Kokzidien und Clostridium perfringens: Studien an
Werbung
Aus dem Institut für Parasitologie der Veterinärmedizinischen Fakultät der Universität Leipzig Kokzidien und Clostridium perfringens: Studien an Koinfektionsmodellen zur Induktion und Bekämpfung der Nekrotischen Enteritis beim Huhn Inaugural-Dissertation zur Erlangung des Grades eines Doctor medicinae veterinariae (Dr. med. vet.) durch die Veterinärmedizinische Fakultät der Universität Leipzig eingereicht von Alaa Aldin Alnassan aus Hama, Syrien Leipzig, 2015 Mit Genehmigung der Veterinärmedizinischen Fakultät der Universität Leipzig Dekan: Prof. Dr. med. vet. Manfred Coenen Betreuer: Prof. Dr. med. vet. Arwid Daugschies Gutachter: Prof. Dr. med. vet. Arwid Daugschies Institut für Parasitologie Veterinärmedizinische Fakultät der Universität Leipzig Prof. Dr. Hafez Mohamed Hafez Institut für Geflügelkrankheiten Fachbereich Veterinärmedizin, Freie Universität Berlin Tag der Verteidigung: 20.10.2015 II Meinen Eltern und Meiner Familie III Inhaltsverzeichnis Seite Inhalt 1 Einleitung ............................................................................................................................ 1 2 Literaturübersicht ................................................................................................................ 2 2.1 Kokzidiose beim Huhn ................................................................................................ 2 2.1.1 Taxonomie und Eigenschaften der Gattung Eimeria......................................... 2 2.1.2 Lebenszyklus der Eimeria spp........................................................................... 5 2.1.3 Epidemiologie und Übertragung der Kokzidiose .............................................. 6 2.1.4 Nachweis der Kokzidiose beim Huhn ............................................................... 7 2.1.5 Entwicklung der Eimerienstadien in Zellkultur und Hühnerembryo................. 9 2.1.6 Immunitätsmechanismen gegen Kokzidien ....................................................... 9 2.1.6.1 Zelluläre Immunität ............................................................................ 10 2.1.6.2 Humorale Immunität .......................................................................... 11 2.1.6.3 Rolle der Zytokine .............................................................................. 12 2.1.7 Bekämpfung und Behandlung der Kokzidiose ................................................ 13 2.1.7.1 Antikokzidia ....................................................................................... 13 2.1.7.2 Vakzinierung ...................................................................................... 14 2.2 Clostridium perfringens............................................................................................. 16 2.2.1 Taxonomie und Eigenschaften der Gattung Clostridium ................................ 16 2.2.2 Eigenschaften von C. perfringens.................................................................... 16 2.2.3 Clostridium perfringens beim Huhn ................................................................ 16 2.2.4 Toxine von C. perfringens ............................................................................... 17 2.2.5 Nekrotische Enteritis des Huhnes .................................................................... 18 2.2.5.1 Klinische und subklinische nekrotische Enteritis des Huhnes ........... 18 2.2.5.2 Prädisponierende Faktoren für die Nekrotische Enteritis................... 19 2.2.5.3 Einfluss der Kokzidiose auf die Entstehung der NE .......................... 20 2.2.5.4 Weitere prädisponierende Faktoren für die Entstehung der NE......... 21 2.2.5.5 Immunität gegen die NE in Mono- und Ko-Infektionen mit Kokzidiose.......................................................................................... 22 2.2.5.6 Pathogenese der NE............................................................................ 23 2.2.5.7 Pathologie (Lesion Score)................................................................... 24 2.2.5.8 Diagnostik von C. perfringens ........................................................... 25 I 2.2.5.8.1 Kultureller Nachweis von C. perfringens .......................... 25 2.2.5.8.2 Pathologische Diagnostik................................................... 25 2.2.5.8.3 Histopathologie .................................................................. 25 2.2.5.9 3 Behandlung und Bekämpfung der NE ...................................................... 26 Tiere, Material und Methoden .......................................................................................... 28 3.1 Tiere und Material ..................................................................................................... 28 3.1.1 Hühner und Tierhaltung................................................................................... 28 3.1.2 Bruteier und Inkubator..................................................................................... 28 3.1.3 Infektionsmaterial ............................................................................................ 29 3.1.3.1 Eimerien ............................................................................................. 29 3.1.3.2 Clostridium perfringens...................................................................... 29 3.1.4 Behandlung mit Toltrazuril.............................................................................. 29 3.1.5 Vakzinierung mit Paracox-8® ......................................................................... 29 3.1.6 Reagenzien zur Gewebsaufarbeitung (Kits, Primer, Puffer, Lösungen) ......... 30 3.1.6.1 Allgemeine Puffer und Lösungen....................................................... 30 3.1.6.2 Puffer und Lösungen für Gelelektrophorese und PCR....................... 31 3.1.6.3 Verwendete Kits ................................................................................. 31 3.1.6.4 Sonstige Materialien und Geräte ........................................................ 31 3.1.6.5 Primer ................................................................................................. 32 3.2 Methoden ................................................................................................................... 33 3.2.1 In-vivo-Passagen zur Gewinnung der frischen Eimeria spp.-Oozysten für die Infektionsdosen und Aufreinigung der Eimerien-Oozysten............................ 33 3.2.1.1 DNA-Extraktion und Durchführung der PCR .................................... 35 3.2.1.2 Einstellen der Infektionsdosis............................................................. 35 3.2.2 Clostridium perfringens-Kultivierung und Toxinnachweis............................. 36 3.2.3 Durchführung der Sektion und weiterführende Untersuchungen .................... 37 3.2.3.1 Pathologische Untersuchung der Hühner ........................................... 37 3.2.3.2 Blutprobenentnahme........................................................................... 38 3.2.3.2.1 Bestimmung der E. tenella-spezifischen Antikörper ......... 38 3.2.3.2.2 Bestimmung der Avidin-Serumkonzentration ................... 38 3.2.3.3 Organproben von Darm und Milz ...................................................... 39 II 3.2.3.3.1 RNA-Extraktion................................................................. 39 3.2.3.3.2 Zytokin-Analyse mittels RT-PCR...................................... 39 3.3.3.4 Bakteriologische Untersuchung.......................................................... 40 3.3.3.5 Wirkung von Toltrazuril auf C. perfringens...................................... 40 3.3 Versuchsplanung ....................................................................................................... 40 3.3.1 Versuch 1: Prüfung verschiedener Infektionsmodelle zur experimentellen Induktion der Nekrotischen Enteritis des Huhnes........................................... 40 3.3.2 Versuch 2: Behandlung der experimentell induzierten Kokzidiose und nekrotischen Enteritis mit Toltrazuril ............................................................. 42 3.3.3 Versuch 3: Prophylaxe der experimentell induzierten Kokzidiose und Nekrotischen Enteritis mit einer attenuierten Lebendvakzine ........................ 44 3.3.4 In-ovo-Versuch: Ko-Infektion von Bruteiern mit Eimerien und Clostridien .. 46 3.3.4.1 Bestimmung der mittleren letalen Dosis (LD50) von C. perfringens in Hühnerembryonen .............................................................................. 46 3.3.4.2 Ko-Infektion der Bruteier mit E. tenella und C. perfringens ............. 46 3.3.5 Statistische Auswertungen............................................................................... 47 4 Ergebnisse ......................................................................................................................... 48 4.1 Versuch 1: Prüfung verschiedener Infektionsmodelle zur experimentellen Induktion der Nekrotischen Enteritis des Huhnes ..................................................... 48 4.1.1 Klinische Überwachungen und Mortalität....................................................... 48 4.1.2 Futterverwertung (FCR) und Futteraufnahme ................................................. 48 4.1.3 Quantitative Oozysten-Ausscheidung (OPG)................................................. 51 4.1.4 Isolierung von C. perfringens aus dem Darminhalt......................................... 52 4.1.5 Kokzidiose- und NE-spezifischer Lesion Score .............................................. 52 4.1.6 Histologische Untersuchung ............................................................................ 56 4.1.7 IgY von E. tenella und Avidin-Serumkonzentration (Experiment 2).............. 57 4.1.8 Expression der Zytokine (Experiment 2)......................................................... 58 4.2 Behandlung der experimentell induzierten Kokzidiose und nekrotischen Enteritis mit Toltrazuril (Versuch 2) ......................................................................... 62 4.2.1 Bestimmung der Eimerienarten und Nachweis des NetB-Toxin-Gens durch PCR ....................................................................................................... 62 4.2.2 Klinische Überwachungen und Mortalität....................................................... 62 III 4.2.3 Futteraufnahme und Körpergewichte .............................................................. 63 4.2.4 Quantitative Oozysten-Ausscheidung (OPG)................................................. 65 4.2.5 Re-Isolierung von C. perfringens aus dem Darminhalt................................... 65 4.2.6 Lesion Score und histologische Untersuchung ................................................ 66 4.2.7 E. tenella-spezifische Antikörper und Avidin-Serumkonzentration ............... 67 4.3 Versuch 3: Prophylaxe der experimentell induzierten Kokzidiose und nekrotischen Enteritis mit einer attenuierten Lebendvakzine ................................... 69 4.3.1 Körpergewichtsentwicklung und Futteraufnahme........................................... 69 4.3.2 Klinische Überwachung und Mortalität........................................................... 71 4.3.3 Quantitative Oozysten-Ausscheidung (OPG).................................................. 72 4.3.4 Isolierung von C.perfringens ........................................................................... 73 4.3.5 Pathologische und histologische Untersuchungen........................................... 73 4.3.6 E. tenella-spezifische Antikörperspiegel ......................................................... 75 4.3.7 Expressionsprofile der Zytokine...................................................................... 76 4.4 Ko-Infektion von Bruteiern mit Eimerien und Clostridien (In-ovo-Versuch)........... 80 4.4.1 Experiment 1: Etablierung des Ei-Modells...................................................... 80 4.4.2 Experiment 2: Ko-Infektion mit E. tenella und C. perfringens in embryonierten Eiern ........................................................................................ 81 4.4.2.1 CAM Läsionen ................................................................................... 81 4.4.2.2 Histologische Untersuchungen ........................................................... 83 4.4.3 Quantifizierung von E. tenella in der Allantoisflüssigkeit .............................. 84 4.4.4 Quantifizierung von C.perfringens in der Allantoisflüssigkeit ....................... 85 5 Diskussion......................................................................................................................... 86 5.1 Prüfung verschiedener Infektionsmodelle zur experimentellen Induktion der Nekrotischen Enteritis des Huhnes............................................................................ 86 5.2 Behandlung der experimentell induzierten Kokzidiose und nekrotischen Enteritis mit Toltrazuril ............................................................................................. 90 5.3 Prophylaxe der experimentell induzierten Kokzidiose und nekrotischen Enteritis mit einer attenuierten Lebendvakzine......................................................... 92 5.4 Koinfektion von Bruteiern mit Eimerien und Clostridien (In-ovo-Versuch) ............ 93 6 Schlussfolgerung............................................................................................................... 95 7 Zusammenfassung............................................................................................................. 96 IV 8 Summary ........................................................................................................................... 98 9 Literaturverzeichnis ........................................................................................................ 100 10 Danksagung..................................................................................................................... 114 V Tabellenverzeichnis Liste der Tabellen Tabelle 1: Darstellung der Eimeria-Arten beim Huhn und ihrer Lokalisation im Darm Tabelle 2: Lesions Score der Nekrotischen Enteritis Tabelle 3: Zusammensetzung des Aufzuchtfutters Tabelle 4: Primer zum Nachweis der Eimerien-DNA und des C. perfringens-NetB-Gens Tabelle 5: Primer zum Nachweis der Hühner-Zytokine (qPCR) Tabelle 6: Versuchsaufbau von Versuch 1 Tabelle 7: Versuchsaufbau von Versuch 2 Tabelle 8: Versuchsplan von Versuch 3 Tabelle 9: Versuchsaufbau Versuch 4 Tabelle 10: Körpergewichtsentwicklung in Experiment 1 Tabelle 11: Körpergewichtsentwicklung in Experiment 2 Tabelle 12: Lesion Scores für Eimeria spp.-typische Läsionen Tabelle 13: Körpergewichte am 14., 24. und 30. LT für alle Gruppen Tabelle 14: Die Zahl der C. perfringens-Kolonien in Abhängigkeit von der Behandlung mit Toltrazuril. Tabelle 15: Lesion Score für Kokzidiose und NE in Abhängigkeit von der Behandlung mit Toltrazuril. Tabelle 16: Vergleich der Körpergewichte zwischen allen Gruppen von Versuch 2 Tabelle 17: Lesion Scores bei vakzinierten (V+) oder nicht vakzinierten (V-) Hühnerküken, die mit Clostridien (C+/C-) und/oder Eimerien (E+/E-) infiziert waren Tabelle 18: Bestimmung der embryonalen Mortalität in Bruteiern nach Infektion mit verschiedenen C. perfringens-Dosierungen. Tabelle 19: Inokulation der Eier und Lesions Score Tabelle 20: Erregernachweis aus inkubierten Bruteiern zu Versuchsende VI Abbildungsverzeichnis Liste der Abbildungen Abbildung 1: Lebenszyklus von Eimerien Abbildung 2: Futteraufnahme im Verlauf von (a) Experiment 1 bzw. (b) Experiment 2. Abbildung 3: Tägliche Gesamtausscheidung von Eimerienoozysten in Experiment 1 und Experiment 2. Abbildung 4: Quantifizierung der C. perfringens-Kolonien in Jejunuminhalt. Abbildung 5: Sektionsbilder des Darmes an Prädilektionsstellen für Eimeria spp.-typische Läsionen Abbildung 6: Sektionsbilder des Jejunums zur Darstellung der Abstufungen entsprechend des Lesion-Scoring-Systems für die Nekrotische Enteritis nach Prescott et al. (1978). Abbildung 7: Histologische Darstellung der Kokzidiose- und NE-bedingten Veränderungen Abbildung 8: Die Konzentration von Avidin im Serum am 24 und 30 LT des Experiments 2. Abbildung 9: Die Konzentration von IgY im Serum am 30. LT des Experiments 2. Abbildung 10: Die Gen-Expression von IFN-γ in Zäkumtonsillen und Milz am 24 und 30 LT Abbildung 11: Die Gen-Expression von IL-2 in Zäkumtonsillen und Milz am 24 und 30 LT Abbildung 12: Die Gen-Expression von IL-10 in Zäkumtonsillen und Milz am 24 und 30 LT Abbildung 13: PCR-Analyse der Infektionsstämme. Abbildung 14: Überlebende Hühner während des Versuchs Abbildung 15: Tägliche durchschnittliche Futteraufnahme je Tier über den Versuchszeitraum Abbildung 16: Oozysten-Ausscheidung über den Versuchszeitraum für die Gruppe G4, G5 und G6 Abbildung17: (a) E. tenella-spezifische Antikörperspiegel; (b) Avidin-Serumkonzentration Abbildung18: (a) Tägliche Futteraufnahme vom 1. LT bis 27 LT; (b) Futteraufnahme von 28. bis 40. LT Abbildung 19: a: OPG-Werte nach der Impfung bis zum 33. LT bzw. 40 LT; (b) OPG-Werte nach der Eimerien-Infektion Abbildung 20: Zahl von C. perfringens-KBE pro Gramm des Zäkuminhaltes. Abbildung 21: Lesion Scores entsprechend der histologischen Untersuchungen Abbildung 22: Serumkonzentrationen der E. tenella-Antikörper (ng/ml). Abbildung 23: Gen-Expression von IFN-y am 34. LT und 40. Abbildung 24: Gen-Expression von IL-12 am 34. LT und 40 Abbildung 25: Gen-Expression von IL-10 am 34. LT und 40. VII Abbildungsverzeichnis Abbildung 26: Gen-Expression von IL-2 am 34. LT und 40. Abbildung 27: Hühnerembryos nach C. perfringens-Infektion. Abbildung 28: Lesions Score von CAM Abbildung 29: Histologische Untersuchung von CAM. VIII Verzeichnis der Publikationen Teile dieser Arbeit wurden in folgenden Zeitschriften publiziert: 1. Alnassan AA, Shehata AA, Kotsch M, Lendner M, Krüger M, Daugschies A, Bangoura B. Embryonated chicken eggs as an alternative model for mixed Clostridium perfringens and Eimeria tenella infection in chickens. Parasitol Res. 2013.112(6):2299-306. 2. Alnassan AA, Shehata AA, Kotsch M, Schrödl W, Krüger M, Daugschies A., Bangoura B. Efficacy of early treatment with toltrazuril in prevention of coccidiosis and necrotic enteritis in chickens. Avian Pathol. 2013.42(5):482-90. 3. Alnassan AA, Kotsch M, Shehata AA, Krüger M, Daugschies A, Bangoura B. Necrotic enteritis in chickens: development of a straightforward disease model system. Vet Rec.2014.31(22):174 4. Bangoura B, Alnassan AA, Lendner M, Shehata AA, Krüger M, Daugschies A. Efficacy of an anticoccidial live vaccine in prevention of necrotic enteritis in chickens. Exp Parasitol. 2014;145:125-34 IX Abkürzungsverzeichnis Abkürzung % Prozent °C Grad Celsius µ Mikro Abb. Abbildung Bp Basenpaar (base pair) BSA Bovines-Serum-Albomin C. Clostridium CAM Chorioallantoismembran Zm Zentimeter DE-52 Diethylaminoethyl Cellulose E. Eimeria DLG darmassoziierte lymphatische Gewebe FW Futterverwertung g Gramm h hour Ig Immunoglobulin IL Interleukin IFN-γ Interferon Gamma Kb Kliobasenpaare KBE Koloniebildende Einheit LD50 mittlere letale Dosis LMH Hepatocellular Epithelial Cell Line LT Lebenstag LS Lesions Score MDBK Madin-Darby-Bovine-Kidney-Zelllinie MIC minimale Hemmkonzentration MHC Antigen-Haupthistokompatibilitätskomplex X Abkürzungsverzeichnis NE Nekrotische Enteritis NetB Necrotic-Like-Beta-Toxin Ng Nanogramm NK Killer natürliche Zellen NSP Nicht-Stärke –Polysaccharide OPG Oozysten pro Gramm PBS Phosphate Buffered Saline Rpm Revolutions Per Minute ppm parts per million qPCR quantitative Reverse Transkriptase-Polymerase RCM Reinforced Clostridium Medium RT Raumtemperatur RT-PCR Reverse Transkriptase-Polymerase-Kettenreaktion SNE Subklinische NE SPF spezifiziert pathogenfrei ST Studientag TBE TRIS-Borat-EDTA-Puffer TMB 3,3′,5,5′-Tetramethylbenzidine Substrate TLR Toll Like Receptor VE-Wasser voll entsalztes Wasser XI Einleitung 1 Einleitung Die nekrotische Enteritis (NE) und Kokzidiose des Huhnes sind häufige Darmerkrankungen weltweit und führen jedes Jahr zu hohen Wirtschaftsverlusten als Folge der Mortalität und Kosten für Behandlung und Bekämpfung. Die beiden Erkrankungen werden meistens bei Mastbroilern zwischen der 3. und 6. Lebenswoche festgestellt. Weil die leistungsfördernden Antibiotika im Geflügelfutter in der EU nicht mehr eingesetzt werden dürfen, ist das Risiko der NE in den letzten Jahren gestiegen. Fischmehl, Stress und Krankheiten sind prädisponierende Faktoren für die Entstehung der NE aber auch die Hühnerkokzidiose spielt in der Hinsicht eine wichtige Rolle. Die Mechanismen der Pathogenese bei der Wechselwirkung zwischen Kokzidiose und NE sind unklar. Bisher wurden verschiedene Infektionsmodelle zur Erforschung der NE unter Beteiligung von Ko-Infektionen zwischen Eimerien und C. perfringens eingesetzt. Dabei steht neben der Krankheitsentstehung auch die effiziente Bekämpfung dieser Erkrankung als großes Problem der Geflügelindustrie im Forschungsmittelpunkt. C. perfringens ist auch bei gesunden Tieren ein häufiger Darmbewohner, wobei bestimmte Stämme verschiedene Toxintypen wie Alpha-, TpeL- und Beta-Toxine produzieren können und damit ursächlich zur Entstehung der NE beitragen, aber ohne andere prädisponierende Auslöser kommt es in der Regel nicht zum Ausbruch. In der vorliegenden Arbeit wurden zwei In-vivo-Modelle zur experimentellen Induktion der NE des Huhnes entwickelt. Ziele waren sowohl die genauere Untersuchung der Pathogenese der NE durch Ko-Infektionen mit Eimerien und Kokzidien als auch die Evaluierung von potentiellen neuartigen Bekämpfungsmöglichkeiten. Außerdem wurde ein In-ovo-Modell etabliert. 1 Literaturübersicht 2 Literaturübersicht 2.1 Kokzidiose beim Huhn Die Kokzidiose der Hühner ist eine wichtige protozoäre Erkrankung, welche weltweit und häufig auftritt. Sie beruht auf der Invasion verschiedener Darmabschnitte mit infektiösen Stadien und führt zur Zerstörung der Epitheldarmzellen und zu Durchfällen. Verminderte Futteraufnahme und Körpergewichtzunahmen oder eine schlechte Futterverwertung (FCR) werden entsprechend des Infektionsgrades festgestellt. Im Feld liegt die Mortalität zwischen 0 bis 30% und erreicht nach der experimentellen Infektion bis 100% bei E. necatrix (MCDOUGALD und STEVE 2013). Die wirtschaftlichen Verluste (jährlich bis zu 300 Millionen US$) werden durch Behandlung, Bekämpfung und auch Mortalität verursacht (SHIRLEY et al. 2005; MCDOUGALD und STEVE 2013). Zusätzlich dazu, dass die Kokzidiose eine hohe Bedeutung als Darmerkrankung besitzt, stellt sie auch einen wichtigen prädisponierenden Faktor für andere Geflügelkrankheiten wie die nekrotische, ulcerative Enteritis des Huhnes (HELMBOLDT und BRYANT 1971; MAXEY und PAGE 1977) oder die Salmonellose (ARAKAWA et al. 1981) dar und führt zur Verstärkung der Schwarzkopfkrankheit beim Huhn (MCDOUGALD und HU 2001). Die Marek’sche Krankheit und die Infektiöse Bursitis (IBDV) interagieren mit der Entwicklung der Immunität gegen die Kokzidiose (BIGGS et al. 1969; MCDOUGALD et al. 1979). 2.1.1 Taxonomie und Eigenschaften der Gattung Eimeria Kokzidiose wird durch Protozoen verursacht, die zum Phylum Alveolata, Klasse Coccidea (DAUGSCHIES, 2006) gehören. Die Gattung Eimeria wurde von SCHNIEDER UND TENTER (2006) folgendermaßen klassifiziert: Reich Mastigota Phylum Alveolata, Subphylum Apikomplexa, Klasse Coccidia, Subklasse Coccidiasina, Ordnung Eimeriida, Familie Eimeriidae, Gattung Eimeria 2 Literaturübersicht Hühnereimerien haben weltweit eine signifikante Bedeutung aufgrund der verursachten wirtschaftlichen Verluste auch in der subklinisch auftretenden Form. Alle Eimerien-Spezies parasitieren wirtsspezifisch und in definierten Darmabschnitten. Bei Hühnern wurden bisher 7 verschiedene Spezies identifiziert, welche in verschiedenen Abschnitten des Darmes vorkommen. E. tenella, E. necatrix, E. maxima und E. brunetti stellen pathogene Spezies dar, wohingegen E. acervulina, E. praecox wenig pathogen und E. mitis apathogen sind (MCDOUGALD und STEVE 2013). Es ist häufig, dass Tiere mit nur einer einzelnen Spezies befallen werden (REID und LONG 1979). Die folgende Tabelle (1) stellt die Prädilektionsstellen der diversen Eimerien-Spezies im Darm dar: 3 Literaturübersicht Tabelle 1: Darstellung Makroskopische Läsionen der Eimeria-Arten beim Huhn und ihrer Lokalisation im Darm (nach LONG und REID 1982 E. acervulina E. brunetti E. maxima E. mitis E. necatrix E. praecox E. tenella Weiße runde Läsionen schleimige blutige Koagulation- verdickte blutige Darmwand, blutige keine Lesions aufgegast weiße Flecken, Petechien, keine Läsionen Blutung im Zäkum manchmal wie verdickte nekrose in Rektum Petechien blutig schaumig gefüllte Streifen der Darmwand Große: Lang X Breit Gewebe Region 18.3 X 14.6 Epithelzellen 24.6 X 18.8 zweite Generation der Schizonten in 30.5 X 20.7 Gamonten in subepithelial subepithelial 15.6 X 14.2 zweite Generation der Schizonten in 20.4 X 17.2 Epithelzellen 21.3 X 17.1 Epithelzellen SubEpithelien 22 X 19 zweite Generation der Schizonten in subepithelien Lebenszyklus-dauer 97 120 121 93 138 83 115 Mortalität + ++ ++ - +++ - +++ Morbidität +++ ++ +++ - +++ - +++ 4 Literaturübersicht 2.1.2 Lebenszyklus der Eimeria spp. Nachdem die sporulierten Oozysten, welche vier Sporozysten mit jeweils 2 Sporozoiten enthalten, oral aufgenommen wurden, wird die Oozystenhülle im Magen-Darmtrakt zersetzt. Im Dünndarm schlüpfen die infektiösen Sporozoiten unter dem Einfluss von Wärme, CO2 und Gallensäuren aus den Sporozysten (DAUGSCHIES 2006; MCDOUGALD und STEVE 2013). Die Sporozoiten befallen bei E. praecox und E. brunetti am Ort ihrer Freisetzung die benachbarten Mukosaepithelzellen, bei den übrigen Spezies erfolgt zunächst ein Transport durch T-Zellen oder Makrophagen in die Darmkrypten, in denen sie sich zu Meronten I und II (Merogonie) als asexuelle Stadien entwickeln. Entsprechend der Eimerien-Spezies ist die Zahl der Merogonien festgelegt (DAUGSCHIES 2006). Als Beispiel treten zwei Merontengenerationen im Entwicklungszyklus von E. necatrix im Jejunum und die folgenden ein oder zwei in den Blinddärmen auf. Nach der Ausbildung der infektiösen Merozoiten platzt die Zelle auf und die Merozoiten werden frei. Es schließt sich die geschlechtliche Gamogonie unter intrazellulärer Bildung von Makro- oder Mikrogameten an. Jeder entstandene Mikrogamet kann einen Makrogameten befruchten, wodurch eine Zygote entsteht. Die Zygoten reifen zu Oozysten heran. Die Präpatenz, also die Dauer bis zur Ausscheidung der Oozysten, hängt von der Eimerien-Spezies ab (DAUGSCHIES 2006; EDGAR und SEIBOLD 1964) und liegt zwischen 97 und 130 Stunden. Die Oozysten sporulieren in der Umwelt in ca. 24-48 Stunden, wenn die geeigneten Bedingungen hinsichtlich Feuchtigkeit und Temperatur vorliegen (DAUGSCHIES 2006). Etwa 28-30 °C und eine Feuchtigkeit von 16 bis 42 % sind optimal für die Sporulation. Über 35 °C sterben die Oozysten rasch ab (DAUGSCHIES 2006; WALDENSTEDT et al. 2001). 5 Literaturübersicht Abb. 1: Lebenszyklus von Eimerien, a: Sporozoiten b: Trophozoit, c und d: Merozoiten e und f: Makrogameten, h und g: Mikrogameten. j: Zygot, k bis m: Oozysten 2.1.3 Epidemiologie und Übertragung der Kokzidiose Die Kokzidiose ist eine streng wirtsspezifische Erkrankung, so dass Hühnereimerien ausschließlich für das Wirtstier Huhn (Gallus gallus) infektiös sind. Die Eimeriose tritt beim Huhn vor allem ab der 3. bis 6. Lebenswoche auf (WILLIAMS 1999 und 2005). Die Verbreitung der Oozysten und das Auftreten in der Geflügelhaltung hängen von unterschiedlichen Faktoren ab. Generell besitzen die Eimerien eine hohe Tenazität, so dass die Oozysten über mehrere Monate bis zu einem Jahr infektiös bleiben und sich auch als sehr widerstandsfähig gegenüber chemischen Desinfektionsmitteln erweisen (DAUGSCHIES 2006; HAFEZ 2008). In der Geflügelhaltung spielen außerdem Managementfaktoren eine wesentliche Rolle: Je näher die Temperatur am optimalen Bereich von 28 - 32 °C liegt und je höher die Feuchtigkeit in der Einstreu ist, desto günstiger sind die Sporulationsbedingungen für die Oozysten und umso stärker wird der Infektionsdruck für den Wirt (RAETHER 1995; DAUGSCHIES 2006; HAFEZ 2008). Hühner jeglichen Alters sind prinzipiell anfällig für die Infektion, entscheidenden Einfluss auf die individuelle Empfänglichkeit und den Infektionsverlauf besitzen aber vor allem der 6 Literaturübersicht Immunstatus, das Alter und die Infektionsdosis. Der Ausbruch dieser Erkrankung ist häufig zwischen der 3. und 6. Lebenswoche zu beobachten, aber sie kann bereits ab dem 7. Lebenstag festgestellt werden. E. tenella (64 %), E. acervulina (97 %) und E. maxima (64 %) stellen die häufigsten Eimerienarten in Geflügelbeständen dar (REYNA 1982). E. necatrix kommt häufig bei Legehennen ab der 18. Lebenswoche, aber selten bei Masthühnern vor (MCDOUGALD 1990). Grundsätzlich variiert die Prävelenz wesentlich mit der Jahreszeit, Übertragungsfaktoren und zwischen den Ländern (GYÖRKE et al. 2013; HADIPOUR et al. 2013). Nach der Ausscheidung der Oozysten und erfolgter Sporulation können sich empfängliche Hühner durch direkte fäkal-orale Übertragung anstecken. Die Übertragung hängt von Hygiene- Managementfaktoren und Haltungsbedingungen (Boden oder Käfighaltung) (DAUGSCHIES 2006). Häufig erfolgt die Übertragung der Oozysten durch kontaminierte Stiefel oder Schuhe, Insekten oder Nagetiere, kontaminiertes Futter und Staubpartikel (REYNA et al. 1982; MCDOUGALD und STEVE 2013). Bei der Aufstallung sind immer einige Oozysten vorhanden und es kommt innerhalb weniger Wochen unter geeigneten Bedingungen zu einer immensen Vermehrung und zunehmendem Infektionsdruck. 