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Aus dem Department für Pathologie – Institut für Klinische Pathologie – der Albert-Ludwigs-Universität Freiburg i. Br. Charakterisierung der epigenetischen Regulation der Glykoproteine „Hematopoietic progenitor cell antigen CD34“ und „Prominin-1“ in Gastrointestinalen Stromatumoren (GIST) INAUGURAL-DISSERTATION zur Erlangung des Medizinischen Doktorgrades der Medizinischen Fakultät der Albert-Ludwigs-Universität Freiburg i. Br. Vorgelegt 2015 von Alexander Florian Braun geboren in Oberkirch Dekan in Prof. Dr. Kerstin Krieglstein 1. Gutachter Prof. Dr. Florian Haller 2. Gutachter Prof. Dr. Jens Höppner Jahr der Promotion 2016 Inhaltsverzeichnis 1 EINLEITUNG ....................................................................................................................................................8 1.1 1.1.1 Einführung ........................................................................................................................................8 1.1.2 Epidemiologie ...................................................................................................................................8 1.1.3 Lokalisation ......................................................................................................................................9 1.1.4 Klinisches Bild ...................................................................................................................................9 1.1.5 Pathologie ......................................................................................................................................10 1.1.6 Klassifikation ..................................................................................................................................10 1.1.7 Prognose.........................................................................................................................................11 1.1.8 Therapie .........................................................................................................................................12 1.2 MOLEKULARGENETIK .....................................................................................................................................13 1.2.1 Die Gene KIT und PDGFRA ..............................................................................................................13 1.2.2 Das Gen BRAF .................................................................................................................................16 1.3 EPIGENETIK..................................................................................................................................................17 1.3.1 DNA-Methylierung und Genexpression ..........................................................................................17 1.3.2 DNA-Methylierung und Karzinogenese ..........................................................................................17 1.3.3 5-Azacytidin ....................................................................................................................................18 1.4 PROTEINEXPRESSION .....................................................................................................................................18 1.4.1 Hematopoietic progenitor cell antigen CD34 .................................................................................18 1.4.2 Prominin-1 ......................................................................................................................................20 1.5 2 DER GASTROINTESTINALE STROMATUMOR (GIST) ................................................................................................8 FRAGESTELLUNG UND ZIELSETZUNG ..................................................................................................................22 MATERIAL UND METHODEN........................................................................................................................23 2.1 UNTERSUCHUNGSMATERIAL ............................................................................................................................23 2.2 DNA-ISOLIERUNG AUS FORMALINFIXIERTEN UND PARAFFINEINGEBETTETEN GEWEBEN ...............................................23 2.3 MUTATIONSANALYSE .....................................................................................................................................26 2.3.1 Amplifizierung der zu evaluierenden Genabschnitte ......................................................................26 2.3.2 Sequenzierung der amplifizierten Genabschnitte...........................................................................32 2.3.3 Auswertung der Sequenzen und Beschreibung der Mutationen ....................................................34 2.4 QUANTITATIVE METHYLIERUNGSANALYSE MITTELS PYROSEQUENZIERUNG ................................................................40 2.4.1 Bisulfitkonvertierung ......................................................................................................................41 2.4.2 Die untersuchten CpG-Loci .............................................................................................................41 2.4.3 Amplifizierung bisulfitbehandelter DNA .........................................................................................43 2.4.4 Pyrosequenzierung .........................................................................................................................45 2.5 IMMUNHISTOCHEMIE UND TISSUE-MICROARRAY ................................................................................................50 2.5.1 Herstellung der Tissue-Microarrays ...............................................................................................51 2.5.2 Immunhistochemische Färbung der Tissue-Microarrays................................................................52 2.6 2.6.1 Zellkultur ansetzen .........................................................................................................................53 2.6.2 Behandlung mit 5-Azacytidin .........................................................................................................54 2.6.3 DNA-Methylierungsanalyse ............................................................................................................55 2.6.4 mRNA-Expressionsanalyse .............................................................................................................56 2.7 3 ZELLVERSUCH ...............................................................................................................................................53 STATISTISCHE AUSWERTUNG ...........................................................................................................................58 ERGEBNISSE..................................................................................................................................................60 3.1 DARSTELLUNG DER KLINISCH-PATHOLOGISCHEN PARAMETER DES KOLLEKTIVS ...........................................................60 3.1.1 Geschlechter- und Altersprävalenz .................................................................................................60 3.1.2 Tumorlokalisation...........................................................................................................................60 3.1.3 Tumorgröße....................................................................................................................................61 3.1.4 Mitosenanzahl ................................................................................................................................61 3.1.5 Histomorphologie ...........................................................................................................................61 3.1.6 Immunphänotyp .............................................................................................................................61 3.1.7 Mutationsstatus .............................................................................................................................62 3.1.8 Risikoklassifikationen .....................................................................................................................70 3.1.9 Follow-up ........................................................................................................................................72 3.2 DARSTELLUNG DER DNA-METHYLIERUNG UND PROTEINEXPRESSION VON CD34 IM ZUSAMMENHANG MIT DEN KLINISCH- PATHOLOGISCHEN PARAMETERN ...............................................................................................................................72 3.2.1 Proteinexpression und DNA-Methylierung .....................................................................................72 3.2.2 CD34 und Tumorlokalisation ..........................................................................................................73 3.2.3 CD34 und Mitosenanzahl ...............................................................................................................76 3.2.4 CD34 und Genotyp..........................................................................................................................78 3.2.5 CD34 und Genotyp unter Berücksichtigung der Lokalisation .........................................................80 3.3 DARSTELLUNG DER DNA-METHYLIERUNG UND PROTEINEXPRESSION VON PROM1 IM ZUSAMMENHANG MIT DEN KLINISCH- PATHOLOGISCHEN PARAMETERN ...............................................................................................................................83 3.3.1 Proteinexpression und DNA-Methylierung .....................................................................................83 3.3.2 PROM1 und Tumorlokalisation ......................................................................................................85 3.3.3 PROM1 und Tumorgröße................................................................................................................87 3.3.4 PROM1 und Genotyp ......................................................................................................................90 3.3.5 PROM1 und Genotyp unter Berücksichtigung der Lokalisation......................................................92 3.4 DARSTELLUNG DES KLINISCHEN VERLAUFS IM ZUSAMMENHANG MIT DEN KLINISCH-PATHOLOGISCHEN PARAMETERN........94 3.4.1 Tumorgröße und Prognose .............................................................................................................94 3.4.2 Mitosenanzahl und Prognose .........................................................................................................95 3.4.3 Mutationsstatus und Prognose ......................................................................................................96 3.4.4 Risikoklassifikationen nach Fletcher und Miettinen und Prognose ................................................97 3.4.5 PROM1 und Prognose ....................................................................................................................99 3.5 ZELLVERSUCH .............................................................................................................................................102 4 DISKUSSION................................................................................................................................................105 4.1 BEDEUTUNG DES MUTATIONSSTATUS .............................................................................................................105 4.1.1 KIT-Mutationen ............................................................................................................................105 4.1.2 PDGFRA-Mutationen ....................................................................................................................107 4.1.3 BRAF-Mutationen .........................................................................................................................109 4.1.4 Wildtyp-GIST.................................................................................................................................109 4.2 DNA-METHYLIERUNGSSTATUS IN DEN PROMOTORREGIONEN DER GENE CD34 UND PROM1 SOWIE DEREN PROTEINEXPRESSION IN KORRELATION MIT KLINISCH-PATHOLOGISCHEN PARAMETERN .......................................................111 4.2.1 CD34 .............................................................................................................................................111 4.2.2 PROM1 .........................................................................................................................................112 4.3 IN-VITRO-KORRELATION VON CD34- BZW. PROM1-EXPRESSION UND IHREM DNA-METHYLIERUNGSSTATUS .............115 4.4 BEDEUTUNG DER KLINISCH-PATHOLOGISCHEN PARAMETER FÜR DEN KLINISCHEN VERLAUF ........................................115 4.4.1 Tumorgröße..................................................................................................................................115 4.4.2 Mitosenanzahl ..............................................................................................................................116 4.4.3 Mutationsstatus ...........................................................................................................................117 4.4.4 Risikoklassifikationen ...................................................................................................................117 4.4.5 PROM1 .........................................................................................................................................118 5 ZUSAMMENFASSUNG ................................................................................................................................120 6 LITERATURVERZEICHNIS ............................................................................................................................121 7 DANKSAGUNG............................................................................................................................................134 8 LEBENSLAUF ...............................................................................................................................................135 Abkürzungsverzeichnis 5-azaC 5-Azacytidin ACTB actin, beta APS Adenosin-5‘-Phosphosulfat AS Aminosäure(n) ATP Adenosintriphosphat Bc Buchstabencode Bp Basenpaar BRAF v-raf murine sarcoma viral oncogene homolog B1 CCD Charge-coupled Device CD34 Hematopoietic progenitor cell antigen CD34 cDNA komplementäre Desoxyribonukleinsäure CDS Coding DNA Sequence Cp Crossing Point CpG Cytosin-Guanin-Dinukleotidsequenz Ct Cycle Threshold (d)dNTP (Di)desoxynukleosidtriphosphat DNA Desoxyribonukleinsäure DPBS Dulbecco’s Buffered Saline Solution E. coli Escherichia coli EC (-Nummer) Enzyme Comission number (Klassifikationssystem für Enzyme) E-Cup 1,5-ml-Eppendorf-Reaktionsgefäß ED Extrazelluläre Domäne EDTA Ethylendiamintetraacetat eGIST extragastrointestinale Stromatumoren ERK mitogen-activated protein kinase ev endogenous virus FFPE formalinfixiertes und paraffineingebettetes Gewebe GIST Gastrointestinale(r) Stromatumor(en) GTP Guanosintriphosphat H2O Molekularbiologisches Wasser HE Hämatoxilin-Eosin HGVS Human Genome Variation Society HIER Hitze-induzierte Epitop-Rückgewinnung HIF-1α Hypoxia-inducible factor 1-alpha HPF high power field / Hauptgesichtsfeld HPLC high performance liquid chromatography ICC Interstitielle Cajal-Zelle(n) JMD Juxtamembranäre Domäne kb Kilobase(n) KIT / CD117 / SCFR v-kit Hardy-Zuckerman 4 feline sarcoma viral oncogene homolog MAP mitogen-activated protein MEK mitogen-activated protein kinase kinase mRNA messenger RNA (Boten-Ribonukleinsäure) mTOR mechanistic Target of Rapamycin n Anzahl n.a. nicht auswertbar NF1 Neurofibromatose Typ 1, Morbus Recklinghausen Nts Nukleotide OD Optische Dichte / Extinktion PCR Polymerase Chain Reaction (Polymerase-Kettenreaktion) PDGF platelet-derived growth factor PDGFR platelet-derived growth factor receptor PDGFRA / CD140a platelet-derived growth factor receptor, alpha polypeptide PPi Pyrophosphat PROM1 / CD133 Prominin-1 qRT-PCR quantitative Echtzeit-PCR Raf rapidly accelerated fibrosarcoma / rat fibrosarcoma Ras Rat sarcoma RNA Ribonukleinsäure rpm revolutions per minute (Umdrehungen pro Minute) RT Raumtemperatur S100 calcium-binding protein SCF Stammzellfaktor SMA smooth muscle actin SPP1 Secreted Phosphoprotein 1 Taq Thermus aquaticus TBE Tris-Borat-EDTA TGF Transforming Growth Factor TK Tyrosin-Kinase-Domäne TMA Tissue-Microarray(s) TNM Tumor, Nodes (Lymphknoten), Metastasen TSP Transkriptionsstartpunkt U Unit(s) UICC Union internationale contre le cancer UTR untranslatierter Bereich UV ultraviolett V Volt Einleitung 8 1 Einleitung 1.1 Der Gastrointestinale Stromatumor (GIST) 1.1.1 Einführung Gastrointestinale Stromatumoren (GIST) werden als spindelzellige, epitheloide oder als pleomorphe, mesenchymale Neoplasien des Gastrointestinaltraktes definiert (Miettinen and Lasota immunhistochemisch 2001). Ein nachweisbare charakteristisches zytoplasmatische Merkmal Expression stellt die eines als „Mast/stem cell growth factor receptor Kit“ bezeichneten Proteins dar (Hirota, Isozaki et al. 1998, Miettinen and Lasota 2001). KIT – auch als CD117 sowie Stem Cell Factor Receptor (SCFR) bezeichnet – ist eine Rezeptor-Tyrosinkinase und Genprodukt des Protoonkogens KIT. Der Begriff GIST wird das erste Mal im Jahr 1983 verwendet, als Mazur und Clark nichtepitheliale Neoplasien des Magen-Darm-Traktes aufgrund ihrer strukturellen und immunhistochemischen Eigenschaften von anderen Tumorentitäten unterscheiden und diese als Stromatumoren bezeichnen (Mazur and Clark 1983). Heutiger Annahme zufolge haben GIST ihren Ursprung in den Interstitiellen CajalZellen (ICC) bzw. deren Vorläuferzellen. ICC sind Schrittmacherzellen, welche im Bereich des Plexus myentericus der Darmwand lokalisiert sind, zwischen autonomem Nervensystem und glatten Muskelzellen vermitteln und so die Kontraktion des Gastrointestinaltraktes regulieren (Miettinen and Lasota 2001). Früher wurden diese Tumoren als Leiomyome, Leiomyosarkome oder Leiomyoblastome klassifiziert. 1.1.2 Epidemiologie Auch wenn GIST die häufigsten mesenchymalen Neoplasien im Gastrointestinaltrakt darstellen, sind sie insgesamt gesehen relativ selten und machen unter 1 % aller Tumoren des Gastrointestinaltraktes aus. Ihre Inzidenz wird mit 1,1 bis 1,45 Fälle pro Einleitung 9 100.000 Einwohner angegeben (Nilsson, Bümming et al. 2005, Tryggvason, Gíslason et al. 2005). Das National Cancer Institute der USA hat bei einer Analyse von 1458 Fällen der Jahre 1992 bis 2000 eine altersadaptierte Inzidenz von 0,68 Neuerkrankungen pro 100.000 Einwohner pro Jahr ermittelt (Tran, Davila et al. 2005). Das mittlere Erkrankungsalter liegt zwischen 60 und 70 Jahren, wobei beide Geschlechter in etwa gleich häufig betroffen sind (DeMatteo, Lewis et al. 2000, Miettinen, Sobin et al. 2005, Nilsson, Bümming et al. 2005, Tryggvason, Gíslason et al. 2005). 1.1.3 Lokalisation GIST können im gesamten Gastrointestinaltrakt vorkommen. Mit etwa 60 % stellt der Magen den häufigsten Manifestationsort dar, der Dünndarm macht circa 30 % aus. Im Kolon und im Rektum kommen unter 10 % der GIST vor, im Ösophagus sind es lediglich 3 % (Miettinen, Sarlomo-Rikala et al. 2000, Miettinen, Sarlomo-Rikala et al. 2000, Miettinen, El-Rifai et al. 2002, Miettinen, Sobin et al. 2005, Corless and Heinrich 2008). In der Literatur werden des Weiteren seltene Neoplasien beschrieben, welche zwar die Kriterien eines GIST erfüllen, aber keinen Bezug zur Wandung des Gastrointestinaltraktes aufweisen. Diese werden auch als eGIST (extragastrointestinale Stromatumoren) bezeichnet und kommen bevorzugt in Mesenterium und Omentum vor (Miettinen, Monihan et al. 1999, Llenas-García, Guerra-Vales et al. 2008). 1.1.4 Klinisches Bild GIST entwickeln sich typischerweise in der muskulären Wandung des Magen-DarmTraktes und können einerseits durch Vorwachsen in die Mukosa Ulzerationen mit klinischer Symptomatik verursachen, andererseits können sie sich auch Richtung Serosa entwickeln und längere Zeit unbemerkt bleiben. Die Symptome dieser Tumorerkrankung sind recht unspezifisch; erwähnenswert sind insbesondere ein frühes Sättigungsgefühl, Übelkeit, Erbrechen, abdominale Beschwerden, Anämie mit Abgeschlagenheit sowie gastrointestinale Blutungen (van der Zwan and DeMatteo 2005, Demetri, von Mehren et al. 2010). Einleitung Tumoren 10 von geringer Größe stellen sich häufig als Zufallsbefund bei endoskopischen Eingriffen, bildgebender Diagnostik oder chirurgischer Intervention am Magen-Darm-Trakt aus anderem Anlass dar (van der Zwan and DeMatteo 2005). Bei Diagnosestellung weisen bereits 20 bis 50 % der Patienten Metastasen auf (DeMatteo, Lewis et al. 2000, Nilsson, Bümming et al. 2005, Tryggvason, Gíslason et al. 2005). Der mit Abstand häufigste Metastasierungsort aggressiver Tumoren ist die Leber, gefolgt von einer peritonealen Absiedlung. Nur vereinzelt lassen sich extraabdominale Metastasen in Knochen, Haut und Lunge nachweisen (Miettinen and Lasota 2006). 1.1.5 Pathologie Gastrointestinale Stromatumoren lassen sich anhand ihrer Morphologie in drei Gruppen einteilen: Spindelzellige (70 %), epitheloide (20 %) oder gemischte Erscheinungsformen. Immunhistochemisch können sie durch die Expression der Rezeptor-Tyrosinkinase KIT (95 %) von anderen Tumorentitäten abgegrenzt werden. Weitere immunhistochemische Eigenschaften sind die Positivität für CD34 (60-70 %), SMA (smooth muscle actin, 30-40 %) und selten (5 %) S100 (Fletcher, Berman et al. 2002). Die Größe der Tumoren ist sehr heterogen und reicht von weniger als 1 cm bis über 40 cm. Im Mittel beträgt sie bei Stellung der Diagnose 5 cm (Corless and Heinrich 2008). Gewöhnlich manifestiert sich ein GIST als einzelner, solitärer Knoten, gelegentlich können aber auch Satellitenherde existieren. Die Konsistenz ist fleischartig und fest; zentrale zystische Degenerationen oder Nekrosen können vorhanden sein (Demetri, von Mehren et al. 2010). 