Entwicklung von Bakterienstämmen für die

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Metabolic Engineering:
Entwicklung von Bakterienstämmen für die Lysinproduktion
Nicole Kennerknecht, Petra Peters-Wendisch, Lothar Eggeling und Hermann Sahm
Institut für Biotechnologie 1, Forschungszentrum Jülich
Mit dem Bakterium Corynebacterium glutamicum werden zurzeit neben 1 000 000
Tonnen L-Glutamat jährlich über 600 000
Tonnen L-Lysin produziert. Während
bislang die Bakterienstämme zur Herstellung dieser für Mensch und Tier essentiellen L-Aminosäure weitgehend empirisch
durch Mutation und Selektion gewonnen
wurden, ermöglichen heutzutage detaillierte Untersuchungen der Stoffwechselwege eine gezielte Verbesserung der
Stämme mit Hilfe gentechnischer
Methoden (Metabolic Engineering). So
konnten Engpässe im Lysinsyntheseweg
und im Zentralstoffwechsel durch Überexpression der entsprechenden Gene beseitigt und die Produktivität dieser Aminosäure signifikant gesteigert werden. Da
auch die Sekretion von Lysin in das Kulturmedium bei der Produktion ein limitierender Faktor sein kann, wurde das Exportsystem in C. glutamicum für diese
Aminosäure untersucht und verbessert.
Der Bedarf an proteinreichen Nahrungsmitteln wächst mit den steigenden Ernährungsansprüchen einer stetig wachsenden
Weltbevölkerung. Mit der klassischen Agrarwirtschaft wird diese „Proteinlücke“ nicht
zu schließen sein, denn es wird pro Kopf immer weniger landwirtschaftliche Nutzfläche
zur Verfügung stehen. Bei pflanzlichen Nahrungs- und Futtermitteln sind häufig einige
der für Mensch und Tier essentiellen Aminosäuren in nur geringen Mengen enthalten.
Durch Anreicherung mit diesen limitierenden Aminosäuren kann der Nährwert jedoch
signifikant gesteigert werden. Die meisten
heute produzierten Aminosäuren werden
mit Hilfe von Bakterien oder Enzymen hergestellt, was zum Vorteil hat, dass ausschließlich die biologisch aktiven L-Aminosäuren gebildet werden.
Abb. 1: L-Lysin-Biosyntheseweg mit den Schlüsselenzymen Aspartatkinase und Dihydrodipicolinatsynthase sowie der verzweigten Biosynthese des Intermediats meso-Diaminopimelat in C. glutamicum.
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Corynebacterium glutamicum – ein
Bodenbakterium wird berühmt
Die Ära der mikrobiellen Aminosäureproduktion begann 1957, als Kinoshita und Mitarbeiter in Japan ein Gram-positives Bakterium isolierten, das bei Wachstum auf einem
einfachen Mineralsalzmedium mit Glukose
als Kohlenstoff- und Energiequelle große
Mengen Glutamat ins Nährmedium ausscheidet[1]. Dieses Bakterium, Corynebacterium glutamicum, bildet bis zu 75 g/l Glutamat pro Tag. Zurzeit werden jährlich über eine Million Tonnen Na-Glutamat als Geschmacksverstärker im Nahrungsmittelbereich mit diesem Mikroorganismus produziert. Es wurden Mutanten von C. glutamicum isoliert, die auch die essentielle Aminosäure Lysin in großer Menge überproduzieren. Die Produktion von Lysin ist in den letzten zehn Jahren stark angestiegen. So wurden im Jahre 2000 etwa 550.000 Tonnen Lysin mit C. glutamicum-Stämmen produziert,
wobei der Markt um sieben bis zehn Prozent
jährlich weiter wächst. Während bislang die
Bakterienstämme zur Herstellung von Lysin weitgehend empirisch durch Mutation
und Selektion gewonnen wurden, ermöglichen heutzutage detaillierte Untersuchungen der Stoffwechselwege und deren Regulationsmechanismen eine gezielte
Stammverbesserung mit Hilfe gentechnischer Methoden (Metabolic Engineering)[2].
te Affinität und eine 8,3-fach erhöhte spezifische Aktivität. Die Homoserindehydrogenase wird durch Threonin gehemmt, und die
Expression des entsprechenden Gens durch
Methionin reprimiert[4]. Kürzlich konnte gezeigt werden, dass bereits zwei Kopien des
Gens für die Dihydrodipicolinatsynthese in
C. glutamicum zu einem Threoninmangel bei
gleichzeitig erhöhter Lysinsynthese führten.
