Habi für UTE für Druck - Stiftung Tierärztliche Hochschule Hannover

Aus dem Institut für Tierzucht und Vererbungsforschung
der Tierärztlichen Hochschule Hannover
Hundegenomik am Beispiel von
MLPH und MDR1 sowie
Kandidatengenen für die dilatative
Kardiomyopathie
Habilitationsschrift zur Erlangung der
VENIA LEGENDI
an der Tierärztlichen Hochschule Hannover
Vorgelegt von
Dr. rer. nat. Ute Elisabeth Philipp
Hannover 2009
Tag der nichtöffentlichen
wissenschaftlichen Aussprache
7. Juli 2009
2
Inhaltsverzeichnis
3
Abkürzungsverzeichnis
4
Verzeichnis der Veröffentlichungen, die Bestandteil der Habilitationsschrift sind
6
1
1.1
1.2
1.3
Einleitung
Stand der Genomanalyse beim Hund
Kartierung des Hundegenoms
Methodische Ansätze zur Identifikation von Genen
7
7
8
10
2
2.1
2.2
2.3
Farbpigmente bei Säugetieren
Farbdilution bei Mensch und Maus
Der Dilutionsgenort beim Hund und mögliche Assoziationen zu Erkrankungen
Zusammenfassung der Ergebnisse der molekulargenetischen Untersuchungen
am caninen Farbdilutionsgenort
Eigene Beiträge zur molekulargenetischen Aufklärung des Farbdilutionsgenorts
bei Hunden
Diskussion
12
15
19
29
29
31
3.4
3.5
Dilatative Kardiomyopathie
Dilatative Kardiomyopathie beim Menschen
Dilatative Kardiomyopathie beim Hund
Zusammenfassung der Ergebnisse zur Untersuchung von Kandidatengenen, die
an der Ausprägung einer DCM beim Irischen Wolfshund beteiligt sein könnten
Eigene Beiträge zur DCM beim Irischen Wolfshund
Diskussion
33
33
36
4
4.1
4.2
4.3
4.4
4.5
4.6
Untersuchungen am caninen MDR1 Gen
Funktion des MDR1 P-Glykoproteins
MDR1 Polymorphismen beim Menschen
Der MDR1 Polymorphismus beim Hund
Ziel der Untersuchungen am caninen MDR1 beim Elo
Eigener Beitrag zur Untersuchung von MDR1 Polymorphismen beim Hund
Diskussion
41
41
41
43
43
44
46
5
Studienübergreifende Diskussion
48
6
Ausblick
50
7
Zusammenfassung
51
8
Literaturnachweis
53
9
Danksagung
65
10
Darstellung des eigenen Anteils an den wissenschaftlichen Arbeiten
66
11
Anhang
68
2.4
2.5
3
3.1
3.2
3.3
20
21
24
3
Abkürzungsverzeichnis
ABD
Actin-Bindungsdomäne
ACTC1
α-Actin, cardiac muscle (Herzmuskel)
α-MSH
Melanozyten stimulierendes Hormon
APC
Adenomatous Polyposis coli Gen
ASIP
Agouti-Signal Protein
BHFD
Black Hair Follicular Dysplasia
bp
Basenpaar
cAMP
cyclo-Adenosinmonophosphat
CDA
Color Dilute Alopecia
CDB103
β-Defensin 103
cDNA
copy DNA
CFA
Canis lupus familiaris Autosom
CHRM2
muscarinischer Acetylcholinrezeptor M2
cM
centiMorgan
CSRP3
Cystein- und glycinreiches Protein 3
CTNNA3
α-Catenin 3
D, d
Allele am Dilutionsgenort
DES
Desmin
DCM
dilatative Kardiomyopathie (dilated cardiomyopathy)
DHI
Dihydroxyindol
DHICA
Dihydroxyindol-Carboxylsäure
DNA
Desoxyribonukleinsäure
DOPA
Dihydroxyphenylalanin
δ-SCGD
δ-Sarcoglycan
FISH
Fluoreszenz in-situ Hybridisierung
GS
Griscelli Syndrom
GTP
Guanosintriphosphat
HSA
Homo sapiens Autosom
IW
Irischer Wolfshund
kb
Kilobasen (1000 Basen)
LMNA
Lamin A/C
4
MATP
Membran assoziiertes Transporter Protein Gen
Mb
Megabasen (eine Million Basen)
MBD
Myosin-Bindungsdomäne
MC1R
Melanocortinrezeptor 1
MDR1
Multidrug Resistance Gene (Multidrug Resistenz Gen)
miRNA
microRNA
MITF
Microphthalmia-associated transcription factor (Mikrophthalmie assoziierter
Transkriptionsfaktor)
MLPH:
Melanophilin
mRNA
messenger RNA (Boten-RNA)
MT
Microtubuli
MYH7
β-Myosin, heavy polypeptide 7, cardiac muscle (schwere Polypeptidkette des kar-
di
alen β-Myosins)
MYO5A
Myosin VA
NCBI
National Center for Biotechnology Information (USA)
PDLIM3
PDZ- und Lim-Domäne 3 Gen
PLN
Phospholamban
RAB27A
Ras related Protein 27A
RBD
Rab-Bindungsdomäne
RNA
Ribonukleinsäure
SCARB1
Scavenger Rezeptor, Klasse B, Typ 1
SNP
Single Nucleotide Polymorphism (Einzelbasenaustausch)
snRNA
small nuclear RNA (kleine nukleäre RNA)
SILV
Silver-Genort
STS Marker sequence tagged site Marker
TAZ
Tafazzin
TCAP
Titin-cap Gen oder Telethonin
TMOD1
Tropomodulin 1
TYR
Tyrosinase
TYRP
Tyrosinase Related Protein
UCSC
University of California, Santa Cruz
UTR
untranslatierte Region
5
Verzeichnis der Veröffentlichungen (veröffentlicht bzw. eingereicht),
die Bestandteil der Habilitationsschrift sind:
1. Philipp U, Quignon P, Scott A, Rak S, Andre C, Breen M, Leeb T. Assignment of the canine myosin Va gene (MYO5A) to chromosome 30q14 by fluorescence in situ hybridization and radiation hybrid mapping. Cytogenet Genome Res. 2003; 101: 92C.
2. Philipp U, Scott A, Quignon P, Andre C, Breen M, Leeb T. Assignment of the RAB27A
gene to canine chromosome 30q15.1 by fluorescence in situ hybridization and radiation
hybrid mapping. Cytogenet Genome Res. 2003; 101: 92E.
3. Philipp U, Quignon P, Scott A, Andre C, Breen M, Leeb T. Chromosomal assignment of
the canine melanophilin gene (MLPH): A candidate gene for coat color dilution in Pinschers. J Hered. 2005; 96: 774-776.
4. Philipp U, Hamann H, Mecklenburg L, Nishino S, Mignot E, Günzel-Apel AR, Schmutz
SM, Leeb T. Polymorphisms within the canine MLPH gene are associated with dilute
coat color in dogs. BMC Genet. 2005; 6: 34.
5. Drögemüller C, Philipp U, Haase B, Günzel-Apel AR, Leeb T. A noncoding melanophilin
gene (MLPH) SNP at the splice donor of exon 1 represents a candidate causal mutation
for coat color dilution in dogs. J Hered. 2007; 98: 468-473.
6. Philipp U, Broschk C, Vollmar A, Distl O. Evaluation of tafazzin as candidate for dilated
cardiomyopathy in Irish wolfhounds. J Hered. 2007; 98: 506-509.
7. Philipp U, Vollmar A, Distl O. Evaluation of six candidate genes for dilated cardiomyopathy (DCM) in Irish wolfhounds. Anim Genet. 2008; 39: 88-89.
8. Philipp U, Vollmar A, Distl O. Evaluation of the Titin-cap Gene (TCAP) as candidate for
dilated cardiomyopathy in Irish wolfhounds. Animal Biotechnol. 2008; 19: 231-236.
9. Philipp U, Fecht S, Wöhlke A, Distl O. A sex-dependent functional polymorphism in the
canine multidrug-resistance (MDR1) gene. submitted
6
1
Einleitung
1.1
Stand der Genomanalyse beim Hund
Der Haushund (Canis lupus familiaris) gehört zu den Säugetieren, deren Genom nahezu komplett sequenziert wurde. Nach dem humanen Genom (Venter et al. 2001) und den Genomen von
Ratte und Maus (Waterston et al. 2002, Gibbs et al. 2004) folgte bereits das Hundegenomprojekt.
Für das Projekt des Instituts für Genom Forschung (TIGR) wurde die DNA eines männlichen
Pudels mit 1,5-facher Genomabdeckung sequenziert (Kirkness et al. 2003), während das Hundegenomprojekt vom Broad Institute die DNA der Boxerhündin Tasha analysierte. Die Rasse Boxer wurde ausgesucht, da eine Voruntersuchung ergeben hatte, dass Boxer aufgrund der hohen
Inzucht eine geringere genetische Varianz aufweisen als andere Hunderassen. Das Genom ingezüchteter Tiere ist leichter zu sequenzieren. Zur Assemblierung des Hundegenoms mit seinen
insgesamt 38 Autosomen und dem X Chromosom standen Einzelsequenzen mit einer durchschnittlichen 7,6-fachen Abdeckung des Genoms zur Verfügung (Lindblad-Toh et al. 2005). Das
Hundegenom besteht aus rund 2.500 Mb. Davon konnten 2.400 Mb aus 39.804.928 Einzelsequenzen, die in der Datenbank des NCBI Trace-Archives hinterlegt sind, assembliert werden.
Die Einzelsequenzen wurden zunächst zu 3315 Contigs (zusammenhängende DNA-Bereiche, die
aus überlappenden Einzelsequenzen zusammengesetzt werden konnten) zusammengefasst, die
anschließend zu den 39 Chromosomen assembliert wurden. Für künftige genetische Studien und
die weitere Entwicklung der Hundegenomik bildet die Hundegenomsequenz eine wichtige
Grundlage. Hunde haben das Interesse der Genetiker geweckt, da sie große Unterschiede bezüglich Morphologie, Verhalten und Erkrankungen aufweisen. Dadurch sind sie zu einem Modellorganismus für genetische Studien geworden. Während zwischen einzelnen Rassen erhebliche Unterschiede in phänotypischen Merkmalen bestehen, weisen Hunde innerhalb einer Rasse eine geringere Varianz auf. Diese Besonderheit macht insbesondere reinrassige Hunde für genetische
Analysen wertvoll und sollte die Identifizierung kausaler Gene erleichtern.
Die vollständige Sequenzierung verschiedener Säugetiergenome soll genomische Analysen erleichtern. Viele biologische Fragestellungen können zudem einfacher beantwortet werden, wenn
man sich nicht nur auf ein Genom beschränkt, sondern die Sequenz weiterer Genome mit berücksichtigt und die Möglichkeiten der vergleichenden Genomik nutzt. Mittlerweile liegen von
vielen weiteren Säugetieren assemblierte Genomsequenzen vor (Tabelle 1, http://
genome.ucsc.edu/goldenpath/credits.html).
7
Tabelle 1: Säugetierarten in Sequenzprojekten, assemblierte genomische Sequenz, die
Abdeckungsrate des Genoms sowie Abbildungsversion des NCBI Map Viewers (die Daten sind
dem UCSC Genome Browser sowie dem NCBI Genome Browser entnommen.)
Säugetierart
Assemblierte Sequenz
Abdeckung des Genoms
Abbildungsversion
Homo sapiens
vollständig sequenziert
10x
36.3
Pan troglodytes
2,9 Gigabasen
6x
2.1
Pongo pygmaeus abelii
3,0 Gigabasen
6x
-
Macaca mulatta
2,8 Gigabasen
5,1x
1.1
Callithrix jacchus
2,9 Gigabasen
6,x
-
Mus musculus
2,7 Gigabasen
vollständig sequenziert
37.1
Rattus norvegicus
2,5 Gigabasen
3x
3.4
Felis catus
1,6 Gigabasen
2x
-
Equus caballus
2,4 Gigabasen
6,8x
2.0
Bos taurus
keine Angabe
7,1x
4.0
Unter http://www.ncbi.nlm.nih.gov/genomes/leuks.cgi?p3=12:Mammals&taxgroup=11:|12:Mammals
sind 78 Säugetiergenomprojekte aufgelistet, die unterschiedlich weit fortgeschritten sind. Nur die
zwei Genome von Homo sapiens und Mus musculus gelten als vollständig sequenziert. Die meisten Genome (40) werden zur Zeit noch sequenziert, die verbleibenden 36 liegen als sogenannte
Draft-Sequenzen (vorläufiger Entwürfe) vor, die noch bearbeitet werden müssen. Unter diesen
vorläufig assemblierten Genomen sind allerdings auch noch humane Genomsequenzen von Einzelpersonen wie Greg Venter oder James Watson aufgeführt.
1.2
Kartierung des Hundegenoms
Bevor die umfangreichen Daten des Hundegenomprojektes zur Verfügung standen, wurden
DNA-Fragmente und polymorphe Marker kartiert. Genetische Kartierungsmethoden beruhen auf
der experimentell ermittelten Rekombinationshäufigkeit zwischen Markern. Für die Entwicklung
genetischer Karten werden Mehrgenerationenpedigrees von Referenzfamilien mit möglichst polymorphen Markern, vor allem Mikrosatellitenmarkern, genotypisiert.
Physikalische Karten stellen die Lage von DNA-Fragmenten direkt auf dem Chromosom dar.
Man unterscheidet Karten, die auf der Fluoreszenz-in-situ Hydridisierung (FISH) Technik, der
Radiation Hybrid (RH-) Kartierung oder der Anordnung überlappender genomischer Klone beruhen. Bei der FISH-Technik werden fluoreszenzmarkierte Sonden auf Metaphase-Chromoso-
8
men hybridisiert und direkt nachgewiesen. Für die RH-Kartierung werden somatische Zellhybride über radioaktive Bestrahlung erstellt, die Chromosomenfragmente einer Zelllinie der zu untersuchenden Spezies in Nagetierchromosomen enthalten. Je höher die Strahlendosis, desto kleiner sind die Fragmente und umso höher ist die Auflösung der RH-Kartierung. Die jetzt zur Verfügung stehenden vergleichenden Genomkarten und auch zuletzt sehr dichten RH-Karten des
Hundegenoms nutzten auch die Erkenntnisse der humanen und murinen Sequenzierprojekte
(Breen et al. 2004, Guyon et al. 2003). Die genaueste physikalische Karte eines Genoms entsteht
durch die vollständige Sequenzierung, da dadurch die exakte Basenabfolge auf den Chromosomen bekannt ist. Mit der nun vorliegenden Hundegenomsequenz, die rund 96 Prozent der 2.500
Mb des Hundegenoms enthält, ist die physikalische Kartierung bei Hunden nahezu abgeschlossen.
Die Erkenntnisse der verschiedenen Kartierungsprojekte wurden genutzt, um Mikrosatellitenmarkersets für Hundegenomscans zu entwickeln. Das bisher entwickelte Panel enthält 507
Mikrosatelliten mit einem durchschnittlichen Abstand von 5 Mb (Sargan et al. 2007). Diese
Markerdichte ermöglicht Kopplungsanalysen mit einer Auflösung von ca. 5-10 cM.
Durch die Sequenzierung des Hundegenoms konnten kürzlich die caninen SNP-Mikroarrays mit
64.000 beziehungsweise ca. 127.000 SNPs pro Chip entwickelt werden, die eine Alternative zu
herkömmlichen Genomscans darstellen. Die wesentlich höhere Markerdichte auf den Mikroarrays sollte die Nachteile der SNP-Marker gegenüber Mikrosatellitenmarker – geringerer Polymorphie- und niedrigerer Heterozygotiegrad – mehr als ausgleichen und Kopplungs- und Assoziationsanalysen mit einer Auflösung von ca. 2 Mb ermöglichen (Andersson 2008).
Die Sequenzdaten, die nun vom Hundegenom vorliegen, und die neuen Technologien, sollten das
Auffinden von Genen, die mit Eigenschaften gekoppelt oder assoziiert sind, erleichtern. Ein Vorteil, der sich durch das Genomprojekt ergibt, ist, dass die Sequenzdaten allen Forschern zur Verfügung stehen. Die Datenbanken ermöglichen das Auffinden von Sequenzen nach chromosomaler Lokalisation oder nach Homologien. Mit Hilfe bioinformatischer Methoden kann man Sequenzmotive im Genom suchen und so z. B. neue Mikrosatellitenmarker entwickeln, Vorkommen und Verteilung von regulativen Sequenzmotiven wie miRNAs untersuchen, Bindungsmotive von Transkriptionsmodulatoren auffinden. Für genetische Studien erweist sich vor allem die
SNP-Datenbank als wertvoll. Mittlerweile sind über 3,3 Millionen Einzelbasenaustausche im
9
Hundegenom annotiert. Durch das Wissen über die genaue Lokalisation sind sie als genetische
Marker einsetzbar. Ein Ergebnis dieser Kenntnisse sind die bereits erwähnten SNP-Mikroarrays.
Darüber hinaus können die SNPs aber auch zu projektbezogenen Markersätzen zusammengestellt werden, um so einen bestimmten genomischen Bereich enger mit Markern abzudecken.
Daraus können dann letztendlich für verschiedene Hunderassen spezifische Markersets entwickelt werden, die ein genetisches Profil der Einzeltiere ergeben und in die Zuchtstrategie der
Rassen einfließen können.
Auch die Expressionschips, mit denen man Veränderungen der Expressionsprofile zwischen verschiedenen Fallgruppen messen kann, sind in Folge der bekannten Genomsequenz entwickelt
worden. Werden die Daten von SNP- und Expressionschipanalysen kombiniert, lassen sich
Wechselwirkungen der Gene erkennen und führen zu einer Weiterentwicklung der Hundegenomik (Georges 2007).
1.3
Methodische Ansätze zur Identifikation von Genen
Um die zu einem Phänotyp führenden (kausalen) Gene zu identifizieren, unterscheidet man prinzipiell zwei verschiedene Vorgehensweisen: den funktionellen Kandidatengenansatz oder eine
positionelle Klonierung nach einer Kopplungs- oder Assoziationsanalyse.
Ein funktioneller Kandidatengenansatz ist am ehesten dann erfolgreich, wenn der Erbgang für
die beobachtete Eigenschaft monogen ist und es nur wenige Gene gibt, deren Mutation zu dem
beobachteten Phänotyp führen kann. Die Hundegenomsequenz erleichtert nun das Auffinden
homologer Genombereiche für Kandidatengene. Aufwändige de-novo-Sequenzierungen können
so vermieden und Kandidatengene gleich gezielt untersucht werden. Die Analyse der Kandidatengenbereiche kann zumeist durch Untersuchung nahe gelegener Mikrosatellitenmarker oder
SNPs erfolgen und durch anschließende vergleichende Sequenzierung der Gene. Allerdings führt
ein Kandidatengenansatz bei genetisch heterogenen Merkmalen wie beispielsweise Progressiver
Retinaatrophie ohne zusätzliche positionelle Information nur selten zum Erfolg (AguirreHernandez und Sargan 2005).
Für den positionellen Ansatz ist es nötig, Untersuchungen mit großen Tierzahlen und mit einer
hohen Markerdichte durchzuführen, um einen QTL einzugrenzen. Da die zu untersuchende Tierzahl oft begrenzt ist, kann man versuchen, die Markerdichte zu erhöhen. Ein Mittel dazu sind die
10
caninen SNP-Chips, denn die Array-Technologie bietet die Möglichkeit viele Marker an einem
Tier in kurzer Zeit zu genotypisieren. Daher scheint für den positionellen Ansatz derzeit die
Chip-Technologie am besten geeignet, zuverlässige Ergebnisse zu liefern.
Für monogene rezessive Eigenschaften reichen rund 20 Proben von wenig verwandten Tieren
aus, um den Genombereich mittels ca. 30.000 genotypisierter SNPs auf rund 1 Mb einzugrenzen
(Karlsson et al. 2007, Andersson 2008). Ist der Genombereich soweit eingegrenzt, kann im annotierten Hundegenom nach möglichen kausalen Genen gesucht werden. Für die Analyse polygener Eigenschaften muss eine deutlich höhere Anzahl von Tieren genotypisiert werden.
Dass die SNP-Array-Technologie bei Hunden zur Identifikation von kausalen Mutationen funktioniert, wurde beim Rhodesian und beim Thai Ridgeback gezeigt. Bei diesen eng verwandten
Rassen wurde die kausale Mutation für den Haarkamm und damit auch die Prädisposition zum
Dermoidsinus aufgeklärt (Salmon Hillbertz et al. 2007). Dabei reichte für die genetische Kartierung der monogen autosomal dominant vererbten Eigenschaft die DNA-Analyse von 21 Hunden,
bei denen ca. 27 000 SNP-Marker ausgewertet worden waren (Karlsson et al. 2007). In der gleichen Arbeit wurde der Genombereich des Scheckungsgenorts (S-Locus) auf 1 Mb eingegrenzt.
Für die semi-dominant vererbte Eigenschaft der Scheckung wurde die DNA von nur 19 Boxern
genotypisiert. Die kausale Mutation für die Scheckung im MITF-Gen, dem einzigen Gen in diesem Chromosomenabschnitt, ist bislang nicht identifiziert (Karlsson et al. 2007). Für weniger
einfache oder eindeutige Erbgänge müssen sicher mehr als 20 DNA-Proben analysiert werden,
um einen QTL zu identifizieren. Um die Zahl der zu genotypisierenden Tiere möglichst niedrig
zu halten, ist die sichere Diagnose der Merkmalsträger wie auch der anlagefreien Tiere von besonderer Bedeutung. Dabei hängt die Anzahl zu genotypisierender Tiere von der Komplexität
des Erbgangs und der Struktur der zu untersuchenden Population ab. Insbesondere die Identifizierung von Genen, die an der Ausprägung polygener Eigenschaften beteiligt sind, leistet einen
Beitrag zum Verständnis der Hundegenomik.
11
2
Farbpigmente bei Säugetieren
Bei Säugetieren werden Farbpigmente (Melanine) in spezialisierten Zellen, den Melanozyten,
synthetisiert. Diese sind in der Basalschicht der Epidermis lokalisiert. Die Pigmentsynthese und
die anschließende Verteilung der Pigmente an die Haar- und Hautzellen sind die Hauptaufgaben
der Melanozyten. Das Melanin wird in Zellorganellen, den Melanosomen, hergestellt und in ihnen in die angrenzenden Zellen transportiert. Melanin wird aus der Aminosäure Phenylalanin in
einem enzymkatalysierten Prozess gebildet (Abbildung 1). Im ersten Reaktionsschritt wird Phenylalanin durch die Phenylalaninhydroxylase zu Tyrosin hydroxyliert. Tyrosin wiederum wird
über die Tyrosinase in DOPA (Dihydroxyphenylalanin) und anschließend über das gleiche Enzym in DOPAquinon umgewandelt. Weitere Zwischenprodukte sind Dihydroxyindol (DHI) und
Dihydroxyindol-Carboxylsäure (DHICA). Melanin stellt ein Polymer dieser Substanzen dar.
