Das multifunktionelle Toxin VacA von Helicobacter

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Bakterielle Immunmodulation
Das multifunktionelle Toxin VacA
von Helicobacter pylori
XAVER SEWALD, RAINER HAAS
MAX VON PETTENKOFER-INSTITUT FÜR HYGIENE UND MEDIZINISCHE
MIKROBIOLOGIE, LMU MÜNCHEN
Die Interaktion des vakuolisierenden Zytotoxins VacA von Helicobacter
pylori mit dem Leukozyten-spezifischen β2-Integrin LFA-1 führt zur
Hemmung der NFAT-abhängigen Gentranskription humaner T-Zellen.
The Helicobacter pylori vacuolating cytotoxin VacA, interacting with the
β2-integrin LFA-1, induces down-regulation of NFAT-dependent gene
transcription in human T cells.
ó Im Jahr 2005 wurden Robin Warren und
Barry Marshall für die Entdeckung und Isolierung von Helicobacter pylori aus der Magenmukosa mit dem Nobelpreis für Physiologie
und Medizin ausgezeichnet. Weltweit ist etwa
jeder zweite Mensch von H. pylori besiedelt.
Die Infektion mit H. pylori führt zu einer chronischen Entzündung der Magenschleimhaut
(Gastritis), die in 90 Prozent der Fälle symptomlos verläuft. Jedoch entwickeln 15 bis 20
Prozent der infizierten Personen aufgrund
dieser chronischen Entzündung Folgeerkrankungen wie Magen- oder Zwölffingerdarmgeschwüre sowie ein bis zwei Prozent
ein Magenkarzinom. Spezielle Pathogenitätsfaktoren von H. pylori, wie das mittels
eines Typ-IV-Sekretionssystems in eukaryotische Zielzellen übertragene Protein CagA,
das Adhäsin BabA sowie das vakuolisierende
Zytotoxin VacA, sind dabei signifikant mit
der Ausbildung von Magengeschwüren und
dem Magenkarzinom assoziiert. Weitere
bakterielle Virulenzfaktoren ermöglichen es
H. pylori, sowohl den extremen Umweltbedingungen (pH 1–2, Nährstoffknappheit) zu
begegnen, als auch dem Immunsystem des
Wirts zu entgehen.
Die Infektion durch H. pylori induziert eine
umfassende Antwort, sowohl des angeborenen als auch des erworbenen Immunsystems. Immunzellen werden dabei von zellulären Zytokinen oder bakteriellen Faktoren
angelockt. Die Produktion pro-inflammatorischer Zytokine wie Interleukin(IL)-8, IL1β und Tumornekrosefaktor(TNF)-α führt
zum Einwandern von Zellen des angeborenen Immunsystems in die Magenmukosa,
darunter Granulozyten, Makrophagen und
Mastzellen. Im späteren Verlauf der Infektion werden auch Zellen des adaptiven
Immunsystems, wie T-Lymphozyten, zur
Infektion rekrutiert. Die starke Immunreaktion kann aber die H. pylori-Infektion nicht
beseitigen.
Das vakuolisierende Zytotoxin VacA
˚ Abb. 1: Funktionelle Domänen und Prozessierung von VacA. Das reife VacA-Toxin besteht aus
p33 und p55. Die Signal-Sequenz (SS, grün) führt zum Sec-abhängigen Transport über die innere
Membran (IM) ins Periplasma. Der C-terminal gelegene Autotransporter (braun) katalysiert die
Translokation über die äußere Membran (OM). Eine am N-Terminus gelegene hydrophobe Region
(orange) aus etwa 30 Aminosäuren vermittelt die Ausbildung der Pore. Die i-Region (rot) ist an der
Zelltyp-spezifischen Vakuolisierung beteiligt.