2.1.4 Nachweis der Kokzidiose beim Huhn Der Nachweis der Kokzidiose ist nicht immer einfach. Es sind verschiedene Methoden zum Nachweis der Kokzidiose verfügbar. Die OPG (Oozystenzahl pro Gramm) im Kot und Identifikation der Morphologie der Oozysten dienen zur Befundung der Oozystenausscheidung, während mit dem Lesion Score (LS) von 0 bis 4 die pathologischen Auswirkungen der Kokzidiose beschrieben werden (JOHNSON UND REID 1970). Die Oozysten im Kot können mithilfe von Flotationsverfahren nachgewiesen werden. Mit der Ausnahme von E. maxima und E. brunetti, die etwas größer sind, können die einzelnen Eimerien-Spezies anhand der Morphologie der Oozysten nicht sicher differenziert werden (DAUGSCHIES 2006; MCDOUGALD und STEVE 2013). WILLIAMS et al. (2009) zeigte, dass E. mivati eigentlich eine ähnliche Art von E. acervulina ist. Die Auswertung der Läsionen stellt die beste Methode zur Diagnostik der Kokzidiose dar, wobei einige EimerienSpezies damit nicht sicher erfasst werden. E. mitis und E. mivati induzieren keine Läsionen. Arten wie E. tenella, E .necatrix, E. acervulina, E. maxima und E. brunetti hingegen verursachen spezifische Läsionen (JOHNSON UND REID 1970). Für die Oozystendifferenzierung wurde eine neue Technik entwickelt, mit deren Hilfe morphologische Befunde durch biometrische Methoden bestimmten Arten zugeordnet werden konnten (JOHNSON und REID 1970; DAUGSCHIES 2006; CASTANON et al. 2007; 7 Literaturübersicht MORRIS et al. 2007; MCDOUGALD und STEVE 2013). Sowohl OPG als auch Lesion Scoring sollten für die subklinische Kokzidiose bewertet werden (GUSSEM 2007). E. maxima und E. necatrix vermehren sich im Dünndarm und sind hoch pathogen (MCDOUGALD und STEVE 2013). Andere pathogene Eimerien-Spezies, namentlich E. tenella und E. brunetti, befallen den Dickdarm (RAMAN et al. 2011; MCDOUGALD und STEVE, 2013). Die Infektionsdosis und der vorliegende Stamm sind von großer Bedeutung für die Entwicklung und den Schweregrad der Kokzidiose. So verursachen 104 Oozysten von E. tenella aber erst 105-106 Oozysten von E. acervulina auffällige Läsionen (SHIRLEY und MILLARD 1986; ABU-AKKADA und AWAD 2012). Tabelle 1 stellt die Prädilektionsstellen, Oozystengrößen und weitere charakteristische biologische Eigenschaften dar (LONG und REID 1982), welche zur Identifizierung der vorliegenden Eimeria spp. beitragen können. Im Folgenden soll auf die wesentlichen spezifischen Befunde beim Vorliegen einer Infektion mit den fünf wichtigen pathogenen Eimeria spp. eingegangen werden, um ihre Differenzierung zu erläutern. E. acervulina: Das Duodenum kann auffallenden blass sein und enthält wässrig-schleimige Flüssigkeit. Eine auffällige weiß-schimmernde Querstreifung der Dünndarmwand liegt durch die Massen verschiedener Stadien der Eimerien vor. In histologischen Schnitten erscheinen die Spitzen der Zotten verkürzt und die Mukosa ist geschwollen (LONG 1968). E. brunetti: Zunächst werden winzige Petechien und dann größere Schleimhautschäden mit Koagulationsnekrosen im Ileum und Rektum nachgewiesen (HEGDA et al. 1969; RYLEY et al. 1972). E. maxima: In ersten asexuellen Phasen der Merogonie werden wenige Läsionen produziert, wobei mit der Bildung der Gamonten in tieferen Gewebeschichten Läsionen entstehen, die sich als Petechien an der Spitze der Zotten zeigen. Das Darmlumen enthält meistens gelb bis orange-farbenen Mukus und Blut (MCDOUGALD und STEVE 2013). E. necatrix: Petechiale Blutungen und ein ballonierendes Jejunum werden während der Bildung der zweiten Merogoniegeneration festgestellt. Der Darm enthält Blut und zerstörte Schleimhaut als Folge der Beschädigung der Submukosa des Darmes und der Darmmuskulatur (HEGDA et al. 1969; HEIN 1971). E. tenella: Der Befall mit E. tenella verursacht Blutungen und Fibringerinnsel im Zäkum (AL-GAWAD et al. 2012). Das pathogene Stadium ist die zweite Generation der Schizonten, die 4 Tage nach der Infektion nachgewiesen werden können (JOHNSON und REID 1970). 8 Literaturübersicht Molekulare Methoden wie die PCR werden zur Differenzierung von Eimerien-Spezies, insbesondere solchen, die keine Läsionen induzieren, eingesetzt (BLAKE et al. 2008; HAMIDINEJAT et al. 2010). 2.1.5 Entwicklung der Eimerienstadien in Zellkultur und Hühnerembryo Verschiedene Zelllinien konnten erfolgreich zur Vermehrung von Eimeria in vitro eingesetzt werden. Dabei wurde nicht in allen Zelllinien die Vollendung eines kompletten endogenen Lebenszyklus des Parasiten bis zur Oozystenbildung beschrieben. So wurden in der MadinDarby-Bovine-Kidney-Zelllinie (MDBK) keine Oozysten nachgewiesen (CHAI et al. 1989), wohingegen bei Einsatz einer primären Nierenzelllinie aus Hühnerembryonen die Entwicklung bis zum Oozystenstadium stattfand (ZHANG et al. 1997). Embryonierte Hühnereier sind eine mögliche Matrix zur Vermehrung von EimerienOozysten, wobei verschiedene Stadien (Schizogonie und Gamogonie) in der Chorioallantoismembran und Oozysten in der Chorioallantois-Flüssigkeit nachgewiesen werden konnten (LONG und MILLARD 1973; JIANG et al. 2012). Durch die Passage von Oozysten in embryonierten Hühnereiern konnten auch attenuierte Lebendimpfstoffe gegen verschiedene virulente Eimerienarten gewonnen werden (LONG 1969; SHIBALOVA et al. 1969). Außerdem wurde ein In-ovo-Modell zur Auswertung der Eimerien-Behandlung durch Antikokzidia von LONG und MILLARD (1973) beschrieben. 2.1.6 Immunitätsmechanismen gegen Kokzidien Nach der Aufnahme der pathogenen Erreger werden strukturelle Änderungen an der Mukosa sowie Infiltration von Entzündungszellen, zunehmende Wucherung der Krypten und Mukusproduktion nachgewiesen. An den Wechselwirkungen sind auch Lymphozyten, Epithelzellen, dendritische Zellen und Makrophagen beteiligt (LILLEHOJ 1998a). Zwei Typen von Lymphozyten reagieren auf die Infektion: B- und T- Lymphozyten. B-Zellen produzieren Immunoglobuline (Ig) und T-Zellen werden über den Antigen- Haupthistokompatibilitätskomplex (MHC) Komplex aktiviert. Die Eimerien-Infektion bzw. Immunisierung fördert eine komplizierte Immunreaktion, an der angeborene und adaptive Mechanismen beteiligt sind. Die Schleimhaut selbst, Phagozyten, Zytokine, Chemokine und TLR (Toll Like Receptor) sind Komponenten der angeborenen bzw. unspezifischen Immunität als erste Immunabwehrlinie gegen Invasion der pathogenen Erregern (DALLOUL und LILLEHOJ 2005). TLR werden bei verschiedenen Zellen wie dendritischen Zellen, Monozyten, Makrophagen und Epitheldarmzellen exprimiert (CACHO et al. 2012 und 2013). Natürliche Killer-T-Zellen (NK) gehören auch zur angeborenen Immunität (LILLEHOJ et al. 1989) und produzieren NK-Lysin gegen Protozoen. Macrophage Migration Inhibitory 9 Literaturübersicht Factor (MIF) ist auch entscheidend bei der Entwicklung der Immunantwort gegen Kokzidiose, indem der MIF die IL-1, IL-6, IFN-γ und TNF-α-Expression fördert (JANG et al. 2011). Die adaptive bzw. spezifische Immunität wird vermittelt durch T-Zellen, B-Zellen und ihre sezernierten Produkte (Antikörper und Zytokine) und reguliert Antigen-spezifische Rezeptoren auf der Oberfläche der B-Zellen (Immunoglobuline: IgY, IgM und IgA) und TZellen (TCR) (Min et al. 2013). Das darmassoziierte lymphatische Gewebe (DLG) stellt die erste immunologische Abwehrlinie gegen Eimerien-Infektionen dar. Ebenso sind die Bursa Fabricii, Zäkumtonsillen und Peyer’sche Plaques, in welchen die Immunzellen aktiviert und primäre Antikörper (IgA) produziert werden, von großer Bedeutung bei der Entwicklung der Immunität gegen die Kokzidien (YUN et al. 2000a; DALLOUL UND LILLEHOJ 2005). Durch die verschiedenen Stadien des endogenen Entwicklungszyklus wird eine komplexe Immunantwort hervorgerufen, die von einer Vielzahl von Faktoren abhängt, zu denen einerseits das Alter, die Genetik und Immunkompetenz des Wirtes sowie andererseits die Eimerienart, die Dosis und die Virulenzfaktoren gehören (LILLEHOJ und RUFF 1987; LILLEHOJ 1988). Insbesondere die Eimerienart beeinflusst die Reaktionen des Immunsystems in hohem Maße. Auch bei einer guten protektiven Immunität gegenüber der jeweiligen Spezies, kommt es kaum zu Kreuzimmunitäten (JENKINS 1998), weil nur wenige kreuzreaktive Epitope bei den einzelnen Arten konserviert sind (SHIRLY et al. 2005). Die Peyer’schen Plaques, Zäkumtonsillen (45-55 % B-Zellen und 35 % T-Zellen) und intraepithilialen Lymphozyten des Darmes (10 % B-Zellen und 90 % T-Zellen; ILEs) gehören zum DLG und spielen eine wichtige Rolle bei Immunantwort und –Abwehr (BEFUS et al. 1980; YUN et al. 2000a). DLG dient 3 Funktionen in der Abwehr gegen Eimerien: (I) Aufbereitung und Präsentation der Antigene, (II) Produktion der Antikörper besonders IgA, (III) Aktivierung der zellulären Immunantwort. Im Bezug auf die Bedeutung der Untergruppen von T-Zellen (T-Helfer, CD4, zytotoxische T-Zellen, CD8) für die Entwicklung der aktiven Immunität bei Hühnern wurde beschrieben, dass sie alle während der EimerienInfektion rekrutiert werden (LILLEHOJ et al. 2000). Eine Vielzahl an Forschungen hat die Rolle dieser Zellen und der Expression von verschiedenen Zytokinen gezeigt (HONG et al. 2006; KIM et al. 2008; LILLEHOJ und LILLEHOJ 2000; LILLEHOJ et al. 2004; PARK et al. 2008). Es wird grundsätzlich angenommen, dass die humorale Immunität eine geringe Rolle an der Abwehr gegen Eimerien spielt. Allerdings zeigten WALLACH et al. (2010), dass IgY Antikörper die Invasion von Sporozoiten vermindern. 2.1.6.1 Zelluläre Immunität Die zelluläre Immunität basiert auf aktivierten T-Zellen, NK und Makrophagen. Bei der Bekämpfung von Kokzidieninfektionen kommt der zellulären Immunabwehr durch T10 Literaturübersicht Lymphozyten eine herausragende Bedeutung zu (YUN et al. 2000a; SHIRLEY et al. 2005). T-Zellen schließen zwei wichtige Untergruppen T-Helfer (Th; CD4) und zytotoxische TZellen (CD8) ein und beide sind sehr wesentlich für die Immunität gegen Eimerien (LILLEHOJ und TROUT 1996; LILLEHOJ und CHOI 1998; LILLEHOJ und LILLEHOJ 2000; YUN et al. 2000a). CD 8-Zellen identifizieren fremde Antigene im Kontext von MHC I und CD4 von MHC II (LILLEHOJ 1998). Eine ansteigende Zahl an T-Lymphzyten wurde nach der E. acervulina-Infektion im Duodenum und bei E. tenella-Infektion im Zäkum festgestellt (YUN et al. 2000a). Die wichtige Funktion der T-Zellen wurde von LILLEHOJ (1987) beschrieben. Sie behandelten Hühner mit Cyclosporin zur Unterdrückung der zellulären Immunität, wodurch höhere Oozystenausscheidungen und stärkere Läsionen erreicht wurden. Bei infizierten Tieren wurde auch eine Vermehrung von T-Zellen, besonders CD8, im Epithel und in der Laminapropia gezeigt (HONG et al. 2006). Die Reaktion der TZellen hängt von verschiedenen Faktoren sowie dem Alter und der Eimerien-Spezies ab. E. acervulina-Infektion führt zur signifikanten Vermehrung der CD8, in denen die Sporozoiten nachgewiesen wurden (LILLEHOJ 1998). Sporozoiten wurden nach 24-48 Stunden meist in CD8 und seltener in CD4 oder Makrophagen nachgewiesen. Bei Reinfektion lokalisieren sich vermehrt CD8 in der Schleimhaut und führen zur Reduktion der Oozystenausscheidung und Läsionen. Andere wichtige Abwehrzellen sind Makrophagen und Monozyten. Diese Zellen, die vor allem in der Laminapropia des Darmes festgestellt werden, exprimieren MHC II an der Oberfläche und präsentieren Antigen zur Induktion adaptiver Immunität (LILLEHOJ et al. 2004). Eimerien aktivieren allgemein dendritische Zellen und Makrophagen im GLD. Daneben sind natürliche Killerzellen (NK) und Makrophagen als Teil der angeborenen Immunabwehr an der Bekämpfung von Eimerien-Infektionen beteiligt (LILLEHOJ et al. 1996). Der inhibitorische Effekt der T-Zellen bei der ersten Infektion scheint an die Produktion von Interferon-γ (IFN-γ) gekoppelt zu sein, welches ein wichtiger Mediator in der Abwehr von Kokzidieninfektion ist (LAURENT et al. 2011; SHIRLEY et al. 2005). Nach der Infektion mit E. tenella, E. acervulina und E. maxima konnte eine signifikante erhöhte IFN-γ Expression (bis zu 300-fach in Zäkumtonsillen und Darmepithels) nachgewiesen werden (LILLEHOJ und CHOI 1998; YUN et al. 2000b). 2.1.6.2 Humorale Immunität Es ist bekannt, dass die zelluläre Immunität der Schlüssel zum Schutz gegen Eimerien ist, wobei die humorale Immunität als untergeordnet für die Reaktion auf Belastungsinfektionen betrachtet wurde (ROSE und LONG 1971). 11 Literaturübersicht Einige Arbeiten zeigten aber, dass die humorale Immunität durchaus eine gewisse Rolle spielt. So wurde die Spitze der Antikörperbildung 9 bis 20 Tage nach der Infektion im Serum beobachtet, wobei große Mengen von spezifischen IgA, IgM und IgY produziert wurden (TREES et al. 1989). Die Schutzwirkung der Antikörper hängt von der Eimerien-Spezies ab. Eine ausgezeichnete passive Immunität gegen Eimerien-Belastungsinfektionen wurde berichtet. Wenn sie oral, intravenös oder subkutan verabreicht werden; unter diesen Bedingungen kann die Protektion bis zu 97 % erreichen (ROSE 1974). Vor allem die Konzentration von IgA in der Darmmukosa erhöht sich nach einer Eimerien-Infektion (GIRARD et al. 1997). Durch Bindung an die Kokzidienoberfläche kann eine Hemmung der Invasion der Sporozoiten und Merozoiten bewirkt werden (LILLEHOJ et al. 2000; YUN et al. 2000b). Einige Studien haben bewiesen, dass IgY-Antikörper die Eimerien-Entwicklung blockieren können (ROSE 1972) und über die Dottersäcke von Hennen auf die Küken als mütterliche Antikörper übertragen werden können. Es wurde dabei eine gute Korrelation zwischen IgY-Serotiter und Schutz vor Kokzidiose gezeigt (ROSE 1972; SMITH et al. 1994). Eine signifikante Reduktion der Oozystenausscheidung und der Läsionsstärke wurde bei einer gemischten Belastungsinfektion mit drei Eimeria spp. festgestellt (CRANE et al. 1988). 2.1.6.3 Rolle der Zytokine Für T-Zellen werden 3 Untergruppen ein T-Helferzellen (Th1, Th2 und Th17) abgegrenzt (HUNDORFEAN et al. 2012). Th1/Th2 sind kritisch für den Schutz gegen pathogene Erreger einschließlich Hühnereimerien. In der Regel reguliert Th1 die Immunität gegen interzelluläre Pathogene und Th2 kontrolliert die Immunantwort gegen extrazelluläre Erreger. Die Mechanismen der zellulären Immunantwort auf Infektionen beziehen Zytokine als lösliche Mediatoren der Entzündung ein (MIN et al. 2013). Die Zytokine sind eine vielfältige Familie von Peptiden und Proteinen, die von verschiedenen Zelltypen produziert werden (HONG et al. 2006; PARK et al. 2008). IFN-γ, IL-1, IL-2, IL-4, IL-5, IL-6, IL-10, IL-12, IL-13, IL-15, IL-16, IL-17, IL-18, und Tumor Necrosis Factor-α (TNF-α) wurden bei Hühnern nach Infektion mit Eimerien untersucht und IFN-γ, IL-2, IL-4, IL-10, IL-17 und TNF-α stellen die wichtigsten Zytokine im Verlauf der Eimerien-Infektion dar (LILLEHOJ und CHOI 1998; LILLEHOJ et al. 2004; MIN et al. 2013). Th1-Zellen sezernieren IFN-γ, IL-2 und IL-6, während aber IL-10, IL-12, IL-4 und IL-16 durch Th2 produziert werden (HONG et al. 2006; LILLEHOJ et al. 2004). INF-γ und andere Zytokine wurden durch Untersuchung des Expressionprofils mittels RTPCR untersucht (HONG et al. 2006; LILLEHOJ 2013; ZHANG et al. 2013). Eine Aufregulation des Zytokins IFN-γ wurde als wichtig für die Kontrolle der Eimeriose dargestellt. Das wurde begleitet von einer Reduktion von IL-10-mRNA als Folge einer 12 Literaturübersicht Umschaltung von Th1- aufTh2-Zytokinen in Darmlymphozyten und der Milz (ROTHWELL et al. 2004). HONG et al. (2006) zeigten, dass IL-10 in der Immunreaktion des Huhns gegen Eimerien herunter und beim Säugetier heraufreguliert wird. Zwar steigt IL-10 nach der E. tenella Infektion an, aber es ist beispielsweise nach der E. acervulina-Infektion reduziert. Von Immunzellen und anderen Zellen werden Zytokine sezerniert, welche die Immunität des Körpers gegen Infektionen organisieren. Eimerien modulieren die Zytokin-Regulation, in Abhängigkeit von der Infektionsdosis, Eimerien-Spezies und der Infektionsphase (LILLEHOJ 1989; TROUT et al. 1996; HONG 2006). Bei Hühnereimerien- Infektion werden meistens Zytokine, besonders IFN-γ, hochreguliert, was die Sporozoiten-Invasion inhibiert (YUN 2000; HONG 2006). Nach einer primären Eimerien-Infektion wird vermehrt IFN-γ von TZellen gebildet (SHIRLEY et al. 2005). IL-17 steigt 6 Stunden nach der E. tenella-Infektion an und führt zur Hemmung von IFN-γ und IL-12, verstärkeren Läsionen und höherer Ausscheidung von Oozysten (ZHANG et al. 2013). Abhängig von der Eimerienspezies und der Infektionsdosis variiert die Gen-Expression der Zytokine. IL-2 aus Th1-Zellen wird im Darm nach der E. tenella-Infektion weniger als nach der E. acervulina-Infektion hoch reguliert (HONG et al. 2006). IL-13 wird nach E. acervulina- Infektion, aber nicht nach E. tenella-Infektion, heruntergeregelt. 2.1.7 Bekämpfung und Behandlung der Kokzidiose Im Grundsatz stehen zwei spezifische Möglichkeiten zur Bekämpfung der Kokzidiose zur Verfügung. Die Anwendung von Antikokzidia oder der Einsatz von Impfstoffen (GUSSEM 2006; WILLIAMS 1999 und 2005). Bereits 1948 wurde Sulphaquinoxalin als Antikokzidium im Geflügelfutter verwendet. Bis heute werden verschiedene Antikokzidia für Bekämpfungsprogramme eingesetzt (CHAPMANN 2003; MCDOUGALD und STEVE2013). 2.1.7.1 Antikokzidia Zwei Kategorien von Antikokzidia stehen zur Bekämpfung der Kokzidiose des Huhnes zur Verfügung, Ionophore und synthetische Kokzidiostatika (JOHNSON und REID 1970; WILLIAMS 2005; XIE et al. 1991). Die Ionophoren, welche mit der Passage von Ionen durch die Zellmembran interferieren, wurden in 3 Klassen eingeteilt: 1. einwertige Ionophoren wie Monensin, Salinomyzin und Narasin; 2. einwertige Glykoside wie Maduramyzin und Semduramyzin; 3. zweiwertige Ionophoren. Weiterhin werden zahlreiche chemische Produkte wie Robenidin, Amprolium, Halofuginon und Diclazuril im Geflügelfutter eingesetzt. Der Mechanismus der Wirkung der Antikokzidia ist zwischen chemisches Produkten und Ionophoren unterschiedlich. Die Ionophoren wirken direkt auf Sporozoiten und freie Stadien des Lebenszyklus im Darmlumen und hemmen so die Invasion 13 Literaturübersicht der Zelle, während chemische Antikokzidia die intrazellulären Stadien zerstören oder inhibieren (CHAPMAN 2011). Resistenz und Toxizität können ein Problem vor allem beim Einsatz der chemischen Antikokzidia darstellen. Nicarbazin ist hoch giftig bei hoher Umgebungstemperatur und kann dann zu Mortalität und reduzierter Schlupfrate und Eierproduktion führen. Ionophoren können bei Pute und Huhn in Überdosis Paralysen und Mortalität verursachen (MCDOUGALD und STEVE 2013). Zur Bekämpfung der Kokzidiose werden Antikokzidia in der Geflügelmast in verschiedener Weise angewendet (CHAPMAN 2011). - Monoprogramm: Einsatz von einem Antikokzidium vom ersten Lebenstag bis zum Mastende. Dieses Programm führt zur schnellen Resistenzentwicklung. - Shuttle Programm: In diesem Programm werden zwei oder drei Antikokzidia entweder im Starter- oder im Mast- und Endfutter eingesetzt, um die Resistenzbildung zu verzögern. - Rotationsprogramm: Im Rotationsprogramm wird das Antikokzidium regelmäßig, beispielsweise alle zwei Monate, gewechselt. Antikokzidia sind nicht nur für die Prophylaxe der Kokzidiose verfügbar, sondern manche sind nur für die Therapie vorgesehen wie Sulfonamide, Amprolium und Toltrazuril. Toltrazuril wirkt gegen die intrazellulären, aber nicht gegen freie Stadien. Es führt zu einer Schwellung des endoplasmatischen Retikulums und des Golgi-Apparates, zu Abnormalitäten im perinukleären Raum, zu Störungen der Kernteilung und Hemmung der nukleären Pyrimidinsynthese in der Parasitenzelle (FEI et al. 2013; HABERKORN, 1996; MATHIAS et al. 2003). Bis jetzt existiert nur ein publizierter Fallbericht über die Resistenzausbildung gegen Toltrazuril bei Eimerien (STEPHAN et al. 1997). 2.1.7.2 Vakzinierung Für eine Immunisierung gegen Kokzidien stehen Vakzinen zur Verfügung. Eine Infektion mit niedrigen Oozystendosen kann die protektive Immunität nach zwei bis drei Entwicklungszyklen hervorrufen (SHIRLEY und BEDMIK 1997; VERMEULEN at al. 2001; CROUCH 2003) . 14 Literaturübersicht In Deutschland werden die meisten Legehennen und Elterntiere gegen Kokzidien geimpft. Zwei Arten von Lebendvakzinen sind entwickelt worden: - Virulenter Lebendimpfstoff: Diese Vakzine enthalten Oozysten von Wildtypen von drei bis acht Eimerien-Spezies. - Attenuierter Lebendimpfstoff: Durch Selektion einer Linie von Oozysten wurden Eimerien-Stämme produziert, die einen verkürzten Entwicklungszyklus und eine reduzierte Virulenz haben. Neben der Tierpassage wurden auch fortlaufende Passagen in Eiern zur Attenvierung verwendet (CROUCH et al. 2003; LONG & MILLARD, 1973; VERMEULEN et al. 2001). Paracox8®, Hipracox® und Livacox® sind in der EU verfügbar für Legehennen und Paracox 5 für Broiler. Paracox 8 enthält E. tenella, E. necatrix, E. acervulina, E. mitis, E. maxima, E. brunetti und E. praecox, Paracox 5 hingegen E. tenella, E. acervulina, E. mitis und E. maxima. In der Regel können die Impfstoffe durch Trinkwasser, Futter und Spray bei den Küken appliziert werden (MALZ 2003; DALLOUL UND LILLEHOJ 2006). In den USA wurde ein neuer kommerzieller Impfstoff (Inovocox) entwickelt, der am 18. Lebenstag des Embryos gegeben wird. In den letzten Jahren wurden verschiedene rekombinante DNA-Vakzinen gegen Kokzidien auf der Basis von Epitop-Protein wie Gam56, So7 und 3-1E von E. maxima, E. tenella und E. acervulina untersucht. Diese Vakzine sind noch experimentell und konnten in gewissem Umfang eine protektive Immunität stimulieren (MIN et al. 2004; SONG et al. 2013; XU et al. 2013). 15 Literaturübersicht 2.2 Clostridium perfringens 2.2.1 Taxonomie und Eigenschaften der Gattung Clostridium Die grampositiven anaeroben sporenbildenden Stäbchen des Genus Clostridium umfassen 203 Spezies, die verschiedene Krankheiten bei Menschen und Tieren verursachen (STEVENS et al. 2002). Clostridien befinden sich in der Umwelt und sind Teil der normalen Darmflora bei Mensch und Tier (PETIT et al. 1999). Dieses Genus wurde entsprechend des folgenden taxonomischen Baumes klassifiziert: Phylum: Firmicutes Klasse: Clostridia Familie: Clostridiacae Ordnung: Clostridiales Genus: Clostridium 2.2.2 Eigenschaften von C. perfringens Das Genus Clostridium wurde auch nach ihrer evolutionären Zusammengehörigkeit in die Cluster I bis XIX eingeteilt (APAJALAHTI et al. 2006). C. perfringens ist unbeweglich, bildet eine Sporen und ist 0,6-2,4 x 1,3-35 µm groß (SEIFERT 1995; HINZ 2005). Diese Bakterienart vermehrt sich im Temperaturbereich zwischen 15 und 50 °C mit einem Optimum zwischen 41 und 45 °C (LILLARD 1977; WILLARDSEN et al. 1978). Runde graue Kolonien (2-5 mm große) von C. wachsen perfringens auf Blutagarplatten mit einer Doppelzonenhämolyse und bildet Toxine (GUBASH 1978). In Kulturpräparaten konnte keine Sporulation nachgewiesen werden. Die gebildeten Sporen sitzen normalerweise zentral oder subterminal. Der Sporulierungsprozess ist abhängig vom Medium, wobei die Sporulation in Fleischbrühe unzureichend stattfand, aber das “Duncan-Strong-Medium“ bei 35-45 °C geeignet für die Sporulation ist (SUÁREZ 1993). Wegen seiner saccharolytischen und proteolytischen Enzymaktivität wird Kohlenstoffdioxid produziert (HINZ 2005). Der optimale pH-Wert für das Wachstum von C. perfringens liegt zwischen 6 und 8 (SUÁREZ 1993). C. perfringens metabolisiert verschiedene Zucker wie Glukose, Laktose, Maltose und Saccharose, das zur Produktion des Gases, Essigsäure und Buttersäure führt. Durch C. perfringens wird Gelatine hydrolysiert und kein Indol produziert. 2.2.3 Clostridium perfringens beim Huhn C. perfringens kann in gesunden und erkrankten Hühnern nachgewiesen werden (SONGER 1996). Ob diese Keime beim Huhn einen Teil der normalen Darmflora darstellen, ist 16 Literaturübersicht umstritten. SHANE et al. (1984) wiesen sie unregelmäßig im Darm nach, während MATEOS et al. (2002) davon ausgeht, dass sich C. perfringens als normale Flora im Blinddarm, aber nicht im Dünndarm ansiedeln. Obwohl diese Keime in gesunden Broilern darstellbar sind, kommt ihnen die größte Bedeutung in der Geflügelproduktion aufgrund der Toxinbildung zu, welche zu verschieden Erkrankungen führt (OPENGART und SONGER 2013). Die Menge von C. perfringens wird als entscheidend für ihren Einfluss auf die Tiergesundheit bewertet, Konzentrationen von 0 bis 105 KBE/g Zäkuminhalt werden als normal betrachtet. C. perfringens-Konzentrationen von über 106 KBE/g werden hingegen als prädisponierend für NE angesehen (BABA et al 1997; LONG und BRANUM 1974), allerdings ist dies nicht allein ausreichend für ihre Entstehung (LONG UND TRUSCOTT 1976; COWEN et al. 1987; KALDHUSDAL et al. 1999). 2.2.4 Toxine von C. perfringens In der Abhängigkeit von den Toxintypen kann C. perfringens in Stämme unterteilt werden. C. perfringens bildet eine große Breite von Toxinen und Enzymen, die verantwortlich für das Auftreten einer Erkrankung beim Geflügel sind (POPFF UND BOUVET 2009). Im Allgemeinen beinhaltet das Klassifikationsschema bezüglich der Toxintypen die Gruppen A, B, C, D und E, das wurde aber an die Produktion der fünf wichtigen extrazellulären Toxine Alpha, Beta, Epsilon, Iota und NetB gekoppelt, welche durch die Gene cpa, cpb, etxD, iap und netb kodiert werden (COOPER UND SONGER 2009; KEYBURN et al. 2008). Auf Grundlage dieser Klassifikation gehören die meisten Isolate beim Geflügel zum Typ A und wenige zum Typ C (COOPER UND SONGER 2009). Alpha-Toxin ist ein enzymatisches, dermonekrotisierendes, hämolysierendes und potentiell letales Toxin, das durch alle Stämme gebildet wird und aus Phospholipase C und einer Sphingomyelinase besteht (HALE UND STILES 1999). Das Beta-Toxin ist gemeinsam mit dem Alpha-Toxin für die Darmwandnekrose und neurologische Ausfälle nach der Absorption des Toxins aus dem Darm verantwortlich, wirkt aber nicht hämolysierend (NAGAHAMA et al. 1991). Andere Toxine wie das porenbildende TPEL- Toxin gehören zum A-Typ und führen zur Förderung der Virulenz von C. perfringens (COURSODON et al. 2012). Lange Zeit wurde vermutet, dass das Alpha-Toxin der wesentliche Faktor bei der Entstehung der NE sei (ALSHEIKHLY UND TRUSCOTT 1977). Ab 2008 änderte sich diese Annahme mit der Entdeckung eines weiteren Toxins, des NetB-Toxins (Necrotic Enteritis Like Beta Toxin) ( KEYBURN et al. 2008). 17 Literaturübersicht Dies wurde erstmalig in australischen Stämmen von C. perfringens-Typ A nachgewiesen. Das NetB-Gen ist ein Poren-formendes Toxin, genetisch zu ca. 38% analog zu Beta- Toxin, und nur für Chicken Leghorn Male Hepatoma Cell Line (LMH)-Zelllinie bewiesenermaßen toxisch (KEYBURN et al. 2008 und 2010). Das Vorhandensein von Stämmen mit NetBToxin wurde in verschiedenen Ländern untersucht. In einer kanadischen Studie wiesen 6090% der isolierten Stämme das Toxin auf (CHALMERS et al. 2008; MARTIN und SMYTH 2009), in Schweden sogar mehr als 90 % (JOHANSSON 2010). Das NetB-Toxin kann ausschließlich in C. perfringens-Isolaten aus erkranktem Geflügel nachgewiesen werden (KEYBURN et al 2008; TOLOOE et al. 2011). 2.2.5 Nekrotische Enteritis des Huhnes Zum ersten Mal wurde diese enterotoxische Erkrankung von PARISH (1961) beschrieben. KEYBURN et al. (2006) zeigten, dass das Alpha-Toxin nicht der wesentliche Faktor bei der NE ist, und benannte das NetB-Toxin bei C. perfringens-Typ-A-Stämmen als ursächlichen Auslöser der NE (KEYBURN et al. 2008). Seit der Entdeckung dieser Erkrankung bemühen sich Forscher um die Klärung ihrer Pathogenese unter Feldbeobachtungen oder mittels experimenteller Studien (ALSHEIKHLY UND TRUSCOTT 1977; WILLIAMS 2005; OLKOWSKI et al. 2008; TSIOURIS et al. 2010; VAN IMMERSEEL et al. 2009). Trotzdem ist der Mechanismus der NE bis heute unbekannt (WILLIAMS 2005). 