eppendorf) 3.2.2 Verbrauchsmaterialien Antikörper: siehe unter 3.2.4 und 3.2.5 Proteinase K (20 mg/ml) (Sigma) Vectastain kit® IgG rat (Vector laboratories, Kalifornien) AEC kit® (Linaris, Vector laboratories, Kalifornien) 0,2-2,0 ml Reaktionsgefäße (Eppendorf) 15 ml und 50 ml Zentrifugengefäße (Falcon /BD) FACS- Röhrchen: 5 ml Rundbodenröhrchen, 12x75 mm (Falcon/BD) 3 ml Blutröhrchen mit Natriumzitrat beschichtet (Sarstedt, Nümbrecht, Deutschland) 5 ml/ 10 ml/ 25 ml Einmalpipetten (Costar Stipette®, Corning Incorporated) 0,22 µm Sterilfilter (Millex®-GV, Millipore) 40 µm Cell Strainer (Falcon) Objektträger Super Frost® plus (Menzel- Gläser) Deckgläser 24 x 60 mm (Carl Roth, Karlsruhe) Material und Methoden 67 Cryomold®Standard 25x20x5 mm Einbettschalen (Miles) Tissue Tek® (Jung freezing medium, Leica Instruments) 1ml Einmalspritzen (B.Braun Melsungen AG) Injektionskanülen (30GA1/2 0,3x13), (20G 11/2 0,9x40) (BD) Zellkulturflaschen 185 cm2 (Nalge Nunc International) Pasteurpipetten, Pipettenspitzen, Rasierklingen Aquatex®(Merck, Darmstadt) Dako Pen® (DAKO) 3.2.3 Verwendete Lösungen PBS: Dulbecco´s PBS ohne Calcium, Magnesium und Natriumbicarbonat, 500ml (Gibco) Aqua ad injectabilia (BBraun) Paraformaldehyd (PFA)(Merck, Darmstadt) Tween 20 (Merck, Darmstadt) Dimethylsulfoxid (DMSO; Sigma) Aceton (Riedel-de Haen) Ethanol (Riedel-de Haen) Hämalaun (Merck, Darmstadt) Serum: Fötales Kälberserum (Foetal Bovine Serum, E.U. approved origin, South America; Gibco), Ziegenserum (PAA laboratories), Mausserum (DAKO) Bovines Serumalbumin (BSA) (Sigma) Zellmedium: Dulbecco´s mod eagle medium (Gibco) versetzt mit 100 ml/l fetalem Kälberserum, 10 ml/l L-Glutamin 200 mmol/l (100x, Gibco) und 10 ml/l antibiotischantimykotischer Lösung (Penicillin/ Streptomycin/ Amphotherin B; 100x; Sigma) Einfriermedium: 55 ml Zellmedium (Gibco), 40 ml fötales Kälberserum, 5 ml DMSO (Sigma) je 100 ml Einfriermedium FACS- Lysing Solution: 1x (Becton-Dickinson); 10x Lösung enthält je 100ml: <15 ml Formaldehyd, <50 ml Diethylenglycol; wird bei Raumtemperatur 1:10 mit aqua ad injectabilia verdünnt (1x). PCR-Ready-Puffer (Lysis-Puffer): 50 mmol/l KCl; 1,5 mmol/l MgCl 2; 10 mmol/l Tris-HCl (pH 8,3); 4,5 ml/l NP-40; 4,5 ml/l Tween 20; dH2O x-Gal-Lösung (2%ige stock solution): 50 ml Dimethyl-Formamid (Sigma Deideshofen, D4254), 1 ml x-Gal (Firma peqlab). 68 Material und Methoden LacZ- Färbelösung: Unter Rühren werden folgende Reagentien in PBS gelöst: 2 mmol/l MgCl 2 Magnesiumchlorid Hexahydrat (Sigma) 0,2 g/l NP-40 Nonindet P40 5 mmol/l K3 Fe(CN)6 (Sigma P-8131) 5 mmol/l K4Fe(CN)6 (Sigma P-9387) 0,25 mmol/l DOC (Fluka, 74585, 1l) Na-deoxycholat (Merck Darmstadt, 100g, 6504) Die Lösung wurde sterilfiltriert, in eine mit Alufolie umwickelte braune Flasche umgefüllt und bei Raumtemperatur gelagert. Zu 19 ml Farblösung wurden unmittelbar vor dem Gebrauch 1 ml x-Gal-Lösung zugesetzt. 3.2.4 Antikörper in der Immunhistochemie und Durchflusszytometrie Zur Darstellung und Charakterisierung verschiedener Zelltypen in immunhistochemischen Färbungen wurden monoklonale Antikörper verwendet, die gegen spezifische Epitope der Zelloberfläche gerichtet sind und mittels biotinylierten Sekundärantikörpern über eine Streptavidin-Peroxidase-Reaktion nach Zugabe des Farbstoffsubstrates sichtbar gemacht werden können: Anti-Pecam-1/CD31 (Immunglobuline der Ratte, Mec 13.3, BD PharMingen), anti-VEGFR2-Antikörper (Hybridomüberstand 1:5 in PBS verdünnt, MaxPlanck-Institut f. klinische und physiologische Forschung Bad Nauheim), anti-CD11b, antiCD45 (Klon M1/9, Hybridom-überstand 1:5 verdünnt, Max-Planck-Institut f. klinische und physiologische Forschung, Bad Nauheim). Immunogen Antikörper Isotyp Pecam-1 (CD31) anti-Pecam IgG Ratte Primärantikörper VEGFR2 (Flk-1) anti- VEGFR2 IgG Ratte Primärantikörper; 12β11 Hybridomüberstand MPI f. physiolog. u. klin. Forschung Bad Nauheim IgG Kan. Primärantikörper Santa Cruz CD11b / Integrin αM anti-CD11b Klon Hersteller Mec 13.3 PharMingen CD45 anti-CD45 IgG Ratte Primärantikörper, M1/9 Hybridomüberstand IgG der Ratte (Fc-Fragment) anti-RatteBiotin IgG Ziege Sekundärantikörper IgG des Kaninchens (Fc-Fragment) anti-Kan.Biotin IgG Ziege Sekundärantikörper MPI f.physiolog. u. klin. Forschung Bad Nauheim Vector laboratories, Kalifornien Vector laboratories, Kalifornien Tab.3.1: Verwendete monoklonale Antikörper in der Immunhistochemie. Kan.: Kaninchen Material und Methoden 69 Folgende monoklonale Antikörper wurden zur Analyse im Durchflußzytometer herangezogen: anti-VEGFR2-Phycoerythrin (anti-VEGFR2-PE; Ratte, Klon Avas 12α1, BD PharMingen, Heidelberg, Deutschland), anti-VEGFR1 (Kaninchen, ImClon Systems Inc., Klon MF-1), anti-CD34-Fluoresceinisothiocyanat (anti-CD34-FITC; Ratte, Klon RAM 34, PharMingen), anti-CD11b-Allophycocyanin (anti-CD11b-APC; Ratte, BD PharMingen), antiCD117 (c-kit)-APC (BD PharMingen), Schwein-anti-Kaninchen-FITC („swine anti rabbit“FITC; DAKO), anti-CD16/CD32 (IgG2a der Ratte, Klon 2.4G2, Pharmingen, Verdünnung 1:200), anti-CD41-PE (Klon MWReg30, BD Biosciences, Heidelberg, Deutschland), antiCD62P-FITC (Klon RB40.34, BD Biosciences, Heidelberg, Germany). Weiterhin fanden in jedem Experiment die entsprechenden Isotyp-Antikörper als Negativkontrollen Verwendung. Immunogen VEGFR2 Protein-Tyrosinkinase VEGFR1 Protein-Tyrosinkinase Antikörper Anti-Maus VEGFR2PE CD34 Glykoprotein Anti- Maus CD34FITC CD11b Integrin Isotyp IgG2a Ratte IgG Kan. Primärantikörper Klon Avas 12α1 Hersteller Pharmingen Primärantikörper MF-1 ImClone Systems IgG2a Ratte Primärantikörper RAM34 PharMingen Anti-Maus CD11bAPC IgG2b Ratte Primärantikörper M1/70 ParMingen CD117 (c-kit) Tyrosinkinaserezeptor Anti- Maus CD117APC IgG2b Ratte Primärantikörper 2B8 PharMingen CD41 Adhäsionsmolekül Anti-Maus CD41-PE IgG Ratte Primärantikörper MWReg 30 BD IgG Ratte Primärantikörper RB40.34 BD IgG Schwein Sekundärantikörper Isotyp- PE IgG2a Ratte Isotypkontrolle R35-95 PharMingen Immunglobuline der Maus (Fab) Isotyp- FITC IgG2a Ratte Isotypkontrolle R35-95 PharMingen Immunglobuline der Maus (Fab) Isotyp- APC IgG1 Isotypkontrolle MOPC-21 PharMingen CD16 / CD32 FcγIII/II-Rezeptor Anti-Maus CD16/ CD32 IgG2b Ratte Fc-Block 2.4G2 PharMingen CD62P P-Selektin Fc- Fragment der Immunglobuline des Kaninchens Immunglobuline der Maus (Fab) Anti- Maus VEGFR1 Anti-Maus CD62PFITC Schwein anti IgG Kan.- AntikörperFITC DAKO Tab.3.2: Monoklonale Antikörper der FACS-Analysen; PE: Phycoerythrin, FITC: Fluorezinisothiocyanat; APC: Allophycocyanin, Kan: Kaninchen. 70 3.2.5 Material und Methoden Pharmazeutika und Antikörper der in vivo- Studien Anaesthetika: Xylazin (Rompun Medistar), Ketamin (Ketavet, Intervet) Heparin: Heparin (Liquemin®, Roche Pharma) wirkt als Antikoagulans, beeinflusst das Immunsystem (Tyrrell et al. 1999), Heparin- oder Heparasulfat-gebundene Wachstumsfaktoren (Vlodavsky et al. 1996), das Enzym Heparanase (Vlodavsky et al. 2002) und die Tumorzelladhäsion an Plättchen und vaskuläre Endothelzellen (Smorenburg & Van Noorden 2001). Epinephrin (Aventis, Bad Soden, Deutschland): Epinephrin diente der Aktivierung muriner Thrombozyten im peripheren Blut. Anti-P-Selektin-Antikörper (+αCD62P, Klon RB40.34, BD Biosciences): Anti-P-Selektin Antikörper inhibieren die Interaktionen des Adhäsionsmoleküls P-Selektin auf Thrombozyten und Endothelzellen. Der Antikörper wurde unmittelbar vor der intravenösen B16Melanomzellinokulation in einer Dosierung von 250 µg/ Maus intraperitoneal appliziert. Anti-VEGFR2-Antikörper (DC101; Firma ImCloneSystems, Inc.): DC101 gehört in die Gruppe der Tyrosinkinase-Inhibitoren und ist als selektiver anti-VEGFR2-Antikörper gegen die extrazelluläre Domaine des Rezeptors gerichtet. Der monoklonale Ratte-anti-Maus Antikörper wurde von der Firma Imclone Sytems für die Studien zur Verfügung gestellt. Die Applikation erfolgte intraperitoneal in dreitägign Rhythmus in einer Dosierung von 750 µg/ Maus. Anti-VEGFR1-Antikörper (MF-1, Firma ImClone Systems, Inc.): Bei MF-1 handelt es sich um einen selektiven anti-VEGFR1-Antikörper, der freundlicherweise von der Firma ImClone Systems für diese Studien zur Verfügung gestellt, und in einem dreitägigem Rhythmus in einer Dosierung von 750 µg/ Maus intraperitoneal appliziert wurde. 3.2.6 Zelllinien Melanomzellen: In den Studien fanden syngene B16-F10-Melanomzellen Verwendung, die C57BL/6J-Mäusen entstammen (Referenz ATCC, Rockville, MD). 3.2.7 Kultivierung von Melanomzellen Murine B16F10-Melanomzellen besitzen einen C57BL/6-Hintergrund und sind durch spontane Mutation entstanden (ATCC, Rockville, MD). Die Kultivierung dieser Tumorzellen erfolgte bei 37°C, 5-7% CO2 in wassergesättigter Atmosphäre. Dem Wachstumsmedium Material und Methoden 71 (Dulbecco´s MOD Eagle Medium, Gibco Invitrogen Corp., Karlsruhe, Deutschland) wurden pro Liter Zellmedium 100 ml Kälberserum (Gibco), 10 ml L-Glutamin (200 mmol/l, Gibco), 10 ml antibiotisch-mykotische Lösung (100 U/ml Penicillin (Sigma, Deisenhofen), 100 µg/ml Streptomycin (Sigma, Deisenhofen) und 250 µg/ml Amphotericin B (Sigma, Deisenhofen, Deutschland)) zugesetzt. Erreichten adhärente Zellen Konfluenz, wurden sie zunächst mit 8 ml PBS ohne Calcium und Magnesium gewaschen und nach einem weiteren Waschvorgang mit 4 ml 0,54 mmol/l EDTA bis zum Ablösen mit 3 ml 0,54 mmol/l EDTA-Lösung inkubiert (3-5 min). Nach Aufnahme der Zellen in Medium und Zentrifugation (4°C, 1000 U/min, 10 min) wurde der Überstand dekantiert, das Zellpellet in frischem Medium aufgenommen und ein Sechstel der Zellsuspension in neuen Gewebekulturflaschen ausgesät werden. 3.2.8 Langzeitlagerung von Melanomzellen Die Langzeitlagerung der Melanomzellen erfolgte in der Gasphase über flüssigem Stickstoff. Zunächst wurden die Zellen, wie beschrieben, vom Boden der Kulturflasche abgelöst. Die Resuspension des Sediments nach der Zentrifugation erfolgte in vorgekühltem Einfriermedium (3 ml pro Zellkulturflasche). Ein Drittel der Zellsuspension wurde anschließend in Kryoröhrchen überführt, über Nacht bei –80°C eingefroren und schließlich in einem Stickstoffbehälter gelagert. Zur erneuten Kultivierung tauten die Kryoröhrchen in einem Wasserbad bei 37°C auf; der Inhalt wurde in 10 ml vorgewärmtem Wachstumsmedium aufgenommen und nach Zugabe weiterer 15 ml Medium bei 37°C inkubiert. Am nächsten Tag erfolgte ein Mediumwechsel. 3.2.9 Mauslinien C57BL/6 (Wildtyp): C57BL/6 (Charles River Deutschland GmbH, Sulzfeld) mit einem Gewicht von 18-20 g (50-63 Tage) wurden als Wildtyp-Kontrollen (wt) eingesetzt. Als Empfängertiere des Knochenmarks im Rahmen der Transplantationsstudien wurden C57BL/6 im Alter von 21 Tagen als Empfängertiere eingesetzt. P-Selektin-defiziente Mäuse mit C57BL/6-Hintergrund (P-Selektin-Knock-out, P-sel-/-): Solche Tiere sind homozygot für die Selptm1Bay-Mutation. Die Tiere wurden von Charles River GmbH Deutschland, Sulzfeld, bezogen. B6.ROSA26 Mäuse (Charles River Deutschland GmbH, Sulzfeld): Diese Mäuse entstammen einer C57BL/6-Linie und exprimieren β-Galaktosidase in allen Geweben. Nach 72 Material und Methoden Transplantation von Knochenmark dieser Mauslinie in C57BL/6-Wildtyp-Mäuse können ins Gewebe integrierte Knochenmarkszellen im Empfängertier durch LacZ-Färbung nachgewiesen werden. VEGFR2+/-Knock-In-Linie (Max-Planck-Institut für klinische und physiologische Forschung, Bad Nauheim, Deutschland): Tiere der VEGFR2+/-Knock-In-Linie besitzen einen genetischen C57Bl/6-Hintergrund und wurden als syngene Knochenmarksspender eingesetzt. Es handelt sich um eine Mauslinie, bei der die Integration des VEGFR2-Gens gestört ist (Shalaby et al. 1995). Das β-Galaktosidase-Gen steht unter Transkriptionskontrolle des VEGFR2Promoters, so dass bei vermehrter VEGFR2-Expression das β-Galaktosidase-Gen (LacZReportergen) anstelle des VEGFR2-Allels translatiert wird. Der Nachweis der intrazellulären β-Galaktosidase erfolgt über die LacZ- Färbung (Shalaby et al. 1995; Heidenreich et al. 2000) (siehe 3.2.14). 15kb H N A P B P S P X Wildtyp B Zielvektor PN tk H N Zielstruktur NPP B Sl H E A P B BH LacZ PN BH LacZ HS P X NPP B Sl HS P X NPP B Sl neo H neo Abb.3.2.1. VEGFR2+/-transgene Mäuse: Darstellung der Schnittstellen von Restriktionsenzymen und der Veränderungen bezüglich des Wildtyps. Restriktionsenzyme spalten die DNA an unterschiedlichen Stellen. Die Schnittstellen werden durch Großbuchstaben gekennzeichnet, wobei jedes Enzym bestimmte Sequenzen erkennt (nach (Shalaby et al. 1995; Heidenreich et al. 2000). H- HindIII N- Ncol A- AscI P- PstI B- BamHI S- SmaI X- XhoI Sl- SalI Exon1 LacZ symbolisiert die Lokalisation des β- Galaktosidase- Gens. Neo steht als Abkürzung für das NeomycinResistenz- Gen. BLACK-nu (Taconic M&B A/S, Ry, Dänemark): Diese immundefiziente Mauslinie entsteht durch 3 bis 4-fache Rückkreuzung des nude-Gens auf C57/BL/6Jbom (Genetik: Black, aBCD). Charakteristisch ist das Fehlen von Thymus und Haarkleid (aufgrund einer Keratinisierungsstörung mit Haarbruch in den Follikeln). Das Immunsystem umfasst nur eine kleine Population an T-Zellen, die Antikörperproduktion ist auf Immunglobuline der Klasse M beschränkt, die T-Zell- abhängige Immunantwort nur schwach ausgeprägt und die Anzahl natürlicher Killerzellen kompensatorisch erhöht. Black-nu („nude mice“, Nacktmäuse) ermöglichen aufgrund ihrer stark reduzierten Immunkompetenz die Applikation körperfremder Proteine, ohne Abstoßungsreaktionen hervorzurufen. Material und Methoden 73 Alle Tiere wurden unter Standardbedingungen (Lichtzyklus 12 Stunden, Standardfutter) in der Zentralen Forschungseinrichtung des Klinikums der Johann-Wolfgang-Goethe Universität Frankfurt gehalten. Die Protokolle sind vom Landesministerium in Darmstadt (Hessen, Deutschland) geprüft und genehmigt. 