Dokument_31.

Aus der Medizinischen Klinik III mit Poliklinik
Institut für klinische Immunologie und Rheumatologie
der Friedrich-Alexander-Universität Erlangen-Nürnberg
Direktor: Prof. Dr. med. G. Schett
Untersuchungen zur Rolle des intrazellulären Kalziums
in einem Modell der Kostimulation
durch CD 28 bei Jurkat-Zellen
Inaugural-Dissertation
zur Erlangung der Doktorwürde
an der Medizinischen Fakultät
der Friedrich-Alexander-Universität
Erlangen-Nürnberg
Vorgelegt von
Jochen Wacker
aus Nürnberg
Gedruckt mit Erlaubnis der
Medizinischen Fakultät der Friedrich-Alexander-Universität
Erlangen-Nürnberg
Dekan:
Prof. Dr. Dr. h.c. J. Schüttler
Referent:
Prof. Dr. G. Schett
Koreferent:
Prof. Dr. B. Manger
Tag der mündlichen Prüfung:
30.09.2010
2
No hay camino, se hace camino al andar.
Antonio Machado
Gewidmet meiner Mutter und meinem Vater
3
Inhaltsverzeichnis
1.
Einleitung
11
1.1
Immunsystem allgemein
11
1.2
Das humorale Immunsystem
11
1.3
Das zelluläre Immunsystem
12
1.4
Aktivierung von T-Lymphozyten
13
1.4.1 Der T-Zell-Rezeptor
13
1.4.2 Immunologische Synapse
14
1.4.3 Kostimulation
15
1.4.4 Das Oberflächenmolkeül CD28
17
1.4.5 Die intrazelluläre Signaltransduktion von CD28
17
1.4.6 Die Rolle des intrazellulären Kalziums bei der Signaltransduktion
20
1.5
Klinische Bedeutung
21
2.
Fragestellung
24
3.
Material
25
3.1
Zelllinien
25
3.1.1 Jurkat-Zellen
25
3.2
25
Chemikalien und Antikörper
3.2.1 Reagenzien für die Zellkultur
25
3.2.2 Reagenzien für die PBMC-Gewinnung und die Blasten-Kultur
26
3.2.3 Reagenzien für die Stimulationsversuche
26
3.2.4 Reagenzien für die IL2-Messung
27
3.2.4.1 Reagenzien und Pufferlösungen
27
3.2.4.2 Kits
28
3.2.5 Reagenzien für die Kalziummessung
28
3.2.6 Verbrauchschemikalien
29
3.3
Verbrauchsmaterial
29
3.4
Geräte
30
4
4.
Methoden
32
4.1
Zellkultur
32
4.1.1 Allgemeine Bedingungen
32
4.1.2 Herkunft und Konservierung
32
4.1.3 Bestimmung der Zellzahl
33
4.1.4 PBMCs und PHA/IL2-Blasten
33
4.2
34
Messung der Oberflächenmarker
4.2.1 Färbung mit unkonjugiertem Primärantikörper
34
4.2.2 Färbung mit biotinyliertem Primärantikörper
35
4.2.3 Färbung mit direkt konjugiertem Antikörper
35
4.2.4 Kontrollen
35
4.2.5 Messung
35
4.3
36
Stimulationsversuche
4.3.1 Voraussetzungen und Vorbereitung der Zellen
36
4.3.2 Versuchsansatz
36
4.3.3 Verlauf und Ende des Versuchs
37
4.4
37
Messung von Interleukin-2 mit ELISA
4.4.1 Präparieren der Platte
37
4.4.2 Auftragen der Proben
38
4.4.3 Detektion
38
4.4.4 Entwicklung und Auswertung
39
4.5
39
Bestimmung der intrazellulären Kalziumkonzentration
4.5.1 Vorbereitungen und Voraussetzung
39
4.5.2 Labeln mit Fluo-3AM
39
4.5.3 Vorbereitung für die Messung
40
4.5.4 Ablauf der Messung
40
4.5.5 Leerwert
41
5.
Ergebnisse
42
5.1
Messung von Interleukin-2 nach Stimulation
42
5.1.1 Untransfizierte Jurkats
42
5
5.1.2 mCD28WT-transfizierte Jurkats
42
5.1.3 mCD28TL-transfizierte Jurkats
43
5.2
44
Messung der intrazellulären Kalzium-Konzentration
5.2.1 Aussagen über die Verwertbarkeit der Ergebnisse
44
5.2.2 Messungen mit Jurkat-Zellen
44
5.2.2.1 Untransfizierte Jurkats
44
5.2.2.1.1 Stimulation mit α-humanCD28-Antikörper
45
5.2.2.1.2 Stimulation mit OKT3-Antikörper
46
5.2.2.1.3 Weitere Messungen
47
5.2.2.2 mCD28WT-transfizierte Jurkats
49
5.2.2.2.1 Stimulation mit α-huCD28-Antikörper
50
5.2.2.2.2 Stimulation mit α-mCD28-Antikörper
50
5.2.2.2.3 Stimulation mit OKT3-Antikörper
51
5.2.2.3 mCD28TL-transfizierte Jurkats
51
5.2.2.3.1 Stimulation mit α-huCD28-Antikörper
52
5.2.2.3.2 Stimulation mit α-mCD28-Antikörper
54
5.2.2.3.3 Stimulation mit OKT3-Antikörper
54
6.
Diskussion
57
7.
Literaturverzeichnis
66
8.
Abkürzungsverzeichnis
71
8.1
Rezeptoren, Proteine, intrazelluläre Signaltransduktion
71
8.2
Reagenzien
72
8.3
Sonstige Abkürzungen
72
9.
Danksagung
73
10.
Lebenslauf
74
6
Zusammenfassung
1) Hintergrund und Ziele
Ein entscheidender Schritt einer effektiven Immunabwehr besteht in der
Aktivierung von Antigen-spezifischen T-Zellen. Dabei ist nicht nur das Antigen
selbst als Signal, sondern auch ein zweites Signal erforderlich. Darauf beruht die
sogennante
Zwei-Signale-Hypothese
der
Kostimulation.
Das
in
diesem
Zusammenhang am Besten untersuchte Signalmolekül ist CD28, dessen
Stimulation neben der Aktivierung von anderen, bereits gut untersuchten
Signaltransduktionswege
auch
eine
Erhöhung
der
intrazellulären
Kalziumkonzentration bewirkt. Ziel dieser Arbeit ist, diesen Mechanismus ebenso
wie seine Bedeutung bei der Aktivierung von T-Lymphozyten zu untersuchen.
2) Material und Methoden
Für diese Arbeit wurden native Jurkat-Zellen mit Zelllinien verglichen, die
entweder mit dem Wildtyp des murinen CD 28 transfiziert worden waren, oder mit
unterschiedlichen Mutationen von diesem, welche abgewandelte intrazelluläre
Domänen aufweisen, bis hin zu einem Konstrukt ganz ohne intrazelluläre
Domänen. Als Kontrolle wurde zunächst die Expression von humanem und
murinem CD28 auf der Oberfläche untersucht. Die Messung der Interleukin-2Produktion nach Stimulation mit PMA/IoM und Antikörpern gegen humanes bzw.
gegen murines CD28 dient zum Nachweis der Spezifität und der Funktionalität
der transfizierten Moleküle.
Mittels
Fluoreszenz-Messung
wurde
die
Veränderung
der
intrazellulären
Kalziumkonzentration nach Zugabe von Antikörpern gegen humanes bzw.
murines CD28 beobachtet.
3) Ergebnisse und Beobachtungen
Auf den transfizierten Zelllinien ließ sich murines CD28 nachweisen. Nach
Stimulation mit anti-huCD28 reagierten alle Zelllinien mit einer deutlichen
Steigerung der IL-2-Produktion, nach Zugabe von anti-mCD28 kam es nur bei
den mit Wildtyp-mCD28 transfizierten Zellen zu einem Anstieg der IL-27
Produktion.
Die Stimulation mit Antikörpern gegen humanes CD28 führte auf allen Zellen zu
einem Anstieg der intrazellulären Kalziumkonzentration. Nach Stimulation mit
Antikörpern gegen murines CD28 dagegen zeigten nicht nur die untransfizierten
Zelllinien, sondern auch alle mit murinem CD28 transfizierten Zelllinien keine
Veränderung der intrazellulären Kalziumkonzentration.