2.2.5.1 Klinische und subklinische nekrotische Enteritis des Huhnes Die nekrotische Enteritis des Huhnes (NE) tritt in zwei Formen auf, entweder klinisch oder subklinisch (milde Form) (KALDHUSDAL und HOFSHAGEN 1992; WU et al. 2010; VAN IMMERSEEL et al. 2004). Die klinische nekrotische Enteritis besitzt einen akuten Verlauf. Die Hühner zeigen Anorexie, Depression, gesträubtes Gefieder, Durchfälle und Bewegungsunlust (SONGER 1996). Diese Symptome werden bei experimentellen Infektionen 3 bis 24 Stunden nach der Infektion gesehen (AL-SHEIKHLY und TRUSCOTT 1977; WILLIAMS et al. 2003; SHOJADOOST et al. 2012). Gelegentlich verläuft die Erkrankung perakut und führt zur plötzlichen Mortalität in 2 bis 3 Stunden (BRANTON et al. 1987). Bei unbehandelten Tieren liegt die Morbidität zwischen 5 und 40 % (KÖHLER et al. 1974) und kann bis zu 100 % betragen, wie von ISLAM et al. (2009) in einem Fallbericht beschrieben. Ohne andere nachteilige Einflussfaktoren kann die Mortalität geringer sein (KALDHUSDAL et al. 1999; OPENGART und SONGER 2013) und bei etwa 1 % (LOVLAND UND KALDHUSDAL 2001) oder auch 10 bis 50 % liegen (HELMBOLDT und BRYANT 1971.; WILLIAMS 2005). Eine klinische Form der NE konnte als Modell durch Einsatz von verschiedenen Faktoren wie Kokzidien oder Fischmehl provoziert werden 18 Literaturübersicht (COWEN et al. 1987; RIDDELL UND KONG 1992; WU et al. 2010; SHOJADOOST et al. 2012), wobei in den Modellen Mortalität, Morbidität und Läsionen variierten. Die subklinische Form der NE (SNE) ist aus ökonomischer Sicht bedeutender. Weil die antibiotischen Leistungsförderer im Geflügelfutter seit 2006 in der EU nicht mehr eingesetzt werden dürfen, ist das Risiko der Infektion mit toxinbildenden C. perfringens und damit einer NE in den letzten Jahren gestiegen. Die einzigen nachweisbaren klinischen Veränderungen bei der subklinischen NE sind verminderte Futteraufnahme und verringerte Lebendmassezunahmen bei Mast- bzw. Aufzuchttieren (KALDHUSDAL und HOFSHAGEN 1992; WILLIAMS 2005). KALDHUSDAL und HOFSHAGEN (1992) haben bei SNE beschrieben, dass fokale Nekrosen in der Mukosa (zwischen 1 und 2 mm Durchmesser) mit erhöhten Keimzahlen im Vergleich zu gesunden Tieren vorliegen (KALDHUSDAL und HOFSHAGEN 1992; SHOJADOOST et al. 2012). Einige Literaturquellen beschreiben, dass die fokalen Nekrosen der SNE ohne komplette Pseudomembran-Bildung und ohne Mortalität verlaufen (GHOLAMIANDEHKORDI et al. 2007). GHOLAMIANDEHKORDI et al. (2007) haben die quantitative histologische Untersuchungen an einem Modell der SNE mit Einsatz einer Kokzidienvakzine und/oder Infekiösen-Bursitis-Vakzine durchgeführt. Die beste Methode zur Diagnostik der SNE ist die Untersuchung von zufällig ausgewählten, lebenden Hühnern der Herde mit unspezifischen Symptomen, um die mittelgradigen Läsionen erkennen zu können (KALDHUSDAL 2002). Bei einer C. perfringens-Infektion kann auch eine assoziierte Hepatitis (CPH) auftreten (ELWINGER et al. 1994; KALDHUSDAL 2002). Dieser Fall ist bis jetzt noch nicht hinreichend untersucht, aber es wird vermutet, dass durch die Schädigung der Darmwand die Toxine mit dem Blut in die Leber gelangen (KALDHUSDAL 2002) In der Leber erscheinen histologisch helle Inseln zwischen dem normal gefärbten Gewebe. Fokale Hepatitis mit fibrinösen Nekrosen tritt ebenfalls, aber seltener, auf (KALDHUSDAL 2002; ONDERKA et al. 1990). 2.2.5.2 Prädisponierende Faktoren für die Nekrotische Enteritis Da C. perfringens ein Bakterium ist, welches in gewissem Besiedlungsgrad als Teil der normalen Flora identifiziert wurde, ist eine massenhafte Vermehrung unter bestimmten prädisponierenden Bedingungen neben der Toxinbildung eine Voraussetzung für die Entstehung einer (klinischen oder subklinischen) NE. Viele Faktoren spielen eine Rolle und lassen sich in drei Hauptaspekte einteilen: - Stress (z. B. Eier-Produktion bei Legehennen (CALEFI et al. 2014a,b; OPENGART und SONGER 2013; WILLIAMS 2005) - Ernährungsfaktoren (z. B. Einsatz von Fischmehl und höheren Proteingehalten im Geflügelfutter (WU et al. 2010) 19 Literaturübersicht - Begleitkrankheiten (z. B. Kokzidiose, Infektiöse Bursitis und Hühner-Anämie-Virus (GHOLAMIANDEHKORDI et al. 2007; OPENGERT und SONGER 2013) In bisherigen Untersuchungen wurde die Kokzidiose als einer der wichtigsten prädisponierenden Faktoren bei der Entstehung der NE festgestellt (TIMBERMONT et al. 2011). Verschiedene Infektionsmodelle wurden zur Induktion der NE entwickelt, wobei als praktikabelster Faktor Ko-Infektionen mit Eimerien erscheinen (TIMBERMONT 2011; VAN IMMERSELL et al. 2009). 2.2.5.3 Einfluss der Kokzidiose auf die Entstehung der NE Es ist bekannt, dass die Eimerien artspezifisch in verschiedenen Teilen des Darmes parasitisieren und sich grob in Dünndarm- und Dickdarmbesiedler einteilen lassen (CONWAY, et al. 2007). Bis jetzt wurden drei Mechanismen für die Rolle der Kokzidiose in der Entstehung der NE aufgezeigt: Zerstören der Darmepithelzellen (1) im Lebenszyklus von Eimeria mit folgender Replikation von C. perfringens und Produktion der Toxine (WILLIAMS 2005; VAN IMMERSEEL et al. 2009), Vermehrung der Mukusproduktion (2) im Darm und Einstrom von Proteinen ins Darmlumen (3), als Substrate für Keimproliferation und Toxinproduktion (COLLIER et al. 2008; WILLIAMS 2005; VAN DER SLUIS 2000). Zur experimentellen Induktion der NE wurden Ko-Infektionen von Eimerien mit C. perfringens eingesetzt. E. acervulina, E. maxima und E. necatrix, welche den Dünndarm befallen, sind sehr geeignet für das NE-Modell (ALSHEIKHLY und ALSAIEG 1980; BABA et al. 1997; VAN IMMERSEEL et al. 2004). Es sind aber auch E. brunetti oder E. tenella eingesetzt worden (BABA et al. 2010; GOLDER et al. 2011). Der Zeitpunkt der KokzidioseInfektion sollte nicht mehr als 4-5 Tage vor der C. perfringens-Infektion liegen (WILLIAMS et al. 2003 und 2005), sonst können keine signifikanten Darmläsionen nachgewiesen werden. Für die Erzeugung der NE wurden auch Kokzidioseimpfstoffe wie Paracox®-5 und Paracox®8 in 10-facher Dosierung ein bis drei Tage vor der C. perfringens-Infektion verabreicht (GHOLAMIANDEHKORDI et al 2007), wodurch eine subklinische NE ohne schwere Darmläsionen induziert werden konnte. In verschiedenen Infektionsmodellen wurden 20.000 E. necatrix- bzw. 20.000 bis 50.000 E. maxima- oder 7,5 x 104 bis 5x 105 E. acervulina Oozysten appliziert (BABA et al. 1997; GHOLAMIANDEHKORDI et al. 2007; COLLIER et al. 2008). Die zunehmende Azidität des Darmes durch den Eimerienbefall (außer E. tenella) verursacht eine schnellere Darmpassage einhergehend mit geringer Malabsorption von Vitamin A und Viskosität des Darminhaltes (ADAMS et al. 1996; RUFF und REID 1975). Zerstörung von Darmgewebe und Austritt von Plasmaproteinen ins Darmlumen wurde bei schweren Eimerieninfektionen festgestellt (ROSE und LONG 1969). Das C. perfringensWachstum und die Toxinbildung sind in einer Umgebung mit geringer Azidität (pH < 5), 20 Literaturübersicht welche durch die Kokzidiose verursacht wird, inhibiert, aber dies scheint die Entstehung der NE nicht zu verhindern (KMET et al. 1993). Die vermehrte Mukusbildung scheint eine höhere Bedeutung zu besitzen als früher angenommen (COLLIER et al. 2008; WILLIAMS 2005). Für das Wachstum von C. perfringens sind die folgenden Nährstoffe sehr wichtig: LLysin, L-Prolin, Hydroxyprolin, Adenin, Uracil, Nikotinsäure, Aminobenzosäure und Thiamin (SEBALD und COSTILOW 1975). Mucine sind heterogene, hoch O-glykosylierte Glykoproteine mit hohem Molekulargewicht und sind reich an Aminosäuren wie Thiamin, LProlin, Serin und auch glycosyliertem Oligosaccharid. Sie begünstigen die vermehrte Kolonisierung von C. perfringens (GOLDER et al. 2011). Die pathogenetische Bedeutung der Dickdarmkokzidiose bei der Induktion der NE ist bis jetzt unklar. E. tenella bzw. E. brunetti parasitisieren im Dickdarm (Zäkum und Rektum) und führen zur Änderung der Struktur der Mikroflora und zur Zerstörung der Epithelzellen (STANLEY 2012). Es wurde nachgewiesen, dass Änderungen in der Blinddarmmikroflora zum Auftreten der NE führen können (STANLEY et al. 2012). 2.2.5.4 Weitere prädisponierende Faktoren für die Entstehung der NE Verschiedene Faktoren beeinflussen das Milieu, in dem sich C. perfringens vermehren kann. So spielt die Fütterung eine wesentliche Rolle für das Entstehen der NE. Die Zusammensetzung des Futters ist ein variabler Faktor in allen beschriebenen Modellen der NE. Zur Förderung der NE wurde ein Futter, das unverdauliche wasserlösliche NichtStärke-Polysaccharide (NSP) sowie Weizen, Roggen, Hafer und Gerste enthält, eingesetzt, das die Viskosität des Darminhaltes steigerte (BARANTON 1987; KALDHUSDAL und SKJERVE 1996). Die Mortalität erreicht bis 26-35 % bei Hühnern, die mit Gerste, Roggen und Weizen gefüttert wurden (RIDDELL und KONG 1992). Fischmehl und höhere Proteingehalte sind ebenfalls zum Hervorrufen der NE geeignet (ALSHEIKHLY UND TRUSCOTT 1977; PRESCOTT 1978; KEYBURN et al. 2006). Verfütterung von Fischmehl 1 bis 7 Tage vor oder nach der Infektion rief NE hervor, die Mortalität betrug bis 12 %. Hingegen konnten WU et al. (2010) bei Fischmehlfütterung ohne Eimerien-Infektion keine vermehrte NE bzw. keine Mortalität beobachten. Durch höhere tierische Rohproteingehalte im Futter kommt es zur Überwucherung von C. perfringens und zur vermehrten Toxinbildung, dies betrifft besonders das Alpha-Toxin (TITBALL et al. 1999). Glycin und Methionin sind Aminosäuren, welche die Proliferation von C. perfringens im Darm erhöhen. Auch andere Faktoren, wie Stress und Immunsupression können NE-fördernd wirken. Zu Beginn der Eierproduktion sind beispielsweise Legehennen Stress ausgesetzt, wodurch vermehrt NE auftreten kann (DHILLON et al. 2004; JORDAN 2008). Der Befall mit dem 21 Literaturübersicht Virus der Infektiösen Bursitis (IBD/Gumboro) führt zu Immunsuppression, besonders in den ersten 3 Wochen der Aufzucht, wodurch die NE-Läsionen verstärkt werden. Für das Modell der NE wurde eine bis 10-fache Dosis der höher pathogenen IBD-Vakzine zur Induktion von Immunsuppression (Intermediate plus) eingesetzt (GHOLAMIANDEHKORDI et al. 2007). 2.2.5.5 Immunität gegen die NE in Mono- und Ko-Infektionen mit Kokzidiose T-Zellen spielen eine große Rolle bei der Entwicklung der lokalen Immunität gegen die NE, wobei bis jetzt nicht beschrieben ist, welchen Einfluss die CD4- und CD8 -Lymphozyten auf den Verlauf der Darmerkrankung exakt haben. Zytokine als Signalstoffe werden allgemein durch Einsatz von Mikroarray- und RT-PCRMethoden gemessen. SARSON et al. (2009) wiesen für C. perfringens-Infektionen eine herunterregulierte Expression von IL-2, IL-10, IFN-γ und der Makrophagenproteine wie CXCR1, CCR8 nach. CAO et al. (2013) zeigten ebenfalls eine niedrigere Expression von IL10 bei C. perfringens-Infektionen, allerdings verbunden mit einer IFN-γ-Genhochregulation. Bezüglich der NE-Induktion wurde meistens ein Ko-Infektionsmodell von Eimerien und C. perfringens eingesetzt. In den entsprechenden Untersuchungen konnte übereinstimmend eine erhöhte Genexpression für IFN-γ, IL-10 und IL-4 gefunden werden (COLLIER et al. 2008; MCDOUGALD et al. 2008; PARK et al. 2008). Eine Vakzinierung gegen die NE wurde von verschiedenen Autoren durch Einsatz von C. perfringens-Proteinen mit gutem Ergebnis beschrieben. PARK et al. (2008) untersuchten die Zytokinexpression in der Darmschleimhaut einen und zwei Tage nach einer C. perfringensInfektion in einem NE-Modell unter Einsatz von E. maxima (Infektion am 18. Lebenstag) und C. perfringens (Infektion am 22. Lebenstag). Eine C. perfringens-Infektion allein führte zur vermehrten Genexpression von IFN-α, IFN-γ, IL-1β, IL-2, IL-13 und IL-17, welche durch Ko-Infektion mit E. maxima signifikant reduziert wurde (PARK et al. 2008). IL-10 hingegen wird bei C. perfringens-Monoinfektionen weniger, bei Ko-Infektionen deutlich mehr exprimiert (COLLIER et al. 2008; PARK et al. 2008). Die Infektion mit C. perfringens verursacht eine zytoplasmatische Vakuolisierung und Infiltration der Mukosa mit Eosinophilien und Basophilien sowie Pyknosen und Karyorrhexis in den Epithelzellen. In der Lamina propria wurde eine Infiltration mit Entzündungszellen wie Lymphozyten, Granulozyten und Makrophagen festgestellt (OLKOWSKI et al. 2006). Die humorale Immunität gegen C. perfringens wurde untersucht, indem die Hühner mit rekombinanten Proteinen von C. perfringens geimpft wurden, was eine signifikante höhere Antikörperkonzentration im Darm und im Serum hervorrief ( KULKARNI et al. 2007; JIANG et al. 2009). Antikörper wurden auch als Bekämpfungsmittel gegen die NE untersucht; bei 22 Literaturübersicht Küken von mit C. perfringens-Toxinen immunisierten Legehennen zeigten sich schwächere Darmläsionen im NE-Modell als bei nicht immunisierter Hemmen Küken (LOVLAND et al. 2004). 2.2.5.6 Pathogenese der NE Im Allgemeinen kommt es durch einen oder mehrere prädisponierende Faktoren wie Kokzidiose zur Vermehrung von Clostridien im Darm und erhöhter Toxinproduktion. Diese Toxine sind ausschlaggebend für die Ausprägung der eigentlichen NE-Erkrankung, deshalb wurden sie in den letzten Jahren tiefgreifend untersucht. So wurde das von C. perfringens produzierte Alpha-Toxin experimentell als reines Toxin appliziert, was zur Ausbildung typischer NE-Läsionen führte (ALSHEIKHLY und TRUSCOTT 1977; SONGER 1996). Obwohl es in gesunden Tieren nachgewiesen werden konnte, zeigte sich im Darm erkrankter Tiere ein signifikant höherer Gehalt dieses Toxins (KEYBURN et al. 2006; MCCOURT et al. 2005). Trotzdem ist nach KEYBURN et al. (2006) das Alpha-Toxin nicht der Hauptfaktor für die Entstehung der NE. Das NetB-Toxin wurde spät von KEYBURN et al. (2008) neu identifiziert und als wesentlich für die Pathogenese der NE betrachtet (KEYBURN et al. 2008). Das NetB-Toxin hat eine Aminosäuresequenz, welche dem Beta-Toxin und dem Poren-Formenden Toxin ähnelt. Es verursacht Nekrosen in der Mukosa (KEYBURN et al. 2008). 70-90 % der C. perfringens-Isolate aus NE-erkrankten Tieren enthielten das NetBGen, das traf hingegen nur auf wenige Isolate aus gesunden Tieren zu (JOHANSSON et al. 2010; KEYBURN et al. 2010). Einige Autoren zeigten, dass auch mit einem für das netbToxin-Gen negativen Stamm die NE im Infektionsmodell ausgelöst werden kann (COOPER und SONGER 2010). Trotzdem ist es unzweifelhaft, dass dieses Toxin der Schlüssel zur Pathogenese der NE ist. Das NetB-Gen ist mit drei Pathogenitätsinseln (NELoc1-3) assoziiert. Der 42 kb große NE Loc-1-Lokus befindet sich auf einem 85 kb großen Plasmid, während der vermutlich weniger wichtige NELoc-3-Lokus auf einem anderen Plasmid liegt. NELoc-2 ist hingegen auf einem Chromosom lokalisiert (PARREIRA et al. 2012). So gehören NE-Isolate zu zwei großen Linien oder Klonen, wobei sie sich anpassen können, um NE auslösen zu können (HIBBERD et al. 2011). Bei der Untersuchung der Kristallstruktur des NetB-Toxins wurde ein zytopathischer Einfluss auf verschiedene Zelllinien (LMH-Zellen und Geflügelerythrozyten) beobachtet, indem die Lipide der Zellmembrane aufgelöst wurden. Das NetB-Oligomer integriert sich dabei direkt in das Cholesterol der Zellmembranen (YAN et al. 2013). 23 Literaturübersicht 2.2.5.7 Pathologie (Lesion Score) Postmortal lassen sich in der Schleimhaut von Jejunum und Ileum NE-typische Läsionen darstellen, zumeist als pseudomembranöse Enteritis, welche seltener auch im Blinddarm oder Duodenum auftritt (OPENGART und SONGER 2013). Dafür wurden verschiedene LäsionenBeurteilungssysteme (Score-Systeme) beschrieben. Die verwendeten Skalen für das sogenannte Lesion Scoring reichen dabei von 0 bis 3 (LOVLAND et al. 2004; GHOLAMIANDEHKORDI et al. 2007), 0 bis 4 (BALAUCA et al. 1976; LONG und TRUSCOTT 1976) und 0 bis 6 (KEYBURN et al. 2008). Alle beschriebenen Systeme erscheinen zur Bewertung der NE geeignet, da sie Abstufungen des Schweregrades beinhalten. Die Variabilität zwischen den Score-Systemen stellt einen Nachteil bei dem Vergleich verschiedener Studien dar, welche zur Untersuchung des Einflusses der Kokzidiose, zur Immunität und Behandlung der NE durchgeführt wurden. Da es sich um einen Beurteilungsschlüssel handelt, welcher generell auf pathologisch-anatomischen Kriterien beruht, ist es wichtig, dass die Bewertung verblindet erfolgt, um subjektive Einflüsse zu vermeiden (GHOLAMIANDEHKORDI et al. 2007; SHOJADOOST et al. 2012). Tabelle (2): Lesions Score der nekrotischen Enteritis. Sie stellt ein System zur Auswertung der NE dar, das auch in dieser Studie eingesetzt wurde (PRESCOTT et al. 1978). Schweregrad der NE- Beobachtete makroskopische Befunde typischen Läsion 0 Keine Läsionen 1 Dünndarm dünnwandiger als normal, zerreißt leicht mit oder ohne Nekrose auf der Schleimhaut 2 ein oder mehrere fokale Nekrosen von etwa 1 bis 5 mm Durchmesser 3 Darm zeigt Bereiche mit dicken Schleimhautnekrosen von mehr als 5 mm Durchmesser, welche aus orange-braunen nekrotischen Trümmern bestehen 4 konfluente große Bereiche von dicken Schleimhautnekrosen des Dünndarms, welche 25 % oder mehr des Dünndarms betreffen sowie Bewertung für alle Hühner, die an intestinalen Läsionen starben 24 Literaturübersicht 2.2.5.8 Diagnostik von C. perfringens Zum spezifischen bakteriellen Nachweis NE-verursachender C. perfringens-Stämme können der kulturelle Erregernachweis, das Lesion Scoring sowie der Nachweis der Gene zur Toxinbildung mittels PCR oder ELISA angewendet werden (JIANG et al. 2009; KEYBURN et al. 2008). Für die klinische NE ist das Lesion Scoring ausreichend, aber bei der SNE ist dies meistens nicht aussagkräftig, weshalb in diesem Fall regelmäßig Proben untersucht werden müssen, um falsch negative Bestandsbefunde zu vermeiden (LOVLAND et al. 2003). Der alleinige Nachweis der Präsenz von C. perfringens wird von vielen Autoren als nicht ausreichend erachtet, weil C. perfringens Bestandteil der natürlichen Darmflora ist (KHALDHOSDAL et al. 1992; LOVLAND et al. 2003). Da aber die Zahl der KBE/g Darminhalt bzw. Kot bei NE-erkrankten Tieren gegenüber gesunden Tieren häufig erhöht ist (KALDHUSDAL 2002), kann eine erhöhte Keimzahl als hinweisend gewertet werden. Trotzdem bleibt unklar, ab welchem Wert die Befunde der quantitativen Untersuchung als NE-typisch zu interpretieren sind. So spricht LONG (1974) von 107 bis 108 KBE/g, SONGER (1996) hingegen fand C. perfringens-Konzentrationen von 104 bis 107 KBE/g bei erkrankten Hühnern. SI et al. (2007) beschrieben einen Schwellenwert von 105 KBE/g für die Entstehung einer NE mit einem Lesion Score von mehr als 2. 2.2.5.8.1 Kultureller Nachweis von C. perfringens Nach dem Tod des Huhnes müssen die Proben zur Untersuchung schnell entnommen werden, um die Bakterienvermehrung im Tierkörper zu vermeiden (JOHANSSON 2006). Verschiedene Medien werden zur Aufzucht von C. perfringens eingesetzt, beispielsweise Blutagar oder Eigelbagar. Neomycin-Blutagar kann auch eingesetzt werden, um das Wachstum gramnegativer Bakterien zu verhindern und damit eine gewisse Selektivität zu ermöglichen. Sulfit-Polymyxin-Sulfadiazin-Agar ist ein häufig gewähltes Medium zur Vermehrung von C. perfringens (OPENGERT und SONGER 2013). 2.2.5.8.2 Pathologische Diagnostik Die Sektion (verendeter oder diagnostisch getöteter Tiere) stellt die gebräuchlichste Methode dar, um die NE anhand der Darmveränderungen sowie der Läsionen darzustellen (JORDAN 2008). In der subklinischen Form ist die Darmwand verdickt und weist fokale Nekrosen in der Schleimhaut auf, ohne dass eine Mortalität auftritt (LOVLAND et al. 2003). 2.2.5.8.3 Histopathologie Für die klinische NE ist die histologische Untersuchung meist nicht notwendig, aber bei der subklinischen Form muss sie häufig durchgeführt werden, um die endgültige Diagnose zu 25 Literaturübersicht ermöglichen. Deshalb wurde ein Lesion-Score-System für histologische NE-typische Schäden entwickelt (GHOLAMIANDEHKORDI et al. 2007). In diesem Modell wurde definiert, welche histologischen Läsionen mit welchem Schweregrad der makroskopischen Läsionen korrelieren. Typische pathologische Befunde sind Zottenfusion, kapilläre Dilatation und Blutungen, Epithelzellzerstörung und erhöhter Proteingehalt im Darmlumen. Die Zottenfusion und sichtbare C. perfringens-Besiedlung der Zotten gehen mit einen Übertritt von Heterophilen und Lymphozyten in das Darmlumen einher (ALSHEIKHLY UND TRUSCOTT 1977; GHOLAMIANDEHKORDI et al. 2007). Die histologischen Läsionen werden als Nekrose der Epithelialzellen mit deutlicher Schuppung, erhöhte zelluläre Infiltration in der Lamina propria, Fibrin mit Zelldetritus auf Schleimhaut angesprochen (ALSHEIKHLY UND TRUSCOTT 1977; ISLAM et al. 2009). 2.2.5.9 Behandlung und Bekämpfung der NE Weil das NE-Risiko für Geflügel seit 2006 wegen der Verbote der leistungsfördernden Antibiotika im Geflügelfutter gestiegen ist, wird nach alternativen Methoden zur Bekämpfung der NE gesucht. Bis jetzt gibt es keinen kommerziellen Impfstoff gegen C. perfringens, obwohl verschiedene Untersuchungen zur Herstellung einer Vakzine durchgeführt wurden (CROUCH et al. 2010; JANG et al. 2012). Die entstehenden Antikörper gegen C. perfringens und seine Toxine könnten die Hühner durch Einsatz von Toxinen und rekombinanten Proteinen in Vakzine gegen die Entstehung der NE schützen (JIANG et al. 2009; CROUCH et al. 2010; JANG et al. 2012). Zur Verhinderung der NE ist z. Zt. vor allem die Bekämpfung der prädisponierenden Faktoren vorrangig. Antikokzidia im Geflügelfutter sind zur Verfütterung erlaubt (ENGBERG et al. 2000; WILLIAMS 2002). WILLIAMS et al. (2002) zeigten, dass Eimerienimpfstoffe zu steigendem Risiko der NE führen können. TSIOURIS et al. (2013) berichten, dass die Läsionen der NE schwächer ausgeprägt sind, wenn die Küken am ersten Lebenstag gegen Kokzidiose geimpft werden. Zur Behandlung der NE sind verschiedene Antibiotika wie Amoxicillin, Ampicillin, Penizillin, Erthromycin, Dihydrostreptomycin, Lincomyzin, Virginamyzin, Tetracyclin und Bacitracin geeignet (HAFEZ 2011; OPENGERT und SONGER 2013). Für 16 Antibiotika wurde die minimale Hemmkonzentration bei 100 Isolaten von C. perfringens aus Puten definiert und wurden gegen β-Laktam-Antibiotika (Amoxicillin, Penzillin usw.), Tylosin oder Tetracyclin keine Resistenz gefunden, während Resistenz gegen Erthromycin, Tiamulin und Colstin bestand (GAD et al. 2011). 26 Literaturübersicht Alternativ wird der Einsatz von Probiotika und Präbiotika wie L. acidophilus und S. faecium als Möglichkeit zur Bekämpfung der NE vorgeschlagen (OPENGERT und SONGER 2013), die eine antiinflamatorische Aktivität haben und damit zur Reduktion der NE-Läsionen führen sollen (CAO et al. 2012). 27 Tiere, Material und Methoden 3 Tiere, Material und Methoden 3.1 Tiere und Material 3.1.1 Hühner und Tierhaltung In allen Tierversuchen wurden Eintagsküken vom Typ Cobb (Cobb 500; Cobb-Deutschland, Avimex GmbH, Wiedemar, Deutschland) eingesetzt. Bis zum 14. LT in Versuch 1 und 2 bzw. bis zum 27. LT in Versuch 3 wurden alle Küken zusammen untergebracht (Versuch 3: in 2 Gruppen nach Impfstatus getrennt). Die Raumtemperatur betrug ca. 25 °C, wobei Rotlichtlampen zur Verfügung standen. Danach wurden die Broiler nach dem Zufallsprinzip in die jeweiligen Versuchsgruppen aufgeteilt und in Einzelkäfige (78 cm lang, 69 cm breit, 45 cm hoch) umgestallt. Futter und Wasser stand allen Tieren kontinuierlich ad libitum zur Verfügung. Zum Tränken wurde Wasser aus dem kommunalen Trinkwassernetz verwendet. Die Futterzusammensetzung ist in Tab. 3 aufgeführt. Es waren keine als prädisponierend für NE bekannte Bestandteile oder Mischungsverhältnisse enthalten (wie z. B. Fischmehl oder besonders hohe Proteingehalte). Bei der Einstallung der Hühner in die Metallkäfige wurden Temperaturen von 29 °C eingehalten. Bis zum 23. Lebenstag wurde die Temperatur in einoder mehrtägigen Schritten um jeweils maximal 1 °C auf 27 °C abgesenkt. Tabelle 3: Zusammensetzung des Aufzuchtfutters Substanz Substanz Rohprotein 17,2 % Methionin 0,35 % Rohasche 5,7 % Lysin 0,85 % Energie 11,5 MJ ME /kg Calcium 0,9 % Rohfett 3,8 % Phosphor 0,6 % Rohfaser 4,5 % Natrium 0,14 % 3.1.2 Bruteier und Inkubator Die Eier wurden von Lohmann (ValoBioMedia GmbH, Osterholz-Scharmbeck, Deutschland) geliefert. Bei 37,6 °C und 55 % Feuchtigkeit wurden die Eier inkubiert. Ab Tag 4 wurden sie jeden Tag 4 Mal gedreht. 28 Tiere, Material und Methoden 3.1.3 Infektionsmaterial 3.1.3.1 Eimerien Vier Eimerien-Spezies wurden in dieser Arbeit eingesetzt, wobei die Hühner jeweils mit zwei Spezies gleichzeitig infiziert wurden. Von E. tenella wurde der als Laborstamm charakterisierte Houghton-Stamm (Dr. D. P. Blake, Royal Veterinary College, University of London, Hatfield, UK), von E. brunetti, E. acervulina und E. maxima wurden Feldstämme genutzt. Alle Eimeria spp. wurden vor dem Einsatz in den Versuchen in vivo in Hühnern passagiert. Die gewonnenen Oozysten wurden aufgereinigt, in Natriumhypochlorit sterilisiert und 3 Mal in PBS gewaschen (siehe Abschnitt 3.2.1), bevor sie bis zur Herstellung der Infektionsdosen in 2 %-igem Kaliumdichromat bei 4 °C gelagert wurden. Die In-vivo-Passage erfolgte jeweils maximal 6 Monate vor dem eigentlichen Versuch, um die Infektiosität der eingesetzten Eimeria spp.-Oozysten zu garantieren. 3.1.3.2 Clostridium perfringens Für die Versuche wurde ein aus erkrankten Legehennen isolierter Feldstamm verwendet, welcher als NetB-positiv charakterisiert ist. Dieser C. perfringens Stamm (Labor-Nr. 2-288) wurde freundlicherweise von Ripac Labor (Potsdam-Golm, Deutschland) zur Verfügnug gestellt und bei -80 °C im Glycerol-Stock bis zum jeweiligen Versuch gelagert. Die Vermehrung zur Herstellung der Infektionsdosis erfolgte bei 37 °C für 24 Stunden im Reinforced Clostridium Medium (RCM) in anaerober Umgebung. 3.1.4 Behandlung mit Toltrazuril Im Versuch 2 wurde Toltrazuril als Antikokzidium eingesetzt. Hierfür wurde das kommerzielle Produkt Baycox® 2,5% für Hühner (Bayer GmbH, Deutschland) eingesetzt. Die Dosis beträgt 7 mg Toltrazuril pro kg Körpergewicht (KGW) entsprechend 75 ppm in der Tränke für 8 Stunden. Empfohlen wird eine kontinuierliche Behandlung mit 25 mg/ml über 48 Stunden oder alternativ eine Behandlung von jeweils 8 Stunden an 2 aufeinander folgenden Tagen. Letzteres wurde angewendet. 3.1.5 Vakzinierung mit Paracox-8® In der dritten Studie wurde eine Kokzidien-Vakzine eingesetzt, um die Wirkung auf die Ausprägung der NE zu untersuchen. Paracox-8® (MSD, Unterschleißheim, Deutschland) ist ein attenuierter Lebendimpfstoff und jede Impfdosis enthält die folgenden Dosierungen von 8 Kokzidienstämmen je Impfdosis (0,1 ml Paracox-8®-Suspension): E. acervulina HP 500 Oozysten, E.brunetti HP 100 Oozysten, E. maxima CP 200 Oozysten E. maxima MFP 100 29 Tiere, Material und Methoden Oozysten, E. mitis HP 1000 Oozysten, E. necatrix HP 500 Oozysten und E. praecox HP 100 Oozysten. Damit wurden je Huhn insgesamt 3000 Oozysten als Lebendvakzine verabreicht. Paracox-8® ist zur oralen Verabreichung über das Trinkwasser oder durch Versprühen auf die Küken in der Brüterei nach Zusatz von rotem Lebensmittelfarbstoff zu verwenden. Zur Dosierung im eigenen Versuch wurden die Vakzine gleichmäßig manuell homogenisiert, 1:1 in Leitungswasser verdünnt und jedem Huhn 200 µl mittels Pasteurpipette direkt in den Kropf eingegeben. 