ZIP
Werbung
Aus dem Institut für Humangenetik der Albert-Ludwigs-Universität Freiburg im Breisgau Kopplungs- und Mutationsanalysen in Familien mit primärer Mikrozephalie INAUGURAL – DISSERTATION zur Erlangung des Medizinischen Doktorgrades der Medizinischen Fakultät der Albert-Ludwigs-Universität Freiburg im Breisgau vorgelegt 2011 von Katrin Maria Margarete Müller geboren in Pegnitz Dekan: Prof. Dr. Kerstin Krieglstein 1. Gutachter: PD Dr. rer. nat. Deborah J. Morris-Rosendahl 2. Gutachter: Prof. Dr. med. Rudolf Korinthenberg Jahr der Promotion: 2014 Diese Arbeit ist Bestandteil einer Veröffentlichung: Lina Issa*, Katrin Mueller*, Katja Seufert, Nadine Kraemer, Henning Rosenkotter, Olaf Ninnemann, Michael Buob, Angela M Kaindl and Deborah J Morris-Rosendahl (2013) Clinical and cellular features in patients with primary autosomal recessive microcephaly and a novel CDK5RAP2 mutation. Orphanet Journal Of Rare Diseases, 8:59 (15. April 2013) Außerdem ist diese Arbeit als Tagungsbeitrag veröffentlicht worden: Mueller K., Liu S., Uyanik G., Morlot S., Albrecht B., Spranger S., Zeschnigk C., Hehr U., Wolff G., Morris-Rosendahl DJ. (2010) Linkage and Mutation Analysis in Families with Primary Microcephaly (MCPH) Medizinische Genetik, Band 22, März 2010: S. 176 21. Jahrestagung der Deutschen Gesellschaft für Humangenetik, gemeinsam mit der Österreichischen Gesellschaft für Humangenetik und der Schweizerischen Gesellschaft für Medizinische Genetik, Hamburg, 2. - 4. März 2010, (P-Neuro-264) Mueller K.*, Seufert K.*, C. Korenke, G. Uyanik, U. Grasshoff, B. Albrecht, A. Kuechler, S. Liu, A. Hotz, H. Rosenkötter, M. Buob, M. Nikolaidou, E. Rudd, A. Kutkowska-Kazmierczak, E. Obersztyn, D. Bartholdi, S. Azzarello-Burri, B. Hartmann, C. Zeschnigk, D. J. MorrisRosendahl (2012) Primary Microcephaly (MCPH): Expanding the Phenotype. European Human Genetics Conference 2012, Nürnberg, 23.-26. Juni, (P12.145) D.J. Morris-Rosendahl, G. Yigit, G. Carpenter, R. Colnaghi, K. Mueller, G. Borck, M. Trimborn, F. Beleggia, M. Leipoldt, G. Nuernberg, K. Seufert, B. Wollnik, M. O'Driscoll (2013) The phenotype associated with ASPM mutation expands to severe Seckel syndrome American Society of Human Genetics meeting 2013, Boston, 22.-26. Oktober, (3013F) *gleichberechtigte Erstautoren Inhaltsverzeichnis 1. Einleitung ........................................................................................................... 1 1.1. Zellzyklus und Mitose................................................................................................. 2 1.2. Zentriolen und Mikrotubuli .......................................................................................... 4 1.3. Kortikoneurogenese ................................................................................................... 5 1.3.1. 1.3.2. 1.4. Symmetrische und asymmetrische Zellteilung .................................................................. 6 Migration und Laminierung ................................................................................................ 8 Autosomal rezessive primäre Mikrozephalie .............................................................10 1.4.1. Phänotyp .......................................................................................................................... 11 1.4.2. Genotyp ........................................................................................................................... 13 1.4.2.1. MCPH1/Microcephalin ................................................................................................. 15 1.4.2.2. MCPH2/WDR62 .......................................................................................................... 18 1.4.2.3. MCPH3/CDK5RAP2 .................................................................................................... 20 1.4.2.4. MCPH4/CEP152 .......................................................................................................... 22 1.4.2.5. MCPH5/ASPM ............................................................................................................. 23 1.4.2.6. MCPH6/CENPJ ........................................................................................................... 26 1.4.2.7. MCPH7/STIL ............................................................................................................... 27 1.4.3. Evolutionäre Aspekte bei MCPH ..................................................................................... 28 1.5. 2. Fragestellung ............................................................................................................30 Material und Methoden ................................................................................... 31 2.1. Patientenkollektiv ......................................................................................................31 2.1.1. 2.1.2. 2.1.3. 2.1.4. 2.1.5. 2.1.6. 2.1.7. 2.1.8. 2.1.9. 2.2. Material .....................................................................................................................48 2.2.1. 2.2.2. 2.2.3. 2.2.4. 2.2.5. 2.2.6. 2.2.7. 2.3. Familie 5398: Patient D5398 ........................................................................................... 31 Familie 5533: Patienten D5533, D5534 ........................................................................... 33 Familie 5938: Patienten D5938, D5939 ........................................................................... 34 Familie 6116: Patienten D6116, D6118 ........................................................................... 37 Familie 5745: Patienten D5745, D5746 ........................................................................... 38 Familie 5663: Patienten D5663, D5664, D5665 .............................................................. 39 Familie 5424: Patienten D5424, D5425 ........................................................................... 40 Familie 5557: Patient D5557 ........................................................................................... 43 Familie 6137: Patienten D6137, D6138 ........................................................................... 45 Chemikalien, Lösungen, Reagenzienansätze ................................................................. 48 Lösungen, Puffer, Gele .................................................................................................... 49 Enzyme, Enzympuffer ...................................................................................................... 50 Materialien ....................................................................................................................... 50 Geräte .............................................................................................................................. 50 Software und Online-Anwendungen ................................................................................ 51 Online-Datenbanken ........................................................................................................ 53 Methoden ..................................................................................................................53 2.3.1. 2.3.2. 2.3.3. 2.3.4. 2.3.5. 2.3.6. 2.3.7. 2.3.8. 2.3.9. DNA-Extraktion ................................................................................................................ 53 Genomamplifizierung ....................................................................................................... 54 Auswahl und Etablierung der Mikrosatellitenmarker ....................................................... 54 Polymerase-Kettenreaktion ............................................................................................. 56 Agarose-Gelelektrophorese ............................................................................................. 59 Enzymatische Aufreinigung der PCR-Produkte............................................................... 59 DNA-Sequenzierung ........................................................................................................ 60 Analyse und Auswertung der Sequenzierungsreaktion ................................................... 61 Allelspezifischer Restriktionsverdau ................................................................................ 61 I 2.3.10. 3. Quantitative Polymerase-Kettenreaktion ......................................................................... 62 Ergebnisse ....................................................................................................... 65 3.1. Kopplungen zum ASPM-Gen ....................................................................................65 3.1.1. 3.1.2. 3.2. Kopplung zum CDK5RAP2-Gen ...............................................................................70 3.2.1. 3.3. 4. Familie 5424: Sequenzvariation in Exon 13 .................................................................... 74 Familie 5557: Sequenzvariationen in Exon 6, 8 und 13 .................................................. 76 Kopplungen zum STIL-Gen.......................................................................................77 3.5.1. 3.5.2. 3.6. Familie 5938: Sequenzvariationen in Exon 2 und Intron 17 ............................................ 71 Kopplungen zum Microcephalin-Gen ........................................................................74 3.4.1. 3.4.2. 3.5. Familie 6137: Mutation in Exon 30 .................................................................................. 70 Kopplung zum CENPJ-Gen ......................................................................................71 3.3.1. 3.4. Familie 6116: Mutation in Exon 18 .................................................................................. 65 Familie 5663: Sequenzvariation in Exon 16 und Intron 8 ................................................ 68 Familie 5745 .................................................................................................................... 77 Familie 5557 .................................................................................................................... 78 Sequenzvariationen unbekannter Signifikanz ...........................................................78 Diskussion ....................................................................................................... 80 4.1. Molekulargenetische Methoden ................................................................................80 4.2. Mutationen im ASPM-Gen ........................................................................................82 4.3. Mutation im CDK5RAP2-Gen....................................................................................84 4.4. Sequenzvariation im MCPH1-Gen ............................................................................85 4.5. Genotyp-Phänotyp-Korrelation ..................................................................................86 4.6. Mutationshäufigkeit und Konsequenzen für die Diagnostik .........................................88 4.7. Bedeutung negativer Kopplungsanalysen .................................................................89 4.8. Ausblick ....................................................................................................................91 5. Zusammenfassung .......................................................................................... 92 6. Literaturverzeichnis ........................................................................................ 93 7. Danksagung ................................................................................................... 102 8. Lebenslauf ..................................................................................................... 103 9. Appendix A – Primersequenzen für PCR und Sequenzierung .................. 104 10. Appendix B – Primersequenzen für qPCR .................................................. 118 II Abkürzungsverzeichnis 5’UTR englisch: 5‘ untranslated region, 5‘ untranslatierter Bereich 6-FAM 6-Carboxyfluorescein A Adenin (Base der DNA) Abb. Abbildung AGAT L-Arginin:Glycin-Amidinotransferase Ala Alanin (Aminosäure) ALL akute lymphatische Leukämie AP antero-posterior/apikale Progenitorzelle Arg Arginin (Aminosäure) ASD englisch: autism spectrum disorders Asp Aspartat (Aminosäure) ASPM englisch: abnormal spindle-like protein ATM englisch: ataxia telangiectasia mutated ATR englisch: ATM-Rad3 related A>G Nukleotidaustausch von Adenin zu Guanin bp Basenpaar(e) BP basale Progenitorzelle BRCA1 englisch: breast cancer 1 BRCA2 englisch: breast cancer 2 BRCT C-terminale Domäne des breast cancer genes 1 (BRCA1) BRIT1 englisch: BRCT-repeat inhibitor of hTERT expression 1 BUBR1 englisch: budding uninhibited by benzamidoles 1 bzw. beziehungsweise C Cytosin (Base der DNA) c. cDNA-Nummerierung CDG englisch: Congenital Disorders of Glycosylation, angeborene Störungen der Glykoproteinbiosynthese CDK/Cdk englisch: cyclin-dependent kinase CDK5RAP2 englisch: cyclin-dependent kinase 5 regulatory associated protein 2 cDNA englisch: complementary DNA, zur mRNA komplementäre DNA CENPJ englisch: centromeric protein J CEP152 englisch: centrosomal protein 152 kDa CGE englisch: caudal ganglionic eminence CGH englisch: Comparative Genomic Hybridization Chk1 englisch: cell cycle checkpoint kinase 1 III CINP englisch: CDK2-interacting protein CK englisch: creatin kinase, Kreatinkinase cM Centimorgan cm Zentimeter CMCB englisch: Craniosynostosis-Microcephaly with Chromosomal Breakage CNV englisch: copy number variant CP englisch: cortical plate CPAP englisch: centrosomal P4.1 associated protein CR Cajal-Retzius Zelle CrT englisch: Creatine transporter Ct englisch: Cycle Threshold, Schwellenwert-Zyklus C>A Nukleotidaustausch von Cytosin zu Adenin C>G Nukleotidaustausch von Cytosin zu Guanin C>T Nukleotidaustausch von Cytosin zu Thymin D. Drosophila ddNTP Disdeoxyribonukleinsäure del Deletion DHPLC englisch: denaturing high-performance liquid chromatography, denaturierende Hochdruckflüssigkeitschromatographie DMSO Dimethylsulfoxid DNA englisch: Deoxyribonucleic acid, Desoxyribonukleinsäure dNTP Desoxyribonukleosidtriphosphat ds englisch : double-strand DSBs englisch : double-strand DNA breaks, DNA-Doppelstrangbrüche EDTA Ethylendiamintetraacetat EEG Elektroenzephalogramm, Elektroenzephalografie engl. Englisch EQ englisch : encephalization quotient et al. lateinisch: et altera etc. lateinisch: et cetera Ex Exon F englisch: forward (DNA-Strang in Leserichtung) ff. folgende FISH Fluoreszenz-in-situ-Hybridisierung Fs englisch: frameshift, Verschiebung im Leseraster des Aminosäurecodes fT3 freies Triiodthyronin fT4 freies Tetraiodthyronin IV G Guanin (Base der DNA)/englisch: gap g Gramm GABA Gammaaminobuttersäure GAMT Guanidinoacetatmethyltransferase GDNF englisch: glial-derived neurotrophic factor Gln Glutamin (Aminosäure) Glu Glutaminsäure (Aminosäure) Gly Glycin (Aminosäure) GTP Guanosin-5´-Triphosphat G>T Nukleotidaustausch von Guanin zu Thymin h englisch: hour, Stunde H2AX englisch: H2A Histone Family, Member X HeLa Henrietta Lacks HI-DI englisch: highly deionized His Histidin (Aminosäure) hTERT englisch: Human Telomerase Reverse Transcriptase I Isoleucin (Aminosäure), Einbuchstabencode IMPDH englisch: inosine monophosphate dehydrogenase IPC englisch: intermediate progenitor cell IQ Intelligenzquotient/Isoleucin-Glutamin-Motiv ISVZ englisch: inner subventricular zone IZ Intermediärzone kb Kilobasenpaar(e) kDa Kilo-Dalton (Einheit des Molekulargewichts) kg Kilogramm KU Kopfumfang l Liter LIN-5 englisch: abnormal cell lineage 5 LIS1 Lissenzephalie 1-Gen/Protein Lys Lysin (Aminosäure) M Molarität m milli (x 10-3)/Meter MAD2 englisch: mitotic arrest-deficient 2 MCPH autosomal rezessive primäre Mikrozephalie MCSZ englisch: microcephaly, seizures, developmental delay Met Methionin (Aminosäure) 2 MgCl Magnesiumchlorid V MGE englisch: medial ganglionic eminence min. Minute mol molar MOPD II englisch: Majewski osteodysplastic primordial dwarfism type II mRNA englisch: messenger RNA MRT Magnetresonanztomographie, Magnetresonanztomogramm MZ Marginalzone n nano (x 10-9) NBS englisch: Nijmegen breakage syndrome NCBI englisch: National Center for Biotechnological Information OMIM englisch: Online Mendelian Inheritance in Man OSVZ englisch: outer subventricular zone P Perzentile p kurzer Arm eines Chromosoms/Piko (x 10-12) p. Nummerierung der Aminosäurenabfolge PCM englisch: pericentriolar matrix PCNT englisch: Pericentrin PCR englisch: Polymerase Chain Reaction, Polymerasekettenreaktion PEG perkutane endoskopische Gastrostomie PIN1 englisch: peptidyl prolyl isomerase 1 Plk4 englisch: polo-like kinase 4 PMM2 Phosphomannomatase 2 PNKP englisch: polynucleotide kinase 3-prime phosphatase PP englisch: preplate, Vorplatte Pro Prolin (Aminosäure) Q Glutamin (Aminosäure), Einbuchstabencode q langer Arm eines Chromosoms qPCR englisch: quantitative Polymerase Chain Reaction, quantitative Polymerase-Kettenreaktion R englisch: reverse (DNA-Strang entgegen der Leserichtung) RELN Reelin RGC englisch: radial glia cell RNA englisch: Ribonucleic acid, Ribonukleinsäure rpm englisch: rounds per minute, Umdrehungen pro Minute s. siehe SD englisch: standard deviation, Standardabweichung sec englisch: second, Sekunde VI Ser Serin (Aminosäure) Shh englisch: sonic hedgehog SNP englisch: single nucleotide polymorphism sog. sogenannte/-r/-s SON 2 1/2 – 7 Snijders-Oomen Non-verbaler Intelligenztest für das Alter 2 ½ - 7 Jahre SP Subplatte SPARC englisch: secreted protein acidic and rich in cysteine SSM Schwangerschaftsmonat SSW Schwangerschaftswoche STIL englisch: SCL/TAL1-interrupting locus SVZ Subventrikulärzone T Thymin (Base der DNA) Tab. Tabelle Taq Thermus aquaticus TBE Tris-Borat-EDTA-Puffer TE Tris-EDTA-Puffer TGF-beta englisch: Transforming Growth Factor beta Thr Threonin (Aminosäure) TORCH Toxoplasmosa gondii, andere (englisch: other) (Parvovirus B19, Hepatitis C, Varizella-Zoster-Virus, Coxsackie-Virus, Listeriose), Rubella, Cytomegalie-Virus, Chlamydia trachomatis, Herpes-simplex-Virus TSH Thyreoidea stimulierendes Hormon TUBA1A Tubulin alpha 1A Tyr Tyrosin (Aminosäure) T>A Nukleotidaustausch von Thymin zu Adenin U englisch: unit, Einheit der Enzymaktivität US englisch: United States USA englisch: United States of America UV Ultraviolett V Volt Val Valin (Aminosäure) vgl. vergleiche VZ Ventrikulärzone WDR62 englisch: WD repeat containing protein 62 X Stoppcodon/X-Chromosom ZNS zentrales Nervensystem °C GradCelsius VII 1. Einleitung Die Entwicklung des Gehirns, speziell der Großhirnrinde (Neokortex1), stellt eines der spannendsten Forschungsgebiete der aktuellen Wissenschaft dar, da diese den Sitz der außergewöhnlichen kognitiven Fähigkeiten des Menschen, des Fühlens, abstrakten Denkens und der Sprache darstellt. Mit 40 % der Gesamtmasse (Dani, Hori, Walter 1997, S. 219) und 20 Milliarden Neuronen (Parnavelas 2007, S. 59) nimmt der Kortex einen gewichtigen Teil des menschlichen Gehirns ein. Insbesondere die Größenzunahme des Neokortex während der Evolution ist ein Schritt von außerordentlicher entwicklungsgeschichtlicher Bedeutung und die genetischen Ursachen, die zu diesem Wachstum geführt haben, sind bisher noch nicht eindeutig geklärt. Die Erforschung von genetischen und spontanen Krankheiten, die zu einer Gehirnmalformation oder -fehlfunktion führen, fördert das Verständnis um die Entwicklung des menschlichen Gehirns sowie die Diagnostik und mögliche Behandlung dieser Erkrankungen. Der autosomal rezessiven primären Mikrozephalie (MCPH) liegt eine Entwicklungsstörung vor allem des Neokortex zugrunde. Die vorliegende Arbeit soll zur weiteren Klärung der molekulargenetischen Ursachen, der Definition des Phänotyps und der Verbesserung der pränatalen Diagnostik der MCPH beitragen. Hauptsymptom dieser hereditären Erkrankung ist eine verminderte Gehirngröße, so dass die MCPH sowohl aus embryologischer, neurologischer und evolutionärer Sicht als Modellerkrankung für die Größenzunahme des menschlichen Gehirns gesehen werden kann. Ursächlich stehen Störungen im Zellzyklus und in der Zellteilung im Mittelpunkt. Eine korrekt ablaufende Zellteilung ist von immenser Wichtigkeit für die regelrechte Funktion eines vielzelligen Organismus. Während der Entwicklung entstehen aus pluripotenten Stammzellen die Anlagen für alle Gewebe und Organe, im adulten Organismus kann ein fehlerhafter Zellzyklus in unkontrolliertem Zellwachstum (Tumor) resultieren. Störungen dieser komplexen Vorgänge können zu verschiedenen Malformationen oder gar zum Absterben des sich entwickelnden Lebewesens führen. Um das Verständnis der Pathomechanismen, die bei der Entstehung der MCPH eine Rolle spielen, zu ermöglichen, sollen zunächst die normale Zellteilung und die Zentriolen, Zellorganellen, die eine essentielle Funktion in der Teilung der Zelle einnehmen, beschrieben werden. Anschließend folgt ein Überblick über die Entwicklung des Neokortex, der bei MCPH besonders betroffen ist. 1 Der Neokortex stellt den entwicklungsgeschichtlich jüngsten Bereich der Großhirnrinde dar und macht etwa 90 % des gesamten Kortex aus. Zur Vereinfachung wird er nachfolgend auch als „Kortex“ bezeichnet. 1 1.1. Zellzyklus und Mitose Fast alle Zellen des menschlichen Körpers sind in der Lage, einen Teilungszyklus, auch Zellzyklus genannt, zu durchlaufen. Dieser besteht aus vier verschiedenen Phasen: G1-, S-, G2- und M-Phase (siehe Abb. 1). G1-, S- und G2-Phase bilden zusammen die Interphase, die dem Zellwachstum und der Vermehrung der Chromosomen dient. Dabei findet die Replikation der DNA in der S-Phase (Synthese-Phase) statt. Während der G1-Phase (G für englisch: gap, Lücke) ist die Zelle in der Lage, ihren spezifischen Funktionen im Organismus nachzugehen. Die G2-Phase dient der Kontrolle der DNA-Synthese. Dabei können auch Korrekturen an der DNA durchgeführt werden. Die M-Phase (Mitose-Phase) beinhaltet die Kernteilung (Mitose) und die Teilung in zwei Tochterzellen (Zytokinese). Abb. 1 Schema des Zellzyklus. Nach der G1-Phase befindet sich der Restriktionspunkt, an dem die Zelle sich ausdifferenzieren kann (G0-Phase). Ein Wiedereintritt in den Zellzyklus ist dabei meistens möglich. Am Ende der G2-Phase kann die Apoptose eingeleitet werden. Während des Zellzyklus werden Kontrollpunkte (englisch: checkpoints) durchlaufen, die gewährleisten, dass die nächste Phase erst nach Abschluss der vorangehenden eintreten kann. Dies geschieht durch phasenspezifische Cyclin-abhängige Kinasen (englisch: cyclindependent kinases, CDK), die durch die Bindung an Cyclin aktiviert werden und eine Kaskade auslösen, die einen Übertritt in die nächste Phase ermöglicht. Der G1/S-Kontrollpunkt (auch Restriktionspunkt) liegt am Ende der G1-Phase. Extrazelluläre Signale (z. B. Wachstumsfaktoren) bestimmen hier, ob die Zelle in die S-Phase eingeht oder sich ausdifferenziert und zunächst keine weiteren Teilungen durchführt (G0-Phase). Nachdem neuronale Zellen in die G0-Phase eingetreten sind, verlieren sie vermutlich die Fähigkeit, sich weiter zu teilen (Janigro 2006). 2 Ein zweiter Kontrollpunkt wird gegen Ende der G2-Phase durchlaufen (G2/M-Kontrollpunkt). Waren zu viele DNA-Korrekturen nötig, wird der programmierte Zelltod (Apoptose) induziert. Bei fehlerfreier DNA-Synthese hingegen werden Gene für die nachfolgende Mitose aktiviert. Die Mitose wird in fünf Phasen eingeteilt: Pro-, Prometa-, Meta-, Ana- und Telophase (siehe Abb. 2). Während der Mitose wird das Erbgut auf zwei Tochterzellen verteilt. Dies geschieht durch den sogenannten Spindelapparat, der die identischen Schwesterchromatiden der Chromosomen durch Spindelfasern (bestehend aus winzigen Röhren, den Mikrotubuli) am Verbindungspunkt (Zentromer/Kinetochor) auseinanderzieht. Die Spindelfasern entspringen dabei aus zwei Zentriolen, die durch Teilung des Zentrosoms, auch Mikrotubuliorganisierende Zentren genannt, entstehen. Abb. 2 Schema der Mitose. (Grafik nach Wehner et al. 2007, S. 47) Während der Prophase kommt es zu einer Verdichtung (Kondensation) der DNA. Das Zentrosom teilt sich in zwei Zentriolen, die zu den Zellpolen wandern. Dadurch wird die Teilungsebene der Zelle festgelegt. Außerdem stellt die Prophase den Beginn der Bildung der Mikrotubuli durch Polymerisation der Tubulin-Untereinheiten dar. Es bilden sich Polfasern aus, die die Zelle von einem Pol zum anderen durchspannen. Während der folgenden Prometaphase zerfällt die Kernhülle und die Spindelfasern, die parallel zu den Polfasern angeordnet sind, setzen durch spezielle Kinetochor- oder Chromosomenmikrotubuli von beiden Seiten an den Zentromeren der Chromosomen an. In der Metaphase werden die Chromosomen durch die Spindelmikrotubuli in der Äquatorialebene ausgerichtet und an ihren Zentromeren geteilt - zwei Schwesterchromatiden entstehen. Anschließend verkürzen sich die Spindelfasern und ziehen so die Schwes- 3 terchromatiden zu den gegenüberliegenden Zellpolen (Anaphase). Zuletzt folgt die Telophase, in der die Chromosomen wieder dekondensieren, die Spindelfasern depolymerisieren und die Kernhülle wieder gebildet wird. Außerdem entsteht ein kontraktiler Ring aus Aktinfasern, der die Zelle in der Mitte zusammenschnürt und dadurch zur Teilung in zwei Tochterzellen (Zytokinese) führt. Auch während der Mitose existiert ein Kontrollpunkt: der Spindel-Checkpoint am Ende der Metaphase verhindert ein Übertreten in die Anaphase, so lange noch nicht alle Chromosomen von beiden Polrichtungen aus an Kinetochormikrotubuli angeheftet sind. Dadurch wird eine gleichmäßige Aufteilung des Chromosomensatzes auf die Tochterzellen gewährleistet. 1.2. Zentriolen und Mikrotubuli Wie bereits erwähnt, spielen die Zentriolen, die durch Teilung aus einem Zentrosom entstehen und aus denen die Spindelfasern erwachsen eine entscheidende Rolle während der Mitose. Auch sie durchlaufen einen Zyklus, der in Abbildung 3 dargestellt ist. Die Zentrosomen stellen eine Hauptquelle des Spindelapparats während der Mitose dar und sind von essentieller Bedeutung für die Trennung der Chromosomen und die Ausrichtung der Teilungsrichtung (Nigg and Raff 2009). Abb. 3 Schematische Darstellung des Zyklus der Zentriolen bzw. des Zentrosoms abhängig von der Zellzyklusphase. Dunkelgrün sind die älteren Mutterzentriolen dargestellt. An ihnen befindet sich eine Tochterzentriole (hellgrün), die entweder eng an der Mutterzentriole liegt (orange) oder nur lose durch ein faseriges Netzwerk verbunden ist. Nach der Mitose hat jede Tochterzelle ein lose verbundenes Paar Zentriolen geerbt. Differenziert sich die Zelle in der G0-Phase weiter aus, können daraus Zilien (wie z. B. im Respirationstrakt) entstehen. Während der S-Phase findet eine Duplikation des Zentriolenpaars statt: an jeder Mutterzentriole bilden sich Prozentriolen (hellgrün), die sich während der G2-Phase weiter verlängern. Schließlich trennen sich die beiden Zentriolen und akkumulieren perizentrioläre Matrix (englisch: pericentriolar matrix, PCM) (gelb). Durch eine Wanderung zu den entgegengesetzten Zellpolen bilden sie die Spindelpole. (Grafik und Text nach Nigg and Raff 2009) Die Mikrotubuli des Spindelapparats bestehen aus α- und β-Tubulin-Einheiten, die sich zu Polymeren zusammenlagern und dadurch lange, röhrenförmige Strukturen bilden können. 4 Dabei werden sowohl am Plus- als auch am Minusende ständig neue Tubulindimere angelagert, wobei dieser Prozess am Pluspol schneller abläuft. Dadurch kommt es zu einem präferentiellen Wachstum in Richtung Pluspol. Sowohl Polymerisation als auch Depolymerisation der Mikrotubuli finden in der Zelle gleichzeitig statt, weshalb man auch von einer dynamischen Instabilität spricht. Als initiierendes Nukleationszentrum dient der sogenannte γ-Tubulin-Ring-Komplex (englisch: gamma-tubulin ring complex, γTuRC) (Schiebel 2000), den Abbildung 4 schematisch dargestellt. Die Mikrotubuli sind dabei mit ihrem Minusende im Zentrosom verankert. An der Formation der Prozentriolen sind unter anderem die Proteine γ-Tubulin und CENPJ (ausführlich in Kapitel 1.4.2.6.) beteiligt (Kleylein-Sohn, Westendorf et al. 2007). Diese Proteine stellen Substrate für eine spezielle Kinase, Plk4, dar (vgl. Kapitel 1.4.2.4.), die die Duplikation der Zentriolen katalysiert. Anschließend erfolgt die Verlängerung durch Anlagerung der α- und β-Tubulindimere. Abb. 4 Schematische Darstellung des γ-Tubulin-Ring-Komplexes (γTuRC) mit daraus erwachsendem Mikrotubuli. Die grauen Strukturen stellen γ-Tubulin dar, mit dem die übrigen γTuRC-Proteine (bunt) assoziiert sind. (Choi, Liu et al. 2010) Doch auch außerhalb der Mitose sind Mikrotubuli an wichtigen Zellfunktionen wie der Ausbildung der Zellform, der Zellpolarität - z. B. von neuronalen Zellen (Higginbotham and Gleeson 2007) - dem intrazellulären Transport von Vesikeln und Zellorganellen und der Motilität der Zelle beteiligt (Nigg and Raff 2009). 1.3. Kortikoneurogenese Der Begriff Kortikoneurogenese beschreibt sowohl den Aufbau und die Strukturierung des Kortex (Kortikogenese) als auch die Bildung und Vermehrung von Neuronen (Neurogenese). Ein wichtiger Pathomechanismus bei der Entstehung der Mikrozephalie ist eine Verminderung der Anzahl der Neuronen im Neokortex. Neurone, die den Kortex bilden, entstammen hauptsächlich Keimzentren, die die zukünftigen lateralen Ventrikel säumen: die Ventrikulärzone (VZ) und die Subventrikulärzone (SVZ) (Noctor, Flint et al. 2001). Dort befinden sich die neuronalen Stammzellen, die auch als Progenitorzellen, neuroepitheliale Zellen oder neuroektodermale Stammzellen bezeichnet werden. Aus diesen Keimzentren wandern neugebildete Neurone aus, um die sechs 5 Schichten des Kortex zu bilden (Laminierung). Dabei befinden sich die früher gebildeten Neurone in den basalen Schichten und die später migrierten Nervenzellen in den superfiziellen Schichten. 1.3.1. Symmetrische und asymmetrische Zellteilung In der VZ befinden sich die apikalen Progenitorzellen (APs), die mit ihrem apikalen Pol Kontakt zum Ventrikellumen haben und untereinander durch Zonulae adhaerentes2 verbunden sind. Um möglichst viele APs auf der laminären Oberfläche der VZ anzusiedeln, sind die Zellen länglich, weisen einen bipolaren Charakter auf und besitzen eine sehr schmale apikale und basale Oberfläche. Während des Zellzyklus wandert der Zellkern von apikal nach basal und wieder zurück (interkinetische Nukleusbewegung). Dadurch wird eine weitere Erhöhung der Zellzahl auf einer Basallamina möglich. Die Nukleusbewegung erweckt den Anschein einer Schichtenbildung in der Ventrikulärzone, auch Pseudostratifizierung genannt. Radiale Gliazellen (englisch: radial glia cells, RGC) stellen eine Hauptgruppe der APs innerhalb der VZ dar (Zhong and Chia 2008). Die Vermehrung der APs kann entweder symmetrisch (Entstehung von zwei APs) oder asymmetrisch verlaufen (Entstehung von einer AP und einer weiter differenzierten Zelle) (siehe Abb. 5 A-C). Eine Verlagerung des Gewichts von symmetrischer zu asymmetrischer Teilung markiert den Wechsel von reiner Proliferation zu Neuronenproduktion (Zhong and Chia 2008). Abb. 5 A) Die symmetrische Teilung dient der Proliferation der APs (blau) (laterale Expansion). Das radiale Wachstum entsteht durch entweder B) Teilung in eine AP und ein Neuron (rot) oder C) Teilung in eine AP und eine BP (orange), die daraufhin zwei Neurone generiert. Die blaue Linie stellt die apikale Membran dar. Grafik aus Fish, Dehay et al. 2008. Die Differenzierung zwischen symmetrischer und asymmetrischer Zellteilung ist für die Anzahl an Nervenzellen von elementarer Bedeutung, da ein ausreichend großer Pool an Pro- 2 Zonulae adherentes sind Strukturen, die dem mechanischen Zusammenhalt von Zellen dienen. Sie laufen gürtelförmig um Eptithelzellen herum. 6 genitorzellen für die Bildung einer suffizienten Anzahl Neurone benötigt wird. Die laterale Expansion (symmetrische Zellteilung) dient der proliferativen Vermehrung der APs und findet vor allem zwischen Embryonaltag 25 und 42 statt (Stiles and Jernigan 2010). Dabei ist entscheidend, ob Determinanten, die die weitere Differenzierung bestimmen (wie z. B. die apikale Membran), gleichmäßig oder ungleichmäßig auf die Tochterzellen verteilt werden (siehe Abb. 6 a - c) (Zhong and Chia 2008; Wang, Tsai et al. 2009). Abb. 6 a) Determinanten, die die weitere Differenzierung der Zelle bestimmen (grün), werden gleichmäßig auf die Zelle verteilt und es resultieren zwei Progenitorzellen (P). b) Eine der Tochterzellen erhält keinerlei Determinanten, sie differenziert sich zu einem Neuron (N) aus. c) Eine ungleiche Verteilung von Determinanten führt zu einer ungleichen Entwicklung der Tochterzellen; blaue Linien stellen die Teilungsebenen der Zellen dar, die pinken Punkte repräsentieren die apikale Membran. (Zhong and Chia 2008) Aufgrund der Morphologie der Progenitorzelle mit einer sehr schmalen apikalen Membran ist eine vertikal verlaufende Teilungsebene durch einen exakt horizontal ausgerichteten Spindelapparat von essentieller Bedeutung für die weitere Entwicklung der Zelle (Chenn and McConnell 1995; Zhang 2003; Kouprina, Pavlicek et al. 2004; Fish, Dehay et al. 2008). Ein Defekt in der Orientierung des Spindelapparats kann außerdem zu einer erhöhten Apoptoserate der neuroepithelialen Stammzellen führen (Yingling, Youn et al. 2008). Etwa ab der vierten Embryonalwoche kommt es zu einem graduellen Wechsel von symmetrischer zu asymmetrischer Zellteilung, kontrolliert durch die Orientierung der Spindelpole während der Mitose (Chenn and McConnell 1995; Gotz and Huttner 2005; Montgomery, Capellini et al. 2011). Dadurch werden Neuroblasten gebildet, die migrieren, um den Kortex zu bilden (radiales Wachstum). Dabei unterscheidet man die neurogene von der differenzierenden asymmetrischen Teilung (siehe Abb. 5 B, C). Durch neurogene Teilung entstehen ein Neuroblast und eine radiale Gliazelle. Eine Sonderform stellt die differenzierende asymmetrische Teilung in eine RGC und eine basale Progenitorzelle, auch intermediäre Vorläuferzellen (englisch: intermediate progenitor cell, IPC) genannt, dar. Die IPCs besitzen eine runde Morphologie und sind in der Lage, in einem weiteren symmetrischen Teilungsschritt zu 90 % zwei Neurone oder zwei neue basale Progenitorzellen (10 %) zu generieren (Wu, Goebbels et al. 2005). IPCs bilden die subventrikuläre Zone, die basal der VZ liegt, und die Intermediärzone. Sie kommen fast ausschließlich im Telenzephalon 3 vor (Haubensak, Attardo et al. 2004). Durch das Wachstum der SVZ kommt es um die 20. Schwangerschaftswoche (SSW) zur Ausbildung zweier Schichten: der inneren und der äußeren SVZ (englisch: inner and outer 3 Das Telenzephalon wird in Paläokortex, Archikortex und Neokortex eingeteilt. Es handelt sich um das Großhirn oder Endhirn. 7 SVZ, ISVZ, OSVZ). Die OSVZ stellt vermutlich den Hauptbildungsort der in der Neurogenese später gebildeten Neurone dar. Zu diesem Zeitpunkt ist die proliferative Aktivität der VZ bereits stark reduziert, was sich in einer verminderten Dicke dieser Schicht zeigt. Im adulten menschlichen Gehirn scheint keine weitere Neurogenese mehr stattzufinden (Bhardwaj, Curtis et al. 2006; Rakic 2006). 