Inhaltsverzeichnis

Inhaltsverzeichnis
1. Einleitung
11
1.1. BMP-Liganden
11
1.2. BMP-Rezeptoren
14
1.3. Einfluss der Ligand-Rezeptor-Komplexe auf die Signaltransduktion
17
1.3.1. Ligand-Rezeptor-Interaktion
17
1.3.2. Smad-abhängiger Signalweg
20
1.3.3. „Non-Smad"-Signalwege
23
1.4. Feinregulierung der BMP/GDF-Signaltransduktion
25
1.4.1. Gegenseitige Regulierung von Smad-abhängigen und „Non-Smad"-Signalwegen
25
1.4.2. Co-Rezeptoren
26
1.4.3. BMP/GDF-Antagonisten
27
1.5. Chondro- und Osteogenese
30
1.5.1. Entwicklung der Knochen und Extremitäten
31
1.5.2. Frakturheilung
34
1.5.3. An Skelettbildung und Frakturheilung beteiligte Signalwege
35
1.5.3.1. Hedgehog-Signalweg
35
1.5.3.2. Wnt-Signalwege
36
1.5.3.3. FGF-Signalweg
38
2. Zielsetzung der Arbeit
40
3. Material und Methoden
41
3.1. Material
41
3.1.1. Geräte und Verbrauchsmaterialien
41
3.1.2. Chemikalien, Enzyme, Kits, Antikörper und Marker
43
3.1.3. Enzyme
45
3.1.4. Primer
45
3.1.5. Standards
46
3.1.6. Bakterienstämme
47
3.1.7. Expressionsvektoren
47
3.1.8. Eukaryotische Expressions-Konstrukte
47
3.1.9. Zelllinien
48
3.1.10. Medien und Reagenzien für die Zellkultur
49
5
http://d-nb.info/1025203259
4.4.1. GDF5-Mutanten verhindern die osteoblastäre Differenzierung von C2C12-Zellen
75
4.4.2. GDF5-Mutanten verhindern die chondrogene Reifung von ATDC5-Zellen
4.4.3.
Die GDF5-S94N-Mutante
fordert
die
chondrogene
Differenzierung
78
von
Micromass-Zellen
81
4.4.4. GDF5-S94N reguliert den Wnt/ß-Catenin-Signalweg nicht
84
4.4.5. GDF5-S94N ist resistent gegen die Inhibierung durch den BMP/GDFAntagonisten Noggin
5. Diskussion: Mutationen des GDF5
86
91
5.1. Einfluss der GDF5-Mutationen auf die einzelnen Ebenen der GDF5-abhängigen
Signaltransduktion
92
5.1.1. Interaktion der GDF5-Mutanten mit den BMP-Rezeptoren
92
5.1.2. Einfluss der GDF5-Mutanten auf die Signalkaskaden
94
5.1.3. Resistenz der GDF5-S94N-Mutante gegen die Inhibierung durch Noggin
96
5.2. Auswirkungen der GDF5-Mutationen auf die Chondrogenese und Osteogenese
98
5.2.1. Einfluss der GDF5-Mutanten auf die osteoblastäre Differenzierung der C2C12Zellen
5.2.2. Einfluss der GDF5-Mutanten auf die endochondrale Ossifikation
5.3. Schlussfolgerungen
6. Ergebnisse: Mutationen im BMP2
98
100
105
106
6.1. Die BMP2-L51P-Mutante verhindert die Induktion BMP2-abhängiger Signalwege. 107
6.1.1. Die Mutation BMP2-L51P verhindert die Bindung an BMPRI
107
6.1.2. Die BMP2-L51P-Mutante verhindert die Aktivierung der Smads
108
6.1.3. Die Mutation BMP2-L51P verhindert die BMP-abhängige Aktivierung des p38
MAPK Weges
113
6.1.4. Die Mutation BMP2-L51P verhindert die osteoblastäre Differenzierung der
C2C12-Zellen
114
6.2. BMP2-S85R/A86P und BMP2-L100K/N102D fördern die Differenzierung zu
Osteoblasten
116
6.2.1. Die Mutationen BMP2-S85R/A86P und BMP2-L100K/N102D verbessern die
Interaktion zu den BMP Typ II-Rezeptoren
116
6.2.2. BMP2-S85R/A86P und BMP2-L100K/N102D fordern die Smad-abhängige
Transkription
118
7
6.2.3. BMP2-S85R/A86P und BMP2-L100K/N102D beschleunigen die Aktivierung der
p38 MAPK
6.2.4.
BMP2-S85R/A86P
124
und
BMP2-L100K/N102D
fördern
die
Differenzierung der C2C12-Zellen
osteoblastäre
126
6.2.5. BMP2-S85R/A86P und BMP2-L100K/N102D fördern die Mineralisierung von
MC3T3-El-Zellen
129
7. Diskussion: Mutationen des BMP2
132
7.1. Einfluss der Rezeptor-Bindungsaffmitäten auf die BMP2-abhängige Signaltransduktion
133
7.1.1. Der Bindungsverlust zu BMPRI durch die Mutation BMP2-L51P verhindert die
Aktivierung der BMP2-abhängigen Signalwege
133
7.1.2. Die verstärkte Interaktion von BMP2-S85R/A86P und BMP2-L100K/N102D mit
den Typ II-Rezeptoren fördert die BMP2-abhängige Signaltransduktion
134
7.2. Die verstärkte Interaktion der BMP2-Mutanten mit den Typ II-Rezeptoren fördert die
Differenzierung
135
7.3 Schlussfolgerungen
140
8. Summary-Zusammenfassung
142
8.1. Summary
142
8.2. Zusammenfassung
143
9. Andere Projekte
9.1.
Feinregulierung des Smad-abhängigen Signalweges
144
durch die
„Non-Smad"-
Signalwege
144
9.2. Sclerostin
149
9.3. „The pro-form o f BMP2 interferes with BMP2 signaling by competing with BMP2 for
IA receptor binding"
153
9.4. „Surface immobilization o f bone morphogenetic protein 2 via a self-assembled
monolayer formation induces cell differentiation"
154
10. Referenzen
155
11. Anhang
172
Abbildungsverzeichnis
172
Abkürzungsverzeichnis
174
Tabellenverzeichnis
175
Danksagung
176
Publikationen
177
8
Lebenslauf
Erklärung