3.2.10 Gewinnung und Aktivierung muriner Thrombozyten Die Gewinnung der Thrombozyten aus dem peripheren Blut von C57BL/6-Mäusen erfolgte nach retrobulbärer Blutentnahme mittels Pasteurpipette. Das Blut wurde in Natriumzitratbeschichteten Röhrchen (Sarstedt, Nümbrecht, Deutschland) aufgefangen. Das periphere Blut wurde anschließend 1:10 mit PBS (mit Ca2+ und Mg2+) verdünnt und mit Epinephrin aktiviert. 3.2.11 PCR-Ready-Lysis für Mäuseschwänze Das Prinzip der Polymerase-Kettenreaktion (PCR, Polymerase Chain Reaction) basiert auf exponentieller Amplifikation von DNA mittels spezifischer Primer und einer thermostabilen DNA-Polymerase in Anwesenheit von Desoxyribonukleosid- Triphosphaten. Zu amplifizierende Matritzen-DNA wird bei 94°C denaturiert (initiale Denaturierung 4 min, Denaturierung 30 s) und dann für 45 Sekunden auf 60°C abgekühlt, bevor sich in der vierminütigen Elongationszeit bei 72°C die komplementären Primer an einzelsträngigen Sequenzen der Matrize anlagern können. Ausgehend von den Primern erfolgt bei 72°C die Synthese der zur Matrizen-DNA komplementären DNA-Sequenzen mittels DNA-Polymerase (45 s). Mit jedem Zyklus verdoppeln sich die DNA-Moleküle. Zur Kontrolle des β-Galaktosidase-Gens in VEGFR2+/--Spendertieren wurde mittels PCR ein Genotyping am Max-Planck-Institut für klinische und physiologische Forschung, Bad Nauheim, durchgeführt. Von jeder Maus wurden 0,5-1 cm des Schwanzendes gewonnen und zweimal separat in kaltem sauberem PBS gewaschen. Nach jedem Schritt erfolgte eine Reinigung aller Instrumente, um Kreuzkontaminationen zu vermeiden. Die Schwanzspitze wurde in saubere 1,5 ml-Reaktionsgefäße (Eppendorf, Hamburg) überführt, die jeweils 400 µl Lysis-Puffer und 8 µl Proteinase K (20 mg/ml) enthielten. Bei 55°C lysierte das Gewebe unter ständigem leichten Schütteln über Nacht. Eine Erhöhung der Temperatur für 20 min auf 95°C inaktivierte die Proteinase. Anschließend wurde der Überstand für spätere PCRUntersuchungen bei –20°C konserviert. 74 Material und Methoden Zur Identifikation des ß-Galaktosidase-Gens wurden 1 µl DNA-Ansatz mit 19 µl Reaktionsmix (2 µl PCR-Puffer 10x; 1,2 µl MgCl2 25 mmol/l; 0,4 µl dNTPs 10 mmol/l, je 0,13 µl Primer 1+2 100mmol/l; 0,2 µl Taq-Polymerase (Promega) und Wasser ad 20 µl) versetzt. Nach initialer Denaturierung (3 min bei 95°C) inkubierten die Proben in 20-30 Zyklen und wurden anschließend gelelektrophoretisch analysiert. Primer lacZ FWD 5' CCG TCA CGA GCA TCA TCC TC 3' REV 5' GAC GAA ACG CCT GCC AGT ATT TAG 3' Tab.3.3: Primer zum Nachweis des LacZ-Reportergens. 3.2.12 Knochenmarkstransplantation Die Knochenmarkstransplantationen wurden nach einem bereits etablierten Transplantationsprotokoll durchgeführt (Mobest et al. 1999; Voswinkel et al. 2003). Als Knochenmarksspender fanden Psel-/--Mäuse, B6.Rosa26-, VEGFR+/-/Lac-Z-Knock-In- und C57BL/6-Mäuse Verwendung. 3.2.12.1 Bestrahlung und Behandlung der Transplantatempfänger Empfängertiere (C57BL/6, 4-6 Wochen alt, Charles River Deutschland) wurden zunächst letal bestrahlt, um eine möglichst vollständige Eradikation der vorhandenen Knochenmarkszellen zu erreichen. Zu diesem Zweck wurden die Mäuse in eine Bestrahlungsbox mit Einzelboxen transferiert und zweimal im Abstand von 6 Stunden mit je 5 Gray im Betatron bestrahlt. Die Bestrahlungsbox aus Plexiglas fasste 12 Tiere, hatte eine Höhe von 5cm und eine Grundfläche von circa 20 x 22 cm. Zwei mit Luftlöchern versehene Schieber aus Plexiglas dienten als Abdeckung. 22 cm 22 cm 5 cm 20 cm Um das Dosismaximum auf die Ebene der zu bestrahlenden Tiere einzustellen, wurde die Bestrahlungsbox auf einen 6 cm dicken Rückstreukörper aus Plexiglas gestellt. Über den Tieren verblieb ein Luftraum von 1 cm, der sich durch eine weitere 2,5 cm dicke Plexiglasplatte zur Strahlungsquelle hin abgrenzte. Dieser Plexiglas-Aufbau diente der Energiereduktion und ermöglichte die punktgenaue Bestrahlung der Tierebene. Der Abstand des Plexiglasaufbaus zur Strahlenquelle betrug 134 cm, der Abstand zur Tierebene 140 cm. Material und Methoden 75 24 Stunden nach erstmaliger Bestrahlung fand die Inokulation der Knochenmarkszellen unter Allgemeinanästhesie durch retrobulbäre Injektion statt (2-4 x 106 Zellen/Tier). Die Transplantation von Knochenmarkszellen der Wildtypmäuse (C57BL/6) dienten als Positivkontrolle. Um eine ausreichende Repopulation des Knochenmarks zu gewährleisten, wurde bis zum Versuchsbeginn eine Periode von mindestens 8 Wochen abgewartet, währenddessen die Tiere unter standardisierten Bedingungen gehalten wurden. Die Rekonstruktion des Knochenmarks wurde durch immunzytochemische Untersuchungen überwacht. Dass mehr als 80% des Knochenmarks nach 6 Wochen mit transplantierten Knochenmarkszellen rekonstruiert wird, konnte bereits in früheren Studien anhand von Markergenen nachgewiesen werden (Voswinkel et al. 2003; Ziegelhoeffer et al. 2004). 134 cm 1 cm 5 cm 6 cm 140 cm Plexiglas- Aufbau Bestrahlungsbox Rückstreukörper Tisch Abb. 3.2.2: Anordnung der Bestrahlungsbox im Strahlengang des Betatron. Neben einem Rückstreukörper und einer Bestrahlungsbox, die die Tiere beinhaltet, ist eine 2,5 cm dicke Plexiglasplatte als Vorlaufstrecke notwendig. Der Abstand der Tiere von der Strahlenquelle beträgt 140 cm. Ein Aufbau aus Plexiglas ermöglicht die punktgenaue Bestrahlung. 3.2.12.2 Gewinnung des Knochenmarks und Transplantation Nach zervikaler Dislokation wurde die Spendermaus auf dem Rücken liegend fixiert. Mit Hilfe einer Pinzette wurde eine Hautfalte der unteren Extremität gefasst und die Haut in Richtung auf das Becken abpräpariert: Tibia und Femur wurden vom umgebenden Muskelgewebe befreit und die Hinterextremität in der Beckensymphyse und kranial des Acetabulums abgesetzt. Unter Schonung der Femuren konnte nun die Tibia unterhalb des Kniegelenks durchtrennt werden. Zur vorübergehenden Lagerung wurde das Präparat in kaltem PBS auf Eis aufbewahrt. 76 Material und Methoden Jeder weitere Schritt erfolgte nun unter sterilen Bedingungen. Noch am Femur anhaftendes Muskelgewebe wurde vom Knochen abgetrennt und die Gelenke vorsichtig exartikuliert. Im Bereich des Caput femoris und des Trochanter major, sowie den distalen Kondylen wurde mit einem Skalpell, möglichst unter Schonung der Epiphysenfugen, der Markraum eröffnet. Die Femuren wurden mit je 1ml PBS (ohne Ca2+ und Mg2+) mittels Einmalspritzen und Injektionskanüle mehrfach von beiden Seiten durchspült, bis der Knochen weiß erschien. Es folgte eine Aufreinigung der Zellen über einen 40 µm Cell Strainer. Das Volumen der retrobulbären Injektion umfasste 100 µl/Maus, was durchschnittlich einer Zellzahl von 2-4 x 106 Zellen entsprach. Die Zellzahl wurde für jede Zellsuspension zytometrisch kontrolliert. (Mobest et al. 1999). Wildtyp C57BL/6 Psel-/Rosa26 VEGFR2+/- Abb. 3.2.3: Murines Knochenmarkstransplantationsmodell: Knochenmark aus den Femuren der Spendertiere (Psel-/-; ROSA26 oder VEGFR+/-) wird in letal bestrahlte Empfängertiere transplantiert. 3.2.13 Experimentelles Lungenmetastasenmodell Die Etablierung des metastasierenden Lungenmelanommodells erfolgte durch intravenöse Injektion von 3x105 vitale B16F10-Melanomzellen in die laterale Schwanzvene der Empfängertiere. Adhärente und in der Zellkultur bis zu 80% konfluierende B16Melanomzellen wurden nach dem Waschen in PBS (ohne Ca2+ und Mg2+) mit EDTA-Lösung (0,54 mmol EDTA/l, EDTA:Sigma, Deideshofen) von den Kulturflaschen abgelöst und in Zellmedium aufgenommen (siehe 3.2.7). Nach Zentrifugation (4°C, 1000 U/min, 10 min) und Dekantierung erfolgte die Resuspension der Melanomzellen in 2%-igem bovinem Kälberserum (2 ml/100ml, verdünnt mit PBS). Zur Elimination von Zellagglomerationen aus der Zellsuspension wurde diese mittels 40 µm Cell Strainer filtriert. Anschließend wurde die Gesamtzahl vitaler Zellen über eine Tryptanblau-Färbung bestimmt und die Zellkonzentration (vitale Zellen/ml) mit Hilfe eines Hämozytometers (Neubauer-Kammer) ermittelt Material und Methoden 77 (Gesamtzellzahl = 2,5 x gezählte Zellen x Verdünnung x 1000 x Volumen; >90% Vitalität). Um die Vitalität der Zellen zu gewährleisten, wurden unmittelbar nach der Vorbereitung je 100 µl der Zellsuspension (3x106 Melanomzellen/ml) in die laterale Schwanzvene der Empfängertiere injiziert, was einer Zellzahl von 3x105 Zellen/Tier entspricht. Zeitpunkt der Probennahme p.i. 3x105 Melanomzellen i.v. 11Tage 20Tage gesunde Lunge geringe Belastung Gruppe I mittlere Belastung Gruppe II hohe Belastung Gruppe III sehr hohe Belastung Gruppe IV Abb. 3.2.4: Murines Lungenmelanommodell. Die Injektion der Melanomzellen erfolgt intravenös in die laterale Schwanzvene. Je nach injizierter Zellzahl, beeinflussenden Faktoren und dem Zeitpunkt der Probengewinnung p.i.unterscheiden sich die Lungenoberflächen in Melanomzahl und Melanomgröße. Hier ein Vergleich einer gesunden Lunge mit verschiedenen Metastasierungsgraden. Durch die Transplantation P-Selektin-defizienten Knochenmarks in bestrahlte C57Bl/6Wildtypmäuse, konnte nach einer 8-wöchigen Repopulationsphase und intravenöser Inokulation von 3x105 B16-Melanomzellen 11 Tage p.i. der Melanomzellen die Ausbildung hämatogener B16-Melanommetstasen in der Lunge untersucht werden. Dies ermöglichte es einerseits den Einfluss der thrombozytäre P-Selektine darzustellen, andererseits ließ sich die Funktion der endothelialen P-Selektine durch den Einsatz von anti-P-Selektin-Antikörpern/ Heparin gezielt analysieren. Dreißig Minuten vor Inokulation der B16-Melanomzellen erfolgte eine einmalige intraperitoneale Injektion von Heparin-Natrium (12,5 I.E. oder 60 I.E.; Liquemin N, Hoffmann-La Roche AG, Grenzach-Whylen, Deutschland) oder P-Selektinblockierenden anti-Psel-Antikörpern (250 µg/Maus; +αCD62P, Klon RB40.34, BD). Zudem wurde Heparin alternativ erstmals 24 Stunden nach Melanomzellinokulation verabreicht und 78 Material und Methoden anschließend jeden zweiten Tag intraperitoneal injiziert. 11 Tage nach Versuchsbeginn wurden die Lungen der Tiere analysiert. Zum Nachweis zirkulierender hämatopoetischer VEGFR1+ und endothelialer VEGFR2+ im Blutgefäßsystem, wurden C57BL/6 elf Tage nach Etablierung des Lungenmelanommodells unter Allgemeinanästhesie (0,016 µg Xylazin/18 g Maus, Firma Medistar und 1,6 µg Ketamin/ 18 g Maus, Firma Intervet) retrobulbär mittels heparinisierter Pasteurpipetten entblutet. Anhand durchflusszytometrischer Analysen konnten VEGFR1+/VEGFR2+-Zellen im peripheren Blut und Knochenmark dargestellt werden. Inwieweit Knochenmarkszellen, bzw. Endothelvorläuferzellen in Melanommetastasen inkorporiert werden, ließ sich durch Inokulation der B16-Melanomzellen in C57BL/6-R oder C57BL/6-F (C57BL/6 nach Destruktion des Knochenmark und Repopulation mit Knochemark von Rosa26(R)-, bzw. VEGFR2+/--Knock-In(F)-Mäusen) nachweisen. Nach der Probengewinnung wurden die Lungen mit 0,5 ml Einfriermedium (Tissue Tek) transtracheal präpariert und in Einfriermedium eingebettet bei –80°C gelagert. Die immunhistochemischen Färbungen und LacZFärbungen erfolgten wie unter 3.2.14 beschrieben. Um zu untersuchen, inwieweit VEGFR1 und VEGFR2 die Entwicklung von Lungenmetastasen beeinflussen und ob sie bei der hämatogenen Metastaierung eine funktionelle Bedeutung besitzen, sollte im Metastasierungmodell des malignen Melanoms in Mäuselungen geprüft werden. Durch intravenöse Injektion von 3x105 B16-Melanomzellen in Black-nuMäuse (18-21 g, Charles River Deutschland) wurden zunächst Lungenmetastasen initiiert. Die intraperitoneale Applikation von neutralisierenden anti-VEGFR2-(DC101; ImClone Systems,Inc.; IgG1, 750 µg/ Maus alle 3 Tage) und/ oder anti-VEGFR1-(MF-1; IgG1 rat anti mouse, ImClone Sytems; 750 µg/ Maus alle 3 Tage) Antikörpern, bzw. Immunglobulinen der Ratte (Sigma-Aldrich, Schnelldorf, Deutschland; IgG aus Rattenserum, 1 mg/Maus alle 3 Tage als Kontrolle) erfolgte ertmals 48 Stunden nach Inokulation der Melanomzellen in die laterale Schwanzvene. Nach einem Zeitraum von 20 Tagen wurden die Tiere unter Allgemeinanästhesie (0,016 µg Xylazin/18 g Maus, Firma Medistar und 1,6 µg Ketamin/18 g Maus, Firma Intervet) entblutet. Nach Tötung der Tiere durch zervikale Dislokation, wurden 0,5 ml Einfriermedium (Tissue Tek) transtracheal in die Lunge instilliert, die Lungen präpariert und es wurden digitale Aufnahmen der Lungenoberfläche unter standardisierten Bedingungen mittels Digitalkamera angefertigt. Beide Lungenhälften wurden getrennt in Einfriermedium (Tissue Tek) eingebettet und bei –80°C konserviert. Die Oberflächenanalyse der metastatischen Areale erfolgte anhand standardisierter Fotografien unter Material und Methoden Verwendung von Java 79 Image J (v1.30). Weiterhin wurden die Lungen für immunhistochemische Untersuchungen herangezogen (siehe 3.2.14) Software, Auswertung und Dokumentation Die Metastasenanzahl der Lungenoberfläche wurde von zwei unabhängigen Untersuchern in einer Blindstudie erfasst. Die fotographische Dokumentation erfolgte mit digitalisierten und standardisierten Aufnahmen der dorsalen Lungenoberfläche. Zu diesem Zweck wurden die Lungen nach Präparation der Trachea in situ mit 0,5 ml Einfriermedium (Tissue Tek®) instilliert und mit der Dorsalfläche nach oben ausgebreitet. Es folgen repräsentative Aufnahmen, die am Computer mittels „Image J“- Softwareprogramm ausgewertet wurden. Zunächst konnte durch Kontrasterhöhung und Farbkonvertierung eine Schwarz-Weiß-Darstellung der Lungen erarbeitet werden. Anschließend wurde das Verhältnis der oberflächlichen Lungenmelanome (schwarz) zur Gesamtoberfläche ermittelt. 