1.3.2. Migration und Laminierung Die meisten Neurone wandern, wie bereits erwähnt, radiär in den sich entwickelnden Kortex (radiale Tangention). Dabei bilden die zu Beginn gebildeten Zellen – mit einer Ausnahme – die inneren Schichten und die später gebildeten Neurone die äußeren Schichten (insideout-Prinzip): in der fünften Schwangerschaftswoche bilden die ersten Neurone einen langen basalen Fortsatz aus, mit dem sie sich an der pialen Oberfläche, die die äußerste Schicht des sich entwickelnden Gehirns darstellt, anheften (Stiles and Jernigan 2010). Anschließend erfolgt die Translokation des Kerns (Nukleokinese) und des Zellkörpers mittels zentrosomalen Mikrotubuli in den apikalen Teil der Zelle, der sich bereits am Bestimmungsort befindet. Diese Art der radialen Migration wird auch als somale Translokation bezeichnet. (Nadarajah, Brunstrom et al. 2001; Borrell, Kaspar et al. 2006). Die Dynamik des neuronalen Zytoskeletts wird dabei durch die Modulation der Mikrotubuli und der Aktinfilamente durch das Enzym Cdk5 reguliert (Huang 2009). Diese früh migrierenden Neurone behalten nun ihre Position bei, während der Kortex basal dieser Zellen wächst. Damit stellen sie die Ausnahme des inside-out-Prinzips dar, da sie als erste Neurone migrieren und trotzdem die äußerste Schicht des Kortex darstellen. Sie bilden eine Struktur, die als Vorplatte (englisch: preplate, PP) bezeichnet wird (siehe Abb. 7b). Durch ab der siebten Woche nachfolgend einwandernde Neuroblasten wird die Vorplatte in die Marginalzone (MZ) und die Subplatte (SP) geteilt und dazwischen während der 8.-18. SSW eine weitere Schicht, die kortikale Platte (englisch: cortical plate, CP), gebildet. In der MZ befinden sich unter anderem Cajal-Retzius Zellen (CR), die durch das Glykoprotein Reelin (kodiert durch das Gen RELN) eine korrekte Positionierung der Neurone in der richtigen Schicht des Kortex gewährleisten; Mutationen in RELN führen zu einer fehlerhaften Schichtenbildung des Kortex (Caviness and Rakic 1978; D'Arcangelo, Miao et al. 1995; Ogawa, Miyata et al. 1995). Die Neurone müssen durch den immer weiter wachsenden Kortex größere Distanzen zurücklegen und die bereits migrierten Neurone passieren. Dabei werden sie von radialen Gliazellen geleitet. Reelin initiiert dabei die Ausbildung langer Fortsätze (Radiärfasern) (siehe Abb. 7a) die von der VZ bis in die piale Oberfläche reichen. An diesen Fasern können die migrierenden Neurone wie auf einer Leitschiene entlang wandern, was auch als Lokomotion bezeichnet wird (Nadarajah, Brunstrom et al. 2001). Bei Erreichen der MZ durch den 8 Führungsfortsatz führt eine über Reelin und SPARC-like1 (Gongidi, Ring et al. 2004) vermittelte Signalkaskade zum Ablösen der Neurone von den Radiärfasern, wodurch die Lokomotion gestoppt wird und die Neurone ihre endgültige Position erreicht haben. Ein Wechsel zur somalen Translokation ermöglicht das Nachfolgen des restlichen Zellkörpers und die Nukleokinese (Nadarajah, Brunstrom et al. 2001), wobei auch hier Reelin eine Rolle zu spielen scheint (Tagami, Okochi et al. 2008). Dabei scheinen die früher gebildeten Neurone die neurogene Zellteilung in der VZ/SVZ zu beeinflussen. Abb. 7 Laminierung des Kortex: a) radiäre Migration eines Neuroblasten entlang der Radiärfaserglia und anschließende Ablösung (Grafik und Text nach Joachim Herz Lab, The University of Texas Southwestern Medical Center 2004) b) Die ersten Neurone migrieren aus der Ventrikulärzone (VZ) um die Vorplatte (PP) zu bilden. Dazwischen befindet sich die Intermediärzone (IZ). Später einwandernde Zellen teilen die PP in die Marginalzone (MZ) und die Subplatte (SP) und bilden dadurch die kortikale Platte (CP). Außerdem entwickelt sich durch vermehrt gebildete basale Progenitorzellen die Subventrikulärzone (SZ). Im reifen Kortex sind schließlich sechs Schichten zu unterscheiden. Am Ende der Fetalperiode lösen sich MZ und SP fast vollständig auf, wobei Reste der MZ als Schicht I des Kortex erhalten bleiben. Aus der IZ bildet sich die weiße Substanz (englisch: white matter, WM), bestehend aus efferenten Axonen der kortikalen Neurone. (Grafik und Text nach Stiles and Jernigan 2010) Neben den Hauptbildungsstätten der Neurone, der Ventrikulär- und Subventrikulärzone, stellen unter anderem auch der mediale und kaudale Ganglienhügel (englisch: medial/caudal ganglionic eminence, MGE/CGE) Bildungsorte vor allem von GABAergen Interneuronen4 dar (Nadarajah, Alifragis et al. 2002) (siehe Abb. 8). Um ihre entfernten kortikalen Bestimmungsorte zu erreichen, müssen die Neurone zunächst parallel zur Hirnoberfläche wandern (tangentiale Migration). Dabei bewegen sich die Neurone vor allem in der MZ und der Grenzzone zwischen SVZ und Intermediärzone (IZ). Sie scheinen dabei verzweigte, Mikrotubuli abhängige Führungsfortsätze auszubilden und sich dadurch fortzubewegen 4 Interneurone sind zwischen zwei oder mehr Projektionsneurone (z. B. im Kortex) geschaltet und wirken mittels des Neurotransmitters GABA inhibitorisch auf diese ein. Ihre kurzen Axone projizieren nur auf direkt benachbarte Zellen. 9 (Nadarajah and Parnavelas 2002). Während ihrer Migration passieren sie verschiedene sich entwickelnde Strukturen. Um das vorzeitige Eintreten der Interneurone zum Beispiel ins Corpus striatum5 zu verhindern, wird von den Striatumzellen Sema3A und 3F ausgeschüttet (Barrot, Abrous et al. 2001; Marin, Yaron et al. 2001; Huang 2009). Weiterhin konnten Neuregulin-1 und GDNF als Schlüsselproteine in der Führung der tangential migrierenden Interneurone beschrieben werden (Flames, Long et al. 2004; Pozas and Ibanez 2005). Nach Erreichen des sich entwickelnden Kortex migrieren sie ebenfalls radiär. Abb. 8 Tangentiale Wanderung von Interneuronen aus dem medialen Ganglionhügel (MGE), vorbei am lateralen Ganglionhügel (LGE) und Striatum, in Richtung Neokortex. Ein Teil der Interneurone wandert auch in das Striatum ein. Ab der 25. SSW differenzieren sich die Neurone weiter aus, bilden Zellfortsätze (Dendriten) und kommunikative Verbindungen (Synapsen) untereinander aus. Im siebten Schwangerschaftsmonat (SSM) ist die Laminierung des Kortex größtenteils beendet. Während der gesamten Kortikoneurogenese findet jedoch auch im nicht pathologisch veränderten Gehirn ein kontinuierlicher Untergang von bis zu 50 % der neuronalen Zellen und gebildeten Synapsen statt (Buss and Oppenheim 2004; Buss, Sun et al. 2006). Es wird vermutet, dass dieser Vorgang einen Mechanismus zur Korrektur von Fehlern in der Produktion und der Migration der Neurone darstellt (Buss and Oppenheim 2004; Stiles and Jernigan 2010). 1.4. Autosomal rezessive primäre Mikrozephalie Der Begriff Mikrozephalie (griechisch mikrosklein, kephaleKopf) bezeichnet das klinische Symptom der verminderten Größe des Neurokraniums. Da sich das Wachstum des Schädels dem Hirnwachstum anpasst (Zilles 2010, S.107), können durch Messung eines verringerten okzipito-frontalen Kopfumfangs (KU) Rückschlüsse auf eine Wachstumsretardierung und damit ein reduziertes Gehirnvolumen, gezogen werden. Eine Mikrozephalie kann erworben oder angeboren auftreten. Äußere Faktoren, welche einen Mikrozephalus verursachen können, sind eine kongenitale Infektion mit Toxoplasma gondii, 5 Das Corpus striatum (kurz: Striatum) gehört zu den Basalganglien, die einen Teil des Telenzephalons darstellen. Die Basalganglien nehmen wichtige Filterfunktionen von Impulsen zwischen Kortex und Thalamus wahr. 10 Zytomegalie- oder Rötelnviren, maternaler Alkoholabusus oder Drogeneinnahme6 während der Schwangerschaft, maternale oder kindliche Phenylketonurie, eine Kraniosynostose oder Strahlenexposition während der Schwangerschaft (Wood, Johnson et al. 1967; Jackson, McHale et al. 1998; Woods, Bond et al. 2005) (Michaelis 2004 S. 153; Kunze 2009, S. 470; Korinthenberg 2009, S. 21). Ein vorzeitiger Verschluss der Schädelnähte kann aber auch erst sekundär im Rahmen einer Mikrozephalie als Folge einer Hirnerkrankung entstehen (Korinthenberg 2009, S. 22). Endokrine, umweltbedingte, syndromale und infektiologische Ursachen der Mikrozephalie müssen daher ausgeschlossen sein. Genetische Ursachen eines Mikrozephalus stellen Chromosomenaberrationen und Mutationen in verschiedenen Genen dar. Eine primäre Mikrozephalie liegt bereits pränatal vor und wird entweder per Sonographie oder bei Geburt diagnostiziert. Von einer sekundären Mikrozephalie hingegen spricht man, wenn sich der Mikrozephalus erst nach der Geburt entwickelt. Ursache hierfür ist vermutlich ein vermehrter Untergang neuronaler Zellen oder die verminderte Ausbildung dendritischer Verbindungen und/oder Gliazellen 7 (Qazi and Reed 1973; Dobyns 2002; Woods 2004). Diese Arbeit beschäftigt sich mit den genetischen Ursachen der autosomal rezessiven primären Mikrozephalie (MCPH), eine Erkrankung, die auf einem, durch eine verminderte Anzahl an kortikalen Neuronen reduzierten Gehirnvolumen bei Geburt beruht und mit schwerer bis grenzwertiger mentaler Retardierung8 (IQ zwischen 30 und 84) einhergeht (Trimborn, Richter et al. 2005; Passemard, Kaindl et al. 2009; Kaindl, Passemard et al. 2010). Der Begriff autosomal rezessive primäre Mikrozephalie, historisch bedingt auch als Microcephalia vera bezeichnet, wurde 1998 von Jackson, McHale et al. geprägt. 1.4.1. Phänotyp Die ursprüngliche Definition der MCPH wurde durch fortwährende Forschungsergebnisse immer wieder erweitert oder korrigiert. Die aktuelle klinische Definition beinhaltet einen kongenitalen Mikrozephalus mit einer Abweichung von -2 SD9 vom Median in Korrelation zu Alter, Ethnie und Geschlecht, ggf. gefolgt von einer relativen Verminderung des Kopfumfangs innerhalb des ersten Lebensjahres, 6 Unter anderem Kokain und N-Methylamphetamin. Gliazellen sind Zellen des zentralen Nervensystems, die keine Neurone sind. Sie erfüllen wichtige Stoffwechsel- und Stützfunktionen im Gehirn. Außerdem sind sie in die Informationsverarbeitung und -speicherung involviert. 8 Bei einem IQ unter 70 spricht man von einer geistigen Retardierung (geistige Behinderung). Ein IQ zwischen 70 und 90 gilt als Intelligenzminderung (borderline-IQ). 9 Das Wachstum des Menschen im Allgemeinen verläuft nicht kontinuierlich oder linear, sondern wird durch genetische Determinanten, äußere Faktoren und altersabhängige biochemische Prozesse beeinflusst. Um die körperliche Entwicklung eines Individuums im Vergleich zur Normalpopulation zu betrachten, werden sogenannte Perzentilenkurven verwendet. Dabei handelt es sich um die Verteilung von Wachstumswerten verschiedener Parameter (z.B. Körpergröße, Gewicht, Kopfumfang) – in Korrelation von Alter und Geschlecht – einer Populati7 11 das Vorliegen einer mentalen Retardierung ohne andere neurologische Auffälligkeiten, außer einer milden Epilepsie (etwa 10-20 % der Fälle) oder milden pyramidalen Symptomen, eine verminderte Gehirngröße in der MRT/CT, das Fehlen von Dysmorphien, außer eine durch die verminderte Größe des Neurokraniums bedingt fliehende Stirn, das Fehlen somatischer Fehlbildungen, einen unauffälligen Befund bei Untersuchung des Fundus. (Bond, Roberts et al. 2002; Roberts, Hampshire et al. 2002; Trimborn, Bell et al. 2004; Woods 2004; Shen, Eyaid et al. 2005; Woods, Bond et al. 2005; Passemard, Kaindl et al. 2009; Passemard, Titomanlio et al. 2009) Tabelle 1 stellt einen Überblick über die verschiedenen klinischen Merkmale dar, die bisher bei MCPH beschrieben wurden. Von einer schweren Mikrozephalie spricht man bei einer Abweichung um mehr als -3 SD vom geschlechts- und altersadaptierten Median. Desweiteren ist häufig ein milder Kleinwuchs bis -3 SD zu beobachten (Passemard, Kaindl et al. 2009). Ein großes Problem stellt die Definition des Kopfumfangs dar: Etwa 2 % der Bevölkerung haben einen Kopfumfang bis -2 SD unter dem geschlechts- und altersabhängigen Median und nur etwa die Hälfte dieser Individuen ist von einer Intelligenzminderung betroffen (Watemberg, Silver et al. 2002; Abuelo 2007). Ein KU mit einer Abweichung bis -2 SD vom Großteil der Bevölkerung kann also auch eine Normvariante darstellen. Dennoch wurden Patienten mit Mutationen in MCPH-Genen beschrieben, deren Kopfumfang lediglich eine Abweichung um -2 SD vom Median aufwies (Passemard, Titomanlio et al. 2009). Schließt man nur Patienten mit einem Kopfumfang von -3 SD (etwa 0,1 % der Bevölkerung) in klinische Studien ein, läuft man Gefahr, einige MCPH-Fälle zu übersehen (Abuelo 2007; Nicholas, Swanson et al. 2009). Die Inzidenz der MCPH beträgt etwa 1:30000 bis 1:250000 (Komai, Kishimoto et al. 1955; Passemard, Kaindl et al. 2009) und 1:10000 in konsanguinen Populationen (Thornton and Woods 2009). Damit handelt es sich um eine sehr seltene Erkrankung. In der MR-Tomographie fällt eine verminderte Gehirngröße auf, wobei der Kortex besonders betroffen zu sein scheint (Bond, Roberts et al. 2002). Desweiteren kann eine reduzierte Gyrierung im Sinne einer Pachygyrie auftreten (Desir, Cassart et al. 2008). Bei Patienten mit Mutationen in ASPM (vgl. Kapitel 1.4.2.5) wurde von Desir et al. (2008) außerdem ein antero-posteriorer Gradient (sog. A>P-Gradient) in der Ausprägung der Gyrierung beschrieben. Die anterioren Anteile sind dabei schwerer von der Pachygyrie betroffen als die posterioren. on. Als normal gelten dabei die Werte zwischen der 3. und 97. Perzentile, also 94 % der untersuchten Population. Die Abweichungen vom Median werden dabei als Standardabweichungen (engl.: standard deviation, SD) angegeben und dienen der Objektivierung der Werte. 12 Ein Mikrozephalus lässt sich intrauterin per Sonographie oder MR-Tomographie etwa ab der 24. SSW diagnostizieren (Tunca, Vurucu et al. 2006). Ist die auslösende Mutation in der Familie bereits bekannt, kann ab der 10.-13. SSW per Chorionzottenbiopsie oder in der 15.18. SSW per Amniozentese eine molekulargenetische Diagnosestellung erfolgen. Tabelle 1 Klinische Merkmale der autosomal rezessiven primären Mikrozephalie. (Tabelle aus Kaindl, Passemard et al. 2010) 1.4.2. Genotyp Bisher wurden sieben Gene beschrieben, in welchen Mutationen zum Phänotyp der autosomal rezessiven primären Mikrozephalie führen: Microcephalin (MCPH1), WDR62 (MCPH2), CDK5RAP2 (MCPH3), CEP152 (MCPH4), ASPM (MCPH5), CENPJ (MCPH6), 13 und STIL (MCPH7). Mutationen in diesen Genen führen jeweils zu MCPH Typ 1-7 (MCPH1-7). WDR62 und CEP152 wurden erst kürzlich als MCPH auslösende Gene identifiziert. Zum Zeitpunkt der molekulargenetischen Untersuchungen für diese Arbeit waren lediglich die Loci MCPH2 und MCPH4 bekannt, nicht jedoch die dazugehörigen Gene. Diese konnten daher nicht in die Analysen eingeschlossen werden. Für eine aktuelle und vollständige Beschreibung aller sieben MCPH-Gene werden diese in der ausführlichen Beschreibung der Gene in Kapitel 1.4.2.1 ff. dennoch erwähnt. Die zugehörigen MCPH-Proteine sind in unterschiedliche zelluläre Prozesse involviert: Regulation des Zellzyklus Checkpoint-Kontrollen im Zellzyklus DNA-Reparaturmechanismen Kondensation der Chromosomen Funktion des Zentrosoms mit Spindelformation und -dynamik Anheftung der Spindeln am Kinetochor Zelluläre Apoptose (Kaindl, Passemard et al. 2010) Ursächlich für MCPH wird ein Defekt in der Proliferation von neuronalen Vorläuferzellen (neuronale Progenitorzellen) angenommen, der in einer verminderten Anzahl dieser Zellen resultiert (Woods 2004; Woods, Bond et al. 2005; Bond and Woods 2006; Cox, Jackson et al. 2006; Fish, Kosodo et al. 2006). Dies legt die Vermutung nahe, dass Mutationen in den MCPH-Genen zu einer fehlerhaften Regulierung zwischen symmetrischer und asymmetrischer Teilung neuronaler Progenitorzellen während der Kortikoneurogenese führen. Daraus resultiert ein verkleinerter Pool an neuronalen Stammzellen und damit auch eine verminderte Anzahl an Neuronen während der späteren Gehirnentwicklung (Stiles and Jernigan 2010), wodurch es zur Ausbildung eines Mikrozephalus kommt. Weiterhin konnten bei Patienten mit Mutationen in Microcephalin periventrikuläre Heterotopien10 gefunden werden, die auf eine neuronale Migrationsstörung hindeuten (Trimborn, Bell et al. 2004; Woods, Bond et al. 2005). Auch Patienten mit Mutationen in ASPM zeigen Hinweise auf eine Migrationsstörung im Sinne einer Polymikrogyrie (Passemard, Titomanlio et al. 2009). Dies wäre auch eine mögliche Erklärung für das Auftreten eines Borderline-KUs bei Geburt und ZNS-Dysplasien wie fokale kortikale Malformationen, erweiterte dysmorphe Ventrikel und eine partielle Agenesie des 10 Es handelt sich um eine Migrationsstörung von Neuronen während der Kortikoneurogenese. Die Neurone können nicht aus der ventrikulären Zone wandern und den Kortex bilden, sondern bleiben als Knötchen auf der Ventrikeloberfläche liegen (Parrini et al. 2004), die zum Beispiel im MRT oder CT sichtbar werden. Dies wird als periventrikuläre noduläre Heterotopie bezeichnet. 14 Corpus callosums, die bei Patienten mit Mutationen im ASPM-Gen beschrieben werden konnten (Passemard, Titomanlio et al. 2009). Die meisten Mutationen wurden bisher im ASPM-Gen gefunden (Gul, Hassan et al. 2006; Nicholas, Swanson et al. 2009). Vor allem in konsanguinen Familien mit klinischem Verdacht auf MCPH konnte eine hohe Rate an Mutationen (~40 %) detektiert werden, auch wenn diese eine unterschiedliche ethnische und geographische Herkunft aufweisen (Nicholas, Swanson et al. 2009). Eine Korrelation zwischen Genotyp und Phänotyp scheint nicht zu bestehen (Bond, Scott et al. 2003), wobei neuere Studien dies in Frage stellen (Wang, Li et al. 2008; Passemard, Titomanlio et al. 2009; Rimol, Agartz et al. 2010). Im Folgenden soll nun ausführlich auf die sieben bekannten MCPH-Gene und ihre Funktion eingegangen werden. 1.4.2.1. MCPH1/Microcephalin11 1998 wurde von Jackson et al. nach Kopplungsanalysen mit Mikrosatellitenmarkern in einer konsanguinen Familie aus Nordpakistan der erste MCPH-Locus auf 8p22-pter beschrieben. Durch weitere Analysen in derselben Familie konnte die Arbeitsgruppe vier Jahre später eine pathogene Nonsense-Mutation (c.74C>G, p.Ser25X) im bis dahin unbekannten Microcephalin-Gen (auch als BRIT1 oder MCPH1 bezeichnet; Chromosom 8p23, OMIM12 607117) nachweisen (Jackson, Eastwood et al. 2002). Weiterhin konnten sie feststellen, dass Microcephalin in verschiedenen fetalen Geweben wie Gehirn, Leber und Niere exprimiert wird; auch in adultem Gewebe konnte Microcephalin-mRNA detektiert werden (Jackson, Eastwood et al. 2002; Kaindl, Passemard et al. 2010). Eine hohe Expression konnte in Mausembryonen während der Neurogenese vor allem im Vorderhirn und in den Wänden der lateralen Ventrikel, wo neuronale Vorläuferzellen sich teilen und von dort migrieren um den Kortex zu bilden, nachgewiesen werden (Jackson, Eastwood et al. 2002). Das Protein Microcephalin besteht aus 835 Aminosäuren und besitzt eine N-terminale 13 (BRCT1) und zwei C-terminale 14 BRCT-Domänen (BRCT2, 3), eine Kernlokalisationssequenz und eine große, zentrale IMPDH-Domäne, deren Funktion nicht geklärt ist (Lin, Liang et al. 2010). BRCT-Domänen finden sich in Schlüsselproteinen zur Kontrolle des Zellzyklus sowie in vielen DNA-Reparatur- und Tumorsuppressorproteinen (Bork, Hofmann et al. 1997; Huyton, Bates et al. 2000). MCPH1 ist an verschiedenen zellulären Mechanismen wie an 11 Sämtliche Bezeichnungen für Gene sind kursiv und die Proteinbezeichnungen recte geschrieben. OMIM™ (Online Mendelian Inheritance in Men) stellt eine Online-Datenbank für menschliche Gene und genetische Erkrankungen dar. (Online Mendelian Inheritance in Man 2011) 13 Der N- oder Amino-Terminus bezeichnet das Ende eines Proteins, das durch eine freie Aminogruppe (NH 2) gebildet wird. 14 Der C- oder Carboxy-Terminus bezeichnet das Ende eines Proteins, das durch eine freie Carboxygruppe (COOH) gebildet wird. 12 15 der Signalisierung eines DNA-Schadens, der DNA-Reparatur und der Kontrolle des Zellzyklus beteiligt. Eine vorzeitige Chromosomenkondensation wird durch die Domäne BRCT1 verhindert (Wood, Liang et al. 2008): MCPH1 rekrutiert gemeinsam mit dem Protein Pericentrin (PCNT) die Kinase Chk1 zum Zentrosom, wodurch eine Kette an inhibitorischen Phosphorylisierungen ausgelöst und ein Eintritt in die Mitose verhindert wird; ein Verlust von MCPH1 resultiert damit in einem verfrühten Eintritt in die Mitose, was sich in einer vorzeitigen Chromosomenkondensation manifestiert (Neitzel, Neumann et al. 2002; Alderton, Galbiati et al. 2006; Tibelius, Marhold et al. 2009). 2004 konnte durch Trimborn et al. auch bei Zellen von Patienten mit Mutationen in Microcephalin eine vorzeitige Kondensation der Chromosomen während der frühen G2-Phase des Zellzyklus beobachtet werden. Aus diesen Ergebnissen schlossen die Autoren, dass Mutationen in Microcephalin entweder zu einem vermehrten Zelltod oder zu einer reduzierten proliferativen Kapazität der Vorläuferzellen während der Neurogenese führen. Desweiteren ist MCPH1 in die Kontrolle des Zellzyklus durch die Aktivierung beziehungsweise positive Regulation der Expression von Zellzyklusproteinen wie Chk1, NBS1 und BRCA115 involviert (Lin, Rai et al. 2005). BRCA1 und Chk1 sind für die Aktivierung der intraS- und G2/M-Zellzyklus-Checkpoints nötig. NBS1 katalysiert dabei die Phosphorylierung von Chk1 und aktiviert dadurch die Kinase. Ein Mangel an MCPH1 resultiert in einer verminderten Expression von BRCA1 und Chk1 und führt dadurch zu einem Verlust der intra-S und G2/M Zellzyklus-Kontrolle. Damit ist ein Mitosestopp bei beschädigten Zellen nicht mehr gewährleistet und es droht unkontrolliertes Zellwachstum. Mikrozephalie ist auch als Symptom bei Patienten mit Seckel16- (O'Driscoll, Ruiz-Perez et al. 2003) und NijmegenBreakage-Syndrom (NBS) (Varon, Vissinga et al. 1998) zu finden. Diese Syndrome zeichnen sich unter anderem durch eine fehlerhafte Regulation von Chk1 aus. NBS1 ist das betroffene Gen beim Nijmegen-Breakage-Syndrom. Beim Seckel-Syndrom konnten unter anderem Mutationen in ATR gefunden werden, das ebenfalls mit Chk1 interagiert (O'Driscoll, Ruiz-Perez et al. 2003; Alderton, Joenje et al. 2004; Lin, Rai et al. 2005). Die Domänen BRCT2 und 3 sind an der biochemischen Antwort auf DNA-Schäden beteiligt (Wood, Singh et al. 2007; Thornton and Woods 2009). MCPH1 hilft, verschiedene Reparaturproteine wie ATM, ATR, Rad17 und γH2AX an den DNA-Schäden zu lokalisieren (Rai, Dai et al. 2006; Lin, Liang et al. 2010). Bei einem Verlust von MCPH1 können diese Proteine, mit Ausnahme von γ-H2AX, nicht mehr korrekt positioniert werden (Lin, Liang et al. 15 Mutationen in BRCA1 finden sich unter anderem bei Patientinnen mit familiärem Brustkrebs (Yu, Chini et al. 2003; Rai, Dai et al. 2006; Hagemann, Anacker et al. 2008). 16 Formenkreis der Seckel-Syndrome: beinhaltet das klassische Seckel-Syndrom (intrauterine und postnatale Wachstumsretardierung, Mikrozephalie, schwere geistige Retardierung, „vogelkopfartige“ Kopfform) (Faivre, Le Merrer et al. 2002) sowie den mikrozephal osteodysplastisch primordialen Kleinwuchs (MOPD) Typ I-III mit typischen dysplastischen Knochenveränderungen (Majewski and Goecke 1998). 16 2010). Weiterhin interagiert MCPH1 mit dem Proteinkomplex BRCA2/RAD51. Dieser Komplex wird benötigt, um Doppelstrangbrüche (englisch: double-strand DNA breaks, DSBs) der DNA zu reparieren. DSBs können zum Beispiel durch ionisierende Strahlung oder endogene Faktoren ausgelöst werden (Pandita and Hittelman 1992; Kuzminov 1995) und zum Zelltod führen (Bassing and Alt 2004). MCPH1 hilft bei der Positionierung des BRCA2/RAD51-Komplexes an den DNA-Bruchstellen und ist daher für DNA- Reparaturmechanismen essentiell (Wu, Mondal et al. 2009; Liang, Gao et al. 2010). MCPH1/BRIT1 verhält sich zudem als Expressionsinhibitor von hTERT, der katalytischen Untereinheit der Enzyms humane Telomerase Reverse Transkriptase (Lin and Elledge 2003), die die Telomere17 der Chromosomen verlängert und damit die Teilungsfähigkeit der Zellen erhält. Zusammenfassend lässt sich festhalten, dass die BRCT1-Domäne vor allem an der Regulation des Zellzyklus und an der Interaktion mit den Chromosomen beteiligt ist, während die Domänen BRCT2 und 3 vor allem Funktionen bei der DNA-Reparatur innehaben. Aus den oben genannten zellulären Aufgaben von MCPH1 ergeben sich verschiedene Effekte in vivo, die bei MCPH1 -/- knockout Mäusen 18 und in Patienten mit MCPH1Mutationen beobachtet werden konnten. Da MCPH1 an der DNA-Reparatur beteiligt ist, lässt sich schließen, dass ein Verlust dieses Proteins zu genomischer Instabilität führen könnte. Tatsächlich zeigten MCPH1 -/- knockout Mäuse ein kürzeres Überleben als die Wildtypen und nach radioaktiver Bestrahlung konnten vermehrt schwere Chromosomenbrüche beobachtet werden (Liang, Gao et al. 2010). Chromosomenbrüche können unter anderem einen Verlust von Tumorsuppressorgenen zur Folge haben und zu unkontrolliertem Zellwachstum führen. 2010 wurden von Lin et al. verminderte Level von MCPH1 in Ovarialund Mammakarzinomzellen beobachtet, so dass vermutet wurde, bei Microcephalin könne es sich um ein neues Tumorsuppressorgen handeln. Richardson et al. konnten eine verminderte Expression von Microcephalin in BRCA1-mutierten Mammakarzinomzellen zeigen und schlagen vor, MCPH1 als prognostischen Indikator bei diesem Karzinomtyp zu verwenden (Richardson, Shaaban et al. 2010). Desweiteren zeigen Patienten mit NBS (Defekte im NBS1-Protein mit dem MCPH1 interagiert) eine erhöhte Sensitivität gegenüber Radioaktivität und eine Prädisposition für Lymphome und Leukämie; dennoch gibt es bisher keinen Anhaltspunkt dafür, dass auch Patienten mit Mutationen in Microcephalin ein erhöhtes Risiko haben, maligne Tumore zu entwickeln (Gavvovidis, Pohlmann et al. 2010). 2010 konnten Gavvovidis et al. an Zellen von Patienten mit MCPH1-Mutationen feststellen, dass 17 Telomere sind nicht kodierende Sequenzen am Ende der Chromosomen. Bei jeder Zellteilung wird ein Teil der Chromosomenenden, bedingt durch den Vorgang der Transkription, abgeschnitten. Telomere stellen daher einen Schutz der kodierenden Sequenz dar. Ein Fehlen der Telomere hat den Zelltod zur Folge. 18 Es handelt sich um gentechnisch veränderte Mäuse, deren MCPH1-Gen künstlich ausgeschaltet wurde (knockout). Die Bezeichnung -/- gibt an, dass dies auf beiden Chromosomen geschehen ist. Diese Tiere sind somit unfähig, das Protein MCPH1 zu produzieren. Durch Untersuchung dieser Mäuse können Rückschlüsse auf die Funktion von MCPH1 gezogen werden. 17 diese die gleichen Raten an Chromosomenbrüchen aufwiesen wie die Wildtyp-Kontrollen. Desweiteren waren die beschädigten Zellen trotz des Defekts in MCPH1 weiterhin in der Lage, den Zellzyklus zu stoppen. Über den diesen Ergebnissen zugrundeliegenden Mechanismus und die Erklärung für die unterschiedlichen Beobachtungen bei humanen Zellen und den MCPH1 -/- knockout Mäusen kann bisher nur spekuliert werden. Bei Patienten mit Mutationen in MCPH1 können gelegentlich periventrikuläre Heterotopien im MRT/CT dargestellt werden (Trimborn, Bell et al. 2004). Dies wirft die Vermutung auf, dass MCPH1 auch eine Funktion bei der Migration der neuronalen Zellen aus der ventrikulären Zone und/oder der Entwicklung der Gliazellen haben könnte (Barkovich, Kuzniecky et al. 2001; Trimborn, Bell et al. 2004). Mutationen und Kopienzahlvariationen (englisch: copy number variants, CNVs) in Microcephalin konnten auch bei anderen Erkrankungen nachgewiesen werden: Patienten mit PCCSyndrom, das durch vorzeitige Chromosomenkondensation gekennzeichnet ist und mit Mikrozephalie und Kleinwuchs einhergeht, zeigen Mutationen in Microcephalin (Trimborn, Bell et al. 2004). Weiterhin wurden Mutationen in Exon 4 des MCPH1-Gens kürzlich bei Patienten mit CMCB (englisch: Craniosynostosis-Microcephaly with Chromosomal Breakage) gefunden (Farooq, Baig et al. 2010). CNVs von MCPH1 konnten außerdem bei Patienten mit Erkrankungen aus dem Formenkreis der Autism spectrum disorders (ASD) detektiert werden (Ozgen, van Daalen et al. 2009). Bei den meisten Mutationen, die bisher im Microcephalin-Gen bei Patienten mit MCPH beschrieben wurden, handelt es sich um Nonsense-Mutationen 19 . Doch auch MissenseMutationen20, die mit einem mildem Phänotyp mit Intelligenzminderung (IQ 84) und vorzeitiger Chromosomenkondensation einhergehen, finden sich in der Literatur (Trimborn, Richter et al. 2005). CNVs fanden sich bisher lediglich bei Patienten mit Erkrankungen aus dem ASD-Formenkreis, nicht jedoch bei MCPH. 1.4.2.2. MCPH2/WDR62 Erst kürzlich konnte durch whole-exome sequencing21 türkischer und kaukasischer Patienten aus konsanguinen Familien mit schweren Hirnmalformationen das Gen WDR62 (Chromosom 19q13.12, OMIM 613583) als MCPH-verursachendes Gen entdeckt werden. Aufgrund des mikrozephalen Phänotyps der Patienten wurde vermutet, dass es sich bei WDR62 um das gesuchte MCPH-Gen des Locus MCPH2 handeln könnte, der bereits seit 19 Nonsense-Mutationen resultieren in einem vorzeitigen Stopp-Codon. Missense-Mutationen führen zu einer Veränderung im Leseraster des Aminosäurecodes. Dadurch kommt es zum Austauch einer oder mehrerer Aminosäuren in der Polypeptidkette des Proteins. 21 Das Exom bezeichnet die Gesamtheit aller Exone (kodierende Abschnitte) des Genoms. Durch whole-exome sequencing ist es möglich, alle Exone des Genoms zu analysieren. 20 18 1999 bekannt ist (Roberts, Jackson et al. 1999). Der Beweis, dass dies tatsächlich der Fall ist, wurde bereits wenige Monate später durch Nicholas et al. (2010) erbracht: in der DNA von Patienten mit der klinischen Diagnose MCPH konnten Missense- und FrameshiftMutationen22 gefunden werden. Im Mausmodel konnte eine Expression des WDR62-Gens in den apikalen und basalen Vorläuferzellen der ventrikulären und subventrikulären Zone und später auch in den neugebildeten Neuronen der kortikalen Platte (Bilguvar, Ozturk et al. 2010; Nicholas, Khurshid et al. 2010) gefunden werden. Außerdem erbrachten Nicholas et al. (2010) den Nachweis einer Expression von WDR62 in den äußersten Schichten des Kortex, was auf eine Funktion von WDR62 bei der kortikalen Laminierung 23 hindeuten könnte. Die Autoren zeigten zudem, dass sich WDR62 am Spindelpol zu akkumulieren scheint; daraus lässt sich ableiten, dass ein Mangel an WDR62 zu Störungen in der Regulation zwischen symmetrischer und asymmetrischer Zellteilung führen und in einer verminderten Anzahl neuronaler Progenitorzellen resultieren könnte (Nicholas, Khurshid et al. 2010). Dennoch bleibt die genaue Funktion des WDR62-Gens ungeklärt (Wollnik 2010). In Zellen eines Patienten mit einer Missense-Mutation (p.Arg438His) war eine korrekte Positionierung des Spindelpols während der Mitose nicht möglich, obwohl die sonstige zelluläre Expression von WDR62 unverändert blieb (Nicholas, Khurshid et al. 2010; Wollnik 2010). Patienten mit MCPH durch Mutationen in WDR62 zeigen neben der Mikrozephalie eine vereinfachte Gyrierung und Malformationen des Corpus callosum; desweiteren konnten Poly-mikrogyrie24, Schizenzephalie25 und subkortikale Heterotopien beobachtet werden (Yu, Mochida et al. 2010). Die histologische Analyse eines 27 Wochen alten Feten mit WDR62-Mutation durch Yu et al. (2010) zeigte schwere kortikale Malformationen, die sich mit einer Insuffizienz in Proliferation und Migration erklären lassen könnten: Die Oberflächenstruktur des Gehirn präsentierte sich glatt und zeigte kaum Sulci; außerdem erbrachte die Untersuchung einen anormalen Kortex mit dünnen Neuronenschichten (mit Ausnahme der Molekularschicht) (Wollnik 2010; Yu, Mochida et al. 2010). Nach aktueller Datenlage sind Mutationen in WDR62 – nach ASPM-Mutationen (Bond, Roberts et al. 2002) – mit bisher 15 beschriebenen Mutationen (Bilguvar, Ozturk et al. 2010; Nicholas, Khurshid et al. 2010; Yu, Mochida et al. 2010) die zweithäufigste Ursache für MCPH (Jackson, Eastwood et al. 2002; Roberts, Hampshire et al. 2002). 22 Bei einer Frameshift-Mutation kommt es zur Verschiebung des Leserasters des Aminosäurecodes und damit zur nachfolgend veränderten Polypeptidkette. 23 Kortikale Laminierung = Ausbildung des Kortex in sechs Schichten 24 Bei der Polymikrogyrie handelt es sich um eine Fehlbildung des Kortex mit exzessiver Gyrierung und flachen Sulci. Desweiteren liegt eine Störung im Aufbau der Schichten der Gehirnrinde vor (Villard 2004). 25 Die Schizenzephalie ist durch liquorgefüllte Spaltbildungen in den Großhirnhemisphären gekennzeichnet (Korinthenberg 2009, S.25). 19 1.4.2.3. MCPH3/CDK5RAP2 Ein dritter Locus für MCPH konnte im Jahr 2000 von Moynihan et al. in verwandten Familien aus Nordpakistan beschrieben werden. Durch Kopplungsanalysen konnte der kritische Bereich auf eine etwa 12 cM große Region eingegrenzt werden (Moynihan, Jackson et al. 2000). Auf Basis dieser Arbeit beschrieben Bond et al. (2005) CDK5RAP2 (Chromosom 9q33.3, OMIM 608201) nach Kopplungsanalysen in konsanguinen Familien aus Nordpakistan als MCPH verursachendes Gen. Eine Expression von CDK5RAP2 konnte im Mausembryo vor allem im Neuroepithelium des frontalen Kortex an den lateralen Ventrikeln, wo die Teilung von neuronalen Progenitorzellen stattfindet, gefunden werden; die Expression ist jedoch nicht auf das Zentralnervensystem beschränkt (Bond, Roberts et al. 2005). Bisher sind vier Isoformen des Proteins CDK5RAP2 bekannt (Kaindl, Passemard et al. 2010). In voller Länge besteht es aus 1893 Aminosäuren und beinhaltet unter anderem eine Bindungsdomäne für den γ-Tubulin-Ring-Komplex (N-terminal, kodiert durch Exon 4) und eine Interaktionsstelle mit Cdk5 (C-terminal) (Graser, Stierhof et al. 2007; Fong, Choi et al. 2008). Es ist während der gesamten Mitose zentrosomal lokalisiert und zeigt vor allem während der Prometa- und Metaphase eine hohe Konzentration an den Spindelpolen (Bond, Roberts et al. 2005; Fong, Choi et al. 2008). Außerdem scheint CDK5RAP2 auch am GolgiApparat26 lokalisiert zu sein, wobei seine Funktion dort bisher nicht geklärt ist (Wang, Wu et al. 2010). CDK5RAP2 interagiert direkt mit γTuRC (Graser, Stierhof et al. 2007; Fong, Choi et al. 2008), einem Proteinkomplex, der eine wichtige Rolle in der Bildung der Mikrotubuli im Zentrosom spielt. Durch die Interaktion mit CDK5RAP2 wird dieser Komplex zum Zentrosom rekrutiert und die γTuRC-vermittelte Bildung von Mikrotubuli stimuliert (Choi, Liu et al. 2010; Lizarraga, Margossian et al. 2010). Weiterhin stellt γ-Tubulin selbst einen wichtigen Faktor für die Progression des Zellzyklus dar: kann es nicht zum Zentrosom rekrutiert werden, tritt die Zelle nicht in die Mitose ein und der programmierte Zelltod wird eingeleitet (Zimmerman, Sillibourne et al. 2004). Eine Maus-Mutante mit einer in-frame27 Deletion von Exon 4, das die Bindungsdomäne für den γ-Tubulin-Ring-Komplex kodiert (Fong, Choi et al. 2008), entwickelte Mikrozephalie, eine global verminderte Dicke des Kortex (vor allem der superfiziellen Schichten) und vergrößerte Ventrikel (Lizarraga, Margossian et al. 2010). Die verminderte Anzahl an Neuronen konnte auf eine erhöhte Apoptoserate der neuronalen Vorläuferzellen sowie der Neu26 Der Golgi-Apparat spielt unter anderem eine wichtige Rolle in der Modifikation von Proteinen und der Verpakkung von Substraten in sekretorische Vesikel. 27 Bei einer in-frame Deletion kommt es zu keiner Verschiebung des Leserasters. Dem Protein fehlen lediglich die deletierten Aminosäuren. 