Funktionelle Blockade des immunsuppressiven Faktors CD200 in
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Aus dem Zentrum für Innere Medizin der Universität zu Köln Klinik I für Innere Medizin Direktor: Universitätsprofessor Dr. med. M. Hallek Funktionelle Blockade des immunsuppressiven Faktors CD200 in der Chronisch Lymphatischen Leukämie (CLL) – ein neuer immuntherapeutischer Ansatz der CLL-Zellvermittelten Immunsuppression Inaugural-Dissertation zur Erlangung der Doktorwürde der Hohen Medizinischen Fakultät der Universität zu Köln vorgelegt von Sabine Labus geb. Ulbrich aus Dormagen Promoviert am 23. März 2011 Gedruckt mit Genehmigung der Medizinischen Fakultät der Universität zu Köln 2011 2 Dekan: Universitätsprofessor Dr. med. J. Klosterkötter 1. Berichterstatter: Universitätsprofessor Dr. med. C.-M. Wendtner 2. Berichterstatter: Universitätsprofessor Dr. med. M. Krönke Erklärung: Ich erkläre hiermit, dass ich die vorliegende Dissertationsschrift ohne unzulässige Hilfe Dritter und ohne Benutzung anderer als der angegebenen Hilfsmittel angefertigt habe; die aus fremden Quellen direkt oder indirekt übernommenen Gedanken sind als solche kenntlich gemacht. Bei der Auswahl und Auswertung des Materials sowie bei der Herstellung des Manuskriptes habe ich keine Unterstützungsleistungen erhalten. Weitere Personen waren an der geistigen Herstellung der vorliegenden Arbeit nicht beteiligt. Insbesondere habe ich nicht die Hilfe einer Promotionsberaterin/eines Promotionsberaters in Anspruch genommen. Dritte haben von mir weder unmittelbar noch mittelbar geldwerte Leistungen für Arbeiten erhalten, die im Zusammenhang mit dem Inhalt der vorgelegten Dissertationsschrift stehen. Die Dissertationsschrift wurde von mir bisher weder im Inland noch im Ausland in gleicher oder ähnlicher Form einer anderen Prüfungsbehörde vorgelegt. Köln, den 3 Der experimentelle Teil der vorliegenden Dissertationsarbeit wurde in der Zeit von Oktober 2005 bis Juli 2007 in der Universitätsklinik Köln, Klinik I für Innere Medizin angefertigt. Leiter der Arbeit war Universitätsprofessor Dr. med. Clemens-Martin Wendtner (Klinik I für Innere Medizin, Universitätsklinik Köln). Die Betreuung fand durch Dr. med. Christian Philipp Pallasch (Klinik I für Innere Medizin, Universitätsklinik Köln) statt. Die in dieser entsprechender Unterstützung Arbeit angegebenen Anleitung der durch Experimente Herrn Dr. Biologisch-Technischen med. sind von C.-P. Assistentin mir nach Pallasch Reinhild mit Brinker ausgeführt worden. 4 DANKSAGUNGEN Ich bedanke mich ganz herzlich bei Herrn Universitätsprofessor Dr. ClemensMartin Wendtner für die Überlassung dieses spannenden Themas und die Möglichkeit, meine Dissertation in seiner Arbeitsgruppe realisieren zu können. Bei Herrn Dr. med. Christian Philipp Pallasch möchte ich mich besonders für die ausgezeichnete Betreuung während des gesamten Erstellungszeitraums dieser Promotionsarbeit bedanken. Bei Janine, Alexandra, Sonja, Nadine, Michi und Adi bedanke ich mich für die gute und humorvolle Zusammenarbeit. Reinhild danke ich besonders für die tatkräftige Unterstützung im letzten Abschnitt meiner Arbeit. Meinen Eltern, meiner Schwester Katrin und meinem Mann Jakob danke ich für die Bereitschaft, mich stets zu motivieren, mental zu stärken und mir Denkanstöße zu geben. 5 Gewidmet meiner lieben Familie 6 INHALTSVERZEICHNIS INHALTSVERZEICHNIS ABKÜRZUNGSVERZEICHNIS 10 1. EINLEITUNG 13 1.1 Die Chronische Lymphatische Leukämie (CLL) 13 1.1.1 Einführung 13 1.1.2 Stadieneinteilung und Prognosefaktoren der CLL 15 1.1.3 Therapie der CLL 17 1.2 Das T-Zell-Immunsystem 18 1.2.1 Einführung 18 1.2.2 Der T-Zell-Rezeptor 18 1.2.3 Die Antigen-Erkennung und T-Zell-Aktivierung 20 1.2.4 Regulatorische Signale bei der T-Zellaktivierung 21 1.2.5 Tumor-assoziierte Antigene (TAA) in der CLL 22 1.3 T-Zell-Defekte in der CLL 23 1.4 CD200 und CD200R 25 1.5 Zielsetzung der Promotionsarbeit 26 2. MATERIALIEN UND METHODIK 27 2.1 Materialien 27 2.1.1 Geräte 27 2.1.2 Verbrauchsmaterialien 28 2.1.3 Chemikalien, Bioreagenzien und Baukästen 29 2.1.4 Enzyme, Proteine, Immunreagenzien und Inhibitoren 30 2.1.5 Antibiotika 31 2.1.6 Antikörper 31 2.1.7 Verwendete Zelllinien 32 2.1.8 Verwendete Software 32 7 INHALTSVERZEICHNIS 2.2 Methodik 33 2.2.1 Patienten 33 2.2.2 Konzept der experimentellen Studie 33 2.2.3 Versuchsprotokolle 35 2.2.3.1 Ficoll-Dichtegradienten-Zentrifugation 35 2.2.3.2 Rosette-Separation 36 2.2.3.3 Zellzählung 36 2.2.3.4 Kryokonservierung 37 2.2.3.5 FACS (Fluorescence-Activated-Cell-Sorter) 37 2.2.3.6 Stimulation in der “Mixed Lymphocyte Reaction” (MLR) 39 2.2.3.7 ELIspot-Verfahren 40 2.2.3.8 CFSE-Färbung 41 2.2.3.9 FOX P3-Färbung 42 2.2.3.10 Zytotoxizitätsprobe mittels FACS 43 2.2.4 Statistik 43 3. ERGEBNISSE 44 3.1 Überexpression von CD200 44 3.1.1 CD200-Expression bei CLL-Patienten und gesunden Probanden 44 3.1.2 Korrelation mit klinischen und prognostischen Markern 46 3.2 T-Zellexpansion im MLR-Modell 49 3.2.1 Teilungspopulationen in der CFSE-Färbung 50 3.2.2 Ergebnisse der T-Zell-Expansion 51 3.2.3 Deskriptive Betrachtung der B-Zell-Anzahl 52 3.3 Zytotoxizität des CD200-Antikörpers 54 3.4 T-Zell-Interaktionen im ELIspot 55 3.5 Anteilsverhältnisse der Treg-Zellen im MLR-Modell 58 8 INHALTSVERZEICHNIS 4. DISKUSSION 61 4.1 Beurteilung der hohen Expressionswerte von CD200 61 4.1.1 Überexpression von CD200 in der CLL 61 4.1.2 Korrelation mit dem Binet-Stadium und prognostischen Faktoren 62 4.2 Bewertung der T-Zellexpansion im MLR-Modell 64 4.3 Deskriptive Betrachtung der T-Zell-Populationen 68 4.4 Fazit und Beurteilung 72 5. ZUSAMMENFASSUNG 75 6. LITERATURVERZEICHNIS 77 7. PUBLIKATIONEN 87 8. LEBENSLAUF 88 9 ABKÜRZUNGSVERZEICHNIS ABKÜRZUNGSVERZEICHNIS °C Grad Celsius 4-1BBL CD137-Ligand, TNF-Rezeptor 7-AAD 7-Amino-Actinomycin-D AK Antikörper APC Allophycocyanin APC-Cy7 APC+Cyanin 7 AS Aminosäure B7h/B7RP Liganden für ICOS, CD274/CD275 bcl2 Oncogene B-cell leukemia 2 BCR B-Zell-Rezeptor B-Ly B-Lymphozyt CD Cluster of Differentiation CFSE Carboxy-Fluoresceindiacetat-Succinimidyl-Ester CLL Chronische Lymphatische Leukämie CR2 Complement receptor, CD21 C-Region konstante Region CSC Cancer stem cells CTL/CTLA zytotoxische T-Lymphozyten/Cytotoxic T-Lymphocyte Antigen DAP Death Associated Proteins DC Dendritische Zelle dl Deziliter DMSO Dimethylsulfoxid DNA Desoxyribonukleinsäure ELISA Encyme-linked-immunosorbent-assay ELIspot Encyme-linked-immuno-spot ERK Extracellular-signal regulated Kinasen Fab Fragment der Immunglobuline (variable Region) FACS Fluorescence-activated-cell-sorter Fas Fatty acid synthase Fc Konstantes Fragment der Immunglobuline FCS Fetal calf serum 10 ABKÜRZUNGSVERZEICHNIS FITC Fluorescein-Isothiocyanat FMNL Formin-like Protein FMOD Fibromodulin FOXP3 Forkhead Box P3 FSC forward scatter g Gramm GITR Glucocorticoid-induced tumor necrosis factor receptor h Stunde HLA Human leukocyte antigen IAP Inhibitor aus der Apoptose-Genfamilie ICOS Inducible costimulator, kostimulatorischer Rezeptor auf aktivierten T-Zellen IFN Interferon Ig Immunglobulin IgVH variable Region der schweren Kette eines Immunglobulins IL Interleukin IMDM Iscove's modified Dulbecco's medium ITIM Immunoreceptor tyrosine-based inhibitory motif kDa Kilo-Dalton KW13 Formin like protein L Ligand LBP Lipopolysaccharid-Bindungsprotein LFA1 Lymphocyte function-associated antigen LK Lymphknoten Ly1 Lymphocyte antigen 1; CD5 M Monozyt MAGE Melanoma antigen MAPK Mitogen-activated protein kinase MEK MAPK/ERK Kinase MFIR Mean fluorescence intensity ratio MHC Haupthistokompatibilitäts-Komplex min Minute miR Micro RNA ml Milliliter MLR Mixed lymphocyte reaction 11 ABKÜRZUNGSVERZEICHNIS mM Milli-Molar n Anzahl NHL Non-Hodgkin-Lymphom OX2/OX40 CD200/CD134 PBMC Peripheral blood mononuclear cell PBS Phosphate-buffered saline PC-5/Pe-Cy5 PE+Cyanin 5 PD Programmierter Tod/programmed death PE Phycoerythrin Pe-Cy7 PE+Cyanin 7 R Rezeptor rAAV rekombinantes Adeno-assoziiertes Virus RNA Ribonukleinsäure rpm rounds per minute RPMI Zellkulturmedium entwickelt am Roswell Park Memorial Institute RT Raumtemperatur SSC Side scatter TAA tumor-assoziiertes Antigen TAPA-1 target of antiproliferative antibody 1; CD81 Tc zytotoxischer T-Lymphozyt TCRα T-Zell-Rezeptor α TCRβ T-Zell-Rezeptor β TGF Tumor growth factor Th1 T-Helfer-Zellen 1 Th2 T-Helfer-Zellen 2 TNF Tumor-Nekrose-Faktor TNFR Tumor-Nekrose-Faktor-Rezeptor TOSO Fas-inhibierendes Molekül 3, benannt nach einem japanischen Likör T-PLL T-Prolymphozytenleukämie Treg regulatorische T-Zellen ZAP70 Zeta-assoziiertes Protein (70 kDa) μg Mikrogramm μl (120) Mikroliter 12 EINLEITUNG 1. EINLEITUNG 1.1 Die Chronische Lymphatische Leukämie (CLL) 1.1.1 Einführung Die Chronische Lymphatische Leukämie (CLL) ist eine leukämisch verlaufende Form des Non-Hodgkin-Lymphoms (NHL). Sie ist eine bislang unheilbare Erkrankung des höheren Lebensalters, deren Überlebenszeit aber zumindest im Frühstadium mit der eines Gesunden korreliert. Männer sind häufiger betroffen als Frauen (M:F = 1,7:1). Die CLL ist die häufigste Form des NonHodgkin-Lymphoms (zirka zehn Prozent) und mit einer Inzidenz von 34/100.000 Einwohnern jährlich hat sie einen Anteil von rund 30 Prozent an allen Leukämien der westlichen Hemisphäre. Das mediane Alter bei Erstdiagnose liegt bei 65 Jahren. Mit zunehmendem Lebensalter steigt die Inzidenz an: Im fünften Lebensjahrzehnt beträgt sie noch 5/100.000/Jahr, während sie im achten Lebensjahrzehnt bei zirka 30/100.000/Jahr liegt. Die Chronische Lymphatische Leukämie ist charakterisiert durch eine unkontrollierte Proliferation und Akkumulation eines transformierten B-ZellKlons. Eine Akkumulation von entarteten T-Zellen, früher als T-CLL bezeichnet, wird nun nach der WHO als Entität einer T-Prolymphozytenleukämie (T-PLL) eingeordnet. Die malignen B-Lymphozyten proliferieren relativ langsam und verfügen über eine verlängerte Lebenszeit. Sie breiten sich in Knochenmark, Leber, Milz und Blut aus. Weil die CLL nur langsam fortschreitet, wird sie als niedrig maligne eingestuft. Initial zeigen sich die Patienten meist asymptomatisch. Die typischerweise vorhandene Lymphadenopathie kann zu Beginn fehlen. Eine periphere Lymphozytose mit Knochenmarksbefall wird deshalb häufig als Zufallsbefund entdeckt. Eine erhöhte Infektneigung und B-Symptome (Fieber, Nachtschweiß, Gewichtsabnahme) können sich manifestieren. Bei zehn Prozent der Patienten können Kälteantikörper im Blut nachgewiesen werden (monoklonales IgM), eine autoimmunhämolytische Anämie durch Wärmeantikörper besteht bei fünf Prozent der Betroffenen (47). 13 EINLEITUNG Ätiologisch resultiert die Vermehrung der reifen Lymphozyten vermutlich aus einer verringerten Apoptose. Die Ursachen hierfür sind noch nicht abschließend erforscht, jedoch konnten verschiedene Mechanismen der apoptotischen Resistenz der CLL-Zellen dargestellt werden: Cimmino et al. zeigten, dass miR-15 und miR-16 zerstört oder herunterreguliert auf CLL-Zellen vorliegen und mit dem antiapoptotischen Faktor bcl2 invers korreliert sind (18). Desweiteren scheinen die CLL-Zellen resistent gegenüber der Fas-induzierten Apoptose zu sein (91). Hitoshi et al. identifizierten TOSO als Fas-inhibierendes Molekül (50). Pallasch et al. untersuchten die Rolle von TOSO in der Chronischen Lymphatischen Leukämie (82). Sie belegten eine Überexpression in der CLL und die Regulation mittels B-Zell-Rezeptor und fanden Hinweise, dass die TOSO-BCR-Interaktion ein zentraler Mediator der Apoptoseresistenz sein könnte. Die primäre Befundkonstellation, in der Regel charakterisiert durch Lymphozytose mit oder ohne begleitender Lymphadenopathie, gibt das diagnostische Vorgehen vor (42). Folgende diagnostische Maßnahmen sind nach der Deutschen Gesellschaft für Hämatologie und Onkologie (DGHO) indiziert: Anamnese: Infektneigung, B-Symptomatik, Leistungsschwäche, Ergebnisse früherer Blutbild-Untersuchungen Klinische Untersuchung: Organomegalie, Lymphknotenstatus, Blutungsund Anämiezeichen Labor: Differenzialblutbild (Lymphozytose, Gumprecht-Kernschatten), LDH, CRP, Elektrophorese, Haptoglobin, Coombs-Test Röntgen-Thorax-Aufnahme: Abklärung von mediastinalen Lymphknotenvergrößerungen, eines Pleuraergusses, einer inaktiven Tuberkulose Gesichert wird die Verdachtsdiagnose daraufhin durch eine zytologische und durchflusszytometrische Untersuchung. Nach den Kriterien der International Workshop CLL (IWCLL) Working Group on Prognostic and Diagnostic Parameters in CLL von 2006 liegt eine Chronische Lymphatische Leukämie vor, wenn folgendes erfüllt wird (10): 14 EINLEITUNG Überwiegendes Vorkommen kleiner, morphologisch reifer Lymphozyten in der zytologischen Untersuchung Koexpression von CD19, CD20, CD23 und CD5. Dabei ist eine relativ schwache Expression von CD20 charakteristisch. CD19 und CD20 sind reguläre B-Lymphozytenmarker, CD5 dagegen wird eigentlich nur auf TZellen exprimiert. Die Monoklonalität der B-Zellen kann durch Leichkettenrestriktion (κ oder λ), als Doppelmarkierung von CD19/κ oder CD19/ λ, belegt werden. Desweiteren wird für die Diagnosestellung einer CLL eine Lymphozytose von ≥ 5 G/l gefordert, ansonsten wird von einer monoklonalen Lymphozytose unbekannter Signifikanz gesprochen (16). Eine Knochenmarkspunktion kann im Krankheitsverlauf zur Beurteilung unklarer Zytopenien bzw. der Messung der Remissionsqualität im Rahmen klinischer Studien erforderlich werden. Eine Lymphknotenbiopsie ist bei Lymphadenopathie oder einer unklaren diagnostischen Situation, wie z.B. der Verdacht einer Transformation in eine aggressive Lymphomform (RichterSyndrom), angezeigt. 1.1.2 Stadieneinteilung und Prognosefaktoren der CLL Die CLL wird nach Binet oder Rai in Stadien eingeteilt (9;86): Risiko Stadium Lymphadenopathie Hämoglobin Thrombozyten Medianes (g/dl) (/μl) Überleben Niedrig A <3 vergrößerte LK >10 normal >10 Jahre Mittel B ≥3 vergrößerte LK >10 normal 5 Jahre Hoch C unabhängig ≤ 10 <100.000 2 Jahre Tab. 1.1: Stadieneinteilung nach Binet (1981) 15 EINLEITUNG Stadium Parameter Medianes Überleben (Jahre) > 12,5 Rai 0 Lymphozytose und Knochenmarksinfiltration Rai I Lymphozytose und Lymphome 8,5 Rai II Lymphozytose und Hepatound/oder Splenomegalie 6 Rai III Lymphozytose und Anämie (Hb < 11 g/dl) 1,5 Rai IV Lymphozytose und Thrombozytopenie (< 100 * 1.000.000.000 /l) 1,5 Tab. 1.2: Stadieneinteilung nach Rai (1975) Die Chronische Lymphatische Leukämie hat einen sehr variablen Krankheitsverlauf: Die Überlebenszeiten reichen von wenigen Monaten bis zu mehreren Jahren nach Diagnosestellung. Ein symptomarmer, langsam fortschreitender Verlauf ist ebenso beschrieben wie ein stark progredienter Verlauf mit sehr hohen Lymphozytenzahlen und Organomegalien. Hinweise auf den Krankheitsverlauf können verschiedene Prognosefaktoren geben. Eine Mutation im variablen Segment der schweren Immunglobulin-Kette (VH-Gen) und eine fehlende Expression von CD38 werden günstig beurteilt, während eine fehlende Mutation, eine CD38- und ZAP70-Expression auf einen foudroyanten Krankheitsverlauf hindeuten können (13). Genomische Abberationen sind ebenfalls mit unterschiedlichen Prognosen behaftet. Als ungünstig werden die 11q23- und die 17p13-Deletion sowie ein komplexer Karyotyp (Trisomie 12) beurteilt, die 13q14-Deletion oder ein normaler Karyotyp lassen einen besseren Verlauf erwarten (25). Weiterhin wurden in jüngerer Zeit folgende Prognosefaktoren identifiziert: Die Lymphozytenverdopplungszeit (76), p53-Läsionen (27), β2-Microglobulin (59), die Serumthymidinkinase (44), komplexe Gentranslokationen (73) und die Lipoproteinlipase (79). Sie alle bedürfen aber weiterhin einer prospektiven Validierung und sind deshalb zur Zeit nicht Grundlage der Therapieentscheidung. Ausnahmen sind Läsionen des p53-Gens bzw. die Deletion 17p13, weil Therapieresistenzen gegenüber Purinanaloga beobachtet wurden (24;41). Als Folge dessen sind diese 16 EINLEITUNG Läsionen mit einer sehr ungünstigen Prognose assoziiert und der Einschluss in alternative Therapieprotokolle sollte angestrebt werden. Prognosefaktoren Stadium Günstig Binet A (Rai 0-I) Ungünstig Binet B, C (Rai II-IV) Geschlecht weiblich männlich LymphozytenVerdopplungszeit Chromosomen < 12 Monate > 12 Monate Deletion 13q14 IgVH-Hypermutation mutiert Trisomie 12, p53Mutationen (17p13), Deletion 11q23 unmutiert ZAP-70 negativ positiv CD38-Expression negativ positiv Tab. 1.3: Übersicht über relevante Prognosefaktoren in der CLL 1.1.3 Therapie der CLL Durch übliche Chemoimmuntherapien ist die Chronische Lymphatische Leukämie bislang nicht heilbar. Die einzige kurative Option ist die allogene Stammzelltransplantation. Im Binet-Stadium A sollte grundsätzlich keine Therapie außerhalb von Studien begonnen werden, außer der Patient klagt über eine ausgeprägte B-Symptomatik oder leidet unter einer progressiven Hyperleukozytose. Ab Binet-Stadium B und fortgeschrittener Symptomatik besteht die Erstlinientherapie in der Kombination Fludarabin plus Cyclophosphamid. Die Kombination mit dem Antikörper Rituximab wurde in den letzten Jahren randomisiert untersucht und stellt seit Dezember 2008 die neue Standardtherapie dar (43). Der Stellenwert autologer und allogener Stammzelltransplantationen in der Erstlinientherapie ist nicht gesichert und sollte nur innerhalb von Studien oder bei jungen Hochrisikopatienten angewendet werden (26). Im Rezidiv hängt das Therapieschema von der Art der Primärtherapie und der erreichten Remissionsdauer ab. Bei gutem Ansprechen und einer Remission von wenigstens einem Jahr kann dasselbe Regime wiederholt werden. 