ZIP
Werbung
Aus dem Pathologischen Institut der Albert-Ludwigs-Universität Freiburg i. Br. Charakterisierung von malignen Tumorzelllinien der Maus hinsichtlich Proliferations- und Apoptoseverhalten sowie der Produktion Apoptose-induzierender Faktoren INAUGURAL-DISSERTATION zur Erlangung des Medizinischen Doktorgrades der Medizinischen Fakultät der Albert-Ludwigs-Universität Freiburg i. Br. vorgelegt 2011 von Kristin Simon geboren in Stuttgart ________________________________________________________________ Dekan Prof. Dr. Dr. h.c. mult. Hubert E. Blum 1. Gutachter Prof. Dr. Dr. h.c. Nikolaus Freudenberg 2. Gutachter Prof. Dr. Axel Göppinger Jahr der Promotion 2013 ___________________________________________________________________________ Für meine Eltern Inhaltsverzeichnis Inhaltsverzeichnis Abkürzungsverzeichnis ___________________________________________________ I 1 Einleitung _____________________________________________________________ 1 1.1 Zellproliferation _____________________________________________________ 1.1.1 Zellzyklus _________________________________________________________ 1.1.1.1 Phasen des Zellzyklus ____________________________________________ 1.1.1.2 Regulation des Zellzyklus _________________________________________ 1.1.2 Zellwachstum in vitro _______________________________________________ 1.1.2.1 Wachstumsverlauf in vitro ________________________________________ 1.2 Zelltod ____________________________________________________________ 1.2.1 Apoptose _________________________________________________________ 1.2.2 Gegenüberstellung von Apoptose und Onkose ____________________________ 1.2.3 Phasen und Signalwege der Apoptose __________________________________ 1.2.3.1 Extrinsischer Signalweg der Apoptose ______________________________ 1.2.3.2 Intrinsischer Signalweg der Apoptose_______________________________ 1.2.4 Schlüsselmoleküle der Apoptose ______________________________________ 1.2.4.1 Caspasen _____________________________________________________ 1.2.4.2 Bcl-2-Proteinfamilie ____________________________________________ 1.2.4.3 CD95/CD95L bzw. Fas/FasL-System _______________________________ 1.2.4.4 TRAIL-System ________________________________________________ 11 11 12 13 14 14 16 16 16 17 17 1.3 Tumorpathologie ____________________________________________________ 1.3.1 Tumorentstehung ___________________________________________________ 1.3.1.1 Tumorentstehung als Mehrstufenprozess ____________________________ 1.3.1.2 Molekulare Kanzerogenese _______________________________________ 1.3.1.3 Eigenschaften von Tumoren und Tumorzellen ________________________ 1.3.2 Tumorimmunologie _________________________________________________ 1.3.2.1 Phasen des „Immunoediting“ _____________________________________ 18 18 18 20 23 25 27 1.4 1 1 1 4 6 9 Fragestellung _______________________________________________________ 31 Inhaltsverzeichnis 2 Material und Methoden__________________________________________ 32 2.1 Kultivierung von Zellen ______________________________________________ 32 2.2 Einfrieren und Auftauen von Zellen ____________________________________ 35 2.3 Bestimmung von Zellzahl und Vitalität _________________________________ 35 2.4 Animpfen besonderer Zellträger _______________________________________ 37 2.5 Wachstumskurven und Populationsverdopplungszeit _____________________ 39 2.6 Gewinnung von Tumorzellüberständen _________________________________ 42 2.7 Hämatoxylin-Eosin-Färbung __________________________________________ 42 2.8 Probenvorbereitung für Western Blot __________________________________ 43 2.9 SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese (PAGE) __________________________ 44 2.10 Western Blot _______________________________________________________ 45 2.11 Immunzytochemie ___________________________________________________ 46 2.12 RNA-Extraktion aus Zellen (Guanin-Isothiocyanat-Phenol-Methode) ________ 52 2.13 Reverse Transkription _______________________________________________ 53 2.14 Polymerase-Ketten-Reaktion (PCR; polymerase chain reaction) _____________ 54 2.15 Agarose-Gelektrophorese _____________________________________________ 56 2.16 TNF-α Bio-Assay ____________________________________________________ 56 2.17 Fas Ligand-ELISA __________________________________________________ 57 2.18 TRAIL-ELISA ______________________________________________________ 58 2.19 Aufstellung der verwendeten Materialien________________________________ 59 3 Ergebnisse _________________________________________________________ 71 3.1 Proliferationsverhalten _______________________________________________ 3.1.1 L929 Fibroblasten __________________________________________________ 3.1.2 Malignes Melanom _________________________________________________ 3.1.3 Tramp Prostatakarzinom _____________________________________________ 3.1.4 Meth-A Fibrosarkom ________________________________________________ 3.1.5 EL-4 Lymphom ____________________________________________________ 3.1.6 Gegenüberstellung der Ergebnisse 3.1.1 bis 3.1.5 _________________________ 71 71 76 81 85 89 94 Inhaltsverzeichnis 3.2 Apoptoseverhalten ___________________________________________________ 98 3.2.1 Qualitativer Nachweis von Bax- und Bcl-2-Protein (Western Blot)____________ 98 3.2.2 Quantitativer Nachweis von Bax- und Bcl-2-Protein (Immunzytochemie) ______ 99 3.2.2.1 Morphologie __________________________________________________ 99 3.2.2.2 L929 Fibroblasten _____________________________________________ 100 3.2.2.3 Malignes Melanom ____________________________________________ 101 3.2.2.4 Tramp Prostatakarzinom ________________________________________ 102 3.2.2.5 Meth-A Fibrosarkom ___________________________________________ 104 3.2.2.6 EL-4 Lymphom _______________________________________________ 105 3.2.2.7 Zusammenstellung der Ergebnisse 3.2.2.2-3.2.2.6 ___________________ 106 3.3 Produktion von Apoptoseinduktoren __________________________________ 3.3.1 Expression von Fas Ligand, TNF-α und TRAIL _________________________ 3.3.1.1 CD95L/Fas-Ligand ____________________________________________ 3.3.1.2 TNF-α („tumor necrosis factor-α”) _______________________________ 3.3.1.3 TRAIL („TNF related apoptosis inducing ligand”) ___________________ 3.3.1.4 Zusammenstellung der PCR-Ergebnisse ____________________________ 3.3.2 Proteinnachweis in Tumorzellüberständen ______________________________ 108 108 108 109 110 111 112 4 Diskussion ________________________________________________________ 113 4.1 Proliferationsverhalten ______________________________________________ 113 4.2 Apoptoseverhalten __________________________________________________ 114 4.3 Produktion von Apoptose-induzierenden Faktoren_______________________ 118 5 Zusammenfassung ______________________________________________ 122 6 Literaturverzeichnis ____________________________________________ 123 7 Anhang ____________________________________________________________ 134 7.1 Lebenslauf ________________________________________________________ 134 7.2 Danksagung _______________________________________________________ 135 Abkürzungsverzeichnis Abkürzungsverzeichnis % Prozent °C Grad Celsius A, mA Ampère, Mili-Ampère A. dest. Aqua destillata ABC-Methode Avidin-Biotin-Komplex-Methode APAF-1 apoptosis activating factor-1 APC antigen presenting cell Bcl B cell lymphoma BH3 Bcl-2 homology domain 3 bp Basenpaare BSA bovine serum albumin bzw. beziehungsweise ca. circa CAK CDK-activating kinase Caspase cysteinyl-aspartate-cleaving proteases CD95/4/8/28 cluster of differentiation 95/4/8/28 CDK cyclin-dependent kinase cFLIP cellular FLICE inhibitory protein CKI CDK-inhibitor CLL Chronisch Lymphatische Leukämie CML Chronisch Myeloische Leukämie CO2 Kohlenstoffdioxid d.h. das heißt DAB 3,3‘-Diaminobenzidin DD death domain DISC death inducing signaling complex DMEM Dulbeccos Modified Eagles Medium DMSO Dimethylsulfoxid DNA desoxyribonucleic acid dNTPs Desoxyribonucleosidtriphosphate I Abkürzungsverzeichnis DR death receptor dt. deutsch EDTA Ethylendiamintetraessigsäure EGF epidermal growth factor ELISA Enzyme-linked Immunosorbent Assay engl. englisch et al. et alii etc. et cetera FADD Fas associated death domain FasL Fas-Ligand FCSi fetal calf serum inactivated FLICE FADD-like interleukin-1 beta-converting enzyme g, mg, µg Gramm, Miligramm, Mikrogramm G1-Phase Gap1-Phase G2-Phase Gap2-Phase GDA Glutardialdehyd griech. griechisch h Stunde H.E.-Färbung Hämatoxylin-Eosin-Färbung HBSS Hanks Balanced Solution HDAC Histon-Deacetylase HEPES 4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid HLA humane leukocyte antigen HRPO horseradish peroxidase IDO Indolamin-2,3-Dioxygenase IFN-γ Interferon-γ IL Interleukin k.o. knockout kDa kilo-Dalton l,ml, µl Liter, Mililiter, Mikroliter lat. lateinisch Log-Phase logarithmische Phase II Abkürzungsverzeichnis m, mm, µm Meter, Milimeter, Mikrometer M, mM, nM Molar, Milimolar, Nanomolar M1 Mortalitätsstadium 1 M2 Mortalitätsstadium 2 MDSC myeloid-derived suppressor cells min. Minute(n) mm2, cm2 Quadratmilimeter, -centimeter MOMP mitochondrial outer membrane permeabilization M-Phase Mitose-Phase mRNA messenger-RNA n Generationszahl n.d. nicht detektierbar NK-Zellen Natürliche Killer-Zellen PCR polymerase chain reaction PD-1 programmed (cell) death-1 PD-L1 programmed (cell) death-ligand 1 Rb-1 Retinoblastomprotein 1 RNA ribonucleic acid ROS reaktive Sauerstoffspezies RPM revolutions per minute SDS Sodiumdodecylsulfat SDS-PAGE SDS-Polyacrylamid-Gelelktrophorese sek. Sekunden S-Phase Synthese-Phase td Populationsverdopplungszeit TEMED Tetramethylethylendiamin tg Generationsverdopplungszeit TGF-β tumor growth factor-β TNF-α tumor necrosis factor-α TRADD TNF alpha receptor 1 associated death domain TRAIL TNF-related apoptosis inducing ligand tx Funktionswert zum Zeitpunkt x III Abkürzungsverzeichnis U Unit u. a. unter anderem usw. und so weiter UV-Licht ultraviolettes Licht v Teilungsrate V Volt VEGF vascular endothelial growth factor α Wachstumsfaktor pro 24h μ exponentielle Wachstumsrate IV V VI 1 Einleitung 1 Einleitung 1.1 Zellproliferation Die Fähigkeit, sich zu vermehren stellt eine elementare Eigenschaft lebender Zellen dar. Sie erfolgt durch Zellteilung und ist Höhepunkt eines komplex gesteuerten Zellzyklus, der sich aus Phasen mit präzise festgelegten Funktionen zusammensetzt. Dadurch wird das Wachstum eines vielzelligen Organismus, die Gewebeerneuerung sowie der Gewebeersatz nach Zellschädigung oder programmierten Zelltod („Apoptose“) ermöglicht (Wolf 2008). 1.1.1 Zellzyklus Der Begriff „Zellzyklus“ bezeichnet den geregelten Ablauf von Ereignissen in eukaryontischen Zellen zwischen den einzelnen Zellteilungen mit dem Ziel, die genetische Information der Zelle identisch zu verdoppeln und auf zwei gleich große Tochterzellen zu verteilen (Netzker 2006a). Die Kenntnis des Zellzyklus gibt zum einen Aufschluss über wichtige zellbiologische Grundlagen einer Zelllinie. Zum anderen trägt das Wissen über Regulationsmechanismen des Zellzyklus zum Verständnis der Krebsentstehung bei. 1.1.1.1 Phasen des Zellzyklus Nach der M-Phase (Mitose), in der die Zelle die mitotische Zellteilung vollzieht, tritt die Zelle in die Interphase ein, die aus der G1-Phase (von engl. gap – dt. Lücke), der S-Phase (Synthese) und der G2-Phase besteht (Abbildung 1.1). Die G1-Phase dient dem Zellwachstum und der Synthese von Proteinen, die für die bevorstehende DNA-Replikation benötigt werden. In der S-Phase stehen die Verdopplung des DNA-Gehalts der Zelle, sowie die Synthese von RNA und Proteinen im Vordergrund. In der G2-Phase wird die RNA- und Protein-Synthese fortgesetzt und die Zelle bereitet sich auf die Zellteilung vor. Die M-Phase lässt sich weiter in die Abschnitte Prophase, Prometaphase, Metaphase, Anaphase und Telophase unterteilen (Abbildung 1.1). Das Hauptmerkmal der Prophase ist die Kondensierung des Chromatins, wodurch die Chromosomen als individuelle Strukturen innerhalb der noch intakten Kernmembran sichtbar werden. Der Spindelapparat beginnt sich, ausgehend von den Zentrosomen her auszubilden, die sich an entgegengesetzten Polen der Zelle niederlassen. In der Prometaphase wird die Kernmembran abgebaut und die Spindelfasern an die Kinetochore 1 1 Einleitung der Chromosomen angeheftet. Kennzeichnend für die Metaphase sind maximal verdichtete Chromosomen, die in der Äquatorialebene angeordnet vorliegen. In dieser sogenannten „Metaphasenplatte“ kann man häufig die beiden Chromatiden eines Chromosoms voneinander unterscheiden. Sie werden in der sich anschließenden Anaphase im Bereich ihres Zentromers voneinander getrennt und durch die Spindelfasern zu den entgegengesetzten Zellpolen gezogen. In der Telophase dekondensieren die Chromatiden wieder zu Chromatin, Kernhülle und Nucleoli bilden sich neu aus, und der Spindelapparat wird abgebaut. Anschließend werden Zytoplasma, Zellorganellen, Proteine und Komponenten des Zytoskeletts aufgeteilt und die Zelle wird durch eine Zytoplasmamembran in zwei gleich große Tochterzellen mit identischem DNA-Gehalt geteilt (Zytokinese) (Speicher 2006). Abbildung 1.1: Zellzyklus und Mitose-Phasen (Hirsch-Kauffmann et al. 2009) 2 1 Einleitung Manche Zellen treten im Anschluss an die Mitose wegen Mangel an Wachstumsfaktoren, im Zuge der Kontaktinhibition oder nach Erreichen eines bestimmten Differenzierungsgrades in die G0-Phase ein. Diese Ruhephase kann die Zelle auf einen mitogenen Reiz hin wieder verlassen. Zeitliche Angaben zur Dauer der verschiedenen Zellzyklusphasen sowie zur Gesamtdauer zeigt Tabelle 1.1 für verschiedene Spezies. Tabelle 1.1: Gesamtdauer des Zellzyklus und die Dauer seiner Stadien von verschiedenen Spezies angegeben in Stunden (Schmitz 2009) Spezies/Zelltyp G1-Phase S-Phase G2-Phase M-Phase Gesamtdauer Maus (Mus musculus): Tumorzellen in Kultur 10 9 4 1 24 Mensch (Homo sapiens): rasch proliferierende menschliche Zellen 9 10 4,5 0,5 24 Mensch (Homo sapiens): Tumorzellen in Kultur 8 6 4,5 1 19,5 Bohne (Vicia faba): Meristem der Wurzelspitze 4 9 3,5 2 18,5 Der Vorgang des Zellzyklus ist besonders gut an einzelligen Eukaryonten wie zum Beispiel an Hefezellen untersucht worden. Bei ihnen führt das Durchlaufen des Zellzyklus, ähnlich der Vermehrung von Bakterien, zur exponentiellen Zunahme der Population. Bei Zellen höherer, vielzelliger Organismen ist hingegen ein dauerndes exponentielles Wachstum nicht erwünscht. Um demnach die Zellmasse eines adulten und ausgewachsenen Organismus aufrecht zu erhalten, muss es Mechanismen geben, die eine übermäßige Zellvermehrung begrenzen. In diesem Kontext spielen der programmierte Zelltod („Apoptose“) sowie die Zellzyklusregulation eine entscheidende Rolle (Montenarh 2006). Die Zellzyklusregulation vermag den Zellzyklus auf bestimmte Reize hin zu stimulieren oder ihn vorübergehend oder endgültig anzuhalten. So finden sich im erwachsenen Menschen je nach funktionellem Anspruch Gewebe mit hoher Zellteilungsrate wie Haut- und Knochenmarkszellen (Wechselgewebe), aber auch Zellen, die sich nach ihrer Differenzierung nicht mehr teilen wie beispielsweise Nerven- und Muskelzellen. Desweiteren gibt es Zellen, die zur Wiederaufnahme ihres Zellzyklus stimuliert werden können wie beispielsweise in der G0-Phase verharrende Leberzellen (Montenarh 2006). 3 1 Einleitung 1.1.1.2 Regulation des Zellzyklus Die Zellteilung ist eine besonders kritische Phase im Lebenszyklus einer Zelle und Störungen in der Zellzyklusregulation können zu unkontrolliertem Zellwachstum führen. Der Ablauf des Zellzyklus wird durch ein Kontrollsystem geregelt, das sicherstellt, dass alle Vorgänge während dieses Prozesses zur richtigen Zeit und in der richtigen Reihenfolge stattfinden (Netzker 2006a). Dieses System verfügt über sogenannte „Kontrollpunkte“ (engl. checkpoints), an denen der Fortschritt des Zellzyklus überprüft wird (Abbildung 1.2). Nur an diesen Punkten kann der Zellzyklus unterbrochen und angehalten werden. Der erste und gleichsam wichtigste Kontrollpunkt befindet sich in der späten G1-Phase und wird auch als „Restriktions-Punkt“ (engl. Restriction-Point) bezeichnet. Er entscheidet über den Eintritt der Zelle in die S-Phase, der nur gewährt wird, wenn externe Wachstumsfaktoren zugegen sind und eine ausreichende Zellgröße mit genügend Organellen erreicht wurde. Außerdem müssen Nukleotide und Nährstoffe für die folgende DNA-Synthese zur Verfügung stehen, und es dürfen keine DNA-Schäden vorliegen. Der nächste Kontrollpunkt befindet sich in der G2Phase und dient der Überprüfung der replizierten DNA auf Unversehrtheit und Vollständigkeit. An einem weiteren Kontrollpunkt am Ende der M-Phase wird die korrekte Aufteilung der beiden Chromosomensätze in der Mitosespindel überprüft, um Fehlverteilungen des genetischen Materials zu vermeiden (Schmitz 2009). Abbildung 1.2: Kontollpunkte des Zellzyklus (Hirsch-Kauffmann et al. 2009) 4 1 Einleitung Es zeigt sich, dass verschiedene externe wie interne Faktoren Einfluss auf die Kontrollpunkte und somit auf die Zellzyklusprogression haben. Der wichtigste externe Faktor, der für die Praxis der Zellkultur essentiell ist, ist die Versorgung mit Wachstumsfaktoren. Ohne diesen mitogenen Stimulus am Restriktions-Punkt kommt es unweigerlich zum Zellzyklusarrest und zum Eintritt der Zellen in die G0-Phase. Die Unterversorgung mit Wachstumsfaktoren durch Serumhunger ist eine bekannte Methode der Zellsynchronisation (Schmitz 2009). Außerdem spielt die Anzahl an Nachbarzellen eine wichtige Rolle. Sind es zu viele, wird die Zellteilung bei normalen Zellen durch Kontakthemmung inhibiert. Zu den internen Faktoren gehören Zellgröße und eine fehlerfreie und vollständige DNA. Die molekulare Basis des Zellzykluskontrollsystems bilden „Zyklin-abhängige Kinasen“ (engl. cyklin-dependent kinases, CDKs), die erst durch Zykline ihre enzymatische Funktion ausüben können. Zykline sind spezielle Proteine, die phasenspezifisch exprimiert werden und mit bestimmten CDKs heterodimere Komplexe bilden. Wird ein Konzentrationsmaximum eines bestimmten CDK-Zyklin-Dimers zu einem bestimmten Zeitpunkt im Zyklus erreicht, so kann durch Phosphorylierung weiterer Enzyme und Transkriptionsfaktoren die nächste Phase des Zellzyklus eingeleitet werden. Kontrollierenden Einfluss haben zum einen Proteinkinasen und Proteinphosphatasen wie beispielsweise „CDK-aktivierende-Kinasen“ (engl. CDKactivating kinase, CAK) und zum anderen „CDK-Inhibitor-Proteine“ (engl. CDK-inhibitors, CKIs) der Cip/Kip- bzw. Ink4-Familie (Netzker 2006a). Am „Restriktions-Punkt“ beispielsweise unterstehen Zyklin-Synthese und Aktivierung der Dimere der Koordination durch Wachstumsfaktoren und Protoonkogene, wie zum Beispiel Ras. Dort wird durch mitogene Stimulierung zelltypspezifisch das Zyklin D1, D2 oder D3 induziert, das dann mit CDK4 oder CDK6 dimerisiert. Nachdem dieses Heterodimer in den Zellkern gelangt ist und durch CAK stimuliert wurde, phosphoryliert es das „Retinoblastoma-Protein“ Rb-1 (Abbildung 1.3). Im nichtphosphorylierten Zustand bindet Rb-1 an die Transaktivierungsdomäne des Transkriptionsfaktors E2F und rekrutiert die Histon-Deacetylase (HDAC). Nach Phosphorylierung des Rb-1 wird die HDAC freigesetzt und es kommt zur Chromatinumstrukturierung. Dadurch wird Zyklin E verstärkt exprimiert und aktiviert die CDK2. Das Zyklin E/CDK 2-Dimer überführt Rb-1 in einen hyperphosphorylierten Zustand, in dem es das E2F nicht mehr in seiner Funktion als Trankrisptionsfaktor blockiert. Somit wird die Transkription verschiedener für die S-Phase notwendiger Gene eingeleitet wie zum Beispiel das DNA-Polymerase-Gen (Netzker 2006a). So kommt dem Rb-1-Protein die Rolle eines Tumrosuppressors und Zyklin D die Rolle eines Onkogens zu. 5 1 Einleitung Abbildung 1.3: Funktion des Retinoblastom-1-Proteins (Böcker et al. 2008) 1.1.2 Zellwachstum in vitro Die Anfänge der angewandten Gewebe- und Organkultur lassen sich etwa auf den Beginn des 20. Jahrhunderts zurückdatieren. Schon damals war das Ziel naturwissenschaftlicher Bestrebungen, Zellen und Gewebe außerhalb eines Organismus am Leben zu erhalten, um sie so näher untersuchen zu können. Im Jahr 1907 gelang es Ross G. Harrison, tierische Gewebestücke außerhalb des Körpers wachsen zu lassen. Auf den Arbeiten des französischen Chirurgen Alexis Carrel beruhte das Dogma der damaligen zellbiologischen Forschung, dass Zellen in Kultur unbegrenzt teilungsfähig seien (Schmitz 2009). 1952 wurde erstmals eine epithelähnliche menschliche Zelllinie aus einem Cervixkarzinom etabliert, welche später unter dem Namen „HeLa“ bekannt wurde. In den folgenden Jahrzehnten wurden insbesondere die Weiterentwicklung von Nährmedien, Wachstumsfaktoren und -bedingungen sowie die Etablierung neuer Zelllinien vorangetrieben. Erst 1961 konnten L. Hayflick und P. Moorhead Carrels Dogma widerlegen, indem sie zeigten, dass normale humane diploide Fibroblasten nur rund 50 Populationsverdopplungen durchführen können. Dieses Phänomen der limitierten Replikationsfähigkeit kultivierter Zelllinien aus Primärkulturen hat unter dem Begriff „Hayflick Limit“ in die Literatur Eingang gefunden (Lindl & Gstraunthaler 2008). Der Entwicklungsverlauf einer Zelllinie wird demnach in drei Phasen eingeteilt (Abbildung 1.4). 6 1 Einleitung Abbildu ung 1.4: Entw wicklungsverrlauf von priimären Zellen unter in-vitro-Bedinguungen (Schmiitz 2009) Phase I umfasst die d Phase der d Primärkkultur, die mit der Biildung der ersten kon nfluenten Zellschiicht beendeet ist. In Phhase II proliferieren diie Zellen maximal m undd können in n kurzen Subkulttivierungsinntervallen umgesetzt u w werden. In Phase III ist das Z Zellteilungsp potenzial erschöppft und die Proliferatio P onssrate nim mmt bis hin zum Wachhstumsstillstand der Ku ultur ab. Die Zelllen könnenn nicht mehhr subkultivviert werden n. Diese lim mitierte Zelllteilungsakttivität ist Folge eines e irreveersiblen Zeellzyklusstoops und wiird als „zeelluläre Senneszenz“ (von ( lat. senescere – dt. alteern) bezeichhnet (Hayfliick 1998). Zellen Z in Seeneszenz sinnd vorerst weiterhin w owie ein metabollisch aktiv. Sie zeigen eine typischhe Morphollogie mit grroßen, flachhen Zellen so typischees Genexprressionsmusster und weeisen zudem m eine spezzifische Chrromatinstru uktur auf (Wagenner & Mülleer 2010). Seneszenz S k konnte nich ht nur bei Fibroblasten F n, sondern auch a bei vielen anderen a Zellltypen und sogar an verschiedene v en Spezies beobachtet b werden. Ess scheint zudem eine e Korrelation zwiscchen dem Zeellteilungsp potential in vitro v und deer Lebenserrwartung einer Spezies S zu geben (Schhmitz 20099). Beim Menschen M z zeigt sich ddas Phänom men der Seneszeenz am klinnischen Beiispiel des Werner-Syn W ndroms, einnem Progerrie-Syndrom m. Zellen dieser Patienten P sinnd zu sehr viel wenigger Populatiionsverdoppplungen fähhig als ihr gesundes g Korrelaat, sodass diie Erkrankteen vorzeitigg altern und d selten dass 50. Lebennsjahr übersschreiten (Schmittz 2009). Es E wird die „replikativee Seneszenz“ von der „nicht-repllikative Sen neszenz“ unterschhieden. Ersttgenannte Form F der Seeneszenz lieegt die repllikative Zellalterung zu ugrunde, bei der sich bei jeeder Zellteiilung bestim mmte DNA A-Sequenzenn an den C Chromosom menenden verkürzen, die alss „Telomeree“ (von griiech. telos – dt. Endee, griech. m meros – dtt. Stück) 7 1 Einleitung bezeichnet werden. Wenn diese Telomere nur noch ungefähr 5000 Basenpaare (bp) lang sind, spricht man vom „ersten Mortalitätsstadium“ (M1) (Wagener & Müller 2010). Über DNASchädigungssignale wird der Zellzyklus über p53 und Rb-1 gestoppt. Sind diese beiden Proteine in ihrer Funktion defekt, erreichen die Zellen das „zweite Mortalitätsstadium“ (M2) und erliegen der Zellkrise, die sie durch irreversible Chromosomenschäden in die Apoptose treibt. Stammzellen der Keimbahn und Tumorzellen können sich diesem Alterungsprozess entziehen, indem sie das Enzym „Telomerase“ exprimieren, welches verlorene Sequenzen mit den Chromosomenenden verknüpft. In Tumorzellen soll dieses „Unsterblichkeitsenzym“ permanent aktiv sein, sodass sie der replikativen Seneszenz entkommen und „unsterblich“ bzw. „immortal“ werden (Lindl & Gstraunthaler 2008). Wie die „replikative Senezenz“ wird auch die „nicht replikative Seneszenz“ durch DNA-Schäden und konsekutive Aktivierung des p53/Rb-Netzwerks ausgelöst. Häufigste Ursache ist die Zellschädigung durch reaktive Sauerstoffradikale sowie oxidativen Stress und defekte DNA-Reparaturmechanismen. Zudem spielen ungünstige Kultur- und Wuchsbedingungen sowie die Aktivierung spezifischer Zellalterungsgene und Onkogene eine wichtige Rolle (Wagener & Müller 2010). Aber auch nicht-transformierte Zellkulturen können in Phase II durch genetische Instabilität spontan „immortalisieren“ und sich zu „kontinuierlichen Kulturen“ entwickeln, die jedoch nicht-transformiert und nicht-tumorigen sind (Abbildung 1.5). Im Gegensatz zu vollständig transformierten Zellen wie den Tumorzellen weisen sie keinen veränderten Phänotyp sowie keine geänderten Wachstumseigenschaften in vitro auf (Lindl & Gstraunthaler 2008) Abbildung 1.5.: Etablierung verschiedener Zelllinien (Lindl & Gstraunthaler 2008) 8 1 Einleitung 1.1.2.1 Wachstumsverlauf in vitro Der Begriff „Wachstum“ einer Kultur beschreibt im Allgemeinen die Zunahme der Zellzahl und bzw. oder die Zunahme der Zellmasse (Lindl & Gstraunthaler 2008). Werden Zellen einer Zelllinie aus Phase II ihres Kultivierungslebens entnommen (siehe oben) und wird ihr Zellzahlzuwachs über die Zeit beobachtet, so ergibt sich eine spezifische Wachstumskurve, die sich in mehrere Phasen gliedern lässt und in Abbildung 1.6 dargestellt ist (Lindl & Gstraunthaler 2008). Abbildung 1.6: Wachstumsphasen einer statischen Bakterienkultur halblogarithmisch aufgetragen (Nethe-Jaenchen 2008) Sie entspricht weitgehend dem Wachstumsverlauf einer statischen Bakterienkultur („BatchKultur“), bei der nach dem Animpfen kein Mediumwechsel mehr vorgenommen wird. In der Praxis der Zellkultur kann je nach Zelllinie ein Mediumwechsel notwendig werden, um eine ausreichende Vitalität über den Beobachtungszeitraum zu gewährleisten. Nach der Einsaat durchlaufen die Zellen zunächst eine sogenannte „lag-Phase“ (von engl. lag – dt. Verzögerung) oder Anlaufphase, in der sie sich an ihre neue Umgebung anpassen müssen. Die Dauer dieser Phase ist abhängig vom Zustand der zur Animpfung herangezogenen Zellen sowie von den im neuen Kulturmilieu herrschenden Wachstumsbedingungen. Ähnlich einer Population von Mikroorganismen können sich die Zellen in der sich anschließenden Phase kontinuierlich teilen. Ihre Vermehrung durch Zweiteilung 9 1 Einleitung entspricht einer geometrischen Reihe, sodass die Zellzahl exponentiell wächst mit einer unter den gegebenen Wachstumsbedingungen maximal erreichbaren Wachstumsrate (NetheJaenchen 2008). Diese Phase wird auch als „log-Phase“ bezeichnet, da ihr exponentieller Wachstumscharakter in der bevorzugten halblogarithmischen Auftragung mit dem Logarithmus der Zellzahl auf der Ordinate und der Zeit auf der Abszisse (linear) eine Gerade darstellt. Die Wachstumsrate bleibt solange konstant bis die Teilungsfähigkeit der Zellen durch Kontaktinhibition oder mangelndes Nährstoffangebot bzw. Anhäufung von Stoffwechselprodukten gehemmt wird (Nethe-Jaenchen 2008). In vivo ist eine entsprechende logarithmische Zunahme der Zellzahl nur in frühen Stadien der Embryogenese oder in den frühen Phasen des bösartigen Wachstums zu beobachten (Dörmer 2000). In der stationären Phase oder Plateauphase findet kein Wachstum mehr statt, die Zellzahl bleibt konstant und bildet ein Plateau. Zellvermehrung und Zellabsterben halten sich die Waage. Sind die Energiereserven vollständig aufgebraucht, beginnt die Absterbephase der Kultur. Angelehnt an die Praxis der mikrobiellen Wachstumsbeobachtung können verschiedene Parameter bestimmt werden. Betrachtet man die Entwicklung der Zellzahl, so beschreibt die Generationszeit tg die Zeit, die eine Zelle für ihren Teilungszyklus und somit für ihre Verdopplung benötigt. Die Populationsverdopplungszeit td hingegen bezeichnet das Zeitintervall für die Verdopplung der Zellzahl einer ganzen Kultur (Schink 2006). Da sich die Zellen einer Kultur nicht synchron teilen und sich ihre Generationszeiten eventuell unterscheiden, können diese Parameter voneinander abweichen. Außerdem befinden sich in einer realen Kultur auch immer defekte, nicht teilungsfähige Zellen (Schink 2006). Die Parameter tg und td lassen sich rechnerisch ermitteln (siehe 2.5). Die Populationsverdopplungszeit lässt sich zudem während der „log-Phase“ aus der Wachstumskurve ablesen. Sie entspricht der Zeit, die für die Verdopplung der Zellzahl benötigt wird. Die Verdopplungszeit definiert hingegen die Verdopplung der Zellmasse, die für stoffwechselphysiologische und biochemische Untersuchungen wichtig ist (Nethe-Jaenchen 2008). Die Teilungsrate ν ist definiert als die Anzahl der Zellteilungen pro Zeiteinheit. Die exponentielle Wachstumsrate µ gibt die Zunahme der Zellzahl oder Zellmasse pro Zeiteinheit an und spiegelt sich in der Steilheit der Geraden in der „log-Phase“ wider (Schink 2006). Unter optimalen Wachstumsbedingungen kann die Zelllinie ihre maximale spezifische Wachstumsrate erreichen. 