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ANALYSE DER DIREKTEN ZYTOKINSIGNALE UND
DES INTERZELLULÄREN
MEMBRANPROTEINAUSTAUSCHS WÄHREND
DER AKTIVIERUNG VON ANTIGENSPEZIFISCHEN
T-ZELLEN IN VIVO
DISSERTATION
zur Erlangung des akademischen Grades
des Doktors der Naturwissenschaften
(Dr. rer. nat.)
an der Fakultät für Biologie
der Albert-Ludwigs-Universität Freiburg
vorgelegt von
Kerstin Rosenits
angefertigt am Institut für Medizinische Mikrobiologie und Hygiene
Freiburg im Breisgau
2010
Dekan:
Prof. Dr. Gunther Neuhaus
Promotionsvorsitzender:
Prof. Dr. Samuel Rossel
Doktorvater:
Prof. Dr. Stefan Martin
Betreuer:
Dr. Peter Aichele
Koreferent:
Prof. Dr. Hassan Jumaa
Drittprüfer:
Prof. Dr. Matthias Müller
Tag der Verkündigung des Prüfungsergebnisses: 03. März 2011
Inhaltsverzeichnis
1 ZUSAMMENFASSUNG
1
2 EINLEITUNG
3
2.1 DIREKTE ZYTOKINSIGNALE WÄHREND DER AKTIVIERUNG VON
ANTIGENSPEZIFISCHEN T-ZELLEN
3
2.1.1
T-Zellaktivierung
3
2.1.2
Pleiotrope Effekte von Typ I Interferonen
4
2.1.3
Direkte Wirkung von Typ I Interferonen auf T-Zellen in vivo
6
2.2 INTERZELLULÄRER MEMBRANPROTEINAUSTAUSCH WÄHREND DER
AKTIVIERUNG ANTIGENSPEZIFISCHER T-ZELLEN
8
2.2.1
Membranproteinaustausch zwischen Zellen des Immunsystems
9
2.2.2
Mechanismen des Transfers von Oberflächenproteinen zwischen Zellen
2.2.3
Funktionelle Konsequenzen des Membranproteinaustauschs zwischen Zellen
des Immunsystems
14
11
3 ZIELSETZUNG
17
4 MATERIALIEN UND METHODEN
19
4.1 MATERIALIEN
19
4.1.1
Versuchstiere
19
4.1.2
Viren und Bakterien
19
4.1.3
Zelllinien
20
4.1.4
Peptide
20
4.1.5
Puffer und Lösungen
21
4.1.6
Medien
21
4.1.7
Antikörper
22
4.1.8
Zytokine
23
4.2 METHODEN
23
4.2.1
Organaufarbeitung
23
4.2.2
Adoptiver T-Zelltransfer
23
4.2.3
Durchflusszytometrie
23
4.2.4
T-Zellproliferation mit CFSE
24
4.2.5
Serologische Analysen
24
I
4.2.6
Biotinylierung von Zielzellen
25
4.2.7
In vivo/in vitro Trogozytose
25
4.2.8
Statistische Analysen
25
5 ERGEBNISSE
26
5.1 DIREKTE ZYTOKINSIGNALE WÄHREND DER AKTIVIERUNG VON
ANTIGENSPEZIFISCHEN T-ZELLEN
5.1.1
Beschreibung des experimentellen Systems zur Untersuchung der direkten
Wirkung von Typ I Interferonen auf CD8 T-Zellen
26
26
5.1.2
Expansionsverhalten von Typ I Interferonrezeptor defizienten (IFNARKO) CD8
T-Zellen in vivo nach Infektion mit unterschiedlichen Pathogenen
27
5.1.3
Dominant-negativer Effekt des LCMV induzierten Zytokinmilieus auf die
Expansion von IFNARKO T-Zellen
28
5.1.4
Mögliche supprimierende Zytokine während einer LCMV Infektion
32
5.1.5
Etablierung eines experimentellen Systems zur Trennung der
antigenspezifischen Stimulation von P14 T-Zellen vom pathogeninduzierten
Zytokinmilieu
37
IL-12 als rettendes Signal 3 für P14.IFNARKO T-Zellen
42
5.1.6
5.2 ANALYSE DES INTERZELLULÄREN MEMBRANPROTEINAUSTAUSCHS
WÄHREND DER AKTIVIERUNG VON ANTIGENSPEZIFISCHEN T-ZELLEN
45
5.2.1
Beschreibung des experimentellen Systems
45
5.2.2
Detektion von in vivo T-Zelltrogozytose mittels unterschiedlicher
Zelloberflächenmarker
46
5.2.3
In vivo T-Zelltrogozytose ist ein antigenspezifischer Prozess
51
5.2.4
In vivo T-Zelltrogozytose nach Kontakt zu APZs mit endogen exprimiertem
Antigen
52
5.2.5
T- und B-Zellen als APZs während einer T-Zelltrogozytose
55
5.2.6
Phänotypische Analyse von trogozytose-positiven und -negativen P14 T-Zellen
57
5.2.7
Trogozytose von Gedächtnis P14 T-Zellen im Vergleich zu naiven P14 T-Zellen
60
5.2.8
Analyse der Trogozytose nach antigenspezifischer Interaktion von T-Zellen mit
Tumorzellen
66
5.2.9
Nachweis von in vivo T-Zelltrogozytose im Kontext viraler Infektionen
6 DISKUSSION
75
6.1 TYP I INTERFERONE ALS SIGNAL 3 DER T-ZELLAKTIVIERUNG
6.1.1
69
75
Expansionsverhalten von P14.IFNARKO T-Zellen im Kontext unterschiedlicher
Erreger
75
II
6.1.2
Dominant-negatives Zytokinmilieu während einer LCMV Infektion
78
6.1.3
IL-12 als rettendes Signal 3 für P14.IFNARKO T-Zellen
80
6.2 INTERZELLULÄRER MEMBRANPROTEINAUSTAUSCH WÄHREND DER
AKTIVIERUNG ANTIGENSPEZIFISCHER T-ZELLEN
83
6.2.1
In vivo Modelle zur Detektion von T-Zelltrogozytose während einer
Immunantwort
83
6.2.2
In vivo T-Zelltrogozytose – Nachweis der Antigenspezifität
88
6.2.3
Aktivierungszustand trogozytose-positiver und -negativer T-Zellen
89
6.2.4
B- und T-Zellen als APZs während der in vivo T-Zelltrogozytose
90
6.2.5
In vivo Trogozytose von Gedächtnis und naiven P14 T-Zellen
91
6.2.6
T-Zelltrogozytose nach antigenspezifischer Interaktion von T-Zellen mit
Tumorzellen
95
In vivo T-Zelltrogozytose im Kontext viraler Infektionen
96
6.2.7
ABKÜRZUNGSVERZEICHNIS
100
LITERATURVERZEICHNIS
103
VERÖFFENTLICHUNGEN
114
III
1 Zusammenfassung
Im ersten Teil der Arbeit wurde die Bedeutung direkter Typ I Interferonsignale auf
antigenspezifische CD8 T-Zellen während der T-Zellaktivierung untersucht. Typ I Interferone
zählen neben IL-12 zu den Zytokinen, die T-Zellen ein drittes Signal vermitteln. Das Signal 3
ist neben Signal 1 (antigenspezifisches Signal) und Signal 2 (kostimulatorisches Signal)
wichtig für die Aktivierung der CD8 T-Zellen. In kürzlich erschienenen Studien wurde
gezeigt, dass Typ I Interferone im Kontext einer Infektion mit Lymphozytärem
Choriomeningitis Virus (LCMV) eine direkte Wirkung als Überlebenssignal auf CD8 TZellen besitzen. In der vorliegenden Arbeit konnte im Gegensatz zu einer LCMV Infektion
keine strikte Abhängigkeit der CD8 T-Zellen von einem direkten Typ I Interferonsignal für
die Expansion im Kontext von Infektionen mit Vaccinia Virus (VV), Vesikulärem Stomatitis
Virus (VSV) oder Listeria monozytogenes beobachtet werden. Somit stellt eine LCMV
Infektion in Bezug auf die Notwendigkeit von Typ I Interferonen als Überlebenssignal für
CD8 T-Zellen eine Besonderheit dar. Experimente zeigten, dass hierfür das durch die LCMV
Infektion
induzierte
dominant-negative
Zytokinmilieu
ausschlaggebend
ist.
Durch
Neutralisierung unterschiedlicher supprimierender Zytokine (IL-10, IFNγ, TNFα, TGFβ)
konnte in der vorliegenden Arbeit das LCMV induzierte dominant-negative Zytokinmilieu
jedoch
nicht
aufgehoben
werden.
Ein
Charakteristikum
des
LCMV
induzierten
Zytokinmilieus ist die hohe Expression von Typ I Interferonen in der Frühphase einer LCMV
Infektion. Da diese zur Unterdrückung der IL-12 Produktion führen, steht im Kontext einer
LCMV Infektion dieses inflammatorische Zytokin nicht als kompensatorisches Signal 3 für
CD8 T-Zellen zur Verfügung. Ermöglicht die experimentelle Anordnung eine IL-12
Produktion auch unter einer LCMV Infektion, so zeigte sich, dass CD8 T-Zellen nicht mehr
strikt von einem Typ I Interferon vermittelten Überlebenssignal abhängig sind.
Im zweiten Teil der Arbeit wurde ein in vivo System etabliert, mit dessen Hilfe der
Membranproteinaustausch zwischen antigenpräsentierenden Zellen und antigenspezifischen
T-Zellen unter physiologischen Bedingungen analysiert werden konnte. In der Literatur wird
diskutiert, dass ein solcher interzellulärer Membranproteinaustausch für die Regulation von
Immunantworten von Bedeutung sein könnte. Für den in vivo Nachweis eines
Membranproteintransfers auf T-Zellen wurden dabei unterschiedliche Marker verwendet
(biotinylierte Membranproteine, MHC Moleküle oder CD45 Moleküle). Es zeigte sich, dass
die T-Zellen, die Membranproteine von antigenpräsentierenden Zellen akquiriert hatten,
1
1 Zusammenfassung
stärker aktiviert waren als T-Zellen, auf denen keine transferierten Membranproteine
nachweisbar waren. Dies deutet darauf hin, dass mittels des etablierten Systems diejenigen TZellen detektiert werden können, die erst kürzlich in Interaktion mit antigenpräsentierenden
Zellen waren. Weitere Experimente zeigten, dass antigenspezifische Gedächtnis T-Zellen
wahrscheinlich aufgrund einer erhöhten Expression von Adhäsionsmolekülen und einem
daraus
resultierenden
stärkeren
Kontakt
mit
antigenpräsentierenden
Zellen
mehr
Membranproteine von antigenpräsentierenden Zellen akquirieren als naive antigenspezifische
T-Zellen. Des Weiteren ist das Ausmaß des Membranproteintransfers auf T-Zellen abhängig
von
der
Art
und
antigenpräsentierenden
der
Zelle.
Lokalisierung
Dies
(in
zeigten
den
lymphatischen
Experimente,
in
denen
Geweben)
ein
der
erhöhter
Membranproteintransfer von antigenbeladenen T-Zellen als von antigenbeladenen B-Zellen
auf antigenspezifische T-Zellen zu beobachten war. Mit Hilfe eines Tumormodells (A9
Lungenkarzinom) und unterschiedlichen viralen Infektionen (LCMV, Vaccinia Virus) konnte
zudem der Membranproteintransfer von antigenpräsentierenden Zellen auf antigenspezifische
T-Zellen im Kontext natürlich ablaufender Immunantworten erstmals in vivo gezeigt werden.
Zusätzlich konnte während der viralen Infektionen beobachtet werden, dass der
antigenspezifische Kontakt zwischen antigenpräsentierenden Zellen und antigenspezifischen
T-Zellen entscheidend für den interzellulären Membranproteintransfer war, und das
infektionsinduzierte Zytokinmilieu kaum Einfluss hatte.
2
2 Einleitung
2.1 Direkte Zytokinsignale während der Aktivierung von
antigenspezifischen T-Zellen
2.1.1 T-Zellaktivierung
CD8 T-Zellen sind Bestandteil der adaptiven Immunabwehr, die sich im Laufe der
Phylogenese neben dem angeborenen Immunsystem entwickelt hat. Die adaptive
Immunantwort wird zeitlich verzögert zur angeborenen Immunantwort aktiviert und ist für die
Ausbildung des immunologischen Gedächtnisses verantwortlich. Vorläufer T-Zellen werden
im Knochemark gebildet und reifen im Thymus heran. Nach Rearrangierung der TZellrezeptorgene und Durchlaufen von positiver und negativer Selektion verlassen die reifen
CD8 T-Zellen den Thymus und gelangen in die Peripherie. Nach Kontakt mit ihrem
spezifischen Antigen beginnt die Effektorphase, in der es zur Aktivierung, Proliferation und
klonalen Expansion sowie der Ausbildung von Effektorfunktionen der antigenspezifischen
CD8 T-Zellen kommt. Für diese Aktivierung der CD8 T-Zellen sind nach der klassischen
Hypothese zwei Signale notwendig. Das erste Signal wird über den T-Zellrezeptor (TZR)
vermittelt, der spezifische Peptid/MHC Klasse I Komplexe erkennt. Durch Interaktion
zwischen B7 Molekülen auf antigenpräsentierenden Zellen (APZs) und CD28, dem Rezeptor
für B7 Moleküle, auf T-Zellen kommt es zum zweiten Signal, der Kostimulation.
Von der Arbeitsgruppe um M. Mescher wurde postuliert, dass für die Aktivierung naiver CD8
T-Zellen noch ein drittes Signal notwendig ist. Dieses Signal wird bei CD8 T-Zellen durch
inflammatorische Zytokine wie Typ I Interferone und IL-12 übermittelt [1, 2]. Dabei
bestimmt das dritte Signal, ob stimulierte CD8 T-Zellen tolerant oder vollständig aktiviert
werden [3]. Die Notwendigkeit des dritten Signales wurde zunächst in in vitro Studien
nachgewiesen. Hierzu wurden aufgereinigte T-Zellen von TZR transgenen Mäusen mit
artifiziellen APZs (Mikrospheren mit Peptid/MHC Klasse I Molekülen und B7-1 Liganden)
stimuliert. Der Vorteil dieser künstlichen APZs ist, dass ihre Eigenschaften nicht durch
inflammatorische Zytokine bzw. Adhäsionsmoleküle beeinflusst werden. Dadurch wird
gewährleistet, dass durch Zugabe von inflammatorischen Zytokinen zur T-Zellkultur deren
direkte Effekte auf CD8 T-Zellen untersucht werden können. Die Ergebnisse zeigten, dass
3
2 Einleitung
naive TZR transgene CD8 T-Zellen nur nach Zugabe von IL-12 oder Typ I Interferonen
vollständig aktiviert werden konnten [1, 2] (Abb. 1).
Signal 3:
IL-12 oder
Typ I
Interferone
Fehlendes
Signal 3
Antigen - Signal 1
Kostimulation - Signal 2
Abb. 1: Signal 3 ist notwendig für Expansion und Überleben antigenspezifischer CD8 T-Zellen. Neben
Signal 1 (Antigen) und Signal 2 (Kostimulation) ist das Signal 3 notwendig für die Expansion und das Überleben
antigenspezifischer CD8 T-Zellen. Dieses Signal 3 kann dabei über IL-12 oder Typ I Interferone vermittelt
werden. Modifiziert nach J.S. Haring et al. [4].
2.1.2 Pleiotrope Effekte von Typ I Interferonen
Interferone sind hormonartige Moleküle, die in Typ I (IFNα/β), Typ II (IFNγ) und Typ III
(IFNλ) Interferone unterteilt werden. Typ I Interferone wurden 1957 zum ersten Mal als
Moleküle beschrieben, die mit der viralen Replikation interferieren [5, 6]. Dabei fanden A.
Isaacs und J. Lindenmann, dass embryonale Hühnerzellen in Gewebekultur nach Inkubation
mit inaktiviertem Influenza Virus eine Substanz in das Medium abgaben, die in der Lage war,
diese oder andere Zellen vor der Zerstörung durch Viren zu schützen. Diese Substanz wurde
von ihnen Interferon genannt. Typ I Interferone werden in geringen Mengen konstitutiv
produziert [7, 8]. Eine Infektion mit Parasiten, Viren oder Bakterien führt zur Induktion von
Typ I Interferonen. Bei einer Infektion mit Bakterien kommt es durch bakterielle Produkte
wie Lipopolysaccharid (LPS) und unmethylierter DNS (CpG Motive) [9, 10], welche über
eine Reihe von Toll-like Rezeptoren (TLRs) und dem Mannoserezeptor erkannt werden [11,
12], zur Produktion von Typ I Interferonen. Doppelsträngige RNS und bestimmte virale
Proteine sind Auslöser der Typ I Interferonproduktion bei viralen Infektionen [13, 14]. Von
infizierten Zellen wird zunächst IFNβ gebildet und sezerniert [15, 16]. IFNβ kann an den Typ
I Interferonrezeptor (IFNAR) der IFNβ produzierenden Zellen (autokrin) oder an den
Rezeptor benachbarter Zellen (parakrin) binden. Dadurch werden benachbarte Zellen in einen
antiviralen Status gebracht, selbst wenn diese nicht infiziert sind.
Der Typ I Interferonrezeptor ist ein heterodimerer, ubiquitär exprimierter Rezeptor, der aus
einer α- und einer β-Kette besteht [17, 18]. Die zytoplasmatischen Domänen der beiden
4
2 Einleitung
Ketten sind an Tyrosinkinasen der Janusfamilie (JAK1 und TYK2) gekoppelt. Nach Bindung
von Typ I Interferonen kommt es zur gegenseitigen Aktivierung der Januskinasen und
Phosphorylierung des Rezeptors. STAT1 und STAT2 (signal transducers and activators of
transcription) sind weitere Moleküle, die an der Signalkaskade beteiligt sind. Am Ende der
Signalkaskade steht die Aktivierung von über 200 IFN-stimulierter Genen (ISGs), die
Proteine kodieren, welche unter anderem bei der Hemmung der viralen Replikation
mitwirken. Außerdem führt die Signalkaskade zu einer de novo Synthese von IRF7
(interferon regulatory factor 7), der nach einer virusinduzierten Phosphorylierung sowohl den
Promotor des IFNβ Gens als auch die Promotoren der IFNα Gene aktiviert [19]. Dadurch
entsteht eine positive Rückkopplung, die eine massive Produktion von Typ I Interferonen
gewährleistet.
Die Effekte von Typ I Interferonen auf das Immunsystem sind vielfältig. Sie tragen zur
Kommunikation von Zellen der angeborenen und erworbenen Immunität bei und sind dadurch
indirekt an der Kontrolle von Infektionen beteiligt. Neben einer Erhöhung der MHC Klasse I
Expression beeinflussen Typ I Interferone die Proliferation und zytolytische Aktivität von
NK-Zellen [20]. Außerdem fördern Typ I Interferone die Reifung dendritischer Zellen. Dies
ist durch eine erhöhte Expression von CD80, CD86, CD40, CD83 und MHC Molekülen
nachweisbar [21, 22]. In einer Studie von Le Bon et al. konnte zudem gezeigt werden, dass
Typ I Interferone die Aktivierung von CD8 T-Zellen durch Kreuzpräsentation von Antigenen
(„Cross-Priming“) beeinflussen [23]. Als Kreuzpräsentation wird das Phänomen bezeichnet,
dass APZs durch Phagozytose aufgenommene extrazelluläre Antigene auf MHC Klasse I
Molekülen präsentieren können. Die Rolle von Typ I Interferonen bei der Kreuzpräsentation
von Antigenen auf APZs wurde dabei während einer Virusinfektion untersucht, in der die
CD8 T-Zellantwort gegen ein irrelevantes exogenes Antigen (Ovalbumin) analysiert wurde.
Hierzu wurde Mäusen mit defektem Typ I Interferonrezeptor (IFNARKO) oder Wildtyp
(WT) Mäusen nach LCMV Infektion, welche in WT Mäusen zu einer starken Typ I Interferon
Produktion führte, Ovalbumin injiziert. In WT Mäusen konnte eine Ovalbumin-spezifische
CD8 T-Zellantwort gemessen werden, die durch Kreuzpräsentation induziert wurde. Im
Gegensatz dazu waren in IFNARKO Mäusen keine Ovalbumin-spezifischen CD8 T-Zellen
detektierbar. Typ I Interferone üben auch auf die stetige proliferative Erneuerung und
Aufrechterhaltung der Gedächtnis T-Zellpopulation Einfluss aus. Dies wird durch eine von
Typ I Interferonen induzierte erhöhte Produktion von IL-15 durch APZs gewährleistet, die zu
einer „Bystander“ Proliferation (TZR unabhängigen Proliferation) von CD8 Gedächtnis T-
5
2 Einleitung
Zellen führt [24, 25]. Neben den proliferativen Effekten besitzen Typ I Interferone auch
antiproliferative Wirkungen auf Zellen des Immunsystems. So kommt es durch Typ I
Interferone direkt oder durch IL-10 produzierende regulatorische T-Zellen zur Inhibierung
von CD8 T-Zellen, wodurch die T-Zellpopulation quantitativ geschwächt wird („T cell
attrition“) [26, 27].
Aufgrund ihrer antiviralen, antiproliferativen und immunmodulatorischen Wirkungen finden
Typ I Interferone auch therapeutische Anwendungen. IFNα wird mittlerweile erfolgreich in
der Therapie von malignen Melanomen, follikulären Lymphomen und Leukämien eingesetzt.
IFNα kann direkt die Proliferation von Tumorzellen hemmen und die Onkogenexpression auf
Tumorzellen herunterregulieren. Außerdem induziert IFNα Tumorsuppressorgene und führt
zur Hochregulation von MHC Klasse I Molekülen [28]. Neben den direkten Effekten auf
Tumorzellen wirkt IFNα durch Förderung der Expansion von tumorspezifischen T- und/oder
B-Zellen und der Aktivierung dendritischer Zellen gegen Tumore [29, 30]. Zusätzlich wird
IFNα unter anderem aufgrund seiner antiviralen Wirkung [31] zusammen mit Ribavirin in der
Therapie von Hepatitis B und C Virus Infektionen eingesetzt. In der Therapie von multipler
Sklerose kommt es zur Verwendung von IFNβ [32], da IFNβ die Permeabilität der Blut-HirnSchranke herabsetzt und die Produktion inflammatorischer Zytokine inhibiert. Außerdem
induziert IFNβ die Produktion des antiinflammatorischen Zytokins IL-10 [33, 34]. Die
genauen Wirkmechanismen der Typ I Interferone in den jeweiligen Therapien sind jedoch
bisher noch nicht genau geklärt.
2.1.3 Direkte Wirkung von Typ I Interferonen auf T-Zellen in vivo
In Infektionsexperimenten konnte gezeigt werden, dass Typ I Interferonrezeptor (IFNAR)
defiziente Mäuse (IFNARKO) unterschiedliche Virusinfektionen nicht oder sehr viel
schlechter als Wildtyp (WT) Mäuse kontrollieren können [35, 36]. Da in IFNARKO Mäusen
alle Zellen einen defekten Typ I Interferonrezeptor aufweisen, konnte nicht unterschieden
werden, ob die mangelnde Kontrolle der viralen Infektionen auf das Fehlen der antiviralen
Wirkung von Typ I Interferonen, auf eine verminderte Antigenpräsentation oder auf eine
eingeschränkte Aktivität von IFNARKO T-Zellen zurückzuführen war. Somit kann in
IFNARKO Mäusen der direkte Einfluss von Typ I Interferonen auf Zellen der erworbenen
Immunität nicht von den indirekten Effekten auf z.B. APZs und NK-Zellen unterschieden
werden. Für die Analyse der direkten Wirkung von Typ I Interferonen auf CD8 T-Zellen im
6
2 Einleitung
Kontext einer LCMV Infektion wurde daher in Arbeiten von K. Murali-Krishna und
P. Aichele ein adoptives Transfermodell mit P14 TZR transgenen CD8 T-Zellen, welche das
LCMV Glykoproteinepitop GP33-41 (GP33) im Kontext von MHC Klasse I H-Db Molekülen
erkennen, verwendet. In dem Modell wurden Typ I Interferonrezeptor kompetente P14 TZellen (P14.WT) oder Typ I Interferonrezeptor defiziente P14 T-Zellen (P14.IFNARKO)
adoptiv in B6 Empfängermäuse transferiert. Mittels des kongenen Thymusmarkers Thy1
konnten die adoptiv transferierten P14 T-Zellen (Thy1.1+) in den B6 Empfängermäusen
(Thy1.2+) detektiert werden. Die Empfängermäuse bieten den adoptiv transferierten P14 TZellen eine Typ I Interferonsignal kompetente Umgebung. Dadurch gewährleistet der
adoptive Transfer die Analyse des direkten Effekts von Typ I Interferonen auf CD8 T-Zellen
z.B. nach Infektion der Rezipientenmäuse mit LCMV. In den Arbeiten von K. Murali-Krishna
und P. Aichele wurde gezeigt, dass P14.IFNARKO T-Zellen im Kontext einer LCMV
Infektion stark in ihrer Expansion eingeschränkt sind. Dabei sind Typ I Interferone nicht für
die initiale Zellteilung, sondern für das Überleben der expandierenden P14 T-Zellen wichtig
[37, 38]. In einer weiteren Arbeit der Gruppe um K. Murali-Krishna wurde gezeigt, dass Typ
I Interferone ebenfalls eine direkte Wirkung auf die klonale Expansion von CD4 T-Zellen
haben [39].
In Mäusen, die mit Virus infiziert oder mit TLR Liganden behandelt wurden, konnte eine
Lymphopenie (verminderte Anzahl von Lymphozyten) in Blut und Lymphe beobachtet
werden [40, 41]. Da eine virale Infektion bzw. Behandlung mit TLR Liganden zu einem
erhöhten Typ I Interferonspiegel in den Mäusen führt, wurde die Lymphopenie in
Zusammenhang mit Typ I Interferonen gebracht. In einer Arbeit von Kamphuis et al. wurde
der Einfluss von Typ I Interferonen auf die Lymphopenie genauer beschrieben [42]. In ihrer
Studie zeigten Kamphuis et al., dass es durch Infektion der Mäuse mit Vesikulärem Stomatitis
Virus (VSV) oder Behandlung mit den TLR Agonisten poly(I:C) bzw. R-848 zu einem
verstärkten Rollen und einer verstärkten Adhäsion der Lymphozyten auf Endothelzellen kam.
Dadurch blieben Lymphozyten am Endothel haften, was eine Lymphopenie im Blut zur Folge
hatte. Durch Verwendung Typ I Interferonrezeptor defizienter T- und B-Zellen konnte gezeigt
werden, dass ein direkter Effekt von Typ I Interferonen auf Lymphozyten Ursache der zu
beobachteten Lymphopenie ist. Die durch Typ I Interferone induzierte Lymphopenie konnte
auch in Patienten beobachtet werden, die eine Typ I Interferonbehandlung gegen Multiple
Sklerose oder chronische Hepatitis erhielten [43, 44].
7
2 Einleitung
Ein weiterer direkter Effekt von Typ I Interferonen auf T-Zellen wurde von der Gruppe um
D.F. Tough beschrieben. D.F. Tough und Kollegen untersuchten dabei in einem Modell, in
welchem das Antigen kreuzpräsentiert wird, die direkte Wirkung von Typ I Interferonen auf
T-Zellen. Hierfür analysierten sie die CD8 T-Zellantworten nach Behandlung von Mäusen mit
dem Proteinantigen OVA in Kombination mit bzw. ohne IFNα. Bis Tag 5 wurde kein
Unterschied in der Anzahl OVA spezifischer CD8 T-Zellen beobachtet. Danach kam es
jedoch zu einer Reduktion der OVA spezifischen CD8 T-Zellen, die ohne IFNα aktiviert
wurden. Da es in C57/BL6 Mäusen duch Immunisierung mit dem Proteinantigen OVA zur
Ausbildung weniger OVA spezifischer T-Zellen kommt, wurde ein adoptives Transfermodell
mit TZR transgenen T-Zellen verwendet. Diese transgenen T-Zellen exprimieren einen TZR,
der spezifisch für ein OVA-Peptid ist. Es zeigte sich, dass IFNα die Proliferationsphase von
OVA spezifischen CD8 T-Zellen verlängert und die Sensitivität der OVA spezifischen CD8
T-Zellen gegenüber IL-2 und IL-15 erhöht. Von anderen Gruppen wurde gezeigt, dass IL-2
und IL-15 während bestimmten viralen Infektionen zur effizienten Generierung einer CD8 TZellantwort beitragen [45-47]. Durch die Wirkung von IFNα wird nach einer Immunisierung
mit dem Proteinantigen OVA eine CD8 T-Zellantwort durch Kreuzpräsentation gewährleistet.
Um festzustellen, ob T-Zellen während der Kreuzpräsentation ein direktes IFNα Signal
erhalten erhalten, wurden Mäuse generiert, deren T-Zellen selektiv defizient für die
Expression des Typ I Interferonrezeptors waren. Es wurde deutlich, dass IFNα die
Expansionsphase von CD8 T-Zellen durch direkte Stimulation verlängerte. Somit konnte in
Zusammenhang mit der Kreuzpräsentation ein direkter Effekt von Typ I Interferonen auf CD8
T-Zellen nachgewiesen werden.
Die oben beschriebenen Studien belegen, dass in unterschiedlichen Situationen direkte
Effekte von Typ I Interferonen auf T-Zellen für die Immunantwort von Bedeutung sind.
2.2 Interzellulärer Membranproteinaustausch während der
Aktivierung antigenspezifischer T-Zellen
Der Transfer von Zellmembranfragmenten und assoziierten Proteinen zwischen Zellen des
Immunsystems wird Trogozytose genannt (nach dem griechischem Wort „trogo“ für
knabbern) [48]. Dieses Phänomen wurde erstmals zu Beginn der 1970er Jahre beschrieben.
Dabei beobachtete man, dass Proteine, die für einen Zelltyp spezifisch waren,
überraschenderweise in vitro und in vivo in geringen Mengen auch auf anderen Zellarten zu
8
2 Einleitung
finden waren. Es konnte unter anderem der Transfer von Immunglobulinen von B-Zellen auf
T-Zellen nachgewiesen werden [49, 50]. Außerdem wurde von Bona et al. der Antigentransfer
von Makrophagen auf T-Zellen [51] und von Lee et al. der Transfer von Fc-Rezeptoren von
Makrophagen auf T-Zellen [52] beschrieben. In Knochenmarkschimären konnte des Weiteren
die Aufnahme von MHC Klasse I und II Molekülen der Rezipientenzellen von den
Thymozyten des Donors gezeigt werden [53, 54]. Der MHC Klasse II Molekültransfer wurde
von Lorber et al. [55] auch in vitro zwischen Milzzellen und allogenen T-Zellklonen
beobachtet.
Mit der Entwicklung sensitiverer Nachweismethoden wurde das Phänomen der Trogozytose
detaillierter untersucht. Mittlerweile gibt es zahlreiche weitere Beispiele für den
Membrantransfer zwischen Zellen des Immunsystems. Dabei zeigt sich, dass es zwischen
unterschiedlichen Zellen des Immunsystems zu einem Austausch von Membrankomponenten
kommen kann. Die Trogozytose kann hierbei unterschiedliche funktionelle Auswirkungen auf
die entsprechenden Zellen haben.
2.2.1 Membranproteinaustausch zwischen Zellen des Immunsystems
Trogozytose ist für CD4 und CD8 T-Zellen, γδ T-Zellen, NK-Zellen, B-Zellen und
dendritische Zellen beschrieben. Dabei kommt es zwischen den Zellen zu einem Transfer von
Bestandteilen der Plasmamembran und assoziierten Oberflächenproteinen, während
zytoplasmatische Komponenten nicht ausgetauscht werden [56].
Membranproteintransfer auf T- und B-Zellen
Der interzelluläre Transfer von MHC Klasse I und II Molekülen von APZs auf T-Zellen ist
dabei das am besten untersuchte Beispiel für Trogozytose [55, 57, 58]. Weitere
Membrankomponenten, die auf T-Zellen übertragen werden können, sind kostimulatorische
Moleküle wie CD80 [59, 60] und OX40L [61]. Außerdem können Adhäsionsmoleküle wie
ICAM-1 auf T-Zellen transferiert werden [59]. Des Weiteren zeigten Domaica et al., dass
humane aktivierte T-Zellen nach einer kurzen Inkubation mit Melanomzellen in der Lage
waren NK-Zellen zu stimulieren, so dass es zur Degranulation und Produktion von IFNγ der
NK-Zellen kam [62]. Diese Fähigkeit erhielten die T-Zellen durch Akquirierung von
NKG2D- und NKp46-Liganden der Melanomzellen. In einer weiteren Arbeit von Espinosa et
al. wurde gezeigt, dass γδ T-Zellen Membranfragmente von Tumorzellen aufnehmen können
9
2 Einleitung
[63]. In älteren Studien aus den 1980er Jahren wurde ein bidirektionaler Austausch von
Oberflächenmolekülen zwischen APZs und T-Zellen postuliert [64-66]. Aktuelle Studien
belegen jedoch, dass es zwischen APZs und T-Zellen zu einem unidirektionalen
Membrantransfer von APZs auf T-Zellen kommt [59, 67, 68]. Diese gegensätzlichen
Ergebnisse sind wahrscheinlich auf die besseren Nachweismethoden, die heutzutage
angewandt werden, zurückzuführen.
Neben dem Transfer von Oberflächenproteinen der APZs auf T-Zellen wurde ebenfalls ein
Austausch von Oberflächenproteinen zwischen APZs und B-Zellen gezeigt. Hierbei können
B-Zellen membrangebundene Antigene von APZs aufnehmen [69] und diese auf MHC Klasse
II Molekülen präsentieren. Die Gemeinsamkeit von T- und B-Zellen in der Aufnahme von
Antigen besteht darin, dass in beiden Fällen die Ausbildung einer immunologischen Synapse
erforderlich ist. Bei den T-Zellen ist die Initalisierung der Trogozytose dabei zusätzlich von
einer Signalisierung über den antigenspezifischen T-Zellrezeptor oder von kostimulatorischen
Rezeptoren, wie z.B. CD28 abhängig [57, 59, 68, 70, 71]. Während die Trogozytose von CD4
und CD8 T-Zellen durch unterschiedliche Inhibitoren der Aktinpolymerisierung oder von
Kinasen, die im Signalweg eine wichtige Rolle spielen, teilweise oder komplett unterbunden
werden konnte, hatten diese Inhibitoren keinen Effekt auf die Trogozytose von B-Zellen [72].
Zusätzlich konnten Aucher et al. zeigen, dass bei tiefen Temperaturen (4 °C) kein Transfer
von Membranproteinen auf T-Zellen stattfand, während der Transferprozess bei B-Zellen
temperaturunabhängig war. Somit stellt die Trogozytose bei B-Zellen im Gegensatz zu TZellen keinen aktiven Prozess dar. Folglich sind die Anforderungen für den Membantransfer
auf B- und T-Zellen unterschiedlich.
Membranproteintransfer auf NK-Zellen
Ein Transfer von MHC Klasse I Molekülen von Zielzellen auf NK-Zellen ist ebenfalls
beschrieben worden. Dieser Transfer erfolgt nach Ausbildung einer inhibitorischen
immunologischen Synapse durch Interaktion der Killer Immunglobulin ähnlichen Rezeptoren
(KIRs) auf den NK-Zellen mit den entsprechenden MHC Klasse I Molekülen auf den
Zielzellen [73-75]. Vanherberghen et al. konnten weiterhin zeigen, dass es bei murinen und
humanen NK-Zellen zu einem Transfer von KIRs auf die Zielzellen kommt. Somit findet im
Falle einer Interaktion von NK- und Zielzellen ein bidirektionaler Membranaustausch statt
[76]. Solch ein bidirektionaler Austausch zwischen NK- und Zielzellen konnte auch für den
Transfer von NKG2D- und MIC-Molekülen gezeigt werden [77]. Neben MHC Klasse I
10
2 Einleitung
Molekülen und MIC-Molekülen können auch Membranfragmente [78] und Virusrezeptoren,
wie der Rezeptor für das Polio-Virus (CD155) [79] oder der Rezeptor für das Epstein-BarrVirus (CD21) [80], auf NK-Zellen übertragen werden.
2.2.2 Mechanismen des Transfers von Oberflächenproteinen zwischen Zellen
Gegenwärtig werden verschiedene Mechanismen diskutiert, die den Transfer von
Membranproteinen zwischen Zellen des Immunsystems erklären. Da Membranproteine durch
hydrophobe Interaktionen in der Zelloberfläche verankert sind, müssen diese Bindungen
aufgebrochen werden, um einen interzellulären Membrantransfer zu ermöglichen. Die
unterschiedlichen Möglichkeiten sind in Abb. 2 aufgeführt.
„Herausreißen“
Erstens könnte es zu einer Art „Herausreißen“ von Membranproteinen während einer
spezifischen Rezeptor/Ligand vermittelten Interaktion zwischen zwei Zellen kommen. Das
„Herausreißen“ von Membranproteinen könnte dabei durch die Internalisierung des Rezeptors
oder die beginnende Trennung der beiden Zellen zustande kommen (Abb. 2A). Für diese
Theorie gibt es bislang jedoch keine experimentellen Belege.
Proteolytische Spaltung
Zweitens
könnte
Trogozytose
auch
durch
die
enzymatische
Abspaltung
von
Oberflächenproteinen ermöglicht werden (Abb. 2B). Hiergegen sprechen jedoch Daten von
Huang et al. [57], Carlin et al. [73] und Vanherberghen et al. [76]. In diesen Studien wurde
mittels Western Blot Analysen von Zelllysaten gezeigt, dass intakte MHC Klasse I Moleküle
und NK-Zellrezeptoren übertragen werden. Des Weiteren zeigten die Studien, dass
intrazelluläre und extrazelluläre Proteindeterminanten transferiert werden. Im Falle einer
enzymatischen Abspaltung käme es jedoch nicht zu einem Transfer von intrazellulären
Proteinbestandteilen, weshalb dieser Mechanismus für das Phänomen der Trogozytose
ausgeschlossen werden kann.
