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Expressionsanalysen von Aminoacylasen – Untersuchungen zu Pathomechanismen angeborener Stoffwechselstörungen INAUGURALDISSERTATION zur Erlangung des Doktorgrades der Fakultät für Chemie, Pharmazie und Geowissenschaften der Albert-Ludwigs-Universität Freiburg im Breisgau vorgelegt von Anke Sommer aus Borna 2012 I Vorsitzender des Promotionsausschusses: Prof. Dr. Thorsten Koslowski Referent: Prof. Dr. Thorsten Friedrich Korreferent: Prof. Dr. Jörn Oliver Saß Datum der Promotion: 07.05.2012 II Veröffentlichungen innerhalb der Promotionszeit Publikationen Sommer A, Christensen E, Schwenger S, Seul R, Haas D, Olbrich H, Omran H, Sass JO. The Molecular Basis of Aminoacylase 1 Deficiency. Biochim Biophys Acta. 2011; 1812:68590. elektronisch erschienen am 23. Mai. Sommer A, Sass JO. Expression of Aspartoacylase (ASPA) and Canavan Disease. Wurde zur Veröffentlichung bei Gene eingereicht. Tylki-Szymanska A, Gradowska W, Sommer A, Heer A, Walter M, Reinhard C, Omran H, Sass JO, Jurecka A. Aminoacylase 1 deficiency associated with autistic behavior. J Inherit Metab Dis. 2010 elektronisch erschienen am 18. Mai. Beiträge auf Konferenzen Posterpräsentation auf der 24. Jahrestagung der Arbeitsgemeinschaft für Pädiatrische Stoffwechselstörungen im März 2010 in Fulda durch Dipl.-Biochem. Anke Sommer: Sommer A, Sass JO. Expressionsanalysen für Aminoacylasen - Auf der Suche nach dem optimalen Zellsystem. Monatsschr Kinderheilkd. 2010; 158:301. Posterpräsentation auf der Jahrestagung der SSIEM (Annual Symposium of the Society for the Study of Inborn Errors of Metabolism) im September 2010 in Istanbul durch Dipl.-Biochem. Anke Sommer: Sommer A, Sass JO. Characterization of mutations underlying aminoacylase 1 deficiency. J Inherit Metab Dis. 2010; 33:48. Vortrag und Posterpräsentation auf dem XIIth ICPLM (International Congress of Pediatric Laboratory Medicine) im Mai 2011 in Berlin durch Dipl.-Biochem. Anke Sommer: III Sommer A, Sass JO. Expression studies of aminoacylases - a turning point in understanding the molecular basis of Canavan disease and aminoacylase 1 deficiency. Clin Biochem. 2011; 44:544-5. Poster Award: „Best Poster submitted by a trainee“, auf dem XIIth ICPLM im Mai 2011 in Berlin Posterpräsentation auf der 36. Jahrestagung der Gesellschaft für Neuropädiatrie im September 2010 in Mannheim durch Prof. Dr. Jörn Oliver Sass: Sass JO, Driess J, Walter M, Grünert S, Sommer A. Laboratory diagnostics of Canavan Disease using EBV-transformed lymphocytes. Neuropediatrics. 2010; 41:87. Posterpräsentation auf der 26. Jahrestagung der Arbeitsgemeinschaft für Pädiatrische Stoffwechselstörungen im März 2012 in Fulda durch Daniel Sexauer: Sexauer D, Sommer A, Sass JO. Lässt sich mit dem synthetischen Substrat NTrifluoroacetyl-L-Aspartat Aspartoacylase-Aktivität im Rahmen der Labordiagnostik des Morbus Canavan auch in Epstein-Barr (EBV)-transformierten (immortalisierten) Lymphozyten quantifizieren? Monatsschr Kinderheilkd. 2012; 160:313. IV Für meine Eltern Heide und Holm V VI Kurzzusammenfassung Expressionsanalysen von Aminoacylasen – Untersuchungen zu Pathomechanismen angeborener Stoffwechselstörungen Der Aminoacylase (ACY)1-Mangel und der Morbus Canavan (ASPA-Mangel) sind autosomalrezessiv vererbte Stoffwechseldefekte, die durch Mutationen im ACY1- bzw. im ASPA-Gen ausgelöst werden. Ziel der vorliegenden Arbeit war es, das Wissen zu molekularen und biochemischen Zusammenhängen bei diesen seltenen Stoffwechseldefekten und zur Aminoacylase (ACY) 3 zu erweitern. Der Nachweis von Mutationen im ACY1- und im ASPA-Gen bei pädiatrischen Patienten diente als Basis zur Durchführung von Expressionsstudien. Nach zielgerichteter Mutagenese fand die Proteinexpression in einer humanen embryonalen Nierenzelllinie (HEK293-Zellen) statt, die postranslationale Modifikationen, einschließlich Glykosylierungen, sicherstellen kann. Sieben von elf ACY1-Mutanten führten zu keinem Proteinnachweis im ACY1-Western-Blot und hatten einen Aktivitätsverlust zur Folge im Vergleich zum Enzym mit der Referenzsequenz. Vier weitere ACY1-Mutanten waren hingegen im Western Blot detektierbar und resultierten in keiner Abnahme der ACY1-Aktivität. Alle fünf exprimierten ASPA-Mutanten führten zum Verlust der ASPA-Aktivität, obwohl die Bildung von mRNA nur für die ASPA-Variante ASPA Phe295Ser ausfiel. Kombinationsstudien bezüglich einer Überlappung der Substratspezifitäten von ACY1 und ASPA bestätigten, dass Nα-Acetyl-L-Methionin kein Substrat für die ASPA darstellt und Nα-Acetyl-L-Aspartat nicht von der ACY1 gespalten wird, die Enzyme also einen Ausfall nicht wechselseitig kompensieren können. Über die Aminoacylase 3 (ACY3) ist bisher nur wenig bekannt. In der vorliegenden Arbeit wurde erstmals begonnen, menschliches ACY3-Protein zu charakterisieren. Dafür wurde die ACY3 mit der Referenzsequenz ebenfalls in HEK293-Zellen überexprimiert und ein geeigneter Enzymaktivitätstest unter Verwendung von Nα-Chloroacetyl-L-Tyrosin als Substrat. Kinetische Untersuchungen lassen für dieses Substrat auf einen KM-Wert von 1,0-15,1 mM (Vmax von 14,8-100,0 µmol*(g*min)-1) schließen. Die Genexpression der humanen ACY1, ASPA und ACY3 in Niere, Gehirn, Lunge sowie Leber wurde mittels quantitativer Polymerase-Kettenreaktion überprüft. Die höchsten mRNA-Syntheseraten der ACY1 und ACY3 wurden in der Niere detektiert, gefolgt von Gehirn, Leber und Lunge. ASPA wurde am meisten in der Niere und im Gehirn exprimiert. Die Erkenntnisse der vorliegenden Dissertation tragen zu einem besseren Verständnis der molekularen Merkmale der angeborenen Stoffwechseldefekte ACY1- und ASPA-Mangel bei, verbessern die Diagnostik des Morbus Canavan und eröffnen eine Perspektive auf die Labordiagnostik des ACY3-Mangels. VII VIII Inhaltsverzeichnis Veröffentlichungen innerhalb der Promotionszeit Kurzzusammenfassung III VII Inhaltsverzeichnis IX Abkürzungsverzeichnis XIII I Einleitung 1 1 Acetylierung und Deacetylierung von Proteinen .......................................................... 1 2 Aminoacylasen (ACY).................................................................................................. 4 2.1 Aminoacylase 1 (ACY1)....................................................................................... 5 2.2 Aspartoacylase (ASPA)......................................................................................... 9 2.3 Aminoacylase 3 (ACY3)..................................................................................... 13 3 Angeborene Stoffwechseldefekte ............................................................................... 16 3.1 Angeborene Aminosäurenstoffwechseldefekte................................................... 17 3.1.1 Aminoacylase-1-Mangel (ACY1-Mangel) .................................................. 18 3.1.2 Morbus Canavan (CD, ASPA-Mangel)...................................................... 19 4 Detoxifizierung und Toxifizierung durch Mercaptursäuren (S-substituierte N-Acetyl-L-Cysteinkonjugate) .......................................................... 22 5 Zielsetzung .................................................................................................................. 24 II Material 27 1 Materialien .................................................................................................................. 27 1.1 Geräte .................................................................................................................. 27 1.2 Chemikalien, Enzyme, Kitsysteme und Oligonukleotide.................................... 29 1.3 Puffersysteme, Lösungen und Medien ............................................................... 33 1.4 Vektoren .............................................................................................................. 36 1.5 Zellen ................................................................................................................... 36 1.6 Ribonukleinsäuren (RNA) und Antikörper ......................................................... 37 1.5 Software............................................................................................................... 38 III Methoden 41 1 DNA-Isolation aus Zellsediment und Blut.................................................................. 41 2 Mutationsanalysen und Polymerasekettenreaktion (PCR).......................................... 41 3 Multiplex Ligation-dependent Probe Amplification (MLPA) für den Nachweis von Deletionen und Duplikationen im ASPA-Gen ........................ 43 4 Agarosegelelektrophorese........................................................................................... 43 5 Gelextraktion von DNA aus Agarosegelen................................................................. 44 IX 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 Sequenzierung............................................................................................................. 44 RNA-Isolation aus Zellsediment................................................................................. 44 Reverse Transkription ................................................................................................. 45 Quantitative Real-time PCR (qPCR)........................................................................... 45 Klonierung in pcDNA3.1/+ durch Restriktionsverdau und Ligation.......................... 46 Restriktionsfragmentlängenanalyse zur Identifizierung der Sequenzvariante ACY1 c. 1156C>T (p. Arg386Cys) ............................................................................. 50 PCR zum Anfügen von Restriktionsschnittstellen...................................................... 51 Zielgerichtete Mutagenese (engl.: site-directed mutagenesis).................................... 52 Plasmidpräparation im Mini- und Midimaßstab ......................................................... 53 Präparation chemisch kompetenter E. coli DH10B-Zellen......................................... 54 Bakterientransformation.............................................................................................. 54 16.1 E. coli DH10B-Zellen.......................................................................................... 54 16.1 E. coli XL1-Blue-Zellen ...................................................................................... 54 Kolonie-PCR............................................................................................................... 55 Prokaryotische Zellkultur............................................................................................ 56 Eukaryotische Zellkultur............................................................................................. 56 19.1 Humane embyronale Nierenzellen (HEK293-Zellen)......................................... 57 19.2 Immortalisierte humane Lymphozyten................................................................ 57 19.2.1 Vermehrung von Epstein-Barr-Viren (EBV) ........................................ 57 19.2.2 EBV-Transformation ............................................................................ 58 19.2.3 Vermehrung und Subkultivierung der Lymphozytenkultur................... 58 19.2.4 Ernten von immortalisierten Lymphozyten .......................................... 58 19.4 Humane Fibroblasten .......................................................................................... 59 19.3 Sf9-Insektenzellen ............................................................................................... 59 BaculoDirect Protein Expression in Sf9-Insektenzellen............................................. 60 Transfektion von HEK293-Zellen mit Xfect Transfektionsreagenz ........................... 64 21.1 Kultivierung stabiler rekombinanter HEK293-Zelllinien ................................... 65 β-Gal-Färbung transfizierter HEK293-Zellen............................................................. 66 Zellaufschluss mittels Ultraschall zur Gewinnung von Zellhomogenaten ................. 67 ACY1-Enzymaktivitätsassay ...................................................................................... 68 24.1 Ansatz der Proben ............................................................................................... 68 24.2 ACY1-Aktivitätsmessung mit photometrischem Test ........................................ 69 24.3 Verdünnungsreihe ............................................................................................... 70 ASPA-Enzymaktivitätsassay ...................................................................................... 71 ACY3-Enzymaktivitätsassay ...................................................................................... 71 Probenvorbereitung zur Aminosäurebestimmung durch TandemMassenspektrometrie .................................................................................................. 72 Proteinbestimmung nach Lowry ................................................................................. 74 SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese und Western Blot-Analyse .......................... 74 IV Ergebnisse 77 1 Mutationsanalysen und Enzymaktivitätsbestimmung von Patientenproben............... 77 1.1 Bestimmung der ACY1-Enzymaktivität bei Patienten mit einem ACY1-Mangel ..................................................................................................... 78 1.2 ACY1-Mutationsanalysen ................................................................................... 79 X 1.3 Bestimmung der ASPA-Enzymaktivität bei Morbus-Canavan-Patienten........... 81 1.4 ASPA-Mutationsanalysen ................................................................................... 82 1.5 MLPA-Untersuchungen ausgewählter Morbus-Canavan-Patienten ................... 84 2 Restriktions-Fragment-Längen-Analyse des Polymorphismus c.1156C>T (p.Arg386Cys) im ACY1-Gen.................................................................. 86 3 Expressionsanalysen von ACY................................................................................... 87 3.1 Expression von ACY1 in verschiedenen eukaryotischen Zelllinien ................... 87 3.2 Überexpression von ACY1 in HEK293-Zellen................................................... 87 3.3 Überexpression von ACY1 in Sf9-Insektenzellen .............................................. 90 3.4 Überexpression von ASPA in HEK293-Zellen ................................................... 91 3.4.1 Expression der ASPA-mRNA...................................................................... 91 3.5 Vergleich zur Bestimmung der spezifischen ACY1-und ASPA-Enzymaktivität mit Hilfe von photometrischen Tests und Tandem-Massenspektrometrie.......... 94 3.6 Überexpression von ACY3 in HEK293-Zellen................................................... 96 3.7 Kinetische Studien zu ACY3............................................................................... 99 3.8 mRNA-Expression verschiedener ACY in unterschiedlichen humane Organen100 3.9 Komplementationsstudien zwischen ACY1 und ASPA.................................... 101 3.9.1 ACY1-Enzymvarianten in Kombination mit dem ASPA-Enzym mit der Referenzsequenz ....................................................................................... 101 3.9.2 ASPA-Enzymvarianten in Kombination mit dem ACY1-Enzym mit der Referenzsequenz ....................................................................................... 103 V Diskussion 105 1 ACY-Proteinexpression in eukaryotischen Zellmodellen......................................... 105 2 Auswirkung von Mutationen auf die Struktur und Funktion von ACY1-Proteinen. 108 2.1 Deletion der Base Adenin an Position 181 (c.181delA) im ACY1-Gen ............ 108 2.2 Insertion der Basen Adenin und Cytosin an Position 1105 (c.1105_1106insAC) im ACY1-Gen..................................................................................................... 109 2.3 Die Mutation c.475G>A (p.Val159Met) ........................................................... 109 2.4 Die Mutationen c.589C>T (p.Arg197Trp) und c.699A>C (p.Glu233Asp) ...... 110 2.5 Die Mutation c.1057C>T (p.Arg353Cys) ......................................................... 110 2.6 Die Mutation c.1156C>T (p.Arg386Cys) ......................................................... 111 2.7 Die Mutationen c.1132C>T (p.Arg378Trp) und c.1133G>A (p.Arg378Gln) .. 112 2.8 Die Mutationen c.1178G>A (p.Arg393His) und c.1177C>T (p.Arg393Cys) .. 113 2.9 Hat die ACY1 eine regulatorische Funktion als Tumorsupressor oder –promotor? ..................................................................... 113 3 Auswirkung von Mutationen auf die Struktur und Funktion von ASPA-Proteinen . 115 3.1 Die Mutation c.863A>G (p.Tyr288Cys) ........................................................... 115 3.2 Die Mutationen c.884T>C (p.Phe295Ser) und c.914C>A (p.Ala305Glu)........ 116 3.3 Die Mutation c.503G>A (p.Arg168His) ........................................................... 117 3.4 Die Mutation c.541C>A (p.Pro181Thr) ............................................................ 118 4 ASPA-Aktivitätbestimmung bei Patienten mit einem Morbus Canavan.................. 119 4.1 MLPA-Analyse ausgewählter Patienten............................................................ 120 5 Können ACY1 und ASPA die Katalyse der hydrolytischen Spaltung von Nα-acetylierten L-Aminosäuren gegenseitig übernehmen ........................................ 122 6 Aktivitätsassay zur humanen ACY3 (hACY3)......................................................... 124 XI 7 Expression von ACY in menschlichen Organen....................................................... 127 Zusammenfassung 129 Literatur 132 Danksagung 149 Anhang 151 Curriculum Vitae 159 Erklärung an Eides Statt XII Abkürzungsverzeichnis A Abb. Acetyl-CoA ACY ACY1 ACY1-Mangel ACY3 ad AquaMP APH Asp-NAT ASPA ATCC ATP bp BCKD C CD cDNA DNA DCVC DMSO dNTPs DSMZ EBV E. coli EDTA ERK1/2 FKS G G-418 GC-MS GSH hACY1 hACY3 hASPA HAT HEK HDAC HPA HPLC IPTG kbp LB mACY3 Adenin Abbildung Acetyl-Coenzym A Aminoacylasen Aminoacylase 1 Aminoacylase-1-Mangel Aminoacylase 3 auffüllen auf destilliertes Wasser (engl.: Aqua Milli Pore Grade) Nα-Acetylpeptide Hydrolase Aspartat-N-Acetyltransferase Aspartoacylase engl.: American Type Culture Collection Adenosintriphosphat Basenpaare α-Ketosäure-Dehydrogenasekomplex Cytosin Morbus Canavan (engl.: Canavan disease) engl.: complementary DNA Desoxyribonukleinsäure S-1,2-Dichlorvinyl-L-Cystein Dimethylsulfoxid Desoxyribonukleosidtriphosphate Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen Epstein-Barr-Virus Escherichia coli Ethylendiamintetraessigsäure engl.: extracellular-signal regulated kinase1/2 fötales Kälberserum Guanin Geneticin Gaschromatographie-Massenspektrometrie Glutathion humane Aminoacylase 1 humane Aminoacylase 3 humane Aspartoacylase Histonacetyltransferasen menschliche embryonale Nierenzellen (engl.: human embryonic kidney cells) Histondeacetylasen Hyperphenylalaninämie Hochleistungsflüssigkeitschromatographie (engl. high performance liquid chromatography) Isopropyl-b-D-Thiogalaktopyranosid Kilobasenpaare engl.: Lysogeny Broth Aminoacylase 3 aus Mäusen XIII mASPA MLPA MSUD NAA NA-DCVC NADH NAT NCBI NMR NTFA OD600 ORF pACY1 PAH PAGE PBS PKU rACY3 rASPA RNA RSA mRNA rRNA tRNA PCR PNGase F qPCR RT Sf SOC SphKI SDS SNP S1P T Tab. TBE TBST TCE TNF TRAF2 Tris Ü.N. UV WT Aspartoacylase aus Mäusen Multiplex-PCR (engl.: Multiplex Ligation-dependent Probe Amplification) Ahornsirup-Krankheit (engl.: maple sirup urine disease) Nα-Acetyl-L-Asparta N-Acetyl-S-1,2-Dichlorvinyl-L-Cystein Nicotinamid-Adenin-Dinukleotid Nα-Acetyltransferasen engl.: National Center for Biotechnology Information Kernspin-Resonanz-Spektroskopie (engl.: Nuclear magnetic resonance) Nα-Trifluoroacetyl-L-Asparat Optische Dichte bei einer Wellenlänge von 600 nm Offener Leserahmen (engl.: open reading frame) Schweineaminoacylase 1 Phenylalaninhydroxylase Polyacrylamidgelelektrophorese phosphatgepufferten Salzlösung (engl.: phosphate buffered saline) Phenylketonurie Aminoacylase 3 aus Ratten Aspartoacylase aus Ratten Ribonukleinsäuren Rinderserumalbumin engl.: messenger RNA ribosomale-RNA Transfer-RNA Polymerase-Kettenreaktion (engl.: Polymerase Chain Reaction) engl.: Peptide-N4-(N-acetyl-beta-glucosaminyl) asparagine amidase F quantitative Polymerase-Kettenreaktion (engl.: Real-time polymerase chain reaction) Raumtemperatur lat.: Spodoptere frugiperda engl.: Super Optimal Broth with Catabolite repression Sphingosinkinase-Typ-I Natriumdodecylsulfat (engl.: sodium dodecylsulfate) Polymorphismus (engl.: single nucleotide polymorphism) Sphingosin-1-Phosphat Thymin Tabelle Tris-Borat-EDTA-Puffer Tris-gepufferte Kochsalzlösung mit Tween Trichloroethen Tumornekrosefaktor Tumornekrosefaktor-Rezeptor assoziierten Faktor 2 Tris-(hydroxymethyl)-aminoethan über Nacht Ultraviolett Wildtyp XIV Kapitel I Einleitung 1 Acetylierung und Deacetylierung von Proteinen Proteinacetylierung durch Acetyltransferasen wird zunehmend als eine biologisch relevante Modifikation angesehen (Kouzarides, 2000). Sie ist Teil einer Gruppe postranslationaler Modifikationen, welche die Proteinvielfalt erhöht und somit die Kontrolle und Steuerung von Proteinfunktionen maßgeblich beeinflussen kann (Dormeyer et al., 2004). Die Acetylgruppenübertragung von Acetyl-Coenzym A (Acetyl-CoA) erfolgt entweder i) an die ε-Aminogruppe von proteininternen Lysinen oder ii) an die α-Aminogruppe des aminoterminalen Restes von Proteinen (Dormeyer et al., 2004; Polevoda & Sherman, 2000, 2002). Nε-Acetylierung von Lysin Die Acetylierung und Deacetylierung von Chromatinproteinen (Histonen) ist in der Epigenetik von großer Bedeutung, weil die Regulation der Transkription vieler Gene direkt durch Histonacetyltransferasen (HAT) beeinflusst wird. Deacetylierungen von Histonen im Nukleus (assoziiert mit dem Chromatin) können zur Unterdrückung der Translation führen, aber in einigen Fällen auch zur Aktivierung der Genexpression (Pazin & Kadonaga, 1997). HAT sind verantwortlich für die reversible Nε-Acetylierung von Lysin. Abhängig von ihrem Wirkort in der Zelle treten HAT entweder als Typ A oder als Typ B in Erscheinung: i) HAT A acetylieren Histone des Chromatins direkt im Nukleus und spielen wahrscheinlich eine wichtige Rolle bei der Transkription. ii) HAT B hingegen acetylieren neu synthetisierte Histone im Zytoplasma, bevor sie in den Nukleus der Zelle transportiert werden. Im Kern werden die Histone durch sogenannte Histondeacetylasen (HDAC) offenbar wieder deacetyliert und ins Chromatin eingebaut (Allis et al., 1985; Pazin & Kadonaga, 1997; Ruiz-Carrillo et al., 1975). 1 Einleitung Nα-terminale Acetylierung Seit kurzem ist die Nα-terminale Acetylierung auch für unterschiedliche Nicht-HistonProteine beschrieben worden. Sie steuert eine große Zahl zellulärer Funktionen (Sterner & Berger, 2000). Vor etwa 50 Jahren wurde das erste Nα-terminal acetylierte Protein entdeckt (Narita, 1958). Die irreversible Nα-terminale Acetylierung durch Nα-Acetyltransferasen (NAT) ist ein ubiquitär und evolutionär hoch konservierter Prozess und dient vor allem dem Schutz vor Proteindegradation (Berger et al., 1981; Bloemendal, 1977; Jornvall, 1975; Persson et al., 1985). Sie ist aber auch Teil eukaryotischer Proteinprozessierung (Persson et al., 1985; Polevoda & Sherman, 2000; Tsunasawa & Sakiyama, 1984). Bei Synthesen von Polypeptidketten, einem co-translationellen Prozess, liegt die Nα–Acetylierung zu Grunde (Strous et al., 1974). Etwa 50-90 % der eukaryotischen zytosolischen Proteine und Kernproteine (vorwiegend Strukturproteine) sind sowohl co- als auch postranslationell Nα-terminal acetyliert. Prokaryotische Proteine werden jedoch meistens von dieser Art der Modifikation ausgenommen (Brown, 1979; Brown & Roberts, 1976; Driessen et al., 1985; Perrier et al., 2005; Polevoda & Sherman, 2000). Bis heute wurden zweiundzwanzig NAT-ähnliche Gene in vierzehn verschiedenen Pro- und Eukaryoten identifiziert. Die prokaryotischen NAT-Gene unterscheiden sich jedoch stark von den eukaryotischen Genen (Butcher et al., 2001). NAT scheinen eine enge Spezifität aufzuweisen. So werden die Aminosäuren Alanin, Glycin, Methionin, Serin und Threonin bevorzugt acetyliert. Es wird angenommen, dass die Postion nach der Nα-acetylierten Aminosäure entscheidend ist (Driessen et al., 1985; Kendall et al., 1990). Ist ein Methionin am Nα-terminalen Ende des Polypeptids zu finden, folgt ihm eine stark hydrophile Aminosäure (Bradshaw et al., 1998; Driessen et al., 1985; Kendall et al., 1990; Persson et al., 2005). Es können drei NAT unterschieden werden: i) NAT A acetylieren verschiedene Proteine, die einen Serin-, Alanin-, Glycin- oder Threonin-Terminus tragen. ii) NAT B erkennt Proteine mit einem Methionin-Glutamat-, Methionin-Aspartat-, MethioninMethionin- beziehungsweise einem Methionin-Asparagin-Terminus. iii) NAT C katalysiert die Acetylierung von Proteinen, die einen Nα-terminalen Methionin-Isoleucin-, MethioninLeucin-, Methionin-Tryptophan- oder einen Methionin-Phenylalanin-Terminus aufweisen (Polevoda & Sherman, 2000, 2002). Deacetylierung von Nicht-Histon-Proteinen Der Protein-Katabolismus, einschließlich der Deacetylierung von Nicht-Histon-Proteinen, ist bisher noch nicht gänzlich verstanden. Es ist möglich, dass zwei Enzyme maßgeblich am Peptidabbau (Polymer aus 5-30 Aminosäuren) nach der Spaltung des Proteins durch den Ade2 Einleitung nosintriphosphat (ATP)- und Ubiquitin-abhängigen Abbau im Proteasom beteiligt sind (Voet et al., 2002). Proteine werden zunächst in drei Reaktionsschritten mit Ubiquitin markiert, um dann im 26S-Proteasom, einem Multiproteinkomplex, proteolytisch gespalten zu werden (Voet et al., 2002). Peptide, die Nα–terminal durch Acetylierung blockiert sind, werden zunächst durch die Nα-Acetylpeptid Hydrolase (APH) in Nα-acetylierte Aminosäuren zerlegt (Gade & Brown, 1981). Anschließend erfolgt die hydrolytische Spaltung der Nα-acetylierten Aminosäure, katalysiert durch eine Aminoacylase (ACY). Dabei entstehen eine freie Aminosäure und Acetat (Gade & Brown, 1981). Bis jetzt sind drei verschiedene Aminoacylasen beschrieben worden: i) Aminoacylase 1 (ACY1; EC 3.5.1.14), ii) Aspartoacylase (Aminoacylase 2; ASPA; EC 3.5.1.15) und iii) Aminoacylase 3 (ACY3; EC 3.5.1.B16). APH und ACY1 sind beide auf dem Chromosom 3 (3p21) lokalisiert (Erlandsson et al., 1991; Jones et al., 1991; Miller et al., 1990). Es wird vermutet, dass die Proteinsequenzen von APH und ACY1 miteinander verwandt sind, jedoch ist dies noch nicht abschliessend bewiesen worden (Jones et al., 1991). 3 Einleitung 2 Aminoacylasen (ACY) Die Enzymfamilie der ACY spalten Nα-acetylierte Aminosäuren hydrolytisch und stereospezifisch in Acetat und die freie Aminosäure (Lindner et al., 2000b) (Abb. 1-1). Sie sind in Bakterien, Eubakterien, Archaeen und im Pflanzenreich weit verbreitet (Ishikawa et al., 2001; Sakanyan et al., 1993; Story et al., 2001). Nierengewebe von Säugetieren weist eine hohe Aktivität von ACY auf (Lindner, 1999; Lindner et al., 2003). ACY gehören zu den Metalloproteasen, die sich in zwei phylogenetisch verwandte Enzymfamilien M20 und M40 unterscheiden. Die beiden Enzymfamilien (M20 und M40) teilen sich wiederum in zwei Unterklassen auf, Peptidasen und Amidohydrolasen (Lindner et al., 2008b). Abb. 1-1: Reaktionsschema zur Hydrolyse von Nα-Acetyl-L-Methionin in Acetat und L-Methionin. Die hydrolytische Spaltung wird durch ACY1 katalysiert. L-Aminoacylasen spalten spezifisch nur ein Aminosäureenantiomer (L-Form). Aus diesem Grund finden sie in der chemischen Industrie eine breite Anwendung als Biotransformationen für die Auftrennung von N-Acyl-DL-Aminosäuregemische (Parker et al., 2011). Damit nehmen sie einen wirtschaftlich hohen Stellenwert ein. ACY zählen zu den zehn biotechnologisch am häufigsten eingesetzten Enzymen mit steigender Nachfrage für die kommerzielle Nutzung (Tewari, 1990). Die chemische Industrie forscht weiter nach noch unbekannten ACY aus Bakterien oder Archaeen, welche an extreme Umweltbedingungen angepasst sind, wie zum Beispiel verschiedene thermostabile ACY, die unterschiedliche Substratspezifitäten aufweisen (Ngamsom et al., 2010; Parker et al., 2011; Toogood et al., 2002). Die verschiedenen ACY unterscheiden sich in der Spezifität für einzelne Edukte. Bei den bis heute bekannten ACY handelt es sich meist um homodimere Metalloproteine. Es sind 4 Einleitung auch homotetramere Formen identifiziert worden (Cho et al., 1987; Gentzen et al., 1980; Palm & Rohm, 1995; Yang et al., 1994). Alle ACY benötigen ein zweiwertiges Kation zur Ausprägung maximaler Enzymaktivität. Dabei handelt es sich meist um Zink. Aber auch Cobalt, Nickel und Mangan sind als effiziente Metallionen in ACY identifiziert worden (Gilles et al., 1984; Wu & Tsou, 1993). Die ACY1 katalysiert die Umsetzung kurzkettiger, neutraler, aliphatischer Nα-acetylierter Aminosäuren. ASPA hingegen spaltet hydrolytisch das physiologische Substrat Nα-Acetyl-LAspartat (NAA). Die ACY3 wurde bislang nur in Mäusen und Ratten untersucht (Endo, 1978; Pushkin et al., 2004; Tsirulnikov et al., 2009). Sie hydrolysiert unter anderem aromatische Nα-acetylierte L-Aminosäuren (Anders & Dekant, 1994). 2.1 Aminoacylase 1 (ACY1) Schmiedeberg lieferte 1881 als Erster den Nachweis für die Existenz der ACY1 („Histoenzym“) in wässrigen Gewebsauszügen der Schweineniere, indem er die Hippursäurespaltung in Schweine- und Hundenierenextrakten verglich. Er untersuchte auch Proben aus Blut, Leber und Lunge der oben genannten Tierarten (Schmiedeberg, 1881). In den folgenden Jahren untersuchten viele Wissenschaftler die Aktivität des Hippursäure hydrolysierenden Enzyms verschiedener Gewebe wie Niere, Milz, Lunge, Leber, Herz- und Skelettmuskulatur von Hund, Ochse und Pferd. Smorodinzew prägte den Begriff der „Acylase“ (Smorodinzew, 1922). Im Jahr 1952 gelang es Birnbaum et al., die Schweineaminoacylase 1 (pACY1) aus der Niere aufzureinigen (Birnbaum et al., 1952). Zehn Jahre später erfolgte die Bestimmung der Michaeliskonstante für Nα–Acetyl-L-Methionin von 2 mM durch Bruns und Schulze (Bruns & Schulze, 1962). Das Enzym konnte in verschiedenen humanen Geweben wie Gehirn, Niere, Plazenta, Lunge, Hoden und Milz nachgewiesen werden (Cook et al., 1993). Neueste Untersuchungen zeigen, dass die ACY1 auch in humanen Neuroblastomzellen exprimiert wird (Long et al., 2011). Das humane Enzym ACY1 (hACY1) wird durch das Gen ACY1 kodiert, welches auf dem kurzen Arm des Chromosoms 3 (3p21.1) lokalisiert ist. Es besteht aus 15 Exons und verschlüsselt eine 408 Aminosäuren lange Sequenz, die für ein 45,882 kDa großes Protein kodiert (Cook et al., 1993; Miller et al., 1990; Naylor et al., 1982; Naylor et al., 1979). Verschiedene Forschergruppen haben seit 1975 den Katalysemechanismus und die Proteinstruktur der pACY1 sowie der hACY1 untersucht (Lindner et al., 2005; Lindner et al., 2008a; Lindner et al., 2003; Löffler et al., 1986). Sie konnten zeigen, dass die ACY1 zur M20-Proteinfamilie gehört. Die Aminosäurensequenzen der pACY1 (Jakob et al., 1992; Mitta 5 Einleitung et al., 1993) und der hACY1 (Cook et al., 1993; Mitta et al., 1993) wurden 1992 und 1993 veröffentlicht. Es zeigte sich, dass beide Proteine zu 93 % ähnlich sind (Palm, 1994) sowie eine 85 % homologe Aminosäuresequenz aufweisen (Lindner et al., 2000a; Pittelkow et al., 1998). Die Aminosäurensequenz der pACY1 weist zwei potentielle Glykosylierungsmuster auf (Pittelkow et al., 1998). Eine Acetylierung in Folge der postranslationalen Modifikation liegt am Alanin vor, welches die zweite Aminosäure nach dem Start-Methionin darstellt (Pittelkow et al., 1998). Die hACY1 hingegen verfügt in ihrer Aminosäurensequenz über eine mögliche Position für Glykosylierung (Asn252-Lys253-Thr254) in der Peptiddimerisierungsdomäne und über zwei weitere Sequenzen (Asn335-Lys336-Thr337; Asn366-Arg367-Thr368) in der C-terminalen Peptidasedomäne (Sommer et al., 2011). Beide Proteine, pACY1 und hACY1, wurden zunächst in verschiedenen Escherichia coli (E. coli)-Stämmen (E. coli BL21 D3; E. coli Y1089; E. coli Rosetta DE3) exprimiert (Liu et al., 2006; Miller et al., 1990; Van Coster et al., 2005; Wardenga et al., 2008). Die Zellsysteme stellten sich als suboptimal heraus, da sie nur niedrige Expressionsraten erzielten. Zur Verbesserung der Expressionsraten der eukaryotischen pACY1 wurden zusätzlich Chaperone zur Co-Expression in E. coli eingesetzt (Wardenga et al., 2008). Um ausreichende Mengen an pACY1 und hACY1 für eventuelle Proteinkristallisationen und zur Durchführung und Etablierung von Enzymaktivitätstests zu erhalten, wurden Insektenzelllinien des „fall army worms“ Spodoptera frugiperda (Sf9- und Sf21-Insektenzelllinie) mit rekombinanten Baculoviren infiziert (Lindner et al., 2000a; Lindner et al., 2003; Pittelkow et al., 1998). Man versprach sich davon höhere Ausbeuten an reinem pACY1 und hACY1 und zusätzlich neue Rekombinanten der hACY1. (Lindner et al., 2003; Pittelkow et al., 1998). Die Expression der ACY1-Proteine in einem eukaryotischen Zellmodell sollte die korrekte Faltung des Proteins sicherstellen. Solche Zellsysteme verfügen über die gesamte Maschinerie der postranslationalen Modifikation. Sie schließt Glykosylierungen der Proteine mit verschiedenen Kohlenhydraten ein. Lindner et al. konnten eine Mutante der hACY1 (ACY1 Thr347Gly) im Sf21Insektenzellsystem überexprimieren und kristallisieren (Abb. 1-2) (Lindner et al., 2003). Der ACY1-Mutante Thr347Gly fehlen die Aminosäuren 199-320, die während der Anreicherung des Proteins degradiert wurden (Lindner et al., 2003). Trotz des Fehlens der 121 Aminosäuren-langen Sequenz erhielten Linder et al. sowohl wichtige Informationen zum Aufbau des aktiven Zentrums als auch zum Ablauf katalytischer Reaktionen der hACY1. Die hACY1 besteht aus zwei gleichen Monomeren mit einer Größe von je etwa 45 kDa und bildet somit ein 6 Einleitung Homodimer (Kördel & Schneider, 1997a; Lindner et al., 2000a; Lindner et al., 2005; Lindner et al., 2003). Abb. 1-2: hACY1-Homodimer (PDB ID: 1Q7L (Lindner et al., 2003)). Die Kristallstruktur zeigt das dimere Protein der hACY1-Mutante Thr347Gly nach Lindner et al. (2003). Ein Monomer ist in blau, das andere in grau dargestellt. Jedes Monomer bindet zwei Zink-Ionen (violett). Sie gehört zu den evolutionär konservierten zytosolischen, wasserlöslichen Di-ZinkPeptidasen. Die hACY1 hat eine geringe Substratspezifität, hinsichtlich des Aminosäure- und den Acylrests (Biagini & Puigserver, 2001; Birnbaum et al., 1952; Mitta et al., 1993). Die ACY1 deacetyliert bevorzugt unverzweigte, aliphatische Aminosäuren mit kurzkettigen Acylresten, wie zum Beispiel Acetat, Propionat oder Formiat (Anders & Dekant, 1994; Birnbaum et al., 1953; Birnbaum et al., 1952). Die Aminosäuren His80, Asp113, Glu148 und His373 bilden die Zink-bindende Domäne, welche in jedem Monomer vorhanden ist und zwei ZinkIonen über Wasserstoffbrückenbindungen stabilisiert (Abb. 1-3) (Lindner et al., 2003). 