2. Material und Methoden
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Inhaltsverzeichnis 1.Theoretischer Hintergrund .................................................................................................. 2 1.1 Biomoleküle ............................................................................................................. 2 1.1.1 Proteine ...................................................................................................... 2 1.1.2 Lipide ......................................................................................................... 4 1.1.3 Nukleinsäuren ............................................................................................ 6 1.1.4 Kohlenhydrate............................................................................................ 8 1.2 Reservestoffe .......................................................................................................... 10 1.3 Energiefluss ............................................................................................................ 10 1.4 Energiegewinnung in der Zelle .............................................................................. 11 1.4.1 Die Glykolyse .......................................................................................... 11 1.4.2 Der Citratzyklus ....................................................................................... 13 1.4.3 Die Atmungskette .................................................................................... 15 1.5 Physikalischer und Physiologischer Brennwert ..................................................... 16 2. Material und Methoden .................................................................................................... 16 Versuch 1: Bombenkalorimetrie................................................................................... 16 Versuch 2: Bestimmung des Proteingehaltes in Muskelfleisch und Fettgewebe vom Rind .............................................................................................................................. 18 Versuch 3: Lipidbestimmung ....................................................................................... 18 3. Ergebnisse ........................................................................................................................ 19 Versuch 1: Bombenkalorimetrie: ................................................................................. 19 Versuch 2: Proteinbestimmung: ................................................................................... 20 Versuch 3: Lipidbestimmung: ...................................................................................... 21 4. Diskussion ........................................................................................................................ 22 5. Literaturverzeichnis .......................................................................................................... 23 1 1.Theoretischer Hintergrund 1.1 Biomoleküle Biomoleküle sind Moleküle, die denselben Grundbauplan haben. Sie haben allesamt ein Grundgerüst aus mehreren Kohlenstoffatomen, sind also organische Moleküle. Beispiele für Biomoleküle sind unter anderem Proteine, Fette, Nukleinsäuren und Kohlenhydrate, die im Folgenden näher erläutert werden. 1.1.1 Proteine Proteine sind sehr häufig vorkommende organische Makromoleküle. Aufgebaut sind sie aus L-α- Aminosäuren, die über Peptidbindungen verknüpft werden. Zurzeit sind 22 proteinogene Aminosäuren bekannt. Die Aminosäuren sind alle nach demselben Prinzip aufgebaut. Sie besitzen ein chirales CAtom, an das ein Wasserstoffmolekül, eine Carboxylgruppe und eine Aminogruppe gebunden sind. Desweiteren ist ein Rest angehängt, der im einfachsten Fall ein weiteres H- Atom darstellt. Diese Aminosäure nennt sich Glycin. Die allgemeine Struktur für Aminosäuren sieht folgendermaßen aus: Abb. 1: Allgemeiner Aufbau einer Aminosäure (Quelle: http://www.biokurs.de/skripten/bilder/!aamodel.gif) Man kann die Aminosäuren in verschiedene Untergruppen unterteilen. Für diese Unterteilung verantwortlich ist der jeweilige Rest, der die chemischen und physikalischen Eigenschaften der Aminosäure bestimmt. So gibt es zum Beispiel Aminosäuren mit polaren (z.B. Serin) oder unpolaren (z.B. Alanin) Seitenketten, oder solche, die sauer (Glutaminsäure) oder basisch (Lysin) sind. Desweiteren gibt es Aminosäuren, die der Körper selbst herstellen kann 2 und solche die essentiell sind, die der Organismus nicht selbst produzieren kann, sondern über die Nahrung aufnehmen muss. Für den Menschen sind Leucin, Lysin und Valin essentiell. Wie oben schon erwähnt, besteht ein Protein aus mehreren über Peptidbindungen verknüpften Aminosäuren. Bei einer Peptidbindung reagiert die Carboxylgruppe der einen Aminosäure mit der Aminogruppe der zweiten Aminosäure unter Abspaltung von Wasser, wie es auch in folgender Abbildung anschaulich dargestellt ist. Abb. 2: Verknüpfung zweier Aminosäuren unter Ausbildung einer Peptidbindung (Quelle: http://www.u-helmich.de/bio/stw/biokatalyse/bilder/abb02-1-04.jpg) Verknüpft man zwei Aminosäuren, so erhält man ein Dipeptid, werden noch mehr Aminosäuren addiert so erhält man ein Polypeptid. Proteine besitzen unterschiedlichste Funktionen, z.B. gibt es hormonelle (Insulin) und kontraktile (Myosin) Proteine, ebenso wie Speicher- (Ovalbumin) oder Strukturproteine (Keratin). Außerdem sind Antikörper Abwehrproteine. Lactasedehydrogenase ist ein Beispiel für enzymatische Proteine. Man unterscheidet verschiedene Strukturen bei den Proteinen. Zum Einen gibt es die Primärstruktur, die ganz einfach die Aneinanderreihung der einzelnen Aminosäuren bezeichnet. Zum Anderen gibt es verschiedene Sekundärstrukturen, beispielsweise die αHelix oder das β- Faltblatt. Die α- Helix ist eine schraubenartig gewundene Peptidkette, die 3 zwischen den einzelnen Windungen Wasserstoffbrücken ausbildet. Beim β- Faltblatt liegen mehrere Peptidketten parallel zu einander, es bilden sich dazwischen ebenfalls Wasserstoffbrücken aus. In der Tertiärstruktur sind verschiedene Sekundärstrukturen zu finden, das Molekül liegt dann eher zusammengeknäult vor. Auch hier treten verschiedene Bindungstypen auf, die diese Struktur festigen. Dazu zählen unter anderen die Van- der- Waals- Kräfte, Wasserstoff- und Disulfidbrücken, Ionenbindungen etc. Diese Bindungen erfolgen bei der Tertiärstruktur im Gegensatz zur Sekundärstruktur aber an den Seitenketten des Proteins, also sind die Reste der jeweiligen Aminosäuren für deren Ausbildung verantwortlich. In der Quartärstruktur findet man verschiedene Peptide, die als Untereinheiten bezeichnet werden. Als Beispiel hierfür kann man das Hämoglobin nennen, das eine zentrale Hämgruppe (Fe2+)- Gruppe besitzt, die über Schwefelbrücken mit vier Polypeptidketten verbunden ist. 1.1.2 Lipide Diese Gruppe kann man noch einmal unterteilen, zum Beispiel in Fette, membranbildende Lipide und Isoprenoide. Allen gemeinsam ist, dass sie zumindest in gewissen Maßen hydrophob sind. Desweiteren sind sie gute Energiespeichermoleküle, die zweimal so viel Energie speichern können wie Kohlenhydrate. Weitere Vorteile der Lipide sind, dass sie osmotisch inaktiv und relativ klein sind. Fette bestehen aus einem Glycerinmolekül und drei Fettsäuren. Dabei kommt es unter Wasserabspaltung zu Estherbindungen zwischen der Hydroxylgruppe des Glycerins und der Carboxylgruppe der Fettsäuren. Es entsteht ein Triglycerid. Dies wird in folgender Abbildung dargestellt: Abb. 3: Bildung eines Fettmoleküls (Quelle: http://www.chempage.de/theorie/fette.1.gif) 4 Es kann nun entweder ein ungesättigtes oder ein gesättigtes Triglycerid vorliegen, je nachdem ob die Fettsäuren gesättigt oder ungesättigt sind. Als ungesättigte Fettsäuren bezeichnet man solche, die mindestens eine Doppelbindung enthalten. Gesättigte Fettsäuren hingegen beinhalten keinerlei Doppelbindungen, weshalb sie ebene Moleküle sind, die große van-derWaals- Kräfte ausbilden können, sind. Deshalb liegen diese Moleküle bei Raumtemperatur meist in fester Form vorliegen. Ungesättigte Triglyceride sind nicht eben und bilden daher Knicke. Dies wiederum bewirkt einen größeren Abstand zwischen benachbarten Molekülen und ist der Grund dafür, dass ungesättigte Triglyceride bei Raumtemperatur eher als Öle oder Fette vorliegen. Bei den membranbildenden Lipiden sind vor allem die Phospholipide wichtig. Diese sind prinzipiell wie die Fette aufgebaut, allerdings wird eine der beiden äußeren Fettsäuren durch eine Phosphatgruppe, an der ein Rest hängen kann, ersetzt. Das Phospholipid ist wie in Abbildung 4 zu sehen aufgebaut. Es besitzt einen geladenen, also polaren Kopf, der hydrophil