11
2 Einleitung
B) Proteolytische Spaltung
A) „Herausreißen“
Zelle 1
Zelle 2
C) Vesikel
D) Membranbrücken
E) Membran-Nanotubuli
Abb. 2: Mechanismen für den interzellulären Membrantransfer zwischen Immunzellen. (A)
Membranproteine können duch „Herausreißen“ zwischen Immunzellen transferiert werden. (B) Extrazelluläre
Domänen von Membranproteinen können durch proteolytische Abspaltung von der Membran auf eine andere
Zelle übertragen werden. (C) Membrankomponenten können über Vesikel, z.B. Exosomen, zwischen Zellen
ausgetauscht werden. (D) Durch eine Membranfusion zwischen zwei Zellen kann es zur Ausbildung von
Membranbrücken kommen, die einen Proteintransfer ermöglichen können. (E) Nach der Trennung von Zellen,
können diese bis zu einer Entfernung von 50 µm über Membranausstülpungen, die Membran-Nanotubuli bilden,
verbunden bleiben. Über diese Tubuli kann es dann zum Transfer von Proteinen kommen. Modifiziert nach D.M.
Davis [81].
Vesikeltransfer
Eine
dritte
Erklärung
für
den
Austausch
von
Membrankomponenten
zwischen
unterschiedlichen Zellen könnte ein Vesikeltransfer, z.B. durch Exosomen, sein (Abb. 2C). In
Exosomen konnten MHC und kostimulatorische Moleküle, Adhäsionsmoleküle und
Hitzeschockproteine nachgewiesen werden [82]. Somit transportieren sie einige Moleküle, für
die bereits gezeigt wurde, dass sie interzellulär transferiert werden können. Exosomen
verfügen jedoch auch über einen hohen Anteil an Myosin und Aktin [83-85], Moleküle die
während der Trogozytose nicht auf Effektorzellen übertragen werden [56]. Weitere
Ergebnisse
aus
unterschiedlichen
Studien
belegen
ebenfalls,
dass
sich
der
Transfermechanismus bei Trogozytose vom Exosomen vermittelten Transfer unterscheidet. In
Arbeiten von Carlin et al. [73] und Vanherberghen et al. [76] wurde gezeigt, dass es während
12
2 Einleitung
einer Kokultivierung von NK- und Zielzellen zu einem Austausch von MHC Klasse I
Molekülen und KIRs zwischen den beiden Zellpopulationen kommt. Dieser Molekültransfer
fand jedoch nicht statt, wenn NK- und Zielzellen in vitro durch eine Membran getrennt
wurden, welche für Exosomen passierbar war. Dies deutet darauf hin, dass nicht die
Exosomen, sondern ein direkter Zell-Zell-Kontakt essentiell für den Molekültransfer
zwischen Zellen ist. Ein weiteres Argument, das gegen die Exosomenhypothese als
Mechanismus für die Trogozytose spricht, ist die Geschwindigkeit der Trogozytose. In oben
genannten Studien kam es innerhalb von Minuten zu einem Membranaustausch zwischen
NK- und Zielzellen. In weiteren Arbeiten konnte innerhalb von einer Stunde ein Transfer von
Oberflächenmarkern zwischen APZs und NK-Zellen [78] bzw. zwischen APZs und T-Zellen
[63] detektiert werden. Diese Ergebnisse weisen darauf hin, dass der Transfer von Proteinen
und Membranfragmenten ein schneller Prozess ist. Somit ist die Trogozytose schneller, als ein
Transfer,
der
über
Exosomen
stattfinden
könnte
[81].
Ein
interzellulärer
Membranproteinaustausch während der Trogozytose über Exosomen erscheint infolgedessen
unwahrscheinlich.
Membranbrücken
In der Gruppe um G.M. Griffiths [86] wurde ein vierter Mechanismus beschrieben, der für
den interzellulären Membranaustausch verantwortlich sein könnte. Diese Arbeitsgruppe
zeigte, dass es bei der Ausbildung einer immunologischen Synapse zwischen zytotoxischen
T-Zellen und APZs zu einer Membranfusion der beiden Zellen kommt. Diese Fusion führte zu
der Ausbildung von sogenannten Membranbrücken, welche die Arbeitsgruppe mittels
Elektronenmikroskopie nachweisen konnte. Über diese Brücken kann es theoretisch zu einem
Transfer von Membrankomponenten kommen (Abb. 2D). Weiterführende Studien, die diese
Theorie belegen, fehlen jedoch.
Membran-Nanotubuli
Onfelt et al. [87] stellten einen fünften Mechanismus zur Diskussion. In dieser Studie wird die
Verbindung von Immunzellen über sogenannte Membran-Nanotubuli beschrieben (Abb. 2E).
Bei
den
Membran-Nanotubuli
handelt
es
sich
um
miteinander
verbundene
Membranausstülpungen von Zellen, die sich nach einer kurzen Interaktion trennen [88].
Durch diese Membran-Nanotubuli können Zellen über eine längere Distanz (im Schnitt
50 µm) hinweg verbunden bleiben. Bisher fehlen aber noch Belege für einen Proteinaustausch
zwischen Immunzellen über Membran-Nanotubuli.
13
2 Einleitung
2.2.3 Funktionelle Konsequenzen des Membranproteinaustauschs zwischen
Zellen des Immunsystems
Die funktionellen Konsequenzen für Zellen, die durch Trogozytose Membranproteine
akquirieren, sind vielfältig. Die Auswirkungen wurden vor allem in vitro analysiert und
können stimulatorischer oder inhibitorischer Art sein. Durch Trogozytose kann es außerdem
auch zur Generierung von Zellen mit einem veränderten Phänotyp kommen.
Generierung von Zellen mit verändertem funktionellem Phänotyp
Zellen erhalten durch den Transfer eines nicht zelleigenen Rezeptors einen veränderten
Phänotyp. So können NK-Zellen, die den B-Zellmarker und EBV-Rezeptor CD21
aufgenommen haben in vitro mit EBV infiziert werden, wodurch die NK-Zellen transformiert
werden und ein NK-Zelllymphom ensteht [80]. Ein weiterer viraler Rezeptor, der mittels
Trogozytose transferiert werden kann, ist der HIV-Rezeptor CCR5. Durch diesen Transfer
werden Zellen, die zuvor CCR5-negativ waren, anfällig für eine HIV Infektion [89]. Des
Weiteren kann zwischen Tumorzellen das transmembrane Transportprotein P-Glykoprotein
ausgetauscht werden, mit dessen Hilfe viele chemotherapeutische Medikamente aus Zellen
herausgepumpt werden. Kommt es innerhalb eines Tumors zur Verbreitung dieses Proteins
zwischen Tumorzellen kann der Tumor resistent gegen Chemotherapeutika werden [90].
Stimulatorische Konsequenzen der Trogozytose für Zellen des Immunsystems
Zu stimulatorischen Konsequenzen der Trogozytose kommt es vornehmlich durch den
Transfer von Peptid/MHC-Komplexen und kostimulatorischen Molekülen von APZs auf TZellen. Zhou et al. [91] zeigten, dass es durch den interzellulären Transfer von CD80 und
Peptid-MHC Klasse II Komplexen von APZs auf antigenspezifische CD4 T-Zellen zu einer
anhaltenden Aktivierung der CD4 T-Zellen kommt, auch wenn sie nicht länger in Kontakt mit
APZs sind. Der Erwerb von CD80 Molekülen führte dabei zu einer gesteigerten Aktivität der
Transkriptionsfaktoren NFκB und AP1. Des Weiteren kam es bis zu 24 h nach Separation der
CD4 T-Zellen von den APZs zu einer anhaltenden Proliferation und Zytokinproduktion der
CD4 T-Zellen. Die Entfernung der erworbenen Moleküle führte dabei zu einer schnellen
Beendigung der Aktivierung und Proliferation der CD4 T-Zellen. Durch den Erwerb von
CD80 und Peptid/MHC Klasse II Komplexen konnten die aktivierten CD4 T-Zellen
außerdem mit antigenspezifischen naiven CD4 T-Zellen interagieren und diese aktivieren.
Somit kann der Transfer von CD80 und Peptid/MHC Klasse II Molekülen durch die
kontinuierliche Proliferation und Interaktion mit naiven T-Zellen zu einer maximalen
14
2 Einleitung
Aktivierung von T-Zellen führen, die unabhängig von der eingeschränkten Kontaktdauer mit
APZs ist. Dadurch kann eine optimale und schnellere klonale Expansion der CD4 T-Zellen
erreicht werden. Die mittels Trogozytose erworbene APZ Funktion der T-Zellen wurde in
weiteren Studien von Game et al. [92], Sabzevari et al. [60] und Xiang et al. [93] bestätigt.
Die Entfernung von spezifischen Peptid/MHC Komplexen auf APZs durch T-Zellen führt
dabei zu einer limitierten Verfügbarkeit dieser Komplexe für andere T-Zellen, die eine
geringere Affinität für das Antigen besitzen. Dadurch kommt es zwischen antigenspezifischen
T-Zellen mit unterschiedlicher Affinität für das Antigen zu einer Kompetition um die
Interaktion mit antigenbeladenen APZs. Infolge der Kompetition zwischen den T-Zellen kann
es zur Generierung von effizienteren Immunantworten kommen [71, 94].
Supprimierende Konsequenzen der Trogozytose für Zellen des Immunsystems
Der Erwerb von Peptid/MHC Komplexen durch T-Zellen kann jedoch nicht nur
stimulatorische, sondern auch suppressive Auswirkungen auf das Immunsystem haben. So
zeigten Cox et al. [95], dass CD4 T-Zellen durch den Erwerb von bystander Peptid/MHC
Klasse I Komplexen zum Ziel einer zytotoxischen T-Zellantwort werden, wenn sie auf
zytotoxische T-Zellen treffen, die einen spezifischen TZR für das präsentierte Peptid tragen.
Das Phänomen, dass sich T-Zellen gegenseitig lysieren, wird als „Fratricide“ bezeichnet.
Zwischen zytotoxischen T-Zellen kann es ebenfalls zu „Fratricide“ kommen, wenn eine
zytotoxische T-Zelle, die einen Peptid/MHC Klasse I Komplex von APZs aufgenommen hat,
auf eine antigenspezifische zytotoxische T-Zelle trifft. „Fratricide“ konnte jedoch nur bei sehr
hohen Antigenmengen nachgewiesen werden [57]. Da ungewiss ist, ob während einer
Infektion eine so hohe Antigenmenge in vivo vorliegt, ist es fraglich, ob diese Art der
Immunregulation eine Rolle während einer Infektion spielt. Eine weitere Studie, die einen
suppressiven Effekt der Trogozytose aufzeigt, stammt aus der Gruppe von H. Sabzevari.
Hierbei wurde gezeigt, dass der Erwerb des sogenannten Antigen-Präsentasoms (APS)
(=Komplex aus MHC und kostimulatorischen Molekülen) von Gedächtnis CD4 T-Zellen zur
Aktivierung von BAX/BAK in diesen Zellen führt. Dadurch gehen die Zellen in Apoptose
[96]. Somit spielt der Erwerb des APS eine wichtige Rolle für die Homöostase von
Gedächtnis T-Zellen. Die Immuantwort kann durch Trogozytose auch noch auf anderem Weg
supprimiert werden. LeMaoult et al. [97] zeigten, dass es zu einem Transfer von HLA-G,
einem Molekül mit starker inhibitorischer Funktion, von APZs auf T-Zellen kommen kann.
Die Effektor T-Zellen, die nach dem Transfer positiv für das HLA-G Molekül sind, werden
durch diesen Membranaustausch zu regulatorischen Zellen. Durch die Blockade der
15
2 Einleitung
aufgenommenen HLA-G Moleküle mit monoklonalem Antikörper kann der regulatorische
Phänotyp wieder aufgehoben werden. In einer weiteren in vitro Studie von Caumartin et al.
[98] wurde der Transfer von HLA-G Molekülen von Tumorzellen auf aktivierte NK-Zellen
gezeigt. Durch den Molekültransfer kam es bei den NK-Zellen zum Proliferationsstopp und
zum
Verlust
der zytolytischen
Aktivität.
Zusätzlich
wurden
die
NK-Zellen
zu
Suppressorzellen, die die zytotoxische Funktion anderer NK-Zellen inhibierten. Dadurch kam
es zum Schutz von Tumorzellen, die sensitiv gegenüber einer NK-Zell vermittelten Lyse sind.
Zu einer Reduktion der zytolytischen Aktivität von NK-Zellen kann es auch durch den
Erwerb von MHC Klasse I Molekülen von Tumorzellen [74] oder den interzellulären
Austausch von NKG2D- und MIC-Molekülen zwischen NK- und Zielzellen kommen [77].
In vivo Trogozytose
All diese Studien zeigen, dass der interzelluläre Membranproteintransfer zwischen Zellen des
Immunsystems Auswirkungen auf die Regulation von Immunantworten haben kann. Das
größte Problem stellt jedoch die in vivo Analyse der Trogozytose dar, da die Detektion der
Trogozytose in vivo, während einer stattfindenen Immunantwort, erschwert ist. Daher wurde
Trogozytose bisher nur in
wenigen
in
vivo
Studien
analysiert.
In
bestrahlten
Knochenmarkschimären wurde ein permanenter Molekülaustausch zwischen Donor- und
Rezipientenzellen detektiert. Dabei fand der Transfer wahrscheinlich unabhängig von einer
Immunantwort statt [54]. In einer weiteren Studie wurden alloreaktive TZR transgene doppelnegative (DN) regulatorische T-Zellen in SCID (severe combined immunodeficiency) Mäuse
transferiert. Hierbei konnte ebenfalls eine Trogozytose in vivo beobachtet werden [99].
Weitere Beispiele für in vivo Trogozytose wurden in TZR transgenen Mäusen, die einen
Transfer von antigenbeladenen DZs oder eine Peptid-Immunisierung erhielten, gezeigt [96,
100]. In einer weiteren Studie wurde eine hohe Anzahl voraktivierter TZR-transgener CD4 TZellen in Rezipientenmäuse transferiert, die mit Peptid immunisiert wurden [101]. Ein
Schwachpunkt all dieser in vivo Studien ist, dass in den experimentellen Ansätzen hohe
Frequenzen spezifischer T-Zellen vorliegen, die nicht der natürlich vorkommenden Frequenz
spezifischer T-Zellen entspricht. Daher ist es bisher noch nicht gelungen, den Einfluss der
Trogozytose auf die Regulation des Immunsystems in einem physiologischen in vivo System
zu analysieren.
16
3 Zielsetzung
Bei der antigenspezifischen Aktivierung von T-Zellen kommt es zu einer Interaktion
zwischen antigenpräsentierenden Zellen (APZs) und T-Zellen. Von der Arbeitsgruppe um
M. Mescher wurde postuliert, dass für die Aktivierung naiver T-Zellen drei Signale
erforderlich sind. Das erste Signal wird über den T-Zellrezeptor (TZR) vermittelt, der
spezifische Peptid/MHC Molekül Komplexe erkennt. Durch Interaktion zwischen B7
Molekülen auf APZs und CD28, dem Rezeptor für B7 Moleküle, auf T-Zellen kommt das
zweite Signal (Kostimulation) zustande. Das dritte Signal wird über inflammatorische
Zytokine (IL-12 und Typ I Interferone) vermittelt [1, 2]. Im ersten Teil der Arbeit wurde der
direkte Effekt von Typ I Interferonen auf CD8 T-Zellen nach antigenspezifischer Aktivierung
im Kontext unterschiedlicher Infektionen genauer untersucht. In Arbeiten von K. MuraliKrishna und P. Aichele konnte bereits nachgewiesen werden, dass es nach LCMV Infektion
zu einer stark eingeschränkten Expansion von Typ I Interferonrezeptor defizienten
(IFNARKO) CD8 T-Zellen kommt [37, 38]. Im Gegensatz dazu expandierten IFNARKO
CD8 T-Zellen nach antigenspezifischer Stimulation im Kontext einer Infektion mit
rekombinantem Vaccinia Virus, welches das LCMV Glykoproteinepitop GP33-41 (GP33)
exprimiert. Im Rahmen dieser Arbeit sollte untersucht werden, unter welchen Bedingungen
IFNARKO CD8 T-Zellen nach viralen oder bakteriellen Infektionen expandieren. Hierfür
wurden P14.WT und P14.IFNARKO T-Zellen in C57BL/6J Mäuse transferiert. Die
Rezipientenmäuse wurden anschließend mit verschiedenen Erregern, die das relevante GP33
Epitop exprimieren, infiziert. Des Weiteren sollten die Faktoren identifiziert werden, die
ausschlaggebend für das eingeschränkte Expansionsvermögen von IFNARKO CD8 T-Zellen
im Kontext einer LCMV Infektion sind. Dazu wurden in den Rezipientenmäusen
unterschiedliche supprimierende Zytokine neutralisiert und der Einfluss auf die Expansion
von P14.IFNARKO T-Zellen in Zusammenhang mit einer LCMV Infektion untersucht.
Außerdem
sollte
analysiert
werden,
ob
IFNARKO
CD8
T-Zellen
durch
ein
kompensatorisches IL-12 vermitteltes drittes Signal im Kontext einer LCMV Infektion
gerettet werden können.
Im zweiten Teil der Arbeit wurde der Membranproteinaustausch zwischen APZs und TZellen während einer antigenspezifischen Interaktion in vivo analysiert. In vorangegangenen
Studien wurde dieser interzelluläre Membranproteintransfer vor allem in vitro untersucht und
es liegen bisher nur vereinzelt in vivo Studien vor. In den in vivo Studien wurden allerdings
17
3 Zielsetzung
hohe
Frequenzen
von
antigenspezifischen
T-Zellen
verwendet,
die
nicht
einer
physiologischen Situation entsprechen [96, 99-101]. In der vorliegenden Arbeit sollte daher
ein in vivo System etabliert werden, mit dessen Hilfe der Membranproteinaustausch zwischen
APZs und antigenspezifischen T-Zellen unter physiologischen Bedingungen analysiert
werden kann. Hierzu wurden Mäuse generiert, die eine im physiologischen Bereich liegende
Anzahl antigenspezifischer T-Zellen (ca. 1 % der gesamten CD8 T-Zellen) besaßen. Der
interzelluläre Membranproteinaustausch sollte dabei im Kontext natürlich ablaufender
Immunantworten, wie anti-Tumor und anti-viraler Antworten, analysiert werden.
18
4 Materialien und Methoden
4.1 Materialien
4.1.1 Versuchstiere
C57BL/6J (B6) und BALB/c Mäuse werden von Janvier (Le Genest St-Isle, Frankreich)
bezogen. B6.SJL (CD45.1; B6.SJL-Ptprca/BoyAiTac) Mäuse stammen von Taconic
(Germantown, New York, USA). B6.Thy1.1-Mäuse (B6.PL-Thy1a) stammen von Jackson
Laboratory (Sacramento, Kalifornien, USA) und werden vor Ort gezüchtet. OT-1 TZRtransgene Mäuse (C57BL/6-Tg(TcraTcrb)1100Mjb/J), spezifisch für die Aminosäuren 257264 (= SIINFEKL) von Ovalbumin, stammen von Jackson Laboratory. P14 TZR-transgene
Mäuse (B6; D2-Tg(TcrLCMV)327Sdz/JDvsJ), spezifisch für die Aminosäuren 33-41
(= GP33) des Lymphozytären Choriomeningitis Virus (LCMV) [102] werden unter SPF
(specific pathogen free)-Bedingungen gezüchtet. IFNα-defiziente IFNARKO (B6.129S7Ifnar1tm1Agt) Mäuse [103] wurden zehnmal auf C57BL/6J Hintergrund zurückgekreuzt und
stammen von Dr. U. Kalinke (Twincore Forschungszentrum, Medizinische Hochschule
Hannover).
Diese
Mäuse
wurden
mit
P14
TZR-transgenen
Mäusen
gekreuzt
(P14.IFNARKO). H8 transgene Mäuse, die das GP33-Epitop ubiquitär unter dem MHC
Klasse I Promotor exprimieren [104], werden unter SPF-Bedingungen gezüchtet. IL-10
defiziente (IL10KO) Mäuse (B6.129P2-IL10tm1Cgn/J) und IFNγ defiziente (IFNγKO) Mäuse
(B6.129S7-Ifngtm1TS/J) stammen von Jackson Laboratory. Perforin defiziente (PKO) Mäuse
[105] stammen aus eigener Zucht.
Es werden Mäuse im Alter von 8-40 Wochen untersucht.
4.1.2 Viren und Bakterien
Der LCMV-WE Virusstamm wird wie beschrieben in L929-Fibroblasten vermehrt [106] und
stammt von Prof. F. Lehmann-Grube (Hamburg). Die LCMV-Mutante LCMV8.7 stammt von
Prof. H. Pircher (Freiburg).
Das rekombinante Vesikuläre Stomatits Virus (rVSVGP) wird in BHK Zellen kultiviert und
stammt von Prof. J. de la Torre (La Jolla, USA). rVSVGP exprimiert das LCMV Glykoprotein.
19
4 Materialien und Methoden
Das rekombinante Vaccinia Virus (rVVM2) und das Wild-Typ Vaccinia Virus (VV-WT)
stammen von Prof. S. Ehl (Freiburg). rVVM2 exprimiert das Respiratorische Syncytial Virus
(RSV) Protein M2. Von Prof. J. Yewdell (NIH, Bethesda, Maryland, USA) stammt das
rVVOVA, welches das OVA-Peptid exprimiert. Das rekombinante Vaccinia Virus (rVVGP)
stammt von Prof. D. Bishop (St. Giles, England). rVVGP exprimiert das LCMV Glykoprotein.
Vaccinia Virus wird in BSC-1 Zellen vermehrt.
Rekombinante Listeria monozytogenes (rListeriaGP33; Prof. H. Shen, Philadelphia, USA)
exprimieren das LCMV Glykoproteinepitop GP33. rListeriaGP33 werden in BHI Medium
kultiviert.
Rezipientenmäuse werden mit 200 PFU (plaque forming units) LCMV, 2x106 PFU VSV,
2x106 PFU VV bzw. 2x104 CFU (colony forming units) Listerien intravenös (i.v.) in die
laterale Schwanzvene infiziert.
4.1.3 Zelllinien
Die Zelllinie MC57 (Maus-Fibroblastenzellen) stammt aus dem Institut für Medizinische
Mikrobiologie und Hygiene Freiburg, Abteilung Immunologie.
Die Zelllinie 3LL-A9 (A9, Lewis Lungenkarzinomzellen) stammt von Prof. L. Eisenbach
(Weizmann Institut of Science, Rehovat, Israel) [107]. Die Zelllinie A9GP33 wurde im Institut
für Medizinische Mikrobiologie und Hygiene Freiburg, Abteilung Immunologie, etabliert
[108].
Die Zelllinie B16.F10 (B16, murine Melanomazelllinie) stammt ursprünglich von Prof. I.
Fidler [109]. Die Zelllinie B16GP33 wurde im Institut für Medizinische Mikrobiologie und
Hygiene Freiburg, Abteilung Immunologie, etabliert [110].
4.1.4 Peptide
Das LCMV Glykoproteinpeptid GP33 (AS 33-41, KAVYNFATM) und das Adenopeptid
E1A (AS 234-243, SGPSNTPPEI) wurden von Neosystem (Straßburg, Frankreich) bezogen.
20
4 Materialien und Methoden
4.1.5 Puffer und Lösungen
PBS
NaCl (150 mM), Na2HPO4·H2O (6,5 mM), KCL (2,7 mM), KH2PO4 (1,5 mM)
FACS-Puffer (für Einzelzellsuspension)
PBS ohne Ca2+ und Mg2+, 2 % hitzeinaktiviertes FKS, 0,2 % NaN3, pH 9
Blutpuffer (für Vollblut)
FACS-Puffer mit 10 U/ml Liquemin (Roche)
MACS-Puffer
PBS ohne Ca2+ und Mg2+, 0,5 % hitzeinaktiviertes FKS, 2 mM EDTA
Verdaulösung
PBS mit 0,1 % Kollgenase, 0,01 % Hyaluronidase, 0,002 % DNase I (außer PBS alles von
Sigma Aldrich, Steinheim, Deutschland)
4.1.6 Medien
IMDM-Kulturmedium:
IMDM-Grundmedium
(GibcoBRL,
Life
Technologies,
Gaithersburg)
mit
5%
hitzeinaktiviertem FKS, 100 U/ml P/S, 2 mM L-Gln
Lymphozyten-Kulturmedium:
IMDM-Kulturmedium mit 10 % FKS und 1 mM β-Mercaptoethanol
DMEM-Kulturmedium:
DMEM „high glucose“-Grundmedium (Biochrom, Berlin) mit 10 % hitzeinaktiviertem FKS,
100 U/ml P/S, 2 mM L-Gln
Selektionsmedium
21
4 Materialien und Methoden
DMEM-Kulturmedium mit 800 µg/ml (für A9GP33 Zellen) bzw. 200 µg/ml (für B16GP33
Zellen) G418 (Life Technologies, Gaithersburg, MD, USA).
4.1.7 Antikörper
Tab. 1: Antikörperliste
Antikörper
Klon
Verwendung
Firma
anti-CD8-APC
53-6.7
Durchflusszytometrie
eBioscience
anti-Thy1.1-pcP,-FITC,-PE
OX-7
Durchflusszytometrie
BD Biosciences
anti-Thy1.2-FITC
53-2.1
Durchflusszytometrie
eBioscience
Durchflusszytometrie
BioLegend, BD
Streptavidin-PE, -APC
Biosciences
anti-CD69-FITC, -PE
H1.2F3
Durchflusszytometrie
eBioscience
anti-IFNγ−ΑPC, −PE
XMG1.2
Durchflusszytometrie
eBioscience
anti-TNFα−PE
MP6-XT22
Durchflusszytometrie
eBioscience
anti-CD107a-FITC
1D4B
Durchflusszytometrie
BD Biosciences
anti-CD45.1-bio
A20 (bio)
Durchflusszytometrie
eBioscience
Durchflusszytometrie
Invitrogen
CFSE
anti-CD40
FGK45
In vivo Stimulation
Eigene Herstellung
anti-IFNγ
R4-6A2
In vivo Neutralisierung
BioXCell
anti-TNFa
XT3.11
In vivo Neutralisierung
BioXCell
anti-TGFβ
1D11.16.8
In vivo Neutralisierung
BioXCell
anti-IL10R1
1B1.3a
In vivo Blockade
BD Biosciences
Isotypkontrolle
Dianova
Ratten IgG
GP33-Tetramer-PE
Eigene Herstellung
22
4 Materialien und Methoden
4.1.8
Zytokine
Es wird rekombinantes IL-12 (Peprotech) verwendet.
4.2 Methoden
4.2.1 Organaufarbeitung
Murine
Lymphozyten
werden
durch
Herstellung
einer
Einzelzellsuspension
aus
unterschiedlichen Organen gewonnen. Milz und Lymphknoten werden hierfür mit einem
Spritzenstempel durch ein feinmaschiges Metallnetz gedrückt. Die Milzzelleinzelsuspension
wird anschließend einmal mit IMDM-Kulturmedium gewaschen. Zur Isolierung von
Immunzellen aus der Lunge wird diese in kleine Stücke geschnitten und für 30 min bei 37°C
in Verdaulösung (siehe Materialien) inkubiert. Im nächsten Schritt werden die verdauten
Lungenstücke durch ein 100 µm Sieb (Cell Strainer, BD Biosciences) gedrückt. Die
Lymphozyten werden anschließend mit Hilfe einer Ficoll Gradientendichtezentrifugation
(Ficoll-PaquePlus, Amersham Biociences, Uppsala, Schweden) gewonnen.
4.2.2 Adoptiver T-Zelltransfer
Milzzellen mit 105 naiven TZR-transgenen CD8 T-Zellen von P14.WT und P14.IFNARKO
Mäusen (Thy1.1+) werden jeweils in verschiedene Rezipientenmäuse (Thy1.2+) transferiert
(i.v.) und am folgenden Tag infiziert. Für die Untersuchung der transferierten Zellen wird den
Rezipientenmäusen Blut und Milz an den angegebenen Zeitpunkten entnommen. Mittels des
Thy1.1 Markers werden die transferierten CD8 T-Zellen detektiert und verschiedene
Oberflächenmarker sowie die intrazelluläre Expression von Zytokinen analysiert.
4.2.3 Durchflusszytometrie
Zur Oberflächenfärbung werden 106 Lymphozyten in 50 µl Antikörperlösung (in FACS
Puffer bei Lymphozyten aus Milz, Lymphknoten und Lunge bzw. in FACS Blutpuffer bei
PBL) für 30 min bei 4 °C inkubiert. Nach der Färbung werden bei den Blutproben die
Erythrozyten durch die FACS-Lysing Solution (BD Biosciences) lysiert. Für eine
intrazelluläre Zytokinfärbung werden bei 106 Lymphozyten zunächst die Oberflächemoleküle
CD8 und Thy1.1 gefärbt. Anschließend werden die Zellen gewaschen, fixiert, permeabilisiert
23
4 Materialien und Methoden
(Cytofix/Cytoperm Kit, BD Biosciences) und mit intrazellulär mit den zytokinspezifischen
Antikörpern gefärbt.
Zur Bestimmung des Anteils LCMV spezifischer CD8 T-Zellen wird eine Färbung mit PEkonjugiertem GP33-41 Tetramer durchgeführt. Für die Färbung werden 1x106 Lymphozyten
mit 1 µl Tetramer in 30 µl FACS-Puffer für 30 min inkubiert. Anschließend werden ohne
weitere Waschschritte weitere Antikörper zur Detektion von Oberflächenmolekülen
hinzugegeben und weitere 20 min inkubiert.
Die in vivo Färbung mit dem Degranulationsmarker CD107a erfolgt durch i.v. Verabreichung
von 50 µg anti-CD107a Antikörper. 3 h nach Applikation werden die Milzzellen analysiert.
Die Zellen werden mit einem FACSCalibur- oder FACSCanto-Durchflusszytometer (BD
Biosciences) gemessen und mithilfe der FlowJo (Tree Star, USA) Software analysiert.
4.2.4 T-Zellproliferation mit CFSE
Für die Markierung mit dem Fluoreszenzfarbstoff 5,6-Carboxyfluoreszein-DiacetatSuccinimidyl-Ester (CFSE) (Invitrogen) werden P14 T-Lymphozyten aus der Milz in PBS
aufgenommen (5x106/ml), für 10 min mit 0,5 mM CFSE bei 37°C inkubiert und anschließend
dreimal mit IMDM Kulturmedium gewaschen.
Bei einer in vivo Proliferation werden 2x106 CFSE gefärbte P14 TZR-transgene CD8 T-Zellen
in naive B6 Mäuse i.v. gespritzt. Diese Rezipientenmäuse werden am darauffolgenden Tag
infiziert. 3 Tage nach Infektion wurden die Milzzellen analysiert.
4.2.5 Serologische Analysen
Zur Gewinnung von Serum werden 200-300 µl Blut in BD Microtainer® SST Plastikröhrchen
überführt. Die Röhrchen werden anschließend für 10 min bei 18500 g zentrifugiert. Nach dem
Zentrifugieren wird der Überstand (Serum) abgenommen und in ein frisches Gefäß überführt.
Das Serum kann bei -80 °C gelagert werden. Die Bestimmung der Serumkonzentrationen
unterschiedlicher Zytokine erfolgte mittels des CBA Kits von BD Biosciences.
24
4 Materialien und Methoden
4.2.6 Biotinylierung von Zielzellen
Als Zielzellen werden gesamte Milzzellen, MACS-aufgereinigte B- (B220+) und T-Zellen
(Thy1.1+), Tumorzellen (B16, A9) oder MC57 Fibroblasten verwendet. Die MC57
Fibroblasten werden für 2 h bei 37 °C in 75 cm2 Zellkulturflaschen mit LCMV-WE
(moi 0,01) infiziert. Danach werden sie für zwei weitere Tage kultiviert. Die Zielzellen
werden mit PBS gewaschen und in PBS mit 1 mg/ml Biotin (EZ-Link Sulfo-NHS-LC biotin,
Pierce)
auf
2x107
Zellen/ml
eingestellt
und
markiert.
Die
Biotinylierung
der
Membranproteine auf den Zielzellen findet für 30 min auf Eis statt. Danach werden die
Zielzellen dreimal mit IMDM-Kulturmedium gewaschen. Falls eine Peptidbeladung der
Zielzellen notwendig ist, werden die Zellen nach der Biotinylierung für 1 h bei 37°C mit
Lymphozyten-Kulturmedium, welches 10-6M GP33- oder Adeno-Peptid enthält, inkubiert. Im
Anschluss werden die Zielzellen zweimal mit IMDM-Kulturmedium gewaschen.
4.2.7 In vivo/in vitro Trogozytose
Für die Analyse der Trogozytose in vivo werden naive C57BL/6J Mäuse mit einem geringen
Anteil LCMV spezifischer Gedächtnis T-Zellen (1 % von gesamten CD8 T-Zellen) generiert.
Hierfür werden 2x106 LCMV spezifische Gedächtnis P14 T-Zellen in naive C57BL/6J Mäuse
transferiert. Diese Gedächtnis T-Zellen werden aus Mäusen isoliert, die 30-40 Tage zuvor
einen adoptiven Transfer von 105 naiven TZR transgenen P14 CD8 T-Zellen erhielten und mit
200 PFU LCMV-WE infiziert wurden. 2-3 h nach Transfer von 3x106 biotinylierten
Zielzellen in C57BL/6J Rezipientenmäuse mit einem geringen Anteil LCMV spezifischer
Gedächtnis T-Zellen, werden die Milzen entnommen. Durch eine Streptavidin Färbung wird
im Durchflusszytometer ermittelt, wieviele LCMV spezifische Gedächtnis T-Zellen
biotinylierte Membranproteine von den Zielzellen aufgenommen haben.
Für die Analyse von Trogozytose in vitro wird pro Vertiefung einer 96 Lochplatte 5x103
LCMV spezifische Gedächtnis T-Zellen zusammen mit 1x104 biotinylierten Zielzellen
inkubiert. Nach 3-4 h werden die Zellen geerntet und im Durchflusszytometer analysiert.
4.2.8 Statistische Analysen
Die statistische Signifikanz wurde mit dem paarigen Studentschen t-Test für unabhängige
Proben bestimmt. Bei Werten von p < 0,05 (= *), p < 0,01 (= **) und p < 0,01 (= ***) wurden
die Unterschiede als statistisch signifikant angesehen.
25
5 Ergebnisse
5.1 Direkte Zytokinsignale während der Aktivierung von
antigenspezifischen T-Zellen
5.1.1 Beschreibung des experimentellen Systems zur Untersuchung der
direkten Wirkung von Typ I Interferonen auf CD8 T-Zellen
Es ist bekannt, dass Typ I Interferone in vivo eine antivirale Wirkung aufweisen [6, 111] und
auf Zellen des Immunsystems wirken. In Infektionsexperimenten konnte gezeigt werden, dass
Typ I Interferonrezeptor (IFNAR) defiziente Mäuse (IFNARKO) unterschiedliche
Virusinfektionen nicht oder sehr viel schlechter als Wildtyp (WT) Mäuse kontrollieren
können [35, 36]. Da in IFNARKO Mäusen alle Zellen einen defekten Typ I Interferonrezeptor
aufweisen, konnte nicht unterschieden werden, ob die mangelnde Kontrolle der viralen
Infektionen auf das Fehlen der antiviralen Wirkung von Typ Interferonen, auf eine
verminderte Antigenpräsentation oder auf eine eingeschränkte Aktivität von IFNARKO TZellen zurückzuführen war. Für die Analyse der direkten Wirkung von Typ I Interferonen auf
T-Zellen können daher IFNARKO Mäuse nicht herangezogen werden. Aus diesem Grund
wurde ein adoptives Transfermodell mit P14 TZR transgenen CD8 T-Zellen, die das LCMV
Glykoproteinepitop GP33-41 (GP33) im Kontext von MHC Klasse I H-Db Molekülen
erkennen, verwendet. Hierzu wurden P14.WT T-Zellen (Thy1.1+) oder P14.IFNARKO TZellen (Thy1.1+) in C57BL/6J (B6) Rezipientenmäuse (Thy1.2+) transferiert. Mithilfe des
Thy1 Oberflächenmarkers können nun die Donor T-Zellen (Thy1.1+) von den endogenen TZellen der Rezipienten (Thy1.2+) unterschieden werden. Da die C57BL/6J Rezipientenmäuse
den adoptiv transferierten P14 T-Zellen eine Typ I Interferonsignal kompetente Umgebung
bieten, lässt sich der direkte Einfluss von Typ I Interferonen auf T-Zellen, die kompetent
(P14.WT) oder defekt (P14.IFNARKO) für die Typ I Interferonsignalisierung sind, ermitteln.
Nach adoptivem T-Zelltransfer wurden die Rezipientenmäuse mit LCMV oder mit
verschiedenen rekombinanten Pathogenen, die das GP33-Peptid exprimieren, infiziert. Die
Infektionen führten zur Aktivierung der GP33 spezifischen P14 T-Zellen. Somit konnte der
Einfluss der Typ I Interferonsignalisierung auf P14 T-Zellen im Kontext unterschiedlicher
Infektionen analysiert werden.
26
5 Ergebnisse
5.1.2 Expansionsverhalten von Typ I Interferonrezeptor defizienten (IFNARKO)
CD8 T-Zellen in vivo nach Infektion mit unterschiedlichen Pathogenen
Zunächst wurde das Expansionsverhalten von adoptiv transferierten P14.IFNARKO T-Zellen
im Kontext einer LCMV Infektion untersucht. Unter der Expansion versteht man hierbei die
Zunahme spezifischer T-Zellen im Verlauf der Immunantwort während einer Infektion. Es
zeigte sich, dass P14.WT T-Zellen an Tag 8 nach Infektion mit einem Anteil von 60 % an der
Gesamtpopulation von CD8 T-Zellen ihr Expansionsmaximum erreichten (Fig. 1). Im
Gegensatz dazu wiesen P14.IFNARKO T-Zellen nur eine geringe Expansion von etwa 5 %
auf. Somit war im Blut der Rezipientenmäuse an Tag 8 nach LCMV Infektion die Frequenz
von P14.IFNARKO T-Zellen 12-mal geringer als die von P14.WT T-Zellen. Nach dem
Expansionsmaximum nahm die Frequenz der P14.WT T-Zellen stark ab und lag während der
Gedächtnisphase (Tag 40) bei etwa 20 %. Die Frequenz der P14.IFNARKO T-Zellen nahm in
der Gedächtnisphase nur leicht ab, sodass die P14.IFNARKO T-Zellen bis Tag 40 nach
% P14 T-Zellen von CD8
Infektion in geringen Frequenzen detektierbar waren.
rVVGP
LCMV
100
rVSVGP
rListeriaGP33
60
60
40
40
40
20
20
20
60
80
60
40
20
0
0
0
5
8
15
40
0
3
5 7 10 15 23
0
0
0
3
5 7 10 15 23
0 3
5
6
7 10 14
Tage nach Infektion
Fig. 1: Expansion von P14.WT und P14.IFNARKO T-Zellen nach Infektion mit unterschiedlichen Erregern.