7 Einleitung Abb. 1-3: Darstellung des Zink-bindenden Zentrums der ACY1-Mutante Thr347Gly in Komplex mit Glycin (diese Abbildung wurde im Journal of Biological Chemistry eröffentlicht (Lindner et al., 2003) © the American Society for Biochemistry and Molecular Biology). Die Stukturen sind farblich dargestellt: rot für hACY1, grün für CPG2 (Carboxypeptidase G2 von Pseudomonas sp.), braun für PepT (Aminotripeptidase von S. typhimurium), türkis für PepV (Peptidase V von L.delbrueckii), blau für AAP (Aminopeptidase von Aeromonas proteolytica und violett SGAP (Aminopeptidase von Streptomyces griseus). Gezeigt sind nur die Aminosäurenseitenketten. Die Nummerierung der Aminosäuren bezieht sich auf die hACY1. Wenn sich die Domänen der hACY1 zusammenlagern, werden His206, Arg276 und Asn263 der Dimerisierungsdomäne in das aktive Zentrum geschoben. His206 und Asp274 konnten durch gezielte Mutagenese verändert werden. Anschließende Enzymaktivitätstests mit dem Substrat Nα–Acetyl-L-Methionin zeigten, dass beide Aminosäuren eine entscheidende Rolle bei der Katalyse spielen (Lindner et al., 2005). Die Aminosäure Arg276 ist offenbar nicht nur maßgeblich an der Substratbindung beteiligt, sondern auch an der katalytischen Umsetzung des Substrats. Somit wird das His206 einer dimeren Untereinheit durch die Zinkbindende Domäne zum aktiven Zentrum der hACY1 geleitet, damit die Katalyse an der Dimer-Bindungsfläche in „trans“-Stellung stattfinden kann. Die Aminosäure Asn263 scheint für die korrekte Faltung der hACY1 wichtig zu sein, da eine Mutation (Asn263Ala) an dieser Stelle eine partielle Proteindegradation zur Folge hat (Lindner et al., 2005; Lindner et al., 2003). Die ACY1 wird seit 2005 als Schlüsselenzym einer vererbbaren Stoffwechselstörung, des Aminoacylase-1-Mangels (ACY1-Mangel), betrachtet (Sass et al., 2006; Van Coster et al., 2005). Mutationen im ACY1-Gen können die Funktionalität des ACY1-Enzyms beeinträchtigen. Die autosomal-rezessiv vererbte Stoffwechselstörung ACY1-Mangel beruht auf Defekten im ACY1-Gen. Patienten, bei denen ein ACY1-Mangel nachgewiesen wurde, sind mehrheit8 Einleitung lich neurologisch auffällig (Engelke et al., 2008; Sass et al., 2006; Sass et al., 2007; TylkiSzymanska et al., 2010; Van Coster et al., 2005). Die Kausalität des ACY1-Mangels wird in Kapitel I Abschnitt 3.1.1 weiter betrachtet. Seit einigen Jahren wird die ACY1 auch in Zusammenhang mit onkologischen Fragestellungen gebracht. So soll die ACY1 als Tumorsupressor in Nieren- und Lungenkarzinomzellen wirken (Cook et al., 1998; Zhong et al., 2009). Die hACY1 beeinflusst zudem die Sphingosinkinase-Typ-I (SphKI)-Enzymaktivität und deren Lokalisation innerhalb der Zelle (Maceyka et al., 2004). Die SphKI hat indirekte regulatorische Wirkung auf apoptotische und proliferative Prozesse. Sie interagiert mit dem Tumornekrosefaktor (TNF)-Rezeptor assoziierten Faktor 2 (TRAF2), was eine Supression der Apoptose durch TNF-α zur Folge haben kann (Xia et al., 2002). Die Wechselwirkung von hACY1 mit der SphKI könnte zur Zellproliferation und Hemmung der Apoptose führen. Sie ist möglicherweise auch für die Umlagerung der SphKI vom Zytosol zur Membran verantwortlich (Maceyka et al., 2004). 2.2 Aspartoacylase (ASPA) Die ASPA (auch als Aminoacylase 2 bezeichnet) ist, wie die ACY1, ein homodimeres Metalloprotein (Abb. 1-4) (Makarova & Grishin, 1999). Sie wird der CarboxypeptidaseEnzymfamilie zugeordnet. Ein 37 kDa großes Monomer bindet ein Zink-Ion (Bitto et al., 2007; Le Coq et al., 2006). Jedes der beiden Monomere besteht aus 313 Aminosäuren. Das ASPA-Gen umfasst 6 Exons und ist auf dem kurzen Arm des Chromosoms 17 (17p13-ter) lokalisiert (Kaul et al., 1993; Matalon et al., 1988). 9 Einleitung Abb. 1-4: hASPA-Homodimer (PDB ID: 2I3C (Bitto et al., 2007)). Die Kristallstruktur zeigt das dimere Protein der hASPA-Mutante. Ein Monomer ist in orange, das andere in grau dargestellt. Jedes Monomer bindet je ein Zink-Ion (violett). Die Aminosäurensequenz der ASPA weist eine Glykosylierungssequenz (Asn117-Thr118Thr119) auf (Kaul et al., 1993; Le Coq et al., 2006). Le Coq et al. gelang es 2006 die humane ASPA mit der Referenzsequenz und eine Rekombinante in der Hefezellline KM71H aus Pichia pastoris zu exprimieren (Le Coq et al., 2006). Sie untersuchten den Kohlenhydratanteil von ASPA und dessen Einfluss auf die Proteinstruktur, indem sie die Aktivität des Referenzenzyms mit einer ASPA-Rekombinante verglichen. Diese wies eine Mutation an der Glykosylierungsstelle Asn117 auf (Asn117Gln). Zudem wurde die N-glykosidische Bindung mit Hilfe des spezifischen PNGase F-Enzyms (engl.: Peptide-N4-(N-acetyl-beta-glucosaminyl) asparagine amidase F) gespalten und der Kohlenhydratrest von ASPA getrennt. ASPAEnzymaktivitätsvergleiche zeigten einen Verlust der Aktivität für die ASPA-Variante mit der Mutation Asn117Gln und das ASPA-Protein ohne Kohlenhydratrest (Le Coq et al., 2006). Diese Ergebnisse bewiesen, dass es sich bei ASPA um ein N-glykosyliertes Protein handelt (Le Coq et al., 2006). Glykosylierungen erhalten sowohl die Stabilität als auch die katalytische Aktivität von Proteinen (Moore et al., 2003). Bitto et al. (2007) konnten maßgeblich zur Aufklärung der Proteinstruktur des ASPAEnzyms beitragen. Es gelang ihnen, humane (hASPA) und ASPA aus Ratten (rASPA) zu kristallisieren. Beide Enzyme (rASPA und hASPA) sind in ihrer Aminosäurensequenz zu 10 Einleitung 86 % identisch und weisen eine Ähnlichkeit von 95 % auf (Bitto et al., 2007). Le Coq et al. gelang es anschliessend, die hASPA im Komplex mit einem tetraedrischen Substratanalogon darzustellen (Le Coq et al., 2008). Dadurch konnten weitere Informationen zum Ablauf der Katalyse erhalten werden. So wird das aktive Zentrum von sieben Aminosäuren gebildet (Arg63; Asn70; Arg71; Tyr164; Arg168; Glu178 und Tyr288), wobei Arg168 und Tyr288 das spezifische Substrat Nα–Acetyl-L-Aspartat stabilisieren (Abb. 1-5) (Bitto et al., 2007; Le Coq et al., 2008). Das dimere Enzym zeichnet sich durch eine große Kontaktfläche zwischen beiden Monomeren aus (Le Coq et al., 2008). ASPA katalysiert die hydrolytische Spaltung von Nα–Acetyl-L-Aspartat (NAA) zu Acetat und der freien Aminosäure Aspartat (Birnbaum et al., 1953; Birnbaum et al., 1952; Matalon et al., 1988). Abb. 1-5: Hypothetischer Katalysemechanismus der ASPA (abgebildet mit der Erlaubnis von (Le Coq et al., 2008); Copyright (2012) American Chemical Society). In A ist der nukleophile Angriff durch das NAA zur Bildung des tetraedrischen Zwischenproduktes B gezeigt. Dabei folgt die Reaktion einem Mechanismus, der dem Carboxypeptidase-Typ ähnelt. Der Zusammenbruch des Zwischenproduktes resultiert in der Produktion von L-Aspartat und Acetat (C). Birnbaum et al. konnten bereits 1952 ASPA-Aktivität im Nierenhomogenat von Schweinen nachweisen (Birnbaum et al., 1952). In Enzymaktivitätstests in verschiedenen Geweben von Hühnern zeigte sich eine hohe ASPA-Aktivität im Nierengewebe und niedrige Aktivität im Herz- und Brustmuskel (D'Adamo et al., 1978). Shu et al. wiesen ASPA-Genexpression in verschiedenen Organen (Leber, Dünndarm, Muskel und Niere) von Schweinen nach (Shu et 11 Einleitung al., 2008). ASPA-Enzymaktivitätstests wurden bereits 1988 in Fibroblastenkulturen von Morbus-Canavan-Patienten durchgeführt (Matalon et al., 1988). Um Aussagen zur Lokalisation von ASPA im Gehirn zu treffen, wurden Untersuchungen an kultivierten Gehirnzellen durchgeführt. Zunächst konnte ASPA-Enzymaktivität in Oligodendrozyten von Ratten nachgewiesen werden (Baslow et al., 1999). Immunhistochemische Untersuchungen von Geweben mit spezifischen Antikörpern gegen hASPA oder ASPA aus Mäusen (mASPA) bestätigten die Expression des Enzyms in Oligodendrozyten in Gehirnen von Nagetieren (Klugmann et al., 2003; Madhavarao et al., 2004). Erst kürzlich, im Jahr 2010, konnten Long et al. zeigen, dass ASPA-Expression auch in verschiedenen humanen Neuroblastomzelllinien (SK-N-SH und SMS-KCNR) zu finden ist (Long et al., 2011). Diese und frühere Studien zeigten, dass ASPA zu einer Enzymfamilie gehört, bei welcher Enzyme sowohl im Zytosol als auch im Zellkern lokalisiert sein können (Hershfield et al., 2006; Madhavarao et al., 2004). Das ASPA-Enzym mit der Referenzsequenz wurde zunächst in E. coli–Stämmen exprimiert (Di Pietro et al., 2008; Kaul et al., 1993). Entsprechende Versuche zeigten jedoch schnell, dass die Aktivität der ASPA aus Prokaryoten sehr gering ist. Im Gegensatz dazu wiesen ASPA-Proteine bedeutend höhere Aktivitäten auf, wenn diese in der eukaryotischen Zelllinie COS (SV40transformierte Nierenfibroblasten-Zelllinie der Grünen Meerkatze (Cercopithecus aethiops)) oder in Hefezellen von Pichia pastoris exprimiert wurden (Gluzman, 1981; Hershfield et al., 2007; Janson et al., 2006; Kaul et al., 1994; Surendran et al., 2003). ASPA wird vorwiegend in der weißen Substanz des Gehirns exprimiert, speziell in den Oligodendrozyten. Durch die Spaltung von NAA durch ASPA wird Acetat freisetzt, welches eine Rolle spielt bei der Lipidsynthese während der Myelinisierung von Axonen (D'Adamo et al., 1973). Aus diesem Grund kann vermutet werden, dass die Funktion von ASPA in einem möglichen Zusammenhang mit dem autosomal rezessiv vererbten Morbus Canavan steht (engl.: Canavan Disease) (Chakraborty et al., 2001; D'Adamo & Yatsu, 1966). NAA wird primär in Neuronen synthetisiert und ist dort bis zu einer Konzentration von 20 mM vorhanden (Baslow, 2003). Der Stoffwechselkreislauf von NAA ist ungewöhnlich, da es zwischen seiner Synthese in Neuronen und seinem Abbau an Oligodendrozyten wechselt. Die physiologische Aufgabe des NAA im Gehirn wird seit Jahren diskutiert und erforscht (Baslow, 2003; Baslow & Guilfoyle, 2009). Die Rolle von ASPA und NAA im Zusammenhang mit Morbus Canavan wird Kapitel I Abschnitt 3.1.2 genauer erläutert. 12 Einleitung 2.3 Aminoacylase 3 (ACY3) Greenstein et al. untersuchten 1961 die Aktivität von ACY aus Nierengewebe. Sie zeigten, dass eine bestimmte ACY bevorzugt aromatische Nα–acetylierte L-Aminosäuren umsetzt und bezeichneten dieses Enzym als Aminoacylase 3 (ACY3) (Greenstein & Winitz, 1961). Im Jahr 1978 griff Endo diese Erkenntnisse auf und vertiefte die Untersuchungen für gewonnene ACY aus Rattennieren (Endo, 1978). Nachdem er ACY1 und ACY3 erfolgreich durch Säulenchromatographie trennte, testete er die Spezifität beider ACY auf verschiedene Substrate. Dabei stellte er fest, dass ACY3 bevorzugt Nα–Acetyl-L-Tyrosin und Nα–Acetyl-L-Phenylalanin umsetzte, D-Isomere hingegen nicht. Nα–Acetyl-L-Histidin wurde besser durch ACY1 gespalten. Er zeigte für Nα–Chloroacetyl-L-Tryptophan eine deutliche Steigerung der Enzymaktivität der ACY3 (Endo, 1978). Pushkin et al. und Tsirulnikow et al. untersuchten die Struktur und Funktion der ACY3 aus Mäusen (mACY3) (Pushkin et al., 2003). Die native mACY3 ist ein Homotetramer mit einer Größe von 140 kDa (Pushkin et al., 2003). Dieses Protein aus 318 Aminosäuren faltet sich zu einem Monomer von etwa 35 kDa. Die mACY3 und mASPA haben eine zu 42 % identische Aminosäurensequenz (Hsieh et al., 2010; Newman et al., 2007). Die Aminosäuren His21, His116 und Glu24 in mASPA, die sich vermutlich an der Zink-Ion-Koordination im Protein beteiligen (Bitto et al., 2007; Hsieh et al., 2010), sind auch in der mACY3 konserviert (Newman et al., 2007; Pushkin et al., 2003). Es wird vermutet, dass es sich bei der mACY3 auch um ein Zink-bindendes Metalloprotein handelt (Tsirulnikov et al., 2009). Tsirulnikow et al. (2009) zeigten nach der Deaktivierung der mACY3 eine Wiederherstellung der Enzymaktivität des mACY3-Holoenzyms bei Zugabe von Zn2+ und Fe2+. Die hypothetischen katalytischen Aminosäuren der mACY3 stimmten stark mit denen der ASPA und Carboxypeptidase A überein (Hsieh et al., 2010). Somit gehören His21, Glu24, Arg63, Asp68, His116 und Glu177 zum aktiven Zentrum der mACY3, wobei His21, Glu24 und His116 ein Zink-Ion koordinieren (Hsieh et al., 2010). In der vorhandenen Literatur finden sich ausschließlich Studien zur mACY3 (Pushkin et al., 2003; Tsirulnikov et al., 2009) oder zu dem Enzym aus Ratten (Endo, 1978; Hanson & Hermann, 1958). Jedoch gibt es in der öffentlichen National Center for Biotechnology Information (NCBI)-Datenbank auch Informationen zur humanen ACY3 (hACY3)1. Danach kodiert ein ACY3-Gen auf Chromosom 11 (11p13.2) für 8 Exons. Die Proteinstruktur der hACY3 wird durch 319 Aminosäuren gebildet. Sie ist hoch konser- 1 [http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gene/91703#reference-sequences] 13 Einleitung viert und zeigt im Vergleich zur mACY3 und ACY3 aus Ratten (rACY3) nur wenig Abweichung in der Aminosäurensequenz (Abb. 1-6). Abb. 1-6: Schema zur Übereinstimmung der ACY3-Aminoäuresequenz zwischen Mensch, Maus und Ratte. Unterschiedliche Bereiche in den Aminosäurensequenzen sind grau unterlegt. Die Aminosäuren His21, His24 und His116 koordinieren das Zink-Ion im ACY3-Protein und sind in der Abbildung hellblau unterlegt. Arg63, Asp68 und Glu117 bzw. Glu178 tragen maßgeblich zur der katalytischen Umsetzung Nα-acetylierter Aminosäuren durch ACY3 bei. Die gelb unterlegten Abschnitte zeigen mögliche Glykosylierungsstellen im ACY3-Protein, die sich bei Betrachtung gemäß des Modells für Glykosylierungssequenzen von Szymanski et al. ergaben (Szymanski et al., 1999) . ACY3 deacetyliert neben aromatischen Nα–acetylierten L-Aminosäuren auch Nα–Acetyl-SBenzyl-L-Cystein zu Mercaptursäuren (Pushkin et al., 2003). Mercaptursäuren können toxisch auf die Niere wirken, nachdem sie durch eine Reaktionsfolge von ACY und β-Lyase verstoffwechselt werden. Das deacetylierte Reaktionsprodukt ist per se ungiftig, jedoch wird es toxisch aufgrund der anschließenden Reaktion mit der Cystein-S-konjugierten β-Lyase (Anders & Dekant, 1998; Dekant et al., 1989, 1994). Auf die Detoxifizierung bzw. Bioaktivierung wird in Kapitel I Abschnitt 4 näher eingegangen. Im Menschen kann die ACY3 zu einer Beeinträchtigung der Gesundheit führen, da sie möglicherweise an der Toxifizierung durch Trichloroethen (TCE) beteiligt ist (Hsieh et al., 2010). TCE wird als Lösungsmittel und vor allem zur Entfettung von Metallen, Plastikwaren und Textilen industriell genutzt (Browning, 1965; Ikeda, 1977). Diese umweltschädliche Chemikalie wurde im Boden sowie im Grundwasser gefunden und hat eine toxische Wirkung Niere und Leber (Cummings & Lash, 2000; Maltoni et al., 1988; Newman et al., 2007). Gelangt TCE in den menschlichen Organismus, wird es im Mercaptursäureweg verstoffwechselt. Dabei kommt es zur Bildung 14 Einleitung von N-Acetyl-S-1,2-Dichlorvinyl-L-Cystein (NA-DCVC), welches zum größten Teil über den Urin ausgeschieden wird (Birner et al., 1997; Dekant et al., 1994). hACY3 deacetyliert NA-DCVC zu S-1,2-Dichlorvinyl-L-Cystein (DCVC) (Pushkin et al., 2003), welches möglicherweise durch β-Lyasen oder Flavin-abhängige Monooxygenasen in hochgiftige Reaktionsprodukte umgewandelt wird. Als Folge kann es zu Nierenversagen und zu toxischen Wirkungen auf Gehirn und Leber kommen (Bull, 2000; Dekant et al., 1994; Lash et al., 2003; Uttamsingh & Anders, 1999). 15 Einleitung 3 Angeborene Stoffwechseldefekte Der englische Begriff der „inborn errors of metabolism“ (angeborene Stoffwechselstörungen) geht zurück auf Garrod (Garrod, 1909a). Er beschrieb, dass ein vererbter Stoffwechseldefekt zu einer Anreicherung eines bestimmten Stoffwechselproduktes (Metabolit) in Körperzellen oder -flüssigkeiten führen kann. Dieser Metabolit im Speziellen könnte prädisponierend für eine Störung im Stoffwechsel sein (Garrod, 1909b; Gray et al., 2000). Bereits 1902 konnte Garrod als Erster die biochemischen Merkmale in Bezug auf Alkaptonurie erklären (Burgio, 1986; Garrod, 1902; Pierce et al., 2011; Scriver, 2008). Er erkannte, dass die Struktur und die Funktion eines Enzyms durch ein einziges Gen gesteuert sein können (Burgio, 1986; Garrod, 1902). Beeinflusst von der Vererbungslehre Mendels (1865) und den Theorien Darwins (Burgio, 1986) konnte er in einigen Fällen angeborener Stoffwechselstörungen zeigen, dass im Vorfeld eine Konsanguinität der Eltern vorhanden war und kam zum Schluss, dass diese Defekte rezessiv vererbten Ursprungs sind (Burgio, 1986; Garrod, 1909a). Heute sind mehr als etwa 1 100 verschiedene angeborene Stoffwechseldefekte bekannt (SSIEM, 2006). Die meisten davon wurden bei Kindern diagnostiziert (Gray et al., 2000). Dies könnte daran liegen, dass Formen von angeborenen Stoffwechseldefekten bei Kindern meist schwerwiegende Folgen haben und deshalb schneller erkannt werden (Gray et al., 2000). Etwa 2,5 % der Kinder bis zum 5. Lebensjahr sind weltweit von geistigen Einschränkungen durch Stoffwechselstörungen betroffen (van Karnebeek & Stockler, 2012). Aber auch bei erwachsenen Patienten werden Fälle von angeborenen Störungen einiger Stoffwechselwege diagnostiziert, wobei die Hypothese eines milden Verlaufs des angeborenen Defektes besteht (Gray et al., 2000). Angeborene Stoffwechselstörungen bilden eine Gruppe von seltenen genetischen Defekten. Dabei handelt es sich um Störungen im Aminosäuren-, Kohlenhydrat-, Lipid- und Lipidproteinstoffwechsel, in den Stoffwechselwegen der Porphyrin- oder Häm-Synthese, bzw. um Defekte in der Funktion von Peroxisomen, um nur einige zu nennen (Zschocke & Hoffmann, 2012). Das Spektrum an Therapiemöglichkeiten ist in den letzen Jahren gewachsen (van Karnebeek & Stockler, 2011). Immer noch stehen Medizin und Wissenschaft vor grossen Herausforderungen, die Komplexität, Variabilität und die verschiedenen klinischen Ausprägungen dieser Defekte besser zu verstehen. Insbesondere das schnelle Erkennen angeborener Stoffwechselstörungen bei Kindern ist essentiell, um gravierende Beeinträchtigungen von körperlicher und geistiger Entwicklung zu verhindern (Burton, 1998). Eine schnelle Diagnose erhöht 16 Einleitung die Wahrscheinlichkeit, permanente Schäden abzuwenden oder gar Todesfälle zu vermeiden und bietet vielen Patienten die Möglichkeit, eine geeignete Therapie zu finden. 3.1 Angeborene Aminosäurenstoffwechseldefekte Defekte im Aminosäurenstoffwechsel können im Kindesalter, aber auch bei Erwachsenen diagnostiziert werden. Die Phenylketonurie (PKU) ist eine der am besten untersuchten autosomal rezessiv vererbten Aminosäurenstoffwechselstörungen (Fölling, 1934; Penrose, 1935; Scriver, 2007). Sie tritt mit einer Häufigkeit von 1:10 000 auf (Maccready & Hussey, 1964; Steinfeld et al., 2004). Bei der PKU liegt eine Aminoacidopathie vor, die durch einen Mangel an Phenylalaninhydroxylase (PAH)-Aktivität verursacht wird. PAH katalysiert in gesunden Individuen die Umsetzung von Phenylalanin zur Aminosäure Tyrosin. Bei Patienten mit PKU kommt es zu einer Anreicherung der Aminosäure Phenylalanin und schliesslich zu Hyperphenylalaninämie (HPA) (Fölling, 1934; Jervis, 1954). Bleibt die PKU unbehandelt, kann dies toxische Folgen für das Gehirn haben und eine geistige Behinderung des Patienten nach sich ziehen (Scriver, 2007). Ende der 60er-Jahre des zwanzigsten Jahrhunderts wurde in Deutschland das Neugeborenenscreening auf PKU eingeführt, womit der Präventivmedizin ein bezeichnender Schritt gelang. Wird aufgrund des Screenings die PKU detektiert, kann dem Neugeborenen sofort die geeignete Diät verabreicht werden, um neurologische Schäden zu vermeiden. Bei dieser Methode, reicht ein Tropfen Blut aus der Ferse des Säuglings, um angeborene Stoffwechseldefekte zu detektieren (Guthrie & Susi, 1963). Scriver et al. (1964) schlugen vor, ein multiples Screening für mehrere verschiedene Defekte einzusetzen (Scriver et al., 1964). Seit 1998 konnten Pilotversuche zum Einsatz der Tandem-Massenspektrometrie für das metabolische Neugeborenenscreening vielversprechende Ergebnisse liefern (Lindner et al., 2001; Roscher et al., 2001). Im Jahr 2005 wurde in Deutschland das Neugeborenenscreening durch die Einführung der Tandem-Massenspektrometrie neu geregelt und der Screeningeffekt erheblich verbessert (Ceglarek, 2007). Die Ahornsirup-Krankheit (engl.: maple sirup urine disease [MSUD]) ist eine angeborene Stoffwechselstörung, deren Häufigkeit im Jahr 1973 noch auf 1:290 000 geschätzt, heute aber mit 1:100 000 deutlich höher beschrieben wurde (Ceglarek, 2007; Levy, 1973). Bei dieser Krankheit kann es durch Mutationen in mindestens einem der vier Gene des α-KetosäureDehydrogenasekomplex (BCKD) zu Störungen im Abbau der verzweigtkettigen Aminosäuren Leucin, Isoleucin und Valin kommen. Bei Patienten mit einer MSUD werden erhöhte Konzentrationen von Leucin, Valin und Isoleucin im Plasma diagnostiziert. Im Urin der Patienten werden vermehrt verzweigtkettige Oxo und Hydroxysäuren detektiert (Zschocke & Hoff17 Einleitung mann, 2012). Klinische Anzeichen für schwere Formen der MSUD können sich durch Lethargie, Trinkschwäsche bis hin zum Koma präsentieren (Zschocke & Hoffmann, 2012). Milde Formen der MSUD kennzeichnen sich beispielsweise durch Entwicklungsverzögerungen oder progrediente neurologische Störungen (Strauss et al., 1993; Zschocke & Hoffmann, 2012). In einigen Fällen kommt es zu einem charakteristischen Geruch des Urins nach Ahornsirup (Zschocke & Hoffmann, 2012). Oft können erste Anzeichen für angeborene Stoffwechseldefekte schon durch die Analyse von Metaboliten im Blut im Rahmen des Neugeborenenscreenings detektiert werden. Bei neurologisch auffälligen Kindern wurden Konzentrationen an N-acetylierten Aminosäuren im Urin gemessen. Es zeigte sich, dass Kinder mit ACY1-Mangel erhöhte Konzentrationen an N-acetylierten Aminosäuren ausscheiden (Engelke et al., 2008; Sass et al., 2006; Sass et al., 2007; Tylki-Szymanska et al., 2010; Van Coster et al., 2005). So konnte unter anderem die autosomal rezessiv vererbte Stoffwechselstörung Aminoacylase 1-Mangel (ACY1- Mangel) entdeckt werden (Engelke et al., 2008; Sass et al., 2006; Sass et al., 2007; Van Coster et al., 2005). 3.1.1 Aminoacylase-1-Mangel (ACY1-Mangel) Im Jahr 2005 beschrieben Van Coster et al. erstmals einen Patienten, der eine Mutation im ACY1-Gen (c.1057C>T; p.Arg353Cys) und eine hohe Konzentration von Nα-acetylierten Aminosäuren im Urin aufwies. Zudem fielen pathologische Veränderungen im Gehirn auf. Lymphozyten des Patienten, die im Labor mit dem Epstein-Barr-Virus (EBV) immortalisiert wurden, zeigten keine ACY1-Enzymaktivität. Basierend auf diesen Ergebnissen definierten Van Coster et al. den ACY1-Mangel (Van Coster et al., 2005). Zur gleichen Zeit konnten Sass et al. (2006) vier weitere Kinder mit einem Mangel an ACY1 identifizieren. Bei gaschromatographischen Untersuchungen der organischen Säuren im Urin der Patienten wurden auffällig hohe Konzentrationen an Nα-Acetylmethionin, Nα-Acetylglutamat, Nα-Acetylalanin, Nα-Acetylleucin, Nα-Acetylisoleucin, Nα-Acetylvalin und Nα-Acetylglycin festgestellt. Auch ACY1-Aktivitätsmessungen der EBV-transformierten Lymphozyten bestätigten den ACY1-Mangel (Sass et al., 2006). Jedoch waren die klinischen Auffälligkeiten der vier Patienten sehr unterschiedlich und reichten von motorischen Entwicklungsstörungen über Entwicklungsstörungen mit einhergehender Atrophie des Vermis Cerebellum bis zur Syringomyelie (Sass et al., 2006). Sass et al. konnten unterschiedliche Mutationen im ACY1-Gen detektieren und die c.1057C>T Mutation, die zu einem Aminosäurenaustausch von Arg353 zu einem Cystein führt, unabhängig nachweisen (Sass et al., 2006; Van Coster et al., 2005). Eine 18 Einleitung weitere Missense-Mutation c.699A>C (p.Glu233Asp), sowie die Insertion von zwei Nukleotiden (A und C) an Position c.1105^1106 im Gen und eine Intronmutation (IVS5-1G>A) wurden in den Patienten durch Mutationsanalyse entdeckt (Sass et al., 2006). Drei weitere ACY1Mangel-Fälle konnten 2007 von Sass et al. beschrieben werden, von denen zwei Patienten die Mutation c.1057C>T (p.Arg353Cys) aufwiesen (Sass et al., 2007). Jedoch wurden auch zwei neue Missense-Mutationen aufgedeckt, die c.589C>T (p.Arg197Trp) und c.1178G>A (p.Arg393His). Bei diesen drei Patienten zeigte sich wiederholt ein sehr variables Spektrum klinischer Anzeichen. So traten neben leichter geistiger Behinderung auch Fieberkrämpfe auf (Sass et al., 2007). Nα-acetylierte Aminosäuren in Urin können sowohl mit Gaschromatographie-Massenspektrometrie (GC-MS) als auch mit Kernspin-Resonanz-Spektroskopie (engl.: Nuclear magnetic resonance (NMR)) detektiert werden und zur Aufklärung eines ACY1-Mangels und zur Detektion eines Morbus Canavan (ASPA-Mangels; Kapitel 1 Abschnitt 3.1.2) dienen (Engelke et al., 2008). 3.1.2 Morbus Canavan (CD, ASPA-Mangel) Der Morbus Canavan ist eine Krankheit aus dem Formenkreis der Leukodystrophien, einer heterogenen Gruppe von Krankheiten, die vorwiegend das Myelin betreffen (Gärtner et al., 2007). Myelin ist Hauptbestandteil der weißen Substanz des Gehirns sowie des Rückenmarks (Costello et al., 2009; Gärtner et al., 2007). Patienten mit einem Morbus Canavan präsentieren sich häufig bereits im frühen Säuglingsalter mit Dystonie (unwillkürliche Muskelanspannungen ausgelöst durch eine fehlerhafte Ansteuerung des Gehirns) sowie neurologischen Symptomen wie Krampfanfällen, Spastik und Blindheit. Zudem besteht typischerweise ein Makrozephalus. In der Regel führt der Morbus Canavan innerhalb der ersten drei Lebensjahre zum Tod (Beaudet, 2001). Ursächlich liegt dem Morbus Canavan ein Mangel des Enzyms ASPA zugrunde (bedingt durch Mutationen im ASPA-Gen) (Beaudet, 2001). Der Mangel an ASPA führt zu einer Akkumulation von NAA in Gehirn, Liquor und Urin. Die erhöhte NAAKonzentration im Gehirn kann NMR-spektroskopisch nachgewiesen werden. Zudem ist die vermehrte Exkretion von NAA im Urin diagnostisch wegweisend. NAA entsteht bei Umsetzung der Aminosäure Aspartat mit Acetyl-CoA durch das Enzym Aspartat-NAcetyltransferase (Asp-NAT) (Moffett et al., 2007) und gilt als Marker für Neuronen-Dichte und -Integrität (Rigotti et al., 2007). NAA findet sich in physiologischem Zustand in hohen Konzentrationen von bis zu 20 mM in Neuronen (Baslow, 2003; Wiame et al., 2010). Ihm wird eine mögliche Schlüsselrolle in der Biochemie des Zentralnervensystems zugesprochen (Moffett et al., 2007). 19 Einleitung Die hydrolytische Spaltung von NAA durch ASPA in Acetat und L-Aspartat wurde in kultivierten Oligodendrozyten von Ratten detektiert (Baslow & Guilfoyle, 2009; Baslow et al., 1999). Bhakoo et al. konnten ASPA-Aktivität in der weißen Substanz von Rattengehirnen nachweisen und zeigten zugleich einen Aktivitätsanstieg während der Entwicklung dieses Organes und der damit einhergehenden Myelinisierung (Bhakoo, 2001). Es gibt zwei Hypothesen, die eine Demyelinisierung in Verbindung mit dem Morbus Canavan beschreiben: i) Acetat als Spaltprodukt von NAA wird zur energieabhängigen Myelinisierung von Oligodendrozyten genutzt (Baslow & Guilfoyle, 2009). Ein Acetatmangel aus der ASPA-katalysierten Reaktion könnte zur Inhibition der Myelinsynthese führen (Moffett et al., 2007). ii) Bei der osmotisch-hydrostatischen Hypothese ist nicht der Mangel an Acetat aus der Spaltung von NAA der Grund der Demyelinisierung, vielmehr fördert die Anwesenheit von nicht hydrolysiertem NAA selbst die Demyelinisierung (Baslow, 2003). ASPA-Enzymaktivität wurde nicht nur in der weißen Substanz des Gehirns gefunden, sondern auch in der grauen Substanz, welche 60 % des Gehirns ausmacht (Inglese et al., 2008). Die primäre Funktion von ASPA ist möglicherweise die Katalyse der hydrolytischen Spaltung von NAA aus der extrazellulären Flüssigkeit des Gehirns (Baslow & Guilfoyle, 2009). ASPAEnzymaktivität wurde durch immunhistochemische Untersuchungen ausschließlich in den Oligodendrozyten-Somata der grauen und weißen Substanz in Rattengehirnen lokalisiert. Die Myelinschichten wiesen keine ASPA-Aktivität auf (Klugmann et al., 2003; Madhavarao et al., 2004). Diese Studien zeigen, dass zwar in kompaktem Myelin keine ASPA-Aktivität zu finden ist, aber dass sich in den ersten lockeren Myelinschichten um das Axon oligendrozytisches Zytosol befindet, in welchem sich zytosolisches wie membrangebundenes ASPA nachweisen lässt (Baslow & Guilfoyle, 2009). Beim Morbus Canavan handelt es sich um eine angeborene Störung des Aminosäurenstoffwechsels (vererbte Leukodystrophie), ausgelöst durch einen Mangel an ASPA. Diese Krankheit wird autosomal rezessiv vererbt (Beaudet, 2001). Die Mehrheit der Morbus Canavan-Patienten findet sich in der Bevölkerungsgruppe der Ashkenazi-Juden, jedoch zeigt sich der Stoffwechseldefekt auch in anderen ethnischen Gruppen (Elpeleg & Shaag, 1999; Kaul et al., 1994; Shaag et al., 1995). Bei 97 % der Ashkenazi-Juden mit einem Morbus Canavan sind die zwei Mutationen p.Glu285Ala und p.Tyr231X zu finden (Elpeleg et al., 1994; Kaul et al., 1994). Weitaus mehr unterschiedliche Mutationen kommen in nicht-jüdischen, vom Morbus Canavan betroffenen Individuen vor. Die Mutation p.Ala305Glu ist die am häufigsten detektierte Veränderung im ASPA-Gen in europäischen, nicht-jüdischen Patienten (Elpeleg & Shaag, 1999; Kaul et al., 1994; Kaul et al., 1996; Shaag et al., 1995). Bis heute ist jedoch eine 20 Einleitung Vielzahl von Missense-Mutationen und Deletionen im ASPA-Gen bekannt und es werden immer wieder neue entdeckt, die zur Manifestation eines Morbus Canavan führen können. 21 Einleitung 4 Detoxifizierung und Toxifizierung durch Mercaptursäuren (S-substituierte N-Acetyl-L-Cysteinkonjugate) Die Entgiftung mit Hilfe des Mercaptursäurewegs (Abb. 1-7) ist ein schon lange bekannter und wichtiger, komplexer Interorganprozess, um endogene Verbindungen und Xenobiotika aus dem Organismus zu schleusen (Elfarra & Anders, 1984). Enzyme, welche die einzelnen Reaktionen dieses Stoffwechselweges katalysieren, sind vor allem in Leber, Niere, Gallenwegen und Dünndarm zu finden. Soll eine bestimmte chemische Verbindung in diesem Stoffkreislauf umgesetzt werden, wird sie zunächst intrazellulär mit Glutathion (GSH) konjugiert. Das Tripeptid GSH kann in in Säugetierzellen in Konzentrationen bis zu 10 mM vorkommen (Aigner et al., 1997). Xenobiotika oder endogene Verbindungen werden hauptsächlich in der Leber an GSH konjugiert (Aigner et al., 1997). Anschließend erfolgt der Transport aus der Zelle mit Hilfe einer ATP-abhängigen GSH-Export-Pumpe (Ishikawa, 1992). Bevor ein Cystein-S-Konjugat (Cys-S-X in Abb. 1-7) gebildet werden kann, muss der γ-Glutamylrest des GSH durch die γ-Glutamyl-Transpeptidase und Glycin mittels der CysteinylglycinDipeptidase abgespalten werden. Spezifische NAT acetylieren im letzten Schritt des Mercaptursäurewegs das Cystein-S-Konjugat zur eigentlichen Mercaptursäure (N-Acetyl-Cystein-SKonjugat) (Elce, 1970). In der Niere zeigt sich im Vergleich zur Leber eine deutlich höhere Aktivität von NAT. Die Ausscheidung von Mercaptursäuren erfolgt über den Urin (Green & Elce, 1975) und führt zu einer Abnahme der Toxizität. Es kann jedoch vorkommen, dass Zwischenstufen des Mercaptursäureweg durch Bioaktivierung zu mutagenen oder nephrotoxischen Substanzen, wie S-substituierte N-Acetyl-L-Cysteinkonjugate, umgewandelt werden (Dekant et al., 1989). Eine solche Bioaktivierung kann durch Acylasen erfolgen (Anders & Dekant, 1994). Dazu wird ein Teil der Cystein-Konjugate, die in den ersten Schritten des Mercaptursäurewegs gebildet wurden, in der Leber N-acetyliert. Es entehen Mercaptursäuren und nicht-acetylierte Konjugate, welche über die basolaterale Membran der proximalen Tubuluszellen der Niere aufgenommen werden (Lash & Anders, 1989). Hier können ACY Mercaptursäuren deacetylieren und damit Verbindungen bilden, die vor allem auf proximale Tubuluszellen toxisch wirken. Die ACY1 ist ein Gegenspieler der NAT und deacetyliert Mercaptursäuren (Lindner, 1999). Tierversuche mit Ratten bestätigten, dass die ACY1 nicht nur für die Spaltung von Nα-Acetyl-L-Cystein verantwortlich ist, sondern auch für die Bioaktivierung von Mercaptursäuren (Uttamsingh et al., 1998). Als Voraussetzung zur Entstehung nephrotoxischer Thiole aus Mercaptursäuren wird die Deacetylierung durch ACY (z.B. ACY1) angesehen. Dadurch können Cystein-S-Konjugate gebildet werden, die anschließend in einer 22 Einleitung β-Lyasereaktion weiter umgewandelt werden (Stevens & Jakoby, 1983; Tateishi et al., 1978). Die durch die β-Lyase-katalysierte Metabolisierung von Cystein-S-Konjugaten zu reaktiven Thiolen, Ammoniak und Pyruvat hat eine große Bedeutung für die Toxifizierung. Abb. 1-7: Der Mercaptursäureweg zur Entgiftung von Xenobiotika oder endogenen Verbindungen: Der Mercaptursäureweg findet hauptsächlich in Leber und Niere statt. Xenobiotika (blau, X) oder endogene Verbindungen werden in der Leber an GSH konjugiert. Es entsteht ein Cystein-S-Konjugat, welches in die Niere transportiert wird, wo es weiter zu einer N-Acetylierung durch NAT kommt. Die entstandenen Mercaptursäuren (violett) können anschließend über den Urin ausgeschieden werden (nach Elfarra & Anders verändert(Elfarra & Anders, 1984)). 