ist, sich also in Richtung des Wassers ausrichtet und die unpolaren Fettsäureketten als hydrophobe Schwänze, die sich vom Wasser abwenden. Typische Anordnungen für Phospholipide sind die Phospholipid- Doppelschicht oder Micelle. Abb. 4: Möglicher Aufbau eines Phospholipids (Quelle: http://upload.wikimedia.org/wikipedia/de/thumb/5/5d/Lecithin.png/800px-Lecithin.png) Eine weitere Gruppe, die es zu nennen gilt, sind die Isoprenoide. Dies sind Moleküle, die aus Isopreneinheiten aufgebaut sind, z.B. die Steroide. Steroide können Vitamine (A, D, E, K) sein, genauso wie Sexualhormone sein. Das Grundgerüst heißt Steran; aus ihm werden die Steroide aufgebaut (siehe Abbildung 5). Cholesterin ist ein wichtiges Steroid, das in viele andere umwandelbar ist. Allerdings ist es in großen Mengen ungesund und sollte mit der Nahrung nicht übermäßig aufgenommen werden. 5 Abb. 5: Steran, das Grundgerüst der Steroide (Quelle: http://www.sci.muni.cz/ptacek/Chemie-bar_soubory/image038.jpg) 1.1.3 Nukleinsäuren Zu allererst muss man die Desoxyribonukleinsäure (DNS) von der Ribonukleinsäure (RNS) unterscheiden. Beide haben ein gemeinsames Grundgerüst, unterscheiden sich aber im jeweiligen Zucker. Die DNS besitzt eine Desoxyribose, die RNS eine Ribose. Beide Pentosen unterscheiden sich lediglich darin, dass die OH- Gruppe der Ribose am C2 bei der Desoxyribose durch ein Wasserstoffatom ersetzt ist, was von folgender Abbildung verdeutlicht wird. Abb. 6: Unterschiede zwischen Desoxyribose und Ribose (Quelle: http://www.mun.ca/biology/scarr/Deoxyribose_vs_Ribose.gif) Wie oben schon erwähnt, besitzen sowohl DNS als auch RNS ein bestimmtes Grundgerüst. Dieses ist aufgebaut aus vielen, aneinandergereihten Nukleotiden. Ein Nukleotid wiederum besteht aus einer stickstoffhaltigen Base, einer Phosphatgruppe und dem jeweiligen Zucker (siehe oben). Dabei bindet die eine Phosphatgruppe an das C3 und die zweite Phosphatgruppe 6 an das C5 des Zuckers. So entsteht ein Zucker- Phosphat- Gerüst. An den Zucker ist aber am C1 zusätzlich noch jeweils eine Base angelagert. Die Basen sind entweder Pyrimidine (Cytosin, Thymin, Uracil nur bei RNA) oder Purine (Adenosin, Guanin). Der Aufbau der Stränge ist in Abbildung 7 schön zu sehen. Zu beachten ist, dass die RNA nur einen Strang ausbildet, während die DNS einen weiteren Komplementärstrang besitz. Gepaart werden bei der DNS immer die Basen Adenosin und Thymin, die zwei Wasserstoffbrücken ausbilden, oder Guanin und Cytosin, die über drei Wasserstoffbrücken verknüpft sind. Abb. 7: Aufbau eines DNA- Strangs (Quelle: http://www.molecularstation.com/images/chemical-structure-dna.gif) 7 1.1.4 Kohlenhydrate Kohlenhydrate sind Makromoleküle, die aus mehreren verschiedenen oder gleichen Grundbausteinen, den sogenannten Monosacchariden (Einfachzucker) zusammengefügt werden. Für alle Kohlenhydrate gilt die Summenformel CnH2nOn. Typisch für die Monosaccharide, wie zum Beispiel Glucose, ist, dass sie eine Carbonyl- und mehrere Hydroxylgruppen als funktionelle Einheiten besitzen. Bei Glucose liegt die Carbonylgruppe randständig, also am C1 vor. Diese Form der Zucker wird auch als Aldose bezeichnet. Darüberhinaus gibt es aber auch Zucker, bei denen die Carbonylgruppe an C2 sitzt. Diese Moleküle werden als Ketosen bezeichnet, ein Beispiel hierfür ist die Fructose. Außerdem kann man sowohl Fructose als auch Glucose als Hexosen bezeichnen, da sie aus sechs aneinander gereihten C- Atomen bestehen. Analog dazu gibt es auch die Bezeichnungen Triose, Tetraose, Pentose, Heptose, etc. für entsprechen kürzere oder längere Kohlenstoffketten. Mono- bis Oligosaccharide sind zumeist gut wasserlöslich und haben einen süßen Geschmack (Zucker). Im Wasser liegen die Moleküle aber in der Regel nicht linear vor. Es kommt hier zu einer Reaktion zwischen der Carbonylgruppe und der OHgruppen von C5, die dafür verantwortlich ist, dass es zu einem Ringschluss kommt, also ein zyklisches Molekül vorliegt. Die nachfolgende Abbildung zeigt ein linear und zyklisch vorliegendes Glucose- Molekül: Abb. 8: Glucose vor und nach dem Ringschluss (Quelle: http://www.palaeos.com/Fungi/FPieces/Images/Glucose.gif) 8 Weitere wichtige Monosaccharide neben Glucose und Fructose Ribose und Desoxyribose (siehe oben), ebenso wie Galaktose und Manose. Verknüpfen sich zwei Monosaccaride unter Ausbildung einer glycosidischen Bindung