20 rone selbst zurückgeführt werden (Lizarraga, Margossian et al. 2010). Lizarraga et al. (2010) und Graser et al. (2007) konnten zeigen, dass ein Knockdown bzw. eine Mutation in CDK5RAP2 zu abnormaler Teilung der Zentrosomen führt, was den Grund für die erhöhte Apoptoserate darstellen könnte (Yingling, Youn et al. 2008). Buchman et al. (2010) konnten zeigen, dass Perizentrin (englisch: pericentrin, PCNT) CDK5RAP2 zum Zentrosom rekrutiert. PCNT interagiert mit vielen γTuRC-Proteinen und eine Störung dieses Prozesses hat eine abnormale Formation des Spindelapparats zur Folge (Dictenberg, Zimmerman et al. 1998; Zimmerman, Sillibourne et al. 2004; Rauch, Thiel et al. 2008; Buchman, Tseng et al. 2010). Im CDK5RAP2-Protein liegen die Bindungsstellen für PCNT und γ-Tubulin an den entgegengesetzten Enden, so dass Buchman et al. (2010) daraus schließen, dass es sich bei CDK5RAP2 um ein Verbindungsprotein zwischen PCNT und γ-Tubulin handeln könnte. Ein Verlust der Interaktion zwischen CDK5RAP2 und PCNT führt zu einem Defekt essentieller Zentrosom-assoziierter Funktionen, was schließlich in einer insuffizienten Neurogenese resultiert (Buchman, Tseng et al. 2010). Eine weitere Funktion von CDK5RAP2 besteht in der Checkpointkontrolle des Spindelapparats: es wirkt als positiver Regulator für die Transkription von BUBR1 und MAD2, zwei Gene, die essentiell für die Checkpointkontrolle des Spindelapparats sind (Zhang, Liu et al. 2009). Ein Mangel an CDK5RAP2 führt zu einem verminderten Proteinlevel von BUBR1 und MAD; als Folge ist ein Übergang von Meta- in Anaphase möglich, obwohl die Mikrotubuli des Spindelapparats noch nicht an die Kinetochore gebunden haben (Zhang, Liu et al. 2009). Zhang et al. (2009) konnten zudem zeigen, dass eine Inhibition der Expression von CDK5RAP2 in einer Resistenz der untersuchten Zellen gegenüber den Chemotherapeutika Paclitaxel und Doxorubicin resultiert. Eine Regulation und Kontrolle der Expression von CDK5RAP2 könnte damit während der Therapie mit Paclitaxel und Doxorubicin helfen, Resistenzen zu erkennen und zu überwinden (Zhang, Liu et al. 2009). CDK5RAP2 ist ein seltener Locus für MCPH: Die einzigen bisher beschriebenen Mutationen im CDK5RAP2-Gen in der DNA von Patienten mit MCPH stammen von Bond et al. (2005) und wurden in einer nordpakistanischen Familie gefunden. Es handelt sich zum einen um die Nonsense-Mutation c.243T>A (p.Ser81X) in Exon 4, welche später durch Sequenzanalysen einer ebenfalls konsanguinen pakistanischen Familie zu c.246T>A (p.Tyr82X) korrigiert wurde (Hassan, Khurshid et al. 2007). Zum anderen wurde eine Veränderung der Spleiß-Akzeptor-Stelle durch die Mutation c.4005-15A>G in Intron 26 nachgewiesen (Bond, Roberts et al. 2005). 21 1.4.2.4. MCPH4/CEP152 Bereits 1999 konnte ein vierter Locus für MCPH durch Kopplungsanalysen einer konsanguinen marokkanischen Familie auf Chromosom 15q15-q21 gefunden werden (Jamieson, Govaerts et al. 1999). Dennoch wurde erst 2010 von Guernsey et al. das zugehörige Gen CEP152 (Chromosom 15q21.1, OMIM 613529) als Ursache für MCPH beschrieben. Guernsey et al. (2010) führten dabei Kopplungsanalysen in drei Familien durch, die einer maritimen Subpopulation in Kanada angehören. Auch wenn eine Verwandtschaft der Eltern nicht vorlag, konnte in dieser Population ein starker Gründereffekt 28 beobachtet werden (Guernsey, Jiang et al. 2010). Die Patienten hatten alle Mikrozephalie (bis -7 SD) mit einer vereinfachten Gyrierung, waren normal groß, zeigten keine weiteren Dysmorphien, keine Epilepsie und lediglich eine milde mentale Retardierung (Guernsey, Jiang et al. 2010). Eine Expression von CEP152 konnte im Gehirn von Mäuseembryonen nachgewiesen werden (Guernsey, Jiang et al. 2010). Das Protein CEP152 besteht aus 1654 Aminosäuren und findet sich in den Zentrosomen (Guernsey, Jiang et al. 2010). Kommt es jedoch zur Trunkierung des CEP152-Proteins, ist es nicht mehr in den Zentrosomen nachzuweisen, wohingegen CEP152 mit veränderter Proteinstruktur durchaus noch in den Zentrosomen vorhanden war (Guernsey, Jiang et al. 2010). CEP152 rekrutiert Plk4 (Bettencourt-Dias, Rodrigues-Martins et al. 2005; Habedanck, Stierhof et al. 2005) und CPAP (Kohlmaier, Loncarek et al. 2009; Tang, Fu et al. 2009) (auch als CENPJ bezeichnet, vgl. Kapitel 1.4.2.6), Proteine, die bei der Formation der Mikrotubuli eine wichtige Rolle spielen, zum Zentrosom (Cizmecioglu, Arnold et al. 2010). Ein Mangel an CEP152 resultiert in einer fehlenden Duplikation der Zentriolen und der Formation monopolarer Spindeln (Cizmecioglu, Arnold et al. 2010). Kalay et al. (2011) konnten in Zellen von Patienten mit der klinischen Diagnose eines Seckel-Syndroms und Mutationen in CEP152 verschiedene Anomalitäten an den Spindelapparaten beobachten. Außerdem konnten sie zeigen, dass ein Mangel an CEP152 in einer verminderten Zellzahl resultiert (Kalay, Yigit et al. 2011). Desweiteren scheint CEP152, ähnlich wie MCPH1, eine Funktion bei der DNA-Reparatur inne zu haben: Kalay et al. (2011) beobachteten eine Chromosomeninstabilität in Zellen mit einem Mangel an CEP152. Normalerweise bindet CEP152 an das Protein CINP, das vermutlich hilft, γH2AX an beschädigte DNA-Loci zu lokalisieren; da CEP152 mit CINP interagiert, könnte es an einer effizienten DNA-Reparatur beteiligt sein (Kalay, Yigit et al. 2011). Die einzigen bisher beschriebenen Mutationen in CEP152 in der DNA von MCPH-Patienten stammen von Guernsey et al. (2010): bei zwei Patienten konnte die homozygote Missense28 In relativ isolierten Populationen (z. B. auf einer Insel, einem abgelegenen Dorf etc.) liegt durch die geringe Anzahl der Gründer dieser Populationen ein eingeschränkter Genpool vor. Dies kann zu Ausbildungen spezifischer Phänotypen führen. 22 Mutationen p.Gln265Pro nachgewiesen werden; bei einer Patientin fand sich eine Compound-Heterozygotie mit der auch bei den anderen Patienten detektierten Mutation und einer Nonsense-Mutation (p.Gln265Pro und p.Arg987X). Die Patientin mit NonsenseMutation zeigte einen schwereren Phänotyp als die Patientin mit homozygoter MissenseMutation (Guernsey, Jiang et al. 2010). Kalay et al. (2011) konnten in Patienten mit Seckel-Syndrom sieben weitere Mutationen in CEP152 ausmachen. 1.4.2.5. MCPH5/ASPM Der Locus MCPH5 konnte im Jahr 2000 durch Kopplungsanalysen in konsanguinen türkischen und pakistanischen Familien mit dem klinischen Phänotyp MCPH auf 1q25-32 ausgemacht werden (Jamieson, Fryns et al. 2000; Pattison, Crow et al. 2000). MCPH5 ist der Locus mit den häufigsten Mutationen bei Patienten mit MCPH (Roberts, Hampshire et al. 2002; Kumar, Blanton et al. 2004; Gul, Hassan et al. 2006). Bond et al. (2002) konnten hier das Gen ASPM (Chromosom 1q31, OMIM 605481) als MCPH5 verursachendes Gen bei konsanguinen Familien aus Nordpakistan ausmachen. Eine hohe Expression des ASPM-Gens findet sich in der ventrikulären Zone des Neuroepitheliums (Thornton and Woods 2009). ASPM mRNA konnte jedoch auch in anderen Geweben29 detektiert werden (Kouprina, Pavlicek et al. 2005). Vor allem zu Beginn der Neurogenese findet sich eine hohe Expression, die anschließend immer weiter abnimmt; dieser Verlauf zeigt eine enge Korrelation zum Wechsel von symmetrischer zu asymmetrischer Zellteilung (Fish, Kosodo et al. 2006). Dennoch scheint ASPM auch danach noch eine wichtige Rolle für eine korrekte Mitose zu spielen (siehe unten) (Higgins, Midgley et al. 2010). Nach der Geburt und in adultem Gewebe ist die Expression von ASPM nur noch in sehr geringen Maßen nachzuweisen (Bond, Roberts et al. 2002; Lin, Pan et al. 2008). Die höchste Expression findet sich in den Progenitorzellen (Thornton and Woods 2009). Die volle Länge des ASPM-Proteins umfasst 3477 Aminosäuren. Es existieren vier bekannte Isoformen (Kouprina, Pavlicek et al. 2005), wobei hauptsächlich zwei davon vorkommen: eine Isoform mit voller Länge der Aminosäuresequenz und eine, die durch einen Verlust von Exon 18 gekennzeichnet ist (Passemard, Titomanlio et al. 2009). ASPM besteht unter anderem aus einer Bindungsdomäne für Mikrotubuli (N-terminal) (Saunders, Avides et al. 1997) und 74 Isoleucin-Glutamin Domänen (IQ-Domänen) (Bond, Roberts et al. 2002). Während der Interphase des Zellzyklus ist ASPM vor allem an den Zentrosomen lokalisiert, während der Pro- bis Telophase vor allem an den Spindelpolen (Zhong, Liu et al. 2005; Fish, Kosodo et al. 2006; Higgins, Midgley et al. 2010; Kaindl, Passemard et al. 2010). 29 Blase, Darm, Herz, Leber, Lunge, Skelettmuskel, Haut, Milz, Magen 23 Ein Mangel an ASPM hat eine veränderte Teilungsebene in neuroepithelialen Zellen zu Folge, woraus eine verminderte Anzahl neuronaler Stammzellen resultieren kann (Fish, Kosodo et al. 2006; Higgins, Midgley et al. 2010). ASPM scheint daher für die Proliferationskapazität von Progenitorzellen eine große Relevanz zu haben (Horvath, Zhang et al. 2006). Ursächlich dafür scheint die Funktion von ASPM zu sein, eine korrekte Organisation und Positionierung des Spindelapparats durch eine Akkumulation von LIN-5 an den Spindelpolen zu gewährleisten (van der Voet, Berends et al. 2009). LIN-5 ist unter anderem an der Positionierung des Spindelapparats und der Ausrichtung der Chromosomen beteiligt (Lorson, Horvitz et al. 2000; Srinivasan, Fisk et al. 2003; Fisk Green, Lorson et al. 2004). Außerdem spielt ASPM vermutlich eine Rolle in der Trennung der beiden Tochterzellen (Zytokinese), da eine Lokalisation am kontraktilen Ring, der durch Aktinfasern die Zelle einschnürt und so zur Teilung führt, nachgewiesen werden konnte (Paramasivam, Chang et al. 2007). Higgins et al. (2005) konnten zudem zeigen, dass ein Verlust von ASPM in einer fehlerhaften Zytokinese und einer erhöhten Apoptoserate resultiert. ASPM wird offensichtlich durch ionosierende Strahlung herab reguliert (Fujimori, Yaoi et al. 2008), was eine verminderte Konzentration von BRCA1, einem Tumorsuppressorgen, zur Folge hat (Zhong, Liu et al. 2005; Kaindl, Passemard et al. 2010). Weiterhin scheint es eine positive Assoziation zwischen einer erhöhten Expression an ASPM und dem Wachstum und Tumorgrad von Glioblastomzellen zu geben (Hagemann, Anacker et al. 2008; Bikeye, Colin et al. 2010). Auch in anderen Tumorarten30 wurde eine Überexpression beschrieben; vermutlich spielt ASPM also auch bei der Mitose von Zellen außerhalb des Gehirns eine Rolle (Kouprina, Pavlicek et al. 2005; Higgins, Midgley et al. 2010). Lin et al. (2008) konnten zudem eine Überexpression von ASPM in Zellen des hepatozellulären Karzinoms als Marker für ein erhöhtes invasives und metastatisches Potential ausmachen. Die Beobachtung, dass ASPM eine generelle Funktion in der Mitose einnimmt (Higgins, Midgley et al. 2010), wirft die Frage auf, warum Patienten mit MCPH neben einer Mikrozephalie nicht auch viele andere Malformationen zeigen. Higgins et al. (2010) stellen die Vermutung auf, dass es einen kompensatorischen Mechanismus in somatischen Zellen geben könnte, der die fehlerhafte Funktion des ASPM-Proteins ausgleicht. Eine weitere Erklärung könnte sein, dass eine Störung in der Ausrichtung der Teilungsebene für die meisten somatischen Zellen einen nicht so dramatischen Effekt haben könnte wie für die Stammzellen des Neuroepitheliums; diese besitzen nur eine schmale apikale und basale Oberfläche und sind daher auf die korrekte Ausrichtung des Spindelapparats angewiesen (Higgins, Midgley et al. 2010). Da viele Mutationen in ASPM eine Trunkierung des Proteins zur Folge haben, wird weiterhin vermutet, dass der MCPH-Phänotyp durch den Verlust der C-terminalen Do30 Unter anderem für Endometrium- und Ovarialkarzinom. 24 mäne verursacht wird und eine Teilfunktion von ASPM erhalten bleibt (Higgins, Midgley et al. 2010). Bisher konnten 74 Mutationen des ASPM-Gens beschrieben werden. Viele dieser Mutationen stellen Nonsense-Mutationen dar und führen somit zu einer Trunkierung des ASPMProteins; doch auch Deletionen (intragenisch und das komplette Gen betreffend), Insertionen und Veränderungen der Spleißstellen wurden beschrieben (Bond, Scott et al. 2003; Kumar, Blanton et al. 2004; Gul, Hassan et al. 2006; Desir, Cassart et al. 2008; Muhammad, Mahmood Baig et al. 2009; Nicholas, Swanson et al. 2009; Passemard, Titomanlio et al. 2009; Darvish, Esmaeeli-Nieh et al. 2010; Halsall, Nicholas et al. 2010). Neueste Studien zeigen, dass auch Missense-Mutationen in ASPM als Ursache für MCPH angesehen werden können (Darvish, Esmaeeli-Nieh et al. 2010). Es scheint jedoch keine Konzentration von Mutationen an bestimmten Stellen des ASPM-Gens (sog. Hotspots) zu geben und sie scheinen auch unabhängig von der Ethnie vorzukommen (Nicholas, Swanson et al. 2009). Bei Patienten mit MCPH5 konnte eine Reihe verschiedener klinischer Auffälligkeiten beobachtet werden: Desir et al. (2008) konnten eine verminderte Gyrierung, die vor allem den frontalen Kortex betraf, beschreiben. Doch auch der umgekehrte Fall, bei dem der posteriore Kortex schwerer betroffenen war, wurde von Passemard, Titomanlio et al. (2009) beschrieben. Erweiterte und dysmorphe Ventrikel sowie eine partielle Agenesie des Corpus callosum fanden sich ebenfalls bei Patienten mit ASPM-Mutationen (Passemard, Titomanlio et al. 2009). Auffällig waren auch die Polymikrogyrie und fokale Dysplasien einiger MCPH5Patienten, die auf eine neuronale Migrationsstörung oder eine Störung der Schichtenbildung des Kortex als weitere Komponenten in der Pathogenese von ASPM-vermittelter MCPH hindeuten (Passemard, Titomanlio et al. 2009). Passemard et al. (2009) zeigten, dass auch ein annähernd normaler Kopfumfang bei Geburt (-2 bis -3 SD) durchaus mit Mutationen in ASPM vereinbar ist. Zudem waren die von ihnen untersuchten Patienten häufig nur von einer Intelligenzminderung (Patienten mit IQ bis 80) betroffen. Epilepsie, Pyramidenbahnzeichen, Hyperaktivität und Aufmerksamkeitsdefizite waren weitere klinische Auffälligkeiten (Passemard, Titomanlio et al. 2009). Desweiteren scheint es eine Korrelation von der Lokalisation der pathogenen Mutation und dem IQ der betroffenen Patienten zu geben: Passemard, Titomanlio et al. (2009) konnten zeigen, dass der durchschnittliche IQ-Wert der von ihnen untersuchten Patienten mit Mutationen in Exon 18 bei 64 lag. Lag die Mutation außerhalb von Exon 18, betrug der Durchschnitts-IQ 42. Die unterschiedliche phänotypische Ausprägung wird von den Autoren damit erklärt, dass Zellen von Patienten mit einer Mutation in Exon 18 noch in der Lage sind, eine der beiden Hauptisoformen des ASPM-Proteins zu bilden; nämlich die, die mit einem Verlust von Exon 18 – und damit der mutierten Aminosäuresequenz – einhergeht. Da diesen 25 Patienten eine Isoform von ASPM erhalten bleibt, könnte dadurch der mildere Phänotyp erklärt werden (Passemard, Titomanlio et al. 2009). 1.4.2.6. MCPH6/CENPJ 2003 konnte durch Kopplungsanalysen in einer konsanguinen brasilianischen Großfamilie der sechste MCPH-Locus auf Chromosom 13q12.2 ausgemacht werden (Leal, Roberts et al. 2003). Bond et al. (2005) konnten daraufhin Mutationen im CENPJ-Gen (Chromosom 13q12.2, OMIM 609279), auch als CPAP bezeichnet, in Patienten mit MCPH nachweisen und damit das zu diesem Zeitpunkt vierte MCPH-Gen beschreiben. CENPJ (17 Exons, 4370 bp) kodiert ein Protein aus maximal 1338 Aminosäuren. Eine Expression von CENPJ findet sich im Mausmodell vor allem im Neuroepithelium des frontalen Kortex an den lateralen Ventrikeln, wobei auch außerhalb des zentralen Nervensystems eine Expression nachgewiesen werden konnte (Bond, Roberts et al. 2005). Das CENPJProtein beinhaltet ein Mikrotubuli-destabilisierendes Motiv PN2-3, das vermutlich der Regulation des dynamischen Auf- und Abbaus der Mikrotubuli dient (Hung, Chen et al. 2004), und zwei Bindungsstellen für 14-3-3 (C-terminal), ein Signalprotein, das vermutlich eine Rolle in der Zellzykluskontrolle spielt; CENPJ könnte dabei durch seine Bindung an 14-3-3 eine wichtige Funktion in der Zellzykluskontrolle innehaben (Hermeking 2003; Chen, Olayioye et al. 2006). Eine Abnahme der zellulären CENPJ-Konzentration führt zu vermehrter Bildung multipler Spindelpole, Mitosearrest und Apoptose (Cho, Chang et al. 2006; Gul, Hassan et al. 2006; Kaindl, Passemard et al. 2010). Eine Überexpression des PN2-3 Motivs hingegen führt zum Ausbleiben der Zellteilung und induziert die Apoptose (Hung, Chen et al. 2004; Kaindl, Passemard et al. 2010). Eine zentrosomale Lokalisation konnte von Hung et al. (2000, 2004) während des gesamten Zellzyklus nachgewiesen werden. Eine hohe Konzentration an CENPJ-Protein findet sich vor allem während der Prometa- und Metaphase an den Spindelpolen (Bond, Roberts et al. 2005). Weiterhin bildet das Protein CENPJ einen Teil des γ-Tubulin-Ring-Komplexes (Hung, Tang et al. 2000), der die Ausbildung des Spindelapparats initiiert (Schiebel 2000). CENPJ scheint außerdem eine Rolle bei der NF-kappaB-abhängigen Transkription einzunehmen; es ist jedoch unwahrscheinlich, dass dieser Mechanismus einen Einfluss auf die Kortikoneurogenese hat (Peng, Sutherland et al. 2002; Koyanagi, Hijikata et al. 2005; Bond and Woods 2006; Gul, Hassan et al. 2006). Bisher sind vier Mutationen im CENPJ-Gen beschrieben, die zu MCPH6 führen (Bond, Roberts et al. 2005; Gul, Hassan et al. 2006; Darvish, Esmaeeli-Nieh et al. 2010). Es handelt sich dabei um jeweils zwei Missense- beziehungsweise Nonsense-Mutationen, wobei 26 sich eine der Missense-Mutationen (c.2462C>T, p.Thr821Met) in einem schwer mikrozephalen Phänotyp mit einem um -4 bis -6 SD vom Median abweichendem Kopfumfang findet (Darvish, Esmaeeli-Nieh et al. 2010). Eine weitere Mutation in CENPJ konnte außerdem bei einer konsanguinen Familie aus Saudi-Arabien mit klinischem Verdacht auf Seckel-Syndrom nachgewiesen werden (AlDosari, Shaheen et al. 2010). Eine der beiden Patientinnen zeigte neben einer schweren primären Mikrozephalie (-7,5 SD) auch eine ausgeprägte Wachstumsstörung (-7 SD) ohne psychomotorische Einschränkungen. Auch beim Seckel-Syndrom wird eine Fehlfunktion des Spindelapparats angenommen (Rauch, Thiel et al. 2008). Eine Erklärung könnten die ähnlichen zellulären Aufgaben von CENPJ und PCNT sein, einem Protein, das bei Patienten mit Seckel-Syndrom gestört ist (Al-Dosari, Shaheen et al. 2010), denn beide beeinflussen den γ-Tubulin-Ring-Komplex (Zimmerman, Sillibourne et al. 2004). 1.4.2.7. MCPH7/STIL Durch Kopplungsanalysen in zum größten Teil konsanguinen indischen Familien konnten Kumar et al. (2009) den siebten MCPH Locus und das zugehörige Gen STIL (Chromosom 1p32, OMIM 612703) beschreiben. Schon länger ist bekannt, dass STIL im proliferierenden fetalen Gewebe ubiquitär exprimiert wird (Izraeli, Colaizzo-Anas et al. 1997; Izraeli, Lowe et al. 1999). Die Expression scheint dabei durch den Transkriptionsfaktor E2F1 reguliert zu werden (Erez, Chaussepied et al. 2008). E2F1 kontrolliert die Transkription von Genen, die mitotische Checkpointproteine kodieren (Erez, Chaussepied et al. 2008). Analysen eines 16 Wochen alten Feten konnten zeigen, dass STIL während der fetalen Entwicklung auch im menschlichen Gehirn exprimiert wird (Kumar, Girimaji et al. 2009). In Mausembryonen konnte eine Expression im Kortex am Embryonaltag 14,5 nachgewiesen werden (Smith, Finger et al. 2007). Auf zellulärer Ebene lässt sich eine vermehrte Expression in der Region um den Nukleus detektieren, die vermutlich eine Rolle beim Eintritt in die Mitose spielt (G2/M-Kontrollpunkt) (Kaindl, Passemard et al. 2010). Die Funktion des STIL-Proteins ist noch nicht genau geklärt. Die volle Länge beinhaltet 1287 Aminosäuren mit einem vermeintlichen Kernlokalisationssignal und einer TGF-beta (englisch: Transforming Growth Factor beta, TGF-beta) ähnlichen Domäne am CTerminalen Ende des Proteins (Karkera, Izraeli et al. 2002; Kaindl, Passemard et al. 2010). TGF-beta ist ein Signalprotein, das in der embryonalen Entwicklung unter anderem Zellproliferation und Zelldifferenzierung beeinflussen kann. 27 In Zebrafisch-Mutanten mit einem Funktionsverlust des orthologen31 Gens sil zeigten sich hochgradig veränderte Spindelapparate (Pfaff, Straub et al. 2007). Weitere Analysen erbrachten eine fehlerhafte Polymerisation der mitotischen Spindeln auch in menschlichen HeLa-Zellen 32 mit ausgeschaltetem STIL-Gen; eine Lokalisation des humanen STILProteins an den Spindelpolen konnte während der Metaphase nachgewiesen werden (Pfaff, Straub et al. 2007). Nach Phosphorylierung während der Mitose interagiert STIL mit PIN1, einem Mitose regulierendem Protein (Campaner, Kaldis et al. 2005). Erez et al. (2007) konnten später zeigen, dass STIL durch Aktivierung des CDK1/Cyclin B Komplexes für den Eintritt der Zelle in die Mitose essentiell ist. STIL scheint außerdem in der Tumorentwicklung eine Rolle zu spielen: neben einer Assoziation zu T-Zell-Lymphomen konnte eine erhöhte Expression von STIL in verschiedenen Tumorarten beschrieben werden, die mit einer vermehrten Expression von Spindelcheckpoint- Genen einhergehen und ein erhöhtes Potenzial zur Metastasierung zeigen; dabei konnte bei einem Knockdown von STIL eine erhöhte Apoptoserate beobachtet werden (Erez, Perelman et al. 2004; Erez, Castiel et al. 2007). Im Mausmodell führt ein Knockdown von STIL zu Entwicklung von Neuralrohrdefekten, Holoprosenezphalie und der verminderten Expression verschiedener Gene, die in der embryonalen Entwicklung eine Schlüsselrolle einnehmen, wie zum Beispiel Sonic Hedgehog (Shh) (Izraeli, Lowe et al. 1999). Die bisher bekannten Aufgaben von STIL lassen sich also folgendermaßen zusammenfassen: Funktion beim Eintritt der Zelle in die Mitose, Organisation eines funktionsfähigen Spindelapparats, Aufrechterhaltung der Teilungsfähigkeit von Tumorzellen und vermutlich eine Mitbeteiligung am Shh-Signalweg. Bisher wurden drei Mutationen im STIL-Gen bei Patienten mit MCPH7 beschrieben; es handelt sich dabei um zwei Nonsense-Mutationen und eine Deletion, die alle eine Trunkierung des Proteins zur Folge haben (Kumar, Girimaji et al. 2009). 1.4.3. Evolutionäre Aspekte bei MCPH Die Zunahme der absoluten und relativen33 Größe des menschlichen Gehirns, insbesondere des zerebralen Kortex, innerhalb der letzten drei bis vier Millionen Jahre ist von enormer Relevanz für die Entwicklung der außerordentlichen kognitiven Leistungen des Homo sapiens. Die genetischen Ursachen für diesen Prozess sind noch nicht hinreichend geklärt. Die Gehirngröße von Patienten mit schwerer MCPH ist vergleichbar mit unseren phylogenetisch nächsten Verwandten, dem Gorilla und dem Schimpansen (Woods 2004). MCPH kann 31 Funktional verwandte Gene oder Proteine verschiedener Spezies werden als ortholog bezeichnet. Diese Gene entstammen dabei einer gemeinsamen entwicklungsgeschichtlichen Linie. 32 Erste menschliche Zelllinie aus Epithelzellen des Zervixkarzinoms der US-amerikanischen Patientin Henrietta Lacks. 33 Die relative Gehirngröße wird in Bezug zu Größe und Gewicht des Individuums errechnet. 28 daher als Modellerkrankung für einen „evolutionären Rückschritt“ angesehen werden, da die Gehirngröße von MCPH-Patienten der sehr früher Hominide entspricht (Rakic 1995; Evans, Anderson et al. 2004; Wang and Su 2004; Kaindl, Passemard et al. 2010). Ein Vergleich der MCPH-Gene mit ihren orthologen Entsprechungen in Primaten und anderen Säugetieren, die eine geringere relative Gehirngröße zeigen (vgl. Tabelle 2), kann dabei helfen, Mechanismen aufzudecken, die zu einer Größenzunahme des menschlichen Gehirns während der Evolution beigetragen haben (Woods 2004). Die MCPH-Gene ASPM, CENPJ, CDK5RAP2 und MCPH1 unterlagen dabei einer positiven Selektion34 (Zhang 2003; Evans, Anderson et al. 2004; Evans, Anderson et al. 2004; Wang and Su 2004; Kouprina, Pavlicek et al. 2005; Evans, Vallender et al. 2006; Montgomery, Capellini et al. 2011). Tabelle 2 Relative Gehirngröße ausgewählter Säugetierspezies (Fish, Dehay et al. 2008) Spezies Maus Affe Mensch EQ* 0,5 2,09 7,44 Neurone im Gehirn 7 10 9 10 11 10 * Der EQ ist ein Wert für die relative Gehirngröße (Jerison 1973, S.61); EQ-Daten aus Macphail 1982, S.243,277; Anzahl Neurone (geschätzt) von Braitenberg (Braitenberg 2001) Bei ASPM handelt es sich um ein Gen, das allgemein stark konserviert wurde. Bond et al. (2002) konnten jedoch eine Korrelation zwischen der Länge der IQ-Domäne in ASPM und der Gehirngröße in verschiedenen Spezies35 aufzeigen. Obwohl die Funktion dieser IQ-Domänen nicht geklärt ist, zeigen Patien- ten mit Mutationen, die zu einer Verkürzung der IQ-Wiederholungen führen, einen mikrophalen Phänotyp; die IQ-Domänen scheinen daher eine essentielle Rolle in der Größenentwicklung des Gehirns einzunehmen (Bond, Roberts et al. 2002). Da ASPM vor allem die Größenzunahme des Kortex beeinflusst (Bond, Roberts et al. 2002), sind vermutlich unterschiedliche Gene an der allgemeinen Größenentwicklung des Gehirns beteiligt (Kaindl, Passemard et al. 2010). Montgomery et al. (2011) konnten zeigen, dass eine adaptive Evolution der Gene ASPM und CDK5RAP2 durch deren Funktion in der pränatalen Kortikoneurogenese die Anzahl der Neurone und die Hirngröße beeinflusst haben könnte. Interessanterweise führten Mutationen des CDK5RAP2-Gens bei Mäusen zur verminderten Ausbildung vor allem der oberflächlichen kortikalen Schichten (Lizarraga, Margossian et al. 2010). Diese später gebildeten Neurone entwickelten sich erst nach der entwicklungsgeschichtlichen Trennung von Reptilien und Säugetieren (Nieuwenhuys 1994; Lizarraga, Margossian et al. 2010). Eine Beteiligung der Gene CENPJ und MCPH1 an der evolutionären Entwicklung der Gehirngröße scheint jedoch nicht vorzuliegen (Montgomery, Capellini et al. 2011). 34 Die positive Selektion beschreibt das Phänomen, der schnelleren Verbreitung von Mutationen innerhalb einer Population, die zu einer besseren Anpassung eines Individuums führen. 35 Homo sapiens, Mus musculus (Maus), Drosophila melanogaster (Fruchtfliege), Caenorhabditis elegans (Fadenwurm) 29 1.5. Fragestellung Die autosomal rezessive primäre Mikrozephalie (MCPH) stellt eine seltene hereditäre Erkrankung dar und betrifft vorrangig konsanguine Familien. Bisher wurden sieben Gene identifiziert, in welchen Mutationen zum äußerst heterogenen Phänotyp MCPH führen können. Am häufigsten sind Mutationen im ASPM-Gen anzutreffen. Eine klinische Verdachtsdiagnose kann per Ultraschall ab der 24. Schwangerschaftswoche erfolgen. Mittels Chorionzottenbiopsie oder Amniozentese kann bereits pränatal fetale DNA gewonnen und eine molekulargenetische Analyse der sieben MCPH-Gene durchgeführt werden. Durch Kopplungsanalysen mit polymorphen Mikrosatellitenmarkern wurden in neun Familien mit insgesamt 17 Kindern mit Verdacht auf MCPH Haplotypen für alle bekannten MCPH-Loci erstellt. In der anschließenden Sequenzierung und Mutationsanalyse sollte – neben der Etablierung der molekulargenetischen Methoden – eine Analyse des betroffenen Gens und damit eine Diagnosesicherung bzw. Ausschluss der Diagnose nach heutigem Kenntnisstand erfolgen. Dies sollte zur Klärung folgender Fragen beitragen: Stellt eine vorangehende Untersuchung mit Mikrosatellitenmarkern eine effiziente Strategie zum Auffinden von Mutationen in häufigen und auch seltenen MCPH-Loci dar? Falls Mutationen in bekannten MCPH-Genen nachgewiesen oder vermutete Kopplungen ausgeschlossen werden können, stimmt die Häufigkeit dieser Ergebnisse mit den bisher in der Literatur beschriebenen Daten überein? Können bisher unbeschriebene Mutationen oder Sequenzvariationen in MCPH-Genen gefunden werden, um eine Diagnosestellung in Zukunft zu vereinfachen, die molekularen Ursachen der MCPH zu erweitern und den Familien eine Erklärung für ihre Erkrankung zu liefern? Tragen die Ergebnisse zu einer Verbesserung der pränatalen Diagnostik von MCPH bei und ermöglichen so eine gezieltere Familienplanung? Welcher Art sind diese Mutationen und zu welchem Phänotyp führen sie? Können zusätzliche phänotypische Auffälligkeiten beschrieben werden, die bisher unbekannt sind? Lässt sich durch eine klinische Analyse der Patienten nach molekulargenetischer Diagnosesicherung eine Korrelation zwischen Genotyp und Phänotyp ableiten, obwohl diese bisher bei MCPH noch nicht eindeutig beschrieben wurden? 30 2. Material und Methoden 2.1. Patientenkollektiv Das uns zur Verfügung stehende Patientenkollektiv umfasste neun Familien mit insgesamt 17 Kindern, bei denen ein klinischer Verdacht auf primäre Mikrozephalie bestand. Im Folgenden sind die – soweit uns bekannten – klinischen und radiologischen Befunde der Patienten sowie die Herkunft und Stammbäume ihrer Familien aufgeführt. 2.1.1. Familie 5398: Patient D5398 I II III 5 ? 1 4 3 2 IV 1 2 3 4 D5399 6 5 D5400 V 1 2 D5398 3 Abb. 9 Stammbaum der Familie 5398 Familie 5398 stammt aus der Türkei. Ihr gehören die gesunden Eltern D5399 und D5400 (siehe Abb. 9 IV.4 und 5) und die betroffene Tochter D5398 (V.2) an. Eine vorangegangene Schwangerschaft endete in der 5. SSW mit einem Abort (V.1). Das Verwandtschaftsverhältnis der Eltern ist enger als das von Cousin und Cousine ersten Grades, da bereits die Eltern des Vaters (III.1 und 2) Vettern waren. In der Familie sind mehrere Fälle von Mikrozephalie bekannt: zwei Geschwister des Vaters (IV.1 und 2) wurden mikrozephal geboren und sind bereits verstorben. Ebenso haben ein Bruder des Vaters (IV.3) und eine Schwester der Mutter (IV.6) einen von Mikrozephalie betroffenen Sohn. 31 Die Indexpatientin D5398 wurde in der 40+6 Schwangerschaftswoche (SSW) mit einem Kopfumfang von 31,4 cm (0,3 cm < 3. Perzentile36, -2,1 SD) und einem Gewicht von 3830 g (85.-95. Perzentile) bei einer Länge von 53 cm (0,5 cm > 97. Perzentile) geboren. Es handelte sich um eine unauffällige Schwangerschaft, bis im siebten Schwangerschaftsmonat (SSM) per Sonographie ein verminderter Kopfumfang auffiel. Ein Stoffwechsel-Screening und eine TORCH-Serologie37 erbrachten kein pathologisches Ergebnis. Auch eine Chromosomenanalyse zeigte einen unauffälligen weiblichen Karyotyp. In der MRT (siehe Abb. 10) im Alter von sechs Jahren zeigten sich eine ausgeprägte Mikrozephalie mit schwerer Lissenzephalie Grad 1-2 nach Barkovich (Pilz, Matsumoto et al. 1998), sowie eine Balkenagenesie und eine schwere zerebelläre Hypoplasie. Weiterhin offenbarte sich eine Verminderung der weißen Substanz. Abb. 10 Photo und MRT-Bilder der Patientin D5398. (a) D5398 zeigt, bis auf eine fliehende Stirn, keine fazialen Auffälligkeiten. (b) MRT, medial, Zerebellumhypoplasie. (c) MRT, axial, erweiterte innere und äußere (Pfeil) Liquorräume bei ausgeprägter Agyrie bis Pachygyrie. Im EEG konnten „schwere Allgemeinveränderungen“ beobachtet werden, über die uns jedoch keine näheren Angaben vorliegen. Im Alter von sechs Wochen traten im Anschluss an einen Infekt Krampfanfälle auf, die mit dem Antiepileptikum Topiramat und dem Barbiturat Phenobarbital behandelt wurden. Dennoch konnten etwa alle sechs bis acht Wochen sowohl Grand-Mal- als auch Petit-Mal-Anfälle beobachtet werden. Im Alter von 18 Monaten wurde bei der Patientin eine hochgradige Innenohrschwerhörigkeit diagnostiziert. Es erfolgte eine Adenotomie sowie eine Paracentese. Ebenso wurde ein Hörgerät angepasst. Aufgrund einer schweren Schluck-Koordinationsstörung, welche sich durch rezidivierende Aspiration von Nahrung manifestierte, musste eine Magensonde (sog. PEG-Sonde) gelegt werden, um das damals dreijährige Mädchen ausreichend zu ernähren. Weiterhin zeigte die Patientin eine beinbetonte muskuläre Hypertonie. Hierdurch kam es zu einer Abduktions36 Alle Angaben zu Perzentilen und Standardabweichungen beziehen sich bis zum 5. Lebensjahr auf die aktuellen WHO Child Growth Standards (de Onis et al. 2006 und 2007) und ab dem 5. Lebensjahr auf Exner 2003 (S. 1-23) 37 TORCH: Toxoplasmosa gondii, andere (englisch: other) (Parvovirus B19, Hepatitis C, Varizella-Zoster Virus, Coxsackie-Virus, Listeriose), Rubella, Cytomegalie-Virus, Chlamydia trachomatis, Herpes-simplex-Virus 32 kontraktur der linken Hüfte und einer fraglichen Hüftluxation der rechten Seite mit Beinverkürzung. An skelettalen Veränderungen findet man bei der Patientin eine Kielbrust und eine Kyphoskoliose. Desweiteren fallen eine Hypertrichose und Uhrglasnägel auf. Nach Angaben der Eltern handelt es sich um ein sehr ruhiges Kind, das kaum weint und vermutlich nur hell und dunkel unterscheiden kann. Es kann seine Mutter durch Anfassen erkennen und seine Gefühle durch Lachen oder Schimpfen ausdrücken. Die Sprachentwicklung blieb bei der Patientin aus. 2.1.2. Familie 5533: Patienten D5533, D5534 Die gesunden Eltern D5536 und D5535 (siehe Abb. 11 III.1 und III.2) sind Cousin und Cousine ersten Grades und stammen aus Algerien. Von den beiden betroffenen Kindern (IV.1 und IV.2) der Familie verstarb die erste Tochter, D5534, im Alter von 25 Monaten. Das dritte Kind der Familie ist phänotypisch gesund. Eine Nichte (IV.3) der Mutter hat ebenfalls einen sehr verminderten Kopfumfang, entwickelt sich jedoch weiter. I II III 1 D5536 2 D5535 3 IV 1 D5534 2 D5533 3 Abb. 11 Stammbaum der Familie 5533 Die Patientin D5534 wurde in der 39. SSW mit einem Geburtsgewicht von 2460 g (3.-5. Perzentile, -5,2 SD) und einer Länge von 46 cm (3.-5. Perzentile, -1,7 SD) geboren. Bereits in der 31. SSW konnte sonographisch ein Mikrozephalus mit Vermishypoplasie diagnostiziert werden. Der KU betrug bei Geburt 27,5 cm (4,2 cm < 3. Perzentile, -5,4 SD). Im Alter von zwei Monaten maß dieser 28,5 cm (7,2 cm < 3. Perzentile, -8,1 SD) und im Alter von vier Monaten 30 cm (8,2 cm < 3. Perzentile, -8,4 SD), so dass es sich um einen progredienten Mikrozephalus handelt. Zudem zeigte die Patientin einen progredienten Kleinwuchs. Im Alter von acht Wochen konnte eine Körperlänge von 50 cm (2,8 cm < 3. Perzentile, -3,3 SD) und im Alter von vier Monaten von 52 cm (6 cm < 3. Perzentile, -4,7 SD) gemessen werden. In der Chromosomenanalyse wurden keine strukturellen oder numerischen Veränderungen nachgewiesen. Eine zytogenetische Untersuchung und eine Analyse der auf subtelomerische Veränderungen mittels Fluoreszenz-in-situ-Hybridisierung (FISH) erbrachte 33 ebenfalls keine Auffälligkeiten. Die Röntgenuntersuchung des Skeletts im Alter von neun Monaten erbrachte keinen Hinweis auf osteoplastische Veränderungen, so dass auch eine Erkrankung aus dem Formenkreis der Seckel-Syndrome ausgeschlossen werden konnte. Mittels MR-Tomographie konnten bei der Patientin zusätzlich zum Mikrozephalus eine Agenesie des Corpus callosum, eine Lissenzephalie mit Kleinhirnhypoplasie und eine fragliche Dandy-Walker-Zyste38 gefunden werden. Die MRT-Bilder zu diesem Fall liegen leider nicht vor. Als Zusatzbefund fiel bei dem Mädchen eine beidseitige Hydronephrose auf. Während der Schwangerschaft mit der zweiten Tochter der Familie erfolgte eine Amniozentese. Bei der folgenden Analyse des Fruchtwassers zeigte sich kein pathologischer Befund. Über das Gestationsalter und den Kopfumfang bei Geburt liegen keine Daten vor. Die MRTBefunde erbrachten eine Mikro-/Lissenzephalie mit Pachygyrie und Balkenhypoplasie. Röntgenaufnahmen von Schädel, Thorax, Wirbelsäule und Becken zeigten wie bei der Schwester keine pathologischen Skelettveränderungen. 