DanielSommerDissertation
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Exzitatorische enterische Co-Innervation von quergestreifter Muskulatur im Mäuseösophagus Der Medizinischen Fakultät / Dem Fachbereich Anatomie Der Friedrich-Alexander-Universität Erlangen-Nürnberg zur Erlangung des Doktorgrades Dr. med. dent. vorgelegt von Daniel Sommer aus Nürnberg 2 Als Dissertation genehmigt von der Medizinischen Fakultät / vom Fachbereich Anatomie der Friedrich-Alexander-Universität Erlangen-Nürnberg Tag der mündlichen Prüfung: 04.09.2013 Vorsitzender des Promotionsorgans: Prof. Dr. Jürgen Schüttler Gutachter: Prof. Dr. Jürgen Wörl Prof. Dr. Winfried Neuhuber 3 Inhaltsverzeichnis 1. 2. 3. Zusammenfassung 1.1. Hintergrund und Ziele 1.2. Methoden 1.3. Ergebnisse und Beobachtungen 4 4 4 5 1.4. Praktische Schlussfolgerungen 5 Summary 2.1. Background and aims 6 6 2.2. Methods 2.3. Results and observations 2.4. Practical conclusions 6 7 7 Einleitung 3.1. Aufbau und Funktion des Ösophagus 3.2. Die enterische Co-Innervation der quergestreiften Ösophagusmuskulatur 8 8 9 3.3. Tachykinine im Gastrointestinaltrakt 3.4. Ziele der Arbeit 9 11 Methoden 12 4.1. Gewebe, Präparation und Fixation 4.2. Kryostatschnitte und Immunzytochemie 4.3. Mikroskopie 12 12 15 Ergebnisse 16 5.1. Motorische Endplatten: enterische Co-Innervation und Co-Innervationsrate 5.2. Myenterische Neurone 16 20 5.3. Hirnstamm 20 6. Diskussion 22 7. Literaturverzeichnis 25 8. Danksagung 29 9. Lebenslauf 30 4. 5. 4 1. Zusammenfassung 1.1. Hintergrund und Ziele Quergestreifte Muskelzellen im Ösophagus werden zum einen von vagalen, cholinergen Nervenfasern aus dem Hirnstamm und zum anderen von enterischen Nervenfasern aus dem Plexus myentericus innerviert. Bisher wurden in den enterischen, coinnervierenden Nervenfasern morphologisch Neuropeptide nachgewiesen, die im restlichen glattmuskulären Verdauungstrakt vor allem eine hemmende Funktion ausüben. Erste funktionelle Untersuchungen mit ausgewählten Neuropeptiden an Invitro-Präparationen bestätigten diese Wirkung auf die vagal-induzierte Kontraktion der quergestreiften Ösophagusmuskulatur. Typischerweise kommen im glattmuskulären Verdauungstrakt auch exzitatorische Neurone vor, die oft Tachykinine als Transmitter benutzen. Eine Beteiligung dieser exzitatorischen Neurone an der enterischen CoInnervation von motorischen Endplatten im Ösophagus ist nicht geklärt. Ziel der vorliegenden Untersuchung war der morphologische Nachweis von enterischen tachykinergen, co-innervierenden Nervenfasern an motorischen Endplatten im Mäuseösophagus, um einen möglichen exzitatorischen Einfluss von enterischen Neuronen auf die Ösophagusperistaltik einschätzen zu können. 1.2. Methoden Die Untersuchung wurde an adulten C57/Bl6 Mäusen beider Geschlechter durchgeführt, denen nach Perfusionsfixierung mit Formaldhydlösung die Speiseröhre und der Hirnstamm entnommen wurden. Der Ösophagus wurde in vier gleich große Stücke unterteilt, die in etwa dem zervikalen, oberen und unteren thorakalen und abdominalen Ösophagusabschnitt entsprachen. Kryostatschnitte des Ösophagus und des Hirnstamms wurden für immunhistochemische Mehrfachfärbungen aufgearbeitet. Substanz P und Neurokinin A wurden zur Charakterisierung von tachykinergen, exzitatorischen, enterischen Neuronen, der vesikuläre Azetylcholintransporter (VAChT) zur Markierung von cholinergen Neuronen im Plexus myentericus und im Hirnstamm und von cholinergen Endigungen an motorischen Endplatten und α-Bungarotoxin (α-BT) zur Markierung von motorischen Endplatten im Ösophagus verwendet. Die 5 immunzytochemischen Färbungen wurden qualitativ und quantitativ mit konventioneller und konfokaler Laserscanning-Mikroskopie ausgewertet. 1.3. Ergebnisse und Beobachtungen Sowohl Substanz P- als auch Neurokinin A-positive Nervenendigungen konnten an vagal-innervierten, motorischen Endplatten im Mäuseösophagus nachgewiesen werden. Die durchschnittliche enterische Co-Innervationsrate lag bei Substanz P bei ca. sieben Prozent und bei Neurokinin A bei ca. drei Prozent. Substanz P bzw. Neurokinin A waren teilweise mit VAChT in eher kleinen Endigungen an der motorischen Endplatte co-lokalisiert, die immer von großen VAChT-immunreaktiven und Substanz P- bzw. Neurokinin A-negativen Endigungen getrennt waren. Co-Lokalisation von Substanz P bzw. Neurokinin A und VAChT war auch in wenigen myenterischen Neuronen nachweisbar. Hirnstammuntersuchungen zeigten, dass in der kompakten Formation des Nucleus ambiguus Neurone vorkamen, die immunreaktiv für VAChT, aber negativ für Substanz P und Neurokinin A waren. 1.4. Praktische Schlussfolgerungen In der quergestreiften Ösophagusmuskulatur der Maus existiert neben einer inhibitorischen eine schwach ausgeprägte cholinerge und tachykinerge, enterische CoInnervation. Das Vorhandensein dieser vermutlich exzitatorischen, enterischen Innervationskomponente im Ösophagus deutet an, dass die Innervationsprinzipien der glattmuskulären Verdauungsabschnitte auch im quergestreiften Ösophagusabschnitt existieren, allerdings in modifizierter Form. Der exzitatorische, periphere Anteil dürfte gegenüber der dominierenden exzitatorischen, vagalen Innervation aus dem Nucleus ambiguus an der motorischen Endplatte eine eher untergeordnete Rolle spielen. 