17 EINLEITUNG Ansonsten gibt es die Möglichkeiten einer Monotherapie, einer Therapie mit dem Antikörper Alemtuzumab oder mit Bendamustin. Die allogene Stammzelltransplantation stellt für Hochrisikopatienten mit ausreichender Fitness eine Option dar. Sie sollte jedoch nur innerhalb klinischer Studien erfolgen. Supportive Therapiekonzepte in der CLL beinhalten intravenöse Gaben von Immunglobulinen, Impfungen, Transfusionen und eine gute internistische Begleitung. 1.2 Das T-Zell-Immunsystem 1.2.1 Einführung Bei den T-Zellen handelt es sich um eine Untergruppe der Lymphozyten, die im Thymus heranreifen. Sie sind durch heterodimere Rezeptoren gekennzeichnet, die mit den Proteinen des CD3-Komplexes assoziiert sind. Man unterscheidet CD4-positive Zellen von CD8-positiven Zellen und regulatorischen T-Zellen. Regulatorische oder T-Suppressorzellen können T-Zell-Reaktionen hemmen. CD4-positive Zellen tragen das Corezeptorprotein CD4. Sie erkennen Peptide aus dem Inneren von Vesikeln, die an MHC-II-Moleküle gebunden sind. Sie differenzieren zu CD4-Th1- und CD4-Th2-Effektorzellen. Th1-Zellen bilden verschiedene Zytokine und wirken vor allem an der Aktivierung von Makrophagen mit. Th2-Zellen produzieren Interleukin 4 und 5 und aktivieren BZellen. CD8-positive Zellen tragen den Corezeptor CD8 und erkennen Antigene auf MHC-I-Komplexen. Sie differenzieren zu zytotoxischen T-Zellen, die andere Zellen abtöten können (54). 1.2.2 Der T-Zell-Rezeptor Im Gegensatz zu den Immunglobulinen erkennen T-Zellen fremde Antigene nur, wenn sie auf den Oberflächen von körpereigenen Zellen präsentiert werden. Dies geschieht über spezialisierte Haupthistokompatibilitätskomplexe (major histocompatibility complex, MHC). Jede T-Zelle trägt rund 30.000 Antigenrezeptoren auf ihrer Oberfläche. Jeder Rezeptor besteht aus zwei verschiedenen Polypeptidketten – T-Zell-Rezeptorα- (TCRα-) und -β- (TCRβ-) Ketten – die durch eine Disulfidbrücke miteinander 18 EINLEITUNG verknüpft sind. Diese Heterodimere sind strukturell dem Fab-Fragment eines Immunglobulins sehr ähnlich. Sie sind für die Antigenerkennung durch die meisten T-Zellen verantwortlich. Eine Minderheit der T-Zellen trägt einen sogenannten γ:δ-T-Zell-Rezeptor mit anderer Funktionsweise, die bisher nicht eindeutig geklärt ist. Vom B-Zell-Rezeptor, einem membrangebundenen Immunglobulin, unterscheidet sich der T-Zell-Rezeptor insofern, als dass er nur eine Antigenbindungsstelle hat, der B-Zell-Rezeptor dagegen zwei. Außerdem werden T-Zell-Rezeptoren nie sezerniert, während Immunglobuline als Antikörper verteilt werden können. Strukturelle Untersuchungen der Aminosäuresequenzen beweisen, dass beide Ketten des Rezeptors eine aminoterminale variable Region in Homologie zur V-Region von Immunglobulinen, ferner eine konstante Region ähnlich der C-Region und eine Gelenkregion mit Cysteinrest für die Disulfidbrückenbindung besitzen (54). Alpha-Kette Beta-Kette Variable Region CD3 Assoziierter CD3-Komplex: wichtig für Signalübertragung Transmembranregion Abbildung 1.1: Vereinfachte Darstellung des T-Zell-Rezeptors 19 EINLEITUNG Antigenbindungsstellen Plasmamembran Abbildung 1.2: Vergleichende schematische Darstellung des B-Zell-Rezeptors 1.2.3 Die Antigen-Erkennung und T-Zell-Aktivierung T-Zellen reagieren mit kurzen zusammenhängenden Aminosäurensequenzen in Proteinen, wobei die Sequenzen oft tief in der nativen Struktur des Proteins verborgen liegen. Erst wenn das Proteinantigen entfaltet und in Peptidfragmenten prozessiert vorliegt, kann es vom T-Zell-Rezeptor erkannt werden. Dafür müssen die Peptidfragmente an ein MHC-Molekül gebunden vorliegen. Diese Zelloberflächenglykoproteine werden von Genen innerhalb des MHC-Komplexes codiert. Die T-Zelle erkennt also einen Liganden, der als Komplex aus Peptid und MHC-Molekül vorliegt. Die CD4- bzw. CD8-Moleküle der jeweiligen T-Zellpopulation binden dabei an die strukturell unterschiedlichen MHC-Komplexe II und I. MHC-II-Moleküle kommen gewöhnlich auf BLymphozyten, dendritischen Zellen und Makrophagen vor. Deshalb dient die Erkennung hier vor allem der Effektorzell-Aktivierung mit anschließender Immunglobulin-Produktion bzw. Erregerzerstörung. MHC-I-Moleküle präsentieren Peptide von Krankheitserregern und kommen daher auf jeder Körperzelle vor. Infizierte Zellen werden so von zytotoxischen T-Zellen erkannt und eliminiert (54). 20 EINLEITUNG 1.2.4 Regulatorische Signale bei der T-Zellaktivierung Der Effekt von Antigen-Anzahl und T-Zell-Rezeptor-Triggering ist beeinflusst von verschiedenen kostimulierenden und regulatorischen Vorgängen. Viele molekulare Interaktionen geschehen zu verschiedenen Zeitpunkten der Aktivierung und tragen zu den verschiedenen Facetten der HomöostaseKontrolle bei (34). CD28/CD80/CD86- und CD40/CD154-Interaktionen sind entscheidend für die Initiation der Immunantwort (1;117). Zytotoxische T-Zellen, die mit Zeitverzögerung nach der T-Zell-Aktivierung vermehrt freigesetzt werden, sind vor allem wichtig zur Ausbildung des T-Zell-Gedächtnisses (101). 4-1BBL/CD137, OX40(CD134)/OX40L und ICOS/B7h/B7RP-1 Interaktionen dagegen treten während späterer Stadien der Immunantwort auf (3;7;60). PD1 (Programmed death), das auf aktivierten B- und T-Zellen exprimiert ist, verwendet die Liganden PD-L1 und PD-L2, die vor allem auf Makrophagen und dendritischen Zellen vorkommen, um die Selbsterkennung und Autoimmunität zu modulieren (84;94). Die T-Zell-Aktivierung kann ebenso durch andere Wege als nur durch TCR/Antigen-Interaktionen reguliert werden. Eine große Anzahl an Molekülen, die zur Tumor-Nekrose-Faktor-Rezeptor (TNFR)-Familie gehören, oder T-ZellImmunglobulin (Ig) und Mucin-Domänen enthaltende Moleküle sind ebenso beteiligt an der Regulation der T-Zell-Funktion und an der MakrophagenAktivierung (55;62;93). Forschungsprojekte zur Regulation der angeborenen Immunantwort auf Pathogene und Antigene haben gezeigt, dass die Feinabstimmung vor allem von Rezeptormolekülen unterschiedlichster Genfamilien abhängt, die Substanzen mit einer Expression gegensätzlicher Funktionen codieren. Als Beispiel seien inhibierende und aktivierende Signale genannt, das frühe funktionell cytoplasmatische ITIM- (Immunoreceptor tyrosine-based inhibitory motif) Motiv und das spätere Signaling mittels DAP10/DAP12, die gemeinsam auf der CD200R-Transmembran-Domäne vorkommen (64;107). Eine Vielzahl solcher Rezeptoren sind beschrieben, die sowohl zu der Ig- und Lectin-Superfamilie gehören. Sie erkennen Moleküle, die allgegenwärtig exprimiert werden, wie MHC-I (63), die N-Acetyl-Neuraminsäure (20), CD47 (80) und das später beschriebene CD200 (5). Forschungsdaten zeigen, dass die Bindung von CD200 an CD200R1 die Phosphorylierung von 21 EINLEITUNG ITIM zur Folge hat, während die Triggerung von CD200R2/3 zum Signaling via DAP12 führt (5;121;123). Eine populäre Theorie besagt, dass die inhibierenden Signale dieser Rezeptormoleküle eine Schlüsselrolle bei der Selbst-Toleranz spielen (64;80). Alternative Signale, sogenannte Pattern-Recognition Receptors, können diese inhibierenden Motive umgehen und zur Aktivierung führen (2;51;75). Postuliert man, dass sowohl die aktivierenden als auch die inhibierenden Isoformen zu der Ig- und Lectin-Superfamilie gehören, kann ein gewisser Grad der Selbstregulation über diese Familienmitglieder angenommen werden. 1.2.5 Tumor-assoziierte Antigene (TAA) in der CLL Als etabliert anzusehen, ist die Theorie, dass T-Lymphozyten in der Lage sind, Tumorzellen spezifisch zu erkennen (89;113). Es wird vermutet, dass die meisten, wenn nicht alle Tumorarten, Antigene exprimieren, die zytotoxische TZellen (CTL) potenziell angreifen können. Bezugnehmend auf Vonderheide et al. muss ein tumor-assoziiertes Antigen überexprimiert im Vergleich zu gesunden Zellen oder neu exprimiert in den Tumorzellen vorliegen. Außerdem muss das TAA Peptidsequenzen einschließen, die MHC-Moleküle binden, um die T-Zellaktivierungskaskade starten zu können (114). Im Gegensatz zu vielfältigen TAAs, die für das Melanom beschrieben sind, wie die MAGE-Gruppe (92), wurde bei der Chronischen Lymphatischen Leukämie erst eine geringe Anzahl von tumor-assoziierten Antigenen gefunden. Survivin, ein Inhibitor aus der Apoptose-Genfamilie (IAP), gilt als TAA in der CLL. Schmidt et al. beschrieben, dass Survivin-spezifische CTLs die Lyse von CLLZellen induzieren konnten (95). KW13 oder Formin-like Protein (FMNL) ist ebenfalls hochexprimiert in CLL-Zellen. Auch hier konnten Peptid-spezifische CTLs generiert werden, die jedoch nicht zur Lyse von CLL-Zellen beitrugen (61). Mayr et al. belegten, dass Fibromodulin, ein Protein der Extrazellularmatrix von kollagenreichen Geweben, ebenfalls die Expansion tumorspezifischer TZellen ermöglichte. Die Effizienz der Immunantwort bei Mayr et al. konnte durch eine Transduktion der CLL-Zellen mit CD40L-rAAV noch verbessert werden. Fibromodulin ist wie KW13 und Survivin in CLL-Zellen überexprimiert (71;72). Die Chronische Lymphatische Leukämie ist, wie zuvor beschrieben, häufig mit Hypogammaglobulinämien und Autoimmunphänomenen assoziiert. Humorale 22 EINLEITUNG oder zelluläre Antitumor-Effekte kommen dagegen äußerst selten vor. Tumorassoziierte Antigene, die von zytotoxischen T-Zellen erfolgreich erkannt werden, könnten im Rahmen von Immuntherapien als Angriffsort genutzt werden (53). 1.3 T-Zell-Defekte in der CLL Im Rahmen der Chronischen Lymphatischen Leukämie entstehen nicht nur immunologisch inkompetente monoklonale B-Zellen, auch im T-Zell-System sind inadäquate Immunantworten und Homöostasedefekte beschrieben (6;96). Die absoluten T-Zell-Zahlen bei CLL-Patienten sind entweder normal oder eher erhöht. Vor allem die CD8-positive Population liegt vermehrt vor, so dass ein Ungleichgewicht im Verhältnis zwischen CD4-positiven und CD8-positivenZellen entsteht (48;58;99). Ansteigende CD8-positive Zellzahlen scheinen zu korrelieren mit der Progression der Erkrankung (109). Obwohl eine eher erhöhte T-Zell-Anzahl beobachtet wurde, scheint die AntigenExpression zum Beispiel von CD3 oder TCR αβ vermindert zu sein. Auch CD4 und CD8 scheinen weniger exprimiert vorzuliegen, ganz im Gegensatz zu einer erhöhten Expression von HLA-DR (23). Ein erhöhtes Vorkommen von Zytokinen wie TGF ß oder Interleukin 10 durch T-Zellen bei CLL-Patienten wurden beschrieben (29;68). In-Vitro-Studien haben gezeigt, dass gesunde BZellen in Ko-Kultur mit CLL-T-Zellen nicht fähig waren, Immunglobuline zu produzieren (49). Umgekehrt wurde bewiesen, dass die Ig-Produktion signifikant erniedrigt war, wenn normale T-Zellen mit CLL-B-Zellen kooperierten (66). Die Expression des Fas-Liganden wird ebenfalls als immunsuppressiver Faktor in der Chronischen Lymphatischen Leukämie diskutiert. Der Fas-Rezeptor wird vermehrt auf den T-Zellen von CLL-Patienten exprimiert, doch vor allem die CD4-positiven Zellen werden durch Apoptose eliminiert, was eine Korrelation zwischen Fas-Sensibilität und dem CD4+/ CD8+ Verhältnis suggeriert (106). Die Studie von Görgün et al. zeigte signifikante Unterschiede in der GenExpression von CD4- und CD8-positiven Lymphozyten, die hauptsächlich Veränderungen in der CD4-Zell-Differenzierung und Defekte im Zytoskelett, „Vesicle-Trafficking“ und der Zell-Zytotoxizität von CD8-positiven Zellen nach 23 EINLEITUNG sich ziehen (40). Zytotoxische T-Zellen führen die Zerstörung von malignen Zellen mittels gerichteter Freisetzung von apoptoseinduzierenden Proteinen wie Perforin oder Granzym aus lytischen Lysosomen herbei. Dieser Vorgang ist abhängig von Konformationsveränderungen der zytoskelettalen Verbindungen, die in der CLL geblockt zu sein scheinen (12;100;116). Görgün et al. stellten desweiteren in Ko-Kultur-Experimenten von gesunden T-Zellen mit CLL-Zellen fest, dass die zuvor beschriebenen T-Zell-Defekte während der Kultivierung auch in den gesunden T-Zell-Populationen auftraten. Diese Veränderungen entwickelten sich nur nach direktem Zellkontakt und nicht zytokinvermittelt (40). Abnormalitäten in beiden Systemen – sowohl im B- als auch im T-ZellKompartiment – führen außerdem zur Unfähigkeit des Immunsystems, leukämische Zellen zu erkennen und zu zerstören. Als Beispiel ist CD40-Ligand (CD40L) – ein wichtiges Molekül für die T-Zell-Aktivierung – herunterreguliert auf den T-Zellen von CLL-Patienten (15). LFA1 – ebenfalls wichtig für T-ZellInteraktionen – ist gleichfalls niedriger exprimiert bei CLL-Patienten als bei gesunden Probanden. Die T-Zell-Rezeptor-Repertoires bei CLL-Patienten unterscheiden sich signifikant und können mit als Erklärung für ineffektive Immunantworten auf CLL-assoziierte Antigene dienen. Eine Minderexpression von CD28 und CD152 wurde ebenfalls beschrieben (97). Außerdem konnte ein reduziertes Signaling via T-Zell-Rezeptor CD3ζ-Signaling in in-Vitro- Experimenten nachgewiesen werden (90). Zuletzt führt auch eine Chemotherapie zum Beispiel mit Fludarabin oder Alemtuzumab sowohl zu einer Zerstörung der B- als auch der T-Zell-Reihe und damit zu einer Immuninkompetenz (112). Fludarabin senkt dabei vor allem den Anteil der regulatorischen T-Zellen (8). Fortschreitende T-Zell-Dysfunktionen korrelieren mit dem Verlaufsgrad der CLL (96). Eine effiziente T-Zell-Immunantwort könnte helfen, leukämische Zellen zu zerstören. Außerdem könnte eine erhöhte Anzahl immunkompetenter Abwehrzellen Begleitinfektionen verhindern und Anti-Tumor-Effekte fördern. 24 EINLEITUNG 1.4 CD200 und CD200R Vielfältige Zell-Oberflächen-Rezeptoren spielen eine Rolle bei der Kontrolle der Immunfunktion via positivem oder negativem Signaling. CD200 ist gewöhnlich auf Thymozyten, T- und B-Lymphozyten, dendritischen Zellen, Neuronen und endothelialen Zellen exprimiert. Es bindet an die Gruppe der CD200Rezeptoren (CD200R), die vor allem auf Zellen der myeloiden, aber auch der lymphoiden Reihe (T-Lymphozyten) exprimiert sind (34). Barclay et al. beschrieben 1981, dass CD200 ein Typ1 Membran-Glykoprotein der Ig-Supergen-Familie sei (4). Mittlerweile ist bekannt, dass CD200 oder wie früher bezeichnet OX2 40% Homologien in der Aminosäuresequenz mit CD80/86 zeigt (11). Der zytoplasmatischen Domäne und der transmembranären Domäne fehlen Signaling-Motive, die als Andockstation für andere Moleküle dienen könnten. Der CD200-Rezeptor verfügt jedoch über diese Signaling-Motive (37;121). CD200: Mitglied der Ig-Supergen-Familie 111 AS NH² V-Region 91 AS 27 AS 19 AS Invariante Asp-N-Stellen CH²-Domäne TM Cy Schematische Repräsentation der CD200R-Familie: V-Region C-Region TM Cy COOH Andockstelle für ITIM CD200R1 (326 AS) V-Region C-Region TM Cy COOH Andockstelle für DAP10/12 CD200R2-4 (~250 AS) Abbildung 1.3: Struktur von CD200 und der CD200R-Familie 25 EINLEITUNG Die Loci, die für CD200 und CD200R kodieren, liegen beide auf Chromosom 3 des Menschen. An dieser Stelle befinden sich noch weitere Loci für transmembranäre Proteine der Ig-Superfamilie. Während CD200 nur als einzelne Kopie vorliegt, existieren diverse Kopien des CD200-Rezeptors (5;37;46;121). Vielfältige Studien zeigten, dass CD200 wohl immunsuppressive Eigenschaften mit trägt (34). Manipulationen in der CD200:CD200R-Interaktion könnten deshalb Immunantworten innerhalb vieler Krankheitsprozesse modifizieren. CD200 gilt als prognostischer Faktor in der Akuten myeloischen Leukämie und beim Multiplen Myelom (77;108). Außerdem scheint es ko-exprimiert vorzuliegen mit CSC-Markern wie CD44 oder CD133. Als CSC (Cancer stem cells) wird eine Subpopulation von malignen Zellen bezeichnet, die konventionelle Chemotherapiestrategien überleben (56). 