1.1.6 Klassifikation Seit Anfang 2010 liegt erstmals eine TNM-Klassifikation für GIST und somit eine Stadieneinteilung nach der Union internationale contre le cancer (UICC) vor (Wittekind and Meyer 2010). Einleitung 11 Größe des LKFernMitosen pro - Stadium nach UICC Primärtumors in cm Metastasen metastasen 50 HPF Magen Dünndarm T1 T2 T3 T4 T1 T2 T3 T4 jedes T jedes T ≤2 >2-5 > 5 - 10 > 10 ≤2 >2-5 > 5 - 10 > 10 N0 N0 N0 N0 N0 N0 N0 N0 N1 jedes N M0 M0 M0 M0 M0 M0 M0 M0 M0 M1 ≤5 ≤5 ≤5 ≤5 >5 >5 >5 >5 jede jede IA IA IB II II II IIIA IIIB IV IV I I II IIIA IIIA IIIB IIIB IIIB IV IV Tabelle 1.1: Stadieneinteilung Gastrointestinaler Stromatumoren nach UICC [T = Tumorgröße; N = Lymphknotenmetastasen; M = Fernmetastasen] 1.1.7 Prognose Im Jahr 2002 wurde im Rahmen einer internationalen Konsensus-Konferenz eine Klassifikation zur Einschätzung der biologischen Aggressivität Gastrointestinaler Stromatumoren entwickelt (Fletcher, Berman et al. 2002). Besondere Bedeutung haben hierbei die Tumorgröße und die mitotische Aktivität der Tumorzellen (siehe Tabelle 1.2). Risiko sehr niedrig niedrig intermediär intermediär hoch hoch hoch Größe des Primärtumors in cm Mitosen pro 50 HPF <2 2-5 <5 5 - 10 >5 > 10 jede Größe <5 <5 6 - 10 <5 >5 jede Anzahl > 10 Tabelle 1.2: Abschätzung der Dignität bei GIST, basierend auf dem Vorschlag einer Konsensus-Konferenz aus dem Jahr 2002 (Fletcher, Berman et al. 2002) Eine weitere veröffentlichte Risikoklassifikation (Tabelle 1.3) berücksichtigt neben den beiden Parametern Tumorgröße und Mitoseindex auch die Lokalisation des Primärtumors (Miettinen and Lasota 2006). Grundlage für diese Klassifikation bildet Einleitung 12 eine retrospektive Studie mit annähernd 1700 Fällen (Miettinen, Sobin et al. 2005, Miettinen, Makhlouf et al. 2006). Gruppe 1 2 3a 3b 4 5 6a 6b Tumorgröße Mitosen in cm pro 50 HPF ≤2 >2-5 > 5 - 10 > 10 ≤2 >2-5 > 5 - 10 > 10 ≤5 ≤5 ≤5 ≤5 >5 >5 >5 >5 GIST des Magens GIST des Darms MalignitätsPatienten mit Malignitätspotenzial Progress, in % potenzial sehr niedriges niedriges niedriges intermediäres niedriges* intermediäres hohes hohes 0 1,9 3,6 12 0 16 55 86 0 4,3 24 52 50 73 85 90 sehr niedriges niedriges intermediäres hohes hohes* hohes hohes hohes * Anzahl der Fälle in dieser Kategorie zu gering, um eine Prognose abgeben zu können. Tabelle 1.3: Risikoklassifikation aus dem Jahr 2006, basierend auf einem großen Kollektiv (Miettinen and Lasota 2006) 1.1.8 Therapie Endoskopische bioptische Verfahren sind nur bei unklarer Diagnose empfohlen. Wenn jedoch eine neoadjuvante Therapie mit Imatinib (Glivec®; Novartis, Basel, Schweiz) eine chirurgische Entfernung mit besserem funktionellem Erfolg ermöglicht, so sind sie zur Diagnosesicherung notwendig (Blackstein, Blay et al. 2006). Eine chirurgische Intervention mit dem Ziel der R0-Resektion des Tumors ist insbesondere bei lokalisiertem Befund die Therapie der Wahl. Eine Ruptur der Tumorkapsel während der chirurgischen Entfernung oder ein mikroskopisch nachweisbarer Tumorbefall der Resektionsränder führen zu einem erhöhten Risiko für Rezidive und gehen mit einer Reduktion der Überlebenszeit des Patienten einher (Ng, Pollock et al. 1992, Chen, Liu et al. 2005). Eine Lymphadenektomie wird wegen der nur äußerst seltenen Metastasierungsbereitschaft in Lymphknoten nicht empfohlen (Blackstein, Blay et al. 2006). Für fortgeschrittene, metastasierte Stadien dieser Tumorerkrankung steht der Rezeptor-Tyrosinkinase-Inhibitor Imatinib zur Verfügung. Imatinib bindet kompetitiv an die ATP-Bindungsstelle des KIT-Rezeptors bzw. des PDGF-Rezeptors α und hemmt die weitere Signaltransduktion (Buchdunger, Cioffi et al. 2000). In Studien wurde gezeigt, dass die Einnahme von 400 mg Imatinib einmal täglich in der Einleitung 13 Behandlung ausreichend ist und eine Dosissteigerung auf 800 mg pro Tag keinen signifikanten Unterschied bezüglich der Überlebenszeit hat (Verweij, Casali et al. 2004, Blanke, Rankin et al. 2008). Patienten mit einer Mutation des Tumors im Exon 9 des KIT-Gens scheinen von einer höheren Dosis Imatinib zu profitieren (DebiecRychter, Sciot et al. 2006, Heinrich, Owzar et al. 2008). Nach einer Studie aus dem Jahr 2012 scheint die dreijährige Gabe von Imatinib nach kompletter chirurgischer Entfernung des Primärtumors das ereignisfreie Überleben bei Patienten mit einem Hochrisiko-GIST zu verlängern (Joensuu, Eriksson et al. 2012). 1.2 Molekulargenetik 1.2.1 Die Gene KIT und PDGFRA In etwa 80 % der GIST kann molekularpathologisch eine Mutation im KIT-Gen, bei fast 10 % im PDGFRA-Gen nachgewiesen werden (Hirota, Isozaki et al. 1998, Heinrich, Corless et al. 2003, Heinrich, Corless et al. 2003, Hirota, Ohashi et al. 2003, Steigen, Eide et al. 2007). Das Gen KIT (v-kit Hardy-Zuckerman 4 feline sarcoma viral oncogene homolog) besteht aus 21 Exons und ist auf dem langen Arm des Chromosoms 4 lokalisiert. Das Genprodukt ist ein membranständiges Protein (KIT, CD117, SCFR), welches als Typ-III-Rezeptor-Tyrosinkinase fungiert. Ligand des Rezeptors ist der Stammzellfaktor (SCF), ein Protein aus der Familie der Zytokine (Roskoski 2005). Das PDGFRA-Gen (platelet-derived growth factor receptor, alpha polypeptide) befindet sich ebenfalls auf dem langen Arm des Chromosoms 4 (Stenman, Eriksson et al. 1989). Die aus 23 Exons zusammengesetzte mRNA codiert ebenso für eine Typ-III-Rezeptor-Tyrosinkinase (PDGFRA, CD140a). Bei deren Ligand handelt es sich um den auf mesenchymale Zellen mitogen wirkenden Wachstumsfaktor PlateletDerived Growth Factor A (PDGF-A). Einleitung 14 1.2.1.1 Beschreibung der Rezeptor-Tyrosinkinasen KIT und PDGFRA sind zellmembrangebundene Proteine aus der Familie der Rezeptor-Tyrosinkinasen (EC 2.7.10.1). Sie bestehen aus einem extrazellulären Bereich (ED), welcher aus fünf immunglobulinähnlichen Einheiten aufgebaut ist, einem juxtamembranären Anteil (JMD) sowie zwei Tyrosin-Kinase-Domänen. Die erste Tyrosin-Kinase-Domäne (TK1) beinhaltet einen ATP-bindenden Bereich, die zweite (TK2) eine Phosphotransferase-Region (Lasota and Miettinen 2008). Durch die intrazellulär lokalisierte Tyrosinkinasen kann eine reversible Phosphorylierung von Proteinen erfolgen (Lennartsson, Jelacic et al. 2005). KIT wird durch die Bindung seines Liganden SCF als Dimer aktiviert, wodurch eine Homodimerisierung des Rezeptors und eine Aktivierung der Tyrosinkinase ausgelöst werden (Blume-Jensen, Claesson-Welsh et al. 1991, Philo, Wen et al. 1996). Das gleiche Prinzip gilt auch für den PDGF-Rezeptor α, wobei dieser durch das dimere Glykoprotein PDGF-A stimuliert wird. Abbildung 1.1: Schematische Darstellung des KIT- bzw. des PDGFRA-Rezeptors mit Zuordnung von Genabschnitten und Proteindomänen. ED: Extrazelluläre Domäne, JMD: Juxtamembranäre Domäne, TK1: Tyrosin-Kinase-Domäne 1, TK2: Tyrosin-Kinase-Domäne 2 (Abbildung modifiziert nach Miettinen and Lasota 2006, Wardelmann, Büttner et al. 2007) Gain-of-function-Mutationen in einem der beiden Gene führen zu einer ligandenunanbhängigen Aktivierung der Rezeptor-Tyrosinkinasen mit permanenter Phosphorylierung und Aktivierung nachgeschalteter Signalwege (Lasota and Miettinen 2008). Mutationen können die regulatorischen Einheiten des Rezeptors (ED und JMD) oder die enzymatischen Regionen (TK1 und TK2) betreffen (Longley, Reguera et al. 2001). Die Juxtamembranäre Domäne hat eine autoinhibitorische Einleitung 15 Funktion und verhindert die Aktivierung eines monomeren Rezeptors (Mol, Dougan et al. 2004). Bei einer Mutation in dieser Domäne ist diese Autoregulation außer Kraft gesetzt und die Kinase kann aktiv werden (Chan, Ilangumaran et al. 2003). Auch bei einer Mutation in der Extrazellulären Domäne handelt es sich um eine gain-offunction-Mutation, welche zur Homodimerisierung des Rezeptors führt (Lasota and Miettinen 2008). Ist die Tyrosin-Kinase-Domäne 2 von einer Mutation betroffen, führt das zu einer Veränderung einer Aktivierungsschleife, welche die ATP-Bindungsstelle beeinflusst und ebenfalls zur Aktivierung der Kinase führt (Rubin, Heinrich et al. 2007). 1.2.1.2 Mutationen im KIT-Gen Die meisten Mutationen des KIT-Gens betreffen mit rund 75 % die Juxtamembranäre Domäne und sind somit im Exon 11 lokalisiert. Es kommen sowohl Deletionen, Punktmutationen als auch Duplikationen vor. Deletionen stellen hierbei den größten Anteil dar und können einen Verlust von drei bis zu 30 Nukleotiden aufweisen (Lasota and Miettinen 2008). Tumoren, die eine Deletion in diesem Exon aufweisen, scheinen ein klinisch aggressiveres Verhalten zu zeigen und betroffene Patienten haben ein erhöhtes Rezidivrisiko sowie ein kürzeres Überleben (Andersson, Bümming et al. 2006, Cho, Kitadai et al. 2006, Steigen, Eide et al. 2007). Im Exon 9 des KIT-Gens sind 10-15 % aller Mutationen lokalisiert, meist kommen hier Duplikationen vor (Lux, Rubin et al. 2000). Diese Tumoren manifestieren sich vorwiegend im Dünndarm und scheinen mit einem ungünstigen klinischen Verlauf assoziiert zu sein (Antonescu, Sommer et al. 2003). Mutationen im Exon 13 sowie Exon 17 sind sehr selten, stellen jeweils Punktmutationen dar und betreffen die Tyrosin-Kinase-Domänen des KIT-Rezeptors (Lux, Rubin et al. 2000, Lasota, Corless et al. 2008). 1.2.1.3 Mutationen im PDGFRA-Gen Im Gegensatz zu KIT-Mutationen, von denen lediglich die Minderheit die TyrosinKinase-Domäne 2 des Rezeptors betrifft, kommen Mutationen des PDGFRA-Gens am häufigsten im Exon 18 vor und haben somit Auswirkungen auf die TK2 Domäne des PDGF-Rezeptors α (Lasota and Miettinen 2008). Die Mehrheit stellen Einleitung 16 Punktmutationen dar, die mit einer gastralen Lokalisation sowie epitheloiden Morphologie des Tumors und einem günstigen klinischen Verlauf korrelieren (Lasota, Dansonka-Mieszkowska et al. 2004). Die Juxtamembranäre Domäne wird durch das Exon 12 repräsentiert und ist von einer Mutation am zweithäufigsten betroffen (Corless and Heinrich 2008). Weiterhin können selten Punktmutationen im Exon 14 nachgewiesen werden, wodurch die Tyrosin-Kinase-Domäne 1 beeinflusst wird (Lasota, Stachura et al. 2006). 1.2.2 Das Gen BRAF Das aus 18 Exons bestehende BRAF-Gen (v-raf murine sarcoma viral oncogene homolog B1) befindet sich auf dem langen Arm des Chromosoms 7. Es codiert für die Isoform B-Raf aus der Familie der Raf-Proteine (rapidly accelerated fibrosarcoma oder rat fibrosarcoma). Hierbei handelt es sich um eine Serin/Threonin-Proteinkinase aus der Klasse EC 2.7.11.1, welche durch das GTP-bindende Protein Ras aktiviert wird und eine zentrale Stellung im Ras-Raf-MEK-ERK-Signalweg einnimmt (Avruch, Khokhlatchev et al. 2001, Peyssonnaux and Eychène 2001). 1.2.2.1 Beschreibung der Serin/Threonin-Proteinkinase Serin/Threonin-Proteinkinasen sind im Zytoplasma lokalisiert und werden u.a. durch extrazelluläre Signale über Rezeptor-Tyrosinkinasen mit nachfolgender Signaltransduktion über die aktive, GTP-gebundene Form von Ras aktiviert (Hilger, Scheulen et al. 2002). Aktivierte Raf-Proteine phosphorylieren MAP-Kinasen-Kinasen (MEK 1 und 2), diese wiederum MAP-Kinasen (ERK 1 und 2), wodurch mitunter nukleäre Transkriptionsfaktoren aktiviert werden (Agaimy, Terracciano et al. 2009). 1.2.2.2 Mutationen im BRAF-Gen In GIST, welche keine Mutationen des KIT- oder PDGFRA-Gens aufweisen, kann selten die Substitution p.V600E im Exon 15 des BRAF-Gens nachgewiesen werden (Agaram, Wong et al. 2008, Agaimy, Terracciano et al. 2009, Hostein, Faur et al. 2010). Durch diese Mutation wird eine Phosphorylierung der Kinase- Einleitung 17 Aktivierungsdomäne des Proteins imitiert, was zu einer dauerhaften Aktivierung der Kinase führt (Hostein, Faur et al. 2010). 1.3 Epigenetik Unter Epigenetik werden alle vererbbaren Veränderungen in der Genexpression bezeichnet, welche nicht in der DNA-Sequenz selbst kodiert sind. Dabei sind besonders DNA-Methylierung, Histon-Modifikation und RNA-Interferenz von Bedeutung (Egger, Liang et al. 2004). Methylierungen der DNA betreffen bei Eukaryoten die Pyrimidinbase Cytosin (5Methylcytosin) und kommen hauptsächlich in Cytosin-Guanin-Dinukleotidsequenzen (CpG) vor (DOSKOCIL and SORM 1962, Grippo, Iaccarino et al. 1968, Stein, Gruenbaum et al. 1982, Jeltsch 2002). Bei eukaryoten Lebewesen sind etwa zwei bis sieben Prozent aller Cytosine der DNA methyliert (Vanyushin, Tkacheva et al. 1970). 1.3.1 DNA-Methylierung und Genexpression Erste Untersuchungen zum möglichen Zusammenhang von DNA-Methylierung von Genen und ihrer Expression wurden Ende der 80er Jahre durchgeführt, kurze Zeit später auch am menschlichen Globin-Gen (Waalwijk and Flavell 1978, McGhee and Ginder 1979, van der Ploeg and Flavell 1980). Durch die Methylierung von CpG-Sites in der Promotorregion eines Gens wird eine verminderte Expression dieses Gens erreicht, dabei scheinen drei mögliche Wege relevant zu sein: Die Methylierung der Promotorregion führt erstens zur verminderten Bindung von Transkriptionsfaktoren, zweitens zur vermehrten direkten Bindung von als Repressor agierenden Proteinen und drittens beeinflusst sie die Deacetylierung von Histonen, was zu einer verstärkten Chromatinkondensation und damit zu einer Hemmung der Genexpression führt (Kass, Pruss et al. 1997, Siegfried and Cedar 1997, Jeltsch 2002). 1.3.2 DNA-Methylierung und Karzinogenese Untersuchungen zur DNA-Methylierung in verschiedenen Tumorgeweben haben gezeigt, dass sowohl Hypomethylierungen als auch Hypermethylierungen der DNA Einleitung 18 beobachtet werden können (Feinberg and Vogelstein 1983, Feinberg and Vogelstein 1983, Gama-Sosa, Slagel et al. 1983, Jones and Laird 1999, Baylin and Herman 2000, Ehrlich 2002). Die Hypomethylierung betrifft meist weite Bereiche des Genoms, während von der Hypermethylierung spezifische Regionen betroffen sind (Jeltsch 2002). Zu diesen Regionen zählen CpG-Sites, welche weit vor dem 5‘-Ende eines Gens gelegen sind, und CpG-Sites im Bereich des Transkriptionsstartpunktes des Gens (Dai, Lakshmanan et al. 2001, Nguyen, Liang et al. 2001, Ehrlich 2002). Als Transkriptionsstartpunkt wird das erste Nukleotid eines transkribierten Gens bezeichnet, er markiert den Beginn des ersten Codons einer mRNA bzw. den für diesen mRNA codierenden DNA-Bereich. 1.3.3 5-Azacytidin Bei Zellversuchen zur DNA-Methylierung wird oft 5-Azacytidin (5-azaC), ein potentes demethylierendes Agens, eingesetzt. Hierbei handelt es sich um ein CytosinAnalogon, welches an Position 5 des Pyrimidinrings anstatt eines Kohlenstoffatoms ein Stickstoffatom trägt und daher nicht methyliert werden kann (Razin and Riggs 1980). Bereits 1979 konnte gezeigt werden, dass es eine Abnahme der DNAMethylierung in E. coli durch Hemmung einer DNA-Methyltransferase bewirkt (Friedman 1979). An Hühnerzellen wurde nachgewiesen, dass die Behandlung mit 5azaC zu einer Demethylierung des inaktiven ev-1-Locus in endogenen Retroviren führt und somit eine Aktivierung der Trankription des Gens induziert (Groudine, Eisenman et al. 1981). 1.4 Proteinexpression 1.4.1 Hematopoietic progenitor cell antigen CD34 Das „Hematopoietic progenitor cell antigen CD34“ ist Produkt des auf dem langen Arm des Chromosoms 1 gelegenen Gens CD34. Es ist ein transmembranäres Glykophosphoprotein, welches erstmals 1984 in frühen hämatopoetischen Stammsowie Vorläuferzellen nachgewiesen wurde. Des Weiteren konnte die Expression in Endothelien kleiner Gefäße sowie verschiedenen mesenchymalen Zellen nachgewiesen werden (Civin, Strauss et al. 1984, Beschorner, Civin et al. 1985, Einleitung 19 Katz, Tindle et al. 1985, Andrews, Singer et al. 1986, Fina, Molgaard et al. 1990, Brown, Greaves et al. 1991, Young, Baumhueter et al. 1995). Untersuchungen zur Regulation von CD34 in hämatopoetischen Zellen haben gezeigt, dass es durch die aktivierte Form der Proteinkinase C phosphoryliert werden kann (Fackler, Civin et al. 1990). Die Funktion von CD34 ist bis heute noch nicht ausreichend geklärt, es wird vermutet, dass das Protein unter anderem eine Rolle bei der Zelladhäsion spielt (Krause, Fackler et al. 1996, Hu and Chien 1998, Lanza, Healy et al. 2001). Es konnte dargestellt werden, dass die Expression von CD34 in kultivierten Endothelzellen supprimiert ist, wenn gleichzeitig Adhäsionsmoleküle hochreguliert sind (Delia, Lampugnani et al. 1993). Daraus lässt sich die Annahme ableiten, dass CD34 eine negative Rolle bei der Regulation der Zelladhäsion spielt (Robinson, Sircar et al. 2000). Daher wurde die Hypothese aufgestellt, die CD34-Expression in GIST sei mit einem Verlust der Adhäsionsfähigkeit der Tumorzellen verknüpft (van de Rijn, Hendrickson et al. 1994). Zur Klärung der Frage, ob GIST von den Interstitiellen Cajal-Zellen (ICC) bzw. deren Vorläuferzellen abstammen, wurde in mehreren Studien die immunhistochemischen Profile beider Zellarten untersucht und miteinander verglichen. Dabei spielte vor allem die Expression von KIT sowie von CD34 eine entscheidende Rolle. Einige Autoren beschreiben ICC als die einzigen Zellen im Gastrointestinaltrakt, die sowohl KIT- als auch CD34-positiv sind und begründen unter anderem damit die Verwandtschaft von GIST und ICC (Hirota, Isozaki et al. 1998, Sircar, Hewlett et al. 1999). Vanderwinden hingegen vertritt die Ansicht, dass es zwar CD34-positive Zellen im Darmtrakt gibt, dabei handele es sich jedoch um KIT-negative, fibroblastenähnliche Zellen, welche lediglich an KIT-positive ICC angrenzen (Vanderwinden, Rumessen et al. 2000). In einer Studie zur mRNA- Expressionsanalyse von KIT und CD34 wird die Doppel-Positivität für beide Marker lediglich in einer Minderheit der ICC gefunden und die Autoren stellen die Vermutung auf, dass KIT-positive, CD34-positive GIST von dieser ICC-Untergruppe abstammen könnten (Robinson, Sircar et al. 2000). Die Mehrheit, aber bei weitem nicht alle GIST sind immunhistochemisch positiv für CD34 (Hirota, Isozaki et al. 1998). Miettinen konnte eine Korrelation der CD34Expression und der anatomischen Lokalisation des Tumors zeigen. Nahezu alle Einleitung 20 Tumoren aus Ösophagus und Rektum und 90 % der GIST des Magens sind in dieser Studie positiv für CD34; in Dünndarm und Kolon konnte dies hingegen nur für die Hälfte der Tumoren nachgewiesen werden (Miettinen, Sobin et al. 2000). 1.4.2 Prominin-1 Prominin-1 ist ein in der Zellmembran lokalisiertes Glykoprotein und besteht aus fünf transmembranären Domänen, an zwei extrazellulär gelegenen Proteinschleifen sind N-glykosidisch Zuckerreste gebunden (Jászai, Fargeas et al. 2007). Prominin-1 ist Genprodukt von PROM1 (auch als PROML1, CD133, AC133 oder RP41 bezeichnet) und wurde erstmals 1997 als Oberflächenmarker hämatopoetischer und neuronaler Stamm- bzw. Vorläuferzellen beschrieben (Weigmann, Corbeil et al. 1997, Yin, Miraglia et al. 1997). Die physiologische Proteinfunktion ist noch nicht ausreichend geklärt, sie scheint eine Rolle bei der Aufrechterhaltung der Lipidzusammensetzung und Strukturierung der Zellmembran zu spielen (Corbeil, Röper et al. 2001, Fargeas, Joester et al. 2004, Mizrak, Brittan et al. 2008). Neben „normalen“ Stamm- und Vorläuferzellen exprimieren Stammzellen von Tumorgeweben, die auch als tumorinitiierende Zellen bezeichnet werden, ebenfalls Prominin-1 (Jordan, Guzman et al. 2006, Tirino, Camerlingo et al. 2009, Shi, Tian et al. 2010). Es gilt derzeit als einer der wichtigsten Oberflächenmarker für diese Art von Tumorstammzellen, wobei die Expression von Prominin-1 immer mehr als nachteiliger Parameter in Erscheinung tritt. Für verschiedene Tumoren, u. a. für Gliome und Medulloblastome, konnte eine Korrelation bezüglich hoher Expression und ungünstigem klinischen Verlauf gezeigt werden (Zeppernick, Ahmadi et al. 2008, Raso, Mascelli et al. 2011). Bei kolorektalen Karzinomen scheinen PROM1-positive Tumoren resistenter gegen eine 5-Fluoruracil-basierte Chemotherapie zu sein als Karzinome ohne PROM1-Expression (Ong, Kim et al. 2010). Zwei Untersuchungen zur Regulation der Expression in Tumoren haben gezeigt, dass die PROM1-Expression epigenetisch – durch Veränderung der DNAMethylierung in der Promotorregion des Gens – beeinflusst wird, wobei eine hohe Methylierung zu einer geringen Expression des Proteins führt (Yi, Tsai et al. 2008, You, Ding et al. 2010). Weiter sind verschiedene Signaltransduktionswege in die Regulation involviert. So hemmt der Transkriptionsfaktor HIF-1α über den mTOR- Einleitung 21 Signalweg die PROM1-Expression, während das Zytokin TGF-β1, vermutlich über Hypomethylierung der Promotorregion, die Transkription erhöht (Matsumoto, Arao et al. 2009, You, Ding et al. 2010). Neuere Studien zur Expression von PROM1 in GIST legen die Annahme nahe, dass dieses Glykoprotein in GIST generell exprimiert wird und keine Tumorstammzellen repräsentiert (Bozzi, Conca et al. 2011, Chen, Guo et al. 2012). In einer Studie konnte dargestellt werden, dass die Expression bei GIST mit einer Mutation im Exon 11 des KIT-Gens, einer gastralen Lokalisation sowie Gesamtüberleben assoziiert ist (Arne, Kristiansson et al. 2011). einem kürzeren Einleitung 22 1.5 Fragestellung und Zielsetzung Die meisten Gastrointestinalen Stromatumoren weisen eine aktivierende Mutation des KIT- oder PDGFRA-Gens auf. Ca. 60-70 % der GIST zeigen eine Positivität für CD34, die PROM1-Expression wurde bisher in nur wenigen Studien untersucht, mit sehr unterschiedlichen Ergebnissen zur Immunopositivität. In der vorliegenden Dissertation sollen folgende Fragen untersucht werden: 1) Welche Mutationen im KIT-, PDGFRA- und BRAF-Gen können in diesem Kollektiv beobachtet werden und spiegelt der Mutationsstatus die in der Literatur angegebenen Verteilungen wieder? 2) Welche Zusammenhänge bestehen zwischen DNA-Methylierung im Promotorbindungsbereich des CD34-Gens bzw. der Proteinexpression von CD34 und den klinisch-pathologischen Parametern dieses Kollektivs? 3) Welche Zusammenhänge bestehen zwischen DNA-Methylierung im Promotorbindungsbereich des PROM1-Gens bzw. der Proteinexpression von PROM1 und den klinisch-pathologischen Parametern dieses Kollektivs? 4) Kann ein Rückschluss auf die Regulation der CD34- bzw. PROM1-Expression in GIST gezogen werden? 5) Welchen Krankheitsverlauf zeigen Patienten, deren Tumor eine geringe DNAMethylierung des PROM1-Gens bzw. hohe Expression des Proteins aufweist? 6) Lässt sich daraus für Prominin-1 eine mögliche prognostische Bedeutung ableiten anhand derer der Krankheitsprogress bei GIST eingeschätzt werden kann? Material und Methoden 23 2 Material und Methoden 2.1 Untersuchungsmaterial Das untersuchte Kollektiv besteht aus 104 primären GIST. Sämtliches Tumormaterial lag als FFPE-Material vor. Die Proben stammen zum einen aus dem Institut für klinische Pathologie des Universitätsklinikums Freiburg (n = 50), zum anderen aus dem Institut für Pathologie der St. Vincentius-Kliniken gAG Karlsruhe (n = 54). Das Kollektiv umfasst einen Zeitraum von 18 Jahren und beinhaltet Präparate von 1992 bis 2010. 