α α/2 Is Intensität
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Aktive Modenkopplung • Modulation der Intensität durch Modulation von α • sukzessive Kopplung der Nachbarmoden: Nur Moden mit richtiger Phasenlage haben kleines α • moduliertes α gewissermassen Taktgeber für die Moden • Nachteil: Länge des Resonators muss genau mit der Modulationsrate korrelieren Passive Modenkopplung • Sättigbare Absorber oder andere optisch nichtlineare Effekte • Hohe Abschwächung für kleine Intensität • Hohe Intensitäten werden nicht abgeschwächt α0 α0/2 Is • Intensität • Zufällige Fluktuation wird verstärkt • Intensitätsmodulationsrate stellt sich von selbst auf die Resonatorlänge ein • Noch kürzere Pulse: chirp mit anschliessender Kompression 31 4 Mikroskopie • ist die Abbildung kleiner Strukturen • Abbildung ist eine Transformationsvorschrift, die einem Punkt im Objekt einen Punkt im Bild zuordnet • Ideal: Eineindeutige Transformation, dann lässt sich Objekt genau rekonstruieren 4.1 Eigenschaften dünner sphärischer Linsen • Wir betrachten zunächst nur Strahlen, die nahe der optischen Achse (Achse senkrcht zur Linsenebene durch deren Mittelpunkt) verlaufen • Dann gilt: alle einfallende Strahlen parallel zur optischen Achse werden zu einem und demselben Punkt auf selbiger, dem Brennpunkt, gebrochen • Demzufolge werden alle Strahlen, die aus dem Brennpunkt kommen, zu parallelen Strahlen • Strahlen durch den Mittelpunkt der Linse werden nicht abgelenkt • Die Linse hat auf beiden Seiten die gleiche Brennweite (Abstand Linse – Brennpunkt) • Bild eines Gegenstandspunktes: Ort, an dem sich alle Strahlen eines Gegenstandspunktes treffen G f F F g b • 4.2 4.2.1 Abbildungsfehler Monochromatische Abbildungsfehler Sphärische Aberrationen 32 B • Treten bei achsfernen Strahlen auf • Je weiter ein Strahl von der Achse entfernt, desto kürzer die Brennweite → nicht alle Parallelstrahlen treffen sich in einem Punkt • Koma • Tritt auf, wenn Parallelstrahlbündel nicht parallel zur optischen Achse einfällt • Brennweite umso kleiner, je grösser der Auftreffwinkel des Lichtes ist • Astigmatismus • Tritt auf, wenn Parallelstrahlbündel nicht parallel zur optischen Achse einfällt, bzw. die Linse unterschiedliche Krümmungsradien in senkrechten Ebenen hat • Unterschiedliche Brennweiten für Strahlen in verschiedenen Ebenen • Beim Fokussieren erhält man ja nach Ebene einen horizontalen oder senkrechten Strich, dazwischen einen Kreis 33 • 4.2.2 Chromatische Aberrationen • Aufgrund der Dispersion ist die Brennweite von der Wellenläne des Lichts abhängig • 4.3 Strahlengang im optischen Mikroskop Klassisches Mikroskop • Gegenstand zwischen doppelter und einfacher Brennweite des Objektivs • reeles Zwischenbild 16 cm hinter Objektiv • Okular betrachtet Zwischenbild als Lupe: Zwischenbild innerhalb der einfachen Brennweite 34 • Unendlich (infinity) Mikroskop • Gegenstand exakt im Brennpunkt des Objektivs • Parallelstrahlen nach Objektiv • Weitere Linse (sog. Tubuslinse) erzeugt Zwischenbild • Danach Okular/Kamera • Vorteil: Grössere Flexibilität (Abstand Objektiv – Tubuslinse kann variiert werden) • 4.4 