Abstract Peres Kerstin Immunhistochemischer Nachweis des zellproliferationsassoziierten Antigens Ki-67 und des BCL-2-Protoonkogens als Prognosefaktoren in duktalen Adenokarzinomen des exokrinen Pankreas Problem: Ziel dieser Arbeit war es - anhand histologisch untersuchtem in Paraffin eingebettetem Tumorgewebe aus tubulären, duktalen Adenokarzinomen des Pankreas - die Korrelation zweier wichtiger Proteine der Tumorgenese zu potentiell prognostisch bedeutsamen pathologisch-anatomischen Faktoren nachzuweisen. Methode: Es wurden an Operationspräparaten von 23 Patienten mit duktalen Pankreaskarzinomen immunhistochemische Untersuchungen mittels der ABCMethode unter der Verwendung von monoklonalen Mausantikörpern MIB-1 und BCL-2 durchgeführt und der TNM-Klassifikation, der Stadieneinteilung nach UICC und dem Grading gegenübergestellt. Mittels des MIB-1-Antikörpers ist es möglich, das Ki-67-Antigen nachzuweisen, welches als Proliferationsmarker gilt. Über Färbungen mit dem BCL-2-Antikörper wird das sogenannte BCL-2-Protoonkogen nachgewiesen, welches die Rolle des Gegenspielers zum programmierten Zelltod übernimmt und damit längeres Zellüberleben ermöglicht. Ergebnis: Es fällt bei dieser Untersuchung sowohl ein vermindertes Färbeverhalten des Antikörpers BCL-2 (4/23) als auch des Antikörpers MIB-1 (14/23) gegenüber dem Tumorgewebe der Pankreaskarzinome auf. Diskussion: Eine Auswertung der Ergebnisse der Färbung mittels des Antikörpers BCL-2 ist in dieser Arbeit nicht möglich gewesen. Dies ist einerseits auf Fehler während der Aufbereitung des Materials zurückzuführen, anderseits ist eine verminderte Sensitivität der Methode und des Antikörpers möglich. Der zweite Untersuchungsabschnitt dieser Arbeit umfaßte den Versuch des Nachweises der Proliferationsaktivität mittels des Antikörpers MIB-1. Jedoch konnte auch hier lediglich eine MIB-1-Expression in insgesamt 61 % der Pankreaskarzinome nachgewiesen werden. Eine signifikante Korrelation zwischen der Intensität der Proliferationsaktivität und den erwähnten Parametern konnte nicht verzeichnet werden. Somit fand zumindest in dieser Studie der Nachweis von BCL-2 und Ki-67 unter Berücksichtigung der geringen Patientenzahl keine Verwendung als Prognosefaktor für das duktale Adenokarzinom des exokrinen Pankreas. Ruhr-Universität Bochum Prof. Dr. med. Stathis Philippou Augusta-Kranken-Anstalt Bochum Institut für Pathologie Immunhistochemischer Nachweis des zellproliferationsassoziierten Antigens Ki-67 und des BCL-2-Protoonkogens als Prognosefaktoren in duktalen Pankreaskarzinomen des exokrinen Pankreas Inaugural- Dissertation zur Erlangung des Doktorgrades der Medizin einer Hohen Medizinischen Fakultät der Ruhr-Universität Bochum vorgelegt von Kerstin Peres aus Bochum 2002 Dekan: Prof. Dr. med. G. Muhr Referent: Prof. Dr. med. Stathis Philippou Korreferent: Tag der mündlichen Prüfung: 22. Oktober 2002 FÜR MEINE ELTERN Inhaltsverzeichnis INHALTSVERZEICHNIS I. EINLEITUNG UND FRAGESTELLUNG 1 II. VORBEMERKUNGEN 2 II.1. Allgemeine Klassifikation der Pankreastumoren 2 II.2. Die malignen Tumoren des exokrinen Pankreas 4 II.2.1. Ätiologische Aspekte des Pankreaskarzinoms 5 II.2.2. Pathogenese des Pankreaskarzinoms 5 II.2.3. Inzidenz des Pankreaskarzinoms 7 II.2.4. Geschlechts–und Altersverteilung des Pankreaskarzinoms 7 II.2.5. Lokalisation des Pankreaskarzinoms 8 II.2.6. Pathologische Anatomie des Pankreaskarzinoms 9 II.2.6.1. Makroskopie II.2.6.2. Histologie 9 10 II.2.7. Histologische Diagnosesicherung 11 II.2.8. Metastasierungswege des Pankreaskarzinoms 16 II.2.9. Klinik, Diagnostik, Therapie und Prognose des Pankreaskarzinoms 16 II.3. Proliferation 19 II.4. Apoptose 20 II.5. Molekularbiologische Aspekte 22 II.5.1. Allgemeiner Ablauf der Kanzerogenese 22 II.5.2. Molekularbiologische Ebene des Pankreaskarzinoms 22 II.5.2.1. Onkogene 23 II.5.2.2. Tumorsuppressorgene 23 Inhaltsverzeichnis III. MATERIAL UND METHODE 27 III.1. Das Untersuchungsgut 27 III.2. Beurteilungskriterien 27 III.3. Polyklonale Antikörper 28 III.4. Monoklonale Antikörper 28 III.5. Immunperoxidase-Färbetechniken 29 III.6. Das Enzym Peroxidase 30 III.7. Die verwendeten Antikörper 37 III.8. Verwendete Reagenzien und Geräte 38 III.9. Schneiden der Gewebeblöcke und Aufziehen der Schnitte auf den Objektträger 39 III.10. Färben der Präparate 39 III.11. Fehlerquellen 41 III.12. Verwendung von Kontrollen 42 III.13. Immunhistochemische Befunde 44 Inhaltsverzeichnis IV. ERGEBNISSE 50 IV.1. Patientenkollektiv sowie allgemeine pathologisch-anatomische Daten IV.2. Ergebnisse im Bezug zum pT-Status 52 56 IV.2.1. Ergebnisdarstellung für den Antikörper MIB-1 56 IV.2.2. Ergebnisdarstellung für den Antikörper BCL-2 57 IV.3. Ergebnisse im Bezug zum pN-Status 58 IV.3.1. Ergebnisdarstellung für den Antikörper MIB-1 58 IV.3.2. Ergebnisdarstellung für den Antikörper BCL-2 59 IV.4. Ergebnisse im Bezug zum pM-Status 60 IV.4.1. Ergebnisdarstellung für den Antikörper MIB-1 60 IV.4.2. Ergebnisdarstellung für den Antikörper BCL-2 61 IV.5. Ergebnisse im Bezug zum Tumorstadium nach UICC 62 IV.5.1. Ergebnisdarstellung für den Antikörper MIB-1 62 IV.5.2. Ergebnisdarstellung für den Antikörper BCL-2 63 IV.6. Ergebnisse im Bezug zum Differenzierungsgrad 64 IV.6.1. Ergebnisdarstellung für den Antikörper MIB-1 64 IV.6.2. Ergebnisdarstellung für den Antikörper BCL-2 65 IV.7. Statistik 66 Inhaltsverzeichnis V. DISKUSSION V.1. 71 Nachweis des Antigens Ki-67 und des BCL-2-Onkoproteins als Prognosefaktoren in duktalen Pankreaskarzinomen mit den V.2. VI. monoklonalen Antikörpern MIB-1 und BCL-2 71 V.1.1. pT-Status 72 V.1.2. pN-Status 75 V.1.3. pM-Status 77 V.1.4. Tumorstadium nach UICC 79 V.1.5. Differenzierungsgrad 81 V.1.6. Überlebenszeit 83 Methodik 85 ZUSAMMENFASSUNG 89 VII. LITERATURVERZEICHNIS 91 VIII. DANKSAGUNGEN 105 IX. 106 LEBENSLAUF Tabellen- und Abbildungsverzeichnis TABELLEN- UND ABBILDUNGSVERZEICHNIS TABELLENVERZEICHNIS zu II. Vorbemerkungen Tabelle 1: Tumoren des exokrinen Pankreas 2 Tabelle 2: Tumoren des endokrinen Pankreas 4 Tabelle 3: Theorien zur Zytogenese von exokrinen Pankreastumoren 6 Tabelle 4: Lokalisation des Pankreaskarzinoms 8 Tabelle 5: TNM-Klassifikation der Pankreastumoren, vierte überarbeitete Auflage, 1987 12 Tabelle 6: Stadiumeinteilung nach UICC, 1987 13 Tabelle 7: Aktuelle TNM-Klassifikation, fünfte überarbeitete Auflage, 1997 13 Tabelle 8: Stadiumeinteilung des AJCC, 1997 15 Tabelle 9: Histologisches Grading für duktale Adenokarzinome des exokrinen Pankreas 15 Onkogene und Wachstumsfaktoren des Pankreasgewebes 25 Tabelle 10: zu III. Material und Methode Tabelle 11: Einteilungskriterien für die Auswertung der Untersuchung 27 Tabelle 12: Substrate der Peroxidase und ihre Farbreaktion 29 Tabelle 13: Methoden zur Blockierung der endogene Peroxidase 31 Tabellen- und Abbildungsverzeichnis zu IV. Ergebnisse Tabelle 14: Ergebnisse der immunhistochemischen Analyse einer BCL-2 und MIB-1-Expression in duktalen Pankreaskarzinomen im Bezug zu klinisch-pathologischanatomischen Faktoren 51 Nachweis der MIB-1-Expression in Korrelation zum pT-Status 56 Tabelle 16: Einteilungskriterien für die Auswertung der Untersuchung 57 Tabelle 17: Nachweis der BCL-2-Expression in Korrelation zum pT-Status 57 Nachweis der MIB-1-Expression in Korrelation zum pN-Status 58 Nachweis der BCL-2-Expression in Korrelation zum pN-Status 59 Nachweis der MIB-1-Expression in Korrelation zum pM-Status 60 Nachweis der BCL-2-Expression in Korrelation zum pM-Status 61 Nachweis der MIB-1-Expression im Bezug zum Tumorstadium nach UICC 62 Nachweis der BCL-2-Expression im Bezug zum Tumorstadium nach UICC 63 Nachweis der MIB-1-Expression bezüglich der Einteilung der Adenokarzinome nach dem Differenzierungsgrad 64 Nachweis der BCL-2-Expression bezüglich der Einteilung der Adenokarzinome nach dem Differenzierungsgrad 65 Statistische Datenanalyse 66 Tabelle 15: Tabelle 18: Tabelle 19: Tabelle 20: Tabelle 21: Tabelle 22: Tabelle 23: Tabelle 24: Tabelle 25: Tabelle 26: Tabellen- und Abbildungsverzeichnis zu IV. Ergebnisse Tabelle 27: Tabelle 28: Tabelle 29: Tabelle 30: zu V. Durchschnittswerte der immunhistochemischen Untersuchung in Korrelation zum pT-Status 67 Durchschnittswerte der immunhistochemischen Untersuchung in Korrelation zum pN-Status 68 Durchschnittswerte der immunhistochemischen Untersuchung in Korrelation zum pM-Status 69 Durchschnittswerte der immunhistochemischen Untersuchung in Korrelation zum Tumorstadium nach UICC 70 Diskussion Tabelle 31: Untersuchungsergebnisse verschiedener Studien der letzten Jahre 88 Tabellen- und Abbildungsverzeichnis ABBILDUNGSVERZEICHNIS zu III. Material und Methode Abbildung 1: Die direkte Methode 32 Abbildung 2: Die indirekte Methode 33 Abbildung 3: Die PAP-Methode 35 Abbildung 4: Die ABC-Methode 36 Abbildung 5: Anfärbung mittels des monoklonalen Antikörpers BCL-2 44 Abbildung 6-10: Anfärbungen mittels des monoklonalen Antikörpers MIB-1 45 zu IV. Ergebnisse Abbildung 11: Abbildung 12: Abbildung 13: Abbildung 14: Verteilung der Patienten zum Zeitpunkt der Diagnosestellung nach der TNM-Klassifikation der UICC 54 Verteilung der Patienten zum Zeitpunkt der Diagnosestellung nach dem Tumorstadium der UICC 54 Verteilung der Patienten zum Zeitpunkt der Diagnosestellung nach dem Differenzierungsgrad 55 Alters- und Geschlechtsverteilung 55 Tabellen- und Abbildungsverzeichnis zu IV. Diskussion Abbildung 15: Abbildung 16: Abbildung 17: Abbildung 18: Abbildung 19: Färbungsintensität von MIB-1 in Korrelation zum pT-Status 73 Färbungsintensität von MIB-1 in Korrelation zum pN-Status 75 Färbungsintensität von MIB-1 in Korrelation zum pM-Status 77 Färbungsintensität von MIB-1 in Korrelation zu den Tumorstadien nach UICC 79 Färbungsintensität von MIB-1 in Korrelation zum Differenzierungsgrad 81 I. Einleitung und Fragestellung I. EINLEITUNG UND FRAGESTELLUNG IMMUNHISTOCHEMISCHER NACHWEIS DES ZELLPROLIFERATIONSASSOZIIERTEN ANTIGENS KI-67 UND DES BCL-2 PROTOONKOGENS ALS PROGNOSEFAKTOREN IN DUKTALEN ADENOKARZINOMEN DES EXOKRINEN PANKREAS Das Pankreaskarzinom liegt nach dem Kolon- und Magen- Karzinom an dritter Stelle unter den Karzinomen des Magen-Darm-Traktes und zeigt weltweit steigende Inzidenz (MÜLLER et al., 2000). Allein in Deutschland werden jährlich 6.000 - 8.000 neue Fälle registriert (BÜCHLER, UHL, MALFERTHEINER, 1996). Der Tumor birgt nach wie vor große therapeutische und diagnostische Probleme. Die Diagnose erfolgt häufig zu spät, was hauptsächlich auf die späte Symptommanifestation zurückzuführen ist. Die daraus resultierende schlechte Prognose manifestiert sich in einer hohen Rezidivrate, einer frühen Metastasierung und einer 5-Jahres-Überlebensrate von etwa 1 - 3 % (WARSHAW et al., 1992). Der Erkennung der Ursachen und einer frühzeitigen und zuverlässigen Diagnosestellung kommt daher eine zunehmende Bedeutung zu. In diesem Zusammenhang hat die Forschung innerhalb der letzten Jahre eine Entwicklung in Richtung Tumorbiologie bzw. Wachstumssteuerung gemacht. Eine entscheidende Rolle in der Genese zahlreicher solider Tumoren spielen das Antigen Ki-67 und das Protoonkogen BCL-2. Ki-67 ist ein zellproliferationsassoziiertes Antigen, während BCL-2 eine wichtige Aufgabe bei der Hemmung der Apoptose übernimmt. Es stellt sich in dieser Arbeit die Frage, ob an histologisch untersuchten, in Paraffin eingebetteten Tumorgewebe aus tubulären, duktalen Adenokarzinomen des Pankreas bestimmte Prognosefaktoren nachgewiesen und Aussagen über das biologische Tumorverhalten gemacht werden können. Demzufolge wurde in dieser retrospektiven Analyse in 23 duktalen Adenokarzinomen des exokrinen Pankreas mittels der paraffingängigen monoklonalen Antikörper MIB-1 und BCL-2 die Proliferationsaktivität bzw. die Intensität der Apoptosehemmung gemessen und zu verschiedenen pathologisch-anatomischen Tumordaten in Beziehung gesetzt. -1- II. Vorbemerkungen II. VORBEMERKUNGEN II.1. ALLGEMEINE KLASSIFIKATION DER PANKREASTUMOREN Entsprechend dem Aufbau des Pankreas differenzieren sich Pankreastumoren entweder zu endokrinen oder exokrinen Tumoren, die maligne bzw. benigne entarten oder zu einer Tumorgruppe mit unsicherem malignen Potential gehören können. Je nach Herkunft ist ebenfalls eine Einteilung in mesenchymale und epitheliale Tumoren möglich. Die nachfolgende internationale histologische Klassifikation der WHO aus dem Jahre 1990 gibt einen kurzen Überblick über die möglichen exokrinen Tumorarten in der Bauchspeicheldrüse: Tabelle 1: Tumoren des exokrinen Pankreas (KLÖPPEL, 1996) 1. Epithelial Tumours 1.1. Benign 1.1.1. 1.1.2. 1.1.3. 1.1.4. Serous cystadenoma Mucinous cystadenoma Intraductal papillary-mucinous adenoma Mature teratoma 1.2. Borderline (Uncertain Malignant Potential) 1.2.1. 1.2.2. 1.2.3. Mucinous cystic tumour with moderate dysplasia Intraductal papillary-mucinous tumour with moderate dysplasia Solid-pseudopapillary tumour 1.3. Malignant 1.3.1. 1.3.2. Severe ductal dysplasia / carcinoma in situ Ductal adenocarcinoma 1.3.2.1. Mucinous noncystic carcinoma 1.3.2.2. Signet-ring cell carcinoma 1.3.2.3. Adenosquamous carcinoma 1.3.2.4. Undifferentiated (anaplastic) carcinoma 1.3.2.5. Mixed ductal-endocrine carcinoma Osteoclast like giant cell tumour Serous cystadenocarcinoma 1.3.3. 1.3.4. -2- II. Vorbemerkungen 1.3.5. Mucinous cystadenocarcinoma 1.3.5.1. Noninvasive 1.3.5.2. Invasive 1.3.6. Intraductal papillary-mucinous carcinoma 1.3.6.1. Noninvasive 1.3.6.2. Invasive (papillary-mucinous carcinoma) 1.3.7. Acinar cell carcinoma 1.3.7.1. Acinar cell cystadenocarcinoma 1.3.7.2. Mixed acinar-endocrine carcinoma 1.3.8. Pancreatoblastoma 1.3.9. Solid-pseudopapillary carcinoma 1.3.10. Miscellaneous carcinomas 2. Nonepithielial Tumours 3. Secondary Tumours 4. Tumour like Lesions 4.1 Chronic pancreatitis 4.2. Miscellaneous inflammatory changes 4.3. Cysts 4.3.1. 4.3.2. 4.3.3. 4.3.4. 4.3.5. 4.3.6. 4.3.7. 4.3.8. Pseudocysts Retention cyst Parasitic cyst Congenital cyst Para-ampullary duodenal wall cyst Enterogenous cyst Lymphoepithelial cyst Endometrial cyst 4.4. Duct changes 4.4.1. 4.4.2. 4.4.3. 4.4.5. Squamous metaplasia Mucinous cell hypertrophy Ductal papillary hyperplasia Adenomatoid ductal hyperplasia 4.5. Acinar changes 4.6. Heterotopic pancreas 4.7. Heterotopic spleen 4.8. Harmatoma 4.9. Inflammatory pseudotumour 4.10. Lipomatous pseudohypertrophy 4.11. Focal lymphoid hyperplasia -3- II. Vorbemerkungen In Anlehnung an eine Klassifikation nach KLÖPPEL (1993) sind folgende endokrine Tumoren ergänzend zu erwähnen (HERMANEK, 1995): Tabelle 2: Tumoren des endokrinen Pankreas A. Benigne Tumoren / Low-grade-Malignome (Makrotumoren > 0,5 cm) funktionell aktiv Insulinom Glucagonom Gastrinom Vipom Sonstige funktionell inaktiv B. Maligne Tumoren schlecht differenziertes endokrines Karzinom II.2. DIE MALIGNEN TUMOREN DES EXOKRINEN PANKREAS Der überwiegende Teil der bösartigen Pankreastumoren sind Karzinome. Das Pankreaskarzinom wurde zum ersten Mal in der Zeit von 1830 - 1860 definiert und beschrieben (MONDIERE, 1836; DA COSTA, 1858). Um die Jahrhundertwende sind dann nach und nach klinische und pathologisch-anatomische Gesichtspunkte festgehalten worden. Zum Ende des 18. Jahrhunderts fand die erste histogenetische Einteilung der exokrinen Tumoren in duktale und acinäre Neoplasien statt (BARD, PIC, 1888), welche schließlich als Grundlage für die Einteilung der exokrinen Pankreastumoren diente (CUBILLA, FITZGERALD, 1980). Der Begriff der malignen Neoplasien wird hauptsächlich durch Pankreaskarzinome geprägt, wovon laut europäischer, japanischer und amerikanischer Studien mehr als 80 % aller maligner Pankreastumoren auf das duktale Adenokarzinom fallen (KLÖPPEL, 1984; CUBILLA, 1984; SAITO, 1990; MOROHOSHI, 1991). Das duktale Karzinom repräsentiert damit den häufigsten Typ und kann als Prototyp angesehen -4- II. Vorbemerkungen werden. Diese Bezeichnung basiert auf der Pathomorphologie des Karzinoms, die verschiedene histologische Varianten aufweisen kann. Nachfolgend soll ein Überblick über das Pankreaskarzinom u.a. unter Berücksichtigung seiner ätiologisch-pathogenetisch und molekularpathologischen Problematik gegeben werden. II.2.1. ÄTIOLOGISCHE ASPEKTE DES PANKREASKARZINOMS Die Entstehung des Pankreaskarzinoms ist multifaktorieller Genese. Sie ist heute noch unklar und weitgehend unerforscht. Jedoch werden Zusammenhänge zwischen der Entstehung des Pankreaskarzinoms und verschiedener Faktoren in der Literatur diskutiert. Zu erwähnen wären hier als exogene Faktoren ein starker Tabakkonsum, eine an tierischen Eiweißen oder fettreiche Nahrung und der Genuß von Kaffee oder Alkohol (LIN, KESSLER, 1981). Als weitere Faktoren werden verschiedene chemische Substanzen, wie z.B. β-Naphthylamine und Benzidine (MANCUSO, EL-ATTAR, 1967), denen vor allem Chemiearbeiter ausgesetzt sind, diskutiert (LI, FRAUMENI, 1969). Ein vermehrtes Vorkommen von Pankreaskarzinomen wurde außerdem bei Arbeitern in der Metallindustrie sowie in Koks- und Gasanlagen beschrieben (BERG, CONNELLY, 1979). Eindeutige Forschungsergebnisse liegen derzeit allerdings nicht vor. In einigen tierexperimentellen Studien wurde über ein erhöhtes Risiko, unter dem Einfluß von Nitrosaminen an einem Pankreaskarzinom zu erkranken, berichtet (POUR et al., 1981). Weiterhin werden in der Literatur als mögliche prädisponierende Faktoren Vorerkrankungen wie der Diabetes mellitus (LIN, KESSLER, 1981) und die akute bzw. chronische Pankreatitis (MEYER et al., 1984) mit der Entstehung des Pankreaskarzinoms in Zusammenhang gebracht. Eine statistische Absicherung dieser Zusammenhänge gelang bisher noch nicht. II.2.2. PATHOGENESE DES PANKREASKARZINOMS Im Gegensatz zum Pankreaskarzinom wird bei der Entwicklung des pankreasnah wachsenden Papillenkarzinoms eindeutig eine Adenom-Karzinom-Sequenz im Menschen beobachtet (BÜCHLER et al., 1984). Es wurden in einer Studie von BÜCHLER und -5- II. Vorbemerkungen Mitarbeitern (1984) in 83 % aller Patienten mit Papillentumoren im karzinomfreien Bereich mittel bis hochgradige Epitheldysplasien bzw. in 91 % sogar Adenomstrukturen beschrieben. Der Nachweis des kontinuierlichen Übergangs vom dysplastischen Epithel zum Karzinom war in einem Viertel der Präparate möglich. Durch die Schwierigkeiten der Entdeckung des Pankreaskrebses im Frühstadium sind konkrete Aussagen über die Karzinogenese bzw. Histogenese des Pankreaskarzinoms schwierig. Die Beobachtungen zur Karzinogenese des Pankreaskarzinoms stammen daher fast ausschließlich nur aus Tierexperimenten mit dem sogenannten syrischen Goldhamster (POUR et al., 1975; 1982). So ist es möglich, Parallelen zur Karzinomentwicklung über eine entsprechende Adenom-Karzinom-Sequenz zu äußern (KLÖPPEL, 1979; POUR, 1982). In der Literatur gehen die Ansichten über die Histo- und Zytogenese des Pankreaskarzinoms weit auseinander und werden teilweise kontrovers diskutiert. Tabelle 3: Theorien zur Zytogenese von exokrinen Pankreastumoren (SCHULZ et al., 1994) - BASALZELLTHEORIE: Basalzellen von terminalen Gangstrukturen sind fähig zur Differenzierung von funktionellen Einheiten. - PLURIPOTENTE UNIZELLULÄRE BASALZELLTHEORIE: Basalzellen von duktulären Strukturen sind zuständig für die Entwicklung von duktulo-lobulären Komplexen. - SEMIPLURIPOTENTE BIZELLULÄRE BASALZELLTHEORIE: Duktale Basalzellen bilden duktuläre Strukturen und epitheliale Vorläuferzellen, die verantwortlich sind für die Entwicklung von Intermediärzellen, zentroazinären und azinären Formationen. - MULTIZELLULÄRE (PLURIPOTENTE) STAMMZELLTHEORIE: Undifferenzierte pluripotente Stammzellen in allen Gangabschnitten sind zur Zellteilung, pluripotenten Differenzierung und