2.2 DNA-Isolierung aus formalinfixierten und paraffineingebetteten Geweben Für die Mutationsanalyse der Gene KIT, PDGFRA und BRAF sowie für die Methylierungsanalyse der Gene CD34 und PROM1 wurde DNA aus Tumorzellen benötigt. Es wurden HE-Schnitte aller formalinfixierten und paraffineingebetteten Gewebeproben (FFPE) angefertigt und das Tumorareal unter einem Lichtmikroskop (Axiolab re Microscope; Carl Zeiss, Oberkochen) markiert. Mit Hilfe eines Skalpells wurden die entsprechenden Gewebeblöcke derart präpariert, dass mit einem Schlittenmikrotom (Leica SM2000 R; Leica Biosystems, Nussloch) 5 bis 10 µm dicke Schnitte angefertigt werden konnten, welche ausschließlich Tumorgewebe enthielten. Je nach Größe und Qualität (Nekrosen, Einblutungen) des Tumorareals waren hierfür vier bis zehn Schnitte notwendig. Nach Verbringen der Schnitte in 1,5-mlReaktionsgefäße (E-Cup) konnte mit der Entparaffinierung begonnen werden. Dafür wurden in jedes E-Cup 1000 µl Roticlear® (Carl Roth, Karlsruhe) pipettiert, anschließend gevortext (VORTEX 3; Ika, Staufen) und die Proben für 10 min in einem Thermomixer (Thermomixer comfort; Eppendorf, Hamburg) bei 60 °C und 1000 Umdrehungen pro Minute (rpm) inkubiert. Nach einer 5-minütigen Zentrifugation (Centrifuge 5417 R, Centrifuge 5424 R; Eppendorf, Hamburg) bei 10500 rpm und Raumtemperatur (RT) wurde der Überstand vorsichtig abpipettiert und verworfen. Alle genannten Schritte zur Entparaffinierung wurden insgesamt dreimal durchgeführt. Es folgten zwei Waschschritte mit Ethanol (Ethanol absolut puriss. p.a.; Sigma-Aldrich, Steinheim). Hierfür wurden jeweils 1000 µl Ethanol in Material und Methoden 24 jedes E-Cup pipettiert, gevortext und für 10 min bei RT und gelegentlichem Vortexen inkubiert. Im Anschluss wurde 5 min bei 10500 rpm zentrifugiert und der Überstand mit Hilfe einer Wasserstrahlpumpe abgesaugt. Das verbleibende Pellet musste nun 10 min bei 45 °C in einer Vakuumzentrifuge (Concentrator 5301; Eppendorf, Hamburg) vollständig getrocknet werden. Die Resuspension erfolgte mit 50 bis 200 µl Proteinase-K-Puffer (0,5 % Tween 20; 50 mM Tris-HCl, pH 8,5; 1 mM EDTA, pH 8,0), abhängig von der Größe des Pellets. Nach einer Inkubationszeit von 10 min bei 80 °C und 700 rpm im Thermomixer und nach Abkühlen auf RT wurde in jedes ECup die Menge an Proteinase K (Proteinase K solution; Qiagen, Hilden) gegeben, welche 10 % der verwendeten Puffermenge entsprach (5 bis 20 µl). Um einen effektiven Verdau aller Proteine mit Hilfe der verwendeten Serinprotease zu ermöglichen, mussten die E-Cups über Nacht im Thermomixer bei 37 °C und 750 rpm inkubiert werden. Am darauf folgenden Tag erfolgte die Inaktivierung der Proteinase K durch Kochen aller Proben im Wasserbad für 20 min. Nach anschließender Abkühlung auf Eis und 10-minütiger Zentrifugation bei 10500 rpm konnte der Überstand in sterile 1,7-ml-Schraubgefäße (Twist Top® Vials, sterile Ausführung; Carl Roth, Karlsruhe) überführt werden. Bevor die Desoxyribonukleinsäure-Lösungen weiterverwendet werden konnten, war es notwendig, die Konzentration sowie die Qualität und die Reinheit der Lösungen zu ermitteln. Zur Bestimmung der DNA-Konzentration wurde von jeder Probe das Absorptionsmaximum bei 260 nm photometrisch bestimmt. Dabei wurde von folgendem Zusammenhang für doppelsträngige DNA ausgegangen: OD260 = 1 entspricht 50 µg/ml. Die Messung erfolgte mit Hilfe eines Spektralphotometers (NanoDrop ND-1000; PEQLAB Biotechnologie GmbH, Erlangen). Hierfür wurden jeweils 1,5 µl Probe auf die Messoberfläche pipettiert. Nach der Messung konnte direkt die Konzentration in ng/µl abgelesen werden. Des Weiteren war es möglich, die Reinheit der DNA – insbesondere in Bezug auf die Kontamination mit Proteinen – zu überprüfen, da zusätzlich die Extinktion bei 280 nm gemessen wurde. Aus den beiden Werten konnte ein 260/280-Quotient gebildet werden, wobei Werte von 1,8 bis 2,0 als optimal galten. Zur Abschätzung der Qualität der DNA-Lösungen erfolgte eine elektrophoretische Trennung in einem 1,2 %igen Agarosegel. Dafür wurden 1,2 g Agarose (peqGOLD Material und Methoden 25 Universal-Agarose; PEQLAB Biotechnologie GmbH, Erlangen) mit 100 ml 1-fach konzentriertem TBE-Puffer (Tris-Borat-EDTA-Puffer, 89 mM Tris-Base, 89 mM Borsäure, 2 mM EDTA) in einem Erlenmeyerkolben gemischt und bei 600 Watt für 3 min in der Mikrowelle erhitzt, bis eine vollständige Lösung der Agarose eintrat. Nach Abkühlen des Erlenmeyerkolbens unter fließendem Wasser wurde ein Tropfen Ethidiumbromid (Lösung 0,07 %; AppliChem GmbH, Darmstadt) zugegeben, welches mit den Basen der DNA interkaliert und bei Anregung mit ultraviolettem Licht zu einer Fluoreszenz führt. Das Gel wurde auf einen mit einem Kamm versehenen UVdurchlässigen Gelträger mit Gummidichtungen (PEQLAB Biotechnologie GmbH, Erlangen) gegossen. Nach Aushärten des Gels wurden in die Geltaschen jeweils 12 µl vorbereitete Lösung, bestehend aus 2500 ng DNA, 2 µl Loading Dye (6x Loading Dye Solution; Fermentas, St. Leon-Roth) und H2O (AccuGene Molecular Biology Water; Lonza, Basel, Schweiz), pipettiert. Als Referenz dienten jeweils 6 µl einer 1kb-DNA-Leiter (GeneRuler™ 1 kb DNA Ladder, ready-to-use; Fermentas St. LeonRoth) und einer 50-bp-DNA-Leiter (GeneRuler™ 50 bp DNA Ladder, ready-to-use; Fermentas St. Leon-Roth). Die Auftrennung erfolgte bei einer angelegten Spannung von 120 V für 60 min in einer mit TBE-Puffer gefüllten horizontalen Gelelektrophoreseapparatur (PerfectBlue™ Gelsystem Mini; PEQLAB Biotechnologie GmbH, Erlangen). Anschließend konnte das Agarosegel unter UV-Licht betrachtet, fotografiert und digital gespeichert werden. Abbildung 2.1: Gelkontrolle zur Bewertung der DNA-Qualität [links: 1-kb-DNA-Leiter; daneben: DNA-Lösungen (250 ng DNA / µl); rechts: 50-bp-DNA-Leiter] Bis zur weiteren Verwendung erfolgte die Aufbewahrung der Nukleinsäurelösungen lichtgeschützt bei +4 °C. Material und Methoden 26 2.3 Mutationsanalyse 2.3.1 Amplifizierung der zu evaluierenden Genabschnitte Um eine Mutationsanalyse der gewünschten Sequenzen durchführen zu können, musste der entsprechende Genabschnitt zunächst amplifiziert werden. Dies geschah mittels der Polymerase-Ketten-Reaktion (PCR). 2.3.1.1 Durchführung der Polymerase-Ketten-Reaktion Pipettenspitzen, 200-µl-PCR-Reaktionsgefäße, E-Cups und H 2O (AccuGene Molecular Biology Water; Lonza, Basel, Schweiz) wurden für 30 min unter UV-Licht bestrahlt, um eine mögliche Kontamination zu vermeiden. Die Proben-DNA wurde auf eine einheitliche Konzentration von 100 ng DNA pro µl durch Hinzufügen von entsprechender Menge H2O verdünnt. Ein hergestellter Master-Mix beinhaltete für die Amplifizierung der Exons 9, 11 und 17 des KIT-Gens sowie der Exons 10, 12, 14 und 18 des PDGFRA-Gens pro Probe folgende Reagenzien: 2,5 µl 10-fach-PCRPuffer S inklusive 15 mM MgCl 2 (Genaxxon BioScience GmbH, Ulm); 0,5 µl dNTPMix (10 mM each; Fermentas, St. Leon-Rot); 1 µl Primer forward und 1 µl Primer reverse (jeweils 10 µM; Eurofins MWG GmbH, Ebersberg); 0,15 µl (= 0.75 U) TaqPolymerase (Genaxxon BioScience GmbH, Ulm) sowie 17,85 µl H2O. Menge Einheit Reagenz Endkonzentration 2,50 μl Puffer 10x, inkl. 15 mM MgCl2 1x, 1,5 mM 0,50 μl dNTP 10 mM 0,2 mM 1,00 μl Primer F 10 μM 0,4 μM 1,00 μl Primer R 10 μM 0,4 μM 2,00 μl DNA ca. 200 ng 17,85 μl H2O AccuGene 0,15 μl DF Taq Polymerase = 0,75 U Tabelle 2.1: PCR-Ansatz (25 µl) für KIT Exons 9, 11 und 17 sowie PDGFRA Exons 10, 12, 14 und 18 Material und Methoden 27 Für das Exon 13 des KIT-Gens sowie für das Exon 15 des BRAF-Gens wurde eine höhere Magnesiumchloridkonzentration verwendet. Der Exon-13-Master-Mix beinhaltete pro Probe 2,5 µl 10-fach-PCR-Puffer S ohne MgCl2 (Genaxxon BioScience GmbH, Ulm); 2,5 µl MgCl2 (25 mM); 0,5 µl dNTP-Mix (10 mM); 1 µl Primer forward und 1 µl Primer reverse (jeweils 10 µM); 0,15 µl (= 0.75 U) TaqPolymerase sowie 15,35 µl H 2O. Menge Einheit Reagenz Endkonzentration 2,50 μl Puffer 10x, ohne MgCl2 1x 2,50 μl MgCl2 25 mM 2,5 mM 0,50 μl dNTP 10 mM 0,2 mM 1,00 μl Primer F 10 μM 0,4 μM 1,00 μl Primer R 10 μM 0,4 μM 2,00 μl DNA ca. 200 ng 15,35 μl H2O AccuGene 0,15 μl DF Taq Polymerase = 0,75 U Tabelle 2.2: PCR-Ansatz (25 µl) für KIT Exon 13 Für das BRAF-Exon 15 wurden pro Probe 2,5 µl 10-fach-PCR-Puffer S ohne MgCl2; 2,5 µl MgCl2; 1,0 µl dNTP-Mix (10 mM); 1 µl Primer forward und 1 µl Primer reverse (jeweils 10 µM); 0,25 µl (= 1.25 U) Taq-Polymerase sowie 14,75 µl H 2O verwendet. Menge Einheit Reagenz Endkonzentration 2,50 μl Puffer 10x, ohne MgCl2 1x 2,50 μl MgCl2 25 mM 2,5 mM 1,00 μl dNTP 10 mM 0,4 mM 1,00 μl Primer F 10 μM 0,4 μM 1,00 μl Primer R 10 μM 0,4 μM 2,00 μl DNA ca. 200 ng 14,75 μl H2O AccuGene 0,25 μl DF Taq Polymerase = 1,25 U Tabelle 2.3: PCR-Ansatz (25 µl) für BRAF Exon 15 Material und Methoden 28 Jeweils 23 µl eines Master-Mixes wurden in 200-µl-PCR-Tubes pipettiert und 2 µl zu untersuchende, vorverdünnte Proben-DNA (200 ng) zugefügt. Bei allen durchgeführten PCRs wurde eine Negativ-Kontrolle mitgeführt, welche anstelle von DNA 2 µl H2O enthielt. Somit konnte eine mögliche Kontamination mit Fremd-DNA während des Pipettierprozesses ausgeschlossen werden. Die Tubes wurden kurz abzentrifugiert und in einen Thermocycler (Thermocycler T3000; Biometra, Göttingen) gestellt. Entsprechend dem zu amplifizierenden Exon wurde das benötigte PCR-Programm gewählt (siehe Tabelle 2.4). Gen BRAF KIT KIT Exon 15 Schritt Zeit Temp. Zyklenanzahl 1. Initiale Denaturierung 2. Denaturierung 3. Annealing 4. Elongation 5. Abschließende Elongation 5 min 1 min 1 min 1 min 5 min 95 °C 95 °C 55 °C 72° C 72 °C 45 Zyklen 9 11 13 1. Initiale Denaturierung 2. Denaturierung 3. Annealing 4. Elongation 5. Abschließende Elongation 2,30 min 30 sec 40 sec 30 min 5 min 95 °C 95 °C 57 °C 72° C 72 °C 45 Zyklen 17 1. Initiale Denaturierung 2. Denaturierung 3. Annealing 4. Elongation 5. Abschließende Elongation 2,30 min 30 sec 40 sec 30 min 5 min 95 °C 95 °C 60 °C 72° C 72 °C 45 Zyklen 1. Initiale Denaturierung 2. Denaturierung 3. Annealing 4. Elongation 5. Abschließende Elongation 5 min 40 sec 15 sec 35 sec 5 min 95 °C 95 °C 61 °C 72° C 72 °C 35 Zyklen PDGFRA 10 12 14 PDGFRA 18 Tabelle 2.4: Übersicht der verwendeten PCR-Programme Material und Methoden 29 2.3.1.2 PCR-Primer Die lyophilisierten, unmodifizierten, HPLC-aufgereinigten (High Performance Liquid Chromatography) Oligonukleotide (Eurofins MWG GmbH, Ebersberg) wurden mit der angegebenen Menge H2O resuspendiert und Verdünnungen mit einer Konzentration von 10 µM hergestellt. In der folgenden Tabelle (Tabelle 2.5) sind die Sequenzen der für die PCRs verwendeten Primer aufgeführt. Gen KIT PDGFRA BRAF Exon Primersequenz forward reverse forward 11 reverse forward 13 reverse forward 17 reverse 5'5'5'5'5'5'5'5'- CAGGGCTTTTGTTTTCTTCC ATCATGACTGATATGGTAGACAGAGC GTGCTCTAATGACTGAGAC TACCCAAAAAGGTGACATGG GCTTGACATCAGTTTGCCAG ATAACCTGACAGACAATAAAAGG AAGTTAGTTTTCACTCTTTACAAG TTGAAACTAAAAATCCTTTGCAGGAC forward reverse forward 12 reverse forward 14 reverse forward 18 reverse 5'5'5'5'5'5'5'5'- CCCAACTCCTTGCCATCTTA CAGCTCTCGGTTCTCAGCTC TCCAGTCACTGTGCTGCTTC GCAAGGGAAAAGGGAGTCTT TGGTAGCTCAGCTGGACTGAT GGGATGGAGAGTGGAGGATT CAGCTACAGATGGCTTGATC GAAGGAGGATGAGCCTGAC 9 10 15 forward 5'- TCATAATGCTTGCTCTGATAGGA reverse 5'- GGCCAAAAATTTAATCAGTGGA Tabelle 2.5: Basensequenzen der für die Amplifizierung mittels PCR verwendeten Primer 2.3.1.3 Funktionsweise der PCR Die Polymerase-Ketten-Reaktion besteht typischerweise aus drei unterschiedlichen, in mehreren Zyklen ablaufenden Schritten: einem Denaturierungsschritt, einem Annealingschritt und einem Elongationsschritt. Material und Methoden 30 Die Denaturierung ist erforderlich, damit sich die beiden Stränge der Template-DNA voneinander trennen. Nur an einzelsträngige DNA können die Oligonukleotidprimer binden. Der Denaturierungsschritt erfolgte bei 95 °C. Unter Annealing versteht man die Hybridisierung der Oligonukleotidprimer an die einzelsträngig vorliegende DNA. Die Temperatur, die für diesen Schritt notwendig ist, richtet sich hauptsächlich nach den verwendeten Primern. Des W eiteren können mit einer Erhöhung der Temperatur unspezifische Bindungen vermieden bzw. gering gehalten werden. Allerdings verringert die Temperaturerhöhung wiederum die Ausbeute an PCR-Produkt. Der Annealingschritt erfolgte daher unter Berücksichtigung dieser Faktoren bei 55 °C, 57 °C, 60 °C oder 61 °C. Bei der Elongation wird der Primer durch Anhängen von freien Nukleotiden an dessen 3'-Ende verlängert, bis wieder eine doppelsträngige DNA vorliegt. Dieser Prozess wird durch die Taq-Polymerase katalysiert. Der Elongationsschritt wurde unter Berücksichtigung des Temperaturoptimums der verwendeten Taq-Polymerase bei 72 °C durchgeführt. 2.3.1.4 Qualitätskontrolle der PCR Nach erfolgter Amplifizierung der gewünschten Genabschnitte im Thermocycler wurde die Qualität der Reaktionen mit Hilfe einer Auftrennung der PCR-Produkte im Agarosegel bewertet. Der Herstellungsprozess des Agarosegels entsprach dem bereits unter Punkt 2.2 beschriebenen Vorgehen. Im Unterschied dazu wurde dieses Mal jedoch ein 2 %iges Agarosegel, bestehend aus 1,6 g Agarose und 80 ml TBEPuffer verwendet. 10 µl PCR-Produkt und 2 µl Loading Dye wurden in die Kammern des Agarosegels pipettiert. Als Referenz dienten 6 µl der 50-bp-DNA-Leiter. Nach 50minütiger Laufzeit in der Gelelektrophoreseapparatur bei einer angelegten Spannung von 120 V konnte das Agarosegel unter UV-Licht betrachtet werden. Auf diese Weise war es möglich, zum einen anhand der Stärke der Banden zu überprüfen, ob eine ausreichende Ausbeute an PCR-Produkt zur weiteren Verwendung verfügbar war, zum anderen konnte eine mögliche Kontamination durch Auswerten der NegativKontrolle ausgeschlossen werden. Material und Methoden 31 Abbildung 2.2: Gelkontrolle der amplifizierten Genabschnitte nach der PCR [links: 50-bpDNA-Leiter; daneben sieben PCR-Produkte (Probe 3 nicht verwertbar; Probe 6 mit Doppelbande, einer Duplikation entsprechend); rechts: Negativkontrolle] 2.3.1.5 Aufreinigung der PCR-Produkte Bevor die amplifizierten Genabschnitte sequenziert werden konnten, war es notwendig, die Proben zuerst aufzureinigen und sie dadurch von störenden Komponenten wie Salzen, überschüssigen Primern und Nukleotiden zu befreien. Der Aufreinigungsprozess erfolgte unter Verwendung von dafür vorgesehenen Säulen und Reagenzien (QIAquick PCR Purification Kit; Qiagen, Hilden). Alle im folgenden Abschnitt erwähnten Zentrifugierschritte erfolgten für 60 sek bei einer Geschwindigkeit von 13000 rpm und bei einer Temperatur von 20 °C. Um die DNA an die Matrix der Säulen zu binden, wurde zunächst das gesamte verbleibende Volumen der PCR-Produkte (15 µl) mit 75 µl Buffer PB gemischt und auf die Säulen pipettiert. Es folgte die erste Zentrifugation und anschließende Verwerfung des Durchflusses. Der anschließende Waschschritt wurde durch Zugabe von 650 µl mit Ethanol (Ethanol absolut puriss. p.a.; Sigma-Aldrich, Steinheim) versetztem Buffer PE durchgeführt. Nach erneuter Zentrifugation und Verwerfung des Durchflusses erfolgte ein weiterer Zentrifugierschritt ohne Reagenzienzugabe, um das im Buffer PE enthaltene Ethanol vollständig zu entfernen. Die Säulen wurden in E-Cups gestellt. Die Elution der an der Matrix gebundenen DNA geschah im letzten Zentrifugierschritt nach Zugabe von 30 µl Buffer EB. Zur Überprüfung, ob die gereinigte DNA quantitativ den erforderlichen Ansprüchen entsprach, wurde eine photometrische Bestimmung des Absorptionsmaximums bei 260 nm im NanoDrop durchgeführt. Dies geschah auf gleiche Weise wie bereits in Kapitel 2.2 beschrieben. Material und Methoden 32 2.3.2 Sequenzierung der amplifizierten Genabschnitte Die weitere Amplifizierung und Sequenzierung der PCR-Produkte wurden von einem externen Dienstleister (Seqlab; Sequence Laboratories Göttingen GmbH, Göttingen) durchgeführt. 2.3.2.1 Vorbereitung und Versand Hierfür war es laut Vorgabe notwendig, die Menge an DNA in ng zu verwenden, welche der PCR-Produkt-Länge geteilt durch 4 entsprach. Des Weiteren wurde der DNA 20 pmol des entsprechenden Primers (forward oder reverse jeweils getrennt) beigefügt und der Ansatz mit H 2O auf 7 µl aufgefüllt. Das Pipettieren der Proben erfolgte in 0,2-ml-Reaktionsgefäße mit flachem Deckel, welche fortlaufend nummeriert werden mussten. Zum Versand an oben genanntes Labor wurden die Proben in dafür bereitgestellte Transportboxen gepackt und von einem Transportdienstleister abgeholt. 2.3.2.2 Sequenzierungs-Primer Die nachfolgende Oligonukleotide Tabelle (Eurofins gibt einen MWG Sequenzierreaktion verwendet wurden. Überblick GmbH, der Ebersberg), HPLC-aufgereinigten welche bei der Material und Methoden Gen KIT PDGFRA BRAF 33 Exon Primersequenz forward reverse forward 11 reverse forward 13 reverse forward 17 reverse 5'5'5'5'5'5'5'5'- AGGGCTTTTGTTTTCTTCCC CCTAAACATCCCCTTAAATTGG TGCTCTAATGACTGAGACAAT AAAAAGGTGACATGGAAAGCC CATCAGTTTGCCAGTTGTGC AACCTGACAGACAATAAAAGGC GTTTTCACTCTTTACAAGTTAAAATG AAAATCCTTTGCAGGACTG forward reverse forward 12 reverse forward 14 reverse forward 18 reverse 5'5'5'5'5'5'5'5'- CCTTGCCATCTTAGAGTGTTCC GATTCTTAGCCAGGCATCG TGGTGCACTGGGACTTTG AAGGGAAAAGGGAGTCTT TGGTAGCTCAGCTGGACTGAT GGGATGGAGAGTGGAGGATT CAGATGGCTTGATCCTGAG AGGATGAGCCTGACCAGTG 9 10 15 forward 5'- TGCTTGCTCTGATAGGAAAATG reverse 5'- ATTTAATCAGTGGAAAAATAGCCTCA Tabelle 2.6: Basensequenzen der zur Sequenzierreaktion verwendeten Primer 2.3.2.3 Grundlagen Für die Sequenzierung fand eine Modifikation der Kettenabbruch-Synthese nach Sanger Verwendung (Sanger and Coulson 1975): Dabei wird die DNA-Doppelhelix durch Erwärmung zunächst denaturiert, wodurch DNA-Einzelstränge entstehen. Ausgehend von dem an einen der beiden Einzelstränge bindenden Primer wird dieser Strang durch die DNA-Polymerase verlängert. Neben den vier verschiedenen Nukleotiden (dNTPs) enthält der Ansatz auch mit Fluoreszenzfarbstoffen markierte Didesoxynukleosidtriphosphate (ddNTPs), welche keine 3'-Hydroxygruppe besitzen. Jedes der vier ddNTPs ist dabei mit einem unterschiedlichen Farbstoff gekoppelt. Werden sie in den neu synthetisierten Strang eingebaut, so ist eine Verlängerung dessen durch die DNA-Polymerase nicht mehr möglich, weil die Hydroxygruppe nun für die Verknüpfung mit der Phosphatgruppe des nächsten Nukleotids fehlt. Auf diese Weise entstehen DNA-Fragmente unterschiedlicher Länge, die jeweils mit einem Material und Methoden 34 markierten ddNTP enden. Die DNA-Fragmente können mittels Kapillarelektrophorese aufgetrennt und mit einem Laser zur Fluoreszenz angeregt werden. Die ddNTPs am Ende jedes Kettenabbruchproduktes zeigen eine Fluoreszenz unterschiedlicher Farbe und werden von einem Detektor erfasst. Die Abfolge der Farbsignale, die am Detektor erscheint, kann in ein Chromatogramm umgeschrieben werden, welches die Reihenfolge der Basen des sequenzierten DNA-Stranges widerspiegelt. 2.3.3 Auswertung der Sequenzen und Beschreibung der Mutationen Die erhaltenen Chromatogramme konnten nach gelungener Sequenzierung ausgewertet werden. Dies erfolgte durch den Vergleich der DNA-Sequenzen mit den entsprechenden Wildtyp-Sequenzen. Für die Gene KIT, PDGFRA und BRAF wurden als Referenz-Sequenzen jene verwendet, die vom National Center for Biotechnology Information (NCBI, http://www.ncbi.nlm.nih.gov/) aufgeführt wurden. Die Version für das KIT-Gen (Homo sapiens v-kit Hardy-Zuckerman 4 feline sarcoma viral oncogene homolog) lautete NG_007456.1, die für das PDGFRA-Gen (Homo sapiens plateletderived growth factor receptor, alpha polypeptide) NG_009250.1 und für das BRAFGen (Homo sapiens v-raf murine sarcoma viral oncogene homolog B1) NG_007873.1. Um Mutationen auch auf Protein-Ebene beschreiben zu können, wurden weiter die Referenz-Sequenzen der jeweiligen Gen-Produkte benötigt. Für das Produkt des KIT-Gens (mast/stem cell growth factor receptor isoform 1 precursor) war dies die NP_000213.1, das PDGFRA-Genprodukt (alpha-type platelet-derived growth factor receptor precursor) hatte die Referenz-Sequenz NP_006197.1 und das BRAF-Genprodukt (serine/threonine-protein kinase B-raf) die NP_004324.2. Ob die gefundenen Mutationen der DNA überhaupt Auswirkungen auf die Proteinstruktur hatten, wurde mit Hilfe des genetischen Codes überprüft (Wittmann 1961). Dabei wird davon ausgegangen, dass drei benachbarte Nukleotide (als Codon bzw. Triplett bezeichnet) eine Aminosäure determinieren und der Code nicht überlappend gelesen wird, also jedes Triplett nur für eine der 20 kanonischen Aminosäuren codiert. Eine Aminosäure kann im Gegensatz dazu jedoch durch mehrere verschiedene Tripletts (siehe Abbildung 2.3) repräsentiert werden. Material und Methoden 35 Abbildung 2.3: Genetischer Code, dargestellt als Code-Sonne. Die Sonne wird von innen (5‘) nach außen (3‘) gelesen und gibt an, welche Basentripletts der mRNA für welche Aminosäuren codieren. Die Base Uracil (U) der mRNA wird in der DNA durch Thymin repräsentiert. [Quelle: Onie, Wikimedia Commons, lizenziert unter CreativeCommons-Lizenz by-sa-3.0; URL: http://commons.wikimedia.org/wiki/File:Codons_aminoacids_table.png] Die Beschreibung der Mutationen wurde stets sowohl auf DNA- als auch auf ProteinEbene vorgenommen und richtet sich in dieser Arbeit nach dem von der Human Genome Variation Society (HGVS) herausgegebenen Leitfaden „Nomenclature for the description of sequence variants“ (http://www.hgvs.org/mutnomen/). Es wurde die aktuelle Version, welche zuletzt im März 2014 modifiziert wurde, verwendet. An dieser Stelle wird kurz auf einige Grundlagen sowie geforderte Neuerungen bei der Beschreibung von Mutationen eingegangen. 2.3.3.1 Allgemeine Grundlagen Die Nummerierung der Nukleotide folgt in dieser Arbeit immer der entsprechenden Coding DNA Sequence (CDS) des jeweiligen Gens und wird mit vorangestelltem „c.“ markiert. Die vier Nukleinbasen Adenin, Cytosin, Guanin und Thymin werden mit ihren Anfangsbuchstaben (A, C, G und T) abgekürzt. Adenin an der Position 1662 der CDS wird beispielsweise durch „c.1662A“ charakterisiert. Nukleotide von Introns sind daher nicht erfasst und sind wie folgt nummeriert: Sind sie am Anfang des Material und Methoden Introns lokalisiert, 36 erhalten sie die Nummer des letzten Nukleotids des vorangegangenen Exons, ein Pluszeichen und die Position im Intron (Bsp.: c.1774+3C für Cytosin als drittes Nukleotid des Introns 11 des KIT-Gens). Sind sie am Ende des Introns gelegen, bildet die Nummer des ersten Nukleotids des folgenden Exons die Grundlage und der upstream-Position wird ein Minuszeichen vorangestellt (c.1648-5C). Die einzelnen Aminosäuren der Proteine werden nach der Referenz-Sequenz der jeweiligen Genprodukte nummeriert und mit „p.“ gekennzeichnet. Die Aminosäuren werden hier mit dem Einbuchstabencode abgekürzt. Tabelle 2.7 gibt einen Überblick über die 20 kanonischen Aminosäuren mit den entsprechenden Abkürzungen im Einund Dreibuchstabencode (IUPAC-IUB 1984). Zum Beispiel wird Tryptophan an Position (Codon / Triplett) 582 der Rezeptor-Tyrosinkinase KIT als „p.W582“ beschrieben. Aminosäure 3-Bc 1-Bc Aminosäure 3-Bc 1-Bc Alanin Arginin Asparagin Asparaginsäure Cystein Glutamin Glutaminsäure Glycin Histidin Isoleucin Ala Arg Asn Asp Cys Gln Glu Gly His Ile A R N D C Q E G H I Leucin Lysin Methionin Phenylalanin Prolin Serin Threonin Tryptophan Tyrosin Valin Leu Lys Met Phe Pro Ser Thr Trp Tyr Val L K M F P S T W Y V Tabelle 2.7: Übersicht der 20 kanonischen Aminosäuren sowie ihrer Schreibweise im Dreibuchstabencode (3-Bc) und Einbuchstabencode (1-Bc) In den nächsten Kapiteln werden beispielhaft einige Mutationen beschrieben sowie die entsprechenden Chromatogramme gezeigt. 2.3.3.2 Punktmutationen Als Punktmutation oder Substitution wird der Austausch eines einzelnen Nukleotids durch ein anderes bezeichnet. Sobald zwei oder mehr aufeinanderfolgende Nukleotide betroffen sind, wird nicht mehr von einer Punktmutation gesprochen und laut HGVS soll dann die Bezeichnung Deletion/Insertion (Indel, siehe unten) Material und Methoden 37 verwendet werden. Die folgende Sequenz (Abbildung 2.4) zeigt einen Ausschnitt von Exon 11 des KIT-Gens mit einer häufigen Punktmutation. p.L576 Abbildung 2.4: Punktmutation im Exon 11 des KIT-Gens. Oben: Wildtyp-Sequenz; unten: Punktmutation c.1727T>C Die Nukleinbase Thymin (T) wird an der Position 1727 der CDS durch Cytosin (C) ersetzt. Auf DNA-Ebene wird diese Punktmutation als c.1727T>C beschrieben. Dadurch wird die Nukleotidsequenz des Tripletts 576 von ursprünglich CTT zu CCT verändert und codiert nun für Prolin (P) statt für Leucin (L). Auf Protein-Ebene wird dies als p.L576P bezeichnet. 