Vergleichende morphogenetische und entwicklungsgeschichtliche

Vergleichende
morphogenetische und entwicklungsgeschichtliche
Untersuchungen an Samenanlagen
Dissertation zur Erlangung des Grades
eines Doktors der Naturwissenschaften
der Fakultät für Biologie und Biotechnologie
der Ruhr-Universität Bochum
angefertigt im
Lehrstuhl für Evolution und Biodiversität der Pflanzen
vorgelegt von
Julia Kunze, geb. Obermann
aus Dortmund
Bochum 2008
Referent
Prof. Dr. Th. Stützel
Koreferent
Prof. Dr. R. Tollrian
VERZEICHNISSE
i
INHALTSVERZEICHNIS
0.
ABBILDUNGSVERZEICHNIS _________________________________________________V
1.
EINLEITUNG ________________________________________________ 1
1.1.
EVOLUTION DES INTEGUMENTS
1
1.1.1.
THEORIE ZUR INTEGUMENTENTWICKLUNG
2
1.1.2.
FOSSILE FUNDE: CUPULA, LAGENOSTOM UND CO.
3
1.1.3.
DIE FUNKTION DES INTEGUMENTS
5
MORPHOLOGISCHE UNTERSUCHUNGEN
7
1.2.1.
UNTERSUCHUNGEN AN URSPRÜNGLICHEN GYMNOSPERMEN
7
1.2.2.
UNTERSUCHUNGEN AN URSPRÜNGLICHEN ANGIOSPERMEN
8
1.2.
1.3.
ENTWICKLUNGSGENETISCHE UNTERSUCHUNGEN
10
1.3.1.
ENTWICKLUNGSGENE UND IHRE WIRKUNGSWEISE
10
1.3.2.
MADS-BOX-GENE
11
1.3.3.
DAS ABC-MODELL
13
1.3.4.
DIE ÜBERTRAGUNG DES ABC-MODELLS AUF DIE GYMNOSPERMEN
14
1.4.
ZIEL DER ARBEIT
16
2.
MATERIAL UND METHODEN ________________________________ 18
2.1.
HISTOLOGISCHE UNTERSUCHUNGEN
18
2.1.1.
FIXIERUNG DES PFLANZENMATERIALS
18
2.1.2.
LICHTMIKROSKOPISCHE UNTERSUCHUNGEN
18
2.1.3.
RASTERELEKTRONENMIKROSKOPISCHE UNTERSUCHUNGEN
21
2.1.4.
DIGITALE DOKUMENTATION
22
ENTWICKLUNGSGENETISCHE UNTERSUCHUNGEN
23
MOLEKULARBIOLOGISCHE VORARBEITEN
23
2.2.1.1.
In-silico-Analyse und Primerdesign
23
2.2.1.2.
RNA-Isolierung und cDNA-Synthese
23
2.2.
2.2.1.
VERZEICHNISSE
ii
2.2.1.3.
Nested PCR
24
2.2.1.4.
Gelelektrophorese
24
2.2.1.5.
Aufreinigung der DNA
25
2.2.1.6.
Klonierung
25
2.2.1.7.
M13-PCR und Plasmidcharakterisierung
25
2.2.1.8.
Isolierung der Plasmid-DNA
26
2.2.1.9.
DNA-Fällung und Sequenzierung
27
2.2.1.10. Synthetisierung der Sonde
27
2.2.1.11. Dot-Blot
28
2.2.2.
IN-SITU-HYBRIDISIERUNG
29
2.2.2.1.
RNasefreie Fixierung von Frischmaterial
29
2.2.2.2.
Überführung in Wachs
30
2.2.2.3.
Erstellung von Paraffinschnitten
31
2.2.2.4.
Entparaffinierung und Prähybridisierung
31
2.2.2.5.
Hybridisierung
32
2.2.2.6.
Antikörper-Behandlung
33
2.2.2.7.
Detektion
34
2.2.2.8.
Stoppen der Reaktion
35
2.2.2.9.
Lichtmikroskopie und Dokumentation
35
2.2.3.
LÖSUNGSLISTE
35
2.2.4.
HERSTELLERNACHWEISE
37
PFLANZENMATERIAL
38
ZAMIA AMBLYPHYLLIDIA (ZAMIACEAE)
38
2.3.1.1.
Allgemeine Artbeschreibung
38
2.3.1.2.
Beschreibung der untersuchten Individuen
39
GINKGO BILOBA (GINKGOACEAE)
41
2.3.2.1.
Allgemeine Artbeschreibung
41
2.3.2.2.
Beschreibung des untersuchten Individuums
42
MAGNOLIA STELLATA (MAGNOLIACEAE)
43
2.3.3.1.
Allgemeine Artbeschreibung
43
2.3.3.2.
Beschreibung des untersuchten Individuums
45
2.3.
2.3.1.
2.3.2.
2.3.3.
VERZEICHNISSE
iii
3.
ERGEBNISSE ______________________________________________ 46
3.1.
HISTOLOGISCHE UNTERSUCHUNGEN
46
3.1.1.
INTEGUMENTENTWICKLUNG BEI ZAMIA AMBLYPHYLLIDIA
46
3.1.2.
INTEGUMENTENTWICKLUNG BEI GINKGO BILOBA
53
3.1.3.
INTEGUMENTENTWICKLUNG BEI MAGNOLIA STELLATA
59
ENTWICKLUNGSGENETISCHE UNTERSUCHUNGEN
66
MOLEKULARBIOLOGISCHE VORARBEITEN
66
3.2.1.1.
Primerdesign zur Gewinnung einer MADS-Box-C-Gen-Sequenz
66
3.2.1.2.
RNA-Isolierung und cDNA-Synthese
70
3.2.1.3.
Klonierung und Sequenzierung der gewonnen Genseqeuenzen
71
3.2.1.4.
Synthetisierung der Sonde
76
3.2.1.5.
Dot-Blot
77
IN-SITU-HYBRIDISIERUNG – METHODISCHE ERGEBNISSE
78
3.2.2.1.
RNasefreie Fixierung von Frischmaterial
78
3.2.2.2.
Überführung in Wachs
78
3.2.2.3.
Erstellung von Paraffinschnitten
79
3.2.2.4.
Entparaffinierung und Prähybridisierung
80
3.2.2.5.
Hybridisierung
81
3.2.2.6.
Antikörper-Behandlung
81
3.2.2.7.
Detektion
82
IN-SITU-HYBRIDISIERUNG – INHALTLICHE ERGEBNISSE
84
3.2.3.1.
Sporophylle von Zamia amblyphyllidia
84
3.2.3.2.
Blätter von Zamia amblyphyllidia
89
3.2.
3.2.1.
3.2.2.
3.2.3.
4.
DISKUSSION _______________________________________________ 91
4.1.
EVOLUTION DES INTEGUMENTS
91
4.1.1.
DIE TELOMTHEORIE UND DIE MORPHOLOGIE DES INTEGUMENTS
91
4.1.2.
DIE FUNKTION DES INTEGUMENTS
94
4.1.3.
ÄUßERES INTEGUMENT UND EPIMATIUM IM VERGLEICH
96
4.1.4.
EIN NEUES KONZEPT ZUR EVOLUTION DES INTEGUMENTS
98
VERZEICHNISSE
4.2.
iv
ENTWICKLUNGSGENETISCHE UNTERSUCHUNGEN
104
4.2.1.
IN-SITU-HYBRIDISIERUNGEN AN SPOROPHYLLEN VON ZAMIA
104
4.2.2.
IN-SITU-HYBRIDISIERUNGEN AN BLÄTTERN VON ZAMIA
106
5.
ZUSAMMENFASSUNG _____________________________________ 107
6.
LITERATURVERZEICHNIS __________________________________ 108
7.
ANHANG__________________________________________________ 116
ERKLÄRUNG
116
LEBENSLAUF
117
DANKSAGUNG
118
VERZEICHNISSE
v
0.1.
Abbildungsverzeichnis
Abb. 1:
Schemazeichnung Samenanlage
Abb. 2:
Schematische Darstellung eines MADS-box-Gens des MIKC-Typs
12
Abb. 3:
Knock-out-Mutanten (MADS-box-Gene) von Arabidopsis thaliana
(L.) HEYNH. (aus: RIECHMANN & MEYEROWITZ, 1997, www.its.edu)
13
Abb. 4:
Schema zur Funktion der MADS-box-Gene innerhalb der Angiospermen-Blüte
14
Abb. 5:
Schematische Darstellung der Sporophylltypen der Cycadales
39
Abb. 6:
Zapfen von Zamia amblyphyllidia D.W.STEV.
40
Abb. 7:
Zamia amblyphyllidia D.W. STEV., BoGa Bochum
40
Abb. 8:
Kurztriebe bei Ginkgo biloba L.
41
Abb. 9:
Ginkgo biloba L., Ast mit „Tschitschi“, aufgenommen am MejiSchrein (Japan)
42
1
Abb. 10: Ginkgo biloba L. , Privatanwesen in Herdecke
43
Abb. 11: Blüten von Magnolia stellata (SIEBOLD & ZUCC.) MAXIM
44
Abb. 12: Karpell-/Samenentwicklung bei Magnolia stellata (SIEBOLD & ZUCC.)
MAXIM
45
Abb. 13: Magnolia stellata (SIEBOLD & ZUCC.) MAXIM in Blüte, BoGa Bochum
45
Abb. 14: Zamia amblyphyllidia D.W. STEV., REM- und LM-Aufnahmen
49
Abb. 15: Zamia amblyphyllidia D.W. STEV., LM- und REM-Aufnahmen
50
Abb. 16: Zamia amblyphyllidia D.W. STEV., LM-, REM und Binokular-Aufnahmen
51
Abb. 17: Zamia amblyphyllidia D.W. STEV., LM-Aufnahmen
52
Abb. 18: Ginkgo biloba L. , REM-Aufnahmen
55
Abb. 19: Ginkgo biloba L. , REM-Aufnahmen
56
Abb. 20: Ginkgo biloba L. , REM- und LM-Aufnahmen
57
Abb. 21: Ginkgo biloba L. , Fotografie und LM- und REM-Aufnahmen
58
VERZEICHNISSE
vi
Abb. 22: Magnolia stellata (SIEBOLD & ZUCC.) MAXIM, LM- und REM-Aufnahmen
62
Abb. 23: Magnolia stellata (SIEBOLD & ZUCC.) MAXIM, LM-Aufnahmen
63
Abb. 24: Magnolia stellata (SIEBOLD & ZUCC.) MAXIM, LM- und REM-Aufnahmen
64
Abb. 25: Magnolia stellata (SIEBOLD & ZUCC.) MAXIM, LM-, REM- und Binokular-Aufnahmen
65
Abb. 26: Aminosäuren-Alignment zu MADS-box-Genen der C-Funktionsklasse von Gymnospermen und ausgewählten Angiospermen
67
Abb. 27: Gelelektrophorese zum 1. Schritt der „nested-PCR“ mit den Primern
„1-mads_for“ und „Poly-T“
68
Abb. 28: Gelelektrophorese zum 2. Schritt der „nested-PCR“ mit den Primern
„2-C_for“ und „Poly-T“
68
Abb. 29: Schrittweise Ermittlung eines degenerierten Reverse-Primers
„primer-mads_rev“
69
Abb. 30: Gelelektrophorese zum 1. Schritt der „nested PCR“ mit den Primern
„1-mads_for“ und „mads_rev“
70
Abb. 31: Gelelektrophorese zum Folgeschritt der „nested PCR“ mit den
Primern „2-C_for“ und „mads _rev“
70
Abb. 32: Gelelektrophorese zur Plasmid-DNA nach M13-PCR der Klonierungsprodukte des 2. PCR-Schrittes einer „nested-PCR“ mit den
Primern „2-C_ for“ und dem Poly-T-Reverse-Primer
71
Abb. 33: Sequenzierungsergebnis der M13-PCR von Klon 3
72
Abb. 34: Gelelektrophorese zur Plasmid-DNA nach M13-PCR der Klonierungsprodukte des 2. PCR-Schrittes einer „nested-PCR“ mit den
Primern „2-C_for“ und „primer-mads_rev“
73
Abb. 35: Nukleotidsequenz-Alignment der Klone 3, 7, 8 und 9 mit den MADSbox-C-Genen der nah verwandten Gymnospermen Cycas edentata
L. und Ginkgo biloba L.
74
Abb. 36: In-silico-Analyse zu den Nukleotidsequenzen der Klone eines MADSbox-C-Gens von Zamia amblyphyllidia D.W. STEV.
75
Abb. 37: Nukleotidsequenz-Alignment der Klone 3, 7, 8, 9 und 13
76
Abb. 38: Schematische Darstellung des Plasmids im Bereich des Inserts
77
VERZEICHNISSE
vii
Abb. 39: „Dot-Blot“ nach erfolgter Färbereaktion
77
Abb. 40: Blattgewebe nach der Behandlung mit Proteinase K
80
Abb. 41: In der In-situ-Hybridisierung unterschiedlich intensiv gefärbte Gewebeschnitte
83
Abb. 42: Zamia amblyphyllidia D.W. STEV., In-situ-Hybridisierung an weiblichen reproduktiven Strukturen (LM-Aufnahmen)
87
Abb. 43: Zamia amblyphyllidia D.W. STEV., In-situ-Hybridisierung an weiblichen reproduktiven Strukturen (LM-Aufnahmen)
88
Abb. 44: Zamia amblyphyllidia D.W. STEV., In-situ-Hybridisierung an Blättern
(LM-Aufnahmen)
90
Abb. 45: Samenschuppe von Saxegothaea conspicua LINDL., REM (Quelle:
RESTEMEYER 2002)
97
Abb. 46: Morphologische Reihe zur Entwicklung der Samenanlagen bei
Lagarostrobus franklinii (HOOK f.) QUINN, REM (Quelle: RESTEMEYER
2002, Beschriftung ergänzt)
97
Abb. 47: Schemazeichnung zur Entwicklung des Integuments
100
Abb. 48: Längshalbierte Samenanlage von Zamia amblyphyllidia D.W.STEV.
zum Zeitpunkt der Bestäubungsreife
101
Abb. 49: Rekonstruktionen fossiler Samenanlagen
103
EINLEITUNG
1.
EINLEITUNG
1.1.
EVOLUTION DES INTEGUMENTS
1
Die Evolution der Spermatophyta als ein wichtiger Schritt der Pflanzen zum Leben an
Land ist eines der in der Geschichte der Botanik am meisten diskutierten Rätsel, dem
schon Generationen von Wissenschaftler(inne)n auf die
Integument
Spur zu kommen versuchen. Fest steht aber, dass die
Mikropyle
Entwicklung der Samenanlage und die damit von einer
feuchten Umgebung unabhängige Befruchtung einen
Nucellus
entscheidenden Schritt zur Anpassung an ein trockenes
MakroHabitat darstellt. Einhergehend mit der Evolution der
prothallium
Samenanlage verlief die Evolution des Integuments. Als
Archegonium
Integument wird eine Hüllstruktur um die Samenanlage
Abb. 1: Schemazeichnung
mit Öffnung, der so genannten Mikropyle, bezeichnet.
Samenanlage
Das Integument umgibt bei allen rezenten Spermatophyta den Nucellus, in dem sich das Makroprothallium mit den Eizellen enthaltenden
Archegonien entwickelt (Abb. 1). Hat eine Befruchtung stattgefunden, spricht man
nicht mehr von der Samenanlage, sondern vom Samen (WAGENITZ, 2003).
Die ersten Landgänger in der Evolution waren vor ca. 450 Millionen Jahren einfache
Gefäßpflanzen wie die fossile Gattung Cooksonia, die eine erste Differenzierung in
Anhangsorgane mit unterschiedlichen Funktionen zeigt (BANKS 1971). So ist der für
die im Wasser lebenden Vorfahren typische thallöse Aufbau einem Aufbau aus
gabelig verzweigten Telomen gewichen, die von einer Protostele, einem ursprünglichen Leitbündeltyp, durchzogen sind. Die Funktion der Wurzel wurde durch Triebe,
die meist parallel zum Boden und manchmal sogar abwärtsgerichtet verliefen, übernommen. Die daran inserierenden Rhizoide dienten der Aufnahme von Wasser und
Mineralien (ZIMMERMANN 1969). Da auf dieser Entwicklungsstufe kaum Festigungsgewebe ausgebildet waren, zeichneten sich die ersten Landpflanzen durch eine
Wuchshöhe von maximal 10 cm aus. Wie alle Vertreter der Rhyniales, einer fossilen
Ordnung der Psilophytopsida (Urfarne), trugen sie Sporangien (EDWARDS 1970a).
Ein grundlegender Schritt für die Evolution der Samenanlage ist die Heterosporie, bei
der im Mikrosporangium viele kleine männliche und im Makrosporangium nur wenige
große weibliche Sporen gebildet werden. Einhergehend mit der Differenzierung in die
so genannten Mikro- und Makrosporen fand eine Reduktion der gametophytischen
Generation statt, da diese aufgrund der in der Spore in großen Mengen enthaltenen,
EINLEITUNG
2
gut verfügbaren Nährstoffe nun ohne photosynthetische Energiegewinnung Gameten
ausbilden kann. Dabei sind die Makrosporen die wesentlich größeren Sporen, da sie
zur Sicherstellung der anfänglichen Entwicklung von der Zygote zum Sporophyten
über eine bessere Ausstattung mit Reservestoffen verfügen (ZIMMERMANN 1969). Die
Heterosporie ist im Laufe der Evolution mehrfach unabhängig voneinander entwickelt
worden und ist rezent innerhalb der Pteridophyta bei den Lycopodiopsida (z.B. bei
Isoetes oder Selaginella) wie auch den Filicopsida (z.B. bei Salvinia oder Pillularia)
vorzufinden.
Ausgehend von der Heterosporie fand eine weitere Reduktion der Sporenmenge bis
auf eine einzige Makrospore statt, die die gesamte Makroprothallienentwicklung in
sehr stark reduzierter Form innerhalb des Sporangiums durchläuft. Mit diesem am
Sporophyten bleibenden Prothallium, das zudem in das Sporangium eingeschlossen
ist, ist die Vorstufe zur Samenanlage entwickelt. Ebenfalls stark reduziert findet die
Entwicklung des Mirkoprothalliums im Sporangium statt. Es verbleibt jedoch nicht am
Sporophyt, sondern wird in der Spore ausgebreitet. Rezent ist diese weit entwickelte,
spezielle Form der Endosporie bei Selaginella rupestris (L.) SPRING und Selaginella
apoda (L.) SPRING beobachtete worden, die im Normalfall allerdings wie alle anderen
Selaginella-Arten auch beide Sporentypen aus den Sporangien entlassen. Mit dem
„Sesshaftwerden“ der Makrospore im Sporangium (HOFMEISTER 1851) ist der erste
Schritt zur Samenanlage vollzogen. Als Samenanlage bezeichnet man den Komplex
aus Makroprothallium, umgebenden Nucellus (= Makrosporangium) und Integument,
wobei die Zahl der Integumente innerhalb der Spermatophyten variiert: die Gymnospermen haben konstant ein Integument, während bei den Angiospermen ein bis drei
Integumente anzutreffen sind. Über die Evolution des Integuments gibt es verschiedene Theorien, die allerdings alle aufgrund fehlender handfester vergleichender oder
entwicklungsgeschichtlicher Grundlagen im Spekulativen geblieben sind.
1.1.1.
THEORIE ZUR INTEGUMENTENTWICKLUNG
Das bekannteste und derzeit allgemein anerkannte Modell zur Evolution der Spermatophyta liefert ZIMMERMANN (1930) im Rahmen seiner Telomtheorie. Er postuliert mit
seiner Theorie, dass sämtliche pflanzlichen Organe aus gabelig verzweigten Trieben
entstanden sind. Die Endglieder dieser Gabeläste werden als Telome, die Abschnitte
zwischen zwei Gabelungen als Mesome bezeichnet. Durch eine Reihe so genannter
Elementarprozesse leitet ZIMMERMANN alle bekannten morphologischen Strukturen
aus diesem Verzweigungssystem ab. Einer der Elementarprozesse ist beispielsweise
die Übergipfelung, bei der einige Telome stärker im Wachstum gefördert werden als
andere, ein anderer ist die Planation, bei der alle Telome in eine Ebene rücken. Von
EINLEITUNG
3
letzterem ausgehend kann eine Verwachsung stattfinden, zudem ist eine Reduktion
aller Telom-Zustände möglich, so dass z.B. reduzierte Schuppen„blätter“ entstehen
können. Der letzte der Elementarprozesse ist die so genannte Einkrümmung, durch
die ZIMMERMANN die Entstehung von Sporophyllen mit randständigen Sporangien bei
vielen fossilen Pteridophyten oder der rezenten Gattung Equisetum erklärt.
ANDREWS (1961) überträgt die Telomtheorie von ZIMMERMANN derart auf die Samenanlagenentwicklung, dass das Integument seiner Interpretation nach im Verlauf der
Evolution aus sterilen, an der Basis des Sporangiums stehenden Hülltelomen durch
Verwachsungsprozesse entstanden ist. ANDREWS Erklärung des Integuments als ein
Verwachsungsprodukt aus sterilen Hüllen dient schon seit vielen Jahrzehnten als ein
grundlegendes Modell zur Evolution der höheren Pflanzen. Wahrscheinlich basiert
ZIMMERMANNS 1930 im Rahmen der Telomtheorie veröffentlichte Modellvorstellung
zur evolutiven Entwicklung der frühen Samenanlagen auf den Ergebnissen von wie
auch die weiterführende Interpretation ANDREWS (1961) auf morphologischen Studien
an Angiospermen, da die Entwicklung der Integumente bei vielen Angiospermen von
der Basis der Samenanlage ausgeht und sich so die in der Telomtheorie formulierte
Verschmelzung basal stehender Hülltelome problemlos auf die Samenanlagenentwicklung bei Angiospermen projizieren lässt. Zu dem Zeitpunkt, als die Telomtheorie
verfasst wurde, fehlten vergleichende Untersuchungen an Gymnospermen fast völlig
und sind auch heute eher spärlich. Das bezüglich des Wachstums der Integumente
bei Angiospermen bekannte Schema wurde nach der Entdeckung des Integuments
bei den Gymnospermen kurzer Hand auf diese übertragen.
1.1.2.
FOSSILE FUNDE: CUPULA, LAGENOSTOM UND CO.
Fossile Funde und ihre Rekonstruktionen bilden die Grundlage für Evolutionsstudien
bezüglich der Integumententwicklung. Bereits weit vor der Evolution des Integuments
sind biologische Entwicklungen wie das Verbleiben des Makroprothalliums im Makrosporangium oder die Evolution der Bestäubung, die beispielsweise die Bildung einer
Bestäubungskammer mit einschließt, aufgetreten (ROTHWELL & SCHECKLER 1988).
Daher fokussiert sich das Interesse auf die Funde fossiler primitiver Gymnospermen,
den evolutiv ersten Pflanzen mit samenanlagenähnlichen Strukturen, d.h. mit einem
von einer Hüllstruktur umgebenen Makrosporangium. Eben diese Strukturen dienen
als eindeutiges Merkmal zur Abgrenzung von den fossilen Pteridophyten des oberen
Devons. Eine hypothetische Entwicklungsreihe von einem von mehreren Lappen
umgebenen Makrosporangium zu einem vollständig umhüllten lässt sich anhand der
von LONG (1959, 1960a, 1960b) veröffentlichten fossilen Funde aus Berkwickshire,
Schottland, erstellen. Die aus dem Unterkarbon stammenden Arten Genomosperma
EINLEITUNG
4
kidstoni mit zahlreichen unverwachsenen, lang ausgezogenen Lappen an der Basis
eines Makrosporangiums und Genomosperma latens mit mehreren basal stehenden
Lappen, die sich über dem distalen Ende des Makrosporangiums zusammenneigen,
können in einer evolutiven Entwicklungsreihe als Vorläufer für die von fast vollständig
miteinander verwachsenen Lappen umgebenen Makrosporangien von Eurystoma
angulare und die bis auf eine apikale Öffnung vollkommen umschlossenen Makrosporangien bei Stamnostoma huttonense interpretiert werden. Die bei St. huttonense
anzutreffende Struktur ist funktionell als Samenanlage mit Integument und Nucellus
anzusehen.
Bei zahlreichen primitiven, fossilen Samenanlagen sind verschiedene Modifikationen
am Integument oder Makrosporangium zu erkennen. Auswüchse am distalen Ende
des Makrosporangiums scheinen der Aufnahme des windverbreiteten Pollens zu
dienen (TAYLOR 1981, NIKLAS 1982). Ist dieser Bereich röhren-, becher- oder glockenförmig umgebildet, so spricht man von einer Salpinx wie sie z.B. fossil bei Eurystoma
angulare anzutreffen ist. Eine andere vom Makrosporangium gebildete Struktur mit
vermutlich gleicher Funktion ist das auch nur fossil bekannte Lagenostom, das sich
aus zwei Komponenten zusammen setzt: zum einen aus einer zentralen Säule, die
von der ausgezogenen Spitze des Makrosporangiums gebildet wird und somit der
beschriebenen Salpinx entspricht, und zum anderen vom eigentlichen Lagenostom,
einer Struktur, die die Mittelsäule becher- oder ringförmig umgibt. Da das nach oben
weit geöffnete Lagenostom starr ist, drückt sich das Makrosporangium im weiteren
Wachstum in den vom Lagenostom gebildeten Hohlraum hinein und nimmt so den
dort angesammelten Pollen auf (STEWART & ROTHWELL 2001). Eine solche Struktur ist
zum Beispiel bei Physostoma elegans (STEWART 1983) und zahlreichen weiteren
fossilen Funden erkennbar (GIFFORD & FOSTER 1996).
Die Abwandlungen in der Ausbildung des Integuments sind ebenfalls sehr vielfältig.
So sind neben den abgeplatteten fossilen Samenanlagen mit geflügeltem Integument
wie bei Spermolithus devonicus (CHALONER et al. 1977) auch rundliche Samenanlagen mit einer auffälligen äußeren Struktur zu finden. Bei Conostoma kestospermum
ist beispielsweise eine bandförmig um die Samenanlage gewundene, unregelmäßig
begrenzte Struktur ausgebildet (TAYLOR & LEISMAN 1963).
Die bisher erwähnten fossilen primitiven Samenanlagen stehen wie die nahezu alle
bekannten Samenanlagen des frühen Karbons auch in einem gabelig verzweigten
Achsensystem, dessen Achsen eine becherförmige Struktur bilden. Diese wird als
Cupula bezeichnet und darüber definiert, dass sie die Samenanlagen einzeln (z.B.
bei Runcaria heinzelinii, GERIENNE et al. 2004) oder in Gruppen (z.B. bei Moresnetia
zalesskyi, FAIRON-DEMARET & SCHECKLER 1987) vollständig oder nur teilweise einhüllt
EINLEITUNG
5
(ROTHWELL & SCHECKLER 1988). Die Achsen der Cupula können dabei miteinander
verschmolzen oder völlig frei sein. Darüber hinaus hüllt die Cupula nicht in jedem Fall
den ganzen Samenanlagenkomplex ein, sondern umgibt oft auch, wie beispielsweise
bei Archaeosperma arnoldii, zwei sich gegenüberstehende Komplexe jeweils nur zur
Hälfte, so dass die Cupulae zusammen die Samenanlagen fast vollständig umgeben
(PETTITT & BECK 1968). Oft ist der Cupula eine sekundäre Struktur aufgelagert. Bei
Lagenostoma lomaxi handelt es sich dabei z.B. um über die ganze Außenseite der
Cupula zerstreut verteilte Drüsen (GIFFORD & FOSTER 1996 nach EMBERGER 1944).
Aus evolutionstheoretischer Sicht ist lange Zeit spekuliert worden, ob es sich bei der
Cupula um einen Vorläufer des Karpells handelt (STEWART & ROTHWELL 2001). Diese
Interpretation basiert auf der Annahme WETTSTEINS (1935), dass die ursprünglichsten
Karpelle einsamige Gynoceen mit basaler Plazentation und orthotropen Samenanlagen gewesen seien. Dies hat WETTSTEIN veranlasst, die Polysonaceae oder auch die
Casuarinaceae als basal zu betrachten. Molekulare Daten stellen jedoch durchweg
Arten mit mehreren Karpellen und marginaler Plazentation an die Basis des Systems
der Angiospermen, so dass WETTSTEINS Annahme längst widerlegt ist. Unabhängig
davon ist die Cupula aber als eine wichtige Struktur zur Klärung der Evolution der
Angiospermen zu betrachten.
1.1.3.
DIE FUNKTION DES INTEGUMENTS
Die Verlagerung der ursprünglich freien gametophytischen Generation in das Makrosporangium stellt einen deutlichen Vorteil für den Gametophyten dar. Im Sporangium
kann sich das Makroprothallium vor äußeren Umwelteinflüssen geschützt entwickeln
und ist dadurch sowohl länger lebensfähig als auch über einen längeren Zeitraum
befruchtungsfähig (TAYLOR 1982). Im Makrosporangium findet die Befruchtung in
völliger Unabhängigkeit von atmosphärischem Wasser statt (STEWARD 1983). Da das
Prothallium im Sporangium keine eigene Photosynthese betreibt, sondern allein über
den Sporophyten ernährt wird, ist es bis auf die generativen Strukturen vollständig
reduziert. Das Makrosporangium mit dem Makroprothallium ist von wenigstens einem
Integument umgeben, dem die Schutzfunktion für den Komplex zugesprochen wird
(TAYLOR 1982).
Ein anderer gedanklicher Ansatz, der die Schutzfunktion des zu Beginn der Makroprothallienentwicklung sehr dünnen Integuments vernachlässigt, befasst sich mit der
Öffnungsweise des Sporangiums bei den Spermatophyta. Innerhalb der Pteridophyta
sind verschiedene Öffnungsmechanismen des Sporangiums zur Sporenentlassung
zu finden. Den Anulus, der aus dickwandigen Zellen besteht, die von dünnwandigen
EINLEITUNG
6
Zellen unterbrochen werden, findet man bei den Filicatae, den Echten Farnen. Bei
der Austrocknung des Sporangiums verhindern die verdickten Zellwände, dass die
Anulus-Zellen einschrumpfen, wodurch die zwischen diesen starren Zellen liegenden
dünnwandigen Zellen, die so genannten Stomium-Zellen, beim trocknungsbedingten
Zusammenziehen des gesamten Sporangiums einer Sollbruchstelle gleich einreißen.
Der Anulus kann das Sporangium sowohl ringförmig umgeben als auch nur auf eine
bestimmte Region konzentriert sein. Die zu den Filicatae gehörenden Salviniales, die
Wasserfarne, verfügen über ein Sporangium, das mit drei Klappen aufplatzt und eine
sich ebenfalls 3-klappig öffnende Spore mit bereits keimendem Prothallium enthält
(BRESINSKY 2002). Das Sporangium der Spermatophyta, das einen Funktionswandel
zum Nährgewebe für das sich entwickelnde Prothallium vollzogen hat, verfügt über
keinen der genannten Öffnungsmechanismen. Der einzige Kontakt zur Umgebung ist
über die Bestäubungskammer gegeben, die direkt unter der Öffnung im Integument,
der Mikropyle, liegt.
Bei fossilen Samenanlagen ist es vielfach eine Aufgabe des Integuments gewesen,
Pollen und Archegonien zusammenzubringen. Wie bereits beschrieben ist zu diesem
Zweck das Integument eine starre Struktur, die nach oben trichterförmig ausgebildet
ist, was die Sammlung vieler Pollenkörner erleichtert, um die Chance auf arteigenen
Pollen zu erhöhen (STEWART & ROTHWELL 2001). Nach der Befruchtung ist ein an das
Wachstum des Nucellus bzw. Embryos angepasstes Wachstum des Integuments
erforderlich (ROTHWELL & SCHECKLER 1988).
Die meisten rezenten Gymnospermen benötigen für die Bestäubung einen Bestäubungstropfen zur Aufnahme des Pollens (STÜTZEL & RÖWEKAMP 1999b), denn sie
verfügen im Gegensatz zu den Angiospermen nicht über eine Narbe als rezeptives
Gewebe, weil die Narbe eine Ausbildung der die Samenanlagen einhüllenden Fruchtblätter ist. Da es vorteilhaft ist, den Bestäubungstropfen möglichst groß zu gestalten
und möglichst lange zu exponieren, um die Trefferquote für ein einziges notwendiges
arteigenes Pollenkorn zu erhöhen, muss der Tropfen zum einen sehr viskos sein und
durch irgendeine Struktur gehalten werden. Die Viskosität wird durch einen extrem
hohen Zuckergehalt im Bestäubungstropfen erreicht, wohingegen das Integument als
verantwortlich für die Haltestruktur gesehen wird. Insbesondere die evolutiv ersten
Samenanlagen tragenden Pflanzen wurden durch Pollenkörner bestäubt, die bewegliche Spermatozoide entließen, die sich aktiv durch den Bestäubungstropfen zu den
Archegonien bewegen konnten (THOMAS & SPICER, 1987).
EINLEITUNG
1.2.
7
MORPHOLOGISCHE UNTERSUCHUNGEN
Die oben vorgestellte Telomtheorie von ZIMMERMANN (1930) (siehe 1.1.1.) dient seit
vielen Jahrzehnten als ein grundlegendes Modell zur Evolution der höheren Pflanzen
und ist sowohl in Schulbüchern als auch in der Wissenschaftsliteratur abgedruckt,
ohne dass aber bislang versucht worden wäre, dieses Modell durch morphologische
Studien zu überprüfen. Für die Rekonstruktion der Evolution der Spermatophyta wie
auch für die Verifizierung der dazu vorhandenen Modelle ist es jedoch unabdinglich,
die Strukturen der Samenanlagen eingehender zu untersuchen.
In der Literatur sind zahlreiche Studien zur Entwicklung der reproduktiven Strukturen
von verschiedenen Arten sowohl der Gymnospermen als auch der Agiospermen zu
finden. Die meisten dieser Studien sind älteren Datums und beinhalten ausführliche
Beschreibungen und sehr detaillierte Zeichnungen. Die Informationen beziehen sich
jedoch häufig nur auf einzelne Organe oder bestimmte Abschnitte aus der gesamten
Organentwicklung, so dass es oftmals sehr problematisch ist, in der Literatur zu der
jeweiligen aktuellen Fragestellung passende Daten zu finden. Erschwerend kommt
hinzu, dass die meist kunstvoll angefertigten Zeichnungen sowohl vom allgemeinen
Wissensstand zur Zeit der Entstehung als auch von der Interpretation des Verfassers
beeinflusst sein können. Die nachstehenden beiden Punkte geben einen knappen
Überblick über die vorhandenen Daten bezüglich der Entwicklung der Integumente
bei den Angio- und Gymnospermen aus der Literatur wie auch aus unveröffentlichten
Arbeiten der Arbeitsgruppe am Lehrstuhl.
1.2.1.
UNTERSUCHUNGEN AN URSPRÜNGLICHEN GYMNOSPERMEN
Morphologische Untersuchungen zur Entwicklung der Samenanlagen von den rezent
vorkommenden stammesgeschichtlich ältesten Vertretern der Spermatophyten, den
Gymnospermen, wurden bereits zu Beginn des letzten Jahrhunderts angefertigt und
anhand von Schemazeichnungen oder sehr detaillierten Zeichnungen dokumentiert.
Hervorzuheben sind hierbei die Arbeiten von VELENOVSKÝ (1910), GOEBEL (1923) und
CHAMBERLAIN (1935), die an verschiedenen Gymnospermen geforscht haben. Um
jedoch die Telomtheorie von ZIMMERMANN (1930) zur Evolution des Integuments aus
miteinander verschmolzenen Telomlappen zu überprüfen, liegt es auf der Hand, die
Untersuchungen an den Arten zu beginnen, bei denen eine zwei- oder mehrlappige
Mikropyle anzutreffen ist. Hier wäre es am ehesten zu erwarten, dass eine Bildung
des Integuments durch die kongenitale Verwachsung ursprünglich noch getrennter
Telomrudimente nachweisbar ist. Die verfügbaren morphogenetischen Arbeiten von
MUNDRY (2000) sowohl zur Entwicklung der Samenanlagen bei Gnetum gnemon L.
EINLEITUNG
8
mit einer mehrlappigen Mikropyle als auch zur Samenanlagenentwicklung von Pinus
mugo TURRA mit einer zweilappigen Mikropyle ließen aber keine derartigen Verwachsungsprozesse erkennen.
Innerhalb der rezenten Gymnospermen werden die Ginkgoaceae und Cycadaceae
als die ursprünglichsten Familien angesehen. Ein Indiz für die Urtümlichkeit dieser
Art ist die Spermatozoidbefruchtung, wie sie bei Landpflanzen außerhalb der Spermatophyten nur noch bei den Bryophyten und Pteridophyten anzutreffen ist. Für die
Betrachtung der Evolution des Integuments sind besonders Vertreter dieser extrem
ursprünglichen Familien von Interesse. Sehr umfangreiche Arbeiten zu Ginkgo biloba
L. und der Cycadacee Zamia floridana A. DC sind von CAROTHERS (1907) und SMITH
(1910) durchgeführt und in detaillierten Zeichnungen festgehalten worden. Allerdings
liegen bei diesen oftmals gerade die entscheidenden Strukturen im Grenzbereich des
Auflösungsvermögens der zur Präparation bzw. Untersuchung eingesetzten Stereomikroskope, so dass es im Laufe der Wissenschaftsgeschichte zahlreiche Beispiele
von fehlerhaften Darstellungen gegeben hat. In neueren Arbeiten sind die aktuellen
Untersuchungsergebnisse zum größten Teil fotografisch dokumentiert und liegen so
als Rohdaten vor (GIFFORD & FOSTER 1996). Unabhängig davon, auf welche Weise
die Daten dokumentiert worden sind, sind sehr selten lückenlose Entwicklungsgänge
aufgezeigt. Demzufolge sollen im Rahmen der vorliegenden Arbeit Untersuchungen
mit modernster morphologischer Methodik zu den beiden Spermatozoid befruchteten
Arten Ginkgo biloba (Ginkogaceae) und Zamia amblyphyllidia (Cycadaceae) anhand
von vollständigen Entwicklungsreihen vorgestellt werden.
