Steigerung der Lysinprodutkion mit Corynebacterium glutamicum

Steigerung der Lysinprodutkion mit Corynebacterium glutamicum
durch Manipulation der Lysinsynthesewege
Einleitung 1
Lysin ist eine essentielle Aminosäure für Säugetiere. Daher wird Lysin in der Nahrungsmittelindustrie
eingesetzt. Neben dem Hinzufügen von Lysin zu Nahrungsmitteln, wird diese Aminosäure auch in der
Tiermast verwendet. Lysin wird dabei als Additiv dem Futter zugegeben.
Lysin hat aktuell ein Marktvolumen von 2 *106 t pro Jahr. Diese Menge wird biotechnologisch mit
klassisch optimierten Stämmen produziert.
Der Produktionsstamm 1,2
Als Produktionsstamm für die Lysin Produktion wird in meiner Masterarbeit das gram+
Bodenbakterium Corynebacterium glutamicum verwendet. Dieses Bakterium, dessen Namen sich von
seiner Keulenform (Coryne (gr.)=Keule) ableitet, dient schon seit über 60 Jahren für die Produktion
von Stoffen und Stoffgemischen in der Biotechnologie. Es wird für die Produktion einer ganzen
Bandbreite von Biomolekülen eingesetzt.
Das Corynebacterium glutamicum ist auf Grund der bestehenden Methoden zur gentechnischen
Manipulation und dem Vorhandensein von Gen-Vektoren für die Erstellung von Produktionsstämmen
von hohem Interesse. Diese Tools erlauben es, Corynebacterium glutamicum im Zusammenhang mit
Bioreffinerie-Konzepten zu betrachten.
Der Lysin-Syntheseweg 2
Lysin wird aus der Aminosäure Aspartat gebildet, welche wiederum die aminierte Form des
Oxalacetat (einem Intermediat des TCA-Zyklus) ist. Die Synthese von Lysin in Corynebacterium
glutamicum folgt dem Diaminopimelin-Säure-Weg. Im Allgemeinen lässt sich die in Formel 1
wiedergegeben Reaktionsgleichung für die Lysinbiosynthese aufstellen.
2 NH4+ + Oxalacetat + 4NADPH + Pyruvat +ATP  Lysin + 4NADP+ + ADP + CO2 (1)
Der erste Schritt der Lysinsynthese ist die ATP abhängige Phosphorylierung des Aspartat durch das
Enzym Aspartokinase. Dieses ist auch gleichzeitig das Schrittmacher Enzym für den gesamten
Syntheseweg von Lysin und Threonin. Der Threonin Biosyntheseweg zweigt von dem
Lysinsyntheseweg auf der Höhe des Intermediates Aspartatsemialdehyd ab.
Da die Aspartokinase das Schrittmacherenzym für die Synthesewege von Threonin und Lysin ist, sind
beide Stoffe als Endprodukte Inhibitoren der Aspartokinase (Feedbackinhibierung).
Klassische Stammoptimierung vs. rationales Design 1
Die klassisch eingesetzten Stämme wurden durch random mutagenesis Erzeugt. Das heißt, dass
Stämme gezielt mutagenen Strahlungen oder Chemikalien ausgesetzt wurden, um Mutationen zu
erzeugen. Auf diese Weise konnte zum Beispiel eine feedbackresistente Aspartokinase-Mutante
erzeugt werden.
Der Nachteil dieser Methode ist das erzeugen von Mutationen in Genbereichen, in denen keine
Veränderung vorgenommen werden wollten. Es kann sich auf diese Weise eine Vielzahl nachteiliger
Mutationen im Genom eines Stammes anhäufen, die dazu führen, dass der Stamm in seinem
Wachstum beschränkt ist.
Beim rationalen Design werden gezielt genetische Veränderungen vorgenommen, um, wie in diesem
Fall, die Lysinprodutkion zu steigern. Dabei liegen vor allem die globale Neuregelung von Flüssen und
das einfügen neuer Synthesewege im Hauptfokus. Der Nachteil dieser Methode ist jedoch, dass für
die Identifizierung von möglichen Zielen riesige Datensetze analysiert und ausgewertet werden
müssen, da es sich bei metabolischen Netzwerken um Komplex ineinander greifende Reaktionen
handelt. Aus den Datensätzen werden Modelle erstellt, um mögliche Ziele zu identifizieren.
Bisherige Manipulationen an Corynebacterium glutamicum 2,3
Um einen Produktionsstamm für Lysin zu erzeugen, der sowohl hohen Produkttiter als auch gute
Ausbeuten besitzt, wurde eine Reihe von Manipulationen an Corynebacterium glutamicum
vorgenommen. Zu nächst wurde eine feedbackresistente Aspartokinase in den Stamm eingebracht.
Somit liegt ein entkoppelter Syntheseweg vor. Desweiteren wurde der Flux der PhosphoenolCarboxykinase verringert, um die Oxalacetatmenge (Lysinvorstufe) zu erhöhen. Eine weitere
Steigergun der Oxalacetatmenge erbrachte die Überexpression der Pyruvat-Carboxykinase. Um den
Gesamtflux des TCA-Zyklus herunter zu regulieren, wurde das Startcodon der Isocitratdehydrogenase
ausgetauscht, wodurch eine Atenuation der Translation dieses Enzyms erreicht wurde.
