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Jahrbuch 2015/2016 | Portugues, Ruben | Neuronale Netze mithilfe der Zebrafischlarve erforschen Neuronale Netze mithilfe der Zebrafischlarve erforschen Using zebrafish larvae to link stimuli to behavior Portugues, Ruben Max-Planck-Institut für Neurobiologie, Martinsried Korrespondierender Autor E-Mail: [email protected] Zusammenfassung Eine Hauptfunktion unseres Gehirns ist es, Sinneseindrücke zu verarbeiten, um das optimale Verhalten zu w ählen. Die Berechnungen, mit denen das Gehirn Sinneseindrücke und Verhalten verbindet, sind kaum verstanden. Um diese komplexen Vorgänge zu verstehen, untersuchen W issenschaftler einfachere Modellorganismen. Die transparente Larve des Zebrafisches erlaubt es den Forschern, mit neuesten optischen Methoden dem gesamten Gehirn und selbst einzelnen Nervenzellen bei der Arbeit zuzuschauen. Dies hilft zu verstehen, w ie neuronale Netzw erke Sinneseindrücke in Verhalten übersetzen. Summary A key function of the brain is to integrate incoming sensory information, and to select the optimal behavior in response to these external cues. The underlying computations in the brain are extremely complex and poorly understood. To address this area of research, scientists use the transparent larval zebrafish as model organism. W ith the aid of pow erful microscopes, scientists can monitor the w hole brain activity at single cell resolution in the intact, behaving animal. This helps to understand how neuronal circuit dynamics translate sensory processing into behavioral output. Eine der größten Herausforderungen der Neurow issenschaften ist es zu verstehen, w ie die Aktivität von Milliarden miteinander verbundener Nervenzellen die Planung und Ausw ahl passender Verhaltensmuster entsprechend den äußeren Umständen beeinflusst. Bis jetzt haben W issenschaftler nur ein sehr eingeschränktes Verständnis von der Funktion solcher neuronalen Netzw erke. Dies liegt vor allem daran, dass diese Netzw erke hochkomplex sind und es kaum passende Methoden gibt, um ihre Aktivität präzise in Zeit und Raum zu erfassen. Durch die einzigarten Eigenschaften der Zebrafischlarve können Forscher einige dieser Einschränkungen bew ältigen, sodass Nervenzellverbände detailliert erforscht w erden können. © 2016 Max-Planck-Gesellschaft w w w .mpg.de 1/6 Jahrbuch 2015/2016 | Portugues, Ruben | Neuronale Netze mithilfe der Zebrafischlarve erforschen A bb. 1: (O be n) Eine Ze bra fischla rve . Da s grüne Vie re ck im obe re n Bild ist im unte re n Bild ve rgröße rt da rge ste llt. (Unte n) Da s Ge hirn de r Ze bra fischla rve le uchte t grün, da hie r in a lle n Ne rve nze lle n e in fluore szie re nde r, ge ne tisch-k odie rte r Ka lzium -Se nsor vorha nde n ist. Da s bla ue Vie re ck gibt die Ansicht in Abbildung 3 wie de r. © Ma x -P la nck -Institut für Ne urobiologie / P ortugue s Die Larve des Zebrafisches (Abb. 1), ursprünglich als Zebrabärbling bekannt, ist ein zirka vier Millimeter langes W irbeltier. Sie besitzt rund 100.000 Nervenzellen. Im Vergleich zum menschlichen Gehirn hat die Larve gut eine Million Mal w eniger Nervenzellen. Sie kann jedoch damit immer noch komplexe Verhaltensmuster abrufen. Der größte Vorteil für die Forschung ist jedoch, dass die Larve durchsichtig ist. Dieser entscheidende Vorteil ermöglicht es, das komplette Gehirn mit einer Einzelzellauflösung zu beobachten. Das Beste ist, dass alles am w achen und sich verhaltenden Tier beobachtet w erden kann und keine invasiven Arbeiten nötig sind. Mit Hilfe der neuesten bildgebenden Verfahren können die W issenschaftler am Max-Planck-Institut für