zwischen zwei Hydroxylgruppen und unter Wasserabspaltung, so erhält man ein Disaccharid. Wichtige Disaccharide sind u.a. Maltose, Laktose und Saccharose. Maltose besteht aus zwei Glucose- Molekülen, die über eine α-1,4- glycosidische Bindung verbunden sind. Bei der Laktose verbinden sich ein Galaktose- und ein Glucose- Molekül β-1,4- glycosidisch. Eine α1,2- glycosidische Verbindung zwischen einer Glucose und einer Fructose findet man bei der Saccharose. Die entsprechenden Disaccharide sind in folgender Abbildung dargestellt. Abb. 9: Übersicht über die wichtigsten Di- und Polysaccharide (Quelle: http://www.bact.wisc.edu/Microtextbook/images/book_4/chapter_2/2-3.gif) Neben den drei genannten Vertretern der Disaccharide kann man obiger Abbildung auch zwei Polysaccharide entnehmen: die Amylose und das Amylopectin. Beide Saccharide sind ausschließlich aus Glucose- Bausteinen aufgebaut. Der Unterschied zwischen ihnen besteht an 9 der Tatsache, dass in der Amylose nur α-1,4- glycosidische Bindungen vorliegen, bei Amylopektin hingegen noch zusätzliche α-1,6- glycosidische Bindungen auftreten, die dazu führen, dass Amylopektin Verzweigungen aufweist, während die Amylose unverzweigt ist. Beide Moleküle zusammen ergeben die pflanzliche Stärke. Der entsprechende Speicherstoff bei Tieren nennt sich Glykogen und ist dem Amylopektin recht ähnlich aufgebaut. Er besteht ebenfalls nur aus Glucose- Molekülen, die wiederum auch hier α-1,4- und α-1,6- glycosidisch verknüpft sind. Der einzige Unterschied liegt darin, dass die Verzweigungen hier deutlich stärker sind als beim Amylopektin. Beide Saccharide, Stärke und Glykogen, dienen der Energiespeicherung. Andere Polysaccharide, wie zum Beispiel Chitin (bei Pilzen und Arthropoden) oder Cellulose (bei Pflanzen), dienen als Strukturpolysaccharide und sind zum Beispiel für den Bau der Zellwand mitverantwortlich. Chitin ist aus Acetylglucosamin- Molekülen aufgebaut, in dem es die einzelnen Moleküle über β-1,4- Glycosidische Bindungen verknüpft. Cellulose hingegen besteht wiederum aus β1,4- glycosidisch verbundenen Glucose- Einheiten. 1.2 Reservestoffe Reservestoffe sind solche Substanzen, die der Körper dem Stoffwechsel entzieht und sie dann speichert. Die Speicherung kann in bestimmten Organen oder Geweben wie zum Beispiel dem Fettgewebe erfolgen. Die gespeicherten Reservestoffe werden dort so lange abgelagert, bis der Organismus wieder mehr Energie benötigt. Dann werden die Reservestoffe in den Stoffwechsel eingebracht und der Körper erhält bei deren Verbrennung Energie. Als Beispiele kann man unter anderem Stärke, Glykogen, Fette und Öle nennen. 1.3 Energiefluss Tiere stehen mit ihrer Außenwelt in Verbindung, sind also nicht isoliert von ihr, chemisch gesehen damit auch kein abgeschlossenes, sondern ein offenes System. Ein Tier nimmt nun über die Nahrung Stoffe auf, aus denen es Energie gewinnen kann. Wie diese Energiegewinnung erfolgen kann, wird im nachfolgenden Teil ausführlich besprochen. Die 10 Energie, die das Tier beim Verstoffwechseln erhält, verbraucht es teilweise selbst für Muskelarbeit, also Bewegung, oder auch für essentielle Vorgänge im Körper, für die Energie zur Verfügung stehen muss, etc. Ein weiterer Teil wird als Wärme an die Umwelt abgegeben, da es bei einem offenen System sowohl zum Austausch von Stoffen als auch von Wärme kommt. Außerdem geht Energie mit der Ausscheidung von Harn und Kot verloren. 1.4 Energiegewinnung in der Zelle 1.4.1 Die Glykolyse Die Glykolyse ist der erste der drei Schritte der Zellatmung und ihre Bedeutung liegt in der Spaltung von Glucose. Sie findet im Cytoplasma der Zellen statt und je nachdem, ob Sauerstoff vorhanden ist oder nicht, gehen ihre Produkte entweder in die Milchsäuregärung oder- über einen kleinen Umweg- in den Citratzyklus über. Die Glykolyse besteht aus zehn Schritten von denen jeder von einem eigenen Enzym katalysiert wird. • Nachdem Glucose in die Zelle gelangt ist, wird sie unter dem Verbrauch von einem ATP von dem Enzym Hexokinase zu Glucose-6-Phosphat phosphoryliert. Aufgrund der nun bestehenden Ladung kann sie die Zelle nicht mehr verlassen. • Durch die Phosphoglucoisomerase wird jetzt das Isomer Fructose-6-Phosphat gebildet. Hier findet also lediglich eine Umordnung der Atome statt. • Die Phosphofructokinase überträgt eine zweite Phosphatgruppe auf die Fructose, wieder