Im Falle des Lysinsynthesewegs wurde der Fluss hin zum Threonin verringert. Eine Deletion der
Threoninsynthese hätte einen Stamm zur Folge gehabt, der auf die Supplementierung von Threonin
und den aus dieser Aminosäure gebildeten weiteren Aminosäuren angewiesen wäre.
Zur Erhöhung der Bereitstellung von Redutkiontäquivalenten in Form von NADPH wurde der
Kohlenstoffflux durch den Pentose-Phosphat-Weg (PPP) erhöht. Dazu wurden die Promotoren der
ersten beiden NADPH regenerierenden Enzyme gegen stärkere ausgetauscht. Desweiteren wurde das
Expressionslevel der Transketolase und Transaldolase erhöht, um den Rückfluss der intermediär
entstehenden Pentosen und Triosen in die Glykolyse zu ermöglichen.
Ansatzpunkte und Zielsetzung der Masterarbeit 4–7
Ziel der Meisterarbeit ist es, einen bestehenden Produktionsstamm dahingehend zu verbessern, dass
mehr Lysin pro Zeiteinheit und bessere Produkt ausbeuten erzielt werden. Das Hauptaugenmerk
dabei liegt auf dem Austausch des Sod Promotors vor dem Aspartokinasegens gegen einen EftuPromotor, welcher des Transkirptionslevel um ein Vielfaches anhebt.
Nach der erfolgreichen Manipulation des Promotors soll validiert werden, in welchem Ausmaß der
Promotoraustausch zu einer höheren Ausbeute an Lysin führt. Außerdem soll untersucht werden, ob
und wie weit der Promotoraustausch die Aspartokinaseaktivität eines Rohextraktes erhöht. Dazu
müssen Methoden etabliert werden. Ein Beispiel ist ein fotometrischer Test, der auf Eisen(III)Komplexen und Hydroxamsäuren beruht.
Ein weiterer Aspekt bei der Veränderung von Flüssen durch einen Syntheseweg und den damit
verbundenen Veränderungen im Kohlenstoff- und Reduktionsäquivalentbedarf ist die Erfassung der
globalen Konsequenzen für den Stoffwechsel des Organismus. Daher ist naheliegend, dass eine
Flussanalyse durchgeführt werden kann, um diese Veränderungen zu quantifizieren.
Lysinbiosynthese als Ausgangspunkt für Biopolymere 8
In der Petrochemier wird eine Vielzahl von Aminogruppen haltigen Stoffen zur Produktion von
Polymeren genommen. Das wichtigste dieser Moleküle ist Diaminohexan, welches das Monomer der
Polyamide ist. Diaminohexan kann jedoch nicht fermentativ gewonnen werden. Dieses Trifft jedoch
nicht für Diaminopentan und Diaminobutan zu.
Diaminopentan ist ein Natürliches Abbauprodukt von Lysin. Eschrichia coli besitzt ein Gen für die
Lysindecarboxylase (ldcC). Dieses Enzym decarboxyliert Lysin zu Diaminopentan. Es ist daher
naheliegend, die Lysinsynthese mit diesem Enzym in C. glutamicum zu kombinieren, um statt Lysin
direkt Diaminopentan zu erzeugen. Ein Nachteil dieser Synthesemethode ist jedoch, dass ein
Kohlenstoffatom in Form von CO2 verloren geht.
References
1. Becker, J. Lange, A. Fabarius, J. & Wittmann, C. Top value platform chemicals. Bio-based
production of organic acids. Current Opinion in Biotechnology 36, 168–175 (2015).
2. Becker, J. Zelder, O. Häfner, S. Schröder, H. & Wittmann, C. From zero to hero—Design-based
systems metabolic engineering of Corynebacterium glutamicum for l-lysine production.
Metabolic Engineering 13, 159–168 (2011).
3. Becker, J. et al. Metabolic flux engineering of l-lysine production in Corynebacterium
glutamicum—over expression and modification of G6P dehydrogenase. Journal of Biotechnology
132, 99–109 (2007).
4. Cahyanto, M. N. Regulation of aspartokinase, aspartate semialdehyde dehydrogenase,
dihydrodipicolinate synthase and dihydrodipicolinate reductase in Lactobacillus plantarum.
Microbiology 152, 105–112 (2006).
5. BLACK, S. & WRIGHT, N. G. beta-Aspartokinase and beta-aspartyl phosphate. The Journal of
biological chemistry 213, 27–38 (1955).
6. MAXIMILLIAN T. FOLLETTIE,t OLIVER P. PEOPLES,* CATHERINE AGOROPOULOU. Gene Structure
and Expression of the Corynebacteriumflavum N13 ask-asd Operon. JOURNAL OF BACTERIOLOGY
1993, 4096–4103.
7. Becker, J. Klopprogge, C. Zelder, O. Heinzle, E. & Wittmann, C. Amplified Expression of Fructose
1,6-Bisphosphatase in Corynebacterium glutamicum Increases In Vivo Flux through the Pentose
Phosphate Pathway and Lysine Production on Different Carbon Sources. Applied and
Environmental Microbiology 71, 8587–8596 (2005).
8. Kind, S. Jeong, W. K. Schröder, H. & Wittmann, C.