1.2.2.
UNTERSUCHUNGEN AN URSPRÜNGLICHEN ANGIOSPERMEN
Die Angiospermen stellen ein bei Weitem intensiver bearbeitete Gruppe dar als die
Gymnospermen. Es gibt unzählige Veröffentlichungen zu anatomischen und morphogenetischen Untersuchungen. Morphologische Arbeiten zu Angiospermen sind dabei
aber oft sehr alt (z.B. GOEBEL 1923). Die aktuelleren Arbeiten auf morphologischer
Ebene befassen sich vornehmlich nicht mehr mit der Histologie oder Morphogenese
verschiedener Organe sondern mit der Expression der für die Organbildung nötigen
Entwicklungsgene und oftmals auch mit den entsprechenden Knock-Out-Mutanten
(ROBINSON-BEERS et al. 1992, KIM et al. 2005, usw.). Ebenso viele Untersuchungen
befassen sich allein mit Gensequenzen, um phylogenetisch verwertbare Aussagen
für Familien (z.B. Azuma et al. 2001) oder sogar für das gesamte Florenreich (z.B.
DOYLE & DONOGHUE 1986) treffen zu können. Dabei ist das Augenmerk entweder auf
Nutzpflanzen oder auf sich schnell reproduzierende Pflanzen gerichtet. Erstere zu
untersuchen kann Perspektiven für eine effektivere wirtschaftliche Nutzung bieten,
EINLEITUNG
9
letztere erfreuen sich zur Untersuchung der reproduktiven Strukturen oder der genetischer Variabilitäten großer Beliebtheit, da ihr Entwicklungszyklus von nur wenigen
Wochen schnelle Ergebnisse fördert.
Da die an der Basis des Stammbaums der Angiospermen stehende Unterklasse der
Magnoliidae weder über einen kurzen Entwicklungszyklus noch über viele nennenswerte Nutzpflanzen verfügt, wurden in den letzten Jahrzehnten keine weitgefächerten
Studien an diesen durchgeführt. Lediglich zur Blütenentwicklung liegen umfangreiche
Werke von ERBAR & LEINS (u.a. 1981, 1983, 1994, 2000) vor. In diesen Arbeiten wird
aber nicht näher auf die Entwicklung der Samenanlage eingegangen, die gerade für
die im Rahmen dieser Arbeit untersuchte Fragestellung von Interesse ist. Innerhalb
der Unterklasse der Magnoliidae sind es insbesondere die Magnoliaceen, die viele
ursprüngliche Merkmale aufweisen. So verfügen sie z.B. über einfache Blätter ohne
Stipeln und einen urtümlichen Aufbau der Blüte mit schraubig angeordneten Tepalen,
Stamen und Karpellen, wobei die beiden letztgenannten in einer nicht festgelegten,
aber immer großen Anzahl vorhanden sind. Die Karpelle entwickeln meist mehrere
Samenanlagen, von denen aber häufig nur eine heranreift. In neueren molekularen
Stammbäumen treten die Amborellales, Nympheales und Illiciales als die basalsten
Ordnungen der Magnoliidae auf (KADEREIT 2002). Aufgrund der Materialverfügbarkeit
im Botanischen Garten Bochum wird in der vorliegenden Arbeit das Augenmerk auf
die Entwicklungsreihe der Samenanlagen von Magnolia stellata (SIEBOLD & ZUCC.)
MAXIM gerichtet. Die Paleoherb-Hypothese von STEBBINS (1974), die besagt, dass an
der Basis der Angiospermen vermutlich krautige Pflanzen gestanden haben, spielt in
diesem Falle keine Rolle, obwohl sie durch die ersten molekulare Stammbäume von
DONOGHUE & DOYLE (1989) untermauert worden sind. 1928 diskutierte ARBER bereits
inhaltlich diese Thematik, die Jahrzehnte später als Paleoherb-Hypothese formuliert
wurde, unter Verweis auf LOTSY (1906) und stellte dabei fest, dass es aufgrund des
langsamen Entwicklungszyklus aber insbesondere die baumförmigen Arten sind, die
dazu tendieren, ursprüngliche Blütenmerkmale zu konservieren. In Einklang damit
sind bei Magnolia stellata zahlreiche als ursprünglich angesehene Merkmale zu
finden und möglicherweise noch weitere zu erwarten.
Die meisten der wissenschaftlichen Arbeiten zu den Magnoliaceen, auf die wir heute
zurückgreifen können, sind älteren Datums und verfügen oft über sehr detailreiche
Zeichnungen, die sich zumeist jedoch auf die Embryologie, die im botanischen Sinne
als Entwicklung des Gametophyten und des Embryos aufgefasst wird, beziehen. Die
für die in dieser Arbeit untersuchte Fragestellung wichtigen Entwicklungsstadien von
Nucellus und Integument sind in diesen Arbeiten nur marginal erwähnt oder gänzlich
unbeachtet geblieben (EARLE 1938, LEINFELLNER 1967, DE BOER & BOUMAN 1972).
Der derzeit aktuellste Artikel stammt von DE-XING XIAO & FENG-XIA XU aus 2006 und
EINLEITUNG
10
dokumentiert die Entwicklung des Makroprothalliums fotografisch. Weitere zahlreiche
Fotografien zur Erforschung der Samenanlagenentwicklung und der Morphologie des
äußeren Integuments sind in einer 1994 veröffentlichten Arbeit von UMEDA, IMAICHI &
KATO enthalten und dienen als Vergleichsbasis für die eigenen Untersuchungen.
Ein zusätzlicher Punkt, der die Familie der Magnoliaceae in Blickfeld des evolutiven
Interesses rücken lässt, ist die Tatsache, dass ihr reifer Same mit seiner fleischigen,
oft intensiv gefärbte Hülle den Samen vieler Cycadeen sehr ähnlich ist, obwohl sich
diese Hüllstruktur nicht aus homologen Strukturen innerhalb der Samenanlage bildet.
Ein ähnliches Endprodukt liefert auch das Epimatium der Podocarpaceae, dessen
Entwicklung bereits mit neusten Methoden studiert wurde (RESTEMEYER 2002, RIEGER
2002). Durch einen Vergleich der Entwicklung der genannten Strukturen, soll geklärt
werden, ob das äußere Integument der Angiospermen möglicherweise einer Struktur
entspricht, die bereits von der Schwestergruppe, den Gymnospermen, bekannt ist.
1.3.
ENTWICKLUNGSGENETISCHE UNTERSUCHUNGEN
Manchmal entstehen morphologische Fragestellungen, bei denen man mit herkömmlichen histologischen und morphologischen Untersuchungsmethoden an die Grenzen
stößt. Hierbei ist es äußerst reizvoll, zu versuchen, ob man mit neuen Methoden, bei
denen die verschiedenen Organstrukturen anhand der für ihre Entwicklung aktiven
Gene verglichen werden, weiter kommt. Auf entwicklungsgenetischer Basis lassen
sich in manchen Fällen Unterscheidungen zwischen Geweben treffen, die hinsichtlich
ihres mikroskopisch erkennbaren Differenzierungsgrades nicht trennbar sind. Diese
Untersuchungsmethode, die auch im Rahmen der vorliegenden Arbeit zum Einsatz
kommt, wird In-situ-Hybridisierung genannt. Mittels der In-situ-Hybridisierung kann
die zeitlich und räumlich begrenzte Expression von Entwicklungsgenen in Gewebeschnitten nachgewiesen werden. Die Methode ist risikobehaftet, da sie nicht ganz
einfach ist. Außerdem verlangt sie, dass bei den Untersuchungen Material verwendet
wird, dass zum richtigen Entwicklungszeitpunkt gesammelt wurde. Allerdings ist es
vorab unmöglich, zu sagen, wann welche Gene exprimiert werden.
1.3.1.
ENTWICKLUNGSGENE UND IHRE WIRKUNGSWEISE
Als Entwicklungsgene werden Gene bezeichnet, die steuernd in einen Entwicklungsprozess eingreifen. Vieler dieser Gene gehören den so genannten Homöobox-Genen
EINLEITUNG
11
an, die schon längere Zeit als verantwortlich für ontogenetische Vorgänge bei Tieren
bekannt sind. Allen Homöobox-Genen ist ein sehr stark konservierter Bereich - die so
genannte Homöobox - gemeinsam, die für die Homöo-Domäne der Homöo-DomänProteine kodiert, die wiederum der DNA-Bindung dient (GEHRING et al. 1994). Hierbei
ist es selten ein einzelnes Gen, das eine spezielle Entwicklung hervorruft, sondern
viel mehr eine Reaktionskaskade, bei der speziell aufeinander abgestimmt Gene
gemeinsam agieren. Sie sind dafür verantwortlich, dass die Zellen eines Individuums,
die alle über das gleiche Erbgut verfügen, dennoch andersartig ausgebildet sind. In
Abhängigkeit von einem Entwicklungsprozess oder vom physiologischen Zustand
einer Pflanze werden die jeweils charakteristischen Gene aktiviert, während andere
Gene reprimiert werden. Eine räumlich und zeitlich differenzierte Genaktivität führt zu
verschiedenartigen Zelltypen, die ihrerseits für die Bildung unterschiedlicher Gewebe
stehen (WEILER 2002).
Ein typisches Beispiel für eine Reaktionskaskade liefern THEISSEN et al. (2000) für die
Blütenbildung beim pflanzlichen Modellorganismus Arabidopsis thaliana (L.) HEYNH.
basierend auf zahlreichen genetische Untersuchungen. Hier sind es fünf nacheinander in Abfolge aktivierte Gene, die benötigt werden, um aus einem undifferenzierten
Meristem Blütenorgane zu bilden. Auf verschiedene Umweltreize hin werden zuerst
Gene, z.B. das Gen LD (LUMINIDEPENDENS), exprimiert, deren Genprodukte die
Expression verschiedener Meristemidentitätsgene zur Bildung des Blütenmeristems
induzieren. Die Transkription der Organidentitätsgene wird erst zwei Schritte später
durch die Produkte der zwischengeschalteten intermediären Gene aktiviert. Organidentitätsgene wirken bei der genetischen Determinierung des Blütenmeristems zu
Petalen und Sepalen (bzw. Tepalen), Stamina und Karpellen oft in Kombination mit
anderen Organidentitätsgenen (siehe auch 1.3.3). Genauer spezifiziert werden diese
Blütenorgane durch die nachgeschalteten so genannten „Downstream genes“, bei
denen es sich wie bei den Organidentitätsgenen um MADS-box-Gene handelt.
1.3.2.
MADS-BOX-GENE
Eine Gruppe der Entwicklungsgene stellen die MADS-box-Gene dar. Sie kodieren für
Transkriptionsfaktoren, die DNA in Form von Proteindimeren binden. Ihre Bezeichnung leitet sich aus dem Akronym der ersten vier Gene ab, die aus dieser großen
Genklasse beschrieben wurden. Es handelt sich dabei um das Gen „MCM1“ aus der
Bäckerhefe Saccharomyces cerevisiae, um „AGAMOUS“ aus Arabidopsis thaliana,
um „DEFICIENS“ aus Antirrhinum majus L., einer Art, die neben A. thaliana häufig für
genetische Untersuchungen an Pflanzen genutzt wird, und um das menschliche Gen
„SRF“, den so genannten Serum Response Factor.
EINLEITUNG
12
MADS-box-Gene treten wie zuvor aufgelistet nicht nur im Pflanzen- sondern auch im
Tierreich und bei den Pilzen auf, so dass davon ausgegangen werden kann, dass sie
sich im Laufe der Evolution vor der Aufspaltung in die einzelnen Stämme entwickelt
haben (THEISSEN et al. 2000). Ein weiteres Indiz für das enorme Alter der MADS-boxGene ist die hoch konservierte ca. 60 Aminosäuren umfassende MADS-Domäne, die
bei allen Vertretern nahe zu identisch ist. Der genaue Ursprung ist jedoch ungewiss.
Sicher ist nur, dass es vor der evolutionären Trennung von Pflanzen und Tieren zu
einer Genverdopplung gekommen sein muss, da es zwei unterschiedliche Typen von
MADS-box-Genen gibt: den „ARG80 – bzw. MEF2-Typ“, der bei Tieren und Pilzen
anzutreffen ist, und den „MIKC-Typ“, der in Pflanzen vorkommt (ALVAREZ-BUYLLA et
al. 2000a). Aufgrund des Vorkommens im gesamten Pflanzenreich sind MADS-boxGene für systematische Analysen gut verwertbar.
Der Name “MIKC-Typ” leitet sich von den aufeinander folgenden Genomabschnitten,
den MADS-, Intervening-, Keratinlike- und C-terminale-Domänen, ab, die über mehr
oder weniger konstante Aminosäurenzahlen verfügen. Die hoch konservierte MADSDomäne ist 57 Aminosäuren lang und bindet DNA sequenzspezifisch. Der MADSDomäne folgt ein kurzer eingeschobener DNA-Abschnitt, die so genannte I-Domäne
(= intervening-domaine), von variabler Länge. Die K-Domäne wiederum, deren Name
sich von der sehr großen Ähnlichkeit mit dem Keratin-Molekül ableitet, umfasst eine
konservierte Region von 70 Aminosäuren. Sie bildet eine amphipatische DNA-Helix,
eine Struktur, die sehr oft in den Aktivierungsdomänen von Transkriptionsfaktoren
enthalten ist. Somit ist anzunehmen, dass die K-Domäne der verbesserten ProteinProtein-Interaktion dient. Beim letzten Abschnitt, der C-terminalen-Domäne handelt
es sich um eine Aminosäurenfolge, die sowohl in der Länge als auch in der Sequenz
sehr stark zwischen verschiedenen MADS-box-Genen variiert (PURRUGGANAN et al.
1995). In Abbildung 2 ist ein MADS-box-Gen des in Pflanzen vorkommenden MIKCTyps schematisch dargestellt.
MADS
-Domäne
“Intervening”
-Region
Keratinähnlicher
Abschnitt
C-terminales
Ende
20 As
Abb. 2: Schematische Darstellung eines MADS-box-Gens des MIKC-Typs
EINLEITUNG
1.3.3.
13
DAS ABC-MODELL
MADS-box-Gene sind nahezu überall in Pflanzen vorzufinden (ALVAREZ-BUYLLA et al.
2000b), nehmen aber eine besondere Rolle bei der Blütenbildung ein. MEYEROWITZ et
al. erforschten dies zu Anfang der 90er Jahre anhand von Knock-out-Mutanten an
Arabidopsis thaliana, der Modellpflanze der Pflanzengenetik. Sie stellten fest, dass
sich die MADS-box-Gene in unterschiedliche Funktionsklassen (A-, B- und C-MADSbox-Gene) untergliedern lassen, die für die unterschiedlichen Organidentitäten der
einzelnen Wirtel innerhalb einer Angiospermen-Blüte stehen (COEN & MEYEROWITZ
1991). Bei einer Ausschaltung der A-Funktion entstehen Pflanzen mit deformierten
Petalen und Sepalen. Wird die B-Funktion unterdrückt, sind die mittleren Blütenwirtel
betroffen, d.h. Petalen werden zu Sepalen und Stamina zu Karpellen umgewandelt.
Der Verlust der C-Funktion betrifft die generativen Strukturen, so dass im Zentrum
der Blüte anstelle von Stamina und Karpellen Petalen und Sepalen stehen. Aufgrund
der allgemein bekannten so genannten „gefüllten Blüten“ ist dieser Funktionsverlust
der prominenteste. Die in Abbildung 3 gezeigten Knock-out-Mutanten zu A. thaliana
sind einer Veröffentlichung von RIECHMANN & MEYEROWITZ (1997) entnommen.
Abb. 3:
Knock-out-Mutanten (MADS-box-Gene) von Arabidopsis thaliana (L.) HEYNH. (aus:
RIECHMANN & MEYEROWITZ, 1997, www.its.edu)
ap1-1: Knock-out-Mutante der A-Funktion; pi-1: Knock-out-Mutante der B-Funktion; ag-1: Knockout-Mutante der C-Funktion
Anhand von Doppelmutanten lassen sich eindeutige Rückschlüsse ziehen, welche
der A-, B- und C-Funktionen in welcher Kombination die Entwicklung der einzelnen
Blütenorgane steuern. Die alleinige Expression von MADS-box-A-Genen ist für die
Bildung von Sepalen zuständig. MADS-box-A-Gene in Kombination mit MADS-boxB-Genen führen zur Bildung von Tepalen. Werden in einem Blütenwirtel neben den
B-Genen auch die MADS-box-C-Gene eingeschaltet, so entstehen Stamina. Für die
EINLEITUNG
14
Bildung von Karpellen ist lediglich die C-Funktion zuständig (WEIGEL & MEYEROWITZ
1994). Über die MADS-box-C-Gene hinaus sind weitere Gene, die D-Funktionsgene,
unabdingbar, um die Entwicklung der Samenanlagen zu steuern (MODRUSAN et al.
1994, COLOMBO et al. 1995), so dass das von COEN & MEYEROWITZ (1991) erstellte
Schema zu den Wirkorten der verschiedenen MADS-box-Gen-Funktionen ergänzt
werden kann (Abb. 4). THEISSEN (2000) fügt diesem Modell eine weitere Funktion
hinzu, die E-Funktion, die an der Entwicklung der Organe der inneren Blütenwirtel
mitwirkt, d.h. die B-, C- und D-Funktion unterstützt.
Sepalen
A
Tepalen Stamina Karpelle
Samenanlagen
A
B
B
C
C
C
D
Abb. 4: Schema zur Funktion der MADS-box-Gene innerhalb der Angiospermen-Blüte
1.3.4.
DIE ÜBERTRAGUNG DES ABC-MODELLS AUF DIE GYMNOSPERMEN
Das oben dargestellte ABC-Modell zur Genregulierung der Blütenentwicklung durch
MADS-box-Gene basiert auf zahlreichen Untersuchungen vor allem an den Modellpflanzen Arabidopsis thaliana und Antirrhinum majus und bezieht sich somit auf eine
klassische Angiospermen-Blüte. Da molekulargenetische Untersuchungen an MADSbox-Genen auf eine evolutive Trennung von Angiospermen und Gymnospermen vor
bereits rund 300 Millionen Jahren (BECKER et al. 2000, ZHANG 2004) hinweisen, ist
anzunehmen, dass die genannten Gene in ihrer getrennten Weiterentwicklung einen
Funktionswandel vollzogenen haben, der die stark abweichende Morphologie von
Angiospermen- und Gymnospermen-Blüte bedingt. Aufgrund der langen getrennten
Entwicklung und der abweichenden Morphologie ist nicht zwangsläufig zu erwarten,
dass die bei Angiospermen gefundenen Gene in gleicher Form bei Gymnospermen
anzutreffen sind. Aus diesen Gründen ist eine direkte Übertragung des ABC-Modells
auf die Gymnospermen unmöglich. Erschwerend kommt hinzu, dass sich die größte
Zahl der molekulargenetischen Arbeiten zu Gymnospermen mit der Phylogenie und
Systematik dieser Gruppe beschäftigt und sich daher mit den dafür typischerweise
EINLEITUNG
15
genutzten Genen befasst. GADEK et al. (2000) z.B. verwenden die Chloroplastengene
matK und rbcL für die Klärung der verwandtschaftlichen Beziehungen innerhalb der
Cupressaceae s.l., WANG et al. (2000) bedienen sich u. a. des mitochondrialen nad5Gens zur systematischen Analyse der Pinaceen.
Die ersten Untersuchungen zu den bei Angiospermen entdeckten Blütenidentitätsgenen an Gymnospermen zeigen, dass auch Gymnospermen über MADS-box-Gene
verfügen, die sich anhand von Sequenzvergleichen den bekannten Gen-FunktionsKlassen der Angiospermen zuordnen lassen. Da es von der Samenkeimung bis zur
ersten Zapfenbildung bei Gymnospermen fünf bis 30 Jahre dauern kann, können die
gefundenen MADS-box-Gene anders als bei Arabidopsis nicht innerhalb von wenige
Jahre andauernden Forschungsprojekten über Knock-out-Mutanten auf ihre Funktion
hin untersucht werden. Daher wird hier oftmals auf die Methode der Real-time-PCR
zurückgegriffen, mittels der man eine quantitative Aussage über die in den einzelnen,
präparierten Pflanzenteilen exprimierten Gene treffen kann (FUKUI et al. 2001, JAGER
et al. 2003). Eine andere Möglichkeit bietet die experimentelle Herstellung von transgenen Arabidopsis-Pflanzen mit den Genen, die bei Gymnospermen isoliert worden
sind. Die Mutationen an den transgenen Pflanzen lassen Rückschlüsse auf die GenFunktionen zu (SUNDSTRÖM & ENGSTRÖM 2002).
Die präzise Lokalisierung des Wirkortes der isolierten Gene erfolgt mittels der in der
Angiospermenforschung weit verbreiteten In-situ-Hybridisierung. Diese Methode ist
für Gymnospermen wegen des Vorhandenseins von sekundären Pflanzenstoffen in
der Handhabung wesentlich problematischer. Trotz allem wurden derartige Versuche
an mehreren Taxa der Pinaceen, u.a. Pinus radiata D.DON. (MOURADOV et al. 1998 &
1999), Picea mariana (MILL.) BR., ST. & PB. (RUTLEDGE et al. 1998) und Picea abies
(L.) KARST (TANDRE et al 1998, SUNDSTRÖM et al. 1999, CARLSBECKER 2004), sowohl
an vegetativen als auch an generativen Knospen durchgeführt. Außer den Pinaceen
sind beispielsweise die Gnetaceae Gnetum gnemon L. (WINTER et al. 1999, BECKER
2000) und die Cycadaceae Cycas edentata DE LAUB. (ZHANG et al. 2004) mittels der
In-situ-Hybridisierung bearbeitet worden. Bei der letztgenannten Art, der ursprünglichen Gymnospermen Cycas edentata, sind bisher nur die männlichen reproduktiven
Strukturen und die reifen Samen untersucht worden. In der Entwicklung befindliche
weibliche Zapfen sind insbesondere in den jungen Stadien sehr schwer zugänglich
und werden pro Individuum nur in sehr geringer Zahl oder sogar in Einzahl gebildet.
Dies erklärt, dass eine Untersuchung der weiblichen reproduktiven Strukturen in ihrer
Entwicklung noch aussteht.
EINLEITUNG
1.4.
16
ZIEL DER ARBEIT
Das Ziel der Arbeit ist es, ein schlüssiges Modell zur Evolution der Samenanlage und
insbesondere des Integuments zu entwickeln. Ein solches Modell darf sich nicht wie
die klassischen Modelle auf eine formale Ableitung von verschiedenen Phänotypen
beschränken, sondern muss im Sinne eines gradualistischen Darwinismus die kontinuierliche Funktionsveränderung einer Struktur mit einbeziehen. Zu diesem Zweck
werden morphologische Studien an Gymnospermen durchgeführt und mit den bereits
vorliegenden Arbeiten zu Gymnospermen wie auch Untersuchungen an Angiospermen verglichen, um anhand der Unterschiede und Gemeinsamkeiten Rückschlüsse
auf die Entstehung und Funktion des Integuments ziehen zu können. Um mehr Licht
ins Dunkel der Evolution zu bringen, werden darüber hinaus fossile Funde eingehend
studiert und von den herkömmlichen Modellvorstellungen losgelöst interpretiert. Ein
besonderer Schwerpunkt wird hierbei auf die Funktion der jeweiligen Strukturen und
ihren Funktionswandel gelegt.
Anhand von entwicklungsgenetischen Studien an ausgewählten Gymnospermen soll
überprüft werden, welche Teile des Modells zur Blütenentwicklung der Angiospermen
auf ihre Schwester- und Ausgangsgruppe, die Gymnospermen, übertragbar sind. Die
Untersuchungen sollen zudem Klarheit verschaffen, ob es sich um Gene gleichen
Ursprungs handelt, die bei Gymnospermen und Angiospermen die Entwicklung der
generativen Strukturen steuern, oder ob unabhängig voneinander Gene mit ähnlicher
Funktion und Struktur im Laufe der Evolution entstanden sind. Dies kann zur Klärung
der Homologie der Samenanlagen von Gymnospermen und Angiospermen beitragen, die bislang unkritisch als gegeben angenommen wird und den Morphologen als
Basis zur systematischen Einordnung beider Gruppen zu den Spermatophyten dient.
Auch der genetisch arbeitende Taxonom fasst sie aufgrund von Chlorplasten-Genen
als Monophylum zusammen. Das macht die Homologie plausibel, ohne sie jedoch zu
beweisen.
Ein umfassenderes Wissen über die Wirkungsweise von MADS-box-Genen bei Gymnospermen wird dabei helfen zu erkennen, ob die Gennetzwerke ebenso komplex
sind wie bei Angiospermen. Darüber hinaus soll durch den zeitlichen und räumlichen
Aktivitätsnachweis von einem speziellen Blütenentwicklungsgen, dem MADS-box-CGen, ein Nachweis über die Gewebespezifität des Integuments der Samenanlage
der Gymnospermen gewonnen werden, um über die entwicklungsgenetische Klärung
der Integumentbildung Rückschlüsse auf die Evolution dieser bedeutenden Struktur
ziehen zu können. Die hierfür notwendige Methode der In-situ-Hybridisierung ist für
den Lehrstuhl Evolution und Biodiversität der Pflanzen der Ruhr-Universität Bochum
EINLEITUNG
17
gänzlich neu. Aufgrund dessen, dass die bei Gymnospermen meist in recht großer
Menge vorhandenen sekundären Pflanzenstoffe - vielfach phenolische Verbindungen
- schon bei einfacheren histochemischen Verfahren äußerst störend sein können, ist
bereits schon vor der Entscheidung für die Anwendung der In-situ-Hybridisierung klar
gewesen, dass die etablierten Protokolle für Arabidopsis thaliana und andere Modellorganismen der Angiospermen nicht direkt auf die Gymnospermen übertragbar sein
würden. Daher ist nicht allein die Etablierung der Methode der In-situ-Hybridisierung
am Lehrstuhl ein Arbeitsziel, sondern vor allem die Entwicklung eines Protokolls, das
zu reproduzierbaren Ergebnissen führt. Größe und Generationsdauer bringen dabei
Schwierigkeiten mit sich, die analog zu denen zu sehen sind, die entstünden, wenn
das zoologische Forschungsobjekt für Entwicklungsgenetik nicht Drosophila sondern
ein Elefanten wäre.
MATERIAL UND METHODEN
18
2.
MATERIAL UND METHODEN
2.1.
HISTOLOGISCHE UNTERSUCHUNGEN
2.1.1.
FIXIERUNG DES PFLANZENMATERIALS
Das Pflanzenmaterial wurde nach der Probenentnahme zum besseren Eindringen
der Fixierlösung und der Reduktion des Probenvolumens soweit wie möglich bis zur
zu untersuchenden Struktur frei präpariert und unverzüglich in FAA, einem FormalinEthanol-Eisessig-Gemisch, für drei Tage fixiert. Größere Objekte mit einem Volumen
von mehr als einem halben Kubikzentimeter wurden für wenigstens fünf Tage im
Fixativ belassen. 100 ml dieses Fixatives setzen sich wie folgt zusammen:
Ethanol 70 %
90 ml
Eisessig (99-100%ige Essigsäure)
5 ml
Formalin 40 %
5 ml
Zur Lagerung der Proben nach der Fixierung erfolgte die Überführung des Materials
in 70%iges Ethanol. Die gegebenenfalls weiteren Präparationen der Proben für die
folgenden Untersuchungen wurden in 70%igem Ethanol unter Zuhilfenahme eines
Stereomikroskops der Firma ZEISS (Stemi SV11) bei bis zu 40facher Vergrößerung
durchgeführt.
2.1.2.
LICHTMIKROSKOPISCHE UNTERSUCHUNGEN
Für die histologischen Untersuchungen sind Serienschnitte in Paraffintechnik erstellt
worden. Die dazu notwendige Entwässerung der zu untersuchenden Objekte erfolgte
in zwei Schritten, sofern die Proben nicht bereits in 70%igem Ethanol lagerten:
Ethanol 70 %
kurz spülen
Ethanol 70 %
mindestens 24 Stunden
Bei der schrittweisen Überführung der Proben in HISTOWAX (HISTOLAB PRODUCTS
AB) nach GERLACH (1984) dient Tertiäres Butanol als Intermedium. Da der Schmelzpunkt von Tertiärem Butanol bei 25°C liegt, wurden die Proben in einem auf 37°C
temperierten Wärmeschrank für je mindestens 24 Stunden in den unten aufgeführten
Lösungen gelagert. Dabei diente der in Lösung IV vorhandene Farbstoff Eosin der
MATERIAL UND METHODEN
19
Anfärbung der Objekte, damit diese während der folgenden Schritte im Wachs
besser sichtbar waren und sich somit im weiteren Arbeitsverlauf besser handhaben
ließen. Im Verlauf des späteren Färbevorgangs ist das Eosin durch Alkohol wieder
vollständig herausgelöst worden. 100 ml der zur Überführung benötigten Lösungen
setzen sich wie in untenstehender Tabelle aufgelistet zusammen:
Lösung I
Lösung II
Lösung III
Lösung IV
Lösung V
Lösung VI
Tertiäres Butanol
abs. (in ml)
Ethanol (96 %)
vergällt (in ml)
Aqua dest.
(in ml)
Eosin
20
35
55
100
100
100
50
50
45
-
30
15
-
ja
-
Die in reines Tertiäres Butanol überführten Proben wurden zusammen mit diesem
Intermedium in Glasbehälter mit Deckeln übertragen und die Glasbehälter dann mit
HISTOWAX-Kügelchen (HISTOLAB PRODUCTS AB) aufgefüllt. Damit das HISTOWAX
(Schmelzpunkt bei ca. 58°C) in die Proben eindringen konnte, wurden sie zugedeckt
zwei bis drei Tage in einem an das Abluftsystem angeschlossenem Wärmeschrank
bei 63°C gelagert. Anschließend sind die Proben mit abgenommenem Deckel für
weitere zwei bis drei Tage im Wärmeschrank belassen worden, um das gesundheitsschädliche Tertiäre Butanol vollständig verdampfen zu lassen.
Anschließend erfolgte das Einbetten der Objekte in Wachs (GERLACH 1984). Das
Wachsblöckchen wurde nach dem Erkalten um das einzelne Objekt herum zu
gleichmäßig-parallelkantigen Quadern geschnitten, die auf kleine Holzblöcke als
Halterung aufgeschmolzen worden sind. Die Holzblöcke wurden anschließend in ein
Rotationsmikrotom MOD 1130/Biocut (REICHERT-JUNG) mit automatischem Objektrückzug eingespannt. Mittels des Mikrotoms wurden von den Objekten 7-10 µm dicke
Serienschnitte angefertigt. Das Aufkleben der erhaltenen Schnittbänder auf Objektträger mit Eiweißglycerin erfolgte nach MAYR (aus GERLACH 1984). Bevor die Schnitte
gefärbt werden konnten, mussten sie für einige Stunden in einem Wärmeschrank bei
40°C auf den Objektträgern antrocknen.
Das Färben der Serienschnitte erfolgte mittels der Safranin-Astrablau-Färbung nach
GERLACH (1984). Zum Entparaffinieren ist allerdings anstelle von Histol das weniger
MATERIAL UND METHODEN
20
intensiv nach Orange riechende ROTICLEAR (ROTH) verwendet worden. Als erstes
wurden die Schnitte in einer absteigenden Alkoholreihe auf die Färbung in wässriger
Lösung vorbereitet:
Roticlear I
10 Minuten
Roticlear II
10 Minuten
Roticlear/Isopropanol abs. (1:1)
5 Minuten
Isopropanol abs.
5 Minuten
Ethanol 96 %
5 Minuten
Ethanol 70 %
2 Minuten
Ethanol 50 %
2 Minuten
Aqua dest.
2 Minuten
Die Zusammensetzung der Safranin- und Astrablau-Lösungen in der nun folgenden
Färbung entspricht mit einer Ausnahme den Lösungen A und B bei GERLACH (1984):
abweichend von der Rezeptur bei GERLACH ist der Lösung B, d.h. der Färbelösung
Astrablau, zur Vermeidung von Pilzinfektionen eine Messerspitze Phenol zugesetzt
worden. Die verwendete Safranin-Lösung färbt die DNA und verholzte Zellwände, die
viel Lignin eingelagert haben, rot an. Der Farbstoff Astrablau hingegen bewirkt eine
Blaufärbung reiner Cellulosewände.
Astrablau-Lösung
5 Minuten
Aqua dest.
kurz spülen
Aqua dest.
kurz spülen
Aqua dest.
kurz spülen
Safranin-Lösung
5 Minuten
Aqua dest.
kurz spülen
Aqua dest.
kurz spülen
Aqua dest.
kurz spülen
Die zunächst überfärbten Serienschnitte wurden anschließend nach Augenmaß mit
stark verdünnter Salzsäure differenziert:
Aqua dest. + 20 Tropfen HCl (5 %)
kurz spülen
Um die differenzierten Schnitte auf das Eindeckeln vorzubereiten mussten sie wieder
entwässert und in ROTICLEAR überführt werden:
MATERIAL UND METHODEN
21
Ethanol 70 %
kurz spülen
Ethanol 96 %
kurz spülen
Isopropanol abs.
2 Minuten
Roticlear IV
5 Minuten
Roticlear V
5 Minuten
Roticlear VI
5 Minuten
Für die Erstellung von Dauerpräparaten wurden die Objektträger mit den safraninastrablau-gefärbten Serienschnitten mit ENTELLAN NEU (MERCK) bedeckt und unter
Vermeidung von Luftblässchen mit Deckgläsern eingedeckt.
Die Untersuchung der erstellten Dauerpräparate erfolgte mit einem Lichtmikroskop
Axioplan der Firma ZEISS in Hellfeld-Durchlicht-Mikroskopie. Die Ergebnisse wurden
über eine daran angeschlossene Digitalkamera ColorView (SOFT IMAGING SYTEMS)
fotografisch dokumentiert. Da jedoch viele Objekte die Größe des Kameraausschnitts
überschritten, war eine Montage aus bis zu 36 Einzelbildern mittels der Anwendung
MIA (Multiple Image Alignment) des speziell für Bildbearbeitung und Bildverwaltung
ausgelegten Computerprogramms analySIS der Firma SOFT IMAGING SYSTEM DIGITAL
erforderlich.
2.1.3.
RASTERELEKTRONENMIKROSKOPISCHE UNTERSUCHUNGEN
Zur Vorbereitung auf die Rasterelektronenmikroskopie wurden die Objekte mittels
der Critical-Point-Trocknung nach GERSTERBERGER & LEINS (1978) getrocknet. Dazu
wurde das präparierte Material zunächst für mindestens 24 h in FDA (FormaldehydDimethylacetat) chemisch entwässert. FDA dient bei der Critical-Point-Trocknung als
ein Intermedium und wird im Verlauf der Trocknung gegen das bei der Trocknung
eingesetzte CO2 ausgetauscht, das im Critical-Point-Dryer CPD 030 (BALZERS) bei 50
bar und 10°C im flüssigen Aggregatzustand vorliegt. Im weiteren Verlauf der CriticalPoint-Trocknung wird bei 73.8 bar und 31°C der kritische Punkt für das Medium CO2
erreicht und ein direkter Übergang vom flüssigen zum gasförmigen Aggregatzustand
findet statt. Der direkte Phasenübergang verhindert Schrumpfungsartefakte wie sie
bei einer Trocknung z.B. in einem Wärmeofen entstehen würden. Um ein Zerbersten
der Proben bei plötzlicher Abnahme des extremen Innendrucks in der Trocknungskammer zu verhindern, wird das das CO2 langsam kontinuierlich abgelassen.
Die getrockneten Präparate wurden abhängig von ihrer Größe entweder mit Leit-C
(NEUBAUER) oder Leit-Tabs (PLANO) auf massive Aluminiumzylinder aufgeklebt. Um
MATERIAL UND METHODEN
22
für die Rasterelektronenmikroskopie ein Abfließen der Elektronen zu gewährleisten,
wurden die Objekte mittels eines Sputtergerätes SCD (BALZERS) hauchdünn mit Gold
besputtert. In der Regel beträgt die Besputterungsdauer zwischen drei und fünfzehn
Minuten. Eine dreiminütige Besputterung ist beispielsweise bei kleinen und wenig
strukturierten Objekten wie den jungen Stadien von Zamia amblyphyllidia D.W. STEV.
ausreichend gewesen, wohingegen ältere Entwicklungsstadien derselben Art bis zu
fünfmal länger besputtert werden mussten.
Die Durchführung der rasterelektronenmikroskopischen Untersuchung der wie oben
beschrieben vorbereiteten Objekte erfolgte mittels des über die Sekundärelektronendetektor-Technologie verfügenden Rasterelektronenmikroskops DSM 950 der Firma
ZEISS. Die Ergebnisse wurden digital mit Hilfe des Programms DIPS (DIGITAL IMAGE
PROCESSING SYSTEM 2.2) erfasst. Die Aufnahmen erfolgten bei einer Auflösung von
2000x2000 Pixel.
2.1.4.
DIGITALE DOKUMENTATION
Die für diese Arbeit erstellten digitalen Fotos sowohl vom Habitus der untersuchten
Pflanzen als auch von Pflanzenteilen im Detail sind entweder mit einer Digitalkamera
COOLPIX 990 der Firma NIKON oder mit einer Digitalkamera PowerShot S2 IS der
Firma CANON und der dazugehörenden Software aufgenommen und aufgearbeitet
worden. Für einige Detailaufnahmen wurden die Objekte unter der Stereolupe Stemi
SV 11 (ZEISS) mit angeschlossener Digitalkamera Colorview (SOFT IMAGING SYSTEMS)
abfotografiert. Diese Aufnahmen wie auch die Aufnahmen der lichtmikroskopischen
und rasterelektronenmikroskopischen Untersuchungen sind mit Hilfe des Computerprogramms Adobe Photoshop 7.0 zu Bildtafeln zusammengestellt und beschriftet
worden.