10 1 Einleitung 1.2 Zelltod Der Zelltod im Allgemeinen beschreibt das irreversible Endstadium einer Zelle. Dieses kann Folge einer Zellschädigung durch exogene und endogene Noxen sein oder sich im Rahmen eines physiologischen Prozesses ereignen. So unterscheidet man auf der einen Seite die „Onkose“ im Sinne eines akzidentellen Zelltodes mit dem histologischen Bild einer unspezifischen Nekrose. Auf der anderen Seite steht der programmierte selektive Zelltod, die „Apoptose“, die sich morphologisch als „Schrumpfnekrose“ darstellt (Majno & Joris 1995, Riede 2004). 1.2.1 Apoptose Mit der Evolution vielzelliger Organismen mussten genetische Programme hervorgebracht werden, die soziale Interaktionen im Gewebeverband regulieren. Bei der Entwicklung von Geweben spielt nicht nur Zellwachstum und Differenzierung zu spezialisierten Zelltypen eine Rolle, sondern auch die gezielte Elimination überflüssiger oder unerwünschter Zellen (Daniel 2007). Dabei handelt es sich nicht um einen zufällig ablaufenden Prozess, sondern um ein genetisch festgelegtes Selbstzerstörungsprogramm der Zelle. Der Begriff des „programmierten Zelltodes“ wurde von Lockshin und Williams 1964 geprägt. Die Pathologen John F. R. Kerr, Andrew H. Wyllie und Alastair R. Currie beschrieben 1972 primär die morphologischen Veränderungen und riefen die Namensschöpfung „Apoptose“ ins Leben (Schmitz 2009). Das Wort „Apoptose“ stammt aus dem Griechischen (griech. apo – dt. weg; griech. ptosis – dt. Fall) und möchte den physiologischen Sinn dieser Zelltodesart durch den metaphorischen Vergleich des Abfallens welker Blätter im Herbst verdeutlichen (Zatloukal et al. 2008). Apoptose ist ein biologisches Schlüsselphänomen des vielzelligen Organismus und ist für die Aufrechterhaltung der Gewebeintegrität unerlässlich. So werden bereits in der Embryonalentwicklung Zellen ohne Funktion durch Apoptose beseitigt wie beispielsweise die Rückbildung der Interdigitalhäute an den Extremitäten. Aber auch im adulten, ausgereiften Gewebe spielt der programmierte Zelltod für die Aufrechterhaltung der Homöostase eine entscheidende Rolle. So werden beispielsweise gealterte Zellen in Haut und Schleimhäuten aus ihrem Gewebeverband entfernt. Auch Blutzellen, männliche Keimzellen und andere im Überschuss produzierte Zellen werden in ihrer Zahl mittels Apoptose minimiert. Ähnliches gilt für Zellen, die ihre Funktion nicht ordnungsgemäß ausführen wie zum Beispiel 11 1 Einleitung Nervenzellen, die keinen Anschluss an benachbarte Zellen finden. Aber auch Zellen, deren Aufgaben erfüllt sind (Zellen des Endometriums) oder die sogar schädigendes Potential aufweisen (autoreaktive B- und T-Lymphozyten, Tumorzellen) unterliegen der apoptotischen Regulation (Netzker 2006b). So ist es nicht verwunderlich, dass Störungen in diesem elementaren Regulationssystem vielfältige Auswirkungen haben können. Verschiedene Autoimmunerkrankungen wie Lupus erythematodes und Wegenersche Granulomatose, aber auch die Entwicklung von Tumoren, insbesondere von Karzinomen mit p53-Mutationen oder Hormonabhängigkeit, basieren auf einer verminderten Apoptosefähigkeit. Im Gegensatz dazu kann eine erhöhte Apoptoserate auch bei AIDS beobachtet werden oder zu neurodegenerativen Erkrankungen wie AlzheimerDemenz und Morbus Parkinson führen (Schmitz 2009). 1.2.2 Gegenüberstellung von Apoptose und Onkose Im Gegensatz zum physiologisch koordinierten „Selbstmord“ einer Zelle im Rahmen der Apoptose stellt die Onkose eher einen „schweren Unfall“ im Gewebe durch exogene „Gewalt“ dar, wie sie zum Beispiel durch hypoxische, toxische, physikalische, immunologische oder mikrobielle Einflüsse entstehen (Debatin & Fulda 2009). Dieser Sachverhalt spiegelt sich auch in der Morphologie wider. So löst sich eine apoptotische Zelle zunächst aus ihrem Zellverband heraus, kugelt sich ab und beginnt zu schrumpfen. Das Chromatin kondensiert und die DNA wird in den Bereichen der Linker-DNA zwischen den Nucleosomen durch Endonukleasen abgebaut, wodurch das für apoptotische Zellen charakteristische DNALeitermuster nach elektrophoretischer Auftrennung im Agarosegel entsteht (Luttmann et al. 2009). Das Zytoskelett wird proteolytisch geschädigt, sodass sich Blasen an der Zelloberfläche ausstülpen (engl. „apoptotic blebs“). Im weiteren Verlauf zerfällt die Zelle in einzelne Vesikel bzw. „Apoptosekörper“ (engl. „apoptotic bodies“), die anfänglich noch strukturell intakte Organellen enthalten. Der bei gesunden Zellen inwendig liegende Membranbaustein Phosphatidyl-Serin wird im Rahmen der Caspase-Kaskade (siehe unten) nach außen gewendet und macht die Zellüberreste für Makrophagen erkenntlich, die diese dann phagozytieren und somit spurlos beseitigen. So wird bei der Apoptose kein Zellinhalt freigesetzt und es kommt folglich zu keiner Entzündungsreaktion des umliegenden Gewebes. Im Gegensatz zur Nekrose sind die apoptotischen Vorgänge abhängig von Energie- und Proteinstoffwechsel. 12 1 Einleitung Die „Onkose“ hingegen läuft energieunabhängig ab und zeigt zu Beginn typischerweise eine Zellschwellung (griech. ónkos – dt. Schwellung), meist nicht nur von einer Zelle, sondern von mehreren benachbarten Zellen. Zellmembran und Zellkern lösen sich auf, und somit gelangt Zellinhalt in die Umgebung und verursacht meistens eine starke Entzündungsreaktion. Im Gegensatz zu den Begriffen „Apoptose“ und „Onkose“, die die auslöserspezifischen Vorgänge des Zelltodes beschreiben, steht der Begriff „Nekrose“ für das morphologische Endstadium, in das beide Zelltodformen münden (Majno & Joris 1995). Neben diesen Hauptformen des Zelltodes gibt es noch weitere Zelltodformen wie zum Beispiel Autolyse, mitotische Katastrophe und andere. 1.2.3 Phasen und Signalwege der Apoptose Der Verlauf der Apoptose gliedert sich in die vier Phasen Initiation, Exekution, Phagozytose und Degradation. Der Initiation liegen extra- oder intrazelluläre Auslöser zugrunde, die unterschiedliche Signalwege nach sich ziehen. Somit wird zwischen einem „extrinsischen Weg“ und einem „intrinsischen Weg“ der Initiation differenziert (Wagener & Müller 2010) (siehe Abbildung 1.7). Abbildung 1.7: Schematische Darstellung der Apoptosevorgänge mit extrinsischem und intrinsischem Weg (Zatloukal et al. 2009) 13 1 Einleitung 1.2.3.1 Extrinsischer Signalweg der Apoptose Der extrinsische Apoptoseweg dient der Erkennung regulierter Apoptosesignale aus der Zellumgebung und führt zur gezielten Entfernung von unerwünschten Zellen aus einem Gewebeverband. Dabei werden sogenannte „Todesrezeptoren“ durch „Todesliganden“ aktiviert. Als Liganden agieren TNF-α (engl. Tumor-Nekrose-Faktor-α), CD95-Ligand (engl. Fas-Ligand), TRAIL (engl. TNF-related apoptosis inducing ligand = APO-2-Ligand) und APO-3-Ligand. Sie entstammen der TNF-Familie, deren Mitglieder vornehmlich Entzündungsreaktionen, aber auch Zellteilung, Differenzierung und Apoptose regulieren. Bei den Todesrezeptoren handelt es sich um in der Plasmamembran lokalisierte Transmembranrezeptoren, deren cysteinreiche extrazelluläre Domäne die Bindung der korrespondierenden Liganden als Trimer ermöglicht und somit wiederum eine Trimerisierung der Rezeptoren vermittelt (Daniel 2007). Zu den gegenwärtig bekannten Todesrezeptoren gehören der 55kDa-TNF-Rezeptor (TNF-R1), CD95 (APO-1, Fas), die TRAIL-Rezeptoren DR4 (TRAILR1) und DR5 (TRAIL-R2), DR3 und DR6. Der intrazelluläre Rezeptoranteil beinhaltet eine Aminosäuresequenz, die als Todesdomäne (engl. „death domain“, DD) bezeichnet wird. Im Falle des TRAIL- und CD95-/Fas-Signalweges bindet das Adaptorprotein FADD (engl. Fas associated death domain) direkt an diese Todesdomäne; beim TNF-Signalweg ist das Adaptorprotein TRADD (engl. TNF alpha receptor 1 associated death domain) vorgeschaltet. Nachfolgend kommt es intrazellulär zur Bildung des DISC (engl. death inducing signaling complex), welcher die Aktivierung der Initiationscaspase Caspase-8 zur Folge hat. In Typ-IZellen werden durch den DISC ausreichend viele aktive Caspase-8-Einheiten aktiviert, um direkt die Exekutionscaspase, Caspase-3, durch Spaltung zu aktivieren und somit die Exekutionsphase einzuleiten. In Typ-II-Zellen muss das Apoptosesignal durch die intrinsische Endstrecke verstärkt werden, indem die Caspase 8 zusätzlich das Bcl-2-Protein Bid aktiviert und somit den Mitochondrien-abhängigen Signalweg initiiert (siehe unten). An das Adaptorprotein FADD können zudem die Procaspase-10 oder cFLIP (engl. cellular FLICE inhibitory protein) binden, die den Apoptosevorgang induzieren bzw. blockieren können (Debatin & Fulda 2009). 1.2.3.2 Intrinsischer Signalweg der Apoptose Der intrinsische Zelltodsignalweg kann rezeptorunabhängig durch intrazelluläre Faktoren sowie unter Beteiligung des Todesrezeptors eingeleitet werden. Zu den zellintern erzeugten Signalen gehören zum Beispiel die DNA-Schädigung (nukleärer Stress), die massive 14 1 Einleitung Akkumulation fehlgefalteter Proteine oder der nutritive Stress bei Entzug von Wachstumsfaktoren (Daniel 2007). Selbige Faktoren führen auch im Vorfeld zum Zellzyklusarrest (siehe 1.1.1). Für die Kontrolle spielen zelltodfördernde und zelltodhemmende Mitglieder der Bcl-2Gen-Familie eine entscheidende Rolle. Im Falle einer DNA-Schädigung kommt es zur Aktivierung des Proteins p53. Dieses Protein hemmt die Bcl-2- und verstärkt die BaxExpression. Bcl-2 kann seiner Funktion als Anti-Apoptose-Protein nicht mehr nachkommen, indem es die Homodimerisierung von Bax und Bak verhindert und somit die Integrität der Mitochondrien schützt. Gebildete Dimere aus Bax- oder Bak-Proteinen bilden Porenkomplexe in der äußeren Mitochondrienmembran mit der Folge einer Permeabilitätserhöhung der äußeren Mitochondrienmembran, auch als „MOMP“ (engl. Mito-chondrial outer Membrane Permeabilization) bezeichnet. Eine „MOMP-positive“ Zelle läuft unweigerlich in die Apoptose, entweder durch den Verlust der für die Zellatmung essentiellen Mitochondrien oder durch die Freisetzung von Molekülen aus dem Intermembranraum zwischen äußerer und innerer Mitochondrienmembran, die die Exekutionscaspasen aktivieren (Wagener & Müller 2010). So gelangen Cytochrom c, Protonen und Ca2+-Ionen ins Zytoplasma. Cytochrom c bildet mit dem Protein APAF-1 (engl. Apoptosis activating Factor-1) und der Procaspase-9 einen heptameren Komplex, das Apoptosom. Es folgt die Aktivierung der Procaspase-9 und im Anschluss die Aktivierung von Procaspase-3, einer Exekutions-caspase (Debatin & Fulda 2009). P53 übernimmt somit als „Wächter des Genoms“ eine Schlüsselfunktion für Zellzyklusarrest und Apoptoseinduktion nach DNA-Schädigung und Tumorsuppressorfunktion. Abbildung 1.8: Tumorsuppressor p53 und seine Interaktionen (Böcker et al. 2008) 15 hat 1 Einleitung Beide Apoptosewege gelangen über die Aktivierung der Caspasen 3 und 6 in die Exekutionsphase. Diese Caspasen spalten mehr als 300 Proteine aus allen funktionellen Gruppen und führen im Zellkern zur Aktivierung der DNAsen. Dadurch werden die oben beschriebenen biochemischen und morphologischen Charakteristika der Apoptose deutlich. Am Ende stehen die Phagozytose und Degradation der Zellreste durch Makrophagen, die ohne Entzündungsreaktion der Umgebung einhergeht (Wagener & Müller 2010). 1.2.4 Schlüsselmoleküle der Apoptose 1.2.4.1 Caspasen Caspasen (engl. „cysteinyl-aspartate-cleaving proteases“) sind intrazelluläre Cysteinproteasen, die bei beiden Signaltransduktionswegen der Apoptose eine wichtige Rolle spielen. Sie spalten Peptidbindungen selektiv hinter Aspartatresten und liegen als inaktive Vorstufen (Proenzyme) vor. Die prozessierte Form verfügt über eine große (ca. 20 kDa) und eine kleine Untereinheit (ca. 10 kDa). Beim Menschen konnten bisher 14 verschiedene Caspasen identifiziert werden, sieben von ihnen sind an der Apoptose beteiligt und lassen sich weiter in Initiations- (Caspase-2, -8, -9, -10) und Exekutionscaspasen (Caspase-3, -6, -7) unterteilen. Entsprechend eines kaskadenförmigen Verlaufes werden Initiationscaspasen von vorgeschalteten Proteinen wie FADD und Apaf-1 aktiviert und aktivieren ihrerseits Exekutionscaspasen, die durch Proteinspaltungen die zelltodbringenden Maßnahmen einleiten und die Apoptose-typischen Veränderungen hervorrufen (Schmitz 2009). 1.2.4.2 Bcl-2-Proteinfamilie Die Bcl-2-Proteinfamilie (von engl. „B cell lymphoma“) besteht aus 20 bisher beim Menschen identifizierten regulatorischen Proteinen, die vermutlich alle eine Rolle bei der Apoptose spielen. Innerhalb dieser Familie werden antiapoptotische Proteine wie Bcl-2, BclxL, Bfl-1, Mcl-1, Boo und Bcl-W und proapoptotische Proteine wie Bax, Bid, Bak, Bok, Bik, Hrk, Bad u. a. unterschieden, wobei das relative Verhältnis der jeweiligen Antagonisten für die Empfindlichkeit bzw. Resistenz von Zellen gegenüber diversen apoptotischen Stimuli verantwortlich ist. Viele dieser Proteine sind in der Mitochondrienmembran lokalisiert und regulieren die Durchlässigkeit dieser Membran für apoptogene Faktoren wie beispielsweise Cytochrom c im Rahmen der intrinsischen Apoptoseinitiation (Schmitz 2009). 16 1 Einleitung 1.2.4.3 CD95/CD95L bzw. Fas/FasL-System CD95 (Fas/APO-1) ist ein membranständiger Rezeptor mit drei extrazellulären Domänen, einer Transmembranregion und einem intrazellulärem Anteil mit einer „Todesdomäne“. Der CD95-Rezeptor wird in einigen Geweben wie beispielsweise der Leber konstitutiv exprimiert und kann in lymphohämatopoetischen Zellen durch Antigenstimulation oder Zytokine induziert werden (Debatin & Fulda 2009). CD95-Ligand (Fas-L) ist ein Typ-II-Transmembranprotein und kann durch proteolytische Abspaltung als lösliches Molekül freigesetzt werden. Dieser Ligand wird nur in wenigen Geweben konstitutiv exprimiert wie beispielsweise in der vorderen Augenkammer und im Hoden, seine Bildung kann aber ebenfalls induziert werden wie zum Beispiel in aktivierten zytotoxischen T-Lymphozyten und NK-Zellen, die über CD95 ihre Zielzellen zerstören. Somit stellt dieses System einen Schlüsselmechanismus für die Homöostase der lymphatischen Zellen dar. CD95-Mutationen wurden in Leukämien und Non-Hodgkin-Lymphomen gefunden (Debatin & Fulda 2009). 1.2.4.4 TRAIL-System TNF-related apoptosis inducing ligand (TRAIL)/Apo-2-Ligand wurde 1995 aufgrund seiner Sequenzhomologie zu anderen Liganden der TNF-Familie identifiziert. Für dieses System sind insgesamt fünf Rezeptoren identifiziert worden. Die beiden agonistischen Rezeptoren TRAIL-R1 und -R2 leiten nach Binden ihres Liganden den oben beschriebenen Todesrezeptorsignalweg ein. Die antagonistischen Rezeptoren TRAIL-R3 und -R4 können nach Aktivierung keine Apoptose initiieren, sondern lediglich die Wirkung von TRAIL auf der Zelloberfläche neutralisieren (Debatin & Fulda 2009). 17 1 Einleitung 1.3 Tumorpathologie 1.3.1 Tumorentstehung Im medizinischen Sprachgebrauch bezeichnet der Begriff „Tumor“ eine Gewebeschwellung und steht im engeren Sinne für eine Neubildung von Gewebe (Neoplasie), die sowohl gutartiger wie auch bösartiger Natur sein kann. Der Begriff „Krebs“ fasst bösartige Neoplasien zusammen und wurde von griechischen Ärzten geprägt, die die oberflächliche stauungsbedingte Venenzeichnung eines Mammakarzinoms mit einem Krebs (von griech. karkinos) verglichen. Die erste schriftliche Erwähnung bösartiger Erkrankungen kann auf das Jahr 1600 v. Chr. zurückdatiert werden und zeigt, dass es sich bei dieser Krankheit nicht um eine Erscheinung der Neuzeit handelt (Wagener & Müller 2010). 1.3.1.1 Tumorentstehung als Mehrstufenprozess Krebs ist eine genetische Erkrankung. Der Biologe Theodor Boveri bemerkte bereits 1908, dass sich solide Tumoren und Normalgewebe in ihren mikroskopisch sichtbaren Chromosomen unterscheiden. Der regelmäßige Nachweis bestimmter Chromosomenveränderungen wie beispielsweise Translokationen bei Leukämien sprechen ebenfalls dafür (Wagener & Müller 2010). Histologische Beobachtungen sowie die Erkenntnisse zu Onkogenen und Tumorsuppressorgenen machten zudem die schrittweise Entwicklung von Krebs deutlich, wie die Entstehung des Retinoblastoms sowie die Kolonkanzerogenese zeigen. An der mehrstufigen Entstehung von Tumoren aus Einzelzellen durch sequentiellen Erwerb von Mutationen besteht kein Zweifel mehr (Schulte-Hermann & Parzefall 2009). Normale Zellen befinden sich in einem homöostatischen Gleichgewicht von Wachstum, Differenzierung und Zelltod, welches durch einen stringent regulierten Zellzyklus und die Fähigkeit zur Apoptose gewährleistet wird (siehe vorherige Abschnitte). In Tumorzellen bestehen dagegen dauerhafte Störungen dieser Regelkreise, die meist auf Mutationen von Schlüsselgenen der Signalgebung und -verarbeitung beruhen. Der Erwerb der ersten Mutation entspricht der Stufe der „Initiation“ (Abbildung 1.9). Die initiierte Zelle stellt den Ausgangspunkt der Krebsentstehung dar. Sie weist zunächst nur einen geringen Wachstumsvorteil gegenüber den normalen Zellen auf, sodass ihr klonales Wachstum nicht oder nur sehr langsam voranschreitet. Über Wachstumssignale wie trophe Hormone und Entzündungsmediatoren kommt es zur „Tumorpromotion“ und damit zur präferenziellen Vermehrung der initiierten Zelle zum präneoplastischen Zellklon. Mit 18 1 Einleitung ansteigender Anzahl an Tochterzellen erhöht sich die Wahrscheinlichkeit, dass weitere Mutationen in Schlüsselgenen auftreten, die zusätzliche Wachstumsvorteile für die initiierten Zellen bedeuten. Nach dem „darwinischen Prinzip“ werden diese bevorteilten Zellen selektioniert und es entstehen weitere (Sub-)Klone (Schulte-Hermann & Parzefall 2009). Abbildung 1.9: Mehrstufenprozess der Krebsentstehung (Schulte-Hermann & Parzefall 2009) So kommt es im Rahmen der „Progression“ durch den schrittweisen Erwerb von genetischen Veränderungen und deren Selektion zur malignen Transformation und somit zur Umwandlung gutartiger Tumorvorstufen in bösartige Tumoren. Grundlage der Progression ist die für Tumorzellen charakteristische genetische Instabilität („Mutatorphänotyp“). Durch die zufallsbedingte Verschiedenheit der Mutationen und deren Selektion können zudem mehrere Zellklone mit unterschiedlichem Genotyp entstehen („Tumorheterogenität“). Diese Erkenntnisse bilden auch die Grundlage für eine Therapieresistenz, die auch während der Therapie neu entstehen kann (Schulte-Hermann & Parzefall 2009). Der klinische Ablauf entspricht weitgehend diesem tumorbiologischen Schema. Zwischen Initiation und klinischer Manifestation der Krebserkrankung liegt eine Latenzphase, die bis zu 19 1 Einleitung mehreren Jahren oder Jahrzehnten andauern kann. Die Krebsentstehung basiert fast immer auf dem Zusammenwirken verschiedener exogener und endogener Ursachen. Dabei dominieren exogene Krebsrisikofaktoren wie beispielsweise chemische Substanzen, α-, β-, γ-Strahlen, UV-Licht sowie bestimmte Viren, Bakterien und Parasiten, die schätzungsweise 80-90 % aller Krebsfälle bedingen. Sie wirken hauptsächlich als Initiatoren oder Promotoren, denn im Verlauf der Progression wird die Krebsentstehung zunehmend unabhängig von äußeren Faktoren und läuft mehr und mehr autonom ab (Schulte-Hermann & Parzefall 2009). 1.3.1.2 Molekulare Kanzerogenese Tumorzellen entziehen sich dem homöostatischen Gleichgewicht normaler Gewebe. Ihre Fähigkeit zur ungehemmten Teilung erlangen sie durch einen übermäßig aktivierten Zellzyklus bei Versagen wichtiger Kontrollmechanismen wie Apoptose und Differenzierung. Auf molekularer Basis spielen dabei „(Proto-)Onkogene“ und „Tumorsuppressorgene“ eine wichtige Rolle. „Protoonkogene“ sind Vorstufen von „Onkogenen“ (Krebsgene), die erst durch exogene Faktoren (siehe oben) in die krebserzeugende Form umgewandelt werden (Schmitz 2009). Sie induzieren physiologischerweise die Zellteilung, indem sie aktivierend auf wachstumsfaktorabhängige Signalwege und Zellzyklusregulation, jedoch hemmend auf Apoptosesignalwege wirken. Sie können demnach funktionell in Wachstumsfaktoren, WachstumsfaktorRezeptoren, G-Proteine, Proteinkinasen und nukleäre Transkriptionsfaktoren eingeteilt werden (siehe Abbildung 1.10). Abbildung 1.10: Wirkungsorte von Onkogenen (modifiziert nach Riede et al. 2004) 20 1 Einleitung Auch bestimmte Zykline und CDKs gehören zu den Protoonkogenen, so beispielsweise das Zyklin D1 und die CDK4 (vgl. Tabelle 1.2). Bcl-2 ist kein klassisches Onkogen, denn seine Aufgabe ist nicht primär die Proliferationsstimulation, sondern der Schutz vor Apoptose. Tabelle 1.3: Beispiele zellulärer Onkogene (modifiziert nach Böcker et al. 2008) Funktion Onkogen Protein Mechanismus Vorkommen Autokrine Wachstumsfaktoren c-sis Plättchenwachstumsfaktor (PDGF) Genamplifikation Osteosarkome WachstumsfaktorRezeptoren erb-B2 (her2/neu) ErbB2-Rezeptor Genamplifikation Mamma-, Ovarialkarzinome u. a. Intrazelluläre Signalvermittlung ras-Familie Ras-Proteine (GTPbindende Proteine) Punktmutation 20% aller Tumoren, häufig Kolon u. exokrines Pankreas abl Abl (Proteinkinase) bcr-abl: Translokation t(9;22), Genfusion CML, ALL myc-Familie Myc-Proteine myc: t(8,14), Translokation Überexpression Myc: BurkittLymphom n-myc: Genamplifikation n-myc: Neuroblastom Zyklin D1 Genamplifikation Ösophagus-, Mammakarzinom CDK 4 Überexpression Melanome, Sarkome Bcl-2 Translokation t(14;18), Überexpression Hypomethylierung Follikuläre Lymphome Nukleäre Transkriptionsfaktoren Zykline, zyklinabhängige Kinasen Apoptoseproteine Bcl-2 B-CLL, NHL Die Aktivierung eines Protoonkogens zum Onkogen erfolgt durch verschiedene Mutationen. Es können quantitative Veränderungen („Genamplifikation“), qualitative Veränderungen („Punktmutation“, „Translokation“), Austauschvorgänge von Regulatorsequenzen sowie fehlerhafte epigenetische Modifikationen wie DNA-Methylierungen vorliegen. Sie bewirken, dass eine Zelle ein normales Protein im Übermaß produziert („Überexpression“) oder eine abweichende überaktive Variante herstellt („konstitutive Aktivierung“) (Buddecke 2002). Im Ergebnis ist ein dereguliertes Gen mit gesteigerter Funktion seines Expressionsprodukts entstanden, was auch als „gain of function“ (dt. Funktionszuwachs) bezeichnet wird. Dabei 21 1 Einleitung reicht bereits die Mutation eines Allels aus. Die Mutation eines Protoonkogens verhält sich demnach dominant und fördert durch einen entfesselten Zellzyklus sowie einen stärkeren Schutz vor Apoptose das Wachstum von Tumorzellen (Böcker et al. 2009). „Tumorsuppressorgene“ hingegen sind negative Regulatoren der Zellteilung; sie haben hemmende Wirkung auf den Zellzyklus und können zudem Apoptosesignalwege induzieren. Sie werden in Zellzyklus- und Transkriptions-Regulatoren, Signaltransduktions-Regulatoren sowie Zelloberflächenrezeptoren eingeteilt (Tabelle 1.4). Sie sind oft im Rahmen von Keimbahnmutationen betroffen. Tabelle 1.4: Beispiele von Tumorsuppressorgenen (modifiziert nach Böcker et al. 2008) Funktion Tumorsuppressorgen Mechanismus Vorkommen Zellzyklus- und Transkriptionsregulatoren RB-Gen Deletion Retinoblastom, Osteosarkom p53-Suppressorgen (TP53) Missense-Mutation Kolon-, Lungen-, Mamma-, Magenkarzinom p16-Suppressorgen Keimbahnmutation Familiäres Melanom, familiäres PankreaskarzinomSyndrom BRCA-1-/BRCA-2-Gen Keimbahnmutation Mamma-, Ovarial-, Prostatakarzinom WT-Gene (Wilms-Tumor-Gene) Deletion Wilms-Tumor, Syndrom APC-Gen (Adenomatöse-PolyposisColi-Gen) Keimbahnmutation Fam. Adenomatöse Polyposis Coli, Kolonkarzinom NF1-Gen (Neurofibromatose-1Gen) Keimbahnmutation Neurofibromatose Typ 1 E-Cadherin-Gen Keimbahnmutation Fam. Magenkarzinomsyndrom DCC-Gen Verlust Kolonkarzinom SignaltransduktionsRegulatoren Zelloberflächenrezeptoren WAGR- Tumorsuppressorgene erfahren mutationsbedingt einen Verlust ihrer Regulatorfunktion durch fehlende oder fehlerhafte Produktion ihres Genprodukts. Das Ergebnis wird als „loss of function“ (dt. Funktionsverlust) bezeichnet und bedarf der Veränderung beider Allele eines Tumorsuppressorgens. Sie verhalten sich demnach rezessiv. Somit resultiert ebenfalls ein gesteigertes Tumorwachstum, da die Zellteilung enthemmt ist und Apoptose nicht mehr 22 1 Einleitung induziert werden kann (Böcker et al. 2009). Die bedeutendsten Tumorsuppressorgene sind das Retinoblastomgen sowie TP53, auch als „Wächter des Genoms“ bezeichnet. So ist in Tumorzellen die Proliferationskontrolle im Allgemeinen außer Kraft gesetzt und kann auch nicht durch Induktion von Apoptose ausgeglichen werden. 1.3.1.3 Eigenschaften von Tumoren und Tumorzellen Mutationen dieser Tumorgene führen somit schrittweise zur malignen Transformation gesunder Zellen in Tumorzellen. Dabei mögen prinzipiell ca. 6-12 Mutationen zur Tumormanifestation nötig sein. Hochdurchsatzsequenzanalysen von Brust- und Kolonkarzinomen kamen zu dem Ergebnis, dass jeweils etwa 90 Gene mutiert sind. Doch nur ungefähr ein Dutzend dieser Mutationen sind tatsächlich für Tumorentstehung sowie Tumorprogression verantwortlich, die restlichen Veränderungen haben keine kanzerogene Relevanz (Schulte-Hermann & Parzefall 2009). Die resultierenden Eigenschaften von Tumoren wurden von Hanahan und Weinberg 2000 in ihrer Veröffentlichung „The hallmarks of cancer“ in sechs Kategorien eingeteilt (siehe Abbildung 1.11). Abbildung 1.11: Eigenschaften von Tumoren (Hanahan und Weinberg 2000) 23 1 Einleitung Näher betrachtet zeigen Tumore also folgende Merkmale (Bartram 2009): • Unabhängigkeit einer Krebszelle von externen Wachstumssignalen (Autonomie), beispielsweise durch konstitutive Expression der Onkogene Ras oder Ret • Verlust einer Gegenregulation von Wachstumsprozessen durch inhibitorische Signale wie etwa über die Tumorsuppressoren p16 oder RB • Entkopplung von den normalen Regelkreisen des programmierten Zelltodes durch Störungen proapoptotischer (p53) oder antiapoptotischer Faktoren (Bcl-2) • „Unbegrenzte“ Fähigkeit zur Zellteilung (Immortalisierung) durch aberrante Telomeraseaktivität (Prototyp) • Rekrutierung neuer Gefäßanschlüsse für den Tumor (Angiogenese), vermittelt durch Angiogenesefaktoren wie VEGF (engl. vascular endothelial growth factor) • Überschreiten der natürlichen Organgrenzen und Metastasierung; Inaktivierung des intrazellulären Signalmediators E-Cadherin Neben diesen etablierten Eigenschaften von Tumoren haben sich weitere für die Tumorentstehung relevante Aspekte herauskristallisiert, die diese Liste eventuell bald erweitern werden. Zum einen sollen Tumore ihren Energiestoffwechsel umstrukturieren können, insbesondere ihren Glukosestoffwechsel („aerobic glycolysis“), um so ihre Proliferation zu unterstützen und voranzutreiben (Hanahan und Weinberg 2011). Ein weiterer Fokus liegt auf der Beziehung zwischen Immunsystem und Tumorzellen. Obwohl diese Beziehung in ihrer Komplexität immer noch viele Fragen offen lässt, scheint festzustehen, dass Tumore in der Lage sind, sich passiv und aktiv der Immunabwehr zu entziehen („Immunoescape“). Wie auch die internen Regulationseinheiten einer Zelle im Rahmen der Tumorentstehung schrittweise im Schlagabtausch von Mutation und Selektion versagen, so kann auch das Immunsystem in seiner regulativen Funktion als Abwehrsystem schrittweise entwaffnet werden (siehe 1.3.2). Zudem kommt man immer mehr zu der Auffassung, einen Tumor als eine Einheit von transformierten Zellen und umliegenden Zellen sowie Gewebestrukturen anzusehen. Tumorzellen und Tumorstroma (engl. „microenvironment“) beeinflussen sich gegenseitig. Dieser Dialog kann das Tumorwachstum hemmen, aber auch fördern (Wagener & Müller 2010). 24 1 Einleitung In-vitro-Eigenschaften von Tumorzellen Auch in vitro werden Unterschiede zwischen normalen, nicht-transformierten Zellen und Tumorzellen deutlich. Letztere sind im unterschiedlichen Maß transformiert und zeigen nachfolgende in-vitro-Eigenschaften im Vergleich zu „normalen“ Zellen. Die Kenntnis dieser Unterschiede ist für den praktischen Umgang mit Zellkulturen relevant, denn die überwiegende Zahl der permanenten Zellkulturen basiert auf transformierten Zellen (Schmitz 2009). Tabelle 1.5: In-vitro-Eigenschaften transformierter Zellen (modifiziert nach Wagener & Müller 2010, Lindl & Gstraunthaler 2008) „Normale“ Zelle Transformierte Zelle Wachstum in Einzelschicht Mehrschichtiges Wachstum Wachstum nur auf geeigneter Oberfläche Adhäsionsunabhängiges Wachstum Kontaktinhibition Wachstum auch bei direktem Kontakt mit anderen Zellen Begrenzte Lebenszeit (Seneszenz) „Unbegrenztes“ Wachstum (Immortalisierung) Kritische Einsaatdichte Reduzierte Einsaatdichte Regulierte Proliferations- und Zellteilungsraten erhöhe Proliferations- und Zellteilungsraten Wachstum nur in Gegenwart von speziellen Wachstumsfaktoren Verringerter Bedarf an Wachstumsfaktoren, Produktion autokriner Wachstumsfaktoren Kein Tumor nach Injektion in geeignete Empfängertiere Entwicklung von Tumoren nach Injektion in geeignete Empfängertiere (Tumorigenität) 1.3.2 Tumorimmunologie Bereits zu Beginn des letzten Jahrhunderts formulierte Paul Ehrlich wohl als erster die Hypothese, dass das Immunsystem entstehende Tumorzellen erkennen und bekämpfen kann (Ehrlich 1909). In den späten 50er Jahren wurde dann von Sir Mac Farlane Burnet und Lewis Thomas eine entsprechende Theorie der Immunüberwachung, zu Englisch „Immunosurveillance“, aufgestellt (siehe unten), nach der das Immunsystem die Entstehung von Tumorzellen kontinuierlich überwacht und entartete Zellen beseitigt (Martin u Resch 2009). 