Entdifferenzierung befähigt. -6- II. Vorbemerkungen II.2.3. INZIDENZ DES PANKREASKARZINOMS Unter den exokrinen Pankreaskarzinomen ist das duktale Adenokarzinom bei weitem der häufigste Tumor des Pankreas und gehört damit weltweit neben dem Lungen-, Kolon-, Rektum- und Brustkrebs in der Liste der Krebserkrankungen zu den sechs bis acht häufigsten malignen Neoplasien (BÖCKER, DENK, HEITZ, 1997). Das Pankreaskarzinom liegt an dritter Stelle nach dem Kolon- und Magenkarzinom unter den Karzinomen des MagenDarm-Traktes (MÜLLER et al., 2000). In den letzten Jahren ist weltweit eine deutliche Zunahme der Inzidenz des Pankreaskarzinoms beobachtet worden. In den westlichen industrialisierten Ländern liegt die Häufigkeit derzeit bei 10 Fällen auf 100.000 Einwohner (BÜCHLER, UHL, MALFERTHEINER, 1996). Es wird für die Vereinigten Staaten über eine Verdreifachung der Inzidenzrate in den Jahren von 1920 - 1970 berichtet (GUDJONSON, 1987). Die Mortalitätsrate des Pankreaskarzinoms nahm in dieser Zeit ebenfalls gewaltig zu (BORING et al., 1993). Auf Grund der schlechten Überlebenschancen (die 5-Jahres-Überlebensrate liegt bei 3 %) sind Mortalitäts- und Inzidenzrate des Pankreaskarzinoms weitgehend identisch. Diese Tendenzen wurden ebenfalls von AOKI und OGAWA basierend auf Datenmaterial der WHO weltweit bestätigt (AOKI, OGAWA, 1978) und blieben bisher unverändert. In Deutschland werden jährlich etwa 6.000 - 8.000 neue Fälle registriert. Die Inzidenz für Männer beträgt 7 Fälle, für Frauen 4 Fälle auf 100.000 Einwohner (BÜCHLER, UHL, MALFERTHEINER, 1996). Die höchsten Inzidenzen werden unter Farbigen mit bis zu 20 Fällen auf 100.000 Einwohner, die Niedrigsten in Indien, Singapur und Kuwait mit 1 Fall auf 100.000 Einwohner gefunden (BÜCHLER, UHL, MALFERTHEINER, 1996). II.2.4. GESCHLECHTS- UND ALTERSVERTEILUNG DES PANKREASKARZINOMS Der internationale Vergleich zwischen Frauen und Männern zeigt, daß das Pankreaskarzinom bei Männern häufiger auftritt (Rate Männer : Frauen 1,5 - 2 : 1). Dem entsprechen viele Daten epidemiologischer Studien (ANDREN-SANDBERG, IHSE ,1983; -7- II. Vorbemerkungen CLEMENS et al., 1985; SAITO, 1990). In den letzten Jahren wurde ebenfalls über eine Zunahme der Krankheitsentwicklung unter Frauen berichtet. Laut dem statistischen Bundesamt starben zusammengenommen in den Jahren 1979 und 1980 7.065 weibliche Personen und 6.505 männliche Patienten (STATISTISCHES BUNDESAMT, 1982). Diese Tendenz ist ebenfalls in den USA zu beobachten (BORING, 1993). Das Pankreaskarzinom ist eine Erkrankung älterer Menschen. Das Hauptmanifestationsalter liegt zwischen dem 50. und 70. Lebensjahr. Obwohl Pankreaskarzinome bereits bei Neugeborenen beschrieben wurden (GROSFELD et al., 1970; ROBEY et al., 1983), ist eine Erkrankung vor dem 40. Lebensjahr relativ selten. Das Wachstumsverhalten und die Prognose ist unabhängig vom Alter gleich aggressiv und schlecht (IVY et al., 1990). II.2.5. LOKALISATION DES PANKREASKARZINOMS Die Lokalisation des Pankreaskarzinoms kann variieren und sich auf Kopf, Körper, Schwanz oder auf mehrere Abschnitte des Pankreas erstrecken bzw. multizentrisch erscheinen. Jedoch geht aus allen Statistiken eine Bevorzugung des Pankreaskopfes beim Karzinom hervor (MILLER et al., 1951; BELL, 1957; KLINTRUP, 1966). Gelegentlich sah man ein Pankreaskarzinom in heterotopen Pankreasanlagen entstehen (SILVER, 1948; GOLDFARB et al. 1963). Die Häufigkeit nach dem Sitz des Karzinoms soll kurz anhand einer nach Becker (BECKER et al., 1983) prozentualen Einteilung dargestellt, und der Lokalisation der Tumoren dieser Arbeit gegenübergestellt werden: Tabelle 4: Lokalisation des Pankreaskarzinoms BECKER et al., 1983: 70 - 80% eigene Untersuchung: Pankreaskopfkarzinome 87% Pankreaskopfkarzinome 6 - 13% Karzinome im Pankreaskörper 4% diffuse Lokalisation 3 - 17% Pankreasschwanzkarzinome 9% Papillenregion -8- II. Vorbemerkungen Die Angaben zur Lokalisation sind in der Literatur häufig unterschiedlich, da bei der Sektion der Ausgangspunkt des Tumors oft nicht mehr exakt feststellbar ist. Mit der Lokalisation des Karzinoms ist jeweils eine etwas anders beginnende Symptomatik und damit ein anderer Zeitpunkt der Diagnosestellung der Erkrankung verbunden. Tumoren im Pankreaskörper und Pankreasschwanz sind dann im Vergleich zu Pankreaskopftumoren die auf Grund der engen Lagebeziehung zu den Gallenwegen eher symptomatisch werden meist größer und haben bereits zu Lebermetastasen oder einer Peritonealkarzinose geführt. II.2.6. PATHOLOGISCHE ANATOMIE DES PANKREASKARZINOMS Unter den Begriff des Pankreaskarzinoms fallen hauptsächlich das duktale Adenokarzinom und das Azinuszellkarzinom. Sie werden beide zu den epithelialen Tumoren gezählt. Das duktale Adenokarzinom macht mehr als 80 % aller Pankreaskarzinome aus, entspringt vom Gangepithel und ist meist im Pankreaskopf lokalisiert (KLÖPPEL, 1996). Das Azinuszellkarzinom ist ein seltener Tumor, der ca. 1 % aller Pankreaskarzinome ausmacht, von den Drüsenazini ausgeht und meist im Pankreasschwanz lokalisiert ist (RIEDE, SCHÄFER, 1995). II. 2.6.1. MAKROSKOPIE Das duktale Adenokarzinom ist bei Diagnosestellung meist 2 - 5 cm groß. Es besitzt infolge fibrotischer und sklerotischer Veränderungen eine feste Konsistenz und ist unscharf begrenzt. Seine grauweißliche Schnittfläche wird durch hämorrhagische und / oder nekrotische Areale sowie häufiger durch Pseudozysten geprägt. Es weist sowohl im Primärtumor als auch in den Metastasen neben zentralen Nekrosen auch perifokale Bindegewebsneubildungen auf. Da es hauptsächlich im Pankreaskopf lokalisiert ist, kann es zu einer Stenose des Ductus choledochus bzw. des Ductus pancreaticus oder zu infiltrierendem Wachstum in das Duodenum kommen. Durch die Obstruktion ist eine starke Ausweitung der Gangabschnitte proximal des Tumors möglich. Bei Pankreaskarzinomen besteht die Möglichkeit, daß sie in das dorsale peripankreatische Fettgewebe einwachsen, -9- II. Vorbemerkungen die V. und A. mesenterica superior ummauern und schließlich in diese Gefäße einbrechen (BÖCKER, DENK, HEITZ, 1997). Das Azinuszellkarzinom unterscheidet sich makroskopisch kaum vom duktalen Adenokarzinom (RIEDE, SCHÄFER, 1995). II.2.6.2. HISTOLOGIE Das histologische Bild des duktalen Pankreaskarzinoms ist außerordentlich vielfältig. Es weist verschiedene Grade der Gewebsausreifung auf. In einem gut differenzierten Tumor sind dicht gelagerte Tumordrüsenschläuche aus weniger polymorphen Zylinderepithelien, die eher an normale Gänge und Duktuli erinnern, mit einem runden Zellkern und einem deutlichen Nukleolus zu erkennen. Das histologische Bild wird ebenfalls durch eine gleichmäßige Schleimproduktion geprägt (schleimbildendes Adenokarzinom). Anderseits sind in einem weniger differenzierten Karzinom sowohl hoch als auch niedrig differenzierte Drüsenschläuche zu beobachten. Charakteristisch für diese atypischen Drüsenformationen ist ihre Fähigkeit in ihrer Umgebung die Bildung von Bindegewebe zu induzieren, was als desmoplastische Stromareaktion bezeichnet wird und den Tumoren histologisch einen szirrhösen, makroskopisch einen derben Aspekt verleiht. Ebenfalls ist zu 90 % eine Nervenscheideninvasion des Tumors zu beobachten. Die schlecht differenzierten Karzinome bestehen aus einem Gemisch sowohl aus dichtgelagerten kleinen irregulären Drüsen als auch aus soliden Tumorzellnestern, welche die azinären Strukturen komplett verdrängen können. Die Tumorzellen zeigen einen hohen Grad an Pleomorphismus, reduzierter Muzin-Produktion und eine extrem hohe Mitoserate. Als topographische Sonderform des duktalen Pankreaskarzinoms ist das Papillenkarzinom von besonderer Bedeutung. Es ist ebenfalls ein Adenokarzinom, das im Bereich der Papilla duodeni major lokalisiert ist, von der Papillenschleimhaut ausgeht und als kleine Tumor- - 10 - II. Vorbemerkungen knoten in das Duodenum hervorspringt. Das histologische Bild entspricht dem des duktalen Pankreaskarzinoms. Aus praktisch-klinischen Gründen werden die Tumoren der Papille und des Pankreaskopfes häufig aufgrund der gleichen klinischen Symptomatik zu Pankreaskopftumoren zusammengefaßt. Die Prognose- bzw. Heilungschance der Papillenkarzinome ist jedoch besser als die der reinen Kopfkarzinome. Sie machen klinisch früher durch einen intermittierenden Verschluß bzw. dem damit verbundenen Ikterus auf sich aufmerksam, werden dadurch früher erkannt und metastasieren später (RIEDE, SCHÄFER, 1995; BÖCKER, DENK, HEITZ, 1997). Das Azinuszellkarzinom weist in gut differenzierten Tumorbereichen azinäre und trabekuläre Zellverbände auf. Die Tumorzellen sind durch ein eosinophiles feinkörniges Zytoplasma und durch die positive PAS-Reaktion an ihrem apikalen Zellpol charakterisiert. Sie sind pathobiologisch besonders sekretorisch aktiv und enthalten elektronenmikroskopisch nachweisbare Zymogengranula mit Amylase, α1-Antitrypsin und Lipase. Bei sekretorisch aktiven Erkrankungen ist gelegentlich ein Lipaseübertritt ins Blut möglich. Von diesem Tumor sind hauptsächlich Männer über 60 Jahre betroffen (RIEDE, SCHÄFER, 1995; BÖCKER, DENK, HEITZ, 1997). II.2.7. HISTOLOGISCHE DIAGNOSESICHERUNG Zur histologischen Diagnosesicherung eines Tumors gehört einerseits die Dignitätsbestimmung und seine Typisierung, anderseits die Beurteilung des Malignitätsgrades (Grading) und der Tumorausbreitung (Staging). Zur Beurteilung der Tumorausbreitung des Pankreaskarzinoms in Form einer Stadieneinteilung wurden laut Literatur verschiedene Vorschläge gemacht. Darunter fallen z.B. die 1974 von Hermeck veröffentlichte sehr grobe und einfache Klassifikation, die vier Stadien des Pankreaskarzinoms unterscheidet. Weitere Versuche zur Einteilung der Pankreaskarzinome wurden von vielen anderen, u.a. 1986 von KLÖPPEL und FITZGERALD unternommen. Die aktuelle TNM-Klassifikation (WITTEKIND, WAGNER, 1997) bietet nun nach mehrfacher Überarbeitung eine gute Grundlage für eine adäquate Therapie. - 11 - II. Vorbemerkungen Jedoch wird an dieser Stelle zunächst die alte Klassifikation erwähnt, da das Patientenkollektiv der Arbeit nach dieser klassifiziert wurde: Tabelle 5: TNM-Klassifikation der Pankreastumoren: Stadieneinteilung von der Union Internationale Contre Le Cancer (UICC), vierte überarbeitete Auflage, 1987 (HERMANEK et al. 1987) T Primärtumor - Tx Ausdehnung des Primärtumors kann nicht bestimmt werden - T0 Primärtumor nicht nachweisbar - T1 Tumor auf das Pankreas begrenzt - T2 - T1a Tumor nicht größer als 2 cm - T1b Tumor größer als 2 cm Tumor infiltriert direkt Duodenum, Ductus choledochus und / oder peri-pankreatisches Fettgewebe - T3 Tumor infiltriert direkt Magen, Milz, Kolon und / oder große Nachbargefäße N regionäre Lymphknotenmetastasen - Nx Lymphknotenmetastasen nicht einzuordnen - N0 keine regionalen Lymphknotenmetastasen - N1 regionale Lymphknotenmetastasen M Fernmetastasen - Mx Vorliegen von Fernmetastasen nicht bestimmbar - M0 keine Fernmetastasen - M1 Fernmetastasen nachweisbar - 12 - II. Vorbemerkungen Tabelle 6: Stadiumeinteilung (UICC, 1987) Stadium I T1 N0 M0 T2 N0 M0 Stadium II T3 N0 M0 Stadium III beliebiges T N1 M0 Stadium IV beliebiges T beliebiges N M1 Im Vergleich zur aufgeführten TNM-Klassifikation wird in der folgenden überarbeiteten fünften Auflage der UICC ein zusätzliches T4-Stadium vorgesehen und das Stadium IV des AJCC (American Joint Commitee for Cancer) in die Stadien A und B unterteilt. Tabelle 7: aktuelle TNM-Klassifikation: fünfte überarbeitete Auflage der Union Internationale Contre Le Cancer (UICC), 1997 (WITTEKIND, WAGNER, 1997) T Primärtumor - Tx Primärtumor kann nicht beurteilt werden - T0 Kein Anhalt für Primärtumor - Tis Carcinoma in situ - T1 Tumor begrenzt auf Pankreas, 2 cm oder weniger in größter Ausdehnung - T2 Tumor begrenzt auf Pankreas, mehr als 2 cm in größter Ausdehnung - T3 Tumor breitet sich direkt in Duodenum, Ductus Choledochus und/oder peripankreatisches Fettgewebe (1) aus - T4 Tumor breitet sich direkt in Magen, Milz, Kolon und/oder benachbarte große Gefäße (2) aus - 13 - II. Vorbemerkungen Tabelle 7 (Fortsetzung): aktuelle TNM-Klassifikation: fünfte überarbeitete Auflage der Union Internationale Contre Le Cancer (UICC), 1997 (WITTEKIND, WAGNER, 1997) N regionäre Lymphknotenmetastasen - Nx Regionäre Lymphknoten können nicht beurteilt werden - N0 Keine regionalen Lymphknotenmetastasen - N1 Regionale Lymphknotenmetastasen - N1a Metastase in einem einzelnen regionären Lymphknoten - N1b Metastasen in mehreren regionären Lymphknoten M Fernmetastasen - Mx Fernmetastasen können nicht beurteilt werden - M0 keine Fernmetastasen - M1 Fernmetastasen nachweisbar (1) Peripankreatisches Gewebe umfaßt das umgebende retroperitoneale Fettgewebe (retroperitoneales Weichgewebe oder retroperitonealer Raum), eingeschlossen Mesenterium (mesenteriales Fett), Mesokolon, großes und kleines Netz und Peritoneum. Direkte Invasion der Gallengänge und des Duodenums schließt Befall der Ampulla Vateri ein. (2) Benachbarte große Gefäße sind die Pfortader, der Truncus coeliacus und die A. mesenterica superior sowie die A. und V. hepatica communis (nicht die Milzgefäße). - 14 - II. Vorbemerkungen Tabelle 8: Stadiumeinteilung des American Joint Commitee For Cancer, 1997 (HERMANEK, 1998) Stadium 0 Tis N0 M0 Stadium I T1-2 N0 M0 lokalisierter operabler Tumor Stadium II T3 N0 M0 Infiltration in die Nachbarorgane nicht mehr operabel Stadium III T1-3 N1 M0 regionale LK-Metastasierung z.T. operabel aber nie kurativ Stadium IVA T4 jedes N M0 Stadium IVB jedes T jedes N M1 inoperabel Das histologische Grading der duktalen Adenokarzinome in hoch, mäßig und niedrig differenzierte Gruppen ist ein prognostisch wichtiges Kriterium. Die unterschiedlichen histologischen Strukturen und Veränderungen werden in der folgenden Tabelle 9 nochmals zusammengefaßt (KLÖPPEL, 1996): Tabelle 9: Histologisches Grading für duktale Adenokarzinome des exokrinen Pankreas Tumour Glandular Grade differentiation Mucin Production Mitoses Nuclear atypia Intensive ≤5 little polymorphism, polar arrangement 1 Well-differentiated duct-like glands 2 Moderately differentiated Irregular duct-like and tubular glands 6 - 10 Moderate polymorphism 3 poorly differentiated glands, Abortive mucoepidermoid and pleomorphic stuctures > 10 Marked polymorphism and increased nuclear size - 15 - II. Vorbemerkungen II.2.8. METASTASIERUNGSWEGE DES PANKREASKARZINOMS Zum Zeitpunkt der Diagnose der Erkrankung hat der Tumor meist die Organgrenze überschritten und sich bereits im Rahmen seiner ausgesprochenen Metastasierungsfreudigkeit ausgebreitet. Das duktale Adenokarzinom metastasiert primär lymphogen in die peripankreatischen und paraaortalen Lymphknoten sowie in die Lymphknoten der Leberpforte. Eine hämatogene Metastasierung findet man vorwiegend in der Leber, der Lunge und Pleura, im Skelettsystem und in den Nebennieren (BECKER ,1976; CUBILLA et al., 1978; LISA et al., 1964; SCHLICK, 1969). Ebenfalls greift der Tumor per continuitatem auf die hintere Bauchwand, das Mesenterium und die benachbarten Hohlorgane über. Das bevorzugte perineurale Wachstum in das peripankreatische Fettgewebe des Pankreaskarzinoms ist für die manchmal unerträglichen Schmerzen verantwortlich (RIEDE, SCHÄFER, 1995). Wie bereits erwähnt zeigen Pankreaskopfkarzinome auf Grund der früher einsetzenden Klinik seltener Metastasen als Karzinome im Körper und Schwanzbereich (DEL REGATO, 1977; FRANTZ, 1959). II.2.9. KLINIK, DIAGNOSTIK, THERAPIE UND PROGNOSE DES PANKREASKARZINOMS Die Symptome des Pankreaskarzinoms ähneln denen der chronischen Pankreatitis, wodurch die Differentialdiagnose erschwert werden kann. Das Leitsymptom der Pankreaskopftumoren ist im Vergleich zu den Schwanzkarzinomen, die hingegen durch Oberbauchbeschwerden auf sich aufmerksam machen, hauptsächlich der - durch die Stenose des distalen Duktus choledochus verursachte - zunehmende Ikterus. Die Obstruktion des Pankreasganges geht mit einer obstruktiven Pankreatitis einher, die wiederum zur Maldigestion mit Diarrhoe bzw. Steatorrhoe und Gewichtsverlust führen kann. Weiterhin klagen die Patienten über Appetitverlust, Übelkeit, Erbrechen und Schmerzen im Epigastrium, im linken Epichondrium und der Lumbalgegend. Der erste positive Palpationsbefund ist meist die Stauungsgallenblase (sog. Courvoirsierzeichen), wesentlich später der Pankreastumor selbst. - 16 - II. Vorbemerkungen Aufgrund der nicht vorhandenen charakteristischen Symptome weist zum Zeitpunkt der Diagnose der Tumor meist ein fortgeschrittenes Stadium auf, hat die Organgrenze überschritten und ist ins peripankreatische Gewebe und in Lymphgefäße eingebrochen. Eine frühzeitige Diagnose ist daher extrem schwierig. Den größten Fortschritt - sowohl hinsichtlich der Diagnosesicherung als auch der präoperativen Planung beim Pankreaskarzinom - haben bildgebende Verfahren erbracht. Die Tumoren können durch Ultraschall (evtl. mit Feinnadelpunktion) und Computertomographie erfaßt werden. Eine Darstellung des Ductus pancreaticus oder Ductus choledochus ist mittels der endoskopisch retrograden Cholangiopankreatikographie (ERCP) möglich. Zur Diagnostik des Pankreaskarzinoms stehen heute ebenfalls verschiedene laborchemische Verfahren zur Verfügung, wobei die α-Amylase-und Lipaseaktivitäten bei diesen Patienten geringfügig erhöht sind. Da der größte Teil der Tumoren zum Zeitpunkt der Diagnosestellung bereits inkurabel ist, wurden innerhalb der letzten Jahre große Hoffnungen auf die sogenannten Tumormarker gesetzt. Diese Marker umfassen Enzyme, Proteine, Peptide und tumorassoziierte oncofetale Antigene. Eine Spezifität dieser Tumormarker liegt jedoch letztendlich nicht vor, so daß sie im Rahmen einer Verdachtsdiagnose in Kombination mit den genannten bildgebenden Verfahren eingesetzt werden und bei der prä- und postoperativen Therapiekontrolle und der Prognosebeurteilung hilfreich sind. Unter den vielen verschiedenen im Pankreaskarzinom gefundenen Antigenen sind CEA, Ca 19-9, Ca 50, Ca 12-5, DU-PAN-2, Span-1 und TAG-72 nützliche Tumormarker. Hinweisende bzw. für die Verlaufskontrolle wichtige Parameter sind vor allem die häufig im Serum in erhöhter Konzentration nachweisbaren Tumormarker CEA und CA-19-9. Ist der Patient noch im operablem Zustand und lassen sich durch bildgebende Verfahren lokale und systemische Metastasen ausschließen, sollte per Laparotomie eine Inspektion des Tumors und bei gesichertem Tumor eine Abklärung des Lymphknoten-Stagings (Lymphknotenstatus im Bereich des Tripus halleri, der Mesenterialwurzel, peripankreatisch und im Bereich des Ligamentum hepatoduodenale) durchgeführt werden. Als Therapie der Wahl ist für das kleine Pankreaskopf- oder Papillenkarzinom schließlich die sogenannte “Rechtsresektion“ (OP nach Whipple bzw. auch proximale partielle DuodenoPankreatektomie) genannt, angezeigt. Die totale Pankreatektomie sowie linksresezierende Verfahren werden bei Tumoren im Korpus- - 17 - und Schwanzbereich angewandt II. Vorbemerkungen (SCHUMPELICK, 1999). Der Anteil der resektablen Tumoren liegt bei 6 - 23 % aller Patienten mit einem Pankreaskarzinom (BÜCHLER et al., 1993; TREDE et al., 1990; WARSHAW et al., 1992), von denen nach 5 Jahren 3 - 24 % der Patienten noch leben (ISHIKAWA et al., 1988; TREDE et al., 1990; FERNANDEZ DEL CASTILLO, 1994; HERMANEK et al., 1994). Dabei ist neben der vorausgesetzten R0-Resektion auch die Frage des Tumorstadiums entscheidend. Bei einer R0-Resektion im Stadium I liegt das 5Jahresüberleben bei 16,5 %, im Stadium II bei 5,8 % (HERMANEK, WITTEKIND, 1994). Das Hauptaugenmerk für eine gute Prognose bzw. für eine erfolgreiche kurative Behandlung weist damit auf eine frühzeitige Diagnoseerstellung