MATERIAL UND METHODEN
2.2.
ENTWICKLUNGSGENETISCHE UNTERSUCHUNGEN
2.2.1.
MOLEKULARBIOLOGISCHE VORARBEITEN
23
Das Ziel der entwicklungsgenetischen Untersuchungen ist die Durchführung einer Insitu-Hybridisierung. Hierzu ist vorab die Synthetisierung einer Hybridisierungs-Sonde
erforderlich. Die hierfür nötigen grundlegenden Arbeitsschritte sind mit der Methode
dargestellt, die sich im Laufe der Versuche als die erfolgreichste heraus gestellt hat.
2.2.1.1. IN-SILICO-ANALYSE UND PRIMERDESIGN
Der Begriff „In-silico-Analyse“ beschreibt als Überbegriff sowohl die Sequenzsuchen
im Internet als auch die Computerprogramm gestützten Verarbeitungen dieser, die
letztendlich als Hilfsmittel zum Design von Oligo-Nukleotid-Primern genutzt werden.
Die für diese Arbeit verwendeten Sequenzen zu MADS-box-C-Genen von wenigen
Gymnospermen und zahlreichen Angiospermen stammen aus der Datenbank des
„National Center for Biotechnology Information“ (NCBI). Unter der Web-Adresse http:
//www.ncbi.nlm.nih.gov/ ist ein freier Zugriff auf alle Sequenzen möglich.
Die Sequenzen sind mit dem Programm BIOEDIT Version 7.0.1. aligniert worden. Aus
den Bereichen mit den am deutlichsten übereinstimmenden Gensequenzen sind die
Oligo-Nukleotid-Sense- und Anti-Sense-Primer gewählt worden. Ebenfalls in dieses
Alignment eingebaut wurden die mir von Dr. Francisco Vergara-Silva zur Verfügung
gestellten Primer. Die Primer wurde von der MWG BIOTECH AG (Web-Adresse: http://
www.mwg-biotech.com) synthetisiert.
2.2.1.2. RNA-ISOLIERUNG UND CDNA-SYNTHESE
Für die Isolierung der RNA aus pflanzlichem Gewebe wird extrem frisches Material
benötigt, das möglichst frei von RNasen ist. Hierzu erfolgte die Materialentnahme
und die erforderliche Präparation mit sterilem Werkzeug, gefolgt vom sofortigen
Schockgefrieren in flüssigem Stickstoff um die RNase-Aktivität einzudämmen. Das
Pflanzenmaterial wurde in einem Mörser unter Zugabe von flüssigem Stickstoff
gemörsert. Anschließend wurde aus den nun mechanisch aufgeschlossenen Zellen
unter Zuhilfenahme des „RNeasy Plant Mini Kit“ der Firma QUIAGEN die Gesamt-RNA
isoliert.
Um in den folgenden Schritten mit stabilerer DNA arbeiten zu können wurde die RNA
unter Zuhilfenahme des „3´RACE System for Rapid Amplification of cDNA Ends“Kits von INVITROGEN in cDNA umgeschrieben.
MATERIAL UND METHODEN
24
2.2.1.3. NESTED PCR
Bei der so genannten „nested PCR“, der verschachtelten Polymerase Kettenreaktion,
werden zwei verschiedene Primer-Paarungen in zwei aufeinander folgenden PCRSchritten genutzt, um ein spezifischeres Ergebnis zu erzielen. Im Rahmen dieser
Arbeit wurden im ersten PCR-Schritt unspezifische, degenerierte Primer für MADSbox-Gene im Allgemeinen eingesetzt. Das Ergebnis dieser PCR mit Temperaturgradienten im Thermocycler PCRExpress (HYBAID) diente als Grundlage für die darauf
folgende PCR, bei der nun spezifischere, degenerierte Primer für MADS-box-C-Gene
zum Einsatz gekommen sind. Diese Verfahrensweise wurde mehrfach abgewandelt,
um das Ergebnis immer wieder zu optimieren. Das Basisprotokoll für einen PCRAnsatz sieht folgendermaßen aus:
Puffer:
5,0 µl
MgCl2:
3,0 µl
H20:
36,5 µl
Forward Primer:
1,0 µl
Reverse Primer:
1,0 µl
dNTPs:
1,0 µl
cDNA:
2,0 µl
taq:
0,5 µl
Die für alle im Rahmen dieser Arbeit durchgeführten PCRs eingesetzten Substanzen
MgCl2, dNTP-Mixe, Puffer und Taq-Polymerasen stammen sowohl von der Firma
INVITROGEN als auch von PROMEGA. Von letztgenanntem Anbieter wurden ebenfalls
die aufeinander abgestimmten „5X Green GoTaq Reaction Buffer“ bzw. „5X Green
GoTaq Flexi Reaction Buffer“ in Kombination mit der „GoTaq DNA Polymerase“
verwendet.
2.2.1.4. GELELEKTROPHORESE
Die Gelelektrophorese dient der Auftrennung der in einer PCR amplifizierten DNAFragmente die durch die Einlagerung von Ethidiumbromid unter UV-Licht im Gel
sichtbar werden. Hierzu wurde aus TBE-Puffer und Agarose ein 1%iges Agarosegel
hergestellt, auf das die PCR-Proben vermischt mit einem Ladepuffer (Bromophenol
Blue Loading Solution, PROMEGA) sowie einem Marker (Gene RulerTM 100bp DNALadder Plus, FERMENTAS) für die Fragmentlängenbestimmung aufgetragen worden
sind. Die Laufzeit der Gelelektrophorese betrug bei 100 V und 175 mA ungefähr 20
bis 30 Minuten.
MATERIAL UND METHODEN
25
2.2.1.5. AUFREINIGUNG DER DNA
Bevor die aus einer PCR gewonnene DNA für weitere Versuche eingesetzt werden
kann, muss sie aus dem Gel herausgelöst und aufgereinigt werden. Die mit einem
sterilen Skalpell aus dem Gel ausgeschnittenen Banden gewünschter Fragmentlänge
wurden in mehreren Zentrifugationsschritten aufgereinigt und behandelt, so dass die
PCR-Fragmente anschließend in H2O gelöst vorlagen. Die Aufreinigungen wurden
unter Verwendung der beiden Kits „QIAquick Gel Extraction Kit (50)“ von QUIAGEN
und „Wizard SV Gel and PCR Clean-Up System“ von PROMEGA durchgeführt.
2.2.1.6. KLONIERUNG
Die Klonierung dient der exponentiellen Vermehrung der aufgereinigten DNA-Fragmente. Dazu wurden die gewünschten DNA-Fragmente in ein Plasmid, einen so
genannten Vektor (pGEM-T Easy, PROMEGA), ligiert. Die ligierten Plasmide wiederum
wurden in kompetente Escherichia coli-Zellen (Stamm JM 109) transformiert. Die
Transformierungen wie auch die vorangegangene Ligationen sind entsprechend der
Anleitung des Kits „pGEM-T und pGEM-T Easy Vector Systems“ der Firma PROMEGA
vorgenommen worden.
Bevor die E. coli-Zellen ausplattiert worden waren, sind sie für 1,5 Stunden bei 37°C
in 950 µl LB-Medium angewachsen. Von dieser Lösung wurden 100 ml und 200 ml
abgenommen und auf zwei LB+X-Gal-Platten verteilt, auf denen die Bakterien für
einige Tage bei 37°C weiter gewachsen sind. Da die Insertionsstelle im lacZ-Gen des
aufgenommen Plasmids liegt, ist bei den ein Insert enthaltenden Bakterienkolonien
der X-Gal-Abbau gestört und sie verfärben sich anders als die Bakterienkolonien mit
intakter ∃-Galactosidase nicht blau, sondern bleiben weiß.
Die weißen, Insert enthaltenden Kolonien wurden von den Platten gepickt, um zum
einen Mittels der M13-PCR (siehe 2.2.1.7.) die Länge der aufgenommen Inserts zu
bestimmen und zum anderen die für die PCR gepickten Kolonien für die Plasmidisolierung zu kultivieren. Die Kultivierung erfolgte durch Inkubation der Kolonien in
300 µl - 600 µl LB+AMP-Nährmedium unter Schütteln im Wärmeschrank bei 37°C.
2.2.1.7. M13-PCR UND PLASMIDCHARAKTERISIERUNG
Bei der M13-PCR setzt man ein spezielles Primer-Paar ein, das vor und hinter der
Insertionsstelle im Plasmid ansetzt und somit während der PCR nur das Insert und
einen kurzen, definierten Bereich des Plasmid-Genoms vervielfältigt. Die Sequenzen
der im Rahmen der vorliegenden Arbeit genutzten Primer lauten zum einen für den
MATERIAL UND METHODEN
26
M13-forward-Primer 5`-GTTTTCCCAGTCACGAC-3´ und zum anderen für den M13reverse-Primer 5`-CAGGAAACAGCTATGAC-3`. Pro gepickter Kolonie ist folgender
Ansatz pipettiert worden:
Puffer:
3 µl
MgCl2:
3 µl
H20:
13 µl
dNTPs:
2 µl
M13_for:
3 µl
M13_rev:
3 µl
taq-Polymerase:
1 µl
gelöste Bakterien:
2 µl
(bei direktem Lösen der gepickten Kolonien
im PCR-Ansatz Zugabe von 2 µl H2O)
Als Plasmidcharakterisierung bezeichnet man eine PCR mit einem Mix kurzer Primer,
die bei unterschiedlichen Klonen an unterschiedlichen Stellen im Genom ansetzten,
so dass sich unterschiedliche Bandenmuster im Gel ergeben. Läuft parallel ein
bereits sequenziertes Insert im Gel mit, ist durch einen Abgleich der Bandenmuster
eine Schlussfolgerung auf die Gensequenz der einzelnen Klone insofern möglich, als
das sich sagen lässt, ob einer der unbekannten Klone dasselbe Insert wie der schon
bekannte Klon enthält. Pro Klon wurde folgender PCR-Ansatz zusammengestellt:
Puffer:
3 µl
MgCl2:
3 µl
H20:
15 µl
dNTPs:
2 µl
Primer-Mix:
5 µl
Plasmid-DNA:
1 µl
taq:
1 µl
2.2.1.8. ISOLIERUNG DER PLASMID-DNA
Die Isolierung der Plasmid-DNA aus den Klonen mit gewünschter Fragmentlänge
bzw. Bandenmuster erfolgte mit Hilfe des „NucleoSpin 96 Plasmid Kits“ (MACHERREYNAGEL) und des Kits „Wizard Plus SV Minipreps DNA Purification System“ der Firma
PROMEGA unter geringfügigen Abwandlung wie z.B. einer verlängerten Inkubationszeit zur Bindung an die Membranen.
MATERIAL UND METHODEN
27
2.2.1.9. DNA-FÄLLUNG UND SEQUENZIERUNG
In Anschluss an die so genannte Miniprep wurde die erhaltene DNA-Menge über die
Extinktionsmessung bei den Wellenlängen 260 nm für die DNA-Konzentration und
280 nm für den Reinheitsgrad der Probe mit einem Extinktionsmessgerät der Firma
EPPENDORF (Biophotometer) ermittelt.
Für die DNA-Fällung werden 2 µg mit wie folgt zusammen pipettiert und bei -20°C für
2 Stunden gelagert:
Natriumacetat
1/10-tel Volumen der DNA
EtOH p.a., -20°C
2,5-fache Volumen der DNA
Anschließend ist für 30 Minuten bei 4°C zentrifugiert und der Überstand verworfen
worden. Nach der Zugabe von 600 µl bis 1000 µl 70%igen Ethanol auf Eis wurde für
weitere 5 Minuten zentrifugiert, der Überstand verworfen und die Probe im Wärmeschrank für etwa 20 Minuten zum Trocknen belassen.
Zur Sequenzierung wurde die gefällte DNA an die MWG BIOTECH AG (Web-Adresse:
http://www.mwg-biotech.com) geschickt, von wo die Ergebnisse der Sequenzierung
per E-Mail übermittelt worden sind. Die erhaltenen Sequenzen werden mit bekannten
Sequenzen aus der Datenbank des „National Center for Biotechnology Information“
(Web-Adresse: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/) abgeglichen. Die vom „NCBI“ erstellten
Stammbäume ermöglichen zudem eine Einordnung zu übergeordneten Gengruppen.
2.2.1.10. SYNTHETISIERUNG DER SONDE
Basierend auf den Sequenzierungsergebnissen wurde das PCR-Produkt der M13PCR eines Klons als Template für die Synthetisierung der Sonde eingesetzt. Vorab
wurde anhand einer Extinktionsmessung im Extinktionsmessgerät Biophotometer der
Firma EPPENDORF die einzusetzende Menge an DNA ermittelt. Es wurden zwei
Ansätze pipettiert: zum einen der Sonden-Mix mit der T7-Polymerase, zum anderen
der Kontrollen-Mix mit der SP6-Polymerase. Die Kontrolle hat in der In-situHybridisierung als negativ Kontrolle Verwendung gefunden. Im Rahmen dieser Arbeit
ist mit Digoxigenin-markierten Sonden gearbeitet worden, die mit Hilfe des „DIG
labeling Kit“ von ROCHE synthetisiert worden sind.
Gefällt wurden Sonde und Kontrolle durch Zugabe der untenstehenden Komponenten und anschließendem Schockgefrieren in flüssigem Stickstoff oder der Lagerung
für 2 Stunden bei -20°C.
MATERIAL UND METHODEN
28
Der Ansatz für die Fällung setzte sich folgendermaßen zusammen:
Ammoniumacetat
1/10tel Volumen der RNA
Glykogen
1 µl
EtOH p.a., -20°C
100 µl
Nach dem Gefrieren sind die Proben für 30 Minuten bei 4°C zentrifugiert worden, der
Überstand wurde abgenommen, 100 µl 70%iger Ethanol zugegeben und nochmals
15 Minuten bei 4°C zentrifugiert. Nach der Abnahme des Überstandes und einer
mindestens 5-minütigen Trocknung im Wärmeschrank bei 37°C wurden die Pellets
von Sonde und Kontrolle in je 50 µl DEPC-Wasser resuspendiert und zur weiteren
Lagerung bei -80°C weggefroren.
2.2.1.11. DOT-BLOT
Der Dot-Blot dient der Bestimmung der für die In-situ-Hybridisierung einzusetzenden
Menge an Sonde. Dafür wurden in Anlehnung an ZACHGO (2002) je 1 µl Sonde in
unterschiedlichen Konzentrationen (1:10, 1:100, 1:1000, 1:10.000) und 1 µl KontrollRNA (aus: „RevertAidTM First Strand cDNA Synthesis Kit“ von FERMENTAS) auf eine
Filtermembran „Schleicher & Schuell Protran Nitrocellulose Membranes“ der Firma
WHATMAN gegeben und auf untenstehende Weise unter Zuhilfenahme einiger
Komponenten des „DIG Nucleic Acid Detection Kit“ (ROCHE) behandelt.
0.2M NaOH
5 Minuten
2x SSPE
5 Minuten
Puffer 1 + 0,1% Tween20
5 Minuten
Puffer 1 + 0,1% Tween20 + 0,5 % Blockingreagenz
20 Minuten
Puffer 1 + anti-DIG-Lösung (1:3000)
50 Minuten
Puffer 1 + 0,1% Tween20
5 Minuten
Puffer 1 + 0,1% Tween20
10 Minuten
Puffer 1 + 0,1% Tween20
15 Minuten
Puffer 2
5 Minuten
Der letzte Inkubationsschritt erfolgte in 10 ml Puffer 2, in denen eine Färbetablette
„SIGMA FASTTM BCIP/NBT“ der Firma SIGMA-ALDRICH gelöst worden war. Nach etwa
10 Minuten war eine Färbung erkennbar. Die Farbintensität der unterschiedlichen
Sonden-Konzentrationen wurde mit der Färbung der Kontroll-RNA abgeglichen, um
die für die In-situ-Hybridisierung einzusetzende Menge an Sonde zu ermitteln.
MATERIAL UND METHODEN
2.2.2.
29
IN-SITU-HYBRIDISIERUNG
Die im Rahmen dieser Arbeit durchgeführten In-situ-Hybridisierungen basieren auf
dem Laborprotokoll „In Situ Hybridization Protocol using Digoxigenin-labeled probes
on tissue sections (Stand April 2003)“ der Arbeitsgruppe von Dr. Stefan Gleissberg
am Institut für Spezielle Botanik der Universität Mainz. Es wurde von GLEISSBERG und
Dr. Erwin Groot in Anlehnung an das Protokoll von ZACHGO (2002) entwickelt. Auf die
in den einzelnen In-situ-Hybridisierungen vorgenommenen Modifikationen wird im
Ergebnisteil eingegangen.
2.2.2.1. RNASEFREIE FIXIERUNG VON FRISCHMATERIAL
Die Materialsammlung für die In-situ-Hybridisierung erfolgte zur Vermeidung einer
Kontamination der Proben mit RNasen unter möglichst sterilen Bedingungen. Um die
Aktivität der immer in lebendem Gewebe vorkommenden RNasen zu hemmen, ist
das Pflanzenmaterial gekühlt zur unmittelbaren Präparation unter einer Stereolupe
transportiert worden, sofern die Präparation der Proben nicht am Ort der Probenentnahme mittels sterilem Werkzeug und einer sterilen Glasplatte als Arbeitsfläche
erfolgten konnte. Direkt in Anschluss an die Präparation wurden die Objekte in das
vorab angesetzte, gekühlte Fixativ überführt, so dass zwischen Probenentnahme und
Fixierbeginn nicht mehr als 30 Minuten vergangen sind.
Für die ausstehenden In-situ-Hybridisierungen wurde auf zweierlei Weise fixiert: zum
einen in FAA, einem Formalin-Ethanol-Eisessig-Gemisch (siehe 2.1.1., jedoch mit
Fixierung bei 4°C), und zum anderen entsprechend dem unten stehendem Rezept
mit Paraformaldehyd nach ZACHGO (2002). Beide Fixative wurden vor der Fixierung
aus RNasefreien Chemikalien frisch angesetzt.
16 % Paraformaldehyd
10x PBS
DEPC-Wasser
10 ml
4 ml
26 ml
Um das Eindringen des Paraformaldehyd-Fixatives zu beschleunigen, wurde in den
Fällen ein Vakuum angelegt, in denen die zu fixierenden Proben nicht von alleine im
Fixativ abgesunken sind oder Proben mit einem Volumen von mehr als einem halben
Kubikzentimeter fixiert wurden. Unabhängig vom Anlegen eines Vakuums betrug die
Fixierdauer mindestens 12 Stunden bei 4°C. Deutlich länger wurde aber nicht fixiert,
da spätestens nach dieser Zeit von einer vollständigen Durchfixierung des Materials
auszugehen ist und eine weitere Verlängerung der Fixierdauer keinen Einfluss auf
das Ergebnis hat.
MATERIAL UND METHODEN
30
2.2.2.2. ÜBERFÜHRUNG IN WACHS
Für die schrittweise Überführung der mit Paraformaldehyd fixierten Proben in HISTOWAX (HISTOLAB PRODUCTS AB) bzw. Paraplast Plus (TYCO HEALTHCARE/ KENDALL)
diente Roti-Histol (ROTH) als Intermedium. Als erstes wurden die Proben direkt in
Anschluss an die Fixierung mit dem im Fixativ enthaltenen 10x PBS bei weiterhin
4°C gewaschen. Danach durchliefen sie eine aufsteigende Alkoholreihe zur Entwässerung bei Raumtemperatur. Zur besseren Durchmischung der Lösungen wurden die
Proben während untenstehender Reihe gewippt.
Der dem 95%igen Ethanol zugesetzte Farbstoff Eosin (WALDECK DIVISION CHROMA)
diente der Anfärbung der Objekte, damit diese im Wachs besser sichtbar wurden und
sich somit besser im Wachsblock für das Schneiden am Mikrotom ausrichten ließen.
Im Verlauf der In-situ-Hybridisierung ist das Eosin durch Alkohol wieder vollständig
herausgelöst worden.
10x PBS
30 Minuten
bei 4°C
10x PBS
30 Minuten
bei 4°C
Ethanol 30 %
mind. 30 - 60 Minuten
Ethanol 50 %
mind. 30 - 60 Minuten
Ethanol 70 %
mind. 30 - 60 Minuten
Ethanol 85 %
mind. 30 - 60 Minuten
Ethanol 95 %
mind. 30 - 60 Minuten
Ethanol 100 %
mind. 30 - 60 Minuten
Ethanol 100 %
mind. 30 - 60 Minuten
Ethanol 100 % : Roti-Histol (1:1)
mind. 60 Minuten
Roti-Histol
mind. 60 Minuten
Roti-Histol
mind. 60 Minuten
Die im Formalin-Ethanol-Eisessig-Gemisch (FAA) fixierten Proben wurden auf Eis mit
70%igem Ethanol gewaschen und anschließend für mindestens 24 Stunden in 70%igem Ethanol gelagert, so dass obige Entwässerungsreihe erst vom Schritt im 85%igem Ethanol durchlaufen worden ist.
Die in Roti-Histol überführten Proben wurden in Glasbehälter übertragen, mit RotiHistol bedeckt und mit mindestens der doppelten Menge an geschmolzenem HISTOWAX bzw. Paraplast Plus aufgefüllt. Damit das HISTOWAX (Schmelzpunkt bei ca.
58°C) bzw. Paraplast Plus (Schmelzpunkt bei ca. 56°C) in die Proben eindringen
kann, wurden die Proben bei knapp 60°C gelagert. Eine Woche lang erfolgte durch
MATERIAL UND METHODEN
31
das tägliche Abschütten und Wiederauffüllen von Wachs unter Vermeidung eines
Trockenfallens der Proben und durch einen einmaligen Austausch des Glasbehälters
die Beseitigung des Intermediums Roti-Histol.
2.2.2.3. ERSTELLUNG VON PARAFFINSCHNITTEN
Zuerst wurden die in Wachs überführten Objekte mittels steriler Keramikschälchen
eingebettet. Nach dem Erkalten wurde das Wachs um das einzelne Objekt herum zu
Quadern geschnitten und die Objekte auf Holzblöcke als Halterung aufgeschmolzen.
Die Holzblöcke sind anschließend in ein Rotationsmikrotom MOD 1130/Biocut der
Firma REICHERT-JUNG eingespannt worden. Es wurden Schnitte von 10 µm Dicke
angefertigt, die einzeln abgenommen und mit Hilfe steriler Pinzetten auf spezielle,
Polylysin-beschichtete Objektträger POLYSINETM der Firma ERIE SCIENTIFIC COMPANY
übertragen wurden. Zum Strecken der Schnitte wurden die Objektträger auf eine vor
Staub geschützte Wärmeplatte (40 – 50°C) gelegt und einige Tropfen DEPC-Wasser
darauf gegeben. Vor der weiteren Behandlung mussten die Schnitte über Nacht
antrocknen; eine längere Lagerung bei 4°C ist möglich.
2.2.2.4. ENTPARAFFINIERUNG UND PRÄHYBRIDISIERUNG
Als Vorbereitung auf die eigentliche In-situ-Hybridisierung wurden die Schnitte als
erstes mit Roti-Histol entparaffiniert und in einer absteigenden Alkoholreihe für die
folgenden Schritte in wässrigen Lösungen präpariert, die wiederum dem Andauen
der Gewebeschnitte (Proteinase K-Behandlung) und der Erhöhung der Permeabilität
der Zellmembranen (Triethanolaminen mit Essigsäure-Anhydriden) dienen, damit die
Sonde während der Hybridisierungsreaktion besser ins Gewebe Eindringen kann.
Roti-Histol I
(2x genutzt)
5 Minuten
Roti-Histol II
(1x genutzt)
5 Minuten
Roti-Histol III (neu)
5 Minuten
Roti-Histol : Ethanol (1:1)
5 Minuten
Ethanol 100 %
5 Minuten
Ethanol 100 %
5 Minuten
Ethanol 95 % in NaCl 0,85 %
2 Minuten
Ethanol 85 % in NaCl 0,85 %
2 Minuten
Ethanol 70 % in NaCl 0,85 %
2 Minuten
Ethanol 50 % in NaCl 0,85 %
2 Minuten
Ethanol 30 % in NaCl 0,85 %
2 Minuten
MATERIAL UND METHODEN
32
0.2 M HCl
20 Minuten
DEPC-H20
10 Sekunden
DEPC-H20
10 Sekunden
2x SSPE
20 Minuten
bei 70°C
5 µg/ml Proteinase K
20 Minuten
bei 37°C
2X SSPE
5 Minuten
Für den nächsten Inkubationsschritt wurden die Proben in 100 mM Triethanolamine
(TEA) gesetzt und tropfenweise mit Acetanhydriden (Endkonzentration 0,5 %) unter
Rühren angereichert.
100 mM TEA + 0,5 % Acetanhydride
15 Minuten unter Rühren
2X SSPE
kurz Spülen
2X SSPE
kurz Spülen
NaCl 0,85 %
kurz Spülen
Ethanol 30 %
kurz Spülen
Ethanol 50 %
kurz Spülen
Ethanol 70 %
kurz Spülen
Ethanol 85 %
kurz Spülen
Ethanol 95 %
kurz Spülen
Ethanol 100 %
kurz Spülen
Ethanol 100 %
kurz Spülen
2.2.2.5. HYBRIDISIERUNG
Die eigentliche Hybridisierungsreaktion findet im feucht-warmen Klima statt. Für die
dafür benötigte Feuchtekammer wurde mit 4x SSPE-Puffer getränktes Filterpapier in
eine dicht verschließbare, sterile Box gelegt. Zur Vermeidung des direkten Kontakts
der Objektträger mit dem Filterpapier wurden Plastikpipetten als Unterlagen für die
Objektträger genutzt. Bevor die Sonde auf die Schnitte gegeben worden ist, wurden
die Objektträger in der „Humid chamber“ für 30 Minuten bei 55°C inkubiert.
Für die Hybridisierung wurde die Sonde verschieden stark mit der Hybridisierungslösung verdünnt (1:100, 1:500, 1:1000). Dazu pipettierte man einen kleinen Ansatz
von 50 µl, wobei die Sondenmenge jedoch vorab auf das Endvolumen von 200 µl bis
400 µl Hybridisierungslösung pro Objektträger berechnet worden ist. Der Ansatz
wurde 2 Minuten bei 80°C inkubiert, anschließend für 5 Minuten auf Eis gelagert und
MATERIAL UND METHODEN
33
kurz abzentrifugiert. Danach wurde der Ansatz mit der entsprechenden Menge an
Hybridisierungslösung aufgefüllt und bei 55°C gelagert. Die Hybridisierungslösung ist
jedes Mal möglichst frisch zusammen pipettiert worden.
2 ml Hybridisierungslösung setzen sich wie folgt zusammen:
Formamide
1000 µl
50 % Dextran Sulfat
500 µl
10x Salze
250 µl
Hefe-tRNA (gelöst in TE-Puffer)
25 µl
50x Dehnhardtsreagenz
50 µl
DEPC-H2O
175 µl
Bevor die Hybridisierungslösung blasenfrei auf die Objektträger gegeben wurde, sind
kleine Deckglassplitter als Abstandhalter zwischen Objektträger und Deckglas gelegt
worden, damit die Hybridisierungslösung einen gleichmäßigen Film auf den Schnitten
bilden konnte. Die Gewebeschnitte inkubierten über Nacht bei 55°C in der luftdicht
verschlossenen Probenkammer. Auf die gleiche Weise ist mit den Negativ-Kontrollen
in einer separaten Kammer verfahren worden.
2.2.2.6. ANTIKÖRPER-BEHANDLUNG
Um die Gewebeschnitte mit den an die Sonde bindenden Antikörpern behandeln zu
können, mussten als erstes mit vorgewärmten 3x SSPE die Deckgläser von den
Objektträger gespült werden wie auch die Hybridisierungslösung in untenstehender
Reihe von den Schnitten gewaschen werden musste. Darüber hinaus wurden die frei
in der Lösung vorhandenen Sonden-Fragmente durch die Behandlung mit RNase A
verdaut.
3x SSPE
30 Minuten bei 45°C
3x SSPE
30 Minuten bei 45°C
3x SSPE
30 Minuten bei 45°C
NTE
20 Minuten bei 37°C
NTE mit 20 µg/ml RNase A
30 Minuten bei 37°C
NTE
5 Minuten bei 37°C
NTE
5 Minuten bei 37°C
1,5x SSPE
30 Minuten bei 52°C
MATERIAL UND METHODEN
34
1x SSPE
30 Minuten bei52°C
0,4x SSPE
30 Minuten bei 52°C
In den nächsten Inkubationsschritten wurden unspezifische Bindungen der restlichen
vorhandenen Sonde blockiert und die Schnitte auf die eigentliche Behandlung mit
den Antikörpern vorbereitet.
Puffer 1 pur
5 Minuten
Puffer 1 mit 0,5 % Blocking Reagenz
30 Minuten
Puffer 1 mit 1% BSA und 0,1% Tween 20
30 Minuten
Für die Inkubation mit den Anti-Digoxigenin-AP konjugierten Antikörpern aus dem
„DIG Nucleic Acid Detection Kit“ der Firma ROCHE wurden diese 1:3000 in Puffer 1
mit 1%igem BSA verdünnt. Bei der Präparation der Objektträger und der Probenkammern wurde wie unter 2.2.2.5. verfahren, jedoch ist nun das Filterpapier für die
Antikörperbehandlung mit DEPC-H2O anstelle von SSPE getränkt worden. Nach der
Zugabe von je 300 µl Antikörperlösung inkubierten die Gewebeschnitte für 1 Stunde
bei Raumtemperatur in den feuchten Klimakammern.
2.2.2.7. DETEKTION
Bei der Dektektionsreaktion werden die Antikörper über die spezifische Bindung des
Farbstoffes „SIGMA FASTTM BCIP/NBT“ (SIGMA-ALDRICH) sichtbar. Da die Antikörper
wiederum an die Sonde gebunden sind, ist eine räumliche Zuordnung der Expression
des mittels der Sonde gesuchten Gens möglich. Bevor jedoch der Farbstoff auf die
Gewebeschnitte gegeben werden kann, müssen die unspezifisch gebundenen bzw.
ungebundenen Antikörper von den Objektträgern gewaschen werden. Dazu wurden
die Objektträger 4-mal hintereinander für je 20 Minuten in Puffer 1 mit 0,1% Tween
20 und anschließend einmal für 5 Minuten in Puffer 2 mit 0,1% Tween 20 bei
Raumtemperatur inkubiert.
Die Objektträger wurden nach Probe und Kontrolle sortiert in zwei Probenkammern
(vergleiche 2.2.2.6) gegeben, mit Deckglassplittern präpariert und mit mindestens
200 µl Detektionslösung bedeckt. Die Detektionslösung besteht aus einer Tablette
„SIGMA FASTTM BCIP/NBT“ (SIGMA-ALDRICH), die in 10 ml DEPC-Wasser unter ca.
2,5-stündiger Rotation bei 37°C vor Licht geschützt gelöst wird. Nach Zugabe der
Detektionslösung mussten die Gewebeschnitte für 1-4 Tage vollständig abgedunkelt
bei Raumtemperatur inkubieren, bis eine deutliche Farbreaktion zu erkennen war.
Gegebenenfalls musste etwas Färbelösung nachgegeben werden.
MATERIAL UND METHODEN
35
2.2.2.8. STOPPEN DER REAKTION
Sobald eine deutliche Färbung in den Proben erkennbar war, wurde die Reaktion mit
Aqua dest. abgestoppt, indem man die Deckgläschen vorsichtig mit viel Aqua dest.
von den Objektträgern spülte. In Anschluss daran durchliefen die Objektträger eine
aufsteigende Alkoholreihe, um anschließend mit Deckgläschen und ENTELLAN NEU
(MERCK) eingedeckt zu werden.
Aqua dest.
5 Minuten
Ethanol 30 %
30 Sekunden
Ethanol 50 %
30 Sekunden
Ethanol 70 %
30 Sekunden
Ethanol 85 %
30 Sekunden
Ethanol 95 %
30 Sekunden
Ethanol 100 %
30 Sekunden
Ethanol 100 %
30 Sekunden
2.2.2.9. LICHTMIKROSKOPIE UND DOKUMENTATION
Lichtmikroskopisch untersucht wurden die Dauerpräparate mit dem Lichtmikroskop
Axioplan der Firma ZEISS mittels Hellfeld-Durchlicht-Mikroskopie. Die fotografische
Dokumentation der Ergebnisse der In-situ-Hybridisierungen erfolgte über die daran
angeschlossene Digitalkamera ColorView (SOFT IMAGING SYTEMS). Bei Objekten, die
die Größe des Kameraausschnitts überschritten, wurde mit Hilfe der Programms MIA
(Multiple Image Alignment) des Computerprogramms analySIS der Firma SOFT
IMAGING SYSTEM DIGITAL ein Bild aus mehreren Einzelbildern zusammengesetzt.
2.2.3.
LÖSUNGSLISTE
Im Folgenden werden nur die Lösungen aufgelistet, auf die in den vorangegangenen
Abschnitten noch nicht ausführlicher eingegangen wurde. Zusätzliche Lösungen, die
in Reinform verwendet wurden, sind den Herstellernachweisen im folgenden Kapitel
2.2.4. zu entnehmen.
0.5 M EDTA
4,653g EDTA.2H2O (Titriplex) auf 25 ml DEPC-Wasser auffüllen und bei pH 12.0
lösen, pH 8.0 mit Essigsäure und NaOH einstellen
MATERIAL UND METHODEN
36
LB-Amp-X-Gal-IPTG-Platten
Ampicillin (20 g), X-Gal (8 g), IPTG (10 g), Agarose (28 g) mit LB-Medium, pH 7.5 auf
200 ml auffüllen
LB-Medium
Trypton (10 g), Hefeextrakt (5 g), NaCl (5 g) auf 1000 ml mit H2O auffüllen, pH 7.5
NTE
0.5 M NaCl, 10 mM Tris-HCl, 1mM EDTA, pH 8.0
10x PBS-Stocklösung
1.3 M NaCl, 0.07 M Na2HPO4, 0.03 M NaH2PO4 in 1 l DEPC-Wasser lösen
Proteinase K Puffer
20 mM Tris-HCl, 2 mM CaCl2, pH 7.0
Puffer 1
100 mM Tris-HCl, 150 mM NaCl, pH 7.5
Puffer 2
100 mM TRIS base, 100 mM NaCl, 50 mM MgCl2, pH 9.5 (Frisch ansetzten!)
10x Salze
5 M NaCl (60 ml), 1 M Tris-HCl, pH 6.5 (10 ml), 0,5 M EDTA (10 ml), NaH2PO4.2H2O
(7,8 g), Na2HPO4 (7,1 g) auf 100 ml mit DEPC-Wasser auffüllen
20x SSPE
3 M NaCl, 20 mM EDTA, 200 mM NaH2PO4.2H2O, pH 7.4
10x TBE-Puffer
890 mM Tris, 890 mM Borsäure, 20 mM EDTA
TE-Puffer
10 mM Tris-HCl pH 7.5, 1 mM EDTA, pH8.0
1 M Tris-HCl
pH 7.5
MATERIAL UND METHODEN
2.2.4.
37
HERSTELLERNACHWEISE
Im Folgenden werden die im Rahmen des molekulargenetischen Teils dieser Arbeit
verwendeten Substanzen mit den dazugehörigen Herstellern aufgelistet, sofern diese
nicht bereits im Text in den Kapiteln 2.2.1. und 2.2.2. genannt wurden.
Substanz
Hersteller
Acetanhydrid, 1 l
BSA Fraktion V, 25 g
CaCl2, 1kg
Chloroform, 1 l
Denhardt´s Lösung, 5 ml
DEPC, 20 ml
Dextransulfat (Natriumsalz), 25 g
Eosin, 10 g
Ethanol absolut, 1 l
Ethanol p.a., 1 l
Formaldehyd (37%), 1 l
Formamid, 1 l
HCl (36-38%), 1 l
HCl 2M, 1 l
MgCl2 . 6 H2O (MolBiol), 250 g
Na2HPO4 . 2 H2O, 1kg
NaCl, 1kg
NaH2PO4 . H2O, 1 kg
NaOH 4Mol, 250 ml
NaOH-Pellets, 1 kg
Paraformaldehyd 16%, 10 x 10 ml-Amp.
Paraplast, 1 kg
Proteinase K, 5 ml
RNase A, 100 mg
Titriplex (EDTA), 250 g
Triethanolamine, 100 ml
Tris (MolBiol), 500 g
TrisHCl (MolBiol), 250 g
Tween 20 (MolBiol), 250 ml
Yeast tRNA, 25g
Sigma-Aldrich
Applichem
J.T.Baker, Baker analyzed
J.T.Baker, Baker analyzed
Applichem
Applichem
Applichem
Waldeck Division Chroma
VWR - Normapur
Merck
J.T.Baker, Baker analyzed
VWR - Normapur
J.T.Baker, Baker analyzed
Applichem
Applichem
J.T.Baker, Baker analyzed
J.T.Baker, Baker analyzed
J.T.Baker, Baker analyzed
Riedel-de Haen
J.T.Baker, Baker analyzed
Electron Microscopy Sciences
Kendall
Applichem
Applichem
Merck
Fluka/Biochemika
Applichem
Applichem
Applichem
Invitrogen
MATERIAL UND METHODEN
2.3.
PFLANZENMATERIAL
2.3.1.
