iv. ergebnisse - Ruhr

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Abstract
Peres
Kerstin
Immunhistochemischer Nachweis des zellproliferationsassoziierten Antigens Ki-67
und des BCL-2-Protoonkogens als Prognosefaktoren in duktalen Adenokarzinomen
des exokrinen Pankreas
Problem: Ziel dieser Arbeit war es - anhand histologisch untersuchtem in Paraffin
eingebettetem Tumorgewebe aus tubulären, duktalen Adenokarzinomen des
Pankreas - die Korrelation zweier wichtiger Proteine der Tumorgenese zu potentiell
prognostisch bedeutsamen pathologisch-anatomischen Faktoren nachzuweisen.
Methode: Es wurden an Operationspräparaten von 23 Patienten mit duktalen
Pankreaskarzinomen immunhistochemische Untersuchungen mittels der ABCMethode unter der Verwendung von monoklonalen Mausantikörpern MIB-1 und
BCL-2 durchgeführt und der TNM-Klassifikation, der Stadieneinteilung nach UICC
und dem Grading gegenübergestellt. Mittels des MIB-1-Antikörpers ist es möglich,
das Ki-67-Antigen nachzuweisen, welches als Proliferationsmarker gilt. Über
Färbungen mit dem BCL-2-Antikörper wird das sogenannte BCL-2-Protoonkogen
nachgewiesen, welches die Rolle des Gegenspielers zum programmierten Zelltod
übernimmt und damit längeres Zellüberleben ermöglicht.
Ergebnis: Es fällt bei dieser Untersuchung sowohl ein vermindertes Färbeverhalten
des Antikörpers BCL-2 (4/23) als auch des Antikörpers MIB-1 (14/23) gegenüber
dem Tumorgewebe der Pankreaskarzinome auf.
Diskussion: Eine Auswertung der Ergebnisse der Färbung mittels des Antikörpers
BCL-2 ist in dieser Arbeit nicht möglich gewesen. Dies ist einerseits auf Fehler
während der Aufbereitung des Materials zurückzuführen, anderseits ist eine verminderte Sensitivität der Methode und des Antikörpers möglich. Der zweite Untersuchungsabschnitt dieser Arbeit umfaßte den Versuch des Nachweises der Proliferationsaktivität mittels des Antikörpers MIB-1. Jedoch konnte auch hier lediglich
eine MIB-1-Expression in insgesamt 61 % der Pankreaskarzinome nachgewiesen
werden. Eine signifikante Korrelation zwischen der Intensität der Proliferationsaktivität und den erwähnten Parametern konnte nicht verzeichnet werden. Somit fand
zumindest in dieser Studie der Nachweis von BCL-2 und Ki-67 unter Berücksichtigung der geringen Patientenzahl keine Verwendung als Prognosefaktor für das
duktale Adenokarzinom des exokrinen Pankreas.
Ruhr-Universität Bochum
Prof. Dr. med. Stathis Philippou
Augusta-Kranken-Anstalt Bochum
Institut für Pathologie
Immunhistochemischer Nachweis
des zellproliferationsassoziierten Antigens Ki-67 und des BCL-2-Protoonkogens
als Prognosefaktoren in duktalen Pankreaskarzinomen des exokrinen Pankreas
Inaugural- Dissertation
zur
Erlangung des Doktorgrades der Medizin
einer
Hohen Medizinischen Fakultät
der Ruhr-Universität Bochum
vorgelegt von
Kerstin Peres
aus Bochum
2002
Dekan:
Prof. Dr. med. G. Muhr
Referent:
Prof. Dr. med. Stathis Philippou
Korreferent:
Tag der mündlichen Prüfung:
22. Oktober 2002
FÜR MEINE ELTERN
Inhaltsverzeichnis
INHALTSVERZEICHNIS
I.
EINLEITUNG UND FRAGESTELLUNG
1
II.
VORBEMERKUNGEN
2
II.1.
Allgemeine Klassifikation der Pankreastumoren
2
II.2.
Die malignen Tumoren des exokrinen Pankreas
4
II.2.1. Ätiologische Aspekte des Pankreaskarzinoms
5
II.2.2. Pathogenese des Pankreaskarzinoms
5
II.2.3. Inzidenz des Pankreaskarzinoms
7
II.2.4. Geschlechts–und Altersverteilung des Pankreaskarzinoms
7
II.2.5. Lokalisation des Pankreaskarzinoms
8
II.2.6. Pathologische Anatomie des Pankreaskarzinoms
9
II.2.6.1.
Makroskopie
II.2.6.2.
Histologie
9
10
II.2.7. Histologische Diagnosesicherung
11
II.2.8. Metastasierungswege des Pankreaskarzinoms
16
II.2.9. Klinik, Diagnostik, Therapie und Prognose des
Pankreaskarzinoms
16
II.3.
Proliferation
19
II.4.
Apoptose
20
II.5.
Molekularbiologische Aspekte
22
II.5.1. Allgemeiner Ablauf der Kanzerogenese
22
II.5.2. Molekularbiologische Ebene des Pankreaskarzinoms
22
II.5.2.1.
Onkogene
23
II.5.2.2.
Tumorsuppressorgene
23
Inhaltsverzeichnis
III. MATERIAL UND METHODE
27
III.1. Das Untersuchungsgut
27
III.2. Beurteilungskriterien
27
III.3. Polyklonale Antikörper
28
III.4. Monoklonale Antikörper
28
III.5. Immunperoxidase-Färbetechniken
29
III.6. Das Enzym Peroxidase
30
III.7. Die verwendeten Antikörper
37
III.8. Verwendete Reagenzien und Geräte
38
III.9. Schneiden der Gewebeblöcke und
Aufziehen der Schnitte auf den Objektträger
39
III.10. Färben der Präparate
39
III.11. Fehlerquellen
41
III.12. Verwendung von Kontrollen
42
III.13. Immunhistochemische Befunde
44
Inhaltsverzeichnis
IV.
ERGEBNISSE
50
IV.1. Patientenkollektiv sowie
allgemeine pathologisch-anatomische Daten
IV.2. Ergebnisse im Bezug zum pT-Status
52
56
IV.2.1. Ergebnisdarstellung für den Antikörper MIB-1
56
IV.2.2. Ergebnisdarstellung für den Antikörper BCL-2
57
IV.3. Ergebnisse im Bezug zum pN-Status
58
IV.3.1. Ergebnisdarstellung für den Antikörper MIB-1
58
IV.3.2. Ergebnisdarstellung für den Antikörper BCL-2
59
IV.4. Ergebnisse im Bezug zum pM-Status
60
IV.4.1. Ergebnisdarstellung für den Antikörper MIB-1
60
IV.4.2. Ergebnisdarstellung für den Antikörper BCL-2
61
IV.5. Ergebnisse im Bezug zum Tumorstadium nach UICC
62
IV.5.1. Ergebnisdarstellung für den Antikörper MIB-1
62
IV.5.2. Ergebnisdarstellung für den Antikörper BCL-2
63
IV.6. Ergebnisse im Bezug zum Differenzierungsgrad
64
IV.6.1. Ergebnisdarstellung für den Antikörper MIB-1
64
IV.6.2. Ergebnisdarstellung für den Antikörper BCL-2
65
IV.7. Statistik
66
Inhaltsverzeichnis
V.
DISKUSSION
V.1.
71
Nachweis des Antigens Ki-67 und des BCL-2-Onkoproteins als
Prognosefaktoren in duktalen Pankreaskarzinomen mit den
V.2.
VI.
monoklonalen Antikörpern MIB-1 und BCL-2
71
V.1.1. pT-Status
72
V.1.2. pN-Status
75
V.1.3. pM-Status
77
V.1.4. Tumorstadium nach UICC
79
V.1.5. Differenzierungsgrad
81
V.1.6. Überlebenszeit
83
Methodik
85
ZUSAMMENFASSUNG
89
VII. LITERATURVERZEICHNIS
91
VIII. DANKSAGUNGEN
105
IX.
106
LEBENSLAUF
Tabellen- und Abbildungsverzeichnis
TABELLEN- UND ABBILDUNGSVERZEICHNIS
TABELLENVERZEICHNIS
zu II.
Vorbemerkungen
Tabelle 1:
Tumoren des exokrinen Pankreas
2
Tabelle 2:
Tumoren des endokrinen Pankreas
4
Tabelle 3:
Theorien zur Zytogenese von exokrinen Pankreastumoren
6
Tabelle 4:
Lokalisation des Pankreaskarzinoms
8
Tabelle 5:
TNM-Klassifikation der Pankreastumoren,
vierte überarbeitete Auflage, 1987
12
Tabelle 6:
Stadiumeinteilung nach UICC, 1987
13
Tabelle 7:
Aktuelle TNM-Klassifikation,
fünfte überarbeitete Auflage, 1997
13
Tabelle 8:
Stadiumeinteilung des AJCC, 1997
15
Tabelle 9:
Histologisches Grading für duktale Adenokarzinome des exokrinen Pankreas
15
Onkogene und Wachstumsfaktoren des Pankreasgewebes
25
Tabelle 10:
zu III. Material und Methode
Tabelle 11:
Einteilungskriterien für die Auswertung der Untersuchung
27
Tabelle 12:
Substrate der Peroxidase und ihre Farbreaktion
29
Tabelle 13:
Methoden zur Blockierung der endogene Peroxidase
31
Tabellen- und Abbildungsverzeichnis
zu IV. Ergebnisse
Tabelle 14:
Ergebnisse der immunhistochemischen Analyse
einer BCL-2 und MIB-1-Expression in duktalen
Pankreaskarzinomen im Bezug zu klinisch-pathologischanatomischen Faktoren
51
Nachweis der MIB-1-Expression
in Korrelation zum pT-Status
56
Tabelle 16:
Einteilungskriterien für die Auswertung der Untersuchung
57
Tabelle 17:
Nachweis der BCL-2-Expression
in Korrelation zum pT-Status
57
Nachweis der MIB-1-Expression
in Korrelation zum pN-Status
58
Nachweis der BCL-2-Expression
in Korrelation zum pN-Status
59
Nachweis der MIB-1-Expression
in Korrelation zum pM-Status
60
Nachweis der BCL-2-Expression
in Korrelation zum pM-Status
61
Nachweis der MIB-1-Expression
im Bezug zum Tumorstadium nach UICC
62
Nachweis der BCL-2-Expression
im Bezug zum Tumorstadium nach UICC
63
Nachweis der MIB-1-Expression bezüglich der Einteilung
der Adenokarzinome nach dem Differenzierungsgrad
64
Nachweis der BCL-2-Expression bezüglich der Einteilung
der Adenokarzinome nach dem Differenzierungsgrad
65
Statistische Datenanalyse
66
Tabelle 15:
Tabelle 18:
Tabelle 19:
Tabelle 20:
Tabelle 21:
Tabelle 22:
Tabelle 23:
Tabelle 24:
Tabelle 25:
Tabelle 26:
Tabellen- und Abbildungsverzeichnis
zu IV. Ergebnisse
Tabelle 27:
Tabelle 28:
Tabelle 29:
Tabelle 30:
zu V.
Durchschnittswerte der immunhistochemischen
Untersuchung in Korrelation zum pT-Status
67
Durchschnittswerte der immunhistochemischen
Untersuchung in Korrelation zum pN-Status
68
Durchschnittswerte der immunhistochemischen
Untersuchung in Korrelation zum pM-Status
69
Durchschnittswerte der immunhistochemischen
Untersuchung in Korrelation zum Tumorstadium
nach UICC
70
Diskussion
Tabelle 31:
Untersuchungsergebnisse verschiedener Studien
der letzten Jahre
88
Tabellen- und Abbildungsverzeichnis
ABBILDUNGSVERZEICHNIS
zu III. Material und Methode
Abbildung 1:
Die direkte Methode
32
Abbildung 2:
Die indirekte Methode
33
Abbildung 3:
Die PAP-Methode
35
Abbildung 4:
Die ABC-Methode
36
Abbildung 5:
Anfärbung mittels
des monoklonalen Antikörpers BCL-2
44
Abbildung 6-10: Anfärbungen mittels
des monoklonalen Antikörpers MIB-1
45
zu IV. Ergebnisse
Abbildung 11:
Abbildung 12:
Abbildung 13:
Abbildung 14:
Verteilung der Patienten
zum Zeitpunkt der Diagnosestellung
nach der TNM-Klassifikation der UICC
54
Verteilung der Patienten
zum Zeitpunkt der Diagnosestellung
nach dem Tumorstadium der UICC
54
Verteilung der Patienten
zum Zeitpunkt der Diagnosestellung
nach dem Differenzierungsgrad
55
Alters- und Geschlechtsverteilung
55
Tabellen- und Abbildungsverzeichnis
zu IV. Diskussion
Abbildung 15:
Abbildung 16:
Abbildung 17:
Abbildung 18:
Abbildung 19:
Färbungsintensität von MIB-1
in Korrelation zum pT-Status
73
Färbungsintensität von MIB-1
in Korrelation zum pN-Status
75
Färbungsintensität von MIB-1
in Korrelation zum pM-Status
77
Färbungsintensität von MIB-1
in Korrelation zu den Tumorstadien nach UICC
79
Färbungsintensität von MIB-1
in Korrelation zum Differenzierungsgrad
81
I.
Einleitung und Fragestellung
I.
EINLEITUNG UND FRAGESTELLUNG
IMMUNHISTOCHEMISCHER NACHWEIS DES ZELLPROLIFERATIONSASSOZIIERTEN ANTIGENS KI-67 UND DES BCL-2 PROTOONKOGENS
ALS PROGNOSEFAKTOREN IN DUKTALEN ADENOKARZINOMEN
DES EXOKRINEN PANKREAS
Das Pankreaskarzinom liegt nach dem Kolon- und Magen- Karzinom an dritter Stelle unter
den Karzinomen des Magen-Darm-Traktes und zeigt weltweit steigende Inzidenz
(MÜLLER et al., 2000). Allein in Deutschland werden jährlich 6.000 - 8.000 neue Fälle
registriert (BÜCHLER, UHL, MALFERTHEINER, 1996). Der Tumor birgt nach wie vor
große therapeutische und diagnostische Probleme. Die Diagnose erfolgt häufig zu spät,
was hauptsächlich auf die späte Symptommanifestation zurückzuführen ist. Die daraus
resultierende schlechte Prognose manifestiert sich in einer hohen Rezidivrate, einer frühen
Metastasierung und einer 5-Jahres-Überlebensrate von etwa 1 - 3 % (WARSHAW et al.,
1992). Der Erkennung der Ursachen und einer frühzeitigen und zuverlässigen Diagnosestellung kommt daher eine zunehmende Bedeutung zu. In diesem Zusammenhang hat die
Forschung innerhalb der letzten Jahre eine Entwicklung in Richtung Tumorbiologie bzw.
Wachstumssteuerung gemacht. Eine entscheidende Rolle in der Genese zahlreicher solider
Tumoren spielen das Antigen Ki-67 und das Protoonkogen BCL-2. Ki-67 ist ein
zellproliferationsassoziiertes Antigen, während BCL-2 eine wichtige Aufgabe bei der
Hemmung der Apoptose übernimmt.
Es stellt sich in dieser Arbeit die Frage, ob an histologisch untersuchten, in Paraffin eingebetteten Tumorgewebe aus tubulären, duktalen Adenokarzinomen des Pankreas bestimmte Prognosefaktoren nachgewiesen und Aussagen über das biologische Tumorverhalten gemacht werden können.
Demzufolge wurde in dieser retrospektiven Analyse in 23 duktalen Adenokarzinomen des
exokrinen Pankreas mittels der paraffingängigen monoklonalen Antikörper MIB-1 und
BCL-2 die Proliferationsaktivität bzw. die Intensität der Apoptosehemmung gemessen und
zu verschiedenen pathologisch-anatomischen Tumordaten in Beziehung gesetzt.
-1-
II.
Vorbemerkungen
II. VORBEMERKUNGEN
II.1. ALLGEMEINE KLASSIFIKATION DER PANKREASTUMOREN
Entsprechend dem Aufbau des Pankreas differenzieren sich Pankreastumoren entweder zu
endokrinen oder exokrinen Tumoren, die maligne bzw. benigne entarten oder zu einer
Tumorgruppe mit unsicherem malignen Potential gehören können. Je nach Herkunft ist
ebenfalls eine Einteilung in mesenchymale und epitheliale Tumoren möglich. Die
nachfolgende internationale histologische Klassifikation der WHO aus dem Jahre 1990
gibt einen kurzen Überblick über die möglichen exokrinen Tumorarten in der
Bauchspeicheldrüse:
Tabelle 1:
Tumoren des exokrinen Pankreas (KLÖPPEL, 1996)
1.
Epithelial Tumours
1.1.
Benign
1.1.1.
1.1.2.
1.1.3.
1.1.4.
Serous cystadenoma
Mucinous cystadenoma
Intraductal papillary-mucinous adenoma
Mature teratoma
1.2.
Borderline (Uncertain Malignant Potential)
1.2.1.
1.2.2.
1.2.3.
Mucinous cystic tumour with moderate dysplasia
Intraductal papillary-mucinous tumour with moderate dysplasia
Solid-pseudopapillary tumour
1.3.
Malignant
1.3.1.
1.3.2.
Severe ductal dysplasia / carcinoma in situ
Ductal adenocarcinoma
1.3.2.1.
Mucinous noncystic carcinoma
1.3.2.2.
Signet-ring cell carcinoma
1.3.2.3.
Adenosquamous carcinoma
1.3.2.4.
Undifferentiated (anaplastic) carcinoma
1.3.2.5.
Mixed ductal-endocrine carcinoma
Osteoclast like giant cell tumour
Serous cystadenocarcinoma
1.3.3.
1.3.4.
-2-
II.
Vorbemerkungen
1.3.5.
Mucinous cystadenocarcinoma
1.3.5.1.
Noninvasive
1.3.5.2.
Invasive
1.3.6. Intraductal papillary-mucinous carcinoma
1.3.6.1.
Noninvasive
1.3.6.2.
Invasive (papillary-mucinous carcinoma)
1.3.7. Acinar cell carcinoma
1.3.7.1.
Acinar cell cystadenocarcinoma
1.3.7.2.
Mixed acinar-endocrine carcinoma
1.3.8. Pancreatoblastoma
1.3.9. Solid-pseudopapillary carcinoma
1.3.10. Miscellaneous carcinomas
2.
Nonepithielial Tumours
3.
Secondary Tumours
4.
Tumour like Lesions
4.1
Chronic pancreatitis
4.2.
Miscellaneous inflammatory changes
4.3.
Cysts
4.3.1.
4.3.2.
4.3.3.
4.3.4.
4.3.5.
4.3.6.
4.3.7.
4.3.8.
Pseudocysts
Retention cyst
Parasitic cyst
Congenital cyst
Para-ampullary duodenal wall cyst
Enterogenous cyst
Lymphoepithelial cyst
Endometrial cyst
4.4.
Duct changes
4.4.1.
4.4.2.
4.4.3.
4.4.5.
Squamous metaplasia
Mucinous cell hypertrophy
Ductal papillary hyperplasia
Adenomatoid ductal hyperplasia
4.5.
Acinar changes
4.6.
Heterotopic pancreas
4.7.
Heterotopic spleen
4.8.
Harmatoma
4.9.
Inflammatory pseudotumour
4.10.
Lipomatous pseudohypertrophy
4.11.
Focal lymphoid hyperplasia
-3-
II.
Vorbemerkungen
In Anlehnung an eine Klassifikation nach KLÖPPEL (1993) sind folgende endokrine
Tumoren ergänzend zu erwähnen (HERMANEK, 1995):
Tabelle 2:
Tumoren des endokrinen Pankreas
A.
Benigne Tumoren / Low-grade-Malignome
(Makrotumoren > 0,5 cm)
funktionell aktiv
Insulinom
Glucagonom
Gastrinom
Vipom
Sonstige
funktionell inaktiv
B.
Maligne Tumoren
schlecht differenziertes endokrines Karzinom
II.2. DIE MALIGNEN TUMOREN DES EXOKRINEN PANKREAS
Der überwiegende Teil der bösartigen Pankreastumoren sind Karzinome. Das Pankreaskarzinom wurde zum ersten Mal in der Zeit von 1830 - 1860 definiert und beschrieben
(MONDIERE, 1836; DA COSTA, 1858). Um die Jahrhundertwende sind dann nach und
nach klinische und pathologisch-anatomische Gesichtspunkte festgehalten worden. Zum
Ende des 18. Jahrhunderts fand die erste histogenetische Einteilung der exokrinen Tumoren in duktale und acinäre Neoplasien statt (BARD, PIC, 1888), welche schließlich als
Grundlage für die Einteilung der exokrinen Pankreastumoren diente (CUBILLA,
FITZGERALD, 1980). Der Begriff der malignen Neoplasien wird hauptsächlich durch
Pankreaskarzinome geprägt, wovon laut europäischer, japanischer und amerikanischer
Studien mehr als 80 % aller maligner Pankreastumoren auf das duktale Adenokarzinom
fallen (KLÖPPEL, 1984; CUBILLA, 1984; SAITO, 1990; MOROHOSHI, 1991). Das
duktale Karzinom repräsentiert damit den häufigsten Typ und kann als Prototyp angesehen
-4-
II.
Vorbemerkungen
werden. Diese Bezeichnung basiert auf der Pathomorphologie des Karzinoms, die verschiedene histologische Varianten aufweisen kann.
Nachfolgend soll ein Überblick über das Pankreaskarzinom u.a. unter Berücksichtigung
seiner ätiologisch-pathogenetisch und molekularpathologischen Problematik gegeben
werden.
II.2.1.