1.5 Zielsetzung der Promotionsarbeit In der vorliegenden Promotionsarbeit soll die Rolle des immunsuppressiven Moleküls CD200 in der Pathogenese der CLL und die des CD200-Antikörpers (1B9 rat anti hCD200 Lot 1, Trillium Therapeutics Inc., Toronto, Kanada) als Therapiekonzept in der Chronischen Lymphatischen Leukämie evaluiert werden. Die Suppression von T-Zell-Effektoren erfolgt im Rahmen der Pathogenese dieser Leukämieform und ist zentraler Ansatzpunkt des der Arbeit zugrunde liegenden Therapiegedankens. Zunächst wird der Nachweis der Überexpression von CD200 auf CLL-Zellen angestrebt. Desweiteren wird eine mögliche Zytotoxizität eines CD200Antikörpers auf CLL-Zellen untersucht. Mit einer Blockade der CD200:CD200R Interaktionen von CLL-Zellen mit autologen T-Zellen soll die Proliferation von T-Zellen in einem MixedLymphocyte-Reaction-Modell untersucht werden. Der Einfluss von CD200 auf die Generierung einer TAA-spezifischen Immunantwort soll mittels ELIspot untersucht werden. Abschließend wird der Einfluß von CD200 auf die T-Zellsubpopulationen, insbesondere zytotoxische und regulatorische T-Zellen ermittelt. 26 MATERIALIEN UND METHODIK 2. MATERIALIEN UND METHODIK 2.1 Materialien 2.1.1 Geräte Analysenwaage BL310, Sartorius, Göttingen, D Autoklav Varioklav, Oberschleißheim, D Begasungsbrutschrank Heraeus, Hanau, D Bestrahlungsgerät Biobeam 8000 Eckert & Ziegler BEBIG, Berlin, D Durchflusszytometer FACS Canto, BD, Erembodegem, B Einfrierbox Nunc GmbH & Co. KG, Wiesbaden, D Eismaschine Scotsman, Vernon Hills, IL, USA ELIspot-Reader ScanPrecision HP, Palo Alto, Kalifornien, USA Handstückzähler IVO, Villingen-Schwenningen, D Kühlschrank (4°C) Bosch, Gerlingen-Schillerhöhe, D Kühltruhe (-20°C) Bosch, Gerlingen-Schillerhöhe, D Kühltruhe (-80°C) Heraeus, Hanau, D Mikroliterpipetten Gilson, Middleton, WI, USA 12-fach-Pipette Finnpipette, Thermo Electron, Waltham, MA, USA Mikroskop ,Telaval 31’, Zeiss, Oberkochen, D Multipette ,HandyStep’, Brand, Wertheim, D Neubauer-Zell-Zählkammer Brand, Wertheim, D Pipettierhilfe (elektrisch) ‚accu-jet’, Brand, Wertheim, D 27 MATERIALIEN UND METHODIK Schüttler UniEquip ‚UNITWIST’, München, D Sterilbank Microflow; clanLAF VFR1206GS, DK Stickstofftank Arpege 140 Air Liquide, Düsseldorf, D Vortexer ‘Vortex-Genie2’, SCIENTIFIC INDUSTRIES, Bohemia, NY, USA Wasserbad P-D Industriegesellschaft mbH, Dresden, D Zentrifugen (Rotoren) - Centrifuge 5415 D, Eppendorf, Hamburg, D - Centrifuge 5415 R, Eppendorf, Hamburg, D - Centrifuge 5402, Eppendorf, Hamburg, D - Minifuge T, Heraeus, Hanau, D - JG-ME, Beckman Coulter, Fullerton, CA, USA 2.1.2 Verbrauchsmaterialien 6-Loch-Platten Nunc GmbH & Co. KG, Wiesbaden, D 96-Loch-Platten Sarstedt, Nümbrecht, D MultiScreen-Platten Millipore Corporation, Bedford, MA, USA Deckgläser Thermo electron corporation, Waltham, MA, USA Einwegpipettenspitzen Brand, Wertheim, D; Sarstedt, Nümbrecht, D Einwegpipettenspitzen (gestopft) ART Molecular BioProducts, San Diego, CA, USA Eppendorf, Hamburg, DReaktionsgefäße (1,5 ml + 2 ml) Eppendorf, Hamburg, D; Sarstedt, Nümbrecht, D FACS-Röhrchen (5 ml, Rundboden) BD Falcon, Erembodegem, B Falcon-Reaktionsgefäße (15 ml + 50 ml) Sarstedt, Nümbrecht, D Gewebekulturflaschen (25 cm² + 75 cm²) Sarstedt, Nümbrecht, D 28 MATERIALIEN UND METHODIK Cryotubes Nunc GmbH & Co. KG, Wiesbaden, D Latex-Handschuhe Meditrade ‚Gentle Skin’, Kiefersfelden, D Nitril-Handschuhe (puderfrei) Meditrade ‚Nitril 3000’, Kiefersfelden, D Objektträger Engelbrecht ‚VWR SuperFrost plus’, Edermünde, D Pasteurpipetten Brand, Wertheim, D PVDF-Membran ‚Hybond’, Amersham Biosciences, Buckinghamshire, England, UK serologische Pipetten (2, 5, 10, 25 ml) Sarstedt, Nümbrecht, D Sterilfilter (0,20 µm) ‚Sartolab – P20’, Sartorius, Göttingen, D Tücher (Kimwipes) Kimberly-Clark, Forchheim, D 2.1.3 Chemikalien, Bioreagenzien und Baukästen 2 mM dNTP Mix Fermentas, St. Leon-Rot, D Annexin V Binding Buffer, 10x Concentrate BD BIOSCIENCES, Erembodegem, B Cellwash (f. FACS) BD BIOSCIENCES, Erembodegem, B CellTrace™ CFSE Cell Proliferation Kit Invitrogen Corporation, Karlsruhe, D Dinatriumhydrogenphosphat ROTH, Karlsruhe, D Dimethylsulfoxid ROTH, Karlsruhe, D Essigsäure ROTH, Karlsruhe, D ELIspot-KIT for Human Interferon-γ MABTECH AB, Nacka Strand, S Ethanol (99,8%) ROTH, Karlsruhe, D Ficoll-Paque Plus GE Healthcare Biosciences AB, Uppsala, S Fötales Kälberserum (FCS) Gibco BRL, Paisley, Schottland 29 MATERIALIEN UND METHODIK PE anti-human Foxp3 Staining Set NatuTec, eBioscience, Frankfurt a. M., D IMDM-Medium Gibco Invitrogen, Carlsbad, CA, USA Isopropanol/2-Propanol ROTH, Karlsruhe, D Natriumchlorid Merck, Darmstadt, D PBS (D-PBS) Gibco (Invitrogen), Paisley, Scotland, UK RosetteSep – Human B-Cell Enrichment Cocktail STEMCELL TECHNOLOGIES INC, F RosetteSep – Human T-Cell Enrichment Cocktail STEMCELL TECHNOLOGIES INC, F RPMI 1640 + L-Glutamin Gibco Invitrogen, Carlsbad, CA, USA Streptavidin Sigma, Steinheim, D Trypanblau Merck, Darmstadt, D Wasser, steril Braun, Melsungen, D; Fermentas, St. Leon-Rot, D Zellfixierung (CellFIX) BD BIOSCIENCES, Erembodegem, B 2.1.4 Enzyme, Proteine, Immunreagenzien und Inhibitoren 7-AAD BD BIOSCIENCES, Erembodegem, B Annexin V-FITC BD BIOSCIENCES, Erembodegem, B Anti-Human HLA ABC-Antigen W 6/32 Dako, Glostrup, Dänemark β2-Microglobulin Sigma, Steinheim, D FMOD 1 LLLAGLFSL FMOD 2 YLQHNEIQEV Gene Center, Ludwig-MaximilianUniversität, München Gene Center, Ludwig-MaximilianUniversität, München Proimmune, Oxford, UK 30 MATERIALIEN UND METHODIK HLA-A0201–binding peptide MAGE-3 (271-279): FLWGPRALV Gene Center, Ludwig-MaximilianUniversität, München Gene Center, Ludwig-MaximilianUniversität, München Proimmune, Oxford, UK Gene Center, Ludwig-MaximilianUniversität, München Proimmune, Oxford, UK Interleukin 2 Cell Concepts, Umkirch, D Interleukin 7 Cell Concepts, Umkirch, D KW 13 AF432213 Gene Center, Ludwig-MaximilianUniversität, München Staurosporin Sigma, Steinheim, D Trypsin Sigma, Steinheim, D FMOD 3 YMEHNNVYTV FMOD 4 YLLDLSYNHL 2.1.5 Antibiotika Penicillin Sigma, Steinheim, D Streptavidin Sigma, Steinheim, D 2.1.6 Antikörper 1B9 rat anti hCD200 Lot 1 Trillium Therapeutics Inc., Toronto, Kanada anti-human CD3 FITC/ CD3 PE/ CD3 APC-Cy 7 BD BIOSCIENCES, Erembodegem, B anti-human CD4 APC/ CD4 FITC BD BIOSCIENCES, Erembodegem, B anti-human CD5 APC BD BIOSCIENCES, Erembodegem, B anti-human CD8 PC-5/ CD8 FITC BD BIOSCIENCES, Erembodegem, B anti-human CD14 APC BD BIOSCIENCES, Erembodegem, B anti-human CD19 FITC/ CD19 PC-5/ BD BIOSCIENCES, Erembodegem, CD19 PE-Cy 7 B 31 MATERIALIEN UND METHODIK anti-human CD25 FITC BD BIOSCIENCES, Erembodegem, B anti-human CD27 PE BD BIOSCIENCES, Erembodegem, B anti-human CD34 PC-5 BD BIOSCIENCES, Erembodegem, B anti-human CD56 PE BD BIOSCIENCES, Erembodegem, B anti-human CD69 PE BD BIOSCIENCES, Erembodegem, B anti-human HLA-A2 Antikörper BD BIOSCIENCES, Erembodegem, B FITC anti-mouse IgG BD BIOSCIENCES, Erembodegem, B PE anti-rat BD BIOSCIENCES, Erembodegem, B PE-Cy5 (PC5) anti-human CD19 BD BIOSCIENCES, Erembodegem, B 2.1.7 Verwendete Zelllinien CD40L-Feeder Layer: Maus-Fibroblasten, Ausgangsvektor pME18S-neo, Nukleinsäure CD40L Human (31) T2-Zellen: DSMZ – Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH, Braunschweig 2.1.8 Verwendete Software Adobe Acrobat Reader 6.0 BD FACSdiva Software Version 4.1.2 ELI.Analyse 4.0 Microsoft Office 2000 Reference Manager 10 SigmaPlot 2001 32 MATERIALIEN UND METHODIK 2.2 Methodik 2.2.1 Patienten Zwischen Oktober 2005 und Juli 2007 wurden 35 Patienten in die experimentelle Studie eingeschlossen. Sie erfüllten die diagnostischen und immunophänotypischen Kriterien einer B-CLL und waren entweder nicht vortherapiert oder seit mindestens sechs Monaten ohne Therapie. Ihnen wurde im Rahmen von weiteren klinischen Blutuntersuchungen 20 ml Heparin-Blut abgenommen und unverzüglich weiterverarbeitet. Die Blutentnahme erfolgte im informativen Einverständnis der Patienten nach der Deklaration von Helsinki und wurde von der Ethikkommission der Universität zu Köln genehmigt. 2.2.2 Konzept der experimentellen Studie Aus Vollblut von CLL-Patienten wurden PBMCs, B-Zellen und T-Zellen mittels Ficoll-Dichtegradientenzentrifugation und B- bzw. T-Zell-Rosette-Separation gewonnen. FACS-Analysen der PBMCs gaben Aufschluss über die T- und BZellzahlen, die Aufteilung der Populationen und den HLA-Status. HLA-A2positive Proben mit einem relativ hohen T-Zellgehalt konnten in die Versuchsreihe eingeschlossen werden. Die T-Zellen wurden in Six-Well-Plates kultiviert und in Anlehnung an Mayr et al. nach einem bestimmten Schema aktiviert und restimuliert (71;72). Die Aktivierung erfolgte mit CD40-Ligand (CD40L)-stimulierten B-Zellen, die zum Teil mit aufsteigenden CD200Rezeptorenblocker-Konzentrationen versetzt waren. Zur Kontrolle erfolgte die Stimulation mit nicht aktivierten B-Zellen im vorletztem Well und das letzte Well enthielt eine reine T-Zellkultur. CFSE-Färbungen verifizierten den Teilungsprozess der T-Zellpopulationen. CD40 L + 1μg/ml CD200AK CD40 L + 5μg/ml CD200AK CD40 L ohne CD200Block Unstimulierte B-Zellen CD40 L + 10μg/ml CD200AK Nur TZellen Grafik 2.1: T-Zell-Expansion in der Six-Well-Plate 33 MATERIALIEN UND METHODIK Die Stimulation erfolgte an Tag 1, Tag 7 und Tag 14. Zuvor wurden jeweils die Zellzahlen am Mikroskop ermittelt und mit Hilfe von FACS-Analysen der prozentuale T- und B-Zellanteil ermittelt und dokumentiert. Die absoluten Zellzahlen der jeweiligen Population ließen sich mit Hilfe dieser Daten berechnen. Nach Ermittlung des effektivsten CD200-Blocks wurde ausschließlich mit der 5 μg/ml-Konzentration restimuliert, so dass sich die Well-Anzahl auf vier verringerte. Um festzustellen, ob spezifische T-Zellen expandiert worden waren, wurde das ELIspot-Verfahren eingesetzt. Der Anteil regulatorischer T-Zellen nach Versuchsende wurde mittels FOX P3-Färbung im FACS deskriptiv dargestellt. Desweiteren wurde die Zytotoxizität des CD200-Antikörpers mit Annexin 5- und 7-AAD-FACS-Analysen kontrolliert. - T- und CLL-Zellisolation Einfrieren der CLL-Zellen Kultivierung der T-Zellen Vorstimulation der CLLZellen mit CD40-Ligand Tag 0 Beginn der Mixed lymphocyte reaction (MLR) mit CD40Laktivierten CLLZellen und AntiCD200Blockade Tag 7 Restimulation der MLR mit CD40Laktivierten CLLZellen und AntiCD200Blockade ELIspot-Assay für Fibromodulin, MAGE3, KW13 Tag 14 Tag 21 Restimulation der MLR mit CD40Laktivierten CLLZellen und AntiCD200Blockade Grafik 2.2: Konzept der Mixed lymphocyte reaction und T-Zell-Expansion 34 MATERIALIEN UND METHODIK 2.2.3 Versuchsprotokolle 2.2.3.1 Ficoll-Dichtegradienten-Zentrifugation Die Dichtegradientenzentrifugation ist ein Prinzip, bei der Blutbestandteile anhand ihrer Dichte voneinander getrennt werden. Mit Hilfe eines Separationsmediums definierter Dichte, hier Ficoll Paque PLUS, können die einzelnen Populationen voneinander isoliert werden. Blutzellen, deren Dichte höher ist als die Mediumdichte (Erythrozyten und Granulozyten), durchwandern das Separationsmedium, während sich Lymphozyten und Monozyten in einer weißlich erscheinenden Interphaseschicht oberhalb des Mediums ablagern. Die sehr leichten Thrombozyten verbleiben in der Plasmaphase (69). Plasmaphase mit Thrombozyten Lymphozyten, Monozyten Ficoll-Separationsmedium Erythrozyten, Granulozyten Grafik 2.3: Darstellung der Phasen nach der Dichtegradientenzentrifugation Protokoll: 1. Zuerst musste das Vollblut aus dem Heparin-Blutröhrchen in einen 50 ml Falcon pipettiert werden. Dann wurde es 1:1 mit D-PBS verdünnt. 2. Nun wurde ein weiteres 50 ml Falcon zur Hälfte mit Ficoll-Paque PLUS befüllt. 35 MATERIALIEN UND METHODIK 3. In einem weiteren Schritt wurde das Blut-PBS-Gemisch vorsichtig in das mit Ficoll befüllte Falcon pipettiert. 4. Dann erfolgte die 30-minütige Zentrifugation bei 2300 rpm und einer Temperatur von 25°C. 5. Die Mono-/Lymphozytenschicht wurde nach Beenden der Zentrifugation abpipettiert und in ein weiteres bereitgestelltes Falcon umgefüllt. 6. Nach dem Auffüllen mit D-PBS wurde das Mono-/Lymphozytengemisch bei 1500 rpm und 22°C zehn Minuten zentrifugiert. 7. Zum Schluss musste das Zellpellet im Falcon mit Medium (IMDM mit 1% Penicillin/Streptomycin, 10% FCS) resuspendiert werden. Nun standen die separierten Zellen zur Weiterverarbeitung zur Verfügung. 2.2.3.2 Rosette-Separation Das RosetteSep-Medium koppelt die ungewünschten Zellen im menschlichen Vollblut an mehrere Erythrozyten. Dadurch erhöht sich deren Dichte. Es bilden sich um die unerwünschten Zellen sog. „Immunorosetten“, so dass diese Zellen bei einer Dichte-Gradienten-Zentrifugation in die Bereiche der roten Blutbestandteile absinken (69). Protokoll: 1. Vollblut wurde aus einem Heparin-Blutröhrchen in ein 50 ml Falcon pipettiert und die B- bzw. T-RosetteSep-Mixtur in entsprechender Konzentration (50 μl/ml Blut) dazu gegeben. 2. Nun erfolgte eine 20-minütige Inkubation bei Raumtemperatur unter gelegentlichem Schütteln. 3. Die weiteren Schritte gleichen dem Dichtegradientenzentrifugationsprotokoll. 2.2.3.3 Zellzählung Die Zellzahlbestimmung erfolgte mit Hilfe der Neubaukammer und Anfärbung mit Trypan-Blau. Trypan-Blau durchdringt die Zellmembran toter Zellen und färbt sie so an. Gezählt wurden demnach alle ungefärbten Zellen in den vier großen Quadranten der Neubaukammer. Dafür wurden 90 μl Trypan-Blau mit 10 μl der Blutzellen in IMDM in einem Glasröhrchen vermengt und 10 μl der 36 MATERIALIEN UND METHODIK Suspension in die Neubau-Zählkammer pipettiert. Die Gesamtzellzahl pro Milliliter errechnete sich anhand folgender Formel: X/4 x n x 104 = Zellzahl /ml X: Anzahl der gezählten Zellen n: Verdünnungsfaktor (10) Die Gesamtzellzahl im Medium wurde durch Multiplikation mit der Suspensionsmenge in ml ermittelt (69). 2.2.3.4 Kryokonservierung Jeweils 1.000.000 bis 100.000.000 Zellen wurden in 2 ml Kryo-Tubes eingefroren. Protokoll: 1. Die gewonnene Zellsuspension wurde im 50 ml Falcon mit PBS aufgefüllt und bei 1500 rpm und Raumtemperatur 10 Minuten zentrifugiert. 2. Das Zellpellet wurde anschließend mit FCS und 10% DMSO gelöst und auf die Kryotubes verteilt. 3. Die Gefrierung erfolgte mittels Einfrierbox in der –80°C-Kühltruhe über 24 Stunden mit anschließender Überführung in den Stickstofftank. 2.2.3.5 FACS (Fluorescence-Activated-Cell-Sorter) FACS oder die Durchflusszytometrie dient der Absolut-Zellzahlbestimmung, der Lymphozytentypisierung oder anderen funktionellen Untersuchungen und DNAZellzyklusanalysen. Die zu untersuchenden Blutzellen werden mit spezifischen Antikörpern gegen Zellbestandteile markiert. Diese Antikörper sind mit einem Fluoreszenzfarbstoff gekoppelt (direkte Markierung) bzw. werden mit einem fluoreszenzgekoppelten Sekundärantikörper (indirekte Markierung) nachgewiesen. Im FACS-Gerät (FACS Canto von BD) werden tausende Zellen innerhalb kürzester Zeit einzeln in einem laminaren Probenstrom an einem Argon-Ionen-Laser vorbei geleitet und charakterisiert. Der Laser im FACS-Gerät regt die gekoppelten Fluoreszenzfarbstoffe an, Licht in einer bestimmten Wellenlänge zu emittieren. Pro Fluoreszenzfarbstoff wird so ein spezifisches Signal erzeugt und analysiert. 37 MATERIALIEN UND METHODIK Fluoreszenzfarbstoffe Wellenlängenbereich Fluorescein-Isothiocyanat (FITC) 530 nm Phycoerythrin (PE) 575 nm Allophycocyanin (APC) 660 nm Pe-Cy 5 Tandemkonjugat (PE+Cyanin 5) 670 nm APC-Cy 7 Tandemkonjugat 595 - 647 nm (APC+Cyanin 7) PE-Cy 7 Tandemkonjugat (PE+Cyanin 7) 488 nm Tabelle 2.1: Wellenlängenbereich der verwendeten Fluoreszenzfarbstoffe Desweiteren gibt das FACS Aussagen über Größe und Granularität der Zellen wieder. Nach vorne abgelenkte Strahlen des Lasers sind ein Maß für die Größe der gemessenen Zellen und Partikel: Vorwärtsstreulicht [Forward-Scatter (FSC)]. Das im 90°-Winkel abgestrahlte Seitwärtsstreulicht [Side-Scatter (SSC)] ist ein Maß für die Zellgranularität (69). Protokoll: 1. 1.000.000 Zellen gelöst in IMDM aus der zu analysierenden Probe wurden in ein FACS-Falcon pipettiert. 2. Dann wurde das definierte Antikörpergemisch zu der Zellsuspension gegeben und vermengt. 3. Nun erfolgte eine mindestens 10-minütige Inkubation bei 4°C. 4. Die Zellsuspension wurde mit 2 ml Cellwash aufgefüllt und im Anschluss 6 Minuten bei 1500 rpm und Raumtemperatur zentrifugiert. 5. Der Überstand im Falcon wurde abgekippt, gegebenenfalls bei einer indirekten Färbung das Protokoll mit dem Sekundärantikörper wiederholt, ansonsten wurden die Zellen in 300 μl Cellwash resuspendiert. 