ZAMIA AMBLYPHYLLIDIA (ZAMIACEAE)
38
2.3.1.1. ALLGEMEINE ARTBESCHREIBUNG
Bei der Art Zamia amblyphyllidia D.W.STEV. handelt es sich um einen Vertreter der
Cycadales, eine evolutiv sehr alte Gymnospermen-Ordnung, die allgemein hin auch
als Palmfarne bekannt sind. Diese Art weist wie alle anderen Vertreter der Ordnung
viele Merkmale der ursprünglichen, fossilen Gymnospermen auf. Zum einen ist das
die Ausbildung beweglicher Spermatozoide, die rezent neben den Cycadales nur
noch bei Ginkgo biloba L. anzutreffen ist, zum anderen ist es die einfache, bei vielen
Cycadales den Baumfarnen stark ähnelnde Erscheinung aus einem mit Blattbasen
besetzten Stamm mit einem Blattschopf aus großen Wedeln. Dieser Habitus spiegelt
sich in der deutschen Bezeichnung Palmfarne wider. Z. amblyphyllidia sieht aufgrund
des kurzen, unmittelbar oberhalb der Erdoberfläche verzweigten Stamms allerdings
nur begrenzt palmenartig aus. Distal an jedem Stammende steht ein Blattschopf aus
maximal 15 Wedeln, die eine Länge von 150 cm erreichen können und aus bis zu 40
gleichmäßig verteilten Fiederpaaren bestehen. Die einzelnen Fiedern sind schmallanzettlichen und im distalen Viertel leicht gezähnt.
Die Cycadales hatten ihren weltweiten Verbreitungshöhepunkt vor rund 150 Millionen
Jahren im Mesozoikum. Rezent sind die 185 Arten der Cycadales in ihrem Vorkommen eng auf die tropischen Breiten aller Kontinente beschränkt. Die Gattung Zamia
umfasst insgesamt 54 Arten, die alle in Mittelamerika zwischen Florida und Bolivien
verbreitet sind. Innerhalb dieses Bereichs ist das natürliche Verbreitungsgebiet der
einzelnen Art stark eingeschränkt. Z. amblyphyllidia kommt auf Jamaika, Kuba und
im Norden Puerto Ricos vor. Das Verbreitungsgebiet ist mit dem von Z. angustifolia
JACQ., Z. pygmea SIMS, Z. pumila L. und Z. portoricensis URBAN vergleichbar (WHITELOCK 2002). Da eine starke Ähnlichkeit dieser Arten untereinander besteht wurde Z.
amblyphyllidia erstmals 1987 von STEVENSON als eigene Art beschrieben. Im rein
vegetativen Zustand sind die vom Habitus her sehr ähnlichen Arten Z. pumila und Z.
amblyphyllidia lediglich anhand der stärkeren Zähnung der Fiedern bei Z. pumila
auseinander zu halten. Weibliche, generative Exemplare lassen sich zudem anhand
der Färbung der Samen unterscheiden, die bei Z. amblyphyllidia dunkelrot und bei Z.
pumila orange ist.
Neben der Familie der Zamiaceae gehören auch die Cycadaceae und Stangeriaceae
zu den Cycadales, die nach JONES (1993) aus der Radiation aus wenigen Reliktarten
hervorgegangen sind. Die drei Familien lassen sich am einfachsten in Hinblick auf die
MATERIAL UND METHODEN
39
Ausbildung ihrer Sporophylle wie folgt klassifizieren. Die Cycadaceae bilden ein Sporophyll mit einem sterilen, phylloiden Endabschnitt und mehreren seitlich ansetzenden
Samenanlagen aus (Abb. 5A). Bei den Stangeriaceen ist der sterile Endabschnitt stark
reduziert und die Zahl der Samenanlagen ist auf zwei festgelegt (Abb. 5B). Die Zamiaceen, deren phylloider Sporophyllabschnitt zu einem schmalen, kompakten Schild
reduziert ist, haben zwei oberhalb des Sporophyllstiels inserierende Samenanlagen
mit - abweichend von den anderen beiden Familien der Cycadales - zur Zapfenachse
weisende Mikropylen (Abb. 5C).
A
Abb. 5:
B
C
Schematische Darstellung der Sporophylltypen der Cycadales
A: Cycas revoluta L., Cycadaceae - Sporophyll mit phylloidem Endabschnitt; B: Stangeria
eriopus (KUNZE) BAILL., Stangeriaceae – Sporophyll mit sehr stark reduziertem phylloiden
Abschnitt, der die Samenanlagen bedeckt; C: Zamia amblyphyllidia D.W.STEV., Zamiaceaea
– Sporophyll mit schildartig komprimiertem Endabschnitt
2.3.1.2. BESCHREIBUNG DER UNTERSUCHTEN INDIVIDUEN
Sämtliches entnommenes Pflanzenmaterial von Zamia amblyphyllidia stammt aus
dem Botanischen Garten der Ruhr-Universität Bochum. Dort werden die Pflanzen in
Kübelkulturen in Gewächshäusern gehalten. Im Bestand des Botanischen Gartens
Bochum befinden sich sowohl mehrere weibliche als auch männliche Exemplare von
Z. amblyphyllidia, einer Art, die wie alle Cycadales diözisch ist. Eine Differenzierung
der Pflanzen in männliche und weibliche Individuen ist allein vom Habitus unmöglich,
so dass das die Zapfen als generative Merkmale herangezogen werden müssen. Die
schlanken Zapfen der männlichen Pflanzen werden bis zu 8 cm lang und haben eine
zylindrische, zur Spitze hin verschmälerte, abgerundete Form. Zum Stäuben weichen
die rot-braunen Sporophylle auseinander (Abb. 6A). Die viel kompakter wirkenden,
zylindrischen weiblichen Zapfen werden etwa 15 cm lang und erreichen dabei einen
Durchmesser von 4-6 cm. Der Apex der zur Bestäubungsreife dunkelbraunen und
später eher gräulichen Zapfen ist zu einer langen sterilen Spitze ausgezogen (Abb.
6B,C). Die einzelnen Sporophylle, die nur zum Zweck der Bestäubung kurz unterhalb
MATERIAL UND METHODEN
40
des Apex auseinander weichen (Abb. 6B), stehen während der gesamten Samenentwicklung extrem kompakt. Sie werden erst durch die Größenzunahme der Samen
auseinander gedrängt und geben den Blick auf die rot gefärbte Sarkotesta der
Samen frei (Abb. 6C).
A
B
C
Abb. 6: Zapfen von Zamia amblyphyllidia D.W.STEV.
A: männlicher Zapfen zum Zeitpunkt des Stäubens; B: Bestäubungsreifer weiblicher
Zapfen mit ringförmig auseinander gewichenen Sporophyllen; C: Weiblicher Zapfen mit
reifen Samen.
Da im botanischen Garten Bochum mehrere weibliche Exemplare vorhanden sind,
wurde abhängig von der gewünschten Zapfengröße von unterschiedlichen Pflanzen
gesammelt, die in Größe und Alter dem in Abbildung 7 gezeigten Exemplar entsprechen. Für die
Erstellung einer lückenlosen Entwicklungsreihe
wurde auf fixiertes Material zurückgegriffen, das
schon in den Jahren 1998, 2000, 2002 und 2003
gesammelt worden war. Die Materialsammlung
für die In-situ-Hybridisierung erfolgte anders als
zur Erstellung einer Entwicklungsreihe punktuell.
So wurde im Juli 2005 ein kaum differenzierter
Zapfen aus einem Vegetationskegel herauspräpariert. Im Mai und November 2006 wurden je
zwei Zapfen unterschiedlichen Alters mit deutlich
entwickelten Sporophyllen entnommen. In 2007
erfolgte im Februar neben der Sammlung eines
Abb. 7: Zamia amblyphyllidia D.W.
ganz jungen, gerade ausdifferenzierten Zapfens
STEV., BoGa Bochum
auch die Entnahme junger Blätter und Fiedern
für die In-situ-Hybridisierung. Für die RNA-Isolierungen wurden aus den Zapfen frei
präparierte Samenanlagen verwendet, die direkt nach den jeweiligen Entnahmen im
Februar, Juli und November 2005 verarbeitet wurden.
MATERIAL UND METHODEN
2.3.2.
41
GINKGO BILOBA (GINKGOACEAE)
2.3.2.1. ALLGEMEINE ARTBESCHREIBUNG
Ginkgo biloba L. ist die einzige rezent vorkommende Art der monotypischen Familie
der Ginkgoaceae. Es handelt sich um einen sommergrünen Baum mit monopodialem
Wuchs, der eine Höhe von 40 m erreicht (SCHÜTT et al. 2002). Im späten Frühjahr
treiben kräftig grün gefärbte Blätter aus, die sich im Verlauf des Sommers grüngräulich verfärben und im Herbst leuchtend gold-gelb erscheinen. Das Artepitheton
„biloba“ leitet sich von der Form der Blätter ab, da die Blätter oftmals durch eine tiefe
Einbuchtung in der Mitte des oberen Spreitenrandes „zweilappig“ sind (Abb. 8A).
Neben diesen „biloben“ Blättern sind an jedem Baum gleichzeitig immer zahlreiche
fächerförmige Blätter ohne eine derartige Zweiteilung vorhanden (Abb. 8A). Sie alle
verfügen über eine Gabelnervatur. Die Gabelnervatur, bei der sich alle Blattgefäße
dichotom verzweigen, ist unter den rezenten Pflanzen nicht weit verbreitet. An den
Langtrieben stehen die Blätter spiralig angeordnet, während sie an den Kurztrieben
aufgrund der stark gestauchten Internodien gebüschelt wirken (Abb. 8A).
An den Kurztrieben der diözischen Ginkgo-Bäume sind entweder die männlichen
oder die weiblichen reproduktiven Strukturen zu finden. Die männlichen Individuen
bilden lockere Kätzchen aus, die den Kätzchen von Weiden ähnlich sind (Abb. 8B).
Bei den Weibchen stehen an den Kurztrieben bis zu einem Dutzend Samenanlagen
tragende Strukturen, die jeweils aus einem Träger und meist zwei Samenanlagen
bestehen. In den meisten Fällen gelangt nur eine der beiden Samenanlagen zur
Reife (Abb. 8C). Das Integument reifer Samen entwickelt sich zu einer inneren stark
verholzten Schicht und einer äußeren Schicht, die eine gelbliche, fleischige Hülle mit
großen Mengen an Buttersäure bildet. Dieser Buttersäureanteil führt beim Faulen der
Samen zu einem extrem unangenehmen Geruch, der an ranzige Butter erinnert.
A
B
C
Abb. 8: Kurztriebe bei Ginkgo biloba L.
A: Vegetativer Kurztrieb mit gabelnervigen Blättern; B: Männlicher Kurztrieb mit sog.
„Kätzchen“; C: Weiblicher Kurztrieb mit Sporangiophoren.
MATERIAL UND METHODEN
42
Aufgrund seiner in Form und Farbe besonderen
Blätter und des sehr hohen Alters, das einzelne
Bäume erreichen können, gelten Ginkgo-Bäume
in ganz Asien als heilig. In China soll es Bäume
geben, die fast 4000 Jahre alt sind. Sie sind mit
einem Stammumfang von annähernd 17 m zu
imposanten Bäumen gewachsen. Eine weitere
interessante Erscheinung, die an den sehr alten
Ginkgo-Exemplaren zu sehen ist, sind die so genannten „Tschitschi“ (Abb. 9). Als „Tschitschi“
werden die verholzten, zylindrischen Auswüchse
an den Astunterseiten bezeichnet. Diese AusAbb. 9: Ginkgo biloba L., Ast mit
wüchse wachsen positiv geotrop Richtung Erde,
„Tschitschi“, abgelichtet
am Meji-Schrein (Japan)
wo sie wurzeln und neue Sprosse bilden können
(FUJI 1998). Nicht weniger interessant als das
Alter einzelner Individuen ist das erdgeschichtliche Alter der Gattung Ginkgo.
Ginkgo biloba ist der einzige bis heute überdauernde Vertreter der Ginkgoales, die
im Mesozoikum mit rund 20 Gattungen eine große Formenvielfalt ausgebildet hatten.
Funde aus dem Jura belegen, dass der rezente Ginkgo seit ca. 150 Millionen Jahren
nahezu unverändert ist. Daher hat DARWIN den für die Wissenschaft so interessanten
Baum als „lebendes Fossil“ bezeichnet. Das weltweite Verbreitungsgebiet der Ginkgoales während ihrer Blütezeit im Mesozoikum, ist auf ein natürliches Vorkommen im
östlichen China reduziert worden. Von dort aus wurde der Ginkgo-Baum im 11.
Jahrhundert n. Chr., der Blütezeit des Buddhismus, in Japan, Korea und Nordchina
eingeführt und kultiviert. Die erste Artbeschreibung erstellte KAEMPFER 1712. 1730
wurde dann das erste Exemplar von Ginkgo biloba auf den europäischen Kontinent
nach Utrecht gebracht. Von dort aus erfolgte, insbesondere durch die Kultivierung in
Botanischen Gärten, eine rasche Ausbreitung innerhalb ganz Europas. Heute ist der
Ginkgo ein häufig angepflanzter Straßenbaum, da er nicht nur gegen Insekten- und
Pilzbefall sondern auch gegen die starke Luftverschmutzung resistent ist (SCHULTZEMOTEL 1992).
2.3.2.2. BESCHREIBUNG DES UNTERSUCHTEN INDIVIDUUMS
Die im Botanischen Garten der Ruhr-Universität Bochum angepflanzten Exemplare
von Ginkgo biloba sind erst rund 25 Jahren alt und haben die Geschlechtsreife noch
nicht erreicht, so dass diese Bäume bislang nicht als Weibchen oder Männchen
identifiziert werden konnten. Aus diesem Grunde bilden sie bislang auch noch keine
MATERIAL UND METHODEN
43
generativen Strukturen aus, die jedoch insbesondere für die im Rahmen dieser Arbeit
untersuchte Fragestellung von Interesse sind. Daher stammt sämtliches verwendetes
Material von einem ca. 80 Jahre alten weiblichen
Exemplar von einem Privatanwesen in Herdecke
(Abb. 10). Das Material von dort wurde sowohl
für die licht- als auch für die rasterelektronenmikroskopischen Untersuchungen von Dezember
2002 bis Juni 2003, im Abstand von 14 Tagen
gesammelt und fixiert, um die Anlegung und die
Entwicklung der Integumente vollständig dokumentieren zu können. Während der Winterruhe
erfolgte die reduzierte Materialsammlung in einer
vierwöchigen Sammelfrequenz. Im Frühling 2007
erfolgten weitere Materialentnahmen mit unmittelbar anschließender RNasefreier Fixierung für
noch ausstehende In-situ-Hybridisierungen. Für
die dafür vorab notwendigen Vorarbeiten wurde
gleichzeitig Material zur RNA-Isolierung schockAbb. 10: Ginkgo biloba L., Privatanwesen in Herdecke
gefroren und im Labor aufgearbeitet.
2.3.3.
MAGNOLIA STELLATA (MAGNOLIACEAE)
2.3.3.1. ALLGEMEINE ARTBESCHREIBUNG
Magnolia stellata (SIEBOLD & ZUCC.) MAXIM gehört zur Familie der Magnoliaceae, die
innerhalb der Magnoliopsida der Unterklasse der Magnoliidea angehört, die ausschließlich größere Holzpflanzen umfasst. Die Magnoliopsida stellen zusammen mit
den Liliopsida und Asteriopsida die drei Klassen der Angiospermen dar. Letztere
Klasse grenzt sich durch das Vorhandensein von tricolpaten Pollen von den beiden
erstgenannten Klassen mit monosulcaten Pollen ab. Die laut kladistischen Analysen
den Magnoliopsida nah stehenden Liliopsida lassen sich aufgrund ihrer Einkeimblättrigkeit aus den dikotylen Magnoliopsida ausgliedern. Zu der M. stellata beinhaltenden
Ordnung Magnoliales zählen die in den Tropen verbreiteten Familien der Degeneriacaeae, Himantandraceae, Annonaceae und Myristicaeae. Das natürliche Verbreitungsgebiet der Magnoliaceae erstreckt sich reliktär über die Nordhemisphäre von
den Tropen bis in die warm-temperierten Zonen (BRESINSKY 2002). So gibt es rezent
ca. 80 Arten, die in Ost-Asien, Nord- und Mittel-Amerika und im Himalaja beheimatet
sind (KRÜSSMANN 1976). Bei den bei uns in den gemäßigten Breiten in großer Vielfalt
MATERIAL UND METHODEN
44
anzutreffenden Magnolien handelt es sich um Anpflanzungen. Den Verbreitungshöhepunkt hatten die Magnoliaceen im Tertiär mit einem Vorkommen auf der gesamten
Nordhalbkugel. Dabei zeigten sie ein typisch arkto-tertiäres Verbreitungsmuster, das
durch die Wanderung der Gletscher und die Kontinetaldrift hervorgerufen worden ist
(WEN 2001). Allerdings stammen zahlreiche fossile Belege bereits aus der Kreide,
was ein Indiz für das hohe erdgeschichtliche Alter dieser Familie ist (KRUSE 1992).
M. stellata ist ein häufig angepflanztes, langsam wachsendes Ziergehölz mit strauchförmigem Wuchs, das in unseren Breiten meist die maximale Höhe von 8 m erreicht.
Aufgrund seiner kräftigen, weißen Blüten, die sich vor dem Austrieb der Laubblätter
öffnen, erfreut sich M. stellata bei uns immer größerer Beliebtheit. Die im Durchmesser ca. 7-8 cm großen, aus 12-15 schmalen Petalen zusammengesetzten Blüten
werden durch dicht behaarte Knospenschuppen vor der Winterkälte geschützt bevor
sie sich im zeitigen Frühjahr öffnen und den Blick auf die zahlreichen Staubgefäße
und Fruchtblätter freigeben (Abb. 11A-C). Die 4-10 cm langen und 3-5 cm breiten
Laubblätter von M. stellata sind verkehrt-eiförmig mit keilförmiger Basis und einer
abgerundeten bzw. stumpfen Spitze (KRÜSSMANN 1976).
A
B
C
Abb. 11: Blüten von Magnolia stellata (SIEBOLD & ZUCC.) MAXIM
A: Blüte kurz vorm Öffnen, umhüllt von den stark behaarten Knospenschuppen, die
bereits geöffnet sind; B: geöffnete ungegliederte Blütenhülle in lateraler Ansicht; C: Blick
in die Blütenmitte mit Staubgefäßen und den zentralen Fruchtblättern, von denen nur die
Narben zu erkennen sind.
Die Fruchtblätter sind spiralig um die säulenförmig ausgezogene Blütenachse, die so
genannte Columella, angeordnet und bilden pro Karpell je zwei Samenanlagen aus,
von denen oftmals eine oder auch beide Samenanlage unbefruchtet bleiben und sich
somit auch nicht weiter entwickeln (Abb. 12A). Während des weiteren Wachstums
platten sich die Samenanlagen gegeneinander ab, so dass sie im reifen Zustand
halbkugelförmig erscheinen (Abb. 12B). Die reife Frucht ist eine verholzte Sammelfrucht, deren einzelne Karpelle sich dorsizid öffnen. Aus den geöffneten Karpellen
hängen die reifen Samen zur besseren Präsentation an den Wandverstärkungen der
MATERIAL UND METHODEN
45
Schraubentracheiden des vertrockneten Funiculs heraus, die sich unter dem Gewicht
der Samen entspiralisieren (Abb. 12C, Pfeil).
A
B
C
Abb.12: Karpell-/Samenentwicklung bei Magnolia stellata (SIEBOLD & ZUCC.) MAXIM
A: Gynoceum mit unbefruchteten und stark angeschwollenen befruchteten Karpellen,
Tepalen und Stamina bereits abgefallen; B: zwei gegeneinander abgeplattete Samen
im am Rücken aufgeplatzten Karpell; C: Fruchtstand mit reifen Samen, die teilweise
schon an einem dünnen Faden heraushängen (Pfeil).
2.3.3.2. BESCHREIBUNG DES UNTERSUCHTEN INDIVIDUUMS
Sämtliches Pflanzenmaterial von Magnolia stellata stammt von einem einzigen etwa
3-4 m hohen Exemplar aus dem Botanischen Garten der Ruhr-Universität Bochum,
das in Abbildung 13 gezeigt ist. Bei den
gesammelten Pflanzenteilen handelt es
sich um Blütenknospen, die sowohl für
die licht- als auch rasterelektronenmikroskopische Untersuchung entnommen
wurden. Die Materialentnahme erfolgte
kontinuierlich von August 2005 bis Mai
2006 mit einer von der Witterung und
Vegetationsphase abhängigen Sammelfrequenz von zwei bis vier Wochen. In
unregelmäßigen Abständen ist zudem
auch an einigen Sammeldaten Material
Abb. 13: Magnolia stellata (SIEBOLD & ZUCC.)
MAXIM in Blüte, BoGa Bochum
für noch ausstehende In-situ-Hybridisierungen RNasefrei gesammelt und fixiert
worden. Die Sammlung der reifen Samen für die morphologischen Untersuchungen
erfolgte gegen Ende September 2007. Ergänzt wurde die Sammlung durch Material
von einem 8 m hohen, ungewöhnlich gut tragenden Exemplar von M. stellata, das im
Stadtpark Bochum angepflanzt ist.
ERGEBNISSE
3.
ERGEBNISSE
3.1.
HISTOLOGISCHE UNTERSUCHUNGEN
3.1.1.
INTEGUMENTENTWICKLUNG BEI ZAMIA AMBLYPHYLLIDIA
46
Die im Folgenden aufgezeigte Entwicklungsreihe zur Integumentbildung beginnt mit
sehr jungen Sporophyllen von gerade einmal 1,2 mm Länge und 0,8 mm Breite, die
an einem 12 mm langen und 6 mm breiten Zapfen stehen. Da die sehr jungen Zapfen
noch von den Blattbasen der Wedel verborgen sind, mussten sowohl die alten als
auch die sehr jungen, noch eingerollten Wedel vor der Materialentnahme entfernt
werden. Oftmals stirbt nach dieser Prozedur der ganze betroffene Seitenast ab. Bei
diesen jungen Sporophyllen ist bereits beidseits des Stiels je ein SamenanlagenPrimordium zu sehen (Abb. 14A). Die undifferenzierten Samenanlagen zeigen in der
distalen Hälfte, die der Zapfenachse zugewandt ist, ringsum die Makrosporenmutterzelle einen zentral gelegenen Bereich von erhöhter Zellteilungsaktivität. Dies
ist an der hohen Dichte des Cytoplasmas und des Fehlens einer Vakuole in diesen
Zellen erkennbar (Abb. 14B). Bei nur geringfügig weiter entwickelten Sporophyllen,
die auf dieselbe aufwändige Weise präpariert worden sind, ist in den histologischen
Untersuchungen im Längsschnitt zu erkennen, dass sich das Primordium in dieser
Zone in Integument und Nucellus differenziert, wobei der Nucellus reicher an Plasma
erscheint als das umgebende Integument (Abb. 14D).
Die Entwicklung des Integuments beginnt damit, dass auf der distalen Fläche der
Samenanlage eine ringförmige Zone im Wachstum zurückbleibt. In der Aufsicht auf
das Primordium ist diese Zone als ringförmige Einbuchtung zu erkennen (Abb. 14C).
Auch im Längsschnitt ist diese Einbuchtung zu erahnen (Abb. 14D, Pfeile). Bei den in
etwa dem gleichen Zeitraum desselben Jahres gesammelten Sporophyllen lässt sich
bereits deutlich zwischen Integument und Nucellus differenzieren. In diesem Stadium
ist bereits eine Mikropyle in Form einer kreisrunden Öffnung auf der der Zapfenachse
zugewandten Seite der Samenanlage erkennbar. Sie misst annähernd 100 µm, was
etwa ein Sechstel der Breite der Samenanlage ausmacht, und lässt den Blick auf den
Nucellus frei (Abb. 14E). Integument und Nucellus zeigen ein Längenwachstum oberhalb der Zone, in der beide Strukturen kongenital verwachsen sind. Der Bereich, in
dem das Integument nun frei ist, macht etwa ein Fünftel der Länge der gesamten
Samenanlage aus (Abb. 14F). Die Differenzierung des Primordiums in Integument
und Nucellus setzt sich ebenso in basaler Richtung als histologische Differenzierung
fort, die der im freien Abschnitt des Integuments gleicht. Durch die beschriebenen
ERGEBNISSE
47
Differenzierungsvorgänge ist nun über die ganze Samenanlage von der Mikropyle bis
zum Funiculus eine Unterscheidung zwischen Nucellus und Integument problemlos
möglich.
Zunächst entwickeln sich Nucellus und Integument in gleichem Maße, so dass bei
einer weiteren Größenzunahme keine wesentlichen Verschiebungen der Größenverhältnisse innerhalb der Samenanlage zu verzeichnen sind (Abb. 15A, B). Erst später
findet das Längenwachstum der Samenanlage überwiegend im distalen Bereich der
Samenanlage statt, dort wo das Integument frei ist. Aus dieser Wachstumsverlagerung resultiert, dass der Nucellus nur noch bis etwa zur Hälfte mit dem Integument
verwachsen ist, bevor die Entwicklung des Makroprothalliums beginnt. Durch ein
vorangegangenes verstärktes Streckungswachstum des Integuments im Vergleich
zum Nucellus umschließt das Integument den Nucellus nun vollständig (Abb. 15C).
Die Mikropyle, die ihre Größe nicht wesentlich verändert hat, macht aufgrund der
starken Größenzunahme der gesamten Samenanlage auf 12 mm in der Breite nun
weniger als ein Zehntel der distalen Fläche der gesamten Samenanlage aus (Abb.
15D). In diesem Stadium bildet das Integument am Mikropylenrand unregelmäßige
Zipfel aus, die aufeinander zu wachsen, bevor sie - wie später noch beschrieben - zu
einer röhrenförmigen Struktur auswachsen, die den Bestäubungstropfen hält. Durch
diese Zipfel wird die Mikropyle zwischenzeitlich verengt (Abb. 15D,F). Zeitgleich mit
den bisher beschriebenen Entwicklungsvorgängen nimmt das Integument an
Mächtigkeit zu.
Über der Nucellusspitze bleibt durch die 200µm dicke Zellschicht des Integuments
ein Kanal als Mikropyle frei (Abb. 15E, F). Dieses Stadium ist Ende Oktober erreicht.
Zu diesem Zeitpunkt setzt die weitere Differenzierung innerhalb des Nucellus mit
einer Größenzunahme der Makrospore ein (Abb. 15E). Bis Anfang Dezember zieht
sich das Integument rund um die Mikropyle zu einer kleinen Spitze aus (Abb. 16A,
B), die sich in der letzten Januarhälfte zu einer Röhre ausformt (Abb. 16C). Parallel
dazu wächst der Nucellus mit der Spitze in die Mikropyle ein (Abb. 16A, C). Zu
diesem Zeitpunkt beginnt die Alveolenbildung, d.h. durch die Bildung von Zellwänden
entwickelt sich das vielkernige Makroprothallium zu einem vielzelligen Gewebe (Abb.
16E). Vor der Alveolenbildung liegen die Zellkerne von zwölf simultanen Kernteilungen frei innerhalb der Wand der ursprünglichen Makrospore vor (Makrosporenwand
ohne Zellkerne, Abb. 16F). Ab Mitte Februar ist im Nucellus im Bereich zwischen
Makroprothallium und Mikropyle unmittelbar unterhalb letzterer die Bestäubungskammer ausgebildet (Abb. 17A). Nach der Bestäubung wachsen einige Zellen des
inneren Mikropylenrandes in die Mikropyle ein und verschließen diese dadurch (Abb.
17B, Pfeil). In diesem Stadium sind bereits die im Längsschnitt deutlich erkennbaren
Archegonien im Makroprothallium entwickelt (Abb. 17C).
ERGEBNISSE
48
Zeitgleich mit der Ausbildung der ausgezogenen Mikropyle Ende Oktober lässt sich
eine Differenzierung des Integuments in zwei Schichten erkennen (Abb. 17D). Die
Zellen der äußeren Schicht sind sehr cytoplasmareich, wohingegen die Zellen der
inneren Schicht stark vakuolisiert sind. Der äußerste Zipfel der Mikropyle wird fast
vollständig von der äußeren Schicht des Integuments gebildet, während die innere
Integumentschicht im basalen Bereich der Samenanlage die deutlich mächtigere ist
(Abb. 17E). In der Übergangszone zwischen den Schichten verläuft bei den älteren
Stadien eine dünne Schicht stark cytoplasmahaltiger Zellen (Abb. 17D, Pfeil). Diese
Schicht wird sich zum Sklerenchym entwickeln. Die innerste Integumentschicht, die
sich nicht bis in den Mikropylenbreich erstreckt (siehe Abb. 17A), besteht aus stark
vakuolisierte Zellen. Sie ist histologisch mit dem Nucellus vergleichbar und wird wie
dieser ebenfalls als Nährschicht für das wachsende Makroprothallium aufgebraucht.
Die äußerste Schicht des Integuments entwickelt sich bei Reifung der Samenanlage
zu einer fleischigen Sarkotesta.
Rund um die Samenanlage ziehen sich Leitbündel vom Funiculus bis zur Mikropyle
durch die außen liegende Schicht des Integuments. Die Leitbündel verzweigen sich
aus einem Strang, der aus dem Stiel des Sporophylls im Bogen zur Samenanlage
zieht (Abb. 17E). Im Bereich des Funiculus sind die Leitbündel noch sehr kräftig und
werden in Richtung Mikropyle immer schwächer. Bei den Leitbündeln handelt es sich
um den so genannten kollateral geschlossenen Leitbündel-Typ, bei dem das Xylem
und das Phloem direkt aneinandergrenzen. Wie üblich ist das Xylem nach innen und
das Phloem nach außen orientiert. An letzteres schließt zum Rand der Samenanlage
hin eine Schicht von parenchymatischen Zellen an (Abb. 17F).
ERGEBNISSE
Abb. 14: Zamia amblyphyllidia D.W.STEV., REM- und LM-Aufnahmen
A: Primordium einer Samenanlage Mitte Juni; B: Quergeschnittenes Primordium Anfang
Juli; C: Samenanlagenprimordium Ende Juli; D: Längsgeschnittenes Primordium Ende
Juli; E: Samenanlage Anfang August; F: Längsschnitt durch Samenanlage Anfang August
(I = Integument; Mi = Mikropyle; Mz = Makrosporenmutterzelle; Nu = Nucellus; PrSa = Primordium Samenanlage; St = Stiel)
49
ERGEBNISSE
Abb. 15: Zamia amblyphyllidia D.W.STEV., LM- und REM-Aufnahmen
A: Schwach entwickelte Samenanlage Ende Oktober im Längsschnitt; B: Samenanlage
Ende Oktober (schwach entwickelt) in der Aufsicht; C: Längsgeschnittene Samenanlage
Ende Oktober; D: Aufsicht auf Samenanlage Ende Oktober; E: Längsschnitt durch weit
entwickelte Samenanlage Ende Oktober; F: Detail Mikropyle einer weit entwickelten
Samenanlage Ende Oktober
(I = Integument; Mi = Mikropyle; Ms = Makrospore; Nu = Nucellus; Sa = Samenanlage; St
= Stiel)
50
ERGEBNISSE
Abb. 16: Zamia amblyphyllidia D.W.STEV., LM-, REM- und Binokular-Aufnahmen
A: Längsgeschnittene Samenanlage Anfang Dezember; B: Mikropyle im Detail Anfang
Dezember; C: Längsschnitt durch Samenanlage Mitte Januar; D: Detail Mikropyle Anfang
Januar; E: Detail Alveolenbildung im Makroprothallium Ende Januar, Pfeil auf Mikrotubuli
zwischen den Zellkernen; F: frei präparierte, mit Safranin angefärbte Makrosporenwand
ohne Zellkerne Mitte Januar
(I = Integument; Mi = Mikropyle; Mp = Makroprothallium; Ms = Makrospore; Nu = Nucellus;
Zk = Zellkern)
51
ERGEBNISSE
Abb. 17: Zamia amblyphyllidia D.W.STEV., LM-Aufnahmen
A: Längsschnitt Samenanlage Mitte Februar, Pfeil auf Bestäubungskammer; B: Mikropyle
Mitte März im Längsschnitt; C: Längsgeschnittene Samenanlage Mitte März; D: Detail
Integument Mitte März, Pfeil auf dünne Sklerenchymschicht; E: jüngere Sporophyllhälfte
im Längsschnitt; F: Leitbündel im Detail
(A = Archegonium, Bk = Bestäubungskammer; Hk = Harzkanal; I = Integument; Lb =
Leitbündel; Mp = Makroprothallium; Ms = Makrospore; Nu = Nucellus; Ph = Phloem; pZ =
parenchymatische Zellen; St = Stiel; Xy = Xylem)
52
ERGEBNISSE
3.1.2.
53
INTEGUMENTENTWICKLUNG BEI GINKGO BILOBA
Anfang Dezember, bevor die kältebedingte Ruhephase die Entwicklung der Samenanlagen unterbricht, hat die Differenzierung des Integuments noch nicht begonnen.
Die Primordien der Samenanlagen am distalen Ende der Sporangiophoren sind aber
bereits in der aufpräparierten Knospe zu erkennen (Abb. 18A). Die noch vollkommen
undifferenzierten Primordien erscheinen in der Frontalansicht annähernd rund (Abb.
18B). In der Aufsicht auf den Vegetationskegel erkennt man jedoch, dass sie bedingt
durch die Platzverhältnisse innerhalb der Knospe seitlich abgeplattet sind (Abb. 18A).
Im Zuge der fortschreitenden Entwicklung wächst verstärkt die vom Vegetationskegel
abgewandte Fläche, so dass sich in der Aufsicht eine mehr oder weniger dreieckige
Form des Primordiums ergibt.
Im Februar beginnt an der zum Knospenrand weisenden Fläche des Primordiums die
Differenzierung in Integument und Nucellus (Abb. 18C, Pfeil) mit einer kreisförmigen
Zone, die im Wachstum zurückbleibt (Abb. 18D, E). Dadurch entwickelt sich bis Ende
Februar eine tiefe Kerbe, die den Nucellus vom Integument trennt (Abb. 18F). In der
weiteren Entwicklung strecken sich Integument und Nucellus und die Samenanlage
nimmt zeitgleich dazu an Umfang zu, so dass die Mikropyle in Relation zur gesamten
Samenanlage kleiner wird. Ende Februar nimmt die Mikropyle in etwa die Hälfte der
distalen Fläche der Samenanlage ein (Abb. 19A). Durch das weitere Wachstum der
Samenanlage erscheint die Mikropyle bei den am weitesten entwickelten Sporangiophoren innerhalb der Knospe von Ende März nur noch wie eine winzige Öffnung,
obwohl die Breite der Mikropyle seit der Ausdifferenzierung im Februar unverändert
etwas mehr als 100 µm beträgt (Abb. 19B).
Im eben beschriebenen Stadium Ende März bildet sich von der Zone ausgehend, in
der die Samenanlagen am distalen Ende des Sporangiophors aneinandergrenzen,
ein ringförmiger Wulst (Abb. 19C). Dieser Wulst verdickt sich während der folgenden
Wochen und umwächst die Basis der Samenanlage vollständig (Abb. 20A). Er ähnelt
rein histologisch eher dem Stiel des Sporangiophors als dem Integument (Abb. 20B).
Im weiteren Wachstum der Samenanlage verändert die Mikropyle ihre anfänglich
kreisrunde Form, da das Wachstum des Integuments unregelmäßig verläuft. Durch
ein verstärktes Wachstum an den seitlichen Rändern der Mikropyle ergibt sich oft
eine zweilippige Form (Abb. 19D). Wachsen die Ränder noch weiter aufeinander zu,
entsteht eine schlitzförmige Mikropyle (Abb. 19E). Die Ausformung der Mikropyle als
ein zweilippiges Integument ist nur eine Entwicklungsmöglichkeit. Häufig entstehen
durch das Wachstum entlang des gesamten Integumentrandes oder das Aufeinanderzuwachsen mehrerer Lappen unregelmäßig geformte Mikropylen (Abb. 19F).
ERGEBNISSE
54
Ende April, wenn sich die Knospe öffnet, ist das Integument um die Mikropyle ein
kleines Stück weit ausgezogen (Abb. 20A). Dadurch entsteht ein Freiraum zwischen
dem Integument und dem distalen Ende des Nucellus (Abb. 20B). Im Zentrum des
Nucellus ist bereits die Makrosporenmutterzelle zu sehen. Der Bereich des Nucellus,
der sich distal der Makrosporenmutterzelle erstreckt, ist nicht mit dem Integument
verwachsen. Die Verwachsungszone beider Strukturen macht in diesem Stadium ca.
zwei Drittel der Länge der gesamten Samenanlage aus.
Anfang Mai ist das Integument zu einem langen Zipfel ausgezogen (Abb. 20C). Der
Nucellus hat distal eine Spitze ausgebildet, die in den entstandenen Zwischenraum
eingewachsen ist. Im Bereich der ausgezogenen Nucellusspitze ist die Bestäubungskammer zu finden, die in die Mikropyle hineinragt (Abb. 20D). Im basalen Abschnitt
des Nucellus entwickelt sich das Makroprothallium. Durch eine deutliche Streckung
der Samenanlage distal des Makroprothalliums sind Integument und Nucellus nur
noch in der basalen Hälfte der Samenanlage miteinander verwachsen. Zeitgleich zur
Ausbildung der Makrospore ist auch die gesamte basale Region gewachsen.
In den folgenden Wochen wächst die Spitze des Integuments bei einer Größenzunahme der gesamten Samenanlage nicht weiter aus, jedoch verdickt sich der Rand
des Integuments rund um die Mikropyle (Abb. 20E). Darüber hinaus ist der Integumentrand leicht nach außen gebogen, wie auch im histologischen Längsschnitt zu
sehen ist (Abb. 20F). Durch diese trichterförmige Ausgestaltung kann die Mikropyle
Bestäubungstropfen tragen, die viel größer sind als der Durchmesser der Mikropyle
(Abb. 21A). Im Laufe des Reifungsprozesses verschließt sich die Mikropyle und die
ausgezogene Spitze des Integuments ist durch die auf die anderen Bereiche beschränkte Dickenzunahme am reifen Samen nicht mehr deutlich auszumachen und
nur aufgrund einer Einbuchtung im fleischigen Integument erkennbar (Abb. 21B).
In etwa zeitgleich mit der Ausbildung der Bestäubungskammer Anfang Mai zeigt sich
eine Differenzierung des Integuments in zwei Schichten (Abb. 20D, 21C). Die innere
Schicht besteht aus stärker vakuolisierten Zellen, die Zellen der äußeren Schicht sind
cytoplasmareicher. Die äußere Schicht, die allein die Mikropyle formt, ist die mächtigere Schicht. Durch diese ziehen sich zahlreiche Harzkanäle rings um den Nucellus.