3.1.6 Reagenzien zur Gewebsaufarbeitung (Kits, Primer, Puffer, Lösungen) 3.1.6.1 Allgemeine Puffer und Lösungen Phosphatgepufferte Kochsalzlösung, Phosphate Buffered Saline (PBS) pH = 7,4 Natriumchlorid 37 mM (Roth®; Karlsruhe, Deutschland) Kaliumchlorid 1,47 mM (Roth®; Karlsruhe, Deutschland) Kaliumdihydrogenphosphat 1,47 mM (Roth®; Karlsruhe, Deutschland) Dinatriumhydrogenphosphat 6,46 mM (Roth®; Karlsruhe, Deutschland) PBST 0,05% Tween 20® (AppliChem GmbH; Darmstadt, Deutschland) in PBS aufgelöst Rinderserumalbumin 3% (BSA) 3 g Rinderserumalbumin (VWR International GmbH, Darmstadt, Deutschland) in 100 ml PBS aufgelöst Hydrogencarbonat / Carbonat-Beschichtungsbuffer (pH=9,6) 317,97 mg Na2CO3 (Roth®; Karlsruhe, Deutschland) 588,00 mg NaHCO3 (Roth®; Karlsruhe, Deutschland) in 100 ml dH2O aufgelöst. Kochsalzlösung mit der Dichte von 1,2 Natriumchlorid 311,5 g (Roth®; Karlsruhe, Deutschland) 1 Liter destilliertes Wasser Die Messung der Dichte erfolgt bei Raumtemperatur Kaliumchlorid 2% Kaliumchlorid 20 g (Roth®; Karlsruhe, Deutschland) 1 Liter destilliertes Wasser Glukose 1% 30 Tiere, Material und Methoden 1 g Glukose (AppliChem GmbH; Darmstadt, Deutschland) 100 ml PBS 3.1.6.2 Puffer und Lösungen für Gelelektrophorese und PCR Agarose- Gel Agarose/Agarose Sieve 1,5 % (Roth®; Karlsruhe, Deutschland) in 1x TBE aufkochen, auf 60 °C abkühlen (AppliChem GmbH; Darmstadt, Deutschland) GeneRuler 100 bp Lader (Fermentas, Fisher Scientific GmbH; Deutschland) Dream Taq Puffer 10x enthält MgCl2 (Fermentas, Fisher Scientific GmbH; Deutschland) dNTPs (Fermentas, Fisher Scientific GmbH; Deutschland) 3.1.6.3 Verwendete Kits QIAamp DNA Mini Kit (QIAGEN Lake Constance GmbH; Deutschland) zur Extraktion der DNA von Oozysten wurde dieses Kit eingesetzt RNeasy Mini Kit (QIAGEN Lake Constance GmbH; Deutschland) Die Gewebe der Zäkumtonsillen und Milz wurden mit diesem Kit zur Auswertung der Zytokine extrahiert. RevertAid Reverse Transcriptase (Fermentas, Fisher Scientific GmbH; Deutschland) Diese Enzyme wurde eingesetzt, um die RNA zur cDNA transkriptiert zu werden Maxima SYBR Green qPCR Master Mixes (Fermentas, Fisher Scientific GmbH; Deutschland) Mastermix für Durchführung der RT-PCR BCA Kit (Fermentas, Fisher Scientific GmbH; Deutschland) 3.1.6.4 Sonstige Materialien und Geräte DE-52 (Diethylaminoethyl Cellulose; Whatman International Ltd, Maidstone England) Sekundäre Antikörper, Anti-Chicken IgY (H+L)-HRP 1ml (SouthernBiotech; USA) Chicken IgY-UNLB (SouthernBiotech; USA) Mikrozentrifuge (Bio-Rad, USA) Spectrophotometer (Eppendorf, Hamburg, Deutschland) Thermocycler (Icycler, Bio-Rad, USA) Real Time Thermocycler (Stratagene, Agilent Technologie GmbH, Waldbronn, Deutschland) MagNa-Lyser® (Roche, Mannheim, Deutschland) 1,5 ml Tube (Eppendorf, Hamburg, Deutschland) 15 ml und 50 ml FalconTM Röhrchen (VWR International GmbH, Darmstadt, Deutschland) 31 Tiere, Material und Methoden pH Messer (WTW GmbH, Weilheim, Deutschland) Elektrophorese (Biometra GmbH, Göttingen, Deutschland) 3.1.6.5 Primer Die in Tabelle 4 aufgelisteten Primer wurden in den verschiedenen Versuchen zum quantitativen Nachweis der einzelnen Eimerienarten eingesetzt, da eine morphologische Identifizierung der Eimerienarten schwierig ist. Ebenso wurde das NetB-Toxin mittels PCR nachgewiesen. Tabelle 4: Primer zum Nachweis der Eimerien-DNA und des C. perfringens-NetB-Gens (konventionelle PCR) Zielsequenz Primer FragmentLängen (bp) Referenz F: 5´-ctgcgagggaacgcttaat-3´ E. acervulina (ITS-1) 303 Su et al. (2003) 151 Su et al. (2003) 463 Su et al. (2003) R: 5´-aacgaacgcaataacacacg-3´ F: 5´-ttgtggggcatattgttgtg-3´ E. maxima (ITS-1) R: 5´-caatgaggcaccacatgtct-3´ F: 5´-cgctgctggttttacaggtt-3´ E. tenella (ITS-1) R: 5´-gctgaagcaaagttccaagc-3´ F: 5´-agcttggattttcgctcaga-3´ 395 E. brunetti (ITS-1) Su et al. (2003) R: 5´-cttccgtacgtcggatttgt-3´ F: 5´-gtcagtttttgcctgggtg-3´ 385 E. necatrix (ITS-1) Su et al. (2003) R: 5´-acagaccgctacacaacacg-3´ F: 5´-gctggtgctggaataaatgc-3´ Keyburn et al. (2008) (AKP 78) 383 NetB Toxin R: 5´- tcgccattgagtttccc-3´ (AKP 79) 32 Tiere, Material und Methoden Der Zytokin-Nachweis erfolgt mit einer quantitativen PCR (Tabelle 5). Als houskepping Gene wurde die für GABDH kodierende DNA-Sequenz gewählt. Tabelle 5: Primer zum Nachweis der Hühner-Zytokine (qPCR) RNA-Ziel Primer Fragmente Accession (bp) number 264 K01458 259 Y07922 256 AF000631 272 AJ621614 F: 5´-GGTGGTGCTAAGCGTGTTAT GAPDH R: 5´-ACCTCTGTCATCTCTCCACA F: 5´-AGCTGACGGTGGACCTATTATT IFN-γ R: 5´-GGCTTTGCGCTGGATTC F: 5´-TCTGGGACCACTGTATGCTCT IL-2 R: 5´-ACACCAGTGGGAAACAGTATCA F: 5´-CGGGAGCTGAGGGTGAA IL-10 R: 5´-GTGAAGAAGCGGTGACAGC 3.2 Methoden 3.2.1 In-vivo-Passagen zur Gewinnung der frischen Eimeria spp.-Oozysten für die Infektionsdosen und Aufreinigung der Eimerien-Oozysten - 10 Hühner für jede Eimerien-Spezies/14 Lebenstag - 2000-10000 /ml sporulierte Oozysten jede Spezies - PBS (PH=7,4) - Kochsalz mit der Dichte von 1,2 - 50 ml Falconröhrchen - Gläser 200 ml - Leitungswasser - Trichter und 100 ml Messzylinder - Glas-Flaschen 1 Liter - Sieb (Größe von 250 und 100 µm) - Teesieb (Maschenweite ca. 250 µm) - Magnetstäbchen 33 Tiere, Material und Methoden - Stabmixer - Holzspatel - McMaster-Kammer - Mikroskop - Magnetrührer - 25 ml Pipette - Zellkulturflaschen (200 ml) - Kaliumdichromat (2%) Die 14 Tage alten Hühner wurden nach Infektionsgruppen in Käfige eingeteilt und mit je 2.000 Oozysten (in PBS) okuliert. Ab Beginn der Ausscheidung wurde die gesamte Kotmenge gesammelt. Nach der Ermittlung des Gewichts der Kotprobe wurde genau die Menge an Wasser zur Probe zugegeben, welche der Hälfte der Kotmenge entsprach, und das Gemisch gut mit Holzspatel homogenisiert und 6 g des Gemischs in einer Einwegschale abgewogen. Das Kot-Wassergemisch wurde in ca. 15 ml gesättigter Kochsalzlösung suspendiert und über Trichter und Teesieb in einen 100ml-Messzylinder überführt. Die Suspension wurde mit gesättigter Kochsalzlösung auf 60 ml aufgefüllt, danach wurde ein Magnetstäbchen hinzugegeben und die Suspension auf einem Magnetrührer mindestens 2 min auf höchster Stufe gemischt. Danach wurden aus dem zentralen Strudel mit einer Pasteurpipette ca. 1 ml entnommen, der erste Tropfen jeweils verworfen und mit dem Rest zwei Zählfelder von zwei McMaster-Kammern (entsprechend 4 Felder) luftblasenfrei befüllt. Die Suspension wurde in der McMaster-Kammer mindestens 2 min flotieren gelassen und anschließend mikroskopisch auf Oozysten durchmustert. Die Oozysten wurden im Lichtmikroskop bei 100x Vergrößerung ausgezählt. Vier Felder jeder Gruppe wurden in dieser Studie gezählt, dann wurde die mittlere Anzahl der Oozysten pro Gramm Kot (OPG) über folgende Gleichung berechnet: OPG= Mittelwert der vier Felder X 100. Bei zur Aufreinigung ausreichendem Oozystengehalt wurde der gesamte restliche Kot mit Leitungswasser homogenisiert und durch ein 250 µl Filter gesiebt. Das erhaltene Filtrat wurde dann durch ein 100 µl Sieb gesiebt, anschließend wurde die gewonnene Suspension bei 2000 g für 6 min zentrifugiert (in 200 ml-Zentrifugengläsern) und die Pellets in gesättigter Natriumchloridlösung resuspendiert. Nach erneuter Zentrifugation (2000 g, 6 min) flotierten die Oozysten an die Oberfläche und konnten mit einer 25 ml Pipette abgesaugt und in Leitungswasser (1 : 10) überführt werden. Nach 24 Stunden wurde der Wasserüberstand abgesaugt und die im Sediment enthaltenen Oozysten in 2 %-igem Kaliumdichromat bei Raumtemperatur zur Sporulation für 2 Tage in 34 Tiere, Material und Methoden Zellkulturflaschen aufgestellt. Die aufgereinigten sporulierten Oozysten wurden bis zum Einsatz bei 8 °C gelagert. 3.2.1.1 DNA-Extraktion und Durchführung der PCR - Eimerien Oozysten - PBS (pH=7,2) - Ultraschall - DNA-Extraktion Kit (Qiagen mini Kit) - PCR Mastermix enthält (2 mM Magnesiumchlorid, 0,5 nM dNTP, 0,5 nM jedes Primers und 0,5 Einheiten Taq Polymerase) - Reaktionsgefäße 1,5 ml - Ethidiumbromid - voll entsalztes Wasser (VE-Wasser) - UV-Lichtquelle, Kamera, Computer Etwa 104 Oozysten je Eimerienspezies wurden 3-mal in PBS gewaschen, danach wurde das Pellet in 400 µl PBS aufgelöst. Durch Einsatz von Ultraschall (50 Pulse/min für 6 min) wurden die Oozysten zersetzt, danach wurde die DNA durch das QIAamp DNA Mini Kit® (Qiagen, Hilden) nach dem Extraktionsprotokoll für Blut aufgereinigt. Zur Bestimmung der Eimerienspezies wurde die PCR unter Einsatz der spezifischen Primer durchgeführt (Tabelle 8). Die PCR wurde in 25 µl Reaktionsvolumen angesetzt, enthalten waren jeweils 2 mM Magnesiumchlorid, 0,5 nM dNTP, 0,5 nM jedes Primers (Eimeria spp.spezifische Primerkombinationen siehe Tab. 8) und 0,5 Einheiten Taq Polymerase (Promega, Mannheim, Deutschland). Der Thermocycler (I-Cycler, Bio-Rad, USA) wurde für die Amplifikation auf folgendes Programm eingestellt: Denaturierung: 94 °C für 45 s (1x), Amplifikation - 94 °C für 45 s, 60 °C für 30 s und 72°C für 45 s (35x) und finale Extension: 72°C für 5 min (1x). Zum Nachweis des PCR-Produktes wurden die Proben auf dem 1,5 % Agarose-Gel analysiert. Das Gel wurde für 30 min in Ethidiumbromidlösung angesetzt und dann in voll entsalztem Wasser entfärbt. Das gefärbte Gel wurde unter UV-Licht analysiert und mit dem Programm Argus® (England, London) ein Gelbild dokumentiert. 3.2.1.2 Einstellen der Infektionsdosis Die sporulierten Oozysten wurden in Kochsalzlösung 1:10 oder 1:100 verdünnt und mit einer 1-ml-Pipette gut gemischt. Je Probe wurden 6 McMaster-Felder gezählt und der Mittelwert berechnet. Die Konzentration der Oozysten in der untersuchten Stammlösung wurde durch folgende Gleichung berechnet: Oozysten pro ml = X * 6,66 * Verdünnungsfaktor 35 Tiere, Material und Methoden 3.2.2 Clostridium perfringens-Kultivierung und Toxinnachweis - C. perfringens aus erkrankten Hühnern (typische NE-Symptome; Stamm 2-288) - PBS (pH = 7,4) - Reinforced Clostridial Medium (RCM; Sifin GmbH, Berlin, Deutschland) - Neomyzin-Blutagar Platten: (Neomyzin (100 mg/l; Carl Roth)/Polymyxin B (50 mg/l; Sigma-Aldrich). - DNA Mini Kit® (Qiagen, Hilden, Deutschland) - Glasröhrchen (10 ml) - Thermocycler (Icycler, Bio-Rad, USA) - Mastermix (2 mM Magnesiumchlorid, 0,2 nM dNTP, 0,5 nM jedes Primers und 0,8 Einheit Taq Polymerase) - VE-Wasser - Ethidiumbromidlösung Dieser Stamm wurde aus erkrankten Hühnern isoliert. Er wurde bei 37 °C für 24 Stunden auf RCM kultiviert und danach bei -80 °C in Glycerin (1:1) bis zum Einsatz gelagert. Vor der Infektion wurde das Material auf Eis aufgetaut und erneut in RCM vermehrt, die Zahl der Kolonie-bildenden Einheiten (KBE) wurde auf Neomyzin-Blutagarplatten bestimmt. In dieser Studie wurden 109 KBE/ml RCM für alle Versuche eingesetzt. In 10 ml-Glasröhrchen waren 4.5 ml PBS vorgelegt und es wurde die Verdünnungsreihe von C. perfringens hergestellt. Von jeder Verdünnungsstufe wurde eine 10 µl-Probe auf einer Neomyzin-Blutagar-Platte angesetzt, für 18 bis 24 Stunden inkubiert und die Anzahl der KBE ausgezählt. Für die Durchführung der PCR zum Nachweis des netB-Gens wurden wenige Kolonien in 10 ml PBS gelöst und bei 6000 g für 5 min zentrifugiert, dann wurden sie in TBE-Puffer auf 95 °C für 5 min erhitzt und die DNA mittels DNA-Kit (Qiagen Mini Kit) extrahiert. Die PCR wurde in Anlehnung an KEYBURN et al. (2008) durchgeführt, wobei die PCR in 25 µl Reaktionsvolumen durchgeführt wurde, worin 2 mM Magnesiumchlorid, 0,2 nM dNTP, 0,5 nM jedes Primers und 0,8 Einheiten Taq Polymerase (Promega, Mannheim, Deutschland) enthalten waren. Der Thermocycler wurde für die Amplifikation auf folgendes Programm eingestellt: Denaturierung - 94 °C für 2 min (1x), Amplifikation - 94 °C für 45 s, 50 °C für 30 s und 72°C für 45 s (35x) und finale Verlängerung - 72°C für 12 min (1x). Zum Nachweis des PCR-Produktes wurden die Proben auf dem 1,5 % Agarose- Gel analysiert. Die Primer AKP 78 und AKP 79 wurden vorher sequenziert (KEYBURN et al. 2008). Das Gel wurde für 30 min in Ethidiumbromidlösung gelegt und dann im VE-Wasser entfärbt. Das gefärbte Gel wurde unter UV-Licht analysiert und durch das Programm Argus® (England, London) ein Gelbild dokumentiert. 36 Tiere, Material und Methoden 3.2.3 Durchführung der Sektion und weiterführende Untersuchungen - 1 ml Pipette und Spitzen - Waage - Scheren und Pinzetten - Alkohol (70%) - Formalin (10 %) - Falconröhrchen 15 ml und 50 ml - Blutröhrchen ohne Ansatz - Sterilisierte Zentrifugierröhrchen 1,5 ml - Sterilisierte Plastikstäbchen - Ether - Sekundäre Antikörper, Anti-Chicken IgY (H+L)-HRP - RNA-Extraktion Kit - 96 Well ELISA Platte - Stickstoff - Seren - Blockpuffer BSA Lösung (3 g BSA + 100 ml PBS) - PBST ( 100 ml PBS + 50µl Tween 20) - Bicarbonatpuffer (PH=9,6; 13,2 mM Na2CO3 + 35,7 mM NaHCO3 in 100 ml H2O) - Schwefelsäure (H2SO4; 1 M) - Sekundäre Antikörper (1:8000 in PBS, HRP-labeled goat anti-chicken IgY, Southern Biotech, Birmingham, USA) - 3,3′,5,5′-Tetramethylbenzidine Substrate (TMB; 0,5 mg/ml; Sigma Aldrich, Deutschland) - Hühner IgY (Southern Biotech, Birmingham, USA) - Anti-Avidin IgY Antikörper (Sigma-Aldrich, Deutschland) - Assaypuffer (20 mM Tris/HCl (pH 8.0), 0.15 M NaCl, 5 mM EDTA, 0.1 % (w/v) bovine casein and 0.1 % Tween 20 (v/v). 3.2.3.1 Pathologische Untersuchung der Hühner Zuerst wurden die Hühner einzeln gewogen, danach wurden sie durch Kopfschlag betäubt und entblutet. Dabei wurden final die Blutproben gesammelt. Alle anderen Proben wurden während der Sektion entnommen. Zu Beginn der Sektion wurden die Milz und die Zäkumtonsillen bzw. die Jejunumproben (je nach Versuch) für die spätere mRNA-Gewinnung entnommen und im Stickstoff gelagert, danach werden die Darmabschnitte und Darminhalt von Jejunum und Zäkum für die bakteriologische und histologische Untersuchung asserviert. 37 Tiere, Material und Methoden Die Bewertung der Kokzidiose- bzw. NE-typischen Läsionen erfolgte anhand der Bewertungsschlüssel von JOHNSON UND REID (1970) bzw. PRESCOTT et al. (1978) nach Eröffnung des Darmes. Die Kokzidiose wurde bezüglich der Eimerienarten im Duodenum, Jejunum, Zäkum und Rektum ausgewertet, wie in den Literaturübersichten beschrieben wurde (siehe Tabelle 1; Seite 12 und 13). Außerdem wurde die NE im Jejunum bis Ileum untersucht und ausgewertet (siehe Tabelle 2). 3.2.3.2 Blutprobenentnahme 3.2.3.2.1 Bestimmung der E. tenella-spezifischen Antikörper Das Antigen zur Durchführung des ELISA wurde aus E. tenella-Oozysten gewonnen. Dafür wurden 107 Oozysten in Bicarbonat-Puffer (pH 9,6) angesetzt und mit Ultraschall für eine Minute behandelt, und anschließend 5 Mal im Stickstoff eingefroren und bei 37 °C aufgetaut. Die zerstörten Oozysten wurden bei 4.000 g für 20 min bei 4 °C zentrifugiert, wobei der Überstand das Protein enthält, was durch Messung mit dem BCA-Kit verifiziert wurde. Die 96-well-Platte wurde mit einer 50 µl Proteinlösung von 100 µg/ml beschichtet und im Kühlschrank über Nacht inkubiert. Die freien Bindungsplätze wurden mit 3 % BSA in PBST für 2 Stunden bei Raumtemperatur geblockt. Die Seren wurden in PBST 1:100 verdünnt und auf die Platte aufgebracht und 1 Stunde bei Raumtemperatur inkubiert, danach wurde mit PBST 5 Mal gewaschen. Die Platte wurde mit dem sekundären Antikörper für 1 Stunde bei Raumtemperatur inkubiert und dann mit PBST erneut 5 Mal gewaschen. Das Farbsubstrat wurde zugegeben und die Reaktion mit H2SO4 abgestoppt. Mittels ELISA-Reader wurde die optische Dichte bei 450 nm und 690 nm Wellenlänge gemessen. Die Standardkurve wurde im Doppelansatz aus Hühner-IgY (von 625 ng bis 0,3 ng /m) angefertigt. 3.2.3.2.2 Bestimmung der Avidin-Serumkonzentration Dieser Test wurde von Herrn Dr. Schrödl (Institut für Bakteriologie und Mykologie durchgeführt. Die ELISA-Platte wurde mit 100 µl/Well von 2 µg/ml Kaninchen-Anti-Avidin-IgYAntikörper in Bicarbonatpuffer beschichtet und für 1 Stunde bei RT inkubiert, dann wurde sie mit PBST zwei Mal gewaschen. 100 µl der verdünnten Seren (1:50 und 1:100) wurden zugegeben und für 1 Stunde bei RT inkubiert. Drei Mal wurde sie danach gewaschen und mit verdünntem sekundärem Antikörper für 1 Stunde inkubiert und dann gewaschen. Das Substrat 3, 3′, 5, 5′-Tetramethylbenzidine (TMB) wurde danach zugegeben und die Farbreaktion mit 1 M H2SO4 abgestoppt. Die optische Dichte wurde bei 450 nm Wellenlänge gemessen. Für Avidin wurde eine Standardkurve mit der Konzentration von 20 ng/ml bis 0,15 ng/ml hergestellt. 38 Tiere, Material und Methoden 3.2.3.3 Organproben von Darm und Milz - Probengewebe (Zäkumtonsillen, Milz und Darm) - RNeasy mini Kit (Qiagen, Hilden, Deutschland - Waage - Magna-Lyser® - Eppendorf Röhrchen 1,5 ml - Zentrifuge (Bio-Rad, USA) - Spectrophotometer (Eppendorf, Hamburg, Deutschland) - Sybr-Green-Maxima-Mastermix 3.2.3.3.1 RNA-Extraktion Unter Einsatz des RNA-Kit wurden die gesamte RNA aus Zäkumtonsillen und Milz extrahiert. 25 mg der bei -80 °C eingefrorenen Proben der Zäkumtonsillen und Milz wurden in 600 µl RTL Buffer angesetzt und im Magna-Lyser® bei 6.500 rpm für 50 s homogenisiert und bei 13.000 Revolution Per Minute (rpm) für 3 min zentrifugiert, dann wurde die enthaltende RNA wurde in ein 1,5 ml Eppendorf-Röhrchenübertragen und die Hälfte des Gesamtvolumens an 70 %-igem Ethanol zugegeben. Durch Filter-Röhrchen wurde es bei 10.000 rpm für 15 s zentrifugiert, wobei die RNA an den Filter gebunden wird. Die gebundene RNA wurde mit Waschbuffer gewaschen, daraufhin 20 Einheiten DNase für 10 min zugegeben und mit RBE-Puffer 2 Mal gewaschen. Die RNA wurde anschließend für 2 min bei 13.000 rpm zentrifugiert, um das Ethanol zu entfernen. Am Ende wurde die RNA in 30 bis 50 µl RNase-freiem Wasser eluiert. 3.2.3.3.2 Zytokin-Analyse mittels RT-PCR Die RNA-Konzentration betrug zwischen 2.000 und 4.000 ng/µl, wobei jede Probe für die weitere Verarbeitung auf eine Konzentration von 500 ng/µl eingestellt und mit dem RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit® zu cDNA transkribiert wurde. Zum Zytokinnachweis wurden die von PARKark et al. (2008) beschriebenen Primer eingesetzt (siehe Tabelle 9). Die RT-PCR wurde unter Einsatz von SYBR-GREEN durchgeführt. Jeder Reaktionsansatz zu 20 µl enthält 10 µl Sybr-Ggreen, 0,5 mM jedes Primers und 7 µl Wasser sowie 2 µl der Probe (entspricht 50 ng pro Reaktion). Das Thermalprofil des Thermocyclers (Mx3000P qPCR System) wurde folgendermaßen gewählt: Denaturierung - 94 °C für 10 min (1x), Amplifikation: 94 °C für 30 s, 60 °C für 45 s und 72 °C für 1 min (40x). Mit der Mx3000p-Software wurden die Ergebnisse der CtWertmessungen analysiert und ausgewertet, danach wurden sie im Programm Geneious® kalibriert. 39 Tiere, Material und Methoden 3.2.3.4 Bakteriologische Untersuchung Zur Quantifizierung von C. perfringens wurden 0,5 g jeder Probe des Darminhaltes aus Jejunum und Zäkum gewogen und in 4,5 ml PBS angesetzt und gut homogenisiert, wovon eine Verdünnungsreihe 1:10 angesetzt wurde. Jeweils 10 µl jeder Verdünnung wurden auf einer Neomyzin-Blutagar-Platte ausgestrichen und anaerob für 18-24 Stunden bei 37 °C in einem anaeroben Behälter inkubiert. Die danach vorhandenen klaren Kolonien wurden gezählt und die Anzahl der KBE je g Kot unter Beachtung der Verdünnung und der angesetzten Menge nach folgender Formel ausgerechnet: KBE/g= Zahl der Kolonie * Verdünnungsfaktor 3.2.3.5 Wirkung von Toltrazuril auf C. perfringens Die Untersuchung der minimalen Hemmkonzentration (MIC) wurde in dreifacher Ausfertigung in einer 48-Well Platte festgestellt. 50 µl von exponentiellem oder stationärem C. perfringens (enthält 105 KBE/ml RCM) wurden zu 450 µl RCM, das verschiedene Konzentrationen von Toltrazuril enthielt (500- 250- 125- 62,5- 31 - 15 oder 7 µg/ml), zugegeben. Die Platte wurde anaerob bei 37 °C über Nacht inkubiert, danach wurde die MICWerte der C. perfringens-Kolonien aus den behandelten und unbehandelten Gruppen verglichen. 3.3 Versuchsplanung 3.3.1 Versuch 1: Prüfung verschiedener Infektionsmodelle zur experimentellen Induktion der Nekrotischen Enteritis des Huhnes In dieser Studie wurden zwei Infektionsmodelle zur Induktion der NE verglichen. Dabei wurden in beiden Fällen Eimerien und C. perfringens eingesetzt, wobei sich die eingesetzten Eimerienarten hinsichtlich ihrer Prädilektionsstellen im Darm unterschieden. Im ersten Experiment wurden E. maxima und E. acervulina, die den Dünndarm befallen, und im zweiten Experiment E. tenella und E. brunetti als vorrangig den Dickdarm befallende Spezies eingesetzt. In beiden Modellen erfolgte die Aufzucht der Eintagsküken (n = 60 je Experiment) bis zum 14. Lebenstag (LT) in Bodenhaltung auf Stroh, danach wurden sie jeweils in 6 Gruppen (n = 10; Tabelle 6) eingeteilt und gruppenweise in Metallkäfigen weiter gehalten. Trinkwasser sowie antikokzidia- und antibiotikofreies kommerzielles Aufzuchtfutter standen über den gesamten Versuchszeitraum ad libitum zur Verfügung. Die Infektionen mit den Eimerien und C. perfringens erfolgten durch Inokulation mittels Einkanalpipette in den Kropf. Im ersten Experiment wurden 150.000 Oozysten von E. acervulina und 40.000 Oozysten von E. maxima, im zweiten Experiment 25.000 Oozysten von E. tenella und 75.000 Oozysten von E. brunetti je Tier jeweils am 18. LT inokuliert. Die Infektion mit 109 KBE C. perfringens je 40 Tiere, Material und Methoden Tier erfolgte in beiden Experimenten in verschiedenen Gruppen zu unterschiedlichen Zeitpunkten (s. Tabelle 6). Tabelle 6: Versuchsaufbau von Versuch 1 (Infektionszeitspunkte und Gruppeneinteilung in den Experimenten 1 und 2) Experiment 1 Experiment 2 Gruppe Eimerien1) C .perfringens Gruppe Eimerien2) C. perfringens (n=10) Infektion Infektion (n=10) Infektion Infektion (am 18. LT) (LT) (am 18. LT) (LT) 1/NK - - 2/NK - - 1/PK + - 2/PK + - 1/E0 - + (14) 2/E0 - + (14) 1/E1 + + (14) 2/E1 + + (14) 1/L0 - + (22) 2/L0 - + (22) 1/L1 + + (22) 2/L1 + + (22) 1) 2) E. acervulina und E. maxima E. tenella und E. brunetti Die Hühner wurden täglich klinisch überwacht. Die Körpergewichte wurden am 14., 24. und 30. LT für jedes Einzeltier erhoben, außerdem wurde die Futteraufnahme je Gruppe durch Einwiegen des Futters und Auswiegen der Futterreste für die einzelnen Käfige bestimmt. Ab dem 18. LT (nach der Eimerien-Infektion) wurden von allen Gruppen jeden Tag Sammelkotproben zur Bestimmung der ausgeschiedenen Oozysten-Zahl gesammelt. Zur Auswertung der Kokzidiose- und NE-typischen Pathologie an Darm und Leber wurden zwei diagnostische Sektionen am 24. und 30. LT (jeweils n = 5 pro Gruppe) durchgeführt. 41 Tiere, Material und Methoden Dabei wurden zügig folgende Untersuchungsmaterialien gewonnen: - Blut zur Gewinnung des Serums (finale Blutentnahme) - Darminhalt von Jejunum und Zäkum für die bakteriologische Untersuchung (2 – 3 g je Tier, bis zur weiteren Bearbeitung bei ca. 7 °C gelagert - Milz und Zäkum-Tonsillen (sofortige Lagerung in flüssigem Stickstoff und spätere Überführung in den -80°C-Gefrierschrank für mRNA-Bestimmungen) - Darmabschnitte von Jejunum und Zäkum (Lagerung in 10%-igem Formalin zur Herstellung histologischer Präparate) 3.3.2 Versuch 2: Behandlung der experimentell induzierten Kokzidiose und nekrotischen Enteritis mit Toltrazuril Das in Versuch 1 zur Induktion der NE als optimal eingestufte Modell wurde eingesetzt, um den Einfluss von Toltrazuril auf den klinischen Verlauf und die Entwicklung der NELäsionen zu untersuchen. Die Aufzucht, Fütterung und Infektion erfolgte analog zu Versuch 1. Die insgesamt 96 Tiere wurden am 14. LT in 8 Gruppen (n = 12) eingeteilt und gruppenweise Käfigen zugeordnet. Als Infektionsmodell wurde hierbei entsprechend Experiment 2 des Versuchs 1 eine Infektion von Hühnern mit 25.000 Oozysten von E. tenella und 75.000 Oozysten von E. brunetti je Tier jeweils am 18. LT sowie 109 KBE C. perfringens je Tier am 22. LT (entsprechend Gruppe 2/L1, siehe Tab. 6) gewählt. Die Behandlung mit Toltrazuril, einem Antikokzidium, wurde zu verschiedenen Zeitpunkten im Bezug auf die Eimerien-Infektion durchgeführt (siehe Tab. 7). Die Dosis von Toltrazuril (75 ppm; Baycox®, Bayer AG, Leverkusen) wurde über Wasser für 8 Stunden an jeweils 2 aufeinander folgenden Tagen gegeben. Wie in Versuch 1 wurde das Körpergewicht am 14., 24. und 30. LT ermittelt, die Futteraufnahme wurde täglich bestimmt. Alle Tiere wurden über den gesamten Versuchszeitraum im Abstand von 12 Stunden klinisch überwacht. 42 Tiere, Material und Methoden Tabelle 7: Versuchsaufbau von Versuch 2 Gruppe (n=12) Behandlung mit Toltrazuril (75 ppm; 2x 8h an 2 aufeinanderfolgenden Tagen) G1 Beginn 12h vor Eimeria spp. Infektion C. perfringens Eimerien Infektion Infektion (am 22. LT) (am 18. LT) - - + + + + + + + + (LT 17/18) G2 Beginn 12h nach Eimeria spp. Infektion (LT 18/19) G3 Beginn 36 h nach Eimeria spp. Infektion (LT 19/20) G4 Beginn 60 h nach Eimeria spp. Infektion (LT 20/21) G5 Beginn 84 h nach Eimeria spp. Infektion (LT 21/22) G6 - + + G7 Beginn 12h vor Eimeria spp. Infektion + + - - (LT 17/18) G8 - Ab dem 18. LT wurden täglich Sammelkotproben von allen Gruppen parasitologisch auf die Höhe der Oozystenausscheidung untersucht. Am 24. und 30. LT wurden verblindet diagnostische Sektionen zur Beurteilung der kokzidiose- und NE-typischen Läsionen 43 Tiere, Material und Methoden durchgeführt (jeweils n = 6 je Gruppe), bei welchen folgende Untersuchungsmaterialien asserviert wurden: - Blutproben zur Gewinnung der Seren (finale Blutentnahme; zur Auswertung von Avidin und E. tenella-Antikörperspiegeln) - Darminhalt von Jejunum und Zäkum für die bakteriologische Untersuchung (2 – 3 g je Tier, bis zur weiteren Bearbeitung bei ca. 7 °C gelagert - Jejunumabschnitte (2 – 3 cm je Probe, Lagerung in 10 %-igem Formalin zur Herstellung histologischer Präparate) 3.3.3 Versuch 3: Prophylaxe der experimentell induzierten Kokzidiose und Nekrotischen Enteritis mit einer attenuierten Lebendvakzine Insgesamt wurden 60 Eintagsküken eingesetzt. Sie wurden bis zum 27. LT in Bodenhaltung auf Stroh (Tiefstreu) aufgezogen, wobei eine Gruppe (n = 36) mit der Lebendvakzine Paracox 8® (MSD, Intervet GmbH, Unterschleißheim) am ersten Lebenstag mit 100 µl Impfstoff (enthält insgesamt 3.000 Oozysten fünf verschiedener Eimerienarten) gegen Kokzidien geimpft wurde, eine zweite Gruppe (n = 24) blieb ungeimpft (siehe Tab. 8). Die Fütterung erfolgte wie in Versuch 1 und 2. Am 28. LT wurden die Hühner in 5 Gruppen eingeteilt (n = 12, siehe Tab. 8) und gruppenweise Käfigen zugeteilt. Die experimentelle Infektion erfolgte wie in Versuch 2 und Gruppe 2/L1 des Versuchs 1 mit 25.000 Oozysten von E. tenella und 75.000 Oozysten von E. brunetti je Tier. Aufgrund der langsamen Immunitätsausbildung gegen E. brunetti wurde die Eimerien-Infektion in Versuch 3 erst am 28. LT und die Infektion mit 109 KBE C. perfringens je Tier entsprechend am 32. LT durchgeführt. Die Körpergewichte wurden wöchentlich erhoben, der Futterverbrauch ab dem 28. LT gruppenweise ermittelt. Ab dem 6. LT wurden in 4-tägigen Intervallen Sammelkotproben von den geimpften und den ungeimpften Tieren auf Oozystengehalt untersucht, um den Impferfolg darzustellen (geimpfte Tiere) und ggf. unerwünschte Infektionen zu erkennen (ungeimpfte Tiere). 44 Tiere, Material und Methoden Tabelle 8: Versuchsplan von Versuch 3 Gruppe ® Impfstoff (Paracox 8 ) Eimerien Infektion C. perfringens Infektion Am 28 LT am 32 LT am ersten LT NK - - - V+/C-E- + - - V+/C-E+ + + - V+/C+E+ + + + V-/C+E+ - + + Klinische Überwachungen aller Tiere wurden täglich durchgeführt. Es fanden 2 diagnostische Sektionen am 34. und 40. LT (je n = 6 je Gruppe) zur Untersuchung der kokzidiose- und NEtypischen pathologischen Veränderungen statt, dabei wurden nachstehende Untersuchungsmaterialien entnommen: - Blutproben zur Gewinnung der Seren (finale Blutentnahme) - Darminhalt von Jejunum und Zäkum für die bakteriologische Untersuchung (2 – 3 g je Tier, bis zur weiteren Bearbeitung bei ca. 7 °C gelagert - Jejunumabschnitte (2 - 3 cm je Probe, Lagerung in 10%-igem Formalin zur Herstellung histologischer Präparate) - Milz und Jejunumabschnitte (Jejunum: ca. 2 cm je Tier; sofortige Lagerung in flüssigem Stickstoff und spätere Überführung in den -80°C-Gefrierschrank Bestimmungen) 45 für mRNA- Tiere, Material und Methoden 3.3.4 In-ovo-Versuch: Ko-Infektion von Bruteiern mit Eimerien und Clostridien Diese Studie wurde in zwei Teilen durchgeführt. Zuerst wurde die mittlere letale Dosis (LD50) von C. perfringens für die Hühnerembryonen detektiert und im Anschluss der Hauptversuch, d. h. die Ko-Infektion der Bruteier mit E. tenella und C. perfringens durchgeführt. 3.3.4.1 Bestimmung der mittleren letalen Dosis (LD50) von C. perfringens in Hühnerembryonen In diesem Experiment wurden 36 spezifisch pathogenfreie Bruteier (SPF-Eier) eingesetzt. Die SPF-Eier wurden bei 37,6 °C und 55% Feuchtigkeit für 15 Tage inkubiert. Ab dem vierten Tag wurden sie jeden Tag vier Mal gedreht. In einer 10-fach-Verdünnungsreihe wurde C. perfringens in PBS von 107 bis 103 KBE/ml verdünnt. 0,1 ml jeder Verdünnungsstufe wurde am 15. LT der Embryos zur Infektion von SPF-Eiern (n = 6) in den Allantois-Sack genutzt. Die verbleibenden SPF-Eier (n = 6) wurden als Negativkontrollgruppe mit PBS inokuliert. Die Auswertung der Mortalität erfolgte über einen Beobachtungszeitraum von 5 Tagen täglich. Dabei wurde mit Hilfe einer Lichtquelle in einem abgedunkelten Raum ermittelt, wie viele Embryonen jeweils lebendig oder verstorben waren. 3.3.4.2 Ko-Infektion der Bruteier mit E. tenella und C. perfringens Insgesamt 24 SPF-Eier wurden in 4 Gruppen (n = 6) eingeteilt (siehe Tab. 9). Die Eier von Gruppe E und CPE wurden mit jeweils 20.000 E. tenella Sporozoiten, Gruppe CP und CPE mit jeweils 104 KBE C. perfringens in 100 µl PBS am 15. LT der Embryos infiziert und Gruppe NK diente als Negativkontrolle. Überlebende Eier wurden für 5 Tage weiter inkubiert, danach wurden die Embryos entnommen und die Chorioallantoismembran abgezogen. Die Läsionen wurden nach einem Bewertungsschlüssel beurteilt. Anschließend wurde die Chorioallantoismembran gewaschen und in 10 %-igem Formalin für die histologische Untersuchung konserviert. Zusätzlich wurden Allantoisflüssigkeit und ca. 300 mg der Chorioallantoismembran für die bakteriologische und parasitologische Untersuchung gewonnen. Die Anzahl der gebildeten E. tenella-Oozysten wurde in der Allantoisflüssigkeit gezählt. Außerdem wurde die Gesamtzahl der E. tenella-Stadien durch qPCR bestimmt. 