3.2.14 Immunhistochemische Analysen und LacZ-Färbung 3.2.14.1 Prinzip der Immunhistochemie Immunhistochemische Methoden ermöglichen den Nachweis von Proteinen mittels Antikörpern, die stabil und spezifisch an Antigene binden und somit als Sonden zur Identifizierung und Lokalisierung spezifischer Moleküle in Geweben eingesetzt werden. Sie erkennen Oberflächenepitope nativer Proteine im Gefrierschnitt. In den durchgeführten Studien wurde die indirekte Immunhistochemie mit Primärantikörpern („first Stepp“) und biotinylierten Sekundärantikörpern („second step") verwendet. Das Detektionssystem Streptavidin-Peroxidase bindet Biotin selektiv und spaltet 3-Amino-9-Ethylcarbazol (AEC) enzymatisch, so dass ein roter Farbstoff entsteht, der die Antikörperbindungen sichtbar macht (siehe Abb. 3.2.5). 80 Material und Methoden Primärantikörper binden an Epitope der Zelloberfläche biotinylierte SekundärAntikörper koppeln an die Fc-Region der Primärantikörper Streptavidin-Peroxidase bindet Biotin Farbreaktion mittels AEC-kit Abb.3.2.5. Prinzip der indirekten immunhistochemischen Färbung mit Streptavidin-Peroxidase und AEC als Detektorsystem. Die Inkubation mit spezifischen Primärantikörpern ermöglicht die Bindung dieser Antikörper an Strukturen der Zelloberfläche. Biotinylierte Sekundärantikörper binden die Fc-Region der Primärantikörper und verstärken das Signal. Zur Darstellung der Epitope wird das Enzym StreptavidinPeroxidase zugesetzt, das an Biotin bindet und AEC zu einem sichtbaren roten Farbstoff spaltet. 3.2.14.2 LacZ/CD11b-, LacZ/VEGFR2- und LacZ/Pecam-1 (CD31)-Doppelfärbungen: Ausgangsmaterial der Färbungen waren Gefrierschnitte von 8 µm Dicke, die nach dem Schneiden zunächst luftgetrocknet und anschließend 90 Sekunden in eiskaltem Aceton fixiert wurden. Nach wiederholter Lufttrocknung können die Objektträger bei –80°C gelagert werden. Für die immunhistochemischen Färbungen wurden die Schnitte bei Raumtemperatur aufgetaut (30-60 min), 10 min in eiskaltem Aceton fixiert und 25 min bei Raumtemperatur getrocknet. Um ein Vermischen von Inkubationslösungen zu vermeiden, wurden die Gewebeteile auf der Oberfläche des Objektträgers mit einem Fettstift eingekreist. Alle nachfolgenden Inkubationen erfolgten bei Raumtemperatur in einer feuchten Kammer. Material und Methoden 81 Nach fünfminütiger Inkubation in PBS-BSA (PBS mit bovinem Serumalbumin versetzt, 5 ml/ 100 ml PBS), inkubierten die Schnitte zur Blockierung unspezifischer Bindungen 15 min mit Ziegenserum, dem 5 ml Mausserum/ 100 ml zugesetzt wurde (NGS-MS, NGS:„normal goat serum“, MS: „mouse serum“, circa 200 µl pro Schnitt). Anschließend erfolgte direkt die Inkubation mit den Primärantikörpern anti-CD11b, anti-VEGFR2 oder anti-Pecam-1 über den Zeitraum von einer Stunde. Überschüssiges Reagenz wurde durch Waschen (1x5 min mit PBS-BSA und 1x5 min in PBS) entfernt. Die Fixierung der Antikörperbindung erfolgte mittels 1-2%-igem Paraformaldehyd in PBS. Anschließend wurde nochmals 2x5 min in PBS gewaschen, bevor die Schnitte in der LacZ-Färbelösung über Nacht im Dunkeln bei 30°C im Brutschrank inkubierten (Schlaeger et al. 1997). Um die überschüssige Färbelösung möglichst vollständig zu entfernen, wurden sie nach erfolgter Inkubation wiederum 3x5 min in PBS gewaschen. Erst dann konnte der biotinylierte Sekundärantikörper aufpipettiert (GAR-Biotin, Vectastain-Kit®: 9 ml PBS + 300 µl Mausserum + 1 Tropfen Antikörper) und für 1 Stunde bei Raumtemperatur inkubiert werden. Nach 30 min wurde der Streptavidin-PeroxidaseKomplex zur Darstellung des Sekundärantikörpers angesetzt (Vectastain-Kit®: 5 ml PBS + 2 Tropfen Reagenz A + 2 Tropfen Reagenz B), der nach dem Waschen (2x5 min mit PBS-BSA und 1x5 min mit PBS- Tween) aufgetragen wurde. Anschließend inkubierten die Schnitte 30 min bei Raum-temperatur. Mittels AEC-Substrat-Kit® (Vectastain AEC-kit, Kalifornien) wurde nach weiteren Waschgängen (2x5 min in PBS-BSA und 1x5 min in PBS-Tween) eine Farbreaktion hervorgerufen, die nach Erreichen der erwünschten Farbintensität durch doppelt destilliertes Wasser gestoppt wurde (Reaktionszeit bis zu 10 min). Nachfolgend war eine Kerngegenfärbung mit Hämalaun (30 Sekunden) notwendig, bevor die Gewebeschnitte mit dem wässrigem Einbettmedium Aquatex® (Merck) eingedeckt wurden. 3.2.14.3 CD45-Einzelfärbung Für die immunhistochemische Färbung wurden die Gefrierschnitte wiederum bei Raumtemperatur aufgetaut (30-60 min), 10 min bei -20°C in eiskaltem Aceton fixiert und 25 min bei Raumtemperatur getrocknet. Die Gewebeteile auf der Oberfläche des Objektträgers wurden mit einem Fettstift eingekreist und alle nachfolgenden Inkubationen erfolgten bei Raumtemperatur in einer feuchten Kammer. Nach fünfminütiger Inkubation in PBS mit 5%igem PBS-BSA, wurden die Schnitte zur Blockierung unspezifischer Bindungen 15 min mit NGS-MS und anschließend eine Stunde mit anti-CD45 (M1/9, Hybridomüberstand 1:2 verdünnt) inkubiert. Überschüssiges Reagenz wurde durch Waschen entfernt, der Sekundärantikörper aufpipettiert (GAR-Biotin, Vectastain-Kit®) und eine Stunde bei 82 Material und Methoden Raumtemperatur inkubiert. Nach dem Waschen wurde der Streptavidin-Peroxidase-Komplex aufpipettiert (Vectastain-Kit®). Anschließend inkubierten die Schnitte 30 min bei Raumtemperatur. Nach wiederholtem Waschen mit PBS-BSA und PBS-Tween erfolgte die Farbentwicklung mittels AEC-Substrat-Kit. Nach Erreichen der erwünschten Farbintensität wurde die Reaktion in doppelt destilliertem Wasser gestoppt (Reaktionszeit bis zu 10 min). Die Kerngegenfärbung mit Hämalaun dauerte eine Minute, bevor die Gewebeschnitte mit wässrigem Einbettmedium (Aquatex®, Firma Merck) eingedeckt werden konnte. 3.2.14.4 Auswertung und Dokumentation Die Auswertung der LacZ- und immunhistochemisch gefärbten Schnittpräparate erfolgte am Binokular-Lichtmikroskop Olympus BX50. Fotografien wurden mit einer Leica S1-Kamera angefertigt und in Adobe Photoshop Software 7.0 (Adobe Systems, Mountain View, Kalifornien) bearbeitet. Die Anzahl CD45+ Zellen in Lungenmetastasen (Tag 11 p.i.) wurden bei 200-facher Vergrößerung ausgezählt. Die Analyse erfolgte anhand repräsentativer HighPower-Fields vier verschiedener Lungenabschnitte (n=6, Mittelwerte ± Standardabweichung SE). 3.2.15 Durchflusszytometrie Die Charakterisierung VEGFR1+ hämatopoetischer und VEGFR2+ endothelialer Vorläuferzellen, sowie Thrombozyten mittels fluoreszenzmarkierten monoklonalen Antikörpern erfolgte durchflusszytometrisch am FACScaliburTM-Zytometer (FACS- fluorescence activated cell sorter; Becton Dickinson, MountainView, CA), das Zellen aufgrund ihrer Größe, Oberflächenstruktur und Fluoreszenzmarkierung unterscheidet. Um die einzelnen Zellpopulationen zu identifizieren werden Epitope von Zellen mittels monoklonalen Antikörpern in direkter oder indirekter Färbung mit Fluoreszenzfarbstoffen gekoppelt. Photomultiplier messen die Lichtstreuung als Maß für Zellgröße und Zellgranularität sowie die Emissionen der verschiedenen Fluoreszenzfarbstoffe. In den Untersuchungen wurden drei Farbstoffe mit unterschiedlichen Absorptions- und Emissionsmaxima verwendet: Fluoresceinisothiocyanat (FITC), Phycoerythrin (PE) und Allophycocyanin (APC). Material und Methoden Fluorochrom Fluoreszeinisothiozyanat* 83 Absorptionsmaxima [nm] 495 Emissionsmaxima [nm] 519 480; 565 578 PE 743 680 APC Phycoerythrin* Allophycocyanin Abkürzung FITC Tab. 3.4: Fluoreszeinfarbstoffe. Auswahl von Absorptions- und Emissionsmaxima der in der Durchflusszytometrie eingesetzten Fluoreszenzfarbstoffe. aus: *http://www.toxikologie.uni-mainz.de/facslab/zytometrie.jsp; http://www.drmr.com/abcon/APC.html 3.2.15.1 Direkte Färbung Die zu färbende Zellsuspension wird direkt mit Farbstoff-gekoppelten monoklonalen Antikörpern versetzt und über 30 min bei Raumtemperatur inkubiert (mAK 1:100 verdünnt). Während dieser Zeit binden die variablen Regionen der Antikörper an spezifische Epitope der Zelloberfläche. Später können Zellen anhand dieser Markierung über die verschiedenen Floureszenzfarbstoffe nachgewiesen werden. PE- gekoppelter mAK gegen Epitop 2 Epitop 2 Epitop 2 Zelle Zelle Epitop 1 Epitop 1 Spezifischer PE- konjugierter monoklonaler Antikörper Abb. 3.2.6. Schematische Abbildung der direkten Markierung von zellulären Oberflächenantigenen. Bei Zusatz eines spezifischen farbstoffgekoppelten monoklonalen Antikörpers besetzt dieser die entsprechenden Epitope. Voraussetzung für eine aussagekräftige Messung ist, dass er in ausreichender Menge vorliegt und unspezifische Bindungen weitmöglichst vermieden werden können (einhalten der Inkubationszeit, zügiges Arbeiten, Zusatz von anti-CD16/CD32). 3.2.15.2 Indirekte Färbung Während der ersten Inkubationszeit binden die variablen Regionen der Primärantikörper an spezifische Epitope der Zelloberfläche. Überschüssiges Reagenz wird in einem Waschschritt entfernt, um im Verlauf der zweiten Inkubation unspezifische Bindungen der Sekundärantikörper zu vermeiden. Die Sekundärantikörper sind Fluoreszenzfarbstoff- 84 Material und Methoden gekoppelt und reagieren spezifisch mit der Fc-Region der Primärantikörper. Später können Zellen anhand dieser Markierung über die verschiedenen Floureszenzfarbstoffe nachgewiesen werden. PrimärAK gegen Epitop 1 Epitop 2 Zelle Epitop 2 Zelle Spezifischer Primärantikörper Epitop 1 Epitop 1 Fc- Fragment- bindender PEkonjugierter Sekundärantikörper Abb. 3.2.7: Schematische Abbildung der indirekten Markierung von zellulären Oberflächenantigenen. Bei Zusatz eines spezifischen unkonjugierten monoklonalen Antikörpers besetzt dieser die entsprechenden Epitope. Farbstoffgekoppelte Sekundärantikörper markieren in einem zweiten Schritt die Primärantikörper. Voraussetzung für eine aussagekräftige Messung ist, dass die Antikörper in ausreichender Menge vorliegen und unspezifische Bindungen weitmöglichst vermieden werden (einhalten der Inkubationszeit, zügiges Arbeiten, Zusatz von anti-CD16/CD32). 3.2.15.3 Durchführung der Färbungen Hämatopoetische (HPC) und endotheliale (EPC) Stamm-/ Vorläuferzellen wurden aufgrund typischer Oberflächenmarker analysiert. Als EPCs gelten alle Zellen, die auf ihrer Zelloberfläche VEGFR2 und CD34 (Heeschen et al. 2003; Aicher et al. 2003) oder VEGFR2 und CD117 (c-kit) exprimieren und somit mit fluoreszenzmarkierten Antikörpern nachweisbar sind. Myeloide hämatopoetische Zellen sind VEGFR1 und CD11b oder VEGFR1 und CD117 positiv (Lyden et al. 2001; Rafii et al. 2002). Für die FACS-Analysen wurden peripheres Blut und Knochenmarkszellen herangezogen. Blut wurde mittels heparinisierter Pasteurpipetten aus dem retrobulbären Plexus gewonnen, Knochenmark konnte aus dem Markraum der Femuren herausgespült werden (siehe unter 3.2.12.2), wobei die Zellsuspension aus dem Knochenmark zunächst auf eine Konzentration von circa 2x106 Zellen/ml verdünnt wurde. Die Färbung des Vollbluts, bzw. des Knochenmarks erfolgte nach dem von Heeschen und Aicher et al. beschriebenen Protokoll (Heeschen et al. 2003; Aicher et al. 2003). Isotypkontrollen (Isotyp-FITC und Isotyp-PE, BD PharMingen; Isotyp-APC) waren notwendig, um eine spätere Ausgrenzung unspezifischer Material und Methoden 85 Bindungen zu gewährleisten. CD45-Einzelfärbungen dienten der Angleichung der Messungen an das Tagesprofil. V1. Analyse der P-Selektin- Expression: Nach Gewinnung des peripheren Blutes und Hemmung der Koagulation mittels Sodiumzitrat (in Natriumzitrat-beschichteten 3 ml Röhrchen (Sarstedt) wurden 5 µl in 50 µl PBS (mit Ca2+ und Mg2+) verdünnt. Die Thrombozyten wurden mit Epinephrin (Aventis) aktiviert und mit anti-CD41-PE (BD) und anti-CD62P-FITC (anti-PSelektin; BD)- Antikörpern versetzt. Nach Abschluß der 30-minütigen Inkubation bei Raumtemperatur unter Lichtausschluß, Erythrolyse (10 min Inkubation mit 1x Lysing Solution, BectonDickinson, MountainView, Kalifornien) und zweimaligem Waschen in PBS wurden je 10000 CD41+ Zellen im FACScalibur-Zytometer auf P-SelektinExpression