Auswirkung von oral verabreichtem Escherichia coli Nissle 1917 auf
Werbung
Aus dem Physiologischen Institut der Tierärztlichen Hochschule Hannover und der Abteilung für Gastroenterologie, Hepatologie und Endokrinologie der Medizinischen Hochschule Hannover Auswirkung von oral verabreichtem Escherichia coli Nissle 1917 auf das Darm-assoziierte Immunsystem des Schweins INAUGURAL DISSERTATION Zur Erlangung des Grades einer Doktorin der Veterinärmedizin (Dr. med. vet.) durch die Tierärztliche Hochschule Hannover Vorgelegt von Swantje Duncker aus Kiel Hannover 2005 Wissenschaftliche Betreuung: Prof. Dr. Gerhard Breves Prof. Dr. Stephan C. Bischoff 1. Gutachter: Prof. Dr. G. Breves 2. Gutachter: Prof. Dr. H.-J. Schuberth Tag der mündlichen Prüfung: 03. Juni 2005 Gefördert durch ein Stipendium der FIRMA ARDEYPHARM GmbH, Herdecke, Deutschland und den Sonderforschungsbereich SFB 621 „Pathobiologie der Intestinalen Mukosa“ der DEUTSCHEN FORSCHUNGSGEMEINSCHAFT (DFG) meinen Eltern und meinem Großvater in Liebe und tiefer Bewunderung in liebevollem Gedenken an meine Großmutter Inhaltsverzeichnis ________________________________________________________________________________ Inhaltsverzeichnis VERZEICHNISS DER ABKÜRZUNGEN 1 EINLEITUNG UND LITERATURÜBERSICHT ..................................................................1 1.1 Physiologische Mikroorganismen des Darms..................................................................2 1.1.1 Darmmikroorganismen beim Schwein.........................................................................4 1.1.2 Intestinale Barriere.......................................................................................................5 1.2 Probiotika ...........................................................................................................................6 1.2.1 Definition .....................................................................................................................6 1.2.2 Anwendung in der Veterinärmedizin und Landwirtschaft...........................................7 1.2.3 Anwendung in der Humanmedizin und Ernährung .....................................................9 1.2.4 Wirkungsmechanismen..............................................................................................12 1.3 1.2.4.1 Wirkung von Probiotika auf die Darmmikroorganismen ......................................13 1.2.4.2 Wirkungen auf den Wirt ........................................................................................14 Escherichia coli Nissle 1917.............................................................................................19 1.3.1 1.4 Escherichia coli Stamm “Abbotstown” ..........................................................................21 1.4.1 1.5 Wirkmechanismen und klinische Bedeutung.............................................................21 Das darmassoziierte Immunsystem................................................................................21 1.5.1 Anatomischer und histologischer Aufbau des Darms beim Schwein ........................22 1.5.2 Immunzellen des Darms.............................................................................................23 1.5.2.1 Zellen des angeborenen Immunsystems ................................................................23 1.5.2.2 Zellen des adaptiven Immunsystems des Schweins...............................................27 1.5.3 1.6 Aufbau des darmassoziierten Immunsystems ............................................................29 1.5.3.1 Intraepitheliale Lymphozyten ................................................................................29 1.5.3.2 Lamina propria Lymphozyten................................................................................31 1.5.3.3 Interleukin-2 Rezeptor (CD25) als Aktivierungsmarker .......................................32 1.5.4 2 Wirkmechanismen und therapeutische Anwendung von EcN...................................20 Antimikrobielle Peptide .............................................................................................33 Ziel der Arbeit ..................................................................................................................34 MATERIAL UND METHODE ..............................................................................................36 2.1 Haltung der Versuchstiere ..............................................................................................36 2.1.1 Versuch mit konventionell gehaltenen Schweinen mit und ohne EcN......................36 2.1.2 Infektionsversuche mit und ohne EcN .......................................................................37 2.2 Versuchsdurchführung....................................................................................................39 2.2.1 Versuch mit konventionell gehaltenen Schweinen mit und ohne EcN......................39 2.2.2 Infektionsversuche mit und ohne EcN .......................................................................40 2.3 Tötung der Tiere ..............................................................................................................43 2.4 Probengewinnung.............................................................................................................44 2.4.1 2.4.1.1 Probenentnahme für mikrobiologische Untersuchungen.......................................44 2.4.1.2 Probenentnahme für die Polymerase-Ketten-Reaktion..........................................44 2.4.1.3 Probenentnahme für histologische und immunhistologische Analysen ................45 2.4.2 2.5 Infektionsversuche mit und ohne EcN .......................................................................46 2.4.2.1 Plasmagewinnung für Plasma-IgA-Bestimmung...................................................46 2.4.2.2 Probenentnahme für mikrobiologische Untersuchungen.......................................46 2.4.2.3 Probenentnahme für luminale IgA-Bestimmung ...................................................46 2.4.2.4 Probenentnahme für histologische Untersuchungen..............................................47 Probenbearbeitung und Lagerung .................................................................................47 2.5.1 2.6 Versuch mit konventionell gehaltenen Schweinen mit und ohne EcN......................44 Einbettung in Paraffin und Anfertigung von Gewebeschnitten .................................47 Mikrobiologische Untersuchungen.................................................................................48 2.6.1 Versuch mit konventionell gehaltenen Schweinen mit und ohne EcN......................48 2.6.2 Infektionsversuche mit und ohne EcN .......................................................................48 2.7 Bestimmung von luminalen und Plasma-IgA................................................................49 2.7.1 Infektionsversuche mit und ohne EcN .......................................................................49 2.7.2 Auswertung ................................................................................................................49 2.8 Histologische Untersuchung............................................................................................49 2.8.1 Entparaffinierung .......................................................................................................49 2.8.2 Hämalaun-Eosin Färbung ..........................................................................................50 2.8.3 Toluidinblaufärbung ..................................................................................................50 2.9 Immunhistologische Methoden.......................................................................................51 2.9.1 Markierte Streptavidin-Biotin Methode.....................................................................51 2.9.2 Verwendete Antikörper..............................................................................................53 2.9.2.1 Darstellung von CD4 Oberflächenantigen.............................................................54 2.9.2.2 Darstellung von CD8 Oberflächenantigen.............................................................55 2.9.2.3 Darstellung von CD25-Oberflächenantigen und intrazellulärem IgA ...................56 2.9.2.4 Gegenfärbung mit Hämalaun .................................................................................56 2.9.3 2.10 RNA-Isolierung, reverse Transkription und Polymerase Kettenreaktion .................58 2.10.1 RNA-Isolierung und reverse Transkription ...............................................................58 2.10.2 PCR ............................................................................................................................59 2.10.3 Verwendete Primer und PCR-Protokolle...................................................................60 2.10.4 Auswertung ................................................................................................................62 2.11 3 Auswertung ................................................................................................................56 Statistik .............................................................................................................................62 ERGEBNISSE ..........................................................................................................................63 3.1 Versuch mit konventionell gehaltenen Schweinen mit und ohne EcN........................63 3.1.1 Gewicht ......................................................................................................................63 3.1.2 Mikrobiologische Untersuchung................................................................................63 3.1.3 Histologische Untersuchung ......................................................................................64 3.1.3.1 Eosinophile Granulozyten......................................................................................65 3.1.3.2 Neutrophile Granulozyten......................................................................................67 3.1.3.3 Basophile Granulozyten.........................................................................................69 3.1.3.4 Mastzellen ..............................................................................................................70 3.1.4 3.1.4.1 T-Helfer-Zellen (CD4+).........................................................................................73 3.1.4.2 CD8+ Zellen...........................................................................................................75 3.1.4.3 Aktivierungsmarker (CD25) ..................................................................................81 3.1.4.4 IgA-produzierende Plasmazellen ...........................................................................82 3.1.5 3.2 Immunhistologische Untersuchung ...........................................................................72 mRNA-Expression von Zytokinen und antimikrobiellen Peptiden ...........................85 Infektionsversuche mit und ohne EcN ...........................................................................89 3.2.1.1 Klinik .....................................................................................................................89 3.2.1.2 Allgemeine mikrobiologische Untersuchung ........................................................93 3.2.1.3 Wassergehalt im Kot..............................................................................................95 3.2.1.4 Luminale und Plasma-IgA-Bestimmung ...............................................................96 3.2.1.5 4 Histologie ...............................................................................................................97 DISKUSSION...........................................................................................................................99 4.1 Konzeptionelle Überlegungen .........................................................................................99 4.2 Konventionell gehaltene Schweine ...............................................................................100 4.3 Infektionsversuch mit und ohne EcN ...........................................................................113 4.4 Neue Erkenntnisse über die Wirkungsweise von EcN................................................119 5 ZUSAMMENFASSUNG .......................................................................................................120 6 SUMMARY ............................................................................................................................122 7 LITERATURVERZEICHNIS..............................................................................................124 8 ANHANG I .............................................................................................................................156 8.1 9 Futterzusammensetzung des verwendeten Grundfutters ..........................................156 8.1.1 E. coli Nissle 1917-Versuch mit konventionell gehaltenen Schweinen ..................156 8.1.2 Infektionsversuche mit und ohne EcN .....................................................................157 ANHANG II............................................................................................................................158 Bakterienstämme ...........................................................................................................158 9.2 Material und Geräte ......................................................................................................158 9.3 Pharmaka und Substanzen ...........................................................................................161 9.4 Lösungen und Protokolle ..............................................................................................163 9.5 Kits ..................................................................................................................................165 10 9.1 ANHANG III ..........................................................................................................................166 10.1 Versuch mit konventionell gehaltenen Schweinen mit und ohne EcN......................166 10.1.1 Gewicht ....................................................................................................................166 10.1.2 Anzahl eosinophiler Granulozyten ..........................................................................167 10.1.3 Anzahl neutrophiler Granulozyten...........................................................................167 10.1.4 Anzahl an Mastzellen...............................................................................................168 10.1.5 Anteil CD4+ Zellen..................................................................................................169 10.1.6 Anzahl CD8+ Zellen ................................................................................................170 10.1.7 Anzahl CD25+ Zellen ..............................................................................................173 10.1.8 10.2 Anteil IgA+ Zellen...................................................................................................173 Infektionsversuche mit und ohne EcN .........................................................................174 10.2.1 Gewicht ....................................................................................................................174 ERKLÄRUNG DANKSAGUNG Verzeichnis der Abkürzungen ________________________________________________________________________________ Verzeichnis der Abkürzungen ® eingetragenes Wahrenzeichen Abb. Abbildung AEC 3-Amino-9-ethylcarbazol Akt-Kinase Protein Kinase B AMG Arzneimittelgesetz Aqua dest. Aqua destilata B.cer. var. toyoi Bacillus cereus Varietas toyoi bzw. beziehungsweise CD cluster of differentiation (zelluläre Differenzierungsantigene) CED chronisch entzündliche Darmerkrankung CTMC connective tissue mast cell (Bindegewebsmastzellen) DC dendritic cell (dendritische Zelle) DNA desoxy ribonucleic acid (Desoxyribonukleinsäure) E. coli Escherichia coli EcN Escherichia coli Nissle 1917 ECP eosinophilic cationic protein (Eosinophiles Kationisches Protein) EPEC enteropathogene Escherichia coli EPX Eosines Protein X et al. et alii (und andere) ETEC enterotoxische Escherichia coli Fa. Firma FMG Futtermittelgesetz GALT gut associated lymphoid tissue (darmassoziiertes lymphoides Gewebe) HE Hämalaun Eosin HRP horseradish peroxidase (Meerrettichperoxidase) IEL intraepitheliale Lymphozyten IFN Interferon Ig Immunglobulin IL Interleukin Verzeichnis der Abkürzungen ________________________________________________________________________________ IL-2R Interleukin-2 Rezeptor IκB inhibitor of kappa B (Hemmstoff von kappa B) KBE koloniebildende Einheiten LCC Laktobazillen LGG Lactobacillus rhamnosus GG LMBG Lebensmittel- und Bedarfsgegenständegesetz LP Lamina propria LPL Lamina propria Lymphozyten LPS Lipopolysaccharid LSAB-Methode labeled streptavidin biotin (gekennzeichnete Streptavidin-Biotin) Methode LT Lymphotoxin mAK monoklonaler Antikörper pAK polyklonaler Antikörper MALT mucosa associated lymphoid tissue (mukosaassoziiertes lymphoides Gewebe) MAP-Kinase Mitogen-aktivierte Protein-Kinase MBP major basic protein MC mast cell (Mastzelle) MCP membrane cofactor protein MHC major histocompatibility complex MIP-1 macrophage inflammatory protein (Makrophagen Entzündungsprotein) MMC mucosal mast cell (mukosale Mastzellen) mRNA messenger ribo nucleic acid (Boten-Ribonukleinsäure) NaCl Natriumchlorid NfE N-freie Extraktstoffe NFκB Nucleus Faktor Kappa B PBS Phosphate buffered saline (phosphatgepufferte Kochsalzlösung) PGE-2 Prostaglandin E-2 PP Peyer´sche Platten RT Raumtemperatur s.c. subcutan SAB Saccharomyces boulardii SCF stem cell factor (Stammzellfaktor) Verzeichnis der Abkürzungen ________________________________________________________________________________ SCFA short chain fatty acids (kurzkettige Fettsäuren) SD standard deviation (Standardabweichung) sIgA sekretorisches IgA ST1p Shigatoxin 1p TBS Tris buffered saline (Tris-gepufferte Kochsalzlösung) TCR T-cell receptor (T-Zellrezeptor) TGF tumor growth factor (Tumorwachstumsfaktor) Th -Zelle T-Helfer-Zelle TNF Tumornekrosefaktor u.ä. und ähnliches WHO World Health Organization (Weltgesundheitsorganisation) z.B. zum Beispiel z.T. zum Teil Chemische Elemente werden entsprechend der internationalen Literatur abgekürzt. Einleitung und Literaturübersicht ________________________________________________________________________________ 1 Einleitung und Literaturübersicht Die ersten Lebewesen, die die Evolution hervorgebracht hat, gehörten zur Gruppe der Mikroorganismen. Noch heute sind verschiedene Formen von Mikroorganismen an der Besiedlung nahezu jedes Lebensraumes unseres Planeten beteiligt. Häufig haben sich im Laufe der Evolution Symbiosen zwischen Mikroorganismen und höher entwickelten Lebewesen als äußerst erfolgreich erwiesen. Eine derartige Symbiose sind auch die Säugetiere mit den ihren Darm besiedelnden Mikroorganismen eingegangen. Die Anzahl der physiologischerweise den Magendarmtrakt besiedelnden Mikroorganismen übersteigt dabei die Zahl der Körperzellen des Wirts um ein Vielfaches. (BRY et al. 1996). Es wird üblicherweise angenommen, dass zwischen 400 und 500 verschiedene Spezies an der Besiedlung des Intestinaltraktes beteiligt sind (SIMON und GORBACH 1982). Nachdem ihre Aufgabe lange Zeit nur auf Seiten der Nährstoffversorgung und Fermentation gesehen wurde, rückten in den letzten Jahren auch immer häufiger immunmodulatorische Wirkungen der Darmmikroorganismen in den Blickpunkt der Forschung (BOURLIOUX et al. 2003). Auf dieser Grundlage erlebte die Erforschung einer Gruppe von Mikroorganismen eine Renaissance, deren positive Wirkung auf die Gesundheit des Menschen schon Anfang des letzten Jahrhunderts von METCHNIKOFF (1907) und in den 20er Jahren des vergangenen Jahrhunderts von NISSLE (1916) untersucht wurde. LILLY et al. (1965) prägten für diese Gruppe von Mikroorganismen den Begriff „Probiotika“. Das Wissen um die genaue Wirkungsweise dieser speziellen Mikroorganismen im Ökosystem Darm und den Einfluss auf den Wirtsorganismus ist aber nach wie vor unzureichend. Dies ist insofern besonders bedauerlich, als Probiotika inzwischen nicht nur in Form von Futtermittel- bzw. Nahrungsmittelzusatzstoffen eine Rolle spielen, sondern einzelne Spezies auch als Medikamente zum Einsatz kommen. Vor allem in der Humanmedizin werden diese Spezies zur Therapie von gastrointestinalen Erkrankungen genutzt und haben sich den pharmakologischen Therapien als ebenbürtig erwiesen (KRUIS et al. 1997, REMBACKEN et al. 1999, GAON et al. 2003, ALLEN et al. 2004). Allerdings scheint die Zahl der Befürworter derartiger Therapieansätze ebenso groß wie die ihrer Gegner. Anstoß der Diskussion um den Einsatz von Probiotika bildet immer wieder das Fehlen befriedigender Erklärung für die Wirkung der verwendeten Keime. In der Veterinärmedizin intensiviert der Einsatz von Probiotika als Ersatz für antimikrobielle 1 Einleitung und Literaturübersicht ________________________________________________________________________________ Leistungsförderer in der Nutztierhaltung die Diskussion um die Wirkungsweise dieser speziellen Mikroorganismen zusätzlich. Eine Aufklärung von probiotischen Wirkmechanismen ist demnach nicht nur in Bezug auf erweiterte und gezieltere therapeutische Anwendungen wünschenswert, sondern könnte auch helfen die prophylaktische Anwendung probiotischer Keime sowohl beim Menschen als auch beim Tier auszuweiten und zu verbessern. 1.1 Physiologische Mikroorganismen des Darms Um Effekte von Probiotika auf die Mikroökologie des Darms und damit auf den Wirt einordnen und die Erkenntnisse zu Wirkungsmechanismen bewerten zu können, soll zunächst kurz auf die physiologischen Mikroorganismen des Darms und ihre Bedeutung für den Wirt eingegangen werden. Sowohl umgangssprachlich als auch in vielen Bereichen der wissenschaftlichen Forschung wird von der sogenannten ”normalen Darmflora” gesprochen. Damit sind in der Regel die Mikroorganismen gemeint, die bei einem gesunden Individuum im Magen-Darm-Trakt vorkommen. Es handelt sich dabei sowohl um residente wie auch um transiente Keime. Die Ansammlung intestinaler Mikroorganismen ist in hohem Maße individuellen Schwankungen unterworfen. Die Speziesverteilung hängt von vielen Faktoren wie dem Alter, dem Geschlecht, der Ernährung, sowie den Umwelt- und Hygieneverhältnissen ab. Auch eine genetische Komponente wird diskutiert. So zeigt die Zusammensetzung der Darmmikroorganismen bei eineiigen Zwillingen eine größere Übereinstimmung als bei zweieigen Zwillingen (VAN DE MERWE et al. 1983). Ein ”Normalzustand”, der für alle Individuen einer Spezies gilt, ist demnach nur schwer vorstellbar, weshalb im Folgenden von physiologischer Besiedlung gesprochen werden soll. Die Verwendung des Wortes Mikroorganismen trägt der Tatsache Rechnung, dass eine Vielzahl verschiedener Organismen aus verschiedenen Gattungen an der Besiedlung des Säugerdarms beteiligt sind (ROBINSON et al. 1984, BLEDAY et al. 1993, TANNOCK 2001, FANARO et al. 2003). Die Anzahl der Mikroorganismen nimmt im Verlauf des Gastrointestinaltrakts von oral nach aboral stetig zu und beläuft sich bei Nutztieren wie dem Schwein auf einer Gesamtzahl von 1014 KBE im Darm. Im Vergleich zwischen den Darmabschnitten ist sie im Dickdarm mit 1012 KBE/g Ingesta am höchsten (GEDEK 1987). Die Gesamtheit der physiologischen Mikroorganismen setzt sich aus 2 Einleitung und Literaturübersicht ________________________________________________________________________________ 400-500 Spezies zusammen, wobei die Angaben zu diesen Zahlen in der Literatur stark differieren (FULLER et al. 1978, ROBINSON et al. 1984, TANNOCK 2001). Neueste präliminäre Ergebnisse für den Menschen lassen allerdings eine sehr viel geringere Zahl von um die 100 Spezies mit einer extremen Diversität zwischen einzelnen Wirten vermuten (ABBOTT 2004). Jedes Individuum scheint somit eine ihm eigene physiologische Darmbesiedlung zu besitzen. Sowohl bei Säugetieren als auch beim Menschen gehören die meisten Darmbakterien dem Genus Lactobacillus, Bifidobacteria und Bacteroides an (25 bzw. 30%) (FULLER et al. 1978, ROBINSON et al. 1984, SALMINEN et al. 1998). Als primäre Aufgabe der gastrointestinalen, mikrobiologischen „Mitbewohner” wird der Abbau von für den Wirt nicht oder nur schwer verdaulicher Kohlenhydrate (Cellulose, Hemizellulose, Oligosaccharide und Pektine) angesehen. Sowohl beim Menschen als auch beim Schwein erfolgt der mikrobielle Abbau in erster Linie im Kolon. Die Produktion kurzkettiger Fettsäuren, besonders von Butyrat, sichert dabei die Energieversorgung der Enterotzyten ( SAVAGE 1977a, b, COATES 1980, FULLER 1989, GUARNER und MALAGELADA 2003,). Allerdings ist die Fermentation von Kohlenhydraten nicht auf den Dickdarm beschränkt. Insbesondere Hemizellulosen und Pektine werden zu einem nicht unerheblichen Anteil auch schon im Dünndarm mikrobiell verstoffwechselt (DROCHNER 1993). Andere Untersuchungen belegen eine beträchtliche Fermentation der Ingesta im terminalen Ileum (HOUDIJK 1998). Neben der Fermentationsleistung synthetisieren einige Darmmikroorganismen B-Vitamine und Vitamin K (SALMINEN et al. 1998). Außerdem sorgen sie für eine Stimulation und Regulation des intestinalen Immunsystems, unterstützen die orale Toleranz gegenüber Nahrungsantigenen und helfen, die Besiedlung des Darms mit pathogenen Mikroorganismen zu vermeiden (TLASKALOVA-HOGENOVA et al. 2004), indem beispielsweise die Anheftung pathogener Mikroorganismen durch von Kommensalen besetzte Anheftungsstellen erschwert wird. Des Weiteren bietet die Wechselwirkung (crosstalk) zwischen den physiologischen Darmbewohnern und der Mukosa des Wirts einen zusätzlichen Schutz (UMESAKI et al. 1997). Alle genannten Eigenschaften unterstützen das intestinale Epithel maßgeblich in seiner Funktion als intestinale Barriere. 3 Einleitung und Literaturübersicht ________________________________________________________________________________ 1.1.1 Darmmikroorganismen beim Schwein Die mikrobielle Besiedlung des Schweinedarms beginnt unter der Geburt und setzt sich durch den nachfolgenden Kontakt mit der Sau und der Umgebung fort. Die Zusammensetzung der Bakterienspezies hängt dabei zu gleichen Teilen von der Besiedlung des Muttertieres zum Zeitpunkt der Geburt und den in der unmittelbaren Umwelt vorherrschenden Keimen ab (SMITH 1965, SCHULZE und BATHKE 1977, SCHULZE et al. 1980). Anders als menschliche Säuglinge, die zumindest in den Industrieländern meist in eine keimarme Umgebung hineingeboren werden, sind die Haussäugetiere sofort nach ihrer Geburt mit einer großen Menge an Keimen konfrontiert. Beim Schwein kommt es schon zwei Stunden nach der Geburt zur Besiedlung des Darms mit koliformen Keimen. Bereits nach 48 Stunden sind Laktobazillen und Clostridien vorhanden und es können strikte Anaerobier, wie z.B. Bacteroides Spezies nachgewiesen werden (DUCLUZEAU 1985, SWORDS et al. 1993). Die Bakteriendichte im Koloninhalt stabilisiert sich ausgehend von Sterilität bei der Geburt nach 12 Stunden auf 109-1010 koloniebildende Einheiten pro Gramm. Durch die veränderte Fütterung in Zusammenhang mit dem Absetzen erhöht sich der Anteil der Bacteroides Spezies als dominierenden Anaerobiern (SWORDS et al. 1993). Im Darm gesunder abgesetzter Schweine (Läufer) überwiegen jedoch die Laktobazillenspezies. Insbesondere Lactobacillus acidophilus, macht den größten Teil der bakteriellen Besiedlung aus. Außerdem sind im gesamten Magen-Darm-Trakt Streptokokken (Streptococcus bovis, Streptococcus fecalis und Streptococcus faecium) nachweisbar. Die größte Dichte findet sich im Ileum und im Dickdarm (GÄRTNER et al. 1973, KENWORTHY 1973). Im Vergleich zum menschlichen Darm, bei dem mit bis zu 90 % der Gesamtbakterienzahl Bacteroides-Spezies und Bifidobakterien vorherrschen (HAENEL 1969), finden sich diese beim Schwein nur zu einem geringen Anteil von ca. 1% (SCHULZE und BATHKE 1977). E. coli-Spezies tragen sowohl beim Schwein als auch beim Mensch mit 1-5% zur anzüchtbaren Stuhlflora bei ( SEELIGER und WERNER 1965, HAENEL 1969). Neben den Bakterien beherbergt der Darm auch Hefen. SCHULZE und BATHKE (1977) konnten Hefen nur in geringen Mengen aus dem Magen und Dünndarm von Schweinen aber nicht aus dem Dickdarm isolieren. 4 Einleitung und Literaturübersicht ________________________________________________________________________________ 1.1.2 Intestinale Barriere Bei allen Säugetieren stellt der Darm die größte Fläche des Körpers dar, an der sich der Organismus mit der Außenwelt auseinandersetzen muss. Um pathogenen und potentiell schädlichen Einflüssen entgegenzuwirken, haben sich im Laufe der Evolution verschiedene Schutzmechanismen entwickelt. Die Gesamtheit dieser Schutzfunktionen im Darm wird als „intestinale Barriere“ bezeichnet. Sie besteht aus den luminalen und epithelialen physiologischen Darmmikroorganismen dem Epithel mit der Mukusschicht und Teilen des darmassoziierten Immunsystems (GALT). A B C D Abb. 1 Intestinale Barriere A =luminale und adhärente, kommensale Mikroorganismen des Darms, B = Mukusschicht, C = Epithelzellschicht, D = GALT Die außerordentliche Bedeutung der kommensalen Mikroorganismen für die „intestinale Barriere“ wird deutlich, wenn keimfrei aufgezogene Tiere, deren Darm keine Mikroorganismen enthält, mit pathogenen Keimen konfrontiert werden. Es genügt dann schon eine geringe Konzentration von Pathogenen, um letale Infektionen zu verursachen. Dabei handelt es sich um Konzentrationen, bei denen konventionell gehaltene Tiere mit intakter Darmbesiedlung nicht oder nur sehr schwach erkranken (NARDI et al. 1989). 5 Einleitung und Literaturübersicht ________________________________________________________________________________ 1.2 Probiotika 1.2.1 Definition Der Begriff Probiotika wurde 1965 eingeführt (LILLY und STILLWELL 1965). Er ist abgeleitet aus den griechischen Worten „pro” und „bios” und bedeutet soviel wie „für das Leben”. Damit wurde er dem Begriff „antibiotisch” gegenüber gestellt. LILLY und SPELLWELL (1965) verwendeten den Begriff zur Beschreibung von „Substanzen, die von einem Mikroorganismus sezerniert werden und das Wachstum eines anderen stimulieren”. Nach und nach setzte sich eine mehr und mehr generalisierte Verwendung des Begriffs durch. PARKER (1974) war der erste, der den Begriff Probiotika in der Weise verwendete, wie er heute benutzt wird. Neben den auf das Wachstum positiv wirkenden Substanzen schloss diese Definition auch Mikroorganismen mit positivem Einfluss auf den Wirt ein. Dabei waren nicht nur Wirkungen in bezug auf die Wachstumsförderung sondern auch die generelle Beeinflussung der intestinalen Flora wichtig. In dem Bestreben, Probiotika zu den in der Definition von Parker eingeschlossenen Antibiotika klarer abzugrenzen, betonten verschiedene Untersucher in den folgenden Jahren die Notwendigkeit der Verwendung lebender Mikroorganismen ( PARKER 1974, HAVENAAR und HUIS IN 'T VELD 1992). Es stand aber immer noch der direkte Einfluss auf die intestinale Mikroflora des Wirtes im Vordergrund (HAVENAAR und HUIS IN 'T VELD 1992). Andere Untersucher vertraten eine generalisiertere Auffassung, in der die Wirkung von Probiotika auf die Gesundheit des Wirtes und die Ernährung berücksichtigt wurde (SALMINEN 1996, SCHAAFSMA 1996). Diese Definition schloss demnach fermentierte Milchprodukte mit ein. SCHRENZENMEIR et al. (2001) kritisierten in diesem Zusammenhang die Verwendung des Begriffs „Ernährung”. Des Weiteren erschien ihnen die Beschränkung auf Milchprodukte ungenau, weil andere fermentierte Produkte, wie z. B. Sauerkraut und Salami, nicht mit einbezogen wurden. Sie veränderten daraufhin die Definition zur heute noch gültigen und von der WHO anerkannten Version von Probiotika als: „Eine Präparation eines Produktes oder ein Produkt, das lebende, definierte Mikroorganismen in ausreichender Zahl enthält, die die Mikroflora (durch Implantation oder Kolonisation) in einem Bereich des Wirtskörpers verändern und dadurch fördernde Gesundheitseffekte auf den Wirt haben.” (SCHREZENMEIR und DE VRESE 2001) Diese Definition trägt dem Umstand Rechnung, dass neben Mikroorganismen auch deren 6 Einleitung und Literaturübersicht ________________________________________________________________________________ Präparationen, etwa in Form von Medikamenten, verwendet werden. Es wird auf die Wichtigkeit einer ausreichenden Anzahl an Organismen hingewiesen. Die fehlende Beschränkung von Einflüssen auf die inhärente Mikroflora trägt der prophylaktischen Anwendung Rechnung, die heute einen Großteil des probiotischen Einsatzes ausmacht. Zuletzt bezieht sich die aktuelle Definition nicht nur auf den Bereich des Magen-Darm-Trakts, sondern auf den gesamten Gastrointestinaltrakt und andere Körperkompartimente, die eine mikrobiologische Flora beherbergen, wie zum Beispiel die Haut oder der weibliche Genitaltrakt. Probiotika werden von alters her zur Verbesserung der Gesundheit von Mensch und Tier eingesetzt. Schon 76 vor Christus empfahl der römische Historiker Plinius die Anwendung von fermentierten Milchprodukten bei Gastroenteritis (SCHREZENMEIR und DE VRESE 2001). Ende des 19. und Anfang des 20. Jahrhunderts beschäftigten sich immer wieder Wissenschaftler mit der gesundheitsfördernden Wirkung bestimmter Bakterienspezies. Neben prophylaktischen Veränderungen der Zusammensetzung von inhärenten Mikroorganismen (CARRE 1887, MECHNIKOFF 1907, TISSIER 1984) wurde auch die direkte therapeutische Bekämpfung pathogener Bakterien diskutiert (NISSLE 1916). Heute werden Probiotika sowohl in der Veterinärmedizin und Landwirtschaft als auch in der Humanmedizin und Humanernährung eingesetzt. 1.2.2 Anwendung in der Veterinärmedizin und Landwirtschaft Man unterscheidet zwischen dem Einsatz von probiotischen Keimen in der Fütterung (1) und dem prophylaktischen und therapeutischen Einsatz in der Medizin (2). (1) Der größte Teil der beim Tier verwendeten Probiotika wird in der Nutztierfütterung eingesetzt und unterliegt damit dem Futtermittelgesetz (FMG). Auf diesen Bereich soll hier wegen seiner großen Bedeutung für die Veterinärmedizin und die Landwirtschaft kurz eingegangen werden, obwohl sich die im Folgenden vorgestellten Untersuchungen mit einem Keim beschäftigen, der als Medikament verwendet wird. Nach dem weitgehenden Verbot antibiotischer Leistungsförderer wurde in der Intensivtierhaltung nach neuen Wegen gesucht, diese zu ersetzen, wobei sich Probiotika als Alternative erwiesen. In 7 Einleitung und Literaturübersicht ________________________________________________________________________________ der Europäischen Union sind derzeit 21 Probiotikapräparationen als Futterzusatzstoffe für die verschiedenen Nutztierspezies (Schwein, Wiederkäuer, Geflügel und Fische) zugelassen (Europäische Union 2003). Sie enthalten als Mono- oder Kombinationspräparate Keime der Bakteriengattungen Bacillus, Bifidobacterium, Enterococcus, Lactobacillus und Streptococcus, sowie der Hefe Saccharomyces. Besonders im Schweinefutter finden sich inzwischen immer häufiger Probiotika. Als deren positive Wirkung wird bei Monogastriern wie dem Schwein nicht primär eine Leistungssteigerung durch höhere Mastleistung und bessere Futterverwertung angenommen, sondern die Aufgabe der Probiotika scheint vielmehr in der Aufrechterhaltung einer physiologischen mikrobiellen Darmbesiedlung zu liegen. Diese soll dann sekundär zu einer verbesserten Leistung zur Folge haben (Europäische Union 2000). So führte die Fütterung von Bifidobacterium pseudolongum und Lactobacillus acidophilus an neugeborene Ferkel von der Geburt, über das Absetzen hinaus bis zum 56. Lebenstag zu einer schnelleren Gewichtszunahme, und Bifidobacterium pseudolongum verbesserte zusätzlich die Futterverwertung. Des weiteren senken bestimmte Bifidobakterienspezies die Mortalitätsrate von Saugferkeln bis zum 28. Lebenstag um 20 % (ABE et al. 1995). Für mit Bacillus cereus substituierte Ferkel ist ebenfalls eine Verbesserung der Gewichtszunahme beschrieben (KIRCHGESSNER et al. 1993). Es wundert nicht, dass Probiotika auf dieser Grundlage heute insbesondere im Ferkelstarterfutter zu finden sind. Die Auswirkungen probiotischer Mikroorganismen auf ältere Schweine sind hingegen widersprüchlich. Während ROSEN (1992) kaum Auswirkungen auf die Leistung (<1%) von erwachsenen Tieren festgestellt hat, konnten eine neuere Feldstudie nach Fütterung eines Präparates mit Bacillus lichiniformis Sporen und Bacillus cereus Sporen zeigt, dass sowohl die mittlere tägliche Gewichtszunahme als auch die Futterverwertung bei Mast- und Endmastschweinen deutlich verbessert sind. Dabei ist die tägliche Gewichtszunahme bei wachsenden Mastschweinen bis zu 7,2% höher als bei Kontrolltieren ohne Probiotika. Die Futterverwertung ist mit einer 9,5%igen Erhöhung in der Mast und 5,5%igen Erhöhung in der Endmast besser als die bei Einsatz von antibiotischen Leistungsförderern als rentable angesehenen 5% (ALEXOPOULOS et al. 2004). ALEXOPOULOS et al. (2004) konnten außerdem zeigen, dass die Schlachtkörper der mit Bacillussporen gefütterten Tier in höhere Güteklassen eingeteilt wurden. 8 Einleitung und Literaturübersicht ________________________________________________________________________________ (2) Die therapeutische Anwendung von Probiotika in der Veterinärmedizin ist eher gering im Vergleich zur prophylaktischen Anwendung in der Fütterung und der therapeutischen Anwendung in der Humanmedizin. Als Medikamente zugelassene Probiotika unterliegen, anders als die Futtermittelzusatzstoffe, dem Arzneimittelgesetz (AMG) und damit den strengen Richtlinien der Arzneimittelzulassung. Sie werden zur Behandlung von Gastroenteritiden insbesondere bei Jungtieren eingesetzt. Allerdings erfolgt die Verwendung weniger zur Monotherapie als zur Prophylaxe, Substitution- oder Regenerationstherapie (KAHRS 1986, FOX 1988, IBEN und LEIBETSEDER 1989). Beispielsweise wird, um Salmonella typhimurium Infektionen vorzubeugen, ein Gemisch aus Lactobacillus acidophilus, Streptococcus faecium und Salmonellen-Antikörper bei Puten eingesetzt (PROMSOPONE et al. 1998). 1.2.3 Anwendung in der Humanmedizin und Ernährung Probiotika werden traditionsgemäß beim Menschen schon sehr viel länger eingesetzt als beim Tier. Im Zuge der Antibiotikaentdeckung Ende des 19. Jahrhunderts gerieten die Anwendungsmöglichkeiten zum Teil wieder in Vergessenheit, und es wurde nur noch von wenigen Wissenschaftlern auf diesem Gebiet geforscht. Nicht zuletzt durch das vermehrte Auftreten von Antibiotikaresistenzen in den letzten Jahren, der Häufung von Allergien, sowie der erhöhten Sensibilisierung der Bevölkerung für gesunde Ernährung und durch die wachsende Akzeptanz ganzheitlicher Heilmethoden, erfreuen sich Probiotika wieder wachsender Beliebtheit. Ähnlich wie beim Tier werden probiotische Mikroorganismen beim Menschen häufiger in der Ernährung (1), in Form von Lebensmitteln oder Lebensmittelzusatzstoffen, als in der Therapie (2) von Erkrankungen eingesetzt. Sie unterliegen in diesen Fällen dem Lebensmittel- und Bedarfsgegenstände-Gesetz (LMBG). Inzwischen beläuft sich der Markt probiotischer Lebensmittel auf einen weltweiten Umsatz von sechs Mil. US$ (ABBOTT 2004). Die Hersteller versprechen dabei eine positive Wirkung auf die Gesundheit und das Immunsystem. (1) Die Verwendung von Nahrungsmitteln mit apathogenen Bakterien, besonders in Form fermentierter Milchprodukte, hat nicht nur in Europa eine lange Tradition. Dem Verzehr von Joghurt oder Sauermilch, bei denen die Beimpfung mit Bakterien ursprünglich nur zur Konservierung erfolgte, wurde mit der Zeit auch mehr und mehr ein gesundheitsfördernder Effekt 9 Einleitung und Literaturübersicht ________________________________________________________________________________ nachgesagt. Um diesen noch zu erweitern, setzt man seit dem letzten Jahrhundert diesen Lebensmitteln neben den klassischen Fermentationskulturen vielfach auch probiotische Keime zu. Es handelt sich dabei hauptsächlich um Bakterien der Gattungen Bifidobacterium und Lactobacillus. Leider gibt es kaum evidenzbasierte Studien über den Nutzen von probiotischen Lebensmitteln für die Gesundheit des Verbrauchers. (2) Anders als in der Veterinärmedizin hat die Verwendung probiotischer Keime als Therapeutikum in der Humanmedizin in den letzen Jahren zugenommen. Die Anwendungen sind dabei vielfältig. Allerdings liegen nicht für alle Bereiche gesicherte, prospektive, klinische Studien vor. Gesicherte Untersuchungen gibt es zu infektiösen Diarrhöen bei Kleinkindern (MCFARLAND et al. 1995, VANDERHOOF et al. 1999, SZAJEWSKA et al. 2001, SURAWICZ 2003), der Remmissionserhaltung von Colitis ulcerosa (KRUIS et al. 1997, REMBACKEN et al. 1999), der Behandlung von Pouchitis (GIONCHETTI et al. 2003) und der Allergievorsorge bei Säuglingen (MAJAMAA und ISOLAURI 1997, ROSENFELDT et al. 2003). Behandlungserfolge bei akuten Diarrhöen werden durch Probiotika, insbesondere Lactobacillus rhamnosus GG (LGG) und Saccharomyces boulardii (SAB), hauptsächlich bei Säuglingen und Kleinkindern erzielt, also in einem Alter, in dem die Darmbarriere noch nicht voll entwickelt ist. Auslöser dieser Diarrhöen sind häufig Rotavirus- und Antibiotika-induzierte Clostridium difficile Infektionen. Prophylaktisch verringern Laktobazillen das Auftreten von Gastroenteritiden durch Rotaviren um 14,5% (SZAJEWSKA et al. 2001). Es wurde gezeigt, dass nicht etwa die Infektionsrate verringert wird, sondern seltener Krankheitssymptome auftreten (SZAJEWSKA et al. 2001, ROSENFELDT et al. 2002a, 2002b). Die Prävention von antibiotikaassoziierten Diarrhöen wird durch LGG um 18 % reduziert (VANDERHOOF et al. 1999). Ähnliche Ergebnisse werden mit SAB erzielt. Die positiven Effekte zeigen sich bei Einsatz von SAB besonders in der Substitutionstherapie mit zusätzlicher Antibiotikagabe (MCFARLAND et al. 1995, SURAWICZ et al. 2000, SURAWICZ 2003). Bei Erwachsenen sind die Ergebnisse zur positiven Wirkung von Probiotika gegen Durchfällen uneinheitlich. Allerdings senkt die Gabe von SAB die Diarrhöerate bei enteral ernährten Intensivpatienten (BLEICHNER et al. 1997). Die Modulation der mechanischen und immunologischen Darmbarriere durch Probiotika 10 Einleitung und Literaturübersicht ________________________________________________________________________________ prädestiniert sie geradezu für den Einsatz bei chronisch-entzündlichen Darmerkrankungen (CED). Obwohl man noch kaum etwas über die Wirkungsmechanismen weiß, existieren insbesondere für die Remmissionserhaltung bei Colitis ulcerosa Studien, die dem probiotischen E. coli Stamm Nissle 1917 (EcN) die gleiche Wirksamkeit wie dem standardmäßig verwendeten Mesalazin bescheinigen (KRUIS et al. 1997, REMBACKEN et al. 1999, KRUIS et al. 2001). Eine andere Studie zeigt Evidenzen, dass auch ein Gemisch aus verschiedenen Laktobazillen- und Bakteroidesspezies (VSL#3) einen positiven Effekt bei der Remmissionserhaltung der Colitis ulcerosa hat (VENTURI et al. 1999). Bei der Remissionserhaltung und Therapie des Morbus Crohn sind die Ergebnisse zur Wirksamkeit von Probiotika widersprüchlich (GUPTA et al. 2000, PRANTERA et al. 2002). Es gibt allerdings Anzeichen, dass Kinder mit mäßig ausgeprägtem Morbus Crohn von der Behandlung mit LGG profitieren (GUPTA et al. 2000). Patienten mit therapierefraktärer Colitis ulcerosa oder Kolonkarzinom wird nach Proktokolektomie ein Pouch angelegt. Eine der häufigsten Komplikationen ist dabei eine rezidivierende Entzündung. Patienten mit chronischer Pouchitis werden unter Anwendung von VSL#3 erfolgreich in Remission gehalten (GIONCHETTI et al. 2000, MIMURA et al. 2004). Außerdem konnte, wenn auch bisher nur für kleine Fallzahlen, gezeigt werden, dass VSL#3 die Inzidenz einer akuten Pouchitis post operationem verringert (GIONCHETTI et al. 2003). Von Allergien sind insbesondere in den Industrieländern große Anteile der Bevölkerung betroffen, und die Inzidenz ist in den letzten Jahren deutlich steigend (KAY 2001a, 2001b). Besonders Kinder und Kleinkinder leiden immer häufiger an verschiedenen Formen allergischer Reaktionen. Es hat sich gezeigt, dass insbesondere Laktobazillen vor Allergien schützen können. So konnte gezeigt werden, dass LGG und Lactobacillus reuteri klinische Symptome und Laborparameter bei Kindern mit atopischer Dermatitis verbessern (MAJAMAA und ISOLAURI 1997, ROSENFELDT et al. 2003). Wenn Mütter ante partum und die Säuglinge postnatal bzw. stillenden Mütter mit LGG behandelt wurden, konnte das Auftreten atopischer Ekzeme bei Kindern mit hohem familiärem Allergierisiko halbiert werden (KALLIOMAKI et al. 2001, KALLIOMAKI et al. 2003). Die Prävention von Allergien oder rezidivierenden Infektionen konnte von anderen Untersuchern auch für die Behandlung mit einem apathogenen E. coli bestätigt werden (LODINOVAZADNIKOVA et al. 2003). Anzumerken ist, dass die allergieprophylaktische Wirkung nur eintritt, 11 Einleitung und Literaturübersicht ________________________________________________________________________________ wenn die Behandlung mit Probiotika in einem Alter erfolgt, in dem sich ein Gleichgewicht in der Darmbesiedlung noch nicht eingestellt hat. Werden die Probiotika erst an Teenager oder beim jungen Erwachsenen gegeben, lässt sich keine positive Wirkung mehr beobachten (HELIN et al. 2002). Außerdem ist die Verwendung lebender Bakterien von entscheidender Bedeutung, da oben genannte Effekte nur mit lebenden, nicht aber mit hitze-inaktivierten Bakterien erzielt werden können (KIRJAVAINEN et al. 2003). Neben den Haupteinsatzbereichen der Probiotika in der Behandlung von Gastroenteritiden und Allergien gibt es auch erste Hinweise auf die Wirksamkeit beim Reizdarmsyndrom vom DiarrhöeTyp (KIM et al. 2003). Eine positive Beeinflussung der Laktoseintoleranz (SALTZMAN et al. 1999) und der Stahlenenteritis (URBANCSEK et al. 2001) konnte hingegen nicht nachgewiesen werden. Für die Tumorprävention bei kolorektalen Karzinomen und die Cholesterinsenkung sind die Daten widersprüchlich (DE ROOS und KATAN 2000, HIRAYAMA und RAFTER 2000). 