Dokument_43.

Konditionelle Gendeletion des Ryanodinrezeptors
RyR2 im Herzen der Maus
Der Naturwissenschaftlichen Fakultät
der Friedrich-Alexander-Universität Erlangen-Nürnberg
zur
Erlangung des Doktorgrades Dr. rer. nat.
vorgelegt von
Anita Milbradt
aus Temeschburg
Als Dissertation genehmigt von der Naturwissenschaftlichen Fakultät
der Friedrich-Alexander-Universität
Erlangen-Nürnberg
Tag der mündlichen Prüfung:
11. November 2011
Vorsitzender der
Promotionskommission:
Prof. Dr. Rainer Fink
Erstberichterstatter:
Prof. Dr. Andreas Ludwig
Zweitberichterstatter:
Prof. Dr. Johann Helmut Brandstätter
Inhaltsverzeichnis
I
Inhaltsverzeichnis
Inhaltsverzeichnis
I
Zusammenfassung
IV
Summary
V
1.
Einleitung
1
1.1
Das Herz
1
1.2
Die elektromechanische Kopplung des Herzens
1
1.3
Der Ryanodinrezeptor
3
1.4
Die Rolle von RyR2 im Reizleitungssystem
4
1.5
Konditionelle Knockout-Tiere: das Cre/loxP-System
6
1.6
Induzierbare konditionelle RyR2-Knockoutmäuse
7
1.7
Ziel dieser Arbeit
8
2.
Material und Methoden
9
2.1
DNA-Techniken
9
2.1.1
Isolierung genomischer DNA zur Genotypisierung
9
2.1.2
Isolierung genomischer DNA aus Mausherz
9
2.1.3
Polymerasekettenreaktion (PCR)
10
2.1.4
Agarose-Gelelektrophorese
11
2.2
RNA-Techniken
12
2.2.1
Isolierung von Gesamt-RNA
12
2.2.2
Semiquantitative RT-PCR aus Gewebe
12
2.2.3
Semiquantitative RT-PCR aus isolierten Sinusknotenzellen
13
2.3
Protein-Techniken
14
2.3.1
Isolierung und Präparation von Proteinen
14
2.3.2
Proteinbestimmung mit BCA
14
2.3.3
SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese (SDS-PAGE)
14
2.3.4
Western-Blot Analyse
16
2.4
Histologische Färbungen
17
2.4.1
Herstellung von Gefrierschnitten
17
2.4.2
Herstellung von Paraffinschnitten
18
2.4.3
HE-Färbung
18
2.4.4
Sirius-Red-Färbung
19
2.4.5
Lektin-Färbung
19
2.5
Isolierung von Sinusknotenzellen
20
2.6
Messung der Ca2+-Konzentration in Sinusknotenzellen
21
Inhaltsverzeichnis
II
2.7
Gewinnung von Kardiomyozyten durch Langendorff-Perfusion
21
2.8
Telemetrische Elektrokardiogramm Ableitungen
23
2.9
Blutdruckmessungen mit Schwanzmanschette (Tail Cuff)
25
2.10
Wiegen und Ausmessen der Herzkompartimente
26
2.11
Haltung und Zucht von Mäusen
26
2.11.1 Haltung
26
2.11.2 Zucht von konditionellen RyR2-Knockout-Mäusen
26
2.11.3 RyR3-Knockout-Mäuse
28
2.11.4 Tamoxifen-Injektion
28
2.12
Statistische Analyse
28
3.
Ergebnisse
29
3.1
Charakterisierung einer herzspezifischen RyR2-KO-Mauslinie (RyR2MerCreMer) 29
3.1.1
Überlebensrate der RyR2MerCreMer-KO-Mäuse
29
3.1.2
Analyse der RyR2 Expression im Herzen nach Deletion
30
3.1.2.1 Analyse der RNA-Expression der drei RyR-Isoformen
30
3.1.2.2 Analyse der RyR2-Proteinexpression
31
3.1.3
Untersuchung des Herzgewichts
32
3.1.4
Analyse der Herzfrequenz und der EKG-Parameter
34
3.1.5
Analyse der strukturellen Veränderungen des Herzens
36
3.1.6
Untersuchung der Morphologie und Größe der Kardiomyozyten
37
3.2
Charakterisierung einer reizleitungs-spezifischen RyR2-KO-Mauslinie (RyR2KiT) 39
3.2.1
Analyse der Expression von RyR2 in RyR2KiT-Mäusen
39
3.2.1.1 Analyse der RNA-Expression der drei RyR-Isoformen
39
3.2.1.2 Analyse der RyR2 Proteinexpression
41
3.2.2
Untersuchung der strukturellen Veränderungen der Herzen
42
3.2.3
Analyse der Herzfrequenz und der EKG-Parameter
43
3.2.4
Analyse der Herzfrequenz-Modulation durch verschiedene Pharmaka
46
3.2.5
Analyse der Herzfrequenzvariabilität
47
3.2.6
Auswirkung der RyR2-Deletion auf den Blutdruck
49
3.2.7
Phosphorylierungstatus von Phospholamban
49
2+
3.2.8
Ermittlung des basalen intrazellulären Ca -Gehalts in Sinusknotenzellen
50
3.3
RyR2-Rekombination ohne Induktion
52
3.3.1
RyR2-Rekombination ohne Induktion in der RyR2MerCreMer-Mauslinie
52
3.3.2
RyR2-Rekombination ohne Induktion in der RyR2KiT-Mauslinie
54
3.3.3 RyR2-Rekombination ohne Induktion in der ubiquitär aktiven Mauslinie
3.4
RyR2CAGG-Cre
56
Analyse der RyR3-Expression im Herzen
56
Inhaltsverzeichnis
III
3.4.1
Nachweis der RyR3-Proteinexpression im Herzen
57
3.4.2
Nachweis der RyR3-Expression in isolierten Sinusknotenzellen
57
3.5
EKG-Untersuchungen an RyR3KO-Mäusen
58
3.5.1
Analyse der Herzfrequenz und der Aktivität der RyR3KO-Mäuse
58
3.5.2
Untersuchung der Herzfrequenz-Modulation in RyR3KO-Mäusen
59
3.5.3
Analyse der Herzfrequenzvariabilität
61
4.
Diskussion
63
4.1
Charakterisierung der RyR2MerCreMer-KO-Mäuse
63
4.2
Charakterisierung der RyR2KiT-KO-Mäuse
66
4.3
Rekombination des gefloxten RyR2-Locus ohne Induktion
70
4.4
Die Rolle von RyR3 im Herzen
71
4.5
Ausblick
73
5.
Anhang
74
5.1
Verwendete Primer
74
5.2
Verwendete Antikörper
75
5.3
Verwendete transgene Mauslinien
76
5.4
Abkürzungsverzeichnis
77
6.
Abbildungsverzeichnis
81
7.
Literaturverzeichnis
84
8.
Eigene Veröffentlichungen
90
9.
Lebenslauf
91
10.
Danksagung
92
Zusammenfassung
IV
Zusammenfassung
Der intrazelluläre Ca2+-Kanal RyR2 steuert die Ca2+-Freisetzung aus dem SR und spielt eine
große Rolle bei der Kontraktion des Herzens. Neben seiner Rolle bei der Kontraktion soll er
auch eine wichtige Funktion bei der Generierung des Schrittmacherpotentials im
Reizbildungs- und leitungssystem haben. Da die globale Deletion von RyR2 embryonal letal
ist, konnte bis jetzt seine genaue Funktion im Herzen anhand eines Mausmodells nicht
untersucht werden. Das Ziel der vorliegenden Arbeit war es die Funktion von RyR2 sowohl
im ganzen Herzen als auch selektiv nur im Reizbildungs- und leitungssystem zu
charakterisieren. Dazu wurden zwei konditionelle KO-Mauslinien verwendet, bei denen der
Knockout im adulten Tier durch Tamoxifen induzierbar war. Zusätzlich sollte die Expression
von RyR3 im Herzen auf Protein-Ebene bestätigt werden und seine Funktion mittels EKGTelemetrie untersucht werden.
Zur Analyse von Mäusen mit einer Deletion von RyR2 im ganzen Herzen wurde die
RyR2MerCreMer-Mauslinie verwendet. Es zeigte sich, dass RyR2MerCreMer-KO-Tiere sehr
schnell nach der Tamoxifen-Behandlung eine Herzinsuffizienz entwickelten und starben.
Dabei zeigten die Herzen typische morphologische Merkmale, wie eine Dilatation der
Vorhöfe oder Bildung von Fibrose. Außerdem waren auf zellulärer Ebene ebenfalls
Unterschiede aufgetreten, so dass die Kardiomyozyten vergrößert und unförmig wirkten.
Beim selektiven RyR2-KO im Reizbildungs- und leitungssystem (RyR2KiT-KO) waren die
Tiere lebensfähig und zeigten keine morphologischen Unterschiede zu den Kontrollen.
Telemetrische EKG-Messungen zeigten jedoch, dass die Deletion von RyR2 zu einer
Bradykardie führte. Zusätzlich konnte gezeigt werden, dass eine Herzfrequenz-Modulation
durch die Gabe von Pharmaka in den RyR2KiT-KO-Tieren zwar noch möglich war, allerdings
erreichten die KO-Tiere nicht die gleichen maximalen Frequenzen wie die Kontrollen.
Außerdem wiesen die RyR2KiT-KO-Tiere eine geringere Herzfrequenzvariabilität auf.
Messungen der intrazellulären basalen Ca2+-Konzentration in isolierten Sinusknotenzellen
zeigten, dass die RyR2KiT-KO-Tiere einen niedrigeren basalen Ca2+-Gehalt hatten als die
Kontrollen. Somit konnte gezeigt werden, dass RyR2 sowohl bei der Kontraktion des
Herzens, als auch bei der Generierung des Schrittmacherpotentials eine wichtige Rolle
spielt. Neben RyR2 wurde auch die Rolle von RyR3 im Herzen untersucht. Es konnte zum
ersten Mal auf Protein-Ebene die Expression von RyR3 im Sinusknoten und in den Vorhöfen
nachgewiesen werden und somit die bereits publizierten RNA-Daten bestätigt werden. EKGUntersuchungen an globalen RyR3KO-Tieren zeigten allerdings keinen Unterschied in der
Herzfrequenz oder Herzfrequenzvariabilität der KO-Tiere im Vergleich zu Wildtyp-Mäusen.
Summary
V
Summary
The intracellular calcium release channel RyR2 governs the release of Ca2+ from the
sarcoplasmic reticulum which initiates muscle contraction. In addition, RyR2 is proposed to
play a crucial role in controlling sinoatrial node (SAN) pacemaking. Since global deletion of
RyR2 in mouse models is embryonically lethal, the role of RyR2 in the adult mouse heart,
especially in the SAN, has been unknown. Objectives of this thesis were to study the role of
RyR2 in the whole heart and only in the pacemaker conduction system using two different
tamoxifen inducible mouse lines. In addition, expression of isoform RyR3 in the heart was to
be confirmed and its role analysed by telemetric electrocardiogram recordings.
The RyR2MerCreMer-mouse line was used to study the role of the channel in the whole
heart. Mice with cardiomyocyte specific knockout of RyR2 died within two weeks after
knockout induction and showed significant atrial dilation and fibrosis. Moreover, the
degenerated morphology and increased size of isolated cardiomyocytes indicated alterations
induced by the knockout also on the cellular level. In contrast, mice with deletion only in the
pacemaker conduction system (RyR2KiT-KO) were viable and had no morphological
changes of the heart or SAN. Telemetric electrocardiogram recordings revealed that RyR2
deletion results in bradycardia. Heart rate modulation with pharmacological substances was
still possible in RyR2KiT-Cre KO mice. However, heart rates never reached similar values as
the controls. In addition RyR2KiT-KO mice had reduced heart rate variability. Analysis of the
intracellular Ca2+ levels demonstrated reduced basal Ca2+ levels measured in isolated RyR2KO SAN cells. These results strongly suggest that sarcoplasmic reticulum Ca 2+ release by
RyR2 plays a dominant role in contraction of the heart as well as in sinoatrial pacemaking.
In addition, it could be demonstrated that the protein of the isoform RyR3 is also expressed
in the SAN and atria, thus confirming published RNA-data on the subject. Electrocardiogram
recordings of RyR3 knockout mice, however showed no differences in the heart rate or heart
rate variability compared to wild type mice.
Einleitung
1
1.
Einleitung
1.1
Das Herz
Die Aufgabe des Herzens ist es, regelmäßig und koordiniert Blut in die Organe zu pumpen
und so jede Zelle des Körpers mit Sauerstoff und Nährstoffen zu versorgen. Es besteht aus
zwei Vorhöfen (rechtes und linkes Atrium) und zwei Herzkammern (rechter und linker
Ventrikel), durch welche ständig Blut in das Kreislaufsystem gepumpt wird. Dies wird durch
einen fortwährenden Ablauf von Kontraktion (Systole) und Relaxation (Diastole) des
Herzmuskels gewährleistet. Jeder Herzschlag wird durch eine elektrische Erregung im
Sinusknoten (SAN, sinoatrial node) ausgelöst. Dieser arbeitet autonom und wird auch als
Schrittmacher des Herzens bezeichnet. Durch die spontane Depolarisation im Sinusknoten
wird ein Aktionspotential (AP) generiert und das Signal über den Atrioventrikularknoten
(AV-Knoten), das His-Bündel und die Purkinje-Fasern an das Myokard weitergegeben,
woraus die Kontraktion des Herzens resultiert. Die kontraktile Funktion der Herzmuskelzellen
wird in erster Linie durch die intrazelluläre Regulation von Calcium-Ionen (Ca2+) gesteuert.
Eine Vielzahl membranständiger und cytosolischer Proteine ist daran beteiligt, die CalciumHomöostase aufrecht zu erhalten.
1.2
Die elektromechanische Kopplung des Herzens
Der auslösende elektrische Reiz, der zur Kontraktion im Herzen führt, ist das
Aktionspotential. Die elektromechanische Kopplung beschreibt den Prozess zwischen dem
AP einer Herzmuskelzelle und der darauf folgenden Kontraktion. Um eine normale
Herzfunktion
zu
2+
gewährleisten,
ist
eine
exakte
Kontrolle
der
intrazellulären
2+
Ca -Konzentration [Ca ]i notwendig. Sobald ein Aktionspotential ausgelöst wird, erhöht sich
kurzzeitig die Permeabilität der Zellmembran für Natriumionen (Na+). Durch den folgenden
Na+-Einstrom ins Cytosol wird die Zellmembran, die den Intrazellulärraum von der
extrazellulären Matrix abgrenzt und an einigen Stellen tubuläre Einstülpungen (T-Tubuli)
aufweist, depolarisiert. Im Bereich der T-Tubuli sind spannungsabhängige L-Typ Ca2+-Kanäle
lokalisiert, die sich bei der Depolarisation der Zellmambran öffnen. Ca2+ fließt als
Einwärtsstrom (ICa) in das Cytosol der Zelle und trägt zur Plateauphase des Aktionspotentials
der Herzmuskelzellen bei (Fabiato 1983, Bers 2002, Kushnir und Marks 2010). Durch den
Anstieg der Ca2+-Konzentration im Cytosol werden die Ryanodinrezeptoren (RyR), welche
die Membran des sarkoplasmatischen Retikulums (SR) durchspannen, aktiviert und Ca2+
strömt
aus
dem
SR
ebenfalls
in
das
Cytosol.
Dies
wird
als
Ca2+-induzierte
Ca2+-Freisetzung (calcium induced calcium release (CICR)) bezeichnet (Fabiato und Fabiato,
Einleitung
2
1975; Sham et al, 1995). Das SR fungiert dabei als Ca2+-Speicher der Zelle. Die erhöhte
cytoplasmatische Ca2+-Konzentration wiederum bewirkt, dass die Aktin-Myosin-Interaktion in
den Myofibrillen aktiviert wird. Dabei wird Ca2+ durch die calciumbindende Untereinheit des
Troponins, das Troponin C, gebunden und es kommt zu einer Konformationsänderung des
Troponinkomplexes, wodurch die Wechselwirkung zwischen Tropomyosin und Aktin
beeinflusst wird. In Folge dessen kann Myosin an Aktin binden und löst so die Kontraktion
des Herzens aus. Damit das Myokard nach der Kontraktion wieder relaxieren kann, muss die
Ca2+-Konzentration im Cytosol wieder erniedrigt werden. Dabei ist der Rücktransport von
cytosolischem Ca2+ in das SR von größter Bedeutung. Die SR-Ca2+-ATPase (SERCA) stellt
dabei den Hauptmechanismus zur Entfernung des Ca2+ aus dem Cytosol dar. Dies erfolgt
unter Verbrauch von einem Molekül ATP (Adenosintriphosphat) pro Transport von zwei Ca2+.
Die Aktivität der SERCA wird durch das Protein Phospholamban (PLB) kontrolliert
(Tada et al, 1974). In seiner unphosphorylierten Form bindet PLB an die SERCA und
inhibiert bei niedriger cytoplasmatischer Ca2+-Konzentration die SERCA-Aktivität. Kommt es
zu einer Phosphorylierung von PLB durch die Protein Kinase A (PKA) oder Calmodulinkinase
II (CaMKII), löst sich das PLB von der SERCA, die Hemmung der SERCA wird aufgehoben
und Ca2+ kann zurück in das SR gepumpt werden. Zusätzlich zur SERCA kommt der
Na+/Ca2+-Austauscher (NCX) in der Plasmamembran zum Einsatz. Dieser pumpt ein Ca 2+ im
Austausch zu drei Na+ aus dem Cytosol heraus. Der zusätzliche Ca2+-Ausstrom durch die
Ca2+-ATPase in der Zellmembran und die Aufnahme von Ca2+ über Uniporter in die
Mitochondrien, spielen beim Ca2+-Transport aus dem Cytosol nur eine untergeordnete Rolle
(Bers, 2002). Wichtig bei diesem System ist, dass die Menge an Ca 2+, welche in die Zelle
eintritt, unter normalen Bedingungen genau dieselbe ist, die durch den NCX wieder
herausgepumpt wird. Eine schematische Darstellung der intrazellulären Ca2+-Bewegungen
im Myokard im Verlauf eines Herzzyklus ist in Abbildung 1.1 gezeigt.
Einleitung
3
Abbildung 1.1: Schematische Darstellung der elektromechanischen Kopplung im Herzen.
Die roten Pfeile stellen den Ca2+-Einstrom und die Ca2+-induzierte Ca2+-Freisetzung während der
Systole dar. Die grünen Pfeile stellen den Rücktransport des Ca2+ ins Sarkoplasmatische Retikulum
(SR) und den Ca2+-Ausstrom durch den NCX während der Relaxation dar. RyR, Ryanodin-Rezeptor;
NCX, Na+-Ca2+-Austauscher; ATP, Ca2+-ATPase; PLB, Phospholamban. Im Kasten ist die Beziehung
von Aktionspotential (AP, schwarz) zu intrazellulärer Ca2+-Konzentration ([Ca]I, blau), und zur
Kontraktion (rot) verdeutlicht (modifiziert nach Bers, 2002).
1.3
Der Ryanodinrezeptor
Ryanodinrezeptoren (RyR) sind intrazelluläre Ca2+-Freisetzungskanäle, die die Membran des
endoplasmatischen Retikulums (ER) oder des SR durchspannen und für den Ca2+- Ausstrom
aus dem ER/SR in das Cytosol verantwortlich sind (Bers, 2002). Sie existieren als
Homotetramere, wobei jede Untereinheit aus etwa 5000 Aminosäuren mit einer molekularen
Masse von ca. 565 kDa besteht (Fill und Copello, 2002). Damit gehören sie zu den größten
bisher identifizierten Ionenkanälen. RyR-Monomere bestehen zu 4/5 aus einer großen
cytoplasmatischen Domäne, die Bindungsstellen für unterschiedliche Modulatoren von RyR
beinhaltet und zu 1/5 aus einer Transmembrandomäne. Der Name der Rezeptoren wurde
von dem pflanzlichen Alkaloid Ryanodin abgeleitet, welches von RyR mit hoher Affinität
gebunden wird und bei einer Konzentration von über 10 µM zu einer Inhibition der Ca2+Freisetzung führt (Li et al, 1997; Rubenstein und Lipsius, 1989). Bisher sind drei RyRIsoformen bekannt: RyR1, RyR2 und RyR3. Die drei RyR-Isoformen besitzen untereinander
eine Homologie von ca. 65 %. RyR1 wird hauptsächlich in der Skelettmuskulatur exprimiert,
wurde aber auch in geringen Mengen in anderen Geweben nachgewiesen (Takeshima et al,
Einleitung
4
1989). RyR2 wird als die kardiale Form angesehen, kommt aber auch in glatten Muskel- und
Gehirnzellen vor (Otsu et al, 1990; Tunwell et al, 1996). RyR3 wird hauptsächlich im Gehirn
exprimiert (Sorrentino und Volpe, 1993; Takeshima et al, 1998). Zudem konnte, bis jetzt
allerdings nur auf RNA-Ebene, nachgewiesen werden, dass neben RyR2 ebenfalls RyR3 im
Herzen vorkommt. Im Gegensatz zu RyR2, der im ganzen Herzen exprimiert wird, konnte
RyR3 allerdings nur im Sinusknoten und in den Vorhöfen nahgewiesen werden (Tellez et al,
2006). Welche wichtige Rolle RyR hat, konnte durch folgende Beispiele gezeigt werden:
Mäuse, bei denen RyR1 deletiert ist, sterben perinatal an Ateminsuffizienz, welche durch
Versagen der Skelettmuskulatur bedingt ist (Takeshima et al, 1994). Ein Fehlen des Gens für
den RyR2 führte zur embryonalen Letalität (Takeshima et al, 1998). Im Gegensatz dazu sind
RyR3-Knockout-Mäuse lebensfähig und zeigen keine veränderten Muskelfunktionen
(Takeshima et al, 1996; Bertocchini et al, 1997). Fehlerhafte Regulation von RyR2 und die
damit verbundene Störung in der Ca2+-Homöostase wird als Ursache für Herzinsuffizienz,
Hypertrophie und Arrhythmien angesehen (Kushnir et al, 2010; Betzenhauser und Marks,
2010).
1.4
Die Rolle von RyR2 im Reizleitungssystem
Die kardiale Isoform RyR2 soll neben ihrer Rolle bei der Kontraktion des Herzmuskels, auch
eine wichtige Rolle bei der Generierung des Schrittmacherpotentials im Sinusknoten spielen
(Maltsev et al, 2006; Lakatta et al, 2010). Wie bereits erwähnt sind Sinusknotenzellen
spontan aktiv und jeder Herzschlag beginnt mit einem Aktionspotential im Sinusknoten. Das
Aktionspotential einer Sinusknotenzelle zeichnet sich durch eine langsame, spontane
Depolarisationsphase und ein relativ positives Ruhemembranpotential aus (Abb. 1.2). Im
Vergleich zu Myokardzellen fehlt dem Sinusknotenaktionspotential eine ausgeprägte
Plateauphase. Die Frequenz, mit der das Herz schlägt wird über die Zeitspanne zwischen
zwei Aktionspotentialen definiert. Verkürzt sich diese, so erhöht sich die Frequenz und das
Herz schlägt schneller. Die Länge dieser Zeitspanne ist dabei insbesondere abhängig von
der diastolischen Depolarisation (DD). Eine Modulation der Steigung der DD z.B. mittels
Pharmaka oder sportlicher Betätigung, moduliert die Herzfrequenz (Abb.1.2).
Einleitung
5
Abbildung 1.2: Schematische Darstellung eines Aktionspotentials und die dazu beitragenden
Ionenströme und Ca2+-Freisetzungen in einer Sinusknotenzelle.
Während der diastolischen Depolarisation führen die Inaktivierung des Kaliumstroms (IK) und die
Aktivierung des HCN-Stroms (If) zur Depolarisation der Zelle. Der anschließende Ca2+-Einstrom über
L- und T-Typ-Ca2+*-Kanäle (ICa,L und ICa,T), sowie die Ca2+-Freisetzung über die RyR sind für die
Aufstrichphase verantwortlich. Durch Rücktransport des Ca2+ in das SR und durch Aktivierung der
Kaliumkanäle wird die Zelle im Anschluss repolarisiert (modifiziert nach Maltsev und Lakatta, 2007).
Welche Komponenten Einfluss auf die Regulation der DD haben, konnte bis jetzt noch nicht
eindeutig geklärt werden. Einerseits wird dem If-Strom, der durch die spannungsabhängigen
HCN-Kanäle (Hyperpolarization-activated and cyclic nucleotide gated cation channels)
(Brown et al, 1979; Ludwig et al, 1998) generiert wird, eine tragende Rolle bei der DD
zugeschrieben, weshalb er als so genannter Schrittmacherstrom bezeichnet wird.