25 1 Einleitung Die Arbeiten von Shankaran et al. 2001 zeigten, dass Tumore aus Mäusen, die über keine intakte Immunabwehr verfügen, immunogener sind als Tumore aus immunkompetenten Mäusen. Das Immunsystem scheint demnach Tumorzellen in ihrer Immunogenität zu „gestalten“ (engl. to edit). Diese und weitere Erkenntnisse führten zur Weiterentwicklung der „Immune-surveillance“-Theorie und riefen das Konzept des „Immunoediting“ ins Leben (Schreiber et al. 2011). Es möchte verdeutlichen, dass das Immunsystem in Bezug auf die Tumorentstehung nicht nur schützende Funktion hat, sondern das Tumorwachstum in einem dynamischen Prozess unter bestimmten Bedingungen sogar fördern kann. Man unterscheidet die drei aufeinanderfolgenden Phasen „Eliminierung“ (engl. „Elimination“), „Gleichgewicht“ (engl. „Equilibrium“) und „Entkommen“ (engl. „Escape“) (Schreiber et al 2011), die in Abbildung 1.12 und im folgenden Kapitel näher erläutert werden. Abbildung 1.12: Konzept des „Immunoediting“ mit den drei Phasen „Elimination“, „Equilibrium“ und „Escape“ (Schreiber et al. 2011) 26 1 Einleitung 1.3.2.1 Phasen des „Immunoediting“ Eliminierungsphase („Elimination“) Die Eliminierungsphase entspricht weitgehend der „Immunosurveillance“-Theorie. Danach überwachen angeborenes und adaptives Immunsystem kontinuierlich die Entstehung von entarteten Zellen, um sie schnellstmöglich zu beseitigen. Wie genau das Immunsystem Tumorzellen aufspüren kann, ist noch nicht eindeutig geklärt. Möglicherweise werden Zellen der angeborenen Abwehr wie NK (Natürliche Killer)-Zellen und Makrophagen durch sogenannte „Gefahrensignale“ (engl. „danger signals“) angelockt. Diese werden bei einer Tumornekrose oder durch lokale Gewebeschädigung durch das beginnende invasive Tumorwachstum freigesetzt. NK-Zellen sezernieren infolgedessen u. a. Interferon-γ (IFN-γ), das antiproliferative, proapoptotische und angiostatische Prozesse aktiviert. Desweiteren induzieren Makrophagen über die Freisetzung von reaktiven Sauerstoff- und Stickstoffradikalen sowie NK-Zellen über TRAIL- bzw. Perforin-induzierte Apoptose den Tumorzelluntergang. Im Verlauf werden Tumorantigene freigesetzt, die über Dendritische Zellen zur Aktivierung von naiven Th1 CD4+ T-Zellen und CD8+ zytotoxischen T-Zellen im drainierenden Lymphknoten führen, die zurückkehren und ihren Beitrag zur Tumorbeseitigung leisten. Gemeinsam ist es somit dem angeborenen und adaptiven Immunsystem möglich, den Organismus in dieser Phase vollständig von Tumorzellen zu befreien (Schreiber et al. 2011). Gleichgewichtsphase („Equilibrium“) Es können jedoch Varianten von Tumorzellen entstehen, die die Eliminierungsphase überleben. Ist dies der Fall, so schließt sich eine Gleichgewichtsphase an, in der das Immunsystem das Tumorwachstum noch kontrollieren kann. Tumorbeseitigung mittels TZellen, IL-12 und IFN-γ und das Hervorbringen neuer Varianten auf Seiten des Tumors halten sich die Waage, die Tumorzellen werden in einer Art „funktionellem Ruhezustand“ (engl. „functional dormancy“) gehalten, der bis zu 20 Jahren andauern kann. Jedoch kommt es dadurch zur Selektion von Tumorvarianten, die immer weniger immunogen sind. Durch dieses „Immunoediting“ hat das Immunsystem also auch tumorpromovierenden Charakter, denn irgendwann wird der Tumor für die Immunabwehr nicht mehr greifbar sein. Diese Phase ist bisher nur sehr wenig in ihren Einzelheiten verstanden. 27 1 Einleitung Abbildung 1.13: „Immunoescape“-Mechanismen (Vesely et al. 2011) Entkommensphase („Escape“) In der Entkommensphase hat sich das Gleichgewicht zugunsten des Tumors verschoben. Tumorzellen haben entweder durch das „Immunoediting“ die Fähigkeit erlangt, sich dem Immunsystem gänzlich zu entziehen oder das Immunsystem ist nach langem, erbittertem Kampf geschwächt bzw. wird durch den Tumor aktiv unterdrückt. Somit kann der Tumor ungestört proliferieren und wird klinisch nachweisbar. Mechanismen, die dem Tumor das „Entkommen“ ermöglichen („Immunoescape“-Mechanismen), können grob in zwei Kategorien eingeteilt werden: Zum einen beinhalten sie Veränderungen der Tumorzellen selbst, die sie vor der Detektion und der Zerstörung durch das Immunsystem schützen. Zum anderen können Tumorzellen Veränderungen in Zellen der Immunabwehr induzieren, um sich so ein immunsuppressives Umfeld zu schaffen (Vesely et al. 2011). Zu den zellautonomen Strategien des Tumors gehören beispielsweise die Antigenmodulation durch Maskierung oder Verlust, die unzureichende Antigenpräsentation durch eine defekte Antigenprozessierungsmaschinerie oder verminderte oder fehlende MHC-Klasse-I-Expression an der Zelloberfläche sowie die Unfähigkeit zur T-Zell-Aktivierung aufgrund fehlender kostimulatorischer Signale. Somit haben Tumorzellen die Eigenschaften professioneller Antigen-präsentierender Zellen (APC) verloren und können unentdeckt bleiben. Werden Tumorzellen dennoch erkannt, so können sie sich durch Mechanismen der Apoptoseresistenz 28 1 Einleitung vor der Abtötung durch Immunzellen schützen, so beispielsweise durch eine vermehrte Expression antiapoptotischer Proteine wie Bcl-2, Bcl-xl, FLIP oder eine verminderte Produktion proapoptotischer Proteine. Zudem verhindern inaktivierende Mutationen in Todesrezeptoren wie beispielsweise Fas/CD95 und DR5 (TRAIL-Rezeptor) den zytotoxischen Angriff durch Immunzellen (Vesely et al. 2011). Tumorzellen können sich auch aktiv gegen solche Angriffe zur Wehr setzen, indem sie immun-inhibitorische Liganden auf ihrer Zelloberfläche exprimieren wie beispielsweise B7H1 (PD-L1), HLA-G, HLA-E, aber auch FasL (CD95L). FasL/CD95L kann auch in löslicher Form vorliegen. Über die Bindung an entsprechende Rezeptoren auf zytotoxischen T-Zellen dämpfen sie deren Wirkung oder induzieren in ihnen Apoptose (vgl. Abbildung 1.13). Dieser aktive Gegenangriff von Tumorzellen, insbesondere die FasL-vermittelte Induktion von Apoptose in CD8+ T-Zellen wird auch als „Counterattack“ bezeichnet (O’Connell et al. 1996). Die zweite Kategorie der „Immunoescape“-Strategien verdeutlicht, dass ein Tumor sein nahes Umfeld beeinflusst mit dem Ziel, es möglichst immunsuppressiv und somit „tumortolerant“ zu gestalten. Das erreicht er durch die Produktion und Sekretion verschiedener parakriner Faktoren, die sowohl auf Gewebezellen in unmittelbarer Nachbarschaft des Tumors wirken, als auch auf Tumor-infiltrierende Leukozyten. So werden beispielsweise die T-Effektorzellen durch die Faktoren TGF-β, IL-10, IDO (Indolamin-2,3-Dioxygenase), Ganglioside u. a. in ihren Funktionen gehemmt. Aber auch Dendrititsche Zellen sowie NK-Zellen werden inhibiert. TGF-β fördert zudem die Differenzierung von CD4+-Effektor-T-Zellen in „Regulatorische T-Zellen“ (Treg). Normalerweise dienen diese T-Zellen in chronischen Abwehrsituationen dazu, Immunreaktionen zu beschränken, um so pathologischen Reaktionen bei Infektionen oder Autoimmunkrankheiten vorzubeugen. In diesem Kontext jedoch unterstützen sie zusammen mit weiteren immunsuppressiven Leukozytenpopulationen wie MDSC (engl. Tumorwachstum, myeloid-derived indem sie über suppressor die cells) Sekretion und M2-Makrophagen insbesondere von TGF-β das ein immunsuppressives Milieu schaffen, das die antitumorale Immunantwort stark abschwächt oder zum Erliegen bringt (Vesely et al. 2011). Tabelle 1.6 zeigt eine Übersicht der verschiedenen „Immunoescape“-Mechanismen. 29 1 Einleitung Tabelle 1.6: Übersicht über „Immunoescape“-Mechanismen (modifiziert nach Igney 2002) Strategie Mechanismus Ignoranz Fehlen von Gefahrensignalen Fehlen von Tumorantigenen in lymphoiden Organen Wachstum in immunprivilegierten Regionen Fehlen von Adhäsionsmolekülen Physische Barriere durch Stroma Defekte Antigenpräsentation Mutation / Herunterregulation von Tumorantigenen, MHC-Genen Defekte in der Antigenprozessierung Induktion von Toleranz Anergie-Induktion durch fehlende kostimulatorische Moleküle Umlenkung der Immunantwort T-Zell-Deletion Regulatorische T-Zellen (Treg) Apoptose-Resistenz Mutation / verminderte Expression proapoptotischer Gene Mutation / verminderte Expression Todesrezeptoren wie Fas, DR5 Induktion antiapoptotischer Proteine Expression von immunsuppressiven Molekülen TGF-β, IL-10, VEGF, Prostaglandine, IDO etc. „Counterattack“ Expression von CD95L und anderer Todesrezeptorliganden „Counterattack“ Wie in den vorangegangenen Abschnitten aufgezeigt, können Tumore im Rahmen des „Immunoescapes“ das Immunsystem auf vielfältige Art überwinden. Ein aktiver Mechanismus dieser Art wird seit 1999 mit dem Begriff „Counterattack“ bezeichnet und beschreibt die Fähigkeit einiger Tumore, sich der Immunabwehr durch Apoptoseinduktion mittels Todesliganden wie beispielsweise Fas-L/CD95L zu widersetzen (Igney et al., 2000). So konnte an verschiedenen Tumoren gezeigt werden, dass sie den Todesliganden FasL/CD95L exprimieren und Apoptose in T-Lymphozyten induzieren können. Wie beispielsweise das Kolonkarzinom (O’Connel et al. 1996), das Mammakarzinom (O’Connel et al. 1999), das Ösophaguskarzinom (Bennet et al. 1999), Melanome (Rivoltini et al. 2002) und weitere. 30 1 Einleitung 1.4 Fragestellung N. Freudenberg et al. beobachteten 1996 im Rahmen einer Injektion von Tumorzellen des Lewis-Lung-Karzinoms in die Milz von C57/BL6-Mäusen vor dem Auftreten erster metastatischer Tumorzellen die Abnahme des Quotienten von reifen zu unreifen Makrophagen in der Leber. Als möglicher Erklärungsansatz wurde der Untergang reifer Makrophagen herangezogen und ein entsprechendes in-vitro-Modell etabliert, in dem Wildtyp-Makrophagen der Maus nach Inkubation mit zellfreien Tumorzellüberständen auf Apoptose hin untersucht wurden. Für die Überstände von Tumorzelllinien unterschiedlicher Histogenese und Malignität wie Lewis-Lung-Karzinom, Malignes Melanom, Tramp Prostatakarzinom, EL-4 Lymphom, Meth-A Fibrosarkom und Emt-6 Mammakarzinom konnte so die Induktion von Apoptosevorgängen in Makrophagen nachgewiesen werden (M. Woisetschläger 2001, S. Göppinger 2006, Y. Rydlewski 2008, Ch. Gläser 2010, M. Brauchle 2009). In ähnlicher Weise zeigten mehrere Studien anderer Arbeitsgruppen, dass Tumorzellen durch Fas-L-vermittelte Apoptoseinduktion Immunzellen aktiv in den Zelltod treiben können (Benett et al. 1998, O’Connell et al. 1996; etc.). In diesem Kontext wurde der Begriff „Counterattack“ (Gegenangriff von Tumorzellen gegen die körpereigene Immunabwehr) geprägt. Aufgabe dieser Doktorarbeit ist es nun, den Großteil der in den vorangegangenen Arbeiten im Rahmen des beschriebenen in-vitro-Modells untersuchten murinen Tumorzelllinien zunächst hinsichtlich ihres Proliferations- und Apoptoseverhaltens zu charakterisieren. Dazu gehören Malignes Melanom, Tramp Prostatakarzinom, EL-4 Lymphom, Meth-A Fibrosarkom und L929-Fibroblasten als nicht-maligne Kontrolle. Im Anschluss soll die Untersuchung auf die Produktion Apoptose-induzierender Faktoren wie FasLigand, TNF-α und TRAIL erfolgen, um so mögliche Mediatoren des „Counterattack“ in den jeweiligen Tumorzellüberständen identifizieren zu können. 31 2 Material und Methoden 2 Material und Methoden 2.1 Kultivierung von Zellen L929 Fibroblasten Die „L929 Fibroblasten-Zelllinie“ wurde freundlicherweise vom Max-Planck-Institut für Immunbiologie und Epigenetik in Freiburg (Labor Frau Prof. M. Freudenberg) zur Verfügung gestellt. Ursprünglich gehen diese Zellen auf L. J. Old (Kettering Institute, New York, USA) zurück. Die adhärent wachsenden L929 Fibroblasten wurden in 25 cm2-Zellkulturflaschen gezüchtet und alle drei Tage subkultiviert. Das alte Medium wurde verworfen und die Zellen wurden mit 1 ml Trypsin-EDTA (0,25 % Trypsin in 1 mM EDTA) für 1-2 Minuten bei 37°C inkubiert. Nach der Inkubation wurde die Ablösung unter dem Phasenkontrastmikroskop kontrolliert und die Zellen mit einer Pipette durch mehrmaliges Auf- und Abpipettieren vorsichtig vereinzelt. Durch Zugabe von 1 ml FCSi wurde das Trypsin inaktiviert. Die Zellen wurden mit 1200 RPM für 8 Minuten bei 21°C zentrifugiert (Thermoscientific Multufuge 3LR) und das Pellet in 5 ml neues Medium aufgenommen. Mit einem Splitfaktor von 1:35 wurden die Zellen in 10 ml neuem Medium in einer neuen 25 cm2-Zellkulturflasche weitergeführt. Die Zellen wurden bei 37°C und 5 % CO2 kultiviert. L929 Fibroblasten Medium: DMEM versetzt mit 10 % FCSi; 2 mM L-Glutamin; 100 U Penicillin pro ml; 100 µg Streptomycin pro ml; 4 mM HEPES Malignes Melanom Die „Maligne Melanom-Zelllinie“ wurde uns freundlicherweise vom Max-Planck-Institut für Immunbiologie und Epigenetik in Freiburg (Labor Frau Prof. M. Freudenberg) überlassen. Die adhärent wachsenden Melanom-Zellen wurden in 25 cm2-Zellkulturflaschen gezüchtet und alle drei Tage subkultiviert. Das alte Medium wurde verworfen und die Zellen wurden mit 1 ml Trypsin-EDTA (0,25 % Trypsin in 1 mM EDTA) für 1-2 Minuten bei 37°C inkubiert. Nach Vereinzelung der Zellen durch vorsichtiges Auf- und Abpipettieren wurde das Trypsin durch Zugabe von 1 ml FCSi inaktiviert. Die Zellen wurden mit 1200 RPM für 8 Minuten bei 21°C zentrifugiert (Thermoscientific Multufuge 3L-R) und das Pellet in 5 ml neues Medium aufgenommen. Mit einem Splitfaktor von 1:30 wurden die Zellen in 10 ml 32 2 Material und Methoden neuem Medium in einer neuen 25 cm2-Zellkulturflasche weitergeführt. Die Zellen wurden bei 37°C und 5 % CO2 kultiviert. Malignes Melanom Medium: DMEM versetzt mit 10 % FCSi; 2 mM L-Glutamin; 100 U Penicillin pro ml; 100 µg Streptomycin pro ml; 4 mM HEPES Tramp Prostatakarzinom Die „Tramp Prostatakarzinom-Zelllinie“ wurde freundlicherweise vom Max-Planck-Institut für Immunbiologie und Epigenetik in Freiburg (Labor Frau Prof. M. Freudenberg) bereitgestellt. Die adhärent wachsenden Prostatakarzinom-Zellen wurden in 25 cm2Zellkulturflaschen gezüchtet und alle drei Tage subkultiviert. Das alte Medium wurde verworfen und die Zellen wurden mit 1 ml Trypsin-EDTA (0,25 % Trypsin in 1 mM EDTA) für 1-2 Minuten bei 37°C inkubiert. Nach Vereinzelung der Zellen durch vorsichtiges Aufund Abpipettieren wurde das Trypsin durch Zugabe von 1 ml FCSi inaktiviert. Die Zellen wurden mit 1200 RPM für 8 Minuten bei 21°C zentrifugiert (Thermoscientific Multufuge 3LR) und das Pellet in 5 ml neues Medium aufgenommen. Mit einem Splitfaktor von 1:60 wurden die Zellen in 10 ml neuem Medium in einer neuen 25 cm2-Zellkulturflasche weitergeführt. Die Zellen wurden bei 37°C und 5 % CO2 kultiviert. Tramp Prostatakarzinom Medium: DMEM versetzt mit 5 % FCSi und 5 % Nu-Serum; 4 mM L-Glutamin; 100 U Penicillin pro ml; 100 µg Streptomycin pro ml; 1 mM Natrium Pyruvat; 5 µg/ml Insulin from bovine pancreas; 10 nM Dehydroandrosteron Meth-A Fibrosarkom Die „Meth-A Fibrosarkom-Zelllinie“ wurde freundlicherweise vom Max-Planck-Institut für Immunbiologie und Epigenetik in Freiburg (Labor Frau Prof. M. Freudenberg) zur Verfügung gestellt. Die in Suspension wachsenden Meth-A Fibrosarkom-Zellen wurden in 25 cm2Zellkulturflaschen gezüchtet und alle drei Tage subkultiviert. Dabei wurde die Zellsuspension in ein 50 ml-Reaktionsgefäß überführt und mit 1200 RPM für 8 Minuten bei 21°C zentrifugiert (Thermoscientific Multufuge 3L-R). Anschließend wurde das Pellet in 5 ml neues Medium aufgenommen. Mit einem Splitfaktor von 1:35 wurden die Zellen in 10 ml 33 2 Material und Methoden neuem Medium in einer neuen 25 cm2-Zellkulturflasche weitergeführt. Die Zellen wurden bei 37°C und 5 % CO2 kultiviert. Meth-A Fibrosarkom Medium: RPMI versetzt mit 10 % FCSi; 2 mM L-Glutamin; 100 U Penicillin pro ml; 100 µg Streptomycin pro ml; 4 mM HEPES EL-4 Lymphom Die „EL-4 Lymphom-Zelllinie“ wurde freundlicherweise vom Max-Planck-Institut für Immunbiologie und Epigenetik in Freiburg (Labor Frau Prof. M. Freudenberg) zur Verfügung gestellt. Die in Suspension wachsenden EL-4 Lymphom-Zellen wurden in 25 cm2Zellkulturflaschen gezüchtet und alle drei Tage subkultiviert. Dabei wurde die Zellsuspension in ein 50 ml-Reaktionsgefäß überführt und mit 1200 RPM für 8 Minuten bei 21°C zentrifugiert (Thermoscientific Multufuge 3L-R). Anschließend wurde das Pellet in 5 ml neues Medium aufgenommen. Mit einem Splitfaktor von 1:80 wurden die Zellen in 10 ml neuem Medium in einer neuen 25 cm2-Zellkulturflasche weitergeführt. Die Zellen wurden bei 37°C und 5 % CO2 kultiviert. EL-4 Lymphom Medium: RPMI versetzt mit 10 % FCSi; 2 mM L-Glutamin; 100 U Penicillin pro ml; 100 µg Streptomycin pro ml; 4 mM HEPES; 60 µM β-Mercaptoethanol C5F6 Zellen Die Bereitstellung sowie die Kultivierung von „C5F6 Zellen“ (subklonierte TNF-sensitive L929 Fibroblasten), die im TNF-α Bio-Assay zum Einsatz kamen, wurde freundlicherweise vom Max-Planck-Institut für Immunbiologie und Epigenetik in Freiburg (Labor Frau Prof. M. Freudenberg) übernommen. Sie entspricht der Kultivierung von L929-Fibroblasten. Es wurde allerdings ein anderes Medium verwendet und die Kultivierung erfolgte bei 37 °C und 8 % CO2. C5F6 Medium: RPMI versetzt mit 10 % FCSi; 2 mM L-Glutamin; 100 U Penicillin pro ml; 100 µg Streptomycin pro ml; 4 mM HEPES; 60 µM β-Mercaptoethanol 34 2 Material und Methoden 2.2 Einfrieren und Auftauen von Zellen Um die Ergebnisse von Versuchen, die zu unterschiedlichen Zeitpunkten stattfanden, vergleichen zu können, wurden die verschiedenen Zelllinien zu Beginn aufgetaut und nach der dritten Passage aliquotiert und eingefroren. Auf diesen Vorrat konnte im Laufe der experimentellen Arbeit zurückgegriffen werden. Dafür wurden die Kryoröhrchen aus dem Stickstoffbehälter im Wasserbad bei 37°C schnell aufgetaut und die Zellsuspension in 10 ml Medium vorgelegt in einer 25 cm2-Kulturflasche überführt. Nach 24 Stunden erfolgte ein Mediumwechsel und anschließend wurden die Zellen wie unter 2.1.1 beschrieben kultiviert. Um die Zellen einzufrieren, wurden sie nach dem Abtrypsinieren pelletiert (1200 RPM, 8 Minuten, 20°C), auf 1 x 107 Zellen / ml mit Einfriermedium (Kulturmedium mit 10 % DMSO) eingestellt und zu je 1 ml in Kryoröhrchen aliquotiert. Diese wurden zunächst für zwei Stunden bei -20°C tiefgefroren und anschließend über Nacht bei -80 °C gelagert. Am nächsten Tag wurden sie in flüssigen Stickstoff (-196 °C) überführt. 2.3 Bestimmung von Zellzahl und Vitalität Für die Bestimmung von Zellzahl und Vitalität wurde die „Neubauer improved“-Zählkammer mit zwei Zählnetzen verwendet. Diese Zählnetze bestehen aus drei mal drei großen Quadraten mit je 1 mm2 Fläche, die jeweils von einer Dreifachlinie umrandet sind. Für die Zellzahlbestimmung der Tumorzellen wurden wie bei der Leukozytenzählung die vier Eckquadrate herangezogen (Abbildung 2.1). Mit aufgebrachtem Deckglas ergab sich bei einer Tiefe von 0,1 mm ein Volumen von 0,1 mm3 oder 0,1 µl. Bei der „Trypanblau-Färbung“ zur Überprüfung der Vitalität von Zellen handelt es sich um eine Ausschlussfärbung. Der Azofarbstoff Trypanblau dringt nur in tote Zellen ein und färbt diese blau an. Die Zellmembranen lebender Zellen kann der Farbstoff aufgrund seiner Größe nicht passieren und folglich kommt es zu keiner Anfärbung. Bei zu langer Inkubation wirkt Trypanblau zytotoxisch, was bedeutet, dass die Zahl falsch-positiver Zellen mit der Zeit ansteigt. Zunächst wurden die Zählkammer sowie das Deckglas mit 70 % -igem Ethanol gereinigt. Das Deckglas wurde durch Anhauchen angefeuchtet und auf die Seitenstege der Kammer gelegt und vorsichtig angedrückt. Das Erscheinen der sogenannte „Newtonringe“ zeigte die korrekte 35 2 Material und M Methodeen Lage dees Deckglasses an und gewährleiste g ete, dass diee Tiefe – deer Abstand zwischen Deckglas D und Mitttelsteg – geenau 0,1 mm m betrug. 80 8 µl einer 0,5 0 %-igen Trypanblauu-Lösung un nd 20 µl der Zelllsuspensionn (Verdünnuungsfaktor 5) 5 wurden vorsichtig v m einer Pippette vermischt und mit für 2 Minuten M bei 37°C inkubbiert. Vor deer Zählung wurde die gefärbte g Zeellsuspensio on erneut gut durrchmischt und anschhließend mit m einer 10 µl-Pipettte in die obere und d untere Zählnettzkammer mittels m Kapillarkräfte apppliziert. Nach kurzer Sedimentattion wurden n die vier großen Eckquadraate à 16 Kleinquadra K ate mit deem 10er-Obbjektiv eines Phasenk kontrasta ( (Abbildung g 2.1), indem jeweils die Gesamtzellzahl mikroskkops mäandderförmig ausgezählt sowie die d Zahl der blau gefärbbten Zellen ermittelt un nd ihre Mitttewerte bereechnet wurd den. Um Zellen, die auf denn Außenlinnien lagen, nicht dopp pelt zu zähllen, wurdenn zwei Auß ßenlinien diskrim miniert und nur n Zellen auf a der oberren und link ken Außenlinie berückksichtigt (Ab bbildung 2.1). ung 2.1: Auffbau einer Neubauerkam N mmer und Darrstellung derr mäanderförrmigen Auszzählweise Abbildu mit Diskkriminierung zweier Außenlinien (Linndl & Gstrau unthaler 20088) Die Berrechnung deer „Gesamtzzellzahl“ wuurde nach fo olgender Foormel vorgeenommen: 5 10 0 Z: Mitttelwert der Zellzahlen Z a den vierr Großquadrraten. aus Faktor 5: 5 Verddünnungsfaaktor 5, da 1:5 1 mit Tryp panblau verddünnt wurdde. V: Voluumen der zuu zählendenn Zellsuspen nsion. 36 2 Material und Methoden 104: Kammerfaktor der Neubauer Zählkammer. Für ein Großquadrat ergibt sich mit einer Fläche von 1 mm2 und einer Tiefe von 0,1 mm ein Volumen von 0,1 µl. Durch den Faktor 104 wird die Zellzahl auf 1 ml bezogen. Um den Anteil der „vitalen Zellen“ an der Gesamtzellzahl zu bestimmen, wurde folgende Formel angewendet: % 100 ä ä ä 100 2.4 Animpfen besonderer Zellträger Neben 25 cm2 Kulturflaschen, die der Zellkultivierung der verschiedenen Zelllinien dienten, wurden weitere Zellträger für die verschiedenen Zelluntersuchungen verwendet. Für die Erstellung von Wachstumskurven (siehe 2.1.4) boten sich für die adhärenten wie auch für die nicht-adhärenten Zelllinien 24-Lochplatten an. Die Zellen wurden wie unter 2.1.1 und 2.1.2 beschrieben aufgetaut und kultiviert. Nach Passage drei wurden die Zellen geerntet, gezählt und auf ihre Vitalität hin überprüft. Lag diese unter 5% wurde die Zellzahl für alle Zelllinien identisch auf 2 x 103 / ml eingestellt und die Vertiefungen von jeweils drei 24Lochplatten mit je 1 ml beimpft. Die Zellen wurden bei 8% CO2 und bei 37°C im Inkubator kultiviert und täglich wurde die Hälfte des Mediums durch frisches ersetzt. Für die Hämatoxylin-Eosin-Färbung sowie für die Immunzytologie hingegen kamen für die adhärenten und nicht-adhärenten Zelllinien unterschiedliche Zellträger zum Einsatz. Für die adhärenten Fibroblasten, Melanom- und Prostatakarzinom-Zellen wurden „Culture-Slides“ der Firma BD Bioscience verwendet. Dabei handelt es sich um Objektträger mit einem Gitteraufsatz, der den Zellträger in Kammern unterteilt. In diesen Kammern können adhärente Zellkulturen unabhängig voneinander kultiviert und nach Abmontage der Kammerkonstruktion weiterverarbeitet werden ohne die Zellen zuvor ablösen zu müssen. 37 2 Material und Methoden Abbildung 2.2: Schematische Darstellung eines Achtkammer-Objektträgers. Um die Kammer zu entfernen, wird der Objektträger in einer Schiene fixiert und die Kammer mit einem Schuber vom Objektträger gelöst (BD Biosciences 2007). So wurden für die Hämatoxylin-Eosin-Färbung Objektträger mit vier Kammern verwendet, da die Wachstumsfläche einer dieser Kammern (1,7 cm2) ungefähr der Wachstumsfläche einer Vertiefung einer 24-Lochplatte (1,9 cm2) entsprach, die für die Erstellung der Wachstumskurven verwendet wurde. Nach Kultivierung der adhärenten Zelllinien wie unter 2.1.1 beschrieben wurden die Zellen nach der dritten Passage auf 2 x 103 Zellen / ml eingestellt und die Kammern von zwölf „Vierkammer-Objektträgern“ für jede Zelllinie in identischer Weise wie die 24-Lochplatten mit 1 ml pro Kammer beimpft. Die Kultivierung erfolgte bei 37°C und 8% CO2. Täglich wurde die Hälfte des Mediums durch frisches ersetzt. Für die Immunzytologie wurden „Achtkammer-Objektträger“ verwendet, um Verdünnungsreihen der Antikörper und weitere Etablierungsschritte möglichst ökonomisch umsetzen zu können. Um in etwa die gleiche Zellzahl pro Fläche vorzufinden wie bei den VierkammerObjektträgern, wurden die Kammern des Achtkammer-Objektträgers mit je 412 µl pro Kammer beimpft und bei 37°C und 8% CO2 kultiviert (Fläche Vierkammer-Objektträger: 1,7 cm2; Fläche Achtkammer-Objektträger 0,7 cm2). Die Vorbedingungen blieben unverändert (Zellernte nach Passage drei, Animpfkonzentration 2 x 103/ml, täglicher Mediumwechsel). Um die Vergleichbarkeit der Wachstumseigenschaften in 24-Lochplatten und in den Vierbzw. Achtkammer-Objektträgern gewährleisten zu können und somit auch die Ergebnisse der einzelnen Untersuchungen gegenüberstellen zu können, wurden in einem Vorversuch Wachstumskurven der Zellen sowohl in den Vier- wie auch in den AchtkammerObjektträgern erstellt und mit denen in 2.1.4 ermittelten Wachstumskurven (24-Lochplatten) verglichen. Es zeigten sich keine großen Unterschiede im Wachstumsverhalten. 38 2 Material und Methoden Die nicht-adhärenten Zelllinien wurden für die Hämatoxylin-Eosin-Färbung wie auch für die immunzytologische Untersuchung erneut in 24-Lochplatten mit ebenfalls 2 x 103 Zellen / ml und 1 ml pro Vertiefung bei 37 und 8 % CO2 kultiviert. Täglich wurde die Hälfte des Mediums durch frisches ersetzt. Um die Zellen einer Kultur bzw. einer Vertiefung der Lochplatte mit Hämatoxylin-Eosin anfärben zu können (siehe 2.1.6), wurden sie mit einer Zytozentrifuge (Thermo Scientific Cytospin 4) bei 600 RPM und 5 Minuten auf SuperFrost Plus Objektträger (R. Langenbrinck) aufgebracht. Die immunzytochemische Untersuchung erfolgte auf „Adhäsionsobjektträgern nach Prof. Bross“. Diese Objektträger weisen zwölf abgegrenzte runde Reaktionsfelder auf, auf deren positiv geladenen Oberflächen sich die negativ geladenen Zellen über elektrostatische Kräfte dauerhaft anheften und mit unterschiedlichen Methoden untersucht werden können. Die hydrophobe Beschichtung zwischen den Feldern verhindert zuverlässig ein Ineinanderlaufen der applizierten Substanzen. Für den immunzytochemischen Nachweis von Bax und Bcl-2 wurden zum Zeitpunkt der maximalen mitotischen Aktivität die Zellen aus einer Vertiefung der 24Lochplatte zweimal mit PBS gewaschen, gezählt und die Vitalität überprüft. Lag diese unter 5% wurden die Fibrosarkom-Zellen auf 1,4 x 106 / ml und die Lymphom-Zellen auf 2,0 x 106 Zellen / ml eingestellt. Zunächst wurden die Objektträger von ihrem blauen Schutzfilm unter fließendem Leitungswasser befreit und mit PBS nachgespült. In einer feuchten Kammer wurde unmittelbar im Anschluss auf jedes Reaktionsfeld 20 µl der Zellsuspension aufgetragen und die Adhäsion nach 20 Minuten mit dem Phasenkontrastmikroskop überprüft bevor die Zellen im nächsten Schritt mit Glutardialdehyd fixiert wurden (siehe 2.1.9). 2.5 Wachstumskurven und Populationsverdopplungszeit Für das Erstellen von Wachstumskurven wurden drei 24-Lochplatten pro Zelllinie wie unter 2.1.3 beschrieben mit Zellen beimpft und kultiviert. Die adhärenten Zellen aus jeweils drei Vertiefungen (Dreifachbestimmung) wurden unter Verwendung von je 200 µl Trypsin und 200 µl FCSi geerntet, in je ein 1ml-Eppendorfreaktionsgefäße überführt und für 30 Sekunden in einer Tischzentrifuge zentrifugiert. Bei den nicht-adhärenten Zelllinien wurde die Zellsuspension aus drei Vertiefungen der 24-Lochplatte sofort in je ein 1mlEppendorfreaktionsgefäße überführt und wie oben beschrieben zentrifugiert. Der Überstand wurde abgenommen und das Pellet in 30-1000 µl je nach Pelletgröße aufgenommen. Es schloss sich die Zellzählung und der Vitalitätstest wie unter 2.1.2 beschrieben an. Dieses 39 2 Material und M Methodeen g Zeit insgesam mt dreimal wiederholt w uund Mittelw werte aus Vorgeheen wurde tääglich zur gleichen Gesamtzellzahlen sowie s der Zahlen Z vitaller Zellen gebildet. g Duurch linearees und halbllogarithmischess Auftragenn dieser Mitttelwerte geggen die Zeiit mit der „G GraphPad P Prism 5.0 So oftware“ erhielt man m Wachsttumskurvenn für die unttersuchten Zelllinien. Z Populattionsverdop pplungszeiit In der halblogarithm h mischen Daarstellung sttellt sich diee Phase des exponentieellen Wachsstums als Gerade dar, die zuur graphischhen Ermittluung der Pop pulationsverrdopplungszzeit td dieneen kann, indem man m aus dem m Schaubilld abliest wie w viel Zeitt bis zur Veerdopplung der Gesamttzellzahl bzw. deer Zellmassee vergeht. ung 2.3: Aus A der haalblogarithm mische Darstellung einer Wachstuumskurve kann k die Abbildu Populationsverdoppllungszeit td graphisch g erm mittelt werdeen Alternattiv ist auchh die rechneerische Erm mittlung der Populationnsverdoppluungszeit td möglich, m denn diie Phase dees exponentiellen Wachhstums kan nn durch folgende Gleichung bescchrieben werden:: (1) wobei μ die Steigunng im exponentiellen Teil T bzw. diie exponentiielle Wachstumsrate daarstellt. 40 2 Material und Methoden Aufgelöst nach μ ergibt sich: μ (2) Aus Gleichung (2) lässt sich die Populationsverdopplungszeit td berechnen (die Zeit t-t0, für die N(t)/N0 = 2 ist): (3) Der Wachstumsfaktor pro 24-Stundenintervall α wurde folgendermaßen berechnet: 2 (4) Generationsverdopplungszeit Für die rechnerische Ermittlung der Generationsverdopplungszeit tg (Verdopplungszeit der Zellzahl) muss zunächst nach folgender Formel die Generationszahl n berechnet werden: (5) Für die Teilungsrate v (Anzahl der Zellteilungen pro Zeit) ergibt sich: (6) Die Berechnung der Generationsverdopplungszeit tg erfolgt mit folgender Formel: (7) 41 2 Material und Methoden 2.6 Gewinnung von Tumorzellüberständen Für die Untersuchungen an „Tumorzellüberständen“ wurden zum einen die von den Doktoranden Ch. Gläser (Prostatakarzinom), M. Brauchle (Malignes Melanom) und M. und A. Osswald (Fibrsarkom, Lymphom) gewonnenen und bei -80°C gelagerten Tumorzellüberstande verwendet. Zum anderen wurde Tumorzellüberstand getestet, der von den aktuell in Kultur genommenen Zelllinien stammte. Dabei wurde analog der Protokolle der früheren Arbeiten verfahren. Die Zelllinien wurden wie unter 2.1.1 und 2.1.2 beschrieben aufgetaut und kultiviert und nach sechsmaligem Passagieren geerntet und mit 1200 RPM bei 4°C für 30 Minuten zentrifugiert (Thermoscientific Multufuge 3L-R), um sie von allen festen Bestandteilen zu befreien. Der Überstand wurde abgenommen, steril filtriert, aliquotiert und bei -80°C eingefroren bzw. gleich im Anschluss mittels ELISA und TNF-α Bio-Assay zusammen mit den aliquotierten Proben aus den früheren Arbeiten untersucht. 