1.2.4 Wirkungsmechanismen Die in der Literatur beschriebenen Verwendungsweisen von Probiotika legen die Vermutung nahe, dass nur einige wenige Mikroorganismen bei bestimmten Erkrankungen wirksam sind. Ob sich diese Sichtweise auf Dauer wird halten lassen, ist noch unklar, da es für die entsprechenden Studien häufig keine Vergleichsuntersuchungen mit anderen probiotischen Mikroorganismen gibt. Ein allgemein gültiges „probiotisches Wirkprinzip“ erscheint aber schon auf Grund der Unterschiede zwischen den verwendeten probiotischen Spezies als unwahrscheinlich. Wie die vielen unterschiedlichen Ansätze in der Erforschung probiotischer Effekte deutlich machen, ist vielmehr davon auszugehen, dass verschiedene Mechanismen als Grundlage probiotischer Wirksamkeit in Frage kommen. Die Erklärungsversuche für die Effekte von Probiotika fokussieren sich auf zwei Möglichkeiten. Bei der einen handelt es sich um die Wechselwirkung und Beeinflussung der inhärenten Darmmikroorganismen durch Probiotika, bei der zweiten um den Einfluss, den Probiotika auf ihren Wirt, insbesondere auf die Epithelbarriere und das darmassoziierte Immunsystem ausüben. 12 Einleitung und Literaturübersicht ________________________________________________________________________________ 1.2.4.1 Wirkung von Probiotika auf die Darmmikroorganismen Das Wechselspiel zwischen pathogenen und fakultativ pathogenen Bakterien auf der einen Seite und physiologischen Darmmikroorganismen und Probiotika auf der anderen Seite wurde am intensivsten bei LGG und SAB untersucht. Die physiologischen Mikroorganismen stellen den am weitesten luminal gelegenen Teil der Darmbarriere dar. Sie schaffen im Normalfall ein stabiles Mikromilieu im Darm, das potentielle Pathogene abwehrt. Unterschiedliche Probiotika können auf verschiedene Weise in dieses Gleichgewicht eingreifen und es positiv beeinflussen. Bifidobacterium bifidum verringert bei Säuglingen den pH-Wert im Stuhl und verschlechtert damit die Lebensbedingungen für Pathogene (LANGHENDRIES et al. 1995). Ähnliche Ergebnisse liegen auch für Versuche mit Bifidobacterium longum bei Erwachsenen vor (BENNO und MITSUOKA 1992). Für die Hefe Saccharomyces boulardii ließ sich ein Einfluss auf den Gehalt und die molaren Anteile der kurzkettigen Fettsäuren (SCFA) im Dickdarm nachweisen. Wird Clindamycin, ein Antibiotikum, von dem bekannt ist, dass es häufig Antibiotika-assoziierte Diarrhöen auslöst, in einem in vitro Simulationsmodell des Kolonstoffwechsels eingesetzt, sinkt die Gesamt-SCFAProduktion. Bei gleichzeitiger Gabe von SAB verändert sich die Gesamt-SCFA-Produktion im Vergleich zu Kontrollbedingungen ohne Clindamycin jedoch nicht. Ein Clindamycin-bedingtes Absinken der Butyratkonzentration wird durch SAB allerdings nicht kompensiert (BREVES et al. 2000a). SCFA, insbesondere Butyrat, sind wichtig für die Ernährung und damit die Integrität der Kolonozyten, sowie eine funktionierende Wasser- und Natriumretention aus dem Darmlumen (ROEDIGER 1980). Zusätzlich konnten BREVES et al. (2000) zeigen, dass die Anwesenheit von SAB ein Clindamycin-abhängiges Absinken der mikrobiellen Proteinsynthese verhindert. Laktobazillen sind in der Lage, die Aktivität verschiedener Enzyme im Kot zu verändern. Sie verringern beispielsweise die Aktivität von β-Glukuronidase, Nitroreduktase und Glykocholathydrogenase und verändern dadurch wiederum das intestinale Milieu zu Ungunsten von Pathogenen (LING et al. 1994). Bifidobakterien können in vitro unter Neutralisierung freier Radikale Eisen an ihre Zellmembran binden (KOT und BEZKOROVAINY 1999). Sie sind damit in der Lage, das Redoxpotential im Darm zu erniedrigen und gleichzeitig eine Verknappung des für die meisten Pathogene wichtigen 13 Einleitung und Literaturübersicht ________________________________________________________________________________ Wachstumsfaktors Eisen zu fördern. Diese Fähigkeit zur Bindung freier Radikale wurde auch bei einigen Laktobazillenstämmen nachgewiesen (STECCHINI et al. 2001). Neben Veränderungen der chemischen Bedingungen im Darmlumen treten Probiotika auch in direkte Wechselwirkung mit anderen Mikroorganismen ihrer Umgebung. Von Laktobazillen weiß man, dass sie in vitro an die gleichen Mannoserezeptoren binden, die auch von pathogenen Stämmen der Spezies E. coli, Enterobacter, Klebsiella, Salmonella, Shigella, Pseudomonas und Vibrio cholerae benötigt werden, um sich im Darm zu etablieren (ADLERBERTH et al. 1996). Auch Bifidobakterien adhärieren in vitro an Epithelzellen (BERNET et al. 1993, PEREZ et al. 1998). Wenn Laktobazillen mit Pathogenen um die Bindung an Rezeptoren im Gastrointestinaltrakt konkurrieren, würde demnach eine Erhöhung der Laktobazillenkonzentration den Konkurrenzdruck verstärken. Bei einigen wenigen Lactobazillenstämmen konnte auch in vivo eine Adhäsion nachgewiesen werden ( TANNOCK et al. 1988, NEMCOVA et al. 1997). Bifidobakterien scheinen jedoch nach der bisherigen Datenlage im Darm nicht zu adhärieren (BOUHNIK et al. 1992). Allerdings konnte ein von Bifidobakterien produziertes Protein nachgewiesen werden, das die Anheftung von E. coli verhindert, was eine direkte Konkurrenz der Bakterien um Rezeptoren überflüssig machen würde (FUJIWARA et al. 1997). Zusätzlich sezernieren LGG und probiotische Bifidobakterien auch noch andere Substanzen, die in der Lage sind, durch pathogene Mikroorganismen produzierte Toxine z.B. Aflatoxin B und E. coli– Endotoxin, zu binden und somit zu inaktivieren (HASKARD et al. 2000, OATLEY et al. 2000). 1.2.4.2 Wirkungen auf den Wirt Epithel ↔ Probiotika Der erste vom Wirt gebildete Anteil der intestinalen Barriere ist die Muzinschicht, die von den Epithelzellen als Schutzfaktor sezerniert wird. Es hat sich gezeigt, dass Probiotika die Bildung und Zusammensetzung der Muzinschicht sowie die Anzahl der muzinproduzierenden Becherzellen beeinflussen können. Von LGG und Lactobacillus plantarum weiß man, dass sie in vitro die mRNA-Expression von MUC2 und MUC3 induzieren (MACK et al. 1999). MUC2 und MUC3 sind die dominierenden Muzine im Dünn- und Dickdarm des Menschen (CHANG et al. 1994). Es handelt sich hierbei um hochmolekulare Glykoproteine, die von Epithelzellen und Becherzellen zum Schutz vor bakterieller und viraler Anheftung und zur 14 Einleitung und Literaturübersicht ________________________________________________________________________________ Bindung proinflammatorischer Moleküle sezerniert werden. Im entzündeten Darm lässt sich dementsprechend auch eine erhöhte Produktion von Muzinen nachweisen. Bei CED-Patienten hingegen ist die Zahl an Becherzellen und damit auch die Menge an sezerniertem Muzin deutlich verringert (MACK et al. 1992), wodurch die Schutzfunktion gegenüber dem Epithel beeinträchtigt ist. Der Verlust dieses Epithelschutzfaktors wird als ein Grund für die Aufrechterhaltung der Entzündung durch die Darmflora bei CED angesehen. SAB und Bacillus cereus Varietas toyoi (B. cer. var. toyoi) führen zu einer Erhöhung der Anzahl von Becherzellen im Dickdarm (BAUM et al. 2002). Es ist also nicht unwahrscheinlich, dass auch weitere probiotische Keime in der Lage sind, durch eine erhöhte Muzinproduktion die Symptome intestinaler Entzündung zu verringern. Neben dem Einfluss auf die Muzinproduktion wirken Probiotika auch direkt auf die Epithelzellen. LGG führt bei der Ratte zu einer erhöhten Mitoserate im Dünndarmepithel und damit zu einer größeren Anzahl an Epithelzellen in den Zotten (BANASAZ et al. 2002). Auch bezüglich der Regeneration des Epithels wurden mit LGG gute Erfolge erzielt. So konnte gezeigt werden, dass LGG durch Blockierung der pro-apoptotischen p38 MAP-Kinase und Produktion eines Akt-Kinaseaktivierenden, und somit anti-apoptotisch wirkenden Faktors, bei Mäusen die zytokininduzierte Apoptose intestinaler Epithelzellen in vitro verhindern kann (YAN und POLK 2002). In einem Milchallergiemodell mit neugeborenen Ratten verringert LGG die Permeabilität des Darmepithels für Antigene. Damit werden die Art und Qualität der Antigenpräsentation gegenüber dem intestinalen Immunsystem durch Veränderung von Dosis und Größe der Antigene beeinflusst. Dies bedingt eine tolerogene Wirkung von LGG (ISOLAURI et al. 1993, GARCIA-LAFUENTE et al. 2001). Eine weitere Möglichkeit zur Beeinflussung des Darmepithels bietet sich für Probiotika durch Veränderung der elektro- und transportphysiologischen Eigenschaften. Prophylaktisch verabreichte Laktobazillen normalisieren einen durch enteropathogene E. coli Bakterien (EPEC) erhöhten Kurzschlussstrom in Epithelzellen einer Kolonzelllinie (CaCo2) (MICHAIL und ABERNATHY 2002). VSL#3 (ein Nahrungsergänzungsmittel für den Menschen mit probiotischen Spezies der Gattungen Lactobacillus, Streptococcus und Bifidobacterium) führt im Tierversuch am Kolonepithel von Mäusen eines Kolitismodells (IL-10 knock-out) im Vergleich mit unbehandelten Tieren ebenfalls zu einer Normalisierung des Kurzschlussstroms. Die cAMPabhängige Chloridsekretion erreicht unter VSL#3-Behandlung Werte, die denen genetisch 15 Einleitung und Literaturübersicht ________________________________________________________________________________ unveränderter Tiere entsprechen. Die parazelluläre Wasserleitfähigkeit des Epithels wird unter VSL#3-Gabe sogar unter die Normalwerte genetisch unveränderter Kontrollen gesenkt (MADSEN et al. 2001). In In-vitro-Experimenten wurde von MADSEN et al. (2001) außerdem gezeigt, dass ein von VSL#3-Bakterien produzierter Faktor für die positiven Effekte auf die Epithelpermeabilität verantwortlich ist. Auch epitheliale Transportvorgänge werden durch Probiotika beeinflusst. So stimulieren SAB und B. cer. var. toyoi die Natrium-abhängige Glukoseaufnahme im Jejunum des Schweins (BREVES et al. 2000b). Damit fördern sie nicht nur die Nährstoffversorgung des Wirts, sondern sorgen auch für einen beschleunigten Abtransport von Glukose aus dem Darmlumen und verringern so die Triebkraft für den luminalen Flüssigkeitsaustritt aus dem Gewebe. Ein interessanter Wirkungsansatz lässt sich aus Versuchen mit apathogenen Salmonellen ableiten. In In-vitro-Versuchen mit intestinalen Epithelzellen (T 84) und apathogenen Salmonellen ergab sich eine Hemmung der IL-8 Produktion, unabhängig davon, ob die Zellen unter proinflammatorischen Stimuli standen oder nicht (NEISH et al. 2000). Eine nähere Untersuchung der Mechanismen durch NEISH et al (2000) zeigte eine verringerte Freisetzung des NFκB-Regulators IκB-α nach erfolgter Phosphorylierung und damit eine verminderte Translokation des Transkriptionsfaktors NFκB in den Zellkern. Dies führte zu einer verminderten Transkription proinflammatorischer Zytokine wie IL-8. Von Epithelzellen gebildetes IL-8 spielt eine wichtige Rolle am Beginn und bei der Aufrechterhaltung intestinaler Entzündungen von CED-Patienten (BANKS et al. 2003). Hinweise darauf, dass auch Probiotika über IL-8 das Entzündungsgeschehen im Darm beeinflussen, ergaben die Untersuchungen von JIJON et al. (2004). Sie konnten zeigen, dass VSL#3-DNA unter Induktion mit TNF-α die mRNA-Expression von IL-8 in HT-29 Zellen zwar erhöht, die Sekretion von IL-8 aber verringert. EcN hingegen induziert, im Gegensatz zu LGG, die IL-8 mRNA-Expression in intestinalen Epithelzelllinien (LAMMERS et al. 2002). Ob dadurch auch die Sekretion von IL-8 erhöht wird, ist allerdings noch nicht bekannt. Neben dem Einfluss auf IL-8 senkt VSL#3 auch die Produktion des proinflammatorischen Zytokins INF-γ im Darm von IL-10 knock-out Mäusen (JIJON et al. 2004). Die weitaus größte Zahl der genannten Mechanismen ist an die Lebensfähigkeit probiotischer Bakterien gekoppelt. 16 Einleitung und Literaturübersicht ________________________________________________________________________________ Immunsystem ↔ Probiotika Probiotika beeinflussen sowohl das angeborene als auch das adaptive Immunsystem. Ein Effekt auf das angeborene Immunsystem zeigt sich insbesondere in einer Beeinflussung der Phagozytose von Makrophagen und Granulozyten. Die orale Gabe verschiedener Laktobazillenstämme fördert die Phagozytoseaktivität von murinen Makrophagen (PERDIGON et al. 1986, PERDIGON et al. 1988). Von Untersuchungen beim Menschen weiß man, dass LGG die Phagozytoseaktivität von neutrophilen Granulozyten im Blut erhöht (SCHIFFRIN et al. 1995). Werden Makrophagen, die zuvor mit zellfreien Lactobacillus acidophilus und Bifidobacterium longum Extrakten behandelt worden sind, in vitro mit pathogenen Salmonellen infiziert, ist ihre Phagozytose gesteigert (HATCHER und LAMBRECHT 1993). Interessanterweise wird eine bei allergischen Patienten häufig pathologisch erhöhte Phagozytoseaktivität nach Behandlung mit LGG herunterreguliert, wohingegen gesunde Probanden eine Hochregulation erkennen lassen (PELTO et al. 1998). Die Ergebnisse legen die Vermutung nahe, dass die Wirkung eines Probiotikums nicht nur vom Probiotikum selbst, sondern auch von der immunologischen Ausgangssituation des Organismus abhängt. Die Wirkung von Probiotika auf die adaptive humorale Immunantwort wurde besonders im Zusammenhang mit Infektionskrankheiten und anhand von Vakzinationsstudien untersucht. Dabei erhöhen Bifidobakterien und LGG bei Mäusen als Antwort auf Choleratoxingabe die lokale Sekretion von spezifischem IgA im Darm (YASUI et al. 1992). Bei Säuglingen wurde im Darm nach Behandlung mit Bifidobakterien und LGG eine erhöhte IgA Konzentration gegen Rotaviren beobachtet (MAJAMAA et al. 1995). In diesem Zusammenhang zeigte sich nicht nur eine erhöhte lokale IgA-Konzentration, sondern auch eine erhöhte Konzentration von antigenspezifischem IgA im Serum (KAILA et al. 1992). Im Milchallergie-Modell mit Labornagern werden unter der Behandlung mit Bifidobakterien bzw. LGG erhöhte Konzentrationen an β-Lactoglobulinspezifischen Antikörpern nachgewiesen (ISOLAURI et al. 1993, TAKAHASHI et al. 1998). Diese Ergebnisse gehen konform mit einer verbesserten Symptomatik der Milch-assoziierten, atopischen Dermatitis bei Kindern mit Milchallergie (MAJAMAA und ISOLAURI 1997). Probiotika können demnach die spezifische Abwehr durch vermehrte Bildung sekretorischer IgA-Antikörper verbessern, ein Mechanismus, den man sich auch bei der Vakzinierung von Kindern zunutze macht (ISOLAURI et al. 1995, FANG et al. 2000). Einige Probiotika sind außerdem in der Lage, Antigene zu degradieren. LGG beispielsweise 17 Einleitung und Literaturübersicht ________________________________________________________________________________ verändert Milchkasein derart, dass es bei in vitro Versuchen mit PBMC von Milchallergikern keine Immunreaktion mehr auslöst (SUTAS et al. 1996a, 1996b). Neben Einflüssen auf die angeborene und adaptiv-humorale Immunantwort gibt es auch zahlreiche Hinweise auf eine Beeinflussung adaptiver zellulärer Immunvorgänge durch Probiotika. Experimente haben gezeigt, dass besonders einige Laktobazillenstämme die adaptive, zelluläre Immunantwort in Richtung einer T-Helferzell-1-Antwort (Th1-Antwort) modulieren können. In vitro stimulieren sie dendritische Zellen (DC), PBMC und Monozyten zur Produktion von IFN-γ und IL-12 und fördern so die Bildung von Th1-Zellen (HALLER et al. 2000a, CHRISTENSEN et al. 2002). Andere Arbeiten zeigten, dass sich verschiedene Probiotika unterschiedlich auf die Differenzierung von DCs auswirken können, was je nach verwendetem Probiotikum zu einer Favorisierung verschiedener Th-Zellantworten führen kann (CHRISTENSEN et al. 2002). Einflüsse auf das Zytokinprofil lassen sich in vivo bei Experimenten an IL-10 knock-out Mäusen bestätigen. Im Darm dieser Tiere normalisiert das Probiotikagemisch VSL#3 die pathologisch erhöhte TNF-α und IFN-γ Sekretion. Außerdem wird unter inflammatorischer Stimulation durch Lipopolysaccharid (LPS) sowohl bei Knock-out-Mäusen als auch bei genetisch unveränderten Tieren eine überschießende TNF-α und IFN-γ Sekretion im Darm verhindert. Klinisch kommt es bei IL-10 knock-out- Mäusen zu einer deutlichen Verbesserung der Kolitissymptomatik (MADSEN et al. 2001). Eine andere In-vivo-Studie an Mäusen zeigt, dass nach Gabe von Laktobazillen die Konzentration an IL-10 produzierenden Zellen im Darm steigt. Dies gilt allerdings nicht für alle getesteten Laktobazillenstämme gleichermaßen. IL-10 ist ein Zytokin, dem antitolerogene und inflammationsregulatorische Eigenschaften zugeschrieben werden. (MAASSEN et al. 2000). Der Einfluss von Probiotika auf die adaptive zelluläre Immunität stellt sich in der Literatur als sehr vielseitig dar und zeigt verschiedene Möglichkeiten für Wirkmechanismen probiotischer Mikroorganismen auf. Interessanterweise haben neue Untersuchungen gezeigt, das Probiotika sogar nach subkutaner Applikation Entzündungssymptome bei IL-10 knock-out Mäusen sowie im Kollagen-induzierten Arthritismodell der Maus verbessern und in der Milz die Produktion von immunmodulatorisch wirkendem TGF-β stimulieren (SHEIL et al. 2004). 18 Einleitung und Literaturübersicht ________________________________________________________________________________ Gewebsmorphologie ↔ Probiotika Nicht zuletzt können Probiotika auch die Architektur der Darmmukosa beeinflussen. SAB und B. cer. var. toyoi erhöhen beim Schwein die Dicke der Jejunummukosa. Die Villi des Jejunums sind verlängert. Als Ursache für eine derartige Zottenverlängerung wird eine möglicherweise verringerte Apoptoserate vermutet. Im Kolon zeigt sich eine Verringerung der Mukosadicke (BAUM et al. 2002). Die dargestellten Wirkungen von Probiotika auf die verschiedenen Bereiche der intestinalen Barriere dürfen nicht isoliert betrachtet werden. Epithel, bakterielle Flora und das Darmimmunsystem stehen nicht nur anatomisch sondern auch physiologisch in enger Wechselwirkung. So zeigten HALLER et al. (2000), dass sich in vitro nach Zugabe von Probiotika die Zytokinsekretion intestinaler Kolonepithelzellen unter Anwesenheit von Lymphozyten von der Zytokinsekretion isolierter Kolonepithelzellen unterscheidet (HALLER et al. 2000b). Außerdem gibt es Untersuchungen, die zeigen, dass Bakterien in Epithelzellen die Expression von Molekülen induzieren, die den Keimen wiederum die Besiedlung des Darms erleichtern (BRY et al. 1996, HOOPER et al. 1999). 1.3 Escherichia coli Nissle 1917 Der probiotische Escherichia coli Stamm Nissle 1917 (EcN) wurde Anfang des letzten Jahrhunderts vom Humanmediziner Dr. Alfred Nissle aus dem Darm eines diarrhöeresistenten Soldaten isoliert. 1917 wurde das von Nissle entwickelte Präparat Mutaflor® mit dem Inhaltsstoff EcN als geschütztes Warenzeichen eingetragen (LOEW 2000). Unter diesem Namen wird es auch heute noch von der Firma Ardeypharm GmbH, Herdecke, Deutschland vertrieben. Der Keim gehört der Serogruppe O6:K5:H1 an. Er verfügt, bedingt durch Typ 1-, F1C-, und CurliAdhäsine, sowie Flagellen-abhängiger Bewegungsmöglichkeit über ein gutes Adhäsionsvermögen, besitzt jedoch keine pathologischen Adhäsionsfaktoren wie F4- oder F6-Fimbrien. EcN bildet fünf verschiedene Siderophorsysteme, was dem Keim insbesondere im eisenarmen Milieu des Darms eine optimale Eisenaufnahme ermöglicht (BLUM et al. 1995). Er produziert Mikrozine, um nahe verwandte Bakterienstämme zu unterdrücken. Entscheidend für eine Verwendung als Probiotikum ist außerdem seine hohe Mutationsresistenz, die ihn von anderen E. coli-Stämmen unterscheidet. 19 Einleitung und Literaturübersicht ________________________________________________________________________________ 1.3.1 Wirkmechanismen und therapeutische Anwendung von EcN In-vitro-Studien mit intestinalen Epithelzelllinien (INT 407) haben gezeigt, dass EcN die Adhäsion und Invasion von Salmonellen und verschiedenen anderen invasiven Pathogenen erheblich reduziert. Dabei ist ein direkter Kontakt mit den Epithelzellen nicht notwendig (ALTENHOEFER et al. 2004). Dies bestätigt sich in In-vivo-Versuchen mit gnotobiotischen Schweinen (MANDEL et al. 1995). Bei Experimenten mit invasiven E. coli Stämmen, die aus dem Stuhl von Morbus Crohn Patienten isoliert wurden, konnte gezeigt werden, dass deren Adhäsion und Invasion um bis zu über 90% verhindert wird. Außerdem wurde nachgewiesen, dass EcN mit bis zu 90% seiner Inokulationsdosis an INT407-Zellen adhäriert. Die Adhäsionsfaktoren weisen dabei eine höhere Affinität auf als die anderer Kolikeime (BOUDEAU et al. 2003). Des Weiteren ist bekannt, dass EcN Mutaflozin, ein spezifisches Mikrozin, bildet, das in Kultur antibakteriell wirksam ist. Gleichzeitig konnte gezeigt werden, dass der Keim resistent gegen Mikrozine anderer Kolistämme ist (SCHUBERT et al. 1999). EcN ist schon bei 37°C zum „Quorum sensing“, dem Messen der Bakteriendichte mit Hilfe von Signalmolekülen durch eine einzelne Zelle, befähigt (HACKER et al. 2000). Andere im Darm vorkommende Kolistämme sind dazu bei Körpertemperatur nicht in der Lage, sondern können dies erst bei 26°C. Alle genannten Mechanismen verschaffen dem Keim bei der Besiedlung des Intestinaltrakts einen Selektionsvorteil. Obwohl im Vergleich zu anderen Probiotika wenig über mögliche Wirkungsmechanismen von EcN veröffentlicht wurde, existieren eine Reihe von Untersuchungen zum therapeutischen Potential. So ergaben doppel-blind, placebokontrollierte Studien mit Colitis ulcerosa Patienten eine vergleichbare Wirksamkeit von EcN und dem standardmäßig verwendeten Mesalazin (KRUIS et al. 1997, REMBACKEN et al. 1999). EcN verbessert die Stuhlfrequenz und -konsistenz bei Patienten mit Obstipation (MÖLLENBRINK und BRUCKSCHEN 1994), und wirkt sich bei Ratten positiv auf die Darmmotilität aus (VODERHOLZER et al. 1995). Bei Neugeborenen, die direkt nach der Geburt mit EcN behandelt worden sind, finden sich weniger potentielle Pathogene im Stuhl als bei unbehandelten Kindern. EcN kann bei diesen Kindern noch bis zu fünf Monate nach dem Absetzen der Therapie nachgewiesen werden, was zumindest beim juvenilen Darm auf eine gute Kolonisationsfähigkeit des Keims hinweist (LODINOVA-ZADNIKOVA und SONNENBORN 1997). Im Vergleich zu unbehandelten Kindern kommt es bei EcN-behandelten Neugeborenen 20 Einleitung und Literaturübersicht ________________________________________________________________________________ außerdem zu einer Erhöhung der Serum-IgA-Konzentration (CUKROWSKA et al. 2002). Aktuelle neuere Studien zeigen auch einen positiven Effekt von EcN bei kollagener Kolitis (TROMM et al. 2004). 1.4 Escherichia coli Stamm “Abbotstown” Der Escherichia coli Stamm „Abbotstown“ (EcA) ist ein enterotoxischer Escherichia coli Stamm (ETEC) der Serologie O149:K91:K88ac. Er trägt F4– und F6-Fimbrien und bildet die Enterotoxine LT-1, ST-lp und ST-II sowie Hämolysin. In der Veterinärmedizin spielen ETEC eine besondere Rolle bei Absetzferkeln. Bei 17,6% der Absetzferkel mit Diarrhöe sind ETEC im Kot nachweisbar (WIELER et al. 2001). EcA ist ein schweinespezifischer Keim, der häufig im Zusammenhang mit Diarrhöe zum Zeitpunkt des Absetzens nachgewiesen wird. 1.4.1 Wirkmechanismen und klinische Bedeutung Hitzelabiles Enterotoxin (LT) und hitzestabiles Entertoxin (ST) führen im Darm durch vermehrte Chloridsekretion ins Darmlumen und einem daraus resultierenden Wassereinstrom zu einer sekretorischen Diarrhöe (CHEN et al. 2003). Die Diarrhöe wird dabei in der Regel nicht von morphologischen Veränderungen in der Darmmukosa begleitet. Die immunologischen Veränderungen im Zusammenhang mit meist unkompliziert verlaufenden ETEC-Monoinfektionen sind beim Schwein gering. Bei humanen Patienten ist bekannt, dass sie auf eine ETEC-Infektion mit der vermehrten Bildung von sekretorischen IgA-Antikörpern reagieren (ESTRADA-GARCIA et al. 2002). 1.5 Das darmassoziierte Immunsystem Der Begriff des Immunsystems umschreibt komplexe Abwehrvorgänge, die den Organismus vor malignen Prozessen, Noxen und Krankheitserregen schützt sollen. Das darmassoziierte Immunsystem (GALT) ist ein spezieller Teil des mukosaassoziierten Immunsystems (MALT), das in unterschiedlicher morphologischer Ausprägung an allen Schleimhautoberflächen des Körpers 21 Einleitung und Literaturübersicht ________________________________________________________________________________ vorkommt. Es übernimmt die Funktion einer Barriere, die den Organismus nach außen hin gegen schädigende Einflüsse abschirmt. Das GALT ist das umfangreichste dieser speziellen mukosaassoziierten Immungewebe und bildet das größte Reservoir von Immunzellen im Körper (ABBAS und LICHTMAN 2003). Es hat als Teil der „intestinalen Barriere“ einen entscheidenden Anteil am Schutz vor intestinalen Pathogenen. So werden z.B. beim Menschen 60% des täglich im Körper produzierten Immunglobulins ins Darmlumen entlassen (BRANDTZAEG et al. 1989). Neben der Immunabwehr steht das darmassoziierte Immunsystem allerdings vor der schwierigen Aufgabe, zwischen den in großen Mengen vorkommenden ungefährlichen Nahrungsantigenen bzw. Kommensalen und für den Organismus gefährlichen Stoffen bzw. Pathogenen differenzieren zu müssen. Erstere führen zur oralen Toleranz und letztere induzieren eine protektive Immunantwort. Gelingt diese Gratwanderung zwischen „gut“ und „böse“ nicht, kommt es zu pathologischen Reaktionen, und es wird beispielsweise eine Abwehrreaktion gegen Nahrungsbestandteile oder physiologische Mikroorganismen initiiert. Beim Menschen kann eine derartige Entgleisung zu Erkrankungen wie Nahrungsmittelallergien oder chronisch entzündlichen Darmerkrankungen führen. Um die Ergebnisse der vorliegenden Studie besser einordnen zu können, soll das darmassoziierte Immunsystem des Schweins im Folgenden erläutert werden. Dabei erfolgt eine Beschränkung auf die anatomischen Strukturen und Zellsysteme, die für die Untersuchungen von Bedeutung sind. 1.5.1 Anatomischer und histologischer Aufbau des Darms beim Schwein Die Darmlänge des Schweins wird mit dem 15-fachen der Körperlänge angegeben, was bei einem ausgewachsenen Tier 16-21 m entspricht. Der Darm wird, wie bei allen Säugetieren, in den Dünndarm und den Dickdarm unterteilt. Am Dünndarm unterscheidet man Duodenum, Jejunum und Ileum. Der Dickdarm beginnt mit dem Caecum und setzt sich dann im Colon ascendens mit seinen die Ansa spiralis coli (Grimmdarmspirale) bildenden Gyri centripetales und Gyri centrifugales fort. Nach der Ansa distalis coli folgen das Colon transversum und das Colon descendens. Einen dem Colon sigmoidum des Menschen und Wiederkäuers entsprechenden Darmabschnitt gibt es beim Schwein nur in den ersten Lebenswochen. Der Dickdarm endet mit dem Rectum und der Ampulla recti am Anus. Die Länge der einzelnen Abschnitte ist in Tabelle 1 dargestellt. 22 Einleitung und Literaturübersicht ________________________________________________________________________________ Tab. 1 Länge verschiedener Darmabschnitte des Schweins Dünndarm Duodenum Jejunum Ileum Dickdarm Caecum Colon/ Rektum Einheit m m m m m m m Länge 16-21 0,7-0,95 14-19 0,7-1 3,5-6 0,3-0,4 3,2-5,6 (NICKEL et al. 1999) Die Darmwand besteht von luminal nach serosal aus der Tunica mucosa (Schleimhaut) mit dem Epithelium mucosae (Epithel) der Lamina propria mucosae und der Lamina muscularis mucosae. Es folgt die Tela submucosae (Submukosa), die die Mukosa von der Tunica muscularis (Muskelschicht) mit dem Stratum circulare (Zirkulärmuskelschicht) und dem Stratum longitudinale (Längsmuskelschicht) abgrenzt. Den Abschluss bildet die Tunica serosa (Bauchfell) mit der Lamina propria serosae und dem Mesothelium serosae (NICKEL et al. 1999). 1.5.2 Immunzellen des Darms 1.5.2.1 Zellen des angeborenen Immunsystems Zellen des angeborenen Immunsystems erkennen und bekämpfen Pathogene anhand ubiquitär vorkommender Antigene. Sie sind häufig die ersten Zellen am Ort des immunologischen Geschehens und eliminieren die Infektion oder sorgen durch Entzündung zumindest für deren Eindämmung, bis das adaptive Immunsystem reagieren kann. Obwohl sich eine Zuteilung der verschiedenen Immunzellen zur adaptiven oder angeborenen Immunität aus Gründen der Übersicht bewährt hat, soll an dieser Stelle noch einmal darauf hingewiesen werden, dass es sich bei dieser Einteilung nicht um ein starres System handelt. Die beiden Verteidigungslinien des Immunsystems sind vielmehr eng miteinander verknüpft. So sind Zellen des angeborenen Immunsystems z.B. in der Lage, adaptive Immunzellen chemotaktisch anzulocken und ihnen Antigene zu präsentieren. Die angelockten Zellen können im Gegenzug die Phagozytoseeffizienz von Zellen des angeborenen Immunsystems durch Markierung von Pathogenen (Opsonisierung) verbessern. (ABBAS und LICHTMAN 2003). Von den Zellen des angeborenen Immunsystems werden hier nur Granulozyten und Mastzellen vorgestellt. 23 Einleitung und Literaturübersicht ________________________________________________________________________________ Granulozyten Granulozyten werden wegen des Erscheinungsbildes ihres Kerns auch als polymorphkernige Leukozyten bezeichnet. Unterschieden werden neutrophile, eosinophile und basophile Granulozyten. Alle Granulozyten reifen unter dem Einfluss hämatopoetischer Wachstumsfaktoren aus gemeinsamen myeloischen Vorläuferzellen im Knochenmark heran und werden dann ins Blut freigesetzt. Sie sind morphologisch durch ihren gelappten Kern und die im Zytoplasma liegenden Granula deutlich zu erkennen (ABBAS und LICHTMAN 2003). Während eosinophile Granulozyten das Blut schnell wieder verlassen und in verschiedene Gewebe rekrutiert werden, stellen die neutrophilen Granulozyten mit einem Anteil von 0,7% stabkernigen und 10-40% segmentkernigen Granulozyten einen Großteil der Leukozyten im Blut (KNICKEL et al. 1998). Die Lebensdauer von neutrophilen Granulozyten wird für Ratte und Mensch mit 2-3 Tagen angegeben (HILDEBRANDT 1998). Im Darmgewebe kommen sie unter physiologischen Bedingungen nur in geringer Zahl von 2-4% in der Lamina propria vor. Sie sind aber in der Lage, chemotaktisch in Entzündungsgebiete einzuwandern. Als Stimulus für die Einwanderung ins Gewebe fungieren bakterielle Toxine, Zytokine oder Komplementfaktoren (BAGGIOLINI et al. 1993). Die wichtigste Effektorfunktion der neutrophilen Granulozyten ist die Phagozytose. Zusätzlich bekämpfen sie extrazelluläre Pathogene durch die Abgabe reaktiver Sauerstoffmetaboliten und Enzymen aus ihren zytoplasmatischen Granula ins umgebende Gewebe (ABBAS und LICHTMAN 2003). Eosinophile Granulozyten kommen im Gegensatz zu neutrophilen Granulozyten im porcinen Blut nur zu einem Anteil von 6% des Differentialblutbildes vor (KNICKEL et al. 1998). Die reifen Eosinophilen emigrieren nach der Ausschleusung aus dem Knochenmark zügig durch das Gefäßendothel ins perivaskuläre Bindegewebe. Im gesunden Organismus akkumulieren sie bevorzugt in der Mukosa des Magen-Darm-Traktes, der Uteruswand, dem Thymus, den Lymphknoten und der Milz, kommen aber in geringer Konzentration auch in vielen anderen Geweben vor. Das einzige Gewebe im Organismus, in dem eosinophile Granulozyten auch beim Gesunden in nennenswertem Ausmaß degranulieren können, ist der Gastrointestinaltrakt (KATO et al. 1998). Die Rekrutierung ins Darmgewebe erfolgt dabei, anders als bei Lymphozyten, unabhängig von der intestinalen Besiedlung durch Mikroorganismen (FERGUSON 1976). Eine besondere Rolle spielt dabei das Eotaxin, das spezifisch eosinophile Granulozyten anlockt und in 24 Einleitung und Literaturübersicht ________________________________________________________________________________ vergleichsweise hohen Konzentrationen in der Lamina propria (LP) vorkommt. Die Überlebenszeit dieser Zellen im Gewebe wird mit 14 Tagen bis zu einigen Wochen angegeben (SPRY 1988). Die zytoplasmatischen Granula enthalten charakteristische Enzyme wie eosinophile Peroxidase, ECP (eosinophil cationic protein), EPX (eosinophil protein X), MBP (major basic protein) (HENDERSON et al. 1980, GLEICH et al. 1987, LI et al. 1995, TOMASSINI et al. 1996). Neben diesen klassischen eosinophilen Enzymen bilden die Zellen noch andere Substanzen, wie z.B. verschiedene Lipidmediatoren (KROEGEL und MATTHYS 1993), reaktive Sauerstoffmetaboliten, die eine Schlüsselrolle bei der Abwehr von Parasiten spielen (KROEGEL et al. 1989), Zytokine, von denen viele auch auf Zellen des adaptiven Immunsystems wirken, und Neuropeptide. Die Freisetzung ihres Inhalts erfolgt anders als bei Mastzellen nicht durch Zerplatzen der Granula, sondern ausschließlich durch Ausschleusung mit Hilfe des tubulovesikulären Systems (DVORAK et al. 1991, ERJEFALT et al. 2001). Die Hauptaufgabe eosinophiler Granulozyten liegt in der Bekämpfung von Parasiten. Außerdem sind sie neben den Mastzellen die klassischen Effektorzellen der allergischen Entzündung. Durch ihre Fähigkeit zur Zytokin- und Lipidmediatorproduktion sind sie aber auch in der Lage, als Immunmodulatoren für Zellen des angeborenen und des erworbenen Immunsystems zu fungieren (ROTHENBERG 1998, ABBAS und LICHTMAN 2003) Basophile Granulozyten zirkulieren nach der Bildung im Knochenmark in verschwindend geringen Mengen von unter 1% im Blut. Ihre Lebensdauer beträgt einige Tage. Sie kommen im gesunden Organismus nicht im Gewebe vor, werden aber bei Entzündungsreaktionen rekrutiert. Trotzdem sind sie auch während der Entzündungsreaktion zahlenmäßig wenig prominent. Ähnlich wie Mastzellen (siehe unten) exprimieren sie den Fcε-Rezeptor I und sind dadurch in der Lage, hochaffin IgE zu binden. Die Aktivierung von basophilen Granulozyten erfolgt demnach primär durch Kreuzvernetzung von IgE. Basophile Granulozyten können aber auch durch IgE-unabhängige Stimuli aktiviert werden. Dazu gehören Produkte des Komplementsystems, sekretorisches IgA, Bakterienprodukte und Eosinophilenmediatoren wie das ECP (KURIMOTO et al. 1989, KURIMOTO et al. 1991, KUNA et al. 1993). In der Produktion von Histamin und proinflammatorischen Lipidmediatoren unterscheiden sie sich nicht von Mastzellen (siehe unten). Die Zytokinproduktion ist jedoch gegenüber der bei Mastzellen eingeschränkt (hauptsächlich IL-4 und IL-13) (BRUNNER et al. 1993, LI et al. 1996). Anders als beim gesunden Organismus ist die Anzahl basophiler Granulozyten bei Allergiepatienten erhöht (ABBAS und LICHTMAN 2003). Obwohl im Gewebe die Anzahl gemessen an der Zahl anderer allergietypischer Zellen wie 25 Einleitung und Literaturübersicht ________________________________________________________________________________ Mastzellen und eosinophiler Granulozyten eher gering ist, sollte ihre Rolle im Entzündungsgeschehen als sehr potente Quelle für Entzündungsmediatoren nicht unterschätzt werden (BISCHOFF 1994). Neben der Beteiligung an der Sofortreaktion gibt es auch Hinweise darauf, dass sie an der Aufrechterhaltung der Entzündung in der Spätreaktion der Allergie beteiligt sind. Daneben wurde eine co-stimulierende Wirkung von basophilen Granulozyten auf B-Zellen nachgewiesen und eine Rolle bei der Präsentation von Antigenen wird diskutiert (GAUCHAT et al. 1993). Über regulative Funktionen von basophilen Granulozyten für die adaptive Immunantwort ist jedoch bisher nur sehr wenig bekannt. Mastzellen Mastzellen (MC) entwickeln sich im Knochenmark unter dem Einfluss des Stammzellfaktors SCF (Mensch und andere Spezies) und IL-3 (nicht beim Menschen) aus denselben hämatopoetischen Stammzellen wie die Granulozyten (ABBAS und LICHTMAN 2003). Allerdings werden sie nicht als ausdifferenzierte Zellen in die Blutbahn entlassen, sondern reifen erst im Gewebe zu voll entwickelten Mastzellen heran (SCHWARTZ und HUFF 1998). Direkte Vorläuferzellen in der Entwicklung zur adulten Mastzelle sind bis heute noch nicht identifiziert. Die Zellen überleben im Gewebe mehrere Wochen bis Monate (ABBAS und LICHTMAN 2003). Aus Untersuchungen bei Mäusen und Ratten stammt die Einteilung der MC in Bindegewebsmastzellen (CTMC) und mukosale Mastzellen (MMC) je nach ihrer Lage im Gewebe und ihrem metachromatischen (farbverschiebendem) Färbeverhalten. Diese Einteilung wird auch für die MC des Schweins verwendet. Die MMC des Schweins zeigen eine deutlich von MMC anderer Spezies abweichende dendritische Morphologie, wohingegen sich die CTMC abgerundet, oval darstellen und sich damit kaum von denen anderer Säuger unterscheiden (XU et al. 1993). Mastzellen üben ihre immunologische Wirkung vorwiegend humoral aus, indem sie präformierte oder de novo-synthetisierte Mediatoren parakrin ins Gewebe sezernieren. Sie sind in der Lage, je nach Art der Stimulation und Herkunft der Zellen eine Vielzahl von verschiedenen Mediatoren auszuschütten. Histamin und Leukotriene (C4, D4, E4) werden bei Aktivierung unabhängig von der Lokalisation durch alle Mastzellen abgegeben (BISCHOFF 1994, OKAYAMA et al. 1995). Andere Mastzellprodukte sind neutrale Proteasen, Proteoglykane, Zytokine (IL-3, IL-4, IL-5, IL-9, IL-13, TNF-α, TGF-β), Chemokine (MIP-1α, MCP-1) und Neutrophine (BISCHOFF und DAHINDEN 1992, GALLI et al. 1993, LORENTZ et al. 2000, BISCHOFF et al. 2001, GEBHARDT et al. 2002). Die am besten bekannte und untersuchte Rolle der MC ist die des Auslösers der allergischen 26 Einleitung und Literaturübersicht ________________________________________________________________________________ Sofortreaktion. Dabei kommt es durch Vernetzung des auf der Plasmamembran gebundenen IgE zur Aktivierung der MC und im Folgenden zur Ausschüttung präformierter Mediatoren sowie der Neusynthese von Effektormolekülen und Immunmodulatoren (ABBAS und LICHTMAN 2003). Das Verständnis der Mastzelle als reine Effektorzelle hat sich in den letzten Jahren immer mehr hin zu einer auch immunmodulatorisch und regulatorisch wirksamen Zelle gewandelt. So zeigte sich beispielsweise, dass MC einen nicht zu unterschätzenden Einfluss auf die Rekrutierung, Entwicklung und Wirkung von eosinophilen Granulozyten (SHAKOORY et al. 2004) und Zellen des adaptiven Immunsystems haben (GALLI und WERSHIL 1996, POLOSA und CRIMI 1998). Andere Untersuchungen konnten zeigen, dass sie costimulatorisch auf B-Zellen wirken und diesen auch Antigen präsentieren können (GAUCHAT et al. 1993). 1.5.2.2 Zellen des adaptiven Immunsystems des Schweins Bei Lymphozyten, die klassischerweise dem adaptiven Immunsystem zugeordnet werden, handelt es sich um die im Thymus gebildeten T-Zellen und die im Knochenmark (bone marrow) gebildeten B-Zellen. Letztere sollen hier nur in einer ihrer aktivierten Form, nämlich als IgA-produzierende Plasmazellen, behandelt werden. T-Lymphozyten Die T-Lymphozyten sind in ihren Aufgaben in der adaptiven Immunantwort sehr heterogen. Die verschiedenen Gruppen lassen sich anhand ihrer Oberflächenrezeptoren erkennen. T-Helferzellen exprimieren CD4, den Corezeptor für MHC II-assoziierte Antigenerkennung und sind die Regulatoren der adaptiven Immunität. Zytotoxische T-Zellen hingegen exprimieren CD8, den Corezeptor für MHC I-assoziierte Antigenerkennung. Sie fungieren als Effektorzellen, indem sie infizierte Zellen erkennen und abtöten (ABBAS und LICHTMAN 2003). Man unterscheidet bei der Aktivierung von CD4+ T-Helferzellen (CD4+ Zellen) Th1 Antworten und Th2 Antworten (SCHWARTZ und HUFF 1998, ABBAS und LICHTMAN 2003). Die Th1Antwort wird durch die Zytokine IL-12 und IFN-γ induziert, die von Makrophagen und dendritischen Zellen sezerniert werden. Th1-Zellen produzieren dann ihrerseits wieder IFN-γ und TNF-α. Sie bewirken so eine Aktivierung der zellabhängigen und zytotoxischen Immunität. Th2-Zellen entwickeln sich beim Vorhandensein von PGE-2 und IL-4 und sezernieren IL-4, IL-5, IL-9 und IL-13. Sie fördern damit die Produktion von Antikörpern, besonders von IgE, und sind 27 Einleitung und Literaturübersicht ________________________________________________________________________________ dadurch stark mit der Entstehung von Allergien verknüpft (VAARALA 2003). Der Vollständigkeit halber sollen hier auch die Th3 oder regulatorischen T-Zellen erwähnt werden, die wahrscheinlich an der Hemmung überschießender Immunreaktionen beteiligt sind. Sie sezernieren nach Stimulation die antiinflammatorischen Zytokine IL-10 und TGF-β (INOBE et al. 1998, PRUD'HOMME und PICCIRILLO 2000). Die genaue Rolle dieser Zellen im immunologischen Netzwerk ist allerdings noch nicht völlig geklärt. IgA-produzierende Plasmazellen IgA ist das dominierende Immunglobulinmolekül mukosaler Oberflächen. Es wird von Plasmazellen gebildet und kommt in zwei Formen im Körper vor. Das Serum-IgA ist ein Monomer, welches im Vergleich zu anderen Immunglobulinen (z.B. IgG) nur zu einem geringen Prozentsatz im Blut gefunden wird. Beim Schwein stammt ein nicht unerheblicher Teil des Serum-IgAs aus dem Darm (VAERMAN et al. 1997). An mukosalen Oberflächen wird IgA als sekretorisches Dimer abgegeben. Letzteres ist resistent gegenüber intraluminaler Proteolyse und zeigt keine Aktivierung von Komplement oder Triggerung entzündlicher Reaktionen (HERR et al. 2003). Es hat vor allem die Aufgabe, Pathogene zu binden und sie so unschädlich zu machen. IgA-produzierende Plasmazellen gehören zum humoralen Teil des mukosalen Immunsystems. Im Darm entstehen sie durch den Einfluss von Th2-Zytokinen aus B-Zellen in den Peyer’schen Platten (XU-AMANO et al. 1992, JAIN et al. 1996,). Der größte Teil von ihnen rezirkuliert über das Lymph- und Blutgefäßsystem des Körpers wieder in die LP des Darms (homing) (PIERCE und CRAY, Jr. 1982, PABST und BINNS 1989). Durch die Immunzellen aus den Peyer’schen Platten ist der Körper in der Lage, an der Mukosa des Darms induzierte Reaktionen auch auf andere mukosale Oberflächen zu übertragen (ROTHKÖTTER et al. 1999a). Die meisten oral verabreichten Vakzinen oder auch Probiotika zeigen ihre positiven Effekte deshalb nicht nur im Darm sondern auch in anderen Körperregionen (BRANDTZAEG 1996). IgA-produzierende Plasmazellen des Darms kommen zehnmal häufiger in der LP der Krypten vor als im Epithel (BROWN und BOURNE 1976, BRANDTZAEG und BAKLIEN 1980, ROTHKÖTTER et al. 1991). Das von ihnen produzierte IgA wird von den Enterozyten über die Bindung an Poly-Ig-Rezeptoren erkannt und selektiv ins Darmlumen transportiert (BRANDTZAEG et al. 1988). 