105 Thy1.1+ P14.WT (●) bzw. P14.IFNARKO (○) T-Zellen wurden in C57BL/6J Empfängermäuse (Thy1.2+)
transferiert (Tag -1). An Tag 0 wurden die Rezipientenmäuse mit 200 PFU LCMV-WE, 2x106 PFU rVVGP,
2x106 PFU rVSVGP oder 2x104 CFU rListeriaGP33 i.v. infiziert. P14.WT und P14.IFNARKO T-Zellen wurden zu
den angegebenen Zeitpunkten durch Färbung mit anti-CD8 und anti-Thy1.1 Antikörpern im Blut analysiert. In
den Kinetiken ist der prozentuale Anteil der transgenen Zellpopulationen an der CD8 T-Zellgesamtpopulation zu
unterschiedlichen Zeitpunkten nach Infektion dargestellt.
Nach Infektion der Rezipientenmäuse mit rVVGP kam es zu einem schnellen Anstieg der
Frequenz von P14 T-Zellen im Blut. An Tag 6 nach Infektion erreichten die P14 T-Zellen ihr
Expansionsmaximum (50 % bei P14.WT und 45 % bei P14.IFNARKO T-Zellen). Danach
nahm der Anteil von P14.WT und P14.IFNARKO T-Zellen ab Tag 7 rasch ab (20 % bzw.
12 %). An Tag 23 nach Infektion lag die Frequenz der P14 T-Zellen noch bei ca. 8 %.
Entscheidend bei der Infektion mit rVVGP ist, dass kein wesentlicher Unterschied im
Expansionsverhalten zwischen P14.WT und P14.IFNARKO T-Zellen nachweisbar war.
27
5 Ergebnisse
In einem weiteren Infektionsmodell wurden die Rezipientenmäuse mit rVSVGP infiziert. Bei
dieser Infektion lag das Expansionsmaximum von P14.WT und P14.IFNARKO T-Zellen an
Tag 6 bei ca. 40 %. Im weiteren Verlauf der Infektion kam es zu einer Kontraktion der P14 TZellen (ca. 5 % ab Tag 7). Bei einer Infektion mit rVSVGP konnte somit ähnlich wie bei
rVVGP Infektion keine strikte Abhängigkeit der P14 T-Zellen von einem direkten Typ I
Interferonsignal für die Expansion beobachtet werden.
Nach der Analyse des Expansionsverhaltens von P14 T-Zellen im Kontext von viralen
Infektionen, wurde in einem weiteren infektiösen System das Verhalten von P14 T-Zellen
nach
Infektion
der
Rezipientenmäuse mit rekombinanten
Listeria monozytogenes
(rListeriaGP33) untersucht. Zum Zeitpunkt des Expansionsmaximums an Tag 6 nach Infektion
war die Frequenz von P14.IFNARKO T-Zellen im Vergleich zu P14.WT um etwa einen
Faktor 2 reduziert (20 % im Vergleich zu 50 %). Im weiteren Verlauf kam es zu einer
Abnahme der Frequenz von P14.WT und P14.IFNARKO T-Zellen, wobei die P14.IFNARKO
T-Zellen etwas stärker kontrahierten als die P14.WT T-Zellen. Somit konnte auch im Kontext
einer Infektion mit rListeriaGP33 eine Abhängigkeit der Expansion von T-Zellen von direkten
Typ I Interferonsignalen beobachtet werden, wobei das Expansionsvermögen der
P14.IFNARKO T-Zellen nicht so drastisch eingeschränkt war wie nach einer LCMV
Infektion.
Folglich scheinen T-Zellen im Kontext einer LCMV Infektion strikt von einem Signal 3,
welches durch Typ I Interferone vermittelt wird, abhängig zu sein. Die fehlende Expansion
der P14.IFNARKO T-Zellen kann dabei auf eine fehlende Proliferation, d.h nicht eintreten in
den Zellzyklus, oder eine fehlende Überlebensfähigkeit zurückgeführt werden.
5.1.3 Dominant-negativer Effekt des LCMV induzierten Zytokinmilieus auf die
Expansion von IFNARKO T-Zellen
Wie in Abschnitt 5.1.2 beschrieben, expandieren P14 T-Zellen im Kontext einer Infektion mit
LCMV kaum, wenn sie keine IFNα oder IFNβ Signale erhalten. Diese Typ I Interferon
Abhängigkeit ist nicht bei Infektionen mit rVVGP oder rVSVGP nachweisbar, während es nach
Infektion mit rListeriaGP33 zu einer partiellen Beeinträchtigung des Expansionsvermögens von
P14.IFNARKO T-Zellen kommt (Fig. 1). Eine Erklärung für das unterschiedliche Verhalten
von P14.IFNARKO T-Zellen im Kontext verschiedener Infektionen könnte in den
unterschiedlichen Zytokinmilieus liegen, die durch die Infektionen induziert werden.
28
5 Ergebnisse
Durch eine LCMV Infektion wird in den Rezipientenmäusen eine starke Typ I
Interferonantwort, welche die Produktion von IL-12 inhibiert, ausgelöst [112, 113]. Somit
kann möglicherweise das fehlende Typ I Interferonsignal bei P14.IFNARKO T-Zellen im
Kontext einer LCMV Infektion nicht durch rettende IL-12 Signale kompensiert werden. Im
Gegensatz dazu kommt es bei Infektionen mit rVVGP oder rVSVGP zur Produktion von IL-12
und Typ I Interferonen [114, 115]. Dadurch könnte bei diesen beiden Infektionen IL-12 als
drittes Signal die fehlende Typ I Interferonsignalisierung bei P14.IFNARKO T-Zellen
ersetzen. Folglich kommt es zu keiner wesentlichen Einschränkung des Expansionsvermögens
von P14.IFNARKO T-Zellen. Bei Infektion mit rListeriaGP33 werden IL-12 und in einem
geringeren Maß Typ I Interferone induziert [115, 116]. Obwohl während einer rListeriaGP33
Infektion IL-12 produziert wird, waren P14.IFNARKO T-Zellen jedoch in ihrer Expansion
eingeschränkt.
In der Folge wurde untersucht, ob durch eine Vaccinia Virus bzw. VSV Infektion das
erregerspezifische Zytokinmilieu (v.a. IL-12) in der Art moduliert werden kann, dass es zu
einer Expansion von P14.IFNARKO T-Zellen im Kontext einer LCMV Infektion kommen
kann. Hierfür wurden Empfängermäuse einen Tag nach adoptivem Transfer der P14 T-Zellen
mit LCMV und einem rVV, welches ein irrelevantes Antigen exprimiert (rVVM2), koinfiziert.
Nach einer Koinfektion mit rVVM2/LCMV wird die antigenspezifische Aktivierung der
P14.IFNARKO T-Zellen nur durch LCMV infizierte APZs vermittelt, da rVVM2 von den
transgenen P14 T-Zellen nicht erkannt wird. Zellen des endogenen Immunsystems der
Empfängermaus konnten jedoch durch rVVM2 aktiviert werden, wodurch es zur Freisetzung
von Vaccinia Virus Infektions-spezifischen Zytokinen kam (v.a. IL-12). Innerhalb einer
Koinfektion mit rVVM2/LCMV kam es jedoch zu keiner Expansion von P14.IFNARKO TZellen (0,03 % P14 T-Zellen an der gesamten CD8 T-Zellpopulation) (Fig. 2A). Folglich
hatte das durch die rVVM2 Infektion induzierte Zytokinmilieu innerhalb einer Koinfektion mit
LCMV keinen positiven Effekt auf die Expansion der P14.IFNARKO T-Zellen. Diese
Versuche legen die Vermutung nahe, dass unter Koinfektionsbedingungen das LCMV
induzierte Zytokinmilieu eine dominierende Wirkung hat. Im Folgenden wurde deshalb
untersucht, ob durch LCMV Infektion ein für P14.IFNARKO T-Zellen dominant-negatives
Zytokinmilieu induziert wird. Hierfür wurden in einem weiteren Koinfektionsexperiment
Rezipientenmäuse mit LCMV und rVVGP koinfiziert. Im Gegensatz zu rVVM2 kann rVVGP
von P14.IFNARKO T-Zellen erkannt werden und diese aktivieren. Bei einer Koinfektion mit
rVVGP/LCMV konnte wiederum keine Expansion der P14.IFNARKO T-Zellen (0,03 % P14
29
5 Ergebnisse
T-Zellen an der gesamten CD8 T-Zellpopulation) beobachtet werden (Fig. 2A). Folglich
konnten P14.IFNARKO T-Zellen im Kontext einer Koinfektion mit rVVM2/LCMV oder mit
rVVGP/LCMV nicht durch das von einer Vaccinia Virus induzierte Zytokinmilieu gerettet
werden. Da P14.IFNARKO T-Zellen jedoch nach Einzelinfektion mit rVVGP expandierten
(Fig. 1), kann auf einen dominant-negativen Effekt einer LCMV Infektion auf das
Expansionsverhalten von P14.IFNARKO T-Zellen geschlossen werden.
Da eine LCMV Infektion zu einer hohen Antigenlast in den Rezipientenmäusen führt, könnte
das eingeschränkte Expansionverhalten von P14.IFNARKO T-Zellen im Kontext einer
Koinfektion mit rVVM2/LCMV oder mit rVVGP/LCMV auf einen AICD (activation induced
cell death) der P14.IFNARKO T-Zellen zurückgeführt werden. Um dies auszuschließen
wurde in einem weiteren Koinfektionsmodell die Virusvariante LCMV8.7 verwendet.
LCMV8.7 weist im immundominanten GP33 Epitop eine Mutation auf, die zu einem
Aminosäureaustausch auf Position 35 von Valin zu Leucin führt. Durch diese Mutation kann
das GP33 Epitop nicht mehr von dem transgenen P14 TZR erkannt werden. Nach Infektion
mit LCMV8.7 kommt es somit zwar zur Induktion des LCMV spezifischen Zytokinmilieus in
den Empfängermäusen, aber zu keiner antigenspezifischen Stimulation der P14 T-Zellen
durch LCMV8.7 infizierte APZs. Werden Rezipientenmäuse mit rVVGP/LCMV8.7 bzw. mit
rVSVGP/LCMV8.7 koinfiziert, können adoptiv transferierte P14 T-Zellen einen GP33spezifischen Antigenstimulus durch rVVGP bzw. rVSVGP infizierte APZs erhalten.
Im Kontext einer Einzelinfektion mit rVVGP betrug der Anteil von P14.WT T-Zellen an der
CD8 T-Zellgesamtpopulation 56 % und der von P14.IFNARKO T-Zellen 50 % (Fig. 2B).
Eine Koinfektion mit rVVGP/LCMV8.7 hatte keinen Einfluss auf die Expansion von P14.WT
T-Zellen (56 % P14 T-Zellen an der CD8 T-Zellgesamtpopulation). Im Gegensatz dazu kam
es bei P14.IFNARKO T-Zellen zu einem drastischen Verlust des Expansionsvermögens im
Kontext einer Koinfektion mit rVVGP/LCMV8.7 (2 % P14 T-Zellen an der CD8 TZellgesamtpopulation). Ein vergleichbares Bild ergab sich für das Expansionsverhalten der
P14.IFNARKO T-Zellen nach Koinfektion mit rVSVGP/LCMV8.7. Nach Einzelinfektion mit
rVSVGP expandierten P14.IFNARKO T-Zellen (18 % P14 T-Zellen an der gesamten CD8 TZellpopulation)
(Fig.
2C).
Nach
Koinfektion
mit
rVSVGP/LCMV8.7
war
das
Expansionsvermögen von P14.IFNARKO T-Zellen stark eingeschränkt (1,2 % P14 T-Zellen
an der CD8 T-Zellgesamtpopulation).
30
5 Ergebnisse
A
rVVM2/LCMV-WE
rVVGP/LCMV-WE
Thy1.1
(0,03)
P14.IFNARKO
(0,03)
CD8
B
rVVGP
rVVGP/LCMV8.7
LCMV8.7
(0,18)
(56,2)
(55,5)
P14.WT
(0,16)
(2,3)
(50,3)
Thy1.1
P14.IFNARKO
CD8
C
rVSVGP
rVSVGP/LCMV8.7
(1,2)
Thy1.1
(18,1)
P14.IFNARKO
CD8
Fig. 2: Expansion von P14.WT und P14.IFNARKO T-Zellen nach Koinfektion. (A) 105 Thy1.1+
P14.IFNARKO T-Zellen wurden in C57BL/6J Empfängermäuse (Thy1.2+) transferiert (Tag -1). An Tag 0
wurden die Rezipientenmäuse mit 2x106 PFU rVVM2/200 PFU LCMV-WE oder mit 2x106 PFU rVVGP/200 PFU
LCMV-WE i.v. infiziert. Die Expansion von P14.IFNARKO T-Zellen wurde an Tag 8 nach Infektion durch
Färbung mit anti-CD8 und anti-Thy1.1 Antikörpern im Blut analysiert. Die prozentualen Anteile der
verschiedenen Zellpopulationen an den PBLs sind in den Quadranten angegeben. Der prozentuale Anteil der
transgenen Zellpopulation an der CD8 T-Zellgesamtpopulation ist in Klammern angegeben. (B, C) 105 Thy1.1+
P14.WT oder P14.IFNARKO T-Zellen wurden in C57BL/6J Empfängermäuse (Thy1.2+) transferiert (Tag -1).
An Tag 0 wurden die Rezipientenmäuse mit 2x106 PFU rVVGP, 2x106 PFU rVSVGP, 200 PFU LCMV8.7 oder
einer Kombination aus rVVGP/LCMV8.7 und rVSVGP/LCMV8.7 i.v. P14.WT und P14.IFNARKO T-Zellen
wurden an Tag 5 nach Infektion durch Färbung mit anti-CD8 und anti-Thy1.1 Antikörpern im Blut analysiert.
Die prozentualen Anteile der verschiedenen Zellpopulationen an den PBLs sind in den Quadranten angegeben.
Der prozentuale Anteil der transgenen Zellpopulation an der CD8 T-Zellgesamtpopulation ist in Klammern
angegeben.
Die Ergebnisse zeigten, dass es bei den beiden Koinfektionen rVVGP/LCMV8.7 und
rVSVGP/LCMV8.7 wider Erwarten zu keiner Expansion der P14.IFNARKO T-Zellen kam.
Somit konnte das durch rVVGP bzw. rVSVGP induzierte Zytokinmilieu (v.a. IL-12) die
Expansion der P14.IFNARKO T-Zellen nicht fördern. Dies war überraschend, da
angenommen wurde, dass P14.IFNARKO T-Zellen durch IL-12 ein Überlebenssignal
erhalten und dadurch nicht weiter in ihrem Expansionsvermögen eingeschränkt sind. Die
31
5 Ergebnisse
Ergebnisse der Koinfektions-Versuche deuten somit auf einen dominant-negativen Effekt des
LCMV induzierten Zytokinmilieus auf das Expansionsverhalten von P14.IFNARKO T-Zellen
hin.
5.1.4 Mögliche supprimierende Zytokine während einer LCMV Infektion
Während einer LCMV Infektion kommt es zur Produktion unterschiedlicher Zytokine, von
denen einige eine supprimierende Wirkung auf T-Zellen besitzen. Bei einer akuten Infektion
mit LCMV wurde bei P14.WT T-Zellen kein Einfluss der supprimierenden Zytokine auf das
Expansionsverhalten beobachtet. Im Gegensatz dazu, war das Expansionsvermögen von P14
T-Zellen, die keine Typ I Interferonsignale erhielten, stark reduziert (Fig. 1). Eine mögliche
Erklärung für diese Beobachtung könnte sein, dass direkte Typ I Interferonsignale die
Wirkung inhibierender Zytokine kompensieren können, sodass es zu keiner Einschränkung
der Expansion und Überlebensfähigkeit der T-Zellen kommt. Da diese „rettenden“ Typ I
Interferonsignale in P14.IFNARKO T-Zellen jedoch fehlen, ist die Expansion und
Überlebensfähigkeit dieser Zellen stark eingeschränkt.
In Studien von Brooks et al. und Ejrnaes et al. [117, 118] konnte gezeigt werden, dass es
während der LCMV Infektion durch supprimierende Effekte von IL-10 zu einer Erschöpfung
der LCMV spezifischen CD8 T-Zellen kommt. Als Folge kann das LCM-Virus nicht
eliminiert werden und persistiert in den Empfängermäusen. Allerdings konnten durch
Behandlung der persistent infizierten Mäuse mit IL-10 Rezeptor blockierenden Antiköpern
die LCMV spezifischen CD8 T-Zellen reaktiviert werden und LCMV daraufhin eliminiert
werden. Um zu untersuchen, ob IL-10 als supprimierendes Zytokin für das eingeschränkte
Expansionsvermögen von P14.IFNARKO T-Zellen im Kontext einer LCMV Infektion
verantwortlich ist, wurde die Expansion von P14.WT und P14.IFNARKO T-Zellen nach
adoptivem Transfer in IL-10 defiziente Rezipienten (IL10KO) analysiert.
Es zeigte sich, dass es wie in C57BL/6J Rezipientenmäusen auch in IL10KO
Rezipientenmäusen zu keiner Expansion von adoptiv transferierten P14.IFNARKO T-Zellen
nach LCMV Infektion kam (0,5 % bzw. 2,1 % P14 T-Zellen von der CD8 TZellgesamtpopulation). Die Expansionsfähigkeit von P14.WT T-Zellen nach LCMV Infektion
war in C57BL/6J und IL10KO Rezipientenmäusen vergleichbar (85,7 % bzw. 77,5 % P14 TZellen von der CD8 T-Zellgesamtpopulation) (Fig. 3A).
32
5 Ergebnisse
A In vivo Expansion
B In vivo Proliferation
AdTf in C57BL/6J
P14.WT
AdTf in C57BL/6J
P14.IFNARKO
(85,7)
P14.WT
(99,4)
(0,5)
AdTf in IL10KO
P14.WT
(70,0)
AdTf in IL10KO
P14.IFNARKO
P14.WT
P14.IFNARKO
(97,9)
(80,0)
(99,0)
(64,7)
(2,1)
Thy1.1
(77,5)
P14.IFNARKO
CD8
Isotypkontrolle
(97,7)
(100,0)
anti-IL-10R AK
Thy1.1
uninfizierte
Kontrolle
CFSE
Fig. 3: Keine Expansion von P14.IFNARKO T-Zellen während einer LCMV Infektion in Abwesenheit eines
IL Signals. (A) Transfer von 105 P14.WT bzw. P14.IFNARKO T-Zellen (Thy1.1+) in C57BL/6J oder IL10KO
(Thy1.2+) Empfängermäuse (Tag -1). An Tag 0 wurden die Rezipientenmäuse mit 200 PFU LCMV-WE i.v.
infiziert. An Tag 7 nach Infektion wurde die Expansion von P14.WT und P14.IFNARKO T-Zellen duch Färbung
mit anti-CD8 und anti-Thy1.1 Antikörpern im Blut analysiert. Die prozentualen Anteile der verschiedenen
Zellpopulationen an den PBLs sind in den Quadranten angegeben. Der prozentuale Anteil der transgenen
Zellpopulation an der CD8 T-Zellgesamtpopulation ist in Klammern angegeben. (B) Transfer von 3x106 MACSaufgereinigten (Miltenyi Biotec) Thy1.1+ , CFSE gefärbten P14.WT oder P14.IFNARKO T-Zellen in C57BL/6J
oder IL10KO Mäuse (Tag -1). An Tag 0 wurden die Empfängermäuse mit 2x104 PFU LCMV-WE i.v. infiziert.
Die Analyse der Proliferation erfolgte an Tag 3 nach Infektion in der Milz durch Färbung mit anti-CD8 und antiThy1.1 Antikörpern. Die prozentualen Anteile der verschiedenen Zellpopulationen an der CD8 TZellgesamtpopulation in der Milz sind in den Quadranten angegeben. In Klammern ist der Anteil der
proliferierenden P14 T-Zellen an der gesamten P14 T-Zellpopulation angegeben. P14 T-Zellen wurden vor
adoptiven Transfer für 1 Stunde mit 250 µg Isotypkontrolle (Ratte IgG) oder anti-IL-10R in vitro inkubiert. An
Tag 1 nach Infektion wurde den entsprechenden Rezipientenmäusen 250 µg anti-IL-10R oder Isotypkontrolle i.p
verabreicht.
In einem weiteren Versuch wurde die in vivo Proliferation von adoptiv transferierten P14.WT
und P14.IFNARKO T-Zellen in IL10KO Rezipientenmäusen nach LCMV Infektion
verglichen. Die P14 T-Zellen wurden hierfür mit dem Fluoreszenzfarbstoff CFSE (5,633
5 Ergebnisse
Carboxyfluoreszein-Diacetat-Succinimidyl-Ester) markiert. Bei jeder Zellteilung wird der
Farbstoff zu gleichen Teilen auf beide Tochterzellen verteilt, wodurch es zu einer
Ausverdünnung des Farbstoffs in den gefärbten T-Zellen kommt, d.h. die Intensität des
Farbstoffes nimmt mit jeder Zellteilung um einen Faktor 2 ab. Folglich kann über die
Abnahme der Fluoreszenzintensität die Anzahl der Zellzyklen, die eine Zelle durchläuft,
bestimmt werden. In IL10KO Rezipientenmäusen proliferierten 98 % der P14.WT und 80 %
der P14.IFNARKO T-Zellen. Die T-Zellen traten also nach antigenspezifischer Stimulierung
in den Zellzyklus eintraten und führten Zellteilungen durch. Allerdings zeigte sich, dass
P14.IFNARKO T-Zellen im Gegensatz zu P14.WT T-Zellen in IL10KO Mäusen nicht
expandierten, sprich zahlenmäßig zunahmen (0,04 % Thy1.1+ P14 T-Zellen von der CD8 TZellgesamtpopulation im Vergleich zu 6,2 %) (Fig. 3B). Dies entspricht dem Phänotyp wie er
nach Transfer der beiden T-Zellpopulationen in C57BL/6J Rezipientenmäuse zu beobachten
ist. Danach wäre eine supprimierende Wirkung von IL-10 auf P14 T-Zellen bei Abwesenheit
eines Typ I Interferonsignals wenig wahrscheinlich. Allerdings muss beachtet werden, dass
die adoptiv transferierten P14 T-Zellen IL-10 produzieren können und dieses autokrin auf P14
T-Zellen wirken kann. Daher wurden in einem weiteren Experiment die IL10KO
Rezipientenmäuse zusätzlich mit einem IL-10 Rezeptor blockierenden Antikörper behandelt.
In dieser experimentellen Konstellation produzieren die Rezipientenmäuse selbst kein IL-10
und die Wirkung von IL-10, produziert von den P14 T-Zellen, wird durch die IL-10
Rezeptorblockade verhindert. Es zeigte sich, dass die zusätzliche IL-10 Rezeptorblockade
weder einen Einfluss auf die Proliferation noch auf die Expansion der P14.IFNARKO TZellen hatte. Diese Ergebnisse zeigten, dass P14.IFNARKO T-Zellen nach LCMV Infektion
zwar proliferieren, aber aufgrund eingeschränkter Überlebensfähigkeit nicht expandieren
können. Die Eliminierung des supprimierenden IL-10 Signals hat dabei keine Auswirkung auf
die Proliferationskapazität und das Expansionsvermögen bzw. Überlebensfähigkeit der
P14.IFNARKO T-Zellen. Somit scheint IL-10 nicht der gesuchte supprimierende Faktor
während einer LCMV Infektion zu sein, welcher für das stark eingeschränkte Überleben von
T-Zellen bei fehlendem Typ I Interferonsignal verantwortlich ist.
Ein weiteres Zytokin, dessen Wirkung auf das Expansionsverhalten von P14.IFNARKO TZellen untersucht wurde, war IFNγ. IFNγ wird von CD8 T-Zellen, TH1 CD4 T-Zellen, NK
und NKT Zellen produziert und signalisiert über den heterodimeren IFNγ Rezeptor, welcher
auf vielen verschiedenen Zellen exprimiert wird [119]. In einigen Studien wurden direkte
Effekte von IFNγ auf T-Zellen beschrieben, die supprimierend und proapoptotisch sind. Zum
34
5 Ergebnisse
einen wurde gezeigt, dass T-Zellen, die mit IFNγ behandelt wurden, eine verringerte
Proliferation und/oder eine erhöhte Apoptose aufweisen [120, 121]. Zum anderen konnten
IFNγ-defiziente Mäuse eine höhere Anzahl Listerien-spezifischer CD8 T-Zellen generieren
als WT Mäuse [122]. Aufgrund der supprimierenden Eigenschaften könnte IFNγ auch für das
reduzierte Expansionsverhalten von P14.IFNARKO T-Zellen während einer LCMV Infektion
verantwortlich sein. Um dies zu untersuchen wurden Empfängermäuse vor und nach LCMV
Infektion mit IFNγ neutralisierenden Antikörpern behandelt. Dabei zeigte sich kein Einfluss
der Neutralisierung von IFNγ auf das geringe Expansionsvermögen der adoptiv transferierten
P14.IFNARKO T-Zellen (Fig. 4). Bei adoptivem Transfer von P14.IFNARKO T-Zellen in
IFNγ defiziente Empfängermäuse (IFNγKO) konnte im Vergleich zum adoptiven Transfer in
C57BL/6J Rezipientenmäuse ebenfalls keine Veränderung in dem Expansionsverhalten von
P14.IFNARKO T-Zellen beobachtet werden. Somit scheint IFNγ nicht der gesuchte
supprimierende Faktor zu sein, der für das fehlende Überleben von P14.IFNARKO T-Zellen
nach LCMV Infektion verantwortlich ist.
P14.WT
P14.IFNARKO
(0,05)
(82,0)
(0,2)
(84,3)
(1,6)
Thy1.1
(90,2)
AdTf in C57BL/6J
AdTf in C57BL/6J
+ anti-IFNγ AK
AdTf in IFNγKO
CD8
Fig. 4: Keine Expansion von P14.IFNARKO T-Zellen während LCMV Infektion nach Neutralisierung von
IFNγ. Transfer von 105 P14.WT bzw. P14.IFNARKO T-Zellen (Thy1.1+) in C57BL/6J oder IFNγKO (Thy1.2+)
Rezipientenrmäuse (Tag -1). An Tag 0 wurden die Rezipientenmäuse mit 200 PFU LCMV-WE i.v. infiziert. Die
Neutralisierung von IFNγ erfolgte durch i.p. Applikation von je 200 µg anti-IFNγ Antikörper an Tag -1, 1, 3, 5.
An Tag 7 nach Infektion wurde die Expansion von Donor P14.WT und P14.IFNARKO T-Zellen duch Färbung
mit anti-CD8 und anti-Thy1.1 Antikörper im Blut analysiert. Die prozentualen Anteile der verschiedenen
Zellpopulationen an den PBLs sind in den Quadranten angegeben. Der prozentuale Anteil der transgenen
Zellpopulation an der CD8 T-Zellgesamtpopulation ist in Klammern angegeben.
35
5 Ergebnisse
Neben den supprimierenden Faktoren IL-10 und IFNγ wurde in dieser Arbeit auch der Effekt
von TNFα und TGFβ auf das Expansionsverhalten von P14.IFNARKO T-Zellen während
einer LCMV Infektion untersucht. TGFβ ist ein immunsupprimierendes Zytokin, welches bei
chronischen viralen Infektionen eine Rolle in der Regulation von Immunantworten spielt. Die
Gruppe um E.I. Zuniga konnte zeigen, dass es während einer chronischen LCMV Infektion
von Mäusen zu einer anhaltenden TGFβ Expression kommt, welche zur TGFβ-abhängigen
Apoptose der virusspezifischen CD8 T-Zellen führt [123]. In einer weiteren Studie von Ulloa
et al. wurde außerdem beschrieben, dass die TGFβ Signalkaskade durch IFNγ gehemmt
werden kann. Innerhalb der TGFβ Signalkaskade kommt es zur Phosphorylierung der
Transkriptionsfaktoren Smad 2 und Smad 3 [124, 125]. Durch die IFNγ Signalkaskade, die
über den JAK/STAT Weg verläuft, kommt es zur Induktion eines antagonistischen Smad
Moleküls (Smad 7) [126]. Da Smad 7 die Phosphorylierung von Smad 3 verhindert, kommt es
zu keiner Translokation des TGFβ-spezifischen Transkriptionsfaktors Smad 3 in den Nukleus
und somit zu keiner Aktivierung TGFβ-regulierter Gene [127]. Die Signalkaskade von Typ I
Interferonen verläuft ebenfalls über den JAK/STAT Weg und es wird vermutet, dass es durch
Typ I Interferone ebenfalls zur Induktion von Smad 7 und zur Inhibition von TGFβ Signalen
kommen kann. Dadurch könnten Zellen durch Typ I Interferone vor einer TGFβ induzierten
Apoptose geschützt werden. Da in P14.IFNARKO T-Zellen dieser Schutzmechanismus der
Typ I Interferone fehlt, könnte es sein, dass es durch negative TGFβ Signale zur Apoptose der
P14.IFNARKO T-Zellen während einer LCMV Infektion kommt. Eine Neutralisierung von
TGFβ mittels spezifischer Antikörper während einer LCMV Infektion führte jedoch zu keiner
Expansion von P14.IFNARKO T-Zellen (0,4 % der gesamten CD8 T-Zellpopulation) (Fig. 5).
Somit wird auch durch die Neutralisierung von TGFβ das supprimierende Zytokinmilieu im
Kontext einer LCMV Infektion nicht aufgehoben. In gleicher Weise war es nicht möglich
durch Neutralisierung von TNFα das Expansionsvermögen von adoptiv transferierten
P14.IFNARKO T-Zellen nach LCMV Infektion zu verbessern (Fig. 5). Die gleichzeitige
Verabreichung neutralisierender Antikörper gegen TNFα und TGFβ hatte ebenfalls keinen
Effekt auf die Expansion von P14.IFNARKO T-Zellen (1,7 % der gesamten CD8 TZellpopulation) (Fig. 5). In einem weiteren experimentellen Ansatz wurde versucht, die
Wirkung von IL-10, TGFβ und TNFα gleichzeitig zu neutralisieren. Hierbei wurde nach
Transfer von P14.IFNARKO T-Zellen in IL10KO Rezipientenmäusen und paralleler
Neutralisierung von TNFα und TGFβ mittels spezifischer Antikörper eine stärkere Expansion
36
5 Ergebnisse
von P14.IFNARKO T-Zellen nach LCMV Infektion beobachet im Vergleich zu
unbehandelten C57BL/6J Rezipientenmäusen (6,9 % der gesamten CD8 T-Zellpopulation)
(Fig. 5). Allerdings lag das Expansionsvermögen von P14.IFNARKO T-Zellen immer noch
weit unterhalb dem von P14.WT T-Zellen (88 % der gesamten CD8 T-Zellpopulation).
Folglich kann selbst durch Neutralisierung mehrerer supprimierender Zytokine das LCMV
induzierte dominant-negative Zytokinmilieu nicht aufgehoben werden.
AdTf in C57BL/6J
anti-TNFα AK
AdTf in IL10KO
anti-TGFβ AK
(80,7)
(87,3)
(0,1)
(0,2)
(0,4)
(91,2)
(1,7)
Thy1.1
(85,0)
anti-TGFβ AK
anti-TNFα AK
anti-TGFβ AK
anti-TNFα AK
(88,0)
(6,9)
P14.WT
P14.IFNARKO
CD8
Fig. 5: Geringe Expansion von P14.IFNARKO T-Zellen während einer LCMV Infektion nach
Neutralisierung von TNFα, TGFβ und IL-10. Transfer von 105 P14.WT bzw. P14.IFNARKO T-Zellen
(Thy1.1+) in C57BL/6J oder IL10KO (Thy1.2+) Empfängermäuse (Tag -1). An Tag 0 wurden die
Rezipientenmäuse mit 200 PFU LCMV-WE i.v. infiziert. Die Neutralisierung von TNFα und TGFβ erfolgte
durch i.p. Applikation von anti-TNFα oder anti-TGFβ AK (je 500 µg an Tag -1, Tag 1 und je 200 µg an Tag 2,
Tag 5). An Tag 8 nach Infektion wurde die Expansion von Donor P14.WT und P14.IFNARKO T-Zellen duch
Färbung mit anti-CD8 und anti-Thy1.1 Antikörper in der Milz analysiert. Die prozentualen Anteile der
verschiedenen Zellpopulationen an den Milzzellen sind in den Quadranten angegeben. Der prozentuale Anteil
der transgenen Zellpopulation an der CD8 T-Zellgesamtpopulation ist in Klammern angegeben.
5.1.5 Etablierung eines experimentellen
antigenspezifischen
Stimulation
pathogeninduzierten Zytokinmilieu
Systems zur Trennung der
von
P14
T-Zellen
vom
Wie in Abschnitt 5.1.4 gezeigt, konnte bisher kein Zytokin identifiziert werden, welches
ursächlich für das von LCMV induzierte, supprimierende Zytokinmilieu ist. Um den
negativen Effekt einer LCMV Infektion auf das Expansionsvermögen von P14.IFNARKO TZellen besser untersuchen zu können, wurde deshalb ein experimentelles System etabliert,
welches eine Trennung der antigenspezifischen Aktivierung von P14 T-Zellen und des
pathogeninduzierten Zytokinmilieus erlaubte. Hierfür wurden H8 Mäuse als Empfängermäuse
verwendet. Diese transgenen Mäuse exprimieren das GP33-Epitop endogen unter der
37
5 Ergebnisse
Kontrolle eines MHC Klasse I Promotors. Ein Transfer von P14.WT bzw. P14.IFNARKO TZellen in H8 Rezipientenmäuse führte zu keiner Aktivierung und Expansion der T-Zellen. In
dieser Situation erhielten die P14 T-Zellen nur ein isoliertes Signal 1 (GP33 Peptid präsentiert
über MHC Klasse I Moleküle) und wurden tolerisiert (Daten nicht gezeigt). Wurden die H8
Rezipientenmäuse nach Transfer der P14 T-Zellen mit einem anti-CD40 Antikörper behandelt
(intraperitoneale Verabreichung an Tag 0 und 2 von jeweils 6 µg), expandierten sowohl
P14.WT als auch P14.IFNARKO T-Zellen (Fig. 6A, linke Spalte). Die Expansion von
P14.WT T-Zellen stieg dabei zwischen Tag 5 und Tag 7 nach Infektion von 49,1 % auf
78,5 % an (Fig. 6A, linke Spalte, obere Zeilen). P14.IFNARKO T-Zellen zeigten bereits an
Tag 5 nach Infektion eine Expansion von 85,8 %, die bis Tag 7 minimal anstieg (91,8 %)
(Fig. 6A, linke Spalte, untere Zeilen). Die Verabreichung des anti-CD40 Antikörpers führte
zu einer Aktivierung der professionellen APZs (dendritische Zellen), so dass neben dem
antigenspezifischen Signal 1 auch ein adäquates kostimulatorisches Signal 2 zur Verfügung
stand. Diese Ergebnisse konnten durch die Applikation einer höheren Menge des anti-CD40
Antikörpers (60 µg an Tag 0 und 2) bestätigt werden (Daten nicht gezeigt). Das Experiment
zeigte, dass P14.IFNARKO T-Zellen nicht per se einen Proliferationsdefekt aufweisen.
In einem weiteren experimentellen Ansatz wurden die P14 T-Zellen, nach Transfer in H8
Rezipientenmäuse (Signal 1) und anti-CD40 Antikörperbehandlung (Signal 2), einem durch
LCMV induzierten Zytokinmilieu ausgesetzt. Hierzu wurden die H8 Rezipientenmäuse
zusätzlich zur anti-CD40 Antikörperbehandlung mit LCMV8.7 infiziert (inflammatorisches
Signal 3), welches aufgrund einer Mutation im GP33 Epitop nicht von P14 T-Zellen erkannt
werden kann. P14.WT T-Zellen expandierten nach LCMV8.7 Infektion und Applikation von
6 µg anti-CD40 Antikörper im Vergleich zu alleiniger anti-CD40 Antiköperbehandlung
stärker und erreichten bereits an Tag 5 nach Infektion einen prozentualen Anteil von über
90 % an der CD8 Gesamtzellpopulation (Fig. 6A, zweite Spalte von links, obere Zeilen). Bei
P14.IFNARKO T-Zellen war bis Tag 5 nach Infektion mit LCMV8.7 die Expansion nicht
eingeschränkt und die T-Zellen erreichten einen prozentualen Anteil von 90 % an der CD8
Gesamtzellpopulation (Fig. 6A, zweite Spalte von links, untere Zeilen). Ab Tag 6 brach die
P14.IFNARKO T-Zellpopulation jedoch drastisch ein und wies nur noch einen Anteil von
weniger als 30 % an der CD8 Gesamtzellpopulation am Tag 7 auf. Diese Ergebnisse
verdeutlichen erneut, dass P14.IFNARKO T-Zellen, sobald sie einem LCMV induzierten
Zytokinmilieu
ausgesetzt
Interessanterweise
konnte
sind,
dieser
eine
verminderte
Einbruch
38
der
Überlebensfähigkeit
P14.IFNARKO
aufweisen.