Andererseits soll dabei auch die intrazelluläre Ca2+-Freisetzung über den RyR2 von großer
Bedeutung sein (Lakatta und DiFrancesco, 2009). Zur Funktion von RyR2 im Sinusknoten
gibt es zwei Theorien: Erstens konnte gezeigt werden, dass im SAN von Kaninchen mehr
zyklisches
Adenosinmonophosphat
(cAMP)
gebildet
wird
als
in
Kardiomyozyten
(Vinogradova et al, 2006). Dies hat zur Folge, dass durch den erhöhten cAMP-Gehalt die
Phosphorylierung verschiedener Ca2+-regulierender Proteine gesteigert wird. So werden
sowohl die membranständigen Ca2+-Kanäle, RyR2, als auch der NCX stärker aktiviert.
Dadurch gelangt zum einen mehr Ca2+ durch die Ca2+-Kanäle in das Zellinnere, zum anderen
strömt durch die stärkere Aktivierung von RyR2 vermehrt Ca2+ aus dem SR in das Cytosol.
Damit die Zelle wieder relaxieren kann, muss somit der NCX ebenfalls verstärkt zum Einsatz
kommen. Dieser pumpt wie bereits in Abschnitt 1.2 beschrieben ein Ca 2+ aus der Zelle
heraus, im Austausch jedoch drei Na+ wieder in die Zelle herein. Durch die verstärkte
Aktivität des NCX wird daher ein Netto-Einwärtsstrom erzeugt welcher die DD beeinflussen
soll (Yang et al, 2002; Bogdanov et al., 2001 und 2006). Als Zweites konnte gezeigt werden,
dass im Sinusknoten von Kaninchen die Adenylatcyclase-Isoformen (AC) fünf und sechs,
Einleitung
6
sowie die Isoformen eins und acht exprimiert werden, welche die Synthese von cAMP
katalysieren können. Im Gegensatz zu AC5 und AC6 können AC1 und AC8 allerdings direkt
durch Ca2+ aktiviert werden (Younes et al, 2008). Da der intrazelluläre Ca2+-Gehalt einer
Zelle hauptsächlich vom Ca2+-Ausstrom aus dem SR durch den RyR2 abhängt, soll RyR2
somit auch direkt den cAMP-Spiegel beeinflussen können. cAMP reguliert zum einen den IfStrom, der durch HCN-Kanäle generiert wird, zum anderen beeinflusst cAMP über die PKA
die Phosphorylierung verschiedenster Proteine, die am Calcium-Signalweg beteiligt sind,
sowie die Regulation weiterer Ionenkanäle (Ludwig et al, 1998; Lakatta und DiFrancesco,
2009). Eine schematische Darstellung der Signalwege, die bei der Generierung des
Schrittmacherpotentials beteiligt sein sollen, ist in Abb. 1.3 dargestellt.
Abbildung 1.3: Schematische Darstellung der basalen Schrittmacherregulation.
Der cAMP-Gehalt einer Sinusknotenzellen wird durch intrazelluläre Ca2+-Signalwege (rot) und
verschiedene Ionenkanäle beeinflusst. Im Sinusknoten sollen im Vergleich zum restlichen Herzen
zusätzlich auch die Adenylatcylasen AC1 und AC8 exprimiert werden (modifiziert nach Vinogradova
und Lakatta, 2009).
1.5
Konditionelle Knockout-Tiere: das Cre/loxP-System
Die Möglichkeit, das Mausgenom durch zufällige Integration von Transgenen oder gezielt
über homologe Rekombination in embryonalen Stammzellen zu verändern, hat entscheidend
dazu beigetragen, die Funktion von Genen besser zu verstehen. Da diese Techniken eine
permanente genetische Modifikation in der Keimbahn der Maus erzeugen, führt das
konventionelle Ausschalten eines Gens (globaler Knockout) in allen Zellen des Tieres
während der prä- und postnatalen Entwicklung zum Verlust der Genfunktion. Ein solcher
Einleitung
7
Gen-Knockout kann zu embryonalem Tod oder Tieren mit schweren Defekten und stark
eingeschränkter Lebensfähigkeit führen. Eine Alternative zu totalen Knockout-Tieren bietet
das Cre/loxP-System. Die Cre-Rekombinase (cyclization recombination) ist ein Protein des
Bakteriophagen P1 und katalysiert die Rekombination zwischen zwei loxP-Erkennungssequenzen („locus of crossing over of P1“), ohne dass die Rekombinase hierzu einen
Cofaktor benötigt. Abhängig von der Orientierung der loxP-Sequenzen untereinander und
dem Ort ihrer Integration kann man durch Cre-vermittelte Rekombination eine Inversion,
Exzision/Integration oder Translokation von DNA erzeugen. Um Veränderungen des
Genoms in vivo durchzuführen, wird das Herausschneiden von loxP-flankierten („gefloxten“)
DNA-Segmenten verwendet (Hoess and Abremski, 1990). In Abbildung 1.4 ist die Exzision
mit Hilfe des Cre/loxP-Rekombinasesystems schematisch dargestellt.
Abbildung
1.4:
Schema
des
Cre/loxPRekombinationssystems.
Cre verursacht die Rekombination zwischen zwei loxP
Erkennungssequenzen (Dreiecke). Die loxP Sequenz
(unten) besteht aus zwei 13 bp Palindromen (waagrechte
Pfeile), die eine asymmetrische 8 bp „core“ Region
flankieren. Die Phosphodiesterbindungen, die Cre
spaltet, sind durch senkrechte Pfeile gekennzeichnet. Die
Rekombination zweier gleichgerichteter loxP Sequenzen
in derselben DNA führt zur Exzision des flankierten
Segments und es bleibt lediglich eine loxP Sequenz
übrig.
Um eine gewebespezifische Deletion zu erreichen, muss die Cre-Rekombinase unter einem
gewebsspezifischen Promoter exprimiert werden. Dadurch wird die Rekombinase ebenfalls
nur in einem bestimmten Gewebe exprimiert und deletiert nur dort die gefloxte DNA-Region
(Metzger und Feil, 1999).
1.6
Induzierbare konditionelle RyR2-Knockoutmäuse
In dieser Arbeit wurden zwei unterschiedliche konditionelle Mauslinien generiert und
charakterisiert, in denen zum einen RyR2 im ganzen Herzen, zum anderen RyR2 spezifisch
nur im Reizleitungssystem deletiert wurde. Mit Hilfe der konditionellen Methode war es
möglich, eine Gendeletion im adulten Tier hervorzurufen. Bei der Deletion im ganzen Herzen
wurde
ein
Cre-Fusionsprotein
verwendet,
das
zwischen
zwei
mutierten
Östrogenrezeptorbindungsdomänen (MerCreMer) liegt. Die Transkription dieses Transgens
steht unter der Kontrolle des herzspezifischen α-Myosin schweren Kette (αMHC) Promotors
und wird somit nur im Herzen exprimiert (Sohal et al, 2001). Zum anderen wurde als CreProtein
das
HCN4KiT-Cre,
das
mit
einer
modifizierten
Ligandenbindungsdomäne
Einleitung
8
(Punktmutationen: G400V/M543A/L544A) des Östrogenrezeptors fusioniert ist, verwendet
(Hoesl et al, 2008). Diese Cre-Rekombinase steht unter der Kontrolle des endogenen HCN4Promotors.
Da
HCN4
im
Herzen
ein
auf
das
Reizleitungssystem
beschränktes
Expressionsmuster besitzt, findet der Knockout nur im Reizleitungssystem statt. Durch die
Modifikationen besitzt endogenes Östrogen bei beiden Cre-Fusionsproteinen keine Affinität
mehr zu den Ligandenbindungsdomänen, die Affinität des SERMs Tamoxifen ist jedoch hoch
(Feil et al, 1997; Kühbandner et al, 2000). Erst nach Applikation und Bindung von Tamoxifen
an die Ligandenbindungsdomäne des Fusionsproteins wird der Proteinkomplex aktiviert, das
Fusionsprotein kann in den Zellkern gelangen und vermittelt die Rekombination an den loxPSequenzen. Mit Hilfe der beiden unterschiedlichen Mauslinien RyR2MerCreMer und
RyR2KiT können adulte herz- bzw. reizleitungsspezifische RyR2-KO-Mäuse generiert und
auf funktionaler und molekularer Ebene charakterisiert werden.
1.7
Ziel dieser Arbeit
Ryanodinrezeptoren (RyR) spielen eine wichtige Rolle bei der Funktion des Herzens. Dabei
sollen sie sowohl bei der Kontraktion des Herzmuskels als auch bei der Generierung des
Schrittmacherpotentials wichtig sein, ihre genaue Funktion ist allerdings noch unklar. Welche
spezifische Rolle der Ryanodinrezeptor RyR2 sowohl bei der Kontraktion des Herzens als
auch bei der Generierung eines Schrittmacherpotentials hat, sollte im Rahmen dieser Arbeit
untersucht werden. Da die globale Deletion von RyR2 embryonal letal ist (Takeshima et al,
1998), sollten in dieser Arbeit zwei konditionelle Mauslinien generiert werden, bei denen die
Deletion von RyR2 erst im adulten Tier erfolgt. Der herzspezifische sowie der
reizleitungsspezifische RyR2-Knockout sollte mit Hilfe molekularbiologischer Methoden
bestätigt werden. Die Auswirkungen der RyR2-Deletion sollten auf morphologischer als auch
funktioneller Ebene bestimmt werden. Zudem sollte die Rolle einer weiteren RyR Isoform
RyR3 bestimmt werden, über deren Funktion im Herzen bisher wenig bekannt war.
Material und Methoden
2.
9
Material und Methoden
Sämtliche gentechnische Versuche nach S1 wurden von der Regierung von Mittelfranken
nach Aktenzeichen 50-8791.2.38/39 genehmigt.
2.1
DNA-Techniken
2.1.1 Isolierung genomischer DNA zur Genotypisierung
Zur Genotypisierung wurde das Mausgewebe (Zehen- oder Schwanzbiopsie) über Nacht bei
55 °C in 100 µl Lysepuffer verdaut (Schüttler: Thermomixer Compact, Eppendorf). Am
nächsten Tag wurde das Lysat zur Inaktivierung der Proteinase K bei 95 °C für 15 min
gekocht. Die isolierte DNA konnte bei 4 °C gelagert werden.
Lysepuffer:
Proteinase K (20 mg/ml, Roth)
2 µl
10x PCR Puffer
10 µl
H2O
88 µl
10x PCR Puffer pH 9,0:
Tris/HCL
1,58 g (100 mM)
MgCl2
0,304 g (15 mM)
KCl
3,73 g (500 mM)
H2O
ad 100 ml
2.1.2 Isolierung genomischer DNA aus Mausherz
Gesamt DNA aus den unterschiedlichen Kompartimenten des Herzens (rechter und linker
Ventrikel, rechter und linker Vorhof und Sinusknotengewebe) wurde mit Hilfe des DNeasy
Tissue Kits (Qiagen) nach Herstellerangaben isoliert. Die eluierte DNA wurde bei 4 °C
gelagert.
Material und Methoden
10
2.1.3 Polymerasekettenreaktion (PCR)
Die Polymerasekettenreaktion (PCR) ist eine in vitro Technik zur Amplifizierung einer
spezifischen Polynukleotidsequenz (Mullis et al, 1986). Sie erfolgt in drei Schritten, deren
Abfolge
temperaturgesteuert
ist:
Im
ersten
Schritt
wird
die
doppelsträngige
Nukleinsäuresequenz durch Hitzeeinwirkung (90-94 °C) aufgeschmolzen (= Denaturierung).
Beim anschließenden Absinken der Temperatur hybridisieren zwei Oligonukleotid-Primer an
komplementäre
Sequenzen
der
Ziel-Sequenz
(=
Primer-Anlagerung).
Nach
dem
Anlagerungsschritt werden die hybridisierten Primer an ihrem 3`-Ende durch die hitzestabile
DNA-Polymerase aus dem Bakterium Thermophilus aquaticus (Taq-Polymerase) verlängert
(= Elongation). Die beiden entstandenen Nukleotid-Stränge bilden die Matrize für den
nächsten Zyklus. Bei einer Zyklenzahl von 30-50 kommt es auf diese Weise zu einer
exponentiellen
Vervielfältigung
der
Sequenz.
Die
PCR-Produkte
wurden
mittels
Gelelektrophorese aufgetrennt und mittels Ethidiumbromid unter UV-Licht sichtbar gemacht.
PCR-Ansatz:
Primer 1 (10 pmol/µl)
1,25 µl
Primer 2 (10 pmol/µl)
1,25 µl
Primer 3 (10 pmol/µl)
(abhängig vom Genotyp)
1,25 µl
10x PCR Puffer
2,5 µl
dNTPs (1,25 mM)
4,0 µl
H2O
12,4 µl
Taq DNA-Polymerase (5 U/µl )
(selbst hergestellt)
DNA (~100 ng/µl)
0,35 µl
2,0 µl
PCR-Programm für Genotypisierung:
95 °C
5 min
95 °C
30 s
65 °C -1 °C / Zyklus
30 s
72 °C
30 s
10x
Material und Methoden
11
95 °C
30 s
55 °C
30 s
72 °C
30 s
72 °C
5 min
28x
Die Reaktionen wurden in einer PCR-Maschine (Mastercycler, Eppendorf) durchgeführt. Ein
Aliquot der PCR-Reaktion (10 µl) wurde auf ein ethidiumbromidhaltiges 2 % Agarosegel
aufgetragen und elektrophoretisch aufgetrennt. Das Gel wurde unter UV-Licht dokumentiert.
PCR-Primer:
Die in der vorliegenden Arbeit verwendeten Primer wurden bei MWG-Biotech, Ebersberg,
synthetisiert. Die Sequenzen sind im Anhang (siehe Abschnitt 5.1) aufgeführt. Die
lyophilisierte Primer-DNA wurde in soviel H2Odest. gelöst, dass die Konzentration 100 pmol/µl
betrug. Davon wurden Arbeitslösungen von 10 pmol/µl hergestellt.
2.1.4 Agarose-Gelelektrophorese
Die DNA-Proben wurden mit 6x Probenpuffer versetzt und zur Analyse in 1 % oder 2 % TBEgepufferten Agarose-Gelen elektrophoretisch aufgetrennt. Für die Größenbestimmung der
DNA wurde ein DNA-Längenstandard (Fermentas) verwendet. Die aufgetrennte DNA konnte
durch den interkalierenden Fluoreszenzfarbstoff Ethidiumbromid (Roth) unter UV-Licht als
Bande sichtbar gemacht werden. Zur Dokumentation wurde das Agarose-Gel auf einem
UV-Transilluminator aufgenommen.
10x TBE-Elektrophorese-Puffer pH 8,0:
Tris (Roth)
108 g (890 mM)
Borsäure (Roth)
55 g (890 mM)
EDTA (Roth)
7.4 g (20 M)
H2O
ad 1000 ml
Ficoll Typ 400 (AppliChem)
18 g (18 %)
EDTA (Roth)
24 ml (0,12 mM)
10x TBE
60 ml
Bromphenolblau (Sigma)
3 ml (aus 50 mg/ml Lösung)
Xylencyanol FF (Sigma)
3 ml (aus 50 mg/ml Lösung)
6x Probenpuffer:
Material und Methoden
2.2
12
RNA-Techniken
2.2.1 Isolierung von Gesamt-RNA
Zur RNA-Isolierung aus Gewebe wurde das Herz in eiskaltem PBS in rechten und linken
Ventrikel, rechter und linker Vorhof und Sinusknoten geteilt. Die Isolierung von RNA wurde
mit dem RNeasy Micro Kit (Qiagen) für Gewebe laut Herstellerangaben durchgeführt. Zum
Schluss wurde die RNA in 30 μl RNase-freiem Wasser aufgenommen.
2.2.2 Semiquantitative RT-PCR aus Gewebe
Da RNA nicht als Template in einer PCR fungieren kann, muss sie erst in ihre
komplementäre DNA (cDNA) umgeschrieben werden. Dies geschieht mit Hilfe der Reversen
Transkriptase, einer RNA-abhängigen DNA-Polymerase. Die reverse Transkriptions-PCR
(RT-PCR) wurde mit dem „OneStep RT-PCR Kit“ (Qiagen) nach Herstellerangaben
durchgeführt. Nach der PCR-Reaktion wurden die Proben auf einem Agarosegel aufgetrennt
und visualisiert.
Komponenten:
Endkonzentration:
5x OneStep RT-PCR Puffer 1x
dNTPs
400 μM dNTP
Primer 1
0,6 μM
Primer 2
0,6 μM
OneStep RT-PCR Enzym Mix
RNase Inhibitor
5-10 U/Reaktion
Template RNA
1 pg bis 2 μg
H2O, RNase frei
ad 25 μl
Material und Methoden
13
RT-PCR-Programm:
50 °C
30 min
95 °C
15 min
94 °C
30 s
65 °C -1 °C / Zyklus
30 s
72 °C
30 s
94 °C
30 s
55 °C
30 s
72 °C
30 s
72 °C
10min
10x
28x
2.2.3 Semiquantitative RT-PCR aus isolierten Sinusknotenzellen
Zum Nachweis von RNA aus einzelnen isolierten Sinusknotenzellen wurden die Zellen, wie
in Abschnitt 2.5 beschrieben, isoliert. Danach wurden die Zellen behutsam mechanisch
vereinzelt, auf Poly-L-Lysin beschichtete Deckgläschen ausgesät und mit einer Pipette
einzeln aufgesaugt. Anschließend wurden die Zellen in ein Eppendorfgefäß mit 4 µl des 5x
Puffers („OneStep RT-PCR Kit“ (Qiagen)) und 16 µl H2O gegeben und in flüssigem Stickstoff
schockgefroren. Die PCR wurde mit dem „OneStep RT-PCR Kit“ (Qiagen) nach
Herstellerangaben durchgeführt.
RT-PCR-Programm:
50 °C
30 min
50 °C
30 min
95 °C
15 min
95 °C
30 s
65 °C -1 °C / Zyklus
30 s
72 °C
1 min
95 °C
30 s
55 °C
30 s
72 °C
1 min
72 °C
5 min
10x
28x
Material und Methoden
2.3
14
Protein-Techniken
2.3.1 Isolierung und Präparation von Proteinen
Für die Proteinisolation aus Herzgewebe wurden jeweils kleine Stücke des rechten und
linken Ventrikels, sowie des rechten und linken Vorhofs verwendet. Für Protein aus
Sinusknotengewebe wurde ein Gewebestück (~1 mm2) vom Übergang der Vena cava
superior in den rechten Vorhof unter einem Stereomikroskop (Zeiss) exzidiert. Die isolierten
Gewebestückchen wurden in Lysepuffer (2 % SDS / 50 mM Tris, pH 7,5 + 1x Protease
Inhibitor Cocktail (Roche)) gegeben und für 2 min in einem Gewebehomogenisator
homogenisiert. Anschließend wurde das Lysat 10 min bei 95 °C erhitzt und bei 13000 rpm für
5 min zentrifugiert. Der Überstand, in dem sich die Proteine befanden, wurde aliquotiert und
bei -80 °C gelagert.
2.3.2 Proteinbestimmung mit BCA
Um die Proteinkonzentration bestimmen zu können, wurde der BCA-Test (BCA Protein
Assay Kit; Pierce) durchgeführt. Dieser Proteinbestimmung liegt zu Grunde, dass Cu2+-Ionen
in alkalischer Umgebung von Proteinen zu Cu+-Ionen reduziert werden. Durch die Zugabe
von BCA (2,2-Bis-(chinolin-4-) carbonsäure) entsteht ein BCA-Cu+-Komplex, der sich violett
färbt und mit Hilfe von BSA-Standardproben (Albumin Standard, Pierce) quantifiziert werden
kann. Die Extinktion dieses Komplexes kann bei 550 nm bis 630 nm gemessen werden. Da
die Intensität der Färbung von Reaktionszeit und Temperatur abhängt, muss bei jeder
Bestimmung eine Eichkurve mit Lösungen bekannter BSA-Konzentration angefertigt werden.
Das instabile BCA Reagenz wurde jeweils kurz vor Gebrauch aus dem Reagenz A und B
(BCA Protein Assay Kit, Pierce) im Verhältnis 50 zu 1 angesetzt, mit der verdünnten
Proteinlösung (1:50 bis 1:500) gemischt und für 60 min bei 60 °C inkubiert. Die Farbreaktion
wurde über einen ELISA-Reader (Dynatech Laboratories) ausgewertet. Anhand der Werte
der Standards konnte die einzusetzende Proteinkonzentration berechnet werden.
2.3.3 SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese (SDS-PAGE)
Die Auftrennung von Proteinen nach ihrem Molekulargewicht erfolgte durch eine SDSPolyacrylamid-Gelelektrophorese nach Laemmli (Laemmli, 1970). Bei dieser Methode wird
das Detergens SDS zugegeben, welches die natürliche Ladung der Proteine überdeckt und
somit die Proteine nur aufgrund ihres Molekulargewichts aufgetrennt werden. Es wurde eine
Gel Apparatur der Firma Biorad (Mini Protean II Cell) verwendet. Zur Herstellung der SDSPolyacrylamidgele wurde das Trenngel bis ca. 2 cm unter den oberen Rand gegossen und
Material und Methoden
15
mit Ethanol überschichtet. Nach der Polymerisation wurde das Ethanol abgehoben, das
Sammelgel darauf gegossen und der Kamm eingesetzt. Benutzt wurde ein 4 %-iges
Trenngel für den Nachweis von RyR2 und RyR3 sowie ein 15 %-iges Trenngel für den
Nachweis von Phospholamban. Die vorbereiteten Proteinlysate (mit 6x Probenpuffer
versehen und 5 min bei 95 °C inkubiert) sowie ein Proteinstandard (Precision Plus Protein
Standard, Biorad) wurden auf das Gel aufgetragen. Die Proteinlysate wurden bei 130 V
elektrophoretisch getrennt.
4x Trenngelpuffer (pH 8,8):
4x Sammelgelpuffer (pH 6,8):
Tris/Base
18,2 g (1,5 M)
Tris/Base
3,02 g (0,5 M)
SDS
0,4 g (0,4 %)
SDS
0,2 g (0,2 %)
H2O
ad 100 ml
H2O
ad 50 ml
15 % bzw. 4 % Trenngel:
Sammelgel:
Acrylamid
7,5 bzw. 2,0 ml
Acrylamid
4x Trenngelpuffer
3,75 ml
4x Sammelgelpuffer 1,25 ml
H2O
3,75 bzw. 9,25 ml
H2O
3,05 ml
20 % APS (Roth)
25 μl
20 % APS (Roth)
12,5 μl
TEMED (Roth)
10 μl
TEMED (Roth)
5 μl
6x Laemmli-Puffer:
0,65 ml
10x SDS-Laufpuffer pH 8,3:
4x Tris/SDS, pH 6,8
7 ml
Tris/Base (Roth)
30,2 g (250 mM)
Glycerin (VWR)
3 ml (30 %)
Glycin (Roth)
144 g (1,92 M)
DTT (Roth)
0,93 g (0,6 M)
SDS (AppliChem)
10 g (1 %)
Bromphenolblau (Sigma)
1,2 mg (0,012 %)
H2O
ad 1000 ml
H2O
ad 10 ml
Acrylamid:
30 % Acrylamid / 0,8 % Bisacrylamid
(Rotiphorese Gel 30, Roth)
Material und Methoden
16
2.3.4 Western-Blot Analyse
Der Protein-Transfer wurde im Semidry-Elektroblot (V20 SDB, Biometra) durchgeführt. Dazu
wurden drei Filterpapiere (G002, Whatman) in Anodenpuffer I (AP I), zwei in Anodenpuffer II
(AP II) und fünf in Kathodenpuffer (KP) präinkubiert. Die Membran wurde zuerst in Methanol,
dann in Anodenpuffer II getunkt. Auf die Anode wurden zuerst die Filterpapiere aus dem
Anodenpuffer I und II gelegt. Darauf wurden die Membran (Immobilon-P, Millipore) und das
Gel gelegt. Zum Schluss folgten die im Kathodenpuffer präinkubierten Filterpapiere
(Abb. 2.1).
Abbildung 2.1: Aufbau der Blotting Apparatur.
Luftblasen zwischen den einzelnen Schichten wurden sorgfältig entfernt. Das Elektroblotting
erfolgte bei 32 mA (0,76 mA pro 1 cm2 Membran) für 1,5 h.