2.3.3.3 Deletionen Eine Deletion beschreibt den Verlust von einem oder mehreren aufeinanderfolgenden Nukleotiden. Es werden „in frame-Deletionen“, bei denen immer drei bzw. das Vielfache von drei Nukleotiden betroffen sind und somit das Leseraster erhalten bleibt, von „out of frame-Deletionen“, die zur Verschiebung des Leserasters (Frameshift) führen, unterschieden. Abbildung 2.5 zeigt wiederum einen Ausschnitt eines sequenzierten KIT-Exons 11. Material und Methoden p.W557 38 p.K558 p.V559 p.V560 Abbildung 2.5: Deletion im Exon 11 des KIT-Gens. Oben: Wildtyp-Sequenz; unten: Deletion c.1669_1674delTGGAAG Es ist ein Verlust von sechs Nukleotiden feststellbar, dadurch wird die entsprechende Sequenz verkürzt und es kommt ab dieser Position zum Auftreten von Doppelpeaks. Da sechs Nukleotide betroffen sind, handelt es sich um eine in frame-Deletion. Auf DNA-Ebene wird die Deletion als c.1669_1674delTGGAAG bezeichnet, was bedeutet, dass die sechs aufgeführten Nukleotide (TGGAAG) der Positionen 1669 bis 1674 der CDS verloren gehen. In diesem Fall betrifft die Mutation die zwei Codons 557 und 558 des Proteins mit den Aminosäuren Tryptophan und Lysin, dies wird als p.W557_K558del beschrieben. Wenn sich in frame-Deletionen nicht an die Triplett-Grenzen halten, kann dies im Protein neben einem Verlust von Aminosäuren auch zu einer Substitution führen. Beispielsweise führt die Deletion der sechs Nukleotide c.1670_1675delGGAAGG (KIT-Exon 11) auf Protein-Ebene zum Verlust von zwei Aminosäuren und Substitution einer dritten durch eine andere. Beschrieben wird dies als Verlust von drei Aminosäuren (Tryptophan, Lysin und Valin der Tripletts 557 bis 559) bei gleichzeitiger Insertion einer neuen Aminosäure (Phenylalanin) an dieser Stelle (p.W557_V559delinsF). Eine einfache Deletion in der DNA-Sequenz kann somit zu einer Deletion/Insertion (Indel) im Protein führen. 2.3.3.4 Duplikationen Als Duplikation wird die Verdopplung einer Nukleotid-Abfolge der DNA-Sequenz mit direkter Insertion dieser Nukleotide am Ende der Abfolge bezeichnet. Nur wenn eingefügte Nukleotide nicht der DNA-Sequenz entsprechen, werden diese Material und Methoden 39 Mutationen als Insertionen bezeichnet. Im nächsten Chromatogramm (Abbildung 2.6), welches einen Abschnitt des 9. Exons des KIT-Gens zeigt, ist eine heterozygote Duplikation von sechs Nukleotiden dargestellt. p.Y503 p.F504 p.A502 p.N505 p.Y503 p.F504 Abbildung 2.6: Duplikation im Exon 9 des KIT-Gens. Oben: Wildtyp-Sequenz; unten: Duplikation c.1504_1509dupGCCTAT Auf DNA-Ebene werden die Positionen der verdoppelten Nukleinbasen und nicht der Ort der Insertion angegeben. In diesem Fall wird die Mutation mit c.1504_1509dupGCCTAT beschrieben, d.h. die sechs Nukleotide der Positionen 1504 bis 1509 in der CDS werden verdoppelt und zwischen den Nukleotiden 1509 und 1510 eingefügt. Das gleiche Prinzip gilt für die Beschreibung der Mutation auf Protein-Ebene. Die Aminosäuren Alanin 502 und Tyrosin 503 werden dupliziert, dies wird als p.A502_Y503dup angegeben. 2.3.3.5 Deletionen/Insertionen Bei einer Indel handelt es sich um eine Kombination von Deletion und Insertion. Die Anzahl der deletierten Nukleinbasen muss dabei nicht identisch mit der der insertierten Basen sein. Die nachfolgende Sequenz des KIT-Exons 11 (Abbildung 2.7) zeigt eine einfache Indel, welche durch die Deletion und Insertion von jeweils zwei Nukleotiden entstanden ist. Material und Methoden 40 p.V560 p.E560 Abbildung 2.7: Einfachste Form einer Indel im Exon 11 des KIT-Gens. Oben: WildtypSequenz; unten: Indel c.1679_1680delTTinsAG An dieser Stelle sei nochmals darauf hingewiesen, dass nach den Vorgaben der HGVS diese Mutation nicht als Punktmutation (Bsp.: c.1679T>A; c.1680T>G oder c.1679_1680TT>AG) zu nomenklatieren ist, da mehr als eine Nukleinbase involviert ist. Korrekt wird diese Mutation mit c.1679_1680delTTinsAG (auch c.1679_1680delinsAG) beschrieben. Diese Situation ist ein weiteres Beispiel dafür, dass sich Mutationen bezüglich ihrer Nomenklatur auf DNA-Ebene und ProteinEbene unterscheiden können. Im Protein kommt es lediglich zu einer Substitution des Valins an Position 560 durch Glutaminsäure, dargestellt als p.V560E. 2.4 Quantitative Methylierungsanalyse mittels Pyrosequenzierung Verschiedene Techniken können verwendet werden, um methylierte DNA aufzuspüren bzw. eine quantitative Aussage bezüglich des Methylierungsstatus einer DNA zu treffen (Gonzalgo, Liang et al. 1997, Fraga, Rodríguez et al. 2000). Die heutzutage am häufigsten verwendete Methode ist die Bisulfitkonvertierung. Dabei wird methylierte DNA mit Natriumhydrogensulfit behandelt, wodurch alle unmethylierten Cytosine zu Uracil desaminiert werden. Methylierte Cytosine werden durch diesen Vorgang nicht beeinflusst. Der Methylierungsstatus kann dann mittels PCR und anschließender Sequenzierung erfasst werden (Frommer, McDonald et al. 1992). Material und Methoden 41 2.4.1 Bisulfitkonvertierung Die isolierte DNA aller Tumoren wurde mit Hilfe eines Kits (EZ DNA MethylationGold™ Kit; Zymo Research Corp., Irvine, USA) der Bisulfitbehandlung unterzogen. Dafür mussten 20 µl DNA-Lösung (500ng DNA und H 2O) in 0,2-ml-PCR-Tubes mit 130 µl aufgelöstem CT Conversion Reagent (H 2O, M-Dilution Buffer, M-Dissolving Buffer) gemischt werden. Danach erfolgte eine Inkubation im Thermocycler bei den in folgender Tabelle aufgeführten Temperaturen. Schritt 1. 2. 3. Temperatur 98 °C 64 °C 4 °C Zeit für 10 min für 2,5 h für bis zu 20 h Tabelle 2.8: Übersicht der Inkubationsschritte im Thermocycler zur Bisulfitkonvertierung Zur weiteren Behandlung wurden 600 µl M-Binding Buffer in eine Zymo-Spin™ IC Column pipettiert, die Probe hinzugefügt und durch Schwenken gemischt. Nach Zentrifugieren bei 12800 rpm für 30 sec musste der Durchfluss verworfen werden. Es folgten ein Waschschritt mit 100 µl M-Wash Buffer und eine Zentrifugation, danach eine Inkubation mit 200 µl M-Desulphonation Buffer für 15 bis 20 min bei RT. Nach erneutem Zentrifugieren und zwei weiteren Waschschritten mit jeweils 200 µl MWash Buffer wurden die Säulen in beschriftete, UV-bestrahlte E-Cups gestellt und die DNA durch Zugabe von 10 µl M-Elution Buffer direkt auf die Säulenmembran sowie Zentrifugation eluiert. Die gewonnenen DNA-Lösungen wurden entweder direkt weiterverarbeitet oder bei -20 °C für die spätere Verwendung eingefroren. 2.4.2 Die untersuchten CpG-Loci Die DNA aller 104 GIST wurde an drei CpG-Loci bezüglich der Methylierung quantitativ untersucht. Die CpG-Loci lagen außerhalb von CpG-Inseln im Promotorbindungsbereich des CD34-Gens bzw. des PROM1-Gens. In der folgenden Tabelle sind die analysierten DNA-Sequenzen dargestellt. Material und Methoden 42 Gen / CpG-Locus zu analysierende Sequenz CD34_P339_R CD34_P780_R PROM1_P44_R GCTGTGTGTGAGTGAAG[CG]TCAGGAGTGAGCAGGTATACG GGCAGCCTAGTCTTGGGGACGTAGAGA[CG]GGAGAAAGGAGAA CTTGGGGAAGGCAAG[CG]TGTTCCTGGGCAGAAGAGGA Tabelle 2.9: Sequenzen der drei untersuchten CpG-Loci, dargestellt vor der Bisulfitbehandlung. Fett: CpG-Locus; unterstrichen: Bindungsbereich der jeweiligen Sequenzier-Primer 2.4.2.1 CD34 Es wurden zwei CpG-Loci des für die Isoform a des humanen CD34-Antigens codierenden Gens analysiert. Dies waren der 339 Nukleotide upstream des Transkriptionsstartpunktes (TSP) gelegene CpG-Locus CD34_P339_R und ein zweiter, 780 Nts upstream des TSP gelegener Locus (CD34_P780_R). Abbildung 2.8: schematische Darstellung der beiden im Promotorbindungsbereich des CD34-Gens, upstream des TSP gelegenen untersuchten CpG-Loci 2.4.2.2 PROM1 An dem Gen, welches für den neuronalen und hämatopoetischen Stammzellmarker Prominin-1 codiert, wurde der CpG-Locus PROM1_P44_R untersucht. Dieser befand sich 44 Nts upstream des TSP. Material und Methoden 43 Abbildung 2.9: schematische Darstellung des im Promotorbindungsbereich des PROM1Gens, upstream des TSP gelegenen untersuchten CpG-Locus 2.4.3 Amplifizierung bisulfitbehandelter DNA Damit eine quantitative Aussage bezüglich des Methylierungsstatus der CpG-Loci getroffen werden konnte, musste der entsprechende bisulfitbehandelte DNAAbschnitt mittels PCR amplifiziert werden. Dafür wurde für CD34_P339_R, CD34_P780_R und für PROM1_P44_R jeweils ein Master-Mix erstellt. Dieser beinhaltete pro untersuchter Probe 2,5 µl 10-fach-PCR-Puffer inklusive 15 mM MgCl2 (Qiagen, Hilden); 0,5 µl dNTP-Mix (10 mM each; Fermentas, St. Leon-Rot); 0,5 µl Primer forward und 0,5 µl modifizierter Primer reverse (jeweils 10 µM; Eurofins MWG GmbH, Ebersberg); 0,15 µl (= 0.75 U) HotStar Taq-Polymerase (Qiagen, Hilden) sowie 19,85 µl H2O. Die verwendeten HPLC-aufgereinigten Primer (Eurofins MWG GmbH, Ebersberg) waren teilweise modifiziert. Die in Tabelle 2.10 aufgeführten Reverse-Primer wurden für die Pyrosequenzierung am 5‘-Ende an Biotin gekoppelt, die Forward-Primer blieben unmodifiziert. Bezeichnung Primersequenz CD34_P339_R forward reverse 5'- ATGTGGTATATTTAGTGATAGTTTTATTAG Biotin-5'- AAAAAATCTCCAAAAATAATTTAAACAACC CD34_P780_R forward reverse 5'- TGGGTGTTGGTTGTATTGAATAGA Biotin-5'- ACCCAAACTAACTTCTCCTT PROM1_P44_R forward reverse 5'- TGGAAGTTTTGGGGAAGGTAA Biotin-5'- CAACAAATCCAATACTTCCTACTC Tabelle 2.10: Nukleinbasensequenzen der zur Amplifizierung der bisulfitbehandelten DNA mittels PCR verwendeten Primer; alle Reverse-Primer waren am 5‘-Ende biotinyliert Material und Methoden 44 Von jedem Master-Mix wurden jeweils 24 µl in 200-µl-PCR-Tubes pipettiert und 1 µl bisulfitbehandelte DNA zugefügt. In der folgenden Tabelle sind die PCR-Ansätze nochmals übersichtlich zusammengestellt. Menge Einheit Reagenz Endkonzentration 2,50 μl Puffer 10x, inkl. 15 mM MgCl2 1x, 1,5 mM 0,50 μl dNTPs 10 mM 0,2 mM 0,50 μl Primer F 10 μM 0,2 μM 0,50 μl Primer R 10 μM 0,2 μM 1,00 μl DNA bisulfitbehandelt 19,85 μl H2O 0,15 μl HotStar Taq = 0,75 U Tabelle 2.11: PCR-Ansatz (25 µl) bisulfitbehandelter DNA zur Pyrosequenzierung Neben einer Negativ-Kontrolle, welche anstatt DNA 1 µl H2O enthielt, wurde eine weitere Kontrolle mit 1 µl genomischer – also nicht bisulfitbehandelter – DNA bei jeder PCR mitgeführt. Nach kurzer Zentrifugation der Tubes wurden diese in einen Thermocycler gestellt und das in der nachfolgenden Tabelle aufgeführte Programm gewählt. Schritt Zeit 1. Initiale Denaturierung 2. Denaturierung 3. Annealing 4. Elongation 5. Abschließende Elongation Tabelle 2.12: PCR-Programm Pyrosequenzierung 15 min 30 sec 45 sec 30 sec 5 min zur Amplifizierung Temp. Zyklenanzahl 95 °C 95 °C 52 °C 50 Zyklen 72° C 72 °C bisulfitbehandelter DNA für die Nach durchgeführter PCR erfolgte eine Qualitätsbeurteilung durch elektrophoretische Auftrennung von 5 µl PCR-Produkt auf einem 2 %igen Agarosegel (Durchführung siehe Kapitel 2.3.1.4). Material und Methoden 45 Abbildung 2.10: Gelkontrolle nach PCR; links: CD34_P339_R; rechts: CD34_P780_R [L = 50-bp-DNA-Leiter; Gen = Negativkontrolle mit genomischer DNA, nicht bisulfitbehandelt; H2O = Negativkontrolle ohne DNA] 2.4.4 Pyrosequenzierung Alle durchgeführten Untersuchungen zur Methylierung wurden auf einem PyroMark® Q24 System (Qiagen, Hilden) analysiert. 2.4.4.1 Prinzip Bei der Pyrosequenzierung wird die DNA-Polymerase quasi während des Einbaus der einzelnen Nukleotide beobachtet. Dies erfolgt ausgehend von einer einzelsträngigen, mittels PCR amplifizierten DNA-Matrize, an die ein SequenzierPrimer hybridisiert wird. Diese Probe wird mit einem Enzym-Mix, welcher alle für die Pyrosequenzierung benötigten Enzyme beinhaltet, sowie mit einem Substrat-Mix inkubiert (PyroMark® Gold Q24 Reagents; Qiagen, Hilden). Lösung Inhaltsstoffe Funktion Enzym-Mix DNA-Polymerase ATP-Sulfurylase Luciferase Apyrase Einbau von Nukleotiden Umwandlung von Pyrophosphat zu ATP Generierung des Lichtsignals Abbau von nicht eingebauten Nts und ATP Substrat-Mix Adenosin-5'-Phosphosulfat Generierung von ATP und Luciferin Tabelle 2.13: Übersicht der für die Pyrosequenzierung benötigten Enzyme und Substrate Material und Methoden 46 Die verschiedenen Nukleotide (dATPαS, dCTP, dGTP, dTTP) werden einzeln, nacheinander, in einer zuvor festgelegten Abfolge hinzugefügt. Wenn das Nukleotid komplementär zur Base im DNA-Strang ist, wird es durch die DNA-Polymerase eingebaut. Durch den Einbau entsteht Pyrophosphat (PPi) in äquimolarer Menge zur Anzahl der eingebauten Nukleotide. Aus PPi und Adenosin-5‘-Phosphosulfat (APS) wird durch das Enzym ATP-Sulfurylase ATP erzeugt, womit die Umwandlung von Luciferin in Oxyluciferin durch die Luciferase getriggert wird. Durch diese Umwandlung entsteht sichtbares Licht, dessen Stärke proportional zur Menge an ATP und somit wiederum direkt proportional zur Menge an eingebauten Nukleotiden ist. Das Lichtsignal wird durch einen CCD-Sensor (Charge-coupled Device) detektiert und als Peak in einem Pyrogramm® sichtbar gemacht. Bevor die nächste Sorte von Nukleotiden hinzugefügt wird, werden alle nicht eingebauten Nukleotide und unverbrauchtes ATP durch die Apyrase abgebaut, um Wechselwirkungen bei der nächsten Reaktion zu vermeiden. In der folgenden Abbildung ist dieser Ablauf der Pyrosequenzierung schematisch dargestellt. Material und Methoden 47 Abbildung 2.11: Oben: Schematische Darstellung der Pyrosequenzierung; unten: Beispiel eines Pyrogramms. Die Höhe der Peaks ist proportional zu der Anzahl der eingebauten Nukleotide, sodass sich folgende Sequenz ergibt: ATACTTTGG (Abbildung modifiziert nach Lehmann 2008) 2.4.4.2 Assay Design und Run Setup Die Erstellung der gewünschten Assays und der Einspritz-Befehle der vier verschiedenen Nukleotide geschah mit einem dafür vorgesehenen Programm (PyroMark® Q24 Software; Qiagen, Hilden). Es mussten die Sequenzen nach der Bisulfitbehandlung mit den zu untersuchenden CpG-Sites eingegeben werden. Falls möglich wurden Bisulfitkontrollen eingebaut, Bisulfitkonvertierung darstellen zu können. um die Funktionalität der Material und Methoden 48 Abbildung 2.12: Assay Design für CD34_P339_R mit eingebauten Bisulfitkontrollen Nach Zuordnung der benötigten Assays zu den entsprechend zu analysierenden Wells einer PyroMark Q24 Plate konnte anhand der ausgegebenen PreRun Information gesehen werden, welche Mengen an Reagenzien für die Sequenzierung notwendig waren. 2.4.4.3 Vorbereitung der PCR-Produkte In die Vertiefungen einer 24-Well-PCR-Platte wurden je 40 µl Puffer (PyroMark Binding Buffer; Qiagen, Hilden), 5 µl Streptavidin Beads (Streptavidin Sepharose™ High Performance; GE Healthcare, München), 25 µl H2O und 10 µl PCR-Produkt pipettiert. Es folgte eine Inkubation der Platte für 10 min bei 1400 rpm und RT in einem Thermomixer. Währenddessen wurden 25 µl einer 0,3-µM-Lösung aus Sequenzier-Primer (siehe Tabelle 2.14) und Puffer (PyroMark Annealing Buffer; Qiagen, Hilden) auf eine PyroMark Q24 Plate pipettiert. Bezeichnung Primersequenz CD34_P339_R sequencing 5'- GTTGTGTGTGAGTGAA CD34_P780_R sequencing 5'- GGTAGTTTAGTTTTGGGGA PROM1_P44_R sequencing 5'- TTTGGGGAAGGTAAG Tabelle 2.14: Nukleinbasenabfolge der für die Pyrosequenzierung verwendeten SequenzierPrimer Material und Methoden 49 Die Proben wurden mit einer PyroMark Q24 Vacuum Workstation (Qiagen, Hilden; siehe Tabelle 2.15) gemäß Anleitung aus der 24-Well-PCR-Platte in die Vertiefungen der PyroMark Q24 Plate überführt und anschließend mittels eines vorgewärmten PyroMark Q24 Plate Holders auf einem Heizblock für 2 min bei 80 °C erhitzt. Damit wurde ein vollständiges Annealen des Sequenzier-Primers an die einzelsträngige PCR-amplifizierte DNA-Matrize gewährleistet. Danach wurden die Proben bei RT für 5 bis 10 min abgekühlt. Kammer Menge 1 2 3 4 5 50 ml 40 ml 50 ml 50 ml 70 ml Inhalt Ethanol (70 %) PyroMark Denaturation solution PyroMark Wash Buffer (1-fach) AccuGene Molecular Biology Water AccuGene Molecular Biology Water Hersteller Sigma-Aldrich, Steinheim Qiagen, Hilden Qiagen, Hilden Lonza, Basel, Schweiz Lonza, Basel, Schweiz Tabelle 2.15: Übersicht über die Befüllung der Kammern der PyroMark Q24 Vacuum Workstation mit den verschiedenen Reagenzien Die gefriergetrockneten Enzym- und Substrat-Mixe wurden durch Zugabe von je 620 µl H2O resuspendiert und eine PyroMark Q24 Cartidge (Qiagen, Hilden) mit den laut PreRun Information angegebenen Volumina an Mix und Nukleotiden befüllt. Nach Einlegen von Kartusche und Reaktionsplatte in das PyroMark Q24 System sowie Laden der benötigten Daten auf einen USB-Stick konnte der Run gestartet werden. 2.4.4.4 Auswertung der Pyrogramme Nach erfolgter Sequenzierung konnten die erhaltenen Pyrogramme mit Hilfe der PyroMark Q24 Software ausgewertet werden. Der Grad der Methylierung wurde als Prozentsatz für jeden CpG-Locus angegeben und die Qualität der Sequenzierung anhand von Peakeigenschaften sowie Referenzkontrollen bewertet. Material und Methoden 50 Abbildung 2.13: Beispiel eines Pyrogramms für CD34_P339_R; in Cytosin-GuaninDinukleotidsequenzen (in hellblauen Säulen oben) entsprechen T-Peaks unmethylierten Cytosinen, C-Peaks methylierten Cytosinen (mC); das Verhältnis mC/(mC+C) ist in Prozent angegeben; Cytosine außerhalb von CpG-Loci dienen als interne Kontrolle für den Erfolg der Bisulfitbehandlung (in gelben Säulen oben); der CpG-Locus dieser Tumor-DNA war zu 6 % methyliert 2.5 Immunhistochemie und Tissue-Microarray Die Tissue-Microarray-Technik wurde erstmals 1998 von Kononen et al. als neue Methode in der onkologischen Forschung beschrieben (Kononen, Bubendorf et al. 1998). Das Prinzip der Tissue-Microarrays (TMA) besteht darin, viele repräsentative Ausschnitte verschiedener Gewebe bzw. Tumoren auf einen Objektträger zu bringen, um diese parallel untersuchen zu können. Dafür werden aus in Paraffin eingebetteten Proben (den sogenannten Spenderblöcken) Zylinder ausgestanzt und diese in einen leeren Paraffinblock (Empfängerblock) überführt. Von dem Empfängerblock werden mehrere Schnitte angefertigt. Diese können nach Durchführung immunhistochemischer Färbungen oder anderer Techniken untersucht werden. Material und Methoden 51 Abbildung 2.14: Tissue-Microarray; links: Empfängerblock; rechts: Schnitt auf einen Objektträger aufgezogen Auf diese Weise können bis zu mehrere hundert Gewebe nicht nur gleichzeitig, sondern durch den sparsamen Gebrauch von Reagenzien und Antikörpern auch kostengünstig analysiert werden. Zudem ist sichergestellt, dass alle Proben identischen Versuchsbedingungen unterliegen, da sie sich auf demselben Objektträger befinden. 2.5.1 Herstellung der Tissue-Microarrays Für alle hergestellten TMA wurde ein Stanzendurchmesser von 1,0 mm gewählt. Die Kapazität eines Empfängerblockes wurde auf maximal acht Reihen à zwölf Stanzen festgelegt, sodass ein Block höchstens 96 Tumorstanzen beinhaltete. Des Weiteren wurde jeder Empfängerblock mit acht Stanzen ausgewählter Referenzgewebe versehen, die einerseits die Orientierung erleichterten, andererseits als Kontrolle für die Qualität der immunhistochemischen Färbungen galten. Von jedem Spenderblock wurden zwei Stanzen entnommen. Waren mehrere Blöcke eines Tumors verfügbar, wurden maximal drei Blöcke verwendet. Auf diese Weise konnte ein Tumor auf dem Empfängerblock durch zwei, vier oder sechs Stanzen repräsentiert werden. Die HE-Schnitte aller Spenderblöcke wurden zunächst lichtmikroskopisch begutachtet und das Tumorareal genau markiert. In den Empfängerblock wurde mit Hilfe eines halbautomatischen Tissue-Microarrayers (MTA1; Beecher Instruments, Inc., Wisconsin, USA) mit Nachrüstsatz (MTABooster®; Alphelys, Plaisir, France) ein Hohlraum gestanzt. Aus dem Spenderblock wurde mit einer weiteren Stanze Material und Methoden 52 Tumormaterial aus der definierten Zone entnommen und in diesen Hohlraum überführt. Diese Methode wurde bei allen weiteren Koordinaten angewandt. Abbildung 2.15: Tissue-Microarray; links: Spenderblöcke und HE-Schnitte mit eingezeichnetem Tumorareal; rechts: halbautomatischer Tissue-Microarrayer mit Nachrüstsatz Nach dem Fertigstellen des Empfängerblockes wurde dieser bei einer Temperatur von 50 °C für 10 min in einem Brutschrank erwärmt und anschließend die Oberfläche des Blockes durch Druck auf einen Objektträger geebnet. 2.5.2 Immunhistochemische Färbung der Tissue-Microarrays Von den TMA-Blöcken wurden an einem Mikrotom 2 µm dicke Schnitte angefertigt, auf sterile Objektträger gezogen und über Nacht bei 56 °C im Brutschrank getrocknet. Die Schnitte wurden in Xylol (Carl Roth, Karlsruhe) entparaffiniert und durch eine absteigende Alkoholreihe und Aqua dest. rehydratisiert. Die Vorbehandlung zur Antigendemaskierung erfolgte durch hitzeinduzierte EpitopRückgewinnung (HIER) mit den in Tabelle 2.16 angegebenen Puffern. Nach dem Abkühlen auf RT wurden die Schnitte für mindestens 5 min in Waschpuffer (D ako, Hamburg) gestellt. Die Färbung wurde in einem Autostainer Plus (Dako, Hamburg) und unter Verwendung eines Kits (Dako REAL™ Detection System, Alkaline Phosphatase/RED, Rabbit/Mouse, Code K5005; Dako, Hamburg) durchgeführt. Dafür wurden die entsprechend verdünnten Primärantikörper auf die Schnitte Material und Methoden 53 pipettiert und für 30 bzw. 60 min inkubiert (siehe Tabelle 2.16). Im Anschluss erfolgten ein Waschschritt mit Waschpuffer und eine 15-minütige Inkubation mit dem Sekundärantikörper (Dako REAL™ Biotinylated Secondary Antibodies; Dako, Hamburg). Nach erneuter Spülung mit Waschpuffer wurden die Schnitte für 15 min mit an alkalische Phosphatase konjugiertem Streptavidin (Dako REAL™ Streptavidin Alkaline Phosphatase; Dako, Hamburg) inkubiert. Anschließend wurde wieder mit Waschpuffer gespült und für 10 min mit Chromogen-Substrat-Lösung (Dako REAL™ Chromogen; Dako, Hamburg) inkubiert. Die Gegenfärbung der Zellkerne erfolgte für 30 sec mit Hämalaun (Mayers Hämalaunlösung; Merck Millipore, Darmstadt). Im Anschluss wurden die Schnitte in einer ansteigenden Alkoholreihe und in Xylol dehydratisiert, bevor sie eingedeckt wurden. AK (Klon) Code Firma Tierquelle CD177, c-kit A4502 Dako rabbit CD34 Class II (QBEnd-10) M7165 Dako mouse Citratpuffer, pH 6,0 1:400 30 min 2 min Dampfdruck CD133/1 (AC133) Vorbehandlung Verd. Dauer Citratpuffer, pH 6,0 1:400 60 min 2 min Dampfdruck 130-090-422 MACS mouse EDTA, pH 9,0 1:100 30 min 30 min Dampfgarer Tabelle 2.16: verwendete Primärantikörper für die Immunhistochemie [AK = Antikörper; Verd. = Verdünnung] 2.6 Zellversuch Für die Zellversuche wurde die GIST-Zelllinie 48B freundlicherweise von Jonathan A. Fletcher, Department of Pathology, Brigham and Women's Hospital, Boston, Massachusetts zur Verfügung gestellt. 