23 Einleitung 5 Zielsetzung Die molekularen Zusammenhänge rund um die angeborene Stoffwechselstörung ACY1Mangel sind bisher wenig erforscht. Inwieweit Mutationen einen Einfluss auf die Proteinstruktur und Funktion der ACY1 haben ist noch nicht geklärt. Um einen Beitrag zum Verständnis der biologischen Funktion der ACY1 leisten zu können, bedarf es Expressionsanalysen für eine Vielzahl von ACY1-Enzymvarianten. Diese sollten Mutationen aufweisen, welche bei Patienten mit einem ACY1-Mangel detektiert wurden. Somit lassen sich die Konsequenzen der Stoffwechselstörung auf molekularer Ebene besser verstehen. Bei dem Morbus Canavan handelt es sich, wie beim ACY1-Mangel, um eine autosomal rezessiv vererbte Störung im Stoffwechsel (Beaudet, 2001; Engelke et al., 2008; Sass et al., 2006; Sass et al., 2007; Van Coster et al., 2005). Expressionsanalysen zu verschiedenen ASPA-Enzymvarianten konnten bisher in E.coli, der Hefe Pichia pastoris und COS-Zellen durchgeführt werden (Beyer, 1998; Di Pietro et al., 2008; Hershfield et al., 2007; Janson et al., 2006; Kaul et al., 1993, 1994; Surendran et al., 2003). Zur Evaluierung des Einflusses von Mutationen im menschlichen ASPA-Gen ist die Expression der ASPA-Enzymvarianten in einem humanen Expressionsmodell von Vorteil, da auf diese Weise eine korrekte Proteinprozessierung stattfinden kann. Aufgrund unzureichender Kenntnisse zu molekularen Grundlagen des ACY1-Mangels und Morbus Canavans sollen im Rahmen dieser Arbeit Expressionsanalysen für die Enzyme ACY1 und ASPA in einem geeigneten eukaryotischen Zellsystem durchgeführt werden. Damit soll es möglich sein, einen Beweis der Kausalität von Mutationen für beide Stoffwechseldefekte zu erbringen, um die funktionellen Konsequenzen abschätzen zu können. Die ACY1 zeichnet sich durch eine geringe Substratspezifität aus, wodurch sie sich von der ASPA unterscheidet, die vorwiegend NAA spaltet (Anders & Dekant, 1994). Inwieweit sich ACY1 und ASPA in ihrer Substratspezifität überschneiden, konnte noch nicht umfassend geklärt werden. Komplementationsstudien dazu fehlen bisher gänzlich, um zu klären, ob einAusfall der ACY1 oder ASPA wechselseitig kompensiert werden kann. Die ACY3 wurde bisher nur aus Mäusen und Ratten untersucht (Endo, 1978; Pushkin et al., 2003; Tsirulnikov et al., 2009). Informationen zum Reaktionsmechanismus und zur Struktur stützen sich maßgeblich auf Sequenzvergleiche zur ASPA und der Überexpression der mACY3 in E. coli oder HEK293-Zellen (Pushkin et al. 2003; Newman et al. 2007; Hsieh et al. 2010). Die Expression menschlicher ACY3 (hACY3) in E.coli oder einer eukaryotischen 24 Einleitung Zelllinie ist bisher nicht beschrieben worden. Es gibt jedoch bisher keine Informationen zur Expression der hACY3. Um neue Informationen zur Funktionsweise der hACY3 zu sammeln, soll die hACY3 ebenfalls in einem humanen Zellmodell exprimiert werden und ein Aktivitätstest entwickelt werden. Dadurch wäre der Grundstein für die Charakterisierung des Enzyms gelegt. Die vorliegende Arbeit soll somit ein besseres Verständnis der Stoffwechseldefekte ACY1Mangel und Morbus Canavan auf molekularer Ebene ermöglichen. Die Charakterisierung der funktionellen sowie strukturellen Eigenschaften der ACY1, ASPA und ACY3 sollen dazu beitragen neue Perspektiven in der Labordiagnostik zu eröffnen. 25 26 Material Kapitel II Material Im diesem Kapitel werden die im Rahmen der Dissertationsarbeit verwendeten Materialen aufgelistet. 1 Materialien Für die experimentellen Arbeiten wurden Verbrauchsmaterialien verwendet, zum Beispiel 1,5-ml-Reaktionsgefäße (Eppendorf, Hamburg), 15-ml- und 50-ml-Falconröhrchen (Greiner Bio-One, Frickenhausen), 96-Well-Mikrotiterplatten Flat-Bottom (Greiner Bio-One, Frickenhausen), 10x4x45-mm-Küvetten (Sarstedt; Nümbrecht), HPLC-Gläschen (Waters, Eschborn) und 903 Protein Saver Cards (Whatman-GE.Healthcare, Dassel). Sterile Zellkulturgefäße wurden von der Firma Greiner Bio-One, Frickenhausen, bezogen. Plastikpipetten und Zellschaber für die Zellkultur wurden von Corning Costar (über Sigma-Aldrich, München) erworben. 1.1 Geräte Neben der üblichen Laborausstattung (wie z.B. verschiedene Pipetten (von Eppendorf, Hamburg, und Gilson, Limburg) wurden folgende Geräte im Rahmen dieser Arbeit verwendet (Tab. 2-1): 27 Material Tab. 2-1: Auflistung der verwendeten Geräte. Gerät Firma Bezugsquelle Autoklav F40-42 Getinge Sverige AB Getinge, Schweden Brutschrank CO2-Auto Zero Heraeus Hanau Evaporator VLM EVA2 / VLM EC2 VLM GmbH Bielefeld Feinwaage BP 121S Sartorins AG Göttingen Inkubationsofen kelvitront Heraeus Hanau Inkubationsschüttler KL2 Laborgerätebau Edmund Bühler Tübingen Massenspektrometer QMicro (QAB 1524) Waters Eschborn Megafuge 1.0 Heraeus Hanau Mikroskop Carl Zeiss Axiovert 25 Carl Zeiss Jena Mini-PROTEAN Tetra Electrophorese-System Biorad München NanoDrop1000 PeqLab Erlangen pH-Meter pH526 Multi Cal WTW Weilheim Pipettierhilfe „Pipettboy acu“ IBS Integra Biosciences Fernwald PowerWave XS2 Photometer Biotek Bad Friedrichshall Scanner hp-scanjet 3970 Hewlett-Packard GmbH Böblingen Sorvall RT 6000 B Ultraschallhomogenisator (Branson Branson digital Sonifier W-250D) Danbury, USA Sterilwerkbank DLF/BSS6 Clean Air Woerden, Niederlande SynergyTM HAT Multi-Detection Microplate Reader Biotek Bad Friedrichshall Thermocycler MJ Mini Biorad München Thermocycler PTC-100 Biorad München Thermocycler Real time CFX96 Biorad München Thermocycler Techne Genius Techne Jahnsdorf Thermocycler TechneT-312 Techne Jahnsdorf Thermomixer 5436 Eppendorf Hamburg Tischkühlzentrifuge (Centrifuge 5415D) Eppendorf Hamburg Tischzentrifuge (Centrifuge 5417C) Eppendorf Hamburg Tischzentrifuge (Centrifuge 5417R) Eppendorf Hamburg Trans-Blot SD Semi-Dry Transfer Cell Biorad München UV/VIS Spectrometer Lambda 20 Perkin Elmer Rodgau Varifuge 3.2 RS Heraeus Hanau Waage P1200N Mettler Giessen Wasserbad GFL 1083 Mettler Giessen 28 Material 1.2 Chemikalien, Enzyme, Kitsysteme und Oligonukleotide Alle hier nicht gelisteten Chemikalien wurden von den Firmen Applichem (Darmstadt), Merck (Darmstadt), Roth (Karlsruhe), Sigma-Aldrich (München) und Serva (Heidelberg) in pro analysis-Qualität bezogen. Zusätzlich verwendete Reagenzien sind in Tabelle 2-2 aufgeführt. Tab. 2-2: Auflistung der verwendeten Chemikalien. Chemikalie Bestellnummer Firma Bezugsquelle 1-Propanol 6776 Roth Karlsruhe 250 Bp-DNA Leiter T.918.1 Roth Karlsruhe 2-Mercaptoethanol M6250 Sigma-Aldrich München 5-Bromo-4-Chloro-3-Indolyl2315.3 beta-D-galactopyranosid (X-Gal) Roth Karlsruhe 6-Aminocapronsäure Sigma-Aldrich München Amersham Hybond™-P-PDVF RPN303F (Polyvinylidenfluorid-Membran) GE-Healthcare Freiburg Amino Acid Reference Standard NSKA Set A Cambridge Isotope Laboratories Cambridge, UK Ammoniumpersulfat A3678 Sigma-Aldrich München Ampicillin-Natriumsalz K029.1 Roth Karlsruhe Antibiotic-Antimycotic® 15240096 Invitrogen Life Technologies Karlsruhe Borsäure 6943 Roth Karlsruhe Caseinhydrolysat AE41.1 Roth Karlsruhe Chloramphenicol 3886.2 Roth Karlsruhe ClinChek -Control Level 1 und 2 10182 Recipe München Deoxynucleotide 200415 Agilent Technologies Böblingen Diethylpyrocarbonat (DEPC) K028.3 Roth Karlsruhe Dimethylformamid (DMF) D4551 Sigma-Aldrich München Dimethylsulfoxid (DMSO) A3566 AppliChem Darmstadt Dulbecco´s Modified Eagle´sMedium (DMEM) 10569077 Invitrogen Life Technologies Karlsruhe ECL Plus Western Blotting Detection Reagent RPN2124 GE-Healthcare Freiburg Natrium EDTA (Ethylendiamintetraessig-säure) (Titriplex III) 159294 Reag. Ph Eur Merck Darmstadt Fetales Kälberserum (FKS) 10439034 Invitrogen Life Technologies Karlsruhe Fetales Kälberserum „Gold“ A15-151 PAA Pasching, Österreich A2504 ® 29 Material Folin & Ciocalteu Phenol Reagent F952 Sigma-Aldrich München Free Carnitine and Acylcarnitin Reference Set B NSKB Cambridge Isotope Laboratories Cambridge, UK G-418-Lösung 4727878001 Roth Karlsruhe Ganciclovir sud-gcv InvivoGen San Diego, USA Grace’s-Insect-Media 11667-037 Invitrogen Life Technologies Karlsruhe Hefeextrakt 2363.3 Roth Karlsruhe Hydroxyethylpiperazin-Nethansulfonsäure (HEPES) H3375 Sigma-Aldrich München Isopropyl-β-Dthiogalactopyranosid 2316.2 Roth Karlsruhe Kalium-Natrium-TartratTetrahydrat A0651,0500 AppliChem Darmstadt Kanamycinsulfat T832.1 Roth Karlsruhe L-Aspartat A9256 Sigma-Aldrich München L-Methionin M9625 Sigma-Aldrich München L-Phenylalanin P2126 Sigma-Aldrich München L-Tyrosin T3754 Sigma-Aldrich München MassCheck Amino Acids, Acylcarnitines Dired Blood Spot 0192 Control Level 1 Chromsystems München MassCheck® Amino Acids, Acylcarnitines Dired Blood Spot 0193 Control Level 2 Chromsystems München Methanol UN1230 VWR International GmbH Bruchsal Milchpulver T145.1 Roth Karlsruhe Mini-Protean TGX, 12% 456-1093SEDU Biorad München N-Acetyl-L-Aspartat 920 Fluka Neu-Ulm N-Acetyl-L-Methionin 1310 Fluka Neu-Ulm N-Acetyl-L-Phenylanlanin A4126 Sigma-Aldrich München N-Chloroacetyl-L-Tyrosin C1878 Sigma-Aldrich München Ninhydrin 1067620010 Merck Darmstadt Penicillin/Streptomycin P4333 Sigma-Aldrich München peqGOLD Universal Agarose 35-120 PeqLab Erlangen Phosphatgepufferter Salzlösung (PBS) 21300058 Invitrogen Life Technologies Karlsruhe Precision Plus Protein Dual Color 161-0377 Standard Biorad München Puromycin Invitrogen Life Technologies Karlsruhe ® A1113803 30 Material Re-Blot Plus Strong Solution (10x) 2504 Millipore Temecula, USA Rinderserumalbumin A7906 Sigma-Aldrich München Roswell Park Memorial Institute 11875-093 (RPMI) 1640 Medium Invitrogen Life Technologies Karlsruhe Sf-900 III SFM-Medium 12658019 Invitrogen Life Technologies Karlsruhe Sodium dodecyl sufate (SDS) 71727 Fluka Neu-Ulm Streptomycinsulfat A1852 AppliChem Darmstadt Tetracyclin-Hydrochlorid 0237.1 Roth Karlsruhe TrackIt 100 bp DNA Ladder 10488058 Invitrogen Life Technologies Karlsruhe Triton X 100 X100 Sigma-Aldrich München Trizma Base T1503 Sigma-Aldrich München Trypsin-EDTA-Lösung T3924 Sigma-Aldrich München Trypton 910108 MP Biomedicals Ohio, USA Tween 20 P1379 Sigma-Aldrich München Xfect® Transfection Reagent 631318 Clontech Mountain View, USA Zinn-II-Chlorid Dihydrat 31669 Riedel-de-Häen Seelze Die verwendeten Enzyme sind in Tabelle 2-3 aufgelistet. Tab.2-3: Auflistung der verwendeten Enzyme. Enzym Bestellnummer Firma Bezugsquelle Gateway®BP-Clonase 11789103 Invitrogen Life Technologies Karlsruhe Gateway®LR-Clonase 11791020 Invitrogen Life Technologies Karlsruhe Hot Start Taq-Polymerase 203205 Qiagen Hilden PfuUltra High Fidelity DNAPolymerase 600385 Agilent Technologies Böblingen Phusion® Hot Start High-Fidelity DNA-Polymerase F-540S Finnzymes Vantaa, Finnland SsoFastTM EvaGreen® Supermix 172-5200 Biorad München SuperScriptTM II Reverse Transcriptase 18064014 Invitrogen Life Technologies Karlsruhe T4 DNA-Ligase 10481220001 Roche Mannheim ThermoScript® RT-PCR System 11146024 Invitrogen Life Technologies Karlsruhe BtgI R068S New England Biolabs Frankfurt am Main EcoRI ER0271 Fermentas St. Leon Roth XhoI ER0691 Fermentas St. Leon Roth 31 Material Die verwendeten Kitsysteme sind in Tabelle 2-4 aufgelistet. Tab. 2-4: Auflistung der verwendeten Kitsysteme. Kitsystem Bestellnummer Firma Bezugsquelle BaculoDirectTM C-Term Expression Kit 12562013 Invitrogen Life Technologies Karlsruhe ECL Plus Western Blotting Detection System RPN2132 Amersham Buckinghamshire, UK High Pure PCR Template Preparation Kit 11796828001 Roche Mannheim High Pure RNA Isolation Kit 11828665001 Roche Mannheim High Pure RNA Tissue Kit 12033674001 Roche Mannheim SALSA MLPA P025 Canavan disease P025-100R EKI-FAM MRC-Holland Amsterdam, Niederlande Plasmid Mini Kit 12123 Qiagen Hilden Plasmid Midi Kit 12143 Qiagen Hilden PCR Purification Kit 28104 Qiagen Hilden QIAquick Gel Extraction Kit 28704 Qiagen Hilden 200518 Agilent Technologies Böblingen QuikChange® II XL Site-Directed 200522 Mutagenesis Kit Agilent Technologies Böblingen Rapid DNA Dephos & Ligation Kit Roche Mannheim ® QuikChange Site-Directed Mutagenesis Kit 4898125001 Oligonukleotide wurden von MWG Eurofins, Ebersberg und Biomers, Ulm, beide in Deutschland bezogen. Die Sequenzen der für diese Arbeit genutzten Oligonukleotide befinden sich im Anhang. 32 Material 1.3 Puffersysteme, Lösungen und Medien Die verwendeten Puffersysteme sind in Tabelle 2-5 aufgelistet. Tab. 2-5: Gelelektrophorese und Western Blot-Puffersysteme Puffer Chemikalie/Lösung Endkonzentration Anodenpuffer I Trizma Base, mit 1 M HCl auf pH 9,4 eingestellt 30 mM Anodenpuffer II Trizma Base, mit 1 M HCl auf pH 9,4 eingestellt 300 mM Zitratpuffer Zitronensäure-Monohydrat, mit 15 % NaOH-Lösung auf pH 5 eingestellt 200 mM Homogenisierungspuffer 50 mM Trizma Base, mit 1 M HCl auf pH 8,5 eingestellt 50 µM Zugabe von ZnCl2-Lösung, anschließend mit 6 M HCl auf pH 8 eingestellt Triton X 100-Lösung 0,1 % Hepespuffer HEPES, mit 1 M NaOH auf pH 8 eingestellt 0,1 M Kathodenpuffer Trizma Base, mit 1 M HCl auf pH 9,4 eingestellt SDS Aminocapronsäure Glycin 30 mM SDS-Laufpuffer (5x) Trizma Base SDS 15,0 g/L 5,0 g/L SDS-Probenpuffer (5x) Trizma Base, mit 1 M HCl auf pH 6,8 eingestellt SDS Glycerin β-Mercaptoethanol Bromophenolblau 250 mM 1,0 g/L 5,26 g/L 94,0 g/L 10 % 30 % 5% 0,02 % Tris-Borat-EDTA (TBE)-Puffer (10x) Trizma Base Borsäure Na2EDTA 108,0 g/L 54,0 g/L 7,44 g/L Tris-gepufferte Kochsalzlösung mit Tween (TBST) (5x) 50 mM Trizma Base, mit 1 M HCl auf pH 6,8 eingestellt NaCl Tween-20 33 43,85 g/L 0,25 % Material Die verwendeten Antibiotika und Lösungen sind in den Tabellen 2-6 und 2-7 aufgelistet. Tab. 2-6: Auflistung der verwendeten Antibiotika. Antibiotikum Stammlösung Arbeitskonzentration Ampicillin-Natriumsalz 100 mg/ml 100 µg/ml Chloramphenicol 34 mg/ml 100 µg/ml Kanamycinsulfat 50 mg/ml 50 µg/ml Streptomycinsulfat 50 mg/ml 50 µg/ml Tetracylcin 50 mg/ml 50 µg/ml Tab. 2-7: Auflistung der verwendeten Lösungen. Lösung Konzentration Lösung A-Lowry 2 % (w/v) Natriumcarbonat in 0,1 M NaOH gelöst Lösung B-Lowry 2 % (w/v) Kalium-Natrium-Tartrat-Tetrahydrat in destilliertem Wasser gelöst Lösung C-Lowry 1 % (w/v) Kupfer(II)-Sulfat-Pentahydrat in destilliertem Wasser gelöst Ninhydrin-Lösung 2 % (w/v) Ninhydrin gelöst in Ethylenglycolmonoethyl-Ether 100 mM Citratpuffer 1-Propanol-Lösung 250 ml 1-Propanol mit 250 ml Aqua dest. gemischt 34 Material Die verwendeten Medien für die Baktieren- und Zellkulturen sind in Tabelle 2-8 aufgelistet. Tab. 2-8: Auflistung der verwendeten Nährmedien für die Baktieren- und Zellkulturen. Medium Lysogeny Broth (LB)-Medium LB-Antibiotika Agar Zusammensetzung 1 % (w/v) NaCl 1 % (w/v) Trypton 0,5 % (w/v) Hefeextrakt Aqua dest. ad 1 L → mit 1 M NaOH auf pH 7,0 eingestellt Autoklavieren 1 % (w/v) NaCl 1 % (w/v) Trypton 0,5 % (w/v) Hefeextrakt 2 % (w/v) Agar Aqua dest. ad 1 L → pH 7,0 mit 1 M NaOH eingestellt autoklavieren bis 55 °C abkühlen steril filtriertes Antibiotikum zugeben, je nach Verwendung entweder 1 ml Ampicillin-Natriumsalz-Stammlösung (100 mg/ml) oder Kanamycinsulfat-Stammlösung (50mg/ml) NZY+ Broth 1 % (w/v) Casein-Hydrolysat 0,5 % (w/v) Hefeextrakt 0,5 % (w/v) NaCl Aqua dest. ad 500 ml → pH 7,5 mit 1 M NaOH eingestellt autoklavieren + 6,25 ml 1M MgCl2-Lösung (steril filtriert) SOC-Medium 0,5 % (w/v) Hefeextrakt 2,0 % (w/v) Trypton 10 mM NaCl 2,5 mM KCl 10 mM MgCl2 10 mM MgSO4 autoklavieren → 20 mM Glukose vor Verwendung dazugeben HEK293-Kulturmedium Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM) 10 % FKS (hitzeinaktiviert) 1 % Antibiotic-Antimycotic® Fibroblasten-Kulturmedium Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM) 10 % FKS (hitzeinaktiviert) 1 % Antibiotic-Antimycotic® Lymphozyten-Kulturmedium RPMI 1640 + Glutamin 10 % FKS (hitzeinaktiviert) 1 % Antibiotic-Antimycotic® Lymphozyten-Waschmedium RPMI 1640 + Glutamin 1 % Antibiotic-Antimycotic® 35 Material Sf-900 III SFM Sf-900 III SFM Medium 10 % FKS (hitzeinaktiviert) 1 % Antibiotic-Antimycotic® 1.4 Vektoren Die verwendeten Vektoren sind in Tabelle 2-9 aufgelistet. Tab. 2-9: Auflistung der verwendeten Vektoren. Vektor Bestellnummer Firma Bezugsquelle pcDNA3.1/+ V79020 Invitrogen Life Technologies Karlsruhe pCMV_SPORT6 mit humanem ASPA5180104 Gen über EcoRV und NotI rekombiniert BioScience Cambridge, UK pDONR221 12536017 Invitrogen Life Technologies Karlsruhe pOTB7 mit humanem ACY1-Gen über EcoRI und XhoI rekombiniert MGC-2251 ATCC Manassas, USA 1.5 Zellen MAX Efficiency E. coli DH10B F- mcrA ∆(mrr-hsdRMS-mcrBC) φ80lacZ∆M15 ∆lacX74 recA1 endA1 araD139 ∆ (ara, leu)7697 galU galK λ- rpsL nupG /pMON14272 / pMON7124 Dieser Bakterienstamm wurde von Invitrogen, Paislay, UK, bezogen E. coli XL1-Blue supercompetent cells recA1 endA1 gyrA96 thi-1 hsdR17 supE44 relA1 lac [F´ proAB lacIqZ∆M15 Tn10 (Tetr)] Dieser Bakterienstamm wurde von Agilent Technologies (QuickChange site-directed mutagenesis), Böblingen, Deutschland, bezogen. Humane embryonale Nierenzellen (HEK293-Zellen) wurden von der Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH (DSMZ), Braunschweig, bezogen. Sf9-Insektenzellen des „fall army worms“ Spodoptera frugiperda wurden von der Firma Pfizer, Freiburg, über den Kontakt von Herrn Dr. Robert Turek, zur Verfügung gestellt. 36 Material 1.6 Ribonukleinsäuren (RNA) und Antikörper Die eingesetzten Ribonukleinsäuren sind in Tabelle 2-10 aufgelistet. Tab. 2-10: Auflistung der verwendeten humanen RNA. Total-RNA Bestellnummer/Lot Firma Bezugsquelle Gehirn (Homo sapiens) 54005/006048990 Agilent Technologies Böblingen Gehirn (Homo sapiens) 636530/0006033655 Clontech Mountain View, USA Leber (Homo sapiens) 636531/9100089A Clontech Mountain View, USA Lunge (Homo sapiens) R1234152-50/A601524 BioChain Hayward, USA Niere (Homo sapiens) 636529/8030501A Clontech Mountain View, USA Die eingesetzten Primär- und Sekundärantikörper sind in den Tabellen 2-10 und 2-12 aufgelistet. Tab. 2-11: Auflistung der verwendeten Primärantikörper. Primär-Antikörper Bestellnummer/Lot Firma Bezugsquelle Aminoacylase 1 (ACY1)Antikörper GTX 110348/40079 GeneTex/Biozol Eching Aspartoacylase (ASPA)Antikörper GTX 113389/40128 GeneTex/Biozol Eching Glyceraldehyd-3-phosphat Dehydrogenase (GAPDH)- GTX100118/39408 Antikörper GeneTex/Biozol Eching Aminoacylase 3 (ACY3)Antikörper Origene Rockville, USA TA502292/3A1 Tab. 2-12: Der verwendete Sekundärantikörper. Sekundär-Antikörper Bestellnummer/Lot Firma Firmenkontakt Goat-Anti-Rabbit IgM+IgG(H+L) 4010-05/ E5606-XF98 Southern Biotech Birmingham, USA 37 Material 1.7 Software Softwareprogramm: Funktion: BioEdit v.7.1.3 Programm zur Auswertung von DNA- Sequenzen und Erstellung von Alignments; frei zugängliche Software (Open source). http://www.mbio.ncsu.edu/bioedit/page2.html Bio-Rad CFX Manager, Programm zur Auswertung von Real-time München, Deutschland PCR-Ergebnissen . Codon Code Aligner, Dedham, USA Programm zur Auswertung von DNA- Sequenzen und Erstellung von Alignments. DNA-Star, Madison, USA Programm zur Erstellung von DNA- Sequenzdateien und Visualisierung von DNAKarten. ImageJ Programm zur Auswertung von Bandenintensitäten im Western Blot, frei zugängliche Software (Open source). http://rsbweb.nih.gov/ij/download.html (am 28.12.2010 heruntergeladen) Instat2, GraphPad Software, Inc., Statistikprogramm zur Auswertung von La Jolla,USA Ergebnisreihen mit dem t-Test. MassLynx, Eschborn, Deutschland Programm zur Auswertung der erhaltenen Daten des Massenspektrometers QMicro (QAB 1524) von Waters, Eschborn. 38 Material MegaBACE™ Genetic Profiler Programm zur Auswertung der Sequenzen von Software Suite v2.2, DNA-Framentanalaysen bei Multiplex GE Healthcare, Piscataway, USA Ligation-dependent Probe Amplification- Studien. Microsoft Excel (Microsoft Office 2003) Tabellenkalkulationsprogramm der Firma Microsoft. Symyx Draw 4.0 Programm zum Zeichnen chemischer Formeln und Reaktionsgleichungen, frei zugängliche Software (Open source). http://accelrys.com/resourcecenter/downloads/ freeware/index.html Primer3, Version 0.4.0 Primerdesignprogramm: frei zugängliche Software (Open source). http://frodo.wi.mit.edu/ Pymol Version 1.5.0.1 Bildverarbeitungsprogramm zur Darstellung und Bearbeitung von Proteinstrukturen im Jmol-Dateienformat: frei zugängliche Software (Open source). http://sourceforge.net/projects/pymol/ 39 40 Methoden Kapitel III Methoden Sämtliche Arbeiten mit gentechnisch veränderten Organismen erfolgten in einem Gentechniklabor der Sicherheitsstufen 1 und 2 (S1- und S2-Bereiche nach Biostoffverordnung und Gentechnikgesetz). Die Puffer und Medien wurden mit destilliertem MilliPore-Wasser (AquaMP) hergestellt. Medien, Lösungen und Verbrauchsmaterialien für alle molekularbiologischen und biochemischen Arbeiten sowie Bakterienabfälle wurden bei 120°C und einem Dampfdruck von 1,4 bar für 20 min autoklaviert. 1 DNA-Isolation aus Zellsediment und Blut Für die DNA-Isolation wurde gefrorenes Zellsediment auf Eis aufgetaut und in 200 µl einer phosphatgepufferten Salzlösung (PBS; [engl.: phosphate buffered saline]) resuspendiert. Aus 200 µl Zellsedimentsuspension beziehungsweise aus 200 µl EDTA- oder Heparin-Blut wurde DNA mittels dem High Pure PCR Template Preparation Kit der Firma Roche gemäß Herstellerprotokoll isoliert. 2 Mutationsanalysen und Polymerasekettenreaktion (PCR) Als Referenz-DNA-Matrizen dienten die Gene ACY1 (NT_022517.18), ASPA (NT_010718.16) und ACY3 (NT_167190.1), deren Sequenzen durch die NCBI-Datenbank1 öffentlich zugänglich sind. Zur Durchführung von Mutationsanalysen für die Gene ACY1, ASPA und ACY3 wurden die Oligonukleotide (Primers) für die PCR mit Hilfe des Designprogramms Primer3 (Version 0.4.0) konstruiert und von den Firmen MWG Eurofins oder Biomers bezogen. Die Primers liegen auf Polymorphismus-freien (engl.: single nucleotide polymorphism (SNP)) Abschnitten des jeweiligen Gens, im Bereich von ca. 100 bp vor Beginn bzw. nach Ende eines Exons. Im Rahmen des Primerdesigns wurde in der NCBI-Datenbank nach SNPs gesucht. Die Primeranlagerungstemperatur (TA) wurde wie folgt errechnet: 1 http://www.ncbi.nlm.nih.gov 41 Methoden Tm = 4 °C * (Anzahl der G’s + C’s im Primer) + 2 °C * (Anzahl der A’s + T’s im Primer) (Tm-Schmelztemperatur) (Mülhardt, 2009) TA = Tm – 5 °C Jeder Zyklus der PCR zur Amplifikation von DNA gliedert sich im Wesentlichen in drei Reaktionsschritte: i) Die Denaturierung der DNA, bei der die Doppelstrangstruktur gelöst wird und DNA-Einzelstränge entstehen; ii) die Anlagerung der spezifischen Primer an die einzelsträngige DNA und iii) die anschließende Elongation des jeweils komplementären DNA-Stranges (Mullis & Faloona, 1987). Für Jede PCR wurde ein Leewert zur Kontrolle mitgeführt, der keine DNA-Matrize enthielt. Die PCRs wurden unter den folgenden Konditionen mit Chemikalienzusätzen der Firma Qiagen (Hot Start Taq Polymerase) durchgeführt: Reaktionsansatz: Reagenz Endkonzentration im Gesamtansatz [50 µl] PCR-Reaction Buffer 1x dNTPs 2 mM Primer F 1,25 µM Primer R 1,25 µM Hot Start Taq Polymerase 1U DNA-Matrize PCR-Programm: 60 µM 1. 94 °C 10 min (Initiation) 2. 94 °C 1 min (Denaturierung) 3. TA °C 30 s (Primeranlagerung) 4. 72°C 1 min (Elongation) → 30 Wiederholungen der Schritte 2. bis 4. 5. 72°C 10 min (finale Elongation) Nach der PCR wurden die dabei entstandenen Produkte mit Hilfe des PCR Purification Kits der Firma Qiagen über Säulen aufgereinigt. Dabei wurde gemäß Herstellerprotokoll verfahren. Für eine anschließende Sequenzierung wurde in AquaMP (destilliertes Wasser engl.: Aqua Milli Pore Grade) (PCR Grade) eluiert. 42 Methoden 3 Multiplex Ligation-dependent Probe Amplification (MLPA) für den Nachweis von Deletionen und Insertionen im ASPA-Gen MLPA ist die Abkürzung für Multiplex Ligation-dependent Probe Amplification. Mit dieser Technik ist es möglich, Mengenunterschiede eines definierten DNA-Abschnitts nachzuweisen (Schouten et al., 2002). Dazu zählen Deletionen und Duplikationen einzelner Exons beziehungsweise ganzer Gene. Schlussendlich können auf diese Weise heterozygote und homozygote Deletionen sowie Duplikationen in krankheitsspezifischen Genen diagnostiziert werden. Die Durchführung der MLPA-Analyse ist in zwei Abschnitte eingeteilt. Zunächst wird in einem ersten Schritt ein Sondenpaar an die DNA-Matrize hybridisiert. Dabei sind die Sequenzen der Sonden so gewählt, dass sie direkt nebeneinander im Genabschnitt liegen und durch eine Ligase verknüpft werden können. In einem zweiten Schritt können diese ligierten Sondenabschnitte mittels PCR amplifiziert werden. Fehlen bestimmte DNA-Abschnitte (beispielsweise durch Deletionen), so können sich die Sondenabschnitte nicht zusammenlagern und es kann dementsprechend kein PCR-Produkt amplifiziert werden. An duplizierte DNAAbschnitte lagern sich doppelt so viele Sondenabschnitte zusammen und die Konzentration an PCR-Produkt nimmt dementsprechend zu (Schouten et al., 2002). Mittels Kapillarelektrophorese werden die PCR-Produkte der Größe nach aufgetrennt und die Mengenunterschiede des spezifischen DNA-Abschnitts, durch Vergrößerung oder Reduktion der gemessenen Peakhöhen sichtbar gemacht. Für die MLPA-Untersuchungen des ASPA-Gens für verschiedene Morbus-Canavan-Patienten wurde ein Kit der Firma MRC-Holland (SALSA MLPA P025 Canavan disease) verwendet. Die MLPA-Reaktion wurde unter den Herstellerkonditionen durchgeführt. Als Positivkontrolle wurde die DNA-Probe „J62“ genutzt. Dabei handelte es sich um isolierte genomische DNA eines Individuums bei dem das gesamte ASPA-Gen deletiert war. Diese DNA-Probe wurde durch Dr. med. Hansjörg Plendl des Instituts für Humangenetik an der Christian-Albrechts Universität zu Kiel zur Verfügung gestellt (Caliebe et al., 2010). Alle MLPA-Ansätze enthielten 250 ng Gesamt-DNA einer zu untersuchenden Probe. Anschließend wurden die Resultate mit Hilfe der MegaBACE™ Genetic Profiler Software Suite v2.2. Software ausgewertet. 4 Agarosegelelektrophorese Mit der Agarosegelelektrophorese können Nukleinsäuren mit einer Größe von 50 bp bis 100 kbp aufgrund ihrer negativen Ladung im elektrischen Feld aufgetrennt werden. Je nach 43 Methoden Größe der zu trennenden DNA-Fragmente wurde eine Agarosekonzentration von 0,8-1,5 % (w/v) in 1x Tris-Borat-EDTA-(TBE) -Puffer verwendet (Kapitel II Abschnitt 1.3). Die Agarose wurde in TBE-Puffer unter Erhitzen in der Mikrowelle gelöst. Nach Abkühlen und Gießen der Lösung in eine horizontale Gelkammer wurde der Probenkamm eingesetzt. Das Gel wurde in eine Kammer mit 1x TBE-Puffer gegeben. Anschließend wurde der Probenkamm entfernt und die mit 1/5 des Volumens an Ladepuffer versetzten Proben aufgetragen. Zudem wurde ein 1 kbp- bzw. ein 100 bp DNA-Standard aufgetragen. Eine Trennung erfolgte bei konstanter Spannung von 10 V/cm. Die Färbung des Gels erfolgte für ca. 30 min in einer Ethidiumbromid-Lösung (2 µg/ml in 1x TBE). Aufgrund der interkalierenden Eigenschaften von Ethidiumbromid in DNA-Doppelsträngen können die Fluoreszenz der Substanz und damit die DNA-Banden unter ultraviolettem (UV)-Licht abgelesen werden. Da UV-Licht gleichzeitig zu einer DNA-Schädigung führen kann, wurde die Bestrahlung möglichst kurz gehalten, um so die DNA für weitere Experimente intakt zu erhalten. 5 Gelextraktion von DNA aus Agarosegelen Zur Reinigung von DNA aus Agarosegelen mittels Gelextraktion wurde mit dem QIAquick Gel Extraction Kit (Qiagen) gemäß Herstellerprotokoll gearbeitet. Eluiert wurde die DNA mit AquaMP (PCR Grade). 6 Sequenzierung Die Sequenzierung von DNA-Proben und Vektor-DNA nach Präparationen im Mini- oder Midimaßstab erfolgte durch die Firma LGC Genomics (vormals AGOWA), Berlin. Dafür wurden die DNA-Proben mit 4 µl des jeweiligen Primers, in einer Konzentration von 5 µM, versetzt. Ausgewertet wurden die erhaltenen DNA-Sequenzen mit den Programmen BioEdit v.7.1.3 und DNA-Star. 7 RNA-Isolation aus Zellsediment Ribonukleinsäuren (RNA) sind unter anderem als mRNA (engl.: messenger RNA), rRNA (ribosomale-RNA) und tRNA (Transfer-RNA) in Lebewesen vorhanden (Voet et al., 2002). Sie sind sehr anfällig gegenüber RNasen, Enzymen, die RNA degradieren. Daher ist es wichtig, auf Sauberkeit bei RNA-Arbeiten zu achten. So wurden alle Geräte, wie beispielsweise Pipetten, zuvor mit Diethylpyrocarbonat (DEPC)-Wasser gereinigt, und andere Materialien vor Gebrauch autoklaviert. Dazu wurde 1ml DEPC zu einem Liter H2O gegeben. Nachdem 44 Methoden die Lösung geschüttelt worden war, wurde sie über Nacht bei 37°C inkubiert. Das verbliebene DEPC wurde durch Autoklavieren entfernt. Das Tragen von Latex- oder Nitrilhandschuhen ist obligatorisch im Umgang mit RNA. Nach dem Auftauen von eingefrorenem Zellsediment auf Eis, wurde dieses in 1 ml kaltem PBS resuspendiert. Die anschließende RNA-Isolation erfolgte mit dem High Pure RNA Isolation Kit von Roche gemäß Herstellerprotokoll. 8 Reverse Transkription Das Enzym Reverse-Transkriptase ermöglicht das Umschreiben von mRNA in cDNA (engl.: complementary DNA), die dadurch keine Introns enthält. Jeweils 3 µg der gewonnenen RNA wurden durch eine Reverse-Transkriptase Reaktion mit random hexamer Primern (2,5 ng/µl Endkonzentration) und der SuperScript II Reverse Transkriptase (Life Technologies), nach Herstellerprotokoll in cDNA umgeschrieben. Die amplifizierte cDNA wurde mittels einer PCR-Reaktion (Kapitel III Abschnitt 2) und anschließender Agarosegelelektrophorese (Kapitel III Abschnitt 4) hinsichtlich ihrer Größe überprüft. 9 Quantitative Real-time-PCR (qPCR) Eine Quantifizierung in Echtzeit ist mit Hilfe der quantitativen Real-time-PCR (qPCR) möglich. Diese Methode beruht auf dem herkömmlichen PCR-Prinzip, indem Nukleinsäuren vervielfältigt werden (Kapitel III Abschnitt 2). Zudem ist die Quantifizierung mittels Fluoreszenz-Messungen am Ende jedes PCR-Zyklus möglich (Holzapfel & Wickert, 2007). Ausgangsprodukt für die qPCR ist amplifizierte cDNA (Kapitel III Abschnitt 8). Jeweils 5 µl einer 1:3 Verdünnung der cDNA-Matrize jeder Probe (in AquaMP, mit DEPC behandelt, verdünnt) wurden pro PCR-Ansatz für die qPCR verwendet. Als Referenzgene wurden das „housekeeping gene“ Glycerinaldehyd-3-phosphat-Dehydrogenase (GAPDH) sowie das h18sRNA-Gen mitbestimmt. Das ideale Referenzgen sollte leicht zu detektieren sein und seine Expression nicht zwischen verschiedenen Geweben eines Organismus varriieren (Holzapfel & Wickert, 2007; Perez et al., 2007). Das h18sRNA-Gen besteht aus 1870 Nukleotiden und verschlüsselt das Protein der kleinen Untereinheit (40 S) des eukaryotischen Ribosoms (Gonzalez & Schmickel, 1986). Die h18sRNA ist evolutionär hoch konserviert, was dadurch verdeutlicht wird, dass sich die Sekundärstruktur in den letzten 3 Millionen Jahren nur wenig veränderte (Gonzalez & Schmickel, 1986). Die 40-S-Untereinheit des Ribosoms weist zudem eine hohe Stabilität auf (Gonzalez & Schmickel, 1986). Primer für ACY1, ASPA, ACY3 sowie GAPDH und h18sRNA wurden unter Verwendung des frei zugänglichen Designprogramms 45 Methoden Primer3 (Version 0.4.0) entworfen (Primersequenzen siehe Anhang) und bei MWG Eurofins synthetisiert. Das spezifische ACY1-Amplicon hat eine Größe von 206 bp, das ASPAAmplicon von 178 bp, das ACY3-Amplicon von 195 bp, das GAPDH-Amplicon von 87 bp und das h18sRNA-Amplicon von 169 bp. Alle Genabschnitte wurden auf Ihre Spezifität durch Blast2 überprüft. Mit Hilfe des Sso Fast EvaGreen Supermix (Fluoreszenzfarbstoff der Firma Biorad) wurde die Amplifikation der DNA in einem CFX 96 Real-Time PCR Thermocycler (Biorad) unter folgenden Konditionen quantifiziert: Reaktionsansatz: Reagenz Endkonzentration im Gesamtansatz [20 µl] Sso Fast EvaGreen Supermix 1x Primer F 300 nM Primer R 300 nM PCR-Programm: 1. 95°C 30 s (Enzymaktivierung) 2. 94°C 5s (Denaturierung) 3. 63°C 5s (Primeranlagerung und Elongation) → 40 Wiederholungen der Schritte 2. bis 3. Schmelzkurve: 65 °C bis 95 °C 5s (in 0,5 °C Schritten) Für alle cDNA-Proben sämtlicher untersuchter Gene (ACY1, ASPA, ACY3, GAPDH und h18sRNA) wurden Doppelbestimmungen gemessen. Zur Auswertung wurde das Programm „Bio-Rad CFX Manager“ der Firma Biorad, München, herangezogen. 