2.1.3. Familie 5938: Patienten D5938, D5939 I II III 2 1 D5941 D5940 IV 1 2 3 D5938 4 D5939 Abb. 12 Stammbaum der Familie 5938 Die türkisch-stämmigen Eltern D5941 und D5940 (siehe Abb. 12 III.1 und III.2) sind Cousin und Cousine ersten Grades. Der erste Sohn (IV.1) leidet an β-Thalassämia major. Von den beiden Zwillingsbrüdern (IV.2 und IV.3) ist der Indexpatient D5938 von Mikrozephalie betroffen. Ebenso entwickelte das vierte Kind der Familie, D5939 (IV.4), einen deutlich verminderten Kopfumfang. Im Folgenden sind die klinischen und pathologischen Befunde der betroffenen Patienten dargestellt: 38 auch Dandy-Walker-Malformation genannt: hypoplastischer Vermis cerebelli mit zystischer Erweiterung des vierten Ventrikels 34 Die Geburt des Patienten D5938 erfolgte in der 38. SSW mit einem Geburtsgewicht von 2290 g (210 g < 3. Perzentile) und einer Länge von 46 cm (0,3 cm < 3. Perzentile). Der KU bei Geburt ist nicht bekannt, lag aber laut pädiatrischen Arztbriefen unter der dritten Perzentile. Im Alter von vier Monaten erfolgte eine Sonographie und im Alter von 17 Monaten eine Röntgenaufnahme des Schädels, wobei Nahtsynostosen als Ursache für den verminderten Kopfumfang ausgeschlossen werden konnten. Eine numerische und strukturelle Chromosomenanalyse zeigte einen normalen männlichen Karyotyp. Auch ein Verdacht auf Fragiles-X-Syndrom konnte nicht bestätigt werden. Die Messung der Schilddrüsenhormone TSH und freies T3 (fT3) mit der Frage nach Hypothyreoidismus erbrachten, neben einem dezent erhöhtem Wert an freiem T4 (fT4), ebenfalls einen Normwert. Bei der Analyse der Guanidinoverbindungen (Kreatinin und Guanidinoacetat) im Urin fanden sich keine abnormen Werte 39 . Weiterhin erbrachte auch ein virologisches und serologisches Screening keine Hinweise auf eine Infektion mit Rubella, Zytomegalieviren, Herpessimplex-Viren oder Toxoplasma gondii als Ursache der Mikrozephalie. In der Magnetresonanztomographie (MRT) zeigten sich eine geringe Erweiterung der Seitenventrikel im Sinne einer leichten subkortikalen Atrophie und eine vereinfachte Gyrierung. Die MR-Bilder liegen jedoch nicht vor. Im Alter von 21 Monaten entwickelte D5938 eine Frontallappenepilepsie mit tonischklonischen Anfällen und Bewusstlosigkeit über drei bis vier Minuten, die jedoch erst im Alter von neun Jahren als solche im EEG nachgewiesen werden konnte. Es erfolgte eine medikamentöse Einstellung mit dem Antikonvulsivum Oxcarbamazepin. Die statomotorische Entwicklung erfolgte regelrecht: Stehen und Gehen war dem Patienten mit vierzehn Monaten möglich, mit neun Jahren sicheres Fahrradfahren ohne Stützräder40. Die sprachliche Entwicklung hingegen verlief verzögert. Erst mit fünfzehn Monaten war der Patient in der Lage, erste Worte („Mama“ und „Papa“) zu bilden. Im Alter von neun Jahren formulierte er Sätze aus drei bis vier Worten41. Bei der pädiatrischen Untersuchung im zehnten Lebensjahr zeigte sich ein Kleinwuchs (124 cm, 6 cm < 3. Perzentile). Der KU betrug 46,5 cm (4 cm < 3. Perzentile). Die geistige Entwicklungsstufe des Patienten entsprach der eines zwei- bis dreijähri- 39 Guanidinoverbindungen können bei den hereditären Kreatinmangelsyndromen (GAMT-Defekt, AGAT-Defekt und CrT-Defekt), welche mit geistiger Retardierung, epileptischen Anfällen, autistischem Verhalten und expressiver Sprachstörung einhergehen, durch erhöhte beziehungsweise erniedrigte Werte gekennzeichnet sein. (Stockler, Schutz et al. 2007, Hoffmann 2004, S.102-108) 40 Zeitfenster normale motorische Entwicklung: Sitzen ohne Hilfe 4 - 9 Monate, Laufen ohne Hilfe 8 - 17 Monate (World Health Organization 2006) bzw. freies Sitzen 7 - 9 Monate, freies Laufen 12,3 - 16 Monate (nach Denver Developmental Screening Test, Sitzmann 2007, S. 10) 41 Zeitfenster normale sprachliche Entwicklung (kulturunabhängig (Yule 1996, S.176-9)): „Mama“ und „Papa“ ungezielt 6,5 - 12 Monate (nach Denver Developmental Screening Test (Sitzmann 2007, S. 10)) (Saxton 2010, S. 7-8) 35 gen Kindes. Die sonstigen neurologischen und internistischen Untersuchungen waren unauffällig. Die Geburt des vierten Kindes, D5939, erfolgte in der 42. SSW mit einem Geburtsgewicht von 3710 g (85. Perzentile), einer Länge von 51 cm (75.-85. Perzentile) und einem Kopfumfang von 34 cm (50.-75. Perzentile). Im ersten Lebensjahr wurde ein progredienter Mikrozephalus auffällig und im Alter von 20 Monaten wurde ein Kopfumfang von 42 cm (2 cm < 3. Perzentile, -3,3 SD) gemessen. Im Alter von sieben Jahren wog die Patientin 19 kg (3.-10. Perzentile) bei einer Größe von 112 cm (3. Perzentile) und hatte einen KU von 45,5 cm (3,1 cm < 3. Perzentile). Eine numerische und strukturelle Chromosomenanalyse und Diagnostik auf Fragiles-X-Syndrom ergaben jeweils einen Normalbefund. Ebenso zeigten ein Stoffwechselscreening im Urin mit Bestimmung der organischen Säuren und Aminosäuren keine pathologischen Auffälligkeiten. Bei der Analyse der Guanidinoverbindungen im Urin zeigten sich auffällige Werte, so dass zweimal der Verdacht auf einen L-Arginin:GlycinAmidinotransferase-Defekt (AGAT-Defekt) gestellt wurde, der mit verminderten Guanidinoacetatwerten in Urin und Plasma einhergeht (Hoffmann 2004, S. 102108) 42 . Mittels MR-Spektroskopie konnte jedoch ein intrazerebraler Kreatinmangel ausgeschlossen werden. Eine MRT-Untersuchung des Schädels im vierten Lebensjahr der Patientin zeigte neben einer beidseits dezent plumpen Gyrierung frontoparital und der bekannten Mikrozephalie keine weiteren Auffälligkeiten. Im Alter von acht Jahren wurde die Patientin mit nächtlichen Krampfanfällen auffällig. Diese gingen mit Tonusverlust und schnarchender Atmung einher und dauerten etwa eine Minute. Es zeigte sich ein pathologisches EEG mit Seitendifferenz bei einem rechts-parieto-occipital flacheren Kurvenbild, jedoch ohne epilepsietypische Potentiale. Es erfolgte eine medikamentöse Einstellung mit den Antikonvulsiva Oxcarbazepin und Sultiam. In der neurologischen Untersuchung zeigte sich eine globale psychomotorische Entwicklungsverzögerung. In der weiteren pädiatrischen Untersuchung fielen zudem drei Café-au-lait-Flecken am Stamm und eine Hypertrichose der Unterschenkel auf. Die Patientin leidet desweiteren unter einem Strabismus convergens des linken Auges und einer Hyperopie. 42 Bei den betroffenen Patienten führt dieser autosomal rezessiv vererbte Kreatintransporter-Defekt zu mentaler Retardierung und Sprachentwicklungsstörungen ohne Epilepsie (Hoffmann 2004, S.102-108). 36 2.1.4. Familie 6116: Patienten D6116, D6118 Die Eltern D6120 und D6119 (siehe Abb. 13 III.1 und IV.1) sind Cousin und Cousine mit Generationenverschiebung und stammen aus Afghanistan. Beide betroffenen Kinder D6116 und D6118 (V.1 und V.3) wurden mit einem Kopfumfang von jeweils 30,5 cm (-3,1 SD) geboren. Das Geburtsgewicht des Kindes D6116 lag mit 2900 g auf der 15. Perzentile bei einer ebenfalls zeitgerechten Körperlänge von 49 cm (25.-50. Perzentile). Der Kopfumfang betrug im Alter von 14 Monaten 38 cm (-6,6 SD). Mit einem Jahr betrug die Körpergröße des Patienten D6116 72 cm (5.-15. Perzentile), was einer normalen Entwicklung entspricht. I II III 1 IV D6120 1 D6119 V 1 D6116 3 2 D6117 D6118 Abb. 13 Stammbaum der Familie 6116 Der jüngere Bruder D6118 wurde mit einem ebenfalls normalen Gewicht (2600 g, 5. Perzentile) und normaler Körperlänge (50 cm, 50.-75. Perzentile) geboren. Auch er entwickelte einen progredienten, wenn auch im Vergleich zum Bruder weniger stark ausgeprägten Mikrozephalus: im Alter von vier Jahren konnte ein Kopfumfang von 43 cm gemessen werden, was einer Abweichung von -4,9 SD zum Median entspricht. D6118 entwickelte im Alter von 18 Monaten eine therapierefraktäre Epilepsie. Weiterhin fiel ein stark verzögerter Spracherwerb auf: erste einzelne Worte konnte der Junge im Alter von sechs Jahren 43 sprechen. Laufen erlernte D6118 mit 14 Monaten44, wobei er jedoch einen Zehengang entwickelte. Der Patient zeigte ein normales Längenwachstum mit einer Körpergröße von 109 cm (25.-50. Perzentile) im Alter von fünf Jahren. Die MRT-Untersuchung des Patienten D6118 offenbarte neben der Mikrozephalie eine verminderte Gyrierung (siehe Abb. 14) bei ansonsten unauffälliger Gehirnstruktur. 43 44 Zeitfenster normale sprachliche Entwicklung: vgl. Fußnote 41 Zeitfenster normale motorische Entwicklung: vgl. Fußnote 40 37 b a Abb. 14 MRT-Bilder des Patienten D6116. (a) MRT, median. (b) MRT, axial 2.1.5. D5748 Familie 5745: Patienten D5745, D5746 D5747 Das gesunde Paar D5748 und D5747 ist deutscher Abstammung und nicht miteinander verwandt (siehe Abb. 15). Beide Kinder der Familie sind von Mikrozephalie betroffen. Bei dem erstgeborenen Sohn, D5745, wurde im Alter von neun Jahren laut Arztbrief ein Kopfumfang mit einer Abwei- D5745 D5746 chung von -2,24 SD vom Median gemessen. Die Größe be- Abb. 15 Stammbaum der Fami- trug zu diesem Zeitpunkt 131 cm (25.-50. Perzentile). Der KU lie 5745 bei Geburt ist nicht bekannt. Ein Screening des Subtelomerbereichs mittels MLPA erbrachte keinen Hinweis auf unbalancierte telomer-nahe Chromosomenstörungen. Auch mittels SNP-Microarrayanalyse mit der Frage nach genomischen Duplikationen oder Deletionen konnten keine auffälligen Ergebnisse nachgewiesen werden. In der MRT zeigten sich eine noduläre Heterotopie subependymal rechts im Sinne einer Migrationsstörung und ein atypischer dritter Ventrikel. Die MRT-Aufnahmen liegen nicht vor. Bei dem Patienten fand sich außerdem eine mediale Gaumenspalte, welche operativ verschlossen werden konnte. Nebenbefundlich zeigten sich eine Uvula bifida und tiefsitzende Ohren. Zudem fiel ein leichter Hypotelorismus auf, der jedoch auch von der Mutter D5747 dokumentiert ist. Eine neurologische Untersuchung erbrachte einen Normalbefund. Die psychomotorische Entwicklung des Jungens wird als verzögert beschrieben. Nähere Daten zu sprachlichen und motorischen Fortschritten liegen allerdings nicht vor. Die Schwester, D5746, zeigte neben einer Mikrozephalie keine weiteren zerebralen Auffälligkeiten. Der Kopfumfang betrug im Alter von 5 5/12 Jahren 46 cm (2 cm < 3. Perzentile) bei einer Größe von 110 cm (25. Perzentile). Ein Stoffwechselscreening erbrachte keinen Hinweis auf Fettsäure-Abbau-Defekte oder Aminoazidopathie. Auch bei ihm wurden eine 38 Gaumenspalte und tiefsitzende Ohren festgestellt. Zusätzlich konnte eine Pulmonalklappenstenose diagnostiziert werden. Die Uvula des Patienten präsentierte sich verdickt mit angedeuteter Spaltung. Wie auch bei der Schwester zeigte sich bei D5746 eine psychomotorische Entwicklungsverzögerung, die jedoch nicht näher beschrieben wurde. 2.1.6. Familie 5663: Patienten D5663, D5664, D5665 Die Eltern der Familie 5663 stammen aus D5667 D5666 Schweden und sind gesund. Es besteht keine Konsanguinität (siehe Abb. 16). Die drei betroffenen Kinder, die im Abstand von 13 und 23 Monaten geboren wurden, starben alle innerhalb der ersten drei Lebensmonate. Der D5663 D5664 D5665 Abb. 16 5663 15 Stammbaum der Familie F5663 Kopfumfang bei Geburt ist nicht bekannt. Um das Risiko eines erneuten Auftretens eines Mikrozephalie-Falles zu minimieren, entschloss sich das Paar zur Erfüllung seines Kinderwunsches zu einer heterogenen Insemination. Die Frau konnte daraufhin ein gesundes Kind gebären. Das klinische Bild der Patienten gestaltete sich sehr homogen. Alle litten unter schweren Neugeborenenkrämpfen und zeigten einen Muskelhypotonus. Eine konventionelle zytogenetische Untersuchung und FISH-Analyse auf Lissenzephalie Typ 1 zeigten bei allen Kindern einen Normalbefund. Auch in einem Screening auf angeborene Stoffwechselstörungen (inklusive CDG45) konnten keine Hinweise auf eine metabolische Ursache für den Mikrozephalus der Geschwister gefunden werden. Ein Screening bei D5665 auf Mikrodeletionen im Subtelomerbereich, welche häufig bei mentaler Retardierung auftreten (De Vries, Winter et al. 2003) erbrachte ebenfalls ein unauffälliges Ergebnis. Die Ergebnisse der MR-Tomographie zeigten bei der Patientin D5663 eine deutlich reduzierte Gyrierung (siehe Abb. 17 a). Diese Pachygyrie konnte beim Bruder D5665 vor allem frontal dargestellt werden (siehe Abb. 17 b und c). Somit entsteht ein fronto-okzipitaler Gradient in der Gyrierung, der typischerweise bei Mikrozephalie, die durch Mutationen im ASPM-Gen verursacht wird (MCPH5), gefunden werden kann (Desir, Cassart et al. 2008). Zudem zeigte sich beim Patienten D5665 eine Hypoplasie des Corpus callosum (siehe Abb. 17 b). 45 CDG = Congenital Disorders of Glycosylation: stellen autosomal rezessiv vererbte Störungen der Glykoprotein-biosynthese dar. Die häufigste Form ist Typ CDG-1a (Mutationen im Gen PMM2), das mit mentaler Retardierung, zerebellärer Hypoplasie, Epilepsie und Atrophie der unteren Extremitäten einhergehen kann. (Jaeken and Carchon 1993, Schollen, Kjaergaard et al. 2000) 39 a c b Abb. 17 MRT-Bilder der Patienten D5663 und D5665. (a) D5663: MRT, koronar. (b) D5665: MRT, median, hypoplastisches Corpus callosum (Pfeil) und deutlicher A>P-Gradient der Gyrierung. (c) D5665: MRT, axial. 2.1.7. Familie 5424: Patienten D5424, D5425 Die Mutter D5427 der Familie 5424 stammt aus Deutschland, der Vater D5428 ist US- D5427 D5428 amerikanischer Abstammung, beide sind gesund und nicht verwandt (siehe Abb. 18). Von den drei Töchtern der Familie sind zwei Patientinnen von Mikrozephalie betroffen. Zur Familie gehört zudem noch eine Tochter aus D5429 D5424 D5425 D5426 einer früheren Partnerschaft der Mutter, die gesund ist. Abb. 18 Stammbaum der Familie 5424 Die klinischen und pathologischen Befunde sind im Folgenden dargestellt: Die Geburt der Patientin D5424 erfolgte in der 38. SSW in den USA. Im letzten Trimenon der Schwangerschaft zeigten sich in der Sonographie ein Oligohydramnion und ein Minderwuchs des Feten. Das Gewicht bei Geburt betrug 2037 g (370 g < 3. Perzentile, -8,2 SD) bei einer Länge von 41 cm (4,6 cm < 3. Perzentile, -4,4 SD) und einem KU von 25,5 cm (6,2 cm < 3. Perzentile, -7,1 SD). Zudem fielen direkt nach der Entbindung gesteigerte Neugeborenenreflexe und ein erhöhter Muskeltonus auf. Ein Infektionsscreening in den USA, zu dem uns keine näheren Daten vorliegen, ergab keine pathologischen Auffälligkeiten. Die numerische und strukturelle Chromosomenanalyse in Deutschland erbrachte einen normalen weiblichen Karyotyp 46,XX. Auch eine FISH-Analyse mit der Fragestellung nach einem Miller-Dieker-Syndrom46 zeigte keine Mikrodeletion auf dem kurzen Arm des Chromosoms 17. Durch Sequenzanalyse des TUBA1A-Gens konnten ebenfalls keine krankheitsverursachenden Mutationen nachgewiesen werden. Mittels CGH-Array konnten Deletionen am kurzen 46 Miller-Dieker-Syndrom: neuronale Migrationsstörung mit Lissenzephalie und Gesichtsanomalien (prominente Stirn, kurze Nase, prominente Oberlippe, kleiner Kiefer u.a.), verursacht durch Mikrodeletionen des Chromosomenabschnitts 17p13.3 (Lo Nigro, Chong et al. 1997) 40 Arm von Chromosom 9 (9p22, 176 kb) und 19 (19p13.12, 18 kb), sowie Duplikationen auf Chromosom 8 (8p11.23, 148 kb) und 15 (15q11, 251 kb) gefunden werden. Die Analyse der DNA der Schwester (D5425) erbrachte bis auf die Deletion 19q13.12 einen identischen Befund. Eine abschließende Beurteilung dieses Ergebnisses erfordert weitere Untersuchungen. Eine kraniale MR-Tomographie zeigte neben der bereits bekannten Mikrozephalie eine stark vergröberte Gyrierung im Sinne einer Pachygyrie, eine Hypoplasie des Corpus callosum und ein hypoplastisches Cerebellum (siehe Abb. 19 a-c). a b c Abb. 19 MRT-Bilder der Patientin D5424. (a) MRT, median, Pfeile: Hypoplasie des Corpus callosum und hypoplastisches Cerebellum. (b) MRT, axial. (c) MRT, koronar. Bei einer pädiatrischen Untersuchung im Alter von dreieinhalb Jahren zeigte sich ein weiterhin bestehender Kleinwuchs (82 cm, 9,4 cm < 3. Perzentile, -4,2 SD) bei einem Körpergewicht von 7,8 kg (4 kg < 3. Perzentile). Der Kopfumfang betrug 36 cm (10,3 cm < 3. Perzentile, -9,2 SD). Eine Übersicht über die vorhandenen Messungen des Kopfumfangs in verschiedenen Altersstufen zeigt Abbildung 20. In der neurologischen Untersuchung fielen generalisiert gesteigerte Muskeleigenreflexe auf. Eine Hörprüfung erbrachte einen Normalbefund. Mittels Echokardiografie konnten eine Dilatation der Aorta ascendens und eine bikuspide Aortenklappe mit Aorteninsuffizienz dargestellt werden. Bei der Patientin besteht zudem eine doppelte Nierenarterie der rechten Seite. Desweiteren fanden sich ein Hypotelorismus, ein Strabismus convergens rechts und eine beidseitige Protrusio bulbi. Die statomotorische Entwicklung erfolgte sehr verzögert. Bis zum Alter vom eineinhalb Jahren war der Patientin freies Sitzen nicht möglich. Laufen ohne Hilfe erlernte sie mit dreieinhalb Jahren47. Auch die sprachliche Entwicklung erfolgte verlangsamt: 47 Zeitfenster normale motorische Entwicklung: vgl. Fußnote 40 41 Erst im Alter von drei Jahren war sie in der Lage, Silben nachzusprechen48. Nach Angaben der Eltern ist sie sehr leicht erregbar, schreit viel und hat immer wieder Phasen, in denen ein Tremor zu beobachten ist. Abb. 20 Entwicklung des Kopfumfangs der Patientin D5424. Die rote Kurve entspricht zwei Standardabweichungen unter dem Median (P50 – 2 SD). Da der Abstand zwischen den Werten der Patientin D5424 dem normalen Perzentilenverlauf größer wird, handelt es sich um einen progredienten Mikrozephalus. (Grafik erstellt mittels R: A Language and Environment for Statistical Computing, R Development Core Team 2011, Perzentilen nach WHO Child Growth Standards (de Onis et al. 2006 und 2007)) In der Schwangerschaft mit dem Mädchen D5425 fiel bereits in der 19. SSW per Sonographie eine Mikrozephalie auf. Die Chromosomenanalyse nach Amniozentese ergab einen unauffälligen weiblichen Chromosomensatz und, wie auch bei der älteren Schwester, keinen Hinweis auf eine Mikrodeletion 17p13. Sie wurde hypotroph bei einem Gestationsalter von 36+3 SSW mit einem Gewicht von 1795 g (600 g < 3. Perzentile) bei einer Länge von 37 cm (8,6 cm < 3. Perzentile) geboren. Der KU betrug 24,5 cm (7,2 cm < 3. Perzentile, -8 SD)49. Direkt nach der Entbindung ergab die Untersuchung der Patientin eine deutliche muskuläre Hypoto- 48 Zeitfenster normale sprachliche Entwicklung: vgl. Fußnote 41 Bei den Geburtsparametern ist zu beachten, dass die Geburt des Kindes vor der vollendeten 37. SSW stattfand und dadurch eine Frühgeburt vorliegt. Die Abweichungen zur dritten Perzentile bzw. die Angabe der Standardabweichung sind daher lediglich Näherungswerte. 49 42 nie und gesteigerte Muskeleigenreflexe der unteren Extremität. Zudem fand sich eine beidseitige Syndaktylie der zweiten und dritten Zehen. Im EEG, das bei der Patientin im Alter von sieben Monaten geschrieben wurde, konnten pathologische Auffälligkeiten dargestellt werden: Nur wenig strukturierte Theta-Delta-Mischaktivität, eine topische Differenzierung war nur ansatzweise erkennbar und es traten steile Transienten in inkonstanter Verteilung auf. Insgesamt handelte es sich jedoch laut neuropädiatrischen Arztbriefen lediglich um einen kontrollwürdigen Befund. In den MRT-Aufnahmen (siehe Abb. 21) zeigte sich eine deutliche Erweiterung der Seitenventrikel, plumpe Gyri im Sinne einer Pachygyrie und ein inkomplettes Corpus callosum. Durch die großen, flüssigkeitsgefüllten Raumforderungen wurde zunächst der Verdacht auf eine Dandy-Walker-Zyste 50 gestellt. Da jedoch nicht der vierte Ventrikel betroffen zu sein scheint, ist von einer nicht näher definierbaren intrazerebralen Zyste auszugehen. b a c Abb. 21 MRT-Bilder der Patientin D5425. (a) MRT, medial, der Pfeil markiert den vierten Ventrikel. (b) MRT, axial. (c) MRT, koronar. 2.1.8. Familie 5557: Patient D5557 Die Familie 5557 ist kurdischer Abstammung. Die Eltern D5560 und D5559 (siehe Abb. 22 IV.4 und IV.5) sind phänotypisch gesund. Da die Mütter des Paares (III.4 und III.5) Cousinen sind, besteht Konsanguinität. Neben der Indexpatientin D5557 sind weitere Fälle von Mikrozephalie in der Familie bekannt. Ein betroffener Bruder der Mutter (IV.6) starb im Alter von 20 Jahren. Ein weiterer Bruder (IV.7) starb während der Geburt. Ob auch er mikrozephal war, ist nicht bekannt. In der Familie des Vaters gab es ebenfalls einen erkrankten Bruder (IV.3), der noch als Kind verstarb. Bei dem mikrozephalen Mädchen IV.2 handelt es sich um eine Großcousine des Großvaters (III.3). Ein weiterer Cousin des Großvaters (III.1) hat ebenfalls ein von Mikrozephalie betroffenes Kind (IV.1). 50 zur Dandy-Walker-Zyste vgl. Fußnote 38 43 I II III 2 1 3 4 5 IV 1 2 3 4 D5560 5 D5559 6 7 V D5558 D5557 Abb. 22 Stammbaum der Familie 5557 Die Geburt der Patientin D5557 erfolgte in der 40+2 SSW. Es handelte sich um eine Spontangeburt. Bereits im letzten Trimenon wurde sonographisch ein Mikrozephalus diagnostiziert, wobei sich der restliche Schwangerschaftsverlauf unauffällig gestaltete. Das Geburtsgewicht betrug 2965 g (25.-50. Perzentile) bei einer Länge von 46 cm (3.-5.Perzentile) und einem Kopfumfang von 29,5 cm (-3,7 SD). Im Alter von neun Monaten konnte ein Kopfumfang von 34 cm (-7,3 SD) gemessen werden, so dass die Entwicklung des Mikrozephalus als progredient beschrieben werden kann. Abb. 23 MRT-Bilder der Patientin D5557. (a) MRT, axial, Pachygyrie. (b) MRT, median, hypoplastisches Corpus callosum (Pfeil), Kleinhirnhypoplasie. (c) MRT, medial, deutlicher A>P-Gradient in der Ausprägung der Gyrierung. Die MRT-Aufnahmen (siehe Abb. 23) des Neugeborenen zeigen eine Mikrozephalie mit vereinfachter Gyrierung im Sinne einer Pachygyrie, einen A>P-Gradienten in der Ausprägung der Gyrierung, eine Hypoplasie des Zerebellums und ein hypoplastisches Corpus callosum. In der pädiatrischen Untersuchung fielen eine zentrale Koordinationsstörung sowie spitz zulaufende Finger auf. Es wurden zudem faziale Auffälligkeiten wie ein beidseitiger Epikanthus, lateral ansteigende Lidachsen und eine Synophrys beschrieben. Weiterhin 44 konnte eine beidseitige Hyperopie mit Astigmatismus und ein ebenfalls beidseitiger Strabismus convergens diagnostiziert werden. 2.1.9. Familie 6137: Patienten D6137, D6138 Beide Kinder der italienisch-stämmigen Familie 6137 sind von Mikrozephalie betroffen. Bei den Eltern handelt es sich um Cousin und Cousine dritten Grades. Die Verwandtschaftsverhältnisse sind in Abbildung 24 dargestellt. Zwei Cousins des Vaters scheinen ebenfalls an einer leichten Mikrozephalie zu leiden. Ob sie einer konsanguinen Verbindung entstammen, ist nicht bekannt. D6140 D6138 D6139 D6137 Abb. 24 Stammbaum der Familie 6137 Im Folgenden werden die klinischen Befunde der Patienten aufgeführt: Der erste Sohn phänotypisch gesunder Eltern, D6138, wurde in Italien geboren. Es handelte sich um eine Frühgeburt mit einem Geburtsgewicht von 2570 g, wobei die Angaben über den genauen Geburtstermin zwischen der 33. SSW und 37. SSW schwanken. Der Kopfumfang und die Körperlänge bei Geburt sind nicht bekannt. Im Alter von drei Monaten wog der Knabe 4530 g (370 g < 3. Perzentile) bei einer Körperlänge von 53 cm (3,9 cm < 3. Perzentile). Der KU betrug zu diesem Zeitpunkt 33,5 cm (4,8 cm < 3. Perzentile, -5,9 SD). In der pädiatrischen Untersuchung fielen eine geschlossene Fontanelle, eine Vierfingerfurche und eine Hernie der rechten Leiste auf. In der Skelettszintigraphie konnte der Verdacht auf einen vorzeitigen Verschluss der Schädelnähte jedoch nicht bestätigt werden. Beim Patienten fielen leicht gesteigerte Muskeleigenreflexe der unteren Extremität auf, jedoch ohne Pyramidenbahnzeichen. Eine Chromosomenanalyse erbrachte den männlichen Karyotyp 46,XY. In der MR-Tomographie zeigten sich eine Balkenaplasie und eine Pachygyrie. Die MRT-Bilder liegen nicht vor. Mittels Serologie konnten keine Antikörper gegen Zytomegalie-Viren nachgewiesen werden. Eine Analyse des Urins auf Amino- und organische Säuren zeigte ebenfalls einen unauffälligen Befund. Der Blutwert der 45 Kreatinkinase (CK) lag im Normbereich. Im EEG konnte ein Fehlen der altersentsprechenden Grundaktivität, jedoch keine epilepsietypischen Potentiale nachgewiesen werden, so dass sich aus diesem Befund bis auf weitere Kontrollen keine Konsequenzen ergaben. Otoakustische Emissionen konnten nicht abgeleitet werden, wobei eine Hirnstammaudiometrie eine Hörschwelle von 35-40 dB wahrscheinlich macht, so dass keine Notwendigkeit zur Hörgerätversorgung bestand. Eine augenärztliche Untersuchung sowie eine Sonographie der Nieren und der Hüftgelenke zeigten einen Normbefund. Im weiteren Verlauf erbrachten neurologische und psychiatrische Untersuchungen eine milde Intelligenzminderung (IQ 50-69) mit leichter Entwicklungsverzögerung in Sprache und Motorik. Zudem leidet der Junge unter einer psychomotorischen Ticstörung, die sich durch repetitives Blinzeln, Nicken oder Schmatzen bemerkbar macht. Ansonsten zeigten sich keine neurologischen Auffälligkeiten. Der soziale Umgang fällt dem Patienten schwer: Er ist sehr unruhig, aufbrausend und gereizt, die Führung zu Hause und in der Schule ist sehr erschwert. Unter dem Neuroleptikum Risperidon (Risperdal®) zeichnete sich eine dezente Besserung der Problematik ab. Das zweite Kind der Familie, D6137, wurde sieben Jahre später in der 39 + 2 SSW mit einem Gewicht von 3130 g (25-50. Perzentile) und einer Länge von 49 cm (25-50. Perzentile) geboren. Der Kopfumfang bei Geburt betrug 30 cm und lag damit 2,1 cm unter der 3. Perzentile (-3,5 SD). Die weitere Entwicklung des Kopfumfangs ist Abbildung 25 zu entnehmen. Kurz nach der Geburt wurde der Patient durch intermittierende Atempausen auffällig. In der Untersuchung des Neugeborenen fielen eine fliehende Stirn, tiefsitzende Ohren, ein relativ hoher Gaumen und eine Vierfingerfurche auf, die auch der Bruder zeigt. Die Fontanelle konnte nicht palpiert werden. Ein standardisiertes Neugeborenen-Screening des Blutes zeigte keine Auffälligkeiten. Die otoakustischen Emissionen der linken Seite waren nicht nachweisbar. Alle weiteren Untersuchungen wie ein EKG, eine Sonographie des Schädels, der Nieren, der Nebennieren und der Harnblase sowie eine augenärztliche und neuropädiatrische Untersuchung erbrachten keinen pathologischen Befund. An der Innenseite des rechten Beins und des linken Sprunggelenks sowie linkspektoral fielen scharf begrenzte Hyperpigmentierungen auf. 46 Abb. 25 Entwicklung des Kopfumfangs der Patienten D6137 und D6138. Die rote Kurve entspricht zwei Standardabweichungen unter dem Median (P50 – 2 SD). Da der Abstand zwischen den Werten der Patienten und dem normalen Perzentilenverlauf innerhalb des ersten Lebensjahres größer wird, handelt es sich um einen progredienten Mikrozephalus. Später erfolgt die Entwicklung parallel zu den Perzentilen. (Grafik erstellt mittels R: A Language and Environment for Statistical Computing, R Development Core Team 2011, Perzentilen nach WHO Child Growth Standards (de Onis et al. 2006 und 2007)) In der MRT im Alter von fünf Monaten zeigten sich bis auf symmetrisch frontal betont erweiterte, externe Liquorräume und insgesamt verkleinerte Proportionen im Sinne der bekannten Mikrozephalie, keine weiteren Fehlbildungen und insbesondere keine Gyrierungs- und Myelinisierungsanomalien. Im Alter von elf Monaten zeigte er nach der Münchner Funktionellen Entwicklungsdiagnostik eine altersentsprechende Entwicklung in allen Bereichen. Zwei Jahre später wurde dennoch eine allgemeine Entwicklungsverzögerung deutlich: nach Bayley II 51 erreichte der Patient einen Indexwert von 56 im Bereich der kognitiven Entwicklung. Wie sein Bruder verhält sich auch D6137 sehr unruhig und trotzig. 51 Bayley II (englisch: Bayley Scales of Infant Development, Second Edition): Test zur kindlichen kognitiven und motorischen Entwicklung. Als zeitgerecht gelten Indexwerte von 85-115 (Durchschnitt 100) (Kaplan 2008, S.281-4). 47 2.2. Material 2.2.1. Chemikalien, Lösungen, Reagenzienansätze 100 bp DNA-Leiter (N3231 L) New England Biolabs, Frankfurt/Main, Deutschland ABI Prism® Big Dye® Terminator Applied Biosystems™, Weiterstadt, Deutschland v1.1, v3.1 Cycle Sequencing Buffer (5x) ABI Prism® Big Dye® Terminator Applied Biosystems™, Weiterstadt, Deutschland v1.1 Cycle Sequencing Kit beinhaltet: Ready Reaction Mix (ddNTPs) Borsäure Carl Roth GmbH, Karlsruhe, Deutschland Bromphenolblau Sigma, Deisenhofen, Deutschland BSA (10 µg/ml) New England Biolabs, Frankfurt/Main, Deutschland Chloroform Roth, Karlsruhe, Deutschland DMSO Sigma, Deisenhofen, Deutschland EDTA Dinatriumsalz Dihydrat Carl Roth GmbH, Karlsruhe, Deutschland Ethanol J.T. Baker, Deventer, Holland Ethidiumbromid Carl Roth GmbH, Karlsruhe, Deutschland Ficoll 400 GE Healthcare, Buckinghamshire, Großbritannien GeneScan™ 500 ROX™ Size Applied Biosystems™, Weiterstadt, Deutschland Standard GenomiPhi™ Whole Genome GE Healthcare, Buckinghamshire, Großbritannien DNA-Amplification Kit Hi-Di™ Formamide Applied Biosystems™, Weiterstadt, Deutschland HPLC-gereinigtes Wasser VWR International S.A.S, Fontenay-sous-Bois, Frankreich illustra™ dNTP Polymerisation GE Healthcare, Buckinghamshire, Großbritannien Mix (20mM) LE-Agarose Biozym Scientific GmbH, Oldendorf, Deutschland NaOH Carl Roth GmbH, Karlsruhe, Deutschland Natriumperchlorat GE Healthcare, Buckinghamshire, Großbritannien Nucleon BACC2 Kit GE Healthcare, Buckinghamshire, Großbritannien Oligonukleotide/Primer APARA-Bioscience GmbH, Denzlingen, Deutschland QuantiTect®SYBR®Green PCR Qiagen GmbH, Hilden, Deutschland 48 Master Mix Kit 2x beinhaltet: HotStarTaq® DNA Polymerase QuantiTect SYBR® Green Puffer dNTP Mix SYBR® Green I ROX passive reference dye 5 mM MgCl2 Sephadex™ G50 Fine GE Healthcare, Buckinghamshire, Großbritannien Tris Carl Roth GmbH, Karlsruhe, Deutschland 2.2.2. Lösungen, Puffer, Gele 10x TBE-Puffer 540 g Tris (Stammlösung) 275 g Borsäure 200 ml 0,5 M EDTA-Lösung (pH 8,0) Millipore-Wasser ad 5 L 1x TBE-Puffer Herstellung durch 1:10 Verdünnung der Stammlösung 1x TE-Puffer 10 mM Tris-HCl 1 mM EDTA pH 8 Enzympuffer vgl. Kapitel 2.2.3 Ladepuffer 10 g Ficoll 400 0,02 g Bromphenolblau 1x TE-Puffer (pH 8,0) ad 50 ml Sephadex™ (7%ig) 3,5 g Sephadex™ G50 Fine 50 ml HPLC-gereinigtes Wasser Agarosegel (2%ig/1%ig) 2g/1 g LE-Agarose in 100 ml 0,5x TBE-Puffer aufkochen; nach Abkühlen auf 40 °C 49 3 µl Ethidiumbromid zugeben 2.2.3. Enzyme, Enzympuffer 10x PCR Puffer Qiagen GmbH, Hilden, Deutschland (enthält 15 mM MgCl2) Exonuklease I (E. coli) M0293L New England Biolabs, Frankfurt/Main, Deutschland Qiagen Taq DNA Polymerase Qiagen GmbH, Hilden, Deutschland (5 U/µl) Restriktionsendonuklease Tsp451 New England Biolabs, Frankfurt/Main, Deutschland mit Puffer 1 2.2.4. Materialien ABsolute QPCR Seal AB-1170 ABgene, Epsom, Großbritannien Optically Clear Adhesive Seal Sheets MicroSpin™ S-200 HR Columns GE Healthcare, Buckinghamshire, Großbritannien Parafilm® Carl Roth GmbH, Karlsruhe, Deutschland Thermo-Fast® 384 PCR Plate ABgene, Epsom, Großbritannien White Thermo-Fast® 96 Detection Plate ABgene, Epsom, Großbritannien Thermo Scientific Verbrauchsgegenstände wie im Verlauf bezogen von Carl Roth GmbH, Karlsruhe, Plastikgefäße, Reaktionsgefäße Deutschland und Pipettenspitzen Greiner, Frickenhausen, Deutschland sowie Eppendorf, Hamburg, Deutschland 2.2.5. Geräte ABI 7900HT Fast Real-Time PCR Applied Biosystems™, Norwalk, Connecticut, USA System Elektrophoresekammern Renner, Dannstadt, Deutschland Elektrophorese Netzgeräte: Microcomputer Electrophoresis Renner GmbH, Dannstadt, Deutschland 50 Power Supply Gibco BRL™ ST305 Life Technologies Inc., Rockville, USA Consort EV 243 Sigma-Adrich, St- Louis, USA Gelträger Renner, Dannstadt, Deutschland Nano Drop® ND-100 Spectropho- PEQLAB Biotechnologie GMBH, Erlangen, Deutsch- tometer land PCR- Geräte: PTC-200 Peltier Thermal Cycler MJ Research, Waltham, USA Tetrad Peltier Thermal Cycler MJ Research, Waltham, USA C1000™ Thermal Cycler Bio-Rad Laboratories GmbH, München, Deutschland Mastercycler epgradient Eppendorf, Hamburg, Deutschland Photodokumentations-System: Digitalkamera Kodak DC290 Kodak GmbH, Stuttgart, Deutschland ZOOM UV-Transilluminator Kompetenzzentrum für Fluoreszente Bioanalytik (KFB), Regensburg, Deutschland Pipetten Gilson, Middleton, USA ABIMED, Langenfeld, Deutschland Eppendorf, Hamburg, Deutschland Reinstwasseranlage MilliQ Refe- Millipore GmbH, Schwalbach (Ts.), Deutschland rence Sequencer: ABI Prism™ 3100 Genetic Applied Biosystems™, Weiterstadt, Deutschland Analyser, 16 Kapillar-Sequencer Thermomixer 5436 Eppendorf, Hamburg, Deutschland Vortexer FB15013 Fisher Scientific GmbH, Schwerte, Deutschland Waage Sartorius, Göttingen, Deutschland Zentrifugen: Centrifuge 5415 D Eppendorf, Hamburg, Deutschland Centrifuge 5804 R Eppendorf, Hamburg, Deutschland Megafuge 1.0 Haereus sepatech, Hanau, Deutschland 2.2.6. Software und Online-Anwendungen 3100 Genetic Analyzer Data Col- Applied Biosystems™, Weiterstadt, Deutschland lection Software v2.0 AlphaDigiDoc™ 1000 v3.2.3 Alpha Innotech Corporation, San Leandro, USA 51 Berkeley Drosophila Genome http://www.fruitfly.org/seq_tools/splice.html Project, BDGP GeneScan® v3.7 ABIPrism®, Applied Biosystems™, Foster City, USA Genotyper v3.7 NT ABIPrism®, Applied Biosystems™, Foster City, USA Human BLAT Search UCSC Human Genome Browser, http://genome.ucsc.edu/cgi-bin/hgBlat?command=start MuStab http://bioinfo.ggc.org/mustab/ (Teng, Srivastava et al. 2010) mutationdiscovery MutationDiscovery.com, Transgenomic, Inc., http://www.mutationdiscovery.com/md/MD.com/home_p age.jsp Mutation Taster Mutation Taster, Charité Berlin, http://mutationtaster.org/MutationTaster/index.html NanoDrop ND-1000 v3.3.0 Coleman Technologies Inc., Orlando, USA NEBcutter V2.0 New England Biolabs Inc., http://tools.neb.com/NEBcutter2/ (Vincze et al. 2003) NetGene2 Server http://www.cbs.dtu.dk/services/NetGene2/ Nucleotide Blast http://www.ncbi.nlm.nih.gov/projects/SNP/ Programm BLASTN 2.2.25+ (Zhang, Schwartz et al. 2000) Optimase ProtocolWriter™ MutationDiscovery.com, Transgenomic, Inc., http://www.mutationdiscovery.com/md/MD.com/screens/ optimase/ OptimaseInput.html?action=none SDS 2.2.1 Applied Biosystems™, Foster City, USA Sequencing Analysis v5.1 Applied Biosystems™, Foster City, USA SeqPilot v3.3.2 JSI medical Systems GmbH, Kippenheim, Deutschland 52 2.2.7. Online-Datenbanken Ensembl Genome Browser http://www.ensembl.org/index.html Human Gene Mutation Data- http://www.hgmd.cf.ac.uk/ac/index.php base, HGMD® National Center for Biotechnolo- http://www.ncbi.nlm.nih.gov gy Information, NCBI NCBI: dBSNP Short Genetic Var- http://www.ncbi.nlm.nih.gov/projects/SNP/ iations OMIM™ (Online Mendelian http://www.ncbi.nlm.nih.gov/sites/entrez?db=omim Inheritance in Man®) UCSC Human Genome Browser 2.3. http://genome.ucsc.edu/cgi-bin/hgGateway Methoden 2.3.1. DNA-Extraktion Die Extraktion lymphozytärer, genomischer DNA erfolgte aus mit EDTA versetzten Blutproben mittels des Kits „Nucleon BACC2“ (GE Healthcare, Buckinghamshire, Großbritannien). Dabei wurden 3-5 ml der Blutprobe mit dem vierfachen Volumen an Lysepuffer (Reagenz A) 5 min. lang bei Raumtemperatur inkubiert und anschließend für weitere 4 min. bei 2600 rpm zentrifugiert. Der dadurch entstandene Überstand wurde verworfen. Das Zellpellet wurde mit 2 ml eines zweiten Puffers (Reagenz B) versetzt, etwa 4 sec gevortext und dadurch resuspendiert. Nach Zugabe von 500 µl Natriumperchlorat-Lösung und 2 ml Chloroform wurden die Lösungen durch siebenmaliges Invertieren gemischt. Anschließend wurden 300 µl Nucleon Resin in das Röhrchen pipettiert und das Gemisch bei 2.800 rpm über 4 min. zentrifugiert. Die dabei entstandene obere Phase (etwa 2,5 ml) wurde abpipettiert, mit dem zweifachen Volumen an kaltem, 100%igem Ethanol versetzt und so lange invertiert, bis ein Ausfällen der DNA zu erkennen war. Anschließend wurde durch Zentrifugation (4000 rpm über 10 min.) das Ethanol vom Pellet getrennt und verworfen. Es folgte ein Waschschritt mit 70%igem Ethanol und erneuter Zentrifugation (3000 rpm, 5 min.). Nach dem Entfernen des Überstands wurde das Pellet luftgetrocknet und anschließend mit 30 µl 1 x TE-Puffer resuspendiert. Die Lagerung der DNA erfolgte bei 4 °C. Die Konzentration der so extrahierten DNA wurde photometrisch durch das Gerät „Nanodrop ND-1000“ (PEQLAB Biotechnologie GmbH, Erlangen, Deutschland) gemessen. Zunächst erfolgte die Null-Eichung des Geräts mit 1 µl reinem Wasser („Blank“). Anschließend wurde 1 µl der zu messenden dsDNA aufgetragen und mit Licht aus einer XenonBlitzlampe (220-750 nm) bestrahlt. Die konzentrationsabhängige Lichtabsorption durch die 53 DNA führt zu einer unterschiedlichen Lichtintensität, die von einem Spektrometer gemessen wird. Aus der Differenz der Lichtintensität zwischen dem Blank und der Probe wurde die Absorption errechnet (-log Intensitätblank/IntensitätProbe). Mithilfe des Lambert-Beerschen Gesetzes kann daraus die Konzentration der dsDNA berechnet werden. Dadurch können mit diesem Gerät Konzentrationen zwischen 2 und 3700 ng/µl detektiert werden. 