Anodenpuffer I, pH 10,4:
Anodenpuffer II, pH 10,4:
Tris/Base
36,3 g (300 mM)
Tris/Base
3,03 g (25 mM)
Methanol (Roth)
200 ml
Methanol (Roth)
200 ml
H2O
ad 1000 ml
H2O
ad 1000 ml
Kathodenpuffer, pH 7,6:
TBST, pH 8,2:
γ-Aminohexansäure (Sigma) 5,2 g (40 mM) 10x TBS
100 ml
Tris/Base
3,03 g (25 mM)
Tween 20 (VWR)
1 ml
Methanol (Roth)
200 ml
H2O
ad 900 ml
H2O
ad 1000 ml
Material und Methoden
17
10x TBS, pH 8,2:
Tris/Base
12,1 g (10 mM)
NaCl
87,6 g (150 mM)
H2O
ad 1000 ml
Immundetektion:
Nach dem Blotten wurde die Membran 2 h bei Raumtemperatur in Blockinglösung (3 % BSA
(Bovines Serum Albumin) in 1x TBST) geschwenkt. Die Membran wurde anschließend mit 1x
TBST gewaschen und mit einem spezifischen primären Antikörper (Antikörper und
Verdünnungen siehe Anhang 5.2) über Nacht bei 4 °C inkubiert. Am nächsten Tag wurde
nach drei zehnminütigen Waschschritten mit 1x TBST die Membran mit dem jeweiligen
Meerettich-Peroxidase-gekoppelten, sekundären Antikörper für 1 h bei RT inkubiert. Nach
drei Waschschritten (jeweils 10 min in 1x TBST) wurden die nachzuweisenden Proteine mit
Hilfe einer Chemilumineszenz Reaktion der Meerrettich-Peroxidase detektiert. Dazu wurden
die beiden Lösungen des Western Lightning Chemiluminsecence Reagenz (PerkinElmer) 1:1
gemischt und für 1 min mit der Membran inkubiert. Anschließend wurde ein Film (Hyperfilm
ECL, Amersham) auf der Membran exponiert und in einer Entwicklermaschine (Agfa)
entwickelt.
2.4
Histologische Färbungen
Für morphologische Untersuchungen von Gewebeschnitten wurden im Rahmen dieser Arbeit
sowohl Gefrierschnitte als auch Paraffinschnitte angefertigt. Anschließend wurden drei
unterschiedliche Färbungen verwendet.
2.4.1 Herstellung von Gefrierschnitten
Das isolierte Mausherz wurde zunächst in Tyrode III (siehe Abschnitt 2.5) und
anschließend in Sucrose-Lösung (20 % in Tyrode III) gewaschen. Um Risse im Gewebe
zu vermeiden wurde das Herz direkt in TissueTek-Einbettmedium (Jung) eingebettet und
bei -20 °C eingefroren. Die Schnitte wurden im Kryostat (HM560, Microm) bei einer
Blocktemperatur von -20 °C angefertigt. Dabei lag die Schnittdicke bei 14 μm. Danach
wurden die Schnitte auf Polylysin-beschichtete Objekträger (VWR) aufgezogen,
getrocknet und feuchtigkeitsgeschützt mit Hilfe von Trockenperlen (Silica Gel Orange
(Roth) eingefroren.
Material und Methoden
18
2.4.2 Herstellung von Paraffinschnitten
Das Mausherz wurde isoliert, in PBS gewaschen und über Nacht in 4 %
Paraformaldehydlösung (PFA, Roth) fixiert. Anschließend wurde das Gewebe über
folgende aufsteigende Ethanolreihe dehydriert:
Ethanolreihe: 70 %, 90 %, 2x 100 %
je 60 min bei 4 °C
1:1 Ethanol/Toluol
30 min bei RT
100 % Toluol
30 min bei RT
Paraffin I, II, III
je 4 bis 16 h bei 60 °C
Danach wurde das Gewebe in Paraffin eingebettet. Mit einem Rotationsmicrotom
(HM335E, Microm) wurden 10 μm dicke Schnitte angefertigt, die im Wasserbad bei
42 °C gestreckt und auf Polylysin-beschichtete Objektträger (VWR) gegeben wurden.
Die Schnitte wurden anschließend für 3h bei 60 °C auf die Objektträger fixiert. Unter
Lichtausschluss konnten die Schnitte einige Monate aufbewahrt werden.
2.4.3 HE-Färbung
Bei der Hämatoxylin/Eosin (HE) Färbung werden die Kerne blauviolett und das Zytoplasma
rosa gefärbt.
Hämatoxylin-Lösung nach Harris (Sigma):
Hämatoxylin 7,5 g/l
Eosin-Lösung:
Eosin Y 6,0 g
Phloxin B 1,5 g
70 % Ethanol ad 250 ml
Die Färbung wurde nach folgendem Protokoll durchgeführt:
Durchführung:
15 sek. Hämatoxylinlsg.
2x2 min in H2O
5 sek. in 0,1 % Amoniaklösung (frisch)
2x2 min in H2O
für 15 sek. in Eosinlösung
Material und Methoden
19
8x in 95 % Ethanol tauchen
8x in 100 % Ethanol tauchen
2 min in 100 % Ethanol
2x2 min in Xylol
Nach der Färbung wurden die Gewebeschnitte mit DePeX-Harz (Serva) und Deckgläschen
bedeckt.
2.4.4 Sirius-Red-Färbung
Bei dieser Färbung stellen sich Kollagenfasern rot dar, während Muskelfasern und
Zytoplasma gelb erscheinen. Die Schnitte wurden 60 min mit Sirius Red gefärbt, kurz mit
1 % HCl gespült und anschließend mittels einer aufsteigenden Alkoholreihe (70 %-iges
Ethanol, 80 %-iges Ethanol, 96 %-iges Ethanol, 100 %-iger Ethanol, Xylol) entwässert. Nach
der Färbung wurden die Schnitte mit DePeX-Harz (Serva) und Deckgläschen bedeckt.
2.4.5 Lektin-Färbung
Lektine sind Proteine, die spezifisch mit Zuckerresten, z.B. von Glykoproteinen der
Zellmembran interagieren. Bei dieser Färbung wurden FITC-konjugierte Lektine verwendet,
die es möglich machten den Zellumriss und somit die Zellgröße zu veranschaulichen. Die
Paraffin-Schnitte wurden in Xylol entparaffiniert, dann einer absteigenden Alkoholreihe (100
%-igen Ethanol, 90 %-igen Ethanol, 70 %-igen Ethanol) unterworfen und mit H2O dest.
gespült. Im Anschluss daran wurden die Schnitte für 2 h bei RT und unter Lichtausschluss
mit 0,1 mg/ml Weizen-Lektin (gelöst in PBS; Sigma Aldrich, FITC-konjugiert) inkubiert,
dreimal 5 min in PBS gewaschen und anschließend mit fluoreszierendem Einbettmedium
(Vectashield, Vectorlabs) eingedeckelt. Die fluorochromen Konjugate wurden mit einem
konfokalen Lasermikroskop (Zeiss) bei einer Wellenlänge von 488 nm angeregt und
aufgenommen.
10x PBS, pH 7,4:
NaCl (Roth)
80 g
KCl (Roth)
2,0 g
Na2HPO4 (Roth)
6,2 g
KH2PO4 (Roth)
2,0 g
H2O
ad 1000 ml
Material und Methoden
2.5
20
Isolierung von Sinusknotenzellen
Der Sinusknoten wurde wie in Abschnitt 2.3.1 beschrieben isoliert, anschließend in mehrere
kleine Stücke geschnitten und in Tyrode-Low-Lösung für 5 min bei 35 °C inkubiert. Danach
wurden 1,75 mg/ml Collagenase B, 0,4 mg/ml Elastase (Roche) und 1 mg/ml BSA in die
Tyrode-Low-Lösung gegeben und für 25 min bei 35 °C verdaut. Nach dem Verdau wurden
die Gewebestücke in mehreren Wasch-/ Zentrifugenschritten von den Enzymen gereinigt
und in KB-Lösung für 2 h bei 4 °C aufbewahrt.
Tyrode-Low, pH 6,9:
Tyrode III, pH 7,4:
NaCl
0,82 g (140 mM)
NaCl
4,1 g (140 mM)
KCl
0,04 g (5,4 mM)
KCl
0,2 g (5,4 mM)
CaCl2
0,02 g (0,2 mM)
CaCl2
0,13 g (1,8 mM)
MgCl2
0,05 g (0,5 mM)
MgCl2
0,1 g (1 mM)
KH2PO4
0.08 g (1,2 mM)
HEPES
0,6 g (5 mM)
Taurin
0,63 g (50 mM)
D-Glucose
0,54 g (5,5 mM)
HEPES
0,12 g (5 mM)
H2O
ad 500 ml
D-Glucose
0,11 g (5,5 mM)
H2O
ad 100 ml
KB (mod. Kraftbrühe) pH 7,4:
KCl
0,19 g (25mM)
L-Glutamat
1,18 g (80 mM)
Taurin
0,25 g (20 mM)
KH2PO4
0,14 g (10 mM)
MgCl2
0,06 g (3 mM)
D-Glucose
0,20 g (10 mM)
HEPES
0,24 g (10 mM)
EGTA
0,02 g (0,5 mM)
H2O
ad 100 ml
Material und Methoden
2.6
21
Messung der Ca2+-Konzentration in Sinusknotenzellen
Die Untersuchung der intrazellulären Ca2+-Konzentration wurde in Zusammenarbeit mit Frau
Dr. Eberhardt aus der Arbeitsgruppe von Prof. Dr. Peter Reeh vom Institut für Physiologie
der FAU durchgeführt. Die Untersuchung erfolgte über eine Fluoreszenzmessung. Dazu
wurde der Farbstoff Fura-2 Acetoxymethylester (AM) verwendet. Dieser bildet einen ChelatKomplex mit den Ca2+-Ionen der Zelle und kann nach Anregung mit einer definierten
Wellenlänge detektiert werden. Für die Messungen wurden die isolierten Sinusknotenzellen
mit einer Pipette behutsam mechanisch vereinzelt und auf Poly-L-Lysin beschichtete
Deckgläschen ausgesät. Anschließend wurden sie für 45 min in Dunkelheit mit 5 µM Fura2AM und 0.02 % Pluronic (Invitrogen) versetzt, um eine Aufspaltung der Esterbindung des
Fura-2AM durch endogene Esterasen und die Freisetzung von Fura zu erlauben. Die
Deckgläschen wurden auf ein Olympus IX71 Mikroskop montiert und konstant bei 37 °C mit
Tyrode III Lösung umspült. Fura-2 wurde bei 340 und 380 nm mit einem Polychrom V
Monochromator angeregt und Aufnahmen für 4 ms, bei 20 Hz mit einer 12bit CCD-Kamera
gemacht. Für die Aufnahme und Analyse der Daten wurde die TILLvisION 4.0.1.3 Software
(Till Photonics) verwendet. Spontane Transienten der Sinusknotenzellen wurden für 2 min
aufgenommen.
Für
die
Auswertung
der
Ca2+-Konzentration
wurde
die
zelluläre
Autofluoreszenz subtrahiert und der Quotient der beiden Anregungswellenlängen gebildet.
Aus dem ermittelten Quotient F340/F380 (ratio F340/F380) lässt sich die zelluläre Ca 2+Konzentration abschätzen. Als repräsentativ für den basalen cytosolischen Ca2+-Gehalt
wurden die untersten zehn Prozent des gemessenen Quotienten von F340/F380 berechnet.
Um auszuschießen, dass der gemessene Ca2+-Gehalt von der Schlagfrequenz der einzelnen
Sinusknotenzellen abhängt, wurden die Zellen, zur Erniedrigung der Schlagfrequenz, mit 1
mM Zatebradin (gelöst in Tyrode) über ein Perfusionssystem umspült und der Ca2+-Gehalt
gemessen.
2.7
Gewinnung von Kardiomyozyten durch Langendorff-Perfusion
Die Isolation adulter Kardiomyozyten wurde mittels retrograder Perfusion nach Langendorff
durchgeführt.
Das
Mausherz
wurde
isoliert
und
eine
abgerundete
20G-Nadel
(BD Microlance, 0,9x40 mm, BD) in den Aortenbogen eingeführt, ohne die Aortenklappe zu
durchstechen. Über eine Kanüle wurde das Herz für acht Minuten mit Perfusionpuffer
perfundiert (Flussrate konstant 3 ml/min, 37 °C). Danach erfolgte eine ebenfalls achtminütige
Perfusion mit enzymhaltigem Verdaupuffer. Nach diesen beiden Perfusionsschritten wurde
das Herz von der Kanüle entfernt und durch vorsichtige Pipettierschritte vereinzelt und
anschließend filtriert. Es folgte ein Zentrifugationsschritt (1 min bei 180 G) bevor die
Material und Methoden
22
Myozyten in Stop-Puffer I und anschließend in Stop-Puffer II überführt wurden. Am Ende
wurden die Zellen für 2 h in KB-Lösung (siehe Abschnitt 2.5) im Kühlschrank gelagert. Um
die Größe und Morphologie der Zellen genau zu ermitteln, wurde die
Kardiomyozyten-
Lösung in eine 12-well-Platte pipettiert und unter dem Mikroskop (Zeiss Axiovert 10) bei
einer 400-fachen Vergrößerung ausgemessen. Die Prozedurschritte und Lösungsprotokolle
wurden in Anlehnung an Protokolle der AfCS (Alliance for Cellular Signaling) durchgeführt.
Perfusionspuffer (Stock), pH 7,46:
NaCl (Merck)
6,60 g (113 mM)
KCl (Roth)
0,35 g (4,7 mM)
KH2PO4 (Normapor)
0,08 g (0,6 mM)
Na2HPO4 (Roth)
0,11 g (0,6 mM)
MgSO4 (B. Schmidt)
0,30 g (1,2 mM)
NaHCO3 (Roth)
1,01 g (12 mM)
HEPES (Roth)
10,00 ml (10 mM)
Taurin (Fluka AG)
3,75 g (30 mM)
H2O
ad 1000 ml
1x Perfusionspuffer:
Perfusionspuffer (Stock)
245,0 ml
Glukose (Fluka AG)
3,75 g (5,5 mM)
BDM (Roth)
5,0 ml (10 mM)
H2O
ad 250 ml
Verdaupuffer:
Collagenase B (Roche)
0,25 mg/ml
CaCl2 (Merck) (Stock 100 mM)
3,12 µl (12,5 µM)
1x Perfusionspuffer
ad 25 ml
Stop-Puffer 1:
BSA (Roth)
10,0 mg
CaCl2 (Merck) (Stock 10 mM) 6,25 μl (12,5 μM)
1x Perfusionspuffer
ad 5 ml
Material und Methoden
23
Stop-Puffer 2:
BSA (Roth)
10,0 mg
CaCl2 (Merck) (Stock 10 mM) 12,5 μl (12,5 μM)
1x Perfusionspuffer
2.8
ad 10 ml
Telemetrische Elektrokardiogramm Ableitungen
Mit Hilfe des Elektrokardiogramms (EKG) kann die elektrische Aktivität des Herzens
aufgezeichnet werden. In dieser Arbeit wurden telemetrische EKG-Messungen durchgeführt.
Den Mäusen wurde im Alter von 2-3 Monaten ein Radiotransmitter (TA10EA-F20, Data
Sciences International, Abb. 2.2.B) intraperitonal unter Isoflurannarkose implantiert. Die
ableitenden Elektroden wurden subkutan im Bereich der rechten Schulter und auf dem linken
Bauchmuskel unterhalb des Rippenbogens angebracht (Abb. 2.2). Bei der telemetrischen
EKG-Messung wird das EKG-Signal vom Transmitter an eine Empfängerplatte gesendet und
an einen Computer weitergeleitet. Anschließend wurden die Daten mit der Dataquest A.R.T.
Software ausgewertet.
Abbildung 2.2: Telemetrische EKG-Ableitung.
(A) Röntgenbild einer Maus mit implantiertem Transmitter (modifiziert nach Kramer et al, 2003).
(B) Aufnahme eines EKG-Transmitters
Material und Methoden
24
Drei Wochen nach der Operation wurde mit den EKG-Messungen begonnen. Bei den
RyR2MerCreMer-Mäusen wurde dabei mit einer Messreihe von sieben Tagen begonnen. Im
Anschluss daran wurde an fünf aufeinander folgenden Tagen zur Induktion der
Rekombination je 2 mg Tamoxifen/100 µl Miglyol intraperitoneal injiziert. Die Messungen
wurden bis zum Tod der Knockout-Tiere weitergeführt, wobei alle 10 Minuten ein 20 s langes
EKG-Signal aufgenommen wurde. Für die Bestimmung der EKG-Parameter wurden mehrere
repräsentative 20 s lange EKG-Segmente ausgewertet (Abb. 2.1). Die erste Messreihe bei
den RyR2KiT-Tieren begann ebenfalls mit einer Dauermessung von sieben Tagen,
wobei alle 10 Minuten ein 20 s langes EKG-Segment aufgenommen wurde.
Anschließend wurde mit der Applikation von Pharmaka begonnen. Hierbei wurde jeweils
60 min vor der Pharmaka-Injektion, während der gesamten Wirkdauer und bis
mindestens 60 min nach Abklingen der Wirkung jede Minute ein 20 s langer EKG
Abschnitt aufgezeichnet. Zwischen den Injektionen der einzelnen Substanzen wurde
jeweils ein Tag Pause eingelegt. Nach der abgeschlossenen Messreihe wurde den
Tieren Tamoxifen an fünf aufeinander folgenden Tagen injiziert. Vier Wochen nach der
ersten Tamoxifen-Injektion wurden die Dauermessung und die Pharmaka-Messreihe
wiederholt.
Pharmaka Konzentrationen:
NaCl (Vehikel)
0,9 %
Isoprenalin
0,5 mg/kg
Carbachol
0,5 mg/kg
CCPA
0,3 mg/kg
Atropin
1 mg/kg
Zatebradin
2,0 mg/kg
Die EKG-Messungen an RyR3KO-Tieren starteten ebenfalls mit einer Dauermessung von
sieben Tagen, gefolgt von der Pharmaka-Aplikation. Die verwendeten Pharmaka und
Konzentrationen waren dieselben wie bei der RyR2KiT-Mauslinie.
Für die Bestimmung der EKG-Parameter wurden mehrere repräsentative 20 s lange EKGSegmente ausgewertet. Dazu wurden die einzelnen Parameter P, PQ, QRS, QT, RR und TP
ermittelt (Abb. 2.3).
Material und Methoden
25
Abbildung 2.3: Definition der EKG-Wellen und -Intervalle.
Die Erregung des Herzens beginnt im Sinusknoten. Aufgrund der wenigen Zellen des
Sinusknotens und der damit insgesamt geringen Potentialänderung bezogen auf das
gesamte Herz ist keine Abweichung von der isoelektrischen Linie im EKG bei der
Sinusknoten-Erregung zu detektieren. Erst wenn das rechte Atrium die Erregungswelle
weiterleitet, wird dies als P-Welle sichtbar. Die atrioventrikuläre Überleitungszeit und die
anhaltende Erregung der Vorhöfe werden durch die PQ-Dauer angezeigt. Der QRS-Komplex
spiegelt die Erregungsausbreitung über die Ventrikel wider. Die Erregungsrückbildung der
Ventrikel wird durch die T-Welle angezeigt. Da das QT-Intervall frequenzabhängig ist, kann
zum besseren Vergleich ein korrigiertes QT-Intervall (QTc) berechnet werden. Das
frequenzunabhängige QTc-Intervall ergibt sich aus der Gleichung
QT
(Mitchell et al,
RR / 100
1998). Die Herzfrequenz (Schläge pro Minute, bpm) ergibt sich aus dem zeitlichen Abstand
von R- zu R-Zacke. Das TP-Intervall spiegelt die Dauer vom Ende eines EKG-Komplexes bis
zum Beginn der folgenden Erregung wider. Die Standardabweichung der R-R Dauer (RRSD) wurde als Maß für die Herzfrequenzvariabilität verwendet. Neben dem EKG kann mit
Hilfe des implantierten Transmitters auch die Aktivität der Tiere gemessen werden. Dabei
wird die horizontale Bewegung des implantierten Transmitters über die Empfängerplatte
erfasst und ausgewertet.
2.9
Blutdruckmessungen mit Schwanzmanschette (Tail Cuff)
Unter der Blutdruckmessung mittels Schwanzmanschette versteht man eine nicht-invasive
Methode der Blutdruckerfassung bei Kleintieren. Die Mäuse befanden sich während der
gesamten Messphase in einer auf 37 °C erwärmten Wärmeröhre. Gemessen wurde anhand
einer Blutdruckmanschette am Schwanz der Tiere (Blutdruckmessgerät und Software der
Material und Methoden
26
Firma „Softron Corporation“). Beim automatischen Aufpumpen der Manschette steigt die
Druckkurve an und im Verlauf des abfallenden Manschettendrucks öffnen sich die
Schwanzgefäße und ein Puls sowie der Blutdruck sind messbar. Die Tiere wurden zunächst
über mehrere Tage an die Messungen gewöhnt, bis die Messwerte stabil waren.
Ausgewertet wurde der systolische Blutdruck.
2.10 Wiegen und Ausmessen der Herzkompartimente
Die Tiere wurde gewogen, anschließend getötet und das Herz in warme Tyrode III (37 °C; s.
Punkt 2.5) gegeben. In der warmen Tyrode konnte das Herz weiter schlagen und wurde von
geronnenem Blut befreit. Anschließend wurden die Herzen nach vorsichtigem Ausdrücken
der Tyrode-Lösung in einer Petrischale gewogen und ausgemessen. Danach wurde das
Herz in die unterschiedlichen Kompartimente (rechter Vorhof, linker Vorhof, rechter Ventrikel,
linker Ventikel und Septum) geteilt und das Gewicht und die Dicke der einzelnen
Kompartimente ermittelt. Zusätzlich wurde das Herzgewicht (mg) durch das Körpergewicht
(g) der jeweiligen Maus geteilt und somit das Verhältnis zwischen Herz- und Körpergewicht
ermittelt (Heart-Bodyweight-Ratio, HBR, (mg/g)).
2.11 Haltung und Zucht von Mäusen
2.11.1 Haltung
Die Mäuse wurden im Tierstall des Instituts für Experimentelle und Klinische Pharmakologie
und Toxikologie der Universität Erlangen gehalten und gezüchtet (12 Stunden Tag/NachtRhythmus, 23 °C). Eine Genehmigung für sämtliche Tierversuche der Regierung von
Mittelfranken lag nach Aktenzeichen: 54-2531.31-8/07 vor. Die Tiere wurden ad libitum mit
einer Zuchtdiät für Ratten und Mäuse (ssniff) gefüttert und mit Trinkwasser versorgt. Die
Verpaarung erfolgte ab einem Alter von sechs Wochen. Die Genotypisierung der
neugeborenen Tiere erfolgte im Alter von 10 Tagen mittels PCR. Im Alter von 3-4 Wochen
wurden die Jungen abgesetzt, mit Ohrmarken versehen und nach Geschlechtern getrennt
gehalten.
2.11.2 Zucht von konditionellen RyR2-Knockout-Mäusen
Zur
Zucht
RyR2
L2/L2
von
gewebespezifischen
,KiT) wurden gefloxte RyR2
L2/L2
Knockout-Mäusen
(RyR2L2/L2,MerCreMer
bzw.
-Mäuse (Takeshima et al, 1998) mit den Cre-
Recombinase exprimierenden Tieren MerCreMer (Sohal et al, 2001) oder HCN4KiT-Cre
Material und Methoden
27
(nachfolgend als KiT bezeichnet) (Hoesl et al, 2008) verpaart. Die daraus entstandenen
RyR2L2/+,MerCreMer bzw. -KiT-Tiere wurden wiederum mit gefloxten RyR2L2/L2-Mäusen
gekreuzt. Durch die gewebespezifische Expression der tamoxifen-induzierbaren CreRekombinasen MerCreMer im ganzen Herzen und KiT im Reizleitungssystem konnte der
RyR2-Knockout zeitlich kontrolliert und gewebespezifisch erreicht werden (Abb. 2.4).
Zusätzlich wurde eine Verkreuzung von RyR2L2/L2-Mäusen mit Mäusen, die das ubiquitäre
CAGG-Cre exprimieren durchgeführt.
Abbildung 2.4: Verpaarungsschema zur Generierung von konditionellen RyR2-KO-Mäusen.
Gefloxte RyR2-Mäuse wurden mit MerCreMer- oder KiT-Mäusen verpaart. Die RyR2L2/+,MerCreMer
bzw. RyR2L2/+,KiT x RyR2L2/L2 Verpaarung ergibt 25 % RyR2L2/L2,MerCreMer- bzw. RyR2L2/L2,KiTMäuse. Mit Hilfe von Tamoxifen kann die Deletion zu einem beliebigen Zeitpunkt induziert werden.