10 Klonierung in pcDNA3.1/+ durch Restriktionsverdau und Ligation Das Gen für die ACY1 (cDNA) wurde in einen pOTB7-Vektor bei der Firma ATTC (Manassas, USA) erworben. ACY1 war über EcoRI- und XhoI-Restriktionsschnittstellen in diesen Vektor einkloniert. ASPA cDNA wurde in einem pCMV-Sport6-Vektor von der Firma BioScience, Cambridge UK, bezogen (Abb. 3-1 und 3-2) 2 http://blast.ncbi.nlm.nhi.gov/Blast.cgi 46 Methoden Abb. 3-1: Vektorkarte des pOTB7-Vektors: Über die Restriktionsschnittstellen EcoRI und XhoI war das ACY1Referenzgen in das pOTB7-Plasmid (American Type Culture Collection (ATTC)) eingefügt. Da der Vektor pOTB7 über die Erkennungssequenzen verfügt, die Voraussetzung für eine BP-Rekombination (attB1 und attB2) sind, wurde er direkt für die Gateway-Klonierung genutzt. Für die Expression der ACY1 mit Hilfe des pcDNA3.1/+-Vektors in HEK293-Zellen wurde das Gen über die Restriktionssequenzen EcoRI und XhoI herausgeschnitten und in den pcDNA3.1/+-Vektor kloniert. Abbildung wurde modifiziert nach www.fruitfly.org/images/EST/pOTB7D.png. Abb. 3-2: Vektorkarte des pCMV-Sport6-Vektors. Über die Restriktionsschnittstellen EcoRI und XhoI wurde das ASPA-Referenzgen aus dem pCMV-Sport6-Vektor (BioScience) herausgeschnitten, um anschließend über diese Restriktionssequenzen in den pcDNA3.1/+ Expressionsvektor kloniert zu werden. Abbildung wurde modifiziert nach www.biovisualtech.com/bvplasmid/pCMV-Sport_6.jpg. 47 Methoden Die beiden Gene ACY1 und ASPA konnten aus den jeweiligen Vektoren über EcoRI- und XhoI-Schnittstellen herausgeschnitten werden. ACY3-cDNA hingegen wurde durch reverse Transkription (Kapitel III Abschnitt 8) von 3 µg humaner Nieren-RNA (total RNA) amplifiziert, und die Restriktionsschnittstellen für EcoRI und XhoI wurden über PCR mit spezifischen Primern an das Amplicon angefügt (Kapitel III Abschnitt 12). Alle Gene (ACY1, ASPA und ACY3) wurden somit über die Schnittstellen EcoRI und XhoI in den pcDNA3.1/+ Expressionsvektor (Abb. 3-3) für Säugetierzellkulturen kloniert. Abb. 3-3: Vektorkarte des pcDNA3.1/+ Expressionsplasmids, modifiziert nach http://tools.invitrogen.com/content/sfs/manuals/pcdna3_1_man.pdf. Die Klonierung der Gene ACY1, ASPA und ACY3 sowie deren Genvarianten in den Expressionsvektor pcDNA3.1/+ erfolgte über die Restriktionsschnittstellen EcoRI und XhoI. Der Vektor enthält neben dem Gen für die Ausprägung einer Ampicillinresistenz zusätzlich auch ein Gen für die Neomycinresistenz (G-418), was eine Vorraussetzung für die Etablierung stabil exprimerender Säugetierzelllinien darstellt. Das Schneiden von DNA mit Restriktionsendonukleasen EcoRI und XhoI erfolgte bei 37 °C für 2 h mit anschließender Hitzeinaktivierung bei 80 °C für 15 min im Thermocycler. Für eine Doppelrestriktion von Vektoren beziehungsweise DNA-Fragmenten galten folgende Konditionen: 48 Methoden Vektor DNA-Fragment (ACY1, ASPA oder ACY3) pcDNA3.1/+-VektorDNA 2 µg DNA 1 µg EcoRI 10 U EcoRI 10 U XhoI 10 U XhoI 10 U Tango Buffer 10x 2x Tango Buffer 10x 2x Beispiel-Verdau: cpcDNA3.1/+ = 0,5 µg/µl cACY3-Insert = 95 ng/µl Vektor-Ansatz Reagenz 4 µl [2 µg] pcDNA3.1/+ - - ACY3-Insert 10, 5 µl [1 µg] 1 µl EcoRI [10U/µl] 1 µl 1 µl XhoI [10U/µl] 1 µl 2 µl Tango Buffer 10x 4 µl 2 µl Aqua MP 3,5 µl Gesamtvolumen 20 µl 10 µl Insert-Ansatz Zur Ligation wurden 300 fmol verdautes DNA-Fragment und 100 fmol der ebenso aufbereiteten Vektor-DNA verwendet. Berechnung von fmol in ng: X ng= (gewünschte fmol)*(Anzahl der Bp der Sequenz)*(660 fg/fmol)*(1 ng/106 fg) Ligationsansatz: 300 fmol DNA-Fragment (ACY1, ASPA oder ACY3) 100 fmol pcDNA3.1/+-Vektor-DNA 1x T4-DNA-Ligase Puffer (10x) 2U T4-DNA-Ligase 49 Methoden Beispiel-Ligationsansatz : cpcDNA3.1/+_verdaut = 38 ng/µl cACY3-Insert_verdaut = 14 ng/µl 300 fmol ACY3-Insert_verdaut entspricht 247 ng = 17,6 µl 100 fmol pcDNA3.1/+_verdaut entspricht 358 ng = 9,4 µl Ansatz: 17,6 µl ACY3-Insert_verdaut 9,4 µl pcDNA3.1/+_verdaut 2 µl T4-DNA-Ligase [1U/µl] 4 µl T4-DNA-Ligase Puffer 10x 7 µl Aqua MP 40 µl Gesamtvolumen Nach Inkubation bei 16°C über Nacht im Thermocycler wurde die Reaktion gestoppt, indem die Proben im Thermoblock für 15 min auf 65°C erhitzt wurden. 11 Restriktionsfragmentlängenanalyse zur Identifizierung der Sequenzvariante ACY1 c. 1156C>T (p. Arg386Cys) Zur Überprüfung, ob eine SNP (c.1156C>T; p.Arg386Cys) im Exon 15 des ACY1 Gens vorliegt, wurde ein Restriktionsverdau mit der Restriktionsendonuklease BtgI entwickelt. Im Genom können SNPs alle 100-300 Nukleotide vorkommen (Bethesda, 2005). Die Häufigkeit der Veränderung sollte größer oder gleich 1 % der untersuchten Chromosomen betragen, damit sie als SNP bezeichnet werden kann (Edwards et al., 2007). Um signifikant zu bestimmen, ob ein Polymorphismus zu 1 % in einer Population vorliegt, sollten mindestens 210 Chromosomen untersucht werden (Collins & Schwartz, 2002). Dazu wurde zunächst ein 606 bp großes PCR-Produkt von 105 anonymen DNA-Kontrollen (210 Chromosomen) mit dem Primerpaar Ex15_RV_F (5’-CTGCCACTGACAACCGCTAT-3’) und Ex15_RV_R (5’-GGTGGCCACTCAAATACCAA-3’) amplifiziert und anschließend bei 37 °C 20 h mit BtgI verdaut (Abb. 3-4). Die Detektion der entstandenen DNA-Fragmente hinsichtlich ihrer Größen [bp] erfolgte mittels Agarosegelelektrophorese (Kapitel III Abschnitt 4). Als Positivkontrollen wurden DNA eines Patienten mit nachgewiesenem ACY1-Mangel, homozygot für c.1156C>T, und seines Elternteils, heterozygot für c.1156C>T, untersucht. 50 Methoden Abb. 3-4: Restiktionsverdau des 606 bp großen PCR-Produkts mit der Restriktionsendonuklease BtgI. Mutationen an der Stelle c.1156 im ACY1-Gen (c.1156C>T) zerstören die Erkennungssequenz der Restriktionsendonuklease und haben keine Restriktion durch BtgI zur Folge, die hingegen beim Genotyp c.1156C>T stattfindet. A zeigt die BtgI-Schnittstelle in der Referenzsequenz von ACY1. B stellt die entstanden DNA-Fragmente (206 bp und 400 bp) dar. C zeigt, dass durch die Mutation c.1156C>T die BtgI-Schnittstelle verändert wird. Dadurch findet keine Restriktion an dieser Postiton statt. 12 PCR zum Anfügen von Restriktionsschnittstellen Um spezifische Restriktionsschnittstellen an DNA-Fragmente (PCR-Produkte) anzufügen, wurden spezifische Primers angefertigt (Kapitel III Abschnitt 2) und eine PCR mit der „Proof-reading“ Polymerase Phusion Hot Start (Fermentas) unter folgenden Konditionen arrangiert: Reaktionsansatz: Reagenz Endkonzentration im Gesamtansatz [50 µl] Phusion Reaction Buffer (10 X) 1x dNTPs 2 mM Primer F 1, 25 µM Primer R 1, 25 µM Phusion Hot Start Polymerase 1U DNA-Matrize 0,2 ng/ µl 51 Methoden PCR-Programm: 1. 98 °C 30 s (Initiation) 2. 98 °C 5s (Denaturierung) 3. TA °C 20 s (Primeranlagerung) 4. 72°C 40 s (Elongation) → 30 Wiederholungen der Schritte 2. bis 4. 5. 72°C 8 min (finale Elongation) PCR-Produkte konnten mittels Agarosegelelektrophorese (Kapitel III Abschnitt 4) überprüft werden. Anschließend wurden diese mit Hilfe des Qiagen PCR Purification Kits (Kapitel III Abschnitt 2) aufgereinigt. 13 Zielgerichtete Mutagenese Sequenzveränderungen auf DNA-Ebene wie beispielsweise Punktmutationen, Deletionen und Insertionen von Nukleotiden können durch zielgerichtete Mutagenese (engl.: site-directed mutagenesis) realisiert werden. Das Einfügen von gewünschten Mutationen in das ACY1- und ASPA-Gen (Tab. 3-1) erfolgte mittels QuikChange® Site-Directed Mutagenesis und QuikChange® II XL Site-Directed Mutagenesis Kit der Firma Agilent Technologies. Es wurden in das ACY1- bzw. in das ASPA-Gen die in Tabelle 3-1 aufgelisteten Mutationen eingefügt. Tab. 3-1: Mutationen im ACY1- bzw. im ASPA-Gen, die durch zielgerichtete Mutagenese eingefügt wurden. Bezeichnung Mutante Mutation auf Genebene Mutation auf Proteinebene ACY1 V159M c.475G>A p.Val159Met ACY1 Del181A c.181delA p.61ThrfsX348 ACY1 R197W c.589C>T p.Arg197Trp ACY1 E233D c.699A>C p.Glu233Asp ACY1 R353C c.1057C>T p.Arg353Cys ACY1 R378W c.1132C>T p.Arg378Trp ACY1 R378Q c.1133G>A p.Arg378Gln ACY1 1105^1106 AC c.1105^1106insAC p.369ProfsX46 ACY1 R386C c.1156C>T p.Arg386Cys ACY1 R393H c.1178G>A p.Arg393His ACY1 R393C c.1177C>T p.Arg393Cys ASPA R168H c.503C>A p.Arg168His ASPA P181T c.541C>A p.Pro181Thr ASPA Y288C c.863A>G p.Tyr288Cys ASPA F295S c.884T>C p.Phe295Ser ASPA A305E c.914C>A p.Ala305Glu 52 Methoden Spezifische Mutageneseprimers wurden mittels QuickChange Tm calculator3 auf der Internetseite der Firma Agilent Technologies konstruiert und über MWG Eurofins bezogen. Alle Primers wurden zu 125 ng/µl in AquaMP (PCR Grade) verdünnt. Die Mutagenesereaktion erfolgte unter folgenden Konditionen: Reaktionsansatz: Reagenz Endkonzentration im Gesamtansatz [50 µl] QuickChange Reaction Buffer (10x) 1x dNTPs 2 mM Mutageneseprimer F 125 ng/µl Mutageneseprimer R 125 ng/µl PfuUltra HF DNA Polymerase 2,5 U DNA-Matrize mind. 1 ng/ µl PCR-Programm: 1. 95 °C 1 min (Initiation) 2. 95 °C 50 s (Denaturierung) 3. 60 °C 50 s (Primeranlagerung) 4. 78°C 5 min 40 s (Elongation) → 18 Wiederholungen der Schritte 2. bis 4. Nach der PCR-Reaktion wurde zu jedem Ansatz 1 U der Restriktionsendonuklease DpnI zugeben und der Ansatz bei 37 °C für 1 h im Thermocycler inkubiert. Zur anschließenden Transformation in chemisch kompetente E. coli XL1-Blue-Zellen wurde 1 µl des Reaktionsansatzes genutzt (Kapitel III Abschnitt 16). Nach erfolgreicher Bakterientransformation wurden je Ansatz fünf Klone mittels Kolonie-PCR (Kapitel III Abschnitt 17) überprüft und anschließend die entsprechende Vektor-DNA (Kapitel III Abschnitt 14) präpariert. 14 Plasmidpräparation im Mini- und Midimaßstab Die Anwendung der Vektor-DNA-Präparations Kits Plasmid Mini und Plasmid Midi der Firma Qiagen, erfolgte gemäß Herstellerangaben. Das DNA-Sediment aus der Präparation im Mini-Maßstab wurde in 30 µl AquaMP (PCR Grade) gelöst. Die getrocknete Plasmid-DNA aus der Präparation im Midi-Maßstab wurde in 100 µl AquaMP (PCR Grade) resuspendiert. 3 https://www.genomics.agilent.com 53 Methoden 15 Präparation chemisch kompetenter E. coli DH10B-Zellen In einem ersten Schritt wurde eine Vorkultur (LB-Medium + Streptomycinsulfat (50 µg/ml)) mit einem Klon der vorher ausgestrichenen E. coli DH10B-Bakterienkultur ange- impft und bei 37 °C über Nacht auf dem Schüttler inkubiert. Nach erfolgter Inkubation wurden 100 ml Hauptkultur (LB-Medium + Streptomycin (50 µg/ml)) auf eine optischen Dichte (OD600) bei 600 nm von 0,10 verdünnt und die Kultur auf eine OD600 von 0,25-0,30 bei 37 °C, bei 170 rpm (Inkubationsschüttler KL2, Heraeus, Hanau) schüttelnd wachsen gelassen. Sämtliche nachfolgenden Arbeitsschritte fanden bei 4°C im Kühlraum statt und alle notwendigen Materialen wurden ebenfalls im Kühlraum vorgekühlt. In einem zweiten Schritt wurde die Hauptkultur auf zwei 50-ml-Falconröhrchen verteilt und bei 4 °C während 10 min bei 3300 x g zentrifugiert. Nach Resuspension der gewonnenen Zellsedimente in 20 ml kalter Calciumchloridlösung (100 mM) quollen diese für 30 min auf Eis. Nach zehnminütiger Zentrifugation bei 4 °C und 3300 x g wurden die Zellsedimente in 1,5 ml kalter Calciumchlorid-Glycerin-Lösung (100 mM CaCl2; 15 % (v/v) Glycerin, unter Vernachlässigung der Volumenkontraktion) aufgenommen und zu 200-µl-Aliquots in Eppendorfgefäße aufgeteilt. Anschließend wurden sie in flüssigem Stickstoff schockgefroren und bei -80 °C im Gefrierschrank bis zu ihrer weiteren Verwendung gelagert. 16 Bakterientransformation 16.1 E. coli DH10B-Zellen Kompetente E. coli DH10B-Zellen in Calciumchlorid-Glycerin-Lösung wurden gekühlt auf Eis aufgetaut und zu je 100 µl in 15-ml-Falconröhrchen aliquotiert. Nun konnten entweder 10 µl von Ligationsansätzen oder ca. 100 ng präparierte Vektor-DNA zugegeben werden, die Mischung kurz geschwenkt und auf Eis für 30 min inkubiert werden. Danach folgte ein Hitzeschritt bei 42 °C für 45 s im Wasserbad. Anschließend wurde der Transformationsansatz auf Eis für 2 min gekühlt und dann bei 37 °C für 1 h schüttelnd inkubiert. Nach Inkubation wurden je 100 µl des Transformationsansatzes auf Raumtemperatur (RT) vorgewärmte LBAntibiotika-Agarplatten ausgestrichen und diese bei 37 °C über Nacht im Brutschrank gelagert. 16.2 E. coli XL1-Blue-Zellen Eine Zellsuspension chemisch kompetenter E. coli XL1-Blue-Zellen (Agilent Technologies, Böblingen, Deutschland) wurden gekühlt auf Eis aufgetaut und zu je 50 µl in vorgekühl54 Methoden te 15-ml-Falconröhrchen aliquotiert. Nach Zugabe von 1 µl mit Dpn I behandelter DNA (QuickChange Mutagenese-Ansatz, Kapitel III Abschnitt 13) wurde der Ansatz kurz geschwenkt und 30 min auf Eis inkubiert. Nach dem anschließenden Hitzeschritt bei 42 °C für 45 s im Wasserbad wurde der Transformationsansatz 2 min auf Eis abgekühlt und danach mit 500 µl NZY+-Bakteriennährmedium gemischt. Der gesamte Ansatz inkubierte bei 37 °C für 1 h auf dem Schüttler. Während der Inkubation wurden LB-Antibiotika-Agarplatten (mit Amipicillin-Natriumsalz) auf RT vorgewärmt und anschließend 100 µl der transformierten Bakteriensuspension ausgestrichen. Die Platten inkubierten bei 37 °C über Nacht im Brutschrank. 17 Kolonie-PCR Zur Verifizierung einer erfolgreichen Klonierung der DNA-Fragmente in einen Vektor diente eine Kolonie-PCR. Dazu wurden 100 µl der transformierten E. coli DH10B-Zellen auf LB-Festagarplatten mit Ampicillin (100 ng/ml LB-Agar) ausgestrichen. Darauf gewachsene Einzelklone konnten mit einer 10 µl Pipettenspitze selektiert und in 0,2-ml-PCRReaktionsgefäße überführt werden. Die Pipettenspitze wurde danach in ein vorbereitetes Vorkulturröhrchen (5 ml LB-Medium + Ampicillin [100 ng/ml LB-Medium]) gegeben und die Kultur über Nacht bei 37 °C auf dem Schüttler herangezogen. Die DNA konnte anschließend mit folgendem PCR-Ansatz amplifiziert werden: Reaktionsansatz: Reagenz Endkonzentration im Gesamtansatz [50 µl] PCR-Reaction Buffer (10x) 1x dNTPs 2 mM pcDNA3.1/+_F 1, 25 µM pcDNA3.1/+_R 1, 25 µM Hot Start Taq Polymerase 1U DNA-Matrize 1 Klon 55 Methoden PCR-Programm: 1. 95°C 10 min (Initiation) 2. 94°C 1 min (Denaturierung) 3. 63°C 1 min (Primeranlagerung) 4. 72°C 1 min 40 s (Elongation) → 30 Wiederholungen der Schritte 2. bis 4. 5. 72°C 10 min (finale Elongation) Anschließend wurde mittels Agarosegelelektrophorese (Kapitel III Abschnitt 4) überprüft, ob sich in den E. coli DH10B-Zellen der Vektor mit dem gewünschten DNA-Fragment befand. 18 Prokaryotische Zellkultur Beide Bakterienkulturen (E. coli DH10B und E. coli XL1-Blue) wurden in LB-Medium (Kapitel II Abschnitt 1.3) in Bakterienkulturflaschen mit Schikanen bei 37 °C, bei 170 rpm schüttelnd kultiviert. E. coli DH10B-Zellen besitzen eine Resistenz gegen das Antibiotikum Streptomycinsulfat. Daher wurde zur Selektion beim Kultivieren von E. coli DH10B-Zellen Streptomycinsulfat (50 µg/ml) zugesetzt. Andere Antibiotika zur Kultivierung waren nur nötig, wenn die Bakterienzellen mit einem Vektor transformiert worden waren, welcher ein Gen für eine bestimmte Antibiotikaresistenz trug: Vektor Antibiotikaresistenz pOTB7 Chloramphenicol pcDNA3.1/+ Ampicillin und Neomycin (G-418) pcDNA3.1/HisB/lacZ Ampicillin und Neomycin (G-418) pDONR221 Kanamycin pCMVSPORT6 Ampicillin 19 Eukaryotische Zellkultur Sämtliche Zellkulturarbeiten wurden unter der Sterilwerkbank mit sterilen Materialien und vorgewärmten (37 °C im Wasserbad), steril filtrierten (Stericup Filtereinheit) Kultur- und Waschmedien durchgeführt. Für alle Medien wurde das zugesetzte fötale Kälberserum (FKS) hitzeinaktiviert. Dafür wurde es 30 min bei 56 °C im Wasserbad inkubiert und danach unter der Sterilwerkbank zu je 50 ml aliquotiert. Bis zur Verwendung wurde es bei -20 °C gelagert. 56 Methoden 19.1 Humane embyronale Nierenzellen (HEK293-Zellen) HEK293-Zellen (transformiert mit DNA-Fragmenten des Adenovirus-Typs 5 (Ad5)) wurden vom DSMZ als kryokonservierte Zellkultur bezogen (Graham et al., 1977). Das gefrorene Zellaliquot wurde für 1 min bei 37 °C im Wasserbad angetaut und in 3 ml vorgewärmtes HEK293-Kulturmedium gegeben. Anschließend wurde bei RT 5 min bei 300 x g zentrifugiert. Als Behälter hierfür diente ein 15-ml-Falconröhrchen. Das alte Medium wurde vorsichtig abgezogen, das Zellsediment in 10 ml neuem HEK293-Kulturmedium gelöst und die Zellsuspension anschließend in eine 75 cm2 große Zellkulturflasche überführt. Bei 37 °C und 5 % CO2 wurden die HEK293-Zellen im Brutschrank inkubiert. Ein Mediumwechsel wurde jeweils alle 24 h vor der Subkultivierung vollzogen. Die Zellen wurden alle 3-4 Tage, wenn sie einen gleichmäßigen Monolayer ausgebildet hatten, im Verhältnis 1:10 in eine neue Zellkulturflasche (75 cm2) aufgeteilt (Subkultivierung). Dafür wurden die adhärenten HEK293Zellen zunächst einmal mit 5 ml PBS gewaschen und anschließend 2 ml Trypsin-EDTALösung aufgetropft. Nach zweiminütiger Inkubation des Ansatzes bei 37 °C im Brutschrank wurden die Zellen durch leichtes Anklopfen der Zellkulturflasche gelöst. Die Zellen wurden in 8 ml frischem HEK293-Kulturmedium aufgenommen und kurz resuspendiert. Danach wurde 1 ml der Suspension in 9 ml frisch vorgelegtes HEK293-Kulturmedium gegeben. Bis zum nächsten Mediumwechsel inkubierten die HEK293-Zellkulturen bei 37 °C und 5 % CO2 im Brutschrank. 19.2 Immortalisierte humane Lymphozyten 19.2.1 Vermehrung von Epstein-Barr-Viren (EBV) Es wurde eine Affenzelllinie des Typs B95-8 aus Marmosetaffen genutzt, die das EBVVirus produziert. Die Zellen wurden vom Institut für Humangenetik Freiburg (Arbeitsguppe Prof. Scherer) bereitgestellt. Der Flüssigkeitsüberstand und einige Zellen der Suspensionskultur (25 cm2 Zellkulturflaschen) wurden vorsichtig abgezogen und in neue Zellkulturflaschen (25 cm2) überführt, danach 4 ml frisches Lymphozyten-Kulturmedium dazugegeben und die Zellen resuspendiert. Auch auf die ursprüngliche Affenzellkultur wurden 4 ml neues Lymphozyten-Kulturmedium gegeben und beide Kulturen bis zum nächsten Mediumwechsel in vier Tagen bei 37 °C und 5 % CO2 im Brutschrank inkubiert. Aus diesen Kulturen wurden für die EBV-Transformation die Viren steril filtriert. Dafür wurde die Virus-Lösung durch eine Spritze mit Spritzenvorsatzfilter (0,22 µm) gedrückt. Der Überstand wurde anschließend vorsichtig abgenommen und verworfen. 57 Methoden 19.2.2 EBV-Transformation Um immortalisierte humane Lymphozytenkulturen zu erhalten, musten frische EDTAoder Heparin-Blutproben von Patienten mit dem EBV-Virus behandelt werden. Als Erstes wurden 1,5 ml der frischen Blutprobe mit 30 ml Lymphozyten-Waschmedium versetzt und das Gemisch bei RT 10 min und 1200 x g zentrifugiert. EBV-Viren befanden sich im Überstand der Affenzellkultur (Kapitel III Abschnitt 19.2.1). Für die Transformation von Lymphozyten musste dieser Überstand steril filtriert werden. Dafür wurde er durch eine Spritze mit Spritzenvorsatzfilter (0,22 µm) gedrückt. Der Überstand wurde anschließend vorsichtig abgenommen und verworfen. Das Sediment wurde anschließend mit 2 ml sterilem EBVVirusfiltrat versetzt, auf die vier vorbereiteten Zellkulturflaschen (vier 25-cm2- Suspensionskulturflaschen mit je 2,5 ml Kulturmedium gefüllt) aufgeteilt (0,3 ml, 0,6 ml, 1,5 ml, restliches Volumen) und durch vorsichtiges Auf- und Abpipettieren gemischt. Die Ansätze wurden bis zum ersten Mediumswechsel nach 5-8 Tagen bei 37 °C und 5 % CO2 im Brutschrank inkubiert. 19.2.3 Vermehrung und Subkultivierung der Lymphozytenkultur Zur Vermehrung der immortalisierten Lymphozyten wurde das Lymphozyten-Kulturmedium über den am Zellkulturboden schwimmenden Zellen vorsichtig abgezogen, ohne dabei die Lymphozyten mit abzusaugen. Mit frischem Lymphozyten-Kulturmedium (2,5 ml) konnten die Zellen anschließend gemischt werden und bis zum nächsten Mediumwechsel in 4 Tagen bei 37 °C und 5 % CO2 inkubieren. Je nachdem wie schnell die Lymphozyten sich vermehrten, konnten diese alternativ in 75 cm2 großen Zellkulturflaschen überführt und darin vermehrt werden. Lymphozyten wurden zur Kultivierung in 75-cm2-Zellkulturflaschen mit einem Gesamtvolumen von 8 ml befüllt. Wenn der Boden der Suspensionskulturflasche von Zellaggregaten bedeckt war, konnten die Lymphozyten geerntet werden. 19.2.4 Ernten von immortalisierten Lymphozyten Zwei Tage vor einer geplanten Herstellung von Lymphozytensedimenten wurde das Medium der Kultur gewechselt. Hierfür wurde der Flüssigkeitsüberstand der Kultur vorsichtig mit der Pipettierhilfe abgezogen, ohne Zellen miteinzusaugen. Die Lymphozyten wurden in vorgekühltem (ca. 4°C) PBS (5 ml) aufgenommen, resuspendiert und in ein 15-mlFalconröhrchen überführt. Anschließend wurde die Suspension für 5 min bei 4 °C und 300 x g zentrifugiert. Das gewonnene Zellsediment wurde daraufhin dreimal mit 5 ml kaltem PBS nach diesem Prozedere gewaschen. Anschließend wurde je 1 ml der Zellsuspension in ein 1,5-ml-Reaktionsgefäß überführt und abermals unter gleichen Bedingungen zentrifugiert. Der 58 Methoden Überstand wurde vollständig abgezogen und das Lymphozytensediment bei -80 °C bis zur Verwendung im ACY1- oder ASPA-Enzymassay gelagert. 19.3 Humane Fibroblasten Für jede Fibroblastenzelllinie wurde ein Mediumwechsel jeweils alle 24 h vor der Subkultivierung vollzogen. Die Zellen wurden, wenn sie einen gleichmäßigen Monolayer ausgebildet hatten, im Verhältnis 1:10 in eine neue Zellkulturflasche (75 cm2) aufgeteilt (Subkultivierung). Dafür wurden die adhärenten Fibroblasten zunächst einmal mit 5 ml PBS gewaschen und anschließend 2 ml Trypsin-EDTA-Lösung aufgetropft. Nach fünfminütiger Inkubation des Ansatzes bei 37 °C im Brutschrank wurden die Zellen durch leichtes Anklopfen der Zellkulturflasche gelöst. Die Zellen wurden in 8 ml frischem Fibroblasten-Kulturmedium aufgenommen und kurz resuspendiert. Danach wurde 1 ml der Suspension in 9 ml frisch vorgelegtes Fibroblasten-Kulturmedium gegeben. Bis zum nächsten Mediumwechsel inkubierten die Fibroblasten-Zellkulturen bei 37 °C und 5 % CO2 im Brutschrank. 19.4 Sf9- und Sf21-Insektenzellen Die Insektenzelllinien Sf9 und Sf21 können in Suspensionskultur oder als adhärente Monolayer wachsen. Die Inkubation der adhärenten Sf9- oder Sf21-Insektenzellen fand in feuchten Kammern bei 27 °C im Brutschrank statt. Das Nährmedium Sf-900 III SFM wurde zur Subkultivierung der Zellen eingesetzt. Zur Vermehrung adhärenter Insektenzelllinien wurden ca. 105 Zellen in einer 75 cm2-Zellkulturflasche in 10 ml Sf-900 III SFM-Insektenzellmedium ausgesät. Nach Ausbildung eines konfluenten Zellrasens wurden die Zellen mit einem sterilen Zellkulturschaber abgelöst und die so erhaltene Zellsuspension 5 min bei 200 x g zentrifugiert. Nach Aufnahme in frischem Medium wurden 100 µl der Zellsuspension 1:5 mit Trypanblau-Lösung (0,5 % (w/v) in Aqua MP) verdünnt und in eine Neubauerzählkammer gegeben, bis diese vollständig gefüllt war. Zellen in allen vier Großquadraten (je 16 kleine Quadrate) wurden ausgezählt, der Mittelwert für ein Großquadrat wurde gebildet und die Gesamtzellzahl und Vitalität der Zellen nach folgendem Ansatz berechnet: Gesamtzellzahl/ml = Zellzahl * Verdünnungsfaktor * Gesamtvolumen * 104 Vitale Zellen = Zellzahl blauer Zellen * 100 % / Gesamtzellzahl 59 Methoden Anschließend wurden die Zellen für adhärentes Wachstum neu ausgesät oder in Suspensionskultur gebracht. Die Sf9-Suspensionskultur wurde (zur Expression von ACY1-Protein) in 1-L-Spinnerflaschen in einer feuchten Kammer bei 27 °C und in serumfreien Sf-900 III SFMMedium kultiviert, um die Transfektionsrate mit rekombinantem Baculovirus zu erhöhen. Die Anpassung der Sf9-Zellen an serumfreies Medium erfolgte schrittweise. Dazu wurden die Zellen zwei Wochen mit Sf-900 III SFM-Medium mit 5 % FKS kultiviert. Anschließend wurden diese Zellen für die nächsten zwei Wochen in 2,5 % serumhaltigen Sf-900 III SFMMedium kultiviert. Wuchsen die Sf9-Zellen ausreichend schnell, wurden sie danach 3 Wochen in Sf-900 III SFM-Medium mit nur noch 1 % FKS kultiviert. Danach erfolgte eine Adaptionsphase von sechs Wochen im serumfreien Medium, bevor sie mit dem rekombinanten Baculovirus infiziert wurden. Für Suspensionskulturen wurden die Zellen auf eine Dichte von 0,5 bis 1,0*106 ml-1 eingestellt und wurde das Sf-900 II SFM Insektenzellmedium durch 1 % Puromycindihydrochlorid ergänzt. Puromycin ist ein Aminonukleosid-Antibiotikum aus Streptomyces alboniger. Das Antibiotikum hemmt das Wachstum grampositiver Bakterien. Die Zellen wurden alle zwei bis drei Tage gezählt und bei einer Dichte von 2,0 bis 2,5* 106 ml-1 mit frischem Medium auf eine Dichte von 0,5*106 ml-1 verdünnt. 20 BaculoDirect Protein Expression in Sf9-Insektenzellen Sf9-Insektenzellen eignen sich zur Überexpression eukaryotischer Proteine, wie des ACY1-Proteins mit der Referenzsequenz, da sie die geeignete Maschinerie für postranslationale Modifikationen, wie beispielsweise Glykosylierungen, bereitstellen. Für das BaculoDirect-System (Agilent Technologies) ist es nötig, die DNA-Sequenz des gewünschten Gens in einem Gateway-Vektor zu rekombinieren. Der Vektor enthält die Rekombinationssequenzen attL. Damit ist eine Rekombination des ACY1-Gens mit der Referenzsequenz in das lineare Baculovirus (das attR-Sequenzen aufweist) möglich. Diese Methode wird als Gateway-Klonierung beschrieben und wurde von der Firma Invitrogen eingeführt (Invitrogen, 2000). In den Gateway-Vektor pDONR221 (Abb. 3-6) wurde das ACY1-Gen mit der Referenzsequenz (im pOTB7-Vektor (Abb. 3-1)) über eine Rekombination mit BPClonase eingebracht. Voraussetzung für eine erfolgreiche Gateway-Klonierung ist, dass der Spendervektor (hier pOTB7-ACY1) die DNA-Sequenz der ACY1 zwischen attB-Sequenzen einschließt (Abb. 3-5). Vor der Rekombinationsreaktion wurde der Vektor (pOTB7-ACY1) mit der Restriktionsendonuklease BamH I linearisiert. 60 Methoden Abb. 3-5: Gateway-Klonierung: Die BP-Rekombination in den Spendervektor pDONR221 gelang über die attBRekombinationssequenzen. Anschließend fand eine LR-Rekombination über den Spendervektor pDONR221 in lineare Baculovirus-DNA mit flankierenden attR-Rekominationssequenzen statt. Dies diente der Klonierung des ACY1-Referenzgens in Baculoviren. Abb. 3-6: Vektorkarte des Spendervektors pDONR221 zur Rekombination von Genen in lineare BaculovirusDNA modifiziert nach http://tools.invitrogen.com/content/sfs/vectors/pdonr221_pdonrzeo_map.pdf. Der Vektor pDONR221 enthält spezifische Sequenzen (attP1 und attP2), die sich nach der Rekombination mit einem Spendervektor (enthält attB1 und attB2 Sequenzen) in attP1 und attP2 Sequenzen umwandeln und das gewünschte Gen umschließen. Aufgrund dieser Sequenzeigenschaft des pDONR221 ist es möglich, Gene in Baculovirus mittels LR-Clonase zu rekombinieren. 61 Methoden Folgende Reaktionsansätze wurden für die Rekombination benötigt: BP-Reaktionsansatz: pDONR221 Spendervektor 50 fmol Linearer pOTB7-ACY1-Vektor 50 fmol BP-Clonase II enzyme mix (5x) TE-Buffer, pH 8,0 1x add zum entsprechenden Gesamtvolumen Beispiel-BP-Reaktion: Berechnung von fmol in ng: X ng= (50 fmol)*(Anzahl der Bp der Sequenz)*(660 fg/fmol)*(1 ng/106 fg) pDONR221=4550 bp pOTB7_ACY1=3300 bp 50 fmol pDONR221 entsprechen 150 ng 50 fmol pOTB7_ACY1 entsprechen 109 ng cpDONR221 = 150 ng/µl cpOTB7_ACY1 = 11,2 ng/µl Beispiel-Ansatz: pDONR221 1 µl pOTB7_ACY1 9,7 µl BP-Clonase II enzyme mix (5x) 4 µl TE-Buffer, pH 8,0 5,3 µl Gesamtvolumen 20 µl LR-Reaktionsansatz: BaculoDirect Linear DNA TE-Buffer, pH 8,0 10 µl (Aliquot) 4 µl Spendervektor pDONR221 –ACY1 LR-Clonase II enzyme mix (5x) 62 300 ng 1x Methoden Beispiel-LR-Reaktion: cpDONR221_ACY1=200 ng/µl Beispiel-Ansatz: BaculoDirect Linear DNA 10 µl (Aliquot) TE-Buffer, pH 8,0 4,5 µl Spendervektor pDONR221 –ACY1 1,5 µl LR-Clonase II enzyme mix (5x) 4 µl Gesamtvolumen 20 µl Beide Rekombinationsreaktionen inkubierten bei 25 °C im Thermoblock für 16 h und wurden danach bei 4 °C bis zur Transfektion der Sf9-Zellen gelagert. Die Transfektion der rekombinanten Baculovirus-DNA mit dem Gen für ACY1 ist die Voraussetzung der Expression des ACY1-Referenzenzyms. Dazu wurden Sf9-Zellen zunächst in einer Zellzahl von 8*105 in 25 cm2 Zellkulturflaschen eingesät. Sf9-Zellen wurden vorsichtig mit einem sterilen Zellschaber in der Kulturflasche abgelöst und die Zellsuspension wurde in ein 15-mlFalconröhrchen überführt. Ein Volumen von 20 µl Zellsuspension wurde zur Zählung verwendet. Das für die Transfektion benötigte Zellsuspensionsvolumen wurde durch Auszählen der Zellen mit Hilfe der Neubauerzählkammer ermittelt. Nach dem Aussäen der Zellen konnte die restliche Zellsuspension in eine neue 75 cm2 Kulturflasche überführt und wieder zurück in den Inkubationsschrank bei 27 °C gestellt werden. Eingesäte Sf9-Zellen wurden dann bei 27°C für 1 h inkubiert bis sie einen adhärent wachsenden Monolayer gebildet hatten. Für den Transfektionsansatz wurde die, durch Gateway-Klonierung hergestellte, rekombinante Baculovirus-DNA mit serumfreien Grace’s-Insect-Medium versetzt. Bei dem für die Transfektion verwendeten Reagenz handelt es sich um Cellfectin (enthalten im BaculoDirect-Kit), ein kationisches Gemisch auf Lipidbasis. Folgende Ansätze wurden benötigt: Transfektions-Mix A: 5-10 µl LR-Reaktion-Mix +100 µl Grace’s-Insect-Medium (ohne Zusätze) Transfektions-Mix B: 6 µl Cellfectin +100 µl Grace’s-Insect-Medium (ohne Zusätze) 63 Methoden Beide Transfektionsansätze (A und B) wurden in einem 1,5-ml-Reaktionsgefäß durch Kippen gemischt und anschließend bei RT 45 min inkubiert, bevor 800 µl Grace’s-InsectMedium dazu gegeben wurden. Dieses Gemisch konnte nach Waschen der nun adhärenten Sf9-Zellen mit 2 ml Grace’s-Insect-Medium vorsichtig auf die Zellen aufgetropft werden. Nach der fünfstündigen Inkubation der transfizierten SF-21-Zellen bei 27 °C im Brutschrank wurde der Transfektions-Mix vollständig abgezogen und 2 ml vorgewärmtes Sf-900 III SFMKulturmedium mit 100 µM Ganciclovir, als Selektionsreagenz, vorsichtig auf die Zellen gegeben. Die transfizierten Zellen wurden anschließend in einer feuchten Kammer bei 27 °C für 96 h im Brutschrank inkubiert. Während dieser Zeit wurden die Zellen täglich auf Veränderungen ihrer Morphologie unter dem Mikroskop untersucht. Nach der Inkubation wurde der Überstand abgezogen, in ein 15-ml-Falconröhrchen überführt und bei RT während 5 min bei 1000 x g zentrifugiert, um Zellen und große Zellbruchstücke zu entfernen. Der Überstand, in dem sich der nun rekombinante Baculovirus (Virusstock P1) befand, wurde in ein neues Röhrchen überführt und bei 4 °C im Kühlschrank lichtgeschützt gelagert, um einen frühen Zerfall der Virus-DNA vorzubeugen. Für die Vermehrung des Virusstocks ist es nötig, weitere Zellen mit diesem zu infizieren, um dadurch einen höheren Virustiter zu erhalten. Dafür wurden wiederum 8*105 Sf9-Zellen in 25 cm2 Zellkulturflaschen eingesät und bei 27 °C etwa 1 h inkubiert, bis sich die Zellen am Zellkulturflaschenboden angeheftet hatten. Im Medium befand sich zudem der Selektionszusatz Ganciclovir (100 µM). Ein Volumen von 5 µl Virusstock P1 wurde anschließend auf die Zellen gegeben und die Flasche wurde vorsichtig geschwenkt, damit sich die Zellen nicht vom Zellkulturflaschenboden ablösten. Nach einer 72 hInkubation der Zellen bei 27 °C in der feuchten Kammer wurde Virusüberstand (P2) von Zellen und Zellstücken durch die Zentrifugation bei RT, 5 min und 1200 x g getrennt. Der erhaltene Virusstock P2 wurde bis zur weiteren Verwendung zur Infektion einer Suspensionskultur bei 4°C im Kühlschrank lichtgeschützt gelagert, um die Infektiösität des Virus aufrecht zu erhalten (Jarvis & Garcia, 1994). 21 Transfektion von HEK293-Zellen mit Xfect Transfektionsreagenz Zur Expression von Proteinen wurde der Expressionsvektor pcDNA3.1/+ gewählt. In diesen konnten in vorhergegangen Klonierungsschritten die Referenzgene von ACY1, ASPA und ACY3 und entsprechende Genvarianten eingebracht werden (Kapitel III Abschnitt 10). Einen Tag vor der Transfektion wurden die Zellen so ausgesät, dass sie zum Zeitpunkt des Transfektionsbeginns ca. 50–80 % Konfluenz aufwiesen. Zur Transfektion der HEK293- 64 Methoden Zellen diente das Transfektionsreagenz Xfect der Firma Clontech. Für 1 µg Vektor-DNA ist ein Volumen von 0,3 µl Xfect nötig, um optimale Reaktionsbedingungen zu schaffen. Es wurden je Transfektionsansatz 10 µg Vektor-DNA benötigt und unter folgenden Bedingungen transfiziert: Transfektions-Mix A: Vektor-DNA 10 µg (Bsp.: pcDNA3.1/+ACY1) Transfektionspuffer Transfektions-Mix B: add Xfect-Transfektionsreagenz Transfektionspuffer 300 µl 3 µl add 300 µl Beide Ansätze wurden gut gemischt, danach zusammengeführt und bei RT 15 min lang inkubiert, bevor der Gesamtansatz tropfenweise zu den am Tag vorher ausgesäten HEK293Zellen zugegeben wurde. Im Anschluss folgte eine vierstündige Inkubation der zu transfizierenden Zellen bei 37 °C und 5 % CO2 im Brutschrank mit anschließendem Mediumwechsel. Die HEK293-Zellen wurden weitere 48 h inkubiert, bevor sie geerntet werden konnten. Die HEK293-Zellen, die nun ein bestimmtes ACY-Protein exprimierten, wurden zweimal mit kaltem (4 °C) PBS gewaschen, bei 4 °C, 1500 x g für 5 min abzentrifugiert. Das Zellsediment wurde im Gefrierschrank bei -80 °C bis zur Verwendung für ein Enzymaktivitätstest oder die SDS-PAGE/Western Blot-Analyse (Kapitel III Abschnitt 29) gelagert. 21.1 Kultivierung stabiler rekombinanter HEK293-Zelllinien Dadurch, dass der pcDNA3.1/+-Vektor eine Neomycinresistenz (G-418) trägt, ist es möglich, HEK293-Zellen, die diesen Vektor in sich tragen, zu selektieren. Dazu wurde das HEK293-Kulturmedium mit 500 µg/ml G-418 versetzt und dann 48 h nach dem Transfektions-Beginn auf die HEK293-Zellen gegeben. Nach etwa 5-7 Tagen starben alle Zellen, die keinen pcDNA3.1/+-Vektor in sich tragen. Zunächst bildeten sich nur wenige Zellkolonien. Ein Mediumwechsel war nur alle 3-4 Tage erforderlich. Sobald sich ein gleichmäßiger Monolayer bildete, konnten die Zellen auf eine 75 cm2 Zellkulturflasche übertragen werden und (Kapitel III Abschnitt 19.1) subkultiviert werden. Der Unterschied zur unter Kapitel III Abschnitt 19 beschriebenen Kultivierung lag darin, dass dem HEK293-Kulturmedium G-418 (500 µg/ml) zugesetzt wurde. 65 Methoden Die Etablierung stabiler HEK293-Zelllinien, die eine bestimmte Variante des ACY1- oder ASPA-Gens exprimieren, war Voraussetzung für die Durchführung von Komplementationsstudien. Für diese Studien wurden HEK293-Zellen, die stabil eine ACY1-Genvariante exprimierten, erneut mit dem ASPA-Gen mit der Referenzsequenz transfiziert. Analog erfolgten dazu die Komplementationsstudien zu ASPA-Genvarianten. 22 β-Gal-Färbung transfizierter HEK293-Zellen Diese Methode diente zum Anfärben adhärent wachsender HEK293-Zellen, die zuvor mit der Vektor-DNA pcDNA3.1/HisB/lacZ (Abb. 3-7) transfiziert worden waren. Dafür wurde die mitgelieferte Fixierlösung und 10 X PBS 1:10 in einem 15-ml-Falconröhrchen verdünnt. Das 5-Bromo-4-hloro-indolyl-β-D-galactopyranosid (X-Gal) wurde abgewogen, mit Dimethylformamid (DMF) in Lösung gebracht (20 mg/ml DMF) und bis zum Verbrauch auf Eis gelagert. Nach dem Waschen der ausgesäten Zellen mit 1x PBS (1 ml), wurden 1,5 ml der verdünnten Fixierlösung langsam und vorsichtig auf die Zellen getropft. Anschließend wurde der Ansatz bei RT 10 min inkubiert. In der Inkubationszeit wurde die Färbelösung hergestellt: 20 µl Lösung A Färbelösung (für 3 ml Zellkulturvolumen): 20 µl Lösung B 20 µl Lösung C 100 µl X-Gal (20 mg/ml DMF) 1840 µl 1x PBS Im Anschluss wurden die Zellen zweimal mit 1x PBS gewaschen und 2 ml Färbelösung vorsichtig tropfenweise auf die Zellen gegeben. Nach dreißigminütiger Inkubation bei 37°C (HEK293-Zellen) konnten die blau gefärbten Zellen unter dem Mikroskop analysiert werden. 