hin. Die Gesamt-5-JahresÜberlebensrate liegt jedoch im Durchschnitt aufgrund der spät auftretenden und uncharakteristischen Symptome bei 1 - 3 % (WARSHAW, 1992; WHO, 1996). Zur Verbesserung der Langzeitergebnisse wird eine präoperative neoadjuvante Chemotherapie mit 5Fluorouracil und Mitomycin C in Kombination mit einer fraktionierten Bestrahlung angewandt, die jedoch laut verschiedener Studien nur für ein kleines Patientenkollektiv (1/3 bis 2/3) eine Steigerung der 5-Jahresüberlebenrate auf 11 - 15 % ermöglicht (HOFFMANN et al., 1995; YEUNG et al., 1993). Anderseits besteht bei nachgewiesener Metastasierung die Möglichkeit der palliativen Therapie. Diese sollte auf die vorhandenen oder zu erwartenden Symptome zentriert sein. Sie beschränken sich bei Tumorschmerzen z.B. auf Bestrahlung, beim Ikterus auf das Einbringen eines Stents oder einer Drainage in den Ductus choledochus bzw. insbesondere operativ bei Pankreaskopfkarzinomen auf die Durchführung einer biliodigestiven sowie einer Gastroenteroanastomose. Als weitere Alternativen zur Palliation ist noch die Möglichkeit der Chemoembolisation über den Truncus coeliacus zu erwähnen. Ebenfalls liegen erste Ergebnisse einer Immuntherapie beim Pankreaskarzinom vor, mit welcher bei einigen Patienten mit fortgeschrittenen Stadien ein Wachstumsstillstand erreicht werden konnte. Von einer Prognoseverbesserung kann aber nicht die Rede sein (SULKOWSKI et al., 1991). Die Prognose des unbehandelten Pankreaskarzinoms ist schlecht. Der durchschnittliche Krankheitsverlauf von den ersten Symptomen bis zum Tode an Metastasierung, Blutungen, Kachexie etc. beträgt im Durchschnitt 7 - 8 Monate (GROß, SCHÖLMERICH, GEROK, 1993). - 18 - II. Vorbemerkungen Der histologische Malignitätsgrad erweist sich als prognostisch stratifizierendes und zweifellos wertvolles Kriterium. Dennoch sollte zur Prognosebeurteilung über die bloße Stadieneinteilung hinaus weiterhin nach Faktoren gesucht werden, die eine enge Korrelation mit der Tumorzelldissimination reflektieren. In diesem Zusammenhang soll in dieser retrospektiven Studie mit dem immunhisochemischen Nachweis des zellproliferationsassoziierten Antigens Ki-67 und des BCL-2-Protoonkogens in duktalen Pankreaskarzinomen als Prognosefaktoren ein kleiner Beitrag in diese Richtung geleistet werden. II.3. PROLIFERATION Die Proliferation ist eine entscheidende Ursache für das Wachstum des Organismus. Die Lebensdauer der Zellen und ihre Teilungsfreudigkeit schwankt in weiten Grenzen. Es besteht jedoch normalerweise beim Erwachsenen ein ausgewogenes Verhältnis (steady state) zwischen Zelluntergang und Zellersatz, so daß der Zellbestand in etwa konstant bleibt, welches durch ein fein abgestimmtes Steuerungssystem kontrolliert wird. Die entprechenden Regulationsmechanismen greifen in die einzelnen Phasen des Zellzyklus ein. Der Zeitpunkt, zu dem eine Zelle in eine neue Zellzyklusphase eintritt sowie deren Dauer, wird durch Cycline in Verbindung mit einer cdc-2-Proteinkinase kontrolliert. Ihre Wirkung wird durch das Zusammenspiel mit bestimmten Genen wie den zyklusabhängigen Genen, den Protoonkogenen und den Suppressorgenen, moduliert. Daneben üben auch bestimmte Schlüsselenzyme des Intermediärstoffwechsels sowie Zellkontaktmechanismen eine Kontrolle auf den Teilungsmechanismus aus (RIEDE, SCHÄFER, 1995). Im folgenden wird in vereinfachter Form der Zellzyklus einer zur Mitose befähigten Zelle kurz wiedergegeben: Innerhalb des Zellzyklus liegen wechselweise Phasen niedriger und sehr hoher Proliferations- und Replikationsaktivitäten vor. In der Phase mit niedriger oder ruhender Aktivität sind die Teilungs- und Replikationsvorgänge in der Zelle abgeschlossen und sie befindet sich in der sogenannten G0-Phase (Gap = Lücke) des Zellzyklus. Die zwischen zwei Mitosen stattfindende Interphase mit hoher zellulärer Aktivität wird in die G1-Phase, S-Phase und G2-Phase unterteilt. In der G1-Phase wachsen die Zellen nach vorausgegangener Zellteilung wieder zu ihrer normalen Größe heran. Die Zellen können somit wieder die ihrer Differenzierung entsprechenden Aufgabe übernehmen. Im Anschluß an die - 19 - II. Vorbemerkungen Wachstumsphase erfolgt die Verdopplung der DNA durch Replikation. In dieser Phase wird die neue DNA synthetisiert und wird daher Synthese-Phase (S-Phase) genannt. Anschließend folgt die prämitotische G2-Phase, in welcher die Zelle durch die Bildung von Spindelfaserproteinen auf die folgende aus Prophase, Metaphase, Anaphase und Telophase bestehender Kernteilung vorbereitet wird. Im nun folgenden Abschnitt, der Zytokinese werden cytoplasmatische Bestandteile zufallsmäßig auf die beiden Tochterzellen verteilt. Es sind durch Zellteilung zwei identische Zellen entstanden, die ihrerseits nun wieder die zuvor beschriebenen Phasen durchlaufen. Der Vorgang der Zellproliferation steht, wie bereits erwähnt, normalerweise unter strikter Kontrolle verschiedener Proliferationsfaktoren und Proliferationsinhibitoren. Zu den Proliferationsfaktoren gehören je nach Organ bestimmte Geschlechtshormone, Vitamine (z.B. Vitamin B12), Protoonkogene und Wachstumsfaktoren. Protoonkogene sind physiologischerweise vorkommende Gensequenzen (c-onc), die sogenannte Oncoproteine codieren, welche die Funktion von Wachstumsfaktoren, Wachstumsfaktorrezeptoren oder Transkriptionsfaktoren einnehmen und für eine rasche effiziente Zellproliferation sorgen. Proliferationsinhibitoren dämpfen bzw. unterdrücken die Wirkung der Wachstumsfaktoren und Protoonkogene und werden deshalb auch als Suppressorgene bezeichnet. Sie fungieren zum Teil auch als Differenzierungsfaktoren und fördern damit nach der Proliferation der Zellen ihre Ausreifung, so daß diese wieder ihre gewohnte Funktion im Zellverband des jeweiligen Organs übernehmen kann. Im Gegensatz zu diesem Kontrollmechanismus kommt es im Rahmen der Kanzerogenese zu einer unkontrollierten Aktivierung von wachstumsinduzierten Genen (Onkogene) und zur Inaktivierung der wachstumshemmenden Genen (Tumorsuppressorgenen). Das dadurch entstandene Ungleichgewicht wachstumsfördernder bzw. hemmender Proteine führt so zu einer unkontrollierten Zellproliferation. II.4. APOPTOSE Die Apoptose ist definitionsgemäß eine Nekrose bestimmter Zellen in einem Gewebe, welche das mittelbare oder unmittelbare Resultat eines zelleigenen Selbstzerstörungsprozesses ist und durch eine Schrumpfung (= Schrumpfnekrose) charakterisiert ist. Der - 20 - II. Vorbemerkungen Prozeß beschränkt sich auf einzelne Zellen, welche wie dürre Blätter von einem herbstlichen Baum abfallen, so daß dieser Vorgang als APOPTOSE (gr.: abfallen) bezeichnet werden kann. Die Apoptose ist die typische Nekroseform des “Programmierten Zelltodes“ und läuft in diesem Zusammenhang über ein zelluläres “Selbstmordprogramm“ der Zelle ab. Die Zelle stirbt entweder durch eine eigene “Zeituhr“ oder durch ein von der Nachbarzelle aufgezwungenes Todesprogramm, wodurch jeder Zelle eines mehrzelligen Organs ermöglicht wird, sich in seiner Gesamtheit dem Wandel der Lebensbedingungen anzupassen. In dieses zelluläre “Selbstmordprogramm“ sind verschiedene Faktoren eingeschaltet, unter denen dem sog. p53-Tumorsuppressorgen die Funktion des “Treibers“ zukommt und das BCL-2-Protoonkogen die Funktion eines “Droßlers“ einnimmt. Als weitere beeinflussende Faktoren dieses Vorganges sind Zell-Stroma-Interaktionen, verschiedene DNS-Replikationsfaktoren, Wachstumsfaktoren und Zytokine zu erwähnen. Bei einigen Zellen ist das “Selbstmordprogramm“ an ihre Lebensdauer gekoppelt, wobei das Genom schrittweise solange reprimiert wird, bis nur noch ein einziges Protein gebildet wird. Meist geht der Zellkern mitsamt den Organellen zugrunde. Der programmierte Zelltod ist ein konstanter Begleiter der Gewebsmauserung und ist in gesteigertem Maße in den Mausergeweben nach Hyperthermie, Bestrahlung, und Zytostase zu beobachten. Eine defekte Apoptose spielt in der Tumorgenese einiger Tumoren eine große Rolle, wodurch Zellen unsterblich werden (= Tumorzell-Immortalisierung). Sie häufen sich ohne proliferationsmäßig zu wuchern im Gewebe an. Morphologisch sind im Falle des programmierten Zelltodes - im Gegensatz zum provozierten Zelltod - keine Zeichen einer zytoplasmatischen Anpassungsreaktion oder einer reparativ-resorptiven Entzündung zu beobachten. Der Abbau des Nekrosematerials erfolgt über Phagozytose (RIEDE, SCHÄFER, 1995). - 21 - II. Vorbemerkungen II.5. MOLEKULARBIOLOGISCHE ASPEKTE II.5.1. ALLGEMEINER ABLAUF DER KANZEROGENESE In den letzten Jahren wurden zahlreiche neue Erkenntnisse über die Entstehung maligner Tumoren gewonnen. Der Ablauf der Kanzerogenese wird in verschiedene Phasen eingeteilt und als Mehrstufen-Hypothese der Kanzerogenese bezeichnet. Durch die genetischen Veränderungen werden viele wichtige Prozesse der Zelle - wie z.B. die Proliferation und das Wachstum bzw. der Zellzyklus - beeinflußt. Als erster Schritt der Kanzerogenese bzw. als Initialphase wird die irreversible DNA-Schädigung in nur einer Zelle bezeichnet. Solange der genetische Schaden nicht auf die Tochterzelle übertragen wurde, kann dieser durch zelleigene DNA-Reparaturvorgänge aufgehoben werden. Durch den Einfluß verschiedener Kofaktoren kann die Effizienz der malignen Transformation unterstützt werden, was als Promotion bezeichnet wird. Die transformierte Zelle durchläuft nun nach einer Latenzzeit, die sich über 5 - 30 Jahre erstrecken kann, das Stadium der Progression, in dem sich der irreversible Übergang von einer präneoplastischen zu einer neoplastischen Zelle mit anschließender Proliferation eines Zellklons vollzieht. Makroskopisch entsteht so das Wachstum eines Tumorknotens mit eventueller darauffolgender Invasion und Metastasierung. II.5.2. MOLEKULARBIOLOGISCHE EBENE DES PANKREASKARZINOMS Wie für andere Neoplasien ist auch für das Pankreaskarzinom eine große Anzahl genetischer Aberrationen beschrieben worden. Diese Veränderungen der genetischen Information beeinflussen die erwähnten, für Entwicklung und Erhalt der Zelle außerordentlich wichtigen Prozesse der Proliferation und des Wachstums. Es besteht eine Assoziation mit der Aktivierung von Onkogenen, wie K-ras, der Inaktivierung von multiplen Tumorsuppressorgenen einschließlich p53, p16, DPC 4 und BRCA 2 sowie der Überexpression der Protoonkogen erbB-Genfamilie (SCHULZ, 1984; HRUBAN, PETERSEN et al., 1998; KORC, 1998 ). Nervale und humorale Faktoren regulieren ebenfalls das Pankreaswachstum. Neuropeptide, Hormone Zytokine und Wachstumsfaktoren stimulieren oder inhibieren den Zellzyklus. - 22 - II. Vorbemerkungen Dieses Fließgleichgewicht kann durch Onkogene oder durch Verlust von Tumorsuppressorgenen gestört sein. Unkontrolliertes Wachstum ist die Folge. II.5.2.1. ONKOGENE Eine veränderte Nucleotidsequenz macht - bedingt durch Genamplifikation, den Einbau von viralen Genen, durch chromosomale Veränderungen sowie durch Deletion oder Punktmutation - aus einem Protoonkogen ein mutiertes Onkogen. Die meisten Onkogene kodieren Proteine, wie Wachstumsfaktoren und -Rezeptoren, DNA-bindende Proteine, Kinasen und GTP-bindende Proteine. Die dabei auftretenden Veränderungen stören die Regulierung von Proliferation und Differenzierung. Eines der am besten untersuchten Beispiele ist die RAS-Genfamilie, die beim Menschen auf Chromosom 6 lokalisiert ist. Sie besteht aus drei eng verwandten Genen (H-ras, K-ras, N-ras). Alle drei Gene codieren für eng verwandte Guanosin-Triphosphat-bindende Proteine. Die Genprodukte können ein transformierendes Potential erhalten. Ermöglicht wird dies durch Überexpression des Normalproteins, verbunden mit einer Amplifikation der Gene. Daneben ist aber bei einer Reihe von Tumoren, wie dem Pankreas- und Kolonkarzinom, eine Punktmutation im ras-Gen nachgewiesen worden. Kritische Positionen für das Auftreten dieser Mutationen in allen drei ras-Genen gelten die Codone 12, 13 und 61 (SCHULZ et al., 1994). II.5.2.2. TUMORSUPPRESSORGENE Dies ist eine Gruppe von rezessiven Genen, welche unter physiologischen Bedingungen die Zellvermehrung unterbrechen. Die genetische Aufgabe der Tumorsuppressorgene ist die Inhibition der Onkogene, vermittelt über zahlreiche Mechanismen. Diese Funktionen beinhalten die Kontrolle des Zellzyklus, die Regulation der Transkription, der Kontrolle der Apoptose, die Zytoskelett-Funktion sowie die Wachstumsinhibition. - 23 - II. Vorbemerkungen Das sogenannte Genomwächterprotein p53 agiert als Kontrollpunkt im Zellzyklus (G1/S) zur Auffindung von DNS-Schäden und gegebenenfalls zur Induktion der Apoptose. In Zellinien des Pankreaskarzinoms ist die Funktion des p53 in nahezu 50 - 70 % aller Fälle inaktiviert. p16 kodiert für ein Protein, welches am Cyclin D-Cdk4-Komplex bindet und somit die Phosphorilierung einer Vielzahl von Wachstums- und Regulatorproteinen inhibiert. p16 gehört somit zum Zellzyklus-Kontrollkomplex. Die Inaktivierung von p53 und p16 ist nicht spezifisch für das Pankreaskarzinom. Dagegen weist der Funktionsverlust von Smad 4 / DPC 4 eine stärkere Assoziation in Zellinien des Pankreaskarzinoms auf (HRUBAN et al., 1998). TGFβ inhibiert normalerweise Onkogene durch Bindung an TGFBR 2 unter Interaktion mit ALK-5. ALK-5 vermittelt über Smad 2, 3 und 4 die Einbringung von DPC4 in den Zellkern, wo es an die DNA bindet und dadurch verschiedene down-regulierte Gene aktiviert. Die Einführung von normalem DPC 4 in Karzinomzellen, denen es an DPC 4 mangelt, bewirkt eine Wachstumshemmung. ALK-5 aktiviert neben DPC 4 noch andere Smad, welche an die Existenz von einigen non-DPC 4 vermittelten TGFβ-Signalwegen denken läßt. Resistenz gegen TGFβ vermittelte Wachstumsinhibition konnte in vitro für das Pankreaskarzinom und andere Tumortypen in über 80 % der Karzinomzellinien nachgewiesen werden. DPC 4 ist genetisch in 48 - 53 % der Pankreaskarzinom-Zellinien inaktiviert (KORC et al., 1998; DUFF et al., 1998). Die nachfolgende Tabelle 10 gibt einen Überblick über die derzeit bekannten Onkogene und Wachstumsfaktoren des Pankreasgewebes, deren Lokalisation und klinischen Bezug (P. DINSE, U. SULKOWSKI, H. NOTTEBERG, 1995/96). - 24 - II. Vorbemerkungen Tabelle 10: Onkogene und Wachstumsfaktoren des Pankreasgewebes Onkogen Literatur K-ras Bos, J .L. Hruban, R. H. Mutation Gewebe Bemerkungen 1989 128/156 → 82% CA Korreliert nicht mit 1993 68/82 → 83% CA Überleben / 1993 46/53 Yanagisawa, A. 1993 10/16 → 87% CA Tumorproliferation → 62,5% CP Scarpa, A. → 41% CA Motojima, K. P53 1993 14/34 Tritt gepaart mit K-rasVeränderungen auf Wachstums- Literatur Positiver Faktor EGF Gewebe Bemerkungen CA 15-fach erhöht; p < 0,0001 (Acinus / korreliert ∅ mit dem Gang- Grading Nachweis Korc, M. 1992 22/22 → 100% zelle) EGF-R Korc, M. 1992 22/22 → 100% CA 3-fach erhöht; p < 0,0001 → 63% CA 7-fach erhöht; p < 0,01 (HER-1) FGF-1 (aFGF) Friess, Korc, Büchler, 38/60 1994 korreliert mit dem Tumorstadium p < 0,05 Überleben ∅ FGF-1 (aFGF) Friess, H. 1994 16/21 FGF-2 (bFGF) Friess, Korc, Büchler 33/60 → 76% CP 14-fach erhöht; p < 0,01 → 55% CA 9-fach erhöht; p < 0,01 1994 korreliert mit dem Tumorstadium p < 0,05 Überleben p < 0,001 FGF-2 (bFGF) Friess, H. 1994 19/21 FGF-R Friess, Korc, Büchler 31/60 → 90% CP 15-fach erhöht; p < 0,01 → 52% CA Korreliert mit dem 1994 Tumorstadium p < 0,05, Überleben p < 0,01 TGF-α Korc, M. 1992 n=22 - 25 - - CA 10-fach erhöht; p < 0,0001 II. Vorbemerkungen Wachstums- Literatur Positiver Faktor TGF-β1 Gewebe Bemerkungen CA Korreliert mit dem Nachweis Friess,H. 1993 28/60 → 47% Tumorstadium ∅ Überleben p < 0,04 TGF-β2 Friess, H. 1993 25/60 → 42% CA Korreliert mit dem Tumorstadium < 0,05 Überleben p < 0,001 TGF-β3 Friess,H. 1993 24/60 → 40% CA Korreliert mit Tumorstadium ∅ Überleben p < 0,02 TβR-II Friess,H. 1993 n= 17 - Ca 4,6-fach erhöht; p < 0,01 TβR-III Friess,H. 1993 n=17 - Ca Nicht signifikant erhöht PCNA Isozaki,H. 1994 n=18 - PaCa Korreliert mit Tumorstadium p = 0,01 LK-Befall p = 0,048 mit EGF/EGF-R = epidermal growth factor / -Rezeptor FGF/FGF-R = fibroblastic growth factor / -Rezeptor TGF/TGF-R = transforming growth factor / -Rezeptor PCNA = proliferating cell nuclear antigen CP = chronische Pankreatitis CA = Karcinom PaCA = Papillenkarcinom - 26 - III. Material und Methode III. MATERIAL UND METHODE III.1. DAS UNTERSUCHUNGSGUT Dieser Untersuchung liegen 23 Pankreaskarzinom-Schnitte - hauptsächlich Adenokarzinome - zu Grunde. Die Schnitte waren zu Beginn dieser Arbeit bereits mit Formalin fixiert und in Paraffin eingebettet. Dieses Einsendegut aus den Jahren 1994 - 1996 der Abteilung für Pathologie an der Ruhr-Universität Bochum wurde zuvor im Institut nach ihrem Staging bzw. der TNM-Klassifikation und ihrem Differenzierungsgrad (Grading) entsprechend eingeteilt. Alle weiteren Informationen über den Krankheitsverlauf der Patienten stammen von dem Einsender des Untersuchungsgutes, der Universitätsklinik Knappschaftskrankenhaus in Bochum. III.2. BEURTEILUNGSKRITERIEN Die Schnitte der Pankreaskarzinome wurden nach ihrer Entparaffinierung mit der AvidinBiotin-Methode mit monoklonalen BCL-2-, und MIB-1-Antikörpern sowohl auf ihr Apoptoseverhalten als auch auf ihr Proliferationsverhalten immunhistochemisch untersucht. Beide Antikörper zeigen im Falle einer positiven Reaktion einen rotbraunen intranukleären Farbniederschlag (Fa. DIANOVA und DAKO). Pro Schnitt wurden 10 Gesichtsfelder bei 400-facher Vergrößerung ausgezählt und daraus jeweils die positiven Kernreaktionen im Verhältnis zu der Gesamtzellzahl prozentual berechnet. Die nachfolgende Tabelle 11 zeigt eine Übersicht über die Einteilungskriterien. Tabelle 11: Einteilungskriterien für die Auswertung der Untersuchung positive > 50 % 10 - 50 % < 10 % Zellkerne +++ ++ + - 27 - einzelne keine Zellkerne Zellkerne (+) - III. III.3. Material und Methode POLYKLONALE ANTIKÖRPER Nach Kontakt mit einem Antigen produziert jeder B-Lymphozyt Antikörper, die gegen ein spezifisches Epitop des Antigens gerichtet sind. Dies führt schließlich zur Ausbildung eines sogenannten Klons von Plasmazellen, die Antikörper produzieren und sezernieren (LÖFFLER, 1993). Da die meisten Antigene mehrere antigene Determinanten besitzen, werden unterschiedliche B-Lymphocyten aktiviert. Dabei entsteht eine größere Zahl an Plasmazellklonen, die sogenannte polyklonale Antikörper produzieren. Am häufigsten werden Kaninchen und Ziegen zur Produktion dieser Antikörper benutzt. III.4. MONOKLONALE ANTIKÖRPER Monoklonale Antikörper stellen für viele experimentelle und diagnostische Zwecke wichtige Werkzeuge dar. Diese Antikörper sind jeweils gegen eine antigene Determinante gerichtet. Nach Immunisierung mit einem Antigen entstehen somit nur einheitliche Antikörper eines B-Zellklons. Monoklonale Antikörper besitzen damit eine extrem hohe Selektivität (PETERS, BAUMGARTEN, 1985). Ein Verfahren zur Herstellung derartiger Antikörper ist 1975 von KÖHLER und MILSTEIN mittels der Hybridomtechnik entwickelt worden. Zur Erzeugung der Antikörper werden Milzzellen, die hauptsächlich aus B-Lymphocyten bestehen, aus einer bereits immunisierten Maus isoliert und experimentell mit Myelomzellen unter Zusatz von Polyethylenglycol fusioniert (LÖFFLER, 1993). Durch diesen Vorgang entsteht eine Immortalisierung der B-Lymphocyten, die dadurch beliebig lange in Zellkulturen gehalten werden können. So ist es möglich von je einer B-Zelle abstammende Klone herzustellen, die spezifische monoklonale Antikörper produzieren. - 28 - III. Material und Methode III.5. IMMUNPEROXIDASE-FÄRBETECHNIKEN Man unterscheidet hauptsächlich vier Methoden, in denen die Immunperoxidase Verwendung findet. Dazu gehören, die direkte, indirekte, PAP- und