wird hierfür ATP verbraucht. Es wird somit Fructose-1,6-bisphospaht gebildet. • Das Molekül, eine Hexose, wird in diesem Schritt in zwei Produkte aufgespalten. Und zwar in Dihydroxyacetonphosphat und in Glycerinaldehyd-3-phophat (GAP), beides dementsprechend Triosen. Das verantwortliche Enzym ist eine Aldolase. • Von den beiden gebildeten Molekülen kann allerdings nur GAP weiterverwertet werden. Deswegen wird alles Dihydroxyacetonphosphat durch die Isomerase in GAP umgewandelt. Die Folge ist, dass aus einem Mol Glucose je zwei Mol der Produkte entstehen. Ab jetzt muss man also alle Produkte mit zwei multiplizieren, um am Ende die richtige Anzahl zu erhalten. 11 • Das Enzym Triosephosphatdehydrogenase führt nun zu zwei aufeinanderfolgenden Schritten: zuerst werden auf NAD+ Elektronen und H+ übertragen, durch die entstandene Energie dieser exergonischen Reaktion wird eine weitere Phosphatgruppe an das Molekül angelagert. So entsteht 1,3-Bisphosphoglycerat. • Auf ADP das in die Reaktion eingeht wird eine der zwei Phosphatgruppen übertragen, und somit Energie erzeugt. Enzym ist die Phosphoglycerokinase. Das Produkt, das entsteht, heißt 3- Phosphoglycerat. • Durch die Phosphoglyceromutase wird die Phosphatgruppe vom C3 auf C2 übertragen und 2-Phosphoglycerat wird gebildet. • Phosphoenolpyruvat (PEP) wird mit Abspalten eines H2O- Molekül durch die Enolase gebildet. • Zum zweiten Mal in der Glykolyse wird eine Phosphatgruppe entfernt und auf ein ADP übertragen. Dies geschieht durch die Pyruvatkinase und hat die Entstehung von Pyruvat zur Folge. Dies war der letzte Schritt der Glykolyse. Besser kann man sich die zehn Schritte anhand eines Schaubildes verdeutlichen. (Siehe Abb. 10). Um noch mal kurz und bündig zu sehen, was passiert, kann man eine Gesamtbilanz aufstellen: C6H1206 + 2 NAD+ + 2 ADP + 2 P 2 CH3-CO-COOH + 2 NADH+H+ + 2 ATP Aus einem Mol Glucose werden also zwei Mol Pyruvat, dieses wird nun oxidativ decarboxiliert und das entstehende Acetyl-CoA durchläuft den Citratcyklus. 12 Abb. 10: Die Glykolyse (Quelle: www.uni-duesseldorf.de/MathNat/Biologie/Didaktik/Hefe/allg/seiten/gaerung/glykolyse.html) 1.4.2 Der Citratzyklus Nachdem Pyruvat gebildet wurde, wird es nun in die Matrix des Mitochondriums transportiert. Dort wird in drei Schritten aus dem Pyruvat Acetyl-CoA. Nachdem ein CO2 abgespalten wurde, werden auf ein NAD+ Elektronen und H+ übertragen und so Energie gespeichert. Zum Schluss wird das Coenzym A an das Molekül angelagert. Der ganze Vorgang wird von einem Multienzymkomplex- der Pyruvat-Dehydrogenase- katalysiert. Nach dieser oxidativen Decarboxilierung kann dass Acetyl-CoA in den Citratzyklus eingehen (Siehe Abb.11). 13 Abb.11: Der Citratzyklus (Quelle:http://www.uniduesseldorf.de/WWW/MathNat/Biologie/Didaktik/Zellatmung/dateien/citratcyclus/dateien/einl.html) Man kann den Zyklus, der ebenfalls in der Matrix der Mitochondrien stattfindet, zur Veranschaulichung in drei Teile teilen. 1. Fixierung: Acetyl-CoA wird unter Abspaltung des Coenzyms A an Oxalacetat gebunden, es entsteht Citrat. 2. Vollständiger Abbau von Glucose: Alle Teile der Glucose, die am Anfang in die Glykolyse eingingen, sind jetzt abgebaut, letzter Schritt ist hiervon die Abgabe von CO2. 3. Regeneration: Über mehrere Zwischenschritte wird am Ende erreicht, dass als Produkt wieder Oxalacetat entsteht, das erneut den Zyklus durchläuft. Wichtig am Citratzyklus ist wiederum die Bilanz, also wie viel von was gebildet und verbraucht wird. Unter dem Verbrauch von einem Acetyl-CoA werden drei NAD+ zu drei NADH +H+; ein ATP (über die Substratkettenphosphorilierung), ein FADH2 und zwei CO2 werden gebildet. 14 1.4.3 Die Atmungskette Die Atmungskette besteht aus vier Enzymkomplexen und der ATP- Synthase (siehe Abb. 12). Durch sie wird der Hauptenergiegewinn durch die Zellatmung erreicht. Sie findet an der Mitochondrien-Membran statt. Die vier Enzymkomplexe sind eine sogenannte ElektronenTransportkette. Nachdem ein Energieträger, z.B. NADH ein Elektron an den Komplex 1 abgegeben hat durchwandert dieses alle vier Komplexe. Diese liegen im oxidierten Zustand vor und werden von den Elektronen reduziert. Am Ende der Kette werden sie wieder abgegeben und auf Sauerstoff übertragen. So wird Wasser gebildet. In Abb. 12 wird Sauerstoff als ½ O2 bezeichnet. Dies soll verdeutlichen dass keine einzelnen Sauerstoffatome