T-Zellen
unter
5 Ergebnisse
Infektionsbedingungen durch die zweimalige Verabreichung von 60 µg anti-CD40 Antikörper
verhindert werden (Fig. 6A, zweite Spalte von rechts, untere Zeilen). Vermutlich wurde durch
die Behandlung der H8 Empfängermäuse mit einer hohen Dosis des anti-CD40 Antikörpers
das Zytokinmilieu in einer Weise verändert, dass der supprimierende Effekt des LCMV
induzierten Zytokinmilieus aufgehoben wurde.
In einem weiteren Kontrollexperiment wurden H8 Rezipientenmäuse nach P14 T-Zelltransfer
mit LCMV8.7 infiziert und nicht mit anti-CD40 Antikörper behandelt. P14.WT T-Zellen
expandierten in LCMV8.7 infizierten H8 Empfängermäusen stark (Fig. 6A, rechte Spalte,
obere Zeilen), während P14.IFNARKO T-Zellen nicht expandierten (Fig. 6A, rechte Spalte,
untere Zeilen). In dieser experimentellen Konstellation führt die LCMV Infektion zur
Aktivierung der H8 APZs, wodurch die P14.WT T-Zellen durch das endogen exprimierte
GP33 Peptid aktiviert werden und anschließend expandieren. P14.IFNARKO T-Zellen
werden ebenfalls aktiviert, können aber wiederum im LCMV induzierten Zytokinmilieu nicht
überleben. Eine Übersicht der Expansion von P14.WT (obere Zeile) und P14.IFNARKO TZellen (untere Zeile) in den unterschiedliche behandelten H8 Rezipientenmäusen ist mittels
Kinetiken in Fig. 6B dargestellt.
Aus den Ergebnissen der T-Zelltransferexperimente in H8 Mäuse lässt sich zusammenfassend
schließen, dass P14.IFNARKO T-Zellen eine eingeschränkte Expansion unter LCMV
Infektionsbedingungen zeigen. Durch eine gleichzeitige Applikation von anti-CD40
Antikörpern konnte dieser supprimierende Effekt von LCMV partiell (geringe anti-CD40
Antikörperdosis, 2x6 µg) oder ganz (hohe anti-CD40 Antikörperdosis, 2x60 µg) aufgehoben
werden.
Welche
Veränderungen
im
Zytokinmilieu
durch
eine
anti-CD40
Antikörperapplikation während der LCMV8.7 Infektion induziert wurden, sollte die Analyse
verschiedener Zytokine aus Seren der behandelten Mäuse zeigen.
39
5 Ergebnisse
A
2x6 µg
anti-CD40 AK
+LCMV8.7
2x6 µg
anti-CD40 AK
2x60 µg
anti-CD40 AK
+LCMV8.7
(97,9)
(49,1)
LCMV8.7
(56,6)
(96,4)
Tag 5
P14.WT
(78,5)
(98,7)
(98,7)
(99,2)
Tag 7
(90,7)
(85,8)
(97,3)
(0,2)
Tag 5
P14.IFNARKO
(91,8)
(97,1)
(27,6)
(0,05)
Thy1.1
Tag 7
CD8
% P14 T-Zellen von CD8
B
2x6 µg
anti-CD40 AK
+LCMV8.7
2x6 µg
anti-CD40 AK
2x60 µg
anti-CD40 AK
+LCMV8.7
LCMV8.7
100
80
60
40
20
0
P14.WT
3
5
6
7
3
5
6
7
5
6
7
3
5
6
7
100
80
60
40
20
0
P14.IFNARKO
3
5
6
7
3
5
6
7
5
6
7
3
5
6
7
Tage nach Infektion
Fig. 6: Expansion von P14.IFNARKO T-Zellen im H8 System nach anti-CD40 Antikörper Behandlung und
LCMV8.7 Infektion. 105 Thy1.1+ P14.WT oder P14.IFNARKO T-Zellen wurden an Tag -1 in H8
Rezipientenmäuse transferiert. An Tag 0 wurden die H8 Empfängermäuse mit 200 PFU LCMV8.7 i.v. infiziert
und erhielten an Tag 0 und 2 eine hohe (je 60 µg) oder geringe (je 6 µg) Dosis anti-CD40 Antikörper i.p.
verabreicht. (A) Darstellung der Expansion von P14.WT bzw. P14.IFNARKO T-Zellen im But an Tag 5 oder 7
nach Infektion. Die prozentualen Anteile der verschiedenen Zellpopulationen an den PBLs sind in den
Quadranten angegeben. Der prozentuale Anteil der transgenen Zellpopulation an der CD8 TZellgesamtpopulation ist in Klammern angegeben. (B) In den Kinetiken ist der prozentuale Anteil von P14.WT
40
5 Ergebnisse
(●) bzw. P14.IFNARKO (○) T-Zellen an der CD8 T-Zellgesamtpopulation zu unterschiedlichen Zeitpunkten
nach Infektion im Blut angegeben.
In Fig. 7 sind diejenigen Zytokine aufgeführt, die nach Behandlung der H8 Rezipientenmäuse
mit einer hohen Dosis (2x60 µg) anti-CD40 Antikörper im Serum deutlich erhöht waren.
Auffallend war der hohe Spiegel an IL-12 (IL-12p70), welches neben Typ I Interferonen als
drittes Signal in der T-Zellaktivierung eine wichtige Rolle spielt. Durch Verabreichung einer
hohen Dosis anti-CD40 Antikörper während der LCMV8.7 Infektion konnten ca. 700 pg/ml
IL-12 24 h nach Infektion im Serum nachgewiesen werden (Fig. 7). Danach fielen die
Serumwerte für IL-12 drastisch ab. Nach Behandlung der H8 Mäuse mit einer geringen Dosis
(2x6 µg) anti-CD40 Antikörper war 24 h nach Infektion die IL-12 Konzentration im Serum
deutlich geringer (ca. 150 pg/ml) und nahm danach ebenfalls stark ab. Eine ähnliche Kinetik
der Serumkonzentrationen konnte für IL-10, IL-6 und TNFα in Seren von H8 Mäusen nach
anti-CD40 Antikörperbehandlung detektiert werden. In LCMV infizierten C57BL/6J Mäusen
war im Gegensatz zu anti-CD40 behandelten, LCMV infizierten H8 Mäusen kein IL-12, IL10, IL-6 und TNFα im Serum detektierbar.
pg/ml
IL-12p70
1000
50
800
40
600
30
400
20
200
10
0
IL-6
IL-10
300
200
100
0
0
24h
48h
96h
24h
48h
96h
24h
48h
TNFα
1400
1200
1000
800
600
400
200
0
400
96h
24h
48h
96h
Stunden nach Infektion
Fig. 7: Erhöhte Produktion von IL-12 in H8 Mäusen nach Behandlung mit einer hohen Dosis (2x60 µg) antiCD40 Antikörper. Messung unterschiedlicher Zytokine (IL-12p70, IL-10, IL-6, TNFα) im Serum von H8
Mäusen mittels des CBA Kits von BD Biosciences. Dargestellt ist die Zytokinproduktion von LCMV infizierten
C57BL/6J Mäusen (○) und LCMV8.7 infizierten H8 Mäusen, die mit einer geringen (2x6 µg) (■) oder einer
hohen Dosis (2x60 µg) (▲) anti-CD40 Antikörper behandelt wurden. Die Serumentnahme erfolgte 24, 48 und
96 Stunden nach Infektion.
Diese Ergebnisse zeigten, dass die Menge des verabreichten anti-CD40 Antikörpers das
Zytokinmuster in den H8 Rezipientenmäusen entscheidend beeinflusste. Während die IL-12
Produktion während einer LCMV Infektion stark unterdrückt ist, kann durch gleichzeitige
Gabe von anti-CD40 Antikörpern die IL-12 Expression drastisch erhöht werden. Es kann
spekuliert werden, dass die Expansion der P14.IFNARKO T-Zellen in dieser experimentellen
41
5 Ergebnisse
Situation durch die hohen Serumkonzentrationen von IL-12 ermöglicht wurde. Dabei
kompensiert IL-12 vermutlich das fehlende Typ I Interferon als Signal 3 in der TZellaktivierung.
5.1.6 IL-12 als rettendes Signal 3 für P14.IFNARKO T-Zellen
Die Ergebnisse aus den T-Zelltransferexperimenten in H8 Mäuse lassen den Schluss zu, dass
es auch während einer Infektion mit LCMV zu einer Expansion von P14.IFNARKO T-Zellen
kommt, unter der Voraussetzung ausreichend vorhandener IL-12 Signale. Es ist bekannt, dass
es während einer LCMV Infektion zu einer starken Produktion an Typ I Interferonen kommt.
Dabei wird von infizierten Zellen zunächst IFNβ gebildet. IFNβ wird sezerniert und bindet an
den Typ I Interferonrezeptor (IFNAR) derselben Zelle (autokrin) oder benachbarter Zellen
(parakrin). Durch die Typ I Interferonsignalkaskade kommt es zur Produktion von
zusätzlichem IFNβ und IFNα. Diese positive Rückkopplung gewährleistet eine massive
Produktion von Typ I Interferonen. In Typ I Interferonrezeptor defizienten (IFNARKO)
Mäusen fehlt diese positive Rückkopplung. Somit produzieren IFNARKO Mäuse nach
LCMV Infektion geringe Mengen an Typ I Interferonen. Weiterhin ist bekannt, dass es durch
die massive Typ I Interferonproduktion in C57BL/6J Mäusen während einer LCMV Infektion
zur Inhibition der IL-12 Expression kommt [112, 128]. Da in IFNARKO Mäusen nach
LCMV Infektion nur eine geringe Menge an Typ I Interferonen vorliegt, wird die IL-12
Produktion nicht gehemmt [112, 113]. Durch dieses veränderte Zytokinmilieu sollte daher im
Kontext einer LCMV Infektion eine Expansion von P14.IFNARKO T-Zellen in IFNARKO
Rezipientenmäusen möglich sein.
Nach adoptivem Transfer von P14.IFNARKO T-Zellen in IFNARKO Empfängermäuse
konnte in dieser Arbeit erstmals eine Expansion von P14.IFNARKO T-Zellen nach Infektion
mit LCMV beobachtet werden (33 % der gesamten CD8 T-Zellpopulation) (Fig. 8). Bei
P14.WT T-Zellen lag die Expansion in IFNARKO Rezipientenmäusen nach LCMV Infektion
bei 43 %. Dies war im Vergleich zur Expansion von P14.WT T-Zellen in C57BL/6J
Empfängermäusen (87 %) nur eine Reduktion um den Faktor 2. Diese Ergebnisse zeigten,
dass es in IFNARKO Empfängermäusen nach LCMV Infektion wahrscheinlich aufgrund
erhöhter IL-12 Konzentrationen im Serum zur Expansion von P14.IFNARKO T-Zellen
kommt.
42
5 Ergebnisse
P14.WT
P14.IFNARKO
(0,2)
(42,9)
(33,1)
Thy1.1
(86,7)
AdTf in C57BL/6J
AdTf in IFNARKO
CD8
Fig. 8: Expansion von P14.IFNARKO T-Zellen in IFNARKO Mäusen. Transfer von 105 P14.WT bzw.
P14.IFNARKO T-Zellen (Thy1.1+) in C57BL/6J oder IFNARKO (Thy1.2+) Empfängermäuse (Tag -1). An
Tag 0 wurden die Rezipientenmäuse mit 200 PFU LCMV-WE i.v. infiziert. An Tag 8 nach Infektion wurde die
Expansion von Donor P14.WT und P14.IFNARKO T-Zellen durch Färbung mit anti-CD8 und anti-Thy1.1
Antikörper in der Milz analysiert. Die prozentualen Anteile der verschiedenen Zellpopulationen an den
Milzzellen sind in den Quadranten angegeben. Der prozentuale Anteil der transgenen Zellpopulation an der CD8
T-Zellgesamtpopulation ist in Klammern angegeben.
Um den Einfluss von IL-12 auf das Expansionsvermögen von P14.IFNARKO T-Zellen
während einer LCMV Infektion genauer zu untersuchen, wurden C57BL/6J Empfängermäuse
mit rekombinantem IL-12 behandelt. Es zeigte sich, dass es bei Behandlung der C57BL/6J
Rezipientenmäuse mit 1 ng, 10 ng oder 100 ng rekombinanten IL-12 (täglich von Tag -1 bis
Tag 6) zu keiner Expansion von adoptiv transferierten P14.IFNARKO T-Zellen nach LCMV
Infektion kam (Fig. 9A). Selbst nach Behandlung der Rezipientenmäuse mit einer hohen
Dosis rekombinanten IL-12 expandierten die P14.IFNARKO T-Zellen nicht (Fig. 9B). Auf
die Expansion der P14.WT hatte die IL-12 Behandlung keinen Einfluss. Trotz Behandlung
der Empfängermäuse mit rekombinantem IL-12 konnte an Tag 2 nach LCMV Infektion kein
Anstieg der IL-12 Konzentration im Serum im Vergleich zu unbehandelten Mäusen gemessen
werden. In IL-12 behandelten Mäusen konnte jedoch ein Anstieg der Serumkonzentration von
IFNγ gemessen werden. (Fig. 9B). Die erhöhte Produktion von IFNγ nach Behandlung mit IL12 ist in der Literatur beschrieben [129] und kann in diesem Experiment als indirekte
Kontrolle für die IL-12 Behandlung betrachtet werden.
43
5 Ergebnisse
A
0 ng rIL-12
1 ng rIL-12
(89,6)
100 ng rIL-12
(90,1)
(91,3)
(89,9)
(0,02)
Thy1.1
10 ng rIL-12
(0,04)
(0,0)
P14.WT
P14.IFNARKO
(0,09)
CD8
B
rIL-12
IL-12p70
12
(91,3)
----
10
pg/ml
P14.WT
8
6
Thy1.1
80
----
40
----
20
2
(0,05)
IFNγ
60
----
4
P14.IFNARKO
100
0
-
+
+
+
0 ----
---+
+
+
rIL-12
LCMV
CD8
C
IFNγ
pg/ml
IL-12p70
1000
400
800
300
600
200
400
100
200
0
0
24h
48h
72h
24h
48h
72h
Stunden nach Infektion
Fig. 9: Keine Expansion von P14.IFNARKO T-Zellen in rIL-12 behandelten LCMV infizierten C57BL/6J
Empfängermäusen. (A, B) Transfer von 105 P14.WT bzw. P14.IFNARKO T-Zellen (Thy1.1+) in C57BL/6J
(Thy1.2+) Empfängermäuse (Tag -1) und Infektion der Empfängermäuse mit 200 PFU LCMV-WE i.v. an Tag 0.
(A) I.p. Behandlung der C57BL/6J Empfängermäuse mit der angegebenen Menge an rIL-12 von Tag -1 bis
Tag 6. An Tag 7 nach Infektion wurde die Expansion von P14.WT und P14.IFNARKO T-Zellen durch Färbung
mit anti-CD8 und anti-Thy1.1 Antikörper im Blut analysiert. Die prozentualen Anteile der verschiedenen
Zellpopulationen an den PBLs sind in den Quadranten angegeben. Der prozentuale Anteil der transgenen
Zellpopulation an der CD8 T-Zellgesamtpopulation ist in Klammern angegeben. (B) I.p. Behandlung der
C57BL/6J Empfängermäuse mit 100 ng rIL-12 an Tag -1, 500 ng rIL-12 an Tag 0, 300 ng rIL-12 an Tag 1 und
100 ng rIL-12 an Tag 2. An Tag 7 nach Infektion wurde die Expansion von P14.WT und P14.IFNARKO TZellen durch Färbung mit anti-CD8 und anti-Thy1.1 Antikörper im Blut analysiert. Die prozentualen Anteile der
verschiedenen Zellpopulationen an den PBLs sind in den Quadranten angegeben. Der prozentuale Anteil der
transgenen Zellpopulation an der CD8 T-Zellgesamtpopulation ist in Klammern angegeben. Die
Serumkonzentration von IL-12p70 und IFNγ von naiven (●), LCMV infizierten (○) und LCMV infizierten, rIL-
44
5 Ergebnisse
12 behandelten (◊) C57BL/6J Empfängermäusen 48 h nach Infektion wurde mittels des CBA Kits von BD
Biosciences bestimmt. (C) Die Serumkonzentrationen von IL-12p70 und IFNγ von 200 PFU LCMV-WE
infizierten C57BL/6J (○) und IFNARKO Empfängermäusen (■) 24 h, 48 h und 72 h nach Infektion wurde
mittels des CBA Kits von BD Biosciences bestimmt.
Weshalb allerdings eine Applikation von IL-12 in C57BL/6J Mäusen die P14.IFNARKO TZellen im Kontext einer LCMV Infektion nicht „retten“ konnte, während ein Transfer dieser
T-Zellen in IFNARKO Mäuse die Expansion ermöglichte, muss in weiteren Experimenten
geklärt werden. Erste Daten zeigen, dass in IFNARKO Mäusen 48 h und 96 h nach LCMV
Infektion hohe IL-12 Serumkonzentrationen nachweisbar sind (700 pg/ml bzw. 890 pg/ml)
(Fig. 9C). Diese Serumwerte entsprechen den IL-12 Serumkonzentrationen, die 24 h nach
Infektion in H8 Mäusen detektierbar waren (ca. 700 pg/ml), die zusätzlich mit einer hohen
Dosis anti-CD40 Antikörper behandelt wurden (Fig. 7). Außerdem kann in LCMV infizierten
IFNARKO Mäusen 24 h und 48 h nach Infektion IFNγ im Serum nachgewiesen werden (Fig.
7). Die Vermutung liegt nahe, dass in C57BL/6J Mäusen durch die Verabreichung von
rekombinantem IL-12 im Vergleich zu anti-CD40 Antikörpern behandelten H8 Mäusen nicht
genügend hohe IL-12 Konzentrationen erreicht werden, um eine Expansion der
P14.IFNARKO T-Zellen zu ermöglichen. Um diese Vermutung zweifelsfrei zu belegen,
müssen weitere Versuche mit P14 T-Zellen durchgeführt werden, die einen defekten Typ I
Interferonrezeptor und einen defekten IL-12 Rezeptor aufweisen (P14.DOKO). Käme es zu
keiner Expansion der P14.DOKO T-Zellen in IFNARKO Empfängermäusen und in antiCD40 AK behandelten H8 Empfängermäusen im Kontext einer LCMV Infektion, so könnte
auf ein kompensatorisches drittes Signal durch IL-12 geschlossen werden.
5.2 Analyse des interzellulären Membranproteinaustauschs
während der Aktivierung von antigenspezifischen
T-Zellen
5.2.1 Beschreibung des experimentellen Systems
Bisher wurde der Membranproteinaustausch zwischen APZs und T-Zellen während einer
antigenspezifischen Interaktion vor allem in vitro untersucht. Es liegen nur wenige in vivo
Studien zu diesem interzellulären Proteinaustausch vor. Zudem wurden bei den vorliegenden
Studien hohe Frequenzen spezifischer T-Zellen verwendet, die nicht einer physiologischen
Situation entsprechen [96, 99-101]. In dieser Arbeit wurde daher ein in vivo System etabliert,
45
5 Ergebnisse
mit dessen Hilfe der Proteinaustausch zwischen antigen-präsentierenden Zellen (APZs) und
antigenspezifischen T-Zellen unter physiologischen Bedingungen analysiert werden konnte.
Hierzu wurde eine geringe Anzahl (2x106) LCMV spezifischer Gedächtnis P14 T-Zellen
(Thy1.1+), welche das immundominante LCMV-Epitop GP33-41 im Kontext von MHC
Klasse I Db Molekülen erkennen, in C57BL/6J Mäuse (Thy1.2+) transferiert. Dies führte zu
einer im physiologischen Bereich liegenden Frequenz antigenspezifischer T-Zellen (1-2% der
gesamten CD8 T-Zellen). Einen Tag nach adoptivem Transfer der Gedächtnis P14 T-Zellen
wurden APZs, welche entweder mit dem nominalen GP33-Peptid oder einem irrelevanten
Peptid beladen waren, in die Rezipientenmäuse transferiert. Während es zwischen den GP33Peptid beladenen APZs und den Gedächtnis P14 T-Zellen zu einer antigenspezifischen
Interaktion kommt, wird das irrelevante Peptid nicht vom P14 TZR erkannt. 2-3 h nach
Transfer der antigenbeladenen APZs wurde den Rezipientenmäusen die Milz entnommen und
der interzelluläre Proteintransfer von den antigenbeladenen APZs auf die Gedächtnis P14 TZellen
mittels
Durchflusszytometrie
analysiert
(Abb.
3).
Dieser
interzelluläre
Membranproteintransfer von APZs auf T-Zellen wird als T-Zelltrogozytose bezeichnet. Der
beschriebene experimentelle Ansatz wurde bis auf die gekennzeichneten Ausnahmen für alle
folgenden Versuche verwendet.
Transfer von Gedächtnis P14 T-Zellen (Tag -1)
+ antigenbeladenen APZs (Tag 0)
2-3 h Milzentnahme
Analyse der Trogozytose
Abb. 3: Experimentelles Modell zur Analyse der in vivo T-Zelltrogozytose. C57BL/6J Rezipientenmäuse
erhielten einen adoptiven Transfer von 2x106 Gedächtnis P14 T-Zellen. Am folgenden Tag wurden 3x106
biotinylierte, antigenbeladene APZs in die Rezipientenmäuse transferiert. 2-3 Stunden nach Transfer wurde die
Milz entnommen. Es wurde mittels einer durchflusszytometrischen Analyse untersucht, ob es zu einem
Membranproteinaustausch zwischen den APZs und den Gedächtnis P14 T-Zellen gekommen ist.
5.2.2 Detektion von in vivo T-Zelltrogozytose mittels unterschiedlicher
Zelloberflächenmarker
Um den Membrantransfer von APZs auf T-Zellen in vivo zu untersuchen, wurden drei
unterschiedliche experimentelle Ansätze verwendet. Zum einen wurden APZs biotinyliert und
der Transfer von biotinylierten Membranproteinen auf T-Zellen untersucht. Zum anderen
wurde in einem semiallogenen System der Transfer von MHC Klasse I Molekülen von APZs
46
5 Ergebnisse
auf T-Zellen analysiert. Des Weiteren wurde untersucht, ob sich CD45.1 Moleküle ebenfalls
als Marker für Trogozytose eignen.
Im ersten experimentellen Ansatz wurden biotinylierte, antigenbeladene (GP33-Peptid oder
Kontroll-Peptid) B6 (C57BL/6J) APZs in Rezipientenmäuse (Thy1.2+) transferiert, die eine
geringe Frequenz LCMV spezifischer Gedächtnis P14 T-Zellen (Thy1.1+) aufweisen. Im
Falle einer T-Zelltrogozytose konnten die erworbenen biotinylierten Membranproteine auf
den T-Zellen mittels einer Streptavidin Färbung im Durchflusszytometer detektiert werden.
Die Analyse der Milzzellen zeigte, dass 40-70 % der P14 T-Zellen, 3 Stunden nach Transfer
der biotinylierten APZs, biotinylierte Membranproteine von GP33-Peptid beladenen APZs
akquiriert haben (Fig. 10A). Im Gegensatz dazu nahmen nur 10 % der P14 T-Zellen im Fall
von Kontroll-Peptid beladenen APZs biotinylierte Membranproteine auf. Dieser Unterschied
in der T-Zelltrogozytose spiegelt sich auch in der mittleren Fluoreszenzintensität (MFI) von
Streptavidin der P14 T-Zellen wieder. Während P14 T-Zellen, die mit GP33-beladenen APZs
in Kontakt waren, eine mittlere Fluoreszenzintensität von 67 aufwiesen, zeigten P14 T-Zellen,
die in Kontakt mit Kontroll-Peptid beladenen APZs waren, eine mittlere Fluoreszenzintensität
von 12 auf. Die Ergebnisse zeigten, dass in dem hier etablierten physiologischen,
experimentellen System eine T-Zelltrogozytose durch den Transfer von biotinylierten
Membranproteinen detektiert werden konnte.
47
5 Ergebnisse
Streptavidin
GP33-Peptid
65,8
Kontroll-Peptid
MFI
11,1
Ko % Trogozytose+ T-Zellen
nt
ro
lle
GP
33
A Transfer von oberflächen-biotinylierten APZs
100
**
80
12,0
----
60
67,7
34,2
40
20
88,9
----
0
Streptavidin
Thy1.1
Transfer von MHC disparaten H-2bxd APZs
GP33-Peptid
50,0
Kontroll-Peptid
MFI
4,6
% Trogozytose+ T-Zellen
% Trogozytose+ T-Zellen
Ko
Ko
nt
n
t
ro
ro
lle
lle
GP
GP
33
33
B
100
**
80
12,5
H-2Dd
60
29,7
50,0
20
95,4
0
H-2Dd
Thy1.1
C Transfer von CD45.1+ APZs
GP33-Peptid
----
40
Kontroll-Peptid
----
100
CD45.1
39,0
MFI
3,7
5,2
**
60
56,7
61,0
80
----
40
20
96,3
----
0
CD45.1
Thy1.1
Fig. 10: Detektion der in vivo Trogozytose mittels Transfer von Membranproteinen. (A) Transfer von
biotinylierten Membranproteinen von antigenbeladenen B6 (C57BL/6J) APZs auf P14 T-Zellen. Der Transfer
wurde mittels einer Streptavidin Färbung nachgewiesen. Die Punktediagramme beziehen sich auf die Thy1.1+
P14 T-Zellen. Die Prozentzahlen der jeweiligen Quadranten sind angegeben. Im Histogramm ist die mittlere
Fluoreszenzintensität von Streptavidin der P14 T-Zellen nach Kontakt mit GP33-beladenen APZs (graue Linie)
oder Kontroll APZs (schwarze Linie) dargestellt. (B) Transfer von MHC Molekülen in einem semiallogenen
System. Dabei wurden MHC Moleküle von H-2bxd Milzzellen, die mit GP33-Peptid oder Kontroll-Peptid
beladen waren, auf P14 T-Zellen (H-2b) transferiert. Die Detektion von Trogozytose erfolgte mit einer
spezifischen Färbung für H-2Dd Moleküle. (C) Transfer von CD45.1 Molekülen von antigenbeladenen APZs
(CD45.1+) auf P14 T-Zellen (CD45.2+). Der Transfer wurde mittels einer CD45.1 spezifischen Färbung
nachgewiesen. Repräsentative Ergebnisse von 2-3 Experimenten mit 2-3 Mäusen pro Gruppe sind gezeigt.
Wie bereits eingangs erwähnt, wurden die transferierten P14 T-Zellen mittels des Thy1.1
Markers in den Rezipienten detektiert. Käme es zwischen enodogenen (Thy1.2+) und adoptiv
transferierten (Thy1.1+) T-Zellen zu einem interzellulären Austausch des Thymusmarkers
Thy1, der auf T-Zellen und zum Teil auf NK-Zellen exprimiert wird, würden endogene TZellen fälschlicherweise als transferierte P14 T-Zellen identifiziert werden. Somit wäre keine
eindeutige Detektion der P14 T-Zellen mehr möglich. Um einen Austausch von Thy1.1 und
Thy1.2 Markermolekülen zwischen transferierten T-Zellen und endogenen T-Zellen
48
5 Ergebnisse
auszuschließen, wurde eine Doppelfärbung für Thy1.1 und Thy1.2 Moleküle durchgeführt.
Diese zeigte, dass während der Trogozytose nur ein geringer Anteil der CD8 T-Zellen
(0,01 %) doppelpositiv für Thy1.1/Thy1.2 Moleküle war. Dabei spielte es keine Rolle, ob
GP33-Peptid oder Kontroll-Peptid beladene APZs transferiert wurden (Fig. 11A und B). Des
Weiteren zeigte eine Färbung mit GP33-Tetramer, dass 97 % der transferierten Gedächtnis
P14 T-Zellen (Thy1.1+) den GP33-spezifischen T-Zellrezeptor trugen. Im Gegensatz dazu
waren nur 0,1 % der endogenen T-Zellen (Thy1.2+) positiv für einen GP33-spezifischen TZellrezeptor. Diese Ergebnisse zeigten, dass es zu keinem Austausch des Thy1.1 Markers
zwischen T-Zellen kommt. Daher ist dieser Marker für die Detektion der transferierten P14 TZellen, im Kontext einer T-Zelltrogozytose, geeignet.
B
A Transfer von Thy1 Marker
Thy1.2
94,8
0,01
94,4
1,61
3,5
1,99
0,01
3,6
Streptavidin
Kontroll-Peptid
GP33-Peptid
Trogozytose
GP33-Peptid
Kontroll-Peptid
17,6
2,6
82,4
97,4
Thy1.1
Thy1.1
Gedächtnis
P14 T-Zellen
GP33-Tetramer
GP33-Tetramer
C GP33-Tetramer positive T-Zellen
97,4
2,6
Endogene
T-Zellen
0,1
99,9
Thy1.2
Thy1.1
Fig. 11: Kein Transfer von Thy1 Markermolekülen zwischen T-Zellen während der Trogozytose. (A) Analyse
des Austauschs von Thy1.1 und Thy1.2 Molekülen zwischen Donor T-Zellen (Thy1.1+) und Rezipienten TZellen (Thy1.2+) nach Transfer von GP33-Peptid oder Kontroll-Peptid beladenen APZs. Die Punktediagramme
beziehen sich auf CD8 T-Zellen. Die Prozentzahlen der jeweiligen Quadranten sind angegeben. (B) Transfer von
biotinylierten Membranfragmenten von antigenbeladenen APZs auf P14 T-Zellen. Der Transfer wurde mittels
einer Streptavidin Färbung nachgewiesen. Die Punktediagramme beziehen sich auf die CD8+/Thy1.1+ T-Zellen.
Die Prozentzahlen der jeweiligen Quadranten sind angegeben. (C) Detektion von GP33-spezifischen T-Zellen
mittels GP33-Tetramer Färbung. Transferierte CD8 P14 T-Zellen (Thy1.1+) und endogene CD8 T-Zellen
(Thy1.2+) sind in den Punktediagrammen dargestellt. Die Prozentzahlen der jeweiligen Quadranten sind
angegeben. Die gezeigten Ergebnisse sind von einem Experiment mit 3 Mäusen pro Gruppe.
Neben dem Transfer von biotinylierten Membranproteinen wurde untersucht, ob in einem
semiallogenen System MHC Klasse I Moleküle von APZs auf T-Zellen transferiert werden.
Hierfür wurden H-2bxd APZs mit GP33- oder Kontroll-Peptid beladen und in
49
5 Ergebnisse
Rezipientenmäuse transferiert. Die MHC Klasse I Db Moleküle präsentieren dabei die
Peptidantigene (GP33- oder das Kontroll-Peptid). Zur Analyse der Trogozytose wurde der
Transfer von H-2Dd Molekülen von den APZs auf die Gedächtnis P14 T-Zellen (H-2Db)
quantifiziert. Dabei zeigte sich, dass 50 % der P14 T-Zellen positiv für H-2Dd Moleküle
wurden, wenn sie in Kontakt mit GP33-Peptid beladenen APZs waren (Fig. 10B). Im
Gegensatz dazu wurden in der Kontrollgruppe nur 5 % der P14 T-Zellen positiv für H-2Dd
Moleküle. Dieser Unterschied wurde auch bei der Analyse der durchschnittlichen
Fluoreszenzintensität für H-2Dd Moleküle auf den P14 T-Zellen sichtbar. Die Ergebnisse
zeigten, dass die T-Zelltrogozytose durch den Nachweis eines Transfers von MHC Molekülen
in vivo detektiert werden kann.
In einem weiteren experimentellen Ansatz wurde der interzelluläre Transfer von CD45.1
Molekülen zur Quantifizierung der in vivo T-Zelltrogozytose herangezogen. CD45 Moleküle
werden als kongene Marker experimentell genutzt und sind auf T- und B-Zellen und APZs
exprimiert. In kürzlich publizierten Arbeiten wurde gezeigt, dass es in einem XenograftMausmodell und während antigenspezifischem Kontakt zwischen APZs und T-Zellen zu
einem Austausch von CD45 Molekülen zwischen den Zellen kommen kann [130, 131]. Um
CD45 als Markermolekül für die Trogozytose zu analysieren, wurden Milzzellen von B6.SJL
Mäusen (CD45.1+) als APZs verwendet und mit GP33- oder Kontroll-Peptid beladen. Nach
Transfer der APZs in Rezipientenmäuse (CD45.2+) wurde der Austausch von CD45.1
Molekülen zwischen APZs (CD45.1+) und P14 T-Zellen (CD45.2+) untersucht. Es zeigte
sich, dass über 40 % der P14 T-Zellen CD45.1 Moleküle akquirierten, wenn sie in Kontakt
mit GP33-Peptid beladenen APZs waren. Im Gegensatz dazu wurden in der Kontroll-Gruppe
weniger als 10 % der P14 T-Zellen positiv für CD45.1 Moleküle (Fig. 10C). Dieses
unterschiedliche Trogozytoseverhalten der T-Zellen wurde auch durch die Analyse der
durchschnittlichen Fluoreszenzintensität für CD45.1 Moleküle auf den P14 T-Zellen deutlich.
Somit konnte in diesem experimentellen Ansatz erfolgreich die Verwendung von CD45.1
Molekülen zum Nachweis und zur Quantifizierung einer in vivo T-Zelltrogozytose aufgezeigt
werden.
Alle drei experimentellen Ansätze zur Untersuchung des Proteintransfers von APZs auf TZellen in vivo zeigten, dass bei einem physiologisch geringen Anteil von Gedächtnis P14 TZellen Trogozytose in vivo nachweisbar ist. Dabei können unterschiedliche Markermoleküle
zur Detektion dieses Prozesses herangezogen werden. Aus den Ergebnissen geht hervor, dass
50
5 Ergebnisse
sich sowohl biotinylierte Membranproteine als auch MHC Klasse I und CD45 Moleküle als
Markermoleküle für den Nachweis von T-Zelltrogozytose in vivo eignen.
5.2.3 In vivo T-Zelltrogozytose ist ein antigenspezifischer Prozess
In Abschnitt 5.2.2 wurde gezeigt, dass bei fehlendem antigenspezifischem Kontakt zwischen
Kontroll-Peptid beladenen APZs und P14 T-Zellen nur ein geringer Prozentsatz der P14 TZellen (5-10 %) trogozytose-positiv wurden. Im Gegensatz dazu konnte nach Transfer von
GP33-Peptid beladenen APZs aufgrund der antigenspezifischen Interaktion zwischen diesen
APZs und den P14 T-Zellen eine deutlich erhöhte T-Zelltrogozytose detektiert werden (4070 % trogozytose-positive P14 T-Zellen) (Fig. 10). Diese Ergebnisse weisen bereits auf eine
Antigenspezifität der Trogozytose hin. In einem weiteren Experiment, der „Cold-target“
Inhibition, sollte diese Antigenspezifität des Trogozytosevorgangs weiter bestätigt werden.
„ Cold-target“ – Inhibition
3x107 Kontroll-Peptid beladen
1x107 Kontroll-Peptid beladen
3x106 Kontroll-Peptid beladen
3x107 GP33-Peptid beladen
1x107 GP33-Peptid beladen
% inhibition of trogocytosis
3x106 GP33-Peptid beladen
Kein Kotransfer
0
10
20
30
40
50
% Inhibition der Trogozytose
Fig. 12: Analyse der Antigenspezifität der T-Zelltrogozytose mittels einer „Cold-target“-Inhibition. Kotransfer
von biotinylierten, GP33-Peptid beladenen B6 (C57BL/6J) APZs und einer unterschiedlichen Anzahl von
unbiotinlyierten, GP33- oder Kontroll-Peptid beladenen B6 APZs. Die P14 T-Zelltrogozytose wurde durch den
Transfer von biotinylierten Membranproteinen von APZs auf P14 T-Zellen bestimmt und mittels einer Färbung
mit Streptavidin durchflusszytometrisch gemessen. Das Balkendiagramm zeigt den Prozentsatz der Inhibition
der Trogozytose nach Kotransfer bezogen auf eine experimentelle Gruppe ohne Kotransfer. Gezeigte Ergebnisse
sind aus einem repräsentativen Experiment mit 2 Mäusen pro Gruppe.
Dabei
wurden
3x106
GP33-Peptid
beladene,
biotinylierte
APZs
zusammen
mit
unbiotinylierten GP33- oder Kontroll-Peptid beladenen APZs in Rezipienten kotransferiert.
Anschließend wurde die Trogozytose der P14 T-Zellen analysiert. Bei einem Kotransfer von
biotinylierten GP33-Peptid beladenen APZs mit 3x106 unbiotinylierten, GP33-Peptid
51
5 Ergebnisse
beladenen APZs kam es zu keiner Inhibition der P14 T-Zelltrogozytose (Fig. 12). Mit 1x107
kotransferierten unbiotinylierten, GP33-Peptid beladenen APZs wurde die P14 TZelltrogozytose zu 10 % gehemmt. Ein Anstieg dieser Inhibition auf 40 % wurde bei einem
Kotransfer von 3x107 kotransferierten, unbiotinylierten, GP33-Peptid beladenen APZs
detektiert. Der Kotransfer von unbiotinylierten, Kontroll-Peptid beladenen APZs führte zu
keiner Inhibition der Trogozytose. Diese Ergebnisse zeigten, dass kotransferierte,
unbiotinylierte GP33-Peptid beladene APZs mit den biotinylierten, GP33-Peptid beladenen
APZs um die antigenspezifische Interaktion mit den P14 T-Zellen kompetitieren. Dadurch
kommt es zu einem verminderten Kontakt von P14 T-Zellen mit biotinylierten GP33-Peptid
beladenen APZs. Dies führt zu einer verringerten P14 T-Zelltrogozytose und somit zu einer
Inhibition der Trogozytose. Bei einem Kotransfer von unbiotinylierten, Kontroll-Peptid
beladenen APZs kommt es zu keiner Kompetition mit den biotinylierten, GP33-Peptid
beladenen APZs um die antigenspezifische Interaktion mit den P14 T-Zellen. Dadurch findet
bei diesem Kotransfer keine Inhibition der P14 T-Zelltrogozytose statt. Diese Ergebnisse
bestätigen somit die Antigenspezifität der Trogozytose in dem verwendeten System.