Aufgrund dieses Befundes wurden gezielt
Mutationen im Promotor des Dihydrodipicolinatsynthase-Gens hergestellt und die
Auswirkungen auf die Lysinbildung getestet[5]. Durch einen Basenaustausch im Promotor gelang es, die spezifische Aktivität der
Dihydrodipicolinatsynthase von 0,05 auf
0,19 µmol min–1 (mg Protein)–1 zu steigern,
was zu einer Erhöhung der Lysinausscheidung um 28 Prozent führte.
Überraschend ist auch, dass es für die Einführung der zweiten Aminogruppe in das Lysinmolekül zwei parallele Synthesewege in
C. glutamicum gibt. Die zweite Aminogruppe stammt entweder aus Glutamat und wird
über den Succinylaseweg eingebaut, oder sie
kommt vom Ammonium, das mit Hilfe der
Diaminopimelatdehydrogenase umgesetzt
wird (Abb. 1). Diese beiden Wege sind wichtig, weil meso-Diaminopimelat, die unmittelbare Vorstufe von Lysin, gleichzeitig
ein essentieller Baustein im Peptidoglykan
der Zellwand ist, und sie damit für die Stabilität der Zelle eine Rolle spielen. Die beiden Biosynthesewege in C. glutamicum stellen somit ein wichtiges System zur Synthese eines zentralen Metaboliten dar und können sehr flexibel bei unterschiedlichen Kulturbedingungen die Synthese der lebensnotwendigen Metabolite gewährleisten. Ferner zeigten Genomanalysen, dass einige weitere Bakterienarten wie Clostridium thermocellum und Porphyromonas gingivalis die
Strukturgene für diese beiden Wege der meso –Diaminopimelatsynthese besitzen. In C.
glutamicum sind beide Stoffwechselwege
wichtig für eine hohe Lysinproduktion.
Die anaplerotischen Reaktionen
Neben der Lysinsynthese spielt der Zentralstoffwechsel für die Bereitstellung der
Vorstufen eine wichtige Rolle bei der Lysinproduktion (Abb. 2). Oxalacetat, ein
Intermediat des Tricarbonsäure-Zyklus,
stellt die direkte Vorstufe der Aminosäure
Aspartat dar. Für die Bereitstellung von Oxalacetat sind die anaplerotischen Reaktionen
von zentraler Bedeutung. Während man lange Zeit davon ausging, dass in C. glutamicum
nur das Enzym PEP-Carboxylase bei Wachs-
Der Syntheseweg
Aspartat und Pyruvat sind die Vorstufen der
Lysinsynthese (Abb. 1). In diesem durch
zehn Enzyme katalysierten Biosyntheseweg
wird das erste Enzym, die Aspartatkinase, in
der Aktivität reguliert. Bei gleichzeitiger Anwesenheit von Lysin und Threonin wird dieses Enzym in seiner Aktivität gehemmt. In
Lysinproduktionsstämmen ist die Aspartatkinase im allosterischen Zentrum so verändert, dass keine Hemmung mehr erfolgt.
Diese Mutationen sind alle in dem Bereich
der β-Untereinheit des Enzyms lokalisiert,
das aus 2 α- und 2 β-Untereinheiten aufgebaut ist[3]. Interessant ist, dass das Gen der
β-Untereinheit im gleichen Leseraster innerhalb des größeren Gens der α-Untereinheit
liegt. Hier ist also der für Bakterien seltene
Fall eines Gens im Gen vorhanden.
Ein weiterer wesentlicher Schritt der Lysinsynthese in C. glutamicum ist die Kondensation des Aspartatsemialdehyds mit Pyruvat zum Dihydrodipicolinat (Abb. 1). Aspartatsemialdehyd dient gleichzeitig auch
der Synthese von Threonin, Isoleucin und
Methionin. Das erste Enzym dieses konkurrierenden Synthesewegs, die Homoserindehydrogenase, hat gegenüber der Dihydrodipicolinatsynthase eine 7,5-fach erhöhBIOspektrum · 5/03 · 9. Jahrgang
Abb. 2: Der Zentralstoffwechsel von C.
glutamicum. Farblich abgehoben sind
die für die L-Lysinproduktion entscheidenden Reaktionen über den Pentosephosphatweg (Grün), die anaplerotischen Reaktionen (Orange) und den
L-Lysinbiosyntheseweg (Blau).