ÄTIOLOGISCHE ASPEKTE DES PANKREASKARZINOMS
Die Entstehung des Pankreaskarzinoms ist multifaktorieller Genese. Sie ist heute noch unklar und weitgehend unerforscht. Jedoch werden Zusammenhänge zwischen der Entstehung des Pankreaskarzinoms und verschiedener Faktoren in der Literatur diskutiert. Zu
erwähnen wären hier als exogene Faktoren ein starker Tabakkonsum, eine an tierischen
Eiweißen oder fettreiche Nahrung und der Genuß von Kaffee oder Alkohol (LIN,
KESSLER, 1981). Als weitere Faktoren werden verschiedene chemische Substanzen, wie
z.B. β-Naphthylamine und Benzidine (MANCUSO, EL-ATTAR, 1967), denen vor allem
Chemiearbeiter ausgesetzt sind, diskutiert (LI, FRAUMENI, 1969). Ein vermehrtes Vorkommen von Pankreaskarzinomen wurde außerdem bei Arbeitern in der Metallindustrie
sowie in Koks- und Gasanlagen beschrieben (BERG, CONNELLY, 1979). Eindeutige
Forschungsergebnisse liegen derzeit allerdings nicht vor. In einigen tierexperimentellen
Studien wurde über ein erhöhtes Risiko, unter dem Einfluß von Nitrosaminen an einem
Pankreaskarzinom zu erkranken, berichtet (POUR et al., 1981). Weiterhin werden in der
Literatur als mögliche prädisponierende Faktoren Vorerkrankungen wie der Diabetes
mellitus (LIN, KESSLER, 1981) und die akute bzw. chronische Pankreatitis (MEYER et
al., 1984) mit der Entstehung des Pankreaskarzinoms in Zusammenhang gebracht. Eine
statistische Absicherung dieser Zusammenhänge gelang bisher noch nicht.
II.2.2.
PATHOGENESE DES PANKREASKARZINOMS
Im Gegensatz zum Pankreaskarzinom wird bei der Entwicklung des pankreasnah
wachsenden Papillenkarzinoms eindeutig eine Adenom-Karzinom-Sequenz im Menschen
beobachtet (BÜCHLER et al., 1984). Es wurden in einer Studie von BÜCHLER und
-5-
II.
Vorbemerkungen
Mitarbeitern (1984) in 83 % aller Patienten mit Papillentumoren im karzinomfreien
Bereich mittel bis hochgradige Epitheldysplasien bzw. in 91 % sogar Adenomstrukturen
beschrieben. Der Nachweis des kontinuierlichen Übergangs vom dysplastischen Epithel
zum Karzinom war in einem Viertel der Präparate möglich.
Durch die Schwierigkeiten der Entdeckung des Pankreaskrebses im Frühstadium sind
konkrete Aussagen über die Karzinogenese bzw. Histogenese des Pankreaskarzinoms
schwierig. Die Beobachtungen zur Karzinogenese des Pankreaskarzinoms stammen daher
fast ausschließlich nur aus Tierexperimenten mit dem sogenannten syrischen Goldhamster
(POUR et al., 1975; 1982). So ist es möglich, Parallelen zur Karzinomentwicklung über
eine entsprechende Adenom-Karzinom-Sequenz zu äußern (KLÖPPEL, 1979; POUR,
1982).
In der Literatur gehen die Ansichten über die Histo- und Zytogenese des Pankreaskarzinoms weit auseinander und werden teilweise kontrovers diskutiert.
Tabelle 3:
Theorien zur Zytogenese von exokrinen Pankreastumoren (SCHULZ et al., 1994)
- BASALZELLTHEORIE:
Basalzellen von terminalen Gangstrukturen sind fähig zur Differenzierung
von funktionellen Einheiten.
- PLURIPOTENTE UNIZELLULÄRE BASALZELLTHEORIE:
Basalzellen von duktulären Strukturen sind zuständig für die Entwicklung
von duktulo-lobulären Komplexen.
- SEMIPLURIPOTENTE BIZELLULÄRE BASALZELLTHEORIE:
Duktale Basalzellen bilden duktuläre Strukturen und epitheliale Vorläuferzellen,
die verantwortlich sind für die Entwicklung von Intermediärzellen, zentroazinären
und azinären Formationen.
- MULTIZELLULÄRE (PLURIPOTENTE) STAMMZELLTHEORIE:
Undifferenzierte pluripotente Stammzellen in allen Gangabschnitten sind
zur Zellteilung, pluripotenten Differenzierung und Entdifferenzierung befähigt.
-6-
II.
Vorbemerkungen
II.2.3.
INZIDENZ DES PANKREASKARZINOMS
Unter den exokrinen Pankreaskarzinomen ist das duktale Adenokarzinom bei weitem der
häufigste Tumor des Pankreas und gehört damit weltweit neben dem Lungen-, Kolon-,
Rektum- und Brustkrebs in der Liste der Krebserkrankungen zu den sechs bis acht häufigsten malignen Neoplasien (BÖCKER, DENK, HEITZ, 1997). Das Pankreaskarzinom liegt
an dritter Stelle nach dem Kolon- und Magenkarzinom unter den Karzinomen des MagenDarm-Traktes (MÜLLER et al., 2000). In den letzten Jahren ist weltweit eine deutliche
Zunahme der Inzidenz des Pankreaskarzinoms beobachtet worden. In den westlichen
industrialisierten Ländern liegt die Häufigkeit derzeit bei 10 Fällen auf 100.000 Einwohner
(BÜCHLER, UHL, MALFERTHEINER, 1996). Es wird für die Vereinigten Staaten über
eine Verdreifachung der Inzidenzrate in den Jahren von 1920 - 1970 berichtet (GUDJONSON, 1987). Die Mortalitätsrate des Pankreaskarzinoms nahm in dieser Zeit ebenfalls
gewaltig zu (BORING et al., 1993). Auf Grund der schlechten Überlebenschancen (die
5-Jahres-Überlebensrate liegt bei 3 %) sind Mortalitäts- und Inzidenzrate des Pankreaskarzinoms weitgehend identisch. Diese Tendenzen wurden ebenfalls von AOKI und
OGAWA basierend auf Datenmaterial der WHO weltweit bestätigt (AOKI, OGAWA,
1978) und blieben bisher unverändert.
In Deutschland werden jährlich etwa 6.000 - 8.000 neue Fälle registriert. Die Inzidenz für
Männer beträgt 7 Fälle, für Frauen 4 Fälle auf 100.000 Einwohner (BÜCHLER, UHL,
MALFERTHEINER, 1996).
Die höchsten Inzidenzen werden unter Farbigen mit bis zu 20 Fällen auf 100.000 Einwohner, die Niedrigsten in Indien, Singapur und Kuwait mit 1 Fall auf 100.000 Einwohner
gefunden (BÜCHLER, UHL, MALFERTHEINER, 1996).
II.2.4.
GESCHLECHTS- UND ALTERSVERTEILUNG
DES PANKREASKARZINOMS
Der internationale Vergleich zwischen Frauen und Männern zeigt, daß das Pankreaskarzinom bei Männern häufiger auftritt (Rate Männer : Frauen 1,5 - 2 : 1). Dem
entsprechen viele Daten epidemiologischer Studien (ANDREN-SANDBERG, IHSE ,1983;
-7-
II.
Vorbemerkungen
CLEMENS et al., 1985; SAITO, 1990). In den letzten Jahren wurde ebenfalls über eine
Zunahme der Krankheitsentwicklung unter Frauen berichtet. Laut dem statistischen
Bundesamt starben zusammengenommen in den Jahren 1979 und 1980 7.065 weibliche
Personen und 6.505 männliche Patienten (STATISTISCHES BUNDESAMT, 1982). Diese
Tendenz ist ebenfalls in den USA zu beobachten (BORING, 1993).
Das Pankreaskarzinom ist eine Erkrankung älterer Menschen. Das Hauptmanifestationsalter liegt zwischen dem 50. und 70. Lebensjahr. Obwohl Pankreaskarzinome bereits
bei Neugeborenen beschrieben wurden (GROSFELD et al., 1970; ROBEY et al., 1983), ist
eine Erkrankung vor dem 40. Lebensjahr relativ selten. Das Wachstumsverhalten und die
Prognose ist unabhängig vom Alter gleich aggressiv und schlecht (IVY et al., 1990).
II.2.5.
LOKALISATION DES PANKREASKARZINOMS
Die Lokalisation des Pankreaskarzinoms kann variieren und sich auf Kopf, Körper,
Schwanz oder auf mehrere Abschnitte des Pankreas erstrecken bzw. multizentrisch
erscheinen. Jedoch geht aus allen Statistiken eine Bevorzugung des Pankreaskopfes beim
Karzinom hervor (MILLER et al., 1951; BELL, 1957; KLINTRUP, 1966). Gelegentlich
sah man ein Pankreaskarzinom in heterotopen Pankreasanlagen entstehen (SILVER, 1948;
GOLDFARB et al. 1963). Die Häufigkeit nach dem Sitz des Karzinoms soll kurz anhand
einer nach Becker (BECKER et al., 1983) prozentualen Einteilung dargestellt, und der
Lokalisation der Tumoren dieser Arbeit gegenübergestellt werden:
Tabelle 4:
Lokalisation des Pankreaskarzinoms
BECKER et al., 1983:
70 - 80%
eigene Untersuchung:
Pankreaskopfkarzinome
87%
Pankreaskopfkarzinome
6 - 13%
Karzinome im Pankreaskörper
4%
diffuse Lokalisation
3 - 17%
Pankreasschwanzkarzinome
9%
Papillenregion
-8-
II.
Vorbemerkungen
Die Angaben zur Lokalisation sind in der Literatur häufig unterschiedlich, da bei der
Sektion der Ausgangspunkt des Tumors oft nicht mehr exakt feststellbar ist. Mit der
Lokalisation des Karzinoms ist jeweils eine etwas anders beginnende Symptomatik und
damit ein anderer Zeitpunkt der Diagnosestellung der Erkrankung verbunden. Tumoren im
Pankreaskörper und Pankreasschwanz sind dann im Vergleich zu Pankreaskopftumoren die auf Grund der engen Lagebeziehung zu den Gallenwegen eher symptomatisch werden meist größer und haben bereits zu Lebermetastasen oder einer Peritonealkarzinose geführt.
II.2.6.
PATHOLOGISCHE ANATOMIE DES PANKREASKARZINOMS
Unter den Begriff des Pankreaskarzinoms fallen hauptsächlich das duktale Adenokarzinom
und das Azinuszellkarzinom. Sie werden beide zu den epithelialen Tumoren gezählt. Das
duktale Adenokarzinom macht mehr als 80 % aller Pankreaskarzinome aus, entspringt vom
Gangepithel und ist meist im Pankreaskopf lokalisiert (KLÖPPEL, 1996).
Das Azinuszellkarzinom ist ein seltener Tumor, der ca. 1 % aller Pankreaskarzinome
ausmacht, von den Drüsenazini ausgeht und meist im Pankreasschwanz lokalisiert ist
(RIEDE, SCHÄFER, 1995).
II. 2.6.1.
MAKROSKOPIE
Das duktale Adenokarzinom ist bei Diagnosestellung meist 2 - 5 cm groß. Es besitzt
infolge fibrotischer und sklerotischer Veränderungen eine feste Konsistenz und ist unscharf
begrenzt. Seine grauweißliche Schnittfläche wird durch hämorrhagische und / oder
nekrotische Areale sowie häufiger durch Pseudozysten geprägt. Es weist sowohl im
Primärtumor als auch in den Metastasen neben zentralen Nekrosen auch perifokale Bindegewebsneubildungen auf. Da es hauptsächlich im Pankreaskopf lokalisiert ist, kann es zu
einer Stenose des Ductus choledochus bzw. des Ductus pancreaticus oder zu infiltrierendem Wachstum in das Duodenum kommen. Durch die Obstruktion ist eine starke Ausweitung der Gangabschnitte proximal des Tumors möglich. Bei Pankreaskarzinomen
besteht die Möglichkeit, daß sie in das dorsale peripankreatische Fettgewebe einwachsen,
-9-
II.
Vorbemerkungen
die V. und A. mesenterica superior ummauern und schließlich in diese Gefäße einbrechen
(BÖCKER, DENK, HEITZ, 1997).
Das Azinuszellkarzinom unterscheidet sich makroskopisch kaum vom duktalen Adenokarzinom (RIEDE, SCHÄFER, 1995).
II.2.6.2.
HISTOLOGIE
Das histologische Bild des duktalen Pankreaskarzinoms ist außerordentlich vielfältig. Es
weist verschiedene Grade der Gewebsausreifung auf.
In einem gut differenzierten Tumor sind dicht gelagerte Tumordrüsenschläuche aus
weniger polymorphen Zylinderepithelien, die eher an normale Gänge und Duktuli erinnern,
mit einem runden Zellkern und einem deutlichen Nukleolus zu erkennen. Das histologische
Bild wird ebenfalls durch eine gleichmäßige Schleimproduktion geprägt (schleimbildendes
Adenokarzinom).
Anderseits sind in einem weniger differenzierten Karzinom sowohl hoch als auch niedrig
differenzierte Drüsenschläuche zu beobachten. Charakteristisch für diese atypischen
Drüsenformationen ist ihre Fähigkeit in ihrer Umgebung die Bildung von Bindegewebe zu
induzieren, was als desmoplastische Stromareaktion bezeichnet wird und den Tumoren
histologisch einen szirrhösen, makroskopisch einen derben Aspekt verleiht. Ebenfalls ist zu
90 % eine Nervenscheideninvasion des Tumors zu beobachten.
Die schlecht differenzierten Karzinome bestehen aus einem Gemisch sowohl aus dichtgelagerten kleinen irregulären Drüsen als auch aus soliden Tumorzellnestern, welche die
azinären Strukturen komplett verdrängen können. Die Tumorzellen zeigen einen hohen
Grad an Pleomorphismus, reduzierter Muzin-Produktion und eine extrem hohe Mitoserate.
Als topographische Sonderform des duktalen Pankreaskarzinoms ist das Papillenkarzinom
von besonderer Bedeutung. Es ist ebenfalls ein Adenokarzinom, das im Bereich der Papilla
duodeni major lokalisiert ist, von der Papillenschleimhaut ausgeht und als kleine Tumor-
- 10 -
II.
Vorbemerkungen
knoten in das Duodenum hervorspringt. Das histologische Bild entspricht dem des
duktalen Pankreaskarzinoms.
Aus praktisch-klinischen Gründen werden die Tumoren der Papille und des Pankreaskopfes häufig aufgrund der gleichen klinischen Symptomatik zu Pankreaskopftumoren
zusammengefaßt. Die Prognose- bzw. Heilungschance der Papillenkarzinome ist jedoch
besser als die der reinen Kopfkarzinome. Sie machen klinisch früher durch einen intermittierenden Verschluß bzw. dem damit verbundenen Ikterus auf sich aufmerksam, werden
dadurch früher erkannt und metastasieren später (RIEDE, SCHÄFER, 1995; BÖCKER,
DENK, HEITZ, 1997).
Das Azinuszellkarzinom weist in gut differenzierten Tumorbereichen azinäre und
trabekuläre Zellverbände auf. Die Tumorzellen sind durch ein eosinophiles feinkörniges
Zytoplasma und durch die positive PAS-Reaktion an ihrem apikalen Zellpol charakterisiert. Sie sind pathobiologisch besonders sekretorisch aktiv und enthalten elektronenmikroskopisch nachweisbare Zymogengranula mit Amylase, α1-Antitrypsin und Lipase.
Bei sekretorisch aktiven Erkrankungen ist gelegentlich ein Lipaseübertritt ins Blut
möglich. Von diesem Tumor sind hauptsächlich Männer über 60 Jahre betroffen (RIEDE,
SCHÄFER, 1995; BÖCKER, DENK, HEITZ, 1997).
II.2.7.
HISTOLOGISCHE DIAGNOSESICHERUNG
Zur histologischen Diagnosesicherung eines Tumors gehört einerseits die Dignitätsbestimmung und seine Typisierung, anderseits die Beurteilung des Malignitätsgrades
(Grading) und der Tumorausbreitung (Staging).
Zur Beurteilung der Tumorausbreitung des Pankreaskarzinoms in Form einer Stadieneinteilung wurden laut Literatur verschiedene Vorschläge gemacht. Darunter fallen z.B. die
1974 von Hermeck veröffentlichte sehr grobe und einfache Klassifikation, die vier Stadien
des Pankreaskarzinoms unterscheidet. Weitere Versuche zur Einteilung der Pankreaskarzinome wurden von vielen anderen, u.a. 1986 von KLÖPPEL und FITZGERALD
unternommen. Die aktuelle TNM-Klassifikation (WITTEKIND, WAGNER, 1997) bietet
nun nach mehrfacher Überarbeitung eine gute Grundlage für eine adäquate Therapie.
- 11 -
II.
Vorbemerkungen
Jedoch wird an dieser Stelle zunächst die alte Klassifikation erwähnt, da das Patientenkollektiv der Arbeit nach dieser klassifiziert wurde:
Tabelle 5:
TNM-Klassifikation der Pankreastumoren: Stadieneinteilung von der Union
Internationale Contre Le Cancer (UICC), vierte überarbeitete Auflage, 1987
(HERMANEK et al. 1987)
T
Primärtumor
-
Tx
Ausdehnung des Primärtumors kann nicht bestimmt werden
-
T0
Primärtumor nicht nachweisbar
-
T1
Tumor auf das Pankreas begrenzt
-
T2
-
T1a
Tumor nicht größer als 2 cm
-
T1b
Tumor größer als 2 cm
Tumor infiltriert direkt Duodenum, Ductus choledochus
und / oder peri-pankreatisches Fettgewebe
-
T3
Tumor infiltriert direkt Magen, Milz, Kolon
und / oder große Nachbargefäße
N
regionäre Lymphknotenmetastasen
-
Nx
Lymphknotenmetastasen nicht einzuordnen
-
N0
keine regionalen Lymphknotenmetastasen
-
N1
regionale Lymphknotenmetastasen
M Fernmetastasen
-
Mx
Vorliegen von Fernmetastasen nicht bestimmbar
-
M0
keine Fernmetastasen
-
M1
Fernmetastasen nachweisbar
- 12 -
II.
Vorbemerkungen
Tabelle 6:
Stadiumeinteilung (UICC, 1987)
Stadium I
T1
N0
M0
T2
N0
M0
Stadium II
T3
N0
M0
Stadium III
beliebiges T
N1
M0
Stadium IV
beliebiges T
beliebiges N
M1
Im Vergleich zur aufgeführten TNM-Klassifikation wird in der folgenden überarbeiteten
fünften Auflage der UICC ein zusätzliches T4-Stadium vorgesehen und das Stadium IV
des AJCC (American Joint Commitee for Cancer) in die Stadien A und B unterteilt.
Tabelle 7:
aktuelle TNM-Klassifikation: fünfte überarbeitete Auflage der Union
Internationale Contre Le Cancer (UICC), 1997
(WITTEKIND, WAGNER, 1997)
T
Primärtumor
-
Tx
Primärtumor kann nicht beurteilt werden
-
T0
Kein Anhalt für Primärtumor
-
Tis
Carcinoma in situ
-
T1
Tumor begrenzt auf Pankreas,
2 cm oder weniger in größter Ausdehnung
-
T2
Tumor begrenzt auf Pankreas,
mehr als 2 cm in größter Ausdehnung
-
T3
Tumor breitet sich direkt in Duodenum, Ductus Choledochus
und/oder peripankreatisches Fettgewebe (1) aus
-
T4
Tumor breitet sich direkt in Magen, Milz, Kolon
und/oder benachbarte große Gefäße (2) aus
- 13 -
II.
Vorbemerkungen
Tabelle 7 (Fortsetzung):
aktuelle TNM-Klassifikation: fünfte überarbeitete Auflage der Union
Internationale Contre Le Cancer (UICC), 1997
(WITTEKIND, WAGNER, 1997)
N
regionäre Lymphknotenmetastasen
-
Nx
Regionäre Lymphknoten können nicht beurteilt werden
-
N0
Keine regionalen Lymphknotenmetastasen
-
N1
Regionale Lymphknotenmetastasen
-
N1a
Metastase in einem einzelnen regionären Lymphknoten
-
N1b
Metastasen in mehreren regionären Lymphknoten
M Fernmetastasen
-
Mx
Fernmetastasen können nicht beurteilt werden
-
M0
keine Fernmetastasen
-
M1
Fernmetastasen nachweisbar
(1) Peripankreatisches Gewebe umfaßt das umgebende retroperitoneale Fettgewebe
(retroperitoneales Weichgewebe oder retroperitonealer Raum), eingeschlossen Mesenterium
(mesenteriales Fett), Mesokolon, großes und kleines Netz und Peritoneum. Direkte Invasion
der Gallengänge und des Duodenums schließt Befall der Ampulla Vateri ein.
(2) Benachbarte große Gefäße sind die Pfortader, der Truncus coeliacus und die A. mesenterica
superior sowie die A. und V. hepatica communis (nicht die Milzgefäße).
- 14 -
II.
Vorbemerkungen
Tabelle 8:
Stadiumeinteilung des American Joint Commitee For Cancer, 1997
(HERMANEK, 1998)
Stadium 0
Tis
N0
M0
Stadium I
T1-2
N0
M0
lokalisierter operabler Tumor
Stadium II
T3
N0
M0
Infiltration in die Nachbarorgane
nicht mehr operabel
Stadium III
T1-3
N1
M0
regionale LK-Metastasierung
z.T. operabel aber nie kurativ
Stadium IVA
T4
jedes N
M0
Stadium IVB
jedes T
jedes N
M1
inoperabel
Das histologische Grading der duktalen Adenokarzinome in hoch, mäßig und niedrig
differenzierte Gruppen ist ein prognostisch wichtiges Kriterium. Die unterschiedlichen
histologischen Strukturen und Veränderungen werden in der folgenden Tabelle 9 nochmals
zusammengefaßt (KLÖPPEL, 1996):
Tabelle 9:
Histologisches Grading für duktale Adenokarzinome des exokrinen Pankreas
Tumour Glandular
Grade differentiation
Mucin
Production
Mitoses Nuclear
atypia
Intensive
≤5
little polymorphism,
polar arrangement
1
Well-differentiated
duct-like glands
2
Moderately differentiated
Irregular
duct-like and tubular glands
6 - 10
Moderate
polymorphism
3
poorly differentiated glands, Abortive
mucoepidermoid and pleomorphic stuctures
> 10
Marked
polymorphism
and increased
nuclear size
- 15 -
II.