4) Schlussfolgerungen
Auf den humanen Jurkat T-Zellen führt die Aktivierung des transfizierten murinen
CD28 nicht zu Kalzium-Einstrom, aber sie steigert die Interleukin-2-Produktion
ebenso wie die Stimulation des humanen CD28-Moleküls. Das bedeutet, dass die
Interleukin-2-Produktion unabhängig von CD28-vermitteltem Kalziumeinstrom ist.
8
Summary
1) Background and objectives
A crucial part of an effective immunological defense is activation of antigenspecific-T-cells.
According to the two-signal-hypothesis of costimulation, this
requires not only the antigen itself, but also a second signal. The best known
signalling molecule in costimulation is CD28 which stimulated leads to an
elevation of intracellular calcium concentration. The mechanisms that lead to this
increase is not known. The aim of this work has been to elucidate the mechanism
that leads to this increase as well as its meaning in the activation of Tlymphocytes.
2) Materials and methods
For this work, native Jurkat-cells were compared to cell lines transfected with
either the wildtype or with different mutations of murine CD28, including a
conctruct completely without intracellular domains. After control of the expression
of human or murine CD28, respectively, the determination of IL-2-production after
stimulation with PMA/IoM and mAbs against human or murine CD28 was used to
prove specifity and functionality of the transfected molecules.
The change of intracellular calcium concentration after incubation with mAbs
against human and murine CD28 was observed by measurement of fluorescence.
3) Results
Murine CD28 could be detected on the transfected cells. All different cell lines
responded with a significant increase of IL-2-production after stimulation with antihumanCD28. After incubation with anti-murineCD28, only the wildtype-mCD28transfected cells produced more IL-2.
Stimulation with mAbs against human CD28 lead to higher intracellular calcium
levels, whereas stimulation with mAbs against murine CD28 not only the nontransfected cells, but also all cells transfected with murine CD28 showed no
response.
9
4) Conclusions
The stimulation of the transfected murine CD28 molecule in the human Jurkat Tcells does not lead to a change of the intracellular concentration of calcium, but
activates interleukin-2-production comparable to the stimulation of the human
CD28. Therefore, interleukin-2-production must be independent of CD28mediated calcium-influx.
10
1. Einleitung
1.1 Immunsystem allgemein
Das Immunsystem ist ein überlebenswichtiger Bestandteil des Organismus. Es
hat die Aufgabe, ihn vor schädlichen Einflüsse der Umwelt zu schützen, seien es
Viren, Bakterien oder Parasiten, und muss dafür sorgen, dass eigene Zellen, die
durch Mutationen dem Körper gefährlich werden könnten, eliminiert werden
können. Mit anderen Worten: Das Immunsystem muss „fremd“ und „selbst“
unterscheiden können, und es muss wirksame Instrumente besitzen, mit denen
Zellen oder anderes biologisches Material zerstört werden kann.
Damit diese Instrumente nicht unkontrolliert arbeiten, besteht das Immunsystem
aus zahlreichen, in einander greifenden Regelkreisen. Die einzelnen Bestandteile
sollen hier kurz beschrieben werden, um die Bedeutung des in dieser Arbeit
untersuchten Mechanismus der Kostimulation darzustellen.
1.2 Das humorale Immunsystem
„Humoral“ bedeutet wörtlich „Saft-bezogen“, denn die Faktoren des humoralen
Immunsystems sind v.a. im Blut und im Extrazellularraum, aber auch in allen
anderen Körperflüssigkeiten gelöste Stoffe. Zunächst muss hier zwischen
angeborenen und erworbenen Faktoren unterschieden werden.
Das angeborene humorale Immunsystem besteht neben Proteinen wie dem Creaktiven Protein, die unspezifisch bakterielle Oberflächenmoleküle erkennen
können, aus dem Komplementsystem, dass nach Aktivierung kaskadenartig
abläuft, ähnlich dem System der Blutgerinnung. Die Endstrecke ist hier ganz
allgemein die Lyse von körperfremden Zellen sowie die weitere Aktivierung des
Immunsystems.
Das erworbene humorale Immunsystem besteht aus den Immunglobulinen oder
Antikörpern. Diese Proteine tragen eine variable Region, die spezifisch an
Strukturen auf fremden Zellen binden kann. Dadurch können Bakterien, Viren
oder andere körperfremde Materialien erkannt und für andere Zellen markiert
11
werden. Anhand der Struktur und der Größe können verschiedene Klassen von
Immunglobulinen unterschieden werden, die auch unterschiedliche Funktionen
übernehmen. Gemeinsam ist allen die Herkunft, denn sie werden von den BZellen synthetisiert und sezerniert.
1.3 Das zelluläre Immunsystem
Die Zellen, die am Immunsystem mitwirken, stammen aus verschiedenen
Organsystemen. Wie beim humoralen Immunsystem, können auch hier ein
angeborenes und ein erworbenes System unterschieden werden.
Granulozyten und Makrophagen dienen vor allem der Phagozytose und der
Zersetzung von biologischer Substanz, insbesondere von Erregern und potentiell
infektiösen oder schädlichen Stoffen. Sie können jedoch nicht spezifisch auf
bestimmte Stoffe reagieren, sondern sie benötigen andere Zellen, um aktiviert zu
werden.
Die Zellen des erworbenen Immunsystems werden als Lymphozyten bezeichnet.
Der Organismus beginnt nach der Geburt, aus einer riesigen Menge von
unterschiedlichen Zellen die auszuwählen, die fremdes biologisches Material
erkennen können, ohne ihm selbst zu schaden.
Diesen Vorgang nennt man Selektion oder auch Prägung. Bei der einen großen
Gruppe von Lymphozyten findet er im Knochenmark statt, daher werden diese
Zellen – nach dem englischen Wort für Knochenmark „bone marrow“ – als BLymphozyten oder B-Zellen bezeichnet. B-Zellen können Antigene präsentieren
und so mit anderen Zellen zusammenarbeiten, und sie sind die einzige
Zellpopulation des Körpers, die Immunglobuline produzieren kann.
Die andere große Gruppe der Lymphozyten wird im Thymus geprägt, und daher
als T-Lymphozyten oder T-Zellen bezeichnet. Sie werden nach ihrer Ausstattung
an Oberflächenmolekülen in CD 4- oder CD 8-positive T-Zellen eingeteilt.
Daneben existieren noch andere, kleinere Gruppen wie NK-Zellen oder
regulatorische
T-Zellen,
die
jeweils
unterschieden werden.
12
anhand
ihrer
Oberflächenmoleküle
Bei den CD4-positiven T-Zellen, die die Gruppe der Helferzellen darstellt, werden
wiederum Th1- und Th2-Zellen unterschieden, die sich in ihrer Reaktion auf
Stimuli
und
unterscheiden:
ihrer
Interaktion
Th1-Zellen
mit
anderen
aktivieren
über
Zellen
Zytokine
des
wie
Immunsystems
Interleukin-2
Makrophagen. Bei zahlreichen Krankheiten des rheumatischen Formenkreises
spielt eine überschießende Aktivierung von Th1-Zellen eine entscheidende Rolle,
während Th2-Zellen über Interleukin-4 und 5 vor allem bei allergischen
Reaktionen ein Rolle spielen.
Allen T-Zellen gemeinsam ist der T-Zell-Rezeptor-Komplex.
1.4 Aktivierung von T-Lymphozyten
1.4.1 Der T-Zell-Rezeptor
Der T-Zell-Rezeptor-Komplex ist ein Transmembranprotein auf T-Zellen, dem die
entscheidende Aufgabe zukommt, spezifisch Antigene zu erkennen. Das Antigen
muss dafür an einen MHC-Komplex der Klasse I oder II gebunden sein. Während
CD8-positive-Zellen den MHC-Komplex der Klasse I erkennen, der sich auf der
Oberfläche aller kernhaltigen Zellen befindet, erkennen Th-Zellen über den
Korezeptor CD4 den MHC-Komplex II auf antigenpräsentierenden Zellen (APC)
(6, 40). Der T-Zell-Rezeptor-Komplex
besteht aus dem eigentlichen T-Zell-
Rezeptor (TCR) und dem CD3-Molekül. Beide sind Mitglieder der ImmunglobulinSuperfamilie. Der TCR ist ein Heterodimer aus je einer a- und einer b-Kette.
Diese enthalten eine variable Region, für die es in jedem Individuum etwa 10h8
unterschiedliche Möglichkeiten gibt. Diese Region erkennt das Antigen auf dem
MHC-Komplex, und es kommt zur Aktivierung der T-Zelle, wobei die Affinität der
TCR-MHC-Bindung für die Aktivierung entscheidend ist (16).