Avidin-Biotin-Methode, die im Einzelnen später erläutert werden. Immunenzymatische Färbemethoden beruhen auf der Fähigkeit spezifischer enzymgekoppelter Antikörper korrespondierende Antigene zu erkennen und darzustellen. Nach der Antigen-Antikörper-Reaktion läßt sich die Lokalisation des Antigens - unter Zusatz von H2O2 und einem als Elektronendonor fungierenden Chromogens - durch einen Farbumschlag erfassen. Voraussetzung dafür ist die Kupplung von Antikörper und Enzym unter Einsatz von verschiedenen Reagenzien. Dies sind z.B. Glutaraldehyd oder m`-Dinitrodiphenylsulfon (LUPPA, 1978). Der histochemische Peroxidasenachweis kann letztendlich über den Farbumschlag licht- oder elektronenmikroskopisch beurteilt werden. Die Farbe hängt von der Art des verwendeten Chromogens ab (NADJI, MORALES, 1986), das sich durch Oxidation in unlösliche und gefärbte Reaktionsprodukte umwandelt. Dabei wären als Chromogene zu erwähnen (BOENISCH,1989): Tabelle 12: Substrate der Peroxidase und ihre Farbreaktion Chemischer Name Abkürzung Farbumschlag 3-Amino-9-Ethylcarbazol AEC Rot 3,3´-Diaminobenzidin DAB Braunrot 4-Chlor-1-Naphtol CN Blau p-Phenylendiamin+ Hanker-Yates-Reagenz Schwarz Tetrahydrochlorid Pyrocatechol - 29 - III. Material und Methode III.6. DAS ENZYM PEROXIDASE Die verschiedenen Peroxidasen stellen ein Enzymsystem dar, dessen Hauptaufgabe die Zerstörung von H2O2 in den Zellen ist. Die gleiche Funktion können die Cytochrom-CPeroxidasen und die Katalase ausüben. Das aus der Meerrettichwurzel gewonnene Enzym Peroxidase besitzt ein Molekulargewicht von 40 kD. Es hat dadurch eine besondere Bedeutung bei Markierungen von Antikörpern, sowie als Marker-Enzym zur Kennzeichnung von Transport und Permeabilitätsprozessen in tierischen Geweben (LUPPA, 1978). Das Aktivitätszentrum der Peroxidasen enthält eine eisenhaltige Hämgruppe (Hämatin). Dieses bildet einen Komplex mit dem Substrat Wasserstoffperoxid. Dieser Komplex reagiert zusammen mit einem Elektronendonor und produziert anschließend die Endprodukte der Reaktion, nämlich ein Farbmolekül und Wasser. Die größere Empfindlichkeit der Immunperoxidase-Techniken liegt an dem Verstärkungsfaktor der Enzymtechnik. Ein Fluoreszensmolekül kann nur einen geringen Teil sichtbares Licht abgeben, ein Peroxidase-Enzym kann hingegen viele Farbmoleküle produzieren (BOURNE, 1983). Durch einen Substratüberschuß können Peroxidasen reversibel gehemmt werden, wobei der Komplex aus Peroxidase und einem Überschuß an Wasserstoffperoxid katalytisch inaktiv ist und bei Fehlen eines geeigneten Elektronendonators (z.B. einer chromogenen Substanz) reversibel blockiert wird. Dieses Prinzip - Überschuß an Wasserstoffperoxid, bei gleichzeitigem Fehlen eines Chromogens - ermöglicht die Unterdrückung der endogenen Peroxidase und führt zur Reduktion unspezifischer Hintergrundreaktionen (BOENISCH, 1989). Unter dem Begriff “endogene Peroxidasen“ werden zahlreiche Zellsysteme, die über eine Peroxidaseaktivität verfügen, zusammengefaßt (HEYDERMANN, 1979). Dazu werden z.B. die Zellen der Myelopoese mit der Myeloperoxidase, der Mastzellen mit der Mastzellperoxidase oder die Erythrozyten mit ihrem Hämoglobin, welches ebenfalls eine solche enzymatische Wirkung besitzt, gezählt (STRAUS, 1971). Diese Zellsysteme können ohne geeignete Blockierungsschritte zu falsch-positiven Färbeergebnissen führen. Weiterhin können folgende Methoden zur Blockierung der endogenen Peroxidase benutzt werden: - 30 - III. Material und Methode Tabelle 13: Methoden zur Blockierung der endogenen Peroxidase Ö Fixation in Methanol plus 1 % Essigsäure und 15 Natriumferricyanid Ö Ethanol plus 0,07 % HCL Ö Perjodsäure-Borhydrid (HEYDERMANN, 1979; KELLY et al., 1987) Ö Natriummetaperjodat Ö Wasserstoffsuperoxid allein (KÖLLER et al., 1986) Ö Wasserstoffsuperoxid (0,5 %) in Methanol für 15 min. (STEEFKERK, 1972) Ö Wasserstoffsuperoxid plus Phenylhydrazin-Hydrochlorid (STRAUS, 1972) Ö Wasserstoffsuperoxid plus 0,005 M Natrium-Azid (FARR, NAKANE, 1981) Ö Wasserstoffsuperoxid 0,04 % plus Natrium-Azid 0,65 % plus Nachbehandlung in Zitronensäure-Phosphatpuffer PH 2,3 für 20 min. (MALORNY et al., 1988) Ö Wasserstoffsuperoxid 1,5 - 2 % plus Natrium-Azid 0,1 % in PBS (ENDL, XU, PETERS, 1990) Folgende Immunperoxidasetechniken werden im Einzelnen beschrieben: a) Die direkte Methode b) Die 2-Schritt-indirekte Methode c) Die 3-Schritt-indirekte Methode d) Die Peroxidase-anti-Peroxidase-Methode (PAP-Methode) e) Die Avidin-Biotin-Methode Die Methoden d) + e) eignen sich in der Routine zur Untersuchung von in Paraffin eingebetteten Präparate (BOURNE, 1983; FRITZ et al., 1985). - 31 - III. Material und Methode a) Die direkte Methode Innerhalb dieser Methode ist bereits der Primärantikörper, der spezifisch gegen das zu untersuchende Antigen gerichtet ist, direkt mit dem Enzym, der Peroxidase, konjugiert (NAKANE, PIERCE, 1966; COONS et al., 1941). Nach Antigen-Antikörper-Kontakt kommt es schließlich zur Ausbildung eines Komplexes. Durch die sich anschließende Inkubation mit einem entsprechenden Chromogen entsteht ein Farbumschlag und die Reaktion ist somit beendet. Obwohl diese Methode zeitlich rasch durchführbar ist, und sie selten zu unspezifischen Reaktionen neigt, wird sie heute kaum noch angewandt und nicht mehr empfohlen. Nachteihaft ist, da nur ein einzelner Antikörper enzymmarkiert wird, die daraus resultierende mangelnde Signalverstärkung. Ferner müssen die spezifischen Antikörper für die zahlreichen verschiedenen darzustellenden Antigene jeweils mit der Peroxidase konjugiert werden. Weiterhin ist die direkte Methode von allen angewandten Immunperoxidaseverfahren die Methode mit der geringsten Sensitivität (BOURNE, 1983). Abbildung 1: Die direkte Methode - 32 - III. Material und Methode b) + c) Die indirekte 2-Schritt und 3-Schritt-Methode Bei dieser Methode reagiert ein unkonjugierter Primärantikörper mit dem Antigen. Nach Ausbildung des Antigen-Antikörper-Komplexes wird ein zweiter enzymmarkierter Antikörper dem Testsystem zugeführt und bindet sich an diesen Komplex. Das FC-Fragment des Primärantikörpers wird dabei vom Zweitantikörper als Antigen erkannt. Durch Zugabe des entsprechenden Chromogens und der darauffolgenden Substrat-Chromogen-Reaktion folgt schließlich der Farbumschlag. Die beschriebene Methode wird als 2-Schritt-Methode bezeichnet und kann durch Zugabe eines weiteren enzymmarkierten Antikörpers erweitert werden, wobei Sekundär und Tertiärantikörper jeweils mit dem selben Enzym markiert sind. Bei dieser Methode kann im Vergleich zur direkten Methode eine Vielzahl von Primärantikörpern aus einer Spezies mit dem gleichen markierten Zweitantikörper kombiniert werden. Da mehrere Zweitantikörper mit verschiedenen Epitopen des Primärantikörpers reagieren können, wird am Gewebsantigen die Zahl der Enzymmoleküle erhöht und somit die Empfindlichkeit der indirekten Methode um ein Mehrfaches verstärkt. Durch die bereits erwähnte 3-Schritt-Methode wird eine weitere Signalverstärkung erzielt. Vorrangig wird diese Methode zum Nachweis von Antikörpern im Serum von Patienten mit autoimmun, bakteriellen oder parasitären Erkrankungen eingesetzt (BOURNE, 1983). Abbildung 2: Die indirekte Methode - 33 - III. Material und Methode d) Die Peroxidase-Anti-Peroxidase-Methode Die Methode ist ursprünglich von STERNBERGER 1970 beschrieben worden und bietet im Vergleich zu den bereits beschriebenen Methoden durch die Verwendung des sogenannten PAP-Komplexes eine wesentlich höhere Sensitivität. Es ist so möglich unerwünschte Reaktionen der spezifischen Antigenbindungsstellen mit zellulärem Material zu vermeiden. Man arbeitet bei dieser Technik mit unkonjugierten monoklonalen Primärantikörpern, die sich mit dem Gewebsantigen zu einem Antigen-Antikörperkomplex zusammenschließen. Durch den Zusatz eines Brückenantikörpers, der mit dem FC-Fragment des Primärantikörpers eine Bindung eingeht, wird schließlich eine Verbindung zu dem PAP-Komplex hergestellt. Dabei müssen der Primärantikörper sowie der Antikörper des Enzymimmunkomplexes für die Verbindung der beiden durch den Brückenantikörper aus der selben Spezies stammen. Der PAP-Komplex ist ein Immunkomplex aus Peroxidase und dem Antikörper gegen Peroxidase (PETERS, 1985). Insgesamt besteht er aus 2 Antikörpern und 3 Peroxidasemolekülen (PETRALI et al., 1974). Nach Zusatz eines Chromogens ist schließlich der Farbumschlag zu beobachten, wobei durch den PAP-Kompex - im Gegensatz zur direkten und indirekten Methode - eine Verstärkung der Nachweisreaktion erreicht wird. Eine der wichtigsten Anwendungen dieser Methode liegt in der Bestimmung eines Tumorursprungs. Dabei werden von Zellen produzierte spezifische Antigene identifiziert. Dazu gehören Tumormarker wie z.B. PSA, hCG oder der Nachweis von Immunglobulinen. Es wird so eine genauere Klassifikation besonders bei schlecht differenzierten und metastasierten Tumoren - gewährleistet (BOURNE, 1983). - 34 - III. Material und Methode Abbildung 3: Die PAP-Methode e) Die Avidin-Biotin-Komplex-Methode (ABC-Methode) Diese Methode ist als erstes 1977 von HEGENESS und ASH in der Fluoreszensmikroskopie eingesetzt worden. Heutzutage wird hauptsächlich die 1981 von HSU et al. entwickelte Methode verwendet. Der vorliegenden Untersuchung liegt die Avidin-BiotinMethode zu Grunde. Diese Methode profitiert von der sehr hohen Affinität zwischen dem Protein Avidin und dem Vitamin Biotin (Affinitätskonstante 10 MOL/L). Avidin ist ein Glycoprotein mit vier Bindungsstellen und einem Molekulargewicht von 68 kD. Sein isoelektrischer Punkt (Ip) liegt um 10 (GREENE, 1975). Allerdings bewirken dieser hohe Ip und der Zuckeranteil eine relativ starke unspezifische Bindung an biologische Strukturen, wie z.B. an Zellmembranen. Diesen Nachteil kann man mit dem Einsatz eines zu Avidin analogen Proteins, dem sogenannten Streptavidin mit einem Ip im sauren Bereich, einem niedrigeren MG von 60 kD und einer fehlenden Zuckergruppe, umgehen (PETERS, 1985). - 35 - III. Material und Methode Biotin ist die wasserlösliche Form des Vitamin H. Es kann sich mit seinem kleinen Molekulargewicht von 244 Dalton (MOSS, LANE, 1971) über die Carboxylgruppe leicht an monoklonale Antikörper binden und so in der gekoppelten Form in vielen immunchemischen Techniken verwendet werden. Die Kopplung der monoklonalen Antikörper an Biotin weist im Vergleich zu der bereits beschriebenen direkten Konjugierung der Antikörper mit Enzymen wesentliche Vorteile auf. Es lassen sich einerseits pro Antikörpermolekül mehrere Biotinmoleküle binden, was zu einer erheblichen Signalverstärkung führt. Anderseits können biotinylierte Antikörper mit unterschiedlichen Avidin oder Streptavidinkonjugaten nachgewiesen werden. Wie bei den zuvor beschriebenen Methoden bindet auch bei der Avidin-Biotin-Methode ein Primärantikörper an das zu untersuchende Gewebsantigen. Nun folgt eine Inkubation mit einem Sekundärantikörper, der kovalent an Biotin gebunden und gegen den Primärantikörper gerichtet ist. Der nachfolgend zugegebene Avidin-Biotin-Peroxidase-Komplex lagert sich mit der freien Bindungsstelle des Avidins an das Biotin an. Der letzte Schritt dieser Methode stimmt wiederum mit dem der bisher beschriebenen überein. Nach Zugabe des Chromogens erfolgt also schließlich wieder über Oxidation der Farbumschlag, wobei dieser durch die bereits erwähnte Signalverstärkung eine hohe Intensität aufweist (PETERS, 1985). Abbildung 4: Die ABC-Methode - 36 - III. III.7. Material und Methode DIE VERWENDETEN ANTIKÖRPER In dieser Untersuchung von Pankreaskarzinom-Gewebe ist der monoklonale Antikörper MIB-1 der Firma DIANOVA und der monoklonale Antikörper BCL-2 der Firma DAKO verwendet worden. Beide eignen sich zur Anwendung an in Paraffin eingebetteten Geweben. Der Antikörper MIB-1 ist gegen das nukleäre zellproliferationsassoziierte Antigen Ki-67 gerichtet, welches auf dem Chromosom Nr. 10 lokalisiert ist und in allen aktiven Phasen des Zellzyklus exprimiert wird. Das Ki-67-Antigen ist ein bimolekularer Komplex mit einem Molekulargewicht von 345 und 395 kD (GERDES et al., 1984; SCHONK et al., 1998). MIB-1 wurde durch Immunisierung mit bakteriell exprimiertem Ki-67 gewonnen (Fa. DIANOVA). Es erkennt das Ki-67-Epitop, das in 9 von 16 concatemeren Wiederholungen im Exon 13 des Ki-67 Gens vorkommt. MIB-1 zeigt in proliferierende Zellen eine starke Kernfärbung auf. Durch die Verwendung des monoklonalen Antikörpers BCL-2 soll in dieser Arbeit das sogenannte BCL-2-Protoonkogen nachgewiesen werden. Dieses Protoonkogen ist ein Bestandteil vieler hochdifferenzierter Zellen, es übernimmt die Rolle des Gegenspielers zur Apoptose und ermöglicht damit längeres Zellüberleben (PEZZELLA et al., 1990). Ursprünglich wurde das BCL-2-Protooncogen in B-Zell-Lymphomen nachgewiesen (TSUJIMOTO et al., 1985), welche eine 14;18 Chromosomentranslokation aufwiesen und für die Überexpression von BCL-2 verantwortlich gemacht wurde (NYGAN et al., 1988). Das BCL-2-Protein wurde jedoch ebenfalls in Zellen ohne diese Translokation gefunden, wie zum Beispiel in lymphatischen Zellen der B- und T-Zellreihe, in lymphatischen Organen und in verschiedenen Lymphom-Formen (PEZZELLA et al., 1990). Ebenfalls gelang der Nachweis des BCL-2-Proteins in proliferierenden und lang lebenden ZellZonen wie z.B. in Drüsenepithelien, in komplex differenzierten lang lebenden Epithelien der Gesichtshaut, des Gastrointestinaltraktes und in postmitotischen Zellen der Neurone (HOCKENBERY et al., 1991). In einigen jüngeren Studien wird das BCL2-Protoonkogen im Zusammenhang mit einer multigenen BCL-2-Familie erwähnt, welche miteinander interagieren und den programmierten Zelltod regulieren. Dabei blockieren einige Mitglieder dieser Gen-Familie - wie zum Beispiel BCL-2, BCL-XL und MCL-1 - den Zelltod, wohingegen die Gene BAX und - 37 - III. Material und Methode BCL-XS als Promotor der Apoptose fungieren (OLTAVAI et al., 1993; BOISE et al., 1993; HANADA et al., 1995). Für MIB-1 wird von Seiten des Herstellers eine Verdünnung der Antikörper1:10 bis 1:100, für BCL-2 eine Verdünnung zwischen 1:40 bis 1:80 empfohlen. Vor Beginn der Färbung wurde für beide Antikörper eine optimale Verdünnung ausgetestet, die für MIB-1 bei 1:20 und für BCL-2 bei 1:40 liegt. Sowohl MIB-1-, als auch BCL-2-Expressionen zeigen unter dem Mikroskop einen rotbraunen intranukleären Farbniederschlag, welcher für die Auszählung ausschlaggebend war. III.8. Verwendete Reagenzien und Geräte Ö Leica-Jung SM 2000 R Mikrotom Ö Xylol Ö Alkohole 100 %, 95 %, 70 %, 50 %, 30 % Ö PBS (Phosphate Buffered Saline), Puffer der Fa. Sigma Diagnostics Ö Zitronensäurepuffer (bestehend aus Lsg. A = 0,1M Zitronensäure und Lsg. B = 0,1 M Natriumcitrat) Ö Philipps A 5100 Mikrowelle Ö Wasserstoffperoxid 1 % Ö Fettstift der Fa. DAKO Ö Vectastain ABC-Kit der Fa. Vector Laboratories mit folgendem Inhalt: Normalserum, biotinylierte Zweitantikörper, Avidin-Biotin-Komplexe Ö Antikörper BCL-2 der Fa. DAKO und MIB-1 der Fa. DIANOVA Ö AEC-Chromogen (kanzerogenes Potential) Ö Mayer`s Hämatoxylin Ö Glyceringelatine Ö Eindeckgläser Ö mit Poly-L-Lysin beschichtete Objektträger Ö Zeiss Axiophot (Mikroskop und Fotoeinheit) - 38 - III. III.9. Material und Methode SCHNEIDEN DER GEWEBEBLÖCKE UND AUFZIEHEN DER SCHNITTE AUF DEN OBJEKTTRÄGER Die in Paraffin eingebetteten Gewebeblöcke wurden an einem Leica-Jung SM 2000 R Mikrotom mit einer Gewebestärke von 5 µm geschnitten. Die Schnitte wurden im Anschluß daran in einem 37 °C warmen Wasserbad mit Hilfe eines Streckmittels (z.B. warmes Mineralöl) gestreckt und auf einen mit Poly-L-Lysin beschichteten Objektträger aufgezogen, wodurch das Abschwimmen der Schnitte verhindert werden soll. Diesem Vorgang schließt sich schließlich eine Trocknung der Schnitte über mehrere Stunden in einem ebenfalls 37 °C warmen Inkubator an. Durch die Beschichtung des Objektträgers ist später eine Mikrowellenbehandlung möglich . III.10. FÄRBEN DER PRÄPARATE Einige wichtige Färbeschritte werden nachfolgend ausführlicher erläutert: 1) Entparaffinieren und Rehydrieren der Schnitte Vor der histochemischen Färbung müssen in Paraffin eingebettete Schnitte von ihrem Einbettungsmedium Paraffin getrennt werden, da dieses zu unerwünschten Hintergrundfärbungen führen kann. Der erste Schritt der sogenannten Entparaffinierung ist die bereits beschriebene Verweildauer der Schnitte von mehreren Stunden in einem 37 °C warmen Inkubator. Dieser Erweichung des Paraffins schließt sich eine 30-minütige Behandlung der Schnitte mit Xylol an. Anschließend müssen die Gewebsschnitte eine absteigende Alkoholreihe (100 % 10 Min.; 95 %, 70 %, 50 % und 30 % für jeweils 5 Min.) zur Rehydrierung durchlaufen. Damit ist die Voraussetzung zur Mikrowellenbehandlung geschaffen. 2) Freilegen der Antigenstruktur durch Behandlung der Schnitte in einer Mikrowelle Um antigene Strukturen freizulegen müssen die Schnitte nach einem vorherigen Spülvorgang in PBS-Puffer 15 Minuten bei 100°C in Zitronensäurepuffer gekocht werden. Dieser Vorgang verbessert die Bindungsmöglichkeiten der Primärantikörper. Anschließend müssen die Schnitte 30 Minuten auf Raumtemperatur abgekühlt werden. - 39 - III. Material und Methode 3) Unterdrückung der Peroxidase Nun schließt sich ein weiterer Spülvorgang in PBS-Puffer an, dem eine 25-minütige Inkubation in 1 % Wasserstoffperoxid folgt. Durch diesen Vorgang wird die endogene Peroxidaseaktivität gehemmt. Nach Beendigung dieser Hemmung folgt wiederum ein Waschvorgang mit PBS-Puffer. 4) Inkubation mit Normalserum Um unspezifische Hintergrundfärbungen zu vermeiden, ist eine 10-minütige Inkubation mit Normalserum nötig. Dieser Schritt ist wichtig, da es sonst zu einer Anlagerung der im nächsten Schritt folgenden Primärantikörper an stark geladene Kollagen und Bindegewebselemente kommen könnte. Durch die Zugabe des Normalserums, das meist von einer Ziege stammt, werden nun die elektrisch geladenen Gewebsstellen besetzt. 5) Zugabe der Primärantikörper Die zuvor 1:20 verdünnten Antikörper MIB-1 und 1:40 verdünnten BCL-2Antikörper werden, nach Abtropfen des Normalserums, jeweils mit einem Volumen von 200 µl auf die Schnitte gebracht. Es folgt nun eine 1-stündige Inkubation. 6) Auftragen des Zweitantikörpers Nach Entfernung der überschüssigen Primärantikörper durch Waschen der Schnitte in PBS-Puffer wird der biotinylierte Zweitantikörper aufgetragen und für 10 Minuten inkubiert. 7) Einsatz des Avidin-Biotin-Peroxidase-Komplexes Durch den folgenden Waschvorgang in PBS-Puffer werden die nicht an den Prmärantikörper gebundenen biotinylierten Zweitantikörper von den Schnitten entfernt. Nun werden die Gewebsschnitte für 10 Minuten mit dem Avidin-BiotinPeroxidase-Komplex versehen. - 40 - III. Material und Methode 8) Zugabe des Chromogens Um die überschüssigen Avidin-Biotin-Peroxidase-Komplexe zu entfernen, muß sich nun wiederum ein Auswaschungsvorgang mit PBS-Puffer anschließen. Nun werden die Schnitte für 15 Minuten mit einem AEC-Chromogen versehen. Dieser Färbeschritt führt schließlich über einen Farbumschlag zur Darstellung positiver AntigenAntikörper-Reaktionen. 