28 Einleitung und Literaturübersicht ________________________________________________________________________________ 1.5.3 Aufbau des darmassoziierten Immunsystems Das darmassoziierte Immunsystem setzt sich aus unterschiedlichen Kompartimenten zusammen, den intraepithelialen Lymphozyten (IEL), den frei in der Lamina propria vorkommenden Lymphozyten (LPL), den in der Lamina propria und in der Submukosa liegenden Lymphonoduli solitarii (Einzellymphknötchen) und den Peyer´sche Platten (PP) (NICKEL et al. 1999). IEL und LPL bilden das diffuse lymphoide Gewebe und die Lymphonoduli solitarii und Peyer´schen Platten das organisierte lymphoide Gewebe. Der Aufbau des organisierten lymphoiden Gewebes soll hier nicht weiter erläutert werden, da es in die vorliegenden Untersuchungen nicht mit einbezogen ist. 1.5.3.1 Intraepitheliale Lymphozyten Als intraepitheliale Lymphozyten (IEL) bezeichnet man mononukleäre Zellen, die innerhalb der Grenzen des Darmepithels liegen. Pro 100 Epithelzellen kommen in den Villi des Dünndarms 10-20 IEL vor (FERGUSON 1977). Sie wurden bereits 1847 zum ersten Mal beschrieben (WEBER 1847). Mikroskopisch sind sie liegend zwischen den Epithelzellen erkennbar dar. Sie befinden sich im basalen Bereich des Epithels, in dem sich auch die Epithelzellkerne erkennen lassen, nahe der Basalmembran und sind dort z.T. regelrecht in diese eingebettet. Sehr viel weniger IEL finden sich im luminalen Bereichen des Epithels (VEGA-LOPEZ et al. 1993). IEL werden nicht im gleichen Tempo wie die Epithelzellen abgeschilfert, vielmehr werden die alten Epithelzellen an ihnen vorbei Richtung Darmlumen geschoben (LEFRANCOISE und PUDDINGTON 1999). Es handelt sich bei den IEL um T-Zellen, von denen der größte Teil den CD8-Corezeptor auf der Plasmamembran exprimiert. Der Anteil dieser CD8+ Lymphozyten differiert allerdings zwischen verschiedenen Tierarten. Bei der Maus sind je nach Stamm 60-90% der IEL im Dünndarm und 30-50% der IEL im Dickdarm CD8+, beim Menschen 60% der IEL. Der Rest der Zellen ist CD4+, bzw. exprimiert keinen der beiden Corezeptoren. Letztere Lymphozyten werden als doppelt-negative IEL bezeichnet. Besonders im Dünndarm finden sich noch eine weitere T-Zellpopulation. Diese Zellen exprimieren sowohl CD4 als auch CD8 und heißen deshalb doppelt-positive T-Lymphozyten. Die IEL des Schweins sind abgesehen von einem kleinen Anteil doppelt-negativer Zellen ausschließlich CD8+ (VEGA-LOPEZ et al. 1993). Abgesehen von der Verteilung der Corezeptoren weisen die Lymphozyten des Epithels gegenüber den Lymphozyten aus anderen Geweben weitere Besonderheiten auf. So spielt bei den IEL anders als im Blut und den lymphatischen Organen, wo die meisten T-Lymphozyten einen aus α- und β29 Einleitung und Literaturübersicht ________________________________________________________________________________ Kette bestehenden T-Zellrezeptor (αβ-TCR) exprimieren, der aus einer γ- und einer δ-Kette bestehende T-Zellrezeptor (γδ-TCR) eine sehr viel größere Rolle. Besonders im Dünndarm sind nahezu 50% der IEL γδ-TCR+ (GOODMAN und LEFRANCOIS 1988, JARRY et al. 1990). Zum Vergleich: In der Lamina propria der Maus tragen nur 1-5% der T-Zellen den γδ-TCR. Als weitere Besonderheit befindet sich auf der Oberfläche von 50-75% der CD8+IEL das CD8 Molekül nicht in Form des αβ-Heterodimers (CD8αβ) sondern als αα-Homodimer (CD8αα). Besonders Zellen mit dem γδ-TCR exprimieren das Homodimer des CD8 Corezeptors. Es gibt Hinweise, dass es sich zumindest bei der Maus um Lymphozyten handeln könnte, die sich außerhalb des Thymus entwickeln (LIN et al. 1994). Es hat sich gezeigt, dass Zellen, die CD8αα auf ihrer Oberfläche exprimieren, keine MHC I-präsentierten Antigene erkennen. Man geht davon aus, dass sie mit invarianten und semi-invarianten T-Zell-Rezeptoren Moleküle erkennen können, die von körpereigenen Zellen nach Infektion oder Transformation auf der Plasmamembran präsentiert werden (JANEWAY et al. 1988). Eine Entstehung derartiger Rezeptoren im Thymus wäre unmöglich, da die Zellen dort während der negativen Selektion der Lymphozyten, also dem Test auf Autoreaktivität, aussortiert würden. Deshalb geht man davon aus, dass sie sich außerhalb des Thymus entwickeln. Tatsächlich wurden bei Mäusen Lymphozyten nachgewiesen, die im unreifen Stadium der T-Zelldifferenzierung aus dem Thymus in die Blutbahn abgegeben werden (GUYGRAND et al. 2003). Anders als über die Morphologie der IEL, die in den letzten Jahren intensiv untersucht worden ist, weiß man über die Aufgaben dieser heterogenen Lymphozytengruppe immer noch relativ wenig. Nach JANEWAY et al. (1988) gibt es Anzeichen dafür, dass sie geschädigte und transformierte Epithelzellen beseitigen können. Damit wird nicht nur die frühzeitige Beseitigung von Pathogenen gefördert, sondern sie verhindern so auch eine Präsentation ungefährlicher Antigene gegenüber dem systemischen Immunsystem und fördern so die orale Toleranz (FUJIHASHI et al. 1990, KE et al. 1997). Außerdem sind sie in der Lage, die Epithelintegrität der „über sie hinwegwachsenden“ Epithelzellen zu fördern. Insbesondere die γδ-TCR-Zellen produzieren in vitro den Epithelwachstumsfaktor KGF (keratinocyte growth factor) (CHEN et al. 2002). Eine weitere Aufgabe ist die Erkennung von Antigenen und die Regulation der lokalen Immunantwort. IEL zeigten in vitro im Dünndarm nach Aktivierung des CD3-TCR Komplexes zwar Zytotoxizität, sie proliferierten aber nur in geringem Maße. Auf unspezifische Aktivierung reagierten IEL aus dem Dünndarm im Gegensatz zu isolierten Blutlymphozyten nur eingeschränkt und IEL aus dem Dickdarm überhaupt nicht (TREJDOSIEWICZ 1992, SYDORA 1993). In 30 Einleitung und Literaturübersicht ________________________________________________________________________________ Untersuchungen an Schweinen, der einzigen Spezies, bei der bisher γδ-TCR CD8αα+ Lymphozyten im Blut nachgewiesen wurden, konnte gezeigt werden, dass γδ-TCR CD8αα+ Lymphozyten aus dem Blut erst nach MHC II-abhängiger Aktivierung, z.B. durch Th-Zellen, proliferieren (WATERS et al. 2000). Ob dies auch für Lymphozyten des Darms gilt, ist jedoch noch nicht geklärt, ebenso wenig wie die genauen Mechanismen, mit denen die IEL in die Immunvorgänge des Darms eingreifen. 1.5.3.2 Lamina propria Lymphozyten Lamina propria Lymphozyten (LPL) sind mononukleäre Zellen der Lamina propria des Darms. Die Gesamtzahl an Lymphozyten steigt beim Schwein in diesem Kompartiment zwischen dem ersten Tag post partum und der vierten Lebenswoche kontinuierlich an, bleibt dann aber konstant. Dabei unterscheiden sich die LP der Krypten und der Villi des Dünndarms in ihrer Gesamtlymphozytenzahl bei den verschiedenen Altersgruppen nicht. Am Schwein konnte außerdem gezeigt werden, dass zumindest ein Teil der LPL in der LP entsteht (ROTHKÖTTER et al. 1991). Die LPL bestehen aus T-Lymphozyten und B-Lymphozyten bzw. Plasmazellen. In der LP des Dünndarms befinden sich die B- und Plasmazellen fast ausschließlich in den Krypten (BROWN und BOURNE 1976), wohingegen die T-Zellen in den Villi dominieren (VEGA-LOPEZ et al. 1993). Im Folgenden beschränkt sich die Bezeichnung LPL auf den T-Zellanteil, da die Plasmazellen der LP gesondert behandelt werden. Die T-Zellen der LP sind hochspezialisierte Effektorzellen (ZEITZ et al. 1988). Es kommen sowohl CD4+ Zellen als auch CD8+ Zellen vor. HAVERSON et al. (1999) gibt das Verhältnis von CD4+T-Zellen zu CD8+T-Zellen mit 0,71:1 für die LP an. Nach anderen Autoren herrschen die CD4+T-Zellen vor (ROTHKÖTTER et al. 1991, VEGA-LOPEZ et al. 1993). Die Kombination der Oberflächenmarker auf LPL ist dabei darmtypisch und kommt in anderen Geweben nur selten vor. Bis zu 88% der Lymphozyten neugeborener Ferkel haben bis zu einem Alter von fünf Tagen weder CD4- noch CD8-Corezeptoren auf der Zelloberfläche exprimiert. Die Anzahl dieser doppelt negativen T-Zellen nimmt ab der zweiten Lebenswoche ab (ROTHKÖTTER et al. 1991) und pendelt sich bei einem Anteil von 7% ein (HAVERSON et al. 1999). Neben den doppelt-negativen T-Zellen kommen auch 14% CD4+CD8+ doppelt-positive T-Zellen in der LP vor. Gleichzeitig lässt sich beobachten, dass die Entwicklung der LPL stark von der mikrobiellen Besiedlung des Darms abhängt. Die LPL keimfrei gehaltener Schweine differenzieren sich nur verzögert oder gar nicht in die vier T-ZellSubpopulationen (ROTHKÖTTER et al. 1991). 31 Einleitung und Literaturübersicht ________________________________________________________________________________ Die starke Konfrontation des intestinalen Immunsystems mit harmlosem Antigen wird auch als Grund für einen ungewöhnlichen Aktivierungsstatus der LPL angesehen. Von humanen LPL ist bekannt, dass sie Merkmale von immunologischen Gedächtniszellen oder aber zumindest Antigenerfahrenen Zellen zeigen (HALSTENSEN et al. 1990). Auch beim Schwein gibt es Hinweise darauf, dass es sich beim Großteil der LPL um antigenerfahrene Zellen handelt. So fehlt 98% der LPL der Oberflächenmarker CD45RC, was für eine bereits in der Vergangenheit abgelaufene, antigenabhängige Aktivierung kennzeichnend ist. Für den antigenerfahrenen Zustand von Lymphozyten der LP sprechen außerdem Untersuchungen, bei denen LPL vom Schwein und auch vom Menschen unter antigenspezifischer Aktivierung zwar wie naive T-Zellen die Zahl ihrer IL2Oberflächenrezeptoren (IL-2R = CD25) erhöhen, es aber nicht zu einer, in anderen lymphatischen Geweben üblichen, Proliferation kommt (siehe 3.5.3.3). So sezernieren LPL, im Unterschied zu naiven T-Zelle nach TCR-spezifischer Stimulation kein IL-2 zur Triggerung der Immunproliferation (BAILEY et al. 1998). Vielmehr produzieren sie große Mengen an IL-4 wie es klassische Th2-Effektorzellen tun (VEGA-LOPEZ et al. 1995). Die von anderen T-Zellen abweichenden Reaktionen auf antigeninduzierte Aktivierung der LPL eröffnen die Möglichkeit, gewebszerstörende Immunantworten gegen die im Darm allgegenwärtigen harmlosen Antigene zu unterbinden (BAILEY et al. 1998). 1.5.3.3 Interleukin-2 Rezeptor (CD25) als Aktivierungsmarker Die T-Zellproliferation ist in erster Linie Folge eines antigeninduzierten autokrinen Aktivierungsweges. Aktivierte T-Zellen induzieren die vermehrte Expression von IL-2-Rezeptor (IL-2R) auf der Zelloberfläche. Das Synonym für den IL-2R in der CD Nomenklatur ist CD25. Antikörper gegen CD25 können deshalb in der Immunhistologie als Marker für den Aktivierungszustand von T-Zellen eingesetzt werden (SCHWARTZ und HUFF 1998, ABBAS und LICHTMAN 2003). Nach neueren Untersuchungen scheinen aber nicht nur aktivierte Effektor-TZellen, sondern auch regulatorische T-Zellen vermehrt CD25 zu exprimieren. Die Gesamtkonzentration an regulatorischen T-Zellen im CD25 exprimierenden T-Zell-Pool des Darms ist allerdings vergleichsweise gering (THOMPSON und POWRIE 2004). 32 Einleitung und Literaturübersicht ________________________________________________________________________________ 1.5.4 Antimikrobielle Peptide Antimikrobielle Peptide (AMP) werden von vielen Tierspezies zur Abwehr von Mikroorganismen gebildet. Es handelt sich dabei um kleine Peptide von 12-100 Aminosäuren (ANDREU und RIVAS 1998). Neben Immunzellen produzieren auch Zellen der Haut, Panethzellen des Darms und Epithelzellen AMP (DIAMOND und BEVINS 1998, GANZ 1999). Sie wurden ursprünglich beim Schwein entdeckt und werden in vier Gruppen eingeteilt: die Cathelicidine, die Defensine, Nk-Lysin und die Cepropine (ZHANG et al. 2000). Die bisher am wenigsten untersuchte Gruppe sind die Cepropine, die Homologien zu von Insekten produzierten AMP aufweisen, auf diese soll hier jedoch nicht weiter eingegangen werden, da sie in den vorliegenden Untersuchungen nicht berücksichtigt werden. Defensine zeichnen sich alle durch Cysteinreste in ihrer Molekularstruktur aus. Bei Säugern werden sie je nach Lokalisation der durch Cysteinreste gebildeten Disulfidbrücken in α-, β-, und δDefensine unterschieden, von denen beim Schwein nur das β-Defensin vorkommt (ZHANG et al. 1998). Sie werden als Prepro-Peptide unter anderem in Epithelzellen gebildet und erst nach ihrer Ausschleusung aus der Zelle aktiviert. Im Darm erfolgt diese Aktivierung durch Trypsin. Neben ihrer antimikrobiellen Wirkung, haben sie auch einen chemotaktischen Effekt auf Immunzellen (GANZ und LEHRER 1995). Ein besonderer Zusammenhang, scheint zwischen bestimmten Formen der CED des Menschen und Veränderungen in der Defensinproduktion zu bestehen. Während die Colitis ulcerosa beim Menschen mit einer spezifisch erhöhten Expression von αDefensinen in Verbindung gebracht wird (WEHKAMP et al. 2002b), liegt beim Morbus Crohn im humanen β-Defensinen HBD-1 eine Defizienz vor. Die Expression der β-Defensine HBD-2 und HBD-3 verhalten sich bei verschiedenen Formen der CED unterschiedlich (WEHKAMP et al. 2003). Cathelicidine sind eine sehr heterogene Molekülfamilie, denen aber allen eine konservierte Proteinsequenz, das „Cathelin“, eigen ist. Zu ihnen gehören auch die porcinen Cathelicidine, das ursprünglich aus dem Schweinedarm isolierte PR-39 und die Protegrine (AGERBERTH et al. 1991). Die Gene, die für diese AMP codieren, enthalten Bindungsstellen für NF-κB und NF-IL-6, was sie für eine Aktivierung in der initialen Phase einer Immunantwort empfänglich macht (ZHAO et al. 1995a, 1995b). Eine Erhöhung der Serum PR-39-Konzentration konnte beim Schwein z. B. im 33 Einleitung und Literaturübersicht ________________________________________________________________________________ Zusammenhang mit Salmonelleninfektionen beobachtet werden (ZHANG et al. 1997). NK-Lysin wurde aus dem Dünndarm des Schweins isoliert und besteht aus 78 Aminosäuren. Es wird von zytotoxischen T-Zellen und natürlichen Killerzellen produziert (ANDERSSON et al. 1995). Bei den AMP handelt es sich um phylogenetisch sehr alte Moleküle, die prophylaktisch vor bzw. zu einem sehr frühen Zeitpunkt einer Infektion oder durch Kontakt mit Bakterien gebildet werden. Inzwischen ist bekannt, dass EcN und andere probiotische Bakterien nach Co-Kultur in verschiedenen humanen Darmzelllinien die Bildung von HBD2 induzieren, wohingegen von mehr als 40 verschiedenen sowohl pathogenen als auch apathogenen E. coli Stämmen keiner Einfluss auf die Defensinexpression nimmt (WEHKAMP et al. 2004). Es ist somit nicht ausgeschlossen, dass die Induktion von AMP einen Anteil an der probiotischen Wirkung bestimmter Keime hat. 1.6 Ziel der Arbeit Über die Wirkmechanismen probiotischer Mikroorganismen ist bisher wenig bekannt. Darüber, wie einer der ältesten therapeutisch verwendeten Probiotikastämme, das gram-negative Bakterium E. coli Nissle 1917, seine positiven Effekte erzielt, gibt es nur wenige Hinweise, die zudem meist aus In-vitro-Untersuchungen stammen. Die wenigen vorhandenen In-vivo-Experimente wurden fast ausschließlich an kleinen Labornagern durchgeführt, die in der Physiologie ihres MagenDarmtraktes nur wenig Gemeinsamkeiten mit den Haustieren und dem Menschen aufweisen. Außerdem wurden in einem Großteil der Fälle Krankheitsmodelle verwendet, die nur eingeschränkte Aussagen über die Mechanismen beim gesunden Tier ermöglichen. Ziel dieser Arbeit war daher, die Wirkung von EcN am Modelltier Schwein zu untersuchen. Das Schwein ist nicht nur im Hinblick auf die Anwendung von probiotischen Keimen interessant, sondern es hat sich zudem speziell zur Untersuchung gastrointestinaler Vorgänge als gutes Modelltier erwiesen. Der erste Teil der folgenden Untersuchungen sollte zunächst an gesunden Schweinen durchgeführt werden. Nachdem bei unveröffentlichten Arbeiten der hiesigen Arbeitsgruppe an gesunden Tieren keine Anzeichen für eine Wirkung von EcN auf die Elektrophysiologie der Darmmukosa vorlagen, 34 Einleitung und Literaturübersicht ________________________________________________________________________________ war es Ziel dieser Versuche, festzustellen, ob und wenn ja, inwieweit die orale Verabreichung von EcN eine Auswirkung auf die Verteilung von mukosalen Immunzellen im Darm gesunder Schweine sowie die Expression verschiedener Zytokine und antimikrobieller Peptide in der Darmmukosa hat. Der zweite Teil der vorliegenden Arbeit hatte die Untersuchung der prophylaktischen Wirksamkeit von EcN zum Ziel. Zu diesem Zweck sollte mit der Etablierung eines neuen Infektionsmodells an ETEC-infizierten Absetzferkeln begonnen werden, um damit zum besseren Verständnis positiver Effekte von EcN bei bakteriell bedingten Erkrankungen des Schweins beizutragen. 35 Material und Methoden ________________________________________________________________________________ 2 Material und Methode Eine alphabetisch geordnete Liste der verwendeten Substanzen und Geräte, Lösungs- und Pufferrezepte befindet sich in Anhang II. Alle im Folgenden beschriebenen Versuche wurden durch den Tierschutzbeauftragten der Tierärztlichen Hochschule geprüft und von der Bezirksregierung des Landes Niedersachsen entsprechend § 8 des Tierschutzgesetzes genehmigt. Die Versuche werden unter der Aktennummer: 509.6-42502-03/720 bei der Bezirksregierung geführt. 2.1 2.1.1 Haltung der Versuchstiere Versuch mit konventionell gehaltenen Schweinen mit und ohne EcN Als Versuchstiere dienten 15 abgesetzte Schweine einer Kreuzung der Rassen ” Deutsche Landrasse” und „Pietrain” aus dem Institut für Tierzucht der Bundesforschungsanstalt für Landwirtschaft, Braunschweig. Die Tiere hatten zu Versuchsbeginn ein Gewicht von 16 ± 2,7 kg. Nach der Ankunft im Physiologischen Institut der Tierärztlichen Hochschule wurde jedes Schwein mit Ivermectin 0,3 mg/kg s.c. (Ivomec® 5%, Bayer AG, Leverkusen) entwurmt und erhielt eine Immunprophylaxe mit 2 ml Baypamun® (Bayer AG, Leverkusen) s.c.. Durch eine zweiwöchige Adaptationsphase wurden Erkrankungen auf Grund der veränderten stallspezifischen Flora und des Transportstresses ausgeschlossen. Als Grundfutter diente ein herkömmliches Schweinemastfutter (Zusammensetzung siehe Anhang I), welches auch schon im Herkunftsbetrieb der Tiere gefüttert worden war. Die Tiere erhielten 400 g Futter pro Tag. Zum Ende des Versuchszeitraums wurde die Futtermenge unter Berücksichtigung der Gewichtsentwicklung auf 500 g pro Tag erhöht. Die Fütterung erfolgte zweimal täglich. Sowohl in der Adaptationszeit als auch während des Versuchs standen die Tiere auf Stroh und hatten freien Wasserzugang über eine Selbsttränke. 36 Material und Methoden ________________________________________________________________________________ 2.1.2 Infektionsversuche mit und ohne EcN Für die Infektionsversuche wurden zwei von Ebern der Rasse „Pietrain“ tragende Sauen (Sau I und II) der „Deutschen Landrasse“ vier bis sechs Wochen vor dem Abferkeltermin in den Stallungen des Physiologischen Instituts eingestellt. Die Tiere entstammten dem Bestand des Lehr- und Forschungsgutes der Tierärztlichen Hochschule in Ruthe. Die Sauen wurden auf Stroh gehalten und hatten freien Zugang zu Wasser. Gefüttert wurden sie zweimal am Tag mit einem Sauenmischfutter (Anhang I). Heu stand zur freien Verfügung. Die Abferkelung erfolgte unter Aufsicht. Beide Sauen erbrachten acht lebende Ferkel. Jedes Ferkel erhielt am dritten und am 18. Lebenstag je 1 ml Eisendextran 20 (Vetoquinol, Oberursel) als subkutane Injektion in die Kniefalte. Ab dem siebten Lebenstag wurde ihnen ein probiotikafreies Ferkelfutter ohne Leistungsförderer (Anhang I) zur freien Aufnahme angeboten. Wasser war jederzeit ad libitum („nach Belieben“) zugänglich. Die Aufteilung der Würfe in die verschiedenen Versuchsgruppen ist aus Tab. 2 und Tab. 3 ersichtlich. Tab. 2 Verteilung der Würfe auf die Versuchsgruppen Ohne E. coli Nissle 1917 (SI2) Mit .E coli Nissle 1917 (SI3) Mit E. coli Abbotstown Sau I = 4 Ferkel Sau II = 4 Ferkel Ohne E. coli Abbotstown Sau I = 4 Ferkel Sau II = 4 Ferkel 37 Material und Methoden ________________________________________________________________________________ Tab. 3 Absetzalter und Gruppenzuordnung einzelner Ferkel Tier Sau Absatzalter E. coli Nissle 1917 E. coli Abbotstown SI2-1 I 21. LT nein nein SI2-2 I 21. LT nein ja SI2-3 I 22. LT nein nein SI2-4 I 22. LT nein ja SI2-5 I 23. LT nein nein SI2-6 I 23. LT nein ja SI2-7 I 24. LT nein nein SI2-8 I 24. LT nein ja SI3-1 II 21. LT ja nein SI3-2 II 21. LT ja ja SI3-3 II 22. LT ja nein SI3-4 II 22. LT ja ja SI3-5 II 23. LT ja nein SI3-6 II 23. LT ja ja SI3-7 II 24. LT ja nein SI3-8 II 24. LT ja ja Bezeichnung Abkürzung: LT = Lebenstag, SI = Schweineinfektionsversuch Ab dem 21. Lebenstag wurden an vier aufeinander folgenden Tagen jeweils zwei Tiere von der Mutter abgesetzt. Während der Versuchsdauer waren die Ferkel einzeln in Haustiertransportkisten (Vari-Kennel® XL, Patmate®,USA) auf staubfreier Weichholzspäne (TierWohl, Super, J. Reppmeier & Söhne, Rosenberg) untergebracht und erhielten weiterhin Ferkelfutter ad libitum. Wasser war frei zugänglich. Zur Deckung des Rohfaserbedarfs und zur Beschäftigung erhielt jedes Tier Heu und Stroh. Die Transportkisten der Infektions- und Kontrollgruppe wurden in voneinander getrennt gelegenen Räumen des Physiologischen Instituts untergebracht. Es wurde eine Raumtemperatur von 22°C 38 Material und Methoden ________________________________________________________________________________ aufrecht erhalten. Die Versorgung und Beobachtung der Tiere erfolgte ausschließlich durch den Untersucher. Alle Räume wurden nur mit separater Schutzkleidung (Handschuhe, Kittel, Schürze und Gummistiefel) über Wannen mit 2%iger Lysovet® PA-Lösung (Schülke & Mayer, Norderstedt) betreten. 2.2 Versuchsdurchführung 2.2.1 Versuch mit konventionell gehaltenen Schweinen mit und ohne EcN Vor Versuchsbeginn wurden drei Gruppen mit je fünf zufällig ausgewählten Schweinen gebildet. Die Tiere der Versuchsgruppen wurden in Einzelhaltung mit Sichtkontakt, die Kontrolltiere zu zweit bzw. zu dritt aufgestallt. In beiden Versuchsgruppen wurde mit dem Grundfutter zweimal am Tag eine Suspension des Escherichia coli Stammes Nissle 1917 (EcN) gefüttert. Die Kontrolltiere erhielten reinen Puffer (Placebo). Escherichia coli Nissle 1917 Suspensionsherstellung und Applikation Die EcN- Suspensionen wurden freundlicherweise von der Firme Ardeypharm, Herdecke, Deutschland, fertig angemischt zur Verfügung gestellt. Es wurden zwei Suspensionen mit verschiedenen EcN-Konzentrationen verwendet. Suspension 1 enthielt: 5,0 x 108 KBE/ml der Charge, Ch.B.:#BF01.1001-1, Lieferung 09.02.01 Suspension 2 enthielt: 5,0 x 1010 KBE/ml der Charge, Ch.B.:#BF01.1001-3, Lieferung 15.02.01 Die Keime wurden in Suspensions–Puffer geliefert. Um die Kontamination bei der Entnahme so gering wie möglich zu halten, wurde vor Versuchsbeginn, die für die gesamte Versuchsdauer von 21 Tagen benötigte Fütterungsdosis pro Tier (42 ml) in sterile 50 ml Reaktionsröhrchen aliquotiert. Die Aufbewahrung erfolgte im Kühlschrank bei 4°C. Unmittelbar vor dem Verabreichen wurde die Suspension durchmischt, um die Bakterien gründlich zu resuspendieren. Die Fütterungsdosis von 1 ml Suspension pro Tier und Mahlzeit wurde anschließend noch im Labor in sterile Einmalspritzen aufgezogen. Tiere der Versuchsgruppe I erhielten zweimal am Tag je 1 ml der Suspension 1 (= 109 KBE EcN) und Tiere der Versuchsgruppe II zweimal am Tag je 1 ml der Suspension 2 (= 1011 KBE EcN). An die Kontrolltiere wurde das gleiche Volumen reiner Suspensionspuffer gefüttert. 39 Material und Methoden ________________________________________________________________________________ Damit die Aufnahme sichergestellt war, wurde den Schweinen zunächst eine kleine Menge Futter mit dem Inokulat angeboten. Erst nachdem diese Menge vollständig aufgenommen worden war, wurde die Fütterung fortgesetzt. Bei den in Kleingruppen gehaltenen Tieren der Kontrollgruppe hatte jedes Tier einen eigenen Futtertrog zur Verfügung. Der Versuchszeitraum erstreckte sich über 21 Tage. Zur Kontrolle der EcN-Besiedlung wurde von den Tieren am 7. und 14. Versuchstag Kotproben genommen und bei –20 °C eingefroren. 2.2.2 Infektionsversuche mit und ohne EcN Bei den Infektionsversuchen wurden die Ferkel mit (Wurf der Sau II) oder ohne (Wurf der Sau I) vorherige, zehntägige EcN-Applikation von der Mutter abgesetzt und dann mit EcA bzw. Placebo inokuliert. Anzüchtung und Suspensionsherstellung des Escherichia coli Stamms „Abbotstown“ Die Stammkultur des Escherichia coli Stammes „Abbotstown“ wurde vom Institut für Hygiene und Infektionskrankheiten der Tiere des Fachbereichs Veterinärmedizin der Justus-Liebig-Universität, Gießen, zur Verfügung gestellt. Die Bakterien wurden auf Comassiblutagar subkultiviert und im Kühlschrank bei 4°C aufbewahrt. Die Anzüchtung erfolgte in Luria-Bertani (LB) –Medium (SEMBROOK et al. 1989). Am Vortag der Inokulation wurden unter der Lamina Airflow (NU 440400E, NuAire, USA) mit einer abgeflammten Metallöse 4-5 Bakterienkolonien von der Blutagarplatte abgenommen und in ein 50 ml Reaktionsröhrchen mit 12 ml LB-Medium überführt. Das Reaktionsröhrchen wurde dann für 16 Stunden in einem Inkubationsschüttler (Innova 4000, New Brunswick Scientific, USA) bei 180 rpm und 37°C über Nacht inkubiert. Nach Übernachtkultur wurden der Suspension zweimal 1 ml zur Keimzahlbestimmung entnommen und in sterilen 1,5 ml Reaktionsgefäßen bei 4°C gelagert. Danach wurde der Rest bei 3000 x g und 4°C für zehn Minuten zentrifugiert. Der Überstand wurde mit einer Glaspipette unter der Lamina Airflow abgenommen, verworfen und das Pellet auf Eis in das Physiologische Institut transportiert. Dort erfolgte die Resuspension der Inokulationsdosis mit 5 ml Nissle-Puffer. Die beschriebene Anzüchtung ergab die Inokulationsdosis für jeweils ein Tier mit einem Keimgehalt von 1,1 x 1010 bis 2,1 x 1010 KBE. 40 Material und Methoden ________________________________________________________________________________ Absetzen und Inokulation mit Escherichia coli Stamm „Abbotstown“ Das Absetzen der Ferkel von der Sau erfolgte morgens um vier Uhr. Die Ferkel wurden gewogen und zufällig auf die Versuchsgruppen verteilt. Soweit möglich wurde dabei eine gleichmäßige Geschlechterverteilung berücksichtigt. Vier Stunden nach Absetzen – in dieser Zeit erhielten die Tiere kein Futter – erfolgte in der Infektionsgruppe die Inokulation mit E. coli Stamm Abbotstown. Die Kontrollgruppe erhielt Puffer ohne den Keim. Dazu wurden die Tiere von einer Hilfsperson festgehalten. Eine zweite Hilfsperson öffnete das Maul und fixierte einen Kunststoffkeil Abb. 2, durch den eine Ernährungssonde (Braun, Deutschland) über den Pharynx und den Oesophagus in den Magen vorgeschoben wurde. Die korrekte Lage der Sonde wurde durch Gabe von 2 ml Leitungswasser überprüft. Anschließend erfolgte die Inokulation mit 5 ml EcA-Suspension (1 Inokulationsdosis) in der Infektionsgruppe bzw. 5 ml Nissle-Puffer (Placebo) in der Kontrollgruppe. Die Inokulation wurde nach 24 Stunden entsprechend dem obigen Protokoll wiederholt. Abb. 2 Fixierung eines Kunststoffkeils im Maul eines drei Wochen alten Ferkels Escherichia coli Nissle 1917 Suspensionsherstellung und Applikation Den Ferkeln des Infektionsversuches mit vorheriger EcN-Applikation (Wurf der Sau II) wurde ab dem 13. Lebenstag bis zum Absetzen jeden Morgen oral 1 ml einer EcN-Suspension verabreicht. Dazu wurde im Labor vorsichtig mit einer Kanüle eine 100 mg Kapsel Mutaflor® an einem Pol 41 Material und Methoden ________________________________________________________________________________ geöffnet. Der Inhalt wurde in 1 ml „Nissle“-Puffer suspendiert. Zur besseren Akzeptanz wurden der Suspension 1-2 Tropfen flüssiger Süßstoff zugesetzt. Nach gründlichem Durchmischen bildete sich eine homogene Suspension, die dann mit einer Kanüle (1,2 x 40 mm) in eine 2 ml Spritze aufgezogen wurde. Eine Kapsel entsprach der täglichen Dosis für ein Tier. Zur oralen Applikation wurden die Ferkel von einer Hilfsperson fixiert, der Spritzeninhalt durch Schütteln noch einmal resuspendiert und dann langsam im Pharynxsbereich der Ferkel appliziert. Die Ferkel wurden erst abgesetzt, wenn die Lösung komplett geschluckt worden war. Vor der Applikation der ersten EcN-Dosis wurde jedem Ferkel ein Rektaltupfer entnommen, um das Vorhandensein von EcN im Darm der Ferkel vor Beginn der EcN-Gabe ausschließen zu können. Während der anschließenden Infektion mit EcA erhielten die Ferkel weiterhin einmal täglich EcN. Die Eingabe erfolgte zur Vermeidung von Wechselwirkungen mit dem pathogenen Infektionsstamm vier Stunden vor der Inokulation mit EcA. Am Tag der Schlachtung wurde kein EcN appliziert. Beobachtungs- und Messparameter Die Ferkel wurden vor Versuchsbeginn und vor der Tötung gewogen. Vor jeder Inokulation wurde die Körpertemperatur mit einem Digitalthermometer (servoprax® GmbH, Wesel) bestimmt. Vom Zeitpunkt des Absetzens erfolgte alle vier Stunden eine Beurteilung des Allgemeinzustandes anhand der Parameter Verhalten, Futter- und Wasseraufnahme und der peripheren Durchblutung. Des Weiteren wurden die Verschmutzung im Bereich des Afters und die Kotkonsistenz kontrolliert. Um Stress für die Tiere zu minimieren, wurden die Ferkel dabei nach Möglichkeit nicht aus dem Käfig herausgenommen. Die Beurteilung erfolgte ausschließlich durch den Untersucher nach folgendem vorab festgelegten Schema (Tab. 4): 42 Material und Methoden ________________________________________________________________________________ Tab. 4 Untersuchungsparameter zur Beurteilung des Krankheitsgrades Verhalten Futter-/Wasseraufnahme periphere Durchblutung Afterregion Kotbeschaffenheit 1 aufmerksam an der Umgebung interessiert 2 gedämpfte Aufmerksamkeit, aber ansprechbar 3 apathisch 1 ungestört 2 eingeschränkt 3 keine 1 rosig 2 blass 1 trocken und sauber 2 stellenweise/in geringem Abstand um den After verschmutzt 3 stark/großflächig verschmutzt, feucht 1 unauffällig 2 pastös 3 semi-flüssig 4 flüssig Modifiziert nach (TO et al. 1998) 2.3 Tötung der Tiere Sowohl die Tiere des ersten Versuchs mit EcN bei konventionell gehaltenen Schweinen als auch die Ferkel aus den Infektionsversuchen wurden am Ende der Versuchsdauer mittels Bolzenschuss betäubt und mit einem Kehlschnitt, der die Luftröhre, beide Carotiden und angrenzende Gefäße und Nerven durchtrennte, getötet. Aus dem ausströmenden Blut wurden bei den Ferkeln der Infektionsversuche mit und ohne EcN zwei Blutproben zur Plasmagewinnung in Li-Heparin Monovetten® (Sarstedt, Nümbrecht) entnommen. 43 Material und Methoden ________________________________________________________________________________ 2.4 Probengewinnung 2.4.1 Versuch mit konventionell gehaltenen Schweinen mit und ohne EcN Zur schnellen und kontaminationsfreien Entnahme des Darmkonvoluts wurden die Tiere wie beim regulären Schlachtvorgang an den Hinterbeinen aufgehängt. Mit einem Schnitt in der Linea alba wurde die Bauchhöhle eröffnet und der Magen an der Kardia vom Oesophagus getrennt. Nach Durchtrennung der vorderen und hinteren Gekrösewurzel und Absetzen des Colon descendens am Übergang zum Rektum, konnte das gesamte Darmkonvolut einschließlich des Magens, der Milz und der Anhangdrüsen entfernt werden. Die weitere Präparation und Probenentnahme erfolgte getrennt vom Tierkörper. Um eine möglichst kontaminationsfreie Probenentnahme für die Polymerase Kettenreaktion (PCR), Histologie und Immunhistologie zu gewährleisten, wurden jeweils 5-10 cm lange Stücke aus verschiedenen Darmabschnitten entnommen, am mesenterialen Rand aufgeschnitten und mehrfach mit 4°C kalter physiologischer Kochsalzlösung gespült, bis die Spülflüssigkeit klar blieb und kein Darminhalt mehr auf der Mukosa zu erkennen war. Das Gewebe wurde zur Weiterverarbeitung mit vier Kanülen auf einer Styroporplatte fixiert. 2.4.1.1 Probenentnahme für mikrobiologische Untersuchungen Aus der im Tierkörper verbliebenen Ampulla recti wurden 2-3g Kot für den Nachweis von EcN in ein steriles Kotröhrchen entnommen und bei –20°C eingefroren. 2.4.1.2 Probenentnahme für die Polymerase-Ketten-Reaktion Die Entnahme von Proben zur Analyse der mRNA-Expression von antimikrobiellen Peptiden und Zytokinen in der Darmmukosa mittels reverse Transkriptase-Polymerase Kettenreaktion (RT-PCR) erfolgte aus dem Duodenum, dem Ileum und dem Kolon. Von den aufgespannten Geweben wurden mit dem Plastiklöffel eines sterilen RNAse-freien Kotröhrchens in einem 0,5 x 0,5 cm großer Bereich die Mukosa von der Submukosa abgeschabt. Der Plastiklöffel wurde dann zusammen mit der Mukosa zurück in das Röhrchen verbracht und sofort in flüssigem Stickstoff schockgefroren. 44 Material und Methoden ________________________________________________________________________________ Bis zur weiteren Verarbeitung wurden die Proben bei –80°C gelagert. 2.4.1.3 Probenentnahme für histologische und immunhistologische Analysen Die Probenentnahme für die histologischen und immunhistologischen Untersuchungen erfolgte aus dem Duodenum, Jejunum, Ileum sowie dem proximalen und distalen Kolon. Es wurden jeweils zwei transmurale („die ganze Wand erfassend“) Gewebestücke von 1,5 x 0,5 cm Größe entnommen. Die Entnahmelokalisationen sind in Abb. 3 dargestellt. 1 8 7 4 Plica ileocaecalis 50 cm 6 2 2 m Jejunum entfernt 3 5 Abb. 3 Lokalisation der Entnahmestellen für Gewebeproben 1= Magen, 2 = Milz, 3 = Duodenum, 4 = Jejunum, 5 = Ileum, 6 = Colon ascendens, 7 = Colon descendens, Plica ileocaecalis (weiße Pfeil), Entnahmelokalisationen für die Gewebeproben (schwarze Pfeile) Sofort nach Entnahme wurde eine Probe in 3 ml 4%iger Paraformaldehyd-Lösung (Anhang II) und eine zweite Probe in 3 ml Carnoy-Lösung (Anhang II) fixiert. Die in Paraformaldehyd fixierten Proben konnten bis zu sieben Tage bei 4°C aufbewahrt werden. Die in Carnoy-Lösung fixierten Proben wurden über Nacht bei 4°C fixiert und am nächsten Tag weiter bearbeitet. Eine dritte Probe von 0,2 x 1 cm Größe wurde in einer Lösung, bestehend aus einer Saccharoselösung (TissueTec®, Sakura, Finnland) und Aqua dest. im Verhältnis 1:1, für fünf 45 Material und Methoden ________________________________________________________________________________ Minuten inkubiert und dann langsam mit 100 % TissueTec® in Crymold®-Einfrierschälchen (Sakura, Finnland) auf Trockeneis gefroren. Zum Schutz gegen Austrocknung wurden die gefrorenen Proben einzeln in Alufolie verpackt und bei –20°C aufbewahrt. 2.4.2 Infektionsversuche mit und ohne EcN Bei den Ferkeln wurde auf Grund der geringen Größe das Darmkonvolut im Tier belassen. Das Tier wurde in Rückenlage fixiert und die Probenentnahme erfolgte nach Eröffnung in der Linea alba direkt aus der Bauchhöhle. 2.4.2.1 Plasmagewinnung für Plasma-IgA-Bestimmung Das heparinisierte Blut wurde in einer Minifuge 2 (Heraeus, Hanau, Deutschland) bei 4000 g zehn Minuten zentrifugiert. Von dem Plasmaüberstand wurden Aliquots zu je 1,5 ml in ein Reaktionsgefäß pipettiert und bis zur weiteren Verwendung bei –20°C gelagert. Die Plasmaproben wurden nach Ende der Versuche in der Bundesforschungsanstalt für Verbraucherschutz, Ernährung und Landwirtschaft in Karlsruhe mittels ELISA auf den Gehalt an IgA untersucht. 2.4.2.2 Probenentnahme für mikrobiologische Untersuchungen Aus einem frischen Anschnitt von Duodenum, Jejunum, Ileum und Kolon erfolgte die Entnahme einer Tupferprobe des Darminhalts, die in Röhrchen mit Transportagar 0482 (nerbe plus, Winsen) bis zur Untersuchung zusammen mit den Gewebeproben bei 4°C im Kühlschrank gelagert wurde. Aus dem Rektum der Tiere wurden außerdem zwei Kotproben gewonnen und bei – 20°C eingefroren. 2.4.2.3 Probenentnahme für luminale IgA-Bestimmung Zur Bestimmung des Gehalts an luminalem IgA wurde ein Stück des Jejunums mit einer Länge von 20 cm entnommen und mehrmals mit 5 ml PBS mit 0,01% Na-Azid (PBS/Na-Azid) gespült. Insgesamt wurde ein Spülvolumen von 20 ml verwendet. Spülflüssigkeit und Darminhalt wurden in einem Weithalsflasche gesammelt. Die Proben wurden in ein 50 ml Reaktionsröhrchen überführt und in einer Ultrazentrifuge CLGS56R (Beckman Coulter, Krefeld) bei 800 g für eine Minute zentrifugiert. Der Überstand wurde in einem 50 ml Reaktionsröhrchen gesammelt und das Pellet mit 10 ml PBS/ Na-Azid für 30 Sekunden gründlich durchmischt, dann erneut bei 800 g für eine 46 Material und Methoden ________________________________________________________________________________ Minute zentrifugiert und der Überstand abgenommen. Dieser Schritt wurde ein weiteres Mal wiederholt. Die Überstände wurden gepoolt und durch Zentrifugation (1800 rpm, drei Minuten) wurden restliche Partikel entfernt. 15 ml des Überstandes wurden über einen Amicon Ultra 100 kD Filter (Millipore, USA) bei 2000 g für 40 Minuten zentrifugiert und so auf ein Volumen von 250500 µl konzentriert, mit PBS/Na-Azid auf 1 ml verdünnt und bei – 80°C eingefroren. 2.4.2.4 Probenentnahme für histologische Untersuchungen Für die histologische Untersuchung wurden je zwei Gewebestücke von 2 cm Länge aus dem Jejunum und dem Ileum entnommen. Das Darmlumen wurde mit physiologischer Kochsalzlösung partikelfrei gespült. Anschließend wurde das Gewebe in 50 ml Polyethylen-Schraubflaschen mit 4%iger Formalinlösung gegeben. Die Proben wurden bis zum Ende des jeweiligen Versuchsdurchgangs bei Raumtemperatur aufbewahrt. Die histologischen Untersuchungen wurde im Institut für Pathologie der Tierärztlichen Hochschule durchgeführt. Die Proben waren verblindet und wurden unabhängig von zwei Untersuchern beurteilt. 2.5 Probenbearbeitung und Lagerung 2.5.1 Einbettung in Paraffin und Anfertigung von Gewebeschnitten Um die Anfertigung von Gewebeschnitten aus den fixierten Proben zu ermöglichen, wurden sie zunächst auf eine Größe von 1 x 0,2 cm geschnitten und dann mit Hilfe einer Histokinette (Reichert-Jung, Nussloch, Deutschland) in Paraffin eingebettet. Durch diesen Automaten wurden die Paraformaldehydproben für je 30 Minuten in Leitungswasser und dann nacheinander in 80%igen und 96%igen Ethanol verbracht. Es folgten zweimal je 30 Minuten in 99%igem Ethanol, Xylol und Paraffin. Bei dem mit Carnoy-Lösung fixiertem Gewebe wurde wegen des alkoholischen Charakters der Lösung auf den Schritt mit Leitungswasser in der Prozedur verzichtet und direkt in 80%igem Ethanol begonnen. Im Anschluss an die Einbettung wurden die erhärteten Proben in einem Paraffinbad bei 62°C vorgewärmt und dann unter Zuhilfenahme einer Blockstation (Shandon, Frankfurt) und einer Kühlplatte (-12°C, Shandon, Frankfurt) mit flüssigem Paraffin in Blöcke gegossen. 47 Material und Methoden ________________________________________________________________________________ Nach dem Herunterkühlen der Blöcke auf –12°C wurden mit einem Mikrotom (HM 335 E Microm, Walldorf) 2 µm dicke Gewebeschnitte angefertigt, auf der Wasseroberfläche eines vorgeheizten Wasserbades (42°C) gestreckt und plan auf Objektträger aufgebracht. Für die histologischen Färbungen wurden unbeschichtete, für die immunhistologischen Färbungen beschichtete Objektträger verwendet. Die Schnitte wurden über Nacht im Trockenschrank bei 37°C oder über mindestens 48 Stunden bei Raumtemperatur getrocknet. Da auf Paraformaldehy-fixierten Schnitten nicht alle Epitope für Antikörper zugänglich sind, wurden für den Nachweis einiger Epitope Gefrierschnitte angefertigt. Dazu wurden von den in TissueTec® eingefrorenen transmuralen Gewebeproben bei –20°C mit einem Cryostaten (HM 500 OM, Microm, Walldorf) 5 µm dicke Schnitte angefertigt und auf beschichtete Objektträger aufgebracht. Nach einstündiger Trocknung bei Raumtemperatur wurden sie entweder direkt weiterbearbeitet oder einzeln in Alufolie verpackt bei – 20°C gelagert. Die gelagerten Schnitte konnten dann später nach langsamem Auftauen und anschließendem erneuten Trocknen bei Raumtemperatur verwendet werden. 2.6 Mikrobiologische Untersuchungen 2.6.1 Versuch mit konventionell gehaltenen Schweinen mit und ohne EcN Die Untersuchung der Kotproben auf Anwesenheit von EcN wurde mit stammspezifischer Multiplex-PCR (BLUM-OEHLER et al. 2003) durch die Firma Ardeypharm, Herdecke, Deutschland, vorgenommen. 2.6.2 Infektionsversuche mit und ohne EcN Die Untersuchung von Rektaltupfern und Kotproben auf Anwesenheit von EcN erfolgte durch die Firma Ardeypharm. Die allgemeine, mikrobiologische Untersuchung der Gewebe- und Tupferproben sowie eine spezifische Untersuchung auf EcA wurde vom Institut für Hygiene und Infektionskrankheiten der Tiere des Fachbereichs Veterinärmedizin der Justus-Liebig-Universität, Gießen, durchgeführt. 48 Material und Methoden ________________________________________________________________________________ Die Untersuchung auf Salmonellen erfolgte dabei nach Standardmethoden auf Blutagar- und Gassnerplatten, sowie nach Anreicherung in den Medien Rappaport-Vissidialis und Thetrathionat. Auf Lawsonia intracellularis und Brachyspira hyodysenteriae wurde mit PCR, auf virale Erreger mit Hilfe des Elektronenmikroskops untersucht. 2.7 Bestimmung von luminalen und Plasma-IgA 2.7.1 Infektionsversuche mit und ohne EcN Die Untersuchung des luminalen und Plasma-IgA wurde in der Bundesforschungsanstalt für Ernährung in Karlsruhe durchgeführt. Mit Hilfe eines ELISAs (enzym-linked immunesorbent assey) wurde der Gehalt an IgA im Darminhalt und im Plasma gemessen (ROLLER 2003). 2.7.2 Auswertung Da kein Standard für porcines IgA zur Verfügung stand, konnten weder für den Serum-IgA-Gehalt noch für den Gehalt an luminalem IgA absolute Konzentrationen bestimmt werden. Die Werte für Serum-IgA sind als Optische Dichte (OD) bei 450 nm dargestellt. Um den unterschiedlichen Ausgangsvolumina bei der Auswertung der OD von intestinaler Spülflüssigkeit Rechnung zu tragen, wurde die OD entsprechend der Formel: OD x 15 x Vkorr korrigiert. Dabei ist OD die optische Dichte gemessen bei 450 nm, 15 ist der Verdünnungsfaktor des Messvolumens, und Vkorr das korrigierte Ausgangsvolumen der aufkonzentrierten intestinalen Spülflüssigkeit (Vkorr = VAusg / 15 x VEluat ; VAusg = Ausgangsvolumen der gepoolten Überstande; 15 = für die Aufkonzentrierung verwendetes Volumen in ml; VEluat = Eluatvolumen aus 15 ml Überstand). 2.8 Histologische Untersuchung 2.8.1 Entparaffinierung Die Gewebeschnitte wurden in Glasküvetten nacheinander durch Xylol, Alkohol und Aqua dest. 49 Material und Methoden ________________________________________________________________________________ geführt. Die Schnitte verblieben dabei zweimal jeweils zehn Minuten in Xylol und zweimal je fünf Minuten in 99%igem vergälltem Alkohol, sowie je fünf Minuten in 96%igem, 70%igem und 50%igem Alkohol. Den Abschluss bildete fünfminütiges Wässern in Aqua dest. 2.8.2 Hämalaun-Eosin Färbung Die Färbung diente zur allgemeinen Beurteilung der Gewebestruktur und ermöglichte die Auszählung von neutrophilen, eosinophilen und basophilen Granulozyten. Für die Färbung wurden die in Aqua dest. gewässerten Schnitte für fünfzehn Sekunden in unverdünnter Hämalaunlösung gefärbt und anschließend fünf Minuten in Leitungswasser gebläut. Nach erneuter Wässerung in Aqua dest. für fünf Minuten folgte eine zweiminütige Inkubation in wässriger Eosinlösung. Die Schnitte wurden für zehn Sekunden in Aqua dest. gespült und über eine aufsteigende Alkoholreihe von 70%igem, 96%igem und 100%igem Ethanol, in dem die Schnitte jeweils für eine Minute verblieben, entwässert. Danach wurden sie für zweimal fünf Minuten in Xylol verbracht und dann mit Entellan® eingedeckt. 