66 Methoden Abb. 3-7: Vektorkarte des pcDNA3.1/HisB/lacZ-Plasmids modifiziert nach http://bioweb.wku.edu/faculty/Crawford/plasmid.jpg. Der Vektor pcDNA3.1/HisB_lacZ diente als Transfektionskontrolle. HEK293Zellen, die diesen Vektor aufgenommen hatten, konnten die Substanz 5-Bromo-4-chloro-indolyl-β-Dgalaktopyranosid (X-Gal) im Färbelösungsansatz durch das Enzym β-Galaktosidase (codiert durch das lacZ-Gen im Vektor pcDNA3.1/HisB_lacZ ) zu 5-Bromo-4-chloro-3-hydroxyindol und Galaktose umsetzten. Transfizierte HEK293-Zellen erschienen anschließend in blauer Farbe unter dem Lichtmikroskop (200-fache Vergrößerung). 23 Zellaufschluss mittels Ultraschall zur Gewinnung von Zellhomogenaten Zellmembranen können mit Hilfe von Ultraschall zerstört werden, um dadurch die im Zytosol befindlichen Enzyme im Zellhomogenat frei zugänglich zu machen. Hierfür werden über eine Sonotrode, die sich in der Zellsuspension befindet, mechanische Schwingungen auf das Medium übertragen. Diese Schwingungen führen zu Kavitationserscheinungen in einem Umkreis von einigen Millimetern um die Sonotrode (Müller, 1996). Durch das Kollabieren der Kavitationserscheinungen entstehen Wirbel mit hohen Scherkräften, die dazu in der Lage sind, die Membranen prokaryotischer und eukaryotischer Zellen zu zerstören (Müller, 1996). Zellsedimente werden vor der Behandlung mit Ultraschall in einem geeigneten Puffersystem suspendiert. Für ACY1- und ACY3-Aktivitätsmessungen wurden Zellsedimente in 350 µl Homogenisierungspuffer (Kapitel II Abschnitt 1.3) gelöst. Zellsedimente zur Messung von ASPA-Enzymaktivitäten konnten in 120 µl kaltem (ca. 4°C), entgastem AquaMP resuspendiert werden. Der Aufschluss per Ultraschall für drei Impulse mit einer Intensität von 10 % und 1 s Schalldauer wurde dreimal nach einer etwa 30 s andauernden Pause wiederholt. Während der Pausen der Ultraschallbehandlung wurden die Zellsuspensionen ständig in Eiswasser gekühlt, um einem Überhitzen der Suspension und dem damit einhergehenden Denaturieren 67 Methoden von Proteinen vorzubeugen. Die Sonotrode wurde zwischen dem Homogenisieren der unterschiedlichen Zellsuspensionen gereinigt, indem sie nacheinander in drei Erlenmeyerkolben, gefüllt mit AquaMP, getaucht wurde und ebenfalls drei Impulse Ultraschall entsandt wurden. Anschließend war die Sonotrode mit Aceton und AquaMP zu reinigen. Die homogenisierten Proben wurden anschließend bis zur Zentrifugation auf Eis gekühlt. Zellhomogenate, die auf ACY1- oder ACY3-Aktivität getestet werden sollten, wurden nach dem Zellaufschluss für 15 min bei 4 °C und 13 000 x g in einer Eppendorftischzentrifuge zentrifugiert. Der Überstand wurde anschließend in ein neues Reaktionsgefäß überführt und bei 4 °C gekühlt, bevor 288 µl des Überstands für das Enzymassay (Kapitel III Abschnitt 24 und 26) eingesetzt wurden. Das restliche Zellhomogenat wurde bis zur Bestimmung der Gesamtproteinmenge (Kapitel III Abschnitt 28) bei -80 °C gelagert. Für Messungen der ASPA-Aktivität wurden die aufgeschlossenen Zellsuspensionen bei einem ersten Zentrifugationsschritt bei 4 °C für 20 min bei 10 000 x g zentrifugiert. Anschließend wurde der Überstand in ein neues Reaktionsgefäß überführt und dieser ein zweites Mal bei 4 °C für 10 min bei 10 000 x g zentrifugiert. Das dadurch als Überstand gewonnene Zellhomogenat wurde bis zum Einsatz im ASPA-Enzymassay auf Eis gelagert. Das danach übrigbleibende Zellhomogenat wurde bei -80 °C bis zur Messung der Proteinkonzentration (Kapitel III Abschnitt 28) gelagert. 24 ACY1-Enzymaktivitätsassay Mitz & Schlueter beschrieben 1958 einen auf der Ninhydrin-Reaktion basierenden Test, um photometrisch proteolytische Enzyme zu untersuchen (Mitz & Schlueter, 1958). Die von ihnen beschriebene Methode wurde im Labor an den Mikromaßstab angepasst und zur Messung der spezifischen ACY1-Aktivität adaptiert (Sommer et al., 2011). Bei dieser Methode reagieren freie Aminosäuren, im Gegensatz zu acetylierten Aminosäuren, mit dem NinhydrinReagenz und verursachen dadurch einem Farbumschlag der Lösung. Aufgrund der Färbung kann mit Hilfe einer Eichkurve auf die Konzentrationen freier Aminosäuren geschlossen werden (Mitz & Schlueter, 1958). 24.1 Ansatz der Proben Zum Testen der Enzymaktivität wurde N-Acetyl-L-Methionin (20 mM im Reaktionsansatz) verwendet. Dafür wurden eingefrorene Zellsedimente der transfizierten HEK293- oder Sf9-Zellen verwendet, die ACY1-Proteine überexprimierten. Die Substratlösung wurde zu 68 Methoden einer Konzentration von 200 mM in Hepespuffer (Kapitel II Abschnitt 1.3) eingestellt. Für eine spätere Analyse durch Tandem-Massenspektrometrie wurden 5 mm große Stanzlinge aus einer 903 Protein Saver Card in verschließbare Glasröhrchen gegeben. Nach dem Aufschluss der Zellen mittels Ultraschall (Kapitel III Abschnitt 23) wurden 288 µl der Homogenate mit 32 µl des 200 mM Nα-Acetyl-L-Methionins versetzt, durch Schwenken gemischt und auf Eis gestellt. Ein Volumen von 40 µl der angesetzten Probe wurde sofort bei -80 °C in einem Eppendorfgefäß eingefroren. Weitere 15 µl der Probe wurden auf ein Stanzling gegeben und bei -80 °C bis zur Aufarbeitung für die Tandem-Massenspektrometrie (Kapitel III Abschnitt 27) gelagert. Das restliche Probevolumen wurde in den auf 37 °C vorgeheizten Thermoblock gestellt und inkubiert. Weitere 40-µl- und 15-µl-Aliquots wurden nach 30 min, 60 min, 90 min und 120 min entnommen. 24.2 ACY1-Aktivitätsmessung mit photometrischem Test Zur Messung der ACY1-Enzymaktivität wurde auch ein photometrischer Assay durchgeführt, in dem die Reaktion von Ninhydrin mit Aminogruppen freier Aminosäuren stattfindet. Ninhydrin ist das Hydrat des 1,2,3-Indantrions und dient zum Nachweis von Aminosäuren, Polypeptiden und Proteinen (Beyer, 1998). Die Aminosäure wird zu einem Amin decarboxyliert. Das Amin unterliegt danach einer oxidativen Desaminierung zu einem Aldehyd. Bei diesem Schritt wird Ninhydrin reduziert. Das Zwischenprodukt, ein Aminoderivat des Reduktons, setzt sich mit einem weiteren Ninhydrin-Molekül zu einem blauen Reaktionsprodukt zusammen (Ruhemanns-Purpur) (Beyer, 1998; Ruhemann, 1910). Beim Erhitzen des Ansatzes mit einer verdünnten Ninhydrin-Lösung (Kapitel II Abschnitt 1.3) tritt somit eine Blaufärbung der Ansatzlösung auf. Gemäß dem Lambert-Beerschen Gesetz ist die Intensität der Farbe proportional zur Konzentration an freiem L-Methionin. Daher sind quantitative Messungen bei 570 nm im Photometer möglich, vorrausgesetzt dass die Konzentration mit Hilfe einer Eichkurve verglichen werden kann. Die Eichkurve ergibt sich aus einer Verdünnungsreihe von L-Methionin: 69 Methoden Dazu wurde zunächst eine 20 mM L-Methionin-Stammlösung A hergestellt. In den folgenden Tabellen (Tab. 3-2 und 3-3) ist die Zusammensetzung der Lösungen für die L-Methionin Verdünnungsreihe dargestellt. Tab. 3-2: Herstellung der Lösungen B und C für das ACY1-Enzymassay Lösung Konzentration Herstellung Lösung B 10 mM 100 µl Stammlösung A + 100 µl Hepespuffer Lösung C 5 mM 50 µl Stammlösung A + 150 µl Hepespuffer 24.3 Verdünnungsreihe: Tab. 3-3: Herstellung der Verdünnungsreihe für L-Methionin zur Messung im ACY1-Enzymassay Lösung Konzentratione A 0,5 mM 10 µl Stammlösung A + 390 µl Hepespuffer B 1 mM 20 µl Lösung B + 180 µl Hepespuffer C 0,5 mM 20 µl Lösung C + 180 µl Hepespuffer D 1 mM 30 µl Stammlösung A + 570 µl Hepespuffer E 0,5 mM 10 µl Stammlösung A + 390 µl Hepespuffer F 0,25 mM 50 µl Lösung D + 150 µl Hepespuffer G 0,1 mM 20 µl Lösung D + 180 µl Hepespuffer H 0,05 mM 10 µl Lösung D + 190 µl Hepespuffer Desweiteren wurde eine 1,6 %-ige ZinnII-Chlorid-Lösung (in 200mM Citratpuffer (Kapitel II Abschnitt 1.3)) benötigt. Nach dem Auftauen der angesetzten Proben wurden in Doppelbestimmung je 20 µl in eine Kavität einer Platte mit insgesamt 96 Kavitäten gefüllt. Dazu wurden je 2 µl der 1,6 %-igen ZinnII-Chlorid-Lösung und 40 µl einer 2 %-igen Ninhydrinlösung (Kapitel II Abschnitt 1.3) zugegeben. Anschließend wurde die Platte bei 80 °C für 20 min im Trockenschrank inkubiert. Mit der Standardreihe wurde analog verfahren. Nach fünfzehnminütiger Abkühlung der Messplatte bei RT wurde die Reaktion durch Zugabe von 200 µl einer 50 %-igen 1-Propanol-Lösung (Kapitel II Abschnitt 1.3) gestoppt und im Photometer bei 570 nm in einer Endpunktbestimmung die Absorption gemessen. Über die erhaltenen Daten der Standardkurve konnte mit der Geradengleichung und der ermittelten Gesamtproteinmenge (Kapitel III Abschnitt 28) die spezifische ACY1-Enzymaktivität errechnet werden. 70 Methoden 25 ASPA-Enzymaktivitätsassay Zunächst wurden die zu untersuchenden Zellsedimente (EBV-transformierte Lymphozyten, Fibroblasten oder HEK293) mit Hilfe von Ultraschall aufgeschlossen (Kapitel III Abschnitt 23). Anschließend wurden die Zelltrümmer für 20 min bei 10 000 x g und 4 °C abzentrifugiert. Anschließend wurde der Überstand in ein neues 1,5-ml-Reaktionsgefäß überführt und bei 10 000 x g und 4 °C für 10 min zentrifugiert. Das erhaltene Zellhomogenat wurde in ein neues 1,5-ml-Reaktionsgefäß überführt und bis zur Verwendung auf Eis gekühlt. Das Verfahren zur Messung der ASPA-Enzymaktivität wurde bereits von Matalon et al. beschrieben und nun im Labor noch an den Mikromaßstab angepasst (Matalon et al., 1988). Zusätzlich wurde die Inkubationszeit von den ursprünglich vorgeschlagenen 8 h auf 18 h verlängert. Um die Enzymaktivität der ASPA zu bestimmen, wurde die ASPA-katalysierte Reaktion (Umsatz von Nα-Acetyl-L-Aspartat zu L-Aspartat und Acetat) an eine Hilfsreaktion mit anschließender NADH-verbrauchender Indikatorreaktion gekoppelt. Das in der ersten Reaktion enstandene L-Aspartat wurde in einer zweiten Reaktion mit α-Ketoglutarat versetzt. Dabei wurden die Reaktionprodukte Oxalacetat und L-Glutamat gebildet. Das Oxalacetat wurde in einer NADH+H+ verbrauchenden Reaktion (katalysiert von Malatdehydrogenase) zu Malat umgwandelt (Matalon et al., 1988). Dadurch war es möglich, den Umsatz von NADH+H+ zu NAD+ bei einer Wellenlänge von 340 nm mit dem PowerWave XS2 Photometer (Biotek) zu verfolgen. Die Nα-Acetyl-L-Aspartat-Substratkonzentration im Ansatz betrug 1,7 mM. Zudem wurde für jedes Zellhomogenat auch ein Negativkontrollansatz (ohne Substratzugabe) analysiert. Es wurden jeweils Doppelbestimmungen aller Proben angesetzt und gemessen. Die Eichkurve ergibt sich aus einer Verdünnungsreihe von L-Aspartat mit den Konzentrationen: 0,17 mM, 0,14 mM, 0,10 mM, 0,068 mM, 0,034 mM, 0,0017 mM und 0,00017 mM. Über die erhaltenen Daten der Standardkurve konnte mit der Geradengleichung und der ermittelten Gesamtproteinmenge die spezifische ASPA-Enzymaktivität errechnet werden. 26 ACY 3-Enzymaktivitätsassay Der Assay zur Messung der spezifischen ACY3-Enzymaktivität erfolgte angepasst an die beschriebene Methode für die Messung der Enzymaktivität der ACY1 (Kapitel III Abschnitt 24) (Mitz & Schlueter, 1958). Als spezifisches Substrat diente das Nα-Chloroacetyl-LTyrosin, Nα-Acetyl-L-Phenylalanin wurde als Vergleichssubstrat getestet, da die ACY3 bevorzugt aromatische N-acetylierte Aminosäuren umsetzt (Anders & Dekant, 1994). Der Anteil von DMSO betrug 5 % im Reaktionsansatz. Zunächst wurde das eingewogene Nα-Chloro71 Methoden acetyl-L-Tyrosin in 500 µl DMSO gelöst und mit 200 µl Hepespuffer versetzt. Anschließend wurde topfenweise NaOH (4M) zugesetzt, bis ein pH-Wert von 7-8 erreicht wurde (pH-Wert mit pH-Papier bestimmt). Herstellung der Substratlösung (1 ml; pH 7-8) Nα-Chloroacetyl-L-Tyrosin (ca. 715 mM): Nα-Chloroacetyl-L-Tyrosin 206,16 mg Hepespuffer 20 % (v/v) DMSO 50 % (v/v) NaOH (4 M) 20 % (v/v) Zunächst wurde das eingewogene Nα-Acetyl-L-Phenylalanin in 500 µl DMSO gelöst und mit 350 µl Hepespuffer versetzt. Anschließend wurde topfenweise NaOH (4M) zugesetzt bis ein pH-Wert von 7-8 erreicht wurde (pH-Wert mit pH-Papier bestimmt). Herstellung der Substratlösung (1 ml; pH 7-8) Nα-Acetyl-L-Phenylalanin (ca. 715 mM): Nα-Acetyl-L-Phenylalanin 164,7 mg Hepespuffer 35 % (v/v) DMSO 50 % (v/v) NaOH (4 M) 14 % (v/v) Die Standardreihe konnte entsprechend auf L-Tyrosin und L-Phenylalanin angepasst werden. Die Konzentration im Reaktionsansatz betrug demnach 71,5 mM für beide Substrate. Herr M. Schmidt führte unter Anleitung weitere Studien zur Enzymkinetik der ACY3 mit dem Substrat Nα-Chloroacetyl-L-Tyrosin durch. Für diese Messungen wurde die Nα-Chloroacetyl-L-Tyrosin (ca. 715 mM)-Stammlösung nochmals auf folgende Konzentrationen verdünnt: 535,3 mM, 357 mM, 178,5 mM, 89 mM, 44,6 mM, 22,3 mM, 11,2 mM und 5,6 mM. Mit diesen Substratkonzentrationen wurde die ACY3-Enzymaktivität bestimmt und nach der Linearisierung mit Hilfe der Lineweaver-Burk-Darstellung die Michaelis-Menten-Konstante (KM) ermittelt. 27 Probenvorbereitung zur Aminosäurebestimmung durch TandemMassenspektrometrie Stanzlinge, die nach dem Ansatz des ACY1-, ASPA- und ACY3-Enzymsassays bei -80 °C lagerten, wurden auf Eis aufgetaut. Zur Extraktion der Proben wurden je 200 µl einer metha72 Methoden nolischen Lösung, die beide interne Referenzenlösungen enthält, auf die Stanzen gegeben und die Ansätze bei RT für 20 min inkubiert. Die interne Referenzlösung setzt sich aus einem Gemisch von zwei Standardlösungen der Firma Cambridge Isotope Laboratories (Set A: Aminosäurereferenzlösung; Set B: freie Carnitin- und Acylcarnitinreferenzlösung) zusammen. Diese enthalten Aminosäuren oder Acyl-Carnitine, die mit stabilen Isotopen markiert sind (C14-markierte und 2-fach- bzw. 3-fach-deuterierte Aminosäuren und Acyl-Carnitine). Aliquots beider Referenzlösungen wurden zunächst in 1 ml Methanol gelöst, gut gemischt und das Gemisch anschließend 1:100 mit Methanol verdünnt, um die interne Referenzlösung zu erhalten. Zur Validierung des Verfahrens mussten vier Qualitätskontrollen durchgeführt werden. Dafür wurden 3 mm große Stanzlinge externer Qualitätskontrollen (Level 1 und 2 ClinChek®-Control und MassCheck® Amino Acids, Acylcarnitines Dired Blood Spot Control) ausgestochen und ebenfalls extrahiert. Anschließend wurden Proben und Qualitätskontrollen für 5 min bei 3500 x g zentrifugiert und der Überstand jeweils in ein HPLC-Gläschen überführt werden. Die folgenden Arbeiten fanden unter dem Abzug statt. Der Probenüberstand wurde bei 65 °C 15 min im Thermoblock inkubiert und im Anschluss mit N2-Gas verblasen. Durch Zugabe 3 M butanolischer HCl (ca. 200 µl) konnten die Aminosäuren derivatisiert werden, indem die Ansätze erneut bei 65 °C für 15 min inkubierten und anschließend mit N2 Gas vollständig verblasen wurden. Mit 200 µl Eluent A (Gemisch aus 50 % Acetonitril + 50 % Wasser [HPLC-Grade]) wurden die eingedampften Probenansätze zur anschließenden Messung im Tandem-Massenspektrometer (Firma Waters) gelöst. Zunächst werden die Proben nach der Injektion ionisiert. Durch Gleich- und Wechselspannung, die am ersten Massenpektrometer anliegt, können die Ionen gescannt werden. Dabei wird das Verhältnis von Masse und Ladung der Ionen bestimmt. Die Masse-Ladungsverhältnisse wurden vor der Messung eingestellt. Dadurch können nur Ionen passieren, die bestimmte Masse-Ladungsverhältnisse aufweisen. Somit findet in diesem Schritt eine Selektion der Ionen statt. Die weitergeleiteten Ionen gelangen in eine Kollisionszelle, die mit dem Inertgas Argon gefüllt ist. In dieser Zelle wurden die Ionen mit Gasatomen beschossen, bis sie zu spezifischen Fragmenten zerfallen. Nach der Fragmentierung der Ionen in einem zweiten nachgeschalteten Massenspektrometer wurden die spezifischen molekularen Masse-Ladungsverhältnisse der Ionenfragmente detektiert (Chace et al., 1997; Eckerskorn, 1998). Im Anschluss konnten die Isotop-markierten Aminosäuren der Referenzlösung von den unmarkierten Aminosäuren aufgrund der unterschiedlichen Masse-Ladungsverhältnisse der Ionenfragmente getrennt detektiert werden. Die Aufzeichnung der Messdaten erfolgte mit der geräteeigenen Software (MassLynx), bevor mit dem Excel-Tabellenkalkulationsprogramm die Auswertung vorgenommen wurde. Für die 73 Methoden ACY1 wurde besonders auf Konzentrationswerte des L-Methionins geachtet. Für ASPA war die Auswertung hinsichtlich des L-Aspartats/L-Asparagins wichtig. Zur Bestimmung der Enzymaktivität der ACY3 mit der Tandem-Massenspektrometrie waren je nach eingesetztem Substrat (Nα-Acetyl-L-Phenylalanin oder Nα-Chloroacetyl-L-Tyrosin) die Konzentrationswerte für L-Phenylalanin oder L-Tyrosin von Bedeutung. 28 Proteinbestimmung nach Lowry Gesamtproteinkonzentrationen in Zellhomogenaten wurden mit Hilfe der von Lowry et al. entwickelten Methode bestimmt (Lowry et al., 1951). Dabei diente eine RinderserumalbuminLösung (RSA) als Standard. Durch Durchführung wurden je 4 µl, 8 µl und 12 µl der Zellhomogenate (bei Bedarf vorverdünnt) in ein vorbeschriftetes 1,5-ml-Reaktionsgefäß gegeben. Anschließend wurde mit AquaMP auf 100 µl Gesamtvolumen (je 1,5-ml-Reaktionsgefäß) aufgefüllt. Für die Eichkurve wurden drei verschiedene RSA-Konzentrationen (50 µg/µl, 100 µg/ml und 150 µg/ml) in Doppelbestimmung (je 100 µl Gesamtvolumenansatz) mitvorbereitet. Zu den vorpipettierten Zellhomogenatlösungen, wie zu den RSA-Ansätzen wurden dann 500 µl einer ABC-Lösung (Kapitel II Abschnitt 1.3) (im Verhältnis 100 A : 1 B : 1 C) zugegeben und die Ansätze für 30 min bei RT inkubiert. Währenddessen wurde eine Verdünnung der Folin & Ciocalteu-Phenol-Reagenz (1 ml Folin & Ciocalteu-Phenol-Reagenz + 3,3 ml AquaMP) hergestellt. Nach der Inkubation wurden dann 100 µl der Folin & Ciocalteu Phenol Reagenz-Verdünnung zu den Proben und den RSA-Ansätzen zugegeben und erneut 30 min bei RT inkubiert. Dann wurden die Proben in vorbeschriftete Küvetten gefüllt und bei 500 nm im UV/VIS Spectrometer Lambda 20 gemessen. Anhand der Eichkurve konnte mit Hilfe der Geradengleichung auf die Proteinkonzentration (mg/ml) geschlossen werden. 29 SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese und Western Blot-Analyse Mit Hilfe der SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese (SDS-PAGE) können Proteine in einem elektrischen Feld nach ihrem Molekulargewicht aufgetrennt werden (Görg & Westermeier, 1998). Dafür wurden 12 %-ige SDS-PAGE-Fertiggele (Mini-Protean TGX, 12%) eingesetzt. Die SDS-PAGE fand bei 200 V für ca. 50 min in dem Mini-PROTEAN Tetra Electrophorese System statt. Als Proteinstandardmarker diente der Precision Plus Protein Dual Color Standard. Während der SDS-PAGE wurden 4 dicke Filterpapiere und eine Amersham Hybond™-P-PVDF (Polyvinylidenfluorid-Membran), auf die Größe des SDSGels zurechtgeschnitten. Je ein Filterpapier wurde in Anodenpuffer I beziehungsweise Ano74 Methoden denpuffer II und zwei Filterpapiere in Kathodenpuffer getränkt. Die PVDF-Membran wurde kurz in Methanol aktiviert, anschließend 5 min in AquaMP und danach 10 min in Anodenpuffer II auf dem Schüttler inkubiert. Das Trans-Blot SD Semi-Dry Transfer CellTrockenblotsystem (Biorad) wurde nach Abbildung 3-8 zusammengebaut. Abb. 3-8: Schematischer Aufbau des Trans-Blot SD Semi-Dry Transfer Cell-Trockenblotsystem: Die aufgetrennten Proteine im SDS-PAGE-Gel werden mit Hilfe dieser Western Blot-Apparatur auf eine PVDF-Membran übertragen. Anschließend wird diese Membran mit einem Antikörper inkubiert, der spezifisch an das Protein der ACY1, ASPA, ACY3 oder GAPDH bindet. Nach dem Anbringen der Kathode wurde die Apparatur mit der Schutzabdeckung verschlossen. Geblottet wurde für eine Stunde bei einer Spannung von 11 V. Der 5x konzentrierte TBST-Puffer wurde für die weitere Verwendung 1:5 mit AquaMP verdünnt. Nach dem Blotten wurden unspezifische Bindungsstellen der Proteine geblockt, indem die Membran über Nacht bei 4 °C im Kühlraum mit 50 ml 5 % Milchpulver in 1x TBST-Puffer auf dem Schüttler inkubierte. Danach wurde die Membran zweimal mit 1x TBST-Puffer abgespült und 5 min mit 1x TBST-Puffer gewaschen. Dann erfolgt die Inkubation der Membran mit dem jeweiligen primären Antikörper (ACY1, ASPA, ACY3 oder: GAPDH) in einer Verdünnung von 1:1000 mit 1x TBST-Puffer bei Raumtemperatur für 1 h auf dem Schüttler. Anschließend konnte die 1x TBST-Primärantikörperlösung in ein 50-ml-Falconröhrchen überführt und bei 20 °C gelagert werden. Die Membran wurde danach dreimal 15 min mit 25 ml 1x TBSTPuffer gewaschen und anschließend bei Raumtemperatur 1 h mit einem Sekundärantikörper (Goat Anti-Rabbit IgM-IgG) 1:8 000 in 1x TBST-Puffer verdünnt) geschwenkt. Nach der In75 Methoden kubation wurde die Membran dreimal für 10 min mit 1x TBST-Puffer gewaschen, bevor das ECL-Färbereagenz (ECL Plus Western Blotting Detection Reagent) auf die Membran gegeben wurde. Dafür wurde 1 ml einer Lösung A mit 25 µl einer Lösung B versetzt und gut gemischt. Diese Lösung wurde danach auf die Membran gegeben und 1 min bei RT inkubiert. Nach der Inkubation wurde die Membran mit der Vorderseite nach unten auf ein Stück Frischhaltefolie gelegt und mit dieser abgedeckt. Danach wurde die Membran in die Filmkammer geklebt und diese lichtdicht verschlossen. Die Entwicklungsapparatur befand sich in einem abgedunkelten Raum, damit beim Auflegen des Fotopapiers auf die Membran in der Filmkammer kein Tageslicht gelangte. Das Fotopapier wurde für variable Zeiten (1 s bis 30 min) auf der Membran in der Filmkammer inkubiert und danach entwickelt. Die Inkubationszeit des Fotopapiers in der Filmkammer richtet sich nach der Spezifität und Sensitivität des Antikörpers bzw. nach der aufgetragenen Proteinmenge. 76 Kapitel IV Ergebnisse Im folgenden Kapitel werden die im Rahmen der Dissertationsarbeit erhaltenen Ergebnisse vorgestellt. Zunächst werden die Resultate der Enzymaktivitätsmessungen in Lymphozytenund Fibroblastenhomogenaten und die der Mutationsanalysen für ACY1 und ASPA bei ACY1-Mangel- und Morbus-Canavan-Patienten aufgezeigt. Im Anschluss erfolgt die Vorstellung der erhalten Daten der Expressionsanalysen für ACY1- und ASPA-Enzymvarianten. Im Zusammenhang damit werden die Ergebnisse der Kombinationsstudien zwischen ACY1 und ASPA dargelegt. Der neu entwickelte Enzymaktivitätsassay für ACY3 erwies sich als nützlich zur Bestimmung der ACY3-Aktivität bezüglich der Substrate Nα-Acetyl-L-Phenylalanin und Nα-Chloroacetyl-L-Tyrosin. Alle Angaben zu den Enzymaktivitäten von ACY1, ASPA und ACY3 werden in [µmol*(g*min)-1] angegeben („g“ entspricht der Masse an Gesamtprotein). Weiterhin werden Aussagen zur mRNA-Expression von ACY1, ASPA und ACY3 in verschiedenen menschlichen Organen getroffen. 1 Mutationsanalysen und Enzymaktivitätsbestimmung von Patientenproben Urin von Patienten wurde im Labor für Klinische Biochemie und Stoffwechsel (Zentrum für Kinder- und Jugendmedizin, Universitätsklinik Freiburg) im Rahmen des selektiven Screenings auf angeborene Stoffwechselstörungen gaschromatographisch-massenspektrometrisch hinsichtlich organischer Säuren untersucht. Individuen, die aufgrund erhöhter Konzentrationen von Nα-acetylierten Aminosäuren im Urin auffällig waren, wurden näher charakterisiert. Dafür wurden Enzymaktivitätsassays (Kapitel III Abschnitt 24 und 25) in PatientenFibroblasten- oder -Lymphozytenhomogenaten durchgeführt. Desweiteren wurden zur Vervollständigung der Konfirmationsdiagnostik die ACY1- und ASPA-Gene von ACY1-Mangel- bzw. Morbus-Canavan-Patienten auf Veränderungen in der DNA-Sequenz überprüft. Dadurch war es unter anderem auch möglich, bis dahin noch unbekannte Mutationen im ACY1-Gen zu entdecken. Aufgrund von Mutationen könnte die Expression der ACY1- und ASPA-Proteine und die korrekte Proteinfaltung eingeschränkt gewesen 77 Ergebnisse sein. Die detektierten Mutationen, die im ACY1- oder ASPA-Gen von Patienten gefunden wurden, bildeten Voraussetzung und Grundlage für Expressionsstudien beider Enzyme. 1.1 Bestimmung der ACY1-Enzymaktivität bei Patienten mit einem ACY1-Mangel Die Enzymaktivitäten bei Patienten mit einem ACY1-Mangel wurden entweder im Homogenat von EBV-transformierten Lymphozyten oder Fibroblasten gemessen. Zur Detektion wurde ein photometrischer Assay (Kapitel III Abschnitt 24) und die TandemMassenspektrometrie (Kapitel III Abschnitt 27) eingesetzt. In jedem Enzymassay wurden drei anonyme Negativkontrollen mitgeführt. In folgenden Tabellen (Tab. 4-1 und 4-2) sind die Daten der ACY1-Aktivitätsmessungen gelistet. Photometrisch ermittelte ACY1-Aktivitäten waren jeweils mit den Daten der Tandem-Massenspektrometrie vergleichbar. Die Aktivitäten bei Patienten mit einem ACY1-Mangel sind deutlich niedriger als die der Negativkontrollen. Tab. 4-1: Mittelwerte der gemessenen ACY1-Enzymaktivitäten [µmol*(g*min)-1] und ihre Standardabweichungen (Stabw) in Zellhomogenaten (EBV-transformierte Lymphozyten) von Patienten mit ACY1-Mangel. EBVtransformierte Lymphozyten Mittelwert spezifischer ACY1-Enzymaktivitäten Stabw [µmol*(g*min)-1] (photometrisch) Mittelwert spezifischer Anzahl ACY1-Enzymaktivitäten -1 [µmol*(g*min) ] Stabw unabhängiger (TandemExperimente [n] Massenspektrometrie) AC011 II-1 0,48 0,20 0,13 0,04 3 AC011 II-2 0,43 0,07 0,16 0,04 4 AC011 I-2 0,74 0,33 0,57 0,08 4 AC013 II-1 0,99 0,41 0,40 0,28 3 AC014 II-1 0,32 0,01 0,93 0,57 3 AC019 II-1 0,19 0,23 0,12 0,08 3 AC021 II-1 0,49 0,12 0,8 0,14 3 AC022 II-1 0,35 0,22 0,34 0,23 3 AC022 II-2 0,20 0,17 0,22 0,06 3 AC023 II-1 0,76 0,22 0,83 0,32 3 Sechs verschiedene Negativkontrollen 1,24 0,57 1,47 0,44 n = 3-4 78 Ergebnisse Tab.: 4-2Mittelwerte der gemessenen ACY1-Enzymaktivitäten [µmol*(g*min)-1] und ihre Standardabweichungen (Stabw) in Zellhomogenaten (Fibroblasten) von Patienten mit ACY1-Mangel. Fibroblasten Mittelwert spezifischer ACY1Enzymaktivitäten [µmol*(g*min)-1] (photometrisch) Stabw AC020 II-1 0,20 0,21 0,16 0,16 3 F-AC499 0,28 0,23 0,06 0,13 4 Drei verschiedene Negativkontrollen 1,55 0,16 1,78 0,43 n = 3-4 Mittelwert spezifischer Anzahl ACY1-Enzymaktivitäten -1 [µmol*(g*min) ] Stabw unabhängiger (TandemExperimente [n] Massenspektrometrie) 1.2 ACY1-Mutationsanalysen Im Rahmen des Dissertationsvorhabens wurden zwanzig Individuen auf DNAVeränderungen im ACY1-Gen mittels Mutationsanalysen untersucht (Abb. 4-1). Die Größen der erhaltenen PCR-Produkte sind in Tabelle 4-3 gelistet. Abb. 4-1: Beispiel der Kontrolle der ACY1-PCR-Produkte auf einem 1 % igen Agarosegel anhand des AC019 II-1-Patienten: Alle PCR-Ansätze und ihre dazugehörigen Leerwerte (LW) wurden auf ein Agarosegel (1 %) aufgetragen und anhand ihrer Größen identifiziert, bevor die PCR-Produkte aufgereinigt und anschließend sequenziert wurden. 79 Ergebnisse Tab. 4-3: ACY1-PCR-Produktgrößen [bp]. PCR-Produkt Größe [bp] Exon1 208 Exon2 373 Exon3+4 437 Exon5 312 Exon6-8 602 Exon9+10 401 Exon11+12 494 Exon13+14 458 Exon15 512 Vier der zwanzig untersuchten Individuen wiesen keine Mutation im ACY1-Gen auf. Bei sechzehn Personen konnten Mutationen im Exon- oder Intronbereich detektiert werden. Neue Mutationen wurden identifiziert und heterozygote von homozygoten Veränderungen unterschieden. Es handelte sich dabei zum größten Teil um Missense-Mutationen, die durch den Austausch einer Base im DNA-Triplett einen Aminosäurenaustausch zur Folge haben. Zudem konnte eine noch unbekannte Deletion c.181delA im ACY1-Gen detektiert werden, welche eine Leserasterverschiebung bei der Translation nach sich zieht. Einige der im Rahmen dieser Arbeit gezeigten Mutationen wurden bereits in Patienten mit einem ACY1-Mangel beschrieben (Engelke et al., 2008; Sass et al., 2006; Sass et al., 2007; Van Coster et al., 2005). Zwölf Individuen fielen bereits im Rahmen des selektiven Screenings wegen eines auffälligen Musters der organischen Säuren im Urin auf. Dabei handelte es sich um Patienten mit Verdacht auf einen ACY1-Mangel. Deshalb wurden alle fünfzehn Exons des ACY1-Gens überprüft. Bei den restlichen vier Personen handelte es sich entweder um die Eltern oder Geschwister der Patienten. Sofern für ein Individuum eine Lymphozyten- bzw. Fibroblastenzelllinie vorhanden war, wurde die Enzymaktivität anhand des ACY1-Assays bestimmt (Tab. 4-1 und 4-2). In folgender Tabelle (Tab. 4-4) sind die in sämtlichen sechzehn Individuen detektierten Mutationen dargestellt: 80 Ergebnisse Tab. 4-4: Mutationsübersicht für das ACY1-Gen: Sechzehn Individuen zeigten Homo- oder Heterozygotie für Mutationen im Intron- oder Exonbereich des ACY1-Gens an. Basenaustausche in Exonbereichen haben einen Aminosäureaustausch zur Folge. Die im Rahmen dieser Arbeit neu identifizierten Mutationen sind fett hervorgehoben. Individuum Generation Mutation Homozygot / Heterozygot AC011 II-1 Patient c.1057C>T (p.Arg353Cys) c.708-9A>G Homozygot Homozygot AC011 II-2 Geschwisterkind c.1057C>T (p.Arg353Cys) c.708-9A>G Homozygot Homozygot AC011 I-2 Mutter c.1057C>T (p.Arg353Cys) c.708-9A>G Heterozygot Heterozygot AC013 II-1 Patient c.1133G>A (p.Arg378Gln) c.437-20C>T c.657+15A>G c.708-9A>G Homozygot Homozygot Homozygot Homozygot AC014 II-1 Patient c.1132C>T (p.Arg378Trp) Homozygot AC015 II-1 Patient c.1057C>T (p.Arg353Cys) c.1001+8C>T Homozygot Homozygot AC015 II-2 Geschwisterkind c.1057C>T (p.Arg353Cys) c.1001+8C>T Homozygot Homozygot AC015 II-4 Geschwisterkind c.1057C>T (p.Arg353Cys) c.1001+8C>T Homozygot Homozygot AC019 II-1 Patient c.1057C>T (p.Arg353Cys) c.475G>A (p.Val159Met) Heterozygot Heterozygot AC020 II-1 Patient c.1057C>T (p.Arg353Cys) c.181_delA (p. 61ThrfsX348) Heterozygot Heterozygot AC020 I-1 Vater c.1057C>T (p.Arg353Cys) Heterozygot AC020 I-2 Mutter c.181_delA (p. 61ThrfsX348) Heterozygot AC021 II-1 Patient c.359+51A>C c.437-19C>T c.657+14 A>G c.708-9 A>G c.1177 C>T (p.Arg393Cys) Heterozygot Heterozygot Heterozygot Heterozygot Heterozygot AC022 II-1 Patient c.1057C>T (p.Arg353Cys) Homozygot AC022 II-2 Geschwisterkind c.1057C>T (p.Arg353Cys) Homozygot AC023 II-1 Patient c.657+15A>G c.437-20C>T c.1133G>A (p.Arg378Gln) Heterozygot Heterozygot Heterozygot 1.3 Bestimmung der ASPA-Enzymaktivität bei Morbus-Canavan-Patienten Die Enzymaktivitäten bei Morbus-Canavan-Patienten wurden im Homogenat von EBVtransformierten Lymphozyten gemessen. Zur Detektion wurde der photometrische Assay (Kapitel III Abschnitt 25) eingesetzt. In jedem Enzymassay wurden drei pseudonymisierte 81 Ergebnisse Negativkontrollen mitgeführt. In den folgenden Tabellen (Tab. 4-5 und 4-6) sind die Daten der ASPA-Aktivitätsmessungen gelistet. Tab. 4-5: Mittelwerte der gemessenen ASPA-Enzymaktivitäten [µmol*(g*min)-1] und ihre Standardabweichungen (Stabw) in Zellhomogenaten (EBV-transformierte Lymphozyten) von Morbus-Canavan-Patienten. EBVtransformierte Lymphozyten Mittelwert spezifischer ACY1-Enzymaktivitäten [µmol*(g*min)-1] Stabw Anzahl unabhängiger Experimente [n] AC508 4,59 3,73 10 AC510 II-1 8,14 5,59 5 AC510 I-1 11,73 12,06 4 AC510 I-2 21,89 9,71 4 AC009 II-1 8,30 4,03 13 AC010 II-1 10,64 8,70 7 AC016 II-1 4,15 3,64 4 AC017 II-1 15,39 12,26 6 AC018 II-1 12,62 11,86 7 AC024 II-1 12,88 8,50 5 16 verschiedene Negativkontrollen 14,64 10,03 n = 3-13 Tab. 4-6 Mittelwerte der gemessenen ASPA-Enzymaktivitäten [µmol*(g*min)-1] und ihre Standardabweichungen (Stabw) in Zellhomogenaten (Fibroblasten) von Morbus-Canavan-Patienten. Fibroblasten Mittelwert spezifischer ASPA-Enzymaktivitäten [µmol*(g*min)-1] Stabw Anzahl unabhängiger Experimente [n] F-AC500 15,80 - 1 F-AC501 6,33 5,47 6 F-AC502 12,15 3,79 4 F-AC505 8,98 6,8 11 F-AC509 78,75 - 1 12 verschiedene Negativkontrollen 284,30 195,94 n = 3-11 1.4 ASPA-Mutationsanalysen Siebzehn Personen wurden auf DNA-Sequenzveränderungen im ASPA-Gen mittels Sequenzierung geprüft. Ausgewählte Patienten, bei denen über die Sequenzierung keine Bestätigung der Diagnose auf DNA-Ebene gelang (nicht zwei Mutationen, außer eine stille Mutation detektiert), wurden zusätzlich mittels MLPA untersucht (Tab. 4-9) (Kapitel IV Abschnitt 1.5). Das ASPA-Gen besteht aus sechs Exons, die durch PCR amplifiziert wurden (Abb. 4-2). Die Größen der erhaltenen PCR-Produkte sind in Tabelle 4-7 gelistet. 82 Ergebnisse Abb. 4-2: Beispiel der Kontrolle der ASPA-PCR-Produkte auf einem Agarosegel anhand des Patienten AC510 II-1): Alle PCR-Ansätze und die dazugehörigen Leerwerte (LW) wurden auf ein Agarosegel (1 %) aufgetragen und die Reaktionsprodukte anhand ihrer Größe (Tab. 3-7) identifiziert, bevor die PCR-Produkte aufgereinigt und anschließend sequenziert wurden. Tab.4-7: ASPA-PCR-Produktgrößen [bp]. PCR-Produkt Größe [bp] Exon1 568 Exon2 460 Exon3 589 Exon4 380 Exon5 422 Exon6 612 Im ASPA-Gen von Morbus-Canavan-Patienten konnten Mutationen nachgewiesen werden. Bei den Veränderungen handelte es sich ausschließlich um Basenaustausche in der DNASequenz des Gens (Tab. 4-8). Die Mutation, welche am häufigsten bei Europäern (nichtjüdischer Abstammung) auftritt (c.914C>T; p.Ala305Glu) (Elpeleg & Shaag, 1999; Kaul et al., 1994; Kaul et al., 1996; Shaag et al., 1995), wurde bei fünf der siebzehn untersuchten Individuen nachgewiesen. Von Homozygotie einiger Mutationen im Erbgut konnte nur ausgegangen werden, wenn die Eltern der Patienten untersucht wurden und für die detektierten Mutationen Heterozygotie aufwiesen. Jedoch hatten nicht alle Austausche auch eine Veränderung der Aminosäurensequenz zur Folge, wie an den Beispielen c.693C>T, p.Tyr231Tyr und c.432G>A, p.Lys144Lys gezeigt wurde. (Tab. 4-8). Sofern für ein Individum eine Lymphozyten- bzw. Fibroblastenzelllinie vorhanden war, wurde in Zellhomogenaten die ASPAEnzymaktivität bestimmt (Tab. 4-5 und 4-6). 