Einen Monat später ist von der inneren Schicht nichts mehr erkennbar, wohingegen
die äußere Schicht mächtiger geworden ist. Ebenso sind die Harzkanäle deutlich
großlumiger als noch im Mai (Abb. 21D). Leitbündel sind im Integument weder in den
Längs- noch in den Querschnitten zu erkennen. Die Versorgung der Samenanlagen
erfolgt durch eines der zwei kräftigen Leitbündel, die sich durch den Stiel des
Sporangiophors zur Basis je einer Samenanlage ziehen (Abb. 21E). Von außen sind
dem Integument kristalline Feinstrukturen aufgelagert (Abb. 21F).
ERGEBNISSE
Abb. 18: Ginkgo biloba L., REM-Aufnahmen
A: Spiralige Anlegung der Blätter und Sporangiophore am frei präparierten Vegetationskegel Anfang Dezember; B: Sporangiophor Anfang Dezember, in der Achsel eines abpräparierten Blattes; C: Sporangiophor mit beginnender Differenzierung des Samenanlagenprimordiums (Pfeil) Mitte Februar; D: Detailausschnitt der Differenzierungszone eines
Samenanlagenprimordiums Mitte Februar; E: Weiter entwickeltes Samenanlagenprimordium Mitte Februar; F: Mikropyle Ende Februar im Detail
(B = Blatt; I = Integument; Nu = Nucellus; PrSa = Primordium Samenanlage; Sph =
Sporangiophor; St = Stiel)
55
ERGEBNISSE
Abb. 19: Ginkgo biloba L., REM-Aufnahmen
A: Aufsicht auf Samenanlagen Anfang März; B: Aufsicht auf Samenanlagen Ende März;
C: Samenanlagen Ende März, Pfeil auf ringförmige Wulst an der Basis der Samenanlage;
D: Samenanlage mit zweilippigem Integument Ende März; E: Schlitzförmige Mikropyle
einer Samenanlage Anfang April im Detail; F: Detailbild einer unregelmäßig geformten
Mikropyle Anfang April
(I = Integument; Mi = Mirkopyle; Nu = Nucellus)
56
ERGEBNISSE
Abb. 20: Ginkgo biloba L., REM-und LM-Aufnahmen
A: Samenanlage Ende April; B: Längsschnitt durch Samenanlage Ende April; C: Samenanlage Anfang Mai; D: Samenanlage von Anfang Mai im Längsschnitt, Pfeil weist auf
(artfremden?) Pollen in der Bestäubungskammer; E: Trichterförmige Mikropyle Ende Mai
im Detail; F: Längsschnitt durch Samenanlage Ende Mai
(Bk = Bestäubungskammer; I = Integument; Mi = Mikropyle; Ms = Makrospore; Nu =
Nucellus; Sa = Samenanlage; W = Wulst)
57
ERGEBNISSE
Abb. 21: Ginkgo biloba L., Fotografien, LM- und REM-Aufnahmen
A: Seitenansicht einer Samenanlage mit Bestäubungstropfen; B: Detailaufnahme einer
zugewachsenen Mikropyle bei einer reifenden Samenanlage; C: Detail des Integuments
einer längsgeschnittenen Samenanlage Anfang Mai; zwischen den Pfeilen jeweils eine
Integumentschicht; D: Längsschnitt durch eine Samenanlage Anfang Juni; E: Längsgeschnittenes Sporangiophor Ende April, Pfeile auf Leitbündel; F: Kristalline Strukturen
auf der Epidermis des Integuments
(Hk = Harzkanal; Mi = Mikropyle; Nu = Nucellus; Sa = Samenanlage; St = Stiel; W = Wulst)
58
ERGEBNISSE
3.1.3.
59
INTEGUMENTENTWICKLUNG BEI MAGNOLIA STELLATA
Die Entwicklung der Samenanlage beginnt gegen Ende des Sommers. Die gesamte
Blüte ist zu diesem Zeitpunkt in einer etwa 5 mm langen endständigen Blütenknospe
verborgen. Sie öffnet sich erst im Frühling des Folgejahres. Die Abbildung 22A zeigt
die generativen Strukturen einer Blüte von Ende August im Längsschnitt. Es wurden
alle Knospenschuppen und Blütenblätter wie auch die basal stehenden Staubblätter
abpräpariert. Anhand der restlichen Stamen ist zu erkennen, dass diese aus sehr
kurzen Filamenten und extrem lang gestreckten Antheren von ca. 2,5 mm Länge in
diesem jungen Stadium aufgebaut sind. Der Querschnitt durch eine Anthere macht
sichtbar, dass die Antheren aus zwei Theken bestehen, die durch ein Konnektiv
verbunden werden. Jede Theke setzt sich aus zwei Pollensäcken zusammen (Abb.
22B). Im abgebildeten Stadium sind die Pollensäcke erst 100 µm breit und enthalten
noch keinen Pollen, sondern die Mirkosporenmutterzellen, aus denen sich je vier
Pollenkörner entwickeln werden. In Abbildung 22B ist ein längsgeschnittenes Karpell
von Ende August mit einem noch völlig undifferenzierten Samenanlagenprimordium
gezeigt (Abb. 22C). Auch anhand der rasterelektronischen Bilder zu freipräparierten
geringfügig älteren Primordien der Samenanlagen von Anfang September ist sowohl
in der Aufsicht wie auch anhand der Detailaufnahme keinerlei Differenzierung zu
erkennen (Abb. 22D, E). Die Primordien der Samenanlagen sind im undifferenzierten
Zustand etwa 50 µm breit und erstrecken sich über 100 µm entlang der Karpellwand.
Die Karpelle haben auf Höhe der Samenanlagenprimordien eine Breite von 400 µm.
Bis Ende September nehmen die Karpelle und Samenanlagenprimordien weder an
Größe zu noch verändert sich der Differenzierungsgrad der Primordien deutlich (Abb.
23A). Dennoch enthalten einige der nur geringfügig weiter entwickelten Karpelle im
basalen Abschnitt der Blütenachse Samenanlagenprimordien mit einer beginnenden
Differenzierung. Der in Abbildung 23B dargestellte Längsschnitt durch ein Karpell
Ende September zeigt ein solches Samenanlagenprimordium, bei dem sich das
innere Integument als eine erste kleine Wölbung vom restlichen Nucellus absetzt.
Bereits zwei Wochen später, Anfang Oktober, ist diese Differenzierung sogar schon
deutlich an weniger weit entwickelten Primordien zu erkennen.
Die Anfang Oktober weniger weit entwickelten Karpelle sind im Bereich der Samenanlagen Primordien bis zu 500 µm Breite gewachsen; die Primordien messen dabei
knapp 75 µm in der Breite und rund 85 µm in der Höhe (Abb. 23C). Im Detailbild in
Abbildung 23D ist zu erkennen, dass sich zentral im oberen Bereich des Nucellus die
Makrosporenmutterzelle entwickelt hat. Sie hebt sich hell von den übrigen Nucelluszellen ab, da sie weniger Cytoplasma enthält. Auf Höhe der Makrosporenmutterzelle
ist nun auch das innere Integument erkennbar. Die weit entwickelten Samenanlagen-
ERGEBNISSE
60
primordien von Anfang Oktober sind 80 µm breit und ohne den nun abzugrenzenden
Funiculus ca. 100 µm hoch. Sie sitzen in Karpellen von 600 µm Breite. Beim in Abbildung 23E gezeigten Karpellquerschnitt ist eine Samenanlage im Karpell erkennbar.
Allerdings wird anhand der angefertigten Serienschnitte deutlich, dass ein Karpell
meistens zwei Samenanlagen enthält, von denen eine jedoch verkümmern kann.
Bei den weiter entwickelten Samenanlagen von Anfang Oktober ist ein einseitiger
basaler Auswuchs der Samenanlage an der dem Funiculus gegenüber liegenden
Seite sichtbar (Abb. 23E). Dieser basale Auswuchs, der wie eine Verlängerung des
Funiculus wirkt, stellt den Entwicklungsbeginn des äußeren Integuments dar. Die
Makrosporenmutterzelle hat sich im Vergleich zu den erst weniger weit entwickelten
Samenanlagen desselben Sammeldatums nicht weiter entwickelt.
Einen Monat später, Anfang November, ist die Differenzierung der Samenanlage in
Nucellus, inneres Integument und äußeres Integument problemlos zu erkennen (Abb.
24A). Das äußere Integument setzt sich als Wulst nun auch bis zum Funiculus weiter
fort. In Kombination mit der rasterelektronenmikroskopischen Aufnahme einer zwei
Wochen älteren Samenanlage ist zu erkennen, dass sich das innere und äußere
Integument mehr oder weniger ringförmig um den Nucellus ziehen. Dabei ragt der
Nucellus zwischen den beiden Integumenten hervor (Abb. 24B). Aufgrund der ringförmigen Entwicklung des äußeren Integuments haben die Samenanlagen ihre Breite
im Laufe von vier bis sechs Wochen mit nun 160 µm mehr als verdoppelt. Auch an
Höhe haben sie in demselben Zeitraum mit einem Wachstum um etwa 50% auf ca.
150 µm deutlich zugenommen.
Die beschriebene ringförmige Struktur ist beim äußeren Integument anfangs noch im
Stielbereich unterbrochen und nur als ein erheblich niedrigerer Wall fortgesetzt, wie
anhand der Abbildung 23D zu erkennen ist. Die dort gezeigte Samenanlage stammt
von Anfang Februar und ist problemlos mit den weit entwickelten Samenanlagen von
Mitte Dezember vergleichbar, da die Art Magnolia stellata eine Winterruhe einlegt. In
Abbildung 24C ist ein Längsschnitt durch eine weit entwickelte Samenanlage von
Mitte Dezember dargestellt, bei dem erkennbar ist, dass die Makrosporenmutterzelle
an Größe zugenommen hat und nicht mehr wie anfänglich knapp 6 µm sondern gut
20 µm breit ist. Die Makrosporenmutterzelle nimmt jedoch nicht nur an Breite zu,
sondern verändert auch ihre Form. Sie entwickelt sich von einer kugeligen zu einer
lang gestreckten Zelle (Abb. 24E). Ende Februar misst sie gut 20 µm mal 30 µm. Der
Nucellus, das innere und das äußere Integument haben sich im apikalen Bereich
gestreckt, so dass die Makrosporenmutterzelle als Folge davon tiefer im Nucellus
gelegen scheint. Parallel dazu ist das äußere Integument stärker als die anderen
Strukturen in entgegengesetzter Richtung gewachsen und stellt nun die mächtigste
ERGEBNISSE
61
Struktur der Samenanlage dar. In der seitlichen Ansicht macht das äußere Integument etwa 60% der Gesamthöhe der Samenanlage aus (Abb. 24F).
Die bisher dargestellten Entwicklungsstadien beziehen sich jeweils, sofern nicht
anders erwähnt, auf das am weitesten entwickelte Stadium zu diesem bestimmten
Sammelzeitpunkt. Anhand der in Abbildung 25A gezeigten Samenanlagen von Mitte
März wird aber deutlich, dass zwei Samenanlagen einer Blüte sogar innerhalb eines
Karpells stark voneinander abweichend entwickelt sein können. Dass der gezeigte
Größenunterschied kein durch die Schnittebene hervorgerufenes Artefakt ist, wird
durch die zwei Samenanlagen desselben Sammeldatums in Abbildung 25B deutlich.
Sie sitzen gemeinsam in einem Karpell, das für die rasterelektronenmikroskopischen
Untersuchungen aufpräpariert wurde. Die rechte Samenanlage ist nur annähernd
200 µm hoch, die linke Samenanlage hat eine Höhe von mindestens 250 µm. Eine
derart weit entwickelte Samenanlage wie letztere ist auch in Abbildung 25C gezeigt.
Im Vergleich zu einer Samenanlage von Ende Februar (Abb. 24E) haben sich der
Nucellus und die beiden Integumente weiter gestreckt, so dass der unverwachsene
Bereich von Nucellus und den Integumenten nicht mehr knapp ein Drittel sondern
nun gut die Hälfte der Gesamthöhe der Samenanlage ausmacht (Abb. 25C). In der
seitlichen Ansicht wird deutlich, dass das Wachstum der Samenanlage auf der vom
Funiculus abgewandten Seite stärker gefördert wird (Abb. 25D).
Am reifen Samen Ende September sind die beschriebenen Entwicklungsvorgänge
nicht mehr nachzuvollziehen. Man erkennt lediglich eine zweigeteilte Strukturierung
in eine harte, schwarz gefärbte Samenschale, die als Sklerotesta bezeichnet wird,
und eine fleischige, den Samen umgebenden Sarkotesta, die rot gefärbt ist (Abb.
25E). An einem Samen, der in der Mitte längs durchgetrennt wurde, sieht man nach
einer kurzen Antrocknungszeit, dass der gesamte Aufbau jedoch vielschichtiger ist
(Abb. 25F). Das äußere Integument, das den größten Teil der Sarkotesta bildet, lässt
eine Trennschicht erkennen, die sich ringsum den Embryo von der Spitze des
Nucellus bis zum Funiculus zieht. Von dieser Trennschicht aus nach innen gelegen
grenzt das innere Integument an, das die Samenschale bildet. Von der Samenschale
umhüllt ist der Nucellus, der als Nährgewebe für den Embryo dient und von diesem
bereits fast vollständig aufgezerrt ist. Der Funiculus ist vollständig ausgetrocknet.
Lediglich die Leitbündel sind erhalten und als fädige Struktur an der Basis des reifen
Samens zu erkennen (Abb. 25F). An diesen Leitbündeln, die unter dem Gewicht des
Samens entspiralisiert sind, hängt der reife Samen zur besseren Präsentation für
endozoochore Verbreiter aus dem Karpell heraus.
ERGEBNISSE
Abb. 22: Magnolia stellata (SIEBOLD & ZUCC.) MAXIM, LM- und REM-Aufnahmen
A: Längsschnitt durch das Gynoeceum und Androceum einer Blütenknospe Ende August;
B: Anthere im Querschnitt; C: Längsschnitt durch ein junges Karpell Ende August; D:
Aufsicht auf die beiden Samenanlagenprimordien in einem aufpräparierten Karpell Anfang
September; E: Detailansicht der apikalen Zone eines Primordiums Anfang September
(An = Anthere; Ba = Blütenstandsachse; Fi = Filament; K = Karpell; Kon = Konnektiv;
PrSa = Primordium Samenanlage; Ps = Pollensack)
62
ERGEBNISSE
Abb. 23: Magnolia stellata (SIEBOLD & ZUCC.) MAXIM, LM-Aufnahmen
A: Quergeschnittenes Karpell Ende September; B: Längsschnitt durch ein weit entwickeltes Karpell Ende September – Pfeil weist beim Samenanlagenprimordium auf beginnende
Bildung des inneren Integuments; C: Querschnitt durch ein Karpell Anfang Oktober; D:
Detailabbildung eines schwach entwickelten Samenanlagenprimordiums Anfang Oktober;
E: Quergeschnittenes Karpell Anfang Oktober; F: Samenanlage Anfang Oktober im Detail
(aI = äußeres Integument; iI = inneres Integument; K = Karpell; Mz = Makrosporenmutterzelle; Nu = Nucellus; PrSa = Primordium Samenanlage)
63
ERGEBNISSE
Abb. 24: Magnolia stellata (SIEBOLD & ZUCC.) MAXIM, LM- und Rem-Aufnahmen
A: Längsgeschnittene Samenanlage von Anfang November im Detail; B: seitliche Ansicht
einer Samenanlage Mitte Dezember; C: Samenanlage im Längsschnitt, Mitte Dezember;
D: Aufsicht auf eine Samenanlage Anfang Februar; E: Längsschnitt durch Samenanlage
Anfang Februar; F: Samenanlage von Ende Februar in seitlicher Ansicht
(aI = äußeres Integument; iI = inneres Integument; Mz = Makrosporenmutterzelle; Nu =
Nucellus)
64
ERGEBNISSE
Abb. 25: Magnolia stellata (SIEBOLD & ZUCC.) MAXIM, LM-, REM- und BinokularAufnahmen
A: Querschnitt durch Karpell Mitte März; B: Aufsicht auf die Samenanlagen eines aufpräparierten Karpells Ende März; C: Längsgeschnittene Samenanlage Mitte März; D: Samenanlage in seitlicher Ansicht Anfang April; E: reifer Samen von Anfang November mit
aufpräparierter Sarkotesta; F: Längsgeschnittener reifer Samen Ende September
(aI = äußeres Integument; E = Endosperm; iI = inneres Integument; K = Karpell; Mp =
Makroprothallium; Mt = Makrosporentetrade; Nu = Nucellus)
65
ERGEBNISSE
3.2.
ENTWICKLUNGSGENETISCHE UNTERSUCHUNGEN
3.2.1.
MOLEKULARBIOLOGISCHE VORARBEITEN
66
Eine wesentliche Aufgabe der vorliegenden Arbeit bestand darin, ein Protokoll für die
In-situ-Hybridisierung an Gymnospermen zu erstellen. Aus diesem Grund wird auch
sehr ausführlich auf die einzelnen dafür notwendigen Arbeitsschritte eingegangen,
ungeachtet dessen, dass diese Vorgehensweise äußerst unüblich für molekularbiologische Arbeiten ist. In Hinblick auf die detaillierte Ergebnisdarstellung zu den In-situHybridisierungen (3.2.2.) sind die Ergebnisse der molekularbiologischen Vorarbeiten
in diesem Kapitel ebenso ausführlich aufgezeichnet. Sämtliche Arbeiten, die ein Genbzw. S1-Labor bedingen, wurden in den Laboren der „AG Parasitologie“ von Prof. Dr.
Schaub am Lehrstuhl für Evolutionsökologie und Biodiversität der Tiere der RuhrUniversität Bochum durchgeführt.
3.2.1.1. PRIMERDESIGN ZUR GEWINNUNG EINER MADS-BOX-C-GEN-SEQUENZ
Das in Abbildung 26 gezeigte Aminosäuren-Alignment basiert auf Ergebnissen der
In-silico-Suche in der Datenbank des „National Center for Biotechnology Information“
(NCBI) zu allen von Gymnospermen verfügbaren MADS-box-C-Gen-Sequenzen ausgehend vom 2003 von JAGER et al. veröffentlichten AGAMOUS-like MADS-box-Transkriptionsfaktor von Ginkgo biloba (Ginkgoaceae). Neben diesem sind im Alignment
drei weitere AGAMOUS-like MADS-box-Transkriptionsfaktoren von Picea mariana
(Pinaceae), das dal2-Gen von Picea abies (Pinaceae), das GGM3-Gen von Gnetum
gnemon (Gnetaceae) und die MADS-box-Transkriptionsfaktoren von Cycas edentata
(Cycadaceae) und den zwei Pinaceen Pinus resinosa und Pinus radiata enthalten.
Ergänzt werden die aus Gymnospermen isolierten Gensequenzen durch MADS-boxC-Funktions-Gene von Oryza sativa (Poaceae), Malus x domestica (Rosaceae) und
Zea mays (Poaceae). Das Alignment (Abb. 26) umfasst sowohl die MADS-, K– und IDomäne als auch knapp 100 Aminosäuren der in der Länge variablen C-terminalenRegion, die durch die rot und schwarz geschriebenen Aminosäurekürzel farblich voneinander abgegrenzt sind. Es bildet die Grundlage für das Primerdesign von MADSbox-C-Gen-Primern für Zamia amblyphyllidia (Cycadaceae).
Ebenfalls farbig markiert sind in diesem Alignment die mir von Dr. F. Vergara-Silva
zur Verfügung gestellten Primer „1-mads_for“ (blau), ein MADS-box-Gen spezifischer
PCR-forward-Primer, und „2-C_for“ (violett), ein C-Gen spezifischer Forward-Primer
für die so genannte „nested PCR“. Um die Oligonukleotid-Primer im AminosäurenAlignment einzuordnen, ist vorab ein Alignment auf Nukleotidsequenzbasis der oben
ERGEBNISSE
67
genannten Gene erstellt und mittels des Programms BIOEDIT in die in Abbildung 26
vorliegende Form umgeschrieben worden. Es wird deutlich, dass der MADS-box-Gen
spezifische Primer „1-mads_for“ in der für alle MADS-box-Gene hoch konservierten
MADS-Domäne gelegen ist, wohingegen der C-Gen spezifische Primer „2-C_for“ im
Übergang von der variablen I-Domäne zur konservierten K-Domäne ansetzt.
________________________MADS-Domäne_______________________________
I-Domäne_
C.edentata --MGRGKIEIKRIENTTNRQVTFCKRRNGLLKKAYELSVLCDAEVALIVFSSRGRLYEFANNSVKRTIERYKKTCAD-NT
C.edentate --MGRGKIEIKRIENTTNRQVTFCKRRNGLLKKAYELSVLCDAEVALIVFSSRGRLYEFANNSVKRTIERYKKTCAD-NT
G.biloba
--MGRGKIEIKRIENTTNRQVTFCKRRNGLLKKAYELSVLCDAEVALIVFSSRGRLYEFANNSVKRTIDRYKKTCAD-NS
P.mariana ------KIEIKRIENTTNRQVTFCKRRNGLLKKAYELSVLCDAEVALIVFSSRGRLYEFANHSVKRTIERYKKTCVD-NN
P.mariana --MGRGKIEIKRIENTTNRQVTFCKRRNGLLKKAYELSVLCDAEVALIVFSSRGRLYEFANHSVKRTIERYKKTCVD-NN
P.abies
--MGRGKIEIKRIENTTNRQVTFCKRRNGLLKKAYELSVLCDAEVALIVFSSRGRLYEFANHSVKRTIERYKKTCVD-NN
P.mariana --MGRGKIEIKRIENTTNRQVTFCKRRNGLLKKAYELSVLCDAEVALIVFSSRGRLYEFANHSVKRTIERYKKTCVD-NN
P.resinosa --MGRGKIEIKRIENTTNRQVTFCKRRNGLLKKAYELSVLCDAEVALIVFSSRGRLYEFANHSVKRTIERYKKTCVD-NN
P.radiata --MGRGKIEIKRIENTTNRQVTFCKRRNGLLKKAYELSVLCDAEVALIVFSSRGRLYEFANHSVKRTIERYKKTCVD-NN
G.gnemon
--MGRGKIEIKRIENTTNRQVTFCKRRNGLLKKAYELSVLCDAEVALIVFSSRGRLYEFANNSVKRTIERYRKTCAD-NN
M.domestica RKLGRGKIEIKRIENTTNRQVTFCKRRNGLLKKAYELSVLCDAEVALIVFSNRGRLYEYANNSVKGTIERYKKASAD-SS
Z.mays
---------------TTSRQVTFCKRRNGLLKKAYELSVLCDAEVALVVFSSRGRLYEYANNSVKSTIERYKKANSD-SS
O.sativa
--MGRGKIEIKRIENTTNRQVTFCKRRNGLLKKAYELSVLCDAEVALIVFSSRGRLYEYANNSVKSTVERYKKANSD-TS
Z.mays
GGRGKGKTEIKRIENTTNRQVTFCKRRNGLLKKAYELSVLCDAEVALIVFSSRGRLYEYANNSVKGTIERYKKATSDNSS
primer1-mads_for
_______
__
K-Domäne_______________________
C.edentata QGGAISESNSQ-YWQQEAGK LRQQIDILQNAN-RHLMGDALTSLSVKELKQLEIRLERGLSRVRSKKNEMLLEEIEIMQ
C.edentata QGGAISESNSQ-YWQQEAGK LRQQIDILQNAN-RHLMGDALTSLSVKELKQLEIRLERGLSRVRSKKNEMLLEEIEIMQ
G.biloba
QGGAISECNSQ-YWQQEAGK LRQQIDILQNAN-RHLMGDALTSLSVKELKQLEIRLERGISRVRSKKNEMLLEEIEIMQ
P.mariana HGGAISESNSQ-YWQQEAGK LRQQIEILQNAN-RHLMGDGLTALNIKELKQLEVRLEKGIGRVRSKKNEMLLEEIDIMQ
P.mariana HGGAISESNSQ-YWQQEAGK LRQQIEILQNAN-RHLMGDGLTALNIKELKQLEVRLEKGIGRVRSKKNEMLLEEIDIMQ
P.abies
HGGVISESNSQ-YWQQEAGK LRQQIEILQNAN-RHLMGDGLTALNIKELKQLEVRLEKGIGRVRSKKNEMLLEEIDIMQ
P.mariana HGGAISESNSQ-YWQQEAGK LRQQIEILQNAN-RHLMGDGLTALNIKELKQLEVRLEKGIGRVRSKKNEMLLEEIDIMQ
P.resinosa HGGAISESNSQ-YWQQEAGK LRQQIEILQNAN-RHLMGDGLTALNIKELKQLEVRLEKGISRVRSKKNEMLLEEIDIMQ
P.radiata HGGAISESNSQ-YWQQEAGK LRQQIDILQNAN-RHLMGDGLTALNIKELKQLEVRLEKGISRVRSKKNEMLLEEIDIMQ
G.gnemon
QGGAIAESNAQ-YWQQEAVK LKQQIDVLNNQI-RHYMGECLQSMTIKELKQLEGKLEKGLGRVRSKRNEKLLEDIDTLQ
M.domestica NTGSVSEASTQ-YYQQEAAK LRARIVKLQNDN-RNMMGDALNSMSVKDLKSLENKLEKAISRIRSKKNELLFAEIEYMQ
Z.mays
NSGTVAEVNAQ-YYQQESSK LRQMIHSLQNANTRNIVGDSIHTMGLRDLKQMEGKLEKAIIKIRARKNELLYAEVDYMQ
O.sativa
NSGTVAEVNAQ-HYQQESSK LRQQISSLQNANSRTIVGDSINTMSLRDLKQVENRLEKGIAKIRARKNELLYAEVEYMQ
Z.mays
AAGTIAEVTIQ-HYKQESARLRQQIVNLQNSN—-RALIGDSITTMSHKELKHLETRLDKALGKIRAKKNDVLCSEVEYMQ
primer2-C_for
primer-mads
_____________________
___C-terminale Domäne______
__________________________
C.edentata RREHILLAENQFLRTKIAE-YE-SNQNTNV-LIPGP--EFDALP---AFDSR-NFLHANLIEAA--AHHYTQQDQAALQL
C.edentata RREHILLAENQFLRTKIAE-YE-SNQNTNV-LIPGP--EFD ALP--AFDSR-NFLHANLIEAA--AHHYTQQDQAALQL
G.biloba
RREHILLAENQFLRTKIAE-CE-SSQNAN--MLPGP--EFD ALP--GFDSR-HFLHASIMD----AHHYAQQDQTALQL
P mariana RREHILIQENEILRSKIAE-CQ-NSHNTN--MLSAP--EYD ALP--AFDSR-NFLHANLIDAA---HHYAHQEQTTLQL
P.mariana RREHILIQENEILRSKIAE-CQ-NSHNTN--MLSAP--EYD ALP--AFDSR-NFLHANLIDAA---HHYAHQEQTTLQL
P.abies
RREHILIQENEILRSKIAE-CQ-NSHNTN--MLSAP--EYD ALP--AFDSR-NFLHANLIDAA---HHYAHQEQTTLQL
P.mariana RREHILIQENEILRSKIAE-CQ-NSHNTS--MLSAP--EYD ALP--AFDSR-NFLHANLIDAA---HHYAHQEQTTLQL
P.resinosa RREHILIQENEILRSKIAE-CQ-NSHNTN--MLSAP--EYD ALP--AFDSR-NFLHANLIDAA---HHYAHQEQTTLQL
P.radiata RREHILIQENEILRSKIAE-CQ-NSHNTN--MLSAP--EYD ALP--AFDSR-NFLHANLIDAA---HHYAHQEQTTLQL
G.gnemon
RREDNLIRENEYIRNKIAE-CQ-SHQHAN--MLTAAAVEYD AIPA-AYDSR-NFMHANLIEAAAAHHHYAQQEQTALHL
M.domestica KRELDLHNNNQLLRAKIAE-NERASRTLNV-MAGGGTSSYD ILQSQPYDSR-NYFQVNALQPN--HQYNPRHDQISLQL
Z.mays
KREMDLQTDNMYLRSKIAESNETGQPAMHMTMGAPPTSEYD HMA--PFDSR-NFLQV---SMPQ--HYSHQLQPTTLQL
O. sativa KREVELQNDNMYLRSKVVE-NERGQQPLNM-MGAASTSEYD HMVNNPYDSR-NFLQVNIMQQPQ--HYAHQLQPTTLQL
Z. mays
RREMELQNDNLYLRSRVDE-NERAQQTANM-MGAPSTSEYQ QHGFTPYDPIRSFLQFNIVQQPQ--FYSQQEDRKDFND
_rev
Abb. 26: Aminosäuren-Alignment zu MADS-box-Genen der C-Funktionsklasse von Gymnospermen und ausgewählten Angiospermen
Aminosäureabkürzungen in rot und schwarz zur optischen Abgrenzung der Domänen (I = Intervening,
K = Keratin-like); blau: Forward-Primer für MADS-box-Gene allgemein; violett: Forward-Primer speziell für C-Gene; grau: für Gymnospermen übereinstimmende Sequenzbereiche; grün: Reverse-Primer
ERGEBNISSE
68
Die ersten „nested PCRs“ mit den aufeinander abgestimmten Primern „1-mads_for“
und „2-C_for“ in Kombination mit Poly-T-Oligonukleotiden als Reverse-Primer führten
zu keinem Ergebnis. Nach dem ersten PCR-Schritt waren in der Gelelektrophorese
keine deutlichen Banden von definierter Fragmentlänge auszumachen, sondern ein
Gemisch aus DNA-Fragmenten von einer Länge zwischen 100 und 300 bp (Abb. 27).
M
47,8
50,2
51,5
52,9
54,4
55,8
[°C]
primer1-mads_for
Abb. 27: Gelelektrophorese zum 1. Schritt
der „nested-PCR“ mit den Primern
„1-mads_for“ und „Poly-T“
(M = Marker)
M
50,2
51,5
52,9
54,4
55,3
55,8
[°C]
primer2C_for
Abb. 28: Gelelektrophorese zum 2. Schritt
der „nested-PCR“ mit den Primern
„2C_for“ und „Poly-T“
(M = Marker)
Bei Einsatz dieser PCR-Produkte in der Folge-PCR waren zwar deutliche Banden
auszumachen, jedoch entsprachen die Fragmentlängen nicht denen der gesuchten
Sequenzlänge (Abb. 28). Die Klonierung und Sequenzierung der DNA-Fragmente,
die der gewünschten Sequenzlänge mit einer Differenz von ca. 100 bp am nahesten
kamen, führte zu einem Ergebnis, das leider in keinem Zusammenhang mit MADSbox-Genen stand (siehe 3.2.1.3.). Dieser Umstand machte die Synthetisierung eines
spezifischeren Reverse-Primers erforderlich.
Dazu wurde im Alignment eine Region gewählt, in der zwischen allen Sequenzen der
Gymnospermen eine 100%-ige Übereinstimmung der Aminosäurenabfolge existiert
und die zudem noch viele Aminosäuren enthält, die nur über wenige Basen-Tripletts
kodiert werden. Die gefundene Aminosäurensequenz wurde in die dazugehörenden
Nukleotidsequenzen umgeschrieben, zu denen dann wiederum der Komplementärstrang in 3`-5`Richtung gebildet wurde, um auf diesem basierend entsprechend dem
internationalen Code für degenerierte Primer die Sequenz für den Reverse-Primer
„primer-mads_rev“ ermitteln zu können (Abb. 29). Dieser Primer ist in den folgenden
nested PCRs eingesetzt worden.
ERGEBNISSE
69
A) Umschreiben der Sequenz(EEIEIMQRREH)in die jeweiligen Triplett-Codes
E
G
A
E
A
G
G
A
I
A
G
A
T
E
T
C
A
G
A
I
A
G
A
T
M
T
C
A
A
T
Q
G
C
A
R
A
G
C
A
G
R
T
C
A
G
A
G
C
G
A
T
C
A
G
A
G
B) Umschreiben der Tripletts in den „Reverse-Strang“
A
A
C
G
T
A
G
T
T
A
C
A
A
G
G
T
T
A
C
A
A
A
G
G
A
A
G
G
A
C) Umschreiben des „Reverse-Strang“ in den „Komplementärstrang“ und degenerierten Prime-Code
T
T
G
C
A
T
C
A
A
T
G
T
T
C
C
T
G
C
A
T
D
A
T
G
T
Y
A
T
T
C
C
T
T
C
T
C
C
T
A
T
Y
T
C
D
A
T
Y
T
C
Y
degen. Primer-Code
Abb. 29: Schrittweise Ermittlung eines degenerierten Reverse-Primers „primer-mads_rev“
A) Aminosäuresequenz der Primer-Region mit darunter stehenden möglichen Triplett-Codons (grau
unterlegt); B) Umschreibung des grau unterlegten Bereichs aus A) von der 5´-3´-Richtung in die
entgegengesetzte 3´-5´-Richtung; C) Bildung des Komplementärstranges zu B) unter Berücksichtigung aller möglichen Nukleotide und Übertragung in den degenerierten Primercode für die nicht
eindeutigen Nukleotidpositionen (gelb unterlegt in der grün markierten Primersequenz)
Die nun folgende „nested PCRs“ unter Einsatz des in Abbildung 29 beschriebenen
Reverse-Primers „primer-mads_rev“ führte mit den beiden wie zuvor nacheinander
eingesetzten Primern „1-mads_for“ und „2-C_for“ zum erwarteten Ergebnis von einer
isolierten Gensequenz mit ca. 200 bp Länge. Im ersten Schritt der „nested PCR“
wurden zwei auf unterschiedliche Weise gewonnene cDNAs (siehe 3.2.1.2.) als
Templates in der Temperaturgradienten-PCR eingesetzt. In der Gelelektrophorese
(Abb. 30) zeigte sich, dass die meisten PCR-Produkte im gleichen Längenbereich
liegen. Da die genaue Länge der MADS-box-Gene von Zamia amblyphyllidia jedoch
unbekannt ist, wurden für den darauf folgenden PCR-Schritt die PCR-Produkte mit
der variabelsten Fragmentlänge eingesetzt (Ansatz 2 bei 48.9°C). Diese ebenfalls mit
einem Temperaturgradienten durchgeführte PCR ergab in der Gelelektrophorese in
allen Ansätzen eine gut sichtbare, klar definierte Bande bei einer Basenlänge von
etwas mehr als 200 bp (Abb. 31).
ERGEBNISSE
48,9
50,2
51,5
70
52,9
54,4
M
48,9
50,2
51,5
52,9
54,4
M
49,8
50,2
[°C]
primer1-mads_for
primer-mads_rev
Abb. 30: Gelelektrophorese zum 1. Schritt
der „nested PCR“ mit den Primern
„1-mads_for“ und „mads_rev“
(M = Marker; links und rechts je zwei unterschiedliche cDNAs als Templates für PCR)
51,5
52,9
54,4
[°C]
primer2C_for
primer-mads_rev
Abb. 31: Gelelektrophorese zum Folgeschritt der „nested PCR“ mit
den Primern „2-C_for“ und „mads
_rev“
(M = Marker)
3.2.1.2. RNA-ISOLIERUNG UND CDNA-SYNTHESE
Die Isolierung der RNA wie auch die anschließende cDNA-Synthese sind jeweils auf
zweierlei Weisen vorgenommen worden. Zum einen wurde das Material für die RNAIsolierung entsprechend der Anleitung des „RNeasy Plant Mini Kits“ von QUIAGEN in
Stickstoff gemörsert, in ein 2 ml-Eppendorfgefäß überführt und unter Verwendung
des RLC-Puffers aufgeschlossen. Zum anderen wurde eine Methode getestet, bei
der das Pflanzenmaterial direkt im Eppendorfgefäß unter Zugabe vom RLC-Puffer
mit einem Mini-Pistill zerkleinert wurde. Mit einer RNA-Ausbeute von ca. 50 µg/ml im
Vergleich zu 154,7 µg/ml RNA (bzw. in späteren Versuchen bis zu 224,5 µg/ml RNA)
bei der Durchführung entsprechend des „RNeasy Plant Mini Kit“-Protokoll erwies sich
die alternative Methode als weniger praktikabel, so dass sie in Kapitel 2 „Material und
Methoden“ unerwähnt bleibt. Im Folgenden ist mit der RNA weitergearbeitet worden,
die mit Hilfe des Kits isoliert wurde.
Bei der cDNA-Synthese wurde ebenfalls eine Alternative zur cDNA-Synthese mittels
eines Kits („3´RACE System for Rapid Amplification of cDNA Ends“, INVITROGEN)
getestet, indem 1 µl RNA mit 1 µl dT18VN-Oligonukleotiden und 11 µl Aqua dest. für
10 Minuten bei 70°C inkubiert wurde, bevor dem Ansatz 2 µl dNTPs, 4 µl Puffer (5x)
und 1 µl Reverse Transkriptase zugegeben wurden, um 1 Stunde lang bei 42°C zu
inkubieren. Nach den anschließenden 10 Minuten Inkubationszeit bei 70°C ist die
ERGEBNISSE
71
Reaktion abgeschlossen. Wie der Abbildung 30 zu entnehmen ist, wurde in der PCR
bei dieser Methode (linke Seite) ein weniger breites Spektrum an DNA als bei der
Isolierung mittels des oben erwähnten Kits (rechte Seite) amplifiziert, so dass auch
diese Methode keine Erwähnung im Kapitel 2 der vorliegenden Arbeit findet.
