Einfluss von Serotonin auf dendritische Zellen, auf die DC-T
Werbung
Aus der Medizinischen Universitätsklinik Abteilung für Pneumologie der Albert-Ludwigs-Universität Freiburg im Breisgau Einfluss von Serotonin auf dendritische Zellen, auf die DC-T-Zell-Interaktion und auf das T-Zell Priming von dendritischen Zellen 5-Hydroxytryptamin moduliert die Expression von 5-HT-Rezeptoren auf dendritischen Zellen und reguliert die Zytokinsekretion der DC-T-Zell-Interaktion Inaugural-Dissertation Zur Erlangung des Medizinischen Doktorgrades der Medizinischen Fakultät der Albert-Ludwigs-Universität Freiburg im Breisgau Vorgelegt 2010 von Nadine Helene Mark geboren in Villingen-Schwenningen 1 Dekan: Prof. Dr. Dr. h. c. mult. Hubert Blum 1. Gutachter: PD Dr. Marco Idzko 2. Gutachter: Prof. Dr. Tobias Huber Jahr der Promotion 2011 2 Inhaltsverzeichnis Inhaltsverzeichnis 3 Abkürzungsverzeichnis 5 1 Einleitung 7 1.1 Allergisches Asthma bronchiale 7 1.2 Dendritische Zellen 7 1.2.1 Entwicklung, Differenzierung, Antigenaufnahme, DC-T-Zell-Interaktion 8 1.2.2 Die Rolle von dendritischen Zellen beim allergischen Asthma 9 bronchiale 1.3 DC-T-Zell-Interaktion 10 1.3.1 Polarisierung der spezifischen Immunantwort 10 1.3.2 Immunologische Synapse 11 1.3.3 Die Rolle von Lymphozyten beim allergischen Asthma bronchiale 12 1.4 Zytokine 13 1.4.1 Interferon-γ 13 1.4.2 Interleukin-5 14 1.4.3 Interleukin-13 15 1.5 Serotonin 15 1.5.1 Geschichte 16 1.5.2 Vorkommen 16 1.5.3 Rezeptoren 17 1.5.4 Der Einfluss von Serotonin im Immunsystem 19 1.5.5 Die Bedeutung von Serotonin für dendritische Zellen 20 1.5.6 Die Rolle von Serotonin beim allergischen Asthma bronchiale 21 2 Zielsetzungen 22 3 Material und Methoden 23 3.1 Material 23 3.1.1 Geräte und Arbeitsmaterialien 23 3.1.2 Chemikalien und Biochemikalien 25 3.1.3 Antikörper 27 3.1.4 Puffer und Lösungen 27 3.1.5 DNA-Marker für PCR 29 3 3.2 Methoden 30 3.2.1 Co-Kultur: DC / CD4+CD45RA+-Zellen 30 3.2.2 Gewinnung von Überständen für ELISA 34 3.2.3 Messung von Zytokinen per ELISA von R & D 35 3.2.4 Isolation von RNA 36 3.2.5 Reverse Transkription 37 3.2.6 Polymerasekettenreaktion (PCR) 37 3.2.7 Gelelektrophorese 39 3.2.8 Statistik 39 4 Ergebnisse 40 4.1 Expression von 5-HT-Rezeptoren durch dendritische Zellen 40 4.2 Messungen der Zytokinsekretion von INF-γ, IL-5 und IL13 und mittels ELISA 42 5 Diskussion 44 5.1 Expression von 5-HT-Rezeptoren durch dendritische Zellen 45 5.2 Einfluss von Serotonin auf die Zytokinsekretion bei der DC-T-Zell-Interaktion 47 5.2.1 Modulation der INF-γ-, IL-5- und IL-13-Sekretion 5.3 Bedeutungen der Ergebnisse im Kontext der asthmatischen 47 50 Entzündungsreaktion 6 Zusammenfassung 54 7 Literaturverzeichnis 55 8 Danksagung 70 9 Lebenslauf 71 4 Abkürzungsverzeichnis Ach Acetylcholin AK Antikörper ATP Adenosin-5´-triphosphat BAL bronchoalveoläre Lavage bp Basenpaar BSA bovines Serumalbumin cAMP zyklisches Adenosin-5´-3´-monophosphat cDNA komplementäre Desoxyribonukleinsäure CD Cluster of differentiation (Einteilung der Oberflächenmoleküle) Da Dalton DC dendritische Zelle DNA Desoxyribonukleinsäure DOI DOI-hydrochloride EDG endothelial differentiation gene EDTA Ethylendiaminotetraessigsäure ELISA Enzyme Linked Immunosorbent Assay FCS Fetales Kälberserum (fetal calf serum) FEV1 Atemvolumen, das in einer Sekunde bei maximal forcierter Ausatmung ausgeatmet werden kann GM-CSF Granulozyten/Makrophagen-Kolonie-stimulierender Faktor („granulocyte macrophage colony stimulating factor”) G-Protein Guaninnukleotid-bindendes Protein 8-HDPAT 8-Hydroxy-2-dipropylaminotetralinhydrobromid HR1-3 Histamin-Rezeptor 1-3 5-HT 5-Hydroxytriptamin, Serotonin 5-HTR 5-Hydroxytriptamin-Rezeptor, Serotonin-Rezeptor 5-HTT 5-Hydroxytryptamin-Transporter, Serotonin-Transporter Ig Immunglobulin IL Interleukin INF Interferon 5 LPS Lipopolysaccharide M Molar MAPK mitogen-activated protein kinase 2Me5HT Methylserotonin MHC major histocompatibility complex 2-MHT 5-Methoxytryptamin mRNA messenger Ribonukleinsäure NK-Zellen natürliche Killerzellen PAF Thrombozyten-aktivierender Faktor (platelet activating factor) PBS Phosphat gepufferte Salzlösung (phosphat buffered saline) PCPA Parachlorophenylalanin PCR Polymerasekettenreaktion PGE2 Prostaglandin E2 PHA Phythämaglutinin PMA 4-Methoxyamphetamin P-Rezeptor Purin-Rezeptor RANTES regulated upon activation, normal T-cell expressed and secreted chemokine RNA Ribonukleinsäure RT Reverse Transkriptase S1P Sphingosin 1-Phospat TCR T-Zell-Rezeptor Th T-Helferzellen TMB Tetramethylbenzidine TNF-α Tumornekrosefaktor-α TPH Tryptophanhydroxylase ZNS Zentrales Nervensystem Selten verwendete Abkürzungen werden an den betreffenden Textstellen erläutert. 6 1 Einleitung 1.1 Allergisches Asthma bronchiale Allergisches Asthma bronchiale ist eine chronisch rezidivierende, entzündliche Erkrankung der Atemwege, dessen akute Symptomatik durch Exposition mit verschiedenen Umweltallergenen hervorgerufen werden kann. Ein Asthmaanfall ist klinisch gekennzeichnet durch Dyspnoe unterschiedlichen Schweregrades, Keuchen, Brustenge und Husten. Die Pathophysiologie des allergischen Asthmas bronchiale beinhaltet bronchiale Hyperreagibilität, Schleimhauthypertrophie und Bronchospasmen. Asthma bronchiale gehört zu der Gruppe der obstruktiven Ventilationsstörungen (Busse and Lemanske 2001). Die Prävalenz von Asthma in Mitteleuropa beträgt 5 - 10 % und die Mortalitätsrate ist steigend. Es ist ein Beispiel für eine Th2-spezifische Immunantwort, welche durch Atemwegsinfiltration mit eosinophilen Granulozyten, erhöhte Schleimproduktion der Becherzellen, Umbau von Gewebsstrukturen der Atemwegswand charakterisiert ist (Lipscomb and Masten 2002). Mehrere Arbeiten weisen darauf hin, dass die Interaktion von pulmonalen dendritischen Zellen mit naiven T-Zellen, Mastzellen und eosinophilen Granulozyten eine entscheidende Bedeutung in der Entwicklung des allergischen Asthmas bronchiale hat (Busse and Lemanske 2001; Lambrecht 2001; Brightling, Bradding et al. 2002). Jedoch sind deren genauen Aktivierungsmuster und deren gegenseitige Beeinflussung noch nicht vollkommen erforscht. 1.2 Dendritische Zellen Diese Zellgruppe wurde erstmals von Ralph Steinmann in den 70iger Jahren beschrieben (Steinman and Cohn 1973; Steinman, Lustig et al. 1974; Steinman, Adams et al. 1975). Er nahm an, dass diese vom Knochenmark abstammenden Zellen in allen lymphatischen und in vielen anderen Geweben existieren. Schon damals bezeichnete er diese als eine der 7 wichtigsten antigenpräsentierende Zelle (Steinman and Cohn 1973; Steinman, Lustig et al. 1974; Steinman, Adams et al. 1975). Nach heutigem Wissensstand gelten dendritsche Zellen als die potentesten antigenpräsentierenden Zellen. Sie besitzen sowohl die Fähigkeit eine unspezifische als auch eine spezifische Immunantwort in vivo auszulösen, als auch diese zu hemmen (Banchereau, Briere et al. 2000; Lambrecht 2001; Lipscomb and Masten 2002). 1.2.1 Entwicklung, Differenzierung, Antigenaufnahme, DC-T-Zell-Interaktion Die heterogene Gruppe der dendritischen Zellen unterscheidet sich in der anatomischen Lokalisation, der Expression von Oberflächenmolekülen und deren Funktion. Jedoch haben sie auch Gemeinsamkeiten (Hart 1997; Banchereau and Steinman 1998). Dendritische Vorläuferzellen stammen von pluripotenten CD34+ hämatopoetischen Stammzellen aus dem Knochenmark ab. Unter dem Einfluss von verschiedenen Zytokinen entwickeln sich aus dendritischen Vorläuferzellen unterschiedliche unreife Subtypen. Diese werden über das Blut zu verschiedenen Organen transportiert, in denen sie sich als unreife dendritische Zellen ansiedeln. In diesem Stadium besitzen sie die Fähigkeit in entzündetes Gewebe zu migrieren und potentielle Antigene aufzunehmen. Die Aufnahme eines Antigens über Phagozytose, Makropinozytose und Endozytose führt zur Ausreifung von dendritischen Zellen. Diese wandern nun über Lymphbahnen zu benachbarten Lymphknoten, um dort mit naiven T-Zellen zu interagieren (Hart 1997; Banchereau and Steinman 1998). Dendritische Zellen haben im reifen und unreifen Stadium verschiedene Eigenschaften. Reifung von dendritischen Zellen bedeutet den Wechsel von einer antigenaufnehmenden zu einer antigenpräsentierenden Zelle. Beide produzieren Chemokine, Zytokine und exprimieren Oberflächenmoleküle. Exposition mit Allergenen, Bakterien, Viren, proinflammatorischen Zytokinen (IL-1β, TNF-α, INF-α, GM-CSF) und angeborene T-ZellInteraktionen, um nur einige aufzuzählen, sind Stimuli, die eine Differenzierung von dendritischen Zellen auslösen können (Banchereau and Steinman 1998; Bell, Young et al. 1999). Reife myeloide dendritische Zellen verlieren ihre Fähigkeit zu Phagozytieren. Sie produzieren eine Vielzahl von pro- und anti-inflammatorischen Zytokinen wie IL-1β, TNF-α, IL-10, IL-12 und IL-6 (Banchereau and Steinman 1998; Dichmann, Rheinen et al. 2000; Cravens and Lipsky 2002; Lipscomb and Masten 2002; Cooper, Fehniger et al. 2004). Außerdem kommt es zu einer gesteigerten Expression von kostimulatorischen 8 Oberflächenmolekülen wie beispielsweise CD40, CD54, CD80, CD86 und von MHCKlasse II-Molekülen, wobei andere Oberflächenmoleküle, z. B. CD1a, weniger ausgebildet werden (Banchereau and Steinman 1998; Lipscomb and Masten 2002). Des Weiteren unterscheiden sich unreife und reife dendritische Zellen bezüglich ihres Migrationsverhaltens, welches auf ungleiche Expression und / oder Signaltransduktion von verschiedenen Rezeptoren beruht (Dieu, Vanbervliet et al. 1998; Dichmann, Rheinen et al. 2000; Idzko, Panther et al. 2004; Idzko, Panther et al. 2004). 1.2.2 Die Rolle von dendritische Zellen bei allergischem Asthma bronchiale Die Anzahl von dendritischen Zellen ist in der Atemwegsschleimhaut von Personen, die an Asthma bronchiale leiden, im Vergleich zu Gesunden erhöht (Bellini, Vittori et al. 1993; Moller, Overbeek et al. 1996). Sie sind die einzigen Zellen im Atemwegsepithel, die MHC Klasse II-Moleküle exprimieren. Dadurch spielen sie eine wichtige Rolle bei der primären Sensibilisierung gegenüber Aerosol-Allergenen (Schon-Hegrad, Oliver et al. 1991; Lambrecht, Salomon et al. 1998; Akbari, DeKruyff et al. 2001). In einem Mausmodell für allergisches Asthma bronchiale entwickelten sich durch die intratracheale Immunisierung mit Ovalbumin-beladenen dendritischen Zellen Th2-Effektor-Zellen. Nach wiederholter inhalativer Ovalbumin-Provokation kontrollierten diese Th2-Effektor-Zellen, die Atemwegsinfiltration mit eosinophilen Granulozyten, die Atemwegsentzündung, die Becherzellhyperplasie sowie die bronchiale Hyperreagibilität (Lambrecht, De Veerman et al. 2000; Sung, Rose et al. 2001). In einem anderen Mausmodell wurden CD11cDiphterie-Toxin-Rezeptor transgene Mäuse verwendet. Diesen wurde lokal Diphterie-Toxin appliziert, welches selektiv nur dendritische Zellen aus der Lunge entfernt. Dadurch konnte eine deutliche Abnahme von eosinophilen Granulozyten in den Atemwegen, der Hyperplasie der Becherzellen und der Metacholin-induzierten bronchialen Hyperreagibilität sowie eine Reduktion der Th2-Effektorzellen ausgelöst werden (Lambrecht and Hammad 2003). Ebenso zeigte sich in anderen Arbeiten, dass durch Beeinflussung der dendritischen Zellen mit verschiedenen Substanzen wie beispielsweise FTY720 (Sphingosin 1-Phosphat-Rezeptor-Agonist), Iloprost (Prostacyclin2-Anologon) die Entstehung von experimentell induziertem Asthma bronchiale verhindert werden konnte (Idzko, Hammad et al. 2006). Die Hauptsymptome von Asthma bronchiale konnten durch Senkung der extrazellulären ATP-Konzentration abgeschwächt werden. Dies kann durch die Gabe von Apyrase, welches lokal ATP hydrolysiert, erreicht werden oder durch die 9 Applikation von P2-Rezeptor-Antagonisten. ATP führte unter anderem zu einer verstärkten Aktivierung von dendritischen Zellen (Idzko, Hammad et al. 2007). Auch Histamin reguliert die Funktionen von dendritischen Zellen. Die gesteigerte Sekretion von Histamin im entzündeten Gewebe führte letztendlich zu einer Th2-polarisierenden Immunantwort (Idzko, la Sala et al. 2002; Idzko, Hammad et al. 2006). 1.3 DC-T-Zell-Interaktion Wie oben beschrieben, wandern dendritische Zellen nach Antigenaufnahme über Lymphbahnen zu benachbarten Lymphknoten, um dort mit naiven T-Zellen zu interagieren. Dies führt zu einer Weiterreifung bzw. terminalen Differenzierung humaner dendritischer Zellen, die letztendlich in Apoptose endet (Hart 1997; Lipscomb and Masten 2002). Bestandteile des internalisierten Antigens werden naiven T-Zellen über MHC-Moleküle (MHC = major histocompatibility complex), welche sich auf der Oberfläche von dendritischen Zellen befinden, präsentiert (Pfeifer, Wick et al. 1993; Reis e Sousa and Germain 1995; Banchereau and Steinman 1998; Lipscomb and Masten 2002). Naive TZellen erkennen das über MHC-Moleküle präsentierte Antigen über einen spezifischen TZell-Rezeptor (TCR) und bilden einen Cluster mit dendritischen Zellen (Starling, McLellan et al. 1995; McLellan, Sorg et al. 1997; Banchereau and Steinman 1998). Dieser wird durch diverse Oberflächenmoleküle stabilisiert wie beispielsweise CD11a / CD54 (Prickett, McKenzie et al. 1992; Hart and Prickett 1993; Starling, McLellan et al. 1995). Durch die Interaktion mit verschiedenen kostimulatorischen Oberflächenmolekülen von dendritischen und von naiven T-Zellen, werden in T-Zellen Signale weitergeleitet, die die Stimulation von T-Zellen regulieren. Dies kann zur Aktivierung mit Zytokinproduktion und Proliferation, zur Toleranz, zur Anergie oder zur Apoptose von naiven T-Zellen führen (Guermonprez, Valladeau et al. 2002; Sharpe and Freeman 2002). Umgekehrt steuern die Signale über kostimulatorischen Moleküle in dendritischen Zellen die Zytokinproduktion, das Ausreifen und das Überleben (Hart 1997; Lipscomb and Masten 2002). 10 1.3.1 Polarisierung der spezifischen Immunantwort Viele Faktoren bestimmen die Polarisierung von naiven T-Zellen zu Th1- oder Th2-Zellen (Macatonia, Hosken et al. 1995; Trinchieri and Scott 1995; Cella, Scheidegger et al. 1996; De Smedt, Van Mechelen et al. 1997). Zusätzlich zur Art und Dosis des Antigens, der Art und Weise der Exposition und des genetischen Hintergrundes des Gastes sind die wichtigsten Faktoren: (1) der Subtyp von dendritischen Zellen, der mit T-Zellen interagiert (Shortman and Liu 2002), (2) die Gruppe der kostimulatorischen Moleküle auf der Oberfläche von dendritischen Zellen (Kuchroo, Das et al. 1995; Haczku, Takeda et al. 1999; Jaffar, Roberts et al. 1999), (3) die Dauer der Interaktion vom Zytokin / Mediatormilieu und der Antigendosis, denen dendritische Zellen vorm Einwandern in die Lymphknoten ausgesetzt waren (Patterson 2000; Vieira, de Jong et al. 2000) sowie (4) die Dauer der DC-T-Zell-Interaktion (Lanzavecchia, Lezzi et al. 1999; Lanzavecchia and Sallusto 2000). Zytokine, welche sich in der Umgebung von dendritischen Zellen und von T-Zellen befinden, können auch die Polarisierung der spezifischen Immunantwort beeinflussen. Prostaglandin E2 (PGE2) ist ein wichtiger Entzündungsmediator und führt zu einer Th2Differenzierung, in dem es beispielsweise die Produktion von IL-2 und INF-γ durch Th1Zellen inhibiert, aber nicht die Produktion von IL-4 durch Th2-Zellen (Davies, Bailey et al. 1984; Betz and Fox 1991; Snijdewint, Kalinski et al. 1993). Werden dendritischen Zellen in der Peripherie hohen Dosen von Lipopolysacchariden (LPS), ein Zellwandbestandteil gram-negativer Bakterien, ausgesetzt, ist die Produktion von IL-12 gesteigert. Dies führt zu einer Differenzierung der spezifischen Immunantwort in Richtung Th1 (Lipscomb and Masten 2002; Eisenbarth, Piggott et al. 2003). Wobei die IL-12-Produktion effektiv durch PGE2 gehemmt werden kann (van der Pouw Kraan, Boeije et al. 1995). 1.3.2 Immunologische Synapse Die Verbindungen von Oberflächenmolekülen werden auch als „immunologische Synapse“ bezeichnet. Von dieser hängt die Bindungsfähigkeit des T-Zell-Rezeptors (TCR) ab, welche wichtig ist für eine produktive T-Zell-Proliferation (Valitutti, Dessing et al. 1995; Iezzi, Karjalainen et al. 1998; Grakoui, Bromley et al. 1999). Der spezielle Kontakt zwischen der T-Zell-Oberfläche und der Oberfläche von antigenpräsentierenden Zellen ist charakterisiert durch die Akkumulation von F-Aktin und anderen Zytoskelettanteilen von 11 naiven T-Zellen (Kupfer and Singer 1989; Pardi, Inverardi et al. 1992). Diese Akkumulation führt zu einer dynamischen Verbindung der Signalmoleküle an der Kontaktfläche beider Zellen. Nicht nur das Zytoskelett von naiven T-Zellen ist aktiv an der Bildung der immunologischen Synapse beteiligt, sondern auch das von dendritischen Zellen (Al-Alwan, Liwski et al. 2003). Diese dynamische Interaktion ist ebenfalls wichtig für die Aktivierung verschiedener anderer Moleküle, z. B. CD11a (Rothlein and Springer 1986). 