2.8.3 Toluidinblaufärbung Der Thiazinfarbstoff o-Toluidinblau färbt Mastzellen auf Grund der metachromatischen Eigenschaften ihrer Granula tief violett. Als Metachromasie bezeichnet man die Eigenschaft bestimmter Verbindungen, sich mit einem Farbstoff in einer anderen als der nach der Grundfarbe des Farbstoffs zu erwartenden Farbe, zu färben. Die Mastzellen heben sich dadurch deutlich von dem sich blau darstellenden Restgewebe ab. Die Schnitte wurden nach der Entparaffinierung zunächst für 60 Minuten in einer o-Toluidinblau Lösung inkubiert, dann für fünf Minuten in Aqua dest. verbracht und schließlich für zwei Minuten mit Giemsalösung gegengefärbt, um die Kerne der restlichen Zellen anzufärben und so später eine leichtere Auswertung zu ermöglichen. Nach erneutem Wässern in Aqua dest. für fünf Minuten wurden die Schnitte wie bei der HämalaunEosin-Färbung in einer aufsteigenden Alkoholreihe dehydriert und nach jeweils zweimal fünf Minuten in einem Xylolbad mit Entellan® eingedeckt. 50 Material und Methoden ________________________________________________________________________________ 2.9 Immunhistologische Methoden 2.9.1 Markierte Streptavidin-Biotin Methode Die bei nachfolgenden Untersuchungen verwendete markierte Streptavidin-Biotin (LSAB = labeled streptavidin biotin) Methode ist eine spezielle Form der indirekten enzymatischen Immunhistologie. Enzym-Substratkomplex Sekundärantikörper Primärantikörper Primärantikörper Antigen Plasmamembran Direkt Indirekt Abb. 4 Schematische Darstellung der Antikörperbindung bei der direkten und indirekten Immunhistologie. Im Unterschied zur direkten Immunhistologie, bei der der antigenspezifische Primärantikörper direkt mit einem Enzym (z.B. Meerrettichperoxidase) gekoppelt ist, sind die Primärantikörper bei der indirekten Methode nicht enzymgekoppelt sondern unmarkiert. Während das Enzym bei der direkten Methode nach der Inkubation mit einem entsprechenden Substrat zu einer Farbreaktion führt (Enzym-Substratkomplex Abb. 4), erfolgt die Farbreaktion bei der indirekten Immunhistologie erst nach Zugabe eines enzymgekoppelten Sekundärantikörpers (Abb. 4). Durch die Bindung von mehreren Sekundärantikörpern an den antigenspezifischen Primärantikörper kommt es zu einer höheren Konzentration von Enzym als bei der direkten Methode und damit zu 51 Material und Methoden ________________________________________________________________________________ einer Amplifikation des Farbsignals. Bei der LSAB-Methode wird zusätzlich die hohe Affinität zwischen dem synthetischen Molekül Streptavidin und Biotin ausgenutzt, um eine zweite Amplifikation des Signals zu erreichen. Dafür wird das Streptavidin mit mehreren Enzymen kovalent gekoppelt. Der Sekundärantikörper ist statt nur mit dem Enzym mit mehreren Biotinmolekülen konjugiert. So können am Antikörper zahlreiche Streptavidinmoleküle und damit überproportional viel Enzym binden (Abb. 5). AEC Meerrettichperoxidase Streptavidin Biotin Sekundärantikörper Abb. 5 Schematische Darstellung der Vorgänge bei der markierten Streptavidin- BiotinImmunhistologie. Das Meerrettichperoxidase gekoppelte Streptavidin bindet an Biotin. Die Meerrettichperoxidase führt dann mit einem Substrat (AEC) zur Farbreaktion. Abkürzungen: AEC = 3-Amino-9-Ethylcarbazol Abhängig von der Spezies, aus der das zu untersuchende Gewebe stammt, der Fixierung der Proben, sowie der Lage des zu untersuchenden Epitops wird die Verwendung unterschiedlicher Protokolle nötig. Auch bei den im Folgenden verwendeten Antikörpern musste dieser Tatsache Rechnung getragen werden. 52 Material und Methoden ________________________________________________________________________________ 2.9.2 Verwendete Antikörper Die verwendeten Antikörper sind in Tab. 5 und Tab. 6 aufgeführt. Die untersuchten Epitope befinden sich an verschiedenen Stellen in der Zelle. CD4, CD8, und CD25 sind Oberflächenepitope. IgA ist ein Immunglobulin, das sowohl intrazellulär in Vesikeln als auch extrazellulär auf der Zellmembran und im Extrazellularraum vorkommt. Tab. 5 Primärantikörper Antigen Klon CD4 74-12-4 Donor/Isotyp Verdünnung Maus 1:50 Art Diluent Hersteller mAk Monet Blue VMRD, IgG2b CD8 MIL-12 Maus Pullman, USA 1:100 mAk IgG2a CD25 231.3B2 Maus 1:20 mAk IgG1 IgA K61 1B4 Maus 1:10 mAk IgG1 - DD7 Maus 1:20 - IgG1 - DD1645 Maus 1: 100 - IgG2a - DD311 Maus IgG2b 1:10 - Van Gogh Serotec, Yellow Oxford, UK Antikörper Serotec, Diluent Oxford, UK Antikörper Serotec, Diluent Oxford, UK Antikörper Chemicon, Diluent Hempshire, UK Van Gogh Chemicon, Yellow Hempshire, UK Monet Blue Chemicon, Hempshire, UK Abkürzungen: CD = Cluster of Differentiation, Ig = Immunglobulin, mAk = monoklonaler Antikörper, 53 Material und Methoden ________________________________________________________________________________ Tab.6 Sekundärantikörper Antigen Klon Donor Verdünnung Art Diluent Hersteller Anti Maus - Ziege 1:50 pAk Antikörper SouthernBiotech, Diluent Birmingham, USA Antikörper SouthernBiotech, Diluent Birmingham, USA Antikörper SouthernBiotech, Diluent Birmingham, USA IgG1 Anti Maus - Ziege 1:50 pAk IgG2a Anti Maus - Ziege 1:50 pAk IgG2b Abkürzungen: CD = Cluster of Differentiation, Ig = Immunglobulin, pAk = polyklonaler Antikörper, Die Antikörper gegen IgA und CD25 können auf Paraformaldehyd-fixierten Gewebeschnitten angewendet werden. Neben der Lage des nachzuweisenden Epitops ist auch die Gewebegängigkeit des verwendeten Antikörpers von großer Bedeutung. Die Antikörper gegen CD4 und CD8 konnten nur auf Schnitten aus unbehandelten Gefrierproben verwendet werden. Sämtliche Inkubationsschritte wurden in einer Klimakammer ausgeführt, um ein Austrocknen der Schnitte zu verhindern. Alle Inkubationsschritte, bei denen keine näheren Angaben zur Temperatur gemacht worden sind, wurden bei Raumtemperatur (RT) vorgenommen. Die Waschschritte erfolgten in Glasküvetten mit einem Flüssigkeitsvolumen von 80 ml. Das zur enzymatischen Entwicklung verwendete 3-Amino-9-ethylcarbazol (AEC) wurde kurz vor Gebrauch aus einem kommerziellen Kit (Zymed, Deutschland) frisch angesetzt, da es nur für etwa 20 Minuten stabil war. Die Farbentwicklung erfolgte in allen Fällen unter Sichtkontrolle am Mikroskop. TBS wurde mit 350 µl Tween/1000 ml verwendet, um die Benetzungseigenschaften der Lösung zu verbessern. 2.9.2.1 Darstellung von CD4 Oberflächenantigen Die aus TissueTec® Gefrierproben angefertigten Gewebeschnitte wurden mit einem wasserabweisenden DakoPen® (Dako, Deutschland) umrandet, um einem Austrocknen vorzubeugen. Anschließend wurden die Schnitte für 90 Sekunden in einem Gemisch aus Methanol und eiskaltem Aceton (Verhältnis 1:1) bei 4°C fixiert, um eine bessere Haftung während der Immunhistologie zu gewährleisten. Nach der Fixierung wurden die Objektträger mit TBS/Tween gespült und zweimal fünf Minuten in TBS/Tween gewaschen. Im Anschluss folgte die Inkubation 54 Material und Methoden ________________________________________________________________________________ mit 30 µl des Primärantikörpers über Nacht bei 4°C. Am nächsten Tag wurden die Schnitte vorsichtig gewaschen und für fünf Minuten in TBS/Tween gestellt. Danach wurden 30 µl Sekundärantikörper aufgebracht und die Schnitte damit für 30 Minuten inkubiert. Nach dem Sekundärantikörper folgte ein Waschschritt mit TBS/Tween. Dann wurden die Schnitte mit 30 µl eines Streptavidin-Biotin-Komplexes für 20 Minuten bedeckt und wiederum mit TBS/Tween gewaschen. Die Sichtbarmachung des Signals erfolgte mit 30 µl AEC für zwei bis sechs Minuten. Die Reaktion wurde anschließend fünf Minuten lang in Aqua dest. gestoppt. 2.9.2.2 Darstellung von CD8 Oberflächenantigen Die Gewebeschnitte für die Darstellung des CD8 Epitops wurden genauso fixiert wie oben beschrieben. Sie wurde vor der Inkubation mit dem Primärantikörper für zehn Minuten mit 30 µl eines 5%igem Schweinenormalserums in TBS geblockt, um unspezifische Bindungen des Primärantikörpers zu verhindern. Das Serum wurde vorsichtig abgeklopft und 30 µl des Antikörpers in einer Verdünnung von 1:100 in van Gogh Revival Series aufgetragen und über Nacht bei 4°C auf dem Objektträger belassen. Am nächsten Tag wurden die Objektträger mit TBS/Tween gewaschen, erneut dieses Mal für 30 Minuten mit 5%igem Schweinenormalserum geblockt, abgeklopft und dann mit einem biotinylierten, isotypspezifischen α-Maus IgG2a Sekundärantikörper für 30 Minuten inkubiert. Nach einem weiteren Waschschritt wurde für 20 Minuten 30 µl des Streptavidin-Meerrettichperoxidase Komplexes (Streptavidin-HRP-Komplex) aufgetragen. Es folgte ein weiterer Waschschritt, dem sich die Farbreaktion von sechs bis sieben Minuten mit 30 µl AEC anschloss. Gestoppt wurde die Reaktion durch eine fünfminütige Inkubation der Objektträger in Aqua dest.. Da weder bei diesem Epitop noch bei dem Nachweis von CD4 unspezifische Färbungen von Zellen im Isotyp zu erkennen waren, und diese auch nach mehrmaliger Wiederholung nicht nachgewiesen wurden, konnten auf die sonst bei der Verwendung eines horseradish peroxidase (HRP)-gestützten, enzymatischen Systems übliche Blockierung endogener Peroxidasen mit H2O2 verzichtet werden, zumal die Verwendung von Wasserstoffperoxid die Darstellung der Epitope erheblich erschwerte oder sogar gänzlich verhinderte. 55 Material und Methoden ________________________________________________________________________________ 2.9.2.3 Darstellung von CD25-Oberflächenantigen und intrazellulärem IgA Für den Nachweis von IgA und CD25 wurden paraformaldehydfixierte Paraffinschnitte verwendet. Sie mussten zunächst entparafffiniert werden. Um die durch Paraformaldehyd hervorgerufene Vernetzung von Proteinen (Maskierung) rückgängig zu machen, wurden die Objektträger in Target Retrieval Puffer® (Dako, Deutschland) für 45 Minuten bei 95°C im Wasserbad inkubiert. Sie wurden dann langsam im Wasserbad auf 80°C abgekühlt und anschließend außerhalb des Wasserbades auf Raumtemperatur gebracht. Nach zweimal fünfminütigem Waschen in TBS/Tween wurden unspezifische Antikörperbindungen für 30 Minuten mit TBS + 5% Schweinenormalserum (TBS/5% SNS) geblockt. Die Schnitte wurden abgeklopft und mit 30 µl eines der beiden Primärantikörper über Nacht bei 4°C inkubiert. Am folgenden Tag wurde der Antikörper abgespült und nach Waschen in TBS/Tween erneut mit 30 µl TBS/5% SNS inkubiert, abgeklopft und 30 µl Sekundärantikörper aufpipettiert. Dieser wurde für 30 Minuten auf den Schnitten belassen und danach mit TBS/Tween gewaschen. Damit keine Entwicklung des Farbsubstrats durch die im Darm ubiquitär vorkommende endogene Peroxidase erfolgen konnte, wurde sie in Methanol mit 1,2% H2O2 in 30 Minuten geblockt. Nach zweimaligem gründlichen Waschen mit TBS/Tween für jeweils fünf Minuten wurden die Objektträger für 20 Minuten mit 30 µl Streptavidin-HRP-Komplex inkubiert und nach erneutem Waschen mit TBS/Tween für 15 Minuten mit AEC entwickelt. Das Stoppen der Farbreaktion erfolgte mit Aqua dest.. 2.9.2.4 Gegenfärbung mit Hämalaun Um eine bessere Differenzierung und Auswertung der Schnitte zu ermöglichen, erfolgte bei allen Antikörpern unabhängig von den jeweiligen Protokollen eine Gegenfärbung mit Hämalaun für 15 Sekunden. Das Gewebe wurde danach in Leitungswasser fünf Minuten gebläut und nach einer weiteren fünfminütigen Inkubation in Aqua dest. eingedeckt. Als Eindeckmedium wurde Faramount® (Dako, Deutschland) verwendet. 2.9.3 Auswertung Die Beurteilung der Gewebeschnitte wurde an verblindeten Objektträgern von immer demselben Untersucher durchgeführt. Auswertung und Darstellung erfolgten mit einem Lichtmikroskop 56 Material und Methoden ________________________________________________________________________________ (Labophot-2, Nikon, Japan) und einer angeschlossenen Digitalkamera (Coolpix 5000, Nikon, Japan) und einem digitalen Zähler (Assistent® Counter AC-8, Karl Hecht GmbH &Co. KG, Sondheim). Die zu untersuchenden Zellen wurden gegen Restzellen gezählt, dabei wurde jede Zelle, die keine typischen Merkmale der zu untersuchenden Population aufwies, als Restzelle gewertet. Die Hämalaun-Eosin-gefärbten Schnitte wurden zunächst in 200facher und 400facher Vergrößerung unter dem Mikroskop allgemein beurteilt. Es wurde in Schnittbereichen gezählt, in denen die mikroskopische Struktur des Darms klar zu erkennen war. Im Dünndarm mussten Krypten und Zotten eindeutig zu differenzieren sein. Im Dickdarm war das Vorhandensein durchgängiger Lumina der Krypten bis zur Grenze zwischen Submukosa und Mukosa ausschlaggebend für die Verwendbarkeit des Schnittes. Das Oberflächenepithel sollte sich in beiden Darmabschnitten weitest gehend einschichtig darstellen. Es wurden immer mindestens 1000 Gesamtzellen (Zielzellen + Restzellen) gezählt. Einige Zellen wie z.B. die neutrophilen Granulozyten kamen in bestimmten Darmabschnitten nur in sehr kleiner Zahl vor. War dies der Fall, wurde über die Gesamtzellzahl von 1000 Zellen hinaus solange weitergezählt, bis mindestens 30 positive Zellen gezählt waren. Als positiv wurden nur Zellen gewertet, bei denen die Zellmorphologie eindeutig erhalten war. Zellkern und Zytoplasmamembran mussten deutlich erkennbar und optisch intakt sein. Bei den hier verwendeten immunhistologischen Färbungen stellten sich die positiven Zellen rot dar. Als positiv wurden bei Oberflächenfärbungen (CD4, CD8 und CD25 Zellen) gewertet, bei denen mindestens die Hälfte bis zu zwei Drittel der Oberfläche angefärbt war. Bei intrazellulären Färbungen (IgA) war die Zelle positiv, wenn das Zytoplasma deutlich rot gefärbt war und den Zellkern zu 2/3 umschloss. Granulozyten, Mastzellen, CD4+ und IgA+ Zellen wurden mangels Vorkommen im Epithel nur in der Lamina propria gezählt. CD25 wurde ebenfalls nur in der Lamina propria gezählt, da sie im Epithel nur sehr vereinzelt zu finden waren. Beginnend an der Grenze zwischen Submukosa und Mukosa wurden die Zellen der Lamina propria in einem Gesichtsfeld bei 1000facher Vergrößerung (10fache Vergrößerung durch das Okular + 100fache Vergrößerung durch ein Ölimmersions-Objektiv) gezählt. Im Anschluss wurde das Gesichtsfeld um genau eine Breite nach luminal verschoben usw. bis zum luminalen Abschluss der Mukosa. Dann erfolgte eine Verschiebung um ein Gesichtsfeld nach rechts, um in gleicher Weise in serosaler Richtung auszuwerten. Auch nach Erreichen der zu zählenden Zellzahl (1000 Zellen oder 57 Material und Methoden ________________________________________________________________________________ mindestens 30 positive Zellen) wurde die Zählung bis zum nächsten luminalen bzw. serosalen Gesichtsfeld fortgesetzt. CD8+ Zellen wurden gesondert in Lamina Propria und Epithel ausgewertet, wobei zusätzlich jeweils zwischen basalem und apikalem Bereich der Mukosa unterschieden wurde. Als intraepithelial galten Zellen, die mit mindestens 2/3 ihrer Zelloberfläche an Epithelzellen grenzten. Der apikale Bereich umfasste im Dünndarm die Zotten von der Zottenspitze bis zur Basis (Übergang zu den Krypten). Beim basalen Bereich handelte es sich um den Abschnitt vom Beginn der Krypten bis zur Submukosa. Im Dickdarm erschwerte das Fehlen von Zotten eine reproduzierbare Differenzierung zwischen apikal und basal. Per definitionem wurde das erste luminale mikroskopische Gesichtsfeld, das den Sichtbereich bei 1000facher Vergrößerung komplett ausfüllte, als apikal gewertet. Das erste serosale Blickfeld an der Grenze zur Submukosa bei 1000facher Vergrößerung wurde als basal definiert. Die Gesichtsfelder haben sich nicht überschnitten. Die angefertigten Fotos wurden mit der Adobe® Photoshop® 7 Software bearbeitet. 2.10 RNA-Isolierung, reverse Transkription und Polymerase Kettenreaktion Es werden verschiedene Formen der PCR unterschieden. Für die nachfolgend beschriebenen Untersuchungen wurde die reverse Transkriptase-PCR (RT–PCR) verwendet. Dabei wurde aus Versuchsproben Gesamt-RNA isoliert und mit Hilfe einer Reversen Transkriptase cDNA generiert, die dann in der PCR als Template Verwendung fand. 2.10.1 RNA-Isolierung und reverse Transkription Für die Bearbeitung von Proben zur RNA-Gewinnung wurden ausschließlich RNAse-freie Materialien verwendet. Für sämtliche Inkubationsschritte und Amplifikationen stand ein Peltier Thermal Cycler (PTC, MJ Research, Watertown, USA) zur Verfügung. Vor der Isolierung der Gesamt-RNA wurde das in RNA-Later gelagerte Gewebe in ein steriles 5 ml Reaktionsröhrchen mit 1 ml RLT-Puffer (siehe Anhang II) überführt und mit einem Homogenisator (Ultra Turrax, IKA® Werke, Staufen) 15-20 Sekunden auf höchster Stufe homogenisiert, dabei erfolgte eine Zerstörung der Gewebezellen, so dass eine Suspension aus Zellwand- und Zellplasmabestandteilen vorlag. Um Zelltrümmer zu entfernen, wurde das Homogenisat in ein 1,5 58 Material und Methoden ________________________________________________________________________________ ml Reaktionsröhrchen pipettiert und bei 15400 g in einer Ultrazentrifuge (Centrifuge 5451c, Eppendorf) für fünf Minuten zentrifugiert. Danach wurde der Überstand zu je 350 µl Aliquots in Reaktionsgefäße pipettiert und bis zur weiteren Bearbeitung bei –80°C eingefroren. Aus 350 µl der Überstände wurde die RNA mit einem RNA-Isolationskit (RNeasy® Kit, Qiagen, Hilden) isoliert. Dabei wurde nach Angaben des Herstellers zur Isolierung von Gesamt-RNA aus tierischen Zellen verfahren. Eine Kontrolle der RNA-Qualität erfolgte mit Hilfe einer Gel-Elektrophorese in einem Agarosegel (1%) mit 500 ng/ml Ethidiumbromid in einer Elektrophoresekammer ( Power Pac 3000, BioRad, USA) bei 120 mV für 45 Minuten. Anschließend wurde die RNA durch reverse Transkription (RT) in cDNA umgeschrieben. Um möglichst identische Mengen an RNA umschreiben zu können, wurde der Gehalt in den Isolaten photometrisch bestimmt (Lamda Scan 200e, MWG AG Biotech, Ebersberg). Die reverse Transkription erfolgte anschließend mit ein µg Gesamt-RNA. Vor der Transkription musste zunächst die genomische DNA bei 37°C für 15 Minuten verdaut werden. Dafür wurden dem RNAIsolat 1U RNAse-freie DNAse und 5 µl 5fach First Strand Puffer zugesetzt, dann wurde das Reaktionsvolumen mit RNAse-freiem H2O auf 25 µl aufgefüllt. Danach wurde mit 2,5 µl EDTA (25 mM) die RNA bei 70°C zehn Minuten lang denaturiert, und die Proben anschließend auf Eis gestellt. Unter Zugabe von 200 U Superskript® III Reverse Transkriptase, 2,5 µl Oligo dT Primer (20 pmol/ µl), 4 µl dNTP Mix (2,5 mM), 5 µl DTT (100 mM), 5 µl 5fach First Strand Puffer und sowie Ergänzung des Volumens auf 50 µl mit RNAse-freiem H2O wurde für eine Stunde bei 49°C cDNA synthetisiert und anschließend sofort für die PCR eingesetzt oder bis zur späteren Verwendung bei -20°C gelagert. 2.10.2 PCR Mit der PCR konnte unter Verwendung einer thermostabilen DNA-Polymerase, zweier Oligonukleotid-Primer (Primer), Desoxynukleotiden und einer geringen Menge an DNA-Vorlage (Template) spezifisch ein DNA-Fragmente amplifizieren werden. Die Probe wurde dabei einem Ablauf von Denaturierungs-, Anlagerungs- (Annealing) und Verlängerungsschritten (Elongation) unterzogen. Das Ablaufen dieser drei Schritte nacheinander wird als „Cycle“ (Zyklus) bezeichnet. 59 Material und Methoden ________________________________________________________________________________ 2.10.3 Verwendete Primer und PCR-Protokolle Tab. 7 verwendete Primer Primer GAPDH INF-γ TNF-α TGF-β IL-4 IL-10 Prepro-Defensin β1 PR-39 Protegrine NK-Lysin Lage Nukleotidsequenz Sense 5’ ACC ACA GTC CAT GCC ATC AC 3’ Antisense 5’ TCC ACC ACC CTG TTG CTG TA 3’ Sense 5´ GCA AGT ACC TCA GAT GTA CC 3´ Antisense 5´ TGG CCT TGG AAC ATA GTC TG 3´ Sense 5´ ACT GCA CTT CGA GGT TAT CG 3´ Antisense 5´ AGA GGA CCT GGG AGT AGA TG 3´ Sense 5´ CAG AGA GGC TAT AGA GG G TT 3´ Antisense 5´ TGT CTA GGC TCC AGA TGT AG 3´ Sense 5´ GTG CGA CAT CAC CTT ACA AG 3´ Antisense 5´ TGG CTT CAT GCA CAG AAC AG 3´ Sense 5´ TTG CCA AGC CTT GTC AGA GA 3´ Antisense 5´ TCA CCC ATG GCT TTG TAG AC 3´ Sense 5´ CCT CCT TGT ATT CCT CCT CA 3´ Antisense 5´ TTG CAG CAT TTG ACT TGG GG 3´ Sense 5´ ACC CAT CCA TTC ACT CAC 3´ Antisense 5´ AGC CAC AAC AAT AAG ATC C 3´ Sense 5´ TGG ATC AGA TCA AGG ACC 3´ Antisense 5´ ACA CAG ACG CAG AAC CTA C 3´ Sense 5´ GAG CAG TTC TGC CAG AAC CT 3´ Antisense 5´ GCA GGA GTT AGG TGA GAG AA 3´ Fragmentgröße 452 bp 359 bp 266 bp 371 bp 254 bp 243 bp 168 bp 262 bp 100 bp 479 bp Abkürzungen: bp = Basenpaare, GAPDH = Glyceraldehyd-3-Phosphat-Dehydrogenase, IL = Interleukin, INF = Interferon, TGF = Tumorwachstumsfaktor (tumor growth factor), TNF = Tumornekrosefactor Im Einzelnen wurden für die PCR 1,5 µl des RT-Produktes eingesetzt. Zusammen mit 2,4 µl 10 x PCR Puffer, 1µl dNTP (2,5 mM), 0,5 µl Magnesiumchlorid (MgCl) (50 mM), 0,75 U Platinum Taq-Polymerase, 5 pmol Sense-Primer und 5 pmol Antisense-Primer (Tab. 7) wurde das Reaktionsvolumen mit H2O zuletzt auf 25 µl aufgefüllt. Die Amplifikation erfolgte im 60 Material und Methoden ________________________________________________________________________________ Thermalcycler mit einer initialen Denaturierung und Aktivierung der Polymerase für fünf Minuten bei 94°C. Je nach dem zu amplifizierenden Fragment wurden verschiedene Annealingtemperaturen und eine unterschiedliche Anzahl Cycle benötigt (Tab. 8). Tab. 8 verwendete Protokolle und Temperaturen bei verschiedenen Primern Primer Denaturierung Annealing Elongation Cycle-Zahl °C s °C s °C s GAPDH 94 30 56 45 72 35 28 INF-γ 94 30 58 45 72 35 34 TNF-α 94 30 58 45 72 35 35 TGF-β 94 30 58 45 72 35 32 IL-4 94 30 56 45 72 35 28 IL-10 94 30 58 45 72 35 40 94 30 58 45 72 35 39 PR-39 94 30 55 45 72 35 42 Protegrine 94 30 55 45 72 35 42 NK-Lysin 94 30 55 45 72 35 36 PreproDefensin β1 Zum Abschluss jeder PCR erfolgte eine abschließende Elongation bei 72°C für zwei Minuten. Zu den 25 µl PCR-Produkten wurden 5 µl eines DNA-Laufpuffers gegeben, und 11 µl davon in einem Agarosegel (1%) mit 500 ng/ml Ethidiumbromid elektrophoretisch aufgetrennt und im ultravioletten Licht fotografiert (Gel Doc 1000, BioRad, USA). Als Standard diente 11µl einer 100 bp DNA-Ladder Lösung. Die Fotos wurden mittels Molecular Analyst® Software digitalisiert. Die PCR erfolgte semiquantitativ. Für jeden verwendeten Primer wurde zunächst die Cycle-Zahl bestimmt, bei der Unterschiede in der Bandenintensität gerade erkennbar waren. Dazu wurden während der PCR nach dem Ablaufen unterschiedlich vieler Cycle Proben entnommen und so die Cycle-Zahl bestimmt, bei der eine Bande gerade erkennbar war. Als Vergleich für den gesamten mRNA-Gehalt der Probe diente die mRNA-Expression von GAPDH („housekeeping gene“). 61 Material und Methoden ________________________________________________________________________________ Um eine Kontamination auszuschließen, wurde bei jeder PCR eine Probe mit allen Reagenzien ohne RT Produkt als Negativkontrolle mitgeführt. Transmurale Gewebeproben aus dem Dünndarm von drei Wochen alten Ferkeln dienten bei den antimikrobiellen Peptiden PR-39 und den Protegrinen als Positivkontrolle. Es wurden jeweils vier bzw. fünf Tiere einer Gruppe untersucht, und die PCR für die verschiedenen Gene wurden im Duplikat durchgeführt. 2.10.4 Auswertung Die Auswertung der PCR-Ergebnisse erfolgte semiquantitativ vergleichend. Die Banden der PCRProben wurden mit dem mRNA-Gehalt von GAPDH der gleichen Proben abgeglichen und danach die Ergebnisse der unterschiedlichen Versuchsgruppen einander gegenübergestellt. 2.11 Statistik In den Graphen des Ergebnisteils stellen die Balken, wenn nicht anders angegeben, die Mittelwerte der entsprechenden Gruppen dar. Bei den angegebenen Mittelwerten handelt es sich um arithmetische Mittel. Zusätzlich ist im Text in Klammern die Standardabweichung (SD) angegeben (Mittelwerte und Standarbweichungen sind im Anhang III tabellarisch aufgeführt.) Der Unterschied der Zellanzahl zwischen den Darmabschnitten wurde mittels t-Test, die Unterschiede zwischen den Versuchsgruppen mit einfaktorieller Varianzanalyse statistisch überprüft. Die Berechnungen erfolgten mit SAS® System 8e. Ab einer Irrtumswahrscheinlichkeit von kleiner 5% (p<0,05) wurde ein Ergebnis als signifikant bezeichnet. Die Signifikanzniveaus wurden wie folgt festgelegt: n.s. = nicht signifikant; * = p ≤ 0,05; ** = P ≤ 0,01; *** = p ≤ 0,001. 62 Ergebnisse ________________________________________________________________________________ 3 Ergebnisse Die Wirkung von EcN als Probiotikum wird nicht nur auf die Verdrängung anderer Bakterien der Darmflora zurückgeführt, sondern auch auf die Beeinflussung des darmassoziierten Immunsystems. Deswegen wurden die Auswirkungen von EcN auf die Anzahl und Verteilung von Immunzellen im Darm untersucht, und die mRNA-Expression verschiedener Entzündungsmediatoren bestimmt. 3.1 Versuch mit konventionell gehaltenen Schweinen mit und ohne EcN Um den Einfluss von EcN auf das GALT des Schweins zu bestimmen, wurden 15 Läuferschweine untersucht, von denen jeweils fünf Tiere für drei Wochen 109 KBE EcN, 1011 KBE EcN oder Placebo erhalten hatten (4.2.1). Die Gewichtszunahme der Tiere unter EcN-Fütterung wurde dokumentiert. Aus dem Duodenum, Jejunum, Ileum und Kolon wurden transmurale Gewebeproben mit Hämalaun-Eosin-Färbung, Toluidinfärbung und LSAB-Immunhistologie untersucht. Die Mittelwerte sowie die Standardabweichung für alle untersuchten Zellpopulationen sind tabellarisch im Anhang III zusammengefasst. Die mRNA-Expression verschiedener Zytokine im Darm wurde mittels semiquantitativer PCR untersucht. Die Ergebnisse sind im Folgenden dargestellt: 3.1.1 Gewicht Um Veränderungen im Verlauf der Gewichtsentwicklung festzustellen, wurden die Versuchstiere einmal pro Woche sowie zu Versuchsbeginn und vor der Schlachtung gewogen. Die Gewichtsveränderung war individuell unterschiedlich. Die Fütterung von EcN hatte keinen Einfluss auf die Gewichtszunahme (Tab. 12 Anhang III). 3.1.2 Mikrobiologische Untersuchung Um sicherzustellen, dass EcN im Darm der Versuchstiere vorhanden war, und die Kontrolltiere frei 63 Ergebnisse ________________________________________________________________________________ von EcN waren, wurden Kotproben der Tiere auf das Vorhandensein des Keims untersucht. Die Untersuchung erfolgte bei der Firma Ardeypharm mittels Multiplex-PCR. Die Kontrolltiere waren frei von EcN. Im Unterschied dazu ließ sich bei allen EcN gefütterten Versuchstieren EcN im Kot nachweisen. Bei den Tieren der Dosisgruppe 1011 KBE EcN war der Kot zu jedem Probenzeitpunkt EcN-positiv. Bei zwei Tieren (S2-10, S2-11) der Dosisgruppe 109 KBE EcN wurde EcN am Tag der Schlachtung nur schwach oder gar nicht mehr nachgewiesen. Bei dem Tier (S2-11), das am Schlachttag kein EcN mehr im Kot hatte, waren auch am 14. Versuchstag nur sehr geringe Mengen an EcN nachweisbar (Tab. 9). Tab. 9 EcN im Kot bei konventionell gehaltenen Schweinen mit und ohne EcN-Fütterung Gruppe Tier 7. Versuchstag 14. Versuchstag Schlachtung Kontrolle S2-3 S2-4 S2-8 S2-12 S2-13 - - - 109 KBE EcN S2-1 S2-2 S2-9 S2-10 S2-11 + + + + + + + + + (+) + + + (+) - 1011 KBE EcN S2-5 S2-6 S2-7 S2-14 S2-15 + + + + + + + + + + + + fehlt + + Abkürzungen: EcN = E. coli Nissle 1917, KBE = koloniebildende Einheit, + = EcN deutlich im Duplikat nachgewiesen, (+) = EcN nachgewiesen, eventuell erst bei Wiederholung der PCR nachgewiesen, - = EcN nicht nachgewiesen 3.1.3 Histologische Untersuchung Der Hypothese folgend, dass EcN Auswirkungen auf die Zahl an Immunzellen haben könnte, wurden zunächst Zellen der unspezifischen Abwehr in der Darmmukosa untersucht. Im Blickpunkt standen insbesondere Granulozyten und Mastzellen, die in Gewebeproben histologisch untersucht wurden. In den Hämalaun-Eosin-gefärbten Schnitten wurde die Anzahl von eosinophilen, neutrophilen und 64 Ergebnisse ________________________________________________________________________________ basophilen Granulozyten und mit Toluidinblaufärbung die Anzahl an Mastzellen bestimmt. 3.1.3.1 Eosinophile Granulozyten Eosinophile Granulozyten waren anhand der leuchtend rosarot gefärbten Granula im Zytoplasma deutlich zu erkennen. Das Zytoplasma färbte sich schwach rosa. Der Zellkern stellte sich violett dar. Bei porcinen eosinophilen Granulozyten heben sich die Granula im Vergleich zu anderen Tieren und dem Menschen durch eine besonders intensive Färbung vom Zytoplasma ab (Abb. 6). Abb. 6 Eosinophile Granulozyten in der Lamina propria des Ileums (schwarzer Pfeil) eines Tieres aus der 1011 KBE EcN Gruppe Hämalaun-Eosin-Färbung, 1000fach vergrößert, Messbalken = 10 µm. Bei allen untersuchten Tieren wurden eosinophile Granulozyten nur in der Lamina propria der Mukosa gefunden. Im Epithel waren sie nicht nachzuweisen. 65 Ergebnisse ________________________________________________________________________________ Eosinophile Granulozyten/ Gesamtzellen LP in % 20 n.s. n.s. 10 0 Kontrollgruppe Duodenum Jejunum Colon ascendens Colon descendens Ileum Abb. 7 Verteilung eosinophiler Granulozyten in der Lamina propria verschiedener Darmabschnitte bei gesunden Läuferschweinen der Kontrollgruppe (n=5), n.s. = nicht signifikant Zwischen allen nicht mit n.s. bezeichneten Darmabschnitten ist die Anzahl eosinophiler Granulozyten signifikant verschieden. In Abb. 7 ist beispielhaft das Verteilungsmuster eosinophiler Granulozyten entlang der Darmachse bei Tieren der Kontrollgruppe dargestellt. Dieses Muster bestätigte sich auch bei den EcN gefütterten Tieren. Die Anzahl an eosinophilen Granulozyten nahm vom Duodenum bis zum Ileum deutlich zu. Im Duodenum fand sich im Vergleich zu den anderen Dünndarmabschnitten eine geringere Zahl von Eosinophilen (p<0,05). Zwischen Ileum und Jejunum war kein Unterschied erkennbar. In allen drei Dünndarmabschnitte ließ sich eine signifikant (p<0,05 und p<0,005) höhere Zahl an eosinophilen Granulozyten als im Kolon beobachten (Abb. 7). Die meisten befanden sich bei allen drei Versuchsgruppen im Ileum. Sie machten zwischen 11% und 13,7% (11% ± 2,2% Kontrolle, 13,7% ± 0,5% 109 KBE EcN und 11,3% ± 8,3% 1011 KBE EcN) der gesamten Zellzahl in der LP aus. Im Kolon hingegen kamen eosinophile Granulozyten beim Schwein nur in verschwindend geringen Mengen (0,6% ± 0,3% Kontrolle, 0,2% ± 0,2% 109 KBE EcN und 0,2% ± 0,2% 1011 KBE EcN) vor ( Tab. 13, Anhang III). 66 Ergebnisse ________________________________________________________________________________ Eosinophile Granulozyten/ Gesamtzellen LP in % 20 Kontrolle 109 KBE 1011 KBE 10 0 Duodenum Abb. 8 Verteilung eosinophiler Jejunum Granulozyten Ileum in Colon ascendens der Lamina Colon descendens propria 9 gesunder 9 Läuferschweine der Kontrollgruppe, nach Fütterung mit 10 KBE EcN/d (10 KBE) oder mit 1011 KBE EcN/d (1011 KBE) (n=5) Die Tiere der Kontrollgruppe und der beiden EcN gefütterten Gruppen unterschieden sich hinsichtlich des Anteils eosinophiler Granulozyten in der Darmmukosa nicht. Die Gruppenzugehörigkeit hatte keinen Einfluss auf die Verteilung entlang der Darmachse (Abb. 8). 3.1.3.2 Neutrophile Granulozyten Neutrophile Granulozyten waren in der Hämalaun–Eosin-Färbung an ihrem tief violetten, gelappten Kern zu erkennen. Das Zytoplasma war zart rosa ohne deutliche Granula (Abb. 9). Diese Zellen wurden genau wie eosinophile Granulozyten ausschließlich in der Lamina propria der Mukosa gefunden. 67 Ergebnisse ________________________________________________________________________________ Abb. 9 Neutrophile Granulozyten in der Lamina propria des Ileums (schwarzer Pfeil) eines Tieres aus der 1011 KBE EcN Gruppe Hämalaun-Eosin-Färbung, 1000fach vergrößert, Messbalken = 10 µm. Neutrophile Granulozyten/ Gesamtzellen LP in % 20 * * * 10 0 Kontrollgruppe Duodenum Jejunum Colon ascendens Colon descendens Ileum Abb. 10 Verteilung neutrophiler Granulozyten in der Lamina propria verschiedener Darmabschnitte bei gesunden Läuferschweinen der Kontrollgruppe (n=5) 68 Ergebnisse ________________________________________________________________________________ Zur Veranschaulichung der Verteilung der neutrophilen Granulozyten in den einzelnen Darmabschnitten dienten die Werte für die Kontrollgruppe. Die Anzahl an neutrophilen Granulozyten in der Lamina propria der Kontrollgruppe war insgesamt gering (zwischen 0,4% ± 0,2% im Jejunum und 3,7% ± 1,4% im Duodenum und Colon ascendens), wobei die Zahlen im Jejunum am geringsten waren (Abb. 10). Neutrophile Granulozyten/ Gesamtzellen LP in % 20 Kontrolle 109 KBE 1011 KBE 10 0 Duodenum Jejunum Ileum Colon ascendens Colon descendens Abb. 11 Verteilung neutrophiler Granulozyten in der Lamina propria gesunder Läuferschweine der Kontrollgruppe, nach Fütterung mit 109 KBE EcN/d (109 KBE) oder mit 1011 KBE EcN/d (1011 KBE) (n=5) Durch die Fütterung von EcN ergaben sich keine Unterschiede bei der Anzahl neutrophiler Granulozyten in den untersuchten Darmabschnitten. Auch die Verteilung entlang der Darmachse war durch die EcN Fütterung nicht beeinflusst (Abb. 11). 3.1.3.3 Basophile Granulozyten Basophile Granulozyten hätten mit Hämalaun-Eosin violette Granula in hellrosa Zytoplasma und einem dunklen gelappten Kern. Im Darm wurden sie bei keinem der untersuchten Tiere gefunden. 69 Ergebnisse ________________________________________________________________________________ 3.1.3.4 Mastzellen Durch metachromatische Eigenschaften des Zytoplasmas färbten sich Mastzellen nach Fixierung mit Carnoy-Lösung durch Toluidinblau violett. Der Zellkern war oval von tief violetter bis schwarzer Farbe und das Zytoplasma dunkelviolett. Mastzellen kamen im porcinen Darmgewebe in der Lamina propria der Mukosa, der Submukosa und in den bindegewebigen Septen zwischen der Längs- und Zirkulärmuskelschicht der Muskularis vor. Im Epithel wurden keine Mastzellen gefunden. Die Mastzellen der Lamina propria hatten eine dendritische Morphologie, mit langgestreckten Zellkörpern und fingerförmigen Zytoplasmafortsätzen (Abb. 12). Sie waren gleichmäßig in der Lamina propria verteilt. Die Fütterung von EcN veränderte diese Morphologie nicht. Die Mastzellen der Submukosa waren stärker abgerundet als die in der Mukosa und befanden sich häufig in der Nähe von Blutgefäßen (Abb. 13). Im Duodenum kamen sie auch im Bindegewebe zwischen den Lieberkühn`schen Drüsen vor. Im Kolon nahm die Anzahl an submukosalen Mastzellen deutlich ab (nicht gezeigt). Abb. 12 Mastzellen in der Lamina propria des Kolons (schwarzer Pfeil) eines Tieres der Kontrollgruppe Toluidinblau-Färbung, 1000fach vergrößert, Messbalken = 10 µm. 70 Ergebnisse ________________________________________________________________________________ BG Abb. 13 Mastzellen in der Submukosa des Jejunums (schwarzer Pfeil) eines Tieres aus der 1011 KBE EcN Gruppe, BG = Blutgefäßes Toluidinblau-Färbung, 1000fach vergrößert, Messbalken = 10 µm. Mastzellen/ Gesammtzellen LP in % 20 10 0 Kontrollgruppe Duodenum Jejunum Colon ascendens Colon descendens Ileum Abb. 14 Verteilung von Mastzellen in der Lamina propria verschiedener Darmabschnitte bei gesunden Läuferschweinen der Kontrollgruppe (n=5) 71 Ergebnisse ________________________________________________________________________________ Die Zahl an Mastzellen in der Darmmukosa war insgesamt gering. Mit Anteilen an der Gesamtzellzahl von 2,3% (± 1,4%) im Jejunum bis 3,1% (± 1%) im Colon ascendens unterschieden sich die Darmabschnitte nicht. Dies galt sowohl für die Kontrolltiere (Abb. 14) als auch für die beiden EcN-gefütterten Gruppen (nicht dargestellt). Nicht nur die Verteilung der Mastzellen entlang der Darmachse, sondern auch der Anteil in der LP der einzelnen Darmabschnitte blieb von EcN unbeeinflusst (Abb. 15). Mastzellen/ Gesammtzellen LP in % 20 Kontrolle 109 KBE 1011 KBE 10 0 Duodenum Jejunum Ileum Colon ascendens Colon descendens Abb. 15 Verteilung von Mastzellen in der Lamina propria gesunder Läuferschweine der Kontrollgruppe, nach Fütterung mit 109 KBE EcN/d (109 KBE) oder mit 1011 KBE EcN/d (1011 KBE) (n=5) 3.1.4 Immunhistologische Untersuchung Um die Anzahl und Verteilung von T-Helfer-Zellen, CD8+ Zellen, CD25+ Zellen und IgAproduzierenden Plasmazellen im Darm EcN-gefütterter Tiere und von Tieren der Kontrollgruppe untersuchen zu können, wurden Gewebe immunhistologisch mit der LSAB-Methode untersucht. Bedingt durch das, für die Farbreaktion verwendete Substrat (AEC) stellten sich positive Zellen im Gewebeschnitt rot dar. 72 Ergebnisse ________________________________________________________________________________ 3.1.4.1 T-Helfer-Zellen (CD4+) CD4 positive Zellen kamen in der Lamina propria der Mukosa, jedoch nicht im Epithel vor. Sowohl im Duodenum als auch im Jejunum waren in den Villi vergleichsweise mehr Zellen zu finden als im Krypentbereich (Abb. 16). Ileum und Kolon zeigten eine gleichmäßige Verteilung der CD4+ Zellen über den gesamten Querschnitt der Mukosa. In der Submukosa waren CD4+ Zellen in nennenswerter Zahl nur im Ileum vorhanden. Sie schlossen sich direkt der Mukosa an und lagen hauptsächlich interfollikulär im Bereich der Peyer´schen Platten. In der Submukosa der anderen Darmabschnitten wurden nur vereinzelt CD4+ Zellen gefunden. Auch in der Peripherie der in der Kolonsubmukosa vorkommenden Lymphfollikel waren im Gegensatz zur Peripherie der Peyer´schen Platten des Ileums kaum CD4+ Zellen vorhanden. Tab. 10 Gruppen für CD4+ Zellen Gruppe Zellzahl 1 < 25% der Lamina propria Zellen CD4+ 2 25% bis 49% der Lamina propria Zellen CD4+ 3 50% bis 75% der Lamina propria Zellen CD4+ 4 > 75% der Lamina propria Zellen CD4+ 73 Ergebnisse ________________________________________________________________________________ Abb. 16 CD4+ Zellen in der Lamina propria des Jejunums (rot) eines Tieres aus der 1011 KBE EcN/d Gruppe LSAB-Methode (Antikörper 74-12-4) mit anschließender Hämalaun-Färbung, 100fach vergrößert, Messbalken = 100 µm. CD4+ Zellen machten in vielen Fällen einen erheblichen Teil der Lamina propria Zellen aus. Da zum Zeitpunkt der Untersuchungen keine Antikörper existierten, die eine Verwendung auf Paraffinschnitten erlaubten, wurden Gefrierschnitte verwendet. Die bei Gefrierschnitten sinnvoll erzielbare Schnittdicke von 5µm ließ dabei keine sichere Differenzierung einzelner Zellen mehr zu. Deshalb wurde die Zellzahl hier abweichend von den anderen Zellarten semiquantitativ bestimmt. Die Gruppeneinteilung ist in Tab. 10 dargestellt. 74 Ergebnisse CD4+ Zellen/Gesamtzellen LP in % ________________________________________________________________________________ * 100 * 75 50 25 0 Duodenum Jejunum Ileum Colon ascendens 109 KBE Kontrolle Colon descendens 1011 KBE Abb. 17 Verteilung von CD4+ Zellen in der Lamina propria gesunder Läuferschweine der Kontrollgruppe, nach Fütterung mit 109 KBE EcN/d (109 KBE) oder mit 1011 KBE EcN/d (1011 KBE) (n=5) Die Bestimmung der Zellzahl erfolgte semiquantitativ (siehe Tab. 10). Das Fehlen einer Standardabweichung im Colon descendens in der 1011 KBE-Gruppe ist die Folge gleicher Werte für alle fünf Tiere. Die Fütterung von EcN veränderte den Anteil CD4+ Zellen in den Darmabschnitten im Vergleich der drei Versuchsgruppen nicht. In der Kontrollgruppe und der 109 KBE EcN gefütterten Gruppe gab es auch entlang der Darmachse innerhalb einer Gruppe keinen Unterschied. Die hohe EcN Dosierung (1011 KBE EcN) führte im Ileum und Colon ascendens im Vergleich zum Colon descendens der selben Gruppe zu einem signifikant geringeren Anteil an CD4+ Zellen (Abb. 17). 3.1.4.2 CD8+ Zellen Anders als CD4+ T-Helfer-Zellen kommen CD8+ Zellen sowohl in der Lamina propria als auch im Epithel des Darms vor. Man bezeichnet sie dort auf Grund ihrer Lage auch als intraepitheliale Lymphozyten (IEL). Die IEL lagen dabei hauptsächlich in der Nähe der Basalmembran zwischen den Zellkernen der Epithelzellen (Abb. 18a + b). 75 Ergebnisse ________________________________________________________________________________ 18a) 18b) Abb. 18a+b CD8+ Zellen in der Mukosa des Duodenum (rot) eines Tier aus der 1011 KBE EcN Gruppe LSAB-Methode (Antikörper MIL-12) mit anschließender Hämalaun-Färbung (18a) und Isotypkontrolle LSAB-Methode (Antikörper Maus IgG2a) mit anschließender Hämalaun-Färbung (18b), 400fach vergrößert, Messbalken = 10 µm. Die Verteilung der CD8+ Zellen in den verschiedenen Bereichen der Darmmukosa und den untersuchten Darmabschnitten ist im Folgenden beispielhaft für die Kontrollgruppe dargestellt. Im luminalen Epithel war der Anteil an CD8+ Zellen deutlich höher als im basalen Epithel (Abb. 19a + b). Das galt für alle Darmabschnitte und alle Gruppen, wobei die Unterschiede zwischen luminalen und basalen IEL im Duodenum und Jejunum stärker ausgeprägt waren als im Ileum und im Kolon. Insgesamt waren im luminalen Epithel des Duodenums mit 33% (± 9,9%) die meisten CD8+ Zellen zu finden. Entlang der Darmachse nahm der Anteil luminal bis zum Kolon (12,1% ± 2,9%) stetig ab. Im basalen Epithel waren keine Unterschiede zwischen den Darmabschnitten zu erkennen. Der Anteil lag zwischen 2,8% und 4,1%. 76 Ergebnisse ________________________________________________________________________________ Abb. 19a IEL luminal Abb. 19b IEL basal *** *** ** 50 50 CD8+ Zellen/Gesamtzellen basales Epithel in % CD8+ Zellen/Gesamtzellen basales Epithel in % * * 40 *** *** 30 20 10 0 Jejunum Ileum Colon ascendens CD8+ Zellen/ Gesam tzellen luminale LP in % CD8+ Zellen/ Gesamtzellen luminale LP in % 40 *** 20 10 0 Colon descendens Jejunum 50 *** 40 *** 30 * 20 10 0 Kontrollgruppe Kontrollgruppe Abb. 19a-d 10 Abb. 19d LPL basal 50 Duodenum 20 Kontrollgruppe Abb. 19c LPL luminal 30 30 0 Kontrollgruppe Duodenum 40 Ileum Colon ascendens Colon descendens Verteilung von CD8+ Zellen im Epithel (19a + b) und der Lamina propria (19c + d) verschiedener Darmabschnitte bei gesunden Läuferschweinen der Kontrollgruppe (n=5) Anteil CD8+ Zellen im Epithel des luminalen Bereichs (19a) und des basalen Bereichs (19b) der Mukosa, Anteil CD8+ Zellen in der Lamina propria des luminalen Bereichs (19c) und des basalen Bereichs (19d) der Mukosa. 77 Ergebnisse ________________________________________________________________________________ Zwischen der luminalen und basalen Lamina propria waren die Unterschiede im Anteil der CD8+ Zellen bei Weitem weniger ausgeprägt als im Epithel. Der Anteil luminaler CD8+ Zellen lag zwischen 10,3% (± 1,3%) im Colon ascendens und 19,1% (± 7,3%) im Jejunum. Der Anteil basaler LP CD8+ Zellen lag zwischen 11,7% (± 1,8%) im Ileum und 6,4% (± 0,8%) im Colon ascendens. Signifikante Unterschiede konnten entlang der Darmachse in der luminalen LP nur zwischen dem Duodenum und Jejunum und in der basalen LP zwischen den Dünndarmabschnitten festgestellt werden (Abb. 19c + d). Die Verteilung CD8+ Zellen zwischen luminaler und basaler Mukosa sowie zwischen den untersuchten Darmabschnitten gilt, wie für die Kontrolltiere dargestellt, auch für die Schweine der beiden EcN-gefütterten Gruppen. Der Vergleich der Anzahl CD8+ Zellen zwischen den Versuchsgruppen soll im Folgenden zur besseren Übersicht nach Darmabschnitten getrennt erfolgen. Im Duodenum und im Colon descendens unterschieden sich die EcN gefütterten Tiere weder untereinander noch im Vergleich mit der Kontrollgruppe. Dies gilt für alle vier untersuchten Lokalisationen im Darmquerschnitt (Abb. 20a + e). Im Jejunum war eine signifikante Veränderung zwischen basalen IEL im Vergleich von Kontrollgruppe und 109 KBE EcN Gruppe zu erkennen, die jedoch nicht für den Vergleich mit der hochdosierten EcN-Gruppe galt (Abb. 20b). Das Ileum zeigte einen signifikanten Anstieg bei den LP CD8+ Zellen zwischen den Tieren der hochdosierten Gruppe (1011 KBE EcN/ Tag) und den Kontrollen (Abb. 20c). Die ausgeprägtesten Veränderungen ergaben sich im Colon ascendens. Dort war in der hochdosierten EcN-Gruppe, verglichen mit den Tieren der Kontrollgruppe, die Zahl der CD8+ Zellen in allen Bereichen der Mukosa mit Ausnahme des basalen Epithelbereichs signifikant erhöht. In der luminalen LP ergab sich auch für die niedrig dosierte EcN-Gruppe (109 KBE EcN/ Tag) eine signifikant höhere Anzahl CD8+ Zellen im Vergleich zu den Kontrollen (Abb. 20d). 