12
Abbildung 1 (Seite 12): Syntheseweg der Melanine in den Melanosomen: Die Ausgangssubstanz
sowohl für Eumelanin als auch Phäomelanin ist Phenylalanin. Phenylalanin wird über mehrere
enzymatische Reaktionen in Dihydroxyindol (DHI) und Dihydroxyindol-Carboxylsäure (DHICA)
umgewandelt. Melanin entsteht durch Polymerisation dieser Produkte. Das Schlüsselenzym der
Melanogenese ist die Tyrosinase, ein bifunktionelles Enzym, da es sowohl Tyrosin in DOPA umwandelt als auch DOPA wiederum in DOPAquinon. Die weitere Umwandlung von DOPAquinon
zu Eumelanin kann langsam auch ohne Hilfe zusätzlicher Enzyme erfolgen. Allerdings steuern
noch zwei weitere Proteine, TYRP-1 und TYRP-2 (TYRP steht für Tyrosinase related Protein), die
Eumelanogenese (Abbildung verändert nach Ortonne und Schwarz 2003).
Es gibt zwei verschiedene Pigmentformen, das Eumelanin, für die Schwarz- und Braunfärbung
sowie das Phäomelanin, für die Rot- und Gelbfärbung. Das Verhältnis von Eu- zu Phäomelanin
bestimmt die Farbe von Haut und Haaren.
Die Regulation der Farbpigmentsynthese wird durch Signalproteine gesteuert, zwei näher charakterisierte Moleküle sind das Melanozyten-stimulierende Hormon (α-MSH) und das AgoutiSignalprotein (ASIP). Beide binden an den Melanocortinrezeptor (MC1R). α-MSH steigert die
Synthese von schwarzem oder braunem Eumelanin, ASIP wirkt antagonistisch, verschiebt die
Synthese hin zu gelbem oder rotem Phäomelanin (Abbildung 2 und 3).
Abbildung 2: Agouti-Signalprotein (ASIP) und das Melanozyten-stimulierende Hormon (α-MSH)
konkurrieren um die Bindungsstelle am Melanocortinrezeptor (MC1R). Besetzt α-MSH die Bindungsstelle, wird Eumelanin synthetisiert. Bindet ASIP, führt eine Signalkaskade zur Phäomelaninbildung (verändert nach He et al. 2001). cAMP: cyclo-Adenosinmonophosphat
13
Abbildung 3: Auswirkung auf Botenstoff und Enzymaktivität nach Bindung vom Agouti-Signalprotein (ASIP) oder vom Melanozyten-stimulierenden Hormon (α-MSH) an den Melanocortinrezeptor (MC1R): α-MSH (links) bindet an MC1R, die Bildung des cytosolischen Botenstoffs cycloAdenosinmonophosphat (cAMP) wird gesteigert, dieses Signal führt zur Bildung von mRNA von
Tyrosinase (TYR) und Tyrosinase related Protein 1 und 2 (TYRP-1 und TYRP-2). In den Melanosomen entsteht Eumelanin, die Phäomelaninsynthese wird reduziert. Wird intaktes TYRP-1 gebildet, entsteht schwarzes Eumelanin, braunes Pigment wird synthetisiert, wenn das TYRP-1
nicht funktionsfähig ist (verändert nach Jordan und Jackson 1998).
Bindet ASIP (rechts) wird die mRNA-Synthese der für die Eumelaninbildung benötigten Enzyme
gestoppt, Phäomelanin entsteht. Phäomelanin wird auch synthetisiert, wenn der MC1-Rezeptor
defekt ist. Im Unterschied zur Agouti induzierten Phäomelaninsynthese entstehen dann keine
schwarzen oder braunen Pigmentbereiche wie dunkle Haarspitzen oder Ohren.
14
Bei Hunden sind Mutationen in verschiedenen Farbgenen beschrieben, die zu einer veränderten
Pigmentierung führen (Tabelle 2).
Tabelle 2: Molekulargenetisch charakterisierte Gene mit Einfluss auf Fell- und Haarfarbe beim
Hund, deren chromosomale Lokalisation im Hundegenom (CFA), deren kodierte Proteine und
zelluläre Funktion, die Allele beim Hund sowie die korrespondierenden Fellfarben der mutierten
Gene bei der Maus.
Gensymbol
CFA
Protein
Funktion
Allele/Phänotyp beim Hund
Mausfarbe
TYR
21
Tyrosinase
Melanosomenprotein
albino (c)
TYRP1
11
Tyrosinase related Protein
Melanosomenprotein
B-schwarzes Eumelanin
SILV
10
Melanozyten Protein mel 17 Melanosomenprotein
b braunes Eumelanin
M ohne Farbe
Mm merle
m Eu-/Phäomelaninpigmentie-
braun ((b)
silver (si)
ASIP
24
Agouti Signal Protein
Signalprotein
rung
ay gelb bis rot (Phäomelanin)
aw dunkel gebänderte Haare
at Schwarz/Braun und Tan
a rezessive schwarz
Em Melaninmaske
MC1R
5
Mc1-Rezeptor
Rezeptorprotein
E Eumelanin schwarz oder braun extension (e)
agouti (a)
e Phäomelanin gelb bis rot
Kb Eumelaninpigmentierung
CBD103
16
β-Defensin103
Signalprotein
Kbr brindle
-
Ky Phäomelanin möglich
S Eu-/PhäomelaninpigmentieMITF
20
Microphthalmia-associated
transcription factor
Signalprotein
rung
Si / Sp gefleckt
mitf (mi)
Sw extreme weiß
D Eu-/PhäomelaninpigmentieMLPH
25
Melanophilin
Melanosomentransport
rung
leaden (ln)
d farbverdünnt
2.1
Farbdilution bei Mensch und Maus
Beim Menschen sind verschiedene komplexe Erkrankungen (Syndrome) mit Albinismus bzw.
Farbaufhellungen assoziiert (Scheinfeld 2003).
Zu den durch Farbaufhellung charakterisierten Syndromen gehören auch die verschiedenen Formen des Griscelli Syndroms (GS). GS ist eine seltene autosomal rezessive Erkrankung, die zu
einer charakteristischen Aufhellung (engl. dilution) von Haut und Haar (Silberhaar) führt.
Mikroskopisch kann mitten in den Melanozyten eine Ansammlung von Melanosomen beobachtet
werden. Im Haar selber werden die Pigmente nicht gleichmäßig verteilt, sondern verbleiben als
15
Pigmentklümpchen im Haarschaft (Mancini et al. 1998). Es sind drei verschiedene Formen (I, II
und III) des Griscelli Syndroms beschrieben, die mit Defekten in drei verschiedenen Genen,
Myosin 5A (MYO5A) (Pastural et al. 1997), RAB27A (Pastural et al. 2000) und Melanophilin
(MLPH) (Ménasché et al. 2003), assoziiert sind, deren Genprodukte am Melanosomentransport
beteiligt sind (Abbildung 4-6).
Abbildung 4: Normale Zelle: Die Melanosomen bilden mit den drei Proteinen Myosin VA,
RAB27A und Melanophilin einen Transportkomplex. Damit werden die Melanosomen von der
Peripherie des Zellkerns (N) entlang der Microtubuli (MT) mit Hilfe von Actinfilamenten in die
Zellperipherie und von dort in die Haar- und Hautzellen transportiert (verändert nach Fukuda
2005).
Abbildung 5: Von Griscelli Syndrom (GS) betroffene Zelle: Eines der zum Melanosomentransport benötigten Proteine ist defekt, die Melanosomen bleiben in der Zellmitte rund um den Zellkern (N) liegen (verändert nach Fukuda 2005). MT: Microtubuli
16
Die drei Proteine bilden einen Komplex, der zur Bindung der Melanosomen im Cytoplasma und
ihrem anschließenden Transport in die Zellperipherie essentiell ist. Dabei bindet das RAB27A
-Protein zunächst an die Fracht – die Melanosomen – und anschließend an das RAB-Effektor
Protein, Melanophilin. Dieser Rezeptor-Proteinkomplex bindet nun an das an Actinfilamente assoziierte Motorprotein Myosin VA (Hume et al. 2002, Strom et al. 2002, Wu et al. 2002a, b). Die
Actinfilamente dienen im intrazellulären zytoplasmatischen Transport als Zugmaschine, an denen entlang das Myosin VA die Melanosomen befördert (Seabra und Coudrier 2004).
Abbildung 6: Der Transportkomplex der Melanosomen: Die Melanosomen binden das RAB27A,
welches über Melanophilin (MLPH) mit Myosin VA verbunden ist. Der Myosin-Actinkomplex ist
die Zugmaschine, die die Melanosomen entlang der Microtubuli bewegt (verändert nach Fukuda
2005). GTP: Guanosintriphosphat, im Melanophilin sind die Bindungsdomänen für RAB (RBD)
Myosin (MBD) und Actin (ABD) gekennzeichnet.
Das Griscelli Syndrom I wird durch Mutationen des Myosin 5A-Gens verursacht. Neben den beschriebenen Pigmentveränderungen entwickeln Betroffene im frühen Kindesalter neurologische
Probleme. Sie weisen zudem oft eine Entwicklungsverzögerung auf (Sanal et al. 2002).
Vom Griscelli Syndrom II betroffene Kinder zeigen keine neurologischen Auffälligkeiten,
krankheitsspezifisch ist vielmehr die Entwicklung einer unkontrollierten T-Lymphozyten- und
Makrophagenaktivierung, die als hämophagozytisches Syndrom oder hämophagozytische Lym-
17
phohistiozytose bezeichnet wird. Diese Erkrankung verläuft tödlich, sofern nicht rechtzeitig eine
Knochenmarktransplantation erfolgt. Ursache des GS II sind Mutationen im RAB27A-Gen.
In den wenigen beschriebenen Fällen mit GS III sind die Symptome auf Pigmentveränderungen
beschränkt. Ursache für diesen Phänotyp können Mutationen im Melanophilingen oder im gewebespezifisch exprimierten Exon F des MYO5A-Gens sein (Ménasché et al. 2003).
Mittlerweile ist auch untersucht, warum die Mutationen in diesen drei Genen zu so unterschiedlichen phänotypischen Ausprägungen führen. Melanophilin wird in verschiedenen Epithelgeweben wie Haut oder Lunge exprimiert, wird aber intrazellulär anscheinend nur für den Melanosomentransport benötigt. RAB27A hingegen ist außer am Melanosomentransport noch am Transport lytischer Granula in zytotoxischen T-Zellen beteiligt. Dies bedingt den Effekt auf das Immunsystem, wenn das Gen mutiert ist. Vom MYO5A-Gen sind verschieden gespleißte Transkripte
beschrieben. Die Verteilung der Isoformen ist gewebeabhängig, einige werden bevorzugt in
Melanozyten, andere in neuronalem Gewebe exprimiert (Seperack et al. 1995, Westbroek et al.
2003). Daher können sich Mutationen innerhalb des Gens unterschiedlich auf den Organismus
auswirken, je nachdem, in welcher Proteinregion eine Base im MYO5A-Gen mutiert ist, und
welche der gewebespezifischen Produkte verändert sind.
Bei der Maus sind ebenfalls den Griscelli Syndromen I bis III entsprechende natürliche Phänotypen beschrieben. Dem GS I Phänotyp, verursacht durch Mutationen des Myo5a-Gens, entspricht
die „dilute“ Maus (Jenkins et al. 1981). Bei der „ashen“ Maus, dem murinen Model für GS II, ist
das RAb27a-Gen mutiert (Wilson et al. 2000). Die „leaden“ Maus, verursacht durch eine Mutation des Mlph, repräsentiert das GS III Mausmodell (Matesic et al. 2001). Phänotypisch sind die
Mausmutanten ihren menschlichen Pendants sehr ähnlich, allerdings wurde für die „ashen“ Maus
bislang kein hämophagozytisches Syndrom beschrieben.
18
2.2
Der Dilutionsgenort beim Hund und mögliche Assoziationen zu Erkrankungen
Die Fellfarbe ist eines der auffälligsten Merkmale bei Hunden. Wie bei anderen Säugetieren wird
die Grundfarbe durch zwei verschiedene Pigmentformen bestimmt: das Eumelanin, für die
Schwarz- und Braunfärbung sowie das Phäomelanin für die Rot- und Gelbfärbung. Genloci wie
der Agouti- und Dilutionsgenort bestimmen die Verteilung der Pigmente am Körper (Tabelle 1).
Eine Übersicht der bekannten und vermuteten Farbgene beim Hund und ihre Auswirkungen auf
die Fellfärbung gibt es im Internet (http://homepage.usask.ca/~schmutz/dogcolors.html).
Bei Hunden des aufgehellten Farbschlags variiert der Phänotyp des Fells entsprechend der genetischen Grundausstattung: eine schwarze Fellfarbe wird zu blau, eine braune zu isabell und eine
rote zu sandfarben. Der Dilutionsgenort (D) ist bei Hunden von Little (1957) beschrieben worden und gehört in die Reihe der Farbverdünnungsgene (Laukner 1998). Der Erbgang der Farbdilution ist autosomal rezessiv. Mutationen im Dilutions-Locus bei Hunden bewirken eine Verklumpung der Pigmentgranula wie es bei Mäusen mit verdünnter Fellfarbe oder GS Betroffenen
beschrieben wurde. Außer im Fell wird die Pigmentverteilung auch in Haut und Iris beeinflusst,
so ist der Nasenspiegel der Hunde daher oft grau oder hellbraun, die Iris gelblich (Laukner
1998).
Während bei einigen Hunderassen Tiere mit aufgehellten Fellfarben wie zum Beispiel blaue
Doggen als Rassestandard zugelassen sind, sind beim Dobermann oder auch beim Deutschen
Pinscher verdünnte Farbschläge nicht erlaubt. Der Grund ist, dass in diesen Hunderassen Tiere
mit verdünnter Fellfarbe häufig von der Farbverdünnungsalopezie (CDA, engl: Color Dilute
Alopecia) betroffen sind. Synonyme für diese Erkrankung sind „Blue Dog Syndrome“, „Blue
Dobermann Syndrome“, „Color Mutant Alopecia“ oder auch Farbmutantenalopezie. Die klinischen Symptome umfassen Trichorrhexis, Alopezie, Hyperkeratose und Parakeratose. Die Hautpartien dieser Tiere zeigen zudem eine erhöhte Sonnenempfindlichkeit. Von der Erkrankung
scheinen eher die Träger blauer Farbschläge betroffen zu sein, wenn auch Fälle bei isabellfarbenen Tieren beschrieben sind. Die Erkrankung tritt außer bei Pinschern sporadisch bei verschiedensten Rassen wie Yorkshire Terrier, Deutsche Dogge, Saluki, Dachshund, Chow Chow, Irischer Setter und italienischem Windspiel auf (Austin 1975, Austin 1979, Laukner 1998). Eine
sehr ähnliche, wenn nicht sogar identische Erkrankung wie CDA, wird bei gescheckten Hunden
wie dem Großen Münsterländer als Black-Hair-Follikeldysplasie (BHFD) bezeichnet (Schmutz
et al. 1998). Bei diesen Tieren sind die sonst schwarz gefärbten Fellareale zu silbergrau aufge-
19
hellt. Die für CDA beschriebenen Symptome sind auf die aufgehellten Bereiche beschränkt,
während die weißen Fellpartien keine Auffälligkeiten zeigen. Histologisch weisen Hautbiopsien
der aufgehellten Fellbereiche die gleichen Auffälligkeiten wie Hautbiopsien von Hunden mit
verdünnten Farbschlägen auf (von Bomhard et al. 2006).
Obwohl ein Zusammenhang zwischen CDA und Farbdilution vorhanden ist, ist unklar, welche
Faktoren zur Ausprägung der CDA besonders bei Tieren mit aufgehellten Farbschlägen führen
(Laukner 1998). Innerhalb dieser Arbeit sollte die molekulargenetische Ursache der Farbdilution
untersucht werden.
2.3
Zusammenfassung der Ergebnisse der molekulargenetischen
Untersuchungen am caninen Farbdilutionsgenort
Im Rahmen des hier vorliegenden Projektes konnte bei verschiedenen Hunderassen (Deutscher
Pinscher, Dobermann Pinscher, Beagle und Großer Münsterländer) das kausale Gen für die
Farbdilution identifiziert werden sowie eine Mutation, die bei diesen Hunderassen vollständig
mit dem Phänotyp der Farbdilution assoziiert ist.
Zur molekulargenetischen Untersuchung des caninen Farbdilutionsgenortes wurde ein funktioneller Kandidatengenansatz gewählt. Das heißt, es wurden Gene analysiert, die für die Merkmalsausprägung Farbdilution Schlüsseleiweiße kodieren. Bei Hunden mit verdünntem Farbschlag werden histologisch Verklumpungen der Pigmentgranula beobachtet. Geeignete funktionelle Kandidatengene sind daher Gene, deren Genprodukte am Melanosomentransport beteiligt
sind. Die Untersuchungen bei Mensch und Maus haben gezeigt, dass die von MYO5A, RAB27A
und MLPH kodierten Proteine Bestandteil des Melanosomentransportkomplexes sind (Barral
und Seabra 2004, van Gele et al. 2009). Zudem führen Mutationen in diesen drei Genen bei
Mensch und Maus zu einem Phänotyp, der dem Phänotyp von Hunden mit verdünnter Fellfarbe
ähnlich ist.
Die caninen Gene MYO5A, RAB27A und MLPH wurden isoliert und charakterisiert. Durch vergleichende Sequenzierung betroffener und nicht betroffener Tiere konnte für die oben genannten
Rassen eine Assoziation zwischen der Farbdilution und dem MLPH-Gen hergestellt und zunächst
ein indirekter Gentest entwickelt werden. Im Laufe der weiteren Arbeit wurde die wahrscheinlich zugrunde liegende kausale Mutation identifiziert.
20
2.4
Eigene Beiträge zur molekulargenetischen Aufklärung des Farbdilutionsgenorts
bei Hunden
Assignment of the canine myosin Va gene (MYO5A) to chromosome 30q14
by fluorescence in situ hybridization and radiation hybrid mapping
Philipp U, Scott A, Rak S, Quignon P, André C, Breen M, Leeb T
Cytogenet Genome Res. 2003; 101: 92C.
In dieser Studie wurde das canine MYO5A-Gen, ein Kandidatengen für Farbdilution beim Hund,
auf Chromosom 30q14 des Hundegenoms lokalisiert. Dazu wurde der BAC-Klon RP81-108N13
durch Hybridisierung einer humanen cDNA-Sonde in der caninen BAC-Bank RP81 identifiziert.
Die Sequenzierung des BAC-Klons bestätigte, dass das MYO5A-Gen teilweise auf dem Klon
vorhanden war. Die genaue chromosomale Zuordnung erfolgte durch FISH- und RH-Kartierung.
Die Fluoreszenz in-situ Hybridisierung zeigte, dass sich MYO5A auf CFA30q14 befindet. Die
RH-Kartierung bestätigte die chromosomale Zuordnung und ein Zweifarben-FISH zeigte, dass
MYO5A proximal zu RAB27A lokalisiert ist. Diese Anordnung der beiden Gene entspricht auch
der relativen Lage der humanen orthologen Gene zueinander auf dem syntänen Bereich von
HSA15. Die Kenntnis der genauen Lage der beiden Kandidatengene sollte das Auffinden genflankierender Marker aus bekannten Markersets vereinfachen und die Durchführung von Kopplungsstudien erleichtern.
Assignment of the RAB27A gene to canine chromosome 30q15.1
by fluorescence in situ hybridization and radiation hybrid mapping
Philipp U, Scott A, Quignon P, André C, Breen M, Leeb T
Cytogenet Genome Res. 2003; 101: 92E.
RAB27A ist ein Kandidatengen für die Farbdilution beim Hund. In dieser Arbeit konnte das canine RAB27A-Gen auf CFA30 lokalisiert werden. Dazu wurde ein BAC-Klon (RP81-109O1) aus
der caninen BAC-Bank RP81 isoliert. Die Sequenzierung der BAC-Randsequenzen sowie von
Shotgun-Klonen bestätigte, dass der Klon das RAB27A-Gen enthält. Die Größe des caninen genomischen Inserts wurde durch Pulsfeld-Gelelektrophorese auf etwa 140 kb geschätzt. Mithilfe
der FISH-Technik wurde das Gen auf Chromosom 30q15.1 lokalisiert. Eine RH-Kartierung bestätigte die chromosomale Zuordnung. Das humane orthologe Gen befindet sich auf HSA15q15-
21
21. Dieser Bereich ist in der vergleichenden humanen-caninen RH-Karte syntän zu der Region,
in der das canine RAB27A liegt. Die genaue chromosomale Lokalisierung sollte weiterführende
Kopplungsstudien vereinfachen.
Chromosomal assignment of the canine melanophilin gene (MLPH):
A candidate gene for coat color dilution in Pinschers
Philipp U, Scott A, Quignon P, André C, Breen M, Leeb T
J Hered. 2005; 96: 774-776.
Um die molekulargenetische Grundlage der Farbdilution bei Pinschern aufzuklären, wurde der
BAC-Klon RP81-203J24 isoliert, der das zum humanen MLPH orthologe Hundegen enthält. Das
canine Insert wurde mittels Pulsfeld-Gelelektrophorese auf etwa 190 kb geschätzt. Die Sequenzierung von Shotgun-Klonen zeigte, dass der Klon Sequenzbereiche des MLPH- und des
COL6A3-Gens enthielt. Diese Gene sind auch im humanen Genom benachbart. Eine RH-Kartierung des MLPH Gens wurde mit einem STS-Marker durchgeführt, der von Sequenzen des BACKlons abgeleitet wurde. Das canine MLPH konnte auf dem distalen Ende von CFA25 lokalisiert
werden. Eine zusätzliche Zweifarben-FISH-Kartierung ergab die genaue Position auf CFA25q24.
Dieser Abschnitt des caninen Chromosoms 25 ist syntän zur Region 2q36-37 des humanen Genoms, in der sich das humane MLPH-Gen befindet.
Polymorphisms within the canine MLPH gene are
associated with dilute coat color in dogs
Philipp U, Hamann H, Mecklenburg L, Nishino S, Mignot E, Günzel-Apel AR, Schmutz SM,
Leeb T. BMC Genet. 2005; 6: 34.
Für diese Arbeit wurde das MLPH-Gen sequenziert und eine Mutationsanalyse der 16 caninen
Exons und ihrer flankierenden Intronsequenz an der DNA von sechs Dobermann Pinschern (Eltern und vier Vollgeschwisternachkommen) sowie von fünf Deutschen Pinschern (Muttertier mit
4 Vollgeschwisternachkommen) durchgeführt. In jeweils beiden Familien traten Nachkommen
mit aufgehellter Fellfarbe auf. Insgesamt wurden 48 Sequenzunterschiede innerhalb und zwischen den beiden Rassen identifiziert. Die weiteren Untersuchungen wurden auf eine Familie
Großer Münsterländer, die für BHFD segregierte und eine Beagle-Familie ausgedehnt.
22
Im MLPH-Gen konnte weder in der kodierenden Region noch an den Spleißstellen eine Mutation identifiziert werden, die kausal für die Farbdilution sein könnte. cDNA-Analysen ergaben
ebenfalls keinen Hinweis auf Spleißmutanten.