1.3.3 Die Rolle von Lymphozyten beim allergischen Asthma bronchiale Antigen-Präsentation durch B-Lymphozyten und direkter Kontakt dieser Zellen zu CD4+ TZellen sind essentiell für die Produktion von IgE, wobei noch weitere Co-Faktoren benötigt werden. Auch die Sekretion von IL-2, IL-5, IL-6, IL-9, IL-13 und INF-γ von T-Zellen reguliert die Bildung von IgE. Es wird angenommen, dass T-Zellen und ihre Zytokine die charakteristische Pathophysiologie der allergisch bedingten Entzündung vermitteln können (McFadden and Gilbert 1992; Kay 2001; Kay 2001; Ying, Zhang et al. 2006). In einem Mausmodell konnte gezeigt werden, dass die durch Antigen-induzierte Infiltration mit eosinophilen Granulozyten in der Trachealschleimhaut mit Hilfe von CD4+ T-Zellen und IL5 vermittelt wird. INF-γ dagegen verhindert eine Einwanderung von eosinophilen Granulozyten und hemmt die Migration von CD4+ T-Zell in die Trachea ausgelöst durch Antigenkontakt (Nakajima, Iwamoto et al. 1992; Iwamoto, Nakajima et al. 1993). Außerdem wird ein Ungleichgewicht zwischen Th1- und Th2-Zellen zu Gunsten von Th2Zellen bei Asthmatikern vermutet. Dies führt zu einer Polarisierung der spezifischen Immunantwort in Richtung Th2. Für die Entstehung dieses Ungleichgewichts gibt es verschiedene Theorien (Busse and Lemanske 2001). Von einer wiederholten Stimulation der Th2-Zellen wird bei der Exazerbation von akuten Asthmaepisoden ausgegangen. Dies führt zu einem Verlängern des Status der chronischen Entzündung, welcher zum Umbau der Atemwege und der Atemwegshyperreagibilität beiträgt (Lipscomb and Masten 2002). 12 1.4 Zytokine Zytokine wirken im Körper als Mediatoren der Entzündungsantwort und des Immunsystems. Sie sind kleine Proteine (< 80 kDa), die von verschiedenen Zellen auf Grund eines aktivierenden Stimulus gebildet und freigesetzt werden. Durch Bindung an spezifische Rezeptoren können sie bestimmte Reaktionen auslösen, wobei sie autokrin, parakrin oder endokrin wirken (Balkwill and Burke 1989). Zytokine lösen bei vielen verschiedenen Zelltypen Reaktionen aus. Diese Eigenschaft nennt man Pleiotropismus. Zytokine werden auch als Interleukine bezeichnet, wobei dies auf der anfänglichen Meinung beruhte, dass Zytokine hauptsächlich von Leukozyten gebildet werden. 1.4.1 Interferon-γ Interferon-γ (INF-γ) gehört zusammen mit IL-2, IL-12, und IL-18 zur Gruppe der Th1Zytokine (Kips 2001). Es hat einen hemmenden Effekt auf die Entstehung einer Th2Antwort (Geha 1992). T-Zellen, B-Zellen, NK-Zellen, Makrophagen und dendritische Zellen können INF-γ produzieren (Okamura, Tsutsi et al. 1995; Puddu, Fantuzzi et al. 1997; Yoshimoto, Okamura et al. 1997; Andersson, Dai et al. 1998; Munder, Mallo et al. 1998; Ohteki, Fukao et al. 1999). Die INF-γ-Produktion kann durch IL-12 induziert werden (Puddu, Fantuzzi et al. 1997; Munder, Mallo et al. 1998; Ohteki, Fukao et al. 1999). IL-4 und IL-18 haben zusammen mit IL-12 einen synergistischen Effekt auf die INF-γProduktion von dendritischen Zellen (Fukao, Matsuda et al. 2000). p 38 MAPK (mitogenactivated protein kinase) ist beteiligt an der Regulation der Produktion von vielen Zytokinen wie auch bei INF-γ. Sie wird durch verschiedene Stimuli wie z.B. proinflammatorische Zytokine, LPS und Stress (Hitze, UV-Strahlung) aktiviert (Freshney, Rawlinson et al. 1994; Han, Lee et al. 1994; Rouse, Cohen et al. 1994; Raingeaud, Gupta et al. 1995). INF-γ besitzt einen Einfluss auf die Entstehung von Asthma bronchiale (Kips 2001). In verschiedenen Arbeiten konnte nachgewiesen werden, dass INF-γ die Entwicklung einer Antigen-induzierten Eosinophilie in den Atemwegen und eine Hyperreaktivität der Atemwege verhindert (Iwamoto, Nakajima et al. 1993; Kohen, Metcalf et al. 1996; Lack, Bradley et al. 1996). Zusammen mit Th1-Zellen hemmt es die Schleimproduktion (Cohn, 13 Homer et al. 1999). Ähnlich wie bei INF-γR-/- Mäusen, die eine verlängerte Atemwegsinfiltration mit eosinophilen Granulozyten zeigten (Coyle, Tsuyuki et al. 1996). Eine Behandlung mit vernebeltem INF-γ hatte jedoch keinen Einfluss auf die FEV1 bei mildem Asthma bronchiale (Boguniewicz, Martin et al. 1995). Auch die subcutane Applikation von INF-γ zeigte keinen Effekt bei steroid-abhängigem Asthma bronchiale (Boguniewicz, Schneider et al. 1993). 1.4.2 Interleukin-5 Interleukin-5 (IL-5) gehört zusammen mit IL-4 und IL-13 zu der Gruppe der Th2-Zytokine (Kips 2001). Es ist ein Glykoprotein und wird von T-Zellen, Mastzellen und eosinophilen Granulozyten produziert und freigesetzt (Karlen, De Boer et al. 1998). Bei eosinophilen Granulozyten veranlasst es die Differenzierung, Proliferation, Chemotaxis und den Übergang in einen aktivierten Phänotyp (Lopez, Sanderson et al. 1988; Owen, Rothenberg et al. 1989; Karlen, De Boer et al. 1998; O'Connell, Wang et al. 2006). Es spielt eine wichtige Rolle bei der Induktion der Eosinophilie bei allergisch bedingten Entzündungen, Asthma bronchiale, Viruserkrankungen und Wurminfektionen (Coffman, Seymour et al. 1989; Limaye, Abrams et al. 1990; Coeffier, Joseph et al. 1994; Coyle, Erard et al. 1995; Faccioli, Vargaftig et al. 1997; Gounni, Lamkhioued et al. 2001). Eine Behandlung mit einem Antikörper gegen IL-5 hemmt die Entwicklung einer Eosinophilie im Blut und im Gewebe (Coffman, Seymour et al. 1989; Eum, Haile et al. 1995; Faccioli, Vargaftig et al. 1997). IL-5-mRNA ist erhöht in der Atemwegsschleimhaut von Asthmatikern. Es wurde gezeigt, dass ein Zusammenhang zwischen der Expression von IL-5-mRNA und dem Auftreten von klinischen Symptomen bei Asthma bronchiale besteht (Yasruel, Humbert et al. 1997). In verschieden Mausmodellen konnte beobachtet werden, dass IL-5 zur Eosinophilie in den Atemwegen führt und eine Zunahme der Atemwegsreagibilität zur Folge hat (Foster, Hogan et al. 1996; Hogan, Koskinen et al. 1998). IL-5 ist entscheidend in der Induktion der Infiltration der Atemwege mit eosinophilen Granulozyten. Jedoch ist die Modulation der Atemwegsreaktionen unabhängig von IL-5 und der eosinophilen Granulozyten in den Atemwegen (Corry, Folkesson et al. 1996; Lefort, Bachelet et al. 1996; Coyle, Kohler et al. 1998; Hogan, Matthaei et al. 1998). 14 1.4.3 Interleukin-13 Interleukin-13 (IL-13) ist eine pleiotropes Th2-Zytokin mit einem Molekulargewicht von 12.000 Da, welches Ähnlichkeiten zu IL-4 aufweist (Minty, Chalon et al. 1993; Zurawski and de Vries 1994; de Vries 1996). Der IL-13-Rezeptor wird aus den Subunits IL-13Rα1 und dem IL-4Rα gebildet (auch bekannt als IL-4 Typ II Rezeptor). Es wird von T-Zellen, dendritischen Zellen, Mastzellen, eosinophilen und basophilen Granulozyten produziert (Kips 2001; Hershey 2003). IL-13 reduziert die Bildung von pro-inflammatorischen Zytokinen wie beispielsweise TNF-α und IL-1β, von Chemokinen (RANTES) und IL-12 (Kips 2001). Die IL-13-Konzentration ist erhöht in der bronchoalveolären Lavage von Asthmatikern (Larche, Robinson et al. 2003). IL-13 induziert zusammen mit IL-4 eine vermehrte Schleimsekretion und einen Umbau der Gewebsstrukturen der Atemwegswand (Kopf, Le Gros et al. 1993; Grunig, Warnock et al. 1998; Wills-Karp, Luyimbazi et al. 1998; Dabbagh, Takeyama et al. 1999; Zhu, Homer et al. 1999). STAT-6, ein Zytokin-abhängiger Transkriptionsfaktor, wird durch IL-13 und IL-4 induziert (Nelms, Keegan et al. 1999; Naughton, Mulrooney et al. 2000). Seine Aktivierung führt zu einer Entwicklung der spezifischen Immunantwort in Richtung Th2 (Shimoda, van Deursen et al. 1996; Moriggl, Kristofic et al. 1998; Kurata, Lee et al. 1999; Christodoulopoulos, Cameron et al. 2001). Er wird im bronchialen Gewebe exprimiert und seine Konzentration ist erhöht bei starkem Asthma bronchiale (Mullings, Wilson et al. 2001). In einer Arbeit mit dendritischen Zellen konnte gezeigt werden, dass diese Zellen nach Allergenstimulation IL-13 produzieren. Dieses IL-13 führt bei der DC-T-Zell-Interaktion zu einer Polarisierung der Immunantwort in Richtung Th2, wobei STAT-6 involviert ist (Bellinghausen, Brand et al. 2003). In einer anderen Untersuchung konnte beobachtet werden, dass IL-13 zusammen mit INF-γ die Migration von dendritischen Zellen in der Lunge reguliert (Hwang, Yen et al. 2003). 1.5 Serotonin Serotonin (5-Hydroxytryptamin; 5-HT) spielt nicht nur eine wichtige Rolle als Neurotransmitter und vasoaktives Amin, sondern auch als Modulator des Immunsystems. 15 In peripheren Organen wird Serotonin von Mastzellen, basophilen Granulozyten, Thrombozyten und enterochromafinen Zellen produziert und sezerniert. Erhöhte extrazelluläre Konzentrationen von Serotonin wurden während Entzündungsprozessen und Thrombozytenaktivierung beobachtet (Segal, Taurog et al. 1977; Jankovic 1989; Matsuda, Ushio et al. 1997). 1.5.1 Geschichte Serotonin wurde erstmals von Vialle und Erspamer 1933 erwähnt, wobei sie es als Enteramin bezeichneten, wegen seines vermeintlichen Ursprungs aus enterochromafinen Zellen (Erspamer and Asero 1952). 1948 isolierten Rapport, Green und Page diese Substanz als Serumbestandteil, der tonisierend auf glatte Muskulatur wirkte und bezeichneten ihn als 5-Hydroxytryptamin (Mossner and Lesch 1998). Der Ausgangsstoff für die Synthese von Serotonin ist die Aminosäure Tryptophan. Im ersten Reaktionsschritt hydroxyliert die zytoplasmatische Tryptophanhydroxylase Tryptophan zu 5- Hydroxytryptophan. Da Tryptophan eine essentielle Aminosäure ist, begrenzt deren Verfügbarkeit die Synthesegeschwindigkeit. Im zweiten Reaktionsschritt decarboxyliert die Aromatische-L-Aminosäure-Decarboxylase 5-Hydroxytryptophan zu Serotonin. Daraufhin erfolgt die Aufnahme von Serotonin in Vesikeln mit Hilfe des reserpinempfindlichen Carriers und dessen Speicherung. Durch verschiedene Stimuli kann Serotonin bei Bedarf freigesetzt werden. Der Abbau erfolgt über die Monoaminoxidasen MAO-A und MAO-B zu 5-Hydroxyindolacetaldehyd, welches weiter oxidiert wird zu 5-Hydroxyindolessigsäure. 1.5.2 Vorkommen Im Zentralnervensystem (ZNS) ist Serotonin der am weitesten verbreitete Neurotransmitter (Lovenberg, Baron et al. 1993; Mossner and Lesch 1998). Die zentralen SerotoninNeurone sollen zur Regulation vieler physiologischer Funktionen beitragen wie SchlafWach-Rhythmus, Nahrungsaufnahme, Körpertemperatur, Stimmung und Schmerzwahrnehmung. Eine Fehlregulation wird seit langem beim Krankheitsbild der Depression diskutiert (Barnes and Sharp 1999). Außerhalb des ZNS befindet sich Serotonin in Thrombozyten, Lymphozyten, Makrophagen, Mastzellen, pulmonalen endokrinen Zellen, enterochromafinen Zellen des 16 Magens und in einigen anderen Zellen. Es wird angenommen, dass das Gehirn und enterochromafine Zellen die Hauptproduzenten von Serotonin sind. Außerdem, dass das von enterochromafinen Zellen sezernierte Serotonin durch andere Zellformen aufgenommen und gespeichert werden kann, vor allem von Thrombozyten und Mastzellen (Mossner and Lesch 1998). Deswegen können Thrombozyten und Mastzellen auch als mobile und stationäre Speicherzellen für Serotonin betrachtet werden. Serotonin wird bei Verletzung und Entzündung durch verschiedene Stimuli wie beispielsweise IgE-Komplexe, Komplementfaktoren und Plättchen-aktivierenden Faktor wieder freigesetzt (Matsuda, Ushio et al. 1997; Gordon and Barnes 2003). Die physiologische basale extrazelluläre Konzentration von Serotonin in verschiedenen Geweben ist niedriger als 100 nM, während sie unter pathologischen Bedingungen wie Entzündung, Ischämie oder Thrombose bis auf 3 µM steigen kann (Mossner and Lesch 1998). 1.5.3 Rezeptoren Die verschiedenen Serotoninrezeptoren (5-HTR) spiegeln die Vielfältigkeit der komplexen pharmakologischen Reaktionen im Körper wieder (Hoyer, Clarke et al. 1994; Hoyer and Martin 1997; Hoyer, Hannon et al. 2002). Bisher wurden 14 unterschiedliche Serotoninrezeptoren beschrieben, die man aufgrund ihres strukturellen und funktionellen Charakters in sieben Klassen (5-HTR1-7) einteilt. Der 5-HT3-Rezeptor stellt als einziger der 5-HTR einen ionotropen Rezeptor da, während man die anderen zu den G-Proteingekoppelten Rezeptoren rechnet, welche der Gruppe der metabotropen Rezeptoren angehören (Hoyer and Martin 1997). Die 5-HT1-Rezeptoren werden in 5 Untergruppen (5-HTR1A, 5-HTR1B, 5-HTR1D, 5-HTR1E und 5-HTR1F) unterteilt. Diese Rezeptoren sind vor allem Gi-Protein-gekoppelt, welche zu einer Hemmung der Adenylatzyklase mit Senkung des cAMP-Spiegels führen (Hamblin, Guthrie et al. 1998; Albert, Sajedi et al. 1999; Wurch and Pauwels 2000). 5-HTR1B und 5HTR1D sind an Pertussistoxin-sensitiven Gi/o- und Pertussiv-insensitiven Gα15-Proteinen zur Bildung von Ionositolphosphat gebunden (Wurch and Pauwels 2000). 8-HDPAT galt bisher als reiner Agonist der 5-HT1-Rezeptoren bis sich herausstellte, dass er auch als Agonist für die 5-HT7-Rezeptoren fungiert (Boldin, Mett et al. 1995; Hoyer, Hannon et al. 2002). 17 Bei den 5-HT2-Rezeptoren unterscheidet man drei verschiedene Klassen: 5-HTR2A, 5HTR2B und 5-HTR2C (Loric, Maroteaux et al. 1995; Launay, Birraux et al. 1996; Jerman, Brough et al. 2001). Sie sind Gq11-Protein-gekoppelte Rezeptoren und stimulieren die Phospholipase C. Daraus resultiert eine Aktivierung des Phosphatidylinositolstoffwechsels und eine Mobilisierung von Ca²+ aus intrazellulären Speichern. Dies führt zur Phosphorylierung von Funktionsproteinen (Barnes and Sharp 1999; Hoyer, Hannon et al. 2002). Als Agonist wirkt DOI und als Antagonist Ketanserin. Der 5-HT3-Rezeptor ist als einziger ein liganden-gesteuerter Kationenkanal (analog zum nikotinergen Ach-Rezeptor), der zu einer Depolarisierung der Plasmamembran durch Aktivierung von Na+- und K+-Ionenströmen führt (Jackson and Yakel 1995). Die Stimulierung des Rezeptors erfolgt selektiv über 2Me5HT. Odansetron (Antiemetikum), AP und Y25130 sind bekannte Antagonisten (Fukuda, Setoguchi et al. 1991; Sato, Sakamori et al. 1992; Haga, Inaba et al. 1993; Monge, Palop et al. 1993). Die 5-HT4-Rezeptoren werden in 2 Subtypen gegliedert, nämlich in 5-HTR4A und 5-HTR4B (Gerald, Adham et al. 1995). Beide sind Gs-Protein-gekopppelte Rezeptoren, welche über die Aktivierung einer Adenylatzyklase eine Zunahme der intrazellulären Konzentration von cAMP verursachen (Bach, Syversveen et al. 2001). Als selektiver Agonist wirkt 2-MHT und als selektiver Antagonist RS 39604 (Eglen, Wong et al. 1995; Hegde, Bonhaus et al. 1995; Hoyer, Hannon et al. 2002). Die 5-HT5-Rezeptoren sind in 2 Gruppen 5-HTR5A und 5-HTR5B eingeteilt (Matthes, Boschert et al. 1993; Barnes and Sharp 1999). Diese Familie der 5-HT-Rezeptoren ist noch nicht vollständig charakterisiert. Sie führen, ähnlich wie die 5-HT1-Rezeptoren, zu einer Abnahme des intrazellulären cAMP-Spiegels (Matthes, Boschert et al. 1993). Die Gruppen der 5-HT6-und 5-HT7-Rezeptoren sind Gs-Protein-gekoppelte Rezeptoren (Bard, Zgombick et al. 1993; Shen, Monsma et al. 1993; Schoeffter and Waeber 1994; Baez, Kursar et al. 1995; Kohen, Metcalf et al. 1996). Psychopharmaka wie Clozapin und Clomipramin haben eine höhere Affinität zu den 5-HT6-Rezeptoren (Hoyer, Hannon et al. 2002). Als Antagonisten wirken Ro 04-6790 und Ro 63-0563 an diesen Rezeptoren (Barnes and Sharp 1999). Wie oben schon erwähnt wirkt 8-HDPAT auch als Agonist an den 5-HT7-Rezeptoren (Mossner and Lesch 1998; Hoyer, Hannon et al. 2002). Als 18 Antagonisten werden die Substanzen SB 269970 und Pimozide verwendet (Roth, Craigo et al. 1994; Hagan, Price et al. 2000; Hoyer, Hannon et al. 2002). 1.5.4 Der Einfluss von Serotonin im Immunsystem Die Funktion von Serotonin in der Modulation des Immunsystems wurde in den letzten Jahren immer mehr zum Objekt der aktuellen Forschung. Serotoninrezeptoren auf Leukozyten wurden zum ersten Mal von Eliseeva und Stefanovich 1982 beschrieben (Eliseeva and Stefanovich 1982).1988 wurden sie von Jackson et al auf Makrophagen beobachtet und von Finocchiaro et al auf mononukläeren Leukozyten (Finocchiaro, Arzt et al. 1988; Jackson, Walker et al. 1988). Diese Rezeptoren wurden meist durch das Einsetzten von pharmakologischen Methoden entdeckt. Durch die Etablierung von Norhtern Blot und PCR konnte der Nachweis auch auf Ebene der mRNA erbracht werden. So wurden verschiedene 5-HT-Rezeptoren auf Zellen des Immunsystems nachgewiesen (Mossner and Lesch 1998). Zu diesen Zellen gehören BLymphozyten (Choquet and Korn 1988; Monge, Palop et al. 1993; Iken, Chheng et al. 1995; Mossner and Lesch 1998), T-Lymphozyten (Ameisen, Meade et al. 1989; Aune, McGrath et al. 1993; Meyniel, Khan et al. 1997), Monozyten (Hellstrand and Hermodsson 1990), Makrophagen (Silverman, Wu et al. 1985; Sternberg, Trial et al. 1986; Sternberg, Wedner et al. 1987) und dendritische Zellen (Idzko, Panther et al. 2004). Der 5-HTTransporter befindet sich auf B-Lymphozyten und Monozyten / Makrophagen (Gripenberg 1976). Die Synthese und der Abbau von Serotonin konnte in B-Lymphozyten und in Monozyten / Makrophagen nachgewiesen werden (Finocchiaro, Arzt et al. 1988). Serotonin übernimmt wichtige Aufgaben im Immunsystem. Diese umfassen die Aktivierung von T-Zellen und natürlichen Killerzellen (NK-Zellen), die Produktion von Chemokinen, die Beeinflussung von Makrophagen, die Überempfindlichkeitsreaktion vom verzögerten Typ (DTH; delayed hypersensitivity response) und die Hyperreaktivität der Atemwege (Mossner and Lesch 1998; Herz, Renz et al. 2004). In Monozyten inhibiert Serotonin die Synthese von IL-1, IL-16 und TNF-α und induziert die Produktion von Leukotrien B4. Mit Parachlorophenylalanine (PCPA; hemmt die Tryptophanhydroxylase) behandelte Mäuse haben einen Defekt in der Makrophagenvermittelten akkzessorischen T-Zell-Aktivierung (Kut, Young et al. 1992; Young, Kut et al. 1993; Young and Matthews 1995). Die Ergebnisse bezüglich der MHC-I und -II-Expression 19 auf der Oberfläche von Makrophagen sind nicht einheitlich. Es konnten sowohl steigernde als auch reduzierende Effekte durch Serotonin beobachtet werden (Sternberg, Trial et al. 1986). Bei B-Zellen wurden durch Versuchen mit Ratten und Mäusen demonstriert, dass Serotonin eine verstärkte B-Zell-Proliferation und eine andere Antikörperproduktion verursacht (Jackson, Cross et al. 1985; Iken, Chheng et al. 1995). T-Zellen werden in der Proliferation und Zytokinproduktion durch Serotonin beeinflusst (Aune, Kelley et al. 1990; Aune, McGrath et al. 1993; Aune, Golden et al. 1994; O'Connell, Wang et al. 2006). Serotonin induziert die Bildung von verschiedenen Chemokinen (Foon, Wahl et al. 1976; Paegelow, Werner et al. 1985; Farber and Beer 1991; Goppelt-Struebe and Stroebel 1995; Laberge, Cruikshank et al. 1996). Beipsielsweise wird die chemotaktische Wirkung von Eotaxin auf eosinophile Granulozyten unterstützt (Das, Flower et al. 1997). Bei Zytokinen verändert Serotonin die Produktion und Sekretion (Ramamoorthy, Ramamoorthy et al. 1995; Kawashima, Hayashi et al. 1998; Cloez-Tayarani, Petit-Bertron et al. 2003; Idzko, Panther et al. 2004). 