Die Beobachtung, dass H. pylori-Kulturüberstand die Ausbildung großer, zytoplasmatischer Vakuolen in Epithelzellen induziert,
führte 1988 zur Entdeckung des vakuolisierenden Zytotoxins VacA[1]. Es wurde 1992
von Cover und Blaser biochemisch gereinigt
und näher charakterisiert[2]. VacA wird als
140 kDa großes Prä-Protoxin produziert, Secabhängig über die innere Membran von H.
pylori exportiert und mit einer C-terminal
gelegenen Autotransporter-Domäne über die
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Epithelzellen
Tab. 1: Effekte von VacA auf Epithelzellen.
VacA-Effekte
Literatur
Endosomales System /
Sekretion
• Hemmung der Carbonat-Sekretion
• Hemmung der Säure-Sekretion
• Umverteilung des späten endosomalen Kompartiments
• Intrazelluläres Wachstum von H. pylori
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Programmierter Zelltod
(Apoptose)
• Hemmung Zell-Zyklus (G1-S)
• Aktivierung von Caspase 8 und 9
• Stimulierung pro-apoptotischer Faktoren (Bax/Bak)
• Reduktion mitochondriales Membranpotenzial
• Ko-Lokalisation von VacA und Mitochondrien
• Freisetzung von Cytochrom C
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Zelluläre Signalwege
• Aktivierung der MAP-Kinase p38
• Phosphorylierung von Git-1
• Aktivierung PI3K/Akt-Signalweg
(Phosphorylierung von PKB, GSK3β)
• Kerntranslokation von β-Catenin
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Integrität der Epithelschicht
und Zellmembran
• Reduktion der transepithelial electric resistance (TER)
• Epithel-Durchlässigkeit (Harnstoff und Carbonat)
• Ausbildung Anion-spezifischer Kanäle in Plasmamembran
(Chlorid, Pyruvat)
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äußere Membran sekretiert (Abb. 1). Die
Autotransporter-Domäne wird abgespalten,
und das Toxin (90 kDa) kann zu hexameren
Ringen oligomerisieren. Das reife Toxin
besteht aus Domänen der Größe 37 kDa (p33)
und 55 kDa (p55), die unterschiedliche Funktionen aufweisen. So ist das p33-Fragment
für die Ausbildung einer Membranpore nötig.
Essenziell für die Insertion in die Membran ist
dabei ein N-terminal gelegener, stark hydrophober Bereich (etwa 30 Aminosäuren) mit
drei Wiederholungen eines Gly-XXX-GlyMotivs. Das p55-Fragment ist für die Bindung
an die Zelloberfläche sowie die Oligomerisierung durch Interaktion der Untereinheiten verantwortlich.
Alle bisher untersuchten H. pylori-Isolate
produzieren VacA, wobei deutliche Variationen in der Sequenz erkennbar sind. Aufgrund
verschiedener Sequenz-Polymorphismen lassen sich VacA-Allele unterscheiden, die sich
in ihrem Bindungsverhalten an eukaryotische
Zellen und ihrer Vakuolisierungsaktivität
unterscheiden (Abb. 1). VacA-Polymorphis-
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men treten im Bereich des N-Terminus
(s-Region), des mittleren Bereichs (m-Region)
sowie in einem intermediären Bereich
(i-Region) auf[3]. Polymorphe VacA unterscheiden sich dabei in ihrer Aktivität und
dem Spektrum sensitiver Zellen. Epidemiologische Studien ergaben, dass H. pylori mit
i1-Allel signifikant mit der Ausbildung von
Magenkrebs assoziiert ist. Weitere Aspekte
zur Charakterisierung funktioneller VacARegionen ergaben sich aus der Kristallstruktur des p55-VacA-Fragments[4]. Das p55
besteht aus einer lang gestreckten β-helikalen
Struktur mehrerer rechtsgedrehter β-Helices,
die durch einen Knick von der C-terminalen,
globulären Domäne abgesetzt sind. Durch Vergleich oberflächenexponierter Aminosäurereste von 92 VacA-Sequenzen konnten zwei
konservierte Bereiche im p55-Fragment
bestimmt werden. Vermutet wird in diesen
Bereichen eine C-terminal lokalisierte Rezeptor-Bindetasche und ein am N-Terminus gelegener Bereich zur Interaktion mit dem p33Fragment (Abb. 1).