Neurobiologie so gew isse Aktivitätsmuster der Nervenzellen mit spezifischen Sinneseindrücken und Verhaltensmustern korrelieren. Ein essenzieller Schritt, um zu verstehen, w ie das eine ins andere übersetzt w ird. Visuell gesteuerte Verhaltensmuster Zebrafischlarven können spezifische Verhaltensmuster abrufen, w enn sie mit verschiedenen Klassen von visuellen Reizen konfrontiert w erden (Abb. 2). Ein Beispiel für eine solche Klasse ist die optokinetische Reaktion: Mit gezielten Augenbew egungen versucht die Larve den Bew egungen von Objekten im visuellen Feld zu folgen. Auf diese Weise bleibt der Blick der Larve möglichst stabil und die Netzhaut nimmt w eniger Bildbew egung w ahr. Ein w eiteres, stereotypes Verhaltensmuster ist die optomotorische Reaktion. Hier © 2016 Max-Planck-Gesellschaft w w w .mpg.de 2/6 Jahrbuch 2015/2016 | Portugues, Ruben | Neuronale Netze mithilfe der Zebrafischlarve erforschen versucht die Zebrafischlarve in die Richtung der w ahrgenommenen Bew egung des kompletten Sichtfeldes zu schw immen. Im Labor kann dieses Verhalten nachgestellt w erden, indem der Larve von unten schw arz-w eiße Balken gezeigt w erden, die sich von ihr w eg bew egen. Dies gaukelt der Larve vor, dass sie durch den Strom des W assers w eggerissen w ird. Durch Schw immen versucht sie, die w ahrgenommene Umw elt zu stabilisieren. A bb. 2: Die La rve schwim m t in e ine r tra nspa re nte n Scha le m it de m visue lle n Stim ulus da runte r. Zwe i Ve rha lte nsm uste r sind illustrie rt: (O be n re chts) Be we gt sich da s visue lle Fe ld na ch vorne (hie r: schwa rz-we iße Ba lk e n), ve rsucht die La rve na ch vorne zu schwim m e n – wa s nicht ge lingt, da de r Kopf fix ie rt ist. (Unte n re chts) R otie rt e in visue lle r, ze ntrie rte r Stim ulus a m Kopf de s Fische s (hie r e in W indm ühle nstim ulus), ve rsucht die La rve ihn m it Auge nbe we gunge n zu ve rfolge n. In die se m Ex pe rim e nt ist de r Körpe r fix ie rt. © Ma x -P la nck -Institut für Ne urobiologie / P ortugue s Dieses Verhaltensmuster können die Neurobiologen auch dynamisch regeln: Sie fixieren den Kopf der Larve temporär in einem Gel. Der Schw anz ist dabei frei und kann sich bew egen. Die Forscher nehmen dann die Schw anzbew egungen durch eine Hochgeschw indigkeitskamera auf und analysieren die spezifischen Schw immcharakteristiken. Durch das Modulieren der Geschw indigkeit der schw arz-w eißen Balken kann eine geschlossene, künstliche Realität gestaltet w erden, in der beispielsw eise die Geschw indigkeit der Balken von den Bew egungen der Larve abhängt: Je schneller oder stärker die Larve schw immt, desto langsamer bew egen sich die Balken. Mit diesem Trick w ird der Larve vorgegaukelt, dass sie sich frei bew egen kann. Mit Hilfe dieses Versuchsaufbaus können die Martinsrieder Forscher auch die Regeln ändern, nach denen die virtuelle Realität funktioniert. Beispielsw eise können sie die Larve künstlich stärker oder schw ächer machen, je nachdem ob die Geschw indigkeit der Balken schneller oder stärker programmiert w ird. Die Larve versucht daraufhin ihr Verhalten an die neuen Regeln anzupassen. Erscheint die Larve zum Beispiel schw ächer, versucht sie länger und stärker zu schw immen um an Ort und Stelle zu bleiben. Diese einfachen aber sehr präzisen Manipulationen können Hinw eise darauf geben, w ie die Larve lernt, eine alte Erw artungshaltung durch eine neue zu ersetzen und sich den neuen Gegebenheiten anzupassen. Funktionelle Bildgebung von neuronalen Netzwerken Mit Hilfe der im Martinsrieder Labor etablierten Verhaltensmuster können die W issenschaftler die Aktivität © 2016 