Material und Methoden
28
2.11.3 RyR3-Knockout-Mäuse
Zur Untersuchung des RyR3 im Herzen wurden konventionelle RyR3-Knockout-Mäuse
verwendet, bei denen das Exon 6 des RyR3 deletiert war (Bertocchini et al, 1997). Die
Mäuse wurden von Maik Gollasch (Max-Delbrück-Center für molekulare Medizin, Berlin)
bezogen.
2.11.4 Tamoxifen-Injektion
Durch die Injektion von Tamoxifen (Sigma) wurde die Cre-vermittelte Rekombination
aktiviert. Tamoxifen (2 mg/100 µl Miglyol; immer frisch angesetzt) wurde gevortext und in ein
Ultraschallbad gegeben bis sich alle Kristalle vollständig gelöst hatten. Die Injektion erfolgte
intraperitoneal an fünf aufeinander folgenden Tagen im Alter von sechs bis acht Wochen. Die
Experimente mit RyR2KiT-KO-Tieren starteten im Normalfall vier Wochen nach der ersten
Tamoxifen Injektion. Für Untersuchungen an RyR2MerCreMer-KO-Mäusen wurden die Tiere
kurz vor ihrem zu erwartenden Tod getötet.
2.12
Statistische Analyse
Die statistischen Auswertungen erfolgten mit Origin6.1 (Origin Lab Corporation). Die
ermittelten Werte sind als Mittelwert ± Standardabweichung angegeben. Die statistische
Signifikanz wurde mittels Student`s t-Test berechnet, wobei Unterschiede mit einem pWert kleiner 0,05 als signifikant angesehen wurden.
Ergebnisse
29
3.
Ergebnisse
3.1
Charakterisierung einer herzspezifischen RyR2-KO-Mauslinie
(RyR2MerCreMer)
Um die genaue Funktion von RyR2 im Herzen von adulten Tieren untersuchen zu können,
wurden konditionale RyR2-Knockout-Mäuse mit Hilfe des Cre/loxP-Systems generiert. Für
die herzspezifische Deletion von RyR2 wurde eine Mauslinie verwendet, bei der das Exon 1
von RyR2 von loxP-Sequenzen flankiert ist (Takeshima et al, 1998). Durch Verpaarung
dieses Stammes mit Mäusen, die das MerCreMer-Fusionsprotein unter der Kontrolle des
Promotors für die herzspezifische α-Myosin schwere Kette (αMHC) exprimierten (Sohal et al,
2001), wurde die Sequenz innerhalb der loxP-Schnittstellen durch die Cre-Rekombinase
spezifisch nur im Herzen exzidiert. Die dadurch entstandenen homozygoten Mäuse
(RyR2L2/L2,MerCreMer) sowie deren heterozygoten Geschwistertiere (RyR2L2/+,MerCreMer)
wurden im Alter von 6 bis 8 Wochen an fünf aufeinander folgenden Tagen mit je 2 mg
Tamoxifen intraperitoneal behandelt. Der dadurch hervorgerufene RyR2-Knockout der
RyR2L2/L2,MerCreMer-Mäuse (nachfolgend als RyR2MerCreMer-KO bezeichnet) und deren
Kontrollen (RyR2L2/+,MerCreMer) wurden anschließend auf funktioneller, histologischer und
molekularer Ebene charakterisiert.
3.1.1 Überlebensrate der RyR2MerCreMer-KO-Mäuse
Um die Auswirkung der RyR2-Deletion im Herzen von RyR2MerCreMer-KO-Tieren zu
untersuchen, wurden sowohl die RyR2L2/L2,MerCreMer-Mäuse als auch deren Kontrollen
(RyR2L2/+,MerCreMer) ab Beginn der Tamoxifen-Behandlung beobachtet. Dabei zeigte sich,
dass die Tamoxifen-Injektion keinen Einfluss auf die Überlebensrate der Kontrolltiere (n=8)
hatte. Allerdings führte die RyR2-Deletion bereits innerhalb von zwei Wochen zum Tod aller
KO-Tiere (n=8) (durchschnittliche Überlebensdauer 12,7±2,8 Tage). In Abbildung 3.1 ist die
Überlebensrate der RyR2MerCreMer-Tiere in Prozent angegeben.
Ergebnisse
30
Abbildung 3.1. Überlebensrate der RyR2MerCreMer-KO-Mäuse.
Von Tag 0 bis Tag 5 fanden die Tamoxifen-Injektionen statt. Alle KO-Tiere (n=8) starben innerhalb von
etwa 2 Wochen nach Injektionsbeginn. Das Überleben der Kontrollen (n=8) war nicht beeinflusst.
3.1.2 Analyse der RyR2 Expression im Herzen nach Deletion
Für die weiteren molekularbiologischen und histologischen Versuche wurden die
RyR2MerCreMer-KO-Tiere kurz vor ihrem zu erwartenden spontanen Tod getötet und das
Herz exzidiert.
3.1.2.1 Analyse der RNA-Expression der drei RyR-Isoformen
Die Deletion von RyR2 wurde durch RT-PCR Experimente überprüft (Abb. 3.2). Dazu wurde
Herzgewebe von RyR2MerCreMer-KO-Tieren präpariert, in die einzelnen Kompartimente
getrennt und daraus RNA isoliert. Bei diesem Versuchsansatz wurden zusätzlich zur
Expression von RyR2 die anderen beiden RyR-Isoformen untersucht (RyR1 und RyR3). Bei
der Analyse von RyR2-mRNA konnte gezeigt werden, dass die Deletion von RyR2 sowohl in
den Ventrikeln als auch im linken Vorhof und im Sinusknoten erfolgreich war. Dagegen ist
eine schwache Bande im rechten Vorhof nachweisbar, was dadurch erklärt werden kann,
dass die MerCreMer-Recombinase dort in geringer Konzentration und/oder als Mosaik
exprimiert ist. Die RyR1-mRNA konnte im ganzen Herzen nicht detektiert werden. Bei RyR3
dagegen konnte gezeigt werden, dass im SAN- und Vorhof-Bereich neben RyR2 auch RyR3
exprimiert wird. Im Vergleich zu Kontrollen (3.2.1.1) wiesen die KO-Mäuse keinen
Unterschied in der Expression der Isoformen RyR1 und RyR3 auf.
Ergebnisse
31
Abbildung 3.2: RT-PCR zum Nachweis der RyR-Isoformen im Herzen der RyR2MerCreMer-KOMäuse.
Verwendete Primerkombinationen und resultierende Bandengröße: RyR1 (for/rev) 719 bp, RyR2
(G/H) 300 bp, RyR3 (Mf/Mr) 380 bp, Oben: Kein Nachweis von RyR1-mRNA. Mitte: Keine RyR2Banden sichtbar, außer einer schwachen Bande im rechten Vorhof. Unten: RyR3 kommt im
Sinusknoten und den Vorhöfen vor.
3.1.2.2 Analyse der RyR2-Proteinexpression
Als Nachweis, ob im Herzgewebe der RyR2MerCreMer-KO-Tiere tatsächlich auch eine
Deletion des RyR2-Proteins stattgefunden hat, wurde eine Western-Blot Analyse
durchgeführt. Dazu wurde Herzgewebe von KO-Tieren und von heterozygoten Kontrollen
verwendet. Die Western-Blot Analyse (Abb. 3.3) zeigte deutliche Unterschiede in der
Proteinexpression zwischen den beiden Genotypen. Im Vergleich zu den Kontrollen lässt
sich das RyR2-Protein in den Ventrikeln der KO-Mäuse nicht mehr detektieren. Dagegen
kann eine RyR2-Bande in den Vorhöfen noch nachgewiesen werden. Demgegenüber konnte
bei den Kontrollen RyR2-Protein sowohl in den Vorhöfen als auch im Ventrikel weiterhin
detektiert werden.
Abbildung 3.3: Expression von RyR2-Protein im Herzen der RyR2MerCreMer-KO-Mäuse.
Im Western-Blot von Herzlysaten der Kontrolltiere wurde mittels RyR-Antikörper das 565 kDa große
RyR2-Protein nachgewiesen. In den Ventrikeln der KO-Tiere wurde kein RyR2-Protein mehr
detektiert. In den Vorhöfen wurde RyR2 in geringerer Expression weiterhin nachgewiesen. Tubulin
diente als Ladekontrolle.
Ergebnisse
32
3.1.3 Untersuchung des Herzgewichts
Als nächstes wurde die Morphologie der Herzen von RyR2MerCreMer-KO-Tiere im Vergleich
zu Kontrollen untersucht. Dazu wurden die Tiere zuerst gewogen, anschließend getötet, die
Herzen entnommen und diese ebenfalls gewogen, in die einzelnen Kompartimente geteilt
und ausgemessen. Die Herzen der KO-Tiere waren vergrößert, wobei vor allem die Vorhöfe
stark vergrößert waren. Insbesondere der linke Vorhof wirkte sehr stark dilatiert und war mit
Thromben gefüllt (Abb. 3.4). Die Veränderungen in der Morphologie der KO-Herzen lassen
darauf schließen, dass die KO-Tiere an den Folgen einer Herzinsuffizienz starben.
Abbildung 3.4: Repräsentative Aufnahmen der RyR2MerCreMer-KO-Herzen.
(A) Kontrollherz. (B) RyR2MerCreMer-KO-Herz. Das KO-Herz weist dilatierte und mit Thromben
gefüllte Vorhöfe auf. Das Myokard der KO-Tiere erscheint nur durch fotografier-bedingte Lichtreflexe
heller als das Myokard der Kontrollen, die augenscheinliche Durchblutung war nicht verändert. r Vo,
rechter Vorhof; l Vo, linker Vorhof.
Zum besseren Vergleich wurde das Herzgewicht auf das Körpergewicht der jeweiligen Maus
normalisiert. Das Verhältnis von Herzgewicht zu Körpergewicht (Heart – Bodyweight – Ratio,
HBR) war um mehr als das 3-fache erhöht (Ctr: 5,1 ± 0,6 mg/g; n=23; KO: 16,1 ± 2,3 mg/g;
n=12; p< 0,001). Besonders auffällig waren die Größe und das Gewicht des linken Vorhofs
der KO-Tiere erhöht (Abb.3.5 und Tabelle 1). Aber auch der rechte Vorhof und der Ventrikel
waren im Vergleich zu den Kontrollherzen signifikant vergrößert.
Ergebnisse
33
Abbildung 3.5: Herz-Gewicht und HBR der RyR2MerCreMer-KO-Tiere.
Das Gewicht der Ventrikel und Vorhöfe sowie der HBR-Wert der KO-Tiere waren signifikant
vergrößert im Vergleich zu den Kontrollen. **, p < 0.01; ***, p < 0.001.
Das Körpergewicht der Kontrolltiere (25,3±4,9 g) war zudem signifikant höher als das
Körpergewicht der KO-Mäuse (20,1±1,9 g). Dieser Unterschied kann darauf zurückgeführt
werden, dass die KO-Tiere zum Zeitpunkt der Herzentnahme durch die Herzinsuffizienz
bereits körperlich beeinträchtigt waren und dadurch innerhalb weniger Tage mehrere Gramm
an Gewicht verloren hatten.
Ctr
(n=23)
KO
(n=12)
pWert
Herzlänge
(mm)
Herzdurchmesser
(mm)
Länge l
Vorhof
(mm)
Länge r
Vorhof
(mm)
linke
Ventrikelwand
(mm)
rechte
Ventrikelwand
(mm)
Septumdicke
(mm)
7.6±0.9
5.1±0.4
2.4±0.3
3.0±0.5
1.9±0.4
0.6±0.1
1.7±0.2
8.5±0.7
5.8±0.5
6.8±1.1
4.2±0.8
2.1±0.4
0.7±0.1
1.8±0.4
< 0.001
< 0.001
< 0.001
< 0.001
> 0.1
< 0.05
> 0.1
Tabelle 1: Biometrische Daten der Ventrikel und Vorhöfe.
Die Länge und Breite der Herzen, sowie die Dicke der einzelnen Kompartimente war verändert in
RyR2MerCreMer-KO-Tieren.
Sowohl die Länge als auch der Durchmesser der KO-Herzen waren etwas vergrößert. Beim
Vermessen der Ventrikelwände und des Septums konnte gezeigt werden, dass zwar die
linke Ventrikelwand und das Septum der KO-Tiere tendenziell dicker waren, der Unterschied
war jedoch nicht signifikant. Lediglich die Dicke der rechten Ventrikelwand war wenig
vergrößert (Tabelle 1).
Ergebnisse
34
3.1.4 Analyse der Herzfrequenz und der EKG-Parameter
Mittels EKG-Telemetrie wurde die Herzfrequenz und die lokomotorische Aktivität der Tiere
untersucht. Dazu wurden Kontrollen und KO-Tiere mit Telemetrie-Transmittern versehen und
das EKG kontinuierlich ab Beginn der Tamoxifen-Injektion aufgezeichnet (Abb. 3.6).
Abbildung 3.6: Telemetrische EKG-Ableitungen an wachen Tieren während der letzten sieben
Tage vor dem Tod der KO-Tiere.
Absinken der Herzfrequenz (oben) und der Aktivität (unten) der RyR2MerCreMer-KO-Tiere im
Vergleich zu den Kontrollen. Die KO-Tiere zeigen keinen Tag-Nacht-Rhythmus mehr.
Dabei ist zu erkennen, dass die Herzfrequenz der KO-Tiere bis zu deren Tod kontinuierlich
abnimmt. Daneben nahm auch die lokomotorische Aktivität der KO-Mäuse immer weiter ab,
was als ein deutliches Zeichen für einen stark eingeschränkten Allgemeinzustand gewertet
werden kann. Während die Kontrolltiere einen normalen Tag-Nacht-Rhythmus, mit höheren
Herzfrequenzen nachts und niedrigeren Herzfrequenzen tagsüber aufwiesen, konnte bei den
KO-Tieren kein Tag-Nacht-Rhythmus mehr festgestellt werden. Des Weiteren wurden die
EKG-Parameter anhand mehrerer 20 s langer EKG-Abschnitte ausgewertet (Abb 3.7). Bei
den KO-Mäusen wurden für die Auswertung EKG-Abschnitte aus Messungen zum Zeitpunkt
sieben Tage, sowie zwei Tage vor dem Tod der Tiere verwendet. Die P-Dauer, RR- ,PQ-,
QRS-, QT- und TP-Intervalle wurden ermittelt und das herzfrequenz-korrigierte QTc-Intervall
wurde berechnet. Bereits eine Woche vor dem Tod der KO-Tiere konnte eine
Sinusbradykardie festgestellt werden, zwei Tage vor dem Tod war die Herzfrequenz noch
weiter gesunken. Dies lässt sich anhand des RR-Intervalls zeigen, welches eine Woche vor
Ergebnisse
35
dem Tod der KO-Tiere um 24 ms, zwei Tage vor dem Tod bereits um 182 ms verlängert war.
Dies entspricht einer Abnahme der Herzfrequenz um 68 bpm sieben Tage vor dem Tod der
KO-Tiere und einer Abnahme um 253 bpm, zwei Tage vor deren Tod. Neben dem RRIntervall waren die QT- und TP-Zeit der KO-Mäuse signifikant verlangsamt.
Abbildung 3.7: EKG-Parameter der RyR2MerCreMer-KO-Mäuse.
Es wurden EKG-Abschnitte zu dem Zeitpunkt sieben Tage bzw. zwei Tage vor dem Tod der KO-Tiere
ausgewertet. (A) Mittelwerte ± Standardabweichung von P-Dauer, PQ, QRS, QT, TP und QTc
(korrigiertes QT-Intervall). (B) Das RR-Intervall bezeichnet die Zeit zwischen den beiden R-R-Zacken.
Die Dauer der einzelnen Parameter in A und B ist in ms angegeben. *, p < 0.05; ***, p < 0.001.
In Abbildung 3.8 sind EKG-Beispiele aus Messungen zwei Tage vor dem Tod der KO-Mäuse
im Vergleich zu deren Kontrollen dargestellt. Während das EKG der Kontrolle normale EKGParameter aufweist, ist das EKG der KO-Maus sichtbar verändert. Besonders auffällig sind
dabei neben der Bradykardie sowohl verlängerte und morphologisch veränderte T-Wellen,
als auch die P-Wellen, die nach unten zeigen. In den KO-Tieren treten also massive
Störungen der Erregungsbildung- und Rückbildung auf.
Ergebnisse
36
Abbildung 3.8: Beispiele telemetrischer EKG-Ableitungen.
(A) EKG-Spur einer Kontroll-Maus. (B) EKG-Spur einer RyR2MerCreMer-KO-Maus. Die P-Welle und
das Ende der T-Welle sind durch Pfeile markiert.
3.1.5 Analyse der strukturellen Veränderungen des Herzens
Um genauere Aufschlüsse über die Auswirkung der RyR2-Deletion auf das Herz der KOTiere zu erhalten, wurden die Herzen eingebettet, geschnitten und histologisch mittels HEund Sirius-Red-Färbung analysiert. Bei der HE-Färbung (Abb. 3.9A) konnten deutliche
morphologische Veränderungen festgestellt werden. Vor allem im stark vergrößerten linken
Vorhof konnten große organisierte Thromben nachgewiesen werden. Der rechte Vorhof war
zwar nicht so stark vergrößert wie der linke, jedoch waren auch hier Thromben zu erkennen.
Das Auftreten von Kollagen und Fibrose im Myokard wurde anhand der Sirius-Red-Färbung
untersucht.
Durch
diese
Färbung
wird
Kollagen
rot
und
das
Zytoplasma
der
Herzmuskelzellen gelb angefärbt. Kollagene gehören zu den Strukturproteinen und kommen
vor allem im Bindegewebe sowie in der extrazellulären Matrix des Herzens vor und können
als Fibrosemarker verwendet werden. Die Abbildungen 3.9B und 3.9C zeigen repräsentative
Aufnahmen der Herzen nach einer Sirius-Red-Färbung. Bei den Kontroll-Herzen wurden
keine vermehrten Kollageneinlagerungen in den zellulären Zwischenräumen nachgewiesen.
Wie zu erwarten, war jedoch das Bindegewebe z.B. um Blutgefäße rot angefärbt. Bei den
KO-Tieren dagegen konnte pathologische Fibrosierung in den Ventrikeln detektiert werden,
die das gesamte Myokard durchzog.
Ergebnisse
37
Abbildung 3.9: Atriale Thrombose und vermehrte Fibrose im Ventrikel der RyRMerCreMer-KOMäuse.
(A) HE-Färbung an Kryoschnitten von KO- und Kontroll-Herzen. (B) Sirius-Red-Färbung an
Kryoschnitten von KO- und Kontroll-Herzen. (C) Vergrößerung aus linker Ventrikelwand von (B). Ao,
Aorta; r Vo, rechter Vorhof; l Vo, linker Vorhof; r Ven, rechter Ventrikel; l Ven, linker Ventrikel.
3.1.6 Untersuchung der Morphologie und Größe der Kardiomyozyten
Um die Veränderungen auf zellulärer Ebene zu untersuchen, wurde die Morphologie und
Größe von über Langendorff-Perfusion frisch isolierten Kardiomyozyten untersucht. Während
die Kardiomyozyten der Kontrolltiere (n=5 Mäuse) unter einem Phasenmikroskop typische
Strukturen wie eine Querstreifung, aufwiesen, waren die Myozyten der KO-Tiere (n=6
Mäuse) pathologisch verändert. Die KO-Kardiomyozyten wirkten ödematös und mit Vakuolen
gefüllt. Zudem konnte keine Querstreifung mehr erkannt werden (Abb. 3.10 A).
Ergebnisse
38
Abbildung 3.10 Analyse der isolierten Kardiomyozyten.
(A) Abbildung einer Kontroll- und einer KO-Kardiomyozyte. (B) Tabelle mit der gemessenen Breite
und Länge (in µm) der Kontrollen (n=350) und KO-Kardiomyozyten (n=420). Maßstabsbalken, 25
μm.*, p < 0.05; ***, p < 0.001.
Das Vermessen der Zellbreite und Zelllänge isolierter Myozyten bestätigte eine leichte
Größenzunahme der KO-Myozyten (Abb. 3.10B). Die Zellen waren signifikant länger und
breiter im Vergleich zu den Kontroll-Myozyten. Desweiteren wurde die Morphologie der
Kardiomyozyten anhand von Paraffin-Schnitten durch eine Lektin-Färbung untersucht,
wodurch die Zellmembran der ventrikulären Kardiomyozyten genauer dargestellt werden
konnte (Abb. 3.11). Auch hierbei konnte deutliche Veränderungen der KO-Kardiomyozyten
festgestellt werden. Die Zellen der KO-Präparate waren stark vergrößert und unförmig.
Abbildung 3.11: Lektin–Färbung von Paraffinschnitten durch das ventrikuläre Myokard zur
Darstellung der Zellmembran.
Links: Kontroll-Kardiomyozyten. Rechts: KO-Kardiomyozyten. Die Zellembran ist grün dargestellt.
Maßstabsbalken, 50 μm.
Ergebnisse
3.2
39
Charakterisierung einer reizleitungs-spezifischen RyR2-KOMauslinie (RyR2KiT)
RyR2 soll neben seiner Funktion im Myokard auch eine wichtige Rolle bei der Generierung
des Schrittmacherpotentials im Reizleitungssystem spielen (Maltsev et al, 2006; Lakatta et
al, 2010). Um die Funktion von RyR2 im Reizleitungssystem besser untersuchen zu können,
wurde neben der RyR2MerCreMer-Mauslinie eine zweite Mauslinie generiert. Dazu wurde
mit Hilfe eines konditionellen Knockout-Systems die Deletion von RyR2 selektiv nur im
Reizbildungs- und Reizleitungssystem hervorgerufen. Zum einen wurde die gefloxte RyR2Mauslinie verwendet (Takeshima et al, 1998), zum anderen die HCN4KiT-Cre Mauslinie
(Hoesl et al, 2008). Bei der HCN4KiT-Cre Mauslinie wird nach Induktion mit Tamoxifen nur in
Zellen des Sinus- und AV-Knotens ein RyR2-Knockout (RyR2KiT-KO) erzeugt. Für die
Zielgendeletion wurden homozygote Mäuse (RyR2L2/L2,KiT) generiert und nach Induktion mit
Tamoxifen untersucht. Als Kontrollen dienten die heterozygoten Geschwister-Tiere
(RyR2L2/+,KiT), die ebenfalls mit Tamoxifen behandelt wurden.
Im Gegensatz zu den herzspezifischen RyR2MerCreMer-KO-Mäusen sind die RyR2KiT-KOTiere nach der Tamoxifen-Behandlung lebensfähig und zeigen keine phänotypischen
Auffälligkeiten.
3.2.1 Analyse der Expression von RyR2 in RyR2KiT-Mäusen
3.2.1.1 Analyse der RNA-Expression der drei RyR-Isoformen
Um die Deletion von RyR2 im Reizleitungssystem auf RNA-Ebene nachzuweisen, wurde
eine RT-PCR mit RNA aus verschiedenen Bereichen des Herzens durchgeführt. Zusätzlich
wurde untersucht, ob in RyR2KiT-KO-Tieren eine kompensatorische Hochregulation der
anderen RyR-Isoformen RyR1 und RyR3 stattgefunden hatte.
Ergebnisse
40
Abbildung 3.12: RT-PCR zum Nachweis der RyR-Isoformen im Sinusknotengewebe der
RyR2KiT-KO-Tiere.
Keine Änderung der RyR1 und RyR3 RNA-Expression in RyR2KiT-KO-Tieren im Vergleich zu den
Kontrollen. Die RyR2 Deletion in den KO-Tieren konnte auf RNA-Ebene nicht nachgewiesen werden.
Wie schon in Abschnitt 3.1.2.1 gezeigt, wird RyR1 im Herzen nicht exprimiert, RyR3 kommt
dagegen im Sinusknoten und den Vorhöfen vor. Wie in Abb. 3.12 zu sehen ist, konnte auch
nach Induktion des RyR2-Knockouts keine RyR1-RNA im Sinusknoten der KO-Mäuse
detektiert werden. RyR3-RNA konnte sowohl im Sinusknotengewebe der KO-Mäuse als
auch in der Kontrolle nachgewiesen werden, war in den KO-Tieren jedoch nicht stärker oder
schwächer exprimiert als in den Kontrollen. Die Deletion von RyR2 konnte mit RT-PCR nicht
bestätigt werden, da RyR2-RNA im Sinusknoten beider Gruppen detektiert werden konnte.
Das lässt sich dadurch erklären, dass sich in isolierten Sinusknoten, aus denen die RNA
gewonnen wurde, viele Vorhofmyozyten befanden, in denen RyR2 weiterhin exprimiert wird.