Vorbemerkungen
II.2.8.
METASTASIERUNGSWEGE DES PANKREASKARZINOMS
Zum Zeitpunkt der Diagnose der Erkrankung hat der Tumor meist die Organgrenze
überschritten und sich bereits im Rahmen seiner ausgesprochenen Metastasierungsfreudigkeit ausgebreitet. Das duktale Adenokarzinom metastasiert primär lymphogen in die
peripankreatischen und paraaortalen Lymphknoten sowie in die Lymphknoten der
Leberpforte. Eine hämatogene Metastasierung findet man vorwiegend in der Leber, der
Lunge und Pleura, im Skelettsystem und in den Nebennieren (BECKER ,1976; CUBILLA
et al., 1978; LISA et al., 1964; SCHLICK, 1969). Ebenfalls greift der Tumor per
continuitatem auf die hintere Bauchwand, das Mesenterium und die benachbarten
Hohlorgane über. Das bevorzugte perineurale Wachstum in das peripankreatische Fettgewebe des Pankreaskarzinoms ist für die manchmal unerträglichen Schmerzen verantwortlich (RIEDE, SCHÄFER, 1995).
Wie bereits erwähnt zeigen Pankreaskopfkarzinome auf Grund der früher einsetzenden
Klinik seltener Metastasen als Karzinome im Körper und Schwanzbereich (DEL
REGATO, 1977; FRANTZ, 1959).
II.2.9.
KLINIK, DIAGNOSTIK, THERAPIE UND PROGNOSE
DES PANKREASKARZINOMS
Die Symptome des Pankreaskarzinoms ähneln denen der chronischen Pankreatitis, wodurch die Differentialdiagnose erschwert werden kann. Das Leitsymptom der Pankreaskopftumoren ist im Vergleich zu den Schwanzkarzinomen, die hingegen durch Oberbauchbeschwerden auf sich aufmerksam machen, hauptsächlich der - durch die Stenose des
distalen Duktus choledochus verursachte - zunehmende Ikterus. Die Obstruktion des
Pankreasganges geht mit einer obstruktiven Pankreatitis einher, die wiederum zur
Maldigestion mit Diarrhoe bzw. Steatorrhoe und Gewichtsverlust führen kann. Weiterhin
klagen die Patienten über Appetitverlust, Übelkeit, Erbrechen und Schmerzen im Epigastrium, im linken Epichondrium und der Lumbalgegend. Der erste positive Palpationsbefund ist meist die Stauungsgallenblase (sog. Courvoirsierzeichen), wesentlich später der
Pankreastumor selbst.
- 16 -
II.
Vorbemerkungen
Aufgrund der nicht vorhandenen charakteristischen Symptome weist zum Zeitpunkt der
Diagnose der Tumor meist ein fortgeschrittenes Stadium auf, hat die Organgrenze
überschritten und ist ins peripankreatische Gewebe und in Lymphgefäße eingebrochen.
Eine frühzeitige Diagnose ist daher extrem schwierig.
Den größten Fortschritt - sowohl hinsichtlich der Diagnosesicherung als auch der präoperativen Planung beim Pankreaskarzinom - haben bildgebende Verfahren erbracht. Die
Tumoren können durch Ultraschall (evtl. mit Feinnadelpunktion) und Computertomographie erfaßt werden. Eine Darstellung des Ductus pancreaticus oder Ductus choledochus ist mittels der endoskopisch retrograden Cholangiopankreatikographie (ERCP)
möglich. Zur Diagnostik des Pankreaskarzinoms stehen heute ebenfalls verschiedene
laborchemische Verfahren zur Verfügung, wobei die α-Amylase-und Lipaseaktivitäten bei
diesen Patienten geringfügig erhöht sind.
Da der größte Teil der Tumoren zum Zeitpunkt der Diagnosestellung bereits inkurabel ist,
wurden innerhalb der letzten Jahre große Hoffnungen auf die sogenannten Tumormarker
gesetzt. Diese Marker umfassen Enzyme, Proteine, Peptide und tumorassoziierte
oncofetale Antigene. Eine Spezifität dieser Tumormarker liegt jedoch letztendlich nicht
vor, so daß sie im Rahmen einer Verdachtsdiagnose in Kombination mit den genannten
bildgebenden Verfahren eingesetzt werden und bei der prä- und postoperativen
Therapiekontrolle und der Prognosebeurteilung hilfreich sind. Unter den vielen
verschiedenen im Pankreaskarzinom gefundenen Antigenen sind CEA, Ca 19-9, Ca 50, Ca
12-5, DU-PAN-2, Span-1 und TAG-72 nützliche Tumormarker. Hinweisende bzw. für die
Verlaufskontrolle wichtige Parameter sind vor allem die häufig im Serum in erhöhter
Konzentration nachweisbaren Tumormarker CEA und CA-19-9.
Ist der Patient noch im operablem Zustand und lassen sich durch bildgebende Verfahren
lokale und systemische Metastasen ausschließen, sollte per Laparotomie eine Inspektion
des Tumors und bei gesichertem Tumor eine Abklärung des Lymphknoten-Stagings
(Lymphknotenstatus im Bereich des Tripus halleri, der Mesenterialwurzel, peripankreatisch und im Bereich des Ligamentum hepatoduodenale) durchgeführt werden. Als
Therapie der Wahl ist für das kleine Pankreaskopf- oder Papillenkarzinom schließlich die
sogenannte “Rechtsresektion“ (OP nach Whipple bzw. auch proximale partielle DuodenoPankreatektomie) genannt, angezeigt. Die totale Pankreatektomie sowie linksresezierende
Verfahren
werden
bei
Tumoren
im
Korpus-
- 17 -
und
Schwanzbereich
angewandt
II.
Vorbemerkungen
(SCHUMPELICK, 1999). Der Anteil der resektablen Tumoren liegt bei 6 - 23 % aller
Patienten mit einem Pankreaskarzinom (BÜCHLER et al., 1993; TREDE et al., 1990;
WARSHAW et al., 1992), von denen nach 5 Jahren 3 - 24 % der Patienten noch leben
(ISHIKAWA et al., 1988; TREDE et al., 1990; FERNANDEZ DEL CASTILLO, 1994;
HERMANEK et al., 1994). Dabei ist neben der vorausgesetzten R0-Resektion auch die
Frage des Tumorstadiums entscheidend. Bei einer R0-Resektion im Stadium I liegt das 5Jahresüberleben bei 16,5 %, im Stadium II bei 5,8 % (HERMANEK, WITTEKIND, 1994).
Das Hauptaugenmerk für eine gute Prognose bzw. für eine erfolgreiche kurative
Behandlung weist damit auf eine frühzeitige Diagnoseerstellung hin. Die Gesamt-5-JahresÜberlebensrate liegt jedoch im Durchschnitt aufgrund der spät auftretenden und uncharakteristischen Symptome bei 1 - 3 % (WARSHAW, 1992; WHO, 1996). Zur Verbesserung
der Langzeitergebnisse wird eine präoperative neoadjuvante Chemotherapie mit 5Fluorouracil und Mitomycin C in Kombination mit einer fraktionierten Bestrahlung
angewandt, die jedoch laut verschiedener Studien nur für ein kleines Patientenkollektiv
(1/3 bis 2/3) eine Steigerung der 5-Jahresüberlebenrate auf 11 - 15 % ermöglicht
(HOFFMANN et al., 1995; YEUNG et al., 1993).
Anderseits besteht bei nachgewiesener Metastasierung die Möglichkeit der palliativen
Therapie. Diese sollte auf die vorhandenen oder zu erwartenden Symptome zentriert sein.
Sie beschränken sich bei Tumorschmerzen z.B. auf Bestrahlung, beim Ikterus auf das
Einbringen eines Stents oder einer Drainage in den Ductus choledochus bzw. insbesondere
operativ bei Pankreaskopfkarzinomen auf die Durchführung einer biliodigestiven sowie
einer Gastroenteroanastomose. Als weitere Alternativen zur Palliation ist noch die Möglichkeit der Chemoembolisation über den Truncus coeliacus zu erwähnen. Ebenfalls liegen
erste Ergebnisse einer Immuntherapie beim Pankreaskarzinom vor, mit welcher bei einigen
Patienten mit fortgeschrittenen Stadien ein Wachstumsstillstand erreicht werden konnte.
Von einer Prognoseverbesserung kann aber nicht die Rede sein (SULKOWSKI et al.,
1991).
Die Prognose des unbehandelten Pankreaskarzinoms ist schlecht. Der durchschnittliche
Krankheitsverlauf von den ersten Symptomen bis zum Tode an Metastasierung, Blutungen,
Kachexie etc. beträgt im Durchschnitt 7 - 8 Monate (GROß, SCHÖLMERICH, GEROK,
1993).
- 18 -
II.
Vorbemerkungen
Der histologische Malignitätsgrad erweist sich als prognostisch stratifizierendes und
zweifellos wertvolles Kriterium. Dennoch sollte zur Prognosebeurteilung über die bloße
Stadieneinteilung hinaus weiterhin nach Faktoren gesucht werden, die eine enge Korrelation mit der Tumorzelldissimination reflektieren. In diesem Zusammenhang soll in dieser
retrospektiven Studie mit dem immunhisochemischen Nachweis des zellproliferationsassoziierten Antigens Ki-67 und des BCL-2-Protoonkogens in duktalen Pankreaskarzinomen als Prognosefaktoren ein kleiner Beitrag in diese Richtung geleistet werden.
II.3.
PROLIFERATION
Die Proliferation ist eine entscheidende Ursache für das Wachstum des Organismus. Die
Lebensdauer der Zellen und ihre Teilungsfreudigkeit schwankt in weiten Grenzen. Es
besteht jedoch normalerweise beim Erwachsenen ein ausgewogenes Verhältnis (steady
state) zwischen Zelluntergang und Zellersatz, so daß der Zellbestand in etwa konstant
bleibt, welches durch ein fein abgestimmtes Steuerungssystem kontrolliert wird. Die
entprechenden Regulationsmechanismen greifen in die einzelnen Phasen des Zellzyklus
ein. Der Zeitpunkt, zu dem eine Zelle in eine neue Zellzyklusphase eintritt sowie deren
Dauer, wird durch Cycline in Verbindung mit einer cdc-2-Proteinkinase kontrolliert. Ihre
Wirkung wird durch das Zusammenspiel mit bestimmten Genen wie den zyklusabhängigen
Genen, den Protoonkogenen und den Suppressorgenen, moduliert. Daneben üben auch
bestimmte Schlüsselenzyme des Intermediärstoffwechsels sowie Zellkontaktmechanismen
eine Kontrolle auf den Teilungsmechanismus aus (RIEDE, SCHÄFER, 1995). Im
folgenden wird in vereinfachter Form der Zellzyklus einer zur Mitose befähigten Zelle
kurz wiedergegeben:
Innerhalb des Zellzyklus liegen wechselweise Phasen niedriger und sehr hoher
Proliferations- und Replikationsaktivitäten vor. In der Phase mit niedriger oder ruhender
Aktivität sind die Teilungs- und Replikationsvorgänge in der Zelle abgeschlossen und sie
befindet sich in der sogenannten G0-Phase (Gap = Lücke) des Zellzyklus. Die zwischen
zwei Mitosen stattfindende Interphase mit hoher zellulärer Aktivität wird in die G1-Phase,
S-Phase und G2-Phase unterteilt. In der G1-Phase wachsen die Zellen nach vorausgegangener Zellteilung wieder zu ihrer normalen Größe heran. Die Zellen können somit wieder
die ihrer Differenzierung entsprechenden Aufgabe übernehmen. Im Anschluß an die
- 19 -
II.
Vorbemerkungen
Wachstumsphase erfolgt die Verdopplung der DNA durch Replikation. In dieser Phase
wird die neue DNA synthetisiert und wird daher Synthese-Phase (S-Phase) genannt.
Anschließend folgt die prämitotische G2-Phase, in welcher die Zelle durch die Bildung
von Spindelfaserproteinen auf die folgende aus Prophase, Metaphase, Anaphase und
Telophase bestehender Kernteilung vorbereitet wird. Im nun folgenden Abschnitt, der
Zytokinese werden cytoplasmatische Bestandteile zufallsmäßig auf die beiden Tochterzellen verteilt. Es sind durch Zellteilung zwei identische Zellen entstanden, die ihrerseits
nun wieder die zuvor beschriebenen Phasen durchlaufen.
Der Vorgang der Zellproliferation steht, wie bereits erwähnt, normalerweise unter strikter
Kontrolle verschiedener Proliferationsfaktoren und Proliferationsinhibitoren. Zu den Proliferationsfaktoren gehören je nach Organ bestimmte Geschlechtshormone, Vitamine (z.B.
Vitamin B12), Protoonkogene und Wachstumsfaktoren. Protoonkogene sind physiologischerweise vorkommende Gensequenzen (c-onc), die sogenannte Oncoproteine
codieren, welche die Funktion von Wachstumsfaktoren, Wachstumsfaktorrezeptoren oder
Transkriptionsfaktoren einnehmen und für eine rasche effiziente Zellproliferation sorgen.
Proliferationsinhibitoren dämpfen bzw. unterdrücken die Wirkung der Wachstumsfaktoren
und Protoonkogene und werden deshalb auch als Suppressorgene bezeichnet. Sie fungieren
zum Teil auch als Differenzierungsfaktoren und fördern damit nach der Proliferation der
Zellen ihre Ausreifung, so daß diese wieder ihre gewohnte Funktion im Zellverband des
jeweiligen Organs übernehmen kann.
Im Gegensatz zu diesem Kontrollmechanismus kommt es im Rahmen der Kanzerogenese
zu einer unkontrollierten Aktivierung von wachstumsinduzierten Genen (Onkogene) und
zur Inaktivierung der wachstumshemmenden Genen (Tumorsuppressorgenen). Das
dadurch entstandene Ungleichgewicht wachstumsfördernder bzw. hemmender Proteine
führt so zu einer unkontrollierten Zellproliferation.
II.4.
APOPTOSE
Die Apoptose ist definitionsgemäß eine Nekrose bestimmter Zellen in einem Gewebe,
welche das mittelbare oder unmittelbare Resultat eines zelleigenen Selbstzerstörungsprozesses ist und durch eine Schrumpfung (= Schrumpfnekrose) charakterisiert ist. Der
- 20 -
II.
Vorbemerkungen
Prozeß beschränkt sich auf einzelne Zellen, welche wie dürre Blätter von einem
herbstlichen Baum abfallen, so daß dieser Vorgang als APOPTOSE (gr.: abfallen)
bezeichnet werden kann. Die Apoptose ist die typische Nekroseform des “Programmierten
Zelltodes“ und läuft in diesem Zusammenhang über ein zelluläres “Selbstmordprogramm“
der Zelle ab. Die Zelle stirbt entweder durch eine eigene “Zeituhr“ oder durch ein von der
Nachbarzelle aufgezwungenes Todesprogramm, wodurch jeder Zelle eines mehrzelligen
Organs ermöglicht wird, sich in seiner Gesamtheit dem Wandel der Lebensbedingungen
anzupassen.
In dieses zelluläre “Selbstmordprogramm“ sind verschiedene Faktoren eingeschaltet, unter
denen dem sog. p53-Tumorsuppressorgen die Funktion des “Treibers“ zukommt und das
BCL-2-Protoonkogen die Funktion eines “Droßlers“ einnimmt. Als weitere beeinflussende
Faktoren dieses Vorganges sind Zell-Stroma-Interaktionen, verschiedene DNS-Replikationsfaktoren, Wachstumsfaktoren und Zytokine zu erwähnen.
Bei einigen Zellen ist das “Selbstmordprogramm“ an ihre Lebensdauer gekoppelt, wobei
das Genom schrittweise solange reprimiert wird, bis nur noch ein einziges Protein gebildet
wird. Meist geht der Zellkern mitsamt den Organellen zugrunde.
Der programmierte Zelltod ist ein konstanter Begleiter der Gewebsmauserung und ist in
gesteigertem Maße in den Mausergeweben nach Hyperthermie, Bestrahlung, und Zytostase
zu beobachten.
Eine defekte Apoptose spielt in der Tumorgenese einiger Tumoren eine große Rolle,
wodurch Zellen unsterblich werden (= Tumorzell-Immortalisierung). Sie häufen sich ohne
proliferationsmäßig zu wuchern im Gewebe an.
Morphologisch sind im Falle des programmierten Zelltodes - im Gegensatz zum
provozierten Zelltod - keine Zeichen einer zytoplasmatischen Anpassungsreaktion oder
einer reparativ-resorptiven Entzündung zu beobachten. Der Abbau des Nekrosematerials
erfolgt über Phagozytose (RIEDE, SCHÄFER, 1995).
- 21 -
II.
Vorbemerkungen
II.5. MOLEKULARBIOLOGISCHE ASPEKTE
II.5.1.
ALLGEMEINER ABLAUF DER KANZEROGENESE
In den letzten Jahren wurden zahlreiche neue Erkenntnisse über die Entstehung maligner
Tumoren gewonnen. Der Ablauf der Kanzerogenese wird in verschiedene Phasen eingeteilt
und als Mehrstufen-Hypothese der Kanzerogenese bezeichnet. Durch die genetischen
Veränderungen werden viele wichtige Prozesse der Zelle - wie z.B. die Proliferation und
das Wachstum bzw. der Zellzyklus - beeinflußt. Als erster Schritt der Kanzerogenese bzw.
als Initialphase wird die irreversible DNA-Schädigung in nur einer Zelle bezeichnet.
Solange der genetische Schaden nicht auf die Tochterzelle übertragen wurde, kann dieser
durch zelleigene DNA-Reparaturvorgänge aufgehoben werden. Durch den Einfluß
verschiedener Kofaktoren kann die Effizienz der malignen Transformation unterstützt
werden, was als Promotion bezeichnet wird. Die transformierte Zelle durchläuft nun nach
einer Latenzzeit, die sich über 5 - 30 Jahre erstrecken kann, das Stadium der Progression,
in dem sich der irreversible Übergang von einer präneoplastischen zu einer neoplastischen
Zelle mit anschließender Proliferation eines Zellklons vollzieht. Makroskopisch entsteht so
das Wachstum eines Tumorknotens mit eventueller darauffolgender Invasion und Metastasierung.
II.5.2.
MOLEKULARBIOLOGISCHE EBENE DES PANKREASKARZINOMS
Wie für andere Neoplasien ist auch für das Pankreaskarzinom eine große Anzahl
genetischer Aberrationen beschrieben worden. Diese Veränderungen der genetischen
Information beeinflussen die erwähnten, für Entwicklung und Erhalt der Zelle
außerordentlich wichtigen Prozesse der Proliferation und des Wachstums. Es besteht eine
Assoziation mit der Aktivierung von Onkogenen, wie K-ras, der Inaktivierung von
multiplen Tumorsuppressorgenen einschließlich p53, p16, DPC 4 und BRCA 2 sowie der
Überexpression der Protoonkogen erbB-Genfamilie (SCHULZ, 1984; HRUBAN,
PETERSEN et al., 1998; KORC, 1998 ).
Nervale und humorale Faktoren regulieren ebenfalls das Pankreaswachstum. Neuropeptide,
Hormone Zytokine und Wachstumsfaktoren stimulieren oder inhibieren den Zellzyklus.
- 22 -
II.
Vorbemerkungen
Dieses
Fließgleichgewicht
kann
durch
Onkogene
oder
durch
Verlust
von
Tumorsuppressorgenen gestört sein. Unkontrolliertes Wachstum ist die Folge.
II.5.2.1.
ONKOGENE
Eine veränderte Nucleotidsequenz macht - bedingt durch Genamplifikation, den Einbau
von viralen Genen, durch chromosomale Veränderungen sowie durch Deletion oder
Punktmutation - aus einem Protoonkogen ein mutiertes Onkogen. Die meisten Onkogene
kodieren Proteine, wie Wachstumsfaktoren und -Rezeptoren, DNA-bindende Proteine,
Kinasen und GTP-bindende Proteine. Die dabei auftretenden Veränderungen stören die
Regulierung von Proliferation und Differenzierung.
Eines der am besten untersuchten Beispiele ist die RAS-Genfamilie, die beim Menschen
auf Chromosom 6 lokalisiert ist. Sie besteht aus drei eng verwandten Genen (H-ras, K-ras,
N-ras). Alle drei Gene codieren für eng verwandte Guanosin-Triphosphat-bindende
Proteine. Die Genprodukte können ein transformierendes Potential erhalten. Ermöglicht
wird dies durch Überexpression des Normalproteins, verbunden mit einer Amplifikation
der Gene. Daneben ist aber bei einer Reihe von Tumoren, wie dem Pankreas- und
Kolonkarzinom, eine Punktmutation im ras-Gen nachgewiesen worden. Kritische
Positionen für das Auftreten dieser Mutationen in allen drei ras-Genen gelten die Codone
12, 13 und 61 (SCHULZ et al., 1994).
II.5.2.2.
TUMORSUPPRESSORGENE
Dies ist eine Gruppe von rezessiven Genen, welche unter physiologischen Bedingungen
die Zellvermehrung unterbrechen. Die genetische Aufgabe der Tumorsuppressorgene ist
die Inhibition der Onkogene, vermittelt über zahlreiche Mechanismen. Diese Funktionen
beinhalten die Kontrolle des Zellzyklus, die Regulation der Transkription, der Kontrolle
der Apoptose, die Zytoskelett-Funktion sowie die Wachstumsinhibition.