reduziert werden sondern O2, also molekularer Sauerstoff. Abb. 12: Die Atmungskette (Quelle: http://archiv.ub.uni-marburg.de/diss/z1999/0061/html/einleit.html) Hauptfunktion ist an der Atmungskette aber natürlich nicht die Wasserproduktion, sondern die ATP-Bildung. Dies geschieht durch das Erzeugen eines H+-Gradienten. Zuerst wird H+ durch die innere Membran in den Intermembranraum transportiert, und durch die Transportkette auch dort gehalten. Manche der Komplexe können nämlich nicht nur Elektronen sondern auch Protonen binden und diese dann nach außen befördern. Durch die 15 ATP-Synthase kann es nun, dem eigenen Konzentrationsgefälle folgend, wieder ins Mitochondrium gelangen. Dies nutzt die ATP-Synthase aus, um aus ADP ATP aufzubauen. Theoretisch kann man durch die oxidative Phosphorilierung auf die Erzeugung von etwa 34 ATP schließen. In der Realität wird aber nur ungefähr die Hälfte dieser Zahl gebildet. Trotzdem macht dies am Meisten der gesamten Atmungskette aus. 1.5 Physikalischer und Physiologischer Brennwert Als physikalischen Brennwert bezeichnet man die Energie, die entsteht, wenn ein Soff vollständig umgesetzt, also verbrannt wird. Der physiologische Brennwert hingegen ist die Energie die erzeugt wird, wenn von einem Organismus eine Substanz verbrannt wird. Der physiologische Brennwert ist bei Kohlenhydraten und Fetten gleich dem physikalischen. Nur bei Proteinen unterscheiden sich die beiden Werte. Die Begründung ist, dass der Körper manche energiereichen, stickstoffhaltigen Verbindungen nicht verbrennt, weil die Produkte giftig für ihn wären, bzw. weil er manche Substanzen gar nicht abbauen kann. Diese Substanzen werden dann über die Exkretion beseitigt. Die Differenz der zwei Brennwerte wurde, unter anderem, in diesem Versuch untersucht. 2. Material und Methoden Versuch 1: Bombenkalorimetrie Ziel war es, die Brennwerte für Albumin und Cellulose zu ermitteln. Dies kann mit Hilfe eines Bombenkalorimeters (siehe Abb. 13) geschehen. Ein Bombenkalorimeter besteht ganz grob aus einer Bombe, einem Alu- Block und einem zweiten Alu- Block als Referenz. Zwischen den beiden Alublöcken sitzt ein Peltier- Element. Außerdem ist ein Schreiber angeschlossen. Die Bombe selbst besitzt ein Ventil, über das Sauerstoff (30 bar) zugeführt werden kann, da es für die Reaktion unbedingt erforderlich ist, dass Sauerstoff im Überfluss vorhanden ist. Die Probe wird auf einem Probenteller gegeben. Dieser steht mit zwei Elektroden in Verbindung, die wiederum mit einem Platindraht, der auch die Probe berührt, verbunden sind. Der Aufbau soll mithilfe der beiden nachfolgenden Abbildungen verdeutlicht werden. 16 Abb. 13: Bombenkalorimeter (Quelle: Vorbereitungsskript) Abb. 14: Bombe des Kalorimeters (Quelle: Vorbereitungsskript) In einem Bombenkalorimeter werden die jeweiligen zu bestimmenden Proben vollständig zu CO2 und H2O verbrannt. Als Proben verwendet man dabei wasserfreie Substanzen, die zu Tabletten gepresst wurden. Die Verbrennung erfolgt, indem man das Kalorimeter an ein Zündgerät anschließt, lädt und bei einer Spannung von 36 Volt zündet. Bei der Verbrennung wird Wärme frei. Diese kann mithilfe des Peltier- Elements aufgenommen und in eine Spannungsänderung umgewandelt werden, die wiederum von einem Schreiber aufgezeichnet wird. Zuerst wurde in unserem Versuch zweimal Benzoesäure verbrannt. Von dieser Substanz ist der Brennwert (6,32 kcal/g) bekannt, man kann sie also zur Eichung verwenden. Danach sollten noch weitere Messungen für Cellulose und Albumin folgen. Diese konnten allerdings aufgrund von Zeitmangel wegen eines Feueralarms nicht durchgeführt werden. 17 Versuch 2: Bestimmung des Proteingehaltes in Muskelfleisch und Fettgewebe vom Rind Zuerst wurden von getrocknetem Muskelfleisch und Fettgewebe jeweils zwei Proben mit einem Gewicht von ca. 0,5 g abgewogen, das genaue Gewicht wurde notiert. Das Gewebe wurde zerkleinert und mit 10 ml 2 N KOH vermischt. Anschließend kam es für eine Stunde in ein 90° heißes Wasserbad, die Reagenzgläser waren dabei mit Murmeln abgedeckt. Zum Schluss wurde die Lösung noch für 15 Minuten bei 3000 rpm zentrifugiert. Nun wurden die Ansätze hergestellt, wobei zu jeweils 2,0 ml Biuret-Reagenz 0,1 ml Überstand der zentrifugierten Lösungen und für den Leerwert 0,1 ml Wasser pipettiert wurden. Bis auf den Leerwert wurde alles doppelt