6 2. Summary 2.1. Background and aims Striated muscle fibers in the esophagus receive a dual innervation both from vagal cholinergic nerve fibers originating in the brain stem and enteric nerve fibers originating in myenteric neurons. Until now neuropeptides were detected in the enteric coinnervating nerve fibers by morphological approaches, which are typical for inhibitory neurons in the smooth muscle of the digestive system. Functional studies of selected neuropeptides in in vitro preparations confirmed this effect on the vagally induced contraction of striated esophageal muscle. In the smooth muscle of the digestive tract also excitatory neurons are typically present, which often use tachykinins as transmitters. The participation of these excitatory neurons in the enteric co-innervation of esophageal motor endplates is unclear. The aim of the present study was the morphological detection of enteric tachykinergic co-innervating nerve fibers on motor endplates in the mouse esophagus to assess a possible influence of excitatory enteric neurons on the esophageal peristalsis. 2.2. Methods The study was carried out on adult C57/Bl6 mice of both sexes. After perfusion fixation with formaldehyde solution the esophagus and the brain stem were removed. The esophagus was divided into four equal parts, which approximately corresponded to the cervical, upper and lower thoracic and abdominal portion. Cryostat sections of the esophagus and the brain stem were processed for immunohistochemical multiple stainings. Substance P and Neurokinin A were used as markers for tachykinergic excitatory enteric neurons, the vesicular acetylcholine transporter (VAChT) as a marker for cholinergic neurons in the myenteric plexus and in the brain stem and for cholinergic terminals on motor endplates and α–bungarotoxin (α-BT) for labeling of motor endplates in the esophagus. The immunocytochemical stainings were qualitatively and quantitatively evaluated with conventional and confocal laser scanning microscopy. 7 2.3. Results and observations Both Substance P- and Neurokinin A-positive nerve endings were detected on vagally innervated motor endplates in the mouse esophagus. The enteric co-innervation rate was on average about seven percent for Substance P and about three percent for Neurokinin A. Substance P and Neurokinin A, respectively, were partially co-localized with VAChT in small nerve endings on motor endplates, which were always separated from large VAChT-immunoreactive and Substance P- or Neurokinin A-negative endings. Colocalization of Substance P and Neurokinin A, respectively and VAChT was also detectable in few myenteric neurons. Investigations of the brain stem demonstrated neurons in the compact formation of the nucleus ambiguus, which were immunoreactive for VAChT, but negative for Substance P and Neurokinin A. 2.4. Practical conclusions In the striated muscle of the mouse esophagus a distinct inhibitory coexists with a weak cholinergic tachykinergic enteric co-innervation. The presence of this presumably excitatory enteric component of the esophagus innervation suggests that the organization of the enteric nervous system in the esophagus is similar, but modified to that of the remaining digestive tract. Compared with the dominant excitatory vagal innervation from the nucleus ambiguus the excitatory peripheral innervation is expected to play a minor role at the neuromuscular junction. 8 3. Einleitung 3.1. Aufbau und Funktion des Ösophagus Die Speiseröhre ist ein elastischer, muskulöser Schlauch, der die Nahrung vom Pharynx in den Magen transportiert. Die Speiseröhre wird in einen kurzen Halsteil, Pars cervicalis, einen langen Brustteil, Pars thoracica, und einen kurzen Bauchteil, Pars abdominalis, der die Strecke vom Durchtritt durch das Zwerchfell bis zum Mageneingang umfasst, eingeteilt. Die Wand des Ösophagus zeigt die für den ganzen Magen-Darm-Kanal charakteristische Schichtung in Tunica mucosa, Tela submucosa, Tunica muscularis und Tunica adventitia. Die Tunica mucosa ist unterteilt in eine Lamina epithelialis mucosae, die aus einem mehrschichtigen Plattenepithel aufgebaut ist, einer dünnen bindegewebigen Lamina propria mucosae und einer aus glatten Muskelzellen bestehenden Lamina muscularis mucosae. Die Tela submucosa ist eine Schicht von lockerem bis dichtem Bindegewebe, die einzelne Lymphozyten, kleine Lymphfollikel, Blutgefäße und Nerven enthält. Die Tunica muscularis besteht aus einer inneren, zirkulären und einer äußeren, longitudinalen Muskelschicht, die durch einen schraubenartigen Verlauf der Muskelzellen nicht vollständig getrennt vorliegen. Die Tunica adventitia verbindet als bindegewebige Schicht den Ösophagus mit angrenzenden Organen des Mediastinums. Nur im abdominalen Abschnitt ist die Vorderwand der Speiseröhre von einem Peritonealüberzug bedeckt (Kaufmann et. al., 1968, Geboes & Desmet, 1978, Benninghoff & Drenckhahn, 2003, Kallmünzer et. al., 2008, Mittal, 2012). Im Gegensatz zum restlichen glattmuskulärem Magen-Darm-Trakt besteht die Tunica muscularis bei verschiedenen Tierspezies einschließlich des