2.6.1 Zellkultur ansetzen Die bei -80 °C gelagerten Zellen wurden bei 37 °C aufgetaut und in 10 ml auf 37 °C erwärmte DPBS (Dulbecco’s Buffered Saline Solution, w/o Ca ++/ Mg++; Cell Concepts, Umkirch) gegeben. Es folgte eine Zentrifugation bei 1000 rpm und RT für 5 min, anschließend wurde die DPBS abpipettiert. Die Zellen wurden mit jeweils 1 ml zuvor angesetztem und auf 37 °C erwärmtem Medium (siehe Tabelle 2.17) Material und Methoden 54 resuspendiert. Die Zellsuspension wurde in 75-cm2-Zellkulturflaschen (CELLSTAR® Standard; Greiner Bio-One, Frickenhausen) überführt, weitere 9 ml Medium wurden hinzugefügt. Die Inkubation erfolgte bei 37 °C im Brutschrank. Menge pro 1 ml Medium 83% 1% 1% 15% 830 µl 10 µl 10 µl 150 µl Zusammensetzung RPMI-1640 Medium L-Glutamin Penicillin-Streptomycin Fetal Bovine Serum Gold Hersteller Sigma-Aldrich, Steinheim Sigma-Aldrich, Steinheim Sigma-Aldrich, Steinheim PAA Laboratories, Cölbe Tabelle 2.17: Zusammensetzung des verwendeten Zellmediums 2.6.2 Behandlung mit 5-Azacytidin Bei diesem Versuch wurde die GIST-Zelllinie 48B mit unterschiedlichen Konzentrationen der demethylierenden Substanz 5-Azacytidin (5-azaC; SigmaAldrich, Steinheim) sowie mit DPBS als Kontrolle behandelt. Es wurden jeweils 1 x 106 Zellen in sechs Petrischalen ausplattiert, durch Zugabe von Medium auf 10 ml aufgefüllt und über Nacht bei 37 °C im Brutschrank inkubiert. Am folgenden Tag, dem ersten Behandlungstag, wurden jeweils zwei Petrischalen nach Abpipettieren des Mediums mit 50 nM 5-azaC, 100 nM 5-azaC oder 1 µl DPBS als Kontrolle versehen und mit der entsprechenden Menge Medium auf 10 ml aufgefüllt. Die Inkubation über Nacht erfolgte weiterhin bei 37 °C im Brutschrank. Am zweiten (nach 24 h) sowie dritten (nach 48 h) Behandlungstag wurde dieser Schritt mit jeweils den gleichen Konzentrationen wiederholt. Nach 72 h wurden die Lösungen abpipettiert, die Petrischalen mit je 10 ml kalter DPBS gewaschen und die DPBS verworfen. Durch Zugabe von je 1 ml kalter DPBS und Verwendung eines sterilen Zellkulturschabers wurden die Zellrasen von den Petrischalen gelöst. Die Resuspendierung erfolgte mit weiteren 9 ml kalter DPBS. Die Zellsuspensionen wurden in Falcon-Röhrchen überführt und für 5 min bei 1000 rpm zentrifugiert. Nach Abpipettieren des DPBS-Überstandes konnten die Zellpellets in beschriftete E-Cups überführt und bis zur weiteren Verwendung bei -80 °C eingefroren werden. Aus der einen Hälfte wurde später DNA für die Methylierungsanalyse extrahiert, aus den verbleibenden Duplikaten wurde für die mRNA-Expressionsanalyse RNA isoliert. Material und Methoden 55 2.6.3 DNA-Methylierungsanalyse 2.6.3.1 DNA-Isolation aus Zellen Zur Isolation der DNA aus den Zellen wurde das DNeasy Blood & Tissue Kit (Qiagen, Hilden) verwendet. Die bei -80 °C eingefrorenen E-Cups mit den Zellpellets wurden bei RT aufgetaut und in einer Tischzentrifuge bei 1800 rpm zentrifugiert. Nach Zugabe von 200 µl DPBS und 200 µl Buffer AL wurden die Tubes gevortext und für 10 min in einem Thermocycler bei 56 °C inkubiert. Anschließend wurde in jedes Tube 200 µl Ethanol (Ethanol absolut puriss. p.a.; Sigma-Aldrich, Steinheim) gegeben und wiederum gründlich gevortext. Der komplette Inhalt der Tubes wurde in DNeasy Mini Spin Columns überführt und für 1 min bei 8000 rpm zentrifugiert, der Durchfluss wurde verworfen. Es folgte ein 1-minütiger Zentrifugationsschritt mit 500 µl verdünntem Buffer AW1 bei 8000 rpm. Nach Verwerfung des Durchflusses wurden 500 µl Buffer AW2 (mit Ethanol verdünnt) auf jede Säule pipettiert und für 3 min bei 14000 rpm zentrifugiert. Die Säulen wurden in zuvor UV-Licht bestrahlte E-Cups gegeben und nach Hinzufügen von 100 µl Buffer AE direkt auf die Säulenmembran sowie nach kurzer Inkubation bei RT für 1 min bei 8000 rpm abzentrifugiert. Die Bestimmung der Konzentrationen der DNA-Lösungen erfolgte mit Hilfe eines Spektralphotometers, wie bereits in Kapitel 2.2 beschrieben. Bis zur weiteren Verwendung wurden die E-Cups mit DNA-Lösung bei -20 °C aufbewahrt. 2.6.3.2 Bisulfitkonvertierung und Pyrosequenzierung Die Durchführung der Methylierungsanalyse der aus der GIST-Zelllinie gewonnenen DNA nach Behandlung mit 5-azaC erfolgte auf gleiche Weise wie in Kapitel 2.4 ausführlich dargestellt. Zur Bisulfitkonvertierung wurden 500 ng bei RT aufgetaute DNA verwendet. Material und Methoden 56 2.6.4 mRNA-Expressionsanalyse 2.6.4.1 RNA-Isolation aus Zellen und Reverse Transkription Die RNA wurde aus den bei RT aufgetauten Zellpellets unter Verwendung des RNeasy Mini Kits (Qiagen, Hilden) wie im RNeasy Mini Handbook (Qiagen, Hilden) beschrieben extrahiert. Die Elution erfolgte mit 50 µl RNAse-freiem sterilem Wasser (AccuGene Molecular Biology Water; Lonza, Basel, Schweiz). Die Konzentrationen der RNA-Lösungen sowie deren Reinheit wurden mittels eines Spektralphotometers auf die gleiche Weise wie bereits in Kapitel 2.2 beschrieben bestimmt. Die isolierte RNA wurde mit einem Kit (RT2 First Strand Kit; Qiagen, Hilden) entsprechend dem Protokoll im RT 2 qPCR Primer Assay Handbook (Qiagen, Hilden) in komplementäre DNA (cDNA) umgeschrieben. Dazu wurde pro Ansatz 1 µg RNA verwendet. Die Reversen Transkriptionsprodukte wurden aliquotiert und bis zur weiteren Verwendung bei -20 °C aufbewahrt. 2.6.4.2 Quantitative Real-Time PCR Im Gegensatz zur herkömmlichen PCR erlaubt die quantitative Real-Time PCR (qRTPCR) neben der Amplifizierung der Nukleinsäuren auch deren Quantifizierung. Dies wird durch die Messung eines Fluoreszenzsignals, welches proportional mit der Menge an entstehendem Produkt zunimmt, ermöglicht. Zur Quantifizierung wird der Ct-Wert (Cycle Threshold) bzw. Cp-Wert (Crossing Point) verwendet. Er entspricht dem Zyklus, an dem die Fluoreszenz ein definiertes Niveau erreicht, alle Proben enthalten am Crossing Point die gleiche Menge DNA (Pfaffl 2004). Die qRT-PCR für CD34, für PROM1 und für das Housekeeping Gen ACTB (actin, beta) wurde unter Verwendung eines Kits (QuantiFast SYBR Green PCR Kit; Qiagen, Hilden) jeweils in dreifacher Ausführung auf einem Real-Time PCR-System (LightCycler® 480 System; Roche Diagnostics, Mannheim) durchgeführt. In 12 µl Reaktionsvolumen wurden 2 µl cDNA-Lösung und spezifische Primer in einer Endkonzentration von je 300 nM eingesetzt. Material und Methoden 57 Menge Einheit Reagenz Endkonzentration 6,00 μl 2x QuantiFast SYBR Green PCR Master Mix 0,18 μl Primer F (10 μM) 300 nM 0,18 μl Primer R (10 μM) 300 nM 2,00 μl cDNA 3,64 μl H2 O Tabelle 2.18: Ansatz für die qRT-PCR Die Primer für die qRT-PCR für PROM1 waren kommerziell erworben (RT² qPCR Primer Assay; Qiagen, Hilden); die Sequenzen der Primer für die qRT-PCR für CD34 und ACTB (Eurofins MWG GmbH, Ebersberg) sind in Tabelle 2.19 dargestellt. Gen Primersequenz CD34 forward 5'- TGCAACATCTCCCACTAAACC reverse 5'- TCTTATTTTGCTCCAGGCAGA ACTB forward 5'- CCAACCGCGAGAAGATGA reverse 5'- CCAGAGGCGTACAGGGATAG Tabelle 2.19: Basensequenzen der für die qRT-PCR verwendeten Primer Die folgende Tabelle 2.20 gibt einen Überblick über die PCR-Bedingungen. Schritt 1. Initiale Akivierung 2. Denaturierung 3. Annealing / Elongation Zeit 5 min 10 sec 30 sec Temp. Zyklenanzahl 95 °C 95 °C 60 °C 35-40 Zyklen Tabelle 2.20: Amplifikationsprogramm für die qRT-PCR 2.6.4.3 Bestimmung der relativen mRNA-Expression Mit der ΔΔCt-Methode erfolgte die relative Quantifizierung der mRNA-Expression der mit 5-azaC behandelten Zellen (Livak and Schmittgen 2001). Als Kontrolle dienten Material und Methoden 58 die mit DPBS anstatt 5-azaC behandelten Proben. Als unreguliertes Referenzgen wurde ACTB verwendet. ΔCt = Ct Zielgen - Ct Referenzgen ΔΔCt = ΔCt Behandlung - ΔCt Kontrolle Relative Expression = 2-ΔΔCt Abbildung 2.16: ΔΔCt-Methode zur Berechnung der relativen mRNA-Expression 2.7 Statistische Auswertung Alle statistischen Berechnungen wurden mit der Computersoftware IBM SPSS Statistics 19 (IBM, Ehningen) durchgeführt. Zur Überprüfung, ob zwei nominalskalierte Variablen unabhängig voneinander sind, wurde der Chi-Quadrat-Test, basierend auf einer Vierfeldertafel, benutzt. War dabei der Erwartungswert aller vier Felder kleiner als 5, so wurde stattdessen der Exakte Test nach Fisher angewandt. Graphisch ist der Vergleich mittels eines gestapelten Balkendiagramms abgebildet, wobei die einzelnen Balken den Prozentsatz für jede X-Achsen-Kategorie darstellen. Mit dem t-Test bei unabhängigen Stichproben wurde für kardinalskalierte Daten überprüft, ob sich die Mittelwerte zweier Stichproben voneinander unterscheiden. Als graphische Darstellung wurde für diese Variablen der Boxplot verwendet. Dabei begrenzt das Rechteck das obere und untere Quartil, der Strich in der Box entspricht dem Median. Die Antennen stellen außerhalb des Rechtecks liegende Werte ohne Ausreißer dar, milde Ausreißer sind durch Kreise, extreme Ausreißer durch Sterne gekennzeichnet. Ereigniszeitanalysen wurden mit dem Kaplan-Meier-Schätzer als nichtparametrisches Verfahren zur Schätzung der Überlebensfunktion durchgeführt. Mit Hilfe des Log-Rang-Tests wurde überprüft, ob die Unterschiede in den verschiedenen Gruppen statistisch signifikant sind. Als graphische Darstellung der Überlebensfunktion wurden Kaplan-Meier-Kurven verwendet, Zensurzeitpunkte sind durch Kreuze dargestellt. Material und Methoden 59 In dieser Dissertation wurden Resultate mit einem p-Wert kleiner 0,05 als statistisch signifikant betrachtet. Alle Ergebnisse sind tabellarisch festgehalten, signifikante Werte unterstrichen. Ergebnisse 60 3 Ergebnisse 3.1 Darstellung der klinisch-pathologischen Parameter des Kollektivs 3.1.1 Geschlechter- und Altersprävalenz Von den 104 GIST kamen 45 (43,3 %) bei Männern vor, 59 (56,7 %) waren bei Frauen zu finden. Das mittlere Alter zum Zeitpunkt der Operation betrug bei den Männern 66,6 (± 11,2) Jahre und bei den Frauen 64,5 (± 15,2) Jahre. Abbildung 3.1: grafische Darstellung der Geschlechter- und Altersverteilung der 104 GIST 3.1.2 Tumorlokalisation Mit 64,4 % stellte der Magen den häufigsten Manifestationsort dar. 23,1 % der GIST kamen in den verschiedenen Abschnitten des Dünndarms vor. Im Dickdarm mit Rektum waren 8,7 % der Tumoren lokalisiert, im Ösophagus nur 1,0 %. Extraintestinal manifestierten sich 2,9 %. Ergebnisse 61 3.1.3 Tumorgröße Bei 100 von den insgesamt 104 Fällen handelte es sich um Tumorresektate, die verbleibenden vier Fälle waren lediglich Biopsien und wurden bei der Größenangabe nicht berücksichtigt. Der kleinste Tumor maß im maximalen Durchmesser 0,4 cm, der größte 25,0 cm. Der Mittelwert betrug 5,8 cm (± 4,8 cm). 3.1.4 Mitosenanzahl Die Anzahl der Mitosen wurde durch lichtmikroskopische Begutachtung der TMA ermittelt. Hierfür wurden Mitosen in 50 Hauptgesichtsfeldern (HPF) ausgezählt und in zwei Kategorien eingeordnet. 80,8 % der Tumoren wiesen ≤5 Mitosen pro 50 HPF auf, 18,3 % mehr als 5 Mitosen pro 50 HPF auf (1,0 % nicht auswertbar). 3.1.5 Histomorphologie Die Beurteilung des histologischen Wachstumsmuster der Tumoren erfolgte lichtmikroskopisch anhand der Tissue-Microarrays. Hierbei ergab sich, dass 54,8 % eine spindelzellige, 26,9 % eine gemischte (sowohl spindelzellig als auch epitheloid) und 14,4 % eine epitheloide Morphologie zeigten (3,8 % nicht auswertbar). 3.1.6 Immunphänotyp An den Tissue-Microarrays wurde die Expression verschiedener Proteine untersucht und die Stärke der Expression durch lichtmikroskopische Begutachtung quantifiziert. Die Einteilung erfolgte in die vier Gruppen „keine Expression“ (vollständig negativ), „geringe Expression“ (schwache Färbung des Zytoplasmas, häufig Einzelzellen oder kleine Cluster), „mäßige Expression“ (mittlere Färbung) und „starke Expression“ (starke Färbung, schon makroskopisch gut zu erkennen). Ergebnisse 62 KIT Anzahl Prozent keine Expression geringe Expression mäßige Expression starke Expression nicht auswertbar CD34 Anzahl Prozent PROM1 Anzahl Prozent 1 17 20 63 1,0 16,3 19,2 60,6 15 23 10 52 14,4 22,1 9,6 50,0 17 36 18 28 16,3 34,6 17,3 26,9 3 2,9 4 3,8 5 4,8 Tabelle 3.1: Darstellung der absoluten und relativen Häufigkeiten der Proteinexpression von KIT, CD34 und PROM1 der 104 GIST 3.1.7 Mutationsstatus Von allen 104 Tumorproben liegen Ergebnisse der Mutationsanalysen der Gene KIT (Exons 9, 11, 13, 17), PDGFRA (Exons 10, 12, 14, 18) und BRAF (Exon 15) vor. Bei 76 Tumoren (73,1 %) konnte eine Mutation im KIT-Gen nachgewiesen werden. Von den 28 Tumoren ohne KIT-Mutationen hatten 16 (15,4 % aller Tumoren) eine Mutation im PDGFRA-Gen. Bei den verbleibenden zwölf Tumoren, die weder eine KIT- noch eine PDGFRA-Mutation aufwiesen, gelang in einem Fall der Nachweis einer Mutation im BRAF-Gen (1,0 % aller GIST). Somit war in 10,6 % der Fälle in keinem der untersuchten Exons eine Mutation nachweisbar, diese 11 Tumoren werden im Folgenden daher als „Wildtyp“ bezeichnet. Mit nur wenigen Ausnahmen handelte es sich bei den nachgewiesenen Mutationen um heterozygote Mutationen, es war nur eines der beiden Allele mutiert. Am häufigsten kamen Deletionen (44,1 %) und Punktmutationen (36,6 %) vor, Duplikationen waren mit 12,9 % vertreten. Insertionen sowie Deletionen/Insertionen (Indels) waren selten nachweisbar (6,5 %) und kamen ausschließlich im Exon 11 des KIT-Gens vor. 3.1.7.1 Mutationen des KIT-Gens Bei insgesamt 76 Tumorproben (73,1 %) war es möglich, eine Mutation im KIT-Gen nachzuweisen. Ergebnisse 63 3.1.7.1.1 Exon 11 Die meisten Mutationen (n = 67) betrafen den für die Juxtamembranäre Domäne der Rezeptor-Tyrosinkinase codierenden Bereich, waren somit im Exon 11 des Gens lokalisiert und machten 72,0 % aller nachgewiesenen Mutationen aus. Am häufigsten waren Deletionen, gefolgt von Punktmutationen zu finden. Duplikationen sowie Insertionen und Indels kamen nur selten in diesem Exon vor. Deletionen: Bei den Deletionen (n = 39) handelte es sich um in frame-Deletionen von DNABasen, welche zu Verlusten von Aminosäuren in der Proteinstruktur führten, gelegentlich verknüpft mit dem Einbau einer neuen Aminosäure an dieser Stelle (in fünf von 39 Fällen). Es konnten 24 verschiedene Deletionen mit einem Verlust von mindestens drei bis maximal 51 Basenpaaren nachgewiesen werden. Am häufigsten waren von einer Deletion sechs Basenpaare betroffen, was sich in der Proteinstruktur mit dem Verlust von zwei Aminosäuren bemerkbar machte (Bsp.: c.1669_1674delTGGAAG führt zu p.W557_K558del). Die Aminosäurenverluste erstreckten sich beinahe über das gesamte Exon 11 und betrafen die Codons 550 bis 579. 580 575 570 565 560 K K K K K K K K K K K K K K K K K K K K K K K K 64 555 1 2 1 1 1 1 2 2 1 8 1 1 2 1 4 1 1 1 1 1 2 1 1 1 Anzahl der Fälle KIT Codon 550 Ergebnisse K P M Y E V Q W K V V E E I N G N N Y V Y I D P T Q L P Y D H K W E P P P P P P P P P P P P P P P P P P P P P P P P M M M M M M M M M M M M M M M M M M M M M M M M Y Y Y Y Y Y Y Y Y Y Y Y Y Y Y Y Y Y Y Y Y Y Y Y E E E E E E E E E E E E E E E E E E E E E E E E V V V V V V V V V V V V V V V V V V V V V V V V Q Q Q Q Q Q Q Q Q Q Q Q Q Q Q Q Q Q Q Q Q Q Q Q W W W R W W W W W W W W W W W W W W W W W W W W K K K K K K K K K K K K K K K K K K K K K K K K V V V V I V V V V V V V V V V V V V V V V V V V V V V V V V V V V V V V V V V V V V V V V V V V E E E E E E E E E E E E E E E E E E E E E E E E E E E E E E E E E E E E E E E E E E E E E E E E I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I N N N N N N N N N N N N N N N N N N N N N N N N G G G G G G G G G G G R G G G G G G G G G G G G N N N N N N N N N N N N N D N N N N N N N N N N N N N N N N N N N N N N N N N N N N N N N N N N Y Y Y Y Y Y Y Y Y Y Y Y Y Y Y Y Y Y Y Y Y Y Y Y V V V V V V V V V V V V V V V V V V V V V V V V Y Y Y Y Y Y Y Y Y Y Y Y Y Y Y Y Y Y Y Y Y Y Y Y I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I D D D D D D D D D D D D D D D D D D D D D D D D P P P P P P P P P P P P P P P P P T P P P P P P T T T T T T T T T T T T T T T T T T T T T T T T Q Q Q Q Q Q Q Q Q Q Q Q Q Q Q Q Q Q Q Q Q Q Q Q L L L L L L L L L L L L L L L L L L L L L L L L P P P P P P P P P P P P P P P P P P P P P P P P Y Y Y Y Y Y Y Y Y Y Y Y Y Y Y Y Y Y Y Y Y Y Y Y D D D D D D D D D D D D D D D D D D D D D D D D H H H H H H H H H H H H H H H H H H H H H H H H K K K K K K K K K K K K K K K K K K K K K K K K W W W W W W W W W W W W W W W W W W W W W W W W E E E E E E E E E E E E E E E E E E E E E E E E Tabelle 3.2: Deletionen im Exon 11 des KIT-Gens, Aminosäurensequenz im Einbuchstabencode dargestellt. [schwarz: AS-Sequenz; grau und durchgestrichen: ASVerlust; schwarz und unterstrichen: durch Deletion verursachte AS-Substitution] Punktmutationen: 26,9 % der Exon-11-Mutationen (n = 18) waren Punktmutationen der DNA, führten somit zur Substitution einer Aminosäure im Protein. Dies betraf die Codons 557, 559, 560 sowie 576 des Proteins. Am häufigsten (in sechs von 18 Fällen) war die Punktmutation c.1727T>C nachweisbar. Dieser Austausch von Thymin durch Cytosin führte zur Substitution von Leucin durch Prolin (p.L576P). 580 575 570 565 K K K K K K K 560 1 4 1 2 1 3 6 Anzahl der Fälle KIT Codon 555 65 550 Ergebnisse K P M Y E V Q W K V V E E I N G N N Y V Y I D P T Q L P Y D H P P P P P P P M M M M M M M Y Y Y Y Y Y Y E E E E E E E V V V V V V V Q Q Q Q Q Q Q G R W W W W W K K K K K K K V V G D V V V V V V V G D V E E E E E E E E E E E E E E I I I I I I I N N N N N N N G G G G G G G N N N N N N N N N N N N N N Y Y Y Y Y Y Y V V V V V V V Y Y Y Y Y Y Y I I I I I I I D D D D D D D P P P P P P P T T T T T T T Q Q Q Q Q Q Q L L L L L L P P P P P P P P Y Y Y Y Y Y Y D D D D D D D H H H H H H H Tabelle 3.3: Punktmutationen im Exon 11 des KIT-Gens, AS-Sequenz im Einbuchstabencode dargestellt [schwarz: AS-Sequenz; unterstrichen: durch Punktmutation verursachte AS-Substitution] Duplikationen / Insertionen: Duplikationen waren in diesem Exon selten vertreten, wobei es sich bei den vier gefundenen um relativ lange Sequenzen mit der Verdopplung von bis zu 57 DNABasen bzw. 19 Aminosäuren handelte (c.1721_1774+3dup57). Die einzige Insertion wurde durch Einfügen der Nukleinbasenabfolge CytosinCytosin-Adenin hervorgerufen (c.1673_1674insCCA), was auf Protein-Ebene zu einem Verlust von Lysin sowie Einbau von Asparagin und Glutamin führte Anzahl der Fälle 590 585 580 575 570 565 KIT Codon 560 (p.K558delinsNQ). W K V V E E I N G N N Y V Y I D P T Q L P Y D H K W E F P R N R L S F 1 1 1 1 W W W W K K K K V V V V V V V V E E E E E E E E I I I I N N N N G G G G N N N N N N N N Y Y Y Y V V V V Y Y Y Y I I I I D D D D P P P P T T T P Q Q Q Q L L L L P P P P Y Y Y Y D D D D H H H H K K K K W W W W E E E E F F F F P P P P R R R R N N N N R R R R L L L L S S S S F F F F G 1 WN Q V V E E I N G N N Y V Y I D P T Q L P Y D H K W E F P R N R L S F Tabelle 3.4: Duplikationen (oben) und Insertion (unten) im Exon 11 des KIT-Gens, ASSequenz im Einbuchstabencode dargestellt [schwarz: AS-Sequenz; unterstrichen: duplizierte Sequenz; kursiv: durch Duplikation verursachte AS-Substitution; fett: AS-Insertion] Indels: In vier der fünf Fälle konnte die Mutation c.1679_1680delTTinsAG nachgewiesen werden, welche auf Protein-Ebene zum Austausch der Aminosäure Valin durch Glutaminsäure führte (p.V560E). 580 575 570 565 560 66 555 KIT Codon 550 Ergebnisse K P M Y E V Q W K V V E E I N G N N Y V Y I D P T Q L P Y D H K W E 1 K P M Y E V Q W K V V E E L N G N N Y V Y I D P T Q L P Y D H K W E 4 K P M Y E V Q W K V E E E I N G N N Y V Y I D P T Q L P Y D H K W E Tabelle 3.5: Indels im Exon 11 des KIT-Gens, AS-Sequenz im Einbuchstabencode dargestellt [schwarz: AS-Sequenz; grau und durchgestrichen: AS-Verlust; kursiv und fett: durch Indel verursachte AS-Substitution] In der folgenden Tabelle sind alle Mutationen im Exon 11 des KIT-Gens mit ihrer Nomenklatur auf DNA- sowie Protein-Ebene zusammengefasst. Ergebnisse Mutation 67 Mutation-Art DNA-Ebene Protein-Ebene c.1648-5_1672del30 c.1653_1658delCATGTA c.1654_1671del18 c.1655_1669del15 c.1655_1675del21 c.1657_1668del12 c.1660_1674del15 c.1660_1677del18 c.1662_1667delAGTACA c.1669_1674delTGGAAG c.1672_1680delAAGGTTGTT c.1673_1693del21 c.1675_1680delGTTGTT c.1676_1696del21 c.1678_1680delGTT c.1678_1728del51 c.1684_1713del30 c.1688_1717del30 c.1689_1727del39 c.1696_1719del24 c.1708_1728del21 c.1711_1716delATACAC c.1723_1728delCAACTT c.1735_1737delGAT p.K550_K558del p.M552_Y553del p.M552_W557del p.M552_W557delinsR p.M552_V559delinsI p.Y553_Q556del p.E554_K558del p.E554_V559del p.V555_Q556del p.W557_K558del p.K558_V560del p.K558_G565delinsR p.V559_V560del p.V559_G566delinsD p.V560del p.V560_L576del p.E562_I571del p.I563_P573delinsT p.N564_L576del p.N566_P573del p.Y570_L576del p.I571_D572del p.Q575_L576del p.D579del 1 2 1 1 1 1 2 2 1 8 1 1 2 1 4 1 1 1 1 1 2 1 1 1 Duplikation c.1717_1761dup45 c.1720_1758dup39 c.1720_1761dup42 c.1721_1774+3dup57 p.P573_N587dup p.T574_R586dup p.T574_N587dup 1 1 1 1 Indel c.1672_1687delinsT c.1679_1680delTTinsAG p.K558_I563delinsL p.V560E 1 4 Insertion c.1673_1674insCCA p.K558delinsNQ 1 p.W557R p.W557R p.W557G p.V559D p.V559G p.V560D p.V560G p.L576P 2 2 1 2 1 3 1 6 KIT Exon 11 Deletion Punktmutation c.1669T>A c.1669T>C c.1669T>G c.1676T>A c.1676T>G c.1679T>A c.1679T>G c.1727T>C Tabelle 3.6: Übersicht aller Mutationen im Exon 11 des KIT-Gens Anzahl Ergebnisse 68 3.1.7.1.2 Exon 9 Am zweithäufigsten betrafen Mutationen des KIT-Gens das Exon 9 (n = 7) und hatten somit Auswirkungen auf die Extrazelluläre Domäne des Rezeptors. Es kamen ausschließlich Duplikationen von sechs Basenpaaren vor, die zu Verdopplungen von zwei Aminosäuren im Protein führten. In allen sieben Fällen konnte die Verdopplung der Aminosäuren Alanin und Tyrosin der Codons 502 und 503 (p.A502_Y503dup) nachgewiesen werden, auf DNA-Ebene bedeutete dies die Duplikation c.1504_1509dup. Mutation Mutation-Art DNA-Ebene Protein-Ebene KIT Exon 9 Duplikation c.1504_1509dupGCCTAT p.A502_Y503dup Anzahl 7 Tabelle 3.7: Übersicht aller Mutationen im Exon 9 des KIT-Gens 3.1.7.1.3 Exon 13 Veränderungen in der Tyrosin-Kinase-Domäne 1 des KIT-Rezeptors wurden durch Substitution von Lysin durch Glutaminsäure im Codon 642 des Proteins hervorgerufen (p.K642E). Diese Mutation konnte bei zwei Fällen des Kollektivs nachgewiesen werden und war die einzige Veränderung im Exon 13. Auf DNAEbene war ursprünglich der Austausch der Pyrimidinbase Alanin durch die Purinbase Guanin (c.1924A>G) dafür verantwortlich. Mutation Mutation-Art KIT Exon 13 Punktmutation DNA-Ebene Protein-Ebene c.1924A>G p.K642E Anzahl 2 Tabelle 3.8: Übersicht aller Mutationen im Exon 13 des KIT-Gens 3.1.7.1.4 Exon 17 Es konnte bei keiner Tumorprobe eine Mutation in dem für die Tyrosin-KinaseDomäne 2 codierenden Abschnitt des Gens nachgewiesen werden. Ergebnisse 69 3.1.7.2 Mutationen des PDGFRA-Gens 16 Mutationen, dies entspricht 17,2 % aller nachgewiesenen Mutationen, betrafen das PDGFRA-Gen. 3.1.7.2.1 Exon 18 75,0 % der Mutationen des PDGFRA-Gens bzw. 12,9 % aller nachgewiesenen Mutationen betrafen das Exon 18 (n = 12), den für die Tyrosin-Kinase-Domäne 2 des PDGF-Rezeptors α codierenden Genabschnitt. In den meisten Fällen wurde an Position 842 des Proteins die Aminosäure Aspartat durch Valin ersetzt. Des Weiteren waren insgesamt zweimal Verluste von je vier Aminosäuren eruierbar. Mutation Mutation-Art PDGFRA Exon 18 Deletion Punktmutation DNA-Ebene Protein-Ebene c.2524_2535del12 c.2527_2538del12 p.D842_H845del p.I843_D846del c.2525A>T p.D842V Anzahl 1 1 10 Tabelle 3.9: Übersicht aller Mutationen im Exon 18 des PDGFRA-Gens 3.1.7.2.2 Exon 12 In diesem Abschnitt des PDGFRA-Gens konnten sowohl zwei Punktmutationen (c.1682T>A, welche zum Austausch der Aminosäure Valin durch Aspartat führten) als auch eine Duplikation von 30 DNA-Basen beschrieben werden. Mutation Mutation-Art PDGFRA Exon 12 Duplikation Punktmutation DNA-Ebene Protein-Ebene Anzahl c.1666_1695dup30 p.E556_I565dup 1 c.1682T>A p.V561D 2 Tabelle 3.10: Übersicht aller Mutationen im Exon 12 des PDGFRA-Gens 3.1.7.2.3 Exon 14 Lediglich bei einem Fall konnte der Austausch der DNA-Base Cytosin durch Guanin mit Auswirkung auf die Proteinstruktur beobachtet werden. Ergebnisse 70 Mutation Mutation-Art PDGFRA Exon 14 Punktmutation DNA-Ebene Protein-Ebene c.1977C>G p.N659K Anzahl 1 Tabelle 3.11: Übersicht aller Mutationen im Exon 14 des PDGFRA-Gens 3.1.7.2.4 Exon 10 In diesem Exon konnte zwar bei einer Tumorprobe die Punktmutation c.1432T>C mit Substitution von Serin durch Prolin auf Protein-Ebene nachgewiesen werden (p.S478P), diese hat jedoch wohl keinen Effekt auf die Proteinaktivität (Maertens, Prenen et al. 2006). In der Single Nucleotide Polymorphism Database (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/projects/SNP/) wird diese Mutation als Single Nucleotide Variation (SNV) unter der reference SNP ID number „rs 35597368“ geführt. 