Bei Deutschen Pinschern wurde ein vollkommen mit dem Phänotyp der Farbdilution gekoppelter
Polymorphismus in Exon 7 des MLPH-Gens entdeckt. Der nichtsynonyme SNP verursachte einen R199H Aminosäureaustausch. Da dieser Aminosäureaustausch auch in wildfarbenen Tieren
anderer Rassen nachgewiesen wurde, musste die Mutation als kausal ausgeschlossen werden.
Bei den Rassen Dobermann Pinscher, Großer Münsterländer und Beagle war ein Set von Polymorphismen in und um Exon 2 des MLPH-Gens vollständig mit dem Phänotyp der Farbverdünnung assoziiert. Diese Sequenz war beim Deutschen Pinscher monomorph. Die Identifizierung
vollständig assoziierter, wenn auch zum Teil rassespezifischer Polymorphismen, wies daraufhin,
dass die Farbdilution bei Hunden durch eine oder mehrere Mutationen innerhalb des MLPHGens oder eines anderen Gens nahe des MLPH Gens verursacht wird.
Die Polymorphismen, die eng mit dem Phänotyp der aufgehellten Fellfarbe assoziiert waren, boten zunächst die Möglichkeit, einen markergestützten genetischen Test für Pinscher und Große
Münsterländer anzubieten und so auf Hunde mit definierten Fellfarben zu selektieren beziehungsweise Verpaarungen zu verhindern, die zu Dilutions- oder BHFD-Merkmalsträgern führen
könnten.
A noncoding melanophilin gene (MLPH) SNP at the splice donor
of exon 1 represents a candidate causal mutation for coat color dilution in dogs
Drögemüller C, Philipp U, Haase B, Günzel-Apel AR, Leeb T.
J Hered. 2007; 98: 468-473.
In der vorausgegangenen Studie hatten wir gezeigt, dass innerhalb verschiedener Hunderassen
bestimmte Polymorphismen des MLPH-Gens mit dem Phänotyp der Farbdilution vollständig kosegregieren. Bei den untersuchten Rassen wurden drei verschiedene Dilutions-Haplotypen identifiziert und keiner der Polymorphismen im kodierenden Bereich des Gens schien kausal zu sein.
Daher resequenzierten wir den 5’- Bereich des Gens zunächst bei sechs wildfarbenen und sechs
Hunden mit aufgehellter Fellfarbe, die die drei Dilutions-Haplotypen repräsentierten. Es konnte
ein 7,8 kb großer Bereich identifiziert werden, in dem die drei Dilutions-Haplotypen gemeinsa-
23
me Allele besitzen. Innerhalb dieses Bereiches identifizierten wir im untranslatierten ersten Exon
des MLPH Gens einen G/A-Polymorphismus (c.-22G>A), der am Ende des ersten Exons direkt
vor der Spleißstelle lokalisiert war. Der c.-22G>A SNP wurde bei 65 Hunden mit verdünntem
Farbschlag, die sieben verschiedenen Rassen angehörten, genotypisiert. Bei allen 65 Tieren
konnte der homozygote c.-22A Genotyp nachgewiesen werden.
Die Dilutions-A-Mutante sollte - computergeneriert - eine achtfach verringerte Spleißeffektivität
besitzen. Eine mRNA-Expressionsstudie mittels quantitativer PCR bestätigte, dass dd-Tiere mit
aufgehellter Fellfarbe nur etwa ein Viertel der MLPH-Transkriptmenge von wildfarbenen DDHunden besitzen. Heterozygote Tiere (Dd) lagen mit der nachgewiesenen Transkripthöhe zwischen dd und DD-Tieren. Diese Ergebnisse deuteten darauf hin, dass eine regulatorische Mutation im MLPH-Gen verantwortlich für die Farbverdünnung bei Hunden ist. Auch wenn nicht eindeutig geklärt werden konnte, welche der 14 assoziierten Mutationen innerhalb des 7,8 kb Genombereichs die verringerte Transkriptionsrate verursacht, erscheint die c.-22 A-Mutation der
wahrscheinlichste Kandidat dafür zu sein.
2.5
Diskussion
Das Farbdilutionsgen ist beim Hund ein Beispiel für die molekulargenetisch untersuchten
Merkmale, die die Fellfarbe beeinflussen. Vier weitere Gene, das Agouti-Gen (ASIP), das Melanocortin 1 Rezeptor Hormon-Gen (MC1R), das Tyrosinase related Protein 1-Gen (TYRP1) und
das β-Defensin 103 (CDB103), deren unterschiedliche Allele den Phänotyp der Fellfarbe bestimmen, sind bislang molekulargenetisch analysiert (Newton et al. 2000, Schmutz et al. 2002,
Kerns et al. 2004, Candille et al. 2007).
Der hier untersuchte Farbschlag der Farbdilution führt bei Hunden zu einer charakteristischen
Farbaufhellung des Felles, das oft wie von einem grauen Schleier überzogen aussieht, die Farbe
wie ausgewaschen wirkt. Nase und Augen der Tiere sind zudem meist aufgehellt. Der Farbschlag
ist bei vielen Hunderassen beschrieben und könnte daher möglicherweise eine von der Evolution
her „alte“ Mutation sein. Weitere Tierarten, bei denen ein verdünnter Farbschlag beobachtet
wurde, sind unter anderem Pferd, Rind, Hauskatze, Nerz (Silbernerz) und Huhn. Molekulargenetisch sind diese Phänotypen bislang noch nicht bei allen Tierarten aufgeklärt. Weitere Gene, deren Mutation eine Farbaufhellung verursachen können, sind das SILV-Gen bei Rindern und Ponys (Gutiérrez-Gil et al. 2007, Reissmann et al. 2007) und das MATP-Gen beim Pferd (Mariat et
24
al. 2003). Mutationen in diesen Genen führen aber nicht zu den histologisch beschriebenen Verklumpungen der Melanosomen wie sie bei Hunden mit verdünntem Farbschlag, „dilute-“, „leaden-“ und „ashen“-Mäusen und von GS betroffenen Menschen beobachtet werden. Aufgrund
dieser histologischen Beobachtungen schien ein Gen, dessen Genprodukt am Melanosomentransport beteiligt ist, als wahrscheinlichster Kandidat.
Die Sequenzierung des caninen MLPH-Gens zeigte, dass der 5’- und 3’- Bereich der orthologen
Gene zwischen Hund, Maus und Mensch konserviert ist. Diese über die Tierarten konservierten
Sequenzbereiche kodieren im Protein die Bindungsdomänen für RAB27A bzw. Myosin VA und
Actin. Im caninen Gen wurde ein zusätzliches Exon identifiziert, das zwischen dem Exon 4 und
5 der orthologen murinen und humanen Gene liegt. Das zusätzliche Exon scheint bei Hunden
konstitutiv exprimiert zu werden, da keine Transkriptisoformen in der analysierten cDNA beobachtet wurden. Das canine Exon 5 ist in einem Genbereich lokalisiert, der außerhalb der konservierten Proteinbindungsdomänen liegt. Ein dem humanen Exon 9 homologer Sequenzbereich
fehlt hingegen im Hundegenom. Den analysierten Transkripten fehlt daher auch ein zu Exon 9
homologer Bereich. Allerdings wird Exon 9 beim Menschen fakultativ exprimiert, während es
bei der Maus anscheinend konstitutiv exprimiert wird. Ein Vergleich mit mittlerweile ebenfalls
bekannten MLPH-Transkripten der Hauskatze zeigte, dass bei der Katze ein dem caninen Exon 5
homologes Exon fakultativ exprimiert wird und eine zum humanen Exon 9 homologe Sequenz
ebenfalls fehlt (Ishida et al. 2006).
Bei den hauptsächlich untersuchten Hunderassen – Dobermann Pinscher, Deutscher Pinscher,
Beagle und Großer Münsterländer – konnten acht nichtsynonyme SNPs identifiziert werden, die
nicht mit dem Phänotyp der Farbdilution assoziiert waren. Allerdings wurden bei allen Rassen
auch Polymorphismen beobachtet, die innerhalb der Rasse vollständig mit dem Phänotyp des
verdünnten Farbschlags korrelierten. Bei anderen Rassen zeigten diese Polymorphismen aber
keine oder eine unvollständige Assoziation zum Phänotyp der Farbdilution. So war der beim Dobermann Pinscher vollkommen assoziierte c.106C>T Polymorphismus beim Deutschen Pinscher
monomorph und damit uninformativ. Andererseits war der beim Deutschen Pinscher vollständig
assoziierte c.596A>G Polymorphismus beim Dobermann Pinscher und beim Großen Münsterländer nicht vollständig assoziiert. Insgesamt konnten bei den in die Untersuchungen einbezogenen Rassen drei Haplotypen unterschieden werden, die mit der aufgehellten Fellfarbe assoziiert
waren.
25
Bei Katzen sind die Farben blau, lilac oder cream die Farbpendants zu blau und isabell bei den
Hunden, bei Nerzen die bereits erwähnten Silbernerze. Bei Hühnern wird der „lavender“ Farbschlag durch Mutation des MLPH-Gens verursacht (Vaez et al. 2008) Beim Silbernerz wurde
ebenfalls eine Kopplung zwischen dem farbverdünnten Phänotyp und dem MLPH-Gen beschrieben (Anistoroaei und Christensen 2007). Bei Katzen konnte die Deletion einer Base als kausal
für diese Farbschläge identifiziert werden (Ishida et al. 2006). Die Mutation liegt in dem felinen
Exon des MLPH-Gens, das zum caninen Exon 2 homolog ist. Die Deletion verursacht eine Verschiebung des Leserasters, die während der Translation zu einem Stoppkodon elf Aminosäuren
stromabwärts der Mutation und so zu einem stark verkürzten und funktionslosen Protein führt.
Bei Mensch, Maus und Huhn liegen die kausalen Mutationen in einem eng benachbarten Sequenzbereich. Bei Mensch und Huhn wurde die gleiche kausale Mutation c.103C>T identifiziert,
die einen R35W Aminosäureaustausch verursacht. Bei der Maus mit der „leaden“-Fellfarbe sind
die Aminosäuren 30 bis 37 des MLPH-Proteins deletiert. Mutationen in diesem Bereich des Gens
bewirken, dass das MLPH-Genprodukt in dem Transportkomplex bestehend aus RAB27A,
MLPH und Myosin VA nicht seine Funktion als Bindeglied erfüllen kann, da die spezifische und
auch zwischen den Spezies konservierte RAB27A Bindungsstelle verändert ist.
Die Untersuchungen am caninen MLPH-Gen zeigten, dass Polymorphismen im MLPH-Gen mit
der Farbverdünnung eng assoziiert waren. Allerdings konnte in der translatierten Sequenz keine
kausale Mutation und auch keine Spleißvariante identifiziert werden. Eine für alle DilutionsHaplotypen identische kausale Mutation wurde daher im regulatorischen oder untranslatierten
Bereich des Gens vermutet. Denn im 5’- untranslatierten Bereich konnten bei Tieren mit aufgehelltem Farbschlag identische Allele von drei SNPs identifiziert werden.
Die Sequenzanalyse eines 12,5 kb großen Genombereiches, der ca. 9 kb 5’- flankierende Region
des ersten Exons und 3 kb des ersten Introns umfasste, zeigte, dass die drei Dilutions-Haplotypen
innerhalb eines 7,8 kb Sequenzbereiches einen gemeinsamen Haplotyp aufwiesen. Von den 14
identifizierten Polymorphismen erwies sich der c.-22G>A SNP direkt am 3’-Ende von Exon 1
als geeignetster kausaler Kandidat, die MLPH-Transkriptionsrate durch eine veränderte Spleißaktivität zu erniedrigen.
Es gibt verschiedenste Untersuchungen wie stumme Mutationen die Expression beeinflussen. So
können synonyme Mutationen die Sekundärstruktur der mRNA und dadurch ihre Stabilität be-
26
einflussen (Duan und Antezana 2003, Chamary und Hurst 2005). Mutationen am 5’- oder 3’Bereich eines Exons hingegen können Auswirkungen auf die Spleiß-Aktivität haben, wie bereits
für humane Gene gezeigt worden ist. So wurde im Tumorsuppressorgen APC beobachtet, dass
Mutationen nahe den Exon-Intron-Übergängen zu dem Verlust eines Exons führen können, auch
wenn die Mutation an sich still war (Aretz et al. 2004). Eine Erklärung für den beschriebenen
Effekt ist, dass Mutationen direkt an den oder nahe den Exon-Intron-Übergängen die Bindungsstelle für die snRNAs der Spleißosomen betreffen und dadurch die Effektivität des Spleißens der
nukleären pre-mRNA beeinflussen. Bei Säugetieren sind zusätzlich zu den Spleißosomen intronische und exonische Spleißverstärker beschrieben, die für vollständiges Spleißen der mRNA
benötigt werden (Fu 2004). Diese Elemente verstärken oder hemmen die Funktion als Donorund Akzeptor-Spleißstelle. Ihre Bindungsstellen befinden sich ebenfalls in der Nähe der klassischen Spleißstellen, so dass Mutationen nahe den kanonischen Spleißstellen die Effektivität des
Spleißens beeinträchtigen können (Parmley et al. 2006). Eine Studie an humanen Genen, die in
der Human Gene Mutation Datenbank (www.hgmd.org) aufgelistet sind, zur Auswirkung von
Einzelbasenaustauschen in Exon-Intron-Übergängen auf die mRNA zeigte, dass Mutationen am
3’- Ende eines Exons (Spleißdonorseite) zum Überspringen eines Exons oder zur Nutzung einer
kryptischen Spleißstelle führen (Krawczak et al. 2007). Eine genauere Aufschlüsselung der Daten ergab für humane Gene, dass Mutationen, die die letzte Base des Exons betreffen, zu etwa 15
Prozent mit krankheitsverursachenden Genen assoziiert sind.
Diese Daten zusammen mit dem eigenen computergenerierten Ergebnis, dass die Effektivität der
Spleißreaktion durch die Mutation in Exon 1 reduziert ist, lässt den Schluss zu, dass der
c.-22G>A SNP kausal für die Farbdilution bei Hunden sein könnte. Gleichwohl ist experimentell
nicht gezeigt, welche Auswirkungen auf die canine MLPH-Transkriptsequenz bestehen und dass
der c.-22G>A Polymorphismus die Farbdilution auslöst. Theoretisch könnte auch einer der anderen 13 assoziierten Polymorphismen kausal sein. Dass der Dilutions-Haplotyp aber tatsächlich
einen Einfluss auf die Transkription hat, zeigten die Untersuchungen zur Expressionshöhe. Im
Quantifizierungsexperiment mittels Realtime-PCR wiesen Tiere mit verdünntem Farbschlag im
Vergleich zu homozygot wildfarbenen Tieren eine auf ein Viertel reduzierte Expressionsrate des
MLPH-Gens auf. Anlageträger für die Farbdilution lagen mit der nachgewiesenen relativen Transkriptmenge zwischen Merkmalsträgern der Farbdilution und homozygoten Wildtyptieren. Somit
27
ist das kausale Gen für die Farbdilution bei Hunden identifiziert. Der genaue molekulare Mechanismus, der bei Hunden zur Farbaufhellung führt, ist jedoch nicht bekannt.
28
3
Dilatative Kardiomyopathie
3.1
Dilatative Kardiomyopathie beim Menschen
Bei Menschen ist die Herzinsuffizienz häufig eine Folge von dilatativer Kardiomyopathie
(DCM). Die Erkrankung ist durch einen progredienten Verlauf mit zunehmender ventrikulärer
Dilatation und abnehmender systolischer Funktion charakterisiert. In 20-30 Prozent der Fälle ist
die Erkrankung genetisch bedingt, dabei wird eine familiäre DCM angenommen, wenn in der
Familie eines DCM-Patienten eine zweite an DCM erkrankte Person identifiziert worden ist oder
wenn bei einem Angehörigen ersten Grades ein unerklärter plötzlicher Herztod vor dem 35. Lebensjahr aufgetreten ist.
Bislang sind 26 Gene beschrieben worden, die bei Menschen DCM verursachen (Tabelle 3).
Zwei weitere Gene TMOD1 und CTNNA3 (OMIM #190930, #601493) sind aufgrund von Kopplungsanalysen mögliche Kandidatengene (Tabelle 3).
Die Funktion der von diesen Genen kodierten Proteine und ihre Lokalisation innerhalb der Zelle
sind sehr unterschiedlich. So sind die Genprodukte DCM verursachender Gene am Zytoskelettoder Sarkomeraufbau, an der Muskelkontraktion oder an der Regulation des Ionentransports beteiligt (Tabelle 3). Biochemisch ist noch unklar, wie die Störungen solch verschiedener Stoffwechselwege zu phänotypisch gleichen Erkrankungen führen können. Die Auswirkung veränderter Gene konnte für einige der Kandidaten in Mausmodellen untersucht werden, für den größten
Teil der bei Menschen mit DCM assoziierten Gene existiert jedoch kein Mausmodell (Tabelle 3,
http://www.informatics.jax.org). Hingegen sind bei Mäusen zusätzliche Gene mit DCM assoziiert, die beim Menschen bislang nicht mit DCM in Verbindung gebracht werden konnten
(http://www.informatics.jax.org).
Der Erbgang für DCM ist bei Menschen in rund 60 Prozent der Fälle autosomal dominant. Als
erstes kausales Gen für eine familiäre DCM wurde das kardiale α-Actin identifiziert (Olson et al.
1998). Die häufigsten Ursachen einer familiären DCM sind Mutationen im Troponin T-Gen und
im β-Myosingen (Osterziel et al. 2005a). Mutationen in den Genen Desmin, δ-Sarcoglycan,
Phospholamban und Metavinculin verursachen ebenfalls eine isolierte DCM ohne Skelettmuskulaturbeteiligung, werden aber nur selten als Ursache einer familiären DCM beobachtet (Sylvius
et al. 2003, Villard et al. 2005). Ein weiteres mit familiärer DCM assoziiertes Gen ist das
CHRM2, das für den muscarinischen Acetylcholinrezeptor M2 kodiert (Zhang et al. 2008), wäh-
29
rend PDLIM3 nur in einem einzelnen idiopathischen DCM-Fall als kausal beschrieben worden
ist (Arola et al. 2007).
Neben diesen ausschließlich auf den Herzmuskel beschränkten familiären Formen gibt es Erkrankungen, in denen die DCM mit Erregungsleitungsstörungen kombiniert vorkommt oder eine
Skelettmuskelbeteiligung vorliegt (Taylor et al. 2003).
Eine relativ häufige Ursache der familiären DCM sind X-chromosomal vererbte Formen. Sie treten in ca. 5–10 Prozent aller familiären DCM-Fälle auf (Osterziel et al. 2005a, b). Verschiedene
Mutationen im Dystrophin-Gen sind in der Regel für die DCM verantwortlich (Muntoni et al.
1993) aber auch das Tafazzin-Gen kann eine isolierte DCM verursachen (D`Adamo et al. 1997,
Ichida et al. 2001).
Tabelle 3: DCM Kandidatengene beim Menschen, ihre Abkürzung, chromosomale Lokalisation
bei Mensch und Hund, Funktion ihrer Genprodukte sowie existierende Mausmodelle
Abkürzung
Homo sapiens
Chromosom
Canis lupus
familiaris
Chromosom
Funktion
Mausmodell
Lamin A/C
LMNA
1q21
7
ja
Troponin 2
TNNT2
1q32
7
α-Actinin 2
ACTN2
1q43
4
Titin
TTN
2q31
36
Desmin
DES
2q35
37
Troponin I
TNNC1
3q21
20
Cardiac Na-Channel
SCN5A
3p22
23
PDLIM3
4q35
16
SGCD
5q33
4
Phospholamban
PLN
6q22-1
1
Eyes absent homolog 4
EYA4
6q23-24
1
Desmoplakin
DSP
6q24
35
Genexpression und
Zellkernstabilität
Muskelkontraktion
Interaktion mit Titin
und Actin
Funktion als elastisches Element
Transduktion der
kontraktilen Kraft
Muskelkontraktion
α-Untereinheit des
Natriumkanals
Zytoskelett-Aufbau
Transduktion der
kontraktilen Kraft
Regulation der
Calciumhomöostase
Transkriptionsfaktor
für Myogenese
Zell-Zell-Verbindung
Kandidatengen
PDZ and LIM domain 3
δ-Sarcoglycan, (35 kDa dystrophinassociated glycoprotein)
ja
ja
ja
30
Fortsetzung Tabelle 3
Abkürzung
Homo sapiens
Chromosom
Canis lupus
familiaris
Chromosom
Cholinergic receptor, muscarinic 2
CHRM2
7q31-35
16
Signaltransduktion
Tropomodulin 1
TMOD1
9q22
11
Ja
LDB3
10q22-23
4
CTNNA3
10q22-23
4
VCL
10q22-23
4
MYBPC
11p11.2
18
Sarkomeraufbau
Aufbau und Anordnung von Membranproteinen
wahrscheinlich
Zell-Zell-Verbindung
Verankerung von FActin an der Plasmamembran
Muskelkontraktion
CSRP3
11p15.1
21
Spannungssensor
ja
ABCC9
12p12.1
27
Regulatorische Untereinheit des KKanals Kir6.2
MYH7
14q12
8
Muskelkontraktion
Kandidatengen
LIM domain binding 3
α-Catenin 3 (cadherin-associated
protein),
(Meta-)Vinculin
Myosin binding protein C, cardiac
Cysteine and glycine-rich protein 3
(cardiac LIM protein)
ATP-binding cassette, sub-family C
(CFTR/MRP), member 9
Funktion
Mausmodell
β-Myosin, heavy polypeptide 7,
cardiac muscle,
α-Myosin, heavy polypeptide 6,
cardiac muscle,
α-Actin, cardiac muscle 1
MYH6
14q11
8
Muskelkontraktion
ja
ACTC1
15q14
30
Muskelkontraktion
ja
Tropomyosin 1
TPM1
15q22
30
Muskelkontraktion
Titin-cap (telethonin)
TCAP
17q12
9
Sarkomeraufbau
Troponin I type 3, cardiac
TNNI3
19q13
1
Muskelkontraktion
Dystrophin
DMD
Xp21.2
X
Kraftübertragung
TAZ
Xq28
X
unbekannt
Tafazzin
Eine autosomal rezessiv vererbte DCM soll in bis zu 15 Prozent aller familiären DCM-Fälle vorliegen (Mestroni et al. 1999). Bislang konnten jedoch nur wenige Familien mit rezessiv vererbter
DCM aufgeklärt werden (Murphy et al. 2004).
Neben diesen bereits bekannten, DCM verursachenden Genen werden noch weitere DCM auslösende Gene vermutet.