VacA als multifunktionales Toxin
Nach der Infektion kommt H. pylori zunächst
mit Zellen des Magenepithels in Kontakt. Diese Zellschicht besteht hauptsächlich aus
Epithelzellen sowie aus Säure- und Magenschleim-produzierenden Zellen. VacA
zeigt zahlreiche Effekte auf Epithel- und
Endothelzellen, wie die Störung des endosomalen Systems, die Induktion von Apoptose,
den Einfluss auf Signaltransduktionswege
und die Zerstörung der Membranintegrität
(Tab. 1).
Der Mechanismus der Vakuolenbildung
geht von einer Bindung von VacA an die Zytoplasmamembran und anschließender Aufnahme aus. VacA bildet einen Anionen-spezifischen Kanal, der nach Ansäuerung des
Lumens der späten Endosomen zum Einstrom
von Chlorid-Ionen (Cl-) führt. Dies hat eine
verstärkte Aktivität der vakuolären ATPase
(v-ATPase) zur Folge, die vermehrt Protonen
ins endosomale Lumen pumpt, um die negative Ladung von Cl- auszugleichen. Durch Einstrom von Wasser kommt es zum osmotischen
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¯ Abb. 2: VacA-Effekte auf Immunzellen. A,
Die Bindung von VacA an den/die Rezeptor/en
führt zur Phosphorylierung der MAPK p38 und
Erk1/2 sowie zur Aktivierung von Vav-1. B,
Aufgenommenes VacA inhibiert die Proliferation von T-Zellen und hemmt die IL-2-Genexpression. C, Die Reifung von H. pylori-beinhaltenden Phagosomen zu Lysosomen wird von
aufgenommenen VacA verhindert. D, In B-Zellen verhindert VacA die Antigen-Präsentation
durch Störung der Ansäuerung der Vesikel.
Vav, GTP-Nukleotid-Austauschfaktor; TACO,
tryptophan aspartate-containing coat-Protein;
IL-2, Interleukin-2; MIP-1a/b, macrophage
inflammatory-Protein-1α/β; NFAT, Nukleärer
Faktor aktivierter T-Zellen; Cn, Calcineurin; AP1, aktivierendes Protein 1; NFκB, Nukleärer
Faktor kappa B; ER, Endoplasmatisches Retikulum; MHCII, Haupthistokompatibilitätskomplex
II; P, Phosphat.
Anschwellen der Membranvesikel. VacA stört
somit die Organisation des intrazellulären
Vesikeltransports, was als mögliche Ursache
für die reduzierte Sekretion von Säure bzw.
Carbonat angesehen wird. Neben dem Einfluss auf das endosomale Kompartiment kann
VacA durch Freisetzung von CytochromC
Apoptose in Epithelzellen induzieren. Dabei
spielen eine Reduktion des mitochondrialen
Membranpotenzials sowie die Aktivierung
pro-apoptotischer Faktoren wie Bax/Bak und
der Caspasen 8 und 9 eine Rolle (Tab. 1).
Insgesamt ist die Bedeutung der verschiedenen VacA-Effekte auf Epithelzellen für die
Infektion des Magens durch H. pylori in vivo
jedoch noch unzureichend verstanden. Aufgrund der vielen unterschiedlichen Effekte
wurde VacA als multifunktionales Toxin
bezeichnet.
VacA als Immunotoxin
Die Besonderheit der H. pylori-Infektion liegt
in der chronischen, meist lebenslangen Entzündung. Bei der Kontrolle einer H. pyloriInfektion spielen neben Makrophagen und
Antigen-präsentierenden Zellen (B-Lymphozyten, Dendritische Zellen), CD4+-T-Lymphozyten eine zentrale Rolle. Die Effekte von
VacA auf verschiedene Typen von Immunzellen sind in Abbildung 2 zusammengefasst.