- 23 -
II.
Vorbemerkungen
Das sogenannte Genomwächterprotein p53 agiert als Kontrollpunkt im Zellzyklus (G1/S)
zur Auffindung von DNS-Schäden und gegebenenfalls zur Induktion der Apoptose. In
Zellinien des Pankreaskarzinoms ist die Funktion des p53 in nahezu 50 - 70 % aller Fälle
inaktiviert.
p16 kodiert für ein Protein, welches am Cyclin D-Cdk4-Komplex bindet und somit die
Phosphorilierung einer Vielzahl von Wachstums- und Regulatorproteinen inhibiert. p16
gehört somit zum Zellzyklus-Kontrollkomplex.
Die Inaktivierung von p53 und p16 ist nicht spezifisch für das Pankreaskarzinom. Dagegen
weist der Funktionsverlust von Smad 4 / DPC 4 eine stärkere Assoziation in Zellinien des
Pankreaskarzinoms auf (HRUBAN et al., 1998).
TGFβ inhibiert normalerweise Onkogene durch Bindung an TGFBR 2 unter Interaktion
mit ALK-5. ALK-5 vermittelt über Smad 2, 3 und 4 die Einbringung von DPC4 in den
Zellkern, wo es an die DNA bindet und dadurch verschiedene down-regulierte Gene
aktiviert. Die Einführung von normalem DPC 4 in Karzinomzellen, denen es an DPC 4
mangelt, bewirkt eine Wachstumshemmung. ALK-5 aktiviert neben DPC 4 noch andere
Smad, welche an die Existenz von einigen non-DPC 4 vermittelten TGFβ-Signalwegen
denken läßt. Resistenz gegen TGFβ vermittelte Wachstumsinhibition konnte in vitro für
das Pankreaskarzinom und andere Tumortypen in über 80 % der Karzinomzellinien
nachgewiesen werden. DPC 4 ist genetisch in 48 - 53 % der Pankreaskarzinom-Zellinien
inaktiviert (KORC et al., 1998; DUFF et al., 1998).
Die nachfolgende Tabelle 10 gibt einen Überblick über die derzeit bekannten Onkogene
und Wachstumsfaktoren des Pankreasgewebes, deren Lokalisation und klinischen Bezug
(P. DINSE, U. SULKOWSKI, H. NOTTEBERG, 1995/96).
- 24 -
II.
Vorbemerkungen
Tabelle 10:
Onkogene und Wachstumsfaktoren des Pankreasgewebes
Onkogen
Literatur
K-ras
Bos, J .L.
Hruban, R. H.
Mutation
Gewebe
Bemerkungen
1989 128/156 → 82%
CA
Korreliert nicht mit
1993 68/82
→ 83%
CA
Überleben /
1993 46/53
Yanagisawa, A. 1993 10/16
→ 87%
CA
Tumorproliferation
→ 62,5%
CP
Scarpa, A.
→ 41%
CA
Motojima, K.
P53
1993 14/34
Tritt gepaart mit K-rasVeränderungen auf
Wachstums-
Literatur
Positiver
Faktor
EGF
Gewebe
Bemerkungen
CA
15-fach erhöht; p < 0,0001
(Acinus /
korreliert ∅ mit dem
Gang-
Grading
Nachweis
Korc, M.
1992 22/22
→ 100%
zelle)
EGF-R
Korc, M.
1992 22/22
→ 100%
CA
3-fach erhöht; p < 0,0001
→ 63%
CA
7-fach erhöht; p < 0,01
(HER-1)
FGF-1 (aFGF)
Friess, Korc, Büchler,
38/60
1994
korreliert mit dem
Tumorstadium p < 0,05
Überleben ∅
FGF-1 (aFGF)
Friess, H.
1994 16/21
FGF-2 (bFGF)
Friess, Korc, Büchler
33/60
→ 76%
CP
14-fach erhöht; p < 0,01
→ 55%
CA
9-fach erhöht; p < 0,01
1994
korreliert mit dem
Tumorstadium p < 0,05
Überleben p < 0,001
FGF-2 (bFGF)
Friess, H.
1994 19/21
FGF-R
Friess, Korc, Büchler
31/60
→ 90%
CP
15-fach erhöht; p < 0,01
→ 52%
CA
Korreliert mit dem
1994
Tumorstadium p < 0,05,
Überleben p < 0,01
TGF-α
Korc, M.
1992 n=22
- 25 -
-
CA
10-fach erhöht; p < 0,0001
II.
Vorbemerkungen
Wachstums-
Literatur
Positiver
Faktor
TGF-β1
Gewebe
Bemerkungen
CA
Korreliert mit dem
Nachweis
Friess,H.
1993 28/60
→ 47%
Tumorstadium ∅
Überleben p < 0,04
TGF-β2
Friess, H.
1993 25/60
→ 42%
CA
Korreliert mit dem
Tumorstadium < 0,05
Überleben p < 0,001
TGF-β3
Friess,H.
1993 24/60
→ 40%
CA
Korreliert mit
Tumorstadium ∅
Überleben p < 0,02
TβR-II
Friess,H.
1993 n= 17
-
Ca
4,6-fach erhöht; p < 0,01
TβR-III
Friess,H.
1993 n=17
-
Ca
Nicht signifikant erhöht
PCNA
Isozaki,H.
1994 n=18
-
PaCa
Korreliert mit
Tumorstadium p = 0,01
LK-Befall p = 0,048
mit
EGF/EGF-R =
epidermal growth factor / -Rezeptor
FGF/FGF-R =
fibroblastic growth factor / -Rezeptor
TGF/TGF-R =
transforming growth factor / -Rezeptor
PCNA
=
proliferating cell nuclear antigen
CP
=
chronische Pankreatitis
CA
=
Karcinom
PaCA
=
Papillenkarcinom
- 26 -
III.
Material und Methode
III.
MATERIAL UND METHODE
III.1.
DAS UNTERSUCHUNGSGUT
Dieser Untersuchung liegen 23 Pankreaskarzinom-Schnitte - hauptsächlich Adenokarzinome - zu Grunde. Die Schnitte waren zu Beginn dieser Arbeit bereits mit Formalin
fixiert und in Paraffin eingebettet. Dieses Einsendegut aus den Jahren 1994 - 1996 der
Abteilung für Pathologie an der Ruhr-Universität Bochum wurde zuvor im Institut nach
ihrem Staging bzw. der TNM-Klassifikation und ihrem Differenzierungsgrad (Grading)
entsprechend eingeteilt. Alle weiteren Informationen über den Krankheitsverlauf der
Patienten stammen von dem Einsender des Untersuchungsgutes, der Universitätsklinik
Knappschaftskrankenhaus in Bochum.
III.2.
BEURTEILUNGSKRITERIEN
Die Schnitte der Pankreaskarzinome wurden nach ihrer Entparaffinierung mit der AvidinBiotin-Methode mit monoklonalen BCL-2-, und MIB-1-Antikörpern sowohl auf ihr
Apoptoseverhalten als auch auf ihr Proliferationsverhalten immunhistochemisch
untersucht. Beide Antikörper zeigen im Falle einer positiven Reaktion einen rotbraunen
intranukleären Farbniederschlag (Fa. DIANOVA und DAKO). Pro Schnitt wurden 10
Gesichtsfelder bei 400-facher Vergrößerung ausgezählt und daraus jeweils die positiven
Kernreaktionen im Verhältnis zu der Gesamtzellzahl prozentual berechnet. Die
nachfolgende Tabelle 11 zeigt eine Übersicht über die Einteilungskriterien.
Tabelle 11:
Einteilungskriterien für die Auswertung der Untersuchung
positive
> 50 %
10 - 50 %
< 10 %
Zellkerne
+++
++
+
- 27 -
einzelne
keine
Zellkerne
Zellkerne
(+)
-
III.
III.3.
Material und Methode
POLYKLONALE ANTIKÖRPER
Nach Kontakt mit einem Antigen produziert jeder B-Lymphozyt Antikörper, die gegen ein
spezifisches Epitop des Antigens gerichtet sind. Dies führt schließlich zur Ausbildung
eines sogenannten Klons von Plasmazellen, die Antikörper produzieren und sezernieren
(LÖFFLER, 1993). Da die meisten Antigene mehrere antigene Determinanten besitzen,
werden unterschiedliche B-Lymphocyten aktiviert. Dabei entsteht eine größere Zahl an
Plasmazellklonen, die sogenannte polyklonale Antikörper produzieren. Am häufigsten
werden Kaninchen und Ziegen zur Produktion dieser Antikörper benutzt.
III.4.
MONOKLONALE ANTIKÖRPER
Monoklonale Antikörper stellen für viele experimentelle und diagnostische Zwecke
wichtige Werkzeuge dar. Diese Antikörper sind jeweils gegen eine antigene Determinante
gerichtet. Nach Immunisierung mit einem Antigen entstehen somit nur einheitliche
Antikörper eines B-Zellklons. Monoklonale Antikörper besitzen damit eine extrem hohe
Selektivität (PETERS, BAUMGARTEN, 1985). Ein Verfahren zur Herstellung derartiger
Antikörper ist 1975 von KÖHLER und MILSTEIN mittels der Hybridomtechnik
entwickelt worden. Zur Erzeugung der Antikörper werden Milzzellen, die hauptsächlich
aus B-Lymphocyten bestehen, aus einer bereits immunisierten Maus isoliert und experimentell mit Myelomzellen unter Zusatz von Polyethylenglycol fusioniert (LÖFFLER,
1993). Durch diesen Vorgang entsteht eine Immortalisierung der B-Lymphocyten, die
dadurch beliebig lange in Zellkulturen gehalten werden können. So ist es möglich von je
einer B-Zelle abstammende Klone herzustellen, die spezifische monoklonale Antikörper
produzieren.
- 28 -
III.
Material und Methode
III.5.
IMMUNPEROXIDASE-FÄRBETECHNIKEN
Man unterscheidet hauptsächlich vier Methoden, in denen die Immunperoxidase Verwendung findet. Dazu gehören, die direkte, indirekte, PAP- und Avidin-Biotin-Methode, die
im Einzelnen später erläutert werden.
Immunenzymatische Färbemethoden beruhen auf der Fähigkeit spezifischer enzymgekoppelter Antikörper korrespondierende Antigene zu erkennen und darzustellen. Nach
der Antigen-Antikörper-Reaktion läßt sich die Lokalisation des Antigens - unter Zusatz
von H2O2 und einem als Elektronendonor fungierenden Chromogens - durch einen Farbumschlag erfassen. Voraussetzung dafür ist die Kupplung von Antikörper und Enzym unter
Einsatz von verschiedenen Reagenzien. Dies sind z.B. Glutaraldehyd oder m`-Dinitrodiphenylsulfon (LUPPA, 1978). Der histochemische Peroxidasenachweis kann letztendlich
über den Farbumschlag licht- oder elektronenmikroskopisch beurteilt werden. Die Farbe
hängt von der Art des verwendeten Chromogens ab (NADJI, MORALES, 1986), das sich
durch Oxidation in unlösliche und gefärbte Reaktionsprodukte umwandelt. Dabei wären
als Chromogene zu erwähnen (BOENISCH,1989):
Tabelle 12:
Substrate der Peroxidase und ihre Farbreaktion
Chemischer Name
Abkürzung
Farbumschlag
3-Amino-9-Ethylcarbazol
AEC
Rot
3,3´-Diaminobenzidin
DAB
Braunrot
4-Chlor-1-Naphtol
CN
Blau
p-Phenylendiamin+
Hanker-Yates-Reagenz
Schwarz
Tetrahydrochlorid
Pyrocatechol
- 29 -
III.
Material und Methode
III.6.
DAS ENZYM PEROXIDASE
Die verschiedenen Peroxidasen stellen ein Enzymsystem dar, dessen Hauptaufgabe die
Zerstörung von H2O2 in den Zellen ist. Die gleiche Funktion können die Cytochrom-CPeroxidasen und die Katalase ausüben. Das aus der Meerrettichwurzel gewonnene Enzym
Peroxidase besitzt ein Molekulargewicht von 40 kD. Es hat dadurch eine besondere Bedeutung bei Markierungen von Antikörpern, sowie als Marker-Enzym zur Kennzeichnung von
Transport und Permeabilitätsprozessen in tierischen Geweben (LUPPA, 1978). Das
Aktivitätszentrum der Peroxidasen enthält eine eisenhaltige Hämgruppe (Hämatin). Dieses
bildet einen Komplex mit dem Substrat Wasserstoffperoxid. Dieser Komplex reagiert
zusammen mit einem Elektronendonor und produziert anschließend die Endprodukte der
Reaktion, nämlich ein Farbmolekül und Wasser. Die größere Empfindlichkeit der
Immunperoxidase-Techniken liegt an dem Verstärkungsfaktor der Enzymtechnik. Ein
Fluoreszensmolekül kann nur einen geringen Teil sichtbares Licht abgeben, ein
Peroxidase-Enzym kann hingegen viele Farbmoleküle produzieren (BOURNE, 1983).
Durch einen Substratüberschuß können Peroxidasen reversibel gehemmt werden, wobei
der Komplex aus Peroxidase und einem Überschuß an Wasserstoffperoxid katalytisch
inaktiv ist und bei Fehlen eines geeigneten Elektronendonators (z.B. einer chromogenen
Substanz) reversibel blockiert wird. Dieses Prinzip - Überschuß an Wasserstoffperoxid, bei
gleichzeitigem Fehlen eines Chromogens - ermöglicht die Unterdrückung der endogenen
Peroxidase und führt zur Reduktion unspezifischer Hintergrundreaktionen (BOENISCH,
1989). Unter dem Begriff “endogene Peroxidasen“ werden zahlreiche Zellsysteme, die
über eine Peroxidaseaktivität verfügen, zusammengefaßt (HEYDERMANN, 1979). Dazu
werden z.B. die Zellen der Myelopoese mit der Myeloperoxidase, der Mastzellen mit der
Mastzellperoxidase oder die Erythrozyten mit ihrem Hämoglobin, welches ebenfalls eine
solche enzymatische Wirkung besitzt, gezählt (STRAUS, 1971). Diese Zellsysteme können
ohne geeignete Blockierungsschritte zu falsch-positiven Färbeergebnissen führen.
Weiterhin können folgende Methoden zur Blockierung der endogenen Peroxidase benutzt
werden:
- 30 -
III.
Material und Methode
Tabelle 13:
Methoden zur Blockierung der endogenen Peroxidase
Ö
Fixation in Methanol plus 1 % Essigsäure und 15 Natriumferricyanid
Ö
Ethanol plus 0,07 % HCL
Ö
Perjodsäure-Borhydrid (HEYDERMANN, 1979; KELLY et al., 1987)
Ö
Natriummetaperjodat
Ö
Wasserstoffsuperoxid allein (KÖLLER et al., 1986)
Ö
Wasserstoffsuperoxid (0,5 %) in Methanol für 15 min.
(STEEFKERK, 1972)
Ö
Wasserstoffsuperoxid plus Phenylhydrazin-Hydrochlorid (STRAUS, 1972)
Ö
Wasserstoffsuperoxid plus 0,005 M Natrium-Azid
(FARR, NAKANE, 1981)
Ö
Wasserstoffsuperoxid 0,04 % plus Natrium-Azid 0,65 % plus
Nachbehandlung in Zitronensäure-Phosphatpuffer PH 2,3 für 20 min.
(MALORNY et al., 1988)
Ö
Wasserstoffsuperoxid 1,5 - 2 % plus Natrium-Azid 0,1 % in PBS
(ENDL, XU, PETERS, 1990)
Folgende Immunperoxidasetechniken werden im Einzelnen beschrieben:
a) Die direkte Methode
b) Die 2-Schritt-indirekte Methode
c) Die 3-Schritt-indirekte Methode
d) Die Peroxidase-anti-Peroxidase-Methode (PAP-Methode)
e) Die Avidin-Biotin-Methode
Die Methoden d) + e) eignen sich in der Routine zur Untersuchung von in Paraffin
eingebetteten Präparate (BOURNE, 1983; FRITZ et al., 1985).
- 31 -
III.
Material und Methode
a)
Die direkte Methode
Innerhalb dieser Methode ist bereits der Primärantikörper, der spezifisch gegen das zu
untersuchende Antigen gerichtet ist, direkt mit dem Enzym, der Peroxidase, konjugiert
(NAKANE, PIERCE, 1966; COONS et al., 1941). Nach Antigen-Antikörper-Kontakt
kommt es schließlich zur Ausbildung eines Komplexes. Durch die sich anschließende
Inkubation mit einem entsprechenden Chromogen entsteht ein Farbumschlag und die
Reaktion ist somit beendet. Obwohl diese Methode zeitlich rasch durchführbar ist, und sie
selten zu unspezifischen Reaktionen neigt, wird sie heute kaum noch angewandt und nicht
mehr empfohlen. Nachteihaft ist, da nur ein einzelner Antikörper enzymmarkiert wird, die
daraus resultierende mangelnde Signalverstärkung. Ferner müssen die spezifischen
Antikörper für die zahlreichen verschiedenen darzustellenden Antigene jeweils mit der
Peroxidase konjugiert werden. Weiterhin ist die direkte Methode von allen angewandten
Immunperoxidaseverfahren die Methode mit der geringsten Sensitivität (BOURNE, 1983).
Abbildung 1: Die direkte Methode
- 32 -
III.
Material und Methode
b) + c) Die indirekte 2-Schritt und 3-Schritt-Methode
Bei dieser Methode reagiert ein unkonjugierter Primärantikörper mit dem Antigen. Nach
Ausbildung des Antigen-Antikörper-Komplexes wird ein zweiter enzymmarkierter Antikörper dem Testsystem zugeführt und bindet sich an diesen Komplex. Das FC-Fragment
des Primärantikörpers wird dabei vom Zweitantikörper als Antigen erkannt. Durch Zugabe
des entsprechenden Chromogens und der darauffolgenden Substrat-Chromogen-Reaktion
folgt schließlich der Farbumschlag. Die beschriebene Methode wird als 2-Schritt-Methode
bezeichnet und kann durch Zugabe eines weiteren enzymmarkierten Antikörpers erweitert
werden, wobei Sekundär und Tertiärantikörper jeweils mit dem selben Enzym markiert
sind. Bei dieser Methode kann im Vergleich zur direkten Methode eine Vielzahl von
Primärantikörpern aus einer Spezies mit dem gleichen markierten Zweitantikörper kombiniert werden. Da mehrere Zweitantikörper mit verschiedenen Epitopen des Primärantikörpers reagieren können, wird am Gewebsantigen die Zahl der Enzymmoleküle erhöht
und somit die Empfindlichkeit der indirekten Methode um ein Mehrfaches verstärkt. Durch
die bereits erwähnte 3-Schritt-Methode wird eine weitere Signalverstärkung erzielt. Vorrangig wird diese Methode zum Nachweis von Antikörpern im Serum von Patienten mit
autoimmun, bakteriellen oder parasitären Erkrankungen eingesetzt (BOURNE, 1983).
Abbildung 2: Die indirekte Methode
- 33 -
III.
Material und Methode
d)
Die Peroxidase-Anti-Peroxidase-Methode
Die Methode ist ursprünglich von STERNBERGER 1970 beschrieben worden und bietet
im Vergleich zu den bereits beschriebenen Methoden durch die Verwendung des sogenannten PAP-Komplexes eine wesentlich höhere Sensitivität. Es ist so möglich unerwünschte Reaktionen der spezifischen Antigenbindungsstellen mit zellulärem Material zu
vermeiden. Man arbeitet bei dieser Technik mit unkonjugierten monoklonalen Primärantikörpern, die sich mit dem Gewebsantigen zu einem Antigen-Antikörperkomplex zusammenschließen. Durch den Zusatz eines Brückenantikörpers, der mit dem FC-Fragment
des Primärantikörpers eine Bindung eingeht, wird schließlich eine Verbindung zu dem
PAP-Komplex hergestellt. Dabei müssen der Primärantikörper sowie der Antikörper des
Enzymimmunkomplexes für die Verbindung der beiden durch den Brückenantikörper aus
der selben Spezies stammen. Der PAP-Komplex ist ein Immunkomplex aus Peroxidase
und dem Antikörper gegen Peroxidase (PETERS, 1985). Insgesamt besteht er aus 2 Antikörpern und 3 Peroxidasemolekülen (PETRALI et al., 1974).
Nach Zusatz eines Chromogens ist schließlich der Farbumschlag zu beobachten, wobei
durch den PAP-Kompex - im Gegensatz zur direkten und indirekten Methode - eine
Verstärkung der Nachweisreaktion erreicht wird. Eine der wichtigsten Anwendungen
dieser Methode liegt in der Bestimmung eines Tumorursprungs. Dabei werden von Zellen
produzierte spezifische Antigene identifiziert. Dazu gehören Tumormarker wie z.B. PSA,
hCG oder der Nachweis von Immunglobulinen. Es wird so eine genauere Klassifikation besonders bei schlecht differenzierten und metastasierten Tumoren - gewährleistet
(BOURNE, 1983).
- 34 -
III.
Material und Methode
Abbildung 3: Die PAP-Methode
e)
Die Avidin-Biotin-Komplex-Methode (ABC-Methode)
Diese Methode ist als erstes 1977 von HEGENESS und ASH in der Fluoreszensmikroskopie eingesetzt worden. Heutzutage wird hauptsächlich die 1981 von HSU et al.
entwickelte Methode verwendet. Der vorliegenden Untersuchung liegt die Avidin-BiotinMethode zu Grunde. Diese Methode profitiert von der sehr hohen Affinität zwischen dem
Protein Avidin und dem Vitamin Biotin (Affinitätskonstante 10 MOL/L). Avidin ist ein
Glycoprotein mit vier Bindungsstellen und einem Molekulargewicht von 68 kD. Sein isoelektrischer Punkt (Ip) liegt um 10 (GREENE, 1975). Allerdings bewirken dieser hohe Ip
und der Zuckeranteil eine relativ starke unspezifische Bindung an biologische Strukturen,
wie z.B. an Zellmembranen. Diesen Nachteil kann man mit dem Einsatz eines zu Avidin
analogen Proteins, dem sogenannten Streptavidin mit einem Ip im sauren Bereich, einem
niedrigeren MG von 60 kD und einer fehlenden Zuckergruppe, umgehen (PETERS, 1985).