3.2
Dilatative Kardiomyopathie beim Hund
DCM ist eine Erkrankung, die besonders bei groß gezüchteten Hunderassen wie Dobermann
Pinscher, Neufundländer, Deutsche Dogge und Irischer Wolfshund beobachtet wird (O`Grady
und Horne 1995, O`Grady und Horne 1998, Vollmar 1999a, b, Vollmar 2000, Dukes-McEwan
31
und Jackson 2002). Genetische Ursachen sind bei diesen Rassen wahrscheinlich, scheinen bei
den verschiedenen Hunderassen aber heterogen zu sein, da das Erkrankungsalter und die Erbgänge zwischen den Rassen variieren. So wird für Boxer ein autosomal dominanter Erbgang
vermutet (Meurs et al. 1999), während bei Doggen ein X-chromosomaler rezessiver Erbgang beschrieben ist (Meurs et al. 2001a). Bei Neufundländern beschreibt ein autosomal dominantes
Modell mit unvollständiger Penetranz den Erbgang am ehesten. Beim portugiesischen Wasserhund wurde bei einer juvenilen DCM-Form ein autosomal rezessiver Erbgang angenommen
(Dambach et al. 1999) und beim Dobermann Pinscher scheint die DCM durch einen autosomal
dominanten Erbgang am ehesten erklärt zu werden (Meurs et al. 2007).
Bislang konnte bei keiner Rasse ein DCM verursachendes Gen identifiziert werden. Allerdings
wurden für die adulte DCM beim Dobermann Pinscher bereits das kardiale α-Actingen (Meurs et
al. 2001b) sowie die Gene Desmin (Stabej et al. 2004), SGCD, PLN (Stabej et al. 2005a, b),
LMNA, Troponin C und T, CSRP3 und MYH7 (Meurs et al. 2008) als kausal für DCM ausgeschlossen. Auch Mutationen in der Promotorregion des Dystrophin-Gens konnten beim Dobermann Pinscher als generelle Ursache der DCM ausgeschlossen werden (Schatzberg et al. 1999).
Bei Irischen Wolfshunden ist DCM eine Erkrankung, die bei adulten Tieren auftritt, mit einem
mittleren Diagnosealter von 4,52 ± 1,99 Jahren. Männliche Tiere sind häufiger und früher von
der Erkrankung betroffen (Brownlie und Cobb 1999, Vollmar 2000). Eine Segregationsanalyse
zeigte, dass der Erbgang durch ein autosomal dominantes Hauptgen-Modell mit geschlechtsspezifischem Alleleffekt am ehesten erklärt werden kann (Distl et al. 2007).
Da DCM bei den Irischen Wolfshunden meist erst diagnostiziert wird, nachdem die Tiere bereits
in der Zucht einsetzt worden sind, ist es ohne molekulargenetische Analyse schwierig, die Prävalenz der Erkrankung innerhalb der Rasse zu senken. Der generelle Zuchtausschluss DCM betroffener Familien könnte zu einer zu starken Einengung des genetischen Pools führen. Eine frühzeitige Diagnose der DCM – bevor Tiere erstmalig in der Zucht eingesetzt werden – wäre daher ein
Mittel, die Erkrankungsrate in der Rasse zu senken. Daher sollen die Untersuchungen dazu beitragen, die molekulargenetische Ursache für die DCM bei Irischen Wolfshunden aufzuklären.
Zusätzlich hätte man ein weiteres definiertes Tiermodell, dessen Studium die Erkenntnisse über
Entstehung und Entwicklung auch der humanen Erkrankung erweitern.
32
3.3
Zusammenfassung der Ergebnisse zur Untersuchung von Kandidatengenen,
die an der Ausprägung einer DCM beim Irischen Wolfshund beteiligt sein könnten
In dem hier vorliegenden Teil wurden canine Gene, deren orthologe Pendants beim Menschen
mit DCM assoziiert sind, bei Irischen Wolfshunden molekulargenetisch analysiert. Die Untersuchungen umfassten cDNA-Analysen, die Identifizierung und Genotypisierung intragenischer
DNA-Marker bzw. die Analyse bekannter Mikrosatellitenmarker. Die Genotypisierungsdaten
wurden zur Berechnung von Kopplung bzw. Assoziation zwischen diesen Genen und der Ausprägung von DCM bei Irischen Wolfshunden genutzt. Von den 24 in Tabelle 3 aufgeführten Genen wurden acht näher untersucht: das X-chromosomal lokalisierte TAZ-Gen, sowie die autosomal lokalisierten Gene ACTC1, CSRP3, DES, PLN, SGCD, TMOD1 und TCAP. Es konnte keine
Assoziation oder Kopplung zwischen DCM bei Irischen Wolfshunden und einem dieser Gene
festgestellt werden.
3.4
Eigene Beiträge zur DCM beim Irischen Wolfshund
Evaluation of tafazzin as candidate for dilated cardiomyopathy in Irish wolfhounds
Philipp U, Broschk C, Vollmar A, Distl O.
J Hered. 2007; 98: 506-509.
Männliche Irische Wolfshunde erkranken früher und häufiger an DCM als weibliche Tiere. Um
eine Beteiligung X-chromosomaler Gene an der Ausprägung der Erkrankung zu überprüfen,
wurde in dieser Arbeit ein Set von acht X-chromosomalen Mikrosatellitenmarkern bei Irischen
Wolfshundfamilien, die für DCM segregieren, auf Kopplung mit DCM getestet. Die Marker
wurden an DNA Proben von 89 Irischen Wolfshunden genotypisiert, von denen 25 Proben von
DCM betroffenen Irischen Wolfshunden stammen und 64 von DCM freien Tieren. Außerdem
wurde das Tafazzin-Gen (TAZ), ein humanes X-chromosomales Kandidatengen für DCM analysiert.
Die statistische Auswertung der Marker gab keinen Hinweis auf Kopplung von X-chromosomalen Genorten und DCM. Die Untersuchung des TAZ-Genes ergab, dass die Sequenzen innerhalb
der Irischen Wolfshunde monomorph waren. Im Vergleich zu der Boxerreferenzsequenz des
Hundegenomprojekts konnten in den rund 5800 sequenzierten Basen acht Sequenzunterschiede
33
identifiziert werden. Die Ergebnisse der Kopplungsanalyse und das Fehlen von Mutationen im
TAZ-Gen innerhalb der Irischen Wolfshunde zeigten, dass TAZ-Gen an der Entstehung der DCM
beim Irischen Wolfshund nicht beteiligt ist.
Evaluation of six candidate genes for dilated cardiomyopathy
in Irish wolfhounds
Philipp U, Vollmar A, Distl O.
Anim Genet. 2008; 39: 88-89.
In dieser Studie wurden sechs humane autosomale Kandidatengene (ACTC1, CSRP3, DES, PLN,
SGCD und TMOD1) auf Kopplung und Assoziation zu DCM bei Irischen Wolfshunden getestet.
Dazu wurden genomische Sequenzen der Gene auf Polymorphismen untersucht und intragenische Marker entwickelt. Außerdem wurden cDNA Sequenzen aus Herzgewebe eines DCM erkrankten Irischen Wolfshundes sowie Skelettmuskulatur eines gesunden Jack Russell Terriers
untersucht sowie die DNA-Sequenzen der 5’- und 3’- untranslatierten Bereiche der Gene analysiert.
Im Vergleich zur Boxerreferenzsequenz wurden in den Genen ACTC1, CSRP3 und TMOD1 keine Mutationen in der kodierenden Region oder den flankierenden UTR gefunden (Tabelle 4). In
SGCD und PLN wurde eine Mutation im 5’- bzw. 3’- UTR detektiert und in DES wurden zwei
synonyme Substitutionen in der cDNA identifiziert (Tabelle 4). Bei keinem der Gene gab es einen Hinweis auf Spleißmutationen.
Für jedes der sechs Gene wurden intragenische Marker entwickelt (Tabelle 4), die in einer Kopplungs- und Assoziationsanalyse verwendet werden konnten. Dazu wurden die Marker an der
DNA von 89 Irischen Wolfshunden genotypisiert. 64 der in dieser Untersuchung einbezogenen
Tiere waren DCM frei, 25 Proben stammten von DCM betroffenen Tieren. In den Genen
ACTC1, CSRP3, SGCD, PLN und TMOD1 sind die DNA-Marker in intronischen Genbereichen
lokalisiert. Im Gen DES ist ein polymorpher Marker in Exon 8, die anderen drei Polymorphismen sind in Intron 7. Die statistische Auswertung ergab, dass keine Kopplung oder Assoziation
zwischen den analysierten intragenischen Polymorphismen und DCM vorliegt. Unsere Ergebnisse ließen den Schluss zu, dass die sechs analysierten Kandidatengene als Ursache für DCM bei
Irischen Wolfshunden ausgeschlossen werden können. Die in dieser Arbeit identifizierten DNA-
34
Marker können für weitere genetische Studien zur DCM bei anderen Hunderassen eingesetzt
werden.
Tabelle 4: Identifizierte Mutationen in den sechs Kandidatengenen im Vergleich zur Boxerreferenzsequenz, Gen, Chromosom, Markerposition, Lokalisierung im Gen, Boxer und Irische
Wolfshund (IW) Allele. Fett: Polymorphismen, die für die Kopplungs- und Assoziationsstudie
verwendet wurden.
Gen
CFA
ACTC1 30
CSRP3 21
DES
37
PLN
1
SGCD
4
TMOD1 11
Caniner Genort Marker
LOC478250
g.2937C>T
LOC610946
g.137A>G
g.8763T>C
g.8959delA
LOC497091
g.1808T>C
g.5840G>A
g.5844C>G
g.5902T>C
g.6062G>A
g.7038C>G
g.7089T>C
LOC414755
g.7867delA
g.10830A>C
LOC612079
g.378499G>C
g.4985C>T
LOC474771
g.43126G>A
g.53452C>T
Lokalisierung
Intron 4
Intron 1
Intron 2
Intron 2
Exon 3, synonym
Intron 7
Intron 7
Intron 7
Exon 8, synonym
putative 3´UTR
putative 3´UTR
Intron 1
Exon 2, 3´UTR
Intron 7
Exon 1, 5´UTR
Intron 7
Intron 8
Boxer Allel
C
A
T
A
T
G
C
T
G
C
T
A
A
G
C
G
C
IW Allele
C/T
G
C/T
A/del A
C
G/A
G/C
C/T
G/A
G
C
A/del A
C
G/C
T
G/A
C/T
Evaluation of the titin-cap gene (TCAP) as candidate for dilated
cardiomyopathy in Irish wolfhounds
Philipp U, Vollmar A, Distl O.
Animal Biotechnol. 2008; 19: 231-236.
Mutationen im Titin-cap-Gen (TCAP oder telethonin) können bei Menschen DCM auslösen. In
dieser Untersuchung wurde TCAP als Kandidatengen für DCM bei Irischen Wolfshunden evaluiert. Dazu wurden die zwei Exons und das Intron des TCAP-Gens sowie flankierende intergenische Bereiche, die regulatorische Sequenzen enthalten könnten, analysiert.
Wir sequenzierten die cDNA von einem an DCM erkrankten Irischen Wolfshund sowie von zwei
nicht an DCM erkrankten Hunden der Rassen Tibet Terrier und Dackel. Die cDNA-Sequenzen
35
zeigten keine Unterschiede zwischen den drei Tieren, jedoch einen c.753G>C (äquivalent zu
g.1134G>C) Austausch im 3’- UTR im Vergleich zur Boxerreferenzsequenz des Hundegenomprojekts.
Das Intron sowie Teile der Exons mit flankierenden intergenischen Sequenzen wurden bei 13
Irischen Wolfshunden sequenziert, von denen acht an DCM erkrankt und fünf nicht von DCM
betroffen waren. Die Sequenzen der Irischen Wolfshunden waren untereinander monomorph, im
Vergleich zur Boxerreferenzsequenz wurden zwei Sequenzunterschiede (g.349A>G und
g.408T>C) im Intron identifiziert. Um zu überprüfen, ob die bei den Irischen Wolfshunden gefundenen Sequenzunterschiede einen DCM prädisponierenden Haplotyp darstellen könnten,
wurden die drei DNA-Polymorphismen zusätzlich bei 24 Elos analysiert. Die Rasse Elo weist
keine Prädisposition für DCM oder andere Herzerkrankungen auf und ist daher als Kontrollgruppe geeignet. Die Untersuchung zeigte, dass 80 Prozent der genotypisierten Elos den TCAPHaplotypen der Irischen Wolfshunden besitzen. Damit ist dieser Haplotyp nicht spezifisch für
den Irischen Wolfshund. Da der Haplotyp zudem bei einer für DCM nicht prädisponierten Rasse
nachgewiesen wurde, schließen wir, dass dieser Haplotyp bei Irischen Wolfshunden nicht die
Suszeptibilität für DCM erhöht.
3.5
Diskussion
Die hier zugrunde liegenden Untersuchungen führten beim Irischen Wolfshund zum Ausschluss
von acht Kandidatengenen für DCM. Die untersuchten Gene erschienen als geeignete Kandidaten, da Mutationen in sieben dieser Gene beim Menschen mit DCM assoziiert sind. Für die Gene
ACTC1, CSRP3, DES, PLN, SCGD und TCAP (OMIM #115200) ist beim Menschen bereits
nachgewiesen, dass Mutationen zu familiärer DCM oder auch anderen Myopathien führen. Auch
für das X-chromosomale TAZ-Gen ist bei Menschen gezeigt worden, dass eine Mutation zu
DCM führen kann. Eine Mutation im TAZ-Gen hätte bei den Irischen Wolfshunden den geschlechtsspezifischen Alleleffekt erklären können. Für das Gen TMOD1 gibt es bislang ein DCM
Mausmodell. Außerdem wurde in einer Familie eine Kopplung zwischen DCM und dem Chromosomenbereich HSA9q13-q.22 festgestellt, dem Genombereich, in dem TMOD1 lokalisiert ist
(OMIM #600884).
36
Die Gene ACTC1, CSRP3, PLN, SCGD und TMOD1 wurden aus zwei Gründen als kausal für
DCM beim Irischen Wolfshund ausgeschlossen. Zum einem wurde keine Mutation in der kodierenden Sequenz identifiziert, zum anderen wurde zwischen den von uns entwickelten intragenischen DNA-Markern und dem Phänotyp DCM keine Kopplung oder Assoziation festgestellt. Die
im Vergleich zur Boxerreferenzsequenz identifizierten Polymorphismen in den untranslatierten
Bereichen von PLN und SCGD waren zwischen einem DCM betroffenen und einem DCM freien
Irischen Wolfshund ebenfalls monomorph. DES wurde als DCM verursachendes Gen ausgeschlossen, da die zwei Mutationen im kodierenden Bereich von DES zu keinem Aminosäureaustausch führen. Außerdem konnte zwischen keinem der vier benachbarten SNPs in Intron 7 und
Exon 8 und dem Phänotyp DCM eine Assoziation oder Kopplung gezeigt werden. Das X-chromosomale TAZ-Gen wurde als kausal für DCM beim Irischen Wolfshund ausgeschlossen, da die
analysierten Gensequenzen innerhalb der Irischen Wolfshunde monomorph waren und die informativen flankierenden Mikrosatellitenmarker keine Kopplung oder Assoziation zum Phänotyp
DCM zeigten. Für TCAP wurde bei den Irischen Wolfshunden ein im Vergleich zur Boxerreferenzsequenz neuer Haplotyp identifiziert, der allerdings innerhalb der Irischen Wolfshunde monomorph war. Der Sequenzvergleich mit Hunden der Rasse Elo, die nicht für DCM prädisponiert
ist, zeigte, dass der Irische Wolfshund Haplotyp auch bei Elos dem häufigeren Haplotyp entspricht. Daher wird dieser Haplotyp nicht die Empfänglichkeit für DCM beim Irischen Wolfshund erhöhen und somit kann das TCAP-Gen beim Irischen Wolfshund als DCM verursachend
ausgeschlossen werden.
Beim Menschen konnten bislang verschiedene familiäre Formen der DCM mit Mutationen in
diesen und anderen Kandidatengenen erklärt werden. Bislang sind alle identifizierten Mutationen, die bei Menschen mit DCM assoziiert sind, Mutationen in den kodierenden Bereichen der
Gene (OMIM http://www.ncbi.nlm.nih.gov/sites/entrez?db=OMIM&cmd=search&term=). Allerdings wurden Untersuchungen zur DCM stets an kleineren Gruppen (Familien) durchgeführt,
die oft nur eine geringe Probandenzahl und wenige Generationen erfassen. Die beobachteten
Erbgänge entsprachen einem einfachen monogenen Erbgang. Die identifizierten Mutationen gelten daher oft nur innerhalb der untersuchten Gruppe. Gentests für ein breites Screening konnten
bislang nicht entwickelt werden, zumal auch nur rund 30 Prozent der familiären Fälle mit Mutationen in den bereits analysierten Genen erklärt werden können (Osterziel et al. 2005a).
37
In den hier vorliegenden Untersuchungen bei Irischen Wolfshunden konnten einige beim Menschen als für DCM kausal bekannte Gene ausgeschlossen werden. Ob weitergehende Analysen
von Kandidatengenen zur Identifizierung von DCM auslösenden Genvarianten führen, bleibt unsicher, da die genaue Zahl der Gene, deren Mutation DCM auslösen könnte, nicht bekannt ist.
Und wie Aguirre-Hernández und Sargan (2005) nach Auswertung verschiedener Studien mit
Kandidatengenansatz feststellten, ist das Auffinden von kausalen Mutationen nur aufgrund der
Auswahl bekannter Kandidatengene ohne zusätzliche positionelle Information wenig erfolgreich,
insbesondere wenn eine genetische Heterogenität für die zu untersuchende Eigenschaft bekannt
ist. Diese These scheint auch eine neue Untersuchung bei Neufundländern zu belegen, bei der 15
Kandidatengene für DCM ausgeschlossen wurden (Wiersma et al. 2008). Allerdings führt ein
rein positioneller Ansatz auch nicht unbedingt zum Erfolg. So konnte in einer prospektiven Studie mit einer Familie aus 41 Dobermann Pinschern, deren DNA an 372 Mikrosatelliten genotypisiert worden waren, keine signifikante Kopplung zu einem Genombereich festgestellt werden
(Meurs et al. 2007). Entscheidend für dieses Ergebnis könnte hier die geringe Tierzahl bei noch
zu geringer Markerdichte gewesen sein.
Ein weiterer Grund, der das Auffinden DCM verursachender Gene erschwert, ist, dass sich beim
Irischen Wolfshund und bei anderen Hunderassen der Erbgang nicht mit einem einfachen monogenen Modell beschreiben lässt. Die Segregationsanalyse für Wolfshunde ergab ein HauptgenModell mit geschlechtsspezifischem modulierenden Einfluss (Distl et al. 2007). Dies könnte die
Zuordnung eines krankheitsassoziierten Haplotyps erschweren. Zudem könnte sich der krankheitsassoziierte Haplotyp bei männlichen und weiblichen Tieren unterscheiden. Daher kann es
sein, dass es gar nicht den einen krankheitsassoziierten Haplotyp bei den Irischen Wolfshunden
gibt. Die krankheitsassoziierten Haplotypen könnten in Abhängigkeit vom genetischen Hintergrund variieren. Dies belegen Untersuchungen zum geschlechtsspezifischen Größendimorphismus beim Portugiesischen Wasserhund, bei dieser Rasse wurde je ein QTL auf dem X Chromosom und CFA15 identifiziert. Die Genprodukte dieser QTL interagieren bei männlichen und
weiblichen Tieren unterschiedlich (Chase et al. 2005). In dieser Studie zum geschlechtsspezifischen Größendimorphismus wurden rund 450 Tiere genotypisiert. Das zeigt auch, dass gerade
für polygene Eigenschaften eine hohe Anzahl von eindeutig diagnostizierten Tieren notwendig
ist, um aussagekräftige Ergebnisse zu erhalten.
38
Das belegt auch die Untersuchung des Addison-Syndroms beim Portugiesischen Wasserhund.
Für diese auch beim Menschen beschriebene Autoimmunerkrankung wurden bei den Portugiesischen Wasserhunden zwei autosomale QTL mittels Mikrosatellitengenomscan identifiziert. Da
die Zahl der von dieser Krankheit betroffenen Tiere aber gering ist, führte eine Haplotypanalyse
bislang zu keinem eindeutigen Ergebnis (Chase et al. 2006).
Die aufgeführten Beispiele zeigen, dass es nötig ist, einen positionellen Ansatz mit hohen Tierzahlen und mit einer hohen Markerdichte durchzuführen, um QTL eingrenzen zu können. Bei
Irischen Wolfshunden hat ein positions- und nicht nur kandidatengengestützter Ansatz für die
Untersuchung der DCM den Vorteil, dass auch Genombereiche außerhalb der klassischen Kandidatengenregionen analysiert werden. Denn in der seit rund 100 Jahren bestehenden Zucht der
Irischen Wolfshunde können sich Defekte von Genen durchgesetzt haben, deren Mutation bei
Mensch oder Maus selten zur Erkrankung an DCM führen. Durch anschließenden Einsatz von
Expressionsarrays können zudem Gene, die in assoziierten Genregionen liegen auf unterschiedliche Expressionsmuster untersucht werden und so die Wahl der näher zu analysierenden Gene
weiter eingrenzen. Bei Hunden konnten bereits kausale Mutationen identifiziert werden, nachdem genomweite Assoziationsstudien mit hoher Markerdichte (SNP-Arrays) durchgeführt worden waren. Bei den engverwandten Rassen Rhodesian und Thai Ridgeback wurde die kausale
Mutation für den Haarkamm und damit auch die Prädisposition zum Dermoid sinus mithilfe der
Array-Technologie aufgeklärt (Salmon Hillbertz et al. 2007). Auch die Mutation für die monogen autosomal semi-dominant vererbte canine ektodermale Dysplasie, die bei Mexikanischen
und Peruanischen Nackthunden sowie beim Chinesischen Schopfhund den Phänotyp der Haarlosigkeit und damit oft verbunden der Zahnlosigkeit verursacht, konnte mithilfe von SNP-Arrays
aufgeklärt werden (Drögemüller et al. 2008). Das heißt, der Einsatz einer großen Anzahl von genetischen Markern führt zur Identifikation von Genombereichen, die merkmalsausprägende Gene enthalten.
Für die Identifikation DCM verursachender Genombereiche bei Irischen Wolfshunden muss aufgrund des komplexen Erbgangs die Anzahl der zu genotypisierenden Tiere hoch sein. Um das
Problem einer eventuell zu geringen Tierzahl zu überwinden, bietet die Untersuchung von Parker
und Ostrander (2005) einen möglichen Ansatz. Diese Autoren haben einen phylogenetischen
Stammbaum der Haushundrassen erstellt und stellen die These auf, dass sich in eng verwandten
Rassen eine Anfälligkeit für eine Krankheit oft auf eine gemeinsame Urmutation zurückführen
39
lässt. So könnte man für die molekulargenetischen Untersuchungen die Probandenzahl erhöhen,
indem man die Untersuchung auf eng verwandte Rassen ausweitet. Dieser Ansatz wurde auch in
der Studie von Salmon Hillbertz et al. (2007) bestätigt, deren Untersuchung vom Rhodesian
Ridgeback auf Thai Ridgeback erweitert wurde, um den Genombereich, der die kausale Veränderung für den Haarkamm enthielt, besser eingrenzen zu können.
