ZIP - FreiDok - Albert-Ludwigs

Aus der Medizinischen Universitätsklinik
Abteilung Innere Medizin I (Hämatologie und Onkologie)
der Albert-Ludwigs-Universität Freiburg i. Br.
Hemmung verschiedener intrazellulärer Signalwege in
Immunzellen zur Reduzierung der akuten Transplantat gegen
Wirt-Erkrankung
INAUGURAL DISSERTATION
Zur Erlangung der Doktorwürde
der Fakultät für Biologie
der Albert-Ludwigs-Universität
Freiburg im Breisgau
vorgelegt von
Anne-Kathrin Hechinger
Freiburg im Breisgau
Mai 2013
Dekan der Fakultät für Biologie:
Prof. Dr. Ad Aertsen
Promotionsvorsitzender:
Prof. Dr. Stefan Rotter
Betreuer der Arbeit:
Prof. Dr. Robert Zeiser
Betreuer vor der Fakultät:
Prof. Dr. Gunther Neuhaus
Gutachter/in
Referent: Prof. Dr. Gunther Neuhaus
Ko-Referent: Dr. Tilman Brummer
Drittprüfer: Prof. Dr. Robert Zeiser
Tag der mündlichen Prüfung
22.07.2013
Publikationen
Wesentliche Teile dieser Arbeit sind in der folgenden Publikation enthalten:
Hechinger, A.K#, Maas K#, Dürr C, Leonhardt F, Prinz G, Marks R, Gerlach U,
Hofmann M, Fisch P, Finke J, Pircher H, Zeiser R. Inhibition of protein geranylgeranylation and farnesylation protects against GvHD via effects on CD4 effector
T cells. Haematologica, 2012; 98(1):31-40
#
equal contribution
Weitere Publikationen:
Leonhardt F, Zirlik K, Buchner M, Prinz G, Hechinger AK, Gerlach UV, Fisch P,
Schmitt-Gräff A, Reichardt W, Zeiser R. Spleen tyrosine kinase (Syk) is a potent
target for GvHD prevention at different celluar levels. Leukemia, 2012; 26(7):161729
Leonhardt F, Grundmann S, Behe M, Bluhm F, Dumont RA, Braun F, Fani M,
Riesner K, Prinz G, Hechinger AK, Gerlach UV, Dierbach H, Penack O,
Schmmitt-Gräff A, Finke J, Weber WA, Zeiser R. Inflammatory neovascularization
during graft-versus-host disease is regulated by αv Integrin and miR-100. Blood in
press 2013
Inhaltsverzeichnis
1
Einleitung .............................................................................. 1
1.1 Das Immunsystem ........................................................................................ 1
1.1.1 Das angeborene Immunsystem ............................................................. 1
1.1.2 Das adaptive Immunsystem ................................................................... 2
1.2 Die gemeinsame gamma-Kette (γc) .............................................................. 6
1.2.1 Die γc-Zytokine ....................................................................................... 8
1.3 Transplantation hämatopoetischer Zellen ................................................... 11
1.4 GvHD .......................................................................................................... 13
1.4.1 Entstehung der aGvHD ........................................................................ 14
1.4.2 Prävention und Behandlung ................................................................. 17
1.5 Transplantat-gegen Leukämie/Lymphom (GvL)-Effekte ............................. 19
1.6 Kleine G-Proteine ....................................................................................... 20
1.7 Prenylierung von Proteinen......................................................................... 24
1.8 Der Mevalonatstoffwechselweg .................................................................. 26
1.9 Inhibitoren des Mevalonatstoffwechselweges ............................................. 28
1.9.1 Statine .................................................................................................. 28
1.9.2 Prenyltransferaseinhibitoren ................................................................. 30
2
Ziel der Arbeit...................................................................... 32
3
Material und Methoden ....................................................... 33
3.1 Materialien .................................................................................................. 33
3.1.1 Mäuse .................................................................................................. 33
3.1.2 Zellen ................................................................................................... 33
3.1.3 Laborgeräte .......................................................................................... 35
3.1.4 Viren ..................................................................................................... 35
3.1.5 Vektoren ............................................................................................... 34
3.1.6 Verbrauchsmaterialien ......................................................................... 35
3.1.7 Reagenzien .......................................................................................... 36
3.1.8 Reaktionssystemansätze ..................................................................... 39
3.1.9 Antikörper für Durchflusszytometrie ..................................................... 40
3.1.10 Antikörper für immunhistochemische Analysen .................................. 41
3.1.11 Antikörper für Westernblot .................................................................. 42
3.1.12 Neutralisierende Antikörper für in vivo Experimente........................... 42
3.1.13 Zellkulturmedien und Puffer ............................................................... 42
3.1.14 EDV-Programme ................................................................................ 45
3.2 Methoden: ................................................................................................... 46
3.2.1 Zellkultur und Zellzählung .................................................................... 46
3.2.2 Herstellung von Luziferase exprimierenden A20 Zellen ....................... 46
3.2.3 Erythrozytenlyse ................................................................................... 47
3.2.4 Herstellung von Zellsuspensionen aus Milz, Lymphknoten oder Thymus
............................................................................................................ 47
3.2.5 Isolation von T-Zellen aus der Milz und den Lymphknoten .................. 47
3.2.6 Herstellung von Inhibitor-Stock-Lösungen............................................ 48
3.2.7 Gewinnung des Knochenmarks ........................................................... 48
3.2.8 Restimulation von Splenozyten zur Färbung von intrazellulären
Zytokinen ............................................................................................. 49
3.2.9 Durchflusszytometrie ............................................................................ 50
3.2.10 Westernblot ........................................................................................ 51
3.2.11 Stimulation von T-Zellen mit Dynabeads® mouse T-activator
CD3/CD28 ........................................................................................... 51
3.2.12 In vitro Gemischte Lymphozyten-Reaktion (mixed lymphocyte reaction;
MLR).................................................................................................... 52
3.2.13 In vitro Proliferationstest ..................................................................... 52
3.2.14 In vitro Migrationstest ......................................................................... 53
3.2.15 Apoptosetest ...................................................................................... 53
3.2.16 AlloKMT und GvHD-Erkrankungsmodell ............................................ 54
3.2.17 Organentnahme und Herstellung von Gefrierschnitten zur
histopathologischen Analyse ............................................................... 54
3.2.18 Histopathologische Analyse von Darm und Leber .............................. 55
3.2.19 Immunhistochemische Färbung von Gefrier- und Paraffinschnitten ... 56
3.2.20 Histopathologische Analyse des Thymus ........................................... 57
3.2.21 Biolumineszenzmessung .................................................................... 57
3.2.22 A20-Leukämie/Lymphom-Modell (GvL-Effekt) ................................... 58
3.2.23 Messung der Zytokinkonzentration im Serum („Bead array“) ............. 59
3.2.24 Messung der Vß-Expression mittels Durchflusszytometrie ................ 59
3.2.25 Zytotoxizitätstest („Killing assay“) ....................................................... 59
3.2.26 Murines Zytomegalovirus (MCMV)-Modell ......................................... 60
3.2.27 Isolation der Lymphozyten aus menschlichem Blut ............................ 61
3.2.28 Statistik............................................................................................... 61
4
Ergebnisse .......................................................................... 63
4.1 Untersuchungen zur Rolle der Prenylierung in der GvHD........................... 63
4.1.1 Überleben im „major-mismatch"-Modell bei Hemmung der Prenylierung
............................................................................................................ 63
4.1.2 GvHD-Schweregrad und proinflammatorische Zytokine bei Behandlung
mit FTI und GGTI................................................................................. 64
4.1.3 Expansion von T-Zellen in vivo bei Hemmung der Geranylgeranylierung
............................................................................................................ 66
4.1.4 Einfluss der Hemmung der Prenylierung auf T-Zellen in vitro .............. 68
4.1.5 Auswirkungen der Behandlung mit FTI und GGTI auf den Thymus bei
GvHD ................................................................................................... 70
4.1.6 Einfluss der Hemmung der Prenylierung auf das T-Zell-Repertoire bei
GvHD ................................................................................................... 75
4.1.7 GvL-Effekte bei Behandlung mit FTI und GGTI .................................... 77
4.1.8 Auswirkungen reduzierter Prenylierung auf Immunantworten bei
Virusinfektion ....................................................................................... 81
4.1.9 Einfluss der Hemmung der Prenylierung auf CD8+ T-Zellen................. 85
4.1.10 Auswirkungen der Hemmung der Prenylierung auf DCs .................... 87
4.2 Untersuchungen zur Rolle der γc in der GvHD ............................................ 91
4.2.1 Einfluss der Hemmung der γc auf das Überleben und das Anwachsen
des Transplantats ................................................................................ 91
4.2.2 Proinflammatorische Zytokine bei GvHD nach Behandlung mit α-CD132
............................................................................................................ 92
4.2.3 Expansion von T-Zellen in vivo nach Hemmung der γc........................ 93
4.2.4 Einfluss der Hemmung der γc auf die Myeloperoxidase-Aktivität ......... 94
4.2.5 Lymphatische und myeloide Zellen bei GvHD und Behandlung mit αCD132 ................................................................................................. 95
4.2.6 Charakterisierung der CD4+ T-Zellen bei GvHD nach Hemmung der γc
............................................................................................................ 98
4.2.7 Charakterisierung der CD8+ T-Zellen bei GvHD und Behandlung mit αCD132 ............................................................................................... 101
4.2.8 Untersuchung zur Rolle des Perforin-Signalwegs in GvHD bei
Hemmung der γc ................................................................................ 105
5
Diskussion ........................................................................ 106
5.1 Einfluss der Hemmung der Prenylierung auf GvHD .................................. 106
5.1.1 Auswirkungen von FTI, GGTI und ZA auf die GvHD-Schwere und T-ZellSignalwege ........................................................................................ 107
5.1.2 Untersuchungen auf Vorgänge im Thymus bei GvHD und Behandlung
mit Inhibitoren .................................................................................... 110
5.1.3 Auswirkungen von FTI und GGTI auf GvL-Effekte im alloKMT-Modell112
5.1.4 Einfluss der Hemmung der Prenylierung auf Immunantworten bei
Virusinfektion ..................................................................................... 116
5.1.5 Einfluss von FTI und GGTI auf DCs ................................................... 117
5.2 Einfluss der Hemmung der γc auf GvHD ................................................... 120
5.2.1 Verbessertes Überleben bei gleichbleibender T-Zell-Proliferation – Rolle
der APCs und der myeloiden Zellen .................................................. 120
5.2.2 Verbessertes Überleben bei gleichbleibender T-Zellproliferation –
Funktion der CD4+ T-Zellen ............................................................... 122
5.2.3 Verbessertes Überleben bei gleichbleibender T-Zell-Proliferation –
Funktion der CD8+ T-Zellen ............................................................... 125
6
Zusammenfassung ........................................................... 129
7
Abkürzungsverzeichnis ................................................... 131
8
Literatur ............................................................................. 137
Einleitung
1 Einleitung
1.1 Das Immunsystem
1.1.1 Das angeborene Immunsystem
Ein Organismus ist täglich einer Vielzahl von Krankheitserregern ausgesetzt, die
durch das Immunsystem größtenteils erfolgreich bekämpft werden können. Die
größte Herausforderung ist hierbei die Erkennung entarteter körpereigener Zellen
sowie körperfremder Pathogene und deren Bekämpfung [1]. Die Zellen des Immunsystems entstehen aus dem Knochenmark (KM). An vorderster Front der Immunabwehr steht das angeborene Immunsystem. Dies ist, verglichen mit dem erworbenen (=adaptiven) Immunsystem, relativ unspezifisch, ermöglicht jedoch eine
sehr schnelle Reaktion auf Krankheitserreger. Ein Eindringen von Pathogenen
kann in vielen Fällen bereits durch physikalische Barrieren der Körperepithelien
wie z.B. die als „tight junctions“ bezeichnete Verbindungen der Epithelzellen und
Schleimbewegungen durch Zilien verhindert werden. Konnte ein Pathogen diese
überwinden, so können bestimmte Muster auf der Oberfläche der Krankheitserreger durch Mustererkennungsrezeptoren (pattern recognition receptors, PRRs) auf
Fresszellen (=Phagozyten) erkannt werden [2]. Des Weiteren kann durch das
Komplementsystem eine Reihe von Entzündungsreaktionen ausgelöst werden, die
zum einen zur Freisetzung von Zytokinen und Chemokinen und zum anderen zu
einer erhöhten Aufnahme der Pathogene durch Phagozyten führt [3]. Zytokine sind
Peptide, die zur Differenzierung und zum Wachstum von Zellen führen, Chemokine bilden innerhalb der Zytokine die Gruppe der chemotaktisch wirksamen Peptide
[4, 5]. Weitere biologisch aktive Moleküle des angeborenen Immunsystems sind
Defensine und Lipidmediatoren [6, 7]. Einige Zellen (Makrophagen, neutrophile
Granulozyten) reagieren auf Pathogene mit der Bildung reaktiver Sauerstoffradikale (reactive oxygen species, ROS), die antimikrobielle Wirkungen zeigen [8]. Natürliche Killerzellen (NK-Zellen) erkennen und eliminieren virusinfizierte oder entartete Zellen [9].
1
Einleitung
1.1.2 Das adaptive Immunsystem
Das hochspezifische adaptive Immunsystem wird typischerweise später als das
angeborene Immunsystem aktiviert, erlaubt jedoch ein langlebiges immunologisches Gedächtnis, was bei einer erneuten Infektion dazu führt, dass die immunologischen Vorgänge sehr viel schneller und effektiver ablaufen können [10]. Das
Bindeglied zwischen angeborenem und adaptivem Immunsystem sind die professionellen antigenpräsentierenden Zellen (APCs), zu denen dendritische Zellen
(DCs), Monozyten und Makrophagen, aber auch B-Lymphozyten gehören [11-13].
Sie präsentieren den Zellen des adaptiven Immunsystems Antigene, die durch das
angeborene Immunsystem nicht beseitigt werden konnten. Die wichtigsten Zellen
des adaptiven Immunsystems sind Lymphozyten, die in Antikörper produzierende
B-Lymphozyten (B-Zellen) und T-Lymphozyten (T-Zellen) eingeteilt werden können. Sie erkennen Pathogene durch Bindung der Antigene an spezifische Oberflächenrezeptoren. Die B-Zellen entstehen und reifen im KM, T-Zellen entstehen
ebenfalls im KM, reifen jedoch im Thymus. Durch zufällige Umordnung der rezeptorkodierenden Gene kommt es zu 1011 verschiedenen Rezeptorspezifitäten für
Antigene auf den Lymphozyten [14]. Hierbei entstehen auch viele Rezeptoren, die
spezifisch für körpereigene Proteine sind. Insbesondere T-Zellen können durch
diese Autoreaktivität großen Schaden anrichten, was eine Selektion der nicht
autoreaktiven T-Lymphozyten erfordert.
1.1.2.1 Reifung der T-Zellen im Thymus
Bei der Reifung der T-Zellen werden verschiedene Stadien an verschiedenen Stellen des Thymus durchlaufen. In jedem Entwicklungsstadium wird überprüft, ob der
Lymphozyt z.B. funktional ist oder eine Autoimmunität vorliegt. Nur wenn alle
überprüften Kriterien erfüllt sind, erhalten sie Signale um zu überleben und weiter
zu reifen. Hierzu ist die Interaktion der unreifen T-Zellen mit Zellen des Thymus
unerlässlich [15]. Die Vorläuferzellen (CD4-CD8-) wandern zunächst aus dem KM
ein und entwickeln sich im äußeren Kortex des Thymus zu CD4+CD8+-doppeltpositiven (DP) T-Lymphozyten. Bei der positiven Selektion im inneren Kortex erhalten zunächst diejenigen T-Zellen, die fähig sind, an Antigene zu binden und
Signale weiter zu leiten ein Überlebenssignal. Bei der negativen Selektion werden
dann alle T-Zellen in den Zelltod (Apoptose) getrieben, die eine Autoreaktivität
2
Einleitung
aufweisen. Durch Interaktion mit den medullären Thymusepithelzellen (mTEC)
wird die Entwicklung vervollständigt, die T-Zellen sind jetzt entweder CD4+ oder
CD8+ und können aus dem Thymus entlassen werden [15-19]. Hierbei handelt es
sich um etwa 1-3 % der zuvor eingewanderten Vorläuferzellen [20].
1.1.2.2 Präsentation von Antigenen
Während B-Zellen direkt an lösliche Antigene binden können, benötigen T-Zellen
eine Präsentation der Antigene auf Molekülen, die im Haupthistokompatibilitätskomplex (major histocompatibility complex, MHC) kodiert sind. Moleküle der MHCKlasse I bestehen aus einer in der Zellmembran verankerten schweren Kette mit
den Domänen α1, α2 und α3 und einer löslichen Untereinheit, dem β 2-Mikroglobulin. α1 und α2 bilden eine Grube für die Peptidbindung. Die Beladung dieser
Moleküle erfolgt im endoplasmatischen Retikulum (ER), somit werden auf MHCKlasse I-Molekülen zum einen zelleigene Peptide oder nach Virusinfektion Produkte der Viren präsentiert. MHC-Klasse I-Moleküle werden auf allen kernhaltigen
Zellen exprimiert [21]. Der MHC-Klasse II-Komplex besteht aus einer α- und einer
β-Untereinheit, die jeweils in zwei Domänen aufgeteilt sind. α2 und β2 sind jeweils
in der Membran verankert während α1 und β1 eine Grube zur Peptidbindung bilden. MHC-Klasse II-Moleküle werden hauptsächlich von professionellen APCs
exprimiert und präsentieren extrazelluläre Antigene [21].
Die MHC-Moleküle des Menschen werden mit humanen Leukozytenantigenen
HLA bezeichnet [22], die der Maus mit H-2 [23]. Innerhalb der Klasse I gibt es drei
Hauptgene, HLA-A, -B und -C beim Mensch und H2-K, -D und -L bei der Maus. In
der Klasse II werden die Gene mit HLA-DR, -DP und -DQ im Mensch und mit
H2-A und -E in der Maus bezeichnet [22, 23]. Eine T-Zelle kann nur aktiviert werden, wenn gleichzeitig das präsentierte Antigen erkannt wird und der Korezeptor
an MHC-Moleküle bindet. CD8 bindet hierbei an MHC-Klasse I- und CD4 an MHCKlasse II-Moleküle. Zur vollständigen Aktivierung von T-Zellen ist außerdem das
Vorhandensein kostimulatorischer Moleküle notwendig. Hierbei handelt es sich um
Mitglieder der B7-Superfamilie. CD80 und CD86 binden an CD28 auf der T-Zelle.
Der induzierbare T-Zellkostimulator ICOS (inducible T cell co stimulator) auf
T-Zellen bindet an ICOS-Ligand auf APCs.
3
Einleitung
1.1.2.3 Mechanismen zytotoxischer Zellen
Zu den zytotoxischen Zellen zählen neben den CD8 + T-Zellen auch die NK-Zellen,
die dem angeborenen Immunsystem zugeordnet werden. Die NK-Zellen exprimieren eine große Anzahl inhibitorischer und aktivierender Rezeptoren [24]. Das
Gleichgewicht der positiven und negativen Signale entscheidet darüber, ob die
Zielzelle eliminiert wird oder nicht. Die inhibierenden Rezeptoren binden an MHCKlasse I-Moleküle und identifizieren die Zelle somit als körpereigen [25]. Einige der
aktivierenden Rezeptoren binden an Zytokine und an bestimmte Virusantigene
[26] oder an durch Stress induzierte Moleküle [27]. Bei Aktivierung der NK-Zellen
kommt es nicht nur zu Lyse der Zielzellen durch Freisetzung zytolytischer Granula,
sondern auch zur Ausschüttung von Zytokinen wie Interferon (IFN)-γ, Tumornekrosefaktor (TNF)-α oder Interleukin (IL)-10, die zur Aktivierung von anderen Immunzellen führt.
CD8+ T-Zellen erkennen über den T-Zellrezeptor (TCR) und CD8 körperfremde
Antigene, die auf MHC-Klasse I-Molekülen präsentiert werden [27], woraufhin zytolytische Granula an die Zielzelle abgegeben werden [28]. Diese Granula enthalten Perforin und GranzymB, die direkt in die Zielzellen gelangen können und dort
Apoptose auslösen [29]. Bisher ist jedoch unbekannt, ob diese Moleküle über
durch Perforin gebildete Poren oder einen Rezeptor in die Zielzelle gelangen [30].
Die Apoptose infizierter oder entarteter Zielzellen wird zusätzlich über das
Fas/Fas-Ligand (FasL) -System [29] ausgelöst. Die zytotoxischen T-Zellen exprimieren den FasL, der an den Rezeptor Fas bindet, wodurch in der Zielzelle die
Apoptose ausgelöst wird. Des Weiteren werden durch CD8 + T-Zellen Zytokine wie
IFN-γ, TNF-α und Lymphotoxin sezerniert, die wiederum zur Aktivierung anderer
Immunzellen führen [31].
1.1.2.4 Helfer-T-Zellen
Peptide, die von professionellen APCs auf MHC-Klasse II-Molekülen präsentiert
werden, werden durch CD4+ T-Zellen erkannt. Dies führt zunächst zu einer Proliferation der T-Zellen, gefolgt von Differenzierung in verschiedene Helfer-T-Zelllinien.
Zum jetzigen Zeitpunkt sind vier verschiedene Linien bekannt und gut charakterisiert: Helfer-T-Zellen Typ1 (TH1), Helfer-T-Zellen Typ2 (TH2), Helfer-T-Zellen
Typ17 (TH17) und regulatorische T-Zellen (Treg). Jede Linie exprimiert spezifische
4
Einleitung
Transkriptionsfaktoren, was auch zur Sezernierung spezifischer Muster an Zytokinen führt [32]. In welche Art von Helfer-T-Zelle sich eine CD4+ T-Zelle differenziert,
hängt stark von den umgebenden Zytokinen ab, die von den Zellen selbst, von
APCs oder weiteren Zellen bei Infektion sezerniert werden [33]. Der Name HelferT-Zelle beschreibt, dass andere Zellen des adaptiven Immunsystems (CD8+ T-Zellen und B-Zellen) ihre Effektorfunktion nicht ohne deren Hilfe ausführen können.
Durch Zytokinproduktion werden jedoch auch Zellen des angeborenen Immunsystems unterstützt [33].
TH1-Zellen unterstützen das zelluläre Immunsystem indem sie Makrophagen stimulieren und die Proliferation von CD8+ T-Zellen fördern. Typische Zytokine der
TH1-Zellen sind IFN-γ, TNF-α und IL-2 [33]. Die Differenzierung zu TH1-Zellen wird
durch Antigenpräsentation in Anwesenheit von IL-12 [34] und IFN-γ [35] induziert.
TH2-Zellen führen zu humoraler Immunität indem sie B-Zellen stimulieren, die ihrerseits zur Antikörperproduktion angeregt werden. Die Hauptzytokine dieser Linie
sind IL-4, IL-5 und IL-13 [33]. Die Anwesenheit von IL-4 und IL-2 bei der Antigenpräsentation führt zur Differenzierung in TH2-Zellen [36, 37].
TH17-Zellen sind gekennzeichnet durch die Produktion von IL-17A, IL-17F und
IL-22 [38-40]. Sie können als Bindeglied zwischen der angeborenen und der adaptiven Immunität gesehen werden, da sie vor allem neutrophile Granulozyten und
Makrophagen stimulieren und die Differenzierung sehr früh nach Infektion stattfindet [41]. Die Differenzierung naiver CD4+ T-Zellen in TH17-Zellen erfolgt am effektivsten, wenn der transformierende Wachstumsfaktor (transforming growth factor,
TGF) –ß und IL-6 verfügbar sind [40, 42], wobei IL-6 auch durch IL-21 ersetzt
werden kann [43-45].
Während TH1, TH2 und TH17 Zellen unterstützende Wirkung auf das Immunsystem
haben, wirken Tregs regulatorisch. Tregs sind charakterisiert durch die Expression
von CD4, der α-Kette des IL-2-Rezeptors CD25 und des Transkriptionsfaktors
„forkhead box P3" (FoxP3) [46]. Während der Reifung im Thymus entstehen viele
T-Zellen, die mit hoher Affinität an MHC-gebundene Selbst-Antigene binden. Sie
gehen wie bereits in 1.1.2.1 beschrieben in Apoptose oder differenzieren zu T regs
[47, 48]. Diese Zellen verhindern spezifisch eine Aktivierung anderer autoreaktiver
T-Zellen, die der negativen Selektion entkommen konnten. Individuen, die auf-
5
Einleitung
grund einer Mutation in FoxP3 keine Tregs hervorbringen können, leiden unter
schweren Autoimmunkrankheiten [48, 49].
Das Immunsystem ermöglicht Individuen einen zuverlässigen Schutz gegen
Krankheiten. Jedoch ist es auch für schwere Komplikationen bei Organtransplantationen [50], wie auch für die Transplantat-gegen-Wirt-Erkrankung (graft-versushost disease, GvHD) (1.3) verantwortlich [51].
1.2 Die gemeinsame gamma-Kette (γc)
Die gemeinsame gamma-Kette (γc) ist die gemeinsame Untereinheit vieler Zytokinrezeptoren, die Signale über den Signalweg der Januskinase (JAK) und
Proteine zur Signaltransduktion und Aktivierung der Transkription (signal transducers and activators of transcription, STAT) weiterleiten. γc (CD132) wurde zunächst als Teil des IL-2-Rezeptors (IL-2R) entdeckt. Dieser besteht aus IL-2Rα,
IL2-Rβ und γc, die zusammen hochaffin an IL-2 binden, wobei IL-2Rα alleine eine
niedrige und IL-2Rβ zusammen mit γc eine mittlere Affinität für IL-2 aufweisen [52].
Patienten mit X-Chromosomal vererbter schwerer kombinierter Immundefizienz
(X-linked severe combined immunodeficiency, X-SCID) haben eine Mutation im
IL2RG, dem Gen, das für γc codiert. Sie weisen weder T- noch NK-Zellen auf, was
zeigt, dass γc eine wichtige Rolle für die Entwicklung und das Überleben dieser
Zellen spielt [53]. Jedoch Mutationen, die zu Defizienz von IL-2 führen, haben weit
weniger drastische Auswirkungen. Sie führen zwar zu reduzierten T-ZellAntworten, jedoch weisen die betroffenen Individuen normale Mengen an T- und
NK-Zellen auf. Somit wurde die Hypothese aufgestellt, dass γc auch Teil von Rezeptoren für andere Zytokine sein könnte [54]. Dies konnte in vielen weiteren Studien bestätigt werden und mittlerweile ist γc bekannt als Teil der Rezeptoren für
IL-2, IL-4, IL-7, IL-9, IL-15 und IL-21 (Tabelle 1-1). Diese Zytokine werden auch
γc-Zytokine genannt. Sie sind Mitglieder der TypI-Zytokine, die aus vier α-HelixBündeln bestehen [55].
6
Einleitung
Tabelle 1-1: Zytokinrezeptoren, mit der γc als Bestandteil. Nach Rochman, Y., R.
Spolski, and W.J. Leonard, New insights into the regulation of T cells by gamma(c) family
cytokines. Nat Rev Immunol, 2009. 9(7): p. 480-90.[55]
Rezep-
Bestandteile
tor
außer γc
Expression auf
Naive T-Zellen
Effektor-T-Zellen
Gedächtnis-T-Zellen
IL-2Rα (CD25)
keine
stark
keine
IL-2Rβ (CD122)
schwach
stark
stark
IL-4
IL-4Rα (CD124)
keine
stark
nicht bekannt
IL-7
IL-7Rα (CD127)
intermediär
keine
stark
IL-9
IL-9Rα (CD129)
keine
stark
keine
IL-15
IL-15Rα(CD215) schwach
stark
stark
IL-2Rβ
schwach
stark
stark
IL-21R (CD360)
schwach
stark
nicht bekannt
IL-2
IL-21
Die γc-Zytokine vermitteln Signale über den JAK-STAT-Signalweg (Abb.1-1), wobei dies hauptsächlich über JAK1 und JAK3 geschieht. JAKs weisen zwei Domänen auf, durch die zum einen die Kinaseaktivität hervorgebracht, und zum anderen
diese Aktivität negativ reguliert wird [55]. Nach der Bindung an ein γc-Zytokin
phosphorylieren die JAKs spezielle intrazelluläre Tyrosinreste der γc, die dann als
Bindungsstelle für STATs dient. Die nun an γc gebundenen STATs werden von
den JAKs an aktivierenden Tyrosinresten phosphoryliert, was zur Konformationsänderung der STATs führt. Diese bilden nun Homo- oder Heterodimere wodurch
sie in den Nukleus transloziert werden, wo sie nun eine Änderung der Genexpression herbeiführen [56]. Jedes γc-Zytokin aktiviert eine spezifische JAK oder
bestimmte Kombination verschiedener JAKs, die dann zur Aktivierung spezifischer
STATs führen. So endet die Bindung an IL-2, IL-7, IL-9 oder IL-15 in der Aktivierung von STAT5, Bindung an IL-4 in der Aktivierung von STAT6 und Bindung an
IL-21 in der Aktivierung von STAT3 [57].
7
Einleitung
Zytokin
JAK
γc
Zytokin
JAK
JAK
P Y
Y P
Nukleus
S
S
T P T
A PA
T
T
P
γc
JAK
S
TP Y
A
T
S
Y P T
A
T
P
S
S
TP T
A PA
T
T
Transkription
Abb. 1-1 Der JAK-STAT-Signalweg: Bei Bindung an ein γc-Zytokin wird die γc durch eine
JAK an spezifischen Tyrosinresten phosphoryliert, die dann als Bindungsstellen für
STATs dienen. Die STATs werden nun von den JAKs phosphoryliert und bilden Dimere,
die dann in den Nukleus wandern, wo sie eine Änderung der Genexpression herbeiführen
1.2.1 Die γc-Zytokine
IL-2 weist sehr vielfältige Eigenschaften auf. Es dient als T-Zell-Wachstumsfaktor,
verstärkt die zytolytische Aktivität von NK-Zellen und fördert die Immunglobulin (Ig)
Produktion in B-Zellen [58]. Es reguliert die klonale Expansion von konventionellen
T-Zellen und die Proliferation und den aktivierungs-induzierten Zelltod (activationinduced cell death, AICD) von aktivierten T-Zellen [59, 60]. IL-2 stellt auch ein
wichtiges Zytokin für die Differenzierung von CD4+ T-Zellen in TH2-Zellen dar, da
es über STAT5 zur Transkription von IL-4 und dem IL-4Rα führt [36, 37], aber
auch eine Differenzierung zu TH1 wird durch IL-2 ermöglicht [61]. Eine sehr wichtige Funktion von IL-2 ist auch die Förderung der Entwicklung von T regs. Diese exprimieren neben dem Transkriptionsfaktor FoxP3 auch konstitutiv CD25, die αKette des IL-2R. Eine Defizienz von IL-2, CD25 oder CD122 ist gekennzeichnet
durch eine verringerte Anzahl und Funktion von T regs, was lymphoproliferative
Erkrankungen und Autoimmunerkrankungen zur Folge hat [62]. Jedoch weisen die
betroffenen Individuen eine geringe Anzahl an T regs auf, während bei einer Defizienz von γc oder JAK3 zusätzlich zur geringen Gesamt-T-Zellzahl keine Tregs vorliegen [63, 64]. STAT5 scheint der essentielle Faktor für die Entwicklung von T regs zu
sein, da seine Aktivierung auch in Abwesenheit von IL-2 zur Erhöhung der Anzahl
8
Einleitung
von Tregs führt [65]. Somit könnten auch die anderen Zytokine, die ihr Signal über
STAT5 weitergeben, für die Entwicklung wichtig sein. Es konnte jedoch nur IL-2 in
vitro die Proliferation und klonale Expansion von T regs vermitteln [66] und in vivo
wurde durch Neutralisierung von IL-2 die klonale Expansion in den Lymphknoten
verhindert [67].
IL-4 ist essentiell für die Entwicklung und Funktion von T H2-Zellen, als klassisches
TH2-Zytokin wird es auch von diesen Zellen exprimiert. Eine weitere wichtige Rolle
spielt IL-4 beim Ig-Klassenwechsel in B-Zellen, wobei es die Produktion von IgE
fördert, was ein wichtiger Faktor in der Entstehung von Allergien ist [68]. IL-4 dient
als Überlebensfaktor in DCs und fördert in Kombination mit dem GranulozytenMakrophagen-Kolonie stimulierenden Faktor (granulocyte macrophage colony stimulating factor, GM-CSF) die Differenzierung von KM-Vorläuferzellen und humanen Monozyten zu DCs in vitro [69, 70].
IL-7 spielt eine zentrale Rolle in der Entwicklung von T-Zellen. Ist der Signalweg
über IL-7 gestört wie bei einer Mutation des IL-7Rα oder in der JAK3, weisen die
betroffenen Individuen die gleichen Entwicklungsdefekte der T-Zellen auf, wie Patienten, die an X-SCID leiden [71]. Somit lassen sich die fehlenden T-Zellen bei
Mutationen in der γc auch auf den beeinträchtigten IL-7-Signalweg zurückführen
[72, 73]. IL-7 ist auch ein Überlebensfaktor für Lymphozyten [74, 75]. Dieser Effekt
wirkt jedoch hauptsächlich auf naive und Gedächtnis-T-Zellen, da auf diesen
IL-7Rα exprimiert und bei TCR-Aktivierung herunterreguliert wird [76, 77]. In DCs
führt IL-7 zu einer Beibehaltung des unreifen Phänotyps und zur Herunterregulierung von MHC-Klasse II-Molekülen, was eine verminderte Proliferation von CD4+
T-Zellen zur Folge hat [78].
Erst kürzlich wurde eine Untergruppe der aktivierten CD4+ T-Zellen charakterisiert,
die IL-9 als Hauptzytokin exprimiert, es handelt sich um T H9-Zellen [79]. Die genaue Rolle in der T-Zellbiologie ist noch nicht vollständig geklärt. Es ist jedoch bekannt, dass IL-9 die Aktivierung von Epithelzellen, Eosinophilen, B-Zellen und
Mastzellen induziert [80]. Außerdem dient es in der späten Phase der Immunantwort als T-Zell-Wachstumsfaktor [81].
IL-15 spielt eine wichtige Rolle in der Entwicklung von NK-Zellen und dessen Fehlen in Patienten mit X-SCID lässt sich auf den defizienten IL-15-Signalweg zurückführen [54]. Des Weiteren ist IL-15 ein wichtiger Faktor in der T-Zellhomöostase
9
Einleitung
[75]. Vor allem Gedächtnis-CD8+ T-Zellen sind sehr sensitiv auf IL-15 [82], sie exprimieren in hohem Maße IL-2Rβ als Teil des IL-15-Rezeptors. Liegt IL-15 in hohen Konzentrationen vor, oder ist IL-7 nicht verfügbar, dann kommt es zu einer
homöostatischen Proliferation von Gedächtnis-CD4+ T-Zellen [82, 83]. DCs exprimieren konstitutiv IL-2Rβ und γc [84, 85] und regulieren die Expression von
IL-15Rα herauf, nachdem sie über IFN oder Liganden der TLRs aktiviert wurden.
Dies fördert das Überleben, die Heraufregulierung kostimulatorischer Moleküle,
die vermehrte Antigenpräsentation und gleichzeitig auch die eigene Produktion
von IL-15 [86-89]. Somit wird eine Immunantwort verstärkt und aufrechterhalten.
IL-21 vermittelt das Überleben und die Funktion von CD8 + T- und NK-Zellen bei
einer Virusinfektion [90, 91]. In Tiermodellen zeigt es auch eine Rolle in der Entstehung von Typ-I-Diabetes [92], systemischem Lupus erythematodes (SLE) [93]
und Antitumorantworten [94]. Auf CD4+ T-Zellen hat IL-21 eher inhibitorische Wirkung, da es die T-Zell-Reifung als Antwort auf Stimuli, die über TLRs vermittelt
werden reduziert [95]. CD4+ T-Zellen produzieren selbst IL-21 nach Aktivierung,
was zu einer negativen Rückkopplung führt [94].
Da die γc-Zytokine vielfältige immunologische Eigenschaften haben, sind sie Gegenstand vieler experimenteller und klinischer Studien, bei denen eine Immunmodulation herbeigeführt werden soll. IL-2 wurde im Rahmen klinischer Studien bereits verabreicht, um die CD4+ T-Zellpopulationen in Patienten, die mit dem humanen Immundefizienzvirus (HIV) infiziert sind zu erhalten und zu expandieren [96].
Weitere Anwendungen findet IL-2 in der Behandlung von Melanomen und Nierenzellkarzinomen [97]. IL-7 könnte zur Erhöhung der T-Zellzahl bei Immundefizienzen eingesetzt werden. Die Verabreichung von IL-7 im Mensch induziert größere
CD4+ und CD8+ T-Zell-Populationen ohne Auswirkungen auf die T regs zu haben
[98]. Der Einsatz von IL-15 als Adjuvanz in Vakzinen wird experimentell überprüft
und verspricht bessere Wirkungen als die Zugabe von IL-2, da IL-15 stärkere Einflüsse auf CD8+- und NK-Zellen hat ohne Tregs zu fördern [99]. IL-21 befindet sich
in einer Phase II-Studie zur Behandlung maligner Erkrankungen wie Melanome,
Nierenzellkarzinome und Colonkarzinome, da es vor allem die Aktivität von CD8+und NK-Zellen fördert [100]. Denkbar wäre auch eine Hemmung von IL-21 für den
Einsatz bei Autoimmunerkrankungen. So konnte in einem Typ I-Diabetes Maus-
10
Einleitung
modell die Erkrankung verhindert werden, wenn die dafür anfälligen Mäuse mit
einem Mausstamm gekreuzt wurden, der defizient für den IL-21R war [92].
Die meisten Studien zur Immunsuppression durch Reduzierung der γc-Zytokine
greifen im JAK-STAT-Signalweg ein. JAK3 eignet sich besonders gut für eine
Hemmung, die immunsuppressive Auswirkungen haben soll, da es nur in hämatopoetischen Zellen exprimiert wird [101]. Die Behandlung mit dem JAK3-Inhibitor
AG490 führte zu einer verzögerten Abstoßung von allogen transplantierten Herzen
in Ratten [102]. Der JAK3-Inhibitor Tofacitinib wurde in Mäusen und in Javaneraffen in einem Herz- bzw. Nierentransplantmodell eingesetzt und führte zur verringerten Abstoßung, die durch eine Verminderung der Lymphozyten im Blut gekennzeichnet war [103, 104]. In einer Phase I-Studie, bei der 22 Patienten mit einer stabilen Nierentransplantation einbezogen waren, führte eine Behandlung mit
Tofacitinib zu reduzierten Anzahlen an NK-Zellen, weniger Tregs, die in ihrer Funktion jedoch intakt waren, erhöhten Anzahlen zirkulierender B-Zellen und zu einer
Inhibition der IL-2 induzierten Produktion von IFN-γ in den mononukleären Zellen
des peripheren Blutes (peripheral blood mononuclear cells, PBMCs) [105, 106].
Tofacitinib wurde ebenfalls in einer Phase II-Studie zur Behandlung von rheumatoider Arthritis (RA) eingesetzt und zeigte bei Anwendung eine klinisch relevante
Reduktion der Symptome [107]. Ebenfalls wurden Blutuntersuchungen in Nierentransplantationspatienten durchgeführt, die mit Tofacitinib behandelt wurden. Es
zeigte sich, dass die STAT-Phosphorylierung in allen T-Zellen reduziert war, wobei
diese Reduktion viel spezifischer auf Effektor-T-Zellen als auf Tregs wirkte. In vitro
zeigten Tregs, die mit Tofacitinib inhibiert wurden, mehr suppressive Aktivität auf
allogen stimulierte Effektor-T-Zellen, als die Kontrolle mit Lösungsmittel. Aus Patienten, die mit Tofacitinib behandelt wurden, gewonnene Tregs waren funktionell in
der Supprimierung der Proliferation von Effektor-T-Zellen [108]. Weitere therapeutische Anwendungen werden in 1.4.2.1 behandelt.
1.3 Transplantation hämatopoetischer Zellen
Die Transplantation hämatopoetischer Zellen wird als Therapie bei einer Vielzahl
von Erkrankungen eingesetzt. Hierzu zählen z.B. Immundefizienzen, Sichelzellanämie, Autoimmunerkrankungen, Leukämien und Lymphome [109]. Nachdem
entdeckt wurde, dass hämatopoetische Erkrankungen durch diese Art von Trans11
Einleitung
plantation behandelt werden konnten, wurde zunächst KM transplantiert [110]. Die
Entdeckung des Granulozyten-Kolonie stimulierenden Faktor (granulocyte colony
stimulating factor, G-CSF), das die Ablösung hämatopoetischer Zellen aus ihrer
Umgebung im KM bewirkt, führte dazu, dass nun hämatopoetische Stammzellen
(HSZ) im Blut der Spender angereichert werden konnten. Man spricht dann von
einer hämatopoetischen Stammzelltransplantation (HSZT). Mittlerweile wird diese
Methode in den meisten Fällen angewandt [111]. Eine weitere Quelle für HSZ ist
Nabelschnurblut. Hier können jedoch nur geringe Mengen des Transplantats gewonnen werden, weshalb diese Methode häufig bei Kindern angewandt wird [112].