2.3.2. Genomamplifizierung Reichte die vorhandene Patienten-DNA für eine molekulargenetische Analyse nicht aus, wurde das Genom synthetisch amplifiziert. Dies geschah mittels des Kits „GenomiPhi™ Whole Genome DNA-Amplification Kit“ (GE Healthcare, Buckinghamshire, Großbritannien). Dafür wurde 1 µl der zu amplifizierenden Patienten-DNA (Konzentration von > 10 ng/µl) mit 9 µl des Probenpuffers vermischt und für 3 min. auf 95 °C erhitzt. Dadurch wird die doppelsträngige DNA in Einzelstränge aufgetrennt. Anschließend wurde die Probe auf Eis auf etwa 4 °C abgekühlt. Nach der Zugabe von 9 µl Reaktionspuffer und 1 µl Enzymmix erfolgte eine Inkubation des Reaktionsansatzes für 16 bis 18 Stunden bei 30 °C. Während dieser Zeit binden die unspezifischen Primer an multiplen Stellen komplementär an die einzelsträngige DNA. Die DNA-Polymerase (aus dem Bakteriophagen Phi29) synthetisiert nun, ausgehend von den Primern, die Tochterstränge. Durch die Korrekturlese-Funktion der Polymerase wird eine sehr genaue Replikation möglich. Die so replizierten DNAEinzelstränge dissoziieren ab einer gewissen Länge von der Matrize und stellen wiederum neue Bindungsstellen für die Primer zur Verfügung. Dadurch entstehen große Mengen an doppelsträngiger DNA mit einem geringen Anteil an Einzelsträngen. Um die Amplifikation nach 16 bis 18 Stunden zu stoppen, wurde der Ansatz über 10 min. auf 65 °C erhitzt, wodurch es zu einer Hitzeinaktivierung der Polymerase kommt. Nach Abkühlen der Probe auf 4 °C wurden 3 µl des Ansatzes zu Kontrolle der Reaktion auf ein 1%iges Agarosegel aufgetragen (vgl. Kapitel 2.3.5). Bei erfolgreicher Amplifikation ist eine deutliche Bande im Gel erkennbar. 2.3.3. Auswahl und Etablierung der Mikrosatellitenmarker Mikrosatellitenmarker stellen polymorphe Sequenzen der DNA dar, welche durch eine bis zu zwanzigfache Wiederholung (Repeat) von zwei bis sechs Basenpaaren gekennzeichnet und an multiplen Stellen des Genoms zu finden sind (Lewin 2010, S. 156-157). Bei den dazugehörigen Markerprimern handelt es sich um kurze Nukleotidsequenzen, die den jeweiligen Repeat flankieren und somit eine Amplifikation des betreffenden Abschnitts erlauben. Die Anzahl der jeweiligen Repeats variiert stark in individuellen Allelen, so dass bei der Analyse von mehreren Mikrosatelliten eine eindeutige Zuordnung zum Individuum möglich ist (genetischer Fingerabdruck). 54 Für die Kopplungsanalysen wurden jeweils die drei am nächsten gelegenen Mikrosatellitenmarker in 5‘ und 3‘ Richtung um die MCPH-Gene bzw. Loci aus der Online-Datenbank “Ensembl Genome Browser“ ausgewählt. Mithilfe des Online-Dienstes „Human Blat Search“ (UCSC) wurde die Spezifität der vorgeschlagenen Primer geprüft. Die Ermittlung der Bindungstemperaturen der Primer und die Erstellung des jeweiligen PCR-Protokolls erfolgte mittels „Optimase Protocol-Writer™“. Verwendung fanden 6-FAM-phosphoramidit fluoreszenzmarkierte Forward-Primer, so dass das daraus entstehende Farbsignal während der Sequenzierung detektiert werden konnte. Die Synthetisierung der Primerpaare erfolgte durch die APARA-Bioscience GmbH (Denzlingen, Deutschland). Tabelle 3 stellt eine Übersicht über die verwendeten Marker mit den verwendeten Annealingtemperaturen (TA) bzw. Touchdown-PCR-Protokollen dar. Die Primersequenzen finden sich in Appendix A. Tabelle 3 Übersicht Mikrosatellitenmarker MCPH1 / Microcephalin Chromosom 8p23, Position: 8:6.264.121-6.506.026* Position Entfernung zum Gen (bp) Marker Repeat GDB:315473 TAGA 8:6.012.857 - 6.013.044 251.077 D8S1099 TATA, GT, ATT 8:6.175.933 - 6.176.182 87.939 D8S1742 D8S277 D8S561 D8S1819 CA CA CA AC 8:6.214.007 8:6.516.725 8:6.622.013 8:6.749.967 - 49.979 10.699 115.987 243.941 6.214.142 6.516.870 6.622.190 6.750.187 MCPH2 Chromosom 19q13 Marker D19S416 D19S569 D19S610 D19S896 D19S220 D19S881 D19S223 D19S260 D19S420 Repeat CA CA CA CA CA CA CA CA CA Position 19:34.068.650 19:35.494.021 19:36.346.486 19:37.478.642 19:38.431.554 19:39.348.129 19:41.394.828 19:42.153.083 19:43.808.799 - 34.068.814 35.494.279 36.346.702 37-478.839 38.431.826 39.348.265 41.395.062 42.153.201 43.809.061 Entfernung zum Gen (bp) entfällt** entfällt entfällt entfällt entfällt entfällt entfällt entfällt entfällt MCPH3 / CDK5RAP2 Chromosom 9q34, Position: 9:123.151.147-123.342.448 Marker CHLC.GGAA23B10 D9S258 D9S2152 D9S103 D9S116 D9S1823 Repeat CCTT CA TAGA CA GT CA Position 9:122.658.934 9:122.926.328 9:122.992.430 9:123.358.961 9:123.621.055 9:123.700.364 - 122.659.299 122.926.486 122.992.835 123.359.055 123.621.155 123.700.470 Entfernung zum Gen (bp) 491.848 224.661 158.312 16.513 278.607 357.916 MCPH4 Chromosom 15q15 Marker D15S1042 Repeat CA Position 15:36.263.611 - 36.263.798 Entfernung zum Gen (bp) entfällt 55 D15S1012 D15S222 D15S1016 D15S962 D15S150 CA GT CA CA CA 15:39.007.543 15:45.445.630 15:53.532.829 15:56.575.068 15:58.651.739 - 39.007.716 45.445.836 53.533.077 56.575.351 58.652.033 entfällt entfällt entfällt entfällt entfällt MCPH5 / ASPM Chromosom 1q31, Position: 1:197.053.258-197.115.824 Marker Repeat D1S1183 D1S2816 GDB:196987 AFM329vc1 SHGC-64057 D1S3469 D1S2143 TA, TAGA CA ATTT CA ATT TAGA TAGA Position 1:196.148.830 1:196.650.545 1:197.007.783 1:197.413.901 1:197.476.251 1:198.029.789 1:198.361.738 - 196.149.021 196.650.792 197.007.951 197.414.141 197.476.372 198.029.921 198.361.992 Entfernung zum Gen (bp) 904.237 402.466 45.307 298.077 360.427 913.965 1.245.914 MCPH6 / CENPJ Chromosom 13q12, Position: 13:25.457.171-25.497.085 Marker Repeat SHGC-151206 D13S1243 D3S1532 D13S308 D13S221 D13S1254 CA CA GAAA CAT TG CA Position 13:24.807.990 13:24.807.993 13:25.282.814 13:26.457.003 13:26.576.866 13:27.518.434 - 24.808.317 24.808.246 25.283.171 26.457.149 26.577.100 27.518.657 Entfernung zum Gen (bp) 648.854 648.925 174.000 959.918 1.079.781 2.021.349 MCPH7 / STIL Chromosom 1p33, Position: 1:47.715.811-47.779.819 Marker Repeat D1S2797 GDB:314853 D1S3714 D1S2874 D1S2134 D1S2839 CA GAAA TG TG TAGA CA Position 1:46.933.592 1:46.966.734 1:47.682.933 1:47.908.231 1:48.281.268 1:48.432.953 - 46.933.758 46.967.069 47.683.133 47.908.472 48.281.554 48.433.181 Entfernung zum Gen (bp) 782.053 748.742 32.678 128.412 501.449 653.134 * Alle Positionsangaben beziehen sich auf die Datenbank UCSC Human Genome Browser Version GRCh37 (hg19) ** Zum Zeitpunkt der Untersuchung waren die Gene für die Loci MCPH2 (WDR62) und MCPH4 (CEP152) noch nicht beschrieben. 2.3.4. Polymerase-Kettenreaktion Die Polymerase-Kettenreaktion (engl.: polymerase chain reaction), kurz PCR, stellt die Standardmethode zur in-vitro Vervielfältigung selektierter DNA-Abschnitte bis zu einer maximalen Größe von 5 kb dar. Sie gliedert sich in drei Einzelschritte (Denaturierung, Hybridisierung (engl.: annealing) und Elongation (engl.: extension)), welche sich zyklisch wiederholen. Im Rahmen dieser Arbeit wurde die Polymerase-Kettenreaktion sowohl mit fluoreszenzmarkierten (Markerprimer), als auch mit nicht markierten Primern (Sequenzierung) durchgeführt. Die Etablierung der Primer erfolgte unter Berücksichtigung folgender Voraussetzungen: Die Sequenzen der Primer sollten innerhalb der menschlichen DNA einzigartig sein. 56 Die Primer sollten eine Länge zwischen 15-25 Basen haben und die zu amplifizierende Sequenz im Abstand von mindestens 50 bp flankieren. Die Schmelztemperaturen (engl.: melting temperature, Tm) der beiden Primer sollten nicht mehr als 3 °C voneinander abweichen und eine Differenz von 10 °C zur Tm des PCR-Produkts nicht überschreiten, andernfalls wurde ein Touchdown-Protokoll angewandt. Die Forward- und Reverse-Primer dürfen zueinander nicht komplementär sein. Die Primersequenz sollte weder einen Repeat noch einen Polymorphismus (engl.: single nucleotide polymorphism, SNP) beinhalten. Eine maximale Größe des PCR-Produkts von 1500 bp sollte nicht überschritten werden. Ein Reaktionsansatz (Volumen 30 µl) zur weiteren Sequenz- bzw. Kopplungsanalyse beinhaltete: 3 µl 10x Taq-Puffer (enthält 15 mM MgCl2) 1,5 µl Primer/6-FAM markierte Marker F‘ (10 pmol/µl) 1,5 µl Primer/Marker R’ (10 pmol/µl) 3 µl dNTPs (2 mM) 0,3 µl Taq-Polymerase (5 U/µl) 150-300 ng genomische DNA 20 µl HPLC-gereinigtes Wasser Zusätzlich wurde eine Leerprobe erstellt, um eine mögliche Kontamination auszuschließen. Dabei wurde statt DNA lediglich HPLC-gereinigtes Wasser verwendet. Die bereits erwähnten drei Einzelschritte der PCR werden im Folgenden ausführlich beschrieben: Zunächst wird der Reaktionsansatz auf 95 °C erhitzt, wodurch sich die Doppelstränge der DNA in zwei Einzelstränge teilen (denaturieren). Durch anschließendes Abkühlen auf die T A erfolgt die Hybridisierung von DNA und komplementären Oligonukleotiden, den sogenannten Primern. Die 3‘ Enden der Primer stellen den Ausgangspunkt für die Synthetisierung neuer komplementärer DNA-Einzelstränge durch die hitzestabile DNA-Polymerase (TaqPolymerase aus Thermus aquaticus) unter Verwendung der im Reaktionsansatz enthaltenen 2´-Desoxyribonukleosidtriphosphaten (dNTPs) dar. Dieser Schritt wird als Extension bezeichnet, und findet bei 72 °C über die Dauer der primerspezifischen Extensionszeit (t Ext) statt. Die so entstandenen Einzelstränge dienen ihrerseits wiederum als Matrizen für eine zusätzliche Kopie. Da der Reaktionsansatz sowohl Forward- als auch Reverse-Primer beinhaltet, entstehen doppelsträngige DNA-Fragmente, die auch als PCR-Produkt oder Ampli- 57 kon bezeichnet werden. Die zyklische Wiederholung dieser Reaktion resultiert in einer exponentiellen Vermehrung des gewünschten Produkts. Nach 25-30 Zyklen wird die Reaktion daher beendet und man erhält die Zielsequenz in etwa 106facher Kopie. Das Standardprotokoll der Polymerase-Kettenreaktion beinhaltete folgende Schritte: 1. initiale Denaturierung 2 min. 95 °C 2. Denaturierung 30 sec 95 °C 3. Annealing 30 sec TA (primerspezifisch) 4. Extension tExt (primerspezifisch) 72 °C 5. Wiederholung von Schritt 2 bis 4 x 29 6. abschließende Extension 5 min. 7. anschließendes Abkühlen auf 72 °C 12 °C Im Rahmen dieser Arbeit wurden die Primer und PCR-Bedingungen für die Gene ASPM, Microcephalin, CDK5RAP2, CENPJ und STIL etabliert. Dabei wurden sämtliche Exons, inklusive der Splice-Sites und anschließender Intronsequenz bis 50 bp, berücksichtigt. Die Optimierung der primerspezifischen Temperaturen wurde durch ein jeweiliges Temperaturscreening erreicht. Die Sequenzen der verwendeten Primer mit dazugehörigen Amplikons und den spezifischen Änderungen des Standard-PCR-Protokolls können dem Appendix A entnommen werden. Da sich die Tm einzelner 6-FAM markierter Markerprimer (vgl. Kapitel 2.3.3) um mehr als 5 °C unterschied, musste in diesen Fällen auf die Anwendung eines Touchdown-Protokolls zurückgegriffen werden. Dabei werden absteigende Annealingtemperaturen von einer initialen (Tinitial ) bis zu einer Zieltemperatur (TZiel ) durchschritten. Das Standardprotokoll der Touchdown-PCR beinhaltete folgende Schritte: 1. initiale Denaturierung 2 min. 95 °C 2. Denaturierung 30 sec 95 °C 3. Annealing 30 sec Tinitial (pro Zyklus Erniedrigung um tExt (primerspezifisch) 72 °C 0,5 °C) 4. Extension 5. Wiederholung von Schritt 2 bis 4 x 15 6. Denaturierung 30 sec 95 °C 7. Annealing 30 sec TZiel (primerspezifisch) 8. Extension tExt (primerspezifisch) 72 °C 9. Wiederholung von Schritt 6 bis 8 x 20 10. abschließende Extension 5 min. 72 °C 58 11. anschließendes Abkühlen auf 2.3.5. 12 °C Agarose-Gelelektrophorese Unter dem Einfluss eines elektrischen Felds bewegt sich DNA aufgrund ihrer negativen Ladung in Richtung der positiv geladenen Anode. Findet diese Bewegung in einem Gel statt, das die Moleküle in ihrer Wanderung in einem gewissen Maße behindert, zeigen die DNAFragmente abhängig von ihrer Größe unterschiedlich lange Laufzeiten. Um die Nukleinsäurefragmente im Gel darzustellen, wurden diese mit Ethidiumbromid eingefärbt: zwischen die Basen der DNA lagern sich einzelne Ionen dieses Phenanthridin-Farbstoffs ein, wodurch sich dessen Anregungsspektrum ändert. Bestrahlt man die Gele nun mit UV-Licht, fluoresziert lediglich das an DNA gebundene Ethidiumbromid und wird dadurch sichtbar. Für die Darstellung der im Rahmen dieser Arbeit amplifizierten PCR-Produkte wurde ein 2%iges Agarosegel verwendet. Für die Herstellung der Gele wurden 2 g Agarose in 100 ml 1x TBE-Puffer aufgekocht, bis die Lösung klar war. Anschließend wurde das flüssige Gel auf etwa 40 °C gekühlt, mit 3 µl Ethidiumbromid versetzt und auf mit Kämmen versehene Gelkammern gegossen. Nach etwa 20 min. war das Gel erkaltet und erstarrt. Die Kämme konnten nun entfernt werden und hinterließen die für die Applikation der PCR-Produkte nötigen Taschen. Die Lagerung der fertigen Gele erfolgte bei 4 °C. Um die erfolgreiche Amplifikation der gewünschten Sequenz mittels vorangegangener PCR zu überprüfen, wurden die PCR-Produkte auf das Agarosegel aufgetragen. Dafür wurden 10 % (3 µl) des Amplikons, bzw. der Leerprobe mit 3 µl Ladepuffer und 4 µl HPLCgereinigtem Wasser versetzt und in die Taschen geladen. Um die Größe des amplifizierten Produkts abschätzen zu können, wurde zusätzlich in eine separate Spur ein 100 bp Marker mit Nukleinsäurefragmenten in definierter Größe geladen. Anschließend wurde eine Gleichspannung von 160 V über 20-30 min. angelegt. Nach Beendigung der Elektrophorese wurden die Gele auf einem UV-Transilluminator (KFB, Regensburg, Deutschland) mit der Digitalkamera Kodak DC290 ZOOM (Kodak GmbH, Stuttgart, Deutschland) fotografiert. Zur digitalen Verarbeitung der Daten wurde die Software AlphaDigiDocTM 1000 (v3.2.3, Alpha Innotech Corporation, San Leandro, USA) verwendet. 2.3.6. Enzymatische Aufreinigung der PCR-Produkte Um den PCR-Reaktionsansatz mit amplifziertem Produkt vor der Sequenzierung von überschüssigen dNTPs, Primern und Pyrophosphaten zu befreien, wurde eine enzymatische Aufreinigung mit den Enzymen Antarktische Phosphatase (5000 U/ml) und Exonuklease I (20000 U/ml) durchgeführt. Hierfür wurde das Produkt mit 4 µl HPLC-gereinigtem Wasser, 59 1 µl (5 U) Antarktischer Phosphatase und 0,5 µl (10 U) Exonuklease I versetzt und anschließend 15 min. bei 37 °C inkubiert. Um den enzymatischen Verdau zu stoppen, erfolgte eine Erhitzung des Reaktionsgemisches auf 80 °C für weitere 15 min., was in einer Hitzeinaktivierung der Enzyme resultierte. Nach Abkühlen des aufgereinigten Amplikons auf 10 °C wurde dieses anschließend bei 4 °C gelagert. 2.3.7. DNA-Sequenzierung Mittels der Kettenabbruch-Methode nach Sanger et al. und Lee et al. (Sanger, Nicklen et al. 1977; Lee, Spurgeon et al. 1997), wurde die Patienten-DNA für die anschließende Mutationsanalyse sequenziert. Es handelt sich, wie die Polymerase-Kettenreaktion, um eine Zyklus-Sequenzierung. Neben den auch in der PCR verwendeten dNTPs sind im Reaktionsansatz auch 2´,3´-Didesoxyribonukleosidtriphosphate (ddNTPs) enthalten. Die vier verschiedenen ddNTPs (ddATP, ddGTP, ddTTP und ddCTP) sind mit jeweils einem unterschiedlichen Fluoreszenzfarbstoff markiert und werden während der DNA-Synthese in die wachsende Nukleotidkette eingefügt. Jeder Einbau eines ddNTP führt zum Kettenabbruch, da den ddNTPs die für die Verknüpfung mit weiteren Nukleosiden nötige 3´-OH-Gruppe fehlt. Diese Kondensationsreaktion wird wie in der PCR durch eine Polymerase katalysiert. Die Reaktion für eine Probe erfolgte in zwei getrennten Ansätzen: jeweils einem für den Forward-Primer (komplementär zum 3´-Ende des nicht kodierenden Strangs) und einem für den Reverse-Primer (komplementär zum 3´-Ende des kodierenden Strangs). Dadurch findet die Polymerisation nur in eine Richtung statt und in der folgenden Mutationsanalyse können die komplementären DNA-Einzelstränge verglichen werden. Für den Reaktionsansatz wurde das Kit BigDye® Terminator v1.1 (Applied Biosystems™, Weiterstadt, Deutschland) verwendet. Ein Reaktionsansatz (Volumen 10 µl) beinhaltete: 2 µl 5x Sequenzierpuffer 1 µl BigDye®-Mix (enthält Polymerase, dNTPs, fluoreszenzmarkierte ddNTPs) 1 µl Primer (10 pmol/µl) (F- bzw. R-Primer) 1 µl 50%iges DMSO 1 µl PCR-Produkt 4 µl HPLC-gereinigtes Wasser Das Standardprotokoll der DNA-Sequenzierungsreaktion beinhaltete folgende Schritte: 1. initiale Denaturierung 1 min. 2. Erhitzen auf 3. konstante Temperatur 96 °C 96 °C 10 sec 96 °C 60 4. Abkühlen auf 5. konstante Temperatur 55 °C 5 sec 6. Erhitzen auf 7. konstante Temperatur 55 °C 60 °C 2 min. 60 °C 8. Wiederholung von Schritt 2 bis 7 x 24 9. anschließendes Abkühlen auf 12 °C Um überschüssige ddNTPs zu entfernen, wurden die Produkte der Sequenzierungsreaktion vor der Analyse mittels Kapillarelektrophorese erneut aufgereinigt. Hierzu wurde zunächst eine 7%ige Sephadex® G50-Suspension mit HPLC-gereinigtem Wasser hergestellt. 2 x 400 µl der Lösung wurden auf MicroSpin™ Säulen (GE Healthcare, Buckinghamshire, Großbritannien) pipettiert und bei 3800 rpm für 2 min. zentrifugiert (Centrifuge 5415 D, Eppendorf, Hamburg, Deutschland). Zum Waschen der Säulen wurden diese durch Zugeben von 400 µl HPLC-gereinigtem Wasser gelöst und für weitere 2 min. bei 3800 rpm zentrifugiert. Die Kalibrierung der Säulen erfolgte mit 10 µl HPLC-gereinigtem Wasser und erneuter Zentrifugation für 2 min. bei 3800 rpm. Die vorbehandelten Sephadex®-Säulen wurden daraufhin in ein neues, mit 10 µl Hi-Di™ Formamide (Applied Biosystems™, Weiterstadt, Deutschland) versetztes Eppendorfröhrchen transferiert. Anschließend wurde das gesamte Volumen der vorangegangenen Sequenzierungsreaktion (10 µl) mittig auf die Säule pipettiert und durch Zentrifugation (3800 rpm, 2 min.) das nun aufgereinigte PCR-Produkt in das vorgelegte Hi-Di™ Formamide eluiert. 2.3.8. Analyse und Auswertung der Sequenzierungsreaktion Die Analyse der Amplikons erfolgte mittels Kapillarelektrophorese (Sequenzierer 3100 Genetic Analyzer, Applied Biosystems™, Foster City, USA). Dabei werden von einem Laser die Fluoreszenzsignale der während der Sequenzierungsreaktion eingefügten ddNTPs detektiert. Da diese nur die letzte Base eines Fragments ausmachen (vgl. Kapitel 2.3.7) kann daraus die exakte Basenabfolge der zu untersuchenden Sequenz errechnet werden. Die Analyse der so gewonnen Daten erfolgte mit den Programmen Sequencing Analysis v5.1 (Applied Biosystems™, Foster City, USA) und SeqPilot v3.3.2 (JSI medical Systems GmbH, Kippenheim, Deutschland). Als Referenzen dienten die Sequenzen der OnlineDatenbank „Ensembl Genome Browser“ sowie als Kontrolle sequenzierte Wildtyp-DNA. 2.3.9. Allelspezifischer Restriktionsverdau Der Verdau mittels Restriktionsenzymen stellt ein Verfahren zur Analyse einer definierten Sequenzänderung eines Amplikons dar. 61 Bei Restriktionendonukleasen handelt es sich um Enzyme, die dsDNA spezifisch an Erkennungssequenzen schneiden (Restriktionsstellen). Ändert sich die Wildtyp-Sequenz zum Beispiel infolge eines SNPs oder einer Punktmutation, kann das zum Verlust oder zur Bildung einer Restriktionsstelle führen. Dadurch entstehen unterschiedlich große Fragmente, die mittels Gelelektrophorese dargestellt werden können und Rückschlüsse auf einen möglichen Nukleotidaustausch zulassen. Durch die Online-Anwendung NEBcutter V2.0 (Vincze et al. 2003) wurden die Enzyme ermittelt, deren Schnittstellen durch die zu untersuchende Sequenzänderung variieren. Zunächst wurde mittels PCR ein Amplikon der zu untersuchenden Sequenz durchgeführt und das Produkt anschließend durch Gelelektrophorese dargestellt. War eine deutliche Bande im Gel erkennbar, wurde der Restriktionsverdau in folgendem Ansatz (30 µl) durchgeführt: 15 µl PCR-Produkt 5 µl (20 U) Enzym Tsp451 (4000U/ml) 3 µl 10x NEB Puffer 1 1 µl BSA (10 µg/l) 6 µl HPLC-gereinigtes Wasser Anschließend konnten die so entstandenen Fragmente mittels erneuter Gelelektrophorese aufgetrennt und somit Rückschlüsse auf den Haplotyp der untersuchten Person bezüglich der Sequenzvariation gezogen werden. 2.3.10. Quantitative Polymerase-Kettenreaktion Die quantitative Polymerase-Kettenreaktion (engl.: quantitative Polymerase Chain Reaction, qPCR), auch real-time PCR genannt, basiert auf dem Prinzip der herkömmlichen PCR, erlaubt jedoch eine quantitative Auswertung der amplifizierten Produktmenge. Dadurch lassen sich Deletionen bzw. Duplikationen ganzer Exone oder Gene detektieren. Die Quantifizierung wird möglich durch Messung der Intensität des Fluoreszenzfarbstoffs SYBR®-Green, welcher in doppelsträngige DNA (dsDNA) interkaliert. Durch die Einlagerung von SYBR®Green in die dsDNA ändert sich dessen Anregungsspektrum durch UV-Licht, so dass die Fluoreszenz des Farbstoffs während der Zyklen proportional zur steigenden Amplikonmenge zunimmt. Die Messung erfolgt während und am Ende eines jeden Zyklus („real-time“). Um die Spezifität der qPCR zu überprüfen, erfolgt am Ende eines Durchlaufs eine Schmelzkurvenanalyse. Dabei werden die amplifizierten Produkte durch Erhitzen auf 95 °C denaturiert, so dass die Fluoreszenz durch das Entstehen von Einzelsträngen sinkt. Da jede Se- 62 quenz eine spezifische Schmelztemperatur besitzt, ergeben sich bei Verunreinigung oder dem Vorliegen mehrerer Amplikons zusätzliche Kurven. Die quantitative Bestimmung der Produktmenge erfolgte durch die Software SDS 2.2.1 (Applied Biosystems™, Foster City, USA). Als Referenz dienten zum einen definierte Standard-Sequenzen (SALL4, Exon 3 (Borozdin, Boehm et al. 2004) und 3p1) welche in vier verschiedenen Standardkonzentrationen (5, 2,5, 1,25 und 0,625 ng/µl) analysiert werden. Zum anderen wurde zusätzlich die Fluoreszenz in Amplikons der Zielsequenz einer gesunden Kontrollperson gemessen. Im Rahmen dieser Arbeit wurden Primer für die Gene MCPH1 und ASPM entwickelt. Die Primer, die in der qPCR Verwendung fanden, entsprachen folgenden Kriterien: Die Primerlänge betrug 20-30 bp. Die Schmelztemperatur (Tm) aller Primerpaare lag bei etwa 60 °C. 50-70 % der Basen in der Primersequenz sollten aus Guanin und Cytosin bestehen. Die Tm der Primer eines Amplikons sollte nicht mehr als 2 °C voneinander abweichen. Die Sequenz der verwendeten Primer sollte einmalig im menschlichen Genom sein. Soweit möglich wurden die Primerpaare der nicht quantitativen PCR genutzt. Andernfalls wurden neue Primer nach oben genannten Kriterien entwickelt. Die Sequenzen der verwendeten qPCR-Primer und die Referenzsequenzen können dem Appendix B entnommen werden. Ein Reaktionsansatz (10 µl) beinhaltete: 2,5 µl genomische DNA (10 ng/µl) 5 µl QuantiTect®SYBR®Green PCR Master Mix (2x) 2,5 µl Amplicon Primer Mix Forward and Reverse (1 pmol/µl) Die Reaktion wurde in qPCR-Platten (Thermo-Fast® 384 PCR Plate White, ABgene, Epsom, Großbritannien) angesetzt und mit selbstklebender, klarer Folie (ABsolute QPCR Seal AB-1170 Optically Clear Adhesive Seal Sheets, ABgene, Epsom, Großbritannien) gegen Verdunstung geschützt. Anschließend wurden die Platten bei 1500 rpm bei 23 °C über 10 min. zentrifugiert (Eppendorf 5804R, Hamburg, Deutschland), um alle Reagenzien am Boden der Vertiefungen zu konzentrieren. Das Standardprotokoll der qPCR beinhaltete folgende Schritte: 1. initiale Denaturierung 15 min. 95 °C 2. Denaturierung 15 sec 95 °C 3. Annealing 30 sec 60 °C 4. Extension 30 sec 72 °C 63 5. Wiederholung von Schritt 2 bis 4 x 39 6. Denaturierung 15 sec 95 °C 7. Annealing 15 sec 60 °C* 8. Denaturierung 15 sec 95 °C Schmelzkurvenanalyse * pro Sekunde Erhöhung der Temperatur um 0,2 °C Jede Probe wurde in mindestens zweifacher Ausführung angesetzt, um Verunreinigungen oder Fehler durch ungenaues Pipettieren zu erkennen. Falls dadurch voneinander abweichende Ergebnisse detektiert wurden, erfolgte eine erneute Analyse des jeweiligen Amplikons in einem weiteren Durchlauf. Um die Quantität der Amplikonmenge zu bestimmen, wurde von der Software SDS 2.2.1 (Applied Biosystems™, Foster City, USA) jeweils eine Standardkurve generiert. Diese kann bei bekannter Produktmenge zu Beginn aus dem Schwellenwert-Zyklus (engl.: Cycle Threshold, Ct), bei dem die Fluoreszenz durch amplifiziertes PCR-Produkt erstmals signifikant die Hintergrundfluoreszenz übersteigt, berechnet werden: Der Ct und der Logarithmus der Ausgangsmenge stehen in linearer, umgekehrt proportionaler Beziehung zueinander. Je mehr Amplikon zu Beginn vorhanden war, desto früher wird dieser Schwellenwert erreicht. Die relative Produktmenge lässt sich durch Vergleich der Ct der Patientenproben mit den Ct der Kontrollproben ermitteln. Aus einem Verhältnis zwischen 0,8 und 1,25 lässt sich auf einen normalen, diploiden Haplotypen schließen, da die Menge an Amplikon und die Geschwindigkeit der Amplifikation der Patientenprobe weitgehend der der Kontrolle entspricht. Werte von 0,40 bis 0,75 weisen auf eine haploide Situation, und damit eine Deletion, hin. Entspricht das Verhältnis 1,5, muss von einer Duplikation in der Patientenprobe ausgegangen werden. 64 3. Ergebnisse Im Rahmen dieser Arbeit wurden neun Familien auf eine mögliche Kopplung zwischen dem Phänotyp Mikrozephalie und den bekannten MCPH-Loci untersucht. Nach Kopplungsanalyse mittels Mikrosatellitenmarker wurde in sieben Familien eine Kopplung zu jeweils einem der fünf Gene ASPM, CENPJ, Microcephalin, CDK5RAP2 und STIL vermutet. Dabei fand sich in einer dieser Familien sowohl zum STIL-, als auch zum Microcephalin-Gen eine fragliche Kopplung. In zwei der sieben Familien wurde die Kopplung für das ASPM- bzw. das CDK5RAP2-Gen durch anschließende Sequenzierung und Mutationsanalyse bestätigt. Durch Mutationsanalyse des CENPJ-, bzw. des Microcephalin-Gens in zwei Familien konnte die vermutete Kopplung ausgeschlossen werden. In zwei Fällen konnte die Kopplung zu den Genen ASPM und Microcephalin nicht endgültig bestätigt oder ausgeschlossen werden. Bei weiteren zwei Familien lag für keine der untersuchten MCPH-Loci eine mögliche Kopplung vor. 3.1. Kopplungen zum ASPM-Gen 3.1.1. Familie 6116: Mutation in Exon 18 Die Fragmentanalyse in Familie 6116 ließ eine Kopplung zwischen der Erkrankung der Kinder und dem ASPM-Gen vermuten. Die beiden Patienten zeigen Homozygotie für den gleichen Haplotyp, den sich auch die verwandten Eltern teilen. Die gesunde Tochter hingegen erbte von der Mutter den gleichen Haplotyp wie die Geschwister, vom Vater jedoch einen anderen (siehe Abb. 26). Die Sequenzanalyse der DNA des Patienten D6116 erbrachte ein eindeutiges Ergebnis: Der erkrankte Sohn zeigt Homozygotie für die Deletion c.7782-7783delGA in Exon 18. Der Verlust der Basen Guanin und Adenin führt zu einer Verschiebung im Leseraster (sogenannter „frameshift“) der Aminosäuresequenz, was Abbildung 27 verdeutlicht. Auch in der DNA des ebenfalls betroffenen Bruders D6118 konnte diese Mutation nachgewiesen werden. Die Verschiebung des Leserasters führt zur Alteration der Aminosäure Lysin zu Serin. Nach insgesamt fünf Änderungen in den aufeinanderfolgenden Aminosäuren resultiert ein vorzeitiges Stoppcodon (p.Lys2595SerfsX5). Es kommt dadurch zu einem vorzeitigen Abbruch der Polypeptidkette und einer Verkürzung des ASPM-Proteins von 3476 auf 2598 Aminosäuren. Das entspricht einer Trunkierung des Proteins auf 75 % der ursprünglichen Länge. Diese Veränderung ist in Exon 18 lokalisiert (siehe Abb. 28), durch das die Mehrheit der 74 Isoleucin-Glutamin Domänen (IQ-Domänen) kodiert wird (Bond, Roberts et al. 2002). Das 65 Screening der Eltern und des gesunden Geschwisterkindes D6117 zeigte, dass diese heterozygot für die oben genannte Mutation sind, was durch eine Überlappung der Sequenzierungsergebnisse sichtbar wird. Somit besteht für diese Mutation eine Anlageträgerschaft bei der nicht betroffenen Tochter. D6120 identisches Allel D6119 D1S1183 182 188 D1S2816 253 249 GDB:196987 184 168 AFM329vc1 247 247 SHGC-64057 103 103 D1S3469 129 117 D1S1183 182 188 D1S2816 251 249 GDB:196987 184 168 AFM329vc1 247 247 SHGC-64057 103 103 D1S3469 125 117 D6118 D6117 D6116 D1S1183 188 188 D1S1183 182 188 D1S1183 188 188 D1S2816 249 249 D1S2816 253 249 D1S2816 249 249 GDB:196987 168 168 GDB:196987 184 168 GDB:196987 168 168 AFM329vc1 247 247 AFM329vc1 247 247 AFM329vc1 247 247 SHGC-64057 103 103 SHGC-64057 103 103 SHGC-64057 103 103 D1S3469 117 117 D1S3469 129 117 D1S3469 117 117 Abb. 26 Haplotypen der Familie 6116 (ASPM) Die hier gefundene Sequenzänderung wurde erstmals bei kaukasischen und pakistanischen Patienten als pathogene Mutation beschrieben (Nicholas, Swanson et al. 2009). Die Autoren bezeichneten die Mutation c.7782_7783delGA auf Proteinebene als p.Gln2594fs. Eine Variation des ersten betroffenen Basentripletts von CAG zu CAA führt jedoch nicht zu einer Veränderung in der Abfolge der Aminosäuren, da beide Tripletts für Glutamin kodieren. Erst das zweite betroffene Basentriplett (AAA) kodiert nun für Serin (Ser) statt im Wildtyp für Lysin (Lys). Die korrekte Bezeichnung, die sich auf die erste veränderte Aminosäure bezieht, müsste demnach der in dieser Arbeit verwendeten Beschreibung (p.Lys2595SerfsX5) entsprechen. 66 Abb. 27 Deletion c.7782-7783delGA in Exon 18: Beim Patienten D6116 resultiert durch die Deletion der Aminosäuren Guanin und Adenin eine Verschiebung im Leseraster des Aminosäurecodes. Die DNA-Sequenz der Kontrollperson verdeutlicht die normale Aminosäureabfolge. Die Eltern, D6119 und D6120, sind heterozygot für die Deletion, was durch eine abrupte Überlappung der sequenzierten Stränge sichtbar wird. Abb. 28 Schematische Darstellung des ASPM-Gens und Proteins. A) Exon/Intron-Struktur des ASPM-Gens. Das größte Exon stellt mit 4,7 kb Exon 18 dar. Der Pfeil markiert die Lokalisation der Mutation in Familie 6116. B) Aufbau des ASPM-Proteins. Hierbei wird deutlich, dass ein Fehlen von Exon 18 durch alternatives Spleißen einzig in einer Längenvariation der IQ-Domänen resultiert. (Grafik und Text nach Nicholas et al. 2009) 67 3.1.2. Familie 5663: Sequenzvariation in Exon 16 und Intron 8 Bei der Analyse der Haplotypen in Familie 5663 zeigte sich eine mögliche Kopplung zwischen dem ASPM-Gen und der Erkrankung der Kinder. Der Stammbaum in Abbildung 29 zeigt, dass alle betroffenen Kinder offenbar die gleichen Haplotypen der Eltern teilen. Das legte bei nicht verwandten Eltern den Verdacht einer Compound-Heterozygotie nahe. Hierbei liegen zwei unterschiedliche Mutationen im selben Gen, eine auf dem väterlichen und die andere auf dem mütterlichen Chromosom, vor. Erhalten die Nachkommen diese mutierten Chromosomen, führt dies zu einem Funktions- oder Stabilitätsverlust des resultierenden Proteins und kann damit eine Erkrankung hervorrufen. In der molekulargenetischen Untersuchung konnte bei den betroffenen Geschwistern D5663 und D5665 ein heterozygoter Basenaustausch c.3796G>T in Exon 16 nachgewiesen werden (siehe Abb. 30). Hierbei kommt es zu einem Verlust der Aminosäure Glutamin (GAA) und zur Bildung eines Stoppcodons (TAA) auf Proteinebene (p.Glu1266X) (sogenannte Nonsense-Mutation). Dies resultiert in einem vorzeitigen Abbruch der Aminosäurekette während der Transkription und verkürzt das ASPM-Protein auf 36 % der eigentlichen Länge. D5667 D5666 D1S1183 192 181 D1S1183 192 181 D1S2816 253 253 D1S2816 251 249 GDB:196987 184 180 GDB:196987 184 176 SHGC-64057 103 103 SHGC-64057 103 103 D1S3469 125 121 D1S3469 121 121 D5665 D5664 D5663 D1S1183 192 192 D1S1183 192 192 D1S1183 192 192 D1S2816 253 251 D1S2816 253 251 D1S2816 253 251 GDB:196987 184 184 GDB:196987 184 184 GDB:196987 184 184 SHGC-64057 103 103 SHGC-64057 103 103 SHGC-64057 103 103 D1S3469 125 121 D1S3469 125 121 D1S3469 125 121 väterliches Allel mütterliches Allel Abb. 29 Haplotypen der Familie 5663 (ASPM) Im Screening der Eltern konnte die oben genannte Mutation bei der Mutter D5666 in heterozygotem Zustand nachgewiesen werden. Eine zweite, väterliche Mutation konnte 68 durch die Analyse der ASPM-Sequenz nicht gefunden werden. Eine heterozygote Deletion oder Insertion, die sich über ein komplettes Exon erstreckt, kann mit herkömmlicher DNASequenzierung nicht zur Darstellung gebracht werden. Um solch eine Mutation auszuschließen, wurde eine quantitative PCR bei den Eltern durchgeführt. Dabei wurden Primer in ausgewählten Exons positioniert, um eine Auflösung von mindestens 6,6 kb zu erreichen. Das Ergebnis erbrachte jedoch einen normalen Befund. Auf ein Screening des Patienten D5664 wurde verzichtet, da alle Geschwister den gleichen Haplotyp teilen und durch die Analyse von mehr als einem Kind ein Zufallsbefund ausgeschlossen werden konnte. Zudem war aufgrund des frühzeitig eingetretenen Todes nur sehr wenig Probenmaterial des Säuglings vorhanden. Bei der hier gefundenen Sequenzvariation handelt es sich um eine bekannte NonsenseMutation, die zuerst bei afrikanischen Patienten als Mutation beschrieben wurde (Nicholas, Swanson et al. 2009). Abb. 30 Basenaustauch c.3796G>T in Exon 16: Die beiden Geschwister und die Mutter zeigen Heterozygotie für die Punktmutation. 69 Weiterhin konnte in der DNA der Patientinnen D5663 und D5665, sowie beim Vater D5667 die bisher nicht beschriebene Sequenzvariation c.2630-26C>T in Intron 8 in heterozygoten Zustand nachgewiesen werden. In der DNA der Mutter liegt der Wildtyp in homozygoter Form vor. Eine Analyse mittels des Splice-Prediction-Programms „Berkeley Drosophila Genome Project“ (BDGP) konnte jedoch keine Änderung der Spleißstelle nachweisen (Reese, Eeckman et al. 1997). 3.2. Kopplung zum CDK5RAP2-Gen 3.2.1. Familie 6137: Mutation in Exon 30 Durch Analysen der Arbeitsgruppe konnte eine mögliche Kopplung zwischen dem mikrozephalen Phänotyp in der konsanguinen, italienisch-stämmigen Familie 6137 und dem CDK5RAP2-Gen nachgewiesen werden. Alle untersuchten Mikrosatellitenmarker lagen bei beiden betroffenen Kindern in homozygotem Zustand vor. Abb. 31 Basenaustauch c.4441C>T in Exon 30: Der Wechsel der Base Cytosin zu Thymin führt zu einem Verlust der Aminosäure Arginin und zu Bildung eines Stoppcodons. Bei den beiden betroffenen Söhnen liegt die Mutation in homozygotem Zustand vor, während die Eltern Heterozygotie für die Punktmutation zeigen. 70 Durch die Sequenz- und Mutationsanalyse der DNA der betroffenen Brüder D6137 und D6138 konnte die homozygote Punktmutation c.4441C>T in Exon 30 gefunden werden. Durch diesen Basenaustausch kommt es zu einem Wechsel des Basentripletts CGA (Arginin) zu TGA und damit zum Austausch der Aminosäure Arginin durch ein Stoppcodon (p.Arg1481X) (siehe Abb. 31). Diese Verkürzung der mRNA führt zu einer Trunkierung des CDK5RAP2-Proteins von 1893 auf 1480 Aminosäuren. Dies entspricht einem Verlust von 27 % der ursprünglichen Länge. Sowohl die Mutter als auch der Vater sind heterozygote Anlageträger. Diese Mutation wurde bisher nicht beschrieben. 