- 35 -
III.
Material und Methode
Biotin ist die wasserlösliche Form des Vitamin H. Es kann sich mit seinem kleinen
Molekulargewicht von 244 Dalton (MOSS, LANE, 1971) über die Carboxylgruppe leicht
an monoklonale Antikörper binden und so in der gekoppelten Form in vielen immunchemischen Techniken verwendet werden. Die Kopplung der monoklonalen Antikörper an
Biotin weist im Vergleich zu der bereits beschriebenen direkten Konjugierung der Antikörper mit Enzymen wesentliche Vorteile auf. Es lassen sich einerseits pro Antikörpermolekül mehrere Biotinmoleküle binden, was zu einer erheblichen Signalverstärkung
führt. Anderseits können biotinylierte Antikörper mit unterschiedlichen Avidin oder Streptavidinkonjugaten nachgewiesen werden. Wie bei den zuvor beschriebenen Methoden
bindet auch bei der Avidin-Biotin-Methode ein Primärantikörper an das zu untersuchende
Gewebsantigen. Nun folgt eine Inkubation mit einem Sekundärantikörper, der kovalent an
Biotin gebunden und gegen den Primärantikörper gerichtet ist. Der nachfolgend zugegebene Avidin-Biotin-Peroxidase-Komplex lagert sich mit der freien Bindungsstelle des
Avidins an das Biotin an. Der letzte Schritt dieser Methode stimmt wiederum mit dem der
bisher beschriebenen überein. Nach Zugabe des Chromogens erfolgt also schließlich
wieder über Oxidation der Farbumschlag, wobei dieser durch die bereits erwähnte Signalverstärkung eine hohe Intensität aufweist (PETERS, 1985).
Abbildung 4: Die ABC-Methode
- 36 -
III.
III.7.
Material und Methode
DIE VERWENDETEN ANTIKÖRPER
In dieser Untersuchung von Pankreaskarzinom-Gewebe ist der monoklonale Antikörper
MIB-1 der Firma DIANOVA und der monoklonale Antikörper BCL-2 der Firma DAKO
verwendet worden. Beide eignen sich zur Anwendung an in Paraffin eingebetteten
Geweben.
Der Antikörper MIB-1 ist gegen das nukleäre zellproliferationsassoziierte Antigen Ki-67
gerichtet, welches auf dem Chromosom Nr. 10 lokalisiert ist und in allen aktiven Phasen
des Zellzyklus exprimiert wird. Das Ki-67-Antigen ist ein bimolekularer Komplex mit
einem Molekulargewicht von 345 und 395 kD (GERDES et al., 1984; SCHONK et al.,
1998). MIB-1 wurde durch Immunisierung mit bakteriell exprimiertem Ki-67 gewonnen
(Fa. DIANOVA). Es erkennt das Ki-67-Epitop, das in 9 von 16 concatemeren Wiederholungen im Exon 13 des Ki-67 Gens vorkommt. MIB-1 zeigt in proliferierende Zellen
eine starke Kernfärbung auf.
Durch die Verwendung des monoklonalen Antikörpers BCL-2 soll in dieser Arbeit das
sogenannte BCL-2-Protoonkogen nachgewiesen werden. Dieses Protoonkogen ist ein
Bestandteil vieler hochdifferenzierter Zellen, es übernimmt die Rolle des Gegenspielers
zur Apoptose und ermöglicht damit längeres Zellüberleben (PEZZELLA et al., 1990).
Ursprünglich wurde das BCL-2-Protooncogen in B-Zell-Lymphomen nachgewiesen
(TSUJIMOTO et al., 1985), welche eine 14;18 Chromosomentranslokation aufwiesen und
für die Überexpression von BCL-2 verantwortlich gemacht wurde (NYGAN et al., 1988).
Das BCL-2-Protein wurde jedoch ebenfalls in Zellen ohne diese Translokation gefunden,
wie zum Beispiel in lymphatischen Zellen der B- und T-Zellreihe, in lymphatischen
Organen und in verschiedenen Lymphom-Formen (PEZZELLA et al., 1990). Ebenfalls
gelang der Nachweis des BCL-2-Proteins in proliferierenden und lang lebenden ZellZonen wie z.B. in Drüsenepithelien, in komplex differenzierten lang lebenden Epithelien
der Gesichtshaut, des Gastrointestinaltraktes und in postmitotischen Zellen der Neurone
(HOCKENBERY et al., 1991).
In einigen jüngeren Studien wird das BCL2-Protoonkogen im Zusammenhang mit einer
multigenen BCL-2-Familie erwähnt, welche miteinander interagieren und den programmierten Zelltod regulieren. Dabei blockieren einige Mitglieder dieser Gen-Familie - wie
zum Beispiel BCL-2, BCL-XL und MCL-1 - den Zelltod, wohingegen die Gene BAX und
- 37 -
III.
Material und Methode
BCL-XS als Promotor der Apoptose fungieren (OLTAVAI et al., 1993; BOISE et al.,
1993; HANADA et al., 1995).
Für MIB-1 wird von Seiten des Herstellers eine Verdünnung der Antikörper1:10 bis 1:100,
für BCL-2 eine Verdünnung zwischen 1:40 bis 1:80 empfohlen. Vor Beginn der Färbung
wurde für beide Antikörper eine optimale Verdünnung ausgetestet, die für MIB-1 bei 1:20
und für BCL-2 bei 1:40 liegt.
Sowohl MIB-1-, als auch BCL-2-Expressionen zeigen unter dem Mikroskop einen
rotbraunen intranukleären Farbniederschlag, welcher für die Auszählung ausschlaggebend
war.
III.8.
Verwendete Reagenzien und Geräte
Ö
Leica-Jung SM 2000 R Mikrotom
Ö
Xylol
Ö
Alkohole 100 %, 95 %, 70 %, 50 %, 30 %
Ö
PBS (Phosphate Buffered Saline), Puffer der Fa. Sigma Diagnostics
Ö
Zitronensäurepuffer (bestehend aus Lsg. A = 0,1M Zitronensäure und
Lsg. B = 0,1 M Natriumcitrat)
Ö
Philipps A 5100 Mikrowelle
Ö
Wasserstoffperoxid 1 %
Ö
Fettstift der Fa. DAKO
Ö
Vectastain ABC-Kit der Fa. Vector Laboratories mit folgendem Inhalt:
Normalserum, biotinylierte Zweitantikörper, Avidin-Biotin-Komplexe
Ö
Antikörper BCL-2 der Fa. DAKO und MIB-1 der Fa. DIANOVA
Ö
AEC-Chromogen (kanzerogenes Potential)
Ö
Mayer`s Hämatoxylin
Ö
Glyceringelatine
Ö
Eindeckgläser
Ö
mit Poly-L-Lysin beschichtete Objektträger
Ö
Zeiss Axiophot (Mikroskop und Fotoeinheit)
- 38 -
III.
III.9.
Material und Methode
SCHNEIDEN DER GEWEBEBLÖCKE UND
AUFZIEHEN DER SCHNITTE AUF DEN OBJEKTTRÄGER
Die in Paraffin eingebetteten Gewebeblöcke wurden an einem Leica-Jung SM 2000 R
Mikrotom mit einer Gewebestärke von 5 µm geschnitten. Die Schnitte wurden im Anschluß daran in einem 37 °C warmen Wasserbad mit Hilfe eines Streckmittels (z.B.
warmes Mineralöl) gestreckt und auf einen mit Poly-L-Lysin beschichteten Objektträger
aufgezogen, wodurch das Abschwimmen der Schnitte verhindert werden soll. Diesem
Vorgang schließt sich schließlich eine Trocknung der Schnitte über mehrere Stunden in
einem ebenfalls 37 °C warmen Inkubator an. Durch die Beschichtung des Objektträgers ist
später eine Mikrowellenbehandlung möglich .
III.10. FÄRBEN DER PRÄPARATE
Einige wichtige Färbeschritte werden nachfolgend ausführlicher erläutert:
1)
Entparaffinieren und Rehydrieren der Schnitte
Vor der histochemischen Färbung müssen in Paraffin eingebettete Schnitte von
ihrem Einbettungsmedium Paraffin getrennt werden, da dieses zu unerwünschten
Hintergrundfärbungen führen kann. Der erste Schritt der sogenannten Entparaffinierung ist die bereits beschriebene Verweildauer der Schnitte von mehreren
Stunden in einem 37 °C warmen Inkubator. Dieser Erweichung des Paraffins schließt
sich eine 30-minütige Behandlung der Schnitte mit Xylol an. Anschließend müssen
die Gewebsschnitte eine absteigende Alkoholreihe (100 % 10 Min.; 95 %, 70 %,
50 % und 30 % für jeweils 5 Min.) zur Rehydrierung durchlaufen. Damit ist die
Voraussetzung zur Mikrowellenbehandlung geschaffen.
2)
Freilegen der Antigenstruktur durch Behandlung der Schnitte in einer Mikrowelle
Um antigene Strukturen freizulegen müssen die Schnitte nach einem vorherigen
Spülvorgang in PBS-Puffer 15 Minuten bei 100°C in Zitronensäurepuffer gekocht
werden. Dieser Vorgang verbessert die Bindungsmöglichkeiten der Primärantikörper.
Anschließend müssen die Schnitte 30 Minuten auf Raumtemperatur abgekühlt
werden.
- 39 -
III.
Material und Methode
3)
Unterdrückung der Peroxidase
Nun schließt sich ein weiterer Spülvorgang in PBS-Puffer an, dem eine 25-minütige
Inkubation in 1 % Wasserstoffperoxid folgt. Durch diesen Vorgang wird die
endogene Peroxidaseaktivität gehemmt. Nach Beendigung dieser Hemmung folgt
wiederum ein Waschvorgang mit PBS-Puffer.
4)
Inkubation mit Normalserum
Um unspezifische Hintergrundfärbungen zu vermeiden, ist eine 10-minütige Inkubation mit Normalserum nötig. Dieser Schritt ist wichtig, da es sonst zu einer
Anlagerung der im nächsten Schritt folgenden Primärantikörper an stark geladene
Kollagen und Bindegewebselemente kommen könnte. Durch die Zugabe des Normalserums, das meist von einer Ziege stammt, werden nun die elektrisch geladenen
Gewebsstellen besetzt.
5)
Zugabe der Primärantikörper
Die zuvor 1:20 verdünnten Antikörper MIB-1 und 1:40 verdünnten BCL-2Antikörper werden, nach Abtropfen des Normalserums, jeweils mit einem Volumen
von 200 µl auf die Schnitte gebracht. Es folgt nun eine 1-stündige Inkubation.
6)
Auftragen des Zweitantikörpers
Nach Entfernung der überschüssigen Primärantikörper durch Waschen der Schnitte
in PBS-Puffer wird der biotinylierte Zweitantikörper aufgetragen und für 10 Minuten
inkubiert.
7)
Einsatz des Avidin-Biotin-Peroxidase-Komplexes
Durch den folgenden Waschvorgang in PBS-Puffer werden die nicht an den
Prmärantikörper gebundenen biotinylierten Zweitantikörper von den Schnitten
entfernt. Nun werden die Gewebsschnitte für 10 Minuten mit dem Avidin-BiotinPeroxidase-Komplex versehen.
- 40 -
III.
Material und Methode
8)
Zugabe des Chromogens
Um die überschüssigen Avidin-Biotin-Peroxidase-Komplexe zu entfernen, muß sich
nun wiederum ein Auswaschungsvorgang mit PBS-Puffer anschließen. Nun werden
die Schnitte für 15 Minuten mit einem AEC-Chromogen versehen. Dieser Färbeschritt führt schließlich über einen Farbumschlag zur Darstellung positiver AntigenAntikörper-Reaktionen.
9)
Gegenfärbung und Eindecken der Schnitte
Da das entstandene Reaktionsprodukt in Alkohol und organischen Lösungsmitteln
löslich ist, sollten zum Gegenfärben und Eindecken Produkte ohne alkoholische
Basis verwendet werden. Es empfehlen sich daher zur Färbung Mayer´s Hämatoxilin
und zum Eindecken flüssige Glyceringelatine (NADJI, MORALES, 1986). Ebenfalls
sollten die gefärbten Präparate in dunklen Räumen gelagert werden, damit eine
fortschreitende Oxidation des Chromogens vermieden werden kann (BOENISCH,
1989).
III.11. FEHLERQUELLEN
Innerhalb der beschriebenen Schritte besteht die große Gefahr, daß die Schnitte austrocknen oder abschwimmen, wodurch schließlich falsch-negative Ergebnisse entstehen
können (NADJI, MORALES, 1986). Um ein Abschwimmen der Schnitte zu verhindern,
sollten - wie bereits erwähnt - mit Poly-L-Lysin beschichtete Objektträger verwandt
werden. Ebenfalls darf der Schnitt nicht zu dick sein oder zu viel Fettgewebe besitzen.
Weiterhin sollte die Zeit des Trocknens der Schnitte (optimal: über Nacht bei 37 °C)
eingehalten werden. Die für die Austrocknung der Schnitte verantwortliche Hauptquelle ist
die Bearbeitung dieser in der Mikrowelle. Es ist dabei zu beachten, daß der dafür
verwandte Citratpuffer aus Natriumcitrat und Zitronensäure hergestellt wird und dieser die
Schnitte während des Kochvorgangs permanent umgibt.
- 41 -
III.
Material und Methode
III.12. VERWENDUNG VON KONTROLLEN
Zur Überprüfung der korrekten Färbung der in dieser Arbeit zu untersuchenden PankreasKarzinom-Präparate, wurde bei jedem Färbedurchgang mit dem monoklonalen Antikörper
BCL-2 als positive Kontrolle Tonsillengewebe mitgeführt. Als zusätzliche interne positive
Kontrolle dienen die im Pankreasgewebe vorhandenen Lymphocyten bzw. Lymphfollikel.
Durch das Mitführen dieser Kontrollen war es möglich zwischen unspezifischer
Hintergrundreaktion und korrektem Antigennachweis zu unterscheiden.
Im Rahmen der Färbungen mit dem Antikörper MIB-1 wurde jedoch keine positive Kontrolle mitgeführt, da die Karzinome selbst als interne Kontrollen gelten.
Durch Weglassen des Primärantikörpers wurden bei beiden Antikörpern immer negative
Kontrollen mitgeführt.
Zum Abschluß dieses Kapitels nun noch eine ausführliche Übersicht über die einzelnen
Arbeitsschritte der ABC-Methode:
(1)
Aufziehen der Schnitte auf beschichtete Objektträger
(Menzel Super Frost Plus)
(2)
Über Nacht bei 37 °C 10 Brutschrank trocknen lassen
(3)
15-minütiges Einstellen der Präparate in Formalin
(4)
Entparaffinieren : 30min. Xylol
(5)
- 10 min.
100 % Alkohol
- 10 min.
95 % Alkohol
- 5 min.
70 % Alkohol
- 5 min.
50 % Alkohol
- 5 min.
30 % Alkohol
- 5 min.
Aqua dest.
- 10 min.
PBS
Einstellen der Schnitte in Citratpuffer
(9 ml Lösung A, 41ml Lösung B, 450 ml Aqua dest.)
- 42 -
III.
Material und Methode
(6)
15-minütiges Erhitzen in der Mikrowelle bei 100 °C
(7)
Abkühlen der Objektträger für 30 min.
(8)
5 Minuten Waschen in PBS-Puffer
(9)
Einkreisen der Präparate mit einem Fettstift und Objektträger
in eine feuchte Kammer bringen
(10) 25-minütige Inkubation mit 1 % H2O2
zur Blockierung der endogenen Peroxidase
(11) 5 Minuten Waschen in PBS-Puffer
(12) Abtrocknen der Objektträger
(13) 10-minütige Inkubation mit Normalserum (1 - 2 Tropfen)
(14) Normalserum nur abtropfen lassen (keine Waschung)
(15) Auftragen der vorverdünnten (s.o.) Primärantikörper je 200 µl pro Schnitt,
dann Inkubation für 1 Stunde
(16) 5 Minuten Waschen in PBS-Puffer
(17) Abtrocknen der Objektträger
(18) 10-minütige Inkubation mit dem Sekundärantikörper (1 - 2 Tropfen)
[biotinylierter Goat-Anti (Mouse, Rabbit, Guinea, Pig, Rat) IgG]
(19) 5 Minuten Waschen in PBS-Puffer
(20) Abtrocknen der Objektträger
(21) 10 Minuten Inkubation mit Streptavidin- Peroxidase-Konjugat
(1 - 2 Tropfen)
(22) 5 Minuten Waschen in PBS-Puffer
(23) Abtrocknen der Objektträger
(24) 15 Minuten Inkubation mit AEC-Chromogen (Ansatz für 10 Schnitte:
1 ml Aqua dest. + je 1 Tropfen A+B+C), 100 µl pro Schnitt
(25) 10-minütiges Auswaschen der Präparate mit PBS-Puffer,
danach Waschen mit Aqua dest.
(26) Präparate 15 sec. mit Mayers Hämalaun gegenfärben und
in Leitungswasser bläuen
(27) Eindecken der Schnitte mit Kaisers flüssiger Glyceringelatine und
Aufbringen der Deckgläser
(28) mikroskopische Auswertung der Antigen-Antikörper-Reaktion
- 43 -
III.
Material und Methode
III.13
IMMUNHISTOCHEMISCHE BEFUNDE
Abbildung 5:
Immunhistochemische Darstellung des BCL-2- Onkoproteins eines pT2, pN1, pM0, G2
duktalen Adenokarzinoms des exokrinen Pankreas.
Anfärbung mittels des monoklonalen Antikörpers BCL-2 nach der ABC-Methode.
(Originalvergrößerung 400-fach)
- 44 -
III.
Material und Methode
Abbildung 6:
Immunhistochemische Darstellung des proliferationsassoziierten Antigens Ki-67 eines
pT2, pN0, pM0, G2, duktalen Adenokarzinoms des exokrinen Pankreas.
Anfärbung mittels des monoklonalen Antikörpers MIB-1 nach der ABC-Methode.
(Originalvergrößerung 200-fach)
- 45 -
III.
Material und Methode
Abbildung 7:
Immunhistochemische Darstellung des proliferationsassoziierten Antigens Ki-67 eines
pT3, pN1, pM1, G2, duktalen Adenokarzinoms des exokrinen Pankreas.
Anfärbung mittels des monoklonalen Antikörpers MIB-1 nach der ABC-Methode.
(Originalvergrößerung 100-fach)
- 46 -
III.
Material und Methode
Abbildung 8:
Immunhistochemische Darstellung des proliferationsassoziierten Antigens Ki-67 eines
pT2, pN0, pM0, G2, duktalen Adenokarzinoms des exokrinen Pankreas.
Anfärbung mittels des monoklonalen Antikörpers MIB-1 nach der ABC-Methode.
(Originalvergrößerung 200-fach)
- 47 -
III.
Material und Methode
Abbildung 9:
Immunhistochemische Darstellung des proliferationsassoziierten Antigens Ki-67 eines
pT2, pN1, pM0, G2, duktalen Adenokarzinoms des exokrinen Pankreas.
Anfärbung mittels des monoklonalen Antikörpers MIB-1 nach der ABC-Methode.
(Originalvergrößerung 400-fach)
- 48 -
III.
Material und Methode
Abbildung 10:
Immunhistochemische Darstellung des proliferationsassoziierten Antigens Ki-67 eines
pT2, pN1, pM1, G2, duktalen Adenokarzinoms des exokrinen Pankreas.
Anfärbung mittels des monoklonalen Antikörpers MIB-1 nach der ABC-Methode.
(Originalvergrößerung 400-fach)
- 49 -
IV.
ERGEBNISSE
Die untersuchten Adenokarzinome des Pankreasgewebes wurden jeweils hinsichtlich der
Lokalisation, des Alters, der Überlebenszeit (in Tagen), der Therapie (OP bzw. Chemo /
Radiatio) und der aufgetretenen Rezidive eingeteilt. Ebenfalls wurde eine Zuordnung des
Stagings und des Gradings vorgenommen.
Im folgenden Kapitel werden zunächst die allgemeinen pathologisch-anatomischen Daten
des Patientenkollektivs erläutert. Des weiteren wird das immunhistochemische Verhalten
der Antikörper BCl-2 und MIB-1 im Pankreasgewebe den verschiedenen Unterteilungskriterien gegenübergestellt.
Zu Beginn folgt eine Aufstellung der Ergebnisse in Form einer Tabelle.
-50-
IV.
Ergebnisse
- 51 -
IV.
Ergebnisse
IV.1. PATIENTENKOLLEKTIV SOWIE
ALLGEMEINE PATHOLOGISCH-ANATOMISCHE DATEN
In der vorliegenden Arbeit wurden Krankenakten von 23 Patienten ausgewertet, bei denen
im Zeitraum von September 1993 bis Dezember 1996 die klinische Diagnose eines
Pankreastumors gestellt und histologisch gesichert wurde. Daraufhin erfolgte eine
Nachbeobachtungszeit bis Oktober 1997.