Es gibt verschiedene Arten von HSZT. Bei der autologen HSZT werden nach einer
Induktions-Chemotherapie die eigenen HSZ des Patienten entnommen und gelagert. Der Patient erhält nun eine hochdosierte Chemotherapie, die alle malignen
Zellen abtöten soll. Jedoch ist das hämatopoetische System nun ebenfalls zerstört
und muss durch Gabe der zuvor entnommenen Zellen wieder rekonstituiert werden [51]. Diese Art von HSZT ist jedoch nicht immer möglich, z.B. wenn immunologische Erkrankungen vorliegen, oder die Tumorzellen durch eine hochdosierte
Chemotherapie nicht vollständig zerstört werden können, wie es z.B. bei verschiedenen Formen der Leukämie oder malignen Lymphomen der Fall ist [113, 114].
Hier wird eine allogene HSZT (alloHSZT) erforderlich (Abb. 1-2). Hierbei handelt
es sich bei Spender und Empfänger nicht um dieselbe Person. Zunächst erhält der
Patient eine Konditionierung, die meist myeloablativ ist. Sie besteht aus einer
Kombination aus Bestrahlung und Chemotherapie. Somit werden maligne Zellen
abgetötet, Platz für die Spenderzellen geschaffen und die Gefahr einer Abstoßung
des Transplantates reduziert. Nun werden die HSZ nach Behandlung des Spenders mit G-CSF im Blut angereichert, durch Leukapherese gesammelt und dem
Patienten intravenös verabreicht [115].
Jährlich werden weltweit etwa 50.000 HSZTs durchgeführt [116], wobei es immer
noch häufig zu Komplikationen kommt wie opportunistische Infektionen, Folgen
der Toxizität der Konditionierung und GvHD [51].
12
Einleitung
DC-Vorläufer
T-Zelle
Leukapherese
HSZ
NK-Zelle
B-Zelle
Donor-PBSCs
1. Immunsuppression des
Chemotherapie
Rezipienten um Abstoßung zu
(und Bestrahlung)
Rezipient
vermeiden
2. Reduktion der Tumorzellen
3. Reduktion der hämatopoetischen
Zellen des Rezipienten
Transplantation der
Donor-Zellen
Hämatopoese (%)
Anwachsen des Transplantats
100
50
Recipient
Donor
0
Tage
Abbildung 1-2: Ablauf der alloHSZT. Der Donor wird mit G-CSF behandelt um die HSZs
im Blut anzureichern, welche dann durch Leukapherese gewonnen werden. Der Rezipient
erhält eine Konditionierungstherapie um die Tumorzellen zu reduzieren, eine Nische für
das Anwachsen des Transplantats zu bilden und die Abstoßung des Transplantats zu
vermeiden. Die peripheren Blutstammzellen (PBSCs) werden nun intravenös injiziert.
Modifiziert nach Shlomchik W. D., Graft-versus-host disease. Nature Reviews Immunology, 2007. 7(5):340-352
1.4 GvHD
Nach einer alloHSZT entwickelt sich in etwa 40 % der Transplantationen eine
GvHD [117], welche dann in etwa 15 % der Fälle zum Tode des Patienten führt
[118, 119]. Die GvHD ist eine heftige Abstoßungsreaktion der transplantierten
hämatologischen Zellen gegen das Empfängergewebe. Die Schwere und die Frequenz einer GvHD korreliert direkt mit den Unterschieden in den hochpolymor13
Einleitung
phen HLA-Genen („HLA-mismatch“) [120]. Obwohl die HLA-Identitäten von Empfänger und Spender mittlerweile vor Transplantationen sehr gut abgestimmt werden, kommt es trotzdem noch sehr häufig zu dieser Komplikation. Dies liegt an
den so genannten „minor-Antigenen“, die nicht im MHC kodiert sind. Hierbei handelt es sich z.B. um die Antigene HY und HA-3, die auf allen Körperzellen exprimiert werden [120] oder auch HA-1 und HA-2 auf hämatopoetischen Zellen [121,
122].
Es gibt zwei Arten der GvHD, akute (aGvHD) und chronische (cGvHD). Per Definition erfolgt die Einteilung nach der Zeit, bis die Erkrankung einsetzt, aGvHD entsteht bis 100 Tage nach Transplantation, die cGvHD danach [122]. Die Übergänge
sind fließend und oft entsteht die cGvHD aus der aGvHD, jedoch unterscheiden
sich die beiden Arten in ihrem Verlauf. Die aGvHD ist ein stark inflammatorischer
Prozess, während die cGvHD eher autoimmunen Charakter hat [122]. Bei einer
GvHD werden die Organe des Empfängers von den Immunzellen des Spenders
angegriffen. Hierbei handelt es sich um die Haut (81 % der Patienten betroffen),
den Gastrointestinal (GI)-Trakt (54 %) und die Leber (50 %) [123]. Die Symptome
sind die Folgenden: Haut: makulopapulöser Ausschlag [124], GI-Trakt: Übelkeit,
Appetitlosigkeit, wässriger Durchfall, starke Bauchschmerzen, blutiger Durchfall
und Darmverschluss [125], Leber: cholestatische Hyperbilirubinämie [126]. Die
GvHD kann in vier Schweregrade eingeteilt werden, wobei Grad I eine milde und
Grad IV eine sehr starke Erkrankung beschreiben. Das Langzeitüberleben (>5
Jahre) bei Grad III beträgt 25 %, bei Grad IV lediglich 5 % [127].
1.4.1 Entstehung der aGvHD
Die aGvHD kann in drei Phasen eingeteilt werden (Abb. 1-3). 1. Die Aktivierung
des angeborenen Immunsystems, 2. die Aktivierung, Proliferation, Differenzierung
und Migration der Donor-T-Zellen und 3. der Angriff auf die Zielorgane im Empfänger [117].
1.4.1.1 Phase I
Die APCs des Empfängers werden bereits durch die vorliegende Erkrankung aktiviert. Die Konditionierung führt ebenfalls zu einer Aktivierung dieser Zellen, da
14
Einleitung
hierdurch schon Gewebe angegriffen und teilweise zerstört werden [117]. Dies
führt zu einer Freisetzung von so genannten „danger signals“, die dem Immunsystem das Vorliegen einer Verletzung signalisieren, wie z.B. Adenosin-Triphosphat
(ATP), das aus sterbenden Zellen hervor geht. ATP bindet an seinen Rezeptor
P2X7 auf APCs und aktiviert in diesen das Inflammasom, was zur Hochregulierung von kostimulatorischen Molekülen auf APCs führt [128]. Es werden weiterhin
proinflammatorische Zytokine wie TNF-α und IL-6 und Chemokine produziert und
sezerniert, Adhäsionsmoleküle und MHC-Moleküle auf APCs werden hochreguliert
[129-132]. Durch die Schädigung einzelner Organe des Empfängers werden außerdem weitere Moleküle freigesetzt, die an PRRs binden, z.B. LPS aus den Zellwänden kommensaler Bakterien, die nun aus dem durchlässigen Darm freigesetzt
werden [131]. LPS bindet an den Toll-ähnlichen Rezeptor (Toll-like receptor, TLR)
4, was ebenfalls zu Ausschüttung von proinflammatorischen Zytokinen führt. Hier
kommt es bereits zum ersten Mal zu einem so genannten „Zytokin-Sturm“, was
bedeutet, dass eine positive Rückkopplung von Zytokinen und Immunzellen entsteht, die sich selbst verstärkt [131].
1.4.1.2 Phase II
Die Kernphase der aGvHD ist der zweite Schritt, in dem die T-Zellen des Donors
durch die APCs des Empfängers aktiviert werden. Die CD4 + und CD8+ T-Zellen
wandern zunächst in die Milz und die Lymphknoten, wo sie auf APCs treffen, welche ihnen die Alloantigene präsentieren und sie somit spezifisch aktivieren. Die
T-Zellen erkennen selbst bei HLA-identischen Transplantationen „minor-Antigene“,
die auf den APCs präsentiert werden. Sie werden somit aktiviert und zur Proliferation und Differenzierung angeregt [117]. Durch das Vorhandensein der Zytokine
IFN-γ, IL-2 und TNF-α differenzieren sich CD4+ T-Zellen hauptsächlich zu TH1Zellen [133]. Die Spender-T-Zellen produzieren nun ebenfalls proinflammatorische
Zytokine [117], was zu einer weiteren Verstärkung der Inflammation führt.
1.4.1.3 Phase III
Die GvHD-Zielorgane reagieren auf die Schädigung mit Überexpression von
Chemokinen. Diese bilden einen Gradienten aus und locken so die in Phase II
15
Einleitung
aktivierten T-Zellen an [133, 134]. Diese beginnen nun die Zielorgane weiter zu
schädigen. Hauptsächlich CD4+ T-Zellen führen durch Expression proinflammatorischer Zytokine wie TNF-α, IFN-γ und IL-1 zu einer weiteren Amplifikation der
Immunantwort [125]. Zytotoxische T-Zellen hingegen greifen die Zellen der Zielorgane direkt an. Das Fas/FasL-System führt hauptsächlich zu Schädigungen in
der Leber, wohingegen Perforin und GranzymB an der Zerstörung der Haut und
des GI-Traktes beteiligt sind [135, 136].
Schädigung des Gewebes
(1) Aktivierung der
Empfänger-APCs
(2) Aktivierung der
Donor-T-Zellen
(3) Angriff auf
Zielgewebe
Abbildung 1-3: Pathophysiologie der akuten GvHD. Die Konditionierungstherapie führt
in Phase I zur Schädigung des Zielgewebes worauf proinflammatorische Zytokine ausgeschüttet werden. Durch die hohe Zytokinkonzentration kommt es zu einer Aktivierung der
APCs des Empfängers, welche wiederum in Phase II die T-Zellen des Donors aktivieren.
Die aktivierten T-Zellen proliferieren, differenzieren und bringen weitere Effektoren wie
zytotoxische T-Zellen, TNF-α und IL-1 hervor. LPS, das durch die zerstörten Darmwände
dringt, führt zu weiterer TNF-α-Produktion. TNF-α kann das Gewebe direkt durch Induktion von Nekrose oder Apoptose schädigen. Die Zielgewebe werden ebenso durch die aktivierten allospezifischen T-Zellen aktiviert. Host tissues: Gewebe des Rezipienten, Small
intestine: Dünndarm, MФ: Makrophagen, Host APC: APCs des Rezipienten
Modifiziert nach Ferrara, J.L., et al., Graft-versus-host disease. Lancet, 2009. 373(9674):
p. 1550-61.[117]
16
Einleitung
1.4.2 Prävention und Behandlung
Ein früher Ansatz zur Prävention von GvHD ist die mittlerweile sehr oft durchgeführte reduzierte Konditionierung [137, 138]. Hierbei erhält der Patient eine geringere Chemotherapie- und/oder Bestrahlungsdosis. Dies führt zu reduzierter Toxizität und Organschädigung, wodurch die GvHD bereits in den frühen Phasen reduziert werden kann. Somit besteht aber auch die Gefahr, dass die zugrunde liegende Erkrankung nicht vollständig eliminiert werden kann. Die Standardbehandlung
der akuten GvHD sind in der Erstlinie Kortikosteroide wie Methylprednisolon [139].
Als Zweitlinie oder bei schwerer GvHD werden zusätzlich Calcineurin-Inhibitoren
(CyclosporinA, CsA), Anti-Thrombozyten-Globulin (ATG) oder Methotrexat gegeben. Auch mTor-Inhibitoren wie Sirolimus in Kombination mit MycophenolatMofetil, was unspezifisch die Proliferation von Lymphozyten hemmt, werden oft
eingesetzt. Eine weitere Möglichkeit stellt die Depletion der T-Zellen im Transplantat dar [139].
Momentan werden zahlreiche klinische Studien durchgeführt, die ebenfalls zu einer Reduktion oder Verhinderung der GvHD führen sollen. Zum einen wird
AEEB071, ein Inhibitor der Protein Kinase C (PKC) eingesetzt. PKC spielt eine
wichtige Rolle in der Aktivierung und dem Überleben von T-Zellen. Für PKCθ
konnte eine Rolle in Alloreaktivität und GvHD aber nicht in der Tumorreaktivität
oder Bekämpfung viraler Infektionen gezeigt werden [140]. In einer weiteren Studie wird ein Antikörper gegen den IL-6-Rezeptor, Tocilizumab verabreicht. Die
Hemmung des IL-6-Rezeptor führt zu einer reduzierten Differenzierung der
T-Zellen zu TH17-Zellen und verstärkter Induktion von T regs [139]. Des Weiteren
werden Tregs direkt mit dem Transplantat injiziert. Diese Zellen können ex vivo oder
in vivo induziert werden. Durch sie wird die T-Zellaktivierung inhibiert [141-144]. In
Phase II Studien werden auch Statine eingesetzt, die T H1-Zellen inhibieren und
TH2-Zellen und Tregs induzieren [145, 146] (1.9.1).
1.4.2.1 Modulation der γc-Zytokine oder deren Signalwege
Jedes der γc-Zytokine ist ein potentielles Ziel zum Einsatz bei der Prävention und
Behandlung von GvHD. In einer klinischen Studie wurde Inolimomab, ein neutralisierender Antikörper gegen den IL-2Rα eingesetzt, der kurzfristig zu einem verlängerten Überleben führte, langfristig jedoch kaum zu einer Verbesserung beitrug
17
Einleitung
[147]. Die als Antagonisten von IL-2 agierenden Antikörper Basiliximab und Daclizumab führten in klinischen Studien zu einer effizienten Prävention von aGvHD,
wobei Basiliximab auch sehr starke positive Effekte auf cGvHD zeigte [148].
IL-4 scheint eher als typisches TH2-Zytokin der stark TH1-vermittelten GvHD entgegenzuwirken. Im Maus-GvHD-Modell konnte gezeigt werden, dass natürliche
Killer-T-Zellen (NKT-Zellen) zur Reduktion von GvHD beitragen können. Dieser
Effekt ist IL-4-abhängig, da die Transplantation von IL-4-defizienten NKT-Zellen
keine Auswirkungen auf die GvHD hatte [149]. Ebenfalls im Mausmodell konnte
durch Injektion von TH2-Zellen die GvHD reduziert werden. Diese Zellen wurden in
vitro in Anwesenheit von IL-4 polarisiert und zeichneten sich ihrerseits bei Reisolation durch Sekretion von IL-4 aus [150, 151].
IL-7 wird konstitutiv von Stromazellen exprimiert und wirkt homöostatisch auf
ruhende T-Zellen, da diese den IL-7Rα exprimieren. Da nach der Konditionierungstherapie eine Lymphopenie vorherrscht, wird systemisch mehr IL-7 produziert um die Lymphozytenzahl wieder zu erhöhen [152]. Somit steigt auch die Anzahl der alloreaktiven T-Zellen, die dann zu einer verstärkten GvHD führen können
[153]. Experimente im Mausmodell mit IL-7-defizienten Transplantaten zeigten
eine Rolle dieses Zytokins in der GvHD-Entstehung, da IL-7-Defizienz eine GvHD
verhindern, diese aber durch Injektion von IL-7 ausgelöst werden konnte [154]. In
einer Studie mit 31 Patienten, die an aGvHD litten, konnten an Tag 7 und Tag 14
nach Eintritt der GvHD erhöhte IL-7-Spiegel im Blut nachgewiesen werden. Die
Konzentrationen an Tag 14 korrelierten mit der Schwere der GvHD [152].
IL-15 stellt ein essentielles Zytokin für das Überleben und die Homöostase von
CD8+ Gedächtnis-T-Zellen dar, die eine wichtige Rolle in der GvHD spielen [82,
135, 136]. Somit scheint auch IL-15 ein Zytokin zur Vermittlung der GvHD zu sein.
Tatsächlich konnte in einem murinen Modell aGvHD durch exogene Verabreichung von IL-15 verstärkt werden [155]. Wie IL-7 hat auch IL-15 homöostatische
Wirkungen auf Immunzellen. Herrscht ein inflammatorisches Milieu vor, wie es
nach einer Konditionierungstherapie der Fall ist, wird IL-15 verstärkt produziert
und sezerniert [156]. Die Untersuchung von Patienten nach einer HSZT zeigte,
dass erhöhte IL-15-Spiegel im Blut mit einem erhöhtem Risiko an GvHD zu
erkranken assoziiert waren, reduzierte IL-15-Konzentrationen jedoch mit einem
höheren Rezidiv-Risiko der malignen Erkrankung korrelierten [157].
18
Einleitung
Eine Rolle von IL-21 in der GvHD konnte in einem Mausmodell nachgewiesen
werden, da die Injektion eines neutralisierenden Antikörpers gegen IL-21 zu einer
starken Reduktion des GvHD-Schweregrades führte. Die positive Wirkung der
IL-21-Blockade wurde darauf zurückgeführt, dass IL-21 die Bildung von induzierbaren Tregs supprimierte und so zur GvHD-Entstehung beitragen konnte [158].
Viele Therapien der GvHD greifen nicht bei einem Zytokin, sondern direkt im weiteren Signalweg der γc ein. Hierbei handelt es sich hauptsächlich um Inhibitoren
der JAK3 wie WHI-P131 oder WHI-P154. Sie führten bei Behandlung zu einer Reduktion der aGvHD unter Beibehaltung von Antitumoreffekten [159, 160]. Der Einsatz des JAK3-Inhibitors Tofacitinib ermöglichte ein vollständiges Überleben der
Rezipienten im GvHD-Maumodell. Die IFN-γ-Produktion der Donor-CD4+ T-Zellen
war hier stark reduziert ebenso wie die Differenzierung zu T H1-Zellen sowohl in
vivo als auch bei in vitro gemischten Lymphozytenreaktionen. Genauere Untersuchungen mit IFN-γ-defizienten Spenderzellen als auch mit Antikörpern gegen IFNγ zeigen hier, dass eine IFN-γ-Produktion sowohl von Zellen des Donors als auch
des Rezipienten wichtig für die Induktion einer GvHD ist. Diese Behandlungen
führten dennoch verzögert zum Tod der Tiere, was zeigt, dass das durch JAK3Inhibition herbeigeführte verbesserte Überleben auf weitere Mechanismen zusätzlich zur Hemmung der IFN-γ-Produktion zurückzuführen ist [161].
Durch Einsatz all dieser Medikamente oder Zellen kommt es immer zu einer
Immunmodulation. Diese kann dazu führen, dass Infektionen auftreten und nicht
angemessen vom Immunsystem bekämpft werden können. Außerdem besteht
immer die Gefahr eines Rezidivs der zugrunde liegenden Erkrankung. Eine GvHD
ermöglicht in den meisten Fällen auch gewünschte Transplantat-gegenLeukämie/Lymphom (graft-versus leukemia/ lymphoma, GvL) –Effekte [162] (1.5).
1.5 Transplantat-gegen Leukämie/Lymphom (GvL)-Effekte
Da mittlerweile sehr oft eine reduzierte Konditionierung vor der HSZT durchgeführt
wird, bei der möglicherweise nicht alle malignen Zellen zerstört werden können, ist
es wichtig, angemessene Immunreaktionen gegen diese Erkrankung zu erzeugen.
Dass die Spender T-Zellen hierbei eine sehr wichtige Rolle spielen, wurde bei
HSZTs gezeigt, bei denen, um eine GvHD zu verhindern, die T-Zellen aus dem
19
Einleitung
Transplantat depletiert wurden. Dies führte häufig zu einem Rezidiv der Leukämieerkrankung [163]. GvL-Effekte werden hauptsächlich durch die alloreaktiven CD4+
und CD8+ T-Zellen vermittelt, welche zum einen die Antigene des Empfängers,
aber auch spezifische Tumorantigene erkennen [164, 165]. Die Mechanismen ähneln hierbei denen der GvHD. So werden die Reaktionen auf den Tumor über Zytokine und zytolytische Vorgänge vermittelt. CD8+ T-Zellen führen über die Ausschüttung von Perforin und GranzymB zum Tod der Zielzellen, während einige
CD4+ T-Zellen ebenfalls Tumorzellen zerstören können, wobei dies meist über den
Fas/FasL-Signalweg stattfindet [166]. Auch NK-Zellen, die in geringeren Mengen
ebenfalls im Transplantat erhalten sind, spielen eine Rolle in der GvL-Antwort. Sie
erkennen stressinduzierte Proteine auf den Zielzellen und MHC-Moleküle, die
durch die Tumoraktivität verändert wurden [167]. Da auf den Tumorzellen oft wenige MHC-Klasse I-Moleküle exprimiert werden, die an die inhibierenden Rezeptoren auf NK-Zellen binden, werden NK-Zellen aktiviert und zerstören die Zielzellen.
Diese NK-Zellen können jedoch keine GvHD erzeugen, da sie keine spezifischen
Rezeptoren für Alloantigene besitzen [24, 168, 169].
Strategien um die GvL-Effekte des Empfängers zu verbessern, versuchen an den
verschiedenen Schutzmechanismen der Tumorzellen anzugreifen um einer Zerstörung zu entgehen. Hierbei werden MHC-Klasse I-Moleküle herunterreguliert um
das Erkennen durch CD8+ T-Zellen zu verhindern, Defekte in T- und NK-Zellen
werden durch die Tumorzellen induziert, Todesrezeptor-Liganden wie CD95 werden exprimiert um zytotoxische Zellen zu zerstören, oder in den Tumorzellen wird
die Resistenz gegen Apoptose erzeugt [170]. Des Weiteren können T-Zellen ex
vivo erzeugt werden, die spezifisch Tumorantigene erkennen, jedoch keine GvHD
auslösen können [171].
1.6 Kleine G-Proteine
In der Gruppe der Guaninnukleotid-bindenden Proteine (G-Proteine) gibt es zum
einen die membranständigen heterotrimeren G-Proteine und die zytosolischen
kleinen G-Proteine. Sie werden auch molekulare Schalter genannt und können
entweder an ein Guanosin-Diphosphat (GDP) oder ein Guanosin-Triphosphat
(GTP) gebunden sein, wobei die an GDP gebundene Form die „aus“-Stellung und
die an GTP gebundene Form die „an“-Stellung repräsentieren (Abb. 1-4). Guanin20
Einleitung
nucleotid-Austauschfaktoren (guanine nucleotide exchange factors, GEFs) tauschen gebundene GDP-Moleküle durch GTP-Moleküle aus, indem sie diese nahe
an die GTP-Bindetasche des G-Proteins bringen. GTPase aktivierende Proteine
(GAPs) hingegen fördern die intrinsische GTPase-Aktivität der G-Proteine, weshalb die kleinen G-Proteine auch kleine GTPasen genannt werden. Durch das gebundene GTP kommt es zu einer Konformationsänderung der kleinen GTPasen,
wodurch sie an Effektormoleküle binden können, die nun Signalweiterleitungskaskaden in Gang setzen [172].
Inaktive
GTPase
P
GDP
GAP
GEF
Aktive
GTPase
GTP
Abbildung 1-4: Signalweg der kleinen GTPasen. Wenn die kleine GTPase an GDP
gebunden ist, befindet sie sich in der „aus“-Stellung. Ein GEF entfernt das gebundene
GDP und ermöglicht somit die Bindung von GTP, womit die kleine GTPase in der „an“Stellung ist. Ein GAP aktiviert die intrinsische GTPase-Aktivität wodurch ein Phosphatrest
des GTP abgespalten wird und die GTPase sich somit wieder in der „aus“-Stellung befindet.
Die größte Gruppe innerhalb der kleinen GTPasen ist die Ratten-Sarcom (Ras) Superfamilie. Ras ist in einer Vielzahl von Tumoren überexprimiert und wurde
deshalb als erstes beschrieben. Danach wurden weitere Mitglieder dieser Superfamilie entdeckt, die die gleiche 3D-Struktur haben. Mittlerweile besteht die RasSuperfamilie aus 150 Mitgliedern, die wiederum in sechs Familien eingeteilt sind
[172] (Tabelle 1-2).
21
Einleitung
Tabelle 1-2: Kleine GTPasen der Ras-Superfamilie
Familie Hauptfunktion
Wichtige
Mitglie-
der
Ras
Überleben, Proliferation, Adhäsion, Migration
H-/K-/N-Ras
Ran
Intrazellulärer Transport
Ran
Rho
Morphologie, Zytoskelett-Umordnung, Zellbewe- Rho, Rac, Cdc42
gung
Arf
Vesikuläre Biogenese, intrazellulärer Transport, Arf 1-6
Aktin-Umordnung
Rab
Membrantransport, vesikulärer Transport
Rab 1-60
Rheb
mTor-Aktivierung
Rheb
Kleine GTPasen der Ras-Superfamilie spielen essentielle Rollen in der Signalweiterleitung der Zellen. Da Ras der Prototyp aller kleiner GTPasen dieser Familie
darstellt, können an dessen Beispiel diese Vorgänge erläutert werden (Abb.1-5):
Bei Stimulation einer Zelle z.B. über einen Wachstumsrezeptor oder den TCR wird
zunächst eine Rezeptor-Tyrosin-Kinase (RTK) aktiviert. Diese wiederum aktiviert
einen GEF, z.B. „son of sevenless“ (SOS) was zum Austausch von GDP zu GTP
und damit zu einer aktivierten GTPase führt. Nun gibt es drei verschiedene Wege
zur Signalweiterleitung. Beim Raf/MEK/ERK-Signalweg handelt es sich um eine
Mitogen-aktivierte Protein (MAP)-Kinase-Kaskade, wobei jeweils eine MAP-Kinase
die nächste MAP-Kinase phosphoryliert. Ratten-Fibrosarkom (Raf) wird durch Ras
phosphoryliert und kann nun seinerseits MEK phosphorylieren, was dann wiederum die Phosphorylierung der Kinase, die durch extrazelluläre Signale reguliert
wird (extracellular-signal regulated kinase, ERK) katalysiert. Darauf kommt es zur
Aktivierung von Transkriptionsfaktoren, die die Transkription von Genen ermöglicht, die zur Proliferation von Zellen führen [172]. Der Signalweg über ERK findet
hauptsächlich in B- und T-Zellen nach Aktivierung des BCR bzw. TCR statt [173].
Die Aktivierung kann eine Fas-vermittelte Apoptose in T-Zellen verhindern und
führt auch zur Produktion von IL-2 [174, 175]. Auch in DCs ist dieser Signalweg
22
Einleitung
vorhanden und notwendig für die Produktion von Chemokinen nach Aktivierung
der TLRs [176].
Ein weiterer Signalweg führt über die Phosphoinositid-3-Kinase (PI3K) und hat
eine große Bedeutung in der Aktivierung und Funktion aller Immunzellen, wie
T-Zellen [177], B-Zellen [178, 179], NK-Zellen [180], Mastzellen [181] und Neutrophilen [182]. Nach Bindung an Ras-GTP katalysiert PI3K die Phosphorylierung
von Phosphatidylinositol 4,5-Bisphosphat (PIP2) zu PIP3, das nun ein Bindemotiv
für Proteine mit einer Pleckstrin-Homologie (PH)-Domäne wie z.B. AKT darstellt.
AKT kann nun das Ziel von Rapamycin in Säugern (mammalian target of Rapamycin, mTor) aktivieren, was zur Proliferation und Aktivierung der Zelle führt.
Durch mTor wird reguliert, ob eine antigenspezifische T-Zelle aktiviert oder anergisch wird [183]. Die Reaktion auf Zytokine in Effektor-T-Zellen und Tregs wird
durch PI3K vermittelt und Mäuse mit PI3K-defizienten T-Zellen weisen schwere
Immundefekte auf [182].
Der letzte Signalweg führt über die kleinen GTPasen der Ras ähnlichen (Ras-like,
Ral) -Familie. Durch Ras-GTP werden die GEFs von Ral aktiviert, die zur Ral Guaninnukleotid Dissiziationsstimulator (ral guanine nucleotide dissociation stimulator, RalGDS) -Familie gehören. Ral-GTP kann nun an eine Reihe von Proteinen
binden, die letztendlich zur Proliferation der Zelle führen. Die GEFs der RalGDSFamilie können auch als Rahmenproteine zur Aktivierung von AKT fungieren, was
den Signalweg über die PI3K verstärkt [184].
Die Prenylierung von kleinen GTPasen ist essentiell für deren Funktion [185].
Mutationen, die zu Defekten in der Prenylierung führen, haben häufig schwere
Immunerkrankungen zur Folge [186, 187].
Viele Mitglieder der Ras-Superfamilie sind Protoonkogene. In 20-30 % aller Tumoren liegt eine Punktmutation von Ras vor, wodurch keine GTPase-Aktivität mehr
stattfindet, was zu einer dauerhaften Aktivierung führt, womit die Zelle durchgehend Proliferationssignale erhält [188]. Die Therapien dieser Erkrankungen beruhen häufig auf der Hemmung der Prenylierung von kleinen GTPasen, die eine
wichtige Rolle in deren Aktivierung und Funktion spielen.
23
Einleitung
Stimulus
Ras-Signalweg
Ral-Segment des
Ras-Signalwegs
Überleben
Proliferation
Polarisierung
Abbildung 1-5 Signalweiterleitung in kleinen GTPasen: Nach Stimulation wird zunächst ein GEF aktiviert, welches dann eine kleine GTPase in „an“-Stellung bringt. Der
weitere Signalweg führt dann entweder über die PI3K, Raf oder RalGDS, was letztendlich
zum Überleben, Polarisierung oder Proliferation der Zelle führt.
RALBP1: Ral bindendes Protein 1; PLD: Phospholipase D
Modifiziert nach Johnson, D.S. and Y.H. Chen, Ras family of small GTPases in immunity
and inflammation. Curr Opin Pharmacol, 2012. 12(4): p. 458-63.[172]
1.7 Prenylierung von Proteinen
Bei der Synthese von Proteinen in der Zelle wird die DNA in RNA kopiert, welche
dann als Vorlage für die Herstellung von Proteinen dient. Dieser Vorgang wird
Translation genannt und findet an den Ribosomen statt. Nach der Translation erfolgen häufig Veränderungen der Proteine, wozu Palmitoylierung, Myristoylierung
und Prenylierung zählen [189]. Diese posttranslationalen Modifikationen dienen
einem breiten Spektrum von Vorgängen wie etwa dem Transport, der Faltung und
der Regulation der Proteine [190]. Bei der Prenylierung werden Isoprenoide über
eine Thioesterverbindung an ein Zystein am Carboxyterminus des Proteins ange24
Einleitung
bracht. Dieses Zystein ist Teil des Erkennungsmusters CAAX, wobei C für das
Zystein, A für eine aliphatische Aminosäure und X für eine beliebige Aminosäure
steht [191, 192]. Die Isoprenoide sind Farnesyl-Pyrophosphat (PP) oder Geranylgeranyl-PP, die im Mevalonatstoffwechselweg entstehen (1.8). Der Farnesylrest
besteht aus einer Kette von 15, der Geranylgeranylrest aus 20 Kohlenstoffatomen
[193]. Ob ein Protein farnesyliert oder geranylgeranyliert wird, hängt von der Erkennungssequenz am Carboxyterminus ab. Handelt es sich bei der beliebigen
Aminosäure um Serin, Methionin, Zystein, Alanin oder Glutamin wird das Protein
farnesyliert. Liegt Isoleuzin oder Phenylalanin vor erfolgt eine Geranylgeranylierung [194-196]. Eine Prenylierung kann bei vielen Proteinen stattfinden. Die am
häufigsten prenylierten Proteine sind jedoch kleine G-Proteine, die in zelluläre
Vorgänge wie Signaltransduktion, Zytoskelettorganisation und Wachstum involviert sind (1.8 und 1.9) [190]. Farnesyliert werden hauptsächlich Mitglieder der
Ras-Familie, die meisten anderen kleinen GTPasen werden geranylgeranyliert,
wie z.B. RhoA, RhoC oder Rap1A/B. Im Falle von RhoB ist sowohl eine Farnesylierung als auch eine Geranylgeranylierung möglich [194-196]. Vor der Prenylierung sind diese Proteine im Zytosol lokalisiert, durch die hydrophoben Isoprenoide
lokalisieren sie sich nun an den Membranen in der Zelle. Hier können auch weitere posttranslationale Modifikationen wie z.B. Methylierungen vorgenommen werden [197]. Die Prenylierung wird durch die Enzyme Farnesyltransferase und Geranylgeranyltransferase katalysiert. In Eukaryoten gibt es drei Prenyltransferasen:
Farnesyltransferase (FTase), Geranylgeranyltransferase I (GGTase I) und Geranylgeranyltransferase II (GGTase II), die auch Rab-GGTase genannt wird [195,
198, 199]. FTase und GGTase I, die auch CAAX-Prenyltransferasen genannt werden, bestehen aus einer identischen α-Untereinheit, sowie einer für die Prenyltransferase spezifischen β-Untereinheit [200, 201]. Farnesyl-PP oder Geranylgeranyl-PP binden mit ihrem Phosphatteil an eine hydrophobe Höhle in der
β-Untereinheit [201-203]. Die FTase kann aufgrund der Länge des Geranylgeranyl-PP nur an Farnesyl-PP binden, GGTase I hingegen an Farnesyl-PP und
Geranylgeranyl-PP, wobei die Bindung an Geranylgeranyl-PP sehr viel effizienter
ist [204]. Die GGTase II ist den CAAX-Prenyltransferasen strukturell ähnlich, jedoch weist sie an der α-Untereinheit noch zwei zusätzliche Domänen auf, deren
Funktion noch unbekannt ist. Funktionell unterscheidet sie sich von FTase und
GGTase I, da sie die Geranylgeranylierung ohne das CAAX-Erkennungsmuster
25
Einleitung
ausführen
kann.
Die
GGTase
II
geranylgeranyliert
ausschließlich
kleine
G-Proteine der Rab-Familie, die sie im Gesamten erkennt. Hierzu ist jedoch ein
weiteres Element, das Rab-Escort-Protein (REP) notwendig, was das zu prenylierende Protein mit der katalytischen Untereinheit der GGTase II zusammenbringt
[205, 206].
1.8 Der Mevalonatstoffwechselweg
Über den Mevalonatstoffwechselweg, der in allen Eukaryoten stattfindet, werden
Sterin-Isoprenoide wie Cholesterin und nichtsteroide Isoprenoide wie Farnesyl-PP
aus 3-Hydroxy-3-Methylglutaryl-Coenzym-A (HMG-CoA) synthetisiert (Abb. 1-6).
Zu Beginn wird HMG-CoA mit Hilfe der HMG-CoA-Reduktase (HMGR) zu Mevalonsäure reduziert. HMGR ist somit das limitierende Enzym dieses Stoffwechselweges und wird auf vielfältige Weise reguliert [145]. Herrscht ein Mangel an Sterinen, kommt es zu erhöhter Transkription von HMGR. Dies wird durch eine Familie
von Transkriptionsfaktoren, den Sterin regulierendes Element bindenden Proteinen, (sterol-regulatory element binding proteins, SREBPs) veranlasst. Andererseits steigt die Degradierungsrate von HMGR, wenn eine ausreichende Menge an
Isoprenoiden vorhanden ist [207, 208]. Die Mevalonatkinase (MK) katalysiert die
Phosphorylierung von Mevalonsäure zu Mevalonat-5-Phosphat. Ihre Aktivität wird
durch negative Rückkopplung über Geranylgeranyl-PP, Farnesyl-PP und GeranylPP reguliert [209]. Die Phosphorylierung von Mevalonat-5-Phosphat über ATP zu
Mevalonat-PP wird durch die Phosphomevalonatkinase (PMK) katalysiert, die
auch die Dephosphorylierung von Mevalonat-PP ermöglichen kann, je nachdem
wo das Gleichgewicht der Produkte und Substrate liegt [210]. FTase und GGTaseI
katalysieren die Prenylierung von Proteinen mit Farnesyl-PP oder Geranylgeranyl-PP und können durch Farnesyltransferaseinhibitoren (FTIs) oder Geranylgeranyltransferaseinhibitoren (GGTIs) inhibiert werden [211]. Durch die SqualenSynthase (SS) wird der erste Schritt der Cholesterinsynthese aus Farnesyl-PP
katalysiert. Bei dieser Reaktion entsteht Squalen, was in 19 weiteren Schritten zu
Cholesterin führt. SS wird durch Saragossasäure (ZA) gehemmt [212]. FTIs und
GGTIs sind synthetische Produkte und werden nicht von der Zelle selbst hergestellt, wohingegen ZA in einigen Pilzen produziert wird.
26
Einleitung
AcetylCoA+AcetoacetylCoA
HMG-CoA
STATINE
HMG-CoAReduktase
Mevalonsäure
Mevalonat-Kinase
Mevalonat-5-Phosphat
Phospho-Mevalonat-Kinase
Mevalonat-PP
IsopentenylPP-Isomerase
Mevalonat-PP-Decarboxylase
Isopentenyl-5-PP (IPP)
Dimethylallyl-PP
Geranyl-PP-Synthase
Geranyl-PP
Farnesyl-PP-Synthase
BIPHOSPHONATE
Farnesyl-PP-Synthase
Farnesyl-PP
Squalen-Synthase
Häm A
Ubiquinon
Dolichol
(-)
BIPHOSPHONATE
Geranyl-geranyl-PP-Synthase
Squalen
ZA
Geranylgeranyl-PP
Oxidosqualen
Protein-Prenylierung
Lanosterin
Steroid-Hormone
Cholesterin
Gallensäuren
Abbildung 1-6: Der Mevalonat-Stoffwechselweg
Modifiziert nach I. Buhaescu und H. Izzedine: Mevalonate pathway: A review of clinical
and therapeutical implications. Clinical Biochemistry, 2007. 40(9-10): p.575-584
PP: Pyrophosphat; IPP: Isopentenyl-Pyrophosphat; ZA: Saragossasäure FTIs: Farnesyltransferase-inhibitoren; GGTIs: Geranylgeranyltransferaseinhibitoren
27
Einleitung
1.9 Inhibitoren des Mevalonatstoffwechselweges
Wie bereits in 1.8 beschrieben gibt es seine Reihe von Möglichkeiten, Teile des
Mevalonatstoffwechselweg zu hemmen. Viele davon sind im therapeutischen Einsatz, um eine Vielzahl von Erkrankungen zu behandeln.
1.9.1 Statine
Eine weit verbreitete Gruppe zur Inhibition des Mevalonatstoffwechselweges sind
die Statine. Sie hemmen die HMG-CoA-Reduktase und somit den gesamten
Mevalonatweg. Ursprünglich wurden Statine zur Reduktion der Cholesterinsynthese bei Patienten mit einem hohen Risiko für kardiovaskuläre Erkrankungen eingesetzt und sind auf diesem Gebiet auch heute noch unter den weltweit meist genutzten Medikamenten [213]. Statine hemmen die Cholesterinsynthese, was zur
erhöhten Expression von Rezeptoren für Lipidproteine mit niedriger Dichte (lowdensity-lipoprotein, LDL) führt [214]. Hierdurch sinkt die LDL-Konzentration im Blut
um 20 – 50 % [215, 216]. Die Ergebnisse vieler experimenteller und klinischer
Studien weisen darauf hin, dass Statine so genannte pleiotropische Effekte haben.
Das sind Wirkungen, die unabhängig vom Haupteffekt, der Senkung von LDL auftreten. Hierzu zählen unter Anderem anti-inflammatorische und immunmodulatorische Effekte, antithrombotische Eigenschaften, Einfluss auf den Knochenmetabolismus, Verbesserung endothelialer Funktionen und antiproliferative Effekte [217].
Viele der pleiotropischen Effekte beruhen auf der Hemmung der Prenylierung von
G-Proteinen, die essentielle Rollen in Zellsignalwegen, Zelldifferenzierung, Proliferation, Zytoskelettdynamik und endo- sowie exozytotischen Transport spielen
[218, 219]. Hierdurch ergeben sich Möglichkeiten, die Statine in einer Reihe von
weiteren Erkrankungen wie Autoimmunerkrankungen [220, 221], multiple Sklerose
(MS) [222-224], RA [225], Sepsis [226, 227] und verschiedenen Arten von Krebserkrankungen einzusetzen [228-230].
Viele Studien wurden bereits zum Einsatz von Statinen bei malignen Erkrankungen durchgeführt. Es ist bekannt, dass G-Proteine der Rho-Familie bei vielen
Arten von Brustkrebs überexprimiert werden. Durch die Behandlung mit Statinen
werden RhoA und RhoC gehemmt [231]. In der Behandlung von Prostatakrebs
konnten gute Erfolge mit Statinen erzielt werden [232], was auf die folgenden
28
Einleitung
Mechanismen zurückzuführen sein könnte. Eine Suppression von RhoA führt zur
Aktivierung von Caspasen, die dann eine Apoptose hervorrufen. Eine Herunterregulierung des AKT-Signalweges könnte zur Inhibition von Migration, Invasion,
Koloniebildung und Proliferation der Tumorzellen führen. Außerdem ist eine verstärkte Proteolyse von Androgenrezeptoren, und Induktion von Autophagie durch
die Inhibition der posttranslationalen Modifikation denkbar [233-237]. Bei malignen
Bluterkrankungen könnten die Effekte von Statinen hauptsächlich das Ergebnis
apoptotischer und anti-inflammatorischer Effekte sein. Hier wurde in vitro gezeigt,
dass die verhinderte Prenylierung von Ras und RhoA und dadurch verminderte
Membranadhäsion zu einer reduzierten Aktivierung von ERK führt. Hierdurch werden Signalwege der Zelle gestört, wodurch es zu Apoptose und reduzierter Adhäsion, Migration und Chemotaxis der Tumorzellen kommt [238-241].