3.3. Kopplung zum CENPJ-Gen 3.3.1. Familie 5938: Sequenzvariationen in Exon 2 und Intron 17 D5941 D5940 identisches Allel D13S1243 252 252 D13S1243 252 252 D3S1532 356 356 D3S1532 356 356 c.61G>A G A c.61G>A G A c.3042A>G G A c.3042A>G G G c.3216+7A>G G G c.3216+7A>G G G c.3478-49C>T T T c.3478-49C>T T T D13S308 148 148 D13S308 148 148 D13S221 241 229 D13S221 241 229 D13S1254 222 220 D13S1254 222 220 D5939 D5938 D13S1243 252 252 D13S1243 252 252 D3S1532 356 356 356 356 D13S1243 252 252 c.61G>A G A 252 D3S1532 G A D3S1532 356 356 c.3042A>G G G 356 c.61G>A G G c.61G>A G G c.3216+7A>G G G G c.3042A>G G G c.3042A>G G G c.3478-49C>T T T G c.3216+7A>G T T c.3216+7A>G G G D13S308 148 148 G c.3478-49C>T 148 148 c.3478-49C>T T T D13S221 241 229 T D13S308 241 229 D13S308 148 148 D13S1254 222 220 148 D13S221 241 D13S1254 222 220 D13S221 241 241 D13S1254 222 222 D13S1243 D3S1532 c.61G>A c.3042A>G c.3216+7A>G c.3478-49C>T D13S308 D13S221 D13S1254 252 356 G G G T 148 241 222 222 Abb. 32 Haplotypen der Familie 5938 (CENPJ): Marker und Ergebnisse der Sequenzierungsanalyse Der durch die Fragmentanalyse erstellte Stammbaum der Haplotypen von Familie 5938 (siehe Abb. 32) zeigte eine mögliche Kopplung zwischen dem Phänotyp der beiden Kinder und dem CENPJ-Gen: Bei verwandten Eltern sind die beiden von Mikrozephalie betroffenen Patienten homozygot für den Haplotyp, der bei den gesunden Geschwisterkindern und den 71 Eltern in heterozygotem Zustand vorliegt. Durch Sequenzanalyse der gesamten kodierenden Region des CENPJ-Gens, inklusive Exon-Intron-Grenzen, konnte der Basenaustausch c.61A>G in Exon 2, welcher in homozygoter Form vorliegt, nachgewiesen werden. Dieser wurde bereits als Polymorphismus mit der Nummer rs35498994 (NCBI dbSNP Short Genetic Variations: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/projects/SNP/) beschrieben. Aus dieser Variation resultiert eine Veränderung in der Abfolge der Aminosäuren von Methionin zu Valin (p.Met21Val), welche eine strukturelle und damit funktionelle Auswirkung auf das CENPJ-Protein haben könnte. Um eine mögliche pathogene Mutation von einem in der türkischen Bevölkerung vorkommenden Polymorphismus ohne Krankheitswert zu unterscheiden, wurden mittels Restriktionsverdau DNA-Proben 58 gesunder türkischer Personen (insgesamt 116 Chromosomen) auf das Vorliegen dieser Variation untersucht. In der Wildtyp-Sequenz existiert lediglich eine Erkennungssequenz für das Enzym Tsp451 innerhalb des 707 bp großen Amplikons (CENPJ, Exon 2). Durch Restriktionsverdau entstehen somit zwei Fragmente (479 bp und 228 bp) (siehe Abb. 33). Wildtyp: 5’CTGGGTTGAGGTTTGGGCTCATTTTTGGTAGGACATCTAATGGCTTTACCTAATACATTTTGTTGGCTAT TTTTGTCTACAGGTGTTGGAAATCAATAGCTCTTCTAGCCTTTGCATTGTTTAAATATAATAGTGTCATTGG ACTAAGATGTTCCTGATGCCAACCTCTTCAGAGTTAAACAGTGGGCAGAACTTCCTAACCCAGTGGATGACC AATCCTTCTCGGGCTGGGGTCATATTAAATCGTGGATTTCCTATTTTGGAAGCAGACAAAGAGAAGCGAGCA GCTGTGGACATTTCTACCAGCTTTCCTATTAAAGGCACACATTTTTCTGATAGCTTCAGCTTTATAAATGAA GAAGATTCACTTCTTGAAGAACAGAAGTTGGAGTCAAACAACCCTTACAAACCACAGTCAGATAAATCTGAA ACCCATACAGCCTTTCCTTGCATTAAAAAGGGACCACAGGTAGCGGCAT▼GTCACAGTGCTCCTGGACACCA GGAAGAAAACAAAAATGACTTCATCCCAGATCTTGCGAGTGAATTCAAAGAAGGGGCTTATAAAGACCCACT TTTTAAAAAACTTGAACAGGTACAATAGGATTTGGCCTACTSTGAATTTATGTCATTGCAGGTTTCTGTTTA TGTAATAAAGTCATTTGTTCTAGGTCTTCTTGTTTTTTCCCCTTCACTCTGAAATCCTCAGA 3’ D5939: 5’CTGGGTTGAGGTTTGGGCTCATTTTTGGTAGGACATCTAATGGCTTTACCTAATACATTTTGTTGGCTAT TTTTGTCTACAGGTGTTGGAAATCAATAGCTCTTCTAGCCTTTGCATTGTTTAAATATAATAGTGTCATTGG ACTAAGATGTTCCTGATGCCAACCTCTTCAGAGTTAAACAGTGGGCAGAACTTCCTAACCCAGTGG▼GTGAC CAATCCTTCTCGGGCTGGGGTCATATTAAATCGTGGATTTCCTATTTTGGAAGCAGACAAAGAGAAGCGAGC AGCTGTGGACATTTCTACCAGCTTTCCTATTAAAGGCACACATTTTTCTGATAGCTTCAGCTTTATAAATGA AGAAGATTCACTTCTTGAAGAACAGAAGTTGGAGTCAAACAACCCTTACAAACCACAGTCAGATAAATCTGA AACCCATACAGCCTTTCCTTGCATTAAAAAGGGACCACAGGTAGCGGCAT▼GTCACAGTGCTCCTGGACACC AGGAAGAAAACAAAAATGACTTCATCCCAGATCTTGCGAGTGAATTCAAAGAAGGGGCTTATAAAGACCCAC TTTTTAAAAAACTTGAACAGGTACAATAGGATTTGGCCTACTSTGAATTTATGTCATTGCAGGTTTCTGTTT ATGTAATAAAGTCATTTGTTCTAGGTCTTCTTGTTTTTTCCCCTTCACTCTGAAATCCTCAGA 3’ EXON / INTRON PRIMER STARTCODON SEQUENZÄNDERUNG ERKENNUNGSSEQUENZ ▼ Restriktionsstelle Abb. 33 CENPJ, Exon 2 (707 bp): In der Wildtyp-Sequenz findet sich eine Schnittstelle für das Enzym Tsp451. Kommt es zum Basenaustausch c.61A>G entsteht eine weitere Restriktionsstelle. Liegt der Basenaustauch c.61A>G vor, entsteht dadurch eine zusätzliche Restriktionsstelle für das Enzym Tsp451. Im Gegensatz zur nicht mutierten Sequenz liegen nach Restrikti- 72 onsverdau somit drei Fragmente (271bp, 228bp und 208 bp) vor. Die Banden, die dadurch in der Gelelektrophorese entstanden, zeigt Abbildung 34. In 10 von 116 Kontrollchromosomen (8,6 %) konnte die Sequenzänderung c.61A>G nachgewiesen werden. Dabei konnte sie bei keiner der untersuchten Personen in homozygotem Zustand gefunden werden. Nach dem Hardy-Weinberg-Gesetz52 errechnet sich daraus jedoch eine Häufigkeit von 0,7 % (1:142) für das Vorliegen homozygoter Mutationsträger in der Gesamtpopulation. Dies übersteigt die Inzidenz von primärer Mikrozephalie, die 1:30000 bis 1:250000 (Passemard, Kaindl et al. 2009) beträgt, bei weitem. Abb. 34 Restriktionsverdau mittels Tsp451 des Amplikons „CENPJ Exon 2“: In Spur 1 wurde das unverdaute Amplikon (707 bp) als Negativkontrolle aufgetragen. Spur 2 (Patient D5939) zeigt zwei deutliche Banden: Die Fragmente der Größe 228 und 208 bp wurden aufgrund der geringen Größendifferenz durch die Elektrophorese nicht komplett aufgetrennt. Zudem ist ein Fragment der Größe 271 bp sichtbar. Dieses ergibt sich aus dem Vorliegen der Sequenzvariation c.61A>G und der dadurch neu entstandenen Schnittstelle, in diesem Fall in homozygotem Zustand. Spur 3-10: Bei den Kontrollpersonen erkennt man beim homozygoten Wildtyp zwei Banden der Größe 479 bp und 228 bp. Liegt die Sequenzvariation in heterozygotem Zustand vor, entstehen drei deutliche Banden (Spuren 7, 9). In Spur 11 wurde der 100 bp-Marker aufgetragen. Die sehr schwachen Banden der Größe 479 bp und 707 bp in den Spuren 2-10 entsprechen nicht komplett verdauten Amplikons bzw. Fragmenten. Desweiteren konnte die bisher nicht beschriebene Sequenzvariationen c.3825-31delT in Intron 17 in homozygotem Zustand nachgewiesen werden. Die Analyse dieser Sequenz durch den Online-Dienst „NetGene2 Server“ zeigte keine Beeinflussung der ursprünglichen Splice-Site (Hebsgaard, Korning et al. 1996). Auch wurde diese Variation der Basenabfolge bisher in der SNP-Datenbank des Onlinedienstes NCBI nicht als Polymorphismus beschrieben. Eine Kopplung zwischen der in der Familie 5938 aufgetretenen Mikrozephalie zum CENPJGen als möglicherweise krankheitsauslösendes Gen ist somit unwahrscheinlich. 52 Das Hardy-Weinberg-Gesetz p²+2pq+q²=1 beschreibt ein Gleichgewicht zwischen dominanten und rezessiven Merkmalen unter der Annahme fehlender Inzucht und Auslese. Dabei bezeichnet p die Häufigkeit eines dominanten Alles und q die Häufigkeit eines rezessiven Allels. 73 3.4. Kopplungen zum Microcephalin-Gen 3.4.1. Familie 5424: Sequenzvariation in Exon 13 Die Fragmentanalyse bei Familie 5424 ergab eine mögliche Kopplung zwischen der Mikrozephalie der zwei erkrankten Kinder zum MCPH1-Gen. Die beiden betroffenen Töchter teilen sich die gleichen Haplotypen, wohingegen das gesunde Geschwisterkind die beiden anderen Allele der Eltern geerbt hat (siehe Abb. 35). Dies lässt bei nicht verwandten Eltern und rezessivem Erbgang eine Compound-Heterozygotie vermuten. D5427 D5429 D5428 GDB:315473 179 179 GDB:315473 191 191 D8S1099 251 260 D8S1099 263 253 D8S1742 129 129 D8S1742 137 139 c.2378C>A C C c.2378C>A A C c.2215-19A>G A G c.2215-19A>G A A c.2215-15C>G C G c.2215-15C>G C C c.2226C>T C T c.2226C>T C C c.2282C>T C T c.2282C>T C C c.2418C>A C A c.2418C>A C C D8S277 156 156 D8S277 156 156 D8S561 176 176 D8S561 176 178 D8S1819 220 228 D8S1819 216 216 D5424 D5426 D5425 GDB:315473 183 179 GDB:315473 191 179 D8S1099 251 260 D8S1099 263 251 D8S1742 129 129 GDB:315473 191 179 D8S1742 137 129 c.2378C>A C C D8S1099 263 251 c.2378C>A A C c.2215-19A>G G G D8S1742 137 129 c.2215-19A>G A A c.2215-15C>G G G c.2378C>A A C c.2215-15C>G C C c.2226C>T T T c.2215-19A>G A A c.2226C>T C C c.2282C>T T T c.2215-15C>G C C c.2282C>T C C c.2418C>A A A c.2226C>T C C c.2418C>A C C D8S277 156 156 c.2282C>T C C D8S277 156 156 D8S561 176 176 c.2418C>A C C D8S561 176 176 D8S1819 222 228 D8S277 156 156 D8S1819 216 220 D8S561 176 176 D8S1819 216 220 mütterliches Allel A väterliches Allel A mütterliches Allel B väterliches Allel B GDB:315473 191 179 D8S1099 253 260 D8S1742 139 129 c.2378C>A C C c.2215-19A>G A G c.2215-15C>G C G c.2226C>T C T c.2282C>T C T c.2418C>A C A D8S277 156 156 D8S561 178 176 D8S1819 216 228 Abb. 35 Haplotypen der Familie 5424 (MCPH1): Marker und bekannte Polymorphismen 74 Bei anschließender Sequenzierung des Microcephalin-Gens bei den Patienten D5424 und D5425 konnte in Exon 13 das Vorliegen einer Sequenzvariation (c.2378C>A) in heterozygoter Form nachgewiesen werden (siehe Abb. 36), die bisher in der SNP-Datenbank des Onlinedienstes NCBI nicht als Polymorphismus beschrieben wurde. Der Wechsel von Cytosin zu Adenin führt zu einer Veränderung der Abfolge der Aminosäuren, nämlich zum Austausch von Alanin (GCC) durch Aspartat (GAC) (p.Ala793Asp). Eine Analyse der veränderten Sequenz durch den Online-Dienst „Mutation Taster“ erbrachte das Ergebnis, dass diese Variation mit einer Wahrscheinlichkeit von 99,99 % als krankheitsverursachend angesehen werden kann. Eine verminderte Proteinstabilität wurde auch durch die Online-Software „MuStab“ (Teng, Srivastava et al. 2010) vorhergesagt. Abb. 36 Basenaustauch c.2378C>A in Exon 13 (MCPH1) in Familie 5424 Auch väterlicherseits konnte diese Variation in der Basenabfolge in heterozygoter Form nachgewiesen werden. Die nicht betroffene Tochter D5426 sowie die Mutter zeigten diese Variation nicht, was wiederum auf eine Compound-Heterozygotie hindeutete. Trotz kompletter Sequenzierung und Mutationsanalyse des MCPH1-Gens konnte jedoch keine zweite, mütterliche Mutation gefunden werden. Auch eine Analyse mittels quantitativer PCR bei den Geschwistern D5424 und D5425 sowie den Eltern erbrachte einen normalen Befund. 75 3.4.2. Familie 5557: Sequenzvariationen in Exon 6, 8 und 13 Durch die für die Kopplungsanalysen durchgeführte Sequenzierung des SNP-reichen Exons 13 des MCPH1-Gens in Familie 5557 wurde deutlich, dass die Patientin D5557 für alle Polymorphismen Homozygotie zeigt, nicht jedoch für die flankierenden Mikrosatellitenmarker (siehe Abb. 37). Um eine möglicherweise pathogene Mutation auszuschließen, erfolgte eine Sequenz- und Mutationsanalyse des Microcephalin-Gens. D5560 c.2215-19A>G c.2215-15C>G c.2226C>T c.2282C>T c.2418C>A D8S1742 D8S561 D8S1819 D5559 G G T T A 138 176 222 c.2215-19A>G c.2215-15C>G c.2226C>T c.2282C>T c.2418C>A D8S1742 D8S561 D8S1819 A C C C C 130 176 218 G G T T A 138 176 222 A C C C C 138 178 214 D5558 D5557 c.2215-19A>G c.2215-15C>G c.2226C>T c.2282C>T c.2418C>A D8S1742 D8S561 D8S1819 G G T T A 142 176 220 G G T T A 142 176 220 mütterliches Allel A väterliches Allel A mütterliches Allel B väterliches Allel B c.2215-19A>G c.2215-15C>G c.2226C>T c.2282C>T c.2418C>A D8S1742 D8S561 D8S1819 A C C C C 130 176 218 A C C C C 138 178 214 Abb. 37 Haplotypen der Familie 5557 (MCPH1) Dabei konnten insgesamt zehn bekannte Sequenzvariationen detektiert werden (vgl. Tabelle 4). Da es sich bei vier dieser SNPs um Missense-Veränderungen handelte, erfolgte eine weitere Analyse durch die Online-Software „Mutation Taster“. Alle Variationen wurden als nicht pathogene Polymorphismen interpretiert. Daraus lässt sich eine Kopplung zum MCPH1-Gen in der Familie 5557 ausschließen. 76 Tabelle 4 Polymorphismen der Patientin D5557 im MCPH1-Gen. MissenseMutationen sind grau markiert. Position Lokalisation cDNA-Ebene Proteinebene NCBI-Referenznummer* 5‘UTR c.1-59G>C rs2305023 Exon 3 c.228G>T p.Val76Val rs2305022 Exon 6 c.513G>T p.Arg171Ser rs2442513 Exon 8 c.940G>C p.Asp314His rs930557 Exon 8 c.1175A>G p.Asp392Gly rs2515569 Intron 12 c.2215-19A>G rs2936531 Intron 12 c.2215-15C>G rs11137040 Exon 13 c.2226C>T p.Ser742Ser rs2912010 Exon 13 c.2282C>T p.Ala761Val rs1057090 Exon 13 c.2418C>A p.Ala806Ala rs2912016 * nach NCBI dbSNP Short Genetic Variations: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/projects/SNP/ 3.5. Kopplungen zum STIL-Gen 3.5.1. Familie 5745 D5748 D5747 D1S2797 165 165 D1S2797 165 165 GDB:314853 333/337 333/337 GDB:314853 333/337 333/337 D1S3714 201 201 D1S3714 201 201 D1S2874 235 235 D1S2874 235 237 D1S2134 257 257 D1S2134 257 287 D1S2839 223 223 D1S2839 223 208 D5745 D5746 D1S2797 165 165 D1S2797 165 165 GDB:314853 333/337 333/337 GDB:314853 333/337 333/337 D1S3714 201 201 D1S3714 201 201 D1S2874 235 237 D1S2874 235 237 D1S2134 257 287 D1S2134 257 287 D1S2839 223 208 D1S2839 223 208 väterliches Allel mütterliches Allel Abb. 38 Haplotypen der Familie 5745 (STIL): Der Marker GDB:314853 konnte keinem Allel eindeutig zugeordnet werden, beweist jedoch die Heterozygotie beim Vater. Die Analyse der Haplotypen in Familie 5745 ergab den Verdacht auf eine Kopplung der Mikrozephalie der Kinder zum STIL-Gen (siehe Abb. 38). Die betroffenen Kinder zeigen 77 beide den gleichen Haplotyp in heterozygoter Form. Bei nicht verwandten Eltern bestand der Verdacht auf Compound-Heterozygotie. Durch weitere Sequenzanalyse der Arbeitsgruppe konnte keine pathogene Mutation detektiert werden. 3.5.2. Familie 5557 Die Fragmentanalyse in Familie 5557 ergab den Hinweis auf eine mögliche Kopplung zum STIL-Gen. Die betroffene Tochter zeigt Homozygotie für den Haplotyp, den sich auch die konsanguinen Eltern teilen (siehe Abb. 39). Beim nicht betroffenen Sohn konnte dieser Haplotyp in heterozygoter Form nachgewiesen werden. Beim Vorliegen einer Mutation im STIL-Gen dieser Familie wäre er damit Überträger des Gendefekts. D5560 D5559 D1S2797 164 164 D1S2797 164 142 GDB:314853 344 340 GDB:314853 344 329 D1S3714 201 190 D1S3714 201 203 D1S2874 235 232 D1S2874 235 237 D1S2134 287 287 D1S2134 287 268 D1S2839 226 222 D1S2839 226 226 D5557 D5558 D1S2797 164 164 D1S2797 164 142 GDB:314853 344 344 GDB:314853 344 329 201 203 D1S3714 201 201 D1S3714 D1S2874 235 235 D1S2874 235 237 287 268 226 226 D1S2134 287 287 D1S2134 D1S2839 226 226 D1S2839 identisches Allel mütterliches Allel, welches nur an den nicht betroffenen Sohn vererbt wurde Abb. 39 Haplotypen der Familie 5557 (STIL) Die Ergebnisse der Sequenz- und Mutationsanalyse ergaben eine mögliche Mutation, die in weiteren Arbeiten außerhalb des Rahmens dieser Dissertation bearbeitet wurde. 3.6. Sequenzvariationen unbekannter Signifikanz Wie bereits in den Kapiteln 3.1.2, 3.3.1 und 3.4 beschrieben, konnten im Laufe dieser Arbeit Sequenzvariationen in Patienten-DNA detektiert werden, die sich einer endgültigen Inter- 78 pretation entziehen. Eine Klärung dieser Befunde müsste in weiteren Untersuchungen angestrebt werden. Tabelle 5 stellt eine Zusammenfassung dieser Sequenzvariationen dar. Tabelle 5 Sequenzvariationen unbekannter Signifikanz Gen ASPM MCPH1 CENPJ Exon/Intron Mutation vorhergesagter Proteineffekt Ethnie Referenz Intron 8 c.2630-26C>T kein Effekt auf Spleißstelle schwedisch diese Arbeit Exon 16 c.3796G>T p.Glu1266X schwedisch Nicholas, Swanson et al. 2009 Exon 6 c.513G>T p.Arg171Ser kurdisch bekannter SNP rs2442513* Exon 8 c.940G>C p.Asp314His kurdisch Exon 8 c.1175A>G p.Asp392Gly Exon 13 c.2282C>T p.Ala761Val Exon 13 c.2378C>A p.Ala793Asp US- amerikanischdeutsch diese Arbeit Exon 2 c.61A>G p.Met21Val türkisch bekannter SNP rs35498994 Intron 17 c.3825-31delT kein Effekt auf Spleißstelle türkisch diese Arbeit kurdisch kurdisch bekannter SNP rs930557 bekannter SNP rs2515569 bekannter SNP rs1057090 * rs-Nummern nach NCBI dbSNP Short Genetic Variations: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/projects/SNP/ 79 4. Diskussion Bei der autosomal rezessiven primären Mikrozephalie (MCPH) handelt es sich um eine genetisch wie klinisch heterogene Erkrankung des zentralen Nervensystems, die auf einem reduzierten Gehirnvolumen bei Geburt beruht und mit schwerer bis grenzwertiger mentaler Retardierung mit einem IQ zwischen 30 und 84 (Trimborn, Richter et al. 2005; Passemard, Kaindl et al. 2009; Kaindl, Passemard et al. 2010) einhergeht. Es handelt sich um ein seltenes Krankheitsbild, das eine erhöhte Inzidenz in konsanguinen Familien zeigt. Bisher wurden sieben Gene beschrieben, in welchen Mutationen zum Phänotyp der autosomal rezessiven primären Mikrozephalie führen: Microcephalin (MCPH1), WDR62 (MCPH2), CDK5RAP2 (MCPH3), CEP152 (MCPH4), ASPM (MCPH5), CENPJ (MCPH6), und STIL (MCPH7). Mutationen in diesen Genen führen jeweils zu MCPH Typ 1-7 (MCPH17). Mutationen in den Genen ASPM und WDR62 stellen mit 37-54 % (Passemard, Kaindl et al. 2009) beziehungsweise 18 % (Woods 2004; Nicholas, Khurshid et al. 2010) der Fälle die häufigsten Ursachen einer MCPH dar. Im Rahmen der vorliegenden Arbeit wurden Haplotypen von neun Familien mit insgesamt 17 Patienten mit klinischem Verdacht auf MCPH erstellt. Bestand der Verdacht auf eine Kopplung zwischen dem Phänotyp der Kinder und einem der MCPH-Loci, erfolgte eine Sequenz- und Mutationsanalyse des betreffenden Gens, sofern dieses zum Zeitpunkt der Untersuchung bekannt war. In dem uns zur Verfügung stehenden Patientenkollektiv konnte bei zwei Familien (22 %) eine pathogene Mutation in homozygotem Zustand detektiert und damit die klinische Diagnose MCPH molekulargenetisch bestätigt werden. Zusätzlich konnten in drei Fällen weitere Sequenzvariationen nachgewiesen werden, die jedoch nicht eindeutig als krankheitsverursachende Mutationen bestätigt werden konnten. Bei zwei Familien (22 %) konnte für keinen der MCPH-Loci eine mögliche Kopplung gefunden werden. In weiteren 22 % der Fälle wurde eine vermutete Kopplung durch anschließende Sequenzierung ausgeschlossen. Somit fand sich bei 44 % der Fälle keine genetische Ursache für das klinische Bild der betroffenen Patienten. 4.1. Molekulargenetische Methoden Kopplungsanalysen mittels polymorpher Mikrosatellitenmarker stellen eine etablierte Methode zur Untersuchung von Krankheiten dar, die einem autosomal rezessiven Erbgang unterliegen. Mit relativ geringem technischem und zeitlichem Aufwand können Haplotypen von Familien mit betroffenen Nachkommen erstellt und die Vererbung der parentalen Chromosomen rekonstruiert werden. 80 Bei autosomal rezessiven Erbgängen ist zu erwarten, dass das betroffene Kind zwei mutierte Chromosomen von den Eltern übertragen bekommen hat und es dadurch zur jeweiligen phänotypischen Ausprägung der Krankheit kommt. In konsanguinen Familien stellt dies meist eine identische Mutation dar, die an die Nachkommen weitergegeben wird. Allgemein ist das Risiko für das Vorliegen kindlicher Malformationen oder geistiger Retardierung im Vergleich zur Normalbevölkerung auf 5-6 % verdoppelt (DiMaio, Mahoeny, Fox 2010, S. 108). Im Laufe dieser Arbeit konnten in sieben von neun Familien (77 %) mögliche Kopplungen zwischen dem klinischem Erscheinungsbild und einem der sieben MCPH-Loci gefunden werden. In zwei Familien wurden dabei durch anschließende Sequenz- und Mutationsanalysen pathogene Mutationen in den Genen ASPM (Familie 6116) und CDK5RAP2 (Familie 6137) nachgewiesen, wobei die Veränderung im CDK5RAP2-Gen bisher unbeschrieben ist. Zusätzlich konnten im Rahmen dieser Arbeit sieben weitere Sequenzvariationen, für die zum Teil ein krankheitsauslösender Effekt vermutet, aber nicht eindeutig nachgewiesen werden konnte, gefunden werden. Zwei davon waren bisher nicht bekannt. Diese Ergebnisse erscheinen auf den ersten Blick unbefriedigend, da zunächst keine eindeutige Einordnung der Signifikanz der gefundenen Sequenzvariationen erfolgen kann. Für zukünftige Arbeitsgruppen, die sich mit den genetischen Ursachen der MCPH beschäftigen, können diese Resultate jedoch wichtige Hinweise für die Interpretation ihrer Ergebnisse liefern, sollten sie hier beschriebene Sequenzvariationen ebenfalls nachweisen. Somit können auch zunächst unklare Befunde helfen, den Genotyp der MCPH zu erweitern und die Summe der Polymorphismen in MCPH-Genen zu vergrößern. Diese Ergebnisse zeigen, dass eine vorangehende Kopplungsanalyse mit polymorphen Mikrosatellitenmarkern eine suffiziente Methode zur Detektion auch von bisher unbekannten Mutationen in seltenen MCPH-Loci darstellt. Bei nicht konsanguinen Familien mit sowohl betroffenen als auch nicht betroffenen Nachkommen, können die dadurch ermittelten Haplotypen ebenfalls hilfreich für die weitere Mutationssuche sein. Die Interpretation der Haplotypen in Familien mit lediglich einem betroffenen Kind ist jedoch nur beschränkt möglich: Sind die Eltern eines betroffenen Einzelkindes nicht verwandt, ist eine Analyse der Haplotypen nicht nutzbar. In konsanguinen Familien hingegen besteht aufgrund des ähnlichen Genoms der Eltern die Gefahr, falsch positive Ergebnisse der Kopplungsanalysen zu erhalten. Ein Beispiel hierfür ist Familie 5938, deren Haplotypen Homozygotie für den MCPH6-Locus zeigten. Dennoch konnte keine krankheitsverursachende Mutation im CENPJ-Gen gefunden werden, so dass vermutlich keine Assoziation zwischen dem Phänotyp der betroffenen Kinder und dem CENPJ-Gen besteht. 81 4.2. Mutationen im ASPM-Gen In 37-54 % der Fälle mit klinischem Verdacht auf MCPH stellen Mutationen im ASPM-Gen den zugrundeliegenden Gendefekt dar (Passemard, Kaindl et al. 2009) und sind dadurch die häufigste Ursache für diese Erkrankung (Roberts, Hampshire et al. 2002; Kumar, Blanton et al. 2004; Gul, Hassan et al. 2006; Nicholas, Swanson et al. 2009). Bisher konnten 89 pathogene Mutationen des ASPM-Gens beschrieben werden. Die meisten dieser Mutationen stellen Nonsense-Mutationen dar und führen somit zu einer Trunkierung des ASPM-Proteins; doch auch Deletionen (intragenisch und das komplette Gen betreffend), Insertionen, Veränderungen der Spleißstellen und Missense-Mutationen wurden beschrieben (Bond, Scott et al. 2003; Kumar, Blanton et al. 2004; Gul, Hassan et al. 2006; Desir, Cassart et al. 2008; Muhammad, Mahmood Baig et al. 2009; Nicholas, Swanson et al. 2009; Passemard, Titomanlio et al. 2009; Darvish, Esmaeeli-Nieh et al. 2010; Halsall, Nicholas et al. 2010). Mutationen in ASPM scheinen dabei unabhängig von der Ethnie vorzukommen (Nicholas, Swanson et al. 2009). In der afghanischen Familie 6116 konnte die bereits durch Nicholas et al. (2009) beschriebene MCPH-verursachende Nonsense-Mutation c.7782_7783delGA in homozygotem Zustand nachgewiesen werden. Diese Veränderung liegt in Exon 18, durch das die Mehrheit der 74 Isoleucin-Glutamin Domänen (IQ-Domänen) kodiert wird (Bond, Roberts et al. 2002). Eine der beiden Hauptisoformen des ASPM-Proteins entsteht durch alternatives Spleißen, wodurch eine Variante mit deletiertem Exon 18 entsteht (Kouprina, Pavlicek et al. 2005). Passemard et al. (2009) stellten daher die Vermutung auf, dass Patienten mit mindestens einer in Exon 18 lokalisierten Mutation einen milderen Phänotyp aufweisen könnten, da sie noch in der Lage sind, eine kompetente Isoform des ASPM-Proteins zu produzieren. Die Autoren konnten diesen Verdacht durch einen Vergleich der IQ-Werte von Patienten mit MCPH5 untermauern: Der durchschnittliche IQ-Wert der von ihnen untersuchten Patienten mit mindestens einer Mutation in Exon 18 lag bei 64. Befanden sich beide Mutationen außerhalb von Exon 18, betrug der Durchschnitts-IQ 42. Der Patient D6118 aus Familie 6116 zeigt jedoch eine starke sprachliche Retardierung (vgl. Kapitel 3.1.1). Ein besonders milder Phänotyp von MCPH5 scheint demnach nicht vorzuliegen. Weitere klinische Angaben zur intellektuellen Entwicklung, auch des ebenfalls betroffenen älteren Bruders D6116, fehlen jedoch, so dass eine abschließende Beurteilung nur eingeschränkt möglich ist. Eine weitere Nonsense-Mutation konnte in heterozygoter Form in DNA der schwedischen, nicht konsanguinen Familie 5663 gefunden werden. Die betroffenen Kinder D5663 und D5665 zeigten einen antero-posterioren Gradienten in der Ausprägung der Gyrierung des Kortex, der auf eine Mutation im ASPM-Gen hinweisen kann (Desir, Cassart et al. 2008). Bei dieser Mutation handelt sich um den Austausch der Basen c.3796G>T in Exon 16, wodurch ein Stoppcodon (p.Glu1266X) entsteht und ein Translationsabbruch resultiert. Die 82 Mutter konnte ebenfalls als heterozygote Anlageträgerin dieser Mutation identifiziert werden. Beim Vater fand sich jedoch keine auffällige Sequenzveränderung. Auch eine Analyse durch qPCR mit der Frage nach heterozygoten Deletionen oder Duplikationen, die durch eine herkömmliche Sequenzanalyse im Normalfall nicht dargestellt werden können, erbrachte keinen pathologischen Befund. Somit ist nicht klar, ob Compound-Heterozygotie vorliegt und die väterliche Mutation eventuell deshalb nicht detektiert werden konnte, da sie einen bisher unbekannten regulierenden Abschnitt des ASPM-Gens (z. B. Promotorbereich) betreffen könnte. Eine bisher unbekannte Sequenzvariation in Intron 8 (c.2630-26C>T) konnte allerdings lediglich in der DNA der betroffenen Kinder und des Vaters in heterozygoter Form gefunden werden, wobei der Haplotyp der Mutter dem homozygoten Wildtyp entspricht. Diese Konstellation deckt sich auch mit der Annahme einer CompoundHeterozygotie. Der beschriebene Basenaustausch scheint nach Analysen durch das Programm „Berkeley Drosophila Genome Project“ (BDGP) (Reese, Eeckman et al. 1997) jedoch keinen Einfluss auf die Spleißstelle zu haben. Erst kürzlich konnte allerdings eine Studie zeigen, dass ein in der intronischen Sequenz von ASPM lokalisierter SNP (rs10922168) in weiblichen Individuen mit dem intrakraniellem Volumen korreliert (Rimol, Agartz et al. 2010). Die Autoren vermuten, dass regulatorische Bereiche des Gens von diesem SNP beeinflusst werden könnten. Ein ähnlicher Pathomechanismus wäre auch bei den betroffenen Patienten aus Familie 5663 möglich, so dass weitere Studien zu den regulatorischen Mechanismen des ASPM-Gens Hinweise zur Interpretation dieser Beobachtung liefern könnten. Eine andere Möglichkeit wäre das Vorliegen einer zufällig detektierten ASPM-Mutation, die in diesem Fall nicht zur Ausbildung des Krankheitsbildes führt. Der Phänotyp in dieser Familie könnte sich auch auf den Defekt eines anderen Gens begründen. Das extrem schwere Krankheitsbild der drei betroffenen Kinder mit ausgeprägter Epilepsie mit Todesfolge stellt – im Gegensatz zum im MRT dargestellten A>P-Gradienten in der Gyrierung – keine typische phänotypische Ausprägung von MCPH5 dar. Einen weiteren Hinweis, dass das Auffinden pathogener Mutationen in ASPM nicht immer mit MCPH5 assoziiert sein könnte, liefern die Arbeiten von Nicholas et al. (2009) und Halsall et al. (2010): Die oben genannte Mutation konnte bereits 2009 von Nicholas et al. in einer einzelnen afrikanischen Familie beschrieben werden, wobei eine Validierung dieses Ergebnisse mittels Sequenzierung oder Restriktionsverdau der DNA von gesunden Kontrollpersonen nicht angegeben wird. Dabei konnten die Autoren bei drei Familien dieser Studie eine Compound-Heterozygotie bei ASPMMutationen beobachten. Da die afrikanische Familie den einzigen bis dahin bekannten Anlageträger darstellt und keine weitere ASPM-Mutation dieser Studie in einer Familie aus Afrika gefunden wurde, ist davon auszugehen, dass der Basenaustausch c.3796G>T erstmals in homozygotem Zustand detektiert wurde. Halsall et al. (2010) beschrieben anschlie- 83 ßend das Auffinden drei pathogener Mutationen in den beiden ASPM-Kopien in der DNA zweier Individuen aus verschiedenen Familien. Dabei konnten sie die oben genannte Mutation c.3796G>T gemeinsam mit einem anderen Basenaustausch (c.10060C>T, p.Arg3354X) auf demselben Chromosom (cis) eines Elternteils finden. Die Autoren errechneten daraufhin aus vorliegenden Daten eine mögliche Frequenz von 3 % für das Vorliegen dreifacher Mutationen im ASPM-Gen. Eine mögliche Erklärung könnte sein, dass sich phylogenetisch ältere Mutationen leichter in Populationen verbreiten konnten und daher auch häufiger multipel vererbt werden könnten (Halsall, Nicholas et al. 2010). Dies ist ein Hinweis darauf, dass es sich bei der in Familie 5663 vorliegenden Mutation um einen Zufallsbefund handeln könnte. Als Schlussfolgerung für den Fall aus unserem Patientenkollektiv lässt sich also feststellen, dass es sich bei der in Familie 5663 gefundenen Mutation mit großer Wahrscheinlichkeit um eine pathogene Mutation handelt, die in homozygotem Zustand oder beim Vorliegen einer Compound-Heterozygotie zu MCPH5 führen kann (Nicholas, Swanson et al. 2009; Halsall, Nicholas et al. 2010). Diese muss jedoch nicht zwingend den Grund für die phänotypische Ausprägung der betroffenen Kinder der Familie 5663 darstellen. 4.3. Mutation im CDK5RAP2-Gen Bisher konnten zwei pathogene Mutationen im CDK5RAP2-Gen pakistanischer Familien beschrieben werden. Somit stellt MCPH3 einen sehr seltenen Locus für MCPH dar. Die Nonsense-Mutation c.243T>A (p.Ser81X) in Exon 4 konnte 2005 von Bond et al. in einer konsanguinen Familie aus dem Norden Pakistans gefunden werden. Hassan et al. (2007) wiesen diese Mutation in einer anderen, ebenfalls konsanguinen pakistanischen Familie nach und korrigierten die Bezeichnung zu c.246T>A (p.Tyr82X). Die zweite durch Bond et al. (2005) beschriebene Mutation stellt der Basenaustausch c.4005-15A>G in Intron 26 dar. Durch diese Variation kommt es zu einer Veränderung der Spleiß-Akzeptor-Stelle (Bond et al. 2005). In dem uns zur Verfügung stehenden Patientenkollektiv konnte in der konsanguinen italienisch-stämmigen Familie 6137 der bisher unbekannte Basenaustausch c.4441C>T in Exon 30 detektiert werden. Diese Punktmutation liegt in homozygotem Zustand vor und führt zur Bildung des Stoppcodons TGA (p.Arg1481X). Durch den vorzeitigen Translationsabbruch kommt es zum Verlust von 412 Aminosäuren am C-Terminus und dadurch zu einer Verkürzung des CDK5RAP2-Proteins auf 73 % der ursprünglichen Länge. Buchman et al. (2010) konnten zeigen, dass CDK5RAP2 eine C-terminale Bindungsstelle für Perizentrin (englisch: pericentrin, PCNT) aufweist. Diese wird durch 622 carboxyterminale Aminosäuren kodiert, wobei vor allem die am weitesten am C-Terminus liegenden Aminosäuren für die Bindung entscheidend sind (Buchman, Tseng et al. 2010). Die Interak- 84 tion dieser Proteine scheint nach Buchman et al. (2010) zwei Auswirkungen zu haben: Zum einen rekrutiert PCNT CDK5RAP2 zum Zentrosom. Zum anderen könnte CDK5RAP2 ein Verbindungsprotein zwischen PCNT und γ-Tubulin darstellen, da die Bindungsstellen für diese Proteine an den entgegengesetzten Termini des CDK5RAP2-Proteins liegen. Ein Verlust der Interaktion zwischen CDK5RAP2 und PCNT führt zu einem Defizit essentieller Zentrosom-assoziierter Funktionen, was schließlich in einer insuffizienten Neurogenese und einer Fehlentwicklung des Kortex resultiert (Buchman, Tseng et al. 2010). Die von uns identifizierte Mutation in Familie 6137 führt zu einer Trunkierung dieser PCNTBindungsdomäne von 622 auf 210 Aminosäuren und damit auf 33 % der ursprünglichen Länge. Da vor allem die am weitesten C-terminal gelegenen Aminosäuren für die PCNTBindung essentiell sind (Buchman, Tseng et al. 2010), scheint die Ausbildung des Phänotyps der Patienten D6137 und D6138 auf eine fehlende Interaktion mit PCNT zurückzuführen zu sein. Es kann somit davon ausgegangen werden, dass die Nonsense-Mutation p.Arg1481X die krankheitsverursachende Mutation in dieser Familie darstellt. 4.4. Sequenzvariation im MCPH1-Gen In Familie 5424 konnte die bisher unbekannte Sequenzvariation c.2378C>A in Exon 13 des Microcephalin-Gens bei den beiden betroffenen Kindern und dem gesunden Vater in heterozygoter Form nachgewiesen werden. Durch zwei bioinformatische Analysen konnte ein krankheitsverursachender Effekt mit einer Wahrscheinlichkeit von 99,99 % bzw. eine verminderte Proteinstabilität errechnet werden. Dennoch blieb eine zweite, mütterliche Mutation auch nach einer DNA-Analyse mittels qPCR unentdeckt. Eine weitere Möglichkeit, pathogene Mutationen zu detektieren, stellt die Untersuchung des Promotors von MCPH1 dar. Bisher ist der Promotor, der regulatorische Bereich eines Gens, nur unsicher vorherzusagen (Irie, Park et al. 2011) und die promotortypischen Motive sind sehr kurz und kommen in sehr vielen kodierenden und nicht-kodierenden Abschnitten der DNA vor (Xiong 2006, S. 113). Dennoch können Mutationen der Promotor-Region Einfluss auf die korrekte Expression des Gens haben, indem sie diese zum Beispiel dauerhaft inhibieren. Aus diesem Grund wurde die regelrechte Funktion des MCPH1-Proteins geprüft: Veränderungen der Microcephalin-Sequenz können zu einer vorzeitigen Kondensierung der Chromosomen und damit zu vorzeitigem Zelltod oder einer verminderten Proliferation führen, was ein geeigneter diagnostischer Marker für Patienten mit primärer Mikozephalie vom Typ MCPH1 zu sein scheint (Trimborn, Bell et al. 2004). Blut der Indexpatientin D5424 wurde daher zur zytogenetischen Untersuchung in das Institut für Medizinische Genetik des Universitätsklinikums Charité in Berlin geschickt, um ein Screening auf vorzeitige Kondensierung der Chromosomen durchzuführen. Ein typischer Befund, wie er durch Trimborn et al. (2004) bei MCPH1-Patienten beobachtet werden konnte, wurde nicht nachgewiesen. 85 Eine Veränderung auf Proteinebene durch die heterozygote Variation im MCPH1-Gen dieser Familie lässt sich daher nicht nachvollziehen. Das Fehlen einer zweiten Variation in der MCPH1-Sequenz und den negativen Befunden aus qPCR und zytogenetischer Untersuchung stellt die Relevanz des MCPH1-Gens bei der Ausbildung des Phänotyps der betroffenen Töchter in Frage. 4.5. Genotyp-Phänotyp-Korrelation Bisher konnte keine Korrelation zwischen Genotyp und Phänotyp bei MCPH sicher bestätigt werden (Bond, Scott et al. 2003), wobei neuere Studien dies in Frage stellen. Passemard, Titomanlio et al. (2009) konnten beispielsweise die bereits erwähnte Korrelation zwischen der Lokalisation von ASPM-Mutationen innerhalb des Gens und den IQ-Werten der von ihnen untersuchten Patienten feststellen. Dabei scheinen Mutationen, die in Exon 18 liegen, von einer milderen mentalen Retardierung betroffen zu sein. Den Autoren standen dabei jedoch lediglich sieben Patienten mit mindestens einem mutierten Exon 18 zur Verfügung, so dass die statistische Aussagekraft dieser Beobachtung beschränkt ist. Wie in Kapitel 4.2. beschrieben, erbrachte ein Vergleich der in dieser Arbeit gewonnenen Daten aus Familie 6116 keine eindeutigen Hinweise auf einen Zusammenhang zwischen dem IQ der Patienten und Lokalisation der Mutation in Exon 18 des ASPM-Gens. Die Autoren beschreiben weiterhin einen progredienten Mikrozephalus aller von MCPH5 betroffenen Patienten dieser Studie auf mehr als -3 SD innerhalb des ersten Lebensjahres. Mit einem Kopfumfang von jeweils -6,6 SD im Alter von 14 Monaten entspricht vor allem Patient D6116 dieser Beobachtung. Vom älteren Bruder D6118 liegen keine genaueren Daten des Kopfumfangs im ersten Lebensjahr vor. Jedoch konnte von Geburt bis zum vierten Lebensjahr eine Abnahme des KU von -3,1 SD auf -4,9 SD gemessen werden, was ebenfalls einem progredienten Mikrozephalus entspricht. Die von MCPH3 betroffenen Patienten D6137 und D6138 zeigen neben der Mikrozephalie einen wenig schweren Phänotyp mit jeweils milder mentaler Retardierung. Bei beiden Patienten fällt jedoch eine ausgeprägte Hyperaktivität auf, die auch bei Patienten mit MCPH5 beobachtet werden konnte (Passemard, Titomanlio et al. 2009). Der erste bekannte Kopfumfang des älteren Sohns D6138 der Familie im Alter von drei Monaten liegt um 5,9 Standardabweichungen unter dem Median. Der Patient verhält sich teilweise aggressiv und aufbrausend. Sein IQ wird von den behandelnden Ärzten zwischen 50 und 69 angesiedelt. Weiterhin fällt eine Tic-Störung auf, die sich durch wiederholendes Schmatzen, Blinzeln oder Nicken bemerkbar macht. Beim jüngeren Bruder D6137 konnte ein Mikrozephalus weniger starker Ausprägung gefunden werden: bei Geburt lag der Messwert des Kopfumfangs 3,5 SD und im Alter von drei Monaten 4,7 SD unter dem Median. Hierbei wird deutlich, dass auch identische Mutationen in MCPH-Patienten zu unterschiedlichen phänotypischen 86 Ausprägungen des jeweils betroffenen Individuums führen können. Weiterhin konnte bei D6137 eine beinbetonte Hyperpigmentierung beobachtet werden. Ob es sich um einen Befund handelt, der in kausaler Beziehung zum Genotyp steht, kann nicht abschließend geklärt werden, da Vergleichsfälle aufgrund des seltenen Krankheitsbildes fehlen. Weiterhin ist nicht bekannt, ob auch die Eltern eine Pigmentstörung aufweisen. Bisher wurden in Patienten mit CDK5RAP2-Mutationen keine Pigmentierungsstörungen oder andere dermatologischen Auffälligkeiten beschrieben (Moynihan, Jackson et al. 2000; Bond, Roberts et al. 2005; Hassan, Khurshid et al. 2007). Aufgrund der Verwandtschaft der Eltern könnte es sich bei dieser phänotypischen Auffälligkeit jedoch auch um die Segregation eines weiteren autosomal rezessiv vererbten Krankheitsbildes oder Merkmals dieser Familie handeln. Vergleicht man diese Daten mit den bisher in der Literatur beschriebenen Fällen, zeigen sich Übereinstimmungen: Moynihan et al. (2000) beschrieben Homozygotie für Chromosom 9q34 in der konsanguinen pakistanischen Familie, in der Bond et al. 2005 Mutationen in CDK5RAP2 nachweisen konnten. Die betroffenen Kinder dieser Familie zeigten intellektuelle Fähigkeiten in der unteren Norm bzw. milde bis moderate mentale Retardierung. Ein Patient litt zudem an kongenitaler Taubheit und zeigte intermittierend tonisch-klonische Krampfanfälle. Der Kopfumfang der von MCPH betroffenen Personen lag -6 bis -8 SD unter dem Median. Hassan et al. (2007) fanden in der von ihnen untersuchten konsanguinen Familie aus Pakistan mit MCPH3 Kopfumfangswerte von -4 bis -7 SD. Die Autoren beobachteten ebenfalls eine milde bis moderate mentale Retardierung ohne weitere neurologische Auffälligkeiten. Die IQ-Werte der dort beschriebenen Patienten lagen zwischen 51 und 65. Diese Ergebnisse decken sich – bis auf den erheblich ausgeprägteren Mikrozephalus – deutlich mit dem phänotypischen Erscheinungsbild der Patienten aus Familie 6137. Nicht unerwähnt bleiben sollen zudem zwei weitere Studien, die eine fragliche GenotypPhänotyp-Korrelation thematisieren: Zum einen konnten Wang et al. (2008) eine positive Assoziation zwischen dem Auftreten eines bestimmten SNPs (rs1057090, c.2282C>T, p.Ala761Val) in Microcephalin in männlichen Personen einer chinesischen Population und der Gehirngröße ausmachen. Dieser SNP konnte auch in DNA der Patientin D5557 als Zufallsbefund gefunden werden. Da es sich um ein Mädchen handelt, kann ein Vergleich zu den Daten aus der Studie von Wang et al. (2008) jedoch nicht gezogen werden. Eine weitere Studie von Rimol et al. (2010) erbrachte eine geschlechtsspezifische Korrelation zwischen dem Auftreten bestimmter SNPs in den Genen ASPM, Microcephalin und CDK5RAP2 und dem Gehirnvolumen, der Kortexfläche und dem intrakraniellem Volumen. Während der Sequenzanalysen im Rahmen dieser Arbeit konnten in den Sequenzen der Gene CDK5RAP2, Microcephalin und ASPM jedoch keiner der durch Rimol et al. (2010) beschriebenen SNPs detektiert werden. 