Für die weiteren Untersuchungen der DCM bei Irischen Wolfshunden bietet der eben diskutierte
methodische Ansatz die Möglichkeit, die Zahl der zu analysierenden Tiere zu erhöhen, indem die
Studie auf andere ebenfalls von DCM betroffene Windhundrassen erweitert wird. Dadurch und
durch den Einsatz der SNP-Array-Technologie sollte es möglich sein, QTL zu identifizieren, in
denen DCM verursachende Gene lokalisiert sind.
40
4
Untersuchungen am caninen MDR1 Gen
4.1
Funktion des MDR1 P-Glykoproteins
MDR1 (Multidrug Resistance Gene oder ABCB1, ATP-binding Cassette, subfamily B member 1)
kodiert ein transmembranes Transportprotein, das P-Glykoprotein. Dieses wirkt als ATP-abhängige Efflux-Pumpe, die den Körper vor Umwelttoxinen schützt. Transportiert werden Verbindungen von chemisch sehr unterschiedlicher Struktur wie Immunsuppressiva (Cyclosporin), Anti-Tumorwirkstoffe, HIV-Proteaseinhibitoren oder auch Herzmedikamente wie Digoxin. Dabei
limitiert P-Glykoprotein zum einen die Aufnahme von Fremdstoffen im Darm, schützt empfindliche Gewebe und Organe wie Gehirn, Hoden oder Plazenta und ist an der Exkretion von Substraten über Harn und Galle beteiligt (Schwab et al. 2003). Einige der transportierten Verbindungen induzieren in Tumorzellen eine erhöhte Expression des Gens und somit wird mehr P-Glykoprotein gebildet (Wang und Sadée 2006). Dadurch werden diese Wirkstoffe aber auch andere
Substrate vermehrt aus den Zellen transportiert und es entsteht eine Resistenz gegen viele Wirkstoffe eine sogenannte Multidrug-Resistenz.
Das P-Glykoprotein ist in vielen Geweben nachweisbar. So ist es nicht nur integraler Bestandteil
der Blut-Hirn-Schranke sondern wird auch in Niere und Leber sowie im Darmepithel exprimiert
(Fojo et al. 1987). Aus dem Gehirn werden Stoffe zurück ins Blut transportiert, im Darmepithel
reguliert P-Glykoprotein die Aufnahme von Medikamenten, während es in Leber und Niere den
Efflux von Substraten steuert.
Die Expression des Transportproteins kann durch verschiedenste Fremdstoffe induziert werden.
Eine erhöhte Expression des P-Glykoproteins geht in Tumorzellen mit der Resistenz gegen Cytostatika einher (Wang und Sadée 2006). Ein Mangel oder Fehlen von P-Glykoprotein führt –
wie in transgenen Mäusen gezeigt wurde – zu einer Überempfindlichkeit gegenüber einigen Substraten wie dem neurotoxischen Pestizid Ivermectin oder dem Krebstherapeutikum Vinblastin
(Schinkel et al. 1997).
4.2
MDR1 Polymorphismen beim Menschen
Im humanen MDR1-Gen konnten in der Sequenz zahlreiche Polymorphismen identifiziert werden (Hoffmeyer et al. 2000). Ein synonymer c.3435C>T Austausch korrelierte mit dem Expressionslevel des MDR1-Gens und mit der P-Glykoprotein-Aktivität. Bei Probanden wurde eine
41
verringerte Menge duodenales P-Glykoprotein sowie eine erhöhte Digoxinkonzentration im
Zellplasma vorgefunden. Somit scheint dieser Polymorphismus die Absorption und Gewebekonzentration von MDR1-abhängigen Substraten zu beeinflussen. Einige Studien zeigten unterschiedliche Expressionshöhen zwischen den beiden allelischen Varianten (Nakamura et al. 2002)
bzw. bestätigten unterschiedliche Plasmakonzentrationen von Wirkstoffen (Sakaeda et al. 2001,
Fellay et al. 2002, Shon et al. 2005). Obwohl in diesen Studien allelspezifische Unterschiede gezeigt wurden, waren die beobachteten allelischen Effekte meist gering und zudem in den verschiedenen Ethnien zum Teil konträr. Außerdem gibt es auch Untersuchungen, die keinen Einfluss des c.3435C>T Polymorphismus nachweisen konnten (Tanabe et al. 2001). Diese unterschiedlichen Befunde können an der Ethnie der Untersuchten liegen aber auch an den Geweben,
die in den Studien analysiert worden waren.
Die molekulare Basis für die beobachteten Alleleffekte ist bislang noch nicht vollständig erklärt.
Der c.3435C>T Austausch ist synonym, die Proteinsequenz (Ile1145Ile) ist durch die Mutation
nicht verändert. Daher sollte auch die Proteinfunktion nicht beeinflusst sein. Eine mögliche Erklärung für die dennoch gemessenen Expressions- und Funktionseffekte wäre, dass der synonyme SNP mit einer bisher nicht näher identifizierten Promotorvariante oder einer anderen regulatorischen Sequenz im Kopplungsungleichgewicht steht und dadurch die Expression verändert
wird. Alternativ käme auch ein zweites gekoppeltes, noch nicht charakterisiertes Gen in Frage,
das die MDR1-Expression reguliert. Neuere Theorien gehen aber davon aus, dass stille Mutationen nicht ohne Effekt sein müssen, sondern durchaus Auswirkungen auf das Transkript haben
können. Eine Hypothese ist, dass stille Mutationen Bindungsstellen von Spleißverstärkern verändern und daher die Effektivität des Spleißens beeinflussen (Parmley et al. 2006). Synonyme
Mutationen können zudem zu einer anderen Faltung der RNA während der Transkription führen,
sich dadurch auf die RNA-Prozessierung, Stabilität und anschließende Proteintranslation auswirken. Der Einfluss des MDR1 c.3435C>T Polymorphismus auf die gebildete RNA- und Proteinmenge ist eher gering, aber die Proteinkonformation könnte modifiziert werden (Kimchi-Sarfaty
et al. 2007). Eine mögliche Erklärung ist, dass die Verwendung eines in der humanen Proteinbiosynthese selteneren RNA-Kodons den zeitlichen Ablauf der kotranslationalen Faltung und damit
auch den Einbau des P-Glykoproteins in die Zellmembran beeinflusst. Dies könnte die Konformation des Proteins verändern. Sind dadurch Strukturen betroffen, die mit Substraten und/oder
42
Inhibitoren in Wechselwirkung treten, führt dies zu einem vom Wildtyp abweichenden Substrattransport.
4.3
Der MDR1 Polymorphismus beim Hund
Bei verschiedenen Hunderassen - erstmals bei Collies - wurde eine Überempfindlichkeit gegen
das Antiparasitenmittel Ivermectin beschrieben (Preston 1983, Seward 1983). Das Medikament
führt bei betroffenen Hunden zu neurotoxischen Symptomen bis hin zum Tod der Tiere abhängig
von der verabreichten Dosis des Wirkstoffes (Pulliam et al. 1985). Ivermectin ist ein Substrat,
dessen Plasmakonzentration durch das P-Glykoprotein reguliert wird. Im caninen MDR1-Gen
ivermectinsensitiver Tiere wurde eine 4-Basen Deletion (mdr1-∆1) nachgewiesen, die zu einem
veränderten Leseraster führt. Dieses bedingt das Ablesen eines vorzeitigen Stoppkodons und somit ein verkürztes Protein. Besonders in Populationen von Hütehundrassen wie Collie, Australischer Hütehund aber auch von langhaarigen Whippets werden hohe Frequenzen des mutierten
MDR1-Allels nachgewiesen (Neff et al. 2004, Kawabata et al. 2005, Mealey und Meurs 2008).
In der seit 1987 neu gezüchteten Rasse Elo waren zu Beginn vier Bobtails – eine Rasse, in der
ebenfalls die mdr1-∆1 nachgewiesen wurde – als Gründertiere eingekreuzt worden. Eine molekulargenetische Analyse zeigte, dass die Deletionsmutation bei keinem der untersuchten EloHunde auftrat und es zudem unwahrscheinlich ist, dass das mdr1-∆1-Allel in der Elo-Population
vorhanden ist (Fecht et al. 2007). Weitere Polymorphismen des caninen Hundegens sind bislang
nicht untersucht worden.
4.4
Ziel der Untersuchungen am caninen MDR1 beim Elo
Ziel der vorliegenden Arbeit war die Analyse des caninen MDR1-Gens auf weitere Polymorphismen innerhalb der Elo-Population und die Untersuchung möglicher Auswirkungen identifizierter Mutationen.
43
4.5
Eigener Beitrag zur Untersuchung von MDR1 Polymorphismen beim Hund
A sex-dependent functional polymorphism in the canine multidrug-resistance (MDR1) gene
Philipp U, Fecht S, Wöhlke A, Distl O. (submitted)
Im vorliegenden Teil der Arbeit wurde die cDNA von vier Elo-Hunden sequenziert. Dabei wurde
ein zuvor auf genomischer DNA identifizierter nichtsynonymer SNP in Exon 26 des Elo MDR1Gens bestätigt (c.3439A>G, Met1147>Val) sowie zwei weitere synonyme SNPs (c.504C>T und
c.1663C>T in den Exons 6 und 14) und ein SNP (c.*230G>A in Exon 28) im 3’-UTR entdeckt.
Die vier Polymorphismen wurden an 186 Tieren genotypisiert und Allel- und Genotypfrequenzen berechnet. Keine der Genotypfrequenzen zeigte eine Abweichung vom Hardy-Weinberg
Gleichgewicht.
Die Loci c.504C>T, c.3439A>G und c.*230G>A befinden sich im Kopplungsungleichgewicht.
Das aminosäureverändernde c.3439G-Allel hat in der untersuchten Elo Stichprobe einen Anteil
von 56,45 Prozent, seine Frequenz wird hauptsächlich durch den Einfluss der Gründerrasse Samoyed bestimmt. In den Rassen Labrador Retriever, Do-Khyi, Dalmatiner, Deutsch Drahthaar,
Hovawart und Border Collie konnte das G-Allel ebenfalls nachgewiesen werden, während in den
Stichproben weiterer neun Hunderassen nur das A-Allel auftrat. Um zu testen, ob der
c.3439A>G SNP oder auch die anderen Polymorphismen Auswirkungen auf die Transkripthöhe
des P-Glykoproteins haben, wurden von 42 Elos mit bekanntem Genotyp für den c.3439A>G
SNP Haarwurzelproben für eine RT-PCR gwonnen. Sechzehn der Hunde waren homozygot für
das c.3439A-Allel und zehn waren homozygot für das c.3439G-Allel. Siebzehn Elos waren an
der c.3439 Possition heterozygot. Die quantitative Analyse zeigte, dass nur der c.3439A>G Polymorphismus die relative Expressionshöhe von MDR1 beeinflusst. Die Auswertung nach dem
Genotyp zeigte, dass G/G-Tiere eine signifikant geringere relative Transkriptmenge aufweisen
als A/A-Tiere.
Eine Auswertung unter Berücksichtigung der Genotyp-Geschlecht-Interaktion zeigte, dass nur
die Rüden den genotypabhängigen Effekt bewirken. Bei homozygot A/A-Elo-Rüden konnte eine
signifikant höhere relative MDR1 Transkriptmenge nachgewiesen werden, als bei homozygot G/
G-Elo-Rüden. Die weiblichen Hunde wiesen eine insgesamt geringere Transkripthöhe auf, der
Einfluss des c.3439 A>G Polymorphismus auf die Transkripthöhe war nicht signifikant. Hetero-
44
zygote Tiere lagen mit ihrer relativen Transkriptmenge zwischen den homozygoten Tieren. Die
genotyp- und geschlechtsabhängige Transkription von MDR1 könnte bei den Hunden zu einer
veränderten Metabolisierung von Substraten führen, die MDR1-abhängig transportiert werden.
Auch wenn die Ergebnisse auf einen Einfluss des c.3439A>G Austausches auf die Transkription
hinweisen, ist nicht auszuschließen, dass noch weitere unbekannte Mutationen in regulatorischen
Bereichen des MDR1-Gens die Transkripthöhe mit beeinflussen.
45
4.6
Diskussion
In dieser Studie wurden im caninen MDR1-Gen vier bislang nicht beschriebene Mutationen –
jeweils Einzelbasenaustausche – identifiziert. Es konnte gezeigt werden, dass diese Genveränderungen innerhalb der Rasse Elo polymorph sind. Drei der Mutationen sind stille Mutationen, führen also zu keiner Veränderung der Proteinsequenz, während die vierte zu einem – wirkungsneutralem – Aminosäureaustausch führt, in der Nähe eines synonymen Polymorphismus im orthologen humanen MDR1-Gen, der zu veränderter Genexpression führt.
Eine Expressionsstudie mittels qPCR zum Einfluss der c.3439-Allele zeigte tatsächlich, dass bei
Elos, die homozygot das c.3439A-Allel tragen, eine signifikant höhere relative MDR1 Transkriptmenge gemessen wurde als bei Elos, die das c.3439G-Allel besitzen. Allerdings zeigte die
Studie hohe individuelle Unterschiede in der Transkripthöhe. Individuelle Variationen in der
Transkripthöhe sind auch zwischen Menschen eines Genotyps des c.3435C>T Polymorphismus
beschrieben worden (Nakamura et al. 2002). Auch das Geschlecht und der Hormonstatus scheinen die Expression von MDR1 zu beeinflussen. Bei weiblichen Elos schwankte die relative Transkripthöhe zwischen Tieren eines Genotyps stärker und bei heterozygoten weiblichen Tieren war
die relative MDR1-Transkripthöhe niedriger als bei homozygot G-Allel tragenden Elos. Bei
männlichen Elos und bei allen Tieren ohne Berücksichtigung des Geschlechts wurde bei homozygot G-tragenden Tieren die geringste relative Transkripthöhe beobachtet. Der Hormoneinfluss
auf die MDR1-Expression zeigte sich insbesondere bei weiblichen Elos. Bei einer tragenden
Hündin konnte eine fast 300-fache Menge des Transkripts nachgewiesen werden, bei einer weiteren Hündin zu Beginn der Tragezeit war die Transkriptmenge rund 20-fach erhöht.
Diese Ergebnisse sind in Übereinstimmung mit Beobachtungen bei Mensch und Nagetieren, bei
denen eine östrogen- und progesteronabhängige Regulierung der orthologen Gene im uteroplazentaren Gewebe gezeigt wurde (Arceci et al. 1990; Axiotis et al. 1991; Piekarz et al. 1993). Allerdings konnte für die mdr1-Expression in Rattenleber kein östrogensteuernder Effekt festgestellt werden (Schuetz et al. 1995). Diese Ergebnisse deuten auf eine unterschiedliche Regulierung der MDR1-Expression in verschiedenen Geweben hin. Der beobachtete geschlechtsabhängige Effekt könnte durch die Wirkung geschlechtshormonspezifischer Rezeptoren entstehen. Im
humanen Intestinaltrakt wird die MDR1-Expression unter anderem durch steroidabhängige Rezeptorproteine induziert (Geick et al. 2001, Burk et al. 2005). Geschlechtsabhängige Auswirkungen von Mutationen sind bei Menschen bereits beschrieben worden. So ist ein Polymorphismus
46
im Troponin T-Gen bei Männern mit einem schwereren DCM Erkrankungsbild als bei Frauen
assoziiert (Stefanelli et al. 2004). Und in dem SCARB1-Gen ist bei Frauen ein Polymorphismus
mit hohen High-Density-Lipoprotein-Cholesterin-Werten assoziiert, während bei Männern keine
Assoziation zwischen Cholesterin-Werten und Polymorphismen im SCARB1-Gen bestand (Roberts et al. 2007). Die molekulare Grundlage dieser geschlechtsabhängigen Effekte ist bislang
nicht bekannt. Eine mögliche Erklärung wäre eine gekoppelte Mutation in einem regulatorischen
DNA-Element, das mit geschlechtsspezifischen Rezeptorproteinen interagiert.
Unsere Untersuchungen wurden an Haarwurzelzellen durchgeführt, da dies ein Gewebe ist, das
ohne invasive Methoden entnommen werden kann. Es ist zwar bekannt, dass MDR1 in Haut und
angrenzendem Gewebe exprimiert wird (Fojo et al. 1987), weitergehende Studien sind bislang
nicht durchgeführt worden. Die physiologische Bedeutung unserer Ergebnisse muss daher noch
geklärt werden.
Allerdings scheint das c.3439A-Allel bei den untersuchten Hunderassen weiter verbreitet zu sein
als das G-Allel, da das G-Allel bei neun Rassen nicht nachgewiesen wurde. Die Allelfrequenz
bei den Rassen, bei denen es beobachtet wurde, wurde aufgrund der zu geringen Tierzahlen nicht
bestimmt. Dass das G-Allel bei einem kleineren Teil der untersuchten Rassen vorkommt, kann
Zufall sein. Die züchterische Selektion der Hunde durch den Menschen kann zu einem Verlust
einzelner Allele führen, ohne dass dies einen Einfluss auf die Fitness der Tiere hat. Welche Auswirkung die caninen MDR1-Genotypen auf den Transport MDR1-abhängiger Substrate in vivo
haben und ob damit eventuelle Vorteile oder Nachteile auf die Fitness verbunden sind, müssen
weitere Studien zeigen.
47
5
Studienübergreifende Diskussion
In der vorliegenden Arbeit wurden drei Themenkomplexe behandelt, um genetisch bedingte
Merkmale bei Hunden zu untersuchen. Die Analysen der Gene MLPH und MDR1 wurden aufgrund eines Kandidatengenansatzes durchgeführt. Dabei sollte im ersten Teil der Arbeit ein Gen
identifiziert werden, das einen bestimmten Farbphänotyp erklärt, während in den Analysen zum
MDR1-Gen untersucht wurde, ob es für dieses Gen noch neue, bislang nicht beschriebene Varianten bei Hunden gibt, die analog den Befunden im humanen MDR1-Gen eine funktionelle Wirkung haben. Damit sollte überprüft werden, ob und in welchem Maße genetische Polymorphismen über die Genregulation Einfluss auf den Phänotyp der Tiere haben.
Durch den Kandidatengenansatz wurde im ersten Teil der Studie eine monogene autosomal rezessive Eigenschaft – die Farbdilution bei Hunden – untersucht und die wahrscheinliche molekulargenetische Ursache für dieses Merkmal aufgeklärt. Der Ansatz führte deshalb zur Identifizierung des Gens, da nur drei Kandidatengene, die bereits bei Mensch und Maus beschrieben waren, einen vergleichbaren Phänotyp verursachen. Außerdem ist das Merkmal – eine Farbvariation
– eindeutig zu beurteilen und bei den in dieser Studie einbezogenen Hunderassen genetisch homogen.
Die Untersuchung des über viele Arten hinweg konservierten MDR1-Gens führte zur Identifizierung eines neuen, bislang nicht beschriebenen Polymorphismus bei Hunden und es konnte gezeigt werden, dass dieser in vitro die Transkripthöhe des MDR1-Gens bei Elos beeinflusst und
zudem einen geschlechtsabhängigen Effekt hat. Dieser geschlechtsabhängige Effekt weist auf
eine komplexe Genregulation des caninen MDR1 hin, die noch weiter aufzuklären ist. Um diese
näher zu untersuchen, sollte insbesondere die Promotorregion, die meist die regulatorischen
Elemente enthält, analysiert werden.
Für die Aufklärung der molekulargenetischen Ursache der DCM beim Irischen Wolfshund erwies sich der Kandidatengenansatz bislang nicht erfolgreich. Dies liegt an der hohen Anzahl potenzieller Kandidatengene, von denen bislang nur ein Teil identifiziert ist. Außerdem entspricht
der Erbgang bei Irischen Wolfshunden einem polygenen Hauptgen-Modell, so dass eine Mutation im Hauptgen nicht alle DCM Fälle erklärt und die Zahl von weiteren zur Erkrankung beitragenden Genen nicht bekannt ist. Für die Untersuchungen haben wir ein dominantes Hauptgen
innerhalb der Irischen Wolfshund Population postuliert. Um kausale Gene für die DCM zu iden-
48
tifizieren, sollte man in einer weiterführenden Studie statt eines Kandidatengenansatzes einen
positionellen Ansatz über eine Assoziationsstudie nutzen, um anschließend assoziierte Regionen
auf funktionelle Kandidatengene hin zu analysieren. Denn in der seit rund 100 Jahre bestehenden
Zucht der Irischen Wolfshunde könnten sich Defektallele etabliert haben, die bei Mensch oder
Maus nur selten zu einer DCM-Erkrankung führen. Für die Assoziationsstudien bieten sich SNPChips an, die eine Alternative zu den früheren positionellen Ansätzen der klassischen Familienuntersuchung mit anschließender Kopplungsanalyse darstellen. Für die Aufklärung multifaktorieller Merkmale wie DCM ist es nicht nur nötig, Genregionen (QTL) einzugrenzen, sondern auch
die Auswirkung der einzelnen Genorte und den Effekt zwischen den Genloci abzuschätzen. Denn
die Ausprägung der Erkrankung wird durch verschiedene genetische Faktoren beeinflusst. Die
Interaktion sowohl zwischen Genen als auch zwischen Allelen eines Gens, also der resultierende
Genotyp aus verschiedenen Genen (Epistasie), prägt den Phänotyp der DCM.
49
6
Ausblick
Bislang steht die Hundegenomik, die das Zusammenwirken von Genprodukten verschiedener
Gene und damit auch den molekularen Aufbau komplexer Eigenschaften erklärt, noch am Anfang. Bei der Suche nach kausalen Mutationen muss man sich – unabhängig, ob Kandidatengenoder positioneller Ansatz - von der Vorstellung lösen, dass diese im proteinkodierenden Bereich
des Gens liegen müssen. Vielmehr, so zeigen neuere Untersuchungen, liegen kausale Mutationen
auch in Promotorbereichen, führen veränderte Kopienzahlen von Genen, Duplikationen von
Genombereichen, Inversionen und Translokationen zu anderen Phänotypen. Letztere sind aber
mit den bislang genutzten Sequenzierungsmethoden nur bedingt zu finden, denn sie erfordern die
Sequenzierung einer hohen Anzahl von Basen an einer großen Anzahl von Individuen. So bietet
die Kombination der jüngst entwickelten Hochdurchsatzstrategien für Genotypisierung, Sequenzierung und Expression eher die Möglichkeit, molekulargenetische Ursachen von Merkmalen zu
identifizieren. Die Kombination dieser Techniken sollte insbesondere das Auffinden regulatorischer Mutationen erleichtern und die Chance bieten, die Interaktion der Gene besser zu verstehen. Dadurch sollte die Klärung der molekularen Mechanismen näher rücken sowie die Variation komplexer Eigenschaften besser erklärt und vorausgesagt werden können und somit ein besseres Verständnis der Hundegenomik erhalten werden.