hin untersucht (siehe Abb. 3.2.8). V2. Nachweis VEGFR2+ Endothelvorläuferzellen im peripheren Blut: 200 µl peripheres, heparinisiertes Vollblut wurde direkt mit monoklonalen antiVEGFR2-PE (BD, PharMingen) und anti-CD34-FITC (BD, Pharmingen) Antikörpern in einer Verdünnung von 1:100 versetzt. Nach Zusatz der monoklonalen Antikörper (mAK) wurden alle Ansätze gut gemischt und 30 min unter Lichtausschluß bei Raumtemperatur inkubiert. Zur Erythrolyse diente die anschließende Inkubation mit je 2 ml Lysing Solution (1 x, BectonDickinson, MountainView, Kalifornien), wobei die Reaktion nach 10 Minuten durch Zusatz von 2 ml PBS gestoppt wurde. Nach dem Waschen in PBS wurde der Überstand abgesaugt und nach wiederholtem Waschen in PBS und Fixierung in 1,5%-igem Formaldehyd/PBS für die FACS-Analysen verwendet. Pro Messung wurden 100000 Zellen auf VEGFR2+ Zellen untersucht. Vorwärts- und Seitwärtsscatter dienten zur Darstellung der Gesamtpopulation und Eingrenzung der Monozyten- und Lymphozytenpopulationen. Für die nachfolgenden Berechnungen wurden VEGFR2+ Zellen der monolymphozytären Zellfraktion herangezogen (siehe Abb. 3.2.8- 3.2.10). V3. Nachweis VEGFR1+ hämatopoetischer Vorläuferzellen im peripheren Blut: Das Vorgehen entsprach im weitesten Sinne der bereits beschriebenen Färbung V2. Allerdings erforderte der Versuchsansatz eine zweite Inkubationsperiode, da der antiVEGFR1-Antikörper (MF1) unkonjugiert vorlag. Zunächst wurden anti-VEGFR1 (MF1, IgG Kaninchen) und der direkt konjugierte anti-CD11b-APC Antikörper (Santa 86 Material und Methoden Cruz) in einer Verdünnung von 1:100 mit heparinisierten, peripheren Blut 30 Minuten inkubiert. Nach einem Waschschritt folgte der Zusatz des SAR(swine anti rabbit)FITC-Antikörpers. Anschließend inkubierte das Reaktionsgemisch wiederum 30 min bei Raumtemperatur. Jede weitere Behandlung entsprach V2. Die Datenanalyse wurde anhand der Monozyten-Lymphozyten-Fraktion von 100000 gezählten Zellen ermittelt (siehe Abb. 3.2.8-3.2.10). V4. Nachweis VEGFR1+ und VEGFR2+ Vorläuferzellen im Knochenmark: Die Zellsuspension aus dem Knochenmark (Zellsuspension aus der Spülung beider Femuren mit 2 ml PBS, 1:10 verdünnt; 200 µl pro Ansatz) wurde entsprechend V2/V3 gefärbt. Auf den Schritt der Erythrolyse wurde verzichtet. Anti-VEGFR2-PE und antiCD117-APC, bzw. anti-VEGFR2-PE, anti-VEGFR1 und nach einem Waschschritt SAR-FITC-Antikörper wurden in einer Verdünnung von 1:100 zugesetzt und die Ansätze gut gemischt. Nach einer 30minütigen Inkubationszeit bei Raumtemperatur unter Lichtausschluss, wurde die Zellsuspension mit PBS gewaschen und der Überstand abgesaugt. Nach wiederholtem Waschen in PBS konnten 300 µl der Zellsuspension für die Messung am Gerät verwendet werden. Pro Messung wurden 100000 Zellen gezählt. Vorwärts- und Seitwärtsscatter dienten zur Darstellung der Gesamtpopulation (siehe Abb. 3.2.11). 3.2.15.4 Auswertung und Dokumentation Die Datenanalyse erfolgte mit BD FACScaliburTM Cytometer (Becton Dickinson, Mountain View,CA), ausgestattet mit CellQuestTMSoftware (BD Biosciences, Heidelberg, Deutschland). Anhand von Doppelfärbungen mit Fluoreszenzfarbstoff-gekoppelten monoklonalen Antikörpern, die eine Markierung der Blutzellen ermöglichen, lassen sich die beschriebenen Zellpopulationen charakterisieren. Die Auswertung erfolgte als zweidimensionale Darstellung, aufgeschlüsselt nach zwei Fluoreszenzfarbstoffen (siehe Abb. 3.2.8-3.2.11). Jeweils eine Fluoreszenz wird an der x- bzw. y-Achse angelegt. Ein Gitterkreuz teilt das Quadrat in vier Bereiche, wobei die Quadranten anhand der Isotypkontrollen (doppelt negativ) ausgerichtet werden. Das Punktdiagramm zeigt im unteren rechten und oberen linken Quadranten alle einfach positiven Zellen, während der obere rechte Quadrant die doppelt positiven Zellen darstellt. -/- +/- CD41-PE +/+ 87 CD41-PE -/+ CD41-PE Farbe 2 Material und Methoden B A P-Selektin-FITC Farbe 1 P-Selektin-FITC Abb. 3.2.8. Darstellung doppelt positiver Zellen am Beispiel der P-Selektin-Expression aktivierter (A) und ruhender (B) Thrombozyten. 3 1 SSC- Seitwärtssctter Monozyten- Lymphozyten-Gate (1, grün) Zelldebris (2, rot) Granulozyten (3, violett) SSC SSC 2 FSC FSC Abb. 3.2.9: Darstellung der Zellpopulationen im peripheren Blut. Die zweidimensionale Darstellung und Charakterisierung der im FACS analysierten Blutzellen anhand von Vorwärts- und Seitwärtsscatter ermöglicht die Auftrennung nach Zellgröße und Granularität. Zu unterscheiden sind Granulozyten (3), Monozyten und Lymphozyten (1). Pro Ansatz wurden 100000 Zellen gezählt. Vorwärts- und Seitwärtsscatter (FSC/SSC) dienten der Darstellung der Gesamtzellpopulation und ermöglichen die Fokussierung auf den Zellpool der Monozyten und Lymphozyten (1). A FL1-H: CD34-FITC FL2-H: VEGFR2-PE B FL3-H: CD45-APC C FL1-H: VEGFR1-FITC FL4-H: CD11b-APC Abb. 3.2.10: Beispiele der zweidimensionalen Darstellungen der Kontrollfärbung (B) und der gewonnen Daten (A,C) im Punktdiagramm (FACS-Analysen peripheres Blut). A: Zweidimensionale Darstellung CD34 und/ oder VEGFR2-markierter Blutzellen. Der Hauptteil monolymphozytärer Zellen ist für CD34 und VEGFR2 doppelt negativ (linker unterer Quadrant). CD34VEGFR2+ Zellen werden im linken oberen Quadranten dargestellt, CD34+VEGFR2+ Zellen finden sich im oberen rechten Quadranten. Die Ausrichtung der Gitterlinien erfolgt anhand der Isotypkontrollen. B: Zweidimensionale Darstellung CD45+ markierter Blutzellen (dient der Einstellung des Tagesprofils). Die Ausrichtung der Gitterlinien erfolgt anhand der Isotypkontrollen. C: Zweidimensionale Darstellung VEGFR1/SAR-FITC und/oder CD11b-APC markierter Blutzellen. Der Hauptteil der monolymphozytären Zellen ist doppelt negativ (linker unterer Quadrant). CD11b+VEGFR1+ Zellen werden im rechten oberen Quadranten dargestellt. Die Ausrichtung des Gitters erfolgt anhand der Isotypkontrollen. 88 Material und Methoden A B C FL2-H: VEGFR2-PE FL4-H: CD11b-APC FL1-H: VEGFR1/SAR-FITC FL4-H: CD117-APC Abb. 3.2.11: FACS-Auswertung der Knochenmarkszellen. Die zweidimensionale Darstellung und Charakterisierung der im FACS analysierten Knochenmarkszellen anhand von Vorwärts- und Seitwärtsscatter (A). (B) Beispiel einer zweidimensionalen Darstellung CD11b-APC und VEGFR2-PE, (B) Beispiel einer zweidimensionalen Darstellung von CD117-APC und VEGFR1-SAR-FITC. Zellen im rechten oberen Quadranten sind doppelt positiv. FACS-Analysen des peripheren Blutes und Knochenmarks werden 11 Tage nach Inokulation der Melanomzellen durchgeführt und die gewonnenen Daten mit Kontrolltieren verglichen. Alle prozentualen Angaben wurden mit dem Software-Programm „Cell Quest Pro“ (Becton Dickinson) ermittelt. 3.2.15.5 Statistische Auswertung Die statistische Auswertung der Gruppen erfolgte mit einem zweiseitigen Student´schen tTest oder Wilcoxon Test für zwei unabhängige Stichproben. Signifikanz wurde ab einem Wert von p < 0,05 angenommen. _________________________________________________________________________89 3.3 Ergebnisse 3.3.1 Bedeutung der P-Selektin-Expression für die Ausbildung von hämatogenen Melanommetastasen der Lunge 3.3.1.1 Transplantation von P-Selektin-defizientem Knochenmark hemmt die Ausbildung von B16F10-Melanommetastasen in der Lunge Um zu ermitteln, ob P-Selektine für die Etablierung syngener B16F10-Lungenmetastasen von funktioneller Bedeutung ist, wurde die Ausbildung experimenteller Lungenmetastasen in PSelektin-defizienten Mäusen und Wildtyp-Kontrollen (Abb.3.3.1 A) miteinander verglichen. Es stellte sich heraus, dass die Metastasenanzahl auf der Lungenoberfläche P-Selektindefizienter (P-Sel-/-) Mäuse signifikant geringer war als jene der Wildtyp (WT)-Kontrolltiere (Median: 46, gegenüber 246 bei den Kontrolltieren). Um die funktionelle Bedeutung der P-Selektin-Expression durch Endothelzellen weiter zu analysieren, wurde zunächst der Einfluss des selektiven thrombozytären P-Selektin-Mangels auf die experimentelle Lungenmetastasierung untersucht. Zu diesem Zweck wurden C57BL/6 Wildtyp (WT)-Mäuse nach Destruktion der Knochenmarkszellen durch β-Strahlung mit Knochenmark von P-Selektin-defizienten Tieren (P-Sel-/--KMT) bzw. mit Knochenmark von WT-Tieren (WT-KMT) rekonstituiert (Abb. 3.3.1 A und C). Die Analysen der etablierten Lungenkolonien 11 Tage nach Melanomzell-Inokulation wiesen eine signifikante Reduktion metastatischer Foci bei Tieren auf, denen Knochenmark von P-Selektin-defizienten Mäusen transplantiert worden war (Median: 138, gegenüber 228 in WT-Kontrollen). Allerdings war das Ausmaß der Metastasen-Hemmung in Mäusen, denen thrombozytäres PSelektin aufgrund der Rekonstitution mit P-Selektin-defizientem Knochenmark fehlt (P-Sel-/KMT), geringer als jenes in P-Selektin-defizienten Mäusen selbst (Abb. 3.3.1 A und B). In diesen Mäusen, denen thrombozytäres, nicht jedoch endotheliales P-Selektin fehlt, kann durch die Gabe von anti-Psel-Antikörper die Metastasenbildung noch weiter reduziert werden (Abb. 3.3.1 C). Es konnte somit gezeigt werden, dass nicht nur thromozytäre, sondern auch endotheliale PSelektine eine funktionelle Bedeutung im Rahmen der hämatogenen Metastasierung besitzen. Um zu klären, in welchen Phasen des Metastasierungsprozesses P-Selektine beteiligt sind, sollte im Folgenden Heparin als P-Selektin-blockierender Faktor eingesetzt werden. 90 Ergebnisse P = 0.0012 A P < 0.0001 B P = 0.0059 350 Lungenkolonien 300 250 200 150 100 50 0 wt P-sel -/- n=12 n=10 wt KMT n=12 P-sel -/KMT n=12 Abb. 3.3.1 A und B: Bedeutung der mangelnden P-Selektin-Expression auf experimentell induzierten B16F10 Lungen-Melanommetastasen. (A) Metastatische Kolonien an der Lungenoberfläche 11 Tage nach i.v. Inokulation mit syngenen B16F10 Melanomzellen in C57BL/6-Wildtyp-Mäusen (WT) und in P-Selektindefizienten Mäusen (P-Sel-/-) mit C57BL/6 Hintergrund. (B) Lungenkolonien 11 Tage nach i.v. Inokulation von B16F10-Melanomzellen in C57BL/6-Mäusen, die mit Knochenmark von wt-Tieren (WT-KMT) oder P-sel-/-Mäusen (P-sel-/--KMT) rekonstituiert worden waren. Pro Versuchsansatz wurden 10-12 Tiere untersucht, wobei Mäuse zweier Knochenmarkstransplantationen verwendet wurden. Für die statistischen Analysen wurde der Wilcoxon Test für zwei unabhängige Stichproben herangezogen. P-Werte für paarweise multiple Vergleiche wurden nach Bonferroni angeglichen (P-Werte multipliziert mit der Anzahl der Vergleiche); mehrfache Signifikanz wurde für angeglichene P-Werte >0,05 angenommen. Die Grundlage der Datenbeschreibung basiert auf Medianen und Quartilen (graphisch als nichtparametrische Box Plots dargestellt). Ergebnisse 91 C P = 0.0009 350 Lungenkolonien 300 250 P = 0.0003 200 150 100 50 0 n=8 wt P-sel -/- P-sel -/- KMT KMT + α Iso KMT + α CD62P n=8 n=8 Abb. 3.3.1 C: Bedeutung der mangelnden P-Selektin-Expression auf experimentell induzierte B16F10Lungen-Melanommetastasen. Lungenkolonien 11 Tage nach i.v. Inokulation mit B16F10-Melanomzellen in C57BL/6-Mäusen, die mit Knochenmark von WT-Tieren (WT-KMT) oder P-sel-/--Mäusen (P-sel-/--KMT) rekonstituiert wurde. Die P-sel-/--KMT Tiere waren vor Inokulation mit einem Isotyp-Kontroll-Antikörper (αIso; Klon R3-34, BD Biosciences, je 250 µg/Maus) oder mit einem P-Selektin-blockierenden Antikörper (αCD62; Klon RB40.34, BD Biosciences; je 250 µg/Maus) behandelt worden. Pro Versuchsansatz wurden 8 Tiere untersucht und Mäuse aus zwei verschiedenen Knochenmarkstransplantationen verwendet. Für die statistischen Analysen wurde der Wilcoxon Test für zwei unabhängige Stichproben herangezogen. P-Werte für paarweise multiple Vergleiche wurden nach Bonferroni angeglichen (P-Werte multipliziert mit der Anzahl der Vergleiche); mehrfache Signifikanz wurde für angeglichene P-Werte >0,05 angenommen. Die Grundlage der Datenbeschreibung basiert auf Medianen und Quartilen (graphisch als nichtparametrische Box Plots dargestellt). 