bestimmt. Die Standard- Lösung musste nicht selbst hergestellt werden, die Werte waren gegeben. Nach einer Zeit von ca. 15 Minuten wurde die Extinktion der einzelnen Proben bei einer Wellenlänge von 546 nm gemessen. Prinzip war in diesem Versuch, die Reaktion von Proteinen mit dem Biuret-Reagenz (enthält Kupferionen und ist alkalisch) zu einem Biuret-Komplex der eine violette Färbung ausbildet. Versuch 3: Lipidbestimmung Für den Versuch Lipidbestimmung wurden zuerst je zwei Proben Muskelgewebe (0,5 g) und Fettgewebe (0,25 g) aus Rindfleisch entnommen, abgewogen und mit 20 ml Isopropanol vermischt und anschließend 30 Minuten zentrifugiert. Die photometrische Bestimmung des gelben Farbstoffes Diacetyldihydrolutidin, der aus Glycerin aus den tierischen Fetten entsteht, sollte Rückschluss auf den Fettgehalt in den einzelnen Proben geben. Folgende Reaktion findet statt: Triglyceride + KOH ---------------------------> Glycerin + Fettsäuren Glycerin + Perjodid ---------------------------> Formaldehyd Formaldehyd + NH4+ + Acetylaceton ----------> Diacetyldihydrolutidin Dazu wurden zuerst folgende Mengen an Isopropanol in Reagenzgläser pipettiert: In den Standard, die Fett- und Muskelprobe jeweils 2,4 ml und in den Leerwert 2,5 ml. Nach der Zugabe wurden die Proben auf dem Rüttler gemixt, anschließend mit je 0,5 ml KOH versehen, wieder gemischt und für ca. 5 min in ein 60 °C warmes Wasserbad gestellt. Glaskugeln auf den Öffnungen der Reagenzgläser sorgten dafür, dass die Verdunstung und 18 die Verschmutzungsgefahr gering blieben. Nach einer kurzen Abkühlzeit wurde jedem Reagenzglas im Abstand von einer Minute 0,5 ml Perjodidlösung zugeführt und dann genau 10 min bei Raumtemperatur stehen gelassen. Nach genau 10 min wurden jeweils 3 ml der Farbreagenz dazugegeben und alle Proben für 30 min in einem 60 °C heißen Wasserbad inkubiert. Zur Photometrie wurden alle Proben gleichmäßig zur Doppelbestimmung in Küvetten pipettiert und bei 410 nm photometriert. 3. Ergebnisse Versuch 1: Bombenkalorimetrie: Die Ergebnisse wurden anhand der vom Schreiber angefertigten Kurve (siehe Anhang) ermittelt. Hierbei wurden folgende Abkürzungen benutzt: a: Tangente an dem Vorlauf b: Tangente an dem Nachlauf M: maximaler Ausschlag; Maximum ∆A: graphisch ermittelter Wert der Probe Das Gewicht der beiden Proben Benzoesäure beträgt 0,40g und 0,53g. Mit der folgenden Formel kann mit diesen Angaben der Wert m ausgerechnet werden. m= [6,32cal/mg * ∆A * (Empfindlichkeit) / (Papierbreite)] / 6320cal/g * gTablette Die Empfindlichkeit beträgt 20mV und die Papierbreite 25cm. Die ∆A-Werte können der Tabelle 1 entnommen werden. Tab.1: Ergebnisse der Bombenkalorimetrie Probe Benzoesäure1 Benzoesäure2 Gewicht [g] 0,40 0,53 ∆A [cm] 15 12 19 Wert für m [mV/mg] 0,03 0,02 Versuch 2: Proteinbestimmung: In diesem Versuch sollte der Proteingehalt in Muskel- und Fettgewebe nachgewiesen werden. Dies wurde indirekt über die Extinktionsmessung mit dem Spektralphotometer durchgeführt. Hierbei wurden folgende Ergebnisse ermittelt: Tab.2: Ergebnisse der Photometrie für die Proteinbestimmung Muskelprobe 1 Muskelprobe 2 Fettprobe 1 Fettprobe 2 Proteinstandard Gewicht [g] 0,5 0,51 0,51 0,51 --- Extinktion E1 0,602 0,570 0,314 0,189 --- Extinktion E2 0,539 0,568 0,422 0,256 1,406 Mittelwert EM 0,5705 0,569 0,368 0,2225 --- Mit diesen Werten und der folgenden Formel lassen sich nun der Proteingehalt und der physikalische Brennwert errechnen: (EM * cStd * 10) / (EStd * gTGW) = mg / g TGW EM: Extinktion des Mittelwertes von E1 und E2 cStd: Konzentration der Proteinstandardlösung (80 mg/g) EStd: Extinktion der Proteinstandardlösung (1,406) gTGW: Trockengewicht der Probe Um den physikalischen Brennwert zu berechnen, multipliziert man den Proteingehalt noch mit dem Faktor 5,5. Beispielrechnung (Muskelprobe 1): (0,5705 *80 mg/ml *10) / (1,406 * 0,5g) = 649,21 mg/g TGW Brennwert: 649,21 mg/g * 5,5/1000 = 3,57 kcal/g 20 Tab.3: Ergebnisse der Proteinberechnungen Proteingehalt [mg/g TGW] 649,21 664,93 410,00 248,24 Muskelprobe 1 Muskelprobe 2 Fettprobe 1 Fettprobe 2 Brennwert [kcal/g] 3,57 3,66 2,26 1,37 Wie man an der Tabelle gut sehen kann, ist der Proteingehalt der beiden Muskelproben deutlich über dem der beiden Fettproben. Der Brennwert liegt bei der Muskelprobe im Durchschnitt bei 3,615 kcal/g und bei den Fettproben bei 1,815 kcal/g. Versuch 