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Abb. 3: Darstellung der komplexen Vernetzung der verschiedenen carboxylierenden und decarboxylierenden Reaktionen zwischen Phosphoenolpyruvat (PEP) bzw. Pyruvat und Oxalacetat bzw. Malat in
C. glutamicum.
tum auf Glukose als anaplerotisches Enzym
für die Bildung von Oxalacetat verantwortlich ist, gelang es kürzlich, die Pyruvatcarboxylase als weiteres anaplerotisches Enzym
nachzuweisen (Abb. 3). Somit besitzt C. glutamicum anders als die meisten Organismen
zwei C3-carboxylierende Enzyme für die Bildung von Oxalacetat. Die Isolierung des pycGens, das für die Pyruvatcarboxylase kodiert,
ermöglichte die Untersuchung des Einflusses dieses Enzyms auf die Lysinbildung. So
führte die Deletion des Gens zu einem drastischen Rückgang der Lysinbildung, während durch Überexpression des Gens eine
50-prozentige Steigerung der Produktion erzielt wurde[6]. Diese Ergebnisse zeigen, das
in C. glutamicum die Synthese von Oxalacetat bei der Überproduktion von Lysin einen
„Flaschenhals“ darstellt, der durch Überexpression des pyc-Gens gezielt beseitigt werden konnte. Quantitative Analysen zu den
in vivo-Flüssen mit Hilfe der 13C-NMRSpektroskopie ergaben, dass etwa 90 Prozent
des Oxalacetats durch die Pyruvatcarboxylase gebildet werden[7]. Interessanterweise
verfügt C. glutamicum nicht nur über zwei C3carboxylierende Enzyme, sondern auch über
die drei Enzyme PEP-Carboxykinase, Oxalacetatdecarboxylase und Malatenzym, welche die Decarboxylierung von Oxalacetat beziehungsweise Malat katalysieren (Abb. 3).
Die 13C-NMR-Analysen ergaben, dass etwa 70 Prozent des Oxalacetats durch die
PEP-Carboxykinase wieder zu Phosphoenolpyruvat decarboxyliert werden. Das gezielte Ausschalten dieses Enzyms in einem
Lysinproduktionsstamm führte dann auch
zu einer nochmaligen Steigerung der Lysinbildung[8].
Der Pentose-Phosphat-Weg
Auch die Verfügbarkeit des reduzierten
Coenzyms NADPH ist bei der Stammverbesserung von großer Bedeutung, da für die
Synthese eines Mols Lysin vier Mol
NADPH benötigt werden. Stoffflussanalysen bei verschiedenen C. glutamicum-Stämmen ergaben, dass der Pentosephosphatweg
(PPW) primär für die NADPH-Bereitstellung verantwortlich ist, obwohl auch bei an-
deren enzymatischen Reaktionen, wie dem Malatenzym oder
der Isocitratdehydrogenase,
NADPH gebildet wird. Wie eine Reihe von Untersuchungen
zeigten, korreliert die Aktivität
des PPW unmittelbar mit dem
Bedarf an NADPH für die Lysinbildung, was die große Flexibilität dieses Stoffwechselweges
widerspiegelt[9]. In neuen Arbeiten konnte durch das Ausschalten des glykolytischen Enzyms Phosphoglucose-Isomerase die Umsetzung der Glukose
ausschließlich über den PPW gelenkt werden. Dies hatte zur
Folge, dass aufgrund der erhöhten NADPH-Bildung einerseits
das Wachstum reduziert und andererseits, bei gleichzeitiger Reduktion der Nebenproduktbildung, die Lysinproduktion um
40 Prozent verbessert wurde[10].
Transport von Lysin
Der Mechanismus der Lysinsekretion in C. glutamicum war lange unklar, obwohl aufgrund der positiven Ladung von Lysin keine Diffusion durch die Cytoplasmamembran erfolgen kann. Untersuchungen
zur Exkretion von Lysin bei C. glutamicum
ergaben, dass der Export vom Membranpotenzial abhängig ist und einer klassischen
Michaelis-Menten-Kinetik unterliegt. Der
Km-Wert für Lysin beträgt etwa 20 mM, und
die maximale Exportgeschwindigkeit liegt
bei 12 nmol min–1 mg–1 Zelltrockengewicht[11].
Die anschließende Klonierung des Strukturgens lysE für den Exporter stellte einen
Durchbruch bei den Untersuchungen zum
Abb. 4: Topologiemodell des L-Lysinexportcarriers aus C. glutamicum mit fünf transmembranen
Helices und einer zusätzlichen hydrophoben α-Helix.