Statine haben weitgreifende immunmodulatorische Effekte. Sie zeigen Auswirkungen auf Immunzellen wie B-Zellen [242], T-Zellen [243, 244], Tregs [245], Makrophagen [246], DCs [243, 247] und endotheliale Zellen [248]. In einem Mausmodell
für MS, in dem experimentelle autoimmune Enzephalomyelitis (EAE) induziert
wurde, führte Atorvastatin zu reduzierter Expression von MHC-Klasse II-Molekülen
und den kostimulatorischen Molekülen CD80 und CD86 auf Mikrogliazellen. Die
T-Zellproliferation war reduziert und es lag eine veränderte Zytokinproduktion vor
[249]. Dies könnte das Resultat aus der verminderten Antigenpräsentation und
Kostimulation sein. In weiteren Experimenten hierzu konnte festgestellt werden,
dass das TH1/TH2-Gleichgewicht zu TH2 verschoben war [250]. Dies konnte durch
die Zugabe von L-Mevalonat, dem Produkt der HMG-CoA-Reduktase wieder aufgehoben werden. Somit lässt sich schließen, dass die Stoffwechselprodukte, die
nach der Umwandlung von HMG-CoA entstehen, für pathologische T-ZellAntworten verantwortlich sind. Im „major-mismatch"-Modell der Maus konnte auch
für GvHD gezeigt werden, dass eine Behandlung mit Statinen zu einer reduzierten
Expression von MHC-Klasse II-Molekülen und kostimulatorischen Molekülen führt.
Der GvHD-Schweregrad war reduziert, die T-Zellen wiesen ein TH2-Profil auf und
zeigten verminderte Proliferation. Die GvL-Effekte waren hier nicht reduziert [243].
Statine wurden bereits in einigen klinischen Studien bei Transplantationen im
Mensch eingesetzt. Hier zeigten beispielsweise Patienten, die Statine eingenommen hatten, weniger Abstoßungsreaktionen bei Herztransplantationen verglichen
29
Einleitung
mit Empfängern, die nicht mit Statinen behandelt wurden [251]. Es wurden ebenfalls bereits einige klinische Studien mit Statinen zur Behandlung von GvHD
durchgeführt. So zeigte sich, dass das Risiko einer Grad III oder IV aGvHD bei
Empfängern, die zusätzlich mit CsA behandelt wurden, deutlich reduziert war,
wenn der Spender oder Spender und Empfänger Statine einnahmen. Das Risiko
auf eine cGvHD blieb hier unverändert [252]. Eine weitere Studie zeigte jedoch,
dass mit CsA behandelte Patienten, dessen Spender Statine einnahmen reduzierte cGvHD-Raten zeigten, das Risiko auf eine aGvHD jedoch unverändert blieb.
Das Risiko auf ein Rezidiv der zugrunde liegenden malignen Erkrankung war hier
erhöht [146]. Eine andere Studie untersuchte die GvHD-Raten in Empfängern, die
selbst Statine einnahmen. Die Grade II-IV der aGvHD waren hier reduziert. Es
waren keine Unterschiede in den cGvHD-Raten zu erkennen und die GvL-Effekte
waren vergleichbar zu den unbehandelten alloHSZT-Rezipienten [253].
1.9.2 Prenyltransferaseinhibitoren
Prenyltransferaseinhibitoren sind mittlerweile Gegenstand vieler klinischer und
experimenteller Studien, die zum großen Teil die Wirkung auf Protoonkogene untersuchen. FTIs werden hauptsächlich zur Hemmung von Ras eingesetzt. Klinische Studien der Phase I und II zeigten eine signifikante Antitumoraktivität von FTI
bei einem akzeptablen Zytotoxizitätsprofil in verschiedensten malignen Erkrankungen. In Phase III-Studien war der Einsatz bei soliden Tumoren jedoch nicht
zufrieden stellend, die besten Behandlungserfolge zeigten sich bei malignen
hämatologischen Erkrankungen wie akuter myeloider Leukämie oder dem myelodysplastischen Syndrom [254, 255]. Neben der Behandlung von Tumorerkrankungen werden FTIs auch auf ihre anti-inflammatorische Wirkung hin untersucht. Im
Mausmodell konnte durch die Behandlung mit FTI eine durch Kollagen induzierte
Arthritis reduziert werden, was mit verminderter TNF-α und IL-1β-Sekretion verbunden war [256]. In einem weiteren Mausmodell wurde bei Stämmen mit unterschiedlichen MHC-Klasse II-Molekülen transplantierte Haut verzögert abgestoßen
wenn die Tiere mit FTI behandelt wurden [257]. Die T-Zelldifferenzierung und
-Proliferation konnten durch das FTI Cinnamaldehyd verändert werden [258, 259].
In vivo und in vitro konnten anti-inflammatorische Effekte nachgewiesen werden.
So waren in einer LPS aktivierten Leukämiezelllinie die Transkription von Chemo30
Einleitung
kinen wie dem Monozyten-chemotaktischen Protein (MCP)-1 und MCP-2, Zytokinen wie IL-1β, IL-6 und IFN-β und Signalmoleküle wie STAT-1 und Gen für die
Primärantwort der Differenzierung in myeloiden Zellen (myeloid differentiation
primary response gene 88, MyD88) inhibiert. In einem Mausmodell war bei LPS
induzierter Inflammation die Produktion von TNF-α, IL-6, MCP-1, IL-1β und Makrophagen-inflammatorischem Protein (MIP)-1α bei Behandlung mit dem FTI Tipifarnib reduziert [260]. Ebenfalls in vivo konnten die durch den nukleären Faktor
kappa B (NFκB) übermittelten proinflammatorischen Effekte durch FTI inhibiert
werden. Dies zeigte sich in reduzierter mRNA-Expression und Produktion der
Chemokine CCL2 und CXCL-1 [261].
Da GGTIs etwas später entdeckt und hergestellt wurden als FTIs, wurden diese
bisher hauptsächlich in experimentellen Studien eingesetzt. Es konnte bereits gezeigt werden, dass die anti-proliferativen Effekte von FTI verstärkt werden, wenn
zusätzlich noch GGTI verabreicht wird [262, 263]. Wie bei FTI wird auch die Wirkung von GGTI auf Tumorzellen durch reduzierte GTPase-Aktivität untersucht.
Eine Mutation von pggt1b, dem Gen, welches die GGTaseI kodiert, führte im
Mausmodell einer myeloproliferativen Erkrankung zu einem milderen Krankheitsverlauf. Das Überleben konnte jedoch nicht verbessert werden [265]. Auch die
Wirkungen von GGTI auf inflammatorische Prozesse wurden bereits in einigen
experimentellen Studien untersucht. Bei in vitro kultivierten Synoviozyten, die aus
Patienten mit RA gewonnen wurden, konnte durch Zugabe von Statinen Apoptose
induziert werden. Dieser Effekt wurde durch Kultur mit Geranylgeranyl-PP, nicht
aber durch Farnesyl-PP wieder aufgehoben. Inkubation mit GGTI führte ebenfalls
zur Apoptose der Synoviozyten [266]. Experimente mit siRNA zeigten, dass geranylgeranyliertes Rac1 eine wichtige Rolle im Überleben von synovialen Fibroblasten spielt. Westernblotanalysen machten deutlich, dass aktiviertes AKT, ein
Zielprotein von Rac1, das das Überleben der synovialen Fibroblasten fördert, in
diesen Zellen um bis zu 75 % reduziert vorlag, wenn die Geranylgeranylierung
inhibiert wurde [267]. In einem Mausmodell zum experimentellen Asthma konnte
gezeigt werden, dass die antigeninduzierte Eosinophileninfiltration der Atemwege
nahezu vollständig reduziert war, wenn die Mäuse mit GGTI behandelt wurden
[268].
31
Ziel der Arbeit
2 Ziel der Arbeit
Einige Studien konnten bereits positive Effekte von Statinen auf das Überleben
und die Schweregrade bei GvHD in Mäusen und Menschen zeigen [146, 243, 252,
253]. Untersuchungen im „major-mismatch“-GvHD-Mausmodell gaben bereits erste Hinweise darauf, dass die beobachteten Effekte der Statinbehandlung unter
anderem auf die reduzierte Farnesylierung von kleinen GTPasen zurückzuführen
sind [269]. Über die Rolle der Geranylgeranylierung in der GvHD ist bisher noch
nichts bekannt. Das Ziel dieser Arbeit war es, die Beobachtungen der FTIBehandlung zu bestätigen, auszuweiten und weiterhin die Effekte der Hemmung
der Geranylgeranylierung auf die GvHD zu untersuchen. Diese sollten abgegrenzt
werden von weiteren Wirkungen der Statine, wie die Hemmung der Cholesterinsynthese. Hierzu wurden die Rezipienten im „major-mismatch“-GvHD-Mausmodell
mit FTI, GGTI und ZA behandelt und auf Überleben, Zytokinproduktion, Rekonstitution des Thymus und Verhalten von T-Zellen und APCs hin untersucht, wobei in
vitro weitere funktionelle Aspekte dieser Zellen analysiert wurden. Weiterhin sollte
überprüft werden, ob die immunmodulatorischen Effekte durch Hemmung der
Prenylierung Auswirkungen auf die GvL-Effekte und antivirale Aktivität der Empfänger hatten.
Ein weiterer Aspekt dieser Arbeit beschäftigte sich mit der Rolle der γc in GvHD.
Zahlreiche Studien konnten zeigen, dass die γc-Zytokine bei der Entstehung einer
GvHD beteiligt sind. Diese Zytokine können die GvHD fördern, wie IL-2 [147, 148],
IL-7 [153] [152, 154], IL-15 [155, 157] und IL-21 [158] oder protektive Effekte haben, wie IL-4 [149]. Die Hemmung von JAKs, die im Signalweg der γc nachgeschaltet sind, hatten eine reduzierte GvHD zur Folge [159-161]. Die Rolle der γc im
Kontext der GvHD wurde bisher jedoch noch nicht untersucht. Somit wurden Empfängertiere im „major-mismatch“-GvHD-Mausmodell mit α-CD132, einem Antikörper, der die γc spezifisch hemmt, behandelt und die Auswirkungen auf Überleben
und Zytokinproduktion untersucht. Weiterhin sollte der Effekt der Hemmung der γ c
auf die Anzahl und Funktion der einzelnen immunologischen Zellpopulationen bei
einer GvHD analysiert werden. Besonders CD4+ und CD8+-T-Zellen sollten hinsichtlich ihrer Funktion untersucht werden.
32
Material und Methoden
3 Material und Methoden
3.1 Materialien
3.1.1 Mäuse
In den Versuchen wurden folgende Mausstämme verwendet: BALB/c (H-2d,
Thy1.2), FVB (H-2q, Thy1.2), C57BL/6 (H-2b, Thy1.2), C57BL/6.Perforin-/- (Perf-/-)
(H-2b, Thy1.2) und luziferasetransgene C57BL/6 Mäuse (C57BL/6 luc, H-2b, Thy1.1)
[270]. Die Perf-/--Mäuse wurden freundlicherweise von Prof. Ehl (Zentrum für chronische Immundefizienz, Universitätsklinikum Freiburg) zur Verfügung gestellt. Alle
Mäuse wurden von der Zentralen Klinischen Forschung (ZKF) des Universitätsklinikums Freiburg bezogen, wo sie zuvor unter spezifischen pathogenfreien (SPF)
Bedingungen gezüchtet und gehalten wurden. Alle Versuche erfolgten entsprechend den vom Regierungspräsidium Freiburg genehmigten Tierversuchsanträgen
(X-12/02J, G-08/102, G-10/62, G-11/114).
3.1.2 Zellen
Folgende Zelllinien wurden in der vorliegenden Arbeit verwendet: Die murinen
B-Zelllymphom-Zelllinien A20, A20luc und L1210, 293T-Zellen, die Hybridomzelllinie X63 sowie murine embryonale Fibroblasten (MEFs). Die A20-Zellen wurden
freundlicherweise von Prof. Negrin (Abteilung Knochenmarktransplantation, Institut
für Medizin, Universität Stanford, USA) zur Verfügung gestellt, die Transfektion zu
A20luc erfolgte wie in 3.2.2 angegeben. Aus der Gruppe von Prof. Diefenbach (Abteilung Immunologie, Institut für Medizinische Mikrobiologie und Hygiene, Universitätsklinikum Freiburg) wurden die L1210-Zellen freundlicherweise an unsere
Gruppe weitergegeben. Die MEFs wurden freundlicherweise in der Gruppe von
Prof. Pircher (Abteilung Immunologie, Institut für Medizinische Mikrobiologie und
Hygiene, Universitätsklinikum Freiburg) von Maike Hofmann isoliert und kultiviert.
Die GM-CSF produzierende Hybridomazelllinie X63 wurde von Ian Anderson
(Institut für Immunologie, Basel) hergestellt und freundlicherweise von Prof. Martin
(Hautklinik, Universitätsklinikum Freiburg) zur Verfügung gestellt.
33
Material und Methoden
3.1.3 Laborgeräte
Tabelle 3-1 Laborgeräte
Gerät
Hersteller
Axio Imager A2 Mikroskop
Zeiss, München
Bestrahlungskäfig
Werkstatt Universitätsklinikum Freiburg
Brutschrank für Zellkultur
Heraeus, Kleinostheim
CyAnTMADP Durchflusszytometer
Beckman Coulter, München
Eismaschine
Ziegra, Isernhagen
Entwicklermaschine
AGFA, München
Feinwaage
Sartorius, Göttingen
Gefrierschrank, -20°C
Siemens, Freiburg
Gefrierschrank, -80°C
Heraeus, Kleinostheim
IBL 637 Bestrahlungsanlage
Cis Bio, Berlin
IVIS Biolumineszenzkamera
Caliper Life Sciences, Rüsselsheim
Kryotom
Leica, Wetzlar
Kühlschrank, 4°C
Liebherr, Biberach
Reax 2000 Vortex
Heidolph, Kelheim
Sterilwerkbänke
Heraeus, Kleinostheim
Thermomixer
Eppendorf, Hamburg
SunriseTM ELISA-Plattenleser
Tecan, Männerdorf, Schweiz
XCell SureLock™ Mini-Cell Electrophore- Invitrogen, Darmstadt
sis System (für Westernblot)
Zählkammer nach Neubauer
Brand, Wertheim
Zentrifugen
Heraeus, Kleinostheim
34
Material und Methoden
3.1.4 Viren
Das murine Zytomegalovirus (MCMV) vom Smith-Stamm [271] wurde freundlicherweise von Prof. Pircher zur Verfügung gestellt.
3.1.5 Vektoren
Tabelle 3-2 Vektoren
Vektor
Eigenschaften
Hersteller
pVSV-G Glycoprotein des vesikulären Stomatitisvirus, Clontech, SaintAmpicillinresistenz, CMV-Promotor
pCMV
Gag-pol-Region,
Germain, Frankreich
Ampicillinresistenz,
CMV- Cell Biolabs, Heidelberg
Promotor
pLLN
Lentiviraler Vektor aus HIV, interne ribosomale Ralph
Eintrittsstelle,
Neomycinresistenz,
Gräser,
Proqi-
Ampicilin- nase, Freiburg
resistenz
3.1.6 Verbrauchsmaterialien
Tabelle 3-3 Verbrauchsmaterialien
Produkt
Hersteller
AmershamTM Hyperfilm
GE Healthcare, München
Cellstar® Zellkulturplatten 6-, 12-, 24-, 48- Greiner Bio-One, Frickenhausen
Loch
Einwegskalpelle Nr. 10
Feather, Osaka, Japan
Hybond-P PVDF-Membran
GE Healthcare, München
Injektionsspritze, 2ml
B. Braun, Melsungen
MACSTM-Multistand
Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach
MACSTM-Säulen, MS und LS
Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach
MicrotestTM Zellkulturplatten, 96-Loch
BD Labware, Le Claix, Frankreich
35
Material und Methoden
NuPAGE® 4-12% Bis-Tris Gele
Invitrogen, Darmstadt
Nylon-Zellsiebe, 70 µm, 100 µm
BD Biosciences, Heidelberg
Objektträger
R. Langenbrinck, Emmendingen
Omnican Einmal-Insulinspritzen
B. Braun, Melsungen
Pipettenspitzen, 10 µl, 200 µl, 1000 µl
Biozym, Hamburg
Pipettenspitzen, steril 10 µl, 200 µl, 1000 µl Biozym, Hamburg
Polystyrol-Rundbodenröhrchen
BD Biosciences, Heidelberg
„FACS-Tube"
Reaktionsgefäße 1,5 ml, 2 ml
Sarstedt, Nürnbrecht
Reaktionsgefäße, 15 ml, 50 ml „Falcon“
Greiner Bio-One, Frickenhausen
Sterican Kanüle, 23G
B. Braun, Melsungen
Stripette® Pipetten, 5 ml, 10 ml, 25 ml
Corning Inc., Wiesbaden
Tissue-Tek®Cryomold®standard,
Sakura Finetek, Staufen
25x20x5 mm
Transferpipetten
Sarstedt, Nürnbrecht
Transwell® 24-Lochplatte, 6,5 mm, Poren- Corning Inc., Wiesbaden
größe 5 oder 3 µm
Zellkulturschalen 100x20 mm, 60x15 mm
Greiner Bio-One, Frickenhausen
3.1.7 Reagenzien
Tabelle 3-4 Reagenzien
Produkt
Hersteller
2-Mercaptoethanol
Gibco, Darmstadt
2-Propanol
Carl Roth, Karlsruhe
Ammoniumchlorid
Merck, Darmstadt
36
Material und Methoden
AnnexinV-Alexa Fluor 488
BD Biosciences, Heidelberg
Aqua ad injectabilia
B. Braun, Melsungen
Bovines Serum-Albumin (BSA), 30%
Sigma-Aldrich, Taufkirchen
Calciumchlorid
Sigma-Aldrich, Taufkirchen
Camptothecin
Sigma-Aldrich, Taufkirchen
Carboxyethylzellulose
Sigma-Aldrich, Taufkirchen
Carboxyfluoreszein Diazetat Succinimidyl Invitrogen, Darmstadt
Ester
CsA
Novartis, Basel, Schweiz
Cytofix/Cytoperm Plus, mit GolgiPlug
BD Biosciences, Heidelberg
D-Luziferin
Biosynth, Staad, Schweiz
Einfriermedium (Tissue-Tek O.C.T Com-
Sakura Finetek, Staufen
pound)
Eosin
Thermo Scientific, Ulm
Ethanol
Sigma-Aldrich, Taufkirchen
Ethylendiamintetraacetat (EDTA)
Merck, Darmstadt
Fetales Kälberserum (fetal calf serum) PANTM Biotech, Aidenbach
(FCS)
Forene 100 % (Isofluran)
Abbott, Wiesbaden
Formaldehyd
Riedel-de Haen, Seelze
FTI/GGTI/ZA
Sigma-Aldrich, Taufkirchen
GM-CSF
Überstand aus X63- Zellkultivierung in
der Arbeitsgruppe
Hämatoxilin
Dako, Hamburg
HCl
Sigma-Aldrich, Taufkirchen
HEPES
Sigma-Aldrich, Taufkirchen
Hexadimethrinbromid
Sigma-Aldrich, Taufkirchen
37
Material und Methoden
Ionomycin
Sigma-Aldrich, Taufkirchen
Kristallviolett
Sigma-Aldrich, Taufkirchen
LPS von Salmonella enterica
Sigma-Aldrich, Taufkirchen
Luminol
Sigma-Aldrich, Taufkirchen
M164-PE
Hergestellt von Oliver Schweier
Methanol
VWR, Darmstadt
Na2HPO4
Sigma-Aldrich, Taufkirchen
NaCl
VWR, Darmstadt
NaN3
Sigma-Aldrich, Taufkirchen
Natriumpyrovat, 100 nM
Gibco, Darmstadt
NEA
Gibco, Darmstadt
Neomycin/G418
PAA, Cölbe
NuPAGE® Antioxidant
Invitrogen, Darmstadt
NuPAGE® Reducing agent (10x)
Invitrogen, Darmstadt
Penicillin/Streptomycin (P/S)
Gibco, Darmstadt
Phalloidin-Alexa Fluor 488
Invitrogen, Darmstadt
Phorbol 12-Myristat 13-Acetat (PMA)
Sigma-Aldrich, Taufkirchen
Phosphataseinhibitor-Cocktail
Sigma-Aldrich, Taufkirchen
Polybren
Sigma-Aldrich, Taufkirchen
pp89-PE
Hergestellt von Oliver Schweier
Propidiumiodid (PI)
Sigma-Aldrich, Taufkirchen
rekombinantes humanes IL-15
ImmunoTools, Friesoythe
rekombinantes humanes IL-7
ImmunoTools, Friesoythe
rekombinantes murines CXCL12
R&D, Wiesbaden
rekombinantes murines IL-2
PeproTech, Hamburg
rekombinantes murines IL-21
Sigma-Aldrich, Taufkirchen
38
Material und Methoden
Tris(hydroxymethyl)-aminomethan (TRIS)
AppliChem, Darmstadt
Triton X-100
Fluka, St. Gallen, Schweiz
Trypanblau
Biochrom AG, Berlin
Tween20
Sigma-Aldrich, Taufkirchen
Xylen
VWR, Darmstadt
3.1.8 Reaktionssystemansätze
Tabelle 3-5 Reaktionssystemansätze
Produkt
Hersteller
ARKTM Peroxidase
Dako, Hamburg
Cytometric Bead Assay Mouse Inflammation BD Biosciences, Heidelberg
Kit (CBA)
Dynabeads® mouse T-activator CD3/CD28
Life Technologies, Darmstadt
ECL Plus Western Blotting Detection System GE Healthcare, München
Kit®
Mouse Vβ TCR Screening Panel
BD Biosciences, Heidelberg
Pan T Cell Isolation Kit II
Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach
Protein Quantification Kit, BCA
Thermo Scientific, Ulm
α-CD4-Micro Beads
Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach
α-CD8-Micro Beads
Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach
39
Material und Methoden
3.1.9 Antikörper für Durchflusszytometrie
Tabelle 3-6 Antikörper für Durchflusszytometrie
Alle Antikörper binden, soweit nicht anders angegeben, an das murine Antigen.
Antigen
Fluorochrom
Klon
Hersteller
CD3
APC / Pacific Blue / PE
17A2
BioLegend, Fell
CD4
APC / Pacific Blue / PE /
GK1.5/RM4-5
BioLegend, Fell
53-6.7
BioLegend, Fell
M1/70
BD Biosciences, Heidel-
FITC
CD8
APC / FITC / PE / Pacific
Blue
CD11b
PE
berg
CD11c
APC / Pacific Blue
HL3/N418
BioLegend, Fell
CD19
APC
6D5
BioLegend, Fell
CD25
PE / APC
PC61
BioLegend, Fell
CD27
PE
LG.3A10
BioLegend, Fell
CD40
FITC
3/23
BioLegend, Fell
CD45
FITC / PE / Pacific Blue
30F11
BioLegend, Fell
CD62L
APC
MEL-14
BioLegend, Fell
CD69
APC
H1.2F3
eBioscience, Frankfurt
CD80
PE / Pacific Blue
16-10A1
BioLegend, Fell
CD86
FITC / Pacific Blue
GL-1
BioLegend, Fell
CD107a
FITC
1D4B
BioLegend, Fell
CD127
PE
A7R34
eBioscience, Frankfurt
F4-80
FITC
BM8
BioLegend, Fell
GB11
BD Biosciences, Heidel-
GranzymB PE
(human)
GranzymB FITC
berg
NGZB
40
eBioscience, Frankfurt
Material und Methoden
H-2kb
PE / Pacific Blue
AF6-88.5
BD Biosciences, Heidelberg
H-2kd
PE
SF1-1.1
BD Biosciences, Heidelberg
H-2kq
FITC
KH114
BioLegend, Fell
I-A/ I-E
PE
M5/114.15.2
BioLegend, Fell
IFN-γ
PE
XMG1.2
eBioscience, Frankfurt
IL-2
FITC
JES6-5H4
BioLegend, Fell
IL-4
APC
11B11
eBioscience, Frankfurt
IL-10
APC
JES5-16E3
BD Biosciences, Heidelberg
IL-17
APC / FITC / Pacific Blue
TC11-18H10
BD Biosciences, Heidelberg
KLRG1
APC
2F1
eBioscience, Frankfurt
Ly6G
PE
1A8
BioLegend, Fell
NK1.1
APC
PK136
BioLegend, Fell
PDGFR
PE
APA5
BioLegend, Fell
Perforin
Pacific Blue
dG9
BioLegend, Fell
Perforin
APC
eBioOMAK-D
eBioscience, Frankfurt
UEA-1
FITC
polyklonal
LifeSpan, Seattle, USA
(human)
3.1.10 Antikörper für immunhistochemische Analysen
Tabelle 3-7 Antikörper für immunhistochemische Analysen
Antigen
Markierung
Klon
Wirt
Hersteller
Cytokeratin 5
keine
polyklonal
Kaninchen
Covance, München
Kaninchen IgG
Biotin
polyklonal
Ziege
Jackson, Hamburg
41
Material und Methoden
3.1.11 Antikörper für Westernblot
Tabelle 3-8 Antikörper für Westernblot
Antigen
Markierung
Wirt
Hersteller
ERK
keine
Kaninchen
Cell Signaling, Frankfurt
phosphoryliertes
keine
Kaninchen
Cell Signaling, Frankfurt
S6
keine
Kaninchen
Cell Signaling, Frankfurt
phosphoryliertes
keine
Kaninchen
Cell Signaling, Frankfurt
β-Aktin
keine
Kaninchen
Cell Signaling, Frankfurt
Kaninchen IgG
Meerrettich-peroxidase Ziege
ERK
S6
(horseradish
Cell Signaling, Frankfurt
peroxi-
dase, HRP)
3.1.12 Neutralisierende Antikörper für in vivo Experimente
Tabelle 3-9 Neutralisierende Antikörper für in vivo Experimente
Antigen
Klon
Hersteller
γc (CD132)
9B5
Novartis, Basel, Schweiz
CsA (Isotyp-Kontrolle)
ACE26243
Novartis, Basel, Schweiz
3.1.13 Zellkulturmedien und Puffer
Tabelle 3-10 Zellkulturmedien und Puffer
Produkt
Hersteller
Annexin-Puffer (10x)
BD Biosciences, Heidelberg
CellTrace™ CFSE Cell Proliferation Kit
Invitrogen, Darmstadt
Cytofix / Cytoperm Plus
BD Biosciences, Heidelberg
DMEM (+4,5 g/l Glukose)
Gibco, Darmstadt
42
Material und Methoden
FoxP3 Fixation/Permeabilisation kit
eBioscience, Frankfurt
NuPage® MES SDS running buffer (20x)
Invitrogen, Darmstadt
NuPage®LDS Samplebuffer (4x)
Invitrogen, Darmstadt
Pancoll human
PANTM Biotech, Aidenbach
Phosphatgepufferte Saline (phosphate buf- PAA, Cölbe
fered saline, PBS)
RIPA Lysis buffer System (inkl. Phenylme- Santa Cruz, Kempten
thylsulfonyl Flurid, Proteaseinhibitor, Natriumorthovanadat)
RPMI-1640
Gibco, Darmstadt
3.1.13.1 Angesetzt für Zellkultur
DMEM-Kulturmedium
500 ml DMEM + 50 ml FCS + 5 ml Penicillin/Streptomycin + 5 ml NEA + 5ml
Natriumpyrovat + 10 ml L-Glutamin
RPMI-Kulturmedium
500 ml RPMI 1640 + 50 ml FCS + 5 ml Penicillin/Streptomycin
DC-Kulturmedium
RPMI-Kulturmedium + 40 ng / ml GM-CSF
Erytrozytenlysepuffer
7,47 g NH4Cl in 900 ml Aqua dest. + 2,059 g TRIS + 100 ml Aqua dest. pH 7,65
HEBS (2x)
280 mM NaCl + 50 nM HEPES + 1,5 mM Na2HPO4. Der Puffer wurde exakt auf
pH 6,8, 7,05 und 7,2 eingestellt und jeweils eine Kultur damit angesetzt.
43
Material und Methoden
3.1.13.2 Angesetzt für funktionelle Versuche
Proliferationsmedium
50 ml RPMI-Kulturmedium + 25 µl 2-Mercaptoethanol (2,5x10-5 M)
Migrationsmedium
49 ml RPMI 1640 + 1 ml FCS
Methylzellulose
1 g Carboxyethylzellulose + 100 ml DMEM-Kulturmedium
Kristallviolett
0,1 g Kristallviolett + 50 ml Ethanol + 50 ml Aqua dest.
3.1.13.3 Angesetzt für Durchflusszytometrie
FACS-Puffer
500 ml PBS + 10 ml FCS + 0,375 g EDTA + 2,1 ml NaN3
FACS-Fixierungspuffer
PBS + 2 % Formaldehyd
3.1.13.4 Angesetzt für Westerblot
Lysepuffer
50 ml RIPA-Lysis buffer + 500 µl Phenylmethylsulfonyl Flurid + 1 ml Proteaseinhibitor + 500 µl Natriumorthovanadat + 500 µl Phosphatase-Inhibitor
Transferpuffer
849 ml Aqua dest. + 50 ml NuPAGE® Transferpuffer + 100 ml Methanol + 1 ml
NuPAGE® Antioxidant
TBS
80 g NaCl + 29,2 g TRIS-HCL + 1 l Aqua dest.
TBS-Tween (TBST)
999 ml TBS + 1 ml Tween®20
44
Material und Methoden
Blockingpuffer
5 % BSA + 5 % Milchpulver in TBST
3.1.13.5 Angesetzt für Histologie
Tris-Puffer
12,11 g TRIS + 1 l Aqua dest.
Blockingpuffer
50 ml PBS + 2,5 g BSA
3.1.14 EDV-Programme
Tabelle 3-11 EDV-Programme
Programm
Hersteller
Anwendung
Endnote X5
Thomson Reuters
Referenz-Verwaltung
FlowJo7/8
BD Biosciences
Analyse durchflusszytometrischer Daten
GraphPad Prism GraphPad Software Inc.
Datenverwaltung, statistische Auswer-
5.0
tung
Living Image 3.2
Caliper Life Sciences
Gewinnung und Analyse der BLI-Daten
Magellan
Tecan
Gewinnung und Auswertung der CBADaten
Summit v4.3®
Dako Cytomation
Messung der durchflusszytometrischen
Daten
Tierbase
Client 4D
Verwaltung der Mausstämme, Züchtung
V12
und Bestellung
Microsoft Office
Microsoft
ImageJ 1.46
National
Erstellung der Arbeit
Institute
of Quantitative Auswertung der Western-
Health
blotergebnisse
45
Material und Methoden
3.2 Methoden:
3.2.1 Zellkultur und Zellzählung
Alle Arbeiten mit Zellen, die für längere Kultivierung vorgesehen waren, erfolgten
unter sterilen Bedingungen. Sofern nicht anders angegeben wurden die Zellen bei
5 % CO2 und 37°C kultiviert. Die Zentrifugationsschritte erfolgten bei 300 g für 8
min. bei Raumtemperatur (sofern nicht anders angegeben). Zur Bestimmung der
Zellzahl wurden die Zellen im Verhältnis 1:10 mit Trypanblau verdünnt und mit Hilfe einer Zählkammer nach Neubauer ausgezählt, wobei nur die ungefärbten Zellen
berücksichtigt wurden.
3.2.2 Herstellung von Luziferase exprimierenden A20 Zellen
Die lentivirale Transduktion erfolgte durch Heide Dierbach. 3x106 adhärente 293
T-Zellen wurden in einer Zellkulturplatte ausgesät und über Nacht in DMEMKulturmedium bei 37°C und 10 % CO2 kultiviert. Dann wurde eine Transfektions
lösung aus 20 µg pLLN, 10 µg pVSV-G und 10 µg pCMV -Vektoren mit 100 µl
CaCl2, 40 µl DNA und 360 µl H2O und 500 µl HEBS hergestellt. Diese wurde tröpfchenweise auf die Zellen gegeben. Nach 3-5 Stunden konnte das Medium entfernt
und durch 20 ml frisches DMEM-Kulturmedium ersetzt werden. Nach 2 Tagen
wurde der Überstand der 293-T-Zellen entfernt und filtriert. Am Tag zuvor wurden
A20-Zellen in RPMI-Kulturmedium auf eine 100x20 mm Zellkulturschale ausgesät.
Nun konnte das Kulturmedium entfernt und durch den Überstand der 293-T-Zellen
ersetzt werden. Zusätzlich wurde Polybren in einer Konzentration von 4 µg/ml zugegeben. Nach 12 h wurde das Virus-enthaltende Medium von den A20-Zellen
entfernt und durch frisches RPMI-Kulturmedium ersetzt. Weitere 2 Tage später
wurde wieder der Überstand der 293-T-Zellen entnommen, filtriert und zu den
A20-Zellen gegeben. Wiederum konnte nach 12 h das Medium durch frisches
RPMI-Kulturmedium ersetzt werden. Nach 2 Tagen wurden die A20-Zellen 1:6
gesplittet und in je 10 ml RPMI-Kulturmedium weiterkultiviert. Die erfolgreich
transduzierten Zellen wurden durch Kultur mit 3 mg/ml Neomycin selektiert.
46
Material und Methoden
3.2.3 Erythrozytenlyse
Um die unerwünschten Erythrozyten aus einer Zellsuspension zu entfernen wurden die Zellen zentrifugiert, der Überstand verworfen und das Pellet in 2 ml
Erythrozytenlysepuffer resuspendiert. Nach einer Inkubationszeit von etwa 3 min
wurde die Reaktion durch Zugabe von 25 ml PBS gestoppt. Nach Zentrifugation
und Verwerfung des Überstandes konnten die Zellen im gewünschten Medium
aufgenommen werden.
3.2.4 Herstellung von Zellsuspensionen aus Milz, Lymphknoten oder
Thymus
Die Mäuse wurden durch zervikale Dislokation getötet. Anschließend wurde mit
Hilfe einer Operationsschere der Bauchraum eröffnet und die Milz bzw. Lymphknoten entnommen. Zur Entnahme des Thymus musste der Brustkorb geöffnet
und der Thymus vorsichtig herauspräpariert werden. Das Organ wurde in einen
sich in einer Zellkulturschale mit RPMI-Zellkulturmedium befindlichen 100 µmNylon-Sieb gelegt und mit einer sterilen Schere in mehrere Teile zerkleinert. Mit
Hilfe eines Spritzenstempels wurde durch mehrmaliges Drücken eine Zellsuspension hergestellt. Diese wurde in ein 50- ml-Falcon überführt und zentrifugiert. Der
Überstand wurde verworfen und das Zellpellet je nach weiterem Vorgehen in PBS,
FACS-Puffer oder RPMI-Zellkulturmedium aufgenommen.
3.2.5 Isolation von T-Zellen aus der Milz und den Lymphknoten
Zunächst wurde eine Zellsuspension (3.2.4) hergestellt und diese in 1 ml PBS
aufgenommen. Die Extraktion von CD4+- und CD8+-Zellen erfolgte mit an magnetische Kügelchen gekoppelten Antikörper und einer magnetischen Säule. Die
Splenozyten wurden 25 min mit MACSTM α-CD4-Micro Beads und α-CD8-Micro
Beads bei 4°C inkubiert, mit PBS gewaschen und in 500 µl PBS aufgenommen.
Währenddessen wurde die MACSTM-Säule mit PBS kalibriert. Daraufhin wurde die
Splenozytensuspension auf die Säule gegeben. Nach dreimaliger Zugabe von je 3
ml PBS wurden die gebundenen Zellen durch Druck mit einem Stempel auf die
Säule aus dem Magnet herausgelöst und in einem Reaktionsgefäß aufgefangen.
47
Material und Methoden
3.2.6 Herstellung von Inhibitor-Stock-Lösungen
Tabelle 3-12 Inhibitor-Stock-Lösungen
Inhibitor
Lösungsmittel
Konzentration
weitere Verdünnung
Farnesyltransferase-
Aqua injektabilis
2,5 mg / ml
-
DMSO
20 mg / ml
1:5,6 mit Aqua
inhibitor FTI-276 (FTI)
Geranylgeranyltransferase-inhibitor
injektabilis
GGTI-2133 (GGTI)
Squalensynthaseinhibitor
Aqua injektabilis
1,79 mg / ml
-
DMSO
-
1:5,6 mit Aqua
Saragossasäure (ZA)
Lösungsmittel (vehicle)
injektabilis
Inhibitor
FTI
Konzentration
Volumen
Verdünnung
Konzentra-
Volumen in
in vivo
in vivo
für in vitro
tion in vitro
vitro
20 mg/kg Kör-
140 µl
1:4,6*
10 µM
10 µl pro ml
pergewicht (KG)
GGTI
20 mg/kg KG
100 µl
1:6,3*
10 µM
10 µl pro ml
ZA
10 mg/kg KG
100 µl
1:2,4*
10 µM
10 µl pro ml
vehicle
-
100 µl
1:6,3
-
10 µl pro ml
* mit Aqua injektabilis zu einer Konzentration von 10 mM
3.2.7 Gewinnung des Knochenmarks
Die Mäuse wurden durch zervikale Dislokation getötet. Die unteren Extremitäten
wurden mit sterilen Skalpellen von dem Fell, der Haut und den Muskeln befreit, bis
der Knochen vollständig freilag. Daraufhin wurde der Femur aus dem Hüftgelenk
gelöst, das Knie- und das Fußgelenk wurden ebenfalls durchtrennt. Wurden aus
48
Material und Methoden
dem KM DCs generiert, wurde von nun an unter sterilen Bedingungen weitergearbeitet. Femur und Tibia wurden mit 70 %igem Ethanol gereinigt und am proximalen und distalen Ende mittels einem sterilem Skalpell eröffnet. Die Herauslösung
des KM erfolgte nun durch eine sterile Spritze, wobei die Knochen mehrmals von
proximal nach distal mit sterilem PBS durchgespült wurden.
3.2.7.1 Generation von dendritischen Zellen aus Vorläuferzellen des Knochenmarks (BMDCs)
Die herausgespülten Zellen wurden in ein 50 ml-Falcon überführt und zentrifugiert.
Nach Abnahme des Überstandes wurde eine Erythrozytenlyse (3.2.3) durchgeführt. Die Zellen wurden in einer Konzentration von 5x10 5 pro ml in DC-Medium
aufgenommen und je 10 ml auf eine 100x20 mm Zellkulturschale gegeben. Die
Inkubation erfolgte über 7 Tage. An Tag 3 wurden 10 ml frisches DC-Medium hinzugegeben. An Tag 5 wurden 10 ml des Medium nach Zentrifugation und Resuspension des Zellpellets durch 10 ml frisches DC-Medium ersetzt.
3.2.8 Restimulation von Splenozyten zur Färbung von intrazellulären
Zytokinen
Da die intrazellulären Zytokine in zu geringer Menge für eine durchflusszytometrische Untersuchung vorliegen, werden die Zellen restimuliert. Dies führt dazu, dass
die für die jeweiligen Zelltypen spezifischen Zytokine vermehrt produziert werden.
Die Zellen wurden auf eine Konzentration von 2x10 6 / ml in Proliferationsmedium
eingestellt und je 200 µl wurden auf einer 96-Loch-Platte ausplattiert. Um die Zellen unspezifisch über die Proteinkinase C und Kalciumeinstrom zu aktivieren wurden je 0,5 µg/ml Phorbol 12-Myristat 13-Acetat (PMA) und 50 ng/ml Ionomycin
zugegeben. Damit die gebildeten Zytokine im Golgi-Komplex akkumulieren wurde
1 h nach der Zugabe von PMA und Ionomycin 0,2 µl GolgiPlugTM zugegeben. 5 h
nach Beginn der Stimulation wurden die Zellen abzentrifugiert und zur Färbung in
FACS-Puffer aufgenommen.
49
Material und Methoden
3.2.9 Durchflusszytometrie
3.2.9.1 Oberflächenfärbung
Die zu untersuchenden Zellen wurden in einer Konzentration von etwa 1x10 6 in 50
µl FACS-Puffer aufgenommen. Die Fluorochrom gekoppelten Antikörper wurden in
einem Volumen von 0,5-1 µl (0,25-0,5 µg) hinzu gegeben und etwa 20 min bei 4°C
im Dunkeln inkubiert. Danach wurden die Zellen mit FACS-Puffer gewaschen und
in einem Volumen von etwa 200 µl FACS-Puffer aufgenommen.
3.2.9.2 Intrazelluläre Färbung
Nach der Oberflächenfärbung sollten in manchen Fällen zusätzlich intrazelluläre
Antigene angefärbt werden. Dies erfolgte mit dem Cytofix/Cytoperm Plus PufferSet. Hierzu wurden die Zellen nach dem letzten Waschschritt in 100 µl Fix/Perm
aufgenommen und 20 min. bei 4°C fixiert und permeabilisiert. Danach wurde zwei
Mal mit 1xPerm/Wash gewaschen wobei jeweils 10 min bei 4°C zentrifugiert wurde. Die Färbung erfolgte dann in 50 µl 1xPerm/Wash mit 0,5 µg Antikörper für 30
min bei 4°C im Dunkeln. Nach weiteren zwei Waschschritten mit 1xPerm/Wash
konnten die Zellen in 200 µl FACS-Puffer aufgenommen und analysiert werden.