9) Gegenfärbung und Eindecken der Schnitte Da das entstandene Reaktionsprodukt in Alkohol und organischen Lösungsmitteln löslich ist, sollten zum Gegenfärben und Eindecken Produkte ohne alkoholische Basis verwendet werden. Es empfehlen sich daher zur Färbung Mayer´s Hämatoxilin und zum Eindecken flüssige Glyceringelatine (NADJI, MORALES, 1986). Ebenfalls sollten die gefärbten Präparate in dunklen Räumen gelagert werden, damit eine fortschreitende Oxidation des Chromogens vermieden werden kann (BOENISCH, 1989). III.11. FEHLERQUELLEN Innerhalb der beschriebenen Schritte besteht die große Gefahr, daß die Schnitte austrocknen oder abschwimmen, wodurch schließlich falsch-negative Ergebnisse entstehen können (NADJI, MORALES, 1986). Um ein Abschwimmen der Schnitte zu verhindern, sollten - wie bereits erwähnt - mit Poly-L-Lysin beschichtete Objektträger verwandt werden. Ebenfalls darf der Schnitt nicht zu dick sein oder zu viel Fettgewebe besitzen. Weiterhin sollte die Zeit des Trocknens der Schnitte (optimal: über Nacht bei 37 °C) eingehalten werden. Die für die Austrocknung der Schnitte verantwortliche Hauptquelle ist die Bearbeitung dieser in der Mikrowelle. Es ist dabei zu beachten, daß der dafür verwandte Citratpuffer aus Natriumcitrat und Zitronensäure hergestellt wird und dieser die Schnitte während des Kochvorgangs permanent umgibt. - 41 - III. Material und Methode III.12. VERWENDUNG VON KONTROLLEN Zur Überprüfung der korrekten Färbung der in dieser Arbeit zu untersuchenden PankreasKarzinom-Präparate, wurde bei jedem Färbedurchgang mit dem monoklonalen Antikörper BCL-2 als positive Kontrolle Tonsillengewebe mitgeführt. Als zusätzliche interne positive Kontrolle dienen die im Pankreasgewebe vorhandenen Lymphocyten bzw. Lymphfollikel. Durch das Mitführen dieser Kontrollen war es möglich zwischen unspezifischer Hintergrundreaktion und korrektem Antigennachweis zu unterscheiden. Im Rahmen der Färbungen mit dem Antikörper MIB-1 wurde jedoch keine positive Kontrolle mitgeführt, da die Karzinome selbst als interne Kontrollen gelten. Durch Weglassen des Primärantikörpers wurden bei beiden Antikörpern immer negative Kontrollen mitgeführt. Zum Abschluß dieses Kapitels nun noch eine ausführliche Übersicht über die einzelnen Arbeitsschritte der ABC-Methode: (1) Aufziehen der Schnitte auf beschichtete Objektträger (Menzel Super Frost Plus) (2) Über Nacht bei 37 °C 10 Brutschrank trocknen lassen (3) 15-minütiges Einstellen der Präparate in Formalin (4) Entparaffinieren : 30min. Xylol (5) - 10 min. 100 % Alkohol - 10 min. 95 % Alkohol - 5 min. 70 % Alkohol - 5 min. 50 % Alkohol - 5 min. 30 % Alkohol - 5 min. Aqua dest. - 10 min. PBS Einstellen der Schnitte in Citratpuffer (9 ml Lösung A, 41ml Lösung B, 450 ml Aqua dest.) - 42 - III. Material und Methode (6) 15-minütiges Erhitzen in der Mikrowelle bei 100 °C (7) Abkühlen der Objektträger für 30 min. (8) 5 Minuten Waschen in PBS-Puffer (9) Einkreisen der Präparate mit einem Fettstift und Objektträger in eine feuchte Kammer bringen (10) 25-minütige Inkubation mit 1 % H2O2 zur Blockierung der endogenen Peroxidase (11) 5 Minuten Waschen in PBS-Puffer (12) Abtrocknen der Objektträger (13) 10-minütige Inkubation mit Normalserum (1 - 2 Tropfen) (14) Normalserum nur abtropfen lassen (keine Waschung) (15) Auftragen der vorverdünnten (s.o.) Primärantikörper je 200 µl pro Schnitt, dann Inkubation für 1 Stunde (16) 5 Minuten Waschen in PBS-Puffer (17) Abtrocknen der Objektträger (18) 10-minütige Inkubation mit dem Sekundärantikörper (1 - 2 Tropfen) [biotinylierter Goat-Anti (Mouse, Rabbit, Guinea, Pig, Rat) IgG] (19) 5 Minuten Waschen in PBS-Puffer (20) Abtrocknen der Objektträger (21) 10 Minuten Inkubation mit Streptavidin- Peroxidase-Konjugat (1 - 2 Tropfen) (22) 5 Minuten Waschen in PBS-Puffer (23) Abtrocknen der Objektträger (24) 15 Minuten Inkubation mit AEC-Chromogen (Ansatz für 10 Schnitte: 1 ml Aqua dest. + je 1 Tropfen A+B+C), 100 µl pro Schnitt (25) 10-minütiges Auswaschen der Präparate mit PBS-Puffer, danach Waschen mit Aqua dest. (26) Präparate 15 sec. mit Mayers Hämalaun gegenfärben und in Leitungswasser bläuen (27) Eindecken der Schnitte mit Kaisers flüssiger Glyceringelatine und Aufbringen der Deckgläser (28) mikroskopische Auswertung der Antigen-Antikörper-Reaktion - 43 - III. Material und Methode III.13 IMMUNHISTOCHEMISCHE BEFUNDE Abbildung 5: Immunhistochemische Darstellung des BCL-2- Onkoproteins eines pT2, pN1, pM0, G2 duktalen Adenokarzinoms des exokrinen Pankreas. Anfärbung mittels des monoklonalen Antikörpers BCL-2 nach der ABC-Methode. (Originalvergrößerung 400-fach) - 44 - III. Material und Methode Abbildung 6: Immunhistochemische Darstellung des proliferationsassoziierten Antigens Ki-67 eines pT2, pN0, pM0, G2, duktalen Adenokarzinoms des exokrinen Pankreas. Anfärbung mittels des monoklonalen Antikörpers MIB-1 nach der ABC-Methode. (Originalvergrößerung 200-fach) - 45 - III. Material und Methode Abbildung 7: Immunhistochemische Darstellung des proliferationsassoziierten Antigens Ki-67 eines pT3, pN1, pM1, G2, duktalen Adenokarzinoms des exokrinen Pankreas. Anfärbung mittels des monoklonalen Antikörpers MIB-1 nach der ABC-Methode. (Originalvergrößerung 100-fach) - 46 - III. Material und Methode Abbildung 8: Immunhistochemische Darstellung des proliferationsassoziierten Antigens Ki-67 eines pT2, pN0, pM0, G2, duktalen Adenokarzinoms des exokrinen Pankreas. Anfärbung mittels des monoklonalen Antikörpers MIB-1 nach der ABC-Methode. (Originalvergrößerung 200-fach) - 47 - III. Material und Methode Abbildung 9: Immunhistochemische Darstellung des proliferationsassoziierten Antigens Ki-67 eines pT2, pN1, pM0, G2, duktalen Adenokarzinoms des exokrinen Pankreas. Anfärbung mittels des monoklonalen Antikörpers MIB-1 nach der ABC-Methode. (Originalvergrößerung 400-fach) - 48 - III. Material und Methode Abbildung 10: Immunhistochemische Darstellung des proliferationsassoziierten Antigens Ki-67 eines pT2, pN1, pM1, G2, duktalen Adenokarzinoms des exokrinen Pankreas. Anfärbung mittels des monoklonalen Antikörpers MIB-1 nach der ABC-Methode. (Originalvergrößerung 400-fach) - 49 - IV. ERGEBNISSE Die untersuchten Adenokarzinome des Pankreasgewebes wurden jeweils hinsichtlich der Lokalisation, des Alters, der Überlebenszeit (in Tagen), der Therapie (OP bzw. Chemo / Radiatio) und der aufgetretenen Rezidive eingeteilt. Ebenfalls wurde eine Zuordnung des Stagings und des Gradings vorgenommen. Im folgenden Kapitel werden zunächst die allgemeinen pathologisch-anatomischen Daten des Patientenkollektivs erläutert. Des weiteren wird das immunhistochemische Verhalten der Antikörper BCl-2 und MIB-1 im Pankreasgewebe den verschiedenen Unterteilungskriterien gegenübergestellt. Zu Beginn folgt eine Aufstellung der Ergebnisse in Form einer Tabelle. -50- IV. Ergebnisse - 51 - IV. Ergebnisse IV.1. PATIENTENKOLLEKTIV SOWIE ALLGEMEINE PATHOLOGISCH-ANATOMISCHE DATEN In der vorliegenden Arbeit wurden Krankenakten von 23 Patienten ausgewertet, bei denen im Zeitraum von September 1993 bis Dezember 1996 die klinische Diagnose eines Pankreastumors gestellt und histologisch gesichert wurde. Daraufhin erfolgte eine Nachbeobachtungszeit bis Oktober 1997. Zum Zeitpunkt der Diagnose befand sich der Großteil des Patientenkollektivs bereits in einem fortgeschrittenen Stadium der Erkrankung. In 61 % der Fälle hatte der Tumor bereits die Organgrenze überschritten und wurde als T2-Tumor diagnostiziert. Bei 30 % der Patienten handelte es sich um Tumoren im T3-Stadium. Lediglich in 9 % der Fälle war der Tumor noch auf das Pankreas begrenzt und konnte als T1-Tumor eingestuft werden. Zum Zeitpunkt der operativ-histologischen Diagnose hatten 43 % der Patienten noch keine Lymphknotenmetastasen, wohingegen in 57 % der Fälle eine lymphogene Metastasierung nachweisbar war. 78 % der Patienten wiesen einen M0-Status auf, das heißt, es konnte ein fehlender Nachweis für Fernmetastasen erbracht werden, wobei bereits in 22 % der Fälle eine Metastasierung vor allem in Leber und Knochen diagnostiziert wurde (siehe auch Abbildung 11). Nach der Einteilung der Patienten in die Stadienklassifizierung der UICC ließ sich bei 22 % der Patienten ein Stadium I, bei 13 % ein Stadium II und bei 43 % der Patienten ein Stadium III feststellen. 22 % der Patienten befanden sich bereits zum Zeitpunkt der Diagnose im IV Stadium (siehe auch Abbildung 12). Entsprechend der histologischen Differenzierung der Tumoren lag kein Tumor in einem gut differenzierten Stadium vor. Bereits 96 % der Patienten besaßen mäßig differenzierte Drüsen, welche dem Differenzierungsgrad G2 entsprechen. In 4 % der Fälle lagen bereits schlecht differenzierte (= G3) Tumoren vor (siehe auch Abbildung 13). Von den 23 diagnostizierten Tumoren waren 87 % der Tumoren im Pankreaskopf lokalisiert, in 4 % der Fälle konnte eine diffuse Lokalisation nachgewiesen werden. Die restlichen 9 % der Fälle befanden sich in der Papillenregion. Diese Angaben stimmen in etwa mit den Angaben der Literatur überein. - 52 - IV. Ergebnisse Die Geschlechtsrelation des untersuchten Patientenkollektivs ist in Abbildung 14 dargestellt. Es bestand ein Verhältnis Männer : Frauen von 1,6 : 1, welches mit der in der Literatur angegebenen Relation übereinstimmt. In der vorliegenden Arbeit liegt der Altersdurchschnitt der Patienten mit einem Adenokarzinom bei 66,3 Jahren und stimmt damit ebenfalls mit den bereits erwähnten Daten überein. Das durchschnittliche Alter der Frau ist mit 67,7 Jahren höher als das der Männer mit 65,4 Jahren. Die jüngste Frau erkrankte bei dieser Untersuchung im Alter von 53 Jahren, während das Alter des jüngsten männlichen Patienten 52 Jahre beträgt. Die älteste Frau erkrankte im Alter von 76 Jahren, wohingegen der älteste Mann mit 79 Jahren ein Pankreaskarzinom entwickelte. Die Altersverteilung, grob eingeteilt in drei verschiedene Altersklassen, wird - bezogen auf das Geschlecht - in Abbildung 14 wiedergegeben. Betrachtet man die Therapie der in dieser Arbeit vorliegenden Pankreaskarzinome, so wurden 87 % der Patienten einer Whipple‘schen Operation unterzogen. Bei lediglich zwei Patienten bestand zusätzlich eine Indikation zur Chemotherapie, ein Patient wurde neben der Operation zusätzlich bestrahlt. Eine 5-Jahres-Überlebensrate konnte in dem Untersuchungszeitraum bis zum Oktober 1997 nicht bestimmt werden. - 53 - Ergebnisse Anzahl Patienten 20 15 10 5 0 pT1 pT2 pT3 pN0 pN1 pM0 pM1 Abbildung 11: Verteilung der Patienten zum Zeitpunkt der Diagnosestellung nach der TNM-Klassifikation der UICC 60% Patienten in % IV. 43% 40% 22% 20% 22% 13% 0% St I St II St III Abbildung 12: Verteilung der Patienten zum Zeitpunkt der Diagnosestellung nach dem Tumorstadium der UICC - 54 - St IV Ergebnisse 96% Prozent 100% 50% 4% 0% 0% G1 G2 G3 Abbildung 13: Verteilung der Patienten zum Zeitpunkt der Diagnosestellung nach dem Differenzierungsgrad Anzahl Patienten IV. 23 25 20 14 15 10 10 5 4 5 1 6 4 8 9 4 4 0 51-60 Jahre 61-70 Jahre 71-80 Jahre männlich Abbildung 14: Alters- und Geschlechtsverteilung - 55 - weiblich gesamt gesamt IV. Ergebnisse IV.2. ERGEBNISSE IM BEZUG ZUM pT-STATUS Es liegen insgesamt zwei pT1-klassifizierte Tumoren, 14 Karzinome im pT2- und sieben Karzinome im pT3-Stadium vor. IV.2.1. ERGEBNISDARSTELLUNG FÜR DEN ANTIKÖRPER MIB-1 In einem der zwei Karzinome im Tumorstadium pT1 kann in dieser Arbeit eine Proliferationsaktivität in < 10 % der Tumorzellen nachgewiesen werden (= 50 %). Vier der 14 pT2-klassifizierten Tumoren (= 28,6 %) weisen eine Proliferationsaktivität in 10 - 50 % der Zellen auf, wohingegen der MIB-1-Nachweis in 35,7 % der Karzinome (5/14) dieses Tumorstadiums nur in jeweils < 10 % der Tumorzellen gelingt. In einem Tumor der sieben pT3-klassifizierten Tumoren (= 14,3%) ist in 10 - 50 % der Zellen ein Proliferationsnachweis möglich. 42,85 % der Karzinome (= 3/7) dieses Stadiums dahingegen weisen in < 10 % der Zellen eine Proliferationsaktivität auf. Die nachfolgende Tabelle 15 gibt die erwähnten Ergebnisse wieder. Tabelle 15: Nachweis der MIB-1-Expression in Korrelation zum pT-Status Fallzahl positive Intensität der MIB-1-Expression Fälle +++ ++ + (+) negativ Gesamt 23 14 0 5 9 0 9 pT1 2 1 0 0 1 0 1 pT2 14 9 0 4 5 0 5 pT3 7 4 0 1 3 0 3 Zum besseren Verständnis der Tabellen dieses Kapitels werden die Einteilungskriterien für die Auswertung dieser Arbeit in der folgenden Tabelle 16 nochmals erläutert: - 56 - IV. Ergebnisse Tabelle 16: Einteilungskriterien für die Auswertung der Untersuchung positive > 50 % 10 - 50 % < 10 % Zellkerne +++ IV.2.2. ++ einzelne keine Zellkerne Zellkerne + (+) - ERGEBNISDARSTELLUNG FÜR DEN ANTIKÖRPER BCL-2 Bei der Betrachtung der Intensität der BCL-2-Expression sind hinsichtlich der Tumoren im pT1-Stadium in 50 % (1/2) der Karzinome lediglich vereinzelte Tumorzellen mit einer BCL-2-Expression zu beobachten. In 21,4 % (3/14) der Adenokarcinome im pT2-Stadium ist in < 10 % der Tumorzellen der Nachweis des Antiapoptosemarkers BCL-2 möglich. In den Tumoren, welche ein pT3-Stadium aufweisen, kann keine BCl-2-Expression nachgewiesen werden (siehe auch Tabelle 17). Tabelle 17: Nachweis der BCL-2-Expression in Korrelation zum pT-Status Fallzahl Positive Intensität der BCL-2-Expression Fälle +++ ++ + (+) negativ Gesamt 23 4 0 0 3 1 19 pT1 2 1 0 0 0 1 1 pT2 14 3 0 0 3 0 11 pT3 7 0 0 0 0 0 7 - 57 - IV. Ergebnisse IV.3. ERGEBNISSE IM BEZUG ZUM pN-STATUS Von den insgesamt 23 Karzinomen werden 10 Tumoren als pN0-Stadium und 13 als pN1Stadium klassifiziert. IV.3.1. ERGEBNISDARSTELLUNG FÜR DEN ANTIKÖRPER MIB-1 Die Betrachtung der Ergebnisse liefert hinsichtlich der Anzahl der positiv reagierenden Zellkerne und damit hinsichtlich der Intensität der Proliferation folgendes Bild: Von den 10 Tumoren im pN0-Stadium ist in 10 % (1/10) der Fälle der Proliferationsnachweis mittels MIB-1 in 10 - 50 % der Zellen möglich. Innerhalb der selben Klassifizierungsgruppe kann in 40 % (4/10) der Fälle eine Proliferation in jeweils < 10 % der Tumorzellen nachgewiesen werden. Unter den Tumoren, welche eine lymphogene Metastasierung aufzeigen, weisen einerseits vier der 13 vorhandenen Karzinome (= 30,75 %) eine Proliferationsaktivität in 10 - 50 % der Tumorzellen auf, anderseits ist in 38,5 % (= 5/13) der Karzinome ein Proliferationsnachweis in < 10 % der Tumorzellen möglich. Die nachfolgende Tabelle 18 zeigt die Ergebnisse im Detail. Tabelle 18: Nachweis der MIB-1-Expression in Korrelation zum pN-Status Fallzahl positive Intensität der MIB-1-Expression Fälle +++ ++ + (+) negativ Gesamt 23 14 0 5 9 0 9 pN0 10 5 0 1 4 0 5 pN1 13 9 0 4 5 0 4 - 58 - IV. Ergebnisse IV.3.2. ERGEBNISDARSTELLUNG FÜR DEN ANTIKÖRPER BCL-2 Bezüglich der Intensität der BCL-2-Expression sind in 10 % (= 1/10) der pN0klassifizierten Tumoren vereinzelt positive Tumorzellen zu beobachten, 23,1 % der pN1Karzinome (= 3/13) weisen in < 10 % der Tumorzellen eine Hemmung der Apoptose auf (siehe auch Tabelle 19). Tabelle 19: Nachweis der BCL-2-Expression in Korrelation zum pN-Status Fallzahl positive Intensität der BCL-2-Expression Fälle +++ ++ + (+) negativ Gesamt 23 4 0 0 3 1 19 pN0 10 1 0 0 0 1 9 pN1 13 3 0 0 3 0 10 - 59 - IV. Ergebnisse IV.4. ERGEBNISSE IM BEZUG ZUM pM-STATUS Von den insgesamt 23 Karzinomen befinden sich 18 im pM0-Stadium und fünf im pM1Stadium. IV.4.1. ERGEBNISDARSTELLUNG FÜR DEN ANTIKÖRPER MIB-1 Bei der Betrachtung der Intensität der Proliferationsaktivität fällt folgendes Ergebnis auf: In 22,22 % der pM0- klassifizierten Tumoren (4/18) ist eine Proliferationsaktivität in 10 50 % der Tumorzellen nachweisbar, wohingegen 33,33 % (6/18) der Tumoren dieser Klassifizierungsgruppe eine Proliferation in < 10 % der Zellen aufweisen. Unter den fünf Tumoren im pM1-Stadium befindet sich ein Karcinom (= 20 %), welches eine Proliferation mittels des Antikörpers MIB-1 in 10 - 50 % der Tumorzellen aufzeigt. In 60 % (= 3/5) der Karzinome dieses Stadiums kann ebenfalls eine Proliferation in < 10 % der Tumorzellen beobachtet werden. Tabelle 20 gibt die einzelnen Ergebnisse wieder. Tabelle 20: Nachweis der MIB-1-Expression in Korrelation zum pM-Status Fallzahl positive Fälle Intensität der MIB-1-Expression +++ ++ + (+) negativ Gesamt 23 14 0 5 9 0 9 pM0 18 10 0 4 6 0 8 pM1 5 4 0 1 3 0 1 - 60 - IV. Ergebnisse IV.4.2. ERGEBNISDARSTELLUNG FÜR DEN ANTIKÖRPER BCL-2 Hinsichtlich der Intensität der BCL-2-Expression ist folgendes Ergebnis zu beobachten: 16,6 % (= 3/18) der Tumoren mit einer pM0-Metastasierung weisen eine BCL-2Expression in < 10 % der Tumorzellen auf. In 20 % (1/5) der Karzinome, welche als pM1 eingestuft wurden, kann lediglich in vereinzelten Tumorzellen eine BCL-2-Expression nachgewiesen werden. Die einzelnen Ergebnisse werden in Tabelle 21 aufgezeigt. Tabelle 21: Nachweis der BCL-2-Expression in Korrelation zum pM-Status Fallzahl positive Intensität der BCL-2-Expression Ergebnisse +++ ++ + (+) negativ Gesamt 23 4 0 0 3 1 19 pM0 18 3 0 0 3 0 15 pM1 5 1 0 0 0 1 4 Aus den bisherigen Tabellen ist ersichtlich, daß die Expression von MIB-1 und BCL-2 bei gleichem biologischem Verhalten unterschiedlich in der Anzahl der reagierenden Tumoren und der Anzahl der positiven Zellkerne ausfällt. Zusammengefaßt ist gegenüber MIB-1 in 14 von 23 Adenokarzinomen (= 61 %) eine Proliferationsreaktion zu beobachten. Neun der 23 Tumoren (= 39 %) weisen allerdings keine Proliferation auf. Bei der Betrachtung der Intensität der Proliferation ist in fünf Karcinomen (= 22 %) eine Proliferationsaktivität in 10 - 50 % der Tumorzellen und in neun Tumoren (= 39 %) eine Zellproliferation in < 10 % der Zellen zu beobachten. Gegenüber dem Antikörper BCL-2 ist in 17 % (4/23) der Fälle eine Hemmung der Apoptose zu beobachten, in 83 % der Tumoren (19/23) kann keine Reaktion nachgewiesen werden. Betrachtet man auch hier die Intensität der BCL-2-Reaktion, so fällt zu 13 % eine Reaktion der Tumoren in < 10 % der Tumorzellen auf. Vier Prozent (=1/23) der Karzinome zeigt vereinzelte Kernreaktionen auf den Antikörper. - 61 - IV. Ergebnisse IV. 5. ERGEBNISSE IM BEZUG ZUM TUMORSTADIUM NACH UICC Betrachtet man die Stadiengruppierung nach UICC in dieser Arbeit, so liegen fünf der Adenokarzinome im Stadium I und drei im Stadium II vor. Zehn der Tumoren werden dem Stadium III, fünf dem Stadium IV zugeordnet. IV.5.1. ERGEBNISDARSTELLUNG FÜR DEN ANTIKÖRPER MIB-1 Betrachtet man die Intensität der Proliferation, so zeigt sich folgendes Ergebnis: 60 % (3/5) der Adenokarzinome im Stadium I weisen eine Proliferationsaktivität in < 10 % der Tumorzellen auf, wohingegen 33,33 % (1/3) der Tumoren im Stadium II eine Reaktion auf den Antikörper in 10 - 50 % der Zellkerne aufzeigen. Im Stadium III sind in 30 % (3/10) der Tumoren positive Kernreaktionen in 10 - 50 % der Zellen nachweisbar. Ebenfalls weisen innerhalb dieses Stadiums 30 % (3/10) der Tumoren eine Proliferationsaktivität in < 10 % der Zellkerne auf. Schließlich ist im IV. Stadium in 20 % (1/5) der Tumoren eine Proliferationsaktivität in 10 - 50 % der Zellen und in 60 % (3/5) der Tumoren eine MIB-1-Expression in < 10 % der Zellkerne zu beobachten. Die folgende Tabelle 22 gibt eine Übersicht der Ergebnisse wieder: Tabelle 22: Nachweis der MIB-1-Expression im Bezug zum Tumorstadium nach UICC Fallzahl Positive Intensität der MIB-1-Expression Fälle +++ ++ + (+) negativ Gesamt 23 14 0 5 9 0 9 St. I 5 3 0 0 3 0 2 St. II 3 1 0 1 0 0 2 St. III 10 6 0 3 3 0 4 St. IV 5 4 0 1 3 0 1 - 62 - IV. Ergebnisse IV.5.2. ERGEBNISDARSTELLUNG FÜR DEN ANTIKÖRPER BCL-2 Hinsichtlich der Intensität der BCL-2-Expression sind - bezüglich der verschiedenen Stadien nach UICC - folgende Ergebnisse innerhalb dieser Arbeit zu beobachten: In den Stadien I und II ist keine BCL-2-Expression zu verzeichnen. Von den insgesamt zehn Tumoren des Stadiums III ist in 30 % (3/10) der Karzinome eine BCL-2-Expression in < 10 % der Tumorzellen zu beobachten. In 20 % (1/5) der fünf Tumoren, welche sich im Stadium IV befinden, ist eine BCL-2-Expression lediglich in vereinzelten Tumorzellen nachweisbar (siehe auch Tabelle 23). Tabelle 23: Nachweis der BCL-2-Expression im Bezug zur Tumorstadium nach UICC Fallzahl Positive Intensität der BCL-2-Expression