46 Tiere, Material und Methoden Tabelle 9: Versuchsaufbau Versuch 4 – Ko-Infektionsversuch von Bruteiern mit E. tenella und C. perfringens Gruppe E. tenella-Infektion C. perfringens-Infektion (10. LT) (15. LT) NK - - E + - CP - + CPE + + 3.3.5 Statistische Auswertungen Alle Daten wurden mit Hilfe des Statistikprogramms IBM SPSS Version 22 (IBM Statistik, New York, USA) analysiert. Alle Parameter wurden mit dem Kolmogorov-Smirnov-Test auf Normalverteilung getestet. Zur Bestimmung der Gruppenunterschiede wurden die Daten entweder mittels ANOVA mit nachfolgendem Bonferroni-Test (normalverteilte Daten) oder mittels Mann-Whitney-U-Test und Kruskal-Wallis-Test (nicht-normalverteilte Daten) analysiert. Die Darstellung der Daten erfolgte entsprechend ihrer statistischen Verteilung entweder als Mittelwert ± Standardabweichung (normalverteilte Daten) oder als Median (erstes Quartil drittes Quartil). 47 Ergebnisse 4 Ergebnisse 4.1 Versuch 1: Prüfung verschiedener Infektionsmodelle zur experimentellen Induktion der Nekrotischen Enteritis des Huhnes 4.1.1 Klinische Überwachungen und Mortalität Die mit Eimerien und C. perfringens ko-infizierten Hühner zeigten klinische Auffälligkeiten wie Anorexie, schaumige Durchfälle und zerzauste Federn ab dem 24 LT. Im ersten Experiment waren keine NE-assoziierten Todesfälle zu verzeichnen, wohingegen die Mortalität infolge der klinischen NE im zweiten Experiment 20 % betrug. In den Gruppen, die nur mit Eimerien oder C. perfringens infiziert wurden, wurde keine klinische NE beobachtet. Blutige Durchfälle zeigten sich in Experiment 2 als Folge der E. tenella-Infektion ab dem 23. LT bis zum 27. LT (s. Abb.2). 4.1.2 Futterverwertung (FCR) und Futteraufnahme In allen Gruppen war die tägliche Futteraufnahme vergleichbar. Ab dem 23. LT wurde eine Reduktion der Futteraufnahme in den mit Eimerien infizierten Gruppen festgestellt. Diese Reduktion dauerte 4 bis 6 Tage an, anschließend normalisierte sich die Futteraufnahme auf das Niveau der übrigen Gruppen. Tabelle 10: Körpergewichtsentwicklung in Experiment 1. Körpergewichte (Mittelwert ± Standardabweichung) FCR1 Gruppe ST 14 ST 24 ST 30 1/NK 265 ± 19 580,6 ± 27,9 1002.1 ± 64 1,99 1/PK 249,5 ± 31.7 497,6 ± 76,9 780.82 ± 50,8 2,33 1/E0 248,5 ± 36.5 520,0 ± 63,3 856.0 ± 161,0 1,94 1/E1 244,2 ± 19.8 444 ± 53,8 * 676.4 ± 126 * 2,52 1/L0 254,3 ± 30 552,6 ± 54,1 843.14 ± 103,5 1,89 1/L1 234,5 ± 28,3 416,6 ± 71,9 * 703,34 ± 121,4 * 2,67 1/NK: negative Kontrolle; 1/PK: postive Kontrolle (die Infektion nur mit Eimerien); 1/E0 und 1/L0 (Infektion mit C. perfringens am 14 LT bzw. 22 LT); 1/E1 und 1/L1 (Infektion mit C. perfringens am 14 LT bzw. 22 LT und Eimerien am 18 LT). * p < 0.05 im Vergleich zu Gruppe 1/NK. 1 Futterverwertung am Ende des Versuches (30. LT). 48 Ergebnisse Tabelle 11: Körpergewichtsentwicklung in Experiment 2. Körpergewichte (Mittelwert ± Standardabweichung) FCR1 Gruppe ST 14 ST 24 ST 30 2/NK 228,91 ± 18,8 474,2 ± 91,0 762,6 ± 82,5 2,26 2/PK 216,3 ± 23,9 441,25 ± 39,9 729,8 ± 72,1 2,65 2/E0 211,51 ± 26,9 470 ± 113,3 711,6 ± 60,5 2,12 2/E1 210,27 ± 22,5 415,2 ± 94,8 585,8 ± 146 * 2,56 2/L0 213,62 ± 23,2 444,8 ± 110,3 756,2 ± 52 2,30 2/L1 214,55 ± 18,9 350,8 ± 35,9 590,4 ± 115,3 * 3,57 2/NK: negative Kontrolle; 2/PK: postive Kontrolle (die Infektion nur mit Eimerien); 2/E0 und 2/L0 (Infektion mit C. perfringens am 14 LT bzw. 22 LT); 2/E1 und 2/L1 (Infektion mit C. perfringens am 14 LT bzw. 22 LT und Eimerien am 18 LT). * p < 0.05 im Vergleich zu Gruppe 2/NK. 1 Futterverwertung am Ende des Versuches (30. LT). Außerdem wurden signifikant niedrigere Körpergewichtszunahmen in den Gruppen 1/L1 und 2/L1 festgestellt. Die Tabelle (10 und 11) und Abb. 2 stellen die Futteraufnahme und Körpergewichte für beide Experimente dar. 49 Ergebnisse 140 1/NK 1/E1 120 1/PK 1/L1 Gramm 100 80 60 40 20 0 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 a Lebenstag 120 2/NK 2/E1 2/PK 2/L1 100 Gramm 80 60 40 20 0 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 Lebenstag 25 26 27 28 29 b Abb.2: Futteraufnahme im Verlauf von (a) Experiment 1 bzw. (b) Experiment 2. 1/NK: negative Kontrolle; 1/PK: postive Kontrolle (die Infektion nur mit Eimerien); 1/E1 und 1/L1 (Infektion mit C. perfringens am 14 LT bzw. 22 LT und Eimerien am 18 LT). 2/NK: negative Kontrolle; 2/PK: postive Kontrolle (die Infektion nur mit Eimerien); 2/E1 und 2/L1 (Infektion mit C. perfringens am 14 LT bzw. 22 LT und Eimerien am 18 LT). 50 Ergebnisse 4.1.3 Quantitative Oozysten-Ausscheidung (OPG) Ab dem 22. LT war in allen Eimerien-infizierten Gruppen eine Oozysten-Ausscheidung nachweisbar, wobei die Hühner der Gruppen 1/L1 und 2/L1 höhere OPG ausgeschieden haben. Abb. 3 zeigt die laufende Ausscheidung während des Experiments. Im Experiment 2 unterscheiden sich infizierte und uninfizierte signifikant (p < 0,05) Gruppen. Die anderen Gruppen zeigten keine Oozysten-Ausscheidung. 3,50E+06 1/PK 3,00E+06 1/E1 1/L1 OPG 2,50E+06 2,00E+06 1,50E+06 1,00E+06 5,00E+05 0,00E+00 21 22 23 24 25 26 27 28 29 a Le be n stag 3,50E+06 2/PK 3,00E+06 2/E1 2/L1 OPG 2,50E+06 2,00E+06 1,50E+06 1,00E+06 5,00E+05 0,00E+00 21 22 23 24 25 Le be n stag 26 27 28 29 b Abb.3: Versuch 1: Tägliche Gesamtausscheidung von Eimerienoozysten in (a) Experiment 1 und (b) Experiment 2. OPG: Oozysten pro Gramm; 1/PK: positive Kontrolle (die Infektion nur mit Eimerien); 1/E1 und 1/L1 (Infektion mit C. perfringens am 14 LT bzw. 22 LT und 51 Ergebnisse Eimerien am 18 LT); 2/PK: postive Kontrolle (die Infektion nur mit Eimerien); 2/E1 und 2/L1 (Infektion mit C. perfringens am 14 LT bzw. 22 LT und Eimerien am 18 LT). 4.1.4 Isolierung von C. perfringens aus dem Darminhalt Die Zahl der C. perfringens-Kolonien schwankte zwischen 0 in uninfizierten Hühnern bis 5x108 in infizierten Hühnern (Gruppe 2/L1 Mittelwert = 6; Im Allgemeinen war die Zahl der Kolonien höher nach der späten Infektion mit C. perfringens als bei anderen infizierten Tieren. Die Zahl der Kolonien war im zweiten Experiment bei später Ko-Infektion mit E. tenella und E. brunetti höher (Mittelwert= 6,0; Gruppe 2/L1) als bei Infektion mit E. acervulina und E. maxima (Gruppe 1/L1 Mittelwert= 4,6), was sich auch in den Läsionen reflektierte. Deshalb wurde dieses Modell für die nächsten Versuche zum Einsatz von Toltrazuril und Paracox-8® genutzt. Die folgende Abbildung 4 stellt die Anzahl der KBE für beide Experimente dar. Log 10 KBE/Gramm vom Darminhalt 10 b 9 24 LT 8 30 LT 7 b 6 5 4 a a 3 a a 2 1 0 1/NK 1/E0 1/E1 1/L0 1/L1 2/NK 2/E0 2/E1 2/L0 2/L1 Abb.4: Quantifizierung der C. perfringens-Kolonien in Jejunuminhalt. a,b verschiedene Buchstaben (a,b) kennzeichnen signifikant unterschiedliche Werte (p < 0,05). 4.1.5 Kokzidiose- und NE-spezifischer Lesion Score Die Läsionen der Kokzidiose wurden nach JOHNSON und REID (1970) beurteilt. Die stärksten Läsionen für die entsprechenden Eimerienarten wurden in beiden Experimenten 52 Ergebnisse jeweils in den ko-infizierten Gruppen festgestellt (s. Tab. 12, Abb. 5). Für die E. tenellaspezifischen Läsionen zeigten sich dabei signifikant höhere Werte in der Gruppe 2/L1 (Median = 3) und 2/E1 (Median = 3) im Vergleich zu Gruppe 2/PK (Median = 1; p < 0,05). Tabelle (12): Lesion Scores für Eimeria spp.-typische Läsionen: Medianwerte (erstes Quartildrittes Quartil); Lesion Score für NE-Läsionen: Mittelwert ± SD. a,b,c verschiedene Buchstaben kennzeichnen signifikant unterschiedliche Werte (p<0,05). Experiment 1 E.acervulina E.maxima Experiment 2 NE E. tenella E. brunetti NE n=10 LT 24/30 1/NK LT 24 0 0 1(1-2) 1(1-1,5) 0 1/PK LT 30 LT 24/30 1/E0 LT 24 0,5(0-1,25) 1(0,5-1) 0 0 2(1-3) 1(1-2) LT 24/30 1/L0 LT 24 LT 30 2/NK b 1(0,5-1,5) 1(1-1) 0 0 2(1-2) 1(1-2) 0 0 1(0,5-1,5) b 1(0,5-2) 0(0-0,5) 0,3± 0,48a 2/E0 b 0 3(2,5-3)b a,b 0.5 ± 0.7 0(0-0,5) 0 0,7 ± 0,6 1(0,5-1,5) 0(0-0,5) 0 0 3(3-3)b 2(1,5-2) 1,3 ± 0,67 a,b 2/L1 1/L1 1(0,5-1) 1(0,5-1) 0,2 ± 0,4c 2(1,5-2) 2/E1 2/L0 0 0 2/PK 1,2 ± 0,7 1/E1 LT 30 0 0,5 ± 0,5c 1,9 ±1,4 a,b,c 1(1-1,75) 1(0-1,5) NK: Negativkontrolle; PK: Positivkontrolle; E0: Monoinfektion mit C. perfringens am 14. LT. E1: Ko-Infektion mit C. perfringens am 14 LT und Eimerien am 18. LT; L0: Monoinfektion mit C. perfringens am 22. LT; L1: Ko-Infektion mit C. perfringens am 22. LT und Eimerien am 18. LT. 53 Ergebnisse Die NE-typischen Läsionen wurden in allen Gruppen, die mit C. perfringens infiziert waren (E0, E1, L0 und L1), beobachtet. Sie waren aber in den mit Eimerien ko-infizierten Gruppen stärker als in den monoinfizierten Gruppen (E0 und L0), besonders hoch waren sie in Gruppe 2/L1 mit einem Mittelwert von 1,9 (s. Tab. 12, Abb. 6). Abb.5: Sektionsbilder des Darmes an Prädilektionsstellen für Eimeria spp.-typische Läsionen; (a) E. maxima, (b) E. acervulina, (c) E. brunetti, (d) E. tenella. (Pfeile: Läsionen) 54 Ergebnisse Abb.6: Sektionsbilder des Jejunums zur Darstellung der Abstufungen entsprechend des Lesion-Scoring-Systems für die Nekrotische Enteritis nach PRESCOTT et al. (1978). (a) Score 0, gesunder Darm ohne Läsionen; (b) Score 1, Dünndarm dünnwandiger als normal, zerreißt leicht, mit oder ohne Schleimhautnekrosen; (c) Score 2, ein oder mehrere fokale Nekrosen von etwa 1 bis 5 mm Durchmesser; (d) Score 3, orange-braune nekrotische Schleimhauttrümmer; (e) und (f) Score 4, konfluente große Bereiche von dicken Schleimhautnekrosen des Dünndarms, welche 25 % oder mehr des Dünndarms betreffen. 55 Ergebnisse Außerdem wurden NE-assoziierte Läsionen in der Leber beobachtet, in akuten Krankheitsfällen als rote dunkle Stauung, oder in der subakuten Form als weiße herdförmige Nekrose als Folge der Belastung durch C. perfringens-Toxine. 4.1.6 Histologische Untersuchung Die histologische Untersuchung zeigte entsprechend der pathologisch-anatomischen Befunde besonders in den ko-infizierten Gruppen pathologische Befunde an Darm und Leber. Es wurde bei den Tieren mit makroskopisch deutlichen Veränderungen (hohe Lesion Scores) histologisch eine massive Nekrose der Darmmukosa mit hochgradigen Mengen von Fibrin und adhärenten Zelltrümmern und verschiedene parasitäre Entwicklungsstadien festgestellt (Abb. 7). Abb.7: Histologische Darstellung der Kokzidiose- und NE-bedingten Veränderungen. (a) gesundes Jejunum mit intakten Zotten; (b) Befall mit E.maxima im Jejunum.-Stadien (Pfeil: Schizonten/Gamonten); (c) hochgradige nekrotische Enteritis (Score 4) mit Zottenabrasion, Fibrinauflagerung und Zelldetritus (Pfeil: Zottenfusion und Fibrinauflagerungen ); (d): venöse Stauungen in der Leber (Pfeile: Venulenquerschnitte). 56 Ergebnisse Es lag eine Infiltration mit Leukozyten, insbesondere heterophilen Granulozyten vor. Außerdem wurde eine Zottenfusion und Besiedlung mit C. perfringens-Kolonien festgestellt. (s. Abb. 7). In den Lebern befallener Tiere wurde eine venöse Stauung gesehen, welche teilweise mit einer vermehrten Präsenz aktivierter Makrophagen und erhöhter Phagozytose von Erythrozyten einherging. 4.1.7 IgY von E. tenella und Avidin-Serumkonzentration (Experiment 2) Die Serumkonzentration des Avidins als Akut-Phase-Protein wurde im zweiten Experiment gemessen. Sie stieg am 24. LT (6 Tage nach Eimerien-Infektion) signifikant in den Gruppen 2/PK und 2/L1 an (p < 0,05 im Vergleich zu 2/NK und 2/L0), die nicht mit Eimerien infiziert waren. Bis zum 30. LT fielen die Avidinkonzentrationen in den Seren der Eimerieninfizierten Tiere wieder ab und näherten sich denen der Kontrolltiere an (s. Abb. 8). 210 24 LT * ng/ml Serum 180 30 LT * 150 120 90 60 30 0 2/NK 2/PK Gruppe 2/L0 2/L1 Abb. 8: Die Konzentration von Avidin im Serum am 24 und 30 LT des Experiments 2. 2/NK: Negativkontrolle; 2/PK: Positivkontrolle (Mono-Infektion mit Eimerien am 18. LT); 2/L0: Monoinfektion mit C. perfringens am 22. LT; 2/L1: Ko-Infektion mit C. perfringens am 22. LT und Eimerien am 18. LT. * p < 0,05 im Vergleich zu 2/NK und 2/L0. 57 Ergebnisse 1,4 * OD values of E. tenella IgY 1,2 1 * 0,8 0,6 0,4 0,2 0 2/NK 2/PK 2/L0 2/L1 Abb. 9: Die Konzentration von E. tenella-IgY im Serum am 30. LT des Experiments 2. 2/NK: Negativkontrolle; 2/PK: Positivkontrolle (Mono-Infektion mit Eimerien am 18. LT); 2/L0: Monoinfektion mit C. perfringens am 22. LT; 2/L1: Ko-Infektion mit C. perfringens am 22. LT und Eimerien am 18. LT. * p < 0,05 im Vergleich zu 2/NK und 2/L0. 4.1.8 Expression der Zytokine (Experiment 2) Die Zytokinprofile für Zäkumtonsillen und Milz der verschiedenen Gruppen sind im Abb. 10 und Abb. 11 dargestellt, aufgeteilt nach Untersuchungszeitpunkten (24. und 30. LT). Die mit Eimerien infizierten Gruppen (Gruppe 2/PK und 2/L1) zeigten 6 Tage nach der Infektion eine signifikante Aufregulation der IFN-γ-Expression (p < 0,05 im Vergleich zu 2/NK) in Zäkumtonsillen und Milz. Die höchste IFN-γ-Expression wurde in der Gruppe 2/PK am 24. LT (6 Tage nach Eimerieninfektion) festgestellt. IL-2-Expression war in den Zäkumtonsillen in der Gruppe 2/PK im Vergleich zur Gruppe 2/NK signifikant erniedrigt (p < 0,05), dann wurde sie am 30 LT in dem Zäkumtonsillen vergleichbar zu 2/NK wieder hochreguliert (Abb. 10; p < 0,05). IL-10 wurde am 24. LT in der Gruppe 2/PK in den Zäkumtonsillen signifikant (Abb. 12; P <0,05) herabreguliert, in der Gruppe 2/L1 in der Milz hingegen signifikant hochreguliert. Die 58 Ergebnisse Abb. 10: Gen-Expression von IFN-γ in Zäkumtonsillen und Milz am 24. und 30. LT (Versuch 1; Experiment 2, die Klammer zwischen Säulen zeigt die statistisch signifikanten Unterschiede an (p < 0,05). 2/NK: Negativkontrolle; 2/PK: Positivkontrolle (Mono-Infektion mit Eimerien am 18. LT); 2/L0: Monoinfektion mit C. perfringens am 22. LT; 2/L1: KoInfektion mit C. perfringens am 22. LT und Eimerien am 18. LT 59 Ergebnisse Abb. 11: Die Gen-Expression von IL-2 in Zäkumtonsillen und Milz am 24 und 30 LT (Experiment 2, die Klammer zwischen Säulen zeigt die signifikanten Unterschiede an (p<0,05). 2/NK: Negativkontrolle; 2/PK: Positivkontrolle (Mono-Infektion mit Eimerien am 18. LT); 2/L0: Monoinfektion mit C. perfringens am 22. LT; 2/L1: Ko-Infektion mit C. perfringens am 22. LT und Eimerien am 18. LT 60 Ergebnisse Abb. 12: Die Gen-Expression von IL-10 in Zäkumtonsillen und Milz am 24 und 30 LT (Experiment 2, die Klammer zwischen Säulen zeigt die signifikanten Unterschiede an (p<0,05). 2/NK: Negativkontrolle; 2/PK: Positivkontrolle (Mono-Infektion mit Eimerien am 18. LT); 2/L0: Monoinfektion mit C. perfringens am 22. LT; 2/L1: Ko-Infektion mit C. perfringens am 22. LT und Eimerien am 18. LT 61 Ergebnisse 4.2 Behandlung der experimentell induzierten Kokzidiose und nekrotischen Enteritis mit Toltrazuril (Versuch 2) 4.2.1 Bestimmung der Eimerienarten und Nachweis des NetB-Toxin-Gens durch PCR Die Hühner wurden in diesem Versuch mit E. tenella und E. brunetti infiziert. Die PCR bestätigte, dass nur diese Arten im Inokolum präsent waren und blieb negativ für E. acervulina, E. maxima und E. necatrix. Der Stamm von C. perfringens war positiv für das das NetB-Toxin kodierende Gen (s. Abb. 13). bp M E. tenella P S E. brunetti N P S N E. acervulina E. maxima P P S N S N E. necatrix P S N N P S 1000 500 500 100 (a) (b) Abb. 13: PCR-Analyse der Infektionsstämme. (a) PCR-Analyse der Eimeriensuspension auf Nachweis von E. tenella und E. brunetti (P= positive Kontrolle, S= E. tenella und E. brunetti, N= negative Kontrolle); (b) Nachweis des NetB–Toxin-spezifischen Gens (P= positive Kontrolle, S= Infektionsstamm, N= negative Kontrolle). 4.2.2 Klinische Überwachungen und Mortalität Die Eimerien-infizierten, früh behandelten Hühner (Gruppe 1 bis 3; siehe Tab. 4, Seite 27) zeigten keine klinischen Symptome. Die Hühner der Gruppen 4 und 5 hingegen wiesen klinische Anzeichen einer Enteritis auf, wobei die infizierte und unbehandelte Gruppe 6 die stärkste Klinik zeigte. Die Mortalität lag bei 8,3 % (Gruppe 4), 16,7 % (Gruppe 5) und 41,7 % (Gruppe 6; s. Abb. 14). In der Gruppe 6 wurden blutige und schaumige Durchfälle 36 bis 48 h nach der C. perfringens-Infektion beobachtet. 62 Ergebnisse 120 Überlebensrate % 100 80 Gruppe G1,G2,G3,G7,G8 Gruppe G4 60 40 Gruppe G5 20 Gruppe G6 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 Tag nach der Eimerien-Infektion Abb. 14: Überlebende Hühner während des Versuchs (Darstellung in Relation zur EimerienInfektion). 4.2.3 Futteraufnahme und Körpergewichte Die behandelten Gruppen 1 bis 5 mit Toltrazuril (siehe Tab. 4, Seite 27) unterschieden sich nicht signifikant in Futteraufnahme und Körpergewichte von den negativen Kontrollen. Gruppe 6 (infizierte und unbehandelte Gruppe) hingegen zeigte am 30. LT signifikant niedrigere Körpergewichte im Vergleich zu allen anderen Gruppen (s. Tab. 13). Tabelle 13: Körpergewichte und Futterverwertung (FCR= feed conversion ratio) am 14., 24. und 30. LT für alle Gruppen. Körpergewichte Gruppe G1 14. 244 LT ± 23,5 G2 G3 247,75 237,55 G4 G5 G6 G7 G8 250 248,35 252,33 247,75 252,5 ± 38,7 ± 36,5 ± 36,7 ± 37,5 ± 28 24. 544,13 553,65 507,95 590,53 527,46 400,68 622.4 583,53 LT ± 72,8 ± 99,4 ± 91,3 ± 76,7 ± 64,12 ± 56,2 ± 87,6 ± 80 30. 835,7 779,3 811,5 833 684,4 648,5* 884,8 885 LT ± 45 ± 111 ± 79 ± 85,5 ± 97 ± 30 ± 141 ± 90 2,29 2,29 2,43 2,03 2,22 4,21 1,94 2,12 2,13 2,30 2,14 2,32 2,63 3,00 2,10 2,09 ± 31,7 ± 27,5 24. FCR LT 30. LT * p < 0,05 im Vergleich zu allen anderen Gruppen außer Gruppe 5. 63 Ergebnisse Ab dem 22. LT (nach 4 Tagen von Eimerien-Infektionen) wurde in G4, G5 und G6 eine reduzierte Futteraufnahme festgestellt (s. Abb. 15). Die anderen Gruppen zeigten keine Änderung beim Futteraufnahmeverhalten. Außerdem war die Futterverwertung in der G6 im Gegensatz zu den anderen Gruppen sehr hoch (s. Tab. 13 und Abb. 14). 140 Futteraufnahme/Gramm G4 G5 G6 G7 G8 120 100 80 60 40 20 a 0 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 Lebenstag 140 G1 G2 G3 G7 G8 Futteraufnahme 120 100 80 60 40 20 b 0 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 Lebenstag Abb. 15: Tägliche durchschnittliche Futteraufnahme je Tier über den Versuchszeitraum. Behandlungsstunden vor 12h von Eimerien-Infektion (G1), nach 12 (G2), 36 (G3), 60 (G4) und 84 Stunden (G5) nach der Infektion; G6: infiziert und unbehandelt; G7: uninfiziert und behandelt; G8: Negativkontrolle. (a: Gruppen G4 bis G8; b: Gruppen G1, G2, G3, G7 und G8). 64 Ergebnisse 4.2.4 Quantitative Oozysten-Ausscheidung (OPG) In den Toltrazuril-behandelten Gruppen G1 bis G3 (12 h vor, 12 und 36 h nach Infektion) wurde keine Oozystenausscheidung beobachtet. In den behandelten Gruppen G4 und G5 (Behandlung 60 h bzw. 84 h Behandlungszeitpunkt nach der Infektion) wurden danach über den gesamten Untersuchungszeitraum signifikant niedrigere OPG-Werte erreicht als in der Positivkontrollgruppe G6 (p < 0,001; s. Abb. 16). Die ausgeschiedenen Oozysten wurden jeden Tag mittels PCR untersucht und gehörten ohne Ausnahme zu E. tenella und E. brunetti und entsprechenden damit dem Inokulat. Gruppe 4 Gruppe 5 Gruppe 6 7 6 Log OpG 5 * 4 3 2 1 0 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 Lebenstag Abb.16: Oozysten-Ausscheidung über den Versuchszeitraum für die Gruppe 4, 5 und 6; * p < 0,001. G4: Behandlung 60 h nach Eimerieninfektion; G5: Behandlung 84 h nach Eimerieninfektion; G6: Positivkontrolle. 4.2.5 Re-Isolierung von C. perfringens aus dem Darminhalt C. perfringens konnte aus allen infizierten G1 bis G6 am 24. und 30. LT isoliert und der Gehalt in KBE logarithmisch berechnet werden. Die Menge von C. perfringens war signifikant höher in der infizierten und unbehandelten G6 im Vergleich zu allen behandelten G1 bis G5 im Jejunum und Zäkum (p < 0,05). Die Tabelle 14 zeigt die log10 Zahl der C. perfringens-Kolonien am 24. und 30. LT. 65 Ergebnisse Tabelle 14: Die Zahl der C. perfringens Kolonien in Abhängigkeit der Behandlung mit Toltrazuril. G1 G2 G3 G4 G5 G6 Jejunum 0,5 4,93 ± 5,14 ± 4,83 ± 6,55 ± 8,69 ± 24 LT ±1,22 2,46 2,91 2,81 3,26 0,67* Zäkum 3,17 ± 6,80 ± 7,22 ± 6,04 ± 6,52 ± 7,75 ± 24 LT 3,54 1,36 0,8 1,33 0,86 7,03 ± 3,26 ± 4,12 ± Jejunum 1,49 ± G7 G8 0 0 0,48† 0 0 4,8 ± 4,15 ± 1,13 ± 30 LT 2,39 0,6 2,88 2,36 1,06 2,57 1,75 0 Zäkum 3,03 ± 7,77 ± 5,76 ± 5,85 ± 7,75 ± 4,71 ± 1± 2,24 ± 30 LT 2,48 0,69 1,01 1,95 1,41 1,75 1,55 1,96 *p < 0,05 im Vergleich zu anderen infizierten Gruppen. † p <0,05 im Vergleich zu G1, G4 und G5. Behandlungsstunden vor 12h von Eimerien-Infektion (G1), nach 12 (G2), 36 (G3), 60 (G4) und 84 Stunden (G5) nach der Infektion; G6: infiziert und unbehandelt; G7: uninfiziert und behandelt; G8: Negativkontrolle. 4.2.6 Lesion Score und histologische Untersuchung Die Gruppe G1 (Behandlung 12 vor der Eimerien-Infektion), G2 (12 h nach EimerienInfektion) und G3 (36 h nach der Infektion) zeigten keine für Kokzidiose spezifischen Läsionen, trotzdem konnten milde NE Läsionen in den Gruppen G1 bis G4 nachgewiesen werden. Ein Huhn aus Gruppe G4 und zwei Tiere aus Gruppe G5 hatten massive NELäsionen (Score 4), woran sie vermutlich auch verstorben sind. Es wurden in Gruppe 6 hochgradige Läsionen aufgrund der Kokzidiose und NE nachgewiesen, welche signifikant höher waren als in den infizierten und behandelten Gruppen 1 bis 5 (p < 0,05). Entsprechend wurden in den histologischen Untersuchungen die typischen Läsionen einschließlich Kolonisation von C. perfringens auf der Schleimhaut und Infiltration der Heterophilen in die Lamina propia besonders bei Gruppe 6 und in geringerer Ausprägung in den anderen Gruppen gefunden (Tabelle15). 66 Ergebnisse Tabelle 15: Lesion Scores für Kokzidiose und NE in Abhängigkeit von Behandlung mit Toltrazuril. Lesion scores für Eimeria spp.: Median und 1./3. Quartil (n=6). NE-Läsionen wurden durch Mittelwert ± SD dargestellt. NE.typische Läsionen E. tenella-typische E. brunetti-typische Läsionen Läsionen Gruppe 24 LT 30 LT 24 LT 30 LT 24 LT 30 LT n=6 n=6 G1 0 0 0 0 0,5 ± 0,8 0,33 ± 0,8 G2 0 0 0 0 0,67 ± 0.8 0,17 ± 0,4 G3 0 0 0 0 0,67 ± 0,8 0,5 ± 0,8 G4 0 (0-1) 0 0 0 (0-0,25) 1,17 ± 1,3 0,5 ± 0,8 G5 0 (0-1) 0 0 (0-1) 0 (0-0,25) 1,17 ± 1,2 0,67 ± 1 3 (2-3)* 0 (0-1) 3,67 ± 0,5 a 1,5 ± 1b G6 3 (2,75-4)* 1 (0,75-1) G7 0 0 0 0 0 0 G8 0 0 0 0 0 0 * p < 0,05 im Vergleich zu allen infizierten Gruppen und p < 0,01 im Vergleich zu den Gruppen G7 und G8. a p < 0,01 zum Vergleich mit Gruppen G1 bis G5, b p< 0,05 im Vergleich mit G1 bis G4. Behandlungsstunden vor 12h von Eimerien-Infektion (G1), nach 12 (G2), 36 (G3), 60 (G4) und 84 Stunden (G5) nach der Infektion; G6: infiziert und unbehandelt; G7: uninfiziert und behandelt; G8: Negativkontrolle. 4.2.7 E. tenella-spezifische Antikörper und Avidin-Serumkonzentration Für den E. tenella-ELISA wurde zunächst der Cut-off Wert von 7,67 ng/ml Serum festgelegt. Bei den anschließenden Messungen wurden in Gruppe G6 signifikant höhere Antikörperspiegel als in den anderen infizierten und behandelten Gruppen gemessen (p < 0,05; Abb. 17a). Serum-Avidin stieg in allen infizierten Gruppen nach der EimerienInfektionen (Abb.17b), die signifikant höchste Konzentration wurde am 24. LT in Gruppe G6 erreicht (p < 0,05 im Vergleich zu allen anderen Gruppen außer Gruppe 5). Am 30. LT 67 Ergebnisse bestanden keine signifikanten Gruppenunterschiede und die Serumkonzentrationen in Gruppe G6 waren wieder auf niedrigem Niveau. 40 * a anti- Eimeria tenella AntikörperKonzentration (ng/ml) 35 30 25 20 15 10 cutoff=7.67 ng/m l --------------------------------------------------------------------------------------- 5 0 1 2 3 4 Gruppe 5 6 7 8 250 24 LT 30 LT 200 Serum-Avidin- ng/ml b * 150 100 50 0 1 2 3 4 5 6 7 8 Gruppe Abb.17: (a) E. tenella-spezifische Antikörperspiegel (p < 0,05 im Vergleich von G6 mit allen anderen Gruppen); (b) Avidin-Serumkonzentration (*p < 0,05 im Vergleich zu allen anderen Gruppen außer Gruppe 5). 68 Ergebnisse 4.3 Versuch 3: Prophylaxe der experimentell induzierten Kokzidiose und nekrotischen Enteritis mit einer attenuierten Lebendvakzine 4.3.1 Körpergewichtsentwicklung und Futteraufnahme Bis zum 27. LT (vor der Eimerien-Infektion) wurden sowohl hinsichtlich der Körpergewichte als auch hinsichtlich der Futteraufnahmemenge keine signifikanten Unterschiede zwischen den Gruppen festgestellt (Abb. 18a). Am 34. LT war die Körpergewichtzunahme mit Ausnahme der ko-infizierten Gruppen (E+C+) zwischen allen Gruppen vergleichbar (siehe Tabelle 16). In den mit Clostridien und Eimerien mischinfizierten Gruppen waren im Vergleich zur Gruppe NK signifikant niedrigere Gewichtszunahmen (p < 0,05) zu verzeichnen, wobei auch zwischen beiden ko-infizierten Gruppen (V-/E+C+ und V+/E+C+) signifikante Unterschiede (p < 0,05) zu Ungunsten der unvakzinierten Gruppe (V-/E+C+) bestanden. Bis zum 40. LT lagen in allen Eimerien- bzw. ko-infizierten Gruppen signifikant geringere Gewichtszunahmen (p < 0,05) vor als in der Gruppen NK und der vakzinierten uninfizierten Gruppe V+/C-E- (siehe Tabelle 16). Die Futteraufnahme war insbesondere in der Gruppe V-/C+E+ um den 34. LT, also während der höchsten Oozystenausscheidung, erniedrigt und wies einen deutlichen Nadir auf (siehe Abb. 18b). Dies reflektierte sich gemeinsam mit den niedrigeren Körpergewichtszunahmen auch in einer ungünstigeren Futterverwertungsrate (siehe Tabelle 16). 69 Ergebnisse a 90 Gramm pro Tag 80 70 geimpft 60 ungeimpft 50 40 30 20 10 0 1 3 5 7 9 11 13 15 17 19 21 23 25 27 Lebenstag 160 b 140 Gramm pro Tag 120 100 80 60 40 20 0 28 29 30 31 32 33 34 35 36 NK V+/C-E+ V-/C+E+ Lebenstag 37 38 39 40 V+/C-EV+/C+E+ Abb.18: (a) Tägliche Futteraufnahme vom 1. LT bis 27 LT; (b) Futteraufnahme von 28. bis 40. LT (gruppenweise ermittelter Mittelwert). 70 Ergebnisse Tabelle 16: 1 Medianwerte (1.– 3. Quartil). 2Mittelwert ± Standardabweichung, Vergleich der Körpergewichte zum 27. LT a p < 0.05 im Vergleich zu Gruppe NK; b p < 0.05 im Vergleich zu Gruppe V+/C+E+; c p < 0.05 im Vergleich zu Gruppe V+/C-EStudientag (ST) 27 34 40 FCR Gruppe Körpergewicht1 Körpergewichtszunahme2 NK 616,5 (557,75 – 687,25) - V+/C-E- 604,0 (562,75 – 623,0) - V+/C-E+ 605,5 (550,25 – 655,25) - V+/C+E+ 613,5 (541,25 – 667,0) - V-/C+E+ 623,5 (562,75 – 680,25) - NK 1029,0 (998,0 – 1143,0) 501,7 ± 81,8 1,69 V+/C-E- 1007,0 (984,75 – 1146,25) 488,3 ± 66,2 1,63 V+/C-E+ 948,5 (892,75 – 1005,75) a 392,0 ± 38,1 1,72 V+/C+E+ 960,0 (814,25 – 997,25) c 368,8 ± 78,8 a 2,15 V-/C+E+ 808,0 (758,5 – 867,75) a,c 238,3 ± 12,9 a,b,c 3,13 NK 1252,5 (1183,25 – 1451,0) 626,2 ± 105,5 2,32 V+/C-E- 1246,0 (1178,75 – 1317,5) 597,7 ± 45,8 b 2,26 V+/C-E+ 1087,0 (1014,5 – 1185,0) a,c 435,0 ± 91,5 a,c 2,69 V+/C+E+ 1073,5 (1022,25 – 1140,0) a,c 410,5 ± 29,3 a,c 2,77 301,8 ± 75,8 a,c 3,83 V-/C+E+ 912,0 (873,5 – 1080,0) a,c 4.3.1 Klinische Überwachung und Mortalität Die Gruppen NK, V+/C-E- und V+/C-E+ zeigten über den gesamten Studienzeitraum keine klinischen Symptome. Die Hühner der Gruppe V+/C+E+ zeigten braunen schaumigen Durchfall am 33. und 34. LT. In der Gruppe V-/C+E+ wurden massive klinische Symptome wie Anorexie und hämorrhagische schaumige Durchfälle ab 33. LT festgestellt, welche 3 Tage andauerten. Diese Gruppe war auch die einzige, in welcher eine Mortalität zu beobachten war (8,3 %). 71 Ergebnisse 4.3.2 Quantitative Oozysten-Ausscheidung (OPG) Vom 6. LT bis zum 30. LT wurde in der geimpften Gruppe eine Oozystenaussscheidung nachgewiesen, wobei die maximale Ausscheidung von 40.000 OPG am 18. LT erreicht wurde (siehe Abb. 19a). Bei den ungeimpften Tieren wurden in diesem Zeitraum keine Oozysten nachgewiesen. Danach wurden vom 33. bis 40. LT die täglichen Parasitenausscheidungen bestimmt. Signifikante Unterschiede (P < 0,01) bestanden dabei zwischen der Gruppe V/C+E+ mit einer maximalen Ausscheidung von 1.580.000 OPG am 34. LT und allen anderen Gruppen (siehe Abb.19b). 4,50E+04 a 4,00E+04 3,50E+04 OPG 3,00E+04 2,50E+04 2,00E+04 1,50E+04 1,00E+04 5,00E+03 0,00E+00 1 6 10 14 18 22 26 30 34 Lebenstag 1,80E+06 NK V+/C-E- 1,60E+06 V+/C-E+ V+/C+E+ b V-/C+E+ 1,40E+06 OPG 1,20E+06 1,00E+06 8,00E+05 6,00E+05 4,00E+05 2,00E+05 0,00E+00 33 34 35 36 37 Lebenstag 38 39 40 Abb.19: a: OPG-Werte nach der Impfung bis zum 33. LT alle geimpften Tiere; (b) OPGWerte nach der Eimerien-Infektion ab dem 33. LT bis 40. LT (V-/C+E+ signifikant höhere OPG-Werte als alle anderen Gruppen, p < 0,01). 72 Ergebnisse 4.3.3 Isolierung von C.perfringens Am 34. LT wurde kein Unterschied in der Anzahl der KBE zwischen den Gruppen festgestellt. Am 40. LT zeigte die Gruppe V-/C+E+ eine signifikant höhere KBE-Zahl im Zäkum verglichen mit den Gruppen NK, V+/C-E- und V+/C-E+ (p < 0,05; siehe Abb. 20). In den isolierten Kolonien konnte das NetB-Gen nachgewiesen werden. * log10 KBE/Gramm D arminhalt 8 7 Jejunum Cecum 6 5 4 3 2 1 0 NK V+/C-E- V+/C-E+ V+/C+E+ V-/C+E+ Gruppe Abb.20: Zahl von C. perfringens-KBE pro Gramm des Zäkuminhaltes. * p < 0,05 im Vergleich zu Gruppen NK, V+/C-E- und V+/C-E+. 4.3.4 Pathologische und histologische Untersuchungen In den uninfizierten Gruppen wurden keine makroskopischen und histologischen Läsionen festgestellt. In allen mit Eimerien infizierten Gruppen wurden infektionsbedingte Darmläsionen festgestellt, welche in der ungeimpften Gruppe V-/C+E+ signifikant stärker ausgeprägt waren als in allen anderen Gruppen (Median: Score 3 für E. tenella und 2 für E. brunetti am 34. LT in Gruppe V-/E+C+, p < 0,05). NE-typische Läsionen wurden nur in den Gruppen V-/C+E+ und V+/C+E+ nachgewiesen (Median: Score 1,5 für V+/C+E+/ und 3 für V-/C+E+). Sie waren signifikant stärker ausgeprägt in Gruppe V-/C+E+ im Vergleich zu allen anderen Gruppen (siehe Tab. 17). 