Diese geringe mRNA-Menge reicht aus, um unter den angewanden RT-PCR-Bedingungen
ein Signal zu generieren. Auf Protein-Ebene (siehe folgender Abschnitt 3.2.2.2) war die
Deletion allerdings eindeutig nachweisbar. Da RyR1 wie bereits beschrieben im Herzen nicht
vorkommt (Tellez et al, 2006), wurde für die Proben aus dem Vorhof und Ventrikel nur die
RNA-Expression von RyR2 und RyR3 untersucht (Abb. 3.13). In den Vorhöfen und in den
Ventrikeln fand wie erwartet keine RyR2-Deletion statt, so dass die RyR2-RNA in den KOTieren weiterhin detektiert werden konnte. Die Isoform RyR3 konnte wie bereits beschrieben,
zwar in den Vorhöfen, jedoch nicht in den Ventrikeln detektiert werden.
Ergebnisse
41
Abbildung 3.13: RT-PCR zum Nachweis der RyR-Isoformen im Herzgewebe der RyR2KiT-KOTiere.
Oben: RyR2-RNA war bei den KO-Tieren und den Kontrollen in allen Kompartimenten zu detektieren.
Unten: RyR3-RNA konnte nur in den Vorhöfen beider Gruppen nachgewiesen werden.
3.2.1.2 Analyse der RyR2 Proteinexpression
Die Deletion von RyR2 sollte bei der RyR2KiT-KO-Maus nur im Reizleitungssystem, nicht
jedoch im restlichen Herzen stattfinden. Zum Nachweis, dass der RyR2-Knockout erfolgreich
war, wurde eine Western-Blot Analyse durchgeführt. Zusätzlich zum Sinusknoten wurde
auch Gewebe aus dem rechten und linken Vorhof der Mausherzen untersucht. Im Gegensatz
zur RNA-Detektion mittels RT-PCR war auf Protein-Ebene keine Bande im Gewebe des
Sinusknotens der KO-Mäuse mehr zu erkennen (Abb. 3.14). Im Vergleich dazu konnte im
Sinusknoten der Kontrollen eine starke RyR2-Bande detektiert werden. RyR2 konnte
unverändert in den Vorhöfen der Kontrollen als auch in denen der KO-Tiere nachgewiesen
werden. Somit war RyR2 wie erwartet im Sinusknoten deletiert, die RyR2 Expression in den
Vorhöfen der KO-Tiere war jedoch nicht beeinflusst.
Abbildung 3.14: RyR2-Proteinexpression im Herzen der RyR2KiT-KO-Mäuse.
Nur im SAN der KO-Mäuse war das RyR2-Protein deletiert. In den Vorhöfen der KO-Tiere konnte das
565 kDa große RyR2-Protein weiterhin detektiert werden. Tubulin diente als Ladekontrolle.
Ergebnisse
42
3.2.2 Untersuchung der strukturellen Veränderungen der Herzen
Um strukturelle Veränderungen in den Herzen zu untersuchen, wurden Kryoschnitte von
RyR2KiT-KO- und Kontroll-Herzen mit HE gefärbt. Nach lichtmikroskopischer Betrachtung
konnten keine Veränderungen der Herzmuskulatur oder des Sinusknotengewebes nach
RyR2-Deletion festgestellt werden (Abb. 3.15 oben). Pathologische Prozesse am Herzen
gehen häufig mit einem Umbau der Herzmuskulatur einher, wobei Herzmuskelgewebe durch
Bindegewebe ersetzt wird. Durch eine Sirius-Red-Färbung werden solche kollagenen Fasern
durch eine Rotfärbung dargestellt und grenzen sich daher deutlich vom Zytoplasma der
Kardiomyozyten ab. Außer den physiologisch vorhandenen Bindegewebsstrukturen, wie z.B.
an den Gefäßen, war bei den KO-Herzen kein vermehrtes Bindegewebe und somit keine
Fibrosierung zu beobachten (Abb. 3.15 unten).
Abbildung 3.15: Morphologie der RyR2KiT-KO-Herzen.
(A) HE-Färbung an Kryoschnitten von Kontroll- und KO-Herzen. (B) Sirius-Red-Färbung an
Kryoschnitten von Kontroll- und KO-Herzen. Es konnten keine Unterschiede in der Morphologie oder
dem Fibrosierungsgrad festgestellt werden. Ao, Aorta; r Vo, rechter Vorhof; l Vo, linker Vorhof.
Ergebnisse
43
3.2.3 Analyse der Herzfrequenz und der EKG-Parameter
Mittels telemetrischer EKG-Transmitter wurden die Herzfrequenz und die lokomotorische
Aktivität der RyR2KiT-KO-Mäuse im Vergleich zu den heterozygoten Kontrollen untersucht.
Da die RyR2KiT-Mauslinie generiert wurde, um spezifisch im Reizleitungssystem den RyR2
zu deletieren, wurde untersucht ob die Rhythmus-Generierung und Reizweiterleitung im
Herzen durch den Knockout beeinflusst wurden. Dazu wurden RyR2L2/L2,KiT- und
RyR2L2/+,KiT-Mäuse mit EKG-Telemetrie-Transmittern versehen. Zur Bestimmung der
basalen Herzfrequenz wurde ihr EKG kontinuierlich eine Woche aufgezeichnet (Abb. 3.16).
Anschließend
wurden
den
Mäusen
verschiedene
Pharmaka
verabreicht,
die
die
Herzfrequenz modulieren sollten. Um den Knockout zu generieren, wurde den Tieren
Tamoxifen injiziert und alle Messungen wurden vier Wochen nach den Tamoxifen-Injektionen
wiederholt. Die EKG-Messungen vor der Tamoxifenbehandlung werden in Abschnitt 3.3.2
näher behandelt.
Abbildung 3.16: Telemetrische EKG-Ableitungen an wachen RyR2KiT-KO- und Kontrolltieren.
Oben: Die mittlere Herzfrequenz der KO-Tiere ist deutlich niedriger als die Herzfrequenz der
Kontrollen. Unten: Die Aktivität der KO-Tiere im Vergleich zu den Kontrollen ist dagegen nicht
verändert. Es gab keinen Unterschied im Tag-Nacht-Rhythmus.
Die Analyse der Herzfrequenz und der lokomotorische Aktivität der Tiere vier Wochen nach
der
Tamoxifen-Behandlung
zeigte,
dass
RyR2
defiziente
Mäuse einen
normalen
Sinusrhythmus und keine Anzeichen für Arrhythmien hatten. Allerdings ist zu erkennen, dass
die mittlere Herzfrequenz der KO-Tiere deutlich niedriger war als die der Kontrollen (Abb.
Ergebnisse
44
3.16). Die KO-Tiere wiesen somit eine Bradykardie auf. Es konnte kein Unterschied bei der
lokomotorischen Aktivität der beiden Gruppen festgestellt werden. Somit lässt sich die
Bradykardie nicht auf eine geringere Aktivität der KO-Tiere im Vergleich zu den Kontrollen
zurückführen. Die mittlere Herzfrequenz über eine Woche betrug bei den KO-Mäusen 330
bpm, bei den Kontrollen 456 bpm (p<0,05). Obwohl die KO-Mäuse eine deutliche
Bradykardie zeigten, blieb der Tag-Nacht-Rhythmus mit höheren Herzfrequenzen nachts
(aktive Phase) und niedrigeren Herzfrequenzen tagsüber weiterhin erhalten. Dies lässt
darauf schließen, dass die Möglichkeit einer Modulation der Herzfrequenz nicht verloren
gegangen war. Der signifikante Unterschied in der Herzfrequenz konnte ebenfalls
beobachtet werden, wenn man die Mittelwerte der Herzfrequenzen nachts und während des
Tages miteinander verglich (Abb. 3.17A). Dabei wurden für die Tagphase Messungen von 7
Uhr bis 19 Uhr verwendet, für die Nachtphase Werte von 19 Uhr bis 7 Uhr.
Überraschenderweise gab es einen signifikanten Unterschied bei der Untersuchung der
Herzfrequenzvariabilität zwischen den beiden Gruppen. Die Herzfrequenz der KO-Mäuse
wies dabei eine geringere Variabilität im Vergleich zu den Kontrollen auf. Dieser Unterschied
ist in Abb. 3.17B anhand der Standardabweichung der RR-Intervalle von Messungen
während der Tag- bzw. Nacht-Phase dargestellt.
Abbildung 3.17 Mittlere Herzfrequenz und Herzfrequenzvariabilität der RYR2KiT-KO-Tiere.
(A) Mittlere Herzfrequenzen nachts und tagsüber. (B) Darstellung der Herzfrequenzvariabilität anhand
der Standardabweichung der RR-Intervalle. Die KO-Tiere (n=7) haben eine niedrigere
Herzfrequenzvariabilität als die Kontrollen (n=7). *, p < 0.05.
Um herauszufinden, welcher EKG-Abschnitt die Bradykardie der RyR2KiT-KO-Tiere
verursacht, wurden die einzelnen EKG-Parameter anhand 20 s langer EKG-Abschnitte aller
Mäuse ausgewertet und die PQ-, QRS-, QT-, TP und RR-Intervalle ermittelt (Abb. 3.18).
Ergebnisse
45
Abbildung 3.18: EKG-Parameter von RyR2KiT-KO- und Kontrolltieren.
Die Mittelwerte ± Standardabweichung von P-Dauer, PQ, QRS, QT, TP und RR sind angegeben. Die
signifikante Verlängerung des RR-Intervalls (und damit der Herzfrequenz) ist auf eine Verlängerung
der PQ- und TP- Intervalle zurückzuführen. *, p < 0.05; **, p < 0.01.
Bei ansonsten normalem EKG (Abb. 3.19) konnte eine signifikant verlängerte PQ-Dauer um
6.4 ms und vor allem ein um 28.1 ms stark verlängertes TP-Intervall der KO-Tiere im
Vergleich zu den Kontrollen festgestellt werden. Die TP-Zeit spiegelt den Abstand zwischen
dem Ende einer T-Welle bis zur darauf folgenden P-Welle wider, also die Zeit, in der der
Sinusknoten aktiv ist. Insgesamt ergibt sich daraus die beobachtete Bradykardie mit einer
Verlängerung des RR-Intervalls der KO-Tiere um 37 ms im Vergleich zu den Kontrollen. Die
übrigen EKG Parameter waren nicht verändert. Daraus lässt sich schließen, dass die
Deletion von RyR2 starke Auswirkungen auf die Generierung des Aktionspotentials im
Sinusknoten hat.
Abbildung 3.19: Beispiele telemetrischer EKG-Ableitungen.
EKG-Spur einer Kontroll-Maus (links) und einer RyR2KiT-KO-Maus (rechts). Pfeile markieren die PWelle und das Ende der T-Welle.
Ergebnisse
46
3.2.4 Analyse der Herzfrequenz-Modulation durch verschiedene Pharmaka
Um zu überprüfen, ob eine Herzfrequenz-Modulation noch möglich ist, wurde den Mäusen
verschiedene Pharmaka appliziert. Eine Herzfrequenz-Steigerung wurde zuerst mit dem βAdrenorezeptor-Agonisten Isoprenalin (0,5 mg/kg) untersucht (Abb. 3.20, 3.21). Sowohl die
Kontrolltiere als auch die RyR2KiT-KO-Tiere konnten nach Injektion von Isoprenalin ihre
Herzfrequenz steigern, die Frequenzen der KO-Tiere waren jedoch stets niedriger als bei
den Kontrolltieren. Während die Kontrollen eine Herzfrequenz von bis zu 700 bpm
erreichten, überstieg die Herzrate bei den KO-Tieren nie 500 bpm. Dabei ist jedoch zu
beachten, dass die Basalfrequenz der KO-Tiere, wie bereits in Abschnitt 3.2.4 beschrieben,
von vornherein niedriger war, als die Frequenz der Kontrollen.
Abbildung 3.20: Herzfrequenz-Steigerung mittels Isoprenalin.
Dargestellt sind die mittleren Herzfrequenzen der RyR2KiT-KO-Mäuse (n=7) und der Kontrollen (n=7)
eine Stunde vor und drei Stunden nach Injektion von 0,5 mg/kg Isoprenalin. Zum Zeitpunkt t=0 wurde
Isoprenalin injiziert. Die KO-Tiere konnten ebenso wie die Kontrollen ihre Herzfrequenz nach
Isoprenalin-Injektion steigern, erreichten aber nicht die gleichen hohen Frequenzen wie die Kontrollen.
Neben Isoprenalin wurden auch der muscarinische Acetylcholin-Rezeptor Antagonist Atropin
(1 mg/kg), der If–Blocker Zatebradin (2 mg/kg), der A1-Adenosin-Rezeptor Agonist CCPA
(0,3 mg/kg) und der muscarinische M2- Rezeptor Agonist Carbachol (0,5 mg/kg) verabreicht
(Abb. 3.21A). Mit Atropin konnte die Herzfrequenz ähnlich wie mit Isoprenalin gesteigert
werden. Allerdings war die Steigerung mit Atropin weniger effizient als mit Isoprenalin, so
dass lediglich Werte von 600 bpm bei den Kontrolltieren erreicht werden konnten. Auch mit
Atropin konnte bei den KO-Tieren aber keine vergleichbar hohen Herzfrequenzen wie bei
den Kontrollen erzielt werden. Mit den getesteten Pharmaka Zatebradin, CCPA und
Carbachol kann die Herzfrequenz gesenkt werden. Dabei fiel auf, dass die KO-Tiere
niedrigere Herzfrequenzen erreichten als die Kontrollen. Somit war zwar mit allen
verabreichten Pharmaka eine Modulation der Herzfrequenz bei den KO-Tieren erzielt
Ergebnisse
47
worden, allerdings konnten nicht dieselben absoluten Frequenzen wie bei den Kontrollen
erreicht werden. Um zu überprüfen, ob die Unterschiede darauf zurückzuführen sind, dass
die KO-Tiere von vornherein eine niedrigere Herzfrequenz haben, wurde ermittelt, ob der
Prozentsatz, mit dem die Herzfrequenz gesteigert oder gesenkt wurde, ebenfalls
unterschiedlich ist. Hierbei konnte kein signifikanter Unterschied bei der Berechnung der
relativen Veränderung festgestellt werden (Abb. 3.21B). Die Herzfrequenz-Steigerung oder Senkung hielt bei allen Pharmaka bei beiden Gruppen gleich lange an. Die Herzfrequenz der
KO-Tiere konnte auch mit höheren Dosierungen, wie z.B. 1 mg/kg Isoprenalin (Ctr: 689±29
bpm; RyR2KiT-KO: 461±18 bpm) nicht weiter gesteigert werden. Dies lässt darauf schließen,
dass zwar die Deletion von RyR2 im Reizleitungssystem zu einer Sinusbradykardie führt, die
Signalwege jedoch, die zu einer Modulation der Herzfrequenz benötigt werden, nicht
beeinträchtigt sind.
Abbildung. 3.21: Herzfrequenz-Modulation in RYR2KiT-KO-Mäusen.
(A) Mittlere Herzfrequenz im Vergleich Ctr (n=7) und RyR2KiT-KO (n=7). Die basale Herzfrequenz
und die Herzfrequenz nach der Gabe von 0,5 mg/kg Isoprenalin (Iso), 1 mg/kg Atropin (Atro), 2 mg/kg
Zatebradin (Zate), 0,3 mg/kg CCPA oder 0,5 mg/kg Carbachol (Carb) waren zwischen den beiden
Genotypen signifikant verändert. (B) Prozentuale Änderung der Herzfrequenz. Kein Unterschied
dagegen bestand bei der relativen Herzfrequenz-Änderung in Prozent. Dargestellt sind die Mittelwerte
± Standardabweichung der ersten 30 min nach Pharmaka-Injektion. n.s., nicht signifikant; *, p < 0,05.
3.2.5 Analyse der Herzfrequenzvariabilität
Die Injektion von Carbachol bewirkt, wie oben bereits beschrieben, dass die Herzfrequenz
gesenkt wird. Carbachol ist ein Strukturanalogon von Acetylcholin und ein Agonist am
muscarinischen M2-Rezeptor. Wenn M2-Rezeptoren mit Carbachol interagieren, wird der
cAMP-Spiegel in einer Myokardzelle gesenkt, was letztendlich in einer HerzfrequenzSenkung resultiert (Abb. 3.22A).
Ergebnisse
48
Abbildung 3.22: Änderung der Herzfrequenzvariabilität bei RyR2KiT-KO-Tieren.
(A) Mittlere Herzfrequenzen der KO-Tiere und Kontrollen vor und nach Carbachol-Injektion (0,5
mg/kg). Zum Zeitpunkt t=0 wurde Carbachol injiziert. Die Striche markieren den Zeitraum, der für die
Auswertung von (B) verwendet wurde. (B) Darstellung der Dauer der RR-Intervalle und
Standardabweichung der RR-Dauer (Kasten). RyR2KiT-KO-Mäuse haben eine geringere
Herzfrequenz-Variabilität als die Kontroll-Mäuse. **, p < 0,01.
Überraschenderweise fiel beim Betrachten der einzelnen EKG-Komplexe nach Injektion von
Carbachol auf, dass es Unterschiede in der Herzfrequenzvariabilität zwischen den Kontrollen
und den KO-Tieren gibt. Besonders auffällig waren diese Unterschiede etwa 15 min nach der
Injektion von Carbachol, wenn die Herzfrequenz wieder begann auf das Basalniveau
anzusteigen. Während die Kontrolltiere in dieser Phase Schwierigkeiten hatten streng
rhythmische Schläge zu generieren, wirkte der Herzschlag der KO-Mäuse gleichmäßiger.
Dies konnte anhand der Dauer des RR-Intervals bestimmt werden (Abb. 3.22B), die
Auswertung bei den KO-Tiere weniger „verrauscht“ wirkte. Die Herzfrequenzvariabilität kann
über die Standardabweichung der RR-Werte (RR-SD) definiert werden. Während die
Kontrolltiere einen mittleren RR-SD-Wert von 54 hatten, wiesen die KO-Tiere lediglich einen
mittleren RR-SD-Wert von 25 auf (Abb. 3.22 Kasten). Beispiele telemetrischer EKGAbleitungen nach Abklingen der Carbachol-Wirkung sind in Abbildung 3.23 dargestellt.
Während das EKG der KO-Maus gleichmäßig wirkt, ist das EKG der Kontrolle dysrhythmisch
mit teils kurzen Sinuspausen und schnelleren bzw. langsameren Herzfrequenzen.
Ergebnisse
49
Abbildung 3.23: Beispiele telemetrischer EKG-Ableitungen nach Abklingen der CarbacholWirkung.
(A) EKG-Spur einer Kontroll-Maus. (B) EKG-Spur einer RyR2KiT-KO-Maus mit weniger
Herzfrequenzvariabilität. Die EKG-Beispiele wurden ca. 15 Minuten nach der Carbachol-Injektion (0,5
mg/kg) aufgezeichnet.
3.2.6 Auswirkung der RyR2-Deletion auf den Blutdruck
Um festzustellen, ob die aufgetretene Bradykardie der RyR2KiT-KO-Tiere auch einen
Einfluss
auf
den
systolischen
Blutdruck
hat,
wurde
eine
nicht-invasive
Blutdruckbestimmungen mittels einer Blutdruckmanschette am Schwanz wacher Tiere
durchgeführt. Dabei konnten keine signifikanten Unterschiede bei den systolischen
Blutdruckwerten zwischen RyR2KiT-KO- und Kontrolltieren festgestellt werden (Abb. 3.24).
Abbildung 3.24: Basale Blutdruckmessungen an RyR2KiT-KO-Tieren.
Dargestellt sind systolische Blutdruckwerte am wachen Tier, gemessen
Blutdruckmanschette am Schwanz. n.s., nicht signifikant.
mittels
einer
3.2.7 Phosphorylierungstatus von Phospholamban
Viele
funktionell
wichtige
Proteine
im
Herzen
werden
durch
cAMP-vermittelte
Phosphorylierung reguliert. Eines dieser Proteine ist Phospholamban (PLB), wobei der Anteil
an phosphoryliertem PLB (P-PLB) als indirekter Nachweis für funktionelles cAMP verwendet
Ergebnisse
50
werden kann. Um zu überprüfen, ob die Deletion von RyR2 im Reizleitungssystem einen
Einfluss auf die Phosphorylierung von PLB hat, wurde eine Western-Blot Analyse
durchgeführt (Abb. 3.25). Während der Proteinlevel von PLB sowohl im Sinusknoten als
auch im Vorhof bei beiden Gruppen nicht unterschiedlich war, war die Proteinexpression des
P-PLB im Sinusknoten von KO-Mäusen im Vergleich zu den Kontrollen deutlich reduziert (n=
3 Westernblots). Bei den Vorhöfen beider Gruppen gab es dagegen keinen Unterschied.
Man kann daraus schließen, dass durch die Deletion von RyR2 die cAMP-abhängige
Phosphorylierung selektiv im Sinusknoten der KO-Tiere erniedrigt ist.
Abbildung 3.25: Western-Blot zur Ermittlung der Expression von Phospho-Phospholamban
und Phospholamban.
Die Expression von P-PLB ist im Sinusknoten der RyR2KiT-KO-Tiere erniedrigt. Die PLB Expression
ist in allen Proben gleich stark. Tubulin diente als Ladekontrolle. Detektion mittels ECL-System.
3.2.8 Ermittlung des basalen intrazellulären Ca2+-Gehalts in Sinusknotenzellen
Es konnte nachgewiesen werden, dass im Sinusknoten von Kaninchen die Adenylatcyclasen
AC5, AC6, AC1 und AC8 exprimiert werden. AC5 und AC6 werden durch Ca2+ gehemmt,
AC1 und AC8 dagegen sind direkt durch Ca2+ aktivierbar (Younes et al, 2008). Da die
intrazelluläre Ca2+-Konzentration einer Zelle hauptsächlich von der Ca2+-Freisetzung aus
dem SR durch den RyR abhängt, sollte somit RyR2 direkt den cAMP-Spiegel beeinflussen
können (Lakatta et al, 2010). Um zu untersuchen, ob die Deletion von RyR2
Auswirkungen auf den Ca2+-Gehalt der Sinusknotenzellen hat, wurden Sinusknotenzellen
isoliert, mit dem Fluoreszenzfarbstoff Fura-2AM beladen und der basale Ca2+-Gehalt
Ergebnisse
51
gemessen. In Abb. 3.26A ist ein Beispiel einer Messung einer KO- sowie einer KontrollSinusknotenzelle dargestellt, bei der ein deutlicher Unterschied im basalen Ca 2+-Gehalt zu
erkennen ist. Dieser Unterschied zwischen den beiden Gruppen war nicht in allen
Messungen eindeutig nachzuweisen. So ist z.B. in Abb. 3.26B ein Beispiel einer Ca 2+Messung dargestellt, bei der der basale Ca2+-Gehalt sowie die Frequenz der KO-Zelle höher
erscheint als bei der Kontroll-Sinusknotenzelle. Aufgrund der Trägheit des verwendeten
Detektionssystems konnte keine sichere Aussage über die Amplitude der Ca 2+-Transienten
gemacht werden.
Abbildung 3.26: Beispiel von zwei verschiedenen Ca2+-Messungen an Sinusknotenzellen.
(A) Die basale Ca2+-Konzentration der RyR2KiT-KO (rot) ist eindeutig niedriger als die der Kontrolle
(schwarz). (B) Kein eindeutiger Unterschied im basalen Ca2+-Gehalt der RyR2KiT-KO im Vergleich zu
der Kontrolle.
Allerdings war der Mittelwert der gemessenen basalen Ca2+-Konzentration der KOSinusknotenzellen (n=14) signifikant erniedrigt gegenüber den Kontroll-Zellen (n=12).
Dagegen konnte bei Ca2+-Messungen von Vorhofzellen (Ctr: n=16; KO: n=11) kein
Unterschied zwischen KO- und Kontrolltieren festgestellt werden (Abb. 3.27A). Ein weiterer
Unterschied konnte bei der Schlagfrequenz der einzelnen Sinusknotenzellen gemessen
werden und zwar war die Frequenz der KO-Zellen meist niedriger als die der Kontrollen. Um
auszuschließen, dass alleine eine niedrigere Schlagfrequenz für den niedrigeren basalen
Ca2+-Gehalt verantwortlich war, wurde die Schlagfrequenz der Kontroll-Sinusknotenzellen mit
Hilfe des If-Blockers Zatebradin (1 mM) in der externen Lösung gesenkt. So konnte mittels
Zatebradin die Schlagfrequenz der Kontroll-Sinusknotenzellen von 150 bpm auf 79 bpm
gesenkt werden und entsprach in etwa der Schlagfrequenz der KO-Sinusknotenzellen (82
bpm). Nach Senkung der Schlagfrequenz mit Zatebradin gab es zwar tatsächlich einen basal
niedrigeren Ca2+-Gehalt in den Kontroll-Zellen, jedoch war der Unterschied nicht signifikant
(Abb. 3.27B). Diese Ergebnisse geben einen ersten Hinweis darauf, dass die KO-
Ergebnisse
52
Sinusknotenzellen auch unabhängig von ihrer Schlagfrequenz einen tendenziell niedrigeren
Ca2+-Gehalt als die Kontroll-Sinusknotenzellen hatten.