3.2.9.3 Färbung mit Phalloidin
Die Zellen wurden nach der Oberflächenfärbung zunächst mit FACS-Fixierungspuffer für 10 min bei 4°C fixiert. Nach einem Waschschritt mit FACS-Puffer konnte
1 µl Phalloidin-Antikörper in 100 µl 2x Permbuffer (aus dem FoxP3 Fixation/Permeabilisation Kit) zugegeben werden. Die Inkubation erfolgte für 30 min bei 4°C im
Dunkeln. Nach 2 Waschschritten mit 1x Permbuffer konnten die Zellen in 200 µl
FACS-Puffer aufgenommen werden.
Die Daten wurden mit einem CyAnTMADP gemessen und dann mittels der FlowJo
7/8 Software analysiert.
50
Material und Methoden
3.2.10 Westernblot
2x106 Zellen wurden pelletiert, in 100 µl Lysepuffer aufgenommen und für 20 min
auf Eis inkubiert. Die Zentrifugation erfolgte für 10 min bei 9000 g und 4°C. Für die
Untersuchung wurde der Überstand verwendet. Die Proteinkonzentration wurde
mittels BCA Protein Quantification Kit bestimmt. 1-10 µg Protein wurde eingesetzt.
Es wurde 6,25 µl NuPAGE® LDS sample buffer (4x) und 2,5 µl NuPAGE® Reducing agent (10x) zugegeben, mit deionisiertem Wasser auf 18-25 µl aufgefüllt und
10 min bei 75°C inkubiert. Die Proben konnten nun auf ein 4-12 % Bis-Tris Gel
geladen werden. Die Gelelektrophorese erfolgte bei 150 V in 1xNuPAGE® Laufpuffer im XCell SureLock™ Mini-Cell Electrophoresis System für etwa 60 min. Vor
dem Transfer wurde eine PVDF-Membran zur Herbeiführung einer Hydrophilie in
Methanol eingelegt. Der Transfer erfolgte im XCell SureLock™ Mini-Cell Electrophoresis System in Transferpuffer bei 30 Volt für 45 min. Um unspezifische Bindungen zu vermeiden wurde die Membran anschließend 90 min bei Raumtemperatur in Blockingpuffer inkubiert. Dann wurde der Primärantikörper in der jeweils
angegebenen Konzentration in Blockingpuffer zugegeben und über Nacht bei 4°C
inkubiert. Danach wurde die Membran dreimal mit TBS-Tween gewaschen. Der an
HRP gekoppelte Sekundärantikörper wurde in der jeweils angegebenen Konzentration für 60 min bei Raumtemperatur in Blockingpuffer zugegeben. Nun wurde
dreimal für etwa 30 min mit TSBT gewaschen. Mit Hilfe des ECL Plus Western
Blotting Detection System Kit® kann die Enzymreaktion des HRP sichtbar gemacht
werden. Das System wurde wie vom Hersteller angegeben benutzt. Zur Entwicklung wurde der AmershamTMHyperfilm verwendet. Die quantitative Auswertung der
Bandenstärke erfolgte mit ImageJ 1.46.
3.2.11 Stimulation von T-Zellen mit Dynabeads® mouse T-activator
CD3/CD28
Inkubation von T-Zellen mit Antikörpern gegen CD3 und CD28 simulieren die Stimulation durch APCs, die zum einen mit dem Antigen an den TCR binden und
somit CD3 als Teil des TCR-Komplexes aktivieren und zum anderen mit ihren kostimulatorischen Molekülen an CD28 auf der T-Zelle binden. Somit wird hier eine
spezifische Aktivierung durch das passende Antigen simuliert. Das Waschen der
51
Material und Methoden
Kügelchen erfolgte wie in den Anweisungen des Herstellers empfohlen. Die
T-Zellen wurden wie in 3.2.5 angegeben isoliert und auf 2x106 Zellen / ml in
Proliferationsmedium eingestellt. Pro 1x106 Zellen wurden 25 µl Kügelchen (an αCD3 und α-CD28 gekoppelt) hinzugegeben. Die Inkubation erfolgte meist in 96Loch-platten in einem Volumen von 200 µl. Die Dauer der Aktivierung betrug zwischen 4 und 48 h.
3.2.12 In vitro Gemischte Lymphozyten-Reaktion (mixed lymphocyte
reaction; MLR)
Für in vitro Experimente, die eine MLR erforderten, wurden sowohl dendritische
Zellen als Stimulatoren als auch T-Zellen als Responder benötigt. Um eine allogene Stimulation herbeizuführen entstammten die BMDCs, sofern nicht anders angegeben, aus BALB/c-Mäusen und die Responderzellen aus C57BL/6-Mäusen.
Wie in 3.2.7 und 3.2.5 angegeben wurden DCs generiert und T-Zellen aufgereinigt. Die CD4+-Zellen wurden auf 2x106 Zellen pro ml Proliferationsmedium eingestellt und jeweils 100 µl in einer 96-Lochplatte ausplattiert. Die dendritischen Zellen wurden im angegebenen Verhältnis in 100 µl Proliferationsmedium dazugegeben. Um eine effektivere Aktivierung der Responder-Zellen herbeizuführen, wurden die DCs teilweise vor dem Ausplattieren mit einer Dosis von 30 Gray (Gy) bestrahlt.
3.2.13 In vitro Proliferationstest
Um die Proliferation von Lymphozyten messen zu können werden diese vor Beginn des Experiments mit Carboxyfluoreszein Diazetat Succinimidyl Ester (CFSE)
gefärbt. Die Succinimydil-Ester-Gruppe des Stoffes reagiert dabei mit intrazellulären Aminen der Zelle und bildet fluoreszierende stabile Komplexe. Die Konzentration des Farbstoffes verringert sich deswegen bei jeder Zellteilung um die Hälfte
und stellt so das Maß der Teilung dar. Diese kann mittels Durchflusszytometrie
(3.2.9) gemessen werden.
Die Färbung der CD4+-Zellen mit CFSE erfolgte mit dem CellTrace™ CFSE Cell
Proliferation Kit. Hierzu wurden die Zellen auf 2x106/ml in PBS + 5 % FCS einge52
Material und Methoden
stellt. Pro ml Zellsuspension wurde 1 µl der 1 mM Stock-Lösung gegeben und 10
min bei Raumtemperatur im Dunkeln inkubiert. Die Zellen wurden 3 mal mit 10 ml
PBS + 5 % FCS gewaschen und danach auf 2x10 6/ml in Proliferationsmedium
eingestellt. Die Zellen konnten nun für eine MLR (3.2.12) ausplattiert werden. Die
Inkubation erfolgte über 5 Tage bei 37°C in Anwesenheit von FTI, GGTI, ZA oder
vehicle. Danach erfolgte die duchflusszytometrische Analyse.
3.2.14 In vitro Migrationstest
Bei diesem Experiment wird die Migration von Zellen entlang eines Chemokingradienten gemessen. In vitro Migrationsstudien wurden sowohl mit DCs als auch mit
T-Zellen durchgeführt. Zunächst wurden die jeweiligen Zelltypen wie bereits beschrieben aufgereinigt oder generiert (3.2.5 und 3.2.7) und 24 h mit FTI, GGTI, ZA
oder vehicle inkubiert. In einer Transwell® 24-Lochplatte wurden 600 µl Migrationsmedium vorgelegt. In dieses wurde, wo angegeben, 100 ng/ml (T-Zellen) oder 50
ng/ml (DCs) CXCL12 gegeben. Nun konnten die Einsätze mit einer Porengröße
von 3 µm (DCs) oder 5 µm (T-Zellen) über den Löchern platziert werden. Die Zellen wurden auf 5x106 / ml in Migrationsmedium eingestellt und je 100 µl der Zellsuspension auf die Einsätze gegeben. Nach einer Inkubation von 2 h (T-Zellen)
bzw. 6 h (DCs) konnten die in die Löcher migrierten Zellen herauspipettiert und
mittels Durchflusszytometrie gezählt werden. Zum Vergleich wurden auch die in
den Einsätzen verbliebenen Zellen gemessen.
3.2.15 Apoptosetest
Die Apoptose von Zellen kann mit Hilfe von AnnexinV und Propidiumiodid (PI)
gemessen werden. AnnexinV bindet an Phosphatidylserin auf der Membranoberfläche, das bei toten Zellen vorkommt, während PI nur Zellmembranen von
apoptotischen Zellen durchdringen kann. Die Zellen wurden jeweils 24 h mit dem
zu testenden Inhibitor inkubiert. Wo angegeben wurde zunächst eine Oberflächenfärbung (3.2.9.1) durchgeführt. Danach wurden die Zellen herunterzentrifugiert, in
50 µl Annexin-Puffer aufgenommen und 20 min mit 1 µl FITC-gekoppeltem AnnexinV bei Raumtemperatur im Dunkeln inkubiert. Direkt vor der Analyse wurde in
53
Material und Methoden
jede Probe 50 µl Annexin-Puffer mit 0,5 µl PI zugegeben. Die toten Zellen wurden
durchflusszytometrisch ermittelt.
3.2.16 AlloKMT und GvHD-Erkrankungsmodell
Die allogene Knochenmarktransplantation (alloKMT) wurde im so genannten
„major-mismatch"-Modell (Haupt-Unverträglichkeits-Modell) durchgeführt. Das bedeutet, dass sich Spender und Empfänger in allen Antigenen des MHC unterscheiden.
Die Empfänger wurden mit 9 Gy (BALB/c) oder 10 Gy (C57BL/6) in einer Cäsiumquelle bestrahlt. Die Bestrahlung erfolgte aufgeteilt auf zwei Dosen im Abstand
von mindestens 4 h. Danach wurden 5x106 Knochenmarkzellen (3.2.7) und die
jeweils angegebene Menge an T-Zellen aufgereinigt (3.2.5) und intravenös (i.v.), in
einem Volumen von 100 µl PBS injiziert. Die Behandlung der Mäuse mit FTI,
GGTI, ZA oder vehicle (3.2.6) erfolgte täglich, beginnend vom Tag vor der Transplantation für insgesamt 10 Tage intraperitoneal (i.p.). Die Injektion von α-CD132,
des Isotyp-Kontrollantikörpers (beides 30 mg/kg KG) oder CsA (50 mg/kg KG) erfolgte an den Tagen -1, 1, 3, 6, 8, 10, 13 und 15 i.p (Antikörper) oder subkutan
(CsA).
Der Schweregrad der GvHD konnte zum einen durch Nachverfolgung des Überlebens und zum anderen durch histopathologische Analyse (3.2.17) ermittelt werden.
3.2.17 Organentnahme und Herstellung von Gefrierschnitten zur
histopathologischen Analyse
Die Tiere wurden an Tag 7 nach Transplantation getötet, Leber, Dünndarm und
Dickdarm entnommen und sofort in Einbettmedium in Plastikschalen gelegt und
mit flüssigem Stickstoff schockgefroren. Die gefrorenen Organblöcke wurden auf
Präparatehaltern platziert und mit Einbettmedium auf die Halter gefroren. Bei einer
Kammertemperatur von -25°C wurden Schnitte in einer Dicke von 5 µm mithilfe
eines Leica Kryotoms angefertigt. Anschließend wurden diese auf elektrostatisch
vorbehandelte Objektträger aufgenommen und danach direkt auf Trockeneis ge54
Material und Methoden
legt. Bei sofortiger Färbung der Schnitte, wurden diese nach dem Schneiden 15
min bei Raumtemperatur gelagert.
3.2.17.1 Hämatoxylin/Eosin-Färbung
Die Färbung der Schnitte erfolgte mit Hämatoxilin/Eosin (H/E). Hämatoxilin färbt
alle basophilen Strukturen (Zellkern, Ribosomen) blau an, wohingegen azidophile
Strukturen (Plasmaproteine) rot angefärbt werden. Zunächst wurden die Schnitte
für 40 sec in Hämatoxilin-Lösung gefärbt und 1 min in H2O gewaschen. Die Färbung mit Eosin erfolgte für 50 sec. Die Reinigung und Dehydrierung erfolgte jeweils 1 min in 70 % Ethanol, 100 % Ethanol und Xylen.
3.2.18 Histopathologische Analyse von Darm und Leber
Die in 3.2.17.1 hergestellten Präparate wurden verblindet in die Abteilung für Pathologie der Uniklinik Freiburg geschickt. Die Darm- und Leber-GvHD wurde nach
einem 2004 publizierten histopathologischen Wertesystem [272] beurteilt:
Tabellen 3-13a und 3-13b Histopathologisches Wertesystem zur Beurteilung
der GvHD
Darm:
Grad
0
Krypten-
1
2
3
Keine Gelegentlich
Einige
Die
Apopto-
bis
apoptotische
der
sen
wenig Körperchen
Körperchen
enthält
apoptotische
4
Mehrheit Die Mehrheit der
Krypten Krypten
ein >1
pro 10 Kryp- pro 10 Kryp- apoptotisches
ten
Inflam-
Keine Mild
enthält
apoptotische
Körperchen
ten
Körperchen
Moderat
Schwer, ohne Schwer, mit Ulze-
mation
Ulzeration
55
ration
Material und Methoden
Leber:
Grad
0
Involvier-
Keine Wenige invol- Viele
te Teile
Inflam-
1
vierte Teile
Keine Mild
2
3
invol- Die
4
meisten Die
meisten
vierte Teile
Teile beschädigt Teile beschädigt
Mild
Moderat
Schwer
mation
3.2.19 Immunhistochemische Färbung von Gefrier- und Paraffinschnitten
Die Organe wurden entweder wie in 3.2.17 angegeben schockgefroren und geschnitten, oder im Falle von Thymi nach der Entnahme in 4 % Paraformaldehyd
für mindestens 48 Stunden fixiert, danach in Paraffin eingebettet und geschnitten.
In diesem Fall ging der Färbung eine Entparaffinierung voraus. Hierzu wurden die
Objektträger zunächst 30 min in Xylol eingelegt. Darauf folgte die abwechselnde
Inkubation in 100 % Ethanol und Xylol dreimal für je 2 min. Danach wurde in einer
absteigenden Ethanolreihe (100 %, 96 %, 70 %, je 2 min) rehydriert und in destilliertem Wasser gespült.
Die immunhistologische Färbung der Paraffin- und Gefrierschnitte erfolgte mit dem
ARKTM Peroxidase Reaktionssystem, wie in der Benutzeranleitung angegeben.
Zunächst wurden die unspezifischen Bindungen durch Inkubation mit 0,1 % BSA
in TRIS (pH 7,5) geblockt. Nach 30 min wurde mit PBS gewaschen und jeweils für
10 min mit Avidin Blocking und Biotin Blocking inkubiert und wiederum mit PBS
gewaschen. Der Primärantikörper wurde in der Konzentration 2 µg/ml in 500 µl
PBS zugegeben und 1 h inkubiert. Nachdem dreimal jeweils 5 min mit PBS gewaschen wurde, wurde der an Biotin gekoppelte Sekundärantikörper ebenfalls für 1 h
hinzu gegeben. Danach wurde dreimal für 5 min mit PBS gewaschen und die Proben für 1 h mit dem StreAP-Komplex inkubiert. Darin war an Peroxidase gekoppeltes Streptavidin enthalten, welches an Biotin bindet. Das Substrat der Peroxidase
wurde in DAB+ Substrat-Puffer angesetzt und für etwa 20 min auf den Objektträgern inkubiert, die Umsetzung des Substrates führt zu Fluoreszenz. Danach wurde
56
Material und Methoden
5 min in Wasser gewaschen. Um die Gewebemorphologie beurteilen zu können
wurde danach eine Färbung mit Hämatoxylin (3.2.17.1) durchgeführt.
Zur mikroskopischen Begutachtung wurde ein Axioplan 2 Imaging Mikroskopsystem benutzt.
3.2.20 Histopathologische Analyse des Thymus
Aus den Thymi wurden zunächst Paraffinschnitte hergestellt um dann eine immunhistochemische Färbung durchzuführen (3.2.19). Um zwischen der Rinde und dem
Mark unterscheiden zu können, wurde hierfür Keratin 5 (K5) verwendet. Um die
Betroffenheit des Kortex beurteilen zu können, wurde der prozentuale Anteil an K5
negativen Arealen im Kortex gemessen. Von jedem Thymus wurden 4 Teile von
verschiedenen Arealen des Thymus analysiert, welche 50 µm voneinander entfernt lagen. Um das Ausmaß des Kortex richtig zu ermessen, wurde der prozentuale Anteil, als ein Maß für die Ausdünnung des Kortex, mit folgender Formel berechnet: ([Thymus gesamt –Markgebiet] / Thymus gesamt) x 100. Jeder Anteil
wurde für jeden Thymus gemittelt.
3.2.21 Biolumineszenzmessung
3.2.21.1 Luziferasemessung
Mithilfe der Biolumineszenzmessung (Bioluminescence Imaging, BLI) können Zellen, die das Enzym Luziferase exprimieren nicht-invasiv im lebenden Organismus
nachgewiesen und quantifiziert werden [270]. In dieser Arbeit exprimierten so genannte Luziferase-transgene Zellen (luc+) dieses aus dem Nordamerikanischen
Glühwürmchen Photinus Pyralis stammende Enzym konstitutiv unter der Kontrolle
des ß-Aktinpromotors. Nur luc+ Zellen sind in der Lage Luziferin zu oxidieren.
Hierbei findet folgende Reaktion statt:
Luziferase
Luziferin + ATP + O2
Oxyluziferin + PPi + CO2 + AMP + hυ
57
Material und Methoden
Die Photonenemmision kann mithilfe der Vivovision IVIS Lumina detektiert werden.
Für die BLI wurde den Mäusen 150 mg/kg KG Luziferin, gelöst in einem Volumen
von 200 µl Aqua injektabilis, i.p. injiziert (je 100 µl pro Seite). Nach 10 min wurden
die Mäuse mit 3 %igem Isofluran unter Sauerstoffzugabe betäubt und für 5 min die
BLI durchgeführt. Die Analyse erfolgte mithilfe der Living Image Software 3.2.
3.2.21.2 Myeloperoxidasemessung
Die BLI erlaubt auch die Messung aktiver Myeloperoxidase (MPO) in vivo durch
Injektion von Luminol i.p. Aktive MPO katalysiert die Umwandlung von Luminol zu
3-Aminophtalat unter Emmision von Photonen [273], welche wiederum mit BLI
detektiert werden kann.
Es wurden 200 mg/kg KG Luminol, gelöst in einem Volumen von 200 µl Aqua
dest., i.p injiziert (100 µl auf jeder Seite). Nach 10 min wurden die Mäuse mit
3 %igem Isofluran unter Sauerstoffzugabe betäubt und für 5 min die BLI durchgeführt. Die Analyse erfolgte mithilfe der Living Image Software 3.2.
3.2.22 A20-Leukämie/Lymphom-Modell (GvL-Effekt)
Um die GvL-Aktivität der transplantierten Donor-T-Zellen zu untersuchen, wurde
eine A20luc B-Zell-Leukämie-Zelllinie verwendet (3.1.2) für die bereits gezeigt wurde, dass sie zunächst ins Knochenmark migriert und sekundär lymphatische Organe wie die Milz infiltriert [274].
Die Bestrahlung und Behandlung der Tiere erfolgte wie in 3.2.16 angegeben.
2x105 A20luc-Zellen wurden in PBS gemeinsam mit 5x106 Knochenmarkzellen in
die laterale Schwanzvene injiziert. Um den Leukämiezellen das Anwachsen zu
ermöglichen wurden die T-Zellen (3x105) erst am Tag 2 nach Transplantation
appliziert. Die A20luc -Zellen konnten mittels BLI (3.2.21.1) verfolgt werden.
58
Material und Methoden
3.2.23 Messung der Zytokinkonzentration im Serum („Bead array“)
Die Gewinnung des Serums erfolgte an Tag 7 nach Transplantation durch direkte
intrakardiale Punktion, die von Robert Zeiser (Arbeitsgruppenleiter) durchgeführt
wurde. Das Blut wurde sofort bei 300 g für 5 min zentrifugiert. Das Serum befand
sich nun im Überstand, welcher zur weiteren Verarbeitung vorsichtig in ein neues
Gefäß überführt wurde. Das weitere Vorgehen erfolgte gemäß den Angaben des
Herstellers mit dem Cytometric Bead Array© Mouse Inflammation Kit. Die Analyse
der Daten wurde mittels Durchflusszytometrie durchgeführt.
3.2.24 Messung der Vß-Expression mittels Durchflusszytometrie
Die variablen Regionen des TCR weisen drei hypervariable Regionen, so genannte Komplementarität bestimmende Regionen (Complementarity determining regions, CDRs) auf, über die sie an das passende Antigen binden. Mithilfe des Mouse
Vβ TCR Screening Panel kann die Verteilung bestimmter Varianten dieser Region
gemessen werden. Bei einer polyklonalen Verteilung liegt ein breites Spektrum an
T-Zellspezifitäten vor, bei einer oligoklonalen Verteilung kann man von einer starken Alloreaktivität ausgehen. Mäuse wurden im C57BL/6=>BALB/c-Modell mit
3x105 T-Zellen transplantiert. An Tag 20 wurden die Milzen entnommen und Zellsuspensionen hergestellt. Die Messung wurde wie in den Herstellerangaben vorgegeben durchgeführt.
3.2.25 Zytotoxizitätstest („Killing assay“)
Um die Funktionalität von T-Zellen in vitro zu untersuchen wurden die A20 und die
L1210 B-Zell-Leukämie-Zelllinien verwendet (3.1.2). Zunächst wurde eine alloKMT
mit T-Zellen durchgeführt (3.2.16). Zwischen Tag 10 und 12 wurden die Milzen
und Lymphknoten entnommen und die T-Zellen mithilfe des Pan T cell isolation kit
aufgereinigt. Dieses Reaktionssystem erlaubt eine Aufreinigung der Zellen, ohne
dass diese an die magnetischen Kügelchen binden. Dies ist vor allem bei aktivierten T-Zellen der Vorteil, da diese nach Aktivierung ihre Korezeptoren CD4 bzw.
CD8 etwas herunterregulieren können.
59
Material und Methoden
Die Mäuse wurden wie in den jeweiligen Versuchen angegeben entweder mit Inhibitoren behandelt oder die T-Zellen nach der Inkubation mit den Inhibitoren inkubiert (3.2.6). Jeweils 2x105 Leukämiezellen wurden pro Loch auf einer 96-Lochplatte vorgelegt und mit der jeweils angegebenen Menge an T-Zellen kokultiviert.
Nach 6 h wurde zunächst eine Oberflächenfärbung gegen CD3 und anschließend
eine Färbung mit AnnexinV-FITC und PI (3.2.15) durchgeführt um die Zytotoxizität
der T-Zellen bestimmen zu können. Bei der durchflusszytometrischen Analyse
wurden alle CD3 positiven Zellen ausgeschlossen um nur die Viabilität der Leukämiezellen zu messen.
3.2.26 Murines Zytomegalovirus (MCMV)-Modell
Um die Immunantwort auf Virusinfektionen untersuchen zu können wurde das
murine Zytomegalovirus (MCMV) verwendet [271] (3.1.4). Die Mäuse wurden zunächst einer alloKMT ohne T-Zellen unterzogen. Nach 30 Tagen wurden 1x105
Flecken-bildende Einheiten (plaque forming units, PFU) MCMV i.p. injiziert. 28
Tage nach der Infektion wurden die Mäuse durch Inhalation von Kohlenstoffdioxid
(CO2) getötet und die Milzen, Lebern und Speicheldrüsen entnommen.
3.2.26.1 Färbung der Splenozyten
Aus den Milzen wurde eine Zellsuspension hergestellt (3.2.4). Die virusspezifischen T-Zellen wurden durch eine so genannte Tetramerfärbung detektiert. Hierzu
wurden Tetramere von Klasse I-MHC-Molekülen verwendet, die die MCMV-Epitope pp89 und M164 präsentieren [275]. Diese waren an PE gekoppelt, sodass
der Nachweis der spezifischen Zellen mithilfe der Durchflusszytometrie erfolgen
konnte [276].
3.2.26.2 Messung der Virusaktivität, Fleckentest („Plaque assay")
Speicheldrüsen und Leber wurden durch Ultraschall homogenisiert und ein so genannter „Plaque assay" durchgeführt. Hierbei wurden zunächst MEFs in einer
24-Lochplatte über Nacht kultiviert um eine konfluente Schicht zu erhalten. Das
Homogenisat wurde in einer Verdünnungsreihe jeweils 1:10 mit DMEM-Kultur60
Material und Methoden
medium verdünnt. Nachdem das Medium von den MEFs abgenommen war, wurden die verschiedenen Konzentrationen des Homogenisats in 2 ml dazu gegeben.
Hierbei wurde mit der unverdünnten Probe begonnen und bei 1:100000 geendet.
Nach 2 h konnte das Medium abgenommen und durch Methylzellulose ersetzt
werden, wodurch die Virusausbreitung verhindert wird. Nach 5 Tagen konnte mit
Kristallviolett gefärbt werden, welches von gesunden Zellen aufgenommen wird.
Die Viruslast konnten wie folgt berechnet werden: Anzahl nicht gefärbte Flecken x
Verdünnungsfaktor / Volumen = PFU/ml
3.2.27 Isolation der Lymphozyten aus menschlichem Blut
Die Blutproben wurden zum einen von freiwilligen gesunden Spendern oder von
freiwilligen Patienten der Abteilung Hämatologie und Onkologie der medizinischen
Universitätsklinik Freiburg erhalten. Die Patienten hatten vor der Blutspende eine
Konditionierungstherapie (Bestrahlung oder Chemotherapie) erhalten.
Mittels Pancoll kann in einem Dichtegradienten Blut in seine Bestandteile durch
physikalische Unterschiede wie Größe und Ladung aufgetrennt werden. Das Blut
wurde zunächst 1:3 mit BPS verdünnt. In einem 50-ml-Falcon wurden 15 ml Pancoll vorgelegt und sehr vorsichtig und langsam mit dem Blut-PBS-Gemisch überschichtet. Nun wurde 30 min bei 400 g ohne Bremse zentrifugiert, wobei sich die
unterschiedlichen Bestandteile des Blutes im Dichtegradienten anordnen konnten.
Die Lymphozyten waren nun als weiß-gelbliche Phase zu erkennen, die mit einer
Transferpipette in ein neues 50-ml-Falcon überführt werden konnte. Dieses wurde
mit PBS auf 50 ml aufgefüllt und bei 300 g 15 min zentrifugiert. Danach wurde der
Überstand verworfen, das Zellpellet in 15 ml PBS resuspendiert und 10 min bei
300 g zentrifugiert. Der Überstand wurde verworfen und das Zellpellet nun zur
Färbung in FACS-Puffer resuspendiert.
3.2.28 Statistik
Statistische Analysen und die Verarbeitung der Daten wurden mit GraphPad Prism
5.0 durchgeführt. Daten wurden immer als Mittelwerte ± Standardfehler des Mittelwerts (standard error of mean, SEM) angegeben. Unterschiede im Überleben
61
Material und Methoden
der Tiere (Kaplan-Meier-Überlebens-Kurven) wurden durch den log-rank Test analysiert. Der Vergleich aller anderen Gruppen wurde mit dem student's t test durchgeführt. Ein p-Wert <0,05 wurde als statistisch signifikant angenommen und in den
Abbildungen angegeben.
62
Ergebnisse
4 Ergebnisse
4.1 Untersuchungen zur Rolle der Prenylierung in der GvHD
In allen Experimenten dieses Teils wurden die Effekte von FTI, GGTI und ZA im
GvHD-Modell untersucht. Ergebnisse für FTI in vivo lagen teilweise bereits vor
[269, 277], sodass aus Tierschutzgründen in einigen Versuchen diese Gruppe
ganz ausgelassen oder nur mit einer sehr geringen Anzahl an Tieren wiederholt
wurde.
4.1.1 Überleben
im
„major-mismatch"-Modell
bei
Hemmung
der
Prenylierung
Um die Auswirkungen der Gabe von FTI, GGTI oder ZA auf das Überleben zu untersuchen,
wurden
alloKMT-Experimente
in
zwei
verschiedenen
„major-
mismatch"-Modellen durchgeführt. Zum einen wurden BALB/c-Mäuse als Empfänger von C57BL/6 -BM und -T-Zellen eingesetzt (C57BL/6 => BALB/c), zum anderen wurden Zellen von FVB-Mäusen in C57BL/6-Empfänger transplantiert (FVB =>
C57BL/6). In beiden Modellen konnte durch Zugabe von T-Zellen eine letale
GvHD induziert werden (Abb. 4-1A, B KM+Tc/vehicle), wobei die Behandlung der
transplantierten Versuchstiere mit FTI oder GGTI zu signifikant verbessertem
Überleben führte (Abb. 4-1A, B). Durch die gleichzeitige Gabe von FTI und GGTI
(KM+Tc/FTI+GGTI) konnte eine signifikante Verlängerung des Überlebens im
Vergleich zur Kontrollgruppe herbeigeführt werden, jedoch nicht im Vergleich zu
den Gruppen, die nur mit FTI oder GGTI behandelt wurden (Abb. 4-1A, B). Die
Injektion von ZA führte nicht zu einer Verlängerung des Überlebens (Abb. 4-1A)
und wurde somit nur im C57BL/6=>BALB/c-Modell eingesetzt.
63
Ergebnisse
A
B
C57BL/6=>BALB/c
100
Überleben [%]
Überleben [%]
100
80
60
40
20
0
FVB=>C57BL/6
0
80
60
40
20
0
20
40
60
80 100
Zeit nach alloKMT [Tage]
KM (n=5)
KM+Tc/vehicle (n=9)
KM+Tc/FTI (n=3 p=0,03)
KM+Tc/GGTI (n=10 p=0,002)
KM+Tc/FTI+GGTI (n=8 p=0,0007)
KM+Tc/ZA (n=5 p=0,10)
0
20
40
60
80 100
Zeit nach alloKMT [Tage]
KM (n=10)
KM+Tc/vehicle (n=10)
KM+Tc/FTI (n=10 p=0,03)
KM+Tc/GGTI (n=10 p=0,01)
KM+Tc/FTI+GGTI (n=5 p=0,006)
Abbildung 4-1: Überleben nach Inhibition der Prenylierung im „major-mismatch"Modell. Es wurde eine alloKMT mit 1x105 T-Zellen durchgeführt. Die Behandlung der Tiere erfolgte wie in den Methoden angegeben, wobei in der KM+Tc/FTI+GGTI-Gruppe jeweils 20 mg/kg KG täglich verabreicht wurden. (A) Als Empfängertiere dienten BALB/cMäuse, als Spender C57BL/6-Mäuse. Der Versuch wurde in zwei unabhängigen Experimenten durchgeführt und in der abgebildeten Überlebenskurve zusammengefasst. (B) Als
Empfängertiere dienten C57BL/6-Mäuse, als Spender FVB-Mäuse. Der Versuch wurde in
zwei unabhängigen Experimenten durchgeführt und in der abgebildeten Überlebenskurve
zusammengefasst. Die p-Werte in den Klammern geben den Wert verglichen zur vehicleGruppe an. p-Werte verglichen mit FTI+GGTI: C57BL/6 =>BALB/c: FTI p=0,1, GGTI
p=0,3; FVB => C57BL/6: FTI p=0,3, GGTI p=0,4
4.1.2 GvHD-Schweregrad
und
proinflammatorische
Zytokine
bei
Behandlung mit FTI und GGTI
Bei der histopathologischen Untersuchung wurden zum einen die Inflammation
und zum anderen die apoptotischen Vorgänge der vorliegenden Organe (Leber
und Darm) untersucht. Diese wurden dann im kumulativen GvHD-Schweregrad
zusammengefasst. Da für FTI bereits gezeigt werden konnte, dass diese Werte
durch Behandlung reduziert werden [269, 277] wurden hier nur noch die Organe
von Mäusen untersucht, die mit Lösungsmittel, GGTI oder ZA behandelt wurden.
Der Inflammationsgrad lag in der vehicle- und der GGTI-Gruppe bei 1 (auf einer
Skala von 0 = keine bis 4 = schwer). Die Organe der Mäuse, die mit ZA behandelt
wurden, zeigten einen mittleren Inflammationsgrad von 1,83 (Abb. 4-2A, links).
Der Apoptose-Grad wurde in der GGTI-Gruppe verglichen mit der vehicle-Gruppe
signifikant von 2,83 auf 1,83 gesenkt. Die Behandlung mit ZA führte zu einem mittleren Apoptose-Wert von 3,5 (Abb. 4-2A, Mitte). Der kumulative GvHD64
Ergebnisse
Schweregrad, der die Inflammation und die Apoptose zusammenfasst, lag mit 3 in
der GGTI-Gruppe unter und mit 5,3 in der ZA-Gruppe über dem in der vehicleGruppe (3,83). Beide Werte erreichten jedoch keine Signifikanz (Abb. 4-2A,
rechts).
Inflammation
Kumulativer GvHD-Grad
Apoptose
3
4
KM+Tc/vehicle
p=0,04
KM+Tc/GGTI
3
KM+Tc/ZA
Apoptose-Grad
2
1
0
2
1
0
KM+Tc/vehicle
KM+Tc/GGTI
KM+Tc/ZA
IFN-
1.5
1.0
0.5
0.001
0.000
1.5
Kumulativ
6
4
2
0
KM+Tc/vehicle
KM+Tc/GGTI
KM+Tc/ZA
TNF-
1.5
p=0,003
KM+Tc(syngen)
p=0,005
KM+Tc/vehicle
KM+Tc/FTI
1.0
KM+Tc/GGTI
KM+Tc/ZA
0.5
p=0,002
p=0,002
Zytokinkonzentration [pg/ml]
(in Relation zu vehicle)
Zytokinkonzentration [pg/ml]
(in Relation zu vehicle)
B
Zytokinkonzentration [pg/ml]
(in Relation zu vehicle)
Inflammations-Grad
A
0.0
IL-6
KM+Tc(syngen)
KM+Tc/vehicle
KM+Tc/FTI
KM+Tc/GGTI
KM+Tc/ZA
1.0
0.5
0.0
Abbildung 4-2: GvHD-Schweregrad und proinflammatorische Zytokine nach Hemmung der Prenylierung. Mäuse wurden im C57BL/6=>BALB/c-Modell mit 3x105 T-Zellen
transplantiert und an Tag 7 analysiert. (A) Histopathologisch ermittelte Werte für die
Schwere der Inflammation (links), der Apoptose (Mitte) und kumulativ (zusammengefasst
aus Inflammation und Apoptose) (rechts). Gezeigt sind die Werte von Dünndarm und
Dickdarm jeweils dreier Mäuse pro Gruppe. (B) Das Blutserum wurde durch intrakardiale
Punktion gewonnen und die Konzentrationen von IFN-γ, TNF-α und IL-6 bestimmt. Es
wurden zwei unabhängige Experimente durchgeführt und zusammengefasst. Es wurden
folgende Anzahlen an Mäusen verwendet: Tc(syngen) n=3; vehicle n=6; FTI n=3; GGTI
n=6; ZA n=5; Die p-Werte sind angegeben, oder im Text erwähnt, wenn p<0,05
65
KM+Tc(syngen)
KM+Tc/vehicle
KM+Tc/FTI
KM+Tc/GTI
KM+Tc/ZA
Ergebnisse
Eine weitere Beurteilung der Schwere der GvHD kann durch die Konzentration
proinflammatorischer Zytokine im Blutserum vorgenommen werden. In diesem
KMT-Experiment erhielt eine Gruppe syngene T-Zellen, wodurch sich keine GvHD
entwickeln konnte. In dieser Kohorte wurden geringe Mengen der Zytokine IFN-γ,
TNF-α und IL-6 detektiert (Abb. 4-2B). Die Induktion einer GvHD mittels allogener
T-Zellen führte zu einem signifikanten Anstieg der Zytokine IFN-γ, TNF-α und IL-6
(IFN-γ p<0,0001; TNF-α p=0,04; IL-6 p=0,045). Wurden die Mäuse mit FTI oder
GGTI behandelt, zeigten sich signifikant reduzierte Konzentrationen von IFN-γ und
TNF-α. Die gemessene Menge an IL-6 war in der FTI-Gruppe um das 2,3fache
und in der GGTI-Gruppe um das 3fache reduziert. Jedoch erreichten diese Werte
keine Signifikanz. Die Zytokinwerte der Tiere, die mit ZA behandelt wurden, waren
vergleichbar mit denen der vehicle-Gruppe (Abb. 4-2B).
4.1.3 Expansion von T-Zellen in vivo bei Hemmung der Geranylgeranylierung
Bei der Entwicklung einer GvHD kommt es zunächst zu einer Akkumulation der
Donor-T-Zellen in den peripheren lymphatischen Organen, die dort proliferieren
um dann in die GvHD-Zielorgane auszuwandern [117]. Um dies in unserem
GvHD-Modell zu untersuchen, wurden KMT-Experimente durchgeführt, bei denen
T-Zellen, die aus luc+ Mäusen gewonnen wurden, transplantiert wurden. Für FTI
konnte bereits eine reduzierte T-Zellexpansion nachgewiesen werden [269, 277].
In der vehicle-Gruppe zeigte sich zunächst ein starkes Signal im Bereich der zervikalen Lymphknoten (Abb. 4-3A, oben rechts), welches sich dann auf den abdominalen Bereich verlagerte. Die gemessene Photonenstärke war signifikant reduziert, wenn die Mäuse mit GGTI behandelt wurden (Abb. 4-3A, oben links, unten,
B). Die Behandlung mit ZA führte zu keiner Änderung der T-Zellexpansion (Abb. 43A, oben rechts, unten, B).
66
Ergebnisse
A
KM+Tcluc/vehicle
KM+Tcluc/GGTI
KM+Tcluc/vehicle
KM+Tcluc/ZA
d6
d8
Photonen/sec/Maus (x106)
d14
1500
1000
KM+Tcluc/vehicle
KM+Tcluc/GGTI
KM+Tcluc/ZA
500
20
10
0
Photonenstärke
(in Relation zu vehicle)
B
0
2
4
6
8 10 12
Zeit nach alloKMT [Tage]
14
3
2
p=0,0006
p=0,042
KM+Tc/vehicle
KM+Tc/GGTI
KM+Tc/ZA
1
0
d4
d8
d14
Abbildung 4-3: Expansion der Donor-T-Zellen in vivo nach GGTI-Behandlung. Es
wurden KMT-Experimente im C57BL/6=>BALB/c-Modell durchgeführt, wobei 3x105 Tcluc
transplantiert wurden. Gezeigt sind die zusammengefassten Werte von 3 Experimenten.
Die Anzahl der Mäuse variiert zwischen 7 (d0) und 4 Tieren (d14). (A) Oben: Repräsentative Bilder der BLI-Kamera an den Tagen 6, 8 und 10. Da die Versuche mit GGTI und ZABehandlung immer getrennt durchgeführt wurden, sind zum Vergleich 2 Kontrollgruppen
dargestellt. Unten: Quantitative Darstellung der Photonen im Zeitverlauf. (B) Relative Photonenstärke im Vergleich zur vehicle-Gruppe; Die p-Werte sind angegeben, wenn p<0,05
67
Ergebnisse
4.1.4 Einfluss der Hemmung der Prenylierung auf T-Zellen in vitro
4.1.4.1 Proliferation und Migration
Zunächst sollte überprüft werden, ob die Inkubation mit FTI, GGTI oder ZA toxische Wirkungen auf die verwendeten T-Zellen hat. Hierfür wurden die Zellen mit
den Inhibitoren inkubiert und nach verschiedenen Zeitpunkten die Anzahl der viablen Zellen bestimmt. Diese waren in allen Gruppen vergleichbar bei etwa 65 %
nach 24 h und etwa 60 % nach 72 h (Abb. 4-4A). Camptothecin, ein Zytostatikum,
wurde als Kontrolle eingesetzt und zeigte eine hohe Zytotoxizität, wodurch nach
72 h nahezu alle Zellen abgetötet waren.
A
60
Medium
+FTI
+GGTI
+ZA
+Camptothecin
40
20
0
24h
48h
72h
B
C
Proliferation [%]
20
p=0,006
15
p=0,015
10
5
0
Medium
+FTI
+GGTI
+ZA
Migrierte Zellen
(relativ zu Medium)
Viable T-Zellen [%]
80
2.0
Medium
Medium
+FTI
+GGTI
+ZA
1.5
p<0.0001
1.0
0.5
0.0
CXCL12
-
+
+
+
+
Abbildung 4-4: Proliferation und Migration von T-Zellen in vitro. (A) Aus der Milz einer C57BL/6-Maus wurde eine Zellsuspension hergestellt. Die Splenozyten wurden jeweils mit 10 µM FTI, GGTI, ZA, Camptothecin oder vehicle (Medium) in Proliferationsmedium inkubiert. An den angegebenen Zeitpunkten wurde ein Apoptosetest mittels AnnexinV und (PI) durchgeführt und durchflusszytometrisch die T-Zellen (CD3+) auf Viabilität
untersucht. Gezeigt ist ein repräsentatives Experiment von drei unabhängig durchgeführten Versuchen mit Triplikaten. (B) Abgebildet ist ein repräsentativer Proliferationstest mit
C57BL/6-BMDCs und BALB/c-CD4+T-Zellen von drei unabhängig durchgeführten Experimenten. (C) Es wurden Migrationstests mit C57BL/6-T-Zellen durchgeführt. Dargestellt
sind die zusammengefassten Ergebnisse dreier unabhängiger Versuche mit Duplikaten,
angegeben im Verhältnis zur unbehandelten Gruppe.