5.2.4 In vivo T-Zelltrogozytose
exprimiertem Antigen
nach
Kontakt
zu
APZs
mit
endogen
In den oben genannten Versuchen wurden die APZs mit hohen Peptidkonzentrationen
(10-6 M) beladen, was zu einer unphysiologisch hohen Dichte an antigenbeladenen MHC
Klasse I Molekülen auf den APZs führt. Dies ist ein kritischer Punkt des experimentellen
Ansatzes, da in Arbeiten von Huang et al. [57] und Hudrisier et al. [68] gezeigt wurde, dass
die Peptidkonzentration direkt mit dem Ausmaß der T-Zelltrogozytose korreliert.
Interessanterweise wurde die in vivo Trogozytose bisher nur mit Hilfe von APZs gezeigt, die
mit hohen Antigenkonzentrationen beladen wurden [96, 100, 101]. Um die Beladung von
APZs mit unphysiologisch hohen Mengen an Antigen zu umgehen, wurden im Folgenden
biotinylierte Milzzellen von H8 transgenen Mäusen als APZs verwendet. H8 transgene Mäuse
exprimieren das GP33-Epitop endogen unter der Kontrolle eines MHC Klasse I Promotors.
Die Abschätzung der Peptidkonzentration, die exogen verabreicht notwendig ist um eine
ähnliche MHC Klasse I Beladung zu erreichen, wie sie nach der Prozessierung eines endogen
exprimierten GP33 Antigens vorliegt, wurde mittels einer in vitro Proliferation ermittelt.
Dabei wurde die Stimulation von P14 T-Zellen durch H8 oder B6 (C57BL/6J) Milzzellen, die
mit unterschiedlichen GP33-Peptidkonzentrationen beladen wurden, verglichen (Fig. 13A).
52
5 Ergebnisse
A
Bestimmung der Antigenmenge auf H8-APZs
GP33-Peptid beladene Milzzellen
10-9 M
10-10 M
H8 Milzzellen
10-8 M
Thy1.1
81,7
16,9
31,5
29,4
(70,0)
(82,9)
0,3
68,7
1,0
0,3
62,8
64,2
(65,0)
(32,9)
0,9
1,6
33,8
0,8
3,4
2,6
CFSE
B
Streptavidin
H8: endogenes GP33
B6: kein GP33
19,6
***
30
----
20
10
287,4
96,7
80,4
0
Thy1.1
C
40
MFI
97,4
3,3
% Trogozytose+ T-Zellen
B6
-b
io
H8
-b
io
Transfer von oberflächen-biotinylierten APZs
Streptavidin
----
Titration von oberflächen-biotinylierten APZs
1x106
6,7
3x106
1x107
18,9
53,2
3x107
61,9
Streptavidin
H8-bio
93.3
81,1
0,7
1,5
46,8
38,1
6,0
14,8
B6-bio
98,5
99,3
94,0
85,2
Thy1.1
D
Kinetik
Streptavidin
3h
8h
H8-bio
H8-bio
B6-bio
19,6
3,3
4,6
2,2
80,4
96,7
95,4
97,8
B6-bio
Thy1.1
Fig. 13: In vivo Trogozytose von T-Zellen nach Interaktion mit APZs, welche das GP33-Epitop endogen
exprimieren. (A) In vitro Proliferation von P14 T-Zellen nach Stimulation mit H8 oder B6 (C57BL/6J)
Milzzellen, die mit unterschiedlichen GP33-Peptidkonzentrationen beladen wurden. 5x104 CFSE-gefärbte P14
T-Zellen wurden mit 104 GP33-beladenen B6 Milzzellen oder H8 Milzzellen in einer 96 Loch Flachbodenplatte
stimuliert. Die B6 Milzzellen wurden hierfür mit 10-8, 10-9 oder 10-10 M GP33-Peptid beladen. Nach 3 Tagen
wurde die Proliferation der CFSE gefärbten P14 T-Zellen bestimmt. Die Punktediagramme beziehen sich auf
CD8 T-Zellen. Die Prozentzahlen der jeweiligen Quadranten sind angegeben. Die Prozentzahlen in Klammern
sind der Anteil der proliferierten P14 T-Zellen an den gesamten P14 T-Zellen. (B) Transfer von biotinylierten
53
5 Ergebnisse
Membranproteinen von H8 oder B6 (C57BL/6J) APZs auf P14 T-Zellen. Der Transfer wurde mittels einer
Streptavidin Färbung nachgewiesen. Die Punktediagramme beziehen sich auf die Thy1.1+ P14 T-Zellen. Die
Prozentzahlen der jeweiligen Quadranten sind angegeben. In dem Histogramm ist die mittlere
Fluoreszenzintensität von Streptavidin auf den P14 T-Zellen gezeigt, die H8 APZs (graue Linie) oder B6 APZs
(schwarze Linie) ausgesetzt waren. Die Werte der durchschnittlichen Fluoreszensintensität sind im Histogramm
angegeben. (C) Titration von biotinylierten H8 bzw. B6 (C57BL/6J) APZs. Es wurden unterschiedliche
Anzahlen (1x106, 3x106, 1x107, 3x107) von biotinylierten H8 bzw. B6 APZs in Rezipientenmäuse transferiert.
Die T-Zelltrogozytose wurde durch Streptavidin Färbung nachgewiesen. Die Punktediagramme beziehen sich
auf die Thy1.1+ P14 T-Zellen. Die Prozentzahlen der jeweiligen Quadranten sind angegeben. (D) P14 TZelltrogozytose 3 bzw. 8 Stunden nach Transfer von biotinylierten H8 bzw. B6 (C57BL/6J) APZs.
Repräsentative Resultate von einem aus zwei bis drei Experimenten mit zwei bis drei Mäusen pro Gruppe sind
gezeigt.
Die
P14
T-Zellen
wurden
hierfür
mit
dem
Fluoreszenzfarbstoff
CFSE
(5,6-
Carboxyfluoreszein-Diacetat-Succinimidyl-Ester) markiert. Bei jeder Zellteilung wird der
Farbstoff auf die beiden Tochterzellen verteilt. Dadurch kommt es zu einer Ausverdünnung
des Farbstoffs, d.h. seine Intensität im Durchflusszytometer nimmt um den Faktor 2 ab.
Folglich kann über die Abnahme der Fluoreszenzintensität die Anzahl der Zellteilungen, die
eine Zelle durchläuft, bestimmt werden. Nach 3 Tagen in vitro Stimulation zeigte sich, dass
mit 10-8 M GP33-beladenen B6 Milzzellen 82,9 % der P14 T-Zellen proliferierten. Mit 10-9 M
GP33-beladenen B6 Milzzellen waren es 70,0 % und mit 10-10 M GP33-beladenen B6
Milzzellen nur 32,9 % der P14 T-Zellen (Fig. 13A). Wurde die gleiche Anzahl an H8
Milzzellen eingesetzt, proliferierten 65,0 % der P14 T-Zellen in vitro. Dies zeigte, dass die
Präsentation des endogen exprimierten GP33-Peptids auf H8 Milzzellen ungefähr einer
exogenen Beladung der MHC Klasse I Moleküle mit 10-9 M GP33-Peptid entspricht.
Die Analyse der Trogozytose nach Kontakt der T-Zellen mit APZs, welche endogen
exprimiertes GP33-Peptid präsentieren (H8 APZs), zeigte, dass 20-30 % der P14 T-Zellen
biotinylierte Membranproteine von H8 APZs aufgenommen hatten. Im Gegensatz dazu waren
in der Kontroll-Gruppe mit B6 (C57BL/6J) APZs nur 3 % der P14 T-Zellen trogozytosepositiv (Fig. 13B). Dieser Unterschied im Trogozytoseverhalten zeigte sich auch in der
mittleren Fluoreszenzintensität von Streptavidin der P14 T-Zellen, die entweder in Kontakt
mit H8 APZs oder B6 APZs waren. Somit ist die Expression eines endogenen Antigens
ausreichend, um in vivo Trogozytose auslösen zu können. Dies ist eine wichtige
Voraussetzung
dafür,
in
vivo
T-Zelltrogozytose
während
natürlich
ablaufenden
Immunantworten nachzuweisen, da dort die Antigenexpression unter Umständen limitiert ist.
In einem weiteren Schritt wurde die Anzahl der H8 APZs, die für den Nachweis einer in vivo
Trogozytose der P14 T-Zellen benötigt werden, bestimmt. Nach Transfer von 3x107
54
5 Ergebnisse
biotinylierten H8 APZs, nahmen 62 % der P14 T-Zellen biotinylierte Membranproteine von
den H8 APZs auf (Fig. 13C). Hierbei zeigte sich jedoch, dass bei einem Transfer von 3x107
biotinlyierten B6 APZs, die kein GP33-Antigen exprimieren, ebenfalls etwa 15 % der P14 TZellen positiv für Trogozytose wurden. Somit kam es bei dieser hohen Zahl transferierter
APZs zu einer verstärkten antigenunspezifischen Trogozytose. Mit dem Transfer von
geringeren APZ-Mengen nahm die T-Zelltrogozytose im Falle von H8 APZs zwar ab
(Reduktion der P14 T-Zelltrogozytose um den Faktor 9 nach Transfer von 1x106
biotinylierten H8 APZs im Vergleich zu 3x107), allerdings weniger stark als nach Kontakt mit
B6 APZs (Reduktion der unspezifischen P14 T-Zelltrogozytose um den Faktor 21 nach
Transfer von 1x106 biotinylierten B6 APZs im Vergleich zu 3x107). Dabei fiel auf, dass selbst
mit einer geringen Anzahl von 1x106 H8 APZs T-Zelltrogozytose detektierbar war (6,7 %).
Dies deutet daraufhin, dass in vivo Trogozytose auch während Immunantworten
nachzuweisen ist, wenn die Anzahl der APZs, die das entsprechende Antigen präsentieren,
limitiert ist.
In einem weiteren Experiment wurde die Kinetik der Trogozytose untersucht. Hierfür wurde
die P14 T-Zelltrogozytose 3 und 8 Stunden nach Transfer von biotinylierten APZs analysiert.
Während nach 3 Stunden 20 % der P14 T-Zellen bei Kontakt mit H8 APZs trogozytosepositiv waren, konnten nach 8 Stunden nur noch 4,6 % trogozytose-positive P14 T-Zellen
nachgewiesen werden (Fig. 13D). Somit ist der Nachweis einer T-Zelltrogozytose in dem hier
verwendeten experimentellen System nur in einem engen zeitlichen Rahmen möglich.
Zusammenfassend zeigten die Ergebnisse, dass die Präsentation eines endogen exprimierten
Antigens auf MHC Molekülen von APZs ausreichend ist, um nach Interaktion mit
antigenspezifischen T-Zellen in vivo eine T-Zelltrogozytose auszulösen.
5.2.5 T- und B-Zellen als APZs während einer T-Zelltrogozytose
Eine Studie von C. Beadling und M.K. Slifka [132] zeigte, dass die Art der APZs eine
entscheidende Rolle für das Ausmaß einer T-Zelltrogozytose spielt. Dabei waren in vitro
keine Unterschiede in der Trogozytose nachweisbar, wenn Milzzellen oder die B-Zelllinie
A20 als APZs verwendet wurden. Bei Verwendung von Makrophagen oder Fibroblasten als
APZs kam es jedoch zu einer verminderten in vitro Trogozytose. Da diese Studie auf in vitro
Daten und Zelllinien basierte, sollte nun geklärt werden, ob die Art der APZs auch in vivo
eine Rolle bei der Trogozytose spielt. Als APZs wurden dabei Gesamtmilzzellen mit
55
5 Ergebnisse
aufgereinigten T- und B-Zellen als APZs verglichen. Dafür wurden T- und B-Zellen mittels
Magnetsäulenisolation aus einer B6 (C57BL/6J) Milzzellsuspension gewonnen und
anschließend biotinyliert und mit Antigen beladen. Im Anschluss wurden 3x106 biotinylierte
und antigenbeladene APZs (Gesamtmilzzellen, T- oder B-Zellen) in Rezipientenmäuse
transferiert. Die Analyse der P14 T-Zelltrogozytose erfolgte nach 3 Stunden. Dabei zeigte
sich, dass P14 T-Zellen weniger trogozytose-positiv waren, wenn sie in Kontakt mit
biotinylierten, GP33-Peptid beladenen B-Zellen waren (26 %), als wie wenn sie mit
biotinylierten, GP33-Peptid Gesamtmilzzellen interagiert hatten (38 %) (Fig. 14A). Wurden
jedoch biotinylierte, GP33-Peptid beladene T-Zellen als APZs verwendet, zeigte sich ein
Anstieg
bei
den
trogozytose-positiven
P14
T-Zellen
(49 %)
im
Vergleich
zu
Geasmtmilzzellen als APZs. Der Anteil unspezifischer P14 T-Zelltrogozytose in den
Kontroll-Gruppen war sowohl bei T-Zellen (9,5 %) als auch bei B-Zellen (8 %) leicht höher
als bei Gesamtmilzzellen (3 %).
A
B
In vivo
Milzzellen
38,5
B-Zellen
T-Zellen
25,9
48,7
In vitro
Milzzellen
12,6
B-Zellen
17,4
T-Zellen
14,2
GP33Peptid
61,5
74,1
3,1
7,9
96,9
51,3
9,5
92,1
Streptavidin
KontrollPeptid
Streptavidin
GP33Peptid
90,5
85,8
6,7
1,5
1,3
KontrollPeptid
93,3
98,5
98,7
Thy1.1
Milzzellen
50
B-Zellen
50
40
40
40
30
30
30
20
20
----
0
----
10
----
10
----
---0
GP
33
Ko
nt
ro
lle
0
GP
33
T-Zellen
Ko
nt
----
20
10
82,6
ro
lle
GP
33
50
Ko
nt
ro
lle
% Trogozytose+ T-Zellen
Thy1.1
87,4
Fig. 14: Einfluss von verschiedenen APZs auf die T-Zelltrogozytose. (A) Die mittels Magnetsäulenisolation
gewonnenen T- und B-Zellen wurden nach Biotinylierung und Antigenbeladung in Rezipientenmäuse
transferiert. Als Kontrolle dienten unaufgereinigte Milzzellen, die ebenfalls biotinyliert und antigenbeladen
wurden. Die in vivo Trogozytose wurde mittels einer Streptavidin Färbung nachgewiesen. Die Punktediagramme
beziehen sich auf die Thy1.1+ P14 T-Zellen. Die Prozentzahlen der jeweiligen Quadranten sind angegeben. (B)
Zur Detektion der T-Zelltrogozytose in vitro wurden 1x104 biotinylierte und antigenbeladene APZs
(Gesamtmilzzellen, T- oder B-Zellen) für 3 Stunden mit 5x103 Gedächtnis P14 T-Zellen inkubiert. Danach
wurden die Zellen geerntet und der interzelluläre Proteintransfer mittels einer Streptavidin Färbung
nachgewiesen. Die Punktediagramme beziehen sich auf die Thy1.1+ P14 T-Zellen. Die Prozentzahlen der
jeweiligen Quadranten sind angegeben. Repräsentative Ergebnisse von 2 Experimenten mit 1-2 Mäusen pro
Gruppe sind gezeigt.
56
5 Ergebnisse
Um zu untersuchen, ob der Unterschied zwischen T- und B-Zellen auf ihre unterschiedliche
Anzahl von antigenbeladenen MHC Molekülen oder ihre unterschiedliche Lokalisierung in
den lymphatischen Organen zurückzuführen ist, wurde ein in vitro Versuchsansatz zur
Analyse der Trogozytose durchgeführt. Mit diesen in vitro Experimenten konnte das
Argument der unterschiedlichen Lokalisierung der B- und T-Zellen in den lymphatischen
Organen ausgeschlossen werden. Hierbei zeigte sich, dass die Trogozytose von P14 T-Zellen
nur gering unterschiedlich war, wenn GP33-Peptid beladene Gesamtmilzzellen (12,6 %), BZellen (17,4 %) oder T-Zellen (14,2 %) als APZs verwendet wurden (Fig. 14B). Weiterhin
fiel auf, dass die unspezifische Trogozytose im Gegensatz zu den in vivo Werten in der
Kontroll-Gruppe bei B- und T-Zellen (1,5 bzw. 1,3 %) in vitro unterhalb der der
Gesamtmilzzellen lag (6,7 %).
Zusammenfassend zeigten diese Ergebnisse, dass die Art der APZs bei der Trogozytose in
vivo eine Rolle spielt. Im Fall von T-Zellen kam es zu einer besseren Trogozytose von P14 TZellen im Vergleich zu Gesamtmilzzellen oder B-Zellen. Ein solcher Unterschied in der TZelltrogozytose konnte in vitro nicht nachgewiesen werden. Dies lässt darauf schließen, dass
der Unterschied zwischen B- und T-Zellen als APZs vermutlich auf deren Lokalisierung in
den lymphatischen Geweben beruht.
5.2.6 Phänotypische Analyse von trogozytose-positiven und -negativen P14
T-Zellen
Um zu untersuchen, ob und wie sich trogozytose-positive von trogozytose-negativen P14 TZellen in ihrem Phänotyp unterscheiden, wurden diese Zellen hinsichtlich ihrer CD69 und
CD107a Expression und ihrer IFNγ und TNFα Produktion analysiert.
Es wurde deutlich, dass nach in vivo Interaktion mit biotinylierten H8 APZs, trogozytosepositive P14 T-Zellen mehr IFNγ produzierten (51 %) als trogozytose-negative P14 T-Zellen
(16,7 %). Dies traf auch für die intrazelluläre TNFα Produktion zu (36,5 % versus 11,1 %).
Die intrazelluläre Zytokinproduktion (IFNγ und TNFα) der P14 T-Zellen wurde dabei ohne in
vitro Restimulation der P14 T-Zellen mit GP33-Peptid bestimmt. Die Analyse des frühen
Aktivierungsmarkers CD69 zeigte, dass die trogozytose-positiven P14 T-Zellen (68,4 %) eine
höhere Expression aufwiesen als die trogozytose-negativen (37,8 %) P14 T-Zellen (Fig. 15A,
B). Im Falle des Degranulationsmarkers CD107a, der auf der Zelloberfläche detektiert wird,
war im Vergleich zu den trogozytose-negativen P14 T-Zellen (60,2 %) auch eine stärkere
57
5 Ergebnisse
Expression bei den trogozytose-positiven P14 T-Zellen (94,1 %) nachweisbar (Fig. 15A).
Somit weisen sowohl trogozytose-positive als auch trogozytose-negative P14 T-Zellen nach
Kontakt mit H8 APZs einen aktivierten Phänotyp auf, wobei dieser bei trogozytose-positiven
P14 T-Zellen stärker ausgeprägt war. Im Gegensatz dazu konnte bei P14 T-Zellen, die in
Kontakt mit Kontroll-APZs (B6-bio) waren keine Aktivierung der P14 T-Zellen gemessen
werden (Fig. 15A, mitte). Diese Ergebnisse zeigten, dass die Aktivierung der P14 T-Zellen
antigenspezifisch ist. Die Tatsache, dass trogozytose-negative P14 T-Zellen im Falle von H8
APZs einen aktivierten Phänotyp aufwiesen kann möglicherweise dadurch erklärt werden,
dass es zu einer „Bystander“-Aktivierung [133] dieser Zellen kam. Dabei käme es zu einer
antigenunabhängigen Aktivierung der P14 T-Zellen.
A
IFNγ
H8-bio
trogozytosepositiv
22,1
77,9
trogozytosenegativ
TNFα
CD69
CD107a
94,1
51,0
36,5
68,4
49,0
63,5
31,6
5,9
16,7
11,1
37,8
60,2
83,3
88,9
62,2
39,8
0,9
2,9
2,9
5,8
Thy1.1
97,1
94,2
Thy1.1
IFNγ
100
80
60
***
----
40
20
0
----
+ -
TNFα
% TNFα+ P14 T-Zellen
H8-bio
56,2
237,2
442,7
44,5
93,6
412,6
100
TNFα
80
60
**
40
20
----
0
13,9
64,4
102,4
CD69
----
+ -
% CD69+ P14 T-Zellen
% of Max
175,6
527,3
1289,2
IFNγ
% IFNγ+ P14 T-Zellen
B
97,1
CD107a
99,1
CD69
97,1
trogozytosenegativ
TNFα
2,9
IFNγ
Streptavidin
B6-bio
100
80
60
40
20
CD107a
CD69
***
----
----
0
+ -
Trogozytose-postive (+) oder -negative (-) P14 T-Zellen
Fig. 15: Phänotypische Analyse von trogozytose-positiven und -negativen P14 T-Zellen. (A) Trogozytosepositive und -negative P14 T-Zellen wurden hinsichtlich ihrer intrazellulären Zytokinexpression (IFNγ, TNFα),
der Expression des frühen Aktivierungsmarkers CD69 und ihrer Oberflächenexpression des
Degranulationsmarkers CD107a analysiert. Die intrazelluläre Färbung gegen IFNγ und TNFα erfolgte direkt ex
58
5 Ergebnisse
vivo ohne Restimulation der Milzzellen mit GP33-Peptid. Die CD107a Färbung erfolgte in vivo durch i.v.
Applikation von 50 µg anti-CD107a Antikörper. 3 h nach Verabreichung wurden die Milzzellen analysiert. Die
Punktediagramme beziehen sich auf die Thy1.1+ P14 T-Zellen. Die Prozentzahlen der jeweiligen Quadranten
bzw. Kästchen sind angegeben. Die Histogramme zeigen die mittleren Fluoreszenzintensitäten von IFNγ, TNFα
oder CD69 von trogozytose-positiven (rot) und -negativen (schwarz) P14 T-Zellen, die H8 APZs ausgesetzt
waren, und von trogozytose-negativen (grau) P14 T-Zellen, die in Kontakt mit B6 (C57BL/6J) APZs waren. Die
Werte der durchschnittlichen Fluoreszensintensitäten sind im Histogramm angegeben. (B) Die
durchflusszytometrischen Analysewerte für IFNγ, TNFα und CD69 von jeweils 4 Rezipienten, die H8 APZs
erhielten, sind angegeben. Gezeigt sind trogozytose-positive (●) und trogozytose-negative (○) P14 T-Zellen.
Um den Einfluss einer „Bystander“-Aktivierung genauer zu untersuchen, wurden
Rezipientenmäuse generiert, die eine geringe Frequenz von Gedächtnis P14 T-Zellen
(Thy1.1+/Thy1.2+) und Gedächtnis OT-1 T-Zellen (Thy1.1+) (jeweils ca. 1-2 % der CD8
Gesamtpopulation) besitzen. Während P14 T-Zellen einen GP33-spezifischen transgenen TZellrezeptor besitzen, tragen OT-1 T-Zellen einen OVA spezifischen transgenen TZellrezeptor, der das OVA257-264 Peptid (= SIINFEKL) im Kontext von MHC Klasse I HKb Molekülen erkennt. Somit konnte untersucht werden, ob es in den Rezipientenmäusen
nach Transfer von GP33-präsentierenden APZs (H8) zu einer Aktivierung von P14 und OT-1
T-Zellen kommt, oder ob nur die P14 T-Zellen aktiviert werden.
Die Analyse zeigte, dass OT-1 T-Zellen sowohl bei einem Transfer von biotinylierten B6 als
auch bei H8 APZs nicht trogozytose-positiv wurden (Fig. 16, oben). Im Gegensatz dazu
wurden trogozytose-positive P14 T-Zellen detektiert, wenn diese in Kontakt mit biotinylierten
H8 APZs waren (Fig. 16, unten). Während es bei trogozytose-negativen und trogozytosepositiven P14 T-Zellen im Fall von H8 APZs zu einer intrazellulären Produktion von IFNγ
(25 % versus 60,4 %) und TNFα (7,2 % versus 30 %) kam, konnte keines der beiden
Zytokine bei den OT-1 T-Zellen detektiert werden. Daraus kann gefolgert werden, dass zum
einen der Vorgang der Trogozytose antigenspezifisch ist und zum anderen, dass es während
der Trogozytose zu keiner „Bystander“-Aktivierung von T-Zellen kommt. Somit kann die
„Bystander“-Aktivierung nicht als mögliche Erklärung für den aktivierten Zustand der
trogozytose-negativen P14 T-Zellen nach Kontakt mit H8 APZs herangezogen werden. Auf
andere Erklärungsmöglichkeiten für diesen Befund wird in der Diskussion näher
eingegangen.
59
5 Ergebnisse
OT-1 T-Zellen (Thy1.1+)
IFNγ
Trogozytose +
Trogozytose -
B6-bio
Keine Zellen
detektierbar
0,8
0,2
TNFα
Trogozytose +
Trogozytose 1,2
Keine Zellen
detektierbar
99,8
98,8
H8-bio
1,8
TNFα
100
Keine Zellen
detektierbar
0,8
0,0
IFNγ
Streptavidin
99,2
99,2
Keine Zellen
detektierbar
98,2
Thy1.1
0,5
Thy1.1
0,5
P14 T-Zellen (Thy1.1+/1.2+)
IFNγ
Trogozytose +
Trogozytose -
Thy1.2
B6-bio
0,3
1,0
99,1
Keine Zellen
detektierbar
99,0
8,2
91,8
25,0
60,4
75,0
39,6
TNFα
H8-bio
IFNγ
Streptavidin
Keine Zellen
detektierbar
0,9
99,7
TNFα
Trogozytose +
Trogozytose -
7,2
30,0
92,8
70,0
Thy1.2
Fig. 16: Keine in vivo Trogozytose und „Bystander“-Aktivierung von GP33-unspezifischen OT-1 T-Zellen
durch H8 APZs. In Rezipientenmäusen mit geringen Frequenzen von OT-1 T-Zellen (Thy1.1+) und P14 TZellen (Thy1.1+/Thy1.2+) wurden biotinylierte H8 bzw. B6 (C57BL/6J) APZs transferiert. Die TZelltrogozytose wurde mittels Streptavidin Färbung detektiert. Außerdem wurde die intrazelluläre Produktion
von IFNγ und TNFα (ohne GP33-Peptid Restimulation der Milzzellen in vitro) durchflusszytometrisch
gemessen. Die Punktediagramme beziehen sich auf die Thy1.1+ OT-1 bzw. Thy1.1+/Thy1.2+ P14 T-Zellen. Die
Prozentzahlen der jeweiligen Quadranten bzw. Kästchen sind angegeben.
5.2.7 Trogozytose von Gedächtnis P14 T-Zellen im Vergleich zu naiven P14
T-Zellen
Im bisherigen Teil der Arbeit wurde die T-Zelltrogozytose der Gedächtnis P14 T-Zellen
analysiert. Daher sollte in diesem Abschnitt untersucht werden, ob es einen Unterschied in der
T-Zelltrogozytose zwischen Gedächtnis und naiven P14 T-Zellen gibt. Dies gibt darüber
Aufschluss, ob der Aktivierungszustand der T-Zelle einen Einfluss auf das Ausmaß der TZelltrogozytose hat. Sabzevari et al. konnten bereits zeigen, dass transgene Gedächtnis CD4
60
5 Ergebnisse
T-Zellen in Gegenwart des entsprechenden Antigens in vitro mehr CD80 von APZs
aufnehmen können als naive CD4 T-Zellen [60]. Eine Erkärung für diese Beobachtung ist,
dass Gedächtnis T-Zellen eine höhere Anzahl des CD80 Liganden, CD28, als naive T-Zellen
exprimieren. Dadurch können Gedächtnis T-Zellen zum einen besser und stärker mit den
APZs interagieren und zum anderen das CD80 Molekül besser akquirieren. Da Sabzevari et
al. Gedächtnis und naive T-Zellen nur in vitro hinsichtlich der T-Zelltrogozytose verglichen
haben, wurde dies in den folgenden Experimenten in vivo genauer untersucht.
Hierfür wurden Rezipientenmäuse generiert, die eine physiologische, geringe Frequenz von
Gedächtnis oder naiven P14 T-Zellen (1-2 % der gesamten CD8 T-Zellen) besaßen. Nach
Transfer von biotinylierten H8 APZs wurden 47,2 % der Gedächtnis P14 T-Zellen positiv für
den Trogozytosemarker Biotin (Fig. 17A, unten). Im Gegensatz dazu nahmen nur 13,3 % der
naiven P14 T-Zellen biotinylierte Membranproteine auf (Fig. 17A, oben). Der Anteil
unspezifischer Trogozytose lag bei den naiven P14 T-Zellen etwas niedriger als bei den
Gedächtnis P14 T-Zellen (3,5 % im Vergleich zu 8,2 %). Diese Ergebnisse zeigten, dass im
Vergleich zu den naiven P14 T-Zellen eine verstärkte Trogozytose der Gedächtnis P14 TZellen zu beobachten war. Dabei konnte jedoch auch beobachtet werden, dass naive P14 TZellen nach Transfer in Rezipientenmäuse im Vergleich zu Gedächtnis P14 T-Zellen vermehrt
in der Milz detektierbar waren (Daten nicht gezeigt). Dadurch ist das Verhältnis von
biotinylierten APZs zu P14 T-Zellen bei naiven und Gedächtnis P14 T-Zellen unterschiedlich.
Dies lässt die Vermutung zu, dass mehr naive P14 T-Zellen pro H8 APZ vorhanden sind,
wodurch möglicherweise eine Konkurrenz um die Interaktion mit den APZs entstehen kann.
Dadurch kann es zu einer verminderten Trogozytose der naiven P14 T-Zellen im Vergleich zu
den Gedächtnis P14 T-Zellen kommen. Um diese Möglichkeit zu untersuchen, wurde ein in
vitro Trogozytoseexperiment mit naiven bzw. Gedächtnis P14 T-Zellen durchgeführt. Dieses
in vitro System ist unabhängig vom Migrationsverhalten der beiden Zellpopulationen und
gewährleistet eine gleiche Anzahl von naiven und Gedächtnis P14 T-Zellen. Hierbei zeigte
sich, dass die in vitro T-Zelltrogozytose der naiven P14 T-Zellen im Vergleich zu der von
Gedächtnis P14 T-Zellen ebenfalls erniedrigt war (15,2 % bzw. 21,8 %) (Fig. 17B). Dabei lag
allerdings der Anteil der unspezifischen Trogozytose bei den naiven P14 T-Zellen (9,8 %)
höher als bei Gedächtnis P14 T-Zellen (2,5 %). Werden die trogozytose-positiven P14 TZellen nach H8 APZ Kontakt ins Verhältnis zu den trogozytose-positiven P14 T-Zellen nach
B6 Kontakt gesetzt, so ist ein Trogozytoseindex von 1,8 für naive P14 T-Zellen und von 6,7
für Gedächtnis P14 T-Zellen berechenbar. Dies zeigt, dass auch in vitro ein Unterschied der
61
5 Ergebnisse
T-Zelltrogozytose zwischen naiven und Gedächtnis P14 T-Zellen vorliegt. Daher ist es
unwahrscheinlich, dass das unterschiedliche Migrationsverhalten der beiden Zellpopulationen
als Erklärung für den beobachteten Unterschied in der in vivo Trogozytose herangezogen
werden kann.
A
Einzeltransfer
Naive P14 T-Zellen
B6-bio
86,7
% Trogozytose+ T-Zellen
3,5
96,5
Gedächtnis P14 T-Zellen
B6-bio
8,2
52.8
91,8
H8-bio
----
----
----
----
Na
ive
Ge
dä
ch
tn
is
Streptavidin
H8-bio
47.2
B6-bio
80
70
60
50
40
30
20
10
0
Na
ive
Ge
dä
ch
tn
is
H8-bio
13,3
Thy1.1
C
B in vitro
Kotransfer
Naive P14 T-Zellen
Naive P14 T-Zellen
H8-bio
H8-bio
B6-bio
15,2
9,8
10,5
3,5
84,8
90,2
89,5
96,5
Gedächtnis P14 T-Zellen
Gedächtnis P14 T-Zellen
H8-bio
B6-bio
21,8
2,5
78,2
97,5
Streptavidin
H8-bio
Streptavidin
B6-bio
B6-bio
42,8
7,7
57,2
92,3
Thy1.1
Thy1.1
Fig. 17: Verstärkte Trogozytose von Gedächtnis P14 T-Zellen im Vergleich zu naiven P14 T-Zellen. (A) In
Rezipientenmäusen mit geringen Frequenzen an naiven (Thy1.1+/Thy1.2+) oder Gedächtnis P14 T-Zellen
(Thy1.1+) wurden biotinylierte H8 bzw. B6 (C57BL/6J) APZs transferiert. Die Trogozytose wurde mittels
Streptavidin Färbung detektiert. Die Punktediagramme beziehen sich auf die Thy1.1+ P14 T-Zellen. Die
Prozentzahlen der jeweiligen Quadranten sind angegeben. In der Statistik sind Daten aus zwei Experimenten
gezeigt. (B) 5x103 naive bzw. Gedächtnis P14 T-Zellen wurden für 2 h mit 1x104 biotinylierten H8 bzw. B6
(C57BL/6J) APZs in einer 96 Loch Rundbodenplatte inkubiert. Die Trogozytose wurde mittels Streptavidin
Färbung detektiert. Die Punktediagramme beziehen sich auf die Thy1.1+ P14 T-Zellen. Die Prozentzahlen der
jeweiligen Quadranten sind angegeben. (C) Adoptiver Kotransfer von 1x106 naiven und 1x106 Gedächtnis P14
T-Zellen. Nach Transfer von biotinylierten H8 bzw. B6 (C57BL/6J) APZs wurde die Trogozytose mittels
62
5 Ergebnisse
Streptavidin Färbung detektiert. Die Punktediagramme beziehen sich auf die Thy1.1+ bzw. Thy1.1+/Thy1.2+
P14 T-Zellen. Die Prozentzahlen der jeweiligen Quadranten sind angegeben.
In einem weiteren Versuch wurden naive und Gedächtnis P14 T-Zellen kotransferiert. Die
beiden Zellpopulationen konnten aufgrund ihrer unterschiedlichen Thy1 Marker voneinander
unterschieden werden. Während naive P14 T-Zellen doppel-positiv für Thy1.1 und Thy1.2
Moleküle waren, trugen Gedächtnis P14 T-Zellen nur den Thy1.1 Marker. In diesem
Experiment sollte untersucht werden, ob es zu einer direkten Kompetition bezüglich des
Kontakts mit antigen-präsentierenden APZs zwischen naiven und Gedächtnis P14 T-Zellen
kommt und inwieweit diese Konkurrenz mittels Trogozytose nachgewiesen werden kann. Bei
der Analyse zeigte sich, dass 10,5 % der naiven und 42,8 % der Gedächtnis P14 T-Zellen den
Trogozytosemarker Biotin akquirierten (Fig. 17C). Dies entsprach den Werten wie sie auch
bei einem Einzeltransfer gemessen wurden (Fig. 17A). Somit kam es bei einem Kotransfer
entweder zu keiner Kompetition zwischen den beiden Zellpopulationen oder diese hatte
keinen wesentlichen Einfluss auf den Membranproteintransfer.
Es ist bekannt, dass ex vivo isolierte Gedächtnis P14 T-Zellen eine GP33-spezifische lytische
Aktivität aufweisen [134, 135]. Dies ist nicht der Fall für naive P14 T-Zellen. Dies lässt
darauf schließen, dass es bei dem verwendeten in vivo Trogozytosemodell zu keiner Lyse der
biotinylierten, antigen-beladenen APZs (H8 APZs) durch die naiven P14 T-Zellen kam. Im
Gegensatz dazu können H8 APZs von den Gedächtnis P14 T-Zellen lysiert werden. Da
spekuliert wird, dass es durch apoptotische Vesikel zu einem Proteintransfer kommen kann,
könnte die fehlende lytische Aktivität von naiven P14 T-Zellen eine mögliche Erklärung für
die eingeschränkte Membranproteinaufnahme sein.
Um den Einfluss der lytischen Funktion auf die Trogozytose in vivo zu untersuchen, wurden
in einem weiteren Experiment Gedächtnis P14 T-Zellen verglichen, die in der Lage waren
APZs zu lysieren oder nicht. Da die Lyse der erkannten Zielzellen durch Gedächtnis P14 TZellen über Perforin vermittelt wird [105], wurden als nicht lysefähige T-Zellen Gedächtnis
P14 T-Zellen von perforin-defizienten (PKO) P14 Mäusen verwendet. Es zeigte sich, dass
neben lysefähigen Gedächtnis P14 T-Zellen (67,2 %) auch lyseunfähige PKO Gedächtnis P14
T-Zellen in der Lage waren Trogozytose durchzuführen (54,8 %) (Fig. 18A) und es dabei zu
keinem signifikanten Unterschied kam. Dies stimmt auch mit den in vitro generierten Daten
von Joly et al. [68] überein. Daher konnte ausgeschlossen werden, dass die unterschiedliche
lytische Aktivität von T-Zellen ausschlaggebend für den Unterschied in der in vivo
63
5 Ergebnisse
Trogozytose der naiven und der Gedächtnis P14 T-Zellen war. Eine weitere Erklärung für den
beobachteten Unterschied zwischen naiven und Gedächtnis P14 T-Zellen könnte die
unterschiedliche Expression von Adhäsionsmolekülen sein. Es ist bekannt, dass Gedächtnis
T-Zellen mehr Adhäsionsmoleküle, wie z.B. LFA-1, auf ihrer Oberfläche exprimieren als
naive T-Zellen [136]. Aufgrund dessen können Gedächtnis T-Zellen stärkere Interaktionen
mit anderen Zellen eingehen als naive T-Zellen, was sich in einer verstärkten Trogozytose der
Gedächtnis T-Zellen manifestieren könnte. Durch eine durchflusszytometrische Analyse
wurde die Expression des Adhäsionsmoleküls LFA-1 auf naiven und Gedächtnis T-Zellen
verglichen.
A
PKO Gedächtnis P14 T-Zellen
H8-bio
B6-bio
54,8
14,4
45,2
85,6
Gedächtnis P14 T-Zellen
Streptavidin
H8-bio
67,2
B6-bio
9,2
% von Max.