Abbildung 3.27: Mittelwerte der basalen Ca2+-Konzentration von Sinusknoten- und
Vorhofzellen.
(A) Basale Ca2+-Konzentration der Sinusknoten- und Vorhofzellen von RyR2KiT-KO-Mäusen und
Kontrollen. (B) Kontroll-Sinusknoten-Zellen (n=12) ohne Zugabe von Zatebradin und KontrollSinusknoten-Zellen (n=8) nach Zugabe von 1 mM Zatebradin in die externe Lösung. Dargestellt sind
die Mittelwerte ± Standardfehler. n.s., nicht signifikant; **, p<0,01.
3.3
RyR2-Rekombination ohne Induktion
3.3.1 RyR2-Rekombination ohne Induktion in der RyR2MerCreMer-Mauslinie
Die Verwendung des Cre/loxP-Systems zur Steuerung der Rekombination ist nicht nur von
der Gewebespezifität, sondern zusätzlich von der Stringenz der Kontrollierbarkeit der
Rekombinaseaktivität abhängig. Es besteht die Gefahr, dass es auch ohne eine direkte
Aktivierung der Cre-Rekombinase durch Tamoxifen möglicherweise zu einer unkontrollierten
Rekombination kommt. Tatsächlich entwickelten die homozygoten RyR2MerCreMer-Tiere
(RyR2L2/L2,MerCreMer) auch ohne Injektion von Tamoxifen eine Kardiomyopathie und
starben im Alter von etwa drei Monaten. Dabei zeigten die Herzen die gleichen Anzeichen für
Fibrose und atriale Dilatation wie die KO-Herzen, denen Tamoxifen injiziert wurde.
Um die Rekombination auf genomischer Ebene zu untersuchen, wurde DNA aus
unterschiedlichen Kompartimenten des Herzens isoliert und mit Hilfe einer PCR amplifiziert.
Als Kontrolle diente DNA aus Muskel- und Lebergewebe. Dabei konnten in einer Reaktion
RyR2L1-, RyR2L2- und Wildtyp-Allele amplifiziert werden (Abb. 3.28). Mit L2 wird das Allel mit
Ergebnisse
53
dem „gefloxten" RyR2-Exon bezeichnet. L1 dagegen steht für das deletierte Allel mit einer
verbliebenen
RyR2
L2/L2
loxP-Stelle.
Die
DNA-Untersuchungen
zeigten,
dass
sowohl
bei
,MerCreMer-Tieren (Abb. 3.28B), als auch bei den heterozygoten Kontrollen,
RyR2L2/+,MerCreMer (Abb. 3.28A), eine geringe Rekombination im rechten und linken
Ventrikel detektiert werden konnte, ohne dass vorher Tamoxifen gespritzt wurde. Nach einer
einmaligen Injektion und verstärkt nach mehrmaligem Injizieren von Tamoxifen, konnten
dann im ganzen Herzen Banden für die erfolgreiche Deletion (L1) nachgewiesen werden. In
der Leber und im Muskelgewebe dagegen konnte, wie zu erwarten, nur Banden für das
gefloxte RyR2-Gen (L2) amplifiziert werden. Dadurch konnte gezeigt werden, dass auch vor
der Behandlung mit Tamoxifen bereits eine geringe Deletion im Ventrikel stattgefunden
hatte, d.h. eine Aktivität der Cre-Rekombinase ohne Tamoxifen-vermittelte Induktion
stattgefunden hatte.
Abbildung 3.28: PCR mit genomischer DNA aus RyR2MerCreMer-KO-Herzen.
(A) PCR mit DNA aus Herzgewebe einer RyR2L2/+,MerCreMer-Maus (B) PCR mit DNA aus Gewebe
einer RyR2L2/L2,MerCreMer-Maus. Es wurden die Allele RyR2L1 (220 bp), RyR2L2 (340 bp) und
RyR2WT (300 bp) nachgewiesen. Somit fand auch ohne Induktion durch Tamoxifen eine
Rekombination statt.
Ergebnisse
54
3.3.2 RyR2-Rekombination ohne Induktion in der RyR2KiT-Mauslinie
Wie bereits in Abschnitt 3.2.3 erwähnt wurde bei EKG-Messungen der RyR2KiT-Linie bereits
vor der Behandlung mit Tamoxifen eine EKG-Dauermessung durchgeführt. Dabei fiel auf,
dass die basale Herzfrequenz der homozygoten RyR2KiT-Tiere (RyR2L2/L2,KiT) bereits vor
der gezielten Deletion von RyR2 im Reizleitungssystem etwas erniedrigt war im Vergleich zu
den Kontrollen (Abb. 3.29). Demgegenüber war die basale Herzfrequenz der Kontrolltiere
(RyR2L2/+,KiT) nach Tamoxifen-Gabe im Vergleich zu den Messungen vor der TamoxifenBehandlung nicht wesentlich verändert. Ein Grund dafür könnte sein, dass wie bereits für die
RyR2MerCreMer-Mauslinie gezeigt, vor der Tamoxifen-Behandlung eine Rekombination des
gefloxten RyR2-Locus stattgefunden hatte. Es muss jedoch klar festgehalten werden, dass
die Herzfrequenz der RyR2KiT-KO-Tiere nach Injektion von Tamoxifen deutlich weiter
erniedrigt.
Abbildung 3.29: Telemetrische EKG-Ableitungen an wachen RyR2KiT-Mäusen.
Dargestellt ist die Herzfrequenz der RyR2L2/L2,KiT-Tiere (n=7) und Kontrollen (n=7) vor und nach
Tamoxifen-Behandlung, gemessen während einer EKG-Dauermessung über sieben Tage. Auch ohne
Tamoxifen-Injektion (rosa) ist die Herzfrequenz der RyR2L2/L2,KiT-Tiere niedriger, als die der
Kontrollen (schwarz ohne Tamoxifen, grau mit Tamoxifen). Zur besseren Darstellung wurden die
Daten durch Mitteln von 50 benachbarten Punkten geglättet. Tam, Tamoxifen.
Um nachzuprüfen, ob die erniedrigte Herzfrequenz tatsächlich, wie vermutet, durch eine
Rekombination ausgelöst wurde, wurde DNA aus Sinusknoten-Gewebe von RyR2L2/L2,KiTTieren ohne Tamoxifen-Injektion isoliert und eine PCR durchgeführt (Abb. 3.30A). Es konnte
in allen drei isolierten Sinusknotenproben neben der L2-Bande auch eine schwache L1-
Ergebnisse
55
Bande nachgewiesen werden. Somit fand tatsächlich auch ohne Tamoxifen eine
Rekombination im Sinusknoten statt. Um die Rekombination genauer zu untersuchen,
wurde, wie für die RyR2MerCreMer-Mauslinie, DNA zu unterschiedlichen Zeitpunkten
während dem Zeitraum der Tamoxifen-Behandlung bzw. sechs Wochen nach Beginn der
Tamoxifen-Injektion, isoliert und mit Hilfe einer PCR amplifiziert. Die DNA-Untersuchungen
zeigten,
dass
bei
RyR2L2/L2,KiT-Tieren
nach
einmaligem
Spritzen
eine
deutliche
Rekombination im Sinusknoten zu erkennen ist. Zudem konnte eine Woche nach Beginn der
Tamoxifen-Behandlung sowie sechs Wochen nach der Behandlung neben dem Sinusknoten
auch im rechten Vorhof eine sehr schwache L1-Bande nachgewiesen werden (Abb. 3.30B).
Somit könnte sich der Knockout nicht wie beabsichtigt nur auf das Reizleitungssystem,
sondern in einem geringen Ausmaß auch auf den rechten Vorhof erstrecken. Andererseits ist
nicht auszuschließen, dass bei der Isolation des rechten Vorhofs zusätzlich auch
Sinusknotenzellen mit isoliert wurden.
Abbildung 3.30: PCR mit genomischer DNA aus Herzgewebe von RyR2L2/L2,KiT-Mäusen.
(A) PCR mit DNA aus Sinusknoten-Gewebe von drei verschiedenen RyR2L2/L2,KiT-Mäusen. (B) PCR
mit DNA aus Herzgewebe einer RyR2L2/L2,KiT-Maus. Es wurde DNA aus den angegebenen Geweben
isoliert und mit einer PCR die Allele RyR2L1 (220 bp) und RyR2L2 (340 bp) nachgewiesen. Es fand
auch ohne Tamoxifen eine geringe Rekombination im Sinusknoten statt.
Ergebnisse
56
3.3.3 RyR2-Rekombination ohne Induktion in der ubiquitär aktiven Mauslinie
RyR2CAGG-Cre
Um zu überprüfen, ob die Rekombination auf ein ungewöhnlich leicht rekombinierbares
gefloxtes RyR2-Allel zurückzuführen ist, wurde die gefloxte RyR2-Mauslinie mit einer dritten
Cre-Linie, der CAGGCre-ERTM-Linie verpaart. Das CAGG-Cre (Hayashi und McMahon,
2002) ist ubiquitär aktiv und kann ebenfalls durch Tamoxifen erst im adulten Tier aktiviert
werden.
Unerwarteterweise
Nachkommen
gezüchtet
konnten
werden.
jedoch
Dagegen
keine
konnten
homozygoten
bei
der
RyR2L2/L2,CAGG-
Genotypisierung
der
Nachkommen RyR2L1/+,CAGG-Tiere, bei denen also bereits ein Allel von RyR2 deletiert war,
nachgewiesen
werden.
Daraus
lässt
sich
schließen,
dass
bereits
während
der
Embryonalentwicklung, ohne Induktion durch Tamoxifen, eine so starke Rekombination des
RyR2-Gens stattgefunden hatte, dass RyR2 deletiert wurde und zur embryonalen Letalität
geführt hat.
Zur genauen Untersuchung wurde eine DNA-Analyse der Herzen der RyR2L1/+,CAGG-Mäuse
durchgeführt. Im Herzgewebe konnten wie erwartet L1-Banden, jedoch keine Banden für L2
nachgewiesen werden. Somit konnte bei allen drei untersuchten Cre-Linien (MerCreMer,
HCN4KiT-Cre und CAGG-Cre) unerwarteterweise eine Rekombination des RyR2-Locus
auch ohne Tamoxifen-Behandlung nachgewiesen werden.
Abbildung 3.31: PCR mit DNA aus Ventrikelgewebe zweier RyR2L1/+,CAGG-Mäuse.
Es konnten in beiden Mäusen Banden für wt und RyR2L1 nachgewiesen werden, nicht jedoch für das
gefloxte RyR2L2.
3.4
Analyse der RyR3-Expression im Herzen
Neben dem RyR2 wird im Sinusknoten und in den Vorhöfen auch der RyR3 exprimiert. Bis
jetzt konnte dies jedoch nur auf RNA-Ebene (Tellez et al, 2006) nachgewiesen werden. Wie
in Abschnitt 3.13 konnten diese Ergebnisse auch in der vorliegenden Arbeit bei RNA-
Ergebnisse
57
Analysen bestätigt werden. Um zu überprüfen, welche Rolle der RyR3 im Herzen spielt,
sollte einerseits seine Expression genauer untersucht und andererseits eine RyR3-KO-Maus
analysiert werden.
3.4.1 Nachweis der RyR3-Proteinexpression im Herzen
Da Untersuchungen auf Transkriptebene nur bedingt Rückschlüsse auf das Proteinniveau
geben, wurde die Expression von RyR3 im Herzen auch auf Proteinebene analysiert. Dazu
wurden Proteinextrakte aus verschiedenen Kompartimenten des Herzens hergestellt und
eine Western-Blot Analyse durchgeführt. Dabei konnte gezeigt werden, dass tatsächlich
neben RyR2- auch RyR3-Protein im Herzen der Mäuse exprimiert wird. Im Gegensatz zu
RyR2, der im ganzen Herzen exprimiert wird, konnte RyR3 jedoch selektiv im Sinusknoten
und in den Vorhöfen detektiert werden. Lebergewebe diente als Negativkontrolle, in der
weder RyR2 noch RyR3 exprimiert werden (Abb. 3.32).
Abbildung 3.32: RyR3-Proteinexpression im Herzen.
Nachweis von RyR3-Protein (565 kDA) im SAN und in den Vorhöfen. Im Ventrikel konnte RyR3 nicht
detektiert werden. r und l bezeichnen den rechten bzw. linken Vorhof oder Ventrikel.
3.4.2 Nachweis der RyR3-Expression in isolierten Sinusknotenzellen
In isoliertem Sinusknoten-Gewebe können sich neben Sinusknotenzellen auch noch andere
Zellarten wie Vorhofmyozyten oder Bindegewebszellen befinden. Um zu untersuchen, ob
RyR3 tatsächlich in einzelnen Sinusknotenzellen exprimiert wird, wurde das Verfahren der
Einzelzell-RT-PCR
durchgeführt.
Dazu
wurden
einzelne
Sinusknotenzellen
isoliert,
eingesammelt und eine RT-PCR durchgeführt. Dabei dienten Primer, die den Sinusknoten
spezifischen-Ionenkanal HCN4 erkennen, als Marker für Sinusknotenzellen. Anhand der RTPCR konnte gezeigt werden, dass einzelne Sinusknotenzellen tastsächlich neben dem
Sinusknotenmarker HCN4 auch RyR3 exprimieren (Abb. 3.33).
Ergebnisse
58
Abbildung 3.33: RyR3-mRNA Expression in isolierten Sinusknotenzellen.
Abgebildet sind die RT-PCR-Ansätze von zwei isolierten Sinusknotenzellen mit spezifischen Primern
für RyR3 (Mf/Mr) und HCN4 (rtE/rtF). RyR3 wird in Sinuskontenzellen exprimiert.
3.5
EKG-Untersuchungen an RyR3KO-Mäusen
Im Gegensatz zum RyR2-total-Knockout sind RyR3KO-Mäuse lebensfähig und zeigen keine
veränderte Muskelfunktion (Takeshima et al, 1996; Bertocchini et al, 1997). Da gezeigt
werden konnte, dass RyR3 im Sinusknoten und Vorhof exprimiert wird (s. Punkt 3.4), wurde
nun untersucht, ob die Deletion von RyR3 einen Einfluss auf die Herzfunktion hat. Dazu
wurden mittels telemetrischer EKG-Ableitung die Herzfrequenz und die Aktivität von globalen
RyR3KO-Mäusen (Bertocchini et al, 1997) im Vergleich zu Wildtyp-Mäusen untersucht.
3.5.1 Analyse der Herzfrequenz und der Aktivität der RyR3KO-Mäuse
Das EKG der RyR3KO-Mäuse und der Wildtyp-Tiere wurde eine Woche lang kontinuierlich
aufgezeichnet. Anschließend wurde die Applikation verschiedener Pharmaka durchgeführt.
Es konnte kein Unterschied in der Herzfrequenz oder der Aktivität der RyR3KO-Tiere im
Vergleich mit den Kontrollen festgestellt werden (Abb. 3.34). Die basale Herzfrequenz lag bei
Wildtyp-Mäusen bei 567±58 bpm und bei RyR3KO-Mäusen bei 537±56 bpm. Außerdem
zeigten die RyR3KO-Mäuse keine Veränderungen im Tag-Nacht-Rhythmus.
Ergebnisse
59
Abbildung 3.34: Herzfrequenz und Aktivität der RyR3KO- und Wildtyp-Mäuse.
Kein Unterschied in der mittleren Herzfrequenz und der Aktivität der RyR3KO-Mäuse (rot) zu den
Kontrollen (schwarz).
Des Weiteren wurden EKG-Parameter ausgewertet (Tab. 3). Sowohl die P-Dauer als auch
die PQ-, QRS- und QT- und TP-Intervalle wurden ermittelt. Das Herzfrequenz-korrigierte
QTc-Intervall wurde berechnet. Auch hier wurden keine signifikanten Unterschiede
festgestellt. Daraus lässt sich schließen, dass RyR3 keinen Einfluss auf die HerzfrequenzRegulation oder Reizweiterleitung hat.
P-Dauer
PQ
QRS
QT
TP
WT (n=4)
11,4±2,5
24,7±1,9
6,6±0,3
41,1±5,1
27,6±5,3
RyR3KO (n=6)
11,8±1,1
27,7±1,0
7,5±0,7
37,8±3,7
31,8±6,4
Tabelle 2: EKG-Parameter von RyR3KO- und Wildtyp-Mäusen.
Die Werte sind als Mittelwerte ± Standardabweichung in ms angegeben. P-Dauer, PQ, QRS und QT
bezeichnen die dazu gehörigen EKG-Intervalle.
3.5.2 Untersuchung der Herzfrequenz-Modulation in RyR3KO-Mäusen
Die Herzfrequenz-Steigerung wurde als erstes mit dem β-Agonisten Isoprenalin untersucht
(Abb. 3.35). Es konnten sowohl die Wildtyp-Mäuse als auch die RyR3KO-Tiere die
Ergebnisse
60
Herzfrequenz auf ungefähr 700 bpm steigern. Folglich war die Herzfrequenz-Steigerung
durch den β-Agonisten in diesen Tieren nicht beeinflusst. Die Herzfrequenz-Senkung wird
am Beispiel von Carbachol gezeigt. Es trat kein signifikanter Unterschied in der
Herzfrequenz-Senkung im Vergleich zwischen RyR3KO-Tieren (182,8±27,2 bpm) und
Wildtyp-Mäusen (174,2±19,3 bpm) auf.
Abbildung 3.35: Herzfrequenz-Modulation in den RyR3KO-Tieren.
(A) Herzfrequenz-Steigerung mittels Isoprenalin (0,5 mg/kg) (B) Herzfrequenzsenkung mit Carbachol
(0,5 mg/kg). Isoprenalin und Carbachol wurden jeweils zum Zeitpunkt t=0 injiziert. RyR3KO-Mäuse
(rot, n=6) konnten ebenso wie die Wildtyp-Tiere (schwarz, n=4) ihre Herzfrequenz nach IsoprenalinInjektion steigern bzw. nach Carbachol-Injektion senken.
Neben Isoprenalin und Carbachol wurde zusätzlich auch die Wirkung der Pharmaka CCPA
und Atropin getestet. Es konnten jedoch auch bei diesen Substanzen kein Unterschied
zwischen den RyR3KO-Mäusen und den Wildtyp-Tieren gemessen werden. Durch den A1Adenosin Rezeptor Agonisten CCPA (0,3 mg/kg) wurde in beiden Gruppen eine Senkung
der Herzfrequenz auf circa 140 bpm erreicht, durch den Acetylcholin-Receptor Antagonist
Atropin (1 mg/kg) ließ sich die Herzfrequenz jeweils auf ca. 710 bpm steigern (Abb. 3.36). Es
waren somit keine signifikanten Unterschiede zwischen den Mauslinien vorhanden.
Ergebnisse
61
Abbildung 3.36: Herzfrequenz-Modulation durch verschiedene Pharmaka in RyR3KO-Tieren.
Mittlere Herzfrequenz im Vergleich zwischen Wildtyp (schwarz, n=4) und RyR3KO-Tieren (rot, n=6).
Die basale Herzfrequenz und die Herzfrequenz nach der Gabe von 0,5 mg/kg Isoprenalin (Iso), 1
mg/kg Atropin (Atro), 2 mg/kg Zatebradin (Zate), 0,3 mg/kg CCPA oder 0,5 mg/kg Carbachol (Carb),
waren zwischen den beiden Genotypen nicht signifikant verändert. Dargestellt sind die Mittelwerte ±
Standardabweichung der ersten 30 min nach der Pharmaka-Injektion. n.s., nicht signifikant.
3.5.3 Analyse der Herzfrequenzvariabilität
Als nächstes wurde untersucht, ob es bei den RyR3KO-Mäusen ähnlich wie bei den
RyR2KiT-KO-Tieren zu Unterschieden in der Herzfrequenzvariabilität kommt. Hierzu wurden
die EKG-Ableitungen nach der Injektion von Carbachol, wenn die Herzfrequenz wieder
begann auf die Basalwerte anzusteigen, untersucht. Die Dauer des RR-Intervale wurde
bestimmt und die Herzfrequenzvariabilität als Standardabweichung der RR-Werte (RR-SD)
dargestellt. Es konnte kein Unterschied in der Herzfrequenzvariabilität zwischen den
RyR3KO-Tieren und den Wildtyp-Mäusen nachgewiesen werden. Beide Gruppen hatten
Schwierigkeiten
in
dieser
Phase
streng
rhythmische
Herzschläge
zu
generieren
(Abb. 3.37).
Somit konnte gezeigt werden, dass RyR3 alleine keinen Einfluss auf die Herzfrequenz oder
Rhythmogenese hat. Weitere Experimente sind nötig um die genaue Rolle von RyR3 im
Herzen bestimm bestimmen zu können.
Ergebnisse
62
Abbildung 3.37: Darstellung der Herzfrequenzvariabilität.
(A) Dauer der RR-Intervalle nach Abklingen der Carbachol-Wirkung. (B) Standardabweichung der RRDauer. Bei RyR3KO-Mäusen war keine veränderte Herzfrequenzvariabilität nachzuweisen. n.s., nicht
signifikant.
Diskussion
4.
63
Diskussion
Der Ryanodinrezeptor RyR2 ist ein intrazellulärer Ca2+-Kanal, der die Ca2+-Freisetzung aus
dem SR steuert und eine große Rolle bei der Kontraktion des Herzens spielt (Bers, 2002).
Da die globale RyR2-Deletion in Mäusen embryonal letal ist (Takeshima et al, 1998), konnte
bis jetzt die genaue Funktion von RyR2 im Herzen anhand eines Mausmodells nicht
untersucht werden. Neben seiner Rolle bei der Kontraktion wird darüber diskutiert, ob RyR2
auch eine wichtige Funktion bei der Generierung des Schrittmacherpotentials im
Sinusknoten hat (Maltsev et al, 2006; Lakatta et al, 2010). Daher war es das Ziel dieser
Arbeit, die Funktion von RyR2 sowohl im ganzen Herzen als auch selektiv nur im
Erregungsbildungs-
und
leitungssystem
mit
Hilfe
zweier
RyR2-KO-Modelle
zu
charakterisieren. Dazu wurden zwei konditionelle Mauslinien verwendet, bei denen der
Knockout im adulten Tier durch Tamoxifen induzierbar war. Mit Hilfe dieser beiden
Mauslinien konnte die RyR2-Deletion sowohl zeitlich als auch gewebespezifisch kontrolliert
werden. Zusätzlich sollte die Expression einer weiteren Ryanodinrezeptor-Isoform RyR3 im
Herzen auf Protein-Ebene analysiert und seine Funktion mittels EKG-Telemetrie untersucht
werden.
4.1
Charakterisierung der RyR2MerCreMer-KO-Mäuse
Die erfolgreiche Deletion in diesem Mausmordell konnte dadurch gezeigt werden, dass
sowohl die mRNA- als auch die Protein-Expression von RyR2 in den Ventrikeln der KO-Tiere
stark erniedrigt war. Allerdings war RyR2-mRNA und RyR2-Protein in den Vorhöfen noch
nachweisbar. Dies kann dadurch erklärt werden, dass die MerCreMer-Recombinase in den
Vorhöfen
in
geringer
Konzentration
und/oder
als
Mosaik
exprimiert
ist.
mRNA-
Untersuchungen der beiden Isoformen RyR1 und RyR3 in RyR2MerCreMer-KO-Mäusen
zeigten keine kompensatorische Hochregulierung der beiden Isoformen nach Deletion von
RyR2. Da es sich bei der durchgeführten RT-PCR jedoch um eine semiquantitative Methode
handelte, konnte die Expression der einzelnen Isoformen nicht genau quantifiziert werden.
Dies könnte mit Hilfe einer quantitativen Real-Time-RT-PCR durchgeführt werden.