3.1.7.3 Mutationen des BRAF-Gens Im untersuchten Exon 15 dieses Gens konnte bei einem Fall, der in allen anderen zuvor untersuchten Abschnitten keine Mutationen gezeigt hatte, eine Substitution nachgewiesen werden. Mutation Mutation-Art DNA-Ebene Protein-Ebene BRAF Exon 15 Punktmutation c.1799T>A p.V600E Anzahl 1 Tabelle 3.12: Übersicht aller Mutationen im Exon 15 des BRAF-Gens 3.1.8 Risikoklassifikationen Die Einteilung der GIST nach der Risikoklassifikation nach Fletcher (Fletcher, Berman et al. 2002), bei der Tumorgröße und mitotische Aktivität der Tumorzellen berücksichtigt werden, ergab, dass 18 Tumoren (17,3 %) ein sehr niedriges, 30 (28,8 %) ein niedriges, 28 (26,9 %) ein intermediäres und 22 Tumoren (21,2 %) ein hohes Risiko zeigten. 5,8 % der Tumoren konnten nicht ausgewertet werden. Ergebnisse 71 Abbildung 3.2: grafische Darstellung der absoluten Häufigkeiten nach Einteilung der 104 GIST nach der Risikoklassifikation nach Fletcher Die Einteilung der GIST nach der Risikoklassifikation nach Miettinen (Miettinen and Lasota 2006), bei der neben Tumorgröße und Mitoseindex auch die anatomische Lokalisation berücksichtigt wird, ergab, dass 18 Tumoren (17,3 %) ein sehr niedriges, 47 (45,2 %) ein niedriges, 15 (14,4 %) ein intermediäres und 20 Tumoren (19,2 %) ein hohes Risiko zeigten. 3,8 % der Fälle konnten nicht ausgewertet werden. Abbildung 3.3: grafische Darstellung der absoluten Häufigkeiten nach Einteilung der 104 GIST nach der Risikoklassifikation nach Miettinen Ergebnisse 72 Fletcher 2002 Anzahl Prozent sehr niedriges Risiko niedriges Risiko intermediäres Risiko hohes Risiko nicht auswertbar Miettinen 2006 Anzahl Prozent 18 30 28 22 17,3 28,8 26,9 21,2 18 47 15 20 17,3 45,2 14,4 19,2 6 5,8 4 3,8 Tabelle 3.13: Darstellung der absoluten und relativen Häufigkeiten nach Einteilung der 104 GIST nach den Risikoklassifikationen nach Fletcher und Miettinen 3.1.9 Follow-up Von 48 der 104 Fälle (46,2 %) lagen zum Zeitpunkt der Erhebung Daten zum Progress und krankheitsfreien Überleben nach Operation vor. Bei zehn Patienten (20,8 %) kam es nach null bis 61 Monaten – im Mittel nach 20 Monaten (± 21 Monaten) – zu einem Tumorprogress. Bei 38 Patienten (79,2 %) wurde keine Tumorprogression beobachtet. Das krankheitsfreie Überleben lag hier zwischen einem und 142 Monaten und betrug im Mittel 60 Monate (± 38 Monate). 3.2 Darstellung der DNA-Methylierung und Proteinexpression von CD34 im Zusammenhang mit den klinisch-pathologischen Parametern 3.2.1 Proteinexpression und DNA-Methylierung Die Expression von CD34 wurde durch lichtmikroskopische Begutachtung der Tissue-Microarrays semiquantitativ beurteilt und in vier Gruppen eingeteilt: „Keine Expression“ bedeutete vollständige Negativität mit Ausnahme Gefäßendothelien, „geringe Expression“ klassifizierte Tumoren eingestreuter mit schwach gefärbtem Zytoplasma und angefärbten Einzelzellen oder kleinen Clustern. Die Kategorie „mäßige Expression“ beinhaltete Tumoren mit durchweg mittlerer Färbung, makroskopisch bereits gut zu erkennende Färbungen wurden der Kategorie „starke Expression“ zugeordnet. Ergebnisse 73 Der Methylierungsstatus der bisulfitkonvertierten DNA aller GIST wurde an zwei CpG-Loci des CD34-Gens (CD34_P339_R sowie CD34_P780_R) quantitativ beurteilt. Abbildung 3.4: links: prozentuale Verteilung der CD34-Expression aller GIST; rechts: mittlere Methylierung an Position P339_R und P780_R des CD34-Gens 14,4 % der GIST zeigten keine CD34-Expression, 22,1 % eine geringe. Eine mäßige Expression wurde bei 9,6 % der Tumoren, eine starke CD34-Expression bei 50,0 % nachgewiesen. Beim Vergleich des prozentualen Methylierungsgrades des CD34-Gens fielen Unterschiede zwischen den beiden Abschnitten auf. CD34_P339_R war im Mittel weniger stark methyliert (31,1 % ± 28,1 %) als CD34_P780_R (55,5 % ± 28,5 %). 3.2.2 CD34 und Tumorlokalisation Im Folgenden sind die Proteinexpression und der Methylierungsgrad der zwei untersuchten CpG-Loci des CD34-Gens in Bezug zu den Lokalisationen Magen, Dünndarm und Dickdarm gesetzt worden. Ergebnisse 74 3.2.2.1 Expression Abbildung 3.5: grafische Darstellung der relativen Häufigkeiten der unterschiedlich starken CD34-Expression, getrennt nach der Lokalisation des Tumors Tumoren des Magens wiesen eine signifikant höhere CD34-Expression auf als Tumoren des Dünndarms (Chi-Quadrat-Test; p = 0,0003). Ähnliches Verhalten zeigten GIST des Dickdarms, der Unterschied zu Tumoren des Dünndarms war jedoch auf Grund der geringen Fallzahl nicht signifikant. CD34-Expression Magen Dünndarm Dickdarm Magen vs. Dünndarm Magen vs. Dickdarm Dünndarm vs. Dickdarm keine/geringe Anzahl Prozent 16 16 3 42,1% 42,1% 7,9% mäßige/starke Anzahl Prozent 48 8 5 77,4% 12,9% 8,1% p-Wert 0,0003 0,4 0,1 Tabelle 3.14: tabellarische Darstellung 1. der absoluten und relativen Häufigkeiten der unterschiedlich starken CD34-Expression, getrennt nach der Lokalisation des Tumors und 2. der durch den Chi-Quadrat-Test ermittelten p-Werte beim Vergleich der verschiedenen Lokalisationen Ergebnisse 75 3.2.2.2 Methylierung Der mittlere Methylierungswert von CD34_P339_R betrug bei im Dünndarm lokalisierten Tumoren 59,3 % (± 18,3 %). Diese GIST waren signifikant höher methyliert als Tumoren des Magens, die im Mittel zu 21,0 % (± 22,9 %) methyliert waren (t-Test bei unabhängigen Stichproben; p < 0,0001), und als Tumoren des Dickdarms, deren mittlere Methylierung 25,6 % (± 27,5 %) betrug (p 0,0003). Abbildung 3.6: grafische Darstellung der mittleren Methylierung an den CpG-Loci CD34_P339_R [links] und CD34_P780_R [rechts], getrennt nach der Tumorlokalisation Ähnliches Bild zeigte sich für CD34_P780_R. Dünndarm-GIST mit einer mittleren Methylierung von 80,5 % (± 7,7 %) waren signifikant höher methyliert als MagenGIST, die eine mittlere Methylierung von 47,7 % (± 27,5 %) boten (p < 0,0001), und ebenfalls signifikant höher methyliert als Dickdarm-GIST, deren Methylierung im Mittel 43,6 % (± 32,8 %) betrug (p = 0,01). Ergebnisse 76 Lokalisation Magen Dünndarm Dickdarm Magen vs. Dünndarm Magen vs. Dickdarm Dünndarm vs. Dickdarm CD34_P339_R Mittelwert SD 21,0% 59,3% 25,6% 22,9% 18,3% 27,5% p-Wert <0,0001 0,6 0,0003 CD34_P780_R Mittelwert SD 47,7% 80,5% 43,6% 27,5% 7,7% 32,8% p-Wert <0,0001 0,7 0,01 Tabelle 3.15: tabellarische Darstellung 1. der mittleren Methylierung an den CpG-Loci CD34_P339_R und CD34_P780_R, getrennt nach der Tumorlokalisation und 2. der durch den t-Test ermittelten p-Werte beim Vergleich der verschiedenen Lokalisationen 3.2.3 CD34 und Mitosenanzahl 3.2.3.1 Expression Abbildung 3.7: grafische Darstellung der relativen Häufigkeiten der unterschiedlich starken CD34-Expression, getrennt nach der Mitosenanzahl Von den auswertbaren Fällen zeigten 72,2 % der GIST mit > 5 Mitosen in 50 HPF eine mäßige bzw. starke CD34-Expression. Bei den Tumoren mit ≤ 5 Mitosen in 50 HPF machte dieser Anteil nur 59,3 % aus. Statistisch signifikant war dieser Unterschied jedoch nicht. Ergebnisse CD34-Expression ≤ 5 in 50 HPF > 5 in 50 HPF 77 keine/geringe Anzahl Prozent 33 5 86,8% 13,2% mäßige/starke Anzahl Prozent 48 13 77,4% 21,0% p-Wert 0,3 Tabelle 3.16: tabellarische Darstellung der 1. absoluten und relativen Häufigkeiten der unterschiedlich starken CD34-Expression, getrennt nach der Mitosenanzahl und 2. des durch den Chi-Quadrat-Test ermittelten p-Wertes beim Vergleich der beiden Kategorien 3.2.3.2 Methylierung Abbildung 3.8: grafische Darstellung der mittleren Methylierung an den CpG-Loci CD34_P339_R [links] und CD34_P780_R [rechts], getrennt nach der Mitosenanzahl Am CpG-Locus CD34_P780_R wiesen Tumoren mit einer Mitosenanzahl von > 5 in 50 HPF eine mittlere Methylierung von 39,2 % (± 29,8 %) auf, Tumoren mit ≤ 5 Mitosen in 50 HPF waren an dieser Position im Mittel zu 59,6 % (± 26,9 %) und im Vergleich somit signifikant höher methyliert (t-Test bei unabhängigen Stichproben; p = 0,004). Die Methylierung am CpG-Locus CD34_P339_R zeigte ähnliche Tendenz, es konnte aber kein signifikanter Unterschied beim Vergleich der Mittelwerte dargestellt werden. Ergebnisse 78 Mitosen ≤ 5 in 50 HPF Mittelwert SD CD34_P339_R CD34_P780_R 33,2% 59,6% 28,5% 26,9% > 5 in 50 HPF Mittelwert SD 22,8% 39,2% 25,7% 29,8% p-Werte 0,1 0,004 Tabelle 3.17: tabellarische Darstellung 1. der mittleren Methylierung an den CpG-Loci CD34_P339_R und CD34_P780_R, getrennt nach der Mitosenanzahl und 2. der durch den tTest ermittelten p-Werte beim Vergleich der beiden Kategorien 3.2.4 CD34 und Genotyp 3.2.4.1 Expression Abbildung 3.9: grafische Darstellung der relativen Häufigkeiten der unterschiedlich starken CD34-Expression, getrennt nach der Genmutation GIST mit einer Mutation im KIT-Gen wiesen eine signifikant höhere CD34-Expression auf als PDGFRA-mutierte Tumoren (Chi-Quadrat-Test; p = 0,02). Ergebnisse CD34-Expression KIT PDGFRA 79 keine/geringe Anzahl Prozent 24 10 63,2% 26,3% mäßige/starke Anzahl Prozent p-Wert 51 6 82,3% 9,7% 0,02 Tabelle 3.18: tabellarische Darstellung 1. der absoluten und relativen Häufigkeiten der unterschiedlich starken CD34-Expression, getrennt nach der Genmutation und 2. des durch den Chi-Quadrat-Test ermittelten p-Wertes beim Vergleich der beiden Kategorien 3.2.4.2 Methylierung Abbildung 3.10: grafische Darstellung der mittleren Methylierung an den CpG-Loci CD34_P339_R [links] und CD34_P780_R [rechts], getrennt nach der Genmutation Die 76 Tumoren mit einer Mutation im KIT-Gen wiesen an der Position CD34_P339_R eine mittlere Methylierung von 25,0 % (± 25,8 %) und am Locus CD34_P780_R von 48,9 % (± 28,3 %) auf. Die 16 PDGFRA-mutierten GIST waren an diesen Loci im Mittel zu 47,4 % (± 23,7 %) bzw. 78,6 % (± 6,1 %) methyliert. GIST mit PDGFRA-Mutation waren an beiden CpG-Loci des CD34-Gens somit signifikant höher methyliert als GIST mit einer KIT-Mutation (t-Test bei unabhängigen Stichproben; p = 0,002 bzw. p < 0,0001). Ergebnisse 80 Mutation CD34_P339_R CD34_P780_R KIT Mittelwert SD 25,0% 48,9% 25,8% 28,3% PDGFRA Mittelwert SD 47,4% 78,6% p-Werte 23,7% 0,002 6,1% <0,0001 Tabelle 3.19: tabellarische Darstellung 1. der mittleren Methylierung an den CpG-Loci CD34_P339_R und CD34_P780_R, getrennt nach der Genmutation und 2. der durch den tTest ermittelten p-Werte beim Vergleich der beiden Kategorien 3.2.5 CD34 und Genotyp unter Berücksichtigung der Lokalisation 3.2.5.1 Expression Abbildung 3.11: grafische Darstellung der relativen Häufigkeiten der unterschiedlich starken CD34-Expression, getrennt nach der Genmutation unter Berücksichtigung der Lokalisation 66,1 % der Tumoren mit mäßiger bzw. starker CD34-Expression wiesen eine Mutation im KIT-Gen auf und waren im Magen lokalisiert. Sie wiesen eine signifikant höhere CD34-Expression auf als zum einen KIT-mutierte Tumoren des Dünndarms, die einen Anteil von 8,1 % der Tumoren mit mäßiger/starker Expression ausmachten (Chi-Quadrat-Test; p < 0,0001), und zum anderen Magen-GIST mit PDGFRAMutation (9,7 % der Tumoren mit mäßiger/starker Expression; p = 0,002). Für KITmutierte Tumoren des Rektums (83,3 % starke Expression, 0,0 % keine/geringe Expression) konnte ebenfalls eine signifikant höhere CD34-Expression als für Ergebnisse 81 Dünndarm-GIST mit Mutation im gleichen Gen und Magen-GIST mit Mutation des PDGFRA-Gens nachgewiesen werden (p = 0,005 und p = 0,03). CD34-Expression KIT-Magen KIT-Dünndarm KIT-Rektum PDGFRA-Magen KIT-Magen vs. KIT-Dünndarm KIT-Magen vs. KIT-Rektum KIT-Magen vs. PDGFRA-Magen KIT-Dünndarm vs. KIT-Rektum KIT-Dünndarm vs. PDGFRA-Magen KIT-Rektum vs. PDGFRA-Magen keine/geringe Anzahl Prozent 8 12 0 8 mäßige/starke Anzahl Prozent 21,1% 31,6% 0,0% 21,1% 41 5 5 6 66,1% 8,1% 8,1% 9,7% p-Wert <0,0001 0,3 0,002 0,005 0,4 0,03 Tabelle 3.20: tabellarische Darstellung 1. der absoluten und relativen Häufigkeiten der unterschiedlich starken CD34-Expression, getrennt nach Genmutation und Lokalisation und 2. der durch den Chi-Quadrat-Test ermittelten p-Werte beim Vergleich der verschiedenen Kategorien 3.2.5.2 Methylierung Abbildung 3.12: grafische Darstellung der mittleren Methylierung am CpG-Locus CD34_P339_R, getrennt nach der Genmutation unter Berücksichtigung der Lokalisation Ergebnisse 82 KIT-mutierte Tumoren des Dünndarms zeigten am CpG-Locus CD34_P339_R eine mittlere Methylierung von 58,8 % (± 15,8 %) und waren somit signifikant höher methyliert als KIT-mutierte Tumoren des Magens, bei denen die Methylierung im Mittel 13,6 % (± 17,3 %) betrug (t-Test bei unabhängigen Stichproben; p < 0,0001). Des Weiteren waren diese Tumoren signifikant höher methyliert als Rektum-GIST mit KIT-Mutation, deren mittlere Methylierung 14,7 % (± 11,9 %) betrug (p < 0,0001), und als Magen-GIST mit PDGFRA-Mutation, die im Mittel zu 42,6 % (± 21,3 %) methyliert waren (p = 0,02). PDGFRA-mutierte GIST des Magens waren an diesem CpG-Locus signifikant höher methyliert als KIT-mutierte Tumoren des Magens (p < 0,0001) und Rektum-GIST mit KIT-Mutation (p = 0,008). Abbildung 3.13: grafische Darstellung der mittleren Methylierung am CpG-Locus CD34_P780_R, getrennt nach der Genmutation unter Berücksichtigung der Lokalisation Dünndarm-GIST mit KIT-Mutation wiesen am CpG-Locus CD34_P780_R eine mittlere Methylierung von 79,2 % (± 8,4 %), KIT-mutierte GIST des Magens von 39,5 % (± 24,7 %) auf. Ein signifikanter Unterschied (p < 0,0001) konnte nachgewiesen werden. Dünndarm-GIST mit KIT-Mutation waren an diesem CpG-Locus ebenfalls signifikant höher methyliert als KIT-mutierte GIST des Rektums, die im Mittel zu 29,5 % (± 30,8 %) methyliert waren (p = 0,01). Ergebnisse 83 GIST des Magens mit einer Mutation im PDGFRA-Gen (mittlere Methylierung 78,0 % ± 5,4 %) waren signifikant höher methyliert als KIT-mutierte GIST gleicher Lokalisation (p < 0,0001) sowie des Rektums (p = 0,01). Methylierung KIT-Magen KIT-Dünndarm KIT-Rektum PDGFRA-Magen CD34_P339_R Mittelwert SD 13,6% 58,8% 14,7% 42,6% KIT-Magen vs. KIT-Dünndarm KIT-Magen vs. KIT-Rektum KIT-Magen vs. PDGFRA-Magen KIT-Dünndarm vs. KIT-Rektum KIT-Dünndarm vs. PDGFRA-Magen KIT-Rektum vs. PDGFRA-Magen 17,3% 15,8% 11,9% 21,3% p-Wert <0,0001 0,9 <0,0001 <0,0001 0,02 0,008 CD34_P780_R Mittelwert SD 39,5% 79,2% 29,5% 78,0% 24,7% 8,4% 30,8% 5,4% p-Wert <0,0001 0,4 <0,0001 0,01 0,7 0,01 Tabelle 3.21: tabellarische Darstellung 1. der mittleren Methylierung an den CpG-Loci CD34_P339_R und CD34_P780_R, getrennt nach Genmutation und Lokalisation und 2. der durch den t-Test ermittelten p-Werte beim Vergleich der verschiedenen Kategorien 3.3 Darstellung der DNA-Methylierung und Proteinexpression von PROM1 im Zusammenhang mit den klinisch-pathologischen Parametern 3.3.1 Proteinexpression und DNA-Methylierung Die Expression von PROM1 wurde durch lichtmikroskopische Begutachtung der Tissue-Microarrays semiquantitativ beurteilt und in die vier Gruppen „keine Expression“, „geringe Expression“, „mäßige Expression“ und „starke Expression“ eingeteilt. Für die Gruppenzuteilung wurden die gleichen Kriterien wie für die CD34Expression verwendet. Der Methylierungsstatus des PROM1-Gens wurde an dem 44 Nukleotide upstream des TSPs gelegenen CpG-Locus PROM1_P44_R mittels Pyrosequenzierung quantitativ beurteilt. Ergebnisse 84 Abbildung 3.14: links: prozentuale Verteilung der PROM1-Expression aller GIST; rechts: Methylierungsstatus am CpG-Locus P44_R des PROM1-Gens 16,3 % aller GIST zeigten keine Expression von PROM1, 34,6 % eine geringe Expression. Eine mäßige Expression konnte bei 17,3 % und eine starke Expression bei 26,9 % der Tumoren nachgewiesen werden. Der CpG-Locus P44_R des PROM1-Gens war im Mittel zu 47,6 % (± 33,0 %) methyliert. Ergebnisse 85 3.3.2 PROM1 und Tumorlokalisation 3.3.2.1 Expression Abbildung 3.15: grafische Darstellung der relativen Häufigkeiten der unterschiedlich starken PROM1-Expression, getrennt nach der Lokalisation des Tumors Tumoren mit mäßiger sowie starker Expression von PROM1 waren signifikant häufiger im Magen lokalisiert (76,1 %) als im Dünndarm (13,0 %; Chi-Quadrat-Test; p = 0,02). PROM1-Expression Magen Dünndarm Dickdarm Magen vs. Dünndarm Magen vs. Dickdarm Dünndarm vs. Dickdarm keine/geringe Anzahl Prozent 30 17 6 56,6% 32,1% 11,3% mäßige/starke Anzahl Prozent 35 6 2 76,1% 13,0% 4,3% p-Wert 0,02 0,1 1,0 Tabelle 3.22: tabellarische Darstellung 1. der absoluten und relativen Häufigkeiten der unterschiedlich starken PROM1-Expression, getrennt nach der Lokalisation des Tumors und 2. der durch den Chi-Quadrat-Test ermittelten p-Werte beim Vergleich der verschiedenen Lokalisationen Ergebnisse 86 3.3.2.2 Methylierung Abbildung 3.16: grafische Darstellung der mittleren Methylierung PROM1_P44_R, getrennt nach der Tumorlokalisation am CpG-Locus Die Methylierung von PROM1_P44_R betrug für GIST des Magens im Mittel 35,0 % (± 30,0 %). Diese Tumoren waren signifikant weniger methyliert als GIST des Dünndarms, bei denen die mittlere Methylierung 77,7 % (± 15,3 %) betrug (t-Test bei unabhängigen Stichproben; p < 0,0001). Weiterhin waren Magen-GIST signifikant geringer methyliert als Tumoren des Dickdarms mit einer mittleren Methylierung von 65,9 % (± 29,9 %; p = 0,005). Lokalisation Magen Dünndarm Dickdarm Magen vs. Dünndarm Magen vs. Dickdarm Dünndarm vs. Dickdarm PROM1_P44_R Mittelwert SD 35,0% 77,7% 65,9% 30,0% 15,3% 29,9% p-Wert <0,0001 0,005 0,3 Tabelle 3.23: tabellarische Darstellung 1. der mittleren Methylierung am CpG-Locus PROM1_P44_R, getrennt nach der Tumorlokalisation und 2. der durch den t-Test ermittelten p-Werte beim Vergleich der verschiedenen Lokalisationen Ergebnisse 87 3.3.3 PROM1 und Tumorgröße 3.3.3.1 Expression Beim Vergleich von Tumorgröße und PROM1-Expression fiel auf, dass große Tumoren eine stärkere Expression zeigten als kleine Tumoren. Abbildung 3.17: grafische Darstellung der relativen Häufigkeiten der unterschiedlich starken PROM1-Expression, getrennt nach der Größe des Tumors 73,3 % der Tumoren mit einem maximalen Durchmesser über 10 cm wiesen eine mäßige bzw. starke PROM1-Expression auf. Sie zeigten eine signifikant höhere Expression als zum einen Tumoren mit einer Größe kleiner als 2 cm, bei denen 30,0 % eine mäßige/starke Expression aufwiesen (Chi-Quadrat Test; p = 0,02), und zum anderen als Tumoren mit einer Größe von 2 bis 5 cm (33,3% mäßige/starke Expression; p = 0,01). Ergebnisse 88 PROM1-Expression <2 cm 2-5 cm >5-10 cm >10 cm <2 cm vs. 2-5 cm <2 cm vs. >5-10 cm <2 cm vs. >10 cm 2-5 cm vs. >5-10 cm 2-5 cm vs. >10 cm >5-10 cm vs. >10 cm keine/geringe Anzahl Prozent 12 25 11 4 mäßige/starke Anzahl Prozent 22,6% 47,2% 20,8% 7,5% 6 13 13 11 13,0% 28,3% 28,3% 23,9% p-Wert 0,9 0,2 0,02 0,1 0,01 0,2 Tabelle 3.24: tabellarische Darstellung 1. der absoluten und relativen Häufigkeiten der unterschiedlich starken PROM1-Expression, getrennt nach der Größe des Tumors und 2. der durch den Chi-Quadrat-Test ermittelten p-Werte beim Vergleich der verschiedenen Größenkategorien 3.3.3.2 Methylierung Der Vergleich des Methylierungsgrades von PROM1_P44_R mit der Tumorgröße erbrachte ebenfalls teilweise statistisch signifikante Unterschiede. Abbildung 3.18: grafische Darstellung der mittleren Methylierung PROM1_P44_R, getrennt nach der Tumorgröße am CpG-Locus Ergebnisse 89 Tumoren mit einer Größe von über 10 cm zeigten eine mittlere Methylierung von 32,3 % (± 33,6 %) und waren somit signifikant geringer methyliert als Tumoren mit einer Größe kleiner als 2 cm, bei denen die Methylierung im Mittel 58,8 % (± 31,5 %) betrug (t-Test bei unabhängigen Stichproben; p = 0,02). Größe < 2 cm 2 - 5 cm > 5 - 10 cm > 10 cm < 2 cm vs. 2 - 5 cm < 2 cm vs. > 5 - 10 cm < 2 cm vs. > 10 cm 2 - 5 cm vs. > 5 - 10 cm 2 - 5 cm vs. > 10 cm > 5 - 10 cm vs. > 10 cm PROM1 P44R Mittelwert SD 58,8% 50,7% 46,5% 32,3% 31,5% 32,4% 32,7% 33,6% p-Wert 0,4 0,2 0,02 0,6 0,07 0,2 Tabelle 3.25: tabellarische Darstellung 1. der mittleren Methylierung am CpG-Locus PROM1_P44_R, getrennt nach der Tumorgröße und 2. der durch den t-Test ermittelten pWerte beim Vergleich der verschiedenen Größenkategorien Ergebnisse 90 3.3.4 PROM1 und Genotyp 3.3.4.1 Expression Abbildung 3.19: grafische Darstellung der relativen Häufigkeiten der unterschiedlich starken PROM1-Expression, getrennt nach der Genmutation 87,0 % der Tumoren mit mäßiger und starker PROM1-Expression hatten eine Mutation im KIT-Gen, demgegenüber hatten 2,2 % der Tumoren dieser Kategorie eine Mutation im PDGFRA-Gen. KIT-mutierte Tumoren wiesen eine signifikant höhere PROM1-Expression auf als PDGFRA-mutierte Tumoren (Chi-Quadrat-Test; p = 0,0007). PROM1-Expression KIT PDGFRA keine/geringe Anzahl Prozent 33 14 62,3% 26,4% mäßige/starke Anzahl Prozent p-Wert 40 1 87,0% 0,0007 2,2% Tabelle 3.26: tabellarische Darstellung 1. der absoluten und relativen Häufigkeiten der unterschiedlich starken PROM1-Expression, getrennt nach der Genmutation und 2. des durch den Chi-Quadrat-Test ermittelten p-Wertes beim Vergleich der beiden Kategorien Ergebnisse 91 3.3.4.2 Methylierung Abbildung 3.20: grafische Darstellung der mittleren Methylierung PROM1_P44_R, getrennt nach der Genmutation am CpG-Locus KIT-mutierte GIST zeigten am CpG-Locus PROM1_P44_R eine mittlere Methylierung von 39,6 % (± 32,1 %) und waren somit signifikant weniger methyliert als PDGFRAmutierte GIST, die eine mittlere Methylierung von 66,6 % (± 18,5 %) zeigten (t-Test bei unabhängigen Stichproben; p < 0,0001). Mutation KIT PDGFRA PROM1_P44_R Mittelwert SD 39,6% 66,6% p-Wert 32,1% < 0,0001 18,5% Tabelle 3.27: tabellarische Darstellung 1. der mittleren Methylierung am CpG-Locus PROM1_P44_R, getrennt nach der Genmutation und 2. des durch den t-Test ermittelten pWertes beim Vergleich der beiden Kategorien Ergebnisse 92 3.3.5 PROM1 und Genotyp unter Berücksichtigung der Lokalisation 3.3.5.1 Expression Abbildung 3.21: grafische Darstellung der relativen Häufigkeiten der unterschiedlich starken PROM1-Expression, getrennt nach der Genmutation unter Berücksichtigung der Lokalisation 69,6 % der Tumoren mit mäßiger bzw. starker PROM1-Expression hatten eine KITMutation und waren im Magen lokalisiert. Sie wiesen eine signifikant höhere PROM1Expression auf als KIT-mutierte GIST des Dünndarms (10,9 % der Tumoren mit mäßiger/starker Expression; Chi-Quadrat-Test; p = 0,008) und eine signifikant höhere Expression als Magen-GIST mit PDGFRA-Mutation, von denen keiner eine mäßige/starke PROM1-Expression zeigte (p < 0,0001). Ergebnisse 93 PROM1-Expression KIT-Magen KIT-Dünndarm KIT-Rektum PDGFRA-Magen KIT-Magen vs. KIT-Dünndarm KIT-Magen vs. KIT-Rektum KIT-Magen vs. PDGFRA-Magen KIT-Dünndarm vs. KIT-Rektum KIT-Dünndarm vs. PDGFRA-Magen KIT-Rektum vs. PDGFRA-Magen keine/geringe Anzahl Prozent 16 12 3 13 30,2% 22,6% 5,7% 24,5% mäßige/starke Anzahl Prozent 32 5 2 0 69,6% 10,9% 4,3% 0,0% p-Wert 0,008 0,2 <0,0001 0,7 0,03 0,02 Tabelle 3.28: tabellarische Darstellung 1. der absoluten und relativen Häufigkeiten der unterschiedlich starken PROM1-Expression, getrennt nach Genmutation und Lokalisation und 2. der durch den Chi-Quadrat-Test ermittelten p-Werte beim Vergleich der verschiedenen Kategorien 3.3.5.2 Methylierung Abbildung 3.22: grafische Darstellung der mittleren Methylierung am CpG-Locus PROM1_P44_R, getrennt nach der Genmutation unter Berücksichtigung der Lokalisation KIT-mutierte GIST des Magens wiesen am CpG-Locus P44_R des PROM1-Gens eine mittlere Methylierung von 24,0 % (± 24,6 %) auf und waren signifikant weniger Ergebnisse 94 methyliert als erstens KIT-mutierte GIST des Dünndarms (t-Test bei unabhängigen Stichproben; p < 0,0001) mit mittlerer Methylierung von 74,2 % (± 16,3 %), zweitens KIT-mutierte GIST des Rektums mit mittlerer Methylierung von 65,7 % (± 35,2 %; p = 0,0005) und drittens PDGFRA-mutierte Magen-GIST, die im Mittel zu 64,5 % (± 18,9 %) methyliert waren (p < 0,0001). Methylierung KIT-Magen KIT-Dünndarm KIT-Rektum PDGFRA-Magen KIT-Magen vs. KIT-Dünndarm KIT-Magen vs. KIT-Rektum KIT-Magen vs. PDGFRA-Magen