78 Ergebnisse ________________________________________________________________________________ 50 40 40 30 30 20 20 10 10 0 0 luminale LP basales Epithel 40 * 30 30 20 20 10 10 0 luminale LP basales Epithel bas ale LP 40 40 * 30 30 20 20 10 10 0 CD8+ Zellen/ Gesamtzellen LP in % 50 0 luminale LP basales Epithel 50 50 40 40 30 * * * 30 * 20 20 10 10 0 bas ale LP CD8+ Zellen/ Gesamtzellen LP in % Abb. 20d Colon ascendens 50 CD8+ Zellen/ Gesamtzellen Epithel in % 40 luminales Epithel Abb. 20c Ileum luminales Epithel 50 0 basale LP CD8+ Zellen/ Gesamtzellen Epithel in % luminales Epithel 50 CD8+ Zellen/ Gesamtzellen LP in % 50 CD8+ Zellen/ Gesamtzellen Epithel in % Abb. 20b Jejunum CD8+ Zellen/ Gesamtzellen LP in % CD8+ Zellen/ Gesamtzellen Epithel in % Abb. 20a Duodenum 0 luminales Epithel luminale LP basales Epithel basale LP 50 50 40 40 30 30 20 20 10 10 0 luminales Epithel Abb. 20a-e CD8+ Zellen/ Gesamtzellen LP in % CD8+ Zellen/ Gesamtzellen Epithel in % Abb. 20e Colon descendens Kontrolle 109 KBE 1011 KBE 0 luminale LP basales Epithel Verteilung von bas ale LP CD8+ Zellen in der intestinalen 9 Mukosa gesunder 9 Läuferschweine der Kontrollgruppe, nach Fütterung mit 10 KBE EcN/d (10 KBE) oder mit 1011 KBE EcN/d (1011 KBE) (n=5) 79 Ergebnisse ________________________________________________________________________________ Um einen Eindruck über die Zusammenhänge zwischen intraepithelialen Lymphozyten und Lamina propria Lymphozyten im luminalen und basalen Teil der Mukosa zu bekommen, wurde das Verhältnis zwischen IEL und LPL bestimmt und die Quotienten anschließend verglichen (Abb. 21a + b). Abb. 21a-c luminale Mukosa Abb. 21b 109 KBE EcN Abb. 21a Kontrolle Abb. 21c 1011 KBE EcN * * 2 1 0 * * 3 4 Quotient IEL/LPL luminal * 3 * 4 * * Quotient IEL/LPL luminal Quotient IEL/LPL luminal 4 * 2 1 0 Duodenum Jejunum * 3 * 2 1 0 Ileum Colon ascendens Colon descendens Abb. 21d-f basale Mukosa Abb. 21e 109 KBE EcN Abb. 21d Kontrolle 3 2 1 0 4 * 3 2 1 0 Duodenum Jejunum Quotient IEL/LPL basal 4 Quotient IEL/LPL basal Quotient IEL/LPL basal 4 Abb. 21f 1011 KBE 3 2 1 0 Ileum Colon ascendens Colon descendens Abb. 21a – f Verhältnis von epithelialen und Lamina propria CD8+ Zellen im luminalen und basalen Bereich der Mukosa von fünf Darmabschnitten gesunder Läuferschweine der Kontrollgruppe, nach Fütterung mit 109 KBE EcN/d (109 KBE) oder mit 1011 KBE EcN/d (1011 KBE) (n=5) Das Verhältnis zwischen luminalen IEL und LPL war in allen Darmabschnitten unabhängig von der EcN-Fütterung eins oder größer (Abb. 21a-c). Der Grund dafür ist ein identischer bzw. höherer 80 Ergebnisse ________________________________________________________________________________ Anteil an IEL im Vergleich zu den CD8+ LPL dieses Mukosabereichs. Im basalen Bereich der Mukosa verhielt es sich umgekehrt. Die Quotienten waren kleiner eins (Abb. 21d-f), was einen Überschuss an CD8+ LPL gegenüber IEL deutlich macht. Bei der hochdosiert EcN-gefütterten Gruppe war der Quotienten (IEL:LPL) für die Zotten des Duodenums zu den Quotienten der anderen Darmabschnitte nicht signifikant unterschiedlich (Abb. 21c). Während bei den anderen beiden Versuchsgruppen die luminalen Quotienten des Duodenums verglichen mit den Quotienten der anderen Darmabschnitte einen signifikanten Unterschied aufwiesen (Abb. 21a+b). 3.1.4.3 Aktivierungsmarker (CD25) CD25+ Zellen/ Gesamtzellen LP in % 20 10 0 Kontrollgruppe Duodenum Jejunum Colon ascendens Colon descendens Ileum Abb. 22 Verteilung von CD25+ Zellen in der Lamina propria verschiedener Darmabschnitte bei gesunden Läuferschweinen der Kontrollgruppe (n=5) CD25+ Zellen kamen fast ausschließlich in der Lamina propria vor. Im Epithel waren sie nur vereinzelt zu finden und zeigten dort weder Abschnitts- noch Gruppenabhängigkeit. Die Anteile waren in der LP aller Darmabschnitte mit Werten zwischen 2,4% und 3,7% niedrig und wiesen 81 Ergebnisse ________________________________________________________________________________ entlang des Darmverlaufs keine Unterschiede auf (Abb. 22). Dies galt ebenfalls für die EcNgefütterten Gruppen. CD25+ Zellen/ Gesamtzellen LP in % 20 10 0 Duodenum Jejunum Kontrolle Ileum Colon ascendens 109 KBE Colon descendens 101 1 KBE Abb. 23 Verteilung von CD25+ Zellen in der Lamina propria gesunder Läuferschweine der Kontrollgruppe, nach Fütterung mit 109 KBE EcN/d (109 KBE) oder mit 1011 KBE EcN/d (1011 KBE) (n=5) Auf den Anteil der CD25+ Zellen in den einzelnen Darmabschnitten hatte die Fütterung von EcN bei den untersuchten Schweinen keinen Einfluss (Abb. 23). 3.1.4.4 IgA-produzierende Plasmazellen Im Gegensatz zu den vorangegangenen Markern handelt es sich bei IgA um ein sowohl extrazellulär als auch intrazellulär gelegenes Antigen. Die Zellen zeigen deshalb auch eine zytosolische Färbung (Abb. 24). IgA+ Plasmazellen kommen ausschließlich in der LP vor. Die Zellen waren insbesondere im Dünndarm nicht gleichmäßig verteilt, sondern befanden sich vermehrt in der LP der Zottenbasis und in der LP der Krypten (Abb. 25). 82 Ergebnisse ________________________________________________________________________________ Abb. 24 IgA+ Plasmazellen in der Lamina propria des Colons descendens (schwarzer Pfeil) eines Tieres der Kontrollgruppe (n=5) LSAB-Methode (K61 1B4) mit anschließender Hämalaun-Färbung, 1000fach vergrößert, Messbalken = 10 µm, rote Färbung im Epithel kennzeichnet sezerniertes IgA (offener Pfeil). Abb. 25 IgA+ Plasmazellen in der Lamina propria des Duodenums (rot) eines Tieres aus der 109 KBE EcN/d Gruppe (n=5) LSAB-Methode (K61 1B4) mit anschließender Hämalaun-Färbung, 200fach vergrößert, Messbalken = 100 µm. 83 Ergebnisse ________________________________________________________________________________ * *** IgA+ Zellen/ Gesamtzellen LP in % 30 *** *** 20 10 0 10 11 KBE EcN/Tag Duodenum Jejunum Colon ascendens Colon descendens Ileum Abb. 26 Verteilung von IgA+ Zellen in der Lamina propria verschiedener Darmabschnitte bei gesunden Läuferschweinen nach Fütterung mit 1011 KBE EcN/d (1011 KBE) (n=5) Der größte Anteil IgA+ Zellen befand sich mit 21,1% (± 3,1%) im Duodenum der hochdosiert EcNgefütterten Schweine, der geringste Anteil mit 3,9% (± 3,4%) im Ileum. In der hochdosierten Gruppe war der Anteil im Duodenum gegenüber dem in den anderen Darmabschnitten signifikant erhöht (Abb. 26). Das gleiche Verteilungsmuster der IgA+ Zellen ließ sich auch in den anderen beiden Versuchsgruppen beobachten. Die Unterschiede zwischen dem Duodenum und den restlichen Abschnitten des Darms waren aber nicht signifikant (nicht dargestellt). 84 Ergebnisse ________________________________________________________________________________ IgA+ Zellen/ Gesamtzellen LP in % 30 20 10 0 Duodenum Kontrolle Jejunum Ileum Colon ascendens Colon descendens 109 KBE 101 1 KBE Abb. 27 Verteilung von IgA+ Zellen in der Lamina propria gesunder Läuferschweine der Kontrollgruppe, nach Fütterung mit 109 KBE EcN/d (109 KBE) oder mit 1011 KBE EcN/d (1011 KBE) (n=5) Die Fütterung von EcN führte bei den Versuchstieren zu keiner signifikanten Änderung des Anteils der IgA+ Zellen. Bei den Ergebnissen für diese Werte fielen besonders hohe Streuungen innerhalb der Versuchsgruppen auf (Abb. 27). 3.1.5 mRNA-Expression von Zytokinen und antimikrobiellen Peptiden Nachdem sich bei den histologischen und immunhistologischen Untersuchungen nur geringe Veränderungen im Anteil der untersuchten Zellpopulationen ergeben hatten, sollte mit Hilfe semiquantitativer RT-PCR eine Veränderung des Zytokinmusters von Immunzellen überprüft werden. Um zusätzlich einen Einfluss von EcN auf die Abwehr durch das angeborene Immunsystem zu untersuchen, wurde auch die mRNA-Expression von antimikrobiellen Peptiden wie Cathelicidinen und Defensinen überprüft. Dafür wurde aus Mukosaproben von 15 Tieren Gesamt-RNA isoliert und mit RT-PCR auf die Zytokine (IFN-γ, TNF-α, TGF-β, IL-4 und IL-10) und AMP (Prepro-Defensin β1, PR-39, NK-Lysin und Protegrine) untersucht. 85 Ergebnisse ________________________________________________________________________________ Die Auswertung der Ergebnisse erfolgte semiquantitativ im Vergleich mit der mRNA-Expression von GAPDH als „housekeeping gene“. Es wurden jeweils vier bzw. fünf Tiere einer Gruppe untersucht. Die PCR für die untersuchten Gene wurden im Duplikat durchgeführt. Die Negativkontrollen für die verschiedenen PCR, in denen die PCR-Reagenzien ohne cDNA-Template eingesetzt wurden, zeigten keine Banden. Die Ergebnisse sind im Folgenden dargestellt. Für IFN-γ, TNF-α, TGF-β und IL-10 ergaben sich in der Mukosa der untersuchten Darmabschnitte keine Unterschiede zwischen der mRNA-Expression bei Tieren der Kontrollgruppe und der hochdosiert gefütterten EcN-Gruppe (Abb. 28). Duodenum Ileum Kontrolle 1011 KBE EcN Colon ascendens Kontrolle 1011 KBE EcN Kontrolle 1011 KBE EcN GAPDH 28 IFN -γ 34 TNF - α 35 TGF - β 32 IL-10 40 IL-4 28 A B C D A B C D A B C D Abb. 28 mRNA-Expression von INFγ, TNF-α, TGF-β, IL-4 und IL-10 in der Mukosa von Duodenum, Ileum und Colon ascendens zweier repräsentativer Tiere der Kontrollgruppe (Kontrolle) und nach Fütterung mit 1011 KBE EcN/d (1011 KBE EcN) (n=4 bzw. n=5) Vergleichende Darstellung mit GAPDH als „housekeeping gene“, Zahlen am Ende der Zeilen geben die Zyklusanzahl an. 86 Ergebnisse ________________________________________________________________________________ Duodenum Kontrolle GAPDH IL-4 1011 KBE EcN 28 28 Abb. 28a mRNA-Expression von IL-4 in der Mukosa des Duodenums aller untersuchten Tieren der Kontrollgruppe und nach Fütterung mit 1011 KBE EcN/d (1011 KBE EcN) (n=4) Vergleichende Darstellung mit GAPDH als „housekeeping gene“, Zahlen am Ende der Zeilen geben die Zyklusanzahl an. Verglichen mit der Expression bei Kontrolltieren war die mRNA-Expression von IL-4 in der Mukosa des Duodenum hochdosiert gefütterter Tiere erhöht (Abb. 28 und Abb. 28a). Wohingegen in der Mukosa des Ileums und Colon ascendens keine EcN-abhängigen Veränderungen der IL-4 mRNA-Expression erkennbar waren. Mit Ausnahme der Ergebnissen für IL-4 im Duodenum fiel für alle untersuchten Zytokine eine hohe individuelle Variabilität der mRNA-Expression auf. Diese war im Duodenum besonders ausgeprägt dabei jedoch gruppen- und einzeltierunabhängig. 87 Ergebnisse ________________________________________________________________________________ Duodenum Kontrolle Ileum 1011 KBE EcN Kontrolle Colon asc. 1011 KBE EcN Kontrolle 1011 KBE EcN GAPDH 28 Prepro Defensin-β 39 PR39 Protegrine 42 42 NK-Lysin 36 A B C D A B C D A B C D Abb. 29 mRNA-Expression von Prepro-Defensin β1 (Prepro-Def.) , PR-39, Protegrine und NK-Lysin in der Mukosa von Duodenum, Ileum und Colon ascendens zweier repräsentativer Tiere der Kontrollgruppe (Kontrolle) und nach Fütterung mit 1011 KBE EcN/d (1011 KBE EcN) (n=4 bzw. n=5) Vergleichende Darstellung mit GAPDH als „housekeeping gene“, Zahlen am Ende der Zeilen geben die Zyklusanzahl an. Die mRNA-Expression von Prepro-Defensin β1 ließ sich in allen Darmabschnitten nachweisen, wobei die Expression im Colon ascendens geringer war als im Ileum. Die Expression im Duodenum war genau wie schon bei den anderen untersuchten Zytokinen heterogen. Ein Einfluss von EcN war nicht erkennbar. Eine mRNA-Expression von PR-39 war unabhängig von der EcN-Fütterung nur vereinzelt im Duodenum und im Colon ascendens vorhanden. Für Protegrine wurden in der Mukosa beider Gruppen keine mRNA gefunden. Positivkontrollen für PR-39 und Protegrine ergaben jedoch klare Banden (nicht dargestellt). NK-Lysin-mRNA war in allen untersuchten Darmabschnitten nachweisbar, wurde aber durch EcNFütterung nicht beeinflusst (Abb. 29). 88 Ergebnisse ________________________________________________________________________________ 3.2 Infektionsversuche mit und ohne EcN Nachdem die Fütterung von EcN an gesunde Läuferschweinen in Bezug auf das darmassoziierte Immunsystem nur wenige Anhaltspunkte für eine Beeinflussung der untersuchten zellulären und humoralen Abwehr lieferte, ergab sich die Frage nach der Wirkung von EcN im infizierten Darm. Zu diesem Zweck wurde im Zuge dieser Arbeit im Physiologischen Institut der Tierärztlichen Hochschule Hannover mit der Etablierung eines Infektionsmodells bei Absetzferkeln begonnen. Zur Untersuchung des EcN Einflusses wurden in einer Pilotstudie Gruppen mit jeweils acht (insgesamt 16) Saugferkeln ab dem 11. Lebenstag für zehn Tage prophylaktisch ohne oder mit EcN behandelt und ab dem 21. Lebenstag paarweise abgesetzt. Danach wurde jeweils eines der beiden Tiere über zwei Tage mit dem pathogenen EcA infiziert bzw. mit Placebo behandelt. Die Ergebnisse der klinischen, mikrobiologischen, histopathologischen und labordiagnostischen Untersuchungen werden im Folgenden dargestellt. Verglichen werden jeweils EcN-gefütterte mit nicht EcN-gefütterten Tieren, aber auch EcA-infizierte mit Placebo-behandelten Tieren der gleichen EcN-Gruppe. 3.2.1.1 Klinik Die klinische Untersuchung erfolgte anhand allgemeiner klinischer Parameter zur Diagnostik von Durchfallerkrankungen sowie weiterer der Literatur entnommener, erprobter Parameter (TO et al. 1998). Gewichtsverlauf Die Bestimmung des Gewichtsverlaufs zwischen dem Absetzen und dem Zeitpunkt des Tötens diente auf der einen Seite der Überprüfung beider Würfe in Bezug auf Vergleichbarkeit der Ferkel hinsichtlich ihres Entwicklungsstandes und auf der anderen Seite als Parameter für den Grad der Erkrankung bei EcA-infizierten im Vergleich zu Placebo-behandelten Tieren. 89 Ergebnisse ________________________________________________________________________________ Abb. 30a Gewichtsverlauf ohne EcN Körpergewicht in kg 10 9 8 7 6 5 Absetzen Placebo Töten EcA Abb. 30b Gewichtsverlauf mit EcN Körpergewicht in kg 10 9 8 7 6 5 Absetzen Placebo Töten EcA Abb. 30a-b Gewichtsentwicklung drei Wochen alter, abgesetzter Ferkel über 2 Tage, nach Inokulation mit EcA (1,1 x 1010 bis 2,1 x 1010 KBE/d) bzw. Placebo ohne zehntägige prophylaktische EcN-Applikation (30a) und mit zehntägiger prophylaktischer EcNApplikation (100 mg Mutaflor®/d) (30b), (n=4) 90 Ergebnisse ________________________________________________________________________________ Beide Würfe waren mit einem mittleren Absetzgewicht von 7,4 kg (± 0,6 kg) in dem Wurf ohne EcN und 8,1 kg (± 0,6 kg) mit EcN homogen. Das Körpergewicht der Tiere änderte sich zwischen dem Absetzen und dem Zeitpunkt des Tötens nach 48 Stunden nicht signifikant. Zu beiden Messzeitpunkten bestand weder zwischen den EcN-gefütterten Tieren (Abb. 30b) bzw. unbehandelten Tieren (Abb. 30a) noch zwischen den mit EcA-infizierten bzw. Placebo behandelten Ferkeln ein Unterschied. Verhalten, Futter- und Wasseraufnahme Das Verhalten der Tiere war weitestgehend ungestört (Abb. 31). Bei den Tieren, die ohne vorherige EcN-Prophylaxe mit EcA infiziert wurden und Durchfall entwickelten, fiel initial vier bis acht Stunden nach der EcA-Infektion eine mittelgradig verringerte Aufmerksamkeit auf (nicht dargestellt). Diese hielt bis zu 24 Stunden an und verschwand dann trotz erhaltener Durchfallsymptomatik wieder. Die Futteraufnahme war bei diesen Tieren ebenfalls eingeschränkt. Die Wasseraufnahme war unbeeinträchtigt. Alle anderen Ferkel zeigten weder bei der Futter- noch bei der Wasseraufnahme Beeinträchtigungen (nicht dargestellt). apatisch gedämpft aufmerksam Kontrolle Infektion Kontrolle EcN Infektion EcN Abb. 31 Verhalten drei Wochen alter, abgesetzter Ferkel nach Inokulation mit EcA (1,1 x 1010 bis 2,1 x 1010 KBE/d) bzw. Placebo, ohne und mit zehntägiger prophylaktischer EcNApplikation (100mg Mutaflor®/d), (n=4) Die Symbole entsprechen den Mittelwerten für jeweils ein Tier über den gesamten Versuchszeitraum von zwei Tagen. 91 Ergebnisse ________________________________________________________________________________ Kotkonsistenz und Verschmutzung der Afterregion Abb. 32a Verschmutzung der Afterregion hochgradig mittelgradig keine Kontrolle Infektion Kontrolle EcN Infektion EcN Abb. 32b Kotkonsistenz wässrig flüssig pastös unauffällig Kontrolle Infektion Kontrolle EcN Infektion EcN Abb. 32a-b Verschmutzung des Afterbereichs (32a) und Kotkonsistenz (32b) drei Wochen alter, abgesetzter Ferkel nach Inokulation mit EcA (1,1 x 1010 bis 2,1 x 1010 KBE/d) bzw. Placebo, ohne und mit zehntägiger prophylaktischer EcN-Applikation (100mg Mutaflor®/d), (n=4) Die Symbole entsprechen den Mittelwerten für jeweils ein Tier über den gesamten Versuchszeitraum von zwei Tagen. 92 Ergebnisse ________________________________________________________________________________ Die Kotkonsistenz war bei 2/4 Tieren der Infektionsgruppe ohne vorherige prophylaktische EcN– Applikation deutlich pastös bis flüssig verändert. Bei diesen Tieren wurde auch eine mittelgradig, vermehrte Verschmutzung der Afterregion festsgestellt, die mit dem Durchfall einherging. Zusätzlich konnte bei den betroffenen Ferkeln eine Verschmutzung der Boxenwände beobachtet werden (Abb. 33). Die Tiere der Kontrollgruppen mit und ohne EcN waren unauffällig. Bei der EcN vorbehandelten Infektionsgruppe konnte trotz EcA-Infektion keine veränderte Kotkonsistenz oder Verschmutzung des Afters beobachtet werden. Abb. 33 Drei Wochen altes Ferkel der EcA-Infektionsgruppe (1,1 x 1010 bis 2,1 x 1010 KBE/d) ohne vorherige EcN-Applikation 24 Stunden post infectionem Das Tier war im Allgemeinbefinden gedämpft und zeigte deutliche Durchfallsymptomatik. An der Wand der Box sind Kotspuren zu erkennen. 3.2.1.2 Allgemeine mikrobiologische Untersuchung Es wurden von allen Tieren zur Bestimmung der Darmmikrobiologie Tupfer aus dem Duodenum, Jejunum, Ileum und dem Kolon entnommen und kulturell auf Salmonellen, mittels PCR auf Brachyspira hyodysenteria und Lawsonia intracellularis und elektronenmikroskopisch auf Viren untersucht. Die Ergebnisse sind in Tab. 11 dargestellt. 93 Ergebnisse ________________________________________________________________________________ Tab. 11 Ergebnisse der mikrobiologischen Untersuchung Tier SI2-1 SI2-3 SI2-5 SI2-7 SI2-2 SI2-4 SI2-6 SI2-8 SI3-1 SI3-3 SI3-5 SI3-7 SI3-2 SI3-4 SI3-6 SI3-8 Gruppe Salmonellen, Lawsonia intracellularis Brachyspirs Hyodysenterica, Viren EcA EcN - - - - - - - - - - - - - + - - + - - + - - + - - - - - - - - - - - - + - + - - + - - - + - - + Placebo ohne EcN Placebo ohne EcN Placebo ohne EcN Placebo ohne EcN Infektion ohne EcN Infektion ohne EcN Infektion ohne EcN Infektion ohne EcN Placebo mit EcN Placebo mit EcN Placebo mit EcN Placebo mit EcN Infektion mit EcN Infektion mit EcN Infektion mit EcN Infektion mit EcN Allgemeine Mikrobiologie Bei keinem der Tiere wurden Salmonellen, Lawsonia intracellularis, Brachyspira hyodysenteria oder Viren nachgewiesen. Die bakteriologische Untersuchung nach Anzüchtung auf Blutagar- und Gassnerplatte war bei den Ferkeln ohne vorherige EcN–Applikation unauffällig. Von den Tieren mit prophylaktischer EcN-Applikation wurde bei je einem Tier der EcAInfektionsgruppe hochgradig Clostridium perfringens Typ A bzw. mittelgradig E. coli des Serotyps O8:K87 nachgewiesen. Ein Tier der EcN behandelten, nicht EcA infizierten Gruppe wies mittelgradig E. coli Serotyp O147:K89 und geringgradig nicht typisierbare, hämolysierende E. coli auf. Bei den nachgewiesenen E. coli Stämmen wurden in der PCR keine schweinetypischen 94 Ergebnisse ________________________________________________________________________________ Virulenzfaktoren gefunden. EcA im Darminhalt Alle acht (2 x 4) Tiere, die statt EcA Placebo erhalten hatten, waren frei von EcA. Bei den Ferkeln der EcA-Infektionsgruppe ohne vorherige EcN-Applikation wurde hingegen bei allen vier Tieren EcA nachgewiesen. In der EcA-Infektionsgruppe mit EcN-Applikation waren nur zwei von vier Tieren EcA-positiv. EcN im Darminhalt EcN konnte zum Zeitpunkt des Todes nur bei drei der insgesamt acht behandelten Tiere im Kot nachgewiesen werden. 3.2.1.3 Wassergehalt im Kot Wassergehalt in % 100 75 50 25 0 Placebo Infektion Placebo EcN Infektion EcN Abb. 34 Wassergehalt im Kot drei Wochen alter Ferkel zum Zeitpunkt des Tötens, nach zweitägiger Inokulation mit EcA (1,1 x 1010 bis 2,1 x 1010 KBE/d) bzw. Placebo, ohne und mit zehntägiger prophylaktischer EcN-Applikation (100mg Mutaflor®/d), (n=4) Der Wassergehalt des Kots betrug in beiden Placebogruppen zwischen 65% (±8%, Placebo) und 66% (±7%, Placebo + EcN). Der Mittelwert in der EcA-Infektionsgruppe + EcN von 66% (± 4%) 95 Ergebnisse ________________________________________________________________________________ entsprach dem der beiden Placebogruppen. Die EcA-Infektionsgruppe ohne EcN hatte mit 74% (± 8%) einen höheren Wasseranteil im Kot als die drei anderen Gruppen (Abb. 34). Der Unterschied erreichte jedoch nicht das Signifikanzniveau. 3.2.1.4 Luminale und Plasma-IgA-Bestimmung Um einen Einfluss von EcN auf die IgA-Konzentration im Plasma und im Darmlumen bewerten zu können, wurde sie mit ELISA untersucht. Weil ein Standard für porcines, sekretorisches IgA nicht zur Verfügung stand, konnte die Auswertung nur vergleichend zwischen den getesteten Gruppen erfolgen. Auf grund des fehlenden Standards konnten keine absoluten IgA-Konzentrationen berechnet werden, weshalb ein Vergleich zwischen den Plasma-IgA-Werten und den Werten für luminales IgA nicht möglich war. Da alle Proben am gleichen Tag in derselben Messung untersucht wurden, könnten jedoch sowohl die Tiere der Placebo- und Infektionsgruppe ohne EcN, die Tiere der Placebo- und Infektionsgruppe mit EcN als auch der beiden Placebo- und Infektionsgruppen miteinander verglichen werden. volumenkorrigierte OD (450 nm) 30 20 10 0 Placebo Infektion Placebo EcN Infektion EcN Abb. 35 Luminales IgA im Jejunum (20 cm) drei Wochen alter, abgesetzter Ferkel nach Inokulation mit EcA (1,1 x 1010 bis 2,1 x 1010 KBE/d) bzw. Placebo, ohne und mit zehntägiger prophylaktischer EcN-Applikation (100mg Mutaflor®/d), (n=4) Die Korrektur der OD-Messwerte wurde entsprechend der Formel: OD x Verdünnung x Ausgangsvolumen berechnet. 96 Ergebnisse OD (450 nm) ________________________________________________________________________________ 0.55 0.50 0.45 0.40 0.35 0.30 0.25 0.20 0.15 0.10 0.05 0.00 ** Placebo Infektion Placebo EcN Infektion EcN Abb. 36 Plasma-IgA drei Wochen alter, abgesetzter Ferkel nach Inokulation mit EcA (1,1 x 1010 bis 2,1 x 1010 KBE/d) bzw. Placebo, ohne und mit zehntägiger prophylaktischer EcNApplikation (100mg Mutaflor®/d), (n=4) Beim luminalen IgA im Jejunum lassen sich keine Unterschiede zwischen den verschiedenen Gruppen erkennen. Insgesamt fällt eine sehr hohe Standardabweichung als Zeichen einer starken individuellen Streuung auf (Abb. 35). Das Plasma-IgA der infizierten Ferkel ohne EcN war gegenüber dem der infizierten Tiere mit vorheriger EcN Applikation signifikant erhöht (Abb. 36). Zwischen den mit Placebo behandelten Gruppen gab es keinen signifikanten Unterschied. 3.2.1.5 Histologie Um eine Aussage über eventuelle Gewebeveränderungen im Darm bei Tieren der vier untersuchten Gruppen machen zu können, wurden transmurale Gewebeschnitte aus dem Jejunum und Ileum nach Hämalaun-Eosin Färbung beurteilt. Die histologische Untersuchung erfolgte durch Mitarbeiter des Instituts für Pathologie der Tierärztlichen Hochschule Hannover. Sie wurde verblindet und unabhängig von zwei verschiedenen Untersuchern durchgeführt. Bei den Tieren, die nicht mit EcA infiziert worden waren, war die Mukosa des Jejunums 97 Ergebnisse ________________________________________________________________________________ unauffällig. Gleiches galt für die Mukosa des Ileums mit Ausnahme eines Tieres der nicht mit EcN gefütterten Gruppe, bei dem sich eine minimale Verkürzung und Fusion der Ileumzotten darstellen ließ. Alle Tiere der EcA-infizierten Gruppe ohne vorherige EcN-Applikation zeigten geringgradige Zottenverkürzungen und –fusionen und/oder eine leichte bis geringgradig vermehrte Infiltration mit Lymphozyten oder neutrophilen Granulozyten im Jejunum. Das Ileum war ohne besonderen Befund. Zottenveränderungen traten bei der EcA-infizierten Gruppe mit vorheriger EcN-Applikation im Jejunum nicht auf. Allerdings enthielt die jejunale LP bei zwei Tieren geringgradig vermehrt Lymphozyten. Die Mukosa des Ileums war unverändert. Alle beobachteten Veränderungen in der Mukosa waren dezent, und es fanden sich keine Hinweise auf manifeste entzündliche Abweichungen. Von den Tieren mit vorheriger EcN-Applikation fand sich bei je einem Tier der EcA-infizierten und nicht EcA-infizierten Gruppe eine gering- bis mittelgradige follikuläre und parafollikuläre Hyperplasie in den Peyer’schen Platten des Ileums. 98 Diskussion ________________________________________________________________________________ 4 Diskussion 4.1 Konzeptionelle Überlegungen Der Darm und seine Mikroökologie rücken immer mehr in den Blickpunkt der medizinischen Forschung. Beim Menschen ist in den letzten Jahren die Inzidenz verschiedener Darmerkrankungen, wie CED oder Nahrungsmittelallergien stetig gestiegen. Während diese Erkrankungen in der Tiermedizin vor allem bei Hund und Katze eine Rolle spielen, wird bei Großtieren eine Häufung von gastrointestinalen Infektionskrankheiten beobachtet. Die Pathogenese all dieser Erkrankungen wird in hohem Maße von Darmbakterien beeinflusst, dabei ist die Interaktion der Bakterien mit dem intestinalen Immunsystem eine wichtiger Faktor (GUARNER und MALAGELADA 2003). Das intestinale Immunsystem stellt das größte immunologische Organ des Körpers dar. Mit Hilfe von am Darm gewonnenen Erkenntnissen lassen sich somit entscheidende Einblicke in den Ablauf immunologischer Vorgänge an mukosalen Oberflächen erlangen. Die Einflüsse der Darmmikroorganismen auf die Entwicklung und Aufrechterhaltung des Darmimmunsystems sind zahlreich (GRONLUND et al. 2000, KALLIOMAKI und ISOLAURI 2002, UMESAKI und SETOYAMA 2000). Dementsprechend sind die Einflussmöglichkeiten durch Probiotika vielfältig. Ein großer Teil der Einsatzgebiete dieser, für den Wirt vorteilhaften, speziellen Mikroorganismen, basiert allerdings nach wie vor nicht auf gesicherten wissenschaftlichen Untersuchungen. Zum einen ist die Pathogenese von Darmerkrankungen oder mit dem Darm assoziierter Erkrankungen unzureichend geklärt, und zum anderen liegen über die Wege und Mechanismen des Probiotikaeinflusses noch zu wenig Erkenntnisse vor. Bei den meisten zum Thema Probiotika vorliegenden Untersuchungen handelt es sich um In-vitroStudien, denen der Ruf eines artifiziellen Systems anhängt, oder um In-vivo-Studien an Labornagern, deren Ergebnisse in bezug auf das Darmimmunsystem nicht uneingeschränkt auf den Menschen und andere Säuger übertragbar sind. Hinzu kommt, dass viele Ergebnisse auf der Verwendung von Krankheitsmodellen beruhen (ALAK et al. 1999) und deshalb über die Wirkung auf das Immunsystem gesunder Individuen nur wenige Aussagen vorliegen. Gerade Letzteres ist für die Veterinärmedizin aber von besonderem Interesse, 99 Diskussion ________________________________________________________________________________ um Probiotika sinnvoll z.B. in der Nutztierhaltung einsetzen zu können. Im Mittelpunkt des ersten Teils der vorliegenden Arbeit standen deshalb Untersuchungen über Einflüsse des Probiotikums EcN auf das Darmimmunsystem gesunder Schweine in einer verblindeten Placebo-kontrollierten Fütterungsstudie. Im zweiten Teil sollte anhand eines neu etablierten ETEC-Diarrhöemodells der Einfluss von EcN auf die Darmgesundheit von frisch abgesetzten Ferkeln untersucht werden. Bei dem verwendeten Probiotikum handelt es sich mit Escherichia coli Nissle 1917 um einen Keim, der seit längerem in der Humanmedizin eingesetzt wird. Als Wirkstoff eines zugelassenen Medikaments (Mutaflor®) hat dieser Keim somit die harten „Qualitätskontrollen“ der Arzneimittelzulassung bestanden und gilt als gut charakterisiert und sicher. Das Schwein wurde als Versuchstier für die Untersuchung der immunologischen und klinischen EcN-Wirkung gewählt, weil es zum einen in der Landwirtschaft und Veterinärmedizin eine wichtige Rolle spielt und zum anderen ein den Labornagern in mancher Hinsicht überlegenes Modelltier für den Menschen darstellt. Mensch und Schwein weisen in Magen-Darm- und Ernährungsphysiologie, sowie der mikrobiellen Darmbesiedlung viele Parallelen auf. Diese spiegeln sich weniger in der Konzentration der im Darm vertretenen Mikroorganismenarten (siehe 1.1.1) als im Artenspektrum der Mikroorganismen wieder (HAENEL 1969, GÄRTNER et al. 1973, KENWORTHY 1973). Somit eignet sich das Schwein trotz höherer Haltungskosten, längerer Generationszeiten und nur teilweise etablierter Labormethoden insbesondere als Modelltier für Fragestellungen zu Darmmikroorganismen und zum Einfluss von pathogenen und probiotischen Keimen. 4.2 Konventionell gehaltene Schweine Als probiotisches Wirkkonzept von EcN wird in der Literatur nicht nur eine Beeinflussung des Darmfloragleichgewichts zur Diskussion gestellt, sondern auch die direkte Beeinflussung des darmassoziierten Immunsystems durch EcN (1.2.4.2.). Die Tatsache, dass sich die Studienergebnisse bei gesunden und kranken Patienten unterscheiden, führt zu der Frage, ob der individuelle Gesundheitszustand die Art der Wirkung beeinflussen kann, und ob auch bei gesunden Tieren Veränderungen in Verteilung und Anzahl der Darmimmunzellen erkennbar sind. 100 Diskussion ________________________________________________________________________________ Unter der Hypothese, dass das gram-negative Probiotikum EcN bei gesunden Schweinen einen Einfluss auf das Immunsystem hat, wurden 15 Tiere auf die Anzahl und Verteilung von Zellen des angeborenen und adaptiven Immunsystems, sowie die mRNA-Expression von Zytokinen und AMP in der Darmmukosa untersucht. Dabei wurden zwei Fragestellungen berücksichtigt: 1. Unterscheidet sich die Anzahl von Zellen bzw. die mRNA-Expression von Zytokinen (IFN-γ, TNF-α, TGF-β, IL-4 und IL-10) und AMP (Prepro-Defensin β1, PR-39, Protegrine und NK-Lysin) zwischen den Fütterungsgruppen in einem definierten Darmabschnitt oder einer Lokalisation der Darmmukosa? 2. Verändern sich unter der Fütterung von EcN die Unterschiede zwischen den verschiedenen Darmabschnitten innerhalb derselben Fütterungsgruppen? Methodendiskussion Bei Studien mit Großtieren können sich schnell Schwierigkeit mit der verwendeten Tierzahl ergeben. Anschaffung und Haltung der Tiere sind im Vergleich zu denen von Labornagern mit einem nicht unerheblichen Kosten- und Arbeitsaufwand verbunden, trotzdem ist eine ausreichende Tierzahl für den Erhalt statistisch signifikanter Ergebnisse notwendig. Bei den hier vorgestellten Untersuchungen an konventionell gehaltenen Schweinen, wurde deshalb als Kompromiss zwischen statistischer Notwendigkeit und Praktikabilität eine Gruppengröße von fünf Tieren gewählt. Diese relativ kleinen Gruppen führen dazu, dass Unterschiede in der Veränderung von Anzahl und Verteilung der Immunzellen sehr deutlich sein müssen, um das Signifikanzniveau zu erreichen. Es werden deshalb im Folgenden auch Tendenzen mit in die Diskussion einbezogen, worauf an den entsprechenden Stellen gesondert hingewiesen wird. Da beim Schwein anders als bei den klassischerweise verwendeten Labortieren keine Inzuchtstämme verfügbar sind, handelt es sich bei den konventionell gehaltenen Schweinen zwar um Tiere aus demselben Herkunftsbetrieb mit einem regulierten Zuchtprogramm, nicht aber um genetisch identische Tiere. Bedingt durch die Anzahl an benötigten Versuchstieren ist es außerdem nicht möglich, nur mit Wurfgeschwistern zu arbeiten, was bei der Beurteilung der statistischen Auswertungen zu berücksichtigen ist. Um die Aufnahme von EcN durch die Versuchstiere überprüfen zu können und sicher zu sein, dass die Kontrolltiere nicht während des Versuchs mit EcN in Kontakt waren, wurde der Kot aller Tiere 101 Diskussion ________________________________________________________________________________ über den gesamten Versuchszeitraum einmal pro Woche auf EcN untersucht. Die Tiere der Kontrollgruppe waren dabei ausnahmslos EcN-negativ. Wohingegen bei allen Tieren der Interventionsgruppen, während des Versuchszeitraums EcN im Kot nachgewiesen werden konnte (Tab. 9). EcN zeigt keinen Einfluss auf Anzahl und Verteilung von Granulozyten und Mastzellen in der Darmmukosa gesunder Schweine. Die Untersuchung von Anzahl und Verteilung eosinophiler Granulozyten in der LP des Dünnund Dickdarms bei Tieren mit und ohne EcN-Fütterung ergab keinen Unterschied zwischen den drei untersuchten Gruppen (Abb. 13). Ein Einfluss der Darmbesiedlung auf die Zahl eosinophiler Granulozyten konnte bisher auch von anderen Untersuchern nicht festgestellt werden. So unterschied sich beispielsweise in Versuchen mit keimfrei gehaltenen Mäusen die Zahl eosinophiler Granulozyten in der LP des Darms nicht von der bei besiedelten Kontrolltieren (ROTHENBERG et al. 2001). Einflüsse probiotischer Keime auf eosinophile Granulozyten in vivo sind allerdings als Folge von Laktobazillengabe bei Patienten mit atopischer Dermatitis beschrieben worden, wobei ihre Wirkung weniger in einer Reduktion der Zahl eosinophiler Granulozyten als vielmehr in einer Verminderung ihrer Aktivität besteht (ROSENFELDT et al. 2003). Ob ein derartiger Einfluss auch durch EcN erfolgt, müssen weiterführende Untersuchungen klären. Unabhängig von der EcN-Fütterung fiel eine Besonderheit in der Verteilung der eosinophilen Granulozyten des Schweins auf. Eosinophile Granulozyten gab es in allen fünf untersuchten Darmabschnitten, wobei die Anteile an der Gesamtzellzahl sehr unterschiedlich waren (Abb. 12). Die geringsten Konzentrationen wurden im Kolon beobachtet, wo die Werte mit einem Anteil von 0,6% deutlich unter den für den Menschen beschriebenen Werten von 3-5% liegen (BISCHOFF et al. 1996). Im porcinen Ileum war der Anteil mit 13,7% am höchsten. Die eosinophilen Granulozyten waren beim Schwein hauptsächlich in der LP der Krypten lokalisiert. Bei der Maus ist eine Ansammlung eosinophiler Granulozyten hingegen nur im Kryptenbereich des Jejunums und Ileums beschrieben. In den anderen Darmabschnitten sind sie gleichmäßig in der LP verteilt (MISHRA et al. 1999). Da alle in den vorliegenden Untersuchungen verwendeten Tiere sowohl im Herkunftsbetrieb als auch beim Einstellen im Physiologischen Institut gegen Darmparasiten behandelt worden waren, 102 Diskussion ________________________________________________________________________________ können Parasiten als Grund für die hohen Zahlen an eosinophilen Granulozyten im Dünndarm nahezu ausgeschlossen werden. Als Ursachen für physiologische Unterschiede in der Verteilung porciner, eosinophiler Granulozyten im Vergleich mit dem Menschen und der Maus könnten differierende Konzentrationen an Eotaxin oder IL-5 diskutiert werden. Eotaxin wirkt spezifisch chemotaktisch auf eosinophile Granulozyten und fördert die Akkumulation im Gewebe. IL-5 wird von Th2-Zellen und Mastzellen gebildet und wirkt proliferativ (SANDERSON 1992, ROTHENBERG 1998, ROTHENBERG et al. 2001). Es ist bekannt, dass eosinophile Granulozyten durch die Abgabe von Enzymen und Sauerstoffmetaboliten nicht nur Effektorzellen darstellen, sondern durch die Produktion von Zytokinen auch immunmodulatorisch wirken. Ob dies auch für eosinophile Granulozyten im Darm gilt, ist noch nicht eindeutig geklärt, da die meisten Versuche zur Wanderung und Aktivierung von eosinophilen Granulozyten im Respirationstrakt durchgeführt wurden. Es gibt Anzeichen, dass sich Eosinophile im Darm anders verhalten als in anderen Geweben. Im Darm erfolgt demnach auch im nicht entzündeten Zustand eine spontane minimale bis moderate Degranulation von eosinophilen Granulozyten, die in anderen Geweben nicht beobachtet wird (MCGOVERN et al. 1991, TALLEY et al. 1992). Die erhöhte Konzentration eosinophiler Granulozyten im Dünndarm des Schweins könnte also neben der Abwehr von Parasiten auch regulatorisch auf andere Zellen des Immunsystems wirken. Weiter Untersuchungen zur Physiologie der eosinophilen Granulozyten im Darm sind nötig, um diese Hypothese zu untermauern. Die Zahl neutrophiler Granulozyten in der Lamina propria des Darms war bei allen untersuchten Tieren gering. Entlang der Darmachse befanden sich die meisten neutrophilen Granulozyten im Duodenum und im Kolon (Abb. 15) und damit in Bereichen des Darms, die auf Grund ihrer Lage (Duodenum) oder Besiedlung (Kolon) besonders anfällig für mikrobielle Infektionen sind. Mit 3,7% der LP-Zellen lagen die Werte dabei im Normbereich für gesunde Tiere. Für den Menschen werden Anteile von 0,4%, wie sie im Jejunum untersuchter Tiere beobachtet wurden, als unauffällig angesehen (OGRA et al. 1999). Höhere Anteile neutrophiler Granulozyten im Duodenum und Kolon bei Schweinen und anderen Haustieren im Vergleich mit dem Menschen könnten auf eine höhere Konzentration an Keimen im Darmlumen zurückgeführt werden. Während der Darm des Menschen beispielsweise im Duodenum nur sehr schwach besiedelt ist (SONNENBORN und 103 Diskussion ________________________________________________________________________________ GREINWALD 1991), findet man beim Schwein zwischen 106 und 107 KBE/ml (SCHULZE und BATHKE 1977, SCHULZE et al. 1980). Des Weiteren leben Schweine in einer Umgebung, in der sie mit mehr potentiellen Pathogenen in Berührung kommen, als dies bei Menschen der westlichen Industrieländer der Fall ist, in denen die Untersuchungen von OGRA et al. (1999) durchgeführt wurden. Dieser Umstand wäre ebenfalls als Ursache für eine geringfügig höhere Grundpräsenz von neutrophilen Granulozyten denkbar. Die EcN-Fütterung in den Interventionsgruppen hatte keinen Einfluss auf die Verteilung und den Anteil der neutrophilen Granulozyten in der LP des Darms (Abb. 16). Bei einem probiotischen Keim wie EcN ergibt sich aus dem Fehlen einer Rekrutierung von neutrophilen Granulozyten eine Bestätigung der Apathogenität. Bakterien der gleichen Gattung mit pathogenen Eigenschaften, z.B. aus der Gruppe der EPECs oder ETECs, führen zur Rekrutierung von neutrophilen Granulozyten. Einige ETEC-Stämme verursachen bei Ferkel eine Transmigration von neutrophilen Granulozyten ins Darmlumen (ROSE und MOON 1985). Auch nach EPECInfektion von Epithelzelllinien in In-vitro-Modellen wird sowohl eine Anreicherung neutrophiler Granulozyten im einschichtigen Epithelzellverband als auch eine Migration durch diesen hindurch beobachtet (MICHAIL et al. 2003). Werden vor der Infektion mit EPECs Laktobazillen zu den Zellen gegeben, verringert sich die transepitheliale Migration der neutrophilen Granulozyten (MICHAIL und ABERNATHY 2003). Es gibt demnach Hinweise darauf, dass Probiotika die Migration von neutrophilen Granulozyten beeinflussen können. Ob EcN bei prophylaktischer Gabe und anschließender Infektion in der Lage ist, einen ebensolchen Effekt hervorzurufen, muss in weiteren Untersuchungen geklärt werden. Die in der Lamina propria der untersuchten Tiere vorkommenden Mastzellen waren von polymorpher Gestalt mit dendritischen Zellausläufern, so wie sie auch von XU et al. (1993) für MMC beschrieben werden. Der Anteil der Mastzellen mit 2,4-3,1% der LP-Zellen in allen untersuchten Darmabschnitten entsprach den von XU et al. (1993) ermittelten Normalwerten für das Schwein und lagt nur wenig unter den physiologischen Werten im Darm des Menschen von 4% (BISCHOFF et al. 1999). Die Fütterung von EcN hatte in keiner der Gruppen Auswirkungen auf die Mastzellzahl in der Darmmukosa. Basophile Granulozyten wurden im Darm erwartungsgemäß weder bei EcN-gefütterten 104 Diskussion ________________________________________________________________________________ Schweinen noch bei den Kontrolltieren gefunden. Bei gesunden Schweinen lassen sich unter EcN-Fütterung bei keiner der untersuchten Zellgruppen des angeborenen Immunsystems Veränderungen in der Zellzahl oder der Verteilung der Zellen in der Mukosa erkennen. Es soll jedoch nicht unerwähnt bleiben, dass Veränderungen in der Menge und Verteilung von Immunzellen nicht die einzigen Einflussmöglichkeiten auf die angeborene Immunantwort darstellen. Über Einflüsse auf andere Parameter wie das Migrationsverhalten oder die Stimulierbarkeit, wie sie für andere Probiotika und andere Zellpopulationen nachgewiesen sind (ISOLAURI et al. 1997, PELTO et al. 1998), bzw. die Mediatorproduktion der entsprechenden Zellen können aus diesen Versuchen keine Aussagen gemacht werden. Es gibt Anzeichen für eine Beeinflussung der Verteilung von T-Zellen durch EcN in der Darmmukosa gesunder Schweine. Stellvertretend für die adaptive Immunantwort wurden CD4+T-Zellen, CD8+ Zellen und IgAproduzierende Plasmazellen sowie der Aktivitätsmarker CD25 untersucht. CD8+ Zellen kamen sowohl im Epithel als auch in der LP vor. Ein Großteil der Zellen, die den CD8-Corezeptor exprimieren, werden auf Grund ihrer MHC-Klasse-I-restringierten Antigenerkennung mit anschließender Sekretion zelltötender Mediatoren auch als zytotoxische TZellen bezeichnet. Die meisten CD8+ Zellen befanden sich, unabhängig von der Gruppenzugehörigkeit der untersuchten Tiere, im luminalen Epithel (Abb. 19a). Dieses Ergebnis entspricht denen aus Untersuchungen am Schwein durch andere Arbeitsgruppen (VEGA-LOPEZ et al. 1993, PABST und ROTHKÖTTER 1999, VEGA-LOPEZ et al. 2001). Im luminalen Epithel des Duodenums war der Anteil der CD8+ Zellen mit etwa einem Drittel der Gesamtzellzahl am höchsten (Abb. 24a). Insgesamt befanden sich im luminalen Bereich der Mukosa mehr CD8+ Zellen als im Bereich der Krypten (Abb. 19a-d). Eine derartige Zellverteilung könnte nach VEGA-LOPEZ et al. (1993) durch die Expression spezifischer Migrationsfaktoren verursacht sein. Anders als von VEGA-LOPEZ et al. (1993) beschrieben, waren die in der LP gelegenen CD8+ Zellen bei der vorliegenden Untersuchung nicht in der Nähe der Basalmembran konzentriert. Möglicherweise beruht diese Diskrepanz in den Ergebnissen auf einer unterschiedlichen 105 Diskussion ________________________________________________________________________________ Einordnung basalmembrannaher Zellen in die IEL- bzw. LP-Gruppe. Leider werden sowohl von VEGA-LOPEZ et al. (1993) als auch von ROTHKÖTTER et al. (1991) nur Angaben zum Anteil der IEL an der mukosalen Gesamtlymphozytenzahl und nicht zum Anteil an der Epithelgesamtzellzahl gemacht, so dass ein direkter Vergleich der Zellzahlen aus den hier durchgeführten Versuchen mit den Ergebnissen der beiden genannten Arbeiten zwecks Überprüfung dieser Hypothese nicht möglich ist. Im Vergleich der untersuchten Tiere fällt besonders im Colon ascendens ein Einfluss von in hoher Dosierung gefüttertem EcN auf die Zahl an CD8+ Zellen auf (Abb. 20d). Resttoxizität von EcN ist als Ursache für die erhöhte Anzahl an CD8+ Zellen insbesondere im Epithel der Kolonmukosa unwahrscheinlich, da beim Vorliegen einer entzündlichen Reaktion durch EcN auch andere Darmabschnitte betroffen wären. Außerdem wären auch andere Anzeichen einer Entzündung zu erwarten, wie z.B. die Rekrutierung von neutrophilen Granulozyten oder die Erhöhung der CD25-Expression von IEL als Zeichen einer Aktivierung. Es ließ sich jedoch weder eine erhöhte Zahl von neutrophilen Granulozyten (Abb.11) nachweisen, noch kamen CD25+ Zellen bei EcN-gefütterten Tieren in größerer Anzahl vor (Abb. 23). Eine mukosale Entzündungsreaktion durch EcN als Grund für eine erhöhte Zahl CD8+ Zellen ist also auszuschließen. Es ist jedoch denkbar, dass durch Verbesserung der mechanischen und immunologischen Integrität des Epithels eine Schutzfunktion auf das Epithel ausgeübt wird. EcN würde demnach durch eine vermehrte Rekrutierung CD8+ T-Zellen zur Verbesserung der intestinalen Pathogenabwehr führen. Eine erhöhte Anzahl im Kolon könnte sich auf die Prävention von Kolitiden auswirken und einen Erklärungsansatz für die von KRUIS et al. (1997) und REMBACKEN et al. (1999) beschriebene, positive EcN-Wirkung in der Remissionserhaltung der Colitis ulcerosa liefern. Des Weiteren gibt es Hinweise, dass CD8+ T-Zellen eine Aufgabe in der Aufrechterhaltung und Verbesserung der Epithelintegrität übernehmen, dabei wird besonders einer Subpopulation von CD8+ T-Zellen, den γδTCR-Zellen, eine entscheidende Rolle zugeschrieben (CHEN et al. 2002). Im Gegensatz zur Maus (GUY-GRAND et al. 1991) und zum Menschen (SPENCER et al. 1989) fehlen diese Zellen im Darmepithel des Schweins (ROTHKÖTTER et al. 1999b). Das bedeutet aber nicht zwangsläufig, dass eine Wirkung auf die Epithelintegrität beim Schwein nicht denkbar ist. Sowohl eine verbesserte Abwehrreaktion als auch eine verbesserte Epithelintegrität würde die Stabilität der „intestinalen Barriere“ erhöhen. Ob sich eine solche Hypothese bestätigen lässt, müssen weitere Untersuchungen zeigen. Zusätzlich zum Vergleich der Anzahl CD8+ Zellen zwischen den Versuchsgruppen wurde in den 106 Diskussion ________________________________________________________________________________ einzelnen Darmabschnitten der Quotient aus IEL und LPL als Maß für die unterschiedliche Konzentration an CD8+ Zellen in Epithel und LP der luminalen und basalen Mukosa ermittelt und nach Gruppen und Darmabschnitten verglichen. In der luminalen Mukosa gab es bei hoch dosierter EcN-Fütterung, anders als bei den Kontrolltieren und niedrig dosierter EcN-Fütterung, keinen signifikanten Unterschied zwischen dem Quotienten im Duodenum und dem in den restlichen Darmabschnitten (Abb. 21c). Da sich daraus im Duodenum trotz fehlender signifikanter Veränderung der Gesamtzahl an CD8+ Zellen (Abb. 20a) eine Tendenz für einen Anstieg in der luminalen LP ergibt, scheint eine Beeinflussung der Verteilung von CD8+ Zellen auch in anderen Darmabschnitten nicht unrealistisch. Mit der Untersuchung einer größeren Tierzahl könnte diese Hypothese überprüft werden. Anders als CD8+T-Zellen kamen CD4+T-Zellen nur in der Lamina propria vor. Im Epithel konnten sie nicht nachgewiesen werden. Bei Zellen, die den CD4-Corezeptor auf der Oberfläche exprimieren, handelt es sich um T-Helferzellen und T-Regulatorzellen. Eine Unterscheidung der beiden Populationen oder auch von Subpopulationen der T-Helferzellen (siehe 1.5.2.2) ist anhand der Monofärbung mit CD4-Antkörpern nicht möglich. Deshalb werden im Folgenden die sich in ihrer Aufgabe z.T. unterscheidenden Subpopulationen gemeinsam als CD4+T-Zellen diskutiert. Die Beschränkung des Vorkommens CD4+T-Zellen auf die LP wird beim Schwein auch von anderen Arbeitsgruppen beschrieben (BIANCHI et al. 1992, VEGA-LOPEZ et al. 2001). Im Unterschied dazu kommen CD4+T-Zellen beim Menschen auch im Epithel vor (LUNDQVIST et al. 1995). Bei allen untersuchten Tieren zeigten CD4+T-Zellen deutliche Unterschiede hinsichtlich ihrer Lokalisation in der Lamina propria. Im Duodenum und Jejunum waren die meisten im Kernbereich der Zotten zu finden. Damit entsprach ihre Verteilung der von VEGA-LOPEZ et al. (1993) in der Mukosa beschriebenen. Anders als dort beschrieben, war bei den in der vorliegenden Arbeit untersuchten Tieren eine Konzentration von CD4+T-Zellen in den Ileumzotten nicht zu beobachten. Die Zellen waren vielmehr gleichmäßig verteilt. Auch im Kolon kamen die CD4+T-Zellen gleichmäßig in der LP verteilt vor. Unterschiedliche Ergebnisse zur Verteilung CD4+ T-Zellen in der LP des Ileums können zum einen auf Rasseunterschiede zurück zu führen sein und, was noch wahrscheinlicher ist, auf das Alter. Die Schweine waren im vorgestellten Versuch wesentlich jünger als bei den Untersuchungen von VEGA-LOPEZ et al. (1993), wo sie ein Durchschnittsalter von 107 Diskussion ________________________________________________________________________________ sechs Monaten hatten. Es ist bekannt, dass sich die Immunzellverteilung im Darm altersabhängig verändert. Dabei sind die Unterschiede in den ersten sechs Lebensmonaten z.T. erheblich (ROTHKÖTTER et al. 1991). Die Anzahl der CD4+ Zellen wurde durch die Fütterung von EcN nicht signifikant verändert (Abb. 22). Das Ergebnis deckt sich mit den bei Hunden unter Fütterung von probiotischen Enterokokken gemachten Beobachtungen, bei denen die Zahl intestinaler CD4+T-Zellen unbeeinflusst bleibt (BENYACOUB et al. 2003). Allerdings sind die in der Literatur beschriebenen Ergebnisse zu diesem Thema nicht einheitlich. In In-vitro-Versuchen mit humanem Darmgewebe konnte nachgewiesen werden, dass die Zugabe von Laktobazillen zur Gewebskultur die Anzahl CD4+TZellen senkt (BORRUEL et al. 2002). Andererseits führt die Fütterung von verschiedenen Laktobazillenstämmen an Mäuse zu einer Erhöhung der Zahl CD4+T-Zellen im Darm (PERDIGON et al. 1999). Die unterschiedlichen Ergebnisse zum Einfluss von Probiotika auf die Zahl an CD4+TZellen in der Darmmukosa weisen auf eine spezies- oder stammspezifische Wirkung hin. Obwohl signifikante Veränderungen in den hier gemachten Versuchen fehlen, lässt sich bei den EcN-gefütterten Tieren in allen Darmabschnitten, mit Ausnahme des Colon descendens, eine tendenzielle Erniedrigung des Anteils von CD4+T-Zellen beobachten. Die tendenzielle Verminderung der T-Helferzellen in den EcN-gefütterten Gruppen könnte ein Hinweis auf eine EcN-bedingte Verringerung des Anteils an CD4+T-Zellen in der LP sein. Zumal sie konstant sowohl bei der niedrig dosierten als auch bei der hoch dosierten Gruppe auftrat. Dass der Anteil dieser Zellen, bedingt durch die Morphologie der Gewebeschnitte und das Färbeverhalten des Antikörpers, semiquantitativ bestimmt wurde (siehe 3.1.4.1), könnte dazu geführt haben, dass die eingangs in der Diskussion schon erwähnten Schwierigkeiten im Zusammenhang mit der statistischen Auswertung der Versuche noch verstärkt werden. Um eine genauere Aussage zu ermöglichen, wäre eine quantitative Zellzahlbestimmung in zukünftigen Versuchen Vorraussetzung. Durch die Verwendung von Paraffinschnitten, anstatt von Gefrierschnitten wäre z. B. eine Verringerung der Schnittdicke (2µm) und damit eine Verbesserung der mikroskopischen Zelldifferenzierung möglich. Zudem wäre eine Vergrößerung der Versuchstiergruppen zur statistischen Absicherung geringgradiger Veränderungen sinnvoll. 