Die Signaltranduktion ins Zellinnere erfolgt über CD3. Normalerweise bedarf es
für eine optimale Aktivierung eines zusätzlichen Signals. Nur bei sehr hohen
Antigen-Mengen und/oder hoher Affinität der Bindung kommt es auch ohne ein
zweites Signal zu einer T-Zell-Antwort.
Bei der Aktivierung werden gleichzeitig die nicht-polymorphen Regionen des
13
MHC-Komplexes von CD4 oder CD8 erkannt. Beide sind mit der ProteinTyrosinkinase LCK assoziiert, die jetzt mit CD3 interagiert. Dieses weist in seiner
ζ-Kette sogenannte ITAMs (Immunoreceptor Tyrosine-based Activation Motifs)
auf, deren Tyrosinrest durch LCK phosphoryliert wird.
Dadurch wiederum kommt es zur Aktivierung von ZAP-70 (ζ-chain associated
protein
of
70kDa)
und
SYK
(spleen
tyrosine
kinase).
Diese
Kinasen
phosphorylieren weitere Adapter-Moleküle. Eines der besser untersuchten dieser
Adapter-Moleküle ist LAT (linker of activated T-cells), andere z.B. SLP-76 (srchomology-2-domain containing leucocyte protein of 76kDa) (15, 21).
Eine der Endstrecken dieser Signaltransduktion ist die Aktivierung der
Phospholipase Cγ1 durch Phosphorylierung. Dies führt zu einer erhöhten
intrazellulären
Kalziumkonzentration
und
zur
Aktivierung
von
Transkriptionsfaktoren, wie z.B. NFAT (nuclear factor of activated T-cells) (40).
Ein weiteres wichtiges intrazelluäres Signal wird über die Aktivierung von JNK
(Jun-N-terminal Kinase) vermittelt. Diese Kinase phosphoryliert und aktviert damit
den Transkriptionsfaktor AP1 (Activator Protein 1), der wiederum für die
Transkription von IL-2 benötigt wird (6).
1.4.2 Immunologische Synapse
In den letzten Jahren hat man die Notwendigkeit eines stabilen Zell-ZellKontaktes als Voraussetzung für die Interaktion von Zellen des Immunsystems
erkannt. Dies beruht unter anderem auf der Erkenntnis, dass die Proteine nicht
starr auf der Zelloberfläche verankert sind, sondern in lipidreichen Mikrodomänen.
Man spricht von einer immunologischen Synapse (42).
Diese
enthalten
vor
allem
Sphingolipide
und
Cholesterin,
die
die
Transmembranproteine – wie CD3, CD28,TCR etc. – umgeben und an denen auf
der Zellinnnenseite Membran-assoziierte Proteine verankert sind, die häufig eine
Rolle in der Signaltransduktion spielen, wie LCK, LAT, Ras oder GTP-bindende
Proteine (8). Normalerweise sind diese in ca. 70nm großen, sogenannten „rafts“
(engl. Flöße), mehr oder weniger gleichmäßig über die gesamte Zellmembran
14
verteilt.
Die Bildung einer immunologischen Synapse beginnt mit der Aktivierung des TCR
durch einen Antigen-MHC-vermittelten Kontakt mit einer Antigen-präsentierenden
Zelle (19). Danach kommt es zu einer Verlagerung von weiteren TCR-Komplexen,
aber auch von anderen Proteinen an die Stelle des Zell-Zell-Kontaktes, anhand
derer sich eine zentrale Region von einer peripheren Region unterscheiden lässt.
Die Mobilität und die Stabilität dieser Struktur ist dabei entscheidend von einer
Erhöhung der intrazellulären Kalzium-Konzentration abhängig (44); wird diese
verhindert, kann sich kein stabiler Zell-Zell-Kontakt entwickeln.
Die zentrale Region einer immunologischen Synapse, auch als „central
supramolecular activation cluster“ (cSMAC) bezeichnet, enthält neben dem
TCR/CD3-Komplex und, je nach Zelltyp, CD4 oder CD8 insbesondere auch CD28
und CD2 (15). Diese cSMAC-Region wird von einem als „peripheral SMAC“
(pSMAC) bezeichneten Ring, der vor allem LFA-1 (Leucocyte function-associated
Antigen 1) enthält, umgeben.
Gerade zur Erklärung der Kostimulation ist dieses Modell gut geeignet, da
gleichzeitig mit dem TCR auch Rezeptoren aktiviert werden können, die eine
niedrigere Affinität zu ihren Liganden haben, die aber für eine effektive
Aktivierung der T-Zelle eine entscheidende Rolle spielen, wie CD28 oder CD40.
Außerdem können antagonistische Prozesse wie das CTLA-4/B-7-System die
aktivierte T-Zelle wieder rechtzeitig bremsen, da der Kontakt zu der APC
bestehen bleibt.
1.4.3 Kostimulation
Unter
zahlreichen
unterschiedlichen
Untersuchngsbedingungen
lässt
sich
feststellen, dass die Stimulation des T-Zell-Rezeptors/CD 3 alleine nicht zu einer
optimalen
T-Zellaktivierung
führt,
sondern
im
Gegenteil
entweder
zu
programmiertem Zelltod, d.h. zur Apoptose, oder zur Anergie dieser Zelle führt
(12). Als Anergie wird dabei ein Zustand bezeichnet, in dem die Zelle auch durch
optimale Stimuli nicht mehr aktiviert werden kann. Werden dagegen gleichzeitig
15
mit dem TCR noch bestimmte Oberflächenmarker aktiviert, kommt es zu einem
langanhaltenden und starkem Effekt. Dieses Phänomen wird als Kostimulation
bezeichnet.
Ein vereinfachtes Modell für die Kostimulation wird durch das Zwei-SignaleModell wiedergegeben. Die erste Beschreibung dieser Hypothese findet sich bei
Bretscher bereits 1970 (5). Sie ist heute als Grundlage der Aktivierung von
Lymphyzyten anerkannt, und wir kennen zahlreiche Rezeptoren, die eine Rolle in
der Kostimulation spielen. Dazu gehören CD28/CTLA4/B7.1/2, CD40/CD40Ligand oder ICOS (Inducible T-Cell Co-Stimulator) (20, 35).
Das am besten untersuchte „zweite Signal" wird über das Oberflächenmolekül
CD28 vermittelt. Effekte, die sich experimentell durch Kostimulation von TCR und
CD28 auslösen lassen, sind eine gesteigerte Zytokinproduktion, Schutz vor
Anergie oder Apoptose und Proliferation der Zellen (34, 2). Außerdem gibt es
Hinweise darauf, dass über CD28 eine bevorzugte Differenzierung zu Th2Helferzellen bewirkt wird (4).
Der physiologische Ligand von CD28 sind die Proteine CD80 und CD86, die auch
als B7.1 und B7.2 bezeichnet werden und die auf der Zelloberfläche von APCs
vorkommen. Neben dem konstitutiv exprimierten CD28 gibt es noch einen
zweiten Liganden für CD80/86 auf T-Lymphozyten: CD152, das zuerst als CTLA4 (Cytotoxic T-Lymphocyte Antigen-4) beschrieben wurde. Es findet sich nicht
konstitutiv auf T-Zellen, sondern es wird erst nach Aktivierung der Lymphozyten
exprimiert (32).
CTLA-4 bindet 50 bis 100 mal stärker an CD80/CD86 als CD28 (16) und kann
dieses so aus der Bindung verdrängen. Auch wenn die intrazellulären Signalwege
noch nicht im Einzelnen bekannt sind, hat es doch klar herunterregulierende
Funktion in aktivierten Lymphozyten. Dadurch wird verhindert, dass eine
Immunreaktion überschießend verläuft oder sich verselbstständigt.
Sowohl CD28 als auch CTLA-4 sind wie auch ihre Liganden B7.1 und B7.2 sind
Mitglieder der Immunglobulin-Superfamilie. Im weiteren soll CD28 genauer
dargestellt werden.
16
1.4.4 Das Oberflächenmolkeül CD28
Bei CD28 handelt es sich um ein 44 kDa großes Glykoprotein, das konstitutiv auf
der Zelloberfläche von CD4+Lymphozyten exprimiert wird und sich auch auf etwa
50 % aller CD8-positiven T-Zellen findet (23). Die Expression ist jedoch nicht
immer gleich stark: Nach Aktivierung des TCR/CD3-Komplexes nimmt die
Expression zu, während sich nach Bindung von B7 an CD28 eine Reduktion
sowohl der mRNA für CD28 als auch der Expression an der Zelloberfläche findet
(24).