83 Ergebnisse Tab. 4-8: Mutationsübersicht für das ASPA-Gen: Siebzehn Individuen zeigten Homo- oder Heterozygotie für Mutationen im Intron- oder Exonbereich des ASPA-Gens. Individuum Generation Mutation Homozygot / Heterozygot F-AC500 Patient c.526+129G>A c.914C>A, p.Ala305Glu Heterozygot Homozygot F-AC501 Patient c.844T>C, p.Phe295Ser Homozygot F-AC502 Patient c.526+129G>A Heterozygot F-AC504 Patient c.914C>A, p.Ala305Glu c.693C>T, p.Tyr231Tyr Heterozygot Heterozygot F-AC505 Patient c.693C>T, p.Tyr231Tyr Homozygot AC508 Patient c.914C>A, p.Ala305Glu Heterozygot F-AC509 Patient c.914C>A, p.Ala305Glu Homozygot AC510 II-1 Patient c.634+1G>T c.693C>T, p.Tyr231Tyr Homozygot Homozygot AC510 I-1 Vater c.634+1G>T c.693C>T, p.Tyr231Tyr Heterozygot Heterozygot AC510 I-2 Mutter c.634+1G>T c.693C>T, p.Tyr231Tyr Heterozygot Heterozygot AC009 II-1 Patient c.432G>A, p.Lys144Lys c.541C>A, p.Pro181Thr c.693C>T, p.Tyr231Tyr Heterozygot Heterozygot Heterozygot AC010 II-1 Patient c.541C>A, p.Pro181Thr c.693C>T, p.Tyr231Tyr Heterozygot Homozygot AC016 II-1 Patient c.694C>T, p.Tyr231Cys Homozygot AC017 II-1 Patient c.362T>C, p.Asn121Ile c.914C>A, p.Ala305Glu Heterozygot Heterozygot AC018 II-1 Patient c.693C>A, p.Tyr231ter Homozygot AC024 II-1 Patient c.79G>A, p.Gly27Arg c.693C>T, p.Tyr231Tyr c.854A>C, p.Glu285Ala Heterozygot Homozygot Heterozygot AC028 II-1 Patient c.693C>T, p.Tyr231Tyr Heterozygot 1.5 MLPA-Untersuchungen ausgewählter Morbus-Canavan-Patienten Morbus-Canavan-Patienten, bei denen über die Sequenzierung keine Bestätigung der Diagnose auf DNA-Ebene gelang, wurden zusätzlich durch MLPA bezüglich. des ASPA-Gens untersucht (Tab. 4-9). Diese Methode hilft, mögliche heterozygote Deletionen oder Duplikationen zu entdecken. Als Positivkontrolle diente die genomische DNA eines Patienten, bei dem das gesamte Gen homozygot deletiert war (Caliebe et al., 2010). Zusätzlich wurden je drei Negativkontrollen mitgeführt. Nachdem die Daten durch eine Intra-Normalisierung (Peakhöhe der ASPA-DNA-Fragmente dividiert durch die Gesamtpeakhöhe der Referenz-DNAFragmente) und eine Inter-Normalisierung (intra-normalisierte Daten der ASPA-DNAFragmente dividiert durch den Durchschnitt der intra-normalisierten Daten der ReferenzDNA-Fragmente) ausgewertet worden waren, wurde die relative Peakhöhe ermittelt. Sie ist 84 Ergebnisse ein Maß für das Vorhandensein heterozygoter Duplikationen beziehungsweise Deletionen. Dabei gilt für eine Reduktion der Peakhöhe ≥ 30 % der Hinweis auf eine heterozygote Deletion und für eine Erhöhung ≥ 30 % der Hinweis auf eine heterozygote Duplikation des Genabschnitts (Exon) (MRCHolland, 2010). Tab. 4-9: Morbus-Canavan-Patienten, die mittels MLPA auf heterozygote Deletionen oder Duplikationen im ASPA-Gen zusätzlich untersucht wurden. Die relativen Peakhöhen größer 130 % sprechen für eine mögliche heterozygote Duplikation beziehungsweise Peakhöhen kleiner 70 % signalisieren eine heterozygote Deletion im ASPA-Gen. Individuum Exon Relative Peakhöhe [%] F-AC500 1 2 3 4 5 6 183 203 221 115 199 190 1 2 3 4 5 6 109 136 135 123 123 131 1 2 3 4 5 6 114 141 142 126 126 140 1 2 3 4 5 6 113 128 145 124 112 130 1 2 3 4 5 6 100 120 115 60 121 109 1 2 3 4 5 6 104 127 124 67 63 121 F-AC502 F-AC505 F-AC508 AC009 II-1 AC010 II-1 Anzahl unabhängiger Experimente 2 Punktmutation im Exon c.526+129G>A c.914C>A, p.Ala305Glu 2 c.526+129G>A 2 c.693C>T, p.Tyr231Tyr 3 c.914C>A, p.Ala305Glu 2 2 85 c.432G>A, p.Lys144Lys c.541C>A, p.Pro181Thr c.693C>T, p.Tyr231Tyr c.541C>A, p.Pro181Thr c.693C>T, p.Tyr231Tyr Duplikation / Deletion Duplikation Duplikation Duplikation Duplikation Duplikation Duplikation Duplikation Duplikation Duplikation Duplikation Duplikation Duplikation Deletion Deletion Deletion - Ergebnisse 2 Restriktions-Fragment-Längen-Analyse des Polymorphismus c.1156C>T (p.Arg386Cys) im ACY1-Gen Anhand eines Restriktionsverdaus durch BtgI an der Position c.1156 im ACY1-Gen konnte für 105 untersuchte DNA-Kontrollen (210 Chromosomen) keine Veränderung der DNASequenz an dieser Stelle nachgewiesen werden. Bei den Kontrollen handelte es sich um Individuen aus Südwestdeutschland. Somit hat sich der Verdacht eines Polymorphismus im ACY1-Gen (c.1156C>T; p.Arg386Cys) innerhalb dieser Population nicht bestätigt. In Abbildung 4-3 zeigt die Größe der DNA-Fragmente, die durch BtgI-Restriktion entstanden. Ist die Schnittstelle noch intakt (d.h. es liegt keine Mutation vor), wurde das 606 bp große DNAFragment in ein 406 bp und ein 200 bp großes DNA-Stück geteilt Liegt Heterozygotie vor, ist nur ein Allel von der Mutation betroffen und ein DNA-Fragment von 606 bp Größe war im Agarosegel detektierbar. Lag die Mutation c.1156C>T homozygot vor, dann war die BtgISchnittstelle nicht mehr intakt und das 606 bp große DNA-Fragment wurde entsprechend nicht geschnitten. 100 Bp-DNALeiter Negativ- Heterozygot c.1156C>T kontrolle Homozygot c.1156C>T 600 bp 400 bp - 200 bp - Abb. 4-3: Agarosegel (1 %) für den Restriktionsverdau eines 606 bp PCR-Produkt mit BtgI. Das amplifizierte PCR-Produkt mit der Größe von 606 bp wurde mit Hilfe der Restriktionsendonuklease BtgI verdaut. War die BtgI-Schnittstelle in der Referenzsequenz des ACY1-Gens intakt, wurden die 606 bp großen DNA-Fragmente in 406 bp und 200 bp große DNA-Bruchstücke geschnitten. War die Restriktionsschnittstelle für BtgI durch die heterozygote Mutation c.1156C>T eingeschränkt, wurden drei DNA-Banden detektiert (606 bp, 406 bp und 200 bp). Lag die Mutation homozygot vor, wurden die 606 bp großen DNA-Fragmente nicht geschnitten. 86 Ergebnisse 3 Expressionsanalysen von ACY 3.1 Expression von ACY1 in verschiedenen eukaryotischen Zelllinien Zur Evaluierung der möglichen Zellexpressionsmodelle wurden sieben verschiedene Zelllinien auf ihre ACY1-Aktivität untersucht (Tab. 4-10). Humane Fibroblasten, humane Lymphozyten, humane Thrombozyten und die humane Neuroblastomzelllinie SH-SY5Y zeigten endogene ACY1-Aktivität. Die Insektenzelllinien Sf21 und Sf9 zeigten höhere ACY1Enzymaktivtät als HEK293-Zellen (menschliche embryonale Nierenzelllinie). Die endogene ACY1-Aktivität in Sf9-Insektenzellen wurde in einem unabhängigen Aktivitätstest nachträglich untersucht. Die zur Expression der ACY1-Proteine genutzte Zelllinie sollte einen geringen potentiellen Hintergrund aufweisen. Tab. 4-10: Messwerttabelle spezifischer ACY1-Enzymaktivitäten in Homogenaten verschiedener Zelllinien. Dargestellt sind spezifische Enzymaktivität im ACY1-Enzymaktivitätstest [µmol*(g*min)-1] in zwei unabhängigen Experimenten (n = 2). Zelllinie Spezifische ACY1-Enzymaktivität Spezifische ACY1-Enzymaktivität [µmol*(g*min)-1] [µmol*(g*min)-1] (Experiment 1) (Experiment 2) Fibroblasten (F-KE001n) 0,45 0,89 HEK293 1,20 0,37 HepG2 4,63 1,63 EBV-transformierte Lymphozyten (EB001) 0,52 1,58 Sf21 0,73 1,75 Sf9 4,05 3,15 Thrombozyten 0,36 0,32 SH-SY5Y 0,60 0,68 3.2 Überexpression von ACY1 in HEK293-Zellen Aufgrund der geringen endogenen ACY1-Aktivität der HEK293-Zellen, ihres schnellen Zellwachstums und ihrer vergleichsweise wenig anspruchsvollen Kulturrbedingungen wurden diese zur Expression von ACY1-Enzym genutzt. Nach gezielter Mutagenese des ACY1-Gens konnten verschiedene ACY1-Genvarianten im HEK293-Zellsystem überexprimiert werden (Abb. 4-4). 87 Ergebnisse Abb. 4-4: Schematische Darstellung des ACY1-Proteins: Die verschiedenen Funktionsbereiche im ACY1Protein sind farbig unterlegt. Zudem sind die Positionen gekennzeichnet, an denen sich die durch gezielte Mutagenese eingefügten Mutationen befinden. Eine deutlich gesteigerte ACY1-Aktivität ist durch die Überexpression des ACY1-Gens mit der Referenzsequenz in HEK293-Zellen nachgewiesen worden. Es war ein 34-facher Anstieg der ACY1-Enzymaktivität zu verzeichnen im Vergleich zu Zellen, die mit dem Leervektor pcDNA3.1/+ transfiziert worden waren (Tab. 4-11 im Anhang). Die meisten ACY1-Varianten wiesen im Vergleich zur überexprimierten ACY1 mit der Referenzsequenz keine ACY1Aktivität auf (im t-Test; p<0,05). Die ACY1-Enzymvarianten ACY1_Arg378Trp, ACY1_Arg378Gln, ACY1_Arg393His und ACY1_Arg393Cys hingegen zeigten hohe ACY1-Aktivität gegenüber HEK293-Zellen, die mit dem pcDNA3.1/+-Leervektor transfiziert worden waren (im t-Test, p<0,05). Sie war vergleichbar mit der Aktivität der überexprimierten ACY1 mit der Referenzsequenz (Abb. 4-5). 88 Ergebnisse Abb. 4-5: Diagramm zur Darstellung der Expressionsstudien verschiedener ACY1-Enzymvarianten im HEK293Zellsystem. Die in schwarz gezeichneten Balken veranschaulichen die Standardabweichung. Die hier dargestellten Werte stammen aus 3 bis 10 voneinander unabhängigen Aktivitätsassays (Anzahl der Experimente n = 3-10). Die Signifikanz der Aktivitätsunterschiede der ACY1-Varianten und der Negativkontrollen (HEK293- ; pcDNA3.1/+) im Vergleich zur ACY1 mit der Referenzsequenz (ACY1 WT) ist mit „**“ angegeben (für p<0,05 im t-Test). Die Ergebnisse der Untersuchung der Proteinexpression aller ACY1-Enzyme (ACY1Enzym mit der Referensequenz (ACY1 WT) und ACY1-Varianten) im Western Blot stützten die Resultate der ACY1-Aktivitätstests. ACY1 ist ein Homodimer aus zwei ca. 46 kDa großen Monomeren (Lindner et al., 2003). Deutliche Proteinbanden, mit einer Größe von etwa 46 kDa, konnten für die ACY1 mit der Referenzsequenz und für die Varianten ACY1_Arg378Trp, ACY1_Arg378Gln, ACY1_Arg393His und ACY1_Arg393Cys im Western Blot detektiert werden (Abb. 4-6). Alle anderen ACY1-Enzymvarianten und die Kontrolle (HEK293-Zellen mit pcDNA3.1/+-Leervektor transfiziert) wiesen keine ACY1Proteinbande im Blot auf. Die Intensitäten der Banden wurden mittels der Software ImageJ1 verglichen. Dementsprechend galt für die Intensität der Bande der ACY1 mit der Referenzsequenz (ACY1 WT) 100 %. Die relative Bandenintensität betrug für ACY1_Arg378Trp 44 %, für ACY1_Arg378Gln 66 %, für ACY1_Arg393His 243 % und für ACY1_Arg393Cys 95 % 1 http://rsbweb.nhi.gov/ij/ 89 Ergebnisse im Vergleich zur Bande der ACY1 mit der Referenzsequenz. Zur Dokumentation übereinstimmender Proteinauftragsmengen wurden die Zellhomogenate auf das Enzym GAPDH im Western Blot untersucht. Eine Bande bei 36 kDa entspricht etwa der Proteingröße der GAPDH. Diese konnte in allen Zellhomogenaten detektiert werden (Abb. 4-6) Abb. 4-6: Western Blots überexprimierter ACY1-Enzyme. HEK293-Zellhomogenate der Kontrollzellen, die mit pcDNA3.1/+-Leervektor transfiziert wurden, und HEK293-Zellhomogenate, die überexprimiertes ACY1-Enzym mit der Referenzsequenz (ACY1 WT) oder die ACY1-Enzymvarianten beinhalteten, wurden im Western Blot überprüft. Deutliche Proteinbanden (bei ca. 46 kDa) sind für das ACY1-Enzym mit der Referenzsequenz (ACY1 WT) und die Varianten ACY1_Arg378Trp, ACY1_Arg378Gln, ACY1_Arg393His und ACY1_Arg393Cys zu erkennen. Zur Kontrolle der Auftragsmenge wurden alle Homogenate auch auf das housekeeping Enzym GAPDH untersucht, dessen Bande entsprechend der Proteinmasse von ca. 36 kDa in jeder Probe nachgewiesen wurde. 3.3 Überexpression von ACY1 in Sf9-Insektenzellen Die Überexpression des humanen ACY1-Enzyms mit der Referenzsequenz in Sf9Insektenzellen zeigte auch einen deutlichen Anstieg der ACY1-Enzymaktivität (Abb. 4-7). Er betrug etwa das Vierfache der nicht infizierten Sf9-Zellkontrolle (Tab. 4-12 im Anhang). Für die ACY1-Variante ACY1_Arg353Cys konnte keine erhöhte Aktivität nachgewiesen werden. Im Western Blot (Abb. 4-8) zeigte sich keine ACY1-Proteinbande in nicht infizierten Sf9Zellen (Sf9-). Dies traf auch für das Zellhomogenat zu, in dem die Enzymvariante ACY1_Arg353Cys überexprimiert wurde sollte. Eine deutliche Proteinbande auf der Höhe von 46 kDa war im Zellhomogenat von infizierten Sf9-Zellen zu sehen, welche die ACY1 mit der Referenzsequenz (ACY1 WT) überexprimierten. 90 Ergebnisse Abb. 4-7: Darstellung der ACY1-Enzymaktivität in Sf9-Zellen (n = 2). Spezifische ACY1-Enzymaktivität [µmol*g*min)-1] in nicht infizierten Sf9-Zellen (Sf9-), für überexprimierte ACY1 mit der Referenzsequenz (ACY1 WT) sowie für die Enzymvariante ACY1_Arg353Cys. Abb. 4-8: Western Blot für verschiedene Sf9-Zellhomogenate. Eine Bande in der Höhe von etwa 46 kDa, die der Größe eines ACY1-Monomers entspricht, konnte im Western Blot für das Sf9-Zellhomogenat detektiert werden, in dem überexprimiertes ACY1-Enzym mit der Referenzsequenz (ACY1 WT) vorhanden war. Im Zellhomogenat der Negativkontrolle (nicht infizierte Sf9-Zellen (Sf9-)) beziehungsweise von Sf9-Zellen, welche die Enzymvariante ACY1_Arg353Cys exprimierten, konnte keine charakteristische ACY1-Proteinbande nachgewiesen werden. 3.4 Überexpression von ASPA in HEK293-Zellen Die Überexpression des ASPA-Enzyms mit der Referenzsequenz (ASPA WT) in HEK293-Zellen verursachte einen ca. siebenfachen Anstieg der ASPA-Enzymaktivität im Vergleich zu HEK293-Zellen, die mit dem pcDNA3.1/+-Leervektor transfiziert wurden (Tab. 4-13 im Anhang). Alle untersuchten ASPA-Enzymvarianten (ASPA_Arg168His, ASPA_Pro181Thr, ASPA_Tyr288Cys, ASPA_Phe295Ser und ASPA_Ala305Glu) wiesen keine erhöhte Enzymaktivität auf (Abb. 4-9), da kein signifikanter Unterschied (im t-Test mit p>0,05) der ASPA-Aktivität der Varianten 91 (ASPA_Arg168His, ASPA_Pro181Thr, Ergebnisse ASPA_Tyr288Cys, ASPA_Phe295Ser und ASPA_Ala305Glu) im Vergleich zur Aktivität der pcDNA3.1/+-Negativkontrolle (HEK293-Zellen transfiziert mit dem pcDNA3.1/+- Leervektor) vorliegt. Überexprimierte ASPA mit der Referenzsequenz weist eine signifikant höhere ASPA-Aktivität gegenüber den exprimierten ASPA-Varianten auf. Der im t-Test errechnete p-Wert ist kleiner als 0,05 für alle Vergleiche von ASPA WT mit den Varianten ASPA_Arg168His, ASPA_Pro181Thr, ASPA_Tyr288Cys, ASPA_Phe295Ser und ASPA_Ala305Glu. Abb. 4-9: Diagramm zur Darstellung der Expressionsstudien verschiedener ASPA-Enzymvarianten im HEK293Zellsystem. Die in schwarz gezeichneten Balken veranschaulichen die Standardabweichung. Die hier dargestellten Werte stammen aus 3 bis 5 voneinander unabhängigen Aktivitätsassays (Anzahl der Experimente n = 3-5). Die Signifikanz der Unterschiede der Aktivitäten der ASPA-Varianten und der Negativkontrolle (pcDNA3.1/+) im Vergleich zur ACY1 mit der Referenzsequenz (ACY1 WT) ist mit „**“ angegeben (für p<0,05 im t-Test). Um einen Einblick in die Proteinexpression zu bekommen, wurden alle enzymatisch getesteten Zellhomogenate auch im Western Blot untersucht. Beim ASPA handelt es sich um ein homodimeres Metalloenzym, bei dem die Größe eines Monomers 37 kDa entspricht (Le Coq et al., 2006). Eine Proteinbande dieser Größe konnte in allen untersuchten Zellhomogenaten nachgewiesen werden (Abb. 4-10). Dies schließt die Negativkontrolle (HEK293-Zellen transfiziert mit pcDNA3.1/+-Leervektor) mit ein. Somit ist in der embryonalen Nierenzelllinie schon so viel endogenes ASPA vorhanden, dass keine quantitative Aussage über das Vorhandensein einer überexprimierten ASPA-Enzymvariante getroffen werden konnte. Als WesternBlot-Ladekontrolle wurde die Membran zusätzlich erneut mit einem Antikörper gegen GAPDH getestet. Dieser Blot zeigte, dass die verschiedenen Zellhomogenate in gleichen Mengen aufgetragen wurden. 92 Ergebnisse Abb. 4-10: Western Blot für ASPA-Protein. Ein Monomer des homodimeren ASPA-Proteins hat eine Größe von 37 kDa. Als Kontrolle für die Auftragsmenge diente die GAPDH (36 kDa), die auch im Zellhomogenat von HEK293-Zellen nachgewiesen werden konnte, welche nur mit dem Leervektor pcDNA3.1/+ transfiziert wurden. 3.4.1 Expression der ASPA-mRNA Die ASPA-mRNA-Synthese für transfizierte HEK293-Zellen wurde mit Hilfe der qPCR untersucht. Die Expression von ASPA-mRNA konnte für das ASPA-Enzym mit der Referenzsequenz (ASPA WT), sowie für die Varianten ASPA_Arg168His, ASPA_Pro181Thr, ASPA_Tyr288Cys und ASPA_Ala305Glu nachgewiesen werden. Die Bestimmung des mRNA-Synthese-Levels mittels qPCR wurde in zwei unabhängigen Experimenten untersucht. Beide Serien wiesen die gleiche Verteilung und ähnliche Werte der mRNA-Expression auf. Die Ergebnisse beider Messreihen wurden gemittelt und im Diagramm (Abb. 4-11) dargestellt. Alle Varianten zeigten eine ähnliche quantitative ASPA-mRNA-Synthese wie das ASPA-Enzym mit der Referenzsequenz. Diese war etwa 2 800-fach höher als in HEK293Zellen, die mit dem Leervektor pcDNA3.1/+ transfiziert waren. Einzig für die Variante ASPA_Pher295Ser war die mRNA-Expression ähnlich zur Negativkontrolle pcDNA3.1/+ und entsprach somit jener des endogen exprimierten ASPA-Gens in HEK293-Zellen (Abb. 4-11). 93 Ergebnisse Abb. 4-11: Darstellung des ASPA-mRNA-Expressionslevels [2∆∆ct] für überexprimierte ASPA-Proteine (n = 2). Die quantitative mRNA-Expressionsanalysen für ASPA in HEK239-Zellen, die das ASPA-Enzym mit der Referenzsequenz oder die verschiedenen ASPA-Enzymvarianten überexprimierten, zeigten starke Expression der mRNA, mit Ausnahme der Negativkontrolle (pcDNA3.1/+) und der ASPA_Phe295Ser-Enzymvariante. 3.5 Vergleich zur Bestimmung der spezifischen ACY1- und ASPA-Enzymaktivität mit Hilfe von photometrischen Tests und Tandem-Massenspektrometrie Spezifische ACY1-Aktivität wurde mit einem photometrischen Assay visualisiert. Zudem wurde die Konzentration des freien Methionins im Ansatz mittels Tandem- Massenspektrometrie detektiert. Für Aktivitätstests von Zellhomogenaten (bei ACY1Mangel-Patienten) wurde neben dem photometrischen ACY1-Assay immer die Konzentrationsbestimmung des freien Methionins durch Massenspektrometrie mitgeführt. Die Ergebnisse waren stets vergleichbar. Dasselbe konnte auch für Messungen der ACY1-Enzymaktivität von überexprimiertem ACY1-Enzym mit der Referenzsequenz und dessen Enzymvarianten mit beiden Verfahren gezeigt werden. Wie in Abbildung 4-12 ersichtlich, lagen die unabhängig bestimmten Aktivitätswerte im höheren Aktivitätsbereich etwas weiter auseinander als im tieferen Bereich, jedoch waren auch diese im Einzelnen noch vergleichbar. Der Anstieg der Regressionsgerade unterscheidet sich signifikant von Null (im t-Test; p<0,0001). 94 Ergebnisse Abb. 4-12: Vergleich der Daten zu ACY1-Enzymaktivitätsbestimmungen zwischen photometrischem Test und Tandem-Massenspektrometrie (n = 1). Die Ergebnisse der Bestimmungen von spezifischen ACY1-Aktivitäten durch einen photometrischen Assay und durch Tandem-Massenspektrometrie sind gegeneinander aufgetragen. Dabei bilden die Messdaten einen annähernd linearen Verlauf. Im Gegensatz dazu legten Tests zur Enzymaktivität von ASPA dar, dass photometrisch ermittelte Enzymaktivitäten stark von denen aus der Tandem-Massenspektrometrie abwichen. Trägt man die Werte aus beiden Verfahren gegeneinander auf, so ließ sich kein linearer Zusammenhang feststellen (Abb. 4-13). Aufgrund der Probenvorbereitung für die Bestimmung der Konzentration von freiem Aspartat im Massenspektrometer kann Aspartat in der Analyse mit dem Tandem-Massenspektrometer nicht mehr von Asparagin unterschieden werden. Wegen der hohen endogenen Asparaginkonzentration in den untersuchten Zellen ist eine genaue Bestimmung der Aspartatkonzentration im Probenansatz mit der Tandem- Massenspektrometrie nicht möglich, was der Grund ist, weshalb die auf diesem Wege gemessenen Werte mit denen im photometrischen Test nicht vergleichbar sind. Der Anstieg der Regressionsgerade unterscheidet sich nicht signifikant von Null (im t-Test mit p=0,1494). 95 Ergebnisse Abb. 4-13: Vergleich der Daten zur ASPA-Enzymaktivitätsbestimmung zwischen photometrischem Test und Tandem-Massenspektrometrie (n = 2). Die Ergebnisse der Bestimmungen von spezifischen ASPA-Aktivitäten durch einen photometrischen Assay und durch Tandem Massenspektrometrie sind gegeneinander aufgetragen. 3.6 Überexpression von ACY3 in HEK293-Zellen In dem für die ACY3 angewandten photometrischen Verfahren wurden die Substrate Nα-Acetyl-L-Phenylalanin und Nα-Chloroacetyl-L-Tyrosin eingesetzt. Alle drei ACY-Enzyme mit der Referenzsequenz (ACY1 WT, ASPA WT und ACY3 WT) wurden im HEK293Zellsystem überexprimiert. Die Zellhomogenate wurden anschließend auf die entsprechenden Enzymaktivitäten photometrisch getestet. Dabei ist deutlich zu erkennen, dass Nα-Acetyl-LPhenylalanin nicht für ASPA WT, aber für ACY1 WT und ACY3 WT ein Substrat darstellt. Die Enzymaktivitäten für ACY1 WT und ACY3 WT sind jedoch sehr gering (Abb. 4-14). Somit präsentiert sich Nα-Acetyl-L-Phenylalanin nicht als spezifisches ACY3-Substrat. Die ACY1 WT weist eine Aktivität mit Nα-Chloroacetyl-L-Tyrosin auf. Die Umsetzung des Substrates durch ACY3 WT ist 18-fach höher als für ACY1 WT (Abb. 4-15). Für ASPA WT stellt Nα-Chloroacetyl-L-Tyrosin kein Substrat dar, die Aktivität unterscheidet sich nicht signifikant von der Negativkontrolle (HEK293-Zellen transfiziert mit dem pcDNA3.1/+Leervektor). 96 Ergebnisse Abb. 4-14: Darstellung der Enzymaktivitäten von überexprimierten ACY1-, ASPA- und ACY3-Enzym hinsichtlich des Substrates Nα-Acetyl-L-Phenylalanin, die photometrisch nachgewiesen worden sind (n = 3). Überexprimiertes ACY1 WT und ACY3 WT zeigten Enzymaktivität mit dem Substrat Nα-Acetyl-L-Phenylalanin. Für ASPA WT wurde keine Aktivität für dieses Substrat nachgewiesen. Signifikante Unterschiede zwischen den Enzymaktivitäten von ACY1 WT, ASPA WT und ACY3 WT sind mit „**“ angegeben (für p<0,05 im t-Test). Abb. 4-15: Darstellung der Enzymaktivitäten von überexprimierten ACY1-, ASPA- und ACY3-Enzym hinsichtlich des Substrates Nα-Chloroacetyl-L-Tyrosin, die photometrisch nachgewiesen worden sind (n = 3). ACY3 WT wies eine etwa 18-fach höhere Enzymaktivität bezüglich des Substrates Nα-Chloroacetyl-L-Tyrosin als ACY1 WT. ASPA WT zeigt keine Aktivität hinsichtlich des Nα-Chloroacetyl-L-Tyrosins. Signifikante Unterschiede zwischen den Enzymaktivitäten von ACY1 WT, ASPA WT und ACY3 WT sind mit „**“ angegeben (für p<0,05 im t-Test). Die photometrisch ermittelten Messwerte der Enzymaktivitätstests mit den Substraten Nα-Acetyl-L-Phenylalanin und Nα-Chloroacetyl-L-Tyrosin konnten durch die TandemMassenspektrometrie im Grundsatz bestätigt werden (Tab. 4-13 und 4-14) 97 Ergebnisse Tab. 4-13: Mittelwerte der Ergebnisse der Bestimmungen der spezifischen ACY-Aktivitäten hinsichtlich des Substrates Nα-Acetyl-L-Phenylalanin im photometrischen Assay und in der Tandem-Massenspektrometrie mit Standardabweichung (Stabw). Experimente in denen keine Aktivität nachgewiesen werden konnte sind mit n.n. (nicht nachweisbar) gekennzeichnet. (Anzahl der Experimente n = 3) Mittelwert spezifischer Enzymaktivitäten HEK293[µmol*(g*min)-1] mit Zellhomogenat dem Substrat NαAcetyl-L-Phenylalanin photometrisch Stabw Mittelwert spezifischer Enzymaktivitäten [µmol*(g*min)-1] mit dem Substrat Nα-Acetyl- Stabw L-Phenylalanin TandemMassenspektrometrie Anzahl unabhängiger Experimente [n] pcDNA3.1+- n.n. n.n. n.n. n.n. 3 ACY1 WT 1,027 0,339 2,10 1,57 3 ASPA WT 0,007 0,012 n.n. n.n. 3 ACY3 WT 0,990 0,202 1,77 1,75 3 Tab. 4-14 Mittelwerte der Ergebnisse der Bestimmungen der spezifischen ACY-Aktivitäten hinsichtlich des Substrates Nα-Chloroacetyl-L-Tyrosin im photometrischen Assay und in der Tandem-Massenspektrometrie mit Standardabweichung (Stabw). Experimente in denen keine Aktivität nachgewiesen werden konnte sind mit n.n. (nicht nachweisbar) gekennzeichnet. (Anzahl der Experimente n = 3) Mittelwert spezifischer Enzymaktivitäten HEK293[µmol * (g*min)-1] mit dem Substrat NαZellhomogenat Chloroacetyl-L-Tyrosin photometrisch Stabw Mittelwert spezifischer Enzymaktivitäten [µmol * (g*min)-1] mit dem Substrat NαChloroacetyl-L-Tyrosin TandemMassenspektrometrie Stabw Anzahl unabhängiger Experimente [n] pcDNA3.1+- 0,145 0,122 n.n. n.n. 3 ACY1 WT 1,173 0,169 n.n. n.n. 3 ASPA WT 0,055 0,056 n.n. n.n. 3 ACY3 WT 20,695 7,801 20,67 4,34 3 Die Western Blot-Analyse im HEK239-Zellhomogenat mit überexprimiertem ACY3Protein ergab im Blot mit einem Antikörper gegen das ACY3-Protein eine deutliche Proteinbande (bei 35 kDa). Diese wurde bei Verwendung der Negativkontrolle pcDNA3.1/+Leervektor nicht detektiert (Abb. 4-16). Dass die Proteinauftragsmenge vergleichbar war, zeigte die Western-Blot-Analyse, bei der die GAPDH (36 kDa) untersucht wurde. 98 Ergebnisse Abb. 4-16: Western Blot für ACY3-Protein. Im Western Blot wurde das ACY3-Referenzprotein (ACY3 WT) im Zellhomogenat transfizierter HEK293-Zellen nachgewiesen. Als Kontrolle diente die GAPDH, die auch im Zellhomogenat von HEK293-Zellen, die nur mit dem Leervektor pcDNA3.1/+ transfiziert worden waren, gezeigt wurde. Ein Monomer des homotetrameren ACY3-Proteins hat eine Größe von 35 kDa. 3.7 Kinetische Studien zu ACY3 Nachdem die Aktivitätstests für die überexprimierte humane ACY3 unter Einsatz des Substrats Nα-Chloroacetyl-L-Tyrosin höhere Enzymaktivitäten als für ACY1 aufzeigten, sollten die enzymkinetischen Parameter wie die Michaelis-Menten-Konstanten KM bestimmt werden. Experimente dazu wurden von Herrn M. Schmidt unter Anleitung durchgeführt. Dafür wurde die ACY3-Enzymaktivität für verschiedene Konzentrationen des Substrates Nα-ChloroacetylL-Tyrosin ermittelt. Nach der Linearisierung gemäß Lineweaver-Burk wurde ein KM-Wert im Bereich von 1,0 – 15,1 mM erhalten, wobei der niedrigsten Substratkonzentrationen von 6,25 µM und 1,25 µM vernachlässigt wurden (Tab. 4-15). Tab. 4-15: KM-Werte und Vmax aus 5 unabhängigen Experimenten. Test Vmax [µmol*(g*min)-1] KM [mM] 1 14,84 0,99 2 26,04 2,42 3 64,10 15,11 4 100,00 12,35 5 91,74 4,92 Vmax = 1/Schnittpunkt der Regressionsgerade mit der y-Achse Anstieg der Regressionsgerade = KM/Vmax KM = Vmax * Anstieg der Regressionsgerade 99 Ergebnisse 3.8 mRNA-Expression verschiedener ACY in unterschiedlichen humanen Organen Mit Hilfe der Real-time-PCR (qPCR) wurden die mRNA-Mengen verschiedener ACY nicht nur semiquantitativ (wie im Western Blot), sondern auch quantitativ bestimmt. Für ACY1, ASPA und ACY3 wurde die mRNA-Expression in verschiedenen humanen Organen (Gehirn, Lunge, Leber und Niere) verglichen. Für alle drei ACY war die höchste mRNA-Expression in der Niere zu finden. Die Abbildungen 4-21 bis 4-23 zeigen die relative mRNA-Synthese im Vergleich zur Niere (1 = 100 %). ACY1-mRNA wurde im Unterschied zu ASPA und ACY3 am wenigsten in Gehirn und Lunge exprimiert (Abb. 4-21). Für ASPA und ACY3 folgt nach der hohen mRNA-Expression in der Niere quantitativ die mRNA-Synthese im Gehirn, gefolgt von Leber und schließlich Lunge (Abb. 4-22 und 4-23). Abb. 4-21 Darstellung der relativen mRNA-Expression von ACY1 in verschiedenen humanen Organen (n = 3). Signifikante Unterschiede zwischen den mRNA-Expressionslevels unterschiedlicher Organe sind mit „**“ angegeben (für p<0,05 im t-Test). 100 Ergebnisse Abb. 4-22 Darstellung der relativen mRNA-Expression von ASPA in verschiedenen humanen Organen (n = 3). Signifikante Unterschiede zwischen den mRNA-Expressionslevels unterschiedlicher Organe sind mit „**“ angegeben (für p<0,05 im t-Test). Abb. 4-23: Darstellung der relativen mRNA-Expression von ACY3 in verschiedenen humanen Organen (n = 3). Signifikante Unterschiede zwischen den mRNA-Expressionslevels unterschiedlicher Organe sind mit „**“ angegeben (für p<0,05 im t-Test). 3.9 Komplementationsstudien zwischen ACY1 und ASPA Um die Frage zu beantworten, ob ACY1 und ASPA gegenseitig die Funktionen der jeweils anderen ACY übernehmen oder diese beeinflussen können, wurden Komplementationsstudien für beide Enzyme durchgeführt. 3.9.1 ACY1-Enzymvarianten in Kombination mit dem ASPA-Enzym mit der Referenzsequenz Zunächst wurden HEK293-Zellen, welche ACY1-Enyzmvarianten stabil überexprimierten, zusätzlich mit dem Gen des ASPA-Proteins mit der Referenzsequenz transfiziert. Anschlie101 Ergebnisse ßend wurde getestet, ob sich die ACY1-Enzymaktivität der Varianten auf diese Weise beeinflussen lässt. Die Messungen zeigten gegenüber vorhergegangenen Expressionsanalysen für ACY1 (Kapitel IV Abschnitt 3.2) keine großen Veränderungen. Die ACY1-Enzymaktivität insgesamt war jedoch in den Kombinationsstudien signifikant verringert (im t-Test; p <0,05) im Vergleich zu den ermittelten Enzymaktivitäten in den ACY1-Expressionsstudien der Enzymvarianten ACY1_Arg378Trp und ACY1_Arg393His (Abb. 4-24). Enzymaktivität von ACY1-Mutanten aus den Expressions- und Komplementationsstudien wurden in unterschiedlichen Serien gemessen. Die Aktivitäts-Messungen des ACY1-Enzyms mit der Referenzsequenz wiesen eine große Standardabweichung auf (Messwerte in Tab. 4-18 im Anhang). Das überexprimierte ASPA-Protein mit der Referenzsequenz (ASPA WT) zeigte keinen Umsatz des Substrates Nα-Acetyl-L-Methionin (im t-Test; p>0,05 im Vergleich zur Negativkontrolle (HEK293-Zellen transfiziert mit dem pcDNA3.1/+-Leervektor)). Abb. 4-24: Diagramm zur Darstellung der Komplementationsstudien zwischen ACY1-Enzymvarianten und dem ASPA-Enzym mit der Referenzsequenz (ASPA WT). Die in weiß gezeichneten Balken zeigen die spezifischen Aktivitäten der ACY1-Proteine aus den Expressionsstudien. Grau gefärbte Balken geben die Aktivität der ACY1-Proteine in Kombination mit dem ASPA-Protein mit der Referenzsequenz wieder. Der in schwarz markierte Balken zeigt die Enzymaktivität der überexprimierten ASPA mit der Referenzsequenz (ASPA-WT), bezogen auf Nα-Acetyl-L-Methionin. Die hier dargestellten Werte stammen aus 3 bis 9 voneinander unabhängigen Aktivitätsassays (n = 3-9). Die Standardabweichung ist durch senkrechte Striche in den Aktivitätsbalken dargestellt. Signifikante Unterschiede zwischen den Enzymaktivitäten von Expressionsanalysen- und Kombinationsstudienmessungen sind mit „**“ angegeben (für p<0,05 im t-Test). 102 Ergebnisse 3.9.2 ASPA-Enzymvarianten in Kombination mit dem ACY1-Enzym mit der Referenzsequenz Kombinationsstudien wurden auch für ASPA-Enzymvarianten vorgenommen, indem HEK293-Zellen, welche stabil die verschiedenen ASPA-Enzyme überexprimierten, zusätzlich mit dem ACY1-Gen mit der Referenzsequenz (ACY1 WT) transfiziert wurden. Überexprimiertes ACY1-Enzym mit der Referenzsequenz (ACY1 WT) weist keine erhöhte Enzymaktivität mit dem Substrat Nα-Acetyl-L-Aspartat auf. Da die ermittelten Messwerte innerhalb der Testreihen sehr stark variieren und somit auch die Standardabweichungen der Messungen deutlich erhöht sind, lässt sich keine zuverlässige Aussage über eine Erhöhung der ASPAAktivität durch den Einfluss von ACY1 WT zeigen (Abb. 4-25). Die ermittelten ASPAEnzymaktivitäten der ASPA-Enzymvarianten ASPA Arg168His, ASPA Pro181Thr, ASPA Tyr288Cys, ASPA Phe295Ser sowie ASPA Ala305Glu an sich haben sich im Wesentlichen gegenüber den vorhergegangenen Expressionsstudien (Kapitel IV Abschnitt 3.4) nicht verändert (im t-Test; p >0,05) (Messwerte in Tab 4-19 im Anhang). Das ACY1-Enzym mit der Referenzsequenz zeigte im Vergleich zu HEK293-Zellen, die mit dem pcDNA3.1/+-Leervektor transfiziert worden waren, keinen signifikanten ASPA-Aktivitätsunterschied bei Verwendung des Substrates Nα-Acetyl-L-Aspartat (im t-Test; p>0,05). Abb. 4-25: Diagramm zur Darstellung der Komplementationsstudien zwischen ASPA-Enzymvarianten und dem ACY1-Enzym mit der Referenzsequenz (ACY1 WT). Die in weiß gezeichneten Balken zeigen die spezifischen Aktivitäten der ASPA-Proteine aus den Expressionsstudien. Grau gefärbte Balken geben die Aktivität der ASPA-Proteine in Kombination mit dem ACY1-Enzym mit der Referenzsequenz wieder. Der schwarz markierte Balken zeigt die Enzymaktivität der überexprimierten ACY1 mit der Referenzsequenz (ACY1-WT), bezogen auf Nα-Acetyl-L-Aspartat. Die hier dargestellten Werte stammen aus 5-7 voneinander unabhängigen Aktivitätsassays (n = 5-7). Die Standardabweichung ist durch senkrechte Striche in den Aktivitätsbalken dargestellt. 103 104 Diskussion Kapitel V Diskussion Zunächst war die Frage nach der Wahl eines geeigneten eukaryotischen Expressionsmodells für ACY-Proteine zu klären. Dazu wurden verschiedene humane Zelllinien (HEK293und HepG2-Zellen, Fibroblasten, Lymphozyten, Thrombozyten sowie SH-SY5Y- Neuroblastomzellen) und zwei Insektenzelllinien (Sf9- und Sf21-Zellen) auf ihre endogene ACY1-Aktivität überprüft. Mit Hilfe des schließlich gewählten HEK293-Zellmodells wurden die Expressionsstudien zur ACY1, ASPA und ACY3 durchgeführt. Die einzelnen Enzymvarianten der ACY1 und ASPA zeigten unterschiedliche Enzymaktivitäten. Im Zusammenhang mit den erhaltenen Enzymaktivitäten aus Lymphozyten- oder Fibroblastenzellhomogenaten von Patienten (ACY1-Mangel und Morbus Canavan) werden diese Ergebnisse hinsichtlich der molekularen Eigenschaften von ACY1 und ASPA diskutiert. Die Kombinationsstudien zu ACY1 und ASPA sollten die Frage nach einer möglichen Überlappung der Substratspezifität beider Enzyme beantworten. Überexpression der humanen ACY3 im HEK293-Zellsystem bot die Basis für die Entwicklung eines geeigneten Enzymaktivitätsassays mit verschiedenen Substraten und die Ermittlung enzymkinetischer Parameter. Analysen zur Genexpression humaner ACY1, ASPA und ACY3 sollten Raum für Interpretation zur Funktion der Enzyme im menschlichen Organismus bieten. Im folgenden Kapitel werden die im Rahmen der Dissertation erbrachten Ergebnisse diskutiert. 1 ACY-Proteinexpression in eukaryotischen Zellmodellen Heutzutage werden die adhärent wie auch in Suspension wachsenden HEK293-Zellen in vielen Laboren zur Proteinexpression eingesetzt. Es handelt sich dabei um eine vergleichweise einfach zu handhabende Zelllinie, die bei 37 °C und 5 % CO2 kultiviert werden kann (Baldi et al., 2005). Da die HEK293-Zellen, als menschliche Zelllinie, die gesamte Maschinerie der humanen postranslationalen Modifikation, einschließlich Glykosylierungen bietet, schien es im Rahmen dieser Arbeit zweckmäßig, diese zur Überexpression von ACY-Proteinen zu nutzen (Sommer et al., 2011). Mit diesem Vorgehen sollte eine korrekte Faltung der Proteine sichergestellt werden können. 