Spezifische und sensitive Diagnostik Mycoplasma pneumoniae IgG
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medac Diagnostika Mycoplasma pneumoniae Spezifische und sensitive Diagnostik Mycoplasma pneumoniae IgG-, IgA-, IgM-ELISA medac Gesellschaft für klinische Spezialpräparate mbH GE Diagnostika Theaterstrasse 6 Telefon 04103/8006-0 Fax 04103/8006-359 www.medac.de D-22880 Wedel medac Diagnostika Mycoplasma pneumoniae Definition/Systematik M ycoplasma pneumoniae zählt zur Familie der Mycoplasmataceae, die mit weiteren vier Familien die eigenständige Klasse der Mollicutes (Weichhäutige) bildet. Mykoplasmen besitzen keine Zellwand. Ihre äußere Begrenzung stellt die Zellmembran dar, die sehr flexibel ist und extreme Formveränderungen (Pleomorphie) zulässt. Einige Arten, wie z. B. Mycoplasma pneumoniae, besitzen zur Stabilisierung der Zellform eine Zytoskelett-ähnliche Struktur. Mykoplasmen repräsentieren mit einer durchschnittlichen Größe von 300-800 nm die kleinsten zur selbständigen Vermehrung fähigen Bakterien. Vergleichbar mit Viren können sie Membranfilter passieren. Mykoplasmen verfügen über ein nur sehr kleines Genom (580 - 2200 kbp), wodurch ihre Synthesefähigkeit stark eingeschränkt ist. Bisher sind über 100 Arten der Familie Mycoplasmataceae bekannt. Die Mehrzahl davon kommt ausschließlich bei Tieren vor. Beim Menschen sind unterdessen 14 Arten isoliert worden, die die Schleimhaut des Respirations- und Urogenitaltrakts besiedeln. Nur wenige Vertreter davon sind pathogen. Zu den humanpathogenen Arten zählt M. pneumoniae. Der Erreger kommt in zwei Varianten vor, die sich durch das P1- Adhäsin unterscheiden. M. pneumoniae ist ein obligater, extrazellulärer Schleimhautparasit, der sich durch seine hohe Wirtsspezifität auszeichnet. Infektion M . pneumoniae verfügt über eine nur geringe Infektiosität. Die Übertragung erfolgt durch Tröpfcheninfektion von Mensch zu Mensch. M. pneumoniae besiedelt zunächst die Schleimhaut des menschlichen Respirationstrakts. Folgende Virulenzfaktoren sind dafür entscheidend: Adhärenz an die Epithelzellen, Mobilität, Anpassung an den Wirt und Induktion pathologischer Immunreaktionen. Die Mykoplasmen heften sich an die Zilien des Flimmerepithels an. Bereits wenige Stunden später tritt eine Ziliostasis mit nachfolgender Zerstörung des Epithels auf. Adhärens und Kolonisierung sind die Voraussetzungen für die weitere Ausbreitung des Erregers im Respirationstrakt. Neben der überwiegend lokalen, im Respirationstrakt ablaufenden Infektion durch M. pneumoniae ist auch eine systemische Ausbreitung bekannt. Der Pathomechanismus, der verantwortlich für das Überwinden der Epithelschranke und den Eintritt des Erregers in das Blut ist, scheint weitgehend ungeklärt. Offensichtlich verändern sich die adhäsiven Eigenschaften des Erregers. Klinische Manifestation M . pneumoniae ruft Erkrankungen sowohl im oberen als auch im unteren Respirationstrakt hervor. Neben Tracheobronchitiden und atypischen Pneumonien können Pharyngitis, Laryngitis, Otitis media und Myringitis verursacht werden. Als mögliche extrapulmonale Komplikationen bzw. Folgeerkrankungen