Wie für Epithelzellen gezeigt, führt VacA auch
bei T-Lymphozyten zur Aktivierung der Mitogen-aktivierten Proteinkinase (MAPK) p38
¯ Abb. 3: Spezies-spezifische Wirkung von
VacA auf T-Zellen. A, In humanen T-Zellen bindet VacA vermutlich über Glykolipide an die
Zelloberfläche. Der Leukozyten-spezifische
Rezeptor CD18, eine Untereinheit des β2-Integrins hLFA-1, vermittelt die funktionelle Aufnahme. VacA führt zur Ausbildung saurer Vakuolen und zur Hemmung der Kerntranslokation
des Transkriptionsfaktors NFAT. Dies hemmt
die IL-2-Expression nach T-Zell-Aktivierung. B,
In murinen T-Zellen kann VacA nicht binden
und aufgenommen werden. Die Zellen weisen
keine Hemmung der IL-2-Expression und Proliferation auf. C, Expression von humanem CD18
in murinen T-Zellen führt zur Ausbildung saurer
Vakuolen. VacA bindet Spezies-spezifisch an
humanes CD18. Eine Hemmung der IL-2Expression findet nicht statt[6]. hLFA-1, humanes LFA-1; mLFA-1, murines LFA-1; VacA p33,
rot; p55, blau; IL-2, Interleukin-2; NFAT, Nukleärer Faktor aktivierter T-Zellen.
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und Erk1/2 sowie des GTP-Nukleotid-Austauschfaktors (GEF) Vav-1 (Abb. 2A). Diese
Aktivierung ist unabhängig von der Aufnahme des Toxins und wird vermutlich über die
Bindung von VacA an Oberflächenrezeptoren
vermittelt. Dies könnte durch die beschriebenen Rezeptoren Sphingomyelin und/oder
LFA-1 erfolgen[5, 6]. Von Makrophagen phagozytierte H. pylori können in einem intrazellulären Kompartiment überdauern, da ein
Abtöten in Lysosomen durch VacA verhindert
wird (Abb. 2C). Weiter wurde gezeigt, dass
VacA die proteolytische Prozessierung von
Antigenen und somit die Antigenpräsentation zur Aktivierung von T- und B-Lymphozyten stört[7], was auf Veränderungen des
endosomalen Transports zurückgeführt wird
(Abb. 2D).
Als ein direkter Effekt von VacA auf T-Lymphozyten ist die Hemmung der Proliferation
von T-Zellen zu nennen, wobei der Mechanismus nicht im Detail geklärt ist[8]. VacA
hemmt die Expression des Zytokins IL-2, das
normalerweise nach Aktivierung des T-ZellRezeptors(TCR)/Korezeptors exprimiert wird.
Die Transkription von IL-2 hängt von der Aktivierung der Ca2+-abhängigen Phosphatase
Calcineurin ab, die zur Dephosphorylierung
des Transkriptionsfaktors NFAT führt. VacA
verhindert die Dephosphorylierung und somit
die Translokation von NFAT in den Nukleus.
Genexpressionsstudien ergaben, dass VacA
die Aktivierung von Calcineurin, ähnlich der
Wirkung des immunsuppressiven Moleküls
FK506 inhibiert[8]. Neben der Expression von
IL-2 ist auch die Produktion weiterer Zytokine wie MIP-1α und MIP-1β betroffen
(Abb. 2B).
Spezies-spezifische Interaktion von
VacA mit T-Lymphozyten
Die Interaktion mit der Zellmembran ist der
erste wichtige Schritt für ein Toxin. Häufig
sind an der Aufnahme eines Toxins spezifische zelluläre Interaktionspartner beteiligt,
die als Rezeptor und/oder Korezeptor bezeichnet werden. Durch die Bindung an einen spezifischen Rezeptor kommt es meistens zur
rezeptorvermittelten Aufnahme des Toxins in
das endosomale System. So dienen beispielsweise für das Botulinum-NeurotoxinA Ganglioside als niedrigaffine Rezeptoren zur Zellbindung und das synaptic vesicle protein als
Proteinrezeptor zur Aufnahme in Neuronen.