3.2.1.3. KLONIERUNG UND SEQUENZIERUNG DER GEWONNENEN GENSEQUENZEN
Die im Rahmen der unter 3.2.1.1. beschriebenen „nested PCR“ gewonnenen DNAFragmente wurden nach der Gelelektrophorese aus dem Gel ausgeschnitten und
eluiert, um sie in einen pGEM-T-Easy-Vektor zu ligieren und dieses Produkt dann in
kompetente Zellen zu transformieren, die auf Nährplatten gegeben wurden, um sich
– und somit auch das Insert – exponentiell zu vermehren. Das „Picken“ der Insert
enthaltenden Kolonien ist auf zwei Weisen vorgenommen worden. Entweder nimmt
man die Kolonien ab und löst sie in 40 µl H2O, von denen 2 µl für einen PCR-Ansatz
verwendet werden und der Rest zu 600 µl LB+AMP-Nährmedium gegeben wird, oder
man löst die mittels eines abgeflämmten Zahnstochers abgenommenen Kolonien
direkt in 30 µl eines PCR-Ansatzes und gibt die restlichen am Zahnstocher haftenden
Kolonien mitsamt des Zahnstochers in 300 µl LB+AMP-Nährmedium. Bei beiden
Methoden folgte eine Inkubation der Kolonien unter Schütteln im Wärmeschrank bei
37°C. Anhand der Trübung der Nährlösung lässt sich auf die Stärke des Bakterienwachstums schließen. Beide Methoden zeigten vergleichbare positive Ergebnisse.
Der oben erwähnte PCR-Ansatz dient der Fragmentbestimmung des Inserts mittels
der M13-PCR, bei der spezielle Primer eingesetzt werden, durch die das Insert und
ein definierter, kurzer Bereich ringsum das Insert vervielfältigt werden, so dass eine
anschließende Gelelektrophorese Aufschluss über die Insertlänge gibt. Eine „nested
PCR“ ohne den speziellen Reverse-Primer „primer-mads_rev“ führte zu zahlreichen
Klonen mit einer Insertlänge von ca. 900 bp (Abb. 32).
Abb. 32: Gelelektrophorese zur Plasmid-DNA nach M13-PCR der
Klonierungsprodukte des 2.
PCR-Schrittes einer „nestedPCR“ mit den Primern „2-C_
for“ und dem Poly-T-ReversePrimer
M
1
2
3
4
5
M13-PCR, Inserts Klone 1-9
6
7
8
9
Klon 1, 3, 4, 5, 6, 7 und 9 zeigen eine
Insertlänge von ca. 900 bp,
Klon 2 ist ca. 400 bp lang,
Klon 8 ist ca. 250 bp lang.
(M = Marker, 1-9 = Klon-Nr.)
ERGEBNISSE
72
Die Länge der variablen C-terminalen Sequenz des gesuchten MADS-box-C-Gens
von Z. amblyphyllidia ist unbekannt. Der Abgleich mit bekannten Sequenzen anderer
Gymnospermen lässt jedoch eine Länge von mehr als 500 bp vermuten, so dass die
die Klone mit kürzerem Insert (= Klon 2 und 8) verworfen wurden. Von den übrigen
Klonen wurde Klon 3 exemplarisch für eine Sequenzierung in einer Übernacht-Kultur
weitervermehrt, „geprept“ (siehe 2.2.1.8.), gefällt und zur Sequenzierung versandt.
Das Sequenzierungsergebnis eines exemplarischen Klons sah so aus (Abb. 33):
madsC_Klon3
Vektor
TATGCATCCAACGCGTTGGGAGCTCTCCCATATGGTCGACCTGCAGGCGGCCGCGAATTCACTAGTGATT
Insert
GGCCACGCGTCGACTAGTACCGGCTGGTCCGCGTTGTTCGAACCCACGACGGGGCCGACGACCGCGCCTA
CCGCTGCGTGTCGCAGGAGGAGGACCCCGAGGGGATTGTGGGGATTTCGCTGTCCAAGGATCTCATGGTC
ATCGCCGGGCGGGCGCTGAGATCCAACATTACCTCGCTGGGGCCCCTCGTGCTCCCCCTTTCCGAGCAGA
TTCTGTACGCCCTGTCGGCGCTGAGGAGGAAATGGGCGGATCCGAAGGCGAGGCTTTATGTGCCGGACTT
CAAGCGCGCGTTCGAGCATTTCTGCATCCACGCGGGGGGGAGGGCCGTCATCGACGAGCTGGAGAAGAAT
TTGTCGCTGACGGAGGAGCAGGTGGAGGCCTCGCGGATGACGCTCTACCGCTTCGGGAACACCTCATCGT
CCTCGCTGTGGTACGAATTGGCTTATATTGAAGCCAAGGGGAGGATGCGGGGGGGGGATCGGGTGTGGCA
GATCGCGTTCGGGAGCGGATTCAAGTGCAATAGCGCCGTTTGGCAGGCGCTTCGCACGGTGAGGA
Vektor
???
Abb. 33:
Sequenzierungsergebnis der M13-PCR von Klon 3
schwarz: Insert = Produkt des zweiten PCR-Schritts einer „nested-PCR“ mit den Primern „2-C_for“
und einem Poly-T-Reverse-Primer; rot: Vektor
In der ermittelten Sequenz (Abb. 33) war nicht der gesamte Vektor zu finden, was auf
ein zu langes Insert für die Sequenzierung schließen lässt. Der Sequenzabgleich
über „NCBI“ (siehe 2.2.1.9.) ergab eine relativ hohe Sequenzübereinstimmung von
76% mit zahlreichen Nukleotidsequenzen von am Aufbau von Fettsäuren beteiligten
Enzymen aus unterschiedlichen Gruppen des Pflanzenreiches. Beispiele daraus sind
das der Sequenz ähnlichste „putative very long chain fatty acid condensing enzyme
CUT1“ aus der Monokotylen Hordeum vulgare L. (Poaceae), die „3-ketoacyl-CoASynthase“ aus der Dikotylen Eranthis hyemalis (L.) SALISB. (Ranunculaceae) oder die
„beta-ketoacyl-CoA-Synthase“ aus dem Lebermoos Marchantia polymorpha L. (Marchantiaceae). Da diese Enzyme in keinem Zusammenhang mit MADS-box-Genen
stehen, wurde die „nested PCR“ wie unter 3.2.1.1. beschrieben modifiziert.
ERGEBNISSE
73
Die PCR-Produkte der „nested PCR“ mit den Primern „1-mads_for“ (MADS-box-Gen
spezifischer PCR-forward-Primer) im ersten Schritt und „2-C_for“ (Forward-Primer für
MADS-box-C-Gene) im Folgeschritt sowie dem Reverse-Primer „primer-mads_rev“
führten zu DNA-Fragmenten gewünschter Länge, die wie bereits oben beschrieben
aufgearbeitet wurden. Abbildung 34 zeigt die Gelelektrophorese mit den Produkten
der M13-PCR von jeweils fünf gepickten Klonen pro Nährplatte, die einmal mit 100 µl
Bakterienlösung und einmal mit 200 µl Bakterienlösung versetzt wurde.
Abb. 34: Gelelektrophorese zur Plasmid-DNA nach M13-PCR der
Klonierungsprodukte des 2.
PCR-Schrittes einer „nestedPCR“ mit den Primern „2C_for“ und „primer-mads_rev“
Links vom Marker (M) Klone von einer
Nährplatte mit 100 µl Auftrag, rechts
davon Klone von einer Platte mit 200 µl
Auftrag an Bakterienlösung
1
2
3
4
5
M
6
M13-PCR, Inserts Klone 1-5 & 6-10
7
8
9
10
Klone 3, 5, 6-9 sind ca. 250 bp lang,
Klon 1 ist etwas kürzer,
Klon 2 etwas länger;
Klon 4 enthält wenig DNA;
Klon 10 zeigt eine Doppelbande.
Die Klone 1, 3 und 6 bis 9 wurden in einer so genannten „Miniprep“ aufgearbeitet, die
isolierte DNA gefällt und zur Sequenzierung versandt. Die erhaltenen Ergebnisse der
Sequenzierung ergaben für die Klone 1 und 6 keine verwertbaren Sequenzen. Klon 6
enthielt eine Nonsens-Sequenz, die in der Blast-Search im NCBI zu gar keinem
Ergebnis führte, wohingegen es sich bei Klon 1 um eine verunreinigte Probe handelt,
die ein Insert enthielt, das mit dem Gen „Def1“ bzw. „defensin“ aus der Raubwanze
Triatoma brasiliensis übereinstimmt. T. brasiliensis ist ein Überträger der ChagasKrankheit und stellt ein Forschungsobjekt der AG Parasitologie von Prof. Dr. Schaub
am Lehrstuhl für Evolutionsökologie und Biodiversität der Tiere der Ruhr-Universität
Bochum dar.
Die übrigen Klone 3, 7, 8 und 9 zeigen untereinander eine hohe Übereinstimmung in
ihren Sequenzen (Abb. 35) und lassen beim Abgleich mit den im „NCBI“ verfügbaren
Nukleotidsequenzen mittels der so genannten „megablast“, eine Suchform nach hoch
ähnlichen Sequenzen, eine eindeutige Zuordnung zu den MADS-box-C-Genen der
Spermatozoid befruchteten Gymnospermen Cycas edentata L. (Cycadaceae) und
Ginkgo biloba L. (Ginkgoaceae) zu. In der Abbildung 35 sind eine Sequenzen von C.
edentata und beide Sequenzen von G. biloba mit den Klonen 3, 7, 8 und 9 aligniert.
ERGEBNISSE
74
Dabei sind die übereinstimmenden Nukleotide aller Sequenzen rot unterlegt. Die
Bereiche, die nur für die Klone und die aus der gleichen Ordnung wie Z. amblyphyllidia stammende Art C. edentata übereinstimmen, sind in pink unterlegt. An fünf
Nukleotidpositionen passt die bei Z. amblyphyllidia gefundene Sequenz besser zu
den Sequenzen von G. biloba als zu C. edentata. Diese Positionen sind durch ein
darunter stehendes Ausrufungszeichen markiert. Die Sequenzabschnitte, die nur für
die Klone identisch sind, sind in hellblau unterlegt. Basen innerhalb der Klonsequenzen, die von den übrigen abweichen, sind in grün farblich hervorgehoben.
Klon 3
Klon 7
Klon 8
Klon 9
C. edentata
G. biloba
G. biloba
*589
-------AGTACTGGCAACAGGAGGCAGGAAAACTCAGGCAACAAATTGACATTGTACAAAA
-------AGTACTGGCAGCAGGAGGCAGGAAAACTCAGGCAACAAATTGACATTGTACAAAA
-------AGTATTGGCAACAGGAGGCAGGAAAACTCAGGCAACAAATTGACATTGTACAAAA
-------AGTACTGGCAGCAGGAGGCAGGAAAACTCAAGCAACAAATTGACATTGTACAAAA
AATTCTCAGTACTGGCAACAGGAGGCAGGAAAACTCAGGCAGCAGATTGACATTCTACAAAA
AATTCTCAGTACTGGCAACAGGAGGCAGGAAAACTGAGACAGCAAATTGATATTCTGCAAAA
AATTCTCAGTACTGGCAACAGGAGGCAGGAAAACTGAGACAGCAAATTGATATTCTGCAAAA
!
Klon 3
Klon 7
Klon 8
Klon 9
C. edentata
G. biloba
G. biloba
*651
*700
TGCTAACAGACACCTAATGGGAGATGCACTTACATCTTTAAGCGTAAAAGAACTTAAGCAGC
TGCTAACAGACACCTAATGGGAGATGCACTTACATCTTTAAGCGTAAAAGAACTTAAGCAGC
TGCTAACAGACACCTAATGGGAGATGCACTTACATCTTTAAGCGTAAAAGAACTTAAGCAGC
TGCTAACAGACACCTAATGGGAGATGCACTTACATCTTTAAGCGTAAAAGAACTTAAGCAGC
TGCTAACAGACACCTAATGGGAGATGCACTCACATCTTTAAGCGTAAAGGAACTTAAGCAGC
TGCAAATAGACACTTGATGGGGGACGCGCTTACATCTTTAAGTGTAAAGGAGCTTAAGCAGC
TGCAAATAGACACTTGATGGGGGACGCGCTTACATCTTTAAGTGTAAAGGAGCTTAAGCAGC
!
Klon 3
Klon 7
Klon 8
Klon 9
C. edentata
G. biloba
G. biloba
*713
*750
TTGAAATTCGACTTGAAAGAGGCCTTAGCCGAGTAAGATCGAAGAAGAACGAAATGCTTCTC
TTGAAATTCAACTTGAAAGAGGCCTTAGCCGAGTAAGATCGAAGAAGAACGAAATGCTTCTC
TTGAAATTCGACTTGAAAGAGGCCTTAGCCGAGTAAGATCGAAGAAGAACGAAATGCTTCTC
TTGAAATTCGACTTGAAAGAGGCCTTAGCCGAGTAAGATCGAAGAAGAACGAAATGCTTCTC
TTGAAATTCGACTAGAAAGAGGCCTCAGCCGAGTACGATCAAAGAAGAATGAAATGCTGCTC
TAGAAATTCGACTTGAGAGGGGCATTAGCAGGGTTCGATCAAAGAAGAATGAAATGTTGCTT
TAGAAATTCGACTTGAGAGGGGCATTAGCAGGGTTCGATCAAAGAAGAATGAAATGTTGCTT
!
!
Klon 3
Klon 7
Klon 8
Klon 9
C. edentata
G. biloba
G. biloba
*775
*800
GAAGAGATAGAGATTATGC------------------------------------------GAAGAAATAGAAATAATGC------------------------------------------GAGGAAATAGAAATAATGC------------------------------------------GAAGAAATAGAAATAATGC------------------------------------------GAAGAGATCGAGATTATGCAAAGAAGGGAACACATATTACTAGCCGAGAATCAGTTTCTTCG
GAGGAGATAGAGATTATGCAAAGAAGGGAACACATATTACTGGCGGAGAACCAGTTTCTTCG
GAGGAGATAGAGATTATGCAAAGAAGGGAACACATATTACTGGCGGAGAACCAGTTTCTTCG
!
Abb. 35: Nukleotidsequenz-Alignment der Klone 3, 7, 8 und 9 mit den MADS-box-C-Genen der
nah verwandten Gymnospermen Cycas edentata L. und Ginkgo biloba L.
Das Alignment zeigt einen Ausschnitt aus einem ca. 1200 bp (= GBM2-Gen von G. biloba) langen
Alignment. Die übertragenen Nukleotidpositionen sind „*“ markiert; rot = für alle Sequenzen identische
Nukleotide; pink = identische Sequenz der Klone mit C. edentata; hellblau = identische Klonsequenzen; grün = abweichende Nukleotidposition der Klone; „!“ = Übereinstimmung der Klone mit G. biloba
ERGEBNISSE
75
Die In-silico-Analyse in den Datenbanken des „NCBI“ mit der so genannten „blastn“Suche, die nicht nur hoch ähnliche Sequenzen erfasst, führte darüber hinaus zu zahlreichen Übereinstimmungen der im Zuge dieser Arbeit gewonnenen Klonsequenzen
mit MADS-box-C-Genen anderer Pflanzen (Abb. 36). Die größten Ähnlichkeiten sind
nach den beiden oben erwähnten Gymnospermen G. biloba und C. edentata zu den
Pinaceen zu finden, die ebenfalls Vertreter der Gymnospermen sind.
Abb. 36: In-silico-Analyse zu den Nukleotidsequenzen der Klone eines MADS-box-C-Gens von
Zamia amblyphyllidia D.W.STEV.
Die Abbildung stellt einen Screenshot zur In-silico-Analyse im „NCBI“ dar. In rot umrandet sind alle
Sequenzen, die von Gymnospermen stammen.
Bei Betrachtung der Ergebnisse der In-silico-Analyse in Abbildung 36 fällt auf, dass
eine MADS-box-C-Gen-Sequenz von C. edentata als höchste Übereinstimmung mit
der Klonsequenz an erster Stelle angezeigt wird, die anderer aber erst gegen Ende
der übrigen Gymnospermensequenzen aufgelistet ist. Das basiert auf der Ergebnisdarstellung. Es besteht zwar eine sehr hohe Übereinstimmung der Gensequenz im
isolierten Bereich des MADS-box-C-Gens von Z. amblyphyllidia mit der AG-Sequenz
von C. edentata („Max ident“ = 94%), jedoch liegt aufgrund der vielfachen Länge der
C. edentata-Sequenz die Suchüberlappung („Query coverage“) bei nur 82%.
ERGEBNISSE
76
3.2.1.4. SYNTHETISIERUNG DER SONDE
Als Template für die Sondensynthese wurde das PCR-Produkt der M13-PCR von
einem frisch abgenommenen Klon verwendet, der auf denselben Platten wie Klon 3,
7, 8 und 9 gewachsen ist. Von diesen Platten wurden mehrere Klone abgenommen
und mittels einer Plasmidcharakterisierung, einer PCR mit einem Mix aus zahlreichen
kurzen Primern, auf ihre Inserts hin überprüft, da man anhand des Bandenmusters in
der Gelelektrophorese durch den Abgleich mit den charakteristischen Bandenmuster
der bereits sequenzierten Klone auf das Insert der noch unbekannten Klone schliessen kann. Von den Klonen, die ein identisches Bandenmuster zeigten, wurde ein
Klon ausgewählt und das Insert in einer M13-PCR vervielfältigt und zur Kontrolle zum
Sequenzieren versandt. Dieser als Template für die Sondensynthese ausgewählte
Klon 13 lässt sich problemlos mit den bekannten Klonen alignieren und zeigt keine
vermehrten Abweichungen von diesen (Abb. 37).
Klon
Klon
Klon
Klon
Klon
3
7
8
9
13
AGTACTGGCAACAGGAGGCAGGAAAACTCAGGCAACAAATTGACATTGTACAAAATGCTAACAGAC
AGTACTGGCAGCAGGAGGCAGGAAAACTCAGGCAACAAATTGACATTGTACAAAATGCTAACAGAC
AGTATTGGCAACAGGAGGCAGGAAAACTCAGGCAACAAATTGACATTGTACAAAATGCTAACAGAC
AGTACTGGCAGCAGGAGGCAGGAAAACTCAAGCAACAAATTGACATTGTACAAAATGCTAACAGAC
AGTACTGGCAGCAGGAGGCAGGAAAACTCAGGCAGCAAATTGACATTGTACAAAATGCTAACAGAC
Klon
Klon
Klon
Klon
Klon
3
7
8
9
13
ACCTAATGGGAGATGCACTTACATCTTTAAGCGTAAAAGAACTTAAGCAGCTTGAAATTCGACTTG
ACCTAATGGGAGATGCACTTACATCTTTAAGCGTAAAAGAACTTAAGCAGCTTGAAATTCAACTTG
ACCTAATGGGAGATGCACTTACATCTTTAAGCGTAAAAGAACTTAAGCAGCTTGAAATTCGACTTG
ACCTAATGGGAGATGCACTTACATCTTTAAGCGTAAAAGAACTTAAGCAGCTTGAAATTCGACTTG
ACCTAATGGGAGATGCACTTACATCTTTAAGCGTAAAAGAACTTAAGCAGCTTGAAATTCGACTTG
Klon
Klon
Klon
Klon
Klon
3
7
8
9
13
AAAGAGGCCTTAGCCGAGTAAGATCGAAGAAGAACGAAATGCTTCTCGAAGAGATAGAGATTATGC
AAAGAGGCCTTAGCCGAGTAAGATCGAAGAAGAACGAAATGCTTCTCGAAGAAATAGAAATAATGC
AAAGAGGCCTTAGCCGAGTAAGATCGAAGAAGAACGAAATGCTTCTCGAGGAAATAGAAATAATGC
AAAGAGGCCTTAGCCGAGTAAGATCGAAGAAGAACGAAATGCTTCTCGAAGAAATAGAAATAATGC
AAAGAGGCCTTAGCCGAGTAAGATCGAAGAAGAACGAAATGCTTCTCGAAGAAATAGAAATCATGC
Abb. 37: Nukleotidsequenz-Alignment der Klone 3, 7, 8, 9 und 13
Das Alignment zeigt die gesamte Insert-Sequenz zu einem MADS-box-Gen der C-Funktionsklasse
von Zamia amblyphyllidia; rot = für alle Sequenzen identische Nukleotide; grün = abweichende
Nukleotidpositionen
Die Synthetisierung der Sonde wurde wie unter 2.2.1.11. beschrieben vorgenommen,
da es sich bei dem für die Klonierung verwendeten Plasmid um den pGEM-T-EasyVektor handelt. Bei diesem ist zwischen dem Insert und der Ansatzstelle für den
Forward-M13-Primer die Promotorregion für die T7-Polymerase zur Synthetisierung
der Sonde gelegen. Die Promotorregion für die SP6-Polymerase zur Synthese der
Negativkontrolle, der so genannten Sense-Sonde, liegt im Plasmid zwischen dem
Insert und der Ansatzstelle für den Reverse-Primer der M13-PCR (Abb. 38).
ERGEBNISSE
Vektor
77
M13_for
T7
Vektor
Insert
Vektor
Sp6 M13_rev
Vektor
Abb. 38: Schematische Darstellung des Plasmids im Bereich des Inserts
Das Plasmid (= pGEM-T-Easy-Vector) ist in gelb dargstellt; rot = Ansatzstellen der M13-PCRPrimer; grün = Promotorregionen für die T7- bzw. SP6-Polymerasen; blau = Insert
Die RNA-Gehaltsmessung in Anschluss an die Fällung und Lösung der Sonde ergab
eine Sondenkonzentration von 230 µg/ml. Die Konzentration der Kontrolle lag sogar
bei 350 µg/ml. Bei den späteren Sondensynthesen auf Basis desselben Templates
wurden keine RNA-Gehaltsmessungen zur Konzentrationsbestimmung durchgeführt,
sondern die für die In-situ-Hybridisierung einzusetzende Menge mittels des Dot-Blots
(siehe 3.2.1.5.) ermittelt.
3.2.1.5. DOT-BLOT
Beim Dot-Blot ermittelt man die für die In-situ-Hybridisierung einzusetzende Menge
an Sonde, indem die Reaktion zwischen Sonde, Antikörpern und Färbelösung auf
einem speziellen Filterpapier wie unter 2.2.1.12. beschrieben in vitro getestet wird. In
Abbildung 39 ist eine solche Filtermembran
nach erfolgter Reaktion dargestellt. Dieser
Dot-Blot zur zweiten synthetisierten Sonde
zeigte, dass die beiden Verdünnungen von
1:10 und 1:100 die besten Ergebnisse in
1: 10
1:1000
x
der In-situ-Hybridisierung erwarten lassen,
1:100
1:10.000
wie anhand von den zwei dunklen Punkten
zu erkennen ist. Die Detektionsreaktion mit
der 1:1000 verdünnten Sonde fiel deutlich
abgeschwächter aus. Bei der Verdünnung
von 1:10.000 ist keine Farbreaktion mehr
erkennbar. Um sparsam mit der erstellten
Sonde bzw. Kontrolle zu arbeiten, ist in den Abb. 39: „Dot-Blot“ nach erfolgter Färbereaktion
nachfolgenden In-situ-Hybridisierungen die
Verdünnung von 1:100 oder maximal 1:50 eingesetzt worden. Nachdem auch diese
Sonde nicht mehr zur Verfügung stand, ist eine neue Sonde synthetisiert worden, die
ebenfalls in einer Konzentration von 1:100 in der In-situ-Hybridisierung zum Einsatz
kam.
ERGEBNISSE
3.2.2.
78
IN-SITU-HYBRIDISIERUNG – METHODISCHE ERGEBNISSE
Die Übertragung des unveröffentlichten Protokolls „In Situ Hybridization Protocol
using Digoxigenin-labeled probes on tissue sections (Stand April 2003)“ des Labors
von DR. STEFAN GLEISSBERG am Institut für Spezielle Botanik der Universität Mainz
von krautigen Angiospermen auf die stark mit sekundären Pflanzenstoffen belastete
Gruppe der Gymnospermen machte einige Modifikationen in der Versuchsdurchführung erforderlich, die nun im Folgenden aufgezeigt und gegebenenfalls unmittelbar
diskutiert werden, so dass der Ergebnisteil 3.2.2. im Kapitel 4 („Diskussion“) keine
weitere Erwähnung findet. Die untenstehende Gliederung richtet sich der Einfachheit
halber streng nach den Gliederungspunkten unter 2.2.2. („In-situ-Hybridisierung“) im
Kapitel 2 („Material und Methoden“).
3.2.2.1. RNASEFREIE FIXIERUNG VON FRISCHMATERIAL
Nach der Probenentnahme unter Kühlung und möglichst sterilen Bedingungen wurde
für die ausstehenden In-situ-Hybridisierungen auf zwei verschiedene Weisen fixiert.
Eine Methode ist die Paraformaldehyd-Fixierung nach ZACHGO (2002), die auch bei
GLEISSBERG (2003) zum Einsatz kommt, die andere Methode stellt die seit Jahren bei
morphologischen Untersuchungen bewährte Fixierung mit einem ebenfalls frisch und
RNase frei angesetztem Formalin-Ethanol-Eisessig-Gemisch (FAA) dar. Für alle im
Rahmen der vorliegenden Arbeit untersuchten Objekte hat sich die herkömmliche
FAA-Fixierung bewährt, die jedoch durch die Kühlung der Proben durch Eis während
des Anlegens eines Vakuums, das für ein schnelleres Eindringen des Fixatives sorgt,
verfeinert wurde. Diese Fixierungsart ist mit am Lehrstuhl für Evolution und Biodiversität der Pflanzen grundsätzlich verfügbaren Substanzen durchführbar und zudem
noch kostengünstiger als die Fixierung mit Paraformaldehyd, so dass sie bei gleichen
Ergebnissen bei den In-situ-Hybridisierungen der Fixierung nach ZACHGO (2002) vorzuziehen ist.
3.2.2.2. ÜBERFÜHRUNG IN WACHS
Das Hochführen ins Intermedium Roti-Histol zur Überführung in Wachs entsprechend
des Protokolls (siehe 2.2.2.2.) verursachte trotz der zum Teil verdreifachten Inkubationszeiten während der Entwässerungsreihe keinerlei Probleme. Als problematisch
stellte sich erst die Überführung in Wachs dar. Unabhängig von der angewandten
Fixierung zeigten die Objekte im Paraplast Plus (TYCO HEALTHCARE/ KENDALL), dem
bei GLEISSBERG (2003) angegebenen Histologiewachs, extreme Schrumpfungsartefakte und waren nicht mehr für die ausstehenden In-situ-Hybridisierungen zu nutzen.
ERGEBNISSE
79
Daher wurde auf das herkömmliche Produkt zur Überführung von morphologischen
Untersuchungsobjekten in Wachs, HISTOWAX der Firma HISTOLAB PRODUCTS AB,
zurückgegriffen. Möglicherweise liegt der Grund für die Schrumpfungsartefakte nicht
am Paraplast Plus an sich sondern am Wärmeschrank, in dem die Proben lagern.
Der Wärmeschrank hat eine starke Schwankungsbreite von mehreren Grad Celcius
um die eingestellte Temperatur von 58°C, bei der ein Erstarren des Paraplast Plus
(Schmelzpunkt bei ca. 56°C) vermieden werden sollte. Ungünstigerweise darf laut
Datenblatt des Herstellers Paraplast Plus im Gegensatz zu HISTOWAX (Schmelzpunkt bei ca. 58°C) keinen Temperaturen über 62°C ausgesetzt sein, da dann mit
Veränderungen der Wachsstruktur gerechnet werden muss.
Bezüglich der Übertragung der Proben in Glasbehälter und die damit einhergehende
Überführung in Wachs wurden mehrere Methoden getestet. Beim Übertragen in die
Glasbehälter wurden die Proben zuerst mit Roti-Histol bedeckt und anschließend ist
entweder mit flüssigem Wachs oder mit Wachsflocken (Paraplast Plus) bzw. Wachskügelchen (HISTOWAX) aufgefüllt worden. Ebenso wurde beim täglichen Wechsel
entweder mit geschmolzenem oder festem Wachs das abgeschüttete Wachs wieder
aufgefüllt. Als die praktikabelste Methode erwies sich die im Protokoll nach GLEISSBERG (2003) aufgeführte Methode der Zugabe von flüssigem Wachs, da hier ein sehr
schnelles Eindringen des Wachses gewährleistet ist.
3.2.2.3. ERSTELLUNG VON PARAFFINSCHNITTEN
Die Paraffinschnitte für die In-situ-Hybridisierungen wurden am Rotationsmikrotom
MOD 1130/ Biocut (REICHERT-JUNG) erstellt, an dem ebenfalls die Serienschnitte für
die morphologischen Untersuchungen angefertigt werden. Abweichend wurde jedoch
das Transportband abmontiert, um einer Verunreinigung der Proben mit RNasen vorzubeugen. Alle anderen Mikrotomteile wurden mit Chloroform gereinigt. Angefertigt
wurden Einzelschnitte bzw. kurze Schnittbänder, die auf zweierlei Weise gestreckt
wurden. Die erste Methode, die im Labor von Dr. Stefan Gleissberg zum Einsatz
kommt, sieht folgendermaßen aus. Die Einzelschnitte werden in eine mit DEPCWasser gefüllte, sterile Wanne gegeben, die auf einer Wärmeplatte steht, so dass
das Wasser angewärmt ist. Haben sich die Schnitte im Wasser gestreckt, werden sie
nacheinander mit einem Objektträger aus dem Wasser gefischt und mitsamt des
Objektträgers zum Trocknen auf die Wärmeplatte gelegt. Diese Methode bietet bei
sehr kleinen Objekten den Vorteil, dass nur gezielte Schnitte aufgenommen werden.
Bei größeren Objekten, wie sie im Rahmen dieser Arbeit genutzt wurden, ist man
aber nicht auf Einzelschnitte angewiesen, da die wichtigen Strukturen oft in vielen
aufeinander folgenden Serienschnitten zu erkennen sind. Aus diesem Grund kam bei
ERGEBNISSE
80
der vorliegenden Arbeit nach anfänglichen Tests mit der eben geschilderten Methode
die durch die morphologischen Untersuchungen vertraute Methode zum Tragen. Bei
dieser werden die Schnittbänder auf Objektträgerlänge gekürzt oder mehrere kurze
Stücke hintereinander auf die Objektträger gelegt, anschließend mit einigen Tropfen
DEPC-Wasser versehen und zum Strecken auf einer Wärmeplatte (50°C) platziert.
Zwischen Wärmeplatte und Objektträger wurde vorab eine sterile Glasplatte gelegt.
Der Erfolg beider Methoden hängt entscheidend von der Wahl des verwendeten
Objektträgers ab. Die Objektträger müssen mit Polylysin beschichtet sein, damit die
Schnitte auf ihnen haften bleiben. Daher wurden spezielle, Polylysin-beschichtete
Objektträger bestellt. Mit dem zuerst ausgewählten Produkt gab es insbesondere bei
der zweiten Streckungsmethode Probleme, da die Objektträger derart beschichtet
waren, dass das Wasser darauf keinen gleichmäßigen Film gebildet hat, sondern
sich bei Kontakt mit dem Objektträger unmittelbar wieder tropfenförmig zusammengezogen hat. Aus diesem Grund war nicht nur die Streckung der Schnitte unmöglich,
sondern stellte sich zudem das Problem, dass das Wasser beim Zusammenziehen
die Schnitte mitzog, so dass diese umklappten, miteinander verschmolzen oder zum
Teil zerrissen. Erst durch den Einsatz der Objektträger POLYSINETM der Firma ERIE
SCIENTIFIC COMPANY, die die Adhäsionskräfte zwischen dem Objektträger und dem
Wasser verstärken, waren diese Probleme behoben.
3.2.2.4. ENTPARAFFINIERUNG UND PRÄHYBRIDISIERUNG
Die Entparaffinierung wie auch die absteigende Alkoholreihe zur Vorbereitung der
Schnitte auf die eigentliche In-situ-Hybridisierung wurden nicht variiert, da diese
Schritte vergleichbar mit der Lösungsreihe zur Entparaffinierung und Vorbereitung
auf wässrige Lösungen von den morphologischen
Untersuchungsmethode (siehe 2.1.2.) sind, die für
die im Rahmen der In-situ-Hybridisierungen untersuchten Objekte erprobt ist. Abwandlungen waren
allerdings bei der Proteinase K-Behandlung nötig.
Diese Behandlung dient dem Andauen der Schnitte
und soll wie auch der Einsatz von Triethanolaminen
mit Acetanhydriden zur Erhöhung der Permeabilität
der Zellmembranen ein problemloseres Eindringen
der Sonde während der Hybridisierungsreaktion
gewährleisten. Allerdings sind unter Verwendung
Abb. 40: Blattgewebe nach der
der Konzentrationsangaben von GLEISSBERG (2003)
Behandlung mit Proteidie Schnitte zu stark angedaut worden, so dass das
nase K
ERGEBNISSE
81
Gewebe zum Teil völlig zerstört war (Abb. 40). Nach verschiedenen von der anfangs
entsprechend des Protokolls verwendeten Konzentration von 10 µg/ml Proteinase K
abweichenden Ansätzen erwies sich die Konzentration von 5 µg/ml Proteinase K als
die geeigneteste Konzentration. Hierbei war ein einfaches Eindringen der Sonde in
den Schnitt gegeben, ohne dass das Gewebe zu stark zerstört wurde. An der Triethanolamin-Lösung (100 mM) mit 0,5%-igen Essigsäure-Anhydriden ist wie auch an
den darauf folgenden Lösungen einschließlich der aufsteigenden Alkoholreihe nichts
weiter abgewandelt worden.
3.2.2.5. HYBRIDISIERUNG
Die eigentliche Hybridisierung wurde strikt entsprechend des In-situ-HybridisierungsProtokolls von GLEISSBERG (2003) durchgeführt, da dies ein sehr sensibler Schritt im
gesamten Versuch ist. Variiert wurden allerdings die Konzentrationen der Sonde von
Verdünnungen zwischen 1:50 und 1:500 und das Volumen der auf die Objektträger
gegebenen Sonden-Hybridisierungslösung-Mixe auf bis zu 400 µl, um das Versuchsergebnis unablässig zu optimieren. Darüber hinaus fand die Hybridisierungsreaktion
anders als im Protokoll vorgegeben nicht in einem mit Parafilm abgedichtetem Gefäß
aus Glas statt, sondern in einer dicht verschließbaren Box aus Kunststoff. Diese Box
hat zwar den Nachteil, dass eine Sterilisation durch Heißluft nicht möglich ist und sie
daher durch Chloroform sterilisiert werden musste, dafür ließ sich in dieser dicht
verschließbaren Kunststoffbox hervorragend ein feucht-warmes Klima schaffen, wie
es für die Hybridisierung nötig ist. Letztendlich ist noch anzumerken, dass die halbstündige Inkubation der Schnitte in den „Humid chamber“ vor Zugabe der Sonde
nach GLEISSBERG (2003) eine Mindestangabe zu sein scheint, damit die Objektträger
im feucht-warmen Klima in der Box mit 4x SSPE benetzt werden. Während einer Insitu-Hybridisierung wurde aufgrund äußerer Umstände diese Inkubationszeit von 30
Minuten um ein Vielfaches auf mehrere Tage gestreckt, während denen regelmäßig
kontrolliert wurde, ob die Kammer noch feucht genug ist. Der Versuch wurde trotz
dieser Unterbrechung gemäß dem Protokoll fortgesetzt und führte letztendlich zu
einem positiven Ergebnis mit einem allerdings nur sehr schwachen Färbesignal.
3.2.2.6. ANTIKÖRPER-BEHANDLUNG
Nach einigen In-situ-Hybridisierungen, die von der zeitlichen Abfolge der AntikörperBehandlung und Detektion den Angaben von GLEISSBERG (2003) entsprachen, wurde
die Versuchsdauer derart gekürzt, dass in Anschluss an die 60-minütige Inkubation
der Gewebeschnitte in einer feuchten Klimakammer bei Raumtemperatur zur Antikörper-Reaktion direkt mit der Detektion fortgefahren wurde. So wird die Lagerung
ERGEBNISSE
82
der Proben über Nacht bei 4°C nach den vier 20-minütigen Waschschritten in Puffer
1 mit 0,1% Tween 20 umgangen. Da nach der Inkubation und den Waschschritten,
die zur Vorbereitung auf den Folgeschritt in Puffer 2 mit 0,1% Tween20 dienen, direkt
die Detektion folgt, sind die genannten vier Waschschritte im Abschnitt „Material und
Methoden“ (Kapitel 2) dem Abschnitt „Detektion“ (siehe 2.2.2.7.) zugeordnet. Durch
die Unterbindung der langen Lagerung der Gewebeschnitte über Nacht wurde nicht
nur die Versuchsdauer um einen Tag gekürzt, sondern auch die Gefahr vermindert,
dass die Objektträger und die darauf befindlichen Gewebeschnitte austrocknen oder
auf andere Weise Schaden nehmen könnten.
3.2.2.7. DETEKTION
Für die Detektionsreaktion, bei der ein Farbstoff spezifisch an die Antikörper bindet,
wurden verschiedene Färbemöglichkeiten getestet. So wurde wie im In-situ-Hybridisierungs-Protokoll nach GLEISSBERG (2003) angegeben die Färbetablette „SIGMA
FASTTM BCIP/NBT“ der Firma SIGMA-ALDRICH verwendet. Diese Färbetabletten sind
auf unterschiedliche Weisen gelöst worden. So wurde zum einen je eine Tablette in
10 ml Polyvinylalkohol gegeben, da dieser Stoff als Reaktionsbeschleuniger für die
Detektion gilt (ZACHGO 2002). Eine weitere Variante stellt das Lösen in 10 ml Aqua
dest. dar, das die Handhabung der gelösten Tablette erleichtert, da es im Gegensatz
zum Polyvinylalkohol nicht viskos ist. Zu guter Letzt wurde auch die vom „Dot Blot“
(siehe 2.2.1.12.) übernommene Lösungsweise in 10 ml Puffer 2 ausprobiert, deren
Vorteil darin liegen kann, dass das Färbeprodukt in der Lösung ist, in der auch die zu
detektierenden Gewebeschnitte kommen. Neben der „SIGMA FASTTM BCIP/NBT“Färbetablette ist auch die in dem „DIG Nucleic Acid Detection Kit“ der Firma ROCHE
beinhaltete NBT/BCIP-Stocklösung entsprechend der dem Kit beiliegenden Anleitung
verwendet worden.