92 Ergebnisse DA Ruhend Aktiviert 0.6 29.0 Thrombozyten (CD41) Wildtyp wild-type KMT Mäuse KMT Mäuse 0.2 0.1 Psel-/-―/― P-seMäuse l KMT KMT Mäuse P-Selektin (CD62P) EB P-Selektin Expression von Plättchen(%) Ruhende Plättchen Aktivierte Plättchen wild-type KMT 1.0 ± 0.5 26.8 ± 2.6 −/− 0.3 ± 0.1 2.1 ± 1.1 1.1 ± 0.2 33.2 ± 4.0 1.1 ± 0.5 2.5 ± 1.1 P-sel KMT wild-type −/− P-sel Abb. 3.3.2: Repräsentative FACS-Analysen zur Darstellung thrombozytären P-Selektins vor und nach erfolgter Plättchenaktivierung. Es wurde peripheres Blut von Mäusen untersucht, denen entweder Knochenmark P-Selektin defizienter Mäuse (Psel-/-KMT) oder Knochenmark von Wildtyp-Mäusen (WT-KMT) transplantiert wurde. Die Expression des Thrombozytenmarkers CD41 ermöglicht die Identifizierung der Blutplättchen. Nach Aktivierung mit Epinephrin exprimieren ca. ¼ aller Thrombozyten von WT- KMT PSelektin; in Psel-/-KMT-Mäusen ist die basale und aktivierbare P-Selektin-Expression auf Expressionslevel reduziert, die denen von P-Selektin-defizienten Mäusen entsprechen. (B) Zusammenfassung der Analysen von Blutproben von 5-6 Mäusen/experimenteller Bedingung (Mittelwert ± Standardfehler, S.E.). Ergebnisse 3.3.1.2 93 Heparin hemmt die Etablierung, nicht jedoch die Aufrechterhaltung und das Wachstum von experimentell induzierter Melanommetastasen Zur Klärung der Fragestellung, ob Heparin als wirksamer P-Selektin-Inhibitor nicht nur die Etablierung von hämatogenen Metastasen, sondern auch das nachfolgende Wachstum experimentell induzierter Melanommetastasen beeinflusst, wurde Heparin sowohl vor als auch nach Inokulation der B16-Melanomzellen appliziert und dessen Auswirkungen auf die Ausbildung von Lungenmetastasen untersucht. Die Ausbildung von Melanom-Lungenmetastasen konnte dosisabhängig supprimiert werden (Abb. 3.3.3). Eine signifikante Reduktion fand sich bereits bei einer Dosis von 12,5 I.E. Heparin, während die hemmenden Effekte durch eine höhere Dosis von 60 I.E. noch gesteigert werden konnten. Um zu klären, ob Heparin nicht nur im Rahmen der Zelladhäsion, sondern zusätzlich auch in der Phase der Aufrechterhaltung und des Wachstums von Lungenkolonien nach Melanomzell-Inokulation wirksame therapeutische Effekte entfaltet, wurde die Ausbildung von Lungenmetastasen in Mäusen untersucht, die vor und nach bzw. nur nach Inokulation mit Heparin behandelt wurden. Die Heparininjektion 24 h post injectionem (p.i.) zeigte keine signifikante Unterdrückung der hämatogenen Metastasierung und des Metastasenwachstums (Abb. 3.3.3). Auch eine intermittierende Applikation von Heparin im Abstand von zwei Tagen nach Tumorzell-Inokulation führte zu keinem additiven oder synergistischen antimetastatischen Effekt. Die gewonnenen Daten stützen die Annahme, dass Heparin seine Wirkung im Verlauf der Adhäsions-Migrationsphase entfaltet, während das Metastasenwachstum nicht beeinflusst wird. 94 Ergebnisse P = 0.0043 P = 0.0259 350 P = 0.0007 Lungenkolonien 300 250 200 150 100 50 0 NaCl prae inj. post inj. Heparin prae inj. post inj. A A B + + + C E + 12.5 C F + 12.5 B D + 12.5 60 60 12.5 D E F Abb. 3.3.3: Effekte verschiedener Heparin-Behandlungsschemata auf die Entstehung und Entwicklung experimenteller Lungenmetastasen des B16-Melanoms. Metastasen 11 Tage nach Inokulation der B16F10- Melanomzellen in C57Bl/6-Wildtypmäuse. Gruppe A diente als Kontrollgruppe; Tieren der Gruppe B wurden 12,5 I.E. Heparin im Abstand von 48 Stunden verabreicht ( Tag 1, 3, 5, 7 und 9); Tiere der Gruppe C erhielten initial vor Inokulation der Melanomzellen 12,5 I.E. Heparin; Gruppe D wurde vor Inokulation der Melanomzellen 12,5 I.E. Heparin verabreicht, dann im Abstand von 48 h entsprechend; Gruppe F entspricht dem Behandlungsprotokoll der Gruppe B mit einer Dosis von je 60 I.E. Heparin; Gruppe F wurden einmalig 60 I.E. vor Injektion der Melanomzellen verabreicht. 0,9%ige NaCl- Lösung dient als Kontrolle. Jede Gruppe umfasste 6-9 Tiere. Zur statistischen Auswertung wurde der Wilcoxon-Test zweier unabhängiger Stichproben herangezogen, wobei Signifikanz ab einem P-Wert von <0,05 angenommen wurde. Die Daten beruhen auf der Verwendung von Mittelwerten und Quartilen (graphisch in nichtparametrischen Boxplots dargestellt). Ergebnisse 3.3.2 95 Bedeutung des VEGFR1 und VEGFR2 für die Ausbildung von hämatogenen Lungen-Melanommetastasen 3.3.2.1 Mobilisierung von VEGFR1+ und VEGFR2+ Populationen in das periphere Blut infolge der Etablierung von Melanommetastasen Inwieweit die Etablierung von B16F10-Melanommetastasen der Lunge zur Mobilisierung hämatopoetischer oder endothelialer Vorläuferzellen führt, sollte durch Analysen des Knochenmarks und peripheren Blutes bezüglich definierter Vorläuferzell-Populationen geklärt werden. Als Ausgangsorganismus dienten C57BL/6-Mäuse mit Lungenmetastasen (MM) 11 Tage p.i., die mit gesunden Kontrolltieren (Ctrl.) verglichen wurden (Abb. 3.3.4). In den durchgeführten FACS-Analysen zeigte sich ein Anstieg VEGFR2+CD34+ endothelialer Vorläuferzellen („endothelial progenitor cells“, EPCs) im peripheren Blut Metastasentragender Mäuse. In vergleichbarer Weise konnte im peripheren Blut tumorbelasteter Tiere ein signifikant höherer Anteil VEGFR1+CD11b+ myeloischer hämatopoetischer Zellen nachgewiesen werden. Ein Anstieg endothelialer Vorläuferzellen im peripheren Blut fand sich auch nach Etablierung von B10F16-Leber-Metastasen. Der Anstieg endothelialer und hämatopoetischer Vorläuferpopulationen in Tieren mit Melanommetastasen war jedoch nicht mit einer Erhöhung der Monozyten-, bzw. Leukozyten-Fraktion im peripheren Blut assoziiert. Um zu überprüfen, ob die Mobilisierung von Vorläuferpopulationen in das periphere Blut nach Ausbildung von Lungenmetastasen mit entsprechenden Veränderungen in der quantitativen Zusammensetzung von Stamm- und Vorläuferpopulationen des Knochenmarks vergesellschaftet ist, wurde zusätzlich die Anzahl VEGFR1+ CD117+ hämatopoetischer und VEGFR2+ CD117+ endothelialer Stammzellen bzw. der Anteil VEGFR1+ CD11b+ hämatopoetischer und VEGFR2+ CD34+ endothelialer Vorläuferzellen im Knochenmark von melanombelasteten und gesunden Tieren untersucht. Die Ergebnisse dieser Knochenmarksanalysen zeigten eine Zunahme beider VEGFR1+ hämatopoetischen Subpopulationen in erkrankten Tieren. Bei den VEGFR2+ CD117+ endothelialen Knochenmarkszellen und VEGFR2+ CD34+ EPCs fand sich ein Trend hinsichtlich einer erhöhten Anzahl im Knochenmark, bzw. peripheren Blut in melanombelasteten Tieren gegenüber den entsprechenden Kontrolltieren (Abb. 3.3.4 G). Zusammengefaßt lassen diese Daten vermuten, dass nicht nur Lokaltumoren sondern auch die Etablierung experimenteller Lungen-Melanommetastasen eine Zunahme von VEGFR1+ und VEGFR2+ Vorläuferzellen im Knochenmark zu induzieren vermag und die Mobilisierung in 96 Ergebnisse das periphere Blut bedingt. Es stellt sich im Folgenden die Frage, ob jene VEGFR+-Zellen tatsächlich aus dem Knochenmark mobilisiert werden oder von Zellen aus der Umgebung abstammen. Weiterhin soll in weiteren Untersuchungen geklärt werden, ob Zellen aus dem Knochenmark in Melanommetastasen integriert werden. A Peripheres Blut B 0,08 VEGFR1/SAR- FITC CD34- FITC 0,04 C CD11- APC VEGFR2- PE D Knochenmark E CD117- APC 0,14 VEGFR1/SAR -FITC VEGFR1/SAR - FITC 0,14 F CD11b- APC Abb.3.3.2 (1): Effekte experimenteller Melanommetastasen der Lungen auf die Proliferation und Mobilisierung von Stamm- und Progenitorzellen. (A) Fokussierung der FACS-Analysen auf die monolymphozytäre Zellfraktion des peripheren Blutes, sowie Ausschluss von Zelldebris, Thrombozyten und Granulozyten. (B) Repräsentative zweidimensionale Darstellung CD34/VEGFR2-markierter monolymphozytärer Zellen. Endotheliale Vorläuferzellen (EPCs), exprimieren CD34 und VEGFR2 auf der Oberfläche. (C) Darstellung myeloider hämatopoetischer Zellen in einer repräsentativen FACS-Analyse. Charakterisiert wird diese Zellpopulation durch die Koexpression von VEGFR1 und CD11b. (D) Fokussierung der Messung von Knochenmarkszellen unter Ausschluß von Zelldebris. (E) Repräsentative FACS- Analyse VEGFR1+ CD117+ und (F) VEGFR1+CD11b+ Knochenmarkszellen. + 0,05 0,04 + 0,03 0,02 0,01 EH n=10, P=0.0367 0,09 Peripheres Blut n=12, P=0.0115 + + D G VEGFR1 CD11b Zellen (%) 97 VEGFR2 CD34 Zellen (%) Ergebnisse 0,08 0,07 0,06 0,05 0,04 0,03 0,02 0,01 0,00 n=8, P=0.0545,n.s. 0,35 + 0,30 0,25 + + + 0,20 0,15 0,10 0,05 Ctrl. n=8, P=0.0091 0,16 0,14 0,12 0,10 0,08 0,06 0,04 0,00 MM IL n=9, P=0.0089 0,16 0,14 + 0,12 0,10 Ctrl. MM n=9, P=0.0028 0,16 0,14 0,12 0,10 0,08 + 0,08 + + VEGFR2 CD34 Zellen (%) K H MM 0,02 VEGFR1 CD11b Zellen (%) 0,00 GJ Ctrl. Knochenmark MM VEGFR1 2 CD117 Zellen (%) FI Ctrl. + VEGFR2 CD117 Zellen (%) 0,00 0,06 0,04 0,02 0,00 Ctrl. MM 0,06 0,04 0,02 0,00 Ctrl. MM Abb.3.3.2 (2): Effekte experimenteller Melanommetastasen der Lungen auf die Proliferation und Mobilisierung von Stamm- und Progenitorzellen. (G) Prozentualer Bestandteil VEGFR2+ CD34+ EPCs und (H) VEGFR1+ CD11b+ myeloider hämatopoetischer Zellen im peripheren Blut der C57Bl/6-MM (MM, graue Balken, 11 Tage p.i.) im Vergleich zu gesunden Kontrolltieren (C57Bl/6; Ctrl, weiße Balken). (I) Verhältnis VEGFR2+ CD117+ EPCs und (J) VEGFR1+ CD11b+ hämatopoetischer Zellen, (K) VEGFR2+ CD34+ EPCs, und (L) VEGFR1+ CD11b+ hämatopoetischer Zellen im Knochenmark der C57Bl/6-MM (MM, graue Balken) und gesunder Kontrollen (Ctrl., weiße Balken). Die Daten wurden als Mittelwerte mit Standardabweichung dargestellt. 98 3.3.2.2 Ergebnisse Inkorporierung von myelomonozytären und megakaryozytären Zellen aus dem Knochenmark in B16-Melanommetastasen der Lunge Um zu klären ob speziell aus dem Knochenmark mobilisierte hämatopoetische oder endotheliale Vorläuferzellen in der Lage sind, in Melanommetastasen einzuwandern, wurde ein Knochenmark-Transplanationsmodell verwendet, das es ermöglicht, über die Darstellung eines Markergens (LacZ) die Herkunft von Zellen aus dem Knochenmark abzuleiten. Zu diesem Zweck erfolgte die Rekonstruktion des durch β-Strahlung zerstörten Knochenmarks (C57BL/6) mit Knochenmarkszellen von LacZ-überexprimierenden BL/6-Rosa26-Tieren. Zellen, die nachfolgend aus dem Knochenmark mobilisiert wurden, konnten somit über ihre LacZ-Expression nachgewiesen werden. Die mit LacZ-überexprimierenden Knochenmarkszellen rekonstruierten Tiere wurden circa acht Wochen nach der Transplantation mit Melanomzellen inokuliert. Elf Tage p.i. wurden die Lungen gewonnen und auf LacZexprimierende Zellen überprüft. Mittels kombinierter LacZ-Färbungen und immunhistochemischen Untersuchungen konnten inkorporierte LacZ+Zellen in Lungenmetastasen dargestellt werden, die überwiegend einen mononukleären Phänotyp aufwiesen und gleichzeitig myelomonozytäre Markerproteine exprimierten (z.B. CD45, CD11b, Abb. 3.3.5 A). Eine Assoziation LacZ+ Zellen mit Gefäßstrukturen ließ sich nicht nachweisen (Abb.3.3.5 B; Darstellung der Endothelzellen mittels Pecam-1/CD31 Färbung). Die Vermutung, dass VEGFR2+ endotheliale Vorläuferzellen nicht in Gefäße proliferierender Metastasen rekrutiert werden, konnte mit Hilfe eines weiteren Knochenmark-Transplanationsmodells gestützt werden, in dem Wildtyp-Mäuse mit Knochenmarkzellen rekonstituiert wurden, die das LacZ-Markergen unter der endothelzellspezifischen Kontrolle des VEGFR2-Promotor exprimieren (siehe 2.2.12). Untersuchungen von Lungenmetastasen dieser Mäuse zeigten ebenfalls keine Gefäß-assoziierten LacZ+ Zellen, obwohl Endothelzellen in Melanommetastasen VEGFR2 exprimieren (VEGFR2 Doppel-/ Einzelfärbungen, Abb. 3.3.5 C). Allerdings waren LacZ+ Zellen gehäuft in metastasenassoziierten Fibringerinnseln und Thromben nachweisbar (Abb. 3.3.5 B). Diese Befunde zeigen, dass Zellen der myelomonozytären Reihe aus dem Knochenmark in Melanommetastasen der Lunge integriert werden. VEGFR2+ Endothelvorläuferzellen und VEGFR1+ Vorläuferzellen hatten in diesem Zusammenhang keine Bedeutung. Aufgrund vorausgegangener Studien, die die Inkorporation VEGFR1+ und VEGFR2+ Vorläuferzellen in Tumore und die Beteiligung von VEGF und seinen Rezeptoren bestätigten, stellte sich die Frage, ob der Prozess der Metastasierung überhaupt VEGF-Rezeptor-abhängig ist. Ergebnisse 99 Bl/6 Rosa26 LacZ Knochenmark L/6 Rosa26 LacZ Knochenmark ↓ Letal bestrahlte Letal bestrahlte C57Bl/6 Wildtyp BL/6 WT A B C D Bl/6 VEGFR2 LacZ Knochenmark L/6 VEGFR2 LacZ Knochenmark ↓ Letalbestrahlte bestrahlte Letal C57Bl/6 Wildtyp BL/6 WT Abb.3.3.5: Nachweis Knochenmark-abstammender myelomonozytärer und megakaryozytärer Zellen in experimentellen Lungen-Melanommetastasen. C57BL/6 Wildtyp-Mäuse wurden nach letaler Bestrahlung mit Knochenmarkszellen von LacZ überexprimierenden Mäusen BL/6 Rosa26 LacZ; A und B) bzw. mit Knochenmarkszellen rekonstituiert, die LacZ unter Kontrolle des VEGFR2-Promotors exprimieren (BL/6 VEGFR2 LacZ). Mäuse von mindestens zwei Transplantationsserien wurden in den Analysen verwendet. Die LacZ-Färbung und Immunhistochemie wurde anhand serieller Gefrierschnitte der Lungen durchgeführt. (A) LacZ-CD11b-Doppelfärbung. Histochemische Färbungen 11 Tage alter Lungenmelanommetastasen mit Darstellung der LacZ(türkis)- und CD11b(rot)-Expression. (B) LacZ-PECAM-1-Doppelfärbung. Histochemische Analysen 11 Tage alter Lungenmetastasen zeigten intravasale LacZ- Positivität in tumor-assoziierten Fibringerinnseln und Thromben. (C) LacZ-VEGFR2-Doppelfärbung. Histochemische VEGFR2-Analysen (rot) 11 Tage alter Lungenmetastasen in Kombination mit einer LacZ- Färbung (türkis) zeigten, dass keine Inkorporation LacZ+ Zellen in Gefäße oder gefäßartige Strukturen erfolgte; Maßstabsleiste, 25 µm. (D) VEGFR2-Einzelfärbung. Histochemische VEGFR2-Analysen (rot) 11 Tage alter Lungenmetastasen zeigten, dass VEGFR2 in Lungenmetastasen exprimiert wird. Es konnten VEGFR2+ Zellstränge nachgewiesen werden. Maßstabsleiste entspricht C. 100 3.3.3 Ergebnisse Die kombinierte Hemmung von VEGFR1 und VEGFR2 unterdrückt die Melanommetastasierung in die Lunge Der Fragestellung, ob durch Blockade der VEGF-Rezeptoren VEGFR1 und VEGFR2 mittels Antikörpern (anti-VEGFR1; Klon MF-1; ImClone Systems Inc.; anti-VEGFR2; Klon DC101; ImClone Systems Inc.) die Ausbildung von experimentellen Lungenmetastasen therapeutisch beeinflusst werden kann, wurde über ein Metastasierungsmodell des malignen Melanoms nachgegangen. Als Parameter