1.5.5 Die Bedeutung von Serotonin für dendritischen Zellen Dendritische Zellen werden abhängig von ihrem Reifestadium unterschiedlich von Serotonin beeinflusst. Sie bilden in diesen Stadien verschiedene 5-HT-Rezeptoren auf ihrer Oberfläche aus. Unreife dendritische Zellen exprimieren vor allem mRNA für 5-HT1B-, 5-HT1E- und 5-HT2B-Rezeptoren. Bei LPS-gereiften dendritischen Zellen ist die Produktion von mRNA für 5-HT4- und 5-HT7-Rezeptoren gesteigert. Die Bildung von mRNA für 5-HT3und 5-HT2A-Rezeptoren variiert durch die Differenzierung nicht. Die Zellfunktionen von dendritischen Zellen in vitro werden in Abhängigkeit ihres Reifegrades moduliert. So veranlasst Serotonin in unreifen dendritischen Zellen über Bindung an 5-HTR1- und 5HTR2-Subtypen die Mobilisation von intrazellulärem Ca2+, die Aktinpolymerisation und die zielgerichtete Migration. In LPS-gereiften dendritischen Zellen induziert Serotonin über die Stimulation der Gs-Protein-gekoppelten 5-HT4- und 5-HT7-Rezeptoren die Produktion von cAMP. Es hemmt die Freisetzung von IL-12 und TNF-α, während die Sekretion von IL-1β und IL-8 verstärkt wird. Durch die verminderte extrazelluläre Konzentration von IL-12 und TNF-α kommt es zu einer Polarisierung der spezifischen Immunantwort in Richtung Th2. Dies spielt im Rahmen der asthmatischen Entzündungsreaktion eine Rolle. Ebenfalls ist die vermehrte Sekretion der pro-inflammatorischen Zytokine IL-1β und IL-8 bedeutend bei der Allergen-induzierten Asthmaexazerbation (Idzko, Panther et al. 2004). Dendritische 20 Zellen exprimieren den 5-HTT (5-HT-Transporter; SERT). Dadurch können sie Serotonin aus der Umgebung direkt aufnehmen, welches durch Mastzellen und Thrombozyten sezerniert wurde. Dieser Vorgang kann mit Hilfe von LPS, CD40L verstärkt werden. Dendritischen Zellen speichern das aufgenomme Serotonin in intrazellulären LAMP-1+ Vesikeln und geben es wieder über Ca2+-abhängige Exozytose frei. Auf diese Weise könnte Serotonin auch die DC-T-Zell-Interaktion beeinflussen (O'Connell, Wang et al. 2006). 1.5.6 Die Rolle von Serotonin beim allergischen Asthma bronchiale In einer Arbeit wurde nachgewiesen, dass dendritische Zellen in Abhängigkeit ihres Reifeprozesses unterschiedliche 5-HT-Rezeptoren auf ihrer Oberfläche exprimieren. Dies hatte auch eine veränderte Zytokinsekretion zur Folge. Die Subtypen der 5-HTR3, 5-HTR4 und 5-HTR7 steuerten die Freisetzung von IL-1β und IL-8 (Idzko, Panther et al. 2004). Andere Untersuchungen zeigten, dass eine Allergenexposition eine IL-8-gesteuerte Infiltration von neutrophilen Granulozyten in der Lunge verursachte. Außerdem führte sie zu einer IL-1β-abhängigen Beeinflussung der Reaktionen der glatten Atemmuskulatur (Hakonarson, Maskeri et al. 1999; Gounni, Lamkhioued et al. 2001). Humane Epithelzellen der Atemwege exprimieren ebenfalls verschiedene 5-HT-Rezeptoren. Dadurch kann Serotonin beispielsweise die IL-6- und CXCL-8 / IL-8-Sekretion der Epithelzellen regulieren (Idzko, Panther et al. 2004). In einem Mausmodell für allergisches Asthma bronchiale wurde beobachtet, dass die Entwicklung einer bronchialen Hyperreagibilität und die Infiltration der Atemwegsmukosa durch eosinophile Granulozyten mit Hilfe der direkten Applikation von 5-HTR-Antagonisten blockiert werden kann (De Bie, Henricks et al. 1998). Mehrere Arbeiten beschrieben, dass eine enge Korrelation zwischen dem klinischen Status von Patienten mit allergischem Asthma bronchiale und der freien SerotoninKonzentration im Plasma besteht (Lechin, van der Dijs et al. 1996; Dupont, Pype et al. 1999; Cazzola and Matera 2000; Lechin, van der Dijs et al. 2002). Die Inhalation von Serotonin beim Asthmatiker führt zu einer Bronchokonstriktion (Lechin, van der Dijs et al. 1996; Dupont, Pype et al. 1999). In einer Studie mit asthmatischen Kindern wurde beobachtet, dass die Gabe des Serotonin-up-take-Accelerators „Tianeptine“ (Stablon®) eine schnelle und drastische Abnahme der freien Serotoninkonzentration im Plasma induziert. Dies ging mit einer signifikanten Verbesserung der Lungenfunktion einher (Lechin, van der Dijs et al. 1998; Lechin, van der Dijs et al. 1998). 21 2 Zielsetzungen Erst in jüngerer Zeit wurde der immunmodulatorische Effekt des bisher als Neurotransmitter bekannten Serotonins entdeckt. Für ein tieferes Verständnis der Funktion von Serotonin im Immunsystem ist es von Bedeutung die verschiedenen Einflussmöglichkeiten zu untersuchen. Es wurde festgestellt, dass Serotonin einen unterschiedlichen Stimulus auf dendritische Zellen abhängig von ihrem Reifeprozess ausübt. Da dendritischen Zellen eine zentrale Rolle in der Immunantwort spielen, ist es wichtig zu wissen, inwiefern Serotonin die DC-TZell-Interaktion und die Polarisierung von T-Zellen beeinflussen kann. Ob beispielsweise die Produktion von Zytokinen variiert und dadurch nachfolgende Reaktionen verändert sind. Im Einzelnen sollen folgende Fragen beantwortet werden: • Ist es möglich, mit Hilfe von RT-PCR die Expression von 5-HT-spezifischer mRNA in unreifen und in LPS-gereiften dendritischen Zellen nachzuweisen? • Kann Serotonin die Sekretion von Interleukinen wie INF-γ, IL-5 und IL-13 durch Beeinflussung der Interaktion zwischen dendritischen Zellen und naiven T-Zellen verändern? • Gibt es eine Differenz in der Freisetzung von Interleukinen wie beispielsweise INF-γ, IL-5 und IL-13 durch Serotonin während der Interaktion zwischen unreifen bzw. reifen dendritischen Zellen und naiven T-Zellen? 22 3. Material und Methoden 3.1 Material 3.1.1 Geräte und Arbeitsmaterialien Combitips 5 ml steril Eppendorf, Hamburg, D Cell Strainer 40 µm Falcon, Eppendorf, D Coulter Z1 (Zellzähler) Coulter Electronics Inc., Miami, USA Begasungsbrutschrank Heraeus, Stuttgart, D Elektrophoresekammer MWG Biotech, Ebersberg, D Elektrophorese-Gerät Supply EPS 200 Pharmacia, Freiburg, D ELISA-Reader Molecular Devices, Boston, USA ELISA-Platten 96 Well Nunc, Dänemark Eppendorf Mastercycler 5530 Eppendorf, Hamburg, D iCycler Bio-Rad, USA Kochplatte mit Magnetrührer IKA-Labortechnik, Staufen, D MACS Separation Columns: LS, LD Miltenyi Biotech, Bergisch Gladbach, D MACS Multistand Miltenyi Biotech, Bergisch Gladbach, D Mikroskop Axiolab Carl Zeiss, Oberkochern, D Millex-HS: Sterilfilter Millipore, Bedfort, MA, USA Multipipette Eppendorf; Hamburg, D Multiwell (sterile 6-, 24-, 48-Well-Platte) Falcon, Heidelberg, D Neubauer-Zählkammer Brand, Wertheim / Main, D PCR-Cycler T-Gradient Biometra, Göttingen, D PCR-Platten Thermo-Fast ABgene, Apson, UK PCR-Softtubes (0,2 ml) Biozym Scientific GmbH, Oldendorf, D pH-Meter pH 535 MultiCal WTW, Weilheim, D 23 Photometer Gene Quant RNA Pharmacia, Freiburg, D Pipetboy (elektrische Pipette) Integra Biosciences, CH Pipetten: Biohit-Proline; Brand, Eppendorf Biohit, Helsinki, Finnland Pipetten Eppendorf, Hamburg, D Pipettenspitzen Greiner, Frickenhausen, D Pipettenspitzen Eppendorf, Hamburg, D Pipetus-Akku Hirschmann, Eberstadt, D Powersupply MWG Biotech, Ebersberg, D Reagenzröhrchen Falcon (15 und 50 ml) Falcon, Heidelberg, D Reaktionsgefäße (0,5; 1,5; 2 ml) Eppendorf, Hamburg, D Reaktionsgefäße (0,2 und 0,6 ml) Eppendorf, Hamburg, D Softmax Pro, Auswertungssoftware Molecular Devices, Boston, USA Spritzenfilter Carl ROTH GmbH + Co, Karlsruhe, D Sterilbank Heraeus, Stuttgart, D Umlufttrockenschrank Heraeus, Stuttgart, D Uvette (220 – 1600 nm) Eppendorf, Hamburg, D Waage: Sartorius Handy H51-D Sartorius, Göttingen, D Waage: Scaltec SBC 52 Scaltec GmbH, Heiligenstadt, D Vortexer Whirlimixer, Laboratory FSA supplies Zentrifuge: Rotanta 460 RS Hettich Zentrifugen, D Zentrifuge: Centrifuge 5415 R Eppendorf, Hamburg, D 24 3.1.2 Chemikalien und Biochemikalien Aceton Merck, Darmstadt, D Adenosin Sigma, Deisenhofen, D Aqua E. Braun, Merlungen, D Argarose Gibco, Gaithersburg, USA Chloroform Merck, Darmstadt, D Desoxynukleotidtriphosphate (dNTP´s) Pharmacia, Uppsala, Schweden Bromphenolblau Merck, Darmstadt, D BSA Sigma, Deisenhofen, D Dithithreitol (DTT) Gibco, Gaithersburg, USA D-PBS Gibco, Grand Island, USA DNAse I Invitrogen, San Diego, USA Duo-Set für ELISA (IL-5) R & D , Minneapolis, USA Duo-Set für ELISA (IL-13) R & D , Minneapolis, USA Duo-Set für ELISA (INF-γ) R & D , Minneapolis, USA EDTA Sigma, Deisenhofen, D Ethanol Baker, Deventer, Holland Ethidiumbromid United States Biochemical (USB), Cleveland, USA FCS gold PAA Laboratories, Pasching, A Ficoll Plus Seromed, Berlin, D Formaldehyd Riedel de Haen AG, Seelze Glycerin Carl Roth, Karlsruhe GM-CSF Immuno Tools, Friesoythe, D 100 bp-Leiter Fermentas, St. Leon-Roth, D rh IL-4 Immuno Tools, Friesoythe, D iQ-Supermix Bio-Rad, USA Kaliumchlorid (KCl) Merck, Darmstadt, D Kaliumhydrogenphosphat (K2HPO4) Merck, Darmstadt, D Mineralöl Sigma, Deisenhofen, D M-MLV Reverse Transkriptase Gibco, Gaithersburg, USA 25 Natriumchlorid (NaCl) Merck, Darmstadt, D Natriumhydrogenphosphat (Na2HPO4) Merck, Darmstadt, D Natriumazid (NaN3) Merck, Darmstadt, D Lipopolysaccharide Sigma, Deisenhofen, D Pd (N)6 primer Life Technologies, Gaithersburg, MD PCR reaction buffer (10 x concentrated) Pharmacia Biotech, Freiburg, D Penicillin Gibco, Gaithersburg, USA 6 x Probenauftragspuffer Fermentas, St. Leon-Roth, D RPMI 1640 Medium Gibco, Gaithersburg, USA SYBR Green master mix Bio-Rad, Hercules, USA Strataskript; RT-Kit Stratagene, La Jolla, USA QIAshredder Quiagen, Hilden, D RNeasy Mini Kit Qiagen, Hilden, D Salzsäure (HCl) Merck, Darmstadt, D Saponin Sigma, Deisenhofen, D Streptomycin Gibco, Gaithersburg, USA Serotonin Sigma, Deisenhofen,D Schwefelsäure (H2SO4) Merck, Darmstadt, D Sucrose Sigma, Deisenhofen, D Taq Polymerase Pharmacia Biotech, Freiburg, D Tetramethylbenzidin (TMB) Sigma, Deisenhofen, D Trizol-Reagent Gibco, Paisley, UK Türks Lösung Merck, Darmstadt, D Tween 20 AppliChem, Darmstadt, D Wasserstoffperoxid (H2O2) Merck, Darmstadt, D Xylenzyanol Merck, Darmstadt, D Zitronensäure-Monohydrat Merck, Darmstadt, D 26 3.1.3 Antikörper CD14 MicroBeads, human Miltenyi Biotech, Bergisch Gladbach, D CD4+ T Cell Isolation Kit II, human Miltenyi Biotech, Bergisch Gladbach, D mit CD4+ T Cell Biotin-Antibody und Antibiotin CD45RO MicroBeads, human Miltenyi Biotech, Bergisch Gladbach, D 3.1.4 Puffer und Lösungen RPMI 1640-Medium + L-Glutamin (Medium) mit 10 % FCS gold, 50 IU / ml Penicillin und 50 UG Streptomycin MACS-Puffer (Zellisolation): 475 ml PBS, 25 ml 10 % BSA (steril filtriert), 2 ml 0,5 M EDTA 10 x PBS (ELISA): 160 g NaCl, 22,12 g Na2HPO4, 4 g KCl, 4 g KH2PO4 in 1.800 ml Aqua dest. lösen auf pH = 7,0 einstellen und auf 2 l mit Aqua dest. auffüllen 10 ml Tween 20 dazugeben Waschpuffer (ELISA): 1 x PBS mit 0,05 % Tween 20 auf pH = 7,0 einstellen Blockpuffer (ELISA): 1 x PBS mit 5 % Sucrose, 1 % BSA und 0,05 % NaN3 auf pH = 7,0 einstellen Reagent Diluent (ELISA): 1 x PBS mit 1 % BSA 27 Citratpuffer (ELISA): 3,15 g Zitronensäure-Monohydrat in 500 ml Aqua bidest. lösen auf pH = 4,1 einstellen TMB-Lösung (ELISA): 240 mg TMB, 5 ml Aceton, 45 ml Ethanol und 500 µl 30 % H2O2 Master Mix (PCR): 10 µl SYBR Green master mix 6 µl H2O 1 µl linkes Oligonukleotid 1 µl rechtes Oligonukleotid TAE-Puffer (PCR): 40 mM Tris 1 mM EDTA 20 mM Essigsäure pH = 8,5 Ethidiumbromidlösung (Gelelekrophorese): 1 µg Ethidiumbromid in 1000 ml Aqua bidest. 10 x Probenauftragspuffer (Gelelektrophorese): 0,25 % Bromphenolblau 0,25 % Xylenzyanol 25 % Ficoll 28 3.1.5 DNA-Marker für PCR 1 Kb DNA-Leiter Gibco, Gaithersburg, USA Primersequenzen für PCR: Gen Primersequenz Bp 5-HTR1A 5´ -GCC GCG TGC GCT CAT CTC G- 3´ (forward) 411 5´ -GCG GCG CCA TCG TCA CCT T- 3´ (reverse) 5-HTR1B 5´ -CAG CGC CAA GGA CTA CAT TTA CCA- 3´ (forward) 460 5´ -GAA GAA GGG CGG CAG CGA GAT AGA- 3´ (reverse) 5-HTR1E 5´ -CAA GAG GGC CGC GCT GAT GAT- 3´ (forward) 461 5´ -CTG CCT TCC GTT CCC TGG TGG- 3´ (revrse) 5-HTR2A 5´ -ACT CGC CGA TGA TAA CTT TGT CCT- 3´ (forward) 359 5´ -TGA CGG CCA TGA TGT TTG TGA T- 3´ (reverse) 5-HTR2B 5´ -GGC CCC TCC CAC TTG TTC T- 3´ (forward) 416 5´ -TAG GCG TTG AGG TGG CTT GTT- 3´ (reverse) 5-HTR2c 5´ -TGT GCC CCG TCT GGA TTT CTT TAG- 3´ (forward) 449 5´ -CTC TTC CTC GGC CGT ATT CCT CTT- 3´ (reverse) 5-HT3 5´ -CCG GCG GCC CCT CTT CTA T- 3´ (forword) 448/352 5´-GCA AAG TAG CCA GGC GAT TCT CT- 3´ (reverse) 5-HTR4 5´ -GGC CTT CTA CAT CCC ATT TCT CCT- 3´ (forward) 411 5´ -CTT CGG TAG CGC TCA TCA TCA CA- 3´ (reverse) 5-HTR6 5´ -CCG CCG GCC ATG CTG AAC G- 3´ (forward) 342 5´ -GCC CGA CGC CAC AAG GAC AAA AG- 3´ (reverse) 5-HTR7 5´ -GCG CTG GCC GAC CTC TC- 3´ (forward) 436 5´ -TCT TCC TGG CAG CCT TGT AAA TCT- 3´ (reverse) β2- 5´ -CCT TGA GGC TAT CCA GCG TA- 3´ (forward) 259 Mikroglobulin 5´ -GTT CAC ACG GCA GGC ATA CT- 3´ (reverse) 29 3.2 Methoden 3.2.1 Co-Kultur: DC / CD4+CD45RA+-Zellen Tag 1: Isolation von Monozyten (CD14+-Zellen) Die Isolation von Monozyten erfolgte aus Vollblut von Spendern. Den Probanden wurden 8 - 10 EDTA-Röhrchen Vollblut abgenommen. Von diesen wurden je drei Röhrchen (ca. 30 ml) in ein leeres Falcontube gegeben und auf 50 ml mit PBS aufgefüllt. Das mit PBS verdünnte Vollblut wurde dann auf 20 ml Ficoll-Paque geschichtet, welches zuvor in 50 mlFalcons vorgelegt worden war. Mit 2.480 U/min, 12° C und deaktivierter Bremse wurden in der Zentrifuge 20 min lang die roten von den weißen Blutzellen segregiert. Die Interphase, welche mononukleäre Zellen enthielt, wurde dann vorsichtig abgenommen und in neue Falcontubes pipettiert. Diese Falcontubes wurden anschließend mit PBS auf 50 ml aufgefüllt und erneut mit 1.720 U/min bei 8° C 10 m in abzentrifugiert. Der entstandene Überstand wurde abgenommen und das verbliebene Zellpellet in 1 ml PBS resuspendiert, in ein neues Falcontube überführt und mit 20 ml PBS aufgefüllt. Dann wurden die Falcontubes wieder über 10 min mit 1.720 U/min bei 8° C zentrifugiert. Der Überstand wurde danach abgenommen und das entstandene Zellpellet in 1 ml MACS-Puffer resuspendiert und auf 10 ml mit MACS-Puffer aufgefüllt. Nun erfolgt die Zellzählung. Für die wurden aus dem 10 ml Zell-MACS-Puffer-Gemisch 10 µl mit der Pipette entnommen und in ein Eppendorf-Cup gegeben, in dem 90 µl Türks Lösung vorgelegt waren. Nach Durchmischen mit dem Vortexer wurden aus dem Eppendorf-Cup ca. 10 µl auf eine Zählkammer pipettiert und die Zellen ausgezählt. Nachdem Auszählen der Zellen konnten die erforderlichen Mengen für MACS-Puffer und CD14 MicroBeads berechnet werden, die für das MACS (Magneting cell sorting) benötigt wurden. In dieser Zeit wurde das Zell-MACS-Puffer-Gemisch für 10 min mit 1.720 U/min bei 8° C zentrifugiert. Dann wurde der Überstand ab genommen und das entstandene Zellpellet mit 80 µl pro 107 Zellen MACS-Puffer resuspendiert. Zu diesem Gemisch wurden 20 µl CD14 MicroBeads pro 107 Zellen pipettiert und gut mit der Pipette vermischt. Dieses Falcontube wurde dann für 15 min bei 4 - 8° C inkub iert. Nach der Inkubation wurden diese Zellen durch Zugabe von 1,5 ml MACS-Puffer pro 107 Zellen gewaschen und bei 1.720 U/min und 8° C 10 min lang abzentrifugiert. D anach wurde der Überstand abgenommen und das entstandene Zellpellet in 500 µl MACS-Puffer pro 107 Zellen 30 resuspendiert. Jetzt erfolgte das Separieren von CD14+-Zellen mit Hilfe von Multi-MACS und der LS-Säule. Dazu wurde die Säule in den Magnet geschoben und mit 3 ml MACSPuffer gewaschen. Während dieser Zeit wurde die Zellsuspension in einem sterilen Falcontube auf Eis gestellt. Nachdem Waschen wurde die Zellsuspension dazugefügt. Danach wurde die Säule dreimal mit 3 ml MACS-Puffer gewaschen, wobei die nächsten 3 ml