Ventrikuläre RyR2-Deletion führt zu Herzinsuffizienz
Die globale Deletion von RyR2 ist vermutlich embryonal letal aufgrund der wichtigen Rolle
der intrazellulären Ca2+-Homöostase für die Kontraktion des Herzens (Takeshima et al,
Diskussion
64
1998). Auch die in dieser Arbeit durchgeführte konditionelle Deletion von RyR2 im Ventrikel
führte zum Tod der KO-Mäuse. Überraschend war, dass bereits innerhalb von zwei Wochen
nach Beginn der Tamoxifen-Injektion eine so starke Beeinträchtigung der Herzfunktion bei
den RyR2MerCreMer-KO-Tieren vorlag, dass die Tiere starben. Die KO-Tiere zeigten
Zeichen einer Herzinsuffizienz mit leicht vergrößerten Ventrikeln und massiv dilatierten und
mit Blut und Thromben gefüllten Vorhöfen. Sowohl das Herzgewicht als auch das
Herz/Körpergewichtverhältnis der KO-Tiere waren signifikant erhöht. Der Grund dafür war
vor allem der sehr schwere linke Vorhof. Durch die Deletion ist die Ca 2+-Homöostase
beeinträchtigt, was in einer Störung des Kontraktionsvermögens resultiert. Anhand der
Sirius-Red-Färbung konnte gezeigt werden, dass durch die Deletion von RyR2 im Herzen
der KO-Mäuse eine Fibrosierung im Myokard entstanden war. Das Vorhandensein einer
Fibrose ist ein deutlicher Hinweis darauf, dass im Herzen Umbauprozesse ablaufen. Dabei
werden die Proteine der extrazellulären Matrix, deren Hauptbestandteil Kollagene darstellen,
im Herzen stark überexprimiert (Burlew und Weber, 2002). Es kommt dadurch zu einer
vermehrten Versteifung und auch zu einer Massenzunahme des Ventrikels. Dies bedingt
eine unzureichende Füllung des Herzens während der Diastole (= diastolische Dysfunktion)
und eine verminderte Auswurfleistung (= systolische Dysfunktion) (Janicki and Brower,
2002). Durch den Rückstau kommt es zur Dilatation der Vorhöfe und zur Bildung von
Thromben, was ausgeprägt in RyR2MerCreMer-KO-Mäusen zu beobachten war. Außerdem
waren Unterschiede auf zellulärer Ebene zu erkennen. So konnte bei der Lektin-Färbung und
der Untersuchung isolierter Kardiomyozyten gezeigt werden, dass die Zellen der
RyR2MerCreMer-KO-Tiere vergrößert und deformiert waren. Dies ist ein weiteres Anzeichen
für die beobachtete Kardiomyopathie der Mutanten. Aufgrund der höheren Belastung der
Kardiomyozyten während der Kardiomyopthie kann es zu einer vermehrten Apoptose der
Zellen kommen. Durch die Apoptose wiederum könnte die Reizleitung im Herz gestört
werden, wodurch die funktionellen Eigenschaften gestört sind (Duszanska et al, 2008).
Ebenfalls führt die Beschädigung der Kardiomyozyten zu einem Verlust an gap junctions,
was in einer systolischen Dysfunktion resultiert. Hinzu kommt die Tatsache, dass sich durch
die Fibrose der elektrische Widerstand erhöht, so dass die elektrophysiologische
Kommunikation der Kardiomyozyten untereinander gestört wird (Lee et al, 1998; Bradford et
al, 2007). Die morphologischen Veränderungen lassen somit auf eine Störung in der
elektromechanischen Kopplung nach Verlust von RyR2 schließen.
Diskussion
65
Therapeutische Beeinflussung der Umbauprozesse im Myokard
Aufgrund der schnellen Entwicklung einer Kardiomyopathie stellt die RyR2MerCreMer-KOMauslinie ein geeignetes Modell dar, Pharmaka zu untersuchen, die sich positiv auf die
aufgetretenen Umbauprozesse im Myokard auswirken könnten (Jones et al, 2004;
Hoshikawa et al, 2011). Dazu wurde in unserer Arbeitsgruppe bereits in ersten Versuchen
RyR2MerCreMerL2/L2-Tieren ab dem Alter von vier Wochen der ACE-Hemmer Captopril (0,25
mg/ml) zusammen mit dem Betablocker Metoprolol (0,5 mg/ml) oral im Trinkwasser
verabreicht. Im Alter von zwei Monaten wurde mit der Tamoxifen-Behandlung begonnen und
das Überleben der KO-Tiere dokumentiert. Es konnte jedoch bisher kein Unterschied bei der
Überlebensrate der RyR2MerCreMer-KO-Tiere, die mit den Pharmaka behandelt wurden, im
Vergleich zu KO-Tieren, die Captopril und Metoprolol nicht erhalten hatten, nachgewiesen
werden. Ein Grund könnte darin liegen, dass die Umbauprozesse, welche durch das Fehlen
von RyR2 aufgetretenen sind, zu schnell abliefen, so dass die KO-Tiere bereits kurze Zeit
nach der Tamoxifen-Behandlung starben. Außerdem fanden, wie in Abschnitt 3.3
beschrieben, auch ohne Tamoxifen-Injektion Rekombinationsereignisse statt. Dadurch
könnte die Herzfunktion auch schon vor dem Verabreichen der Pharmaka stark
beeinträchtigt gewesen sein. Dagegen konnten mit Candesartan, einem AT1-RezeptorAntagonisten, bereits erste Unterschiede in der Überlebensdauer der KO-Tiere festgestellt
werden (R. Hummel, unveröffentlichte Daten). Dabei wurden RyR2L2L2,MerCreMer-Tiere
ohne Injektion von Tamoxifen verwendet. Die Tiere entwickelten auch ohne Tamoxifen eine
Herzinsuffizienz,
im
Gegensatz
zu
den
behandelten
Kardiomyopathie jedoch deutlich langsamer. Den RyR2
L2/L2
Tieren
entwickelt
sich
die
,MerCreMer-Tieren wurde dazu
ab einem Alter von 6-8 Wochen täglich 2,5 mg/kg Candesartan oral verabreicht. Es zeigte
sich, dass durch die Gabe von Candesartan die Überlebensdauer der Tiere um 17 Tage
verlängert werden konnte. In weiteren Versuchen wird sich zeigen, wie ausgeprägt die
Umbauprozesse im Myokard der Mutanten durch die Pharmaka-Wirkung beeinflusst werden.
Beeinträchtigung der Herzfunktion
Da vermutet wird, dass RyR2 auch wichtig bei der Generierung des Schrittmacherpotentials
ist, wurde versucht, auch diese Rolle mit Hilfe der RyR2MerCreMer-KO-Tiere zu
untersuchen. Dazu wurden EKG-Analysen an RyR2MerCreMer-KO-Mäusen durchgeführt.
Dabei zeigten sich bereits wenige Tage nach Beginn der Tamoxifen-Injektion Unterschiede
in den EKG-Ableitungen der KO-Tiere im Vergleich zu den Kontrollen. Die KO-Mäuse
entwickelten
eine
Bradykardie,
wobei
die
Herzfrequenz
immer
weiter
absank.
Untersuchungen der einzelnen EKG-Abschnitte zeigten, dass neben der RR-Zeit vor allem
Diskussion
66
das TP-Intervall stark verlängert und die Morphologie der T-Welle verändert war. Das TPIntervall spiegelt den Zeitraum vom Ende eines EKG-Komplexes bis zum Beginn des
folgenden EKG-Abschnitts wider. Die Verlängerung der TP-Zeit könnte durch eine
fehlgesteuerte Aktionspotential-Generierung im Sinusknoten erklärt werden. Aufgrund der
Morphologie-Änderung der T-Welle scheint auch die Erregungsrückbildung, welche durch die
T-Welle angezeigt wird, beeinträchtigt. Auffällig war auch, dass besonders häufig negative PWellen auftraten. Die Vorhöfe werden in diesem Fall nicht vom Sinusknoten aus
depolarisiert, sondern retrograd über den AV-Knoten. Dies deutet ebenfalls auf eine
Dysfunktion des Sinusknotens hin. Neben der immer langsamer werdenden Herzfrequenz
war bei den KO-Tieren bereits kurze Zeit nach der Tamoxifen-Injektion keine circadiane
Rhythmik mehr zu erkennen. Dies lässt darauf schließen, dass bei den KO-Tieren keine
Modulation der Herzfrequenz mehr möglich ist. Die Veränderungen im EKG lassen somit auf
eine Störung der Rhythmogenese nach Verlust von RyR2 schließen. Jedoch ist nicht
auszuschließen, dass die aufgetretene Störung in der Rhythmogenese auch ein sekundärer
Effekt der Herzinsuffizienz ist.
4.2
Charakterisierung der RyR2KiT-KO-Mäuse
Der Mechanismus, der der spontanen Aktivität der Sinusknotenzellen zugrunde liegt, beruht
auf einem Zusammenspiel von Ionenkanälen, intrazellulärer Ca 2+-Freisetzung und
Ionentransportern. Die Rolle von RyR2 wird dabei in der Literatur kontrovers diskutiert
(Maltsev und Lakatta, 2008; Mangoni und Nargeot, 2008; Lakatta und DiFrancesco, 2009).
Es wird jedoch vermutet, dass die intrazelluläre Ca2+-Freisetzung über den RyR2 eine
wichtige Rolle bei der Generierung des Schrittmacherpotentials spielt (Vinogradova et al,
2006). Da nicht genau geklärt werden konnte, ob die Störung in der Rhythmogenese bei der
RyR2MerCreMer-KO-Mauslinie ein sekundärer Effekt der Herzinsuffizienz ist oder RyR2
tatsächlich auch eine große Rolle bei der Generierung des Schrittmacherpotentials spielt,
wurde in dieser Arbeit neben den RyR2MerCreMer-KO-Mäusen, auch die RyR2KiTMauslinie untersucht. Bei diesen Mäusen wird RyR2 nach Injektion von Tamoxifen spezifisch
nur in Zellen des Reizbildungs- und leitungssystems ausgeschaltet. Im Gegensatz zu den
RyR2MerCreMer-KO-Mäusen waren die RyR2KiT-KO-Tiere lebensfähig und zeigten keine
offensichtlichen phänotypischen Auffälligkeiten. Es konnten ebenfalls keine Anzeichen für
Veränderungen in der Morphologie der Herzen oder des Sinusknotens zwischen den beiden
Gruppen bei histologischen Färbungen (HE- und Sirius-Red-Färbung) festgestellt werden.
Die erfolgreiche Deletion von RyR2 konnte anhand einer Western-Blot Analyse gezeigt
werden, wobei das RyR2-Protein wie erwartet lediglich im Sinusknoten der KO-Mäuse
Diskussion
67
deletiert war, dagegen im Sinusknoten der Kontrollen sowie in den Vorhöfen beider Gruppen
weiterhin exprimiert wurde. Dagegen wurde bei RT-PCR-Untersuchungen weiterhin RyR2RNA im Sinusknoten der RyR2KiT-KO-Tiere nachgewiesen. Dies könnte damit erklärt
werden, dass in isoliertem Sinusknotengewebe immer noch verhältnismäßig viele
Vorhofmyozyten zu finden sind, in denen RyR2-mRNA weiterhin exprimiert wird, da in diesen
Zellen keine KiT-Cre vermittelte Rekombination stattfindet. Zudem ist die Methode der RTPCR sehr sensitiv, so dass bereits geringste Mengen an mRNA detektiert werden können.
Wie oben dargestellt ist auf der Proteinebene aber kein RyR2 mehr nachweisbar. RNAUntersuchungen der Isoformen RyR1 und RyR3 zeigten keine Unterschiede zwischen den
Kontrollen und den KO-Tieren. Es gab somit keine kompensatorische Hochregulation dieser
Isoformen in den KO-Tieren.
RyR2-Deletion im Sinusknoten führt zu Bradykardie
Mittels EKG-Telemetrie konnte gezeigt werden, dass die Deletion von RyR2 im Sinus- (und
AV-) Knoten zu einer deutlichen Bradykardie führte. Dieses Ergebnis ist mit den
Untersuchungen von Li et al, (1997) in Einklang zu bringen, die zeigen konnten, dass bei
Zugabe von Ryanodin, mit dem man RyR2 blockieren kann, die Schlagfrequenz von
kultivierten Kaninchen-Sinusknotenzellen erniedrigt wird. Die Ursache für die Bradykardie
könnte möglicherweise in einer Verzögerung der Impulsleitung liegen. Die in dieser Arbeit
durchgeführten EKG-Messungen zeigten tatsächlich eine verlängerte PQ-Zeit bei den
RyR2KiT-KO-Mäusen. Die PQ-Zeit ist das Intervall vom Beginn der Vorhoferregung bis zum
Beginn der Kammererregung, sie gibt Auskunft über die sogenannte Überleitungszeit. Es
zeigte sich jedoch, dass die Bradykardie hauptsächlich durch eine Verlängerung der TPDauer zustande kam. Es war also nicht nur die Erregungsüberleitung von den Vorhöfen auf
die Ventrikel, sondern insbesondere die Zeit zwischen dem Ende eines EKG-Komplexes bis
zum Beginn der nächsten Erregung (TP-Zeit) verlangsamt. Dies lässt darauf schließen, dass
die Funktion des Sinusknotens gestört ist. So kann es z.B. sein, dass das Zusammenspiel
der einzelnen Sinusknotenzellen aufgrund der Deletion nicht mehr richtig funktioniert und es
somit längert dauert, bis ein adäquates, koordiniertes Aktionspotential generiert wird. Ein
weiterer Grund für die verlängerte TP-Zeit könnte sein, dass zwar ein Signal im Sinusknoten
generiert wird, das Signal jedoch nicht aus dem Sinusknoten-Bereich weitergeleitet wird.
Obwohl die KO-Mäuse eine Bradykardie aufwiesen, blieb der Tag-Nacht-Rhythmus weiterhin
erhalten. Dies ist ein Anzeichen dafür, dass die Möglichkeit einer Modulation der
Herzfrequenz nicht verloren gegangen war. Somit konnte eindeutig gezeigt werden, dass der
RyR2 eine wichtige Rolle bei der Generierung des Schrittmacherpotentials spielt.
Diskussion
68
Herzfrequenz-Modulation
Die Herzfrequenz kann mit Hilfe verschiedener Neurotransmitter und Pharmaka moduliert
werden. So kann z.B. durch den β-Adrenorezeptor-Agonisten Isoprenalin oder den
muscarinischen Acetylcholin-Rezeptor-Antagonisten Atropin die Herzfrequenz gesteigert
werden. Eine Herzfrequenz-Modulation war in den RyR2KiT-KO-Mäusen jedoch nur
eingeschränkt möglich. Zwar ließ sich die Herzfrequenz der KO-Tiere genauso wie die der
Kontrollen durch Isoprenalin oder Atropin steigern, es konnten jedoch nicht die gleichen
maximalen Frequenzen erreicht werden. Zudem konnte die Herzfrequenz durch höhere
Pharmaka-Konzentrationen nicht weiter gesteigert werden. Dies stimmt nur zum Teil mit den
Studien von Vinogradova et al (2002) überein. Diese zeigten zwar ebenfalls, dass der RyR2
eine wichtige Rolle bei der Modulation des Herzrhythmus spielt, allerdings beschrieben sie,
dass die Ca2+-Freisetzung aus dem SR über den RyR2 hauptsächlich für den positiv
chronotrophen Effekt des β-adrenergen Signalwegs verantwortlich sei. Dazu schalteten sie
den RyR mit Hilfe von Ryanodin (3 µmol/L) während β-adrenerger Stimulation funktionell
aus, so dass kein Ca2+ mehr aus dem SR freigesetzt wurde. Dagegen konnte in der
vorliegenden Arbeit gezeigt werden, dass eine Steigerung der Herzfrequenz durch
Isoprenalin nach Deletion von RyR2 immer noch möglich war. Ein ähnliches Ergebnis konnte
auch mit Pharmaka erzielt werden, die die Herzfrequenz senken. In diesem Fall, erreichten
die KO-Tiere niedrigere Herzfrequenzen als die Kontrollen. Jedoch war aufgrund der
Bradykardie die Herzfrequenz der KO-Tiere bereits vor der Pharmaka-Applikation im
Vergleich zu den Kontrollen erniedrigt. Um diesen Effekt zu berücksichtigen, wurde
berechnet, um welchen Prozentsatz sich die Herzfrequenz durch die Pharmaka-Injektion
verändert hatte. Dabei konnte gezeigt werden, dass der relative Anstieg oder Abfall der
Herzfrequenzen zwischen den Kontrollen und den KO-Mäusen nach Injektion der
verschiedenen Pharmaka nicht unterschiedlich war. Somit sind die beobachteten
Unterschiede in den Herzfrequenzen auf die Bradykardie der KO-Mäuse zurückzuführen.
Dies spricht stark dafür, dass die Herzfrequenz-Stimulation nicht alleine von RyR2 abhängt,
sondern, dass dabei auch andere Mechanismen oder Ionenkanäle eine Rolle spielen. So
könnten z.B. die HCN-Kanäle, die T- und L-Typ Ca2+-Kanäle, der NCX1 oder sogar RyR3 der
ebenfalls im Sinusknoten exprimiert wird, wichtig für die Herzfrequenz-Regulierung sein
(Mangoni und Nargeot, 2008). RyR2 dagegen scheint eher für die Generierung der basalen
Herzfrequenz als für deren Modulation verantwortlich zu sein.
Verringerte Herzfrequenzvariabilität bei RyR2KiT-KO-Mäusen
Diskussion
69
Die Herzfrequenz passt sich beständig momentanen Erfordernissen an. So hat z.B.
körperliche Beanspruchung in der Regel eine Erhöhung der Herzfrequenz zur Folge, die bei
Entlastung und Entspannung normalerweise wieder sinkt. Dabei zeigt sich eine höhere
Anpassungsfähigkeit an Belastungen in einer größeren Variabilität der Herzfrequenz.
Überraschenderweise wiesen die RyR2KiT-KO-Mäuse eine geringere Herzfrequenzvariabilität auf als die Kontrollen. Dies zeigte sich besonders deutlich, wenn die Herzfrequenz
nach Abklingen der Wirkung von Carbachol wieder begann auf das Basalniveau
anzusteigen. Während die Herzschläge der Kontroll-Tiere in dieser Phase ungleichmäßig
erschienen, war die Herzfrequenz der KO-Mäuse rhythmischer. Im Gegensatz zu den
Ergebnissen dieser Arbeit werden Mutationen im RyR2-Gen oft mit Arrhythmien, wie z.B. der
catecholaminergen polymorphen ventrikulären Tachykardie (CPVT), in Verbindung gebracht
(Priori et al, 2001). Der Unterschied könnte daran liegen, dass in der vorliegenden Arbeit
eine Deletion von RyR2 gezielt im Reizleitungssystem stattfand, während bei den anderen
Studien das RyR2-Gen im ganzen Herzen mutiert vorliegt. Außerdem konnte bei Studien von
Watanabe et al (2009) gezeigt werden, dass die pharmakologische Hemmung von RyR2 bei
Patienten, die an CPVT erkrankt waren, einen antiarrhythmischen Effekt hat. Dies könnte
ebenfalls darauf hindeuten, dass eine Deletion von RyR2 eine antiarrhythmische Wirkung
hat. Eine erhöhte Herzfrequenzvariabilität spiegelt ein funktionierendes autonomes
Nervensystem wider (Gehrmann et al, 2000). Eine niedrigere Herzfrequenzvariabilität wie bei
den RyR2KiT-KO-Tieren dagegen wird oft mit Krankheiten wie Herzinsuffizienz in
Verbindung gebracht (Rich et al, 1988; Binkley et al, 1991). Die Höhe der Ruheherzfrequenz
scheint jedoch ein entscheidender Faktor im Hinblick auf die Lebenserwartung zu sein, so
dass möglicherweise eine anhaltend niedrigere Herzfrequenz eine erhöhte Lebenserwartung
zur Folge hätte. So wurde in größeren Studien gezeigt, dass eine erhöhte Herzfrequenz ein
Risikofaktor für die kardiovaskulär bedingte Mortalität ist (Kannel et al, 1987; Benetos et al,
1999). Mit Hilfe der RyR2KiT-KO-Mäuse könnte untersucht werden, ob tatsächlich ein
Zusammenhang
zwischen
einer
niedrigeren
Herzfrequenz
und
einer
erhöhten
Lebenserwartung besteht.
Beeinflussung des intrazellulären Ca2+-Gehalts und cAMP durch RyR2
Es wird vermutet, dass RyR2 durch die Kontrolle des intrazellulären Ca2+ einen Einfluss auf
den cAMP-Gehalt und damit auch auf die Schrittmacheraktivität im Sinusknoten hat.
Interessanterweise wurde bereits gezeigt, dass im Sinusknoten von Kaninchen mehr cAMP
gebildet wird als in Kardiomyozyten (Vinogradova et al, 2006). Dies wiederum hätte zur
Folge, dass im Sinusknoten durch den erhöhten cAMP-Gehalt essenzielle Regulatorproteine
Diskussion
70
stärker phosphoryliert werden könnten als im restlichen Herzen. Eines dieser Proteine ist
Phospholamban (PLB). Somit kann der Phosphorylierungslevel von PLB als indirekter
Nachweis für den funktionellen cAMP-Gehalt verwendet werden. In dieser Arbeit konnte
gezeigt werden, das P-PLB im Sinusknoten von RyR2KiT-KO-Tieren im Vergleich zu
Kontrollen deutlich reduziert war. Dies spricht dafür, dass der cAMP-Gehalt im Sinusknoten
der KO-Tiere ebenfalls reduziert ist. Der RyR2 scheint somit tatsächlich einen direkten
Einfluss auf den cAMP-Gehalt zu haben.
Zusätzlich konnten Younes et al (2008) zeigen, dass im Sinusknoten von Kaninchen, im
Gegensatz zum Ventrikel, neben den Adenylatcyclasen AC5 und AC6 auch AC1 und AC8
exprimiert werden. AC5 und AC6 werden durch Ca2+ gehemmt, AC1 und AC8 dagegen
direkt durch Ca2+ aktiviert. Um zu untersuchen, ob in den Sinusknotenzellen der KO-Tiere
der basale Ca2+-Gehalt verändert ist und somit einen Einfluss auf die Aktivität der
unterschiedlichen AC-Isoformen hat, wurden fluorometrische Ca2+-Messungen durchgeführt.
Es konnte gezeigt werden, dass in Sinusknoten-Zellen von RyR2KiT-KO-Mäusen der basale
Ca2+-Gehalt niedriger war als in den Kontrollzellen. Jedoch war der Unterschied nicht immer
eindeutig. So gab es z.B. auch Messungen, bei denen der basale Ca2+-Gehalt sowie die
Frequenz der KO-Zellen höher erschien, als bei den Kontroll-Sinusknotenzellen. Der
niedrigere intrazellulärer Ca2+-Spiegel in den KO-Mäusen könnte allerdings einen Hinweis
darauf geben, dass die AC1 und AC8 weniger aktiviert werden, was somit zu einem
geringeren cAMP-Gehalt in den KO-Zellen führen könnte. Der erniedrigte cAMP-Gehalt
könnte schließlich zu einer geringeren Aktivierung von If und dadurch zu einer
Verlangsamung der diastolischen Depolarisationsrate des SAN führen. Dies wiederum
könnte eine Erklärung für die Bradykardie der RyR2KiT-KO-Mäuse darstellen. Allerdings
konnten bis jetzt nur in Sinusknotenzellen von Kaninchen die AC1 und AC8 nachgewiesen
werden, somit ist noch nicht geklärt, ob im Sinusknoten der Maus die beiden Isoformen
ebenfalls exprimiert werden. Außerdem werden im Sinusknoten der Maus auch die
Isoformen AC5 und AC6 exprimiert, die ebenfalls durch Ca2+ beeinflusst werden können und
so ebenfalls den cAMP-Spiegel steuern können.
4.3
Rekombination des gefloxten RyR2-Locus ohne Induktion
Erstaunlicherweise starben RyR2L2/L2,MerCreMer-Tiere auch ohne Injektion von Tamoxifen
im Alter von etwa drei Monaten. Dabei zeigten sie die gleichen Anzeichen für eine
Kardiomyopathie und Herzinsuffizienz wie die KO-Tiere, denen Tamoxifen injiziert wurde.