sind Meningitis, Meningoenzephalitis, Polyneuritis (Guillain-Barré-Syndrom), Myound Perikarditis, Myalgien, Arthralgien, Arthritis, hämolytische Anämien, thrombopenische Purpura sowie Affektionen der Haut (u.a. Stevens-Johnson-Syndrom) bekannt. Epidemiologie M . pneumoniae findet weltweite Verbreitung. Dieser Erreger kann sowohl endemisch als auch epidemisch zu jeder Jahreszeit auftreten. Epidemien, die durch M. pneumoniae hervorgerufen werden, sind alle drei bis sieben Jahre zu beobachten. 2 medac Diagnostika Infektionen Krankheitsverlauf/Therapie D ie Inkubationszeit für eine M. pneumoniae-Erkrankung beträgt 10 bis 21 Tage. M. pneumoniaeInfektionen verlaufen sowohl asymptomatisch als auch symptomatisch. Jedoch sind die Symptome, wie Fieber, trockener Husten und Kopfschmerz, sehr unspezifisch. Infektionen bei Kleinkindern unter 5 Jahren zeigen im Gegensatz zu Infektionen bei Jugendlichen und Erwachsenen einen milderen Verlauf. Bei Kleinkindern ist die Erkrankung häufig selbstlimitierend. Erstinfektionen scheinen im allgemeinen einen günstigeren Verlauf als Reinfektionen zu nehmen. Bei Reinfektionen durch M. pneumoniae kann es auf Grund autoimmuner Prozesse zu wesentlich stärkeren Entzündungsprozessen kommen. Nach einer abgelaufenen Infektion sind häufig noch persistierende Erreger über Wochen und Monate nachweisbar. Das sogenannte Switching, d.h. das spontane An- und Abschalten der Synthese von Membranproteinen ermöglicht eine kurzfristige Veränderung der antigenen Eigenschaften der Membran. So entzieht sich der Erreger der vorhandenen Immunabwehr. Zur Therapie von M. pneumoniae-Infektionen werden klassischerweise Tetrazykline eingesetzt. Daneben kommen auch Makrolide und Chinolone zur Anwendung. Auf Grund der fehlenden Zellwand sind zellwandspezifische Antibiotika unwirksam. Inzidenz/Prävalenz M . pneumoniae-Infektionen gehören zu den häufigsten Ursachen von ambulant erworbenen Tracheobronchitiden und Pneumonien im Kindesalter und bei Jugendlichen. Die höchste Inzidenz liegt zwischen dem 5. und 15. Lebensjahr. Bis zu 20% aller ambulant erworbenen respiratorischen Erkrankungen sind auf M. pneumoniae zurückzuführen. In 5-10 % der Erkrankungen entwickeln sich atypische Pneumonien. Die Antikörperprävalenz, gemessen in einer gesunden Population, ist altersabhängig. So schwankt die Seroprävalenz für IgG zwischen 15% bei Kleinkindern und etwa 40 bis 50% bei Erwachsenen. IgAAntikörper sind bei Kleinkindern nicht nachweisbar. In einer gesunden Population Erwachsener sind bis zu 30% IgA-Antikörper beschrieben worden. Diagnostik D a die klinische Symptomatik einer M. pneumoniae-Infektion nicht erregerspezifisch abläuft, ist eine Differenzialdiagnostik zu anderen Erregern, wie Viren und grampositiven Bakterien, entscheidend für die adäquate Therapie. Die Diagnostik ist mittels Direktnachweis und Serologie möglich. Der Erreger-/Antigennachweis stellt die effiziente Diagnostik in der akuten, frühen Phase der Erkrankung dar. Als Referenzmethode gilt hier die Erregeranzucht, die jedoch zu unempfindlich und zeitintensiv (6 - 14 Tage) ist. Der Erreger-DNA-Nachweis (PCR) steht