Max-Planck-Gesellschaft w w w .mpg.de 3/6 Jahrbuch 2015/2016 | Portugues, Ruben | Neuronale Netze mithilfe der Zebrafischlarve erforschen involvierter Nervenzellen aufnehmen. Diese w erden dann mit spezifischen Parametern korreliert, die Eigenschaften von Sinneseindrücken oder Bew egungsabläufen darstellen. Die Aktivität der Nervenzellen kann anhand von transgenen Tieren erforscht w erden, die in bestimmten Nervenzellen einen genetisch-codierten Kalziumsensor exprimieren. Potenziell ist es sogar möglich, diesen Sensor in alle Nervenzellen des Gehirns zu bringen. Diese Sensoren erlauben es, die Nervenzellaktivität live zu beobachten: Sie fluoreszieren unterschiedlich stark, je nachdem, w ieviel Kalzium in der Nervenzelle vorhanden ist. Ist eine Zelle aktiv, ist die Kalziumkonzentration in der Zelle hoch, der Sensor fluoresziert stark und die Zelle ist hell. Damit können die Forscher erkennen, w elche Nervenzellen w elche Eigenschaften eines Sinneseindruckes verarbeiten. Beispielsw eise können sie auf diese Weise erkennen, w elche Nervenzellen die Geschw indigkeit der schw arzw eißen Balken codieren bzw . verarbeiten. Interessant ist dabei natürlich auch, w ie sich die Aktivität dieser Nervenzellen verändert, w enn sich die Geschw indigkeit ändert. Es w äre möglich, dass die Geschw indigkeit von einer gew issen Anzahl an Nervenzellen codiert w ird. Diese w ürden aktiver, w enn sich die Geschw indigkeit erhöht. Eine alternative Hypothese w äre, dass Geschw indigkeit durch die Anzahl aktiver Nervenzellen codiert ist: Je höher die Geschw indigkeit, desto mehr Nervenzellen sind aktiv. Am Modell des Zebrafisches können die W issenschaftler verfolgen, w ie diese Codierung auf Sinnesebene die Bew egungsabläufe Schw immverhalten beeinflusst, indem korrelieren. So sie können die sie Aktivität der Nervenzellen untersuchen, w elche mit Nervenzellen dem resultierenden direkt Muskelzellen kontrollieren und w elche die Schw immgeschw indigkeit der Larve regulieren. W ie oben beschrieben, können die Regeln der virtuellen Realität geändert w erden, um neuronale Korrelate der motorischen Anpassung zu finden. W ird die Reaktion des visuellen Stimulus auf das Verhalten der Larve geändert, kann die Larve eventuell die neuen Regeln erlernen und ihre Bew egungen darauf einstellen. Ein Vergleich zw ischen den Nervenzellaktivitäten bei verschiedenen Bedingungen kann Hinw eise auf die Gehirnregionen geben, die an Lernen und Adaption beteiligt sind. Beispiele hierfür sind das Kleinhirn (Cerebellum) und die untere Olive, eine ovale Struktur im Hirnstamm. Für beide w urde bereits eine funktionelle Rolle in der Adaption bestätigt [1]. A bb. 3: Die Abbildung ze igt die a k tive n Ne rve nze lle n, we nn e ine La rve m it ihre n Auge n e ine r R ota tionsbe we gung folgt. Die Fa rbe e ntspricht de r Be we gungspha se . © Ma x -P la nck -Institut für Ne urobiologie / P ortugue s Interessanterw eise zeigt ein Vergleich von W iederholungen des gleichen Verhaltensmusters in einigen Fällen, dass es in einem hohen Grad ähnliche Aktivitätsmuster gibt. Beispielsw eise erfolgt die zugrundeliegende Nervenzellaktivität der optokinetischen Reaktion in einem stereotypen, geordneten Muster. Auch fanden die W issenschaftler w eitere neuronale Module, die mit Sinneseindrücken und Bew egungssignalen korrelieren (Abb. 3), [2]. Zudem können mithilfe eines Referenzgehirns verschiedene individuelle Larven kartiert © 2016 Max-Planck-Gesellschaft w w w .mpg.de 4/6 Jahrbuch 2015/2016 | Portugues, Ruben | Neuronale Netze mithilfe der Zebrafischlarve erforschen w erden. So können die Forscher Unterschiede und Ähnlichkeiten zw