Menschen aus unterschiedlichen Anteilen von quergestreifter und glatter Muskulatur. Beim Menschen und manchen Säugetieren ist die Tunica muscularis des oberen Ösophagusabschnitts ganz oder mehrheitlich aus quergestreiften Muskelzellen aufgebaut, die sich mit unterschiedlichen Anteilen von glatten Muskelzellen mischen. Nach kaudal nehmen die quergestreiften schrittweise ab und die glatten Muskelzellen schrittweise zu, bis im unteren Ösophagusabschnitt die Tunica muscularis nur noch aus glatten Muskelzellen besteht. Im Gegensatz dazu existieren Spezies, bei denen die Tunica muscularis komplett aus quergestreifter, z.B. bei Nagetieren, oder komplett aus glatter Muskulatur, 9 z.B. bei Vögeln, aufgebaut ist (Shiina et. al., 2005, Wörl & Neuhuber, 2005, Kallmünzer et. al., 2008). 3.2. Die enterische Co-Innervation der quergestreiften Ösophagusmuskulatur Quergestreifte Ösophagusmuskulatur wird neben vagalen, motorischen Nervenfasern aus dem Nucleus ambiguus des Hirnstamms von varikösen, enterischen Nervenfasern innerviert, deren Ursprung in Neuronen des Plexus myentericus liegt (Wörl & Neuhuber, 2005). In elektronenmikroskopischen Untersuchungen zeigte sich, dass die enterischen, co-innervierenden Nervenendigungen im motorischen Endplattenbereich enge Kontakte sowohl mit der postsynaptischen Membran als auch mit präsynaptischen, vagalen Endigungen ausbildeten (Wörl et. al., 1997). Diese enge Beziehung ließ auf einen modulierenden Einfluss der enterischen, co-innervierenden Nervenfasern auf die vagal-induzierte Kontraktion der quergestreiften Ösophagusmuskulatur auf peripherer Ebene schließen. Da die meisten der bisher in den enterischen, co-innervierenden Nervenfasern nachgewiesenen Transmitter und Marker wie die neuronale Stickoxidsynthase (nNOS), Galanin, das Neuropeptid Y (NPY) und das vasoaktive intestinale Peptid (VIP) eine hemmende Wirkung im glattmuskulären Verdauungssystem besitzen, lag die Vermutung nahe, das dies auch für den Ösophagus gilt (Wörl & Neuhuber, 2005, Furness, 2006). Die zunächst auf morphologische Daten gestützten Vermutungen wurden später durch physiologische Untersuchungen untermauert. In einem Nervus vagus-Ösophagus-Präparat konnte in vitro ein hemmender Effekt von Capsaicin auf die vagal-induzierte Kontraktion der quergestreiften Ösophagusmuskulatur gezeigt werden, der über Capsaicin-empfindliche, afferente und enterische Neurone vermittelt wird (Izumi et. al., 2003, Shiina et. al., 2006, Boudaka et. al., 2007). 3.3. Tachykinine im Gastrointestinaltrakt Im Gastrointestinaltrakt kommen Tachykinine als Neurotransmitter in Neuronen vor, die Motilität, Sekretion und Durchblutung der entsprechenden Magen-Darm-Abschnitte regulieren. Sie sind weiter an der spinal-afferenten Innervation des Verdauungssystems beteiligt und besitzen Funktionen in der Immunantwort des Verdauungstraktes auf Entzündungsreize (Holzer & Holzer-Petsche, 1997, Holzer & Holzer-Petsche, 1997, 10 Severini et. al., 2002, Shimizu et. al., 2008). Tachykinine bewirken in der Regel eine Kontraktion der glatten Muskulatur in allen Muskelschichten des Verdauungssystems. Bisher konnten folgende Tachykinine beschrieben werden: Substanz P, Neurokinin A, Neurokinin B und Hemokinin-1. Von Neurokinin A existieren zusätzlich die elongierten Formen Neuropeptid K und Neuropeptid-γ, von Hemokinin-1 die elongierten Formen Endokinin A und B. Tachykinine wirken auf spezifische Membranrezeptoren, die zur Familie der G-Protein-gekoppelten Rezeptoren zählen. Drei Tachykinin Rezeptoren, genannt NK1, NK2 und NK3 wurden bisher entdeckt und auf molekularer Ebene charakterisiert (Holzer & Holzer-Petsche, 1997, Holzer & Holzer-Petsche, 1997, Severini et. al., 2002, Shimizu et. al., 2008). In physiologischen Untersuchungen an isolierten Ösophaguspräparaten mit gemischtmuskulärem und rein quergestreiftem Phenotyp konnte herausgefunden werden, dass Tachykinine im Ösophagus von Säugetieren nur die glattmuskulären Anteile der Tunica muscularis und die Lamina muscularis mucosae kontrahieren und den Druck im unteren ebenfalls glattmuskulären Ösophagussphinkter ansteigen lassen (Daniel et. al., 1989, Holzer & Holzer-Petsche, 1997, Krysiak & Preiksaitis, 2001, Kovac et. al., 2006, Shiina et. al., 2010). An Nervus vagus-Ösophagus-Präparaten von Tierspezies mit rein quergestreiftem Phenotyp konnte zusätzlich gezeigt werden, dass Tachykinine eine hemmende Wirkung auf die vagal-induzierte Kontraktion der quergestreiften Ösophagusmuskulatur besitzen. Die Autoren postulierten einen Reflexkreis, der Capsaicin-empfindliche und Substanz P-haltige spinale Afferenzen und inhibitorische enterische Neurone, die vagal-innervierte, motorische Endplatten kontaktieren, mit einbezieht (Izumi et. al., 2003, Shiina et. al., 2006). Obwohl morphologische Daten über die Lokalisation von Tachykininen im Ösophagus nur wenig detailliert verfügbar sind, bestätigen die vorhandenen Arbeiten den in physiologischen Untersuchungen gesehenen Einfluss von Tachykininen auf die Ösophagusperistaltik. Mehrheitlich in glattmuskulären, aber auch vereinzelt in quergestreiften Ösophagusabschnitten von verschiedenen Säugetierspezies einschließlich des Menschen konnten z.B. Substanz P-immunoreaktive Neurone im Plexus myentericus und Nervenfasern vor allem in der Tunica muscularis, Lamina muscularis mucosae und an Blutgefäßen nachgewiesen werden (Leander et. al., 1982, Christensen et. al., 1989, Christensen & Fang, 1994, Singaram et. al., 1994, Uddman et. al., 1995, Shochina et. al., 1997, Rumessen et. al., 2001, Kuramoto et. al., 2004). 