6. Nun erfolgte die Messung am Durchflusszytometer. Verwendeter Fluoreszenzgekoppelter Volumen der Antikörper Antikörpersuspension Bedeutung des Markers CD3 FITC/ CD3 PE/ CD3 T-Zell-Antigen-Rezeptor, APC-Cy 7 Je 2 μl Signaltransduktion Ko-Rezeptor für MHCKlasse- II-Moleküle; CD4 APC/ CD4 FITC Je 2 μl Signaltransduktion 38 MATERIALIEN UND METHODIK CD5 APC Ly1, mögliche Co-Rezeptor Funktion; Scavenger Rezeptor, Adhäsion, bindet CD72 Co-Rezeptor für MHCKlasse-I –Moleküle Rezeptor für LipopolysaccharidKomplex und LipopolysaccharidBindungsprotein (LBP); Monozytenmarker Im Komplex mit CD21 (CR2) und CD81 (TAPA1); Ko-Rezeptor für BZellen CD8 PC-5/ CD8 FITC Je 2 μl 2 μl 1:100 verdünnt/ 2 μl CD14 APC Je 2 μl CD19 FITC/ CD19 PC-5/ CD19 PE-Cy 7 Je 2 μl CD25 FITC Je 2 μl CD27 PE Je 2 μl CD34 PC-5 Je 2 μl CD56 PE Je 2 μl CD69 PE CD200 AK + sek. AntiRat IgG PE HLA-A2 AK + sek. AntiMouse IgG FITC Je 2 μl Je 2 μl Annexin V Je 2 μl Unbekannt Menschliches Klasse IHistokompatibilitätsmolekül Verlust der Membranintegrität, Apoptose 7-AAD Je 2 μl Nekrosemarker 8 μl 1:10 verdünnt/ 2μl IL-2 Rezeptor α-Kette TNF-Rezeptor, bindet CD70 Ligand für CD62L (LSelektin), Adhäsion, Markierung für hämatopoietische Vorläuferzellen Adhäsionsmolekül, NKZell-Marker Unbekannt, frühes Aktivations- Antigen Tabelle 2.2: Verwendete Antikörpersuspensionen und deren Bedeutung (52) 2.2.3.6 Stimulation in der “Mixed Lymphocyte Reaction” (MLR) 1. An Tag 1 wurde die T-Zell-Suspension (IMDM; 10% FCS; 1% Penicillin/Streptavidin) nach T-RosetteSep zu je 3.000.000 Zellen auf eine Six-Well-Plate verteilt und kultiviert. Zusätzlich wurden CLL-Zellen zum Teil auf mit bestrahlten CD40L versetzten Feederzellen, zum anderen Teil unstimuliert im Brutschrank bei 37°C 24 Stunden kultiviert. 39 MATERIALIEN UND METHODIK 2. An Tag 2 wurden die CD40L stimulierten bzw. die nativen CLL-Zellen zu je 1.000.000 Zellen nach dem oben beschriebenem Studienprotokoll teilweise in bestimmten Konzentrationen mit Anti-CD200R versetzt und zu den T-Zellen gegeben. Allen mit CD40L stimulierten Zellen besetzten Wells wurden nach Methodikoptimierung FMOD2, FMOD4 (je 40 μg/ml) sowie β2-Microglobulin (1,5 μg/ml) hinzugefügt. Im Anschluss erfolgte die einwöchige Kultivierung unter Interleukin 2- und 7-Zusatz (IL2: 40 U/ml; IL7: 10 ng/ml) (71). 3. Nach der einwöchigen Kultivierung wurde nach Waschung und Zellverteilungs-Bestimmung mittels FACS das beschriebene Schema bis zur ELIspot-Auswertung an Tag 21 wiederholt. 2.2.3.7 ELIspot-Verfahren Das ELIspot-Verfahren (Encyme-linked-immuno-spot) ist ein einfaches und hochsensitives Verfahren, um eine Zellaktivierung auf Einzelzellniveau zu messen. Es ist vor allem sinnvoll zur Analyse spezifischer Immunantworten auf ganze Antigene oder Peptide. Bei der Zellaktivierung werden Zytokine, die der Zellkommunikation dienen, freigesetzt. Diese von den Zellen freigesetzten Proteine werden durch zwei monoklonale Zytokinantikörper als farbige Punkte detektiert, die unterschiedliche Epitope dieses Zytokins erkennen. Der eine der beiden Antikörper ist beim ELIspot an eine feste Phase gebunden, so dass es sich vom Prinzip her um einen Festphasen-ELISA handelt (69;78;120). 40 MATERIALIEN UND METHODIK Protokoll: 1. Der Test wurde in 96-Loch-Mikrotiterplatten durchgeführt. Als erster Schritt wurde ein hochaffiner monoklonaler Interferon-γ-Antikörper (1-D1K) über Nacht auf die Platte gegeben. YYYYYYYYY YYYYYYYYY 2. Es wurden für 24 bis 48 Stunden die expandierten MLR-Zellen in Gegenwart der Antigene (KW13, MAGE, FMOD1/2/3/4) kultiviert. Während dieser Zeit setzten die Zellen Zytokine frei, die an die Antikörper auf der Platte gebunden wurden. ************ ************ 3. Die Zellen wurden durch Waschen entfernt und ein biotinylierter Antikörper (7-B6-1Biotin), der ein zweites Epitop des Zytokins erkennt, für 2 Stunden hinzugegeben. YYYYYYYYY YYY YYYYYY 4. Streptavidin-ALP wurde für 1 Stunde nach Waschung hinzugefügt. YYYYYYYYY YYYYYYYYY ° ° ° 5. Ein präzipitierendes Substrat für Meerrettichperoxidase wurde zugegeben, bis dort Spots entstanden, wo eine antigenspezifische Zelle reagiert hatte. Die Spots wurden mit einem automatischen Bildanalyse-System detektiert (ELI.Analyse 4.0) und ausgezählt. Grafik 2.4: Protokoll der ELIspot-Auswertung 2.2.3.8 CFSE-Färbung Mit Hilfe einer CFSE-Färbung lassen sich die verschiedenen Zellpopulationen innerhalb einer Lymphozyten-Kultur unterscheiden. Carboxy-Fluorescein- diacetat-Succinimidyl-Ester (CFSE) enthält ein fluoreszierendes Molekül mit einer funktionellen Succimidyl-Ester-Gruppe und zwei Acetat-Gruppen. CFSE diffundiert frei in die Lymphozyten und intrazelluläre Esterasen spalten die Acetat-Gruppen, so dass der fluoreszierende Farbstoff freigesetzt wird. Die 41 MATERIALIEN UND METHODIK Zellfunktion wird durch CFSE in keinster Weise beeinträchtigt. Der Farbstoff verbleibt nun im Zytoplasma und wird bei jeder Zellteilung zur Hälfte mitgegeben. Die Fluoreszenz-Intensität verringert sich dadurch bei jeder Teilung um die Hälfte und lässt sich im FACS im FITC-analogen Kanal darstellen. Protokoll: 1. 30.000.000 Zellen wurden pro Färbung entnommen und auf 10 ml mit PBS aufgefüllt. Im Anschluss erfolgte die Zentrifugation bei Raumtemperatur (RT), 1400 rpm 5 Minuten lang. 2. Die Waschung wurde zweimal wiederholt. 3. Das entstehende Zellpellet wurde in 2 ml PBS aufgenommen. 4. Nun wurden 3 µl CFSE (Konzentration 0,5 mM) hinzugefügt. 5. Anschließend erfolgte eine 8-minütige Inkubation bei RT auf dem Schüttler. 6. Dann wurde die Probe auf 10 ml mit IMDM; 10% FCS; 1% Penicillin/Streptomycin aufgefüllt. 7. Es erfolgten drei Waschungen mit IMDM mit anschließender Pelletlösung, so dass 1.000.000 Zellen pro Well eingesetzt werden konnten. 8. Am ersten, dritten, fünften und siebten Tag erfolgte die Messung am FACS. 2.2.3.9 FOX P3-Färbung FOX P3, ein 49 bis 55 kDa-Protein, ist ein regulativer Transkriptionsfaktor und wird vor allem auf regulatorischen T-Zellen (Treg-Zellen) exprimiert. Treg-Zellen können im FACS anhand ihrer Färbeeigenschaften CD4+, CD25high und FOX P3+ dargestellt werden. Protokoll: 1. 1.000.000 Zellen wurden pro Färbung eingesetzt und mit den FACSAntikörpern Anti-CD25-FITC, -CD8-PC-5 und -CD4-APC gefärbt. 2. Nach 10-minütiger Inkubation und anschließender Waschung wurden 1 ml eBioscience Fixation-Permeabilization Puffer hinzugefügt. 3. Im Anschluss erfolgte die 30-minütige Inkubation im Kühlschrank. 42 MATERIALIEN UND METHODIK 4. Nach dreimaligem Waschen wurde mit 2%igem (2 µl) Rattenserum für 15 Minuten bei 4°C geblockt. 5. Ohne Waschung wurden 20 µl FOX P3-Antikörper hinzugegeben und es erfolgte eine weitere 30-minütige Inkubation im Kühlschrank. 6. Nach zwei Waschschritten konnten die Proben im FACS analysiert werden. 2.2.3.10 Zytotoxizitätsprobe mittels FACS Annexin V ist ein Protein, das eine hohe Affinität zu Phosphatidylserin zeigt und an Zellen bindet, die Phosphatidylserin präsentieren. Eine Annexin V-Bindung zeigt den Verlust der Membranintegrität an, die während der Apoptose entsteht. 7-Amino-Actinomycin-D (7-AAD) färbt im PC-5-Kanal sichtbar vor allem spätapoptotische oder nekrotische Zellanteile an. In der FACS-Analyse können also apoptotische Zellen, die zunächst Annexin V- (hier FITC-gelabelt) positiv und 7-AAD-negativ sind, von spätapoptotischen oder toten Zellen, die für beide Faktoren positiv sind, unterschieden werden. Die Zytotoxizitätsprobe für Anti-CD200R erfolgte mit PBMCs von CLLPatienten. Gleiche Zellanteile wurden in eine 96-Well-Plate pipettiert und mit aufsteigenden Konzentrationen (1 μl/ml, 5 μl/ml, 10 μl/ml, 20 μl/ml, 50 μl/ml) von Anti-CD200R und zur Kontrolle mit Staurosporin und einer nativen Probe versetzt. Die FACS-Analyse erfolgte nach 24, 48 und 72 Stunden. Die Suspensionen wurden mit 7-AAD und Annexin V versetzt und die Zellanteile im FITC und PC-5-Kanal gegatet. 2.2.4 Statistik Für die statistische Evaluierung wurde der SigmaPlot paired t-Test verwendet. Unterschiede wurden bei einem p-Wert ≤ 0,05 als signifikant betrachtet. 43 ERGEBNISSE 3. ERGEBNISSE 3.1 Überexpression von CD200 3.1.1 CD200-Expression bei CLL-Patienten und gesunden Probanden Um eine signifikante Rolle von CD200 in der Pathogenese der CLL postulieren zu können, war es notwendig, die Zelloberflächen-Expression von CD200 von CLL-Patienten und gesunden Probanden zu vergleichen. Um die Hypothese der Überexpression von CD200 zu verifizieren, wurden Proben von 25 gesunden Probanden und 33 CLL-Patienten mit dem 1B9 anti-CD200-Antikörper (Trillium Therapeutics, Toronto) sowie einem sekundären PE-gekoppelten Antikörper versetzt und durchflußzytometrisch analysiert. Alle Blutentnahmen erfolgten nach Feststellung des informativen Einverständnisses. Die LymphozytenPopulationen wurden mittels Ficoll-Dichtegradientenzentrifugation gewonnen und die CD3-, CD5-, CD19- und CD200-Expression durchflusszytometrisch ausgewertet. Alle Proben der CLL-Patienten zeigten im FACS eine deutlich erhöhte Expression der leukämischen Zellen im Vergleich zu den patienteneigenen T-Zellen sowie den B-Zellen der gesunden Studienteilnehmer. B-Zellen T-Zellen Grafik 3.1: CD200-Expression, beispielhaft gezeigt bei einem CLL-Patienten (Probe 8403) und einem gesunden Probanden (Probe 8528) 44 ERGEBNISSE Die PE-Mean-Werte bei den CLL-Patienten reichten von 2,431 bis 25,47, die der gesunden Probanden von 1,114 bis 7,105. Im Median ergab sich für die Studiengruppe ein Wert von 10,461 und für die gesunde Kontrollgruppe ein Wert von 3,46. Im Schnitt konnte so eine dreifach erhöhte Expression, bei einzelnen Proben aber sogar eine bis zu siebenfach erhöhte Expression festgestellt werden. Mediane Verteilung der CD200-PE-Mean-Werte im FACS 18 PE-Mean im FACS 16 14 12 10,461 10 8 6 4 3,46 2 0 Gesunde Probanden CLL-Patienten Population Grafik 3.2: Darstellung der medianen Verteilung der CD200-PE-Mean-Werte Um einen quantitativen Unterschied feststellen zu können, wurde die Mean Fluorescence Intensitity Ratio (MFIR) – der Quotient zwischen dem PE-MeanWert des Experimentes und dem PE-Mean-Wert des Isotypes – für die verschiedenen Proben im FACS bestimmt und mittels gepaartem T-Test verglichen. Die eindeutige Signifikanz von p=0,0000109464 bewies, dass CD200 auf der Oberfläche von CLL-Zellen überexprimiert vorliegt. Der mediane Wert der MFIR bei den CLL-Patienten lag bei gerundet 2,1, der der gesunden Testpersonen bei ungefähr 0,5. Jedoch zeigte sich eine enorme Variabilität der MFIR-Werte bei den CLL-Patienten. Sie reichten von 1,01 bis 11,32 (gerundet) und waren im unteren Bereich vergleichbar mit einer hochnormalen Expression der gesunden Probanden (0,18-1,8). 45 ERGEBNISSE Vergleich der Mean Fluorescence Intensity Ratio (CD200PE) zwischen Kontroll- und Vergleichspopulation 5 MFIR 4 2,108035605 3 2 0,47403946 1 0 Gesunde Probanden CLL-Patienten Population Grafik 3.3: Vergleich der MFIR (medianer Wert aller Proben) von CLL-Patienten und gesunden Testpersonen Im Rahmen des Arbeitsprozesses veröffentlichten McWhirter et al. eine experimentelle Untersuchung, in der sie ebenfalls eine deutliche Überexpressivität von CD200 in der Chronischen Lymphatischen Leukämie – die Ergebnisse zeigten eine 1,6- bis 5,4-fache Erhöhung der Expressivität bei der Studiengruppe – belegten (74). 3.1.2 Korrelation mit klinischen und prognostischen Markern Aufgrund der Patientengruppe Variabilität wurde der nach CD200-Expression einer Korrelation innerhalb der Daten der mit CLLden prognostischen Markern ZAP70, IgVH und CD38 gesucht. Außerdem wurden die MFIR-Werte für die CD200-Expressivität mit dem Binet-Stadium verglichen. Insgesamt konnten 21 Patienten mit bekanntem Binet-Stadium für die Analyse herangezogen werden. Im Stadium A befanden sich 6 Patienten, Binet BPatienten gab es 9 und dem Stadium C waren wiederum 6 Patienten zugeteilt. Die mediane Ermittlung der verschiedenen MFIR-Werte ergab folgendes: Dem Stadium A konnte ein medianer Wert von 1,84, dem Stadium B ein Wert von 2,16 und dem Stadium C ein Wert von 1,71 zugeteilt werden. 46 ERGEBNISSE MEDIAN MFIR (CD200-Expressivität) Vergleich der CD200-Expression in den drei Binet-Stadien 5 4,5 4 3,5 3 2,5 2 1,5 1 0,5 0 Binet A Binet B Binet C Grafik 3.4: Korrelation des Binet-Stadiums mit der CD200-Expression Nach der statistischen Auswertung der einzelnen MFIR-Werte zeigte sich, dass innerhalb der einzelnen Binet-Stadien kein signifikanter Unterschied der CD200-Expression existierte. Die mittels gepaartem t-Test errechneten p-Werte reichten von 0,2 (Binet B im Vergleich mit Binet C) bis 0,6 (Binet A in Gegenüberstellung zu Binet B). Für den ZAP70-Vergleich konnten 22 Patienten mit eingeschlossen werden. Jeweils 11 Patienten wurden als ZAP70–positiv und –negativ eingestuft. Von ihren bereits ermittelten MFIR-Werten wurde ein neuer Median gebildet und dieser grafisch sowie statistisch verglichen. Für die ZAP70-negativen Patienten ergab sich ein medianer Wert von 2,4 und für die ZAP70-positiven Patienten ein Median von 1,62. Im gepaarten T-Test konnte ein p-Wert von 0,03 und damit ein statistisch signifikanter Unterschied festgestellt werden. Die PE-Mean-Fluoreszenz lag bei den ZAP70-negativen Patienten bei 10,476 und bei den ZAP70-positiven Patienten bei 8,782. 47 ERGEBNISSE MEDIAN MFIR (CD200-Expressivität) Mediane Verteilung der CD200-Expression in Bezug zu ZAP-70 6 5 4 3 2 1 0 ZAP70-negative Patienten ZAP70-positive Patienten Grafik 3.5: Korrelation der CD200-Expression mit dem ZAP70-Status Da bei nur 10 Patienten der IgVH-Status bekannt war, konnten auch nur diese in den Vergleich eingeschlossen werden. Nach neuer Berechnung des Medians der MFIR-Werte ergab sich folgendes Bild: Der mediane MFIR-Wert der Patienten mit mutiertem IgVH ergab 1,56, der Median der Erkrankten mit unmutiertem IgVH lag bei 1,73. Eine statistische Signifikanz konnte nicht ermittelt werden (p=0,65). MEDIAN MFIR (CD200-Expressivität) Mediane Verteilung der CD200-Expression in Bezug zum IgVHStatus 4,5 4 3,5 3 2,5 2 1,5 1 0,5 0 IgVH mutiert IgVH unmutiert Grafik 3.6: Korrelation der CD200-Expression mit dem IgVH-Status 48 ERGEBNISSE Für den CD38-Vergleich wurden 12 Patienten eingeschlossen. 4 waren CD38negativ, 8 CD38-positiv getestet worden. Als medianer MFIR-Wert der negativen Patienten wurde die Zahl 4,8 ermittelt, der Median der positiven Patienten ergab den Wert 2,13. Eine statistische Signifikanz wurde jedoch nicht festgestellt (p=0,46). MEDIAN MFIR (CD200-Expressivität) Mediane Verteilung der CD200-Expression in Bezug zu CD38 10 9 8 7 6 5 4 3 2 1 0 CD38-negative Patienten CD38-positive Patienten Grafik 3.7: Korrelation der CD200-Expression in Bezug zu CD38 3.2 T-Zellexpansion im MLR-Modell Ein wichtiges Ziel der vorliegenden Arbeit war es, im MLR-Modell einen statistisch signifikanten Unterschied der T-Zellzahlen zu erreichen. Dafür wurden zunächst 14 CLL-Patienten nach HLA-Analyse und T-ZellzahlBestimmung (Einschlusskriterien: Keine oder seit einem halben Jahr keine Therapie, Status: HLA-A2-positiv, prozentuale T-Zell-Anzahl über 8 Prozent) in die experimentelle Studie eingeschlossen. Mit Hilfe des T-RosetteSepVerfahrens konnten die T-Lymphozyten der Studienteilnehmer mit einer Reinheit von > 95% separiert werden. Mittels des im Kapitel Materialien und Methodik beschriebenen Modells wurden die jeweiligen Blutproben in 6 T-ZellPopulationen aufgesplittet, mit unterschiedlichen Konzentrationen des CD200Antikörpers (1/5/10 μg/ml), Interleukin 2 und 7 versetzt und mit CD40Laktivierten oder herkömmlichen CLL-Zellen stimuliert bzw. nativ belassen. Innerhalb von 21 Tagen wurde vier Mal die Zellanzahl unter dem Mikroskop 49 ERGEBNISSE bestimmt und qualitativ sowie quantitativ am FACS (Messung der CD3-/CD8-/ CD5-/CD19-Expression) ausgewertet. Nach der Zählung an den Tagen 1, 7 und 14 erfolgte die (Re-) stimulation. 