87 In Zusammenschau der während dieser Arbeit gewonnenen Ergebnisse und vorhandener Literatur bleibt eine Korrelation zwischen Genotyp und Phänotyp bei MCPH fraglich. Die Patienten der in dieser Dissertation untersuchten Kohorte zeigen zwar phänotypische Auffälligkeiten, die zum Teil bereits in anderen Patienten mit MCPH3 beziehungsweise MCPH5 beschrieben werden konnten, unterscheiden sich jedoch auch nicht durch ein grundlegendes Merkmal von anderen MCPH-Fällen. Mit den durch diese Arbeit untersuchten Patienten liegt die Anzahl bisher beschriebener Fälle von MCPH3 bei acht und ist damit sehr gering. Beim Vorliegen eines Borderline-Kopfumfangs in Kombination mit einem A>P-Gradienten in der Ausprägung der kortikalen Gyrierung könnte jedoch eine molekulargenetische Analyse des ASPM-Gens ohne vorangehende Kopplungsanalyse in Erwägung gezogen werden. Zum einen handelt es sich bei Mutationen in ASPM um die häufigste genetische Ursache für MCPH, so dass die Wahrscheinlichkeit, bei begründetem klinischem Verdacht Mutationen zu detektieren, hoch ist. Zum anderen scheint eine Minderentwicklung vorrangig des frontalen Kortex häufig bei Patienten mit ASPM-Mutationen vorzukommen (Desir, Cassart et al. 2008). Die bei Familie 6116 und 6137 gefundenen Daten zeigen einen progredienten Mikrozephalus, wie er bei MCPH auftreten kann und unterstreichen die Notwendigkeit, den Kopfumfang von mikrozephalen Kindern auch postnatal zu überwachen. Für die klinische Praxis bedeutet dies auch, dass in solchen Fällen nach Ausschluss externer Ursachen eines kongenitalen Mikrozephalus eine molekulargenetische Analyse der MCPH-Gene angestrebt werden sollte. 4.6. Mutationshäufigkeit und Konsequenzen für die Diagnostik Im Rahmen dieser Arbeit konnte bei zwei von neun Indexpatienten eine eindeutige genetische Ursache des familiären Phänotyps gefunden und dadurch die klinische Verdachtsdiagnose MCPH bestätigt werden. Dies entspricht einer definitiven Detektionsrate von 22 %. Schließt man die Familien 5663, 5557 und 5424 mit in allen Fällen fraglich pathogenen Mutationen in die Berechnung ein, erhält man eine Detektionsrate von 55 %. Durch Vergleich mit Daten aus der Literatur zeigt sich, dass sich auch die Detektionsraten vorangegangener Studien um diese Werte bewegen: Passemard, Titomanlio et al. (2009) konnten in 22 % der von ihnen untersuchten Patienten Mutationen im ASPM-Gen nachweisen. Eine große Studie von Nicholas et al. (2009) mit insgesamt 99 Familien erbrachte eine kohortenabhängige Detektionsrate von ASPM-Mutationen zwischen 7 % und 40 %. Durch die molekulargenetische Analyse der DNA von 112 konsanguinen Familien mit insgesamt 315 betroffenen Patienten konnten pathogene Mutationen der Gene ASPM, CENPJ und Microcephalin in 20 Familien nachgewiesen werden (Darvish, Esmaeeli-Nieh et al. 2010). Dies entspricht einer 88 Detektionsrate von 18 %, wobei Mutationen im ASPM-Gen mit 55 % den Hauptteil der in dieser Studie gefundenen Mutationen stellen. Bei einer durchschnittlichen Detektionsrate von etwa 20 % ist eine molekulargenetische Diagnostik bei klinisch begründetem Verdacht auf MCPH durchaus sinnvoll. Auch wenn durch eine Erweiterung der Einschlusskriterien, wie in dieser und anderen Studien (Nicholas, Swanson et al. 2009; Passemard, Titomanlio et al. 2009) geschehen, die Detektionsrate gesenkt werden könnte, können dennoch MCPH-verursachende – zum Teil auch unbekannte – Mutationen nachgewiesen werden. Eine genauere pränatale Diagnostik kann den betroffenen Familien helfen, eine genetische Klärung ihrer Erkrankung zu erhalten, wodurch sich für die Überträger von MCPH verbesserte Möglichkeiten zur zukünftigen Familienplanung ergeben. 4.7. Bedeutung negativer Kopplungsanalysen 20-32 % aller Familien mit dem klinischen Bild einer MCPH zeigen keine Kopplung zu einem der bisher bekannten MCPH-Loci (Woods 2004; Kaindl, Passemard et al. 2010). Bei zwei aus neun Familien (22 %) unserer Kohorte konnte für keinen der MCPH-Loci eine mögliche Kopplung gefunden werden. Darvish et al. (2010) konnten sogar bei 72,3 % der Fälle keinerlei Kopplung zu den MCPH-Loci 1-7 aufzeigen. Schließt man die Loci, für die durch anschließende Sequenzanalyse eine Kopplung eindeutig ausgeschlossen werden konnte, in die Berechnung mit ein, erhält man eine Rate von 44 %. Bei den Familien 5424 (fragliche Kopplung zu Microcephalin), 5663 (fragliche Kopplung zu ASPM) und 5557 (fragliche Kopplung zu STIL) konnte jedoch keine Mutation detektiert werden, die zweifelsfrei den familiären Phänotyp verursacht. Damit konnte lediglich bei zwei der neun Familien die genetische Ursache des Krankheitsbildes geklärt werden. 77 % der in dieser Arbeit untersuchten Fälle bleiben somit vorerst ungelöst. Die Tatsache, dass einige der betroffenen Familien keine Kopplung zu den bisher bekannten MCPH-Loci zeigen, deutet darauf hin, dass die Entdeckung weiterer MCPH-Gene zu erwarten ist (Woods 2004). Denkbar wären auch Mutationen, die einem autosomal dominanten Erbgang unterliegen und daher durch die Suche nach homozygoten DNAAbschnitten in betroffenen Familien, wie sie bisher durchgeführt wird, nicht aufgedeckt werden können. Die Haplotypen von Familien, die eine Kopplung zu einem bereits bekannten MCPH-Locus vermuten ließen, diese aber durch anschließende Sequenzierung ausgeschlossen werden konnte, entziehen sich einer eindeutigen Interpretation. Zum einen könnten Mutationen in bisher unbekannten Bereichen eines Gens, wie zum Beispiel dem Promotorbereich, vorliegen, die durch die bisherige molekulargenetische Analyse nicht zufriedenstellend dargestellt werden können. Zum anderen könnte es sich bei homozygoten Berei- 89 chen in konsanguinen Familien, die aufgrund ihrer Konsanguinität einen sehr ähnlichen Genotyp aufweisen, um reine Zufallsbefunde handeln. Weiterhin besteht die Möglichkeit, dass aufgrund der geringen Fallzahlen die Definition anderer, MCPH verwandter Krankheitsbilder, durch weitere Analysen zu Unterformen der autosomal rezessiven primären Mikrozephalie umgedeutet werden könnten. Mögliche Kandidatengene, in denen Mutationen zu einem der MCPH sehr ähnlichen Phänotyp führen, sind zum Beispiel PCNT und PNKP. Mutationen in PNKP führen zur Ausbildung vom Mikrozephalie, schwerer Epilepsie, Entwicklungsverzögerung und Hyperaktivität, auch als MCSZ (englisch: microcephaly, seizures) bezeichnet (Shen, Gilmore et al. 2010). Dieser Phänotyp, der eine große Ähnlichkeit zu MCPH aufweist, könnte somit auch eine weitere Form von MCPH darstellen. PNKP wird in neuronalen Progenitorzellen der Ventrikulärzone exprimiert und scheint – ähnlich wie Microcephalin – wichtige Funktionen in der Reparatur von Doppel- und Einzelstrangbrüchen der DNA inne zu haben (Liang, Gao et al. 2010; Shen, Gilmore et al. 2010). Die enge funktionelle Beziehung zwischen den Proteinen PCNT, MCPH1 und CDK5RAP2 legen die Vermutung nahe, dass Mutationen in Perizentrin zu einer weiteren Form von MCPH führen könnten. Bisher wurden Mutationen im PCNT-Gen in Patienten mit MOPD II (englisch: Majewski osteodysplastic primordial dwarfism type II) nachgewiesen (Rauch, Thiel et al. 2008). Dieses Krankheitsbild ist durch extremen Kleinwuchs (durchschnittliche Körpergröße 100 cm), Knochen- und Zahnanomalien und Mikrozephalie gekennzeichnet; eine schwere mentale Retardierung tritt jedoch nur selten auf (Hall, Flora et al. 2004). Auch Patienten mit MCPH1 können einen milden Kleinwuchs (bis 3 SD) zeigen (Trimborn, Bell et al. 2004; Passemard, Kaindl et al. 2009). Trotz der klinischen Unterschiede wäre es denkbar, dass Mutationen im PCNT- oder PNKP-Gen auch MCPH verursachen. Beispiele aus der Literatur verdeutlichen die engen Beziehungen der an MCPH beteiligten Gene mit weiteren kortikalen Fehlbildungen: in der DNA von Patienten mit dem klinischen Bild eines Seckel-Syndroms konnten Mutationen in CENPJ nachgewiesen werden, von dem bis zu diesem Zeitpunkt lediglich bekannt war, MCPH6 zu verursachen (Al-Dosari, Shaheen et al. 2010). Eine weitere Studie von Trimborn et al. aus dem Jahr 2004 erbrachte, dass Mutationen in Microcephalin sowohl zum Phänotyp MCPH1, als auch zum PCC-Syndrom führen können. Das PCC-Syndrom präsentiert sich mit Mikrozephalie, postnatalem Kleinwuchs und vorzeitiger Chromosomenkondensation (Neitzel, Neumann et al. 2002), könnte also auch dem klinischen Bild bei MCPH1 entsprechen. Weitere Studien, die die DNA bisher ungeklärter MCPH-Verdachtsfälle auf Mutationen des PNKP- und PCNT-Gens untersuchen, könnten zur Einordnung dieser erst kürzlich beschriebenen Krankheitsbilder beziehungsweise Gene beitragen. 90 4.8. Ausblick Durch die Mutationsanalysen dieser Arbeit konnte eine bisher unbekannte Mutation des seltenen MCPH-Locus CDK5RAP2 beschrieben werden. Diese Entdeckung trägt zur stetig wachsenden Genotypisierung der MCPH bei. Weiterhin helfen die Erkenntnisse über bisher unbeschriebene Mutationen, die molekularen Ursachen der MCPH besser zu verstehen. Auch betroffene Familien profitieren von der Entdeckung bisher unbekannter Mutationen, da sich ihnen weitere Möglichkeiten der molekulargenetischen Diagnosestellung eröffnen. Desweiteren können neue MCPH-typische Phänotypen analysiert und somit das klinische Bild dieser seltenen Erkrankung erweitert werden. In Exon 18 des ASPM-Gens lokalisierte Mutationen könnten mit einem milderen Phänotyp im Sinne höherer IQ-Werte im Vergleich zu anderen Patienten mit MCPH5 einhergehen (Passemard, Titomanlio et al. 2009). Eine retrospektive Analyse von MCPH5- Patientenkohorten vorangehender Studien in Bezug auf eine mögliche Korrelation könnte zur Klärung dieser Fragestellung beitragen. Kann dabei eine deutliche Differenz der IQWerte bewiesen werden, wäre die Nutzung dieses Zusammenhangs als prädiktiver Marker für die weitere kindliche Entwicklung denkbar. Durch technische Fortschritte im Bereich des Sequenzierens kompletter Exome und wachsende Erkenntnisse zu Genregulierungen, zur Rolle der intronischen Sequenzen und zur Kortikoneurogenese, werden in Zukunft höchstwahrscheinlich noch weitere Mutationen in MCPH-Genen und bisher unbekannte Loci und Pathomechanismen der MCPH gefunden werden. Somit bleibt zu hoffen, dass die Entdeckung weiterer beteiligter Gene dazu beiträgt, die zukünftige molekulargenetische Diagnostik zu erleichtern, die Detektionsrate von Mutationen weiter zu erhöhen und das Verständnis dieser seltenen Erbkrankheit zu vertiefen. 91 5. Zusammenfassung Die primäre Mikrozephalie (MCPH) stellt eine genetisch und klinisch heterogene Erkrankung des zentralen Nervensystems dar. Die bisher bekannten Formen folgen einem autosomal rezessiven Erbgang. Die Inzidenz beträgt 1:10000 in konsanguinen Populationen. Klinisch ist ein verminderter Kopfumfang ab -2 SD bei Geburt wegweisend. Endokrine, umweltbedingte, syndromale und infektiologische Ursachen der Mikrozephalie müssen ausgeschlossen sein. Bei Patienten mit MCPH findet sich im kranialen MRT typischerweise eine weitgehend normale Hirnarchitektur mit insgesamt verminderten Proportionen. Weiterhin können Kleinwuchs (bis -3 SD), eine Intelligenzminderung sowie Epilepsie auftreten. Bisher wurden sieben Gene, in denen Mutationen zum Phänotyp der primären Mikrozephalie führen können, beschrieben: Microcephalin (MCPH1), WDR62 (MCPH2), CDK5RAP2 (MCPH3), CEP152 (MCPH4), ASPM (MCPH5), CENPJ (MCPH6), und STIL (MCPH7). Die Gene WDR62 und CEP152 waren zum Zeitpunkt der molekulargenetischen Untersuchungen für diese Arbeit noch nicht bekannt, so dass lediglich die zugehörigen Loci, MCPH2 und MCPH4, analysiert wurden. Im Rahmen der vorliegenden Arbeit wurden Haplotypen von Patienten mit MCPH und deren Familien für alle bekannten Loci mittels polymorphen Mikrosatellitenmarkern erstellt. Wurde eine Kopplung zu einem der Gene beziehungsweise Loci vermutet, erfolgte anschließend eine Sequenzierung und Mutationsanalyse des betreffenden Gens. Das uns zur Verfügung stehenden Patientenkollektiv umfasste neun Familien mit insgesamt 17 betroffenen Kindern. In zwei Familien konnten im ASPM- beziehungsweise CDK5RAP2Gen pathogene Sequenzvariationen detektiert werden. Die Mutation im CDK5RAP2-Gen ist bisher nicht beschrieben. Bei zwei nicht konsanguinen Familien wurde eine Kopplung mit Compound-Heterozygotie vermutet, wobei jeweils nur eine von zwei zu erwartenden Mutationen im ASPM- bzw. Microcephalin-Gen identifiziert werden konnte. Somit wurde lediglich bei 22 % der Familien eine eindeutige molekulargenetische Ursache der Mikrozephalie gefunden. Die Entdeckung der bisher unbekannten Mutation im CDK5RAP2-Gen trägt dabei zur stetig wachsenden Genotypisierung der MCPH bei. Insgesamt konnten in 55 % der Fälle fraglich pathogene Sequenzvariationen bzw. Mutationen nachgewiesen werden. Dies zeigt, dass eine vorangehende Kopplungsanalyse mit anschließender gezielter Sequenzierung eines Gens eine effiziente Methode zur Detektion von Mutationen darstellt. In den restlichen Familien (44 %) konnte keine Kopplung vermutet bzw. bewiesen werden. Zusätzliche MCPH-Loci scheinen daher noch unentdeckt zu sein. Diese Ergebnisse können helfen, eine molekulargenetische Diagnose der MCPH in Zukunft weiter zu verbessern. 92 6. Literaturverzeichnis Abuelo, D. (2007). "Microcephaly syndromes." Semin Pediatr Neurol 14(3): 118-127. Al-Dosari, M. S., R. Shaheen, et al. (2010). "Novel CENPJ mutation causes Seckel syndrome." J Med Genet 47(6): 411-414. Alderton, G. K., L. Galbiati, et al. (2006). "Regulation of mitotic entry by microcephalin and its overlap with ATR signalling." Nat Cell Biol 8(7): 725-733. Alderton, G. K., H. Joenje, et al. (2004). "Seckel syndrome exhibits cellular features demonstrating defects in the ATR-signalling pathway." Hum Mol Genet 13(24): 3127-3138. Barkovich, A. J., R. I. Kuzniecky, et al. (2001). "Classification system for malformations of cortical development: update 2001." Neurology 57(12): 2168-2178. Barrot, M., D. N. Abrous, et al. (2001). "Influence of glucocorticoids on dopaminergic transmission in the rat dorsolateral striatum." Eur J Neurosci 13(4): 812-818. Bassing, C. H. and F. W. Alt (2004). "The cellular response to general and programmed DNA double strand breaks." DNA Repair (Amst) 3(8-9): 781-796. Bettencourt-Dias, M., A. Rodrigues-Martins, et al. (2005). "SAK/PLK4 is required for centriole duplication and flagella development." Curr Biol 15(24): 2199-2207. Bhardwaj, R. D., M. A. Curtis, et al. (2006). "Neocortical neurogenesis in humans is restricted to development." Proc Natl Acad Sci U S A 103(33): 12564-12568. Bikeye, S. N., C. Colin, et al. (2010). "ASPM-associated stem cell proliferation is involved in malignant progression of gliomas and constitutes an attractive therapeutic target." Cancer Cell Int 10: 1. Bilguvar, K., A. K. Ozturk, et al. (2010). "Whole-exome sequencing identifies recessive WDR62 mutations in severe brain malformations." Nature 467(7312): 207-210. Bond, J., E. Roberts, et al. (2002). "ASPM is a major determinant of cerebral cortical size." Nat Genet 32(2): 316-320. Bond, J., E. Roberts, et al. (2005). "A centrosomal mechanism involving CDK5RAP2 and CENPJ controls brain size." Nat Genet 37(4): 353-355. Bond, J., S. Scott, et al. (2003). "Protein-truncating mutations in ASPM cause variable reduction in brain size." Am J Hum Genet 73(5): 1170-1177. Bond, J. and C. G. Woods (2006). "Cytoskeletal genes regulating brain size." Curr Opin Cell Biol 18(1): 95-101. Bork, P., K. Hofmann, et al. (1997). "A superfamily of conserved domains in DNA damageresponsive cell cycle checkpoint proteins." FASEB J 11(1): 68-76. Borozdin, W., D. Boehm, et al. (2004). "SALL4 deletions are a common cause of Okihiro and acro-renal-ocular syndromes and confirm haploinsufficiency as the pathogenic mechanism." J Med Genet 41(9): e113. Borrell, V., B. K. Kaspar, et al. (2006). "In vivo evidence for radial migration of neurons by long-distance somal translocation in the developing ferret visual cortex." Cereb Cortex 16(11): 1571-1583. Braitenberg, V. (2001). "Brain size and number of neurons: an exercise in synthetic neuroanatomy." J Comput Neurosci 10(1): 71-77. Buchman, J. J., H. C. Tseng, et al. (2010). "Cdk5rap2 interacts with pericentrin to maintain the neural progenitor pool in the developing neocortex." Neuron 66(3): 386-402. Buss, R. R. and R. W. Oppenheim (2004). "Role of programmed cell death in normal neuronal development and function." Anat Sci Int 79(4): 191-197. Buss, R. R., W. Sun, et al. (2006). "Adaptive roles of programmed cell death during nervous system development." Annu Rev Neurosci 29: 1-35. Campaner, S., P. Kaldis, et al. (2005). "Sil phosphorylation in a Pin1 binding domain affects the duration of the spindle checkpoint." Mol Cell Biol 25(15): 6660-6672. Caviness, V. S., Jr. and P. Rakic (1978). "Mechanisms of cortical development: a view from mutations in mice." Annu Rev Neurosci 1: 297-326. Chen, C. Y., M. A. Olayioye, et al. (2006). "CPAP interacts with 14-3-3 in a cell cycledependent manner." Biochem Biophys Res Commun 342(4): 1203-1210. 93 Chenn, A. and S. K. McConnell (1995). "Cleavage orientation and the asymmetric inheritance of Notch1 immunoreactivity in mammalian neurogenesis." Cell 82(4): 631-641. Cho, J. H., C. J. Chang, et al. (2006). "Depletion of CPAP by RNAi disrupts centrosome integrity and induces multipolar spindles." Biochem Biophys Res Commun 339(3): 742-747. Choi, Y. K., P. Liu, et al. (2010). "CDK5RAP2 stimulates microtubule nucleation by the gamma-tubulin ring complex." J Cell Biol 191(6): 1089-1095. Cizmecioglu, O., M. Arnold, et al. (2010). "Cep152 acts as a scaffold for recruitment of Plk4 and CPAP to the centrosome." J Cell Biol 191(4): 731-739. Cox, J., A. P. Jackson, et al. (2006). "What primary microcephaly can tell us about brain growth." Trends Mol Med 12(8): 358-366. D'Arcangelo, G., G. G. Miao, et al. (1995). "A protein related to extracellular matrix proteins deleted in the mouse mutant reeler." Nature 374(6524): 719-723. Dani S. U., Hori A., Walter G. F. (1997): Principles of neural aging. Elsevier Health Sciences Darvish, H., S. Esmaeeli-Nieh, et al. (2010). "A clinical and molecular genetic study of 112 Iranian families with primary microcephaly." J Med Genet 47(12): 823-828. de Onis, M. e. a., World Health Organization (2007). WHO child growth standards. head circumference-for-age, arm circumference-for-age, triceps skinfold-for-age and subscapular skinfold-for-age : methods and development. Genf, WHO Press. de Onis, M. e. a., World Health Organization (2006). World Health Organization child growth standards. length/height-for-age, weight-for-age, weight-for-length, weight-forheight and body mass index-for-age : methods and development. Genf, WHO Press. Desir, J., M. Cassart, et al. (2008). "Primary microcephaly with ASPM mutation shows simplified cortical gyration with antero-posterior gradient pre- and post-natally." Am J Med Genet A 146A(11): 1439-1443. De Vries, B. B., R. Winter, et al. (2003). "Telomeres: a diagnosis at the end of the chromosomes." J Med Genet 40(6): 385-398. Dictenberg, J. B., W. Zimmerman, et al. (1998). "Pericentrin and gamma-tubulin form a protein complex and are organized into a novel lattice at the centrosome." J Cell Biol 141(1): 163-174. DiMaio M. S., Mahoney M. J., Fox J. E. (2010): Prenatal Diagnosis: Cases and Clinical Challenges. John Wiley and Sons Dobyns, W. B. (2002). "Primary microcephaly: new approaches for an old disorder." Am J Med Genet 112(4): 315-317. Erez, A., A. Castiel, et al. (2007). "The SIL gene is essential for mitotic entry and survival of cancer cells." Cancer Res 67(9): 4022-4027. Erez, A., M. Chaussepied, et al. (2008). "The mitotic checkpoint gene, SIL is regulated by E2F1." Int J Cancer 123(7): 1721-1725. Erez, A., M. Perelman, et al. (2004). "Sil overexpression in lung cancer characterizes tumors with increased mitotic activity." Oncogene 23(31): 5371-5377. Evans, P. D., J. R. Anderson, et al. (2004). "Reconstructing the evolutionary history of microcephalin, a gene controlling human brain size." Hum Mol Genet 13(11): 11391145. Evans, P. D., J. R. Anderson, et al. (2004). "Adaptive evolution of ASPM, a major determinant of cerebral cortical size in humans." Hum Mol Genet 13(5): 489-494. Evans, P. D., E. J. Vallender, et al. (2006). "Molecular evolution of the brain size regulator genes CDK5RAP2 and CENPJ." Gene 375: 75-79. Exner, G. U. (2003): Normalwerte in Wachstum und Entwicklung, 2. Auflage. Stuttgart, Thieme Faivre, L., M. Le Merrer, et al. (2002). "Clinical and genetic heterogeneity of Seckel syndrome." Am J Med Genet 112(4): 379-383. Farooq, M., S. Baig, et al. (2010). "Craniosynostosis-microcephaly with chromosomal breakage and other abnormalities is caused by a truncating MCPH1 mutation and is 94 allelic to premature chromosomal condensation syndrome and primary autosomal recessive microcephaly type 1." Am J Med Genet A 152A(2): 495-497. Fish, J. L., C. Dehay, et al. (2008). "Making bigger brains-the evolution of neural-progenitorcell division." J Cell Sci 121(Pt 17): 2783-2793. Fish, J. L., Y. Kosodo, et al. (2006). "Aspm specifically maintains symmetric proliferative divisions of neuroepithelial cells." Proc Natl Acad Sci U S A 103(27): 10438-10443. Fisk Green, R., M. Lorson, et al. (2004). "Identification of critical domains and putative partners for the Caenorhabditis elegans spindle component LIN-5." Mol Genet Genomics 271(5): 532-544. Flames, N., J. E. Long, et al. (2004). "Short- and long-range attraction of cortical GABAergic interneurons by neuregulin-1." Neuron 44(2): 251-261. Fong, K. W., Y. K. Choi, et al. (2008). "CDK5RAP2 is a pericentriolar protein that functions in centrosomal attachment of the gamma-tubulin ring complex." Mol Biol Cell 19(1): 115-125. Fujimori, A., T. Yaoi, et al. (2008). "Ionizing radiation downregulates ASPM, a gene responsible for microcephaly in humans." Biochem Biophys Res Commun 369(3): 953-957. Gavvovidis, I., C. Pohlmann, et al. (2010). "MCPH1 patient cells exhibit delayed release from DNA damage-induced G2/M checkpoint arrest." Cell Cycle 9(24): 4893-4899. Gongidi, V., C. Ring, et al. (2004). "SPARC-like 1 regulates the terminal phase of radial gliaguided migration in the cerebral cortex." Neuron 41(1): 57-69. Gotz, M. and W. B. Huttner (2005). "The cell biology of neurogenesis." Nat Rev Mol Cell Biol 6(10): 777-788. Graser, S., Y. D. Stierhof, et al. (2007). "Cep68 and Cep215 (Cdk5rap2) are required for centrosome cohesion." J Cell Sci 120(Pt 24): 4321-4331. Guernsey, D. L., H. Jiang, et al. (2010). "Mutations in centrosomal protein CEP152 in primary microcephaly families linked to MCPH4." Am J Hum Genet 87(1): 40-51. Gul, A., M. J. Hassan, et al. (2006). "A novel deletion mutation in CENPJ gene in a Pakistani family with autosomal recessive primary microcephaly." J Hum Genet 51(9): 760-764. Gul, A., M. J. Hassan, et al. (2006). "Genetic studies of autosomal recessive primary microcephaly in 33 Pakistani families: Novel sequence variants in ASPM gene." Neurogenetics 7(2): 105-110. Habedanck, R., Y. D. Stierhof, et al. (2005). "The Polo kinase Plk4 functions in centriole duplication." Nat Cell Biol 7(11): 1140-1146. Hagemann, C., J. Anacker, et al. (2008). "Expression analysis of the autosomal recessive primary microcephaly genes MCPH1 (microcephalin) and MCPH5 (ASPM, abnormal spindle-like, microcephaly associated) in human malignant gliomas." Oncol Rep 20(2): 301-308. Hall, J. G., C. Flora, et al. (2004). "Majewski osteodysplastic primordial dwarfism type II (MOPD II): natural history and clinical findings." Am J Med Genet A 130A(1): 55-72. Halsall, S., A. K. Nicholas, et al. (2010). "Critical consequences of finding three pathogenic mutations in an individual with recessive disease." J Med Genet 47(11): 769-770. Hassan, M. J., M. Khurshid, et al. (2007). "Previously described sequence variant in CDK5RAP2 gene in a Pakistani family with autosomal recessive primary microcephaly." BMC Med Genet 8: 58. Haubensak, W., A. Attardo, et al. (2004). "Neurons arise in the basal neuroepithelium of the early mammalian telencephalon: a major site of neurogenesis." Proc Natl Acad Sci U S A 101(9): 3196-3201. Hebsgaard, S. M., P. G. Korning, et al. (1996). "Splice site prediction in Arabidopsis thaliana pre-mRNA by combining local and global sequence information." Nucleic Acids Res 24(17): 3439-3452. Hermeking, H. (2003). "The 14-3-3 cancer connection." Nat Rev Cancer 3(12): 931-943. Higginbotham, H. R. and J. G. Gleeson (2007). "The centrosome in neuronal development." Trends Neurosci 30(6): 276-283. 95 Higgins, J., C. Midgley, et al. (2010). "Human ASPM participates in spindle organisation, spindle orientation and cytokinesis." BMC Cell Biol 11: 85. Hoffmann, G. F. (2004): Stoffwechselerkrankungen in der Neurologie, 1. Auflage. Stuttgart, Thieme Horvath, S., B. Zhang, et al. (2006). "Analysis of oncogenic signaling networks in glioblastoma identifies ASPM as a molecular target." Proc Natl Acad Sci U S A 103(46): 17402-17407. Huang, Z. (2009). "Molecular regulation of neuronal migration during neocortical development." Mol Cell Neurosci 42(1): 11-22. Hung, L. Y., H. L. Chen, et al. (2004). "Identification of a novel microtubule-destabilizing motif in CPAP that binds to tubulin heterodimers and inhibits microtubule assembly." Mol Biol Cell 15(6): 2697-2706. Hung, L. Y., C. J. Tang, et al. (2000). "Protein 4.1 R-135 interacts with a novel centrosomal protein (CPAP) which is associated with the gamma-tubulin complex." Mol Cell Biol 20(20): 7813-7825. Huyton, T., P. A. Bates, et al. (2000). "The BRCA1 C-terminal domain: structure and function." Mutat Res 460(3-4): 319-332. Irie, T., S. J. Park, et al. (2011). "Predicting promoter activities of primary human DNA sequences." Nucleic Acids Res 39(11): e75. Izraeli, S., T. Colaizzo-Anas, et al. (1997). "Expression of the SIL gene is correlated with growth induction and cellular proliferation." Cell Growth Differ 8(11): 1171-1179. Izraeli, S., L. A. Lowe, et al. (1999). "The SIL gene is required for mouse embryonic axial development and left-right specification." Nature 399(6737): 691-694. Jackson, A. P., H. Eastwood, et al. (2002). "Identification of microcephalin, a protein implicated in determining the size of the human brain." Am J Hum Genet 71(1): 136142. Jackson, A. P., D. P. McHale, et al. (1998). "Primary autosomal recessive microcephaly (MCPH1) maps to chromosome 8p22-pter." Am J Hum Genet 63(2): 541-546. Jaeken, J. and H. Carchon (1993). "The carbohydrate-deficient glycoprotein syndromes: an overview." J Inherit Metab Dis 16(5): 813-820. Jamieson, C. R., J. P. Fryns, et al. (2000). "Primary autosomal recessive microcephaly: MCPH5 maps to 1q25-q32." Am J Hum Genet 67(6): 1575-1577. Jamieson, C. R., C. Govaerts, et al. (1999). "Primary autosomal recessive microcephaly: homozygosity mapping of MCPH4 to chromosome 15." Am J Hum Genet 65(5): 1465-1469. Janigro D. (2006): The Cell Cyclus in the Central Nervous Sytem, Har/Cdr Auflage. Berlin, Springer Jerison, H. J. (1973): Evolution of the brain and intelligence. New York, Academic Press. Joachim Herz Lab, The University of Texas Southwestern Medical Center at Dallas (2004) Current Research, figure 2. URL: http://www4.utsouthwestern.edu/moleculargenetics/pages/herz/current2.html Stand: 27.04.2011 Kaindl, A. M., S. Passemard, et al. (2010). "Many roads lead to primary autosomal recessive microcephaly." Prog Neurobiol 90(3): 363-383. Kalay, E., G. Yigit, et al. (2011). "CEP152 is a genome maintenance protein disrupted in Seckel syndrome." Nat Genet 43(1): 23-26. Kaplan R., Saccuzzo D. (2008): Psychological Testing: Principles, Applications, and Issues, 7. Auflage. Cengage Learning Karkera, J. D., S. Izraeli, et al. (2002). "The genomic structure, chromosomal localization, and analysis of SIL as a candidate gene for holoprosencephaly." Cytogenet Genome Res 97(1-2): 62-67. Kleylein-Sohn, J., J. Westendorf, et al. (2007). "Plk4-induced centriole biogenesis in human cells." Dev Cell 13(2): 190-202. Kohlmaier, G., J. Loncarek, et al. (2009). "Overly long centrioles and defective cell division upon excess of the SAS-4-related protein CPAP." Curr Biol 19(12): 1012-1018. 96 Komai, T., K. Kishimoto, et al. (1955). "Genetic study of microcephaly based on Japanese material." Am J Hum Genet 7(1): 51-65. Korinthenberg, R. (2009): Neuropädiatrie: Evidenzbasierte Therapie, 1. Auflage. München, Urban & Fischer Verlag Kouprina, N., A. Pavlicek, et al. (2005). "The microcephaly ASPM gene is expressed in proliferating tissues and encodes for a mitotic spindle protein." Hum Mol Genet 14(15): 2155-2165. Kouprina, N., A. Pavlicek, et al. (2004). "Accelerated evolution of the ASPM gene controlling brain size begins prior to human brain expansion." PLoS Biol 2(5): E126. Koyanagi, M., M. Hijikata, et al. (2005). "Centrosomal P4.1-associated protein is a new member of transcriptional coactivators for nuclear factor-kappaB." J Biol Chem 280(13): 12430-12437. Kumar, A., S. H. Blanton, et al. (2004). "Genetic analysis of primary microcephaly in Indian families: novel ASPM mutations." Clin Genet 66(4): 341-348. Kumar, A., S. C. Girimaji, et al. (2009). "Mutations in STIL, encoding a pericentriolar and centrosomal protein, cause primary microcephaly." Am J Hum Genet 84(2): 286-290. Kunze, Jürgen (2009): Wiedemanns Atlas klinischer Syndrome, 6. Auflage. Stuttgart, Thieme Kuzminov, A. (1995). "Collapse and repair of replication forks in Escherichia coli." Mol Microbiol 16(3): 373-384. Leal, G. F., E. Roberts, et al. (2003). "A novel locus for autosomal recessive primary microcephaly (MCPH6) maps to 13q12.2." J Med Genet 40(7): 540-542. Lee, L. G., S. L. Spurgeon, et al. (1997). "New energy transfer dyes for DNA sequencing." Nucleic Acids Res 25(14): 2816-2822. Lewin, Benjamin et al. (2010): Lewin’s Genes X, Sudbury, Jones & Bartlett Learning Liang, Y., H. Gao, et al. (2010). "BRIT1/MCPH1 is essential for mitotic and meiotic recombination DNA repair and maintaining genomic stability in mice." PLoS Genet 6(1): e1000826. Lin, S. Y. and S. J. Elledge (2003). "Multiple tumor suppressor pathways negatively regulate telomerase." Cell 113(7): 881-889. Lin, S. Y., Y. Liang, et al. (2010). "Multiple roles of BRIT1/MCPH1 in DNA damage response, DNA repair, and cancer suppression." Yonsei Med J 51(3): 295-301. Lin, S. Y., H. W. Pan, et al. (2008). "ASPM is a novel marker for vascular invasion, early recurrence, and poor prognosis of hepatocellular carcinoma." Clin Cancer Res 14(15): 4814-4820. Lin, S. Y., R. Rai, et al. (2005). "BRIT1/MCPH1 is a DNA damage responsive protein that regulates the Brca1-Chk1 pathway, implicating checkpoint dysfunction in microcephaly." Proc Natl Acad Sci U S A 102(42): 15105-15109. Lizarraga, S. B., S. P. Margossian, et al. (2010). "Cdk5rap2 regulates centrosome function and chromosome segregation in neuronal progenitors." Development 137(11): 19071917. Lo Nigro, C., C. S. Chong, et al. (1997). "Point mutations and an intragenic deletion in LIS1, the lissencephaly causative gene in isolated lissencephaly sequence and MillerDieker syndrome." Hum Mol Genet 6(2): 157-164. Lorson, M. A., H. R. Horvitz, et al. (2000). "LIN-5 is a novel component of the spindle apparatus required for chromosome segregation and cleavage plane specification in Caenorhabditis elegans." J Cell Biol 148(1): 73-86. Macphail, E. (1982): Brain and intelligence in vertebrates. Oxford, Clarendon Press. Majewski, F. and T. O. Goecke (1998). "Microcephalic osteodysplastic primordial dwarfism type II: report of three cases and review." Am J Med Genet 80(1): 25-31. Marin, O., A. Yaron, et al. (2001). "Sorting of striatal and cortical interneurons regulated by semaphorin-neuropilin interactions." Science 293(5531): 872-875. Michalis, R. (2004): Entwicklungsneurologie und Neuropädiatrie: Grundlagen und diagnostische Strategien, 3. Auflage. Stuttgart, Thieme 97 Mizrachi-Koren, M., S. Shemer, et al. (2006). "Homozygosity mapping as a screening tool for the molecular diagnosis of hereditary skin diseases in consanguineous populations." J Am Acad Dermatol 55(3): 393-401. Montgomery, S. H., I. Capellini, et al. (2011). "Adaptive evolution of four microcephaly genes and the evolution of brain size in anthropoid primates." Mol Biol Evol 28(1): 625-638. Moynihan, L., A. P. Jackson, et al. (2000). "A third novel locus for primary autosomal recessive microcephaly maps to chromosome 9q34." Am J Hum Genet 66(2): 724727. Muhammad, F., S. Mahmood Baig, et al. (2009). "Compound heterozygous ASPM mutations in Pakistani MCPH families." Am J Med Genet A 149A(5): 926-930. Nadarajah, B., P. Alifragis, et al. (2002). "Ventricle-directed migration in the developing cerebral cortex." Nat Neurosci 5(3): 218-224. Nadarajah, B., J. E. Brunstrom, et al. (2001). "Two modes of radial migration in early development of the cerebral cortex." Nat Neurosci 4(2): 143-150. Nadarajah, B. and J. G. Parnavelas (2002). "Modes of neuronal migration in the developing cerebral cortex." Nat Rev Neurosci 3(6): 423-432. Neitzel, H., L. M. Neumann, et al. (2002). "Premature chromosome condensation in humans associated with microcephaly and mental retardation: a novel autosomal recessive condition." Am J Hum Genet 70(4): 1015-1022. Nicholas, A. K., M. Khurshid, et al. (2010). "WDR62 is associated with the spindle pole and is mutated in human microcephaly." Nat Genet. Nicholas, A. K., E. A. Swanson, et al. (2009). "The molecular landscape of ASPM mutations in primary microcephaly." J Med Genet 46(4): 249-253. Nieuwenhuys, R. (1994). "The neocortex. An overview of its evolutionary development, structural organization and synaptology." Anat Embryol (Berl) 190(4): 307-337. Nigg, E. A. and J. W. Raff (2009). "Centrioles, centrosomes, and cilia in health and disease." Cell 139(4): 663-678. Noctor, S. C., A. C. Flint, et al. (2001). "Neurons derived from radial glial cells establish radial units in neocortex." Nature 409(6821): 714-720. O'Driscoll, M., V. L. Ruiz-Perez, et al. (2003). "A splicing mutation affecting expression of ataxia-telangiectasia and Rad3-related protein (ATR) results in Seckel syndrome." Nat Genet 33(4): 497-501. Ogawa, M., T. Miyata, et al. (1995). "The reeler gene-associated antigen on Cajal-Retzius neurons is a crucial molecule for laminar organization of cortical neurons." Neuron 14(5): 899-912. Online Mendelian Inheritance in Man, OMIM (TM). McKusick-Nathans Institute of Genetic Medicine, Johns Hopkins University (Baltimore, MD) and National Center for Biotechnology Information, National Library of Medicine (Bethesda, MD), 05.03.2011. World Wide Web URL: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/omim/ Ozgen, H. M., E. van Daalen, et al. (2009). "Copy number changes of the microcephalin 1 gene (MCPH1) in patients with autism spectrum disorders." Clin Genet 76(4): 348356. Pandita, T. K. and W. N. Hittelman (1992). "The contribution of DNA and chromosome repair deficiencies to the radiosensitivity of ataxia-telangiectasia." Radiat Res 131(2): 214-223. Paramasivam, M., Y. J. Chang, et al. (2007). "ASPM and citron kinase co-localize to the midbody ring during cytokinesis." Cell Cycle 6(13): 1605-1612. Parnavelas, J. G. (2007): Cortical development: genes and genetic abnormalities. John Wiley and Sons Parrini, E., Ramazzotti, A., Guerrini, R. (2004) Heterotopie, noduläre periventrikuläre. URL: http://www.orpha.net/consor/cgi-bin/OC_Exp.php?lng=DE&Expert=98892. Stand: 12.04.2011 Passemard, S., A. M. Kaindl, et al. (2009). "Primary Autosomal Recessive Microcephaly." 