Es handelt sich um ein über Disulfid-Brücken verbundenes Homodimer. Die
Sequenz weist eine Homologie zwischen humanem und murinem CD28 von 77%
auf. Insbesondere die Struktur der cytoplasmatischen Kette ist zwischen
verschiedenen Spezies hoch konserviert (3). Ohne diese Kette lässt sich keiner
der Effekte auslösen, die sonst bei Kostimulation auftreten würden.
1.4.5 Die intrazelluläre Signaltransduktion von CD28
Bei Bindung eines Liganden wie B7.1 oder B7.2 an CD28 wird intrazellulär eine
Signalkaskade ausgelöst, die eine verstärkte Expression und Sekretion von
proinflammatorischen Zytokinen und eine Hemmung der Apoptose auslöst (18, 7).
Der am besten bekannte Signaltransduktionsweg benutzt als second messenger
die Phosphatidyl-Inositol-3-Kinase (39).
In der zytoplasmatischen Domäne von CD28 existiert eine Struktur aus den
Aminosäuren Tyrosin-Methionin-Asparagin-Methionin, ein sogenanntes YMNMMotiv. Dieses Motiv ist für die weitere Signaltransduktion von entscheidender
Bedeutung, denn es dient als Bindungsstelle für Adapter-Moleküle mit SH-2-(Srchomology-2)-Domänen. Dazu gehört beispielsweise die p85-Untereinheit der
Phosphatidyl-Inositol-3-Kinase (PI3K) der Klasse 1A. Sie weist zwei dieser SH-2Domänen
auf,
neben
weiteren
Abschnitten,
die
eine
Rolle
in
der
Signaltransduktion spielen (24).
Durch die Bindung von p85 an CD28 wird so die katalytische p110-Untereinheit
17
der PI3K aktiviert, was die Phosphorylierung von Phosphatidyl-Inositol-4,5-bisPhosphat zu Phosphatidyl-Inositol-3,4,5-tris-Phosphat (PI3P) bewirkt. Diese
Aktivierung erfolgt innerhalb von Sekunden.
PI3P bindet an zahlreiche, für die intrazelluläre Signalvermittlung wichtigen,
Proteine, die eine PH-2-(Pleckstrin-homology)-Domäne aufweisen. Bei der
Signaltransduktion von CD28 von besonderer Bedeutung sind hier die PDK-1
(Phosphoinositol-dependent Kinase 1), eine Serin/Threonin-Kinase, und die
Proteinkinase B (PKB) (31).
Der Signaltransduktionswegs von CD28 über PI3K und PKB spielt bei
verschiedenen Effekten, die von CD28 vermittelt werden, eine Rolle. Dies sind im
Wesentlichen eine anti-apoptotische Wirkung und die Steigerung der Interleukin2-Produktion (22).
PI3K übernimmt eine anti-apoptotische Funktion durch die Bindung an NGFR
(nerve growth-factor receptor). Außerdem erhöht PI3K die Aktivität von BCL-XL,
das aus der Familie der BCL-(B-cell lymphoma)-2-Proteine stammt und die CD95vermittelte Bildung des Apoptose-induzierenden DISC (Death-inducing signalling
Complex) inhinbiert (7). Ein weiterer anti-apoptotischer Effekt, der über CD28
vermittelt wird, kommt vermutlich über die Inaktivierung von pro-apoptotischen
Transkriptionsfaktoren der FOXO-Familie durch die phosphorylierte PKB zu
Stande (18).
Die andere bekannte, wichtige Wirkung, die über PI3K vermittelt wird, ist die
Phosphorylierung der GSK-3 (Glykogensynthase-Kinase 3) durch die aktive PDK1. Die GSK-3 ist in ruhenden Zellen aktiv. Ihre Substrate sind neben zahlreichen
anderen Proteinen (u.a. auch die Glykogensynthase) auch NFAT (nuclear factor
of activated T-cells), der die Transkription des IL-2-Gens fördert (39, 24). Bei
diesem Transkriptionsfaktor wird die Aufenthaltsdauer im Zellkern – und damit die
Verstärkung der Transkription von IL-2 – durch Phosphorylierung verkürzt. Bei
inaktivierter GSK-3 liegt er damit überwiegend in seiner unphosphorylierten Form
vor, wodurch vermehrt IL-2-RNA abgelesen wird.
T-Zellen mit einer CD28-Mutation, bei der das Tyrosin des TMNM-Motivs gegen
ein Phenylalanin ausgetauscht wurde, können PI3K bei CD28-Stimulation nicht
mehr aktivieren (3). Diese Zellen sind nicht mehr wie T-Zellen mit Wildtyp-CD28
18
durch erhöhte Spiegel von Kalzium vor Apoptose geschützt (41).
Außer über NFAT steigert eine Aktivierung von CD28 die IL-2-Produktion auch
über ein CD28-spezisches Antwort-Element ("responsive element") in der
Promotor-Region des IL-2-Gens (14). Diese Elemente sind Bindungsstellen für
NFkB. Dieser Transkriptionsfaktor befindet sich normalerweise als Dimer im
Zytosol, wo sie an IkB (Inhibitor of NFkB) gebunden sind. Die Phosphorylierung
von IkB durch die Kinase IKK (IkB-Kinase) löst diese Bindung, so dass NFkB in
den Zellkern gelangen kann und dort als Transkriptionsfaktor wirksam wird.
CD28 verstärkt die Aktivität von IKK und damit den Abbau von IkB, z.B. über eine
Aktivierung von IKK über PKB, aber der genaue Weg der Signaltransduktion ist
nicht bekannt. Aber auch Mitglieder der Familie der MAPKKK (Mitogen activated
Protein Kinase Kinase Kinase) wie MEKK1, MEKK2 oder MLK3, die ebenfalls IKK
aktivieren, werden über CD28 aktiviert (38).
Weitere Wege der Signaltransduktion benutzen das GDP-GTP-Austausch-Protein
VAV1, das bei Überexpression durch CD28-Stimulation auch ohne Beteiligung
des TCR die IL-2-Produktion verstärkt. VAV1 kann das Protein RAC aktivieren,
das ein wichtige Rolle beim Umbau des Actin-Zytoskeletts der Zelle und somit bei
der Ausbildung der immunologischen Synapse zu spielen (42, 44). Wird es
blockiert, kann CD28 JNK nicht mehr aktivieren, die eine Steigerung der
Expression von IL-2 bewirkt und auch bei der Signaltransduktion durch den TCR
eine Rolle spielt.
Ebenfalls eine gemeinsame Endstrecke mit dem TCR ist eine Erhöhung des
intrazellulären Kalziums nach Aktivierung von CD28. Der Anstieg fällt zwar
deutlich niedriger aus als bei Aktivierung von TCR/CD3 (24), besteht aber wie
dieser aus zwei Komponenten: Die schnelle
Freisetzung von Kalzium aus
intrazellulären Speichern, und die anhaltende Erhöhung der Konzentration durch
Einstrom von außen (25). Die genaue Bedeutung der über CD28-vermittelten
Erhöhung von Kalzium ist nicht geklärt, ebensowenig sind die molekularen
Mechanismen bekannt, über die dieser Vorgang reguliert wird.
19
1.4.6 Die Rolle des intrazellulären Kalziums bei der Signaltransduktion
Bei der Aktivierung des Immunsystems spielt Kalzium, wie in nahezu allen
eukaryoten Zellen, eine wichtige Rolle als second messenger. Die normale
Konzentration für Kalzium liegt extrazellulär bei etwa 1-2 mmol/l und damit etwa
1000-fach über dem Wert im Zytosol. Normalerweise existiert also ein starkes
Konzentrationsgefälle von außen nach innen (9).
Kurzfristig beeinflusst ein erhöhter Kalzium-Spiegel vor allem die Motilität der
Zelle. Wird der Kalzium-Einstrom verhindert, kommt es bei Aktivierung nicht zur
Ausbildung einer immunologischen Synapse, die für eine stabile Zell-ZellInteraktion
zwischen
CD4-Zellen
und
Antigen-präsentierenden
Zellen
entscheidend ist (11, 42, 43).
Langfristig bestimmen Kalzium-Signale, welche Gene als Folge der Aktivierung
einer Zelle zur RNA-Synthese angeschaltet, und damit welche Zytokine
freigesetzt werden, ob sich die Zelle weiter differenziert, oder ob sie in den
Zustand der Anergie versetzt wird (2, 16).