3.2.1 Teilungspopulationen in der CFSE-Färbung Um zu zeigen, dass sich die T-Zell-Populationen im Teilungsprozess befinden, wurde mittels CFSE-Färbung durchflusszytometrisch das Wachstum belegt. CFSE lagert sich im Zytoplasma von Lymphozyten an und wird bei jeder Zellteilung an die Tochterpopulation weitergegeben. Dabei verringert sich die CFSE-Intensität, gemessen im FITC-Kanal, jeweils um die Hälfte. Beispielhaft konnten bei zwei Studienteilnehmern die CFSE-Färbung durchgeführt und die Teilungsprozesse dargestellt werden. Jede Probe wurde zu 4 Zeitpunkten im FACS analysiert. An den Tagen 1, 3, 5 und 7 des Experimentes erfolgten die Messungen und verdeutlichten den Fortschritt des Wachstums. Beispielhaft zeigen die Grafiken den Wachstumsverlauf der Probe 7901 unter Anti-CD200-Blockade und CD40LAktivierung: Grafik 3.8: CFSE-Teilungsschritte innerhalb der T-Zell-Populationen mit Stimulation nur durch CD40L-aktivierte CLL ,Vergleich Tag 1 und Tag 7, Probe 7901 50 ERGEBNISSE Grafik 3.9: CFSE-Teilungsschritte innerhalb der T-Zell-Populationen mit Stimulation durch CD40L-aktivierte CLL mit CD200, Vergleich Tag 1 und Tag 7, Probe 7901 3.2.2 Ergebnisse der T-Zell-Expansion Mit Hilfe der FACS-Werte für die einzelnen Subpopulationen und der jeweils ausgezählten Gesamtzellzahlen, die in jeder Stimulationswoche bestimmt wurden, konnten die absoluten T-Zellzahlen berechnet werden. Tabellarisch wurden sie für jede Stimulationswoche und jede Studienpopulation aufgeführt und die jeweiligen Mediane bestimmt. Dabei konnten erhöhte T- Lymphozytenanteile für alle mit CD40L-CLL stimulierten Proben erreicht werden. Vor allem die mit Anti-CD200 geblockten Populationen zeigten deutlich erhöhte T-Zellzahlen. MEDIAN Proben 7911-8177 (n=14) T-Zellzahl [/ml] Studienpopulation Tag 7 Tag 14 Tag 21 1006400 2191000 2911400 CD40L-CLL + Anti-CD200 1μg/ml 1570750 2830400 3681300 CD40L-CLL + Anti-CD200 5μg/ml 914350 2104850 2480800 CD40L-CLL + Anti-CD200 10μg/ml 871450 1831650 1876750 nur CD40L-CLL 564600 1143500 1403850 unstimulierte CLL 531950 874500 680650 nur T-Zellen Tab. 3.1: Median der T-Zellzahlen für jede Stimulationswoche Im Median konnte die T-Zellzahl der Probe mit 5 μg/ml Anti-CD200 von 1.570.750 Zellen/ml nach der ersten Stimulationswoche auf 3.681.300 Zellen/ml zu Versuchsende gesteigert werden. Im Vergleich dazu wurden bei der nur CD40L-stimulierten Probe Zahlen von 871.450 Zellen/ml bis 1.876.750 51 ERGEBNISSE Zellen/ml festgestellt. Damit ergab sich eine fast zweifach verbesserte Expansion in den mit Anti-CD200 geblockten Wells. 1,2e+7 T-Zellen absolut 1,0e+7 8,0e+6 6,0e+6 4,0e+6 2,0e+6 0,0 APC: - native anti-CD200: - - CD40L CD40L - CD40L CD40L 1 µg/ml 5 µg/ml 10 µg/ml Grafik 3.10: Darstellung der T-Zellzahlen im MLR-Modell (Tag 21) Weiterhin konnte mit Hilfe der medianen Zellzahlen und des Schaubildes die Annahme formuliert werden, dass die Blockade mit der CD200-AK- Konzentration von 5 μg/ml die effektivste sei. Mit einem p-Wert von 0,00046 beim Vergleich der 1 μg/ml- mit der 5 μg/ml-Konzentration und von 0,024 beim Vergleich der 5 μg/ml- mit der 10 μg/ml-Konzentration konnte auch eine statistische Signifikanz nachgewiesen werden. 3.2.3 Deskriptive Betrachtung der B-Zell-Anzahl Während sich die T-Zellen im Mixed-lymphocyte-reaction-Modell stetig weiter expandieren ließen, fielen im FACS sinkende CLL-Zellzahlen auf. Obwohl bei jeder neuen Stimulation der gleiche Anteil an CLL-Zellen zur Aktivierung zu den T-Zellpopulationen gegeben wurden, ergaben sich im FACS unterschiedliche prozentuale Anteile der B-Lymphozyten. Dabei ließ sich 52 ERGEBNISSE beobachten, dass gerade in den mit Anti-CD200 geblockten Wells niedrigere BZellzahlen erreicht wurden. MEDIAN Proben 7950-8177 (n=12) Studienpopulation Tag 7 CD40L-CLL + Anti-CD200 1μg/ml CD40L-CLL + Anti-CD200 5μg/ml CD40L-CLL + Anti-CD200 10μg/ml nur CD40L-CLL unstimulierte CLL nur T-Zellen 32,95 33,95 34,25 36,75 33,25 5,6 B-Zellzahl [%] Tag 14 Tag 21 18,65 17,1 16,65 24,5 25,25 3,9 10,3 8,75 7,8 14,3 22,1 0,5 Tab. 3.2: Median der B-Zellzahlen [%] für jede Stimulationswoche Im Vergleich ergab sich bei den mit 5 μg/ml Anti-CD200 geblockten Populationen nach einer Stimulationswoche im MLR-Modell ein medianer Wert von 33,95%, während zum Versuchsende ein Median von 8,75% vorlag. Bei den ausschließlich mit CD40-Ligand-stimulierten Wells ergab sich eine mediane Anzahl von 36,75 % in Gegenüberstellung zu 14,3% beim Stimulationsende. Für beide Populationen konnte eine statistische Signifikanz berechnet werden (p=0,00035 und p=0,0071). Im Gegensatz dazu konnte für die B- Lymphozytenveränderungen im unstimulierten Well zu Beginn und Ende des Experimentes kein statistischer Unterschied nachgewiesen werden (p=0,25). B-Zellabnahme bei CD200-Blockade 40 CD40L-CLL+1μg/ml Anti-CD200 B-Zellzahl [%] 35 CD40L-CLL+5μg/ml Anti-CD200 30 25 CD40L-CLL+10μg/ml Anti-CD200 20 15 nur CD40L-CLL 10 5 unstimulierte CLL 0 1 2 3 nur T-Zellen Stimulationswoche Grafik 3.11: Darstellung der B-Lymphozytendeletion im MLR-Modell 53 ERGEBNISSE Eine Gegenüberstellung am Tag 21 zeigt sowohl eine statistisch signifikante Überlegenheit der Anti-CD200-geblockten Populationen (5 μg/ml) gegenüber der nur CD40L-stimulierten als auch der unstimulierten Wells (p=0,0016 und p=0,012). B-Zellzahlen im MLR-Modell (Tag 21) 30 % B-Zellen 25 20 15 10 5 0 Negativkontrolle 1µg/ml Anti-CD200 5 µg/ml Anti-CD200 10 µg/ml Anti-CD200 Grafik 3.12: Unterschiede der prozentualen B-Zellzahlen an Tag 21 bei den Anti-CD200geblockten Populationen und der Kontrollgruppe 3.3 Zytotoxizität des CD200-Antikörpers Die Abnahme der B-Lymphozytenzahl im Mixed-lymphocyte-reaction-Modell führte zu folgenden Rückschlüssen: Zum einen könnte eine mögliche Zytotoxizität des Anti-CD200-Präparates auf CLL-Zellen zu einer verringerten Anzahl derselben führen, zum anderen bestünde die Möglichkeit, dass die aktivierten zytotoxischen T-Zellen die hinzugegebenen CLL-Zellen eliminieren. Um eine Zytotoxizität des CD200-Antikörpers auszuschließen, wurde dieser in unterschiedlichen Konzentrationen zu jeweils gleichen CLL-Anteilen von 10 Patientenproben gegeben. Die Kontrolle erfolgte zum einen mit dem starken Zellgift Staurosporin und zum anderen mit einer nativen Probe. Färbungen mit Annexin V-FITC und 7-AAD, die die apoptotischen Zellen im FACS sichtbar machen, wurden nach 24/48/72 Stunden angefertigt und analysiert. Dabei zeigte sich, dass die mit Anti-CD200 versetzten Proben nur unwesentlich von der Nativkontrolle abwichen und der apoptotische sowie nekrotische Zellanteil bei den mit Staurosporin versetzten Proben signifikant höher war. 54 ERGEBNISSE Zytotoxizitätsprobe mittels FACS Apoptotische Zellen [%] 100 90 80 70 60 50 40 30 20 10 0 24 h 48 h 72 h Negativkontrolle 1μl/ml AntiCD200 5μl/ml AntiCD200 10μl/ml AntiCD200 20μl/ml AntiCD200 50μl/ml AntiCD200 Staurosporin Grafik 3.13: Zytotoxizitätsprobe von Anti-CD200 3.4 T-Zell-Interaktionen im ELIspot Nachdem es experimentell geglückt war, die T-Lymphozytenanteile im Mixedlymphocyte-reaction-Modell zu steigern, ging es im zweiten Schritt um den Nachweis der Effektivität der expandierten T-Zellen mittels ELIspot. Getestet wurde die Interferon-γ-Sekretion nach Exposition mit den Peptiden KW13, FMOD1/2/3/4, MAGE3 und T2-Zellkontakt. Als Methodikkontrolle wurden die Zellen nur mit den Peptiden ohne T2-Präsentation versetzt. je 10 μg/ml Peptid MLR-Proben T2-Zellen KW 13 100000 Zellen/100 μl 30000 Zellen/50 μl FMOD1/2 100000 Zellen/100 μl 30000 Zellen/50 μl FMOD3/4 100000 Zellen/100 μl 30000 Zellen/50 μl MAGE 100000 Zellen/100 μl 30000 Zellen/50 μl FMOD2 100000 Zellen/100 μl 30000 Zellen/50 μl FMOD4 100000 Zellen/100 μl 30000 Zellen/50 μl FMOD1/2 Kontrolle 100000 Zellen/100 μl keine FMOD3/4 Kontrolle 100000 Zellen/100 μl keine Tab. 3.3: Schema des ELIspot-Verfahrens 55 ERGEBNISSE Nach 21 Tagen im MLR-Modell wurde die immunologische Aktivität der expandierten Zellen mittels ELIspot getestet. Die mit 5μg/ml Anti-CD200 geblockte Population und als Kontrolle die nur CD40L-stimulierte Probe wurden mit Hilfe dieses Verfahrens analysiert. Insgesamt sieben Proben flossen in den Versuchsaufbau ein und wurden mittels ELI.Analyse 4.0 und folgenden Parametereinstellungen ausgewertet: Programm-Parameter Übersetzung Minimum Spot Size Minimum Spot Intensity Spot Circularity Separate Spots Kleinste Punktgröße Kleinste Punktdichte Punktrundung Punkttrennung Einstellung 3 10 80 100 Tab. 3.4: Parametereinstellungen bei ELI.Analyse 4.0 Im Scan zeigte sich beispielhaft folgendes: Abbildung 3.1: Scan des ELIspots der Probe 8519 Es ergaben sich für die Kontroll-Wells ohne T2-Zugabe wie erwartet niedrige Spot-Anzahlen. In der Kontrolle mit MAGE3, einem Peptid, das nicht spezifisch für die CLL ist, zeigten sich jedoch unerwartet hohe Interferon-γ-Spot-Werte. Da das Peptid in DMSO gelöst vorlag, kann vermutet werden, dass das DMSO die hohe Hintergrundverunreinigung auslöste. 56 ERGEBNISSE MITTELWERT KW 13 FMOD1/2 FMOD3/4 MAGE FMOD2 FMOD4 FMOD1/2 Kontrolle FMOD3/4 Kontrolle CD40L-CLL mit CD200 nur CD40L-CLL 79,42857143 91 88,14285714 75 96,14285714 86,14285714 12,14285714 13,14285714 68,57142857 74,71428571 83,71428571 73,28571429 80,42857143 74 6,714285714 11,57142857 Tab. 3.5: Mittelwerte der ELIspots 8484-8599 Im Vergleich der beiden im ELIspot analysierten Proben zeigten sich zumeist erhöhte Spot-Anzahlen bei den mit Anti-CD200-versetzten Zellsuspensionen. Vor allem bei den mit Fibromodulin versetzten ELIspot-Wells wurden höhere Werte erreicht. Für FMOD1/2 konnten zum Beispiel Spot-Anzahlen von 15 bis 250 bei den AntiCD200 geblockten Wells erreicht werden, im Gegensatz zu den nur mit CD40Lstimulierten Wells, für die Spot-Anzahlen zwischen 25 und 163 ermittelt wurden. Grafik 3.14: Gemittelte ELIspot-Ergebnisse mit Peptidpulsung 57 ERGEBNISSE Im statistischen Vergleich der beiden Proben konnte allerdings nur eine Signifikanz für die erhöhte Anzahl an Interferon-γ-Spots in den ELIspot-Wells mit Zugabe von FMOD 2 und 4 berechnet werden (p=0,046 bzw. p=0,014). 3.5 Anteilsverhältnisse der Treg-Zellen im MLR-Modell Deskriptiv wurden im Rahmen der experimentellen Studie auch die Anzahlen der regulatorischen T-Zellen bestimmt. Die sogenannten Treg-Zellen wurden von Beyer et al. als überrepräsentiert in der Chronischen Lymphatischen Leukämie beschrieben (8). Regulatorische T-Lymphozyten vermögen die zytotoxischen TZelleffekte inhibierend zu beeinflussen und deren Anzahl zu minimieren. Da in der vorliegenden Arbeit im MLR-Modell für die Anti-CD200-geblockten Studiengruppen stets erhöhte T-Zellwerte erreicht werden konnten, wurde postuliert, dass in den entsprechenden Proben die Anzahl der Treg-Zellen verringert sein könne. Mittels intrazellulärer PE-FOXP3-Färbung und Markierung mit Anti-CD25-FITC, -CD4-APC und –CD8-PC-5 konnten im FACS die prozentualen T-Zell-Anteile bestimmt werden. Eingeschlossen wurden die 7 Proben mit Peptidpulsung, die auch mittels ELIspot analysiert wurden. T-HelferZellen Treg-Zellen Intermediäre Zellen Grafik 3.15: Darstellung der Treg-Zellen im FACS 58 ERGEBNISSE Im Median wurden Treg-Anzahlen von 5,1% bei der mit Anti-CD200 versetzten Probe, von 7,1% bei der nur mit CD40L-stimulierten Probe und von 14,7% im mit unstimulierten CLL-Zellen versetzten Well erreicht. 20 15 10 + % CD4 CD25 high + 25 FoxP3 A 5 0 B keine APC native CLL CD40L-stim. CD40L-stim. CLL CLL + anti-CD200 mAb native CLL CD40L-stim. CD40L-stim. CLL CLL + anti-CD200 mAb 50 % CD8+ 40 30 20 10 keine APC 0 Grafik 3.16: Prozentualer Anteil der Treg-Zellen im MLR-Modell 59 ERGEBNISSE Als statistisch signifikant erwies sich sowohl der Vergleich der Anti-CD200 geblockten Gruppe mit den mit unstimulierten CLL-Zellen versetzten Wells als auch die Gegenüberstellung von der Anti-CD200-Probe mit der nur CD40Lstimulierten Probe (p=0,002/p=0,04). Im FACS wurden neben den Treg-Zellen ebenfalls die CD4+- und CD8+-TLymphozytenanteile dargestellt. Wie zu erwarten, zeigten sich in der mit AntiCD200 versetzten Probe erhöhte zytotoxische T-Zell-Anteile. Sie lagen im Median bei 41,2% im Vergleich zu 34,7% bei den nur CD40L-stimulierten und 25,7% in den mit unstimulierten CLL-Zellen versetzten Wells. Prozentual verteilten sich die CD4+-T-Lymphozyten dagegen wie folgt: Im Median konnte bei der Anti-CD200-Probe eine Zellzahl von 12,4% erreicht werden. Ähnlich hoch war der Anteil bei der mit CD40L-stimulierten Probe. Er lag bei 12,8%. In dem mit unstimulierter CLL versetzten Well konnte ein Median von 11,8% dargestellt werden. Eine statistische Signifikanz zeigte sich bei den unterschiedlichen CD4+-Populationen im MLR-Modell nicht. Als statistisch signifikant erwiesen sich jedoch die unterschiedlichen CD8+-TZellwerte. Beim Vergleich der Anti-CD200 stimulierten Probe mit der nur CD40L-aktivierten Population errechnete sich ein p-Wert von 0,035. In Gegenüberstellung mit der nur CLL-versetzten Probe konnte eine Signifikanz sowohl für das Anti-CD200- als auch das CD40L-stimulierte Well gezeigt werden (p=0,005 bzw. p=0,006). Mediane Verteilung [%Parent] der T-Lymphozytenpopulationen im MLR-Modell Anteil [% Parent] 80 60 40 20 0 CD40L-CLL mit CD200 nur CD40L-CLL Treg-Zellen (CD 4+/CD25 high/FoxP3+) unstimulierte CLL CD4+-Zellen CD8+-Zellen Grafik 3.17: Anteilsverhältnisse der T-Lymphozyten im MLR-Modell 60 DISKUSSION 4. DISKUSSION 4.1 Beurteilung der hohen Expressionswerte von CD200 4.1.1 Überexpression von CD200 in der CLL Für CD200 ist eine immunsuppressive Funktion in diversen experimentellen Studien gezeigt worden. Zum einen konnten Gorczynski et al. 1999 zeigen, dass eine lösliche Version von CD200 (CD200Fc, Trillium Therapeutics Inc.) das Überleben sowohl von Heterotransplantaten als auch allogenen Transplantaten im Maus-Modell aufgrund seiner immunsuppressiven Wirkung verlängern konnte (36). Humane Herpes- und Myxomaviren exprimieren ergänzend dazu CD200, um eine Immunantwort zu blockieren (14;17;98). Zum anderen zeigten Gorczynski et al. 2001, dass eine Infusion von CD200Fc im Maus-Modell den natürlichen Schutzmechanismus des Immunsystems, Tumorwachstum zu unterdrücken, aufhob (38). Eine Hochregulation von CD200 auf Tumorzellen scheint deshalb ein weiterer Mechanismus zu sein, wie Tumore ein Erkennen und Zerstören durch das Immunsystem verhindern. In der vorliegenden Arbeit konnte im Schnitt eine dreifach erhöhte Expression von CD200 auf B-CLL-Zellen (n=33) im Vergleich zu gesunden B-Lymphozyten (n=25) – bei einzelnen Proben sogar eine bis zu siebenfach erhöhte Expression – gezeigt werden. Nach Bestimmung der MFIR-Werte ergab sich im Median eine vierfach signifikant erhöhte Expression. Petermann et al. betrachteten die Rolle von CD200 beim Malignen Melanom. Sie stellten dar, dass die Expression von CD200-Micro-RNA mit dem Krankheitsprogress korreliert und eine ERK-Aktivierung CD200 im Melanom induziert. Diese Induktion scheint die Tumor-Immunogenität herabzusetzen (83). In der CLL sorgt eine verlängerte BCR-Aktivierung für die Apoptoseresistenz. Dieses antiapoptotische BCR-Signal scheint assoziert zu sein mit einer fortgesetzten Aktivierung von MEK/ERK-Signalwegen, die Hauptregulatoren des Zellüberlebens und der Proliferation sind. Longo et al. zeigten den Zusammenhang zwischen MEK/ERK und dem B-Zell-Rezeptor (67). Eine 61 DISKUSSION Ursache der CD200-Hochregulation auf CLL-Zellen könnte somit das ERKSignaling sein. 4.1.2 Korrelation mit dem Binet-Stadium und prognostischen Faktoren Weiterhin wurde im Rahmen der experimentellen Studie nach Korrelationen mit klinischen und prognostischen Faktoren gesucht. Patienten mit bekanntem Binet-Stadium, bekanntem IgVH-, ZAP70- und CD38-Status wurden dafür verglichen. Bereits in den 70er Jahren publizierten Rai et al. eine Einteilung der CLL in verschiedene Stadien (86). In Europa ist die Einteilung nach Binet von 1981 gebräuchlicher (9). Das Binet A-Stadium charakterisiert Patienten in einem frühen Krankheitsstadium, während Binet B und C auf eine Progression der CLL hindeuten. Das Binet-Stadium war bei 21 der 33 im FACS untersuchten Patienten bekannt. 6 Patienten konnten dem Stadium A, 9 dem Stadium B und wiederum 6 dem Stadium C zugeordnet werden. Es zeigte sich, dass keine Korrelation zwischen der Expression und dem BinetStadium existierte (p>0,05). Daraus schlussfolgernd ergab sich die These, dass sich die CD200-Expression im Krankheitsverlauf der Chronischen Lymphatischen Leukämie nicht verändert und bereits in frühen Stadien hochreguliert vorliegt. Nun wurden die prognostischen Parameter IgVH, ZAP70 und CD38 für einen Vergleich herangezogen. Einer der wichtigsten molekulargenetischen Marker, die Untergruppen der CLL einteilen, ist der Mutationsstatus von IgVH. Es werden CLL-Patienten mit unmutiertem IgVH-Gen, das in prägerminalen Zentrumszellen seinen Ursprung hat, von Patienten mit mutiertem IgVH, das von postgerminalen Zentrumszellen stammt, unterschieden. Dabei ist der unmutierte Status mit einem rascher progredienten Krankheitsverlauf assoziiert (21;45). Damle et al. beobachteten außerdem eine Korrelation zwischen dem IgVHMutationsstatus und der CD38-Expression (21). Crespo et al. zeigten dagegen 62 DISKUSSION 2003 einen Zusammenhang zwischen IgVH und dem Zeta-assozierten Protein (ZAP) 70 (19). Beim Vergleich der CD200-Expression mit IgVH-Status und CD38-Expression konnte kein signifikanter Unterschied zwischen den einzelnen Subpopulationen berechnet werden (p=0,65 bzw. p=0,46). Eine statistische Signifikanz mit p=0,03 zeigte sich jedoch bei der Gegenüberstellung von ZAP70-positiven Patienten mit ZAP70-negativen Patienten. Einschränkend muss allerdings angegeben werden, dass 22 Patienten mit bestimmtem ZAP70-Status, aber nur 10 bzw. 12 Patienten für den IgVH- bzw. CD38-Status-Vergleich eingeschlossen werden konnten. Insgesamt muss die eingeschlossene Patientenzahl deshalb als zu niedrig bewertet werden, um eine definitive Aussage treffen zu können. Außerdem konnte zwar eine statistische Signifikanz berechnet werden und im Median ergab sich bei den ZAP70negativen Patienten ein MFIR-Wert von 2,4 und bei den ZAP-positiven Patienten ein Wert von 1,62. Stellt man jedoch die jeweils 11 einzelnen MFIRWerte pro ZAP70-Status gegenüber, so ergibt sich eine große Varianz der Werte für beide Gruppen. Bei der ZAP70-negativen Population konnten MFIRWerte zwischen 1,32 und 11,32 erzielt werden, während bei den ZAP70positiven Patienten MFIR-Werte von 1,01 bis 6,21 bestimmt wurden. Ein Grenzwert der CD200-Expression zur prognostischen Beurteilung konnte somit nicht festgelegt werden. Durch die in der vorliegenden Dissertationsarbeit statistisch belegte vielfach erhöhte Expression von CD200 in der CLL kann auch bei diesem Krankheitsbild eine immunsupprimierende und tumorfördernde Wirkung des Moleküls angenommen werden. 