105 Diskussion Die humane ACY1 verfügt über drei mögliche Glykosylierungssequenzen (Asparagin (Asn) 252-Lysin (Lys) 253-Threonin (Thr) 254; Asn335-Lys336-Thr337 und Asn366-Arginin (Arg) 367-Thr368) (Pittelkow et al., 1998; Sommer et al., 2011). Das ASPA-Protein enthält nur ein Muster für eine mögliche Glykosylierung (Asn117-Thr118-Thr119) (Kaul et al., 1993). Glykosylierungssequenzen im ACY3-Protein wurden bislang noch nicht beschrieben. Jedoch weist die Aminosäurenabfolge der ACY3 zwei mögliche Positionen für glykosidische Modifikationen auf (Asn70-Arg71-Thr72 und Asn117-Thr118-Thr119) (Abb. 1-6), die den Kritierien, beschrieben durch Szymanski et al., zugunde liegen (Szymanski et al., 1999). Um Unterschiede in der endogenen ACY1-Aktivität zwischen HEK293-Zellen und anderen menschlichen Zellen festzustellen, wurden im Rahmen dieses Dissertationsprojektes Vorversuche unternommen. Dabei konnte kein Unterschied in der ACY1-Aktivität zwischen HEK293-Zellen und menschlichen Fibroblasten, Lymphozyten, Thrombozyten sowie SH-SY5Y-Neuroblastomzellen festgestellt werden. Hingegen schienen die Leberzellen HepG2 aufgrund ihrer dreifach höheren ACY1-Aktivität weniger geeignet für Expressionsstudien von ACY1 zu sein. Der Hintergrund an endogener ACY1-Aktivität würde es erschweren, geringe Restaktivitäten von ACY1-Mutanten zu detektieren. Daher ist ein geringer Anteil an endogener ACY1-Enzymaktivität von Vorteil. Aufgrund der geringen endogenen ACY1Aktivität, des schnellen Wachstums der HEK293-Zellen und ihrer relativ einfachen Kulturbedingungen wurde diese Zellmodel zur Expression der ACY-Proteine gewählt. Die Überexpression des ACY1-Proteins mit der Referenzgensequenz in HEK293-Zellen ergab eine deutliche Steigerung der ACY1-Aktivität. Dadurch konnte zwischen Negativkontrollen (HEK293-Zellen transfiziert mit dem pcDNA3.1/+-Leervektor) und Zellen, welche die ACY1 überexprimierten, unterschieden werden. Diese Ergebnisse bildeten die Basis dafür, erfolgreich Expressionsstudien zu mutierten ACY1-Proteinen in diesem Zellmodell durchzuführen (Sommer et al., 2011). Sf21-Insektenzellen leiten sich aus Ovarialzellen des „fall army worms“ Spodoptera frugiperda ab (Wickham et al., 1992). Frühere Arbeiten zur Expression von ACY1 in diesen Zelllinien führten zu hohen Ausbeuten an Protein und Aktivität (Lindner et al., 2000b; Lindner et al., 2003; Pittelkow et al., 1998). Die Baculovirus-induzierte Expression rekombinanter Glykoproteine in Insektenzelllinien ist zudem weit verbreitet (Luckow, 1995). Betreffend ihrer Fähigkeiten zu postranslationalen Modifikationen stehen diese Zellsysteme gleich an zweiter Stelle hinter Säugetierzellmodellen (Altmann et al., 1999). Es ist jedoch festzuhalten, dass N-glykosidische Modifikationen an Proteinen von Insektenzelllinien unterschiedlich zu denen in Säugetierzellen erfolgen können (Altmann et al., 1999; März et al., 1995). 106 Diskussion Die im Rahmen der vorliegenden Arbeit gemessene endogene ACY1-Aktivität in Sf21Insektenzellen war nicht wesentlich höher als die in HEK293-Zellen gemessene. Jedoch scheiterten Pilotversuche zur Expression von ACY1-Proteinen in Sf21-Insektenzellen durch Infektion mit genetisch veränderten Baculoviren. Zwar konnte die Rekombination des ACY1Gens in den linearen Baculovirus abgeschlossen werden, jedoch zeigten die Sf21Insektenzellen keine morphologischen Anzeichen einer erfolgreichen Transfektion. Spätere Versuche zur Baculovirus-induzierten ACY1-Expression in Sf9-Insektenzellen, eine andere Zelllinie aus Spodoptera frugiperda, resultierten in einen Anstieg der ACY1-Aktivität um das Zehnfache. Im Vergleich dazu wies transient in HEK293-Zellen überexprimiertes ACY1Enzym mit der Referenzsequenz einen 34-fachen Anstieg der Aktivität auf. Da Sf9-Zellen in großen Volumina als Suspensionskultur herangezogen werden können, bietet sich dieses Expressionssystem zur Gewinnung hoher Proteinkonzentrationen an. Um jedoch Expressionsstudien nah am menschlichen Organismus zu halten (menschliche postranslationale Modifikationen) und deutlichere Unterschiede in Enzymaktivitäten messen zu können, wurden ACY1, ASPA und ACY3 hier im HEK293-Zellmodel exprimiert. 107 Diskussion 2 Auswirkung von Mutationen auf die Struktur und Funktion von ACY1Proteinen Die autosomal rezessiv vererbte Stoffwechselstörung ACY1-Mangel wird durch Mutationen im ACY1-Gen ausgelöst (Engelke et al., 2008; Sass et al., 2006; Sass et al., 2007; Sommer et al., 2011; Tylki-Szymanska et al., 2010; Van Coster et al., 2005). Solche Mutationen im ACY1-Gen können durch Mutationsanalysen von Patienten-DNA detektiert werden, jedoch fehlten bislang Untersuchungen zur Expression verschiedener ACY1-Genmutanten. Um eine bessere Charakterisierung des ACY1-Mangels zu ermöglichen, sind Studien auf molekularer Ebene nötig. In der vorliegenden Arbeit wurde der Einfluss bestimmter Mutationen, die bei ACY1-Mangel-Patienten analysiert worden waren, auf die Funktion der ACY1 untersucht. Die Expression der verschiedenen ACY1-Mutanten im HEK293-Zellmodel lieferte hierbei vielversprechende Ergebnisse. Die transient überexprimierten ACY1-Proteinvarianten (ACY1 Val159Met; ACY1 61ThrfsX348; ACY1 Arg197Trp; ACY1 Glu233Asp; ACY1 Arg353Cys; ACY1 369ProfsX46 und ACY1 Arg386Cys) wiesen keine erhöhte ACY1-Aktivität im Vergleich zur Negativkontrolle (HEK293-Zellen transfiziert mit dem Leervektor pcDNA3.1/+) auf (Abb. 4-5). Fehlende Banden in der Western-Blot-Analyse bestätigten diese Messungen. Somit ist möglicherweise die Proteinexpression dieser ACY1-Mutanten bereits auf Ebene der Translation gestört. Es ist möglich, dass diese Mutationen im ACY1-Gen erhebliche Veränderungen in der Proteinstruktur auslösen, was nachfolgend im Detail diskutiert werden soll. 2.1 Deletion der Base Adenin an Position 181 (c.181delA) im ACY1-Gen Eine Deletion der Base Adenin (A) an Position 181 in der proteinkodierenden DNASequenz des ACY1-Gens führt bereits in der Transkription zu einer Leserahmenverschiebung. Wird die ACY1-mRNA anschließend in eine Aminosäurensequenz umgeschrieben, kommt es zu einem verfrühten Ende der Translation durch ein Stopp-Codon. Dieses liegt nur zwei Basentripletts von der Deletionsstelle entfernt. Aufgrund dessen ist eine frühe Degradation der unvollständigen Aminosäuresequenz der ACY1 61ThrfsX348 möglich. Daher ist für diese ACY1-Variante keine Enzymaktivität detektiert worden. Der Patient AC020 II-1 mit einem ACY1-Mangel zeigte eine deutlich verminderte ACY1-Aktivität (Tab. 4-2), obwohl er für diese Mutation (c.181delA) nur heterozygot war. Er wies jedoch auch Heterozygotie für c.1057C>T (p.Arg353Cys) auf (Tab. 4-4). 108 Diskussion 2.2 Insertion der Basen Adenin und Cytosin an Position 1105 (c.1105_1106insAC) im ACY1-Gen Die Insertion der Basen Adenin und Cytosin an der Nukleotidpostion 1105 führt auch zu einer Leserahmenverschiebung des ACY1-Gens. Diese Leserahmenverschiebung ergibt einen Verlust der Aminosäure Histidin (His) 373. Diese ist maßgeblich an der Zink-Ion-Bindung im ACY1-Protein beteiligt (Lindner et al., 2003). Durch die Insertion wird eine veränderte Aminosäuresequenz translatiert und ein neues Stopp-Codon generiert (TGA). Die Sequenz enthält dadurch nur noch 406 Aminosäuren. Folglich ist das ACY1-Protein wahrscheinlich anfälliger für einen frühen Abbau im Proteasom (Hilt, 2005; Schubert et al., 2000). Möglicherweise könnte sich die ACY1-Mutante auch in eine inaktive Form falten, was ebenfalls einen Verlust der Aktivität nach sich ziehen würde (Sommer et al., 2011). Sass et al. beschrieben einen Patienten mit ACY1-Mangel, der Homozygotie für die Mutation c.1105_1106insAC aufwies (Sass et al., 2006). Sie kamen zum Schluss, dass sich ein längeres Protein als das ACY1Protein mit der Referenzsequenz bildet und die Mutation damit auch zur frühzeitigen Termination der Translation führt (Sass et al., 2006). Dies spricht gegen das Vorhandensein eines unkorrekt gefalteten ACY1-Proteins. Um konkrete Aussagen zum zeitlichen Abbau der veränderten mRNA oder Aminosäuresequenz der ACY1-Proteinvarianten ACY1 61ThrfsX46 und ACY1 369ProfsX46 zu erhalten, wäre eine Abklärung mittels qPCR anstrebenswert. So kann das Expressionslevel der mRNA dieser Varianten überprüft werden. Auf diese Weise könnten konkrete Schlussfolgerungen bzgl. eines möglichen transkiptionellen mRNA-Abbaus getroffen werden. 2.3 Die Mutation c.475G>A (p.Val159Met) Die Mutation p.Val159Met liegt im Bereich der funktionell wichtigen und evolutionär hoch konservierten Peptidasedomäne des ACY1-Proteins (Abb. 4-4) (Sass et al., 2006). Valin (Val) 159 ist Teil einer α-Helix im Protein (Abb. 5-1). Der Austausch der Aminosäure Val mit Methionin (Met) könnte zu einer Störung der α-helikalen Struktur führen, wodurch eine fehlerhafte Faltung des Proteins möglich wäre. Das hätte den umgehenden Abbau der Proteinstruktur im Proteasom zur Folge (Hilt, 2005; Schubert et al., 2000). Der von einem ACY1Mangel betroffene Patient AC019 II-1 war für diese Mutation (c.475G>A) und für c.1057C>T compound-heterozygot (Tab. 4-4). Somit konnte im Enzymassay keine erhöhte ACY1Aktivität im Vergleich zur Positivkontrolle (Kontrolle mit nachgewiesenem ACY1-Mangel; EBV-tansformierte Lymphozyten) ermittelt werden. 109 Diskussion 2.4 Die Mutationen c.589C>T (p.Arg197Trp) und c.699A>C (p.Glu233Asp) Die Genveränderungen c.589C>T (p.Arg197Trp) und c.699A>C (p.Glu233Asp) liegen in der evolutionär hoch konservierten Peptidase-Dimerisierungsdomäne (Abb. 4-4). Diese beinhaltet die Zink-Ion-bindende Struktur, welche für die Ausprägung der Enzymaktivität essentiell ist (Lindner et al., 2003). Zwar befinden sich beide Aminosäuren (Arg197 und Glutamat (Glu) 233) in entgegengesetzter Ausrichtung zur Zink-Ion-bindenden Struktur und zum aktiven Zentrum (Abb. 5-1), jedoch ist für die ACY1-Mutanten ACY1 Arg197Trp und ACY1 Glu233Asp keine Restaktivität nachgewiesen worden. Da sich beide Aminosäuren (Arg197 und Glu233) zum zweiten Monomer ausrichten, sind sie möglicherweise an der Stabilisierung der Dimerisierung des ACY1-Proteins beteiligt. Diese Annahme wird durch folgende Beobachtungen gestützt: In EBV-transformierten Lymphozyten eines Patienten, der compoundheterozygot für die Mutationen p.Glu233Asp und p.Arg353Cys war, konnte keine ACY1Aktivität detektiert werden (Sass et al., 2006). Bei einem Patienten, welcher homozygot für p.Arg197Trp war, wurde ein ACY1-Aktivitätsverlust in EBV-transformierten Lymphozyten erkannt (Sass et al., 2007). 2.5 Die Mutation c.1057C>T (p.Arg353Cys) Der Austausch der Aminosäure Arg353 durch ein Cystein (Cys) scheint die globuläre Untereinheit des aktiven Zentrums zu stören (Abb. 5-1) (Van Coster et al., 2005). Die Mutation c.1057C>T (p.Arg353Cys) wurde bereits mehrfach im ACY1-Gen von ACY1- Mangelpatienten detektiert (Sass et al., 2006; Tylki-Szymanska et al., 2010; Van Coster et al., 2005). Auch wenn diese Mutation nicht als Polymorphismus (engl: single nucleotide polymorphism - SNP) in die SNP-Datenbank1 eingetragen ist, besteht der Verdacht, dass es sich um einen SNP handelt, der die ACY1-Aktivität maßgeblich beeinflusst (Sass et al., 2006; Van Coster et al., 2005). ACY1-Mangel-Patienten, welche die Mutation p.Arg353Cys trugen, zeigten in allen bisherigen Arbeiten einen deutlichen Verlust der ACY1-Aktivität (Sass et al., 2006; Sass et al., 2007; Tylki-Szymanska et al., 2010; Van Coster et al., 2005). Auch Lymphozyten/Fibroblasten von Patienten, bei denen diese Mutation in homozygoter Form angezeigt wurden, wiesen einen deutlichen ACY1-Aktivitätsverlust auf (AC011 II-1, AC011-II-2, AC022 II-1 und AC022 II-2) (Tab. 4-1 und 4-4). 1 http://www.ncbi.nlm.nih.gov/projects/SNP 110 Diskussion 2.6 Die Mutation c.1156C>T (p.Arg386Cys) Eine Proteinstrukturänderung könnte der Grund für den Aktivitätsverlust der ACY1Enzymvariante ACY1 Arg386Cys sein. Dies begründet sich auf der Tatsache, dass Arg386 Teil einer α-Helix in der C-terminalen Peptidasedomäne darstellt (Abb. 4-4 und Abb. 5-1) (Lindner et al., 2003; Sass et al., 2006). Ein Verlust der ACY1-Aktivität war bei der ACY1 Mutante ACY1 Arg386Cys und bei dem Patienten AC007 II-1 detektiert. Dieser war homozygot für c.1156C>T (p.Arg386Cys) und wies einen ACY1-Mangel auf (Sommer et al., 2011). Die Mutation p.Arg386Cys ist als SNP (rs2229152) in der NCBI-Datenbank2 aufgeführt. Sie wurde bislang bei 3,5 % von 113 Individuen (226 Chromosomen) aus SubsaharaAfrika entdeckt, in 105 Kontrollproben (210 Chromosomen) aus Südwestdeutschland wurde diese Sequenzvariante nicht detektiert (Sommer et al., 2011). Somit lässt sich für die ACY1-Mutanten zusammenfassen, dass eine Proteindestabilisierung oder frühe Proteindegradation der ACY1-Enzymvarianten (ACY1 Val159Met; ACY1 61ThrfsX348; ACY1 Arg197Trp; ACY1 Glu233Asp; ACY1 Arg353Cys; ACY1 369ProsX46 und ACY1 Arg386Cys) hierbei möglicherweise verantwortlich für den Verlust der ACY1Enzymaktivität war (Lindner et al., 2003; Sommer et al., 2011). Deshalb wurden auch keine immunoreaktiven ACY1-Proteinvarianten im Western Blot detektiert. 2 http://www.ncbi.nlm.nih.gov/projects/SNP/ snp_ref.cgi?rs=2229152 111 Diskussion Abb. 5-1: Monomer der Thr347Gly-ACY1-Mutante geändert nach Lindner et al. (2003) (PDB ID: 1Q7L (Lindner et al., 2003)). Die katalytischen und Zink-Ion-bindenden Aminosäuren sind schwarz eingefärbt. Pro Monomer bindet die ACY1 zwei Zink-Ionen (hellblaue Kugeln). Aminosäuren, die durch eine Mutation beeinflusst bzw. ausgetauscht wurden, sind in blau gezeichnet. Die Aminosäure Glu233 kann nicht dargestellt werden, da die Aminosäuren 199-320 in dieser Kristallstruktur nicht enthalten waren. Im Gegensatz zu den bisher diskutierten Mutationen stehen die Untersuchungen der ACY1-Mutanten ACY1 Arg378Trp, ACY1 Arg378Gln, ACY1 Arg393His und ACY1 Arg393Cys: Die Proteinexpression der vier Enzymvarianten konnte nicht nur im Western Blot nachgewiesen werden, sondern sie zeigten alle auch hohe Restaktivität. 2.7 Die Mutationen c.1132C>T (p.Arg378Trp) und c.1133G>A (p.Arg378Gln) Die Aminosäure Arg378 ist Teil der C-terminalen Peptidasedomäne (Abb. 4-4) und wendet sich vom katalytischen Zentrum der ACY1, sowie von der Zink-Ion-bindenden Domäne ab (Abb. 5-1) (Lindner et al., 2003; Sommer et al., 2011). Der Austausch des Arg378 durch die Aminosäure Tryptophan (Trp) scheint einen weit aus stärkeren Effekt auf die Sekundärstruktur des Proteins zu haben, als ein Austausch durch Glutamin (Gln) (Sommer et al., 2011). Das Trp nimmt aufgrund seiner Struktur mehr Platz ein als Gln. Die Seitenkette des Trp könnte daher in Kontakt mit Prolin (Pro) 369 treten, welches in einer angrenzenden Loop-Struktur lokalisiert ist. Somit würde der Austausch des Arg378 mit einem Trp eine Änderung der Ka112 Diskussion talyse auslösen und die ACY1-Aktivität senken. Trp ist eine lipophile, aromatische Aminosäure, die möglicherweise die ACY1-Proteinstruktur stärker beeinflusst als Gln an der gleichen Stelle. Arg und Gln sind im Gegensatz zu Trp basische Aminosäuren und haben eine ähnliche Seitenkettenstruktur. Das spiegelt sich vor allem in der höheren ACY1-Aktivität der ACY1 Arg378Gln im Gegensatz zur ACY1 Arg378Trp wider. Dass in EBV-transformierten Lymphozyten von Patienten mit einem ACY1-Mangel (AC013 II-1 und AC014 II-1 in Tab. 4-1), die für eine der beiden Mutationen (p.Arg378Trp oder p.Arg378Gln) homozygot waren (Tab. 4-4), eine große Restaktivität im Vergleich zur Positivkontrolle (Kontrolle mit nachgewiesenem ACY1-Mangel; EBV-tansformierte Lymphozyten) detektiert wurde, stützt diese These zusätzlich (Sommer et al., 2011). 2.8 Die Mutationen c. 1178G>A (p.Arg393His) und c.1177C>T (p.Arg393Cys) Die Mutationen c. 1178G>A (p.Arg393His) und c.1177C>T (p.Arg393Cys) verändern die Aminosäure Arg393 am C-terminalen Ende des Proteins außerhalb funktionell wichtiger Domänen (Abb. 4-4) Arg 393 liegt nur 16 Aminosäuren vom Ende der Aminosäuresequenz des ACY1-Proteins entfernt. Arg393 geht zudem keine Interaktionen mit einer der katalytischen Aminosäureseitenketten ein (Lindner et al., 2003; Sommer et al., 2011). Dadurch ist die hohe Restaktivität der überexprimierten ACY1-Enzymvarianten ACY1 Arg393His und ACY Arg393Cys zu erklären. Da der Austausch des Arg mit His oder Cys keine strukturell bedeutenden Veränderungen nach sich zieht, war die Detektion einer Proteinbande (im Bereich von 46 kDa) im Western Blot möglich. Diese Ergebnisse sprechen für die strukturell korrekten Faltungen der Proteinvarianten und für die Expression funktioneller ACY1-Mutanten ACY1 Arg378Trp, ACY1 Arg378Gln, ACY1 Arg393His und ACY1 Arg393Cys im HEK293Zellmodel. 2.9 Hat die ACY1 eine regulatorische Funktion als Tumorsupressor oder –promotor? Auch wenn die ACY1-Aktivität durch Mutationen wie p.Arg378Gln, p.Arg393His oder p.Arg393Cys nicht beeinträchtigt ist, können diese Veränderungen eventuell andere biologische Auswirkungen nach sich ziehen. Maceyka et al. zeigte, dass das ACY1-Protein mit der Sphingosinkinase 1 (SphK1) interagieren kann (Maceyka et al., 2004). Sie ist verantwortlich für die Vermittlung der Zellproliferation und die damit einhergehende Hemmung der Apoptose (Xia et al., 2002). SphK1-Aktivierung führt zur Freisetzung von Sphingosin-1-Phosphat (S1P), einem Signalmolekül, das als intrazellulärer „second messenger“ wirksam ist (Hla, 2001; Spiegel & Milstien, 2003). S1P fördert die Zellproliferation und hemmt die Apoptose 113 Diskussion (Maceyka et al., 2002; Pyne & Pyne, 2000; Spiegel & Milstien, 2003). Die SphK1 wird durch direkte Phosphorylierung am Ser255 durch ERK1/2 (engl.: extracellular-signal regulated kinase 1/2) aktiviert und vom Zytosol zur Zellmembran umgelagert (Pitson et al., 2003). Durch die Interaktion von SphK1 und Tumornekrosefaktor (TNF)-Rezeptor assoziierten Faktor 2 (TRAF2) wird die Hemmung der Apoptose durch TNF-α induziert (Xia et al., 2002). Maceyka et al. stellten fest, dass die ACY1 die SphK1-Aktivität und ihre biologischen Funktionen direkt beeinflusst (Maceyka et al., 2004). Die ACY1 und SphK1 sind beide in hohen Konzentrationen im Gehirn und in der Niere zu finden (Kohama et al., 1998; Uttamsingh et al., 2000). Die Wechselwirkung zwischen ACY1 und SphK1 können zur Proliferation der Zellen und Hemmung apoptotischer Prozesse führen (Maceyka et al., 2004). Zong et al. führten Untersuchungen in Nierentumorzellen von Ratten durch. Sie fanden eine erhöhte mRNAExpression der SphK1 und konnten einen SphK1-ACY1-Komplex in diesen Krebszellen detektieren (Zhong et al., 2009). Ferner zeigten sie, dass Nierenkarzinomzellen, transfiziert mit der ACY1, langsamer wuchsen als die Zellen, die mit dem Leervektor pIRES2-AcGFP1 transfiziert worden waren. Zudem wurde eine große Anzahl apoptotischer Zellen detektiert (Zhong et al., 2009). Sie prognostizierten daher im Gegensatz zu Maceyka et al., dass die ACY1 die Zellproliferation hemmt und die Apoptose begünstigt (Maceyka et al., 2004; Zhong et al., 2009). Ein C-terminales ACY1-Fragment kann laut Maceyka et al. auch die Funktion der SphK1 negativ beeinflussen. Daher soll diese Interaktion die Fähigkeit der SphK1 zur Steigerung der Zellproliferation und Inhibierung der Apoptose mindern (Maceyka et al., 2004). Eine Inaktivierung der ACY1 durch Mutationen (c.657C>T und c.834A>C) konnte eine stimulierende Wirkung auf das Zellwachstum von kleinzelligem Lungenkarzinom ausüben (Cook et al., 1998). Demnach ist die Frage nach der eigentlichen Funktion der ACY1 als Tumorsupressor oder –promoter noch nicht vollständig beantwortet. 114 Diskussion 3 Auswirkung von Mutationen auf die Struktur und Funktion von ASPA-Proteinen Auch die Expressionstudien zum ASPA-Gen erfolgten im HEK293-Zellmodell. Das humane Zellsystem stellt die Glykosylierung der ASPA (an Asn117-Thr118-Thr119) und damit die korrekte Faltung des ASPA-Proteins sicher (Kaul et al., 1993; Sommer et al., 2011). Erste Expressionsstudien von ASPA-Protein in E. coli resultierten in grossen Aktivitätsverlusten (Di Pietro et al., 2008; Kaul et al., 1993). Experimente in COS-Zellen anstelle von E. coli eliminierten das Problem (Hershfield et al., 2006; Hershfield et al., 2007; Janson et al., 2006; Kaul et al., 1994; Surendran et al., 2003). COS-Zellen sind Fibroblasten, welche von der SV40-transformierten Nierenzelllinie der Grünen Meerkatze (Cercopithecus aethiops) abgeleitet sind (Gluzman, 1981). Es bestehen jedoch Zweifel daran, ob COS-Zellen wirklich ein geeignetes System zur Expression von mutierten ASPA-Proteinen darstellten. Le Coq et al. (2006) konnten durch die Expression humaner ASPA mit der Referenzsequenz in einer Hefezelllinie KM71HP aus Pichia pastoris genügend funktionelles Protein für Aktivitätstests und Strukturanalysen bereitstellen (Le Coq et al., 2006). 3.1 Die Mutation c.863A>G (p.Tyr288Cys) Als Surendran et al. die ASPA-Enzymvariante (ASPA Tyr288Cys) in COS-Zellen exprimierten, konnten sie dabei keinen Aktivitätsverlust detektieren (Surendran et al., 2003). Die Aminosäure Tyrosin (Tyr) 288 ist maßgeblicher Teil des aktiven Zentrums und an der Katalyse beteiligt. Sie ist zudem evolutionär hoch konserviert (Le Coq et al., 2008) und stabilisiert die Substratbindung, indem sie über eine Wasserstoffbrückenbindung die terminale Karboxylgruppe von NAA bindet (Bitto et al., 2007). Die von Surendran et al und Tacke et al. beschriebenen Patienten wiesen CompoundHeterozygotie auf (p.Tyr288Cys und eine Deletion der Basen AC im Intron vor Exon 3 des ASPA-Gens (c.432-2delAC) (Surendran et al., 2003); p.Tyr288Cys und p.Phe295Ser auf (Tacke et al., 2005). Die ASPA-Aktivität in Fibroblasten der Patienten lag stets erniedrigt vor (Tacke et al., 2005). Dies wirft Zweifel an den erzielten Ergebnissen der Untersuchungen von ASPA Tyr288Cys in COS-Zellen auf (Surendran et al., 2003). Die in den HEK293-Zellen exprimierte ASPA-Enzymvariante ASPA Tyr288Cys zeigte keine Restaktivität. Le Coq et al. untersuchten eine andere ASPA-Mutante, in der Tyr288 gegen ein Phe ausgestauscht wurde. Die Mutation hatte einen hohen ASPA-Aktivitätverlust zur Folge. Die Enzymaktivität betrug nur noch 1 % der Aktivität des nativen ASPA-Enzyms mit der Referenzsequenz (Le Coq et 115 Diskussion al., 2008). Die Ergebnisse aus diesen Versuchen zeigen deutlich, dass die Mutation p.Tyr288Cys eine Ursache eines Morbus Canavans darstellen kann. 3.2 Die Mutationen c.884T>C (p.Phe295Ser) und c.914C>A (p.Ala305Glu) Der im HEK293-Zellmodell detektierte Aktivitätsverlust der ASPA-Varianten ASPA p.Phe295Ser und ASPA Ala305Glu, stimmt mit früheren Untersuchungen in E. coli und COS-Zellen überein (Hershfield et al., 2007; Janson et al., 2006). Beide Mutationen werden häufig bei europäischen, ethnisch nicht-jüdischen Morbus Canavan-Patienten nachgewiesen (Feigenbaum et al., 2004; Hershfield et al., 2007; Janson et al., 2006; Kaul et al., 1994). Die Aminosäure Alanin (Ala) 305 ist Teil eines β-Faltblattes am C-terminalen Ende des Proteins (Abb. 5-2) (Le Coq et al., 2006). Diese Sekundärstruktur scheint bedeutend für die Ausprägung der ASPA-Aktivität zu sein. Die Ergebnisse der qPCR zeigten deutlich, dass die mRNA-Expression durch die Mutation nicht gestört ist. Entweder wird die entstehende Aminosäurekette bereits während der Translation abgebaut, oder das Protein kann sich aufgrund der Mutation nicht zu einem funktionellen ASPA-Protein falten. Ein Proteinabbau gleich im Anschluss an die Translation wäre auch in Betracht zu ziehen. Fünf DNA-Proben von Patienten mit einem Morbus Canavan wiesen die Mutation p.Ala305Glu auf (Tab. 4-8). Da keine der mRNA-Expression der ASPA-Mutante detektiert werden konnte, lässt sich auf einen Abbau der mRNA von ASPA Phe295Ser auf transkriptioneller Ebene schließen. Somit ist ein Umschreiben der mRNA in die Aminosäuresequenz unmöglich und die Synthese eines funktionellen ASPA-Proteins kann nicht stattfinden. Der Austausch des Phenylalanins (Phe) 295 durch Serin (Ser) hat Relevanz für eine β-Faltblattstuktur im Protein (Le Coq et al., 2006). 116 Diskussion Abb. 5-2: Proteinstruktur eines ASPA-Monomers (37 kDa) geändert nach Bitto et al. (2007) (PDB ID: 2I3C (Bitto et al., 2007): Die katalytischen und Zink-Ion-bindenden Aminosäuren sind schwarz eingefärbt. Pro Monomer bindet ASPA ein Zink-Ion (hellblaue Kugel). Aminosäuren, die durch eine Mutation ausgetauscht wurden, sind in blau gezeichnet. 3.3 Die Mutation c.503G>A (p.Arg168His) Die Mutation c.503G>A (p.Arg168His) wiesen Sistermans et al. im ASPA-Gen eines Morbus-Canavan-Patienten nach (Sistermans et al., 2000). Sie wurde bisher noch nicht in vitro untersucht. Kaul et al. detektierten eine Mutation im selben Codon, die einen Aminosäureausstausch vom Arg168 zu Cys168 nach sich zog (Kaul et al., 1996). Expressionsstudien für diese ASPA-Mutante (p.Arg168Cys) in COS-Zellen, ergaben keine ASPA-Aktivität (Kaul et al., 1996). Interessanterweise ist Arg168 Teil des aktiven Zentrums und von großer Bedeutung für die Katalyse (Bitto et al., 2007; Le Coq et al., 2008). Diese Aminosäure stabilisiert NAA im katalytischen Zentrum, indem die Seitenkette spezifisch über eine Wasserstoffbrückenbindung an die β-Karboxylgruppe des NAA bindet (Bitto et al., 2007). Arg168 ist einerseits eine bedeutende Aminosäure für die Katalyse der Hydrolyse von NAA und andererseits eine potentielle Mutationsstelle im ASPA-Gen bei Patienten mit einem Morbus Canavan. 117 Diskussion Histidin (His) ist eine Aminosäure mit einer geladenen polaren Seitenkette und hat aufgrund der Größe des Imidazolrings eventuell eine sterische Auswirkung auf das aktive Zentrum. Die Seitenkette von His ist wesentlich kürzer als die des Arg. Diese würde deshalb nicht weit genug ins aktive Zentrum hineinreichen, um mit NAA in Wechselwirkung zu treten. Daher könnte His nicht in der Lage sein, NAA zu stabilisieren und eine Abspaltung des AcylRestes verhindern. Der Austausch von Arg168 mit His führt zur Destabilisierung des aktiven Zentrums und damit möglicherweise zu einem Verlust der Enzymaktivität. Die mRNAExpression der ASPA-Variante ASPA Arg168His war ähnlich der mRNA-Synthese des ASPA-Gens mit der Referenzsequenz. In dem Fall könnte die wachsende Aminosäurenkette entweder während der Translation abgebaut oder das Gesamtprotein frühzeitig im Proteasom abgebaut worden sein (Hilt, 2005; Schubert et al., 2000). Wurde die ASPA-Mutante (ASPA Arg186His) exprimiert und nicht degradiert, war das Protein wahrscheinlich nicht korrekt gefaltet und konnte daher die hydrolytische Spaltung von NAA nicht katalysieren. 3.4 Die Mutation c.541C>A (p.Pro181Thr) Die überexprimierte ASPA-Mutante ASPA Pro181Thr zeigte keine erhöhte ASPAAktivität im Vergleich zur Negativkontrolle (HEK293-Zellen transfiziert mit dem pcDNA3.1/+-Leervektor) aber ein ähnliches mRNA-Expressionslevel im Vergleich zu ASPA mit der Referenzsequenz. Pro181 ist eine evolutionär hoch konservierte Aminosäure und Teil einer Loop-Sekundärstruktur im Protein (Abb. 5-2). Der Austausch von Pro181 durch Thr könnte die Proteinstruktur von ASPA stören und auf diese Weise Konformationsänderungen auslösen. Es ist möglich, dass solche Veränderungen zu einer inaktiven ASPA-Mutante führen und das Protein frühzeitig abgebaut wird. Die Mutation p.Pro181Thr konnte bei zwei Morbus-Canavan-Patienten (aus Deutschland und Österreich) im Rahmen dieser Studie nachgewiesen werden (Kapitel IV Abschnitt 1.4). Sistermans et al. detektierten dieselbe Mutation bei zwei Patienten (eineiigen Zwillingen) dänisch/türkischer Herkunft (Sistermans et al., 2000). 118 Diskussion 4 ASPA-Aktivitätsbestimmung bei Patienten mit einem Morbus Canavan Matalon et al. beschrieben 1988 ein Verfahren zur Bestimmung der ASPA-Aktivität in Zellhomogenaten von menschlichen Fibroblasten (Matalon et al., 1988). Damit war es möglich, Fibroblasten von Morbus-Canavan-Patienten auf ihre spezifische ASPA-Enzymaktivität zu untersuchen. Im Rahmen der Konfirmationsdiagnostik des Morbus Canavans im Labor wurde dieser Assay für die Analyse von Fibroblastenhomogenaten von Morbus-CanavanPatienten eingesetzt. Es fiel leicht eine Unterscheidung zwischen Patienten und Negativkontrollen mit Hilfe des Assays zu treffen. Patienten zeigten eine deutlich geringere ASPAAktivität als die untersuchten Negativkontrollen (Kapitel IV Abschnitt 1.3). Jedoch musste für eine Fibroblastenkultur zunächst eine Hautstanze des Patienten entnommen werden. Es wurde geprüft, ob funktionelle Tests auch in EBV-transformierten Lymphozyten von MorbusCanavan-Patienten durchgeführt werden können. Die Ergebnisse der Tests zeigten jedoch deutlich geringere ASPA-Aktivitäten von EBV-transformierten-Lymphozyten- Negativkontrollen auf, als von entsprechenden Fibroblastenhomogenaten (Kapitel IV Abschnitt 1.3). Zudem schwankten die Messerwerte zwischen den verschiedenen Assays deutlich. Es konnte nicht immer eindeutig zwischen Negativkontrolle und Patient unterschieden werden. Somit liegt es nahe, dass das von Matalon et al beschriebene Verfahren nicht zuverlässig auf Homogenate EBV transformierter Lymphozyten anwendbar ist (Matalon et al., 1988). Die Daten der erhaltenen ASPA-Aktivität für Morbus-Canavan-Patienten in Lymphozyten sind somit mit Vorsicht zu betrachten. Erste Versuche zur Entwicklung eines neuen ASPA-Enzymaktivitätsassays, die parallel im Rahmen einer Bachelor-Arbeit von D. Sexauer im Labor für Klinische Biochemie und Stoffwechsel (Zentrum für Kinder- und Jugendmedizin, Universitätsklinikum Freiburg) durchgeführt wurden, zeigten positive Ergebnisse (Sexauer et al., 2012). Bei diesem Aktivitätstest handelt es sich um eine Modifikation des ACY1-Aktivitätsassays (Kapitel III Abschnitt 25). Dabei wurde für ASPA das synthetische Substrat Nα-Trifluoroacetyl-L-Asparat (NTFA) eingesetzt. Erste Ergebnisse dieser Testreihen mit Lymphozytenhomogenaten von Patienten mit einem Morbus Canavan zeigten einen deutlichen Unterschied in der ASPA-Aktivität zwischen Negativkontrollen und PatientenLymphozyten (Sexauer, 2012; Sexauer et al., 2012). Dies ermöglicht eine Verbesserung der Diagnostik des Morbus Canavans hinsichtlich eines geeigneten Enzymassays für die ASPA in Lymphozytenhomogenaten von Patienten. Dies würde einen weniger invasiven Eingriff 119 Diskussion (Blutabnahme zur Gewinnung einer Lymphozytenzellkultur) für den Patienten bedeuten, da keine Hautstanze für die Kultivierung von Fibroblasten genommen werden müsste. Zusätzlich zur Überprüfung der ASPA-Aktivität in Fibroblasten- oder Lymphozytenzellhomogenaten wurden auch die ASPA-Gene der Patienten mit einem Morbus Canavan sequenziert. Dabei wurden in fünf der fünfzehn Patienten die bei nicht-jüdischen Europäern häufige Mutation c.914C>T (p.Ala305Glu) detektiert (Elpeleg & Shaag, 1999; Kaul et al., 1996; Shaag et al., 1995). In sieben Patienten wurde zudem die stille Mutation c.693C>T (p.Tyr231Tyr) nachgewiesen. Bei dieser Mutation handelt es sich um einen in der SNPDatenbank des NCBI3 eingetragenen Polymorphismus (rs12948217). Das Nukleotidtriplett TAC kann jedoch auch durch zwei andere Mutationen (in Patienten mit Morbus Canavan) verändert sein. Dabei handelt es sich zum einen um den Austausch der Base Adenin (A) mit einen Guanin (G) (c.694A>G). Dabei wird Tyr231 durch ein Cys getauscht (Patient AC016 II-1, Tab. 4-8). Dabei handelt es sich ebenfalls um einen SNP (rs104894550)4. Eine weitere Mutation (c.692C>A) bewirkt, dass an dieser Stelle ein Stop-Codon entsteht und es zum vorzeitigen Kettenabbruch der Aminosäuresequenz bei der Translation kommt. Dem Patient AC018 II-1 konnte diese Mutation nachgewiesen werden (homozygot) (Tab. 4-8). 4.1 MLPA-Analyse ausgewählter Patienten Sechs Patienten mit einem Morbus Canavan (F-AC500, F-AC502, F-AC505, F-AC508, AC009 II-1 sowie AC010 II-1) wurden zusätzlich durch MLPA auf heterozygot vorliegende Deletionen und Duplikationen im ASPA-Gen untersucht. Bei diesen Patienten waren die Ergebnisse der Sequenzierung nicht zweifelsfrei einem Morbus Canavan zu zuordnen. Die MLPA-Ergebnisse waren jedoch nicht immer eindeutig zu interpretieren. So können bereits einzelne Punktmutationen, wie das Beispiel des Patienten F-AC500 mit c.526+129G>A und c.914C>A zeigt, das Ergebnis der MLPA-Untersuchungen beeinflussen und verfälschen. Ein Auftreten falsch-positiver Ergebnisse kann also schon vorliegen, wenn das ASPA-Gen bereits Mutationen aufweist. Somit sind die Daten der hier durchgeführten MLPA-Untersuchungen mit Vorsicht zu betrachten. Es wurden in den meisten Fällen (F-AC500, F-AC502, AC009 II-1, AC010 II-1) Deletionen bzw. Duplikationen für einzelne Exone detektiert, in denen bereits Mutationen detektiert wurden. Es ist sehr unwahrscheinlich, dass beispielsweise Exon 2, 3 und 5 heterozygot dupli- 3 4 http://www.ncbi.nlm.nih.gov/projects/SNP/snp_ref.cgi?rs=12948217 http://www.ncbi.nlm.nih.gov/projects/SNP/snp_ref.cgi?rs=104894550 120 Diskussion ziert vorlagen, die anderen Exone jedoch nicht (F-AC502 und F-AC505). Duplikationen oder Deletionen eines Exons im ASPA-Gen (F-AC508 und AC009 II-1) sind wahrscheinlicher, wenn dieses von großen Intronbereichen (größer 25 kbp) eingeschlossen vorliegen würde (MRCHolland, 2010). Jedoch haben die Introns, welche Exon 3 und Exon 4 einschließen eine Größe von 2,8-5,6 kpb. Ob somit wirklich eine Duplikation des Exons 3 (F-AC508) oder eine Deletion des Exons 4 (AC009 II-1) vorlag, war nicht eindeutig zu beantworten. Duplikationen oder Deletionen mehrerer zusammenhängender Genabschnitte (Exons und Introns) sind möglich, wenn das MLPA-Signal einen Anstieg (>130 %) oder eine Abnahme (<70 %) anzeigt (MRCHolland, 2010). Somit könnte bei dem Patient AC010 II-1 Exon 4 und 5 heterozygot deletiert vorliegen. Bei dem Patienten F-AC500 trat für fünf der sechs Exons des ASPA-Gens Heterozygotie für Duplikationen auf (Kapitel IV Abschnitt 1.4). Es ist jedoch unwahrscheinlich, dass alle Exons außer Exon 4 betroffen waren. Es ist daher möglich, dass Heterozygotie für die Duplikation des gesamten ASPA-Gens vorlag. Eindeutige Aussagen, ob heterozygote Deletionen oder Duplikationen vorlagen, können anhand dieser Ergebnisse nicht getroffen werden. Möglicherweise ist die MLPA-Analyse zur Erkennung von Duplikationen und Deletionen, die heterozygot vorkommen, in der hier vorliegenden Konstellation nicht geeignet. 