Zum Zeitpunkt der Diagnose befand sich der Großteil des Patientenkollektivs bereits in
einem fortgeschrittenen Stadium der Erkrankung. In 61 % der Fälle hatte der Tumor bereits
die Organgrenze überschritten und wurde als T2-Tumor diagnostiziert. Bei 30 % der
Patienten handelte es sich um Tumoren im T3-Stadium. Lediglich in 9 % der Fälle war der
Tumor noch auf das Pankreas begrenzt und konnte als T1-Tumor eingestuft werden. Zum
Zeitpunkt der operativ-histologischen Diagnose hatten 43 % der Patienten noch keine
Lymphknotenmetastasen, wohingegen in 57 % der Fälle eine lymphogene Metastasierung
nachweisbar war. 78 % der Patienten wiesen einen M0-Status auf, das heißt, es konnte ein
fehlender Nachweis für Fernmetastasen erbracht werden, wobei bereits in 22 % der Fälle
eine Metastasierung vor allem in Leber und Knochen diagnostiziert wurde (siehe auch
Abbildung 11). Nach der Einteilung der Patienten in die Stadienklassifizierung der UICC
ließ sich bei 22 % der Patienten ein Stadium I, bei 13 % ein Stadium II und bei 43 % der
Patienten ein Stadium III feststellen. 22 % der Patienten befanden sich bereits zum
Zeitpunkt der Diagnose im IV Stadium (siehe auch Abbildung 12).
Entsprechend der histologischen Differenzierung der Tumoren lag kein Tumor in einem
gut differenzierten Stadium vor. Bereits 96 % der Patienten besaßen mäßig differenzierte
Drüsen, welche dem Differenzierungsgrad G2 entsprechen. In 4 % der Fälle lagen bereits
schlecht differenzierte (= G3) Tumoren vor (siehe auch Abbildung 13).
Von den 23 diagnostizierten Tumoren waren 87 % der Tumoren im Pankreaskopf
lokalisiert, in 4 % der Fälle konnte eine diffuse Lokalisation nachgewiesen werden. Die
restlichen 9 % der Fälle befanden sich in der Papillenregion. Diese Angaben stimmen in
etwa mit den Angaben der Literatur überein.
- 52 -
IV.
Ergebnisse
Die Geschlechtsrelation des untersuchten Patientenkollektivs ist in Abbildung 14
dargestellt. Es bestand ein Verhältnis Männer : Frauen von 1,6 : 1, welches mit der in der
Literatur angegebenen Relation übereinstimmt. In der vorliegenden Arbeit liegt der
Altersdurchschnitt der Patienten mit einem Adenokarzinom bei 66,3 Jahren und stimmt
damit ebenfalls mit den bereits erwähnten Daten überein. Das durchschnittliche Alter der
Frau ist mit 67,7 Jahren höher als das der Männer mit 65,4 Jahren. Die jüngste Frau
erkrankte bei dieser Untersuchung im Alter von 53 Jahren, während das Alter des jüngsten
männlichen Patienten 52 Jahre beträgt. Die älteste Frau erkrankte im Alter von 76 Jahren,
wohingegen der älteste Mann mit 79 Jahren ein Pankreaskarzinom entwickelte. Die
Altersverteilung, grob eingeteilt in drei verschiedene Altersklassen, wird - bezogen auf das
Geschlecht - in Abbildung 14 wiedergegeben.
Betrachtet man die Therapie der in dieser Arbeit vorliegenden Pankreaskarzinome, so
wurden 87 % der Patienten einer Whipple‘schen Operation unterzogen. Bei lediglich zwei
Patienten bestand zusätzlich eine Indikation zur Chemotherapie, ein Patient wurde neben
der Operation zusätzlich bestrahlt. Eine 5-Jahres-Überlebensrate konnte in dem
Untersuchungszeitraum bis zum Oktober 1997 nicht bestimmt werden.
- 53 -
Ergebnisse
Anzahl Patienten
20
15
10
5
0
pT1
pT2
pT3
pN0
pN1
pM0
pM1
Abbildung 11:
Verteilung der Patienten zum Zeitpunkt der Diagnosestellung
nach der TNM-Klassifikation der UICC
60%
Patienten
in %
IV.
43%
40%
22%
20%
22%
13%
0%
St I
St II
St III
Abbildung 12:
Verteilung der Patienten zum Zeitpunkt der Diagnosestellung
nach dem Tumorstadium der UICC
- 54 -
St IV
Ergebnisse
96%
Prozent
100%
50%
4%
0%
0%
G1
G2
G3
Abbildung 13:
Verteilung der Patienten zum Zeitpunkt der Diagnosestellung
nach dem Differenzierungsgrad
Anzahl Patienten
IV.
23
25
20
14
15
10
10
5
4
5
1
6
4
8
9
4 4
0
51-60 Jahre 61-70 Jahre 71-80 Jahre
männlich
Abbildung 14:
Alters- und Geschlechtsverteilung
- 55 -
weiblich
gesamt
gesamt
IV.
Ergebnisse
IV.2.
ERGEBNISSE IM BEZUG ZUM pT-STATUS
Es liegen insgesamt zwei pT1-klassifizierte Tumoren, 14 Karzinome im pT2- und sieben
Karzinome im pT3-Stadium vor.
IV.2.1.
ERGEBNISDARSTELLUNG FÜR DEN ANTIKÖRPER MIB-1
In einem der zwei Karzinome im Tumorstadium pT1 kann in dieser Arbeit eine
Proliferationsaktivität in < 10 % der Tumorzellen nachgewiesen werden (= 50 %). Vier der
14 pT2-klassifizierten Tumoren (= 28,6 %) weisen eine Proliferationsaktivität in 10 - 50 %
der Zellen auf, wohingegen der MIB-1-Nachweis in 35,7 % der Karzinome (5/14) dieses
Tumorstadiums nur in jeweils < 10 % der Tumorzellen gelingt. In einem Tumor der sieben
pT3-klassifizierten Tumoren (= 14,3%) ist in 10 - 50 % der Zellen ein Proliferationsnachweis möglich. 42,85 % der Karzinome (= 3/7) dieses Stadiums dahingegen weisen in
< 10 % der Zellen eine Proliferationsaktivität auf. Die nachfolgende Tabelle 15 gibt die
erwähnten Ergebnisse wieder.
Tabelle 15:
Nachweis der MIB-1-Expression in Korrelation zum pT-Status
Fallzahl
positive
Intensität der MIB-1-Expression
Fälle
+++
++
+
(+)
negativ
Gesamt
23
14
0
5
9
0
9
pT1
2
1
0
0
1
0
1
pT2
14
9
0
4
5
0
5
pT3
7
4
0
1
3
0
3
Zum besseren Verständnis der Tabellen dieses Kapitels werden die Einteilungskriterien für
die Auswertung dieser Arbeit in der folgenden Tabelle 16 nochmals erläutert:
- 56 -
IV.
Ergebnisse
Tabelle 16:
Einteilungskriterien für die Auswertung der Untersuchung
positive
> 50 %
10 - 50 %
< 10 %
Zellkerne
+++
IV.2.2.
++
einzelne
keine
Zellkerne
Zellkerne
+
(+)
-
ERGEBNISDARSTELLUNG FÜR DEN ANTIKÖRPER BCL-2
Bei der Betrachtung der Intensität der BCL-2-Expression sind hinsichtlich der Tumoren im
pT1-Stadium in 50 % (1/2) der Karzinome lediglich vereinzelte Tumorzellen mit einer
BCL-2-Expression zu beobachten. In 21,4 % (3/14) der Adenokarcinome im pT2-Stadium
ist in < 10 % der Tumorzellen der Nachweis des Antiapoptosemarkers BCL-2 möglich. In
den Tumoren, welche ein pT3-Stadium aufweisen, kann keine BCl-2-Expression
nachgewiesen werden (siehe auch Tabelle 17).
Tabelle 17:
Nachweis der BCL-2-Expression in Korrelation zum pT-Status
Fallzahl
Positive
Intensität der BCL-2-Expression
Fälle
+++
++
+
(+)
negativ
Gesamt
23
4
0
0
3
1
19
pT1
2
1
0
0
0
1
1
pT2
14
3
0
0
3
0
11
pT3
7
0
0
0
0
0
7
- 57 -
IV.
Ergebnisse
IV.3.
ERGEBNISSE IM BEZUG ZUM pN-STATUS
Von den insgesamt 23 Karzinomen werden 10 Tumoren als pN0-Stadium und 13 als pN1Stadium klassifiziert.
IV.3.1.
ERGEBNISDARSTELLUNG FÜR DEN ANTIKÖRPER MIB-1
Die Betrachtung der Ergebnisse liefert hinsichtlich der Anzahl der positiv reagierenden
Zellkerne und damit hinsichtlich der Intensität der Proliferation folgendes Bild:
Von den 10 Tumoren im pN0-Stadium ist in 10 % (1/10) der Fälle der Proliferationsnachweis mittels MIB-1 in 10 - 50 % der Zellen möglich. Innerhalb der selben
Klassifizierungsgruppe kann in 40 % (4/10) der Fälle eine Proliferation in jeweils < 10 %
der Tumorzellen nachgewiesen werden. Unter den Tumoren, welche eine lymphogene
Metastasierung aufzeigen, weisen einerseits vier der 13 vorhandenen Karzinome (= 30,75
%) eine Proliferationsaktivität in 10 - 50 % der Tumorzellen auf, anderseits ist in 38,5 % (=
5/13) der Karzinome ein Proliferationsnachweis in < 10 % der Tumorzellen möglich. Die
nachfolgende Tabelle 18 zeigt die Ergebnisse im Detail.
Tabelle 18:
Nachweis der MIB-1-Expression in Korrelation zum pN-Status
Fallzahl
positive
Intensität der MIB-1-Expression
Fälle
+++
++
+
(+)
negativ
Gesamt
23
14
0
5
9
0
9
pN0
10
5
0
1
4
0
5
pN1
13
9
0
4
5
0
4
- 58 -
IV.
Ergebnisse
IV.3.2.
ERGEBNISDARSTELLUNG FÜR DEN ANTIKÖRPER BCL-2
Bezüglich der Intensität der BCL-2-Expression sind in 10 % (= 1/10) der pN0klassifizierten Tumoren vereinzelt positive Tumorzellen zu beobachten, 23,1 % der pN1Karzinome (= 3/13) weisen in < 10 % der Tumorzellen eine Hemmung der Apoptose auf
(siehe auch Tabelle 19).
Tabelle 19:
Nachweis der BCL-2-Expression in Korrelation zum pN-Status
Fallzahl
positive
Intensität der BCL-2-Expression
Fälle
+++
++
+
(+)
negativ
Gesamt
23
4
0
0
3
1
19
pN0
10
1
0
0
0
1
9
pN1
13
3
0
0
3
0
10
- 59 -
IV.
Ergebnisse
IV.4.
ERGEBNISSE IM BEZUG ZUM pM-STATUS
Von den insgesamt 23 Karzinomen befinden sich 18 im pM0-Stadium und fünf im pM1Stadium.
IV.4.1.
ERGEBNISDARSTELLUNG FÜR DEN ANTIKÖRPER MIB-1
Bei der Betrachtung der Intensität der Proliferationsaktivität fällt folgendes Ergebnis auf:
In 22,22 % der pM0- klassifizierten Tumoren (4/18) ist eine Proliferationsaktivität in 10 50 % der Tumorzellen nachweisbar, wohingegen 33,33 % (6/18) der Tumoren dieser
Klassifizierungsgruppe eine Proliferation in < 10 % der Zellen aufweisen. Unter den fünf
Tumoren im pM1-Stadium befindet sich ein Karcinom (= 20 %), welches eine
Proliferation mittels des Antikörpers MIB-1 in 10 - 50 % der Tumorzellen aufzeigt. In 60
% (= 3/5) der Karzinome dieses Stadiums kann ebenfalls eine Proliferation in < 10 % der
Tumorzellen beobachtet werden. Tabelle 20 gibt die einzelnen Ergebnisse wieder.
Tabelle 20:
Nachweis der MIB-1-Expression in Korrelation zum pM-Status
Fallzahl
positive Fälle
Intensität der MIB-1-Expression
+++
++
+
(+)
negativ
Gesamt
23
14
0
5
9
0
9
pM0
18
10
0
4
6
0
8
pM1
5
4
0
1
3
0
1
- 60 -
IV.
Ergebnisse
IV.4.2.
ERGEBNISDARSTELLUNG FÜR DEN ANTIKÖRPER BCL-2
Hinsichtlich der Intensität der BCL-2-Expression ist folgendes Ergebnis zu beobachten:
16,6 % (= 3/18) der Tumoren mit einer pM0-Metastasierung weisen eine BCL-2Expression in < 10 % der Tumorzellen auf. In 20 % (1/5) der Karzinome, welche als pM1
eingestuft wurden, kann lediglich in vereinzelten Tumorzellen eine BCL-2-Expression
nachgewiesen werden. Die einzelnen Ergebnisse werden in Tabelle 21 aufgezeigt.
Tabelle 21:
Nachweis der BCL-2-Expression in Korrelation zum pM-Status
Fallzahl
positive
Intensität der BCL-2-Expression
Ergebnisse
+++
++
+
(+)
negativ
Gesamt
23
4
0
0
3
1
19
pM0
18
3
0
0
3
0
15
pM1
5
1
0
0
0
1
4
Aus den bisherigen Tabellen ist ersichtlich, daß die Expression von MIB-1 und BCL-2 bei
gleichem biologischem Verhalten unterschiedlich in der Anzahl der reagierenden Tumoren
und der Anzahl der positiven Zellkerne ausfällt. Zusammengefaßt ist gegenüber MIB-1 in
14 von 23 Adenokarzinomen (= 61 %) eine Proliferationsreaktion zu beobachten. Neun der
23 Tumoren (= 39 %) weisen allerdings keine Proliferation auf. Bei der Betrachtung der
Intensität der Proliferation ist in fünf Karcinomen (= 22 %) eine Proliferationsaktivität in
10 - 50 % der Tumorzellen und in neun Tumoren (= 39 %) eine Zellproliferation in < 10 %
der Zellen zu beobachten.
Gegenüber dem Antikörper BCL-2 ist in 17 % (4/23) der Fälle eine Hemmung der
Apoptose zu beobachten, in 83 % der Tumoren (19/23) kann keine Reaktion nachgewiesen
werden. Betrachtet man auch hier die Intensität der BCL-2-Reaktion, so fällt zu 13 % eine
Reaktion der Tumoren in < 10 % der Tumorzellen auf. Vier Prozent (=1/23) der
Karzinome zeigt vereinzelte Kernreaktionen auf den Antikörper.
- 61 -
IV.
Ergebnisse
IV. 5.
ERGEBNISSE IM BEZUG ZUM TUMORSTADIUM NACH UICC
Betrachtet man die Stadiengruppierung nach UICC in dieser Arbeit, so liegen fünf der
Adenokarzinome im Stadium I und drei im Stadium II vor. Zehn der Tumoren werden dem
Stadium III, fünf dem Stadium IV zugeordnet.
IV.5.1.
ERGEBNISDARSTELLUNG FÜR DEN ANTIKÖRPER MIB-1
Betrachtet man die Intensität der Proliferation, so zeigt sich folgendes Ergebnis:
60 % (3/5) der Adenokarzinome im Stadium I weisen eine Proliferationsaktivität in < 10 %
der Tumorzellen auf, wohingegen 33,33 % (1/3) der Tumoren im Stadium II eine Reaktion
auf den Antikörper in 10 - 50 % der Zellkerne aufzeigen. Im Stadium III sind in 30 %
(3/10) der Tumoren positive Kernreaktionen in 10 - 50 % der Zellen nachweisbar.
Ebenfalls weisen innerhalb dieses Stadiums 30 % (3/10) der Tumoren eine
Proliferationsaktivität in < 10 % der Zellkerne auf. Schließlich ist im IV. Stadium in 20 %
(1/5) der Tumoren eine Proliferationsaktivität in 10 - 50 % der Zellen und in 60 % (3/5)
der Tumoren eine MIB-1-Expression in < 10 % der Zellkerne zu beobachten. Die folgende
Tabelle 22 gibt eine Übersicht der Ergebnisse wieder:
Tabelle 22:
Nachweis der MIB-1-Expression im Bezug zum Tumorstadium nach UICC
Fallzahl
Positive
Intensität der MIB-1-Expression
Fälle
+++
++
+
(+)
negativ
Gesamt
23
14
0
5
9
0
9
St. I
5
3
0
0
3
0
2
St. II
3
1
0
1
0
0
2
St. III
10
6
0
3
3
0
4
St. IV
5
4
0
1
3
0
1
- 62 -
IV.
Ergebnisse
IV.5.2.
ERGEBNISDARSTELLUNG FÜR DEN ANTIKÖRPER BCL-2
Hinsichtlich der Intensität der BCL-2-Expression sind - bezüglich der verschiedenen
Stadien nach UICC - folgende Ergebnisse innerhalb dieser Arbeit zu beobachten:
In den Stadien I und II ist keine BCL-2-Expression zu verzeichnen. Von den insgesamt
zehn Tumoren des Stadiums III ist in 30 % (3/10) der Karzinome eine BCL-2-Expression
in < 10 % der Tumorzellen zu beobachten. In 20 % (1/5) der fünf Tumoren, welche sich im
Stadium IV befinden, ist eine BCL-2-Expression lediglich in vereinzelten Tumorzellen
nachweisbar (siehe auch Tabelle 23).
Tabelle 23:
Nachweis der BCL-2-Expression im Bezug zur Tumorstadium nach UICC
Fallzahl
Positive
Intensität der BCL-2-Expression
Fälle
+++
++
+
(+)
negativ
Gesamt
23
4
0
0
3
1
19
St.I
5
0
0
0
0
0
5
St.II
3
0
0
0
0
0
3
St.III
10
3
0
0
3
0
7
St.IV
5
1
0
0
0
1
4
- 63 -
IV.
Ergebnisse
IV. 6.
ERGEBNISSE IM BEZUG ZUM DIFFERENZIERUNGSGRAD
Es liegt insgesamt ein Patientenkollektiv von 23 Patienten vor, das 22 mäßig differenzierte
Tumoren (G2) und einen schlecht differenzierten Tumor (G3) aufweist.
IV.6.1.
ERGEBNISDARSTELLUNG FÜR DEN ANTIKÖRPER MIB 1
Die Auswertung der Untersuchung ergibt bei unterschiedlichem Grading der
Adenokarzinome, bezüglich der Intensität der Proliferationsaktivität, für den Antikörper
MIB-1 folgendes Bild:
Unter den mäßig differenzierten Tumoren (G2) ist in 22,7 % der Fälle (= 5/22) eine
Proliferationsaktivität in 10 - 50 % der Tumorzellen nachweisbar, wohingegen acht (= 36,4
%) eine Proliferationsaktivität in < 10 % der Zellen aufweisen. Schließlich zeigt das
vorliegende schlecht differenzierte (G3) Karzinom in < 10 % der Tumorzellen positive
Kernreaktionen bzw. eine Proliferationsaktivität auf. Eine Ergebnisübersicht ist in der
folgenden Tabelle 24 wiedergegeben.
Tabelle 24:
Nachweis der MIB-1-Expression bezüglich der Einteilung der Adenokarzinome
nach dem Differenzierungsgrad
Fallzahl
positive
Fälle
Intensität der MIB-1-Expression
Gesamt
23
14
+++
0
G1
0
0
0
0
0
0
0
G2
22
13
0
5
8
0
9
G3
1
1
0
0
1
0
0
- 64 -
++
5
+
9
(+)
0
negativ
9
IV.
Ergebnisse
IV.6.2.
ERGEBNISDARSTELLUNG FÜR DEN ANTIKÖRPER BCL-2
Für den Antikörper BCL-2 können folgende Ergebnisse bezüglich des Gradings und der
Intensität der BCL-2-Expression beobachtet werden:
In 13,6 % (3/22) der G2-differenzierten Tumoren ist in <10 % der Tumorzellen eine BCL2-Expression nachweisbar. In einem Tumor (= 4,5 %) dieses Differenzierunsgrades sind
vereinzelt positive Kernreaktionen zu beobachten. Im gesamten übrigen Patientengut
dieser Untersuchung können keine weiteren positiven Reaktionen gegenüber dem
Antikörper BCL-2 nachgewiesen werden. (siehe auch Tabelle 25).
Tabelle 25:
Nachweis der BCL 2-Expression bezüglich der Einteilung
der Adenokarzinome nach dem Differenzierungsgrad
Fallzahl
positive
Intensität der BCL2-Expression
Fälle
+++
++
+
(+)
negativ
Gesamt
23
4
0
0
3
1
19
G1
0
0
0
0
0
0
0
G2
22
4
0
0
3
1
18
G3
1
0
0
0
0
0
1
- 65 -
IV.
Ergebnisse
IV.7.
STATISTIK
Tabelle 26:
Statistische Datenanalyse (Prüfung der Abhängigkeit zwischen prognostisch
bedeutsamen Faktoren und einer MIB-1- bzw. einer BCL-2-Expression in
duktalen Pankreaskarzinomen)
Abhängigkeitsbeziehung
Test
cases p (corrected for Ties)
pT-Status versus MIB-1 (%)
Kruskal-Wallis
23
0,4676
pT-Status versus BCL-2 (%)
Kruskal-Wallis
23
0,2841
pN-Status versus MIB-1 (%)
Mann-Whitney U
23
0,2244
pN- Status versus BCL-2 (%)
Mann-Whitney U
23
0,3480
pM-Status versus MIB-1 (%)
Mann-Whitney U
23
0,4892
pM-Status versus BCL-2(%)
Mann-Whitney U
23
1,0000
23
0,8505
23
0,4126
Kruskal-Wallis
23
0,9852
Mann-Whitney U
23
0,0912
23
0,8233
23
0,4416
Tumorstadium n. UICC versus Kruskal-Wallis
MIB-1 (%)
Tumorstadium n. UICC versus Kruskal-Wallis
BCL-2 (%)
pT-Status versus MIB-1
(Intensität 0/+/++)
pT-Status versus BCL-2
(Intensität 0/+)
Tumorstadium n. UICC versus Kruskal-Wallis
MIB-1 (Intensität 0/+/++)
Tumorstadium n. UICC versus Kruskal-Wallis
BCL-2 ( Intensität 0/+)
- 66 -
IV.