Von allen im Rahmen dieser Arbeit getesteten Detektionslösungen wurden mit der
letztgenannten, d.h. der im Detektionskit enthaltenen Färbelösung, die schlechtesten
Ergebnisse erzielt, da bei allen Proben keine Färbung erkennbar war. Am zweitschlechtesten schnitt die Methode der in Polyvinylalkohol gelösten Färbetablette ab,
obwohl hier deutliche Färbereaktionen zu erkennen waren. Das Problem bei dieser
Methode lag an anderer Stelle. Durch die starke Viskosität des Polyvinylalkohols hat
sich die Färbetablette nicht vollständig gelöst, so dass kleine Klumpen in der Lösung
verblieben, die auf die Objektträger gegeben wurde. Diese Klumpen führten zu teilweise sehr fleckigen Färbeergebnissen. Die besten Resultate wurden mit Aqua dest.
und Puffer 2 als Lösemedium für die BCIP/NBT-Färbetablette erzielt. Der Einfachheit
halber hat sich im Laufe der In-situ-Hybridisierungen das Lösen in Aqua dest. durch-
ERGEBNISSE
83
gesetzt. Die Abbildung 41 zeigt die unterschiedlichen Farbergebnisse zweier In-situHybridisierungen anhand von Digitalaufnahmen jeweils eines Kontroll-Objektträgers
und eines Objektträgers, der mit Sonde behandelt wurde. Dabei handelt es sich bei
beiden Abbildungen (41A, B) um ein Versuchsergebnis nach Einsatz einer in Aqua
dest. gelösten Färbetablette, wie auch anhand der gleichmäßigen Färberesultate zu
erkennen ist. In diesem Falle beruht die extrem unterschiedliche Färbung also nicht
auf dem zur Färbereaktion eingesetzten Medium, sondern auf einer Kombination aus
der Menge der bei der Hybridisierung eingesetzten Sonde und der Einwirkzeit, die
von Versuch zu Versuch variiert worden ist.
A
B
Abb. 41: In der In-situ-Hybridisierung unterschiedlich intensiv gefärbte Gewebeschnitte
Die Abbildung zeigt die Ergebnisse zweier In-situ-Hybridisierungen an Sporophyllen von Zamia
amblyphyllidia - der Kontroll-Objektträger ist jeweils oben, der mit der Sonde behandelte Objektträger darunter; A) intensiv gefärbtes Hybridisierungsergebnis; B) schwach gefärbtes Ergebnis
einer In-situ-Hybridisierung.
Das Stoppen der Reaktion (siehe 2.2.2.8.) war ein unproblematischer Vorgang am
Ende des mehrtägigen In-situ-Hybridisierungsversuchs, so dass nicht weiter darauf
eingegangen wird, wie auch die Lichtmikroskopie und Dokumentation (siehe 2.2.2.9.)
als eine Standardmethode der etablierten morphologischen Untersuchungen keiner
weiteren Beachtung bedarf.
ERGEBNISSE
3.2.3.
84
IN-SITU-HYBRIDISIERUNG – INHALTLICHE ERGEBNISSE
Unter diesem Gliederungspunkt werden die Ergebnisse der In-situ-Hybridisierungen
an verschiedenen Strukturen von Zamia amblyphyllidia anhand ausgewählter lichtmikroskopisch dokumentierter Gewebeschnitte dargestellt.
3.2.3.1. SPOROPHYLLE VON ZAMIA AMBLYPHYLLIDIA
Die Abbildung 42 zeigt die Ergebnisse einer In-situ-Hybridisierung zu MADS-box-CGenen an Sporophyllen von Zamia amblyphyllidia. Aus diesem Versuch resultierte
eine intensive Färbung der mit Sonde behandelten Gewebeschnitte. Die in Abbildung
43 dargestellten Hybridisierungsergebnisse zu Sporophyllen bei Z. amblyphyllidia
zeigen eine weniger intensive Färbung. In Anbetracht des nur geringfügig weniger
fortgeschrittenen Entwicklungsstandes der Sporophylle ist dennoch mit einer vergleichbaren Expressionsstärke zu rechnen.
Die in Abbildung 42 gezeigten Sporophylle wurden Anfang Mai gesammelt, in FAA
fixiert und in HISTOWAX überführt. Der Stand der Entwicklung ist mit den von Ende
Dezember bis Mitte Januar für die morphologischen Untersuchungen gesammelten
Sporophyllen vergleichbar (Abb. 16). Integument und Nucellus sind deutlich voneinander zu differenzieren, da sie nur in den basalen zwei Dritteln der Samenanlage
miteinander verwachsen sind. Zudem ist die Makrospore bereits in ein vielkerniges
Stadium übergegangen, ohne dass bislang eine Zellwandbildung stattgefunden hat.
Eine Bestäubungskammer ist noch nicht ausgebildet. Dies ist das Stadium, in dem
zahlreiche Entwicklungen sowohl in der Makrospore als auch im Nucellus initiiert
werden. In der Makrospore wird in Kürze die Alveolenbildung einsetzen, nach der die
Archegonienentwicklung beginnen kann. Vorher wird der Nucellus in die Mikropyle
einwachsen und unterhalb dieser Region eine Bestäubungskammer ausbilden (Abb.
11).
Die Abbildungen 42A und B zeigen jeweils einen Längsschnitt durch ein Sporophyll
von Z. amblyphyllidia des oben beschriebenen Entwicklungsstandes. Das Sporophyll
hat bereits eine Breite von gut 7 mm und eine Höhe von knapp 8 mm erreicht. Von
der Höhe entfallen 60% auf die Mächtigkeit des Schildes des Sporophylls während
die beiden Samenanlagen lediglich eine Länge von gut 3 mm bei einer Breite von
maximal 2,5 mm erreicht haben. Die mit der MADS-box-C-Gen-Sonde behandelte
Probe (Abb. 42A) zeigt eine deutliche Violettfärbung, die sich über den gesamten
Längsschnitt erstreckt. Die Bereiche von besonders intensiver Färbung sind die
Bereiche besonders hoher Zellteilungsaktivität (z.B. in der Makrospore), besonders
großer Zelldichte (z.B. äußere Integumentschicht) und die Bereiche mit Zellen, die
ERGEBNISSE
85
viele sekundäre Inhaltsstoffe enthalten (z.B. die bräunlich erscheinenden Haare am
Sporophyll). Dieses Färbungsmuster ist auch in der Detailaufnahme der mit Sonde
behandelten Samenanlage erkennbar (Abb. 42 C).
Die Kontroll-Längsschnitte, die abgesehen von der Zugabe einer MADS-box-C-GenSonde wie die Proben (Abb. 42 A, C) behandelte wurden, zeigen keinerlei künstliche
Färbung, so dass sie blass-bräunlich erscheinen (Abb. 42 B, D). Auch hier sind im
Längsschnitt durch das gesamte Sporophyll die Bereiche größerer Zelldicht wie auch
die Zellen mit sekundären Inhaltsstoffen deutlich dunkler, so dass das Schild des
Sporophylls auch ohne eine histologische Färbung gut erkennbar ist (Abb. 42 B). In
der sehr blassen Detailaufnahme der Samenanlage (Abb. 42 D) sind sowohl die
äußere Integumentschicht als auch die Zellkerne der Makrospore erheblich schwerer
auszumachen als in der Probe (Abb. 42 C).
Die Detailbilder zu Ausschnitten aus den Integumentwänden zeigen die Unterschiede
im Gewebe von Probe (Abb. 42 E) und Kontrolle (Abb. 42 F) auf zellulärer Ebene.
Bei der Kontrolle sehen die Zellkerne blass-braun gefärbt aus, wohingegen sie bei
der Probe eine intensiv violette Färbung angenommen haben. Auch das Cytoplasma,
das bei der Kontrolle auch in der Detailaufnahme kaum erkennbar ist, erscheint in
der Probe deutlich violett.
Das in Abbildung 43 dargestellte Sporophyll von Z. amblyphyllidia stammt nicht vom
selben Objektträger bzw. aus demselben In-situ-Hybridisierungsversuch wie das in
Abbildung 42 gezeigte Sporophyll. Es wurde in einem anderen Versuchsdurchlauf
hybridisiert, bei dem die Inkubationszeit der Färbereaktion abgekürzt worden war.
Die Sammlung der Probe sowie ihre unmittelbare Fixierung mit Paraformaldehyd
fanden Anfang November statt. Wie beim zuvor beschriebenen Sporophyll (Abb. 42)
wurde als histologisches Paraffin HISTOWAX verwendet.
Das Ende November gesammelte Sporophyll (Abb. 43) ist vom Entwicklungsstand
her gut mit den Anfang Dezember für morphologische Untersuchungen gesammelten
Sporophyllen gleichzusetzen (Abb. 15) und daher nur geringfügig jünger als das in
Abbildung 42 gezeigte Sporophyll. Dieses erkennt man zum einen an der geringeren
Größe des Sporophylls, das knapp 6 mm breit und nur rund 6 mm hoch ist, und den
kleineren Samenanlagen, die erst 2 mm breit und gerade 2,7 mm hoch sind. Zum
anderen ist bei diesen Samenanlagen auch die Makrospore in Relation zur gesamten
Samenanlage kleiner. Mit einem Durchmesser von 600 µm macht sie gerade mal ein
Drittel der Gesamtbreite der Samenanlage auf Höhe der Makrospore aus, wohingegen die Makrospore beim geringfügig weiter entwickelten Sporophyll schon einen
Anteil von 45% an der Breite der Samenanlage erreicht.
ERGEBNISSE
86
Unabhängig von den entwicklungsbedingten Unterschieden zwischen den beiden
Sporophyllen aus Abbildung 42 und 43 und der stark abweichenden Farbintensität,
sind die Hybridisierungsergebnisse bezüglich der Unterschiede zwischen der Probe
und der Kontrolle sehr gut vergleichbar. Im Längsschnitt der mit der MADS-box-CGen-Sonde behandelten Probe ist eine nur schwache Violettfärbung des gesamten
Sporophylls zu erkennen (Abb. 43A). Dennoch ergibt sich auch hier eine HellDunkel-Verteilung innerhalb des Sporophylls. Wie beim zuvor beschriebenen Sporophyll erscheinen die Bereiche mit besonders großer Zelldichte, die Bereiche mit
hoher Zellteilungsaktivität und die eingelagerten sekundären Pflanzenstoffen deutlich
dunkler im Vergleich zu den sehr hell erscheinenden großlumigen Zellen. Auch die
Samenanlage, die mit der Sonde behandelt worden ist, zeigt diese Farbverteilung
deutlich. Das Integument setzt sich aus einer dunkleren äußeren und einer helleren
inneren Schicht zusammen und innerhalb der Makrospore sind die dunkel gefärbten
Zellkerne erkennbar (Abb. 43 C).
Die beschriebene Farbverteilung ist allerdings ebenfalls bei den Längsschnitten, die
in der In-situ-Hybridisierung als Negativ-Kontrolle verwendet wurden, vorhanden
(Abb. 43 B, D). Jedoch variiert die Färbung hier nicht von einem dunklen zu einem
hellen Violett, sondern beschränkt sich auf die natürlicher Weise vorhandene Braunfärbung des gesamten Sporophylls. Kleine unregelmäßig geformte violette Flecken
auf den Kontroll-Schnitten sind deutlich als aufgelagerte Strukturen erkennbar, die
keine Farbreaktion innerhalb des Gewebes darstellen. Eine derartige Auflagerung ist
auch in Abbildung 43 A an der rechten Samenanlage zu sehen.
Die Farbunterschiede zwischen Probe und Kontrolle, die in den Längsschnitten durch
das Sporophyll bzw. durch jeweils eine Samenanlage nur schwer zu erkennen sind,
sind in den Detailaufnahmen (Abb. 43 E, F) gut ersichtlich. Die Detailaufnahmen des
Integumentgewebes, aufgenommen von je einem als Probe (Abb. 43 E) und einem
als Kontrolle (Abb. 43 F) behandelten Objektträger, zeigen die Färbungsunterschiede
auf zellulärer Ebene deutlich. Wie bei der Kontrolle der oben beschriebenen In-situHybridisierung mit dem intensiven Färbeergebnis (Abb. 42) sind auch hier in dieser
Kontrolle lediglich die Zellkerne als dunkle, braune Strukturen auszumachen (Abb. 43
F). Die Zellwände erscheinen sehr blass, das Cytoplasma ist fast nicht zu erkennen.
Bei der Probe ist insbesondere das Cytoplasma deutlich violett angefärbt, so dass
auch hier unabhängig von der Intensität der Färbung die Hybridisierung erfolgreich
verlaufen ist (Abb. 43 E).
ERGEBNISSE
Abb. 42: Zamia amblyphyllidia D.W.STEV., In-situ-Hybridisierung (LM-Aufnahmen)
A: Längsschnitt durch schwach entwickeltes Sporophyll Anfang Mai (Probe); B: Schwach
entwickeltes Sporophyll Anfang Mai im Längsschnitt (Kontrolle); C: Längsschnitt durch die
Samenanlage eines schwach entwickelten Sporophylls Anfang Mai (Probe); D: Längsgeschnittene, schwach entwickelte Samenanlage Anfang Mai (Kontrolle); E: Detail des
Integumentgewebes der Probe; F: Detail des Integumentgewebes der Kontrolle
(I = Integument; Ms = Makrospore; Nu = Nucellus; Sa = Samenanlage)
87
ERGEBNISSE
Abb. 43: Zamia amblyphyllidia D.W.STEV., In-situ-Hybridisierung (LM-Aufnahmen)
A: Längsgeschnittenes Sporophyll Anfang November (Probe); B: Längsschnitt durch ein
Sporophyll Anfang November (Kontrolle); C: Samenanlage Anfang November im Längsschnitt (Probe); D: Längsgeschnittene Samenanlage Anfang November (Kontrolle); E:
Detail des Integumentgewebes der Probe; F: Detailansicht des Integumentgewebes der
Kontrolle
(I = Integument; Ms = Makrospore; Nu = Nucellus; Sa = Samenanlage)
88
ERGEBNISSE
89
3.2.3.2. BLÄTTER VON ZAMIA AMBLYPHYLLIDIA
In Abbildung 44 sind die Ergebnisse einer In-situ-Hybridisierung dargestellt, bei der
längsgeschnittene Blattfiedern eines jungen Fiederblatts von Zamia amblyphyllidia
untersucht wurden. Neben diesen Blattlängsschnitten wurden in der für die Abbildung
44 ausgewählten In-situ-Hybridisierung auch Längsschnitte von Sporophyllen von Z.
amblyphyllidia hybridisiert. Da diese zu einem Hybridisierungsergebnis führten, das
dem in Abbildung 43 gleicht, werden diese im Folgenden nicht dargestellt.
Abbildung 44 A zeigt die Hälfte eines Längsschnitts durch ein junges Fiederblatt, das
in der In-situ-Hybridisierung mit der MADS-box-C-Gen-Sonde behandelt wurde. Die
Kontrolle, die abgesehen von der Zugabe der Sonde auf die gleiche Weise wie die
Probe behandelt wurde, wird in Abbildung 44 B gezeigt. Bei beiden Schnitten ist das
dünne Gewebe teilweise stark zerstört worden. Darüber hinaus ist sowohl bei der
Probe als auch bei der Kontrolle keine Farbreaktion erkennbar. Beide Schnitte wirken
zwar auf den ersten Blick leicht violett gefärbt, doch erweist sich dieser Eindruck bei
genauerer Untersuchung als falsch (Abb. 44 A, B).
Bei der Betrachtung der Detailabbildungen auf zellulärer Ebene, die jeweils von der
Probe (Abb. 44 C) und der Kontrolle (Abb. 44D) einen Gewebeausschnitt im Bereich
eines Leitbündels sowie ein Stück Epidermis zeigen, ist deutlich zu erkennen, dass
keine dieser Zellen violett angefärbt ist. Weder die Zellkerne noch das Cytoplasma
haben die violette Detektionslösung angelagert. Kräftig gefärbt erscheinen lediglich
einige Zellen des Leitbündels, da sie sekundäre Pflanzenstoffe beinhalten. Jedoch
handelt es sich in diesem Fall um eine Braun- und nicht um eine Violettfärbung. Die
verdickten Zellwände der Epidermis wirken grau.
ERGEBNISSE
Abb. 44: Zamia amblyphyllidia D.W.STEV., In-situ-Hybridisierung (LM-Aufnahmen)
A: Quergeschnittene Fieder eines jungen Blattes (Probe); B: Querschnitt durch eine junge
Blattfieder (Kontrolle); C: Detailaufnahme eines Leitbündels und des umliegendes Blattgewebes einer Blattfieder im Querschnitt (Probe); D: Leitbündel mit umliegendem Gewebe
einer quergeschnittenen Blattfieder im Detail (Kontrolle)
(E = Epidermis; Lb = Leitbündel)
90
DISKUSSION
4.
DISKUSSION
4.1.
EVOLUTION DES INTEGUMENTS
4.1.1.
DIE TELOMTHEORIE UND DIE MORPHOLOGIE DES INTEGUMENTS
91
Die Integumententwicklung ist im Rahmen der vorliegenden Arbeit am Beispiel der
beiden Gymnospermen Zamia amblyphyllidia D.W.STEV. und Ginkgo biloba L. wie
auch an der Angiospermen Magnolia stellata (SIEBOLD & ZUCC.) MAXIM in Hinblick auf
die 1930 von ZIMMERMANN aufgestellte Telomtheorie untersucht worden. Wie bereits
in der Einleitung (1.1.1.) beschrieben, besagt die Telomtheorie in Bezug auf die
Samenanlagenentwicklung, dass das Integument im Laufe der Evolution aus sterilen
Hülltelomen an der Basis von Sporangien durch Verwachsungsprozesse entstanden
ist. Zahlreiche Rekonstruktionen fossiler Funde scheinen diese These zu stärken. Es
ist allerdings schwierig dabei heraus zu finden, ob unbewusste und unbeabsichtigte
Interpretationen in den sowohl handwerklich als auch gedanklich anspruchsvollen
Rekonstruktionen stecken, da die bekanntesten Werke zu den frühesten fossilen
Samenanlagen erst Jahrzehnte nach der Formulierung der Telomtheorie verfasst
worden sind (ANDREWS 1963; GILLESPIE et al. 1981; VEGA & ARCHANGELSKY 1997 und
andere). Jedoch stammt die Vorstellung, dass die Bildung des Integuments von der
Basis der Samenanlage ausgeht, aller Wahrscheinlichkeit nach nicht allein von der
Betrachtung fossiler Funde. Es scheint eher nahe liegend, dass die Darstellung der
Samenanlagenentwicklung im Rahmen des Telom-Modells auf den damals bereits in
großer Zahl vorliegenden Beobachtungen der Samenanlagenentwicklung bei Angiospermen basiert, da bei diesen zumindest die Entwicklung des äußeren Integuments
deutlich erkennbar von der Basis der Samenanlage ausgeht. Ein bekanntes Werk,
das gewiss auch schon ZIMMERMANN bei der Formulierung der Telomtheorie vorlag,
stammt von COULTER & CHAMBERLAIN aus dem Jahr 1912 und befasst sich mit der
Samenanlagenentwicklung bei Angiospermen u. a. am Beispiel von Capsella bursapastoris (L.) MED.. Die Arbeit von COULTER & CHAMBERLAIN dient auch heute noch als
Vorlage für die Darstellung der Samenanlagenentwicklung bei Angiospermen in den
meisten Lehrbüchern, da sich seit der Veröffentlichung vor knapp einem Jahrhundert
Generationen von Standardlehrwerken auf diese beziehen.
Die Entwicklung des Integuments bei den zwei untersuchten Gymnospermen Ginkgo
biloba und Zamia amblyphyllidia erfolgt nicht durch eine Verwachsung von Integumentlappen, die an der Basis der Samenanlage gebildet werden. Die Beobachtung
eines solchen Verwachsungsprozesses wäre jedoch innerhalb der Gymnospermen
DISKUSSION
92
am ehesten bei diesen als ursprünglich angesehenen Gymnospermen und ihren eng
verwandten Arten zu erwarten gewesen. Die monotypische Familie der Ginkgoaceae
und die Ordnung der Cycadales, zu denen Zamia amblyphyllidia gehört, sind nämlich
die einzigen rezenten Vertreter der Spermatophyta bei denen die Befruchtung über
Spermatozoide erfolgt. Bei den untersuchten Arten handelt es sich beim Integument
um eine ringförmige Struktur, die als ganzes angelegt wird und sich gleichmäßig
weiterentwickelt, so dass die in Hinblick auf die Telomtheorie geforderten späteren
Verwachsungsprozesse nicht auch nur im Ansatz erkennbar sind. Auch bei Arten, wo
die Mikropyle in zwei Arme oder Lappen ausgezogen ist (z.B. Pinus oder Picea,
MUNDRY 2000) oder sogar weiter aufgeteilt sein kann, wie beispielsweise bei Gnetum
(MERSMANN 1998), handelt es sich bei der Ausformung der Mikropyle immer um eine
ontogenetisch späte Aufteilung einer ursprünglich glatten, ringförmigen Integumentanlage. Darüber hinaus erfolgt die Differenzierung des Integuments bei beiden im
Rahmen der vorliegenden Arbeit untersuchten Gymnospermen von der Spitze der
Samenanlagenprimordien und nicht von ihrer Basis aus, wie das für ein Integument
zu erwarten wäre, das entsprechend ZIMMERMANNs Telomtheorie aus an der Basis
der Samenanlage stehenden Hülltelomen im Verlauf der Evolution entstanden sein
soll. Bei Zamia amblyphyllidia ist zu diesem Zeitpunkt die Makrosporenmutterzelle
bereits im Nucellus zu erkennen. Laut Untersuchungen von QUISUMBING (1925; zitiert
nach SCHNARF 1937) setzt die Entwicklung der Makrosporenmutterzelle jedoch erst
nach der Differenzierung des Samenanlagenprimordiums in Nucellus und Integument
ein. Dieser Fall trifft auf Ginkgo biloba zu. Hier ist die Makrosporenmutterzelle im
Nucellus erst nach der Initiierung des Integuments erkennbar. Für beide Arten trifft
aber zu, dass die Makrosporenmutterzelle und das sich daraus entwickelnde Makroprothallium, von dem sich letztendlich der wachsende Embryo ernährt, innerhalb des
Nucellus proximal vom Ansatzpunkt des Integuments gelegen sind.
Die reifen Samen von Ginkgo und Zamia amblyphyllidia zeigen eine Dreischichtigkeit
innerhalb des Integuments. Die innerste Schicht gleicht dem Nucellusgewebe und
wird von Embryo als Nährgewebe aufgezehrt. Daran anschließend ist eine dünne,
aber sehr harte Schicht, die so genannte Sklerotesta, zu finden. Die äußere Schicht
entwickelt sich bei beiden Gymnospermen zu einer fleischigen Hülle, die als Sarkotesta bezeichnet wird. Eine ähnlich aufgebaute Hülle um den Embryo findet man
auch bei den Taxaceae. Jedoch wird bei diesen die fleischige Schicht nicht aus einer
Schicht des Integuments sondern aus einer separaten Struktur gebildet, die sich an
der Basis der Samenanlage entwickelt und als Arillus bezeichnet wird. Bei der
Gattung Taxus ist diese Struktur nicht mit dem Samen verwachsen, wohingegen bei
der Gattung Cephalotaxus eine vollständige Verwachsung beider Strukturen zu
beobachten ist (MUNDRY 2000).
DISKUSSION
93
Ähnlich stellt sich die Integumententwicklung bei der Angiospermen Magnolia stellata
dar. Anders als gemeinhin angenommen, konnte im Rahmen dieser Arbeit nicht
gezeigt werden, dass beide Integumente an der Basis der Samenanlage entstehen.
Ganz im Gegenteil dazu lassen die im Kapitel 3.1.3. gezeigten Ergebnisse für das
innere Integument auf eine Entwicklung schließen, die sehr stark an die Entwicklung
des Integuments der beiden untersuchten Gymnospermen-Arten erinnert. Auch die
wenigen in der Literatur verfügbaren Arbeiten zur Samenanlagenentwicklung bei
Magnolia widersprechen diesem Ergebnis nicht. Jedoch hat keiner der Autoren einen
Vergleich zur Samenanlagenentwicklung bei Gymnospermen gezogen. DE BOER und
BOWMAN (1972) beispielsweise geben nicht an, auf welcher Höhe des Samenanlagenprimordiums die Entwicklung des inneren Integuments initiiert wird, da sie vor
allem daran interessiert sind, dass dessen Entwicklung im subdermalem Gewebe mit
periklinen Zellteilungen beginnt und somit ein deutlicher Unterschied zur Entwicklung
des inneren Integuments mit Ursprung in der dermalen Zellschicht bei Capsella
bursa-pastoris vorliegt (ROTH 1957). Den Zeichnungen von DE BOER und BOWMAN ist
jedoch zu entnehmen, dass das innere Integument in der Mitte des Primordiums der
Samenanlage und nicht an der Basis entsteht. Deutlicher erkennbar ist dies anhand
der lichtmikroskopischen Aufnahmen zur Samenanlagenentwicklung bei Magnolia
grandiflora L. von UMEDA et al. (1994), die zudem die einzige Vergleichsbasis für die
eigenen Ergebnisse bieten. Aus den Aufnahmen ist ersichtlich, dass die Entwicklung
des inneren Integuments wie bei Magnolia stellata auf Höhe der Makrosporenmutterzelle beginnt. UMEDA et al. beschreiben diesen Entwicklungsursprung des inneren
Integuments als das Erscheinen des inneren Integuments rings um den Apex des
Samenanlagenprimordiums. Ein basaler Ursprung des inneren Integuments ist somit
auch für Magnolia grandiflora auszuschließen. Lichtmikroskopische Aufnahmen zur
Samenentwicklung bei der nicht zur Gattung Magnolia gehörenden Art Manglietia
decidua Q.Y.ZHENG (Magnoliaceae) bestätigen die im Zuge dieser Arbeit gefundenen
Ergebnisse bei Magnolia stellata ebenfalls (XIAO & XU 2006). Bei Magnolia stellata ist
zum Zeitpunkt der Initiierung des inneren Integuments im Nucellus bereits die Makrospore zu erkennen. Sie liegt wie bei den beiden untersuchten Gymnospermen in
etwa auf Höhe der Ansatzstelle des inneren Integuments. Bis zum Einsetzten der
Bildung des äußeren Integuments hat sich die Makrosporenmutterzelle vergrößert,
jedoch noch nicht geteilt.
Soweit die oben genannten Arbeiten auch Bezug auf die Entwicklung des äußeren
Integuments nehmen, belegen sie dessen basalen Ursprung. In Ergänzung dazu
zeigen die eigenen Untersuchungen, dass das äußere Integument anders als das
innere Integument nicht ringförmig sondern als ein am Funiculus unterbrochener
Ring angelegt wird. Dies kann als Folge der zu diesem Zeitpunkt bereits weitgehend
DISKUSSION
94
anatropen Lage der Samenanlage gesehen werden. Der Ursprungsort des äußeren
Integuments entspricht der in Hinblick auf die Telomtheorie geforderten basal an der
Samenanlage beginnenden Entwicklung. Jedoch fehlt wie beim inneren Integument
eine Bildung aus „Lappen“ oder Telomresten. In ebenso deutlichem Widerspruch zur
Telomtheorie steht aber der Anlegungszeitpunkt des äußeren Integuments, da auch
die Telomtheorie verlangt, dass alle Strukturen an einer Achse in der Abfolge von
unten nach oben angelegt werden. Auf die Samenanlagenentwicklung übertragen
bedeutet dies, dass zuerst das äußere Integument, daraufhin das innere Integument
und zum Schluss der Nucellus gebildet werden müssten. Allerdings wird das äußere
Integument erst angelegt, nachdem die Entwicklung des inneren Integuments bereits
eingesetzt hat. Diese offensichtliche Unstimmigkeit bleibt schon bei ANDREWS (1961),
der die Telomtheorie ZIMMERMANNs auf die Evolution der Samenanlagen projizierte,
unbeachtet. Insgesamt sind bei der Untersuchung der Entwicklung der Integumente
von Magnolia stellata - abgesehen vom Entwicklungsursprung des äußeren Integuments an der Basis der Samenanlage - keinerlei Hinweise auf eine Verwachsung
aus mehren Integumentlappen zu finden, so dass auch diese morphologische Entwicklungsreihe ebenfalls keine Indizien zur Stärkung eines Telomkonzeptes für die
Entstehung des Integuments liefert.
4.1.2.
DIE FUNKTION DES INTEGUMENTS
Eine in der Wissenschaft unkritisch reflektierte These zur Funktion des Integuments
besagt, dass das Integument die Samenanlage schützen soll. In den frühen Stadien,
in denen die Integumentbildung einsetzt, scheint ein Schutz der Samenanlage durch
das Integument jedoch aus zweierlei Gründen eher unwahrscheinlich. Zum einen ist
die als Integument bezeichnete Struktur noch parenchymatisch weich, zum anderen
werden die Nährstoffe in das Endosperm erst nach der Bestäubung oder sogar erst
nach der Befruchtung eingelagert. Da also die Samenanlagen erst mit Nährstoffen
ausgestattet werden, wenn die Entwicklung eines Embryos zu erwarten ist, macht
dieser reduzierte Nährstoffaufwand einen besonderen Schutz der Samenanlage zum
Zeitpunkt der Bestäubung überflüssig, da sie zu diesem Zeitpunkt nicht attraktiver für
Herbivore als die übrigen Blütenbestandteile ist. Hingegen ist es biologisch sinnvoll,
den reifen Samen zu schützen. Dies kann am einfachsten durch die zu diesem Zeitpunkt äußerste Schicht übernommen werden. Erst der reifende Samen wird durch
das Integument geschützt, wenn er in etwa seine endgültige Größe erreicht hat. Die
schützende Sklerenchymschicht umschließt dabei immer den Embryo und dessen
Nährgewebe. Diese harte Samenschale kann die äußerste Schicht sein, sie kann
aber auch - wie bei den Ginkgoales, den Cycadales und den Magnoliales – von einer
fleischigen, der zoochoren Ausbreitung dienlichen Schicht, der Sarkotesta, umgeben
DISKUSSION
95
sein. Es ist daher zu fragen, ob nicht andere Ursachen und funktionelle Zwänge zur
Entwicklung des Integuments geführt haben.
Sicherlich besteht eine erste und entscheidende Funktion des Integuments bei den
rezenten Gymnospermen in der Exponierung des Bestäubungstropfens, der bei den
meisten Gymnospermen zur Pollenaufnahme notwendig ist. Anders als Angiospermen bilden Gymnospermen keine Narbe als rezeptives Gewebe aus, da die Narbe
eine Bildung der Fruchtblätter ist, die wiederum nur bei den Angiospermen zu finden
sind. Bei den Gymnospermen wird der Pollen daher in der Regel durch dem Bestäubungstropfen aufgenommen. Zieht sich der Bestäubungstropfen durch Resorption
oder Austrocknung in die Mikropyle zurück, nimmt er den aufgenommenen Pollen
mit. Dabei wird nicht nach der Art des Pollens selektiert. Daher ist es vorteilhaft, den
Bestäubungstropfen so groß wie möglich zu gestalten und so lange wie möglich zu
exponieren, um die Wahrscheinlichkeit zu erhöhen, arteigenen Pollen aufzunehmen.
Zum einen besteht der Bestäubungstropfen aus einer durch einen geringen Gehalt
an Zuckern leicht viskosen, wässrigen Lösung, die das Zerfließen des Tropfens bis
zu einer gewissen Tropfengröße verhindert. Zum anderen ist mit der trichterförmigen
Ausformung der Mikropyle durch das Integument eine Struktur geschaffen worden,
die dem Bestäubungstropfen einen zusätzlichen Halt verleiht. Würde der Tropfen,
der zum größten Teil aus der Zellflüssigkeit der zur Bildung der Bestäubungskammer
aufgelösten Zellen besteht, direkt aus dem Nucellus austreten, wäre es der Pflanze
nur möglich, einen sehr kleinen und vor allem sehr flachen Tropfen zu halten. Hinzu
kommt, dass die Nucellusränder der lysogenen Öffnungszone äußert unregelmäßig
geformt sind und daher auch keine ausgeprägte Adhäsionszone zwischen dem
Bestäubungstropfen und der Samenanlage bieten wie es eine glatte Struktur tun
würde. Daher ist es nicht unwahrscheinlich, dass im Laufe der Evolution eine glatte,
starre Konstruktion rings um den sich lysogen öffnenden Bereich des Nucellus entwickelt wurde, die schon vor dem Austreten des Bestäubungstropfens gebildet wird,
damit sie diesen sofort stützen kann. Mit Hilfe einer solchen Konstruktion kann der
Bestäubungstropfen deutlich größer und runder gestaltet und auch länger und somit
erfolgreicher exponiert werden. Nicht nur durch die trichterförmige, starre Ausbildung
der Mikropyle sondern auch durch die Wendung der gesamten Samenanlage wurden
verschiedene Wege zur Exponierung von besonders großen Bestäubungstropfen
geschaffen. Durch die Umwendung der Samenanlage wird der Bestäubungstropfen
zusätzlich in einen vor Wind und Verdunstung geschützten Raum verlagert. Im Zuge
der Evolution sind verschiedenartige Ausbildungen der Mikropyle geschaffen worden
wie beispielsweise die papillöse Mikropyle der Lacrioideae oder Mikropyle von Pinus,
die zwei Ärmchen ausbildet. Die große Radiation dieses Organs ist ein starkes Indiz
für die enorme Bedeutung, die das Integument für den Bestäubungsvorgang bei den
DISKUSSION
96
Gymnospermen einnimmt. Daraus darf allerdings nicht zwangsläufig geschlossen
werden, dass das Integument zur Bildung einer Haltestruktur für den Bestäubungstropfen zielgerichtet evoluiert wurde.
Ein weiterer Denkansatz zur funktionellen Evolution des Integuments befasst sich mit
dem Öffnungsmechanismus des Nucellus, der mit dem Makrosporangium der Farne
zu homologisieren ist. Die Sporangien der Farne öffnen beispielsweise über AnulusZellen. Bei einigen rezenten Pteridophyten wie z.B. Trichomanes sind diese Zellen
ringförmig um das distale Ende des Sporangiums angeordnet. Da solche Strukturen
in den Samenanlagen der rezenten Gymnospermen aber nicht einmal rudimentär zu
erkennen sind, ist zu schlussfolgern, dass eine andere Struktur die Öffnungsfunktion
übernommen haben muss, damit dem Pollen bzw. den aus dem Pollen entlassenen
Spermatozoiden ein Weg zu den sich im Sporangium entwickelnden Archegonien frei
gehalten wird. Die Funktion des Integuments könnte also bei den ursprünglichen
Samenanlagen darin gelegen haben, als Ergänzung zum extrem weichen Gewebe
des Nucellus eine starrere Struktur zu bilden, die mittels einer speziellen Öffnung (=
Mikropyle) den Kontakt zur Außenwelt sichert. Dieser Kontakt ist dadurch notwendig
geworden, dass anders als bei den Farnen keine Sporen aus den Sporangien mehr
entlassen wurden und außerhalb keimten, sondern die ganze Sporenentwicklung mit
Makroprothalliumsentwicklung und Bildung der Archegonien in stark reduzierter Form
in den Nucellus verlagert worden ist. Durch diese Verlagerung ins Innere der Pflanze
musste gewährleistet sein, dass die Mikrosporen ebenfalls in den Nucellus gelangen
können.
4.1.3.
ÄUßERES INTEGUMENT UND EPIMATIUM IM VERGLEICH
Bei der Betrachtung der Entwicklung des äußeren Integuments von Magnolia stellata
fällt auf, dass diese sehr stark an die Entwicklung vom Epimatium (Podocarpaceae)
erinnert. Das Epimatium ist wie auch der Arillus der Taxaceae bzw. Phyllocladaceae
eine oftmals fleischige und intensiv gefärbte Hüllstruktur, die die Samenanlage zum
Teil oder auch vollständig umgibt. Die Ontogenese der weiblichen Zapfen einiger
Podocarpaceen wurde bereits eingehend im Rahmen einer Diplomarbeit und einer
Dissertation am Lehrstuhl für Evolution und Biodiversität der Pflanzen untersucht
(RIEGER 2002, RESTEMEYER 2002). In Bezug auf die Ähnlichkeit der Entwicklung des
Epimatiums zum Wachstum des äußeren Integuments von Magnolia stellata sind
zwei Arten der Podocarpaceae hervorzuheben: Lagarostrobus franklinii (HOOK f.)
QUINN und Saxegothaea conspicua LINDL. Diese beiden Arten stehen jeweils in einer
monotypischen Gattungen. Bei Lagarostrobus franklinii handelt es sich um einen
langsam wachsenden mittelgroßen Baum, der in Tasmanien beheimatet ist. Die Art
DISKUSSION
97
Saxegothaea conspicua kommt im Süden Chiles sowie im angrenzenden Gebiet zu
Argentinien vor und wächst zu kleinen bis mittelgroßen Bäumen aus (FARJON 1998).
Wie auch bei der Initiierung des äußeren Integuments von Magnolia stellata beginnt
die Entwicklung des Epimatiums bei den beiden oben genannten Podocarpaceen mit
einer mehr oder weniger ringförmigen Struktur an der Basis der Samenanlage, die zu
diesem Zeitpunkt bei den drei verglichenen Arten eine beginnende Differenzierung in
Nucellus und Integument zeigt. Dieser Auswuchs an der Basis der Samenanlage ist
zu Beginn noch nicht ringförmig. Bei Magnolia stellata ist dieser Ring im Bereich des
Funiculus unterbrochen (vgl. Abb. 24D). Bei beiden Podocarpaceen ist dieser Ring in
der Zone abgeplattet, in der die Samenanlage der
Samenschuppe anliegt. Abbildung 45 zeigt eine
sehr junge, kaum differenzierte Samenanlage von
Saxegothaea conspicua auf der aus dem Zapfen
freipräparierten Samenschuppe für ein besseres
räumliches Verständnis in der Übersicht (RESTEMEYER 2002). In Abbildung 46 ist ein Ausschnitt
aus der vollständigen morphologischen Reihe zur
Anlegung der Samenanlagen von Lagarostrobus
Abb. 45: Samenschuppe von
franklinii aus der Dissertation von RESTEMEYER
Saxegothaea conspidargestellt. Vergleicht man diese rasterelektronencua LINDL., REM
(Quelle: RESTEMEYER 2002)
mikroskopischen Aufnahmen mit den Aufnahmen
zur Entwicklung der Samenanlagen bei Magnolia
stellata (Abb. 24, 25), ist die verblüffende Ähnlichkeit dieser Entwicklungen nicht zu
übersehen.