Um die Proliferation, ausgelöst durch Stimulation über Alloantigene zu untersuchen, wurden in einer MLR aufgereinigte CD4+ T-Zellen einer BALB/c-Maus mit
BMDCs einer C57BL/6-Maus inkubiert, woraufhin etwa 10 % der unbehandelten
68
Ergebnisse
T-Zellen proliferiert waren. Die Inkubation mit FTI führte zu einer signifikant reduzierten Proliferation von etwa 3,5 %. Durch die Anwesenheit von ZA war die Zellteilungsrate auf etwa 1,5 % gesenkt, wohingegen die mit GGTI inkubierten
T-Zellen keine veränderte Proliferation zeigten (Abb. 4-4B).
In einem in vitro Migrationstest zeigte sich eine um 43 % reduzierte Migration von
T-Zellen entlang eines CXCL12-Chemokingradienten, wenn GGTI im Medium vorhanden war, verglichen zur Kultur mit Lösungsmittel (Abb. 4-4C). Die Inkubation
mit FTI oder ZA führte nicht zu einem veränderten Migrationsverhalten.
4.1.4.2 Phosphorylierung von nachgeordneten („downstream“) Kinasen
Die Prenylierung kleiner GTPasen führt zur Phosphorylierung vieler im Signalweg
nachgeordneter Kinasen. Um zu überprüfen, für welche Kinasen dies in den verwendeten Modellen zutrifft, wurden Westernblots mit stimulierten T-Zellen durchgeführt. Untersucht wurden ERK und das ribosomale Protein S6. Die Phosphorylierung beider Proteine konnte durch Stimulation über CD3 und CD28 erhöht werden (Abb. 4-5). Wurden die Ergebnisse einzeln betrachtet, so führte eine Inkubation mit FTI oder GGTI augenscheinlich zu einer reduzierten Phosphorylierung von
ERK (Abb. 4-5A, links). Wurde eine quantitative Auswertung durchgeführt und die
Ergebnisse zusammengefasst, konnte dies jedoch nicht bestätigt werden (Abb. 45A, rechts).
Die Phosphorylierung des ribosomalen Protein S6 wurde durch die Inhibitoren
nicht beeinflusst (Abb. 4-5B).
69
m um
I
diu edi FTI GT ZA
e
G
+
+
M
M
+
Erk
pErk
β-actin
α-CD3/CD28
-
+
+
+
+
m um
I
diu edi FTI GT ZA
e
G
+
M + +
M
B
S6
pS6
β-actin
α-CD3/CD28
-
+
+
+
+
0.8
Medium
Medium
+FTI
+GGTI
+ZA
0.6
0.4
0.2
0.0
-CD3/CD28 -
Verhältnis pS6/S6
A
Verhältnis pERK/ERK
Ergebnisse
+
+
+
+
1.5
Medium
Medium
+FTI
+GGTI
+ZA
1.0
0.5
0.0
-CD3/CD28
-
+
+
+
+
Abbildung 4-5: Phosphorylierung nachgeordneter („downstream") Kinasen.
C57BL/6-T-Zellen wurden für 4h mit α-CD3/CD28-Kügelchen im Verhältnis 1:1 in Proliferationsmedium stimuliert und gleichzeitig mit 10 µM des jeweiligen Inhibitors oder mit vehicle (Medium) inkubiert. Die Zellen wurden lysiert und Westernblots durchgeführt. ß-Aktin
diente hierbei als Ladekontrolle, der Antikörper gegen ß-Aktin wurde im Verhältnis 1:2000,
der Sekundärantikörper im Verhältnis 1:20000 zugegeben. (A) links: Repräsentativer
Westernblot gegen ERK und pERK. Die Primärantikörper wurden im Verhältnis 1:1250
und die Sekundärantikörper im Verhältnis 1:2000 zugegeben. rechts: Zusammengefasste
Ergebnisse der Bandenquantifizierung dreier unabhängiger Versuche. (B) links: Repräsentativer Westernblot gegen S6 und pS6. Die Primärantikörper wurden im Verhältnis
1:1000 (S6) bzw. 1:500 (pS6) und die Sekundärantikörper im Verhältnis 1:10.000 zugegeben. rechts: Zusammengefasste Ergebnisse der Bandenquantifizierung dreier unabhängiger Versuche, wobei das Verhältnis des phosphorylierten Protein zum nicht phosphorylierten Protein dargestellt ist.
4.1.5 Auswirkungen der Behandlung mit FTI und GGTI auf den Thymus
bei GvHD
4.1.5.1 Thymusstruktur und -architektur
Der Thymus stellt neben Darm, Haut und Leber ein wichtiges GvHD-Zielorgan dar,
dessen Zerstörung zu schweren immunologischen Beeinträchtigungen führen
kann [278]. Um die Schäden am Thymus durch die GvHD beurteilen zu können,
wurde dieser an Tag 10 nach KMT entnommen und zunächst auf die Dicke des
verbleibenden Kortex hin untersucht. Da für FTI bereits gezeigt werden konnte,
dass die Kortexdicke durch Behandlung nahezu erhalten bleibt [269, 277], wurden
70
Ergebnisse
hier nur noch die Organe von Mäusen untersucht, die mit Lösungsmittel, GGTI,
einer Kombination von FTI und GGTI oder ZA behandelt wurden. Die Induktion
einer GvHD durch T-Zellen führte zu einer Reduktion des prozentualen Anteils am
Gesamtorgan auf 43 %, verglichen mit 61 %, wenn nur KM transplantiert wurde
(Abb. 4-6, unten). Wurden die Mäuse mit GGTI behandelt, konnte dieser Wert mit
56 % nahezu wieder erreicht werden. Die Kombinationstherapie aus FTI und GGTI
führte zu einer Kortexdicke, die etwa 65 % des Gesamtorgans ausmachte. Die
Behandlung mit ZA führte zu keiner Änderung des prozentualen Anteils am Gesamtorgan im Vergleich zu der Behandlung mit vehicle (42 %) (Abb. 4-6 unten).
KM
KM+Tc/GGTI
Thymuskortex
[% des gesamten Organ]
KM+Tc/vehicle
KM+Tc/ZA
100
80
p=0,0006
60
40
unbehandelt
KM
KM+Tc/vehicle
KM+Tc/GGTI
KM+Tc/FTI+GGTI
KM+ZA
20
0
Abbildung 4-6: Thymusstruktur bei GvHD nach Behandlung mit Inhibitoren. Mäuse
wurden im C57BL/6=>BALB/c-Modell mit 3x105 T-Zellen transplantiert. An Tag 10 wurden
die Thymi entnommen und wie in den Methoden angegeben mit dem medullären Marker
Keratin 5 (K5) angefärbt. (A) Repräsentative Schnitte einzelner Gruppen. Die gepunkteten
Linien zeigen den Übergang von Kortex und Medulla, die volle Linie die Dicke des Kortex.
(B) Darstellung des prozentualen Anteil des Kortex (K5-negativ) am gesamten Thymus.
Jedes Symbol zeigt den Wert einer Maus. Die p-Werte sind nur angegeben, wenn p<0,05
4.1.5.2 Zellpopulationen
Um einen Eindruck in die Größe und die Zusammensetzung des Thymus zu erhalten wurde an Tag 12 nach KMT eine Analyse der einzelnen Thymuszellpopulationen, CD4+CD8+-DP, mTEC, cTEC und Fibroblasten durchgeführt. Die Bestrahlung
und KMT führte bei allen untersuchten Populationen zu reduzierten Zellzahlen
(Abb. 4-7). Betrachtet man die Gesamtzellzahl, wurde dieser Wert durch zusätzliche GvHD-Induktion mittels T-Zellen nicht verändert (Abb. 4-7, oben links). Die
71
Ergebnisse
Behandlung mit FTI, GGTI und auch ZA führte zu einem Trend in Richtung höherer Zellzahlen, wobei diese Unterschiede keine signifikanten Werte erreichten
(Abb. 4-7, oben links). Wurden die CD4 und CD8-DP Zellen untersucht (Abb. 4-7,
oben rechts), so zeigte sich eine deutliche Reduktion dieser Zellen bei GvHDMäusen (3x104 Zellen/Thymus) im Vergleich zu den Tieren, die keine T-Zellen erhalten hatten (5,3x106). Die Therapie mit FTI oder GGTI führte zu erhöhten Zellzahlen von 3,6x106 bzw. 6,2x106, die bei der GGTI-Gruppe statistische Signifikanz
erreichten, wohingegen eine Behandlung mit ZA keine Auswirkungen auf diese
Zellpopulation hatte (Abb. 4-7, oben rechts). Auch die Anzahl der mTEC wurde
durch GvHD-Induktion stark reduziert (von 3,8x104 auf 5x103) und durch Behandlung mit FTI oder GGTI wieder erhöht (3,8x104 bzw. 3,3x104). Die Injektion von ZA
führte zu keiner Veränderung in dieser Zellpopulation (Abb. 4-7, Mitte links). Im
Falle der cTEC führte die Induktion einer GvHD nicht zu einer Reduktion der Zellzahlen, jedoch wurden durch Gabe von FTI oder GGTI, nicht aber ZA etwa um
das 3fache höhere Zahlen erreicht, die in der FTI-Gruppe statistische Signifikanz
erreichten (Abb. 4-7, Mitte rechts). Die Anzahl der Fibroblasten wurde durch Gabe
von T-Zellen von 3,3x104 auf 1x104 reduziert (Abb. 4-7, unten). Die Behandlung
mit FTI, GGTI oder ZA führte zu leicht höheren Werten (Abb. 4-7, unten).
72
Gesamtzellzahl (x106)
Gesamtes Organ
30
20
10
0
CD4+CD8+Zellen (x106)
Ergebnisse
CD4+CD8+
20
unbehandelt
15
KM
KM+Tc/vehicle
10
KM+Tc/FTI
KM+Tc/GGTI
5
KM+Tc/ZA
mTEC
cTEC
cTEC (x105)
mTEC (x105)
0.6
0.4
0.2
0.0
unbehandelt
KM
KM+Tc/vehicle
KM+Tc/FTI
KM+Tc/GGTI
KM+Tc/ZA
0.05
0.00
1.0
0.8
p=0,04
3
unbehandelt
p=0.03
KM
KM+Tc/vehicle
2
KM+Tc/FTI
KM+Tc/GGTI
KM+Tc/ZA
1
unbehandelt
KM
KM+Tc/vehicle
KM+Tc/FTI
KM+Tc/GGTI
KM+Tc/ZA
0
Fibroblasten (x105)
Fibroblasten
1.5
1.0
0.5
unbehandelt
KM
KM+Tc/vehicle
KM+Tc/FTI
KM+Tc/GGTI
KM+Tc/ZA
0.0
Abbildung 4-7: Zellpopulationen im Thymus bei GvHD nach Behandlung. Es wurde
eine KMT im C57BL/6=>BALB/c-Modell mit 3x105 T-Zellen durchgeführt. An Tag 12 wurden die Thymi entnommen und eine Zellsuspension hergestellt. Diese wurde gefärbt und
durchflusszytometrisch analysiert. mTEC: CD45-MHC-Klasse IIint/hi UEA-1+; cTEC: CD45MHC-Klasse IIint/hi UEA-1-; Fibroblasten: CD45-PDGFR1+. Absolute Zahlen sind gezeigt.
Jedes Symbol repräsentiert eine Maus. Die p-Werte sind nur angegeben, wenn p<0,05.
Die Ergebnisse der Untersuchung der Zellpopulationen im Thymus an Tag 12
nach KMT zeigen, dass durch Bestrahlung, KMT und GvHD-Induktion Schaden
am Thymus entsteht. Es sollte nun untersucht werden, ob dieser im Verlauf der
GvHD reversibel ist und durch Inhibition der Prenylierung die Regeneration beeinflusst wird. Hierzu wurde der Versuch aus Abb. 4-7 an Tag 100 nach KMT wiederholt. Da in dem in dieser Arbeit verwendeten letalen GvHD-Modell die vehicleKontrollmäuse an Tag 100 bereits verstorben sind, wurden die einzelnen Gruppen
mit den Werten der vehicle-Mäuse an Tag 10 verglichen. Da bei einer Behandlung
mit ZA ebenso keine Aussicht darauf bestand, dass es zu diesem Zeitpunkt noch
73
Ergebnisse
lebende Tiere gibt, wurden keine Tiere mit ZA behandelt. Es zeigte sich sowohl in
der Gesamtzellzahl als auch bei den einzelnen Zellpopulationen, dass auch 100
Tage nach der KMT ein Schaden des Thymus sichtbar ist (Abb. 4-8). Verglichen
mit den Werten der vehicle-Gruppe an Tag 10 zeigte sich ein signifikanter Anstieg
der Gesamtzellzahlen in allen behandelten Gruppen um etwa das 20-30fache
(Abb. 4-8, oben links). Ähnliche Verhältnisse zeigten sich bei der Untersuchung
der CD4 und CD8-doppelt positiven Zellen, jedoch führte hier die Behandlung mit
FTI, GGTI oder der Kombination aus beidem zu einer Erhöhung der Zellzahl um
das 200-300fache (Abb. 4-8, oben rechts). Die Zahl der mTEC war in allen behandelten Gruppen höher als in der vehicle-Gruppe, jedoch war dies nur in der GGTIGruppe statistisch signifikant (Abb. 4-8, unten links). Die Zahl der Fibroblasten war
lediglich in der FTI-Gruppe deutlich erhöht (8x104), verglichen mit der vehicleGruppe (2x104). Allerdings wurde hier keine Signifikanz erreicht. Eine Analyse der
cTEC wurde in diesem Versuch nicht durchgeführt.
CD4+CD8+
150
100
p<0.0001
p=0.002
p=0.03
50
0
CD4+CD8+ Zellen (x106)
Gesamtzellzahl (x106)
Gesamtes Organ
100
p=0.0001
p=0.001
80
60
p=0.03
40
20
0
Fibroblasten
mTEC (x106)
0.4
0.3
0.2
0.1
0.0
p=0.03
Fibroblasten (x106)
mTEC
0.5
unbehandelt
KM
KM+Tc/vehicle
KM+Tc/FTI
KM+Tc/GGTI
KM+Tc/FTI+GGTI
0.20
unbehandelt
KM
KM+Tc/vehicle
KM+Tc/FTI
KM+Tc/GGTI
KM+Tc/FTI+GGTI
0.15
0.10
0.05
0.00
Abbildung 4-8: Zellpopulationen im Thymus nach GvHD. Es wurde eine KMT im
C57BL/6=>BALB/c-Modell mit 3x105 T-Zellen durchgeführt. An Tag 100 wurden die Thymi
entnommen und eine Zellsuspension hergestellt. Diese wurde gefärbt und durchflusszytometrisch analysiert. mTEC: CD45-MHC-Klasse IIint/hi UEA-1+; Fibroblasten: CD45PDGFR1+. Die jeweiligen Gruppen wurden mit Mäusen der vehicle-Gruppe an Tag 10
verglichen. Absolute Zahlen sind gezeigt, jedes Symbol repräsentiert eine Maus. Die pWerte sind nur angegeben, wenn p<0,05
74
Ergebnisse
4.1.5.3 Antigenpräsentation
Die Selektion von T-Zellen im Thymus findet durch Präsentation von Antigenen
statt. Bei einer zu starken Bindung an syngene Peptide werden die T-Zellen negativ selektioniert um Autoimmunität zu verhindern. Bei einer zu schwachen Bindung
an körpereigene Antigene erhält die Zelle nicht genug Überlebenssignale und geht
zugrunde. Um zu untersuchen, ob die Antigenpräsentation im Thymus durch FTI,
GGTI oder ZA beeinflusst wird, wurden Thymus-Epithelzellen mit den jeweiligen
Inhibitoren inkubiert und die Expression von MHC-Klasse II-Molekülen durch-
MHC Klasse II [MFI]
flusszytometrisch analysiert. Diese war vergleichbar in allen Ansätzen (Abb. 4-9).
1200
Medium
+FTI
+GGTI
+ZA
800
400
0
cTEC
mTEC
Abbildung 4-9: Einfluss der Inhibitoren auf die MHC Klasse II-Expression von
Thymus-Epithelzellen. Der Thymus unbehandelter BALB/c-Mäuse wurde entnommen
und eine Einzelzellsuspension hergestellt. Diese wurde mit 10 µM FTI, GGTI, ZA oder
vehicle (Medium) für 24 h inkubiert. Die Thymus-Epithelzellen wurden durchflusszytometrisch auf die Expression von MHC-Klasse II untersucht. mTEC: CD45-MHC-Klasse IIint/hi
UEA-1+; cTEC: CD45-MHC-Klasse IIint/hi UEA-1-. Dargestellt ist ein repräsentatives Experiment von drei unabhängigen Versuchen mit jeweils Triplikaten.
4.1.6 Einfluss der Hemmung der Prenylierung auf das T-Zell-Repertoire
bei GvHD
In einem weiteren Versuch sollte das T-Zellrepertoire bei GvHD untersucht werden. Wie bereits gezeigt, wird der Thymus bei einer GvHD beschädigt (Abb. 4-6,
4-7, 4-8). Dies kann zu einem verminderten T-Zellrepertoire führen, was wiederum
eine reduzierte Immunität der T-Zellen zur Folge haben kann. Bei diesem Experiment können auch Rückschlüsse auf die Alloreaktivität der T-Zellen gezogen werden, die sich zeigt, wenn bestimmte Genfamilien der T-Zellrezeptoren besonders
stark ausgeprägt sind.
75
15
unbehandelt
Prozentualer Anteil
an den CD3+Zellen
Prozentualer Anteil
an den CD3+Zellen
Ergebnisse
10
5
5
2
3
5.4
1
8. 6
1 7
8.
8.2
3
109
b
11
12
13
1
174
a
2
3
5.4
1
8. 6
1 7
8.
8. 2
3
109
b
11
12
13
1
174
a
CDR-3 Sequenzlänge
CDR-3 Sequenzlänge
15
KM+Tc/vehicle
Prozentualer Anteil
an den CD3+Zellen
Prozentualer Anteil
an den CD3+Zellen
10
0
0
10
5
10
5
2
3
5.4
1
8. 6
1 7
8.
8.2
3
109
b
11
12
13
1
174
a
2
3
5.4
1
8. 6
1 7
8.
8.2
3
109
b
11
12
13
1
174
a
CDR-3 Sequenzlänge
CDR-3 Sequenzlänge
KM+Tc/GGTI
Prozentualer Anteil
an den CD3+Zellen
15
KM+Tc/FTI
15
0
0
Prozentualer Anteil
an den CD3+Zellen
KM
15
10
5
15
KM+Tc/ZA
10
5
0
2
3
5.4
1
8. 6
1 7
8.
8.2
3
109
b
11
12
13
1
174
a
2
3
5.4
1
8. 6
1 7
8.
8.2
3
109
b
11
12
13
1
174
a
0
CDR-3 Sequenzlänge
CDR-3 Sequenzlänge
Abbildung 4-10: T-Zellrezeptorrepertoire bei GvHD. Es wurde eine KMT im
C57BL/6=>BALB/c-Modell mit 3x105 T-Zellen durchgeführt. An Tag 20 wurden von drei
Mäusen pro Gruppe die Milzen entnommen und Einzelzellsuspensionen hergestellt, die
wie in den Methoden angegeben gefärbt und durchflusszytometrisch analysiert wurden.
Aufgetragen sind verschiedene Vß-Genfamilien und deren prozentualer Anteil an den
CD3+-Zellen.
An Tag 20 nach KMT wurden T-Zellen der Milz auf verschiedene Vß-Genfamilien
hin untersucht. Bei einer unbehandelten Maus zeigte sich, wie in der Literatur beschrieben, eine Gauss-Verteilung dieser Rezeptoren (Abb. 4-10, oben links)
[279]. Wurde nur Knochenmark transplantiert ist diese Verteilung auch noch er76
Ergebnisse
kennbar (Abb. 4-10, oben rechts), zeigt sich aber nicht mehr, wenn eine GvHD
induziert wurde (Abb. 4-10, Mitte links). Hier wurden die meisten der untersuchten
Genfamilien in hohem Maße exprimiert. Wurden die Mäuse mit FTI behandelt,
zeigte sich ebenfalls ein sehr hoher Anteil einiger Rezeptorvarianten, vor allem die
Expression von Vß 3 und 17a war deutlich erhöht im Vergleich zur KM-Gruppe. Im
Vergleich zur vehicle-Gruppe zeigten sich jedoch auch deutliche Abnahmen in den
Varianten 5.1, 6, 7, 11, 12, 13 und 14 (Abb. 4-10, Mitte links). Die Therapie mit
GGTI führte zu einer Verteilung, die der KM-Gruppe sehr ähnlich war. Lediglich
die Expression von Vß 17a war im Vergleich erhöht (Abb. 4-10, unten links). Behandlung der Mäuse mit ZA führte zu einer starken Ausprägung von Vß 3, 4, 5.1,
6 und 14, wohingegen Vß 7, 8.1 8.2, 8.3, 9, 10b, 11 und 17a eher schwach exprimiert wurden (Abb. 4-10, unten rechts).
4.1.7 GvL-Effekte bei Behandlung mit FTI und GGTI
Knochenmark- oder Stammzelltransplantationen im Menschen werden unter
Anderem nötig, wenn bösartige Erkrankungen des hämatopoetischen Systems
vorliegen. Somit ist es für diese Patienten wichtig, dass trotz immunmodulatorischer Behandlung weiterhin eine GvL-Antwort stattfinden kann. Um die Auswirkungen der Therapie mit FTI, GGTI oder ZA auf die Tumorimmunität zu untersuchen
wurden
zunächst
in
vitro-Experimente
mit
A20-
und
L1210-
Lymphomzelllinien durchgeführt. Zunächst sollte überprüft werden, ob FTI, GGTI
oder ZA einen direkten zytotoxischen Effekt auf diese Zellen haben. Inkubation mit
den Inhibitoren für bis zu 72 h hatte keine Auswirkungen auf die Viabilität von A20und L1210-Zellen, wohingegen Kultivierung mit Camptothecin diese auf 10 % bis
20 % reduzierte (Abb. 4-11A). L1210-Zellen wurden nun in einem Zytotoxizitätstest als Zielzellen verwendet und mit aus GvHD-Mäusen isolierten T-Zellen und
FTI, GGTI oder ZA inkubiert. Der prozentuale Anteil abgetöteter L1210-Zellen lag
bei einem Verhältnis von 1:10 (L1210:Tc) bei etwa 70 % in allen Gruppen (Abb. 411B, links).
77
Ergebnisse
A
A20
Viable Zellen [%]
Viable Zellen [%]
100
80
60
40
20
0
B
48h
Tote Zellen [%]
Tote Zellen [%]
60
40
20
Medium
+FTI
+GGTI
+ZA
48h
72h
40
L1210
L1210:Tc 1:1
30
L1210:Tc 1:2
L1210:Tc 1:10
20
L1210
L1210:Tc 1:1
L1210:Tc 1:2
L1210:Tc 1:10
10
0
+vehicle +FTI +GGTI +ZA
Behandlung in vivo
30
Tote Zellen [%]
24h
Behandlung in vivo
100
C
20
72h
80
Medium
+FTI
+GGTI
+ZA
+Camptothecin
40
0
24h
Inkubation ex vivo
0
L1210
100
Medium
+FTI
80
+GGTI
+ZA
60
+Camptothecin
A20
A20:Tc 1:1
A20:Tc 1:2
A20:Tc 1:10
20
10
0
+vehicle +FTI +GGTI +ZA
Abbildung 4-11: Auswirkungen der Hemmung der Prenylierung auf GvL-Effekte in
vitro. (A) A20- oder L1210-Zellen wurden mit 10 µM FTI, GGTI, ZA, Camptothecin oder
vehicle (Medium) inkubiert. An den gezeigten Zeitpunkten wurden Apoptosetests mittels
AnnexinV und PI durchgeführt. Aufgetragen sind die lebenden Zellen zu den angegebenen Zeitpunkten. (B) links: Mäuse wurden im C57BL/6=>BALB/c-Modell mit 3x105 TZellen transplantiert. An d14 wurden die T-Zellen aus den Milzen isoliert und in einem
Zytotoxizitätstest mit L1210-Zellen eingesetzt. Aufgetragen sind die toten Zellen. Dargestellt ist einer von zwei unabhängig durchgeführten Versuchen mit je Triplikaten. rechts:
Mäuse wurden im C57BL/6=>BALB/c-Modell mit 3x105 T-Zellen transplantiert und für 10
Tage mit vehicle, FTI, GGTI oder ZA behandelt. An d12 wurden aus den Milzen die TZellen aufgereinigt und in einem Zytotoxizitätstest mit L1210-Zellen eingesetzt. Aufgetragen sind die toten Zellen. Dargestellt sind die zusammengefassten Werte von 3 unabhängig durchgeführten Versuchen mit je Triplikaten. (C) Mäuse wurden im
C57BL/6=>BALB/c-Modell mit 3x105 T-Zellen transplantiert und für 10 Tage mit FTI, GGTI
oder ZA behandelt. An d12 wurden aus den Milzen die T-Zellen aufgereinigt und in einem
Zytotoxizitätstest mit A20-Zellen eingesetzt. Aufgetragen sind die toten Zellen. Dargestellt
sind die zusammengefassten Werte von 3 unabhängig durchgeführten Versuchen mit je
Triplikaten.
78
Ergebnisse
Um die systemischen Effekte von FTI, GGTI oder ZA mit einzubeziehen wurden
GvHD-Mäuse für 10 Tage mit den Inhibitoren behandelt und danach die T-Zellen
reisoliert um ebenfalls in einem Zytotoxizitätstest gegen L1210-Zellen eingesetzt
zu werden. Dies führte bei einem Verhältnis von 1:10 (L1210:Tc) zu einem Anteil
von etwa 25 % abgetöteter Zellen in den Gruppen, in denen die Mäuse vehicle,
FTI oder GGTI erhielten (Abb. 4-11B, rechts, vehicle, FTI, GGTI). Wurden die
Mäuse zuvor mit ZA behandelt, war die Zytotoxizität reduziert und lag bei etwa
10 %. Auch A20-Zellen wurden in einem Zytotoxizitätstest, bei dem die Mäuse,
aus denen die T-Zellen isoliert wurden zuvor mit den Inhibitoren behandelt wurden, eingesetzt. Hier zeigte sich in allen Gruppen eine Zytotoxizität von etwa 20 %
wobei diese im Falle von ZA und einem A20:Tc-Verhältnis von 1:10 auf etwa 12 %
reduziert war (Abb. 4-11C).
Nun sollten die Auswirkungen der Therapie mit FTI, GGTI oder ZA auf die Tumorimmunität in vivo untersucht werden. Hierzu wurden BALB/c-Mäuse transplantiert und zusätzlich A20luc-Lymphom-Zellen injiziert, deren Expansion zu mehreren
Zeitpunkten nach alloKMT mittels BLI dargestellt wurde. Diese Zellen zeigen bei
BLI deutliche Signale in der Gruppe, die keine T-Zellen erhalten hatte (Abb. 4-12A,
B). Am stärksten ausgeprägt waren diese im Bereich des Femurs, des Sternums
und der Lymphknoten. An Tag 7 waren in allen anderen Gruppen ebenfalls Signale an ähnlichen Stellen zu erkennen, was zeigt, dass die Lymphome in allen Mäusen anwachsen konnten (Abb. 4-12A, oben). 14 Tage nach der Transplantation
war in allen Gruppen, die T-Zellen erhalten hatten, kein BLI-Signal der Lymphomzellen mehr sichtbar, wohingegen die Gruppe ohne T-Zellen nicht in der Lage war,
diese Zellen zu eliminieren (Abb. 4-12A, B). Um dieses Ergebnis zu bestätigen
wurde das KM einiger Tiere an Tag 16 nach Transplantation entnommen und
durchflusszytometrisch auf die Expression des gelb fluoreszierenden Protein (yellow-fluoreszent protein, YFP), was in den A20luc-Zellen ebenfalls unter der Kontrolle des ß-Aktin-Promotors exprimiert wird, untersucht. Im KM der Tiere, die keine
T-Zellen erhalten hatten, waren etwa 22 % aller KM-Zellen positiv für YFP (Abb. 412C). In der vehicle-Gruppe hingegen betrug dieser Wert lediglich 3 %. Wurden
Tiere mit FTI oder GGTI behandelt, waren diese Frequenzen auf 0,1 bzw. 0,3 %
gesunken und lagen somit auf dem Niveau der Tiere, die keine A20 luc-Zellen erhalten hatten (Abb. 4-12C).
79
Ergebnisse
A
KM+A20luc
KM+A20luc
+Tc/vehicle
KM+A20luc
+Tc/FTI
KM+A20luc
+Tc/GGTI
KM+A20luc
+Tc/ZA
d7
C
2000
1000
400
200
0
0
5
10
15
Zeit nach alloKMT [Tage]
D
BM+A20 (n=6)
BM+A20+Tc/vehicle (n=3)
BM+A20+Tc/GGTI
(n=8 p=0,012)
BM+A20+Tc/ZA (n=8)
Überleben [%]
KM+A20luc
KM+A20luc +Tc/vehicle
KM+A20luc +Tc/FTI
KM+A20luc +Tc/GGTI
KM+A20luc +Tc/ZA
% der Knochenmarkzellen YFP +
B
Photonen/sec/Maus x10 6
d14
25
p=0,001
20
15
10
5
p=0,006
p=0,003
0
unbehandelt
KM+A20luc
KM+A20luc +Tc/vehicle
KM+A20luc +Tc/FTI
KM+A20luc +Tc/GGTI
100
80
60
40
20
0
0
20
40
60
80 100
Zeit nach alloKMT [Tage]
Abbildung 4-12: GvL-Effekte bei Hemmung der Prenylierung. Mäuse wurden im
C57BL/6=>BALB/c-Modell transplantiert, wobei an d0 zusätzlich 2x105 A20luc Zellen, die
auch YFP+ sind, injiziert wurden. An d2 wurden 3x105 T-Zellen gegeben. (A) Repräsentative BLI-Aufnahmen an d7 und d14. (B) Quantitative Darstellung der Photonen im Zeitverlauf. Die Zahl der Mäuse variiert zwischen 5 und 3, je nach Zeitpunkt und Gruppe. Dargestellt ist ein repräsentatives von zwei unabhängig durchgeführten Experimenten. (C) An
Tag 16 nach Transplantation wurde von 3 Mäusen pro Gruppe das Knochenmark des
Femurs entnommen und durchflusszytometrisch auf YFP untersucht. (D) Überleben der
Mäuse. Alle Gruppen, die T-Zellen erhielten, entwickelten letale GvHD. Mäuse der
BM+A20-Gruppe verstarben am Lymphom.
80
Ergebnisse
In einer weiteren Studie sollte nun untersucht werden, wie sich die Behandlung mit
GGTI oder ZA auf das Überleben der Tiere mit Lymphomen auswirkt. In Abb. 412A, B und C wurde gezeigt, dass Tiere, die zu den Lymphomzellen noch T-Zellen
erhalten hatten, die A20luc-Zellen eliminieren konnten, die Tiere ohne T-Zelltransplantation jedoch nicht. Somit konnte davon ausgegangen werden, dass alle
verstorbenen Tiere, die mit T-Zellen transplantiert wurden, durch GvHD zu Tode
kamen, die Tiere ohne T-Zellen durch das Lymphom. Da für FTI bereits gezeigt
werden konnte, dass die Behandlung bei Transplantation mit A20-Zellen zu verlängertem Überleben führt [269, 277], wurde in diesem Experiment lediglich GGTI
oder ZA zur Therapie verwendet. Alle Mäuse, die Lymphomzellen, aber keine
T-Zellen erhalten hatten, starben bis Tag 24 am Lymphom (Abb. 4-12D). Mäuse,
die mit vehicle oder ZA behandelt wurden, starben in etwa im gleichen Zeitraum
an GvHD. Die Behandlung mit GGTI führte zu signifikant verlängertem Überleben.
4.1.8 Auswirkungen reduzierter Prenylierung auf Immunantworten bei
Virusinfektion
Die Reaktivierung latenter CMV-Viren ist eine der Hauptkomplikationen nach alloHSZT [280] und führt in vielen Fällen zum Tode des Patienten. Das murine CMV
(MCMV) infiziert zunächst Leber, Lunge und Nieren und persistiert nach ca. 28
Tagen in der Speicheldrüse [281].
Zur Untersuchung der Immunrekonstitution im Hinblick auf die Immunantwort bei
Infektion mit MCMV wurden Mäuse ohne T-Zellen transplantiert und nach 30 Tagen mit MCMV infiziert. Weitere 28 Tage später wurden die Milzen entnommen
und zunächst auf virusspezifische CD8+ T-Zellen hin untersucht. Diese können
durch eine so genannte Tetramerfärbung sichtbar gemacht werden, bei der Tetramere von MHC-Klasse I-Molekülen Epitope des Virus präsentieren. Diese MHC
Moleküle sind an ein Fluorochrom gekoppelt. Die für dieses Epitop spezifischen
CD8+ T-Zellen binden an diese Tetramere und können im Durchflusszytometer
sichtbar gemacht werden. In allen Gruppen war der prozentuale Anteil der spezifischen CD8+ T-Zellen für die Epitope pp89 und M164 vergleichbar (Abb. 4-13A,
links). Repräsentative durchflusszytometrische Analysen zeigten außerdem, dass
viele der spezifischen Zellen auch KLRG1 exprimieren, einen Marker für proliferierte Zellen (Abb. 4-13A, rechts) [282]. Um eine durch die Transplantation herbei81
Ergebnisse
geführte Lymphopenie auszuschließen, wurden durchflusszytometrisch auch die
Anteile CD8 positiver Zellen an der gesamten Milz bestimmt. Hier zeigte sich, dass
diese in allen Gruppen vergleichbar waren (Abb. 4-13B). Die CD8+ Zellen wurden
nun auf eine Reihe von Oberflächenmarkern hin untersucht, die bei Virusinfektionen eine Rolle spielen. CD62L, CD27 und CD127 waren, wie in der Literatur beschrieben, bei der Infektion mit MCMV auf CD8+ Zellen signifikant herunterreguliert (Abb. 4-13C) [283, 284]. Innerhalb der infizierten Gruppen unterschied
sich die Expression nicht (Abb. 4-13C). KLRG1 hingegen wurde durch die Infektion mit MCMV signifikant heraufreguliert. Bei KLRG1 waren keine Unterschiede
zwischen den infizierten Gruppen festzustellen.
82
Ergebnisse
CD62L+
[% der CD8+ Zellen]
C
pp89
2.5
MCMV
KM+MCMV/vehicle
KM+MCMV/FTI
KM+MCMV/GGTI
KM+MCMV/ZA
2.0
1.5
1.0
0.0
1.5
KM+MCMV/
FTI
M164
1.0
CD8
0.5
0.0
MCMV
KM+MCMV/vehicle
KM+MCMV/FTI
KM+MCMV/GGTI
KM+MCMV/ZA
CD8+
[% aller Splenozyten]
B
30
KM
KM+MCMV/vehicle
KM+MCMV/FTI
KM+MCMV/GGTI
KM+MCMV/ZA
20
10
0
CD62L
100 p=0,0014
80
60
KLRG1
80
KM
60 p<0,0001
KM+MCMV/vehicle
KM+MCMV/FTI
40
KM+MCMV/GGTI
20
KM+MCMV/ZA
40
20
CD127
60
40
20
0
CD127+
[% der CD8+ Zellen]
100 p=0,0009
80
KM
KM+MCMV/vehicle
BM+MCMV/FTI
BM+MCMV/GGTI
BM+MCMV/ZA
0
0
CD27
CD27+
[% der CD8+ Zellen]
KM+MCMV/
vehicle
0.5
KLRG1+
[% der CD8+Zellen]
M164+ [% der CD8+ Zellen] pp89+ [% der CD8+ Zellen]
(in Relation zu vehicle)
(in Relation zu vehicle)
A
80 p=0,013
KM
KM+MCMV/vehicle
60
KM+MCMV/FTI
KM+MCMV/GGTI
40
KM+MCMV/ZA
20
KM
KM+MCMV/vehicle
KM+MCMV/FTI
KM+MCMV/GGTI
KM+MCMV/ZA
0
Abbildung 4-13: Charakterisierung der CD8+ T-Zellen nach MCMV-Infektion. Es wurden KMT-Experimente im C57BL/6=>BALB/c-Modell ohne T-Zellen mit 5 Mäusen je
Gruppe durchgeführt. Nach 30 Tagen wurden 1x105 PFU MCMV i.p. injiziert, Mäuse der
MCMV-Gruppe wurden ohne Bestrahlung und KMT infiziert. 28 Tage später wurden die
Milzen entnommen. (A) links: Prozentuale Anteile der spezifischen CD8+ T-Zellen (oben:
pp89, unten: M164), dargestellt im Verhältnis zur vehicle-Gruppe. Es wurden 5 Mäuse pro
Gruppe untersucht. rechts: Repräsentative durchflusszytometrische Analysen, welche die
KLRG1-Expression der spezifischen CD8+ T-Zellen zeigen. (B) Die Splenozyten wurden
gegen CD8 gefärbt und durchflusszytometrisch analysiert. Der prozentuale Anteil der
CD8+ T-Zellen an allen Splenozyten ist dargestellt. (C) Durchflusszytometrische Analyse
der Splenozyten. Die Zellen wurden gegen CD8 und CD62L, KLRG1, CD27 und CD127
gefärbt. Dargestellt ist der prozentuale Anteil der jeweils positiven Zellen aller CD8+ TZellen. Die p-Werte sind angegeben, wenn p<0,05
83
Ergebnisse
Um die Effektivität der Immunantwort gegen MCMV zu untersuchen wurden ebenfalls an Tag 28 nach Infektion die Lebern und Speicheldrüsen entnommen und die
Viruslast bestimmt. In der Leber lag diese in allen Gruppen unterhalb der Detektionsgrenze von 50 PFU (Abb. 4-14A, oben). Die Speicheldrüsen wiesen Virusmengen von etwa 12000 PFU in allen Gruppen auf (Abb. 4-14A, unten).
A
Leber
Viruslast [pfu/Organ]
100000
KM+MCMV/vehicle
KM+MCMV/FTI
KM+MCMV/GGTI
KM+MCMV/ZA
10000
1000
100
Detektionsgrenze
10
1
Speicheldrüse
Viruslast [PFU/Organ]
100000
KM+MCMV/vehicle
KM+MCMV/FTI
KM+MCMV/GGTI
KM+MCMV/ZA
10000
1000
100
Detektionsgrenze
10
1
B
Überleben [%]
100
MCMV (n=6)
MCMV+KM/vehicle (n=6)
MCMV+KM/FTI (n=6)
MCMV+KM/GGTI (n=6)
MCMV+KM/ZA (n=6)
MCMV+KM+Tc/vehicle (n=6)
80
60
40
Tag 14:
20 MCMV-Infektion
0
0
14
28
42
56
Zeit nach alloKMT [Tage]
Abbildung 4-14: Überleben und Viruslast nach MCMV-Infektion. (A) Es wurden KMTExperimente im C57BL/6=>BALB/c-Modell ohne T-Zellen durchgeführt. An Tag 30 wurden die Mäuse mit 1x105 PFU MCMV infiziert und nach 28 Tagen die Viruslast in Leber
(oben) und Speicheldrüse (unten) mittels Plaque assay bestimmt. Jedes Symbol repräsentiert ein Tier. (B) Es wurden KMT-Experimente wie in (A) durchgeführt, wobei die Infektion an Tag 14 und mit 2x105 PFU MCMV durchgeführt wurde. Eine Gruppe (MCMV)
wurde ohne KMT infiziert, wobei MCMV+KM+Tc/vehicle zusätzlich an d0 1x105 T-Zellen
erhalten hat.
84
Ergebnisse
In einer Überlebensstudie sollte in einem subletalen Modell die Auswirkungen der
Behandlung mit den Inhibitoren auf die Sterberate durch MCMV untersucht werden. Die Infektion erfolgte bereits an Tag 14 nach KMT. Wurden ansonsten unbehandelte Tiere mit MCMV infiziert, so überlebten sie den gesamten Studienzeitraum (Abb. 4-14B). Die Überlebensrate der anderen Gruppen betrug zwischen 33
und 40 %. Wurden die Tiere mit ZA behandelt, stieg sie auf 80 %, wobei der Unterschied zu den anderen Gruppen nicht signifikant war (Abb. 4-14B).
4.1.9 Einfluss der Hemmung der Prenylierung auf CD8+ T-Zellen
Die Behandlung mit FTI und GGTI führte zu reduzierter Proliferation von T-Zellen
in vivo (Abb. 4-3) und CD4+ T-Zellen in vitro (Abb. 4-4B). Die GvL-Effekte und
Immunantworten bei MCMV, die stark von CD8+ T-Zelleffekten abhängen [164,
285, 286], waren trotzdem noch intakt. Somit sollte in weiteren Experimenten die
These überprüft werden, dass die Hemmung der Prenylierung weniger Einfluss
auf CD8+ T-Zellen hat. Hierzu wurden zunächst KMT-Experimente durchgeführt,
bei denen zusätzlich zum KM nur CD8+luc T-Zellen transplantiert wurden. Die Photonenstärke ausgehend von den CD8+luc T-Zellen war an Tag 9 signifikant reduziert, wenn Mäuse mit FTI oder GGTI behandelt wurden und an Tag 3 und Tag 28
signifikant erhöht, wenn eine Therapie mit ZA durchgeführt wurde. Alle weiteren
Werte waren in allen Gruppen vergleichbar (Abb. 4-15A).