2.7 Hämatoxylin­Eosin­Färbung (H.E.­Färbung) Die Hämatoxylin-Eosin-Färbung diente der Ermittlung des „Mitotischen Index“. Die Zelllinien Melanom, Prostatakarzinom und Fibroblasten wurden wie unter 2.1.3 beschrieben auf „Vierkammer-Objektträger“ kultiviert. Täglich wurde ein Objektträger zur H.E.-Färbung herangezogen, indem der Tumorzellüberstand aus den Kammern entfernt wurde, die Zellen einmal mit PBS gewaschen und das Kammergitter mit speziell vom Hersteller zur Verfügung gestelltem Werkzeug abmontiert wurde (Abbildung 2.2). Die Fixation der Zellen erfolgte in noch feuchten Zustand mit dem Mercofix-Fixationsspray. Die Fibrosarkom- und die Lymphom-Zellen wurden wie unter 2.1.3 beschrieben in 24-Lochplatten kultiviert und täglich mit einer Zytozentrifuge (Thermo Scientific Cytospin 4) auf SuperFrost Plus Objekttäger zentrifugiert und ebenfalls mit dem Mercofix-Fixationsspray fixiert. Die so vorbereiteten Objektträger wurden nach folgendem Protokoll mit Hämatoxylin und Eosin angefärbt: Protokollschritte Dauer Hämatoxylinlösung nach Gill 2-3 min. Bläuen in fließendem, lauwarmen Leitungswasser 10 min. Eosinlösung (1%, wässrig) 15 sec. 42 2 Material und Methoden Spülen in Leitungswasser 30 sec. 70%iger Alkohol Eintauchen 96%iger Alkohol 1 min. 100%iger Alkohol 1 min. Xylol 2 min. Xylol 2 min. Eindecken in Xylol Die H.E.-Färbung ist eine Routinefärbung in der konventionellen Histologie und Zytologie. Dabei werden Zellkerne und Nukleolen durch Hämatoxylin blau-violett bis schwarz gefärbt. Der Xanthen-Farbstoff Eosin hingegen stellt das Zytoplasma im Sinne einer Gegenfärbung rosa bis rot dar. Bei den adhärenten Zelllinien wurden drei der vier Kulturen des Vierkammer-Objektträgers pro Tag im Rahmen der Mitoseverlaufsbeobachtung ausgezählt und der Mittelwert sowie die Standardabweichungen mit der „GraphPad Prism 5.0 Software“ berechnet und in Schaubildern dargestellt. Bei den nicht-adhärenten Zelllinien wurden drei Vertiefungen der 24-Lochplatte pro Tag auf je einen Objektträger zentrifugiert, die drei Objektträger ausgezählt und der Mittelwert sowie die Standardabweichungen wie oben beschrieben ermittelt. Ausgezählt wurden alle Zellen mit sichtbaren Chromosomen. Dabei wurde wie unter 2.1.9 Auswertung und Statistik vorgegangen. 2.8 Probenvorbereitung für Western Blot Die Zellen aller Tumorzelllinien sollten qualitativ mittels Western Blot auf das Vorhandensein der Proteine Bax und Bcl-2 untersucht werden. Dafür wurden sie wie in 2.1.1 beschrieben kultiviert, geerntet und gezählt. 2 x 106 wurden in ein 1,5 ml-Eppendorfreaktionsgefäß überführt und mit 3000 RPM bei 4°C für 5 Minuten zentrifugiert (Eppendorf Zentrifuge 5417R). Danach wurde das Pellet in 200 µl L1-Puffer aufgenommen und 5 Minuten auf Eis lysiert. Nach Zentrifugation mit 3000 RPM für 5 Minuten bei 4°C (Eppendorf Zentrifuge 5417R) befanden sich im Überstand die zytoplasmatischen Bestandteile der Zellen. Der Überstand wurde mit 1/5 seines Volumens mit 5 x SDS-Puffer 43 2 Material und Methoden versetzt und für 5 Minuten bei 99°C erhitzt. Die zytoplasmatischen Proteine wurden mittels SDS-PAGE analysiert (siehe 2.1.8). L1-Puffer: 50 mM Tris pH 8,0; 2 mM EDTA; 1 % NP-40; 10 % Glycerin 5 x SDS-Puffer: 125 mM Tris/HCl pH 6,8; 25 % Glycerol; 4 % SDS; 0,1 % Bromphenolblau; 10 % β-Mercaptoethanol 2.9 SDS­Polyacrylamid­Gelelektrophorese (PAGE) Für die SDS-PAGE wurde das Mini-vertical System von BioRad benutzt. Die Glasplatten wurden mit 100%igem Ethanol geputzt und in dem Casting-Modul fixiert. Das 12%-ige Trenngel wurde zwischen die Glasplatten gegossen und mit 100 µl Isopropanol überschichtet. Nach der vollständigen Polymerisation des Gels von mindestens 15 Minuten bei Raumtemperatur wurde das Gel fünfmal mit destilliertem Wasser gewaschen und vorsichtig mit einem Filterpapier getrocknet. Das Sammelgel wurde darüber geschichtet und der Kamm mit 1,5 mm Abstandshalter eingesetzt. Nach der Polymerisation wurde der Kamm entfernt, das Gel fünfmal mit destilliertem Wasser gewaschen und in dem Laufmodul befestigt. Nachdem das Modul mit Laufpuffer befüllt war, wurden die Proben und 5 µl des Proteinmarkers geladen. Die Auftrennung der Proteine erfolgte zunächst bei 60 V bis die Proben das Trenngel erreichten, anschließend bei 150 V bis die Proben den unteren Rand des Gels erreichten. Trenngel (12%) Sammelgel Aqua dest. 4,22 ml 2,36 ml Puffer 1 (4x) 2,98 ml - Puffer 2 (4x) - 1 ml 4,80 ml 0,64 ml TEMED 12 µl 4 µl 10 % APS 80 µl 40 µl Acrylamid Lösungen: Puffer 1 (4x): 1,5 M Tris/HC1 pH 8,8; 0,4 % (w/v) SDS Puffer 2 (4x): 0,5 M Tris/HC1 pH 6,8; 0,4 % (w/v) SDS Laufpuffer: 25 mM Tris-base; 250 nM Glycin pH 8,3; 0,1 % SDS 44 2 Material und Methoden 2.10 Western Blot Nachdem die Proteinproben mittels SDS-PAGE aufgetrennt waren, wurden sie auf eine Nitrozellulosemembran (0,45 µm) mit Hilfe des Mini Trans-Blot cell übertragen. Die Nitrozellulosemembran, das Gel, die Gel-Halter-Kassette, die beiden Filterpapiere und die beiden Filterpads wurden in Transferpuffer eingeweicht. In die Gel-Halter-Kassette wurden die einzelnen Komponenten von der Anode (schwarze Seite) zur Kathode (weiße Seite) wie folgt eingestellt: Filterpad, Filterpapier, Gel, Nitrozellulosemembran, Filterpapier, Filterpad. Bevor die Kassette geschlossen wurde, wurden Luftblasen vorsichtig entfernt. Die Kassette wurde in das Elektrodenmodul geschoben, anschließend in den Tank gestellt und dieser komplett mit dem Transferpuffer gefüllt. Die Proteinpoben wurden im Kühlraum bei 150 mA über Nacht auf die Nitrozellulosemembran übertragen. Die Nitrozellulosemembran wurde im Anschluss für eine Stunde in Blockierpuffer bei Raumtemperatur auf einem Schüttelaparat inkubiert. Nachdem die Membran viermal für je 5 Minuten gewaschen wurde, konnte sie in die Lösung mit dem ersten Antikörper gelegt werden. Für die immunologische Detektion eines Proteins wurde die Nitrozellulosemembran in dem entprechenden Antikörperbad, eine Stunde bei Raumtemperatur, geschwenkt. Um ungebundene Antikörper zu entfernen, wurde die Membran viermal für je 5 Minuten gewaschen und im Anschluss eine Stunde bei Raumtemperatur mit einem Idiotyp-spezifischen HRPO-konjugierten zweiten Antikörper inkubiert (Goat anti-rabbit-HRPO-Antikörper verdünnt in Blockierpuffer). Nach viermaligem Waschen für 5 Minuten wurde die Membran für vier Minuten in der ECL-Lösung inkubiert. Anschließend wurde die Membran zwischen zweier, mit Ethanol gesäuberten, Plastikfolien in ein Entwicklerbuch gelegt, um ein Ausbleichen der Membran zu verhindern. Mit Hilfe der High Performance Chemiluminescence Filme wurde in der Dunkelkammer zweitgebundene Antikörper nachgewiesen. 10 x Transferpuffer: 250 mM Tris; 1,92 M Glycin; 10% Methanol 10 x TBS: 200 mM Tris; 1,65 M NaCI; eingestellt auf pH 7,6 Waschpuffer: 0,1 % Tween in 1 x TBS Blockierpuffer: 5 % Magermilch in Waschpuffer Erstes Antikörperbad: Verdünnter Antikörper in 5% BSA in Waschpuffer Zweites Antikörperbad: Verdünnter Antikörper in Blockierpuffer ECLplus western blotting detection system: 3,9 ml Solution A + 100 µl Solution B 45 der 2 Material und Methoden 2.11 Immunzytochemie ABC-Methode Die Immunzytochemie nach der „Avidin-Biotin-Komplex-Methode“ (ABC-Methode) wurde für den quantitativen Nachweis der Apoptosemarker Bax und Bcl-2 in einer Kultur gewählt. Bei dieser Standardmethode bindet ein Primärantikörper spezifisch an seine Antigendeterminanten in einem Gewebe oder einer Zelle. Der anschließend applizierte sekundäre, Biotin-markierte Antikörper erkennt den Fc-Teil des ersten Antikörpers und dient als Verbindungsglied zwischen Primärantikörper und dem (Strept-)Avidin-Biotin-PeroxidaseKomplex. Durch Zugabe des Peroxidase-Substrates 3,3‘-Diaminobenzidin (DAB) kann dieses Detektionssystem sichtbar gemacht werden und zeigt ein bräunliches Reaktionsprodukt. Um falsch-positive Reaktionen durch endogene Peroxidase zu vermeiden, wurde diese mittels Wasserstoffperoxid blockiert. Substrat DAB Bax Bcl-2 Sekundärantikörper Primärantikörper Abbildung 2.4: Schematische Darstellung der ABC-Methode. B: Biotin; A: (Strept-)Avidin; E: Enzym (modifizert nach Thermo Scientific 2011) Antikörper Bei den Primärantikörpern handelte es sich um polyklonale Antikörper aus dem Kaninchen gegen die Proteine Bax und Bcl-2. Ihre optimale Konzentration wurde in Verdünnungsreihen für jede Zelllinie bestimmt und ist nachfolgend dargestellt: 46 2 Material und Methoden Tabelle 2.1: Verdünnungen der Primärantikörper für die verschiedenen Zelllinien Anti-Bax (43 mg/ml) Anti-Bcl-2 (43 mg/ml) Fibroblasten Malignes Melanom Prostatakarzinom Fibrosarkom Lymphom 1:400 1:300 1:150 1:800 1:400 1:400 1:150 1:150 1:400 1:400 NAG wurde als Antikörperverdünnungsmedium gewählt und enthielt 10 % Ziegenserum, 0,36 % DMSO und 0,04 % TritonX-100. DMSO und TritonX-100 sind Substanzen, die für eine erhöhte Permeabilität der Zellmembranen und somit für ein besseres Eindringen des Antikörpers in die Zelle sorgen. Als Zweitantikörper diente ein biotinylierter Ziege anti-Kaninchen-Antikörper. Dieser wurde für alle Zelllinien identisch 1:200 mit NAG plus DMSO-TritonX100 versetzt mit 10 % Mausserum verdünnt. Zeitpunkt Die immunzytochemische Darstellung der Proteine Bax und Bcl-2 sollte der Quantifizierung der Bax- bzw. Bcl-2-positiven Zellen in einer Kultur dienen, um die ermittelten Werte in Relation zueinander bewerten zu können. Als geeigneten Zeitpunkt für solch eine Betrachtung wurde der Zeitpunkt der maximalen mitotischen Aktivität gewählt und aus den Mitoseverlaufskurven für jede Zelllinie ermittelt. Zu diesem Zwecke wurden die Zelllinien wie unter 2.1.3 beschrieben auf Achtkammer-Objektträgern kultiviert bzw. auf Adhäsions- Objektträgern nach Prof. Bross aufgebracht. Zum Zeitpunkt der maximalen mitotischen Aktivität wurden die Kulturen beendet und für die Immundetektion vorbereitet. Fixierung und Vorbereitung der Objektträger Bei den adhärent wachsenden Zelllinien Fibroblasten, Malignes Melanom und Prostatakarzinom, kultiviert in Achtkammer-Objektträgern, erfolgte die chemische Fixierung mittels Glutardialdehyd (GDA) mit erhaltener Kammerkonstruktion, um so ein partielles Austrocknen während der Abmontage zu vermeiden. So wurde der Inhalt einer Kammer bis knapp oberhalb des Zellrasens entfernt, die Kultur einmal vorsichtig mit PBS gespült und 47 2 Material und Methoden dann für 15 Minuten mit 200 µl GDA pro Kammer fixiert. Dieser wie auch alle weiteren Inkubationsschritte erfolgte in einer feuchten Kammer. Nach der Fixierung wurde mit PBS gespült und die Kulturen mit 200 µl 0,1 M Glycin pro Kammer für 5 min inkubiert, um freie Aldehydgruppen des Glutardialdehyds abzusättigen und somit Hintergrundsignale abzuschwächen. Nach erneuten Spülen mit PBS erfolgte eine zusätzliche gleichmäßige Trockenfixierung für mindestens 30 Minuten in einem 59°C-Wärmeschrank. Erst nach dieser zweifachen Fixierung wurde das Kammergitter mit dem eigens dafür vorgesehenen Werkzeug entfernt (siehe Abbildung 2.2). Somit wurden die blauen Kulturzwischenbereiche freigelegt und jedes Kulturfeld konnte mit dem Liquid-Blocker-Stift umrahmt und somit von den anderen Kulturfeldern abgegrenzt werden. Dieses Vorgehen konnte im Verlauf des Färbeprotokolls gewährleisten, dass sich zum einen verschiedene Antikörperkonzentrationen nicht miteinander vermischten und zum anderen die Applikationsmengen für die Kulturfelder auf einem Objektträger ungefähr gleich waren. Nach weiteren 5 Minuten im Brutschrank zur Fixierung des Liquid-Blocker-Stiftes wurden die Kulturfelder für 10 Minuten mit Waschpuffer rehydriert, um dann weiter nach dem Färbeprotokoll verfahren zu können. Die in Suspension wachsenden Fibrosarkom- und Lymphom-Zellen durften nach Aufbringen auf Bross-Objektträgern zunächst 20 Minuten sedimentieren, um stabile Adhäsionskräfte mit der positiv geladenen Oberfläche des Bross-Objektträgers einzugehen. Nach einer Blickkontrolle unter dem Phasenkontrastmikroskop wurde der Tumorzellüberstand mit einem Sauger abgenommen und die Zellen sofort mit 30 µl Glutardialdehyd (GDA) pro Feld für 15 Minuten fixiert. Danach erfolgte ein Spülvorgang mit PBS sowie die Inkubation mit 0,1 M Glycin für 5 Minuten. Anders als die Zellen auf den Kammerobjektträgern wurden die BrossObjektträger nicht trockenfixiert, sondern nach einem weiteren PBS-Spülschritt nach folgendem Färbeprotokoll weiterverarbeitet. Glutardialdehyd-Fixans PBS supplementiert mit Glutardialdehyd (0,04 %) und Glukoselösung (0,8 %). Glukoselösung 40 % w/v D-Glukose wasserfrei gelöst in A. bidest. Waschpuffer NKH, 20% Tween 20 48 2 Material und Methoden Färbeprotokoll Alle Inkubationsschritte wurden in einer „feuchten Kammer“ durchgeführt. Nach Abschütten von Waschpuffer bzw. PBS wurden die Kulturen auf den ehemaligen Kammer-Objektträgern bzw. auf den Bross-Objektträgern mit 40 µl bzw. 30 µl unverdünntem Ziegenserum pro Feld 30 Minuten lang bei Raumtemperatur inkubiert. Im Anschluss wurde nicht mit PBS gespült, sondern das Serum lediglich abgesaugt, um auf die Kulturen sofort 40 µl bzw. 25 µl des Primärantikörpers auftragen zu können. Nach zwölf Stunden über Nacht bei 4°C wurde der Erstantikörper wiederum vorsichtig mit einem Sauger abgenommen und die Objektträger in PBS-Küvetten dreimal fünf Minuten gewaschen. Währenddessen wurde die Verdünnung des Sekundärantikörpers vorgenommen, da dieser 45 Minuten ruhen sollte. Zudem wurde die Blockier-Lösung hergestellt und nach Abschlagen des PBS mit 80 µl bzw. 40 µl pro Feld großzügig aufgetragen. Nach 30-minütiger Inkubation und erneutem Spülen mit PBS (dreimal fünf Minuten) folgte die Inkubation mit 40 µl bzw. 25 µl Sekundärantikörper pro Feld für 40 Minuten Währenddessen wurde das A und B-Reagenz vorbereitet, das 30 Minuten vor Gebrauch angesetzt werden sollte. Zu 1 ml PBS wurden je 10 µl Reagenz A und Reagenz B hinzugegeben. Die Objektträger wurden nach Ablauf der 40 Minuten wieder in PBS gespült (dreimal fünf Minuten) und mit der A und B-Lösung für 30 Minuten beschickt. Nach einem weiteren PBS-Spülschritt wie oben beschrieben folgte der Auftrag der nach Anweisungen des Herstellers frisch angesetzten DAB-Lösung für genau 10 Minuten Danach wurden die Objektträger in endionisiertem Wasser gespült (dreimal fünf Minuten) und mit Aquatex eingedeckt. Um eine Expansion eingeschlossener Luftblasen zu vermeiden, wurden die Kanten des Objektträgers mit Nagellack versiegelt. NAG/DMSO/TritonX100- NKH-Puffer supplementiert mit HEPES pH 7,4 (0,04 M), Puffer Gelatinelösung (0,2 %), BSA (0,22 %) und DMSO/Triton X100 (0,36 % DMSO, 0,04 % Triton X100). DMSO / TritonX100 In 20 ml DMSO wurden 5 ml Triton X100 (2%) gelöst und auf 50 ml mit DMSO aufgefüllt. Blockier-Lösung 0,3 % H2O2 in 70 % Methanol/A. bidest. 5 % Gelatine-Lösung 5 % w/v Gelatine gelöst in A. bidest, Zugabe von 0,1 % NaN3 und 0,01 M HEPES. Es wurde mit 1 N NaOH auf pH 7,4 eingestellt und auf 50 ml aufgefüllt. 49 2 Material und Methoden Kontrollen Wie der qualitative Nachweis von Bax und Bcl-2 durch den Westernblot zeigte, ist der Primärantikörper für sein Zielantigen sensitiv und spezifisch. Auf jedem Objektträger wurde eine Negativkontrolle mitgeführt. Dabei wurde das Zellpräparat nicht mit dem spezifischen Primärantikörper, sondern mit PBS inkubiert. Sämtliche andere Protokollschritte blieben unverändert. Auf diese Weise wurde das dem Primärantikörper nachgeschaltete Detektionssystem auf unspezifische Immunreaktionen in Form von Hintergrundfärbungen überprüft. Bei regelrechtem Versuchsablauf konnte hierbei keine Farbreaktionen festgestellt werden. Auswertung und Statistik Für die Auswertung der angefärbten Kulturen auf den Objektträgern wurden diese zunächst mittels einer digitalen Lichtmikroskop-Kamera und -Software auf einem Computer dargestellt. Je nach Zellmorphologie und -größe wurde ein Kulturfeld des KammerObjektträgers bzw. des Bross-Objektträgers mit 20- bzw. 40-facher Vergrößerung betrachtet und jedes fünfte Kameragesichtsfeld fotografisch dokumentiert. Dabei wurde in der linken oberen Ecke begonnen und der Objektträger jeweils um ein Kameragesichtsfeld nach rechts bewegt. Am rechten Rand angelangt, erfolgte eine Bewegung um die Breite eines Kameragesichtsfeld nach unten und wieder zurück in Richtung des linken Randes usw. Die Bilder konnten in Schärfe und Kontrast nachbearbeitet werden, um die Trennschärfe zwischen positiven und negativen Zellen zu verbessern. Anhand dieser digitalen Fotos, die auch in ausgedruckter Form vorlagen, um gezählte Zellen zu markieren, wurde für jedes Foto die Gesamtzellzahl sowie die Anzahl der positiven Zellen notiert sowie der Anteil der positiven Zellen an der Gesamtzellzahl in Prozent ermittelt. Zellen, die nicht eindeutig zugeordnet werden konnten, die übereinander lagen, unscharf oder nur zum Teil abgebildet waren, wurden in der Zählung nicht berücksichtig. Bei den adhärent wachsenden Zelllinien Fibroblasten, Malignes Melanom und Prostatakarzinom konnten auf einem Achtkammer-Objektträger insgesamt sieben unabhängige Kulturen mit anti-Bax bzw. anti-Bcl-2 angefärbt werden, sodass drei Kulturen pro Primärantikörper mit je 1000 Zellen ausgezählt und statistisch ausgewertet werden konnten. Eine Kultur diente als Negativkontrolle und wurde lediglich mit PBS inkubiert. 50 2 Material und Methoden 1 AchtkammerObjektträger 2 1 Kultur anti-Bax 3 1 Kultur anti-Bax 8 7 1 Kultur anti-Bcl-2 4 1 Kultur anti-Bax 6 1 Kultur anti-Bcl-2 1 Kultur anti-Bax 5 1 Kultur anti-Bcl-2 1 Kultur PBS Abbildung 2.5: Schematische Darstellung der Versuchsanordnung auf einem AchtkammerObjektträger Bei den in Suspension wachsenden Zelllinien Fibrosarkom und Lymphom wurden die Zellen einer Kultur, die in einer Vertiefung einer 24-Lochplatte gewachsen waren, auf die zwölf adhäsiv beschichteten Felder eines Adhäsions-Objektträgers nach Prof. Bross verteilt. Auf diese Weise wurden drei Bross-Objektträger generiert, die jeweils aus einer Kultur gespeist worden waren. Jeweils sechs der zwölf Reaktionsfelder wurden mit anti-Bcl-2 und weitere fünf mit anti-Bax angefärbt. Ein Feld diente als Negativkontrolle und wurde statt mit einem Primärantikörper mit PBS inkubiert. So wurden insgesamt 3 Kulturen pro Primärantikörper zu je 1000 Zellen ausgezählt und statistisch ausgewertet werden. 1 Well einer 24-Lochplatte: 1 Kultur Adhäsionsobjektträger nach Prof. Bross 1 2 antiBcl-2 12 antiBcl-2 3 antiBcl-2 11 4 antiBcl-2 10 antiBcl-2 5 antiBax 9 antiBcl-2 6 antiBax 8 antiBax antiBax 7 antiBax PBS Abbildung 2.6: Schematische Darstellung der Versuchsanordnung auf einem AdhäsionsObjektträgers nach Prof. Bross Mit der „GraphPad Prism 5.0 Software" wurden die Standardabweichungen berechnet und diese zusammen mit den Mittelwerten graphisch dargestellt. Quotientenbildung Bax/Bcl-2 Im Anschluss an die Auszählung wurde der „Quotient Bax / Bcl-2“ gebildet. Dabei war von Bedeutung, ob der ermittelte Wert größer oder kleiner eins war. Je nachdem überwiegte Bax bzw. Bcl-2 und es konnte eine Aussage über den Zustand der Kultur hinsichtlich ihres Apoptoseverhaltens gemacht werden. Ist der Quotient größer eins, überwiegt Bax und die 51 2 Material und Methoden Zelllinie ist unter den gegebenen Bedingungen proapoptotisch eingestellt. Liegt der Quotient unter eins, so überwiegt Bcl-2 und die Zelllinie neigt nicht zur Apoptose. Abbildung 2.7: Graphische Veranschaulichung der Bedeutung des Bax/Bcl-2-Quotienten 2.12 RNA­Extraktion aus Zellen (Guanin­Isothiocyanat­Phenol­ Methode) Alle Arbeitsschritte wurden auf Eis, unter dem Abzug und mit sterilen Filterspitzen durchgeführt. Die Pipetten und der Arbeitsplatz wurden mit 70 %igem Ethanol gesäubert. Zu den Zellen wurde 500 µl Solution D, das mit 3,5 µl 0,1 M β-Mercaptoethanol versetzt war, gegeben. Die Zellen wurden mit einer Kanüle (Nr. 1) in eine 1 ml Spritze 4-5-mal resuspendiert. Danach wurde 75 µl 2 M Natrium-Acetat pH 4,5 zugegeben und 4-5-mal resuspendiert, die Zelllysate in ein 1,5 ml Eppendorfreaktionsgefäß überführt und bei -80°C gelagert. Für die RNA-Extraktion wurde zu 500 µl der Lysaten das gleiche Volumen an wassergesättigtem Phenol gegeben und für 15 Sekunden per Hand stark geschüttelt. Danach wurde 1/10 des Gesamtvolumens an Chloroform/Isoamylalkohol 49:1 zugegeben und wieder per Hand geschüttelt bis die Suspension milchig trüb war (einige Sekunden). Die Suspension wurde für 15 Minuten auf Eis gestellt und danach für 15 Minuten bei 14000 RPM bei 4°C (Eppendorf Zentrifuge 5417R) zentrifugiert, wodurch es zur Phasentrennung kam. Die obere wässrige Phase wurde in ein neues 1,5 ml Eppendorfreaktionsgefäß überführt und das gleiche Volumen an -20°C kaltem 2-Propanol zugefügt. Nach der Präzipitation bei -20°C für eine 52 2 Material und Methoden Stunde erfolgte eine weitere Zentrifugation für 30 Minuten bei 20000 x g bei 4°C (Eppendorf Zentrifuge 54.17R). Der Überstand wurde im Anschluss abgekippt und das Pellet einmal in 20°C kaltem 80 %-igem Ethanol für 7 Minuten bei 20000 x g bei 4°C (Eppendorf Zentrifuge 5417R) gewaschen. Das Ethanol wurde abgesaugt und das Pellet 3 Minuten trocknen gelassen und in 10 µl A. dest. aufgenommen. Die RNA-Konzentration wurde am Nano Drop bestimmt und die gewonnene RNA bei -80°C gelagert. Die RNA wurde mit DNase behandelt, um eine DNA-Kontamination auszuschließen. Zu maximal 10 µg RNA in 10 µl wurde 5 µl des folgenden Mastermixes zugegeben: 1,5 µl 10 x Reaktionspuffer 0,125 µl DNase 3,375 µl H2O (kohleabsorbiert und 2 x steril filtriert) Die DNAse Behandlung erfolgte bei 37°C für 45 Minuten. Zur Inaktivierung der DNAse wurden 1,5 µl 25 mM EDTA zugegeben und für 10 Minuten bei 65°C inkubiert. Solution D: 47,3 g Guanidium-thiocyanat (4 M) wurden in 50 ml H2O (kohleabsorbiert und 2x steril filtriert) gelöst; 0,5 g N-Laurosylsarcsine (0,5 %) und 2,5 ml 1 M Natrium-Acetat wurden hinzugegeben. Die Lösung wurde auf pH 7,0 eingestellt und auf 100 ml aufgefüllt. 2.13 Reverse Transkription Das „Roche expand Reverse Transkriptase"-Kit wurde verwendet, um aus der gewonnen RNA cDNA zu erhalten. Zu maximal 1,5 µg RNA in einem Volumen von 4,75 µl wurden 0,5 µl Oligo dTs (111 pg/ml) gegeben und 10 Minuten bei 65°C inkubiert. Im Anschluss wurden 4,75 µl des folgenden Mastermix zugegeben: 2 µl 5 x Expand Reverse transcriptase Puffer 1 µl 100 mM DTT 1 µl dNTPs (10 mM) 0,25 µl 0,5 µl RNase Inhibitor 40 U/µl (Promega) Expand reverse Transcriptase (50 U/µl) 53 2 Material und Methoden Die Inkubation erfolgte bei 43°C für eine Stunde. Die gewonnene cDNA wurde bei -20°C gelagert. 2.14 Polymerase­Ketten­Reaktion (PCR; polymerase chain reaction) Fas Ligand Die Genexpression wurde mit Hilfe der Polymerase-Kettenreaktion untersucht. Hierfür wurden in 0,2 ml PCR-Gefäße 23,5 µl bzw. 24 µl des folgenden Mastermixes zu 1,5 µl bzw. 1 µl cDNA oder 1,5 µl bzw. 1 µl A. dest. (Negativkontrolle) gegeben: β-Aktin Fas Ligand 17,3 µl H2O (KA 2xS) 8,5 µl 2,5 µl 10 x PCR Puffer E mit (NH4)2 und MgCl2 H2O (KA 2xS) 12,5 µl Hotstart Mastermix 1 µl Primer Sense (10 µM) 1,25 µl Primer Sense (10 µM) 1 µl Primer Antisense (10 µM) 1,25 µl Primer Antisense (10 µM) 2 µl dNTPs 0,2 µl Hotstart Taq DNA-Polymerase 24 µl 23,5 µl + 1 µl cDNA/A. dest. + 1,5 µl 25 µl Gesamtvolumen 25 µl cDNA/A. dest. Gesamtvolumen Bei dem Hotstart Mastermix handelt es sich um eine vorgefertigte Mischung aus chemisch modifizierter Taq-Polymerase, dNTPs, MgCl2 und Reaktionspuffer. Die Reaktion erfolgte in einem Thermocycler T3 (Biometra). β-Aktin Fas Ligand Aktivierung der Polymerase 95°C 3 Minuten 95°C 15 Minuten Denaturierung 95°C 30 Sekunden 95°C 45 Sekunden Anlagerung 56°C 30 Sekunden 60°C 30 Sekunden Elongation 72°C 30 Sekunden 72°C 45 Sekunden Zyklenzahl 30 31 Im Anschluss wurden die Proben gelelektrophoretisch aufgetrennt. 54 2 Material und Methoden TRAIL und TNF-α Die quantitative Bestimmung von TNF-α- und TRAIL-mRNA über cDNA Transkripte wurde mittels quantitativer Real-Time PCR und dem „LightCycler 2.0 Real-Time PCR System“ (Roche) untersucht. Es wurden neben Primern für das TNF-α- und TRAIL-Gen Primer für das Maus ß-Aktin-Gen verwendet, um die eingesetzten cDNA-Mengen auf die Expression des übiquitär exprimierten ß-Aktin-Gens zu normalisieren. Für die relative Quantifizierung der Ziel-Gene wurden 3-5 Verdünnungen einer Standard-cDNA verwendet und eine Negativkontrolle (H2O) wurde stets mitgeführt. Es wurden in Light Cycler Polycarbonat-kapillaren 9,0 µl bzw. 9,5 µl des folgenden Real-Time PCR Mastermixes zu 1,0 µl bzw. 0,5 µl cDNA oder Aqua dest. (Negativkontrolle) gegeben: TNF-α TRAIL β-Aktin H2O 3,5 µl 3,2 µl 3,7 µl Sybr Green 5,0 µl 5,0 µl 5,0 µl Primer Sense (10 µM) 0,5 µl 0,4 µl 0,4 µl Primer Antisense (10 µM) 0,5 µl 0,4 µl 0,4 µl 9,5 µl 9,0 µl 9,5 µl + 0,5µl + 1,0 µl + 0,5 µl 10 µl 10 µl 10 µl cDNA/A. dest. Gesamtvolumen Diese Reaktionsansätze wurden dann im Light Cycler nach folgenden Programmschemata amplifiziert: TNF-α TRAIL β-Aktin Aktivierung der Polymerase 95°C 15 min. 95°C 15 min. 95°C 15 min. Denaturierung 94°C 15 sek. 95°C 15 sek. 95°C 10 sek. Anlagerung 61°C 20 sek. 61°C 20 sek. 58°C 10 sek. Elongation 72°C 15 sek. 72°C 20 sek. 72°C 14 sek. Zyklenzahl 55 56 43 Nach jedem Elongationsschritt wurde die Fluoreszenz gemessen, welche proportional mit der PCR-Produktmenge zunahm. Nach erfolgter Amplifikation wurde eine Schmelzkurven55 2 Material und Methoden analyse der PCR-Produkte durchgeführt, um die Spezifität der Amplifikation zu überprüfen. Für die Datenverarbeitung wurde die Light Cycler Software Version 3 verwendet. Die mRNA-Expression für das Ziel-Gen wurde in relativen Einheiten angegeben und mit 105 multipliziert. 2.15 Agarose­Gelektrophorese Zur gelelektrophoretischen Auftrennung der DNA wurden die Proben auf ein 2%-iges Agarosegel aufgetragen. 2 g Agarose wurden in 100 ml 1 x TEA-Puffer gegeben und 3 Minuten gekocht. Die heiße, flüssige Agarose wurde in eine Gelkammer gegeben und nach 30-minütiger Polymerisation in eine mit 1 x TAE befüllte Laufkammer platziert. Die Proben (25 µl) wurden mit 5 µl 5 x Ladepuffer versetzt und 10 µl auf das Gel aufgetragen. Von dem DNA-Marker wurden 5µl aufgetragen (100 bp DNA Ladder; Invitrogen). Die Elektrophorese erfolgte bei 100 V für 1 Stunde. Das Gel wurde im Anschluss für 20 Minuten in einem Ethidiumbromidbad (1 x TAE, 100 ng/ml Ethidiumbromid) gefärbt und die DNA wurde unter UV-Licht fotografiert (FluorChemTM with Alpha Imager 3400 Software, Alpha Innotech, San Leandro, CA, USA). 5 x Ladepuffer: 2 ml 0,5 M Tris (HCl) pH7,3; 2 ml 0,5 M EDTA pH 8,0; 0,5 ml 2 % SDS; 1 ml Bromphenolblau TAE-Puffer 40 mM Tris-Acetat; 1 mM EDTA Ethidiumbromidbad 1 x TAE, 100 ng/ml Ethidiumbromid 2.16 TNF­α Bio­Assay Bei den 4 Tage in Kultur gewachsenen C5F6 Zellen (TNF-α sensitive L-929 Zellen) wurde der Überstand abgesaugt und die adhärent wachsenden Zellen mit 5 ml PBS-MC versetzt mit Trypsin/EDTA gelöst. Die Zellen wurden in ein mit 5 ml FCSi befülltes 50 ml Röhrchen überführt und bei 1200 RPM für 8 Minuten bei 20°C zentrifugiert. Der Überstand wurde abgesaugt und das Pellet in 10 ml Medium resuspendiert. Anschließend wurden die Zellen mit Medium auf 5 x 105 Zellen pro ml eingestellt. In die inneren 60 Vertiefungen einer flachen 96-Loch Platte (Nunc) wurden 100 µl Zellsuspension und in die äußeren Vertiefungen 100 µl 56 2 Material und Methoden Medium pipettiert. Im Anschluss wurden die Platten für 3 Stunden bei 37°C und 5 % CO2 kultiviert. Nach der dreistündigen Inkubationszeit wurde in jede Vertiefung 50 µl Actinomycin D zum Stoppen des Zellwachstums gegeben. TNF-α ist lethal für C5F6 Zellen, auf die Actinomycin D gegeben wurde. Tote Zellen können durch Waschen entfernt werden. Es wurden 50 µl von der Probe in eine Vertiefung mit der Zellsuspension und dem Actinomycin D gegeben. Von dem TNF-α-Standard wurde eine Doppelbestimmung gemacht. Die Standardwerte wurden in 1:2 Verdünnungen durchgeführt (300 bis 18,75 pg/ml). Als Nullwert wurde nur Medium gegeben. Die Inkubation erfolgte für 20 Stunden bei 37°C und 5 % CO2. Die Platten wurden zweimal in 1 x HBSS gewaschen, der Überstand wurde verworfen und die Platten auf Zellstoff abgeklopft. Anschließend wurde 50 µl Kristallviolett in jede Vertiefung gegeben und für 15 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert. Danach wurde zweimal mit Leitungswasser gewaschen. Auch hier wurde jeweils der Überstand verworfen und die Platten auf Zellstoff sanft abgeklopft. Im Anschluss wurden 50 µl einer KH2PO4/Ethanol Mischung pipettiert. Zum Lösen des Farbstoffes aus den Zellen wurden die Platten für 4 Minuten auf den Schüttler gestellt. Zum Schluss wurde die optische Dichte der Proben mit Hilfe eines ELISA-Readers bestimmt (Wellenlänge: 550 nm, Referenzwellenlänge: 690 nm). C5F6 Medium RPMI versetzt mit 10 % FCSi; 2 mM L-Glutamin; 100 U Penicillin pro ml; 100 µg Streptomycin pro ml; 10 mM HEPES; 60 µM βMercaptoethanol Actinomycin D 245 mg D-Mannitol werden in 50 ml PBS-MC gelöst und steril filtriert. 