Es gibt auf molekularer Ebene zwei unterschiedliche Wege, die zu einer
Erhöhung der intrazellulären Kalzium-Konzentration führen:
Kalzium wird aus intraplasmatischen Speichern, vor allem im endoplasmatischen
Retikulum freigesetzt. Diese Speicher werden durch den second messenger IP3
geöffnet, der bei der Spaltung von Phosphatidylinositol-4,5-Bisphosphat (PIP2)
durch die Phospholipase C entsteht (27). Die Aktivierung dieser Kanäle führt zu
einem Anstieg der Konzentration innerhalb von wenigen Sekunden. Danach fällt
der Spiegel aber sehr rasch wieder auf Werte, die im Bereich der
Ausgangskonzentration liegen.
Neben IP3 spielt in T-Lymphozyten auch der second messenger cAMP-R (cyclic
Adenosin-Diphosphat-Ribose, cADP-R) eine Rolle in der Freisetzung von Kalzium
(12). cADP-R wird nach Aktivierung des TCR-Komplexes freigesetzt und kann
einen Kalzium-Kanal öffnen, der zu den Ryanodin-sensiblen Kalzium-Kanälen
zählt, und durch den Kalzium aus intrazellulären Speichern freigesetzt werden
kann (13).
Der
Anstieg
der
intrazellulären
Kalziumkonzentration
20
öffnet
aber
auch
transmembranäre Kalzium-Kanäle, die als Calcium-Release-activated-Calciumoder CRAC-Kanäle bezeichnet werden. Dieser Prozess führt nicht zu einem
raschen
Anstieg,
sondern
zu
einer
länger
anhaltenden
Erhöhung
der
intrazellulären Kalziumkonzentration (30).
Es sind mehrere Signaltransduktionswege bekannt, über die ein Anstieg der
intrazellulären Kalzium-Konzentration weitere Vorgänge in der Zelle auslöst:
Transkriptionsfaktoren wie NFAT (nuclear factor of activated T-Cells) oder NFkB
(nuclear factor-kB) werden durch Kalzium direkt aktiviert (1, 10). NFAT wird durch
die Phosphatase Calcineurin dephosphoryliert, und gelangt dann in den Zellkern,
wo zahlreiche Transkriptionsvorgänge reguliert werden.
Dafür
ist
eine
länger
anhaltende
Erhöhung
der
Kalzium-Konzerntration
erforderlich, da eine Abnahme des Spiegels rasch zu einer Phosphorylierung von
NFAT und damit zur Entfenrung aus dem Zellkern führt (27). Bei der Kinase JUN
N-terminal Kinase (JNK) reicht dagegen schon eine kurze Erhöhung des
intrazellulären Kalziums aus, um den Transkriptionsfaktor ATF2 (activating
transcription factor 2) durch eine Phosphorylierung zu aktivieren.
1.5 Klinische Bedeutung
Die Regulation des Immunsystems spielt bei der Entstehung vieler Krankheiten
eine wichtige Rolle. Ohne Infektabwehr erliegt der menschliche Organismus in
kurzer Zeit ubiquitären Krankheitserregern, auch wenn wirksame Antiinfektiva
verabreicht werden. Aber auch eine überschießende oder fehlgesteuerte
Immunabwehr
kann
Krankheiten
auslösen:
Man
spricht
von
Autoimmunerkrankungen. Daraus wird die Bedeutung einer feinen Regulation der
Aktivität der Zellen des Immunsystems ersichtlich, und im Folgenden sollen einige
Krankheiten dargestellt werden, bei denen eine Dysregulation des Immunsystems
die Ursache ist.
Bei eingen Patienten mit dem schweren angeborenen Krankheitsbild der SCID
(severe combined immunodeficiency), bei der ein funktioneller Defekt sowohl der
T- als auch der B-Zellen vorliegt, konnte die Mutation einer Untereinheit der
21
CRAC-Kanäle (ORAI1) als Ursache identifiziert werden (9). Die T-Zellen dieser
Patienten
sind
in
der
Produktion
proinflammatorischer
Zytokine
stark
eingeschränkt.
Im Gegensatz zu Krankheiten, die mit einer Abwehrschwäche einhergehen, sind
Autoimmunerkrankungen durch Entzündungsprozesse charakterisiert, die ohne
ein nachweisbares infektiöses Agens in nahezu allen Organen auftreten können.
Meist verlaufen diese Krankheiten chronisch, häufig handelt es sich um eine
systemische Erkrankung.
Beispiele sind die Rheumatoide Arthritis (RA), die durch ein chronische
Entzündung vor allem der kleinen Gelenke mit häufig destruierendem Verlauf
gekennzeichnet ist; der Systemische Lupus erythematodes (SLE), bei dem es
durch eine starke Aktivierung der systemischen Entzündung, typischerweise mit
Verbrauch und serologisch messbarem Abfall der Komplement-Faktoren, in vielen
Organen zu einer Vaskulitis kommt; auch die Multiple Sklerose oder
Enzephalomyelitis disseminata ist eine Autoimmunerkrankung.
Das Wissen über die Entstehung dieser Krankheiten und die beteiligten
physiologischen Prozesse hat in den letzten Jahren zu einer Vielzahl neuer
Therapie-Möglichkeiten beigetragen, indem auf molekularer Ebene Stoffe, z.T.
Antikörper, z.T. Rezeptor-Konstrukte oder niedermolekulare Verbindungen,
entwickelt wurden, die gezielt in einzelne Regelkreise des Immunsystems
eingreifen (28).
Seit Mitte der neunziger Jahre sind in der Therapie der RA Wirkstoffe, die gegen
den Tumor-Nekrose-Faktor alpha gerichtet sind, zugelassen, die inzwischen
großen Stellenwert erreicht haben. Dabei handelt es sich um monoklonale
Antikörper bzw. ein Rezeptorkonstrukt; man spricht von der Klasse der Biologics.
Zahlreiche weitere selektiv wirkende Proteine befinden sich inzwischen kurz vor
der Zulassung oder in der klinischen Erprobung, und einige haben in den letzten
Jahren die Zulassung als Arzneimittel erhalten.
Auch das CD28-CD80/86-System ist Ziel eines dieser neuen Klasse von
Biologics, nämlich ein Fusionsprotein von CTLA-4 und dem Fc-terminalem Ende
eines Immunglobulin. Dieses Protein ist unter dem Namen Abatacept inzwischen
für die Therapie der RA zugelassen (17).
22
Ein weiterer potentieller Wirkstoff, der in dieses System eingreift, hatte im Jahr
2006 für Schalgzeilen gesorgt: Ein Antikörper gegen CD 28 hatte in
Mausmodellen
von
Autoimmunerkrankungen
gute
Wirkung
auf
den
Entzündungsprozess gezeigt (33), so dass dieser Wirkstoff zur Phase I der
klinischen Prüfung zugelassen wurde. Nach Infusion des Antikörpers kam es
jedoch bei allen sechs vorher gesunden Probanden zu einem rapid verlaufenden
schwerem Schock mit Multiorganversagen, ausgelöst durch ein SIRS (systemic
inflammatory response syndrome) (37). Dieser Prozess war zwar innerhalb von
Tagen reversibel, aber es blieben aufgrund des Schocks zumindest bei einigen
Patienten dauerhafte Schädigungen von Organen bestehen.
Offenbar bewirkt der Antikörper beim Menschen über CD 28 eine Aktvierung von
zahlreichen T-Zellen (36), die nach Aktivierung eine massiv Entzündungskaskade
auslösen; man sprich daher auch von einem Zytokin-Sturm ("cytokine storm").
Ausgehend vom Zwei-Signale-Modell der Kostimulation ist dies verständlich;
schließlich hat CD 28 hier die Funktion, T-Zellen zu aktivieren, und eine massive
und unspezifische Aktivierung von T-Zellen führt zur Freisetzung großer Mengen
proinflammatorischer Botenstoffe wie IL-2. Allerdings hatten die Mausmodellen
keinerlei Hinweise auf eine solche Reaktion gezeigt, sondern im Gegenteil waren
gesteigerte Entzündungsprozesse durch die Aktivierung von regulatorischen TZellen gebremst worden.
Dieser Fall illustriert auf drastische Art sowohl den großen Unterschied von
Laborexperimenten, auch wenn sie in vivo entstanden sind, zu dem tatsächlichen
Einsatz einer Therapie, als auch wie schwer Ergebnisse von einer Spezies auf
eine andere übertragen werden kann, in diesem Fall Mensch und Maus.