B
612,5
1281,7
LFA-1
32,8
90,8
Thy1.1
Fig. 18: Erhöhte Expression von Adhäsionsmolekülen auf Gedächtnis P14 T-Zellen. (A) In
Rezipientenmäusen mit geringen Frequenzen von perforin-defizienten (PKO) Gedächtnis (Thy1.1+) oder WT
Gedächtnis P14 T-Zellen (Thy1.1+) wurden biotinylierte H8 bzw. B6 (C57BL/6J) APZs transferiert. Die
Trogozytose wurde mittels Streptavidin Färbung detektiert. Die Punktediagramme beziehen sich auf die Thy1.1+
P14 T-Zellen. Die Prozentzahlen der jeweiligen Quadranten sind angegeben. (B) Durchflusszytometrische
Analyse der Expression von LFA-1 auf naiven (grau) und Gedächtnis P14 T-Zellen (schwarz). Die Werte der
durchschnittlichen Fluoreszenzintensitäten sind im Histogramm angegeben.
Dabei zeigte sich, dass die MFI von LFA-1 bei den naiven T-Zellen um einen Faktor von
zwei gegenüber der von Gedächtnis T-Zellen erniedrigt war (612 versus 1281) (Fig. 18B).
Dieses Ergebnis zeigte, dass Gedächtnis T-Zellen eine höhere Oberflächenexpression des
Adhäsionsmoleküls LFA-1 aufweisen als naive T-Zellen. Dieser Unterschied könnte, wie
bereits eingangs beschrieben, den Unterschied in der in vivo Trogozytose bei naiven und
Gedächtnis
T-Zellen
erklären.
Entsprechende
64
Blockierungsexperimente
mit
LFA-1
5 Ergebnisse
spezifischen Antikörpern sind allerdings noch notwendig, um diese Vermutung experimentell
abzusichern.
Ein weiterer Aspekt, der bei naiven P14 T-Zellen untersucht werden sollte, war der Phänotyp
der trogozytose-positiven und -negativen P14 T-Zellen. Der Phänotyp der trogozytosepositiven und -negativen Gedächtnis P14 T-Zellen wurde bereits in 5.2.6 beschrieben.
H8-bio
IFNγ
CD69
83,0
52,0
58,2
17,0
48,0
41,8
53,5
35.5
43,5
46,5
H8-bio
IFNγ
trogozytosepositiv
86,5
trogozytosenegativ
IFNγ
13,5
CD69
64.5
56,5
TNFα
CD69
0,6
10,8
64,8
99,4
89,2
35,2
0,4
99,6
1,7
98,3
CD69
Naive P14 T-Zellen
TNFα
trogozytosenegativ
TNFα
47,0
53,0
Streptavidin
TNFα
trogozytosepositiv
IFNγ
Streptavidin
Gedächtnis P14 T-Zellen
16,3
83,7
Thy1.1
Fig. 19: Trogozytose-positive naive P14 T-Zellen weisen keine Zytokinexpression aber Expression von CD69
auf. In Rezipientenmäusen mit geringen Frequenzen von Gedächtnis oder naiven P14 T-Zellen (Thy1.1+)
wurden biotinylierte H8 APZs transferiert. Die Trogozytose wurde mittels Streptavidin Färbung detektiert.
Außerdem wurden die intrazelluläre Produktion von IFNγ und TNFα (direkt ex vivo ohne GP33-Peptid
Restimulation der Milzzellen in vitro) und die Oberflächenexpression von CD69 gemessen. Die
Punktediagramme beziehen sich auf die Thy1.1+ P14 T-Zellen. Die Prozentzahlen der jeweiligen Quadranten
bzw. Kästchen sind angegeben.
Hierbei zeigte sich, dass nach Interaktion mit H8 APZs sowohl trogozytose-positive, als auch
trogozytose-negative Gedächtnis P14 T-Zellen einen aktivierten Phänotyp hinsichtlich CD69
und CD107a Expression und Zytokinproduktion (TNFα, IFNγ) aufweisen (Fig. 15A, Fig. 19,
oben). Bei den naiven P14 T-Zellen konnte nach Kontakt mit H8 APZs sowohl bei den
trogozytose-negativen als auch bei den trogozytose-positiven T-Zellen keine intrazelluläre
Produktion von IFNγ und TNFα nachgewiesen werden (Fig. 19, unten). Dies stimmt mit
65
5 Ergebnisse
Daten von Zimmermann et al. überein, die zeigten, dass Gedächtnis T-Zellen nach
antigenspezifischer in vitro Stimulation Zytokine (z.B. IFNγ) rascher sezernieren als naive TZellen [135]. Es kam jedoch zu einer Expression des frühen Aktivierungsmarkers CD69 auf
den trogozytose-positiven naiven P14 T-Zellen, die bei 64,8 % lag. Dies entsprach der
Expression, die auch auf den trogozytose-positiven Gedächtnis P14 T-Zellen gemessen wurde
(58,2 %). Bei den trogozytose-negativen naiven P14 T-Zellen konnte eine weitaus geringere
Expression von CD69 detektiert werden, als bei den trogozytose-negativen Gedächtnis P14 TZellen (16,3 % bzw. 43,5 %) (Fig. 19). Diese Ergebnisse entsprechen den Daten in einer
Publikation von Veiga-Fernandes et al. [137]. In dieser Studie wurden naive bzw. Gedächtnis
T-Zellen, die einen transgenen T-Zellrezeptor für das männliche Antigen besitzen, in
weibliche Rezipienten transferiert. Innerhalb einer Kinetik bis 120 Stunden nach Transfer der
T-Zellen wurde die Expression von CD69 auf naiven und Gedächtnis T-Zellen verglichen.
Dabei zeigte sich, dass bis 12 Stunden nach Transfer kein Unterschied in der Frequenz der
CD69-positiven naiven bzw. Gedächtnis T-Zellen feststellbar war.
Die
Ergebnisse
zeigten
zusammenfassend,
dass
naive
P14
T-Zellen
weniger
Membranproteine aufnehmen als Gedächtnis P14 T-Zellen. Dies liegt wahrscheinlich an der
geringeren Expression von Adhäsionsmolekülen auf den naiven im Vergleich zu den
Gedächtnis P14 T-Zellen und der daraus resultierenden schwächeren Interaktion mit APZs.
Außerdem zeigte sich, dass naive T-Zellen im Gegensatz zu Gedächtnis P14 T-Zellen, wie
erwartet, nach antigenspezifischer Stimulation in vivo kein IFNγ intrazellulär produzieren.
Hinsichtlich der Expression des frühen Aktivierungsmarkers CD69 zeigten sich keine
Unterschiede zwischen naiven und Gedächtnis P14 T-Zellen.
5.2.8 Analyse der Trogozytose nach antigenspezifischer Interaktion von
T-Zellen mit Tumorzellen
Einige in vitro Studien belegen, dass Trogozytose auch nach Interaktion von Lymphozyten
und NK-Zellen mit Tumorzellen nachweisbar ist [62, 98, 138, 139]. Da in diesen Studien der
Membranproteintransfer zwischen Tumorzellen und Lymphozyten bzw. NK-Zellen nur in
vitro untersucht wurde, sollte ein entsprechendes in vivo Tumormodell mit Gedächtnis P14 TZellen etabliert werden.
Zunächst wurden P14 T-Zellen mit verschiedenen GP33 exprimierenden Tumorzelllinien
inkubiert und das Ausmaß der Trogozytose in vitro analysiert. Biotinylierte, GP33-Epitop
exprimierende B16 Melanomzellen wurden für 4 h mit Gedächtnis P14 T-Zellen in einer 96
66
5 Ergebnisse
Loch Rundbodenplatte inkubiert. Dabei zeigte sich, dass es zu einer geringen Trogozytose der
Gedächtnis P14 T-Zellen bei Kontakt mit biotinylierten B16GP33 Zellen kam (7,3 %) (Fig.
20A, oben). Die unspezifische Trogozytose bei biotinylierten Kontroll-B16 Zellen, die das
GP33-Epitop nicht exprimieren, lag bei 2,3 % (Fig. 20A, unten). Diese Ergebnisse stimmen
mit Daten von Daubeuf et al. [140] überein. In dieser Studie wurde gezeigt, dass zwischen
B16 Melanomzellen und T-Zellen ein geringer Proteintransfer stattfindet. Dies könnte an der
geringen Expression von MHC Klasse I Molekülen auf B16 Melanomzellen liegen [110] oder
auf andere unbekannte Membraneigenschaften der Melanomzellen zurückzuführen sein.
B16GP33 Melanomzellen waren jedoch in der Lage Gedächtnis P14 T-Zellen antigenspezifisch
zu aktivieren, da eine intrazelluläre Produktion von IFNγ mittels Durchflusszytometrie
gemessen werden konnte. Etwa 50 % der trogozytose-positiven Gedächtnis P14 T-Zellen
produzierten nach Kontakt mit B16GP33 Zellen IFNγ (Fig. 20A, oben). Im Gegensatz dazu
produzierten nur 0,8 % der trogozytose-negativen Gedächtnis P14 T-Zellen IFNγ. Nach
Inkubation mit B16 Kontrollzellen, die kein GP33-Antigen exprimieren, konnte bei den
Gedächtnis P14 T-Zellen kein IFNγ detektiert werden (Fig. 20A, unten). Auffallend war, dass
im Gegensatz zu den in Abschnitt 5.2.6 beschriebenen Experimenten, die trogozytosenegativen P14 T-Zellen nach Kontakt mit B16GP33 keinen aktivierten Phänotyp aufwiesen. Im
B16 Tumormodell korreliert folglich das Ausmaß der T-Zelltrogozytose sehr stark mit der
Aktivierung der P14 T-Zellen. Allerdings stellte der geringe Transfer von Membranproteinen
von B16GP33 Melanomzellen auf P14 T-Zellen eine starke experimentelle Limitation dar.
Deshalb wurde die Trogozytose der P14 T-Zellen nach Kontakt mit GP33 exprimierenden A9
Lungenkarzinom Zellen (A9GP33) getestet.
Etwa 60 % der Gedächtnis P14 T-Zellen nahmen während einer in vitro Inkubation mit
A9GP33 Zellen biotinylierte Membranproteine auf (Fig. 20B, oben). Bei der Kontrollgruppe
mit biotinylierten A9 Zellen, die kein GP33-Peptid exprimieren, wurde eine unspezifische
Trogozytose von 6,1 % detektiert (Fig. 20B, unten) und es war keine intrazelluläre IFNγ
Produktion nachweisbar. Im Gegensatz dazu führte der Kontakt mit A9GP33 Zellen zu einer
Aktivierung der Gedächtnis P14 T-Zellen, was sich in der Produktion von IFNγ äußerte.
Hierbei produzierten 45,2 % der trogozytose-positiven Gedächtnis P14 T-Zellen IFNγ. Bei
den trogozytose-negativen Gedächtnis P14 T-Zellen lag der Anteil der IFNγ-produzierenden
T-Zellen deutlich tiefer (12,6 %). Somit konnte mit A9GP33 Karzinomzellen der
Membranproteintransfer zwischen Tumorzellen und GP33-spezifischen T-Zellen in vitro
gezeigt werden.
67
5 Ergebnisse
A
B
IFNγ
IFNγ
53,8
B16GP33-bio
45,2
A9GP33-bio
trogozytosepositiv
46,2
7,3
92,7
trogozytosepositiv
54,8
62,1
37,9
0,8
12,6
trogozytosenegativ
trogozytosenegativ
99,2
87,4
4,0
trogozytosepositiv
Streptavidin
98,4
2,3
97,7
trogozytosepositiv
96,0
6,1
93,9
IFNγ
0,2
trogozytosenegativ
A9-bio
1,0
trogozytosenegativ
IFNγ
Streptavidin
1,6
B16-bio
99,0
99,8
Thy1.1
Thy1.1
Fig. 20: In vitro T-Zelltrogozytose mit B16 und A9 Tumorzellen als APZs. 5x103 Gedächtnis P14 T-Zellen
wurden mit 1x105 biotinylierten Zielzellen, (A) B16 oder (B) A9 Tumorzellen, für 4 h in einer 96 Loch
Rundbodenplatte inkubiert. Anschließend wurde die Trogozytose mittels einer Färbung mit Streptavidin
detektiert. Zusätzlich wurde auch eine intrazelluläre Färbung gegen IFNγ durchgeführt. Die Punktediagramme
für die Trogozytose beziehen sich auf die Thy1.1+ P14 T-Zellen. Die Punktediagramme für die IFNγ Färbung
zeigen die trogozytose-positiven oder -negativen P14 T-Zellen.
In einem nächsten Schritt wurde das A9 Tumormodell zum Nachweis einer in vivo TZelltrogozytose herangezogen. Hierfür wurden den Rezipientenmäusen Gedächtnis P14 TZellen und biotinylierte A9GP33 bzw. A9 Karzinomzellen intravenös appliziert. 4 Stunden
nach
Transfer
der
Zellen
wurde
in
der
Lunge
analysiert,
ob
es
zu
einem
Membranproteinaustausch zwischen Tumor- und P14 T-Zellen gekommen ist. Dabei zeigte
sich, dass nach Transfer von A9GP33 Zellen 19 % der Gedächtnis P14 T-Zellen positiv für
biotinylierte Membranproteine waren (Fig. 21) während nach Transfer von A9 Zellen die
unspezifische Trogozytose nur bei 4 % lag. Diese Ergebnisse zeigten, dass es in einem in
vitro und in einem in vivo System mit einer geringen Frequenz antigenspezifischer T-Zellen
(P14 T-Zellen) möglich war, den Membranproteintransfer von antigenpräsentierenden
Tumorzellen (A9) auf antigenspezifische T-Zellen zu analysieren. Allerdings hatte das A9
Lungentumormodell den entscheidenden Nachteil, dass nur relativ wenige P14 T-Zellen in
der Lunge detektierbar waren und deshalb die Analyse der Trogozytose erschwert war.
68
81,4
96,1
----
10
---0
A9
Thy1.1
*
20
io
3,9
GP
33 b
Streptavidin
18,6
30
A9
-b
io
A9-bio
A9GP33-bio
% Trogozytose+ T-Zellen
5 Ergebnisse
Fig. 21: In vivo Trogozytose im A9 Tumormodell. In B6 (C57BL/6J) Rezipientenmäuse wurden 1x106
Gedächtnis P14 T-Zellen (Thy1.1+) sowie 1x106 biotinylierte A9 oder A9GP33 Zellen zeitgleich i.v. transferiert.
4 h nach Transfer wurde die Lunge entnommen und analysiert. Die Trogozytose wurde mittels Streptavidin
Färbung detektiert. Die Punktediagramme beziehen sich auf die Thy1.1+ P14 T-Zellen. Die Prozentzahlen der
jeweiligen Quadranten sind angegeben.
5.2.9 Nachweis von in vivo T-Zelltrogozytose im Kontext viraler Infektionen
Neben dem Tumormodell (5.2.8) wurde ein weiteres in vivo System etabliert, um während
einer natürlich vorkommenden Immunantwort das Phänomen der Trogozytose genauer zu
analysieren. Hierfür wurde das Infektionsmodell mit LCMV verwendet.
Zunächst sollte in vitro untersucht werden, ob T-Zellen nach Kontakt mit virusinfizierten
Zellen Membranproteine der APZs akquirieren. Hierzu wurden LCMV-infizierte bzw.
uninfizierte biotinylierte murine Fibroblasten (MC57 Zelllinie) mit Gedächtnis P14 T-Zellen
inkubiert. Als Positiv-Kontrolle wurden biotinylierte H8 Milzzellen verwendet, die das GP33Epitop endogen exprimierten. Die anschließende Analyse zeigte, dass 60 % der Gedächtnis
P14 T-Zellen nach Kontakt mit H8 APZs den Trogozytosemarker Biotin aufgenommen hatten
(Fig. 22). Der prozentuale Anteil trogozytose-positiver Gedächtnis P14 T-Zellen lag nach
Kontakt mit LCMV infizierten MC57 Zellen mit 46 % etwas unterhalb dieses Wertes. Die
unspezifische Trogozytose lag bei uninfizierten MC57 Zellen bei 2,4 % und für B6 Milzzellen
bei 8,3 %. Diese Ergebnisse zeigten, dass eine LCMV Infektion zu einer ausreichenden
Anzahl von GP33-beladenen MHC Klasse I Molekülen auf MC57 Zellen führte, wodurch es
zu einer Interaktion zwischen den infizierten MC57 Zellen und den GP33-spezifischen
Gedächtnis P14 T-Zellen kam, welche T-Zelltrogozytose ermöglichte. Ähnliche Befunde
wurden auch in einer Publikation von Beadling et al. [132] gezeigt. Die Tatsache, dass durch
LCMV Infektion eine ausreichende Antigenpräsentation auf APZs vorhanden ist mit der
Trogozytose in vitro detektierbar ist, ist eine wichtige Voraussetzung dafür, in vivo TZelltrogozytose während Infektionen nachzuweisen.
69
5 Ergebnisse
Milzzellen-bio
Streptavidin
H8
MC57 Fibroblasten-bio
B6
LCMV
uninfiziert
60,2
8,3
46,2
2,4
39,8
91,7
53,8
97,6
Thy1.1
Fig. 22: In vitro T-Zelltrogozytose nach Interaktion mit LCMV infizierten MC57 Fibroblasten. 1x105
biotinylierte Zielzellen (Milzzellen oder MC57 Fibroblasten) wurden für 3 Stunden mit 5x103 Gedächtnis P14 TZellen auf einer 96 Loch Rundbodenplatte inkubiert. T-Zelltrogozytose wurde mittels Streptavidin Färbung
detektiert. Die Punktediagramme beziehen sich auf die Thy1.1+ P14 T-Zellen. Die Prozentzahlen der jeweiligen
Quadranten sind angegeben.
Um die T-Zelltrogozytose während einer viralen Infektion in vivo zu untersuchen, wurden
CD45.1 Mäuse (B6.SJL, Thy1.2+) zunächst lokal mit LCMV infiziert. Die lokale Infektion
erfolgte dabei über die Fußpfote (i.f.). Drei Tage nach Infektion wurden Gedächtnis P14 TZellen (CD45.2+, Thy1.1+) in die CD45.1 Rezipientenmäuse transferiert. Nach drei bis vier
Stunden wurde die T-Zelltrogozytose in Milz und lokalen Lymphknoten analysiert (Abb. 4).
i.f. oder i.v. Infektion
von CD45.1+ Mäusen
Transfer von Gedächtnis
P14 T-Zellen (CD45.2+)
Tag -2/-3
Tag 0
Analyse von
Trogozytose
3-4 h
Abb. 4: Experimentelles Infektionsmodell zur Analyse der in vivo T-Zelltrogozytose. CD45.1+ Mäuse
(Thy1.2+) wurden mit unterschiedlichen Isolaten von LCMV oder Vaccinia Virus i.v. oder i.f. infiziert. 2-3 Tage
nach Infektion erhielten die infizierten CD45.1+ Mäuse einen adoptiven Transfer von Gedächtnis P14 T-Zellen
(CD45.2+, Thy1.1+). 3-4 Stunden nach Zelltransfer wurde in Milz und inguinalen Lymphknoten untersucht, ob
es zum Proteinaustausch zwischen infizierten APZs und transferierten P14 T-Zellen kam. Als
Trogozytosemarker dienten hierbei CD45.1 Moleküle.
Als Trogozytosemarker diente in diesem System das CD45.1 Molekül. Dieses
Oberflächenmolekül wurde bereits in vorangegangenen Experimenten als Marker für in vivo
Trogozytose verwendet (5.2.2, Fig. 10C). Bei der Analyse der lokalen Infektion mit LCMV
zeigte sich, dass 27 % der Gedächtnis P14 T-Zellen im lokalen Lymphknoten den
Trogozytosemarker CD45.1 von LCMV infizierten APZs akquirierten (Fig. 23). In der
Kontrollgruppe
mit
uninfizierten
CD45.1
Rezipientenmäusen
konnte
eine
antigenunspezifische Trogozytose von unter 10 % detektiert werden. In LCMV infizierten
Rezipientenmäusen wurden in der Milz weniger trogozytose-positive Gedächtnis P14 T70
5 Ergebnisse
Zellen detektiert, als in den inguinalen Lymphknoten (12 % im Vergleich zu 27 %). Dies
könnte einerseits mit einer geringeren Viruslast in der Milz oder andererseits durch eine
zeitlich verzögerte Einwanderung trogozytose-positiver T-Zellen aus den Lymphknoten
erklärt werden.
40
30
----
20
30
20
10
----
----
10
----
0
inf
un
inf
er
t
izi
er
t
0
izi
Thy1.1
40
izi
90,3
Milz
50
*
inf
68,0
9,7
iLN
50
un
inf
CD45.1
32,0
uninfiziert
er
t
izi
er
t
LCMV
% Trogozytose+ T-Zellen
Lokale Infektion
Fig. 23: In vivo T-Zelltrogozytose während einer lokalen viralen Infektion. CD45.1+ Mäuse wurden mit
104 PFU LCMV-WE i.f. infiziert. 3 Tage später wurden 2x106 Gedächtnis P14 T-Zellen in die infizierten bzw.
uninfizierten Mäuse i.v. adoptiv transferiert. Nach 4 Stunden wurde der Transfer von CD45.1 Molekülen auf die
Gedächtnis P14 T-Zellen in Milz und inguinalen Lymphknoten bestimmt. Die Detektion der Trogozytose
erfolgte dabei mittels einer Färbung gegen den Trogozytosemarker CD45.1. Die Punktediagramme beziehen sich
auf die Thy1.1+ P14 T-Zellen. Die Prozentzahlen der jeweiligen Quadranten sind angegeben. In der Statistik
sind Daten aus 3 Experimenten dargestellt.
Um zu untersuchen, ob die Trogozytose von Gedächtnis P14 T-Zellen bei einer systemischen
Infektion in der Milz nachweisbar ist, wurden CD45.1 Mäuse intravenös mit LCMV infiziert.
Während einer systemischen Infektion mit LCMV-WE wurden zwischen 20-30 % der
Gedächtnis P14 T-Zellen trogozytose-positiv (Fig. 24A, oben). In uninfizierten CD45.1
Rezipientenmäusen lag die antigenunspezifische Trogozytose bei 12 %.
In einem nächsten Schritt wurde analysiert, welchen Einfluss das LCMV induzierte
Zytokinmilieu im Vergleich zum antigenspezifischen Kontakt auf die T-Zelltrogozytose hat.
Um einen antigenspezifischen Kontakt zwischen infizierten APZs und P14 T-Zellen
auszuschließen, wurden die CD45.1 Rezipientenmäuse mit der LCMV Mutante 8.7 infiziert.
Diese Virusmutante weist im immunodominantem GP33-Epitop von LCMV eine Mutation
auf, die zu einem Aminosäureaustausch auf Position 35 von Valin zu Leucin führt. Der
transgene T-Zellrezeptor der P14 T-Zellen kann dieses mutierte Epitop nicht mehr erkennen.
Somit wird durch LCMV8.7 Infektion ein LCMV spezifisches Zytokinmilieu induziert, aber
es findet kein antigenspezifischer Kontakt zwischen LCMV8.7 infizierten APZs und
transferierten Gedächtnis P14 T-Zellen statt. Nach Infektion mit LCMV8.7 kam es zu einer
71
5 Ergebnisse
stark verringerten Trogozytose der Gedächtnis P14 T-Zellen (8 %), die sich im Bereich der
antigenunspezifischen Trogozytose in uninfizierten Rezipientenmäusen bewegte (12 %).
Aufgrund dieser Ergebnisse kann gefolgert werden, dass T-Zelltrogozytose während einer
LCMV Infektion von einer antigenspezifischen Interaktion zwischen LCMV infizierten APZs
und LCMV spezifischen T-Zellen abhängig ist und nicht durch das Infektionsmilieu induziert
wird.
Systemische Infektion
40
***
30 ---20
---- ----
10
0
rVVGP
100 ---***
60
40
20
0
**
60
-------
80
rVVGP
VV-WT
***
----
60
40
----
20
+ -
+ -
0
----
+ -
----
+ -
Kinetik
% Trogozytose+ T-Zellen
80
40 ---20
---- ---0
VV -GP
un -W
inf T
izi
er
t
Thy1.1
95,6
% Trogozytose+ T-Zellen
65,3
4,4
----
100
Trogozytose-positive (+) oder -negative (-) P14 T-Zellen
rV
V
CD45.1
34,7
VV-WT
VV-WT
80
C
rVVGP
Aktivierungsmarker
% IFNγ+ P14 T-Zellen
93,9
50
LC
78,8
6,1
% CD69+ P14 T-Zellen
21,2
LCMV8.7
MV
-W
LC
E
MV
un 8.7
i
nf
.
izi
er
t
LCMV-WE
B
% Trogozytose+ T-Zellen
A Trogozytose
4h
60
----
***
40
8h
12 h
***
----***
□: rVVGP
◊: VV-WT
----
20
0
----
----
----
Fig. 24: In vivo T-Zelltrogozytose während unterschiedlichen systemischen viralen Infektionen. (A-C) Für die
Analyse der T-Zelltrogozytose während einer systemischen Infektion wurden CD45.1+ Mäuse mit 2x104 PFU
LCMV-WE bzw. LCMV8.7 oder 2x106 PFU rVVGP bzw. VV-WT i.v. infiziert. Zwei Tage später wurden 2x106
Gedächtnis P14 T-Zellen in die infizierten bzw. uninfizierten CD45.1+ Mäuse i.v. transferiert. (A) Transfer von
CD45.1 Molekülen auf Gedächtnis P14 T-Zellen in der Milz 4 Stunden nach Infektion. Die Detektion der
Trogozytose erfolgte dabei mittels einer Färbung gegen den Trogozytosemarker CD45.1. Die Punktediagramme
beziehen sich auf die Thy1.1+ P14 T-Zellen. Die Prozentzahlen der jeweiligen Quadranten sind angegeben. In
der Statistik sind Daten aus 2 Experimenten dargestellt. (B) Analyse der CD69 Expression und der
intrazellulären Produktion von IFNγ von trogozytose-positiven (■) und -negativen (□) Gedächtnis P14 T-Zellen
4 h nach Infektion mittels Durchflusszytometrie. (C) Kinetik der T-Zelltrogozytose (4, 8 und 12 h nach Transfer
der Gedächtnis P14 T-Zellen) in der Milz nach Infektion mit rVVGP (□) oder VV-WT (◊).
Im Kontext einer LCMV Infektion kommt es zu einer hohen Antigenlast in der Milz. Da die
Antigenlast einen Einfluss auf das Ausmaß der Trogozytose hat [57, 68], könnte der
Nachweis der T-Zelltrogozytose während einer LCMV Infektion einen Sonderfall darstellen.
Es wurde deshalb ein zweites Infektionssystem ausgewählt, bei welchem eine deutlich
72
5 Ergebnisse
geringere Antigenlast auftritt. Hierbei handelt es sich die Infektion mit einem rekombinanten
Vaccinia Virus, welches das Glykoprotein von LCMV exprimiert (rVVGP) und somit von P14
T-Zellen erkannt werden kann. Zwischen 25 % und 50 % der Gedächtnis P14 T-Zellen
akquirierten in rVVGP infizierten CD45.1 Rezipientenmäusen den Trogozytosemarker CD45.1
(Fig. 24A, unten). Im Gegensatz dazu waren in der mit VV-WT infizierten Kontrollgruppe
nur 10 % der Gedächtnis P14 T-Zellen trogozytose-positiv. Im direkten Vergleich der TZelltrogozytose nach LCMV oder rVVGP Infektion zeigte sich eine Tendenz zu vermehrter
Trogozytose von Gedächtnis P14 T-Zellen nach Interaktion mit rVVGP infizierten APZs.
Im nächsten Schritt wurde der Aktivierungsstatus von trogozytose-positiven und -negativen
Gedächtnis P14 T-Zellen während einer Vaccinia Virus Infektion untersucht. Dabei wurde die
Expression des frühen Aktivierungsmarkers CD69 und die intrazelluläre IFNγ Produktion
durchflusszytometrisch bestimmt. Hinsichtlich der CD69 Expression zeigte sich, dass bei
einer Infektion der Rezipientenmäusen mit rVVGP nahezu 100 % der trogozytose-positiven
Gedächtnis P14 T-Zellen CD69 auf ihrer Oberfläche exprimierten (Fig. 24B). 52 % der
trogozytose-negativen Gedächtnis P14 T-Zellen waren ebenfalls positiv für CD69. In der VVWT infizierten Kontrollgruppe zeigte sich eine CD69 Expression von 18 % bei den
trogozytose-positiven Gedächtnis P14 T-Zellen und 3 % bei den trogozytose-negativen
Gedächtnis P14 T-Zellen. Bei der Analyse für die intrazelluläre Produktion von IFNγ zeigte
sich, dass nach Infektion der Rezipientenmäuse mit rVVGP eine hohe Frequenz der
trogozytose-positiven Gedächtnis P14 T-Zellen IFNγ produzierten (70 %). Im Gegensatz dazu
waren nur 32 % der trogozytose-negativen P14 T-Zellen positiv für IFNγ. Innerhalb der VVWT infizierten Kontrollgruppe, konnte bei den trogozytose-positiven und trogozytosenegativen Gedächtnis P14 T-Zellen nur eine sehr geringe bis keine Produktion von IFNγ
nachgewiesen werden. Diese Ergebnisse zeigten, dass es während einer Infektion mit
Vaccinia Virus zu einer antigenspezifischen Aktivierung der Gedächtnis P14 T-Zellen kam.
Dabei besaßen die P14 T-Zellen, die in Kontakt mit Vaccinia Virus infizierten APZs waren
und dadurch trogozytose-positiv wurden, hinsichtlich den Aktivierungsmarkern CD69 und
IFNγ einen aktivierteren Phänotyp als diejenigen, die keinen Kontakt mit den infizierten
APZs hatten. Diese Antigenspezifität wurde auch in einem in vitro Experiment von Beadling
et al. [132] gezeigt. Hierbei wurden Vaccinia Virus oder LCMV infizierte APZs mit LCMV
spezifischen Gedächtnis T-Zellen in vitro inkubiert. Nach Kontakt der T-Zellen mit LCMV
infizierten APZs konnte ein Membranproteintransfer und eine Aktivierung der T-Zellen
73
5 Ergebnisse
nachgewiesen werden. Wurden Vaccinia Virus infizierte APZs eingesetzt, konnte hingegen
keine Aktivierung der T-Zellen und kein Membranproteintransfer detektiert werden.
In Abschnitt 5.2.4 wurde bereits eine Kinetik für eine in vivo T-Zelltrogozytose mit
biotinylierten H8 APZs gezeigt. Dabei war zu sehen, dass es 3 Stunden nach Transfer der
biotinylierten H8 APZs zu einem messbaren Membranproteintransfer auf die Gedächtnis P14
T-Zellen kam. 8 Stunden nach Transfer war jedoch keine T-Zelltrogozytose mehr
detektierbar. In einem weiteren Versuch sollte nun auch eine Kinetik für die in vivo TZelltrogozytose während einer Infektion mit Vaccinia Virus über 12 Stunden erstellt werden.
Dabei zeigte sich, dass es nach einer Infektion der Rezipientenmäuse mit rVVGP zu einem
Anstieg der antigenspezifischen Trogozytose durch die Gedächtnis P14 T-Zellen von den
Zeitpunkten 4 h (38 %), über 8 h (53 %) zu 12 h (60 %) nach adoptivem Transfer der
Gedächtnis P14 T-Zellen kam (Fig. 24C). Die antigenunspezifische Trogozytose nahm nach
Infektion mit VV-WT über den betrachteten Zeitverlauf nicht zu.
Zusammenfassend zeigten die Ergebnisse, dass T-Zelltrogozytose im Kontext verschiedener
viraler Infektionen in vivo nachweisbar ist. Außerdem wiesen die trogozytose-positiven TZellen nach Kontakt mit infizierten APZs einen aktivierteren Phänotyp auf, als trogozytosenegative T-Zellen.
74
6 Diskussion
6.1 Typ I Interferone als Signal 3 der T-Zellaktivierung
Typ I Interferone werden zu einem frühen Zeitpunkt einer Infektion produziert und haben
neben ihrer antiviralen Aktivität vielfältige Auswirkungen auf Zellen des Immunsystems. Die
antivirale Aktivität von Typ I Interferonen konnte eindrücklich in Infektionsversuchen mit
Typ I Interferonrezeptor defizienten (IFNARKO) Mäusen gezeigt werden. Diese Mäuse
konnten im Vergleich zu WT Mäusen eine Reihe von Infektionen schlechter oder gar nicht
kontrollieren [113, 141, 142]. Da CD8 T-Zellen eine wichtige Rolle für die Kontrolle viraler
Infektionen spielen, sollte in dieser Arbeit der direkte Einfluss von Typ I Interferonen auf TZellen analysiert werden. Aufgrund der pleiotropen Wirkungen von Typ I Interferonen konnte
eine solche Analyse nicht in IFNARKO Mäusen durchgeführt werden. Deshalb wurde mittels
eines adoptiven Transfersystems mit P14.WT und P14.IFNARKO T-Zellen die Bedeutung
des direkten Einflusses von Typ I Interferonen auf CD8 T-Zellen untersucht.
6.1.1 Expansionsverhalten
von
unterschiedlicher Erreger
P14.IFNARKO
T-Zellen
im
Kontext
Der direkte Einfluss von Typ I Interferonen auf CD8 T-Zellen wurde im Kontext
unterschiedlicher Erreger analysiert. Nach LCMV Infektion zeigte sich, dass P14.IFNARKO
T-Zellen im Vergleich zu P14.WT T-Zellen stark in ihrer Expansion eingeschränkt sind. Am
Tag des Expansionsmaximums (Tag 8 nach Infektion) war die Frequenz der P14.IFNARKO
T-Zellen im Blut um das 12-fache geringer als von P14.WT T-Zellen (Fig. 1). Dieser
drastische Unterschied kann nicht auf ein unterschiedliches Migrationsverhalten von P14.WT
und P14.IFNARKO T-Zellen in andere Organe wie Gehirn, Lunge, Leber, Milz und
Lymphknoten zurückgeführt werden [37]. Mittels einer in vivo Proliferation von CFSE
markierten P14 T-Zellen konnten Aichele et al. zeigen, dass nach LCMV Infektion direkte
Typ I Interferonsignale nicht essentiell für die initiale Proliferation von P14 T-Zellen, sondern
für deren Überleben sind [38]. Dies bedeutet, dass P14.IFNARKO T-Zellen zunächst wie P14
WT T-Zellen aktiviert werden, anschließend in den in den Zellzyklus eintreten und sich
teilen. Allerdings nimmt die P14.IFNARKO T-Zellzahl in der Folge nicht zu, vermutlich
wegen einer eingeschränkten Überlebensfähigkeit unter Infektionsbedingungen. Eine erhöhte
75
6 Diskussion
Apoptoserate der P14.IFNARKO T.Zellen konnte ex vivo nicht nachgewiesen werden (Daten
nicht gezeigt). Dies ist aber vermutlich auf die technischen Limitationen der verwendeten
Methode zurückzuführen, da apoptotische Zellen in vivo sehr rasch eliminiert werden und
dadurch nicht mehr detektierbar sind. Die Ergebnisse deuten daraufhin, dass die
Proliferationsfähigkeit von P14.IFNARKO T-Zellen im Kontext einer LCMV Infektion nicht
beeinträchtigt ist und eine verminderte Überlebensfähigkeit die stark eingeschränkte
Expansion (Zunahme der Zellzahl) der T-Zellen erklärt.
Infektionen
mit
weiteren
Erregern
(rVVGP,
rVSVGP,
rListeriaGP33)
zeigten,
dass
P14.IFNARKO T-Zellen nach adoptivem Transfer expandieren konnten (Fig. 1). Somit sind
P14.IFNARKO T-Zellen nach antigenspezifischer Stimulation nicht generell in ihrer
Expansionsfähigkeit eingeschränkt. Die Infektion mit LCMV stellt deshalb hinsichtlich ihrer
Auswirkungen auf das Expansionsverhalten von P14.IFNARKO T-Zellen einen Extremfall
dar, wofür es unterschiedliche Erklärungen gibt, die im Folgenden erläutert werden.
AICD-Hypothese
Ein Grund für die fehlende Expansion von P14.IFNARKO T-Zellen im Kontext einer LCMV
Infektion könnte in der hohen Antigenlast während einer LCMV Infektion im Vergleich zu
Infektionen mit rVVGP, rVSVGP oder rListeriaGP33 liegen. Durch die erhöhte Antigenmenge
kommt es zu einer stärkeren Stimulation des transgenen TZR. Dies wiederum könnte zu
einem vermehrten AICD (activation-induced cell death) der P14.IFNARKO T-Zellen führen
[143], die aufgrund eines defekten Typ I Interferonrezeptors keine Typ I Interferon
vermittelten Überlebenssignale erhalten. In einem in vitro Experiment konnten jedoch keine
Unterschiede zwischen P14.WT und P14.IFNARKO T-Zellen hinsichtlich AICD nach
Stimulation mit hohen Mengen an GP33 Peptid nachgewiesen werden (Daten nicht gezeigt).
Weiter zeigten die Koinfektionsexperimente mit rVVGP/LCMV8.7, dass P14.IFNARKO TZellen unter diesen Bedingungen ebenfalls nicht expandierten (Fig. 2B). Die Antigenlast
entspricht in dieser experimentellen Konstellation einer rVVGP Infektion, da LCMV8.7 nicht
von den antigenspezifischen P14 T-Zellen erkannt wird. Die fehlende Expansion von
P14.IFNARKO T-Zellen ist daher nicht auf AICD zurüchzuführen, sondern eher auf ein
durch LCMV induziertes supprimierendes Zytokinmilieu (siehe Zytokinhypothese).
76
6 Diskussion
Infektionshypothese
Eine weitere Erklärung für das fehlende Expansionsvermögen von P14.IFNARKO T-Zellen
während einer LCMV Infektion könnte die bevorzugte Infektion der P14.IFNARKO T-Zellen
mit LCMV sein. Dadurch würden P14.IFNARKO T-Zellen verstärkt in Apoptose gehen oder
Ziel der endogenen, LCMV spezifischen T-Zellantwort werden. Da eine direkte Analyse der
Infizierbarkeit von P14.IFNARKO T-Zellen im Kontext einer LCMV Infektion aufgrund der
geringen Anzahl überlebender P14.IFNARKO T-Zellen nicht möglich war, wurde dies in
einem in vitro Ansatz untersucht. Dabei konnte jedoch keine Infektion von P14.WT und
P14.IFNARKO T-Zellen mit LCMV festgestellt werden (Daten nicht gezeigt). In einer Studie
von Kolumam et al. konnte zudem gezeigt werden, dass es bei Infektion mit LCMV
Armstrong, einer LCMV Variante die weder CD8 T-Zellen infiziert noch zum Zelltod
infizierter Zellen führt [144, 145] zu einer eingeschränkten Expansion adoptiv transferierter
P14.IFNARKO T-Zellen kam [37]. Somit ist die Infektion von P14.IFNARKO T-Zellen
durch LCMV nicht die Ursache der verminderten Expansion dieser T-Zellen.