108 Diskussion ________________________________________________________________________________ EcN zeigt keinen Einfluss auf IgA -produzierende Plasmazellen in der Darmmukosa gesunder Schweine IgA kann besser als jedes andere Immunglobulin an Mukosaoberflächen sezerniert werden. Damit bildet es die erste Verteidigungslinie des Immunsystems. IgA-produzierende Plasmazellen kamen in der Darmmukosa in Übereinstimmung mit Angaben anderer Autoren nur in der LP und dort speziell im Bereich der Krypten vor (ROTHKÖTTER et al. 1991, BIANCHI et al. 1992). Die höchste Konzentration befand sich in der LP des Duodenums (Abb. 26). Es ergaben sich als Folge von EcN-Fütterung keine signifikanten Unterschiede in der Zahl IgA-produzierender Plasmazellen (Abb. 27). Damit lässt sich ein aus der Literatur bekannter Einfluss anderer Probiotika auf die Anzahl IgA-produzierender Plasmazellen für EcN in vivo beim gesunden Schwein nicht bestätigen. Im Unterschied zu den in der vorliegenden Studie gemachten Beobachtungen ist bekannt, dass einige Laktobazillen- und Bifidobakterienstämme die Anzahl IgA-produzierender Plasmazellen in der intestinalen LP von gesunden Mäusen erhöhen können (PERDIGON et al. 1999, PARK et al. 2002). Ergebnisse von KAILA et al. (1992) bestätigen für Laktobazillen auch im Zusammenhang mit Rotavirusinfektionen bei menschlichen Säuglingen eine gesteigerte Zahl IgA-produzierender Plasmazellen im Darm. Bei der Fütterung der probiotischen Hefe Saccharomyces boulardii an gesunde Absatzferkel erhöhte sich die Zahl der IgA+ Plasmazellen im Zottenbereich des Duodenums (VAN BRIEL 2002). Das Ausbleiben von Veränderung in der IgA+ Plasmazellzahl nach Fütterung von EcN im Vergleich zu anderen Probiotika weist erneut darauf hin, dass Probiotika nicht als eine homogene Gruppe von Mikroorganismen angesehen werden dürfen, sondern jedes Probiotikum seine Wirkungen spezies- und stammspezifisch zu erzielen scheint. PERDIGON et al. (1999) konnten zeigen, dass die Erhöhung der Zahl an IgA-produzierenden Plasmazellen dosis- und zeitabhängig erfolgt. Ob dies bei den hier untersuchten EcN-gefütterten Tieren auch der Fall war, lässt sich anhand des verwendeten Versuchsaufbaus nicht klären. Allerdings könnte die im Vergleich mit den beiden anderen Gruppen festgestellte tendenzielle Erhöhung der Zahl IgA+ Plasmazellen im Jejunum, Ileum und Kolon der niedrigdosierten EcNGruppe (Abb. 27) ein Hinweis auf eine Dosisabhängigkeit sein. 109 Diskussion ________________________________________________________________________________ EcN beeinflusst die mRNA-Expression von IL4 in der Duodenummukosa gesunder Schweine. Eine unveränderte Anzahl bei den histologisch und immunhistologisch untersuchten Zellgruppen bedeutet nicht zwingend einen fehlenden Einfluss von EcN. So können Veränderungen in den Subpopulationen der untersuchten Zellen mit den verwendeten Antikörpern nicht detektiert werden. Außerdem ist anhand der immunhistologischen Untersuchungen keine Aussage über die Zellphysiologie, z.B. die Produktion von Mediatoren, möglich. Es ist bekannt, dass Probiotika auf diese Weise Immunzellen beeinflussen können (MAASSEN et al. 2000, MADSEN et al. 2001). So konnten MAASSEN et al. (2000) zeigen, dass verschiedene Laktobazillenstämme unterschiedliche Zytokinexpressionsmuster in den Zellen der Darmzotten induzieren. MADSEN et al. konnten außerdem zeigen, dass ein Gemisch verschiedener Laktobazillenstämme (VSL#3) in der Lage ist, die erhöhte Expression von TNF-α und INF-γ im Darm von IL10-knock out Mäusen zu normalisieren. Auch für EcN ist bekannt, dass es im Dextran-Natrium Sulfat (DSS) Kolitismodell der Maus die Expression der proinflammatorischen Zytokine IFN-γ und IL6 verringert (SCHULTZ et al. 2004). Untersuchungen zur EcN-induzierten Zytokinexpression in der Mukosa des gesunden Darms fehlen jedoch bisher. Zur Bestimmung der Expressionen verschiedener Zytokin wurde deshalb in der Mukosa des Duodenums, Ileums und Kolons semiquantitative RT-PCR durchgeführt. Da sich in den histologischen und immunhistologischen Untersuchungen Hinweise ergeben hatten, dass mit einem Einfluss von EcN am wahrscheinlichsten bei hoher Dosierung zu rechnen ist, wurden nur diese Gruppe und die Kontrollgruppe untersucht. Dies gilt im Folgenden auch für die Untersuchung der Expression antimikrobieller Peptide. Nachdem die Zellzahlbestimmungen von CD4+T-Zellen kaum Hinweise auf eine Beeinflussung durch EcN erbracht hatte, wurde insbesondere die Expression von für Subpopulationen der CD4+TZellen typischen Zytokinen bestimmt, um eventuelle Verschiebungen im Gleichgewicht dieser Populationen zu detektieren. Dabei werden INF-γ und TNF-α vermehrt im Zusammenhang mit einer Th1-Antwort und IL-4 im Zusammenhang mit Th2-Antworten exprimiert (siehe 1.5.2.2). Erhöhte TGF-β und IL-10 Expression gelten als Zeichen einer durch regulatorische T-Zellen bestimmten Immunantwort (siehe 1.5.2.2). Eine Beeinflussung der untersuchten Zytokine war nur bei IL-4 zu erkennen. Die hochdosierte EcNFütterung führte im Duodenum zu einer Induktion von IL-4 (Abb. 28 +28a). Im Ileum und Kolon war kein Einfluss feststellbar. IL-4 spielt als Zytokin der Th2-Antwort im Darm eine besondere 110 Diskussion ________________________________________________________________________________ Rolle. So ist nachgewiesen, dass es sich bei CD4+T-Zellen in der Darmmukosa um antigenerfahrene Zellen handelt. Diese exprimieren im Gegensatz zu klassischen Gedächtniszellen zwar nach TCR-spezifischer Stimulation vermehrt IL-2 Rezeptoren, sezernieren aber kaum IL-2, eines der wichtigen Zytokine der initialen T-Zell-Reaktion. Stattdessen kann man eine deutliche Steigerung der IL-4 Sekretion nach spezifischer Stimulation erkennen (BAILEY et al. 1998). Werden LPL hingegen in vitro unspezifisch z.B. mit Concavalin A stimuliert, produzieren sie große Mengen an IL-2 (JAMES et al. 1990, BAILEY et al. 1994). Dieses Verhalten wird als Zeichen für eine spezielle Regulationsfunktion im stark antigenbeladenen Milieu des Darms gewertet, welches überschießende Immunreaktionen gegen ungefährliche Antigene und damit einhergehende Gewebszerstörung verhindern soll (MEUER et al. 1996). Eine erhöhte Expression von IL-4 in der LP des Duodenums EcN-gefütterter Schweine könnte ein Hinweis auf die Stimulation von Th2Zellen sein. Allerdings kann von der mRNA-Expression nicht automatisch auch auf eine vermehrte Produktion und Sekretion von IL-4-Protein geschlossen werden, so dass eine Messung der IL-4Konzentration nötig wäre, um Aussagen über die biologische Relevanz der erhöhten mRNAExpression zu erlauben. Anzeichen für eine erhöhte Aktivierung von LPL liegen bei den EcN-gefütterten Tieren nicht vor, da sich die Zahl der CD25+ Zellen in der LP nach EcN-Fütterung im Duodenum nicht verändert (Abb. 23). In jüngster Zeit gibt es aus Untersuchungen an Mäusen Hinweise darauf, dass es sich bei einem geringen Teil der T-Zellen im Darm, die in hoher Konzentration den CD4-Corezeptor und in niedriger Konzentration CD25 exprimieren (= CD4highCD25low), nicht um ruhende T-Helferzellen, sondern um eine spezielle Population regulatorischer T-Zellen handelt. Diesen Zellen soll eine hemmende Funktion in der intestinalen Immunantwort zukommen (THOMPSON und POWRIE 2004). Beim Schwein wurde eine derartige Population aber bisher noch nicht beschrieben. Da bei einer Immunzellaktivierung die Zahl der CD25+ Effektorzellen die der regulatorischen T-Zellen bei weitem übersteigt und letztere CD25 außerdem nur schwach exprimieren, kann beim Schwein nach wie vor der vermehrte Nachweis von CD25+Zellen als Zeichen einer Immunaktivierung gewertet werden. Ein Marker wie etwa das beim Menschen als Aktivierungsmaker verwendete CD69 ist zur Zeit beim Schwein nicht bekannt. 111 Diskussion ________________________________________________________________________________ EcN beeinflusst die mRNA-Expression antimikrobieller Peptide in der Darmmukosa gesunder Schweine nicht. In der vorliegenden Studie wurde die mRNA-Expression der mit dem Darmgewebe des Schweins assoziierten AMP (PR-39, Protegrine, Nk-Lysin und Prepro-Defensin β1) anhand semiquantitativer RT-PCR untersucht. PR-39 wirkt gegen gram-positive und gram-negative Bakterien. Es verhindert effektiv das Wachstum von E. coli durch Blockierung der DNA-Synthese (BOMAN et al. 1993). Obwohl PR-39 ursprünglich aus dem Darm des Schweins isoliert wurde, kann bei gesunden Tieren im Jejunum und Kolon ab dem 28. Lebenstag keine PR-39-Expression mehr nachgewiesen werden (WU et al. 1999). Anders als bei den Untersuchungen von WU et al. (1999) wurde im Duodenum und Kolon sowohl bei EcN-gefütterten Tieren als auch bei Kontrolltieren vereinzelt eine schwache Expression von PR-39 gefunden. Ein Unterschied zwischen den beiden Gruppen ergab sich hingegen nicht (Abb. 29). Im Ileum wurde PR-39 nicht exprimiert. Protegrine wurden bei keiner Gruppe in der Mukosa der untersuchten Darmabschnitte exprimiert (Abb. 29). Als Positivkontrolle für PR-39 und die Protegrine diente transmurales Mukosagewebe von drei Wochen alten Ferkeln eines anderen Versuchs. Diese Kontrollproben waren positiv, so dass eine fehlende Expression nicht auf methodische Mängel zurückzuführen war. Die Expression von NK-Lysin war in allen drei Darmabschnitten nachweisbar, zeigte aber keine Unterschiede bei hochdosiert EcN-gefütterten Tieren und Kontrolltieren (Abb. 29). Prepro-Defensin β1 war im Ileum stärker exprimiert als im Duodenum und Kolon. Ein Einfluss von EcN ließ sich aber auch hier nicht feststellen (Abb. 29). Außerdem war bei allen untersuchten Tieren, eine hohe individuelle Variabilität der Prepro-Defensin β1 Expression zu beobachten. Damit konnten In-vitro-Untersuchungen, die eine Induktion des humanen β-Defensins HBD-2 durch EcN in humanen Kolonepithelzelllinien nachweisen (WEHKAMP et al. 2002a), in vivo für das PreproDefensin β1 beim Schwein nicht bestätigt werden. EcN führt demnach in der Mukosa von gesunden Tieren nicht zu einer veränderten Expression der untersuchten AMP. Es ist aber denkbar, dass ein Einfluss auf die mukosale AMP-Expression durch EcN-Gabe nur im Zusammenhang mit intestinaler Entzündung erfolgt. Auch das Alter der Tiere könnte von Bedeutung sein. 112 Diskussion ________________________________________________________________________________ Fazit für die Fütterung von EcN an konventionell gehaltene Schweine Die EcN-Fütterung an gesunde, konventionell gehaltene Schweine zeigte keinen signifikanten Einfluss auf die Verteilung von Mastzellen und Granulozyten in der Darmmukosa. Ebenso wenig verändert sich die mRNA-Expression von IFN-γ, TNF-α, TGF-β, IL-10 und die der AMP (PreproDefensin β1, PR-39, NK-Lysin und Protegrine). Die hohe Dosierung von EcN bewirkt im Kolon eine Erhöhung des Anteils CD8+ Zellen, was eine verbesserte Epithelintegrität zur Folge haben könnte und so den Schutz vor luminalen Pathogenen erhöhen würde. Eine signifikante Veränderung des Anteils CD4+T-Zellen ist durch EcN-Fütterung nicht festzustellen. Es erfolgt jedoch eine tendenzielle Erhöhung der Zellzahl. Obwohl mit den hier verwendeten Untersuchungsmethoden keine Erhöhung der aktivierten Lymphozytenzahl gefunden wurde (CD25), zeigten sich im Duodenum Hinweise auf eine vermehrte Th2-Aktivität (erhöhte Expression von IL-4 mRNA), der eine Verschiebung des Gleichgewichts zwischen Th1 und Th2-Antwort in der Mukosa zugrunde liegen könnte. Diese Hypothese bedarf aber noch einer näheren Untersuchung und Klärung der funktionellen Relevanz. 4.3 Infektionsversuch mit und ohne EcN Wie schon eingangs der Diskussion erwähnt, wurde ein Großteil der Untersuchungen zur Wirkung von EcN an Entzündungsmodellen mit Mäusen gemacht. Den meisten dieser Modelle liegen stark inflammatorische Pathomechanismen zu Grunde (HOCKERTZ 1997, SCHULTZ et al. 2004), weshalb sich die Ergebnisse nur schlecht auf weniger immunzelldominierte Infektionen, wie z.B. ETEC-Infektionen, übertragen lassen. Außerdem sind Untersuchungen am Epithel und den epithelialen Immunmechanismen in diesen teilweise mit erheblicher Gewebsdestruktion einhergehenden Modellen nur schwer oder gar nicht möglich. Deshalb wurde EcN im zweiten Teil der vorliegenden Arbeit hinsichtlich seiner Wirkung bei bakteriellen Erkrankungen des Schweins näher charakterisiert. Dazu wurde eine Pilotstudie mit einem neuen Krankheitsmodell an abgesetzten Ferkeln durchgeführt, in dem der ETEC-Stamm E. coli „Abbotstown“ eine sekretorische Diarrhöe induziert. 113 Diskussion ________________________________________________________________________________ Methodendiskussion Für diese Pilotstudie wurden je acht Ferkel (insgesamt 16 Tiere) aus den Würfen zweier Sauen verwendet. Die acht Ferkel des einen Wurfs wurden zehn Tage lang oral mit EcN behandelt (EcN+). Die acht Ferkel des anderen Wurfs blieben unbehandelt (EcN-). Nach dem Absetzen wurden je vier Tiere aus beiden Würfen (insgesamt acht) zusätzlich mit EcA infiziert (EcN+ EcA+ bzw. EcN- EcA+) und je vier Tiere (insgesamt acht) mit Placebo behandelt (EcN+ EcA- bzw. EcNEcA-). Da es sich bei diesem, in der Pilotstudie verwendeten Tiermodell, um ein neues Infektionsmodell handelt, sollen zunächst Methodik und Versuchsaufbau kurz diskutiert werden. Die Applikation der EcN-Suspension erfolgte bei den Ferkeln nicht, wie für die Verabreichung von Bakterien üblich, per Magensonde, sondern direkt ins Maul. Eine tägliche Sondenverwendung hätte für die Tiere einen unnötigen Stressfaktor bedeutet. Die gesüßte EcN-Suspension wurde gut akzeptiert und von den Ferkeln bereitwillig aus der Spritze aufgenommen. Die Tiere wurden immer paarweise im Abstand von einem Tag abgesetzt. Daraus ergab sich eine drei Tage längere Fütterungsdauer mit EcN für die letzten Tiere. Eine nach Absetzterminen gestaffelte Fütterung von EcN konnte nicht realisiert werden, weil die Wurfgeschwister der behandelten Tiere in diesem Fall den Keim über die Umwelt, in nicht kontrollierbarer Dosis aufgenommen hätten. Um eine konstante Dosierung zu gewährleisten, wurde deshalb mit der Fütterung von EcN bei allen Tieren zum gleichen Zeitpunkt begonnen. Bei Ferkeln verändert sich das mukosale Immunsystem im Zusammenhang mit der post natalen Differenzierung in den ersten 14 Lebenstagen rapide. Die Differenzierung des Immunsystems hat sich in einem Alter von 21 Tagen aber soweit verlangsamt (BIANCHI et al. 1992), dass über einen Zeitraum von drei Tagen keine Unterschiede bezüglich des Immunstatus zu erwarten sind. Die Gruppen können somit trotz eines geringen Altersunterschiedes der Tiere von bis zu drei Tagen, hinsichtlich der Entwicklung des Darmimmunsystems als homogen angesehen werden. Die Fütterung von EcN schützt Absetzferkel vor einer EcA-induzierten Diarrhöe. Die klinische Beurteilung der Ferkel erfolgte anhand von Gewichtsüberprüfung, des Verhaltens, der Futter- und Wasseraufnahme sowie der Verschmutzung des Afterbereichs und der Kotkonsistenz. 114 Diskussion ________________________________________________________________________________ Das Durchschnittsgewicht der Ferkel war beim Absetzen in beiden Würfen homogen. Auch nach dem Absetzen und der Infektion mit EcA veränderte sich das Körpergewicht der Tiere kaum (Abb. 30a+b). Damit konnte der schon bei den Versuchen mit älteren Tiere fehlende Einfluss von EcN auf das Körpergewicht (siehe 3.1.1) ebenfalls bei Saugferkeln bestätigt werden (Abb. 30a+b). Eine direkte anabole Wirkung von EcN bei gesunden Tieren ist demnach unwahrscheinlich. Dieses Ergebnis deckt sich mit Überlegungen aus der Literatur, wonach Probiotika ihre anabolen Effekte nicht direkt sondern indirekt durch eine Verbesserung der Gesundheit erreichen, und damit verbunden zu einer konstanteren Leistung der Tiere beitragen (ROSEN 1992). Einen weiteren Anteil der klinischen Bewertung bildeten das Verhalten, sowie die Futter- und Wasseraufnahme der Tiere. In allen drei Parametern unterschieden sich die untersuchten Tiere nicht. Ferkel mit Diarrhöe aus der EcN-EcA+ Gruppe zeigten initial vier bis acht Stunden nach Infektion vor dem Einsetzen der Diarrhöe ein gedämpftes Verhalten, das sich mit Einsetzen des Durchfalls wieder normalisierte (Abb. 31). Dieser geringe Einfluss der EcA-Infektion auf das Allgemeinbefinden ist typisch für eine unkompliziert verlaufende ETEC-Infektion (KRSNIK et al. 1999). Auch in der Praxis leiden Ferkel in der Regel nicht an direkt durch E. coli hervorgerufenen Veränderungen, sondern an den Folgen der durch die Diarrhöe verursachten Exsikose (ROLLE und MAYR 2002). Bei der Kotkonsistenz und der Verschmutzung der Afterregion fielen zwei Tiere der EcN–EcA+ Gruppe durch gelblichen, pastösen bis flüssigen Durchfall auf. Dies entsprach einem Anteil an Diarrhöe erkrankter Tiere von 50 %. In der EcN+EcA+ Gruppe gab es keine Anzeichen von Durchfall, ebenso wenig wie in den beiden EcA- Gruppen (Abb. 32a+b). Diese Ergebnisse werden durch die Messungen des Wassergehaltes im Kot der Tiere bestätigt (Abb. 34). Das Fehlen einer Signifikanz bei der Erhöhung des Wassergehalts von Tieren der EcNEcA+ Gruppe lässt sich darauf zurückführen, dass nur zwei der Tiere Durchfall und somit einen deutlich erhöhten Wassergehalt im Kot hatten, die beiden anderen Tiere aber unauffällig waren. Es ergeben sich somit Hinweise, dass die prophylaktische Behandlung mit EcN zu einer verminderten Anfälligkeit von Ferkeln für EcA-bedingte Diarrhöen führt. Die histologische Untersuchung EcA-infizierter Tiere ergab, wie für eine sekretorische Diarrhöe zu erwarten, kaum inflammatorische Veränderungen. Es fiel aber auf, dass EcN-EcA+ Tiere zu einer geringgradigen Zottenverkürzung und –fusion im Jejunum neigten. EcN verhinderte eine 115 Diskussion ________________________________________________________________________________ Veränderung der Zotten bei EcA-Infektion. Das bei EcN-EcA+ Tieren gezeigte geringgradig vermehrte Vorkommen von Lymphozyten wurde durch EcN um die Hälfte verringert, und die bei EcN-EcA+ Ferkeln z.T. beobachteten leicht erhöhten Granulozytenzahlen fehlten bei EcN+EcA+ Tieren völlig (siehe 3.2.1.5). Ob EcN ursächlich die Gewebsinfiltration verringert oder durch Verdrängung des pathogenen Keims indirekt die morphologischen Veränderungen einschränkt, bleibt zu klären. Eine Herunterregulierung der intestinalen Immunreaktion im Zusammenhang mit der Abwehr eines pathogenen Keims ist allerdings unwahrscheinlich, da kontraproduktiv. Wahrscheinlicher ist eine Verdrängung von EcA durch EcN auf Grundlage des Konkurrenzprinzips. Auch ein Einfluss auf mechanische und immunologische Abwehrmechanismen des intestinalen Epithels der Ferkel ist denkbar. In der histologischen Untersuchung fand sich bei zwei der EcNgefütterten Tiere eine gering- bis mittelgradige, follikuläre und parafollikuläre Hyperplasie der Peyer’schen Platten, die bei keinem der nicht EcN-gefütterten Tiere beobachtet wurde. Ob die gemachten Beobachtungen ein Hinweis auf eine immunmodulatorische Wirkung von EcN im Darm von EcA-infizierten Ferkeln sind, müssen weitere Untersuchungen klären. EcN führt zu einer verminderten Ausscheidung von EcA bei infizierten Ferkeln. Um eine Beeinträchtigung der Darmgesundheit der Versuchstiere durch andere pathogene Erreger als EcA ausschließen zu können, wurden alle Tiere mit praxisüblichen Methoden mikrobiologisch untersucht. Alle untersuchten Ferkel waren frei von klassischen porcinen Enteritiserregern wie Lawsonia intracellularis, Brachyspira hyodysenteriae oder Salmonellen, die die Interpretation der Ergebnisse hätten beeinträchtigen können. Die bei einigen EcN+ Tieren nachgewiesenen E. coli wiesen keine Virulenzfaktoren auf. Einzig der hochgradige Clostridienbefall eines der EcN+EcA+ Tiere stellte ein Problem dar. Da dieses Tier aber keinerlei Auffälligkeiten im Vergleich mit den anderen Gruppenangehörigen zeigte, gab es keinen Grund, es aus der Studie auszuschließen. Am Versuchsende konnte EcA bei allen EcN-EcA+ Tieren aus dem Darm nachgewiesen werden. Bei EcN+EcA+ Tieren gelang der Nachweis von EcA nur bei zwei Tieren. Die Placebokontrollen waren alle EcA-negativ (Tab. 11). Die Untersuchung auf EcN ergab bei allen nicht EcN-gefütterten Tiere einen negativen Kotbefund. Es konnte aber auch im Kot von fünf der acht EcN-gefütterten Tiere bei Versuchende kein EcN nachgewiesen werden. 116 Diskussion ________________________________________________________________________________ Es ist bekannt, dass die Verabreichung von EcN an noch nicht besiedelte humane Neugeborene zu einer unterschiedlich lang anhaltenden Kolonisation führen kann (LODINOVA-ZADNIKOVA und SONNENBORN 1997). Dies gilt jedoch nur für Kinder, die direkt nach der Geburt mit EcN besiedelt wurden. Die EcN-Fütterung der Ferkel begann am 11. Lebenstag. Zu diesem Zeitpunkt ist der Darm bereits mit Bakterien besiedelt, was beim Schwein auf Grund der keimreichen Umgebung innerhalb der ersten Stunden bis wenige Tage nach der Geburt erfolgt (SCHULZE et al. 1980). Eine dauerhafte Besiedlung des Darms durch EcN ist also zu diesem Zeitpunkt nicht mehr zu erwarten. Dass EcN generell nach Fütterung im Kot von Schweinen nachweisbar ist, zeigen die Ergebnisse der drei EcN-positiven Tiere (Tab. 11) und die Ergebnisse aus dem Versuch mit konventionell gehaltenen Schweinen (Tab. 9). Bei letzteren wurde EcN allerdings zweimal am Tag verabreicht, so dass die letzte Applikation zum Zeitpunkt der Probenentnahme am Schlachttermin erst maximal 12 Stunden zurücklag. Bei den Ferkeln waren es auf Grund der täglich nur einmal stattfindenden Applikation 28 Stunden. Ferkel haben mit einer Dauer von 16 Stunden eine kurze Darmpassage. Es ist somit wahrscheinlich, dass EcN lediglich zum Zeitpunkt der Probennahme bei einigen Tieren nicht mehr in ausreichender Konzentration im Kot vorhanden war, um es erfolgreich zu detektieren. Für eine erfolgreiche Behandlung mit EcN sprechen außerdem die drei EcN-positiven Tiere und die deutlich positive Wirkung auf die Durchfallsymptomatik sowie die Histologieergebnisse. Bei weiteren Versuchen sollte aber dazu übergegangen werden, zusätzliche Kotproben während des Versuchsverlaufs zu nehmen, um Aussagen über die Kinetik von EcN im Darm der Versuchstiere machen zu können. Unter Umständen könnte eine zweimalige EcN-Applikation pro Ferkel und Tag die positiven Effekte von EcN noch verstärken. Beim Vergleich der Nachweise von EcN und EcA im Kot fällt auf, dass genau die Tiere der EcN+EcA+ Gruppe kein EcN im Kot haben, bei denen EcA nachgewiesen wurde und umgekehrt (Tab. 11). Eine große Anzahl an EcN im Darm könnte demnach den pathogenen Keim verdrängen. Eine Verringerung der Anzahl pathogener Keime durch EcN wurde von LODINOVAZADNIKOVA et al. (1997) schon für Säuglinge beschrieben. Auch andere probiotische Mikroorganismen verringern die Zahl an pathogenen Erregern wie EPEC (DAI und WALKER 1998) und Rotaviren (GAON et al. 2003) im Stuhl von Kindern. 117 Diskussion ________________________________________________________________________________ EcN beeinflusst die Plasma-IgA-Konzentration, zeigt jedoch keinen Einfluss auf die intestinale, luminale IgA-Konzentration bei EcA-infizierten Schweinen. IgA ist das wichtigste Immunglobulinmolekül zum Schutz mukosaler Oberflächen. Es wird als sekretorisches IgA (sIgA) in Form eines Dimers sezerniert. IgA kommt aber auch im Blut vor. Dort liegt es fast ausschließlich als Monomer vor (siehe 1.5.2.2). Etwa 31% des im Blut vorkommenden IgAs wird im Darm gebildet (VAERMAN et al. 1997). Bei den untersuchten Schweinen des Infektionsmodells wurden der Serum-IgA-Wert und die luminale IgA-Konzentration bestimmt. Da Nachweismethoden zur Bestimmung absoluter Konzentrationen für porcines IgA nicht zur Verfügung standen, konnten mit der verfügbaren Methode nur relative Werte ermittelt werden. Diese Werte erlaubten einen Vergleich nur zwischen den Gruppen des vorliegenden Versuchs. Ein Vergleich mit Werten anderer Arbeitsgruppen war nicht möglich (siehe 3.2.1.4). Die Konzentration des Plasma-IgAs unterschied sich nicht zwischen den EcA-infizierten und den Placebo-behandelten Tieren derselben EcN-Fütterungsgruppe. Demgegenüber war der Plasma-IgAGehalt der EcN+EcA+ Tiere deutlich niedriger als der Plasma-IgA-Gehalt der EcN-EcA+ Tiere. Zwischen den Placebo-behandelten Tieren der beiden EcN-Fütterungsgruppen ergab sich kein Unterschied für den IgA-Gehalt im Plasma (Abb. 36). Beim luminalen IgA-Gehalt konnte kein Unterschied zwischen den Gruppen festgestellt werden (Abb. 35). Die Ergebnisse für den Plasma-IgA-Gehalt bei den nicht EcA-infizierten Ferkeln stehen im Einklang mit denen für humane Säuglinge unter der Behandlung mit EcN (CUKROWSKA et al. 2002). Hingegen erscheint das Absinken der IgA-Plasmakonzentration EcN+EcA+ Tiere gegenüber der IgA-Plasmakonzentration von EcN-EcA+ Tieren zunächst paradox. Eine Erklärungsmöglichkeit besteht darin, dass das normalerweise aus dem Darmgewebe ins Blut abgegebene IgA (bis zu 31%) an Ort und Stelle zur Abwehr von EcA benötigt wird, und deshalb für das Plasma nicht mehr zur Verfügung steht. Es müsste dann im Darmgewebe vorhanden sein, da sich der luminale Gehalt an IgA nicht erhöht (Abb.35). Bei Untersuchungen an humanen Neugeborenen führt die Gabe von E. coli O83, einem apathogenen Stamm mit probiotischen Eigenschaften, anders als die Applikation von EcN im vorliegenden Versuch, zu einer Erhöhung von IgA sowohl im Serum als auch im Stuhlfiltrat (LODINOVA-ZADNIKOVA et al. 1991). Verschiedene E. coli Stämme scheinen demnach in 118 Diskussion ________________________________________________________________________________ unterschiedlichem Maße zur Aktivierung der IgA-Produktion in der Lage zu sein. Fazit für die Infektionsversuche mit und ohne EcN Im zweiten Teil der Arbeit konnte anhand einer Pilotstudie gezeigt werden, dass E. coli Nissle 1917 Ferkel zum Zeitpunkt des Absetzens vor einer EcA-induzierten Diarrhöe zu schützen vermag. Die Mechanismen, mit deren Hilfe EcN diesen positiven Effekt erzielt, sollten Gegenstand zukünftiger Untersuchungen sein. 4.4 Neue Erkenntnisse über die Wirkungsweise von EcN Im Rahmen der vorliegenden Arbeit konnten gezeigt werden, dass EcN einen Einfluss auf die Anzahl CD8+ Zellen in der Darmmukosa gesunder Schweine hat. Die Wirksamkeit von EcN kann deshalb nicht alleine durch die Verdrängung pathogener Keime unter Infektionsdruck erklärt werden. Die Erhöhung der Zahl CD8+ Zellen im Colon ascendens gesunder Schweine ist ein Hinweis darauf, dass durch EcN unabhängig von einer Infektion Abwehrmechanismen des Wirtes aktiviert werden. Ob es sich dabei um eine direkt Interaktion zwischen EcN und der Darmmukosa oder um eine indirekte Einflussnahme durch Veränderung der Zusammensetzung der inhärenten Darmflora handelt, müssen weitere Untersuchungen klären. Die Pilotstudie zur Wirksamkeit von EcN im ETEC-Infektionsmodell beim Absetzferkel zeigte, dass EcN eine EcA-induzierte Diarrhöe wirksam verhindert. Ob dieser positive Effekt auf einer reinen Verdrängung des pathogenen durch den probiotischen E. coli beruht, kann anhand dieser Ergebnisse nicht beantwortet werden. Ein direkter oder indirekter Einfluss von EcN auf das Darmimmunsystem scheint aber unter Berücksichtigung der Ergebnissen bei gesunden Schweinen nicht ausgeschlossen. Da es sich bei der Diarrhöe im neu etablierten EcA-Infektionsmodell um eine sekretorische Diarrhöe mit erhaltener Epithelintegrität handelt, bietet sich in Zukunft die Möglichkeit in vivo am Schwein weiter Untersuchungen zur EcN Wirkung auf die Darmbarriere durchzuführen. 119 Zusammenfassung ________________________________________________________________________________ 5 Zusammenfassung Swantje Duncker: Auswirkungen von oral verabreichtem Escherichia coli Nissle 1917 auf das darmassoziierte Immunsystem des Schweins Über die Wirkmechanismen probiotischer Mikroorganismen ist bisher wenig bekannt. Es gibt nur wenige Hinweise darüber, wie einer der ältesten therapeutisch verwendeten Probiotikastämme, das gram-negative E. coli Bakterium Nissle 1917 (EcN), seine positiven Effekte erzielt. Diese Ergebnisse stammen zudem meist aus In-vitro-Untersuchungen. Die wenigen vorhandenen In-vivoExperimente wurden fast ausschließlich an kleinen Labornagern durchgeführt. Diese Arbeit soll dazu beitragen, die Wirkung von EcN auf die Immunzellverteilung und mRNA-Expression von Zytokinen und antimikrobiellen Peptiden in der Darmmukosa gesunder Schweine zu klären, und die Auswirkung der EcN-Fütterung im ETEC-Infektionsmodell bei Absetzferkeln zu untersuchen. Es wurden zunächst 15 junge Schweine (Gewicht 16 ± 2,7 kg) in Gruppen zu je fünf Tieren über drei Wochen mit 109 KBE/d, 1011 KBE/d oder Placebo gefüttert. Nach der Tötung wurden Gewebeproben aus verschiedenen Darmabschnitten histologisch (Granulozyten und Mastzellen) und immunhistologisch (CD4, CD8, CD25 und IgA) auf die Verteilung von Immunzellen untersucht. Mit RT-PCR erfolgte die Bestimmung der mRNA-Expression verschiedener Zytokine (IFN-γ, TNF-α, TGF-β, IL-4 und IL-10) sowie antimikrobieller Peptide (Prepro-Defensin β1, Protegrine, PR-39 und NK-Lysin). In einem zweiten Versuch wurden von acht Absetzferkeln nach vorheriger zehntägiger EcN-Gabe (1010 KBE/d) und acht unbehandelten Tieren jeweils vier an zwei aufeinanderfolgenden Tagen mit Escherichia coli „Abbotstown“ (EcA) infiziert. Es erfolgte eine klinische Beurteilung des Krankheitsverlaufs, mikrobiologische Kotuntersuchungen und eine Bestimmung des Serum- und luminalen IgA-Gehalts. Die Verteilung der Immunzellen in der Darmschleimhaut gesunder Schweine entsprach der von anderen Autoren beschriebenen. Eosinophile Granulozyten wiesen die geringste Konzentration im Kolon und die höchste im Ileum auf. Neutrophile Granulozyten und Mastzellen kamen in allen Darmabschnitten nur in geringer Anzahl und basophile Granulozyten überhaupt nicht vor. Bei keiner der untersuchten Zellgruppen des angeborenen Immunsystems ließen sich Veränderungen 120 Zusammenfassung ________________________________________________________________________________ durch EcN-Fütterung feststellen. Anders verhielt es sich bei Zellen des adaptiven Immunsystems. Die Zahl CD8+ Zellen im Epithel des Colon ascendens war in der hochdosiert gefütterten EcNGruppe signifikant höher als bei Kontrolltieren, was eine verbesserte Abwehrbereitschaft im Epithel zur Folge haben könnte und so den Schutz vor luminalen Pathogenen erhöhen würde. Mit Ausnahme einer Erhöhung der mRNA-Expression von IL-4 im Duodenum hochdosiert EcNgefütterter Schweine lies sich kein Einfluss auf die mRNA-Expression der untersuchten Zytokine und antimikrobiellen Peptide erkennen. Die funktionelle Relevanz der vermehrten IL-4 mRNAExpression im Ileum muss erst noch untersucht werden. Sie könnte ein Hinweis auf eine Verschiebung des Gleichgewichts der T-Helfer-Zellen in der Darmmukosa in Richtung Th2Antwort sein. Im Infektionsmodell vermag eine zehntägige Prophylaxe mit EcN die Tiere zum Zeitpunkt des Absetzens vor einer EcA-induzierten Diarrhöe zu schützen. Im Rahmen der vorliegenden Arbeit wurden Hinweise erbracht, dass die Wirkung von EcN nicht, wie häufig vermutet wurde, nur auf einer Verdrängung pathogener Keime beruht. Die Erhöhung der Zahl CD8+ Zellen im Colon ascendens gesunder Schweine legt nahe, dass ein Informationsaustausch zwischen Darmmukosa und dem probiotischen Keim erfolgt, der auch Abwehrmechanismen des Wirtes aktiviert. Die Entwicklung einer Diarrhöe bei erhaltener Epithelzellintegrität im EcA-Infektionsmodell bietet die Möglichkeit, Untersuchungen zur EcN Wirkung auf die Darmbarriere in Zukunft auch in vivo durchzuführen. 121 Summary ________________________________________________________________________________ 6 Summary Swantje Duncker: The effects of orally administered Escherichia coli Nissle 1917 on the gutassociated-lymphoid-tissue of the pigs. The mechanisms used by probiotic microorganisms to achieve their beneficial effects have not yet been elucidated. There is only partial knowledge how one of the oldest used probiotic strain E. coli Nissle 1917 (EcN) influences the host. Most investigations were done by in vitro experiments. The few in vivo experiment, were mostly carried out in rodents. It was the aim of the present study to gain a better knowledge about the effects of EcN on the distribution of immune cells, the cytokine expression and the expression of antimicrobial peptides in the intestinal mucosa of healthy young pigs. Further more the influence of EcN on an ETEC-infection model in weaned piglets should be investigated. Fifteen young pigs (weight 16 ± 2,7 kg ) were divided into three groups of five animals each. They were either fed with 109 CFU EcN/d, 1011 CFU EcN/d or placebo for three weeks. Following stunning and exsanguination tissue samples were taken and histological (granulocytes and mast cells) and immunohistochemical (CD4, CD8, CD25 and IgA) investigations of immune cell distribution in the intestinal mucosa were performed. The mRNA expression of cytokines (IFN-γ, TNF-α, TGF-β, IL-4 and IL-10) and antimicrobial peptides (prepro-defensine β1, protegrine, PR-39 and NK-lysin) were analyzed by RT-PCR. The second experiment focused on the influence of EcN in a piglet infection model with E. coli “Abbotstown” (EcA). For that purpose eight animals were fed with 1010 CFU EcN/d for ten days. Eight other piglets served as control. Four animals of each group were subsequently infected with EcA on two consecutive days. The clinical symptoms were recorded, feces microbiology was investigated and serum- and intestinal luminal IgA concentration were analyzed. The general distribution of immune cells in the pigs intestine confirmed results achieved by other groups. Eosinophils were less concentrated in the colon compared to the ileum, which harbors the highest number of eosinophils in the porcine intestine. Neutrophiles and mast cells were equally distributed in small numbers, but basophiles were absent. In none of the investigated cells, 122 Summary ________________________________________________________________________________ associated with the innate immune system, changes were detected following EcN treatment. The results for cells of the adaptive immune system were different. The number of CD8+ in the epithelium of the ascending colon was significantly higher in pigs fed high doses EcN than in controls. This may contribute to higher resistance of these animals to luminal pathogens. The investigation of cytokine- and antimicrobial peptide-mRNA-expression showed no differences between feeding groups except IL4. The IL-4 mRNA-expression was increased in the duodenum of high doses EcN-fed animals. To clarify the functional relevance of these findings further investigations are necessary. A shift in IL-4 mRNA-expression might be due to a shift in T-helper cell balance towards a Th2 response. In response to ten days prophylactic administration of EcN the incidence of diarrhea in EcA infected piglets decreased. The EcN treatment therefore seems capable of protecting piglets from EcA-induced diarrhea around weaning. From the present study it may be concluded that the effects of EcN are not limited to the displacement of pathogenic microorganisms in the intestine, even though this may play an important role in intestinal defense. The increase of CD8+ cells in the ascending colon of healthy pigs suggests an influence of EcN on the epithelial part of the intestinal barrier and thereby on the adaptive immunity of the host. The new EcA-infection model gives an appropriate basis to further investigate the influence of EcN on the intestinal barrier in vivo. 123 Literaturverzeichnis ________________________________________________________________________________ 7 Literaturverzeichnis 2000 Report of the Scientific Committee on Animal Nutrition on the assessment under directive 87/153/EEC of the efficiacy of micro-organisms used as food additives. (http://europa.eu.int/comm/food/fs/sc/scan/out40_en.pdf) 9 Seiten Europäische Union, vom 18. Feb. 2000 Europa - Food Safety - Scientific Committee on Animal Nutrition (http://europa.eu.int/comm/food/fs/sc/scan/index_en.html) 2003 Opinion on the use of certain micro-organisms as additives in feedingstuffs. (http://europa.eu.int/comm/food/fs/sc/scan/out93_en.pdf) 8 Seiten Europäische Union, vom 25. Apr. 2003 Europa - Food Safety - Scientific Committee on Animal Nutrition (http://europa.eu.int/comm/food/fs/sc/scan/index_en.html) ABBAS, A. K. u. A. H. LICHTMAN (2003): Cellular and Molecular Immunology. 5. Aufl. Verlag Saunders, Philadelphia ABBOTT, A. (2004): Microbiology: gut reaction. Nature 427, 284-286 ABE, F.; N. ISHIBASHI u. S. SHIMAMURA (1995): Effect of administration of bifidobacteria and lactic acid bacteria to newborn calves and piglets. J. Dairy Sci. 78, 2838-2846 ADLERBERTH, I.; S. AHRNE; M. L. JOHANSSON; G. MOLIN; L. A. HANSON u. A. E. WOLD (1996): A mannose-specific adherence mechanism in Lactobacillus plantarum conferring binding to the human colonic cell line HT-29. Appl. Environ. Microbiol. 62, 2244-2251 AGERBERTH, B.; J. Y. LEE; T. BERGMAN; M. CARLQUIST; H. G. BOMAN; V. MUTT u. H. JORNVALL (1991): Amino acid sequence of PR-39. Isolation from pig intestine of a new member of the family of proline-arginine-rich antibacterial peptides. Eur. J. Biochem. 