KIT-Dünndarm vs. KIT-Rektum KIT-Dünndarm vs. PDGFRA-Magen KIT-Rektum vs. PDGFRA-Magen PROM1_P44_R Mittelwert SD 24,0% 74,2% 65,7% 64,5% 24,6% 16,3% 35,2% 18,9% p-Wert <0,0001 0,0005 <0,0001 0,6 0,1 0,9 Tabelle 3.29: tabellarische Darstellung 1. der mittleren Methylierung am CpG-Locus PROM1_P44_R, getrennt nach Genmutation und Lokalisation und 2. der durch den t-Test ermittelten p-Werte beim Vergleich der verschiedenen Kategorien 3.4 Darstellung des klinischen Verlaufs im Zusammenhang mit den klinisch-pathologischen Parametern 3.4.1 Tumorgröße und Prognose Die Tumorgröße hatte einen signifikanten Einfluss auf den klinischen Verlauf. Patienten mit einem GIST größer als 5 cm hatten eine signifikant geringere rezidivfreie Überlebensrate nach Operation als Patienten mit einem GIST ≤ 5 cm (Log-Rang-Test; p = 0,04). Ergebnisse 95 Abbildung 3.23: Überlebenskurve nach Kaplan-Meier für das rezidivfreie Überleben nach Operation, getrennt nach der Tumorgröße 3.4.2 Mitosenanzahl und Prognose Die anhand der TMA lichtmikroskopisch erhobene Mitosenanzahl pro 50 HPF hatte ebenfalls einen signifikanten Einfluss auf das progressionsfreie Überleben nach Operation. Patienten, deren Tumor mehr als fünf Mitosen in 50 HPF aufwies, hatten eine signifikant geringere rezidivfreie Überlebensrate als Patienten, deren Tumor eine geringere Mitoserate aufwies (Log-Rang-Test; p = 0,0008). Ergebnisse 96 Abbildung 3.24: Überlebenskurve nach Kaplan-Meier für das rezidivfreie Überleben nach Operation, getrennt nach der Mitosenanzahl 3.4.3 Mutationsstatus und Prognose Beim Vergleich von Magen-GIST fiel auf, dass Tumoren mit einer Punktmutation im KIT-Gen tendenziell einen günstigeren klinischen Verlauf zeigten als Tumoren mit einer Deletion im KIT-Gen. Statistisch signifikant war dieser Unterschied nicht (LogRang-Test; p = 0,2). Abbildung 3.25: Überlebenskurve nach Kaplan-Meier für das rezidivfreie Überleben nach Operation von Patienten mit KIT-mutierten Magen-GIST, getrennt nach der Mutationsart Ergebnisse 97 Weiterhin fiel bei GIST des Magens auf, dass keiner der Patienten, dessen Tumor eine Mutation im PDGFRA-Gen aufwies, einen Tumorprogress hatte (n = 4), wohingegen sechs der 27 Patienten mit KIT-mutierten Magen-GIST einen Progress zu verzeichnen hatten. Auf das progressionsfreie postoperative Überleben hatte dieser Vergleich keinen signifikanten Einfluss (Log-Rang-Test; p = 0,4). Abbildung 3.26: Überlebenskurve nach Kaplan-Meier für das rezidivfreie Überleben nach Operation von 31 Patienten mit Magen-GIST, getrennt nach der Genmutation 3.4.4 Risikoklassifikationen nach Fletcher und Miettinen und Prognose Sowohl die Einteilung der GIST anhand der Risikoklassifikation nach Fletcher als auch nach Miettinen hatten einen signifikanten Einfluss auf das krankheitsfreie Überleben nach Operation. Patienten, deren Tumor nach Fletcher als NiedrigrisikoGIST eingestuft wurde, hatten eine signifikant höhere progressionsfreie Überlebensrate als Patienten mit mittlerem Risiko (Log-Rang-Test; p = 0,04) oder als Patienten mit hoher Risikoeinstufung (p = 0,003). Ergebnisse 98 Abbildung 3.27: Überlebenskurve nach Kaplan-Meier für das rezidivfreie Überleben nach Operation, getrennt nach der Einteilung anhand der Risikoklassifikation nach Fletcher Patienten, deren Tumor in der Risikoklassifikation nach Miettinen – bei der auch die anatomische Lokalisation des Tumors berücksichtigt wird – als Hochrisiko-GIST eingestuft wurde, hatten eine signifikant geringere progressionsfreie Überlebensrate als Patienten mit intermediärem Risiko (Log-Rang-Test; p = 0,05) oder als Patienten mit niedriger Risikoeinstufung (p = 0,003). Abbildung 3.28: Überlebenskurve nach Kaplan-Meier für das rezidivfreie Überleben nach Operation, getrennt nach der Einteilung anhand der Risikoklassifikation nach Miettinen Ergebnisse 99 3.4.5 PROM1 und Prognose Das Glykoprotein Prominin-1 wurde bezüglich seiner prognostischen Wertigkeit, insbesondere in Hinblick auf Krankheitsprogress und krankheitsfreies Überleben nach der Operation, untersucht. Die Patienten wurden in zwei Gruppen unterteilt. Für die Proteinexpression gab es die zwei Gruppen „keine/geringe/mäßige Expression“ und „starke Expression“. Für die DNA-Methylierung wurde der jeweilige Median gebildet und die Patienten den Gruppen „Methylierung ≤ Median“ oder „Methylierung > Median“ zugeteilt. Für die PROM1-Expression des gesamten Tumorkollektivs konnte ein Einfluss auf das progressionsfreie postoperative Überleben gezeigt werden. Patienten, deren GIST eine starke Expression zeigten, hatten eine signifikant geringere progressionsfreie Überlebensrate nach Operation als Patienten mit einem Tumor mit keiner, geringer und mäßiger Proteinexpression (Log-Rang-Test; p = 0,007). Abbildung 3.29: Überlebenskurve nach Kaplan-Meier für das rezidivfreie Überleben nach Operation, getrennt nach der Expression von PROM1 Dieser Trend konnte auch bei Betrachtung der DNA-Methylierung von PROM1_P44_R beobachtet werden: Patienten, deren Tumoren eine Methylierung unterhalb des Medians aufwiesen, hatten – jedoch ohne statistische Signifikanz – ein kürzeres krankheitsfreies Überleben nach Operation (p = 0,14). Ergebnisse 100 Abbildung 3.30: Überlebenskurve nach Kaplan-Meier für das rezidivfreie Überleben nach Operation, getrennt nach dem Grad der Methylierung am CpG-Locus P44_R des PROM1Gens Betrachtet man in diesem Kollektiv nun ausschließlich KIT-mutierte GIST des Magens (n = 49), welche wie zuvor dargestellt eine hohe PROM1-Expression bei geringer DNA-Methylierung zeigen, so ergeben sich innerhalb dieser Gruppe deutliche Unterschiede beim klinischen Verlauf. Patienten dieser Gruppe, deren Tumor eine starke PROM1-Expression aufwies, hatten ein kürzeres progressionsfreies postoperatives Überleben als Patienten, deren Tumor keine, eine geringe bzw. mäßige Expression aufwies. Statistisch signifikant war dieser Trend, vermutlich auch durch die gringe Fallzahl bedingt, nicht (Log-RangTest; p = 0,09). Ergebnisse 101 Abbildung 3.31: Überlebenskurve nach Kaplan-Meier für das rezidivfreie Überleben nach Operation von Patienten mit KIT-mutierten Magen-GIST, getrennt nach der Expression von PROM1 Für die Methylierung von PROM1_P44_R konnte dagegen ein signifikanter Einfluss auf das krankheitsfreie Überleben demonstriert werden. Patienten mit Magen-GIST, KIT-Mutation und einer Methylierung unterhalb des Medians wiesen ein signifikant kürzeres krankheitsfreies Überleben nach Operation auf als Patienten mit gleicher Tumorkonstellation, aber einer Methylierung oberhalb des Medians (p = 0,046). Zur Medianberechnung wurden in diesem Fall ausschließlich Daten von Patienten mit KIT-mutierten Magen-GIST herangezogen. Ergebnisse 102 Abbildung 3.32: Überlebenskurve nach Kaplan-Meier für das rezidivfreie Überleben nach Operation von Patienten mit KIT-mutierten Magen-GIST, getrennt nach dem Grad der Methylierung am CpG-Locus PROM1_P44_R 3.5 Zellversuch Die DNA der mit unterschiedlichen Konzentrationen von 5-Azacytidin (5-azaC) behandelten GIST-Zelllinie 48B wurde an den CpG-Loci CD34_P339_R, CD34_P780_R sowie PROM1_P44_R bezüglich der Ausprägung der DNAMethylierung untersucht. Die DNA der unbehandelten Zellen war an den untersuchten CpG-Loci unterschiedlich stark methyliert. Der CpG-Locus CD34_P339_R war im Mittel zu 95,3 % (± 0,6 %) methyliert, CD34_P780_R im Mittel zu 94,3 % (± 0,6 %). Die mittlere Methylierung am CpG-Locus PROM1_P44_R betrug 76,0 % (± 1,0 %). Ergebnisse 103 Abbildung 3.33: grafische Darstellung der mittleren Methylierung an den CpG-Loci CD34_P339_R, CD34_P780_R und PROM1_P44_R vor und nach Behandlung mit 50 nM und 100 nM 5-azaC Es konnte gezeigt werden, dass es durch die Behandlung der Zellen mit 5-azaC an beiden CpG-Loci im Promotorbindungsbereich des CD34-Gens sowie am CpGLocus im Promotorbindungsbereich des PROM1-Gens zu einer konzentrationsabhängigen Demethylierung kommt (Abbildung 3.33 und Tabelle 3.30). CD34_P339_R Mittelwert SD Kontrolle 50 nM 5-azaC 100 nM 5-azaC 95,3 67,0 58,7 0,6 1,0 1,5 CD34_P780_R PROM1_P44_R Mittelwert SD Mittelwert SD 94,3 61,3 55,0 0,6 0,6 1,0 76,0 48,7 41,7 1,0 0,6 0,6 Tabelle 3.30: tabellarische Darstellung der mittleren Methylierung an den CpG-Loci CD34_P339_R, CD34_P780_R und PROM1_P44_R vor und nach Behandlung mit 50 nM und 100 nM 5-azaC Die Bestimmung der relativen mRNA-Expression der Gene CD34 und PROM1 nach Behandlung der Zellen mit 5-azaC erfolgte nach Isolation der RNA und Umschreiben in cDNA mittels quantitativer Real-Time PCR. Die Quantifizierung der mRNA- Ergebnisse 104 Expression erfolgte mit der der ΔΔCt-Methode, wie in Kapitel 2.6.4.3 dargestellt. Als unreguliertes Referenzgen wurde ACTB verwendet. Abbildung 3.34: grafische Darstellung der relativen mRNA-Expression der Gene CD34 und PROM1 vor und nach Behandlung mit 50 nM und 100 nM 5-azaC Sowohl für CD34 als auch für PROM1 konnte eine im Vergleich zur Kontrolle relative Zunahme der mRNA-Expression mit steigender Konzentration an 5-azaC dargestellt werden (Abbildung 3.34 und Tabelle 3.31). ACTB Kontrolle 50 nM 5-azaC 100 nM 5-azaC CD34 Ct SD Ct SD 25,8 24,4 24,8 0,2 0,1 0,1 39,0 37,6 37,3 0,3 1,1 0,2 PROM1 -DDCt Ct SD 2-DDCt 1,00 0,96 1,73 32,9 31,1 31,1 0,1 0,0 0,1 1,00 1,32 1,79 2 Tabelle 3.31: tabellarische Darstellung der relativen mRNA-Expression der Gene ACTB, CD34 und PROM1 vor und nach Behandlung mit 50 nM und 100 nM 5-azaC Diskussion 105 4 Diskussion 4.1 Bedeutung des Mutationsstatus Bei 76 der 104 GIST konnte eine KIT-Mutation (73,1 %), bei 16 eine PDGFRAMutation (15,4 %) und bei einem Tumor eine BRAF-Mutation (1,0 %) nachgewiesen werden. Elf GIST hatten in diesen Genen keine Mutation (10,6 %). 4.1.1 KIT-Mutationen Die häufigsten KIT-Mutationen Gastrointestinaler Stromatumoren stellen in frameDeletionen dar und kommen fast ausschließlich, laut Lasota und Miettinen mit nur einer Ausnahme, im Exon 11 vor. Sie führen im Protein zu Verlusten von Aminosäuren, die in manchen Fällen mit Insertionen kombiniert sind. Die Mutation c.1669_1674delTGGAAG (p.W557_K558del) ist dabei am häufigsten vertreten (Lasota and Miettinen 2008). Im eigenen Kollektiv bilden ebenfalls Deletionen mit 51,3 % der KIT-Mutationen die Mehrheit und sind nur im Exon 11 lokalisiert. Der Verlust von Tryptophan und Lysin an Position 557 und 558 wird auch hier in acht von 39 Deletionen (20,5 %) und damit am häufigsten beobachtet. Bei einem Fall betrifft die am 5‘-Ende des Exons 11 gelegene homozygote/hemizygote Deletion auch die 3‘-splice-site des Introns 10. Dadurch wird die Grenze des Introns verschoben und es entsteht eine neue splice-acceptor-site („AG“), was auf der Protein-Ebene zum Verlust der ersten neun Codons (p.K550_K558del) führt. Des Weiteren konnte bei diesem Tumor die Punktmutation c.1680T>G nachgewiesen werden, diese stellt jedoch eine stille Mutation dar und hat somit keine Auswirkung auf die Proteinstruktur. Im Gegensatz zum häufigen Funktionsverlust falsch gespleißter Proteine konnte für diese Situation gezeigt werden, dass es zu einer gain-of-functionMutation kommt, die immer mit der Deletion p.K550_K558del assoziiert ist (Corless, McGreevey et al. 2004, Chen, Sabripour et al. 2005). Diskussion KIT 106 Intron 10 Exon 11 As -Seq K P M Y E V Q W K V V E Codon 550 551 552 553 554 555 556 557 558 559 560 561 Nt-Seq C C C A C A G A A A C C C A T G T A T G A A G T A C A G T G G A A G G T T G T T G A G Fall CCCA CA G A A A CCC A T G T A T GA A GT A CA G T GG A AG GT T GT G GAG Tabelle 4.1: ein Fall des Kollektivs mit Deletion von 30 Nukleotiden (grau) des Introns 10 und Exons 11 des KIT-Gens und neu entstandener splice-acceptor-site (AG); unterstrichen: DNA-Punktmutation (ohne Auswirkung auf die AS-Sequenz); AS-Sequenz im Einbuchstabencode dargestellt KIT-Exon-11-Punktmutationen des dieser Dissertation zu Grunde liegenden Kollektivs betreffen ausschließlich die vier Codons p.W557, p.V559, p.V560 und p.L576. Diese Beobachtung deckt sich mit Angaben in der Literatur (Lasota and Miettinen 2008). Die zwei im Exon 13 nachgewiesenen Punktmutationen des Kollektivs sind identisch (c.1924A>G) und führen auf Protein-Ebene zu p.K642E. In der Literatur wird ebenfalls diese Mutation als vorrangig in diesem Exon beschrieben (Lasota, Corless et al. 2008). Von den elf nachgewiesenen Duplikationen im KIT-Gen betreffen sieben das Exon 9. Bei diesen sieben Duplikationen handelt es sich um die in mehreren Arbeiten beschriebene Mutation c.1504_1509dupGCCTAT bzw. p.A502_Y503dup (Lasota, Wozniak et al. 2000, Lux, Rubin et al. 2000, Hirota, Nishida et al. 2001, Sakurai, Oguni et al. 2001). Die vier Duplikationen des Exons 11 sind alle downstream von c.1717C gelegen und mit 39 bis 57 Nukleotiden recht groß. Duplikationen dieses Exons kommen mit nur seltenen Ausnahmen an dessen 3‘-Ende vor und werden mit einer Größe von ein bis zu 18 Tripletts angegeben (Lasota and Miettinen 2008). Die 19 Codons umspannende Duplikation c.1721_1774+3dup57 dieses Kollektivs betrifft auch das nachfolgende Intron 11 und stellt ein bisher nur selten berichtetes Phänomen dar. Eine ähnliche Duplikation (c.1720_1774+2dup bzw. p.T574_F591dup;F591_G592insA) beschreiben Steigen et al. bei einem Fall aus ihrem norwegischen Kollektiv (Steigen, Eide et al. 2007). Die 104 GIST dieses Kollektivs wurden bei 103 Patienten diagnostiziert. Eine zum Zeitpunkt der Operation 67-jährige Patientin wies neben einem 8 cm großen gastralen GIST einen weiteren 0,8 cm großen, ebenfalls im Magen lokalisierten, Tumorknoten auf. Dieser wurde als Satellitenherd ohne Bezug zu dem größeren GIST charakterisiert. Die von beiden Tumoren durchgeführte Mutationsanalyse konnte zwei unterschiedliche Mutationen des KIT-Gens nachweisen. Beide Male Diskussion 107 handelt es sich um eine Punktmutation. Beim größeren Tumor kommt es zur Transversion der Pyrimidinbase Thymin gegen die Purinbase Guanin im Exon 11 (c.11679T>G), dies führt im Protein zur Substitution von Valin durch Glycin (p.V560G). Der Satellitenherd hat die im Exon 13 lokalisierte KIT-Mutation c.1924A>G, wodurch es auf Protein-Ebene zum Austausch der Aminosäure Lysin durch Glutaminsäure (p.K642E) kommt. Bei der Literaturrecherche konnten verschiedene Ursachen für multizentrisch auftretende GIST gefunden werden. Neben den in Kapitel 4.1.4 erwähnten Carney-Trias, pädiatrischen GIST und NF1assoziierten GIST ohne KIT- und PDGFRA-Mutation gibt es auch familiär auftretende GIST. Bei dieser autosomal-dominant vererbten Erkrankung können Keimbahnmutationen von KIT oder PDGFRA nachgewiesen werden (Nishida, Hirota et al. 1998, Chompret, Kannengiesser et al. 2004, Li, Fletcher et al. 2005). Im Gegensatz dazu wurden in zwei Untersuchungen multizentrischer Magen-GIST gezeigt, dass sich die einzelnen Tumoren eines Individuums hinsichtlich ihrer Mutationen unterscheiden, in solchen Fällen wird von einem simultanen Auftreten sporadischer GIST ausgegangen (Haller, Schulten et al. 2007, Agaimy, Dirnhofer et al. 2008). 4.1.2 PDGFRA-Mutationen Substitutionen einzelner Aminosäuren – verursacht durch eine Punktmutation auf DNA-Ebene – stellen die häufigsten PDGFRA-Mutationen bei GIST dar und können neben dem Exon 18 selten auch die Exons 12 und 14 betreffen (Lasota and Miettinen 2008). Bei insgesamt 13 Fällen des dieser Dissertation zu Grunde liegenden Kollektivs können Punktmutationen des PDGFRA-Gens nachgewiesen werden. Die absolute Mehrheit mit zehn der 13 Punktmutationen manifestiert sich im Exon 18 und wird ausschließlich durch die Nukleinbasensubstitution c.2525A>T, welche auf Protein-Ebene zu p.D842V führt, gekennzeichnet. Dass es sich dabei mit nur wenigen Ausnahmen um das einzige von einer Punktmutation betroffene Codon handelt, wird in mehreren Untersuchungen gezeigt (Heinrich, Corless et al. 2003, Lasota, Dansonka-Mieszkowska et al. 2004, Corless, Schroeder et al. 2005). Zwei der 13 PDGFRA-Punktmutationen betreffen mit c.1682T>A das Exon 12 und führen im Protein zu p.V561D. Im Exon 14 manifestiert sich die Mutation c.1977C>G, die auf Protein-Ebene zur Substitution p.N659K führt. Auch die bereits angeführten Studien Diskussion 108 zur Assoziation von PDGFRA und GIST erwähnen Substitutionen des Exons 12 ausschließlich vom Typ p.V561D (Heinrich, Corless et al. 2003, Lasota, DansonkaMieszkowska et al. 2004, Corless, Schroeder et al. 2005). Bei Punktmutationen des Exons 14 scheint es sich um äußerst seltene Ereignisse mit nur wenig beschriebenen Fällen zu handeln (Corless, Schroeder et al. 2005, Lasota, Stachura et al. 2006). Dabei stellt die in diesem Kollektiv gefundene Mutation c.1977C>G neben c.1977C>A, was auf Protein-Ebene die gleiche Substitution zur Folge hat, die Mehrheit dar (Lasota and Miettinen 2008). Für die Punktmutation c.2525A>T (Exon 18), welche auf Protein-Ebene zu p.D842V führt, wurde sowohl in vitro als auch in vivo gezeigt, dass es sich um eine Mutation handelt, die zur Aktivierung des PDGF-Rezeptors α befähigt ist, also eine gain-offunction-Mutation darstellt (Heinrich, Corless et al. 2003, Hirota, Ohashi et al. 2003). Dies konnte in vitro auch für die Substitutionen p.V561D und p.N659K bestätigt werden (Hirota, Ohashi et al. 2003, Corless, Schroeder et al. 2005). Zweimal können in diesem Kollektiv Deletionen von je zwölf Nukleotiden im PDGFRA-Gen nachgewiesen werden. Dabei handelt es sich um c.2524_2535del (p.D842_H845del) und um c.2527_2538del (p.I843_D846del), beide Deletionen sind im Exon 18 lokalisiert. Lasota und Miettinen beschreiben Deletionen dieses Gens als heterogene Gruppe, wobei die im Exon 18 vorkommenden Mutationen häufig zwischen p.A840 und p.N848 lokalisiert sind (Lasota and Miettinen 2008). Dies trifft auf beide gefundenen Mutationen zu. Duplikationen sind laut Lasota und Miettinen nur selten im PDGFRA-Gen zu finden. Bisher sind drei verschiedene Duplikationen identifiziert, die alle im Exon 12 vorkommen (Lasota and Miettinen 2008). Auch die in diesem Kollektiv gefundene Duplikation bei einem GIST des Magens ist im Exon 12 gelegen und führt zur Verdopplung von zwölf Aminosäuren im Protein (c.1666_1695dup; p.E556_I565dup). Die identische Duplikation beschreiben Haller et al. bei einem Magen-GIST einer 61jährigen Patientin (Haller, Happel et al. 2007). Diskussion 109 4.1.3 BRAF-Mutationen Bei einem Tumor des Kollektivs ohne KIT- und PDGFRA-Mutation kann eine Punktmutation im BRAF-Gen, die zur Substitution p.V600E führt, nachgewiesen werden. Agaram et al. erwähnen diese Mutation bei 4,9 %, Hostein et al. bei 12,9 % der GIST ohne KIT-/PDGFRA-Mutation. Schließt man in beiden Studien die Tumoren pädiatrischer Patienten aus, so steigt die Frequenz auf 6,5 % bzw. 13,0 % (Agaram, Wong et al. 2008, Hostein, Faur et al. 2010). In einer Studie aus dem Jahr 2009 beträgt diese Frequenz 7,1 % (Agaimy, Terracciano et al. 2009). Berücksichtigt man in dem dieser Dissertation zu Grunde liegenden Kollektiv ebenfalls nur die sporadischen Wildtyp-GIST und schließt die syndromalen Formen aus (siehe Kapitel 4.1.4), so haben 12,5 % der KIT-/PDGFRA-Wildtyp-Fälle (einer von acht Tumoren) diese BRAF-Mutation. Sowohl Agaram et al. als auch Hostein et al. beobachten eine Tendenz zur dominierenden Lokalisation dieser Tumoren im Dünndarm (Agaram, Wong et al. 2008, Hostein, Faur et al. 2010). Der BRAF-mutierte GIST dieses Kollektivs manifestierte sich im Dünndarm einer zum Zeitpunkt der Operation 74 Jahre alten Patientin. 4.1.4 Wildtyp-GIST In diesem Kollektiv erbrachte die Mutationsanalyse bei elf der 104 GIST (10,6 %) keinen Hinweis auf eine Mutation in den Exons der untersuchten Gene. Der Nachweis einer Wildtyp-Sequenz kann durchaus durch die Qualität des verwendeten Materials sowie durch Kontamination der Tumorproben mit anderen Geweben und folglich relativer Abnahme der Tumor-DNA begünstigt werden. Es wird beschrieben, dass die Nachweisquote von Mutationen mit zunehmendem Alter des FFPE-Materials abnimmt. So beträgt die Mutationsrate in Material, welches älter als 1990 ist, in einer bevölkerungsbezogenen Studie von Steigen et. al aus Norwegen 75,7 % (vs. 91,1 % bei neuerem Material) und in einer schwedischen Studie von Andersson et al. 37,4 % vs. 64,0 % (Andersson, Bümming et al. 2006, Steigen, Eide et al. 2007). Bei der Analyse werden daher von beiden Autoren nur Fälle seit dem Jahr 1990 eingeschlossen. Im vorliegenden Kollektiv stammen die ältesten GIST aus dem Jahr 1992, der älteste Wildtyp-Fall ist aus dem Jahr 2002. Von einer Verzerrung der Mutationsrate durch diesen Störfaktor ist somit nicht auszugehen. Diskussion 110 Zwei der elf Wildtyp-GIST dieses Kollektivs kommen bei minderjährigen Personen weiblichen Geschlechts vor. Die erste, zum Zeitpunkt der Operation 15-jährige Patientin zeigt ein inkomplettes Bild einer Carney-Trias mit paraaortalen Paragangliomen. Die zweite, 13-jährige Patientin hat ebenfalls einen GIST des Magens mit vergleichbarer Histomorphologie, assoziierte Erkrankungen sind aber nicht nachweisbar. Im ersten Fall kann lediglich ein Polymorphismus (c.1432T>C; p.S478P) im Exon 10 des PDGFRA-Gens nachgewiesen werden (Otto, Agaimy et al. 2011). Die Carney-Trias wurden 1977 von J. Aiden Carney als Assoziation von gastralen Tumoren (damals als Leiomyosarkome bezeichnet), pulmonalen Chondromen und Paragangliomen beschrieben (Carney, Sheps et al. 1977). Dabei handelt es sich um ein äußerst seltenes Erkrankungsbild, das fast ausschließlich bei jungen Frauen vorkommt (Stratakis and Carney 2009, Zhang, Smyrk et al. 2010). Als pädiatrische GIST werden Tumoren beschrieben, die bei Kindern und jungen Erwachsenen auftreten und nicht mit anderen Erkrankungen assoziiert sind (Miettinen, Lasota et al. 2005). Beide Entitäten zeigen eine gastrale Lokalisation mit einem möglichen multifokalen Auftreten, eine epitheloide Histomorphologie, aber keine der üblichen KIT- oder PDGFRA-Mutationen und Keimbahnmutationen (Miettinen, Lasota et al. 2005, Prakash, Sarran et al. 2005, Agaimy, Pelz et al. 2007, Matyakhina, Bei et al. 2007). Ein weiterer als Wildtyp-GIST klassifizierter Tumor dieses Kollektivs kommt bei einem an Neurofibromatose 1 (Morbus Recklinghausen, NF1) erkrankten Patienten vor. Bei dieser autosomal-dominant vererbten Erkrankung können neben Neurofibromen eine Reihe weiterer Tumoren vorkommen, u.a. auch GIST. In den meisten Studien zu dieser Assoziation kann bei Patienten mit NF1 und GIST der oft multizentrisch betroffene Dünndarm als Prädilektionsstelle nachgewiesen werden, zudem sind in den Tumoren keine KIT- und PDGFRA-Mutationen zu finden (Kinoshita, Hirota et al. 2004, Andersson, Sihto et al. 2005, Miettinen, Fetsch et al. 2006). Auch der GIST dieses Patienten ist im Dünndarm lokalisiert, es handelt sich aber um einen singulär auftretenden Befund. Diskussion 111 4.2 DNA-Methylierungsstatus in den Promotorregionen der Gene CD34 und PROM1 sowie deren Proteinexpression in Korrelation mit klinisch-pathologischen Parametern In der vorliegenden Dissertation wurden sowohl die Expression von CD34 und PROM1 als auch der Methylierungsstatus bestimmter CpG-Loci in den Promotorregionen der jeweiligen Gene untersucht und mit verschiedenen klinischpathologischen und prognostischen Parametern verglichen. 