Fälle +++ ++ + (+) negativ Gesamt 23 4 0 0 3 1 19 St.I 5 0 0 0 0 0 5 St.II 3 0 0 0 0 0 3 St.III 10 3 0 0 3 0 7 St.IV 5 1 0 0 0 1 4 - 63 - IV. Ergebnisse IV. 6. ERGEBNISSE IM BEZUG ZUM DIFFERENZIERUNGSGRAD Es liegt insgesamt ein Patientenkollektiv von 23 Patienten vor, das 22 mäßig differenzierte Tumoren (G2) und einen schlecht differenzierten Tumor (G3) aufweist. IV.6.1. ERGEBNISDARSTELLUNG FÜR DEN ANTIKÖRPER MIB 1 Die Auswertung der Untersuchung ergibt bei unterschiedlichem Grading der Adenokarzinome, bezüglich der Intensität der Proliferationsaktivität, für den Antikörper MIB-1 folgendes Bild: Unter den mäßig differenzierten Tumoren (G2) ist in 22,7 % der Fälle (= 5/22) eine Proliferationsaktivität in 10 - 50 % der Tumorzellen nachweisbar, wohingegen acht (= 36,4 %) eine Proliferationsaktivität in < 10 % der Zellen aufweisen. Schließlich zeigt das vorliegende schlecht differenzierte (G3) Karzinom in < 10 % der Tumorzellen positive Kernreaktionen bzw. eine Proliferationsaktivität auf. Eine Ergebnisübersicht ist in der folgenden Tabelle 24 wiedergegeben. Tabelle 24: Nachweis der MIB-1-Expression bezüglich der Einteilung der Adenokarzinome nach dem Differenzierungsgrad Fallzahl positive Fälle Intensität der MIB-1-Expression Gesamt 23 14 +++ 0 G1 0 0 0 0 0 0 0 G2 22 13 0 5 8 0 9 G3 1 1 0 0 1 0 0 - 64 - ++ 5 + 9 (+) 0 negativ 9 IV. Ergebnisse IV.6.2. ERGEBNISDARSTELLUNG FÜR DEN ANTIKÖRPER BCL-2 Für den Antikörper BCL-2 können folgende Ergebnisse bezüglich des Gradings und der Intensität der BCL-2-Expression beobachtet werden: In 13,6 % (3/22) der G2-differenzierten Tumoren ist in <10 % der Tumorzellen eine BCL2-Expression nachweisbar. In einem Tumor (= 4,5 %) dieses Differenzierunsgrades sind vereinzelt positive Kernreaktionen zu beobachten. Im gesamten übrigen Patientengut dieser Untersuchung können keine weiteren positiven Reaktionen gegenüber dem Antikörper BCL-2 nachgewiesen werden. (siehe auch Tabelle 25). Tabelle 25: Nachweis der BCL 2-Expression bezüglich der Einteilung der Adenokarzinome nach dem Differenzierungsgrad Fallzahl positive Intensität der BCL2-Expression Fälle +++ ++ + (+) negativ Gesamt 23 4 0 0 3 1 19 G1 0 0 0 0 0 0 0 G2 22 4 0 0 3 1 18 G3 1 0 0 0 0 0 1 - 65 - IV. Ergebnisse IV.7. STATISTIK Tabelle 26: Statistische Datenanalyse (Prüfung der Abhängigkeit zwischen prognostisch bedeutsamen Faktoren und einer MIB-1- bzw. einer BCL-2-Expression in duktalen Pankreaskarzinomen) Abhängigkeitsbeziehung Test cases p (corrected for Ties) pT-Status versus MIB-1 (%) Kruskal-Wallis 23 0,4676 pT-Status versus BCL-2 (%) Kruskal-Wallis 23 0,2841 pN-Status versus MIB-1 (%) Mann-Whitney U 23 0,2244 pN- Status versus BCL-2 (%) Mann-Whitney U 23 0,3480 pM-Status versus MIB-1 (%) Mann-Whitney U 23 0,4892 pM-Status versus BCL-2(%) Mann-Whitney U 23 1,0000 23 0,8505 23 0,4126 Kruskal-Wallis 23 0,9852 Mann-Whitney U 23 0,0912 23 0,8233 23 0,4416 Tumorstadium n. UICC versus Kruskal-Wallis MIB-1 (%) Tumorstadium n. UICC versus Kruskal-Wallis BCL-2 (%) pT-Status versus MIB-1 (Intensität 0/+/++) pT-Status versus BCL-2 (Intensität 0/+) Tumorstadium n. UICC versus Kruskal-Wallis MIB-1 (Intensität 0/+/++) Tumorstadium n. UICC versus Kruskal-Wallis BCL-2 ( Intensität 0/+) - 66 - IV. Ergebnisse Tabelle 27: Durchschnittswerte der immunhistochemischen Untersuchung in Korrelation zum pT-Status Ergebnisse für das pT1-Stadium Nummer MIB-1e BCL-2 Durchschnittliche Ergebnisse für das pT2-Stadium Ergebnisse für das pT3-Stadium Nummer MIB-1 positive Durchschnittliche Reaktionen pro Gesichtsfeld 1 0,8 0,8 BCL-2 Nummer positive MIB-1 Durchschnittliche Reaktionen pro Gesichtsfeld 1 1,6 0,9 1 3,1 2 2,2 3,1 2 9,0 3 4,3 3,3 3 4,1 4 8,2 4 7,4 5 11,7 6 7,3 7 12,5 8 5,8 9 2,4 0,8 0,8 Mittelwert 6,2 2,43 Mittelwert 5,9 Mittelwert- 0 0 Mittelwert- 3,28 1,023 Mittelwert- 2,3 Prozentual abweichung 0 0 abweichung Prozentual 52,9% 42,1% Prozentual Mw- Mw- Mw- Abweichung Abweichung Abweichung - 67 - positive Reaktionen pro Gesichtsfeld Mittelwert Abweichung BCL-2 38,98% IV. Ergebnisse Tabelle 28: Durchschnittswerte der immunhistochemischen Untersuchung in Korrelation zum pN-Status Ergebnisse für das pN0-Stadium Nummer MIB-1 BCL-2 Durchschnittliche Ergebnisse für das pN1-Stadium Nummer positive 0,8 2 0,8 BCL-2 Durchschnittliche Reaktionen pro Gesichtsfeld 1 MIB-1 positive Reaktionen pro Gesichtsfeld 1 1,6 0,9 2,2 2 3,1 3,1 3 8,2 3 4,3 3,3 4 5,8 4 11,7 5 7,4 5 7,3 6 9,0 7 12,5 8 4,1 9 2,4 Mittelwert 4,88 0,08 Mittelwert 6,2 2,43 Mittelwert- 2,704 0 Mittelwert- 3,468 1,023 55,94% 42,112% abweichung prozentual abweichung 55,4% 0 prozentual - 68 - IV. Ergebnisse Tabelle 29: Durchschnittswerte der immunhistochemischen Untersuchung in Korrelation zum pM-Status Ergebnisse für das pM0-Stadium Ergebnisse für das pM1-Stadium Nummer MIB-1 BCL-2 Durchschnittliche Nummer positive MIB-1 BCL-2 Durchschnittliche Reaktionen pro Gesichtsfeld 1 1,6 0,9 1 0,8 2 2,2 3,1 2 3,1 3 4,3 3,3 3 9,0 4 8,2 4 12,5 5 11,7 6 7,3 7 4,1 8 5,8 9 2,4 10 7,4 Mittelwert 5,5 2,43 Mittelwert 6,35 0,8 Mittelwert- 2,61 1,023 Mittelwert- 4,4 0 69,29% 0 abweichung prozentual 0,8 abweichung 47,45% 42,11% positive Reaktionen pro Gesichtsfeld prozentual - 69 - IV. Ergebnisse - 70 - V. Diskussion V. DISKUSSION V.1. NACHWEIS DES ANTIGENS KI-67 UND DES BCL-2-ONKOPROTEINS ALS PROGNOSEFAKTOREN IN DUKTALEN PANKREASKARZINOMEN MIT DEN MONOKLONALEN ANTIKÖRPERN MIB-1 UND BCL-2 Innerhalb der letzten Jahre hat die Anwendung monoklonaler Antikörper zur pathologischen Diagnostik zunehmend an Bedeutung gewonnen. Sie ermöglicht in zahlreichen Fällen, ergänzend zu konventionellen histologischen Färbungen, die Durchführung einer besseren Klassifizierung von Gewebeproben. Ebenfalls sind durch dieses Verfahren klinisch-pathologische Aussagen bezüglich diverser Tumorerkrankungen möglich geworden. Im Rahmen der Diagnostik maligner Pankreastumoren, die eine verhältnismäßig ungünstige Prognose unter soliden Tumoren besitzen, sind bisher in diesem Zusammenhang eine Reihe von Onkogenen und Wachstumsfaktoren nachgewiesen worden (siehe Tabelle 10). In dieser Arbeit wurde mit Hilfe der ABC-Methode - unter Verwendung der monoklonalen Antikörper MIB-1 und BCL-2 - die Proliferationsaktivität bzw. die Expression von BCL-2 als Hemmer der Apoptose an 23 in Paraffin eingebetteten Adenokarzinomen bezüglich der Korrelation zu potentiell prognostisch bedeutsamen pathologisch-anatomischen Faktoren untersucht. Die Auswertung der Ergebnisse dieser Untersuchung wird folgend gemäß der TNM-Klassifikation, der Tumorstadieneinteilung nach UICC und dem Differenzierungsgrad aufgeführt und den Angaben der Literatur gegenübergestellt. Bei der Auswertung soll der Schwerpunkt auf dem biologischen Verhalten der Tumoren in Korrelation zur Intensität der MIB-1- bzw. BCL-2-Expression liegen. Ausführungen bezüglich einer retrospektiven statistischen Bearbeitung der entsprechenden Daten werden jeweils ergänzend an die nachfolgenden Kapitel angehängt. Wie bereits erwähnt, ist insgesamt in 61 % der Adenokarzinome der Nachweis von Ki-67 durch den monoklonalen Antikörper MIB-1 und damit der Nachweis einer Proliferationsaktivität möglich. Folglich weisen 39 % der Tumoren bei dieser Untersuchung keine - 71 - V. Diskussion Proliferationsaktivität auf. Dieses Ergebnis ist überraschend, da in allen Pankreaskarzinomen der Nachweis einer gewissen Proliferationsaktivität zu erwarten gewesen wäre. Es ist anzunehmen, daß die Karzinome mit einer negativen MIB-1Reaktion Fixierungsartefakte oder eine Überhitzung bei der Aufbereitung des Materials erfahren haben, eine Antigenmaskierung erfolgte und sich somit ein negatives Reaktionsergebnis ergab. Bei der Betrachtung der Intensität der Proliferation ist eine Zunahme der Proliferationsaktivität mit fortschreitender Tumorprogression zu erwarten. In insgesamt 17 % der Adenokarzinome ist der Nachweis einer BCL-2-Expression möglich, während in 83 % keine Expression zu verzeichnen ist. Dieses schlechte Färbeverhalten des Patientengutes entspricht ebenfalls nicht den Erwartungen an diese Untersuchung. Eine Auswertung der Ergebnisse ist aufgrund des stark verminderten Färbeverhaltens der Tumoren auf den Antikörper BCL-2 leider nicht möglich. Auf die Diskussion der aufgeführten Färbungsergebnisse dieses Antikörpers wird daher in diesem Kapitel verzichtet. Im Vorhinein wäre auch hier eine Zunahme der Apoptosehemmung, d.h. ein verlängertes Zellüberleben mit ansteigender Tumorprogression zu erwarten gewesen. Die extrem schwache Reaktion des Gewebes auf den Antikörper BCL-2 ist hier ebenfalls am ehesten auf Fixierungsartefakte oder eine Überhitzung des Gewebes während der Aufbereitung des Materials zurückzuführen. Als weitere Fehlerquelle kommt eine verminderte Sensitivität der Methode bzw. der Antikörper in Frage. Spezielle methodische Fehler, welche im Rahmen dieser immunhistochemischen Färbung unterlaufen konnten, werden in diesem Kapitel noch diskutiert. V.1.1. pT-STATUS Vergleicht man die Ergebnisse der MIB-1-Expression im Bezug zu den verschiedenen pTStadien, so ist wider der Erwartungen - unter Berücksichtigung der geringen Patientenzahl der einzelnen Stadien - keine Korrelation der Proliferationsintensität mit ansteigendem pTStadium zu verzeichnen. Es ist hier eher eine entgegengesetzte Tendenz zu beobachten. So ist unter den sich im pT1-Stadium befindlichen Tumoren eine Proliferationsaktivität in < - 72 - V. Diskussion 10 % der Tumorzellen in 50 % der Karzinome nachweisbar. Im pT2-Stadium können 35,7 % der Tumoren mit einer entsprechenden MIB-1-Expression beobachtet werden. Schließlich gelingt in 42,85 % der Tumoren im pT3-Stadium der Nachweis einer Proliferation in < 10 % der Tumorzellen. Betrachtet man nun die verschiedenen Tumorstadien anhand der nachgewiesenen Proliferationsaktivität in 10 - 50 % der Tumorzellen, so ist diese Proliferationsaktivität in 28,6 % der Tumoren im pT2-Stadium und in 14,3 % der sich im pT3-Stadium befindlichen Karzinome zu beobachten (siehe auch Abbildung 15). 100% Fälle in % 80% 60% 40% 20% 0% pT 1 pT 2 < 10 % 10 - 50 % pT 3 negativ Abbildung 15: Färbungsintensität von MIB-1 in Korrelation zum pT-Status Eine ähnliche Studie von GANSAUGE et al. aus dem Jahre 1998 zeigte ebenfalls keine signifikanten Zusammenhänge zwischen einer Expression des proliferationsassoziierten Antigens Ki-67 und den verschiedenen pT-Stadien in Pankreaskarzinomen auf. Der Nachweis einer signifikanten BCL-2-Expression gelang in diesem Zusammenhang ebenfalls nicht. Diese immunhistochemischen Untersuchungen wurden mit den monoklonalen Antikörpern MIB-1 und BCL-2 durchgeführt. - 73 - V. Diskussion Auch MIYAMOTO et al. verzeichneten in ihrer Studie (1999) mittels monoklonaler BCL2-Antikörper keine signifikante Beziehung zwischen einer Expression des BCL-2Protoonkogens und den verschiedenen pT-Stadien. Betrachtet man im Vergleich dazu die BCL-2-Expression im Tumorgewebe anderer Organe, so konnte in einer Studie von BUBENDORF et al. im Jahre 1996 in Prostatakarzinomen eine Zunahme der Tumorprogression bzw. des pT-Stadiums in Korrelation mit einer Zunahme der Anzahl der positiv auf den Antikörper reagierenden Tumoren beobachtet werden. Bei der statistischen Überprüfung eines Abhängigkeitsverhältnisses nach Kruskal-Wallis (siehe Tabelle 26) zwischen den unterschiedlichen pT-Stadien und einer MIB-1- und BCL2-Expression - sowohl bezogen auf die Färbungsintensität als auch auf die allgemeinen Färbungsergebnisse (pos. / neg.) - konnten keine signifikanten Zusammenhänge nachgewiesen werden (p > 0,05). Betrachtet man die durchschnittlich positiven Reaktionen der beiden Antikörper im Bezug zu den drei verschiedenen pT-Stadien, so kann - unter Berücksichtigung nur eines pT1-Tumors - keine signifikante Korrelation zwischen den genannten Parametern beobachtet werden (siehe Tabelle 27). - 74 - V. Diskussion V.1.2. pN-STATUS Bei der Betrachtung des Zusammenhanges zwischen der Intensität der MIB-1-Expression und dem Befall der regionären Lymphknoten ist keine eindeutige Korrelation zwischen der Intensität der Proliferation und dem Lymphknotenstadium zu beobachten. Von den pN0klassifizierten Tumoren ist zu 40 % eine Proliferationsaktivität in < 10 % der Tumorzellen zu verzeichnen. Unter den Tumoren, welche bereits eine lymphogene Metastasierung aufweisen (= pN1), zeigen 38,5 % eine Proliferationsaktivität in < 10 % der Tumorzellen auf. Eine Proliferationsaktivität in 10 - 50 % der Tumorzellen läßt sich in 10 % der pN0klassifizierten Tumoren und in 30,75 % der pN1-klassifizierten Tumoren nachweisen. Zwar ist unter den Tumoren, welche eine Proliferationsaktivität in 10 - 50 % der Tumorzellen aufweisen, ein leichter Anstieg der Anzahl der reagierenden Tumoren mit einem Anstieg des Lymphknotenstatus zu verzeichnen, von einer eindeutigen Korrelation kann jedoch aufgrund des kleinen Patientenkollektivs nicht die Rede sein (siehe auch Abbildung 16). 100% Fälle in % 75% 50% 25% 0% pN 0 < 10 % Abbildung 16: Färbungsintensität von MIB-1 in Korrelation zum pN-Status - 75 - pN 1 10 - 50 % negativ V. Diskussion In der Literatur werden entsprechend dieser Beobachtung bezüglich einer MIB-1Expression keine Angaben gemacht. MIYAMOTO et al. konnte in der erwähnten Studie aus dem Jahre 1999 bezüglich einer BCL-2-Expression in Pankreaskarzinomen ebenfalls keinen signifikanten Zusammenhang zwischen dem Lymphknotenbefall und einer Apoptosehemmung mittels des Antikörpers BCL-2 nachweisen. Betrachtet man auch hier mit Hilfe des Kruskal-Wallis-Tests die statistische Abhängigkeit zwischen den verschiedenen Stadien der lymphogenen Metastasierung und der MIB-1- und BCL-2-Expression, so sind bei vorliegendem p > 0,05 jeweils keine signifikanten Unterschiede zu verzeichnen (siehe auch Tabelle 26). Die Berechnung der Durchschnittswerte der positiven Reaktionen (siehe Tabelle 28) weist bei der Verwendung des Antikörpers MIB-1 tendenziell - unter Berücksichtigung der Mittelwertabweichung - einen Anstieg des Durchschnittswertes mit Zunahme des pN-Stadiums auf. So ist eine Zunahme der durchschnittlich positiven Reaktionen pro Gesichtsfeld von 4,88 in Tumoren ohne lymphogene Metastasierung auf 6,2 in pN1-klassifizierten Tumoren zu beobachten. Jedoch kann in diesem Zusammenhang auf Grund von nur 10 pN0-klassifizierten Tumoren und 13 pN1-klassifizierten Tumoren von keinem eindeutigen signifikanten Zusammenhang die Rede sein. - 76 - V. Diskussion V.1.3. pM-STATUS Ein signifikanter Zusammenhang zwischen einem Anstieg der Proliferationsintensität und der Zunahme der hämatogenen Metastasierung kann in dieser Arbeit ebenfalls nicht verzeichnet werden. So weisen von den Tumoren im pM0-Stadium 33,33 % eine Proliferationsaktivität in < 10 % der Tumorzellen, während 22,22 % der Karzinome eine Aktivität der Proliferation in 10 - 50 % der Zellen aufzeigen. Betrachtet man nun die pM1klassifizierten Tumoren, so ist in 60 % der Tumoren eine Proliferation in < 10 % der Zellen und in lediglich 20 % der Karzinome ein Proliferationsnachweis in 10 - 50 % der Tumorzellen nachweisbar (siehe auch Abbildung 17). Fälle in % 100% 75% 50% 25% 0% pM 0 < 10 % Abbildung 17: Färbungsintensität von MIB-1 in Korrelation zum pM-Status - 77 - pM 1 10 - 50 % negativ V. Diskussion In der Literatur werden keine Angaben über einen möglichen Zusammenhang zwischen den Stadien der hämatogenen Metastasierung und dem proliferationsassoziierten Antigen Ki-67 in Adenokarzinomen des Pankreas gemacht. In der bereits mehrfach erwähnten Studie von MIYAMOTO et al. (1999) konnte bezüglich der hämatogenen Metastasierung ebenfalls kein Zusammenhang zu einer BCL-2-Expression in Pankreaskarzinomen festgestellt werden. Die aus Tabelle 26 entnehmbare nach Mann-Whitney U geprüfte Abhängigkeitsbeziehung zwischen der hämatogenen Metastasierung und der MIB-1- und BCL-2-Expression zeigt ebenfalls keine signifikanten Zusammenhänge der Parameter auf (p > 0,05). Bei Berechnung der Durchschnittswerte der jeweiligen positiven Reaktionen auf die Antikörper ist unter Berücksichtigung der Mittelwertabweichung eine geringgradige Zunahme des MIB-1-Mittelwertes mit Zunahme des Stadiums der hämatogenen Metastasierung zu verzeichnen (pM0: 5,5 → pM1: 6,35). Von einer signifikanten Korrelation zwischen der hämatogenen Metastasierung und einer MIB-1-Expression kann jedoch aufgrund der niedrigen Anzahl von fünf Patienten unter den pM1-klassifizierten Tumoren nicht die Rede sein (siehe auch Tabelle 29). - 78 - V. Diskussion V.1.4. TUMORSTADIUM NACH UICC Betrachtet man die Intensität der MIB-1-Expression bezüglich der Tumorstadieneinteilung nach UICC dieses histologischen Patientengutes, so ist auch hier wider der Erwartung keine Zunahme der Antikörper-Intensität mit Zunahme des Stadiums zu beobachten. So kann eine Proliferationsaktivität in < 10 % der Tumorzellen innerhalb des Stadium I in 60 % der Karzinome, im Stadium III in 30 % der Tumoren verzeichnet werden. Schließlich weisen wiederum 60 % der Tumoren im Stadium IV eine Proliferationsaktivität in < 10 % der Tumorzellen auf. Von den Tumoren, welche eine MIB-1-Expression in 10 - 50 % der Tumorzellen aufzeigen sind 33,33 % dem Stadium II zuzuordnen. Im Stadium III kann ebenfalls in 30 % der Tumoren eine Proliferationsaktivität in 10 - 50 % der Tumorzellen nachgewiesen werden. Schließlich ist eine entsprechende MIB-1-Expression im Stadium IV in 20 % der Karzinome nachweisbar. Eine Korrelation zwischen einer MIB-1Expression und den verschiedenen Tumorstadien nach UICC kann also folglich in dieser Arbeit nicht nachgewiesen werden (siehe auch Abbildung 18). Fälle in % 100% 75% 50% 25% 0% St I St II < 10 % 10 - 50 % Abbildung 18: Färbungsintensität von MIB-1 in Korrelation zu den Tumorstadien nach UICC - 79 - St III St IV negativ V. Diskussion Sowohl GANSAUGE et al. (1998), als auch LUNDIN et al. (1995) machten ähnliche Beobachtungen. Sie konnten in ihren Studien ebenfalls keinen signifikanten Zusammenhang zwischen den Tumorstadien nach UICC und der Expression des proliferationsassoziierten Antigens Ki-67 aufweisen. In einer Studie von GENTIL-PERET (1998), welche mit neuroendokrinen Tumoren des Pankreas durchgeführt wurde, korrelierte jedoch die Proliferationsaktivität mit der Stadieneinteilung nach UICC. Es konnte mittels monoklonaler Antikörper MIB-1 eine Zunahme der Anzahl der positiv reagierenden Tumoren mit Zunahme der Stadien beobachtet werden. Die Färbungsintensität blieb hier unbeachtet. Studienergebnisse bezüglich einer Korrelation zwischen einer BCL-2-Expression in Pankreaskarzinomen und den verschiedenen Tumorstadien nach UICC konnten GANSAUGE et al. (1998) ebenfalls nicht nachweisen. Zu entsprechend ähnlichen Ergebnissen sind MIYAMOTO et al. im Jahre 1999 gekommen. Eine statistische Abhängigkeitsprüfung zwischen den verschiedenen Tumorstadien und einer allgemeinen MIB-1- und BCL-2-Expression (pos. / neg.) bzw. einer Expression unter Berücksichtigung der Färbungsintensität mittels des Kruskal-Wallis-Tests (siehe Tabelle 26) ergibt keine signifikanten Zusammenhänge der genannten Parameter (p > 0,05). Auch der Vergleich, der in Tabelle 30 wiedergegebenen durchschnittlichen Werte positiver Reaktionen pro Gesichtsfeld beider Antikörper - bezogen auf die unterschiedlichen Stadien nach UICC - zeigt unter Berücksichtigung der niedrigen Fallzahlen pro Stadium keine signifikante Korrelationen auf. - 80 - V. Diskussion V.1.5. DIFFERENZIERUNGSGRAD Betrachtet man nun die erwähnten Ergebnisse der Intensität der Proliferation bzw. der MIB-1-Expression bezüglich des Gradings, so ist - unter Berücksichtigung fehlender G1und nur eines G3-Tumors - kein Zusammenhang zwischen einer