11 3.4. Ziele der Arbeit In den bisherigen Untersuchungen über die Funktion der enterischen Co-Innervation konnte nur ein inhibitorischer Anteil des enterischen Nervensystems an der exzitatorischen Innervation der quergestreiften Ösophagusmuskulatur herausgearbeitet werden (Izumi et. al., 2003, Wörl & Neuhuber, 2005). Da im glattmuskulären Verdauungssystem typischerweise exzitatorische und inhibitorische, enterische Neuronen vorkommen und auch exzitatorische, cholinerge Neurone im Plexus myentericus des Rattenösophagus beschrieben sind (Furness, 2006, Kuramoto & Kadowaki, 2006), stellte sich die Frage, ob sich exzitatorische Neurone auch an der enterischen Co-Innervation der quergestreiften Ösophagusmuskulatur beteiligen. Als Marker für exzitatorische, myenterische Neurone wurde in der vorliegenden Arbeit Substanz P und Neurokinin A in immunhistochemischen Einfach- und Mehrfachfärbungen verwendet. Die Untersuchung wurde an C57/Bl6 Mäusen durchgeführt, da diese Spezies einen komplett quergestreiften Ösophagus besitzt und dort bereits ausführliche Ergebnisse zur enterischen Co-Innervation der quergestreiften Ösophagusmuskulatur vorliegen (Wörl et. al., 2002, Breuer et. al., 2004, Wörl & Neuhuber, 2005, Wörl et. al., 2009, Hempfling et. al., 2012). 12 4. Methoden 4.1. Gewebe, Präparation und Fixation Für die vorliegende Untersuchung wurden fünfundzwanzig Mäuse beider Geschlechter im Alter von drei Monaten der Zuchtlinie C57/Bl6 von Charles River (Sulzfeld, Deutschland) verwendet. Die Mäuse wurden mit einer Überdosis Thiopental (Trapanal®, 250 mg/kg Körpergewicht), die intraperitoneal appliziert wurde, getötet. Um Veränderungen des Gewebes durch den Zelltod zu vermeiden, wurde eine Perfusionsfixierung der Mäuse über die Aorta ascendens durchgeführt. In einem ersten Schritt wurde mit ca. 20ml Ringer-Lösung, der 200 I.E. Heparin zugesetzt war, das Blut aus dem Gefäßsystem gespült. In einem zweiten Schritt wurde zur schnellen Fixierung des Gewebes ca. 40ml einer 4%igen Phosphat-gepufferten Formaldehyd-Lösung, pH 7,4, durch das Gefäßsystem perfundiert. Anschließend wurden bei jeder Maus die Speiseröhre in ihrer ganzen Länge und der Hirnstamm entnommen, für weitere 6-8 Stunden in der gleichen Fixierungslösung nachfixiert und danach für 24 Stunden in Phosphatpuffer und für 12 Stunden in 12%igem Saccharose-Phosphatpuffer als Gefrierschutz gespült. Die Ösophagi wurden in vier Teile geteilt, die in etwa dem zervikalen, oberen und unteren thorakalen und abdominalen Abschnitt entsprachen. 4.2. Kryostatschnitte und Immunzytochemie Die vorbereiteten Ösophagusstücke und Hirnstämme wurden mit Einbettmedium (Tissue Tek® embedding medium, Slee Technik GmbH, Mainz, Deutschland) bedeckt und nachfolgend in einem durch flüssigen Stickstoff auf ca. -70°C gekühlten Behälter, der mit 2-Methyl-butan gefüllt war, schockgefroren, mit Parafilm und Aluminiumfolie umgeben und in einem Gefrierschrank bei -20°C gelagert. Für die immunhistochemischen Untersuchungen wurden 12-14µm dicke Längsschnitte der Ösophagusstücke und Querschnitte der Hirnstämme an einem Leica CM 1900 Kryostaten (Leica Mikrosysteme, Wetzlar, Deutschland) angefertigt. Die Temperatur des Kryostaten wurde bei den Ösophagusschnitten auf ca. -18°C und bei den Hirnstammschnitten auf ca. -12°C eingestellt. Alle Kryostatschnitte wurden auf Poly-L- 13 Lysin-beschichtete Objektträger aufgezogen, für eine Stunde bei Raumtemperatur (RT) luftgetrocknet und kurz in Tris-gebufferter Salzlösung (TBS, 0,05 M, pH 7,4) gespült. Doppeldarstellung von Substanz P bzw. Neurokinin A und α-Bungarotoxin: Zur qualitativen Untersuchung von Substanz P bzw. Neurokinin A Immunreaktivität im Ösophagus wurden Kryostatserienschnitte für eine Stunde mit 1%igem Rinderserumalbumin (BSA; Roth, Karlsruhe, Deutschland), 5%igem Eselnormalserum (Dako, Glostrup, Dänemark) und 0,5%igem Triton X-100, gelöst in TBS (pH 7,4) inkubiert. Nach einer kurzen Spülung in TBS erfolgte die getrennte Inkubation mit den primären Antikörpern Substanz P (Peninsula Laboratories, San Carlos, USA; Kaninchen-IgG, Verdünnung 1:2000 in TBS mit 1% BSA und 0,5% Triton X-100) und Neurokinin A (Peninsula Laboratories, San Carlos, USA; Kaninchen-IgG, Verdünnung 1:2000 in TBS mit 1% BSA und 0,5% Triton X-100) über Nacht bei RT. Bei jeder Inkubation wurde jeweils ein Objektträger mit Ösophagusgewebe als Negativkontrolle mitgeführt. Nach einer 30-minütigen Spülung mit TBS erfolgte eine einstündige Inkubation mit der sekundären Antikörperlösung (Alexa-488-gekoppeltes Esel AntiKaninchen IgG; Molecular Probes, Eugene, USA; Verdünnung 1:1000 in TBS mit 1% BSA und 0,5% Triton X-100). Nach einer weiteren Spülung in TBS wurden die Schnitte zur Darstellung der motorischen Endplatten mit Alexa-594-gekoppeltem α- Bungarotoxin (α-BT) für zwanzig Minuten bei RT in einer Verdünnung von 1:1000 