73 Ergebnisse Tabelle 17: Lesion Scores bei vakzinierten (V+) oder nicht vakzinierten (V-) Hühnerküken, die mit Clostridien (C+/C-) und/oder Eimerien (E+/E-) infiziert oder nicht infiziert waren: Medianwerte (1.–3. Quartil); n = 6 per Gruppe. 1 Score für Eimeria spp.-spezifische Läsionen nach JOHNSON und REID (1970). 2Score für NE-spezifische Läsionen nach PRESCOTT et al. (1978). Gruppe E. tenella 1 E. brunetti 1 SD 34 SD 40 SD 34 SD 40 SD 34 SD 40 NK 0 0 0 0 0 0 V+/C-E- 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1,5 0 (0-2,0) (0-1,0) 3,0 1.0 0 0 0 V+/C-E+ (0-1) (0-1) 0,5 0,5 0 V+/C+E+ (0-1) V-/C+E+ a NE2 0 (0-1) 3,0 0 (1,75-3,25) a (0-1,5) 2,0 1,0 (1,75-2,25) a (0-1,0) (2,0-3,0) b (0-2,5) p < 0.01 im Vergleich zu allen anderen Gruppen; b p < 0,05 im Vergleich zu allen anderen Gruppen. In den histologischen Untersuchungen wurden für die NE die makroskopisch nachgewiesenen Läsionen bestätigt und eine Infiltration der Lamina propria des Jejunums mit Heterophilen sowie eine Kolonisation der geschädigten Darmschleimhaut mit C. perfringens beobachtet. Analog zu den pathologisch-anatomischen Befunden waren die pathohistologischen Veränderungen am stärksten in der Gruppe V-/C+E+ und weniger stark in der Gruppe V+/C+E+. Abb. 21 stellt die Lesion Scores aus den histologischen Untersuchungen für alle Gruppen dar. 74 Ergebnisse 4,5 4 ST 34 ST 40 histologische Score 3,5 3 2,5 2 1,5 1 0,5 0 NK V+/C-E- V+/C-E+ V+/C+E+ V-/C+E+ Gruppe Abb.21: Lesion Scores entsprechend der histologischen Untersuchungen 4.3.5 E. tenella-spezifische Antikörperspiegel Der Cut-off-Wert des genutzten ELISA lag im durchgeführten Versuch bei 10,69 ng/ml Serum. In allen Gruppen außer Gruppe NK konnten Antikörper nachgewiesen werden. Die Antikörperspiegel lagen in den geimpften Gruppen verglichen mit Gruppe V-/C+E+ sowohl am 34. als auch am 40. LT signifikant höher (p < 0,01; siehe Abb. 22). b Konzentration der Antikörper ng/ml 700 600 500 400 34 LT 300 200 a 40 LT c 100 0 NK V+/C-E- V+/C-E+ V+/C+E+ V-/C+E+ Gruppe Abb. 22: Serumkonzentrationen der E. tenella-Antikörper (ng/ml). a,b,c verschiedene Buchstaben bedeuten signifikant unterschiedliche Konzentrationen (p < 0,01 im Vergleich zu NK). C p< 0,05 im Vergleich zu NK. 75 Ergebnisse 4.3.6 Expressionsprofile der Zytokine Alle Expressionsmessungen aus Jejunum- und Milzproben wurden auf Basis der GAPDHExpression normalisiert (siehe Abb. 23 bis 26). IFN-γ war in der Gruppe V-/C+E+ im Darm im Vergleich zu allen Gruppen deutlich hochreguliert (p < 0,01 am 34. LT mit ca. 16facher Erhöhung im Vergleich zur Gruppe NK; p < 0,05 am 40. LT; Abb.23). In der Milz war die IFN-γ-Expression auch zu beiden Zeitpunkten im Vergleich zu Gruppe NK in der Gruppe V-/C+E+ signifikant höher (p < 0,05; Abb. 22). Bezüglich der IL-12-Expression wurden im Darmgewebe signifikant höhere Werte in Gruppe V-/C+E+ im Vergleich zu Gruppe NK (8fache Erhöhung) und V+/C-E+ festgestellt (p < 0,05 für beide Gruppenvergleiche). In der Milz waren die IL-12-Expresssionswerte zwischen den Gruppen vergleichbar (Abb. 24). Die Gruppe V-/C+E+ zeigte im Darm signifikant höhere IL-10-mRNA-Expressionswerte (p < 0,05) im Vergleich zu den Gruppen NK, V+/C-E- und V+/C+E+ am 34. LT; die Gruppe V+/C+E+ zeigte erhöhte Werte verglichen zu Gruppe NK am 40. LT (p < 0,05). In der Milz wurden für IL-10 keine Gruppenunterschiede festgestellt (Abb. 25). Bei IL-2 zeigten sich keine Gruppenunterschiede in der Expression im Darm und in der Milz (Abb. 26). Abb. 23: Gen-Expression von IFN-y am 34. LT und 40. LT in Zäkumtonsillen und Milz. Die Klammern zwischen Säulen zeigen die statistisch signifikanten Differenzen (p < 0,05). 76 Ergebnisse Abb. 24: Gen-Expression von IL-12 am 34. LT und 40. LT in Zäkumtonsillen und Milz. Die Klammer zwischen Säulen zeigen die signifikante Unterschiede (p < 0,05). 77 Ergebnisse Abb. 25: Gen-Expression von IL-10 am 34. LT und 40. LT in Zäkumtonsillen und Milz. Die Klammer zwischen Säulen zeigen die signifikante Unterschiede (p < 0,05). 78 Ergebnisse Abb. 26: Gen-Expression von IL-2 am 34. LT und 40. LT in Zäkumtonsillen und Milz. 79 Ergebnisse 4.4 Ko-Infektion von Bruteiern mit Eimerien und Clostridien (In-ovo-Versuch) 4.4.1 Experiment 1: Etablierung des Ei-Modells Es zeigte sich, dass die eingesetzte hohe Dosis von C. perfringens während der Inkubationsphase zum Tod aller Embryos führte. Die LD50 über einen Infektionszeitraum von 5 Tagen für den verwendeten Stamm wurde als 105 KBE/Ei ermittelt (siehe Tabelle 18 und Abb. 26). Die Veränderungen an den Embryos stellten sich in Abhängigkeit von der C. perfringensDosis als Hämorrhagien bis Embryodegenerationen dar. Aufgrund der Beobachtungen aus dem ersten Experiment wurde für das zweite Experiment die Infektionsdosis von 104 KBE/Ei gewählt. Tabelle 18: Bestimmung der embryonalen Mortalität in Bruteiern nach Infektion mit verschiedenen C. perfringens-Dosierungen. Mortalität der Embryos (Tag nach der Infektion) Dosis Total Mortalität 1 2 3 4 5 6 1.0 x 107 4 2 0 0 0 0 6/6 (100 %) 1.0 x 106 2 1 0 1 1 0 5/6 (83.3 %) 1.0 x 105 0 1 0 1 1 0 3/6 (50 %) 1.0 x 104 0 0 0 0 1 0 1/6 (16.6 %) 1.0 x 103 0 0 0 0 0 0 0/6 (0 %) Negativkontrollea 0 0 0 0 0 0 0/6 (0 %) a Negativkontrolle wurde mit RCM-frei-C. perfringens inokuliert 80 Ergebnisse Hämorrhagische und nekrotische Läsionen konnten in den Embryos der Gruppen CP und CPE, nicht aber in den Gruppen NK oder E nachgewiesen werden. Ihr Stärkegrad war abhängig von der C. perfringens-Dosis (Abb.27). In dem ersten Experiment wurde somit gezeigt, dass infektionsbedingte Läsionen mit Blutungen oder Nekrosen induziert werden konnten und die LD50 bei 105 KBE/Ei liegt. Abb.27: Hühnerembryos nach C. perfringens-Infektion. (a) und (d): uninfizierte Embryos (keine Läsionen); (b), (c) und (e): mit verschiedenen Dosen von C. perfringens infiziert: (b) 107 KBE/ml; (c) und (e) je 106 KBE/ml. h: Hämorrhagie, n: Nekrose 4.4.2 Experiment 2: Ko-Infektion mit E. tenella und C. perfringens in embryonierten Eiern 4.4.2.1 CAM Läsionen Die an der CAM festgestellten Läsionen werden in Tabelle 20 beschrieben. Die Embryos der Gruppe NK zeigten keine Läsionen, ebenso wurde nach der Inokulation von reinem RCMMedium keine Mortalität beobachtet. In Gruppe CP (Infektion mit C. perfringens) wurde maximal Score 1 (Mittelwert 0,67) beobachtet. In Gruppe E (Infektion mit Eimerien) traten Läsionen des Stärkegrades 1 bis 2 (Mittelwert 1,5) auf; Gruppe CPE zeigte die stärksten 81 Ergebnisse Läsionen (Mittelwert 2,33; p < 0,01 im Vergleich zu allen anderen Gruppen) nach der KoInfektion mit beiden Erregern. Dies äußerte sich im Nachweis von Blutungen, Stauungen und weißen Herden in dieser Gruppe (siehe Tabelle 19 und Abb. 28). In den Gruppen CP und CPE wurde auch eine Gasbildung gesehen. Tabelle 19: Inokulation der Eier und Lesion Score: a Inokulation mit 2x104 E. tenellaSporozoiten je Ei in den Allantoissack am 10. Bruttag; b Inokulation mit 1x104 KBE C.perfringens je Ei in den Allantoissack am 15. Bruttag; c Lesion Score (0: keine Läsionen; 1: Stauung und Blutung; 2: weniger als 10 weiße Herde; 3: 10 oder mehr weiße Herde. d MLS: Mittelwert von Lesions Score Gruppe (N=6) CAM Lesion Score c Infektion E. tenellaa C. perfringens b Mortalität 0 1 2 3 MLSd P Werte* NK - - 0/6 (0 %) 6 0 0 0 0 - CP + - 1/6 (16.6 %) 2 4 0 0 0.67 - E - + 1/6 (16.6 %) 0 3 3 0 1.5 0.065 CPE + + 3/6 (50 %) 0 1 2 3 2.33 < 0.01 * Im Vergleich zu NK 82 Ergebnisse Abb. 28: Lesion Scores an der CAM: (a) unveränderte CAM (Gruppe NK, Score 0); (b) wenige weiße Herde; (c) massive Blutung; (d) viele weiße Herde und Blutung. 4.4.2.2 Histologische Untersuchungen In allen mit E. tenella infizierten Gruppen wurden parasitäre Entwicklungsstadien in der CAM festgestellt. In C. perfringens-infizierten Gruppen wurde eine Kolonisation mit Clostridien und CAM-Nekrosen festgestellt. Außerdem lag eine leukozytäre Infiltration vor. (siehe Abb. 29). 83 Ergebnisse , Abb. 29: Histologische Untersuchung von CAM. (a) unveränderte CAM (Gruppe NK); (b) und (c) verschiedene Entwicklungsstadien von E. tenella d: C. perfringens auf CAM (Pfeile); (e) und (f) Nekrose der CAM als Folge der Ko-Infektion mit E. tenella und C. perfringens. Schwarze Pfeile zeigen die Entwicklungsstadien von Eimerien und die weißen zeigen C. perfringens. cp: C. perfringens; Et: E. tenella; n: Nekrose; L: entzündliches fibrinreiches Exsudat. 4.4.3 Quantifizierung von E. tenella in der Allantoisflüssigkeit Die Oozysten-Zahl lag in den Eimerien-infizierten Gruppen E und CPE zwischen 0 und 1485 Oozysten pro ml Allantoisflüssigkeit. Die Unterschiede zwischen beiden Gruppen waren nicht signifikant. 84 Ergebnisse Vier Proben der Gruppe E und 6 Proben der Gruppe CPE waren in der qPCR positiv für E. tenella. Die logarithmische Anzahl der Kopien des nachgewiesenen E. tenella-Gens war signifikant höher in der Gruppe CPE mit 4,79 Kopien im Vergleich zur Gruppe E mit 3,80 Kopien (p < 0,05). 4.4.4 Quantifizierung von C.perfringens in der Allantoisflüssigkeit Die Anzucht bakterieller Erreger gelang lediglich aus den Allantoisflüssigkeiten (AF) und CAM der C. perfringens-infizierten Gruppen CP und CPE (s. Tab. 20). Die Zahl der C. perfringens-Kolonien war signifikant höher in AF und CAM der Gruppe CPE im Vergleich zu Gruppe CP (p < 0,01). Die Untersuchung mittels MALDI-TOF ergab, dass es sich bei den isolierten Keimen ausschließlich um C. perfringens handelte. Tabelle 20: Erregernachweis aus inkubierten Bruteiern zu Versuchsende. aE. tenella-Oozysten in Allantoisflüssigkeit (AF). bC. perfringens-Zahl in AF und Chorioallantoismembran (CAM). Gruppe (n=6) Zahl der E. tenella- C. perfringens-KBE (Mittelwert log10 ± Oozystena StAbw)b (Mittelwert log10 ± AF CAM StAbw) NK 0 0 0 E 0.8 ± 0.6 0 0 CP 0 4.2 ± 0.75 3.84 ± 0.36 CPE 1.98 ± 1.4* 8.17 ± 0.85** 5.55 ± 1.36 *p = 0.15; ** p < 0.01 85 Diskussion 5 Diskussion Das Verbot des Einsatzes von leistungsfördernden Antibiotika in der EU führte zum vermehrten Auftreten von NE-Fällen in der Geflügelindustrie (WILLIAMS 2005; VAN IMMERSEEL et al. 2009). Dazu stiegen die wirtschaftlichen Verluste wegen der hohen Mortalität, Behandlungs- und Bekämpfungskosten deutlich an. Die grundsätzlichen Bekämpfungsmöglichkeiten der NE sind die Vermeidung prädisponierender Faktoren oder die Behandlung der klinischen NE. Bis jetzt konnte die Pathogenese der NE durch die prädisponierenden Faktoren nicht komplett verstanden werden, auch wenn verschiedene Publikationen seit 2008 mit Fokus auf Pathogenese oder Bekämpfung der NE des Huhnes veröffentlicht wurden (LANCKRIET et al. 2010; TSIOURIS et al. 2010). In vorliegender Arbeit wurden beide Schwerpunkte für die durch Ko-Infektionen mit Hühnereimerien und C. perfringens verursachte NE untersucht. Ursprünglich wurde das Alpha-Toxin als Hauptfaktor für die Entstehung der NE beschrieben (SAKURAI et al. 2004; TITBALL et al. 1999). KEYBURN et al. 2006 zeigten, dass das Alpha-Toxin nicht den Hauptfaktor bei der Hervorrufung der NE darstellt und wiesen nach, dass ein neu entdecktes Toxin, das so genannte Necrotic-Enteritis-Like-Beta-Toxin (NetB Toxin), der Schlüssel zur Pathogenese der NE ist. Seit Entdeckung dieses Toxins richteten sich alle Forschungen in diese Richtung (KEYBURN et al. 2008), weshalb auch in dieser Arbeit ein C. perfringens-Stamm genutzt wurde, welcher PCR-positiv für das netb-Gen war. Es ist bekannt, dass massive Infektionen mit C. perfringens zu Darmzerstörungen und komplizierten Erkrankungen führen (AL-SHEIKHLY und TRUSCOTT 1977). In Verbindung mit Eimerien, Fischmehl und Stress als prädisponierende Faktoren wurden Modelle für die NE des Huhnes publiziert (AL-SHEIKHLY und TRUSCOTT 1977; KÖHLER et al. 1974; WU et al. 2010) und die Kokzidiose scheint der wichtigste prädisponierende Faktor für diese Erkrankung zu sein (TRIMBERMONT et al. 2011; VAN IMMERSEEL et al. 2009; WILLIAMS 2005). 5.1 Prüfung verschiedener Infektionsmodelle zur experimentellen Induktion der Nekrotischen Enteritis des Huhnes Zwei Modelle der NE wurden bei Hühnern in dieser Studie untersucht. Im ersten Experiment wurden die Ko-Infektionen mit C. perfringens, E. acervulina und E. maxima getestet. Diese Kokzidien befallen den Dünndarm. Im zweiten Experiment wurden E. tenella und E. brunetti, die die Dickdärme befallen, eingesetzt. In beiden Experimenten wurde die C. perfringensInfektion 4 Tage vor oder nach der Eimerien-Infektion appliziert. Infektionsmodelle unter Nutzung von Ko-Infektionen mit E. acervulina und E. maxima wurden vorher von 86 Diskussion verschiedenen Forschern publiziert (ALSHEIKHLY und ALSAIEG 1980; BABA et al. 1997; COLLIER et al. 2008; VAN IMMERSEEL et al. 2009). Das zweite Modell mit Einsatz von E. tenella- und E. brunetti-Ko-Infektionen und auch der Vergleich zwischen beiden Modellen unter C. perfringens-Inokulation vor oder nach der Eimerieninfektion wurden vorher nicht beschrieben. Einige Forscher sind der Meinung, dass NE im Dünndarm entsteht und durch E. acervulina und E. maxima provoziert wird (SHOJADOOST et al. 2012). Es konnte aber gezeigt werden, dass NE durch die Dickdarmkokzidiose (E. brunetti) ebenfalls ausgeprägt wird (BABA et al. 1997). In den eigenen Versuchen wurde daher zunächst vergleichend untersucht, ob die Dünndarm- oder Dickdarmkokzidiose besser geeignet ist, um NE auszulösen und welche Sequenz der parasitären und bakteriellen Infektion am günstigen ist. Die klinische Überwachung ergab erst ab 3 bis 24 h nach der C. perfringens- Infektion erste Anzeichen der klinischen NE. Dazu zählten Apathie, schaumige Durchfälle, Fress- und Bewegungsunlust und gesträubtes Gefieder, gefolgt von einer Mortalität bis 20 %. Manchmal kann die Erkrankung perakut, ohne vorherige klinische Symptome und lediglich unter Ausprägung einer plötzlichen hohen Mortalität verlaufen, wie in der Literatur beschrieben (ALSHEIKHLY und ALSAIEG 1980; BABA et al. 1997). Dabei kann die Mortalität stark schwanken und wurde mit etwa 1 % bis 53 % beschrieben (ALSHEIKHLY und ALSAIEG 1980; KALDHUSDAL et al. 1999; VAN IMMERSEEL et al. 2009). Die Reduktion der Futteraufnahme und der Körpergewichtszunahme wurde in beiden Experimenten als Folge der Mischinfektion mit Kokzidien (besonders im zweiten Experiment durch E. tenella und E. brunetti) und nachfolgender C. perfringens-Inokulation beobachtet. Die Körpergewichtszunahmen waren in beiden Experimenten in den ko-infizierten Gruppen sowohl bei früher als auch bei später Clostridieninfektion signifikant geringer im Vergleich zu den uninfizierten Gruppen (p < 0,05). Das bestätigt die Berichte von AL-SHEIKHLY und TRUSCOTT (1977) und COLLIER et al. (2008). Eine Mono-Infektion mit Eimerien oder Clostridien führte im Gegensatz zur Ko-Infektion nicht zur signifikanten Reduktion der Körpergewichte. Deshalb wird gefolgert, dass die Infektionen mit Kokzidien die Wirkung von C. perfringens fördern und damit höhere Verluste und stärkere Darmerkrankungen verursachen. Das wurde vorher nur bei Einsatz von Eimerien nach einer C. perfringensInfektion beschrieben (AL-SHEIKHALY und AL-SAIEG 1980; COLLIER et al. 2008; WILLIAMS et al. 2003). In der eigenen Arbeit wurde bereits erstmals gezeigt, dass NE auch induziert werden kann, wenn C. perfringens bereits vor den Eimerien inokuliert wird, aber die den Kokzidien nachfolgende Infektion von C. perfringens ist zur Auslösung der NE günstiger, weil die Läsionen stärker ausgeprägt sind. Ab Tag 4-5 p.i. bezogen auf die Eimerien wurde in den ko-infizierten Gruppen, besonders in Gruppe 2/L1, eine erhöhte Oozystenausscheidung 87 Diskussion nachgewiesen. Die Oozystenausscheidung pro Gramm Kot war in den ko-infizierten Gruppen beider Experimente im Mittel über den Zeitraum vom Ausscheidungsbeginn bis zum Versuchsende mehr als 3-fach höher als in der mit Kokzidien monoinfizierten Gruppe. Die Ursache für diese Steigerung ist unklar. Eine immunologische Ursache ist denkbar. COLLIER et al. (2008) zeigten, dass IFN-γ nach C. perfringens-Infektion in ko-infizierten Tieren für 2 Tage herabreguliert ist. Da IFN-γ die Invasion von Eimerien inhibiert, könnte die Herabregulierung von IFN-γ in ko-infizierten Gruppen die Entwicklung der Eimerien fördern, was in dem eigenen Versuch in den Zäkumtonsillen festgestellt wurde (Abb. 10; Seite 59). Die Läsionensbeurteilung erfolgte neben der pathologisch-anatomischen Untersuchung auch mikroskopisch-histologisch. Es wurde festgestellt, dass die Läsionen der NE bei Gruppe 2/L1 (Mittelwert = 1,9) durch Ko-Infektionen mit Eimerien und späte C. perfringens-Infektion stärker ausgeprägt als bei mit Clostridien monoinfizierten Tieren waren. Die durch Eimerien verursachten Läsionen, zeigten keinen großen Unterschied zwischen koinfizierten und monoinfizierten Gruppen. Eine Ausnahme bildeten die E. tenella-typischen Läsionen, welche in den ko-infizierten Gruppen signifikant schwerer (p < 0,05) waren. Weil die Ko-Infektion auf Körpergewicht, Ausscheidung und Läsionen Einfluss zeigte, ist zu vermuten, dass besonders zwischen dem Verlauf der Infektion mit C. perfringens und E. tenella eine Wechselwirkung besteht. So kann C. perfringens die Läsionen von E. tenella fördern und nicht nur umgekehrt, wie BALAUCA et al. (1976) bereits zeigten. Eigene Forscher konnten eine Eignung eines Ko-Infektionsmodells unter Einsatz von E. acervulina und E. maxima zur Induktion einer NE nachweisen (COLLIER et al. 2008; PARK et al. 2008; TSIOURIS et al. 2010). Die eigenen Ergebnisse, z. B. die Auswertung der Läsionsstärke, weisen dagegen darauf hin, dass das Modell unter Nutzung von E. tenella und E. brunetti geeigneter ist. Die Ursache könnte sein, dass die Infektion mit E. tenella zu Änderungen der Bakterienflora im Zäkum führt, was wiederum die Entstehung der NE fördert (STANLEY et al. 2012 und 2014), so dass Butyrat-produzierende Bakterien (wie Bifidobacterium und die Lactobacillus- Gruppe) im Zäkum nach der Infektion mit Eimerien reduziert sind. Das führt zur Förderung der NE. Es kann spekuliert werden, dass Eimerien auch zur Zerstörung von Rezeptoren dieser Keime führt. Nach der Infektion bildet der Körper Antikörper gegen pathogene Erreger, das wurde durch ELISA in dem eigenen Versuch für die Kokzidiose bestätigt (WALLACH 2010). In dieser Studie wurde festgestellt, dass sich die Wechselwirkung zwischen C. perfringens und E. tenella nicht Clostridienvermehrung nur in manifestiert, der Stärke sondern 88 von auch Läsionen, in den E. Ausscheidung und tenella-spezifischen Diskussion Antikörperspiegeln. In der ko-infizierten Gruppe waren die IgY-Werte höher als in der nur mit E. tenella und E. brunetti infizierten Gruppe. Die Antikörper reflektieren vermutlich das Ausmaß der Parasitenproduktion und damit der Oozystenausscheidung. Welche Rolle die IgY-Antikörper gegen Eimerien spielen, ist allerdings unterschritten (AKHTAR et al. 2005). Weiterhin wurden Zytokine in Zäkumtonsillen und Milz bestimmt, für die eine große Rolle in der Zäkumtonsillen-Immunität gegen C. perfringens und Kokzidien angenommen wird. Beispielweise inhibiert IFN-γ die Eimerien-Invasion. PARK et al. (2008) zeigten den Effekt von C. perfringens und E. maxima auf die Expression der Zytokine im Darm, in dem es einen Tag nach C. perfringens-Infektion zur Herabregulation von IFN-α, IFN- γ, IL-1b, IL-2, IL-12, IL-13, IL-17, und TGF-β4 und zur aufregulieren IL-8, IL-10 und IL-15 kam. Die eigenen Ergebnisse zeigten, dass C. perfringens ein schwacher Induktor von IFN-γ in Zäkumtonsillen und Milz ist. Die Monoinfektion mit Eimerien führte dagegen zu einer Hochregulation von IFN-γ am 24. LT und 30. LT. Es ist bekannt, dass IFN-γ die Invasion von Sporozoiten inhibiert (LILLEHOJ et al. 2000). Die Ko-Infektion mit Eimerien und C. perfringens führt zur vermehrten Expression von IFN-γ, aber in geringerem Umfang als eine Mono-Infektion mit Eimerien. PARK et al. (2008) fanden nach der Infektion mit C. perfringens und E. maxima sogar eine Herabregulation von IFN-γ, während COLLIER et al. (2008) gegenteilige Resultate erzielten. Es könnte sein, dass die bei Ko-Infektion geringere Bildung von IFN-γ eine vermehrte Invasion der Sporozoiten oder Merozoiten erlaubt und in der Folge sowohl die Läsionen an Schwere als auch die Ausscheidung von Oozysten zunahmen. IL-10 war in den Zäkumtonsillen der mit Eimerien monoinfizierten Gruppe am 24. LT signifikant herabreguliert, analog zu den Beschreibungen von PARK et al. (2008). In der Milz wurde IL-10 am 24. LT dagegen signifikant in der ko-infizierten Gruppe hochreguliert. IL-10 aktiviert die Th1-Abwehr und spielt eine wichtige Rolle für die humorale Immunität (GROUX und POWRIE 1999), und dies kann die höhere Antikörperspiegel gegen Eimerien in der ko-infizierten Gruppe erklären. Hinsichtlich IL-2 führt die Monoinfektion mit Eimerien zur Herabregulation in den Zäkumtonsillen (24. LT), gefolgt von einer späteren Hochregulation (30. LT). Das deckt sich mit Beobachtungen von HONG et al. (2006), welche ebenfalls anfänglich eine Herab- und 6-7 Tage nach der Infektion eine Hochregulation von IL-2 zeigten. IL-2 ist ein Marker für Th1-Zellen. Es kann gefolgert werden, dass die Zäkumtonsillen eine Rolle bei der Immunabwehr von Kokzidiose assoziierter NE spielen. IFN-γ wird bis jetzt als wichtigstes Zytokin bei Darmerkrankungen, besonders bei Kokzidiose ausgesehen, Kokzidien führen zu einer vermehrten IFN-γ Ausschüttung, aber wenn andere Pathogene wie C. perfringens gleichzeitig präsent sind, kann die Induktion von IFN-γ 89 Diskussion vermindert sein, was den Verlauf der Kokzidiose in Sinne einer schweren Erkrankung beeinflussen kann. IL-2 ist ein Entzündung hemmendes Zytokin. Es beeinflusst die Proliferation von Lymphokin-aktivierten Killerzellen und natürlichen Killerzellen (NK) und stimuliert Zytokin-Produktion durch T-Helfer- und NK-Zellen. Reduziertes IL-2 wird bei Kokzidiose im Zusammenhang mit schweren Läsionen Anfang der Infektion gesehen. Nach 6 Tagen der Infektion steigen die IL-2-Werte wegen der Regeneration der Mukosa wieder an (HONG et al. 2006). Es erscheint sinnvoll und notwendig die Expressionsmuster und Funktion der Zytokine im Verlauf von Eimeriosen und auch durch Kokzidien induzierter NE genauer zu untersuchen. Avidin ist ein Akut-Phase-Protein (KUNNAS et al. 1992 und MATULOVA et al. 2012), dessen Konzentration durch die Gewebsschädigung im Serum stark ansteigt (ELO und KORPELA 1984). Unsere Ergebnisse zeigten, dass es nach Eimerieninfektionen im Vergleich zu der negativen Kontrolle und Monoinfektion mit C. perfringens vermehrt gebildet wird. Avidin kann während einer akuten Infektion durch IL-6 induziert werden, wenn die Zellen unter Stress oder bakteriell infiziert sind (ZEREGA et al. 2001). Inwieweit es eine Rolle bei der Abwehr von Eimerien spielt, wurde bislang nicht untersucht. 5.2 Behandlung der experimentell induzierten Kokzidiose und nekrotischen Enteritis mit Toltrazuril Im zweiten Versuch wurde Toltrazuril zu verschiedenen Zeitpunkten nach der Infektion mit E. tenella, E. brunetti und C. perfringens therapeutisch verwendet. Toltrazuril ist ein Antikokzidium und wird zur strategischen Behandlung der Kokzidiose eingesetzt. Es wirkt durch Unterbrechung des Entwicklungszyklus der Parasiten (MATHIAS et al. 2003). In den letzten Jahren war es das wirksamste Antikokzidium bei der Bekämpfung der Hühnerkokzidiose. Es gibt zwar einen Bericht über eine Toltrazuril-Resistenz bei Eimerien (STEPHAN et al. 1997), aber ein verbreitetes Problem scheint dies bislang nicht zu sein. Im eigenen Versuch wurde die Wirksamkeit von Toltrazuril bei Einsatz zu den Zeitpunkten 12 h vor oder 12, 36, 60 oder 84 h nach der Eimerieninfektion in Kombination mit einer induzierten Clostridiose vergleichend untersucht. Frühe Behandlungen bis zu 36 h nach Eimerieninfektionen schützten die Hühner am effektivsten gegen beide Erkrankungen (Kokzidiose und massive NE). Später behandelte Gruppen (60 oder 84 h nach Eimerieninfektion) zeigten im Vergleich zur Negativkontrolle eine schlechtere Futterverwertung und es traten Todesfälle auf (Mortalität 8,3 % (60 h) und 16,7 % (84 h)). Trotzdem waren die Tiere weniger stark betroffen als die Hühner in der unbehandelten Positivkontrolle, wo über 41 % Mortalität auftrat und die Läsionen signifikant massiver als in allen infizierten behandelten Gruppen (p < 0,05) waren. Der Einfluss von 90 Diskussion Toltrazuril auf experimentell durch Ko-Infektion mit Kokzidien induzierte NE wurde vorher nicht untersucht. Einen generell positiven Effekt von Antikokzidia in Form von geringeren NE-typischen Darmläsionen beschrieb allerdings schon WILLIAMS (2005). Studien zur Wirksamkeit von Ionophoren in einem subklinischem Modell der NE zeigten auch einen Effekt, wenn sie ab dem ersten Lebenstag appliziert wurden (LANCKRIET et al. 2010). In der eigenen Studie wird gezeigt, dass der Einsatz von Toltrazuril zur Kontrolle der klinischen NE führt, wenn die Hühner für 2 Tage behandelt werden. Indirekt belegt dies den NE auslösenden Charakter der Kokzidiose. Ein MIC-Test für Toltrazuril zeigte einen gewissen direkten antibiotischen Einfluss auf C. perfringens, was vorher nicht beschrieben wurde. Die MIC von Toltrazuril auf C. perfringens betrug für die exponentielle Kultur 125 µg/ml. Die Ergebnisse des In-vivo-Versuches zeigten auch eine Hemmung von C. perfringens, besonders bei einer frühen Behandlung der Hühner (bis zu 36 h vor Eimerien-Infektion). Die Behandlung mit Toltrazuril kann bei Kokzidienexposition durch die Hemmung der Eimerienentwicklung die Schleimproduktion, Proteinverluste und Zerstörung der Epitheldarmzellen reduzieren. Das wirkt der NE entgegen. In diesem Fall konnte festgestellt werden, dass sich der Wirkstoff Toltrazuril, wenn er ab Beginn der Eimerien-Vermehrung und vor Zerstörung der Epithelzellen appliziert wird, vor NE schützt. Dies dürfte primär an der bekannten Wirkung auf die Kokzidien liegen, allerdings konnte zumindest in vitro auch ein gewisser Hemmeffekt auf die Clostridien gezeigt werden. Eine Oozystenausscheidung konnte nur bei Tieren, die frühestens 36 h nach Eimerieninfektion behandelt wurden, nachgewiesen werden. Dies entspricht den Ergebnissen von MENGEL et al. (2012) für die durch Isospora suis induzierte NE beim Schwein. Die Autoren vermuteten ebenfalls, dass Toltrazuril über die Verhinderung einer Kokzidien bedingten Schleimproduktion die Clostridien-Vermehrung hemmt. Bei den mit Toltrazuril behandelten Gruppen (60 und 84 h nach Eimerien Infektion) und positiv Kontrollen waren die C. perfringens-Zahlen höher als in den behandelten Gruppen. Es müssen sich viele C. perfringens-Keime im Jejunum befinden, damit es zur Entstehung der NE kommt (LONG et al. 1974; BABA et al. 1997; SI et al. 2007) und dies kann offenbar bei einer unzureichenden Kokzidienkontrolle der Fall sein. Avidin stieg 6 Tage nach der Eimerieninfektion im Vergleich zur Negativkontrolle in allen infizierten Gruppen, aber dieser war Effekt nur gegenüber der unbehandelten Positivkontrollgruppe signifikant. Avidin ist als Abwehrprotein gegen Infektionserreger bedeutsam (ZEREGA et al. 2001), und dies könnte auch für Kokzidien gelten, es liegen aber in der Literatur bislang keine entsprechende Angaben vor. Die humorale Immunantwort des Huhnes gegen Kokzidien wurde breit intensiv untersucht (WALLACH 2010), und die Antikörperspiegel werden auch als Hinweis für den 91 Diskussion Immunisierungserfolg genutzt. Der Einsatz von Antikokzidia wie Toltrazuril führt zur Vermeidung der interzellulären Reproduktion, was Auswirkungen auf die Ausbildung von Antikörpern haben kann. Zwar hilft die Behandlung mit Toltrazuril unter Laborbedingungen nicht nur gegen Kokzidien, sondern sie verhindert auch NE, Felderfahrungen stehen aber noch aus. Es ist wahrscheinlich, dass die übliche Applikation am 15. und 16. LT oder bei Ausbruch einer Kokzidiose (MORRIS et al. 2007) nicht ideal ist, um NE zu verhindern und damit auch wirtschaftliche Verluste durch NE zu senken. Der direkte antimikrobielle Effekt des Toltrazurils in vitro dürfte bei der festgestellten MIC eher keine bedeutende Rolle spielen. 