3: Lipidbestimmung: Im dritten Versuch sollte der Lipidgehalt in Muskel- und Fettproben mit Hilfe von Photometrie bestimmt werden. Hierzu wurden wie im Versuch 2 die Extinktionswerte ermittelt. Die Ergebnisse der Extinktion sind in folgender Tabelle wiedergegeben: Tab.4: Ergebnisse der Photometrie für die Lipidbestimmung Muskelprobe 1 Muskelprobe 2 Fettprobe 1 Fettprobe 2 Standard Gewicht [g] 0,52 0,52 0,26 0,24 --- Extinktion E1 0,177 0,143 0,490 0,276 0,471 Extinktion E2 0,184 0,140 0,485 0,276 0,479 Mittelwert EM 0,1805 0,1415 0,4875 0,276 0,475 Anhand dieser Werte kann nun mit folgender Formel sowohl Brennwert als auch Lipidgehalt berechnet werden: Lipidgehalt: (EM * cStd * 20 ( * 5 nur bei Fettgewebe notwendig)) / (EStd * gTGW) = mg/g TGW EM: Extinktion des Mittelwertes von E1 und E2 cStd: Konzentration der Proteinstandardlösung (80 mg/g) EStd: Extinktion der Proteinstandardlösung (1,406) gTGW: Trockengewicht der Probe Um den Brennwert zu berechnen, multipliziert man den Lipidgehalt mit dem Faktor 9: Beispielberechnung (Muskelprobe 1): 21 (0,1805 * 2,5 mg/ml * 20) / (0,475 * 0,52 g) = 36,54 mg/g TGW Brennwert: 36,54 mg/g * 9/1000 = 0,33 kcal/g Tab.5: Ergebnisse der Lipidberechnung Lipidgehalt [mg/g] 36,54 28,64 986,84 598,68 Muskelprobe 1 Muskelprobe 2 Fettprobe 1 Fettprobe 2 Brennwert kcal/g 0,33 0,26 8,88 5,39 Hier kann man sehen, dass der Lipidgehalt in den Muskelproben deutlich geringer ausfällt, als in den Fettproben. Der Brennwert der beiden Muskelproben liegt mit einem Durchschnittswert von 0,205 kcal/g weit unter dem der beiden Fettproben mit 7,135 kcal/g. 4. Diskussion Da der Versuch mit dem Bombenkalorimeter auf Grund von Zeitmangel und eines Feueralarms nicht ganz durchgeführt werden konnte, liegen nur die Messergebnisse der Eichsubstanz Benzoesäure vor. Im Ergebnisteil kann man in der Tabelle 1 erkennen, dass der m-Wert um den Faktor 10 zu klein ist. Der Grund dafür ist wohl in der fehlerhaften Waage zu finden. Außerdem waren die verwendeten Tabletten porös und konnten somit nicht vollständig in die Bombe gebracht werden. Auch können die ∆A-Werte ungenau sein, da sie, wie in Material und Methoden erklärt, mit der Hand ausgemessen wurden. Im zweiten Versuch weichen die Werte der Extinktionen trotz doppelter Doppelbestimmung mehr oder weniger stark voneinander ab. Bei der Muskelprobe 2 stehen die Extinktionswerte mit 0,570 und 0,568 mit einer Differenz von 0,002 sehr nah zusammen. Auch liegen die Werte für die Muskelprobe 1 sehr dicht an der Muskelprobe 2. Bei den beiden Fettproben ist der Abstand der Werte für die Extinktion allerdings recht hoch. Die Ursache dafür ist eventuell in verunreinigten Küvetten zu suchen. Der gemessene Proteingehalt und der Brennwert der beiden Muskelproben liegen deutlich über dem der beiden Fettproben. Das ist damit zu erklären, dass das Muskelgewebe zum Großteil aus Proteinen aufgebaut ist und das Fettgewebe fast ausschließlich aus Lipiden besteht. Allerdings können auch hier Messfehler vorliegen, da wie in Versuch 1 eine 22 fehlerhafte Waage benutzt wurde und menschliche Messungenauigkeiten beim Pipettieren und Abwiegen auftreten konnten. Dies gilt auch für den dritten Versuch, in dem der Lipidgehalt untersucht werden sollte. Die Ergebnisse hier sind wohl am repräsentativsten, weil innerhalb der Extinktionswerte keine großen Schwankungen zu beobachten sind und auch die daraus ermittelten Lipidgehalte und Brennwerte mit Ausnahme der Fettprobe 2 mit 598,68mg/g und 5,39kcal/g sehr gut mit Literaturwerten übereinstimmen. Im Fettgewebe ist selbstverständlich ein höherer Fettgehalt vorhanden als im Muskelgewebe. Hier sind es im Durschnitt 792,76mg/g (Fettgewebe) zu 32,59mg/g (Muskelgewebe). Desweiteren liegt im Vergleich der Versuche 2 und 3 der höchste Brennwert bei den Lipiden mit 986,84kcal/g deutlich über dem höchsten gemessenen Brennwert der Proteine mit 3,66kcal/g. Dies liegt wohl daran, dass Lipide bezogen auf ihren Massenanteil einen viel höheren Energiewert besitzen. 5. Literaturverzeichnis - Eckert, Roger: Tierphysiologie; 2. Auflage, 1993, Thieme - Campell/ Reece: Biologie, 6. Auflage, 2006, Pearson - Penzlin, Heinz: Lehrbuch der Tierphysiologie; 6. Auflage, 1996, Gustav Fischer - Wehner/ Gering: Zoologie, 24. Auflage, 2007, Thieme - H. Hart, L.E. Craine, D.J. Hart: Organische Chemie, 2. Auflage, 2002, Wiley-VCH 23