in TBS mit 1% BSA und 0,5% Triton X-100 behandelt, nochmals gespült und in TBSGlycerin (1:1; pH 8,6) eingedeckt und ausgewertet. Die Kalkulation von Co-Innervationsraten wurde an oben beschriebenen Doppelfärbungen durchgeführt. Es wurden jeweils für Substanz P und für Neurokinin A jeweils 250 motorische Endplatten im zervikalen, oberen und unteren thorakalen und abdominalen Ösophagusabschnitt ausgewertet, d.h. pro Ösophagus und Neuropeptid 1000 motorische Endplatten. Insgesamt wurden sechs Mäuse in die Untersuchung einbezogen. Nachfolgend wurden Durchschnittswerte für den ganzen Ösophagus und für den zervikalen, thorakalen und abdominalen Ösophagusabschnitt einschließlich des Standardfehlers (SEM) ausgerechnet. Dreifachdarstellung von Substanz P bzw. Neurokinin A, α-Bungarotoxin und dem vesikulären Azetylcholintransporter: Zur Bestimmung der räumlichen Anordnung von vagalen und enterischen Nervenendigungen an der motorischen Endplatte wurden 14 Kryostatschnitte nach einer oben beschriebenen Vorinkubation doppelt für die primären Antikörper Substanz P bzw. Neurokinin A und dem vesikulären Azetylcholintransporter (VAChT; Biotrend, Köln, Deutschland, Ziegen IgG, Verdünnung 1:200 in TBS mit 1% BSA und 0,5% Triton X-100) über Nacht bei RT inkubiert. Die Visualisierung der Bindungsstellen wurde mit Alexa-488-konjugiertem Esel Anti-Kaninchen IgG und Alexa-647-konjugiertem Esel Anti-Ziege IgG (Molecular Probes, Eugene, USA; Verdünnung 1:1000 in TBS mit 1% BSA und 0,5% Triton X-100) erreicht. Zur Darstellung der motorischen Endplatten wurden die Kryostatschnitte mit Alexa-594bzw. Alexa-555-gekoppeltem α-BT für zwanzig Minuten bei RT in einer Verdünnung von 1:1000 in TBS mit 1% BSA und 0,5% Triton X-100 behandelt, nochmals gespült und in TBS-Glycerin (1:1; pH 8,6) bzw. Vectashield (Linaris, Wertheim, Deutschland) eingedeckt und ausgewertet. Alexa-594-gekoppeltes α-BT wurde in der Anfangsphase der Untersuchung für das Biorad Mikroskop und Alexa-555-gekoppeltes α-BT in der Endphase für das Nikon Mikroskop verwendet (siehe Kapitel 3.3.). Einfachdarstellung von Substanz P, Neurokinin A und dem vesikulären Azetylcholintransporter: Zur Beurteilung der Immunreaktivität von Substanz P und Neurokinin A im Nucleus ambiguus der Maus wurden Serienschnitte durch den Hirnstamm angefertigt und alternierend für Substanz P, Neurokinin A und VAChT (Phoenix, Mountain View, USA; Kaninchen IgG, Verdünnung 1:1000) gefärbt. Die Vorinkubation und Inkubation mit den primären Antikörpern erfolgte wie oben beschrieben. Als sekundärer Antikörper wurde Alexa-488-gekoppeltes Esel AntiKaninchen IgG verwendet. Die Schnitte durch den Hirnstamm wurden gespült und anschließend in TBS-Glycerin (1:1; pH 8,6) eingedeckt und ausgewertet. Insgesamt wurden sechs Hirnstämme qualitativ ausgewertet. Die Spezifität der immunhistochemischen Reaktion von Substanz P und Neurokinin A wurde durch den Ersatz der primären Antikörper durch TBS oder Kaninchennormalserum und durch Präabsorption mit dem entsprechenden Antigen (Substanz P, Peninsula Laboratories, San Charlos, USA; Neurokinin A, Bachem, Bubendorf, Schweiz) sichergestellt. Die Spezifität der primären Antikörper gegen VAChT aus der Ziege und aus dem Kaninchen wurde bereits in vorhergehenden Arbeiten getestet (Breuer et. al., 2004, Hempfling et. al., 2012). 15 4.3. Mikroskopie Die Gewebsschnitte wurden in der Anfangsphase der Untersuchung mit älteren Mikroskopen ausgewertet, die in der Endphase durch neue ersetzt wurden. Folgende Mikroskope wurden verwendet: (1) ein Leica Aristoplan Mikroskop für konventionelle Mikroskopie, das mit den entsprechenden Filtern für Alexa-488 und Alexa-594 Fluoreszenz und einer CCD Kamera (Visitron Systems, Puchheim, Deutschland) ausgestattet war; (2) ein kombiniertes Durchlicht- und Fluoreszenzmikroskop Nikon Eclipse E1000-M (Nikon Corporation, Tokio, Japan), das mit der digitalen Kamera Nikon Digital Sight DS-2MBWc kombiniert war; (3) ein konfokales LaserscanningMikroskop (Biorad) bestehend aus einem Dreilinien Krypton-Argon Laser (American Laser Corporation, Salt Lake City, USA) mit den entsprechenden Filtern (488 nm Erregung, Filter 522 DF 32; 594 nm Erregung, Filter 605 DF 32; 647 nm Erregung, Filter 680 DF 32) und einem Nikon Diaphot 300 Invert-Mikroskop (Nikon, Corporation, Tokyo, Japan). Für konfokale Aufnahmen wurde ein 60x Ölobjektiv verbunden mit einem elektronischen Zoomfaktor von bis zu 2,5 verwendet; (4) ein konfokales Laserscanning-Mikroskop (Nikon Digital Eclipse C1; Software EZ-C1 3.91; Nikon Corporation, Tokyo, Japan), das mit einem 488 nm Argon Laser, einem 533 nm Helium-Neon Laser (beide von Melles Griot Inc., Carlsbad, CA, USA) und einem 638 nm Diode Laser (Coherent, Santa Clara, CA, USA) ausgestattet war. Verwendet wurde ein 60x Ölobjektiv in Kombination mit einem elektronischen Zoomfaktor von bis zu 4.0. Zur Gewinnung von Summationsbildern wurden bis zu 14 Schnitte mit einem Abstand in der Z-Achse von 1 µm elektronisch überlagert. Die Bildverarbeitung erfolgte mit der Confocal Assistant 4.02 Software für das Biorad Mikroskop oder mit der Nikon Free Viewer Software (EZ-C1 3.60) für das Nikon Mikroskop und die Justierung bezüglich Helligkeit und Kontrast mit dem Adobe Photoshop CS4 (Adobe Systems, San Jose, CA, USA). 