erwartungsgemäßen Zunahme der Intensität der Proliferationsaktivität mit Zunahme des Differenzierungsgrades festzustellen. So weisen unter den Tumoren im G2-Stadium 36,4 % eine Proliferationsaktivität in < 10 % der Tumorzellen und 22,7 % eine Proliferation in 10 - 50 % der Tumorzellen auf. In dem einzig vorhandenen Tumor des G3-Stadiums ist in < 10% der Tumorzellen eine MIB-1-Expression nachweisbar (siehe auch Abbildung 19) Fälle in % 100% 75% 50% 25% 0% G2 < 10 % Abbildung 19: Färbungsintensität von MIB-1 in Korrelation zum Differenzierungsgrad - 81 - G3 10 - 50 % negativ V. Diskussion In einer ähnlichen Studie von LUNDIN et al. (1995) wurde ebenfalls keine Wechselbeziehung zwischen dem Nachweis des proliferationsassoziierten Antigens Ki-67 und dem Grading gefunden (der Nachweis erfolgte hier mittels polyklonaler Ki-67-Antikörper). Auch im Jahre 1998 konnten GANSAUGE et al. und MAKINEN et al. keine signifikanten Zusammenhänge der genannten Parameter mittels monoklonaler Antikörper MIB-1 nachweisen. In der bereits erwähnten Studie von GENTIL-PERET (1998) wurde ebenfalls in neuroendokrinen Tumoren des Pankreas eine Korrelation zwischen dem Differenzierungsgrad und der Proliferation nachgewiesen. Es konnte eine Zunahme der Anzahl der positiv reagierenden Tumoren mit Zunahme des Differenzierungsgrades verzeichnet werden. Bezüglich einer BCL-2-Expression konnte in der von MIYAMOTO et al. veröffentlichten Studie aus dem Jahre 1999 ebenfalls keine Korrelation zwischen dem Grading und einer BCL-2-Expression in duktalen Pankreaskarzinomen nachgewiesen werden. Zu dem gleichen Ergebnis kamen sowohl MAKINEN et al. als auch GANSAUGE et al. im Jahre 1998. Sowohl die Berechnung der Durchschnittswerte der MIB-1- und BCL-2-Expression im Bezug zu den unterschiedlichen Differenzierungsgraden als auch eine Abhängigkeitsprüfung ist unter Berücksichtigung nur eines G3-differenzierten Tumors von statistischer Seite nicht sinnvoll. - 82 - V. Diskussion V.1.6. ÜBERLEBENSZEIT Auswertungen der Ergebnisse zur Überlebenszeit bzw. eine graphische Darstellung der Überlebenskurve nach Kaplan-Meier im Bezug zur MIB-1- und BCL-2- Expression ist aufgrund des kleinen Patientenkollektivs von 23 Patienten nicht sinnvoll. Jedoch sind in einigen Veröffentlichungen folgende Beobachtungen bezüglich einer BCL2- bzw. MIB-1-Expression im Zusammenhang mit der Überlebenszeit gemacht worden: In einer Studie von LUNDIN et al. aus dem Jahre 1995 wurden bei Untersuchungen des Ki-67-Antigens im Zusammenhang mit der Überlebenszeit duktaler Pankreaskarzinome folgende prognostisch bedeutsame Beobachtungen gemacht: ein längeres Überleben korrelierte mit einer positiven Kernreaktion bzw. Proliferation in < 50 % der Tumorzellen, analog dazu korrelierte eine positive Kernreaktion in > 50 % der Tumorzellen mit einer geringeren Überlebenszeit. Allerdings wurde diese Untersuchung im Gegensatz zur vorliegenden Arbeit mit polyklonalen Ki-67-Antikörpern durchgeführt. Diese rufen im Vergleich zu den hier verwendeten monoklonalen MIB-1-Antikörpern sowohl eine intensivere Färbung als auch eine höhere Anzahl an Kernfärbungen hervor. Vergleichbare Beobachtungen machten FERRARA et al. im Jahre 1999. In ihrer Arbeit konnte eine signifikante Ki-67-Expression mittels monoklonaler Ki-67-Antikörper in Pankreaskarzinomen als Prognosefaktor im Zusammenhang mit der Überlebenszeit nachgewiesen werden, d.h. in den Tumoren der Patienten mit einer verminderten Überlebenszeit reagierten vermehrt Tumorzellen mit einer erhöhten Intensität auf den Antikörper. Allerdings wurde diese Untersuchung ebenfalls nur mit einem Kollektiv von 23 Patienten durchgeführt. In den erwähnten Studien von MAKINEN et al. aus dem Jahre 1998 und GANSAUGE et al. (1998) konnte allerdings kein signifikanter Zusammenhang zwischen einer Ki-67Expression und dem Überleben der Erkrankung verzeichnet werden. Entsprechend dieser Untersuchungen wurde ebenfalls im Jahre 1996 von VAIDYA et al. ein Zusammenhang zwischen der Überlebenszeit und dem Ki-67-Antigen mittels monoklonaler MIB-1- Antikörper nachgewiesen (Patienten der Tumoren mit einer - 83 - V. Diskussion vermehrten Expression wiesen eine schlechtere Prognose und damit eine verminderte Überlebenszeit auf). Jedoch wurde diese Studie mit Karzinomen der Papilla Vateri durchgeführt. Betrachtet man dahingegen die Proliferationsaktivität in neuroendokrinen Tumoren des Pankreas, so wurde in der erwähnten Studie von GENTIL-PERET et al. aus dem Jahre 1998 ebenfalls eine Abnahme der Überlebenszeit mit Zunahme der Anzahl der positiv reagierenden Tumoren nachgewiesen. Weiterhin berichten zahlreiche Studien ebenfalls über eine Ki-67-Expression als Prognosefaktor bezüglich maligner Tumorerkrankungen anderer Organe. Dazu zählen zum Beispiel Karzinome der Brust (WINTZER et al., 1991), der Lunge (TUNGEKAR et al., 1991), des Magens (KAKEJI et al., 1991), der Prostata (SADI et al., 1991), der Niere (DELAHUNT et al., 1995), Melanome (SMOLLE et al., 1992) und Non-HodgkinLymphome (GROGAN et al., 1988). Bezüglich einer BCL-2-Expression in Korrelation mit der Überlebenszeit wurde in den erwähnten Studien von FRIESS et al. (1998) und GANSAUGE et al. (1998) kein Zusammenhang nachgewiesen. In einer Studie von MAKINEN et al (1998) konnte ebenfalls keine signifikante Aussage bezüglich der Korrelation einer BCL-2-Expression und der Überlebenszeit der Erkrankung gemacht werden. Jedoch wurde in dieser Studie unter Berücksichtigung positiver Kern und Zytoplasmaanteile den BCL-2-positiven Pankreaskarzinomen eine verminderte Aggressivität zugesprochen und damit der Verdacht auf eine günstigere Prognose der Erkrankung geäußert. Betrachtet man nun abschließend die BCL-2-Expression innerhalb von Tumoren anderer Organe, so berichteten BINDER et al. bereits im Jahre 1995 über einen signifikanten Zusammenhang zwischen einer BCL-2-Expression in malignen Tumorzellen der Brust und einer günstigeren Prognose der Erkrankung. Dieser Zusammenhang wurde ebenfalls bezüglich Ovarialkarzinomen (HEROD et al., 1996) Bronchialkarzinome (PEZZELLA et al., 1993) beobachtet. - 84 - und nicht kleinzelliger V. V.2. Diskussion METHODIK Betrachtet man allgemein die Ergebnisse dieser immunhistochemischen Untersuchung, so fällt - wie bereits erwähnt - wider der Erwartung sowohl bezüglich der MIB-1-Expression als auch der BCL-2-Expression ein verminderter Färbungsnachweis auf. In lediglich 17 % des Tumorgewebes der Pankreaskarzinome ist eine BCL-2-Expression zu verzeichnen. Ebenfalls kann bei der Betrachtung der Intensität der BCL-2-Expression kein Tumor mit einem Antiapoptosenachweis sowohl in > 50 % Tumorzellen als auch in 10 - 50 % der Zellen verzeichnet werden. Auf eine Auswertung der Ergebnisse wurde also, wie bereits erwähnt, aufgrund des extrem verminderten Färbeverhaltens des Antikörpers BCL-2 in duktalen Pankreaskarzinomen in diesem Kapitel verzichtet. In den hierzu erwähnten verschiedenen Literaturbeispielen der letzten Jahre wurden vergleichsweise ähnliche Untersuchungen mittels des Antikörpers BCL-2 in Karzinomen des Pankreasgewebes durchgeführt. Zusammengefaßt konnten in diesen Arbeiten- wie auch in dieser Untersuchung- ebenfalls geringe Ansprechraten des Tumorgewebes auf den Antikörper verzeichnet werden (siehe Tabelle 31). Beobachtungen bezüglich einer eindeutigen signifikanten Korrelation zwischen einer BCL-2-Expression und dem biologischen Tumorverhalten duktaler Pankreaskarzinome wurden in den erwähnten Veröffentlichungen ebenfalls nicht gemacht. Bei der Betrachtung der Proliferationsaktivität mittels des Antikörpers MIB-1 ist allgemein in 61 % der Fälle eine Proliferation zu beobachten, welche zu 39 % ebenfalls entgegen aller Erwartung nicht nachweisbar ist. Auch ist hier bei der Auszählung der positiven Kernreaktionen keine Proliferationsaktivität in > 50 % der Tumorzellen zu beobachten. Die in diesem Kapitel zum Vergleich herangezogenen Studienergebnisse der letzten Jahre basieren auf insgesamt besseren Ansprechraten des Pankreasgewebes auf den Antikörper MIB-1 (siehe auch Tabelle 31). Allerdings konnte in den erwähnten Literaturbeispielen, bis auf die erwähnten Beobachtungen bezüglich der Überlebenszeit, ebenfalls keine signifikante Korrelation zwischen pathologisch-anatomischen Parametern und der Proliferation des Pankreasgewebes beobachtet werden. - 85 - V. Diskussion Es stellt sich nun die Frage, aus welchen Gründen im Tumorgewebe des Pankreas, welches erwartungsgemäß sowohl eine hohe Proliferationsrate als auch eine vermehrte Hemmung der Apoptose aufweisen sollte, lediglich in 61 % der Fälle eine MIB-1- und in nur 17 % eine BCL-2-Expression nachweisbar ist. Eine mögliche Begründung für den unterschiedlichen Ausfall des Färbeverhaltens von in Formalin fixierten Geweben kann in der Methodik der Gewebefixierung und der Gewebeeinbettung liegen. Als besonders kritische Schritte im Arbeitsablauf der immunhistologischen Färbungen sind daher die Fixation und die Paraffineinbettung zu betrachten (FISHER et al., 1994). Nach BOURNE (1983) muß ein Antigen vorhanden, fixiert und für den Primärantikörper zugänglich sein. Ist ein Antigen nicht fixiert, so wird es aus dem Gewebe ausgewaschen und ist für eine Anfärbung nicht mehr zugänglich. Anderseits entstehen durch Überfixierung Probleme wie Maskierung und Denaturierung des Antigens. Eine entsprechende Kontrolle des Fixationsschrittes ist für den Untersucher schwierig, da die meisten Gewebeproben bereits noch am Entnahmeort fixiert und erst danach der untersuchenden Person zugängig ist. Ferner können später bei dem Schritt der Paraffineinbettung des fixierten Gewebes durch zu hohe Temperaturen Antigenstrukturen des nachzuweisenden Proteins zerstört werden (FISHER et al., 1994). Zusammengefaßt können nach BOURNE (1983) durch folgende Fehler unspezifische Färbereaktionen entstehen: Ö Ö Ö Ö Ö Ö Ö Ö Fehler im Bereich der Fixation Nekrotisches und gequetschtes Material Mangelnde Ausschaltung der endogenen Peroxidaseaktivität Nicht optimale Antikörperverdünnung Unvollständige Entfernung von Paraffin Unspezifische Bindung von Protein Beschichtungssubstanzen der Objektträger Unzureichendes Waschen zwischen den einzelnen Inkubationsschritten Abgesehen von den oben beschriebenen Fehlern zum Zeitpunkt der Materialgewinnung können für jeden Antikörper dieser Arbeit - trotz mangelnden Färbeverhaltens methodische Fehler durch die Mitführung und Bewertung von positiven und negativen Kontrollen weitgehend ausgeschlossen werden - 86 - V. Diskussion Weitere Aussagen immunhistochemischer Studien bezüglich einer BCL-2- und Ki-67Expression seien nun noch ergänzend erwähnt: In einer Studie von MIYAMOTO et al. aus dem Jahre 1999 gelang der Nachweis des BCL2-Protoonkogens in 23 % der Fälle der invasiv-duktalen Adenokarzinome des Pankreas. Neben diesem Ergebnis wurden jedoch von MIYAMOTO in weiteren immuhistochemischen Untersuchungen weitaus bessere Färbungsergebnisse bezüglich weiterer apoptosehemmender Proteine BCL-XL und MCL-1 der BCL-2-Familie in Pankreaskarzinomen nachgewiesen. MIYAMOTO berichtete über eine mögliche Imbalance zwischen antiapoptotischer und proapoptotischer Proteine der BCL-Familie als beeinflussender Faktor für die Entstehung von Adenokarcinomen des Pankreas. Eine signifikante Korrelation bezüglich klinisch-pathologischer Parameter wiesen diese jedoch nicht auf. ZHAO et al. berichteten 2001 über einen immunhistochemischen Nachweis des zellproliferationsassoziierten Antigens Ki-67 mittels monoklonaler Ki-67-Antikörper und bezeichneten diese als sinnvollen Indikator malignen Potentials in mucinös-cystischen Tumoren des Pankreas. Abschließend soll auf die schwierige Vergleichbarkeit der zu diesem Thema durchgeführten und veröffentlichten Untersuchungen hingewiesen werden. Vor allem variiert die Zahl der untersuchten Fälle zwischen 22 und 133. Ebenso sind die Art der Einbettung, die Konzentration und Art der Antikörper, die Durchführung der Färbungen und die Kriterien der Auswertung der Reaktionen sehr unterschiedlich. Tabelle 31 gibt folgend eine Übersicht über die wesentlichen Arbeiten: - 87 - V. Diskussion Tabelle 31: Untersuchungsergebnisse verschiedener Studien der letzten Jahre Untersucher Jahr Gewebe Einbettung Antikörper Fälle positiv LUNDIN et al. 1995 Adenokarzinome Paraffin 133 87% 60 28% 82 55% 82 69% 64 52% 74 80% 22 64% 30 23% Ki-67 (polyklonal) FRIESS et al. 1998 Adenokarzinome Paraffin BCL-2 (monoklonal) GANSAUGE et al. 1998 Adenokarzinome Paraffin BCL-2 (monoklonal) MIB-1 (monoklonal) MAKINEN et al. 1998 Adenokarzinome Paraffin BCL-2 (monoklonal) MIB-1 (monoklonal) FERRARA 1999 Adenokarzinome Paraffin Ki-67 (monoklonal) MIYAMOTO et al. 1999 Adenokarzinome Paraffin BCL-2 (monoklonal) EIGENE 2001 Adenokarzinome UNTERSUCHUNG Paraffin BCL-2 23 17% 23 61% (monoklonal) MIB-1 (monoklonal) In dieser Studie fand sowohl die BCL-2-Expression als auch die Ki-67-Expression als Prognosefaktor für das duktale Adenokarzinom des exokrinen Pankreas keine Verwendung. Ebenfalls erfüllen die Ergebnisse nicht die an diese Arbeit gestellten Erwartungen. Dies mag neben den erwähnten Fehlerquellen während der Aufbereitung des Materials auch an dem sehr kleinen Patientenkollektiv von nur 23 Patienten liegen. Die statistische Aussagekraft eines kleinen Kollektivs ist demzufolge als kritischer zu betrachten als die Aussagen von meist recht groß angelegten Untersuchungen mit über 100 Patienten in den Literaturangaben. - 88 - VI. VI. Zusammenfassung ZUSAMMENFASSUNG Das Pankreaskarzinom steht bei weiter steigender Inzidenz an dritter Stelle unter den Karzinomen des Magen-Darm-Traktes mit unverändert schlechter Prognose (MÜLLER et al., 2000). Da die operative Tumorresektion zur Zeit das einzige kurative Therapiekonzept darstellt, muß das Hauptaugenmerk auf die Früherkennung des Pankreaskarzinoms gelegt werden. Neben verbesserten bildgebenden Verfahren und der konventionellen histologischen Diagnostik haben - wie auch bei diversen anderen Tumorerkrankungen - immunhistochemische Untersuchungen im Rahmen der Diagnostik und Prognose zunehmend an Bedeutung gewonnen. Ziel dieser Arbeit war es - anhand histologisch untersuchtem in Paraffin eingebettetem Tumorgewebe aus tubulären duktalen Adenokarzinomen des Pankreas - die Korrelation zweier wichtiger Proteine der Tumorgenese zu potentiell prognostisch bedeutsamen pathologisch-anatomischen Faktoren nachzuweisen. Dazu wurden an Operationspräparaten von 23 Patienten mit duktalen Pankreaskarzinomen immunhistochemische Untersuchungen mittels der ABC-Methode unter der Verwendung von monoklonalen Mausantikörpern MIB-1 und BCL-2 durchgeführt und der TNMKlassifikation, der Stadieneinteilung nach UICC und dem Grading gegenübergestellt. Mittels des MIB-1 Antikörpers ist es möglich das Ki-67-Antigen nachzuweisen, welches als Proliferationsmarker gilt. Über Färbungen mit dem BCL-2-Antikörper wird das sogenannte BCL-2-Protoonkogen nachgewiesen, welches die Rolle des Gegenspielers zum programmierten Zelltod übernimmt und damit längeres Zellüberleben ermöglicht. Insgesamt fällt bei dieser Untersuchung sowohl ein vermindertes Färbeverhalten des Antikörpers BCL-2 (4/23) als auch des Antikörpers MIB-1 (14/23) gegenüber dem Tumorgewebe der Pankreaskarzinome auf. Eine Auswertung der Ergebnisse der Färbung mittels des Antikörpers BCL-2 ist in dieser Arbeit nicht möglich gewesen. Dies ist einerseits auf Fehler während der Aufbereitung des Materials zurückzuführen, anderseits ist eine verminderte Sensitivität der Methode und des Antikörpers möglich. - 89 - VI. Zusammenfassung Der zweite Untersuchungsabschnitt dieser Arbeit umfaßte wie bereits erwähnt den Versuch des Nachweises der Proliferationsaktivität mittels des Antikörpers MIB-1. Jedoch konnte auch hier lediglich eine MIB-1-Expression in insgesamt 61 % der Pankreaskarzinome nachgewiesen werden. Eine signifikante Korrelation zwischen der Intensität der Proliferationsaktivität und den erwähnten Parametern konnte ebenfalls nicht verzeichnet werden. Jedoch ist der auffällig verminderte Nachweis der Proliferationsaktivität innerhalb des Tumorgewebes auch hier auf mögliche Fehler während des Vorganges der Fixation oder der Hitzebehandlung des Gewebes zurückzuführen. Somit fand in dieser Studie der Nachweis von BCL-2 und Ki-67 keine Verwendung als Prognosefaktor für das duktale Adenokarzinom des exokrinen Pankreas. Dies mag neben den erwähnten Problemen während der Aufbereitung des Materials ebenfalls an der Durchführung der Untersuchung mit einem sehr kleinen Patientenkollektiv von nur 23 Patienten liegen. - 90 - VII. Literaturverzeichnis VII. LITERATURVERZEICHNIS 1) Andren-Sanberg, A., Ihse, I. Factors influencing survival after total pancreatectomy in patients with pancreatic cancer Ann. Surg.; 198: 605-610 (1983) 2) Aoki, K., Ogawa, H. Cancer of the pancreas, international mortality trends World Health Stat. Rep.; 31: 2-27 (1978) 3) Bard, L., Pic, A. Contribution à l`étude clinique et anatomo - pathologique du cancer primitif du pancréas Revue de Médicine; 8: 257-282 (1888) 4) Becker, V. et al. Tumoren des Pankreas In: Forell M. M. (Hrsg.) Pankreas Hdb. Inn. Med., 5. Auflage, Bd.3, Teil 6: 1007-1106 Springer- Verlag (1976) 5) Becker, V. et al. Begleittext zum Schnittseminar: Erkrankungen des exo- und endokrinen Pankreas inkcl. Diabetes mellitus. XIX. Symposium, Bonn, 18.