Ergebnisse
Tabelle 27:
Durchschnittswerte der immunhistochemischen Untersuchung
in Korrelation zum pT-Status
Ergebnisse für das pT1-Stadium
Nummer
MIB-1e
BCL-2
Durchschnittliche
Ergebnisse für das pT2-Stadium Ergebnisse für das pT3-Stadium
Nummer
MIB-1
positive
Durchschnittliche
Reaktionen pro Gesichtsfeld
1
0,8
0,8
BCL-2
Nummer
positive
MIB-1
Durchschnittliche
Reaktionen pro Gesichtsfeld
1
1,6
0,9
1
3,1
2
2,2
3,1
2
9,0
3
4,3
3,3
3
4,1
4
8,2
4
7,4
5
11,7
6
7,3
7
12,5
8
5,8
9
2,4
0,8
0,8
Mittelwert
6,2
2,43
Mittelwert
5,9
Mittelwert-
0
0
Mittelwert-
3,28
1,023
Mittelwert-
2,3
Prozentual
abweichung
0
0
abweichung
Prozentual
52,9%
42,1%
Prozentual
Mw-
Mw-
Mw-
Abweichung
Abweichung
Abweichung
- 67 -
positive
Reaktionen pro Gesichtsfeld
Mittelwert
Abweichung
BCL-2
38,98%
IV.
Ergebnisse
Tabelle 28:
Durchschnittswerte der immunhistochemischen Untersuchung
in Korrelation zum pN-Status
Ergebnisse für das pN0-Stadium
Nummer
MIB-1
BCL-2
Durchschnittliche
Ergebnisse für das pN1-Stadium
Nummer
positive
0,8
2
0,8
BCL-2
Durchschnittliche
Reaktionen pro Gesichtsfeld
1
MIB-1
positive
Reaktionen pro Gesichtsfeld
1
1,6
0,9
2,2
2
3,1
3,1
3
8,2
3
4,3
3,3
4
5,8
4
11,7
5
7,4
5
7,3
6
9,0
7
12,5
8
4,1
9
2,4
Mittelwert
4,88
0,08
Mittelwert
6,2
2,43
Mittelwert-
2,704
0
Mittelwert-
3,468
1,023
55,94%
42,112%
abweichung
prozentual
abweichung
55,4%
0
prozentual
- 68 -
IV.
Ergebnisse
Tabelle 29:
Durchschnittswerte der immunhistochemischen Untersuchung
in Korrelation zum pM-Status
Ergebnisse für das pM0-Stadium Ergebnisse für das pM1-Stadium
Nummer
MIB-1
BCL-2
Durchschnittliche
Nummer
positive
MIB-1
BCL-2
Durchschnittliche
Reaktionen pro Gesichtsfeld
1
1,6
0,9
1
0,8
2
2,2
3,1
2
3,1
3
4,3
3,3
3
9,0
4
8,2
4
12,5
5
11,7
6
7,3
7
4,1
8
5,8
9
2,4
10
7,4
Mittelwert
5,5
2,43
Mittelwert
6,35
0,8
Mittelwert-
2,61
1,023
Mittelwert-
4,4
0
69,29%
0
abweichung
prozentual
0,8
abweichung
47,45%
42,11%
positive
Reaktionen pro Gesichtsfeld
prozentual
- 69 -
IV.
Ergebnisse
- 70 -
V.
Diskussion
V.
DISKUSSION
V.1.
NACHWEIS DES ANTIGENS KI-67 UND DES BCL-2-ONKOPROTEINS
ALS PROGNOSEFAKTOREN IN DUKTALEN PANKREASKARZINOMEN MIT DEN MONOKLONALEN ANTIKÖRPERN MIB-1 UND BCL-2
Innerhalb der letzten Jahre hat die Anwendung monoklonaler Antikörper zur pathologischen Diagnostik zunehmend an Bedeutung gewonnen. Sie ermöglicht in zahlreichen
Fällen, ergänzend zu konventionellen histologischen Färbungen, die Durchführung einer
besseren Klassifizierung von Gewebeproben. Ebenfalls sind durch dieses Verfahren
klinisch-pathologische Aussagen bezüglich diverser Tumorerkrankungen möglich geworden.
Im Rahmen der Diagnostik maligner Pankreastumoren, die eine verhältnismäßig ungünstige Prognose unter soliden Tumoren besitzen, sind bisher in diesem Zusammenhang eine
Reihe von Onkogenen und Wachstumsfaktoren nachgewiesen worden (siehe Tabelle 10).
In dieser Arbeit wurde mit Hilfe der ABC-Methode - unter Verwendung der monoklonalen
Antikörper MIB-1 und BCL-2 - die Proliferationsaktivität bzw. die Expression von BCL-2
als Hemmer der Apoptose an 23 in Paraffin eingebetteten Adenokarzinomen bezüglich der
Korrelation zu potentiell prognostisch bedeutsamen pathologisch-anatomischen Faktoren
untersucht. Die Auswertung der Ergebnisse dieser Untersuchung wird folgend gemäß der
TNM-Klassifikation,
der
Tumorstadieneinteilung
nach
UICC
und
dem
Differenzierungsgrad aufgeführt und den Angaben der Literatur gegenübergestellt.
Bei der Auswertung soll der Schwerpunkt auf dem biologischen Verhalten der Tumoren in
Korrelation zur Intensität der MIB-1- bzw. BCL-2-Expression liegen. Ausführungen bezüglich einer retrospektiven statistischen Bearbeitung der entsprechenden Daten werden
jeweils ergänzend an die nachfolgenden Kapitel angehängt.
Wie bereits erwähnt, ist insgesamt in 61 % der Adenokarzinome der Nachweis von Ki-67
durch den monoklonalen Antikörper MIB-1 und damit der Nachweis einer Proliferationsaktivität möglich. Folglich weisen 39 % der Tumoren bei dieser Untersuchung keine
- 71 -
V.
Diskussion
Proliferationsaktivität
auf.
Dieses
Ergebnis
ist
überraschend,
da
in
allen
Pankreaskarzinomen der Nachweis einer gewissen Proliferationsaktivität zu erwarten
gewesen wäre. Es ist anzunehmen, daß die Karzinome mit einer negativen MIB-1Reaktion Fixierungsartefakte oder eine Überhitzung bei der Aufbereitung des Materials
erfahren haben, eine Antigenmaskierung erfolgte und sich somit ein negatives
Reaktionsergebnis ergab.
Bei der Betrachtung der Intensität der Proliferation ist eine Zunahme der Proliferationsaktivität mit fortschreitender Tumorprogression zu erwarten.
In insgesamt 17 % der Adenokarzinome ist der Nachweis einer BCL-2-Expression
möglich, während in 83 % keine Expression zu verzeichnen ist. Dieses schlechte
Färbeverhalten des Patientengutes entspricht ebenfalls nicht den Erwartungen an diese
Untersuchung. Eine Auswertung der Ergebnisse ist aufgrund des stark verminderten
Färbeverhaltens der Tumoren auf den Antikörper BCL-2 leider nicht möglich. Auf die
Diskussion der aufgeführten Färbungsergebnisse dieses Antikörpers wird daher in diesem
Kapitel verzichtet. Im Vorhinein wäre auch hier eine Zunahme der Apoptosehemmung,
d.h. ein verlängertes Zellüberleben mit ansteigender Tumorprogression zu erwarten
gewesen. Die extrem schwache Reaktion des Gewebes auf den Antikörper BCL-2 ist hier
ebenfalls am ehesten auf Fixierungsartefakte oder eine Überhitzung des Gewebes während
der Aufbereitung des Materials zurückzuführen. Als weitere Fehlerquelle kommt eine
verminderte Sensitivität der Methode bzw. der Antikörper in Frage.
Spezielle methodische Fehler, welche im Rahmen dieser immunhistochemischen Färbung
unterlaufen konnten, werden in diesem Kapitel noch diskutiert.
V.1.1.
pT-STATUS
Vergleicht man die Ergebnisse der MIB-1-Expression im Bezug zu den verschiedenen pTStadien, so ist wider der Erwartungen - unter Berücksichtigung der geringen Patientenzahl
der einzelnen Stadien - keine Korrelation der Proliferationsintensität mit ansteigendem pTStadium zu verzeichnen. Es ist hier eher eine entgegengesetzte Tendenz zu beobachten. So
ist unter den sich im pT1-Stadium befindlichen Tumoren eine Proliferationsaktivität in <
- 72 -
V.
Diskussion
10 % der Tumorzellen in 50 % der Karzinome nachweisbar. Im pT2-Stadium können 35,7
% der Tumoren mit einer entsprechenden MIB-1-Expression beobachtet werden.
Schließlich gelingt in 42,85 % der Tumoren im pT3-Stadium der Nachweis einer
Proliferation in < 10 % der Tumorzellen. Betrachtet man nun die verschiedenen
Tumorstadien anhand der nachgewiesenen Proliferationsaktivität in 10 - 50 % der
Tumorzellen, so ist diese Proliferationsaktivität in 28,6 % der Tumoren im pT2-Stadium
und in 14,3 % der sich im pT3-Stadium befindlichen Karzinome zu beobachten (siehe auch
Abbildung 15).
100%
Fälle in %
80%
60%
40%
20%
0%
pT 1
pT 2
< 10 %
10 - 50 %
pT 3
negativ
Abbildung 15:
Färbungsintensität von MIB-1
in Korrelation zum pT-Status
Eine ähnliche Studie von GANSAUGE et al. aus dem Jahre 1998 zeigte ebenfalls keine
signifikanten Zusammenhänge zwischen einer Expression des proliferationsassoziierten
Antigens Ki-67 und den verschiedenen pT-Stadien in Pankreaskarzinomen auf. Der
Nachweis einer signifikanten BCL-2-Expression gelang in diesem Zusammenhang
ebenfalls nicht. Diese immunhistochemischen Untersuchungen wurden mit den
monoklonalen Antikörpern MIB-1 und BCL-2 durchgeführt.
- 73 -
V.
Diskussion
Auch MIYAMOTO et al. verzeichneten in ihrer Studie (1999) mittels monoklonaler BCL2-Antikörper keine signifikante Beziehung zwischen einer Expression des BCL-2Protoonkogens und den verschiedenen pT-Stadien.
Betrachtet man im Vergleich dazu die BCL-2-Expression im Tumorgewebe anderer
Organe, so konnte in einer Studie von BUBENDORF et al. im Jahre 1996 in Prostatakarzinomen eine Zunahme der Tumorprogression bzw. des pT-Stadiums in Korrelation mit
einer Zunahme der Anzahl der positiv auf den Antikörper reagierenden Tumoren
beobachtet werden.
Bei der statistischen Überprüfung eines Abhängigkeitsverhältnisses nach Kruskal-Wallis
(siehe Tabelle 26) zwischen den unterschiedlichen pT-Stadien und einer MIB-1- und BCL2-Expression - sowohl bezogen auf die Färbungsintensität als auch auf die allgemeinen
Färbungsergebnisse (pos. / neg.) - konnten keine signifikanten Zusammenhänge
nachgewiesen werden (p > 0,05). Betrachtet man die durchschnittlich positiven Reaktionen
der beiden Antikörper im Bezug zu den drei verschiedenen pT-Stadien, so kann - unter
Berücksichtigung nur eines pT1-Tumors - keine signifikante Korrelation zwischen den
genannten Parametern beobachtet werden (siehe Tabelle 27).
- 74 -
V.
Diskussion
V.1.2.
pN-STATUS
Bei der Betrachtung des Zusammenhanges zwischen der Intensität der MIB-1-Expression
und dem Befall der regionären Lymphknoten ist keine eindeutige Korrelation zwischen der
Intensität der Proliferation und dem Lymphknotenstadium zu beobachten. Von den pN0klassifizierten Tumoren ist zu 40 % eine Proliferationsaktivität in < 10 % der Tumorzellen
zu verzeichnen. Unter den Tumoren, welche bereits eine lymphogene Metastasierung
aufweisen (= pN1), zeigen 38,5 % eine Proliferationsaktivität in < 10 % der Tumorzellen
auf. Eine Proliferationsaktivität in 10 - 50 % der Tumorzellen läßt sich in 10 % der pN0klassifizierten Tumoren und in 30,75 % der pN1-klassifizierten Tumoren nachweisen.
Zwar ist unter den Tumoren, welche eine Proliferationsaktivität in 10 - 50 % der
Tumorzellen aufweisen, ein leichter Anstieg der Anzahl der reagierenden Tumoren mit
einem Anstieg des Lymphknotenstatus zu verzeichnen, von einer eindeutigen Korrelation
kann jedoch aufgrund des kleinen Patientenkollektivs nicht die Rede sein (siehe auch
Abbildung 16).
100%
Fälle in %
75%
50%
25%
0%
pN 0
< 10 %
Abbildung 16:
Färbungsintensität von MIB-1
in Korrelation zum pN-Status
- 75 -
pN 1
10 - 50 %
negativ
V.
Diskussion
In der Literatur werden entsprechend dieser Beobachtung bezüglich einer MIB-1Expression keine Angaben gemacht.
MIYAMOTO et al. konnte in der erwähnten Studie aus dem Jahre 1999 bezüglich einer
BCL-2-Expression in Pankreaskarzinomen ebenfalls keinen signifikanten Zusammenhang
zwischen dem Lymphknotenbefall und einer Apoptosehemmung mittels des Antikörpers
BCL-2 nachweisen.
Betrachtet man auch hier mit Hilfe des Kruskal-Wallis-Tests die statistische Abhängigkeit
zwischen den verschiedenen Stadien der lymphogenen Metastasierung und der MIB-1- und
BCL-2-Expression, so sind bei vorliegendem p > 0,05 jeweils keine signifikanten Unterschiede zu verzeichnen (siehe auch Tabelle 26). Die Berechnung der Durchschnittswerte
der positiven Reaktionen (siehe Tabelle 28) weist bei der Verwendung des Antikörpers
MIB-1 tendenziell - unter Berücksichtigung der Mittelwertabweichung - einen Anstieg des
Durchschnittswertes mit Zunahme des pN-Stadiums auf. So ist eine Zunahme der
durchschnittlich positiven Reaktionen pro Gesichtsfeld von 4,88 in Tumoren ohne
lymphogene Metastasierung auf 6,2 in pN1-klassifizierten Tumoren zu beobachten. Jedoch
kann in diesem Zusammenhang auf Grund von nur 10 pN0-klassifizierten Tumoren und
13 pN1-klassifizierten Tumoren von keinem eindeutigen signifikanten Zusammenhang die
Rede sein.
- 76 -
V.
Diskussion
V.1.3.
pM-STATUS
Ein signifikanter Zusammenhang zwischen einem Anstieg der Proliferationsintensität und
der Zunahme der hämatogenen Metastasierung kann in dieser Arbeit ebenfalls nicht
verzeichnet werden. So weisen von den Tumoren im pM0-Stadium 33,33 % eine
Proliferationsaktivität in < 10 % der Tumorzellen, während 22,22 % der Karzinome eine
Aktivität der Proliferation in 10 - 50 % der Zellen aufzeigen. Betrachtet man nun die pM1klassifizierten Tumoren, so ist in 60 % der Tumoren eine Proliferation in < 10 % der
Zellen und in lediglich 20 % der Karzinome ein Proliferationsnachweis in 10 - 50 % der
Tumorzellen nachweisbar (siehe auch Abbildung 17).
Fälle in %
100%
75%
50%
25%
0%
pM 0
< 10 %
Abbildung 17:
Färbungsintensität von MIB-1
in Korrelation zum pM-Status
- 77 -
pM 1
10 - 50 %
negativ
V.
Diskussion
In der Literatur werden keine Angaben über einen möglichen Zusammenhang zwischen
den Stadien der hämatogenen Metastasierung und dem proliferationsassoziierten Antigen
Ki-67 in Adenokarzinomen des Pankreas gemacht.
In der bereits mehrfach erwähnten Studie von MIYAMOTO et al. (1999) konnte bezüglich
der hämatogenen Metastasierung ebenfalls kein Zusammenhang zu einer BCL-2-Expression in Pankreaskarzinomen festgestellt werden.
Die aus Tabelle 26 entnehmbare nach Mann-Whitney U geprüfte Abhängigkeitsbeziehung
zwischen der hämatogenen Metastasierung und der MIB-1- und BCL-2-Expression zeigt
ebenfalls keine signifikanten Zusammenhänge der Parameter auf (p > 0,05). Bei
Berechnung der Durchschnittswerte der jeweiligen positiven Reaktionen auf die
Antikörper ist unter Berücksichtigung der Mittelwertabweichung eine geringgradige
Zunahme des MIB-1-Mittelwertes mit Zunahme des Stadiums der hämatogenen
Metastasierung zu verzeichnen (pM0: 5,5 → pM1: 6,35). Von einer signifikanten
Korrelation zwischen der hämatogenen Metastasierung und einer MIB-1-Expression kann
jedoch aufgrund der niedrigen Anzahl von fünf Patienten unter den pM1-klassifizierten
Tumoren nicht die Rede sein (siehe auch Tabelle 29).
- 78 -
V.
Diskussion
V.1.4.
TUMORSTADIUM NACH UICC
Betrachtet man die Intensität der MIB-1-Expression bezüglich der Tumorstadieneinteilung
nach UICC dieses histologischen Patientengutes, so ist auch hier wider der Erwartung
keine Zunahme der Antikörper-Intensität mit Zunahme des Stadiums zu beobachten. So
kann eine Proliferationsaktivität in < 10 % der Tumorzellen innerhalb des Stadium I in
60 % der Karzinome, im Stadium III in 30 % der Tumoren verzeichnet werden. Schließlich
weisen wiederum 60 % der Tumoren im Stadium IV eine Proliferationsaktivität in < 10 %
der Tumorzellen auf. Von den Tumoren, welche eine MIB-1-Expression in 10 - 50 % der
Tumorzellen aufzeigen sind 33,33 % dem Stadium II zuzuordnen. Im Stadium III kann
ebenfalls in 30 % der Tumoren eine Proliferationsaktivität in 10 - 50 % der Tumorzellen
nachgewiesen werden. Schließlich ist eine entsprechende MIB-1-Expression im Stadium
IV in 20 % der Karzinome nachweisbar. Eine Korrelation zwischen einer MIB-1Expression und den verschiedenen Tumorstadien nach UICC kann also folglich in dieser
Arbeit nicht nachgewiesen werden (siehe auch Abbildung 18).
Fälle in %
100%
75%
50%
25%
0%
St I
St II
< 10 %
10 - 50 %
Abbildung 18:
Färbungsintensität von MIB-1
in Korrelation zu den Tumorstadien nach UICC
- 79 -
St III
St IV
negativ
V.
Diskussion
Sowohl GANSAUGE et al. (1998), als auch LUNDIN et al. (1995) machten ähnliche
Beobachtungen.
Sie
konnten
in
ihren
Studien
ebenfalls
keinen
signifikanten
Zusammenhang zwischen den Tumorstadien nach UICC und der Expression des
proliferationsassoziierten Antigens Ki-67 aufweisen.
In einer Studie von GENTIL-PERET (1998), welche mit neuroendokrinen Tumoren des
Pankreas durchgeführt wurde, korrelierte jedoch die Proliferationsaktivität mit der
Stadieneinteilung nach UICC. Es konnte mittels monoklonaler Antikörper MIB-1 eine
Zunahme der Anzahl der positiv reagierenden Tumoren mit Zunahme der Stadien
beobachtet werden. Die Färbungsintensität blieb hier unbeachtet.
Studienergebnisse bezüglich einer Korrelation zwischen einer BCL-2-Expression in
Pankreaskarzinomen und den verschiedenen Tumorstadien nach UICC konnten
GANSAUGE et al. (1998) ebenfalls nicht nachweisen. Zu entsprechend ähnlichen
Ergebnissen sind MIYAMOTO et al. im Jahre 1999 gekommen.
Eine statistische Abhängigkeitsprüfung zwischen den verschiedenen Tumorstadien und
einer allgemeinen MIB-1- und BCL-2-Expression (pos. / neg.) bzw. einer Expression unter
Berücksichtigung der Färbungsintensität mittels des Kruskal-Wallis-Tests (siehe Tabelle 26) ergibt keine signifikanten Zusammenhänge der genannten Parameter (p > 0,05).
Auch der Vergleich, der in Tabelle 30 wiedergegebenen durchschnittlichen Werte positiver
Reaktionen pro Gesichtsfeld beider Antikörper - bezogen auf die unterschiedlichen Stadien
nach UICC - zeigt unter Berücksichtigung der niedrigen Fallzahlen pro Stadium keine
signifikante Korrelationen auf.
- 80 -
V.
Diskussion
V.1.5.
DIFFERENZIERUNGSGRAD
Betrachtet man nun die erwähnten Ergebnisse der Intensität der Proliferation bzw. der
MIB-1-Expression bezüglich des Gradings, so ist - unter Berücksichtigung fehlender G1und nur eines G3-Tumors - kein Zusammenhang zwischen einer erwartungsgemäßen
Zunahme der Intensität der Proliferationsaktivität mit Zunahme des Differenzierungsgrades
festzustellen. So weisen unter den Tumoren im G2-Stadium 36,4 % eine Proliferationsaktivität in < 10 % der Tumorzellen und 22,7 % eine Proliferation in 10 - 50 % der
Tumorzellen auf. In dem einzig vorhandenen Tumor des G3-Stadiums ist in < 10% der
Tumorzellen eine MIB-1-Expression nachweisbar (siehe auch Abbildung 19)
Fälle in %
100%
75%
50%
25%
0%
G2
< 10 %
Abbildung 19:
Färbungsintensität von MIB-1
in Korrelation zum Differenzierungsgrad
- 81 -
G3
10 - 50 %
negativ
V.