202, 849-854 124 Literaturverzeichnis ________________________________________________________________________________ ALAK, J. I.; B. W. WOLF; E. G. MDURVWA; G. E. PIMENTEL-SMITH; S. KOLAVALA; H. ABDELRAHMAN u. V. SUPPIRAMANIAM (1999): Supplementation with Lactobacillus reuteri or L. acidophilus reduced intestinal shedding of cryptosporidium parvum oocysts in immunodeficient C57BL/6 mice. Cell Mol. Biol. (Noisy. -le-grand) 45, 855-863 ALEXOPOULOS, C.; I. E. GEORGOULAKIS; A. TZIVARA; C. S. KYRIAKIS; A. GOVARIS u. S. C. KYRIAKIS (2004): Field evaluation of the effect of a probiotic-containing Bacillus licheniformis and Bacillus subtilis spores on the health status, performance, and carcass quality of grower and finisher pigs. J. Vet. Med. A Physiol. Pathol. Clin. Med. 51, 306-312 ALLEN, S. J., B. OKOKO, E. MARTINEZ, G. GREGORIO u. L. F. DANS (2004) Probiotics for treating infectious diarrhoea. Cochrane. Database. Syst. Rev. 2, CD003048 ALTENHOEFER, A.; S. OSWALD; U. SONNENBORN; C. ENDERS; J. SCHULZE; J. HACKER u. T. A. OELSCHLAEGER (2004): The probiotic Escherichia coli strain Nissle 1917 interferes with invasion of human intestinal epithelial cells by different enteroinvasive bacterial pathogens. FEMS Immunol. Med. Microbiol. 40, 223-229 ANDERSSON, M.; H. GUNNE; B. AGERBERTH; A. BOMAN; T. BERGMAN; R. SILLARD; H. JORNVALL; V. MUTT; B. OLSSON; H. WIGZELL u. . (1995): NK-lysin, a novel effector peptide of cytotoxic T and NK cells. Structure and cDNA cloning of the porcine form, induction by interleukin 2, antibacterial and antitumour activity. EMBO J. 14, 1615-1625 ANDREU, D. u. L. RIVAS (1998): Animal antimicrobial peptides: an overview. Biopolymers 47, 415-433 BAGGIOLINI, M.; F. BOULAY; J. A. BADWAY u. J. W. CURNUTTE (1993): Activation of neutrophile leukocytes: chemoattractant receptor and respiratory burst. FASEB J. 7, 1004-1011 BAILEY, M.; L. HALL; P. W. BLAND u. C. R. STOKES (1994): Production of cytokines by lymphocytes from spleen, mesenteric lymph node and intestinal lamina propria of pigs. Immunology 82, 577-583 BAILEY, M.; F. PLUNKETT; A. CLARKE; D. STURGESS; K. HAVERSON u. C. STOKES (1998): Activation of T cells from the intestinal lamina propria of the pig. Scand. J. Immunol. 48, 177-182 125 Literaturverzeichnis ________________________________________________________________________________ BANASAZ, M.; E. NORIN; R. HOLMA u. T. MIDTVEDT (2002): Increased enterocyte production in gnotobiotic rats mono-associated with Lactobacillus rhamnosus GG. Appl. Environ. Microbiol. 68, 3031-3034 BANKS, C.; A. BATEMAN; R. PAYNE; P. JOHNSON u. N. SHERON (2003): Chemokine expression in IBD. Mucosal chemokine expression is unselectively increased in both ulcerative colitis and Crohn's disease. J. Pathol. 199, 28-35 BAUM, B.; E. M. LIEBLER-TENORIO; M. L. ENSS; J. F. POHLENZ u. G. BREVES (2002): Saccharomyces boulardii and bacillus cereus var. Toyoi influence the morphology and the mucins of the intestine of pigs. Z. Gastroenterol. 40, 277-284 BENNO, Y. u. T. MITSUOKA (1992): Impact of Bifidobacterium longum on human fecal microflora. Microbiol. Immunol. 36, 683-694 BENYACOUB, J.; G. L. CZARNECKI-MAULDEN; C. CAVADINI; T. SAUTHIER; R. E. ANDERSON; E. J. SCHIFFRIN u. W. T. VON DER (2003): Supplementation of food with Enterococcus faecium (SF68) stimulates immune functions in young dogs. J. Nutr. 133, 1158-1162 BERNET, M. F.; D. BRASSART; J. R. NEESER u. A. L. SERVIN (1993): Adhesion of human bifidobacterial strains to cultured human intestinal epithelial cells and inhibition of enteropathogen-cell interactions. Appl. Environ. Microbiol. 59, 4121-4128 BIANCHI, A. T.; R. J. ZWART; S. H. JEURISSEN u. H. W. MOONEN-LEUSEN (1992): Development of the B- and T-cell compartments in porcine lymphoid organs from birth to adult life: an immunohistological approach. Vet. Immunol. Immunopathol. 33, 201-221 BISCHOFF, S. C. (1994): Humane basophile Granulozyten und Mastzellen: Vermittler zwischen allergischer Entzündung und spezifischem Immunsystem. Immun. Infekt. 22, 93-103 BISCHOFF, S. C. u. C. A. DAHINDEN (1992): Effect of nerve growth factor on the release of inflammatory mediators by mature human basophils. Blood 79, 2662-2669 126 Literaturverzeichnis ________________________________________________________________________________ BISCHOFF, S. C.; G. SELLGE; A. LORENTZ; W. SEBALD; R. RAAB u. M. P. MANNS (1999): IL-4 enhances proliferation and mediator release in mature human mast cells. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 96, 8080-8085 BISCHOFF, S. C.; G. SELLGE; M. P. MANNS u. A. LORENTZ (2001): Interleukin-4 induces a switch of human intestinal mast cells from proinflammatory cells to Th2type cells. Int. Arch. Allergy Immunol. 124, 151-154 BISCHOFF, S. C.; J. WEDEMEYER; A. HERRMANN; P. N. MEIER; C. TRAUTWEIN; Y. CETIN; H. MASCHEK; M. STOLTE; M. GEBEL u. M. P. MANNS (1996): Quantitative assessment of intestinal eosinophils and mast cells in inflammatory bowel disease. Histopathology 28, 1-13 BLEDAY, R.; J. BRAIDT; K. RUOFF; P. C. SHELLITO u. F. W. ACKROYD (1993): Quantitative cultures of the mucosal-associated bacteria in the mechanically prepared colon and rectum. Dis. Colon Rectum 36, 844-849 BLEICHNER, G.; H. BLEHAUT; H. MENTEC u. D. MOYSE (1997): Saccharomyces boulardii prevents diarrhea in critically ill tube-fed patients. A multicenter, randomized, double-blind placebo-controlled trial. Intensive Care Med. 23, 517-523 BLUM, G.; R. MARRE u. J. HACKER (1995): Properties of Escherichia coli strains of serotype O6. Infection 23, 234-236 BLUM-OEHLER, G.; S. OSWALD; K. EITELJORGE; U. SONNENBORN; J. SCHULZE; W. KRUIS u. J. HACKER (2003): Development of strain-specific PCR reactions for the detection of the probiotic Escherichia coli strain Nissle 1917 in fecal samples. Res. Microbiol. 154, 59-66 BOMAN, H. G.; B. AGERBERTH u. A. BOMAN (1993): Mechanisms of action on Escherichia coli of cecropin P1 and PR-39, two antibacterial peptides from pig intestine. Infect. Immun. 61, 2978-2984 BORRUEL, N.; M. CAROL; F. CASELLAS; M. ANTOLIN; F. DE LARA; E. ESPIN; J. NAVAL; F. GUARNER u. J. R. MALAGELADA (2002): Increased mucosal tumour necrosis factor alpha production in Crohn's disease can be downregulated ex vivo by probiotic bacteria. Gut 51, 659-664 127 Literaturverzeichnis ________________________________________________________________________________ BOUDEAU, J.; A. L. GLASSER; S. JULIEN; J. F. COLOMBEL u. A. DARFEUILLEMICHAUD (2003): Inhibitory effect of probiotic Escherichia coli strain Nissle 1917 on adhesion to and invasion of intestinal epithelial cells by adherent-invasive E. coli strains isolated from patients with Crohn's disease. Aliment. Pharmacol. Ther. 18, 45-56 BOUHNIK, Y.; P. POCHART; P. MARTEAU; G. ARLET; I. GODEREL u. J. C. RAMBAUD (1992): Fecal recovery in humans of viable Bifidobacterium sp ingested in fermented milk. Gastroenterology 102, 875-878 BOURLIOUX, P.; B. KOLETZKO; F. GUARNER u. V. BRAESCO (2003): The intestine and its microflora are partners for the protection of the host: report on the Danone Symposium "The Intelligent Intestine," held in Paris, June 14, 2002. Am. J. Clin. Nutr. 78, 675-683 BRANDTZAEG, P. (1996): The human intestinal immune system: basic cellular and humoral mechanisms. Baillieres Clin. Rheumatol. 10, 1-24 BRANDTZAEG, P. u. K. BAKLIEN (1980): Immunohistochemical studies of the immunoglobulin-producing cell systems of the human intestinal mucosa. Acta Histochem. Suppl 21, 105-119 BRANDTZAEG, P.; T. S. HALSTENSEN; K. KETT; P. KRAJCI; D. KVALE; T. ROGNUM; H. SCOTT u. L. SOLLID (1989): Immunobiology and immunopathologie of human gut mucosa: humoral immunity and intraepithelial lymphocytes. Gastroenterology 97, 1562-1584 BRANDTZAEG, P.; L. M. SOLLID; P. S. THRANE; D. KVALE; K. BJERKE; H. SCOTT; K. KETT u. T. O. ROGNUM (1988): Lymphoepithelial interactions in the mucosal immune system. Gut 29, 1116-1130 BREVES, G.; K. FAUL; B. SCHRODER; H. HOLST; W. F. CASPARY u. J. STEIN (2000a): Application of the colon-simulation technique for studying the effects of Saccharomyces boulardii on basic parameters of porcine cecal microbial metabolism disturbed by clindamycin. Digestion 61, 193-200 128 Literaturverzeichnis ________________________________________________________________________________ BREVES, G.; C. WALTER; M. BURMESTER u. B. SCHROEDER (2000b): In vitro studies on the effects of Saccharomyces boulardii and Bacillus cereus var. toyoi on nutrient transport in pig jejunum. J. Anim Physiol Anim Nutr. (Berl) 84, 9-20 BROWN, P. J. u. F. J. BOURNE (1976): Distributions of immunoglobulin-containing cells in alimentary tract, spleen, and mesenteric lymph node of the pig demonstrated by peroxidase-conjugated antiserums to porcine immunoglobulins G, A, and M. Am. J. Vet. Res. 37, 9-13 BRUNNER, T.; C. H. HEUSSER u. C. A. DAHINDEN (1993): Human peripheral blood basophils primed by interleukin 3 (IL-3) produce IL-4 in response to immunoglobulin E receptor stimulation. J. Exp. Med. 177, 605-611 BRY, L.; P. G. FALK; T. MIDTVEDT u. J. I. GORDON (1996): A model of host-microbial interactions in an open mammalian ecosystem. Science 273, 1380-1383 CARRE, C. (1887): Über Antagonisten unter den Bakterien. Korrespondenz-Blatt für Schweizer Ärzte 17, 385-392 CHANG, S. K.; A. F. DOHRMAN; C. B. BASBAUM; S. B. HO; T. TSUDA; N. W. TORIBARA; J. R. GUM u. Y. S. KIM (1994): Localization of mucin (MUC2 and MUC3) messenger RNA and peptide expression in human normal intestine and colon cancer. Gastroenterology 107, 28-36 CHEN, Q.; S. Y. YU; H. SHEN; Y. X. WANG u. M. WU (2003): Pathogenic mechanisms of enterotoxigenic Escherichia coli in guinea pigs (Abstract). Di Yi. Jun. Yi. Da. Xue. Xue. Bao. 23, 826-829 CHEN, Y.; K. CHOU; E. FUCHS; W. L. HAVRAN u. R. BOISMENU (2002): Protection of the intestinal mucosa by intraepithelial gamma delta T cells. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 99, 14338-14343 CHRISTENSEN, H. R.; H. FROKIAER u. J. J. PESTKA (2002): Lactobacilli differentially modulate expression of cytokines and maturation surface markers in murine dendritic cells. J. Immunol. 168, 171-178 129 Literaturverzeichnis ________________________________________________________________________________ COATES, M. E. (1980): The gut microflora and growth. Verlag Butterworth, London, S. 175-183 CUKROWSKA, B.; R. LODINOVA-ZADNIKOVA; C. ENDERS; U. SONNENBORN; J. SCHULZE u. H. TLASKALOVA-HOGENOVA (2002): Specific proliferative and antibody responses of premature infants to intestinal colonization with nonpathogenic probiotic E. coli strain Nissle 1917. Scand. J. Immunol. 55, 204-209 DAI, D. u. W. A. WALKER (1998): Role of bacterial colonization in neonatal necrotizing enterocolitis and its prevention. Zhonghua Min Guo. Xiao. Er. Ke. Yi. Xue. Hui. Za Zhi. 39, 357-365 DE ROOS, N. M. u. M. B. KATAN (2000): Effects of probiotic bacteria on diarrhea, lipid metabolism, and carcinogenesis: a review of papers published between 1988 and 1998. Am. J. Clin. Nutr. 71, 405-411 DIAMOND, G. u. C. L. BEVINS (1998): beta-Defensins: endogenous antibiotics of the innate host defense response. Clin. Immunol. Immunopathol. 88, 221-225 DROCHNER, W. (1993): Digestion of carbohydrates in the pig. Arch. Anim. Nutr. 43, 95-116 DUCLUZEAU, R. (1985): Implantation and development of the gut flora in the newborn piglet. Pig News Inf. 6, 415-418 DVORAK, A. M.; T. FURITSU; L. LETOURNEAU; T. ISHIZAKA u. S. J. ACKERMAN (1991): Mature eosinophils stimulated to develop in human cord blood mononuclear cell cultures supplemented with recombinant human interleukin-5. Part I. Piecemeal degranulation of specific granules and distribution of Charcot-Leyden crystal protein. Am. J. Pathol. 138, 69-82 ERJEFALT, J. S.; L. GREIFF; M. ANDERSSON; E. ADELROTH; P. K. JEFFERY u. C. G. PERSSON (2001): Degranulation patterns of eosinophil granulocytes as determinants of eosinophil driven disease. Thorax 56, 341-344 130 Literaturverzeichnis ________________________________________________________________________________ ESTRADA-GARCIA, M. T.; Z. D. JIANG; J. ADACHI; J. J. MATHEWSON u. H. L. DUPONT (2002): Intestinal immunoglobulin a response to naturally acquired enterotoxigenic Escherichia coli in US travelers to an endemic area of Mexico. J. Travel. Med. 9, 247-250 FANARO, S.; R. CHIERICI; P. GUERRINI u. V. VIGI (2003): Intestinal microflora in early infancy: composition and development. Acta Paediatr. Suppl 91, 48-55 FANG, H.; T. ELINA; A. HEIKKI u. S. SEPPO (2000): Modulation of humoral immune response through probiotic intake. FEMS Immunol. Med. Microbiol. 29, 47-52 FERGUSON, A. (1976): Models of intestinal hypersensitivity. Clin. Gastroenterol. 5, 271-288 FERGUSON, A. (1977): Intraepithelial lymphocytes of the small intestine. Gut 18, 921-937 FOX, S. M. (1988): Probiotics: Intestinal inoculans for production animals. Vet. Med. (Praha) 83, 806-830 FUJIHASHI, K.; T. TAGUCHI; J. R. MCGHEE u. J. H. ELDRIDGE (1990): Regulatory function of murine intraepithelial lymphocytes. Two subsets of CD3+ T cell receptor-1+ intraepithelial lymphocyte T cells abrogate oral tolerance. J. Immunol. 145, 2010-2019 FUJIWARA, S.; H. HASHIBA; T. HIROTA u. J. F. FORSTNER (1997): Proteinaceous factor(s) in culture supernatant fluids of bifidobacteria which prevents the binding of enterotoxigenic Escherichia coli to gangliotetraosylceramide. Appl. Environ. Microbiol. 63, 506-512 FULLER, R. (1989): Probiotics in man and animals. J. Appl. Bacteriol. 66, 365-378 FULLER, R.; P. A. BARROW u. B. E. BROOKER (1978): Bacteria associated with gastric epithelium of neonatal pigs. Appl. Environ. Microbiol. 35, 582-591 131 Literaturverzeichnis ________________________________________________________________________________ GALLI, S. J.; J. R. GORDON u. B. K. WERSHIL (1993): Mast cell cytokines in allergy and inflammation. Agents Actions Suppl 43, 209-220 GALLI, S. J. u. B. K. WERSHIL (1996): The two faces of the mast cell. Nature 381, 21-22 GANZ, T. (1999): Defensins and host defense. Science 286, 420-421 GANZ, T. u. R. I. LEHRER (1995): Defensins. Pharmacol. Ther. 66, 191-205 GAON, D.; H. GARCIA; L. WINTER; N. RODRIGUEZ; R. QUINTAS; S. N. GONZALEZ u. G. OLIVER (2003): Effect of Lactobacillus strains and Saccharomyces boulardii on persistent diarrhea in children. Medicina (B Aires) 63, 293-298 GARCIA-LAFUENTE, A.; M. ANTOLIN; F. GUARNER; E. CRESPO u. J. R. MALAGELADA (2001): Modulation of colonic barrier function by the composition of the commensal flora in the rat. Gut 48, 503-507 GÄRTNER, H.; E. LOHE u. P. DITTMAR (1973): Untersuchung über die Darmflora von Hausschweinen und über ihre Beeinflußbarkeit. Dtsch. tierärztl. Wochenschr. 80, 125-131 GAUCHAT, J. F.; S. HENCHOZ; G. MAZZEI; J. P. AUBRY; T. BRUNNER; H. BLASEY; P. LIFE; D. TALABOT; L. FLORES-ROMO; J. THOMPSON u. . (1993): Induction of human IgE synthesis in B cells by mast cells and basophils. Nature 365, 340-343 GEBHARDT, T.; G. SELLGE; A. LORENTZ; R. RAAB; M. P. MANNS u. S. C. BISCHOFF (2002): Cultured human intestinal mast cells express functional IL-3 receptors and respond to IL-3 by enhancing growth and IgE receptor-dependent mediator release. Eur. J. Immunol. 32, 2308-2316 132 Literaturverzeichnis ________________________________________________________________________________ GEDEK, B. R. (1987): Mikrobielle Leistungsförderer in der Schweinefütterung. Verlag Niederösterreichische Landes-Landwirtschaftskammer, Wien, S. 13-32 GIONCHETTI, P.; F. RIZZELLO; U. HELWIG; A. VENTURI; K. M. LAMMERS; P. BRIGIDI; B. VITALI; G. POGGIOLI; M. MIGLIOLI u. M. CAMPIERI (2003): Prophylaxis of pouchitis onset with probiotic therapy: a double-blind, placebo-controlled trial. Gastroenterology 124, 1202-1209 GIONCHETTI, P.; F. RIZZELLO; A. VENTURI; P. BRIGIDI; D. MATTEUZZI; G. BAZZOCCHI; G. POGGIOLI; M. MIGLIOLI u. M. CAMPIERI (2000): Oral bacteriotherapy as maintenance treatment in patients with chronic pouchitis: a double-blind, placebo-controlled trial. Gastroenterology 119, 305-309 GLEICH, G. J.; S. MOTOJIMA; E. FRIGAS; G. M. KEPHART; T. FUJISAWA u. L. P. KRAVIS (1987): The eosinophilic leukocyte and the pathology of fatal bronchial asthma: evidence for pathologic heterogeneity. J. Allergy Clin. Immunol. 80, 412-415 GOODMAN, T. u. L. LEFRANCOIS (1988): Expression of the gamma-delta T-cell receptor on intestinal CD8+ intraepithelial lymphocytes. Nature 333, 855-858 GRONLUND, M. M.; H. ARVILOMMI; P. KERO; O. P. LEHTONEN u. E. ISOLAURI (2000): Importance of intestinal colonisation in the maturation of humoral immunity in early infancy: a prospective follow up study of healthy infants aged 0-6 months. Arch. Dis. Child Fetal Neonatal Ed 83, F186-F192 GUARNER, F. u. J. R. MALAGELADA (2003): Gut flora in health and disease. Lancet 361, 512-519 GUPTA, P.; H. ANDREW; B. S. KIRSCHNER u. S. GUANDALINI (2000): Is lactobacillus GG helpful in children with Crohn's disease? Results of a preliminary, open-label study. J. Pediatr. Gastroenterol. Nutr. 31, 453-457 GUY-GRAND, D.; O. AZOGUI; S. CELLI; S. DARCHE; M. C. NUSSENZWEIG; P. KOURILSKY u. P. VASSALLI (2003): Extrathymic T cell lymphopoiesis: ontogeny and contribution to gut intraepithelial lymphocytes in athymic and euthymic mice. J. Exp. Med. 197, 333-341 133 Literaturverzeichnis ________________________________________________________________________________ GUY-GRAND, D.; N. CERF-BENSUSSAN; B. MALISSEN; M. MALASSIS-SERIS; C. BRIOTTET u. P. VASSALLI (1991): Two gut intraepithelial CD8+ lymphocyte populations with different T cell receptors: a role for the gut epithelium in T cell differentiation. J. Exp. Med. 173, 471-481 HACKER, J., U. DOBRINDT u. L. EMÖDY (2000): Wie Bakterien kommunizieren: Quorum sensing und Crosstalk in bakteriellen Lebensgemeinschaften. Verlag Alfred Nissle Gesellschaft, Hagen, S. 73-81 HAENEL, H. (1969): Neuere Auffassung zur Zusammensetzung, Wirkung und Bedeutung der intestinalen Mikroflora. Internist (Berl) 10, 279-283 HALLER, D.; S. BLUM; C. BODE; W. P. HAMMES u. E. J. SCHIFFRIN (2000a): Activation of human peripheral blood mononuclear cells by nonpathogenic bacteria in vitro: evidence of NK cells as primary targets. Infect. Immun. 68, 752-759 HALLER, D.; C. BODE; W. P. HAMMES; A. M. PFEIFER; E. J. SCHIFFRIN u. S. BLUM (2000b): Non-pathogenic bacteria elicit a differential cytokine response by intestinal epithelial cell/leucocyte co-cultures. Gut 47, 79-87 HALSTENSEN, T. S.; H. SCOTT u. P. BRANDTZAEG (1990): Human CD8+ intraepithelial T lymphocytes are mainly CD45RA-RB+ and show increased coexpression of CD45R0 in celiac disease. Eur. J. Immunol. 20, 1825-1830 HASKARD, C.; C. BINNION u. J. AHOKAS (2000): Factors affecting the sequestration of aflatoxin by Lactobacillus rhamnosus strain GG. Chem. Biol. Interact. 128, 39-49 HATCHER, G. E. u. R. S. LAMBRECHT (1993): Augmentation of macrophage phagocytic activity by cell-free extracts of selected lactic acidproducing bacteria. J. Dairy Sci. 76, 2485-2492 HAVENAAR, R. u. M. HUIS IN 'T VELD (1992): Probiotics : a general view. 1. Aufl. Verlag Elsevier Applied Science Publisher, Amsterdam 134 Literaturverzeichnis ________________________________________________________________________________ HAVERSON, K.; M. BAILEY u. C. R. STOKES (1999): T-cell populations in the pig intestinal lamina propria: memory cells with unusual phenotypic characteristics. Immunology 96, 66-73 HELIN, T.; S. HAAHTELA u. T. HAAHTELA (2002): No effect of oral treatment with an intestinal bacterial strain, Lactobacillus rhamnosus (ATCC 53103), on birch-pollen allergy: a placebo-controlled double-blind study. Allergy 57, 243-246 HENDERSON, W. R.; E. Y. CHI u. S. J. KLEBANOFF (1980): Eosinophil peroxidase-induced mast cell secretion. J. Exp. Med. 152, 265-279 HERR, A. B.; E. R. BALLISTER u. P. J. BJORKMAN (2003): Insights into IgA-mediated immune responses from the crystal structures of human FcalphaRI and its complex with IgA1-Fc. Nature 423, 614-620 HILDEBRANDT, H. (1998): Pschyrembel Klinisches Wörterbuch. 258. Aufl. Verlag Walter de Gruyter, Berlin HIRAYAMA, K. u. J. RAFTER (2000): The role of probiotic bacteria in cancer prevention. Microbes. Infect. 2, 681-686 HOCKERTZ, S. (1997): Augmentation of host defence against bacterial and fungal infections of mice pretreated with the non-pathogenic Escherichia coli strain Nissle 1917. Arzneimittelforschung. 47, 793-796 HOOPER, L. V.; J. XU; P. G. FALK; T. MIDTVEDT u. J. I. GORDON (1999): A molecular sensor that allows a gut commensal to control its nutrient foundation in a competitive ecosystem. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 96, 9833-9838 HOUDIJK, J. (1998): Effects of non-digestible oligosaccharids in young pigs diet. Wageningen, Landbouwuniversiteit, Diss. IBEN, C. u. J. LEIBETSEDER (1989): Untersuchung zur leistungsfördernden Wirkung von Toyocerin in der Ferkelaufzucht. Wien. tierärztl. Mschr. 76, 363-366 135 Literaturverzeichnis ________________________________________________________________________________ INOBE, J.; A. J. SLAVIN; Y. KOMAGATA; Y. CHEN; L. LIU u. H. L. WEINER (1998): IL-4 is a differentiation factor for transforming growth factor-beta secreting Th3 cells and oral administration of IL-4 enhances oral tolerance in experimental allergic encephalomyelitis. Eur. J. Immunol. 28, 2780-2790 ISOLAURI, E.; J. JOENSUU; H. SUOMALAINEN; M. LUOMALA u. T. VESIKARI (1995): Improved immunogenicity of oral D x RRV reassortant rotavirus vaccine by Lactobacillus casei GG. Vaccine 13, 310-312 ISOLAURI, E.; H. MAJAMAA; T. ARVOLA; I. RANTALA; E. VIRTANEN u. H. ARVILOMMI (1993): Lactobacillus casei strain GG reverses increased intestinal permeability induced by cow milk in suckling rats. Gastroenterology 105, 1643-1650 ISOLAURI, E.; L. PELTO; J. NUUTILA; H. MAJAMAA; E. M. LILIUS u. S. SALMINEN (1997): Altered expression of IgG and complement receptors indicates a significant role of phagocytes in atopic dermatitis. J. Allergy Clin. Immunol. 99, 707-713 JAIN, S. L.; K. S. BARONE; M. P. FLANAGAN u. J. G. MICHAEL (1996): Activation patterns of murine B cells after oral administration of an encapsulated soluble antigen. Vaccine 14, 1291-1297 JAMES, S. P.; W. C. KWAN u. M. C. SNELLER (1990): T cells in inductive and effector compartments of the intestinal mucosal immune system of nonhuman primates differ in lymphokine mRNA expression, lymphokine utilization, and regulatory function. J. Immunol. 144, 1251-1256 JANEWAY, C. A.; B. JONES u. A. HAYDAY (1988): Specificity and function of T-cells bearing gamma-delta receptors. Immunol. Today 9, 73-76 JARRY, A.; N. CERF-BENSUSSAN; N. BROUSSE; F. SEIZ u. D. GUY-GRAND (1990): Subsets of CD3+ and CD3- lymphocytes isolated from normal human gut epithelium display phenotypic features different from their counterparts in peripheral blood. Eur. J. Immunol. 20, 1097-1103 JIJON, H.; J. BACKER; H. DIAZ; H. YEUNG; D. THIEL; C. MCKAIGNEY; C. DE SIMONE u. K. MADSEN (2004): DNA from probiotic bacteria modulates murine and human epithelial and immune function. Gastroenterology 126, 1358-1373 136 Literaturverzeichnis ________________________________________________________________________________ KAHRS, D. (1986): Toyocerin, ein Weg zur Stabilisierung der Darmflora. Kraftfutter 69, 364-370 KAILA, M.; E. ISOLAURI; E. SOPPI; E. VIRTANEN; S. LAINE u. H. ARVILOMMI (1992): Enhancement of the circulating antibody secreting cell response in human diarrhea by a human Lactobacillus strain. Pediatr. Res. 32, 141-144 KALLIOMAKI, M. u. E. ISOLAURI (2002): Pandemic of atopic diseases--a lack of microbial exposure in early infancy? Curr. Drug Targets. Infect. Disord. 2, 193-199 KALLIOMAKI, M.; S. SALMINEN; H. ARVILOMMI; P. KERO; P. KOSKINEN u. E. ISOLAURI (2001): Probiotics in primary prevention of atopic disease: a randomised placebo-controlled trial. Lancet 357, 1076-1079 KALLIOMAKI, M.; S. SALMINEN; T. POUSSA; H. ARVILOMMI u. E. ISOLAURI (2003): Probiotics and prevention of atopic disease: 4-year follow-up of a randomised placebo-controlled trial. Lancet 361, 1869-1871 KATO, M.; G. M. KEPHART; N. J. TALLEY; J. M. WAGNER; M. G. SARR; M. BONNO; T. W. MCGOVERN u. G. J. GLEICH (1998): Eosinophil infiltration and degranulation in normal human tissue. Anat. Rec. 252, 418-425 KAY, A. B. (2001a): Allergy and allergic diseases. First of two parts. N. Engl. J. Med. 344, 30-37 KAY, A. B. (2001b): Allergy and allergic diseases. Second of two parts. N. Engl. J. Med. 344, 109-113 KE, Y.; K. PEARCE; J. P. LAKE; K. H. ZIEGLER u. A. KAPP (1997): Gamma-delta T lymphocytes regulate the induction and maintenance of oral tolerance. J. Immunol. 158, 3610-3618 KENWORTHY, R. (1973): Intestinal microbial flora of the pig. Advanc. Appl. Microbiol. 16, 31-54 137 Literaturverzeichnis ________________________________________________________________________________ KIM, H. J.; M. CAMILLERI; S. MCKINZIE; M. B. LEMPKE; D. D. BURTON; G. M. THOMFORDE u. A. R. ZINSMEISTER (2003): A randomized controlled trial of a probiotic, VSL#3, on gut transit and symptoms in diarrhoeapredominant irritable bowel syndrome. Aliment. Pharmacol. Ther. 17, 895-904 KIRCHGESSNER, M.; F. X. ROTH; U. EIDELSBURGER u. B. GEDEK (1993): The nutritive efficiency of Bacillus cereus as a probiotic in the raising of piglets. 1. Effect on the growth parameters and gastrointestinal environment. Arch. Tierernähr. 44, 111-121 KIRJAVAINEN, P. V.; S. J. SALMINEN u. E. ISOLAURI (2003): Probiotic bacteria in the management of atopic disease: underscoring the importance of viability. J. Pediatr. Gastroenterol. Nutr. 36, 223-227 KNICKEL, U. R., C. WILCZEK u. K. JÖST (1998): MemoVet Praxis-Leitfaden Tiermedizin. 3. Aufl. Verlag Schattauer, Stuttgart KOT, E. u. A. BEZKOROVAINY (1999): Binding of ferric iron to the cell walls and membranes of Bifidobacterium thermophilum: effect of free radicals. J. Agric. Food Chem. 47, 4606-4610 KROEGEL, C. u. H. MATTHYS (1993): Platelet-activating factor-induced human eosinophil activation. Generation and release of cyclooxygenase metabolites in human blood eosinophils from asthmatics. Immunology 78, 279-285 KROEGEL, C.; T. YUKAWA; G. DENT; P. VENGE; K. F. CHUNG u. P. J. BARNES (1989): Stimulation of degranulation from human eosinophils by platelet-activating factor. J. Immunol. 142, 3518-3526 KRSNIK, B.; R. YAMMINE; Z. PAVICIC; T. BALENOVIC; B. NJARI; I. VRBANAC u. I. VALPOTIC (1999): Experimental model of enterotoxigenic Escherichia coli infection in pigs: potential for an early recognition of colibacillosis by monitoring of behavior. Comp. Immunol. Microbiol. Infect. Dis. 22, 261-273 KRUIS, W., P. FRIC, AND M. STOLTE (2001): Maintenance of remission in ulcerative colitis is equally effective with Escherichia coli Nissle 1917 and with standard Mesalazine.(Abstr). Gastroenterology 120, A127 138 Literaturverzeichnis ________________________________________________________________________________ KRUIS, W.; E. SCHUTZ; P. FRIC; B. FIXA; G. JUDMAIER u. M. STOLTE (1997): Double-blind comparison of an oral Escherichia coli preparation and mesalazine in maintaining remission of ulcerative colitis. Aliment. Pharmacol. Ther. 11, 853-858 KUNA, P.; S. R. REDDIGARI; T. J. SCHALL; D. RUCINSKI; M. SADICK u. A. P. KAPLAN (1993): Characterization of the human basophil response to cytokines, growth factors, and histamine releasing factors of the intercrine/chemokine family. J. Immunol. 150, 1932-1943 KURIMOTO, Y.; A. L. DE WECK u. C. A. DAHINDEN (1989): Interleukin 3-dependent mediator release in basophils triggered by C5a. J. Exp. Med. 170, 467-479 KURIMOTO, Y.; A. L. DE WECK u. C. A. DAHINDEN (1991): The effect of interleukin 3 upon IgE-dependent and IgE-independent basophil degranulation and leukotriene generation. Eur. J. Immunol. 21, 361-368 LAMMERS, K. M.; U. HELWIG; E. SWENNEN; F. RIZZELLO; A. VENTURI; E. CARAMELLI; M. A. KAMM; P. BRIGIDI; P. GIONCHETTI u. M. CAMPIERI (2002): Effect of probiotic strains on interleukin 8 production by HT29/19A cells. Am. J. Gastroenterol. 97, 1182-1186 LANGHENDRIES, J. P.; J. DETRY; J. VAN HEES; J. M. LAMBORAY; J. DARIMONT; M. J. MOZIN; M. C. SECRETIN u. J. SENTERRE (1995): Effect of a fermented infant formula containing viable bifidobacteria on the fecal flora composition and pH of healthy full-term infants. J. Pediatr. Gastroenterol. Nutr. 21, 177-181 LEFRANCOISE, L. u. L. PUDDINGTON (1999): Basic aspects of intraepithelial lymphocyte immunobiology. 2. Aufl. Verlag Academic Press, San Diego LI, H.; T. C. SIM u. R. ALAM (1996): IL-13 released by and localized in human basophils. J. Immunol. 156, 4833-4838 LI, M. S.; L. SUN; T. SATOH; L. M. FISHER u. C. J. SPRY (1995): Human eosinophil major basic protein, a mediator of allergic inflammation, is expressed by alternative splicing from two promoters. Biochem. J. 305, 921-927 139 Literaturverzeichnis ________________________________________________________________________________ LILLY, DM. u. R. H. STILLWELL (1965): Growth promoting factors produced by micro-organismen. Science 147, 747-748 LIN, T.; G. MATZUSAKI; H. YOSHIDA; K. KOBAYASHI; H. KENAI; K. OMOTO u. K. NOMOTO (1994): CD3-CD8+ intestinal intraepithelial lymphocytes (IEL) and the extrathymic development of IEL. Eur. J. Immunol. 24, 1080-1087 LING, W. H.; R. KORPELA; H. MYKKANEN; S. SALMINEN u. O. HANNINEN (1994): Lactobacillus strain GG supplementation decreases colonic hydrolytic and reductive enzyme activities in healthy female adults. J. Nutr. 124, 18-23 LODINOVA-ZADNIKOVA, R.; B. CUKROWSKA u. H. TLASKALOVA-HOGENOVA (2003): Oral administration of probiotic Escherichia coli after birth reduces frequency of allergies and repeated infections later in life (after 10 and 20 years). Int. Arch. Allergy Immunol. 131, 209-211 LODINOVA-ZADNIKOVA, R.; M. SLAVIKOVA; H. TLASKALOVA-HOGENOVA; I. ADLERBERTH; L. A. HANSON; A. WOLD; B. CARLSSON; C. SVANBORG u. L. MELLANDER (1991): The antibody response in breast-fed and non-breast-fed infants after artificial colonization of the intestine with Escherichia coli O83. Pediatr. Res. 29, 396-399 LODINOVA-ZADNIKOVA, R. u. U. SONNENBORN (1997): Effect of preventive administration of a nonpathogenic Escherichia coli strain on the colonization of the intestine with microbial pathogens in newborn infants. Biol. Neonate 71, 224-232 LOEW, D. (2000): Leben und Werken von Alfred Nissle. Verlag Alfred Nissle Gesellschaft, Hagen, S. 11-19 LORENTZ, A.; S. SCHWENGBERG; G. SELLGE; M. P. MANNS u. S. C. BISCHOFF (2000): Human intestinal mast cells are capable of producing different cytokine profiles: role of IgE receptor cross-linking and IL-4. J. Immunol. 164, 43-48 140 Literaturverzeichnis ________________________________________________________________________________ LUNDQVIST, C.; V. BARANOV; S. HAMMARSTROM; L. ATHLIN u. M. L. HAMMARSTROM (1995): Intra-epithelial lymphocytes. Evidence for regional specialization and extrathymic T cell maturation in the human gut epithelium. Int. Immunol. 7, 1473-1487 MAASSEN, C. B.; C. HOLTEN-NEELEN; F. BALK; M. J. BAK-GLASHOUWER; R. J. LEER; J. D. LAMAN; W. J. BOERSMA u. E. CLAASSEN (2000): Strain-dependent induction of cytokine profiles in the gut by orally administered Lactobacillus strains. Vaccine 18, 2613-2623 MACK, D. R.; T. S. GAGINELLA u. P. M. SHERMAN (1992): Effect of colonic inflammation on mucin inhibition of Escherichia coli RDEC-1 binding in vitro. Gastroenterology 102, 1199-1211 MACK, D. R.; S. MICHAIL; S. WEI; L. MCDOUGALL u. M. A. HOLLINGSWORTH (1999): Probiotics inhibit enteropathogenic E. coli adherence in vitro by inducing intestinal mucin gene expression. Am. J. Physiol 276, G941-G950 MADSEN, K.; A. CORNISH; P. SOPER; C. MCKAIGNEY; H. JIJON; C. YACHIMEC; J. DOYLE; L. JEWELL u. C. DE SIMONE (2001): Probiotic bacteria enhance murine and human intestinal epithelial barrier function. Gastroenterology 121, 580-591 MAJAMAA, H. u. E. ISOLAURI (1997): Probiotics: a novel approach in the management of food allergy. J. Allergy Clin. Immunol. 99, 179-185 MAJAMAA, H.; E. ISOLAURI; M. SAXELIN u. T. VESIKARI (1995): Lactic acid bacteria in the treatment of acute rotavirus gastroenteritis. J. Pediatr. Gastroenterol. Nutr. 20, 333-338 MANDEL, L.; I. TREBICHAVSKY; I. SPLICHAL u. J. SCHULZE (1995): Stimulation of intestinal immune cells by E. coli in gnotobiotic piglets. Adv. Exp. Med. Biol. 371A, 463-464 MCFARLAND, L. V.; C. M. SURAWICZ; R. N. GREENBERG; R. FEKETY; G. W. ELMER; K. A. MOYER; S. A. MELCHER; K. E. BOWEN; J. L. COX u. Z. NOORANI (1995): Prevention of beta-lactam-associated diarrhea by Saccharomyces boulardii compared with placebo. Am. J. Gastroenterol. 90, 439-448 141 Literaturverzeichnis ________________________________________________________________________________ MCGOVERN, T. W.; N. J. TALLEY; G. M. KEPHART; H. A. CARPENTER u. G. J. GLEICH (1991): Eosinophil infiltration and degranulation in Helicobacter pylori-associated chronic gastritis. Dig. Dis. Sci. 36, 435-440 MECHNIKOFF, E. (1907): The prolongation of life. Verlag Butterworth-Heinemann, London MEUER, S. C.; F. AUTSCHBACH; G. SCHURMANN; M. GOLLING; J. BRAUNSTEIN u. L. QIAO (1996): Molecular mechanisms securing "unresponsiveness" in lamina propria T lymphocytes. Ann. N. Y. Acad. Sci. 778, 174-184 MICHAIL, S. u. F. ABERNATHY (2002): Lactobacillus plantarum reduces the in vitro secretory response of intestinal epithelial cells to enteropathogenic Escherichia coli infection. J. Pediatr. Gastroenterol. Nutr. 35, 350-355 MICHAIL, S. u. F. ABERNATHY (2003): Lactobacillus plantarum inhibits the intestinal epithelial migration of neutrophils induced by enteropathogenic Escherichia coli. J. Pediatr. Gastroenterol. Nutr. 36, 385-391 MICHAIL, S. K.; D. R. HALM u. F. ABERNATHY (2003): Enteropathogenic Escherichia coli: stimulating neutrophil migration across a cultured intestinal epithelium without altering transepithelial conductance. J. Pediatr. Gastroenterol. Nutr. 36, 253-260 MIMURA, T.; F. RIZZELLO; U. HELWIG; A. VENTURI; P. BRIGIDI; D. MATTEUZZI; G. BAZZOCCHI; G. POGGIOLI; M. MIGLIOLI u. M. CAMPIERI (2004): Once daily high dose probiotics therapy (VSL#3) for maintaining remission in recurrent or refractory pouchitis. Gut 53, 108-114 MISHRA, A.; S. P. HOGAN; J. J. LEE; P. S. FOSTER u. M. E. ROTHENBERG (1999): Fundamental signals that regulate eosinophil homing to the gastrointestinal tract. J. Clin. Invest 103, 1719-1727 MÖLLENBRINK, M. u. E. BRUCKSCHEN (1994): Behandlung der chronischen Obstipation mit physiologischen Escherichia-coli-Bakterien. Ergebnisse einer klinischen Studie zur Wirksamkeit und Verträglichkeit der mikrobiologischen Therapie mit dem E.-coli-Stamm Nissle 1917 (Mutaflor). Med. Klin. (Munich) 89, 587-593 142 Literaturverzeichnis ________________________________________________________________________________ NARDI, R. M.; M. E. SILVA; E. C. VIEIRA; E. A. BAMBIRRA u. J. R. NICOLI (1989): Intragastric infection of germfree and conventional mice with Salmonella typhimurium. Braz. J. Med. Biol. Res. 22, 1389-1392 NEISH, A. S.; A. T. GEWIRTZ; H. ZENG; A. N. YOUNG; M. E. HOBERT; V. KARMALI; A. S. RAO u. J. L. MADARA (2000): Prokaryotic regulation of epithelial responses by inhibition of IkappaB-alpha ubiquitination. Science 289, 1560-1563 NEMCOVA, R.; A. LAUKOVA; S. GANCARCIKOVA u. R. KASTEL (1997): In vitro studies of porcine lactobacilli for possible probiotic use. Berl. Münch. tierärztl. Wochenschr. 110, 413-417 NICKEL, R., A. SCHUMMER u. E. SEIFERLE (1999): Lehrbuch der Anatomie der Haustiere. 8. Aufl. Verlag Parey, Berlin NISSLE, A. (1916): Über die Grundlagen einer neuen ursächlichen Bekämpfung der pathologischen Darmflora. Dtsch. med. Wochenschr. 42, 1181-1184 OATLEY, J. T.; M. D. RARICK; G. E. JI u. J. E. LINZ (2000): Binding of aflatoxin B1 to bifidobacteria in vitro. J. Food Prot. 63, 1133-1136 OGRA, P. L., M. E. LAMM, J. BIENENSTOCK, J. MESTECKY, W. STROBER u. J. R. MCGHEE (1999): Mukosal Immunology. 2. Aufl. Verlag Academic Press, San Diego OKAYAMA, Y., P. BRADDING, J. M. TUON-DE LARA, S. T. HOLGATE u. M. K. CHURCH (1995): Cytokine production by human mast cells and basophils. Verlag Karger, Basel, S. 114-134 PABST, R. u. R. M. BINNS (1989): Heterogeneity of lymphocyte homing physiology: several mechanisms operate in the control of migration to lymphoid and non-lymphoid organs in vivo. Immunol. Rev. 108, 83-109 PABST, R. u. H. J. ROTHKÖTTER (1999): Postnatal development of lymphocyte subsets in different compartments of the small intestine of piglets. Vet. Immunol. Immunopathol. 72, 167-173 143 Literaturverzeichnis ________________________________________________________________________________ PARK, J. H.; J. I. UM; B. J. LEE; J. S. GOH; S. Y. PARK; W. S. KIM u. P. H. KIM (2002): Encapsulated Bifidobacterium bifidum potentiates intestinal IgA production. Cell Immunol. 219, 22-27 PARKER, R. B. (1974): Probiotics, the other half of the antibiotic story. Anim. Nutr. Health 29, 4-8 PELTO, L.; E. ISOLAURI; E. M. LILIUS; J. NUUTILA u. S. SALMINEN (1998): Probiotic bacteria down-regulate the milk-induced inflammatory response in milk-hypersensitive subjects but have an immunostimulatory effect in healthy subjects. Clin. Exp. Allergy 28, 1474-1479 PERDIGON, G.; M. E. DE MACIAS; S. ALVAREZ; G. OLIVER u. A. A. RUIZ HOLGADO (1986): Effect of perorally administered lactobacilli on macrophage activation in mice. Infect. Immun. 53, 404-410 PERDIGON, G.; M. E. DE MACIAS; S. ALVAREZ; G. OLIVER u. A. P. RUIZ HOLGADO (1988): Systemic augmentation of the immune response in mice by feeding fermented milks with Lactobacillus casei and Lactobacillus acidophilus. Immunology 63, 17-23 PERDIGON, G.; E. VINTINI; S. ALVAREZ; M. MEDINA u. M. MEDICI (1999): Study of the possible mechanisms involved in the mucosal immune system activation by lactic acid bacteria. J. Dairy Sci. 82, 1108-1114 PEREZ, P. F.; Y. MINNAARD; E. A. DISALVO u. G. L. DE ANTONI (1998): Surface properties of bifidobacterial strains of human origin. Appl. Environ. Microbiol. 64, 21-26 PIERCE, N. F. u. W. C. CRAY, Jr. (1982): Determinants of the localization, magnitude, and duration of a specific mucosal IgA plasma cell response in enterically immunized rats. J. Immunol. 128, 1311-1315 POLOSA, R. u. N. CRIMI (1998): Exposing the mast cell: its novel integrated role in allergy. Ann. Ital. Med. Int. 13, 78-80 144 Literaturverzeichnis ________________________________________________________________________________ PRANTERA, C.; M. L. SCRIBANO; G. FALASCO; A. ANDREOLI u. C. LUZI (2002): Ineffectiveness of probiotics in preventing recurrence after curative resection for Crohn's disease: a randomised controlled trial with Lactobacillus GG. Gut 51, 405-409 PROMSOPONE, B.; T. Y. MORISHITA; P. P. AYE; C. W. COBB; A. VELDKAMP u. J. R. CLIFFORD (1998): Evaluation of an avian-specific probiotic and Salmonella typhimurium-Specific antibodies on the colonization of Salmonella typhimurium in broilers. J. Food Prot. 61, 176-180 PRUD'HOMME, G. J. u. C. A. PICCIRILLO (2000): The inhibitory effects of transforming growth factor-beta-1 (TGF-beta1) in autoimmune diseases. J. Autoimmun. 14, 23-42 REMBACKEN, B. J.; A. M. SNELLING; P. M. HAWKEY; D. M. CHALMERS u. A. T. AXON (1999): Non-pathogenic Escherichia coli versus mesalazine for the treatment of ulcerative colitis: a randomised trial. Lancet 354, 635-639 ROBINSON, I. M.; S. C. WHIPP; J. A. BUCKLIN u. M. J. ALLISON (1984): Characterization of predominant bacteria from the colons of normal and dysenteric pigs. Appl. Environ. Microbiol. 48, 964-969 ROEDIGER, W. E. (1980): Role of anaerobic bacteria in the metabolic welfare of the colonic mucosa in man. Gut 21, 793-798 ROLLE, M. u. A. MAYR (2002): Medizinische Mikrobiologie, Infektions- und Seuchenlehre. 7. Aufl. Verlag Enke, Stuttgart ROLLER, M. (2003): Einfluss von Pro-, Prä- und Synbiotika auf das Immunsystem der Ratte und des Menschen. Fakultät für Chemie und Biowissenschaften, Universität Karlsruhe, Diss. ROSE, R. u. H. W. MOON (1985): Elicitation of enteroluminal neutrophils by enterotoxigenic and nonenterotoxigenic strains of Escherichia coli in swine. Infect. Immun. 48, 818-823 145 Literaturverzeichnis ________________________________________________________________________________ ROSEN, G. D. (1992): Antibacterials in disease control and performance enhancement. Part II. Feed Compounder 12, 20-23 ROSENFELDT, V.; E. BENFELDT; S. D. NIELSEN; K. F. MICHAELSEN; D. L. JEPPESEN; N. H. VALERIUS u. A. PAERREGAARD (2003): Effect of probiotic Lactobacillus strains in children with atopic dermatitis. J. Allergy Clin. Immunol. 111, 389-395 ROSENFELDT, V.; K. F. MICHAELSEN; M. JAKOBSEN; C. N. LARSEN; P. L. MOLLER; P. PEDERSEN; M. TVEDE; H. WEYREHTER; N. H. VALERIUS u. A. PAERREGAARD (2002a): Effect of probiotic Lactobacillus strains in young children hospitalized with acute diarrhea. Pediatr. Infect. Dis. J. 21, 411-416 ROSENFELDT, V.; K. F. MICHAELSEN; M. JAKOBSEN; C. N. LARSEN; P. L. MOLLER; M. TVEDE; H. WEYREHTER; N. H. VALERIUS u. A. PAERREGAARD (2002b): Effect of probiotic Lactobacillus strains on acute diarrhea in a cohort of nonhospitalized children attending day-care centers. Pediatr. Infect. Dis. J. 21, 417-419 ROTHENBERG, M. E. (1998): Eosinophilia. N. Engl. J. Med. 338, 1592-1600 ROTHENBERG, M. E.; A. MISHRA; E. B. BRANDT u. S. P. HOGAN (2001): Gastrointestinal eosinophils. Immunol. Rev. 179, 139-155 ROTHKÖTTER, H. J.; C. HRIESIK; N. N. BARMAN u. R. PABST (1999a): B and also T lymphocytes migrate via gut lymph to all lymphoid organs and the gut wall, but only IgA+ cells accumulate in the lamina propria of the intestinal mucosa. Eur. J. Immunol. 29, 327-333 ROTHKÖTTER, H. J.; R. PABST u. M. BAILEY (1999b): Lymphocyte migration in the intestinal mucosa: entry, transit and emigration of lymphoid cells and the influence of antigen. Vet. Immunol. Immunopathol. 72, 157-165 ROTHKÖTTER, H. J.; H. ULBRICH u. R. PABST (1991): The postnatal development of gut lamina propria lymphocytes: number, proliferation, and T and B cell subsets in conventional and germ-free pigs. Pediatr. Res. 29, 237-242 146 Literaturverzeichnis ________________________________________________________________________________ SALMINEN, S. (1996): Uniqueness of probiotic strains. IDF Nutr News Letter 5, 16-18 SALMINEN, S.; C. BOULEY; M. C. BOUTRON-RUAULT; J. H. CUMMINGS; A. FRANCK; G. R. GIBSON; E. ISOLAURI; M. C. MOREAU; M. ROBERFROID u. I. ROWLAND (1998): Functional food science and gastrointestinal physiology and function. Br. J. Nutr. 80 Suppl 1, S147-S171 SALTZMAN, J. R.; R. M. RUSSELL; B. GOLNER; S. BARAKAT; G. E. DALLAL u. B. R. GOLDIN (1999): A randomized trial of Lactobacillus acidophilus BG2FO4 to treat lactose intolerance. Am. J. Clin. Nutr. 69, 140-146 SANDERSON, C. J. (1992): Interleukin-5, eosinophils, and disease. Blood 79, 3101-3109 SAVAGE, D. C. (1977a): Interaction between the host and its microbes. Verlag Academic Press, London, S. 277-310 SAVAGE, D. C. (1977b): Microbial ecology of the gastrointestinal tract. Annu. Rev. Microbiol. 31, 107-133 SCHAAFSMA, G. (1996): State of art concerning probiotic strains in milk products. IDF Nutr News Letter 5, 23-24 SCHIFFRIN, E. J.; F. ROCHAT; H. LINK-AMSTER; J. M. AESCHLIMANN u. A. DONNET-HUGHES (1995): Immunomodulation of human blood cells following the ingestion of lactic acid bacteria. J. Dairy Sci. 78, 491-497 SCHREZENMEIR, J. u. M. DE VRESE (2001): Probiotics, prebiotics, and synbiotics - approaching a definition. Am. J. Clin. Nutr. 73, 361S-364S SCHUBERT, S.; A. RAKIN; D. FISCHER; J. SORSA u. J. HEESEMANN (1999): Characterization of the integration site of Yersinia high-pathogenicity island in Escherichia coli. FEMS Microbiol. Lett. 179, 409-414 147 Literaturverzeichnis ________________________________________________________________________________ SCHULTZ, M.; U. G. STRAUCH; H. J. LINDE; S. WATZL; F. OBERMEIER; C. GOTTL; N. DUNGER; N. GRUNWALD; J. SCHOLMERICH u. H. C. RATH (2004): Preventive effects of Escherichia coli strain Nissle 1917 on acute and chronic intestinal inflammation in two different murine models of colitis. Clin. Diagn. Lab Immunol. 11, 372-378 SCHULZE, F. u. W. BATHKE (1977): Zur quantitativen Zusammensetzung der Magen-Darm-Flora beim Läuferschwein. Arch. exp. Veterinärmed. 