für die Beurteilung des Ausmaßes der Metastasierung wurde die betroffene Fläche metastatischer Foci im Bereich der Lungenoberfläche an Tag 20 p.i. gewählt. Über einen Zeitraum von 20 Tagen erfolgte nach Inokulation der Melanomzellen die intraperitoneale Applikation von anti-VEGFR1 und/oder anti-VEGFR2-Antikörper bzw. Immunglobulinen der Ratte als Kontrollbehandlung (jeden dritten Tag jeweils in einer Dosis von 750 µg pro Tag und Tier; zwei unabhängige Versuchsansätze mit jeweils 5 Tieren pro Gruppe). Die erste Injektion erhielten die Tiere am dritten Tag nach Inokulation der Melanomzellen. Die Injektion von anti-VEGFR1-Antikörper allein führte nur zu einer moderaten, nichtsignifikanten Reduktion metastatischer Foci auf der Lungenoberfläche (Abb. 3.3.7 und Abb. 3.3.8). Vergleichbare Ergebnisse zeigten sich auch nach alleiniger Gabe von antiVEGFR2-Antikörpern. Demgegenüber konnte jedoch durch die gleichzeitige Anwendung beider Antikörper eine starke Reduktion bei der Ausbildung von B16F10-Lungenmetastasen erzielt werden (Abb. 3.3.7 und Abb. 3.3.8). Unter der Annahme, dass die anti-VEGFR-Antikörper-vermittelten Effekte auf zellulären Veränderungen beruhen, wurden Lungenmetastasen von Tieren der verschiedenen Behandlungsbedingungen mit Leukozyten-spezifischen Antikörpern gefärbt und analysiert (Abb. 3.3.7). Die histochemischen Analysen der Tag 20-Metastasen ließen beim Einsatz des anti-VEGFR1 geringere Mengen CD45+ Zellen in Lungenmelanomen erkennen als in den anderen Behandlungsgruppen. Obwohl die Auswertung aufgrund der limitierten Anzahl der Lungenmetastasen in Mäusen, die gleichzeitig mit VEGFR1- und VEGFR2-Antikörpern behandelt wurden, erschwert war, führte die zusätzliche Gabe von VEGFR2-Antikörpern in den durchgeführten histochemischen Untersuchungen scheinbar zu keiner weiteren Reduktion des CD45+ Zellinfiltrates (Abb. 3.3.7). Ergebnisse 101 Metastatische Foci (betroffene Lungenoberfläche) Lung Colony Surface Area 50 40 30 20 10 0 n=10 Ratte IgG n=10 n=10 n=10 α α α VEGFR2 VEGFR1 VEGFR1 + 2 Abb. 3.3.6. Effekte der Behandlung mit anti-VEGFR1 und anti-VEGFR2-Antikörpern auf die Entwicklung experimenteller Lungenmelanommetastasen. Die durch metastatische Foci betroffenen Areale auf der Lungenoberfläche 20 Tage nach Inokulation der B16-Melanomzellen wurde als Maß für die Ausbreitung der Metastasierung herangezogen. Standardisierte Fotographien der Lungenoberfläche dienten als Grundlage der Image-Analysen (siehe Material und Methoden). Black-nu-Mäuse wurden 48 h nach intravenöser Inokulation der Melanomzellen mit IgG der Ratte (Ctrl., 1,5 mg/Maus), anti-VEGFR1 (αVEGFR1, Klon MF1, 750 µg/ Maus) und/oder anti-VEGFR2 (αVEGFR2, Klon DC101, 750µg/Maus) durch intraperitoneale Injektion in dreitägigen Rhythmus behandelt. In die Analyse wurden 11 Tiere aus zwei separaten Versuchsansätzen mit einbezogen. Für die statistischen Analysen wurde der Wilcoxon-Test für zwei unabhängige Stichproben verwendet. Multiple Signifikanz wurde etabliert für angepasste P-Werte von < 0,05: Ctrl. vs. αVEGFR2: p=0,6842; Ctrl. vs. αVEGFR1: p=0,1413; Ctrl. vs. αVEGFR1+2: p=0,0003; αVEGFR2 vs. αVEGFR1+2: p=0,0002; αVEGFR1 vs. αVEGFR1+2: p=0,0086. Die Darstellung der Daten beruht auf Medianen und Quartilen (graphisch dargestellt als nicht-parametrische Box-Plots). 102 Ergebnisse VEGFR2 Ak Ratte IgG Ak A C VEGFR1 Ak VEGFR1 Ak + VEGFR2 Ak B D n=6, P=0.0185 E n=6, P=0.49, n.s. CD45+ cells per HPF 35 30 25 20 15 10 5 0 Ratte IgG α α α VEGFR2 VEGFR1 VEGFR1+2 Abb. 3.3.7. Auswirkungen der Behandlung mit anti-VEGFR1 und anti-VEGFR2-Antikörper auf das entzündliche Infiltrat in Lungenmelanommetastasen. Histochemische Analysen von Tag 20-Lungen- + metastasen auf CD45 -Entzündungszellen (rot-braun) in Serienschnitten von Mäusen, die mit Ratten-IgG (A), anti-VEGFR1 (B), anti-VEGFR2 (C) oder anti-VEGFR1- und anti-VEGFR2-Antikörpern (D) behandelt worden sind; Maßstabsleiste: 25 µm. Die Anzahl analysierter Tiere pro Behandlungsgruppe betrug 6 Tiere, Mäuse zweier unabhängiger Versuchsansätzen wurden mit einbezogen. Es wurden jeweils vier hochaufgelöste Ausschnitte (high power fields) serieller Lungenschnitte analysiert. Die Daten sind als Mittelwerte ± Standardabweichung (S.D.) dargestellt (E). Ergebnisse 103 Um zu klären, ob anti-VEGFR1 und anti-VEGFR2 einen Einfluss auf zirkulierende VEGFR1+- und VEGFR2+-Vorläuferzellen besitzen, wurde das periphere Blut jener Mäuse durchflusszytometrisch VEGFR2+CD34+ analysiert. endothelialer Es konnte Vorläuferzellen gezeigt und werden, dass VEGFR1+CD11b+ der Anteil myeloischer hämatopoetischer Zellen im peripheren Blut durch die Behandlung mit anti-VEGFR1- oder anti-VEGFR2-Antikörpern gegen nicht signifikant beeinflusst werden kann (Abb. 3.3.8). In vergleichbarer Weise führte auch die simultane Blockade der VEGF-Rezeptoren 1 und -2, die die Ausbildung von Melanommetastasen in der Lunge wirkungsvoll unterdrückt (Abb. 3.3.6), zu keiner bedeutsamen Verminderung der VEGFR2+CD34+ endothelialen Vorläuferzellen oder VEGFR1+CD11b+ myeloischen hämatopoetischen Zellen im peripheren Blut. Diese Daten weisen daraufhin, dass die gleichzeitige Beeinträchtigung des VEGFR1 und VEGFR2 für den Prozess den Metastasierungsprozess von entscheidender Bedeutung ist (Abb. 3.3.7 und Abb. 3.3.8), wobei die funktionelle Wirkung der anti-VEGFR-Antikörper im Lungenmetastasenmodell jedoch nicht durch eine hemmende Vorläuferzellmobilisierung und -inkorporierung erklärt werden kann. Wirkung auf die 104 Ergebnisse n=8, P=0.41, n.s. A n=8, P=0.0255 0,05 Peripheres Blut ++ VEGFR2 Zellen VEGFR2++CD34 CD34 cells (%) 0,06 0,04 0,03 0,02 0,01 0,00 Ratte IgG Ratte IgG α α α VEGFR2 VEGFR1 VEGFR1 + 2 Ctrl. MM n=8, P=0.71, n.s. B 0,09 0,08 Peripheres Blut + + (%) VEGFR1+CD11b CD11b+ Zellen cells (%) n=8, P=0.0323 0,07 0,06 0,05 0,04 0,03 0,02 0,01 0,00 Ratte IgG Ratte IgG Ctrl. α α α VEGFR2 VEGFR1 VEGFR1 + 2 MM Abb. 3.3.8: Effekte der Behandlung mit anti-VEGFR1 und anti-VEGFR2-Antikörper auf die Mobilisierung von Progenitor-Zellpopulationen durch Etablierung von Lungenmelanommetastasen. Durchflusszytometrische Analysen von (A) VEGFR2+CD34+ endothelialen Vorläuferzellen und (B) VEGFR1+CD11b+ myeloischen hämatopoetischen Zellen im peripheren Blut von Metastasen-tragenden Mäusen (MM, graue Balken, Tag 11 nach Inokulation) gegenüber gesunden Kontrollen (Ctrl., weiße Balken). C57BL/6 Mäuse wurden 48 h nach intravenöser Inokulation der Melanomzellen mit IgG der Ratte (Ctrl., 1,5 mg/Maus), anti-VEGFR1 (αVEGFR1, Klon MF-1, 750 µg/Maus) und/oder anti-VEGFR2 Antikörper (αVEGFR2, Klon DC101, 750 µg/Maus) durch intraperitoneale Injektion in dreitägigen Rhythmus behandelt. Die Tiere wurden mit Ratte-IgG (1,5 mg/Maus), anti-VEGFR1 (αVEGFR1, Klon MF-1, 750 µg/Maus) und/oder anti-VEGFR2 Antikörper (αVEGFR2, Klon DC101, 750 µg/Maus) durch intraperitoneale Injektion in dreitägigen Rhythmus behandelt. Die Daten sind dargestellt als Mittelwerte ± Standardfehler (S.E.). ________________________________________________________________________105 4. Diskussion Die hämatogene Metastasierung beruht auf der Abfolge spezieller Einzelschritte, wobei Adhäsionsmoleküle wahrscheinlich als spezifische „Homing“-Faktoren (selekive Adhäsion) wirken, die nachfolgend weitere Tumorzell-Endothelzell-Interaktionen, sowie die Extravasation ins umliegende Gewebe ermöglichen. In diesem Zusammenhang gewinnen endotheliale P-Selektine zunehmend an Bedeutung. Insbesondere Heparin scheint seine antimetastatische Wirkung über Interaktionen mit P-Selektinen zu vermitteln, indem sie diese für ihre natürlichen Liganden, bzw. Tumormuzine blockieren (Kim et al. 1999; Borsig et al. 2001; Nelson et al. 1993; Koenig et al. 1998). Während bisherige Studien thrombozytäre PSelektine in den Vordergrund stellten und aufgrund der durch sie vermittelten ThrombozytenTumorzell-Interaktionen als wichtige Strukturen der hämatogenen Metastasierung charakterisierten, wurde die Bedeutung der endothelialen P-Selektine bei TumorzellEndothelzell-Kontakten noch nicht ausreichend geklärt. Neuere experimentelle Daten zeigen P-Selektin-abhängige Interaktionen von Endothelzellen mit Melanomzellen in vitro (Kaytes & Geng 1998; Ma & Geng 2000) und Ludwig et al. (2004) liefern erste Hinweise direkter Interaktionen der Melanomzellen mit postkapillären Venolen in vivo. In der vorliegenden Arbeit sollte die funktionelle Bedeutung der P-Selektine in vivo im Mausmodell dargestellt werden. Um den Einfluss des selektiven thrombozytären P-SelektinMangels auf die Lungenmetastasierung zu ermitteln, wurden C57BL/6-Wildtyp(WT)-Mäuse nach Destruktion des Knochenmarks mittels β-Strahlung mit Knochenmark von P-Selektindefizienten Tieren (P-Sel-/--KMT) bzw. Wildtyp-Mäusen (WT-KMT) rekonstituiert. Jene Tiere, denen Knochenmark P-Selektin-defizienter Mäuse transplantiert worden war, wiesen 11 Tage nach Inokulation der B16-Melanomzellen signifikant weniger Lungenmetastasen auf, als entsprechende WT-KMT-Kontrollen. Allerdings war das Ausmaß der Metastasenbildung in P-Sel-/- KMT-Mäusen höher als in P-Selektin-defizienten Mäusen selbst (Abb. 3.3.1 A und B) und konnte durch Gabe von anti-P-Selektin-Antikörpern (anti-Psel) weiter reduziert werden (Abb. 3.3.1 C). Diese Daten korrelieren mit den Ergebnissen der intravitalmikroskopischen Untersuchungen von Ludwig et. al (2004), in denen die Interaktionen zwischen Melanomzellen und Gefäßendothel durch spezifische P-Selektin-Antikörper wirkungsvoll unterdrückt werden konnten. Sie stützen die derzeitige Annahme, dass nicht nur die thrombozytäre P-Selektin-Expression einen wichtigen Faktor bei der hämatogenen Metastasierung darstellt, sondern dass auch endotheliales P-Selektin für die Ausbildung experimenteller Melanommetastasen von funktioneller Bedeutung ist. 106 Diskussion Neben seinen antikoagulativen Eigenschaften wird Heparin als Substanz mit P-Selektinblockierenden Eigenschaften beschrieben (Nelson et al. 1993; Koenig et al. 1998), die die Ausbildung hämatogener Metastasen in verschiedenen Tumormodellen hemmen kann (Smorenburg & Van Noorden 2001; Nelson et al. 1993; Koenig et al. 1998). Die Anwedung von Heparin im Maus-Metastasierungsmodell führte zu Ergebnissen, die sich mit bereits gemachten Beobachtungen decken (Sciumbata et al. 1996; Kim et al. 1998; Borsig et al. 2001). Heparin reduzierte die Etablierung von B16-Lungemetastasen im Metastasierungsmodell auf ein Maß, das jenem P-Selektin-defizienter Mäusen entsprach (Abb. 3.3.1.2). Ähnliche Befunde wurden kürzlich auch von einem experimentellen Metastasierungsassay unter Verwendung von Adenokarzinomzellen berichtet, wobei die antimetastischen Effekte zum überwiegenden Teil als Folge der P-Selektin-Blockierung angesehen wurden (Borsig et al. 2001; Borsig et al. 2002). Ausserdem haben intravitalmikroskopische Untersuchungen aus der eigenen Arbeitsgruppe zeigen können, dass die P-Selektin-abhängigen Interaktionen der Melanomzellen mit Endothelzellen postkapillärer Venolen (am Modell des murinen Ohres) durch Heparin unterdrückt werden, während das in P-Selektin-defizienten Mäusen reduzierte Rollen („rolling“) der Melanomzellen durch Heparin nicht beeinflusst werden konnte (Ludwig et al. 2004). P-Selektinen des Endothels scheint somit eine wichtige Bedeutung als Adhäsionsmoleküle bei der hämatogenen Metastasierung zuzukommen. Allerdings ist bisher ungeklärt geblieben, ob und in welchem Ausmaß Heparine die Ausbildung und das Wachstum experimenteller Lungenkolonien beeinflussen. Sciumbata et al. berichteten von einer moderaten, allerdings nicht signifikanten Verlängerung der Überlebensrate in Tieren, denen nach Injektion der B16Melanomzellen drei Wochen lang zweimal wöchentlich Heparin verabreicht wurde (Sciumbata et al. 1996). Die Ergebnisse der eigenen Untersuchungen zeigten, dass HeparinInjektionen 24 h nach intravenöser Inokulation von B16-Melanomzellen ohne therapeutischen Einfluss bleibt (Abb. 3.3.3 D). Auch führte eine Heparin-Therapie, die nach der MelanomzellInjektion initiiert und im Abstand von 48 Stunden weitergeführt wurde, zu keinen zusätzlichen oder synergistischen antimetastatischen Effekten, wenn die Ergebnisse mit Tieren verglichen wurden, die vor der Melanomzellinokulation einmalig mit Heparin behandelt wurden. Heparin beeinflusst somit in erster Linie die Etablierung von Metastasen, während Initiierung beeinträchtigt und werden. Unterhaltung Somit greift des Metastasenwachstums Heparin in der scheinbar Adhäsionsphase in nicht den Metastasierungsprozess ein, was durch seine P-Selektin-blockierende Wirkung erklärt werden könnte. Obwohl auch L-Selektine die metastatische Ausbreitung von Tumorerkrankungen Diskussion 107 in vivo begünstigen könnten (nachgewiesen bei leukozytären L-Selektinen durch Borsig et al. 2002), entspricht die reduzierte Ausbildung experimenteller Metastasen (Abb. 3.3.3) durch eine initiale Heparinbehandlung dem Umfang, der auch in P-Selektin-defizienten Mäusen beobachtet werden konnte (Abb. 3.3.1). Diese Annahme wird von neueren Untersuchungen gestützt, in denen gezeigt werden konnte, dass