5 mg Actinomycin D werden mit 50 ml D-Mannitol gelöst. Kristallviolett 25g Kristall Violett, 50 ml Ethanol, 390 ml H2O dest., 60 ml Neutral Formalin. Nach Ansetzen filtrieren (Filter-Porengröße: 0,45µm). KH2PO4/Ethanol- 50 µl 0,1 M KH2PO4; 50 % Ethanol Mischung 2.17 Fas Ligand­ELISA Das „DuoSet ELISA Development Kit“ (R&D Systems, Minneapolis, USA) wurde für den Fas Ligand ELISA verwendet. Der Erstantikörper wurde 1:180 in 1 x PBS verdünnt 57 2 Material und Methoden (Konzentration: 4,0 µg/ml) und 50 µl in jede Vertiefung (außer dem BLANK) einer 96-LochPlatte gegeben. Es folgte zunächst eine Inkubation für zweimal 30 Minuten bei jeweils 37°C und bei Raumtemperatur und schlussendlich bei 4°C über Nacht. Danach wurde die Platte dreimal mit 300 µl Waschpuffer pro Vertiefung gewaschen und anschließend für zwei Stunden bei Raumtemperatur mit 300 µl 2% BSA in 1x PBS pro Vertiefung blockiert. Nach dreimaligem Waschen wurden 50 µl der Proben und 50 µl des rekombinanten FasL Standards aufgetragen. Die Proben und der Standard wurden in 1x Reagent Diluent (1 % BSA in 1x PBS) verdünnt und die Startkonzentration des Standards betrug 1000 pg/ml. Davon wurden mindestens vier 1:2 Verdünnungen aufgetragen. Die Platte wurde für zwei Stunden bei Raumtemperatur inkubiert und danach dreimal mit 300 µl Waschpuffer pro Vertiefung gewaschen, um ungebundene Antigene zu entfernen. Der Zweitantikörper wurde 1:90 in 1x Reagent Diluent (Konzentration: 0,8 µg/ml), in jede Vertiefung (außer dem BLANK) 50 µl gegeben und für zwei Stunden bei Raumtemperatur inkubiert. Überschüssige Zweitantikörper wurden durch dreimaliges Waschen (300 µl pro Vertiefung) entfernt und 50 µl des Enzyms SAP verdünnt in Reagent Diluent (Konzentration: 1,5 mg/ml) in jede Vertiefung, außer dem BLANK, pipettiert. Nach einer 30 minütigen Inkubationszeit wurde die Platte dreimal mit 300 µl Waschpuffer pro Vertiefung gewaschen. Das Substrat pNPP wurde in Substratpuffer verdünnt (Konzentration: 1mg/ml) und 50 µl in jede Vertiefung (inklusive BLANK) pipettiert. Die Platte wurde abgedunkelt und die optische Dichte nach 20-30 Minuten im ELISA-Reader (Tecan, Crailsheim) bei 492 nm gegen 405 nm als Referenzwert photometrisch gemessen. Die Nachweisgrenze betrug 62,5 pg Fas Ligand pro ml. Waschpuffer 0,1% Tween 20 in PBS Substratpuffer 50 mM Na2CO3; 2 mM MgCl2 2.18 TRAIL­ELISA Der Erstantikörper wurde 1:150 in 1 x PBS verdünnt (Konzentration: 3,3 ng/ml) und 50 µl in jede Vertiefung (außer dem BLANK) einer 96-Loch-Platte gegeben. Die Platte wurde über Nacht bei 4°C inkubiert und am nächsten Tag dreimal mit 300 µl Waschpuffer pro Vertiefung gewaschen und anschließend für 90 Minuten bei Raumtemperatur mit 300 µl 2% BSA in 1x PBS pro Vertiefung blockiert. Nach dreimaligem Waschen wurden 50 µl der Proben und 50 58 2 Material und Methoden µl des rekombinanten TRAIL-Standards aufgetragen. Die Proben und der Standard wurden in 1% BSA/PBS verdünnt und die Startkonzentration des Standards betrug 5000 pg/ml. Davon wurden sieben 1:2-Verdünnungen aufgetragen. Die Platte wurde für zwei Stunden bei Raumtemperatur inkubiert und danach dreimal mit 300 µl Waschpuffer pro Vertiefung gewaschen, um ungebundene Antigene zu entfernen. Der Zweitantikörper wurde 1:300 in 1 x PBS verdünnt (Konzentration: 50 µg/ml), in jede Vertiefung (außer dem BILANK) 50 µl gegeben und für 45 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert. Überschüssige Zweitantikörper wurden durch dreimaliges Waschen (300 µl pro Vertiefung) entfernt und 50 µl des Enzyms SAP verdünnt in 0,5 % BSA in PBS (Konzentration: 1 µg/ml) in jede Vertiefung, außer dem BLANK, pipettiert. Nach einer 30 minütigen Inkubationszeit wurde die Platte dreimal mit 300 µl Waschpuffer pro Vertiefung gewaschen. Das Substrat pNPP wurde in Substratpuffer verdünnt (Konzentration: 1mg/ml) und 50 µl in jede Vertiefung (inklusive BLANK) pipettiert. Die Platte wurde abgedunkelt und die optische Dichte nach 20-30 Minuten im ELISA-Reader (Tecan, Crailsheim) bei 492 nm gegen 405 nm als Referenzwert photometrisch gemessen. Die Nachweisgrenze betrug 78 pg TRAIL pro ml. Waschpuffer 0,1% Tween 20 in PBS Substratpuffer 50 mM Na2CO3; 2 mM MgCl2 2.19 Aufstellung der verwendeten Materialien Zellkultur Zelllinien L929 Fibroblasten Die L929 Fibroblasten-Zelllinie wurde freundlicherweise vom Max-Planck-Institut für Immunbiologie und Epigenetik in Freiburg (Labor Frau Prof. M. Freudenberg) zur Verfügung gestellt. Ursprünglich gehen diese Zellen auf L. J. Old (Kettering Institute, New York, USA) zurück. 59 2 Material und Methoden Malignes Melanom Die Melanom-Zelllinie wurde freundlicherweise vom Max-Planck-Institut für Immunbiologie und Epigenetik in Freiburg (Labor Frau Prof. M. Freudenberg) zur Verfügung gestellt. Tramp Prostatakarzinom Die Tramp Prostatakarzinom-Zelllinie wurde freundlicherweise vom Max-Planck-Institut für Immunbiologie und Epigenetik in Freiburg (Labor Frau Prof. M. Freudenberg) bereitgestellt. Diese wurde käuflich von der Firma ATCC erworben (Tramp-C1, ATCC CRL-2730). Meth-A Fibrosarkom Die Meth-A Fibrosarkom-Zelllinie wurde freundlicherweise vom Max-Planck-Institut für Immunbiologie und Epigenetik in Freiburg (Labor Frau Prof. M. Freudenberg) zur Verfügung gestellt. Dieses Fibrosarkom wurde mittels kutaner Applikation von 3-Methylcholanthren in Mäusen induziert. EL-4 Lymphom Die EL-4 Lymphom-Zelllinie wurde freundlicherweise vom Max-Planck-Institut für Immunbiologie und Epigenetik in Freiburg (Labor Frau Prof. M. Freudenberg) zur Verfügung gestellt. C5F6 Zellen Die Bereitstellung sowie die Kultivierung von C5F6 Zellen (subklonierte TNF-sensitive L929 Fibroblasten), die im TNF-α Bio-Assay zum Einsatz kamen, wurde freundlicherweise vom Max-Planck-Institut für Immunbiologie und Epigenetik in Freiburg (Labor Frau Prof. M. Freudenberg) übernommen. Zellkulturmedien DMEM (Dulbeccos Modified Eagles Medium): DMEM mit viel Glukose (4,5 g/l) wurde aus INSTAMED Puder (Biochrom AG, Berlin) nach Anweisung des Herstellers hergestellt und durch Filtration sterilisiert. 60 2 Material und Methoden RPMI (RPMI 1640): RPMI-Medium wurde aus INSTAMED Puder (Biochrom AG, Berlin) nach Anweisung des Herstellers hergestellt und durch Filtration sterilisiert. Tabelle 2.2: Übersicht der zu den Kulturmedien hinzugefügten Zusätze Zusätze FCSi (fetal calf serum) Sigma (Deisenhofen) HEPES 1M Gibco Invitrogen (Karlsruhe) L-Glutamin Sigma (Deisenhofen) β-Mercaptoethanol Sigma (Deisenhofen) Natrium Pyruvat Gibco Invitrogen (Karlsruhe) Penicillin/Streptomycin Sigma (Deisenhofen) Insulin Sigma (Deisenhofen) Dehydroandrosteron Sigma (Deisenhofen) Nu-Serum IV Becton Dickinson (Heidelberg) FCSi wurde bei 56°C für eine Stunde inaktiviert. Hämatoxylin-Eosin-Färbung Tabelle 2.3: Materialien für HE-Färbung Material Hersteller CultureSlides, 4-well BD Biosciences (San Jose, USA) SuperFrost Plus Objektträger R. Langenbrinck (Emmendingen) Mercofix Fixationsspray Merck (Darmstadt) Hämatoxylin nach Gill Merck (Darmstadt) Eosin Merck (Darmstadt) Xylol Merck (Darmstadt) 61 2 Material und Methoden Probenvorbereitung für Western Blot Tabelle 2.4: Materialien für die Probenvorbereitung für den Western Blot Material Hersteller Nonidet-P40 (NP40) Sigma (Deisenhofen) Bromphenolblau Sigma (Deisenhofen) SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese (PAGE) Tabelle 2.5: Materialien für die SDS-PAGE Material Hersteller Mini-vertical System BioRad (München) Acrylamid (Rotiphorese 30 mit 30% Acrylamid; 0,8% Bisacrylamid) Roth (Karlsruhe) N,N,N‘,N‘-Tetramathylen-diamin (TEMED) Sigma (Deisenhofen) 10 % APS (10 % (w/v) Ammonium peroxydisulfat) Merck (Darmstadt) Proteinmarker BioRad (München) Western Blot Tabelle 2.6: Materialien für Western Blot Material Hersteller Nitrozellulosemembran (0,45 µm) BioRad Laboratories (München) Filterpapier PerkinElmer (Rodgau) Mini Trans-Blot cell BioRad Laboratories (München) Polyclonal rabbit anti-mouse Bax antibody BD Biosciences (San Jose, USA) Polyclonal rabbit anti-mouse Bcl-2 antibody BD Biosciences (San Jose, USA) Polyclonal anti-actin (I-19) (sc-1616) Santa Cruz Biotechnology (Heidelberg) Goat anti-rabbit-HRPO Pierce (Rockford, USA) ECLplus western blotting detection system GE Healthcare (Buckinghamshire, UK) High Performance Chemiluminescence Filme 62 GE Healthcare (Buckinghamshire UK) 2 Material und Methoden Immunzytologie Tabelle 2.7: Materialien für die Immunzytologie Material Hersteller Glutardialdehyd (25 %) Serva (Heidelberg) D-Glukose wasserfrei Merck (Darmstadt) DMSO (Dimethyl sulfoxide) Merck Schuchardt OHG (Hohenbrunn) Triton X-100 Merck (Darmstadt) BSA (bovine serum albumin) Biotest (Dreieich) Gelatine Roth (Karlsruhe) HEPES, 1 M, pH 7,4 Gibco Invitrogen (Karlsruhe) Ziegenserum Dako (Carpinteria, CA, USA) H2O2 (30%) J.T. Baker (Deventer, NL) Vectastain ABC-Kit (Standard) Vector Laboratories (Burlingame, CA, USA) Liquid DAB+ Substrate Chromogen System Dako (Carpinteria, USA) Aquatex (wässriges Eindeckmedium) Merck (Darmstadt) CultureSlides, 8-well BD Biosciences (San Jose, USA) Adhäsionsobjektträger n. Prof. Bross Marienfeld Superior (Lauda-Königshofen) Polyclonal rabbit anti-mouse Bax antibody BD Pharmingen (Franklin Lakes, USA) Polyclonal rabbit anti-mouse Bcl-2 antibody BD Pharmingen (Franklin Lakes, USA) Biotinylated goat anit-rabbit IgG Vector Laboratories (Burlingame, CA, USA) Liquid Blocker Stift Dako (Carpinteria, USA) Deckgläser (24 x 60 mm) R. Langenbrinck (Emmendingen) Natriumazid Merck (Darmstadt) Nagellack Dr. Scheller Cosmetics AG (Eislingen) Mausserum wurde freundlicherweise vom Max-Planck-Institut für Immunbiologie und Epigenetik in Freiburg (Labor Frau Prof. M. Freudenberg) zur Verfügung gestellt. 63 2 Material und Methoden RNA-Extraktion Tabelle 2.8: Materialien für RNA-Extraktion Material Hersteller Guanidium-thiocyanat (4M) Fluka (Steinheim) N-Laurosylsarcosine (0,5 %) Sigma (Deisenhofen) Natrium-Acetat Merck (Darmstadt) Phenol, flüssig Roth (Karlsruhe) Chloroform/Isoamylalkohol 49:1 Fluka (Steinheim) 2-Propanol J.T. Baker (Deventer, Niederlande) 10 x Reaktionspuffer Fermentas (St. Leon-Rot) DNAse: Desoxyribonuclease I Fermentas (St. Leon-Rot) EDTA 25 mM Fermentas (St. Leon-Rot) β-Mercaptoethanol Sigma (Deisenhofen) Reverse Transkription Tabelle 2.9: Materialien für Reverse Transkription Material Hersteller Oligo dT (111 pg/ml) Hermann (Denzlingen) 100 mM DTT (Dithiothreitol) Roche (Grenzach-Whylen) 5x Expand Reverse Transkriptase Puffer Roche (Grenzach-Whylen) Expand Roche Reverse Transkriptase (50 U/µl) Roche (Grenzach-Whylen) Nucleosid Triphosphat Set, PCR grade Roche (Grenzach-Whylen) RNAse Inhibitor Promega (Mannheim) 64 2 Material und Methoden Polymerase-Kettenreaktion Tabelle 2.10: Materialien für PCR Material Hersteller 10x Hotstart PCR-Puffer E mit (NH4)2 mit MgCl2 Genaxxon (Biberach) Hotstart Taq DNA-Polymerase Genaxxon (Biberach) Nucleosid Triphosphat Set, PCR grade Roche (Grenzach-Whylen) Sybr Green Qiagen N.V. (Venlo, NL) Hotstart Mastermix Genaxxon (Biberach) PCR-Reaktionsgefäße Biozym Scientific (Oldendorf) Light Cycler Polycarbonatkapillaren Genaxxon (Biberach) Synthetische Oligonukleotide (Primer): Diese wurden HPLC gereinigt und von der Firma Eurofins mwg/operon (Ebersberg) bezogen. Die Primer wurden in Aqua dest. nach Anweisung des Herstellers verdünnt und bei -20°C gelagert. Tabelle 2.11: Primersequenzen Primer Sequenz (5‘ Æ 3‘) β-Aktin sense GTC CAC ACC CGC CAC CAG TTC G β-Aktin antisense GGA ATA CAG CCC GGG GAG CAT CGT C Fas Ligand sense AGC TCT TCC ACC TGC AGA AGG Fas Ligand antisense CAG CCC CAA GCT TTA TGT CCC TNF-α F sense AGG GGC CAC CAC GCT CTT CTG TCT ACT G TNF-α R antisense GCT ACG ACG TGG GCT ACA GGC TTG TCA CT TRAIL F sense CCC TTG CCC AGA GGT GGA AGA CCT TRAIL R antisense ACA GGC CCT CCT GCT CGA TGA C 65 2 Material und Methoden Agarose-Gelelektrophorese Tabelle 2.12: Materialien für Agarose-Gelelktrophorese Material Hersteller Agarose Roth (Karlsruhe) Bromphenolblau Sigma (Deisenhofen) 100 bp DNA Ladder (Marker) Invitrogen (Karlsruhe) Ethidiumbromid (10 mg/ml) Sigma (Deisenhofen) FluorChemTM with Alpha Imager 3400 Software Alpha Innotech (San Leandro, USA) TNF-α Bio-Assay Tabelle 2.13: Materialien für TNF-α Bio-Assay Material Hersteller D-Mannitol Sigma (Deisenhofen) Actinomycin D (# A-1410, 10 mg) Sigma (Deisenhofen) Kristall Violett (# C-3886, 25 g) Sigma (Deisenhofen) Kaliumhydrogenphosphat Merck (Darmstadt) Neutral Formalin Roth (Karlsruhe) ELISA Tabelle 2.14: Materialien für Fas Ligand- und TRAIL-ELISA Substanz Hersteller Reagent Diluent (1 % BSA in PBS, pH 7,2 – 7,4) (R&D Systems # DY995) R&D Systems (Minneapolis, USA) Erstantikörper: Rat anti-mouse Fas Ligand monoclonal antibody (DuoSet ELISA Development Kit DY526) R&D Systems (Minneapolis, USA) Purified Anti-mouse TRAIL Biolegend (San Diego, USA) Zweitantikörper: 66 2 Material und Methoden Biotinylated goat anti-mouse Fas Ligand antibody (DuoSet ELISA Development Kit DY526) R&D Systems (Minneapolis, USA) Biotinylated goat anti-mouse secondary antibody Biolegend (San Diego, USA) Standard: Recombinant mouse Fas Ligand (DuoSet ELISA Development Kit DY526) R&D Systems (Minneapolis, USA) Recombinant mouse TRAIL Biolegend (San Diego, USA) Enzym: SAP (Streptavidin-alkalische Phosphatase) mg/2 ml) (3 Zymed Lab. Inc. (San Francisco, USA) Substrat: p-Nitrophenyl-Phosphat (PNPP) Tabletten (5 mg) Sigma (Deisenhofen) Puffer und Lösungen Es wurde immer zweifach destilliertes, deionisiertes Wasser verwendet. 10x PBS (Phosphat-gepufferte Kochsalzlösung): 1,37 M NaCl; 87,65 mM NaH2PO4 x H2O auf pH 6,6 eingestellt mit NaOH. Nach der Verdünnung wurde die gebrauchsfertige Lösung (1x PBS) auf pH 7,2 eingestellt. 1x PBS-MC: 137 mM NaCl; 2,7 mM NaH2PO4 x H2O; 1,5 mM NaH2PO4; pH 7,2. Durch Autoklavieren wurde die Lösung sterilisiert. 1x NKH: NaCl 8g, KCl 0,4g, HEPES-Puffer 2ml, Aqua dest. ad 1000ml. 10x HBSS (Hanks Balanced Solution): 1,37 M NaCl; 53,7 mM KCL; 8,1 mM Mg SO4 x 7 H2O; 3,4 mM NaH2PO4 x 2 H2O; 4,4 mM KH2PO4; 55,5 mM D-Glikose; 12,7 mM CaCl2 x 2 H2O. Nachdem die Lösung filtriert wurde, wurde sie auf 1x HBSS verdünnt und der pH auf 7,4 eingestellt. 67 2 Material und Methoden Pyrogenfreiese, kohleabsorbiertes Wasser bzw. PBS (H2O KA 2xS; PBS KA 2xS): 20 g/l Aktivkohle wurden in Glasflaschen (hitzefest) für 2 Stunden bei 220°C hitzesterilisiert. Anschließend wurde zweifach destilliertes Wasser bzw. PBS zugegeben und durch Invertieren vermischt. Die Suspension wurde autoklaviert und nach dem Abkühlen und Sedimentieren der Kohlepartikel wurde der Überstand zweimal steril filtriert. Reagenzien Tabelle 2.15: Aufstellung der verwendeten Reagenzien Substanz Hersteller BSA (bovine serum albumin) Roche (Grenzach-Whylen) DMSO Merck (Darmstadt) EDTA Merck (Darmstadt) Ethanol J.T. Baker (Deventer, Niederlande) Glycerin Merck (Darmstadt) Glycin Roth (Karlsruhe) Isopropanol Merck (Darmstadt) Magnesiumchlorid Merck (Darmstadt) Mercaptoethanol Sigma (Deisenhofen) Methanol J.T. Baker (Deventer, Niederlande) Natriumcarbonat Merck (Darmstadt) Natriumchlorid Merck (Darmstadt) Salzsäure (HCl) J.T. Baker (Deventer, Niederlande) SDS (Sodiumdodecylsulfat) Serva (Heidelberg) Tris-Acetat Sigma (Deisenhofen) Tris-Base Sigma (Deisenhofen) Tris-HCl Sigma (Deisenhofen) Trypanblau-Lösung Sigma (Deisenhofen) Trypsin-EDTA Gibco (Invitrogen) Tween 20 Roth (Karlsruhe) 68 2 Material und Methoden Gebrauchwaren Tabelle 2.16: Aufstellung der verwendeten Gebrauchwaren Gebrauchware Hersteller 15 und 50 ml Reaktionsgefäße (blue caps) BD Falcon (Heidelberg) 24-Loch Zellkulturplatten Greiner Bio-One (Frickenhausen) 96-Loch Zellkulturplatten (Flach- oder Rundboden) Nunc (Roskilde, Dänemark) Einmalpipettenspitzen Greiner Bio-One (Frickenhausen), Eppendorf (Hamburg), Matrix (Lowell, USA) Einmalspritzen Becton Dickinson (Heidelberg) ELISA Platte Maxisorb Sarstedt (Nümbrecht) Eppendorfreaktionsgefäße (1 ml - 2 ml) Eppendorf (Hamburg) Kanülen Termuo (Leuven, Belgien) Luminometer-Röhrchen Nunc (Roskilde, Dänemark) Multipipettenspitzen (combitips) Eppendorf (Hamburg) Pasteurpipetten Roth (Karlsruhe) PCR-Reaktionsgefäße Biozym Scientific GmbH (Oldendorf) Zellkulturflaschen Cellstar Greiner Bio-One (Frickenhausen) Pipetten Eppendorf (Hamburg); Gilson (Middleton,USA) Kryoröhrchen Corning Inc. (NY, USA) Neubauerkammer improved Optik Labor (Bad Homburg) Cytoclip Objektträger-Halterungsclip Thermo Scientific (Waltham, Massachusetts) Präparatekammer für Zytospin-Zentrifuge Thermo Scientific (Waltham, Massachusetts) Filterkarten für Zytospin-Zentrifuge Thermo Scientific (Waltham, Massachusetts) Spitzenfilter (0,45 µm) Millipore (Billerica, USA) 69 2 Material und Methoden Geräte Tabelle 2.17: Aufstellung der verwendeten Geräte Gerät Hersteller Brutschränke Heraeus (Hanau); Memmert (Schwabach) Eismaschine Ziegra (Isernhagen) Gefrierschrank HERAfreeze (-80°C) Heraeus (Langenselbold) Gelelektrophorese-Kammer Gibco Invitrogen (Karlsruhe); Biorad (München) Inkubator Heraeus (Hanau) Kühlschrank Dometic Medical Systems (Hosingen, Luxembourg) Mikroskop Axioskop Zeiss (Jena) Multipipetten Eppendorf (Hamburg) NanoDrop ND-1000 Spectrophotometer NanoDrop (Wilmington, DE, USA) Phasenkontrastmikroskop Axiovert 40 CFL Zeiss (Jena) Photometer für 96-Loch Platten EAR400 TECAN/SLT (Crailsheim) Schüttler (Polymax 1040) Heidolph (Schwabach) Sterilbank Hera Cell Heraeus (Hanau) Thermal-Cycler T3 (für PCR) Biometra (Göttingen) Tischzentrifuge Roth (Karlsruhe) Vortexer Heidolph (Schwabach) Waschautomat für 96-Lochplatten Thermo Scientific (Dreieich) Wasserbad Certomat WR B.Braun (Melsungen) Zentrifuge Eppendorf 5417 R Eppendorf (Hamburg) Zentrifuge Multifuge 3L-R Thermo Scientific (Waltham, Massachusetts) Zytozentrifuge Cytospin 4 Thermo Scientific (Waltham, Massachusetts) LightCycler 2.0 Real-Time PCR System Roche (Grenzach-Whylen) 70 3 Ergebnisse 3 Erg gebnisse 3.1 P Prolifera ationsverrhalten P nsverhaltenss wurden für f die muurinen Tum morzellen Zur Chharakterisierrung des Proliferation Wachstuumskurven sowie Mitooseindexverrläufe erstelllt und aus den zugrunnde liegendeen Daten spezifische meter Wachhstumsparam erm mittelt (sieehe 2.5, 2.7). Zudem konn nte die Zellmorrphologie soowie das alllgemeine Wachstumsm W muster der Tumorzellen T n beurteilt werden. w n 3.1.1 L929 Fibrroblasten Morph hologie Zur moorphologiscchen Darsteellung wurrden L929 Fibroblasten auf Kaammerobjek ktträgern kultiviert und mit m Hämatooxylin-Eosinn angefärb bt (Abbilduung 3.1.1). Zu Beg ginn der Kultivieerung lagenn die Fibroblasten nochh in abgerun ndeter Form m vor. Erst m mit der Zeit bildeten sie vielee zytoplasm matische Zelllfortsätze aus, a nahmen n eine längliiche, oft auuch dreieckige Form an und zeigten einn insgesam mt homogennes Wachstu umsmuster mit netzarrtiger Struk ktur. Die Zellkernne waren rund r bis ovval mit feiinem Chromatin und von basopphilem Zyttoplasma umgebeen. Mitotischhe Zellen unterschiede u en sich durch ihre abgerrundete Forrm und den deutlich sichtbarren Mitosefi figuren (siehhe Pfeile). Die D Fibroblaasten wuchssen einschicchtig. Abbildu ung 3.1.1: L929 L Fibroblasten nach H.E.- Färbu ung unter deem Fotolichhtmikroskop bei 400facher Prrimärvergrößßerung. Daraaus vergrößerter Ausschn nitt (rechts). Pfeile P zeigenn mitotische Zellen. 71 3 Ergebnisse Wachstumskurve Abbildung 3.1.2 zeigt die Wachstumskurve der L929 Fibroblasten nach Beobachtung von Gesamtzellzahl und Lebendzellzahl über einen Zeitraum von 15 Tagen. Auf der Ordinate sind die Gesamtzellzahlen sowie die Lebendzellzahlen (x 103), auf der Abszisse die Zeit in Tagen jeweils linear aufgetragen. Es ergibt sich ein sigmoidaler Kurvenerlauf mit exponentieller Anfangsphase bis Tag sechs. In dieser Phase nimmt die Zellzahl während jedes Zeitabschnittes um einen konstanten Faktor von etwa drei zu. Ab Tag sieben verlangsamt sich das Wachstum aufgrund mangelnder Ressourcen wieder und geht in eine Plateauphase über, die bis Tag 13 aufrecht erhalten werden kann. Dabei wird eine maximale Zelldichte von durchschnittlich 9,47 x 105 Zellen pro cm2 bzw. ein durchschnittlicher Ertrag von 1,8 x 106 erreicht. Im Anschluss ab Tag 13 nehmen Gesamt- wie auch Lebendzellzahl ab, womit die Absterbephase der Kultur eingeleitet wird. Dies zeigt sich besonders eindrücklich in der Zeit von Tag 14 auf Tag 15. Abbildung 3.1.2: Lineare Darstellung der Wachstumskurve von L929 Fibroblasten. Aufgetragen sind die Gesamtzellzahlen und vitale Zellzahl gegen die Zeit in Tagen. 72 3 Ergebnisse Populationsverdopplungszeit und Generationszeit Abbildung 3.1.3 zeigt eine halblogarithmische Darstellung der Wachstumskurve der L929 Fibroblasten. Dabei wird der Logarithmus der Gesamtzellzahlen auf der Ordinate gegen die Zeit in Tagen (linear) auf der Abszisse aufgetragen. Abbildung 3.1.3: Halblogarithmische Darstellung der Wachstumskurve von L929 Fibroblasten. Aufgetragen sind die Gesamtzellzahlen gegen die Zeit in Tagen. Die Populationsverdopplungszeit td kann aus dem vergrößerten Ausschnitt der Wachstumskurve abgelesen werden. Der Wachstumsverlauf in den ersten sechs Tagen stellt sich in dieser Darstellung annäherungsweise als Gerade dar und unterstreicht die Tatsache, dass es sich in diesem Zeitraum um ein exponentielles Wachstum handelt („log-Phase“). Eine „lag-Phase“ im Sinne einer anfänglichen Anlaufphase kann nicht beobachtet werden. Wie auch in Abbildung 3.1.2 findet ab Tag sechs der Übergang in die Plateauphase statt. Durch Ablesen der Zeit, die es braucht, damit sich die Zellzahl in der „log-Phase“ von 50 x 103 auf 100 x 103 Zellen verdoppelt, kann die Populationsverdopplungszeit graphisch ermittelt werden und beträgt für die Fibroblasten ca. 16,3 h (siehe Auschnittsvergrößerung in Abbildung 3.1.3). Für die Berechnungen von Populationsverdopplungs- und Generationszeit wurden die Gesamtzellzahlen an Tag null (t=0 h, N0=2 x 103 Zellen) und Tag sechs (t=147,09 h, N6=874,7 x 103) verwendet. Rechnerisch ergibt sich bei einer exponentiellen Wachstumsrate µ von 0,0413 eine Populationsverdopplungszeit td von 16,77 h, d.h. alle 16,77 h verdoppelt sich die Gesamtzellzahl oder pro 24-Stundenintervall wächst die Zahl annäherungsweise um den konstanten Faktor 2,86. Für den beschriebenen Zeitraum lässt sich 73 3 Ergebnisse eine Generationszahl n = 8,773 und eine Generationsverdopplungszeit tg von 16,77 h errechnen (Teilungsrate v = 1,43 / 24h). Mitoseindex Abbildung 3.1.4 zeigt den zeitlichen Verlauf der Mitoseindices in Prozent über elf Tage für L929-Fibroblasten. Abbildung 3.1.4: Mitoseindices (in Prozent) von L929 Fibroblasten aufgetragen gegen die Zeit in Tagen Beginnend mit einem Mitoseindex von 7,65 % an Tag eins zeichnet sich an Tag drei ein Maximum der mitotischen Aktivität mit 9,5 % ab. Im Anschluss nimmt der Anteil von Zellen in der Zellteilung an der Gesamtzellzahl kontinuierlich bis Tag neun ab, um sich dann zum elften Tag hin auf ca. 0,8 % einzupendeln. Gemittelt ergibt sich ein Mitoseindex von 8,13 % während der exponentiellen Phase (Tag eins bis fünf). 74 3 Ergebnisse Gegenüberstellung Wachstumskurve und Mitoseindex Abbildung 3.1.5 zeigt die beiden Proliferationskriterien Wachstumskurve und Mitoseindex der L929 Fibroblasten in graphischen Zusammenhang. Es zeigt sich, dass die mitotische Aktivität der L929-Fibroblasten zur Mitte der exponentiellen Wachstumsphase der Kultur maximal wird (Tag drei) und zur Plateauphase hin abfällt. Abbildung 3.1.5: Gegenüberstellung der Wachstumskurve und des Mitosindexverlaufes von L929 Fibroblasten 75 3 Ergebnisse 3.1.2 Malignes Melanom m Morph hologie (Ab bbildung 3.1.6) 3 Nach Anfärben A m Hämatooxylin-Eosinn zeigt sicch folgendees morphollogisches Bild mit B der Maligneen Melanom m-Zellen: Abbilldung 3.1.6: Maligne MeelanomZellen n nach H.E.-F Färbung unteer dem Fotoliichtmikroskoop bei 100-faacher (links oben), 200-facher (rechts obenn) und 400facherr (links untenn) Primärverrgrößerung. Pfeilee zeigen mitootische Zellenn. In der 100-fachen 1 Primärverggrößerung zeigt z sich ein e inselartiiges Wachsstum der MelanomM Zellen. Ausgehendd von eineem Wachstuumszentrum m von wennigen, zunäächst abge-rrundeten r sich die Nachkommen außßen an, bis sich die Innseln berühren und sch hließlich Zellen reihen konfluieeren. Dabeii bilden die Zellen teeils sehr laange zytoplasmatische Fortsätze aus und stehen mit m diesen oftmals übber längeree Strecken in Kontakt. Zusammeen mit den oftmals spindeliigen und poolygonalen Zellleibernn entsteht eiin unruhigees und impuulsives Wacchstumsmuster. Nach Erreeichen der Konfluenz K wachsen diie Melanom m-Zellen m mehrschichtig g weiter und türm men sich zuu Zellhügelln auf. Aucch hier lasseen sich die mitotischenn Zellen du urch ihre abgerunndete Form m und ihre sichtbaren Chromoso omen deutllich untersccheiden. Veereinzelt konnte auch intraazytoplasmaatisches dunkelbraunes Pigment melaninhaaltiger Tum morzellen entdeckkt werden. 76 3 Ergebnisse Wachstumskurve Für die Malignen Melanom-Zellen ergab sich nach Beobachtung von Gesamtzellzahl und Vitalität über elf Tage hinweg die in Abbildung 3.1.7 dargestellte Wachstumskurve, bei der Gesamt- und Lebendzellzahl (x 103) auf der Ordinate und die Zeit in Tagen auf der Abszisse linear aufgetragen wurden. Abbildung 3.1.7: Lineare Darstellung der Wachstumskurve von Maligne Melanom-Zellen. Aufgetragen sind die Gesamt- und Lebendzellzahlen gegen die Zeit in Tagen. Die rote Linie markiert den maximalen Ertrag der Kultur unter den gegebenen Bedingungen. Es zeigt sich ebenfalls ein sigmoidaler Kurvenverlauf mit exponentiellem Wachstum bis Tag fünf. Dabei wächst die Gesamtzellzahl während jedes 24-Stunden-Zeitintervalls ca. mit dem Faktor 3,5. Zwischen Gesamt- und Lebendzellzahl besteht kein großer Unterschied. Ab Tag fünf verlangsamt sich das Zellwachstum und es zeichnet sich der Übergang in eine Plateauphase ab. Diese Plateauphase ist jedoch nicht stabil, denn es kommt bereits ab Tag sechs zur Abnahme der vitalen Zellen und ein frühzeitiger Übergang in die Absterbephase zeichnet sich ab. Es wird eine maximale Zelldichte von durchschnittlich 7,8 x 105 Zellen pro cm2 bzw. ein Ertrag von 1,5 x 106 Zellen erreicht. 77 3 Ergebnisse Populationsverdopplungszeit und Generationszeit Die halblogarithmische Auftragung der Gesamtzellzahlen (Ordinate) gegen die Zeit in Tagen (Abszisse) für Maligne Melanom-Zellen zeigt Abbildung 3.1.8. Abbildung 3.1.8: Halblogarithmische Darstellung der Wachstumskurve von Malignen MelanomZellen. Aufgetragen sind die Gesamtzellzahlen und vitalen Zellzahlen gegen die Zeit in Tagen. Die Populationsverdopplungszeit td kann aus dem vergrößerten Ausschnitt der Wachstumskurve (rechtes Schaubild) abgelesen werden. Vergleichbar mit dem Verlauf der Wachstumskurve der Fibroblasten stellt sich die Phase des exponentiellen Wachstums als Gerade dar („log-Phase“), die zur graphischen Ermittlung der Populationsverdopplungszeit herangezogen wurde. Eine „lag-Phase“ ist auch hier nicht von der „log-Phase“ abgrenzbar. Entsprechend Abbildung 3.1.7 markiert Tag fünf den Beginn der Plateauphase. Für die Malignen Melanom-Zellen konnte graphisch eine Populationsverdopplungszeit von 13,5 h ermittelt werden (siehe Auschnittsvergrößerung in Abbildung 3.1.8). Die Gesamtzellzahlen an Tag 0 (t0=0 h, N0=2 x 103 Zellen) und Tag fünf (t5=121,5 h, N5=892,97 x 103 Zellen) dienten der Berechnung von Populationsverdopplungs- und Generationszeit. Bei einer exponentiellen Wachstumsrate µ von 0,0502 ergab sich eine Populationsverdopplungszeit td von 13,80 h bzw. ein Wachstum pro 24-Stundenintervall um den Faktor 3,5. Im Verlauf des beobachteten Zeitraumes wurden 8,802 Generationen (n) hervorgebracht. Die Generationsverdopplungszeit tg beträgt somit 13,80 h (Teilungsrate v = 1,74/24h). 78 3 Ergebnisse Mitoseindex Abbildung 3.1.9 zeigt den zeitlichen Verlauf der Mitoseindices in Prozent über elf Tage für Maligne Melanom-Zellen. Abbildung 3.1.9: Mitoseindices (in Prozent) von Malignen Melanom-Zellen aufgetragen gegen die Zeit in Tagen. Die rote Linie markiert den maximalen Mitotischen Index. Beginnend mit einem Mitoseindex von 6,23 % an Tag eins bildet sich an den folgenden zwei Tagen ein Plateau ab mit einem Maximum der mitotischen Aktivität von 9,1 %. Im Anschluss nimmt der Anteil von Zellen in der Zellteilung an der Gesamtzellzahl zügig bis Tag acht ab und nähert sich im weiteren Verlauf dem Nullwert an. Gemittelt ergibt sich für den Zeitraum des exponentiellen Wachstums (Tag eins bis Tag fünf) ein Mitoseindex von 7,79 %. 79 3 Ergebnisse Gegenüberstellung Wachstumskurve und Mitoseindex Abbildung 3.1.10 zeigt die zuvor beschriebenen Proliferationscharakteristika Wachstumskurve und Mitosindex in graphischem Zusammenhang. Auch hier zeigt sich, dass der Zeitpunkt der maximalen mitotischen Aktivität (zwischen Tag zwei und Tag drei) ungefähr in die Mitte der exponentiellen Wachstumsphase der Kultur fällt (zwischen Tag zwei und Tag drei). Abbildung 3.1.10: Gegenüberstellung der Wachstumskurve und des Mitosindexverlaufes von Malignen Melanom-Zellen 80 3 Ergebnisse 3.1.3 Tramp Pr T rostatakarzinom hologie (A Abbildungg 3.1.11) Morph Abbilduung 3.1.11 zeigt das morphologis m sche Bild einer e Prostaatakarzinom m-Kultur gew wachsen auf Kam mmerobjektträgern undd mit Hämattoxylin-Eosin angefärbbt. Abbildu ung 3.1.11: Tramp Prrostatakarzinnom-Zellen nach H.E.