kommerziell nicht in der erforderlichen Qualität zur Verfügung. Bisher stellt die Serologie die Methode der Wahl für die Diagnose einer M. pneumoniae-Infektion dar. Als klassischer Antikörpernachweis gilt die Komplementbindungsreaktion (KBR). Die KBR kann nicht zwischen den Antikörperklassen unterscheiden. Auch mit den Agglutinationstesten können die Antikörper nicht differenziert werden. Beide Testarten erfassen vorrangig die IgM-Antwort. Bei Reinfektionen fallen sowohl die KBR als auch der Agglutinationstest überwiegend negativ aus. Gegenwärtig dominiert die ELISA-Technik, mit deren Hilfe IgG-, IgA- und IgM-Antikörper differenziert werden können. Entscheidend für einen spezifischen und sensitiven ELISA ist das Antigen. 3 medac Diagnostika Mycoplasma pneumoniae Antigene Strukturen A ls entscheidender Virulenzfaktor für M. pneumoniae gilt die Adhärenz an die Wirtszelle. Das Andocken des Erregers erfolgt über die Terminal- oder Tip-Struktur, die charakteristisch für den Erreger ist (Abbildungen ). Tip-Struktur Tip-Struktur Tip-Struktur Abb.: Elektronenmikroskopische Aufnahme von M. pneumoniae: Mit freundlicher Erlaubnis von Prof. G. Christiansen, Prof. S. Birkelund, Universität Aarhus, Dänemark, 2004. D ie wichtigen hochimmunogenen Proteine sind grundsätzlich über die gesamte Oberfläche des Erregers verbreitet. Auf der Terminal-Struktur können sie auch als größere Cluster vorkommen. Von den mehr als 10 bekannten immunogenen Proteinen kommt dem P1- (170 kDa) Protein eine vorrangige Bedeutung zu. Vor diesem Hintergrund wurde das Antigen für den Mycoplasma pneumoniae-ELISA medac ausgewählt. Das Antigen des Mycoplasma pneumoniae-IgG- und IgA-ELISA medac stellt ein Gemisch aus mehreren rekombinant hergestellten Proteinen dar. Für den Mycoplasma pneumoniae-IgM-ELISA medac wird ein natives, aufgereinigtes Antigen eingesetzt. 4 medac Diagnostika IgG-, IgA-, IgM-ELISA medac Quantifizierung D ie Quantifizierbarkeit der Mycoplasma pneumoniae-IgG- und IgA-ELISA medac bietet eine gute Voraussetzung für das Monitoring bei nachgewiesener Infektion. Für das IgM ist eine Ja-NeinAussage State of the Art. Die Einpunktquantifizierung stellt eine anwenderfreundliche, kostengünstige Methode zur Ermittlung von quantitativen Ergebnissen dar. Die medac-Einpunktquantifizierung ist einfach durchzuführen, leicht programmierbar und softwaregestützt schnell auswertbar. Formel zur Konzentrationsberechnung a Konzentration [ AU/ml ] = b/ ODkorrigiert -1 ) ( AU = arbiträre Einheit Die Kurvenparameter a und b sind dem chargenspezifischen Datenblatt zu entnehmen. ODkorrigiert = OD-Sollwert des Kalibrators OD-Messwert des Kalibrators x ODgemessen Konzentrationsbestimmung über Standardkurve und Kalibrator (Einpunktquantifizierung) Die Einpunktquantifizierung von medac ist eine hochpräzise Methode, die gleichwertige Ergebnisse, wie die Mitführung einer konventionellen Standardkurve, liefert (Abb.). Der Messbereich erstreckt sich von 9 bis 125 AU/ml. IgG IgA y = 1,039x - 0,056 R2 = 0,990 100 80 60 40 100 80 60 40 20 20 n = 499 0 Konz. (AU/ml) 0 y = 1,034x - 0,963 R2 = 0,993 120 Kit Kalibrator Kit Kalibrator 120 20 40 60 80 100 120 Interne Kalibrationskurve Konz. (AU/ml) n = 255 0 0 20 40 60 80 100 120 Interne Kalibrationskurve Der Cut off liegt bei 10 AU/ml. Der Grenzbereich erstreckt sich von 9 bis 11 AU/ml. Proben mit Werten unterhalb des Grenzbereichs (< 9 AU/ml) sind als negativ und Werte > 11 AU/ml als positiv zu bewerten. 