Auch die RyR2L2/L2,KiT-Tiere wiesen vor Tamoxifen bereits eine leichte Bradykardie auf. Ein
Diskussion
71
Grund dafür könnte sein, dass bereits ohne Tamoxifen eine Rekombination des gefloxten
RyR2-Allels stattgefunden hatte. Tatsächlich konnte dies auf DNA-Ebene sowohl für die
RyR2MerCreMer- als auch für die RyR2KiT-Mauslinie bestätigt werden. Zusätzlich wurde ein
induzierbarer ubiquitärer RyR2-KO mit Hilfe der CAGG-Cre-Mauslinie erzeugt. Auch in
dieser Line fand eine Rekombination ohne Induktion mit Tamoxifen statt. Im Gegensatz zu
den beiden anderen Mauslinien war die Rekombination jedoch bereits im Embryonalstadium
so ausgeprägt, dass keine homozygoten RyR2L2/L2,CAGG-Nachkommen gezüchtet werden
konnten. Dies deutet in allen drei RyR2-KO-Linien darauf hin, dass die verschiedenen CreRekombinasen “leaky” sind, also eine Rekombinaseaktivität auch ohne Tamoxifenvermittelte Induktion stattgefunden hatte. Eine mögliche Erklärung für diese unerwartete
Beobachtung
verschiedener
bietet
Gene.
die
Der
Tatsache
unterschiedlicher
RyR2-Locus
weist
Chromatinstrukturen
vermutlich
eine
leicht
innerhalb
zugängliche
Chromatinstruktur auf, wodurch bereits durch eine sehr geringe Cre-Aktivität eine
Rekombination hervorgerufen werden kann. Dass die Rekombination ohne Tamoxifen auf
den außergewöhnlich leicht zugänglichen RyR2-Locus zurückzuführen ist, konnte auch
dadurch bestätigt werden, dass bei weiteren Versuchen in unserer Arbeitsgruppe, z.B. bei
der Deletion des Ca2+-Kanals Cav1.2 mit Hilfe der MerCreMer-Mauslinie, keine
Rekombination ohne Tamoxifen beobachtet wurde. Auch bei der Verwendung der KiT-CreMaus zur Rekombination verschiedener anderer Loci konnte dieses Phänomen nicht
beobachtet werden (Hoesl et al, 2008; Hermann et al, 2011). Da die RyR2 L2/L2,MerCreMerTiere auch vor einer Behandlung mit Tamoxifen eine Kardiomyopathie entwickelten, war es
schwierig die zeitliche Entwicklung der Umbauprozesse im Herzen nach Tamoxifen genau zu
bestimmen. Außerdem ist es sehr wahrscheinlich, dass auch bei der Verpaarung der
RyR2L2/L2-Tiere mit anderen Cre-Linien zur Untersuchung von RyR2 z.B. im glatten Muskel
oder im Gehirn schon vor einer Tamoxifen-Injektion eine Rekombinaton stattfinden wird.
Diese Ergebnisse weisen darauf hin, dass generell bei der Verwendung konditioneller
Mausmutanten genau überprüft werden muss, wann und inwieweit eine Rekombination
stattgefunden hat, um Ergebnisse richtig interpretieren zu können.
4.4
Die Rolle von RyR3 im Herzen
Bereits in früheren Studien konnte auf RNA-Ebene nachgewiesen werden, dass neben RyR2
auch RyR3 im Sinusknoten und in den Vorhöfen exprimiert wird (Mangoni und Nargeot,
2008; Tellez et al, 2006). Es konnte zudem gezeigt werden, dass der mRNA-Gehalt an RyR3
im zentralen Sinusknotengewebe sogar höher ist als der mRNA-Gehalt von RyR2. In der
vorliegenden Arbeit konnte RyR3 zum ersten Mal auch auf Protein-Ebene im Sinusknoten-
Diskussion
72
und Vorhof-Gewebe, nicht jedoch im Ventrikel, nachgewiesen werden. Zusätzlich konnte
RyR3 auch in einzelnen isolierten Sinusknotenzellen detektiert werden. In isoliertem
Sinusknotengewebe können sich immer noch Vorhofmyozyten befinden, daher war es
wichtig zu zeigen, dass RyR3 auch in einzelnen Sinusknotenzellen vorkommt.
Welche Rolle RyR3 in der Funktion des Herzens hat, wurde in ersten Versuchen anhand von
EKG-Messungen von RyR3KO-Tieren untersucht. Es konnten sowohl in der Herzfrequenz
als auch in der Aktivität der RyR3KO-Mäuse kein Unterschied zu den Kontrollen festgestellt
werden. Auch nach Applikation verschiedener Pharmaka zeigten sich keine Unterschiede in
der Herzfrequenz-Modulation. Im Gegensatz zu den RyR2KiT-KO-Tieren konnten auch keine
Unterschiede in der Herzfrequenzvariabilität detektiert werden. Diese Ergebnisse stimmen
zum Teil mit einem Bericht von Kihwan et al (1997) überein, der ebenfalls keine
Unterschiede in der Herzfrequenz von RyR3KO-Tieren mit Wildtyp-Mäusen zeigen konnten.
Dagegen wurde im Gegensatz zu dieser Arbeit eine verringerte Herzfrequenzvariabilität bei
RyR3KO-Tieren im Vergleich zu den Kontrollen festgestellt. Der Unterschied könnte darin
liegen, dass in der vorliegenden Arbeit eine RyR3KO-Mauslinie verwendet wurde bei der das
Exon 6 und somit das Carboxy-Ende des Proteins deletiert wurde (Bertocchini et al, 1997).
Im Gegensatz dazu wurde bei der RyR3KO-Mauslinie, die bei der Arbeit von Kihwan et al
(1997) verwendet wurde, das Exon 1 deletiert (Takeshima et al, 1996). Daraus lässt sich
schließen, dass RyR3 alleine keinen Einfluss auf die Herzfrequenz-Regulation oder
Reizweiterleitung hat. Seine Rolle im Herzen bleibt jedoch weiterhin unklar. Es könnte sein,
dass RyR3 und RyR2 sich gegenseitig beeinflussen und somit die Analyse einer Mauslinie,
bei der sowohl der RyR2 als auch der RyR3 gleichzeitig deletiert sind, weitere Aufschlüsse
über die Funktion von RyR3 im Herzen liefern könnte.
Diskussion
4.5
73
Ausblick
Die RyR2MerCreMer-Mauslinie kann in Zukunft für die Untersuchung von Pharmaka
verwendet werden, die positiv auf die Umbauprozesse im Myokard wirken, wie z.B. ATIIAntagonisten oder ACE-Hemmer. Dabei kann die RyR2MerCreMer-Mauslinie (aufgrund der
nachgewiesenen Deletion von RyR2 auch ohne Tamoxifen) ein geeignetes Modell darstellen
diese Pharmaka in einer sich langsam entwickelnden Herzinsuffizienz zu untersuchen.
Um die Rolle von RyR2 im Reizleitungssystem genauer zu untersuchen, könnten zusätzlich
spontane Aktionspotentiale von einzelnen RyR2KiT-KO- und Kontroll-Sinusknotenzellen
aufgezeichnet und analysiert werden. Zusätzlich könnte versucht werden, den cAMP-Gehalt
im Sinusknoten der RyR2KiT-KO-Tiere genauer zu bestimmen.
Weitere Studien sind außerdem nötig, um für die Rolle von RyR3 während der autonomen
Herzaktion ein größeres Verständnis zu bekommen. Die funktionelle Analyse eines DoppelKnockouts, bei dem sowohl RyR3 als auch RyR2 im Reizleitungssystem deletiert ist, könnte
hierbei wichtige Hinweise liefern. Dazu sollten Doppel-KO-Mäuse auf funktioneller,
histologischer und molekularer Ebene charakterisiert werden.
Anhang
74
5.
Anhang
5.1
Verwendete Primer
Die Primer der folgenden Tabellen wurden von der Firma MWG Biotech bezogen. Die
Arbeitslösungen der Primer waren auf 10 pmol/µl verdünnt. „f“ steht für forward und „r“ für
reverse.
Primer für Genotypisierung:
Primerbezeichnung
Sequenzen
5´- GAC CCG AGT AGC AGC CGT TGCAG GGA GGA CTG
RyR 143
RyR 142
RyR JS4r
RyR3 M1f
RyR3 M2r
GCC ATA ACT AT - 3`
5´- CCG CAG CCG GTT GTC ACT CTCAC CCA AAA GGA
GGA CAG TAG AGT - 3´
5´- ATT GGG ACC ACG CCA GTG AACTG CCC TCA TCC
AGT CGC TAG AC - 3´
5´- CAC ATC CCA ATC TCC TTT ACT CC GTA CGC ATC
GTG AAC CTC ATT G - 3
5´- GCT TAT TCT GCC CTA ATG CCA C TTT CGG CAG TTA
AAG TTG ATG - 3´
RyR3 pGK_JS1
5´- CGT GCT ACT TCC ATT TGT CAC GTC - 3´
Cre 800
5´- GCT GCC ACG ACC AAG TGA CAG CAA TG - 3´
Cre 1200
5´- GTA GTT ATT CGG ATC ATC AGC TAC AC - 3´
Gabra1F
5´- AAC ACA CAC TGG AGG ACT GGC TAG G - 3´
Gabra1R
5´- CAA TGG TAG GCT CAC TCT GGG AGA TGA TA - 3´
Tabelle 3: Verwendete Primer für Genotypisierung.
Anhang
75
Primer für RT-PCR:
Primerbezeichnung
Sequenzen
RyR1 for
5´- TGA ATA CAA CGC CTG CTC TG - 3`
RyR1 rev
5´- ATG TGT GGG ACT TGG ACC AG - 3´
RyR2 G
5´- GCG AAG GCG AGG ATG AGA TC - 3´
RyR2 H
5´- CGT AGC AAT ATG GCG TGT CC - 3
RyR3 Mf
5´- CAA CAA CAA CCT GGG CAT TGA T - 3´
RyR3 Mr
5´- GAA TGA AGA CCT CGG CCA CCA - 3´
HCN4 rt E
5´- ACA AAG TTG GGA TCT GCG TT - 3´
HCN4 rt F
5´- GAC AGC GCA TCC ATG ACT AC - 3´
Tabelle 4: Verwendete Primer für RT-PCR.
5.2
Verwendete Antikörper
Antikörper gegen
Spezies
Bezeichnung/Verdünnung
Herkunft
RyR *
Maus
MA3-916 / 1:500
Thermo Scientific
α-Tubulin
Kaninchen
11H10 / 1:1000
PLB
Maus
MA3-922 / 1:200
Thermo Scientific
p-PLB
Kaninchen
07-052 / 1:200
Upstate
RyR3
Kaninchen
1:1000
Kaninchen-IgG
Meerrettichperoxidase
Ziege
goat anti-rabbit IgG-HRP/
1:50.000
New England
Biolabs
Giannini et al,
1995
Dianova
Anhang
76
Maus-IgG
Meerrettichperoxidase
Ziege
goat anti-mouse IgG-HRP/
1:50.000
Dianova
Tabelle 5: Verwendete Antikörper.
* Der RyR-Antikörper wird von Thermo Scientific so beschrieben, dass er RyR2 sowie
schwach RyR1 im Gewebe von Amphibien, Hunden, Hühnern, Fischen, Meerschweinchen
und Ratten erkennen soll. Somit sollte er im Herzen der Maus spezifisch RyR2 detektieren.
5.3
Verwendete transgene Mauslinien
Mauslinie
Promotor
Eigenschaften
Referenz
Takeshima et al, 1998
RyR2
L2/L2
RyR3
Das vierte Exon des
(erhalten von K. Chien,
RyR2-Gens ist von loxP-
Cardiovascular Research
Sequenzen flankiert
Center, Boston)
Das sechste Exon des
-/-
RyR3-Gens ist deletiert
Bertocchini et al, 1997
(erhalten von M.
Gollasch, MDC, Berlin)
Hoesl et al, 2008
HCN4KiT-Cre
HCN4
Exprimiert Cre-ERT2 im
(Generiert von AG
Reizleitungssystem
Ludwig)
Sohal et al, 2001
MerCreMer
α- MHC
Exprimiert MerCreMer im
ganzen Herzen
Enhancer und
Exprimiert Cre-ERT2
Huhn-Actin
ubiquitär
Promotor/Enhancer
Tabelle 6: Verwendete Mauslinien.
Cardiovascular Research
Center, Boston)
Hayashi und McMahon,
Cytomegalovirus
CAGG-Cre
(erhalten von K. Chien,
2002
(bezogen von
Charles River)
Anhang
5.4
77
Abkürzungsverzeichnis:
Abkürzung
Erklärung
°C
Grad Celsius
Abb.
Abbildung
AC
Adenylatcyclase
AP
Aktionspotential
AP I
Anodenpuffer 1
AP II
Anodenpuffer 2
APS
Ammoniumperoxidsulfat
ATP
Adenosintriphosphat
Atro
Atropin
AV-Knoten
Atrioventrikularknoten
BCA
Bicinchoninsäure
BDM
Diacetylmonoxim
bp
Basenpaar
bpm
beats per minute
BSA
Bovines Serum Albumin
cAMP
zyklisches Adenosin-3', 5'-Monophosphat
Carb
Carbachol
CCPA
2-Chloro-N6-Cyclo-pentyl-Adenosin
cDNA
Komplementäre Desoxyribonukleinsäure
Cre
Cre-Rekombinase
CreERT2
Tamoxifen-induzierbare Cre-Rekombinase
C-Terminus
Carboxy-Terminus
Ctr
Kontrolle
dATP
Desoxyadenosintriphosphat
dCTP
Desoxycytosintriphosphat
dest
destilliert
dGTP
Desoxyguanosintriphosphat
DMSO
Dimethylsulfoxid
DNA
Desoxyribonukleinsäure
DNAse
Desoxyribonuclease
dNTP
Desoxynukleosidtriphosphat
DTT
Dithiothreitol
dTTP
Desoxythymidintriphosphat
Anhang
78
ECL
enhanced chemiluminescence
EDTA
Natrium-Ethylendiamin-N,N,N´,N´-Tetraacetat
EKG
Elektrokardiogramm
T2
ER
Fura 2 AM
Modifizierte Ligandenbindungsdomäne
des Östrogenrezeptors
Acetoxymethylester des Fluoreszenzfarbstoffes
Fura 2
g
Gramm
GABRA
GABAA1-Rezeptor
GAPDH
Glycerinaldehyd-3-phosphat-Dehydrogenase
gefloxt
loxP flankiert
h
Stunde
HBR
Heart Bodyweight Ratio
HCN
Hyperpolarisations-aktivierter durch zyklische
Nukleotide modulierter Kationenkanal
HE
Hämatoxylin / Eosin
HRP
Meerrettichperoxidase
i.p.
Intraperitoneal
If
"Funny" Strom der HCN-Kanäle
IgG
Immunglobulin G
Iso
Isoprenalin
kb
Kilobasen
KB
Kraftbrühe
kDa
Kilodalton
kg
Kilogramm
KiT
Knock-in induzierbar durch Tamoxifen
KO
Knockout
KP
Kathodenpuffer
loxP
Locus of crossover (x) of Phage P
LSM
Laser Scan Mikroskopie
M
Mol
mA
Milliampere
Mer
mutierter Östrogenrezeptor
mg
Milligramm
MHC
myosin heavy chain
min
Minute
ml
Milliliter
Anhang
79
mm
Millimeter
mM
Millimol
mRNA
Messenger RNA
n.s.
Nicht signifikant
PAGE
Polyacrylamid-Gelelektrophorese
PBS
Phosphat-gepufferte Kochsalzlösung
PCR
Polymerasekettenreaktion
PFA
Paraformaldehyd
PLB
Phospholamban
P-PLB
Phospho-Phospholamban
PVDF
Polyvinylidendifluorid
RNA
Ribonukleinsäure
RNAse
Ribonuklease
rpm
Umdrehungen pro Minute
RT
Raumtemperatur
RT-PCR
Reverse Transkriptions-PCR
RyR
Ryanodinrezeptor
s
Sekunde
SAN
Sinusknoten
SD
Standardabweichung
SDS
Natriumdodecylsulfat
SERCA
sarcoendoplasmatische Retikulum-CalciumATPase
SERMs
Selective Etrogen Receptor Modulators
TAM
Tamoxifen
TBE
Tris-Borat-EDTA-Puffer
TBST
Tris-Borat-Puffer mit Tween
TE
Tris-EDTA
TEMED
N,N,N´,N´,Tetramethylethyldiamin
tg
Transgen
Tris
Tris-(hydroxymethyl)-methylamin
Tub
Tubulin
U
Einheit
ÜN
über Nacht
UV
Ultraviolett
Anhang
80
V
Volt / Ventrikel
WT
Wildtyp
Zate
Zatebradin
μg
Microgramm
μl
Microliter
μm
Micrometer
μM
Micromolar
μm2
Quadratmicrometer
Tabelle 7: Verwendete Abkürzungen.
Abbildungsverzeichnis
6.
81
Abbildungsverzeichnis
Einleitung:
Abbildung 1.1:
Schematische Darstellung der elektromechanischen Kopplung im Herzen.
Abbildung 1.2:
Schematische
Darstellung
beitragenden
Ionenströme
eines
Aktionspotentials
und
Ca2+-Freisetzungen
und
die
dazu
in
einer
Sinusknotenzelle.
Abbildung 1.3:
Schematische Darstellung der basalen Schrittmacherregulation.
Abbildung 1.4:
Schema des Cre/loxP-Rekombinationssystems.
Material und Methoden:
Abbildung 2.1:
Aufbau der Blotting Apparatur.
Abbildung 2.2:
Telemetrische EKG-Ableitung.
Abbildung 2.3:
Definition der EKG-Wellen und -Intervalle.
Abbildung 2.4:
Verpaarungsschema zur Generierung von konditionellen RyR2-KOMäusen.
Ergebnisse:
Abbildung 3.1:
Überlebensrate der RyR2MerCreMer-KO-Mäuse.
Abbildung 3.2:
RT-PCR
zum
Nachweis
der
RyR-Isoformen
im
Herzen
der
RyR2MerCreMer-KO-Mäuse.
Abbildung 3.3:
Expression von RyR2-Protein im Herzen der RyR2MerCreMer-KO-Mäuse.
Abbildung 3.4:
Repräsentative Aufnahmen der RyR2MerCreMer-KO-Herzen.
Abbildung 3.5:
Herz-Gewicht und HBR der RyR2MerCreMer-KO-Tiere.
Abbildung 3.6:
Telemetrische EKG-Ableitungen an wachen Tieren während der letzten
sieben Tage vor dem Tod der KO-Tiere.
Abbildung 3.7:
EKG-Parameter der RyR2MerCreMer-KO-Mäuse.
Abbildung 3.8:
Beispiele telemetrischer EKG-Ableitungen.
Abbildung 3.9:
Atriale
Thrombose
und
vermehrte
Fibrose
im
Ventrikel
der
RyRMerCreMer-KO-Mäuse.
Abbildung 3.10:
Analyse der isolierten Kardiomyozyten.
Abbildung 3.11:
Lektin–Färbung von Paraffinschnitten durch das ventrikuläre Myokard zur
Darstellung der Zellmembran.
Abbildung 3.12:
RT-PCR zum Nachweis der RyR-Isoformen im Sinusknotengewebe der
RyR2KiT-KO-Tiere.
Abbildungsverzeichnis
Abbildung 3.13:
82
RT-PCR zum Nachweis der RyR-Isoformen im Herzgewebe der RyR2KiTKO-Tiere.
Abbildung 3.14:
RyR2-Proteinexpression im Herzen der RyR2KiT-KO-Mäuse.
Abbildung 3.15:
Morphologie der RyR2KiT-KO-Herzen.
Abbildung 3.16:
Telemetrische EKG-Ableitungen an wachen RyR2KiT-KO- und Kontrolltieren.
Abbildung 3.17:
Mittlere Herzfrequenz und Herzfrequenzvariabilität der RYR2KiT-KOTiere.
Abbildung 3.18:
EKG-Parameter von RyR2KiT-KO- und Kontrolltieren.
Abbildung 3.19:
Beispiele telemetrischer EKG-Ableitungen.
Abbildung 3.20:
Herzfrequenz-Steigerung mittels Isoprenalin.
Abbildung 3.21:
Herzfrequenz-Modulation in RYR2KiT-KO-Mäusen.
Abbildung 3.22:
Änderung der Herzfrequenzvariabilität bei RyR2KiT-KO-Tieren.
Abbildung 3.23:
Beispiele telemetrischer EKG-Ableitungen nach Abklingen der CarbacholWirkung.
Abbildung 3.24:
Basale Blutdruckmessungen an RyR2KiT-KO-Tieren.
Abbildung 3.25:
Western-Blot zur Ermittlung der Expression von Phospho-Phospholamban
und Phospholamban.
Abbildung 3.26:
Beispiel von zwei verschiedenen Ca2+-Messungen an Sinusknotenzellen.
Abbildung 3.27:
Mittelwerte der basalen Ca2+-Konzentration von Sinusknoten- und
Vorhofzellen.
Abbildung 3.28:
PCR mit genomischer DNA aus RyR2MerCreMer-KO-Herzen.
Abbildung 3.29:
Telemetrische EKG-Ableitungen an wachen RyR2KiT-Mäusen.
Abbildung 3.30:
PCR mit genomischer DNA aus Herzgewebe von RyR2L2/L2,KiT-Mäusen.
Abbildung 3.31:
PCR mit DNA aus Ventrikelgewebe zweier RyR2L1/+,CAGG-Mäuse.
Abbildung 3.32:
RyR3-Proteinexpression im Herzen.
Abbildung 3.33:
RyR3-mRNA Expression in isolierten Sinisknotenzellen.
Abbildung 3.34:
Herzfrequenz und Aktivität der RyR3KO- und Wildtyp-Mäuse.
Abbildung 3.35:
Herzfrequenz-Modulation in den RYR3KO-Tieren.
Abbildung 3.36:
Herzfrequenz-Modulation durch verschiedene Pharmaka in RyR3KOTieren.
Abbildung 3.37:
Darstellung der Herzfrequenzvariabilität.
Tabellen:
Tabelle 1:
Biometrische Daten der Ventrikel und Vorhöfe.
Tabelle 2:
EKG-Parameter von RyR3KO- und Wildtyp-Mäusen.
Tabelle 3:
Verwendete Primer für Genotypisierung.
Tabelle 4:
Verwendete Primer für RT-PCR.
Abbildungsverzeichnis
Tabelle 5:
Verwendete Antikörper.
Tabelle 6:
Verwendete Mauslinien.
Tabelle 7:
Verwendete Abkürzungen.
83
Literaturverzeichnis
7.
84
Literaturverzeichnis
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Lebenslauf
91
9. Lebenslauf
Anita Milbradt geb. Kilian
Geburtsdatum, -ort
10. Januar 1981, Temeschburg
Nationalität
deutsch
Familienstand
verheiratet
Ausbildung
1987-1990
Grundschule Temeschburg, Rumänien
1990-1992
Grundschule Guldeinstraße, München
1992-2001
Wittelsbacher Gymnasium, München
Erhalt der Allgemeinen Hochschulreife
09/2001-09/2003
Friedrich-Alexander-Universität (FAU), Erlangen
Grundstudium (Biologie, Diplom)
10/2003-09/2006
Friedrich-Alexander-Universiät (FAU), Erlangen
Hauptstudium (Biologie, Diplom)
04/2006
Friedrich-Alexander-Universiät (FAU), Erlangen
Diplomprüfung
im
Nebenfächern
Hauptfach
Biotechnik,
Biochemie
und
Immunologie
den
und
Entwicklungsbiologie
08/2006-06/2007
Medizinische Klinik III, Erlangen
Abschluss des Studiums zur Diplom-Biologin mit Anfertigung
der Diplomarbeit „Die Rolle der p38MAPK-Isoformen in der
Osteoklastogenese“
Seit 11/2007
Institut für Pharmakologie und Toxikologie, Erlangen
Promotion mit dem Titel: “Konditionelle Gendeletion des
Ryanodinrezeptors RyR2 im Herzen der Maus“
Danksagung
92
Danksagung
Herrn Prof. Dr. Andreas Ludwig danke ich für sein großes Interesse an meiner Arbeit, seine
freundliche Unterstützung sowie seine hervorragende Betreuung.
Frau PD Dr. Juliane Stieber danke ich für ihre Geduld, die großartige Betreuung und, dass
sie stets ein offenes Ohr für alles (auch Privates) hatte. Vielen Dank für Alles, Juliane.
Herrn Prof. Dr. Brandstätter danke ich für seine Bereitschaft das Zweitgutachten zu erstellen.
Frau Dr. Mirjam Eberhardt danke ich herzlich für die Hilfe bei den Ca2+-Messungen.
Mein besonderer Dank gilt vor allem Susanne, Sabine, Claudia, Andrea und Hugo für all die
lustigen Stunden im und außerhalb des Labors.
Allen derzeitigen und ehemaligen Mitarbeitern der AG Ludwig danke ich für das angenehme
Arbeitsklima, für wissenschaftliche sowie auch für weniger wissenschaftliche Diskussionen
und für gesellige Aktivitäten abseits des Laboralltags.
Mein besonderer Dank gilt meiner Familie und meinen Freunden die immer zu mir gehalten
haben, danke für alles.
Jens, danke, dass du immer für mich da bist.