-20.02.1983 6) Bell, E. T. Carcinoma of the pancreas A clinical and pathologic study of 609 necropsied cases Amer. J. Path.; 33: 499 (1957) 7) Berg, J. W., Connelly, R. R. Updating the epidemiologic data on pancreatic cancer Seminars in Oncology; 6: 275-283 (1979) 8) Bettendorf, U., Klinge, O., Morgenroth, K., Remmele, W. Pathologie 2, Verdauungsorgane einschließlich exokrines Pankreas, Leber, Gallenwege, Peritoneum, Retroperitoneum, Hernien Springer - Verlag: 835-842 (1984) 9) Binder C. et al. Bcl-2 protein expression in breast cancer in relation to established prognostic factors and other clinico-pathological variables Ann. Oncol.; 6: 1005-1010 (1995) 10) Boecker, W., Denk, H., Heitz, PH. U. Pathologie Urban und Schwarzenberg: 721-732 (1997) - 91 - VII. Literaturverzeichnis 11) Boenisch, T., Naish, S. J. ( Hrsg.) Handbuch immunhistochemischer Färbemethoden I Carpinteria, CA, USA: DAKO CORPORATION (1989) 12) Boise, L. H. et al. Bcl-x, a bcl-related gene that functions as a dominant regulator of apoptotic cell death Cell; 74: 597-608 (1993) 13) Boring, C. C. et al. Cancer statistics J. Am. Cancer Soc.; 43: 7-26 (1993) 14) Bos, J. L. Ras oncogenes in human cancer: a review Cancer Res.; 49: 4682-4689 (1989) 15) Bourne, J. A.; Bourne, J. A. (Hrsg.) Handbuch I der Immunperoxidase Färbemethoden Carpinteria, CA, USA: DAKO Corporation (1983) 16) Bubendorf, L. et al. Prognostic significance of BCL-2 in clinically localized prostate cancer Am. J. Pathol; 148: 1557-1565 (1996) 17) Büchler, M. et al. Klinik und Feinstruktur des Papillenkarzinoms unter besonderer Berücksichtigung der morphologischen Karzinogenese Dtsch. Med. Wschr.; 109: 1629-1634 (1984) 18) Büchler, M. et al. Grenzen chirurgischen Handelns beim Pankreaskarcinom Arch. Klein. Chir. Suppl. II (Kongreßbericht): 460-464 (1993) 19) Büchler, M., Uhl, W., Malfertheiner, P. Pankreaserkrankungen Akute Pankreatitis, chronische Pankreatitis, Tumore des Pankreas Karger: 120-140 (1996) 20) Clemens, M. et al. Perioperatives Staging und Münsteraner TNM - Klassifikation beim Papillen- und Pankreaskarzinom Langenbecks Arch. Chir.; 365: 169-178 (1985) 21) Coons, A. H. et al. Immunological properties of an antibody containing a fluorescent group Proc. Soc. Exp. Biol. Med.; 47: 200-202 (1941) - 92 - VII. Literaturverzeichnis 22) Da Costa, J. Cancer of the pancreas North American Medico - Chirurgical Review 2: 883-909 (1858) 23) Cubilla, A. L. et al. Pancreas cancerduct cell adenocarcinoma: survival in relation to site, size, stage and type of therapy. J. Surg. Oncol.; 10: 465-482 (1978) 24) Cubilla, A. L., Fitzgerald, P. J. Surgical pathology of tumors of the exocrine pancreas Moossa A. R. (ed.) Tumors of the Pancreas Williams & Wilkins: 159-193 (1980) 25) Cubilla, A. L., Fitzgerald, P. J. Malignant neoplasms in tumors of the exocrine pancreas Atlas of tumor pathology, Second Series Fascicle 19 AFIP, Washington DC: 109-233 (1984) 26) Firma DAKO Dänemark Monoclonal Mouse Anti-Human bcl-2 Oncoprotein 27) Delahunt B. et al. Proliferation of renal cell carcinoma assessed by fixation-resistant polyclonal Ki-67 antibody labeling Cancer; 75: 2714-2719 (1995) 28) Dinse, P., Sulkowski, U., Nottberg, H. Experimentelle Karzinogenese beim Pankreaskarcinom Chir. Praxis; 50: 227-240 (1995/96) 29) Firma DIANOVA Gesellschaft für biochemische, immunologische und mikrobiologische Diagnostik mbH, Hamburg Monoklonaler Antikörper gegen das Ki-67 Antigen 30) Doerr, W., Seifert, G., Uelinger, E. (Herausgeber) Spezielle pathologische Anatomie Band 6 Springer- Verlag: 463-491 (1973) 31) Duff, et al. Smad 4 (DPC4) - a potent tumour suppressor? British Journal of Cancer; 78 (12): 1615-1619 (1998) - 93 - VII. Literaturverzeichnis 32) Endl, J., Xu, H., Peters, J. H., Peters, J. H., Baumgarten, H., (Hrsg.) Monoklonale Antikörper 2nd ed. Springer-Verlag: 362-378 (1990) 33) Farr, A., Nakane, P. Immunchemistry with enzym - labeled antibodies: a brief review J. Immunol. Methods; 47: 129-144 (1981) 34) Fernandez- Del Castillo, C., Warshaw, A. L. Pancreatic carcinoma Pancreas; 10: 507-512 (1994) 35) Ferrara, C. et al. Ki-67 and c-jun expression in pancreatic cancer: a prognostic marker? Oncol. Rep.; 6 (5) :1117-1122 (1999) 36) Frantz, V. K. Tumors of the pancreas Atlas of tumor pathology Vol. VII, fasc. 27-28, USAFIP, Washington (1959) 37) Friess, H. et al. Enhanced expression of transforming growth factor - beta isoforms in pancreatic cancer correlates with decreased survival Gastroenterology; 105: 1846-1856 (1993) 38) Friess, H. et al. Enhanced expression of the type II transforming growth factor - beta receptor in human pancreatic cancer cells without alteration of type III receptor expression Cancer Res.; 53: 2704-2707 (1993) 39) Friess, H. et al. Increased expression of acidic and basic fibroblast growth factor in chronic pancreatitis Am. J. Path.; 144: 117-128 (1994) 40) Friess, H., Korc, M., Büchler, M. W. Molekularbiologie beim Pankreaskarzinom: Überexpression von Fibroblast Growth Factors Chirurg 65: 904-910 (1994) 41) Friess, H. et al. Bax but not bcl-2 influences the prognosis of human pancreatic cancer Gut. 43 (3) :414-421 (1998) - 94 - VII. Literaturverzeichnis 42) Fritz, P., Müller, I., Wegener, G., Braun, U., Grau, A., Tuczek, H., Moessner, E., Schenk, R. Immunhistochemie: Theoretische Möglichkeiten, praktische Anwendung Zbl. allg. Pathol. u. pathol. Anat.; 130: 187-203 (1985) 43) Gansauge, F., Gansauge, S., Schmidt, E., Müller, J., Beger, H. G. Prognostic significance of molecular alterations in human pancreatic carcimoma - an immunohistological study. Langenbeck`s Arch. Surg.; 383: 152-155 (1998) 44) Gentil Perret, A., et al. The relationship between MIB-1 proliferation index and outcome in pancreatic neuroendocrine tumors Am. J. Clin. Pathol.; 109: 286-293 (1998) 45) Gerdes, J. et al. Production of a mouse monoclonal antibody reactive with a human nuclear antigen associated with cell proliferation Int. J. Cancer; 31: 13-20 (1983) 46) Goldfarb, W. B. et al. Carcinoma in heterotopic gastric pancreas Ann. Surg.; 158: 56-58 (1963) 47) Greene, N. M. Avidin. In: Anfinsen C. B., Edsell J. T., Richards F. M. (eds.) Advances in Protein Chemistry Vol. 29. Academic Press, New York London Toronto Sydney San Francisco: 85-133 (1975) 48) Gogan T. M. et al. Independent prognostic significance of a nuclear proliferation antigen in diffuse large cell lymphomas as determined by the monoklonal antibody Ki-67 Blood; 71: 1157-1160 (1988) 49) Grosfeld, J. L. et al. Pancreatic malignancy in children Arch. Surg.; 101: 370-374 (1970) 50) Gross, R., Schölmerich, P., Gerok, W. Die Innere Medizin 8. Auflage, Schattauer-Verlag: 568-569 (1996) 51) Gudjonson, B. Cancer of the pancreas 50 years of surgery Cancer; 60: 2284-2303 (1987) - 95 - VII. Literaturverzeichnis 52) Hanada, M., Aime Sempe, C., Sato, T. Structurefunction analysis of Bcl-2 protein. Identification of conserved domains important for homodimerization with Bcl-2 and heterodimerization with Bax J. Biol. Chem.; 270: 11962-11969 (1995) 53) Hermanek, P. et al. UICC International Union Against Cancer TNM- Klassifikation maligner Tumoren Vierte, vollständig überarbeitete Auflage Springer-Verlag: 69-71 (1987) 54) Hermanek, P., Wittekind, C. Residual tumor (R) classification and prognosis Semin. Surg. Oncol.; 10: 12-20 (1994) 55) Hermanek, P. Qualitätssicherung in der Onkologie Diagnostische Standards Lungen-, Magen-, Pankreas- und kolorektales Karzinom W. Zuckerschwerdt Verlag: 84-93 (1995) 56) Hermanek, P. et al. Pathology and biology of pancreatic ductal adenocarcinoma Langenbeck´s Arch. Surg.; 383: 116-120 Spinger - Verlag (1998) 57) Herod J. J. et al. The prognostic significance of BCL-2 and p-53 expression in ovarian carcinoma Cancer Res.; 56: 2178-2184 (1996) 58) Heyderman, E. Immunperoxidase technique in histopathology: applications, methods and controls J. Clin. Pathol.; 32: 971-978 (1979) 59) Hockenbery, D. et al. BCL-2 is an inner mitochondrial membrane protein that blocks programmed cell death Nature; 348: 334-336 (1990) 60) Hockenbery, D., Zutter, M., Hickey, W., Nahm, M. BCL-2 protein is tophographically restricted in tissues characterized by apoptotic cell death Proc. Natl. Acad. Sci. USA, Vol. 88: 6961-6965 (1991) - 96 - VII. Literaturverzeichnis 61) Hoffmann, J. P. et al. A pilot study of preoperative chemoradiation for patients with localized adenocarcinoma of the pancreas Am. J. Surg.; 169: 71-78 (1995) 62) Hruban, R. H. et al. K-ras oncogene activation in adenocarcinoma of the human pancreas Am. J. Path.; 143: 545-554 (1993) 63) Hruban R. H., et al. Genetics of pancreatic cancer Surgical Oncology Clinics of North America; 7 (1): 1-23 (1998) 64) Ishikawa, O. et al. Practical usefulness of lymphatic and connective tissue clearance for the carcinoma of the pancreas head Ann. Surg.; 208: 215-220 (1988) 65) Isozaki, H. et al. The significance of proliferating cell nuclear antigen (PCNA) expression in cancer of the ampulla of Vater in terms of prognosis Surgery Today Jap. J. Surg.; 24: 494-499 (1994) 66) Ivy, E. J. et al. Nonenocrine cancer of the pancreas in patients under age forty years Surgery; 108: 481-487 (1990) 67) Kakeji Y. et al. Predictive value of Ki-67 and agyrophilic nucleolar organizer region staining for lymph node metastasis in gastric cancer Cancer. Res.; 51: 3503-3506 (1991) 68) Kelly, J., Wheland, C. A., Weir, D. G., Feighery, C. Removal of endogenous peroxidase activity from cryostat sections for immunperoxidase activity visualisation of monoclonal antibodies J. Immunol. Methods; 96: 127-32 (1987) 69) Klintrup, H. E. Carcinoma of the pancreas A statistical, clinical and pathological study Acta chir. Scand. Suppl.: 362 (1966) 70) Köller, U., Stockinger, H. Majdic, O., Bettelheim, P., Knapp, W. A rapid and simple immunperoxidase staining procedure for blood and bone marrow samples J. Immunol. Meth.; 86: 75-81 (1986) - 97 - VII. Literaturverzeichnis 71) Klöppel, G. et al. Pankreasgangproliferation und Pankreaskarzinogenese: Vergleich menschlicher und tierexperimenteller Veränderungen Verh. Deutsch. Ges. Pathol.; 63: 387-391 (1979) 72) Klöppel, G., Heitz, P. U. Anatomy and physiology of the exocrine pancreas Pancreatic Pathology Churchill Livingstone: 3-21 (1984) 73) Klöppel, G. Pancreatic non-endocrine tumours in pancreatic pathology In: Klöppel G., Heitz P. U. (eds.) Churchill Livingstone: 79-113 (1984) 74) Klöppel, G. Pathology of nonendocrine pancreatic tumours In: Go, V. L. W., Di Magno, E. P., Gardner, J. D., Lebenthal, E., Reber, H. A., Scheele, G. A., (eds.) The pancreas: Biology, pathobiology and disease. Raven Press New York (1993) 75) Klöppel, G. et al. Pancreatic endocrine tumours in man In: Polak, J. M., (ed.) Diagnostic histopathology of neuroendocrine tumours Churchill Livingstone: (1993) 76) Klöppel, G. et al. Histological typing of tumours of the exocrine pancreas World Health Organisation International Histological Classification of Tumours Springer- Verlag, Second Edition (1996) 77) Korc, M. et al. Overexpression of the epidermal growth factor in human panceatic cancer is associated with concomitant increases in the levels of epidermal growth factor alpha J. clin. Invest.; 90: 1352-1360 (1992) 78) Korc, M. et al. Role of growth factors in pancreatic cancer Surgical of Oncology Clinics of North America; 7 (1): 25-41 (1998) 79) Li, F. P., Fraumeni, J. F., Mantel, N., Miller, R. W. Cancer mortality among chemists J. Natl. Cancer Inst.; 43: 1159-1164 (1969) - 98 - VII. Literaturverzeichnis 80) Lin, R. S., Kessler, A. A multifactorial model for pancreatic cancer in man Epidemiologic evidence J. Am. Med. Assoc.; 245: 147-152 (1981) 81) Lisa, J. R. et al. Pulmonary manifestation of carcinoma of the pancreas Cancer; 17: 395-401 (1964) 82) Löffler, G. Funktionelle Biochemie Eine Einführung in die medizinische Biochemie Springer- Verlag: 420-437 (1993) 83) Lundin, J., Nordling, S., Von Boguslawski, K., Roberts, P. J. Prognostic value of Ki-67 expression, ploidy and S-phase fraction in patients with pancreatic cancer Anticancer Res.; 15 (6 B): 2659-2668 (1995) 84) Luppa, H. Grundlagen der Histochemie Teil I Vieweg Braunschweig: 237-239; 259-261 (1976) 85) Makinen, K., Hakala, T., Lipponen, P., Alhava, E., Eskelinen, M. Clinical contribution of BCL-2, p-53 and Ki-67 proteins in pancreatic ductal adenocarcinoma Anticancer - Res.; 19 (1 B): 615-618 (1998) 86) Malorny, U., Bildau, H., Sorg, C. Efficient inhibition of endogenous peroxidase without antigen denaturation in immunhistochemistry J. Immunol. Methods; 111: 101-7 (1988) 87) Mancuso, T. F., El - Attar, A. A. Cohort study of workers exposed to betanaphtylamine and benzidine J. Occup. Med.; 9: 277-285 (1967) 88) Meyer, J. et al. Das Papillen und Pankreaskarzinom Eine epidemiologisch - klinische Fall - Kontrollstudie von 198 Patienten Zent. bl. Chir.; 109: 1231-1237 (1984) 89) Miller, J. R., et al. Carcinoma of the Pancreas Effect of histological type and grade of malignancy on its behaviour Cancer (Philad.); 4: 233 (1951) - 99 - VII. Literaturverzeichnis 90) Minna, J. D. The Molecular Biology of Lung Cancer Pathogenesis Chest 103: 449-456 (1993) 91) Miyamoto, Y. et al. Immunohistochemical Analysis of BCL-2, BAX, BCL-X, and MCL-1 Expression in pancreatic cancer Oncology; 56: 73-82 (1999) 92) Mondière, J. T. Recherches pour servir à l`histoire pathologique du pancréas Arch. Gen. Med. 2e série; 3: 133-154 (1836) 93) Moroshi, T., Shimizu, K., Kanda, M. Pancreatic tumors - their pathology and morphogenesis Jpn. J. Cancer Dig. Org.; 1: 556-562 (1991) 94) Moss, J, Lane. M, D. The biotin - dependend enzymes Adv. Enzymol.; 35: 321-442 (1971) 95) Motojima, K. et al. Detection of point mutations in the Kirsten - ras oncogene provides evidence for the multicentricity of pancreatic carcinoma. Ann. Surg.; 217: 138-143 (1993) 96) Müller, M. et al. Chirurgie für Studium und Praxis 5. Auflage Medizinische Verlags - und Informationsdienste Breisach: 234-237 (2000/01) 97) Nadji, M., Morales, A .R., Nadji, M., Morales, A. R. Immunperoxidase techniques: a practical approach to tumor diagnosis American Society of Clinical Pathologists Chicago: 1-10 (1986) 98) Nakane, P., Pierce, G. J. Enzyme-labeled antibodies: Preparation and application for the localisation of antigens J. Histochem. Cytochem.; 14: 929-931 (1966) 99) Nygan, B. Y., Chen - Levy, Z., Weiss, L. M., Warnke, R. A., Cleary, M. L. Expression in non -Hodgkin lymphoma of the bcl-2 protein associated with the (14;18) translokation N. Engl. Med.; 318: 1638-1644 (1988) - 100 - VII. Literaturverzeichnis 100) Oltavi, Z. N., Molliman, C. L., Korsmeyer, S. J. BCL-2 heterodimerizes in vivo with a conserved homolog Bax, that accelerates programmed cell death Cell; 74: 609-619 (1993) 101) Peters, J. H., Baumgarten, H., Schulze, M. Monoklonale Antikörper Herstellung und Charakterisierung Springer -Verlag: 9; 154-158; 209-212 (1985) 102) Petrali, J .P. et al. The unlabeled antibody enzyme method of immuncytochemstry J. Histochem. Cytochem.; 22: 782-801 (1974) 103) Pezzella, F., Tse, A. G. D., Cordell, J. L., Pulford, K. A. F., Gatter, K. C., Mason, D. Y. Expression of the bcl-2 oncogene protein is not specific for the 14;18 chromosomal translocation Am. J. Pathol.; 137: 225-232 (1990) 104) Pezzella F. et al. Bcl-2 protein in non-small-cell lung carcinoma (see comments) N. Engl. J. Med.; 329: 690-694 (19939 105) Pour, P. et al. Pancreatic neoplasms in an animal model: morphological, biological and comparative studies Cancer; 36: 379-389 (1975) 106) Pour, P. M. et al. Current knowledge of pancreatic carcinogenesis in the hamster and its relevance to the human disease Cancer; 47: 1573-1587 (1981) 107) Pour, P. et al. Hyperplastic, preneoplastic and neoplastic lesions found in 83 human pancreas Am. J. Clin. Pathol; 77: 137-152 (1982) 108) Pour, P., Konishi, Y., Klöppel, G., Longnecker, D. S. Atlas of exocrine pancreatic tumors Morphology biology and diagnosis with an international guide for tumor classification A publication of the International Pancreatic Cancer Study Group (IPCSG) Springer- Verlag: 117-146 (1994) 109) Del Regato, J. A. et al. Cancer Diagnosis, treatment, and prognosis 5 th edn. Mosby, St Louis (1977) - 101 - VII. Literaturverzeichnis 110) Riede, U. N., Schaefer, H.E. Allgemeine und spezielle Pathologie Georg - Thieme - Verlag, 4.Auflage: 787-796 (1995) 111) Robey, G. et al. Pancreatic carcinoma in neonate Pediatr. Radiol.; 13: 284-286 (1983) 112) Sadi M. V. et al. Determination of growth fraction in advanced prostate cancer by Ki-67 immunostaning and its relationship to the time to tumour progression after hormonal therapy Cancer; 67: 3065-3071 (1991) 113) Saito, Y. Annual report of pancreatic cancers registered at Japan Pancreatic Society Japanese Pancreatic Cancer Registration (1990) 114) Scarpa, A. et al. Pancreatic adenocarcinomas frequently show p-53 gene mutations Am. J. Path.; 142: 1534-1543 (1993) 115) Schlick, U. Über das Pankreaskarzinom Med. Inaug. Diss. Heidelberg (zit. nach Becker) (1969) 116) Schonk D. M. et al. Assignment of the gene(s) involved in the expression of the proliferation-related Ki67 antigen to human chromosome 10 Hum. Genet.; 83: 297-299 (1989) 117) Schulz Lesions of the pancreatic duct epithelium and histogenesis of exocrine pancreatic carcinomas Zentralblatt der Pathologie; Vol.140 (3): 203-210 (1994) 118) Schumpelick, V. et al. Chirurgie 4., neu bearbeitete Auflage Ferdinand Enke Verlag: 1030-1032 (1999) 119) Silver, G. B. et al. Carcinoma of the Pancreas A Clinicopathologic survey Surg. Gynec. Obstet.; 86: 703-716 (1948) - 102 - VII. Literaturverzeichnis 120) Smolle J. et al. Prognostic significance of proliferation diffuse and motility in primary malignant melanoma of the ski J. Cutan. Pathol.; 19: 110-115 (1992) 121) Statistisches Bundesamt (Hrsg.) Statistisches Jahrbuch 1982 für die Bundesrepublik Deutschland Kohlhammer, Wiesbaden (1982) 122) Straus, W. Inhibition of peroxidase by methanol and by methanol - nitroferricyanide for use in immunperoxidase procedures J. Histochem. Cytochem.; 19: 682-688 (1971) 123) Straus, W. Phenyl hydrazine as inhibitor of horseradish peroxidase for use in immunperoxidase procedures J. Histochem. Cytochem.; 20: 949-951 (1972) 124) Streefkerk, J. Inhibition of erythrocyte pseudoperoxidase activity by treatment with hydrogen peroxide following methanol J. Histochem. Cytochem.; 20: 829-931 (1972) 125) Sulkowski, U., Meyer, J. Erkrankungen des Pankreas Diagnostik und Therapie Deutscher Ärzte-Verlag Köln: 125-154 (1991) 126) Trede, M. et al. Survival after pancreaticoduodenectomy Ann. Surg.; 211: 447-458 (1990) 127) Tsujimoto, Y., Cossman, J., Jaffe, E., Croce, C. M. Involvement of the bcl-2 gene in human follicular lymphoma Science; 228: 1440-1443 (1985) 128) Tungekar M. F. et al. Ki-67 immunostaning an survival in operable lung cancer Histopathology; 19: 545-550 (1990) 129) Vaidya, P. et al. Combined analysis of expression of c-erbB-2, and Ki-67 antigen, and tenascin provides a better prognostic indicator of carcinoma of the papilla of Vater Pancreas; 12 (2): 196-201 (1996) - 103 - VII. Literaturverzeichnis 130) Warshaw, L.A. et al. Pancreatic carcinoma New Engl. J. Med.; 326: 455-465 (1992) 131) Wintzer H. O. et al. Ki-67 immunostaining in human breast tumours and its relationship to prognosis Cancer; 67: 421-428 ( 1991) 132) Wittekind, C. H., Wagner, G. TNM-Klassifikation maligner Tumoren 5. Auflage Springer-Verlag: 84-87 (1997) 133) Yanagisawa, A. et al. Frequent c-Ki-ras oncogeneactivation in mucous cell hyperplasias of pancreas suffering from chronic inflammation Cancer Res.; 53: 953-956 (1993) 134) Yeung, R. S. et al. Neoadjuvant chemoradiation in pancreatic and duodenal carcinoma. A phase II study Cancer; 72: 2124-2133 (1993) 135) Zhao, J. et al. An immunostaining panel for diagnosis of malignancy in mucinous tumors of the pancreas (In Process Citation) Arch. Pathol. Lab. Med.; 125 (6) : 765-769 (2001) - 104 - VIII. Danksagungen VIII. DANKSAGUNGEN Meinem Doktorvater Prof. Dr. med. S. Philippou danke ich herzlich für die Geduld und Unterstützung bei der Durchführung dieser Arbeit sowie für die Anfertigung der Abbildungen. Bei Herrn Prof. Dr. med. K. Morgenroth möchte ich mich ebenfalls für die mir für die Durchführung meiner Arbeit zur Verfügung gestellten Materialien und Geräte im Institut für Pathologie der Medizinischen Fakultät der Ruhr-Universität Bochum bedanken. Mein Dank gilt weiterhin meinem Schwager, Herrn Dr. Lars Rüsberg, der mir tatkräftig bei der Überarbeitung dieser Arbeit und der Überwindung technischer Tücken zur Seite stand. - 105 - IX. Lebenslauf IX. LEBENSLAUF Kerstin Peres Girondelle 103 44799 Bochum Telefon 0234/380271 Geburtstag Geburtstag Familienstand 19.2.1971 Bochum ledig Schulausbildung 1977-1981 Grundschule Auf dem alten Kamp, Bochum 1981-1990 Schiller-Schule, Gymnasium, Bochum Abschluß: Allgemeine Hochschulreife 1990-1992 Ausbildung zur Medizinisch-Technischen-Assistentin, MTA-Schule Bergmannsheil, Bochum Abschluß: Staatlich geprüfte Medizinisch-Technische Laborassistentin Berufsausbildung Berufliche Tätigkeiten 12/1992 - 10/1993 Laborpraxis Dr. Scharmann, Arzt für Labormedizin, Mikrobiologie und Infektionsepidemiologie, Bochum Tätigkeiten während des Studiums 1995 stationäre Aushilfstätigkeit - 1997 im St.Elisabeth-Hospital-gGmbH, Bochum 1997 - 8/2000 Nachtdienste im Zentrallabor des Marienhospitals in Herne 1993-1999 Ruhr-Universität Bochum 8/1995 Ärztliche Vorprüfung 8/1996 Erster Abschnitt der Ärztlichen Prüfung 4/1999 Zweiter Abschnitt der Ärztlichen Prüfung 4/1999 - 3/2000 Praktisches Jahr, Augusta Krankenanstalten, Bochum 5/2000 Dritter Abschnitt der Arztlichen Prüfung 8/2000 Ärztin im Praktikum in der Abteilung für Anästhesiologie und Operative Intensivmedizin in der Augusta Krankenanstalt Bochum Studium - 106 -