In einem in vitro Proliferationstest mit CD8+ T-Zellen sollte dieser Befund bestätigt
werden. Die Proliferation der Zellen, die mit FTI inkubiert wurden, war vergleichbar
mit denen, die unbehandelt blieben (Abb. 4-15B) und lag bei etwa 9,8 %. Inkubation mit GGTI oder ZA hingegen führte zu einer signifikant erhöhten Proliferation
von 13,4 % bzw. 12,2 %.
Da die in vivo und in vitro gewonnenen Daten zu verschiedenen Ergebnissen führten, wurden, um die gleichen Bedingungen wie in den zuvor durchgeführten KMTExperimenten zu haben, in einem weiteren KMT-Experiment zusätzlich zum Knochenmark CD4+ T-Zellen und CD8+luc T-Zellen transplantiert. Es waren Signale im
Bereich der Milz und der zervikalen Lymphknoten und auch im Bereich des GItraktes zu erkennen (Abb. 4-15C, rechts), die Photonenstärke war jedoch in allen
Gruppen vergleichbar (Abb. 4-15C, links).
85
Ergebnisse
B
15
KM+Tc/vehicle
KM+Tc/FTI
KM+Tc/GGTI
KM+Tc/ZA
10
5
0
0
10
20
30
Zeit nach alloKMT [Tage]
p=0,045
15
Proliferation [%]
Photonen/sec/Maus x106
A
p=0,014
10
5
0
Medium +FTI +GGTI +ZA
C
Photonen/sec/Maus x106
KM+CD8Tcluc KM+CD8Tcluc KM+CD8Tcluc KM+CD8Tcluc
/vehicle
/FTI
/GGTI
/ZA
d5
15
10
5
d9
0
0
5
10
15
Zeit nach alloKMT [Tage]
KM+Tc/vehicle
KM+Tc/FTI
KM+Tc/GGTI
KM+Tc/ZA
d14
Abbildung 4-15: Proliferation von CD8-T-Zellen nach Inhibition der Prenylierung. (A)
Es wurden KMT-Experimente im C57BL/6=>BALB/c-Modell durchgeführt, wobei 5x105
CD8+luc T-Zellen transplantiert wurden. Gezeigt sind die Photonenstärken gemessen
durch BLI zu verschiedenen Zeitpunkten. Es wurden zwei unabhängige Experimente zusammengefasst. Die Zahl der Mäuse variiert je nach Gruppe und Zeitpunkt zwischen 3
und 5. Folgende Werte unterschieden sich signifikant von der vehicle-Gruppe: d9: FTI
p=0,0028; GGTI p=0,002; d23: ZA p=0,043; d28: ZA p=0,049 (B) Gezeigt ist ein repräsentativer in vitro Proliferationstest mit C57BL/6-BMDCs und BALB/c-CD8+-T-Zellen von drei
unabhängig durchgeführten Experimenten mit je Triplikaten. Die p-Werte sind angegeben,
wenn p<0,05. (C) Es wurden KMT-Experimente im C57BL/6=>BALB/c-Modell durchgeführt, wobei 1,5x105 CD4+ T-Zellen und 1,5x105 CD8+luc T-Zellen transplantiert wurden.
Die Mauszahl reicht von 1 (FTI, Tag 15) bis 3 Mäuse. links: Photonenstärken der BLIMessungen an verschiedenen Zeitpunkten. rechts: repräsentative BLI Bilder an den Tagen 5, 9 und 14.
86
Ergebnisse
4.1.10 Auswirkungen der Hemmung der Prenylierung auf DCs
Es wird angenommen, dass DCs als professionelle APCs eine wichtige Rolle in
der Induktion einer GvHD spielen [117]. Um den Effekt von FTI und GGTI auf diese Zellen zu untersuchen, wurden in KMT-Experimenten zusätzlich zum Knochenmark und den T-Zellen DCsluc transplantiert. Es waren deutliche Signale ausgehend von den DCsluc im Bereich verschiedener Lymphknoten und der Milz erkennbar, wenn Mäuse mit Lösungsmittel oder ZA behandelt wurden, nicht aber bei
Mäusen der FTI- oder GGTI-Gruppe (Abb. 4-16A, oben). Die Photonenstärke war
in der FTI-Gruppe deutlich und zu einigen Zeitpunkten signifikant reduziert im Vergleich zur vehicle-Gruppe (Abb. 4-16A, links unten). Mäuse, die mit GGTI behandelt wurden, zeigten leicht reduzierte Photonenstärken, wohingegen Behandlung
mit ZA zu keiner Veränderung führte (Abb. 4-16A, rechts unten). Wurden die Photonenstärken mehrerer Experimente zusammengefasst und in Relation zur vehicle-Gruppe betrachtet, so waren diese an Tag 6 nach Transplantation in allen
Gruppen signifikant reduziert (Abb. 4-16B). An Tag 14 war die Photonenstärke in
den Mäusen der FTI- und GGTI-Gruppe um das 142fache bzw. um das 50fache
reduziert, jedoch erreichten diese Werte keine Signifikanz, weil eine starke Variation vorlag. Zu diesem Zeitpunkt wiesen die mit ZA behandelten Tiere Werte auf,
die mit der vehicle-Gruppe vergleichbar waren.
87
Ergebnisse
Photonen/sec/Maus x106
DCluc+KM
+Tc/vehicle
400
300
200
100
DCluc+KM
+Tc/vehicle
DCluc+KM
+Tc/FTI
Photonen/sec/Mausx106
A
DCluc +KM+Tc/vehicle
DCluc +KM+Tc/FTI
*
10
*
5
0
0
**
5
10
Zeit nach alloKMT [Tage]
DCluc+KM
+Tc/GGTI
2000
1500
1000
500
30
20
10
0
15
DCluc+KM
+Tc/ZA
DCluc+KM+Tc/vehicle
DCluc+KM+Tc/GGTI
DCluc+KM+Tc/ZA
0
5
10
Zeit nach alloKMT [Tage]
15
Photonenstärke
(im Vergleich zu vehicle)
B
2.0
p=0,0004
1.5
p=0,02
p=0,0006
1.0
DCluc+KM+Tc/vehicle
DCluc +KM+Tc/FTI
DCluc +KM+Tc/GGTI
DCluc +KM+Tc/ZA
0.5
0.0
6
14
Zeit nach alloKMT [Tage]
Abbildung 4-16: Expansion und Migration von DCs in vivo. Es wurden KMTExperimente im C57BL/6=>BALB/c-Modell mit 3x105 T-Zellen durchgeführt. Zusätzlich
wurden 5x106 C57BL/6 BM-DCsluc injiziert und zu verschiedenen Zeitpunkten per BLI
nachverfolgt. (A) Dargestellt sind zwei unabhängige Experimente, in welchen die Mäuse
mit Lösungsmittel und FTI (links) oder Lösungsmittel, GGTI und ZA behandelt wurden
(rechts). Oben: Repräsentative BLI Bilder an Tag 14 nach Transplantation. Unten: Quantitative Darstellung der Photonen im Zeitverlauf die p-Werte sind die folgenden: d6
p=0,016; d7 p=0,004; d9 p=0,019. (B) Relative Photonenstärke im Vergleich zur vehicleGruppe. Die oben dargestellten Experimente sind zusammengefasst Die Anzahl der
Mäuse variiert je nach Zeitpunkt und Gruppe zwischen vier und einer (GGTI, d14). Die pWerte sind angegeben, wenn p<0,05
Nun sollte ausgeschlossen werden, dass die Inkubation mit FTI, GGTI oder ZA
toxische Wirkungen auf DCs hat. Hierfür wurden DCs für 24h mit Lösungsmittel,
88
Ergebnisse
FTI, GGTI oder ZA inkubiert. Die durchflusszytometrische Analyse mit AnnexinV/PI zeigte, dass keiner der Inhibitoren toxisch auf DCs wirkt (Abb. 4-17A).
DCs tragen als professionelle APCs erheblich zur Aktivierung von T-Zellen bei.
Hierzu ist neben der Präsentation von Antigen auch die Stimulation über kostimulatorische Moleküle notwendig. Somit wurden DCs mit LPS stimuliert, was zu einer
signifikanten Heraufregulierung der kostimulatorischen Moleküle CD40, CD80 und
CD86 führte (Abb. 4-17D, Medium, CD40, CD80: p<0,0001, CD86: p=0,0006). Die
Inkubation mit FTI, GGTI oder ZA führte jedoch zu keiner Veränderung in der Expression dieser Moleküle verglichen mit der Kontrollgruppe (Abb. 4-17D). Eine
Stimulation mit LPS führte ebenfalls zu einer signifikanten Heraufregulierung von
MHC-Klasse II-Molekülen (Abb. 4-17E, Medium p=0,0023), wobei eine Inkubation
mit FTI, GGTI oder ZA keine Expressionsveränderungen herbeiführte (Abb. 417E)
89
Ergebnisse
A
B
Migrierte Zellen
(relativ zu Medium)
Viable Zellen [%]
100
80
60
40
20
0
C
1.0
0.5
300
200
100
-
+
+
+
+
+
CD40
Medium
Medium
+FTI
+GGTI
+ZA
-
+
+
+
+
CD86
150
100
50
0
25
Medium
Medium
20
+FTI
15
+GGTI
+ZA
10
Medium
Medium
+FTI
+GGTI
+ZA
5
0
-
E
MHC-Klasse II (MFI)
LPS
+
CD86 (MFI)
CD80 (MFI)
+
CD80
200
LPS
+
0
0
LPS
-
CD40 (MFI)
Phalloidin (MFI)
400
Medium
Medium
+FTI
+GGTI
+ZA
p=0,002
0.0
+GGTI
CXCL12
+ZA
+Camptothecin
150
DMedium
Medium
+FTI
100
+GGTI
+ZA
50
Medium
+FTI
p=0,016
1.5
+
+
+
+
LPS
-
+
+
+
+
MHC-Klasse II
2500
Medium
Medium
+FTI
+GGTI
+ZA
2000
1500
1000
500
0
LPS
-
+
+
+
+
Abbildung 4-17: Migration in vitro und Expression kostimulatorischer Moleküle auf
DCs (A) C57BL/6 BMDCs wurden jeweils mit 10 µM FTI, GGTI, ZA, Camptothecin oder
vehicle (Medium) in Proliferationsmedium inkubiert. Nach 24h wurde ein Apoptosetest
mittels AnnexinV und PI durchgeführt und die Zellen durchflusszytometrisch auf Viabilität
untersucht. Gezeigt ist ein repräsentatives Experiment von drei unabhängig durchgeführten Versuchen. (B) Es wurden in vitro Migrationstests mit C57BL/6-T-Zellen durchgeführt.
Dargestellt sind die zusammengefassten Ergebnisse dreier unabhängiger Versuche im
Verhältnis zur unbehandelten Gruppe. (C-E) C57BL/6 BMDCs wurden 24h mit LPS stimuliert und mit 10 µM FTI, GGTI, ZA oder vehicle (Medium) inkubiert. (C) Die Expression von
F-Aktin wurde mittels FITC-gekoppeltem Phalloidin angefärbt und durchflusszytometrisch
analysiert. Gezeigt ist ein repräsentatives Experiment von fünf unabhängig durchgeführten Versuchen. (D) Die Expression der kostimulatorischen Moleküle CD40, CD80 und
CD86 wurden durchflusszytometrisch ermittelt. Gezeigt ist jeweils ein repräsentatives Experiment von fünf unabhängig durchgeführten Versuchen. (E) Die Expression von MHCKlasse II-Molekülen wurde durchflusszytometrisch ermittelt. Gezeigt ist jeweils ein repräsentatives Experiment von drei unabhängig durchgeführten Versuchen.
90
Ergebnisse
4.2 Untersuchungen zur Rolle der γc in der GvHD
4.2.1 Einfluss der Hemmung der γc auf das Überleben und das
Anwachsen des Transplantats
Um die Auswirkungen der Inhibition der γc auf das Überleben zu untersuchen,
wurden alloKMT-Experimente im C57BL/6 => BALB/c-Modell durchgeführt. Hierbei konnte durch Zugabe von T-Zellen eine letale GvHD induziert werden (Abb. 418A, KM+Tc/Isotyp-Kontrolle). Die Hemmung der γc transplantierter Versuchstiere
mit α-CD132 führte zu signifikant verbessertem Überleben (Abb. 4-18A). Da die
Behandlung mit CsA im Mensch eine sehr häufige und erfolgreiche Methode zur
Behandlung der GvHD darstellt [119] sollte dies im vorliegenden Versuch auch im
Mausmodell untersucht werden. Die Behandlung mit CsA führte jedoch zu keinem
verbessertem
Überleben
verglichen
zur
Kontrollgruppe
(Abb.
4-18A,
KM+Tc/Isotyp-Kontrolle KM+Tc/CsA).
Eine Komplikation nach einer HSZT ist die Abstoßung, bzw. das nicht-Anwachsen
des Transplantats [287]. Um zu untersuchen, ob durch die Behandlung mit αCD132 das Anwachsens des Transplantats gestört war, wurde an Tag 100 nach
alloHSZT bei den überlebenden Mäusen eine sogenannte Chimerismusanalyse
der lymphatischen Zellen durchgeführt. Hierbei zeigte sich ein vollständiges Anwachsen des gespendeten Knochenmarks, da alle Zellen den kongenen Marker
H2kb der Spendertiere aufwiesen (Abb. 4-18B).
91
Ergebnisse
C57BL/6=>BALB/c
A
Überleben [%]
100
KM+Tc/Isotyp-Kontrolle (n=16)
KM+Tc/-CD132 (n=16 p=0,0008)
KM+Tc/CsA (n=8)
80
60
40
20
0
0
20
40
60
80
100
Zeit nach alloKMT [Tage]
H2kb+ Zellen [%]
B
100
80
unbehandelt (C57BL/6)
KM+Tc/-CD132
60
40
20
0
CD4+ CD8+ CD11c+CD19+ NK1.1+
Abbildung 4-18: Überleben nach Hemmung der γc im „major-mismatch"-Modell. Es
wurde eine alloKMT mit 5x105 T-Zellen durchgeführt. Als Empfängertiere dienten BALB/cMäuse, als Spender C57BL/6-Mäuse. Die Behandlung der Tiere erfolgte wie in den Methoden angegeben. (A) Der Versuch wurde in zwei unabhängigen Experimenten durchgeführt und in der abgebildeten Überlebenskurve zusammengefasst. (B) An Tag 100 nach
Transplantation wurden die Milzen der überlebenden Tiere entnommen und eine Chimerismusanalyse durchgeführt. Hierbei wurden durchflusszytometrisch Marker verschiedener Zellpopulationen und der kongene Marker H2kb für die Spenderzellen analysiert. Es
wurden 3 Tiere pro Gruppe verwendet.
4.2.2 Proinflammatorische Zytokine bei GvHD nach Behandlung mit αCD132
Um das inflammatorische Milieu in Mäusen bei GvHD zu untersuchen wurden an
Tag 7 nach alloHSZT die Konzentrationen der Zytokine IFN-γ, TNF-α, MCP-1 und
IL-6 im Blut gemessen. In Mäusen, die keine GvHD entwickelten, da sie keine TZellen erhielten, wurden geringe Mengen dieser Zytokine detektiert (Abb. 4-19,
KM). Die Induktion einer GvHD mittels allogener T-Zellen führte zu einem signifikanten Anstieg (Abb. 4-19, KM, KM+Tc/Isotyp-Kontrolle; IFN-γ: p=0,0016; TNF-α:
p<0,0001; MCP-1: p<0,0001; IL-6: p=0,0015). Durch die Hemmung der γc waren
diese Werte signifikant reduziert (Abb. 4-19, KM+Tc/α-CD132). Die Behandlung
mit CsA führte zu einer Reduktion von IFN-γ, MCP-1 und IL-6 um das 1,8- bis
2,5fache, die signifikant war für MCP-1 (p=0,02) und IL-6 (p=0,04) (Abb. 4-19,
KM+Tc/CsA).
92
Ergebnisse
IFN-
TNF-
1500
Zytokinkonzentration
[pg/ml]
Zytokinkonzentration
[pg/ml]
p=0,012
1000
500
0
400
300
200
100
0
KM
KM+Tc/Isotyp-Kontrolle
KM+Tc/-CD132
KM+Tc/CsA
KM
KM+Tc/Isotyp-Kontrolle
KM+Tc/-CD132
KM+Tc/CsA
IL-6
MCP-1
2000
Zytokinkonzentration
[pg/ml]
Zytokinkonzentration
[pg/ml]
p=0,0002
p=0,001
1500
1000
500
250
p=0,0014
200
150
100
50
0
0
KM
KM+Tc/Isotyp-Kontrolle
KM+Tc/-CD132
KM+Tc/CsA
KM
KM+Tc/Isotyp-Kontrolle
KM+Tc/-CD132
KM+Tc/CsA
Abbildung 4-19: Proinflammatorische Zytokine im Serum transplantierter Mäuse
nach Hemmung der γc. Mäuse wurden im C57BL/6=>BALB/c-Modell transplantiert mit
5x105 T-Zellen. An Tag 7 wurde das Blutserum durch intrakardiale Punktion gewonnen
und die Konzentrationen von IFN-γ, TNF-α, MCP-1 und IL-6 bestimmt. Es wurden 2 unabhängige Experimente durchgeführt und zusammengefasst. Gezeigt sind die Werte von
insgesamt 12 Mäusen pro Gruppe. Die p-Werte sind hier oder im Text angegeben, wenn
p<0,05
4.2.3 Expansion von T-Zellen in vivo nach Hemmung der γc
Um die Expansion und Migration der Donor-T-Zellen im Rezipienten zu untersuchen wurde ein KMT-Experiment durchgeführt, bei dem T-Zellen, die aus luc+
Mäusen gewonnen wurden, transplantiert wurden. Es zeigten sich in allen untersuchten Gruppen starke Signale im Bereich der zervicalen Lymphknoten, und im
abdominalen Bereich (Abb. 4-20A). Die Photonenstärke war über den gesamten
Beobachtungszeitraum in allen Gruppen vergleichbar.
93
d6
d10
+Tc/CsA
+Tc/
unsp.IgG
d6
d10
Ergebnisse
+Tc/
unsp.IgG
A
KM+Tcluc/
d6
Isotyp-Kontrolle
+Tc/
d6
unsp.IgG
+Tc/CsA
+Tc/
+Tc/
unsp.IgG
α-CD132
d6
+Tc/CsA
+Tc/
α-CD132
KM+Tcluc/
CsA
d10
+Tc/CsA
d10
+Tc/d8
+Tc/CsA
α-CD132
+Tc/CsA
B +Tc/
+Tc/
α-CD132
+Tc/
α-CD132
α-CD132
25
Photonen/sec/Maus x106
+Tc/
unsp.IgG
KM+Tcluc/
d10
α-CD132
d6
20
15
KM+Tc/Isotyp-Kontrolle
KM+Tc/-CD132
KM+Tc/CsA
10
5
0
0
3 6 8 10 13 15 21
Zeit nach alloKMT [Tage]
Abbildung 4-20: Expansion der Donor-T-Zellen in vivo bei Inhibition der γc. Es wurden KMT-Experimente im C57BL/6=>BALB/c-Modell durchgeführt, wobei 5x105 T-Zellenluc
transplantiert wurden. Gezeigt sind die zusammengefassten Werte von 2 Experimenten.
Die Anzahl der Mäuse variiert zwischen 16 (d0, Isotypkontrolle) und 2 Tieren (d21, CsA)
(A) Repräsentative Bilder der BLI-Kamera an den Tagen 6 und 10. (B) Quantitative Darstellung der Photonen im Zeitverlauf
4.2.4 Einfluss der Hemmung der γc auf die Myeloperoxidase-Aktivität
Myeloide Zellen zeichnen sich durch die Aktivität der MPO aus, die hauptsächlich
antibakterielle Aktivität vermittelt [288]. Neuere Studien gaben auch Hinweise auf
einen Beitrag dieser Zellen in der GvHD im Mensch [289]. In unserer Arbeitsgruppe wurden ebenfalls Hinweise gefunden, dass myeloide Zellen zur GvHDEntstehung beitragen (nichtveröffentlichte Daten). Die MPO-Aktivität kann durch
die Injektion von Luminol im BLI-System sichtbar gemacht werden [273]. Zunächst
sollte das Verhalten von MPO-produzierenden Zellen bei Behandlung mit αCD132 durch Luminol-BLI untersucht werden. Es zeigten sich vor allem an Tag 3
und 4 nach alloHSZT starke Signale im abdominalen Bereich der Mäuse (Abb. 421A), die ab Tag 5 wieder abfielen. Wurde keine GvHD induziert, wiesen die Sig94
Ergebnisse
nale zu jedem gemessenen Zeitpunkt vergleichbare Werte zu den anderen Zeitpunkten auf (Abb. 4-21A, links, Abb. 4-21B, KM). Die Stärke der gemessenen
Photonen war in jeder Gruppe, die T-Zellen erhielt, vergleichbar (Abb.4-21B).
A
KM
KM+Tc/
Isotyp-Kontrolle
KM+Tc/α-CD132
KM+Tc/α-CsA
d3
d4
Photonen/sec/Maus x106
B
KM
KM+Tc/Isotyp-Kontrolle
KM+Tc/-CD132
KM+Tc/CsA
5
4
3
2
1
0
-1
0 1 2 3 4 5 6
Zeit nach alloKMT [Tage]
Abbildung 4-21: Myeloperoxidase-Aktivität bei GvHD bei Inhibition der γc. Es wurden
KMT-Experimente im C57BL/6=>BALB/c-Modell durchgeführt, wobei 5x105 T-Zellen
transplantiert wurden. Es wurde im gezeigten Zeitraum täglich BLI mit Luminol durchgeführt. (A) Repräsentative Bilder der BLI-Kamera an den Tagen 3 und 4. (B) Quantitative
Darstellung der Photonen im Zeitverlauf von je 6 Mäusen pro Gruppe.
4.2.5 Lymphatische und myeloide Zellen bei GvHD und Behandlung
mit α-CD132
Die in 4.2.3 gewonnenen Ergebnisse deuten an, dass die Reduktion der GvHD
durch α-CD132-Behandlung (Abb. 4-18, 4-19) nicht auf eine reduzierte Expansion
der Donor-T-Zellen zurückzuführen ist (Abb. 4-20). Um genauere Einblicke in das
Vorhandensein einzelner Zellpopulationen in den Rezipienten zu erhalten wurden
die Milzen an Tag 7 nach alloHSZT auf verschiedene lymphatische Zellen hin un95
Ergebnisse
tersucht. In Tieren, die mit α-CD132 behandelt wurden, zeigten sich signifikante
Reduktionen der CD4+-Zellen (3,3 % auf 1,3 %), CD11c+-Zellen (16,6 % auf 10,2
%) und CD19+-Zellen (7,8 % auf 4,6 %). Auch die CD8+-Zellen zeigten einen
Trend zu einem geringeren Anteil (24,1 % auf 13,3 %), jedoch war dies nicht signifikant (Abb. 4-22A, KM+Tc/Isotyp-Kontrolle, KM+Tc/α-CD132). Die Werte der mit
CsA behandelten Tiere waren vergleichbar mit denen der Kontrollgruppe (Abb. 422A, KM+Tc/Isotyp-Kontrolle, KM+Tc/CsA). In der Gruppe der myeloiden Zellen
wiesen alle untersuchten Tiere vergleichbare Werte auf (Abb. 4-22B), was in Einklang mit der unveränderten MPO-Aktivität steht (Abb. 4-21). In einer Reihe weiterer Versuche sollte nun einzelne Zellpopulationen genauer untersucht werden.
96
Ergebnisse
CD8
CD4
A
p=0,01
10
5
60
40
20
0
0
KM+Tc/Isotyp-Kontrolle
CD11c
KM+Tc/-CD132
KM+Tc/CsA
p=0,007
30
20
10
CD19
5
0
KM+Tc/Isotyp-Kontrolle
inflammatorische
KM+Tc/-CD132
Monozyten/Makrophagen
KM+Tc/CsA
% der CD45+CD11b+ Zellen
F4-80
nicht-inflammatorische
Monozyten/Makrophagen
60
40
20
0
% der CD45+CD11b+ Zellen
nicht-inflammatorische
Monozyten/Makrophagen
Neutrophile
30
KM+Tc/
Isotyp-Kontrolle
KM+Tc/-CD132
KM+Tc/CsA
20
10
0
+
% der CD45+CD11b
Zellen
% der CD45+CD11b+ Zellen
Ly6G
Neutrophile
80
KM+Tc/
Isotyp-Kontrolle
KM+Tc/-CD132
KM+Tc/CsA
10
0
100
p=0,005
15
CD19+ aller
Splenozyten [%]
CD11c+ aller
Splenozyten [%]
40
B
KM+Tc/
Isotyp-Kontrolle
KM+Tc/-CD132
KM+Tc/CsA
80
CD8+ aller
Splenozyten [%]
CD4+ aller
Splenozyten [%]
15
inflammatorische
inflammatorische
Monozyten/Makrophagen
Monozyten/Makrophagen
30
30
20
20
KM+Tc/Isotyp-Kontrolle
10
KM+Tc/-CD132
10
KM+Tc/Isotyp-Kontrolle
KM+Tc/
KM+Tc/-CD132
Isotyp-Kontrolle
KM+Tc/CsA
KM+Tc/-CD132
KM+Tc/CsA
KM+Tc/CsA
0
0
Abbildung 4-22: Analyse der Zellpopulationen bei GvHD nach Behandlung mit αCD132. (A, B) Es wurden KMT-Experimente im C57BL/6=>BALB/c-Modell durchgeführt,
wobei 5x105 T-Zellen transplantiert wurden. An Tag 7 nach KMT wurden die Milzen entnommen und auf verschiedene Antigene gefärbt. Die Kombination verschiedener Oberflächenmoleküle erlaubte die Einteilung in verschiedene Gruppen bei durchflusszytometrischer Analyse. Aufgetragen sind die prozentualen Anteile der Zellpopulationen an der
Gesamtzellzahl. Gezeigt sind die zusammengefassten Werte von 2 Experimenten mit
insgesamt 12 Mäusen pro Gruppe. (B) links oben: Beispiel der Einteilung der myeloiden
Zellen anhand der durchflusszytometrischen Analyse. Die myeloiden Zellen wurden folgendermaßen definiert: CD11b+CD45+, Neutrophile: Ly6G+F4-80-; Inflammatorische Monozyten/Makrophagen: Ly6G+F4-80+; Nichtinflammatorische Monozyten/Makrophagen:
Ly6G-F4-80+. Die p-Werte sind angegeben, wenn p<0,05
97
Ergebnisse
4.2.6 Charakterisierung der CD4+ T-Zellen bei GvHD nach Hemmung
der γc
4.2.6.1 Überleben
Um zu untersuchen, welche Rolle die CD4+ T-Zellen beim verbesserten Überleben
nach Hemmung der γc spielen, wurde ein alloKMT-Experiment im C57BL/6 =>
BALB/c-Modell durchgeführt, wobei nur KM und CD4+ T-Zellen transplantiert wurden. Es konnte hierdurch eine letale GvHD induziert werden, die Mäuse der Kontrollgruppe verstarben in den ersten 12 Tagen (Abb. 4-23, KM+Tc/IsotypKontrolle). Eine Behandlung mit α-CD132 führte zu keinem verbesserten Überleben (Abb. 4-23, KM+Tc/α-CD132). Mäuse die keine T-Zellen erhalten hatten überlebten vollständig bis zum Ende des Beobachtungszeitraums (Abb. 4-23, KM).
CD4+ T-Zellen
Überleben [%]
100
80
60
KM (n=3)
KM+CD4+Tc/Isotyp-Kontrolle (n=6)
40
KM+CD4+Tc/-CD132 (n=6)
20
0
0
10
20
30
Zeit nach alloKMT [Tage]
Abbildung 4-23: Überleben nach Hemmung der γc im „major-mismatch"-Modell mit
nur CD4+ T-Zellen. Es wurde eine alloKMT im C57BL/6 => BALB/c-Modell durchgeführt.
Zur Induktion der GvHD wurden 7,5x105 CD4+ T-Zellen transplantiert. Der Versuch wurde
einmal mit der angegebenen Mauszahl durchgeführt und in der abgebildeten Überlebenskurve zusammengefasst.
4.2.6.2 Aktivierungs- und regulatorische Marker
Die CD4+ T-Zellen wurden auch auf ihren Aktivierungsstatus hin untersucht. CD25
wird wie CD69 auf aktivierten CD4+ T-Zellen stark exprimiert [52, 290]. CD107a
stellt hingegen einen Degranulierungsmarker dar [291]. Die Expression von CD25
war reduziert in Mäusen, die mit α-CD132 behandelt wurden (51,8 % vs. 29,8 %),
was jedoch nicht statistisch signifikant war (Abb. 4-24A, oben links KM+Tc/IsotypKontrolle, KM+Tc/α-CD132). Die CD69-Expression war vergleichbar in allen
Gruppen (Abb. 4-24A, oben rechts). In den mit α-CD132 behandelten Tieren wurden jedoch signifikant erhöhte prozentuale Anteile an CD107a-positiven Zellen
gefunden, die etwa das 1,4fache der Kontrollgruppe betrugen. In den mit CsA be98
Ergebnisse
handelten Mäusen waren die Werte vergleichbar mit der Kontrollgruppe (Abb.24A,
unten links).
Der für Tregs spezifische Transkriptionsfaktor FoxP3 [46] wurde in etwa 35 % der
CD4+ Zellen exprimiert, die aus den Mäusen der Kontrollgruppe isoliert wurden,
und in etwa 48 % der CD4+ Zellen aus der α-CD132 behandelten Gruppe (Abb. 424 B). Dieser Unterschied war jedoch nicht signifikant. Wurden Zellen aus Mäusen
untersucht, die mit CsA behandelt wurden, zeigten sich etwa 24 % FoxP3-positive
CD4+ Zellen in der Milz (Abb. 4-24 B), jedoch wurde auch hier keine statistische
Signifikanz im Vergleich zu den Werten der anderen Gruppen erreicht.
CD25
CD69
% CD69+ der CD4+ Zellen
% CD25+ der CD4+ Zellen
A
100
80
60
40
20
0
60
KM+Tc/Isotyp-Kontrolle
KM+Tc/-CD132
KM+Tc/CsA
KM+Tc/Isotyp-Kontrolle
KM+Tc/-CD132
KM+Tc/CsA
40
20
0
CD107a
80
60
40
20
0
p=0,003
FoxP3
% FoxP3+ der CD4+ Zellen
% CD107a+ der CD4+ Zellen
B
100
KM+Tc/Isotyp-Kontrolle
80
KM+Tc/-CD132
KM+Tc/CsA
KM+Tc/Isotyp-Kontrolle
KM+Tc/-CD132
KM+Tc/CsA
60
40
20
0
Abbildung 4-24: Aktivierungsmarker auf CD4+ T-Zellen bei GvHD nach Behandlung
mit α-CD132. Es wurden KMT-Experimente im C57BL/6=>BALB/c-Modell durchgeführt,
wobei 5x105 T-Zellen transplantiert wurden. An Tag 7 nach KMT wurden die Milzen entnommen und gefärbt. Gezeigt sind die zusammengefassten Werte von 2 Experimenten
mit insgesamt 12 Mäusen pro Gruppe. (A) Die Zellen wurden auf CD4 und verschiedene
Oberflächenmarker gefärbt und durchflusszytometrisch untersucht. (B) Die Zellen wurden
auf CD4 und intrazellulär auf den Transkriptionsfaktor FoxP3 gefärbt und durchflusszytometrisch untersucht. Die p-Werte sind angegeben, wenn p<0,05
99
Ergebnisse
4.2.6.3 Intrazelluläre Zytokine
In 4.2.5 wurde eine Reduktion der CD4+ T-Zellen in den Milzen der mit α-CD132
behandelten Empfängertiere an Tag 7 beobachtet. Um einen Einblick in die Differenzierung und Funktion dieser Zellen zu erhalten wurden an Tag 7 nach KMT
CD4+ Zellen aus der Milz isoliert und auf die intrazellulär vorhandenen Zytokine
IFN-γ, IL-2, IL-17, IL-4 und IL-10 untersucht. Verglichen mit der Kontrollgruppe
waren in der mit α-CD132 behandelten Gruppe prozentual mehr CD4+ Zellen positiv für alle gemessenen Zytokine. Dies war statistisch signifikant für IL-2, IL-17 und
IL-10 (Abb. 4-25, KM+Tc/Isotyp-Kontrolle, KM+Tc/α-CD132). Mäuse, die mit CsA
behandelt wurden, zeigten für alle Zytokine eine signifikante Abnahme der positiven Zellen verglichen mit der Kontrollgruppe (Abb. 4-25, KM+Tc/Isotyp-Kontrolle,
KM+Tc/CsA; IFN-γ: p=0,004; IL-2: p=0,007; IL-17: p=0.014; IL-4: p= 0,0004; IL-10:
p=0,0002).
100
Ergebnisse
IL-2
% IL-2+ der CD4+ Zellen
% IFN+ der CD4+ Zellen
IFN-
80
25
p=0,046
20
KM+Tc/Isotyp-Kontrolle
KM+Tc/-CD132
15
KM+Tc/CsA
60
40
20
0
10
5
0
p=0,017
IL-4
% IL-4+ der CD4+ Zellen
% IL17+ der CD4+ Zellen
IL-17
10
15
KM+Tc/Isotyp-Kontrolle
KM+Tc/-CD132
10
KM+Tc/CsA
8
6
4
2
0
KM+Tc/Isotyp-Kontrolle
KM+Tc/-CD132
KM+Tc/CsA
KM+Tc/Isotyp-Kontrolle
KM+Tc/-CD132
KM+Tc/CsA
5
0
% IL-10+ der CD4+ Zellen
IL-10
20
p=0,002
15
KM+Tc/Isotyp-Kontrolle
KM+Tc/-CD132
KM+Tc/CsA
10
5
0
Abbildung 4-25: Expression von Zytokinen in CD4+ T-Zellen bei GvHD nach Behandlung mit α-CD132. Es wurden KMT-Experimente im C57BL/6=>BALB/c-Modell durchgeführt, wobei 5x105 T-Zellen transplantiert wurden. An Tag 7 nach KMT wurden die Milzen
entnommen, auf CD4 und verschiedene intrazelluläre Zytokine gefärbt und durchflusszytometrisch untersucht. Aufgetragen sind die prozentualen Anteile der Zytokin-positiven
Zellen an der Gesamtzellzahl der CD4 positiven Zellen. Gezeigt sind die zusammengefassten Werte von 2 Experimenten mit insgesamt 12 Mäusen pro Gruppe. Die p-Werte
der α-CD132-Gruppe, verglichen mit der Isotyp-Kontroll-Gruppe sind angegeben, wenn
p<0,05
4.2.7 Charakterisierung der CD8+ T-Zellen bei GvHD und Behandlung
mit α-CD132
4.2.7.1 Überleben
Um zu untersuchen, welche Rolle die CD8+ T-Zellen beim Überleben nach Hemmung der γc spielen, wurde ein alloKMT-Experiment im C57BL/6 => BALB/c101
Ergebnisse
Modell durchgeführt, wobei nur KM und CD8+ T-Zellen transplantiert wurden. Es
konnte hierdurch eine letale GvHD induziert werden, die Mäuse der Kontrollgruppe
verstarben in den ersten 30 Tagen (Abb. 4-26, KM+Tc/Isotyp-Kontrolle). Eine Behandlung mit α-CD132 führte jedoch zu signifikant verbessertem Überleben (Abb.
4-26, KM+Tc/α-CD132). Mäuse, die keine T-Zellen erhalten hatten überlebten
vollständig bis zum Ende des Beobachtungszeitraums (Abb. 4-26, KM).
CD8+ T-Zellen
Überleben [%]
100
80
KM (n=3)
KM+CD8+ Tc/Isotyp-Kontrolle (n=12)
KM+CD8+ Tc/-CD132 (n=12) (p<0,0001)
60
40
20
0
0
20
40
60
80
100
Zeit nach alloKMT [Tage]
Abbildung 4-26: Überleben nach Hemmung der γc im „major-mismatch"-Modell mit
nur CD8+ T-Zellen. Es wurde eine alloKMT durchgeführt. Als Empfängertiere dienten
BALB/c-Mäuse, als Spender C57BL/6-Mäuse. Die Behandlung der Tiere erfolgte wie in
den Methoden angegeben. Zur Induktion der GvHD wurden 1x106 CD8+ T-Zellen transplantiert. Der Versuch wurde zweimal mit der angegebenen Mauszahl durchgeführt und in
der abgebildeten Überlebenskurve zusammengefasst.
4.2.7.2 Zytotoxizität
Zur genaueren Untersuchung der Rolle der CD8+ T-Zellen in GvHD wurden zunächst humane Blutproben von Patienten, die eine Konditionierungstherapie und
KMT erhalten hatten, auf Expression der zytotoxischen Moleküle GranzymB und
Perforin in CD8+ T-Zellen untersucht. In den Proben freiwilliger gesunder Spender
waren etwa 30 % der CD8+ T-Zellen positiv für GranzymB, dieser Wert lag in den
CD8+ T-Zellen der Patienten mit Konditionierungstherapie signifikant höher bei
etwa 50 % (Abb. 4-27 A, links). Die Untersuchung auf Perforin ergab 47 % positive
CD8+ T-Zellen bei den gesunden Spendern, während dieser Anteil bei den Patienten signifikant auf etwa 72 % erhöht war (Abb. 4-26 A, rechts).
Im murinen GvHD-Modell wurden CD8+ T-Zellen aus der Milz an Tag 7 nach
GvHD untersucht. Hier zeigte sich in Mäusen, die mit α-CD132 behandelt wurden,
eine signifikante Abnahme der GranzymB positiven Zellen von 6,3 % auf 2,3 %
102
Ergebnisse
(Abb. 4-27B, rechts, KM+Tc/Isotyp-Kontrolle, KM+Tc/α-CD132). Die Behandlung
mit CsA führte zu vergleichbaren Ergebnissen zur Kontrollgruppe (Abb. 4-27B,
rechts, KM+Tc/Isotyp-Kontrolle, KM+Tc/CsA). Der Anteil CD107a positiver Zellen
an den CD8+ Zellen war vergleichbar in allen untersuchten Gruppen (Abb. 4-27 B,
links).
GranzymB
100
80
60
40
20
0
% GranzymB+ der CD8+Zellen
% CD107a+ aller CD8+ Zellen
B
CD107a
80
100
80
gesund
60
Konditionierungstherapie
40
20
0
GranzymB
20
p=0,04
KM+Tc/Isotyp-Kontrolle
KM+Tc/-CD132
15
KM+Tc/CsA
60
40
20
0
GranzymB
20
p=0,0003
% GranzymB+ aller CD8+ Zellen
p=0,042
Perforin
% Perforin+ aller CD8+ Zellen
% GranzymB+ aller CD8+ Zellen
A
p=0,04
KM+Tc/Isotyp-Kontrolle
KM+Tc/-CD132
KM+Tc/CsA
10
5
0
KM+Tc/Isotyp-Kontrolle
KM+Tc/-CD132
KM+Tc/CsA
15
Abbildung 4-27: Aktivierung zytotoxischer T-Zellen bei GvHD. (A) Aus menschlichen
Blutproben
wurden die Lymphozyten isoliert und auf CD8, GranzymB und Perforin durch10
flusszytometrisch untersucht. Aufgetragen ist der prozentuale Anteil der jeweils positiven
5
Zellen
an den CD8+ Zellen. Es wurde das Blut von 20 Patienten untersucht, die eine Konditionierungstherapie (Bestrahlung oder Chemotherapie) erhalten hatten und mit dem von
0 gesunden freiwilligen Spendern verglichen. (B) Es wurden KMT-Experimente im
10
C57BL/6=>BALB/c-Modell durchgeführt, wobei 5x105 T-Zellen transplantiert wurden. An
Tag 7 nach KMT wurden die Milzen entnommen, auf CD8 und verschiedene Oberflächenmarker gefärbt und durchflusszytometrisch untersucht. Gezeigt sind die zusammengefassten Werte von 2 Experimenten mit insgesamt 12 Mäusen pro Gruppe. Die p-Werte
sind angegeben, wenn p<0,05
Um die Rolle der γc-Zytokine für die Funktion der zytotoxischen T-Zellen zu untersuchen, wurden CD8+ T-Zellen durch α-CD3/CD28-Kügelchen oder mit allogenen
DCs stimuliert und mit IL-2, IL-7, IL-15, IL-21 oder einer Kombination aus diesen
103
Ergebnisse
Zytokinen inkubiert. Im gleichen Ansatz wurden ebenfalls CD8 + T-Zellen ohne weiteren Stimulus mit den Zytokinen kultiviert. Die durchflusszytometrische Untersuchung von intrazellulärem GranzymB zeigte bei beiden Ansätzen, dass eine Inkubation mit IL-2, IL-15 oder einer Kombination aus IL-2, IL-7, IL-15 und IL-21 zu
einer signifikant verstärkten Produktion von GranzymB in CD8 + T-Zellen führte
(Abb. 4-28). Wurden die T-Zellen durch Bindung an CD3 und CD28 stimuliert führte die gleichzeitige Anwesenheit von IL-2, IL-15, IL-21 oder der Kombination aus
allen eingesetzten Zytokinen zu einem signifikant erhöhten Signal durch
GranzymB. Dieses war vergleichbar in all diesen Gruppen (Abb. 4-28 A). Die Stimulation der T-Zellen durch allogene DCs in Anwesenheit von IL-2, IL-7, IL-15, IL21 oder der Kombination dieser Zytokine führte zu einer signifikant erhöhten Produktion von GranzymB, verglichen mit der Probe, die ohne Zytokin belassen wurde. Auch hier waren diese erhöhten Werte in den Gruppen vergleichbar (Abb. 4-28
B).