63 DISKUSSION 4.2 Bewertung der T-Zellexpansion im MLR-Modell Wie oben gezeigt, wird CD200 auf der Oberfläche von CLL-Zellen exprimiert. CD200 interagiert mit seinem Rezeptor, CD200R, der sowohl auf Makrophagen und dendritischen Zellen als auch auf T-Lymphozyten vorkommt. Experimentell ist der Effekt von CD200 auf Makrophagen und dendritschen Zellen am besten untersucht. Die Interaktion mit CD200R auf dendritischen Zellen induziert den immunsuppressiven Tryptophan-Signalweg (28). Dendritische Zellen von Tumorpatienten –auch bei der CLL – sind oftmals defekt und lassen eine effektive Immunantwort gegen Tumorzellen vermissen (81). Die Interaktion von CD200 als ein zellgebundener Ligand mit dem zugehörigen Rezeptor auf Makrophagen stört die Immunfunktion und verschiebt die Immunantwort von einem Th1- zu einem Th2- Zytokin-Profil (74). Diese Veränderung der Zytokin-Produktion wurde während der Progression verschiedener Tumorarten – zum Beispiel bei Lymphomen, renalen und Prostata-Karzinomen oder Melanomen – beobachtet und ist assoziiert mit einer negativen Prognose (30;65;102;103;105). Podhorecka et al. zeigten eine Verlagerung von der Th1- zur Th2-Zytokin-Antwort im Krankheitsverlauf der CLL (85). McWhirther et al. stellten 2006 fest, dass CLL-Zellen im MLR-Modell wahrscheinlich in der Lage sind, dass Zytokinprofil umgebender Zellen zu beeinflussen. Sie postulierten, dass eine Verschiebung zur Th2-Antwort eine Aktivierung zytotoxischer T-Lymphozyten, von denen angenommen wird, dass sie potenziell Tumorzellen eliminieren können, verhindere. Außerdem wurde berichtet, dass ein Typ 2-Profil tumorspezifische Immunantworten aufgrund einer reduzierten Präsentation mittels MHC herunterreguliert (74). Weiterhin scheint Interleukin 4, der Apoptose leukämischer Zellen in der CLL vorzubeugen (57). Verschiedene Tumore, die CLL eingeschlossen, können lösliche Faktoren wie Interleukin 10 und 6 produzieren, mit denen sie ein breites Spektrum an Immunfunktionen, unter anderem die Th1-ZytokinProduktion, inhibieren (29). McWhirthers Arbeitsgruppe demonstrierte, dass eine erhöhte Zelloberflächenpräsentation von CD200 suffizient einer Th1Antwort vorbeugt (74). 64 DISKUSSION Um einen therapeutischen Benefit zu erzielen, müsste eine Blockierung von CD200 eine Th1-Reaktion erzielen, mit der zum Beispiel gegen CLL-Zellen vorgegangen werden könnte. M BLy DC IL 1 IL 12 TNF-α, etc. IL 6 IL 10 Th0 Th1 IL 2 IFN-γ Zelluläre Immunität Th2 Humorale Immunität Th3 IL 4 IL 5 TGF-β Suppression Zytotoxische Zell-ZellKontakte Teilnahme an zellulärer und humoraler Immunität Antikörper Abbildung 4.1:Vereinfachte Darstellung der zellulären und humoralen Aktivierungskaskaden Nachdem es in der vorliegenden Arbeit gelungen war, eine Überexpression von CD200 darzustellen, ging es im zweiten Schritt darum, eine vermehrte T-ZellExpansion im MLR-Modell zu erreichen. In der CLL sind vielfältige T-ZellDefekte bekannt, die alle zu einer ungenügenden körpereigenen Immunantwort gegen die malignen B-Zellen führen (96). Die Wiederherstellung einer effizienten T-Zellimmunität – vor allem die Restitution effektiver zytotoxischer TLymphozyten – wird als neuer Ansatz der Tumorbekämpfung erforscht. TZellen sind in der Lage, Tumorzellen spezifisch anhand eines Antigen-Profils zu 65 DISKUSSION erkennen. Dies ist Grundlage der Antigen-spezifischen Immuntherapie (71;72;89;113). Mayr et al. gelang es, CD8+-T-Zellen im MLR-Modell zu expandieren, die eine spezifische Interferon-γ-Antwort im ELIspot sezernierten. Als tumor-assoziiertes Antigen identifizierten sie damals Fibromodulin (71). In einer hierauf aufbauenden Versuchsstruktur ging es in dieser Arbeit um den Nachweis, durch eine CD200-Blockade zum einen weitaus mehr TLymphozyten in vitro zu expandieren und zum anderen eine Modulierung der spezifischen Immunität gegen Tumor-assoziierte Antigene nachzuweisen. Im Mixed-Lymphocyte-Reaction-Modell zeigte sich schnell, dass die mit AntiCD200 und CD40L-CLL versetzten Wells stets erhöhte T-Zellzahlen erreichten im Vergleich mit den nur CD40L-stimulierten oder gar den nativen Proben. Während der 3-wöchigen Stimulation wurden alle 7 Tage die totalen Zellzahlen und durchflusszytometrisch die prozentualen Populationsanteile bestimmt. Daraus errechneten sich die absoluten T-Zellzahlen, die gegeneinander aufgetragen werden konnten. Es wurde für die mit Anti-CD200 versetzten Wells eine fast zweifach verbesserte Expansion erreicht. Weiterhin konnte gezeigt werden, dass die Blockade mit 5 μg/ml Anti-CD200 bei weitem die effektivste war. Daraus schlussfolgernd ergibt sich, dass CD200 als Inhibitor der T-ZellProliferation in der Chronischen lymphatischen Leukämie identifiziert werden konnte. Eine direkte T-Zell-/CLL-Zell-Interaktion via membrangebundener Mechanismen wurde von Görgün et al. als ursächlich für die T-Zellsuppression erkannt. CD200 scheint ein wichtiger Faktor dieser Mechanismen zu sein (40). Im Gegensatz zu den stets steigenden T-Zellzahlen konnte deskriptiv eine Verringerung der prozentualen B-Zellanteile im MLR-Modell beobachtet werden, obwohl in jeder Stimulationswoche gleiche Anteile an CLL-Zellen – CD40L-aktiviert oder unstimuliert – zu den T-Zell-Suspensionen gegeben wurden. Nachdem der Beleg erbracht worden war, dass die Anti-CD200Lösung nicht direkt zytotoxisch wirkt, wurde postuliert, dass die abnehmenden B-Zellzahlen durch eine zytotoxische Zell-Zell-Immunität zu erklären sind. 66 DISKUSSION Im nächsten Schritt sollte zum einen nachgewiesen werden, dass die expandierten T-Lymphozyten in der Lage sind, spezifische und effektive Immunantworten auszulösen und zum anderen geklärt werden, ob die AntiCD200 geblockten Populationen auch im ELIspot überlegene Ergebnisse aufzeigen. Um reliable ELIspot-Analysen zu erzielen, musste der experimentelle Aufbau ergänzt werden: Nach dem Vorbild von Mayr et al. wurde deshalb im MLRModell zusätzlich mit Fibromodulin 2 und 4 sowie β2-Mikroglobulin gepulst (71). Nach 3-wöchiger Stimulation erfolgte dann die Analyse mittels des ELIspotVerfahrens. Zwar zeigte sich in fast jedem ELIspot eine überwiegende Überlegenheit der Interferon-γ-Sekretion bei den Anti-CD200 geblockten Proben, aber eine statistische Signifikanz konnte nur für die Reaktivität gegenüber den Peptiden FMOD 2 und 4 nachgewiesen werden. Im Vergleich der Anti-CD200-Proben mit den nur CD40L-stimulierten Populationen wurde mittels gepaartem t-Test im FMOD2-Well ein p-Wert von 0,046 und im FMOD4-Well ein p-Wert von 0,014 errechnet. Kritisch muss allerdings angemerkt werden, dass in allen ELIspots auch bei den MAGE3-versetzten Wells viele Interferon-γ-Spots detektiert werden konnten. Da MAGE3 nicht als TAA in der CLL gilt, hätten eigentlich nur geringe unspezifische Spot-Anzahlen erreicht werden dürfen. Da aber zum einen die Lösung in zu hoch konzentriertem DMSO generell überhöhte Spotanzahlen hervorrufen kann und zum anderen die restlichen Kontrollen im Assay einwandfreie Resultate aufwiesen, kann der berechnete signifikante Unterschied der vorliegenden Proben als eindeutiges Ergebnis gewertet werden. Das als vorrangig gesetzte Ziel, mehr suffiziente und immungesunde TLymphozyten mittels CD200-Blockade zu expandieren, konnte in der vorliegenden experimentellen Studie also in vitro erreicht werden. 67 DISKUSSION 4.3 Deskriptive Betrachtung der T-Zell-Populationen Die Chronische Lymphatische Leukämie wird in erster Linie durch eine Akkumulation immuninkompetenter B-Zell-Klone verursacht, aber auch das TZell-System von CLL-Patienten weist einige Abnormitäten auf. Diese Anomalien reichen von Veränderungen der T-Zell-Anzahl und der CD4+-/ CD8+Ratio bis hin zu funktionellen Ausfällen (48;58;99). Die Überexpression des Fas-Rezeptors zum Beispiel führt zur Apoptose von CD4+-T-Lymphozyten (106), die Existenz abnormaler Repertoires der T-Zell-Rezeptor-Ketten α und β wird als Ursache einer ineffektiven Immunantwort auf CLL-assoziierte Antigene angesehen (23) oder die Minderexpression von CD28 scheint über eine fehlende CD80/86- und CD40-Interaktion eine Nicht-Aktivierung von T-Zellen nach sich zu ziehen (97). Eine bedeutende Rolle im Pathogeneseprozess der Chronischen Lymphatischen Leukämie wird außerdem den regulatorischen (Treg-) T-Zellen zugesprochen: Beyer et al. zeigten, dass aus Blutproben von CLL-Patienten signifikant mehr CD4+-CD25high-Treg-Zellen als aus Proben von gesunden Testpersonen isoliert werden konnten. Diese regulatorischen T-Lymphozyten verfügten gleichzeitig über die Merkmale FOXP3+, CTLA+, GITR+, CD62L+, TGF-β1+ und IL10+. Vor allem bei unbehandelten Patienten, die den Stadien Binet B oder C zugeordnet werden konnten, fiel ein erhöhtes Vorkommen dieser Treg-Zellen auf. Eine Chemotherapie mit Fludarabin ließ jedoch die Treg-Zellzahl wieder abfallen (8). Bereits 2004 wiesen Trzonkowski et al. nach, dass regulatorische T-Zellen die zytotoxische Aktivität von CD8+-T-Lymphozyten und NK-Zellen in einer direkten Zell-Zell-Interaktion hemmen können. Bei Anwesenheit von Treg-Zellen stagnierte und verringerte sich unter anderem die Produktion von IFN-γ und Perforin (111). Zwei Jahre später beleuchteten Yang et al., dass intratumorale Treg-Zellen in einem B-Zell-Non-Hodgkin-Lymphom-Modell ebenfalls die Proliferation und Granula-Produktion von zytotoxischen T-Lymphozyten inhibieren. Die Arbeitsgruppe stellte dar, dass die Degranulation und anschließende zytotoxische Aktivität der infiltrierenden CD8+-T-Zellen, die den Lymphomzellen ausgesetzt waren, fast vollständig durch die Präsenz der intratumoralen Treg68 DISKUSSION Zellen verhindert wurde. Die immunogene Funktionalität der infiltrierenden CD8+-T-Zellen wurde zuvor nachgewiesen. Sie postulierten, dass humane Lymphomzellen zwar sensitiv auf den autologen CTL-vermittelten Zelltod reagieren, aber durch die inhibitorische Funktion der intratumoralen Treg-Zellen geschützt werden. Außerdem zeigten sie eine inverse Beziehung der Anteile von Treg-Zellen und zytotoxischen T-Lymphozyten in Biopsien von B-NHLPatienten (122). Ebenfalls 2006 hatten schon Zhou et al. nachgewiesen, dass die CD4+-TZellantwort durch Treg-Zellen gehemmt wird (124). Desweiteren verfügen Tumorzellen allgemein über Schutzmechanismen gegen Angriffe durch das Immunsystem. Dazu zählen die Sekretion von immuninhibitorischen Faktoren und Zytokinen (zum Beispiel Interleukin 10 und TGF β) und/oder das Fehlen von Tumor-Antigenen (114;115). Mit Hilfe dieser Mechanismen wird so ein Milieu um den Tumor geschaffen, das Immunzellen (dendritische Zellen, zytotoxische T-Zellen und T-Helfer-Zellen) supprimiert und die Umgebung mit regulatorischen T-Zellen anreichert. Abbildung 4.2: Schematische Repräsentation der zell. Interaktion in der Tumorumgebung 69 DISKUSSION In der vorliegenden Dissertationsarbeit konnten stark divergierende T-ZellAnteile im MLR-Modell nachgewiesen werden. Mittels intrazellulärer PEFOXP3-Färbung und Markierung mit Anti-CD25-FITC, -CD4-APC und -CD8PC-5 wurden die Treg-Zellen von den zytotoxischen T-Zellen und den T-HelferLymphozyten separiert betrachtet. Eingeschlossen wurden die 7 Proben mit Peptidpulsung. Dabei fiel auf, dass in den nur mit unstimulierten CLL-Zellen versetzten MLRs weitaus höhere Treg-Zellanteile gemessen wurden, als in den mit CD40Lstimulierten Proben. Weiterhin wurde im mit Anti-CD200-geblockten Well die niedrigste Treg-Zellzahl bestimmt. Die statistische Auswertung ergab, dass sowohl der Treg -Zellanteilsunterschied der Anti-CD200 geblockten Gruppe mit den mit unstimulierten CLL-Zellen versetzten Wells, als auch die Gegenüberstellung von der Anti-CD200-Probe mit der nur CD40L-stimulierten Probe im gepaarten t-Test signifikant war. Analog dazu zeigten sich erhöhte Zellanteile der CD8+-T-Lymphozyten. Sie lagen im Median bei 41,2% im Vergleich zu 34,7% bei den nur CD40Lstimulierten und 25,7% in den mit unstimulierten CLL-Zellen versetzten Wells. Auch hier ließ sich eine Signifikanz berechnen. Im Gegensatz dazu unterschieden sich die CD4+-T-Zellanteile im MLR-Modell nicht bedeutsam. Die im Versuchsaufbau erreichten prozentualen Anteilsverhältnisse erscheinen zwar unverhältnismäßig hoch, aber unter Beachtung der artifiziellen experimentellen Strategie eines vor allem auf T-Zell-Stimulation basierenden MLR-Modells erscheint die Verteilung durchaus glaubwürdig. Diese Auswertung stärkte das Ergebnis, durch die Blockade von CD200 nicht nur eine vermehrte Proliferation von T-Lymphozyten, sondern auch ein erhöhtes Vorkommen von zytotoxischen T-Zellen erzielt zu haben. Der verminderte Treg-Anteil in den mit Anti-CD200-versetzten Wells begünstigte die Vermehrung von CD8+-T-Zellen. Rijkers et al. belegten, dass der immun-inhibitorische CD200R-Rezeptor verschieden auf menschlichen B- und T-Lymphozyten exprimiert ist. Sie zeigten eine klare Expression von CD200R auf B-Zellen. Die Arbeitsgruppe identifizierte ebenfalls eine Subpopulation von B-Lymphozyten, die sowohl den 70 DISKUSSION Rezeptor als auch seinen Liganden – CD200 – exprimiert (88). In der vorliegenden Arbeit wurde jedoch der Nachweis einer Überexpression von CD200 auf den B-CLL-Zellen angestrebt und auch belegt. McWhirther et al. zeigten ebenfalls eine 1,6- bis 5,4-fache Hochregulation von CD200 auf CLLZellen im Gegensatz zu gesunden B-Lymphozyten (74). Die zweite für diese Dissertationsschrift relevante Erkenntnis von Rijkers et al. ist, dass der CD200R-Rezeptor nicht nur generell auf den T-Zellen exprimiert vorliegt, sondern die CD200R-Expression auf CD4+-T-Zellen auch höher ist als auf CD8+-T-Lymphozyten (88). Nicht ganz mit diesen Erkenntnissen in Deckung zu bringen, ist die hier belegte Tatsache, dass durch die Blockade der CD200:CD200R-Interaktion vor allem die zytotoxischen T-Zellanteile zur Proliferation gebracht werden konnten. Allerdings muss der Interaktionsanteil der regulatorischen T-Zellen mit in Betracht gezogen werden. Gorczynski et al. wiesen in einem Maus-Modell nach, dass das Zusammenspiel von CD200 mit seinem Rezeptor zum einen die Entwicklung von dendritischen Zellen begünstigt, die indirekt Treg-Zellen induzieren, und zum anderen die direkte Bildung von regulatorischen T-Zellen aus Thymozyten anregt (33;35;39). Wie zuvor bereits beschrieben, inhibieren diese Treg-Zellen die Aktivierung von zytotoxischen T-Lymphozyten. Im Umkehrschluss ist es so nun einleuchtend, dass verminderte Treg-Zellzahlen eine Erhöhung der CD8+-TZellzahlen nach sich zieht. 71 DISKUSSION 4.4 Fazit und Beurteilung T-Zell-basierte Immuntherapiestrategien sollten zwei relevante Endpunkte beinhalten: Zum einen müssen die T-Zellen vor der tumorinduzierten Apoptose und Anergie geschützt, zum anderen sollte die Erkennung und Eliminierung von Tumorzellen durch körpereigene T-Zellen verbessert werden. Basierend auf diesen Strategien wurde in der vorliegenden Arbeit die Unterbrechung TZell-supprimierender Interaktionen durch CD200 auf die T-Zell- Proliferationssteigerung und die TAA-Erkennung untersucht. In der vorliegenden Dissertationsarbeit konnte eine Proliferationssteigerung der T-Zellen dargelegt werden. Um die funktionelle Rolle von CD200 in der Inhibierung von TAA-spezifischen T-Zellen zu analysieren, konnte die Modulation von Fibromodulin-spezifischen T-Zellen gezeigt werden. Obwohl CLL-Zellen schwache antigenpräsentierende Zellen sind, wahrscheinlich infolge einer niedrigen Expression ko-stimulatorischer Moleküle und der Überexpression von CD200, gibt es Belege, dass autologe zytotoxische T-Zellen die Potenz haben, CLL-Zellen in vitro zu eliminieren (110;118). Es existieren außerdem Daten, dass tumorspezifische CD8+-T- Lymphozyten auch in vivo expandiert werden können (32;119). Mayr et al. konnten zeigen, dass CD40L-transduzierte CLL-Zellen eine Antigen-spezifische T-Zellantwort induzieren können (70;71). In der vorliegenden Arbeit konnte zusätzlich belegt werden, dass die Anzahl der antigenspezifischen CD8+-TLymphozyten nach CD200/CD200R-Interaktionsblockade signifikant gesteigert wurde. Die in der Dissertationsarbeit beobachtete Unterdrückung der regulatorischen T-Zellanzahl durch Blockade der CD200/CD200R-Interaktion ist von speziellem Interesse und sie ist konsistent mit vorherigen Untersuchungen, die zeigten, dass das CD200R-Engagement Knochenmarksstammzellen beeinflusste, sich zu supprimierenden Antigen-präsentierenden Zellen zu entwickeln, die TregZellen induzieren können (39). Die erfolgreiche Stimulation gerade der zytotoxischen T-Zellen und die gleichzeitige Suppression der Treg-Zellen könnten als chemotherapieunterstützendes Behandlungskonzept in der Chronischen Lymphatischen Leukämie aufgenommen werden. 