E
E
E
I
I
Nu
Nu
I
Abb. 46: Morphologische Reihe zur Entwicklung der Samenanlagen bei Lagarostrobus
franklinii (HOOK f.) QUINN, REM
Die in der Aufsicht erkennbaren Strukturen sind in den übernommen Abbildungen C-E jeweils
von außen nach innen: Epimatium (E) Integument (I) Nucellus (Nu)
(Quelle: RESTEMEYER 2002, Beschriftung ergänzt)
DISKUSSION
98
Zur Klärung der nun zwangsläufig aufkommenden Frage, inwieweit das Epimatium
von Lagarostrobus franklinii bzw. auch von Saxegothaea conspicua mit dem äußeren
Integument von Magnolia stellata vergleichbar ist, müssen die Funktionen der beiden
Strukturen geklärt sein. Hierbei wird es schwierig, da zur Funktion beider Strukturen
nur sehr unvollständige Daten in der Literatur vorliegen. Im Allgemeinen wird aber
angenommen, dass das äußere Integument bei Magnolia stellata als Attraktion für
samenausbreitende Tiere dient. Dafür spricht neben der auffällige Färbung und der
fleischigen Beschaffenheit auch die Präsentation der reifen Samen außerhalb des
Karpells (vgl. Abb. 12C). Darüber hinaus unterstützt die im Rahmen dieser Arbeit
untersuchte Samenanlagenentwicklung bei Magnolia stellata die Annahme, dass das
äußere Integument maßgeblich an der Umwendung der Samenanlage beteiligt ist.
Besonders die letzte Funktion lässt sich nach Auswertung der Entwicklungsreihen
von Lagarostrobus franklinii und Saxegothaea conspicua ebenso auf das Epimatium
projizieren. Betrachtet man das äußere Integument der Angiospermen als eine dem
Epimatium der Podocarpaceen homologe Struktur, würde das bedingen, dass beide
Strukturen auf eine gemeinsame Vorläuferstruktur zurückzuführen sind, die vor der
evolutiven Trennung von Gymnospermen und Angiospermen existiert haben muss.
Ebenso ist denkbar, dass die „Hülle“ um die Samenanlage aus einer konvergenten
Entwicklung resultiert. Allein bei den Gymnospermen muss eine Hüllstruktur in Form
vom Arillus der Taxaceae, dem Arillus der Phyllocladaceae und dem Epimatium der
Podocarpaceae mehrfach im Evolutionsverlauf entwickelt worden sein, da diese drei
Familien innerhalb der Systematik der Gymnospermen deutlich getrennt voneinander
stehen. So erscheint es mehr als wahrscheinlich, dass auch das äußere Integument
der Angiospermen keine abgeleitete Struktur darstellt, sondern als ein Neuerwerb
dieser Gruppe zu betrachten ist. So ist innerhalb der Angiospermen eine derartige
Struktur ein zweites Mal quasi als drittes Integument, wie z.B. der fleischige Arillus
der Passiofloraceen, entstanden. Trotz der verblüffenden, aber wahrscheinlich funktionsbedingten Ähnlichkeit, also nicht zwangsläufig von einer Homologie auszugehen.
4.1.4.
EIN NEUES KONZEPT ZUR EVOLUTION DES INTEGUMENTS
Die Untersuchungen zur Integumententwicklung an den zwei Gymnospermen-Arten
Ginkgo biloba und Zamia amblyphyllidia, die in unterschiedlichen je ursprünglichen
Ordnungen der Gymnospermen stehen, sowie an der über zahlreiche ursprüngliche
Merkmale verfügenden Angiospermen Magnolia stellata, ergeben keine Bestätigung
für die Telomtheorie nach ZIMMERMANN bezüglich der Entwicklung der Integumente
als ein Verwachsungsprodukt an der Basis der Samenanlage stehender Hülltelome.
Aus diesem Grund soll im Folgenden ein anderer denkbarer Evolutionsweg für die
Struktur „Integument“ aufgezeigt werden. Bei diesem Denkansatz wird davon ausge-
DISKUSSION
99
gangen, dass die im Laufe der Ontogenese nachvollziehbaren Entwicklungsschritte
auf vergleichbare Weise ebenfalls im Laufe der Evolution durchlaufen worden sind.
Dem entsprechend ist der evolutive Ursprung des Integuments nicht in einer basalen
Hüllstruktur der Samenanlage zu suchen, sondern handelt es sich beim Integument
vielmehr um eine Bildung des Nucellus. Ausgangsform war vermutlich eine anulusartige Struktur wie sie rezent in hoch spezialisierter Form bei einigen Pteridophyten,
z.B. innerhalb der Ordnung Schizaeales, zu finden ist. Eine vergleichbare ringförmige
Struktur kann verhindern, dass die lysogen entstandene Sporangienöffnung durch
das Einsinken der weichen, parenchymatischen Ränder wieder verschlossen wird.
Durch eine entsprechende Ausformung des Randes erlaubt dieser die Bildung sehr
großer Bestäubungstropfen. So gesehen ist die Mikropyle ein Teil der Öffnungsstruktur des Makrosporangiums, das bei den Spermatophyten als Nucellus bezeichnet
wird. Zum Zeitpunkt, zu dem die Mikropyle gebildet wird, ist bereits eine Mehrschichtigkeit des Integuments zu erkennen. Interessanter Weise wird die Mikropyle nur von
der Hüllstruktur, nicht aber von der späteren Nährschicht gebildet (vgl. Abb. 16A,C
oder 20F). Dabei bildet der innen liegende Bereich der Mikropyle, der zu der Struktur
umgeformt wird, die den Bestäubungstropfen hält, eine extrem glatte Oberfläche und
somit eine gute Adhäsionszone für den Bestäubungstropfen aus. Zudem ist dieser
Bereich die einzige hydrophile Zone der Epidermis der Samenanlage. Ansonsten ist
die Samenanlage wie auch alle übrigen Teile des Zapfeninneren hydrophob, so dass
der Bestäubungstropfen die angrenzenden Oberflächen nicht benetzt, sondern als
ein Tropfen in der Mikropyle akkumuliert.
Die oben beschriebenen, für die Evolution der Samenanlage postulierten Vorgänge
lassen sich anhand der Ontogenese der untersuchten Arten Zamia amblyphyllidia,
Ginkgo biloba und Magnolia stellata nachvollziehen. So bildet der Nucellus bei allen
Arten am distalen Ende eine ringförmige Struktur aus, die im weiteren ontogenetischen Entwicklungsverlauf die ursprüngliche Nucellusspitze übergipfelt und auch
die Mikropyle bildet. Die beschriebenen Vorgänge, die sich auf den distalen Bereich
der Samenanlage beschränken, lassen sich in der Aufsicht nachvollziehen. Weitere
Differenzierungsvorgänge innerhalb der Samenanlage, die sich in basaler Richtung
erstrecken, können nur anhand lichtmikroskopischer Untersuchungen nachvollzogen
werden. Durch diese wird deutlich, dass auch in dieser Richtung eine Umbildung des
äußeren Nucellusgewebes derart satt findet, dass dieses Gewebe histologisch dem
Gewebe im Mikropylenbereich gleicht. Dementsprechend sind in der Ontogenese die
Integumente von Zamia amblyphyllidia und Ginkgo biloba wie auch das innere Integument von Magnolia stellata durch eine Differenzierung des Nucellus entstanden.
Aus dieser Tatsache lässt sich schließen, dass der evolutive Weg zum Integument
ebenfalls über eine Umbildung des Nucellus bzw. des Makrosporangiums verlaufen
DISKUSSION
100
ist. Die Schemazeichnung in Abbildung 47 verdeutlicht die Beteiligung des Nucellus
an der Entwicklung des Integuments.
A
B
C
Abb. 47: Schemazeichnung zur Entwicklung des Integuments
A: Die Initialisierung des Integuments (grün) erfolgt am distalen Ende des Nucellus
(orange); B: Integumentbildung durch Ausdifferenzierung des äußeren Nucellusgewebes
in basaler Richtung; C: Relationen von Nucellus (orange), Sklerotesta (schwarz) und
Sarkotesta (grün) an einer reifen Samenanlage
Ein weiteres Indiz für die oben aufgestellte These bietet der reifende Samen. Anhand
von längs halbierten Samen lassen sich – insbesondere nach kurzer Antrocknung –
die einzelnen Integumentschichten deutlich von einander unterscheiden. Eine solche
Samenanlage zum Zeitpunkt der Bestäubungsreife von Zamia amblyphyllidia ist in
der Abbildung 48 gezeigt. Die Abbildung 48A dient der Übersicht. In Abbildung 48B
hingegen sind die entscheidenden Strukturen, auf die im Folgenden eingegangen
wird, farbig markiert. Wie in der Literatur z.B. bei SMITH 1910 beschrieben ist das
Integument in eine fleischige Sarkotesta (in grün markiert) und eine harte Sklerotesta
(Markierung in rot) differenziert. Diese beiden Schichten bilden das Integument einer
reifen Samenanlage. Bei der in Abbildung 48 gezeigten Samenanlage zum Zeitpunkt
der Bestäubung ist überall im Bereich, in dem das Integument nicht mit dem Nucellus
verwachsen ist, eine dritte Integumentschicht (in gelb markiert) zu erkennen. Diese
dritte Schicht ist nach innen gelegen und ragt nicht bis in die Mikropyle hinein. Rein
histologisch ist sie nicht vom Nucellusgewebe zu unterscheiden. Da sie während der
weiteren Entwicklung der Samenanlage vom Embryo als Nährgewebe aufgebraucht
wird, unterscheidet sie sich auch in ihrer Funktion nicht vom restlichen Gewebe des
Nucellus. Aufgrund der funktionellen und histologischen Übereinstimmung von der in
Abbildung 48B gelb markierten dritten Integumentschicht und dem Nucellus ist davon
auszugehen, dass es sich bei dieser Schicht um eine Bildung des Makrosporangiums und nicht um eine separate Struktur handelt. Betrachtet man die Herkunft dieser
einen Integumentschicht, die sich zunächst nicht vom übrigen Integument unterscheidet, ist davon auszugehen, dass es sich auch bei der Sarkotesta und der Sklerotesta
um keine separate Struktur sondern ebenfalls um eine Bildung des Nucellus handelt.
DISKUSSION
A
101
B
Abb. 48: Längshalbierte Samenanlage von Zamia amblyphyllidia D.W.STEV.
zum Zeitpunkt der Bestäubungsreife
A) Bestäubungsreife Samenanlage differenziert in Integument (I) und Nucellus
(N) mit Makroprothallium (Mp) sowie Bestäubungskammer (Pfeil)
B) Samenanlage wie bei A) mit farbig hervorgehoben Integumentschichten:
grün = Sarkotesta; rot = Sklerotesta; gelb = dem Nucellus histologisch
gleichende Nährschicht für den Embryo
Basierend auf der Ontogenese, Histogenese und Morphologie des Integuments ist
unerlässlich ein neues Konzept zur Evolution der Samenanlage aufzustellen. Anders
als bisher angenommen handelt es sich beim Integument nicht um eine separate
Struktur, die an der Basis der Samenanlage gebildet wird und diese umwächst,
sondern um eine Struktur, die ihren Ursprung an der Spitze des Nucellus hat und
sich gänzlich aus diesem entwickelt. Darüber, weshalb die Evolution überhaupt ein
Integument hervor gebracht hat, lässt sich nur spekulieren. Als sehr wahrscheinlich
erscheint es aber, dass nach dem Sesshaft werden des Makrosporangiums an der
Mutterpflanze ein System hervorgebracht werden musste, mit dessen Hilfe die
Pollenkörner auch unabhängig vom atmosphärischen Wasser am Sporangium haften
blieben und die zur Keimung notwendigen feuchten Bedingungen vorfanden. Diese
wäre durch eine lysogene Öffnungsweise des Sporangiums, das bei den Spermatophyta als Nucellus bezeichnet wird, umsetzbar. Die Bildung einer lysogenen Öffnung
des Sporangiums alleine dürfte aber unzweckmäßig gewesen sein, da das dünne
Gewebe wieder in sich zusammenfällt und die gebildete Öffnung somit selbst wieder
verschließen würde. Aufgrund dessen ist anzunehmen, dass - möglicherweise aus
einer gemeinsamen Vorläuferstruktur des Anulus der Pteridophyten abgeleitet - eine
Struktur entstanden ist, mit der das dünne Gewebe im Öffnungsbereich stabilisiert
werden konnte. Aus dieser stabilisierenden Struktur hat sich im Laufe der Evolution
das rezente Integument durch Differenzierungsvorgänge in den äußeren Schichten
des Nucellusgewebes entwickelt.
DISKUSSION
102
Einhergehend mit dem oben beschriebenen Konzept zur Evolution der Samenanlage
müssen zahlreiche fossile Funde nochmals neu interpretiert und teilweise auch neu
untersucht werden. Die eingangs im Kapitel 1.1.2. beschriebenen fossilen Strukturen
„Cupula“ und „Lagenostom“ bzw. „Salpinx“ stehen aber nicht im Widerspruch zum im
Rahmen dieser Arbeit neu entwickelten Evolutionskonzept. Vielmehr können diese
fossilen Rekonstruktionen zur Untermauerung des Konzepts herangezogen werden.
Wie schon durch TAYLOR (1981) und NIKLAS (1982) beschrieben, sind bei zahlreichen
primitiven, fossilen Samenanlagen Modifikationen am Makrosporangium zu finden,
die der Aufnahme des windverbreiteten Pollens dienlich zu sein scheinen. Sind diese
Auswüchse becher-, röhren- oder glockenförmig ausgebildet, werden sie als Salpinx
bezeichnet. Besteht die Struktur zur Aufnahme des Pollens aus der so genannten
Mittelsäule und einem umgebenden Becher bzw. Ring, spricht der Paläobotaniker
von einem Lagenostom (z.B. STEWART 1983). Beide Strukturen, Lagenostom und
Salpinx, lassen sich als unterschiedliche Entwicklungsstufen der Integumentevolution
in das neue Konzept integrieren. Die Salpinx stellt dabei eine sehr ursprüngliche Öffnungsstruktur dar, die eher als eine primitive Struktur zur Stabilisierung der lysogen
entstandenen Makrosporangienöffnung anzusehen ist. Eine etwas weiter entwickelte
Ausformung der Öffnungsregion stellt das Lagenostom dar, wenn die „Mittesäule“ als
Nucellusspitze interpretiert wird, die von einer stabilisierenden Struktur umgeben
wird. Die „becher- oder ringförmige“ Bildung des fossilen Lagenostoms, die an der
Spitze des Makrosporangiums steht und die Mittelsäule umgibt (siehe auch STEWART
& ROTHWELL 2001 oder GIFFORD & FOSTER 1996), entspricht im Rahmen des neuen
Evolutionskonzepts der Mikropyle der rezenten Spermatophyta (Abb. 49).
In der obigen Ausführung zur Interpretation fossiler Samenanlagen werden bereits
die fossilen Makrosporangien mit einer Salpinx oder einem Lagenostom am distalen
Ende als Samenanlagen interpretiert. Diese Interpretation steht im Widerspruch zu
der in der Paläobotanik anerkannten Definition für die primitiven, fossilen Samenanlagen ähnlichen Strukturen, die sich auf die Hüllstruktur um ein Makrosporangium
stützt (ROTHWELL & SCHECKLER 1988). Löst man sich von dem Gedanken, dass das
Integument aus einer mehr oder weniger verwachsenen Hüllstruktur an der Basis
eines Makrosporangiums entstanden ist, lassen sich diese Strukturen ebenfalls neuartig interpretieren. Dabei verliert beispielsweise die von LONG (1959, 1960a, 1960b)
aufgestellte hypothetische Entwicklungsreihe zur Bildung des Integuments nicht an
Bedeutung. Es muss lediglich davon ausgegangen werden, dass es sich bei der aus
mehreren Lappen verwachsenen Struktur an der Basis des Makrosporangiums nicht
um ein Integument handelt, sondern vielmehr um eine Struktur, die die aus Makrosporangium und Salpinx bzw. Lagenostom bestehende Samenanlage umgibt. Diese
Struktur könnte ein sehr primitiver Vorläufer der Blütenhülle der Angiospermen sein.
DISKUSSION
103
Betrachtet man den u.a. von LONG beschrieben Komplex aus Samenanlage und
Hüllstruktur als Samenanlage mit einer primitiven Blütenhülle, d.h. als eine primitive
eingeschlechtige Blüte, muss in dem Zug auch die Cupula weitergehend interpretiert
werden. ROTHWELL & SCHECKLER (1988) definieren die Cupula als eine Struktur, die
aus einem verzweigten Achsensystem hervorgeht und die Samenanlagen becherförmig einzeln oder in Gruppen vollständig oder nur zum Teil einhüllt. Diese Struktur
kann dabei sehr vielfältig gestaltet sein. Bei fossilen Arten, bei denen von der Cupula
nur eine einzelne „primitive Blüte“ umhüllt wird, lässt sich unter Betrachtung der
rezenten Blüten die Cupula problemlos als der erste Schritt zu einer zweiten Blütenhülle interpretieren, um beispielsweise die Attraktivität der „Blüte“ zu erhöhen. Ein
funktioneller Zusammenhang ist z.B. bei der 1944 von EMBERGER beschriebenen
Cupula von Lagenostoma lomaxi herzustellen, denn diese Cupula ist möglicherweise
als Anlockung für potentielle Bestäuber auf der Außenseite mit zerstreut verteilten
Drüsen besetzt. Die Interpretation der Cupula als zweite Blütenhülle lässt sich auch
auf die Fossilien übertragen, bei denen die Cupula nicht nur eine sondern mehrere
Samenanlagen mit primitiver Blütenhülle umschließt. Die beschriebene Erscheinung
könnte als erster Schritt zu mehrkarpelligen Blüten interpretiert werden. Genauso ist
es aber auch denkbar, dass eine Cupula aus ökonomischen Gründen mehr als eine
Samenanlage umhüllt. Die Abbildung 49 zeigt anhand von Rekonstruktionen fossiler
Funde die bislang als gültig angesehenen Interpretationen der einzelnen Strukturen
und farblich (blau) hervorgehoben die Neuinterpretationen, wie sie im Rahmen dieser
Arbeit entwickelt worden sind.
Lagenostom
Integument
Mittelsäule
Nucellusspitze
Integument
Hüllstruktur
(Blütenhülle?)
Cupula
Cupula
Integument
Hüllstruktur
Makroprothallium
Makroprothallium
A
B
Abb. 49: Rekonstruktionen fossiler Samenanlagen
A) Schemazeichung einer fossilen Samenanlage mit Lagenostom (Quelle: ROTHWELL
& SCHECKLER, in BECK 1988, Beschriftung ergänzt)
B) Rekonstruktion des Cupula-Komplexes von Archaeosperma arnoldii nach Pettit &
Beck 1968 (Quelle: STEWARD & ROTHWELL 1993, Beschriftung ergänzt)
DISKUSSION
4.2.
ENTWICKLUNGSGENETISCHE UNTERSUCHUNGEN
4.2.1.
IN-SITU-HYBRIDISIERUNGEN AN SPOROPHYLLEN VON ZAMIA
104
Die Ergebnisse der In-situ-Hybridisierung an Sporophyllen von Zamia amblyphyllidia
zum MADS-box-C-Gen zeigen, dass dieses Gen in der gesamten Samenanlage wie
auch im ganzen Sporophyll exprimiert wird (Abb. 42,43). Diese Versuchsergebnisse
stehen in keinem Widerspruch zu den Ergebnissen von In-situ-Hybridisierungen mit
verschiedenen MADS-box-C-Genen an Angiospermen. Sie lassen sich problemlos in
das ABC-Modell von COEN & MEYEROWITZ (1991) integrieren, das auf der Basis von
Knockout-Mutanten zu MADS-box-Genen der Klassen A, B und C erstellt worden ist.
In diesem Modell wird den MADS-box-C-Genen eine Beteiligung an der Steuerung
der Entwicklungsprozesse aller generativen Strukturen der Blüte zugesprochen. Die
alleinige Expression von C-Genen führt zur Bildung von weiblichen Strukturen, d.h.
von Karpellen. Findet die Expression eines C-Gens in Kombination mit einem MADSbox-B-Funktionsgen statt, so entwickeln sich die männlichen Strukturen der Blüte,
d.h. Staubgefäße. Daher überrascht es nicht, dass ein Gen aus der MADS-box-CFunktionsklasse auch in der gesamten reproduktiven Struktur einer Gymnosperme
zu finden ist.
Studien über das Vorhandensein von MADS-box-Genen aus den drei verschiedenen
Funktionsklassen bei Gymnospermen lagen schon zu Beginn der vorliegenden Arbeit
vor. Allerdings ist dabei nur vereinzelt auf die räumliche und zeitliche Verteilung der
Genexpression innerhalb der Samenanlage bzw. ihrer Trägerstruktur eingegangen
worden, so dass diese mittels der Methode der In-situ-Hybridisierung geklärt werden
sollte. Aus den Ergebnissen der Untersuchungen an Zamia amblyphyllidia lässt sich
ableiten, dass das im Rahmen dieser Arbeit isolierte MADS-box-C-Gen gleichmäßig
im gesamten Sporophyll einschließlich der Samenanlage exprimiert wird. Es konnte
auch keine gesteigerte Expression in den Bereichen festgestellt werden, in denen
zum jeweiligen Sammelzeitpunkt entscheidende Entwicklungsschritte statt gefunden
haben. Im in der Abbildung 43A gezeigten Sporophyll ist beispielsweise zu erwarten
gewesen, dass die Samenanlage eine stärkere Expression des MADS-box-C-Gens
aufweist als das Schild und der Stiel des Sporophylls, da sich zum Sammelzeitpunkt
innerhalb der Samenanlage eine Vielzahl von verschiedenen Entwicklungsschritten
vollziehen wohingegen im Schild und Stiel lediglich eine Größenzunahme statt findet.
Eine ebenso gleichmäßige Expression eines MADS-box-C-Gens (CyAG) ist auch am
reifen Samen einer nahverwandten Art, der Cycadaceae Cycas edentata L., deutlich
zu erkennen (ZHANG et al. 2004). Wie schon von den Angiospermen bekannt werden
bei den Gymnospermen ebenfalls MADS-box-Gene der C-Funktionsklasse in allen
DISKUSSION
105
generativen Strukturen exprimiert. BECKER et al. (2003) belegen dies anhand von Insitu-Hybridisierungen an männlichen Zapfen der Gymnospermen Gnetum gnemon L..
CARLSBECKER et al. (2004) sprechen dem Gen DAL1 aus der Gymnospermen Picea
abies (L.) H. KARST., das den MADS-box-C-Genen sehr ähnlichen ist, eine wichtige
Rolle beim Übergang vom juvenilen zum adulten Stadium der generativen Strukturen
zu. Damit könnte die Expression von MADS-box-C-Genen sowohl in weiblichen als
auch in männlichen Strukturen erklärt werden.
Die im Rahmen dieser Arbeit gewonnen Ergebnisse von In-situ-Hybridisierungen mit
einem MADS-box-C-Gen aus Zamia amblyphyllidia an Sporophyllen bzw. Samenanlagen dieser Art, lassen sich problemlos in die bisherigen Forschungsergebnisse
anderer Arbeitsgruppen eingliedern. Sie lassen sich ebenfalls bestens in das bereits
im Kapitel 4.1.4. dargelegte neue Konzept zur Evolution der Samenanlage einfügen,
da Nucellus und Integument auch bezüglich der Expression des MADS-box-C-Gens
keinerlei Unterschiede aufweisen, so dass die Ergebnisse den Ansatz untermauern,
dass das Integument eine Bildung des Nucellus und keine separate Struktur darstellt.
Weitaus differenzierter stellen sich die Ergebnisse von In-situ-Hybridisierungen mit
MADS-box-C-Genen an jungen weiblichen Zapfen verschiedener Pinaceen dar. Bei
Picea abies (TANDRE et al. 1998), Picea mariana (MILL.) BSP. (RUTLEDGE et al. 1998)
und Pinus radiata DON. (MOURADOV et al. 1999) ist jeweils deutlich zu erkennen, dass
die Expression der MADS-box-C-Gene nur auf die Samenschuppe begrenzt ist. Die
In-situ-Hybridisierungen bei Picea mariana wurden zudem an Stadien durchgeführt,
bei denen auf der Samenschuppe bereits eine Samenanlage entwickelt ist. Hier ist
eine verstärkte Genexpression innerhalb der Samenanlage besonders im Nucellus
verglichen mit der gesamten Samenschuppe zu verzeichnen. Wie bereits erwähnt,
konnten derartige Expressionsmuster anhand von In-situ-Hybridisierungen an Zamia
amblyphyllidia nicht ermittelt werden. Aufgrund dieser erhaltenen relativ undifferenzierten Expressionsmuster lassen sich keine Aussagen über die genregulatorischen
Vorgänge bei der Entwicklung der einzelnen Strukturen innerhalb der Samenanlage
treffen, so dass hier eine Genregulation der Entwicklungsprozesse der Samenanlage
mittels anderer, untergeordneter Gene zu vermuten ist. Bei Angiospermen werden
z.B. die so genannten MADS-box-D-Gene als verantwortlich für die Entwicklung der
Samenanlagen (MODRUSAN ET AL. 1994, COLOMBO ET AL. 1995) diskutiert. Für eine
weitere Klärung der Wirkungsweise der MADS-box-Gene bei Zamia amblyphyllidia
oder auch anderen Cycadeen müssen in Zukunft vielfältige In-situ-Hybridisierungen
mit MADS-box-Genen aus den verschiedenen Funktionsklassen B, B-sister (BECKER
2000), C und D durchgeführt und ausgewertet werden. Des Weiteren ist interessant,
innerhalb der Gymnospermen nach MADS-box-Genen der A-Funktion zu suchen, da
diese MADS-box-Gene bei den Angiospermen bislang nur in Zusammenhang mit der
DISKUSSION
106
Entwicklung der Blütenhülle, die eine Bildung der Angiospermen ist, nachgewiesen
wurden. Darüber hinaus besteht in Hinblick auf die oben dargestellten In-situ-Hybridisierungsergebnisse zu den Pinaceen Picea abies, Picea mariana und Pinus radiata
in Bezug auf zwei Fragen Klärungsbedarf. Zum einen ist nicht einsichtig, weshalb bei
den genannten Pinaceen eine differenzierte Genexpression der MADS-box-C-Gene
innerhalb der Samenanlage zu erkennen ist und im Gegensatz dazu die Expression
bei Zamia amblyphyllidia innerhalb der ganzen Samenanlage konstant wirkt. Zum
anderen sollte auch anhand von In-situ-Hybridisierungen mit MADS-box-C-Genen an
jungen weiblichen Zapfen von Zamia amblyphyllidia überprüft werden, ob diese Gene
im ganzen Zapfen exprimiert werden oder ob in der Sprossachse wie bei den zum
Vergleich zur Verfügung stehenden Pinaceen keine MADS-box-C-Genexpression
nachweisbar ist. Anhand von derartigen vergleichenden Untersuchungen können
gegebenenfalls Aussagen über eine differenzierte Funktion der MADS-box-C-Gene
innerhalb verschiedener Gruppen der Gymnospermen getroffen werden bzw. eine
Einteilung in Unterklassen der MADS-box-C-Gen- vorgenommen werden.
4.2.2.
IN-SITU-HYBRIDISIERUNGEN AN BLÄTTERN VON ZAMIA
Die In-situ-Hybridisierungsversuche an sehr jungen, kaum ausdifferenzierten Blättern
sowie an jungen Fiedern bereits ausdifferenzierter Wedel, dienten zur Kontrolle des
im Rahmen dieser Arbeit isolierten MADS-box-C-Gens. Den Erwartungen nach sollte
dieses Gen nur in generativen Strukturen exprimiert werden, nicht aber im Spross, in
den Blättern oder in den Wurzeln. Um auszuschließen, dass es sich beim überall im
Sporophyllgewebe nachzuweisenden MADS-box-Gen nicht um ein funktionsloses,
ubiquitär exprimiertes Genduplikat handelt, sind in mehreren In-situ-Hybridisierungen
parallel zu den histologischen Schnitten von Samenanlagen bzw. Sporophyllen auch
Schnitte von RNase frei fixiertem Blattgewebe mitgeführt und auf dieselbe Weise wie
das zu untersuchenden Material behandelt worden. Diese Vorgehensweise diente
der Kontrolle für den Fall, dass das Blattgewebe zwar ein negatives Hybridisierungsergebnis zeigt, aber der Grund z.B. auch in einer fehlerhaften Versuchsdurchführung
zu suchen sein könnte. Zeigen die parallel mitgeführten Samenanlagen bzw. Sporophylle eine positive Hybridisierungsreaktion an, kann man sich sicher sein, dass ein
negatives Ergebnis bezüglich des Blattgewebes nicht auf Mängel bei der Versuchsdurchführung zurück zu führen ist. Aus dem Grund können die in der Abbildung 44
exemplarisch gezeigten In-situ-Hybridisierungsergebnisse zu Blattgewebe von Zamia
amblyphyllidia als Beweis dafür gewertet werden, dass im Rahmen der vorliegenden
Arbeit tatsächlich ein MADS-box-C-Gen aus der als sehr ursprünglich angesehenen
Gymnospermen Zamia amblyphyllidia isoliert worden ist.
ZUSAMMENFASSUNG
5.
107
ZUSAMMENFASSUNG
Das im Rahmen dieser Arbeit erstellte Konzept zur Evolution der Samenanlage steht
vollkommen losgelöst von der Telomtheorie ZIMMERMANNS, die eine Bildung des Integuments aus sterilen Telomlappen an der Basis der Samenanlage postuliert. Ganz
im Gegensatz dazu konnte anhand von morphologischen Studien an als ursprünglich
angesehenen Gymno- bzw. Angiospermen gezeigt werden, dass das Integument an
der Spitze des Nucellus initiiert wird und vollständig aus umgewandelten Nucellusgewebe aufgebaut ist. Somit ist das Integument keine separate Struktur. Es ist vielmehr
eine Struktur, die allein vom Nucellus gebildet wurde, um der lysogen entstandenen
Öffnung an dessen apikalen Ende Festigkeit zu verleihen. Dieses neu entwickelte
Konzept steht nicht im Widerspruch zu den fossilen Funden, die sich basierend auf
dieser These neu und zum Teil sogar sinnvoller interpretieren lassen. So stellen die
fossilen Strukturen Salpinx und Lagenostom keine Randerscheinungen der Evolution
dar, sondern sind Indizien dafür, dass die Evolution des Integuments ebenso abgelaufen ist, wie die Ontogenese dieser Struktur, die sich anhand von morphologischen
Studien bei rezenten Spermatophyta nachvollziehen lässt. Die Cupula, eine andere
fossile Struktur, die bei vielen primitiven, fossilen Samenanlagen beschrieben ist,
kann demnach als eine primitive Blütenhülle betrachtet werden.
Ein anderer Aspekt der vorliegenden Arbeit hat sich damit befasst, den Ursprung
dessen, was im Allgemeinen als Integument bezeichnet wird, über die histologischen
Methoden hinaus mit Mitteln der Entwicklungsgenetik als eine Bildung des Nucellus
zu beweisen. Zu diesem Zweck ist die Methode der In-situ-Hybridisierung am Lehrstuhl für Evolution und Biodiversität der Pflanzen der Ruhr-Universität Bochum im
Rahmen dieser Arbeit etabliert worden. Dazu wurde nicht nur ein vollständiges Labor
eingerichtet, sondern auch ein Laborprotokoll für In-situ-Hybridisierungen an Gymnospermen entwickelt. Dieses Protokoll ist permanent optimiert worden, so dass es in
Zukunft als Vorlage für In-situ-Hybridisierungen an Gymnospermen genutzt werden
kann. Die Entwicklung eines speziell auf Gymnospermen abgestimmten Protokolls
war notwendig, da sich die Standardprotokolle von In-situ-Hybridisierungen an Angiospermen aufgrund der vielen sekundären Pflanzenstoffe bei Gymnospermen nicht
auf diese übertragen ließen. Die erhaltenen Ergebnisse der In-situ-Hybridisierungen
an Sporophyllen und Samenanlagen von Zamia amblyphyllidia lassen sich nahtlos in
die aktuellen Forschungsergebnisse anderer Arbeitsgruppen zu MADS-box-Genen
einfügen. Zudem untermauern die gewonnen In-situ-Hybridisierungsergebnisse das
bereits oben dargestellte Konzept zur Evolution der Samenanlage, das im Rahmen
der vorliegenden Arbeit entwickelt worden ist.
LITERATURVERZEICHNIS
6.
108
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ANHANG
7.
116
ANHANG
ERKLÄRUNG
Hiermit erkläre ich, dass ich die Arbeit selbstständig verfasst und bei keiner anderen Fakultät
eingereicht und dass ich keine anderen als die angegebenen Hilfsmittel verwendet habe. Es
handelt sich bei der heute von mir eingereichten Dissertation um fünf in Wort und Bild völlig
übereinstimmende Exemplare.
Weiterhin erkläre ich, dass digitale Abbildungen nur die originalen Daten enthalten und in
keinem Fall inhaltverändernde Bildbearbeitung vorgenommen wurde.
Bochum, den 01.04.2008
______________________________
(Unterschrift)
ANHANG
117
LEBENSLAUF
Name:
Julia Gabriela Kunze, geb. Obermann
Anschrift:
Fahrendelle 23e, 58455 Witten
Tel.: 02303/423888
Mail: [email protected]
Geburtsdatum:
Geburtsort:
Staatsangehörigkeit:
Konfession:
Familienstand:
29.09.1978
Dortmund-Hörde
deutsch
evangelisch
verheiratet
Ehepartner:
Eltern:
Christian Kunze - Studienrat
Doris Obermann, geb. Göbel - Lehrerin i. R.
Frank Obermann - Schulleiter i. R.
Eva Christine Weberink - Juristin
Geschwister:
Schulbesuch:
Abschluss:
Studium:
Abschluss:
1985 – 1989: Jahnschule (Grundschule), Kamen-Methler
1989 – 1998: Städtisches Gymnasium, Kamen
08.06.1998: Abitur (Note 1,9)
WS 1998/99 – SS 2003:
Studiengang Biologie an der Ruhr-Universität Bochum
07.08.2003: Diplom (Note 1,2)
Bisherige Tätigkeiten:
09/2003 – 05/2004: WHK am LS für Spezielle Botanik,
Ruhr-Universität Bochum
06/2004 – 11/2006: Promotionsstipendiatin des „Allgemeinen Promotionskollegs der RUB“ am
LS für Spezielle Botanik
12/2006 – 06/2007: WHK am LS für Spezielle Botanik,
Ruhr-Universität Bochum
07/2007 – 03/2008: Fertigstellung der Promotionsarbeit
Aktuelle Tätigkeit:
Seit 01/2008:
Lehramtsanwärterin für GHR am Studienseminar Dortmund
ANHANG
118
DANKSAGUNG
Mein Dank gilt ...
... selbstverständlich an erster Stelle meinem Betreuer Prof. Dr. Thomas Stützel für
die Überlassung des spannenden und facettenreichen Themas.
... ebenfalls meinem Korreferenten Prof. Dr. Ralf Tollrian, der so spontan bereit war,
das Korreferat zu übernehmen. Danke!
... Prof. Dr. Gerd Schaub und seiner gesamten Arbeitsgruppe (AG Parasitologie am
Lehrstuhl für Evolutionsökologie und Biodiversität der Tiere), da ich das dortige
S1-Labor mitsamt des gesamten Equipments für meine molekulargenetischen
Vorarbeiten nutzen durfte.
... in Zusammenhang mit letzterem Punkt ganz besonders Dr. Peter Waniek, der mir
die molekularbiologische Arbeitsweise nahe gebracht und geduldig meine ersten
Schritte auf diesem weiten Feld begleitet hat. Nach Peters Aufbruch ins ferne
Brasilien wurde Dr. Markus Deckers ein immer wichtigerer Ansprechpartner für
kurze, aber dringende labortechnische Anfragen. Danke dafür!
... allen Mitgliedern des Lehrstuhls für Evolution und Biodiversität der Pflanzen. Sie
alle haben meinen Uni-Alltag in den letzten vier Jahren entscheidend beeinflusst
und zum häufig sehr fröhlichen Arbeitsklima am Lehrstuhl sowie auf Exkursionen
beigetragen.
... aber ganz besonders einer hier an dieser Stelle hervorzuhebenden Mitarbeiterin
des Lehrstuhls: Dipl.-Biol. Nicole Hille. Da Nicole ein methodisch gleiches Thema
wie ich in ihrer Promotion bearbeitet hat, konnten wir gemeinsam den neuen und
oft auch steinigen Weg zur In-situ-Hybridisierung betreten und uns so gegenseitig
durch Höhen und Tiefen ziehen. Was hätte ich alleine nur gemacht ...
... zu guter Letzt natürlich auch meinem ganzen Freundeskreis, meinem Rausche
und dem Rest meiner Familie, die irgendwann aufgegeben haben, mich nach
dem Fortgang meiner Arbeit zu fragen und mich so in Ruhe und mit vollstem
Verständnis für meinen chronischen Zeitmangel promovieren ließen.
... vorsichtshalber auch noch all denen, die ich eventuell an dieser Stelle vergessen
habe, denen ich aber dennoch sehr dankbar bin wie z.B. den lieben CafêtenFrauen oder den geduldigen Herren im Chemikalienlager.
Vielen Dank!