23
2. Fragestellung
Ein entscheidender Schritt einer effektiven Immunabwehr besteht in der
Aktivierung von Antigen-spezifischen T-Zellen. Dabei gilt inzwischen als
gesichert, das dafür nicht nur ein Signal erforderlich ist, sondern neben der
eigentlichen Antigen-Erkennung auch ein zweites Signal benötigt wird. Darauf
beruht die sogennante Zwei-Signale-Hypothese der Kostimulation. Das in diesem
Zusammenhang am Besten untersuchte Signalmolekül ist CD 28, dessen
Stimulation neben der Aktivierung von anderen Signaltransduktions-wegen, von
denen bereits viele Details bekannt sind, eine Erhöhung der intrazellulären
Kalziumkonzentration bewirkt, deren genaue Bedeutung noch nicht bekannt ist.
Um den Zusammenhang der Erhöhung des intrazellulären Kalzium und der
Aktivierung von CD28 genauer untersuchen, verglichen wir native Jurkat-Zellen
mit Zelllinien, die entweder mit dem Wildtyp des mCD 28 transfiziert worden
waren, oder mit unterschiedlichen Mutationen von diesem, welche abgewandelte
intrazelluläre Domänen aufweisen, bis hin zu einem Konstrukt ganz ohne
intrazelluläre Domänen ("tailless").
Ob in vitro durch eine bestimmte Versuchsanordnung eine Aktivierung analog der
Kostimulation erreicht wird, lässt sich anhand verschiedener Ansätze überprüfen.
Blastäre Zellen, wie Jurkat-Zellen, proliferieren auch ohne zusätzliche Aktivierung,
so dass die Bestimmung des Zellumsatzes hier keine Aussage über eine
erfolgreiche Stimulation liefert. Daher ist die Messung der Interleukin-2-Produktion
bei diesen Zelllinien eine etablierte Methode.
In dieser Arbeit wurden daher bei den verwendeten Jurkat-Zellen zunächst die
Expression
von
verschiedenen
Oberflächenmarkern
bestimmt,
dann
die
Interleukin-2-Produktion nach Stimulation über CD 28 und schließlich mittels
Fluoreszenz-Messung
die
Veränderungen
der
intrazellulären
Kalziumkonzentration nach Aktivierung von CD 28 gemessen.
Durch den Vergleich der unterschiedlichen Konstrukte sollten Hinweise darauf
gefunden werden, wie in T-Zellen die Signaltransduktion über CD28 abläuft, die
zur Erhöhung der intrazellulären Kalziumkonzentration führt.
24
3. Material
3.1 Zelllinien
3.1.1 Jurkat-Zellen
Für die Experimente, die im Rahmen dieser Arbeit durchgeführt wurden, wurden
Jurkat-Zellen verwendet. Bei Jurkat-Zellen handelt es sich um eine menschliche
Tumorzelllinie, die zum ersten Mal 1977 beschrieben wurde. Sie stammt aus dem
peripheren Blut eines vierzehnjährigen Jungen mit Akuter Lymphatischer
Leukämie im ersten Rezidiv. Sie proliferiert in RPMI-Medium bzw. R10F+ ohne
Zusätze.
Die
für
diese
Arbeit
verwendeten
Konstrukte
bzw.
die
nativen,
also
untransfizierten Jurkat-Zellen stammen aus Beständen des Labors Thomas
Nagel. Die Transfektionen wurden von Dr. Thomas Nagel et al. an der University
of Caifornia, San Francisco durchgeführt.
Mit folgenden Konstrukten wurden Experimente durchgeführt:
Konstrukt
mCD28WT
Klon
1C6EWT-A3
A4-1A10
1EWT-A1
mCD28TL
B5A5
C1-II B6
D5-I B2
3.2 Chemikalien und Antikörper
3.2.1 Reagenzien für die Zellkultur
RPMI 1640
GIBCO
Fetales Kälberserum
GIBCO
Glutamin
GIBCO
Penicillin
GIBCO
25
Streptomycin
GIBCO
3.2.2 Reagenzien für die PBMC-Gewinnung und die Blasten-Kultur
Unfraktioniertes Heparin
Hanks-Lösung:
NaCl
8,4g
KCl
0,4g
MgSO4x7H20
0,2g
KH2PO4
0,06g
NaHCO3
0,35g
CaCl2x2H2O
0,14g
Na2HPO4x2H2O
0,06g
Glucosemonohydrat
1,0g
Phenolrot
0,02g
H2O ad inject.
ad 1,0l
(hergestellt von der Apotheke des Universitätsklinikums Erlangen)
Lymphoflot
Biotest
humanes IL2
Sigma
PHA
Sigma
3.2.3 Reagenzien für die Expressionsmessung
Gegen humane Epitope gerichtete Antikörper:
mouse-α-CD3; biotinyliert
UCHT1
R&D
mouse-α-CD28; PE-konjugiert
28.2
PharMingen
Isotyp-Kontrolle:
murines IgG1, κ; PE-konjugiert
PharMingen
Streptavidin; PE-konjugiert
PharMingen
26
Gegen murine Epitope gerichtete Antikörper:
hamster-α-CD3e; unkonjugiert
145-2C11
PharMingen
hamster-α-CD28; PE-konjugiert
37.51
PharMingen
Isotyp-Kontrolle:
hamster-IgG1, κ; PE-konjugiert
PharMingen
Sekundärantikörper:
goat-α-hamster-IgG; FITC-konjugiert
ICNBiomedicals
3.2.4 Reagenzien für die Stimulationsversuche
PMA
Sigma
IoM
Sigma
Verwendete Antikörper:
α-humanCD28
28.2
PharMingen
α-murinCD28
37.51
PharMingen
3.2.5 Reagenzien für die IL2-Messung
3.2.5.1
Reagenzien und Pufferlösungen
Waschpuffer:
0,05% Tween 20 in PBS gelöst; pH 7,2 – 7,4
Blockpuffer:
1% BSA, 5% Saccharose, 0,05% NaN3; in PBS gelöst
Verdünnungslösung:
0,1% BSA, 0,05% Tween 20, 20mM Tris-Base, 150mM NaCl;
27
pH7,2 – 7,4; 0,22µm-sterilfiltriert
Substratlösung:
gebrauchsfertige Lösung aus TMB und H2O2;
Sigma
Stopplösung:
2N H2SO4
Merck
3.2.5.2
Kits
Zur Messung von IL2 wurden die kommerziellen Kits DuoSet ELISA Development
System der Firma R&D Systems verwendet. Diese bestanden aus:
hu-IL2:
m-IL2
Kopplungsantikörper
mouse-α-human-IL2
Zweitantikörper
goat-α-human-IL2, biotinyliert
Detektionssytem
Streptavidin-Meerrettich-Peroxidase
Standard
rekombinantes humanes IL2
Kopplungsantikörper
rat-α-mouse-IL2
Zweitantikörper
goat-α-mouse-IL2, biotinyliert
Detektionssytem
Streptavidin-Meerrettich-Peroxidase
Standart
rekombinantes murines IL2
3.2.6 Reagenzien für die Kalziummessung
Fluo-3AM
Fluka
IoM
Sigma
SPy
Sigma
Verwendete Antikörper:
α-humanCD3
OKT3
α-humanCD28
28.2
PharMingen
α-murinCD28
37.51
PharMingen
28
3.2.7 Verbrauchschemikalien
3.3
BSA
Merck
CaCl2
Merck
DMSO
Sigma
EGTA
Merck
Ethanol
Merck
HCl
Merck
H2O-MilliPore
hauseigene Herstellung
Isotone Kochsalzlösung
Baxter
KCl
Merck
NaCl
Merck
Na2HPO4
Merck
NaH2PO4
Merck
NaOH
Merck
NaN3
Merck
Pluronic-F127
Sigma
Ringer-Lösung
Baxter
Saccharose
Merck
Tris-HCl
Merck
Trypanblau
Merck
Tween20
Serva
Verbrauchsmaterial
Einmalpipette
2ml, 10ml
Sarstedt
20ml
Greiner
Injektionsspritzen 2ml, 5ml, 10ml, 20ml
Braun/
Beckton-Dickinson
29
Kulturflaschen 50ml, 250ml Cellstar
Greiner
Mikrotiterplatten
24-well, Flachboden, steril
Greiner
96-well, Flachboden, steril
Greiner
96-well, Rundboden, steril
Greiner
96-well, Spitzboden, unsteril
Greiner
96-well, Immuno Plate MaxiSorp
Nunc
Pipettenspitzen 20µl, 300µl, 1000µl
Greiner
Reaktionsgefäße
3.4
0,5ml, 1,5ml
Eppendorf
Einfrierröhrchen 2ml mit Schraubverschluss
Nunc
FACS-Röhrchen 5ml
Beckton-Dickinson
Falcon-Röhrchen 15ml, 50ml
Beckton-Dickinson
Stericup-Filtersystem, Filtergröße 0,22µm
Pall
Sterilfiter 0,2µm
MilliPore
Geräte
Es folgt eine Aufzählung der verwendeten elektrischen Geräte in alphabetischer
Reihenfolge mit Angabe der Bezeichnung und des Herstellers.