5 medac Diagnostika Mycoplasma pneumoniae Sensitivität/Spezifität Z ur Ermittlung von Sensitivität und Spezifität wird ein Referenzsystem benötigt. Für die MycoplasmaSerologie liegt jedoch kein “Goldstandard” vor. Daraus ergibt sich die Schwierigkeit, diese Zielgrößen zu bestimmen. Um dennoch eine Richtgröße zu erhalten, wurde eine Referenz (I), bestehend aus einem Partikelagglutinationstest (PAT) und einem kommerziellen ELISA (C-EIA), definiert. Zur Bestimmung von Sensitivität* und Spezifität* wurden Seren ausgewählt, die sowohl im PAT als auch C-EIA übereinstimmend negativ oder positiv waren. Die Seren wurden in den Mycoplasma pneumoniae-IgG-, IgA-, IgM-ELISA medac (MP-ELISA) gemessen. Alle sog. falsch negativen Ergebnisse im medac-ELISA wurden erneut in einem weiteren kommerziellen ELISA (Referenz II) überprüft. Unter Berücksichtigung des Ergebnisses wurde die Sensitivität neu berechnet (korrigierte Sensitivität). MP-ELISA IgG Spezifität Sensitivität NPV PPV Korrelation Referenz I - + - 32 6 + 7 38 82% 86% 84% 84% 84% 83 V on den 6 im medac-IgG-ELISA falsch negativ bewerteten Seren waren in der zweiten Referenz 5 ebenfalls negativ oder grenzwertig, so dass sich unter Berücksichtigung dieses Ergebnisses eine korrigierte Sensitivität von 98% ergab. MP-ELISA IgA Spezifität Sensitivität NPV PPV Korrelation Referenz I - + - 39 13 + 1 20 98% 61% 75% 95% 81% 73 V on den 13 im medac-IgA-ELISA falsch negativ bewerteten Seren waren in der zweiten Referenz 9 ebenfalls negativ oder grenzwertig, so dass sich unter Berücksichtigung dieses Ergebnisses eine korrigierte Sensitivität von 88% ergab. MP-ELISA IgM Spezifität Sensitivität NPV PPV Korrelation Referenz I - + - 40 8 + 0 31 100% 80% 83% 100% 90% 79 V on den 8 im medac-IgM-ELISA falsch negativ bewerteten Seren waren in der zweiten Referenz alle ebenfalls deutlich negativ, so dass sich unter Berücksichtigung dieses Ergebnisses eine korrigierte Sensitivität von 100% ergab. 6 * Grenzwertige Seren wurden in die Berechnung nicht einbezogen. medac Diagnostika IgG-, IgA-, IgM-ELISA medac Häufigkeiten D ie Häufigkeit von M. pneumoniae-Infektionen und deren serologische Widerspiegelung wird sehr unterschiedlich diskutiert. Um einen aktuellen Einblick zu erhalten, wurden Seren von drei Probandengruppen verglichen: Blutspender (allgemeine Durchseuchung) sowie hospitalisierte Kinder und Erwachsene mit akuten respiratorischen Erkrankungen. Kranke und gesunde Probandengruppen können anhand der Antikörperkonstellationen gut differenziert werden. Auffallend ist jedoch die hohe Anzahl grenzwertiger Seren im IgG und IgA beim kommerziellen Vergleichstest/C-EIA (Tab.). IgG IgA IgM medac C-EIA medac C-EIA medac C-EIA B l u t s p e n d er (n = 300) + +/- 39% 11% 50% 30% 22% 48% 6% 3% 91% 7% 17% 76% 2% 2% 96% 1% 1% 98% Kranke Kinder (n = 166) + +/- 67% 4% 29% 63% 10% 27% 9% 3% 88% 13% 16% 71% 28% 5% 67% 35% 5% 60% Kranke Erwachsene (n = 189) + +/- 44% 5% 51% 29% 14% 57% 10% 3% 87% 13% 3% 84% 21% 5% 74% 25% 1% 74% D er Partikelagglutinationstest (PAT) ist ein Screeningtest für M. pneumoniae-Antikörper. 