der Effekt einer einzelnen Heparindosis allein durch die Blockade P-Selektin-abhängiger Plättchen-Tumorzell-Interaktionen vermittelt werden kann (Borsig et al. 2002). Während Heparin das Ausmaß der hämatogenen Metastasierung in Sekundärorgane verminderte, konnte in P-Selektin-defizienten Mäusen keine weitere Hemmung nachgewiesen werden (Borsig et al. 2001; Borsig et al. 2002). Somit stützten mehrere Befunden das Konzept, dass Heparin seine antimetastatischen Effekte zum überwiegenden Anteil über Hemmung der P-Selektin-abhängigen Interaktionen vermittelt. Der Einsatz von Heparin als Tumortherapeutikum birgt die Problematik, dass die Effekte sehr vom Zeitpunkt der Applikation abhängen. Weiterhin bleibt ungeklärt, wie lange Heparin die P-Selektine zu blockieren vermag und da Tumorzellen vom Primärtumor jederzeit abgeschwemmt werden können, besitzt eine einmalige prophylaktische Gabe wahrscheinlich nur geringen Nutzen. Ein mögliches Einsatzgebiet wäre die postoperative Phase, wenn damit gerechnet werden muss, dass eine größere Anzahl an Tumorzellen ins Blutgefäßsystem eingetreten ist. In diesem Zusammenhang sind die antikoagulativen Eigenschaften des Heparins jedoch meist unerwünscht, so dass chemisch modifiziertes Heparin mit reduzierter antikoagulativer Wirkung von Intersse sein könnte. Als weiterer Angriffspunkt in der Tumortherapie gewinnen antiangiogene Strategien und VEGF/VEGFR-Inhibitoren zunehmend an Bedeutung (Kerbel 2000). Aufgrund neuerer Studien ist denkbar, dass eine verminderte Rekrutierung VEGFR+ endothelialer und hämatopoetischer Vorläuferzellen aus dem Knochenmark einen zusätzlichen antivaskulären Wirkungsmechanismus darstellt (Rafii et al. 2002; Carmeliet 2003). Um die mögliche Bedeutung von Vorläuferpopulationen aus dem Knochenmark für die Etablierung und das Wachstum der B16-Melanommetastasen im Mausmodell klären zu können, wurde der Anteil VEGFR1+ hämatopoetischer und VEGFR2+ endothelialer Vorläuferzellen im peripheren Blut und Knochenmark durchflusszytometrisch analysiert (Abb.3.3.4). VEGFR2+CD34+ endotheliale Vorläuferzellen (EPCs) und VEGFR1+CD11b+ hämatopoetische Zellen ließen sich im lymphomonozytären Zellpool des peripheren Blut jener Tiere, die Lungenmelanome ausgebildet hatten, in höheren Prozentsätzen nachweisen als in gesunden Kontrollgruppen (Abb. 3.3.4). Auch im Knochenmark schien die Anzahl endothelialer VEGFR2+CD117+ und VEGFR1+CD117+ hämatopoetischer Zellen im Vergleich zu metastasenfreien Mäusen 108 Diskussion anzusteigen (Abb. 3.3.4). Diese Daten unterstützen die Annahme, dass Vorläuferzellen aus dem Knochenmark mobilisiert und von Tumoren für die Ausbildung neuer Gefäße verwendet werden könnten. Als limitierender Faktor der Studie gestaltete sich die Notwendigkeit, ausreichend Zellmaterial zu gewinnen, da pro Maus nur etwa 1,5-2 ml Blut zur Verfügung standen. Dreifachfärbungen erwiesen sich aufgrund von unspezifischen Bindungen und Messfehlern als nicht praktikabel und auch auf die Verwendung von Messungen mit Blut von mehreren Probanden wurde aufgrund der damit verbundenen höheren Tierzahlen und unspezifischen Reaktionen verzichtet. Ein weiterer Punkt, der in die Überlegungen mit einbezogen werden sollte ist, dass die monoklonalen Antikörper direkt, d.h. ohne Aufreinigung des peripheren Blutes/ Knochenmarks zugunsten der lymphozellulären Fraktion zugesetzt wurden. Aufgrund der insgesamt geringen Prozentsätze von HPCs und EPCs in Blut und Knochenmark sollte die Bedeutung der gewonnen Daten kritisch betrachtet werden, auch wenn der Anstieg VEGFR1+- und VEGFR2+-Vorläuferzellen signifikant war. Weitere Forschungsarbeiten sind notwendig, um die Daten zu verifizieren und die Aufreinigung der Zellen zu etablieren. Die nachgewiesene Zunahme VEGFR1+ und VEGFR2+ Zellen im peripheren Blut und Knochenmark deckt sich allerdings mit den Ergebnissen verschiedener Arbeitsgruppen (Monestiroli et al., 2001; Asahara et al., 1999; Takahashi et al., 1999). So legten einige Studien dar, dass die Gefäßneubildung in Angiogenese-abhängigen entzündlichen und malignen Erkrankungen durch die Mobilisierung und Inkorporierung von EPCs unterstützt werden kann (Rafii & Lyden 2003; Jain & Duda 2003). Zudem wurde gezeigt, dass endogene EPCs auch in Gefäße ischämischen Gewebes und lokal wachsender Tumoren integriert werden können (Asahara et al. 1999a). Um nachzuweisen, dass Vorläuferzellen aus dem Knochenmark auch in Melanommetastasen inkorporiert werden, fand ein Knochenmarks-Transplantationsmodell Verwendung, das es ermöglicht, über die Darstellung des LacZ-Markergens die Herkunft von Zellen aus dem Knochenmark abzuleiten. Zu diesem Zweck wurde Knochenmark der Rosa26-, bzw. VEGFR2+/--Linie in bestrahlte C57BL/6-Mäuse transplantiert (C57BL/6-R, C57BL/6-F; siehe auch Asahara et al. 1999a). Anhand von PCR-Untersuchungen konnte der Nachweis erbracht werden, dass das Knochenmark 8 Wochen nach Transplantation mit Markergen-tragenden Zellen rekonstruiert war. Postnatal aus dem Knochenmark in Lungengewebe ausgewanderte Zellen (Rosa26), bzw. Enothelvorläuferzellen (VEGFR+/-) ließen sich mittels LacZ-Färbung im Gefrierschnitt darstellen (Abb. 3.3.5). Im Gegensatz zu zuvor publizierten Daten bezüglich lokal wachsender Tumoren fanden sich in Gefäßen experimenteller Lungenmetastasen jedoch keine LacZexprimierenden Zellen (Abb. 3.3.5). Allerdings hat auch eine kürzlich veröffentlichte Diskussion 109 Untersuchung unter Verwendung verschiedener subkutaner Tumoren keine Rekrutierung von EPCs aus dem Knochenmark in Gefäßstrukturen der Tumorgewebe detektieren können (De Palma et al. 2003). Die beschriebenen Befunde legen die Vermutung nahe, dass EPCs zumindest in den frühen Wachstumsphasen keine Bedeutung bei der Etablierung von Lungenmetastasen besitzen. Der fehlende Nachweis von Zellen, die LacZ+ unter Transkriptionskontrolle des VEGFR2-Promoters exprimieren und somit aus dem Knochenmark stammen, beruht allerdings nicht auf einer mangelnden VEGFR2-Expression, wie immunhistochemische Färbungen bestätigten. Der fehlende Nachweis endothelialer Vorläuferzellen könnte mit der geringeren Größe der Lungenkolonien im Vergleich zu expandierenden Lokaltumoren zusammenhängen. Vielleicht ist die Diffusion aufgrund der ausgeprägten Gefäß- und Sauerstoffversorgung des Lungengewebes für die Versorgung der Tumorzellen zunächst ausreichend, so dass angiogene Vorgänge erst in späteren Wachstumsphasen zum Tragen kommen. Um auszuschließen, dass eine unzureichende Zerstörung des Knochenmarks der Empfängertiere oder eine zu geringe Zahl transplantierter Zellen die Ursache für die fehlende LacZ-Positivität darstellte, wurden Tiere zweier Knochenmarkstransplantationen in den Versuch aufgenommen und die Präsenz des Markergens durch PCR bestätigt. Zwar lieferten die LacZ-immunhistochemischen Doppel-färbungen keinen Hinweis auf die Integration endothelialer Vorläuferzellen, jedoch konnten myelomonozytäre LacZ+-Zellen in Lungenmelanomen der C57BL/6-R dargestellt werden. Myeloische Zellen aus dem Knochenmark werden in zunehmendem Maße als zusätzliche Quelle Tumor-assoziierter mononuklärer Zellen angesehen (Lyden et al. 2001; De Palma et al. 2003). De Palma et al. (2003) beobachteten die Integration CD45+CD11b+ myelomonozytärer Zellen aus dem Knochenmark in Lungenmetastasen. Tumorzell-assoziierte Makrophagen, die aus monozytären Vorläufern differenzieren, sind sowohl Ziel als auch Quelle von Zytokinen und Chemokinen innerhalb des Tumor-Mikromilieus (Mantovani et al. 1992a; Mantovani et al. 2002). Von Tumorzellen sezernierte Wachstumfaktoren (u.a. VEGF, PlGF, M-CSF) und Chemokine (z.B. das CC-Chemokin CCL2) begünstigen nicht nur die Rekrutierung der Makrophagen, sondern veranlassen Monozyten und Makrophagen zur Freisetzung proangiogener Faktoren und Matrixmetalloproteinasen (MMP) (Mantovani et al. 2002). Diese Beobachtungen stützen das Konzept, dass Angiogenese-abhängiges Tumorwachstum eng mit den Wechselwirkungen zwischen Tumorzellen, Leukozyten, Endothelzellen und Komponenten des Wirtsstromas verknüpft ist (Liotta & Kohn 2001; Fidler 2002b; Leek et al. 1996; Torisu et al. 2000). 110 Diskussion Obwohl endotheliale Vorläuferzellen scheinbar keine Bedeutung während der initialen Wachstumsphase maligner Lungenmelanommetastasen besitzen, stellte sich die Frage, ob anti-VEGFR-Antikörper durch selektive Blockierung der VEGFR1-/ VEGFR2- Rezeptoren die Metastasierung beeinflussen (Abb. 3.3.6). In früheren Studien konnte bereits gezeigt werden, dass die Blockade des VEGFR2 Angiogenese und Wachstum verschiedener Lokaltumoren zu hemmen vermag (Prewett et al. 1999; Izumi et al. 2003). Kürzlich konnte auch durch Anwendung VEGFR1-blockierender Antikörpern das Angiogenese-abhängige Wachstum epidermoider A431-Tumoren gehemmt werden (Luttun et al. 2002b). Konzentrationsabhängige Effekte sind vermutlich dafür verantwortlich, dass der alleinige Einsatz von anti-VEGFR1-Antikörpern keine sichtbaren therapeutischen Effekte auf das Wachstum von Lewis Lung-Karzinomzellen (LCC) erkennen ließ (Lyden et al. 2001), jedoch konnten die antivaskulären Effekte der anti-VEGFR2-Antikörper im LCC-Tumormodell durch die Kombination mit anti-VEGFR1-Antikörpern deutlich verstärkt werden (Lyden et al. 2001). Unter Verwendung des experimentellen B16-Metastasierungs-Modells führte weder die Anwendung neutralisierender VEGFR1-Antikörper, noch neutralisierender VEGFR2Antikörper allein zu sichtbaren therapeutischen Effekten hinsichtlich der Wirkung auf die Entwicklung von Metastasen an der Lungenoberfläche (Abb. 3.3.6). Nur die Kombination beider anti-VEGFR-Antikörper, konnte Entwicklung und Wachstum von B16-Metastasen mindern (Abb.3.3.6). Vergleichbar mit früheren Befunden bei subkutanen epidermoiden A431-Tumoren (Luttun et al. 2002b) ließ sich in immunhistochemischen Analysen zeigen, dass anti-VEGFR1 den Anteil CD45+ Zellen in Lungenmelanomen (Tag 20 p.i.) reduziert (Abb. 3.3.7), obwohl nur die kombinierte Blockade von VEGFR1 und VEGFR2 einen therapeutischen Einfluss auf die Ausbildung der Lungenmetastasen ausübt (Abb. 3.3.6). Entgegen eigener Vermutungen wurden endotheliale Vorläuferzellen (EPCs) und hämatopoetische Zellen (HPCs) im peripheren Blut durch die Behandlung mit VEGFR1- oder VEGFR2-Antikörpern nicht signifikant beeinflusst (Abb. 3.3.8). Auch führte die simultane Blockade der VEGFR1 und VEGFR2, welche die Ausbildung von Melanommetastasen in der Lunge wirkungsvoll unterdrücken (Abb. 3.3.6), weder zu einer bedeutsamen Verminderung endothelialer, noch zu einer Reduktion hämatopoetischer Vorläuferzellen im peripheren Blut metastasenbelasteter Tiere. Somit scheinen Vorläuferzellen keine Zielstruktur der antimetastatischen Effekte bei der Etablierung experimenteller Lungenmetastasen darzustellen. Auch wenn die exakten Wirkungsmechanismen der durch neutralisierende VEGFRAntikörper vermittelten therapeutischen Effekte noch weiter untersucht werden müssen, so zeigen die hier vorgestellten Daten, dass die simultane Blockierung der beiden VEGF- Diskussion 111 Rezeptoren für die Etablierung experimenteller B16-Lungenmetastasen von funktioneller Bedeutung ist. Trotz der offensichtlichen Limitierung des Metastasierungsmodells lassen sich mit diesem experimentellen Ansatz wichtige Faktoren für die Ausbildung hämatogener Metastasen identifizieren. Somit könnten sich Therapiestrategien, die VEGFR1-/ VEGFR2abhängige Effekte simultan unterbinden, als vielversprechende Ansätze für zukünftige Therapien metastasierender Tumorerkrankungen erweisen. 112 . 