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Aminosäureexport dar, da damit der erste
bakterielle Aminosäureexporter identifiziert
werden konnte[12]. Dieser Lysinexporter
(LysE) ist ein verhältnismäßig kleines Protein mit einem Molekulargewicht von
25.424. Seine Topologie wurde durch Fusionen mit Reporterproteinen eingehend
untersucht[13]. Wie diese Experimente ergaben, besitzt der Lysinexporter fünf transmembrane Helices; eine zusätzliche hydrophobe α-Helix befindet sich vermutlich auf
der periplasmatischen Seite der Membran
(Abb. 4).
Interessanterweise wurde bei der Analyse des Genortes von lysE benachbart ein Regulatorgen identifiziert, das divergent zu
lysE transkribiert wird. Dieser mit LysG
bezeichnete Regulator zeigt eine hohe
Ähnlichkeit zu Regulatorproteinen der
LTTR(LysR-type transcriptional regulators)-Familie. Viele Vertreter dieser Regulatorfamilie wirken als transkriptionelle Aktivatoren, die meist noch Induktormoleküle
benötigen. Wie Transkriptionsstudien mit
LysG in C. glutamicum ergaben, findet eine
transkriptionelle Aktivierung der lysE-Expression statt[14]. Dabei wirkt Lysin als Induktor, wodurch die Expression des Lysinexportergens mit zunehmender interner Lysinkonzentration gesteigert wird. Durch
Überexpression des lysE-Gens konnte die
Lysinsekretionsrate um ein Mehrfaches gesteigert werden. Erste Hinweise auf die eigentliche Bedeutung von LysE im Wildtyp
von C. glutamicum ergaben sich bei Untersuchungen zum Wachstum einer lysE-Deletionsmutante, die auf Komplexmedium nur
noch sehr langsam wuchs. Bei Zugabe von
Lysin-haltigen Peptiden zum Nährmedium
wurde das Wachstum dieser Mutante vollständig gehemmt, da die intrazelluläre Lysinkonzentration auf über 1 M anstieg. Offensichtlich dient der Exporter LysE dazu,
bei Wachstum auf Peptiden oder Proteinen
eine toxische Akkumulation von Lysin im
Cytosol zu verhindern, da C. glutamicum Lysin nicht abbauen kann. Die generelle Bedeutung des Aminosäureexporters LysE
wird auch durch die weite Verbreitung homologer Exportsysteme in anderen Bakterien deutlich. Bei Genomanalysen sind bis
heute mehr als 100 mit LysE verwandte Exporter in anderen Organismen identifiziert
worden, deren physiologische Funktion bisher noch nicht im Detail aufgeklärt ist.
schungsprojekt für ihre engagierte und erfolgreiche Zusammenarbeit, sowie der Degussa AG und dem Fonds der Chemischen
Industrie für die kontinuierliche Förderung.
Literatur
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J. Gen. Appl. Microbiol. 3: 193–205
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Danksagung
Hermann Sahm dankt allen Mitarbeiterinnen und Mitarbeitern an diesem For-
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Hermann
Sahm
Nicole
Kennerknecht
Lothar
Eggeling
Petra
Peters-Wendisch
(Jahrgang 1942) leitet
seit 1977 das Institut für
Biotechnologie (IBT1)
des Forschungszentrums und ist C4-Professor für Biotechnologie
an der Universität Düsseldorf.
(Jahrgang 1970) studierte nach einer Ausbildung zur medizinisch-technischen
Laborassistentin Biologie in Düsseldorf, promovierte in der Arbeitsgruppe und arbeitet
dort seit 2003 als Postdoc.
(Jahrgang 1948) studierte Biologie an der
Universität Braunschweig und promovierte 1973–1976 bei Fritz
Wagner an der Gesellschaft für Biotechnologische Forschung (GBF)
in Braunschweig. Er ist
seit 1977 wissenschaftlicher Mitarbeiter des
Forschungszentrums Jülich am IBT.
(Jahrgang 1966) studierte Biologie an der
Universität zu Köln und
arbeitet seit ihrer Promotion (1992–1996) in
der Arbeitsgruppe
Sahm, unterbrochen
von einem Postdoc
(1998–1999) an der
University of California
Berkeley
BIOspektrum · 5/03 · 9. Jahrgang
Korrespondenzadresse:
Prof. Dr. Hermann Sahm
Institut für Biotechnologie 1
Forschungszentrum Jülich GmbH
D–52425 Jülich
Tel.: 02461/613294
Fax: 02461/612710
[email protected]