193 Seren von Patienten mit respiratorischen Erkrankungen wurden mit dem PA-Test gemessen (negativ: n = 31; Titer 40 - 160: n = 107; Titer 320 - 640: n = 27; Titer 1280: n = 28). In der Abbildung sind die PAT-Ergebnisse denen der M. pneumoniae-IgG-, IgA-, IgM-ELISA medac gegenüber gestellt. 100% MP-ELISA positiv 90% 80% IgG IgA IgM 70% 60% 50% 40% 30% 20% 10% 0% Neg. 40 - 160 320 - 640 1280 PAT Titer D ie Mycoplasma pneumoniae-ELISA medac liefern differenzierte Ergebnisse für IgG, IgA und IgM. Damit kann der Krankheitsverlauf konkret eingeschätzt werden. Im Gegensatz dazu ist mit dem PAT eine Differenzierung der drei Immunglobulinklassen nicht möglich. 7 medac Diagnostika Mycoplasma pneumoniae Automatisierbarkeit D ie Automatisierbarkeit des Mycoplasma pneumoniae-IgA-, IgG-, IgM-ELISA medac wurde an mehreren offenen Systemen/ELISA-Prozessoren überprüft. Die Übereinstimmung zwischen automatisierter und manueller Testdurchführung zeigt sich in der guten Korrelation der erhaltenen Werte (Abb.). 100 140 120 DIAS: y = 0,94x + 0,85 R2 = 0,98 Automat Automat 100 80 60 40 BEP III: y = 0,97x - 0,91 R2 = 0,99 20 60 40 BEP III: y = 0,90x + 0,22 R2 = 0,99 20 0 0 Konz. 0 (AU/ml) DIAS: y = 0,83x + 2,28 R2 = 0,97 80 20 40 60 80 Konz. 0 (AU/ml) 100 120 140 Manuell IgM 2,0 DIAS: y = 1,02x + 0,03 R2 = 0,99 Automat 1,6 1,2 0,8 BEP III: y = 0,98x + 0,01 R2 = 0,99 0,4 0,0 OD 0,0 0,4 0,8 1,2 Manuell 8 1,6 2,0 20 40 60 Manuell 80 100 medac Diagnostika IgG-, IgA-, IgM-ELISA medac Präzision D ie Messungen zur Ermittlung der Intra- und Interassay-Varianz wurden mit jeweils fünf unterschiedlich reaktiven Seren durchgeführt (manueller Ansatz). Zur Bestimmung der Intraassay-Varianz wurden diese Seren jeweils in 22-fach Bestimmung in einem Testlauf untersucht. Zur Feststellung der Interassay-Varianz wurden die Seren jeweils in 13 unabhängigen Testläufen gemessen. Intraassay-Varianz IgG Serum IgA IgM AU/ml VK AU/ml VK OD VK 1 6 6% 6 3% 0,021 18% 2 16 4% 12 6% 0,542 3% 3 36 5% 21 3% 0,792 6% 4 50 6% 27 2% 0,990 4% 5 88 5% 116 3% 1,480 4% Interassay-Varianz IgG Serum IgA IgM AU/ml VK AU/ml VK OD VK 1 3 4% 6 3% 0,033 11% 2 34 5% 21 6% 0,651 2% 3 69 5% 22 5% 0,838 2% 4 82 5% 115 10% 1,141 2% 5 128 7% 126 5% 1,611 2% 9 medac Diagnostika Mycoplasma pneumoniae Literatur Clyde WA jr: Clinical overview of typical Mycoplasma pneumoniae infections. Clin Infect Dis 17 Suppl. 1, S32-36 (1993). Daxboeck F, Kircher K, Krause R, Heinzl H, Wenisch C, Stanek G: Effect of stage on antibody titer to Mycoplasma pneumoniae. Scand J Infect Dis 34, 577-579 (2002). Dionisio D, Valassina M, Uberti M, Fabbri C, Parri F, Saffi EG: Mycoplasma pneumoniae non-pulmonary infection presenting with pharyngitis, polyarthritis and localized exanthem. Scan J Infect Dis 33, 782-783 (2001). 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