98 Passemard, S., L. Titomanlio, et al. (2009). "Expanding the clinical and neuroradiologic phenotype of primary microcephaly due to ASPM mutations." Neurology 73(12): 962-969. Pattison, L., Y. J. Crow, et al. (2000). "A fifth locus for primary autosomal recessive microcephaly maps to chromosome 1q31." Am J Hum Genet 67(6): 1578-1580. Peng, B., K. D. Sutherland, et al. (2002). "CPAP is a novel stat5-interacting cofactor that augments stat5-mediated transcriptional activity." Mol Endocrinol 16(9): 2019-2033. Pfaff, K. L., C. T. Straub, et al. (2007). "The zebra fish cassiopeia mutant reveals that SIL is required for mitotic spindle organization." Mol Cell Biol 27(16): 5887-5897. Pilz, D. T., N. Matsumoto, et al. (1998). "LIS1 and XLIS (DCX) mutations cause most classical lissencephaly, but different patterns of malformation." Hum Mol Genet 7(13): 2029-2037. Pozas, E. and C. F. Ibanez (2005). "GDNF and GFRalpha1 promote differentiation and tangential migration of cortical GABAergic neurons." Neuron 45(5): 701-713. Qazi, Q. H. and T. E. Reed (1973). "A problem in diagnosis of primary versus secondary microcephaly." Clin Genet 4(1): 46-52. R Development Core Team (2011): R: A Language and Environment for Statistical Computing, R Foundation for Statistical Computing, Wien, ISBN: 3-900051-07-0, URL: http://www.R-project.org Rai, R., H. Dai, et al. (2006). "BRIT1 regulates early DNA damage response, chromosomal integrity, and cancer." Cancer Cell 10(2): 145-157. Rakic, P. (1995). "A small step for the cell, a giant leap for mankind: a hypothesis of neocortical expansion during evolution." Trends Neurosci 18(9): 383-388. Rakic, P. (2006). "Neuroscience. No more cortical neurons for you." Science 313(5789): 928-929. Rauch, A., C. T. Thiel, et al. (2008). "Mutations in the pericentrin (PCNT) gene cause primordial dwarfism." Science 319(5864): 816-819. Reese, M. G., F. H. Eeckman, et al. (1997). "Improved splice site detection in Genie." J Comput Biol 4(3): 311-323. Richardson, J., A. M. Shaaban, et al. (2010). "Microcephalin is a new novel prognostic indicator in breast cancer associated with BRCA1 inactivation." Breast Cancer Res Treat. Rimol, L. M., I. Agartz, et al. (2010). "Sex-dependent association of common variants of microcephaly genes with brain structure." Proc Natl Acad Sci U S A 107(1): 384-388. Roberts, E., D. J. Hampshire, et al. (2002). "Autosomal recessive primary microcephaly: an analysis of locus heterogeneity and phenotypic variation." J Med Genet 39(10): 718721. Roberts, E., A. P. Jackson, et al. (1999). "The second locus for autosomal recessive primary microcephaly (MCPH2) maps to chromosome 19q13.1-13.2." Eur J Hum Genet 7(7): 815-820. Sanger, F., S. Nicklen, et al. (1977). "DNA sequencing with chain-terminating inhibitors." Proc Natl Acad Sci U S A 74(12): 5463-5467. Saunders, R. D., M. C. Avides, et al. (1997). "The Drosophila gene abnormal spindle encodes a novel microtubule-associated protein that associates with the polar regions of the mitotic spindle." J Cell Biol 137(4): 881-890. Saxton, M. (2010). Child Lanuage. Acqusition and Development. London, Sage Schiebel, E. (2000). "gamma-tubulin complexes: binding to the centrosome, regulation and microtubule nucleation." Curr Opin Cell Biol 12(1): 113-118. Schollen, E., S. Kjaergaard, et al. (2000). "Lack of Hardy-Weinberg equilibrium for the most prevalent PMM2 mutation in CDG-Ia (congenital disorders of glycosylation type Ia)." Eur J Hum Genet 8(5): 367-371. Shen, J., W. Eyaid, et al. (2005). "ASPM mutations identified in patients with primary microcephaly and seizures." J Med Genet 42(9): 725-729. Shen, J., E. C. Gilmore, et al. (2010). "Mutations in PNKP cause microcephaly, seizures and defects in DNA repair." Nat Genet 42(3): 245-249. 99 Sitzmann, F. C. (2007): Pädiatrie, 3. Auflage. Stuttgart, Thieme Smith, C. M., J. H. Finger, et al. (2007). "The mouse Gene Expression Database (GXD): 2007 update." Nucleic Acids Res 35(Database issue): D618-623. Srinivasan, D. G., R. M. Fisk, et al. (2003). "A complex of LIN-5 and GPR proteins regulates G protein signaling and spindle function in C elegans." Genes Dev 17(10): 12251239. Stiles, J. and T. L. Jernigan (2010). "The basics of brain development." Neuropsychol Rev 20(4): 327-348. Stockler, S., P. W. Schutz, et al. (2007). "Cerebral creatine deficiency syndromes: clinical aspects, treatment and pathophysiology." Subcell Biochem 46: 149-166. Tagami, S., M. Okochi, et al. (2008). "Regulation of Notch signaling by dynamic changes in the precision of S3 cleavage of Notch-1." Mol Cell Biol 28(1): 165-176. Tang, C. J., R. H. Fu, et al. (2009). "CPAP is a cell-cycle regulated protein that controls centriole length." Nat Cell Biol 11(7): 825-831. Teng, S., A. K. Srivastava, et al. (2010). "Sequence feature-based prediction of protein stability changes upon amino acid substitutions." BMC Genomics 11 Suppl 2: S5. Thornton, G. K. and C. G. Woods (2009). "Primary microcephaly: do all roads lead to Rome?" Trends Genet 25(11): 501-510. Tibelius, A., J. Marhold, et al. (2009). "Microcephalin and pericentrin regulate mitotic entry via centrosome-associated Chk1." J Cell Biol 185(7): 1149-1157. Trimborn, M., S. M. Bell, et al. (2004). "Mutations in microcephalin cause aberrant regulation of chromosome condensation." Am J Hum Genet 75(2): 261-266. Trimborn, M., R. Richter, et al. (2005). "The first missense alteration in the MCPH1 gene causes autosomal recessive microcephaly with an extremely mild cellular and clinical phenotype." Hum Mutat 26(5): 496. Tunca, Y., S. Vurucu, et al. (2006). "Prenatal diagnosis of primary microcephaly in two consanguineous families by confrontation of morphometry with DNA data." Prenat Diagn 26(5): 449-453. van der Voet, M., C. W. Berends, et al. (2009). "NuMA-related LIN-5, ASPM-1, calmodulin and dynein promote meiotic spindle rotation independently of cortical LIN5/GPR/Galpha." Nat Cell Biol 11(3): 269-277. Varon, R., C. Vissinga, et al. (1998). "Nibrin, a novel DNA double-strand break repair protein, is mutated in Nijmegen breakage syndrome." Cell 93(3): 467-476. Villard, L. (2004) Polymikrogyrie. URL: http://www.orpha.net/consor/cgibin/OC_Exp.php?lng=DE&Expert=35981. Stand: 15.04.2011 Vincze, T., Posfai, J. and Roberts, R.J. (2003), NEBcutter: a program to cleave DNA with restriction enzymes, Nucleic Acids Res. 31: 3688-3691 Wang, J. K., Y. Li, et al. (2008). "A common SNP of MCPH1 is associated with cranial volume variation in Chinese population." Hum Mol Genet 17(9): 1329-1335. Wang, X., J. W. Tsai, et al. (2009). "Asymmetric centrosome inheritance maintains neural progenitors in the neocortex." Nature 461(7266): 947-955. Wang, Y. Q. and B. Su (2004). "Molecular evolution of microcephalin, a gene determining human brain size." Hum Mol Genet 13(11): 1131-1137. Wang, Z., T. Wu, et al. (2010). "Conserved motif of CDK5RAP2 mediates its localization to centrosomes and the Golgi complex." J Biol Chem 285(29): 22658-22665. Watemberg, N., S. Silver, et al. (2002). "Significance of microcephaly among children with developmental disabilities." J Child Neurol 17(2): 117-122. Wehner R., Gehring W., Kühn A. (2007): Zoologie, 24. Auflage. Stuttgart, Thieme Wollnik, B. (2010). "A common mechanism for microcephaly." Nat Genet 42(11): 923-924. Wood, J. L., Y. Liang, et al. (2008). "Microcephalin/MCPH1 associates with the Condensin II complex to function in homologous recombination repair." J Biol Chem 283(43): 29586-29592. Wood, J. L., N. Singh, et al. (2007). "MCPH1 functions in an H2AX-dependent but MDC1independent pathway in response to DNA damage." J Biol Chem 282(48): 3541635423. 100 Wood, J. W., K. G. Johnson, et al. (1967). "In utero exposure to the Hiroshima atomic bomb. An evaluation of head size and mental retardation: twenty years later." Pediatrics 39(3): 385-392. Woods, C. G. (2004). "Human microcephaly." Curr Opin Neurobiol 14(1): 112-117. Woods, C. G., J. Bond, et al. (2005). "Autosomal recessive primary microcephaly (MCPH): a review of clinical, molecular, and evolutionary findings." Am J Hum Genet 76(5): 717-728. World Health Organization (2006). "WHO Motor Development Study: windows of achievement for six gross motor development milestones." Acta Paediatr Suppl 450: 86-95. Wu, S. X., S. Goebbels, et al. (2005). "Pyramidal neurons of upper cortical layers generated by NEX-positive progenitor cells in the subventricular zone." Proc Natl Acad Sci U S A 102(47): 17172-17177. Wu, X., G. Mondal, et al. (2009). "Microcephalin regulates BRCA2 and Rad51-associated DNA double-strand break repair." Cancer Res 69(13): 5531-5536. Xiong, J. (2006): Essential Bioinformatics, illustrated edition. Cambridge, Cambridge University Press Yingling, J., Y. H. Youn, et al. (2008). "Neuroepithelial stem cell proliferation requires LIS1 for precise spindle orientation and symmetric division." Cell 132(3): 474-486. Yu, X., C. C. Chini, et al. (2003). "The BRCT domain is a phospho-protein binding domain." Science 302(5645): 639-642. Yu, T. W., G. H. Mochida, et al. (2010). "Mutations in WDR62, encoding a centrosomeassociated protein, cause microcephaly with simplified gyri and abnormal cortical architecture." Nat Genet. Yule, G. (1996). The Study of Language. 2. Auflage, Cambridge, Cambridge University Press. Zhang, J. (2003). "Evolution of the human ASPM gene, a major determinant of brain size." Genetics 165(4): 2063-2070. Zhang, X., D. Liu, et al. (2009). "CDK5RAP2 is required for spindle checkpoint function." Cell Cycle 8(8): 1206-1216. Zhang, Z., S. Schwartz, et al. (2000). "A greedy algorithm for aligning DNA sequences." J Comput Biol 7(1-2): 203-214. Zhong, W. and W. Chia (2008). "Neurogenesis and asymmetric cell division." Curr Opin Neurobiol 18(1): 4-11. Zhong, X., L. Liu, et al. (2005). "The abnormal spindle-like, microcephaly-associated (ASPM) gene encodes a centrosomal protein." Cell Cycle 4(9): 1227-1229. Zilles, K. und Tillmann, B. (2010). Anatomie. 1. Auflage. Berlin, Springer Zimmerman, W. C., J. Sillibourne, et al. (2004). "Mitosis-specific anchoring of gamma tubulin complexes by pericentrin controls spindle organization and mitotic entry." Mol Biol Cell 15(8): 3642-3657. 101 7. Danksagung Mein besonderer Dank gilt Frau PD Dr. Deborah J. Morris-Rosendahl für die Überlassung des Themas und Ihre hervorragende Unterstützung während der gesamten Zeit vom Eintreten in Ihre Arbeitsgruppe bis zur Endfassung dieser Arbeit. Ihre ausgezeichnete Betreuung, ihre Fairness und ihr Optimismus machen mir den Abschluss dieses Projekts und den damit verbundenen Abschied aus ihrem Labor nicht leicht. Herrn Prof. Dr. med. R. Korinthenberg danke ich für die freundliche Übernahme des Zweitgutachtens. Danke auch an Christine Zeschnigk, die mir nicht nur alle nötigen Methoden näher gebracht hat, sondern dank ihrer großen Erfahrung auch in der Interpretation der Ergebnisse immer eine enorme Hilfe war und für alle Probleme stets Zeit und Geduld aufbringen konnte. Große Unterstützung erfuhr ich außerdem von Angela Steiert (DNA-Extraktion und Herrin der Restriktionsenzyme), Gerlind Franke (qPCR), Bernd Rösler (qPCR und Computersorgen) und Kirsten Borchert (Organisatorisches). Mein besonderer Dank gilt selbstverständlich auch allen Familien, die in dieser Arbeit erwähnt werden und ohne deren Kooperation Forschung nicht möglich wäre. Für die Überlassung der DNA, die klinische Evaluation und wissenschaftliche Unterstützung danke ich allen einsendenden Ärzten, Laboren und Wissenschaftlern. Für all die offenen Ohren und die Unterstützung während großer und kleiner Krisen möchte ich meinen Freunden meinen Dank aussprechen. Für eine gewissenhafte Korrektur danke ich Dirk-Olivier Laurent und Astrid Pechman. Ulrike Schneider bereicherte diese Arbeit zudem durch ihre großartigen Kenntnisse im Programmieren von R. An Mama, Papa, Agnes, Hasso, Hasso sen., Inge, Dirko und Arpad: für eure Liebe und eure ununterbrochene Unterstützung in allen Lebenslagen empfinde ich tiefe Dankbarkeit. 102 8. Lebenslauf Die Seite 103 enthält persönliche Daten. Sie sind deshalb nicht Bestandteil der Online-Veröffentlichung. 103 9. Appendix A – Primersequenzen für PCR und Sequenzierung MCPH1/Microcephalin MCPH1 Ex1F: MCPH1 Ex1R: GCCTCCCGCCTCACCTACAG53 CTCCCACGGGATCCCCCGAGT MCPH1 Ex2F: CTGTGCCGGCCTCGGTTTAC MCPH1 Ex2R: CTTACCCATTGCTTCGTCCAGATT MCPH1 Ex3F: MCPH1 Ex3R: GATCAGTTGTAGTTAAGTTGTG CACAGAAATTGAGGCTGGAG MCPH1 Ex4F: MCPH1 Ex4R: GCTAATACATGTGCAGATTTAGTG CATCAATAGCATATTTAAGACAACTC MCPH1 Ex5F: MCPH1 Ex5R: GTATCAGAAATGTATGCGAAAGGGC CTTCATCAGCTCTCTCATGCTGAAC MCPH1 Ex6F: MCPH1 Ex6R: CAGGAGTAGGTAATGATGTTGAAAG GAAGCTTTCCACCATAATTGAATCG MCPH1 Ex7F: MCPH1 Ex7R: CCCTTCTAACTTTGTGATTATAGGA CTCATCAGAAGTTGCTACATGAA MCPH1 Ex8F: GAGAAGAACTCAAGTGTGGTTAATAG MCPH1 Ex8R: GGAGTAAATGGGGAAATAAGTTATG 54 Sequenzierungsprimer : MCPH1 Ex8F1: CAGGTATGTCTCAGGAGACG MCPH1 Ex8R2: CGTCTCCTGAGACATACCTG MCPH1 Ex8F2: GTCTGATTTTTCCTGCGTTGGC MCPH1 Ex8R1: GCCAACGCAGGAAAAATCAGAC MCPH1 Ex8R4: GAGTTAAATCATCATCATGT MCPH1 Ex9F: MCPH1 Ex9R: GGCCTATAACTTCCTGTTTCCAT GTTTCATTGACCCAGAGAAGAAC tA = 30 sec TA 67,4 °C tExt 40 sec 265 bp TA 61,8 °C tExt 40 sec 315 bp TA 56,2 °C tExt 40 sec 347 bp TA 56,2 °C tExt 40 sec 293 bp TA 61,8 °C tExt 40 sec 301 bp TA 61,8 °C tExt 40 sec 340 bp TA 57,5 °C tExt 40 sec 311 bp TA 60 °C tA 40 sec tExt 150 sec 1402 bp TA 59 °C tExt 40 sec 53 Die Sequenzen aller Primer sind in 5‘ zu 3‘-Richtung angegeben Für die Sequenzierung wurden jeweils die flankierenden Primer und – wenn nötig – zusätzlich spezielle Sequenzierungsprimer verwendet. 54 104 294 bp MCPH1 Ex10F: MCPH1 Ex10R: CAGTATCTGAGTTTCTATCTCTTGG CAAGTTGCCTAAAGGCACCCAGA MCPH1 Ex11F: MCPH1 Ex11R: GAGTGTAACTGCTTTGATGGGCA GTGCTGATGTCGGCACCTCA MCPH1 Ex12F: MCPH1 Ex12R: CAGATCTGCGGAGTGTATCACT GGGCATAATTGTGCTTGACTGGA MCPH1 Ex13F: MCPH1 Ex13R: GCAACAGTTCGCCTACGC CCACAGATCTGGACCACACC MCPH1_Ex14F: GCCTATGGACAACACAGCTCTTG MCPH1_Ex14R: GCCAAGAAACTTGCAGAGTTCTC Sequenzierungsprimer: MCPH1_Ex14R2: CAGGGCAGGACTCCGTCTC TA 61 °C tExt 40 sec 316 bp TA 61 °C tExt 40 sec 315 bp TA 61 °C tExt 40 sec 298 bp TA 59,9 °C tExt 40 sec 357 bp TA 61,1 °C tExt 90 sec 809 bp Markerprimer GDB:315473_F: CAGCCTGGTAACAGAGCAA GDB:315473_R: ACATGCAACAGAGTGCTTC TA 55,7 ºC tExt 30 sec D8S1099_F: TATCCCTGAGTGGTAAGCCG D8S1099_R: CAACAGAGCAAGACTGTCTCA TA 58,5 ºC tExt 30 sec D8S1742_F: CCCCCACCAAGACACA D8S1742_R: CTCAAGGGATATGAAGGGCA Touchdown-PCR TA 60 °C (-0,5 °C pro Zyklus) TA 53 °C tExt 20 sec D8S277_F: CCAGGTGAGTTTATCAATTCCTGAG D8S277_R: TGAGAGGTCTGAGTGACATCCG TA 61,3 ºC tExt 30 sec D8S561_F: GGAACCTACCTCACAGGCT D8S561_R: GCTCTAGTATAAGGCAGAATGC TA 58,5 ºC tExt 30 sec D8S1819_F: CGTGCTGAGAATGAGACC D8S1819_R: CGTGCTGAGAATGAGACC TA 61,3 ºC tExt 30 sec MCPH2 tA = 30 sec Markerprimer D19S416_F: CCTGTCCCAGAGAGACCCTA D19S416_R: AAGAGAGTGTGCCATTTGCT Touchdown-PCR TA 61,2 °C (-0,5 °C pro Zyklus) 105 TA 54,2 °C tExt 20 sec D19S569_F: TTGCTTCCGCAGACAC D19S569_R: CATACCTATGATGCTGTTGCTC Touchdown-PCR TA 58,3 °C (-0,5 °C pro Zyklus) TA 51,3 °C tExt 30 sec D19S610_F: CTTCTCTCCAAGGACTCGG D19S610_R: GTGGATCTATCTGCCAATCTC TA 58,3 ºC tExt 30 sec D19S896_F: GTTGACAAAATTCATCAGACTGACC D19S896_R: ATAGTTGGATTCCCTGGGATTC TA 58,6 ºC tExt 30 sec D19S220_F: ATGTTCAGAAAGGCCATGTCATTTG D19S220_R: TCCCTAACGGATACACAGCAACAC Touchdown-PCR TA 64,7 °C (-0,5 °C pro Zyklus) TA 57,7 °C tExt 30 sec D19S881_F: TGAGATCACACGCCACTGC D19S881_R: CTCTGCCCAGCCACAAAGGT TA 60,1 ºC tExt 30 sec D19S223_F: CAAAATCGAGGTGCATAGAA D19S223_R: ACCATGACTGGCTAATTGTG TA 54,2 ºC tExt 30 sec D19S260_F: GAAAGTGTCCACAACGGTAGC D19S260_R: AAAGGGGTTAGAGGAGAAGGC TA 59,6 ºC tExt 30 sec D19S420_F: CTGGGGCAGGAGCACT D19S420_R: GCTTACCAAACCTAAAGGATGTC TA 58 ºC tExt 30 sec MCPH3/CDK5RAP2 CDK5RAP2 Ex1F: CDK5RAP2 Ex1R: GCCCTTAGTTAAGATGGCACCT CCCTCAAGAGCAAACCCCAA CDK5RAP2 Ex2F: CDK5RAP2 Ex2R: GATGATTGTCATGTGCAGTCCA CCAATTCAATGTCCAGCCTC CDK5RAP2 Ex3F: CDK5RAP2 Ex3R: CCTCTCTGTGCTCTATTCCC GATCTCAAGAAACACAGCTTTCCT CDK5RAP2 Ex4F: CDK5RAP2 Ex4R: CAGTTTTGTAGCCTCGTAATCCA GCTCCCCATAATCAATTCAGATTA CDK5RAP2 Ex5F: CAGTCTGTGCTGGAAGCAGTT tA = 30 sec TA 60 °C tExt 45 sec 437 bp TA 59 °C tExt 45 sec 461 bp TA 60 °C tExt 45 sec 239 bp TA 59 °C tExt 45 sec 350 bp TA 60 °C tExt 45 sec 106 CDK5RAP2 Ex5R: CGGCTCTATTTCACTGACCAAC CDK5RAP2 Ex6F: CDK5RAP2 Ex6R: GAAGCTCAGCACAGGTCTGT GAAACAAAACTGTGCCAGCCTA CDK5RAP2 Ex7F: CDK5RAP2 Ex7R: GAGGGGAAATGTGCTGGAGAA CACTCAAGTCCTATGGGAAACAT CDK5RAP2 Ex8F: CDK5RAP2 Ex8R: CTTTGAAGATATCTGGCCCCAT CAGCTGACAGGGGACTCATAT CDK5RAP2 Ex9F: CDK5RAP2 Ex9R: CTTCATTCAAATCAGGCAGGGC GAGTGACAGCTACTGTGACACA CDK5RAP2 Ex10F: CDK5RAP2 Ex10R: CTTGGAGCTGATGGCACTATGT CCACTTTCTATACTACCTCAGCT CDK5RAP2 Ex11F: CDK5RAP2 Ex11R: GCACGACACAATTGAGCAGGAA CACTGAAGACCACCCACAGTT CDK5RAP2 Ex12F: CDK5RAP2 Ex12R: GCACGACACAATTGAGCAGGAA CACTGAAGACCACCCACAGTT CDK5RAP2 Ex13F: CDK5RAP2 Ex13R: CTATTATCTTGCTCTCTTGTAGCA CTGAAACATAGCAATGATTACTGTA CDK5RAP2 Ex14F: CDK5RAP2 Ex14R: CCTTAAGGAGTTTGGGACAGTT GGCATTTGAGGATCTCTAGATCA CDK5RAP2 Ex15F: CDK5RAP2 Ex15R: GCCTCTCTCACCTTCGTTTGA CTGCCTTAGAGATCAGCACTGA CDK5RAP2 Ex16F: CDK5RAP2 Ex16R: GTGTTAGTTGGTAGTAGGAGCAT CGTGTATGCTTCATCCCTTAACA CDK5RAP2 Ex17F: GATTGCACTGGGGTCAGTCTT 235 bp TA 59 °C tExt 45 sec 316 bp TA 60 °C tExt 45 sec 393 bp TA 59 °C tExt 45 sec 387 bp TA 60 °C tExt 45 sec 341 bp TA 60 °C tExt 45 sec 408 bp TA 60 °C tExt 45 sec 305 bp TA 59 °C tExt 45 sec 382 bp TA 57 °C tExt 45 sec 383 bp TA 59 °C tExt 45 sec 321 bp TA 60 °C tExt 45 sec 323 bp TA 58,7 °C tExt 45 sec 438 bp TA 58,7 °C 107 CDK5RAP2 Ex17R: GAGGCCTTCAGAATCTTAACCT Sequenzierungsprimer: CDK5RAP2 Ex17F2: GCAGAAGAATCATTTTCACT tExt 45 sec CAAAGAGTCGCTTGATAGGGCT GAGACAGGGTCTCGCTCTAT TA 60 °C tExt 45 sec CDK5RAP2 Ex18F: CDK5RAP2 Ex18R: CDK5RAP2 Ex19F: CGCCACAACTAGCAACTCTAA CDK5RAP2 Ex19R: GAACAGAAAACCCACTGGACTCA Sequenzierungsprimer: CDK5RAP2 Ex19F2: GACATCACTGACTTATTCATA CDK5RAP2 Ex20F: CDK5RAP2 Ex20R: CTTACCCTGCATCTCCATCCT CTCAGGTAAATTACACAGCACGA CDK5RAP2 Ex21F: CDK5RAP2 Ex21R: CAACAGTAGGTGGGGATAACTT GGGAGACACTGGACATTCTTGT CDK5RAP2 Ex22F: CDK5RAP2 Ex22R: GTCTGGGCAGCCAGTTCGAA CAAGGTTGACATTTCAAGCAGTTC CDK5RAP2 Ex23F: CDK5RAP2 Ex23R: CTCAGTTGCTTGGCTAAGTTTCA GGGCTGCTATGGGCTTAGTAA CDK5RAP2 Ex24F: CACTGCAGTGGTCTTGGCTT CDK5RAP2 Ex24R: CCATCACAGAGTAGTGTTCTCTT Sequenzierungsprimer: CDK5RAP2 Ex24F2: GAAGGCTACCAGAATTTCA CDK5RAP2 Ex24R2: TGAAATTCTGGTAGCCTTC CDK5RAP2 Ex25F: CDK5RAP2 Ex25R: CTTGTACAGCTGCAGGCTTTT CTAAGGCCAAGGAGTTAGCTC CDK5RAP2 Ex26F: CDK5RAP2 Ex26R: CAAGTGGAATAGTGCTTCTGC GCAGGAAACAAACAGAATGGGAA CDK5RAP2 Ex27F: CDK5RAP2 Ex27R: GTTGCAAACATTGGGGAGTTACT CCACACTCTGCTTACTAAGGTT CDK5RAP2 Ex28F: CDK5RAP2 Ex28R: CCAGTTGCTAACCATCTTAACAC GCACCTGCTTTGTACACAGATG 298 bp TA 60 °C tExt 45 sec 377 bp TA 60 °C tExt 45 sec 362 bp TA 60 °C tExt 60 sec 630 bp TA 60 °C tExt 45 sec 420 bp TA 60 °C tExt 45 sec 291 bp TA 60 °C tExt 60 sec 773 bp TA 58,7 °C tExt 45 sec 442 bp TA 58,7 °C tExt 45 sec 258 bp TA 58,7 °C tExt 45 sec 373 bp TA 60 °C tExt 45 sec 338 bp 108 CDK5RAP2 Ex29F: CDK5RAP2 Ex29R: CAGGAGGGATTTTCATTGTATGTT CAGACTCCAATGCCTGCATTCT CDK5RAP2 Ex30F: CDK5RAP2 Ex30R: CCCAAAGTGTGTAAGATAATTGGA GACGTACAATGTGTTTGTGTCTACT CDK5RAP2 Ex31F: CDK5RAP2 Ex31R: CTCTTGTGACTGAGGGTGGAA GTGGGTCAAAGAGCTAGCTTCA CDK5RAP2 Ex32F: CDK5RAP2 Ex32R: GAGTGTAAAATGCGATTGAGTTCCT GCAAAGGCATCATTCAGAAGTTCA CDK5RAP2 Ex33F: CDK5RAP2 Ex33R: GGATAAGTGAATGTGAGGGGCT CTTACCAAATACCCTCCTGAGTT CDK5RAP2 Ex34F: CDK5RAP2 Ex34R: CTAGCCCTCCTAGCTAGCTT CAGGGTCCTAATGAGGACAACT CDK5RAP2 Ex35F: CDK5RAP2 Ex35R: GCGTGTGAAACAGAAGCCCTA CTGCTTGGCATGGAGGAAACT CDK5RAP2 Ex36F: CDK5RAP2 Ex36R: CTAGTGAGGTTGAGCATCATCTT CAAACCATCTGGGCTCCAAAGT CDK5RAP2 Ex37F: CDK5RAP2 Ex37R: CTAGTGAGGTTGAGCATCATCTT CAAACCATCTGGGCTCCAAAGT CDK5RAP2 Ex38F: GAATACAGTATGATCTCATCGTTGT CDK5RAP2 Ex38R: GTGCTCTTCTCTGGACACTTGA Sequenzierungsprimer: CDK5RAP2 Ex38R2: GCACCTGCACCTTTCTGA TA 60 °C tExt 45 sec 316 bp TA 58,7 °C tExt 45 sec 476 bp TA 60 °C tExt 45 sec 377 bp TA 60 °C tExt 45 sec 408 bp TA 60 °C tExt 45 sec 289 bp TA 60 °C tExt 45 sec 458 bp TA 60 °C tExt 45 sec 331 bp TA 60 °C tExt 45 sec 330 bp TA 60 °C tExt 45 sec 258 bp TA 60 °C tExt 60 sec 714 bp Markerprimer CHLC.GGAA23B10_F: GAGAATTGAGTTCAAATCTCAGC CHLC.GGAA23B10_R: AATATTGATTTGGAAGTAAAAGCG TA 55,2 °C tExt 30 sec D9S258_F: GCTAGAGATGCCCTTGAGTG D9S258_R: AGGATTTATAGAAAGTCCAAAACCC TA 58,4 °C tExt 30 sec 109 D9S2152_F: TGCATGATTTTCTGAGATGGTGA D9S2152_R: GACACTTTCACATGTCTTACCG TA 57,4 °C tExt 30 sec D9S103_F: ATAGACTTCCAGACAGATAG D9S103_R: CCTCTCTCATTCCTGGTACT Touchdown-PCR TA 59,2 °C (-0,5 °C pro Zyklus) TA 52,2 °C tExt 10 sec D9S116_F: GTCCATTTCTCTAACACCCG D9S116_R: TACCCTAGAGCCTGGATGG TA 58,1 °C tExt 30 sec D9S1823_F: AACTACCATTGACATTATTATGTGC D9S1823_R: GTTGGATTCATCTTGGATTC TA 54,3 °C tExt 30 sec MCPH4 tA = 30 sec Markerprimer D15S1042_F: CTCTGGCTAATGCCATGA D15S1042_R: GCTGCTTAATTTCCCTGTAGA TA 54,8 °C tExt 30 sec D15S1012_F: CAACAAGAACGAAACTGTCA D15S1012_R: AGCCTTAAGTTCCTGGACT TA 53,9 °C tExt 30 sec D15S222_F: CCTCAGCGTCCTCTCTTG D15S222_R: CTGGTCACTGTCTGTCCTGT TA 58,9 °C tExt 30 sec D15S1016_F: GATCCGTCACATAATGGC D15S1016_R: ACACCTCAGCTTTCCTGG TA 55,1 °C tExt 30 sec D15S962_F: AATTCTGCTCATTGGGG D15S962_R: GGATATTTTGGAACTGCACT TA 51,9 °C tExt 30 sec D15S150_F: CTGTATGGCCTCAGTCTCGG D15S150_R: AGCTCTGTGCGGAAGTCCCT TA 58,9 °C tExt 30 sec MCPH5/ASPM ASPM Ex1F: CTAGGGAGTAGGTTAGTGGAA ASPM Ex1R: CTCCAATCGTCAACCTTCCTG ASPM Ex2F: GAGTGTTGGTTAACAATTATTAAGCC ASPM Ex3R: CAAGCTTATCAATAGCAGATTTAC Sequenzierungsprimer: ASPM Ex2R: GCAATATTACTTCAAGCCTGTTATC ASPM Ex3F: GATAACAGGCTTGAAGTAATATTGC ASPM Ex3F2: GTACACAGTGCCAACGTTTCA ASPM Ex3R2: GGATCTATAATTGGAAGATAAGAATG ASPM Ex3F3: CATGGCATATATGTGTACATCTCA ASPM Ex3R3: TGAGATGTACACATATATGCCATG tA = 40 sec TA 60,3 °C tExt 60 sec 548 bp TA 58,6 °C tExt 180 sec 1968 bp 110 ASPM Ex3F4: CATTCTTATCTTCCAATTATAGATCC ASPM Ex3R4: TGAAACGTTGGCACTGTGTAC ASPM Ex4F: CCACTGAATTCATAGCATTAGTGCG ASPM Ex4R: CACACTTTAACAATTCTTCCAGGCTG Sequenzierungsprimer: ASPM Ex4F2: CAGTGGTTATTAAGTGTTTGCT ASPM Ex4R2: CCAGGCTGTTATTCAACAACA ASPM Ex5F: CAGCTCTTTCCTGCAAGTAGTAGA ASPM Ex5R: GGCTAATGAACAGGGAATTATGCC Sequenzierungsprimer: ASPM Ex5F2: GGTATTGCTAGTAAAAATGACT ASPM Ex5R2: GAACAGGGAATTATGCCATT ASPM Ex6F2: CAGCTCTTTCCTGCAAGTAGTAGA ASPM Ex7R2: GGCATAGTCTATTTACCTAATAAGCA Sequenzierungsprimer: ASPM Ex6R: GCCAGTTTTACCTGTCAATTATATG ASPM Ex7F: CCCACTGATATACTCTCCTTGA ASPM Ex8F: CATGCCAGTTCCTTAGGTTATGG ASPM Ex10R: GTACTACTTGAAAGAGCAAGATTGA Sequenzierungsprimer: ASPM Ex8R: GAGAGTACTAGAAGCAGAGACT ASPM Ex9F: GTGCTTGCTACCCTACACTT ASPM Ex9R: GAAAACATACCATGAAAGCAAGC ASPM Ex10F: GTACAGAATGATTTGGAGGAT ASPM Ex11F: GCCCTGTAACTGTTGGGATTTATGT ASPM Ex13R: CTCATTTGAGGGAAAGTTTGCTTACA Sequenzierungsprimer: ASPM Ex12R: GTTATTCTTTATTAGATTCAAATTGT ASPM Ex13F: CAGTTTCTCTAAATAGAAGACAGT ASPM Ex14F2: GCCATTACTTGCCTTGTAGATTTGT ASPM Ex16R: TATATGTATTTTGGGTTGGGGAGG Sequenzierungsprimer: ASPM Ex14F: CTGCAAACCATTATGTCTATACTAC ASPM Ex15R: GAATACAGTACTTACTATCATCTTCT ASPM Ex16R: AGAAGATGATAGTAAGTACTGTATTC ASPM Ex17F: GTGTAGGGGTGTTTTATTTCCAGTA ASPM Ex17R: CAGCCTTCTGCTGAACACCATAA ASPM Ex18F1: TGGCTACAGGTATATCAATGTAAAACC ASPM Ex18R5: TGAAGAGTCTTGTACGCCCTG Sequenzierungsprimer: ASPM Ex18F2: CATCAACTCTTATAATCCAATCTA ASPM Ex18R2: TAGATTGGATTATAAGAGTTGATG ASPM Ex18F3: GTGTTATTCAGTCATACTGGAG TA 62 °C tExt 60 sec 390 bp TA 60,3 °C tExt 60 sec 415 bp TA 58,3 °C tExt 170 sec 1644 bp TA 57 °C tExt 180 sec 1768 bp TA 60,9 °C tExt 140 sec 1322 bp TA 60,3 °C tExt 120 sec 958 bp TA 60,3 °C tExt 60 sec 492 bp TA 59,7 °C tExt 90 sec 1718 bp 111 ASPM Ex18R3: CTCCAGTATGACTGAATAACAC ASPM Ex18F4-2: GCAGCTGCACTATTTATCCAGCA ASPM Ex18R4: ATTGCTGGATAAATAGTGCAGC q-PCR: ASPM qEx18F11: GTCCTTTCTTACCTTTTCCAGGGAT ASPM qEx18R10: GCCAATGCCTCTGAATTGTAACTGT ASPM Ex18F4-2: GCAGCTGCACTATTTATCCAGCA ASPM Ex18R8-2: ATCCATCTTCTGTATGATGACTGG Sequenzierungsprimer: ASPM Ex18F5: CAGGGCGTACAAGACTCTTCA ASPM Ex18R5: TGAAGAGTCTTGTACGCCCTG ASPM Ex18F6: GTAGTAACTTTACAGTCAGCTTAT ASPM Ex18R6: GCTGACTGTAAAGTTACTACA ASPM Ex18F7-2: GAGTTAGACGGACTCTTAGAAAGAT ASPM Ex18R7: ATCTTTCTAAGAGTCCGTCTAAC ASPM Ex18F7-2: GAGTTAGACGGACTCTTAGAAAGAT ASPM Ex18R1: GGTCACCTCAACTAAGTACTATTCT Sequenzierungsprimer: ASPM Ex18F8: CATCATACAGAAGATGGATGATA ASPM Ex18R8-2: ATCCATCTTCTGTATGATGACTGG ASPM Ex18F9: CAGAAAGTATTTCAACACAATGA ASPM Ex18R9: GATGACTGTATTGTAATGGCTGC ASPM Ex18F: GCAGCCATTACAATACAGTCATC ASPM Ex18R: CATAATCAACTTTGGCCCT ASPM Ex18F10: CAGTATGAAGCTGTTCAAAGTGA ASPM Ex19F: GAGTCATGATATGACTATGCAA ASPM Ex19R: CAAAACCAACCATATAAATTAAGC ASPM Ex20F2: CTTCTTTCGTGTGCGTGTGTAA ASPM Ex20R: GATGTGTGTGAAATAAATGCATACT ASPM Ex21F: GCCATCTCATTGAGAAATTCAAGA ASPM Ex21R: GGTCATATTAGTTCTGAAATTATTCTCT ASPM Ex22F: GCTAGTTTATATAATTTGATGTTGAG ASPM Ex22R: GGCTAAATGTTGTACGACCTTA ASPM Ex23F: GCCTCTGTGGAAAGCTGAAAGATT ASPM Ex25R: GAGATTTAAGCCCTAGTGATGAGTA Sequenzierungsprimer: ASPM Ex23R: GGTAACTATGTTTTTATAGTGTTAG ASPM Ex24F: CATTGTGAAAACAGATGTAGATAT ASPM Ex24R: CACACAGGTAAATTTACAGCAACA ASPM Ex25F: TTTTCTTTCAGAGGTAGTTA TA 59,3 °C tExt 180 sec 1871 bp TA 59,3 °C tExt 180 sec 2397 bp TA 54,1 °C tExt 60 sec 432 bp TA 57 °C tExt 60 sec 440 bp TA 57 °C tExt 60 sec 411 bp TA 55,5 °C tExt 60 sec 364 bp TA 60,9 °C tExt 140 sec 1340 bp 112 ASPM Ex26F: CTTTGCACTTGCTGCAGGTGGT ASPM Ex26R: CCTGAATTCATTTTATCCGTGCA Touchdown-PCR TA 62,7 °C (-0,5 °C pro Zyklus) TA 55,7 °C tA 30 sec tExt 50 sec 461 bp ASPM Ex27F: GATTTTGCTAGTCTAAAAGAGAT ASPM Ex27R: GCACATCTTGTTTATGGTAAGTGCT Touchdown-PCR TA 59,1 °C (-0,5 °C pro Zyklus) TA 52,1 °C tA 30 sec tExt 40 sec 336 bp ASPM Ex28F: GATGTGTTCAGGAGTAGCTACAAT ASPM Ex28R: CCTCAACTTACCTATAAAAAAGGTGT TA 60,3 °C tExt 60 sec 512 bp Markerprimer D1S1183_F: TCTTCATTTTTTTCTCTCCTC D1S1183_R: ACAAACTCTGAAGCTGAAGA D1S2816_F: TTCCCCAAATGTATTACTGC D1S2816_R: AAAGGAGTACCCAATCCCAG TA 52,5 °C tExt 30 sec Touchdown-PCR TA 59,2 °C (-0,5 °C pro Zyklus) TA 52,2 °C tExt 10 sec GDB:196987_F: TGAGGTGGTGTACTACCATA GDB:196987_R: GATCATGCCATTGCACTCTA TA 55,2 °C tExt 30 sec AFM329vc1_F: GACTATGGCTTTTACATATTTGCAC AFM329vc1_R: ACCACAGTGTTTACTCACAGTGAC TA 59 °C tExt 30 sec SHGC-64057_F: TCTCAGCTAATAACTTCCAGGCAA SHGC-64057_R: TCCCTGCTCTGAAGGAACAA TA 58 °C tExt 30 sec D1S3469_F: GGCTTCTCCAGAGAGACACA D1S3469_R: CCATAATCATGTAGGCCAATTCTC TA 59,1 °C tExt 30 sec D1S2143_F: CTTCTAACAGAAATCTGATTAATGA D1S2143_R: GAAAGTAGTTGTCCCAGTAG TA 54,7 °C tExt 30 sec MCPH6/CENPJ CENPJ Ex1F: CGTCGCTGTGGCGTCACTGG CENPJ Ex1R: TCCGAGCAGAGTCCTGCCCGC TA 66,4 °C tExt 40 sec tA 40sec 113 305 bp CENPJ Ex2F: CTGGGTTGAGGTTTGGGCTC CENPJ Ex2R: CTGAGGATTTCAGAGTGAAGGGG Sequenzierungsprimer: CENPJ Ex2R2: GCTCGCTTCTCTTTGTCTGCTTC CENPJ Ex2R3: GACTTTATTACATAAACAGAAAC CENPJ Ex3F: CTTCTTACCAGGAAAGATAGGA CENPJ Ex3R: GGAGTTCACAACACATGATACA TA 62 °C tExt 80 sec tA 45 sec 706 bp TA 56,2 °C tExt 40 sec tA 40 sec 335 bp CENPJ Ex4F: GTTGTCACTGTGGAGAAGTCT CENPJ Ex4R: CATGGAAAGGCTTCATCTTAGGA TA 58,1°C tExt 80 sec tA 40 sec 473 bp CENPJ Ex5F: CCTCAAGTGTCTTAATTGGAGTT CENPJ Ex5R: CCTTAAAAGCATAGTCAAGCAAA TA 55,2°C tExt 50 sec tA 40 sec 426 bp CENPJ Ex6F: CATGTTGTCAAGGGTTTCTATACCA CENPJ Ex7R: GATTTTAAGCATTCTGACAGCATACT Sequenzierungsprimer: CENPJ Ex7R2: GTGCTCTGGTTAGTCACTAGT CENPJ Ex7F: ACTAGTGACTAACCAGAGCAC CENPJ Ex7R3: CTGTTGAAAGAGGAAGTCTGTCT CENPJ Ex7F2: AGACAGACTTCCTCTTTCAACAG CENPJ Ex7R4: GCTGAGGACAATGAATGAAGTTGT CENPJ Ex7F3: ACAACTTCATTCATTGTCCTCAGC CENPJ Ex7R5: CTCGAGGGCTCAGACACTTTAT CENPJ Ex7F4: ATAAAGTGTCTGAGCCCTCGAG CENPJ Ex8F: GCTCTTAGTGTTACTAGCTAGCTA CENPJ Ex8R: GTTTCAGACTGTTTATAGATGGTCT TA 58,4°C tExt 130 sec tA 45 sec 2022 bp TA 58,6°C tExt 60 sec tA 40 sec 296 bp CENPJ Ex9F: GATGAATTCACTAGGACTAGCAGT CENPJ Ex9R: GGATTGATACACAGTTTTGCTTTGA TA 57,6°C tExt 40 sec tA 40 sec 375 bp CENPJ Ex10F: CCCTTTCTTGCTGGCTATTCTG CENPJ Ex10R: GAATGCTCAGATATTGAAGCTCCC Sequenzierungsprimer: CENPJ Ex10F2: GAGAGACTTTAAAACAGC CENPJ Ex10R2: CTGACACAACCCACCCGCCTC TA 60,2°C tExt 40 sec tA 45 sec CENPJ Ex11F: CACAGCATTCTTAGCACTAGCT TA 58,6°C tExt 60 sec 393 bp 114 CENPJ Ex11R: GATGCACAGGAGCTTCAATTACA tA 40 sec 332 bp CENPJ Ex12F: GACAGCAGTTCACAGGATATGA CENPJ Ex13R: GCAACTAAAGGCATCTTGTCCA Sequenzierungsprimer: CENPJ Ex12R: CGTTAAGTCTATTAACAAATTGA CENPJ Ex13F: GTAAACACTAGTCCTAGAAC CENPJ Ex14F: CAGTTGGGAGGAGAATTAGC CENPJ Ex16R: CCTAATATGGGTGTCACATATCA Sequenzierungsprimer: CENPJ Ex14R: AGTCTGCCTTTTCTCCAGAG CENPJ Ex15F: CTCTGGAGAAAAGGCAGACT CENPJ Ex16R1: GGCACCTTCTGAGCACAGAT CENPJ Ex17F: GGATAACCAAGGGATGTCTCCA CENPJ Ex17R: GGGTAGTGAATTATAAATGAGAGCT Sequenzierungsprimer: CENPJ Ex17F1: CAGTGATGGCAACAAACTCA TA 58,1°C tExt 80 sec tA 40 sec 609 bp TA 58,1°C tExt 80 sec tA 40 sec 685 bp TA 58,6°C tExt 60 sec tA 40 sec 514 bp Markerprimer SHGC-151206_F: CACTGCTGACAGGCTACAGAACT SHGC-151206_R: GATGCAGTACATCATGACAAGTTGA TA 60,6 °C tExt 30 sec D13S1243_F: TGCTGACAGGCTACAGAACTTT D13S1243_R: CTCTTGTGCAGGTATAGGGG TA 58,7 °C tExt 30 sec D3S1532_F: TCCAGCCTGGTCAACACAG D3S1532_R: TCCAGACTTCCCAATTCAGG TA 58,1 °C tExt 30 sec D13S308_F: AGCTTGAATAAAGTGCCCAGC D13S308_R: GCATGTTGTCCTTAAAGCCCC TA 58,7 °C tExt 30 sec D13S221_F: TAGCCATGATAGGAAATCAACC D13S221_R: GAGATCGTGCAGCACTTGT TA 56,5 °C tExt 30 sec D13S1254_F: AAATTACTTCATCTTGACGATAACA D13S1254_R: CTATTGGGGACTGCAGAGAG Touchdown-PCR TA 60,2 °C (-0,5 °C pro Zyklus) TA 53,2 °C tExt 30 sec MCPH7/STIL STIL Ex1F: CCTGACTGGCGAGGTTTCTGA STIL Ex1R: GTCATCTGCTCCAGGCTCCT TA 61,5 °C tA 30sec tExt 40 sec 312 bp STIL Ex2F: GCAGTTTCACTCTTTGGCCCA TA 59,8 °C 115 STIL Ex2R: CGTTCAAATCATCCTCACCCCT tA 30sec tExt 50 sec 1358 bp STIL Ex3F: GGCAGAATGACTCTAACGTATGA STIL Ex3R: CCACCTAACAAGTGGTAGAGCT TA 61,5 °C tA 40sec tExt 60 sec 408 bp STIL Ex4F: GGCAGAATGACTCTAACGTATGA STIL Ex4R: CCACCTAACAAGTGGTAGAGCT TA 57 °C tA 30sec tExt 60 sec 300 bp STIL Ex5F: CAGTGTCTGTTTATTGCCATTCTA STIL Ex6R: GCTACTCATATCGCTTACCTAGA Sequenzierungsprimer: STIL Ex5R: CCTAGGTTCAAGTGATCCT STIL Ex6F: CTATTGGTATGAACAAAGTGCT STIL Ex7F: CGAGAACTGAAATGCTGTAAATCA STIL Ex7R: GCCACCATATCTCTGGCATAT TA 59,8 °C tA 40sec tExt 120 sec 1164 bp TA 56,2 °C tA 30sec tExt 60 sec 505 bp STIL Ex8F: CCTTTCTAAAGTATGCTTCAGCA STIL Ex8R: GACAACCACTTATCTTTGTGGCT TA 57,2 °C tA 30sec tExt 60 sec 302 bp STIL Ex9F: GGCTGATAAAAGCCATACGTCTA STIL Ex9R: GTAAAAGGTTACGGCATTACATGA Sequenzierungsprimer: STIL Ex9R2: GGGACCATAAACTATGAATG STIL Ex10F: STIL Ex10R: CTAGATTGGGAGACTCACATGA GTGAGTAACCTCTGGTTCTCTAT TA 59,4 °C tA 30sec tExt 60 sec 289 bp TA 56,8 °C tA 30sec tExt 60 sec 466 bp STIL Ex11F: CAGTTTACAAAAGAGGGTTACAGA STIL Ex11R: CCTAGTGAATATGAAGGAATGCA Sequenzierungsprimer: STIL Ex11F2: GAGGGTTACAGAAATCAGAA STIL Ex11R2: GTGAATATGAAGGAATGCAT TA 56 °C tA 30sec tExt 60 sec STIL Ex12F: GATCTGAGTACTACTGCAACTTA STIL Ex12R: GAATGATACTTAGGTTTCAGGTAGT Sequenzierungsprimer: STIL Ex12F2: CTGAGTACTACTGCAACTTA TA 55,1 °C tA 40sec tExt 50 sec 409 bp 321 bp 116 STIL Ex12R2: GATACTTAGGTTTCAGGTAGT STIL Ex13F: GGAAATACTGGTCTGAGGAAAGT STIL Ex13R: CCTAATTCTGACATTCTATACTTCTA Sequenzierungsprimer: STIL Ex13R2: GTGGCTGTCTTACTTTGCA STIL Ex13F2: CTGCAAAGTAAGACAGCCA STIL Ex13R3: CACTTGGGTGAAATAATGAAT STIL Ex13F3: GCATTCATTATTTCACCCAAGT STIL Ex14F: STIL Ex14R: GTTTCATGGTATGGTCTAGTTGAA CCTACTGCACCATGCACCAAT TA 59,8 °C tA 40sec tExt 120 sec 1163 bp TA 56,8 °C tA 30sec tExt 60 sec 416 bp STIL Ex15F: STIL Ex15R: GCACCCAGCCAATATGGCTA CATCTAAACATTGTGCCCCACA TA 56,8 °C tA 30sec tExt 60 sec 432 bp STIL Ex16F: STIL Ex16R: GTGCTGCTTGAGTCTTAACCCT GTCTCAATCAGTTTAAACCTAGGA TA 59,4 °C tA 30sec tExt 60 sec 404 bp STIL Ex17F: STIL Ex17R: GTGTTGCCCAGGGTCTTAAACT CTGATGAGATTGCCACAATACATCT TA 61,5 °C tA 40sec tExt 60 sec 520 bp STIL Ex18F: GCTTGTATAGAATGGAACACATTGA STIL Ex18R: GAGACTTAGAGCTGGATAGTATCT Sequenzierungsprimer: STIL Ex18R2: CCTCTTCATCTTCACTATTGT STIL Ex18F2: GACAATAGTGAAGATGAAGA STIL Ex18R3: CTTTAGCGTTTCAGAAGGTT STIL Ex18F3: CAACCTTCTGAAACGCTAAA TA 57,9 °C tA 40sec tExt 120 sec 1155 bp Markerprimer D1S2797_F: ATCACATCACACACAATGACTGTGG D1S2797_R: TGTCCATTCAAAGGATTGGTCTC TA 59,7 °C tExt 30 sec GDB:314853_F: GGGGCAAGAGAATCACTTGA GDB:314853_R: TCCCCTAGATAACCCTGTGT TA 57,2 °C tExt 30 sec D1S3714_F: GCTTTGGCCTGAGTTATTGAGA D1S3714_R: ACCTGTGGTCCTCCCTACT TA 58,5 °C tExt 30 sec D1S2874_F: GCAAGAATTATGTCTGATGGTG D1S2874_R: CCTAGAAGCCCCTATAAGG TA 56,5 °C tExt 30 sec 117 D1S2134_F: AAAGCACAGTCCACACTCCT D1S2134_R: AGCTCACCTCCTCCAAGAAG TA 58,3 °C tExt 30 sec D1S2839_F: AGCTGAGTTATCCACCCCTC D1S2839_R: TCAGGTGAAGATGGTGAGGT TA 58,5 °C tExt 30 sec 10. Appendix B – Primersequenzen für qPCR Referenz SALL4 Ex3-F: SALL4 Ex3-R: 3p1_F: 3p1_R: GTTCCTGGCACATTTGTGGGACCC GCTGAAAGCCCACACAAACCCACC GTGCCAGCCCCACTGCCAGGAACAA GCTGCTGTCGTCCCTGGGAACGACC MCPH1/Microcephalin55 MCPH1 qEx1F: MCPH1 qEx1R: AATCCCGGAAACGCG GGTGCCGGTCCTCAAA MCPH1 Ex8F1: CAGGTATGTCTCAGGAGACG MCPH1 qEx8R3: CCTGGTGCTCCTCTTTCTCTTG MCPH1 Ex13F: GCAACAGTTCGCCTACGC MCPH1 qEx13R: GGACTTGGCTGACCCG MCPH1 qEx14F: MCPH1 qEx14R: GTTATCACTTTCCTATGTGGCTG TCTCATTTGAACATCCAAAGACAGT MCPH5/ASPM ASPM qEx1F2: GCGAGGCTGCTGGGAAGTGA ASPM qEx1R2: CCTGCAACACGAAACAGCGCT ASPM qEx4F3: CCACTGAATTCATAGCATTAGTGCGT ASPM qEx4F3: TGGCACAGTCCAGTTTGACCTTC ASPM Ex5F: CAGCTCTTTCCTGCAAGTAGTAGA ASPM qEx5R3: CAAGTGAAGCCCTGTTCCTGCT ASPM Ex8F: CATGCCAGTTCCTTAGGTTATGG ASPM qEx8R2: GGAGAGAATGTAGGAGAGGCAGA 55 Für die MCPH1-Exons, für die keine speziellen qPCR-Primer aufgeführt werden, wurden die herkömmlichen PCR-Primer aus Appendix A verwendet. 118 ASPM Ex11F: GCCCTGTAACTGTTGGGATTTATGT ASPM qEx11R: CCTCTACTCAGTTTTTACCATGCTCA ASPM qEx15F: GAGACCTTGGTGGAATACCTGCT ASPM qEx15R2: CCATGTTGTTTGTATGAGTCGAGCA ASPM qEx17F2: GGCGAAGAGTCTTAGCACAGAGA ASPM qEx17R2: CTTCTGCTGAACACCATAACGAGCT ASPM qIntr.17F: CCTGTCACCCAGGTATTGAGCA ASPM qIntr.17R: GCACATAAGCACCATGGAATACCA ASPM qIntr.17F2: GAAGGAGTCTCTGTTTCTTAGCTTACT ASPM qIntr.17R2: GAACGCTGAAACTTCCCAACTCATT ASPM qEx18F12: CTGGCCTTGCTTGTTCACAGGA ASPM qEx18R11: GTGATAGCAGCTCTTTTCTGCTGAA ASPM qEx19F2: CACGGTAATGTATCATAGTTCTGTGGA ASPM qEx19R2: CACTTCCTACGTCTCTGTCCTTACT ASPM qEx24F2: GGAGAGGCTATTCTTGGAGGAAGA ASPM qEx24R2: GTGTTTTAAGGCCTCAAGAATGGCA ASPM qEx28F2: GGCAATAATATGAAGTTCTCCCACCT ASPM qEx28R2: GAATGCCAAGCGTATCCATCACCA 119