72 DISKUSSION Gerade Erkrankungen mit einem niedrigmalignem Verlauf wie die Chronische Lymphatische Leukämie verlangen Behandlungskonzepte, die effizient im Pathogeneseprozess eingreifen, dabei aber möglichst wenig toxisch sind. Immuntherapeutische Ansätze mittels Antikörper oder Vakzination sind in den letzten Jahren immer stärker favorisierte Modelle (72). Der CD20-Antikörper Rituximab zum Beispiel wurde in der Chronischen Lymphatischen Leukämie bereits erfolgreich getestet und stellt einen neuen Standard in der Erstlinientherapie dar. Vor allem durch die Kombination mit dem bewährten Fludarabin-Cyclophosphamid-Schema konnte das allgemeine und Gesamtansprechen gesteigert werden (22;43;104). Die Beobachtung von natürlicher T-Zell-Reaktivität gegenüber CLL-Zellen und die Abstoßung von CLL-Zellen durch Donor-T-Lymphozyten nach allogener Stammzelltransplantation bestärken die Entwicklung T-Zell-basierter Immuntherapien. Gorczynski et al. zeigten in einem Maus-Leukämie-Modell, dass die Gabe eines Anti-CD200-Antikörpers die Anti-Tumor-Immunität fördern kann (38). Mit den Erkenntnissen dieser Dissertationsarbeit kann postuliert werden, dass eine CD200-Blockade mit anderen immuninduzierenden Therapien der CLL kombiniert werden kann. Anti-CD200 könnte zum Beispiel in Kombination besonders mit Fludarabin Wirkung entfalten und die Treg-Population in der CLL weiter herunterfahren. Überhaupt ist Anti-CD200 möglicherweise ein potenter Partner bei Chemotherapien, um schneller und effektiver ein T-Zell-Immunsystem mit Konzentration auf die zytotoxischen Anteile wiederaufzubauen. Diese CD8+-TZellen wären möglicherweise in der Lage, restliche CLL-Zellen zu eliminieren. CD200 scheint ein wichtiges immunsuppressives Molekül in der Chronischen Lymphatischen Leukämie zu sein: Durch Unterdrückung der CD200/CD200RInteraktion kann die Tumorantigentoleranz in der CLL beseitigt und gleichzeitig die Treg-Anzahl dereguliert werden. Vielleicht ist der CD200-Komplex zusätzlich an defekten immunologischen Synapsen, die von Ramsay et al. beschrieben wurden, beteiligt. Ramsay et al. zeigten, dass eine beeinträchtigte Aktin-Polymerisation auf CD4+- und CD8+-T-Lymphozyten von CLL-Patienten zu einer fehlenden 73 DISKUSSION Synapsenausbildung mit Antigen-präsentierenden Zellen führt. Sie demonstrierten außerdem zum einen, dass zuvor gesunde T-Zellen nach Kontakt mit CLL-Zellen ebenfalls defekte Immunsynapsen ausbilden und zum anderen, dass die Behandlung der CLL-Zellen mit Lenalidomid in einer verbesserten Immunsynapsenformation resultierte (87). Weiterführende Untersuchungen sollten diesen möglichen Aspekt der CD200-Wirkweise miteinbeziehen, um verbesserte Immuntherapien der CLL zu entwickeln. Abbildung 4.3: Entwurf der zell. Interaktion in der Tumorumgebung nach Anti-CD200 Zusatz Zur weiteren klinischen Applikation von Anti-CD200-basierten Therapiekonzepten sind derzeit multizentrischePhase I/II Studien bezüglich Toxizität und Effektivität von funktionellen Anti-CD200 Antikörpern begonnen worden. Hier wird es von zentraler Bedeutung, ob die hier in vitro erhobenen Befunde in der Behandlung des Patienten ebenfallls anwendbar sind und zu einer verbesserten T-Zell Funktion besonders in der antileukämischen Wirkung von TAAspezifischen T-Zellen führt. 74 ZUSAMMENFASSUNG 5. ZUSAMMENFASSUNG Die Chronische Lymphatische Leukämie (CLL) wird als die häufigste adulte Leukämieform der westlichen Welt angesehen. Ursächlich ist eine klonale Proliferation immuninkompetenter B-Lymphozyten, aber auch diverse T-ZellDefekte tragen zur Pathogenese dieser Erkrankung bei. In der vorliegenden Dissertationsarbeit sollte die Blockade des immuninhibierenden Moleküls CD200 als Therapiestrategie in der Chronischen Lymphatischen Leukämie beleuchtet werden. Da die CD200:CD200R- Interaktion immunsupprimierende Signalwege nach sich zieht, wurde eine Beteiligung von CD200 in der Pathogenese der CLL postuliert. Gestärkt wurde die Annahme durch den Nachweis einer Überexpressivität von CD200 auf CLLZellen. Variationen der Expression innerhalb unterschiedlicher Binetstadien oder bei Vorliegen diverser klinischer Prognosefaktoren konnten nicht suffizient festgestellt werden. Im autologen Mixed-lymphocyte-reaction-(MLR)-Modell aus CLL und autologen T-Zellen konnte eine signifikant erhöhte T-Zell-Proliferation unter CD200Blockade und CD40L-Stimulation erreicht werden. Im ELIspot wurde die Spezifität der expandierten T-Lymphozyten für Tumor-assoziierte Antigene (TAA) mittels Interferon-γ-Freisetzung nachgewiesen, hier ließ sich eine verstärkte spezifische TAA-Antwort nach CD200 Blockade zeigen. Desweiteren wurden die T-Zell-Anteile nach Abschluss des MLR-Versuches untersucht. Es zeigte sich eine verminderte Anzahl regulatorischer T-Zellen (Treg) und eine erhöhte Anzahl zytotoxischer CD8+-T-Zellen in den mit AntiCD200 versetzten MLRs. Dies stärkte die These, dass CD200 eine wesentliche Rolle im immunsupprimierenden Mikromilieu der CLL spielt. Zusammenfassend lassen sich als wichtigste Ergebnisse der vorliegenden Arbeit die gelungene Proliferationssteigerung TAA-spezifischer zytotoxischer TLymphozyten und eine Reduktion der regulatorischen T-Zellen dank CD200Blockade hervorheben. Dies lässt die CD200-Blockade als möglichen immunogenen Therapieansatz – vor allem in Kombination mit Fludarabin wegen der ebenfalls den Treg-Zellanteil vermindernden Potenz – als wirkungsvoll erscheinen. 75 ZUSAMMENFASSUNG SUMMARY: Chronic lymphocytic leukaemia of the B cell type (B-CLL) is one of the most common leukaemias in the elderly and is manifest as a clonal proliferation of immune incompetent B-lymphocytes. Furthermore there exist multiple T cell abnormalities in B-CLL patients, which are associated with the development of this leukaemic disease. This thesis proves if blockage of the immune-inhibiting molecule CD200 can be used as therapeutic support. The CD200:CD200R interaction encourages suppression of the immune system. We wanted to show that CD200 is part of CLL pathogenesis. Overexpression of CD200 was detected by flow cytometry but no significant correlation could be seen with Binet stage or prognostic factors. In mixed lymphocyte reaction (MLR) an increased T cell proliferation could be found under blockage of CD200 and stimulation with CD40L. Immune competence of these artificial created T cells was verified by ELIspot. Interferone γ secretion in reaction to tumor associated antigens (Fibromodulin) was detected in this setting. Decreasing CLL cell counts in MLR led to supplying the evidence, that the CD200 solution is not cytotoxic and T cell cytotoxicity downsized the CLL population. Finishing the experiments T cell contingents were explored. Decreased regulatory T-cells (Treg) and increased cytotoxic CD8+ T cell counts in the CD200 blocked MLRs were shown by flow cytometry. This strengthened the assumption that CD200 plays a key role in the immune suppressing tumor microenvironment of CLL. In summary the most important findings were the enhancement of TAA-specific CD8+ T cell proliferation and the reduction of Treg cells. Therefore CD200 blockage could be an effective therapeutic strategy particularly in combination with fludarabine, that decreases Treg cells as well. 76 LITERATURVERZEICHNIS 6. LITERATURVERZEICHNIS (1) Adler SH, Turka LA. Immunotherapy as a means to induce transplantation tolerance. Curr Opin Immunol 2002; 14(5):660-665. (2) Akira S, Takeda K, Kaisho T. Toll-like receptors: critical proteins linking innate and acquired immunity. Nat Immunol 2001; 2(8):675-680. (3) Bansal-Pakala P, Halteman BS, Cheng MH, Croft M. Costimulation of CD8 T cell responses by OX40. J Immunol 2004; 172(8):4821-4825. (4) Barclay AN. Different reticular elements in rat lymphoid tissue identified by localization of Ia, Thy-1 and MRC OX 2 antigens. Immunology 1981; 44(4):727-736. (5) Barclay AN, Wright GJ, Brooke G, Brown MH. CD200 and membrane protein interactions in the control of myeloid cells. Trends Immunol 2002; 23(6):285-290. (6) Bartik MM, Welker D, Kay NE. Impairments in immune cell function in B cell chronic lymphocytic leukemia. Semin Oncol 1998; 25(1):27-33. (7) Bertram EM, Tafuri A, Shahinian A, Chan VS, Hunziker L, Recher M et al. Role of ICOS versus CD28 in antiviral immunity. Eur J Immunol 2002; 32(12):3376-3385. (8) Beyer M, Kochanek M, Darabi K, Popov A, Jensen M, Endl E et al. Reduced frequencies and suppressive function of CD4+CD25hi regulatory T cells in patients with chronic lymphocytic leukemia after therapy with fludarabine. Blood 2005; 106(6):2018-2025. (9) Binet JL, Auquier A, Dighiero G, Chastang C, Piguet H, Goasguen J et al. A new prognostic classification of chronic lymphocytic leukemia derived from a multivariate survival analysis. Cancer 1981; 48(1):198206. (10) Binet JL, Caligaris-Cappio F, Catovsky D, Cheson B, Davis T, Dighiero G et al. Perspectives on the use of new diagnostic tools in the treatment of chronic lymphocytic leukemia. Blood 2006; 107(3):859-861. (11) Borriello F, Lederer J, Scott S, Sharpe AH. MRC OX-2 defines a novel T cell costimulatory pathway. J Immunol 1997; 158(10):4548-4554. (12) Bromley SK, Iaboni A, Davis SJ, Whitty A, Green JM, Shaw AS et al. The immunological synapse and CD28-CD80 interactions. Nat Immunol 2001; 2(12):1159-1166. (13) Byrd JC, Stilgenbauer S, Flinn IW. Chronic lymphocytic leukemia. Hematology Am Soc Hematol Educ Program 2004;163-183. (14) Cameron CM, Barrett JW, Liu L, Lucas AR, McFadden G. Myxoma virus 77 LITERATURVERZEICHNIS M141R expresses a viral CD200 (vOX-2) that is responsible for downregulation of macrophage and T-cell activation in vivo. J Virol 2005; 79(10):6052-6067. (15) Cantwell M, Hua T, Pappas J, Kipps TJ. Acquired CD40-ligand deficiency in chronic lymphocytic leukemia. Nat Med 1997; 3(9):984-989. (16) Cheson BD, Bennett JM, Grever M, Kay N, Keating MJ, O'Brien S et al. National Cancer Institute-sponsored Working Group guidelines for chronic lymphocytic leukemia: revised guidelines for diagnosis and treatment. Blood 1996; 87(12):4990-4997. (17) Chung YH, Means RE, Choi JK, Lee BS, Jung JU. Kaposi's sarcomaassociated herpesvirus OX2 glycoprotein activates myeloid-lineage cells to induce inflammatory cytokine production. J Virol 2002; 76(10):46884698. (18) Cimmino A, Calin GA, Fabbri M, Iorio MV, Ferracin M, Shimizu M et al. miR-15 and miR-16 induce apoptosis by targeting BCL2. Proc Natl Acad Sci U S A 2005; 102(39):13944-13949. (19) Crespo M, Bosch F, Villamor N, Bellosillo B, Colomer D, Rozman M et al. ZAP-70 expression as a surrogate for immunoglobulin-variable-region mutations in chronic lymphocytic leukemia. N Engl J Med 2003; 348(18):1764-1775. (20) Crocker PR, Varki A. Siglecs, sialic acids and innate immunity. Trends Immunol 2001; 22(6):337-342. (21) Damle RN, Wasil T, Fais F, Ghiotto F, Valetto A, Allen SL et al. Ig V gene mutation status and CD38 expression as novel prognostic indicators in chronic lymphocytic leukemia. Blood 1999; 94(6):1840-1847. (22) Del Poeta G, Del Principe MI, Buccisano F, Maurillo L, Capelli G, Luciano F et al. Consolidation and maintenance immunotherapy with rituximab improve clinical outcome in patients with B-cell chronic lymphocytic leukemia. Cancer 2008; 112(1):119-128. (23) Dianzani U, Omede P, Marmont F, DiFranco D, Fusaro A, Bragardo M et al. Expansion of T cells expressing low CD4 or CD8 levels in B-cell chronic lymphocytic leukemia: correlation with disease status and neoplastic phenotype. Blood 1994; 83(8):2198-2205. (24) Döhner H, Fischer K, Bentz M, Hansen K, Benner A, Cabot G et al. p53 gene deletion predicts for poor survival and non-response to therapy with purine analogs in chronic B-cell leukemias. Blood 1995; 85(6):15801589. (25) Döhner H, Stilgenbauer S, Benner A, Leupolt E, Krober A, Bullinger L et al. Genomic aberrations and survival in chronic lymphocytic leukemia. N Engl J Med 2000; 343(26):1910-1916. (26) Dreger P, Corradini P, Kimby E, Michallet M, Milligan D, Schetelig J et al. 78 LITERATURVERZEICHNIS Indications for allogeneic stem cell transplantation in chronic lymphocytic leukemia: the EBMT transplant consensus. Leukemia 2007; 21(1):12-17. (27) el Rouby S, Thomas A, Costin D, Rosenberg CR, Potmesil M, Silber R et al. p53 gene mutation in B-cell chronic lymphocytic leukemia is associated with drug resistance and is independent of MDR1/MDR3 gene expression. Blood 1993; 82(11):3452-3459. (28) Fallarino F, Asselin-Paturel C, Vacca C, Bianchi R, Gizzi S, Fioretti MC et al. Murine plasmacytoid dendritic cells initiate the immunosuppressive pathway of tryptophan catabolism in response to CD200 receptor engagement. J Immunol 2004; 173(6):3748-3754. (29) Fayad L, Keating MJ, Reuben JM, O'Brien S, Lee BN, Lerner S et al. Interleukin-6 and interleukin-10 levels in chronic lymphocytic leukemia: correlation with phenotypic characteristics and outcome. Blood 2001; 97(1):256-263. (30) Filella X, Alcover J, Zarco MA, Beardo P, Molina R, Ballesta AM. Analysis of type T1 and T2 cytokines in patients with prostate cancer. Prostate 2000; 44(4):271-274. (31) Garrone P, Neidhardt EM, Garcia E, Galibert L, van Kooten C, Banchereau J. Fas ligation induces apoptosis of CD40-activated human B lymphocytes. J Exp Med 1995; 182(5):1265-1273. (32) Gitelson E, Hammond C, Mena J, Lorenzo M, Buckstein R, Berinstein NL et al. Chronic lymphocytic leukemia-reactive T cells during disease progression and after autologous tumor cell vaccines. Clin Cancer Res 2003; 9(5):1656-1665. (33) Gorczynski R, Khatri I, Lee L, Boudakov I. An interaction between CD200 and monoclonal antibody agonists to CD200R2 in development of dendritic cells that preferentially induce populations of CD4+CD25+ T regulatory cells. J Immunol 2008; 180(9):5946-5955. (34) Gorczynski RM. CD200 and its receptors as targets for immunoregulation. Curr Opin Investig Drugs 2005; 6(5):483-488. (35) Gorczynski RM. Thymocyte/splenocyte-derived CD4+CD25+Treg stimulated by anti-CD200R2 derived dendritic cells suppress mixed leukocyte cultures and skin graft rejection. Transplantation 2006; 81(7):1027-1034. (36) Gorczynski RM, Cattral MS, Chen Z, Hu J, Lei J, Min WP et al. An immunoadhesin incorporating the molecule OX-2 is a potent immunosuppressant that prolongs allo- and xenograft survival. J Immunol 1999; 163(3):1654-1660. (37) Gorczynski RM, Chen Z, Clark DA, Kai Y, Lee L, Nachman J et al. Structural and functional heterogeneity in the CD200R family of immunoregulatory molecules and their expression at the feto-maternal interface. Am J Reprod Immunol 2004; 52(2):147-163. 79 LITERATURVERZEICHNIS (38) Gorczynski RM, Chen Z, Hu J, Kai Y, Lei J. Evidence of a role for CD200 in regulation of immune rejection of leukaemic tumour cells in C57BL/6 mice. Clin Exp Immunol 2001; 126(2):220-229. (39) Gorczynski RM, Lee L, Boudakov I. Augmented Induction of CD4+CD25+ Treg using monoclonal antibodies to CD200R. Transplantation 2005; 79(9):1180-1183. (40) Görgün G, Holderried TA, Zahrieh D, Neuberg D, Gribben JG. Chronic lymphocytic leukemia cells induce changes in gene expression of CD4 and CD8 T cells. J Clin Invest 2005; 115(7):1797-1805. (41) Grever MR, Lucas DM, Dewald GW, Neuberg DS, Reed JC, Kitada S et al. Comprehensive assessment of genetic and molecular features predicting outcome in patients with chronic lymphocytic leukemia: results from the US Intergroup Phase III Trial E2997. J Clin Oncol 2007; 25(7):799-804. (42) Hallek M, Eichhorst B, Dreger P. Chronische lymphatische Leukämie. http://www.dgho.de/_cmsdata/_file/file_178.pdf . 2006. (43) Hallek M, Fingerle-Rowson G, Fink AM, Busch R, Mayer J, Hensel M et al. Immunochemotherapy with Fludarabine (F), Cyclophosphamide (C), and Rituximab (R) (FCR) Versus Fludarabine and Cyclophosphamide (FC) Improves Response Rates and Progression-Free Survival (PFS) of Previously Untreated Patients (pts) with Advanced Chronic Lymphocytic Leukemia (CLL). Blood (ASH Annual Meeting Abstracts 2008) 112: Abstract 325. 