MACS-Puffer erst hinzugegeben werden durften, wenn die vorigen durchgelaufen waren. Am Schluss wurde die Säule aus der Halterung genommen und mit 5 ml MACSPuffer gespült. Dann wurde der Stempel auf die Säule gesetzt und zügig durchgedrückt. Die so entwichene Zellsuspension wurde dabei in einem sterilen Falcontube aufgefangen. Sie wurde als Positivfraktion (CD14+-Zellen) bezeichnet. Aus der aufgefangenen Zellsuspension erfolgte eine Zellzählung. Die Negativfraktion (CD14--Zellen), die während dem Durchlaufen des MACS- Puffer und der Zellsuspension durch die LS-Säule in einem sterilen Falcontube gesammelt wurde, konnte verworfen werden. Während der Zellzählung wurde das Falcontube 10 min lang mit 1.720 U/min bei 8° C zentrifugiert. Die CD14+-Zellen wurden in 1 ml Medium resuspendiert. Mit dem Medium wurden sie soweit verdünnt, dass sich letztendlich 106 Zellen pro ml Medium befanden. Von dieser Verdünnung wurden je 6 ml in sterile 6-Well-Platten pipettiert. In jedes Well wurde 60 µl IL-4 (10 µg / 1 ml) und 60 µl Granulozyten-Makrophagen-Kolonie stimulierenden Faktor (GM-CSF) (30 µg / 2 ml) hinzugegeben und die Zellsuspension wurde noch einmal gut mit der Pipette gemischt. Die gesamte Isolation geschah unter sterilen Verhältnissen unter der Flow. Reifung von Monozyten zu unreifen dendritischen Zellen Die Reifung der Monozyten zu unreifen dendritischen Zellen geschah im Brutschrank bei 37° C in feuchtwarmer Atmosphäre und einer 5%-igen CO2-Begasung. Nach 5 - 6 Tagen waren die Monozyten zu unreifen dendritischen Zellen ausdifferenziert. Tag 6: Stimulation von unreifen dendritischen Zellen mit Serotonin bzw. mit Lipopolysacchariden und Serotonin Die unreifen dendritischen Zellen wurden mit oder ohne Lipopolysaccharide weiter stimuliert. Dazu wurde die Konzentration der Zellen auf 5 x 105 Zellen / ml Medium eingestellt. Die Hälfte der Zellen wurde mit 20 µg / 500 ml Lipopolysacchariden versetzt, während die andere Hälfte unbehandelt blieb. Beide Hälften wurden dann mit absteigenden Konzentrationen von Serotonin vermischt. Die Stimulation geschah in 31 sterilen 24-Well-Platten. Bei Serotonin reichte die Stimulationsreihe von 10-3 bis 10-7. Die Positiv-Kontrolle erfolgte mit Adenosin 10-4. Die Inkubation erfolgte wiederum im Brutschrank bei 37° C und 5%-iger CO 2-Begasung für 24 h. Tag 7: Isolation von CD4+CD45RA+ und Co-Kultur Isolation der CD4+ T-Zellen Der Anfang ist genau gleich der der Monozyten-Isolation (Blutabnahme, + Monozytenisolation - CD14 -Zellen - mit LS-Säule). Die Positivfraktion (CD14+-Zellen) kann zur Generierung von dendritischen Zellen genommen werden. Für die Isolation der CD4+ T-Zellen geht es jetzt mit der Negativfraktion (CD14--Zellen) weiter, die in einem sterilem Falcontube nach Filtration der CD14+-Zellen durch die LSSäule aufgefangen wurde. Das Falcontube wurde in der Zentrifuge bei 1.720 U/min und 8° C für 10 min zentrifugiert. Nach Abnahme des Überstandes wurde das entstandene Zellpellet in 1 ml MACS-Puffer resuspendiert und auf 10 ml mit MACS-Puffer aufgefüllt. Aus der Zellsuspension der CD14--Zellen erfolgte eine Zellzählung mit der Zählkammer (Anleitung siehe oben). Nun konnten die für die Isolation benötigten Substanzmengen berechnet werden. In der Zwischenzeit wurden die CD14--Zellen in dem Falcontube in der Zentrifuge bei 1.720 U/min und 8° C für 10 min zentrifugiert. Dana ch wurde der Überstand abgenommen und das entstandene Zellpellet in 40 µl MACS-Puffer pro 107 Zellen resuspendiert. Zu diesem Gemisch wurden 10 µl des CD4+ T-Zell Biotin-Antikörper Cocktails pro 107 Zellen hinzu gegeben, gut durchmischt und bei 4 - 8° C für 10 min inkubiert. Nach der Inkubation wurden 30 µl MACS-Puffer pro 107 Zellen und 20 µl des Anti-Biotin MicroBeads pro 107 Zellen hinzugefügt. Dann wurde es wieder gut mit der Pipette gemixt und für 15 min bei 4 - 8° C inkubiert. Danach wurden die Zellen gewasche n, in dem 10 x das Gesamtvolumen der zuvor berechneten Werte MACS-Puffer dazu gegeben wurde. Das Falcontube wurde dann für 10 min bei 1.720 U/min und 8° C abzentrifu giert. Nach dem Zentrifugieren wurde der Überstand abgenommen. Das entstandene Zellpellet wurde in 500 µl MACS-Puffer pro 108 Zellen resuspendiert. Jetzt erfolgte das Separieren der CD4+ T-Zellen mit Hilfe von Multi-MACS und der LS-Säule. Diese Separation ist in der Durchführung gleich der CD14+-Zellen (s. o.). Hier wird wieder die Negativfraktion (CD4- T-Zellen) nach Durchwandern der LS-Säule in einem sterilen Falcontube aufgefangen und für 10 min bei 1.720 U/min und 8° C abzentrifugiert. Die Positivfr aktion (CD4+ T-Zellen) konnte verworfen 32 werden. Der Überstand wurde abgenommen und das entstandene Zellpellet in 1 ml MACS-Puffer resuspendiert und auf 10 ml mit MACS-Puffer aufgefüllt. Aus dieser Zellsuspension erfolgte die Zellzählung (Anleitung siehe oben). Nun konnten die Mengen der benötigten Substanzen für die Isolation der CD45RO-Zellen berechnet werden. Isolation von CD45RO-Zellen In der Zwischenzeit wurde das Zell-MACS-Puffer-Gemisch bei 1.720 U/min und 8° C für 10 min zentrifugiert. Nach der Abnahme des Überstandes wurde das entstandene Zellpellet in 80 µl MACS-Puffer pro 107 Zellen resuspendiert und 20 µl des CD45RO MicroBeads pro 107 Zellen wurden hinzu gegeben. Nach gutem Durchmischen mit der Pipette wurde das Falcontube für 10 min bei 4 - 8° C inkubiert. Danach wurden die Zellen gewaschen, in dem 1,5 ml MACS-Puffer pro 107 Zellen hinzugefügt wurde. Nun erfolgte das Zentrifugieren bei 1.720 U/min und 8° C für 10 min. Der Überstand wurde abgenommen und das entstandene Zellpellet in 500 µl MACS-Puffer pro 108 Zellen resuspendiert. Jetzt erfolgte das Separieren der CD45RO-Zellen mit Hilfe von Multi-MACS und der LD-Säule. Dazu wurde die Säule in den Magnet geschoben und mit 2 ml MACSPuffer gewaschen. Während dieser Zeit wurde die Zellsuspension im Falcontube auf Eis gestellt. Nachdem Waschen wurde die Zellsuspension hinzugefügt. Danach wurde die Säule zweimal mit 1 ml MACS-Puffer gewaschen, wobei der nächste 1 ml MACS-Puffer erst dazugegeben werden durfte, wenn der vorige durchgelaufen war. Die Negativfraktion (CD45RA+) wurde in einem sterilen Falcontube aufgefangen. Die Positivfraktion (CD45RO) konnte verworfen werden. Das Falcontube wurde bei 1.720 U/min und 8° für 10 min zentrifugiert. Der Überstand wurde abgenommen und das entstandene Zellpellet in 1 ml Medium resuspendiert. Die CD45RA+-Zellen wurden mit Hilfe der Zählkammer ausgezählt (Anleitung siehe oben). Dann wurde die entsprechende Menge an Medium hinzugegeben, so dass eine Konzentration von 1 x 106 CD45RA+-Zellen pro ml Medium entstand. Vorbereitung von mit Serotonin stimulierten dendritischen Zellen Die mit Serotonin stimulierten dendritischen Zellen wurden nach 24 h Inkubation im Brutschrank bei 37° C und 5%-iger CO 2-Begasung für die Co-Kultur vorbereitet. Zum Ablösen der Zellen wurden die 48-Well-Platten für 1 h auf Eis gestellt. Danach wurden die Zellen eines Wells in ein steriles Eppendorf-Cup mit der Pipette überführt und für 5 min bei 2.500 U/min abzentrifugiert. Die Wells wurden in der Zwischenzeit mit auf Eis gekühltem PBS mit Hilfe einer Pipette gespült, so dass sich weitere Zellen ablösen konnten. Nach 33 dem Zentrifugieren wurde der Überstand in jedem Eppendorf-Cup abgenommen und das entstandene Zellpellet mit dem PBS aus dem dazugehörigen Well resuspendiert. Die Eppendorf-Cups wurden wieder für 5 min bei 2.500 U/ min zentrifugiert. Danach wurde der Überstand in jedem Eppendorf-Cup abgenommen und das entstandene Zellpellet gevortext. Es wurden neue sterile Eppendorf-Cups mit je 200 µl Medium gerichtet. Die gevortexten Zellsuspensionen wurden mit den vorgerichteten 200 µl Medien in der Pipette auf insgesamt 200 µl aufgezogen und in neue sterile Eppendorf-Cups überführt. Aus diesen 200 µl erfolgte dann die Zellzählung (Anleitung siehe oben). Die Eppendorf-Cups wurden in der Zwischenzeit mit 2.500 U/min für 5 min zentrifugiert. Nach der Zellzählung wurden die entsprechenden Mengen an Medien ausgerechnet, die dazugegeben oder abpipettiert werden mussten, so dass eine Konzentration von 1 x 106 DCs / ml Medium erreicht wurde. Herstellung einer Co-Kultur Für die Co-Kultur wurden 100 µl (=100.000 Zellen) DCs und 500 µl (=500.000 Zellen) CD4+CD45RA+-Zellen in ein Well einer sterilen 24-Well-Platte pipettiert. Die Stimulationsreihe von Serotonin ging von 10-3 bis 10-7 und die Positivkontrolle erfolgte mit Adenosin 10-4. Die Co-Kultur wurde für 5 Tage im Brutschrank bei 37° C und 5%-iger CO 2Begasung inkubiert. Nach 5 Tagen wurden dann die Überstände für die ELISAs abgenommen. Die gesamten Isolationen, die Vorbereitung der dendritischen Zellen und die Herstellung der Co-Kultur geschahen unter sterilen Verhältnissen unter der Flow. 3.2.2 Gewinnung von Überständen für ELISA Nach Abzentrifugieren der 24-Well-Platten bei 1.500 U/min, 4° C und 5 min Dauer wurden die zellfreien Überstände in sterile 48-Well-Platten pipettiert. Diese wurden bei -20° C eingefroren. 34 3.2.3 Messung von Zytokinen per ELISA von R & D Zur Bestimmung von unbekannten Konzentrationen bestimmter Substanzen in den Überständen kamen Sandwich-ELISAs zum Einsatz. Bei diesem ist die nachzuweisende Substanz an zwischen zwei substanzspezifischen Antikörpern, die sich gegen verschiedene Epitope dieser Substanz richten, gebunden. Hierbei ist der erste Antikörper an einer festen Phase gebunden, der zweite Antikörper wird durch ein Enzym markiert, welches eine Farbreaktion katalysiert. Anhand einer Standardkurve lässt sich so die unbekannte Substanzkonzentration photometrisch bestimmen. Im Folgenden wird die Handhabung von ELISA-Sets der Firma R&D-Systems beschrieben: 12 h bevor die Zytokin-Messung mittels ELISA vorgenommen wurde, wurden die ELISAPlatten (NUNC Maxisorp) mit 100 µl des jeweiligen mit PBS-verdünnten CaptureAntibodys pro Well bei Raumtemperatur inkubiert. Nach Ablauf der 12 h wurden die Platten dann mit 200 µl Waschpuffer / Well gewaschen. Diese Prozedur wurde dreimal wiederholt. Nach jeder Waschung wurden die Platten auf Zellulose-Papier ausgeklopft, um den restlichen Waschpuffer zu entfernen. Nach dem ersten Waschschritt wurden dann 200 µl Blockpuffer / Well aufgetragen, um unspezifische Bindungsvorgänge zu vermeiden. Die Platten mit aufgetragenem Blockpuffer wurde eine Stunde bei Raumtemperatur inkubiert. Anschließend folgte wieder eine dreimalige Waschung. Nun konnten die Proben, die zuvor bei Raumtemperatur aufgetaut wurden, mit Medium in sterilen Eppendorf-Cups verdünnt werden. Gleichzeitig wurde auch der jeweilige Standard nach Herstellerangaben in einem sterilen Eppendorf-Cup verdünnt. Dann wurden je 100 µl verdünnter Standard pro Well und je 100 µl verdünnte Proben pro Well aufgetragen, wobei die Eppendorf-Cups zuvor gevortext wurden. Nach zwei Stunden Inkubationszeit bei Raumtemperatur oder im Kühlschrank über Nacht folgte der nächste Waschschritt, wobei hier insgesamt viermal gewaschen wurde. Darauf folgend wurden 100 µl Detection-Antibody / Well aufgetragen, der zuvor nach Anleitung mit Reagent Diluent verdünnt wurde. Wiederum folgte eine Inkubation von zwei Stunden bei Raumtemperatur. Daraufhin wurden die Platten vier Mal gewaschen und danach mit 100 µl Streptavidin HRP (Horse-Radish-Peroxidase) pro Well versetzt. Da Streptavidin HRP hochaffin an Biotin bindet, vermittelt es die Bindung zwischen dem biotinylierten Zweitantikörper (Detection-Antibody) und der Horse-RadishPeroxidase (HRP). Durch Streptavidin HRP wird die Farbreaktion verstärkt, da es mehr freie Bindungsstellen für Tetramethylbenzidin (TMB) besitzt. Streptavidin HRP wurde zuvor mit Reagent Diluent zu 1:200 verdünnt. Die Platten wurden dann für 20 min bei 35 Raumtemperatur inkubiert. Es folgte der letzte Waschschritt mit insgesamt vier Waschungen. An diesen anschließend wurde je 100 µl pro Well einer Lösung mit Citratpuffer und TMB aufgetragen. In dieser Lösung waren 500 µl TMB mit 10 ml Citratpuffer (entspricht der Menge pro Platte) verdünnt worden. Es erfolgte dann eine Inkubation unter Lichtausschluss über 20 min bei Raumtemperatur. Nach Ablauf der 20 min wurde der ELISA mit Hilfe von 50 µl 4 N H2SO4 pro Well abgestoppt und sofort im Anschluss bei einer Wellenlänge von 450 nm mit Hilfe des ELISA-Readers gemessen. Die weitere Auswertung erfolgte mit Hilfe der mitgelieferten Software des ELISA-Readers. 3.2.4 Isolation von RNA Zur Phasenseparation wurden die mit Trizolreagenz lysierten Zellen fünf Minuten bei 30º C auf der Heizplatte inkubiert. Es erfolgte die Zugabe von 70 µl Chloroform und die Reaktionsgefäße wurden 15 Sekunden lang geschüttelt. Nach drei Minuten bei 30º C auf der Heizplatte wurden die Reaktionsgefäße bei 12.000 U/min und 4º C zentrifugiert. In dem zentrifugierten Reaktionsgefäß befinden sich nun drei Phasen übereinander: zu unterst eine leicht rote phenolhaltige, flüssige Phase; in der Mitte eine dünne, schleimige, weiße Phase; zu oberst eine klare, flüssige Phase. Die oberste Phase wurde abgenommen und in ein neues Reaktionsgefäß gegeben. Der Rest wurde verworfen. Es erfolgte die Fällung der alkoholunlöslichen RNA durch Zugabe von 150 µl Isopropylalkohol. Nach einer Inkubationszeit von 10 min bei 30º C auf der Heizplatte schloss sich eine erneute Zentrifugation bei 12.000 U/min und 4º C an. Die RNA befindet sich nun als Pellet am Boden des Reaktionsgefäßes. Der Überstand wurde abgekippt. Die Reinigung der RNA wurde durch Zugabe von 300 µl 75%igem Ethanol ausgelöst. Das Reaktionsgefäß wurde kurz gerüttelt und dann bei 7.500 U/min 5 min lang bei 4º C zentrifugiert. Der Überstand wurde abgekippt, die nun gereinigte RNA befindet sich als Pellet am Boden des Reaktionsgefäßes. Dieses wurde 10 - 30 min lang an der Luft getrocknet bis der Alkohol verdunstet war. Dann wurde das trockene Pellet in 30 µl DEPCH2O gelöst. Es erfolgte eine Inkubation von 10 min bei 60º C auf der Heizplatte. Der RNAGehalt der Lösung wurde nun mit dem Photometer bei 260 nm gemessen. 36 3.2.5 Reverse Transkription Die reverse Transkription (RT) ermöglicht es RNA in Einzelstrang-DNA / RNA-Hybride umzuschreiben. Diese Hybride werden im Folgenden als cDNA (zelluläre DNA) bezeichnet. Mit der cDNA ist im Gegensatz zur RNA eine Amplifikation spezifischer Nukleinsäureabschnitte durch Polymerasekettenreaktion (PCR) möglich. Für die RT-PCR wurde zuerst photometrisch die RNA-Konzentration in den verschiedenen Proben bestimmt. Dann wurde berechnet, wie viel µl RNA-Probe nötig waren, um insgesamt 5 µg RNA zu erhalten. Es wurde so viel DEPC-H2O hinzugefügt, damit ein Gesamtvolumen von 38 µl erreicht wurde. Zu diesem Ansatz wurden 3 µl Oligo-dT-Primer gegeben und das Ganze wurde für 5 min bei 65° C in den PCR-Cycler gestellt. Nach langsamen Abkühlen auf Raumtemperatur, erfolgte die Zugabe von 9 µl des Reaktionsansatzes (siehe unten). Im nächsten Schritt wurde die cDNA im PCR-Cycler bei 37° C für 1 h synthetisiert. Es schloss sich eine I naktivierungsphase von 5 min bei 95° C an. Nach Abkühlen auf Raumtemperatur konnte die cDNA bei -20° C eingefroren oder direkt weiter verwendet werden. Reaktionsansatz: Endkonzentration 5 µl 10 x Reaktionspuffer 1x 2 µl DTT 0,8 U/µl 2 µl dNTP-Mix 100 mM 4 mM 1 µl StrataScript Reverse Transkriptase 1 U/µl 3.2.6 Polymerasekettenreaktion (PCR) 1983 wurde von K.B. Mullis eine Methode entwickelt, die es ermöglichte, spezifische DNASequenzen mit hoher Ausbeute zu amplifizieren. Hierfür waren nur geringste Mengen DNA notwendig. Die Entdeckung einer hitzestabilen DNA-Polymerase (Taq-Polymerase) machte die Methode noch wesentlich einfacher. In dieser Arbeit wurde die PCR in einem Ansatz von 50 µl durchgeführt, der aus 2 µl cDNA und 48 µl PCR-Mastermix bestand. 37 PCR-Mastermix: Endkonzentration 10 x Puffer 1x dNTP 0,4 mM/Nukleotid Taq-Polymerase 0,05 U/µl Primermix 0,4 µM berechnet auf das Gesamtvolumen 50 µl Es wurden 48 µl des PCR-Mastermix zusammen mit 2 µl cDNA in ein 0,6 ml Reaktionsgefäß pipettiert, gut gemischt und kurz abzentrifugiert. Um das Verdunsten der Proben im Thermozykler zu verhindern, erfolgte die Überschichtung jedes Ansatzes mit 20 µl Mineralöl. Die PCR umfasste folgende Phasen: • Initialphase: dreiminütige Denaturierung der DNA-Doppelstränge • Hauptphase: Amplifikation der DNA mit variabler Zyklenzahl unterteilt in drei Schritte je Zyklus: • 1. einminütige Denaturierung der DNA-Doppelstränge 2. einminütige Hybridisierung der spezifischen Primer an die einzelsträngige DNA 3. einminütige Kettenverlängerung durch die Taq-Polymerase (72° C) Finalphase: achtminütige Kettenverlängerung durch die Taq-Polymerase („Endpolymerisation“) Es wurden 30 PCR-Zyklen bei folgenden Temperaturen pro Zyklus durchgeführt. Die Denaturierung erfolgte bei 94° C, das Annealing bei 58° C bzw. 62° C und die Kettenverlängerung bei 72° C. Die PCR-Produkte wurden bis zur weiteren Verarbeitung bei 4° C im Kühlschrank gelagert. 