A
IL-2
IL-7
IL-21
** **
80
*
IL-2,7,15,21
******
**
**
**
60
***
***
40
B
IL-2
0
10
50
0
10
50
-
50
***
***
***
+
-
+
IL-7
*
-
+
IL-15
-
0
10
50
0
10
50
**
0
10
50
0
10
50
**
0
10
50
0
10
50
20
***
0
10
50
0
10
50
***
0
Zytokinkonzentration(ng/ml)
-CD3/CD28
+
IL-21
-
+
IL-2,7,15,21
***
40
***
30
**
20
**
* **
** **
**
* **
**
**
*
-
+
-
+
-
+
-
+
0
10
50
0
10
50
0
10
50
0
10
50
0
Zytokinkonzentration(ng/ml)
BM-DCs
0
10
50
0
10
50
10
0
10
50
0
10
50
% GranzymB+
aller CD8+ Zellen
IL-15
0
10
50
0
10
50
% GranzymB+
aller CD8+ Zellen
100
-
+
Abbildung 4-28: Induktion von GranzymB in CD8+T-Zellen durch γc-Zytokine. CD8+
Zellen aus C57BL/6-Mäusen wurden nicht stimuliert (schwarz) oder für 48h mit Dynabeads® mouse T-activator α-CD3/CD28 (A) oder mit alloDCs (B) inkubiert (weiß). Zusätzlich
wurden die jeweiligen Zytokine in der angegebenen Konzentration zugegeben. Die
GranzymB-Expression in den Zellen wurde durchflusszytometrisch bestimmt. Gezeigt ist
jeweils 1 represäntatives Ergebnis von insgesamt jeweils 3 durchgeführten Versuchen mit
Triplikaten. Die p-Werte beziehen sich auf die jeweiligen Proben mit Zytokin verglichen mit
104
Ergebnisse
0 ng/ml und sind wie folgt dargestellt: *p<0,05; **p<0,01; ***p<0,001. Sie sind angegeben,
wenn p<0,05
4.2.8 Untersuchung zur Rolle des Perforin-Signalwegs in GvHD bei
Hemmung der γc
Da in Abb. 4-27 und 4-28 Hinweise zu finden waren, dass der Signalweg über
GranzymB und Perforin eine Rolle bei der GvHD spielt und die Blockade der γc
möglicherweise diesen Signalweg inhibiert, wurde eine alloKMT mit T-Zellen aus
Perf-/--Mäusen durchgeführt. Dass diese T-Zellen trotz Defizienz in Perforin eine
GvHD auslösen können, konnte bereits gezeigt werden [166] und wurde in diesem
Experiment bestätigt (Abb. 4-29, KM+Tc(Perf-/-)/Isotyp-Kontrolle). Das Überleben
dieser Tiere war vergleichbar mit Mäusen, die zur GvHD-Induktion T-Zellen aus
C57BL/6-Mäusen erhalten hatten (Abb. 4-29, KM+Tc(wt)). Eine Behandlung der
Empfängertiere mit α-CD132 führte zu keiner Veränderung im Überleben, sodass
alle Tiere an Tag 38 verstorben waren.
Überleben [%]
100
KM+Tc(Perf -/-)/-CD132 (n=12)
KM+Tc(Perf -/-)/Isotyp-Kontrolle (n=12, p=0,62)
KM+Tc(wt) (n=12)
80
60
40
20
0
0
10
20
30
40
Zeit nach alloKMT [Tage]
Abbildung 4-29: Einfluss der Hemmung der γc bei durch Perforin-defizienten TZellen ausgelöster GvHD. Es wurde eine alloKMT im C57BL/6=>BALB/c-Modell durchgeführt. Die Behandlung der Tiere erfolgte wie in den Methoden angegeben. Zur Induktion
der GvHD wurden 8x105 T-Zellen aus C57BL/6 (wt) oder Perf-/- Mäusen transplantiert.
Das KM stammte aus C57BL/6-Mäusen. Der Versuch wurde zweimal mit der angegebenen Mauszahl durchgeführt und in der abgebildeten Überlebenskurve zusammengefasst.
105
Diskussion
5 Diskussion
Die HSZT ist eine der am weitesten verbreiteten Therapien für die Behandlung
einer Vielzahl benigner und maligner hämatologischer Erkrankungen. Für die
meisten davon stellt sie die einzige Chance auf eine Heilung dar. Trotz dieser vielversprechenden Behandlungsmöglichkeit ist die HSZT auch geprägt durch Komplikationen, wobei die GvHD eine der Hauptkomplikationen darstellt. Therapien zur
Prävention und Behandlung der GvHD haben immer einen immunmodulatorischen
Charakter, da das Ziel ist, die pathologischen Reaktionen der Immunzellen des
Donors zu reduzieren oder zu unterbinden. Hierdurch kann es nun auch zu verminderten Reaktionen gegenüber Infektionen oder auch verringerten GvL-Effekten
bei malignen Grunderkrankungen kommen. Somit ist es wünschenswert bei der
Entwicklung neuer Strategien gegen die GvHD diese Effekte weiterhin zu gewährleisten.
5.1 Einfluss der Hemmung der Prenylierung auf GvHD
Frühere Arbeiten konnten bereits zeigen, dass die Behandlung mit Statinen, die
den gesamten Mevalonatstoffwechselweg hemmen, GvHD experimentell sowie in
klinischen Studien hemmen konnte [146, 243, 252, 253]. Im Mausmodell ging diese reduzierte GvHD mit einer verminderten Expression von MHC-Klasse IIMolekülen und kostimulatorischen Molekülen einher, sowie einer Polarisierung der
T-Zellen in Richtung TH2, wobei die GvL-Effekte unverändert blieben [243]. Eine
Behandlung mit FTI führte ebenfalls zu reduzierter GvHD bei gleichbleibenden
GvL-Effekten [277]. Somit sollte hier nun die Hypothese überprüft werden, dass
die beobachteten Effekte beim Einsatz von Statinen darauf zurückzuführen sind,
dass durch die Hemmung des Mevalonatstoffwechselweges auch keine Prenylierung von Proteinen mehr möglich war, was zu einer Hemmung der Aktivität von
Immunzellen führte.
106
Diskussion
5.1.1 Auswirkungen von FTI, GGTI und ZA auf die GvHD-Schwere und
T-Zell-Signalwege
Eine Behandlung mit FTI, GGTI oder einer Kombination aus beidem führte zu signifikant verbessertem Überleben in zwei verschiedenen letalen „major-mismatch"Modellen (Abb. 4-1). Dies ging einher mit signifikant reduzierten Serumspiegeln
der proinflammatorischen Zytokine IFN-γ und TNF-α sowie tendenziell reduzierten
Serumkonzentrationen von IL-6. Ebenso war der Grad der Apoptose in Leber und
Darm in Mäusen, die GGTI erhielten, signifikant reduziert (Abb. 4-2). Gleiche Ergebnisse konnten in früheren Arbeiten bereits durch Behandlung mit Statinen bzw.
FTI im Falle der histopathologischen Untersuchung erzielt werden [243, 277].
In vorangegangenen Arbeiten wurde durch Statin- oder FTI-Behandlung eine Inhibition der Proliferation der Donor-T-Zellen in vivo und mit Statinen auch in vitro
herbeigeführt [243, 277]. Diese Ergebnisse konnten durch Therapie mit GGTI in
vivo und Inkubation von T-Zellen mit FTI und ZA, nicht aber GGTI, bei Stimulation
durch Alloantigene bestätigt werden. Des Weiteren zeigte sich eine signifikant reduzierte Migration von T-Zellen entlang eines Chemokingradientens in vitro, wenn
sie mit GGTI, nicht aber mit FTI, behandelt wurden (Abb. 4-3, 4-4).
Untersuchungen zur Phosphorylierung der im Signalweg einiger kleiner GTPasen
nachgeordneten Kinasen ERK und S6 zeigten bei mehrmaliger Wiederholung der
Versuche keine Auswirkungen der Inkubation mit FTI oder GGTI (Abb. 4-5). Einzelne Ergebnisse wiesen jedoch darauf hin, dass sowohl die Behandlung mit FTI
als auch mit GGTI zu einer reduzierten Phosphorylierung von ERK führen könnten. Um hier gesicherte Aussagen treffen zu könnten müsste der Versuch evtl. mit
anderen Parametern wie z.B. veränderter Inkubationszeit oder auch Reisolation
und Untersuchung der Spender-T-Zellen nach alloHSZT wiederholt werden.
IFN-γ und TNF-α sind typische TH1-Zytokine [33]. Die reduzierten Serumspiegel
geben einen Hinweis darauf, dass in den FTI- oder GGTI-behandelten Mäusen
keine Polarisierung der T-Zellen in Richtung TH1 stattgefunden hat, wie sie üblich
ist für eine GvHD. Statin-Behandlung im GvHD-Modell führte zu einer Polarisierung zu TH2-Zellen und auch in vitro Studien zeigten, dass murine TH1- und TH2Klone reduzierte Zelllinien-spezifische Zytokinproduktion aufwiesen, wenn sie mit
FTI behandelt wurden [292]. Jedoch handelte es sich hierbei um bereits polarisierte klonale Zelllinien, während in der vorliegenden Studie primäre Zellen verwendet
107
Diskussion
wurden. Die reduzierte TH1-Polarisierung scheint auch in diesem Modell zugunsten der TH2-Polarisierung reduziert zu sein.
Ausgehend von reduzierter ERK-Phosphorylierung könnte hier ein Mechanismus
der verringerten Zytokinexpression zu finden sein. In einem allogenen Herztransplantationsmodell konnte bereits gezeigt werden, dass Inhibition von ERK zu verminderter Alloreaktivität der T-Zellen mit reduzierter Produktion von IFN-γ führt
[293]. Eine weitere Erklärung für die verminderte Zytokinproduktion könnte die reduzierte Expansion der T-Zellen sein, wodurch nun eine geringere Anzahl an Zellen zur Verfügung stand um Zytokine zu produzieren. Durch die geringe Konzentration dieser proinflammatorischen Zytokine wird wiederum die T-Zell-Proliferation
gehemmt, wodurch die negativen Effekte beidseitig bestärkt werden.
Die verminderte Proliferation von T-Zellen könnte bei GGTI-Behandlung auch teilweise durch die beobachtete reduzierte Migration von mit GGTI inkubierten TZellen entlang eines CXCL12-Chemokingradienten erklärt werden. Dass eine Geranylgeranylierung zur Migration von T-Zellen beiträgt, konnte bereits im EAEMausmodell beobachtet werden. Hierbei wurde die besondere Rolle von geranylgeranyliertem RhoA bei der Migration von T-Zellen entlang eines CXCL12Gradienten gefunden [294]. CXCL12 wird bei inflammatorischen Erkrankungen
exprimiert und rekrutiert T-Zellen zum Entzündungsherd, was in zahlreichen Studien gezeigt werden konnte [295-297], wobei auch eine Rolle von CXCL12 bei
entzündlichen Darmerkrankungen zu finden ist [298]. Somit kann angenommen
werden, dass auch eine Bestrahlung und die daraus resultierende Entzündungsreaktion zu einer erhöhten Expression von CXCL12 im Darm führt, wodurch zahlreiche T-Zellen zum Entzündungsherd rekrutiert werden. CXCL12 trägt auch zur
Aktivierung und zum Überleben von T-Zellen bei [299, 300]. Gelangen also auf
Grund der reduzierten Geranylgeranylierung weniger T-Zellen in die entzündlichen
Gewebe, erhalten sie weniger Aktivierungs- und Überlebenssignale. Hierdurch
könnten auch die unterschiedlichen Resultate zur T-Zellproliferation in vivo und in
vitro mit FTI und GGTI erklärt werden. Um diese Hypothese zu überprüfen könnte
die CXCL12-Expression in den GvHD-Zielorganen nach Bestrahlung und alloKMT
in mit FTI oder GGTI behandelten Mäusen gemessen werden.
Bei beiden Inhibitoren führte eine Behandlung der Mäuse zu reduzierter T-Zellproliferation, jedoch bei Stimulation durch Alloantigene in vitro nur bei Kultur mit
108
Diskussion
FTI (Abb. 4-3, 4-4). Während bei GGTI-Behandlung diese verminderte Proliferation ein sekundärer Effekt durch reduzierte Migration darstellen könnte, der im in
vitro Versuch bei Stimulation mit Alloantigenen nicht gegeben ist, kann sich die
Inhibition der Proliferation durch FTI hauptsächlich als Folge des inhibierten RasSignalweg erklären lassen, der in T-Zellen zur Proliferation nach TCR-Stimulation
führt [172]. Durch fehlende Farnesylierung kann Ras keine Signale des TCR mehr
weiterleiten, was dann sowohl in vitro als auch in vivo zu reduzierter Proliferation
führt. Ras wird nicht geranylgeranyliert, somit hat die GGTI-Behandlung hier keine
Auswirkungen. Die reduzierte Proliferation, Migration und Zytokinausschüttung
nach Behandlung mit FTI und GGTI können als maßgebliche Vorgänge angesehen werden, die zur Verbesserung des Überlebens von an GvHD erkrankten Tieren führen.
Überraschenderweise zeigten bei in vitro Stimulation mit Alloantigenen auch TZellen, die mit ZA inkubiert wurden, eine reduzierte Proliferation (Abb. 4-4). Dies
war nicht zu erwarten, da eine Behandlung mit ZA in allen weiteren Versuchen
gleiche Ergebnisse wie in den vehicle-Kontroll-Gruppen zur Folge hatte und die TZellproliferation in vivo durch ZA nicht beeinflusst wurde (Abb. 4-3). ZA hemmt die
Synthese von Squalen und somit auch Cholesterin, hat jedoch keinen Einfluss auf
die Prenylierung von Proteinen, somit scheint sie keine starke Wirkung auf die
Immunreaktionen zu haben, was in den meisten Versuchen bestätigt wurde. Als
Bestandteil der Zellmembran ist Cholesterin wichtig für den Aufbau der Zellen. Ein
Mangel könnte direkt zu reduzierter Zellteilung führen, da die Membranen nicht
richtig ausgebildet werden können. Es ist weiterhin bekannt, dass der TCR zusammen mit einigen Signalmolekülen wie die Lymphozyten-spezifische TyrosinKinase (lymphocyte-specific protein tyrosine kinase, Lck) und dem Bindeglied in
der T-Zell-Aktivierung (linker of activation in T cells, LAT) an der Zellmembran in
sogenannten Lipidflößen organisiert sind [301, 302]. Diese bestehen hauptsächlich aus Cholesterin [303] und die Signalmoleküle können über palmitoylierte Zysteinreste an diese binden. Eine Inhibierung der Palmitoylierung und somit der Anordnung in den Lipidflößen hat eine reduzierte TCR-Signalweiterleitung zur Folge
[304]. Eine Inhibition der Cholesterinsynthese könnte somit auch zu einer reduzierten Bildung von Lipidflößen führen. Dies könnte zur Folge haben, dass Signalmoleküle sich nicht mehr in der richtigen Position zum TCR befinden und somit eine
Signalweiterleitung nach Stimulation vermindert ist. Dies wäre auch in einer redu109
Diskussion
zieren Proliferation infolge der Antigenstimulation sichtbar. Jedoch war die Gabe
von ZA in vivo nicht ausreichend um die T-Zellproliferation zu reduzieren und auch
in den anderen Experimenten zeigte sich keine hemmende Wirkung auf die TCRSignalweiterleitung. Dies könnte daran liegen, dass durch Inhibition der Cholesterinsynthese die Lipidflöße nur langsam abgebaut werden, bzw. nach einer Zellteilung keine neuen gebildet werden, wodurch die Signalwege nicht völlig unterbunden sondern nur nach und nach reduziert werden. Nach einer Bestrahlung und
Beginn einer GvHD herrscht ein stark inflammatorisches Milieu im gesamten Organismus vor [125], was möglicherweise stark genug ist um die Signalweiterleitung aufrecht zu erhalten, während die inflammatorischen Signale bei einem in
vitro Proliferationstest lediglich von den allogenen Zellen ausgelöst werden, somit
sehr viel schwächer sind und zu keiner Proliferation mehr führen können.
5.1.2 Untersuchungen auf Vorgänge im Thymus bei GvHD und
Behandlung mit Inhibitoren
Durch die Bestrahlung und durch die alloreaktiven Donor-T-Zellen kommt es nach
einer alloHSZT auch zu einer Zerstörung des Thymus [278, 305]. Da der Thymus
ein sehr wichtiges Organ in der Entwicklung von T-Zellen ist, kann eine Störung in
dessen Funktion zur verminderten Reifung von T-Zellen führen, was reduzierte
Rezeptordiversitäten und somit reduzierte Immunantworten zur Folge hat. Des
Weiteren kann durch fehlende negative Selektion Autoimmunität entstehen. Um
die Schäden am Thymus durch die GvHD beurteilen zu können, wurden Thymi
aus behandelten Tieren an Tag 10 nach alloHSZT entnommen und auf den verbleibenden Kortex hin untersucht. Eine typische Schädigung des Thymus durch
die Induktion von aGvHD ist die Abnahme der Kortexdicke. Für FTI konnte bereits
gezeigt werden, dass die Kortexdicke durch Behandlung nahezu erhalten bleibt
[277]. Dies konnte hier auch mit Injektion von GGTI oder einer Kombination aus
FTI und GGTI erreicht werden (Abb. 4-6).
Die Untersuchung einzelner im Thymus vorhandener Zellpopulationen an Tag 12
und Tag 100 nach KMT bestätigte die bereits gezeigte Reduktion der gesamten
Zellzahl durch Bestrahlung [305] (Abb. 4-7, 4-8). Die Induktion einer GvHD durch
alloT-Zellen brachte für einzelne Populationen wie CD4+CD8+doppelt positive Zel110
Diskussion
len, mTEC und Fibroblasten eine weitere Reduktion mit sich. Dies ist ebenfalls im
Einklang mit bereits veröffentlichten Daten [278]. Die Behandlung mit FTI oder
GGTI führte zu Erhöhungen dieser Zellzahlen, die in etwa auf oder über dem Niveau der Thymi der Mäuse lag, die lediglich bestrahlt und mit KM transplantiert
wurden. Dass nur in zwei Fällen eine statistische Signifikanz dieser Werte erreicht
wurde, könnte zum einen auf die geringe Gruppengröße (n=3 in der KM, FTI und
GGTI-Gruppe) zurückzuführen sein, eine Wiederholung des Versuches mit mehr
Tieren könnte diese herbeiführen. Zum anderen wurde hier ein sehr früher Zeitpunkt nach KMT gewählt, um den primären Schutz des Thymus durch FTI- oder
GGTI-Behandlung zu untersuchen. In einem weiteren Experiment wurde deshalb
eine Untersuchung des Thymus an Tag 100 durchgeführt. Hier konnte nun die
Rekonstitution bewertet werden. Da es zu diesem Zeitpunkt keine überlebenden
Tiere in der vehicle-Gruppe gibt, wurden die Werte der mit FTI, GGTI oder der
Kombinationstherapie behandelten Mäuse mit der vehicle-Gruppe an Tag 10 verglichen. Es zeigten sich in allen untersuchten Zellpopulationen Zellzahlen, die über
dem Niveau der vehicle-Gruppe lagen, wenn die Mäuse mit FTI, GGTI oder
FTI+GGTI behandelt wurden. Diese Ergebnisse zeigen zum ersten Mal, dass die
Hemmung der Prenylierung zu einem Schutz des Thymus vor Zerstörung durch
Bestrahlung und GvHD führt. Dieser Schutz lässt sich zum einen auf die verminderte Donor-T-Zellzahl zurückführen, die durch reduzierte Proliferation mit FTI und
GGTI erreicht wurde und eine wichtige Rolle in der Zerstörung des Thymus bei
GvHD spielt [278] und zum anderen auf die reduzierten Serumspiegel von TNF-α
und IFN-γ. Für TNF-α konnte gezeigt werden, dass es eine Rolle in der Zersörung
von Epithelien spielt [306], wodurch es auch an der Zerstörung von TECs beteiligt
sein könnte. Im Mausmodell wurde gezeigt, dass aktivierte Donor-T-Zellen in den
Thymus der Rezipienten einwandern und dort IFN-γ sezernieren. Hierdurch wird in
TECs Apoptose ausgelöst [307]. Die Verminderung von IFN-γ und TNF-α verbunden mit reduzierter T-Zellexpansion scheinen somit gemeinsam zum Schutz des
Thymus bei Behandlung mit FTI und GGTI beizutragen.
Durch die Erhaltung bzw. Regeneration der Thymusstruktur und der einzelnen
Zellpopulationen ist ein wichtiger Teil der T-Zellentwicklung gewährleistet. Weiterhin geklärt werden sollte jedoch auch die Funktion der TECs. Die Hauptaufgabe
dieser Zellen ist die Präsentation von Antigenen, durch die funktionelle T-Zellen
positiv und autoreaktive T-Zellen negativ selektioniert werden [15]. Eine Beeinflus111
Diskussion
sung der Antigenpräsentation im Thymus durch FTI, GGTI oder ZA wurde durch in
vitro-Inkubation von TECs mit den Inhibitoren und anschließender durchflusszytometrischer Analyse der MHC-Klasse II-Moleküle auf diesen Zellen ausgeschlossen (Abb. 4-9). Somit kann geschlossen werden, dass eine Behandlung mit FTI
oder GGTI sowohl zu einem Schutz des Thymus nach Bestrahlung und GvHDInduktion führt als auch weiterhin die Funktion der Thymuszellen gewährleistet.
Um diese Aussagen funktionell bestätigen zu können wurden an Tag 20 nach
KMT die T-Zellen aus der Milz isoliert und auf ihr TCR-Repertoire hin untersucht
(Abb- 4-10). Durch Analyse verschiedener Vβ-Genfamilien kann bestimmt werden,
wie groß das Repertoire ist und ob eine Allo- oder Autoreaktivität vorliegt, die sich
zeigt, wenn bestimmte Genfamilien besonders stark ausgeprägt sind. Die untersuchten Genfamilien in einer unbehandelten Maus entsprechen, wie bereits gezeigt, einer Gauss-Verteilung [279]. Dieses Muster zeigt sich auch weitgehend
nach Bestrahlung, jedoch lässt sich bereits hier eine leichte Abweichung dieser
Gauss-Verteilung feststellen. Im Menschen zeigen sich nach HSZTs bereits durch
die Bestrahlung teilweise schwerwiegende Immundefekte, die jedoch durch Induktion einer GvHD sehr viel ausgeprägter sind [308]. Die Analyse des TCRRepertoires in diesem Versuch ließ in der vehicle-Gruppe die Gauss-Verteilung
nicht mehr erkennen, hier wurden die meisten der untersuchten Genfamilien in
hohem Maße exprimiert. Die Behandlung mit FTI hingegen führte ebenfalls zu einer Abnahme in einigen Genfamilien, wobei die Therapie mit GGTI ein Muster
herbeiführte, das dem der KM-Gruppe sehr ähnlich war. Auch hier zeigte sich der
Schutz des Thymus vor Zerstörung durch alloreaktive T-Zellen bei Behandlung mit
FTI und GGTI. Dass das TCR-Repertoire hier dennoch einige Abweichungen von
der Normverteilung zeigt, könnte an dem relativ frühen Zeitpunkt der Analyse liegen. Eine Untersuchung zu einem späteren Zeitpunkt könnte die Regeneration
des Thymus deutlicher widerspiegeln.
5.1.3 Auswirkungen von FTI und GGTI auf GvL-Effekte im alloKMTModell
Eine HSZT wird oft dann durchgeführt, wenn maligne hämatologische Erkrankungen wie Leukämien, maligne Lymphome, myeloproliferative Erkrankungen oder
112
Diskussion
myelodysplastische Syndrome vorliegen. Ein wichtiger Vorteil dieser therapeutischen Modalität ist die Fähigkeit der allogenen T-Zellen, verbliebene maligne Zellen im Empfänger abzutöten und somit das Rezidivrisiko zu senken. Es sollte daher sichergestellt werden, dass die GvL-Effekte in den Rezipienten trotz der immunmodulatorischen Wirkungen der Inhibitoren weiterhin in vollem Maße vorhanden sind. Statine wurden bereits in einigen klinischen Studien zur Behandlung maligner hämatologischer Erkrankungen mit Erfolg eingesetzt [238-240] und dass die
Behandlung mit Statinen im GvHD-Mausmodell weiterhin GvL-Effekte gewährleistet, konnte bereits gezeigt werden [243]. Auch FTIs wurden in klinischen Studien
bereits zur Behandlung von akuter myeloiden Leukämie oder dem myelodysplastischen Syndrom eingesetzt [254, 255]. Die antitumorösen Wirkungen beider Inhibitoren könnten sich ebenfalls positiv auf die Bekämpfung der in dem vorliegenden
Modell verwendeten Lymphomzellen auswirken. GGTIs kamen bisher nur in einer
Studie zur Behandlung solider Tumoren zum Einsatz [309]. Eine FTI-Behandlung
zeigte bereits keine Auswirkungen auf das Überleben von Mäusen im GvHDModell, die Lymphomzellen erhielten [277]. In den vorliegenden Versuchen sollte
jedoch eine genauere Analyse des Verhaltens der Donor-T-Zellen auf die Lymphomzellen unter FTI- und GGTI-Behandlung durchgeführt werden. Hierzu erhielten Mäuse nach Bestrahlung eine alloKMT und zusätzlich A20luc-Lymphomzellen
(Abb. 4-12). Ohne die zusätzliche Gabe von T-Zellen ließ sich eine rasche Expansion der Lymphomzellen beobachten, welche durch die zusätzliche Gabe von alloT-Zellen unterbunden wurde, was zeigt, dass die GvL-Effekte hauptsächlich durch
die transplantierten T-Zellen vermittelt werden. Mäuse, die keine T-Zellen erhielten, starben nach etwa 15-20 Tagen durch die Lymphomaktivität. Mäuse, die TZellen ohne die Behandlung mit einem Inhibitor erhielten, starben etwas früher.
Dass die Todesursache hier GvHD war, lässt sich aus dem Fehlen von Lymphomzellen ableiten, das sowohl durch BLI als auch durchflusszytometrisch bestimmt
wurde.
Die Behandlung mit GGTI führte zu signifikant verbessertem Überleben (Abb. 412), was zeigt, dass GGTI zwar immunmodulatorische Effekte hat, da eine GvHD
reduziert wurde, diese aber nicht stark immunsuppressiv sein können, da GvLEffekte trotzdem noch möglich sind. Dies konnte auch in vitro sowohl für FTI als
auch für GGTI gezeigt werden (Abb. 4-11).
113
Diskussion
In zahlreichen Studien wurden Korrelationen zwischen GvHD und GvL aufgezeigt
[162, 164, 285]. Diese Effekte werden zum großen Teil dadurch ermöglicht, dass
allogene T-Zellen die fremden MHC Klasse-I und –II-Moleküle auf den Zellen des
Rezipienten erkennen, zu denen auch die malignen Zellen gehören, und diese
zerstören. Dass hier trotz reduzierter GvHD-Aktivität starke GvL-Effekte stattgefunden haben, könnte sich durch verschiedene Mechanismen erklären lassen.
Zum einen zeigten sich bei Behandlung mit FTI oder GGTI reduzierte inflammatorische Vorgänge in der Maus, hierdurch findet eine geringere Aktivierung der
transplantierten T-Zellen statt, die nun gezieltere Reaktionen auf die Lymphomzellen zeigen können. Diese reduzierte Aktivität ließ sich bei L1210-Zellen auch in
vitro beobachten. Wurden die Mäuse vor Reisolation der T-Zellen mit den Inhibitoren behandelt, zeigte sich eine verminderte Toxizität verglichen mit einer Inkubation der T-Zellen mit den Inhibitoren aus unbehandelten Mäusen. Bei einer starken
GvHD werden Chemokine von den beschädigten Organen produziert, die dann
CD4+ T-Zellen anlocken, welche ihrerseits durch Expression von TNF-α, IFN-γ
und IL-1 zu Aktivierung weiterer Immunzellen und einer Amplifikation der Immunantwort führen [125]. Bei einer Abschwächung der GvHD wie im Falle der FTIoder GGTI-Behandlung könnten nun weniger Zellen zu den Zielorganen gelockt
werden, was dann eine zielgerichtetere Migration der T-Zellen zu den Lymphomzellen erlaubt.
Die GvL-Effekte werden sowohl von CD4+ als auch CD8+ T-Zellen vermittelt [164,
165]. In dieser Arbeit konnte gezeigt werden, dass bei einer Transplantation von
CD4+ und CD8+ -Zellen die Behandlung mit FTI oder GGTI zu einer reduzierten
Proliferation der gesamten T-Zellen führt (Abb 4-3) , CD8+ T-Zellen hiervon jedoch
nicht betroffen sind (Abb. 4-15), was den Schluss zulässt, dass hier hauptsächlich
eine Hemmung der CD4+ T-Zellen stattfindet. Dies steht im Gegensatz zu einer
Studie im Hauttransplantationsmodell der Maus, bei der ein Effekt sowohl auf
CD4+ als auch CD8+ T-Zellen durch FTI beobachtet wurde [257], was jedoch auf
die verschiedenen Modelle zurückzuführen sein könnte. CD4+ T-Zellen vermitteln
im GvHD-Modell zum großen Teil eine systemische Aktivierung der Immunzellen
durch Expression proinflammatorischer Moleküle [117, 125], wohingegen CD8+ TZellen eine zielgerichtete Zerstörung der Zellen über Perforin und GranzymB herbeiführen [166]. Die CD4+ T-Zellen tragen somit durch die Aktivierung der CD8+ TZellen zu einer verstärkten GvL-Antwort bei. In diesem Modell scheint jedoch die
114
Diskussion
reduzierte Aktivierung für die Zerstörung der Lymphomzellen auszureichen. Da die
CD8+ T-Zellen eine normale Proliferation zeigen, können diese nun ausreichende
und zielgerichtete GvL-Effekte vermitteln.
Die in vitro erhaltenen Daten zur reduzierten zytotoxischen Aktivität gegen A20und insbesondere gegen L1210-Zellen von T-Zellen aus ZA-behandelten Mäusen
(Abb. 4-12) widersprechen der in vivo gezeigten vollständigen GvL-Aktivität. Eine
Erklärung hierfür könnten sogenannte ermüdete (exhausted) T-Zellen sein. Diese
Zellen wurden zunächst im Kontext chronischer Virusinfektionen beschrieben
[310] und später in Mausmodellen und in Menschen auch bei bakteriellen und parasitären Infektionen sowie bei Menschen mit Tumorerkrankungen gefunden [311].
Bei Vorhandensein einer stark entzündlichen Umgebung mit wiederholter Stimulation durch Antigene kommt es nach einer gewissen Zeit nach und nach zum Verlust einiger Funktionen der T-Zellen, wobei als erstes IL-2-Produktion, die hochproliferative Kapazität und ex vivo zytotoxische Funktionen betroffen sind [311].
Dies geschieht vor allem durch die Expression inhibitorischer Rezeptoren wie etwa PD-1 auf den T-Zellen [312]. Eine GvHD stellt die geeignete Umgebung zur
Induktion seneszenter T-Zellen dar, da eine starke Inflammation vorherrscht mit
wiederholter Antigenstimulation. Somit könnten die an d12 isolierten T-Zellen bereits in einem Stadium der Differenzierung gewesen sein, an dem die ex vivoZytotoxizität bereits reduziert ist. Dass diese T-Zellen jedoch trotzdem eine GvLAntwort in vivo vermitteln können, könnte daran liegen, dass hier die Bekämpfung
der Lymphomzellen bereits zu früheren Zeitpunkten stattfindet, bevor eine Ermüdung einsetzt. Dies könnte auch die Vermittlung der GvHD erklären. Zum anderen
herrschen in GvHD-Mäusen solch starke Stimulationen für die T-Zellen vor, dass
hier trotzdem noch Zytotoxizität vermittelt werden kann. Dass dieser Effekt bei TZellen beobachtet wurde, die aus Mäusen isoliert wurden, die mit ZA behandelt
wurden, nicht aber auf Zellen aus FTI oder GGTI-Mäusen, lässt sich auf das reduzierte inflammatorische Milieu in diesen Tieren erklären, was nicht ausreichend ist
um ermüdete T-Zellen hervorzubringen.
115
Diskussion
5.1.4 Einfluss der Hemmung der Prenylierung auf Immunantworten bei
Virusinfektion
Eine häufige Komplikation nach einer HSZT ist die Reaktivierung von CMV [280].
CMV gehört zur Familie der Herpesviren. Nach der Erstinfektion, die fast immer
ohne oder mit sehr milden Symptomen abläuft, persistiert das Virus lebenslang in
einer latenten Form. Deutschlandweit sind etwa 40 bis 80 % der Bevölkerung infiziert, wobei die Infektionsrate mit steigendem Alter zunimmt. Liegt eine Immunsuppression vor, wie etwa bei einer AIDS-Erkrankung oder transplantierten Patienten, kommt es häufig zu einer Reaktivierung von CMV mit schweren Krankheitsverläufen, die Lungenentzündungen, Hepatitis, bakterielle oder Pilzinfektionen mit
sich bringen, die oft zum Tode führen können. Somit sollte die antivirale Aktivität in
transplantierten Mäusen in einem MCMV-Modell untersucht werden. Es zeigte
sich, dass an Tag 28 nach Infektion, an dem bereits die latente Phase begonnen
hat, in allen Gruppen gleiche Mengen an CD8+ T-Zellen in der Milz vorhanden waren und die Inhibitoren somit nicht zu einer Abnahme dieser Zellen führten (Abb.
4-13). Die Anteile an virusspezifischen CD8+ T-Zellen waren vergleichbar in allen
Gruppen. Ein großer Teil dieser spezifischen Zellen zeichnete sich durch die Expression von KLRG1 aus, was zeigt, dass sie bereits proliferiert waren [282].
CD62L, CD27 und CD127 werden nach Virusinfektion auf CD8 + T-Zellen herunterreguliert [283, 284], was in den vorliegenden Versuchen ebenfalls für alle Gruppen
gezeigt werden konnte. KLRG1 hingegen wird erst auf aktivierten und proliferierten CD8+ T-Zellen exprimiert [282], was ebenfalls durch MCMV-Infektion und auch
bei Behandlung mit FTI und GGTI herbeigeführt werden konnte. Dies zeigt, dass
die untersuchten CD8+ T-Zellen funktionell in ihrer anti-viralen Aktivität sind (Abb.
4-13). Somit war auch an Tag 28 nach Infektion kein Virus mehr in der Leber
nachzuweisen. In der Speicheldrüse, einem Organ der Persistenz zeigten sich
vergleichbare Viruslasten in allen Gruppen. Auch das Überleben nach MCMVInfektion in einem subletalen Modell wies keine signifikanten Unterschiede in allen
untersuchten Gruppen auf (Abb. 4-14). Somit konnte zum ersten Mal gezeigt werden, dass weder FTI noch GGTI Auswirkungen auf die Funktionalität in der Virusabwehr von CD8+ T-Zellen im murinen HSZT-Modell haben.
Die Abwehr viraler Infektionen wird hauptsächlich durch CD8 + T-Zellen und NKZellen vermittelt. Die Depletion einer dieser Zellpopulationen führte zu erhöhten
116
Diskussion
Viruslasten bei Infektion mit verschiedenen Viren in der Maus [286, 313]. Dies
wurde für NK-Zellen zu sehr frühen Zeitpunkten nach Infektion zwischen sechs
Stunden und drei Tagen gezeigt [313]. Während NK-Zellen als Teil der angeborenen Immunität sofort nach Infektion antivirale Aktivität zeigen, werden CD8+ TZellen erst nach einigen Tagen aktiv. Durch die Antigen-spezifische Proliferation
wird jedoch der größte Teil der Virusabwehr nun durch die zytotoxischen T-Zellen
vermittelt. Somit wurde im vorliegenden Modell hauptsächlich die Reaktion von TZellen untersucht. Dass die Behandlung mit FTI und GGTI trotz Immunmodulation
keine Auswirkungen auf die Virusabwehr in den untersuchten Mäusen hatte, lässt
sich wie im Lymphommodell schon angedeutet damit erklären, dass die Inhibitoren
hauptsächlich Wirkung auf CD4+ T-Zellen haben und somit zielgerichtete CD8+ TZellantworten zulassen.
Die vorliegenden Daten zeigten jedoch nur indirekte Effekte von FTI und GGTI auf
die anti-virale Aktivität von T-Zellen, da die Behandlung stattfand, bevor die Mäuse
mit Virus infiziert wurden. Eine Infektion direkt nach KMT und somit im Behandlungszeitraum war jedoch nicht möglich, da durch die myeloablative Bestrahlung
keine Immunantworten stattfinden konnten, was in kurzer Zeit zum Tode der Versuchstiere geführt hat (nicht gezeigte Daten). Jedoch konnte mit den vorliegenden
Experimenten gezeigt werden, dass das Immunsystem sich auch bei Behandlung
mit den immunmodulatorischen Inhibitoren nach KMT wieder in kurzer Zeit erholt
und eine Bekämpfung viraler Infektionen möglich ist.
5.1.5 Einfluss von FTI und GGTI auf DCs
Ein wichtiger Beitrag in der GvHD wird von APCs geleistet, die entscheidende Rollen in den Phasen I und II der Entstehung spielen. In Phase I werden sie durch
das angegriffene Gewebe aktiviert [117] und reagieren mit der Hochregulierung
kostimulatorischer Moleküle, Adhäsionsmoleküle, MHC-Moleküle und der Ausschüttung proinflammatorischer Zytokine [130, 132]. Die Präsentation von Antigenen sorgt nun für die Aktivierung und Proliferation der Donor-T-Zellen, wobei die
CD4+ T-Zellen sich durch das vorhandene Zytokinmilieu zu T H1-Zellen differenzieren. Somit kann es nun zu einer Zerstörung der Zielgewebe kommen. Es sollte
nun untersucht werden, ob die Reduktion der GvHD auch auf Hemmung der Aktivität von DCs beruht.
117
Diskussion
In einem Atherosklerosemodell mit humanen DCs konnte gezeigt werden, dass
die Hemmung des Mevalonatsignalwegs durch Statine zu reduzierter Adhäsion
und Invasion dieser Zellen führt [314]. Statinbehandlung führte ebenfalls zu verminderter Aufnahme von Tetanus-Toxoid-Antigenen und somit reduzierter Antigenpräsentation. Dies ließ sich hauptsächlich auf die verminderte Prenylierung
von Rho- und Rab-GTPasen zurückführen [315]. Die Wirkungen der spezifischen
Hemmung der Farnesylierung und Geranylgeranylierung auf die Funktion von DCs
wurden bisher noch nicht untersucht.
In einem in vivo Migrationsassay konnte bei GvHD-Induktion mittels BLI deutlich
eine Akkumulation der transplantierten DCsluc in den lymphatischen Organen beobachtet werden (Abb. 4-16). Auch die Signalstärke der von den DCsluc ausgehenden Photonen nahm zu, was heißt, dass die DCs sich auch vermehrten. Beides
war stark reduziert in Mäusen, die mit FTI oder GGTI behandelt wurden. Auch in
vitro zeigte sich eine signifikant reduzierte Abnahme der Migration entlang eines
Chemokingradienten (Abb. 4-17). Kleine GTPasen sind wichtige Vermittler der
Migration von Zellen. Cdc42, ein Mitglied der Rho-Familie ist ein wichtiger Regulator der Zellpolarität [316]. Cdc42-defiziente DCs waren unfähig in dreidimensionalen Umgebungen zu migrieren [317]. In einem Mausmodell mit defizienten Mäusen
konnte gezeigt werden, dass Rac1 und Rac2, die auch zur Rho-Familie gehören
ebenfalls eine wichtige Rolle für die Migration von DCs spielen, da diese bei Defizienz dieser kleinen GTPasen vermindert war [318]. Die beobachtete reduzierte
Migration von DCs könnte somit auf die durch die fehlende Prenylierung herbeigeführte verminderte Aktivität von kleinen GTPasen zurückzuführen sein. Ist die Anzahl der DCs in den lymphatischen Organen reduziert, können den T-Zellen weniger Antigene präsentiert werden, wodurch auch die Zahl der aktivierten T-Zellen
sinkt. Des Weiteren werden durch die DCs weniger proinflammatorische Zytokine
ausgeschüttet, was ebenfalls zu reduzierter T-Zell-Aktivierung führt. Somit scheint
die Hemmung der DC-Migration ebenfalls zu Reduktion der GvHD zu führen.
In vitro wurde die Funktion der DCs genauer untersucht. Da angenommen wird,
dass die durch kleine GTPasen herbeigeführte Migration von Zellen über die Regulation des Aktin-Zytoskeletts herbeigeführt wird [316], wurde dies mithilfe der
Färbung über Phalloidin untersucht (Abb. 4-17). Die Inkubation mit FTI oder GGTI
führte jedoch zu keiner Veränderung von F-Aktin. Das Zytoskelett einer Zelle be118
Diskussion
steht neben den Aktinfilamenten auch aus Intermediärfilamenten und Mikrotubuli,
welche ebenfalls zur Migration beitragen können [316]. Somit kann eine Veränderung des Zytoskeletts in diesen Zellen durch dieses Ergebnis nicht ausgeschlossen werden. Mögliche Ansätze für die Untersuchung der Auswirkung der Inhibitorbehandlung auf die Mikrotubuli und die Intermediärfilamente wären konfokale
Fluoreszenz- oder Elektronenmikroskopie.