--Färbung unnter dem FotolichtF mikroskoop bei 200-fa facher (links)) und 400-faccher (rechts) Primärvergrrößerung Die 2000-fache Primärvergrößßerung zeiggt das bevo orzugte Wacchstum derr Prostatakaarzinomzellen inn Nestern (engl. ( clusteers) und einner damit eiinhergehendden Wirbelbbildung. Diie Zellen stehen mit ihren langen l Zelllfortsätzen in Verbind dung. Die Zellgrenzen Z n wirken zum Teil d Zytoplassma unruhiig. Die Kerrne sind ovvaloid und cchromatinreeich und verwascchen und das zeigen die d für das Prostatakarrzinom typiischen, prom minenten Nukleolen. N N Nach Erreicchen der Konflueenz gehen siie in ein meehrschichtigges Wachstu um über undd bilden Zelllhügel aus. Wachsstumskurvve Abbilduung 3.1.12 zeigt z die Wachstumsku W urve von Tramp T Prosttatakarzinom m-Zellen in linearer Auftraggung von Geesamt- und Lebendzelllzahl (x 103) auf der Ordinate O undd Zeit in Taagen auf der Absszisse nachh Beobachtuung über einen Zeitraaum von innsgesamt ellf Tagen. Wie W man schon bei b den vorhherigen Zellllinien beobbachten kon nnte stellt sich das Prooliferationsv verhalten zu Begiinn als expponentielles Wachstum m dar und erstreckt e sicch bis Tag fünf. Die Gesamtzellzahll wächst dabbei ungefähhr mit dem Faktor F drei pro 24-Stunnden-Zeitinntervall. Diee Kurven 81 3 Ergebnisse für Gesamt- und Lebendzellzahl verlaufen in den ersten fünf Tagen annähernd identisch. Ein klassischer S-förmiger Verlauf mit Übergang in ein Plateau lässt sich für die Prostatakarzinom-Zellen nicht erkennen. Vielmehr erreicht die Kultur ihre maximale Zelldichte von ca. 3,6 x 105 Zellen pro cm2 bzw. ihren maximalen Ertrag von 7 x 105 Zellen an Tag sechs und nimmt dann – unmittelbar im Anschluss – an Zellzahl und Vitalität bis zum Ende der Beobachtung kontinuierlich ab. Abbildung 3.1.12: Lineare Darstellung der Wachstumskurve von Tramp Prostatakarzinom-Zellen. Aufgetragen sind die Gesamt- und Lebend-zellzahlen gegen die Zeit in Tagen. Die rote Linie markiert den maximalen Ertrag der Kultur unter den gegebenen Beding-ungen. Populationsverdopplungszeit und Generationszeit Die halblogarithmische Auftragung der Gesamtzellzahlen (Ordinate) gegen die Zeit in Tagen (Abszisse) für Tramp Prostatakarzinom-Zellen zeigt Abbildung 3.1.13. Auch bei dieser Zelllinie ähnelt der Verlauf in der „log-Phase“ einer Geraden und lässt Schlüsse über die Populationsverdopplungszeit zu. Eine „lag-Phase“ ist auch hier nicht von der „log-Phase“ abgrenzbar. Entsprechend Abbildung 3.1.12 zeichnet sich auch in der halblogarithmischen Anschauung ab Tag fünf der Übergang in die Plateauphase ab. Graphisch konnte für die Tramp Prostatakarzinom-Zellen eine Populationsverdopplungszeit von ca. 12,6 h ermittelt 82 3 Ergebnisse werden (siehe Auschnittsvergrößerung in Abbildung 3.1.13). Um Populationsverdopplungsund Generationszeiten zudem auch berechnen zu können, wurden die Gesamtzellzahlen an Tag 0 (t0=0 h, N0=2 x 103 Zellen) und Tag fünf (t5=122,83 h, N5=645,03 x 103 Zellen) herangezogen. Bei einer exponentiellen Wachstumsrate µ von 0,0470 ergab sich eine Populationsverdopplungszeit td von 14,74 h bzw. ein Wachstum der Gesamtzellzahl um den Faktor 3,3 pro 24-Stundenintervall. Die Generationsverdopplungszeit tg beträgt bei einer Generationszahl n=8,330 ebenfalls 14,75 h (Teilungsrate v = 1,63/24h). Abbildung 3.1.13: Halblogarithmische Darstellung der Wachstumskurve von Tramp Prostatakarzinom-Zellen. Aufgetragen sind die Gesamtzellzahlen und vitalen Zellzahlen gegen die Zeit in Tagen. Die Populationsverdopplungszeit tD kann aus dem vergrößerten Ausschnitt der Wachstumskurve (rechtes Schaubild) abgelesen werden. 83 3 Ergebnisse Mitoseindexverlauf Abbildung 3.1.14 zeigt den zeitlichen Verlauf der Mitoseindices in Prozent über elf Tage für Tramp Prostatakarzinom-Zellen. Beginnend mit einem Mitoseindex von 8,4 % an Tag eins erreicht der Mitoseindex an Tag drei mit 13,4 % sein Maximum und fällt dann zügig innerhalb der nachfolgenden sechs Tage auf 0,5 % ab. Betrachtet man den Zeitraum des exponentiellen Wachstums von Tag eins bis Tag fünf so ergibt sich ein gemittelter Mitoseindex von 9,96 %. Abbildung 3.1.14: Mitoseindices (in Prozent) von Tramp Prostatakarzinom-Zellen auf-getragen gegen die Zeit in Tagen. Die rote Linie markiert den maximalen Mitotischen Index. Gegenüberstellung von Wachstumskurve und Mitoseindexverlauf Abbildung 3.1.15 zeigt die zuvor präsentierten und beschriebenen Proliferationscharakteristika Wachstumskurve und Mitoseindex-Verlauf in graphischen Zusammenhang. Auch hier trifft der Zeitpunkt der maximalen mitotischen Aktivität ungefähr auf die Mitte der exponentiellen Wachstumsphase. 84 3 Ergebnisse Abbildu ung 3.1.15: Gegenüberst G ellung der Wachstumsku W urve und dess Mitosindexxverlaufes vo on Tramp Prostatakkarzinom-Zeellen. om 3.1.4 Meth‐A Fibrosarko Morph hologie (Ab bbildung 3.1.16) 3 Zur moorphologischhen Darstelllung wurdden die Fib brosarkom-Z Zellen mit Hämatoxylin-Eosin angefärbbt. Abbildu ung 3.1.16: Meth-A Fibrosarkom-Zeellen nach H.E.-Färbung H g unter dem Fotolicht-m mikroskop bei 400-facher Primäärergrößerunng. Pfeile zeiggen mitotisch he Zellen. Es fällt auf, dass diese Zellen im Gegensatz zu deen adhärentt wachsendden Zelllinieen keine zytoplassmatischen Ausläufer,, höchstens dezente Ausstülpung A gen zeigen. Neben auffälligen 85 3 Ergebnisse atypischen Mitosen fallen Zellen mit mehreren Zellkernen auf (siehe Pfeile). Die Kultur weist mit der Zeit zunehmend Zelltrümmer auf. Wachstumskurve Abbildung 3.1.17 zeigt den Verlauf der Wachstumskurve der Meth-A Fibrosarkom-Zellen nach Beobachtung von Gesamt- und Lebendzellzahl (x 103) über 15 Tage hinweg. Auf der Ordinate sind Gesamtzellzahlen und vitale Zellen linear aufgetragen, die Abszisse zeigt die Zeit in Tagen. Bis Tag fünf lässt sich ein exponentielles Wachstum feststellen. Die Gesamtzellzahl wächst ungefähr mit dem Faktor drei pro 24-Stunden-Zeitintervall. Die Verläufe von Gesamtzellzahl und vitaler Zellen weisen nahezu identische Werte auf. Im Anschluss schwächt sich das Wachstum wieder ab, gefolgt von einem dreitägigem Plateau und den frühzeitigen Übergang in die Absterbephase. Der breite S-förmige Verlauf und die früh einsetzende Absterbephase verleihen der Wachstumskurve ein kuppelähnliches Bild zwischen Tag sechs und 15. Währenddessen wird eine maximale Zelldichte von 7,68 x 105 Zellen pro cm2 und ein maximaler Ertrag der Kultur von 1,46 x 106 an Tag zehn erreicht. Abbildung 3.1.17: Lineare Darstellung der Wachstumskurve von Meth-A Fibrosarkom-Zellen. Aufgetragen sind die Gesamtzellzahlen und vitalen Zellzahlen gegen die Zeit in Tagen. 86 3 Ergebnisse Populationsverdopplungszeit und Generationszeit Die halblogarithmische Auftragung der Gesamtzellzahlen (Ordinate) gegen die Zeit in Tagen (Abszisse) für Meth-A Fibrosarkom-Zellen zeigt Abbildung 3.1.18. Abbildung 3.1.18: Halblogarithmische Darstellung der Wachstumskurve von Meth-A FibrosarkomZellen. Aufgetragen sind die Gesamt- und Lebendzellzahlen gegen die Zeit in Tagen. Die Populationsverdopplungszeit tD kann aus dem vergrößerten Ausschnitt der Wachstumskurve (rechtes Schaubild) abgelesen werden. Auch hier verläuft die exponentielle Phase („log-Phase“) nahezu gerade. Eine „lag-Phase“ ist auch hier nicht von der „log-Phase“ abgrenzbar. Entsprechend Abbildung 3.1.17 markiert Tag fünf den Beginn der Plateauphase. Graphisch konnte für die Fibrosarkom-Zellen eine Populationsverdopplungszeit von ca. 12,8 h ermittelt werden (siehe Auschnittsvergrößerung in Abbildung 3.1.18). Für die Berechnung von Populationsverdopplungs- und Generationszeit wurden die Gesamtzellzahlen an Tag 0 (t0=0 h, N0=2 x 103 Zellen) und Tag fünf (t5=123,02 h, N5=689,38 x 103 Zellen) herangezogen. Bei einer exponentiellen Wachstumsrate µ von 0,0475 ergab sich eine Populationsverdopplungszeit td von 14,59 h bzw. ein Wachstum der Kultur um den Faktor 3,3 pro 24-Stundenintervall. Innerhalb dieser fünf Tage wurden insgesamt ungefähr 8,429 Generationen (n) hervorgebracht. Die Generationsverdopplungszeit tg beträgt somit ebenfalls 14,59 h (Teilungsrate v = 1,64/24h). 87 3 Ergebnisse Mitoseindexverlauf In Abbildung 3.1.19 ist der zeitliche Verlauf der Mitoseindices in Prozent über elf Tage für Meth-A Fibrosarkom-Zellen dargestellt. Beginnend mit einem Mitoseindex von 3,6 % an Tag eins steigt der Anteil an Zellen in der Mitose bis Tag fünf auf den maximalen Wert der mitotischen Aktivität von 14,8 % und fällt spitzwinklig bis Tag zwölf auf 2,5 % wieder ab. Gemittelt über den Zeitraum des exponentiellen Wachstums (Tag eins bis fünf) ergibt sich ein Mitoseindex von 9,64 %. Abbildung 3.1.19: Mitoseindices (in Prozent) von Meth-A Fibrosarkom-Zellen aufgetragen gegen die Zeit in Tagen Gegenüberstellung von Wachstumskurve und Mitoseindexverlauf Abbildung 3.1.20 zeigt die zuvor präsentierten und beschriebenen Proliferationscharakteristika Wachstumskurve und Mitoseindex-Verlauf in graphischen Zusammenhang. Bei den Meth-A Fibrosarkom-Zellen erreicht der Mitoseindex im Gegensatz zu den übrigen Zelllinien sein Maxiumum erst am Ende der „log-Phase“ bzw. zu Beginn der Plateau-Phase 88 3 Ergebnisse . Abbildu ung 3.1.20: Gegenüberste G ellung der Wachstumsku W urve und des Mitoseindexxverlaufes von MethA Fibrossarkom-Zelleen mphom 3.1.5 EL‐4 Lym Morph hologie (Ab bbildung 3.1.16) 3 Eine Hämatoxylinn-Eosin-Färbbung der EL-4 E Lymphom-Zellenn diente deer morpholo ogischen Charaktterisierung. Abbildu ung 3.1.21: EL-4 Lympphom-Zellen nach H.E.-F Färbung untter dem Fottolicht-mikro oskop bei 200-fachher (links) unnd 400-facheer (rechts) Primärvergrößerung. Pfeilee zeigen mitootische Zelleen. 89 3 Ergebnisse Die Lymphom-Zellen sind kleine, rundliche Zellen, die solitär vorliegen und ein monotones Zellbild darbieten. Mitotische Zellen sind vergrößert und deutlich zu erkennen (siehe Pfeile). Sie können Atypien aufweisen. Mit voranschreitender Kulturdauer sind zunehmend Zelltrümmer neben gesunden und toten Zellen zu beobachten. Wachstumskurve Abbildung 3.1.22 zeigt den Verlauf der Wachstumskurve der EL-4 Lymphom-Zellen. Auf der Ordinate sind Gesamt- und Lebendzellzahlen (x103) linear aufgetragen, auf der Abszisse die Zeit in Tagen. Bis Tag fünf lässt sich ein exponentielles Wachstum feststellen. Die Gesamtzellzahl wächst ca. mit dem Faktor vier pro 24-Stundenintervall und weist keinen deutlichen Unterschied zur Kurve der vitalen Zellen auf. Ab Tag fünf flacht sich die Kurve ab, verharrt aber nicht auf einem Plateau, sondern nimmt stetig weiter zu. Dieses geringfügige Wachstum in der zweiten Hälfte des Schaubilds ist jedoch ebenfalls gekennzeichnet durch eine Abnahme an vitalen Zellen. Eine eindeutige Absterbephase lässt sich bis zum Ende der Beobachtung nicht eindeutig definieren, sodass die maximale Zelldichte von durchschnittlich 6 x 106 Zellen pro cm2 und der maximale Ertrag von 5,4 x 106 Zellen erst am letzten Tag der Beobachtung erreicht werden. Abbildung 3.1.22: Lineare Darstellung der Wachstumskurve von EL-4 Lymphom-Zellen. Aufgetragen sind die Gesamtzellzahlen und vitalen Zellzahlen gegen die Zeit in Tagen. 90 3 Ergebnisse Populationsverdopplungszeit und Generationszeit Die halblogarithmische Auftragung der Gesamtzellzahlen (Ordinate) gegen die Zeit in Tagen (Abszisse) für EL-4 Lymphom-Zellen ist in Abbildung 3.1.23 dargestellt. Analog zu den vorherigen halblogarithmisch dargestellten Wachstumskurven kann aus dem Verlauf der „logPhase“ zwischen Tag eins und fünf die Populationsverdopplungszeit für die EL-4 LymphomZellen bestimmt werden. Auch hier ist keine eindeutige „lag-Phase“ festzustellen. Entsprechend Abbildung 3.1.22 markiert Tag fünf den Beginn der Plateauphase, die sich in dieser Darstellung stabil auf einem Niveau bis Tag 15 halten kann. Für die EL-4 LymphomZellen konnte graphisch eine Populationsverdopplungszeit von ca. 10,1 h ermittelt werden (siehe Auschnittsvergrößerung in Abbildung 3.1.23). Berechnet wurden Populationsverdopplungs- und Generationszeit mit den Gesamtzellzahlen an Tag 0 (t0=0 h, N0=2 x 103 Zellen) und Tag fünf (t5=123,63 h, N5=2390,79 x 103 Zellen). Es ergab sich bei einer exponentiellen Wachstumsrate µ von 0,0573 eine Populationsverdopplungszeit td von 12,09 h bzw. ein Wachstum pro 24-Stundenintervall um den Faktor 3,97. Insgesamt wurden während dieser Zeit ungefähr 10,22 Generationen (n) hervorgebracht. Die Generationsverdopplungszeit tg beträgt somit ebenfalls 12,09 h (Teilungsrate v = 1,98/24h). Abbildung 3.1.23: Halblogarithmische Darstellung der Wachstumskurve von El-4 Lymphom-Zellen. Aufgetragen sind die Gesamtzellzahlen und vitalen Zellzahlen gegen die Zeit in Tagen. Die Populationsverdopplungszeit td kann aus dem nebenstehenden Schaubild abgelesen werden. 91 3 Ergebnisse Mitoseindexverlauf Abbildung 3.1.24 zeigt den zeitlichen Verlauf der Mitoseindices in Prozent über elf Tage für El-4 Lymphom-Zellen. Beginnend mit einem Mitoseindex von 4,1 % an Tag eins steigt der Anteil an Zellen in der Mitose zügig bis Tag fünf auf den maximalen Wert der mitotischen Aktivität von 16 % und fällt kontinuierlich über einen Zeitraum von neun Tagen auf 2,8 % ab. Gemittelt über den exponentiellen Wachstumszeitraum von Tag eins bis fünf ergibt sich ein Mitoseindex von 12,46 %. Abbildung 3.1.24: Mitoseindices (in Prozent) von EL-4 Lymphom-Zellen aufgetragen gegen die Zeit in Tagen. Gegenüberstellung von Wachstumskurve und Mitoseindexverlauf Abbildung 3.1.21 und 3.1.24 wurden in Abbildung 3.1.25 kombiniert und stellen die zuvor präsentierten Proliferationscharakteristika Wachstumskurve und Mitoseindex-Verlauf in graphischen Zusammenhang. Auch bei den EL-4 Lymphom-Zellen ereignet sich der Zeitpunkt der maximalen mitotischen Aktivität frühzeitig im Verlauf der Wachstumskurve und trifft ungefähr auf die Mitte der exponentiellen Wachstumsphase um Tag drei. 92 3 Ergebnisse Abbildung 3.1.25: Gegenüberstellung der Wachstumskurve und des Mitoseindexverlaufes von EL-4 Lymphom-Zellen. 93 3 Ergebnisse 3.1.6 Gegenüberstellung der Ergebnisse 3.1.1 bis 3.1.5 Wachstumskurven Abbildung 3.1.26 zeigt alle Wachstumskurven vereint in einem Schaubild, links linear und rechts halblogarithmisch gegen die Zeit in Tagen aufgetragen. Die Betrachtung der Steigung des Kurvenverlaufs in der exponentiellen Wachstumsphase, die sich für alle Zelllinien grob zwischen Tag eins und Tag fünf abspielt, lässt Schlüsse über die Teilungsrate bzw. die Populationsverdopplungszeit der Zelllinien relativ zueinander zu. Die größte Wachstumsgeschwindigkeit weisen die EL-4 Lymphom-Zellen auf, gefolgt von den Tramp Prostatakarzinom-Zellen, die jedoch an Tag vier ihre kurze Plateauphase einleiten und den Malignen Melanom-Zellen sowie den Meth-A Fibrosarkom-Zellen den Vortritt lassen. Die Fibrosarkom-Zellen wachsen etwas langsamer als die Melanom-Zellen und die Fibroblasten haben relativ gesehen die geringste Wachstumsrate. Abbildung 3.1.26: Gegenüberstellung der Wachstumskurven aller Zelllinien 94 3 Ergebnisse Betrachtet man die Plateauphase und die maximal erreichte Zelldichte, so verhalten sich wiederum die Melanom-Zellen und die Fibrosarkom-Zellen recht ähnlich und bilden zusammen mit den Fibroblasten das Mittelfeld. Es werden maximale Zellzahlen von 1,5-1,8 x 106 Zellen erreicht, wobei auffällt, dass die Fibroblasten trotz geringster Wachstumsgeschwindigkeit etwas protrahiert ein stabileres Plateau auf höherem Zellzahlniveau erzielen. Die Lymphom-Zellen erreichen mit durchschnittlich 5,4 x 106 Zellen den höchsten und die Prostatakarzinom-Zellen mit durchschnittlich 8 x 105 den geringsten Zellertrag. Populationsverdopplungszeiten und Generationszeiten Tabelle 3.1.1 zeigt eine Zusammenstellung der aus den Wachstumskurven ermittelten Parameter. Wie schon oben angedeutet weist das Lymphom die geringsten Verdopplungszeiten auf, gefolgt vom Prostatakarzinom, Melanom und Fibrosarkom. Die Fibroblasten bilden auch hier das Schlusslicht. Tabelle 3.1.1: Übersicht über alle ermittelten Wachstumsparameter Fibroblasten Melanom Prostatakarzinom Populationsverdopplungszeit td [h], graphisch 16,3 13,5 12,6 12,8 10,1 Populationsverdopplungszeit td [h], berechnet 16,77 13,80 14,74 14,59 12,09 Wachstumsfaktor α pro 24 h 2,86 3,48 3,26 3,30 3,97 Generationszahl n 8,77 8,80 8,33 8,43 10,22 Generationsverdopplungszeit tg [h] 16,77 13,80 14,75 14,59 12,09 Teilungsrate v pro 24h 1,43 1,74 1,63 1,64 1,98 95 Fibrosarkom Lymphom 3 Ergebnisse Mitoseindices-Verläufe Abbildung 3.1.27 fasst alle Mitoseindex-Verläufe in ein Schaubild zusammen. Abbildung 3.1.27: Zusammenfassende Darstellung aller Mitoseindex-Verläufe Ausgehend von unterschiedlichen Startpunkten erreichen alle Zelllinien bis auf das Fibrosarkom ihren maximalen Mitoseindex an Tag drei. Dabei weisen die Fibroblasten und die Melanom-Zellen einen ähnlichen Verlauf auf. Die Prostatakarzinom-Zellen erzielen zwar einen höheren maximalen Wert, dafür nimmt der Mitoseindex auch rascher bis zum neunten Tag hin ab. Die Lymphom-Zellen erreichen von allen untersuchten Zelllinien den höchsten Mitoseindex und weisen zudem einen relativ langsamen Abfall auf und münden in ein Endniveau von drei Prozent. Die Fibrosarkom-Zellen erreichen ihr Maximum etwas protrahiert an Tag fünf, erreichen dafür aber nach den Lymphom-Zellen den höchsten Index unter den restlichen Zelllinien und weisen ebenfalls ein Endniveau um die 2,5 Prozent auf. Tabelle 3.1.2 zeigt eine Übersicht über die maximalen und gemittelten Mitoseindex-Werte der verschiedenen Zelllinien. Die Prostatakarzinom-Zellen weisen an Tag drei einen Peak in ihrer Mitoseindex-Kurve an Tag auf. Dennoch liegt der gemittelte Mitoseindex über den Zeitraum ihres exponentiellen Wachstums unterhalb derjenigen für Fibroblasten und Melanom. Das bedeutet, je breiter und höher die Kurve der Mitoseindices verläuft, desto höher ist der mittlere Mitoseindex. Das ist zum Beispiel bei Fibrosarkom- und Lymphom-Zellen zu beobachten. 96 3 Ergebnisse Tabelle 3.1.2: Übersicht der aus den Mitoseindex-Verläufen ermittelten Parameter während der exponentiellen Wachstumsphase Fibroblasten Melanom Prostatakarzinom Maximaler Mitoseindex [%] 9,5 9,1 13,4 14,8 16 Mittlerer Mitoseindex [%] 8,13 7,79 6,02 9,64 12,46 97 Fibrosarkom Lymphom 3 Ergebnisse 3.2 Apoptoseverhalten Zur Charakterisierung des Apoptoseverhaltens wurden die murinen Tumorzellen qualitativ und quantitativ auf die Proteine Bax (proapoptotisch) und Bcl-2 (antiapoptotisch) untersucht und der Quotient Bax/Bcl-2 gebildet. 3.2.1 Qualitativer Nachweis von Bax‐ und Bcl‐2‐Protein (Western Blot) Auf das qualitative Vorhandensein der beiden Proteine Bax und Bcl-2 wurden die Zelllinien mittels Western Blot überprüft. Jeweils 1 x 107 der unstimulierten Tumorzellen wurden lysiert, die Lysate durch SDS-PAGE aufgetrennt und die Proteine Bax und Bcl-2 mittels Antikörper im Western Blot nachgewiesen. Als Ladekontrolle wurde ein anti-β-AktinAntikörper verwendet. Abbildung 3.2.1: Qualitativer Nachweis von Bax- und Bcl-2-Protein im Western Blot. Als Ladekontrolle diente β-Aktin Diese Untersuchung zeigt, dass sich in allen fünf Zelllinien sowohl Bax als auch Bcl-2 mit dem verwendeten Primärantikörper nachweisen lassen. Somit erweist sich der Bax/Bcl-2Nachweis für die Charakterisierung des Apoptoseverhaltens als sinnvoll und der Primärantikörper als geeignet für eine quantitative immunzytochemische Untersuchung der Zelllinien. 98 3 Ergebnisse 3.2.2 Quantitattiver Nach hweis von n Bax‐ und d Bcl‐2‐Protein (Immunzzytochemiie) 3.2.2.1 Morphollogie Die imm munzytocheemischen Fäärbeergebnisse für anti--Bax und annti-Bcl-2 sinnd nachfolg gend für alle Tum morzelllinieen dargestellt. anti-Baxx anti-Bccl-2 Malignes Melanom m Prostattakarzinom m Fibrosaarkom hom Lymph Abbildu ungen 3.2.3:: Übersicht über ü die imm munzytochem mischen Färrbeergebnisse mit anti-B Bax/Bcl-2 aller Tum morzelllinienn bei 200-faccher Primärvergrößerung 99 3 Ergebnisse Das Substratchromogen DAB färbt Bax- bzw. Bcl-2-positive Zellen bräunlich an. Da auf eine Kerngegenfärbung verzichtet wurde, erscheinen Bax- bzw. Bcl-2-negative Zellen farblos. Die auf den Achtkammer-Objektträgern gewachsenen und angefärbten Zelllinien Malignes Melanom, Tramp Prostatakarzinom und L929 Fibroblasten zeigen auch bei dieser Darstellung ihre oben beschriebene Wachstumsmorphologie. Die Suspensionszellen Meth-A Fibrosarkom und EL-4 Lymphom wurden aus ihrem Wachstumsumfeld entnommen und liegen in abgerundeter Form auf den adhäsiv beschichteten Objektträgern nach Prof. Bross vor. 3.2.2.2 L929 Fibroblasten Für die L929 Fibroblasten ergab sich aus dem Mitoseindexverlauf Tag drei als Zeitpunkt der maximalen mitotischen Aktivität (vgl. Abbildung 3.1.4). Die Auszählung der drei mit antiBax bzw. anti-Bcl-2 angefärbten Kulturen ergab folgende Werte: Tabelle 3.2.1: Prozentualer Anteil der Bax- bzw. Bcl-2-Protein-positiven Fibroblasten ermittelt aus drei unabhängigen Kulturen und zusammengefasst als Mittelwert Fibroblasten Bax Bcl-2 Kultur 1 45,65 53,61 Kultur 2 46,40 51,48 Kultur 3 45,93 54,43 Mittelwert 45,99 53,17 Eine graphische Gegenüberstellung der Mittelwerte dieser Auszählung zeigt Abbildung 3.2.4. Mit 53,17 % Bcl-2-positiver Zellen und 45,99 % Bax-positiver Zellen überwiegen bei den Fibroblasten die antiapoptotischen Proteine. Um beide Werte in Relation zu setzen, wurde der Quotient der Mittelwerte Bax/Bcl-2 gebildet. Dieser betrug für die Fibroblasten 0,865 (Bax/Bcl-2 = 45,99/53,17) und unterstreicht – als Wert kleiner eins – die Feststellung, dass die untersuchten Kulturen zum Zeitpunkt ihrer maximalen mitotischen Aktivität und in unstimulierten Zustand nicht zur Apoptose neigen. 100 3 Ergebnisse Abbildung 3.2.4 Graphische Darstellung der Bax- bzw. Bcl-2-Mittelwerte der L929 Fibroblasten in Prozent (links) und graphische Einordnung des Bax/Bcl-2-Quotienten in pro- bzw. antiapoptotisch (links) 3.2.2.3 Malignes Melanom Bei den Malignen Melanom-Zellen konnte aus dem Mitoseindexverlauf Tag drei als Zeitpunkt der maximalen mitotischen Aktivität festgestellt werden (vgl. Abbildung 3.1.9). Die Auszählung der drei mit anti-Bax bzw. anti-Bcl-2 angefärbten Kulturen ergab folgende Werte: Tabelle 3.2.2: Prozentualer Anteil der Bax- bzw. Bcl-2-Protein-positiven Melanom-Zellen ermittelt aus drei unabhängigen Kulturen und zusammengefasst als Mittelwert Melanom Bax Bcl-2 Kultur 1 33,57 41,48 Kultur 2 33,10 41,73 Kultur 3 29,57 46,60 Mittelwert 32,08 43,27 Eine graphische Gegenüberstellung der Mittelwerte dieser Auszählung zeigt Abbildung 3.2.5. Die Auszählungen ergaben 43,27 % Bcl-2-positive und 32,08 % Bax-positive Zellen. Somit überwiegen auch bei den Malignen Melanom-Zellen die antiapoptotischen Proteine. Der 101 3 Ergebnisse Quotient Bax/Bcl-2 betrug für die Malignen Melanom-Zellen 0,741 (Bax/Bcl-2 = 32,08/43,27). Somit neigen auch diese untersuchten Kulturen zum Zeitpunkt ihrer maximalen mitotischen Aktivität und in unstimulierten Zustand nicht zur Apoptose. Abbildung 3.2.5: Graphische Darstellung der Bax- bzw. Bcl-2-Mittelwerte der Malignen MelanomZellen in Prozent (links) und graphische Einordnung des Bax/Bcl-2-Quotienten in pro- bzw. antiapoptotisch (links). 3.2.2.4 Tramp Prostatakarzinom Tramp Prostatakarzinom-Zellen erreichen ihre maximale mitotische Aktivität ebenfalls an Tag 3 (vgl. Abbildung 3.1.14). Die Auszählung der drei mit anti-Bax bzw. anti-Bcl-2 angefärbten Kulturen ergab folgende Werte: Tabelle 3.2.3: Prozentualer Anteil der Bax- bzw. Bcl-2-Protein-positiven Prostatakarzinom-Zellen ermittelt aus drei unabhängigen Kulturen und zusammengefasst als Mittelwert Prostatakarzinom Bax Bcl-2 Kultur 1 26,02 34,77 Kultur 2 25,07 33,74 Kultur 3 25,68 32,86 Mittelwert 25,59 33,79 102 3 Ergebnisse Eine graphische Gegenüberstellung der Mittelwerte zeigt Abbildung 3.2.6: Abbildung 3.2.6: Graphische Darstellung der Bax- bzw. Bcl-2-Mittelwerte der Tramp Prostatakarzinom-Zellen in Prozent (links) und graphische Einordnung des Bax/Bcl-2-Quotienten in pro- bzw. antiapoptotisch (links). Die Auszählungen ergaben 33,79 % Bcl-2-positive und 25,59 % Bax-positive Zellen. Somit überwiegt auch bei den Prostatakarzinom-Zellen das antiapoptotische Protein. Der Quotient Bax/Bcl-2 betrug für die Tramp Prostatakarzinom-Zellen 0,757 (Bax/Bcl-2 = 25,9/33,79) und unterstreicht – als Wert kleiner eins – die Feststellung, dass die Kulturen während ihrer maximalen mitotischen Aktivität und in unstimulierten Zustand nicht apoptotisch werden. 103 3 Ergebnisse 3.2.2.5 Meth-A Fibrosarkom Das Meth-A Fibrosarkom erreicht seine maximale mitotische Aktivität an Tag fünf. Die Auszählung der drei mit anti-Bax bzw. anti-Bcl-2 angefärbten Kulturen ergab folgende Werte: Tabelle 3.2.4: Prozentualer Anteil der Bax- bzw. Bcl-2-Protein-positiven Meth-A Fibrosarkom-Zellen (Dreifachbestimmung) und zusammengefasst als Mittelwert Fibrosarkom Bax Bcl-2 Kultur 1 52,55 60,81 Kultur 2 55,88 59,77 Kultur 3 54,00 60,29 Mittelwert 54,14 60,29 Eine graphische Gegenüberstellung der Mittelwerte dieser Auszählung zeigt Abbildung 3.2.7: Abbildung 3.2.7: Graphische Darstellung der Bax- bzw. Bcl-2-Mittelwerte der Meth-A Fibrosarkom-Zellen in Prozent (links) und graphische Einordnung des Bax/Bcl-2-Quotienten in pro- bzw. antiapoptotisch (links) Die Auszählungen ergaben 60,29 % Bcl-2-positive und 54,14 % Bax-positive Zellen. Somit überwiegen auch bei den Fibrosarkom-Zellen die antiapoptotischen Proteine. Mit einem Quotienten Bax/Bcl-2 von 0,898 (Bax/Bcl-2 = 54,16/60,29) befinden sich auch die unstimulierten Fibrosarkom-Kulturen zum Zeitpunkt ihrer maximalen mitotischen Aktivität in einem nicht-apoptotischen Zustand. 104 3 Ergebnisse 3.2.2.6 EL-4 Lymphom Das EL-4 Lymphom erreicht seine maximale mitotische Aktivität an Tag 3. Die Werte der Auszählung der drei mit anti-Bax bzw. anti-Bcl-2 angefärbten Kulturen zeigt Tabelle 3.2.5. Tabelle 3.2.5: Prozentualer Anteil der Bax- bzw. Bcl-2-Protein-positiven EL-4-Tumorzellen ermittelt aus drei unabhängigen Kulturen und zusammengefasst als Mittelwert EL-4 Bax Bcl-2 Kultur 1 50,53 55,38 Kultur 2 49,9 56,62 Kultur 3 50,2 56,09 Mittelwert 50,21 56,03 Eine graphische Gegenüberstellung der Mittelwerte dieser Auszählung zeigt Abbildung 3.2.8. Die Auszählungen ergaben 56,03 % Bcl-2-positive und 50,21 % Bax-positive Zellen. Somit überwiegen auch bei den Lymphom-Zellen die antiapoptotischen Proteine. Abbildung 3.2.8: Graphische Darstellung der Bax- bzw. Bcl-2-Mittelwerte der EL-4 LymphomZellen in Prozent (links) und graphische Einordnung des Bax/Bcl-2-Quotienten in pro- bzw. antiapoptotisch (links) 105 3 Ergebnisse Der Quotient Bax/Bcl-2 betrug für die EL-4 Lymphom-Zellen 0,896 (Bax/Bcl-2 = 50,21/6,03) und unterstreicht als Wert kleiner eins die Feststellung, dass unstimulierte Lymphom-Zellen an Tag drei ihrer Kultivierung und somit zum Zenit ihrer mitotischen Aktivität nicht zur Apoptose neigen. 3.2.2.7 Zusammenstellung der Ergebnisse 3.2.2.2-3.2.2.6 Um einen Überblick der Ergebnisse aus 2.2.1 bis 2.2.5 zu erhalten, wurden diese in Tabelle 3.2.6 zusammenfassend dargestellt. Tabelle 3.2.6: Gegenüberstellung der Mittelwerte der immunzytochemischen Auszählungen der Proteine Bax und Bcl-2 in den verschiedenen Zelllinien sowie der daraus ermittelten Quotienten Bax/Bcl-2 Fibroblasten Melanom Prostatakarzinom Bax Mittelwert 45,99 32,08 25,59 50,21 54,14 Bcl-2 Mittelwert 53,17 43,27 33,79 56,03 60,29 Quotient Bax / Bcl-2 0,865 0,741 0,757 0,896 0,898 106 Lymphom Fibrosarkom 3 Ergebnisse Eine graphische Veranschaulichung der Quotienten Bax/Bcl-2 zeigt Abbildung 3.2.9. Abbildung 3.2.9: Gegenüberstellung der Quotienten Bax/Bcl-2 aller untersuchten Zelllinien Die Quotienten aller Zelllinien sind kleiner eins. Somit befinden sich alle Zelllinien in einem antiapoptotischen Zustand. Dennoch gibt es Unterschiede in der Ausprägung dieses antiapoptotischen Zustandes zwischen den verschiedenen Zelllinien. Je näher sich der Wert des Quotienten an eins befindet, desto geringer ist das Überwiegen der antiapoptotischen Proteine. Beim Malignen Melanom und beim Prostatakarzinom ist das antiapoptotische Überwiegen am stärksten ausgeprägt. Die Fibroblasten bilden mit einem Quotienten von 0,865 das Mittelfeld. Beim Lymphom sowie beim Fibrosarkom ist das Überwiegen von Bcl-2 am geringsten ausgeprägt und ihre Quotienten von beinahe 0,9 liegen dicht unterhalb der eins. 107 3 Ergebnisse 3.3 P Produkti ion von A Apoptose einduktorren Vor dem m Hintergruund der Errgebnisse voon S. Göpp pinger, Ch. Gläser, M M. Brauchle und M. Osswaldd, die zeigtten, dass muurine Makrrophagen naach Inkubattion mit Tum morzellüberstanden verschieedener murriner Tumoorzellarten Apoptose einleiteten,, war nun von Intereesse die Tumorzzelllinien auuf die Produuktion von Apoptose-in A nduzierendeer Faktorenn zu untersu uchen. In diesem Sinne wurrden die Zeelllinien auuf Fas Ligaand, TNF-α α und TRA AIL zum ein nem auf nd zum andderen auf Prrotein-Ebenee mittels mRNA--Ebene mitttels PCR bzzw. Real-Time-PCR un ELISA und Bioassay getestet. 3.3.1 Expressio on von Faas Ligand, TNF‐α un nd TRAIL L Die Exppression vonn Fas Ligannd, TNF-α und u TRAIL L wurde unteersucht, inddem mRNA A aus den Tumorzzellen extrahhiert und inn cDNA um mgeschrieben n wurde. Diiese cDNA wurde mit Primern für Fass Ligand, TNF-α T undd TRAIL inkubiert, evtl. ampliifiziert undd qualitativ v in der Gelelekktrophorese (Fas Ligaand) bzw. quantitativ q in der Ecchtzeit-PCR R (TNF-α, TRAIL) nachgew wiesen. 