50
7
Zusammenfassung
In der vorliegenden Arbeit wurden mittels molekulargenetischer Methoden züchterisch relevante
Merkmale bei Hunden (Canis lupus familiaris) untersucht. Das Ziel war, eine zum Phänotyp assoziierte Genvariante zu finden bzw. die kausale Mutation zu identifizieren. Die Arbeit gliedert
sich in drei Teile: In den ersten beiden Kapiteln wurden Gene analysiert, deren Mutation ursächlich für beobachtete Phänotypen - Farbdilution bei Pinschern beziehungsweise dilatative Kardiomyopathie (DCM) bei Irischen Wolfshunden - sein könnten. Im abschließenden Teil der Arbeit
wurden bei der Rasse Elo Polymorphismen im MDR1-Gen (Multidrug Resistance Gene oder
ABCB1, ATP-binding Cassette, subfamily B member 1) charakterisiert und die Auswirkung der
Genvarianten auf die Expression und damit den Phänotyp untersucht.
Im ersten Teil der Arbeit wurde das Dilutionsgen bei Hunden charakterisiert und die wahrscheinlich kausale Mutation für die Farbdilution identifiziert. Diese Analysen wurden hauptsächlich bei
den Rassen Deutscher Pinscher und Dobermann Pinscher durchgeführt. Der Phänotyp der Farbdilution wird monogen autosomal rezessiv vererbt. Um das bei Hunden kausale Gen für die
Farbdilution zu identifizieren, wurde das Melanophilingen (MLPH), ein bei Mensch und Maus
beschriebenes Kandidatengen für Farbaufhellung, sequenziert und auf Mutationen untersucht,
die spezifisch bei Hunden mit aufgehellter Fellfarbe auftreten. Eine Assoziationsstudie mit 343
Hunden verschiedener Rassen zeigte, dass das MLPH-Gen mit der Farbverdünnung assoziiert ist.
Eine kausale Mutation im kodierenden Bereich des Gens konnte nicht nachgewiesen werden.
Allerdings konnte bei allen Tieren mit dieser Farbmutation des Fells eine gemeinsame Mutation
direkt an der Spleißstelle des nicht-kodierenden ersten Exons des MLPH-Gens identifiziert werden. Diese Mutation könnte zu abnormalen Spleißprodukten führen und damit kausal für die
Aufhellung der Fellfarbe bei Hunden sein. Expressionsanalysen bestätigten zudem, dass bei
Hunden mit aufgehellter Fellfarbe die MLPH-Transkripthöhe verglichen mit Hunden ohne den
Aufhellungsfaktor reduziert ist. Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass die Mutation im ersten
Exon tatsächlich die kausale Mutation für die Farbdilution bei Hunden sein könnte.
Der zweite Teil der Arbeit befasst sich mit den molekulargenetischen Grundlagen der dilatativen
Kardiomyopathie bei Irischen Wolfshunden. DCM ist eine Erkrankung, deren Ausprägung vom
Zusammenspiel mehrerer Gene bestimmt wird. Ihre Vererbung bei Irischen Wolfshunden entspricht einem dominanten Hauptgen-Modell mit einem geschlechtsspezifischen Alleleffekt. In
der Studie wurden insgesamt acht bei Mensch und Maus beschriebene Kandidatengene, TAZ,
51
ACTC1, CSRP, DES, PLN, SCGD, TMOD1 und TCAP, untersucht und auf Kopplung und Assoziation zu DCM bei Irischen Wolfshunden getestet. Alle acht Kandidatengene konnten als für
DCM kausal bei Irischen Wolfshunden ausgeschlossen werden, da eine Kosegreagtion von Allelen mit dem DCM Status nicht nachweisbar war.
Im dritten Teil der Arbeit wurde das MDR1-Gen bei der Hunderasse Elo charakterisiert. MDR1
kodiert ein transmembranes Transportprotein, das P-Glykoprotein, das u. a. eine wichtige Rolle
im Stofftransport verschiedener Gewebe spielt. Ziel dieser Studie war, die Identifizierung bislang
unbekannter caniner MDR1-Genvarianten und ihr Einfluss auf die Expression. Dazu wurde die
cDNA von Elos sequenziert und vier Polymorphismen identifiziert, von denen einer, der
c.3439A>G Polymorphismus, zu einem Met1147Val Aminosäureaustausch führte. Die anschließende Expressionsstudie an Haarwurzelzellen zeigte, dass Genotyp und Geschlecht der Tiere die
relative Transkripthöhe von MDR1 beeinflussen. Bei G/G-Tieren konnte insgesamt eine niedrigere relative Transkriptmenge nachgewiesen werden als bei A/A-Tieren. Die Auswertung nach
Geschlecht und Genotyp ergab, dass der genotypspezifische Effekt nur durch die männlichen
Tiere verursacht wurde. Bei männlichen A/A-Tieren konnte die höchste relative MDR1-Transkripthöhe gemessen werden. Der Unterschied zur Transkripthöhe bei männlichen G/G-Tieren
war signifikant. Die bei weiblichen A/A-Tieren gemessene relative MDR1-Transkripthöhe war
im Vergleich zu männlichen Tieren des gleichen Genotyps verringert. Auch bei weiblichen A/ATieren war die relative MDR1-Transkriptmenge höher als bei weiblichen G/G-Tieren. Der genotypspezifische Unterschied war jedoch nicht signifikant. Ob und welche Auswirkungen diese Ergebnisse in-vivo auf den Transport MDR1-abhängiger Substrate haben, müssen weitere Studien
zeigen.
52
8
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Dubchak I, Dunn DM, Eddy SR, Elnitski L, Emes RD, Eswara P, Eyras E, Felsenfeld A,
Fewell GA, Flicek P, Foley K, Frankel WN, Fulton LA, Fulton RS, Furey TS, Gage D,
Gibbs RA, Glusman G, Gnerre S, Goldman N, Goodstadt L, Grafham D, Graves TA, Green
ED, Gregory S, Guigó R, Guyer M, Hardison RC, Haussler D, Hayashizaki Y, Hillier LW,
Hinrichs A, Hlavina W, Holzer T, Hsu F, Hua A, Hubbard T, Hunt A, Jackson I, Jaffe DB,
Johnson LS, Jones M, Jones TA, Joy A, Kamal M, Karlsson EK, Karolchik D, Kasprzyk A,
Kawai J, Keibler E, Kells C, Kent WJ, Kirby A, Kolbe DL, Korf I, Kucherlapati RS, Kulbokas EJ, Kulp D, Landers T, Leger JP, Leonard S, Letunic I, Levine R, Li J, Li M, Lloyd
C, Lucas S, Ma B, Maglott DR, Mardis ER, Matthews L, Mauceli E, Mayer JH, McCarthy
M, McCombie WR, McLaren S, McLay K, McPherson JD, Meldrim J, Meredith B, Mesirov JP, Miller W, Miner TL, Mongin E, Montgomery KT, Morgan M, Mott R, Mullikin JC,
Muzny DM, Nash WE, Nelson JO, Nhan MN, Nicol R, Ning Z, Nusbaum C, O'Connor MJ,
Okazaki Y, Oliver K, Overton-Larty E, Pachter L, Parra G, Pepin KH, Peterson J, Pevzner
P, Plumb R, Pohl CS, Poliakov A, Ponce TC, Ponting CP, Potter S, Quail M, Reymond A,
63
Roe BA, Roskin KM, Rubin EM, Rust AG, Santos R, Sapojnikov V, Schultz B, Schultz J,
Schwartz MS, Schwartz S, Scott C, Seaman S, Searle S, Sharpe T, Sheridan A, Shownkeen
R, Sims S, Singer JB, Slater G, Smit A, Smith DR, Spencer B, Stabenau A, StangeThomann N, Sugnet C, Suyama M, Tesler G, Thompson J, Torrents D, Trevaskis E, Tromp
J, Ucla C, Ureta-Vidal A, Vinson JP, Von Niederhausern AC, Wade CM, Wall M, Weber RJ,
Weiss RB, Wendl MC, West AP, Wetterstrand K, Wheeler R, Whelan S, Wierzbowski J,
Willey D, Williams S, Wilson RK, Winter E, Worley KC, Wyman D, Yang S, Yang SP,
Zdobnov EM, Zody MC, Lander ES. Initial sequencing and comparative analysis of the
mouse genome. Nature. 2002; 420: 520-562.
Westbroek W, Lambert J, Bahadoran P, Busca R, Herteleer MC, Smit N, Mommaas M, Ballotti
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human melanocytes, are tightly regulated by the tail domain. J Invest Dermatol. 2003; 120:
465-475.
Wiersma AC, Stabej P, Leegwater PA, Van Oost BA, Ollier WE, Dukes-McEwan J. Evaluation
of 15 Candidate Genes for Dilated Cardiomyopathy in the Newfoundland Dog. J Hered.
2008; 99: 73-80.
Wilson SM, Yip R, Swing DA, O´Sullivan TN, Zhang Y, Novak EK, Swank RT, Russell LB,
Copeland NG, Jenkins NA. A mutation in Rab27A causes the vesicle transport defects observed in ashen mice. Proc Natl Acad Sci. 2000; 57: 7933-7938.
Wu XS, Rao K, Zhang H, Wang F, Sellers JR, Matesic LE, Copeland NG, Jenkins NA, Hammer
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Wu X, Wang F, Rao K, Sellers JR, Hammer JA 3rd. Rab27a is an essential component of melanosome receptor for myosin Va. Mol Biol Cell. 2002b; 13: 1735-1749.
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Zhang L, Hu A, Yuan H, Cui L, Miao G, Yang X, Wang L, Liu J, Liu X, Wang S, Zhang Z, Liu
L, Zhao R, Shen Y. A missense mutation in the CHRM2 gene is associated with familial
dilated cardiomyopathy. Circ Res. 2008; 102: 1426-1432.
64
9
Danksagung
Herrn Prof. Dr. Ottmar Distl danke ich für die stetige Unterstützung, seine guten Ideen und Ratschläge zur Planung und Auswertung der Versuche sowie seine konstruktiven Anmerkungen bei
der Durchsicht der Arbeit.
Herrn Prof. Tosso Leeb danke ich dafür, dass er mir ermöglichte, nach meiner Kindererziehungszeit wieder in die wissenschaftliche Laufbahn zurückzukehren und ich in seiner Arbeitsgruppe
den Grundstock für den ersten Teil der hier vorliegenden Habilitationsschrift legen konnte. Außerdem danke ich ihm für die konstruktiven Diskussionen und freundschaftliche Zusammenarbeit.
Den Kooperationspartnern an der Stiftung Tierärztliche Hochschule Hannover – insbesondere
Frau Prof. Anne-Rose Günzel-Apel – danke ich für die stets gute und kollegiale Zusammenarbeit. Außerdem gilt mein Dank den niedergelassenen Tierärzten – insbesondere Frau Dr. Andrea
Vollmar – für deren vorbildliche Unterstützung.
Allen Mitarbeitern des Instituts für Tierzucht und Vererbungsforschung an der Stiftung Tierärztliche Hochschule Hannover – ob im Labor oder Stall, im Geschäftszimmer oder am Computer –
möchte ich ebenfalls für die gute Zusammenarbeit danken.
65
10
Darstellung des eigenen Anteils an den wissenschaftlichen Veröffentlichungen
Philipp U, Quignon P, Scott A, Rak S, Andre C, Breen M, Leeb T. Assignment of the canine
myosin Va gene (MYO5A) to chromosome 30q14 by fluorescence in situ hybridization and radiation hybrid mapping. Cytogenet Genome Res. 2003; 101: 92C.
Idee und Versuchsplanung:
Durchführung:
Auswertung:
Manuskript:
Philipp, Leeb
Philipp, Quignon, Scott, Rak
Philipp, André, Breen, Leeb, Quignon, Scott
Philipp, Leeb
Philipp U, Scott A, Quignon P, Andre C, Breen M, Leeb T. Assignment of the RAB27A gene to
canine chromosome 30q15.1 by fluorescence in situ hybridization and radiation hybrid mapping.
Cytogenet Genome Res. 2003; 101: 92E.
Idee und Versuchsplanung:
Durchführung:
Auswertung:
Manuskript:
Philipp, Leeb
Philipp, Quignon, Scott
Philipp, André, Breen, Leeb, Quignon, Scott
Philipp, Leeb
Philipp U, Quignon P, Scott A, Andre C, Breen M, Leeb T. Chromosomal assignment of the canine melanophilin gene (MLPH): A candidate gene for coat color dilution in Pinschers. J Hered.
2005; 96: 774-776.
Idee und Versuchsplanung:
Durchführung:
Auswertung:
Manuskript:
Philipp, Leeb
Philipp, Quignon, Scott
Philipp, André, Breen, Leeb, Quignon, Scott
Philipp, Leeb
Philipp U, Hamann H, Mecklenburg L, Nishino S, Mignot E, Günzel-Apel AR, Schmutz SM,
Leeb T. Polymorphisms within the canine MLPH gene are associated with dilute coat color in
dogs. BMC Genet. 2005; 6: 34.
Idee und Versuchsplanung:
Durchführung:
Auswertung:
Manuskript:
Externe kooperierende Autoren:
Philipp, Leeb, Mecklenburg
Philipp
Philipp, Hamann, Leeb
Philipp, Leeb
Günzel-Apel, Mignot, Nishino, Schmutz
66
Drögemüller C, Philipp U, Haase B, Günzel-Apel AR, Leeb T. A noncoding melanophilin gene
(MLPH) SNP at the splice donor of exon 1 represents a candidate causal mutation for coat color
dilution in dogs. J Hered. 2007; 98: 468-473.
Idee und Versuchsplanung:
Durchführung:
Auswertung:
Manuskript:
Kooperierende Autorin:
Philipp, Drögemöller, Leeb
Philipp, Drögemöller, Haase
Philipp, Drögemöller, Leeb
Drögemöller, Leeb
Günzel-Apel
Philipp U, Broschk C, Vollmar A, Distl O. Evaluation of tafazzin as candidate for dilated cardiomyopathy in Irish wolfhounds. J Hered. 2007; 98: 506-509.
Idee und Versuchsplanung:
Durchführung:
Auswertung:
Manuskript:
Philipp, Distl
Philipp
Philipp, Distl, Vollmar
Philipp, Distl
Philipp U, Vollmar A, Distl O. Evaluation of six candidate genes for dilated cardiomyopathy
(DCM) in Irish wolfhounds. Anim Genet. 2008; 39: 88-89.
Idee und Versuchsplanung:
Durchführung:
Auswertung:
Manuskript:
Philipp, Distl
Philipp
Philipp, Distl, Vollmar
Philipp, Distl
Philipp U, Vollmar A, Distl O. Evaluation of the Titin-cap Gene (TCAP) as candidate for dilated
cardiomyopathy in Irish wolfhounds. Animal Biotechnol. 2008; 19: 231-236.
Idee und Versuchsplanung:
Durchführung:
Auswertung:
Manuskript:
Philipp, Distl
Philipp
Philipp, Distl, Vollmar
Philipp, Distl
Philipp U, Fecht S, Wöhlke A, Distl O. A sex-dependent functional polymorphism in the canine
multidrug-resistance (MDR1) gene. submitted
Idee und Versuchsplanung:
Durchführung:
Auswertung:
Manuskript:
Philipp, Distl
Philipp, Fecht, Wöhlke
Philipp, Distl, Fecht
Philipp, Distl, Fecht
67
11
Anhang
Publikationen, die Bestandteil der Habilitationsschrift sind:
Cytogenet Genome Res. 2003; 101: 92C.
Assignment of the canine myosin Va gene (MYO5A) to chromosome 30q14
by fluorescence in situ hybridization and radiation hybrid mapping.
Philipp U, Quignon P, Scott A, Rak S, André C, Breen M, Leeb T.
Institute of Animal Breeding and Genetics, School of Veterinary Medicine Hannover, Hannover,
Germany.
No abstract available.
http://content.karger.com/produktedb/produkte.asp?typ=fulltext&file=CGR2003101001092C
68
Cytogenet Genome Res. 2003; 101: 92E.
Assignment of the RAB27A gene to canine chromosome 30q15.1 by
fluorescence in situ hybridization and radiation hybrid mapping.
Philipp U, Scott A, Quignon P, André C, Breen M, Leeb T.
Institute of Animal Breeding and Genetics, School of Veterinary Medicine Hannover, Hannover,
Germany.
No abstract available.
http://content.karger.com/produktedb/produkte.asp?typ=fulltext&file=CGR2003101001092E
69
J Hered. 2005; 96: 774 - 776.
Chromosomal assignment of the canine melanophilin gene (MLPH): a
candidate gene for coat color dilution in Pinschers.
Philipp U, Quignon P, Scott A, André C, Breen M, Leeb T.
Institute for Animal Breeding and Genetics, University of Veterinary Medicine Hannover, Bünteweg 17p, 30559 Hannover, Germany.
Pinschers affected by coat color dilution show a specific pigmentation phenotype. The dilute
pigmentation phenotype leads to a silver-blue appearance of the eumelanin-containing fur and a
pale sandy color of pheomelanin-containing fur. In Pinscher breeding, dilute black-and-tan dogs
are called "blue," and dilute red or brown animals are termed "fawn" or "Isabella fawn." Coat
color dilution in Pinschers is sometimes accompanied by hair loss and a recurrent infection of
the hair follicles. In human and mice, several well-characterized genes are responsible for similar
pigment variations. To investigate the genetic cause of the coat color dilution in Pinschers, we
isolated BAC clones containing the canine ortholog of the known murine color dilution gene
Mlph. RH mapping of the canine MLPH gene was performed using an STS marker derived from
BAC sequences. Additionally, one MLPH BAC clone was used as probe for FISH mapping, and
the canine MLPH gene was assigned to CFA25q24.
http://jhered.oxfordjournals.org/cgi/content/full/96/7/774
70
BMC Genet. 2005; 6: 34.
Polymorphisms within the canine MLPH gene are associated with dilute
coat color in dogs.
Philipp U, Hamann H, Mecklenburg L, Nishino S, Mignot E, Günzel-Apel AR, Schmutz SM,
Leeb T.
Institute of Animal Breeding and Genetics, University of Veterinary Medicine Hannover, Bünteweg 17p, 30559 Hannover, Germany.
BACKGROUND: Pinschers and other dogs with coat color dilution show a characteristic pigmentation phenotype. The fur colors are a lighter shade, e.g. silvery grey (blue) instead of black
and a sandy color (Isabella fawn) instead of red or brown. In some dogs the coat color dilution is
sometimes accompanied by hair loss and recurrent skin inflammation, the so called color dilution
alopecia (CDA) or black hair follicular dysplasia (BHFD). In humans and mice a comparable
pigmentation phenotype without any documented hair loss is caused by mutations within the melanophilin gene (MLPH). RESULTS: We sequenced the canine MLPH gene and performed a
mutation analysis of the MLPH exons in 6 Doberman Pinschers and 5 German Pinschers. A total
of 48 sequence variations was identified within and between the breeds. Three families of dogs
showed cosegregation for at least one polymorphism in an MLPH exon and the dilute phenotype.
No single polymorphism was identified in the coding sequences or at splice sites that is likely to
be causative for the dilute phenotype of all dogs examined. In 18 German Pinschers a mutation
in exon 7 (R199H) was consistently associated with the dilute phenotype. However, as this mutation was present in homozygous state in four dogs of other breeds with wildtype pigmentation, it
seems unlikely that this mutation is truly causative for coat color dilution. In Doberman Pinschers as well as in Large Munsterlanders with BHFD, a set of single nucleotide polymorphisms
(SNPs) around exon 2 was identified that show a highly significant association to the dilute phenotype. CONCLUSION: This study provides evidence that coat color dilution is caused by one
or more mutations within or near the MLPH gene in several dog breeds. The data on polymorphisms that are strongly associated with the dilute phenotype will allow the genetic testing of
Pinschers to facilitate the breeding of dogs with defined coat colors and to select against Large
Munsterlanders carrying BHFD.
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC1183202/?tool=pubmed
71
J Hered. 2007; 98: 468 - 473.
A noncoding melanophilin gene (MLPH) SNP at the splice donor of exon 1
represents a candidate causal mutation for coat color dilution in dogs.
Drögemöller C, Philipp U, Haase B, Günzel-Apel AR, Leeb T.
Institute of Genetics, Vetsuisse Faculty, University of Berne, Bremgartenstrasse 109a, 3001 Berne, Switzerland. Coat color dilution in several breeds of dog is characterized by a specific pigmentation phenotype and sometimes accompanied by hair loss and recurrent skin inflammation,
the so-called color dilution alopecia or black hair follicular dysplasia. Coat color dilution (d) is
inherited as a Mendelian autosomal recessive trait. In a previous study, MLPH polymorphisms
showed perfect cosegregation with the dilute phenotype within breeds. However, different dilute
haplotypes were found in different breeds, and no single polymorphism was identified in the coding sequence that was likely to be causative for the dilute phenotype. We resequenced the 5'-region of the canine MLPH gene and identified a strong candidate single nucleotide polymorphism
within the nontranslated exon 1, which showed perfect association to the dilute phenotype in 65
dilute dogs from 7 different breeds. The A/G polymorphism is located at the last nucleotide of
exon 1 and the mutant A-allele is predicted to reduce splicing efficiency 8-fold. An MLPH
mRNA expression study using quantitative reverse transcriptase-polymerase chain reaction confirmed that dd animals had only about approximately 25% of the MLPH transcript compared
with DD animals. These results provide preliminary evidence that the reported regulatory MLPH
mutation might represent a causal mutation for coat color dilution in dogs.
http://jhered.oxfordjournals.org/cgi/content/full/98/5/468
72
J Hered. 2007; 98: 506 - 509.
Evaluation of tafazzin as candidate for dilated cardiomyopathy in Irish
wolfhounds.
Philipp U, Broschk C, Vollmar A, Distl O.
Institute for Animal Breeding and Genetics, University of Veterinary Medicine Hannover, Bünteweg 17p, 30559
Hannover, Germany.
Dilated cardiomyopathy (DCM) is a common disease in humans and dogs. Large-breed dogs and
especially Irish wolfhounds belong to the frequently affected breeds. Male Irish wolfhounds
show a significantly higher prevalence of DCM than females. Therefore, we evaluated X chromosome markers for linkage with DCM as well as a human candidate gene on the X chromosome. A set of X chromosomal microsatellites was genotyped in Irish wolfhound families segregating for DCM. In addition, exon and intron sequences of the tafazzin (TAZ) gene were assayed
for polymorphisms segregating in these families. Statistical analysis of the microsatellite markers
did not reveal linkage to DCM. Furthermore, all Irish wolfhounds included in this study were
monomorphic for TAZ, and only 8 sequence differences to the Dog Genome Assembly 2.1 could
be found. The results indicate that due to the lack of mutations, TAZ is unlikely to cause DCM in
Irish wolfhounds.
http://jhered.oxfordjournals.org/cgi/content/full/98/5/506
73
Anim Genet. 2008; 39: 88 - 89.
Evaluation of six candidate genes for dilated cardiomyopathy in Irish
wolfhounds.
Philipp U, Vollmar A, Distl O.
Institute for Animal Breeding and Genetics, University of Veterinary Medicine Hannover, Bünteweg 17p, 30559
Hannover, Germany.
No abstract available.
http://www3.interscience.wiley.com/journal/119401064/abstract
74
Anim Biotechnol. 2008; 19: 231 - 236.
Evaluation of the titin-cap gene (TCAP) as candidate for dilated
cardiomyopathy in Irish wolfhounds.
Philipp U, Vollmar A, Distl O.