Diskussion
In einer ähnlichen Studie von LUNDIN et al. (1995) wurde ebenfalls keine Wechselbeziehung zwischen dem Nachweis des proliferationsassoziierten Antigens Ki-67 und dem
Grading gefunden (der Nachweis erfolgte hier mittels polyklonaler Ki-67-Antikörper).
Auch im Jahre 1998 konnten GANSAUGE et al. und MAKINEN et al. keine signifikanten
Zusammenhänge der genannten Parameter mittels monoklonaler Antikörper MIB-1
nachweisen.
In der bereits erwähnten Studie von GENTIL-PERET (1998) wurde ebenfalls in
neuroendokrinen
Tumoren
des
Pankreas
eine
Korrelation
zwischen
dem
Differenzierungsgrad und der Proliferation nachgewiesen. Es konnte eine Zunahme der
Anzahl der positiv reagierenden Tumoren mit Zunahme des Differenzierungsgrades
verzeichnet werden.
Bezüglich einer BCL-2-Expression konnte in der von MIYAMOTO et al. veröffentlichten
Studie aus dem Jahre 1999 ebenfalls keine Korrelation zwischen dem Grading und einer
BCL-2-Expression in duktalen Pankreaskarzinomen nachgewiesen werden. Zu dem
gleichen Ergebnis kamen sowohl MAKINEN et al. als auch GANSAUGE et al. im Jahre
1998.
Sowohl die Berechnung der Durchschnittswerte der MIB-1- und BCL-2-Expression im
Bezug zu den unterschiedlichen Differenzierungsgraden als auch eine Abhängigkeitsprüfung ist unter Berücksichtigung nur eines G3-differenzierten Tumors von statistischer
Seite nicht sinnvoll.
- 82 -
V.
Diskussion
V.1.6.
ÜBERLEBENSZEIT
Auswertungen der Ergebnisse zur Überlebenszeit bzw. eine graphische Darstellung der
Überlebenskurve nach Kaplan-Meier im Bezug zur MIB-1- und BCL-2- Expression ist
aufgrund des kleinen Patientenkollektivs von 23 Patienten nicht sinnvoll.
Jedoch sind in einigen Veröffentlichungen folgende Beobachtungen bezüglich einer BCL2- bzw. MIB-1-Expression im Zusammenhang mit der Überlebenszeit gemacht worden:
In einer Studie von LUNDIN et al. aus dem Jahre 1995 wurden bei Untersuchungen des
Ki-67-Antigens im Zusammenhang mit der Überlebenszeit duktaler Pankreaskarzinome
folgende prognostisch bedeutsame Beobachtungen gemacht: ein längeres Überleben
korrelierte mit einer positiven Kernreaktion bzw. Proliferation in < 50 % der Tumorzellen,
analog dazu korrelierte eine positive Kernreaktion in > 50 % der Tumorzellen mit einer
geringeren Überlebenszeit. Allerdings wurde diese Untersuchung im Gegensatz zur
vorliegenden Arbeit mit polyklonalen Ki-67-Antikörpern durchgeführt. Diese rufen im
Vergleich zu den hier verwendeten monoklonalen MIB-1-Antikörpern sowohl eine
intensivere Färbung als auch eine höhere Anzahl an Kernfärbungen hervor.
Vergleichbare Beobachtungen machten FERRARA et al. im Jahre 1999. In ihrer Arbeit
konnte eine signifikante Ki-67-Expression mittels monoklonaler Ki-67-Antikörper in
Pankreaskarzinomen als Prognosefaktor im Zusammenhang mit der Überlebenszeit
nachgewiesen werden, d.h. in den Tumoren der Patienten mit einer verminderten
Überlebenszeit reagierten vermehrt Tumorzellen mit einer erhöhten Intensität auf den
Antikörper. Allerdings wurde diese Untersuchung ebenfalls nur mit einem Kollektiv von
23 Patienten durchgeführt.
In den erwähnten Studien von MAKINEN et al. aus dem Jahre 1998 und GANSAUGE et
al. (1998) konnte allerdings kein signifikanter Zusammenhang zwischen einer Ki-67Expression und dem Überleben der Erkrankung verzeichnet werden.
Entsprechend dieser Untersuchungen wurde ebenfalls im Jahre 1996 von VAIDYA et al.
ein Zusammenhang zwischen der Überlebenszeit und dem Ki-67-Antigen mittels
monoklonaler MIB-1- Antikörper nachgewiesen (Patienten der Tumoren mit einer
- 83 -
V.
Diskussion
vermehrten Expression wiesen eine schlechtere Prognose und damit eine verminderte
Überlebenszeit auf). Jedoch wurde diese Studie mit Karzinomen der Papilla Vateri
durchgeführt.
Betrachtet man dahingegen die Proliferationsaktivität in neuroendokrinen Tumoren des
Pankreas, so wurde in der erwähnten Studie von GENTIL-PERET et al. aus dem Jahre
1998 ebenfalls eine Abnahme der Überlebenszeit mit Zunahme der Anzahl der positiv
reagierenden Tumoren nachgewiesen.
Weiterhin berichten zahlreiche Studien ebenfalls über eine Ki-67-Expression als
Prognosefaktor bezüglich maligner Tumorerkrankungen anderer Organe. Dazu zählen zum
Beispiel Karzinome der Brust (WINTZER et al., 1991), der Lunge (TUNGEKAR et al.,
1991), des Magens (KAKEJI et al., 1991), der Prostata (SADI et al., 1991), der Niere
(DELAHUNT et al., 1995), Melanome (SMOLLE et al., 1992) und Non-HodgkinLymphome (GROGAN et al., 1988).
Bezüglich einer BCL-2-Expression in Korrelation mit der Überlebenszeit wurde in den
erwähnten Studien von FRIESS et al. (1998) und GANSAUGE et al. (1998) kein
Zusammenhang nachgewiesen.
In einer Studie von MAKINEN et al (1998) konnte ebenfalls keine signifikante Aussage
bezüglich der Korrelation einer BCL-2-Expression und der Überlebenszeit der Erkrankung
gemacht werden. Jedoch wurde in dieser Studie unter Berücksichtigung positiver Kern und
Zytoplasmaanteile
den
BCL-2-positiven
Pankreaskarzinomen
eine
verminderte
Aggressivität zugesprochen und damit der Verdacht auf eine günstigere Prognose der
Erkrankung geäußert.
Betrachtet man nun abschließend die BCL-2-Expression innerhalb von Tumoren anderer
Organe, so berichteten BINDER et al. bereits im Jahre 1995 über einen signifikanten
Zusammenhang zwischen einer BCL-2-Expression in malignen Tumorzellen der Brust und
einer günstigeren Prognose der Erkrankung. Dieser Zusammenhang wurde ebenfalls
bezüglich
Ovarialkarzinomen
(HEROD
et
al.,
1996)
Bronchialkarzinome (PEZZELLA et al., 1993) beobachtet.
- 84 -
und
nicht
kleinzelliger
V.
V.2.
Diskussion
METHODIK
Betrachtet man allgemein die Ergebnisse dieser immunhistochemischen Untersuchung, so
fällt - wie bereits erwähnt - wider der Erwartung sowohl bezüglich der MIB-1-Expression
als auch der BCL-2-Expression ein verminderter Färbungsnachweis auf.
In lediglich 17 % des Tumorgewebes der Pankreaskarzinome ist eine BCL-2-Expression
zu verzeichnen. Ebenfalls kann bei der Betrachtung der Intensität der BCL-2-Expression
kein Tumor mit einem Antiapoptosenachweis sowohl in > 50 % Tumorzellen als auch in
10 - 50 % der Zellen verzeichnet werden. Auf eine Auswertung der Ergebnisse wurde also,
wie bereits erwähnt, aufgrund des extrem verminderten Färbeverhaltens des Antikörpers
BCL-2 in duktalen Pankreaskarzinomen in diesem Kapitel verzichtet.
In den hierzu erwähnten verschiedenen Literaturbeispielen der letzten Jahre wurden
vergleichsweise ähnliche Untersuchungen mittels des Antikörpers BCL-2 in Karzinomen
des Pankreasgewebes durchgeführt. Zusammengefaßt konnten in diesen Arbeiten- wie
auch in dieser Untersuchung- ebenfalls geringe Ansprechraten des Tumorgewebes auf den
Antikörper verzeichnet werden (siehe Tabelle 31). Beobachtungen bezüglich einer
eindeutigen signifikanten Korrelation zwischen einer BCL-2-Expression und dem
biologischen Tumorverhalten duktaler Pankreaskarzinome wurden in den erwähnten
Veröffentlichungen ebenfalls nicht gemacht.
Bei der Betrachtung der Proliferationsaktivität mittels des Antikörpers MIB-1 ist allgemein
in 61 % der Fälle eine Proliferation zu beobachten, welche zu 39 % ebenfalls entgegen
aller Erwartung nicht nachweisbar ist. Auch ist hier bei der Auszählung der positiven
Kernreaktionen keine Proliferationsaktivität in > 50 % der Tumorzellen zu beobachten. Die
in diesem Kapitel zum Vergleich herangezogenen Studienergebnisse der letzten Jahre
basieren auf insgesamt besseren Ansprechraten des Pankreasgewebes auf den Antikörper
MIB-1 (siehe auch Tabelle 31). Allerdings konnte in den erwähnten Literaturbeispielen,
bis auf die erwähnten Beobachtungen bezüglich der Überlebenszeit, ebenfalls keine
signifikante Korrelation zwischen pathologisch-anatomischen Parametern und der
Proliferation des Pankreasgewebes beobachtet werden.
- 85 -
V.
Diskussion
Es stellt sich nun die Frage, aus welchen Gründen im Tumorgewebe des Pankreas, welches
erwartungsgemäß sowohl eine hohe Proliferationsrate als auch eine vermehrte Hemmung
der Apoptose aufweisen sollte, lediglich in 61 % der Fälle eine MIB-1- und in nur 17 %
eine BCL-2-Expression nachweisbar ist. Eine mögliche Begründung für den unterschiedlichen Ausfall des Färbeverhaltens von in Formalin fixierten Geweben kann in der
Methodik der Gewebefixierung und der Gewebeeinbettung liegen. Als besonders kritische
Schritte im Arbeitsablauf der immunhistologischen Färbungen sind daher die Fixation und
die Paraffineinbettung zu betrachten (FISHER et al., 1994). Nach BOURNE (1983) muß
ein Antigen vorhanden, fixiert und für den Primärantikörper zugänglich sein. Ist ein
Antigen nicht fixiert, so wird es aus dem Gewebe ausgewaschen und ist für eine
Anfärbung nicht mehr zugänglich. Anderseits entstehen durch Überfixierung Probleme wie
Maskierung und Denaturierung des Antigens. Eine entsprechende Kontrolle des
Fixationsschrittes ist für den Untersucher schwierig, da die meisten Gewebeproben bereits
noch am Entnahmeort fixiert und erst danach der untersuchenden Person zugängig ist.
Ferner können später bei dem Schritt der Paraffineinbettung des fixierten Gewebes durch
zu hohe Temperaturen Antigenstrukturen des nachzuweisenden Proteins zerstört werden
(FISHER et al., 1994). Zusammengefaßt können nach BOURNE (1983) durch folgende
Fehler unspezifische Färbereaktionen entstehen:
Ö
Ö
Ö
Ö
Ö
Ö
Ö
Ö
Fehler im Bereich der Fixation
Nekrotisches und gequetschtes Material
Mangelnde Ausschaltung der endogenen Peroxidaseaktivität
Nicht optimale Antikörperverdünnung
Unvollständige Entfernung von Paraffin
Unspezifische Bindung von Protein
Beschichtungssubstanzen der Objektträger
Unzureichendes Waschen zwischen den einzelnen Inkubationsschritten
Abgesehen von den oben beschriebenen Fehlern zum Zeitpunkt der Materialgewinnung
können für jeden Antikörper dieser Arbeit - trotz mangelnden Färbeverhaltens methodische Fehler durch die Mitführung und Bewertung von positiven und negativen
Kontrollen weitgehend ausgeschlossen werden
- 86 -
V.
Diskussion
Weitere Aussagen immunhistochemischer Studien bezüglich einer BCL-2- und Ki-67Expression seien nun noch ergänzend erwähnt:
In einer Studie von MIYAMOTO et al. aus dem Jahre 1999 gelang der Nachweis des BCL2-Protoonkogens in 23 % der Fälle der invasiv-duktalen Adenokarzinome des Pankreas.
Neben diesem Ergebnis wurden jedoch von MIYAMOTO in weiteren immuhistochemischen Untersuchungen weitaus bessere Färbungsergebnisse bezüglich weiterer
apoptosehemmender Proteine BCL-XL und MCL-1 der BCL-2-Familie in Pankreaskarzinomen nachgewiesen. MIYAMOTO berichtete über eine mögliche Imbalance
zwischen antiapoptotischer und proapoptotischer Proteine der BCL-Familie als beeinflussender Faktor für die Entstehung von Adenokarcinomen des Pankreas. Eine
signifikante Korrelation bezüglich klinisch-pathologischer Parameter wiesen diese jedoch
nicht auf.
ZHAO et al. berichteten 2001 über einen immunhistochemischen Nachweis des
zellproliferationsassoziierten Antigens Ki-67 mittels monoklonaler Ki-67-Antikörper und
bezeichneten diese als sinnvollen Indikator malignen Potentials in mucinös-cystischen
Tumoren des Pankreas.
Abschließend soll auf die schwierige Vergleichbarkeit der zu diesem Thema
durchgeführten und veröffentlichten Untersuchungen hingewiesen werden. Vor allem
variiert die Zahl der untersuchten Fälle zwischen 22 und 133. Ebenso sind die Art der
Einbettung, die Konzentration und Art der Antikörper, die Durchführung der Färbungen
und die Kriterien der Auswertung der Reaktionen sehr unterschiedlich. Tabelle 31 gibt
folgend eine Übersicht über die wesentlichen Arbeiten:
- 87 -
V.
Diskussion
Tabelle 31:
Untersuchungsergebnisse verschiedener Studien der letzten Jahre
Untersucher
Jahr
Gewebe
Einbettung Antikörper
Fälle
positiv
LUNDIN et al.
1995
Adenokarzinome
Paraffin
133
87%
60
28%
82
55%
82
69%
64
52%
74
80%
22
64%
30
23%
Ki-67
(polyklonal)
FRIESS et al.
1998
Adenokarzinome
Paraffin
BCL-2
(monoklonal)
GANSAUGE et al.
1998
Adenokarzinome
Paraffin
BCL-2
(monoklonal)
MIB-1
(monoklonal)
MAKINEN et al.
1998
Adenokarzinome
Paraffin
BCL-2
(monoklonal)
MIB-1
(monoklonal)
FERRARA
1999
Adenokarzinome
Paraffin
Ki-67
(monoklonal)
MIYAMOTO et al.
1999
Adenokarzinome
Paraffin
BCL-2
(monoklonal)
EIGENE
2001
Adenokarzinome
UNTERSUCHUNG
Paraffin
BCL-2
23
17%
23
61%
(monoklonal)
MIB-1
(monoklonal)
In dieser Studie fand sowohl die BCL-2-Expression als auch die Ki-67-Expression als
Prognosefaktor für das duktale Adenokarzinom des exokrinen Pankreas keine
Verwendung. Ebenfalls erfüllen die Ergebnisse nicht die an diese Arbeit gestellten
Erwartungen. Dies mag neben den erwähnten Fehlerquellen während der Aufbereitung des
Materials auch an dem sehr kleinen Patientenkollektiv von nur 23 Patienten liegen. Die
statistische Aussagekraft eines kleinen Kollektivs ist demzufolge als kritischer zu
betrachten als die Aussagen von meist recht groß angelegten Untersuchungen mit über
100 Patienten in den Literaturangaben.
- 88 -
VI.
VI.
Zusammenfassung
ZUSAMMENFASSUNG
Das Pankreaskarzinom steht bei weiter steigender Inzidenz an dritter Stelle unter den
Karzinomen des Magen-Darm-Traktes mit unverändert schlechter Prognose (MÜLLER et
al., 2000). Da die operative Tumorresektion zur Zeit das einzige kurative Therapiekonzept
darstellt, muß das Hauptaugenmerk auf die Früherkennung des Pankreaskarzinoms gelegt
werden. Neben verbesserten bildgebenden Verfahren und der konventionellen histologischen Diagnostik haben - wie auch bei diversen anderen Tumorerkrankungen - immunhistochemische Untersuchungen im Rahmen der Diagnostik und Prognose zunehmend an
Bedeutung gewonnen. Ziel dieser Arbeit war es - anhand histologisch untersuchtem in
Paraffin eingebettetem Tumorgewebe aus tubulären duktalen Adenokarzinomen des
Pankreas - die Korrelation zweier wichtiger Proteine der Tumorgenese zu potentiell
prognostisch bedeutsamen pathologisch-anatomischen Faktoren nachzuweisen. Dazu
wurden an Operationspräparaten von 23 Patienten mit duktalen Pankreaskarzinomen
immunhistochemische Untersuchungen mittels der ABC-Methode unter der Verwendung
von monoklonalen Mausantikörpern MIB-1 und BCL-2 durchgeführt und der TNMKlassifikation, der Stadieneinteilung nach UICC und dem Grading gegenübergestellt.
Mittels des MIB-1 Antikörpers ist es möglich das Ki-67-Antigen nachzuweisen, welches
als Proliferationsmarker gilt. Über Färbungen mit dem BCL-2-Antikörper wird das sogenannte BCL-2-Protoonkogen nachgewiesen, welches die Rolle des Gegenspielers zum
programmierten Zelltod übernimmt und damit längeres Zellüberleben ermöglicht.
Insgesamt fällt bei dieser Untersuchung sowohl ein vermindertes Färbeverhalten des
Antikörpers BCL-2 (4/23) als auch des Antikörpers MIB-1 (14/23) gegenüber dem
Tumorgewebe der Pankreaskarzinome auf.
Eine Auswertung der Ergebnisse der Färbung mittels des Antikörpers BCL-2 ist in dieser
Arbeit nicht möglich gewesen. Dies ist einerseits auf Fehler während der Aufbereitung des
Materials zurückzuführen, anderseits ist eine verminderte Sensitivität der Methode und des
Antikörpers möglich.
- 89 -
VI.
Zusammenfassung
Der zweite Untersuchungsabschnitt dieser Arbeit umfaßte wie bereits erwähnt den Versuch
des Nachweises der Proliferationsaktivität mittels des Antikörpers MIB-1. Jedoch konnte
auch hier lediglich eine MIB-1-Expression in insgesamt 61 % der Pankreaskarzinome
nachgewiesen werden. Eine signifikante Korrelation zwischen der Intensität der
Proliferationsaktivität und den erwähnten Parametern konnte ebenfalls nicht verzeichnet
werden. Jedoch ist der auffällig verminderte Nachweis der Proliferationsaktivität innerhalb
des Tumorgewebes auch hier auf mögliche Fehler während des Vorganges der Fixation
oder der Hitzebehandlung des Gewebes zurückzuführen.
Somit fand in dieser Studie der Nachweis von BCL-2 und Ki-67 keine Verwendung als
Prognosefaktor für das duktale Adenokarzinom des exokrinen Pankreas. Dies mag neben
den erwähnten Problemen während der Aufbereitung des Materials ebenfalls an der
Durchführung der Untersuchung mit einem sehr kleinen Patientenkollektiv von nur
23 Patienten liegen.
- 90 -
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VIII. Danksagungen
VIII. DANKSAGUNGEN
Meinem Doktorvater Prof. Dr. med. S. Philippou danke ich herzlich für die Geduld und
Unterstützung bei der Durchführung dieser Arbeit sowie für die Anfertigung der
Abbildungen.
Bei Herrn Prof. Dr. med. K. Morgenroth möchte ich mich ebenfalls für die mir für die
Durchführung meiner Arbeit zur Verfügung gestellten Materialien und Geräte im Institut
für Pathologie der Medizinischen Fakultät der Ruhr-Universität Bochum bedanken.
Mein Dank gilt weiterhin meinem Schwager, Herrn Dr. Lars Rüsberg, der mir tatkräftig bei
der Überarbeitung dieser Arbeit und der Überwindung technischer Tücken zur Seite stand.
- 105 -
IX.
Lebenslauf
IX.
LEBENSLAUF
Kerstin Peres
Girondelle 103
44799 Bochum
Telefon 0234/380271
Geburtstag
Geburtstag
Familienstand
19.2.1971
Bochum
ledig
Schulausbildung
1977-1981
Grundschule Auf dem alten Kamp, Bochum
1981-1990
Schiller-Schule, Gymnasium, Bochum
Abschluß: Allgemeine Hochschulreife
1990-1992
Ausbildung zur Medizinisch-Technischen-Assistentin,
MTA-Schule Bergmannsheil, Bochum
Abschluß: Staatlich geprüfte Medizinisch-Technische
Laborassistentin
Berufsausbildung
Berufliche Tätigkeiten
12/1992
- 10/1993
Laborpraxis Dr. Scharmann, Arzt für Labormedizin,
Mikrobiologie und Infektionsepidemiologie, Bochum
Tätigkeiten während des Studiums
1995
stationäre Aushilfstätigkeit
- 1997
im St.Elisabeth-Hospital-gGmbH, Bochum
1997
- 8/2000
Nachtdienste im Zentrallabor des
Marienhospitals in Herne
1993-1999
Ruhr-Universität Bochum
8/1995
Ärztliche Vorprüfung
8/1996
Erster Abschnitt der Ärztlichen Prüfung
4/1999
Zweiter Abschnitt der Ärztlichen Prüfung
4/1999
- 3/2000
Praktisches Jahr,
Augusta Krankenanstalten, Bochum
5/2000
Dritter Abschnitt der Arztlichen Prüfung
8/2000
Ärztin im Praktikum
in der Abteilung für Anästhesiologie
und Operative Intensivmedizin
in der Augusta Krankenanstalt Bochum
Studium
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