38 3.2.7 Gelelektrophorese Die Gelelektrophorese ermöglicht die Auftrennung der PCR-Produkte anhand ihrer Größe. Dazu wurden 2 g Agarose abgewogen, in 100 ml 1 x TBE-Puffer gelöst (2%iges Gel) und kurz aufgekocht, bis die Lösung klar wurde. Nach Abkühlen der Agarose auf 60° C wurden dem Gel 5 µg Ethidiumbromid zugefügt und das flüssige Gel in den Schlitten der Elektrophoresekammer gegossen. Die Bildung der Probenauftragstaschen erfolgte mit zwei Kämmen, die nach dem Erkalten wieder entfernt wurden. Anschließend wurde der Schlitten in die mit 1 x TBE gefüllte Elektrophoresekammer überführt. Jeweils 7 µl PCRProdukt bzw. 1,5 µl eines DNA-Größenstandards (1 µg / µl) wurden zusammen mit 3 µl 10 x Probenauftragspuffer (0,42 % Bromphenolblau, 0,42 % Xylenzyanol, 50 % Glyzerin) in die Taschen des Gels pipettiert. Nach einer 60 bis 90 min dauernden elektrophoretischen Auftrennung (im Powersupply von MWG Biotech, Ebersberg, FRG) bei 120 V und 400 mA, konnten die spezifischen Banden mit kurzwelligem UV-Licht sichtbar gemacht werden. Zur Dokumentation der Ergebnisse diente das Anfertigen von Fotos. 3.2.8 Statistik Die Ergebnisse sind als Mittelwerte ± Standardfehler (SEM) dargestellt. Die statistische Auswertung erfolgte mit dem ANOVA-Test (analysis of variance). Als signifikant wurde p < 0,05 angesehen. 39 4 Ergebnisse 4.1 Expression von 5-HT-Rezeptoren durch dendritische Zellen Die mRNA-Expression für die verschiedenen 5-HTR-Subtypen wurde mit Hilfe von RTPCR in humanen unreifen und in humanen mit LPS-gereiften von Monozyten abgeleiteten dendritischen Zellen analysiert. Eine relative Quantifizierung dieser Rezeptoren wurde an drei unterschiedlichen Zeitpunkten während des Reifeprozess mit LPS von humanen von Monozyten abgeleiteten dendritischen Zellen durchgeführt. Es wurde festgestellt, dass durch die Stimulation von humanen von Monozyten abgeleiteten dendritischen Zellen mit LPS sich die mRNA-Produktion für 5-HT-Rezeptoren abhängig von ihrem Reifegrad veränderte. Humane unreife und mit LPS-stimulierte von Monozyten abgeleitete dendritische Zellen produzierten mRNA für 5-HTR1B, 5-HTR1E, 5-HTR2A, 5-HTR2B, 5HTR3, 5HTR4 und 5HTR7. Es konnte keine mRNA-Expression für 5-HTR1A, 5-HTR1D, 5-HTR1F, 5-HTR2C, 5HTR5 und 5HTR6 in humanen von Monozyten abgeleiteten dendritischen Zellen nachgewiesen werden. Die Bildung von mRNA für 5-HTR1B, 5-HTR1E und 5-HTR2B nimmt signifikant ab, während sie für 5-HTR4 und 5-HTR7 nach der Stimulation mit LPS ansteigt. Das Expressionsniveau der mRNA für den liganden-abhängigen Kationenkanal 5-HTR3 und für den heptahelikalen 5-HTR2A wurde durch die Reifung mit LPS von humanen von Monozyten abgeleiteten dendritischen Zellen nicht eindeutig beeinflusst. Die Ergebnisse zur Untersuchung der Expression von 5-HT-Rezeptoren auf der Oberfläche von humanen von Monozyten abgeleiteten dendritischen Zellen wurden mit Hilfe der RT-PCR ermittelt und sind in Abbildung 1 dargestellt. 40 Abbildung 1: Humane unreife und mit LPS-gereifte von Monozyten abgeleitete dendritische Zellen exprimieren mRNA für unterschiedliche 5HTR-Subtypen (A und B). Die Analyse der RT-PCR wurde mit mRNA von humanen unreifen von Monozyten abgeleiteten dendritischen Zellen und von humanen mit LPSgereiften von Monozyten abgeleiteten dendrischen Zellen durchgeführt. 1A: Banden: A, 5-HTR2B; B, 5-HTR2A; C, 5-HTR1E; D, 5-HTR1B. 1B: Banden: E, 5-HTR7; F, 5-HTR4; G, 5HTR3. Für Abbildung 1A und 1B wurde ein repräsentatives Experiment von einem Stichprobenumfang aus vier gezeigt (n=4). 1C, 1D: Die relative Quantifizierung der Banden wurde mit dem iCycler durchgeführt. Die Werte sind dargestellt als Mittelwert ± SEM (n=4). Globale Unterschiede zwischen den Gruppen: p ≤ 0.0001 (ANOVA); ≤ 0.01 (***); ≤0,05 (*) verglichen mit unbehandelten Zellen (Tukey’s multiple comparison test). 41 4.2 Messungen der Zytokinsekretion von INF-γ, IL-5 und IL-13 mittels ELISA INF-γ gehört zu der Gruppe der Th1-Zytokine und wird unter anderem von naiven T-Zellen nach Kontakt mit dendritischen Zellen gebildet. Es hat einen hemmenden Effekt auf die Polarisierung der spezifischen Immunantwort in Richtung Th2. Bei der Entwicklung des allergischen Asthmas bronchiale hat es eine wichtige Funktion. IL-5 und IL-13 dagegen gehören zu der Gruppe der Th2-Zytokine. Die Produktion und Sekretion von IL-5 erfolgt beispielsweise durch T-Zellen. Es spielt eine bedeutende Rolle beim allergischen Asthma bronchiale durch Induktion der eosinophilen Granulozyten. IL-13 ist ein pleiotropes Zytokin und wird von T-Zellen, dendritischen und anderen Zellen produziert. Durch die Kontrolle der Entwicklung der Atemwegshyperreaktivität, Schleimzellhyperplasie und Atemwegsentzündung beeinflusst es ebenfalls die Entstehung des allergischen Asthmas bronchiale. Um den Einfluss von Serotonin auf die Interaktion zwischen naiven T-Zellen und dendritischen Zellen zu untersuchen, wurden humane unreife und mit LPS-gereifte von Monozyten abgeleitete dendritische Zellen mit unterschiedlichen Serotoninkonzentrationen für 24 Stunden stimuliert. Diese dendritischen Zellen wurden anschließend mit humanen naiven CD4+CD45RA+-Zellen für 5 Tage co-kultiviert. Nach 5 Tagen wurden die Überstände mit Hilfe von ELISA auf die Sekretion von INF-γ, IL-5 und IL-13 untersucht. Die von humanen von Monocyten abgeleiteten dendritischen Zellen und die humanen naiven CD4+CD45RA+-Zellen wurden aus Vollblut von Probanden isoliert. Bei Co-Kulturen mit humanen naiven CD4+CD45RA+ T-Zellen und humanen mit LPSgereiften von Monozyten unterschiedlichen abgeleiteten dendritischen Serotoninkonzentrationen stimuliert Zellen, welche zuvor mit wurden, konnten wir eine geschwächte Th1- und eine verstärkte Th2-polarisierende Immunantwort nachweisen. Dies zeigte sich in der Zytokinsekretion von INF-γ, IL-5 und IL-13. Die Freisetzung von INF-γ war vermindert, wohingegen die Sekretion von IL-5 und IL13 erhöht war. Humane naive CD4+CD45RA+ T-Zellen co-kultiviert mit humanen unreifen von Monozyten abgeleiteten dendritischen Zellen zeigten ebenfalls eine gesteigerte Bildung von IL-5 und IL-13. Die Sekretion von INF-γ war auch reduziert. Diese Effekte waren bei einer Serotoninkonzentration von 10-4 am stärksten ausgeprägt. 42 Die Ergebnisse zur Messung der Zytokinproduktion von INF-γ, IL-5 und IL-13 bei der Interaktion von humanen unreifen und mit LPS-gereiften von Monozyten abgeleiten Zellen, die zuvor mit unterschiedlichen Serotoninkonzentrationen stimuliert wurden, und humanen naiven CD4+CD45RA+ T-Zellen wurden mit Hilfe von ELISA ermittelt und sind in Abbildung 2 dargestellt. Abbildung 2: Darstellung der Sekretion von IL 5 (A), IL-13 (B) und INF-γ (C) von Co-Kulturen mit humanen unreifen bzw. LPS-gereiften von Monozyten abgeleiteten dendritischen Zellen, welche zuvor mit 5-HT in + + unterschiedlichen Konzentrationen stimuliert wurden, und humanen naiven CD4 CD45RA T-Zellen. Die Ergebnisse werden gezeigt als Mittelwert (pg/ml) ± Standardabweichung (n=3). *p ≤ 0,05 zwischen der Zytokinsekretion von T-Zellen, die mit von Monozyten abgeleiteten dendritischen Zellen stimuliert wurden, welche zuvor nicht oder mit 5-HT aktiviert wurden. 43 5 Diskussion Serotonin (5-Hydroxytryptamin; 5-HT) ist ein bekanntes vasoaktives Amin und ein gut charakterisierter Neurotransmitter, der für die Regulation zahlreicher physiologischer Funktionen wie Schlaf, Appetit und Verhalten eine wichtige Rolle spielt. Ebenso ist Serotonin in der Modulation des Immunsystems von zentraler Bedeutung (Segal, Taurog et al. 1977; Jankovic 1989; Matsuda, Ushio et al. 1997). In unterschiedlichen Untersuchungen konnte nachgewiesen werden, dass die basalen extrazellulären 5-HT-Spiegel in verschiedenen Geweben niedriger als 100 nM sind. Unter pathologischen Bedingungen wie Entzündung, Ischämie oder Thrombose können die extrazellulären 5-HT-Konzentrationen bis auf 3 µM ansteigen (Mossner and Lesch 1998). Serotonin kann im Immunsystem die angeborene Immunantwort aktivieren, welche beispielsweise durch Makrophagen vermittelt wird. Ebenfalls kann Serotonin die erworbene Immunantwort stimulieren, in dem es die Funktionen von B-, T- und NK-Zellen beeinflusst. Des Weiteren verändert Serotonin die Produktion und die Sekretion verschiedener Zytokine und Chemokine, übernimmt eine wichtige Aufgabe bei der Regulation der Überempfindlichkeitsreaktion vom verzögerten Typ (DTH; delayed hypersensitivity response), sowie in der Pathophysiologie atopischer Erkrankungen wie beispielsweise beim allergischen Asthma bronchiale (Monge, Palop et al. 1993; Lechin, van der Dijs et al. 1996; Cazzola and Matera 2000; Fukao, Matsuda et al. 2000; Lechin, van der Dijs et al. 2002; Herz, Renz et al. 2004). Dendritische Zellen gelten nach aktuellem Wissensstand als die potentesten antigenpräsentierenden Zellen. Sie können sowohl eine Immunantwort in vivo auslösen, als auch diese hemmen (Limaye, Abrams et al. 1990; Lack, Bradley et al. 1996; Banchereau, Briere et al. 2000). Abhängig von ihrem Reifezustand können sie verschiedene Chemokine und Zytokine produzieren, sowie unterschiedliche Oberflächenmoleküle exprimieren (Bell, Young et al. 1999; Banchereau, Briere et al. 2000). Unreife dendritische Zellen migrieren ins entzündete Gewebe und nehmen dort potentielle Antigene über Phagozytose, Makropinozytose und Endozytose auf. Dadurch kommt es zur Reifung von dendritischen Zellen. Diese wandern nun über Lymphbahnen zu benachbarten Lymphknoten, um dort mit naiven T-Zellen zu interagieren (Hart 1997; Banchereau and Steinman 1998). Die DC-T-Zell-Interaktion kann zur Aktivierung von T44 Zellen mit Zytokinproduktion und Proliferation, zur Toleranz, zur Anergie oder zur Apoptose von naiven T-Zellen führen (Guermonprez, Valladeau et al. 2002; Sharpe and Freeman 2002). Bei dendritischen Zellen kommt es durch die Interaktion mit T-Zellen zu einer Weiterreifung bzw. zu einer terminalen Differenzierung, welche letztendlich in Apoptose mündet (Corry, Folkesson et al. 1996; Lipscomb and Masten 2002). Dendritische Zellen spielen auch eine wichtige Rolle bei der Entwicklung des allergischen Asthmas bronchiale. Sie sind die einzigen Zellen im Atemwegsepithel, die MHC Klasse IIMoleküle exprimieren. Dadurch übernehmen sie eine einmalige Funktion bei der primären Sensibilisierung gegenüber Aerosol-Allergenen (Schon-Hegrad, Oliver et al. 1991; Lambrecht, Salomon et al. 1998; Akbari, DeKruyff et al. 2001). Ebenso sind sie bedeutend für die Aktivierung von pulmonalen CD4+ Th2-Zellen und tragen zur Infiltration der Atemwege durch eosinophile Granulozyten bei (Lambrecht 2001; Eisenbarth, Piggott et al. 2003; Lambrecht and Hammad 2003). Die Wirkung von Serotonin wird über membranständige 5-HT-Rezeptoren vermittelt. Es wurden bis jetzt 14 unterschiedliche Serotoninrezeptoren beschrieben, die man wegen ihres strukturellen und funktionellen Charakters in sieben Klassen (5-HTR1-7) einteilt. Der bisher alleinige Vertreter der ionotropen Rezeptoren stellen die 5-HT3-Rezeptoren dar. Die anderen Serotoninrezeptoren werden zur Gruppe der metabotropen Rezeptoren, welche an ein G-Protein gekoppelt sind, gezählt (Hoyer, Clarke et al. 1994; Hoyer and Martin 1997; Hoyer, Hannon et al. 2002). Unbekannt ist jedoch, welche Serotoninrezeptoren von dendritischen Zellen exprimiert werden, und ob Serotonin die DC-T-Zell-Interaktion beeinflussen kann. Für ein tieferes Verständnis der immunmodulatorischen Bedeutung des Serotonins ist es daher von Interesse, die mögliche Rolle von Serotonin bei der DC-T-Zell-Interaktion zu analysieren. 5.1 Expression von 5-HT-Rezeptoren durch dendritische Zellen Es konnte mittels RT-PCR belegt werden, dass dendritische Zellen in Abhängigkeit von ihrem Reifezustand mRNA für verschieden 5-HTR-Subtypen exprimieren. Sowohl unreife als auch unter dem Einfluss von LPS-gereifte dendritische Zellen produzieren mRNA für 545 HTR1B, 5-HTR1E, 5-HTR2A, 5-HTR2B, 5HTR3, 5HTR4 und 5HTR7. Für die Subtypen 5HTR1A, 5-HTR1D, 5-HTR1F, 5-HTR2C, 5HTR5 und 5HTR6 konnte jedoch keine mRNAExpression nachgewiesen werden. Durch den Reifeprozess nimmt die mRNA-Produktion der Unterklassen 5-HTR1B, 5-HTR1E und 5-HTR2B bedeutsam ab, während die Bildung von 5-HTR4 und 5-HTR7 gesteigert ist. Das Expressionsniveau der übrigen 5-HT-Rezeptoren wurde durch die Reifung von dendritischen Zellen nicht signifikant beeinflusst. Ein ähnliches Expressionsprofil der 5-HTR-Subtypen konnte in einer Arbeit mit humanen Monozyten gezeigt werden. Mit Hilfe der RT-PCR wurde beobachtet, dass humane Monozyten mRNA für 5-HT1E-, 5-HT2A-, 5-HT3-, 5-HT4- und 5-HT7-Rezeptoren ausbilden. Im Unterschied zu unseren Ergebnissen beeinflusst die Stimulation mit LPS die mRNAExpression in humanen Monozyten nicht. Dieses unterschiedliche Verhalten könnte durch den unterschiedlichen Differenzierungsgrad der Zellen zu erklären sein. Monozyten sind im Vergleich zu dendritischen Zellen Vorläuferzellen. Des Weiteren könnten gewebsspezifische regulatorische Mechanismen eine Rolle spielen (Idzko, Panther et al. 2004). In verschiedenen Arbeiten wurde untersucht, ob T-Zellen ebenfalls membranständige 5HT-Rezeptoren exprimieren. Diese zeigten, dass T-Zellen mRNA für die Subtypen 5HTR1A, 5-HTR2, 5-HTR3 und 5-HTR7 produzieren (Ameisen, Meade et al. 1989; Aune, McGrath et al. 1993; Aune, Golden et al. 1994; O'Connell, Wang et al. 2006). Aune et al beobachteten, dass es durch die Aktivierung von T-Zellen mittels PHA (Phytohämagglutinin) zur Hochregulation von 5-HTR1A kommt (Aune, McGrath et al. 1993). Léon-Ponte et al demonstrierten, dass eine Stimulation der T-Zellen mit Concanavlin A oder PMA plus Ionomycin zu einer verstärkten Expression von mRNA für die Unterklassen 5-HTR1B und 5-HTR2A führte. Sie legten ebenfalls dar, dass naive TZellen vor allem mRNA für 5-HTR7 bilden. Jedoch sei die Produktion bei T-Zellen, die mit Concanavlin A oder PMA plus Ionomycin aktiviert wurden, stärker (O'Connell, Wang et al. 2006). Diese Resultate bestätigten, dass T-Zellen in Analogie zu dendritischen Zellen abhängig von ihrem Aktivierungszustand ein unterschiedliches Profil von 5-HT-Rezeptoren aufweisen. 46 5.2 Einfluss von Serotonin auf die Zytokinsekretion bei der DC-T-ZellInteraktion In den letzten Jahren zeigte sich, dass Serotonin, welches bisher vor allem als Neurotransmitter bekannt war, ein bedeutender Modulator des Immunsystems ist. Serotonin spielt eine wichtige Rolle bei der Aktivierung von T-Zellen und natürlichen KillerZellen (NK-Zellen), der Produktion von Chemokinen, der Beeinflussung von Makrophagen, der Überempfindlichkeitsreaktion vom verzögerten Typ (DTH; delayed hypersensitivity response) und der Pathogenese der bronchialen Hyperreagibilität (Mossner and Lesch 1998; Herz, Renz et al. 2004). Die Stimulation mit Serotonin führt bei vielen Zellen des Immunsystems zu einer anderen Zytokinsekretion (Kalinski, Vieira et al. 2001; Idzko, Panther et al. 2004). Aus pneumologischer Sicht von besonderem Interesse ist die in mehreren Arbeiten aufgezeigte enge Korrelation zwischen dem klinischen Status von Patienten mit allergischem Asthma bronchiale und der Konzentration von freiem Serotonin im Plasma (Lechin, van der Dijs et al. 1996; Lechin, van der Dijs et al. 2002). Wir stellten uns erstens die Frage, ob durch die Stimulation von dendritischen Zellen mit Serotonin eine vermehrte Sekretion von Th2-Zytokinen wie IL-5 und IL-13 durch T-Zellen begünstigt wird. Ebenfalls, ob die Freisetzung von INF-γ, einem Th1-Zytokin, verändert wird. Zweitens untersuchten wir, ob es Unterschiede in der Zytokinsekretion bei der DC-T-Zell-Interaktion zwischen Normalpersonen und Asthmatikern gibt, wenn dendritische Zellen zuvor mit Serotonin stimuliert wurden. Dazu wurde die Zytokinproduktion von DCs / T-Zellen in CoKulturen mittels ELISA gemessen. 