Desweiteren wurde die Expression kostimulatorischer Moleküle und von MHCKlasse II-Molekülen auf DCs untersucht, wobei hier durch FTI- oder GGTIBehandlung keine Veränderung beobachtet werden konnte (Abb. 4-17). Somit
führt die Hemmung der Prenylierung in vitro nicht zu einer reduzierten Antigenpräsentation und auch die ausreichende Aktivierung von T-Zellen durch kostimulatorische Moleküle wäre gewährleistet. Dass die GvHD in vivo trotzdem stark reduziert
war bei Behandlung mit FTI und GGTI lässt sich somit hauptsächlich auf die verminderte Migration der DCs und somit reduzierter Anwesenheit in den lymphatischen Organen erklären. Somit stehen den T-Zellen in vivo weniger APCs zur Verfügung. DCs, die in der Blutbahn vorhanden sind, können T-Zellen nicht effektiv
aktivieren, da die speziellen Mikromilieubedingungen der lymphatischen Organe
nicht gegeben sind.
In neueren Studien in GvHD-Mausmodellen wurden nicht-hämatopoetische APCs
als weitere Gruppe der APCs vorgestellt. Sie haben mesenchymalen Ursprung
und sind bisher nur im Darm gefunden worden. Diese Zellen spielen eine wichtige
Rolle in der GvHD-Induktion [319]. Um die Auswirkungen der Inhibitoren auf APCs
zu vervollständigen, könnten die nicht-hämatopoetischen APCs auch im GvHDModell bei Behandlung mit FTI und GGTI untersucht werden.
Insgesamt konnte in diesem Teil der Arbeit gezeigt werden, dass die Behandlung
von Mäusen im GvHD-Modell mit FTI oder GGTI zu einer Reduktion der GvHD
führte, die verbunden war mit verbessertem Überleben, reduzierter Ausschüttung
proinflammatorischer Zytokine und reduziertem GvHD-Schweregrad. Schäden am
Thymus konnten vermindert werden was zu einem breiteren Repertoire an TCRs
führte. Diese Beobachtungen lassen sich auf eine reduzierte T-Zell-Expansion und
verminderte DC-Migration zurückführen. Die anti-virale und GvL-Aktivität waren
119
Diskussion
intakt, sodass in dieser präklinischen Studie die Vorraussetzungen für einen eventuellen Einsatz im Mensch gegeben sind.
5.2 Einfluss der Hemmung der γc auf GvHD
Zur Prävention und Behandlung der GvHD liegen bereits zahlreiche Studien vor, in
denen einzelne γc Zytokine gehemmt wurden. Viele von ihnen zeigten positive
Auswirkungen auf das Überleben und den Schweregrad der GvHD [148, 154, 155,
158]. Andererseits scheint die Hemmung des γc Zytokin IL-4 eher nachteilige Effekte auf die Reduktion von GvHD zu haben, da es als typisches T H2-Zytokin einer
hauptsächlich TH1-vermittelten GvHD entgegenwirken kann [149-151]. Studien,
bei denen der γc Signalweg an der JAK3 und somit Signale über viele der γ c Zytokine inhibiert wurden, zeigten jedoch, dass auch diese Hemmung positive Auswirkungen auf das Überleben und den GvHD-Schweregrad hatten, wobei diese Effekte zu einem Teil über die Reduktion der IFN-γ-Produktion vermittelt wurden
[159-161]. Die Auswirkungen von Mutationen der γc wurden bereits gründlich untersucht, da diese durch die defekte Reifung von T-, B- und NK-Zellen zu einer
schweren Immundefizienz führen [53]. Zu den Auswirkungen der Inhibition der γc
im GvHD-Modell liegen bisher jedoch noch keine Publikationen vor.
5.2.1 Verbessertes Überleben bei gleichbleibender T-Zell-Proliferation
– Rolle der APCs und der myeloiden Zellen
Eine Behandlung der Empfängertiere mit α-CD132 führte im letalen „major mismatch“-GvHD-Modell zu signifikant verbessertem Überleben, wenn CD4 +- und
CD8+-T-Zellen transplantiert wurden (Abb. 4-18). Dies ging einher mit reduzierten
Serumspiegeln der proinflammatorischen Zytokine IFN-γ, TNF-α, MCP-1 und IL-6
(Abb. 4-19). Das Anwachsen des Transplantats erfolgte vollständig (Abb. 4-18).
Das verbesserte Überleben der Empfänger steht im Einklang mit klinischen und
experimentellen Studien, die zeigen konnten, dass die Hemmung einzelner γcZytokine zu einer Reduktion der GvHD in Menschen und Mäusen führt. Untersucht
wurde hierbei die Inhibition von IL-2 [148] und IL-21 [158]. Des Weiteren wurden
erhöhte Serumspiegel der γc-Zytokine IL-7 und IL-15 im Blut von Patienten nach
HSZT gefunden, wobei die Konzentration dieser Zytokine mit dem Risiko einer
120
Diskussion
GvHD-Erkrankung korellierte [152, 157]. Im Mausmodell konnte durch Gabe von
IL-7 und IL-15 die Schwere der GvHD verstärkt werden [154, 155]. Auch die Inhibition der JAK3, die über die γc aktiviert wird, führte im Mausmodell zur Reduktion
der GvHD mit verbessertem Überleben [159, 160]. Dies ging einher mit reduzierter
IFN-γ-Produktion der Donor-T-Zellen, was im Einklang mit den in dieser Arbeit
gefundenen verminderten Serumspiegeln von IFN-γ bei an GvHD erkrankten
Mäusen steht (Abb. 4-19).
Interesannterweise wurde die Proliferation der Donor-T-Zellen in den Empfängermäusen durch Behandlung mit α-CD132 nicht reduziert (Abb. 4-20). Dies wäre
jedoch zu erwarten gewesen, da viele der γc-Zytokine Wachstumsfaktoren für TZellen darstellen und die Proliferation als Antwort auf Antigene fördern. Auch das
verbesserte Überleben ließe eine verminderte T-Zellexpansion erwarten, da die
GvHD zu großen Teilen über T-Zellen vermittelt wird [125]. Über reduzierte GvHD
bei gleichbleibender T-Zellexpansion wurde ebenfalls bereits berichtet [320], jedoch war die Verbesserung der Erkrankung hier auf reduzierte Neovaskularisierung und somit verminderter Infiltration der Zielorgane mit löslichen und zellulären
inflammatorischen Mediatoren zurückzuführen. Das beobachtete verbesserte
Überleben bei Behandlung mit α-CD132 im GvHD-Maumodell bei gleichbleibender
T-Zellproliferation kann jedoch über einige andere Mechanismen erklärt werden.
Zum einen wurden an Tag 7 nach alloKMT in der Milz geringere Mengen an
CD11c-positiven Zellen gefunden (Abb. 4-22). CD11c ist ein Antigen, das verbreitet auf DCs und anderen APCs vorkommt. Es ist bekannt, dass vor allem Empfänger-APCs eine wichtige Rolle in der Induktion einer GvHD spielen [117, 130, 132].
Die Stimulation der TLRs, wie sie bei einer GvHD durch kommensale Bakterien
entsteht, welche die nun durchlässige Darmwand durchdringen, führt zur Produktion und Ausschüttung der proinflammatorischen Zytokine TNF-α, MCP-1 und IL-6
[132, 321, 322]. Die Konzentrationen dieser Zytokine waren an Tag 7 nach alloKMT bei Behandlung mit α-CD132 signifikant reduziert (Abb. 4-19), was als Folge
der geringeren Anzahl der APCs gesehen werden kann. Vor allem die reduzierte
Menge an TNF-α hat direkten Einfluss auf den Schweregrad der GvHD, da dieses
Zytokin nicht nur Effektorzellen aktiviert sondern auch direkt Zielgewebe durch
Auslösung von Apoptose und Nekrose schädigen kann [117]. Zellen, die CD19,
einen Marker für B-Zellen exprimieren waren ebenfalls reduziert, wenn die Empfänger mit α-CD132 behandelt wurden (Abb. 4-22). Experimentelle und klinische
121
Diskussion
Studien zeigten, dass B-Zellen als APCs auch eine wichtige Rolle in der GvHDInduktion spielen [323, 324]. Ebenso ist bekannt, dass auch B-Zellen ÜberlebensAktivierungs- und Wachstumssignale über die γc erhalten [54, 58, 68, 80, 94].
Somit kann das verbesserte Überleben zumindest zum Teil auf die reduzierte Anzahl der APCs zurückgeführt werden.
Myeloide Zellen zeichnen sich durch die Aktivität der MPO aus, die hauptsächlich
antibakterielle Aktivität vermittelt [288]. Sie spielen ebenfalls eine Rolle in der
GvHD-Induktion. Im Mausmodell konnte bereits ein Anteil myeloider Zellen an der
Gewebezerstörung bei GvHD gezeigt werden [325] und auch in Gewebsschnitten
humaner GvHD-Patienten wurden vermehrt MPO poitive Zellen gefunden [289].
Somit wurde der Effekt der Hemmung der γc auf die Anteile der myeloiden Zellen
und deren MPO-Aktivität untersucht (Abb. 4-21). Es zeigten sich keine Auswirkungen der Behandlung mit α-CD132 auf diese Zellen. Dies kann dadurch erklärt
werden, dass ein direkter Effekt nicht möglich war, da die myeloiden Zellen ihre
Signale über TLRs vermitteln, die unabhängig von der γc sind [326]. Indirekte Effekte durch reduziertes Vorhandensein von Zytokinen oder verminderte inflammatorische Prozesse fanden nicht statt, da die myeloiden Zellen hauptsächlich zu
sehr frühen Zeitpunkten der GvHD aktiv sind, wenn die Auswirkungen der Hemmung der γc noch nicht stark ausgeprägt sind
5.2.2 Verbessertes Überleben bei gleichbleibender T-Zellproliferation –
Funktion der CD4+ T-Zellen
Das reduzierte Vorhandensein der APCs und die damit verbundene verminderte
Präsentation von Alloantigenen und reduzierte Zytokinproduktion ließ ebenfalls
eine verminderte Expansion der Donor-T-Zellen erwarten, da diese durch reduzierten Kontakt mit Antigenen und verminderter Stimulation mit proinflammatorischen Zytokinen weniger Signale zur Proliferation erhalten. Eine Hypothese für
diese unerwartete Beobachtung ist eine Differenzierung der CD4+ T-Zellen in TH2anstelle von TH1-Zellen, wie es bei GvHD üblich ist [133]. Um dies zu überprüfen
wurden die T-Zellen an Tag 7 aus der Milz isoliert und auf intrazelluläre Zytokine
untersucht (Abb. 4-25). Interessanterweise waren sowohl TH1-typische Zytokine
wie IFN-γ und IL-2, TH2-Zytokine wie IL-10 und IL-4 als auch das TH17-Zytokin IL122
Diskussion
17 erhöht, wobei dies jedoch nur für IL-2, IL-17 und IL-10 signifikant war. Die γcZytokine spielen eine wichtige Rolle in der Differenzierung von CD4+ T-Zellen [32],
somit wäre hier zu erwarten gewesen, dass eine Blockade der γc dazu führt, dass
die T-Zellen weniger linienspezifische Zytokine exprimieren. Die spezifischen
Transkriptionsfaktoren differenzierter CD4+ T-Zellen inhibieren jeweils die Differenzierung weiterer CD4+ T-Zellen in andere Helfer-Zelllinien, fördern jedoch dessen Differenzierung in die eigene Linie [327]. Dass hier gleichzeitig Zytokine sowohl von TH1-, TH2- und TH17-Zellen verstärkt exprimiert wurden zeigt, dass eine
Differenzierung nicht stattgefunden hat. Dies lässt sich auch mit den reduzierten
Serumspiegeln (Abb. 4-19) in Einklang bringen, wobei hier jedoch hauptsächlich
TH1-spezifische Zytokine untersucht wurden.
Die erhöhten Zytokinspiegel in den CD4+ T-Zellen (Abb. 4-25) lassen auch ein
vermehrtes Vorliegen an Serumzytokinen erwarten. IFN-γ wurde sowohl in den
Zellen als auch im Serum gemessen und war im Serum reduziert, in den Zellen
jedoch erhöht. Die Analyse von CD107a zeigte ein verstärktes Vorhandensein an
der Zelloberfläche bei Behandlung mit α-CD132 (Abb. 4-24). CD107a liegt in den
intrazellulären Granula vor und wird bei Veschmelzung der Granula mit der Zellmembran an die Oberfläche transloziert [291]. Die aus den behandelten Mäusen
gewonnenen CD4+ T-Zellen zeigen also den Phänotyp von Zellen, die bereits hohe Mengen an intrazellulären Zytokinen ausgeschüttet haben. Da diese jedoch im
Serum nur vermindert vorlagen, in den Zellen aber vermehrt, lässt sich schließen,
dass die Sezernierung dieser Zytokine noch nicht stattgefunden hat. Zytokine
werden nach der Translation zunächst im Golgi-Apparat in sekretorischen Vesikeln oder Granula verpackt und dort gespeichert [328]. Wird die Zelle aktiviert,
werden die Vesikel zur Oberfläche transportiert und deren Inhalt freigesetzt. Die
vorliegenden Zellen scheinen zwar fähig zu sein, Vesikel zu transportieren, was
durch das Vorhandensein an CD107a auf der Zelloberfläche deutlich wird, jedoch
deuten die vermehrten intrazellulären Zytokinspiegel darauf hin, dass bereits das
Verpacken am Golgi-Apparat fehlerhaft war. Die Verpackung einiger Zytokine, wie
z.B. IFN-γ oder TNF-α wird durch Sortilin gewährleistet. Die Stimulation von TZellen über CD3 und CD28 aus Sortilin-defizienten Mäusen zeigte eine signifikant
reduzierte Freisetzung von IFN-γ bei gleichbleibender intrazellulärer Expression
[329]. Über die weitere Rolle von Sortilin in Immunzellen ist bisher noch wenig bekannt. Vor allem die Vorgänge zur Regulation dieses Proteins in T-Zellen konnte
123
Diskussion
bisher noch nicht aufgeklärt werden. Die Ergebnisse der vorliegenden Studie
könnten jedoch Hinweise darauf geben, dass Sortilin über Signalwege der γ c aktiviert wird. Eine Hemmung der γc könnte somit zu reduziertem Vorhandensein oder
Funktion von Sortilin führen, was dann vermehrtes Vorliegen an intrazellulären
Zytokinen bei reduzierter Sekretion zur Folge haben könnte. Ein experimenteller
Ansatz, um diese Hypothese zu überprüfen, wäre die Messung der Menge an Sortilin in den Zellen, inkubiert mit α-CD132 oder reisoliert aus behandelten GvHDMäusen mittels Westernblot
.
Die Anteile an Tregs in den Milzen an Tag 7 nach alloKMT waren nicht verändert,
wenn Empfängermäuse mit α-CD132 behandelt wurden (Abb. 4.24). Eine IL-2Defizienz führt zu reduzierter Anzahl an Tregs [62] und Mäuse, die keine γc exprimieren, zeigten vollständiges Fehlen dieser T-Helferzelllinie [63]. Somit hätte auch
im vorliegenden GvHD-Modell bei Hemmung der γc eine reduzierte Anzahl an Tregs
erwartet werden können. Signalwege über IL-2 sind zum einen wichtig für die
Entwicklung von Tregs und zum anderen für das Überleben in der Peripherie. Dies
wurde in Mäusen gezeigt, die defizient für IL-2, CD25, CD122 oder der γc waren
[67, 330, 331]. In diesen Tieren war durch die von Geburt an fehlenden IL-2Signalwege keine Entstehung von Tregs möglich. Im vorliegenden Mausmodell
konnten sich die Tregs jedoch in den Empfängertieren vor der Transplantation und
Behandlung mit α-CD132 entwickeln. Eine Abnahme der Zellzahlen durch fehlende Signale über IL-2 tritt erst nach längeren Zeiträumen auf [331]. Hier wurden die
Anteile der Zellen bereits nach 7 Tagen untersucht, zu diesem Zeitpunkt hatte das
Fehlen von IL-2 vermittelten Signalen noch keine Auswirkungen auf das Überleben der Tregs. Eine spätere Untersuchung hätte vermutlich geringere Anteile an
Tregs gezeigt. Dass dies dann keine nachteiligen Auswirkungen auf das Überleben
der Tiere hatte, lässt sich dadurch erklären, dass die grundlegenden Vorgänge,
die zu einer aGvHD führen, ausgelöst durch die Konditionierungstherapie sehr
früh stattfinden, während die Tregs noch vorhanden sind. Zu diesen Zeitpunkten ist
die Reduzierung der Inflammation durch APCs und konventionelle T-Zellen ausschlaggebend.
Zur weiteren Untersuchung der Funktion der CD4+ T-Zellen in der GvHD bei
Hemmung der γc wurde eine alloKMT durchgeführt, bei der, zusätzlich zum KM,
nur CD4+ T-Zellen zur GvHD-Induktion transplantiert wurden (Abb. 4-23). Dies
124
Diskussion
führte zu einer letalen GvHD, bei der das Überleben auch durch Behandlung der
Empfängertiere nicht verbessert werden konnte. Daraus lässt sich schließen, dass
die Effekte der Hemmung der γc, die bei CD4+ T-Zellen beobachtet wurden, nicht
alleine ausschlaggebend für das verbesserte Überleben sind, das bei einer alloKMT mit CD4+ und CD8+ T-Zellen durch Behandlung mit α-CD132 erreicht wurde.
5.2.3 Verbessertes Überleben bei gleichbleibender T-Zell-Proliferation
– Funktion der CD8+ T-Zellen
Bei einer GvHD spielen sowohl CD4+ als auch CD8+ T-Zellen wichtige Rollen [135,
136]. Dies konnte auch im vorliegenden Maumodell bestätigt werden, da eine letale GvHD sowohl durch Transplantation von CD4+- gemeinsam mit CD8+-T-Zellen,
als auch durch die Injektion der einzelnen T-Zelluntergruppen induziert werden
konnte (Abb. 4-18, 4-23, 4-26). Das Überleben der Empfänger bei einer durch
CD8+ T-Zellen induzierten GvHD konnte durch Behandlung mit α-CD132 signifikant verbessert werden (Abb. 4-26), was zeigt, dass die protektiven Effekte bei
Hemmung der γc hauptsächlich über die CD8+ T-Zellen vermittelt werden.
Die Untersuchung menschlicher Blutproben von Patienten, die eine Konditionierungstherapie und KMT erhalten hatten, bestätigte auch hier die Aktivierung von
zytotoxischen T-Zellen als Folge der Behandlung, die vor einer alloKMT durchgeführt wird. In den CD8+-T-Zellen dieser Patienten lagen GranzymB sowie Perforin
signifikant erhöht vor, im Vergleich zu den CD8+ T-Zellen gesunder Probanden
(Abb. 4-27). CD8+ T-Zellen, gewonnen aus den Milzen von Mäusen an Tag 7 nach
alloKMT, zeigten eine signifikante Reduktion an GranzymB, wenn die Tiere mit αCD132 behandelt wurden (Abb. 4-27). CD8+ T-Zellen weisen zwei wesentliche
Mechanismen zur Vermittlung der Zytotoxizität auf. Zum einen wird in Zielzellen
über das Fas/FasL-System die Apoptose ausgelöst, indem FasL an Fas auf den
Zielzellen bindet [29]. Zum anderen können Perforin und GranzymB, abgegeben
durch die zytotoxischen Zellen, in die Zielzelle eindringen und dort ebenfalls eine
Apoptose auslösen [29]. In der GvHD sind beide Signalwege als Bestandteil der
pathologischen Vorgänge bekannt. Das Fas/FasL-System führt hierbei hauptsächlich zu Schädigungen in der Leber, wohingegen Perforin und GranzymB bevorzugt
an der Zerstörung der Haut und des GI-Traktes beteiligt sind [135, 136]. Studien
125
Diskussion
im Mausmodell haben gezeigt, dass der Darm eine herausragende Rolle als
GvHD-Zielorgan spielt und maßgeblich an der Amplifikation der systemischen
Vorgänge der GvHD beteiligt ist [131, 132]. Somit wurde die Rolle der γc bei der
Aktivierung und Funktion zytotoxischer T-Zellen anhand des Perforin-GranzymBSignalweges untersucht.
Zunächst sollte überprüft werden, ob γc-Zytokine in der Lage sind, die Produktion
von GranzymB in T-Zellen auszulösen. Eine Inkubation von CD8+ T-Zellen mit IL2, IL-7, IL-15, IL-21 oder einer Kombination aller Zytokine führte zu einer signifikant erhöhten Produktion von GranzymB nach 48 h (Abb. 4-28). Dies steht im Einklang mit Studien in Menschen, die an verschiedenen Medikamentenallergien leiden. Inkubation der T-Zellen aus Patienten, die nur leichte proliferative und zytotoxische Reaktionen auf das Medikament zeigten, mit dem Allergen zusammen mit
IL-7 oder IL-15 steigerte die Produktion von GranzymB [332]. Ebenso konnte in
einem Mausmodell gezeigt werden, dass IL-21 die Expression des Transkriptionsfaktors T-bet über STAT1 induziert, was zur Produktion von GranzymB führte
[333]. Im Kontext einer Stimulation über CD3 und CD28 oder allogene DCs führten
alle Zytokine, außer IL-7, im Falle der Stimulation über CD3 und CD28 zu einer
signifikant erhöhten Produktion von GranzymB, verglichen mit Proben, die nur stimuliert, nicht aber mit Zytokinen kultiviert wurden (Abb. 4-28). Somit liegt der
Schluß nahe, dass eine Hemmung der γc im GvHD-Mausmodell zu reduzierter
GranzymB-Produktion in CD8+ T-Zellen und somit zu einer verminderten Zerstörung der GvHD-Zielgewebe, vor allem des GI-Traktes und somit zu einem verbessertem Überleben führt. Um diese Hypothese zu bestätigen, könnte in GvHDMäusen, die mit α-CD132 behandelt wurden, eine histopathologische Untersuchung des Darms und der anderen GvHD-Zielorgane durchgeführt und mit den
Proben von unbehandelten GvHD-Tieren verglichen werden.
Interessanterweise führte die Inkubation von stimulierten T-Zellen mit den einzelnen Zytokinen zu etwa der Selben Produktion von GranzymB, wie die Inkubation
mit der Kombination aus allen Zytokinen. Dies wurde sowohl für die Anteile der
GranzymB-positiven Zellen gezeigt (Abb. 4-28), als auch für die Menge des produzierten GranzymB (Daten nicht gezeigt). Somit liegen hier keine synergistischen
Effekte der einzelnen Zytokine vor, jedes Zytokin löst einzeln bereits die maximal
mögliche Produktion von GranzymB aus. IL-2, IL-7 und IL-15 lösen in T-Zellen die
126
Diskussion
Aktivierung von STAT5 aus, und IL-21 die Aktivierung von STAT3 [57]. Es ist bekannt, dass die GranzymB-Produktion über STAT5 oder STAT3 aktiviert werden
kann [334]. In einer Zelle steht eine begrenzte Anzahl an STAT-Molekülen und
auch an γc zur Verfügung. Bei Exposition mit Zytokinen in einer relativ hohen Konzentration werden möglicherweise bereits alle γc-Moleküle besetzt und alle verfügbaren STAT-Moleküle aktiviert. Eine gleichzeitige Inkubation mit verschiedenen
Zytokinen kann die Effekte nun nicht mehr steigern, da bereits das Maximum der
Signalübertragungskapazität erreicht ist.
Da einige Hinweise darauf hindeuten, dass die Hemmung der γc bei GvHD zu einer Reduktion des Perforin-GranzymB-Signalwegs führt, sollte dies in einem
GvHD-Mausmodell untersucht werden, bei dem die T-Zellen zur GvHD-Induktion
aus Mäusen isoliert wurden, die defizient für Perforin waren (Perf-/-). Es konnte
bereits gezeigt werden, dass T-Zellen aus diesen Mäusen eine letale GvHD induzieren können [166], was auch im vorliegenden Modell gelang. Eine Behandlung
der Empfänger mit α-CD132 führte zu keiner Verbesserung des Überlebens (Abb.
4-29). Dies gibt einen weiteren Hinweis darauf, dass die verminderte GvHD bei
Hemmung der γc durch die Reduktion des Perforin-GranzymB-Signalwegs vermittelt wurde. Da hier die CD8+ T-Zellen nicht in der Lage waren, ihre zytotoxische
Aktivität über den Perforin-GranzymB-Signalweg zu vermitteln, konnte dieser
durch α-CD132-Behandlung auch nicht gehemmt werden, weshalb das Überleben
nicht verbessert war. Dies wirft jedoch die Frage auf, weshalb diese T-Zellen in
der Lage waren, eine letale GvHD zu vermitteln. Studien zur Charakterisierung
von Perf-/--Mäusen zeigten, dass Perforin-defiziente T-Zellen in der Lage waren
allogene Zielzellen abzutöten [335]. Diese Beobachtung wurde zurückgeführt auf
alternative zytotoxische Mechanismen wie Fas/FasL oder TNF-α, die in diesen
Zellen vorhanden sein könnten. Zytotoxizität durch TNF-α stellt einen wichtigen
Teil der GvHD dar, da es Zielgewebe direkt schädigen kann [117] und TNF-αdefiziente T-Zellen zeigten reduzierte GvHD in einem Mausmodell [336]. Die Produktion von TNF-α wird bei entzündlichen Vorgängen in T-Zellen über die Aktivierung der MAPK p38 induziert [337]. Sind die T-Zellen nicht mehr in der Lage, Perforin als Antwort auf Stimulation über die STATs zu produzieren, wäre es denkbar,
dass sie auf die starken Stimulationen, die bei einer GvHD vorherrschen, mit vermehrter Produktion von TNF-α reagieren. Weiterhin wäre es möglich, dass die
zytotoxischen T-Zellen zur Kompensation der Perforin-Produktion vermehrt den
127
Diskussion
FasL exprimieren. Um dies zu untersuchen könnten nach GvHD-Induktion mit Perforin-defizienten T-Zellen, diese reisoliert und durchflusszytometrisch auf die Expression von FasL untersucht werden. Die Produktion von TNF-α könnte durch
Untersuchung der mRNA analysiert werden.
Die Mechanismen über TNF-α sind zum einen die direkte Schädigung des Zielgewebes durch Auslösen der Apoptose, zum anderen wirkt es aber auch stimulierend auf CD8+ T-Zellen. In einer neuen Studie wurden im Mausmodell T-Zellen,
die defizient für p57, einem Rezeptor für TNF-α, sind, zur GvHD-Induktion transplantiert. Die transplantierten CD8+ T-Zellen waren nicht fähig, Perforin zu produzieren. Dies ist ein Hinweis darauf, dass TNF-α als zusätzliches Signal zur Stimulation über den TCR nötig ist, um in CD8+ T-Zellen Zytotoxizität auszulösen [338].
Der Spiegel von TNF-α im Serum der untersuchten Empfängermäuse war signifikant reduziert, wenn die Tiere mit α-CD132 behandelt wurden (Abb. 4-19). Dies
könnte zu einer reduzierten Zytotoxizität in den T-Zellen führen. Somit wäre dies
ein weiterer, aber indirekter Mechanismus, durch den die Funktion der zytotoxischen T-Zellen durch Hemmung der γc reduziert wird.
Insgesamt konnte in diesem Teil der Arbeit gezeigt werden, dass die Behandlung
von Mäusen im GvHD-Modell mit α-CD132 zu einer Reduktion der GvHD führte,
die verbunden war mit verbessertem Überleben, und reduzierter Ausschüttung
proinflammatorischer Zytokine. Diese Beobachtungen lassen sich hauptsächlich
auf eine reduzierte zytotoxische Aktivität der CD8+ T-Zellen zurückführen, wobei
auch eine reduzierte Anzahl an APCs und verminderte Fähigkeiten der CD4 + TZellen Zytokine zu sezernieren einen geringen Anteil an der reduzierten GvHD
haben könnten. Untersuchungen zu GvL- und antiviralen Effekten wurden hierbei
noch nicht untersucht und könnten als weiterer Teil dieses Ansatzes durchgeführt
werden.
128
Zusammenfassung
6 Zusammenfassung
Die HSZT ist eine der am weitesten verbreiteten Therapien für eine Vielzahl benigner und maligner Erkrankungen und stellt oft die einzige Chance auf eine Heilung dar. Trotz dieser vielversprechenden Behandlungsmöglichkeit ist diese Methode auch geprägt durch Komplikationen, wobei die GvHD eine der Hauptkomplikationen darstellt. Akute GvHD entsteht als Gewebeschaden durch alloreaktive
Spender-T-Zellen, die durch die Empfänger-APCs nach Konditionierungstherapie
und alloHSZT aktiviert werden und epitheliale Organe wie Haut, Leber und Darm
schädigen. Das Ziel dieser Arbeit war, im experimentellen Mausmodell Ansätze für
neue Therapieformen zu finden und die Mechanismen dahinter aufzuklären. Hierbei wurden zwei verschiedene Ansätze verfolgt.
Zum einen wurden die Wirkungen der Hemmung der Prenylierung von Proteinen
untersucht. Prenyltransferasen katalysieren die Anheftung von Farnesyl- oder Geranylgeranylresten, die im Mevalonatsignalweg entstehen, an Proteine, wie z.B.
kleine GTPasen. Diese können somit in der Zellmembran verankert werden, wo
sie nun verschiedenste Signalwege in Gang setzen können. Die Inhibition der
Prenyltransferasen durch FTI oder GGTI stellt einen vielversprechenden Ansatz
zur Verminderung der GvHD dar, da bereits gezeigt wurde, dass eine Hemmung
des Mevalonatsignalwegs durch Statine zu reduzierten GvHD-Raten führte. Die
Behandlung der Empfängertiere mit FTI oder GGTI im „major-mismatch“-GvHDMausmodell führt zu verlängertem Überleben, begleitet von reduzierten GvHDSchweregraden, verminderten proinflammatorischen Zytokinen im Serum, reduzierter T-Zellproliferation und verminderter DC-Migration in die lymphatischen Organe. Es konnte ein Schutz des Thymus gewährleistet werden, was sich sowohl in
der Struktur als auch in der Anzahl der im Thymus vorhandenen Zellen zeigte und
zu einem breiteren TCR-Repertoire führte. Die Hemmung der Prenylierung zeigte
stärkere Effekte auf CD4+- als auf CD8+-T-Zellen, somit waren GvL-Effekte und
antivirale Immunantworten intakt. ZA-Behandlung, die die Cholesterinsynthese
inhibiert, hatte hingegen keinen positiven Effekt auf die Reduktion von GvHD, sodass die Hemmung der Prenylierung als Hauptmechanismus der Statinbehandlung bei GvHD identifiziert werden konnte. Da das Ziel von Therapien nach HSZT
eine Reduzierung der GvHD bei gleichbleibenden GvL-Effekten und Immunant129
Zusammenfassung
worten gegen Pathogene ist, sind für FTI und GGTI die Voraussetzungen für weitere Studien für die Anwendungen in der Klinik erfüllt.
Weiterhin wurde die Rolle der γc in der GvHD untersucht. Sie ist Bestandteil der
Rezeptoren für IL-2, -4, -7, -9, 15, und -21. Da zahlreiche Studien zeigen konnten,
dass die γc-Zytokine bei der Entstehung einer GvHD beteiligt sind, sollten die
Auswirkungen
der
Hemmung
dieser
Rezeptorkette
im
„major-mismatch“-
Mausmodell untersucht werden. Es zeigte sich, dass eine Hemmung der γc zu
verbessertem Überleben führte. Auch hier waren die proinflammatorischen Zytokine im Serum reduziert, die Expansion der Donor-T-Zellen blieb jedoch unverändert. Es konnten starke Effekte der Hemmung der γc auf CD8+ T-Zellen nachgewiesen werden. Hiervon war vor allem der Perforin-GranzymB-Signalweg betroffen. Dass dieser Signalweg bei der Konditionierungstherapie aktiviert wird, konnte
an menschlichen Blutproben gezeigt werden, da die enthaltenen CD8+ T-Zellen
erhöhte Werte an Perforin und GranzymB aufwiesen. Geringere Effekte waren bei
den CD4+ T-Zellen zu beobachten, die jedoch eine erhöhte Ansammlung an Zytokinen in den Zellen zeigten. Die Anzahl an APCs war in den Milzen der Tiere reduziert. Diese Studie erlaubt noch keinen Transfer in die Klinik, da weder GvLnoch andere immunologische Effekte untersucht wurden. Jedoch erlaubt sie einen
guten Einblick in Mechanismen, die zur GvHD führen.
Insgesamt konnte diese Arbeit die Hemmung der Prenylierung von kleinen GTPasen sowie die Hemmung der Signaltransduktion von Zytokinen über die γ c als innovative Ansatzpunkte für die Entwicklung von Therapiekonzepten für die GvHDBehandlung etablieren. Durch die Steuerung von allogenen Immunantworten sowohl über CD4+ als auch CD8+ T-Zellen ergeben sich neue Perspektiven für die
Optimierung der Prognose von Patienten nach allogener HSZT.
130
Abkürzungen
7 Abkürzungsverzeichnis
α
gegen (anti-)
α-CD132
Antikörper gegen CD132
°C
Grad Celsius
µ
micro
γc
gemeinsame gamma-Kette
alloHSZT
allogene hämatopoeitsche Stammzelltransplantation
alloKMT
allogene Knochenmarktransplantation
aLN
axilärer Lymphknoten
APC
antigenpräsentierende Zelle
ATP
Adenosin-Triphosphat
BCR
B-Zell-Rezeptor
BLI
Biolumineszenzmessung (bioluminescence imaging)
BMDCs
dendritische Zellen aus Vorläuferzellen des Knochenmarks (bone
marrow-derived dendritic cells)
BPs
Biphosphonate
BSA
bovines Serumalbumin
CD
Unterscheidungsgruppen (cluster of differentiation)
CFSE
Carboxyfluoreszein Diazetat Succinimidyl Ester
CO2
Kohlenstoffdioxid
CsA
Cyclosporin A
cTEC
kortikale Thymus-Epithelzellen
DC
dendritische Zelle
DP
CD4+CD8+ doppelt positiv
EAE
experimentelle autoimmune Enzephalomyelitis
131
Abkürzungen
ER
endoplasmatisches Retikulum
(p)ERK
(phosphorylierte)Kinase, die durch extrazelluläre Signale reguliert
wird (extracellular-signal regulated kinase)
FITC
Fluoresceinisothiocyanat
FoxP3
Transkriptionsfaktor forkhead box P3
FTase
Farnesyltransferase
FTI
Farnesyltransferaseinhibitor
g
Beschleunigung auf der Erdoberfläche (~9.81m/sec2); Gramm
GAP
GTPase aktivierendes Protein
G-CSF
Granulozyten-Kolonie stimulierender Faktor
(granulocyte colony-
stimulating factor)
GDP
Guanosin-Diphosphat
GEF
Guaninnucleotid-Austauschfaktor (guanine nucleotide exchange factor)
GGTase
Geranylgeranyltransferase
GGTI
Geranylgeranyltransferaseinhibitor
GI
gastrointestinal
GM-CSF
Granulozyten-Makrophagen-Kolonie
stimulierender
Faktor
(gra-
nulocyte macrophage colony-stimulating factor)
G-Protein
Guaninnukleotid-bindendes Protein
GTP
Guanosin-Triphosphat
GvHD
Transplantat gegen Wirt-Erkrankung (graft-versus-host-disease)
GvL
Transplantat gegen Leukämie/Lymphom (graft-versus-Leukemia)
Gy
Gray
h
Stunde
H2O
Wasser (Diwasserstoffmonoxid)
HIV
humanes Immundefizienzvirus
132
Abkürzungen
HLA
humanes Leukozyten-Antigen
HMG-CoA
3-Hydroxy-3-Methylglutaryl-Coenzym-A
HMGR
3-Hydroxy-3-Methylglutaryl-Coenzym-A-Reduktase
HRP
Meerrettichperoxidase (horseradish peroxidase)
HSZ
Hämatopoetische Stammzelle
i.p.
intraperitoneal
i.v.
intravenös
ICOS
induzierbarer T-Zell Kostimulator (inducible T cell co stimulator)
IFN
Interferon
Ig
Immunglobulin
iLN
inguinaler Lymphknoten
JAK
Januskinase
k
Kilo
K5
Keratin 5
KG
Körpergewicht
KLRG1
Mitglied 1 der Unterfamilie G der Lektin-ähnlichen Rezeptoren auf
Killerzellen (Killer cell lectin-like receptor subfamily G member 1)
KM
Knochenmark
KMT
Knochenmarktransplantation
l
Liter
LAT
Bindeglied der T-Zell-Aktivierung (linker of activation in T cells)
Lck
Lymphozyten-spezifische Tyrosin-Kinase (lymphocyte-specific protein
tyrosine kinase)
LDL
Lipidprotein mit niedriger Dichte (low-density-lipidprotein)
LM
Lösungsmittel
LN
Lymphknoten
133
Abkürzungen
LPS
Lipopolysaccharid
luc
Luziferase exprimierend
M
Molar
m
Meter; Milli
MAP
Mitogen-aktiviertes Protein
MCMV
murines Zytomegalovirus (murine cytomegalovirus)
MCP
Monozyten-chemotaktisches Protein
MEFs
embryonale Mausfibroblasten, (murine embryonic fibroblasts)
MFI
mittlere Fluoreszenzintensität
MHC
Haupthistokompatibilitätskomplex (major histocompatibility complex)
min
Minuten
MIP
Makrophagen-inflammatorisches Protein
MK
Mevalonatkinase
mLN
mesenterialer Lymphknoten
MLR
gemischte Lymphozyten-Reaktion (mixed lymphocyte reaction)
MPO
Myeloperoxidase
MS
multiple Sklerose
mTEC
medulläre Thymus-Epithelzellen
mTor
Ziel von Rapamycin in Säugern (mammalian target of Rapamycin)
MyD88
Gen für die Primärantwort der Differenzierung in myeloiden Zellen
(myeloid differentiation primary response gene 88)
n
Nano
NFκB
nukleärer Faktor kappa B
NKT-Zelle
natürliche killer-T-Zelle
NK-Zelle
natürliche Killerzelle
P/S
Penicillin/Streptomycin
134
Abkürzungen
PBMCs
mononukleären Zellen des peripheren Blutes (peripheral blood mononuclear cells)
PBS
phosphatgepufferte Salzlösung (phosphate buffered saline)
PDGFR
Rezeptor für aus Plättchen abgeleiteter Wachstumsfaktor (plateletderived growth factor receptor)
PFU
fleckenbildende Einheiten
PH
Pleckstrin-Homologie
pH
negativer dekadischer Logarithmus der Wasserstoffionen-Aktivität
PI
Propidiumiodid
PI3K
Phosphoinositid-3-Kinase
PIP2
Phosphatidylinositol 4,5-Bisphosphat
PKC
Proteinkinase C
Perf-/-
C57BL/6.Perforin-/--Maus
PLD
Phospholipase D
PMA
Phorbol 12-Myristat 13-Acetat
PMK
Phosphomevalonatkinase
PP
Pyrophosphat
PRRs
Mustererkennungsrezeptoren (pattern recognition receptors)
PVDF
Polyvinylidenfluorid
RA
Rheumatoide Arthritis
Raf
Ratten-Fibrosarkom
Ral
Ras-ähnlich (Ras-like)
RALBP1
Ral bindendes Protein 1
RalGDS
Stimulator der Dissoziation von Guaninnukleotiden bei Ral (ral guanine nucleotide dissociation stimulator)
Ras
Ratten-Sarcom
135
Abkürzungen
ROS
reaktive Sauerstoffradikale (reactive oxygen species)
RTK
Rezeptor-Tyrosin-Kinase
(p)S6
(phosphoryliertes)Ribosomales Protein S6
SEM
Standardfehler des Mittelwerts (standard error of mean)
SLE
systemischer Lupus erythematodes
SOS
„son of sevenless“
SREBPs
Sterin regulierendes Element bindendes Protein, (sterol-regulatory
element binding protein)
SS
Squalensynthase
STAT
Proteine zur Signaltransduktion und Aktivierung der Transkription
(signal transducers and activators of transcription)
TBS
trisgepufferte Salzlösung (tris-buffered saline)
Tc
T-Zelle
TCR
T-Zell-Rezeptor
TEC
Thymus-Epithelzellen
TGF
transformierender Wachstumsfaktor (transforming growth factor)
TH-Zelle
Helfer-T-Zelle
TLR
Toll-ähnlicher Rezeptor (Toll-like receptor)
Treg
regulatorische T-Zelle
TRIS
Tris(hydroxymethyl)-aminomethan
UEA-1
Agglutinin-1 der Stechginster (Ulex europaeus agglutinin-1)
V
Volt
X-SCID
X-Chromosomal vererbte schwere kombinierte Immundefizienz (Xlinked severe combined immunodeficiency)
YFP
gelb fluoreszierendes Protein (yellow floureszent protein)
ZA
Saragossasäure (Zaragozic Acid)
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