Institute for Animal Breeding and Genetics, University of Veterinary Medicine Hannover,
Hannover, Germany.
Dilated cardiomyopathy (DCM) is a myocardial disorder characterized by left ventricular dilatation and impaired systolic contraction. Irish wolfhounds (IW) and other large breed dogs are
most commonly disposed to DCM. We analyzed the titin-cap (TCAP, telethonin) gene as candidate for DCM. Genomic DNA was analyzed in eight DCM affected and five DCM-free IWs.
cDNA was sequenced in one DCM-affected IW and two unaffected dogs, one Tibetan terrier and
one Dachshund. Compared to the Boxer reference sequence, one sequence difference was identified in the 3'UTR and two in the intron sequence. In the IWs the sequences were monomorphic.
In order to rule out a breed-specific haplotype that predisposes to DCM, the polymorphisms were genotyped in 24 Elo dogs, a breed mix established from nine different breeds. The analysis
showed that the mutations were not restricted to IW. Moreover, 80% of the Elos were homozygous for the IW haplotype. We conclude that TCAP can most likely be eliminated as cause for
DCM in IWs.
http://www.informaworld.com/smpp/content~db=all?content=10.1080/10495390802281952
75
BIOLOGICAL SCIENCE
Genetics
A sex-dependent functional polymorphism in the canine multidrug resistance (MDR1) gene
Ute Philipp*, Silvia Fecht*, Anne Wöhlke, Ottmar Distl
*authors contributed equally to the work
Institute for Animal Breeding and Genetics, University of Veterinary Medicine Hannover, Bünteweg 17p, 30559 Hannover, Germany (Philipp, Fecht, Wöhlke and Distl)
Corresponding author:
Ute Philipp
University of Veterinary Medicine Hannover
Bünteweg 17p
30559 Hannover
Germany
Phone +49 511-953-8866
Fax
+49 511-953-8582
E-mail: [email protected]
76
Abstract
MDR1 encodes P-glycoprotein which plays a significant role in the xenobiotic transport process.
In several dog breeds, the mdr1-1Δ mutation was associated with multiple drug sensitivity, but
no further sequence variations in the canine MDR1 gene have been described. To analyse
whether functional polymorphisms exist in exon 12, 21 and 26 of the canine MDR1 gene
analogically to findings in the orthologous human gene, sequence analysis was performed. We
detected a non-synonymous c.3439A>G transition in exon 26 which causes a Met1147Val substitution. Subsequently, we analysed 186 Elo dogs and 65 dogs of different breeds for the c.3439A
>G polymorphism. The presence of the G-allele in the analysed Elos with a frequency of 56.45%
was mainly influenced by the founder breed Samoyed. Furthermore, the mutant allele was found
in six of 15 analysed breeds.
cDNA analysis performed in four Elos previously genotyped for the c.3439A>G SNP revealed
two further synonymous SNPs c.504C>T and c.1663C>T in the coding region and a c.*230G>A
in the 3`UTR. SNP frequencies and haplotypes for all identified mutations were determined in
186 Elos on genomic DNA.
Using quantitative RT-PCR, the relative expression levels of MDR1 in hair root samples depending on the M1147V genotype were compared. We found genotype and gender specific expression
differences. Homozygous male A/A dogs showed higher relative MDR1 expression levels than
female Elos and male G/G animals. These in-vitro observations might reflect transcriptional differences in dogs and might have impact on the metabolizing of drugs using the MDR1 transporter system in-vivo.
77
The superfamily of ABC (ATP-binding cassette) transporters have been of particular interest for
research work in humans and animals, i.e. mice and dogs, for several years now. The MDR1 gene
(multidrug resistance gene, also known as ABCB1 gene, ATP-binding cassette sub-family B
member 1) and its gene product P-glycoprotein are the most thoroughly analysed among the
ABC transporters (1).
The physiological role of P-glycoprotein is the protection of the organism from toxic xenobiotics. P-glycoprotein is normally expressed in various mammalian tissues including brain capillary
endothelial cells (2), the apical border of intestinal epithelial cells (3), biliary canalicular cells
(4), renal proximal tubular epithelial cells (5), placenta (6), and testes (7). P-glycoprotein confers
protection by limiting the uptake of compounds from the gastrointestinal tract and by contributing to their excretion via the liver, kidneys, and intestine. Moreover, P-glycoprotein in the bloodbrain-barrier and other blood-tissue barriers protects sensitive organs from exposure to toxic
compounds that may have entered the bloodstream (8). P-glycoprotein actively extrudes selected
xenobiotics from within the cell back into the lumen of brain capillary, intestine, bile canaliculus,
or renal tubule.
More than 50 structurally different therapeutic drugs are known substrates for human and murine
P-glycoprotein. Because of the high degree of homology of P-glycoprotein between species, the
same drugs are expected to be substrates of the canine P-glycoprotein (9). Degree of expression
and the functionality of the MDR1 gene product can directly affect the therapeutic effectiveness
of such agents because they play an important role for the physiological cell protection during
drug therapy (10).
The canine MDR1 gene attracted interest for research work after several descriptions of ivermectin neurotoxicity in Collies and the observation that affected dogs had elevated concentrations of
ivermectin in the central nervous system indicating that ivermectin neurotoxicity was caused by
a defect in the blood-brain barrier (11, 12 and 13).
The canine MDR1 gene is located on CFA (Canis familiaris autosome) 14 and composed of 28
exons. The human MDR1 (ABCB1) gene is located on HSA (Homo sapiens autosome) 7. The
product of the human MDR1 gene is among all species documented in data banks the most similar to that of the canine gene. Human and dog P-glycoprotein display 91 % overall homology,
with non-consensus residues being located outside the functional segments and are composed
each of 12 transmembrane domains and two nucleotide binding domains (14). A 4-bp deletion
mutation in the fourth exon of the MDR1 gene was found to be the cause of ivermectin sensitiv-
78
ity in dogs (14, 15 and 16). This mdr1-1Δ mutation causes a frame-shift accompanied by multiple premature stop codons resulting in a severely truncated P-glycoprotein composed of < 10%
of the wild-type amino acid sequence. The remainder of the protein lost its protecting function,
e.g. in the blood-brain-barrier. Neurotoxic side effects are provoked in dogs with the mdr1-1Δ
mutation in the case of drug therapy with P-glycoprotein substrates because of accumulation of
these substrates in brain tissue. Although both research groups screened the whole cDNA of the
canine MDR1 gene, there was no evidence on further sequence variations in this gene in the analysed Collies.
In humans, many studies were concerned with sequence variations in the MDR1 gene. DNA sequence variations cause phenotypic changes by multiple mechanisms, e.g. by changing the encoded protein sequence, or by affecting gene regulation, mRNA processing, and translation (17).
Many of the detected polymorphisms in humans do not show effects on expression or function of
MDR1 but some implicate modified protein levels or functionality, e.g. the SNP in exon 26
(c.3435C>T) (10). This research group performed the first systematic screening of the MDR1
gene for the presence of polymorphisms by sequencing all 28 exons including the core promoter
region and flanking intron-exon boundaries. Of the 15 identified SNPs, the research group identified two SNPs at wobble positions with no amino acid changes [exon 12 (c.1236C>T) and exon
26 (c.3435C>T)] and found an association of the SNP c.3435C>T with a modified level of intestinal MDR1-expression. Although results are not always consistent, most studies suggest that the
c.3435C>T transition is associated with decreased MDR1 function and reduced mRNA and/or
protein expression in some tissues (1). The two synonymous SNPs [exon 12 (c.1236C>T) and
exon 26 (c.3435C>T)] are in linkage disequlibrium (17) with a nonsynonymous SNP in exon 21
(c.2677G>T/A) which causes an amino acid change (899Ala>Ser/Thr). Furthermore, they stated
that c.3435C>T is a functional SNP that decreases mRNA stability, thereby decreasing MDR1
mRNA and/or protein levels, by analysis of allele-specific expression in liver autopsy samples
and in vitro expression experiments.
It is not yet known whether polymorphisms in the canine MDR1 gene exist like in the human
gene. In addition to the known deletion mutation in the fourth exon, further sequence variations
in the canine MDR1 gene might also be found which modify the structure or expression levels of
the MDR1 mRNA and/or protein and thereby change the function of P-glycoprotein. Therefore,
the purpose of this study was to search for functional polymorphisms by sequencing the canine
MDR1 gene.
79
Results
Genotyping of c.3439 polymorphism. Sequence analysis of the exons 12, 21, 26 was performed
in two Collies and six Elos. The analysed DNA sequences of the exons 12 and 21 perfectly
matched with the reference sequence of the canine MDR1 gene (GenBank accession no.
NC_006596.2). We found an A to G transition in exon 26 (c.3439A>G) in the DNA sequences of
four from six Elos. Three Elos were homozygous G/G, one Elo was heterozygous A/G and two
Elos as well as the two Collies were homozygous A/A. The reference boxer sequence (dog genome assembly 2.1) showed an A at this position and was therefore defined as wild-type.
Thereupon, an analysis of the c.3439A>G SNP in exon 26 was performed in 186 Elos and 65
dogs of different breeds using the RFLP developed. In Elos, the wild-type A-allele was found
with a frequency of 43.55%, whereas the G-allele was prevalent with a frequency of 56.45%.
Altogether, 144 from 186 Elos (77.4%) were heterozygous or homozygous for the G-allele (Table 1). In most of the analysed breeds the mutated allele could not be detected. In addition to the
Elo breed, the G-allele was detected in Labrador Retrievers, Do-Khyis, Dalmatians, German
Wirehaired Pointers, Hovawarts and Border Collies (Table 2). The G-allele could not be detected in Collies, German Shepherds, Dachshunds, Tibetan Terriers, English Cocker Spaniels,
Irish Wolfhounds, Jack Russell Terriers, Boxers and Kromfohrlanders.
The subsequent regression analysis evaluated the influence of the gene contributions by the different founder breeds on the presence of the allele A or the allele G. After the exclusion of seven
from nine founder breeds due to very low and insignificant contributions to the variance explained, the final model included the gene contributions by Samoyed and Dalmatian and was
significant with a p-value of 0.0036. Table 3 shows the regression coefficients and error probabilities for the influence of gene contributions by Samoyed and Dalmatian on the presence of
the alleles A and G in a random sample of 88 analysed Elo dogs. The regression coefficient for
the gene contribution by Samoyed was at +0.0201 which indicated a major influence of the
founder breed Samoyed for the G-allele. So, an increase by one percent of the gene contribution
by Samoyed raises the frequency of the G-allele by 2.01%. The regression coefficient for the
gene contribution by Dalmatian was at -0.0519 which indicated a major influence of the founder
breed Dalmatian for the A-allele. Consequently, the frequency of the A-allele rises by 5.19% if
the gene contribution by Dalmatian increases by one percent.
80
Effect of c.3439 polymorphism on protein sequence. The non-synonymous A to G exchange in
exon 26 of the canine MDR1 gene causes an amino acid substitution from methionine to valine at
position 1147 in the amino acid sequence (GenBank accession no. NP_001003215.1). For the
analysis of possible impact of the modified amino acid sequence on P-glycoprotein, PolyPhen
prediction and protein alignment for five selected species using ClustalW were performed. PolyPhen analysis resulted in the prediction that this variant is benign with a PSIC (Position-Specific
Independent Counts) score difference of 0.322. The protein alignment showed that only the dog
displayed methionine at position 1147 in the amino acid sequence whereas in human, mouse and
rat the amino acid valine was given at the corresponding position in the reference sequence (Figure 2).
Polymorphisms in canine MDR1 trancript. To evaluate whether further sequence variations of
the MDR1 transcript exist in the Elo breed, MDR1 cDNA of four Elo liver samples was sequenced. The sequence data were compared to the Collie mRNA (NM_001003215.1) and the
deduced mRNA from the genomic Boxer reference sequence (NC_006596.2).
Between the Elo dogs, three other SNPs (c.504C>T coding for Asp168 and c.1663C>T coding
for Leu554 and the noncoding c.*230G>A, respectively) could be detected. The SNPs are localized in exons 6, 14 and 28. The c.504T and c.1663T alleles were not found in the Collie or Boxer
reference sequence. Concerning the c.*230G>A polymorphism, the Boxer carries the A-allele
while the Collie sequence exhibits the G-allele. The overall comparison to the deduced Boxer
mRNA sequence revealed four polymorphisms (Table 4). Beside the c.3439A>G SNP, the sequence differences between Elo and Boxer mRNA are synonymous or in the 3´UTR. Compared
to the Collie mRNA sequence, 13 sequence differences including the c.3439 SNP were identified
in the Elo mRNA leading to seven amino acid exchanges and insertion of asparagine (p.Lys24_
Glu25insAsn), respectively. The other sequence differences between Elo and Collie mRNA were
synonymous or in the 3`UTR (Table 4).
The three newly identified SNPs were genotyped in 186 Elos (Table 1). The genomic Boxer sequence (NC_006596.2) was set as wildtype sequence. For all SNPs, the Boxer alleles were more
often observed. For polymorphisms c.504 and c.1663, the wildtype C alleles represented a frequency of 63.17 and 84.02 percent, respectively. And the c.*230 G-allele was even prevalent
with a frequency of 91.94 percent. Linkage disequilibrium was observed between the loci c.504,
c.3934 and c.*230 (Figure 3). For all four polymorphisms, haplotypes and their frequencies
81
were calculated. From 16 possible haplotypes, 15 were observed. Only nine showed a frequency
over 0.01 percent (Table 5).
Expression of MDR1 using qRT PCR. To test whether the polymorphisms might influence the
MDR1 expression hair root samples from 43 previously genotyped Elo dogs were taken and analysed by qRT-PCR. The analysis showed, that only the c.3439A>G SNP affected the transcript
level. The dogs carrying the A allele homozygous were considered as wild type, therefore the
mean of the ΔCT of the AA dogs was used as calibrator. The relative expression levels of MDR1
in the analysed Elos by individual and genotype showed that A/A dogs have higher relative expression levels than G/G and A/G dogs (Figure 3). Comparison of LS-means revealed a significant difference between the relative expression levels of all Elos with the A/A-genotype and the
G/G-genotype. The expression level of the heterozygous animals showed an intermediate value
(Table 6). A model which included the sex genotype interaction revealed that the expression level
differences were mainly caused by the males while only slight differences were observed in females (Table 7). Nonetheless, high individual differences of the expression levels of MDR1 in
hair roots could be measured.
Discussion
A sample of 186 dogs of the Elo breed was analysed for a newly detected non-synonymous single nucleotide polymorphism in exon 26 (c.3439A>G) of the canine MDR1 gene. The mutated
G-allele was prevalent in the Elo breed with a frequency of 56.45 % which is remarkable because the A-allele is given in the reference sequence of the canine MDR1 gene. The regression
analysis evaluated the influence of the gene contributions by the different founder breeds of the
Elo on the presence of the A-allele or the G-allele in a random sample of 88 Elo dogs out of the
186 genotyped animals. The analysis resulted in the conclusion that the presence of the G-allele
was mainly influenced by the founder breed Samoyed, whereas the presence of the A-allele in
the analysed Elos was largely influenced by the Dalmatian founder dogs. Nevertheless, in the
RFLP-PCR the G-allele was also found in the analysed Dalmatians, so this breed was also
proved to carry both types of alleles. In addition, the G-allele was detected in the breeds Labrador Retriever, Do-Khyi, German Wirehaired Pointer, Hovawart and Border Collie. Due to the
small number of dogs genotyped, the prevalence of the mutant allele in other dog breeds remains
unknown.
82
Sequence analysis of the Elo MDR1 gene of four dogs which were genotyped for the c3439A>G
SNP showed several sequence differences in and between breeds. The sequences were compared
to the Collie reference mRNA and to genomic Boxer reference sequence. While the deduced protein sequence between Boxer and Elo were identical except the Met1147Val polymorphism,
seven amino acid exchanges were observed between the Elo and Collie protein and Boxer and
Collie protein sequence, respectively. In human MDR1 mRNA, 61 SNPs are listed in dbSNP,
from which are 39 missense mutations. In the orthologue mouse transcript 50 SNPs are reported,
but only six non synonymous polymorphisms are described. These data implicates that the
MDR1 Gene varies considerably within species and many functional isoforms may exist. The
impact of the different isoforms on drug metabolizing has not been fully investigated as most
studies have been focused on the c.3435C>T SNP in human, respectively.
Compairing the canine MDR1 amino acid sequence to four other mammal p-glycoprotein sequences showed that the inserted Asn in the Boxer and Elo protein at position 25 is unique. Otherwise, the Elo and Boxer protein sequence seem to represent the more conserved isoform between the species. For the surveyed amino acids, the 1147Val-Elo sequence matches best to the
human orthologue (Table 8). Concerning the other amino acid positions, even if there were
polymorphic sites between the other species, the Collie amino acid could not be observed. Nonetheless, all canine protein isoforms lead to functional receptor proteins which only differ slightly
in molecular weight and amino acid composition (SI Table 4). The calculated isoelectric point
shows no variation between the three canine MDR1 isoforms.
The c.3439A>G SNP in exon 26 causes an amino acid substitution in the MDR1 protein. Comparison to a structural protein model of human p-glycoprotein indicates that the amino acid 1147
is part of an intracytoplasmic functional not conserved protein region (18). Protein alignment
with four species and the PolyPhen prediction gave no further evidence that the substitution from
methionine to valine has effects on structure or function of the protein. Valine is also found at the
corresponding position in the reference amino acid sequence of other mammalian species like
human, mouse or rat. Thus, valine in dogs may not have great impact on the functionality of Pglycoprotein since it is usually found at this position for functional proteins in other species. This
location does not seem to be highly conserved because in the PolyPhen alignment output there
are several amino acids listed for this position including valine, methionine, isoleucine and glutamic acid. It has to be assumed that a substitution from a nonpolar amino acid to another nonpolar amino acid does not have great impact on the structure of a protein. Nevertheless, modifica-
83
tions in amount or character of bonds in the case of an amino acid substitution can alter the stability of the protein structure.
Moreover, the c.3439A>G SNP in exon 26 of the canine MDR1 gene is closely neighboured to
the c.3435C>T SNP in the orthologous sequence of the human MDR1 gene. It is possible that the
c.3439A>G transition has effects on mRNA and/or protein as it is the case for the c.3435C>T
SNP in the human MDR1 gene. The c.3435C>T polymorphism is a synonymous substitution, so
the amino acid sequence is not affected and there are no obvious structure modifications. Anyhow, association of c.3435C>T with decreased MDR1 function and reduced mRNA or protein
expression in some tissues was described (1). It was discussed that modification in MDR1
mRNA expression resulted from changing of mRNA stability (19).
Canine MDR1 expression was quantified in hair root cells. These samples are available without
using invasive techniques. Prior to the assay, MDR1 expression could be detected in a measurable quantity in hair root cells but showed a reduced abundance compared to the expression level
in liver (data not shown). This is in concordance with a previous study (20) which demonstrated
that MDR1 transcripts were in several human tissues, quantification showed that MDR1 was in
liver more abundant than in skin.
In Elo dogs the individual MDR1 expression levels vary considerable in hair root cells. Such individual variations were already observed in duodenal enterocytes of male Japanese in dependence of their c.3435C>T genotype (21). There might be several causes which contribute to the
individual expression levels of the MDR1. In dogs, the estrogen concentration seems to influence
the transcript level as gestating dogs showed increased expression levels. One female in the
fourth week of gestation showed a 300-fold expression level, in a second dog known to be in an
earlier gestation an eighteenfold increase of the expression level was observed. That would be in
accordance with the observation that the expression of human MDR1 and its rodent orthologues
is controlled by estrogens and progesterone in uteroplacental tissues (22, 23 and 24) and MDR1
mRNA were inducible by several female sex steroids in vitro (25). Contrary to this, no effect of
estrogene or progesterone was found on mdr1 expression in rat liver (26). And, in lung parenchyma individual expression variations of rat mdr1 was observed but no effect of pregnancy
(27). Therefore, the regulation of MDR1 might differ between the species and / or tissues.
The synonymous polymorphisms between the Elo dogs do not influence the protein sequence but
might have impact on RNA structure and thus influence RNA stability. But statistical analysis
did not show an effect of one of these SNPs on MDR1 expression. Therefore, we conclude that
84
these polymorphisms and the resulting haplotypes did not contribute to the high variation of
MDR1 expression in Elos.
The expression analysis in hair root cell samples revealed differences between the expression
levels of MDR1 dependent on the genotype. The MDR1 expression is decreased significantly in
the G/G genotype dogs. The heterozygous A/G carriers also showed a reduced expression compared to the A/A genotype animals. Considering the sex genotype interaction the statistical
model revealed that only males contributed to the genotype dependent MDR1 expression levels
(Table 7). The female A/A dogs showed overall a reduced MDR1 transcription level compared to
the male A/A and the transcription level of females was less influenced by the c.3439 polymorphism. Only a marginal reduced MDR1 transcription level could be observed in A/G females and
G/G females showed a non significant reduction of MDR1 expression. A gender dependent expression was also reported for members of the cytochromes P450 superfamily in rats (28). Cytochromes P450 are part of the catalytic metabolism of various endo- and xenobiotics. Moreover,
gender specific effects of DNA polymorphism which are not located in obvious sex specific
genes have already been observed. In human cardiac troponin T, a mutation was reported that
resulted in a more severe dilated cardiomyopathy phenotype in male than in women (29). And in
young women, SNPs in the SCARB1 gene were significantly associated with higher HDL cholesterol levels but not in men (30). Causes of these gender dependent differences have still to be
elucidated. One possibility might be that such gender dependent SNPs are in linkage disequilibrium with functional variants of sexual hormone responding elements. For human instestinal
MDR1, regulation by the steroid and xenobiotic receptors PRX and CAR was demonstrated (31,
32). The two receptors share some of their ligands which might exert opposing effects on both
(33). In addition, the receptors seem to compete their nuclear response elements (32). Further
nuclear receptors might exist which could differentially regulate MDR1. Therefore, regulation of
canine MDR1 expression might depend on the amounts of various receptor proteins and modulation of their activities by ligands. In this context, the gender dependent expression levels might
be explained by a reduced base induction of MDR1 expression in female Elo dogs. The observed
effect of the canine c.3439 polymorphism on male might be caused by a mutation in a male specific regulatory DNA element which is in linkage disequilibrium with c.3439 G allele. Nonetheless, the molecular basis for these gender dependent effects remains to be investigated.
Summarized, our analyses showed that the canine MDR1 gene sequence varies in and between
dog breeds. The observed transcript isoforms also lead to protein isoforms. In Elo dogs, four
85
DNA polymorphisms were identified one leading to a Met1147Val amino acid polymorphism.
qPCR assays indicate that the c.3439A>G mutation but not the other observed polymorphisms
has some impact on the male canine expression level of MDR1, in-vitro. In-vivo, the relevance
for substrate metabolizing of the c.3439A>G polymorphism remains to be elucidated.