5.2.1 Modulation der INF-γ-, IL-5- und IL-13-Sekretion Unreife und LPS-gereifte von Monozyten abgeleitete dendritische Zellen wurden mit unterschiedlichen Serotoninkonzentrationen stimuliert, und diese zur Co-Kultur mit naiven CD4+CD45RA+ T-Zellen eingesetzt. Anschließend bestimmten wir mit Hilfe von ELISA die Zytokinsekretion von INF-γ, IL-5 und IL-13. Bei den Co-Kulturen mit LPS-gereiften von Monozyten abgeleiteten dendritischen Zellen führte die Stimulation mit Serotonin zu einer veränderten Zytokinsekretion von INF-γ, IL-5 und IL-13. Serotonin hemmte konzentrationsabhängig die Freisetzung von INF-γ, wohingegen es die Sekretion von IL-5 und IL-13 dosisabhängig steigerte. Dieser Effekt war bei einer Serotoninkonzentraton von 47 10-4 am stärksten ausgeprägt. Ebenso vergleichbare Ergebnisse zeigten sich bei den CoKulturen mit unreifen von Monozyten abgeleiteten dendritischen Zellen und naiven CD4+CD45RA+ T-Zellen. INF-γ gehört zu der Gruppe der Th1-Zytokine (Kips 2001). Die Entstehung einer Th2-Antwort wird durch INF-γ supprimiert (Geha 1992). IL-5 zählt zusammen mit IL-13 zu den Th2-Zytokinen (Minty, Chalon et al. 1993; Zurawski and de Vries 1994; de Vries 1996; Jacob and Baltimore 1999). Daraus lässt sich folgern, dass es durch Serotonin zur Veränderung der Zytokinsekretion bei der DC-T-Zell-Interaktion zu Gunsten von Th2-Zytokinen kommt. Bei den Co-Kulturen von unreifen von Monozyten abgeleiteten dendritischen Zellen mit naiven CD4+CD45RA+ T-Zellen ergaben sich Unterschiede in der Zytokinproduktion abhängig von den verschiedenen Serotoninkonzentrationen, wobei sie bei den CoKulturen mit LPS-gereiften von Monozyten abgeleiteten dendritischen Zellen stärker ausgeprägt waren und insgesamt eine höhere Zytokinsekretion gemessen werden konnte. Dieses Ergebnis könnte daher bestätigen, dass dendritische Zellen vor allem durch Reifung die Fähigkeit erlangen Antigene zu präsentieren und mit T-Zellen zu interagieren (Hart 1997; Banchereau and Steinman 1998). Vorarbeiten haben ergeben, dass Serotonin die Zytokinsekretion von dendritischen Zellen beeinflusst: In LPS-gereiften dendritischen Zellen bewirkte Serotonin über die Gs-Protein gekoppelten 5-HT4- und 5-HT7-Rezeptoren einen Anstieg des intrazellulären cAMPs. Die Freisetzung von IL-1β und IL-8 war gesteigert, während die Sekretion von TNF-α und IL-12p70 inhibiert wurde (Idzko, Panther et al. 2004). IL-12 fördert die Differenzierung von naiven CD4+-T-Helferzellen zu Th1Zellen und unterdrückt die Synthese von Th2-typischen Zytokinen (Trinchieri and Scott 1995). In anderen Arbeiten konnte nachgewiesen werden, dass verschiedene Substanzen, wie beispielsweise Adenosin und Histamin, die über eine Erhöhung des intrazellulären cAMP-Spiegels die Produktion von IL-12 durch dendritische Zellen hemmen, eine Th2Differenzierung begünstigen und eine Th1-Polarisieung supprimieren (Idzko, la Sala et al. 2002; Panther, Corinti et al. 2003). Somit liegt die Beteiligung des cAMP-Signalwegs an der Induktion einer Th2-Antwort durch Serotonin nahe. Dendritische Zellen können Serotonin aus der Umgebung über einen Serotoninspezifischen Transporter (SERT, 5-HTT) aufnehmen. Dieses wird in LAMP+-Vesikeln gespeichert und durch Ca2+-abhängige Exozytose freigesetzt (O'Connell, Wang et al. 2006). Auf T-Lymphozyten konnten verschiedene 5-HT-Rezeptoren nachgewiesen werden. Aktivierte T-Zellen exprimieren vor allem 5-HT1A-, 5-HT1B- und 5-HT2A-Rezeptoren 48 (Aune, McGrath et al. 1993; Aune, Golden et al. 1994; O'Connell, Wang et al. 2006), naive T-Zellen besonders 5-HT2-, 5-HT3- und 5-HT7-Rezeptoren (Ameisen, Meade et al. 1989; Meyniel, Khan et al. 1997; O'Connell, Wang et al. 2006). Dendritische Zellen könnten dadurch Serotonin, welches sie bei der Stimulation über SERT (5-HTT) aufgenommen haben, bei der DC-T-Zell-Interaktion sezernieren. Auf diese Weise könnte Serotonin direkt an 5-HT-Rezeptoren der T-Zellen binden und somit die T-Zell-Proliferation und die T-ZellDifferenzierung beeinflussen (O'Connell, Wang et al. 2006). Durch unseren Versuchsansatz mit der Co-Kultivierung von mit Serotonin-stimulierten von Monozyten abgeleiteten dendritischen Zellen und naiven CD4+CD45RA+ T-Zellen können wir daher eine direkte Wirkung von Serotonin auf T-Zellen nicht vollständig ausschließen. In einer anderen Arbeit wurde gezeigt, dass die Hemmung der 5-HT-Synthese oder die Blockade des 5-HT1A-Rezeptors bei T-Zellen zur Erhöhung des intrazellulären cAMPSpiegels und zur Reduktion der INF-γ- und die IL-2-Produktion führt (Aune, Golden et al. 1994). Serotonin müsste auf Grund dieser Ergebnisse über die Bindung an den 5-HTR1A zu einer Zunahme der INF-γ-Sekretion durch T-Zellen führen. In unserer Untersuchung wurde aber eine verminderte Ausschüttung von INF-γ bei den Co-Kulturen mit unreifen oder LPS-gereiften von Monozyten abgeleiteten dendritischen Zellen und naiven CD4+CD45RA+ T-Zellen bei Serotoninkonzentrationen von 10-3 und 10-4 nachgewiesen. Bei einem Serotoninspiegel von 10-5 und 10-6 kam es zu einer verstärkten INF-Sekretion. Das deutet darauf hin, dass in unserem Versuchsansatz nicht nur die Bindung von Serotonin an 5-HTR1A von T-Zellen zu einer veränderten Sekretion von INF-γ führt, sondern stattdessen die Aktivierung von 5-HT-Rezeptoren auf dendritischen Zellen eine reduzierte Freisetzung von INF-γ bei der DC-T-Zell-Interaktion bei Serotoninkonzentrationen 10-3 und 10-4 zur Folge hat. Bei Serotonindosen von 10-5 und 10-6 könnte die vermehrte Bindung von Serotonin an 5-HTR1A auf T-Zellen überwiegen beispielsweise aufgrund einer höheren Rezeptoraffinität. Verminderung der endogenen 5-HT-Synthese führte in verschieden Arbeiten zu einer Schwächung der T-Zell-Proliferation (Aune, McGrath et al. 1993; Aune, Golden et al. 1994; O'Connell, Wang et al. 2006). Aune, Léon-Ponte et al stimulierten T-Zellen mit PCPA, um die endogene Serotoninsynthese zu supprimieren. Dies führte zu einer Schwächung der T-Zell-Proliferation, welche durch Zugabe von Serotonin wieder aufgehoben werden konnte. Mössner et al berichteten jedoch, dass exogenes Serotonin die T-Zell-Proliferation ausgelöst durch die Stimulation mit Con A, PHA oder LPS, unterdrückt (Mossner and 49 Lesch 1998). Dieser Effekt wurde bei den Serotoninkonzentrationen zwischen 100 µM und 1 mM gesehen. Die Autoren gingen aber davon aus, dass diese Eigenschaft von Serotonin keine Relevanz für das Immunsystem habe, da sie nur bei unphysiologisch hohen Serotoninspiegeln zu beobachten waren. Bei pathologischen Bedingungen wie Entzündung, Ischämie oder Thrombose konnte ein Anstieg der extrazellulären Konzentration von Serotonin auf 3 µM nachgewiesen werden (Mossner and Lesch 1998). Diese Serotoninkonzentration wäre zu gering, um eine Reaktion auslösen zu können. Die Ergebnisse von Aune, Léon-Ponte et al zeigten, dass Serotonin eine wichtige Rolle bei der T-Zell-Proliferation spielt. Dies konnten wir durch unsere Arbeit nur zum Teil bestätigen. In den Co-Kulturen mit Serotonin-stimulierten, LPS-gereiften von Monozyten abgeleiteten dendritischen Zellen kam es zu einer gesteigerten Zytokinausschüttung von IL-5 und IL13, welche auf eine verstärkte Proliferation der naiven CD4+CD45RA+ T-Zellen zurückzuführen sein könnte. Die Sekretion von INF-γ wurde jedoch dosisabhängig bei einer Serotoninkonzentration von 10-3 und 10-4 gehemmt. Daher könnten noch andere Faktoren die Zytokinsekretion bei der DC / T-Zell-Interaktion beeinflussen. Des Weiteren ist zu beachten, dass in den Arbeiten von unterschiedlichen Versuchsansätzen ausgegangen wurde. Aune et al kultivierten naive T-Zellen mit IL-2, Léon-Ponte et al mit IL-12. Bei der Stimulation naiver T-Zellen mit IL-2 oder IL-12 wird eine Th1-Polarisation begünstigt, und es entwickeln sich Th1-Zellen. Bei unserem Versuchsansatz kultivierten wir naive CD4+CD45RA+ T-Zellen mit Serotonin-stimulierten von Monozyten abgeleiteten dendritischen Zellen. Aufgrund der Zytokinsekretion gingen wir davon aus, dass eine Th2Differenzierung der naiven CD4+CD45RA+ T-Zellen stattgefunden hat. Dies könnte bedeuten, dass Serotonin einen unterschiedlichen Einfluss auf die T-Zell-Proliferation abhängig von der Differenzierung der T-Zellen ausübt. 5.3 Bedeutungen der Ergebnisse im Kontext der asthmatischen Entzündungsreaktion Die Zytokine INF-γ, IL-5 und IL-13 spielen eine wichtige Rolle bei der Pathophysiologie des Asthmas bronchiale (Yasruel, Humbert et al. 1997; Busse and Lemanske 2001; Kips 2001; Larche, Robinson et al. 2003). INF-γ gehört zu der Gruppe der Th1-Zytokine zusammen mit IL-2, IL-12 und IL-18. In verschiedenen Tiermodellen konnte belegt 50 werden, dass die Freisetzung der Th1-Zytokine beim allergischen Asthma bronchiale vermindert ist. Außerdem wirkt INF-γ inhibitorisch auf die Entstehung einer Th2-Antwort. IL-5 und IL-13 zählen wie IL-4 zu den Th2-Zytokinen. Diese werden bei der asthmatischen Entzündungsreaktion vermehrt sezerniert (Kips 2001). IL-5 veranlasst bei eosinophilen Granulozyten die Differenzierung, die Proliferation, die Chemotaxis und den Übergang in einen aktivierten Phänotyp (Lopez, Sanderson et al. 1988; Owen, Rothenberg et al. 1989; Karlen, De Boer et al. 1998; O'Connell, Wang et al. 2006). IL-13, welches Ähnlichkeiten zu IL-4 aufweist, hat die Fähigkeit eosinophile Granulozyten zu aktivieren und deren Überleben zu verlängern (Luttmann, Knoechel et al. 1996). Weiterhin veranlasst IL-13 bei B-Zellen einen Wechsel der Immunglobulin-Klassen-Produktion zu Gunsten von IgE (Kips 2001). In verschieden Mausmodellen konnte gezeigt werden, dass INF-γ die Entwicklung einer Antigen-induzierten Eosinophilie in den Atemwegen und eine Hyperreaktivität der Atemwege verhindert (Iwamoto, Nakajima et al. 1993; Kohen, Metcalf et al. 1996; Lack, Bradley et al. 1996). In einem weiteren Mausmodell konnte INF-γ zusammen mit Th1Zellen die Schleimproduktion in den Atemwegen hemmen (Cohn, Homer et al. 1999). Für IL-5 wurde nachgewiesen, dass die Expression von IL-5-mRNA in der Atemwegssschleimhaut mit dem Auftreten von klinischen Symptomen bei Asthma bronchiale korreliert (Yasruel, Humbert et al. 1997). In unterschiedlichen Experimenten mit Mäusen konnte beobachtet werden, dass IL-5 eine Eosinophilie in den Atemwegen induziert und eine Atemwegshyperreagibilität auslöst (Foster, Hogan et al. 1996; Hogan, Matthaei et al. 1998). IL-13 veranlasste zusammen mit IL-4 eine vermehrte Schleimsekretion und den Umbau von Gewebsstrukturen der Atemwegswand in verschiedenen Untersuchungen (Kopf, Le Gros et al. 1993; Grunig, Warnock et al. 1998; Wills-Karp, Luyimbazi et al. 1998; Dabbagh, Takeyama et al. 1999; Zhu, Homer et al. 1999). INF-γ, IL-5 und IL-13 können nicht nur auf Grund ihrer Eigenschaften die Pathophysiologie des Asthmas bronchiale gut erklären, sondern bei Patienten mit Asthma bronchiale wurden ebenfalls erhöhte Konzentrationen der Th2-Zytokine wie IL-5 und IL-13, sowie ein verminderter Spiegel der Th1-Zytokine wie beispielsweise INF-γ nachgewiesen (Monge, Palop et al. 1993; Busse and Lemanske 2001; Kips 2001). Es wurde schon lange vermutet, dass es einen Zusammenhang zwischen allergischem Asthma bronchiale und Serotonin gibt, unter anderem weil Serotonin ein potenter Bronchokonstriktor ist (Hukovic, Kosak et al. 1956). Lechin et al konnten belegen, dass die Werte für Serotonin im Serum von symptomatischen Asthmatikern im Vergleich zu asymptomatischen Patienten deutlich erhöht sind (Matsuda, Ushio et al. 1997; Lechin, van 51 der Dijs et al. 2002). In verschiedenen Arbeiten wurde beobachtet, dass eine enge Korrelation zwischen dem klinischen Status von Patienten mit allergischem Asthma bronchiale und der freien Serotonin-Konzentration besteht (Lechin, van der Dijs et al. 1996; Dupont, Pype et al. 1999; Cazzola and Matera 2000; Lechin, van der Dijs et al. 2002). In einer Studie mit asthmatischen Kindern wurde festgestellt, dass die Gabe des Serotonin-up-take-Accelerators „Tianeptine“ (Stablon®) eine schnelle und drastische Abnahme der freien Serotonin-Konzentration zur Folge hat. Dies ging mit einer signifikanten Verbesserung der Lungenfunktion einher (Lechin, van der Dijs et al. 1998; Lechin, van der Dijs et al. 1998). Auch auf zellulärer Ebene konnten zahlreiche Effekte von Serotonin belegt werden. Lange Zeit war unklar, welcher Zelltyp beim Menschen für die gesteigerte Serotoninsekretion beim symptomatischen Asthmatiker verantwortlich ist. Heute weiß man, dass Serotonin vor allem von Mastzellen und Thrombozyten nach Allergenstimulation freigesetzt wird (Yoshida, Ohba et al. 2002). Das bei der Allergenprovokation freigesetzte Serotonin könnte unter anderem auch dendritische Zellen beeinflussen. In unserer Arbeit zeigten wir, dass dendritische Zellen abhängig von ihrem Reifestadium unterschiedliche membranständige 5-HT-Rezeptoren exprimieren. Durch Interaktion mit diesen könnte Serotonin die dendritischen Zellen direkt beeinflussen. Dendritische Zellen besitzen sowohl beim Sensibilisierungsprozess als auch bei der Aktivierung von pulmonalen CD4+ Th2-Zellen und der Induktion der Infiltration mit eosinophilen Granulozyten in der Pathophysiologie des allergischen Asthmas bronchiale eine Schlüsselfunktion (Lambrecht 2001; Sung, Rose et al. 2001; Eisenbarth, Piggott et al. 2003; Lambrecht and Hammad 2003). In einer Untersuchung konnte nachgewiesen werden, dass Serotonin bei unreifen dendritischen Zellen die Produktion der proinflammatorischen Zytokine IL-8 und IL-1β steigert, die bekanntermaßen eine Rolle bei Allergen-induzierten Asthamexazerbationen spielen. Ebenso zeigte sich, dass Serotonin bei mit LPS-gereiften dendritische Zellen über die Bindung an 5-HTR4 und 5-HTR7 die Bildung von cAMP bewirkt und die Freisetzung von IL-12 und TNF-α inhibiert (Idzko, Panther et al. 2004). In diesem Zusammenhang ist es von Bedeutung, dass in unterschiedlichen Arbeiten berichtete wurde, dass cAMP die IL-12-Produktion von dendritischen Zellen hemmt, die Th2-Polarisation begünstigt und die Th1-Differenzierung unterdrückt (Idzko, Panther et al. 2002; Panther, Corinti et al. 2003). Somit scheint, dass dendritische Zellen, die in Anwesenheit von Serotonin ausreifen, eine verminderte 52 Fähigkeit zur Typ1-Polarisierung naiver T-Zellen besitzen und dadurch die Entwicklung einer Th2-Antwort begünstigen. Diese Eigenschaften fördern auch die Entwicklung einer asthmatischen Entzündungsreaktion. Möglicherweise sind Serotoninrezeptoren auf dendritischen Zellen ein guter Angriffspunkt in der medikamentösen Therapie des allergischen Asthmas bronchiale für die Zukunft. 53 6 Zusammenfassung Serotonin ist nicht nur ein bekannter Neurotransmitter und ein vasoaktives Amin, sondern auch einer wichtiger Modulator des Immunsystems. Dendritische Zellen gelten als die potentesten antigenpräsentierenden Zellen. Nach Aufnahme von potentiellem Antigen wandern dendritische Zellen zu Lymphknoten, um mit naiven T-Zellen zu interagieren. Dies bewirkt eine Differenzierung beider Zelltypen. In T-Zellen führt es zur Aktivierung mit Zytokinproduktion und Proliferation, zur Toleranz, zur Anergie oder zur Apoptose. Dagegen werden in dendritischen Zellen die Zytokinproduktion, das Ausreifen und das Überleben reguliert. Durch Priming der T-Zellen kommt es zur Polarisierung der Immunantwort in Richtung Th0, Th1 oder Th2. In wiefern Serotonin über die Bindung von 5-HTR einen Einfluss auf die T-Zell-PrimingKapazität von dendritischen Zellen hat, wurde im Rahmen dieser Arbeit untersucht. Hierbei konnte der Nachweis von Serotoninrezeptor spezifischer mRNA von 5-HTR1B, 5HTR1E, 5-HTR2A, 5-HTR2B, 5HTR3, 5HTR4 und 5HTR7 in dendritischen Zellen erbracht werden. Bei 5-HTR1B, 5-HTR1E und 5-HTR2B nahm die Expression signifikant ab, während sie für 5-HTR4 und 5-HTR7 anstieg nach der Stimulation mit LPS. Dagegen wurde die Produktion für 5-HTR3 und für 5-HTR2A durch die Reifung nicht signifikant beeinflusst. Weiterhin konnte gezeigt werden, dass durch die Stimulation von dendritischen Zellen mit Serotonin und anschließenden Co-Kulturexperimenten mit naiven T-Zellen die Zytokinsekretion der DC-T-Zell-Interaktion beeinflusst wurde. Die Freisetzung von INF-γ war dosisabhängig vermindert, dagegen stieg sie bei IL-5 und IL-13 konzentrationsabhängig an. Dies bestätigt, dass Serotonin zu einer geschwächten Th1und eine verstärkten Th2-polarisierende Immunantwort führt. Schlussfolgernd lässt sich die Hypothese aufstellen, dass Serotonin eine wichtige Rolle bei der Aktivierung von dendritischen Zellen, der DC-T-Zell-Interaktion und der T-ZellPolarisierung bei chronisch-entzündlichen Atemwegserkrankungen wie beispielsweise beim allergischen Asthma bronchiale spielt. Der Einsatz von selektiven 5-HTR- Agonisten / Antagonisten könnte somit eine neue therapeutische Option bei der Behandlung dieser Erkrankungen darstellen. 54 7 Literaturverzeichnis Akbari, O., R. H. DeKruyff, et al. (2001). "Pulmonary dendritic cells producing IL-10 mediate tolerance induced by respiratory exposure to antigen." Nat Immunol 2(8): 725-31. Al-Alwan, M. M., R. S. Liwski, et al. (2003). "Cutting edge: dendritic cell actin cytoskeletal polarization during immunological synapse formation is highly antigen-dependent." J Immunol 171(9): 4479-83. Albert, P. R., N. Sajedi, et al. (1999). "Constitutive G(i2)-dependent activation of adenylyl cyclase type II by the 5-HT1A receptor. Inhibition by anxiolytic partial agonists." J Biol Chem 274(50): 35469-74. Ameisen, J. C., R. Meade, et al. (1989). "A new interpretation of the involvement of serotonin in delayed-type hypersensitivity. Serotonin-2 receptor antagonists inhibit contact sensitivity by an effect on T cells." J Immunol 142(9): 3171-9. Andersson, A., W. J. Dai, et al. (1998). "Early IFN-gamma production and innate immunity during Listeria monocytogenes infection in the absence of NK cells." J Immunol 161(10): 5600-6. Aune, T. M., H. W. Golden, et al. (1994). "Inhibitors of serotonin synthesis and antagonists of serotonin 1A receptors inhibit T lymphocyte function in vitro and cell-mediated immunity in vivo." J Immunol 153(2): 489-98. Aune, T. M., K. A. Kelley, et al. (1990). "Serotonin-activated signal transduction via serotonin receptors on Jurkat cells." J Immunol 145(6): 1826-31. Aune, T. M., K. M. McGrath, et al. (1993). "Expression of 5HT1a receptors on activated human T cells. Regulation of cyclic AMP levels and T cell proliferation by 5hydroxytryptamine." J Immunol 151(3): 1175-83. Bach, T., T. Syversveen, et al. (2001). "5HT4(a) and 5-HT4(b) receptors have nearly identical pharmacology and are both expressed in human atrium and ventricle." Naunyn Schmiedebergs Arch Pharmacol 363(2): 146-60. Baez, M., J. D. Kursar, et al. (1995). "Molecular biology of serotonin receptors." Obes Res 3 Suppl 4: 441S-447S. Balkwill, F. R. and F. Burke (1989). "The cytokine network." Immunol Today 10(9): 299304. Banchereau, J., F. Briere, et al. (2000). "Immunobiology of dendritic cells." Annu Rev Immunol 18: 767-811. 