Zytokinhypothese
Ein weiterer Grund für das unterschiedliche Expansionsverhalten von P14.IFNARKO TZellen
im
Kontext unterschiedlicher
Infektionen
könnte das
infektionsspezifische
Zytokinmilieu sein. Es wurde gezeigt, dass es durch LCMV Infektion zu einem erhöhten Typ
I Interferongehalt im Serum im Vergleich zu Infektionen mit VV, VSV oder Listerien kommt
[115]. Dies liegt zum einen daran, dass LCMV keine Interferon-antagonistischen
Mechanismen entwickelt hat. Zum anderen kommt es bei VV Infektion durch Freisetzung
IFNAR ähnlicher Moleküle zur Verringerung der biologisch verfügbaren Menge an Typ I
Interferonen [146, 147]. Außerdem induzieren Listerien und VV im Vergleich zu LCMV nur
in speziellen Zelltypen Typ I Interferone, wodurch es zu einer geringeren Typ I
Interferonproduktion kommt [148-150]. Im Gegensatz zu einer LCMV Infektion können
durch Infektion mit VV, VSV und Listerien signifikante Mengen an IL-12 induziert werden
[114]. Da sowohl Typ I Interferone als auch IL-12 als dritte Signale für eine optimale TZellaktivierung verantwortlich sind, kann das fehlende Überlebenssignal durch Typ I
Interferone bei P14.IFNARKO T-Zellen während Infektionen mit VV, VSV und Listerien
durch IL-12 Signale substituiert werden. Zur genaueren Analyse der gegenseitigen
Substitution der dritten Signale wurden Infektionsexperimente mit IL-12 Rezeptor defizienten
P14 T-Zellen (P14.IL12RKO), P14.IFNARKO T-Zellen und P14 T-Zellen, die sowohl einen
77
6 Diskussion
defekten Typ I Interferonrezeptor als auch einen defekten IL-12 Rezeptor besitzen
(P14.DOKO T-Zellen), durchgeführt (Daten nicht gezeigt, [151]). Wie erwartet kam es im
Kontext einer LCMV Infektion zu keiner Expansion der adoptiv transferierten
P14.IFNARKO und P14.DOKO T-Zellen, während P14.WT und P14.IL12RKO T-Zellen in
der Lage waren zu expandieren. Somit war die LCMV spezifische CD8 T-Zellexpansion
komplett von Typ I Interferonsignalen abhängig.
Zusammenfassend lässt sich sagen, dass im Kontext einer LCMV Infektion Typ I
Interferonsignale essentiell für das Überleben LCMV spezifischer CD8 T-Zellen sind. Diese
Abhängigkeit kann durch das LCMV induzierte Zytokinmilieu, welches die IL-12 Produktion
und eventuell die eines weiteren dritten Signales inhibiert, hervorgerufen werden.
6.1.2 Dominant-negatives Zytokinmilieu während einer LCMV Infektion
Für eine genauere Untersuchung des LCMV-induzierten Zytokinmilieus auf CD8 T-Zellen
wurden Koinfektionsexperimente mit rVVGP/LCMV8.7 bzw. mit rVSVGP/LCMV8.7
durchgeführt. Die LCMV Mutante LCMV8.7, deren mutiertes GP33 Epitop vom P14 TZR
nicht erkannt wird, wurde verwendet, um einen AICD der P14.IFNARKO T-Zellen
auszuschließen und gleichzeitig ein LCMV typisches Zytokinmilieu zu induzieren. Bei beiden
Koinfektionsexperimenten kam es wider Erwarten nur zu einer eingeschränkten Expansion
der P14.IFNARKO T-Zellen (Fig. 2B, C). Diese Ergebnisse zeigten, dass das durch rVVGP
bzw. rVSVGP induzierte Zytokinmilieu die Expansion der P14.IFNARKO T-Zellen nur
begrenzt förderte, und dass das LCMV-induzierte Zytokinmilieu sich dominant negativ auf
die Expansion von P14.IFNARKO T-Zellen auswirkte. Eine Ursache für den negativen Effekt
des LCMV-induzierten Zytokinmilieus könnte die hohe Typ I Interferonmenge während einer
LCMV Infektion und die daraus resultierende Hemmung der IL-12 Produktion sein [152].
Eine weitere Erklärung des Phänomens ist die Induktion inhibitorischer Zytokine im Kontext
einer LCMV Infektion, die sich in Abwesenheit eines direkten Typ I Interferonsignals negativ
auf das Expansionsvermögen von P14.IFNARKO T-Zellen auswirken. Es wurden daher
verschiedene Zytokine analysiert, von denen eine inhibitorische Wirkung auf T-Zellen
bekannt war.
Bei Analyse von P14.IFNARKO T-Zellen nach Transfer in IL10KO Rezipienten zeigte sich
nach LCMV Infektion weiterhin eine reduzierte Expansion im Vergleich zu P14.WT T-Zellen
(Fig. 3A). Die reduzierte Expansion von P14.IFNARKO T-Zellen wurde auch während einer
78
6 Diskussion
in vivo Proliferation in IL10KO Rezipientenmäuse beobachtet (Fig. 3B). Dabei zeigte sich,
dass P14.IFNARKO T-Zellen in IL10KO und C57BL/6J Rezipientenmäusen nach LCMV
Infektion proliferierten (Zellteilungen durchführten), aber nicht expandierten (zahlenmäßig
nicht zunahmen). Die zusätzliche Blockade des IL-10R auf adoptiv transferierten P14 TZellen durch einen spezifischen Antikörper hatte dabei ebenfalls keinen positiven Einfluss auf
deren Expansion. Diese Ergebnisse zeigten, dass inhibitorische IL-10 Signale auf
P14.IFNARKO T-Zellen nicht ausschlaggebend für die fehlende Expansion der
P14.IFNARKO T-Zellen während einer LCMV Infektion sind.
Neben IL-10 wurde der Effekt von IFNγ auf das Expansionsvermögen von P14.IFNARKO TZellen untersucht. In einer Studie von Tewari et al. wurde gezeigt, dass indirekte IFNγ
Signale während einer LCMV Infektion wichtig für die Expansion LCMV spezifischer CD8
T-Zellen sind [153]. In einer weiteren Studie postulierte die Gruppe um L. Whitton hingegen,
dass während einer LCMV Infektion IFNγ Signale direkt auf LCMV spezifische CD8 TZellen wirken und wichtig für deren Expansion sind [154]. In weiteren Studien wurden neben
den direkten, stimulierenden Effekten von IFNγ auf CD8 T-Zellen auch direkte,
supprimierende und proapoptotische Wirkungen auf CD8 T-Zellen beschrieben [120, 121]. In
den in dieser Arbeit durchgeführten Experimenten bewirkte die Neutralisierung von IFNγ in
vivo durch spezifische Antikörper bzw. der Transfer von P14 T-Zellen in IFNγ-defiziente
Rezipientenmäuse jedoch keine Expansion der adoptiv transferierten P14.IFNARKO T-Zellen
nach LCMV Infektion (Fig. 4). Somit ist IFNγ nicht der gesuchte supprimierende Faktor, der
während einer LCMV Infektion für das fehlende Überleben von P14.IFNARKO T-Zellen
verantwortlich ist.
Weitere potenziell supprimierende Zytokine, deren Wirkung auf das Expansionsverhalten von
P14.IFNARKO T-Zellen bei LCMV Infektionen untersucht wurden, waren TGFβ und TNFα.
Dabei zeigte sich, dass weder die Neutralisierung von TNFα oder TGFβ bzw. die
Neutralisierung beider Zytokine durch spezifische Antikörper positive Auswirkungen auf das
Expansionsvermögen von P14.IFNARKO T-Zellen hatten (Fig. 5). Nach adoptivem Transfer
von P14.IFNARKO T-Zellen in IL10KO Rezipientenmäuse und Neutralisierung von TNFα
und TGFβ durch spezifische Antikörper konnte jedoch eine schwache Expansion von
P14.IFNARKO T-Zellen nach LCMV Infektion beobachtet werden (Fig. 5). Folglich kann
durch Neutralisierung mehrerer Zytokine das supprimierende Zytokinmilieu von LCMV
teilweise aufgehoben werden. Die hier angewandte Methode, Zytokine mittels spezifischer
79
6 Diskussion
Antiköper zu neutralisieren, hat allerdings technische Limitationen. So kann die Applikation
der Antikörper nur zu einer unvollständigen Neutralisierung der Zytokine führen. Weiter ist
wenig bekannt inwieweit die Neutralisierung von Zytokinen mittels Antikörper lokal während
eines
engen
Kontakts
von
T-Zellen
und
APZs
wirksam
ist.
Daher
müssten
Transferexperimente mit P14 T-Zellen durchgeführt werden, welche nicht nur im Typ I
Interferonrezeptor defizient sind, sondern denen zusätzlich Rezeptoren für inhibitorische
Zytokine fehlen.
6.1.3 IL-12 als rettendes Signal 3 für P14.IFNARKO T-Zellen
Es war in den bisherigen Experimenten nicht möglich, den Faktor, der sich im Kontext eines
LCMV-induzierten
Zyokinmilieu
inhibitorisch
auf
das
Expansionsvermögen
von
P14.IFNARKO T-Zellen auswirkte, zu identifizieren. Deshalb wurde ein in vivo System
etabliert, welches eine experimentelle Trennung der antigenspezifischen Aktivierung von P14
T-Zellen und des pathogen-induzierten Zytokinmilieus erlaubte. Hierfür wurden H8 Mäuse
als Rezipientenmäuse verwendet. Diese transgenen Mäuse exprimieren das GP33 Epitop
unter der Kontrolle eines MHC Klasse I Promotors. Werden H8 Mäuse mit anti-CD40
Antikörper behandelt kommt es zur Aktivierung der H8 APZs, die damit verantwortlich für
die antigenspezifische Stimulation der transferierten P14 T-Zellen sind. Eine Infektion mit
LCMV8.7, welches von P14 T-Zellen nicht erkannt wird, sorgt für die Induktion eines LCMV
typischen
Zytokinmilieus.
Somit
ermöglicht
dieses
System
eine
Trennung
von
antigenspezifischer Stimulation der T-Zellen und pathogeninduziertem Zytokinmileu. Die
Experimente zeigten, dass sowohl P14.WT als auch P14.IFNARKO T-Zellen nach anti-CD40
Antikörperbehandlung der H8 Mäuse stark expandierten (Fig. 6A, B, linke Spalte). Wurde die
anti-CD40 Antikörperbehandlung jedoch im Kontext einer LCMV8.7 Infektion durchgeführt,
wirkte sich das virusinduzierte Zytokinmilieu negativ auf das Überleben der P14.IFNARKO
T-Zellen aus. Bei Behandlung der H8 Mäuse mit einer geringen Dosis (2x6 µg) des antiCD40 Antikörpers und Infektion mit LCMV8.7 konnten die adoptiv transferierten
P14.IFNARKO T-Zellen bis Tag 5 nach Infektion ähnlich wie P14.WT T-Zellen expandieren.
Danach kam es jedoch zu einem drastischen Rückgang der P14.IFNARKO T-Zellpopulation
(Fig. 6A, B, zweite Spalte von links). Dieser Absturz der P14.IFNARKO T-Zellen ist
vermutlich auf eine eingeschränkte Überlebensfähigkeit dieser Zellen im Kontext einer
LCMV Infektion zurückzuführen. Interessanterweise konnte der inhibitorische Effekt der
LCMV Infektion auf P14.IFNARKO T-Zellen durch Applikation hoher Dosen (2x60 µg) von
80
6 Diskussion
anti-CD40 Antikörper aufgehoben werden (Fig. 6A, B, zweite Spalte von rechts). Eine
mögliche Erklärung hierfür ist, dass es durch Behandlung der H8 Mäuse mit einer hohen
Dosis von anti-CD40 Antikörper zu einer stärkeren Aktivierung der H8 APZs kam, welche zu
einer erhöhten Expression kostimulatorischer Moleküle und/oder zu einem veränderten
Zytokinmilieu führte. Bei der Analyse des Zytokinmusters der unterschiedlich behandelten
H8 Mäuse fiel auf, dass in LCMV8.7 infizierten H8 Mäusen nach Applikation einer hohen
Dosis anti-CD40 Antikörper eine stark erhöhte Produktion von IL-12 festzustellen war (Fig.
7). Dabei war die Konzentration von IL-12 im Vergleich zu infizierten H8 Mäusen, die mit
einer geringen Dosis anti-CD40 Antikörper behandelt wurden, um den Faktor 4 erhöht. Dies
ist deshalb von Bedeutung, da IL-12 ebenfalls als Signal 3 direkt auf T-Zellen wirken kann [1,
2]. Somit könnte die erhöhte IL-12 Menge, die in der Frühphase der Infektion vorliegt,
ausschlaggebend für die Rettung von P14.IFNARKO T-Zellen sein. Es ist bekannt, dass es
durch die massive Typ I Interferonproduktion in C57BL/6J Mäusen während einer LCMV
Infektion zur Inhibition der IL-12 Expression kommt [112, 113, 128]. Daher erhalten
P14.IFNARKO
T-Zellen
nach
Transfer
in
C57BL/6J
Mäuse
unter
LCMV
Infektionsbedingungen kein kompensatorisches IL-12 Signal. Im Gegensatz dazu wurden
nach anti-CD40 Antikörperapplikation in H8 Mäusen hohe Konzentrationen an IL-12
festgestellt, obwohl die Mäuse zeitgleich mit LCMV8.7 infiziert waren. Diese Ergebnisse
zeigten, dass die Verabreichung des anti-CD40 Antikörpers das Zytokinmuster in den H8
Rezipientenmäusen
entscheidend
beeinflusste
und
die
erhöhte
IL-12
Produktion
kompensatorisch auf P14.IFNARKO T-Zellen wirkte.
In einem weiteren adoptiven Transferexperiment von P14 T-Zellen in IFNARKO
Rezipientenmäuse wurde der Effekt von IL-12 auf das Expansionsvermögen von
P14.IFNARKO T-Zellen im Kontext einer LCMV Infektion untersucht. Da es in IFNARKO
Mäusen aufgrund der fehlenden positiven Rückkopplung des Typ I Interferonsignals zu einer
geringen Produktion von Typ I Interferonen kommt, kann in diesen Mäusen die IL-12
Produktion nicht gehemmt werden [112, 113]. Folglich liegen in diesen Mäusen nach LCMV
Infektion höhere IL-12 Konzentrationen vor als in LCMV infizierten C57BL/6J Mäusen.
Dadurch könnten P14.IFNARKO T-Zellen ein kompensatorisches IL-12 Signal erhalten und
expandieren. Wie in Fig. 8 dargestellt, ist dies tatsächlich der Fall. P14.IFNARKO T-Zellen
expandierten in IFNARKO Rezipientenmäusen nach LCMV Infektion (Fig. 8). Basierend auf
diesen Resultaten wurde eine Behandlung von C57BL/6J Rezipientenmäusen mit rIL-12
durchgeführt, um den P14.IFNARKO T-Zellen in dieser Situation ein kompensatorisches IL-
81
6 Diskussion
12 Signal zur Verfügung zu stellen. Es konnte jedoch keine Expansion von P14.IFNARKO TZellen im Kontext einer LCMV Infektion unter täglicher Applikation von rIL-12
nachgewiesen werden (Fig. 9A, B). Eine Analyse der IL-12 Konzentrationen in Seren von
LCMV infizierten Mäusen ergab sehr hohe IL-12 Mengen in IFNARKO Mäusen, während in
rIL-12 behandelten B6 Mäusen kaum IL-12 nachweisbar war (Fig. 9B, C). Eine erhöhte
Konzentration von IFNγ im Serum von IL-12 behandelten C57BL/6J Mäusen war jedoch ein
Indiz für eine erfolgreiche IL-12 Behandlung. Vermutlich sind die erreichten Serumwerte
nach rIL-12 Applikation zu gering, um kompensatorisch auf P14.IFNARKO T-Zellen im
Kontext einer LCMV Infektion zu wirken. Weitere Experimente müssen abklären, inwieweit
sich Typ I Interferone und IL-12 als drittes Signal für die T-Zellaktivierung während einer
LCMV Infektion gegenseitig kompensieren können. Hierzu könnten höhere IL-12 Dosen zur
Behandlung von C57BL/6J Rezipientenmäuse eingesetzt werden. Weiter wäre ein Transfer
von P14 T-Zellen, welche defizient im Typ I Interferonrezeptor und im IL12 Rezeptor sind, in
IFNARKO Rezipientenmäuse aufschlussreich.
Zusammenfassend kann aus diesen Resultaten geschlossen werden, dass T-Zellen für ihr
Überleben während einer LCMV Infektion essentiell auf ein direktes Typ I Interferonsignal
angewiesen sind. Die hohe Expression von Typ I Interferonen in der Frühphase einer LCMV
Infektion führt zur Unterdrückung der IL-12 Produktion, so dass IL-12 nicht als
kompensatorisches Signal 3 zur Verfügung steht. Ermöglicht die experimentelle Anordnung
eine IL-12 Produktion auch unter LCMV Infektion (Transfer von P14.IFNARKO T-Zellen in
IFNARKO oder anti-CD40 Antikörper behandelte H8 Rezipientenmäuse), so überleben die
P14.IFNARKO T-Zellen und expandieren.
Der Nachweis einer direkten Stimulation von B- und T-Zellen durch Typ I Interferone ist von
großer Bedeutung, da Typ I Interferone erfolgreich in der Behandlung unterschiedlicher
Erkrankungen (z.B. Multiple Sklerose, Hepatitis C) erfolgreich eingesetzt werden. Allerdings
sind die genauen Wirkmechanismen einer Therapie mit Typ I Interferonen im Kontext einer
bestimmten Krankheit oftmals nicht bekannt. Daher könnten weitere Untersuchungen über die
direkte Wirkung von Typ I Interferonen auf B- und T-Zellen von großer Bedeutung für
zukünftige Vakzinierungs- und Therapiestrategien sein.
82
6 Diskussion
6.2 Interzellulärer Membranproteinaustausch während der
Aktivierung antigenspezifischer T-Zellen
6.2.1 In vivo Modelle zur Detektion von T-Zelltrogozytose während einer
Immunantwort
Zahlreiche Studien zeigten eine mögliche Relevanz des Membrantransfers zwischen
Immunzellen für die Regulation von Immunantworten auf. Es wurde beschrieben, dass TZellen durch Akquirierung von Peptid/MHC-Komplexen und kostimulatorischen Molekülen
selbst stimulatorische APZ Funktionen übernehmen können [60, 91-93]. Der Transfer von
Peptid/MHC-Komplexen kann jedoch auch supprimierende Auswirkungen auf T-Zellen
haben, da T-Zellen durch ihn zum Ziel der gegenseitigen Zytolyse („Fratricide“) werden
können [96]. Neben den stimulatorischen und supprimierenden Konsequenzen der
Trogozytose kann es durch Transfer unterschiedlicher Rezeptoren zur Generierung von Zellen
mit einem verändertem Phänotyp kommen [80, 89]. Bisher sind jedoch nur wenige Arbeiten
veröffentlicht, in welchen mit in vivo Modellen die Trogozytose durch Zellen des
Immunsystems
nachgewiesen
werden
konnte
[54,
96,
99-101].
Hierbei
wurden
unphysiologisch hohe Frequenzen von spezifischen T-Zellen verwendet, da zum einen mit
TZR transgenen Mäusen gearbeitet wurde oder zum anderen eine große Anzahl von T-Zellen
transferiert wurde. Daher lassen diese Studien nur bedingt Rückschlüsse auf die in vivo
Bedeutung der Trogozytose im Kontext von Immunantworten zu. Aus diesem Grund wurde in
der vorliegenden Arbeit ein in vivo Modell zur Analyse des Membranproteinaustausches
zwischen APZs und antigenspezifischen T-Zellen etabliert, in welchem die Anzahl
antigenspezifischer T-Zellen in einem physiologischen Bereich (1-2 % der gesamten CD8 TZellen) lag. Als antigenspezifische T-Zellen dienten Gedächtnis P14 T-Zellen, die spezifisch
für das LCMV Glykoproteinepitop GP33-41 (GP33) sind (Abb.1).
Zur Analyse des Membranproteinaustauschs zwischen APZs und antigenspezifischen TZellen wurden drei unterschiedliche experimentelle Ansätze verwendet. Zum einen wurden
APZs biotinyliert und der Transfer von biotinylierten Membranproteinen analysiert. Zum
anderen wurde in einem semiallogenen System der Transfer von MHC Klasse I Molekülen
von APZs auf T-Zellen untersucht. Des Weiteren wurde analysiert, ob sich der Transfer von
CD45.1 Molekülen als Nachweis der Trogozytose eignet. Es zeigte sich, dass es nach
Antigenbeladung der APZs mit GP33-Peptid zu einem antigenspezifischem Kontakt zwischen
APZs und GP33-spezifischen Gedächtnis P14 T-Zellen kam. Aufgrund dieses Kontakts
83
6 Diskussion
konnte ein Transfer von biotinylierten Membranproteinen, MHC Molekülen oder CD45.1
Molekülen von APZs auf Gedächtnis P14 T-Zellen (Fig. 10) detektiert werden.
In der vorliegenden Arbeit wurde neben dem Transfer von biotinylierten Membranproteinen
und CD45 bzw. MHC Molekülen von APZs auf T-Zellen auch der Transfer des
Thymusmarkers Thy1, der ausschließlich auf T-Zellen und zum Teil auf NK-Zellen
exprimiert wird, im Detail untersucht. Bei einem Transfer des Thy1 Markers zwischen
endogenen (Thy1.2+) und adoptiv transferierten (Thy1.1+) T-Zellen wäre eine eindeutige
Detektion der P14 T-Zellen nicht mehr gewährleistet, da endogene T-Zellen fälschlicherweise
zu den transferierten P14 T-Zellen gezählt würden.
Ein solcher Transfer könnte dadurch zustande kommen, dass APZs, welche mit GP33-Peptid
beladen sind, den Thymusmarker Thy1.1 von den P14 T-Zellen aufgrund eines
bidirektionalen Membranproteinaustausches aufnehmen. Würden diese Thy1.1-positiven
APZs nun auf eine endogene, GP33-spezifische T-Zelle (Thy1.2+) treffen, könnte der Thy1.1
Marker auf diese T-Zelle transferiert werden. Somit käme es zu doppelpositiven
(Thy1.1+/Thy1.2+) endogenen T-Zellen. Eine weitere Möglichkeit besteht darin, dass
antigenspezifische Gedächtnis P14 T-Zellen bei der Interaktion mit APZs GP33-Peptid
beladene MHC Klasse I Moleküle aufnehmen. Dadurch könnten Gedächtnis P14 T-Zellen
von endogenen GP33-spezifischen T-Zellen erkannt werden, wodurch es zu einem Transfer
des Thy1.1 Moleküls der P14 T-Zellen auf endogene T-Zellen kommen kann. Die Ergebnisse
zeigten, dass während der Trogozytose nur ein sehr geringer Anteil der CD8 T-Zellen
doppelpositiv für Thy1.1/Thy1.2 Moleküle war (Fig. 11A, B). Folglich stellt der Transfer des
Thymusmarkers Thy1 kein Problem für die eindeutige Detektion von P14 T-Zellen dar.
Eine mögliche Erklärung für den geringen Austausch von Thy1 Molekülen zwischen Zellen
könnte sein, dass der Thymusmarker aufgrund seiner Verankerung auf den T-Zellen nicht gut
transferiert werden kann; beziehungsweise, dass kein bidirektionaler Transfer zwischen APZs
und T-Zellen stattfindet. Der Thymusmarker Thy1 ist ein GPI-verankertes Protein. Daubeuf et
al. [56] konnten zeigen, dass GPI-verankerte Membranproteine wie z.B. CD59 transferiert
werden können. Somit stellt die Art der Verankerung kein Hindernis für einen
Membranproteinaustausch dar. Ein bidirektionaler Austausch zwischen APZs und T-Zellen
wurde in einer Studie von Stinchcombe et al. [86] ausgeschlossen. Es wurde beobachtet, dass
nach zweistündiger in vitro Koinkubation ein Transfer von MHC Molekülen der APZs auf TZellen stattfand, jedoch kein Transfer von CD8 Molekülen der T-Zellen auf APZs messbar
war. Von der Gruppe um J. Sprent [59] wurde ebenfalls ein unidirektionaler
84
6 Diskussion
Membranproteintransfer von APZs auf T-Zellen beschrieben. In dieser Studie wurde gezeigt,
dass es in vitro zu einem Transfer von B7 Molekülen der APZs auf T-Zellen kommt. Es
konnte allerdings kein Transfer von CD28 Molekülen der T-Zellen auf APZs beobachtet
werden. Somit werden Membranproteine bei einer T-Zelltrogozytose eher unidirektional
transferiert. Daher würde es während einer Interaktion zwischen antigenbeladenen APZs und
Gedächtnis P14 T-Zellen aufgrund des detektierbaren Membranproteintransfers von APZs auf
T-Zellen (Fig. 10) zu keinem Transfer des Thy1.1 Moleküls der P14 T-Zellen auf APZs
kommen. Dies könnte eine mögliche Erklärung für die sehr geringe Frequenz von doppelpositiven (Thy1.1+/Thy1.2+) CD8 T-Zellen sein.
Zusätzlich könnte auch die geringe Anzahl von naiven endogenen GP33-spezifischen TZellen limitierend sein. In einer naiven C57BL/6J Maus sind weniger als 0,1 % der CD8 TZellen GP33-spezifisch (Fig. 11C). Aufgrund dieser sehr geringen Frequenz ist die
Wahrscheinlichkeit, dass eine endogene GP33-spezifische T-Zelle auf eine adoptiv
transferierte P14 T-Zelle, die GP33-Peptid beladene MHC Klasse I Moleküle trägt, sehr
gering. Somit ist das Fehlen von Thy1.1/Thy1.2 doppelpositiven T-Zellen wahrscheinlich auf
die geringe Frequenz von endogenen GP33-spezifischen T-Zellen zurückzuführen.
In einem weiteren Teil der Arbeit wurde untersucht, wie sich die Antigenbeladung auf das
Ausmaß der Trogozytose auswirkt.
In Arbeiten von Huang et al. [57] und Hudrisier et al. [68] konnte gezeigt werden, dass die
Peptidkonzentration direkt mit dem Ausmaß der Trogozytose korreliert. Deshalb wurde in
einem weiteren Abschnitt der vorliegenden Arbeit auf die exogene Peptidbeladung von APZs
verzichtet. Stattdessen wurden biotinylierte Milzzellen von H8 transgenen Mäusen, die das
GP33-Epitop endogen unter Kontrolle eines MHC Klasse I Promotors exprimieren,
verwendet. Dabei entspricht die MHC-Beladung durch endogen exprimiertes und
prozessiertes GP33 auf H8 Milzzellen ungefähr einer exogenen Beladung mit 10-9 M GP33Peptid (Fig. 13A). Die Trogozytoseeffizienz von Gedächtnis P14 T-Zellen nach Kontakt mit
biotinylierten H8 Milzzellen ist deutlich geringer als nach Kontakt mit 10-6 M GP33-Peptid
beladenen APZs (Fig. 10A, Fig. 13B). Dieses Ergebnis bestätigt die oben genannten Studien
von Huang et al. und Hudrisier et al., da es eine Korrelation zwischen der
Antigenkonzentration und dem Ausmaß der Trogozytose zeigt. Des Weiteren verdeutlichte
der Versuch, dass die Expression eines endogenen Antigens ausreichend ist, um in vivo TZelltrogozytose nachzuweisen. Dies ist eine wichtige Voraussetzung für die in vivo Detektion
von Trogozytose, da in diesem Fall die Antigenexpression limitiert sein kann.
85
6 Diskussion
Um zu untersuchen, ob ein Zusammenhang zwischen der Anzahl transferierter APZs und dem
Ausmaß einer T-Zelltrogozytose besteht, wurde eine Titration von biotinylierten H8 APZs
durchgeführt. Dabei zeigte sich, dass mit steigender Anzahl von biotinylierten H8 APZs eine
Zunahme der trogozytose-positiven Gedächtnis P14 T-Zellen zu verzeichnen war (Fig. 13C).
Dies war wenig erstaunlich, da in diesem Fall mehr H8 APZs für eine antigenspezifische
Interaktion mit Gedächtnis P14 T-Zellen vorhanden waren. Somit können innerhalb einer
vorgegebenen Zeit mehr Gedächtnis P14 T-Zellen mit transferierten H8 APZs interagieren,
wodurch mehr Gedächtnis P14 T-Zellen Membranproteine aufnehmen können. Es soll
allerdings darauf hingewiesen werden, dass mit ansteigender Anzahl von transferierten
biotinylierten Kontroll APZs, welche kein GP33 Antigen präsentieren, ein Anstieg der
antigenunspezifischen T-Zelltrogozytose bei Gedächtnis P14 T-Zellen zu beobachten war.
Diese antigenunspezifische T-Zelltrogozytose kann dadurch erklärt werden, dass T-Zellen
antigenunabhängig immunologische Synapsen mit APZs bilden. Eine in vitro Studie von der
Gruppe um A. Trautmann [155] zeigte, dass ohne exogene Zugabe von Antigen bzw. in
Abwesenheit von MHC Molekülen auf dendritischen Zellen die Ausbildung einer
immunologischen Synapse zwischen dendritischen Zellen und polyklonalen, naiven T-Zellen
möglich war. Aufgrund der Tatsache, dass die Ausbildung einer immunologischen Synapse
nicht notwendigerweise auf einer antigenspezifischen Interaktion zwischen APZ und T-Zelle
beruht, stellt sich die Frage, ob neben dem antigenspezifischem TZR [57, 68, 156] auch
andere Zelloberflächenmoleküle eine Bedeutung für die T-Zelltrogozytose haben. Studien
zeigten, dass nicht-Antigenrezeptoren wie CD28, CD8α oder β, CD2 und CD27 den Transfer
von CD80 Molekülen oder Membranproteinen auf T-Zellen vermitteln können [59, 157]. In
einer weiteren Studie wurde beschrieben, dass eine CD8αα-vermittelte Trogozytose
stattfinden kann [158]. Dabei kam es in vitro und in vivo zu einem Transfer von nichtklassischen MHC Klasse I Molekülen (TL) auf intraepitheliale Lymphozyten. Aufgrund
dieser Studien kann der beobachtete Anstieg der antigenunspezifischen Trogozytose bei
zunehmender Anzahl transferierter biotinylierter B6 APZs durch den vermehrten Kontakt der
Gedächtnis P14 T-Zellen mit biotinylierten B6 APZs erklärt werden. Bei diesem Kontakt
kann eine TZR-unabhängige immunologische Synapse gebildet werden, wodurch es zu einem
Transfer von biotinylierten Membranproteinen von B6 APZs auf Gedächtnis P14 T-Zellen
kommen kann.
Zur Untersuchung der Kinetik der Trogozytose wurden Gedächtnis P14 T-Zellen 3 bis 8 h mit
biotinylierten H8 APZs in vivo konfrontiert. Während nach 3 h ein Membranproteintransfer
86
6 Diskussion
auf Gedächtnis P14 T-Zellen nachweisbar war, konnte nach 8 h keine T-Zelltrogozytose mehr
detektiert werden (Fig. 13D). Somit konnte gezeigt werden, dass T-Zelltrogozytose unter
diesen experimentellen Bedingungen nur innerhalb eines engen Zeitfensters detektierbar ist.
Dies wurde auch in einem in vivo Experiment von der Gruppe um D. Hudrisier beschrieben
[100]. Hierbei wurden P14/rag+ Mäuse, in denen ca. 90 % der CD8 T-Zellen P14 T-Zellen
sind, mit 5 µg GP33-Peptid i.v. behandelt. Drei Tage nach Peptid-Injektion wurden 2x107
biotinylierte und GP33-Peptid beladene RMA Zellen in P14/rag+ Rezipientenmäuse
transferiert. Bei der Analyse der Trogozytose in der Milz zeigte sich, dass nicht nach 2 oder
24 h sondern nach 5 h ein optimaler Transfer von biotinylierten Membranproteinen von RMA
Zellen auf aktivierte P14 T-Zellen stattfand. Die Ergebnisse aus den beiden experimentellen
Ansätzen zur Analyse der Trogozytose können nicht direkt miteinander verglichen werden, da
zum einen ein unterschiedlicher Aktivierungzustand der P14 T-Zellen und eine
unterschiedliche Frequenz der antigenspezifischen P14 T-Zellen (1 % im Vergleich zu 90 %
der CD8 T-Zellen) vorliegt und zum anderen unterschiedliche Arten (Milzzellen bzw. RMA
Zelllinie) und Mengen (3x106 Zellen im Vergleich zu 2x107 Zellen) von APZs eingesetzt
wurden. Dennoch zeigen die beiden Experimente unabhängig voneinander, dass sich ein
früher Zeitpunkt (3 bzw. 5 h) besser für die Analyse der Trogozytose eignet als ein später (8
bzw. 24 h). Eine Erklärung hierfür könnte sein, dass es durch P14 T-Zellen zu einer schnellen
Elimination biotinylierter H8 APZs bzw. biotinylierter GP33-Peptid beladenen RMA Zellen
kommt. Somit können nicht alle P14 T-Zellen mit biotinylierten APZs interagieren. Die P14
T-Zellen, die jedoch mit APZs interagierten und biotinylierte Membranproteine von ihnen
aufgenommen haben, verlieren aufgrund ihrer Membranerneuerung die Biotinylierung auf
ihrer Zelloberfläche. Da nun keine biotinylierten APZs mehr zur Verfügung stehen, können
diese P14 T-Zellen nicht erneut biotinylierte Membranproteine aufnehmen. Somit kommt es
bei einem späteren Zeitpunkt der Analyse zu einem Verlust der trogozytose-positiven P14 TZellen. Eine weitere Erklärung ist, dass durch die Membranerneuerung der biotinylierten
APZs ebenfalls ein Verlust der Biotinylierung auf APZs durch Membranerneuerung eintritt.
Infolgedessen kommt es zwischen diesen APZs und P14 T-Zellen zwar zu einer Interaktion
und einem Membranproteintransfer, jedoch können die transferierten Membranproteine der
APZs
aufgrund
der
fehlenden
Biotinylierung
nicht
Membranproteinen auf P14 T-Zellen unterschieden werden.
87
mehr
von
den
endogenen
6 Diskussion
Zusammenfassend lässt sich sagen, dass in der vorliegenden Arbeit ein in vivo System
etabliert
wurde,
mit
Membranproteinaustausch
dessen
Hilfe
zwischen
es
APZs
zum
und
ersten
Mal
möglich
antigenspezifischen
war,
T-Zellen
den
unter
physiologischen Bedingungen zu analysieren. Als Trogozytosemarker wurden dabei
biotinylierte Membranproteine, CD45 Moleküle und MHC Moleküle verwendet. Da der
Thymusmarker Thy1 nicht transferiert wird, eignet er sich als Detektionsmarker für adoptiv
transferierte P14 T-Zellen. Außerdem zeigte sich, dass die Trogozytose neben exogen
antigenbeladenen APZs auch mit APZs, die das relevante Antigen endogen exprimieren (H8
APZs), möglich war. Dabei konnte mit einer geringen Anzahl an H8 APZs ein Transfer von
Membranproteinen auf antigenspezifische T-Zellen beobachtet werden. Dieses Ergebnis lässt
darauf schließen, dass eine in vivo Trogozytose während natürlich ablaufenden
Immunantworten nachzuweisen ist.
6.2.2 In vivo T-Zelltrogozytose – Nachweis der Antigenspezifität
Wie bereits diskutiert, konnte in mehreren Studien eine antigenunspezifische Trogozytose in
vitro nachgewiesen werden [59, 157]. In der vorliegenden Arbeit war eine in vivo
Trogozytose durch P14 T-Zellen in einem hohen Maße auf eine antigenspezifische Interaktion
mit APZs zurückzuführen. So zeigten Gedächtnis P14 T-Zellen auf ihrer Zelloberfläche eine
hohen Anteil transferierter Membranproteine nach Kontakt mit GP33-Peptid beladenen bzw.
H8 APZs auf, während nach Kontakt mit Kontroll-Peptid beladenen bzw. B6 APZs (Kontroll
APZs) nur ein sehr geringer Membranproteintransfer detektierbar war (Fig. 10A-C, Fig. 13B).
Während des Kontaktes zwischen Gedächtnis P14 T-Zellen und Kontroll APZs kommt es
vermutlich aufgrund der fehlenden antigenspezifischen Erkennung zu keiner hinreichend
langen Interaktion zwischen T-Zellen und APZs. Die fehlende antigenspezifische Stimulation
des TZRs verhindert die Ausbildung einer immunologischen Synapse und die anschließende
Internalisierung des TZRs. Als Folge dessen kommt es nur zu einem geringfügigen
Membranproteintransfer von der APZ auf die T-Zelle. In einem weiteren Experiment konnte
die Antigenspezifität der in vivo Trogozytose mit Hilfe einer sogenannten „Cold-target“
Inhibition demonstriert werden. Ein Kotransfer von unbiotinylierten Kontroll-Peptid
beladenen APZs und biotinylierten GP33-Peptid beladenen APZs führte zu keiner Inhibition
der Trogozytose (Fig. 12). Im Gegensatz dazu kam es zu einer Inhibition der TZelltrogozytose, wenn unbiotinylierte GP33-Peptid beladene APZs und biotinylierte GP33Peptid beladene APZs kotransferiert wurden. In dieser experimentellen Situation
88
6 Diskussion
konkurrierten beide APZs um die antigenspezifische Interaktion mit Gedächtnis P14 TZellen. Aufgrund dieser Kompetition kam es zu einem verminderten Kontakt der P14 TZellen mit biotinylierten GP33-Peptid beladenen APZs und somit zu einem verminderten
Transfer biotinylierter Membranproteine auf T-Zellen.