3.3.1.1 CD95L/F Fas-Ligand d Abbilduung 3.3.1 zeigt das Errgebnis des qualitativeen mRNA-N Nachweisess für Fas Ligand in unstimuulierten Tum morzellen mittels m PCR. ProstataFibrroblasten M Melanom karzinom Fibrosarkom Lymphom m Posittivkontrrolle Fass Ligand β-A Aktin Abbildu ung 3.3.1: Exxpression vonn mRNA fürr Fas Ligand in unstimuliierten Tumorrzellen 108 Negativkonttrolle 3 Ergebnisse Als Positivkontrolle dienten LCMV-infizierte Milzzellen der Maus, als Negativkontrolle Milzzellen aus Fas Ligand-k.o.-Mäusen. Der Nachweis von β-Aktin diente als Ladekontrolle. Es zeigt sich, dass sich mRNA für Fas Ligand neben der Positivkontrolle nur in Zellen des EL-4 Lymphoms nachweisen lässt. Über die Menge der Expression kann keine Aussage gemacht werden. 3.3.1.2 TNF-α („tumor necrosis factor-α”) Tabelle 3.3.1 zeigt die Ergebnisse der Real-Time-PCR für TNF-α. Nach Normalisierung dieser Ergebnisse mittels β-Aktin (Quotient TNF-α/β-Aktin) können Aussagen über die Expression von TNF-α der untersuchten Zelllinien relativ zueinander gemacht werden. Tabelle 3.3.1: Ergebnisse der Light-Cycler-RT-PCR für TNF-α Fibroblasten Melanom Prostatakarzinom TNF-α (x 105) Mittelwert 65,11 0,00 0,00 4,955 153,4 β-Aktin 8276 4324 1785 20880 15020 Quotient TNF-α/ βAktin (x 10-5) 786,73 0 0 23,73 1021,30 Fibrosarkom Lymphom Eine graphische Veranschaulichung zeigt Abbildung 3.3.2. Dabei fällt auf, dass sich in unstimulierten Melanom- und Prostatakarzinom-Zellen eine mRNA-Expression von TNF-α nicht detektieren lässt. Die Fibrosarkom-Zellen weisen eine geringe Expression von TNF-α auf. Relativ gesehen zeigen die Fibroblasten das 33-fache und die Lymphom-Zellen das 43fache der Expression der Fibrosarkom-Zellen. 109 3 Ergebnisse Abbildung 3.3.2: Graphische Darstellung der Quotienten TNF-α/β-Aktin (x 10-5) als Maß für die relative Expression von TNF-α (n.d.: nicht detektierbar). 3.3.1.3 TRAIL („TNF related apoptosis inducing ligand”) Tabelle 3.3.2 zeigt analog die Ergebnisse der Real-Time-PCR für TRAIL. Die Ergebnisse wurden ebenfalls mittels β-Aktin (Quotient TNF-α/β-Aktin) normalsiert, um Aussagen über die Expression der TRAIL-mRNA der untersuchten Zelllinien relativ zueinander machen zu können. Tabelle 3.3.2: Ergebnisse der Light-Cycler-RT-PCR für TRAIL Fibroblasten Melanom Prostatakarzinom TRAIL (x 105) Mittelwert 0,00 0,00 1927 3048 56520 β-Aktin 8276 4324 1785 20880 15020 Quotient TRAIL/β-Aktin (x 10-5) 0 0 1,08 0,15 3,76 Fibrosarkom Lymphom Abbildung 3.3.3 dient der graphischen Darstellung der obigen Ergebnisse. Die MelanomZellen weisen auch hier keine detektierbare Expression auf. Im Gegensatz zur TNF-αExpression lässt sich bei dieser Untersuchung für die Fibroblasten keine Expression 110 3 Ergebnisse detektieren. Dafür zeigen sich jedoch die Prostatakarzinom-Zellen positiv und verbuchen eine siebenfach höhere TRAIL-m-RNA-Expression im Vergleich zu den Fibrosarkom-Zellen. Das Lymphom ist auch hier wieder Vorreiter und weist eine 3,5-fache Expression verglichen mit den Prostatakarzinom-Zellen und eine 25-fache Expression verglichen mit den FibrosarkomZellen auf. Abbildung 3.3.3: Graphische Darstellung der Quotienten TRAIL/β-Aktin (x 10-5) als Maß für die relative Expression der TRAIL-mRNA (n.d.: nicht detektierbar). 3.3.1.4 Zusammenstellung der PCR-Ergebnisse Zur Übersicht sind die Ergebnisse der PCR tabellarsich zusammengefasst. Tabelle 3.3.3: Übersicht über die PCR-Ergebnisse für Fas Ligand, TNF-α und TRAIL Fibroblasten Melanom Prostatakarzinom Fas Ligand Expression - - - - vorhanden TNF-αExpression [relative Einheit] 786,73 - - 23,73 1021,3 TRAILExpression [relative Einheit] - - 1,08 0,15 3,76 111 Fibrosarkom Lymphom 3 Ergebnisse Für die Melanom-Zellen konnte keinerlei Expression nachgewiesen werden. Bei den Fibroblasten war eine TNF-α- und für die Prostatakarzinom-Zellen eine TRAIL-mRNAExpression festzustellen. Die Fibrosarkom-Zellen exprimierten sowohl TNF-α, als auch TRAIL in geringem Maß und die Lymphom-Zellen sind die einzigen Zellen, die die mRNA aller drei untersuchter Apoptose-induzierender Faktoren vorweisen können und zudem auch relativ gesehen die höchsten Werte erzielen. 3.3.2 Proteinnachweis in Tumorzellüberständen Der Proteinnachweis für Fas Ligand und TRAIL in Tumorzellüberständen wurde mithilfe eines ELISAs, der Nachweis von TNF-α mithilfe eines TNF-α Bioassays geführt. Bei diesem Bioassay werden TNF-α-sensible C5F6 Zellen neben eines TNF-α-Standards mit zu testenden Proben inkubiert. Bei Vorhandensein von TNF-α gehen diese Zellen in Apoptose, lösen sich ab und können anschließend mit Kristallviolett nicht mehr angefärbt werden. Somit nimmt die optische Dichte umgekehrt proportional mit der TNF-α-Menge ab. Die verwendeten Tumorzellüberstände entstammten zum einen dem bei -80°C gelagerten Vorrat aus den Versuchen der oben genannten Doktoranden, zum anderen wurden sie nach identischem Protokoll neu gewonnen, untersucht und ebenfalls bei -80°C eingefroren. Abbildung 3.3.4 zeigt das Ergebnis des TNF-α Bioassays. In keinem der untersuchten Tumorzellüberstände konnte das Protein TNF-α detektiert werden. Als Positivkontrolle dienten LPS-stimulierte Makrophagen. Abbildung 3.3.4: Ergebnis des TNF-α Bioassays. Als Kontrolle dienten LPS-stimulierte Makrophagen (n.d.: nicht detektierbar). Auch im Fas Ligand- und TRAIL-ELISA liesen sich keine detektierbaren Proteinmengen in den Tumorzellüberständen nachweisen. 112 4 Diskussion 4 Diskussion 4.1 Proliferationsverhalten Teilaufgabe dieser Arbeit war es, das Proliferationsverhalten maligner Tumorzellen der Maus durch Erstellen von Wachstumskurven und Mitoseindexverläufen zu charakterisieren. Es konnten einige der in-vitro-Eigenschaften transformierter Zellen bestätigt werden (vgl. Tabelle 1.5). So zeigten die adhärent wachsenden Tumorzelllinien Malignes Melanom sowie Prostatakarzinom in ihrem Wachstumsverlauf den Verlust der Kontaktinhibition und ein zunehmend mehrschichtiges Wachstum. Die nicht-malignen Fibroblasten hingegen wuchsen bis zu ihrer Absterbephase in einer Einzelschicht (engl. monolayer). Desweiteren mussten die Tumorzellen in der routinemäßigen Zellkultur nach der Passagierung mit einem sehr hohem Splitfaktor von 1:30 bis 1:80 weitergeführt werden, um die rasch proliferierenden Kulturen für mindestens drei Tage in morphologisch intakter Form aufrecht erhalten zu können. Eine derartig geringe Einsaatdichte ist ebenfalls kennzeichnend für transformierte Zellen. Bei nicht-neoplastischen Zellen könnte sie zum Absterben der Kultur führen. Die Wachstumskurvenverläufe sowie Wachstumsparameter bestätigen das Kriterium der erhöhten Proliferationsgeschwindigkeit von Tumorzellen. Bei den Tumorzellen wie auch bei den Fibroblasten konnten unter den gegebenen Bedingungen die unter 1.1.2 beschriebenen Wachstumsphasen in unterschiedlicher Ausprägung beobachtet werden. Jedoch lässt sich eine „lag-Phase“ (Anlaufphase) nicht eindeutig von der sich anschließenden „log-Phase“ (exponentielle Wachstumsphase) abgrenzen, was zeigt, dass die untersuchten Zelllinien bei adäquater Medium-Zusammensetzung sehr schnell ihre Proliferation vorantreiben. Alle malignen Tumorzelllinien zeigen einen steileren Zellzahlzuwachs während der „log-Phase“ als die Fibroblasten. Das spiegelt sich auch in den verschiedenen Wachstumsparametern wider (vgl. Tabelle 3.1.1.). Verglichen mit Angaben aus der Literatur zur Zellzyklusgesamtdauer von rasch proliferierenden menschlichen Zellen (24 h), murinen Tumorzellen in Kultur (24 h) und humanen Tumorzellen in Kultur (19,5 h) zeigen die hier untersuchten Tumorzelllinien deutlich geringere Generationszeiten von ca. 12-15 h. Um überhaupt Wachstumsverläufe der verwendeten Tumorzellen in angemessener Form präsentieren zu können, musste ein täglicher Mediumwechsel erfolgen. Vorversuche ohne Mediumwechsel zeigten ein rasantes Absterben der Tumorzellen nach wenigen Tagen, 113 4 Diskussion einhergehend mit einem schnellen Absinken des pH-Werts des ursprünglichen Mediums. Dies konnte insbesondere bei den Fibrosarkom-Zellen und den Prostatakarzinom-Zellen beobachtet werden. Diese Tatsache verdeutlicht die Ausrichtung der Tumorzellen auf schnelles Wachstum, was mit hohem Energieverbrauch einhergeht und sich im Verlauf auch nachteilig auswirken kann. Dieses Phänomen zeigt Parallelen zur Tumornekrose in vivo auf und macht verständlich, dass die Angiogenese eine für die Versorgung des Tumors wichtige Maßnahme darstellt. Auch die Maxima der Mitoseindices der Tumorzellen liegen deutlich über dem Maximum, das die Fibroblasten mit 9,5% erreichen, jedoch trifft das nicht auf die Melanom-Zellen zu (9,1%). Auffällig ist, dass die Maxima bei allen Zelllinien bis auf das des Fibrosarkoms in etwa in die Mitte der „log-Phase“ fallen. Das bedeutet, dass der Motor der Proliferation, die Zellteilung, zum Wendepunkt des Zellzahlzuwachses maximal wird, um dann die Kultur durch nachlassende Leistung in die Plateauphase münden zu lassen, in der dann relativ rasch die Zahl vitaler Zellen abnimmt. Insgesamt konnten anhand dieser Proliferationscharakterisierung Merkmale transformierter Zellen an den Tumorzellen veranschaulicht werden, die der AG N. Freudenberg (S. Göppinger 2006, Y. Rydlewski 2008, C. Gläser 2009), seit Beginn der Arbeiten zum Thema „Counterattack“, als Tumorzellüberstand-Lieferanten dienten. Zum anderen erleichtern die neu erworbenen Kenntnisse die Planung zukünftiger Versuche mit diesen Zelllinien. 4.2 Apoptoseverhalten Auch die Untersuchungen zum Apoptoseverhalten entsprechen den Eigenschaften, die Tumorzellen und Tumoren zugesprochen werden (siehe Tabelle 1.5). Demnach ist ein wichtiger pathogenetischer Aspekt der Kanzerogenese die mangelnde Fähigkeit zum programmierten Zelltod (Hanahan u. Weinberg 2000). Alle Tumorzelllinien – wie auch die Fibroblasten – zeigen ein Überwiegen an Bcl-2-Protein und sind somit antiapoptotisch eingestellt. Um das Apoptoseverhalten der Tumorzellen zu untersuchen, wurde der immunzytochemische Nachweis der Proteine Bcl-2 und Bax gewählt. Sowohl intrinsischer wie auch extrinsischer Signalweg nehmen Einfluss auf das Gleichgewicht dieser pro- und antiapoptotischen Vertreter der Bcl-2-Familie, das über das Schicksal der Mitochondrien und somit über das der Zelle insgesamt entscheidet (vgl. Abbildung 1.7). Das Verhältnis Bax zu Bcl-2 gibt somit 114 4 Diskussion Auskunft darüber, in welchem „Zustand“ – antiapoptotisch oder proapoptotisch – sich eine Zelle oder eine Kultur befindet und wie ausgeprägt dieser ist. Die Proteine Bcl-2 und Bax spiegeln demnach die Situation in der „Initiationsphase“ der Apoptose wider und ermöglichen eine quantitative Aussage, die Schlüsse über den wahrscheinlichen Werdegang zulässt: Wird die Zelle in Apoptose gehen oder ist sie davor geschützt, bzw. welcher Zustand überwiegt in einer Kultur und wie ausgeprägt ist dieser. Andere Methoden beruhen auf dem Nachweis fragmentierter DNA (DNA-Leiter, TUNEL-Technik). Sie bestätigen die „Exekutionsphase“ der Apoptose qualitativ durch DNA-Strangbrüche, können jedoch keine Aussage zur Apoptoseempfindlichkeit im Vorfeld machen. Zudem zeigen sich häufig Schwachpunkte in der Abgrenzung zur Nekrose (Nachweis von Annexin V, Nukleosomen-QuantifizierungsELISA, TUNEL-Technik) (Luttmann et al. 2009). Die Untersuchungen zum Apoptoseverhalten der Tumorzellen wurden zum Zeitpunkt der maximalen mitotischen Aktivität durchgeführt, was anhand der Mitoseindexverläufe ermittelt wurde. Damit wurde beabsichtigt, einen Zeitpunkt mit höchstmöglicher Referenztauglichkeit heranzuziehen. Denn die Gegenüberstellungen von Wachstumskurven und Mitoseindexverläufen ergaben, dass sich die Mitosemaxima bei fast allen Zelllinien in der Mitte der „log“bzw. Proliferationsphase befanden und der zugehörige Zeitpunkt mit höchstmöglicher Wahrscheinlichkeit die Kultur in ihrem bestmöglichen Zustand präsentiert. Während der Zeitspannen davor bzw. danach sind zuverlässige Aussagen schwierig – die Kultur könnte noch von der Einsaat bzw. bereits durch die Einleitung der Plateauphase beeinträchtigt sein. Interessant wäre in diesem Zusammenhang der Verlauf des Bax-/Bcl-2-Gleichgewichts über den Zeitraum der Wachstumsbeobachtung. Insgesamt zeigen die Ergebnisse somit ein Bcl-2-Überwiegen einer intakten und unstimulierten Tumorzellkultur. Es wäre nun interessant, wie durabel dieser durch Bcl-2 vermittelte Schutz der untersuchten Tumorzellen vor Apoptose ist. Das könnte durch Apoptoseinduktion untersucht werden, indem man beispielsweise die Tumorzellen mit Zytostatika oder Bestrahlung behandelt. Da DNA-Schäden über p53 die Bcl-2-Expression hemmen und die Bax-Expression steigern, könnte man die Auswirkungen auf das Bax/Bcl-2Gleichgewicht beobachten und zudem Aussagen über das Therapieansprechen machen (siehe unten). Alternativ könnte Apoptose über den Todesliganden TRAIL induziert werden, der seine Wirkung bevorzugt in Tumorzellen und nicht in normalen Zellen ausüben soll (Mellier et al. 2009). Bei den Prostatakarzinom-Zellen könnte der Entzug der Hormone Insulin und Dehydroandrosteron von Interesse sein. 115 4 Diskussion „Targeted Therapies“ Die klassische Zytostatika-Therapie beruht auf großen Reihenuntersuchungen („screening“) an Modellsystemen wie beispielsweise murinen Tumoren. Im Gegensatz dazu basiert die Entwicklung von sogenannten „targeted therapies“ (dt. zielgerichtete Therapien) auf dem Verständnis der Pathogenese und Pathophysiologie der Tumorentstehung (Berger 2010). Dies spiegelt sich in den möglichen Angriffspunkten und den jeweiligen Zielstrukturen wider. So spielen beipielsweise Angiogeneseregulatoren wie VEGF (engl. vascular endothelial growth factor), Onkogene wie ras, raf oder jun, Wachstumsfaktoren wie EGF (engl. epidermal growth factor), Signaltransduktionsmoleküle wie Tyrosinkinasen aber auch verschiedene Zellzyklus- und Apoptoseregulatoren eine wichtige Rolle. Durch Modifikationen von Genfunktionen (Gentherapie, Antisense-Oligonukleotide) oder Proteinfunktionen (monoklonale Antikörper, Rezeptoranatgonisten, Inhibitoren der intrazellulären Signaltransduktion etc.) sowie durch gezielte toxische Wirkungen (Immuntoxine) können sie therapeutischen Nutzen zeigen. Bisher konnten mit Tyrosinkinase-Hemmern wie beispielsweise Imatinib (Glivec) für die Therapie der CML (Chronisch Myeloische Leukämie) große Erfolge erzielt werden (Berger 2010). Die Modifikation der Apoptoseregulation verspricht ebenfalls großes Potenzial. Es wurden einige Therapieansätze in den letzten Jahren entwickelt, mit dem Ziel Apoptose direkt in Tumorzellen zu induzieren oder ihre Apoptosesensitivität für die konventionelle Zytostatikatherapie zu erhöhen (siehe unten). Da sich für viele Krebsarten eine verstärkte Expression von antiapoptotischen Bcl-2-Proteinen feststellen ließ, lag es nahe, diese gezielt zu hemmen, um so das Gleichgewicht zugunsten der Apoptose zu verschieben (Debatin & Fulda 2009). In diesem Sinne wurden „niedermolekulare Inhibitoren“, „Antisense-Oligonukleotide“ sowie „BH3-Peptidomimetika“ entwickelt. Oblimersen (Genasense®) beispielsweise ist ein „Bcl-2-Antisense-Oligonukleotid“, das die Bcl-2-Expression hemmt. In Kombination mit Chemotherapie soll es das Therapieansprechen von malignen Melanomen, B-CLL (Chronisch Lymphatische B-Zell-Leukämie) oder Multiplem Myelom verbessern. Insgesamt zeigen jedoch Phase-III-Studien nur eine geringe Wirksamkeit. Als ursächlich kommen andere Bcl-2-homologe Apoptosehemmer wie Bcl-xl und Bcl-w in Frage, die nicht durch Genasense® gehemmt werden und somit den antiapoptotischen Schutz der Tumorzellen aufrecht erhalten können (Daniel 2008). ABT-737® hingegen ist ein „BH3-Mimetikum“, das kompetitiv die Interaktion von anti- und proapoptotischen Bcl-2-Proteinen blockiert, indem es an die hydrophobe Tasche in Bcl-2, 116 4 Diskussion Bcl-xl und Bcl-w bindet. Dadurch sind diese Proteine in ihrer hemmenden Funktion blockiert, sodass Bax, Bak und NOXA ihre proapoptotische Wirkung entfalten können. ABT-737® zeigt in präklinischen Studien eine ausreichende zytotoxische Wirkung in der Therapie von CLL (Chronisch Lymphatische Leukämie), follikulärem Lymphom sowie kleinzelligem Lungenkarzinom; in anderen Malignomen muss mit Zytostatika oder Bestrahlung kombiniert werden. ABT-263® stellt die weiterentwickelte Form dar, die oral verfügbar ist und in klinischen Phase-I-Studien getestet wird (Debatin & Fulda 2009). Prognose und Chemosensitivität Verschiedene Studien konnten zeigen, dass die Überexpression von Bcl-2 und Bcl-xl in humanen Tumorzellen zu einem deutlichen Wirkungsverlust der chemotherapeutisch induzierten Apoptoseantwort führen. So konnte in einigen Fällen der Zusammenhang zwischen einer hohen Expression von Bcl-2 und Bcl-xl des Tumors und einer schlechten Prognose hergestellt werden. Umgekehrt konnte bei einer hohen Expression von Bax eine bessere Chemosensibilität beobachtet werden (Debatin & Fulda 2009). Die Studienlage ergab diesbezüglich jedoch kein einheitliches Bild, sodass die alleinige konstitutive Expression einzelner Apoptosefaktoren in unbehandelten Tumorzellen eher keinen prognostischen Wert zu haben scheint. So zeigen zahlreiche Studien insbesondere an Leukämien mit dem Ziel, Prognose oder Therapieansprechen mit der Genexpression zu korrelierten, dass in diesem Zusammenhang Gene von Zellzyklusregulatoren, Intermediärstoffwechsel und Proteinbiosynthese im Vordergrund stehen und nicht die Expression Apoptose-regulierender Gene (Debatin & Fulda 2009). Jedoch gelang es, die allgemeine Apoptosesensitivität in vitro mit Therapieansprechen bzw. Prognose direkt zu korrelieren. In den letzten Jahren hat sich gezeigt, dass die Apoptosesensitivität der Tumorzellen für die Wirksamkeit von Chemotherapie und γBestrahlung entscheidend sind. Allgemein haben Zytostatika über ihre Einflussnahme auf die DNA-, RNA- oder Proteinsynthese oder über die Hemmung bestimmter Proteine, die für Überleben, Proliferation und Migration von Tumorzellen wichtig sind, eine antiproliferative (zytostatischen) und/oder zytotoxische Wirkung. So wird die Zytostatikawirkung u. a. über DNA-Schäden und die p53-vermittelte Apoptose vermittelt und durch die relative Expression von pro- versus antiapoptotischen Bcl-2-Molekülen moderiert. Beide Instanzen stellen somit wichtige Säulen der Apoptosesensitivität dar. P53-negative Tumore zeigen entsprechend ein deutlich geringeres Therapieansprechen (Debatin & Fulda 2009). 117 4 Diskussion So scheint das Therapieansprechen eines Tumors von der Intaktheit wichtiger Elemente des programmierten Zelltods abzuhängen, die durch die therapeutischen Maßnahmen aktiviert werden können und somit die Tumorzelle in den Zelltod treiben. Umgekehrt kann eine Apoptoseresistenz in Form von „Programmdefekten“ der Apoptose zur Zytostatikaresistenz führen (Debatin & Fulda 2009). TRAIL Auch das TRAIL-System ist im Rahmen der Tumortherapie interessant, da TRAIL vornehmlich in Tumorzellen und nicht in normalen Zellen Apoptose induziert (Mellier et al. 2009). Toxizitätsstudien in Primaten zeigen zudem, dass TRAIL im Vergleich zu Fas-Ligand oder TNF-α, nahezu keine unerwünschten Wirkungen verursacht. Die systemische Gabe von Fas-L/CD95L beispielsweise führt zu einer ausgeprägten Hepatotoxizität und macht die klinische Anwendung unattraktiv. Präklinische Tiermodelle wiesen jedoch eine zu geringe Wirksamkeit von TRAIL allein in der Tumorwachstumskontrolle auf. Dennoch wurden erste klinische Studien mit rekombinanten, löslichen TRAIL oder TRAIL-R1- bzw. TRAIL-R2spezifischen Antikörpern initiiert. Kombinationen von TRAIL-Agonisten zusammen mit konventioneller Chemotherapie haben einen Zugewinn an Wirksamkeit gezeigt (Debatin & Fulda 2009). Jedoch stieß man bei vielen in vitro untersuchten Tumorzelllinien auf Resistenzentwicklungen gegenüber TRAIL-induzierter Apoptose, die auf einem Verlust an Bax bzw. der TRAIL-Rezeptor-Expression beruht. Zudem vermag TRAIL in solchen apoptoseresistenten Tumoren sogar die Proliferation und Metastasierung der Tumorzellen fördern (Daniel 2008). 4.3 Produktion von Apoptose­induzierenden Faktoren Im Hinblick auf die „Counterattack“-Theorie sollte überprüft werden, ob die in vorangegangenen Arbeiten verwendeten Tumorzelllinien Fas-L/CD95L oder andere Todesliganden wie TNF-α oder TRAIL produzieren, die für die erhöhte Apoptosebereitschaft von Makrophagen nach Inkubation mit zellfreien Überständen dieser Tumoren verantwortlich sein könnten. Die Untersuchung der mRNA ergab, dass drei der vier Tumorzelllinien (Tramp Prostatakarzinom, Meth-A Fibrosarkom, EL-4 Lymphom) mindestens einen dieser Todesliganden exprimieren. In den Tumorzellüberständen konnte jedoch keiner der möglichen Apoptoseinduktoren nachgewiesen werden, sodass die Frage, was in den 118 4 Diskussion Makrophagen die Verschiebung des Bax/Bcl-2-Gleichgewichts hin zur Proapotose verursacht hat, weiterhin offen bleibt. Von methodischer Seite muss in Betracht gezogen werden, dass eventuell die Nachweisgrenzen der Proteine in den Überständen für die angewandten Nachweisverfahren (ELISA, Bio-Assay) zu hoch bzw. diese Methoden nicht sensitiv genug für den Proteinnachweis sind. Es könnte sein, dass Tumorzellen im unstimulierten Zustand nur sehr geringe Mengen an Todesliganden produzieren, die erst durch Stimulation hochreguliert werden. Zu hohe Nachweisgrenzen sind ein immerwährendes Problem in der Analytik vieler Substanzen. Einen Lösungsansatz könnte die Etablierung einer Immuno-PCR (IPCR) darstellen, die bereits 1992 von Sano, Smith und Cantor ins Leben gerufen wurde (Luttmann et al. 2009). Diese Innovation kombiniert die Methoden ELISA und PCR, indem ein Detektionsantikörper (Sekundärkonjugat) mit einem DNA-Fragment (Marker-DNA) konjugiert wird, das dann mittels DNA-Polymerase vervielfältigt und detektiert werden kann (Luttmann et al. 2009). Somit lässt sich eine Signalverstärkung um den Faktor 10 000 zum herkömmlichen ELISA erreichen. Zudem können mehrere verschiedene Antigene in einem Ansatz durch den Einsatz verschiedenartiger Marker-DNA nachgewiesen werden. Wie in der Einleitung unter 1.3.2 dargestellt, haben sich die Vorstellungen im Rahmen der Tumorimmunologie in den letzten Jahren weiterentwickelt. So greift das aktuelle Konzept des „Immunoediting“ die zuvor favorisierten Prinzipien der „Immunosurveillance“ und des „Counterattack“ auf und vereint sie mit weiteren Erkenntnissen in einem dynamischen Prozess, in dem sich Tumor und Immunsystem in ihren Funktionen und Möglichkeiten gegenseitig beeinflussen (Croci et al. 2007, Manjili 2011). Die sich dabei abzeichnende Komplexität dieser Thematik lässt Raum für neue Erklärungsansätze. So tritt der „Counterattack“ in seiner Bedeutung als FasL-vermittelter Gegenangriff von Tumorzellen angesichts der zahlreichen Möglichkeiten, die sich ein Tumor im Laufe seines Selektionsprozesses aneignen kann, als eigenständiger strategischer Schachzug in den Hintergrund. Er ist vielmehr ein Mosaikstein im Gesamtwirken vieler „Immunoescape“Mechanismen, die es dem Tumor im Verlauf ermöglichen, sich über das Immunsystem hinweg zu setzen und sich ein „tumortolerantes“ Umfeld zu schaffen. Die Arbeit von M. Woisetschläger 2001 zeigte indirekt, dass das Fas/Fas-L-System ein möglicher Erklärungsansatz für die Apoptoseinduktion in Wildtyp-Makrophagen nach Inkubation mit Lewis-Lung-Tumorzellüberstand sein könnte. Die Tatsache jedoch, dass sich in Makrophagen aus Fas-Rezeptor-k.o-Mäusen unter den gleichen Bedingungen ebenfalls ein hochsignifikanter Unterschied in der Anzahl Bax-positiver Zellen zwischen Kontrolle und 119 4 Diskussion Tumorzellüberstand im Sinne einer erhöhten Expression ergab, führte zu dem Schluss, dass es wohl noch andere FasL-unabhängige Signalwege oder Auslösemechanismen für das Überwiegen des proapoptotischen Proteins Bax geben muss (S. Griesbaum 2003). In analoger Weise stellte auch M. Brauchle 2009 im Rahmen seiner Untersuchungen fest, dass Makrophagen des Fas-Rezeptor-k.o.-Typ vor der Apoptose-induzierenden Wirkung des Melanom-Tumorzellüberstandes nicht geschützt sind. Der Wert des Quotienten Bax/Bcl-2 sank zwar, verglichen mit seinem Pendant bei den Wildtyp-Makrophagen (Y. Rydlewski 2009), war aber stets größer eins (1,28) und somit herrschte auch in den Makrophagen aus Fas-Rezeptor-k.o.-Mäusen ein proapoptotischer Zustand. Ähnliches konnte in den Arbeiten von M. Osswald und A. Osswald für die Tumorzelllinien Meth-A Fibrosarkom bzw. EL-4 Lymphom gezeigt werden. Makrophagen aus TNF-αRezeptor-k.o.-Mäusen wiesen nach Inkubation mit Meth-A Fibrosarkom-Überständen keine Abnahme ihres Quotienten Bax/Bcl-2 (1,082) verglichen mit Wildtyp-Makrophagen (1,035) auf, die von S. Göppinger 2006 untersucht wurden. Somit ist TNF-α bei der Apoptoseinduktion durch Meth-A Fibrosarkom-Überstand höchstens mitbeteiligt, denn die Untersuchungen von M. Osswald zeigten nur eine minimal erhöhte Apoptosebereitschaft der TNF-α-Rezeptor-k.o.-Makrophagen durch den Meth-A-Überstand im Vegleich zum Medium und zum Fibroblasten-Überstand, was für einen schwachen Schutz der TNF-α-Rezeptor-k.o.Makrophagen vor der Apoptoseinduktion sprechen würde. TNF-α-Rezeptor-k.o.-Makrophagen zeigten hingegen nach Inkubation mit EL-4 LymphomÜberstand zwar eine Abnahme des Quotienten von 1,53 (S. Göppinger 2006) auf 1,18 (A. Osswald 2011). Da der Quotient Bax/Bcl-2 dennoch größer eins ist und somit im Vergleich zur internen Kontrolle (TNF-α-Rezeptor-k.o.-Makrophagen inkubiert mit Medium (0,93) bzw. Fibroblasten-Überstand (0,85) einen proapoptotischen Zustand repräsentiert, kann ebenfalls höchstens von einer Mitbeteiligung von TNF-α in der Apoptoseinduktion durch EL-4 Lymphom-Überstand ausgegangen werden. Die Ergebnisse der vorangegangenen Arbeiten sowie der vorliegenden schließen also FasL/CD95L, TNF-α und TRAIL als Verursacher der Apoptose-induzierenden Wirkung von Melanom-Tumorzellüberständen in unserem in-vitro-Modell aus, da weder auf mRNA-Ebene noch auf Proteinebene ein Nachweis erfolgte und auch die Ergebnisse von M. Brauchle (2009) dagegen sprechen. Beim Fibrosarkom sowie beim Lymphom könnte die mangelnde Sensitivität der Nachweismethoden bei vorhandener mRNA-Expression aller drei Todesliganden – bis auf FasL beim Fibrosarkom – ursächlich für den nicht erbrachten 120 4 Diskussion Proteinnachweis sein. Im Falle von TNF-α zeigzen jedoch die k.o.-Versuche von A. und M. Osswald, dass diesem Liganden höchstens eine Mitbeteiligung bei der Apoptoseinduktion zukommen kann. Über das Prostatakarzinom kann keine eindeutige Aussage gemacht werden. So müssen weitere Auslösemechanismen für den „Counterattack“ im weiteren Sinne in Betracht gezogen werden. Ähnlich wie die klassischen Todesrezeptoren und ihre Liganden wie Fas/Fas-L könnten beispielsweise PD-1 (engl. programmed cell death 1) und sein Ligand PD-L1 von Bedeutung sein. PD-1 ist ein Mitglied der CD28/B7-Familie, die für die T-ZellRegulation wichtige kostimulatorische Moleküle beinhaltet. PD-1 wird von aktivierten CD4+sowie CD8+-T-Zellen sowie von Antigen-präsentierenden Zellen (APCs) exprimiert (Dinesh et al. 2010). Zu letztgenannten gehören per Definition dendritische Zellen, Monozyten, Makrophagen und B-Lymphozyten. Die Funktion dieses Systems besteht in der Limitierung der T-Zell-Aktivierung und spielt somit eine wichtige Rolle in der Toleranzentwicklung sowie in der Aufrechterhaltung der Immunhomöostase (Fife u. Pauken 2011). PD-L1 wird konstitutiv von vielen Zellen des Immunsystems sowie von einigen nicht-hämatopoetischen Zelltypen exprimiert (Dinesh et al 2010). Die starke Expression von PD-L1 in Tumoren legt die Vermutung nahe, dass eine PDL1/PD-1-Interaktion die Tumorresistenz gegenüber tumorspezifischen T-Zellen vermitteln könnte (Thompson et al. 2004). Für das humane primäre Nierenzellkarzinom konnte die Expressionsdichte von PD-L1 mit der Prognose dieser Patienten korreliert werden (Thompson et al. 2004). In Bezug auf den Kontext dieser Arbeit muss zunächst geklärt werden, ob PD-L1 auch in löslicher Form von Tumorzellen sezerniert werden kann und ob die untersuchten Makrophagen PD-1 exprimieren. Weitere Erklärungsansätze könnten die Produktion immunsuppressiver Zytokine wie IL-10 oder TGF-β sowie die Sekretion der Indolamin-2,3-Dioxygenase (IDO) oder anderer Enzyme liefern, die für die Makrophagen lebensnotwendige Stoffe verstoffwechseln (vgl. 1.3.2). Zudem könnte der Energiemetabolismus von Tumorzellen eine Rolle spielen, der vorwiegend über die Glykolyse bestritten wird und durch Defekte in der mitochondrialen Atmungskette gekennzeichnet ist (Frezza et al. 2011). So wäre es denkbar, dass im Zuge dieser metabolischen Umstrukturierung sich Metabolite anhäufen oder reaktive Sauerstoffspezies (ROS) generiert werden, die die Makrophagen in ihrer Zellintegrität angreifen und eventuell zu einer Störung des Apoptosegleichgewichts führen. 