55 Banchereau, J. and R. M. Steinman (1998). "Dendritic cells and the control of immunity." Nature 392(6673): 245-52. Bard, J. A., J. Zgombick, et al. (1993). "Cloning of a novel human serotonin receptor (5HT7) positively linked to adenylate cyclase." J Biol Chem 268(31): 23422-6. Barnes, N. M. and T. Sharp (1999). "A review of central 5-HT receptors and their function." Neuropharmacology 38(8): 1083-152. Bell, D., J. W. Young, et al. (1999). "Dendritic cells." Adv Immunol 72: 255-324. Bellinghausen, I., P. Brand, et al. (2003). "Production of interleukin-13 by human dendritic cells after stimulation with protein allergens is a key factor for induction of T helper 2 cytokines and is associated with activation of signal transducer and activator of transcription-6." Immunology 108(2): 167-76. Bellini, A., E. Vittori, et al. (1993). "Intraepithelial dendritic cells and selective activation of Th2-like lymphocytes in patients with atopic asthma." Chest 103(4): 997-1005. Betz, M. and B. S. Fox (1991). "Prostaglandin E2 inhibits production of Th1 lymphokines but not of Th2 lymphokines." J Immunol 146(1): 108-13. Boguniewicz, M., R. J. Martin, et al. (1995). "The effects of nebulized recombinant interferon-gamma in asthmatic airways." J Allergy Clin Immunol 95(1 Pt 1): 133-5. Boguniewicz, M., L. C. Schneider, et al. (1993). "Treatment of steroid-dependent asthma with recombinant interferon-gamma." Clin Exp Allergy 23(9): 785-90. Boldin, M. P., I. L. Mett, et al. (1995). "Self-association of the "death domains" of the p55 tumor necrosis factor (TNF) receptor and Fas/APO1 prompts signaling for TNF and Fas/APO1 effects." J Biol Chem 270(1): 387-91. Brightling, C. E., P. Bradding, et al. (2002). "Mast-cell infiltration of airway smooth muscle in asthma." N Engl J Med 346(22): 1699-705. Busse, W. W. and R. F. Lemanske, Jr. (2001). "Asthma." N Engl J Med 344(5): 350-62. Cazzola, I. and M. G. Matera (2000). "5-HT modifiers as a potential treatment of asthma." Trends Pharmacol Sci 21(1): 13-6. Cella, M., D. Scheidegger, et al. (1996). "Ligation of CD40 on dendritic cells triggers production of high levels of interleukin-12 and enhances T cell stimulatory capacity: T-T help via APC activation." J Exp Med 184(2): 747-52. Choquet, D. and H. Korn (1988). "Dual effects of serotonin on a voltage-gated conductance in lymphocytes." Proc Natl Acad Sci U S A 85(12): 4557-61. Christodoulopoulos, P., L. Cameron, et al. (2001). "TH2 cytokine-associated transcription factors in atopic and nonatopic asthma: evidence for differential signal transducer and activator of transcription 6 expression." J Allergy Clin Immunol 107(4): 586-91. 56 Cloez-Tayarani, I., A. F. Petit-Bertron, et al. (2003). "Differential effect of serotonin on cytokine production in lipopolysaccharide-stimulated human peripheral blood mononuclear cells: involvement of 5-hydroxytryptamine2A receptors." Int Immunol 15(2): 233-40. Coeffier, E., D. Joseph, et al. (1994). "Role of interleukin-5 in enhanced migration of eosinophils from airways of immunized guinea-pigs." Br J Pharmacol 113(3): 749-56. Coffman, R. L., B. W. Seymour, et al. (1989). "Antibody to interleukin-5 inhibits helminthinduced eosinophilia in mice." Science 245(4915): 308-10. Cohn, L., R. J. Homer, et al. (1999). "T helper 1 cells and interferon gamma regulate allergic airway inflammation and mucus production." J Exp Med 190(9): 1309-18. Cooper, M. A., T. A. Fehniger, et al. (2004). "NK cell and DC interactions." Trends Immunol 25(1): 47-52. Corry, D. B., H. G. Folkesson, et al. (1996). "Interleukin 4, but not interleukin 5 or eosinophils, is required in a murine model of acute airway hyperreactivity." J Exp Med 183(1): 109-17. Coyle, A. J., F. Erard, et al. (1995). "Virus-specific CD8+ cells can switch to interleukin 5 production and induce airway eosinophilia." J Exp Med 181(3): 1229-33. Coyle, A. J., G. Kohler, et al. (1998). "Eosinophils are not required to induce airway hyperresponsiveness after nematode infection." Eur J Immunol 28(9): 2640-7. Coyle, A. J., S. Tsuyuki, et al. (1996). "Mice lacking the IFN-gamma receptor have impaired ability to resolve a lung eosinophilic inflammatory response associated with a prolonged capacity of T cells to exhibit a Th2 cytokine profile." J Immunol 156(8): 2680-5. Cravens, P. D. and P. E. Lipsky (2002). "Dendritic cells, chemokine receptors and autoimmune inflammatory diseases." Immunol Cell Biol 80(5): 497-505. Dabbagh, K., K. Takeyama, et al. (1999). "IL-4 induces mucin gene expression and goblet cell metaplasia in vitro and in vivo." J Immunol 162(10): 6233-7. Das, A. M., R. J. Flower, et al. (1997). "Eotaxin-induced eosinophil migration in the peritoneal cavity of ovalbumin-sensitized mice: mechanism of action." J Immunol 159(3): 1466-73. Davies, P., P. J. Bailey, et al. (1984). "The role of arachidonic acid oxygenation products in pain and inflammation." Annu Rev Immunol 2: 335-57. De Bie, J. J., P. A. Henricks, et al. (1998). "Modulation of airway hyperresponsiveness and eosinophilia by selective histamine and 5-HT receptor antagonists in a mouse model of allergic asthma." Br J Pharmacol 124(5): 857-64. De Smedt, T., M. Van Mechelen, et al. (1997). "Effect of interleukin-10 on dendritic cell maturation and function." Eur J Immunol 27(5): 1229-35. 57 de Vries, J. E. (1996). "Molecular and biological characteristics of interleukin-13." Chem Immunol 63: 204-18. Dichmann, S., H. Rheinen, et al. (2000). "Downregulation of platelet-activating factor responsiveness during maturation of human dendritic cells." J Cell Physiol 185(3): 394400. Dieu, M. C., B. Vanbervliet, et al. (1998). "Selective recruitment of immature and mature dendritic cells by distinct chemokines expressed in different anatomic sites." J Exp Med 188(2): 373-86. Dupont, L. J., J. L. Pype, et al. (1999). "The effects of 5-HT on cholinergic contraction in human airways in vitro." Eur Respir J 14(3): 642-9. Eglen, R. M., E. H. Wong, et al. (1995). "Central 5-HT4 receptors." Trends Pharmacol Sci 16(11): 391-8. Eisenbarth, S. C., D. A. Piggott, et al. (2003). "The master regulators of allergic inflammation: dendritic cells in Th2 sensitization." Curr Opin Immunol 15(6): 620-6. Eliseeva, L. S. and L. E. Stefanovich (1982). "[Specific binding of serotonin by blood leukocytes and peritoneal cells in the mouse]." Biokhimiia 47(5): 810-3. Erspamer, V. and B. Asero (1952). "Identification of enteramine, the specific hormone of the enterochromaffin cell system, as 5-hydroxytryptamine." Nature 169(4306): 800-1. Eum, S. Y., S. Haile, et al. (1995). "Eosinophil recruitment into the respiratory epithelium following antigenic challenge in hyper-IgE mice is accompanied by interleukin 5-dependent bronchial hyperresponsiveness." Proc Natl Acad Sci U S A 92(26): 12290-4. Faccioli, L. H., B. B. Vargaftig, et al. (1997). "Cytokines in the modulation of eosinophilia." Mem Inst Oswaldo Cruz 92 Suppl 2: 109-14. Farber, H. W. and D. J. Beer (1991). "Restricted secretion of a T-lymphocyte chemotactic cytokine by serotonin-stimulated cultured aortic endothelial cells." Circ Res 69(2): 257-65. Finocchiaro, L. M., E. S. Arzt, et al. (1988). "Serotonin and melatonin synthesis in peripheral blood mononuclear cells: stimulation by interferon-gamma as part of an immunomodulatory pathway." J Interferon Res 8(6): 705-16. Foon, K. A., S. M. Wahl, et al. (1976). "Serotonin-induced production of a monocyte chemotactic factor by human peripheral blood leukocytes." J Immunol 117(5 Pt 1): 154552. Foster, P. S., S. P. Hogan, et al. (1996). "Interleukin 5 deficiency abolishes eosinophilia, airways hyperreactivity, and lung damage in a mouse asthma model." J Exp Med 183(1): 195-201. 58 Freshney, N. W., L. Rawlinson, et al. (1994). "Interleukin-1 activates a novel protein kinase cascade that results in the phosphorylation of Hsp27." Cell 78(6): 1039-49. Fukao, T., S. Matsuda, et al. (2000). "Synergistic effects of IL-4 and IL-18 on IL-12dependent IFN-gamma production by dendritic cells." J Immunol 164(1): 64-71. Fukuda, T., M. Setoguchi, et al. (1991). "The antiemetic profile of Y-25130, a new selective 5-HT3 receptor antagonist." Eur J Pharmacol 196(3): 299-305. Geha, R. S. (1992). "Regulation of IgE synthesis in humans." J Allergy Clin Immunol 90(2): 143-50. Gerald, C., N. Adham, et al. (1995). "The 5-HT4 receptor: molecular cloning and pharmacological characterization of two splice variants." Embo J 14(12): 2806-15. Goppelt-Struebe, M. and M. Stroebel (1995). "Synergistic induction of monocyte chemoattractant protein-1 (MCP-1) by platelet-derived growth factor and interleukin-1." FEBS Lett 374(3): 375-8. Gordon, J. and N. M. Barnes (2003). "Lymphocytes transport serotonin and dopamine: agony or ecstasy?" Trends Immunol 24(8): 438-43. Gounni, A. S., B. Lamkhioued, et al. (2001). "Human neutrophils express the high-affinity receptor for immunoglobulin E (Fc epsilon RI): role in asthma." Faseb J 15(6): 940-9. Grakoui, A., S. K. Bromley, et al. (1999). "The immunological synapse: a molecular machine controlling T cell activation." Science 285(5425): 221-7. Gripenberg, J. (1976). "Inhibition of reserpine, guanethidine and imiparmine of the uptake of 5-hydroxytryptamine by rat peritoneal mast cells in vitro." Acta Physiol Scand 96(3): 407-16. Grunig, G., M. Warnock, et al. (1998). "Requirement for IL-13 independently of IL-4 in experimental asthma." Science 282(5397): 2261-3. Guermonprez, P., J. Valladeau, et al. (2002). "Antigen presentation and T cell stimulation by dendritic cells." Annu Rev Immunol 20: 621-67. Haczku, A., K. Takeda, et al. (1999). "Anti-CD86 (B7.2) treatment abolishes allergic airway hyperresponsiveness in mice." Am J Respir Crit Care Med 159(5 Pt 1): 1638-43. Haga, K., K. Inaba, et al. (1993). "The effects of orally administered Y-25130, a selective serotonin3-receptor antagonist, on chemotherapeutic agent-induced emesis." Jpn J Pharmacol 63(3): 377-83. Hagan, J. J., G. W. Price, et al. (2000). "Characterization of SB-269970-A, a selective 5HT(7) receptor antagonist." Br J Pharmacol 130(3): 539-48. 59 Hakonarson, H., N. Maskeri, et al. (1999). "Autocrine interaction between IL-5 and IL-1beta mediates altered responsiveness of atopic asthmatic sensitized airway smooth muscle." J Clin Invest 104(5): 657-67. Hamblin, M. W., C. R. Guthrie, et al. (1998). "Gs protein-coupled serotonin receptors: receptor isoforms and functional differences." Ann N Y Acad Sci 861: 31-7. Han, J., J. D. Lee, et al. (1994). "A MAP kinase targeted by endotoxin and hyperosmolarity in mammalian cells." Science 265(5173): 808-11. Hart, D. N. (1997). "Dendritic cells: unique leukocyte populations which control the primary immune response." Blood 90(9): 3245-87. Hart, D. N. and T. C. Prickett (1993). "Intercellular adhesion molecule-2 (ICAM-2) expression on human dendritic cells." Cell Immunol 148(2): 447-54. Hegde, S. S., D. W. Bonhaus, et al. (1995). "RS 39604: a potent, selective and orally active 5-HT4 receptor antagonist." Br J Pharmacol 115(6): 1087-95. Hellstrand, K. and S. Hermodsson (1990). "Monocyte-mediated suppression of IL-2induced NK-cell activation. Regulation by 5-HT1A-type serotonin receptors." Scand J Immunol 32(2): 183-92. Hershey, G. K. (2003). "IL-13 receptors and signaling pathways: an evolving web." J Allergy Clin Immunol 111(4): 677-90; quiz 691. Herz, U., H. Renz, et al. (2004). "Animal models of type I allergy using recombinant allergens." Methods 32(3): 271-80. Hogan, S. P., A. Koskinen, et al. (1998). "Interleukin-5-producing CD4+ T cells play a pivotal role in aeroallergen-induced eosinophilia, bronchial hyperreactivity, and lung damage in mice." Am J Respir Crit Care Med 157(1): 210-8. Hogan, S. P., K. I. Matthaei, et al. (1998). "A novel T cell-regulated mechanism modulating allergen-induced airways hyperreactivity in BALB/c mice independently of IL-4 and IL-5." J Immunol 161(3): 1501-9. Hoyer, D., D. E. Clarke, et al. (1994). "International Union of Pharmacology classification of receptors for 5-hydroxytryptamine (Serotonin)." Pharmacol Rev 46(2): 157-203. Hoyer, D., J. P. Hannon, et al. (2002). "Molecular, pharmacological and functional diversity of 5-HT receptors." Pharmacol Biochem Behav 71(4): 533-54. Hoyer, D. and G. Martin (1997). "5-HT receptor classification and nomenclature: towards a harmonization with the human genome." Neuropharmacology 36(4-5): 419-28. Hukovic, S., R. Kosak, et al. (1956). "[Effects of adrenochrome and adrenoxyl on 5hydroxytryptamine-induced asthma.]." Allerg Asthma (Leipz) 2(4): 212-5. 60 Hwang, J., D. Yen, et al. (2003). "Interleukin-13 and interferon modulators of dendritic cell migration in the lungs." Chest 123(3 Suppl): 439S. Idzko, M., H. Hammad, et al. (2006). "Local application of FTY720 to the lung abrogates experimental asthma by altering dendritic cell function." J Clin Invest 116(11): 2935-44. Idzko, M., H. Hammad, et al. (2007). "Inhaled iloprost suppresses the cardinal features of asthma via inhibition of airway dendritic cell function." J Clin Invest 117(2): 464-72. Idzko, M., A. la Sala, et al. (2002). "Expression and function of histamine receptors in human monocyte-derived dendritic cells." J Allergy Clin Immunol 109(5): 839-46. Idzko, M., E. Panther, et al. (2002). "Sphingosine 1-phosphate induces chemotaxis of immature and modulates cytokine-release in mature human dendritic cells for emergence of Th2 immune responses." Faseb J 16(6): 625-7. Idzko, M., E. Panther, et al. (2004). "Characterization of the biological activities of uridine diphosphate in human dendritic cells: Influence on chemotaxis and CXCL8 release." J Cell Physiol 201(2): 286-93. Idzko, M., E. Panther, et al. (2004). "The serotoninergic receptors of human dendritic cells: identification and coupling to cytokine release." J Immunol 172(10): 6011-9. Iezzi, G., K. Karjalainen, et al. (1998). "The duration of antigenic stimulation determines the fate of naive and effector T cells." Immunity 8(1): 89-95. Iken, K., S. Chheng, et al. (1995). "Serotonin upregulates mitogen-stimulated B lymphocyte proliferation through 5-HT1A receptors." Cell Immunol 163(1): 1-9. Iwamoto, I., H. Nakajima, et al. (1993). "Interferon gamma regulates antigen-induced eosinophil recruitment into the mouse airways by inhibiting the infiltration of CD4+ T cells." J Exp Med 177(2): 573-6. Jackson, J. C., R. J. Cross, et al. (1985). "Influence of serotonin on the immune response." Immunology 54(3): 505-12. Jackson, J. C., R. F. Walker, et al. (1988). "Specific uptake of serotonin by murine macrophages." Life Sci 42(17): 1641-50. Jackson, M. B. and J. L. Yakel (1995). "The 5-HT3 receptor channel." Annu Rev Physiol 57: 447-68. Jacob, J. and D. Baltimore (1999). "Modelling T-cell memory by genetic marking of memory T cells in vivo." Nature 399(6736): 593-7. Jaffar, Z., K. Roberts, et al. (1999). "B7 costimulation is required for IL-5 and IL-13 secretion by bronchial biopsy tissue of atopic asthmatic subjects in response to allergen stimulation." Am J Respir Cell Mol Biol 20(1): 153-62. 61 Jankovic, B. D. (1989). "Neuroimmunomodulation: facts and dilemmas." Immunol Lett 21(2): 101-18. Jerman, J. C., S. J. Brough, et al. (2001). "Pharmacological characterisation of human 5HT2 receptor subtypes." Eur J Pharmacol 414(1): 23-30. Kalinski, P., P. L. Vieira, et al. (2001). "Prostaglandin E(2) is a selective inducer of interleukin-12 p40 (IL-12p40) production and an inhibitor of bioactive IL-12p70 heterodimer." Blood 97(11): 3466-9. Karlen, S., M. L. De Boer, et al. (1998). "Biological and molecular characteristics of interleukin-5 and its receptor." Int Rev Immunol 16(3-4): 227-47. Kawashima, S., M. Hayashi, et al. (1998). "Serotonin derivative, N-(p-coumaroyl) serotonin, inhibits the production of TNF-alpha, IL-1alpha, IL-1beta, and IL-6 by endotoxinstimulated human blood monocytes." J Interferon Cytokine Res 18(6): 423-8. Kay, A. B. (2001). "Allergy and allergic diseases. First of two parts." N Engl J Med 344(1): 30-7. Kay, A. B. (2001). "Allergy and allergic diseases. Second of two parts." N Engl J Med 344(2): 109-13. Kips, J. C. (2001). "Cytokines in asthma." Eur Respir J Suppl 34: 24s-33s. Kohen, R., M. A. Metcalf, et al. (1996). "Cloning, characterization, and chromosomal localization of a human 5-HT6 serotonin receptor." J Neurochem 66(1): 47-56. Kopf, M., G. Le Gros, et al. (1993). "Disruption of the murine IL-4 gene blocks Th2 cytokine responses." Nature 362(6417): 245-8. Kuchroo, V. K., M. P. Das, et al. (1995). "B7-1 and B7-2 costimulatory molecules activate differentially the Th1/Th2 developmental pathways: application to autoimmune disease therapy." Cell 80(5): 707-18. Kupfer, A. and S. J. Singer (1989). "The specific interaction of helper T cells and antigenpresenting B cells. IV. Membrane and cytoskeletal reorganizations in the bound T cell as a function of antigen dose." J Exp Med 170(5): 1697-713. Kurata, H., H. J. Lee, et al. (1999). "Ectopic expression of activated Stat6 induces the expression of Th2-specific cytokines and transcription factors in developing Th1 cells." Immunity 11(6): 677-88. Kut, J. L., M. R. Young, et al. (1992). "Regulation of murine T-lymphocyte function by spleen cell-derived and exogenous serotonin." Immunopharmacol Immunotoxicol 14(4): 783-96. 