2008. (44) Hallek M, Langenmayer I, Nerl C, Knauf W, Dietzfelbinger H, Adorf D et al. Elevated serum thymidine kinase levels identify a subgroup at high risk of disease progression in early, nonsmoldering chronic lymphocytic leukemia. Blood 1999; 93(5):1732-1737. (45) Hamblin TJ, Davis Z, Gardiner A, Oscier DG, Stevenson FK. Unmutated Ig V(H) genes are associated with a more aggressive form of chronic lymphocytic leukemia. Blood 1999; 94(6):1848-1854. (46) Han P, Goularte OD, Rufner K, Wilkinson B, Kaye J. An inhibitory Ig superfamily protein expressed by lymphocytes and APCs is also an early marker of thymocyte positive selection. J Immunol 2004; 172(10):59315939. (47) Herold G. Innere Medizin - Eine vorlesungsorientierte Darstellung. Herold-Verlag, 2005. (48) Herrmann F, Lochner A, Philippen H, Jauer B, Ruhl H. Imbalance of T cell subpopulations in patients with chronic lymphocytic leukaemia of the B cell type. Clin Exp Immunol 1982; 49(1):157-162. (49) Hersey P, Wotherspoon J, Reid G, Gunz FW. Hypogammaglobulinaemia associated with abnormalities of both B and T lymphocytes in patients with chronic lymphatic leukaemia. Clin Exp Immunol 1980; 39(3):69880 LITERATURVERZEICHNIS 707. (50) Hitoshi Y, Lorens J, Kitada SI, Fisher J, LaBarge M, Ring HZ et al. Toso, a cell surface, specific regulator of Fas-induced apoptosis in T cells. Immunity 1998; 8(4):461-471. (51) Hoffmann JA, Kafatos FC, Janeway CA, Ezekowitz RA. Phylogenetic perspectives in innate immunity. Science 1999; 284(5418):1313-1318. (52) ImmunDefektCentrum der Charité. Die CD Nomenklatur. http://www.immundefekt.de/cd.shtml . 2006. (53) Jäger E, Jager D, Knuth A. Peptide Vaccination in Clinical Oncology. Onkologie 2000; 23(5):410-415. (54) Janeway CA, Travers P, Walport M, Shlomchik M. Immunologie. Spektrum Akademischer Vlg., Auflage: 5, 2005. (55) Kanamaru F, Iwai H, Ikeda T, Nakajima A, Ishikawa I, Azuma M. Expression of membrane-bound and soluble receptor activator of NFkappaB ligand (RANKL) in human T cells. Immunol Lett 2004; 94(3):239246. (56) Kawasaki BT, Mistree T, Hurt EM, Kalathur M, Farrar WL. Co-expression of the toleragenic glycoprotein, CD200, with markers for cancer stem cells. Biochem Biophys Res Commun 2007; 364(4):778-782. (57) Kay NE, Han L, Bone N, Williams G. Interleukin 4 content in chronic lymphocytic leukaemia (CLL) B cells and blood CD8+ T cells from B-CLL patients: impact on clonal B-cell apoptosis. Br J Haematol 2001; 112(3):760-767. (58) Kay NE, Johnson JD, Stanek R, Douglas SD. T-cell subpopulations in chronic lymphocytic leukemia: abnormalities in distribtuion and in in vitro receptor maturation. Blood 1979; 54(2):540-544. (59) Keating M.J., Lerner S, Kantarjian H. The serum b2-microglobulin (b2m) level is more powerful than stage in predicting response and survival in chronic lymphocytic leukemia (CLL). Blood 1995; 86 (Suppl. 1):606a. (60) Kosuge H, Suzuki J, Gotoh R, Koga N, Ito H, Isobe M et al. Induction of immunologic tolerance to cardiac allograft by simultaneous blockade of inducible co-stimulator and cytotoxic T-lymphocyte antigen 4 pathway. Transplantation 2003; 75(8):1374-1379. (61) Krackhardt AM, Witzens M, Harig S, Hodi FS, Zauls AJ, Chessia M et al. Identification of tumor-associated antigens in chronic lymphocytic leukemia by SEREX. Blood 2002; 100(6):2123-2131. (62) Kuchroo VK, Umetsu DT, DeKruyff RH, Freeman GJ. The TIM gene family: emerging roles in immunity and disease. Nat Rev Immunol 2003; 3(6):454-462. 81 LITERATURVERZEICHNIS (63) Lanier LL. NK cell receptors. Annu Rev Immunol 1998; 16:359-393. (64) Lanier LL. Face off--the interplay between activating and inhibitory immune receptors. Curr Opin Immunol 2001; 13(3):326-331. (65) Lauerova L, Dusek L, Simickova M, Kocak I, Vagundova M, Zaloudik J et al. Malignant melanoma associates with Th1/Th2 imbalance that coincides with disease progression and immunotherapy response. Neoplasma 2002; 49(3):159-166. (66) Lauria F, Foa R, Mantovani V, Fierro MT, Catovsky D, Tura S. T-cell functional abnormality in B-chronic lymphocytic leukaemia: evidence of a defect of the T-helper subset. Br J Haematol 1983; 54(2):277-283. (67) Longo PG, Laurenti L, Gobessi S, Sica S, Leone G, Efremov DG. The Akt/Mcl-1 pathway plays a prominent role in mediating antiapoptotic signals downstream of the B-cell receptor in chronic lymphocytic leukemia B cells. Blood 2008; 111(2):846-855. (68) Lotz M, Ranheim E, Kipps TJ. Transforming growth factor beta as endogenous growth inhibitor of chronic lymphocytic leukemia B cells. J Exp Med 1994; 179(3):999-1004. (69) Luttmann W, Bratke K, Küpper M, Myrtek D. Der Experimentator: Immunologie. Spektrum-Akademischer Vlg; Auflage: 1, 2004. (70) Mayr C, Bund D, Schlee M, Bamberger M, Kofler DM, Hallek M et al. MDM2 is recognized as a tumor-associated antigen in chronic lymphocytic leukemia by CD8+ autologous T lymphocytes. Exp Hematol 2006; 34(1):44-53. (71) Mayr C, Bund D, Schlee M, Moosmann A, Kofler DM, Hallek M et al. Fibromodulin as a novel tumor-associated antigen (TAA) in chronic lymphocytic leukemia (CLL), which allows expansion of specific CD8+ autologous T lymphocytes. Blood 2005; 105(4):1566-1573. (72) Mayr C, Kofler DM, Buning H, Bund D, Hallek M, Wendtner CM. Transduction of CLL cells by CD40 ligand enhances an antigen-specific immune recognition by autologous T cells. Blood 2005; 106(9):32233226. (73) Mayr C, Speicher MR, Kofler DM, Buhmann R, Strehl J, Busch R et al. Chromosomal translocations are associated with poor prognosis in chronic lymphocytic leukemia. Blood 2006; 107(2):742-751. (74) McWhirter JR, Kretz-Rommel A, Saven A, Maruyama T, Potter KN, Mockridge CI et al. Antibodies selected from combinatorial libraries block a tumor antigen that plays a key role in immunomodulation. Proc Natl Acad Sci U S A 2006; 103(4):1041-1046. (75) Medzhitov R. Toll-like receptors and innate immunity. Nat Rev Immunol 2001; 1(2):135-145. 82 LITERATURVERZEICHNIS (76) Molica S, Alberti A. Prognostic value of the lymphocyte doubling time in chronic lymphocytic leukemia. Cancer 1987; 60(11):2712-2716. (77) Moreaux J, Hose D, Reme T, Jourdan E, Hundemer M, Legouffe E et al. CD200 is a new prognostic factor in multiple myeloma. Blood 2006; 108(13):4194-4197. (78) Nagorsen D, Marincola FM. Analyzing T Cell Responses - How to Analyze Cellular Immune Responses against Tumor Associated Antigens. Springer Netherlands, 2005. (79) Nückel H, Huttmann A, Klein-Hitpass L, Schroers R, Fuhrer A, Sellmann L et al. Lipoprotein lipase expression is a novel prognostic factor in B-cell chronic lymphocytic leukemia. Leuk Lymphoma 2006; 47(6):1053-1061. (80) Oldenborg PA, Zheleznyak A, Fang YF, Lagenaur CF, Gresham HD, Lindberg FP. Role of CD47 as a marker of self on red blood cells. Science 2000; 288(5473):2051-2054. (81) Orsini E, Guarini A, Chiaretti S, Mauro FR, Foa R. The circulating dendritic cell compartment in patients with chronic lymphocytic leukemia is severely defective and unable to stimulate an effective T-cell response. Cancer Res 2003; 63(15):4497-4506. (82) Pallasch CP, Schulz A, Kutsch N, Schwamb J, Hagist S, Kashkar H et al. Overexpression of TOSO in CLL is triggered by B-cell receptor signaling and associated with progressive disease. Blood 2008; 112(10):42134219. (83) Petermann KB, Rozenberg GI, Zedek D, Groben P, McKinnon K, Buehler C et al. CD200 is induced by ERK and is a potential therapeutic target in melanoma. J Clin Invest 2007; 117(12):3922-3929. (84) Petroff MG, Chen L, Phillips TA, Hunt JS. B7 family molecules: novel immunomodulators at the maternal-fetal interface. Placenta 2002; 23 Suppl A:S95-101. (85) Podhorecka M, Dmoszynska A, Rolinski J, Wasik E. T type 1/type 2 subsets balance in B-cell chronic lymphocytic leukemia--the three-color flow cytometry analysis. Leuk Res 2002; 26(7):657-660. (86) Rai KR, Sawitsky A, Cronkite EP, Chanana AD, Levy RN, Pasternack BS. Clinical staging of chronic lymphocytic leukemia. Blood 1975; 46(2):219-234. (87) Ramsay AG, Johnson AJ, Lee AM, Gorgun G, Le Dieu R, Blum W et al. Chronic lymphocytic leukemia T cells show impaired immunological synapse formation that can be reversed with an immunomodulating drug. J Clin Invest 2008; 118(7):2427-2437. (88) Rijkers ES, de Ruiter T, Baridi A, Veninga H, Hoek RM, Meyaard L. The inhibitory CD200R is differentially expressed on human and mouse T and B lymphocytes. Mol Immunol 2008; 45(4):1126-1135. 83 LITERATURVERZEICHNIS (89) Rosenberg SA. Cancer vaccines based on the identification of genes encoding cancer regression antigens. Immunol Today 1997; 18(4):175182. (90) Rossi E, Matutes E, Morilla R, Owusu-Ankomah K, Heffernan AM, Catovsky D. Zeta chain and CD28 are poorly expressed on T lymphocytes from chronic lymphocytic leukemia. Leukemia 1996; 10(3):494-497. (91) Roué G, Lancry L, Duquesne F, Salaun V, Troussard X, Sola B. Upstream mediators of the Fas apoptotic transduction pathway are defective in B-chronic lymphocytic leukemia. Leuk Res 2001; 25(11):967980. (92) Russo V, Tanzarella S, Dalerba P, Rigatti D, Rovere P, Villa A et al. Dendritic cells acquire the MAGE-3 human tumor antigen from apoptotic cells and induce a class I-restricted T cell response. Proc Natl Acad Sci U S A 2000; 97(5):2185-2190. (93) Sabatos CA, Chakravarti S, Cha E, Schubart A, Sanchez-Fueyo A, Zheng XX et al. Interaction of Tim-3 and Tim-3 ligand regulates T helper type 1 responses and induction of peripheral tolerance. Nat Immunol 2003; 4(11):1102-1110. (94) Salama AD, Chitnis T, Imitola J, Ansari MJ, Akiba H, Tushima F et al. Critical role of the programmed death-1 (PD-1) pathway in regulation of experimental autoimmune encephalomyelitis. J Exp Med 2003; 198(1):71-78. (95) Schmidt SM, Schag K, Muller MR, Weck MM, Appel S, Kanz L et al. Survivin is a shared tumor-associated antigen expressed in a broad variety of malignancies and recognized by specific cytotoxic T cells. Blood 2003; 102(2):571-576. (96) Scrivener S, Goddard RV, Kaminski ER, Prentice AG. Abnormal T-cell function in B-cell chronic lymphocytic leukaemia. Leuk Lymphoma 2003; 44(3):383-389. (97) Scrivener S, Kaminski ER, Demaine A, Prentice AG. Analysis of the expression of critical activation/interaction markers on peripheral blood T cells in B-cell chronic lymphocytic leukaemia: evidence of immune dysregulation. Br J Haematol 2001; 112(4):959-964. (98) Seet BT, Johnston JB, Brunetti CR, Barrett JW, Everett H, Cameron C et al. Poxviruses and immune evasion. Annu Rev Immunol 2003; 21:377423. (99) Semenzato G, Pezzutto A, Foa R, Lauria F, Raimondi R. T lymphocytes in B-cell chronic lymphocytic leukemia: characterization by monoclonal antibodies and correlation with Fc receptors. Clin Immunol Immunopathol 1983; 26(2):155-161. (100) Stinchcombe JC, Bossi G, Booth S, Griffiths GM. The immunological 84 LITERATURVERZEICHNIS synapse of CTL contains a secretory domain and membrane bridges. Immunity 2001; 15(5):751-761. (101) Suresh M, Whitmire JK, Harrington LE, Larsen CP, Pearson TC, Altman JD et al. Role of CD28-B7 interactions in generation and maintenance of CD8 T cell memory. J Immunol 2001; 167(10):5565-5573. (102) Tabata T, Hazama S, Yoshino S, Oka M. Th2 subset dominance among peripheral blood T lymphocytes in patients with digestive cancers. Am J Surg 1999; 177(3):203-208. (103) Takeuchi T, Ueki T, Sasaki Y, Kajiwara T, Li B, Moriyama N et al. Th2like response and antitumor effect of anti-interleukin-4 mAb in mice bearing renal cell carcinoma. Cancer Immunol Immunother 1997; 43(6):375-381. (104) Tam CS, Keating MJ. Chemoimmunotherapy of chronic lymphocytic leukemia. Best Pract Res Clin Haematol 2007; 20(3):479-498. (105) Tendler CL, Burton JD, Jaffe J, Danielpour D, Charley M, McCoy JP et al. Abnormal cytokine expression in Sezary and adult T-cell leukemia cells correlates with the functional diversity between these T-cell malignancies. Cancer Res 1994; 54(16):4430-4435. (106) Tinhofer I, Marschitz I, Kos M, Henn T, Egle A, Villunger A et al. Differential sensitivity of CD4+ and CD8+ T lymphocytes to the killing efficacy of Fas (Apo-1/CD95) ligand+ tumor cells in B chronic lymphocytic leukemia. Blood 1998; 91(11):4273-4281. (107) Tomasello E, Cant C, Buhring HJ, Vely F, Andre P, Seiffert M et al. Association of signal-regulatory proteins beta with KARAP/DAP-12. Eur J Immunol 2000; 30(8):2147-2156. (108) Tonks A, Hills R, White P, Rosie B, Mills KI, Burnett AK et al. CD200 as a prognostic factor in acute myeloid leukaemia. Leukemia 2007; 21(3):566568. (109) Totterman TH, Carlsson M, Simonsson B, Bengtsson M, Nilsson K. T-cell activation and subset patterns are altered in B-CLL and correlate with the stage of the disease. Blood 1989; 74(2):786-792. (110) Trojan A, Schultze JL, Witzens M, Vonderheide RH, Ladetto M, Donovan JW et al. Immunoglobulin framework-derived peptides function as cytotoxic T-cell epitopes commonly expressed in B-cell malignancies. Nat Med 2000; 6(6):667-672. (111) Trzonkowski P, Szmit E, Mysliwska J, Dobyszuk A, Mysliwski A. CD4+CD25+ T regulatory cells inhibit cytotoxic activity of T CD8+ and NK lymphocytes in the direct cell-to-cell interaction. Clin Immunol 2004; 112(3):258-267. (112) Tsiodras S, Samonis G, Keating MJ, Kontoyiannis DP. Infection and immunity in chronic lymphocytic leukemia. Mayo Clin Proc 2000; 85 LITERATURVERZEICHNIS 75(10):1039-1054. (113) Van den Eynde BJ, van der BP. T cell defined tumor antigens. Curr Opin Immunol 1997; 9(5):684-693. (114) Vonderheide RH, Hahn WC, Schultze JL, Nadler LM. The telomerase catalytic subunit is a widely expressed tumor-associated antigen recognized by cytotoxic T lymphocytes. Immunity 1999; 10(6):673-679. (115) Wahl SM, Swisher J, McCartney-Francis N, Chen W. TGF-beta: the perpetrator of immune suppression by regulatory T cells and suicidal T cells. J Leukoc Biol 2004; 76(1):15-24. (116) Waugh SM, Harris JL, Fletterick R, Craik CS. The structure of the proapoptotic protease granzyme B reveals the molecular determinants of its specificity. Nat Struct Biol 2000; 7(9):762-765. (117) Wekerle T, Kurtz J, Bigenzahn S, Takeuchi Y, Sykes M. Mechanisms of transplant tolerance induction using costimulatory blockade. Curr Opin Immunol 2002; 14(5):592-600. (118) Wendtner CM, Kofler DM, Theiss HD, Kurzeder C, Buhmann R, Schweighofer C et al. Efficient gene transfer of CD40 ligand into primary B-CLL cells using recombinant adeno-associated virus (rAAV) vectors. Blood 2002; 100(5):1655-1661. (119) Wierda WG, Cantwell MJ, Woods SJ, Rassenti LZ, Prussak CE, Kipps TJ. CD40-ligand (CD154) gene therapy for chronic lymphocytic leukemia. Blood 2000; 96(9):2917-2924. (120) Wikipedia. The Free Encyclopedia. http://www.wikipedia.org/ . 2008. (121) Wright GJ, Cherwinski H, Foster-Cuevas M, Brooke G, Puklavec MJ, Bigler M et al. Characterization of the CD200 receptor family in mice and humans and their interactions with CD200. J Immunol 2003; 171(6):3034-3046. (122) Yang ZZ, Novak AJ, Ziesmer SC, Witzig TE, Ansell SM. Attenuation of CD8(+) T-cell function by CD4(+)CD25(+) regulatory T cells in B-cell nonHodgkin's lymphoma. Cancer Res 2006; 66(20):10145-10152. (123) Zhang S, Cherwinski H, Sedgwick JD, Phillips JH. Molecular mechanisms of CD200 inhibition of mast cell activation. J Immunol 2004; 173(11):6786-6793. (124) Zhou G, Drake CG, Levitsky HI. Amplification of tumor-specific regulatory T cells following therapeutic cancer vaccines. Blood 2006; 107(2):628636. 86 PUBLIKATIONEN 7. PUBLIKATIONEN Die Ergebnisse dieser Dissertationsschrift wurden mit Genehmigung des Medizinischen Dekanates der Universität Köln in folgenden Fachzeitschriften und bei nachstehenden Fachtagungen publiziert: Christian P. Pallasch, Sabine Ulbrich, Reinhild Brinker, Michael Hallek, Robert A. Uger and Clemens-Martin Wendtner. Disruption of T cell suppression in chronic lymphocytic leukemia by CD200 blockade. Leukemia Research 2008, Oct 4. [Epub ahead of print] Christian P. Pallasch, Sabine Ulbrich, Reinhild Brinker, Michael Hallek, Robert A. Uger and Clemens-Martin Wendtner. Disruption of T cell suppression in chronic lymphocytic leukemia by CD200 blockade. Jahrestagung der DeutschÖstereichischen Gesellschaft für Hämatologie und Onkologie (DGHO) in Wien, Okt. 2008, Posterpräsentation Auszeichnung der DGHO für die beste ausgestellte Veröffentlichung 87 LEBENSLAUF 8. Mein LEBENSLAUF Lebenslauf wird aus Gründen des Datenschutzes in der elektronischen Fassung meiner Arbeit nicht veröffentlicht. Druck und Bindung: Hundt Druck GmbH, Köln Tel: +49 (0) 221 940 68-0 · www.hundt-druck.de 88