Materials and Methods
Animals. Blood samples of 186 clinically healthy, client-owned Elo dogs were used for this
analysis. For all Elos, the existence of the mutant mdr1-1Δ allele was excluded in a previous
study (34). Additionally, blood samples of eleven Collies, two Border Collies, four German
Shepherds, four Do-Khyis, four German Wirehaired Pointers, four Dachshunds, four Labrador
Retrievers, four Tibetan Terriers, four English Cocker Spaniels, four Irish Wolfhounds, four
Dalmatians, four Jack Russell Terriers, four Boxers, four Hovawarts and four Kromfohrlanders
were available for genotyping of exon 26. Genomic DNA was extracted from EDTA
(ethylenediaminetetraacetic)-anticoagulated blood using the NucleoSpin Kit 96 Blood Quick
Pure Kit (Macherey-Nagel, Düren, Germany). For the transcript analysis of MDR1, four liver
biopsies of previously genotyped Elo dogs were available. Two Elos were homozygous for the
G-allele and the other two dogs showed homozygously the A-allele. In addition, MDR1 expression was analysed in hair root samples from 42 previously genotyped Elo dogs. For the A-allele,
16 Elos were homozygous and ten for the G-allele. The other 17 dogs represented the heterozygous A/G-genotype.
Genomic sequence analysis. We chose the canine exonic sequences according to the dog genome assembly 2.1 which corresponded to the orthologous human exons of MDR1 including the
SNPs c.1236C>T, c.2677G>T/A and c.3435C>T to search for polymorphisms in dogs by sequencing genomic DNA of two Collies and six Elos. The human sequences which included the
three linked SNPs [c.1236C>T, c.2677G>T/A and c.3435C>T] matched with the sequences of
the exons 12, 21 and 26 of the canine MDR1 gene. Three primer pairs encompassing the exons
12, 21 and 26 including the flanking introns were designed (SI Table 1) The PCR reactions were
performed in a total volume of 30 µl using 2 µl (~ 20 ng/µl) genomic DNA, and 1u Taq Polymerase (Qbiogene, Heidelberg, Germany). The reactions were performed with 5 min initial
denaturation at 95°C, followed by 36 cycles at 95 °C for 30 sec, annealing temperature (Ta) at
60°C for 1 min, and extension at 72 °C for 45 sec. The cleaned PCR products were directly se-
86
quenced with the DYEnamic ET Terminator Cycle Sequencing kit (GE Healthcare) on a MegaBACE 1000 capillary sequencer (GE Healthcare). Sequence data was analyzed using the Sequencher 4.7 program (GeneCodes, Ann Arbor, MI).
Genotyping. For the SNP in exon 26, a PCR-RFLP was developed as the mutation modifies the
recognition site of the restriction enzyme Bsg I (GTGCAG(N)16). The restriction enzyme Bsg I
cut the PCR product if a G exists at the substitution position. Digestion of the PCR product with
The Bsg I restricted PCR products were size-fractionation by gel electrophoresis to distinguish
the alleles. Genotyping in 186 Elos and 65 dogs of different breeds was performed digesting
10 µl of the PCR product with Bsg I (New England Biolabs, Frankfurt/Main, Germany) and subsequently separated on a 2% agarose gel so that a 372-bp fragment for the A/A genotype, 258-bp
and 116-bp fragments for the G/G genotype, and 372-bp, 258-bp and 116-bp fragments for the
G/A genotype were observed (SI Figure 1).
Primer and probes for the three other MDR1 SNPs (c.504C>T c.1663C>T and c*230G>A) were
designed using Custom Taqman SNP genotyping assay service (SI Table 3). MGB probes were
dye-labelled with FAM and VIC, respectively. Genotyping was performed in 12.5 µl containing
6.25µl SensiMix DNA Kit (Quantance Ltd, London, Great Britain), 0.3125 µl 40xAssay (ABI)
and 1.5 µl genomic DNA on ABI 7300 instrument. Reaction conditions for a two step PCR were
set using ABI instructions.
cDNA and UTR sequence analysis. cDNA analysis of the canine MDR1 transcript was performed on RNA from four Elo dogs genotyped for the c3439A>G SNP. Two dogs were homozygous for the A-allele and two for the G-allele, respectively. RNA was isolated from liver biopsies
directly with the RNeasy 96 Universal Tissuekit (Qiagen, Hilden, Germany) according to the
manufacturer’s instructions. The reverse transcription into cDNA was performed by using 200 U
SuperScript III Reverse Transcriptase (Invitrogen, Karlsruhe, Germany), an oligo-dT primer, and
10 µl of the isolated RNA in a 20-µl reaction. The MDR1 transcript was assembled from eight
overlapping PCR amplicons (primers, their position and annealing temperature are in SI Table
2). The MDR1 transcript was generated from c.-45 to c.*373, spanning all predicted 28 exons
and the open reading frame (ORF) of the canine MDR1 gene. The missing UTR sequences were
analysed on amplicons of genomic DNA.
87
qRT PCR Analysis of MDR1 expression. For the analysis of MDR1 expression in Elo dogs,
RNA of 42 hair root samples was isolated and transcribed as described before. A single PCR assay was used for quantification of the MDR1 gene transcript (GenBank NM_001003215) using a
forward primer situated in exon 12 (5’-GAC CGT GCA GCT GAT GCA-3’) and a reverse primer in exon 13 (5’-GGT CCT AAT GTC CTG TCC ATC AA-3’) amplifying an 79-bp product
with a VIC-labelled TaqMan minor groove binding (MGB) probe (Applied Biosystems, Darmstadt, Germany) located at the boundary of exon 12 and 13 (5’-ACA GAT GGC ATG GTC T-3’).
Canine GAPDH transcript was determined as endogenous control using a forward primer situated in exon 4 (5’-GGC ACA GTC AAG GCT GAG AAC-3’) and a reverse primer in exon 5 (5’CCA GCA TCA CCC CAT TTG AT-3’) amplifying a 101-bp product in combination with a
FAM-labelled TaqMan MGB probe (Applied Biosystems) spanning the boundary of exon 4 and
5 (5’-TCC AGG AGC GAG ATC-3’) according to the canine reference mRNA sequence (GenBank NM_001003142). The quantitative reverse transcriptase (qRT)-PCR was carried out with
an ABI 7300 sequence detection system (Applied Biosystems) in a 20-µl reaction containing
SensiMix DNA Kit (Quantance Ltd, London, Great Britain), 10 µM forward primer, 10 µM reverse primer, and 10 µM TaqMan probe using an annealing and elongation temperature of 58 °C.
The MDR1 transcript specific expression was normalised by the canine GAPDH expression level
(ΔCT), and the relative expression level was calculated by the 2-ΔΔCT method using the average
ΔCT of the homozygous AA samples as calibrator (35). All assays were performed in duplicates.
Three female samples were excluded from the expression study showing more than fifteen fold
relative MDR1 expression levels. The dog owners confirmed that two of them were gestating.
The elevated expression level in the other female could not be explained by gestating or drug
treatment.
Protein Sequence Alignments. PolyPhen (http://genetics.bwh.harvard.edu/pph/) was used for
the prediction of possible impact of the amino acid substitution on the structure and function of
the protein via analysis of multiple sequence alignments and protein 3D-structures.
The amino acid sequence of the canine MDR1 product (GenBank accession no
NP_001003215.1) obtained from the NCBI database (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/sites/ entrez)
with the variants methionine and valine at position 1147 was supplied to PolyPhen for analysis.
Additionally to PolyPhen prediction, we compared the amino acid sequences of dog (GenBank
accession no. NP_001003215.1), human (GenBank accession no. NP_000918.2), mouse (GenBank accession no NP_035205.1), rat (GenBank accession no. NP_036755.2) and sheep (Gen-
88
Bank accession no. NP_001009790.1) using the ClustalW (1.83) multiple sequence alignment
from the EMBL toolbox (http://www.ebi.ac.uk/clustalw/index.html) (Figure 2).
Statistical Analyses. For evaluation of the four polymorphisms c.504C>T, c,1663C>T,
c.3439A>G and c*.230A>G genotype frequencies, allele frequencies, their confidence intervals,
deviations from Hardy-Weinberg equilibrium and linkage disequilibrium among loci were assessed using the ALLELE procedure of SAS/Genetics, version 9.2 (Statistical Analysis System,
SAS Institute, Cary, NC, USA). Haplotypes frequencies of the four SNPs were obtained using
the HAPLOTYPE procedure of SAS/Genetics. Linkage disequilibrium and haplotype block
analysis of the SNPs was performed with haploview version 4.1
(http://www.broad.mit.edu/mpg/haploview/).
Statistical analysis of the gene contributions by the different founder dog breeds and their association with the distribution of the alleles A and G was made by stepwise forward/backward regression analysis employing GLM (general linear model) of SAS, version 9.2. The presence of
the allele A or the allele G in a specific individual dog was used as dependent variable and tested
for the influence of gene contributions by the different founder breeds. Therefore, the allele A
was encoded as 1 and the allele G as 2. First the influence of each founder breed was calculated
separately. Finally, the breeds significant in simple analysis of variance were analysed simultaneously. The final model included the gene contributions by Samoyed and Dalmatian.
Yijk = µ + b1SAMi + b2DALj + eijk
Yijk
presence of allele A or G in the ijk-th dog in the 88 randomly sampled Elos
µ
model constant
b1, b2
linear regression coefficients
SAMi
gene contribution by Samoyed
DALj
gene contribution by Dalmatian
eijk
random residual effects
Statistical evaluation of MDR1 expression results was performed using the t-test with GLM
(general linear model) of SAS, version 9.2.
Yijk = µ + Genotypei + Sexj + eijk
A second model included the sex genotype interaction.
Yijk = µ + Genotypei + Sexj + GenotypeixSexj +eijk
Yijk
relative expression level of MDR1
89
µ
model constant
Genotypei
fixed effect of genotype (A/A, A/G, G/G)
Sexj
fixed effect of sex (j=1-2)
eijk
random residual effects
We thank H. Klippert-Hasberg for expert technical support and all of the dog owners who contributed samples.
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32. Burk O, Arnold KA, Geick A, Tegude H, Eichelbaum M (2005) A role for constitutive androstane receptor in the regulation of human intestinal MDR1 expression. Biol Chem
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33. Moore LB, Parks DJ, Jones SA, Bledsoe RK, Consler TG, Stimmel JB, Goodwin B, Liddle
C, Blanchard SG, Willson TM, Collins JL, Kliewer SA (2000) Orphan nuclear receptors
constitutive androstane receptor and pregnane X receptor share xenobiotic and steroid
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quantitative PCR and the 2(-Delta Delta C(T)) Method. Methods 25:402-408.
93
Tables
Exon
Primer
Sequence (5’- 3’)
12
MDR1_ex12_F
MDR1_ex12_R
MDR1_ex21_F
MDR1_ex21_R
MDR1_ex26_F
MDR1_ex26_R
TCAGTGATTCAACCATGTATTGG
AATGTGAGCTGTGCAAATGG
CATCATCCTGAAGAAAATCTAGGC
AACACCGTTCTCCAAGCATAGT
TGTCCCATGGTAACCTGACA
AAAGTGTAGGCCAGGGAGGT
21
26
Ta [°C]
PCR product [bp]
60,0
352
60,0
393
60,0
372
SI Table 1: PCR primers for exons 12, 21 and 26 of the canine MDR1 gene
SI Table 2: Primer name, sequence, Annealing temperature, amplicon size and position in gene
(NM_001003215.1) for cDNA analysis.
Primer name
Sequence (5’- 3’)
MDR1_cDNA_ex1F
MDR1_cDNA_ex7R
MDR1_cDNA_ex7F
MDR1_cDNA_ex12R
MDR1_cDNA_ex11F
MDR1_cDNA_ex15R
MDR1_cDNA_ex15F
MDR1_cDNA_ex21R
MDR1_cDNA_ex20F
MDR1_cDNA_ex25R
MDR1_cDNA_ex23F
MDR1_cDNA_ex28R
MDR1_cDNA_ex27F
MDR1_cDNA_UTRR
AATTCCCTTCTCGGTGGAG
CTGATGGCCAAAATCACAAG
TGTCTCCAAAATCAATGAAGG
ACTGTCTGCCCACTCTGAAC
CAAGCATTGACAGCTATTCG
CCTTTCTCCACAATGACTCC
TACAGTTCGTAATGCCGATG
TTCTGGGTAATGACAGCAAG
GATGTCAGCTGGTTTGATGAC
CTGGTCGAGTGGGATAGTTG
TTTCCTATGCTGGCTGTTTC
CTTGGACAACCTTTTCACTTTC
GACAAAGGAACCCAGCTCTC
GCTAGCACTTTATTCAAACATTCAG
Annealing
temp. [C°]
59
59
58
58
57
57
57
57
58
58
58
58
58
58
Amplicon cDNA position
size
713 bp
c.(-45)-(-27)
c.649-668
735 bp
c.537-557
c.1251-1272
712 bp
c.1121-1140
c.1813-1832
747 bp
c.1773-1792
c.2500-2519
748bp
c.2401-2421
c.3129-3148
795 bp
c.2855-2874
c.3629-3649
703 bp
c.3514-3533
c.*348-372
94
SI Table 3: PCR primers annealing temperature, probes and amplicon size for SNP genotyping
for c.504C>T, c.1663C>T and c.*230G>A of the canine MDR1 gene
Primer name
Sequence (5’- 3’)
A n n e a l i n g Probes#
temp [C°]
Amplicon
size
MDR_Ex6_MDR_F
ACAGGAGATTGGCTGGTTTGAC
60
VIC-TCCCCAACGTCATGC
57 bp
MDR_Ex6_MDR_R
TGTGAGCCGGGTGTTAAGC
60
FAM-CCCCAACATCATGC
MDR_Ex14_MDR_F
GCTCGGGCCCTGGTT
60
VIC-CCTCATCCAGCAGAAG
MDR_Ex14-MDR_R
CAGTGTCCAGAGCTGACGTT
60
MDR_Ex28_MDR_F
AGGAACCAAAAGAAACATTATCTGATGGA
60
FAM-CCTCATCCAACAGAAG
V
I
C
-
MDR_Ex28_MDR_R
ACCACTTCTATAATCTTTCAGCAAAGCA
60
#
ACTGGTGTTAATTGCATTAT
F
A
M
66 bp
169 bp
-
CTGGTGTTAATTACATTAT
Probes for c.504 and c.1663 polymorphism are reverse designed. Polymorphic sites are marked
by bold letters.
SI Table 4:
Molecular weight, amino acid composition and isoelectric point of canine p-
glycoproteins of Collie, Boxer and Elo breed.
polar
amino acid isoelectic point
P-glycoprotein Mw (dal) strongly acidic strongly basic Hydrophobic
amino acid
amino acid amino acid amino acid
total
Collie
141523.76
126
147
509
311
1280
9.125
Boxer
141664.89
126
147
509
312
1281
9.125
Elo
141641.85
126
147
510
312
1281
9.125
95
Table 1: Allele and genotype frequencies of the c.504C>T, c.1663C>T1 c.3439A>G c.*.230A>G
SNPs in exon 6, 14, 26 and 28 of the canine MDR1 gene in Elo dogs (n=186)1185 Elo dogs were
genotyped for c.1603C>T polymorphism.
Polymorphism
c.504C>T
Allele
Genotype
c.1663C>T
Allele
Genotype
c.3439A>G
Allele
Genotype
c.*.230G>A
Allele
Genotype
Frequency (%) Standard error 95 % Confidence limits
C
63.17
0.0266
0.5806
0.6828
T
36.83
0.0266
0.3172
0.4194
C/C
43.01
0.0172
-0.0007
0.0662
C/T
40.32
0.0172
-0.0007
0.0662
T/T
16.67
0.0172
-0.0007
0.0662
C
84.05
0.0195
0.7989
0.8777
T
15.95
0.0195
0.1223
0-2011
C/C
71.35
0.0107
-0.0136
0.0286
C/T
25.41
0.0107
-0.0136
0.0286
T/T
3.24
0.0107
-0.0136
0.0286
A
43.55
0.0275
0.3790
0.4892
G
56.45
0.0275
0.5108
0.6210
A/A
22.58
0.0179
0.0029
0.0697
A/G
41.94
0.0179
0.0029
0.0697
G/G
35.48
0.0179
0.0029
0.0697
A
8.06
0.015
0.0538
0.1102
G
91.94
0.015
0.8898
0.9462
A/A
1.61
0.0081
-0.0049
0.0277
A/G
12.90
0.0081
-0.0049
0.0277
G/G
85.48
0.0081
-0.0049
0.0277
96
Table 2: Distribution of genotypes of the c.3439A>G SNP in 65 dogs of different breeds
Dog breed
Collie
German Shepherd
Dachshund
Tibetan Terrier
English Cocker Spaniel
Irish Wolfhound
Jack Russell Terrier
Kromfohrlander
Boxer
Labrador Retriever
Do-Khyi
Dalmatian
German Wirehaired Pointer
Hovawart
Border Collie
Number of
dogs
11
4
4
4
4
4
4
4
4
4
4
4
4
4
2
Distribution of genotypes
A/A
A/G
G/G
11
4
4
4
4
4
4
4
4
3
3
2
1
2
1
0
0
0
0
0
0
0
0
0
1
1
2
3
1
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
1
1
97
Table 3: Regression coefficients (b), standard errors and error probabilities (p) for the influence
of gene contributions by the founder breeds Samoyed and Dalmatian on the presence of the alleles A and G
Simple analysis
Simultaneous analysis
Founder breed
SAM
DAL
b
0.0216
-0.0539
Standard error
0.0106
0.0193
p
0.0431
0.0058
SAM
DAL
0.0201
-0.0519
0.0104
0.0191
0.0558
0.0075
Table 4: Identified mutations in MDR1 cDNAs between the data base reference sequences of
Collie and Boxer and experimental Elo sequences.
MDR1 Position
Protein
Collie
Boxer
NM_001003215
-
Elo1_
E l o 2 _E l o 3 _E l o 4 _
c.3439AA
c.3439AA
c.3439GG
c.3439GG
c.73-74delinsAAT
p . L y s 2 4 _
Glu25insAsn
c 7 3
74insAAT
c.504C>T
pAsp168 =
C/C
C/C
C/C
C/C
T/T
C/T
c.571G>A
Iso 191Val
GG
AA
AA
AA
AA
AA
c.632C>G
Pro 211Arg
CC
GG
GG
GG
GG
GG
c.982A>T
Thr 328Ser
AA
T/T
T/T
T/T
T/T
T/T
c.993G>A
p.Gly331 =
GG
AA
AA
AA
AA
AA
c.1592G>A
Arg 531Gln
GG
AA
AA
AA
AA
AA
c.1663C>T
Leu554 =
C/C
C/C
C/T
C/C
C/C
C/T
c.2079T>A
Val 693 =
T/T
AA
AA
AA
AA
AA
c.2083T>C
Ser 695 Pro
T/T
C/C
C/C
C/C
C/C
C/C
c.3439A>G
1146Met>Val
AA
AA
AA
AA
GG
GG
c.3814A>G
1272 Iso>Val
AA
GG
GG
GG
GG
GG
c.*218T>C
T/T
C/C
C/C
C/C
C/C
C/C
c.*230G>A
GG
AA
A/G
GG
GG
GG
c73-74insAAT c73-74insAAT c73-74insAAT c73-74insAAT
98
Table 5: Resulting haplotypes1 and their frequencies of MDR1 cDNA SNPs (c.504C>T,
c.1603C>T2, 3439A>G, c*. 203A>G) in 186 Elo dogs.
Haplotypes
TCGG
CCAG
CCGG
CTGG
CCAA
TTAG
TCAG
TTGG
TTAA
1
Frequencies
0.3103
0.3003
0.1395
0.1113
0.0806
0.0449
0.0096
0.0035
0.0001
Standard error
0.024
0.023
0,018
0.016
0.014
0.011
0.005
0.003
0.0004
from 15 haplotypes only haplotypes with frequencies ≥ 0.01 percent listed above.
2 185
Elo dogs were genotyped for c.1603C>T polymorphism
Table 6: c.3439 genotypes, least square (LS) means of the relative expression levels (xle) in dependence of the c.3439 genotype, their corresponding standard error (SE) comparisons and their
p values of the t-test.
Genotype
AA
AG
GG
LS means of xle
1.56
0.75
0.38
SE
0.4
0.27
0.3
comparison
AA vs GG
AA vs AG
AG vs GG
Pr > t
0.023 *
0.10
0.37
99
Table 7: c.3439 genotypes, sex, least square (LS) means of MDR1 expression levels (xle) in dependence of genotype*sex interaction, their corresponding standard error (SE), comparison and
their p values for the t-test.
Genotype
AA
AA
AG
AG
GG
GG
Sex
m
f
m
f
m
f
LS means of xle
2.85
0.78
0.66
0.78
0.025
0.44
SE
0.61
0.48
0.48
0.31
0.75
0.31
comparison
p value
AAm vs AAf
AAm vs AGm
AAm vs AGf
AAm vs GGm
AAm vs GGf
0.012
0.008
0.005
0.006
0.001
Table 8: Comparisons of polymorph canine p-glycoprotein amino acids in Collie, Boxer and Elo
breed and different species.
P-glyco-protein
25 insAsn
191Iso>Val
211Pro>Arg
328Thr>Ser
531Arg>Gln
695 Ser>Pro
1147Met>Val
1272 Iso>Val
Collie
n.d.
Val
Pro
Thr
Arg
Ser
Met
Iso
Boxer
Asn
Iso
Arg
Ser
Gln
Pro
Met
Val
Elo
Asn
Iso
Arg
Ser
Gln
Pro
Val/Met
Val
human
n.d.
Iso
Arg
Ser
Gln
Pro
Val
Val
mouse
n.d.
Iso
Ser
Ser
Gln
Leu
Val
Val
rat
n.d.
Leu
Ser
Ser
Gln
Met
Val
Val
sheep
n.d.
Iso
thr
Ser
Gln
Pro
Glu
Val
100
Figures legend
SI Figure 1: The PCR-RFLP test for the c.3508A>G SNP in exon 26 of the canine MDR1 gene.
The represented Elo dogs show all three genotypes.
1: A/A; 2: A/A; 3: G/G; 4: A/G; 5: A/G; 6: G/G; 7: A/A; 8: G/G; 9: 100bp DNA ladder
dog
1135 GDNSRVVSHEEIMQAAKEANIHHFIETLPEKYNTRVGDKGTQLSGGQKQRIAIARALVRQ 1194
human
1134 ********Q***VR********A***S**N**S*K************************* 1193
mouse
1132 *****A******VR********Q**DS**D****************************** 1191
rat
1131 ************VR**R*****Q**DS********************************* 1190
sheep
1139 ********Q***EH********S***M**D****************************** 1198
Figure 1: Section of the alignment of the canine MDR1 protein with known orthologous MDR1
protein sequences. The amino acid sequences were derived from GenBank entries with the accession nos. NP_001003215.1 (dog), NP_000918.2 (human), NP_035205.1 (mouse),
NP_036755.2 (rat) and NP_001009790.1 (sheep). Identical residues are indicated by asterisks.
101
SI Figure 2: Linkage disequilibrium (LD) values for four observed MDR1 polymorphisms.
Figure 2: The relative MDR1expression was assayed in duplicates by quantitative RT-PCR for
each Elo. The individual and mean relative expression levels of MDR1 are shown in 38 Elos by
genotype.
102
103