Für VacA wurde in vitro die Interaktion mit
Glykosphingolipiden beschrieben. Außerdem
konnte mit Sphingomyelin ein Korezeptor auf
Endothelzellen identifiziert werden[5]. SphinBIOspektrum | 02.09 | 15. Jahrgang
gomyelin könnte auch ein möglicher Korezeptor auf Leukozyten darstellen, der die initiale Bindung von VacA an die Zelloberfläche
vermittelt. Die funktionelle Aufnahme von
VacA in T-Lymphozyten erfolgt jedoch über
CD18, der β-Untereinheit Leukozyten-spezifischer Integrine[6]. Das auf Immunzellen
dominierende Integrin LFA-1, bestehend aus
den Untereinheiten β2 (CD18) und αL (CD11a),
stellt somit einen zentralen Rezeptor für VacA
auf verschiedenen Immunzellen dar. Wie im
Modell (Abb. 3) dargestellt, kommt es zur
initialen Interaktion von VacA mit einem
Korezeptor (Glykolipid) auf Lymphozyten. Die
Bindung führt zu strukturellen Umlagerungen und zur Übertragung auf den Leukozytenspezifischen VacA-Rezeptor CD18. Das Integrin LFA-1 vermittelt die funktionelle Aufnahme von VacA, was die Ausbildung saurer
Vakuolen und die Hemmung der ZytokinExpression auslöst (Abb. 3A).
In murinen T-Zellen führt VacA nicht zur
Ausbildung saurer Vakuolen und zur Hemmung der IL-2-Expression. Diese Spezies-Spezifität von VacA wird durch die Beobachtung
gestützt, dass ausschließlich H. pylori ein
vacA-Gen besitzt, nicht jedoch andere Helicobacter-Spezies, wie Helicobacter felis, der
im Magen von Katzen und Hunden vorkommt.
VacA bindet weder an die Zelloberfläche von
primären murinen T-Zellen, noch wird es aufgenommen (Abb. 3B). Eine mögliche Ursache hierfür ist die fehlende Bindung an den
spezifischen Rezeptor oder Korezeptor. Werden die humanen β2-Integrine (hLFA-1, hMac1) in Maus-T-Zellen exprimiert, kann man
eine verstärkte Vakuolisierung dieser „humanisierten“ murinen T-Zellen beobachten. Eine
Hemmung der IL-2-Expression durch VacA
ist jedoch weiterhin nicht möglich (Abb. 3C).
Als Ursache hierfür sind Variationen in der
Zielstruktur (Signalwege, Calcineurin usw.) in
Betracht zu ziehen, sodass VacA trotz funktioneller Aufnahme die Expression von IL-2
nicht hemmen kann. Zusätzlich könnte das
Fehlen des VacA-spezifischen Korezeptors
auf murinen T-Zellen zu einer uneffizienten
Aufnahme führen.
Danksagung
Unsere Arbeiten wurden durch die Deutsche
Forschungsgemeinschaft unterstützt.
ó
Literatur
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Korrespondenzadresse:
Dr. Xaver Sewald
LMU München
Lehrstuhl Bakteriologie
Max von Pettenkofer-Institut
Pettenkoferstraße 9A
D-80336 München
Tel.: 089-5160-5420
[email protected]
AUTOREN
Rainer Haas
Xaver Sewald
1977–1984 Studium der Biologie. 1987 Promotion an der
Universität Tübingen. 1992–
1993 Auslandsaufenthalt in Lausanne, Schweiz. 1996 Habilitation im Fach Mikrobiologie. Seit
1997 Professor für Medizinische
Mikrobiologie an der LMU München. Schwerpunkte: Pathogenitätsmechanismen in Helicobacter pylori.
1998–2003 Studium der Biologie an der LMU München.
2003 Diplomarbeit am Institut
für Genetik und Mikrobiologie,
LMU München. 2004–2008
Promotion am Max von Pettenkofer-Institut, LMU München
in der AG von Prof. Dr. Haas.
Ab April 2009 Postdoc in der
AG von Prof. Dr. Mothes, Yale
University, New Haven, USA.