5.3 Prophylaxe der experimentell induzierten Kokzidiose und nekrotischen Enteritis mit einer attenuierten Lebendvakzine Im dritten Versuch wurde der Einfluss einer Impfung gegen Kokzidiose auf die experimentell induzierte klinische NE untersucht. Bislang wurde nur eine Studie mit Einsatz einer Lebendvakzine im subklinischen Modell der NE durchgeführt (TSIOURIS et al. 2013). In Übereinstimmung mit vorherigen Beschreibungen (VELKERS et al. 2012) wurden in den geimpften Gruppen nach Belastungsinfektion signifikant weniger Oozysten ausgeschieden als in der ungeimpften Gruppe (mehr als 13-fache Reduktion der Gesamt-OPG am 34. LT im Vergleich zur monoinfizierten Gruppe). Parallel zeigten die ungeimpften im Vergleich zu den geimpften Hühnern verringerte Körpergewichte und eine deutlich schlechtere Futterverwertung. In der eigenen Studie zeigten sich signifikant massivere NE-Läsionen in der ungeimpften Gruppe verglichen mit allen anderen Gruppen. So vermeidet die Impfung nicht nur die Kokzidiose, wie bereits von SHIRLEY et al. (1995) und WILLIAMS (2003) nachgewiesen, sondern auch die klinische NE. TSIOURIS et al. (2013) haben ein Modell der subklinischen NE für die Prüfung der Effizienz einer Kokzidienvakzine eingesetzt. Sie haben gezeigt, dass die Läsionen im Darm und in der Leber geringer in der geimpften und infizierten Gruppe als in den ungeimpften infizierten Tieren waren. TSIOURIS et al. (2013) wiesen eine reduzierte Zahl von C. perfringens und niedrigere pH-Werte im Darm nach der Impfung nach, was die geringen Läsionen durch NE erklärte. Hohe Anzahlen von NetB-Toxin-positiven C. perfringens-Kolonien konnten in den eigenen Versuchen lediglich in den nicht vakzinierten und mit Kokzidien belasteten Tieren (V-/E+C+ am 40. LT) nachgewiesen werden. Diese Gruppe zeigte auch die meisten signifikanten Veränderungen bei den Messwerten für die Zytokin-mRNA-Expression (IFN-γ, IL-10 und IL-12). Im Allgemeinen waren die Zytokinspiegel in den geimpften Hühnern niedriger. Dies kann als Folge der reduzierten 92 Diskussion Besiedlung mit C. perfringens und Eimerien betrachtet werden. In dieser Studie wurde die Expression der Zytokine der Th1-abhängigen Immunantwort (IFN- γ, IL-2 und IL-12) oder Th2-abhängigen Immunreaktion (IL-10) anhand der mRNA gemessen. IL-10 führt zur Aktivierung von B Zellen und hemmt die Entzündung (CAO et al. 2010). Die Zytokine IFN- γ, IL-12 und IL-10 der geimpften Gruppe wurden teilweise hochreguliert, für IFN-γ war dies signifikant. Letzteres entspricht Ergebnissen von ROTHWELL et al. (2000) und ist wahrscheinlich auf CD4+-Zellen zurückzuführen. Erwartungsgemäß waren Serum-Antikörperspiegel gegen E. tenella infolge der Primärinfektion in den geimpften Gruppen signifikant höher als in den ungeimpften Gruppen. In den letzen Jahren wurden Toxoid-Vakzinen gegen C. perfringens getestet, aber sie haben nur eine teilweise oder keine Wirkung gezeigt (JANG et al. 2012; KEYBURN et al. 2013; MOT et al. 2013). Die Vakzinierung gegen Kokzidiose ist dagegen eine übliche Maßnahme, sie ist einfach zu applizieren und es besteht keine Gefahr einer Resistenz. Berichte aus dem Feld zeigten, dass die Impfung auch zu einer Verringerung der Resistenzproblematik gegen Antikokzidia beitragen kann. Die Vakzinierung gegen Kokzidien schützt gegen subklinische NE, wie TSIOURIS et al. (2013) gezeigt haben, und auch klinische NE kann deutlich verringert werden, wie in der eigenen Studie gezeigt wurde. 5.4 Koinfektion von Bruteiern mit Eimerien und Clostridien (In-ovo-Versuch) Wie oben beschrieben wurde, fördern Eimerien die Vermehrung von C. perfringens und damit die Entstehung der NE. Alternativen zum Tiermodell wären für weitere Studien sehr zu begrüßen. Darum wurde die Ko-Infektion mit beiden Erregern auch in ovo untersucht. Die Sporozoiten invadieren die CAM, in der sich asexuelle und sexuelle Stadien entwickeln und zur Zerstörung der Epithelzellen führen (JANG et al., 2013). Die Vermehrung der Eimerien bereitet offenbar auch in ovo das Milieu für C. perfringens, was zu einer vermehrten Toxinbildung und dem Absterben des Embryos führt. Die Eimerienstadien zerstören Zellen der CAM und steigen so ihre Durchlässigkeit. Aus den zerstörten Zellen freigesetzte Proteine stellen eine Nährsubstanz für C. perfringens dar, was das weitere Wachstum des Bakteriums fördert. Die CAM wurde vorher als Modell für aerobe Bakterien wie E. coli und Salmonellen beschrieben (ADAM et al. 2012), aber nicht für anerobe Bakterien. In dieser Arbeit wurde ein In–ovo-Modell durch Einsatz von E. tenella und C. perfringens als Alternative zum Tierversuch entwickelt, da die Kultivierung von Eimerien in embryonierten Eiern besser gelingt als in der Zellkultur. Die Mortalität der Embryos und die Stärke der Läsionen waren höher in der ko-infizierten Gruppe im Vergleich zu mit E. tenella oder C. perfringens monoinfizierten Gruppen. Massive makroskopische und mikroskopische Läsionen wurden in der koinfizierten Gruppe 93 Diskussion nachgewiesen, außerdem wurden in der Allantoisflüssigkeit C. perfringens-Kolonien festgestellt. Das zeigte eine offensichtliche Wechselwirkung zwischen beiden Erregern in ovo, analog zu den Bebachtungen im In-vivo-Modell (VAN IMMERSSEL et al. 2009). In histologischen Präparaten konnten Merozoiten und andere Stadien dort gesehen werden, wo makroskopisch weiße Herde festgestellt wurden (HAFEEZ et al., 2006). Durch qPCR wurde die Zahl der Gen-Kopien von E. tenella untersucht, die in den ko-infizierten Gruppen höher war. Die histologischen Präparate zeigten, dass sich C. perfringens auf der CAM ansiedelt und bei Koinfektionen mit E. tenella kam es zur Vermehrung von C. perfringens, erhöhter Toxinausschüttung und anschließender Nekrose der CAM. Die Toxine führen nicht nur in der CAM, sondern auch im Embryo zu Nekrosen, wie im Vorversuch festgestellt wurde. Wenn die embryonierten Eier mit 107 KBE/ml infiziert wurden, waren die Nekrosen massiver als bei Infektionen mit 106 oder 105 KBE/ml. Dieses Modell kann weiterführend für Untersuchungen zur Pathogenese und Interaktion beider Erreger eingesetzt werden. 94 Schlussfolgerung 6 Schlussfolgerung Die Ergebnisse belegen deutlich, dass Hühnereimerieninfektionen die Nekrotische Enteritis des Huhnes induzieren können, Obwohl andere prädisponierende Faktoren einen Einfluss bei der Entstehung der NE besitzen, ist die Kokzidiose bedeutsam. Eimerien führen zur Zerstörung der Darmepithelzellen und ermöglichen es den Clostridien, sich verstärkt zu vermehren. C. perfringens verstärkt E. tenella und E. brunetti –bedingte Läsionen, die Mechanismen sind aber noch nicht bekannt. Eventuell stellt das herabregulierte IFN-γ nach der Ko-Infektion einen wesentlichen Aspekt dar, oder verschiedene Faktoren greifen ineinander. Unabhängig vom Zeitpunkt der C. perfringens-Infektion (vor oder nach der EimerienInfektion) kommt es bei Ko-Infektionen beider Erreger zur Entstehung einer NE, wobei die spätere C. perfringens-Infektion zuverlässiger als experimentelles Infektionsmodell der klinischen NE ist. Toltrazuril ist eines der derzeit wirksamsten Antikokzidia und besitzt in hoher Dosierung in vitro auch einen direkten Effekt gegen C. perfringens. Die Behandlung der Kokzidiose sollte am 15.-18. LT bzw. zum vermuteten Infektionszeitpunkt erfolgen, den die Tierärzte vor Ort im Allgemeinen der Betriebshistorie entnehmen können. Der optimale Behandlungszeitpunkt ist zur Minimierung der wirtschaftlichen Verluste zu beachten. Die gegen Kokzidiose geimpften Hühner zeigten weniger mit NE assoziierte Läsionen und Mortalität. In Deutschland werden Legehennen und Broiler ggf. am 1. LT gegen Kokzidiose geimpft. Dies führt nicht nur zur Bekämpfung der Kokzidien, sondern wirkt auch der NE entgegen. Die eigenen Ergebnisse legen dabei besonders den Einsatz der Impfung gegen NE in Legehennenhaltungen nahe, um die Vorteile durch die Immunisierung nutzen zu können (kurze Standzeit in der Broilermast). Die Bekämpfung der prädisponierenden Faktoren ist aktuell die beste Methode, um Hühner gegen NE zu schützen. Die Anwendung von attenuierten Lebendvakzinen gegen Eimerien wirkt der NE entgegen. Der Einsatz von Antikokzidia schützt ebenfalls vor NE, allerdings gibt es Anwendungsbeschränkungen (Legehennen) und es ist nicht sicher, wie sich die Zulassungssituation entwickeln wird. So sollte der Fokus in Zukunft darauf liegen, über Maßnahmen wie eine gezielte Entwicklung optimierter Impfstoffe oder verbesserte Herdenmanagement die Problematik beider Erreger besser in dem Griff zu bekommen. 95 Zusammenfassung 7 Zusammenfassung Alaa Aldin Alnassan Kokzidien und Clostridium perfringens: Studien an Koinfektionsmodellen zur Induktion und Bekämpfung der Nekrotischen Enteritis beim Huhn Institut für Parasitologie, Zentrum für Infektionsmedizin der Veterinärmedizinischen Fakultät der Universität Leipzig 99 Seiten, 20 Tabellen, 29 Abbildungen, 205 Literaturstellen, Eingereicht im Mai.2015 Schlüsselwörter: Nekrotische Enteritis, Hühner, Kokzidiose, Clostridium perfringens, Eimerien, Zytokine. Einleitung: Die nekrotische Enteritis (NE) und Kokzidiose des Huhnes sind schwere Darmerkrankungen und führen zu hohen wirtschaftlichen Verlusten. Das Risiko des Auftretens der NE ist in den letzten Jahren gestiegen, weil die leistungsfördernden Antibiotika seit 2006 im Geflügelfutter nicht mehr eingesetzt werden dürfen. Die Kokzidiose ist ein prädisponierender Faktor zur Induktion der NE beim Geflügel. Der Befall mit Kokzidien führt zur vermehrten Mukusbildung, Zerstörung des Epithels und Proteineinstrom in das Darmlumen Protein. Dies stellt eine günstige Umgebung zum Wachstum von C. perfringens dar. Ko-Infektionen von Hühnereimerien und C. perfringens wurden in verschiedenen Modellen untersucht. Ziel der Arbeit: - Die Modelle zur Induktion der NE durch Kokzidien sollten variiert werden, um optimale Versuchsbedingungen zu erhalten. - Gegen Kokzidiose gebräuchliche Bekämpfungsoptionen (Behandlung mit Toltrazuril und Impfung) sollten auf ihre Auswirkungen im NE-Modell untersucht werden. - Ein in ovo-Modell für die NE sollte als Alternative zum Tierversuch zu etabliert werden. Material und Methoden: In dieser Arbeit wurden In–vivo-Modelle der NE eingesetzt, indem Hühner zusätzlich zu Clostridien mit verschiedenen Eimerienarten infiziert wurden. Nach der Etablierung zweier NEModelle (E. acervulina/ E. maxima und E. tenella/ E. brunetti) wurde Toltrazuril zu verschiedenen Zeitpunkten vor und nach der Eimerien-Infektion (12h vor und 12, 36, 60 und 84 h nach) oder Paracox 8® am ersten Lebenstag appliziert, um die Eignung dieser Maßnahmen zur Bekämpfung der experimentellen NE zu untersuchen. Darmläsionen, Körpergewicht, Futteraufnahme, C. perfringens-Wachstum und Oozysten-Ausscheidung wurden als Bewertungskriterien gewählt. Außerdem wurde die Immunreaktion nach den Infektionen in Form der Zytokin-mRNA-Expression in Darm und Milz durch RT-PCR und IgY untersucht. 96 Zusammenfassung Ergebnisse: Die Ergebnisse zeigen, dass die Ko-Infektion mit Eimerien und Clostridien zu massiven NEtypischen Läsionen führte. Die Läsionen waren besonders stark (p < 0,05 verglichen mit der Negativkontrolle und mit C. perfringens monoinfizierten Tieren), wenn C. perfringens 4 Tage nach E. tenella und E. brunetti inokuliert wurde. Das spiegelte sich auch in der Körpergewichtsentwicklung und Futteraufnahme wider. Die Futterverwertung (FCR) lag in der ko-infizierten Gruppe bei 3,57 verglichen mit 2,26 in der Negativkontrollgruppe. IFN-γ war signifikant hochreguliert in den mit Eimerien infizierten Gruppen und in der mit Eimerien monoinfizierten Gruppe höher als in den ko-infizierten Gruppen. Die Ko-Infektion mit Dünndarm-Kokzidien (E. acervulina/ E. maxima) und Clostridien verursachte ebenfalls NE, allerdings in deutlich schwächerer Ausprägung. In dem folgenden Versuchen wurde daher das NE-Modell unter Verwendung der Dickdarmkokzidien eingesetzt. Im Toltrazurilbehandlungsversuch zeigte die unbehandelte, infizierte Gruppe massive Kokzidiose- und NE-typische Läsionen (Mittelwert = 3,67, p < 0,05 im Vergleich zu den früh behandelten Gruppen: 12 h vor bis 36 h nach der Eimerien-Infektion). Während die früh behandelten Gruppen keine NE aufwiesen hatten. Die spät behandelten Gruppen (Behandlung nach 60 und 84 h) wiesen zwar NE-Läsionen auf, die aber weniger stark ausgeprägt waren als in der unbehandelten Kontrolle (Mittelwert = 1,17). Avidin als Akute-Phase-Protein war in der unbehandelten, infizierten Gruppe signifikant erhöht (ca. 200 ng/ml; p < 0,05). Das reflektiert den starken Entzündungsverlauf bei dieser Gruppe im Vergleich zu den infizierten aber behandelten Gruppen. Nach der experimentellen Belastungsinfektion mit Kokzidien war die Oozysten-Ausscheidung in der ungeimpften Gruppe signifikant höher als in den geimpften Gruppen (p < 0,01). Die Futterverwertung lag in der infizierten, ungeimpften Gruppe bei 3,83 und war damit ungünstiger als in der geimpften, infizierten Gruppe (2,77) und in der Negativkontrolle (2,32). Im Vakzineversuch wies die infizierte, ungeimpfte Gruppe signifikant massiver NE-Läsionen (Median = 3) als die geimpfte, infizierte Gruppe (Median = 1,5) auf. IFN-γ und IL-12-Expression waren im Darm nur in der infizierten, ungeimpften Gruppe signifikant erhöht (p < 0,05). In embryonierten Hühnereiern führte die Ko-Infektion mit E. tenella und C. perfringens zur höheren embryonalen Mortalität und massiveren Läsionen in Embryos und Chorioallantoismembran (CAM) im Vergleich zu mit E. tenella oder C. perfringens monoinfizierten Eiern (p < 0,01). Schlussfolgerung: Der Einsatz von E. tenella und E. brunetti ist besser geeignet zur Induktion der NE als die KoInfektion von Clostridium mit Dünndarmkokzidien (E. acervulina und E. maxima). Daher wird die Dickdarmkokzidiose in Kombination mit C. perfringens als experimentelles Modell zur Untersuchung der NE empfohlen. Der Einsatz von Toltrazuril um den vermutlichen Zeitpunkt der Eimerien-Infektion kann zur Reduzierung des Auftretens der NE und Vermeidung von wirtschaftlichen Verlusten führen. Weil die NE bei Legehennen häufig zwischen der 5. und 7. Lebenswoche auftritt, kann die Anwendung von Paracox 8® in der Legehennenaufzucht eine Verringerung der NE bewirken. Solange keine kommerzielle Vakzine gegen die NE entwickelt wurden, ist die Ausschaltung der prädisponierenden Faktoren und vor allem der Kokzidiose eine wichtige Maßnahme zur Kontrolle der NE. 97 Summary 8 Summary Alaa Aldin Alnassan Coccidia and Clostridium perfringens: Studies using co-infection models for induction and control of chicken necrotic enteritis Institute of Parasitology, Center of Infectious Diseases, Faculty of Veterinary Medicine, Leipzig University 99 pages, 29 figures, 20 tables, 205 references, submitted in May.2015 Keywords: Necrotic enteritis, chickens, coccidiosis, Clostridium perfringens, Eimeria, cytokines. Introduction: Coccidiosis and necrotic enteritis (NE) in chicken are considered severe intestinal diseases causing very high economic losses. Prevalence of NE has increased during the recent years, because antibiotic growth promoters are no longer allowed in poultry feed since 2006 in the EU. Coccidiosis is a predisposing factor for induction of NE in poultry; it destructs intestinal epithelial cells, increases mucus production and protein leakage. This forms a suitable environment for the growth of C. perfringens. The pathogenesis of NE in cases of coinfection between Eimeria spp. and C. perfringens is not completely clarified so far. In this project pathogenesis of NE was studied using different models of co-infection. Objectives of this project: - to compare two models to induce NE experimentally at various time points in order to define optimal experimental conditions. - to investigate the efficacy of an attenuated coccidial live vaccine (Paracox 8®) or toltrazuril (Baycox®), in their ability to protect against NE in cases of co-infection between coccidia and clostridia. - to develop an in ovo model that can be used as alternative to chicken experimentation on NE. Materials and methods: In this work, in vivo models to induce NE were used. Chickens were infected with C. perfringens different Eimeria spp. After the establishment of tow suitable in vivo models (E. acervulina/ E. maxima and E. tenella/ E. brunetti), the effect of toltrazuril on NE was studied. Toltrazuril was applied at different time points before and after infection with Eimeria (12 h before, or 12, 36, 60 and 84 h after infection). The effect of Paracox8® against experimental NE infection was studied, after immunisation of one day old chicks. In both trials, efficacy parameters were intestinal lesions, body weight, feed intake, number of intestinal C. perfringens colonies and oocyst excretion. Additionally, immune response after the infection was investigated by assessment of expression of cytokines in the colon and spleen using RTPCR and IgY. 98 Summary Results: Our results showed that co-infection with Eimeria and clostridia led to massive lesions typical for NE. The lesions were significantly more severe (P < 0.05) in cases when C. perfringens infection was set 4 days after infection with E. tenella and E. brunetti, which led to differences in body weight and feed intake; the feed conversion ratio (FCR) was 3.57 in coinfected groups (late infection with C. perfringens compared with 2.26 in the uninfected negative control. IFN-γ was significantly upregulated in the groups infected with Eimeria. However, it was lower in the co-infected group compared with only Eimeria infected chickens. Co-infection of clostridia and coccidia of the small intestine (E. acervulina/ E. maxima) also induced NE, however less regularly and less intensive. In the following experiments the NE model of clostridia and large bowel coccidia (E. tenella/ E. brunetti) was use. In the toltrazuril treatment experiment, the untreated and infected group showed significantly more severe lesions of coccidiosis and NE (mean = 3.67; p <0.05) in comparison with the early treated groups (12 h before, or 12 to 36 h after Eimeria infection). No NE lesions were seen in the latter groups. Later treatment (60 and 84 h after Eimeria infection) resulted in lesions that were, however, less severe (mean 1.17) than the untreated controls. Avidin, an acute phase protein, was significantly higher in the infected-untreated group compared to other groups, which reflect the severity of the inflammation process in this group compared to the treated infected groups. Vaccination with Paracox 8® led to development of immunity and diminished oocyst excretion from the 26th day of life onwards. After experimental challenge infection, oocyst excretion was significantly higher in the non-vaccinated group (P < 0.01). In addition, feed conversion ratio was 3.83 in the nonvaccinated-infected group compared with 2.77 and 2.32 in vaccinated-infected animals and the uninfected negative control, respectively. Nonvaccinated-infected group showed significant NE lesions (median = 3) compared with moderate lesions (median = 1.5) in the vaccinated-infected group. Intestinal IFN-γ and IL-12 expression were significantly elevated in the nonvaccinated-infected group (p <0.05 compared to negative control).The co-infection of embryonated eggs by E. tenella and C. perfringens caused high mortality rate of embryos and severe lesions in the chorioallantoic membrane (CAM). The lesions in the CAM were significantly more massive in the co-infected group compared to groups mono-infected with E. tenella or C. perfringens (p < 0.01). Conclusion: It is concluded that the use of E. tenella and E. brunetti as predisposing factors is advantageous to induce NE compared to the use of other Eimeria spp. Therefore, this Eimeria spp. in combination with C. perfringens are proposed as experimental model to study NE in chickens. Application of toltrazuril around the assumed time point of the coccidial infection can lead to reduction of the occurrence of NE and prevent economic losses in the field. In laying hens, incidence of NE is often high between the 5th and 7th week of age. Therefore, Paracox 8® can be used to reduce cases of NE especially in laying hens. Up to now, there is no commercially available vaccine against NE in Germany, thus combating predisposing factors is the best control option of chicken NE in the very moment. 99 Literaturverzeichnis 9 Literaturverzeichnis Abu-Akkada SS, Awad AM. Isolation, propagation, identification and comparative pathogenicity of five Egyptian field strains of Eimeria tenella from broiler chickens in five different provinces in Egypt. Res Vet Sci. 2012;92(1):92-95. Adams BY, Vahl HA, Veldman A. Interaction between nutrition and E. acervulina infection in broilers chickens: diet composition that improve fat digestion during E.acervulina infection.Br J Nutr. 1996;75(6): 875-880. Al-Gawad AA, Mahdy OA, El-Massry AA, Al-Aziz SA. Studies on Coccidia of Egyptian Balady Breed Chickens. Life Sci J. 2012;9(3):568-576. Akhtar M, Hafeez MA, Haq AU. Immunity agains coccidiosis in poultry- A review. Int Poult Sci J. 2005;4(10):812-817. Doi: 10.3923/ijps.2005.812-817· Arakawa A, Baba E, Fukata T. Eimeria tenella infection enhances Salmonella typhimurium infection in chickens. Poult Sci. 1981;60(10):2203-2209. Al-Sheikhly F, Al-Saieg A. Role of Coccidia in the occurrence of necrotic enteritis of chickens. Avian Dis. 1980;24(2):324-333. Al-Sheikhly F, Truscott RB. The Pathology of Necrotic Enteritis of Chickens Following Infusion of Crude Toxins of Clostridium perfringens into the Duodenum. Avian Dis. 1977; 21(2):241-255. Apajalahti J, Kettunen A. Microbes of the chicken gastrointestinal tract. In: Perry GC. Avian Gut Function in Health and Disease. 28. Aufl. Nosworthy:Wallingford; 2006. p. 124-137. Baba E, Fuller AL, Gilbert JM, Thayer SG, McDougald LR. Effects of Eimeria brunetti infection and dietary zinc on experimental induction of necrotic enteritis in broiler chickens. Avian Dis.2010;36(1):59-62. Baba E, Ikemoto T, Fukata T, Sasai K, Arakawa A, McDougald LR. Clostridial population and the intestinal lesions in chickens infected with Clostridium perfringens and Eimeria necatrix. Vet Microbiol. 1997;54(3-4):301-308. Balauca N. Experimental reproduction of necrotic enteritis in the chicken. 1. Mono- and polyinfections with Clostridium perfringens and coccidia with reference to cage managemen. Arch Exp Vet. 1976;30(6):903-912. Balauca N, Köhler B, Horsch F, Jungmann R, Prusas E. Experimental reproduction of necrotic enteritis in the chicken. 2. Further mono- and polyinfections with C. perfringens and coccidia with special reference to ground-kept chickens. Arch Exp Vet. 1976;30(6):913-923. Befus AD, Johnston N, Leslie GA, Bienenstock J. Gut-associated lymphoid tissue in the chicken. I. Morphology, ontogeny, and some functional characteristics of Peyer’s patches. Immuno J. 1980;125(6):2626-2632. 100 Literaturverzeichnis Biggs PM, Long PL, Kenzy SG. Investigations into the association between Marek’s disease and coccidiosis. Acta Vet. 1969;38:65-75. Blake DP, Qin Z, Cai J, Smith AL. Development and validation of real-time polymerase chain reaction assays specific to four species of Eimeria. Avian Pathol. 2008;37(1):89-94 Branton SL, Reece FN, Hagler WM. Influence of a wheat diet on mortality of broiler chickens associated with necrotic enteritis. Poult Sci. 1987;66(8):1326-1330. Cacho DE, Gallego M, Lee SH, Lillehoj HS, Quilez J, Lillehoj EP, Sánchez AC. Induction of protective immunity against Eimeria tenella, Eimeria maxima, and Eimeria acervulina infections using dendritic cell-derived exosomes. Infect Immun. 2012;80(5):1909-1916. Cacho DE, Gallego M, Lillehoj HS, Quilez J, Lillehoj EP, Sánchez AC. Tetraspanin-3 regulates protective immunity against Eimeria tenella infection following immunization with dendritic cell-derived exosomes. Vaccine. 2013;31(41):4668-4674. Calefi AS, Fonseca JG, Costola-de-Souza C, Cohn DW, Honda BT, Quinteiro-Filho WM, Tsugiyama LE, Piantino-Ferreira AJ, Palermo-Neto J. 169. Heat stress and avian necrotic enteritis modulates c-fos activation in the brain: A brain-gut axis approach. Brain Behav Immun. 2014a;40:e49. Calefi AS, Honda BT, Costola-de-Souza C, de Siqueira A, Namazu LB, Quinteiro-Filho WM, Fonseca JG, Aloia TP, Piantino-Ferreira AJ, Palermo-Neto J. Effects of long-term heat stress in an experimental model of avian necrotic enteritis. Poult Sci. 2014b;93(6):1344-1353. Cao L, Yang XJ, Li ZJ, Sun FF, Wu XH, Yao JH. Erratum to “Reduced lesions in chickens with Clostridium perfringens-induced necrotic enteritis by Lactobacillus fermentum. Poult Sci. 2013;92(12):3065-71. Castanon CAB, Fraga JS, Fernandez S, Gruber A, Costa LF. Biological shape characterization for automatic image recognition and diagnosis of protozoan parasites of the genus Eimeria. Pattern Recogn. 2007; 40(7):1899-1910. Chai JY, Lee SH, Kim WH, Yun CK. Development of Eimeria tenella in MDBK cell culture with a note on enhancing effect of preincubation with chicken spleen cells. Korean J Parasitol. 1989;27(2):87-100. Chalmers G, Martin SW, Hunter DB, Prescott JF, Weber LJ, Boerlin P. Genetic diversity of Clostridium perfringens isolated from healthy broiler chickens at a commercial farm. Vet Microbiol. 2008;127:116-27. Chapman HD. Origins of coccidiosis research in the fowl-the first fifty years. Avian Dis. 2003;47(1):1-20. Chapman HD. Rotation programmes for coccidiosis control. Int Poult Product. 2011;15(1):79. Collier CT, Hofacre CL, Payne AM, Anderson DB, Kaiser P, Mackie RI, Gaskins HR. Coccidia-induced mucogenesis promotes the onset of necrotic enteritis by supporting Clostridium perfringens growth. Vet Immunol Immunopthol. 2008;122(1-2):104-115. 101 Literaturverzeichnis Conway DP, Mckenzie ME. Poultry Coccidiosis Diagnostic and Testing Procedures. 3. Aufl Iowa: Blackwell Publishing Professional; 2007: p. 1-30. Cooper KK, Songer JG. Necrotic enteritis in chickens: a paradigm of enteric infection by Clostridium perfringens type A. Anaerobe. 2009;15(1-2):55-60. Cooper KK, Songer JG. Virulence of Clostridium perfringens in an experimental model of poultry necrotic enteritis. Vet Microbiol. 2010;142(3-4):323-328. Coursodon CF, Glock RD, Moore KL, Cooper KK, Songer JG. TpeL-producing strains of Clostridium perfringens type A are highly virulent for broiler chicks. Anaerobe. 2012;18(1):117-21. Cowen BS, Schwartz LD, Wilson RA, Ambrus SI. Experimentally induced necrotic enteritis in chickens. Avian Dis. 1987;31(4):972-976. Crane MS, Murray PK, Gnozzio MJ, MacDonald TT. Passive protection of chickens against Eimeria tenella infection by monoclonal antibody. Infect Immun. 1988;56(4):972-976. Crouch CF, Andrews SJ, Ward RG, Francis MJ. Protective efficacy of a live attenuated anticoccidial vaccine administered to 1-day-old chickens. Avian Pathol. 2003;32(3):297-304. Crouch CF, Withanage GS, De Haas V, Etore F, Francis MJ. Safety and efficacy of a maternal vaccine for the passive protection of broiler chicks against necrotic enteritis. Avian Pathol. 2010;39(6):489-497. Dalloul RA, Lillehoj HS. Recent advances in immunomodulation and vaccination strategies against coccidiosis. Avian Dis. 2005;49(1):1-8. Dalloul RA, Lillehoj HS. Poultry coccidiosis: recent advancements in control measures and vaccine development. Expert Rev Vaccines. 2006;5(1):143-163. Dhillon AS, Roy P, Lauerman L, Schaberg D, Weber S, Bandli D, Wier F. High mortality in egg layers as a result of necrotic enteritis. Avian Dis. 2004;48(3):675-680. Daugschies A. Parasitosen des Nutzgeflügels. In Schnieder T. Veterinärmedizinische Parasitologie. Aufl. 6. Stuttgart; 2006. p. 576-599. Edgar SA, Seibold CT. A New Coccidium of chickens Eimeria mivati spp. (Protozoa:Eimeriidae) with details of its life history. J Parasitol. 1964;50:193-204. Elo HA, Korpela J. The occurrence and production of avidin: a new conception of the highaffinity biotin-binding protein. Comp Biochem Physiol B. 1984;78(1):15-20. Elwinger K, Engstrom B, Fossum SH. Effect of coccidiostats on necrotic enteritis and performance in broiler chickens. Swed J Agricult Res. 1994;24(1):39-44. Engberg RM, Hedemann MS, Leser TD, Jensen BB. Effect of zinc bacitracin and salinomycin on intestinal microflora and performance of broilers. Poult Sci. 2000;79(9):1311-1319. 102 Literaturverzeichnis Fei C, Fan C, Zhao Q, Lin Y, Wang X, Zheng W, Wang M. Anticoccidial effects of a novel triazine nitromezuril in broiler chickens. Vet Parasitol. 2013;198(1-2):39-44. Gad W, R Hauck, M Krüger and HM Hafez. Determination of antibiotic sensitivities of Clostridium perfringens isolates from commercial turkeys in Germany in vitro. Arch Geflügelk. 2011;75(2): 80-83. Gholamiandehkordi AR, Timbermont L, Lanckriet A, Van Den Broeck W, Pedersen K, Dewulf J, Pasmans F. Quantification of gut lesions in a subclinical necrotic enteritis model. Avian Pathol. 2007;36(5):375-382. Girard F, Fort G, Yvoré P, Quéré P. Kinetics of specific immunoglobulin A, M and G production in the duodenal and caecal mucosa of chickens infected with Eimeria acervulina or Eimeria tenella. Int J Parasitol. 1997;27(7):803-809. Golder HM, Geier MS, Forder RE, Hynd PI, Hughes RJ. Effects of necrotic enteritis challenge on intestinal micro-architecture and mucin profile. Br Poult Sci. 2011;52(4):500506. Groux H, Powrie F. Regulatory T cells and inflammatory bowel disease. Immunol Today. 