4.2.1 CD34 In dem dieser Arbeit zu Grunde liegenden Kollektiv weisen GIST des Dünndarms eine signifikant geringere CD34-Expression auf als Tumoren des Magens oder des Dickdarms (inklusive Rektum). Vergleicht man die Proteinexpression mit der Methylierung des CD34-Gens, so wird eine inverse Korrelation deutlich: An beiden CpG-Loci des Gens sind Tumoren des Dünndarms im Mittel signifikant höher methyliert als Tumoren des Magens oder des Dickdarms. Ähnliche Daten für die unterschiedliche Häufigkeit der CD34-Expression in Abhängigkeit von Tumorlokalisation lassen sich in der Literatur finden. Miettinen zeigt in einer Analyse von 292 KIT-positiven GIST, dass die Tumoren an verschiedenen Lokalisationen unterschiedlich positiv für CD34 sind. 90 % der GIST des Magens und 89 % der Tumoren des Dickdarms (inklusive Rektum), aber nur 51 % der Dünndarm-GIST sind in dieser Studie immunhistochemisch positiv für CD34 (Miettinen, Sobin et al. 2000). Bezüglich der Mitosenanzahl kann für die Expression kein signifikantes Ergebnis dargestellt werden. Es lässt sich jedoch die Tendenz feststellen, dass GIST mit einer Mitosenanzahl von mehr als fünf Mitosen in 50 HPF eine stärkere CD34-Expression aufweisen als GIST mit fünf und weniger Mitosen pro 50 HPF. Hinsichtlich der Methylierung auf DNA-Ebene kann für den CpG-Locus CD34_P780_R ein statistisch signifikanter Unterschied eruiert werden: GIST der Kategorie „> 5 Mitosen in 50 HPF“ waren im Mittel signifikant geringer methyliert als GIST der Kategorie „≤ 5 Mitosen in 50 HPF“. In einer immunhistochemischen Studie von 109 GIST kann bezüglich Malignität – anhand des Mitoseindex eruiert – und CD34-Expression kein signifikanter Zusammenhang herausgestellt werden (Miettinen, Virolainen et al. 1995). Diskussion 112 GIST mit einer Mutation im KIT-Gen weisen eine signifikant höhere CD34-Expression auf als PDGFRA-mutierte Tumoren. Auch für die DNA-Methylierung kann ein statistisch signifikanter Unterschied zwischen den beiden mutierten Genen nachgewiesen werden. KIT-mutierte Tumoren weisen an beiden CpG-Loci des CD34-Gens eine signifikant geringere mittlere Methylierung auf als Tumoren mit PDGFRA-Mutation. Bei Betrachtung der Tumorlokalisation unter Beachtung der Genmutation kann weiter gezeigt werden, dass KIT-mutierte Tumoren des Magens signifikant stärker CD34 exprimieren als Magen-GIST mit PDGFRA-Mutation oder als KIT-mutierte Tumoren des Dünndarms. Gleichzeitig sind KIT-mutierte Tumoren des Magens an beiden CpG-Loci des CD34-Gens im Mittel signifikant geringer methyliert als PDGFRAmutierte GIST gleicher Lokalisation oder als Dünndarm-GIST mit KIT-Mutation. Für KIT-mutierte Tumoren des Rektums kann eine signifikant höhere CD34-Expression als für Dünndarm-GIST mit KIT-Mutation oder Magen-GIST mit Mutation des PDGFRA-Gens nachgewiesen werden. Auch hier zeigt sich auf DNA-Ebene, dass die CpG-Loci bei Rektum-GIST mit KIT-Mutation eine signifikant geringere mittlere Methylierung aufweisen als KIT-mutierte Dünndarm-GIST oder PDGFRA-mutierte Magen-GIST. In dieser Arbeit wird deutlich, dass die CD34-Expression in GIST nicht nur wie bereits in der Literatur erwähnt mit der anatomischen Lokalisation des Tumors korreliert, sondern auch mit dem Genotyp. Die CD34-Expression kann somit trotz gleicher anatomischer Lage der Tumoren starke Unterschiede aufweisen. Des Weiteren kann auf Grund der Beobachtung, dass eine starke Proteinexpression von CD34 mit einer geringen DNA-Methylierung an den beiden CpG-Loci im Promotorbindungsbereich einhergeht, die Annahme gemacht werden, dass die Proteinexpression von CD34 in GIST über den Grad der Methylierung auf DNA-Ebene und somit epigenetisch reguliert wird. 4.2.2 PROM1 In dem dieser Dissertation zu Grunde liegenden Kollektiv sind 82,8 % der auswertbaren Fälle immunhistochemisch unterschiedlich stark positiv für das Glykoprotein Prominin-1. Arne et. al beurteilen in ihrer Studie aus dem Jahr 2011 die Diskussion 113 Expression von PROM1 in Imatinib-naiven GIST ebenfalls durch Immunhistochemie an TMA und Verwendung desselben monoklonalen Antikörpers. Sie können eine PROM1-Positivität bei lediglich 28 % der 195 untersuchten Tumorproben eines schwedischen Kollektivs feststellen (Arne, Kristiansson et al. 2011). Eine Studie aus China beschreibt eine immunhistochemische PROM1-Expression bei 43,2 % der Patienten (Lu, Liu et al. 2013). Eine weitere Studie, in der unter anderem die Immunfluoreszenz von PROM1 sowohl Imatinib-naiver als auch Imatinib-behandelter GIST an TMA untersucht wird, zeigt bei 95 % der TMA-Stanzen ein diffuses und starkes Expressionsmuster (Chen, Guo et al. 2012). In der Arbeit von Bozzi et al. kann bei allen 18 untersuchten (Imatinib-naiven und Imatinib-behandelten) GIST eine PROM1-Expression nachgewiesen werden. Als Nachweismethode wird hierbei allerdings die Durchflusszytometrie verwendet, des Weiteren wird im Gegensatz zu den anderen Studien Frischgewebe untersucht (Bozzi, Conca et al. 2011). Der Vergleich von Tumorlokalisation und PROM1-Expression zeigt, dass Tumoren mit mindestens mäßiger Expression signifikant häufiger im Magen lokalisiert sind als im Dünndarm. Entsprechende Beobachtung kann für die DNA-Methylierung am CpGLocus P44_R des PROM1-Gens gemacht werden: GIST des Magens sind im Mittel signifikant geringer methyliert als Tumoren des Dünndarms oder des Dickdarms. Vergleichbare Ergebnisse beobachten Arne et al. in ihrem Kollektiv. 48 % der Magen-GIST sind immunhistochemisch positiv für Prominin-1 aber lediglich 4 % der GIST aus dem Dünndarm (Arne, Kristiansson et al. 2011). Auch Chen et al. können bei Tumoren des Magens eine signifikant höhere mRNA-Expression von PROM1 nachweisen als bei Tumoren des Dünndarms (Chen, Guo et al. 2012). Während Arne et al. in ihrer Studie keine signifikanten Zusammenhänge bezüglich PROM1-Expression und Tumorgröße nachweisen können (Arne, Kristiansson et al. 2011), erbringt der Vergleich in diesem Kollektiv teilweise statistisch signifikante Ergebnisse. Mit zunehmender Größe zeigen prozentual mehr Tumoren eine mäßige und starke Expression als keine oder eine geringe Expression des Proteins: Von den auswertbaren GIST mit einer Größe < 2 cm zeigen 33,3 % eine mäßige/starke Expression, bei den Tumoren von 2-5 cm Größe macht dieser Anteil 34,2 % aus, bei den 5-10 cm großen GIST sind es 54,2 % und bei den Tumoren > 10 cm 73,3 %. Dementsprechend nimmt mit zunehmender Tumorgröße die mittlere Methylierung des PROM1-Gens kontinuierlich von 58,8 % in der kleinsten Kategorie, über 50,7 % Diskussion 114 und 46,5 % bis hin zu 32,3 % in der größten Kategorie ab. Auch Lu et al. beschreiben in ihrer Studie, dass GIST mit einer Größe von mindestens 5 cm signifikant häufiger PROM1 exprimieren als Tumoren mit einer Größe kleiner als 5 cm (Lu, Liu et al. 2013). Bei Betrachtung der Expression von Prominin-1 unter Berücksichtigung des Mutationsstatus des Tumors wird deutlich, dass GIST mit einer Mutation im KIT-Gen eine signifikant höhere Expression aufweisen als GIST mit einer PDGFRA-Mutation. Die untersuchte DNA-Methylierung der Promotorregion des PROM1-Gens weist – wie erwartet – eine inverse Korrelation zur Proteinexpression auf. KIT-mutierte GIST sind im Mittel signifikant weniger methyliert als PDGFRA-mutierte GIST. Diese Beobachtung wird in einer Studie anhand der mRNA-Expression von PROM1 bestätigt, GIST mit PDGFRA-Mutation zeigen hier eine geringere PROM1Expression als Tumoren mit KIT-Mutation oder ohne Mutationsnachweis (Chen, Guo et al. 2012). Ähnliches Ergebnis wird aus der schwedischen Studie mit 204 analysierten GIST ersichtlich: GIST mit einer Mutation im Exon 11 des KIT-Gens exprimieren signifikant höher PROM1 als GIST mit einer Mutation im Exon 9 des Gens oder im PDGFRA-Gen (Arne, Kristiansson et al. 2011). Untersucht man wie bei CD34 die PROM1-Expression unter gleichzeitiger Berücksichtigung der Lokalisation des Tumors und der Genmutation, so kann dargestellt werden, dass KIT-mutierte Tumoren aus dem Magen Prominin-1 stärker exprimieren als PDGFRA-mutierte Tumoren gleicher Lokalisation oder als KITmutierte GIST aus dem Dünndarm. Des Weiteren zeigen letztgenannte Tumoren eine signifikant höhere Expression als PDGFRA-mutierte Tumoren des Magens. Auf DNA-Ebene haben Magen-GIST mit KIT-Mutation eine signifikant geringere mittlere Methylierung des PROM1-Gens als Magen-GIST mit PDGFRA-Mutation oder als KIT-mutierte GIST des Dünndarms oder des Rektums. Ähnlich wie die CD34-Expression korrelieren also die Proteinexpression von PROM1 und der Methylierungsstatus im Promotorbindungsbereich des PROM1-Gens neben der anatomischen Lokalisation auch mit dem Genotyp des Tumors. Auch für PROM1 lässt sich auf Grund des gegensätzlichen Verhaltens von DNA-Methylierung und Proteinexpression eine epigenetische Regulation in GIST vermuten. Diskussion 115 4.3 In-vitro-Korrelation von CD34- bzw. PROM1-Expression und ihrem DNA-Methylierungsstatus Um den vermuteten Zusammenhang zwischen der Proteinexpression und der DNAMethylierung im Promotorbindungsbereich des jeweiligen Gens in vitro nachzuweisen, wurde die GIST-Zelllinie 48B mit dem demethylierenden Agens 5azaC behandelt. Nach 3-tägiger Behandlung konnte sowohl für beide CpG-Loci des CD34-Gens als auch konzentrationsabhängige für den Abnahme CpG-Locus des des PROM1-Gens Methylierungsstatus gezeigt eine werden (Abbildung 3.33). Gleichzeitig kam es durch die Demethylierung zu einer ebenfalls konzentrationsabhängigen Zunahme der mittels real-time PCR ermittelten mRNAExpression (Abbildung 3.34). Daher lässt sich rückschließen, dass die Expression der Glykoproteine CD34 und Prominin-1 in GIST durch den Grad der Methylierung in den Promotorbindungsbereichen der jeweiligen Gene beeinflusst wird und somit epigenetisch reguliert ist. Ein vergleichbares epigenetisches Phänomen wird in einer aktuellen Studie an einer großen Kohorte von 141 GIST gezeigt. Für SPP1 (Secreted Phosphoprotein 1), einem Glykoprotein, das in die Extrazellulärmatrix sezerniert wird und mehrere Integrinrezeptoren bindet (Rangaswami, Bulbule et al. 2006), kann gezeigt werden, dass die mRNA-Expression von SPP1 invers mit der DNAMethylierung korreliert und eine Hypomethylierung im Promotorbindungsbereich des Gens signifikant mit einer Tumorprogression assoziiert ist (Haller, Zhang et al. 2014). 4.4 Bedeutung der klinisch-pathologischen Parameter für den klinischen Verlauf 4.4.1 Tumorgröße Das progressionsfreie Überleben nach Tumorresektion wird von der Tumorgröße signifikant beeinflusst. Patienten, deren GIST einen maximalen Durchmesser größer als 5 cm aufweist, haben ein signifikant kürzeres progressionsfreies Überleben als Patienten, deren GIST 5 cm und kleiner ist. Vergleichbare Daten finden sich in der Literatur. Nilsson et al. zeigen in ihrer Studie an 251 GIST-Patiente, dass die Tumorgröße als unabhängiger Faktor einen signifikanten Einfluss auf das krankheitsspezifische Überleben hat (Nilsson, Bümming et al. 2005). Auch Miettinen Diskussion 116 et al. können die Tumorgröße als unabhängigen prognostischen Faktor für GIST des Magens darstellen (Miettinen, Sobin et al. 2005). Für GIST des Dünndarms ist die Tumorgröße – insbesondere bei Tumoren mit einer Mitoserate von ≤ 5 Mitosen pro 50 HPF – von prognostischer Bedeutung, da GIST mit mehr als fünf Mitosen pro 50 HPF eine Mortalität von wenigstens 50 % aufweisen (Miettinen, Makhlouf et al. 2006). Singer et al. zeigen, dass das progressionsfreie Überleben signifikant durch die Tumorgröße beeinflusst wird. Tumoren mit einer Größe kleiner als 10 cm sind mit einer rezidivfreien 5-Jahres-Überlebensrate von 68 % assoziiert, im Gegensatz zu 27 % bei Tumoren ≥ 10 cm (Singer, Rubin et al. 2002). In einer weiteren Studie mit 80 primären, komplett resezierten GIST werden für die 5-Jahres-Überlebensrate vergleichbare, ebenfalls statistisch signifikante Ergebnisse dargestellt (DeMatteo, Lewis et al. 2000). 4.4.2 Mitosenanzahl Für die an den TMA lichtmikroskopisch erhobene Mitosenanzahl in 50 HPF kann ebenso ein signifikanter Einfluss auf das krankheitsfreie Überleben nach der Operation dargestellt werden. Patienten, deren Tumor eine Mitoserate von mehr als fünf Mitosen pro 50 HPF aufweist, haben eine signifikant geringere kumulierte Überlebenswahrscheinlichkeit als Patienten, deren GIST fünf oder weniger Mitosen in 50 HPF aufweist. Vergleichbare Ergebnisse zeigen Singer et al. in ihrer Studie, allerdings wird hier die mitotische Aktivität in 30 HPF beurteilt. Tumoren mit einer Mitoserate von drei oder weniger Mitosen pro 30 HPF haben eine signifikant günstigere rezidivfreie 5-Jahres-Überlebensrate als GIST mit vier bis 15 Mitosen und als GIST mit mehr als 15 Mitosen pro 30 HPF (Singer, Rubin et al. 2002). Ähnliche Daten für die krankheitsspezifische Mortalität zeigen die bereits erwähnten Studien von Miettinen et al. sowohl für GIST des Magens als auch des Dünndarms. MagenGIST mit einer mitotischen Aktivität von mehr als fünf Mitosen pro 50 HPF haben mit einem Anteil von 46 % eine signifikant höhere tumorspezifische Mortalität als Tumoren mit fünf und weniger Mitosen pro 50 HPF, deren Anteil an der Mortalität 3 % beträgt (Miettinen, Sobin et al. 2005). Bei Dünndarm-GIST stellt die Zellteilungsrate einen wichtigen prognostischen Faktor für alle Tumorgrößen dar. Die krankheitsbedingte Mortalität erhöht sich um das Zwei- bis Dreifache in Tumoren mit einer Mitoserate von mehr als fünf Mitosen pro 50 HPF, verglichen mit Tumoren mit Diskussion 117 ähnlicher Größe und geringerer mitotischer Aktivität (Miettinen, Makhlouf et al. 2006). In einer populationsbezogenen Studie aus Norwegen kann anhand der Daten von 96 Patienten ebenfalls für Tumoren mit mehr als fünf Mitosen pro 50 HPF ein signifikant schlechteres Überleben als für Tumoren mit einer Mitoserate von fünf und weniger Mitosen pro 50 HPF dargestellt werden (Steigen, Eide et al. 2007). 4.4.3 Mutationsstatus In dieser Studie aus Norwegen wird des Weiteren ein signifikanter Zusammenhang zwischen Mutationsstatus und Gesamtüberleben dargestellt. Patienten, deren Tumor im Magen lokalisiert ist und eine Punktmutation im Exon 11 des KIT-Gens aufweist, haben eine signifikant bessere 5-Jahres-Überlebensrate als Patienten, deren MagenGIST eine Deletion in dem gleichen Exon dieses Gens aufweist (Steigen, Eide et al. 2007). Auch Miettinen et al. beobachten in ihrer Studie bei Magen-GIST mit einer Deletion im Exon 11 des KIT-Gens signifikant häufiger einen Krankheitsprogress als bei Magen-GIST mit einer Punktmutation in diesem Exon (Miettinen, Sobin et al. 2005). In dem dieser Arbeit zu Grunde liegenden Kollektiv kann eine ähnliche Beobachtung gemacht werden. Keiner der acht Patienten mit Magen-GIST und Punktmutation im KIT-Gen erleidet einen Krankheitsprogress, wohingegen drei von 13 Patienten mit Magen-GIST und Deletion im KIT-Gen einen Tumorprogress aufweisen. Eine statistische Signifikanz kann jedoch nicht nachgewiesen werden. Keiner der im Magen lokalisierten Tumoren mit PDGFRA-Mutation zeigt eine Tumorprogression, dahingegen weisen 22 % der KIT-mutierten GIST des Magens einen Progress auf. Statistisch signifikant ist dieser Unterschied nicht, jedoch ist die Anzahl der PDGFRA-mutierten GIST mit vollständigem Follow-up in dieser Arbeit auch sehr gering. Miettinen et al. kommen ebenfalls zu dem Ergebnis, dass PDGFRA-mutierte Tumoren des Magens tendenziell eine günstige Prognose haben, aber auch in ihrer Studie ist dies statistisch nicht signifikant (Miettinen, Sobin et al. 2005). 4.4.4 Risikoklassifikationen Ebenfalls zeigt die Einteilung der Tumoren anhand der beiden gängigen Risikoklassifikationen in GIST mit sehr niedrigem, niedrigem, intermediärem oder Diskussion 118 hohem Risiko im Hinblick auf den klinischen Verlauf relevante Unterschiede. Sowohl die Klassifikation der GIST nach den Kriterien von Fletcher als auch nach den Kriterien von Miettinen zeigt, dass das progressionsfreie postoperative Überleben mit zunehmend höherer Kategorie einen ungünstigeren Verlauf aufweist. Auch in der Literatur lassen sich signifikante Zusammenhänge zwischen klinischem Verlauf und Risikoklassifikation finden. Die rezidivfreie 5-Jahres-Überlebensrate der 48 Fälle bei Singer et al. beträgt für Patienten mit niedriger Risikoeinstufung 100 %, für Patienten mit mittlerem Risiko 90 % und 15 % für Patienten mit hohem Risiko (Singer, Rubin et al. 2002). Nilsson et al. können im Vergleich zur Normalbevölkerung eine statistisch signifikante Abnahme des Gesamtüberlebens sowohl für die Niedrigrisikogruppe, für die Hochrisikogruppe als auch zusammengefasst für alle Risikogruppen zeigen (Nilsson, Bümming et al. 2005). 4.4.5 PROM1 Da wie bereits erwähnt Prominin-1 als Oberflächenmarker für Tumorstammzellen gilt (Jordan, Guzman et al. 2006, Tirino, Camerlingo et al. 2009, Shi, Tian et al. 2010), stellt sich die Frage des Stellenwertes als solcher in GIST. Während Arne et al. auf Grund ihrer Beobachtungen von einem Vorhandensein von Tumorstammzellen in GIST ausgehen (Arne, Kristiansson et al. 2011), zeigen zwei weitere Studien, dass Prominin-1 neben KIT oder CD34 generell überexprimiert wird und Prominin-1 in GIST nicht als Tumorstammzell-Marker, sondern eher als Abstammungs-Marker fungiert (Bozzi, Conca et al. 2011, Chen, Guo et al. 2012). Wegen der Assoziation der PROM1-Expression mit gastraler Lokalisation, KIT-Exon11-Mutation und ungünstiger Prognose in GIST erwägen die Autoren einer Studie aus dem Jahr 2011 die Verwendung von Prominin-1 zum einen als neuen prognostischen Biomarker zur Selektion von Patienten, die von einer adjuvanten Therapie profitieren würden, und zum anderen als mögliche therapeutische Zielstruktur für neuartige Behandlungsstrategien (Arne, Kristiansson et al. 2011). Lu et al. können an einem Follow-up von 111 Patienten zeigen, dass die 1-, 3- und 5Jahres-Überlebensraten von Patienten mit PROM1-positiven Tumoren signifikant geringer sind als von Patienten mit PROM1-negativen Tumoren (Lu, Liu et al. 2013). Auch in diesem Kollektiv kann ein Einfluss der PROM1-Expression auf das krankheitsfreie Überleben nach der Operation gezeigt werden. So haben Patienten Diskussion 119 mit starker PROM1-Expression verglichen mit Patienten mit keiner, geringer oder mäßiger Expression ein signifikant geringeres progressionsfreies Überleben nach Operation. Dieser Trend wird auch bei Betrachtung der DNA-Methylierung der Promotorregion von PROM1 deutlich. Patienten, deren Tumor eine Methylierung unterhalb des Medians aufweist, haben ein kürzeres postoperatives krankheitsfreies Überleben als Patienten, deren Tumor eine Methylierung oberhalb des Medians aufweist. Statistisch signifikant ist dieser Unterschied jedoch nicht. Betrachtet man jedoch ausschließlich KIT-mutierte Tumoren mit gastraler Lokalisation und bildet bei dieser Gruppe (n = 49) erneut den Median der Methylierung von PROM1_P44_R, so kann dargestellt werden, Promotorbindungsbereich des dass eine PROM1-Gens geringe mit DNA-Methylierung einem signifikant im kürzeren progressionsfreien Überleben nach Operation assoziiert ist. Gerade für Patienten aus dieser Gruppe, also deren Tumor gastral lokalisiert ist und eine Mutation im KIT-Gen aufweist, könnte Prominin-1 als prognostischer Marker von Bedeutung sein. Allerdings sind weitere Untersuchungen an größeren Kollektiven nötig, um die Frage der prognostischen Wertigkeit für diesen Teil der Patienten abschließend zu beantworten. Zusammenfassung 120 5 Zusammenfassung In dieser Arbeit wurden 104 zwischen den Jahren 1992 und 2010 operativ entfernte GIST zweier Pathologischer Institute untersucht. Der Mutationsstatus der Gene KIT (Exon 9, 11, 13 und 17), PDGFRA (Exon 10, 12, 14 und 18) und BRAF (Exon 15) wurde durch Sequenzierung analysiert. An Tissue-Microarrays wurde die immunhistochemische Expression von CD34 und PROM1 semiquantitativ beurteilt. Mittels Pyrosequenzierung wurden Methylierungsanalysen von zwei CpG-Loci im Promotorbindungsbereich des CD34Gens (CD34_P339_R und CD34_P780_R) und einem CpG-Locus im Promotorbindungsbereich des PROM1-Gens (PROM1_P44_R) durchgeführt. KIT-mutierte GIST des Magens wiesen eine signifikant höhere CD34-Expression auf als KITmutierte GIST des Dünndarms (Chi-Quadrat-Test; p < 0,0001) oder als PDGFRA-mutierte GIST des Magens (p = 0,002). Tumoren des Rektums mit KIT-Mutation zeigten eine höhere Proteinexpression von CD34 als KIT-mutierte Dünndarm-GIST (p = 0,005) oder als MagenGIST mit einer PDGFRA-Mutation (p = 0,003). Der Grad der DNA-Methylierung im Promotorbindungsbereich des CD34-Gens korrelierte reziprok mit der Proteinexpression: KIT-mutierte Tumoren des Magens waren an beiden CpG-Loci signifikant geringer methyliert als KIT-mutierte Dünndarm-GIST (t-Test bei unabhängigen Stichproben; p < 0,0001) oder als Magen-GIST mit einer PDGFRA-Mutation (p < 0,0001). GIST des Rektums mit einer KITMutation waren an diesen CpG-Loci des CD34-Gens signifikant geringer methyliert als KITmutierte Dünndarm-GIST (p ≤ 0,01) oder als PDGFRA-mutierte GIST des Magens (p ≤ 0,01). KIT-mutierte Magen-GIST hatten sowohl einen signifikant geringeren Methylierungsstatus im Promotorbindungsbereich des PROM1-Gens als auch eine signifikant höhere Proteinexpression von PROM1 verglichen mit KIT-mutierten GIST des Dünndarms (p ≤ 0,008). Magen-GIST mit PDGFRA-Mutation hingegen hatten eine signifikant höhere DNAMethylierung am untersuchten CpG-Locus des PROM1-Gens und eine signifikant geringere Expression von Prominin-1 verglichen mit KIT-mutierten Tumoren des Magens (p < 0,0001). Methylierungsstatus und Proteinexpression von PROM1 waren zudem mit der Tumorgröße assoziiert. Des Weiteren korrelierten zum Teil signifikant ein niedriger DNA- Methylierungsstatus sowie eine starke Proteinexpression von PROM1 mit einem kürzeren krankheitsfreien Überleben nach Operation. Die Expression von CD34 und PROM1 in GIST scheint epigenetisch reguliert zu sein und korreliert sowohl mit dem Genotyp als auch mit der anatomischen Lokalisation des Tumors. Prominin-1 könnte zudem als neuer prognostischer Marker, insbesondere bei Magen-GIST mit KIT-Mutation, von Bedeutung sein. Literaturverzeichnis 121 6 Literaturverzeichnis Agaimy, A., et al. (2008). "Multiple sporadic gastrointestinal stromal tumors (GISTs) of the proximal stomach are caused by different somatic KIT mutations suggesting a field effect." Am J Surg Pathol 32(10): 1553-1559. Agaimy, A., et al. (2007). "Epithelioid gastric stromal tumours of the antrum in young females with the Carney triad: a report of three new cases with mutational analysis and comparative genomic hybridization." Oncol Rep 18(1): 9-15. Agaimy, A., et al. (2009). "V600E BRAF mutations are alternative early molecular events in a subset of KIT/PDGFRA wild-type gastrointestinal stromal tumours." J Clin Pathol 62(7): 613-616. Agaram, N. 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Sehr herzlich möchte ich mich auch bei Claudia Köbele für ihre tatkräftige Unterstützung im Labor, insbesondere bei den immunhistochemischen Färbungen und Zellversuchen, bedanken. Weiterer Dank gilt den Mitarbeitern im Labor, die mich jederzeit geduldig unterstützt haben, insbesondere seien hier Anja Schöpflin und Andreas Gaa erwähnt. Ein ganz besonderer Dank geht an meine Eltern. Sie haben mir das Medizinstudium und damit auch diese Doktorarbeit ermöglicht und standen mir während der Anfertigung immerzu unterstützend zur Seite. Zuletzt danke ich meiner Frau Melina für ihre unermüdliche Geduld und Ihr volles Verständnis während der Zeit, in der diese Dissertation entstand. Lebenslauf 135 8 Lebenslauf Die Seite 135 enthält persönliche Daten und ist daher in der Online-Version aus Gründen des Datenschutzes nicht enthalten.