62 Laberge, S., W. W. Cruikshank, et al. (1996). "Secretion of IL-16 (lymphocyte chemoattractant factor) from serotonin-stimulated CD8+ T cells in vitro." J Immunol 156(1): 310-5. Lack, G., K. L. Bradley, et al. (1996). "Nebulized IFN-gamma inhibits the development of secondary allergic responses in mice." J Immunol 157(4): 1432-9. Lambrecht, B. N. (2001). "Allergen uptake and presentation by dendritic cells." Curr Opin Allergy Clin Immunol 1(1): 51-9. Lambrecht, B. N., M. De Veerman, et al. (2000). "Myeloid dendritic cells induce Th2 responses to inhaled antigen, leading to eosinophilic airway inflammation." J Clin Invest 106(4): 551-9. Lambrecht, B. N. and H. Hammad (2003). "Taking our breath away: dendritic cells in the pathogenesis of asthma." Nat Rev Immunol 3(12): 994-1003. Lambrecht, B. N., B. Salomon, et al. (1998). "Dendritic cells are required for the development of chronic eosinophilic airway inflammation in response to inhaled antigen in sensitized mice." J Immunol 160(8): 4090-7. Lanzavecchia, A., G. Lezzi, et al. (1999). "From TCR engagement to T cell activation: a kinetic view of T cell behavior." Cell 96(1): 1-4. Lanzavecchia, A. and F. Sallusto (2000). "Dynamics of T lymphocyte responses: intermediates, effectors, and memory cells." Science 290(5489): 92-7. Larche, M., D. S. Robinson, et al. (2003). "The role of T lymphocytes in the pathogenesis of asthma." J Allergy Clin Immunol 111(3): 450-63; quiz 464. Launay, J. M., G. Birraux, et al. (1996). "Ras involvement in signal transduction by the serotonin 5-HT2B receptor." J Biol Chem 271(6): 3141-7. Lechin, F., B. van der Dijs, et al. (2002). "Severe asthma and plasma serotonin." Allergy 57(3): 258-9. Lechin, F., B. van der Dijs, et al. (1998). "Neuropharmacologic treatment of bronchial asthma with the antidepressant tianeptine: a double-blind, crossover placebo-controlled study." Clin Pharmacol Ther 64(2): 223-32. Lechin, F., B. van der Dijs, et al. (1998). "The serotonin uptake-enhancing drug tianeptine suppresses asthmatic symptoms in children: a double-blind, crossover, placebo-controlled study." J Clin Pharmacol 38(10): 918-25. Lechin, F., B. van der Dijs, et al. (1996). "Increased levels of free serotonin in plasma of symptomatic asthmatic patients." Ann Allergy Asthma Immunol 77(3): 245-53. 63 Lefort, J., C. M. Bachelet, et al. (1996). "Effect of antigen provocation of IL-5 transgenic mice on eosinophil mobilization and bronchial hyperresponsiveness." J Allergy Clin Immunol 97(3): 788-99. Limaye, A. P., J. S. Abrams, et al. (1990). "Regulation of parasite-induced eosinophilia: selectively increased interleukin 5 production in helminth-infected patients." J Exp Med 172(1): 399-402. Lipscomb, M. F. and B. J. Masten (2002). "Dendritic cells: immune regulators in health and disease." Physiol Rev 82(1): 97-130. Lopez, A. F., C. J. Sanderson, et al. (1988). "Recombinant human interleukin 5 is a selective activator of human eosinophil function." J Exp Med 167(1): 219-24. Loric, S., L. Maroteaux, et al. (1995). "Functional serotonin-2B receptors are expressed by a teratocarcinoma-derived cell line during serotoninergic differentiation." Mol Pharmacol 47(3): 458-66. Lovenberg, T. W., B. M. Baron, et al. (1993). "A novel adenylyl cyclase-activating serotonin receptor (5-HT7) implicated in the regulation of mammalian circadian rhythms." Neuron 11(3): 449-58. Luttmann, W., B. Knoechel, et al. (1996). "Activation of human eosinophils by IL-13. Induction of CD69 surface antigen, its relationship to messenger RNA expression, and promotion of cellular viability." J Immunol 157(4): 1678-83. Macatonia, S. E., N. A. Hosken, et al. (1995). "Dendritic cells produce IL-12 and direct the development of Th1 cells from naive CD4+ T cells." J Immunol 154(10): 5071-9. Matsuda, H., H. Ushio, et al. (1997). "Human platelets can initiate T cell-dependent contact sensitivity through local serotonin release mediated by IgE antibodies." J Immunol 158(6): 2891-7. Matthes, H., U. Boschert, et al. (1993). "Mouse 5-hydroxytryptamine5A and 5hydroxytryptamine5B receptors define a new family of serotonin receptors: cloning, functional expression, and chromosomal localization." Mol Pharmacol 43(3): 313-9. McFadden, E. R., Jr. and I. A. Gilbert (1992). "Asthma." N Engl J Med 327(27): 1928-37. McLellan, A. D., R. V. Sorg, et al. (1997). "T lymphocyte mediated regulation of costimulator molecule expression on human dendritic cells." Adv Exp Med Biol 417: 203-6. Meyniel, J. P., N. A. Khan, et al. (1997). "Identification of lymphocyte 5-HT3 receptor subtype and its implication in fish T-cell proliferation." Immunol Lett 55(3): 151-60. Minty, A., P. Chalon, et al. (1993). "Interleukin-13 is a new human lymphokine regulating inflammatory and immune responses." Nature 362(6417): 248-50. 64 Moller, G. M., S. E. Overbeek, et al. (1996). "Increased numbers of dendritic cells in the bronchial mucosa of atopic asthmatic patients: downregulation by inhaled corticosteroids." Clin Exp Allergy 26(5): 517-24. Monge, A., J. A. Palop, et al. (1993). "Novel antagonists of 5-HT3 receptors. Synthesis and biological evaluation of piperazinylquinoxaline derivatives." J Med Chem 36(19): 2745-50. Moriggl, R., C. Kristofic, et al. (1998). "Activation of STAT proteins and cytokine genes in human Th1 and Th2 cells generated in the absence of IL-12 and IL-4." J Immunol 160(7): 3385-92. Mossner, R. and K. P. Lesch (1998). "Role of serotonin in the immune system and in neuroimmune interactions." Brain Behav Immun 12(4): 249-71. Mullings, R. E., S. J. Wilson, et al. (2001). "Signal transducer and activator of transcription 6 (STAT-6) expression and function in asthmatic bronchial epithelium." J Allergy Clin Immunol 108(5): 832-8. Munder, M., M. Mallo, et al. (1998). "Murine macrophages secrete interferon gamma upon combined stimulation with interleukin (IL)-12 and IL-18: A novel pathway of autocrine macrophage activation." J Exp Med 187(12): 2103-8. Nakajima, H., I. Iwamoto, et al. (1992). "CD4+ T-lymphocytes and interleukin-5 mediate antigen-induced eosinophil infiltration into the mouse trachea." Am Rev Respir Dis 146(2): 374-7. Naughton, M., J. B. Mulrooney, et al. (2000). "A review of the role of serotonin receptors in psychiatric disorders." Hum Psychopharmacol 15(6): 397-415. Nelms, K., A. D. Keegan, et al. (1999). "The IL-4 receptor: signaling mechanisms and biologic functions." Annu Rev Immunol 17: 701-38. O'Connell, P. J., X. Wang, et al. (2006). "A novel form of immune signaling revealed by transmission of the inflammatory mediator serotonin between dendritic cells and T cells." Blood 107(3): 1010-7. Ohteki, T., T. Fukao, et al. (1999). "Interleukin 12-dependent interferon gamma production by CD8alpha+ lymphoid dendritic cells." J Exp Med 189(12): 1981-6. Okamura, H., H. Tsutsi, et al. (1995). "Cloning of a new cytokine that induces IFN-gamma production by T cells." Nature 378(6552): 88-91. Owen, W. F., M. E. Rothenberg, et al. (1989). "Interleukin 5 and phenotypically altered eosinophils in the blood of patients with the idiopathic hypereosinophilic syndrome." J Exp Med 170(1): 343-8. Paegelow, I., H. Werner, et al. (1985). "Influence of serotonin on lymphokine secretion in vitro." Int J Immunopharmacol 7(6): 889-96. 65 Panther, E., S. Corinti, et al. (2003). "Adenosine affects expression of membrane molecules, cytokine and chemokine release, and the T-cell stimulatory capacity of human dendritic cells." Blood 101(10): 3985-90. Pardi, R., L. Inverardi, et al. (1992). "Antigen-receptor complex stimulation triggers protein kinase C-dependent CD11a/CD18-cytoskeleton association in T lymphocytes." J Cell Biol 116(5): 1211-20. Patterson, S. (2000). "Flexibility and cooperation among dendritic cells." Nat Immunol 1(4): 273-4. Pfeifer, J. D., M. J. Wick, et al. (1993). "Phagocytic processing of bacterial antigens for class I MHC presentation to T cells." Nature 361(6410): 359-62. Prickett, T. C., J. L. McKenzie, et al. (1992). "Adhesion molecules on human tonsil dendritic cells." Transplantation 53(2): 483-90. Puddu, P., L. Fantuzzi, et al. (1997). "IL-12 induces IFN-gamma expression and secretion in mouse peritoneal macrophages." J Immunol 159(7): 3490-7. Raingeaud, J., S. Gupta, et al. (1995). "Pro-inflammatory cytokines and environmental stress cause p38 mitogen-activated protein kinase activation by dual phosphorylation on tyrosine and threonine." J Biol Chem 270(13): 7420-6. Ramamoorthy, S., J. D. Ramamoorthy, et al. (1995). "Regulation of the human serotonin transporter by interleukin-1 beta." Biochem Biophys Res Commun 216(2): 560-7. Reis e Sousa, C. and R. N. Germain (1995). "Major histocompatibility complex class I presentation of peptides derived from soluble exogenous antigen by a subset of cells engaged in phagocytosis." J Exp Med 182(3): 841-51. Roth, B. L., S. C. Craigo, et al. (1994). "Binding of typical and atypical antipsychotic agents to 5-hydroxytryptamine-6 and 5-hydroxytryptamine-7 receptors." J Pharmacol Exp Ther 268(3): 1403-10. Rothlein, R. and T. A. Springer (1986). "The requirement for lymphocyte functionassociated antigen 1 in homotypic leukocyte adhesion stimulated by phorbol ester." J Exp Med 163(5): 1132-49. Rouse, J., P. Cohen, et al. (1994). "A novel kinase cascade triggered by stress and heat shock that stimulates MAPKAP kinase-2 and phosphorylation of the small heat shock proteins." Cell 78(6): 1027-37. Sato, N., M. Sakamori, et al. (1992). "Antagonistic activity of Y-25130 on 5-HT3 receptors." Jpn J Pharmacol 59(4): 443-8. 66 Schoeffter, P. and C. Waeber (1994). "5-Hydroxytryptamine receptors with a 5-HT6 receptor-like profile stimulating adenylyl cyclase activity in pig caudate membranes." Naunyn Schmiedebergs Arch Pharmacol 350(4): 356-60. Schon-Hegrad, M. A., J. Oliver, et al. (1991). "Studies on the density, distribution, and surface phenotype of intraepithelial class II major histocompatibility complex antigen (Ia)bearing dendritic cells (DC) in the conducting airways." J Exp Med 173(6): 1345-56. Segal, D. M., J. D. Taurog, et al. (1977). "Dimeric immunoglobulin E serves as a unit signal for mast cell degranulation." Proc Natl Acad Sci U S A 74(7): 2993-7. Sharpe, A. H. and G. J. Freeman (2002). "The B7-CD28 superfamily." Nat Rev Immunol 2(2): 116-26. Shen, Y., F. J. Monsma, Jr., et al. (1993). "Molecular cloning and expression of a 5hydroxytryptamine7 serotonin receptor subtype." J Biol Chem 268(24): 18200-4. Shimoda, K., J. van Deursen, et al. (1996). "Lack of IL-4-induced Th2 response and IgE class switching in mice with disrupted Stat6 gene." Nature 380(6575): 630-3. Shortman, K. and Y. J. Liu (2002). "Mouse and human dendritic cell subtypes." Nat Rev Immunol 2(3): 151-61. Silverman, D. H., H. Wu, et al. (1985). "Muramyl peptides and serotonin interact at specific binding sites on macrophages and enhance superoxide release." Biochem Biophys Res Commun 131(3): 1160-7. Snijdewint, F. G., P. Kalinski, et al. (1993). "Prostaglandin E2 differentially modulates cytokine secretion profiles of human T helper lymphocytes." J Immunol 150(12): 5321-9. Starling, G. C., A. D. McLellan, et al. (1995). "Intercellular adhesion molecule-3 is the predominant co-stimulatory ligand for leukocyte function antigen-1 on human blood dendritic cells." Eur J Immunol 25(9): 2528-32. Steinman, R. M., J. C. Adams, et al. (1975). "Identification of a novel cell type in peripheral lymphoid organs of mice. IV. Identification and distribution in mouse spleen." J Exp Med 141(4): 804-20. Steinman, R. M. and Z. A. Cohn (1973). "Identification of a novel cell type in peripheral lymphoid organs of mice. I. Morphology, quantitation, tissue distribution." J Exp Med 137(5): 1142-62. Steinman, R. M., D. S. Lustig, et al. (1974). "Identification of a novel cell type in peripheral lymphoid organs of mice. 3. Functional properties in vivo." J Exp Med 139(6): 1431-45. Sternberg, E. M., J. Trial, et al. (1986). "Effect of serotonin on murine macrophages: suppression of Ia expression by serotonin and its reversal by 5-HT2 serotonergic receptor antagonists." J Immunol 137(1): 276-82. 67 Sternberg, E. M., H. J. Wedner, et al. (1987). "Effect of serotonin (5-HT) and other monoamines on murine macrophages: modulation of interferon-gamma induced phagocytosis." J Immunol 138(12): 4360-5. Sung, S., C. E. Rose, et al. (2001). "Intratracheal priming with ovalbumin- and ovalbumin 323-339 peptide-pulsed dendritic cells induces airway hyperresponsiveness, lung eosinophilia, goblet cell hyperplasia, and inflammation." J Immunol 166(2): 1261-71. Trinchieri, G. and P. Scott (1995). "Interleukin-12: a proinflammatory cytokine with immunoregulatory functions." Res Immunol 146(7-8): 423-31. Valitutti, S., M. Dessing, et al. (1995). "Sustained signaling leading to T cell activation results from prolonged T cell receptor occupancy. Role of T cell actin cytoskeleton." J Exp Med 181(2): 577-84. van der Pouw Kraan, T. C., L. C. Boeije, et al. (1995). "Prostaglandin-E2 is a potent inhibitor of human interleukin 12 production." J Exp Med 181(2): 775-9. Vieira, P. L., E. C. de Jong, et al. (2000). "Development of Th1-inducing capacity in myeloid dendritic cells requires environmental instruction." J Immunol 164(9): 4507-12. Wills-Karp, M., J. Luyimbazi, et al. (1998). "Interleukin-13: central mediator of allergic asthma." Science 282(5397): 2258-61. Wurch, T. and P. J. Pauwels (2000). "Coupling of canine serotonin 5-HT(1B) and 5-HT(1D) receptor subtypes to the formation of inositol phosphates by dual interactions with endogenous G(i/o) and recombinant G(alpha15) proteins." J Neurochem 75(3): 1180-9. Yasruel, Z., M. Humbert, et al. (1997). "Membrane-bound and soluble alpha IL-5 receptor mRNA in the bronchial mucosa of atopic and nonatopic asthmatics." Am J Respir Crit Care Med 155(4): 1413-8. Ying, S., G. Zhang, et al. (2006). "How much do we know about atopic asthma: where are we now?" Cell Mol Immunol 3(5): 321-32. Yoshida, A., M. Ohba, et al. (2002). "Accumulation of platelets in the lung and liver and their degranulation following antigen-challenge in sensitized mice." Br J Pharmacol 137(2): 146-52. Yoshimoto, T., H. Okamura, et al. (1997). "Interleukin 18 together with interleukin 12 inhibits IgE production by induction of interferon-gamma production from activated B cells." Proc Natl Acad Sci U S A 94(8): 3948-53. Young, M. R., J. L. Kut, et al. (1993). "Stimulation of splenic T-lymphocyte function by endogenous serotonin and by low-dose exogenous serotonin." Immunology 80(3): 395400. 68 Young, M. R. and J. P. Matthews (1995). "Serotonin regulation of T-cell subpopulations and of macrophage accessory function." Immunology 84(1): 148-52. Zhu, Z., R. J. Homer, et al. (1999). "Pulmonary expression of interleukin-13 causes inflammation, mucus hypersecretion, subepithelial fibrosis, physiologic abnormalities, and eotaxin production." J Clin Invest 103(6): 779-88. Zurawski, G. and J. E. de Vries (1994). "Interleukin 13, an interleukin 4-like cytokine that acts on monocytes and B cells, but not on T cells." Immunol Today 15(1): 19-26. 69 8 Danksagung Für meine Doktorarbeit schulde ich sehr vielen Menschen einen herzlichen Dank. Besonders möchte ich mich bei meinem Doktorvater PD Dr. Marco Idzko bedanken, denn er brachte mir sehr viel Geduld entgegen und sorgten mit wertvollen Ratschlägen für das Gelingen der Arbeit. Ein großer Dank geht aber auch an das Laborteam, Dr. Tobias Müller und PD Dr. Gernot Zissel, denn die Zusammenarbeit mit ihnen war ein Meilenstein bei der Erstellung meiner Doktorarbeit. Sie gaben mir mit ihrem fundierten Fachwissen viele Anregungen für meine wissenschaftliche Arbeit. Ohne ihr Wissen, ohne ihre Ideen und ihre Kritik wäre mein Forschungsprojekt niemals soweit gekommen. Zum Schluss sind noch alle freiwilligen Probanden zu erwähnen, ohne die keine Forschungsarbeit möglich gewesen wäre. Des Weiteren möchte ich mich bei meinen Eltern bedanken, ohne die ein Studium und eine Doktorarbeit niemals erreichbar gewesen wären. 70 9 Lebenslauf Die Seite 71 (Lebenslauf) enthält persönliche Daten. Sie sind deshalb nicht Bestandteil der Online-Veröffentlichung. 71