Auflösungsvermögen • Mindestabstand zweier Punkte, so dass Sie im Bild noch als zwei “Punkte” unterscheidbar sind • Geometrischer Optik: aus einem Gegenstandspunkt wird immer ein Bildpunkt • Wellenoptik: Die Kugelwelle, die von einem Gegenstandspunkt ausgeht, wird durch die Öffnung der Linse abgeschnitten: Beugungseffekte • Aus Punkt wird Beugungsmuster (der englische Begriff dafür ist Point Spread Function, PSF) 35 • PSF bei kreisförmiger Apertur: Airy-Muster • • Mathematische Beschreibung in radialer (quer zur optischen Achse) und longitudinaler (längs der optischen Achse in z) Richtung: I(r) = I0 ! " # $2 J1 2πN.A. λr πN.A. λr ! " π # $2 sin z 2λn N.A.2 I(z) = π z 2λn N.A.2 • Nach Rayleigh-Kriterium sind zwei Punkte auflösbar, wenn das erste Beugungsminimum des einen mit dem Beugungsmaximum nullter Ordnung des anderen zusammenfällt 36 • • Das führt zu einem Abstand der Punkte d: λ λ d = 0.61 = 0.61 n sin Θ N.A. • n: Brechungsindex des Mediums zwischen Gegenstand und Objektiv • Θ: Halber Öffnungswinkel des Objektivs • Anderes Kriterium: Sparrow-Kriterium: Zwei Punkte werden aufgelöst, wenn es einen Sattelpunkt in der Addition der PSF’s gibt 5 Hochauflösende Fernfeldmikroskopie • Fernfeldmikroskopie: Bild entsteht aus Licht, dass einen Weg zurückgelegt hat, der grösser als die Wellenlänge ist • Hochauflösend: Höhere Auflösung als konventionelles Mikroskop 5.1 5.1.1 Konfokalmikroskopie Konfokales Prinzip • Konventionelles Mikroskop: Der gesamte Gegenstand wird beleuchtet, Lichtquelle in zu Gegenstand konjugierter Ebene 37 1.0 1.0 0.8 0.8 0.6 0.6 0.4 0.4 0.2 0.2 0.0 0.0 -800 -600 -400 -200 0 x (nm) 200 400 600 800 -800 -600 -400 -200 0 x (nm) 200 400 600 800 Abbildung 2: Links Rayleigh, rechts Sparrow-Kriterium. Gezeigt ist ein Schnitt durch die PSFs entlang der Verbindungslinie der Punkte • Konfokalmikroskop: Beleuchtung eines “Punktes” • Detektion ebenfalls in Punkt • Abbildung und Beleuchtung in einem Fokus: daher konfokal • Gemeinsamer Fokus von Detektion und Beleuchtung: konfokaler “Punkt” (engl. spot) • Fluoreszenzmikroskop: Licht vom Objekt (Fluoreszenz) spektral von Beleuchtung (Anregung) getrennt • Epifluoreszenz: Beleuchtung und Abbildung durch Objektiv • Trennung von Beleuchtung und Fluoreszenz durch dichroischen Strahlteiler 38 Bildebene dichroischer Strahlteiler Tubuslinse Objektiv Gegenstand Kondensor Leuchtfeldblende Kollimator Lichtquelle • • Signal nur von einem Punkt → Bild durch rastern (scanning), entweder Gegenstand oder konfokaler “Punkt” 5.1.2 Scanmodi Proben (Sample-) Sanning • Dreidimensionale Bewegung der Probe • Vorteile: – Scanbereich nur durch Probenscanner begrenzt – Nur achsparallele Strahlen • Nachteile: – langsam 39 – teuer – nicht in jeder Umgebung einfach realisierbar (tiefe T , Ultrahochvakuum) Strahl (Beam-, Laser-) Scanning • Parallelstrahlbündel muss um Objektiv gedreht werden • Telezentrisches Linsensystem: Spiegel wird in hinteren Brennpunkt des Objektivs abgebildet • Kippung des Spiegels → Verschiebung des Punktes f1 f1 f2 f3 f3 Bild des Spiegels Sc an sp ie g el Bild Lichtquelle/Detektor f2 • • Vorteile: – billig – schnell – Abbildungsmasstab kann durch verschiedene Objektive verändert werden – Probe und Scaneinheit getrennt: UHV und Tief-T kompatibel • Nachteile: – Sichtfeld durch Objektiv beschränkt – Abbildungsfehler durch nichtachsparallele Strahlen 40 5.1.3 Auflösungsvermögen • Anregungs-Licht-“Punkt” durch Beugung auch Airy-Muster • Gesamt-PSF des Systems ist Produkt aus Anregungs-PSF und DetektionsPSF • Unter Vernachlässigung des Stokes-Shifts: Anregungs-PSF = ˆ DetektionsPSF → Gesamt-PSF=PSF2klass • Gesamt-PSF also Airy2 • • Auflösung im Vgl. zum klass. Mikroskop um Faktor √ 2 besser • Zusätzlich Unterdrückung der Nebenmaxima der Airy-Scheibe • 5.1.4 Experimentelle Aspekte Punktlichtquelle • Fokussierung des Lasers auf eine kleine Blende, ein sog. Pinhole – Vorteile: ∗ Polarisation bleibt erhalten 41 ∗ Verschiedene Grössen des Pinholes möglich – Nachteile: ∗ Schlechte Transmission ∗ Strahlprofil i.d.R. nicht Gaussförmig • Einkopplung des Lasers in eine Einzelmode-Lichtleitfaser (single mode fiber) – Vorteile: ∗ ideales Strahlprofil ∗ Laser kann von Mikroskop getrennt sein – Nachteile: ∗ Polarisation i.d.R. nicht erhalten ∗ Faser nur für bestimmten Wellenlängenbereich single mode Scanning • Probenscanning meist durch Piezo-Scanner realisert • Piezoelektrischer Effekt: Längenänderung bei Anlegen einer Spannung • Längenänderung nicht proportional zur Spannung, zusätzlich Hysterese l l U U 42 • Regelkreis (closed loop) mit kapazitiver Längenmessung ermöglicht Linearisierung (Spannung wird so geregelt, dass Sollposition erreicht wird) • Für Laserscanning werden meist elektromagnetische Spiegel-Scanner (auch Galvo-Scanner genannt) verwendet Detektoren • Photomultiplier, Detektionseffizienz bis 40% , im Analog- oder Photonenzählmodus • grosse Aktive Fläche • Avalanche Photodioden (APDs), Detektionseffizienz bis 80%, im Photonenzählmodus • kleine aktive Fläche 43 Optik • Hochwertige Spiegel, Linsen: Wellenfront-Verzerrung < λ/10, hohe Transmission/Reflexion • Objektive mit hoher numerischer Apertur: z.B. Luft, N.A. = 0.95, Ölimmersion, N.A. = 1.2, Wasserimmersion, N.A. = 1.2 (für Abbildung in wässriger Umgebung) • Farbkorrektur – Achromat: 2 Wellenlängen mit gleicher Brennweite – Apochromat: 3 Wellenlängen mit gleicher Brennweite Filter für Fluoreszenzanwendungen • Dielektrische Schichtsysteme 44 • Holographische Filter 5.2 4-π Mikroskopie • Konfokalmikroskopie: Detektion im besten Fall in einem Halbraum (Raumwinkel 2π) • Anregung und Detektion im gesamten Raum (Raumwinkel 4π): 4π-Mikroskopie • Realisierung durch zwei Objektive, damit natürlich nicht wirklich 4π • Exakte Phasenanpassung der beiden Lichtwege notwendig • Reduktion der PSF hauptsächlich in z-Richtung 45 • Jedoch Entstehung von ausgeprägten Neben-Maxima 5.3 Zwei-Photonen-Mikroskopie • Anregung der Fluoreszenz über 2-Photonenprozess • Wahrscheinlichkeit dass ein Photon in Zeitintervall τ eintrifft sei p • Dann ist WK, dass zwei Photonen innerhalb τ eintreffen p2 : Nichtlinearer Prozess • Anregungswahrscheinlichkeit für 2-Photonenprozess also proportional zum Quadrat der Anregungs-Intensität • Anregungs-WK-PSF damit Quadrat der