121 6 Zusammenfassung 5 Zusammenfassung Die „Counterattack“-Theorie besagt, dass Tumorzellen in der Lage sind, sich aktiv der Immunabwehr durch Todesligand-vermittelte Apoptoseinduktion in Lymphozyten zu widersetzen. Untersuchungen des Labors N. Freudenberg konnten in den letzten Jahren dieses Prinzip auch für Makrophagen anhand eines in-vitro-Modells zahlreich demonstrieren. Sie zeigten, dass sich in Wildtyp-Makrophagen das Gleichgewicht zwischen pro- und antiapoptotischen Proteinen – Bax auf der einen, Bcl-2 auf der anderen Seite – nach Inkubation mit zellfreien Überständen von murinen malignen Tumorzellkulturen im Vergleich zum Medium und zu Fibroblasten-Überständen (nicht-maligne Kontrolle) zugunsten des proapoptotischen Proteins Bax verschiebt und somit von einer Apoptoseinduktion ausgegangen werden kann. Im Rahmen dieser Arbeit sollten einerseits die bei den vorangegangenen Untersuchungen verwendeten Tumorzelllinien Malignes Melanom, Tramp Prostatakarzinom, EL-4 Lymphom und Meth-A Fibrosarkom hinsichtlich ihres Proliferations- und Apoptoseverhaltens charakterisiert werden. L929-Fibroblasten dienten bei allen Untersuchungen als nicht-maligne Tumorzell-Kontrolle. Es wurden Wachstumskurven und Verläufe der jeweiligen Mitoseindices erstellt. Für die Apoptosebereitschaft der Tumorzellen wurde in analoger Weise zu den vorangegangenen Arbeiten der immunzytochemische Nachweis der Proteine Bcl-2 und Bax herangezogen. Es zeigte sich bei allen Tumorzelllinien ein beschleunigtes Wachstum sowie das Überwiegen des antiapoptotischen Proteins Bcl-2. Diese Ergebnisse verdeutlichen die charakteristischen Eigenschaften von Tumoren und Tumorzellen im Sinne einer erhöhten Proliferation sowie einer eingeschränkten Apoptosefähigkeit. Zudem sollten die Tumorzellen auf die Produktion bekannter Apoptose-induzierender Faktoren wie FasLigand (CD95L), TNF-α (engl. tumor necrosis factor α) und TRAIL (engl. TNF related apoptosis inducing ligand) untersucht werden, um so mögliche Todesliganden im Rahmen des „Counterattack“ in den Tumorzellüberständen identifizieren zu können. Bei drei von vier Tumorzelllinien konnte die mRNA-Expression einer dieser Faktoren nachgewiesen werden, in den Tumorzellüberständen jedoch war der Proteinnachweis bisher nicht möglich. Somit bleibt die Frage offen, was in den Makrophagen die Gleichgewichtsveränderung hin zur Proapoptose bewirkt haben könnte. Diese Ergebnisse müssen im Rahmen der sich zunehmend als komplex darstellenden Beziehung zwischen Tumor und Immunsystem gesehen werden, die für Tumorzellen ein ganzes Spektrum an Möglichkeiten bereithält, sich der Immunabwehr zu entziehen (engl. „Immunoescape“). 122 6 Literaturverzeichnis 6 Literaturverzeichnis 1. Adams J. M. and Cory S. (1998) The Bcl-2 protein family: arbiters of cell survival. Science 281(5381): 1322-1326 2. Adams J. M. and Cory S. (2001) Life-or-death decisions by the Bcl-2 protein family. Trends in biochemical sciences 26(1): 61-66 3. Andera L. (2009) Signaling activated by the death receptors of the TNFR family. Biomedical papers of the Medical Faculty of the University Palacky, Olomouc, Czechoslovakia 153(3): 173-180 4. Antonsson B. (2001) Bax and other pro-apoptotic Bcl-2 family "killer-proteins" and their victim the mitochondrion. Cell and tissue research 306(3): 347-361 5. Barker K. (2006) Das Cold Spring Harbor Laborhandbuch für Einsteiger. 1. Aufl. Elsevier, München 6. Bartram C. R. (2009) Genetische Grundlagen der Kanzerogenese. In: Hiddemann W., Bartram C. (Hg.) Die Onkologie. Teil 1: Epidemiologie, Pathogenese, Grundprinzipien der Therapie. 2. Aufl. Springer, Berlin, S. 68-127 7. Bayley J. P. and Devilee P. (2010) Warburg tumours and the mechanisms of mitochondrial tumour suppressor genes. Barking up the right tree? Current opinion in genetics & development 20(3): 324-329 8. BD Biosciences (2007) BD FalconTM – BD BioCoatTM: BD Biosciences – Discovery Labware Produktübersicht 2007. BD Biosciences Discovery Labware, Heidelberg. 9. Bennett M. W., O'Connell J., O'Sullivan G. C., Brady C., Roche D., Collins J. K., Shanahan F. (1998) The Fas „Counterattack“ in vivo: apoptotic depletion of tumorinfiltrating lymphocytes associated with Fas ligand expression by human esophageal carcinoma. Journal of immunology 160(11): 5669-5675 10. Berger D. P. (2010) „Targeted Therapies“. In: Berger D. P., Engelhardt R., Mertelsmann R. Das Rote Buch: Hämatologie und internistische Onkologie. 4. Aufl. Ecomed, Heidelberg, S. 221-236 11. Bidere N. and Senik A. (2001) Caspase-independent apoptotic pathways in T lymphocytes: a minireview. Apoptosis: an international journal on programmed cell death 6(5): 371-375 123 6 Literaturverzeichnis 12. Böcker W., Höfler H. K., Lax S., Poremba Ch., Moll R., Tannapfel A., Probst-Hensch N. (2008) Tumorerkrankungen. In: Böcker W., Denk H., Heitz Ph. U., Moch H. (Hg.) Pathologie. 4. Aufl. Elsevier, München, S. 167-218 13. Borner C. (2003) The Bcl-2 protein family: sensors and checkpoints for life-or-death decisions. Molecular immunology 39(11): 615-647 14. Brauchle M. (2009) Untersuchungen zum Apoptoseverhalten von Kulturmakrophagen an FAS-Ligand-Rezeptor knock-out Mäusen nach Inkubation mit Tumorüberständen des malignen Melanoms. Inauguraldissertation der medizinischen Fakultät Freiburg. 15. Bru A., Albertos S., Luis Subiza J., Garcia-Asenjo J. L., Bru I. (2003) The universal dynamics of tumor growth. Biophysical journal 85(5): 2948-2961 16. Buddecke E. (2002) Molekulare Medizin: eine systematische Einführung. 1. Aufl. Ecomed, Landsberg/Lech. 17. Corazza N., Kassahn D., Jakob S., Badmann A., Brunner T. (2009) TRAIL-induced apoptosis: between tumor therapy and immunopathology. Annals of the New York Academy of Sciences 1171: 50-58 18. Croci D. O., Zacarias Fluck M. F., Rico M. J., Matar P., Rabinovich G. A., Scharovsky O. G. (2007) Dynamic cross-talk between tumor and immune cells in orchestrating the immunosuppressive network at the tumor microenvironment. Cancer immunology, immunotherapy: CII 56(11): 1687-1700 19. Dang C. V., Hamaker M., Sun P., Le A., Gao P. (2011) Therapeutic targeting of cancer cell metabolism. Journal of molecular medicine 89(3): 205-212 20. Danial N. N. and Korsmeyer S. J. (2004) Cell death: critical control points. Cell 116(2): 205-219 21. Daniel P. (2007) Molekulare Grundlagen der Apoptose. In: Ganten D., Ruckpaul K. (Hg.) Grundlagen der Molekularen Medizin. 3. Aufl. Springer, Berlin, S. 160-203 22. Debatin K.-M., Fulda S. (2009) Apoptose. In: Hiddemann W., Bartram C. (Hg.) Die Onkologie. Teil 1: Epidemiologie, Pathogenese, Grundprinzipien der Therapie. 2. Aufl. Springer, Berlin, S.152-161 23. Dinesh R. K., Hahn B. H., Singh R. P. (2010) PD-1, gender, and autoimmunity. Autoimmunity reviews 9(8): 583-587 24. Dörmer P. (2000) Zellproliferation und Tumorwachstum. In: Wilmanns W., Huhn D., Wilms K. (Hg.) Internistische Onkologie. 2. Aufl. Thieme, Stuttgart, S. 93-101 124 6 Literaturverzeichnis 25. Dunn G. P., Bruce A. T., Ikeda h., Old, L. J., Schreiber R. D. (2002) Cancer immunoediting: from immunosurveillance to tumor escape. Nature immunology 3(11): 991-998 26. Dunn G. P., Old L. J., Schreiber R. D. (2004) The immunobiology of cancer immunosurveillance and immunoediting. Immunity 21(2): 137-148 27. Dunn G. P., Old L. J., Schreiber R. D. (2004) The three Es of cancer immunoediting. Annual review of immunology 22: 329-360 28. Ehrlich P. (1909) Über den jetzigen Stand der Karzinom Forschung. Ned Tijdschr Geneeskd 5: 273–290. 29. Elgert K. D., Alleva D. G., Mullins D. W. (1998) Tumor-induced immune dysfunction: the macrophage connection. Journal of leukocyte biology 64(3): 275-290 30. Falschlehner C., Schaefer U., Walczak H. (2009) Following TRAIL's path in the immune system. Immunology 127(2): 145-154 31. Fife B. T. and Pauken K. E. (2011) The role of the PD-1 pathway in autoimmunity and peripheral tolerance. Annals of the New York Academy of Sciences 1217: 45-59 32. Francisco L. M., Sage P. T., Sharpe A. H. (2010) The PD-1 pathway in tolerance and autoimmunity. Immunological reviews 236: 219-242 33. Freudenberg N., Rahner P., Darda C., Kiss A., Veres G., Nees T., Lamers R., Riede U. N., Kortsik C., Schubert M., Frenzer-Welle K. (1996) Early detection of metastasis by alterations in the cellular immune system in the murine liver and blood. Virchows Archiv: an international journal of pathology 428(3): 187-194 34. Frezza C., Pollard P. J., Gottlieb E. (2011). Inborn and acquired metabolic defects in cancer. Journal of molecular medicine 89(3): 213-220 35. Gajewski T. F. (2006) Identifying and overcoming immune resistance mechanisms in the melanoma tumor microenvironment. Clinical cancer research: an official journal of the American Association for Cancer Research 12(7 Pt 2): 2326s-2330s 36. Gajewski T. F., Meng Y., Blank C., Brown I., Kacha A., Kline J., Harlin H. (2006) Immune resistance orchestrated by the tumor microenvironment. Immunological reviews 213: 131-14 37. Gajewski T. F., Meng Y., Harlin H. (2006) Immune suppression in the tumor microenvironment. Journal of immunotherapy 29(3): 233-240 38. Galluzzi L. and G. Kroemer (2008) Necroptosis: a specialized pathway of programmed necrosis. Cell 135(7): 1161-1163 125 6 Literaturverzeichnis 39. Gläser Ch. (2009) Beobachtungen des Apoptoseverhaltens von Kulturmakrophagen auf den Überstand von Prostatakarzinom-Zellen in vitro. Inauguraldissertation der medizinischen Fakultät Freiburg 40. Göppinger S. (2006) „Counterattack“ – ein Prinzip der Metastasierung maligner Tumoren. Inauguraldissertation der medizinischen Fakultät Freiburg 41. Green D. R. (2003) Overview: apoptotic signaling pathways in the immune system. Immunological reviews 193: 5-9 42. Griesbaum S. (2003) Untersuchung der Rolle des Fas/FasL-Systems bei der Auslösung der Apoptose durch Tumorzellen in Fas-knock out Maus-Makrophagen. Inauguraldissertation der medizinischen Fakultät Freiburg 43. Grimm M., Kim M., Rosenwald A., von Rahden B., Tsaur I., Meier E., Heeman U., Germer C. T., Gasser M., Waaga-Gasser A. M. (2010) Tumour-mediated TRAILReceptor expression indicates effective apoptotic depletion of infiltrating CD8+ immune cells in clinical colorectal cancer. European journal of cancer 46(12): 23142323 44. Guicciardi M. E. and Gores G. J. (2009) Life and death by death receptors. The FASEB journal: official publication of the Federation of American Societies for Experimental Biology 23(6): 1625-1637 45. Hanahan D. and Weinberg R. A. (2011) Hallmarks of cancer: the next generation. Cell 144(5): 646-674 46. Hayflick L. (1998) „How and why we age.” Exp Gerontol 33(7-8): 639-653 47. Hirsch-Kauffmann M., Schweiger M., Schweiger M.-R. (2009) Biologie und molekulare Medizin für Mediziner und Naturwissenschaftler. 7. Aufl. Thieme, Stuttgart, S.53-56 48. Hoffmann O., Zipp F., Weber J. R. (2009) Tumour necrosis factor-related apoptosisinducing ligand (TRAIL) in central nervous system inflammation. Journal of molecular medicine 87(8): 753-763 49. Houston A. and O'Connell J. (2004) The Fas signalling pathway and its role in the pathogenesis of cancer. Current opinion in pharmacology 4(4): 321-326 50. Huang D. C., Adams J. M., Cory S. (1998) The conserved N-terminal BH4 domain of Bcl-2 homologues is essential for inhibition of apoptosis and interaction with CED-4. The EMBO journal 17(4): 1029-1039 126 6 Literaturverzeichnis 51. Huang R. P., Fan Y., Peng A., Zeng Z. L., Reed J. C., Adamson E. D., Boynton A. L. (1998) Suppression of human fibrosarcoma cell growth by transcription factor, Egr-1, involves down-regulation of Bcl-2. International journal of cancer. Journal international du cancer 77(6): 880-886 52. Igney F. H., Behrens C. K., Krammer P. H. (2000) Tumor „Counterattack“--concept and reality. European journal of immunology 30(3): 725-731 53. Igney F. H., Behrens C. K., Krammer P. H. (2005) CD95L mediates tumor „Counterattack“ in vitro but induces neutrophil-independent tumor rejection in vivo. International journal of cancer. Journal international du cancer 113(1): 78-87 54. Igney F. H., Krammer P. H. (2002) Immune escape of tumors: apoptosis resistance and tumor „Counterattack“. Journal of leukocyte biology 71(6): 907-920 55. Igney F. H., Krammer P. H. (2005) Tumor „Counterattack“: fact or fiction? Cancer immunology, immunotherapy : CII 54(11): 1127-1136 56. Joza N., Pospisilik J. A., Hangen E., Hanada T., Modjtahedi N., Penninger J. M., Kroemer G. (2009) AIF: not just an apoptosis-inducing factor. Annals of the New York Academy of Sciences 1171: 2-11 57. Kagawa S., He C., Gu J., Koch P., Rha S. J., Roth J. A., Curley S. A., Stephens L. C., Fang B. (2001) Antitumor activity and bystander effects of the tumor necrosis factorrelated apoptosis-inducing ligand (TRAIL) gene. Cancer research 61(8): 3330-3338 58. Kang M. H. and Reynolds C. P. (2009) Bcl-2 inhibitors: targeting mitochondrial apoptotic pathways in cancer therapy. Clinical cancer research: an official journal of the American Association for Cancer Research 15(4): 1126-1132 59. Kim R., Emi M., Tanabe K., Arihiro K. (2006) Tumor-driven evolution of immunosuppressive networks during malignant progression. Cancer research 66(11): 5527-5536 60. Kim R., Emi M., Tanabe K., Uchida Y., Toge T. (2004) The role of Fas ligand and transforming growth factor beta in tumor progression: molecular mechanisms of immune privilege via Fas-mediated apoptosis and potential targets for cancer therapy. Cancer 100(11): 2281-2291 61. Krajewski S., Krajewska M., Shabaik A., Miyashita T., Wang H. G., Reed J. C. (1994) Immunohistochemical determination of in vivo distribution of Bax, a dominant inhibitor of Bcl-2. The American journal of pathology 145(6): 1323-1336 127 6 Literaturverzeichnis 62. Kremer B. P. (2010) Vom Referat bis zur Examensarbeit: Naturwissenschaftliche Texte perfekt verfassen und gestalten. 3. Aufl. Springer, Heidelberg 63. Labi V., Grespi F., Baumgartner F., Villunger A. (2008) Targeting the Bcl-2-regulated apoptosis pathway by BH3 mimetics: a breakthrough in anticancer therapy? Cell death and differentiation 15(6): 977-987 64. Ladstein R. G., Bachmann I. M., Straume O., Akslen L. A. (2010) Ki-67 expression is superior to mitotic count and novel proliferation markers PHH3, MCM4 and mitosin as a prognostic factor in thick cutaneous melanoma. BMC cancer 10: 140 65. Lee H. O. and Ferguson T. A. (2003) Biology of FasL. Cytokine & growth factor reviews 14(3-4): 325-335 66. Lindl T., Gstraunthaler G. (2008) Zell- und Gewebekultur: Von den Grundlagen zur Laborbank. 6. Aufl. Spektrum, Heidelberg 67. Locksley R. M., Killeen N., Lenardo M. J. (2001) The TNF and TNF receptor superfamilies: integrating mammalian biology. Cell 104(4): 487-501 68. Loose D. and Van de Wiele C. (2009) The immune system and cancer. Cancer biotherapy & radiopharmaceuticals 24(3): 369-376 69. Luttmann W., Bratke K., Küpper M., Myrtek D. (2009) Der Experimentator Immunologie. 3. Aufl. Spektrum, Heidelberg 70. Mackillop W. J. (1990) The growth kinetics of human tumours. Clinical physics and physiological measurement : an official journal of the Hospital Physicists' Association, Deutsche Gesellschaft fur Medizinische Physik and the European Federation of Organisations for Medical Physics 11 Suppl A: 121-123 71. Majno G. and Joris I. (1995) Apoptosis, oncosis, and necrosis. An overview of cell death. The American journal of pathology 146(1): 3-15 72. Manjili M. H. (2011) Revisiting cancer immunoediting by understanding cancer immune complexity. The Journal of pathology 224(1): 5-9 73. Martin M., Resch K. (2009) Immunologie. 1. Aufl. UTB Ulmer, Stuttgart. 74. Mehrara E., Forssell-Aronsson E., Ahlman H., Bernhardt P. (2009) Quantitative analysis of tumor growth rate and changes in tumor marker level: specific growth rate versus doubling time. Acta oncologica 48(4): 591-597 75. Mellier G., Huang S., Shenoy, K., Pervaiz S. (2010) TRAILing death in cancer. Mol Aspects Med 31(1): 93-112 128 6 Literaturverzeichnis 76. Miller L. A., Goldstein N. B., Johannes W. U., Walton C. H., Fujita M., Norris D. A., Shellman Y. G. (2009) BH3 mimetic ABT-737 and a proteasome inhibitor synergistically kill melanomas through Noxa-dependent apoptosis. The Journal of investigative dermatology 129(4): 964-971 77. Montenarh M. (2006) Replikation und Gentechnik. In: Löffler G., Petrides P. E., Heinrich P. C. (Hg.) Biochemie und Pathobiochemie. 8. Aufl. Springer, Heidelberg, S. 219-254 78. Nagata S. (1997) Apoptosis by death factor. Cell 88(3): 355-365 79. Nethe-Jaenchen R. (2008) Mikrobielles Wachstum. In: Munk K. (Hg.) Mikrobiologie, Taschenlehrbuch Biologie. 1.Aufl. Thieme, Stuttgart, S. 257-303 80. Netzker R. (2006a) Der Zellzyklus. In: Rassow J., Hauser K., Netzker R., Deutzmann R., Bob A., Bob K. (Hg.) Biochemie, Duale Reihe. 1. Aufl. Thieme, Stuttgart, S. 512516 81. Netzker, R. (2006b) Die Apoptose. In: Rassow J., Hauser K., Netzker R., Deutzmann R., Bob A., Bob K. (Hg.) Biochemie, Duale Reihe. 1.Aufl. Thieme, Stuttgart, S. 517521 82. O'Connell J., Bennett M. W., O'Sullivan G. C., Collins J. K., Shanahan F. (1999) Resistance to Fas (APO-1/CD95)-mediated apoptosis and expression of Fas ligand in esophageal cancer: the Fas „Counterattack“. Diseases of the esophagus: official journal of the International Society for Diseases of the Esophagus / I.S.D.E 12(2): 8389 83. O'Connell J., Bennett M. W., O'Sullivan G. C., Collins J. K., Shanahan F. (1999) The Fas „Counterattack“: cancer as a site of immune privilege. Immunology today 20(1): 46-52 84. O'Connell J., Bennett M. W., O'Sullivan G. C., Roche D., Kelly J., Collins J. K., Shanahan F. (1998) Fas ligand expression in primary colon adenocarcinomas: evidence that the Fas „Counterattack“ is a prevalent mechanism of immune evasion in human colon cancer. The Journal of pathology 186(3): 240-246 85. O'Connell J., O'Sullivan G. C., Collins J. K., Shanahan F. (1996) The Fas „Counterattack“: Fas-mediated T cell killing by colon cancer cells expressing Fas ligand. The Journal of experimental medicine 184(3): 1075-1082 129 6 Literaturverzeichnis 86. O'Connor L., Strasser A., O'Reilly L. A., Hausmann G., Adams J. M., Cory S., Huang D. C. (1998). Bim: a novel member of the Bcl-2 family that promotes apoptosis. The EMBO journal 17(2): 384-395 87. Okazaki T. and Honjo T. (2007) PD-1 and PD-1 ligands: from discovery to clinical application. International immunology 19(7): 813-824 88. Osswald A. (2011) Der Effekt des Kulturüberstandes von EL-4-Tumorzellen auf Knochenmarksmakrophagen von TNF-α- k.o.-Mäusen in vitro. Inauguraldissertation der medizinischen Fakultät Freiburg 89. Osswald M. (2011) Der Einfluss von bislang unbekannten humoralen Faktoren des MethA-Fibrosarkoms auf Makrophagen von TNF-α k.o.-Mäusen in der Zellkultur. Inauguraldissertation der medizinischen Fakultät Freiburg 90. Ostrand-Rosenberg S. (2008) Immune surveillance: a balance between protumor and antitumor immunity. Current opinion in genetics & development 18(1): 11-18 91. Pezzutto A., Ulrichs T., Burmester G-.R. (2007) Taschenatlas der Immunologie: Grundlagen – Labor – Klinik. 2. Aufl. Thieme, Stuttgart 92. Plattner H., Hentschel J. (2006) Zellbiologie. 3. Aufl. Thieme, Stuttgart 93. Prestwich R. J., Errington F., Hatfield P., Merrick A. E., Ilett E. J., Selby P. J., Melcher A. A. (2008) The immune system--is it relevant to cancer development, progression and treatment? Clinical oncology 20(2): 101-112 94. Quezada S. A., Peggs K. S., Simpson T. R., Allison J. P. (2011) Shifting the equilibrium in cancer immunoediting: from tumor tolerance to eradication. Immunological reviews 241(1): 104-118 95. Raisova M., Hossini A. M., Eberle J., Riebeling C., Wieder T., Sturm I., Daniel P. T., Orfanos C. E., Geilen C. C. (2001) The Bax/Bcl-2 ratio determines the susceptibility of human melanoma cells to CD95/Fas-mediated apoptosis. The Journal of investigative dermatology 117(2): 333-340 96. Raiss N. (2003) Wirkung von Endotoxinauf Kulturmakrophagen nach Inkubation mit einem Apoptose induzierenden Faktor des LEWIS-Lung-Karzinoms. Inauguraldissertation der medizinischen Fakultät Freiburg 97. Ramaswamy M., Cleland,S. Y., Cruz A. C., Siegel R. M. (2009) Many checkpoints on the road to cell death: regulation of Fas-FasL interactions and Fas signaling in peripheral immune responses. Results and problems in cell differentiation 49: 17-47 130 6 Literaturverzeichnis 98. Reiman J. M., Kmieciak M., Manjili M. H., Knutson K. L. (2007) Tumor immunoediting and immunosculpting pathways to cancer progression. Seminars in cancer biology 17(4): 275-287 99. Riede U.-N. (2004) Störungen der Reizbeantwortung. In: Riede U.-N., Schäfer H.-E., Werner M. (Hg.) Allgemeine und spezielle Pathologie. 5. Aufl. Thieme, Stuttgart, S. 117-156 100. Riede U.-N., Walch A., Wiestler O. D. (2004) Störungen des Zellwachstums. In: Riede U.-N., Schäfer H.-E., Werner M. (Hg.) Allgemeine und spezielle Pathologie. 5. Aufl. Thieme, Stuttgart, S. 329-384 101. Rivoltini L., Carrabba M., Huber V., Castelli C., Novellino L., Dalerba P., Mortarini R., Arancia G., Anichini A., Fais S., Parmiani G. (2002) Immunity to cancer: attack and escape in T lymphocyte-tumor cell interaction. Immunological reviews 188: 97-113 102. Rydlewski Y (2008) Der Einfluss des Tumorzellüberstandes von Melanom- Zellenauf die Apoptoseaktivität von Knochenmarksmakrophagen. Inauguraldissertation der medizinischen Fakultät Freiburg 103. Schink B. (2006) Wachstum und Ernährung der Mikroorganismen. In: Fuchs G. (Hg.) Allgemeine Mikrobiologie. 8. Aufl. Thieme, Stuttgart, S. 157-194 104. Schmitz S. (2009) Der Experimentator Zellkultur. 2. Aufl. Spektrum, Heidelberg 105. Schmoll H.-J., Höffken K., Possinger K. (Hg.) (2005) Kompendium internistische Onkologie: Standards in Diagnostik und Therapie. 4. Aufl. Springer, Heidelberg 106. Schreiber R. D., Old L. J., Smyth M. J. (2011) Cancer immunoediting: integrating immunity's roles in cancer suppression and promotion. Science 331(6024): 1565-1570. 107. Schreiber T. H. and Podack E. R. (2009) A critical analysis of the tumour immunosurveillance controversy for 3-MCA-induced sarcomas. British journal of cancer 101(3): 381-386 108. Schulte-Hermann R., Parzefall W. (2009) Mehrstufenprozess der Krebsentstehung und chemische Kanzerogenese. In: Hiddemann W., Bartram C. (Hg.) Die Onkologie. Teil 1: Epidemiologie, Pathogenese, Grundprinzipien der Therapie. 2. Aufl. Springer, Berlin, S. 182-223 131 6 Literaturverzeichnis 109. Sengupta N., MacFie T. S., MacDonald T. T., Pennington D., Silver A. R. (2010) Cancer immunoediting and "spontaneous" tumor regression. Pathology, research and practice 206(1): 1-8 110. Shankaran V., Ikeda H., White J. M., Swanson P. E., Old L. J., Schreiber R. D. (2001) IFNgamma and lymphocytes prevent primary tumour development and shape tumour immunogenicity. Nature 410(6832): 1107-11 111. Speicher M. (2006) Chromosomen des Menschen. In: Murken J., Grimm T., Holinski-Feder E. (Hg.) Humangenetik, Taschenlehrbuch. 7. Aufl. Thieme, Stuttgart, S. 126-174 112. Srivastava R. K. (2001) TRAIL/Apo-2L: mechanisms and clinical applications in cancer. Neoplasia 3(6): 535-546 113. Szliszka E., Czuba Z. P., Sedek L., Paradysz A., Krol W. (2011) Enhanced TRAIL-mediated apoptosis in prostate cancer cells by the bioactive compounds neobavaisoflavone and psoralidin isolated from Psoralea corylifolia. Pharmacological reports : PR 63(1): 139-148 114. Terawaki S., Tanaka Y., Nagakura T., Hayashi T., Shibayama S., Muroi K., Okazaki T., Mikami B., Garboczi D. N., Honjo T., Minato N. (2007) Specific and high-affinity binding of tetramerized PD-L1 extracellular domain to PD-1-expressing cells: possible application to enhance T cell function. International immunology 19(7): 881-890 115. Thermo Scientific Homepage: Protein Methods Library > Avidin-Biotin Complex for IHC Detection. <http://www.piercenet.com/browse.cfm?fldID=5E9905 AB-CA02-E370-95DE-C9816CF9F7DC> (20.02.2011) 116. Thompson R. H., Gillett M. D., Cheville J. C., Lohse C. M., Dong H., Webster W. S., Krejci K. G., Lobo J. R., Sengupta S., Chen L., Zincke H., Blute M. L., Strome S. E., Leibovich B. C., Kwon E. D. (2004) Costimulatory B7-H1 in renal cell carcinoma patients: Indicator of tumor aggressiveness and potential therapeutic target. Proc Natl Acad Sci USA 101:17174–17179 117. Van Engeland M., Nieland L. J., Ramaekers F. C., Schutte B., Reutelingsperger C. P. (1998) Annexin V-affinity assay: a review on an apoptosis detection system based on phosphatidylserine exposure. Cytometry 31(1): 1-9 118. Vesely M. D., Kershaw M. H., Schreiber R. D., Smyth M. J. (2011) Natural innate and adaptive immunity to cancer. Annual review of immunology 29: 235-271 132 6 Literaturverzeichnis 119. Vinay D. S., Kwon B. S. (2009) TNF superfamily: costimulation and clinical applications. Cell biology international 33(4): 453-465 120. Wagener Ch., Müller O. (2010) Molekulare Onkologie: Entstehung, Progression, klinische Aspekte. 3. Aufl. Thieme, Stuttgart 121. Wajant H., Pfizenmaier K., Scheurich P. (2003) Tumor necrosis factor signaling. Cell death and differentiation 10(1): 45-65 122. Weinlich R., Brunner T., Amarante-Mendes G. P. (2010) Control of death receptor ligand activity by posttranslational modifications. Cellular and molecular life sciences: CMLS 67(10): 1631-1642 123. Whiteside T. L. (2007) The role of death receptor ligands in shaping tumor microenvironment. Immunological investigations 36(1): 25-46 124. Williams G. T., Smith, C. A., McCarthy N. J., Grimes E. A. (1992) Apoptosis: final control point in cell biology. Trends in cell biology 2(9): 263-267 125. Woisetschläger M. (2001) Nachweis des apoptoseinduzierenden Faktors in LEWIS-Lung-Karzinomüberstand nach Inkubation von Kulturmakrophagen der C57/BL6 Maus. Inauguraldissertation der medizinischen Fakultät Freiburg 126. Wolf K. W. (2008) Zellteilung. In: Munk, K. (Hg.) Biochemie – Zellbiologie, Taschenlehrbuch Biologie. 1. Aufl. Thieme, Stuttgart, S. 508-530. 127. Wolff J. (2001) Etablierung eines in vitro Modells zum Nachweis von Apoptose an reifen Mausmakrophagen. Inauguraldissertation der medizinischen Fakultät Freiburg 128. Yang A., Wilson N. S., Ashkenazi A. (2010) Proapoptotic DR4 and DR5 signaling in cancer cells: toward clinical translation. Current opinion in cell biology 22(6): 837-844 129. Zatloukal K., Roth J., Denk H. (2008) Zell- und Gewebereaktionen. In: Böcker W. (Hg.), Denk H. (Hg.), Heitz Ph. U. (Hg.), Moch H. (Hg.) Pathologie, 4. Aufl. Elsevier, München, S. 35-72 130. Zhang L., Ming L., Yu J. (2007) BH3 mimetics to improve cancer therapy; mechanisms and examples. Drug resistance updates: reviews and commentaries in antimicrobial and anticancer chemotherapy 10(6): 207-217 131. Zhu Q., Liu J. Y., Xu H. W., Yang C. M., Zhang A. Z., Cui Y., Wang H. B. (2005) Mechanism of „Counterattack“ of colorectal cancer cell by Fas/Fas ligand system. World journal of gastroenterology: WJG 11(39): 6125-6129 133 7 Anhang 7 Anhang 7.1 Lebenslauf Persönliche Daten Name: Kristin Tanja Simon Geburtsdatum: 15.05.1985 Geburtsort: Stuttgart, Bad-Cannstatt Wohnort: Nöllenstr. 23c, 70195 Stuttgart Staatsangehörigkeit: deutsch Familienstand: ledig Eltern: Dr. med. Christian Simon *02.01.1948, Beruf: Neurologe und Psychiater Angelika Simon, geb. Möbus *10.09.1948, Beruf: Apothekerin Schulischer / Beruflicher Werdegang: Grundschule: von 1991 bis 1995 Franz-Schubert-Schule, Stuttgart-Botnang Gymnasium: von 1995 bis 2004 Karls-Gymnasium Stuttgart Schulabschluss: Abitur Studium: Studium der Humanmedizin an der Albert-Ludwigs-Universität Freiburg i. Br. seit 2004 Physikum: März 2007 Promotion: 2009 bis 2011 am Institut für Pathologie der Universität Freiburg i. Br. Doktorvater: Prof. Dr. Dr. h.c. Nikolaus Freudenberg 134 7 Anhang 7.2 Danksagung An dieser Stelle möchte ich mich recht herzlich bei all denjenigen bedanken, die mich bei der Erstellung dieser Dissertation unterstützt haben. Mein besonderer Dank gilt Herrn Prof. Dr. Nikolaus Freudenberg für die Überlassung des Themas und seine stets freundliche Betreuung und Unterstützung bei der Durchführung dieser Doktorarbeit. Außerdem möchte ich mich bei Frau Brigitte Freudenberg und Frau Ulrike Weber für die tatkräftige Unterstützung in allen praktischen Angelegenheiten bedanken. Desweiteren möchte ich mich herzlich bei Frau Prof. Dr. Marina Freudenberg und Herrn Prof. Dr. Chris Galanos sowie allen Mitarbeitern der Arbeitsgruppe M. Freudenberg am MaxPlanck-Institut für Immunbiologie und Epigenetik in Freiburg bedanken, die es mir ermöglicht haben einen großen Teil meiner Arbeit in ihrem Labor unter fachkundiger Beratung zu verwirklichen. Insbesondere danken möchte ich Dr. Sandrine Tchaptchet und Dr. Simone Keck, die mich zu Beginn meiner Arbeit sehr unterstütz haben. Den Dipl.Biologinnen Ines Müller und Mareike Wegner gilt meine besondere Aufwartung – an unsere gemeinsame Zeit im Labor sowie unsere zahlreichen Kaffeepausen werde ich mich immer mit Freuden erinnern und ich danke euch von ganzem Herzen für Eure wunderbare Unterstützung. Nicht zuletzt geht mein besonderer Dank an die technischen Assistenten Petra Lüderitz und Jasmin Ippisch, die mir zu Beginn grundlegende Techniken der Zellkultur vermittelt haben. Natürlich geht mein Dank auch an meine geschätzten Freunde Marco Kirchhoff, Julia Schlotter, Annik Heyer, Kristina Oppermann und Ann-Kathrin Koch, die mich während der Durchführung dieser Arbeit immer unterstützt haben. Zu guter Letzt möchte ich meinen Eltern Angelika und Christian sowie meinen Geschwistern Katharina und Oliver meinen tiefsten Dank aussprechen. In manch schwerer Stunde hatten sie stets ein geduldiges Ohr für mich und standen mir mit Rat und Tat beiseite. Schön, dass es sie gibt. 135