31, 161-185 SCHULZE, F.; H. BOCKLISCH; P. KIELSTEIN; D. SCHIMMEL u. H.-G. SATTLER (1980): Zur quantitativen Zusammensetzung der Magen-Darm-Flora bei Ferkeln in den ersten zwei Lebenswochen. Arch. exp. Veterinärmed. 34, 235-245 SCHWARTZ, L. B. u. T. F. HUFF (1998): Biology of mast cells. 5. Aufl. Verlag Mosby -Year Book, St.Louis, S. 261-276 SEELIGER, H. P. R. u. H. WERNER (1965): Methodik der Darmflorauntersuchung. Ernährungsforschung 10, 509-515 SEMBROOK, I., E. F. FRITSCH u. T. MANIATIS (1989): Molecular Cloning: A laboratory Manual. Verlag Cold Spring Harbour Laboratory Press, Cold Spring Harbour SHAKOORY, B.; S. M. FITZGERALD; S. A. LEE; D. S. CHI u. G. KRISHNASWAMY (2004): The role of human mast cell-derived cytokines in eosinophil biology. J. Interferon Cytokine Res. 24, 271-281 SHEIL, B.; J. MCCARTHY; L. O'MAHONY; M. W. BENNETT; P. RYAN; J. J. FITZGIBBON; B. KIELY; J. K. COLLINS u. F. SHANAHAN (2004): Is the mucosal route of administration essential for probiotic function? Subcutaneous administration is associated with attenuation of murine colitis and arthritis. Gut 53, 694-700 SIMON, G. L. u. S. L. GORBACH (1982): Intestinal microflora. Med. Clin. North Am. 66, 557-574 148 Literaturverzeichnis ________________________________________________________________________________ SMITH, H. W. (1965): The development of the flora of the alimentary tract in young animals. J. Pathol. Bacteriol. 90, 495-513 SONNENBORN, H. u. R. GREINWALD (1991): Beziehungen zwischen Wirtsorganismus und Darmflora unter besonderer Berücksichtigung von Physiologie und Funktion der normalen Escherichia coli Flora. 2. Aufl. Verlag Schattauer, Stuttgart SPENCER, J.; T. T. MACDONALD; T. C. DISS; J. A. WALKER-SMITH; P. J. CICLITIRA u. P. G. ISAACSON (1989): Changes in intraepithelial lymphocyte subpopulations in coeliac disease and enteropathy associated T cell lymphoma (malignant histiocytosis of the intestine). Gut 30, 339-346 SPRY, C. F. (1988): Eosinophils.A comprehensive guide to the scientific and medical literature. Verlag Oxford University Press, Oxford STECCHINI, M. L.; M. DEL TORRE u. M. MUNARI (2001): Determination of peroxy radical-scavenging of lactic acid bacteria. Int. J. Food Microbiol. 64, 183-188 SURAWICZ, C. M. (2003): Probiotics, antibiotic-associated diarrhoea and Clostridium difficile diarrhoea in humans. Best. Pract. Res. Clin. Gastroenterol. 17, 775-783 SURAWICZ, C. M.; L. V. MCFARLAND; R. N. GREENBERG; M. RUBIN; R. FEKETY; M. E. MULLIGAN; R. J. GARCIA; S. BRANDMARKER; K. BOWEN; D. BORJAL u. G. W. ELMER (2000): The search for a better treatment for recurrent Clostridium difficile disease: use of high-dose vancomycin combined with Saccharomyces boulardii. Clin. Infect. Dis. 31, 1012-1017 SUTAS, Y.; M. HURME u. E. ISOLAURI (1996a): Down-regulation of anti-CD3 antibody-induced IL-4 production by bovine caseins hydrolysed with Lactobacillus GG-derived enzymes. Scand. J. Immunol. 43, 687-689 SUTAS, Y.; E. SOPPI; H. KORHONEN; E. L. SYVAOJA; M. SAXELIN; T. ROKKA u. E. ISOLAURI (1996b): Suppression of lymphocyte proliferation in vitro by bovine caseins hydrolyzed with Lactobacillus casei GG-derived enzymes. J. Allergy Clin. Immunol. 98, 216-224 149 Literaturverzeichnis ________________________________________________________________________________ SWORDS, W. E.; C. C. WU; F. R. CHAMPLIN u. R. K. BUDDINGTON (1993): Postnatal changes in selected bacterial groups of the pig colonic microflora. Biol. Neonate 63, 191-200 SYDORA, B. C. (1993): Intestinal intraepithelial lymphocytes are activated and cytolytic but do not proliferate as well as other T-cells in response to mitogenic signals. J. Immunol. 150, 2179-2193 SZAJEWSKA, H.; M. KOTOWSKA; J. Z. MRUKOWICZ; M. ARMANSKA u. W. MIKOLAJCZYK (2001): Efficacy of Lactobacillus GG in prevention of nosocomial diarrhea in infants. J. Pediatr. 138, 361-365 TAKAHASHI, T.; E. NAKAGAWA; T. NARA; T. YAJIMA u. T. KUWATA (1998): Effects of orally ingested Bifidobacterium longum on the mucosal IgA response of mice to dietary antigens. Biosci. Biotechnol. Biochem. 62, 10-15 TALLEY, N. J.; G. M. KEPHART; T. W. MCGOVERN; H. A. CARPENTER u. G. J. GLEICH (1992): Deposition of eosinophil granule major basic protein in eosinophilic gastroenteritis and celiac disease. Gastroenterology 103, 137-145 TANNOCK, G. W. (2001): Molecular assessment of intestinal microflora. Am. J. Clin. Nutr. 73, 410S-414S TANNOCK, G. W.; C. CRICHTON; G. W. WELLING; J. P. KOOPMAN u. T. MIDTVEDT (1988): Reconstitution of the gastrointestinal microflora of lactobacillus-free mice. Appl. Environ. Microbiol. 54, 2971-2975 THOMPSON, C. u. F. POWRIE (2004): Regulatory T cells. Curr. Opin. Pharmacol. 4, 408-414 TISSIER, H. (1984): Taxonomy and ecology of bifidobacteria. Bifidobacteric Microflora 3, 11-28 150 Literaturverzeichnis ________________________________________________________________________________ TLASKALOVA-HOGENOVA, H.; R. STEPANKOVA; T. HUDCOVIC; L. TUCKOVA; B. CUKROVSKA; R. LODINOVA-ZADNIKOVA; H. KOZAKOVA; P. ROSSMANN; J. BARTOVA; D. SOKOL; D. P. FUNDA; D. BOROVSKA; Z. REHAKOVA; J. SINKORA; S. P. HOGAN; P. DRASTICH u. A. KOKESOVA (2004): Commensal bacteria (normal microflora), mucosal immunity and chronic inflammatory and autoimmune disease. Immunol. Lett. 93, 97-108 TO, T. L.; L. A. WARD; L. YUAN u. L. J. SAIF (1998): Serum and intestinal isotype antibody responses and correlates of protective immunity to human rotavirus in a gnotobiotic pig model of disease. J. Gen. Virol. 79, 2661-2672 TOMASSINI, M.; L. MAGRINI; G. DE PETRILLO; E. ADRIANI; S. BONINI; F. BALSANO u. S. BONINI (1996): Serum levels of eosinophil cationic protein in allergic diseases and natural allergen exposure. J. Allergy Clin. Immunol. 97, 1350-1355 TREJDOSIEWICZ, L. K. (1992): Intestinal intraepithelial lymphocytes and lymphoepithelial interaction in the human gastrointestinal mucosa. Immunol. Lett. 32, 13-19 TROMM, A.; U. NIEWERTH; M. KHOURY; E. BAESTLEIN; G. WILHELMS; J. SCHULZE u. M. STOLTE (2004): The probiotic E. coli strain Nissle 1917 for the treatment of collagenous colitis: first results of an open-label trial. Z. Gastroenterol. 42, 365-369 UMESAKI, Y.; Y. OKADA; A. IMAOKA; H. SETOYAMA u. S. MATSUMOTO (1997): Interaction between epithelial cells and bacteria, normal and pathogenic. Science 276, 964-965 UMESAKI, Y. u. H. SETOYAMA (2000): Structure of the intestinal flora responsible for development of the gut immune system in a rodent model. Microbes. Infect. 2, 1343-1351 URBANCSEK, H.; T. KAZAR; I. MEZES u. K. NEUMANN (2001): Results of a double-blind, randomized study to evaluate the efficacy and safety of Antibiophilus in patients with radiation-induced diarrhoea. Eur. J. Gastroenterol. Hepatol. 13, 391-396 151 Literaturverzeichnis ________________________________________________________________________________ VAARALA, O. (2003): Immunological effects of probiotics with special reference to lactobacilli. Clin. Exp. Allergy 33, 1634-1640 VAERMAN, J. P.; A. LANGENDRIES; R. PABST u. H. J. ROTHKÖTTER (1997): Contribution of serum IgA to intestinal lymph IgA, and vice versa, in minipigs. Vet. Immunol. Immunopathol. 58, 301-308 VAN BRIEL, C. (2002): Veränderung der Anzahl und Verteilung von Plasmazellen und Lymphozytenpopulationen in der Darmschleimhaut des Schweins nach Applikation von Probiotika. Hannover, tierärztl. Hochsch., Diss. VAN DE MERWE, J.; J. STEGEMAN u. M. HARZENBERG (1983): The resident fecal flora is determined by genetic characteristics of the host. Implications for Crohn´s disease? Antonie Van Leeuwenhoek 49, 119-124 VANDERHOOF, J. A.; D. B. WHITNEY; D. L. ANTONSON; T. L. HANNER; J. V. LUPO u. R. J. YOUNG (1999): Lactobacillus GG in the prevention of antibiotic-associated diarrhea in children. J. Pediatr. 135, 564-568 VEGA-LOPEZ, M. A.; G. ARENAS-CONTRERAS; M. BAILEY; S. GONZALEZ-POZOS; C. R. STOKES; M. G. ORTEGA u. R. MONDRAGON-FLORES (2001): Development of intraepithelial cells in the porcine small intestine. Dev. Immunol. 8, 147-158 VEGA-LOPEZ, M. A.; M. BAILEY; E. TELEMO u. C. R. STOKES (1995): Effect of early weaning on the development of immune cells in the pig small intestine. Vet. Immunol. Immunopathol. 44, 319-327 VEGA-LOPEZ, M. A.; E. TELEMO; M. BAILEY; K. STEVENS u. C. R. STOKES (1993): Immune cell distribution in the small intestine of the pig: immunohistological evidence for an organized compartmentalization in the lamina propria. Vet. Immunol. Immunopathol. 37, 49-60 VENTURI, A.; P. GIONCHETTI; F. RIZZELLO; R. JOHANSSON; E. ZUCCONI; P. BRIGIDI; D. MATTEUZZI u. M. CAMPIERI (1999): Impact on the composition of the faecal flora by a new probiotic preparation: preliminary data on maintenance treatment of patients with ulcerative colitis. Aliment. Pharmacol. Ther. 13, 1103-1108 152 Literaturverzeichnis ________________________________________________________________________________ VODERHOLZER, W. A.; H. D. ALLESCHER u. S. A. MULLER-LISSNER (1995): The effect of hormones and peptides involved in water balance on rat colonic motility in vitro. Neurogastroenterol. Motil. 7, 15-21 WATERS, W. R.; R. HONTECILLAS; R. E. SACCO; F. A. ZUCKERMANN; K. R. HARKINS; J. BASSAGANYA-RIERA u. M. J. WANNEMUEHLER (2000): Antigen-specific proliferation of porcine CD8alphaalpha cells to an extracellular bacterial pathogen. Immunology 101, 333-341 WEBER, E. (1847): Über den Mechanismus der Einsaugung des Speisesaftes beim Menschen und bei einigen Tieren. Physiol. wissenschaftliche Med. Archiv Anat. 400-402 WEHKAMP, J.; J. HARDER; K. WEHKAMP; B. WEHKAMP-VON MEISSNER; M. SCHLEE; C. ENDERS; U. SONNENBORN; S. NUDING; S. BENGMARK; K. FELLERMANN; J. M. SCHRODER u. E. F. STANGE (2004): NF-kappaB- and AP-1-mediated induction of human beta defensin-2 in intestinal epithelial cells by Escherichia coli Nissle 1917: a novel effect of a probiotic bacterium. Infect. Immun. 72, 5750-5758 WEHKAMP, J.; J. HARDER; B. WEHKAMP-VON MEISSNER; L. SCHWICHTENBERG; K. FELLERMANN; K. R. HERRLINGER u. E. F. STANGE (2002a): The probiotic E. coli Nissle 1917 (Mutaflor) induces defensins in intestinal epithelial cells: a novel mechanism of action. Gastroenterology 122, A75 WEHKAMP, J.; J. HARDER; M. WEICHENTHAL; O. MUELLER; K. R. HERRLINGER; K. FELLERMANN; J. M. SCHROEDER u. E. F. STANGE (2003): Inducible and constitutive beta-defensins are differentially expressed in Crohn's disease and ulcerative colitis. Inflamm. Bowel. Dis. 9, 215-223 WEHKAMP, J.; B. SCHWIND; K. R. HERRLINGER; S. BAXMANN; K. SCHMIDT; M. DUCHROW; C. WOHLSCHLAGER; A. C. FELLER; E. F. STANGE u. K. FELLERMANN (2002b): Innate immunity and colonic inflammation: enhanced expression of epithelial alpha-defensins. Dig. Dis. Sci. 47, 1349-1355 WIELER, L. H.; A. ILIEFF; W. HERBST; C. BAUER; E. VIELER; R. BAUERFEIND; K. FAILING; H. KLOS; D. WENGERT; G. BALJER u. H. ZAHNER (2001): Prevalence of enteropathogens in suckling and weaned piglets with diarrhoea in southern Germany. J. Vet. Med. B Infect. Dis. Vet. Public Health 48, 151-159 153 Literaturverzeichnis ________________________________________________________________________________ WU, H.; G. ZHANG; C. R. ROSS u. F. BLECHA (1999): Cathelicidin gene expression in porcine tissues: roles in ontogeny and tissue specificity. Infect. Immun. 67, 439-442 XU, L. R.; M. M. CARR; A. P. BLAND u. G. A. HALL (1993): Histochemistry and morphology of porcine mast cells. Histochem. J. 25, 516-522 XU-AMANO, J.; K. W. BEAGLEY; J. MEGA; K. FUJIHASHI; H. KIYONO u. J. R. MCGHEE (1992): Induction of T helper cells and cytokines for mucosal IgA responses. Adv. Exp. Med. Biol. 327, 107-117 YAN, F. u. D. B. POLK (2002): Probiotic bacterium prevents cytokine-induced apoptosis in intestinal epithelial cells. J. Biol. Chem. 277, 50959-50965 YASUI, H.; N. NAGAOKA; A. MIKE; K. HAYAKAWA u. M. OHWAKI (1992): Detection of Bifidobacterium strains that induce large quantities of IgA. Microb. Ecol. Health Dis. 5, 155-162 ZEITZ, M.; W. C. GREENE; N. J. PEFFER u. S. P. JAMES (1988): Lymphocytes isolated from the intestinal lamina propria of normal nonhuman primates have increased expression of genes associated with T-cell activation. Gastroenterology 94, 647-655 ZHANG, G.; C. R. ROSS u. F. BLECHA (2000): Porcine antimicrobial peptides: new prospects for ancient molecules of host defense. Vet. Res. 31, 277-296 ZHANG, G.; C. R. ROSS; S. S. DRITZ; J. C. NIETFELD u. F. BLECHA (1997): Salmonella infection increases porcine antibacterial peptide concentrations in serum. Clin. Diagn. Lab. Immunol. 4, 774-777 ZHANG, G.; H. WU; J. SHI; T. GANZ; C. R. ROSS u. F. BLECHA (1998): Molecular cloning and tissue expression of porcine beta-defensin-1. FEBS Lett. 424, 37-40 ZHAO, C.; T. GANZ u. R. I. LEHRER (1995a): Structures of genes for two cathelin-associated antimicrobial peptides: prophenin-2 and PR-39. FEBS Lett. 376, 130-134 154 Literaturverzeichnis ________________________________________________________________________________ ZHAO, C.; T. GANZ u. R. I. LEHRER (1995b): The structure of porcine protegrin genes. FEBS Lett. 368, 197-202 155 Anhang I ________________________________________________________________________________ 8 Anhang I 8.1 Futterzusammensetzung des verwendeten Grundfutters 8.1.1 E. coli Nissle 1917-Versuch mit konventionell gehaltenen Schweinen Tab. 12 Futterzusammensetzung für den Versuch mit konventionell gehaltenen Schweinen Ferkelfutter Einzelkomponenten Mischfuttermenge Rohprotein Rohfett Rohfaser NfE % kg % % % % Gerste 48,50 48,50 12,50 2,70 5,70 76,40 Hafer 15,00 15,00 12,30 5,20 11,30 67,90 Weizen 9,50 9,50 13,80 2,00 2,90 79,40 Erbsen 8,50 8,50 25,90 1,50 6,80 62,10 Maiskleber 12,50 12,50 70,50 5,10 1,30 21,00 Sojaöl 1,00 1,00 0,00 99,90 0,00 0,00 Lysinmonohydrochl. 0,85 0,85 93,33 0,00 0,00 0,00 DL-Methionin 0,05 0,05 99,00 0,00 0,00 0,00 L-Threonin 0,10 0,10 99,00 0,00 0,00 0,00 L-Tryptophan 0,10 0,10 99,00 0,00 0,00 0,00 Schweinemin. (pro fit) 3,00 3,00 0,10 0,00 0,00 8,00 Futterkalk 0,90 0,90 0,00 0,00 0,00 0,00 100,00 100,00 Abkürzungen: NfE = nicht-Fett Enegie, Schweinemin. = Schweinemineralfutter 156 Anhang I ________________________________________________________________________________ 8.1.2 Infektionsversuche mit und ohne EcN Tab. 13 Futterzusammensetzung für Tiere der Infektionsversuche Sauenfutter / Probiotikafreies Ferkelfutter Einzelkomponenten Mischfuttermenge Rohprotein Rohfett Rohfaser NfE % kg Gerste (geschrotet) 40,50 Weizen (geschrotet) % % % 40,50 10,40 2,20 6,00 76,40 35,00 35,00 11,90 1,80 2,60 79,40 Soja (geschrotet) 20,00 20,00 45,30 1,30 6,20 62,10 Sojaöl 1,00 1,00 0,00 99,90 0,00 0,00 Schweinemin. (Phoskana 580) 3,50 3,50 0,10 0,00 0,00 8,00 100,00 % 100,00 Abkürzungen: NfE = nicht-Fett Enegie, Schweinemin. = Schweinemineralfutter 157 Anhang II ________________________________________________________________________________ 9 Anhang II 9.1 Bakterienstämme Escherichia coli Stamm Nissle 1917 Fa. Ardeypharm, Herdecke, Deutschland → Suspension 1: 5,0 x 108 KBE/ml Charge: Ch.B.:#BF01.1001-1 → Suspension 2: 5,0 x 1010 KBE/ml Charge: Ch.B.:#BF01.1001-3 Mutaflor® 100 mg Kapseln Fa. Ardeypharm, Herdecke, Deutschland Escherichia coli Stamm „Abbotstown“ AG Prof. Baljer, Justus-Liebig Universität, Gießen, Deutschland 9.2 Material und Geräte Amicon Ultra 100 Fa. Millipore, Bedford, USA Analysewaage Satorius RP 221 S Fa. Omnilab-Laborzentrum GmbH & Co. KG, Gehrden, Deutschland Analysewaage Satorius Typ 1475 Fa. Omnilab-Laborzentrum GmbH & Co. KG, Gehrden, Deutschland Assistent® Counter AC-8 Karl Hecht GmbH &Co. KG, Sondheim, Deutschland Blockstation Fa. Shandon, Frankfurt, Deutschland Brucheisautomat Fa. Ziegra, Hannover, Deutschland chirurgische Pinzetten Fa. Omnilab-Laborzentrum GmbH & Co. KG, Gehrden, Deutschland chirurgische Schere, gerade Fa. Omnilab-Laborzentrum GmbH & Co. KG, Gehrden, Deutschland Columbia Blutagarplatten Fa. Oxoid GmbH, Wesel, Deutschland Coolpix MDC Lens Fa. Nikon GmbH, Düsseldorf, Deutschland Coolpix5000 Digitalkamera Fa. Nikon GmbH, Düsseldorf, Deutschland Cryostat HM 500 OM Fa. Microm, Walldorf, Deutschland Deckgläser 24 x 50 mm Fa. Menzel GmbH & Co KG, Braunschweig, Digi-Clock Timer TR 119 OS Fa. Oregon Scientific, Villingen, Deutschland DIGItempTM Digitales Fieberthermometer Fa. Servoprax® GmbH, Wesel, Deutschland 158 Anhang II ________________________________________________________________________________ Einmalspritzen 10 ml Fa. Codan Medical ApS, Rødby, Dänemark Einmalspritzen 2 ml Fa. Codan Medical ApS, Rødby, Dänemark Einmalspritzen 5 ml Fa. Codan Medical ApS, Rødby, Dänemark Electrothermal Praffin Section Mounting Bath Fa. Barnstead International, Dubuque, USA EnghalsspritzflaschenPE-LD 500ml Fa. Omnilab-Laborzentrum GmbH & Co. KG, Gehrden, Deutschland Eppendorf Centrifuge 5451c Fa. Eppendorf AG, Hamburg, Deutschland Ernährungssonde 1,5 x 2,1 mm Fa. Braun Melsungen AG, Melsungen, Deutschland Färbekästen nach Hellendahl 60 x 55 x 105 mm Fa. Karl Roth GmbH & Co. KG, Karlsruhe, Deutschland Reaktionsröhrchen 50 ml Fa. Becton Dickinson GmbH, Heidelberg, Deutschland Gasprofi 1 SCS Fa. WLD-Tec, Göttingen, Deutschland Gefrierschrank –20°C Einzelhandel Gefrierschrank –80°C Einzelhandel Gel Doc 1000 Fa. BioRad, Hercules, USA Glaspipetten 20 ml Fa. Ochs, Bovenden, Deutschland Heidelberg, Deutschland Histokinette Fa. Reichert-Jung, Nussloch, Deutschland Inkubations-Schüttler Innova 4000 Fa. New Brunswick Scientific, Großbritannien Kanülen 0,4 x 20 mm Fa. Terumo Europe N.V., Leuven, Belgien Kanülen 1,2 x 40 mm Fa. Terumo Europe N.V., Leuven, Belgien Kühlplatte Fa. Shandon, Frankfurt, Deutschland Kühlschrank 4°C Einzelhandel Labophot-2 Mikroskop Fa. Nikon GmbH, Düsseldorf, Deutschland Laborflaschen Schott Duran®1000ml Fa. Omnilab-Laborzentrum GmbH & Co. KG, Gehrden, Deutschland Laborflaschen Schott Duran®100ml Fa. Omnilab-Laborzentrum GmbH & Co. KG, Gehrden, Deutschland Laborflaschen Schott Duran®250ml Fa. Omnilab-Laborzentrum GmbH & Co. KG, Gehrden, Deutschland 159 Anhang II ________________________________________________________________________________ Laborflaschen Schott Duran®500ml Fa. Omnilab-Laborzentrum GmbH & Co. KG, Gehrden, Deutschland Labor pH-Meter „ Knick“ 766 Calimatic Fa. Omnilab-Laborzentrum GmbH & Co. KG, Gehrden, Deutschland Lambda Scan 200e Photometer Fa. MWG AG Biotech, Ebersberg, Deutschland Lamina Airflow NU 440-400E Fa. NuAire, Plymouth, USA Latex-Untersuchungshandschuhe Fa. Kimberly-Clark, Zaventem, Belgien Li-Heparin LH/9 ml Monovette® Fa. Sarstedt, Nümbrecht, Deutschland Magnetrührer RET basic Fa. IKA®-Werke GmbH & Co KG, Staufen, Deutschland Microtom HM 335 E Fa. Microm, Walldorf, Deutschland Mikroskopobjektive 10x, 20x, 40x, 100x Fa. Nikon GmbH, Düsseldorf, Deutschland Minifuge 2 Fa. Heraeus, Hanau, Deutschland Nikon EH 21 Netzadapter Fa. Nikon GmbH, Düsseldorf, Deutschland Nikon View software Fa. Nikon GmbH, Düsseldorf, Deutschland NuncTM Cryo TubeTM Vials Fa. Nunc, Roskilde, Dänemark Objektträger unbeschichtet Fa. Menzel GmbH & Co KG, Braunschweig, Parrafinbad Medax WB24 Fa. Medax Nagel KG, Kiel, Deutschland pH-Meter Einstabmesskette „ Knick“ SE 100 Fa. Omnilab-Laborzentrum GmbH & Co. KG, Gehrden, Deutschland PIPETBOY acu Fa. Integra Bioscience, Fernwald, Deutschland Pipetten Eppendorf 10 µl Fa. Eppendorf AG, Hamburg, Deutschland Pipetten Eppendorf 10 ml Fa. Eppendorf AG, Hamburg, Deutschland Pipetten Eppendorf 100 µl Fa. Eppendorf AG, Hamburg, Deutschland Pipetten Eppendorf 1000 µl Fa. Eppendorf AG, Hamburg, Deutschland Pipetten Eppendorf 200 µl Fa. Eppendorf AG, Hamburg, Deutschland Pipetten PE 10 ml Fa. Sarstedt, Nümbrecht, Deutschland Pipetten PE 10 ml Fa. Sarstedt, Nümbrecht, Deutschland Pipetten PE 25 ml Fa. Sarstedt, Nümbrecht, Deutschland Pipettenspitzen 10 ml Fa. Sarstedt, Nümbrecht, Deutschland Pipettenspitzen 10µl Fa. Sarstedt, Nümbrecht, Deutschland Pipettenspitzen 1000 µl Fa. Sarstedt, Nümbrecht, Deutschland 160 Anhang II ________________________________________________________________________________ Pipettenspitzen 200 µl Fa. Sarstedt, Nümbrecht, Deutschland Power Pac 3000 Gel-Elektrophoresekammer Fa. BioRad, Hercules, USA Reaktionsgefäß 50 ml Fa. Sarstedt, Nümbrecht, Deutschland Reaktionsgefäße 1500 µl Fa. Eppendorf AG, Hamburg, Deutschland Reaktionsgefäße 200 µl Fa. Biozym Diagnostic GmbH, Hessisch Oldendorf, Deutschland Reaktionsgefäße 500µl Fa. Sarstedt, Nümbrecht, Deutschland Rosenberg, Deutschland SuperFrost®Plus Objektträger Fa. Menzel GmbH & Co KG, Braunschweig, TierWohl Super Weichholzspäne Fa. J. Reppmeier + Söhne GmbH&Co Transportagar 0482 Fa. Nerbe plus, Winsen/Luhe, Deutschland Ultra-Thurax T8 Fa. IKA®-Werke GmbH & Co KG, Staufen, Deutschland Vari-Kennel® XL Fa. Patmate®, Arlington, USA Vortexer „Vortex-Genie 2 Fa. Scientific Industries Inc., Bohemia, USA Wasserbad Fa. GFL m.b.H., Burgwedel, Deutschland Weithalsflaschen PP Kautex Fa. Omnilab-Laborzentrum GmbH & Co. KG, Gehrden, Deutschland Weithalsgläser Glas 250 ml Fa. Omnilab-Laborzentrum GmbH & Co. KG, Gehrden, Deutschland Zentrifuge CLGS56R Beckman Coulter, Krefeld, Deutschland Zentrifuge ZK 380 Fa. Hermle, Buckley, USA 9.3 Pharmaka und Substanzen β-Mercaptoethanol Fa. Sigma Aldrich, Steinheim, Deutschland 10x PCR-Buffer Fa. Invitrogen, Karlsruhe, Deutschland 5x First-strand-Buffer Fa. Invitrogen, Karlsruhe, Deutschland Ampuwa® für Spülzwecke Plastipur® Fa. Ardeypharm, Herdecke, Deutschland Antikörper Diluent Fa. Zymed, San Francisco, USA Baypamun ® Fa. Bayer AG, Leverkusen, Deutschland Bromphenolblau Fa. Sigma Aldrich, Steinheim, Deutschland 161 Anhang II ________________________________________________________________________________ Chloroform Fa. Merck, Darmstadt, Deutschland d(T)12_18 5`-PO4,Na+Salt oligo dt Primer Fa. Amersham Pharmacia Biotech, Freiburg, Deutschland dNTP-Mix 2,5 mM Fa. Invitrogen, Karlsruhe, Deutschland DTT Fa. Invitrogen, Karlsruhe, Deutschland 0,1 M EDTA Ethylenediaminetetraaceticacid Fa. Sigma Aldrich, Steinheim, Deutschland Eisendektran 20 Fa. Vetoquinol, Oberursel, Deutschland Eisessig Fa. Merck, Darmstadt, Deutschland Entellan Fa. Merck, Darmstadt, Deutschland Eosin Y(wässrig) Fa. Sigma Aldrich, Steinheim, Deutschland Ethanol 100 % Fa. Merck, Darmstadt, Deutschland Ethidium-Bromid Fa. Sigma Aldrich, Steinheim, Deutschland Paraformaldehyd Fa. Merck, Darmstadt, Deutschland Giemsa Fa. Merck, Darmstadt, Deutschland Glycerol Fa. Merck, Darmstadt, Deutschland Handedesinfektion „Sterilium®“ Fa. Bode Chemie, Hamburg, Deutschland Ivomec 5% Schwein Injektionslösung Fa. Bayer AG, Leverkusen, Deutschland Kalium-dihydrogenPhosphat (KH2PO4) Fa. Merck, Darmstadt, Deutschland Lysovet® PA als 2% Lösung Fa. Schülke & Mayer, Norderstedt, Deutschland Meyer’s Hämalaun Fa. Merck, Darmstadt, Deutschland Magnesiumchlorid (MgCl2) 50 mM Fa. Invitrogen, Karlsruhe, Deutschland Monet Blue Fa. Biocare Medical, Hamburg, Deutschland Natriumchlorid (NaCl) Fa. Merck, Darmstadt, Deutschland Platinum® Taq DNA-Polymerase Fa. Invitrogen, Karlsruhe, Deutschland RLT-Puffer Fa. Quiagen, Hilden, Deutschland RNA-Later Fa. Quiagen, Hilden, Deutschland RQ1 Rnase-free DNAse Fa. Promega, Madison, Wisconsin Süßstoff handelsüblich SuperscriptTM III Reverse Transkriptase Fa. Invitrogen, Karlsruhe, Deutschland o-Toluidinblau Fa. Merck, Darmstadt, Deutschland Tris(hydroxymethyl)aminomethan Fa. Merck, Darmstadt, Deutschland Tween® 20 Fa. Sigma Aldrich, Steinheim, Deutschland 162 Anhang II ________________________________________________________________________________ vanGogh Yellow Fa. Biocare Medical, Hamburg, Deutschland Wasserstoffperoxid 30 % (H2O2) Fa. Merck, Darmstadt, Deutschland Xylencyanol Fa. Merck, Darmstadt, Deutschland Xylol Fa. Merck, Darmstadt, Deutschland 9.4 Lösungen und Protokolle Wenn nicht anders angegeben, wurde zur Einstellung des pH-Wertes bei allen Lösungen 5 M NaOH bzw. 18%ige HCl verwendet. Alle Puffer wurden bei 4°C im Kühlschrank gelagert. Tab. 14 Puffer und Lösungsrezepte 100 bp DNA Ladder-Lösung: DNA-Laufpuffer 100 bp Ladder DNA Ladder (1µg/ml) Aqua dest. ad 80µl 20µl 300 µl ad 3g 15 µl 1000 ml Agarose-Gel (1%): Agarose Ethidiumbromid TAE-Puffer Carnoy Lösung: 60 ml 30 ml 10 ml Ethanol 100 % Chloroform Eisessig DNA Laufpuffer: Glycerol EDTA (0,5 M, pH 8) Bromphenolblau Xylencyanol Aqua dest. ad 30 ml 4 ml 50µl 50 µl 100 ml ad 2,5 g 2,5 g 0,2 g 0,2 g 0,2 g 20 µl 1000 ml Nissle -Puffer:(Ferkelinfektionsversuche mit und ohne EcA) NaCl KCl MgSO4 CaCl2 MgCl2 x 6 H2O NaOH (32%) Aqua dest. pH-Wert 8,8; 152 mosmol/l 163 Anhang II ________________________________________________________________________________ Paraformaldehyd (4%): Paraformaldehyd ad PBS-Puffer (einfach) unter Rühren auf einer Wärmeplatte lösen, vollständige Lösung erst nach Einstellung auf pH 7,4 PBS mit 0,01% Natrium-Azid: Na- Azid PBS-Puffer (einfach) ad 100 mg 1000 ml ad 50 ml 1000 ml ad 180 g 5,34 g 28,66 g 1000 ml ad 9g 1000 ml PBS-Puffer (einfach): PBS (20x) Aqua dest. pH-Wert auf 7,4 einstellen. PBS-Puffer (20-fach): NaCl KH2PO4 Na2HPO4*2H2O Aqua dest. pH-Wert auf 6,4-6,6 einstellen Physiologische Kochsalzlösung: NaCl Aqua dest. RLT-Puffer: 20 ml 200 µl RNA- Lysis-buffer β-Mercaptoethanol Lagerung bei RT Suspensions -Puffer: gehaltenen Tieren) NaCl NaH2PO4 x H2O Na2HPO4 x 2H2O Aqua dest. (Versuche mit konventionell ad 8,18 g 0,276 g 1,42 g 1000 ml ad 4,84 g 1,142 g 2 ml 1000 ml ad 87,66 g 60,55 g 1000 ml TAE (1x): Tris Eisessig EDTA (0,5 mM, pH 8) Aqua dest. TBS-Puffer (10x): NaCl TRIS Aqua dest. pH-Wert auf 7,4 einstellen TBS/Tween: TBS (1x) Tween 20 4g 1000 ml 1000 ml 350 µl 164 Anhang II ________________________________________________________________________________ Tris Buffered Saline (TBS) (1x): TBS (10x) Aqua dest. pH-Wert kontrollieren und bei Abweichung auf 7,4 einstellen Wässrige Eosinlösung: Wässriges Eosin Eisessig ad 100 ml 1000 ml 70 ml 2-3 Tropfen 9.5 Kits RNeasy Kit Fa. Qiagen, Hilden, Deutschland AEC Substrat Chromogen Kit Fa. Zymed, San Francisco, USA 165 Anhang III ________________________________________________________________________________ 10 Anhang III 10.1 Versuch mit konventionell gehaltenen Schweinen mit und ohne EcN 10.1.1 Gewicht Tab. 15 Gewichtsverlauf konventioneller Schweine Tier Gruppe Einstallung Versuchsbeginn Schlachtung Zunahme im Versuch Gesamtzunahme kg kg kg kg kg S2-3 S2-4 S2-8 S2-12 S2-13 S2-1 S2-2 S2-9 S2-10 S2-11 K K K K K 9 10 KBE/Tag 109 KBE/Tag 109 KBE/Tag 109 KBE/Tag 109 KBE/Tag 23,0 15,3 12,8 15,6 13,0 15,3 13.0 17,1 19,0 18,2 23,9 16,6 12,3 16,1 13,1 15,7 13,1 16,5 18,5 17,6 25,4 17,4 12,5 16,8 17,4 17,1 15,0 16,7 19,0 18,2 1,5 0,8 0,2 0,7 4,3 1,4 1,9 0,2 0,5 0,6 2,4 2,1 -0,3 1,2 4,4 1,8 2,0 -0,4 0,0 0,0 S2-5 S2-6 S2-7 S2-14 S2-15 1011 KBE/Tag 1011 KBE/Tag 1011 KBE/Tag 1011 KBE/Tag 1011 KBE/Tag 18,0 15,0 16,2 16,0 13,5 17,5 15,2 15,2 17,5 15,1 19,0 12,5 15,0 18,2 18,0 1,5 -2,7 -0,2 0,7 2,9 1,0 -2,5 -1,2 2,2 4,5 Abkürzungen: KBE = koloniebildende Einheit, S2 = Schweineversuch 2 166 Anhang III ________________________________________________________________________________ 10.1.2 Anzahl eosinophiler Granulozyten Tab. 16 Anteil eosinophiler Granulozyten in mukosaler LP (Mittelwert und SD) Gruppe Darmabschnitt Mittelwert (positive Zellen/100 LP-Zellen) SD Kontrolle Duodenum Jejunum Ileum Colon ascendens Colon descendens 0,012 0,083 0,110 0,005 0,006 0,011 0,028 0,022 0,005 0,003 109 KBE/Tag Duodenum Jejunum Ileum Colon ascendens Colon descendens 0,016 0,092 0,137 0,001 0,002 0,003 0,003 0,005 0,001 0,002 1011 KBE/Tag Duodenum Jejunum Ileum Colon ascendens Colon descendens 0,014 0,080 0,113 0,005 0,002 0,015 0,035 0,083 0,007 0,002 Abkürzungen: KBE = koloniebildende Einheit, SD = Standardabweichung 10.1.3 Anzahl neutrophiler Granulozyten Tab. 17 Anteil neutrophiler Granulozyten in mukosaler LP (Mittelwert und SD) Gruppe Darmabschnitt Mittelwert (positive Zellen/100 LP-Zellen SD Kontrolle Duodenum Jejunum Ileum Colon ascendens Colon descendens 0,037 0,004 0,019 0,025 0,037 0,014 0,002 0,015 0,026 0,019 109 KBE/Tag Duodenum Jejunum Ileum Colon ascendens Colon descendens 0,027 0,006 0,016 0,016 0,048 0,023 0,008 0,014 0,007 0,020 1011 KBE/Tag Duodenum Jejunum Ileum Colon ascendens Colon descendens 0,019 0,011 0,033 0,047 0,049 0,010 0,009 0,026 0,034 0,046 Abkürzungen: KBE = koloniebildende Einheit, SD = Standardabweichung 167 Anhang III ________________________________________________________________________________ 10.1.4 Anzahl an Mastzellen Tab. 18 Anteil an Mastzellen in mukosaler LP (Mittelwert und SD) Gruppe Darmabschnitt Mittelwert (positive Zellen/100 LP-Zellen SD Kontrolle Duodenum Jejunum Ileum Colon ascendens Colon descendens 0,025 0,023 0,026 0,031 0,023 0,012 0,014 0,011 0,010 0,007 109 KBE/Tag Duodenum Jejunum Ileum Colon ascendens Colon descendens 0,024 0,022 0,027 0,028 0,014 0,016 0,008 0,005 0,014 0,008 1011 KBE/Tag Duodenum Jejunum Ileum Colon ascendens Colon descendens 0,015 0,020 0,030 0,026 0,016 0,006 0,006 0,012 0,008 0,008 Abkürzungen: KBE = koloniebildende Einheit, SD = Standardabweichung 168 Anhang III ________________________________________________________________________________ 10.1.5 Anteil CD4+ Zellen Tab. 19 Anteil CD4+ Zellen in mukosaler LP (Mittelwert und SD) Gruppe Darmabschnitt Mittelwert* SD Kontrolle Duodenum 2,8 0,447 Jejunum 2,6 0,548 Ileum 2,8 0,837 Colon ascendens 2,6 0,895 Colon descendens 2,8 0,447 Duodenum 2,4 0,548 Jejunum 2,8 0,447 Ileum 2,2 0,447 Colon ascendens 2,0 0,707 Colon descendens 2,4 0,894 Duodenum 2,6 0,548 Jejunum 2,8 0,447 Ileum 2,2 0,447 Colon ascendens 1,4 0,894 Colon descendens 3,0 0,000 109 KBE/Tag 1011 KBE/Tag *Bestimmung semiquantitativ Abkürzungen: KBE = koloniebildende Einheit, SD = Standardabweichung 169 Anhang III ________________________________________________________________________________ 10.1.6 Anzahl CD8+ Zellen Tab. 20a Anteil CD8+ Zellen, IEL luminal (Mittelwert und SD) Gruppe Darmabschnitt Mittelwert (positive Zellen/100 LP-Zellen SD Kontrolle Duodenum Jejunum Ileum Colon ascendens Colon descendens 0,330 0,243 0,179 0,121 0,145 0,099 0,075 0,027 0,029 0,044 109 KBE/Tag Duodenum Jejunum Ileum Colon ascendens Colon descendens 0,300 0,219 0,175 0,134 0,194 0,063 0,095 0,043 0,038 0,073 1011 KBE/Tag Duodenum Jejunum Ileum Colon ascendens Colon descendens 0,351 0,255 0,207 0,160 0,123 0,087 0,094 0,048 0,044 0,074 Abkürzungen: KBE = koloniebildende Einheit, SD = Standardabweichung Tab. 20b Anteil CD8+ Zellen, LPL luminal (Mittelwert und SD) Gruppe Darmabschnitt Mittelwert (positive Zellen/100 LP-Zellen SD Kontrolle Duodenum Jejunum Ileum Colon ascendens Colon descendens 0,138 0,191 0,128 0,103 0,125 0,048 0,072 0,040 0,013 0,043 109 KBE/Tag Duodenum Jejunum Ileum Colon ascendens Colon descendens 0,167 0,202 0,156 0,144 0,172 0,050 0,042 0.037 0,021 0,050 1011 KBE/Tag Duodenum Jejunum Ileum Colon ascendens Colon descendens 0,194 0,211 0,202 0,131 0,149 0,060 0,054 0,084 0,034 0,026 Abkürzungen: KBE = koloniebildende Einheit, SD = Standardabweichung 170 Anhang III ________________________________________________________________________________ Tab. 20c Anteil CD8+ Zellen, IEL basal (Mittelwert und SD) Gruppe Darmabschnitt Mittelwert (positive Zellen/100 LP-Zellen SD Kontrolle Duodenum Jejunum Ileum Colon ascendens Colon descendens 0,023 0,036 0,040 0,041 0,040 0,008 0,012 0,020 0,018 0,014 109 KBE/Tag Duodenum Jejunum Ileum Colon ascendens Colon descendens 0,031 0,052 0,049 0,045 0,047 0,007 0,007 0,020 0,018 0,017 1011 KBE/Tag Duodenum Jejunum Ileum Colon ascendens Colon descendens 0,025 0,042 0,044 0,059 0,040 0,005 0,010 0,010 0,014 0,018 Abkürzungen: KBE = koloniebildende Einheit, SD = Standardabweichung Tab. 20d Anteil CD8+ Zellen, LPL basal (Mittelwert und SD) Gruppe Darmabschnitt Mittelwert (positive Zellen/100 LP-Zellen SD Kontrolle Duodenum Jejunum Ileum Colon ascendens Colon descendens 0,085 0,101 0,117 0,064 0,081 0,033 0,020 0,018 0,008 0,023 109 KBE/Tag Duodenum Jejunum Ileum Colon ascendens Colon descendens 0,109 0,098 0,099 0,087 0,085 0,016 0,016 0,006 0,023 0,042 1011 KBE/Tag Duodenum Jejunum Ileum Colon ascendens Colon descendens 0,073 0,097 0,120 0,096 0,066 0,026 0,034 0,011 0,036 0,044 Abkürzungen: KBE = koloniebildende Einheit, SD = Standardabweichung 171 Anhang III ________________________________________________________________________________ Tab. 21a Anteil CD8+ Zellen, Verhältnis IEL:LPL luminal (Mittelwert und SD) Gruppe Darmabschnitt Mittelwert (positive Zellen/100 LP-Zellen SD Kontrolle Duodenum Jejunum Ileum Colon ascendens Colon descendens 2,00 1,30 1,47 1,18 1,19 0,67 0,24 0,28 0,30 0,26 109 KBE/Tag Duodenum Jejunum Ileum Colon ascendens Colon descendens 1,88 1,16 1,15 0,93 1,13 0,56 0,67 0,27 0,21 0,33 1011 KBE/Tag Duodenum Jejunum Ileum Colon ascendens Colon descendens 2,06 1,29 1,12 1,26 0,83 1,03 0,53 0,35 0,44 0,45 Abkürzungen: KBE = koloniebildende Einheit, SD = Standardabweichung Tab. 21b Anteil CD8+ Zellen, Verhältnis IEL:LPL basal (Mittelwert und SD) Gruppe Darmabschnitt Mittelwert (positive Zellen/100 LP-Zellen SD Kontrolle Duodenum Jejunum Ileum Colon ascendens Colon descendens 0,29 0,36 0,34 0,65 0,52 0,08 0,11 0,18 0,36 0,23 109 KBE/Tag Duodenum Jejunum Ileum Colon ascendens Colon descendens 0,29 0,53 0,49 0,52 0,72 0,07 0,05 0,18 0,16 0,47 1011 KBE/Tag Duodenum Jejunum Ileum Colon ascendens Colon descendens 0,39 0,46 0,37 0,69 0,71 0,18 0,12 0,10 0,30 0,41 Abkürzungen: KBE = koloniebildende Einheit, SD = Standardabweichung 172 Anhang III ________________________________________________________________________________ 10.1.7 Anzahl CD25+ Zellen Tab. 22 Anteil CD25+ Zellen in mukosaler LP (Mittelwert und SD) Gruppe Darmabschnitt Mittelwert (positive Zellen/100 LP-Zellen SD Kontrolle Duodenum Jejunum Ileum Colon ascendens Colon descendens 0,032 0,028 0,028 0,037 0,024 0,009 0,009 0,014 0,015 0,013 109 KBE/Tag Duodenum Jejunum Ileum Colon ascendens Colon descendens 0,033 0,032 0,036 0,035 0,034 0,016 0,013 0,015 0,013 0,017 1011 KBE/Tag Duodenum Jejunum Ileum Colon ascendens Colon descendens 0,035 0,050 0,030 0,031 0,019 0,019 0,022 0,008 0,010 0,007 Abkürzungen: KBE = koloniebildende Einheit, SD = Standardabweichung 10.1.8 Anteil IgA+ Zellen Tab. 23 Anteil IgA+ Zellen in mukosaler LP (Mittelwert und SD) Gruppe Darmabschnitt Mittelwert (positive Zellen/100 LP-Zellen SD Kontrolle Duodenum Jejunum Ileum Colon ascendens Colon descendens 0,150 0,051 0,056 0,062 0,063 0,084 0,031 0,034 0,050 0,028 109 KBE/Tag Duodenum Jejunum Ileum Colon ascendens Colon descendens 0,143 0,120 0,086 0,105 0,108 0,124 0,087 0,057 0,059 0,053 1011 KBE/Tag Duodenum Jejunum Ileum Colon ascendens Colon descendens 0,211 0,067 0,039 0,066 0,083 0,031 0,051 0,034 0,031 0,056 Abkürzungen: KBE = koloniebildende Einheit, SD = Standardabweichung 173 Anhang III ________________________________________________________________________________ 10.2 Infektionsversuche mit und ohne EcN 10.2.1 Gewicht Tab. 24 Durchschnittsgewicht Ferkel aus den verwendeten Würfen (Mittelwert und SD) Wurf Mittelwert Gewicht kg 7,4 8,1 ohne EcN mit EcN SD kg 0,62 0,64 Abkürzungen: EcN = Escherichia coli nissle 1917, SD = Standardabweichung Tab. 25 Gewichtsentwicklung der Ferkel im Infektionsversuch ohne EcN Tier Gruppe Absetzen kg Schlachtung kg Gesamtzunahme kg SI2-1 SI2-3 SI2-5 SI2-7 K K K K 7,2 6,9 6,2 8,7 7,0 6,8 6,0 9,1 -0,22 -0,08 -0,20 0,36 SI2-2 SI2-4 SI2-6 SI2-8 I I I I 6,8 7,3 7,5 8,4 6,3 7,7 7,1 8,1 -0,54 0,38 -0,40 -0,30 Abkürzungen: I = Infektion, K = Kontrolle, SI =Schweineinfektionsversuche Tab. 26 Gewichtsentwicklung der Ferkel im Infektionsversuch mit EcN Tier Gruppe Absetzen kg Schlachtung kg Gesamtzunahme kg SI3-1 SI3-3 SI3-5 SI3-7 K K K K 6,9 7,9 7,9 8,9 6,2 7,8 7,6 8,0 -0,69 -0,04 -0,30 -0,96 SI3-2 SI3-4 SI3-6 SI3-8 I I I I 9,1 8,2 7,3 8,8 8,4 7,9 7,2 8,7 -0,70 -0,32 -0,08 -0,14 Abkürzungen: I = Infektion, K = Kontrolle, SI =Schweineinfektionsversuche 174 Erklärung ________________________________________________________________________________ Erklärung Hiermit erkläre ich, dass ich die Dissertation „Auswirkung der oralen Gabe von Escherichia coli Nissle 1917 auf das darm-assoziierte Immunsystem des Schweins“ selbstständig verfasst habe. Bei der Anfertigung wurden folgende Hilfen dritter in Anspruch genommen: - Materialien und Geräte wurden von der Arbeitsgruppe Bischoff aus der Abteilung für Gastroenterologie, Hepatologie und Endokrinologie der Medizinischen Hochschule Hannover und dem Physiologischen Institut der Tierärztlichen Hochschule zur Verfügung gestellt. - Die Gefrierschnitte für immunhistologische Untersuchungen wurden von Frau Ute Peters aus der Arbeitsgruppe Bischoff Abteilung für Gastroenterologie, Hepatologie und Endokrinologie der medizinischen Hochschule Hannover angefertigt. - Histologische Untersuchungen von Darmgewebe der Tiere des Enteritismodells wurden vom Institut für Pathologie der Tierärztlichen Hochschule Hannover durchgeführt. - Die bakteriologischen Untersuchungen wurden von Frau Dr. Stephanie Barth aus dem Institut für Hygiene und Infektionskrankheiten der Tiere der Justus-Liebig Universität, Gießen (allgemeine Mikrobiologie und EcA), dem diagnostischen Labor des Instituts für Mikrobiologie und Tierseuchen der Tierärztlichen Hochschule Hannover und der Firma Ardeypharm GmbH, Herdecke (EcN) durchgeführt. - Die Anzüchtung von EcA erfolgte durch Frau Dr. Stefanie Barth aus dem Institut für Hygiene und Infektionskrankheiten der Tiere der Justus-Liebig Universität, Gießen und Frau Sabine Jeckstadt aus dem Institut für Mikrobiologie und Tierseuchen der Tierärztlichen Hochschule Hannover. - Die Bestimmung der luminalen und Plasma-IgA-Konzentration wurde von Frau Stephanie Erklärung ________________________________________________________________________________ Girrbach aus dem Institut für Ernährungsphysiologie der Bundesforschungsanstalt für Ernährung und Lebensmittel, Karlsruhe durchgeführt. - Diese Arbeit wurde mit einer finanziellen Hilfe in Form eines Promotionsstipendiums von der Firme ARDEYPHARM GmbH, Herdecke unterstützt. Ich habe keine entgeldliche Hilfe von Vermittlungs- bzw. Beratungsdiensten (Promotionsberater oder anderer Personen) in Anspruch genommen. Niemand hat von mir unmittelbar oder mittelbar entgeldliche Leistungen für Arbeiten erhalten, die im Zusammenhang mit dem Inhalt der vorgelegten Dissertation stehen. Ich habe die Dissertation an folgenden Institutionen angefertigt: Abteilung für Gastroenterologie, Hepatologie und Endokrinologie der Medizinischen Hochschule Hannover und dem Physiologischen Institut der Tierärztlichen Hochschule Hannover. Die Dissertation wurde bisher nicht für eine Prüfung oder Promotion oder für einen ähnlichen Zweck zur Beurteilung eingereicht. Ich versichere, dass ich die vorstehenden Angaben nach bestem Wissen vollständig und der Wahrheit entsprechend gemacht habe. Hannover, den 28. Februar 2005 Swantje Duncker Danksagung ________________________________________________________________________________ Danksagung Mein ausdrücklicher Dank gilt den beiden Betreuern dieser Arbeit, Prof. Dr. Gerhard Breves und Prof. Dr. Stephan C. Bischoff, ohne deren Kooperationsbereitschaft und gutes Einvernehmen diese Arbeit sicher nicht möglich gewesen wäre. Sie haben mir nicht nur zu diesem Thema verholfen, sondern mir auch bei meinem „Doppelarbeitsplatz“ jegliche Freiheit gelassen. Prof. Breves danke ich besonders für das Vertrauen in meine Arbeit und die Bemühungen, mich und damit die Anfertigung dieser Dissertation finanziell auf feste Füße zu stellen. Prof. Bischoff sei herzlich gedankt für die überaus freundliche Aufnahme in seine Arbeitsgruppe und dafür, dass er mir immer ein bisschen mehr zugetraut hat als ich mir selbst. Dr. Axel Lorentz war immer wieder bereit meine mäßigen Grundkenntnisse der Molekularbiologie aufzubessern und meine allzu enthusiastischen Interpretationsversuche von PCR-Ergebnissen in realistische Bahnen zu lenken. Das Korrekturlesen dieser Arbeit wurde nicht zuletzt dadurch so wertvoll. Vielen Dank dafür! Vielen Dank auch an Prof. Dr. Bernd Schröder für die geduldige Hilfe bei technischen Problemen und viele wertvolle Tipps. Bei PD Dr. Korinna Huber bedanke ich mich für die Unterstützung in tiermedizinischen Fragen. Einen ganz besonders lieber Dank geht an die „guten Seelen“ der beiden Labore. In der Medizinischen Hochschule: Gisela Weier, die immer auch noch bei der fünften Nachfrage für Auskünfte zur Verfügung stand und mich uneingeschränkt an ihrem großen Pool technischen Wissens teilhaben ließ. Ute Peters, die auch wenn mal wieder „ganz schnell noch“ eine Gewebefärbung nötig war, ohne zu murren, den Kryostaten angeschmissen hat. Brigitte Markfeldt, die mir immer wieder ihren Arbeitsplatz zur Verfügung stellte, wenn ich als Arbeitsnomade mit meinem Laptop mal wieder jemandem im Weg war. In der Tierärztlichen Hochschule: Frau Gerhild Becker, ohne deren taktisches Eingreifen ich wohl mehr als einmal im Organisationssumpf stecken geblieben wäre. Frau Marion Burmester und Ulrike Dringenberg für ihre jederzeit vorhandene Hilfsbereitschaft. Danksagung ________________________________________________________________________________ Ein ganz lieber Dank geht an meine Mitdoktoranden von denen die meisten inzwischen auch zu Freunden geworden sind: Jörn, Fabian, Leif, Nicole, Seza, Hans, Frank und Mirjam. Mikel: ohne Deinen Fundus an Computerwissen, wäre diese Arbeit wohl irgendwann in den Tiefen der Festplatten und Dateien verschollen und die „Ausbildung“ meiner „Singstimme“ verkümmert. Gernot: für die brillanten Ideen und Lösungsvorschläge und die unglaublich mitreißende gute Laune zu jeder Tages- und Nachtzeit. Thomas: für die immer konstruktive und wohlwollende Kritik und die Gespräche auf den vielen gemeinsamen Fahrten in die Südstadt. Sigrid: für die Aufmunterungen und Deine Bereitschaft immer noch „mal eben“ den Fehlerteufel in diesen Seiten zu jagen. Anne: für Deine selbstverständliche Freundschaft und uneingeschränkte Hilfe in jeder Lebenslage. Die Picknicks in, vor und außerhalb der MHH waren großartig. Die Laborfeste, Feuerzangenbowlen und sonstigen Feierlichkeiten mit Euch allen sind jetzt schon legendär! Danke, dass wir immer ein Team waren! Auch meinen Mitdoktoranden an der TiHo sei herzlich gedankt: Magnus, Eva, Sonja, Julia, Alex, Johanna, Diana, Melle, Mirja und Balazc. Gundula: Danke dass Du den wohl während jeder Arbeit aufkommenden, Frust gepuffert und immer dafür gesorgt hast, dass ich auch noch was esse. Michael Rohde und Yvonne Armbrecht möchte ich für ihre Hilfe mit den Versuchstieren danken und für Eure wunderbare Art, mit den vierbeinigen Mitgliedern der Physiologie umzugehen (I did it my way!). Das ist ganz großartig! Dirk Voigtländer: Danke für Deinen trockenen Humor. Ich werde bei jedem „Bauer Nussjoghurt“ an Dich denken. Mein besonderer Dank geht an die fachexternen Helfer und Freunde. Frau Dagmar und Hanni LassHennemann. Ihr habt dafür gesorgt, dass der Leser dieser Arbeit zu dem Eindruck kommen könnte, ich verstünde etwas von deutscher Grammatik und Rechtschreibung. Matthias Silberkuhl, der als Architekt für ein gelegentliches Ablegen der naturwissenschaftlichen Scheuklappen meinerseits gesorgt hat. Safty, für seine professionelle Rettung der Fotos in letzter Minute. Susi Westphal für unzählige Problemtees und Spaziergänge. Sandra Gaupels, die immer zugehört und mir hin und wieder den Kopf zurechtgerückt hat. („Ich sach ma ........ Danke.“) Danksagung ________________________________________________________________________________ Zuletzt danke ich meiner großartigen Familie, besonders meinen Eltern Christiane und Peter Duncker und meinem Großvater Friedl Sander. Ihr habt immer uneingeschränkt an mich geglaubt und mir gezeigt, dass die Welt nicht groß genug für mich sein kann.