Zusammenfassend zeigten die Ergebnisse, dass die in vivo Trogozytose in hohem Maße auf
einer antigenspezifischen Interaktion von T-Zellen mit APZs beruht.
6.2.3 Aktivierungszustand trogozytose-positiver und -negativer T-Zellen
Die im obigen Abschnitt beschriebene Notwendigkeit einer antigenspezifischen Interaktion
zwischen APZs und T-Zellen für den Nachweis einer in vivo Trogozytose lässt auf eine
Aktivierung
der
trogozytose-positiven
T-Zellen
schließen.
Die
Analyse
des
Aktivierungzustandes von P14 T-Zellen nach Interaktion mit biotinylierten H8 APZs zeigte
überraschenderweise, dass sowohl trogozytose-positive als auch trogozytose-negative P14 TZellen hinsichtlich ihrer CD69 und CD107a Expression, sowie der intrazellulären Produktion
von IFNγ und TNFα einen aktivierten Phänotyp aufwiesen (Fig. 15). Dabei war allerdings die
Aktivierung der trogozytose-negativen T-Zellen weniger stark ausgeprägt als bei trogozytosepositiven T-Zellen.
Eine mögliche Erklärung für den aktivierten Zustand der trogozytose-negativen P14 T-Zellen
ist eine „Bystander“ Aktivierung durch hoch aktivierte trogozytose-positive T-Zellen [133].
Hierbei käme es zu einer antigenunabhängigen Aktivierung der trogozytose-negativen
Gedächtnis P14 T-Zellen. Um das Phänomen der „Bystander“ Aktivierung im Kontext einer
in vivo Trogozytose genauer zu untersuchen, wurden GP33-Peptid spezifische P14
Gedächtnis T-Zellen und OVA-Peptid spezifische OT-1 Gedächtnis T-Zellen in
Rezipientenmäuse kotransferiert. Nach dem Transfer von biotinylierten GP33-Peptid
präsentierenden APZs zeigte sich, dass nur P14 T-Zellen und nicht OT-1 T-Zellen
trogozytose-positiv wurden (Fig. 16). Weiter waren die OT-1 T-Zellen in dieser Situation
nicht aktiviert, was anhand der fehlenden intrazellulären Produktion von IFNγ und TNFα
nachgewiesen werden konnte. Diese Ergebnisse verdeutlichten erneut die Antigenspezifität
der in vivo Trogozytose und zeigten zusätzlich, dass der aktivierte Zustand der trogozytosenegativen P14 T-Zellen nach Interaktion mit H8 APZs nicht durch eine „Bystander“
Aktivierung erklärt werden kann. Es scheint daher wahrscheinlicher, dass ein Teil der P14 TZellen
nach
antigenspezifischer
Interaktion
89
mit
APZs
aufgrund
der
ständigen
6 Diskussion
Membranerneuerung
(turn over)
relativ
schnell
die
akquirierten
biotinylierten
Membranproteine bereits wieder verloren haben. Des Weiteren ist es möglich, dass die
verwendete durchflußzytometrische Analysemethode nicht sensitiv genug ist, um geringe
Mengen der Trogozytosemarker auf T-Zellen zu detektieren. Dadurch würden P14 T-Zellen,
welche nur wenige Membranproteine akquiriert haben, als trogozytose-negative T-Zellen
detektiert werden. Eine Möglichkeit zur Verbesserung der Sensitivität der Detektionsmethode
stellen sogenannte „Quantum Dots“ dar. „Quantum Dots“ sind Halbleiter-Nanokristalle, die
eine neue Klasse von Fluoreszenzmarkern darstellen. Sie werden durch Licht eines breiten
Wellenlängenbereichs angeregt und emittieren bei unterschiedlichen Wellenlängen, abhängig
von ihrer Größe und Zusammensetzung [159]. Aufgrund des großen Unterschiedes zwischen
den Maxima der Absorptions- und Emissionswellenlängen („Stokes-Shift“) kommt es zu
einer verringerten Autofluoreszenz der „Quantum Dots“. Dadurch wird die Sensitivität der
„Quantum Dots“ erhöht [160], weshalb sie sich möglicherweise ausgezeichnet zur Analyse
der Trogozytose eignen. Innerhalb dieser Arbeit wurde diese Methode allerdings noch nicht
verwendet.
Eine weitere Erklärung für das Auftreten von trogozytose-negativen, aber aktivierten T-Zellen
ist ein Austausch von Antigen bzw. antigenbeladenen MHC Molekülen zwischen APZs [161,
162]. Somit wäre es möglich, dass endogene, unbiotinylierte APZs Antigen/MHC Moleküle
von biotinylierten H8 APZs aufnehmen und anschließend mit P14 T-Zellen interagieren. In
diesem Fall würden P14 T-Zellen aktiviert, blieben aber trogozytose-negativ, da sie von den
endogenen APZs kein Biotin akquirieren.
Zusammenfassend lässt sich sagen, dass trogozytose-positive T-Zellen stärker aktiviert als
trogozytose-negative T-Zellen sind. Allerdings sind weitere Versuche notwendig, um das
Phänomen der aktivierten, aber trogozytose-negativen T-Zellen im Detail zu analysieren.
6.2.4 B- und T-Zellen als APZs während der in vivo T-Zelltrogozytose
Im Vergleich von antigenbeladenen B- und T-Zellen als APZs konnte bezüglich des
Membranproteintransfers auf antigenspezifische P14 T-Zellen in einem in vitro Experiment
kein Unterschied beobachtet werden (Fig. 14B). Des Weiteren unterschieden sich B- und TZellen hinsichtlich des Membranproteintransfers auch nicht von antigenbeladenen
Gesamtmilzzellen als APZs. Diese Ergebnisse stimmen mit Daten von C. Beadling und M.K
Slifka [132] überein, die zeigten, dass es in vitro keinen Unterschied in der Trogozytose gab,
90
6 Diskussion
wenn Milzzellen oder die B-Zelllinie A20 als APZs eingesetzt wurden. Bei den hier
beschriebenen in vivo Experimenten zeigte sich jedoch, dass bei Verwendung von B-Zellen
als APZs, im Vergleich zu T-Zellen und Gesamtmilzzellen, eine verminderte TZelltrogozytose der P14 T-Zellen zu beobachten ist (Fig. 14A). Ein Transfer von
antigenbeladenen T-Zellen als APZs führte hingegen zu einer verstärkten T-Zelltrogozytose
der P14 T-Zellen.
Diese Ergebnisse zeigten, dass es für den Membranproteintransfer auf T-Zellen in vitro
unerheblich ist, ob antigenbeladene B- oder T-Zellen oder Gesamtmilzzellen verwendet
werden. Im Gegensatz dazu spielt dies in vivo eine Rolle. Der Unterschied im Ausmaß der
Trogozytose bei Verwendung von B- oder T-Zellen als APZs beruht vermutlich auf deren
Lokalisierung in den lymphatischen Geweben. P14 T-Zellen sind überwiegend in der TZellzone
der
lymphatischen
Organe
lokalisiert
und
treffen
daher
mit
hoher
Wahrscheinlichkeit auf antigenbeladene T-Zell APZs, die ebenfalls in diese Zone einwandern.
Im Gegensatz dazu durchwandern die transferierten B-Zell APZs die T-Zellzone und sind
überwiegend in der B-Zellzone der lymphatischen Organe anzutreffen. Daher kommt es zu
einer schlechteren Interaktion zwischen P14 T-Zellen und B-Zellen. Dies ist vermutlich die
Erklärung für die geringere Trogozytose der P14 T-Zellen, wenn B-Zellen als APZs
verwendet werden.
6.2.5 In vivo Trogozytose von Gedächtnis und naiven P14 T-Zellen
In einem weiteren Teil der Arbeit wurde die Trogozytoseaktivität von Gedächtnis und naiven
P14 T-Zellen miteinander verglichen. Hierfür wurden Rezipientenmäuse mit einer geringen
Frequenz von Gedächtnis oder naiven P14 T-Zellen (1-2 % der CD8 T-Zellgesamtpopulation)
generiert. Nach Transfer von biotinylierten H8 APZs zeigte sich, dass der prozentuale Anteil
der trogozytose-positiven P14 T-Zellpopulation bei Gedächtnis P14 T-Zellen um etwa einen
Faktor 3 höher lag als bei naiven P14 T-Zellen (Fig. 17A). Wie kann diese verstärkte in vivo
Trogozytose von Gedächtnis P14 T-Zellen im Vergleich zu naiven P14 T-Zellen erklärt
werden?
Es konnte in diesen Experimenten beobachtet werden, dass die Anzahl von Gedächtnis P14 TZellen in der Milz im Vergleich zu naiven P14 T-Zellen reduziert war, obwohl gleiche
Zellzahlen transferiert wurden (Daten nicht gezeigt). Diese Diskrepanz in der Zellzahl von
Gedächtnis und naiven P14 T-Zellen hat ein unterschiedliches Verhältnis von H8 APZs zu
91
6 Diskussion
P14 T-Zellen zur Folge. Dabei treffen mehr naive P14 T-Zellen als Gedächtnis P14 T-Zellen
auf eine bestimmte Anzahl von H8 APZs. Möglicherweise tritt damit unter den naiven P14 TZellen eine stärkere Konkurrenz um die Interaktion mit H8 APZs auf. Diese Konkurrenz
würde zu einer verminderten Trogozytose der naiven P14 T-Zellen im Vergleich zu
Gedächtnis P14 T-Zellen führen. Eine weitere Ursache für die verminderte Anzahl von
Gedächtnis P14 T-Zellen nach Transfer von H8 APZs könnte eine gegenseitige Zytolyse
(„Fratricide“) von Gedächtnis P14 T-Zellen sein. Wie in Fig. 10B gezeigt, kann es durch
antigenspezifische Interaktion zwischen Gedächtnis P14 T-Zellen und antigenbeladenen
APZs zu einem Transfer von MHC Klasse I Molekülen von APZs auf P14 T-Zellen kommen.
Somit können Gedächtnis P14 T-Zellen GP33-Peptid beladene MHC Klasse I Komplexe von
H8 APZs aufnehmen und stellen somit ein gegenseitiges Ziel für ihre zytolytische Aktivität
dar. „Fratricide“ im Zusammenhang mit Trogozytose konnte von Mostböck et al. für
antigenspezifische CD4 Gedächtnis T-Zellen nach Akquirierung von kostimulatorischen
Molekülen und peptidbeladenen MHC Molekülen in vitro nachgewiesen werden [96]. Im Fall
von naiven P14 T-Zellen kann es ebenfalls zu einem Transfer von GP33-Peptid beladenen
MHC Klasse I Molekülen auf P14 T-Zellen kommen. Da naive P14 T-Zellen jedoch innerhalb
von 3 h nach antigenspezifischer Aktivierung noch keine zytolytische Aktivität aufweisen,
können sie sich nicht gegenseitig durch „Fratricide“ eliminieren. Inwieweit „Fratricide“ die
geringere Frequenz von Gedächtnis T-Zellen in diesem in vivo Modell erklärt, muss jedoch
mit Vorsicht betrachtet werden. So konnte Huang et al. in einer Studie zeigen, dass
„Fratricide“ in vitro nur bei relativ hohen Antigenmengen von 10-9 M bis 10-6 M auftritt [57].
Wie in Fig. 13A gezeigt, entspricht die Expression des endogenen GP33-Peptides auf H8
APZs einer exogenen Antigenbeladung mit etwa 10-9 M GP33-Peptid. Somit liegt bei dem
hier verwendeten in vivo Modell für Trogozytose die Antigenbeladung der H8 APZs am Limit
für das Auslösen von „Fratricide“ zwischen T-Zellen.
Eine weitere mögliche Erklärung für die reduzierte Anzahl von Gedächtnis P14 T-Zellen nach
Transfer von H8 APZs könnte die von Mostböck et al. beschriebene Beobachtung sein, dass
in vitro generierte antigenspezifische CD4 Gedächtnis T-Zellen, die MHC und
kostimulatorische Moleküle (= Antigen-Präsentasom, APS) von antigenbeladenen APZs
aufgenommen haben, nach Restimulation in Apoptose gehen [96]. Dies ist wahrscheinlich auf
die Aktivierung von BAX, BAK und Caspase 3 zurückzuführen. Ob dies auch für das in
dieser Arbeit verwendete in vivo System zutrifft, muss in weiteren Experimenten geklärt
werden.
92
6 Diskussion
Das unterschiedliche Migrationsverhalten von Gedächtnis und naiven T-Zellen nach
adoptiven Transfer in Rezipientenmäuse könnte ebenfalls die unterschiedliche Zellzahl der
beiden Zellpopulationen in der Milz und somit das Trogozytoseverhalten von Gedächtnis und
naiven P14 T-Zellen erklären. Um dies zu untersuchen, wurden Gedächtnis und naive P14 TZellen in vitro mit biotinylierten H8 APZs inkubiert. Dabei zeigte sich, dass der in vivo
beobachtete Unterschied in der Trogozytose zwischen naiven und Gedächtnis P14 T-Zellen
auch in vitro reproduziert werden konnte (Fig. 17B). Somit kann das Migrationsverhalten
vermutlich nicht als Ursache für das unterschiedliche Trogozytoseverhalten von naiven und
Gedächtnis P14 T-Zellen herangezogen werden.
Es bleibt somit zu klären, ob „Fratricide“ und/oder Apoptose von Gedächtnis P14 T-Zellen
Ursache(n) für die verminderte Zellzahl von Gedächtnis P14 T-Zellen nach Transfer von H8
APZs darstellen und somit Einfluss auf das Zellzahlverhältnis von H8 APZs zu P14 T-Zellen
haben. Des Weiteren ist offen, ob sich dieses Zellzahlverhältnis tatsächlich auf die TZelltrogozytose von Gedächtnis und naiven P14 T-Zellen auswirkt.
Eine weitere Ursache für die verstärkte Trogozytose von Gedächtnis P14 T-Zellen im
Vergleich zu naiven P14 T-Zellen könnte in ihrer ad hoc zytolytischen Aktivität liegen. Es ist
bekannt, dass ex vivo isolierte Gedächtnis P14 T-Zellen direkt zytolytisch aktiv sind,
wohingegen naive P14 T-Zellen bezüglich ihrer Effektorfunktionen als ruhend zu bezeichnen
sind [134, 135]. Folglich können in dem hier verwendeten in vivo Trogozytosemodell H8
APZs durch Gedächtnis P14 T-Zellen lysiert werden, nicht aber durch naive P14 T-Zellen.
Durch die zytolytische Aktivität der Gedächtnis P14 T-Zellen könnten von H8 APZs
apoptotische Vesikel freigesetzt werden, über die verstärkt Oberflächenproteine auf
Gedächtnis
P14
T-Zellen
transferiert
werden
könnten.
Der
Transfer
von
Zelloberflächenproteinen mittels apoptotischer Vesikel würde aufgrund der fehlenden
zytolytischen Fähigkeit bei naiven P14 T-Zellen entfallen. Um den Einfluss der lytischen
Aktivität der T-Zellen auf die in vivo Trogozytose zu untersuchen, wurden Gedächtnis P14 TZellen verglichen, die APZs lysieren können oder nicht (perforin-defiziente Gedächtnis P14
T-Zellen = PKO Gedächtnis P14 T-Zellen). Es zeigte sich, dass es zu keinem Unterschied in
der T-Zelltrogozytose zwischen lytischen Gedächtnis P14 T-Zellen und nichtlytischen PKO
Gedächtnis P14 T-Zellen kommt (Fig. 18A). Dieses Ergebnis stimmt mit in vitro Daten von
Hudrisier et al. überein, die zeigten, dass die perforin-vermittelte zytolytische Aktivität keinen
Einfluss auf den Transfer von Membranproteinen hat [68]. Deshalb kann die verstärkte
Trogozytose von Gedächtnis T-Zellen wahrscheinlich nicht auf eine höhere Freisetzung von
93
6 Diskussion
apoptotischen Vesikeln zurückgeführt werden. In dieselbe Richtung weisen auch
Kotransferexperimente, bei welchen naive und Gedächtnis P14 T-Zellen gleichzeitig in
Rezipientenmäuse transferiert wurden. Die T-Zelltrogozytose von naiven P14 T-Zellen stieg
durch Kotransfer von Gedächtnis P14 T-Zellen nicht an (Fig. 17C). Dies zeigte, dass die
durch die zytolytische Aktivität von Gedächtnis P14 T-Zellen freigesetzten apoptotischen
Vesikel keinen Einfluss auf die T-Zelltrogozytose von naiven P14 T-Zellen haben. Somit
spielt die zytolytische Aktivität von P14 T-Zellen keine Rolle für das Ausmaß der T-ZellTrogozytose.
Eine weitere Erklärung für den beobachteten Unterschied in der T-Zelltrogozytose zwischen
Gedächtnis und naiven P14 T-Zellen könnte in der unterschiedlichen Expression von
Adhäsionsmolekülen liegen. Es ist bekannt, dass Gedächtnis T-Zellen im Vergleich zu naiven
T-Zellen verstärkt Adhäsionsmoleküle wie z.B. LFA-1 auf ihrer Oberfläche exprimieren
[136]. Hudrisier et al. zeigten in vitro, dass die Interaktion von LFA-1 mit ICAM-1
Molekülen kein direkter Auslöser für eine T-Zelltrogozytose darstellt [157]. Durch die
erhöhte Expression von LFA-1 Molekülen auf Gedächtnis P14 T-Zellen im Vergleich zu
naiven P14 T-Zellen (Fig. 18B), könnte allerdings zwischen Gedächtnis P14 T-Zellen und
APZs eine stärkere Zell-Zell-Interaktion stattfinden als zwischen naiven P14 T-Zellen und
APZs. Durch diesen stärkeren Kontakt verlängert sich die Interaktion zwischen den Zellen
und es könnte zu einer verstärkten T-Zelltrogozytose kommen. Weiter könnte die Expression
von CD28 Molekülen auf T-Zellen ebenfalls Auwirkungen auf die T-Zelltrogozytose
besitzen. Rothoeft et al. zeigten, dass die Interaktion zwischen CD80/86 und CD28
Molekülen
die
T-Zellaktivierung
moduliert.
Dadurch
wird
die
Formation
der
immunologischen Synapse beeinflusst und es kommt zu einem längeren Kontakt zwischen
APZ und T-Zelle [163]. Da Gedächtnis T-Zellen mehr CD28 Moleküle exprimieren als naive
T-Zellen könnte darin eine Erklärung für die unterschiedliche Trogozytosefähigkeit der
beiden Zellpopulationen liegen. Dies muss in weiteren Versuchen im Detail analysiert
werden. Durch die unterschiedliche Expression von Adhäsions- und CD28 Molekülen auf
Gedächtnis und naiven P14 T-Zellen würde man bei einem Kotransfer eine Konkurrenz um
die Interaktion mit APZs zwischen den beiden Zellpopulationen vermuten. Da Gedächtnis
P14 T-Zellen längere und stabilere Kontakte zu H8 APZs ausbilden können als naive P14 TZellen, würden Gedächtnis P14 T-Zellen verhindern, dass naive P14 T-Zellen mit den APZs
interagieren. Folglich müsste bei einem Kotransfer im Vergleich zu einem Einzeltransfer eine
verringerte T-Zelltrogozytose der naiven P14 T-Zellen zu beobachten sein. Dies war jedoch
94
6 Diskussion
nicht der Fall (Fig. 17A, C), so dass die Kompetition um die Interaktion mit APZs für das
Trogozytoseverhalten von naiven und Gedächtnis vermutlich keine Rolle spielt.
Zusammenfassend zeigte sich, dass die unterschiedliche Trogozytosefähigkeit von Gedächtnis
und naiven P14 T-Zellen wahrscheinlich nicht durch Unterschiede in dem Verhältnis von P14
T-Zellen zu APZs oder in der zytolytischen Aktivität der P14 T-Zellen erklärt werden kann.
Vielmehr könnte die erhöhte Expression von Adhäsionsmolekülen auf Gedächtnis P14 TZellen der Grund für die verstärkte T-Zelltrogozytose der Gedächtnis P14 T-Zellen sein.
6.2.6 T-Zelltrogozytose nach antigenspezifischer Interaktion von T-Zellen mit
Tumorzellen
In einer Studie der Gruppe um M. Lotem wurde der Membrantransfer von antigenbeladenen
Melanomzellen auf antigenspezifische CD8 T-Zellen in vitro beschrieben [139]. In der
vorliegenden Arbeit wurde nach in vitro Inkubation von Gedächtnis P14 T-Zellen mit
verschiedenen GP33-Epitop exprimierenden Tumorzelllinien das Ausmaß der Trogozytose
analysiert. Dabei konnte nur eine geringe Trogozytose von Gedächtnis P14 T-Zellen nach
Interaktion mit GP33-Epitop exprimierenden B16 (B16GP33) Melanomzellen festgestellt
werden (Fig. 20A). In einer Studie von Daubeuf et al. wurde ebenfalls nur ein geringer
Proteintransfer von B16 Melanomzellen auf T-Zellen beobachtet [140]. Der Grund hierfür
liegt wahrscheinlich in der geringen Expression von MHC Klasse I Molekülen auf B16
Melanomzellen [110]. Diese geringe Expression an MHC Klasse I Molekülen war jedoch
ausreichend für die antigenspezifische Aktivierung von Gedächtnis P14 T-Zellen durch
B16GP33 Melanomzellen, was sich in einer intrazellulären Produktion von IFNγ zeigte (Fig.
20A). Im Gegensatz zu biotinylierten B16GP33 Melanomzellen konnte bei biotinylierten
A9GP33
Lungenkarzinomzellen
in
vitro
ein
hoher
Transfer
von
biotinylierten
Membranproteinen auf Gedächtnis P14 T-Zellen beobachtet werden (Fig. 20B). Außerdem
zeigte die Analyse der intrazellulären IFNγ Produktion, dass trogozytose-positive Gedächtnis
P14 T-Zellen nach Kontakt mit biotinylierten A9GP33 Tumorzellen stärker aktiviert sind als
trogozytose-negative Gedächtnis P14 T-Zellen. Bei dem Nachweis von in vivo Trogozytose
mit A9GP33 Tumorzellen zeigte sich zudem, dass 4 Stunden nach Kotransfer von Gedächtnis
P14 T-Zellen und biotinylierten A9GP33 Tumorzellen in Rezipientenmäuse ein Transfer von
biotinylierten Membranproteinen auf Gedächtnis P14 T-Zellen zu beobachten war (Fig. 21).
Somit kann in einem in vitro und in einem in vivo System bei einer geringen Frequenz von
Gedächtnis P14 T-Zellen ein Membranproteintransfer von A9 Tumorzellen auf T-Zellen
95
6 Diskussion
beobachtet werden. Dies ist der erste Hinweis auf T-Zelltrogozytose in einem in vivo
Tumormodell. Als nächsten Schritt müsste die T-Zelltrogozytose in einem etablierten Tumor
analysiert werden.
6.2.7 In vivo T-Zelltrogozytose im Kontext viraler Infektionen
In weiteren Experimenten wurde die in vivo T-Zelltrogozytose im Kontext antiviraler
Immunantworten eingehender analysiert.
Zunächst wurde in vitro untersucht, ob T-Zelltrogozytose nach Interaktion mit virusinfizierten APZs nachweisbar ist. Hierzu wurden biotinylierte LCMV infizierte MC57 Zellen
mit Gedächtnis P14 T-Zellen inkubiert. Nach dreistündiger in vitro Inkubation konnte ein
Transfer von biotinylierten Membranproteinen der infizierten MC57 Zellen auf Gedächtnis
P14 T-Zellen beobachtet werden (Fig. 22). Dies zeigte, dass nach LCMV Infektion eine
ausreichend hohe Anzahl an GP33-Epitop beladenen MHC Klasse I Molekülen auf infizierten
Zellen vorhanden ist, um einen Membranaustausch zwischen APZs und T-Zellen zu
ermöglichen. Diese Ergebnisse stimmen mit Daten von Beadling et al. überein, die ebenfalls
einen Membrantransfer von LCMV infizierten APZs auf LCMV spezifische T-Zellen zeigen
konnten [132]. Im nächsten Schritt wurde die in vivo T-Zelltrogozytose von Gedächtnis P14
T-Zellen während einer Infektion mit LCMV untersucht. Hierfür wurden CD45.1
Rezipientenmäuse zunächst lokal i.f. mit LCMV infiziert. Durch die lokale Infektion wird im
lokalen Lymphknoten eine hohe Viruslast generiert. Nach adoptivem Transfer von
Gedächtnis P14 T-Zellen (CD45.2) kommt es durch die lokale Virusinfektion zu einer
verstärkten Einwanderung LCMV spezifischer T-Zellen in den lokalen Lymphknoten. Es
zeigte sich, dass in den inguinalen Lymphknoten ein hoher Anteil der Gedächtnis P14 TZellen CD45.1 Moleküle von LCMV infizierten APZs akquirierten und dadurch trogozytosepositiv wurden (Fig. 23). Im Vergleich dazu waren in der Milz weitaus weniger Gedächtnis
P14 T-Zellen positiv für den Trogozytosemarker CD45.1. Der beobachtete Unterschied in der
T-Zelltrogozytose von Gedächtnis P14 T-Zellen zwischen inguinalen Lymphknoten und Milz
kann durch die höhere Viruslast in den inguinalen Lymphknoten erklärt werden. Aufgrund
der höheren Viruslast sind in den inguinalen Lymphknoten mehr LCMV infizierte APZs
vorhanden mit denen die LCMV spezifischen T-Zellen interagieren können. Eine weitere
Erklärungsmöglichkeit für den Nachweis trogozytose-positiver Gedächtnis P14 T-Zellen in
der Milz könnte eine Einwanderung dieser T-Zellen aus den Lymphknoten sein.
96
6 Diskussion
Neben der lokalen Infektion mit LCMV, wurde die T-Zelltrogozytose von Gedächtnis P14 TZellen während einer systemischen Virusinfektion untersucht. Hierfür wurden CD45.1
Rezipientenmäuse i.v. mit LCMV infiziert. Auch nach systemischer LCMV Infektion konnte
in vivo T-Zelltrogozytose durch P14 T-Zellen nachgewiesen werden (Fig. 24A, oben, linke
Spalte). Die systemische LCMV Infektion führt zu einer relativ hohen Antigenlast in der Milz
und ist deshalb nicht repräsentativ für andere Infektionen. Weiter ist bekannt, dass die
Antigenlast, also die Anzahl der antigenbeladenen APZs und die Expressionsstärke des
Antigens, das Ausmaß der Trogozytose wesentlich beeinflusst [57, 68]. Deshalb kann
argumentiert werden, dass der Nachweis einer Trogozytose durch T-Zellen während der
LCMV Infektion einen Sonderfall darstellt. Daher wurde in einem nächsten Schritt die TZelltrogozytose während einer systemischen, viralen Infektion analysiert, bei der es zu einer
weitaus geringeren Viruslast kommt. Dafür wurden CD45.1 Rezipientenmäuse i.v. mit einem
rekombinanten Vaccinia Virus infiziert, welches das Glykoprotein von LCMV exprimiert
(rVVGP). Im Gegensatz zu LCM-Virus repliziert Vaccinia Virus abortiv in der Milz, so dass
zum Zeitpunkt der Analyse keine replikationsfähigen Vaccinia Viren in der Milz detektiert
werden konnten (Daten nicht gezeigt).
In rVVGP infizierten CD45.1 Rezipientenmäusen zeigte sich im Vergleich zu LCMV
infizierten CD45.1 Rezipientenmäusen eine Tendenz zu verstärkter Trogozytose von P14 TZellen nach Interaktion mit rVVGP infizierten APZs (Fig. 24A, unten). Diese Beobachtung
kann unterschiedliche Ursachen haben. Zum einen ist es möglich, dass während einer LCMV
Infektion die Antigenlast so hoch ist, dass es zu „Fratricide“ zwischen Gedächtnis P14 TZellen kommt und dadurch die Anzahl trogozytose-positiver Gedächtnis P14 T-Zellen
abnimmt. Zum anderen kann das durch LCMV oder Vaccinia Virus Infektion induzierte
Zytokinmilieu einen Einfluss auf die Trogozytose haben. Während nach einer LCMV
Infektion kein IL-12 im Serum detektierbar ist [128], sind deutlich ehöhte Mengen IL-12 zwei
Tage nach Infektion mit rVVGP im Serum der infizierten Mäuse nachweisbar (Daten nicht
gezeigt). Die Gruppe um A.S. Shaw konnte in einer kürzlich erschienenen Studie zeigen, dass
IL-12 die Bildung einer immunologischen Synapse zwischen T-Zellen und APZs positiv
beeinflusst, indem es die Affinität von LFA-1 erhöht [164]. Somit könnte es aufgrund der
erhöhten IL-12 Mengen während einer Infektion mit rVVGP zu einem verstärkten
Membranproteintransfer von rVVGP infizierten APZs auf Gedächtnis P14 T-Zellen nach
antigenspezifischer Interaktion kommen.
97
6 Diskussion
Um zu untersuchen, ob das induzierte Zytokinmileu im Kontext einer LCMV oder einer
Vaccinia Virus Infektion allein für eine antigenunspezifische T-Zelltrogozytose der P14 TZellen verantwortlich gemacht werden kann, wurden CD45.1 Rezipientenmäuse mit VV-WT
(exprimiert
kein
GP33-Epitop)
oder
LCMV8.7
infiziert.
LCMV8.7
weist
im
immunodominanten GP33-Epitop von LCMV eine Mutation auf, aufgrund derer der
transgene T-Zellrezeptor der P14 T-Zellen das GP33-Epitop nicht mehr erkennen kann. Somit
kommt es bei Infektion mit VV-WT oder LCMV8.7 zwar zur Induktion des
infektionsspezifischen Zytokinmilieus aber zu keiner antigenspezifischen Interaktion
zwischen infizierten APZs und Gedächtnis P14 T-Zellen. Es zeigte sich, dass weder nach
Infektion mit LCMV8.7 noch nach Infektion mit VV-WT ein signifikanter CD45.1
Molekültransfer auf Gedächtnis P14 T-Zellen stattfand (Fig. 24A). Folglich reicht ein LCMV
oder VV spezifisches Zytokinmilieu nicht zur Induzierung einer T-Zelltrogozytose aus.
Dieser Befund wird durch eine Studie von Beadling et al. bestätigt, die zeigte, dass für den
Membranproteintransfer auf T-Zellen in vitro ein antigenspezifischer Kontakt mit APZs
erforderlich ist und die Aktivierung der T-Zellen mittels Zytokinen (IL-12 und IL-18) nicht
ausreichend ist [132]. Diese Ergebnisse bestätigen außerdem die Antigenspezifität der TZelltrogozytose.
Während der Infektion mit VV-WT konnte in Abwesenheit eines antigenspezifischen Signals
nur eine geringe Aktivierung der Gedächtnis P14 T-Zellen beobachtet werden, da nur ein
geringer
Anteil
der
trogozytose-positiven
Gedächtnis
P14
T-Zellen
den
frühen
Aktivierungsmarker CD69 auf ihrer Oberfläche exprimierten. Bei den trogozytose-negativen
Gedächtnis P14 T-Zellen konnte keine CD69-Expression detektiert werden (Fig. 24B). Im
Gegensatz zur CD69-Expression konnte bei Fehlen eines antigenspezifischen Signales keine
intrazelluläre IFNγ-Produktion bei trogozytose-positiven und -negativen Gedächtnis P14 TZellen gemessen werden. Hingegen war nach Infektion mit rVVGP eine intrazelluläre
Produktion von IFNγ bei trogozytose-positiven und -negativen Gedächtnis P14 T-Zellen
detektierbar, Ebenso wie eine Expression von CD69. Dabei zeigte sich, dass, gemessen an der
Expression von CD69 und der Produktion von IFNγ, die trogozytose-positiven Gedächtnis
P14 T-Zellen einen aktivierteren Phänotyp aufweisen als die trogozytose-negativen
Gedächtnis P14 T-Zellen. Diese Beobachtung den Ergebnissen wie sie in Abschnitt 5.2.6
beschrieben wurden. Hierbei wurde nach Interaktion mit biotinylierten H8 APZs ebenfalls ein
aktivierterer Phänotyp der trogozytose-positiven Gedächtnis P14 T-Zellen beschrieben. Es
fällt jedoch auf, dass Gedächtnis P14 T-Zellen nach Interaktion mit rVVGP infizierten APZs
98
6 Diskussion
stärker aktiviert wurden als nach Interaktion mit H8 APZs. Dies könnte zum Teil durch den
unterschiedlichen Reifezustand der APZs erklärbar sein. Während H8 APZs unreif sind, führt
eine rVVGP Infektion zur Generierung von reifen APZs.
Im Folgenden wurde eine Zeitkinetik für in vivo T-Zelltrogozytose während einer Infektion
mit rVVGP durchgeführt, welche zeigt, dass es zu einem Anstieg der T-Zelltrogozytose von
Gedächtnis P14 T-Zellen innerhalb von 4 und 12 Stunden kommt (Fig. 24C). Im Gegensatz
zur T-Zelltrogozytose während einer viralen Infektion wurde bei der Trogozytosekinetik mit
biotinylierten H8 APZs eine drastische Abnahme der T-Zelltrogozytose der Gedächtnis P14
T-Zellen zwischen 3 und 8 Stunden beobachtet (Fig. 13D). Der Anstieg der T-Zelltrogozytose
während einer Infektion mit rVVGP kann dadurch erklärt werden, dass der Trogozytosemarker
CD45.1 auf den infizierten APZs konstant vorhanden bleibt, während die Biotinylierung der
Oberflächenmembranproteine auf H8 APZs aufgrund der Membranerneuerung verloren geht.
Somit können auch zu einem späteren Zeitpunkt noch CD45.1 Moleküle auf Gedächtnis P14
T-Zellen übertragen werden. Außerdem stehen nach Eliminierung der biotinylierten H8 APZs
durch Gedächtnis P14 T-Zellen keine neuen Zielzellen mehr zur Verfügung, während es bei
einer Virusinfektion zu einem stetigen Nachschub an infizierten Zielzellen kommt, mit denen
die Gedächtnis P14 T-Zellen interagieren können.
Zusammenfassend konnte in der vorliegenden Arbeit zum ersten Mal gezeigt werden, dass es
während einer viralen Infektion mit LCMV oder rVVGP in vivo zu einem Transfer von
CD45.1 Molekülen von infizierten APZs auf Gedächtnis P14 T-Zellen kommt. Dabei spielt
der antigenspezifische Kontakt zwischen APZs und T-Zellen eine entscheidende Rolle für die
T-Zelltrogozytose und weniger das durch die Infektionen induzierte Zytokinmilieu.
Mittels des in dieser Arbeit etablierten in vivo Modells zur Detektion der T-Zelltrogozytose ist
es möglich die T-Zellen zu detektieren, die kürzlich in Interaktion mit APZs waren. Dadurch
besteht die Möglichkeit in einem nächsten Schritt den Kontakt zwischen APZs und T-Zellen
zu visualisieren und das Schicksal der T-Zellen mittels „intravital imaging“ zu verfolgen.
Somit stellt das hier etablierte in vivo Modell zur Detektion von T-Zelltrogozytose das
experimentelle Fundament für eine zukünftige Analyse der T-Zelltrogozytose und ihrer
Bedeutung für die Regulation von Immunantworten dar.
99
Abkürzungsverzeichnis
AICD
aktivierungsinduzierter Zelltod (activation induced cell death)
AK
Antikörper
APC
Allophycocyanin
APZs
antigenpräsentierende Zellen
B6
C57BL/6J Mäuse
BHI
brain heart infusion
CD
cluster of differentiation
CFSE
5,6-Carboxyfluoreszein-Diacetat-Succinimidyl-Ester
CFU
colony forming unit
CpG
Oligodesoxynukleotid
DNS
Desoxyribonukleinsäure
DZ
dendritische Zelle
DMEM
Dulbecco’s Modified Essential Medium
EDTA
Ethylendiamintetraessigsäure
FACS
Durchflusszytometer (fluorescence activated cell sorter)
FITC
Fluoreszeinisothiocyanat
FKS
fötales Kälberserum
g
Erdbeschleunigung
GP
Glykoprotein
GP33
LCMV Glykoproteinepitop GP33-41
HLA
human leukocyte antigen
i.f.
intra footpad
i.p.
intraperitoneal
i.v.
intravenös
100
IFN
Interferon
IFNAR
Typ I Interferonrezeptor
IgG
Immunglobulin G
IL
Interleukin
p70
Heterodimer aus p40 und p35 (Untereinheiten von IL-12)
IMDM
Iscove’s Modified Dulbecco’s Medium
IRF
interferon regulatory factor
ISGF
interferon stimulated gene factor
JAK
Januskinase
KO
knockout
KIR
killer cell immunglobulin-like receptor
LCMV
Lymphozytäres Choriomeningitis Virus
LFA
lymphocyte function-associated antigen
L-Gln
L-Glutamin
LK
Lymphknoten
iLK
inguinaler Lymphknoten
Listeria
Listeria monozytogenes
M
molar
M2
M2 Protein des Respiratorischen Syncytial Virus
MFI
mittlere Fluoreszenzintensität
MHC
Haupthistokompatibilitätskomplex (major histocompatibility complex)
MIC-Moleküle
MHC Klasse I ähnliche Moleküle
moi
Anzahl der Viruspartikel pro Zelle (multiplicity of infection)
NFκB
nukleärer Faktor κB
NK-Zelle
natürliche Killerzellen
OVA
Ovalbumin
101
P/S
Penicillin/Streptomycin
PBL
periphere Blutlymphozyten
PBS
phosphatgepufferte Kochsalzlösung (phosphate buffered saline)
PE
Phycoerythrin
PFU
plaque forming units
poly(I:C)
polyinosinic:polycytidylic acid
RNS
Ribonukleinsäure
SCID
severe combined immunodeficiency
STAT
signal transducer and activator of transcription
Thy
Thymusmarker
TNF
Tumornekrosefaktor
TYK
Tyrosinkinase
TZR
T-Zellrezeptor
VSV
Vesikuläres Stomatitis Virus
VV
Vaccinia Virus
WT
Wildtyp
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