Autoklav
A5
Webeco
Brutschrank
B 5060 EK/CO2
Heraeus
Fluoreszenz-Messgerät
Epics
Eismaschine
??
Feinwaagen
R160P – D1
Sartorius
Gasbrenner
Fireboy
TecnoMara
Kalzium-Messplatz:
Photonenlampe
Messschacht/
Heizblock
30
Thermostat
Photomultiplier
Magnetrührer
Kühlgeräte:
Kühlschrank 4°C
Liebherr
Gefrierschrank –20°C
Liebherr
Gefrierschrank –80°C
Queue Basic
Stickstofftank
Kryson
Magnetrührer
MR2002
Heidolph
Mikroskope
Leitz
pH-Messgerät
pH Meter pH 340
WTW
Photometer
Dynatech M5
Panasonic
5000 KX PII 70
Pipetten
je ein Satz mit
Finnpipette
10µl/40µl/200µl/1000µl
für Zellkultur-Arbeit und
Arbeiten außerhalb der
Zellkultur;
für ELISA zusätzlich 300µl
Multipette
Pipettierhilfe
accu-jet
Brand
Sterilbank
LaminAir HLB2448 GS
Heraeus
Taschenrechner
fx-991D
Casio
Vakuumpumpe
Mini Vac E1
AXON LAB
Vortex-Gerät
REAX 2000
Heidolph
Wasserbad
3042
KÖTTERMANN
Wasserfiltrationsanlage MilliQ
MilliPore
Zentrifugen
GPR 310 626
Beckmann
GS-15R
Beckmann
Rotixa R/P
Hettich
SuperspeedRC2-B
Sorvall
31
4.
Methoden
4.1 Zellkultur
4.1.1 Allgemeine Bedingungen
Jurkat und A1.1 Zellen wurden im Brutschrank bei 37°C, 100% Luftfeuchtigkeit
und 5% CO2 kultiviert. Als Medium wurde RPMI 1640 verwendet, dem 4mM LGlutamin, Penicillin G und Streptomycin sowie fetales Kälberserum (FCS) in
10%iger (R10F+) bzw. 20%iger Verdünnung (R20F+) zugesetzt wurden. Das FCS
wurde vor der Zugabe 30 Minuten bei 56°C inaktivier t. Das fertige Medium wurde
zu je 500ml angesetzt und vor der Verwendung mit Hilfe einer Filtereinheit, die an
eine Vakuumpumpe angeschlossen wurde, sterilfiltriert. Die Filtergröße betrug
0,2µm. Das so hergestellte Medium wurde bei 8°C auf bewahrt und innerhalb 10
bis 14 Tagen aufgebraucht; Reste wurden verworfen.
4.1.2 Herkunft und Konservierung
Alle verwendeten Jurkat- und A1.1-Konstrukte stammen aus den Beständen der
Arbeitsgruppe Nagel. Sie wurden in flüssigem Stickstoff bei –196°C konserviert.
Vor dem Einfrieren wurden die Zellen in R20F+ aufgenommen, auf Eis 1:1 mit
18% DMSO in R10F+ versetzt und direkt anschließend bei –80°C eingefr oren.
Nach 24 Stunden erfolgte dann das Umsetzen in einen Tank mit flüssigem
Stickstoff.
Nach dem Auftauen wurden die Proben in R10F+ aufgenommen, abzentrifugiert
und in R10F+ resuspendiert, um das DMSO aus der Zellsuspension zu entfernen.
Die Zellen wurden je nach Bedarf in Kulturflaschen von 10ml oder 50 ml
expandiert. Nach etwa ein bis zwei Wochen Kultur nach dem Auftauen standen
wieder ausreichend Zellen zur Verfügung. Während der Kultur wurde auf
Selektionsmedium mit Zusatz von Geneticin (G418) verzichtet, um eine
Interaktion des Aminoglykosides mit dem Calciumstoffwechsel der Zellen
auszuschließen.
32
4.1.3 Bestimmung der Zellzahl
Zur Bestimmung der Zelldichte werden 10µl der Kulturflasche entnommen und mit
10µl Trypanblau gemischt. Dabei wird diese Mischung mehrmals mit einer Pipette
aufgenommen und wieder in das Reaktionsgefäß gegeben, um Zellhaufen zu
trennen, die sonst bei der Zählung das Ergebnis verfälschen würden.
Die Zählung wird mit Hilfe einer Neubauer-Zählkammer am Lichtmikroskop
vorgenommen. Es wurden je 2x16 Kleinquadrate ausgezählt. Die Zelldichte in
Kultur ergibt sich dann aus folgender Formel:
Anzahl Zellen pro ml = Gezählte Zellen (in 32 Kleinquadraten) x 10000
4.1.4 PBMCs und PHA/IL2-Blasten
Zur Gewinnung von Lymphozyten aus dem peripheren Blut von gesunden
Spendern wurden mittels Venenpunktion 20ml Vollblut gewonnen. Dieses wurde
dann mit 2ml Heparin ungerinnbar gemacht und in einem 50ml-Falcon-Röhrchen
mit Hanks-Lösung auf ca. 40ml aufgefüllt.
In einem zweiten 50ml-Röhrchen wurden 12ml Saccharose-Lösung, z.B.
Lymphoflot, vorgelegt und vorsichtig mit der Blut/Hanks-Mischung überschichtet.
Nach zwanzigminütiger Zentrifugation (1920 U/min, keine Bremse) sammeln sich
die Lymphozyten an der Grenzschicht zwischen Saccharose-Lösung und HanksLösung.
Dort lassen sie sich mit einer 10ml-Pipette abnehmen, wobei darauf geachtet
werden
sollte,
dass
möglichst
wenig
Saccharose-
oder
Hanks-Lösung
mitabpipettiert wird. Die so gewonnene Lymphozyten-Fraktion wird mit HanksLösung auf 30ml aufgefüllt, abzentrifugiert, der Überstand wird verworfen und das
Pellet wird mit Hanks resuspendiert. Zur Kontrolle wird eine Zählung (s.o.)
durchgeführt; normalerweise sollten sich aus 20ml Vollblut mindestens 30
Millionen PBMCs gewinnen lassen.
33
Anschließend werden die Zellen in R10F+ auf 6 Millionen Zellen pro ml eingestellt
und in Kulturflaschen gegeben. Dem Medium werden zusätzlich noch 1,0ml PHALösung (Zielkonzentration: 1,0µg/ml) und 1,2 ml humanes IL2 zugesetzt.
Je nach Wachstum – kontrolliert durch den Umschlag des Indikators im Medium
und mikroskopisch – werden die Zellen am zweiten oder dritten Tag in neues
Medium umgesetzt. Dazu wird die Zellsuspension abzentrifugiert und mit frischem
R10F+ und PHA und IL2 in denselben Konzentrationen wie am ersten Tag
resuspendiert.
Das nächste Umsetzen erfolgt genauso, zwei bis drei Tage später, wobei dann
kein PHA mehr zugesetzt wird. Am siebten Tag in Kultur stehen die Zellen für
Versuche zur Verfügung.
4.2 Messung der Oberflächenmarker
4.2.1 Färbung mit unkonjugiertem Primärantikörper
Zur Messung der Expression von murinem CD3 auf der Oberfläche von Zellen
wurden je Probe 0,5 – 1 Mio Zellen in 5ml-FACS-Röhrchen eingesetzt,
abzentrifugiert und der Überstand verworfen. Das Pellet wurde dann mit 1ml PBS,
in dem ein unkonjugierter hamster-α-murinCD3e mAb als Primärantikörper in
einer Konzentration von 10µg/ml gelöst war, resuspendiert und auf Eis für 30
Minuten inkubiert.
Anschließend folgten drei Waschschritte mit Abzentrifugieren, Verwerfen des
Überstandes und Resuspendieren in PBS, um freien Erstantikörper komplett aus
der Suspension zu entfernen.
Als Zweitantikörper wurde ein FITC-konjugierter goat-α-hamsterIgG-Antikörper
ebenfalls in einer Konzentration von 10µg/ml eingesetzt. Nach weiteren 30
Minuten Inkubationszeit wurde jede Probe wieder dreimal in PBS gewaschen und
zur Messung resuspendiert.