5. Zusammenfassung Beatrice Böhme, Funktionelle Bedeutung des endothelialen P-Selektins und der VEGF-Rezeptoren VEGFR1 und VEGFR2 bei der hämatogenen Metastasierung im Lungenmelanommodell der Maus, 2004. Die limitierte Wirksamkeit Tumormetastasen ist zumeist derzeit für verfügbarer die ungünstige Therapieansätze Prognose im betroffener Falle von Patienten verantwortlich. Zur Verbesserung der therapeutischen Möglichkeiten sind daher zusätzliche Erkenntnisse bezüglich der Ausbildung und des Wachstums vo n Metastasen in Sekundärorganen von essentieller Bedeutung. In früheren Untersuchungen konnte gezeigt werden, dass dem Adhäsionsmolekül P-Selektin eine zentrale Rolle bei der hämatogenen Metastasierung und Etablierung von Sekundärtumoren zukommt. Während vor allem die Rolle des thrombozytären P-Selektins im Fokus früherer Untersuchungen stand, war es Ziel dieser Arbeit, auch den Einfluss der endothelialen P-Selektin- Expression bei der hämatogenen Metastasierung zu untersuchen. Weiterhin sollte geklärt werden, ob die endothelialen Tyrosinkinase-Rezeptoren VEGFR1 und VEGFR2, deren Bedeutung beim Angiogenese-abhängigen Wachstum von Lokaltumoren bereits nachgewiesen werden konnte, auch eine zentrale Rolle bei der Etablierung und dem Wachstum hämatogener Fernmetastasen übernehmen und somit einen Angriffspunkt neuer therapeutischer Ansätze darstellen könnten. Aufgrund neuerer Untersuchungen, die zeigen, dass der Mobilisierung und Rekrutierung von VEGFR2 + endothelialen und VEGFR1 + hämatopoetischen Vorläuferzellen aus dem Knochenmark eine funktionelle Bedeutung in lokal wachsenden Tumoren zukommt, sollte deren Beteiligung an der Entwicklung hämatogener Metastasen untersucht werden. Es war zudem Ziel dieser Arbeit, durch den Einsatz neutralisierender monoklonaler anti- VEGFR1-/ anti-VEGFR2-Antikörper die Rolle der VEGF-Rezeptoren bei der Entwicklung hämatogener Metastasen im Mausmodell zu prüfen. Um zunächst die funktionelle Bedeutung der P-Selektin-Expression durch Thrombozyten und Endothelzellen analysieren zu können, wurde der Einfluss eines selektiven thrombozytären PSelektin-Mangels auf die experimentelle Lungenmetastasierung analysiert. Zu diesem Zweck wurden Wildtyp-Mäuse nach letaler Bestrahlung mit Knochenmark P-Selektin-defizienter Tieren rekonstituiert. Metastasenwachstums Dabei in zeigte Mäusen, sich, denen dass das thrombozytäres Ausmaß des P-Selektin reduzierten aufgrund der Rekonstitution mit P-Selektin-defizientem Knochenmark fehlte (P-Sel-/--KMT), geringer ausgeprägt war, als die Hemmung in P-Selektin-defizienten Mäusen selbst. In Mäusen, denen thrombozytäres, nicht jedoch endotheliales P-Selektin fehlte, konnte die Metastasenbildung Zusammenfassung 113 durch die Gabe von anti-P-Selektin-Antikörpern noch weiter reduziert werden. Folglich kann aufgrund dieser Daten davon ausgegangen werden, dass die endotheliale P-SelektinExpression die hämatogene Metastasierung zusätzlich begünstigt. In weiteren Untersuchungen zur Hemmung des P-Selektins durch Heparine zeigte sich, dass die einmalige Gabe von Heparin während der Zirkulation der Tumorzellen ausreicht, um die Entwicklung hämatogener Metastasen signifikant zu reduzieren. Allerdings war bisher ungeklärt geblieben, ob und in welchem Ausmaß Heparine zusätzlich die Ausbildung und das Wachstum experimenteller Lungenkolonien nach Inokulation mit Tumorzellen beeinflussen. Die Ergebnisse der eigenen Untersuchungen zeigen hier sehr deutlich, dass bei Beginn einer Heparin- Behandlung 24 h nach intravenöser Inokulation von B16-Melanomzellen kein therapeutischer Einfluss beobachtet werden kann. Auch eine Heparin- Therapie, die nach Melanomzell-Injektion initiiert und im Abstand von 48 Stunden weitergeführt wurde, zeigte im Vergleich zu Tieren, die nur vor Inokulation mit Heparin einmalig behandelt wurden, keinen zusätzlichen oder synergistischen antimetastatischen Effekten. Heparin beeinflusst somit in erster Linie die Etablierung von Metastasen, während die Initiierung und die Unterhaltung des Metastasenwachstums scheinbar nicht beeinträchtigt werden. Durch die Untersuchungen zur Bedeutung der VEGF-Rezeptoren konnte zunächst dargelegt werden, dass die Ausbildung experimenteller Melanommetastasen zu einer Mobilisierung von VEGFR1 + und VEGFR2 + Vorläuferzellen aus dem Knochenmark führt. Um nachfolgend überprüfen zu können, ob aus dem Knochenmark stammende Vorläuferzellen tatsächlich in Metastasen integriert werden, wurde ein Transplantationsmodell verwendet, bei dem Empfängertiere mit Knochenmark von Mäusen rekonstituiert wurden, die das LacZReportergen in allen Zellspezies bzw. unter der transkriptionellen Kontrolle des endothelzellspezifischen VEGFR2-Promotor exprimieren. Im Gegensatz zu früher publizierten Daten bezüglich lokal wachsender Tumoren konnten in den eigenen Untersuchungen keine LacZexprimierenden Zellen in Gefäßen experimenteller Lungenmetastasen nachgewiesen werden. Während eine Integration von Endothelvorläuferzellen nicht gezeigt werden konnte, ließ sich jedoch die Rekrutierung myelomonozytärer Zellen aus dem Knochenmark in experimentelle Lungenmetastasen darstellen. Somit stützen diese Befunde die Einschätzung, dass myeloische Zellen aus dem Knochenmark als zusätzliche Quelle Tumor-assoziierter Zellen Angiogeneseabhängiges Wachstum von Lungenmetastasen unterstützen können. Zur Überprüfung der funktionellen Bedeutung der VEGF-Rezeptoren wurde der Einfluss einer selektiven VEGFR1- bzw. VEGFR2-Blockade auf die Ausbildung experimenteller Lungenmetastasen hin untersucht. Unter Verwendung des experimentellen B16- 114 Zusammenfassung Metastasierungsmodells führte in diesen Studien weder die alleinige Anwendung von Antikörpern gegen VEGFR1, noch gegen VEGFR2 zu sichtbaren therapeutischen Effekten hinsichtlich der Etablierung und des Wachstums von Metastasen der Lungeoberfläche. Nur bei gleichzeitiger Anwendung von anti- VEGFR1- und anti- VEGFR2-Antikörpern konnten Entstehung und Wachstum von B16-Metastasen substantiell unterdrückt werden. Die unterschiedliche Wirksamkeit der kombinierten gegenüber der alleinigen Hemmung von VEGF-Rezeptoren war dabei nicht mit entsprechenden Veränderungen im entzündlichen CD45+ Infiltrat assoziiert. Auch führte die simultane Blockierung der VEGF-Rezeptoren 1 und-2, die die Ausbildung von Melanommetastasen in der Lunge wirkungsvoll unterdrückt, weder zu einer bedeutsamen Verminderung der endothelialen, noch der hämatopoetischen Vorläuferzellen im peripheren Blut Metastasen-erkrankter Tiere. Somit scheint die induzierte Mobilisierung der untersuchten Vorläuferzellen keine essentielle Zielstruktur antimetastatischer Effekte durch VEGFR1-/ VEGFR2-Antikörper bei der Etablierung von experimentellen Lungenmetastasen darzustellen. Zusammenfassend zeigen die eigenen Ergebnisse, dass die Expression des endothelialen PSelektins und die der VEGF Rezeptoren VEGFR1 und VEGFR2 mögliche attraktive Zielstrukturen für zukünftige Ansätze Tumorerkrankungen darstellen könnten. in der Behandlung von metastasierenden Abstract 6. 115 Abstract Beatrice Böhme, meaning of P-selectin and VEGFR1/VEGFR2 for the process of hematogenous metastasis in a mice lung metastasis assey, 2004. Metastasis continues to be the major cause of morbidity and mortality in malignancies. Accordingly, factors that may contribute to the ability of cancer cells to establish metastases could serve as attractive target for therapeutic intervention. Former studies have characterized P-selectin as an adhesion molecule playing a central role in blood-born tumor metastasis. Whereas previous attention has focused on P-selectin-dependent tumor cell-platelet interactions, the aim of the current study was to address the potential contribution of endothelial P-selectin expression to adhesive events between the microvasculature and melanoma cells in vivo. Transplantation of bone marrow from P-selectin-deficient into wildtype mice is shown to convey inhibition of experimental melanoma metastasis, whereas the extent to which bone marrow-conferred lack of platelet P-selectin expression attenuated melanoma lung metastasis was significantly less than that seen in P-selectin-deficient mice. By blocking P-selectin function via administration of heparin or P-selectin-directed antibodies, this effect could still be reduced, suggesting that endothelial P-selectin expression may additionally contribute to formation of hematogenous metastasis. However, heparin was only effective when given prior to inoculation of melanoma cells. No additional effects of continued heparin therapy were noticed after tumor cell seeding. Another area of interest for therapeutic intervention is the formation of new blood vessels in tumor tissue. Until recently, formation of new vascular networks was viewed primarily as a result of sprouting by expansion of differentiated endothelial cells (ECs). Accumulating evidence suggests that new vessel formation may also be contributed to by endothelial cells that originate from bone marrow-derived highly proliferative endothelial progenitor cells (EPCs). Remodeling of extracellular matrix components and altering the balance towards proangiogenic stimuli may enable micrometastases to acquire the ability to eventually become vascularized and to induce the recruitment of bone- marrow-derived VEGFR1 + hematopoetic and VEGFR2 + endothelial progenitor cells (postnatal vasculogenesis). These studies sought to extend the current knowledge about the role of VEGFR+ bone marrow-derived progenitors in malignancies by employing an experimental melanoma metastasis assay. It is herein demonstrated that formation of B16- melanoma lung metastases elevated counts of VEGFR1 +CD117+ hematopoietic and VEGFR2 +CD117+ endothelial progenitors in the bone marrow and increased mobilization of myeloid VEGFR1 + and endothelial VEGFR2 + progenitor cells into the peripheral circulation. In transplantation studies utilizing genetically 116 Abstract marked bone marrow, examination of lung metastases showed recruitment primarily of myelomonocytic and megakaryocytic bone marrow-derived cells, whereas integration of EPCs was rarely observed. As VEGF and its receptor tyrosine kinases VEGFR1 and VEGFR2 have received great attention as important therapeutic targets in pathologic angiogenesis, the potential effects of neutralizing antibodies directed against either VEGFR1 or VEGFR2 were studied in experimental melanoma lung metastasis. Taking metastatic foci at lung surfaces as end-point in the experimental metastasis assay, sole administration of neutralizing antibody directed against either VEGFR1 or VEGFR2 failed to exert significant effects on formation of lung melanoma metastasis. Only when neutralizing antibodies against VEGFR1 and VEGFR2 were simultaneously applied, formation and growth of B16 cell metastases were substantially suppressed. The divergent efficacy of combined versus single blocking of VEGFR on metastasis formation was not accompanied with corresponding changes in CD45+ inflammatory infiltrates. Also, mobilization of VEGFR+ proge nitor subsets in metastasesbearing mice was independent of VEGFR1- and VEGFR2. Whereas the precise mechanisms of action of anti- VEGFR blockade are yet to be defined, the presented data clearly indicate that simultaneous signaling via VEGFR1 and VEGFR2 is critical for melanoma experimental lung metastasis to occur. Together, these data indicate that (A) endothelial P-selectin plays an important role as adhesion molecule in blood-born melanoma metastasis, and that (B) VEGFR1/VEGFR2signaling contributes to both establishment and growth of lung metastases. Thus, P-selectin, VEGFR1 and VEGFR2 could serve as potential future targets for therapeutic strategies. Referenzen 7. 117 Literaturverzeichnis 1. Ahmad,S.A., Jung,Y.D., Liu,W., Reinmuth,N., Parikh,A., Stoeltzing,O., Fan,F. & Ellis,L.M. 2002. The role of the microenvironment and intercellular cross-talk in tumor angiogenesis. Semin.Cancer Biol. 12, 105-112. 2. 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Dr. Ralf Ludwig unterlagen die dargestellten FACS-Analysen aktivierter und ruhender Thrombozyten. Herr Prof. Dr.Gille half bei der statistischen Auswertung, insbesondere dem Wilcoxon Test. Referenzen 154 Danksagung Die dieser Arbeit zugrundeliegenden Untersuchungen wurden im Zeitraum August 2001 bis August 2003 in der Abteilung Dermatologie und Venerologie am Universitätsklinikum der Johann Wolfgang Goethe Universität durchgeführt und von Prof.Dr.med. Jens Gille betreut. Ich möchte mich für seine Mühe und zahlreichen produktiven Ideen und Ratschläge bedanken. Herrn Prof. Dr. Gruber und Herrn Prof.Dr.Schuberth, die die veterinärmedizinische Seite unterstützt haben und die Einreichung der Arbeit ermöglicht haben, möchte ich ebenfalls meinen besonderen Dank aussprechen. Mein Dank gilt insbesondere Frau Dr. Alexandra Aicher, sowie Herrn Dr. Christopher Heeschen und Frau Prof.Dr. Stefanie Dimmeler aus der Abteilung Molekulare Kardiologie, die mich während der ganzen zwei Jahre tatkräftig unterstützt haben und mir die Grundbegriffe der FACS-Analysen, deren Durchführung und statistische Auswertung vermittelten. Für die erfolgreiche Zusammenarbeit und das Engagement möchte ich mich insbesondere bei Andreas Gaumann, sowie Herrn Dr.Georg Breier aus dem Max-Planck-Institut für klinische und physiologische Forschung, Bad Nauheim, bedanken. Ihrer Hilfe verdanke ich die Bereitstellung der Flk+/--Knock-In-Mauslinie, sowie Kenntnisse und Unterstützung bei der Durchführung immunhistochemischer Färbungen und LacZ-Färbungen. Mein Dank gilt weiterhin Dr. Ralf Ludwig, der zum Gelingen der Arbeit einen entscheidenden Grundstein beigetragen hat, sowie Herr Dr. Reinhard Henschler aus dem Institut für Transfusionsmedizin, Blutspendedienst, Frankfurt am Main, für seine Kenntnisse bezüglich der Knochenmarkstransplantationsmodelle. Besonderen Dank gilt meinen Arbeitskollegen/- innen und Mitstreiter/- innen Kerstin Reisinger, Monika Stein, Cristina Gauert und Dr. Markus Meissner für die Unterstützung und Hilfe. Natürlich geht der Dank auch an das gesamte B- Labor. Ich danke Dr. med. vet. Matthias Gräber, Christina Müller und Katja Ehret für das notwendige Gegengewicht, ihre Unterstützung und Fröhlichkeit. In besonderem Maße möchte ich meinen Eltern für ihre Unterstützung und Kraft danken und dafür, dass sie immer für mich da sind. Ich möchte all meinen Freunden danken, die mir immer wieder Mut machen ........und natürlich „Dana“ für die täglichen Spaziergänge und ihre uneingeschränkte Lebensfreude.