121 Diskussion 5 Können ACY1 und ASPA die Katalyse der hydrolytischen Spaltung von Nα-acetylierten L-Aminosäuren gegenseitig übernehmen? Die ACY1 weist eine geringe Substratspezifität auf (Birnbaum et al., 1952; Mitta et al., 1993). Sie hydrolysiert bevorzugt unverzweigte, aliphatische, Nα-acetylierte Aminosäuren (Anders & Dekant, 1994; Birnbaum et al., 1953; Birnbaum et al., 1952). ASPA spaltet die Nα-Acetylgruppe des NAA und des NTFA spezifisch (Birnbaum et al., 1952; Matalon et al., 1988). Da beide ACY die Hydrolyse von Nα-Acetyl-L-Aminosäuren katalysieren, ist eine Überschneidung ihrer Substratspezifitäten denkbar. Vor diesem Hintergrund wurden Kombinationsstudien zwischen ACY1 und ASPA vorgenommen. Dabei wurden HEK293-Zellen, die stabil ACY1-Enzymvarianten exprimierten, mit dem ASPA-Gen mit der Referenzsequenz transfiziert. Eine Änderung der Enzymaktivität wurde danach mit dem ACY1-Assay überprüft. Als Substrat diente Nα-Acetyl-L-Methionin. Es waren keine großen Änderungen in der ACY1-Aktivität für alle ACY1-Proteine messbar. Somit kann davon ausgegangen werden, dass ASPA die Spaltung von Nα-Acetyl-L-Methionin in Acetat und freies L-Methionin nicht katalysiert. ACY1 und ASPA werden beide in den gleichen Organen (z.B. Gehirn und Niere) exprimiert (Cook et al., 1993; D'Adamo et al., 1973; Kirmani et al., 2002; Klugmann et al., 2003; Madhavarao et al., 2004). Nα-Acetyl-L-Methionin scheint kein Substrat für ASPA darzustellen. Der Aktivitätsverlust bei stabil exprimierten ASPA-Enzymvarianten in HEK293-Zellen sollte in der vorliegenden Arbeit durch eine Transfektion der Zellen mit dem ACY1-Gen mit der Referenzsequenz ausgeglichen werden. Die ACY1 konnte die Hydrolyse von NAA für mutierte ASPA-Proteine nicht übernehmen. Enzymassays wiesen allesamt keinen Umsatz von NAA nach. Obwohl ACY1 und ASPA beide Zink-bindende Metalloproteine sind und ihre Reaktionsmechanismen der Carboxypeptidase-Familie ähnlich sind, scheinen sie sich nicht in ihrer Substratspezifität hinsichtlich Nα-Acetyl-L-Methionin und NAA zu überschneiden (Bitto et al., 2007; Lindner et al., 2008a; Lindner et al., 2003). ASPA und ACY3 hingegen sind sich in Struktur und Reaktionsverhalten ähnlicher als ASPA und ACY1. Die Aminosäuresequenz von ASPA ist der Sequenz der ACY3 zu 42 % identisch, die Ähnlichkeit zur ACY1 ist wesentlich geringer (Abb. 5-3) (Hsieh et al., 2010; Newman et al., 2007). ACY3 gehört zu den Zink-bindenden, homotetrameren Metalloproteinen (Hsieh et al., 2010; Pushkin et al., 2004; Tsirulnikov et al., 2009). Daher liegt die Vermu- 122 Diskussion tung nahe, dass ASPA und ACY3 sich möglicherweise mehr in ihren Substratspezifitäten überschneiden als ASPA und ACY1. Abb. 5-3: Alignment der humanen ASPA- und ACY3-Aminosäurensequenz im Einbuchstabencode. Die grauen Bereiche sind die konservierten Aminosäuren beider Sequenzen (ASPA und ACY3). Die Zink-Ion-bindenden Aminosäuren (H21, E24 und H116) sind blau unterlegt. Gelb markierte Aminosäuren (N70-R71-T72 und N117T118-T119) entsprechen den möglichen Glykosylierungspostionen in beiden ACY. Aminosäuren (R63, N70, R71, Y164, R168, E178 und Y288), die an der Hydrolyse Nα-acetylierter L-Aminosäuren beteiligt sind, sind rot gefärbt. 123 Diskussion 6 Aktivitätsassay zur humanen ACY3 (hACY3) Strukturelle und funktionelle Informationen zur hACY3 sind bisher noch nicht veröffentlicht worden. Die erfolgreiche Überexpression der hACY3 im HEK293-Zellsystem konnte mittels eines ACY3-Aktivitätstests und anhand der Western-Blot-Analyse erwiesen werden. Es wurde eine Proteinbande bei 35 kDa detektiert, was der Größe eines Monomers der Zinkbindenden hACY3 entspricht (Pushkin et al., 2004; Suzuki & Tateishi, 1981). Die ACY3 kann als dimeres oder tetrameres Protein exprimiert vorliegen (Newman et al., 2007; Ryazantsev et al., 2007). Wie bereits in Kapitel V Abschnitt 5 erwähnt, zeigen hACY3 und humane ASPA (hASPA) große Übereinstimmungen in ihrer Aminosäurensequenz (Abb. 5-3). Die für die mACY3 prognostizierten katalytischen Aminosäuren His21, Glu24, Arg63, His116 und Glu178 gleichen denen der an der Katalyse beteiligten Aminosäuren der ASPA (Bitto et al., 2007; Hsieh et al., 2010; Newman et al., 2007; Pushkin et al., 2003; Tsirulnikov et al., 2009) Analysen zur Aktivität von ACY3 sind in der Vergangenheit zum größten Teil in Ratten und Mäusen durchgeführt wurden (Endo, 1978; Hanson & Hermann, 1958; Lorentz et al., 1975; Newman et al., 2007; Pushkin et al., 2004; Ryazantsev et al., 2007). Birnbaum et al. (1952) zeigten, dass ACY1 und ASPA chloroacetylierte Substrate vierfach stärker hydrolysierten als acetylierte Substrate. Aufbauend auf den von Birnbaum et al. (1952) durchgeführten Studien zur Aktivität von Acylasen konnten Hansen und Hermann bereits 1958 zeigen, dass Chloroacetyl-L-Tyrosin enzymatisch durch ein „Gewebsferment“ hydrolysiert wurde. Sie verwendeten Nieren- und Leberpräparationen von Ratten (Hanson & Hermann, 1958). Auch Endo untersuchte, wie Hansen und Hermann, chloroacetylierte Substrate, wie beispielsweise Nα-Chloroacetyl-L-Tryptophan, hinsichtlich ihrer Spaltung durch ein Enzym aus Rattennieren (rACY3). Nα-Chloroacetyl-L-Tryptophan (12,76 nmol/min Deacetylierungsrate) wurde ähnlich gut umgesetzt wie Nα-Acetyl-L-Tyrosin (13,00 nmol/min Deacetylierungsrate) (Endo, 1978). Auch die ACY1 wurde auf ihre Spezifität hinsichtlich chloroacetylierter Substrate getestet. So zeigten Lorentz & Flatter höhere ACY1-Aktivitäten für Chloroacetyl-LMethionin als für Acetyl-L-Methionin in Zellhomogenaten humaner Niere und Leber (Lorentz & Flatter, 1975). Der Einsatz von Chloroacetyl-L-Leucin zeigte eine geringere Hydrolyserate als die des Acetyl-L-Methionins (Lorentz & Flatter, 1975). Pushkin et al. untersuchten die in HEK293-Zellen überexprimierte Maus-ACY3 (mACY3) hinsichtlich der Enzymaktivität auf S-Benzyl-Nα-Acetyl-L-Cystein, Nα-Acetyl-L-Histidin, Nα-Acetyl-L-Tyrosin 124 Diskussion und Nα-Acetyl-L-Phenylalanin (Pushkin et al., 2004). Sie bewiesen anhand eines fluorometrischen Assays, dass S-Benzyl-Nα-Acetyl-L-Cystein (Michaelis-Menten-Konstante (KM) = 1,1 mM) gefolgt von Nα-Acetyl-L-Tyrosin (KM = 1,4 mM) und Nα-Acetyl-L-Phenylalanin (KM = 1,6 mM) gute Substrate für mACY3 darstellen (Pushkin et al., 2004). Aufgrund dieser Arbeiten lag es nahe, die im HEK293-Zellsystem überexprimierte hACY3 auf ihre Aktivität gegenüber Nα-Chloroacetyl-L-Tyrosin zu testen. Da das angewandte Assay für die Messungen von ACY1-Aktivitäten überzeugte, wurde es an die Anforderungen (Substrateinsatz) der hACY3 angepasst. Vorversuche mit Nα-Acetyl-LPhenylalanin wiesen darauf hin, dass dieses Substrat auch im gleichen Maße von humaner ACY1 (hACY1) umgesetzt wird. Somit stellt Nα-Acetyl-L-Phenylalanin kein spezifisches Substrat der hACY3 dar. Es konnte ein 18-fach höherer Anstieg an hACY3-Enzymaktivität beim Einsatz von Nα-Chloroacetyl-L-Tyrosin gegebenüber der hACY1-Aktivität nachgewiesen werden. Aktivitätsbestimmungen für hACY3 mit dem photometrischen Assay und der Tandem-Massenspektrometrie lieferten ähnliche Ergebnisse (Tab. 4-13 und 4-14). Damit wurde gezeigt, dass auch die Tandem-Massenspektrometrie eine verlässliche Methode zur Bestimmung der hACY3-Enzymaktivität für das Substrat Nα-Chloroacetyl-L-Tyrosin darstellt. Weiterführende kinetische Untersuchungen durch den Auszubildenden Herrn M. Schmidt (Labor für Klinische Biochemie und Stoffwechsel am Zentrum für Kinder- und Jugendmedizin des Universitätklinikums Freiburg) mit Nα-Chloroacetyl-L-Tyrosin ließen auf einen KM-Wert zwischen 1,0-15,1 mM mit Vmax zwischen 14,8-100,0 µmol*(g*min)-1 schließen (Kapitel IV Abschnitt 3.7). Aktivitätsbestimmungen mit überexprimierter hACY3 in HEK293-Zellen sind präziser als die bereits beschrieben Daten für aufgereinigte Organextrakte aus Säugetieren (Birnbaum et al., 1952; Endo, 1978; Hanson & Hermann, 1958; Lorentz et al., 1975). Die hier detektierte Aktivität der hACY3 bezieht sich direkt auf das überexprimierte Enzym. Da bisher weitere KM-Wert-Analysen mit chloroacetylierten Substraten für ACY3 fehlen, ist es schwierig den ermittelten KM-Wert für Nα-Chloroacetyl-L-Tyrosin zu vergleichen. Jedoch weisen die hier beschriebenen Ergebnisse darauf hin, dass Nα-Chloroacetyl-L-Tyrosin ein sehr gutes Substrat für die Bestimmung von hACY3-Aktivität in Zellhomogenaten darstellt. Umfassende Untersuchungen hinsichtlich der hACY3Enzymaktivität auf verschiedene Substrate (weitere acetylierte aromatische und andere chloroacetylierte Aminosäuren) würden zur Aufklärung der Substratspezifität der hACY3 beitragen. Um die Funktionen der ACY3 genau zu definieren, bedarf es jedoch auch weiterer experimenteller Ansätze zur Untersuchung des Reaktionsmechanismus der hACY3. Ob die ACY3 auch Interaktionen mit anderen Proteinen eingehen könnte wie die ACY1 (Maceyka et al., 125 Diskussion 2004), wurde noch nicht beschrieben. Jedoch ist durch die Überexpression der hACY3 in HEK293-Zellen und der Entwicklung eines ACY3-spezifischen Enzymassays in dieser Arbeit ein Grundstein zur weiteren Erforschung der hACY3 gelegt. 126 Diskussion 7 Expression von ACY in menschlichen Organen ACY werden in verschiedenen Organen unterschiedlicher Organismen exprimiert. Alle drei ACY (ACY1, ASPA und ACY3) wurden bereits aus Nieren verschiedener Tierarten isoliert (Birnbaum et al., 1952; Bruns & Schulze, 1962; Cook et al., 1993; D'Adamo et al., 1973; Endo, 1978; Schmiedeberg, 1881; Shu et al., 2008; Smorodinzew, 1922; Traka et al., 2008). ACY spielen zudem eine Rolle in der Bioaktivierung von Mercaptursäuren in der Niere (Lash & Anders, 1989). So ist die ACY1 beispielsweise ein Gegenspieler der N-Acetyltransferase und deacetyliert Mercaptursäuren (Lindner, 1999). Die mRNA-Expressionsstudien zu ACY1, ASPA und ACY3 wiesen auf eine gleichmäßige Verteilung in den untersuchten menschlichen Organen hin (Niere, Gehirn, Leber und Lunge). ACY1 und ACY3 zeigten die höchste mRNA-Expression in der Niere im Vergleich zu Gehirn, Leber und Lunge. Northern-BlotAnalysen wiesen ebenfalls auf eine hohe ACY1-Expression in der Niere hin (Sass et al., 2006). ASPA wies, verglichen mit Leber und Lunge, in der Niere und in Gehirn das höchste mRNA-Expressionlevel auf. Es ist somit naheliegend, dass ACY1, ASPA sowie ACY3 zur Bioaktivierung von Mercaptursäuren in der Niere beitragen können. Die Beteiligung der ACY1 am Aminosäure-„Salvage“ ist bisher noch umstritten (Lindner, 1999; Pittelkow et al., 1998). Pittlekow et al. postulierten, dass N-terminal blockierte Aminosäuren in der Niere akkumulieren (Pittelkow et al., 1998). Voraussetzung hierfür ist jedoch, dass Nα-acetylierte L-Aminosäuren wirklich physiologische Substrate für ACY1 in der Nierenrinde sind, so dass eine Umsetzung der ACY1 tatsächlich erfolgen kann (Lindner, 1999; Pittelkow et al., 1998). Die ACY1 mRNA-Expressionsraten in Gehirn, Leber und Lunge lagen in ähnlichen Bereichen. Daher könnte die ACY1 im Gehirn eine wichtige Rolle spielen. Sass et al. (2006) zeigten mit Hilfe von Northern-Blot-Analysen eine relativ hohe ACY1-Expression im Gehirn im Vergleich zu Lunge, Placenta, Milz und Gebärmutter (Sass et al., 2006). Es ist jedoch schwer zu sagen, ob eine hohe Expression von hACY1 im Gehirn wirklich in Zusammenhang mit neurodegenarativen Symptomen beim ACY1-Mangel steht. Die ACY1 weist laut Zabel et al. eine veränderte Expression in Mäusen auf, die an der Huntington-Krankheit litten oder des Fragile-X-Syndrom aufwiesen (Zabel et al., 2006). Die Frage nach der Funktion der ACY1 im Gehirn ist noch nicht eindeutig beantwortet. Es sind weitere Untersuchungen nötig um die genannte Hypothese zu bestätigen. Die Funktion der ASPA, NAA spezifisch in Acetat und freies Aspartat zu spalten, hat im Gehirn eine Bedeutung für den Morbus Canavan (Chakraborty et al., 2001; D'Adamo & Yat- 127 Diskussion su, 1966). Die in dieser Arbeit durchgeführte mRNA-Expressionsanalyse zeigte, dass ASPA im Vergleich zu den anderen Organen (Leber und Lunge) die höchste mRNA-Expressionrate in Gehirn und Niere aufwies. Die gemessenen Abweichungen in der ASPA mRNAExpression in Leber und Lunge im Vergleich zu Gehirn und Niere sind jedoch minimal (Kapitel IV Abschnitt 3.8). Welche bedeutende Funktion die ASPA in diesen Organen übernimmt, ist bisher noch nicht geklärt. Die ACY3 zeigt die höchste mRNA-Synthese in der Niere (Kapitel IV Abschnitt 3.8). Informationen zur Funktion der ACY3 in der Niere sind rar. Endo zeigte, dass die ACY3 aus Rattennieren spezifisch Nα-acetylierte aromatische L-Aminosäuren spaltet (Endo, 1978). Jedoch ist die Auswirkung und Bedeutung dieser Funktion bis heute nicht geklärt. Die Ergebnisse der qPCR für ACY3 in Gehirn, Leber und Lunge zeigten ähnliche mRNAExpressionsraten. Möglicherweise ist die hohe Expression der ACY3 im Gehirn nicht unbedeutend. Es wäre interessant zu überprüfen, ob die ACY3, aufgrund ihrer strukturell ähnlichen Eigenschaften zur ASPA auch in der Lage wäre NAA zu spalten. Wäre dies der Fall, könnte die ACY3, bei Verlust der ASPA-Aktivität, die Funktion der Spaltung von NAA in Acetat und L-Aspartat übernehmen. Damit könnte zumindest ein Teil des benötigten Acetats zur Meylinisierung zur Verfügung gestellt werden (Baslow & Guilfoyle, 2009; Moffett et al., 2007). Jedoch sind diese Überlegungen bisher nur rein hypothetisch (Baslow & Guilfoyle, 2009). 128 Zusammenfassung ACY1 und ASPA sind Schlüsselenzyme für die Stoffwechselstörungen ACY1-Mangel (Engelke et al., 2008; Sass et al., 2006; Sass et al., 2007; Sommer et al., 2011; TylkiSzymanska et al., 2010; Van Coster et al., 2005) und Morbus Canavan (Beaudet, 2001; Kaul et al., 1994; Moffett et al., 2007). Beides sind autosomal rezessiv vererbte Stoffwechseldefekte, die durch Mutationen im ACY1- bzw. ASPA-Gen ausgelöst werden (Beaudet, 2001; Engelke et al., 2008; Sass et al., 2006; Sass et al., 2007; Sommer et al., 2011; Tylki-Szymanska et al., 2010; Van Coster et al., 2005). Das Ziel der Arbeit war es, das Wissen zu grundlegenden Fragen hinsichtlich molekularer und biochemischer Zusammenhänge der Stoffwechseldefekte ACY1-Mangel und Morbus Canavan zu erweitern. Im Rahmen der Konfirmationsdiagnostik wurden Patienten, die von den genannten Stoffwechselstörungen betroffen waren, untersucht. Hierfür wurden die Gene ACY1 sowie ASPA von Patienten mit einem Verdacht auf einen ACY1-Mangel bzw. auf einen Morbus Canavan sequenziert. Dadurch wurden fünf bislang unbekannte Mutationen (p.Val159Met, p.61ThrfsX348, p.Arg378Trp, p.Arg378Gln und p.Arg393Cys) im ACY1-Gen detektiert. Die ACY1-Aktivitätstests in Lymphozyten- und Fibroblastenzellhomogenaten von Patienten bestätigten durch Aktivitätsverluste den Verdacht auf einen ACY1-Mangel. Die Ergebnisse des photometrischen ACY1-Enzymaktivitätsassays waren vergleichbar mit den Daten, die mittels Tandem-Massenspektrometrie erhalten wurden. Patienten, mit Verdacht auf einen Morbus Canavan, wiesen mindestens eine Mutation im ASPA-Gen auf. Für sechs ausgewählte Patienten wurde zudem eine MLPA-Untersuchung zur Detektion heterozygoter Duplikationen bzw. Deletionen durchgeführt. Die Ergebnisse der MLPA-Studien lieferten keine eindeutigen Resultate. Die Überprüfung der ASPA-Aktivität in Fibroblastenzellhomogenaten von Patienten mit einer Modifikation des Assays von Matalon et al. (1988) zeigte eine verminderte ASPA-Enzymaktivität. Dieser Aktivitätsassay ließ sich jedoch nicht auf Lymphozytenzellhomogenate von Patienten mit einem Morbus Canavan übertragen. Ein neu entwickelter Assay, bei dem NTFA als Substrat für die ASPA eingesetzt wurde, zeigte hingegen vielversprechende Ergebnisse (Sexauer, 2012; Sexauer et al., 2012). Damit wäre die ASPA-Aktivitätsbestimmung in Lymphozytenhomogenaten von Patienten mit einem Morbus Canavan auch zur Diagnose einsetzbar und weniger invasiv, da für die bislang benötigte Fibroblastenkultur eine Hautstanze des Patienten entommen werden muss. 129 Zusammenfassung Die bei Patienten detektierten Mutationen im ACY1- und ASPA-Gen dienten als Basis für die Durchführung von Expressionsstudien. Hierfür wurden diese Mutationen mittels zielgerichteter Mutagenese in die Gene der ACY1 sowie der ASPA eingefügt. Die anschließende Proteinexpression fand nach Transfektion der HEK293-Zellen statt. Durch die Expression der menschlichen Gene in einem humanen Zellsystem sollten korrekte postranslationale Modifikationen, einschließlich Glykosylierungen, sichergestellt werden. Es gelang die ACY1, die ASPA und die ACY3 mit der Referenzsequenz in diesem Zellmodell zu exprimieren. Die ACY1 mit der Referenzsequenz konnte auch in Baculovirus-infizierten Sf9-Insektenzellen überexprimiert werden. Jedoch wies die Enzymaktivität dieser ACY1 im Gegensatz zu überexprimierter ACY1 in HEK293-Zellen (34-facher Anstieg der Aktivität) nur einen etwa 4-fachen Anstieg auf. Zusätzlich wurden verschiedene Enzymvarianten der ACY1 und ASPA im HEK293-Zellsystem exprimiert. Das Einfügen von Mutationen in das ACY1-Gen hatte für die Enzymvarianten ACY1 Val159Met, ACY1 61ThrfsX348, ACY1 Arg197Trp, ACY1 Glu233Asp, ACY1 Arg353Cys, ACY1 369ProfsX46 sowie ACY1 Arg386Cys einen Aktivitätsverlust zur Folge. Die WesternBlot-Analyse zeigte für diese Varianten keine immunoreaktiven Proteinbanden. Diese Mutationen liegen in funktionell wichtigen strukturellen Domänen der ACY1. Durch eine Veränderung der Aminosäurenabfolge ist in den meisten Fällen mit einer falschen Proteinfaltung zu rechnen, welche einen frühzeitigen Abbau der entsprechenden Proteinvariante zur Folge haben kann. Für vier ACY1-Mutanten (ACY1 Arg378Trp, ACY1 Arg378Gln, ACY1 Arg393His und ACY1 Arg393Cys) war kein ACY1-Aktivitätverlust zu verzeichnen. Die Aminosäurenaustausche hatten weder einen Einfluss auf die Enzymaktivität, noch auch auf die Proteinexpression. Für diese Varianten konnte im Western Blot eine Proteinbande bei ca. 46 kDa detektiert werden. Das entspricht der Größe eines Monomers des homodimeren ACY1-Proteins. Alle untersuchten ASPA-Mutanten (ASPA Arg168His, ASPA Pro181Thr, ASPA Tyr288Cys, ASPA Pher295Ser sowie ASPA Ala305Glu) wiesen einen Aktivitätsverlust auf. Einzig für die ASPA-Variante ASPA Phe295Ser konnte keine mRNA-Expression detektiert werden. Alle übrigen überexprimierten ASPA-Mutanten zeigten eine erhöhte mRNAExpression. Die Erkenntnisse der im Rahmen dieser Arbeit durchgeführten Expressionsstudien können weitere Informationen zur pathogenetischen Bedeutung der untersuchten Mutationen für Patienten mit einem Morbus Canavan liefern. Sie verhelfen damit zum besseren Verständnis der molekularen Ereignisse innerhalb der ASPA-Proteinsynthese. Dies ist eine wichtige Basis zur weiteren Charakterisierung des Morbus Canavans. 130 Zusammenfassung Es gelang erstmals, die humane ACY3 (hACY3) mit der Referenzsequenz in HEK293 Zellen zu überexprimieren und einen geeigneten Enzymaktivitätstest für diese zu entwickeln. NαChloroacetyl-L-Tyrosin diente dabei als Substrat. Kinetische Untersuchungen zur hACY3 ergaben einen KM-Wert von etwa 1,0-15,1 mM (Vmax von 14,84-100,0 µmol*(g*min)-1) für dieses Substrat. Um den Kreis der Untersuchungen zu den humanen Enzymen ACY1, ASPA und ACY3 zu schließen, wurde die Genexpression der drei ACY in humanen Organen (Niere, Gehirn, Lunge sowie Leber) mittels qPCR überprüft. Dabei wurden die höchsten Expressionsraten der ACY1 und ACY3 in der Niere detektiert, gefolgt von Gehirn, Leber und Lunge. Die Leber ist im Allgemeinen das Organ, in welchem vor allem detoxifizierende Prozesse katalysiert werden. Ein hohes Expressionsniveau von ACY1 und ACY3 in der Leber stützt den Verdacht, dass sich die beiden Enzyme an Entgiftungsprozessen beteiligen. Die ASPA-mRNA wurde am meisten in der Niere und im Gehirn exprimiert. Sämtliche ACY leisten einen wichtigen Beitrag zur Bioaktivierung von Mercaptursäuren in der Niere. Somit ist die hohe Expression der ACY in der Niere nicht verwunderlich. Die Untersuchungen zur ACY1 und ASPA im Rahmen dieser Arbeit tragen zu einem besseren Verständnis der molekularen Merkmale der angeborenen Stoffwechseldefekte ACY1Mangel und Morbus Canavan bei. Basierend auch dieser Arbeit ist der Beweis der Kausalität von Mutationen im ACY1- bzw. ASPA-Gen für einen ACY1-Mangel oder einen Morbus Canavan möglich, um auf diese Weise die funktionellen Konsequenzen der Mutationen zu klären. 131 Literatur Aigner, A., Wolf, S., & Gassen, H. G. (1997). 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Für die Unterstützung bei den experimentellen Arbeiten danke ich Daniel Sexauer, Michel Schmidt, Julia Drieß und Miriam Schrempp. Herrn Dr. Hansjörg Pendl des Instituts für Humangenetik im Universitätsklinikum Kiel gilt der Dank für die Bereitstellung von Probenmaterial für die MLPA-Untersuchungen. Außerdem bedanke ich mich für die finanzielle Unterstützung meiner Promotion bei der Jürgen Manchot Stiftung, der Arbeitsgemeinschaft für Pädiatrische Stoffwechselstörungen, der B. Braun-Stiftung sowie bei der FAZIT-Stiftung. Nicht zuletzt möchte ich mich besonders herzlich bei meinen Eltern, meiner Schwester Grit und bei Felix für deren Geduld, Verständnis und außerordentliche Hilfsbereitschaft bedanken. 149 Anhang 150 Anhang Anhang Tab.4-11: Messwerttabelle der Expressionsstudien zu verschiedenen ACY1-Enzymvarianten im HEK293Zellmodell. Dargestellt sind spezifische Enzymaktivität im ACY1-Enzymaktivitätstest [µmol*(g*min)-1] und deren Standardabweichung (Stabw) (3 bis 10 unabhängige Experimente je Enzymvariante bzw. Messung mit dem Leervektor pcDNA3.1+ transfizierte HEK293-Zellhomogenate und nicht transfizierte HEK293-Zellen [HEK293-]). Mittelwert spezifischer ACY1Enzymaktivitäten [µmol*(g*min)-1] Stabw Anzahl unabhängiger Experimente [n] HEK293- 0,12 0,12 3 pcDNA3.1+-Leervektor 0,47 0,27 10 ACY1 WT 16,48 9,90 10 ACY1_Val159Met 1,90 0,27 4 ACY1_61ThrfsX348 0,53 0,23 3 ACY1_Arg197Trp 0,16 0,14 3 ACY1_Glu233Asp 0,54 0,39 4 ACY1_Arg353Cys 0,73 0,25 6 Gemessene Probe/ Enzymvariante ACY1_Arg378Trp 14,99 5,01 4 ACY1 Arg378Gln 42,48 12,902 5 ACY1_369ProfsX46 0,23 0,23 4 ACY1_Arg386Cys 0,88 0,195 4 ACY1_Arg393His 27,46 5,26 4 ACY1_Arg393Cys 16,77 6,90 3 Tab. 4-12: Messwerte spezifischer ACY1-Aktivitäten in nicht infizierten Sf9-Zellen, in Zellen, die das ACY1Referenzenzym oder die ACY1_Arg353Cys-Enzymvariante überexprimierten. Zellhomogenat Spezifische ACY1-Enzymaktivität [µmol * (g*min)-1] Sf9- 3,055 Sf9-ACY1 WT 11,370 Sf9-ACY1_ Arg353Cys 3,792 151 Anhang Tab. 4-13: Messwerttabelle der Expressionsstudien zu verschiedenen ASPA-Enzymvarianten im HEK293Zellmodell. Dargestellt sind spezifische Enzymaktivität im APSA-Enzymaktivitätsassay [µmol*(g*min)-1] und deren Standardabweichung (Stabw) (3 bis 5 unabhängige Experimente je Enzymvariante bzw. Messung mit dem Leervektor pcDNA3.1+ transfizierte HEK293-Zellhomogenate). Mittelwert spezifischer ASPAEnzymaktivitäten [µmol*(g*min)-1] Stabw Anzahl unabhängiger Experimente [n] pcDNA3.1+-Leervektor 11,30 7,70 5 ASPA WT 81,98 37,09 5 ASPA_Arg168His 4,85 5,77 5 ASPA_Pro181Thr 5,41 2,66 5 ASPA_Phe295Ser 12,10 9,73 5 Gemessene Probe/ Enzymvariante ASPA_Ala305Glu 7,50 9,32 5 ASPA_Tyr288Cys 10,50 6,13 3 Tab. 4-16: Messwerte der Bestimmung der spezifischen ACY1-Enzymaktivitäten durch photometrischen Test und Tandem Massenspektrometrie überexprimierter ACY1-Enzymvarianten, überexprimierte ACY1-mit der Referenzsequenz und der Negativkontrolle pcDNA3.1/+-Leervektor. Gemessene Probe/ Enzymvariante spezifische ACY1Enzymaktivitäten [µmol*(g*min)-1] Photometrischer Test spezifische ACY1Enzymaktivitäten [µmol*(g*min)-1] Tandem-Massenspektrometrie pcDNA3.1+-Leervektor 0,89 1,44 ACY1 WT 13,63 17,91 ACY1_Val159Met 1,95 3,36 ACY1_61ThrfsX348 0,54 nicht quantifiziert ACY1_Glu233Asp 1,11 nicht quantifiziert ACY1_Arg353Cys 0,84 1,43 ACY1_Arg378Gln 0,55 1,24 ACY1_369ProfsX46 1,05 1,28 ACY1_Arg386Cys 27,39 26,83 ACY1_Arg393His 35,26 30,66 ACY1_Arg393Cys 24,73 17,65 152 Anhang Tab. 4-17: Messwerte der Bestimmung der spezifischen ASPA-Enzymaktivitäten durch photometrischen Test und Tandem-Massenspektrometrie überexprimierter ASPA-Enzymvarianten, überexprimiertes ASPA mit der Referenzsequenz und der Negativkontrolle pcDNA3.1/+-Leervektor.) Gemessene Probe/ Enzymvariante spezifische ASPAEnzymaktivitäten [µmol*(g*min)-1] Photometrischer Test spezifische ASPA-Enzymaktivitäten [µmol*(g*min)-1] Tandem-Massenspektrometrie pcDNA3.1+-Leervektor 9,51 32,73 ASPA WT 46,52 76,22 ASPA_Arg168His 48,34 34,74 ASPA_Pro181Thr 84,82 53,31 ASPA_Tyr288Cys 55,51 45,03 ASPA_Phe295Ser 51,53 70,32 ASPA_Ala305Glu 31,03 15,91 Tab. 4-18: Messwerttabelle der Komplementationsstudien von ACY1-Enzymvarianten mit ASPAReferenzenzym (ASPA WT). Dargestellt sind spezifische Enzymaktivität im ACY1-Enzymaktivitätstest [µmol*(g*min)-1] und deren Standardabweichung (Stabw) (3-9 Versuche je Enzymvariante bzw. Messung der mit dem Leervektor pcDNA3.1+ transfizierten HEK293-Zellhomogenate). Gemessene Probe/ Enzymvariante Mittelwerte spezifischer ACY1-Enzymaktivitäten [µmol*(g*min)-1] Stabw Anzahl unabhängiger Experimente [n] pcDNA3.1+-Leervektor 0,43 0,28 9 ACY1 WT 20,41 15,71 9 ASPA WT 0,41 0,09 4 ACY1_Val159Met_ASPA WT 1,36 0,77 3 ACY1_61ThrfsX348_ASPA WT 0,53 0,35 3 ACY1_Arg197Trp_ASPA WT 0,41 0,19 3 ACY1_Glu233Asp_ASPA WT 0,54 0,50 3 ACY1_Arg353Cys_ASPA WT 0,86 0,37 3 ACY1_369ProfsX46_ASPA WT 1,09 0,34 3 ACY1_Arg378Trp_ASPA WT 4,68 2,25 3 ACY1_Arg378Gln_ASPA WT 27,84 7,30 3 ACY1_Arg386Cys_ASPA WT 0,98 0,26 3 ACY1_Arg393His_ASPA WT 10,19 0,12 3 ACY1_Arg393Cys_ASPA WT 3,22 0,29 3 153 Anhang Tab. 4-19: Messwerttabelle der Komplementationsstudien von ASPA-Enzymvarianten mit ACY1Referenzenzym (ACY1 WT). Dargestellt sind spezifische Enzymaktivität im ASPA-Enzymaktivitätstest [µmol*(g*min)-1] und deren Standardabweichung (Stabw) (7 unabhängige Experimente je Expressionsvariante Mittelwert spezifischer ASPAEnzymaktivitäten [µmol*(g*min)-1] Gemessene Probe/ Enzymvariante Stabw Anzahl unabhängiger Experimente [n] pcDNA3.1+-Leervektor 14,84 12,40 7 ASPA WT 77,11 50,02 7 ACY1 WT 16,83 11,86 7 ASPA_Arg168His_ACY1 WT 20,80 13,57 7 ASPA_Pro181Thr__ACY1 WT 29,84 29,80 7 ASPA_Tyr288Cys_ACY1 WT 37,54 18,19 7 ASPA_Phe295Ser__ACY1 WT 29,23 21,54 7 ASPA_Ala305Glu__ACY1 WT 16,09 15,03 7 Tab. 4-20: Primer-Sequenzen für die ACY1-Mutationsanalyse. Primername Sequenz Ex1_neu_ACY1_F CACTGACGGTCTTCGGTCTC ACY1_Ex1_R AGCCCCAGTCCCTCTATCC ACY1_Ex2_F CACGGTATCCTACCCCTGTG ACY1_Ex2_R TACTTGGGGAATGGCTGGAG ACY1_Ex3+4_F CTGGGTATGCTCCACTCTCC ACY1_Ex3+4_R GGACCATGAGCAACTTGAGG ACY1_Ex5_F ACCACTCCACCTGTCACTCC ACY1_Ex5_R TCCTTGGCCTTGAGTTTCTC ACY1_Ex6-8_F GGGTAAAGTCCAGGACACAGG ACY1_Ex6-8_R CTCAACTTTGCTGTGCAACC ACY1_Ex9+10_F AGAGGAGCCTGGAATGAGG ACY1_Ex9+10_R GCGGCAGCAACAGATAAAAG ACY1_Ex11+12_F GGCGGTACCACAGAGGATAG ACY1_Ex11+12_R AATGCCCAGACATATGCAGAC ACY1_Ex13+14_F TGTACTAGGCACAGCCCACTC ACY1_Ex13+14_R AAGAGCCGTTAGGGAAAAGC ACY1_Ex15_F ATATAGTGCCTGGGCAGTGG ACY1_Ex15_R GGCTGGATGGTACTGAATGG 154 Anhang Tab. 4-21: Primer-Sequenzen für die ASPA-Mutationsanalyse. Primername Sequenz ASPA_Ex1_F TGCCCTTTGGGTAAAGTCTC ASPA_Ex1_R CACACACCTACCACTTTTCACAC ASPA_Ex2_F AAAGATTTGGCGACTGGTTC ASPA_Ex2_R CCATTTCTCTTGCACCTTCC ASPA_Ex3_F GCAAAGAGAACAAAACATACGG ASPA_Ex3_R2 ATCACCTGAGGTCAGGAGTTTG ASPA_Ex4_F2 CTCCCGTCACAGCTAAATGTT ASPA_Ex4_R CTCCCGTCACAGCTAAATGTT ASPA_Ex5_F3 CTCAGGTGATCCACCCAACT ASPA_Ex5_R3 GCCAGCACAGGTTACACTGA ASPA_Ex6_F ATCTCAATGCCTCGCTCAAG ASPA_Ex6_R CCGTGTAAGATCTAAGCTGGAAG ASPA_in_ex1_F TGTGAAAGCCTCACTGGATG ASPA_in_ex1_R GCGATTCAGGTCACAGTCAA ASPA_in_ex6_F TCAATGCCTCGCTCAAGTATC ASPA_in_ex6_R AAGAATGTTGAGCTACCCAAGT Tab. 4-22: Primer-Sequenzen für die ACY3-Mutationsanalyse. Primername Sequenz ACY3_Ex1_f CTTTCTTCCCTGAAGGAGCA ACY3_Ex1_r TTAGTTAACACCCGCCAAGC ACY3_Ex2_f CAGGAGCAGTGGAGCAGAC ACY3_Ex2_r GCCCAACTGTTCAGGAAGAT ACY3_Ex3_f CAGCTGTCCACACCTCTTGCA ACY3_Ex3_r TGAACCAACTTGCAGTCAGG ACY3_Ex4_f ACACAGCCACAACGTCTGAA ACY3_Ex4_r ACTGAGGTGGGAAGGTGTTG ACY3_Ex5,6,7_f CAACACCTTCCCACCTCAGT ACY3_Ex5,6,7_r CACTGTGGCCTCTTGTGCTA ACY3_Ex8_f CCCAAGGTGACCTGTGTCTT ACY3_Ex8_r TCCCACACTCTGGAATCCTC 155 Anhang Tab. 4-23: Primer-Sequenzen zum Einfügen von Mutationen in das ACY1-Gen (zielgerichtete Mutagenese). Primername Sequenz ACY1_G475A_F GGCATGGAGCTGTTCATGCAGCGGCCTGAGTTC ACY1_G475A_R GAACTCAGGCCGCTGCACGAACAGCTCCATGCC ACY1_DEL181_F CTGGCTATGTGGTGCCGTGTTGACCTGG ACY1_DEL181_R CCAGGTCAACACGGCACCACATAGCCAG ACY1_c589t_F TCCCTGGTGGGTGTGGGTTACCAGCAC ACY1_c589t_R AGGGACCACCCACACCCAATGGTCGTG ACY1_a699c_F TGGCATTCCGGGAGAAGGACTGGCAGAGGC ACY1_a699c_R ACCGTAAGGCCCTCTTCCTGACCGTCTCCG ACY1_C-T_1057_F ACCGCTATATCTGCGCGGTGGGGGTCCCAGCTCTAG ACY1_C-T_1057_R CCCACCGCGCAGATATAGCGGGTTGTCAGTGGCAGCAG ACY1_ins_2nt_1105_F CATGAACCGCACACACCTGTGCTGCTGCAC ACY1_ins_2nt_1105_R GTACTTGGCGTGTGTGGACACGACGACGTG ACY_C1132T_F CTGCACGACCACGATGAATGGCTGCATGAG ACY_C1132T_R CTCATGCAGCCATTCATCGTGGTCGTGCAG ACY1_g1133a_F CGACCACGATGAACAGCTGCATGAGGCTG ACY1_g1133a_R CAGCCTCATGCAGCTGTTCATCGTGGTCG ACY1_c1156t_F GAGGCTGTGTTCCTCTGTGGGGTGGACATAT ACY1_c1156t_R CTCCGACACAAGGAGACACCCCACCTGTATA ACY1_C1177T_F CGTGGGGTGGACATATATACATGCCTGCTGCCT ACY1_C1177T_R AGGCAGCAGGCATGTATATATGTCCACCCCACG ACY1_g1178a_F GGTGGACATATATACACACCTGCTGCCTGCCC ACY1_g1178a_R CCACCTGTATATATGTGTGGACGACGGACGGG Tab. 4-24: Primer-Sequenzen zum Einfügen von Mutationen in das ASPA-Gen (zielgerichtete Mutagenese). Primername Sequenz ASPA_g503a_F TCAAATATGCGACCACTCATTCCATAGCCAAGTATCC ASPA_g503a_R GGATACTTGGCTATGGAATGAGTGGTCGCATATTTGA ASPA_c541a_F GGGTATAGAAGTTGGTACTCAGCCTCAAGGGGT ASPA_c541a_R ACCCCTTGAGGCTGAGTACCAACTTCTATACCC ASPA_a863g_F GTTTGTGAATGAGGCCGCATGTTACGAAAAGAAAGAAGCTT ASPA_a863g_R CAAACACTTACTCCGGCGTACAATGCTTTTCTTTCTTCGAA ASPA_t884c_F CGCATATTACGAAAAGAAAGAAGCTTCTGCAAAGACAACTAAACTAAC ASPA_t884c_R GTTAGTTTAGTTGTCTTTGCAGAAGCTTCTTTCTTTTCGTAATATGCG ASPA_c914a_F GACAACTAAACTAACGCTCAATGAAAAAAGTATTCGCTGCTGTTTAC ASPA_c914a_R GTAAACAGCAGCGAATACTTTTTTCATTGAGCGTTAGTTTAGTTGTC 156 Anhang Tab. 4-25: Primer-Sequenzen für die qPCR. Primername Sequenz GAPDH qPCR_F GCCTTCCGTGTCCCCACTGC GAPDH qPCR_R CAATGCCAGCCCCAGCGTCA hRNA18S_F CGGGGCCCGAAGCGTTTACT hRNA18S_R GCGGCGCAATACGAATGCCC ACY1_qPCR_F GCCACCGGTTCCCCAGAACC ACY1_qPCR_R GCTGGTAACCCGCACCCACC APSA_qPCR_F TCCTCCCTGCGCCATTGAGGT ASPA_qPCR_R TCCGCCCAGTGGGATCGTCT ACY3_qPCR_F AATTCCAGGCCCACCCCGGA ACY3_qPCR_R CAGATGGCGGCACAGGTGCA Tab. 4-26: Primer-Sequenzen zur Überprüfung der Kolonie-PCR. Primername Sequenz pCDNA3.1+_F CGGTGGGAGGTCTATATAAGCA pCDNA3.1+_R TTAGGAAAGGACAGTGGGAGTG Tab. 4-27.: Drei- und Einbuchstabencode der Aminosäuren. Aminosäuren Dreibuchstabencode Einbuchstabencode Alanin Arginin Asparagin Asparaginsäure Cystein Glutamin Glutaminsäure Glycin Histidin Isoleucin Leucin Lysin Methionin Phenylalanin Prolin Serin Threonin Tryptophan Tyrosin Valin Ala Arg Asn Asp Cys Gln Glu Gly His Ile Leu Lys Met Phe Pro Ser Thr Trp Tyr Val A R N D C Q E G H I L K M F P S T W Y V 157 158 CURRICULUM VITAE Dipl. -Biochem. Anke Sommer Persönliche Daten Adresse Erligtweg 7B 04654 Frohburg Tel.: +49 176 80137412 E-Mail: [email protected] Geburtsdatum 26.09.1983 Geburtsort Borna Staatsangehörigkeit Deutsch Familienstand ledig Akademische Ausbildung Seit Dezember 2008 Promotion am Zentrum für Kinder- und Jugendmedizin des Universitätsklinikums Freiburg Titel der Dissertation: „Expressionsanalysen von Aminoacylasen – Untersuchungen zu Pathomechanismen angeborener Stoffwechselstörungen“ Oktober 2005 – bis Oktober 2008 Hauptstudium Biochemie Diplom an der Universität Leipzig Spezialisierung: Molekulare Medizin Diplomarbeit: „Erstellung und Screening einer Spezifitätsbank für das Enzym PQQ abhängige Glucose-Dehydrogenase“ Abschluss: Diplom-Biochemikerin 159 August 2007 – November 2007 Praktikum am Institut “Life Science”, University of Arizona, USA “Selektionsstudien zum Hautpigmentgen SLC24A5 in Europäern” März 2007 – Juli 2007 Projektarbeit am Institut für klinische Immunologie und Medizin, Universität Leipzig „Genexpression von Micro RNA in verschiedenen Krebszelllinien” August 2006 – September 2006 Praktikum bei der Firma GlaxoSmithKline, Dresden, Germany „Vergleich der SDS-PAGE mit dem automatisierten Elektrophoresesystem Experion® (Biorad) zur Informationsgewinnung über verschiedene Proteinstrukturen unterschiedlicher Influenza Viren“ Oktober 2003 – September 2005 Grundstudium Biochemie Diplom an der Martin Luther Universität Halle, Deutschland August 2000 – Juli 2001 Travelers Rest High School, South Carolina, USA September 1995 – Juni 2003 Conrad Felixmüller Gymnasium Geithain Abitur Berufserfahrung September 2006 – April 2007 Studentische Hilfskraft bei der Firma Applied Biosystems, Applera Germany GmbH Januar 2007 – August 2007 Studentische Hilfskraft am Max Planck Institut für Evolutionäre Anthropologie Leipzig, Deutschland Förderungen /Auszeichnung Mai 2011 Poster Award XIIth International Congress of Paediatric Laboratory Medicine “Best Poster submitted by a trainee” 160 Dezember 2008 – Dezember 2010 Promotionsstipendium der Jürgen Manchot Stiftung August 2010 Reisekostenstipendium der FAZIT-Stiftung Sprachkenntnisse Deutsch Muttersprache Englisch fließend in Wort und Schrift Französisch Grundkenntnisse Zusatzqualifikationen Prüfarzt-Kurs Zertifikat zur Prüfärztin Sprach-Kurs „FCE-First Certificate in English“, Cambridge University Computer Datenverarbeitung, statistische Auswertung (Microsoft Office, INSTAT) Illustration and grafisches Design wissenschaftlicher Zusammenhänge Bioinformatik PubMed, Ensemble, Primer3, OLIGO Primer Analysis Software, BioEdit, CodonCode Aligner, Sequencher, DNASTAR, ImageJ Akademische Lehre Sommersemester 2009 „Blockpraktikum-Labor Klinische Biochemie und Stoffwechsel“ Medizinische Fakultät, Universität Freiburg 161 Anke Sommer ____________________________ Name des Promovenden Erklärung an Eides Statt gemäß § 8 (1) 8. und 9. der Promotionsordnung I. Ich erkläre hiermit, daß ich die vorliegende Arbeit ohne unzulässige Hilfe Dritter und ohne Benutzung anderer als der angegebenen Hilfsmittel angefertigt habe. Die aus anderen Quellen direkt oder indirekt übernommenen Daten und Konzepte sind unter Angabe der Quelle gekennzeichnet. Insbesondere habe ich hierfür nicht die entgeltliche Hilfe von Vermittlungs- bzw. Beratungsdiensten (Promotionsberater oder anderer Personen) in Anspruch genommen. Niemand hat von mir unmittelbar oder mittelbar geldwerte Leistungen für Arbeiten erhalten, die im Zusammenhang mit dem Inhalt der vorgelegten Dissertation stehen. Die Arbeit wurde bisher weder im In- noch im Ausland in gleicher oder ähnlicher Form einer anderen Prüfungsbehörde vorgelegt. II. Die Bestimmungen der Promotionsordnung der Fakultät für Chemie, Pharmazie und Geowissenschaften sind mir bekannt. Insbesondere weiß ich, daß ich vor Aushändigung der Promotionsurkunde zur Führung des Doktortitels nicht berechtigt bin. Freiburg im Breisgau, 7. Mai 2012 _______________________________ Ort, Datum ____________________________ Unterschrift