ischen Larven analysieren. Die daraus entstehenden Karten geben detaillierte Einsicht in die funktionelle Anatomie des Gehirns einer Zebrafischlarve. Solche funktionellen Daten können beispielsw eise erklären, w elcher Anteil des Gehirns bei einer untersuchten Verhaltensw eise aktiv ist und w elche Aktivitätsmuster sich bei gleichem Stimulus zw ischen den Individuen unterscheiden. Wie sich Änderungen der Nervenzellaktivität auf das Verhalten auswirken Funktionelle Bildgebung kann Aufschluss darüber geben, w elche Gehirnstrukturen mit w elchen Sinneseindrücken oder Bew egungsmustern korrelieren. Um jedoch festzustellen, w elche Gehirnstrukturen w irklich notw endig und w elche für ein gew isses Verhaltensmuster ausreichend sind, ist es zw ingend notw endig, die Aktivität des Gehirns zu beeinflussen. Es ist möglich, eine Gehirnstruktur "stummzuschalten" und so ihre Beteiligung an einem Verhalten zu untersuchen: Zeigt die Larve immer noch das gleiche Verhaltensmuster? Dieses „Stummschalten“ kann auf verschiedene Arten erreicht w erden. Beispielsw eise können die Forscher Nervenzellen mithilfe von Laserlicht aus dem Zellverband herausnehmen. Werden die Nervenzellen, die zur Gruppe der unteren Olive gehören, aus dem Schaltplan entfernt, kann die Larve sich nicht an verschiedene Geschw indigkeiten visueller Stimuli anpassen (im Falle der optomotorischen Reaktion). Die Larve schw immt immer gleich, egal w ie stark sie die Geschw indigkeit kompensiert [1]. Ein w eiterer Weg, um die Notw endigkeit einer Gehirnstruktur zu überprüfen, ist ihre direkte Aktivierung. Die W issenschaftler können die Stärke der Aktivierung in einer Gehirnregion verändern und so überprüfen, w ie dies das Verhalten beeinflusst. Solch eine Strategie ermöglichte es ihnen, eine Nervenzellgruppe im Mittelhirn zu identifizieren, die die Geschw indigkeit der Fortbew egung steuert [3]. Zukünftige Schritte Obw ohl die Fortschritte deutlich sind, gibt es noch immer eine Vielzahl an dringenden Fragen: Welche präzisen Stimulus-Eigenschaften Eigenschaften verursachen verschiedene ein bestimmtes Verhaltensw eisen Verhalten? hervorrufen? Was W ie können macht das Änderungen Gehirn, w enn in diesen mehrere Sinneseindrücke gegensätzliche Informationen vermitteln? Welche Gehirnstrukturen sind verantw ortlich in der Wahl des optimalen Verhaltens und w ie ist diese Wahl im Gehirn repräsentiert? Was passiert im Gehirn, w enn ein neues Verhaltensmuster gelernt w urde? Mit dem breiten Angebot an Geräten, Methoden und etablierten Verhaltensmodellen in der Zebrafischlarve w ollen die Martinsrieder W issenschaftler Schritt für Schritt Antw orten auf die genannten Fragen finden. Jede Antw ort bringt sie ihrem Langzeitziel näher, besser zu verstehen, w ie auch unser Gehirn durch Berechnungen Sinneseindrücke in ein geeignetes Verhalten übersetzt. Literaturhinweise [1] Ahrens, M. B.; Li, J. M.; Orger, M. B.; Robson, D. N.; Schier, A. F.; Engert, F.; Portugues, R. Brain-wide neuronal dynamics during motor adaptation in zebrafish Nature 485(7399), 471-477 (2012) © 2016 Max-Planck-Gesellschaft w w w .mpg.de 5/6 Jahrbuch 2015/2016 | Portugues, Ruben | Neuronale Netze mithilfe der Zebrafischlarve erforschen [2] Portugues, R.; Feierstein, C. E.; Engert, F.; Orger, M. B. Whole-brain activity maps reveal stereotyped, distributed networks for visuomotor behavior Neuron 81(6), 1328-1343 (2014) [3] Severi, K. E.; Portugues, R.; Marques, J. C.; O'Malley, D. M.; Orger, M. B.; Engert, F. Neural control and modulation of swimming speed in the larval zebrafish Neuron 83(3), 692-707 (2014) © 2016 Max-Planck-Gesellschaft w w w .mpg.de 6/6