Anregungs-Intensitäts-PSF • Führt zu einer weiteren Verbesserung der Auflösung aufgrund eines spektroskopischen Mechanismus’ • Weitere Vorteile – Weniger Streulicht (geht ∝ 1/λ4 ) 46 – i.d.R. weniger Hintergrund-Fluoreszenz (kleine π-Elektronensysteme häufiger) • Nachteile: – – – – Andere Auswahlregeln: Einphotonendrehimpuls ist !, damit ∆l = ±1 Im Fokus des Objektivs Mischung der Polarisationszustände Zweiphotonendrehimpuls kann sehr komplex sein, damit u.U. ∆l = 0; ±2 – Dadurch sonst verbotene Übergänge möglich 5.4 STED-Mikroskopie • Ebenfalls nichtlinearer Prozess ausgenutzt • Normaler Anregungspuls wird von einem rotverschobenen Puls gefolgt, der das Fokalvolumen wie eine Hülle umschliesst 47 • Stimulierte Emission führt zu Reduktion der Fluoreszenz • Sättigung ist nicht-linearer Effekt • • Nicht-Linearität führt zu Verschmälerung des Anregungsprofils Anregungspuls STED-Puls Verbleibende Anregung 1.0 Verbleibende Anregung (bel. Einh.) Intensität (bel. Einh.) 1.2 1.0 0.8 0.6 0.4 0.2 0.0 0.8 0.6 0.4 0.2 0.0 -800 -400 0 x (nm) 400 800 0.0 • Problem: Photodestruktion des Farbstoffs • Anwendung 48 0.2 0.4 0.6 0.8 STED-Intensität (bel. Einh.) 1.0 6 Nahfeldmikroskopie 6.1 Das optische Nahfeld z !E(x, y, z) Probe !E(x, y, 0) • Darstellung des elektrischen Feldes am Ort der Probe durch seine Fourierkomponenten: % % 1 % % 0 (kx , ky )ei(kx x+ky y) dkx dky E(x, y, 0) = A 2π • Wellengleichung der in Richtung z propagiernden Welle: % % E(x, y, z) = E(x, y, 0)eikz z • Darstellung des elektrischen Feldes durch Fourierkomponenten: % % 1 % % z (kx , ky )ei(kx x+ky y) dkx dky E(x, y, z) = A 2π % • Einsetzen der Wellengleichung und von E(x, y, 0) ergibt: % % 1 % % 0 (kx , ky )eikz z ei(kx x+ky y) dkx dky E(x, y, z) = A 2π • sowie % z (kx , ky ) = A % 0 (kx , ky )eikz z A • Letzter Ausdruck wird als Propagator bezeichnet % 0 mit z • Transport der Information über E 49 • Mit k = 2 & 2πn λ '2 = kx2 + ky2 + kz2 • folgende Fälle " #2 • kx2 + ky2 > 2πn , damit kz2 negativ, kz imaginär, eikz z fällt expentiell ab λ • kx2 +ky2 < " 2πn #2 λ , damit kz2 positiv, kz reell, eikz z ist periodische Funktion • kx und ky sind Raumfrequenzen, je kleiner die Struktur, desto grösser kx,y • Raumfrequenzen grösser als reziproke Wellenlänge gehören zu Strukturen kleiner als Wellenlänge • Raumfrequenzen grösser als reziproke Wellenlänge werden exponentiell mit dem Abstand von der Probe gedämpft → Nahfeld • Raumfrequenzen kleiner als reziproke Wellenlänge werden über grosse Entfernung transportiert → Fernfeld • Strukturen kleiner als Wellenlänge abbilden: Nahfeld nutzen • Unerlässlich: Sonde nahe (% λ) an Gegenstand heranbringen 6.2 6.2.1 Realisation von Nahfeldmikroskopen Apertur-Nahfeldmikroskop • Öffnung (Apertur) kleiner als Wellenlänge wird ins Nahfeld gebracht • Umwandlung der Nahfeldkomponenten in propagierende Wellen an der Apertur • Detektion im Fernfeld • Umgekehrt: Beleuchtung durch Apertur, erzeugt Nahfeld • Detektion im Fernfeld • Vorteil: wenig Hintergrund • Nachteile: Realisierung der Apertur sehr schwierig • Licht dringt auch in gute Leiter wie Al einige nm ein: Apertur nicht beliebig klein 50