16 5. Ergebnisse Im Mäuseösophagus konnten Substanz P und Neurokinin A in varikösen Nervenfasern in der Lamina propria mucosae, Tela submucosa, zwischen den glatten Muskelzellen der Lamina muscularis mucosae, zwischen den quergestreiften Muskelzellen der Tunica muscularis, an α-BT-gefärbten motorischen Endplatten (Abbildungen 1, 2 und 3), an Gefäßen, an myenterischen Neuronen (Abbildung 4) und in Nervenfaserbündeln der Tunica adventitia in allen Abschnitten nachgewiesen werden. Substanz P und Neurokinin A Färbung war zusätzlich in einzelnen Neuronen des Plexus myentericus (Abbildung 4) zu finden. In der kompakten Formation des Nucleus ambiguus im Hirnstamm fanden sich zahlreiche cholinerge, VAChT-immunoreaktive, aber keine Substanz P- bzw. Neurokinin A-positiven Nervenzellen (Abbildung 5). 5.1. Motorische Endplatten: enterische Co-Innervation und Co-Innervationsrate Motorische Endplatten von quergestreiften Muskelzellen waren unregelmäßig verteilt im zervikalen, thorakalen und abdominalen Ösophagus zu finden. Ihre Dichte nahm leicht von zervikal nach abdominal zu. Das Endplattengebiet war in der Regel kompakt und oval und nur in wenigen Fällen verzweigt. Im Endplattengebiet kamen Bereiche mit intensiver α-BT Färbung neben ungefärbten Stellen vor (Abbildungen 1a, b und 2a, b). In Dreifachfärbungen für Substanz P bzw. Neurokinin A, α-BT und VAChT konnte gezeigt werden, dass Substanz P- bzw. Neurokinin A-immunreaktive Nervenfasern im ganzen Ösophagus Kontakt zu einer geringen Anzahl von α-BT-positiven motorischen Endplatten besaßen (Abbildungen 1, 2 und 3). Substanz P- und Neurokinin A-positive Nervenfasern kontaktierten das Endplattengebiet nur an wenigen Stellen und zeigten sich in der Mehrheit auch positiv für VAChT (Abbildungen 1 und 2). Das mit α-BTangefärbte, motorische Endplattengebiet war vollständig mit eher größeren VAChTimmunreaktiven Boutons bedeckt, die sich weder für Substanz P, noch für Neurokinin A anfärbten (Abbildungen 1 und 2). Durchschnittlich wurden 7,4 ± 1,5% bzw. 3,1 ± 0,7% aller motorischen Endplatten im Ösophagus von Substanz P- bzw. Neurokinin A-reaktiven Nervenfasern co-innerviert (Abbildung 3a). Die enterische Co-Innervationsrate für Substanz P und Neurokinin A 17 wurde jeweils an 6000 motorischen Endplatten im zervikalen, thorakalen und abdominalen Ösophagus in sechs Mäusen im Alter von drei Monaten erhoben. Abbildung 1: Immunhistochemische Dreifachfärbung für Substanz P (grün makiert), VAChT (blau markiert) und α-BT (rot markiert) dargestellt als Summationsbilder (a, b) oder Einzelbilder (c, d) des Summationsbildes in b. Substanz P-positive Nervenendigungen traten neben vagalen Endigungen in einen engen Kontakt mit motorischen Endplatten (a,b, langer Pfeil). Während Substanz P-positive Nervenendigungen häufig auch immunreaktiv für VAChT waren (b-d, langer Pfeil), gab es VAChT-reaktive Endigungen, die das motorische Endplattenareal bedeckten, aber kein Substanz P besaßen (b-d, kurzer Pfeil). Konfokale Bilder von Kryostatschnitten des zervikalen (a) und thorakalen (b-d) Ösophagus; z zeigt die Anzahl der übereinander gelagerten Einzelschnitte. Scale bars = 10 µm. 18 Abbildung 2: Immunhistochemische Dreifachfärbung für Neurokinin A (grün makiert), VAChT (blau markiert) und α-BT (rot markiert) dargestellt als Summationsbilder (a, b) oder Einzelbilder (c, d) des Summationsbildes in b. Neurokinin A-positive Nervenendigungen traten neben vagalen Endigungen in einen engen Kontakt mit motorischen Endplatten (a,b, langer Pfeil). Während Neurokinin A-positive Nervenendigungen häufig auch immunreaktiv für VAChT waren (b-d, langer Pfeil), gab es VAChT-reaktive Endigungen, die das motorische Endplattenareal bedeckten, aber kein Neurokinin A besaßen (b-d, kurzer Pfeil). Konfokale Bilder von Kryostatschnitten des zervikalen Ösophagus; z zeigt die Anzahl der übereinander gelagerten Einzelschnitte. Scale bars = 10 µm. Die enterische Co-Innervationsrate stieg bezüglich Substanz P von 6,8 ± 0,9% im zervikalen auf 8,9 ± 2,1% im thorakalen Abschnitt an und fiel auf 4,8 ± 1,2% im abdominalen Abschnitt ab. Bezüglich Neurokinin A stieg die enterische CoInnervationsrate von 2,5 ± 0,7% im zervikalen auf 4,1 ± 1,0% im thorakalen Abschnitt an und fiel auf 1,9 ± 0,3% im abdominalen Abschnitt ab (Abbildung 3b). 19 3a 100 Co-Innervationsrate in % 90 80 70 60 50 40 30 20 10 0 Substanz P Neurokinin A 3b 100 zerikaler Abschnitt thorakaler Abschnitt abdominaler Abschnitt Co-Innervationrate in % 90 80 70 60 50 40 30 20 10 0 Substanz P Neurokinin A Abbildung 3: Enterische Co-Innervationsrate von adulten C57/Bl6 Mäusen dargestellt für Substanz P und Neurokinin A im gesamten Ösophagus (a) und getrennt für den zervikalen, thorakalen und abdominal Abschnitt (b). Sowohl für Substanz P als auch für Neurokinin A ergab sich eine geringe durchschnittliche Co-Innervationsrate im gesamten Ösophagus (a), die für beide Neuropeptide eine ähnliche kraniokaudale Verteilung aufwies (b). Prozentsätze sind Durchschnittswerte ± SEM. 20 5.2. Myenterische Neurone Um den Ursprung von Substanz P- bzw. Neurokinin A-positiven Nervenfasern an motorischen