1999;20(10):442-445. Gubash SM. Clostridium perfingens and streptococcal CAMP factor in presumptive streptococcal grouping. J Clin Microbiol. 1978;8:480-88. Gussem MD. Coccidiosis in poultry: review on diagnosis , control , prevention and interaction with overall gut health. 16th European Symposium on Poultry Nutrition. 2006. p. 253-261. Györke A, Pop L, Cozma V. Prevalence and distribution of Eimeria species in broiler chicken farms of different capacities. Parasite. 2013;20(50):1-8. Haberkorn A. Chemotherapy of human and animal coccidioses: state and perspectives. Parasitol Res. 1996;82(3):193-199. Hadipour MM, Olyaie A, Naderi M, Azad F, Nekouie O. Prevalence of Eimeria species in scavenging native chickens of Shiraz, Iran. Afr J Poult Farm. 2013;5(20):3296-3299. Hafez H. Poultry coccidiosis: Prevention and control approaches. Arch Geflügelk. 2008;72(1):2-7. Hale ML, Stiles BG. Detection of Clostridium perfringens alpha toxin using a capture antibody ELISA. Toxicon. 1999;37(3):471-484. Hamidinejat H, Shapouri MS, Mayahi M, Borujeni MP. Characterization of Eimeria Species in Commercial Broilers by PCR Based on ITS1 Regions of rDNA. Iran J Parasitol. 2010;5(4):48-54. Hegde KS, Reid WM, Johnson J, Womack HE. Pathogenicity of Eimeria brunetti in bacteriafree and conventional chickens. J Parasitol. 1969;55(2):502-5. 103 Literaturverzeichnis Hein H. Pathogenic effects of Eimeria necatrix in young chickens. Exp Parasitol. 1971;30(3):321-330. Helmboldt CF, Bryant ES. The pathology of necrotic enteritis in domestic fowl. Avian Dis. 1971;15(4):775-780. Hibberd MC, Neumann AP, Rehberger TG, Siragusa GR. Multilocus sequence typing subtypes of poultry Clostridium perfringens isolates demonstrate disease niche partitioning. J Clin Microbiol. 2011;49(4):1556-1567. Hinz KH. Nekrotisierende Enteritis. In: Kompendium der Geflügelkrankheiten. 6. Aufl; 2005.p. 252-256. Hong YH, Lillehoj HS, Lee SH, Dalloul RA, Lillehoj EP. Analysis of chicken cytokine and chemokine gene expression following Eimeria acervulina and Eimeria tenella infections. Vet Immunol Immunopathol. 2006;114(3-4):209-223. Hundorfean G, Neurath MF, Mudter J. Functional relevance of T helper 17 (Th17) cells and the IL-17 cytokine family in inflammatory bowel disease. Inflammat Bowel Dis. 2012;18(1):180-186. Islam MN, Rashid SM , Juli MS, Hoque MF, Akter MR. Necrotic enteritis in chickens: pathological, bacteriological and therapeutical investigation. Int J Sustain Crop Prod. 2009;4(3):1-7. Jang SI, Lillehoj HS, Lee SH, Kim DK, Pagés M, Hong YH, Min W. Distinct immunoregulatory properties of macrophage migration inhibitory factors encoded by Eimeria parasites and their chicken host. Vaccine. 2011;29(48):8998-9004. Jang SI, Lillehoj HS, Lee SH, Lee KW, Lillehoj EP, Hong YH, An DJ, Jeong W, Chun JE, Bertrand F, Dupuis L, Deville S, Arous JB. Vaccination with Clostridium perfringens recombinant proteins in combination with MontanideTM ISA 71 VG adjuvant increases protection against experimental necrotic enteritis in commercial broiler chickens. Vaccine.2012;30(36):5401-406. Jenkins MC. Progress on developing a recombinant coccidiosis vaccine. Int J Parasitol. 1998;28(7):1111-1119. Jiang L, Zhao Q, Zhu S, Han H, Dong H, Huang B. Establishment of Eimeria tenella (local isolate) in chicken embryos. Parasite.2012;19(3):285-289. Jiang Y, Kulkarni RR, Parreira VR, Prescott JF. Immunization of broiler chickens against Clostridium perfringens-induced necrotic enteritis using purified recombinant immunogenic proteins. Avian Dis. 2009;53(3):409-415. Johansson A, Aspán A, Kaldhusdal M, Engström BE. Genetic diversity and prevalence of netB in Clostridium perfringens isolated from a broiler flock affected by mild necrotic enteritis. Vet Microbiol. 2010;144:87-92. Johnson J, Reid WM. Anticoccidial drugs: lesion scoring techniques in battery and floor-pen experiments with chickens. Exp Parasitol. 1970;28:30-36. 104 Literaturverzeichnis Johansson A. Clostridium perfringens the causal agent of necrotic enteritis in poultry [Dissertation. med. vet]. Uppsala: Univ.Swedish; 2006. Jordan F. Poultry Diseases. 6.Aufl. Joyce Rodenhuis: Elsevier; 2008. Kaldhusdal M, Hofshagen M. Barley inclusion and avoparcin supplementation in broiler diets. 2. Clinical, pathological, and bacteriological findings in a mild form of necrotic enteritis. Poult Sci. 1992;71:11(7)45-53. Kaldhusdal M, Hofshagen M, Løvland A, Langstrand H, Redhead K. Necrotic enteritis challenge models with broiler chickens raised on litter: evaluation of preconditions, Clostridium perfringens strains and outcome variables. Fems Immunol Med Microbiol. 1999;24(3):337-343. Kaldhusdal M. Clostridial Necrotic Enteritis and Cholangiohepatitis [Dissertation. med. vet]. Norway: Univ. Norwegian School of Veterinary Science; 2002. Kaldhusdal M, Skjerve E. Association between Cereal Contents in the Diet and Incidence of Necrotic Enteritis in Broiler Chickens in Norway. Prevent Vet Med. 1996;28(1):1-16. Keyburn AL, Sheedy SA, Ford ME, Williamson MM, Awad MM, Rood JI, Moore RJ. AlphaToxin of Clostridium perfringens Is Not an Essential Virulence Factor in Necrotic Enteritis in Chickens. Infect Immun. 2006;74(11):6496-6500. Keyburn AL, Boyce JD, Vaz P, Bannam TL, Ford ME, Parker D, Di Rubbo A. NetB, a new toxin that is associated with avian necrotic enteritis caused by Clostridium perfringens. PLoS Pathog. 2008;4(2):e26. 10.1371/journal.ppat.0040026. Keyburn AL, Bannam TL, Moore RJ, Rood JI. NetB, a pore-forming toxin from necrotic enteritis strains of Clostridium perfringens. Toxins. 2010a;2(7):1913-1927. Keyburn AL, Yan XX, Bannam TL, Van Immerseel F, Rood JI, Moore RJ. Association between avian necrotic enteritis and Clostridium perfringens strains expressing NetB toxin. Vet Res. 2010b;41(2):21. Kim CH, Lillehoj HS, Bliss TW, Keeler CL, Hong YH, Park DW, Yamage M, Min W, Lillehoj EP. Construction and application of an avian intestinal intraepithelial lymphocyte cDNA microarray (AVIELA) for gene expression profiling during Eimeria maxima infection. Vet Immunol Immunopathol. 2008;124(3-4):341-354. Kmet V, Stachov M, Nemcov R, Jonecov Z, Lauk A. The interaction of intestinal microflora with avian enteric pathogens. Acta Vet. 1993;62(6):87-89. Köhler B, Marx G, Kolbach S, Bottcher E. Untersuchungen zur nekrotischen Enteritis der Hühner. I. Mitt.: Diagnostik und Bekämpfung.; Studies on necrotic enteritis of fowl. I. Diagnosis and control. Monatsh Vet Med. 1974;29:385-391. Kulkarni RR, Parreira VR, Sharif S, Prescott JF. Immunization of broiler chickens against Clostridium perfringens-induced necrotic enteritis. Clin Vaccine Immunol. 2007;14(9):10707. 105 Literaturverzeichnis Lanckriet A, Timbermont L, Eeckhaut V, Haesebrouck F, Ducatelle R, Van Immerseel F. Variable protection after vaccination of broiler chickens against necrotic enteritis using supernatants of different Clostridium perfringens strains. Vaccine. 2010;28(36):5920-5923. Laurent F, Mancassola R, Lacroix S, Menezes R, Naciri M. Analysis of chicken mucosal immune response to Eimeria tenella and Eimeria maxima infection by quantitative reverse transcription-PCR. Infect Immun. 2011;69(4):2527-2534. Lillard HS. Effect of freezing on incidence and levels of Clostridium perfringens in mechanically deboned chicken meat. Poult Sci. 1977;56(6):2052-2055. Lillehoj HS. Effects of immunosuppression on avian coccidiosis: cyclosporin A but not hormonal bursectomy abrogates host protective immunity. Infect Immun. 1987;55(7):16161621. Lillehoj HS, Ruff MD. Comparison of disease susceptibility and subclass-specific antibody response in SC and FP chickens experimentally inoculated with Eimeria tenella, E. acervulina, or E. maxima. Avian Dis. 1987;31(1):112-119. Lillehoj, H S. Influence of inoculation dose, inoculation schedule, chicken age, and host genetics on disease susceptibility and development of resistance to Eimeria tenella infection. Avian Dis. 1988;32(3), 437-444. Lillehoj HS, Kang SY, Keller L, Sevoian M. Eimeria tenella and E. acervulina: lymphokines secreted by an avian T cell lymphoma or by sporozoite-stimulated immune T lymphocytes protect chickens against avian coccidiosis. Exp Parasitol. 1989;69(1):54-64. Lillehoj HS, Sasai K, Matsuda H. Development and characterization of chicken-chicken B cell hybridomas secreting monoclonal antibodies that detect sporozoite and merozoite antigens of Eimeria. Poult Sci. 1994;73(11):1685-1693. Lillehoj HS, Trout JM. Avian gut-associated lymphoid tissues and intestinal immune responses to Eimeria parasites. Clin Microbiol Rev.1996;9(3):349-360. Lillehoj HS. Role of T lymphocytes and cytokines in coccidiosis. Int J Parasitol. 1998;28(7):1071-1081. Lillehoj HS, Choi KD. Recombinant chicken interferon-gamma-mediated inhibition of Eimeria tenella development in vitro and reduction of oocyst production and body weight loss following Eimeria acervulina challenge infection. Avian Dis. 1998a;42(2):307-314. Lillehoj HS, Kang SY, Keller L, Sevoian M. Eimeria tenella and E. acervulina: lymphokines secreted by an avian T cell lymphoma or by sporozoite-stimulated immune T lymphocytes protect chickens against avian coccidiosis. Exp Parasitol.1998b;69(1):54-64. Lillehoj HS, Choi KD, Jenkins MC, Vakharia VN, Song KD, Han JY, Lillehoj EP. A recombinant Eimeria protein inducing interferon-gamma production: comparison of different gene expression systems and immunization strategies for vaccination against coccidiosis. Avian Dis. 2000;44(2):379-389. 106 Literaturverzeichnis Lillehoj HS, Lillehoj EP. Avian coccidiosis. A review of acquired intestinal immunity and vaccination strategies. Avian Dis. 2000;44(2):408-425. Lillehoj HS, Min W, Dalloul RA. Recent progress on the cytokine regulation of intestinal immune responses to Eimeria. Poult Sci. 2004;83(4):611-623. Lillehoj HS. Recent Progress in the Understanding of Host Immunity to Avian Coccidiosis: IL-17 Family Cytokines as the Sentinels on the Intestinal Mucosa. The XVIIIth Congress of the World Veterinary Poultry Association; 2013 Aug 19-23; Nantes, France. Long, JR, Truscott RB. Necrotic enteritis in broiler chickens. III. Reproduction of the disease. Can J Comp Med. 1976;40(1):53-59. Long PL. The pathogenic effects of Eimeria praecox and E. acervulina in the chicken. Parasitology. 1968;58(3):691–700. Long PL. Observations on the growth of Eimeria tenella in cultured cells from the parasitized chorioallantoic membranes of the developing chick embryo. Parasitology. 1969;59(3):757– 765. Long PL, Millard BJ. Eimeria infection of chicken embryos: the effect of known anticoccidial drugs against E. tenella and E. mivati. Avian Pathol. 1973;2(2):111–125. Long JR, Branum DA. Necrotic Enteritis in Broiler Chickens II. Pathology and Proposed Pathogenesis. Can J Comp Med. 1974;38(4):467–474. Long PL, Millard BJ, Joyner LP, Norton CC. A guide to laboratory techniques used in the study and diagnosis of avian coccidiosis. Folia Vet Latina.1976;6(3):201-217. Long PL, Reid WM. A Guide for the Diagnosis of Coccidiosis in Chickens. Aufl. 404. Athens, GA: College of Agriculture Experiment Station, Univ. Georgia. 1982. Löscher W, Ungemach FR, Kroker R.. Pharmakotherapie bei Haus- und Nutztieren.4. Aufl. Berlin: Parey; 1999. Lovland A, Kaldhusdal M. Severely impaired production performance in broiler flocks with high incidence of Clostridium perfringens-associated hepatitis. Avian Pathol. 2001;30(1):73– 81. Lovland A, Kaldhusdal M, Redhead K, Skjerve E, Lillehaug A. Maternal vaccination against subclinical necrotic enteritis in broilers. Avian Pathol. 2004;33(1):83–92. Lovland A, Kaldhusdal M, Reitan LJ. Diagnosing Clostridium perfringens-associated necrotic enteritis in broiler flocks by an immunoglobulin G anti-alpha-toxin enzyme-linked immunosorbent assay. Avian Pathol. 2003;32(5):527–534. Malz C. Möglichkeiten der Kokzidioseprophylaxe beim Geflügel. Lohman Info. 2003 (zitiert vom 1. 5. 2015):1-5. http://www.lohmann-information.com/content/l_i_1_03_artikel4.pdf Martin TG, Smyth JA. Prevalence of netB among some clinical isolates of Clostridium perfringens from animals in the United States. Vet Microbiol. 2009;36(1-2):202–205. 107 Literaturverzeichnis Mathis GF, Froyman R, Irion T, Kennedy T. Coccidiosis control with toltrazuril in conjunction with anticoccidial medicated or nonmedicated feed. Avian Dis. 2003;47(2):463469. Mateos GG, La´zaro R, Gracia MI. The feasibility of using nutritional modifications to replace drugs in poultry feeds. Poult Res. 2002;11(4):437-52. Maxey BW, Page RK. Efficacy of lincomycin feed medication for the control of necrotic enteritis in broiler-type chickens. Poult Sci. 1977;56(6):1909-1913. McCourt MT, Finlay DA, Laird C, Smyth JA, Bell C, Ball HJ. Sandwich ELISA detection of Clostridium perfringens cells and alpha-toxin from field cases of necrotic enteritis of poultry. Vet Microbiol. 2005;106(3-4):259-264. McDougald LR, Fuller AL, McMurray BL. An outbreak of Eimeria necatrix coccidiosis in breeder pullets: analysis of immediate and possible long-term effects on performance. Avian Dis. 1990;34(2):485-487. McDougald LR, Hofacre C, Mathis G, Fuller L, Hargrove JL, Greenspan P, Hartle DK. Enhancement of resistance to coccidiosis and necrotic enteritis in broiler chickens by dietary muscadine pomace. Avian Dis. 2008;52(4):646–651. McDougald LR, Hu J. Blackhead disease (Histomonas meleagridis) aggravated in broiler chickens by concurrent infection with cecal coccidiosis (Eimeria tenella). Avian Dis. 2001;45(2):307–312. McDougald LR, Karlsson T, Reid WM.. Interaction of infectious bursal disease and coccidiosis in layer replacement chickens. Avian Dis. 1979;23(4):999–1005. McDougald LR, Steve H. Chicken Coccidiosis. In: Swayne DE. Diseases of Poultry. 13. Aufl. USA: Blackwell Publishing; 2013. p.1147-1201. Min W, Dalloul RA, Lillehoj HS. Application of biotechnological tools for coccidia vaccine development. J Vet Sci. 2004;5(4):279–288. Min W, Kim WH, Lillehoj EP, Lillehoj HS. Recent progress in host immunity to avian coccidiosis: IL-17 family cytokines as sentinels of the intestinal mucosa. Dev Comp Immunol. 2013;41(3):418–428. Morris GM, Woods WG, Grant Richards D, Gasser RB.The application of a polymerase chain reaction (PCR)-based capillary electrophoretic technique provides detailed insights into Eimeria populations in intensive poultry establishments. Mol Cell Probes. 2007;21(4):288294. Nagahama M, Kobayashi K, Ochi S, Sakurai J. Enzyme-linked immunosorbent assay for rapid detection of toxins from Clostridium perfringens. FEMS Microbiol Lett. 1991,68(1):4144. Narro GC, Barragán JI, Soler MD, Mateos M, López-Mendoza MC, Homedes J. Efficacy of low-dose tylvalosin for the control of clostridiosis in broilers and its effect on productive parameters. Poult Sci. 2013;92(4):975-8. 108 Literaturverzeichnis Olkowski AA, Wojnarowicz C, Chirino-Trejo M, Drew MD. Responses of broiler chickens orally challenged with Clostridium perfringens isolated from field cases of necrotic enteritis. Res Vet Sci.2006;81(1):99-108. Olkowski AA, Wojnarowicz C, Chirino-Trejo M, Laarveld B, Sawicki G. Sub-clinical necrotic enteritis in broiler chickens: novel etiological consideration based on ultra-structural and molecular changes in the intestinal tissue. Res Vet Sci. 2008;85(3):543–553. Onderka DK, Langevin CC Hanson JA. Fibrosing cholehepatitis in broiler chickens induced by bile duct ligations or inoculation of Clostridium perfringens. Can. J Vet Res. 1990;54(2):285-90. Opengart K, Songer G. Necrotic Enteritis. In: Swayne DE. Diseases of Poultry. 13. Aufl. USA: Blackwell Publishing; 2013. p.949-53. Park SS, Lillehoj HS, Allen PC, Park DW, FitzCoy S, Bautista DA, Lillehoje EP. Immunopathology and cytokine responses in broiler chickens coinfected with Eimeria maxima and Clostridium perfringens with the use of an animal model of necrotic enteritis. Avian Dis. 2008;52(1):14–22. Parish WE. Necrotic enteritis in the fowl (Gallus gallus domesticus). I. Histopathology of the disease and isolation of a strain of Clostridium welchii. J Comp Pathol. 1961;71:377-393. Parreira VR, Costa M, Eikmeyer F, Blom J, Prescott JF. Sequence of two plasmids from Clostridium perfringens chicken necrotic enteritis isolates and comparison with C. perfringens conjugative plasmids. PloS One. 2012;7(11):e49753. doi: 10.1371/journal.pone.0049753. Petit L, Gibert M, Popoff MR. Clostridium perfringens: toxinotype and genotype. Trends Microbiol. 1999;7(3):104–110. Popoff MR, Bouvet P. Clostridial toxins. Future Microbiol. 2009;4(8):1021–1064. Prescott JF, Sivendra R, Barnum DA. The use of bacitracin in the prevention and treatment of experimentally-induced necrotic enteritis in the chicken. Can Vet J.1978;19(7):181-183. Raman M, Banu S, Gomathinayagam S, Raj G. Lesion scoring technique for assessing the virulence and pathogenicity of Indian field isolates of avian Eimeria species. Vet Arhiv.1978;81(2):259–271. Raether W, Hofmann J, Uphoff M P. In vitro cultivation of avian Eimeria species: Eimeria tenella. In: Eckert J, Braun R, Shirley MW, Coudert. Guidelines on techiques in coccidiosis researches. Aufl.1. Luxombourg: The European Communities; 1995. p. 79-82. Reid WM, Long PL. A diagnostic chart for nine species of fowl coccidian. Aufl.1. Athens Ga; 1979. Reyna PS, McDougald LR, Mathis GF. Survival of coccidia in poultry litter and reservoirs of infection. Avian Dis. 1989;27(2):464–473. Riddell C, Kong XM. The influence of diet on necrotic enteritis in broiler chickens. Avian Dis. 1992;36(3):499–503. 109 Literaturverzeichnis Rose ME, Long PL. Immunity to coccidiosis: gut permeability changes in response to sporozoite invasion. Experientia. 1969;25(2):183–184. Rose ME, Long PL. Immunity to coccidiosis: protective effects of transferred serum and cells investigated in chick embryos infected with Eimeria tenella. Parasitol.1971; 63(2):299–313. Rose ME. Immunity to coccidiosis: maternal transfer in Eimeria maxima infections. Parasitol. 1972;65(4):273–282. Rose ME. Protective antibodies in infections with Eimeria maxima: the reduction of pathogenic effects in vivo and a comparison between oral and subcutaneous administration of antiserum. Parasitol.1974;68(3):285–292. Rothwell L, Young JR, Zoorob R, Whittaker CA, Hesketh P, Archer A, Smith AL, Kaiser P. Cloning and characterization of chicken IL-10 and its role in the immune response to Eimeria maxima. J Immunol. 2004;173(4):2675–2682. Ruff MD, Reid WM. Coccidiosis and intestinal pH in chickens. Avian Dis. 1975;19(1):52–58. Ryley JF, Millard BJ, Long PL. Further studies on the life cycle of Eimeria brunetti Levine 1942. Z Parasitenk.1972;40(1):35-48. Sakurai J, Nagahama M, Oda M. Clostridium perfringens alpha-toxin: characterization and mode of action. J Biochem. 2004;136(5):569-574. Sarson AJ, Wang Y, Kang Z, Dowd SE, Lu Y, Yu H, Han Y, Zhou H, Gong J. Gene expression profiling within the spleen of Clostridium perfringens-challenged broilers fed antibiotic-medicated and non-medicated diets. BMC Genomics.2009;10:260. doi: 10.1186/1471-2164-10-260. Schnieder T and Tenter AM. Erreger von Parasiten: Taxonomie, Systematik und allgemeine Merkmale. In: Schnieder T (editor). Veterinärmediziniche Parasitologie. 6. Aufl. Stuttgart: Parey Buchverlag; 2006. p. 26-72. Sebald M, Costilow RN. Minimal growth requirements for Clostridium perfringens and isolation of auxotrophic mutants. Appl Microbiol. 1975;29(1):1-6. Seifert HS. Clostridiosen bei Mensch und Tieren. In: Blobel H, Schließer T, Handbuch der bakteriellen Infektionen bei Tieren. Aufl. 2. Gustav Fischer Verlag, Stuttgart, New York. 1995. Shane SM, Koetting DG, Harrington KS. The occurrence of Clostridium perfringens in the intestine of chicks. Avian Dis. 1984;28(4):1120-1124. Shibalova TA, Korolev AM, Sobchak IA. Culturing chicken coccidia on chick embryos. Veterinariia. 1969;46(11):68-71. Shirley MW, Millard BJ. Studies on the immunogenicity of seven attenuated lines of Eimeria given as a mixture to chickens. Avian Pathol. 1986;15(4):629–638. 110 Literaturverzeichnis Shirley MW, Bedrník P. Live attenuated vaccines against avian coccidiosis: Success with precocious and egg-adapted lines of Eimeria. Parasitol Today. 1997;13(12):481–484. Shirley MW, Smith AL, Tomley FM. The biology of avian Eimeria with an emphasis on their control by vaccination. Adv Parasitol. 2005;60:285–330. Shojadoost B, Vince AR, Prescott JF. The successful experimental induction of necrotic enteritis in chickens by Clostridium perfringens: a critical review. Vet Res. 2012;43(1):1–26. Si W, Gong J, Han Y, Yu H, Brennan J, Zhou H, Chen S. Quantification of Cell Proliferation and Alpha-Toxin Gene Expression of Clostridium perfringens in the Development of Necrotic Enteritis in Broiler Chickens. Appl Environ Microbiol. 2007;73(21):110-113. Smith NC, Wallach M, Miller CM, Braun R, Eckert J. (1994). Maternal transmission of immunity to Eimeria maxima: western blot analysis of protective antibodies induced by infection. Infect Immun.1994;62(11):4811–4817. Song H, Qiu B, Yan R, Xu L, Song X, Li X. The protective efficacy of chimeric SO7/IL-2 DNA vaccine against coccidiosis in chickens. Res Vet Sci. 2013;94(3):562-567. Songer JG. Clostridial enteric diseases of domestic animals. Clin Microbiol Rev. 1996;9(2):216-234. Stanley D, Keyburn AL, Denman SE, Moore RJ. Changes in the caecal microflora of chickens following Clostridium perfringens challenge to induce necrotic enteritis. Vet Microbiol. 2012;159(1-2):155-162. Stanley D, Wu SB, Rodgers N, Swick RA, Moore RJ. Differential Responses of Cecal Microbiota to Fishmeal, Eimeria and Clostridium perfringens in a Necrotic Enteritis Challenge Model in Chickens. PLoS One. 2014. 28;9(8):e104739. Stephen B, Rommel M, Daugschies A, Haberkorn A. Studies of resistance to anticoccidials in Eimeria field isolates and pure Eimeria strains. Vet Parasitol. 1997;69(1-2):19-29. Stevens EA, Bryant AE. The Role of Clostridial toxins in the pathogenesis of gas gangrene. Clin Infect Dis. 2002;35(1):93-100. Su YC, Fei AC, Tsai FM. Differential diagnosis of five avian Eimeria species by polymerase chain reaction using primers derived from the internal transcribed spacer 1 (ITS-1) sequence. Vet Parasitol. 2003;117(3):221-227. Suarez OG. Untersuchungen über Einflüsse auf die Clostridium perfringens EnterotoxinBildung in vitro und zum Einfluss des Zeit- und Temperaturfaktors sowie des Kochsalzgehaltes auf das Clostridium perfringens-Enterotoxin. [Dissertation Med Vet]. Leipzig: Univ. Leipzig; 1993. Timbermont L, Haesebrouck F, Ducatelle R, Van Immerseel F. Necrotic enteritis in broilers: an updated review on the pathogenesis. Avian Pathol. 2011;40(4):341-347. 111 Literaturverzeichnis Tolooe A, Shojadoost B, Peighambari SM, Tamaddon Y. Prevalence of netB Gene among Clostridium perfringens Isolates Obtained from Healthy and Diseased Chickens. J Anim Vet Adv. 2011;10(1):106-110. Titball RW, Naylor CE., Basak AK. The Clostridium perfringens alpha-toxin. Anaerobe. 1999;5(2):51–64. Trees AJ, Karim MJ, McKellar SB, Carter SD. Eimeria tenella: local antibodies and interactions with the sporozoite surface. J Protozool. 1989;36(4):326–333. Trout JM, Lillehoj HS. T lymphocyte roles during Eimeria acervulina and Eimeria acervulina infections. Vet Immunol Immunpathol. 1996;53(1-2):163-172. Tsiouris VS, Georgopoulou II, Petridou IE. Update on the emergence and pathogenesis of necrotic enteritis in broiler chickens. J Hellenic Vet Med Soci. 2010;61:144-153. Tsiouris V, Georgopoulou I, Batzios C, Pappaioannou N, Diakou A, Petridou E, Ducatelle R, Fortomaris P.The role of an attenuated anticoccidial vaccine on the intestinal ecosystem and on the pathogenesis of experimental necrotic enteritis in broiler chickens. Avian Pathol. 2013;42(2):163-170 Van der Sluis W. Clostridial enteritis is an often underestimated problem. World Poult. 2000;16:42–43. Van IF, De Buck J, Pasmans F, Huyghebaert G, Haesebrouck F, Ducatelle R. Clostridium perfringens in poultry: an emerging threat for animal and public health. Avian Pathol. 2004;33(6):537–549. Van IF, Rood JI, Moore RJ, Titball RW. Rethinking our understanding of the pathogenesis of necrotic enteritis in chickens. Trends Microbiol.2009;17(1):32–36. Velkers F. Transmission dynamics of Eimeria acervulina in broilers [Dissertation. med. vet]. The Netherlands: Univ. Wageningen; 2011. Vermeulen AN, Schaap DC, Schetters TP. Control of coccidiosis in chickens by vaccination. Vet Parasitol. 2001;100(1-2):13-20. Wallach M. Role of antibody in immunity and control of chicken coccidiosis. Trends Parasitol. 2010;26(8):382-387. Waldenstedt L, Elwinger K, Lundén A, Thebo P, Uggla A.Sporulation of Eimeria maxima oocysts in litter with different moisture contents. Poult Sci. 2001; 80(10):1412–1415. Willardsen RR, Busta FF, Allen CE, Smith LB. Growth and survival of Clostridium perfringens during constantly rising temperatures. Food Sci. 1978;43(2):470–475. Williams RB. A compartmentalised model for the estimation of the cost of coccidiosis to the world’s chicken production industry. Inter J Parasitol. 1999;29(8):1209-1229. Williams, R. B. Anticoccidial vaccines for broiler chickens: Pathways to success. Avian Pathol. 2002;31(4):317–353. 112 Literaturverzeichnis Williams RB. Intercurrent coccidiosis and necrotic enteritis of chickens: rational, integrated disease management by maintenance of gut integrity. Avian Pathol. 2005;34(3):159-180. Williams RB, Marshall RN, La Ragione RM, Catchpole J. A new method for the experimental production of necrotic enteritis and its use for studies on the relationships between necrotic enteritis, coccidiosis and anticoccidial vaccination of chickens. Parasitol Res. 2003;90(1):19-26. Williams RB, Marshall RN, Pagés M, Dardi M, Cacho DE. Pathogenesis of Eimeria praecox in chickens: virulence of field strains compared with laboratory strains of E. praecox and Eimeria acervulina. Avian Pathol. 2009;38(5):359-366. Wu SB, Rodgers N, Choct M. Optimized necrotic enteritis model producing clinical and subclinical infection of Clostridium perfringens in broiler chickens. Avian Dis. 2010;54(3):1058-1065. Xie MQ, Fukata T, Gilbert JM, McDougald LR. Evaluation of anticoccidial drugs in chicken embryos. Parasitol Res. 1991;77(7):595-599. Xu J, Zhang Y, Tao J. Efficacy of a DNA vaccine carrying Eimeria maxima Gam56 antigen gene against coccidiosis in chickens. Korean J Parasitol. 2013;51(2):147-154. Yan XX, Porter CJ, Hardy SP, Steer D, Smith AI, Quinsey NS, Hughes V, Cheung JK, Keyburn AL, Kaldhusdal M, Moore RJ, Bannam TL, Whisstock JC, Rood JI. Structural and functional analysis of the pore-forming toxin NetB from Clostridium perfringens. M Bio. 2013;4(1):13–19. Yun CH, Lillehoj HS, Lillehoj EP. Intestinal immune responses to coccidiosis. Develop Comp Immunol. 2000;24(2-3):303-324. Yun CH, Lillehoj HS, Choi KD. Eimeria tenella infection induces local gamma interferon production and intestinal lymphocyte subpopulation changes. Infect Immunol. 2000;68(3):1282-1288. Zerega B, Camardella L, Cermelli S, Sala R, Cancedda R, Descalzi Cancedda F. Avidin expression during chick chondrocyte and myoblast development in vitro and in vivo: regulation of cell proliferation. J Cell Sci. 2001;114(8):1473-1482. Zhang J, Wilson E, Yang S, Healey MC. Adapting Eimeria tenella to grow in primary chicken kidney cells following repeated passages between cell culture and chickens. Avian Dis. 1997;41(1):111–116. Zhang L, Liu R, Song M, Hu Y, Pan B, Cai J, Wang M. Eimeria tenella: interleukin 17 contributes to host immunopathology in the gut during experimental infection. Exp Parasitol. 2013;133(2):121-130. 113 Danksagung 10 Danksagung Mein besonderer Dank gilt Herrn Prof. Dr. Arwid Daugschies für die wissenschaftliche Betreuung meiner Dissertation und meine fachliche, berufliche und persönliche Förderung. Sie sind für mich wie ein Vater für seinen Sohn. Bei Frau Dr. Berit Bangoura möchte ich mich bedanken. Vielen herzlichen Dank für die Betreuung, wissenschaftlichen Beratung und sprachliche Korrektur meiner Doktorarbeit. Mein herzlicher Dank geht an Herrn Dr. Mathias Lendner für wissenschaftliche Beratung und Hilfe bei der molekularen Biologie. Ebenfalls auch vielen Dank an alle Mitarbeiter des Instituts für Parasitologie, besonderes Herrn Gerd Kunz, Frau Nadine Roßner für die Hilfe im Labor und auch Frau Janet Reichenbach für die Hilfe bei der Vorbereitung meiner Dissertation. Meiner Familie, ohne die ich diesen großen Schritt wohl nicht gemacht hätte. Meinen Eltern und Geschwistern, die mich immer bestärkt haben und an meiner Arbeit interessiert sind. Da das Beste immer am Schluss kommt: Lina, ohne Dich hätte mich so manche Krise in den Wahnsinn getrieben. Danke, dass Du immer für mich da bist. 114