Endplatten abschätzen zu können, wurden in Doppelfärbungen mit VAChT Neurone im Plexus myentericus des Ösophagus untersucht. Aufgrund von Hintergrundfluoreszenz stellte sich der Plexus myentericus des Mäuseösophagus als ein eher locker aufgebautes Netzwerk mit kleinen und schütter eingestreuten Ganglien dar. Die Anzahl der Neurone pro Ganglion erstreckte sich in den untersuchten Ganglien von eins bis zwölf. Substanz P bzw. Neurokinin A kam in diesem spärlich ausgeprägten Plexus myentericus in wenigen einzelnen Neuronen in allen Abschnitten des Ösophagus vor, oft mit VAChT co-lokalisiert. Die neuronale Färbung aller Marker war schwach, aber deutlich im Zytoplasma erkennbar. Zellkerne der Nervenzellen waren nicht für Substanz P und Neurokinin A positiv (Abbildung 4). Substanz P-positive Neurone wurden teilweise von Substanz P-reaktiven, varikösen Nervenfasern kontaktiert, die sich größtenteils auch positiv für VAChT darstellten (Abbildung 4). Bezüglich Neurokinin A fanden sich Neurone, die nur von VAChT-positiven Nervenendigungen umgeben waren (nicht dargestellt). 5.3. Hirnstamm In Serienschnitten durch die kompakte Formation des Nucleus ambiguus fanden sich zahlreiche VAChT-positive Neurone, die bereits in einer vorhergehenden Untersuchung gefunden wurden (Hempfling et. al., 2012). Im Gegensatz dazu waren keine Substanz Pbzw. Neurokinin-immunoreaktive Nervenzellen in der gleichen Schnittserie im Nucleus ambiguus zu finden (Abbildung 5). Das Vorhandensein von Substanz P- und Neurokinin A-immunreaktiven Nervenfasern in der Umgebung des Nucleus ambiguus bestätigte die (Abbildung 5). erfolgreiche Anwendung der immunzytochemischen Färbung 21 Abbildung 4: Myenterisches Ganglion im thorakalen Mäuseösophagus. Ein einzelnes Neuron färbte sich schwach für Substanz P (a, b; Pfeil) und VAChT (a, c; Pfeil) an. Es war umgeben von Substanz P- und VAChT-immunreaktiven und -co-lokalisierten, varikösen Nervenfasern. Abbildung 5: Im Nucleus ambiguus stellten sich nur VAChT-positive Neurone dar (a). Es kamen keine Substanz P- bzw. Neurokinin A-reaktiven Nervenzellen (b, c) vor. Die kompakte Formation des Nucleus ambiguus ist mit einem weißen, gestrichelten Kreis markiert (a-c). Scale Bar in Abbildung 4 = 20 µm, in Abbildung 5 = 50 µm. 22 6. Diskussion Die vorliegende Untersuchung ergab folgende Hauptbefunde: (1) myenterische Neurone und Nervenfasern waren im Mäuseösophagus immunreaktiv für die Tachykinine Substanz P und Neurokinin A und häufig mit VAChT co-lokalisiert; (2) variköse, Substanz P- bzw. Neurokinin A-reaktive und häufig mit VAChT co-lokalisierte Nervenfasern kontaktierten motorische Endplatten der quergestreiften Ösophagusmuskulatur und waren dort nicht deckungsgleich mit größeren vagalen, VAChT-positiven Endigungen; (3) die Co-Innervationsraten für Substanz P (~7%) und für Neurokinin A (~3%) waren im Vergleich zu anderen bisher nachgewiesenen Neuropeptiden in enterischen co-innervierenden Nervenfasern relativ niedrig; (4) VACHT-positive, aber keine Substanz P- bzw. Neurokinin A-reaktive Neurone kamen in der kompakten Formation des Nucleus ambiguus vor. Substanz P- und Neurokinin A-immunreaktive Neurone waren in der kompakten Formation des Nucleus ambiguus, der mit cholinergen, vagalen Efferenzen die quergestreifte Ösophagusmuskulatur innerviert, nicht nachzuweisen. Gleichzeitig fanden sich Substanz P- und Neurokinin A-reaktive Neurone in intrinsischen, myenterischen Ganglienzellen. Diese Befunde sind im Einklang mit anderen Neuropeptiden, z.B. nNOS oder VIP, in enterischen co-innervierenden Nervenfasern an motorischen Endplatten im Mäuse- und Rattenösophagus (Neuhuber et. al., 1994, Wörl & Neuhuber, 2005). Ein spinaler Ursprung scheidet aus, da spinale, afferente Nervenfasern im Ösophagus Substanz P und das Calcitionin Gene Related Peptide, aber kein VAChT besitzen (Holzer & Holzer-Petsche, 1997). In der vorliegenden Untersuchung zeigten sich Substanz P-reaktive myenterische Neurone und Nervenfasern häufig mit VAChT co-lokalisiert. Folglich kann auch für Substanz P- und Neurokinin A-positive Nervenfasern an motorischen Endplatten im Mäuseösophagus ein enterischer Ursprung angenommen werden. Die Co-Innervationsraten von Substanz P und Neurokinin A lagen bei ca. sieben bzw. drei Prozent. Im Vergleich dazu liegen die Werte von anderen Neuropeptiden in coinnervierenden Nervenfasern im Ösophagus von C57/Bl6 Mäusen höher: die CoInnervationsrate von nNOS liegt bei ca. 37%, von VIP bei 39%, von Galanin bei 15% und von Serotonin bei ca. 13% (Breuer et. al., 2004, Hempfling et. al., 2012). Diese Unterschiede in den Co-Innervationsraten in dem gleichen Mäusestamm und bei 23 identischen Quantifizierungsmethoden lassen darauf schließen, dass unterschiedliche Gewichtungen in der Bedeutung der verschiedenen Neuropeptide existieren. Im glattmuskulären Darmsystem typischerweise inhibitorische Neuropeptide wie nNOS oder VIP haben im Ösophagus eine wesentlich höhere Co-Innervationsrate als Substanz P und Neurokinin A, die typischerweise im glattmuskulären Darmsystem exzitatorische Funktion ausüben. Andererseits hat eine niedrige Co-Innervationsrate nicht zwangsläufig zu Folge, dass enterische, co-innervierende Nervenfasern einen sehr geringen Effekt auf die Innervation der quergestreiften Muskelzellen im Ösophagus besitzen. In In-vitro-Untersuchungen konnte gezeigt werden, dass Galanin trotz der relativ niedrigen Co-Innervationsrate von 15% eine deutliche Hemmung der vagalinduzierten Kontraktion der quergesteiften Ösophagusmuskulatur in der Maus auslösen kann (Boudaka et. al., 2009). In Untersuchungen zur Entwicklung der enterischen Co-Innervation konnte im Mäuseösophagus gezeigt werden, dass nach Ausbildung von motorischen Endplatten ohne Nervenkontakt in der Perinatalzeit zunächst vagale gefolgt von enterischen, nitrergen Nervernfasern Kontakt mit den motorischen Endplatte aufnehmen (Breuer et. al., 2004). Während vagale Nervenendigungen an motorischen Endplatten persistieren, ziehen sich enterische, nitrerge Nervenfasern nach einer Phase, in der alle motorischen Endplatten co-innerviert werden, auf die adulte Co-Innervationsrate von ca. 37% wieder zurück (Breuer et. al., 2004). Nitrerge, co-innervierende Nervenfasern repräsentieren in diesen Untersuchungen den bisher bekannten hemmenden Anteil der enterischen CoInnervation. Diese geordnete Entwicklung der motorischen Endplatten im Ösophagus erinnert an die vorübergehende polyneuronale Innervation von motorischen Endplatten der sich entwickelnden Skelettmuskulatur (Lichtman & Colman, 2000, Craig & Lichtman, 2001). Dort dient dieser Mechanismus dazu, aus eher diffusen neuronalen Kontakten zwischen Rückenmark und quergestreiften Muskelzellen spezifische Innervationsmuster auszubilden. Übertragen auf den Ösophagus könnte es bedeuten, dass bei der Reifung der vagal-innervierten, motorischen Endplatten der hemmende Anteil der enterischen Co-Innervation sich ebenfalls mit entwickelt, um im Erwachsenenalter zentrale, vagale Impulse auf peripherer Ebene präzise zu modulieren. Über die Entwicklung der tachykinergen, enterischen, co-innervierenden Nervenfasern ist bisher nichts bekannt. Daten darüber könnten weitere Hinweise auf die Bedeutung 24 der tachykinergen, wahrscheinlich exzitatorischen Innervation von motorischen Endplatten im Ösophagus geben. Zusammenfassend zeigen die vorliegenden Befunde, dass neben einer inhibitorischen höchstwahrscheinlich auch eine exzitorische, enterische Co-Innervation der quergestreiften Muskulatur im Mäuseösophagus existiert. Diese exzitatorische Innervation könnte im Zusammenspiel mit der inhibitorischen Komponente eine Rolle bei der peripheren Feinregulation der vagal-induzierten Kontraktion der quergestreiften Ösophagusmuskulatur spielen. 25 7. Literaturverzeichnis 1. Benninghoff, A. and D. Drenckhahn, eds. Anatomie. 16th ed. 2003, Urban&Fischer: München. 2. Boudaka, A., J. Wörl, T. Shiina, W.L. Neuhuber, H. Kobayashi, Y. Shimizu, and T. Takewaki, Involvement of TRPV1-dependent and -independent components in the regulation of vagally induced contractions in the mouse esophagus. Eur J Pharmacol, 2007. 556: 157-165. 3. Boudaka, A., J. Wörl, T. Shiina, Y. Shimizu, T. Takewaki, and W.L. Neuhuber, Galanin modulates vagally induced contractions in the mouse oesophagus. Neurogastroenterol Motil, 2009. 21: 180-188. 4. Breuer, C., W.L. Neuhuber, and J. 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Danksagung Mein Dank für die hilfreiche Unterstützung bei der Erstellung meiner Doktorarbeit geht vor allem an meinen Betreuer und Doktorvater, Herrn Professor Dr. Jürgen Wörl und an den Leiter des Instituts für Anatomie, Herrn Professor Dr. Winfried Neuhuber. Weiterer Dank geht an Frau Karin Löschner, Frau Hedwig Symowski, Frau Andrea Hilpert und Frau Anita Hecht für die stets freundliche und sehr wertvolle Unterstützung im Labor. Ganz besonders danken möchte ich meinen Eltern und Großeltern, die mich in jeder Hinsicht während des Studiums unterstützten und einen großen Anteil am erfolgreichen Abschluss des Studiums und dem Gelingen der Doktorarbeit hatten. 30 9. Lebenslauf Persönliche Daten Name: Sommer Vorname: Daniel Geburtsdatum: 22.03.1982 Geburtsort: Nürnberg Vater: Werner Sommer Mutter: Angelika Sommer, geb. Hoppe Schulbildung 09/1988 – 07/1992 Grundschule Thoner Espan, Nürnberg 09/1992 – 06/2001 Gymnasium Peter-Vischer-Schule, Nürnberg 30.06.2001 Allgemeine Hochschulreife Wehrdienst 09/2001 – 07/2002 Gebirgsjägerbataillon 233 Mittenwald Hochschulbildung 10/2002 – 02/2003 Studium der Chemie (Diplom) an der Friedrich-AlexanderUniversität Erlangen-Nürnberg 03/2003 – 07/2009 Studium der Zahnmedizin an der Friedrich-AlexanderUniversität Erlangen-Nürnberg 02/2004 Naturwissenschaftliche Vorprüfung 08/2006 Zahnärztliche Vorprüfung 07/2009 Zahnärztliche Prüfung 03.08.2009 Approbation als Zahnarzt Promotion 03/2009 – 02/2013 Doktorand am Institut für Anatomie (Lehrstuhl I) der Friedrich-Alexander-Universität Erlangen-Nürnberg (Direktor: Prof. Dr. W.L. Neuhuber) Thema: Exzitatorische enterische Co-Innervation von quergestreifter Muskulatur im Mäuseösophagus (Betreuer: Prof. Dr. J. Wörl) 31 Beruflicher Werdegang 12/2009 - 04/2011 Assistenzzahnarzt, Praxis Dr. Schönwälder (Weißenburg i. Bay.) 05/2011 – 10/2011 Assistenzzahnarzt, Praxis Dr. Dorn (Nürnberg) seit 11/2012 Angestellter Zahnarzt, Praxis Dres. Pompl & Bienzeisler (Forchheim)