34
4.2.2 Färbung mit biotinyliertem Primärantikörper
Die Expression von humanem CD3 auf kultivierten Zellen wurde mit Hilfe eines
biotinyliertem mouse-α-humanCD3-Antikörper bestimmt. Die Färbung erfolgt nach
dem gleichem Schema wie bei unkonjugiertem Antikörper, nur dass statt
Zweitantikörper mit PE-konjugiertem Streptavidin inkubiert wird.
4.2.3 Färbung mit direkt konjugiertem Antikörper
Für die Messung der Expression von humanem und murinem CD28 standen PEkonjugierte mouse-α-humanCD28- bzw. hamster-α-mouseCD28-Antikörper zur
Verfügung, deshalb erfolgte hier nur ein Färbeschritt und die Proben konnten
nach dreimaligem Waschen direkt zur Messung eingesetzt werden.
4.2.4 Kontrollen
Als Negativkontrolle wurde bei allen Messungen eine Probe mit unbehandelten
Zellen mitgeführt, eine Probe derselben Zellen mit Isotyp-Kontrolle und ggf. mit
Sekundärantikörper inkubiert und eine Probe lediglich mit dem Zweitantikörper
bzw. Streptavidin-PE behandelt.
Als Positivkontrolle dienten Zellen mit bekannter Expression von humanem bzw.
murinem CD3 und CD28.
4.2.5 Messung
Die eigentliche Messung erfolgte an einem Durchfluss-Fluoreszenz-Cytometer
EPICS XL bei einer Verstärkung von 850V.
35
4.3 Stimulationsversuche
4.3.1 Voraussetzungen und Vorbereitung der Zellen
Vor den Versuchen wurde durch gleichzeitiges Splitten der verschiedenen
Kulturen dafür gesorgt, dass sich alle Konstrukte in einer vergleichbares
Wachstumsphase befanden. Die Zellen sollten ebenfalls nicht überwachsen sein.
Am Versuchstag wurde mit der Neubauer-Zählkammer (s.o.) die Zelldichte in den
einzelnen Kulturen bestimmt.
Zur Vorbereitung wurde zunächst das Medium, in dem die Zellen gewachsen
waren,
durch Zentrifugieren vollständig entfernt, um stimulierende oder
inhibierende Faktoren zu entfernen. Das Zellpellet wurde dann in frischem R10F+
wieder aufgenommen; dabei wurden alle Konstrukte auf die Konzentration von
500000 Zellen pro ml eingestellt.
4.3.2 Versuchsansatz
Die Versuche wurden in 96well-Platten als Doppelwerte angesetzt, d.h. jeder
einzelne Ansatz wurde zweimal durchgeführt.
Pro well wurden 125µl Zellsuspension und 125µl Ansatz eingesetzt, so dass die
endgültige Zelldichte bei 250000 Zellen pro ml lag. Der Ansatz enthielt die
untersuchten Simulantien, gelöst in R10F+. Dabei wurden eingesetzt:
Stocklösung
Zielkonzentration
Ionomycin 1mM in DMSO
1µM
PMA
1mg/ml in DMSO
5ng/ml
mAbs
1mg/ml
10µg/ml
36
Die Plattenbelegung war wie folgt:
Jurkat-plain
1
2
Jurkat-mCD28WT
Jurkat-mCD28TL
3
5
4
A
unstimuliert
B
PMA/IoM + ∅
C
PMA/IoM + a-huCD28
D
∅ + a-huCD28
E
PMA/IoM + a-mCD28
F
∅ + a-mCD28
6
4.3.3 Verlauf und Ende des Versuchs
Die Platten wurden 24h im Brutschrank inkubiert. Das Wachstum der Zellen
wurde lichtmikroskopisch kontrolliert. Am Versuchsende wurden die Platten
abzentrifugiert und der Überstand abgenommen. Dabei wurde darauf geachtet,
möglichst wenig Zellen mit aufzunehmen, da diese Interleukin-2 zerstören und so
das Versuchsergebnis verfälschen könnten.
Die Überstände wurden direkt zur Messung eingesetzt; es ist prinzipiell auch
möglich, die Überstände bei –20°C für spätere Messu ngen zu konservieren.
4.4 Messung von Interleukin-2 mit ELISA
4.4.1 Präparieren der Platte
Am Vortag der Messung wurde der Kopplungsantikörper (bei Messung von
humanem IL2: mouse-α-human-IL2, für murines IL2: rat-α-mouse-IL2) in der
Arbeitskonzentration von 4µg/ml in PBS auf der 96-well-Platte aufgebracht. Dabei
wurden pro well 100µl eingesetzt.
37
Die so vorbereitete Platte wurde dann mit selbstklebender Folie versiegelt und
über Nacht bei Raumtemperatur inkubiert.
Am Messtag selbst wurde die Platte mit Hilfe eines autowashers fünfmal mit
Waschpuffer
gespült
und
nach
dem
letzten
Waschschritt
auf
Zellstoff
ausgeschlagen.
Anschließend wurden in jedes well 400µl Blockpuffer mit 1% BSA aufgebracht
und versiegelt über zwei Stunden bei Raumtemperatur inkubiert.
Nach erneutem fünfmaligen Waschen und Entfernung des Waschpuffers nach
dem letzten Schritt mittels Ausklopfen auf Zellstoff ist die Platte bereit zum
Auftragen der Proben.
4.4.2 Auftragen der Proben
Es wurden für jedes well auf der Messplatte 100µl Probe eingesetzt. Die Proben,
bei denen ein Wert zu erwarten war, der außerhalb des optimalen Messbereichs
lag, wurden in Verdünnungen von 1:3 oder 1:10 eingesetzt. Außerdem wurden
die Leerwerte und die Standards von 1000pg/ml IL2 bis 15,625pg/ml IL2 jeweils
1:1 verdünnt aufgetragen. Für den Leerwert wurden zwei wells nicht gefüllt.
Anschließend wurde die Platte mit Folie bedeckt und für zwei Stunden bei
Raumtemperatur inkubiert und danach erneut – wie oben beschrieben –
gewaschen. Als Zweitantikörper wurde ein Ziege-a-human-IL2 mAb verwendet,
der in einer Konzentration von 50ng/ml eingesetzt wurde und zwei Stunden
inkubiert.
4.4.3 Detektion
Nach abermaligen Waschen wurde zur Detektion an Streptavidin gekoppelte
Meerrettich-Peroxidase in einer Konzentration von 1:200 der Stocklösung
eingesetzt und für 20 Minuten bei Raumtemperatur unter Lichtabschluss inkubiert.
Auf den nächsten Waschschritt folgte die Zugabe von gebrauchsfertiger TMB38
Lösung mit H2O2 und Inkubation für 20 Minuten unter Lichtabschluss bei
Raumtemperatur.
4.4.4 Entwicklung und Auswertung
Der ELISA wurde gestoppt, wenn der Standard mit der höchsten Konzentration
eine deutliche Blaufärbung erreicht hat. Als Stopplösung wurde pro well 50 µl 2NH2SO4 zugegeben.
Das Ablesen der Extinktionswerte erfolgte mit dem Photometer DYNATECH
MR5000 bei 520nm. An Hand der Standardwerte wurde automatisch eine
Standardkurve berechnet, aus der wiederum die Konzentrationen der Proben
extrapoliert wurde. Dabei wurden eventuelle Verdünnungen der Proben
berücksichtigt.
4.5 Bestimmung der intrazellulären Kalziumkonzentration
4.5.1 Vorbereitungen und Voraussetzung
Zur Messung des intrazellulären Kalziums wurden Zellen aus Kultur verwendet,
wenn die Dichte in Kultur über einer Million Zellen pro ml Zellsuspension lag. Die
Zählung erfolgte mit Hilfe einer Neubauer-Zählkammer (s.o.). Pro Ansatz wurden
zwei Millionen Zellen gerechnet.
4.5.2 Labeln mit Fluo-3AM
Die Inkubation mit Fluo-3AM erfolgte lichtgeschützt über 30 Minuten im
Brutschrank. Dabei wurde eine Zellsuspension mit einer Zelldichte von 10
Millionen Zellen pro ml mit Fluo-3AM in einer Endkonzentration von 2µM, gelöst in
DMSO, versetzt. Um einen aktiven Transport des Fluo-3AM aus den Zellen zu
verhindern, wurde zusätzlich noch Sulfinpyrazon (SPy) in einer Endkonzentration
39
von 250µM zugegeben.
4.5.3 Vorbereitung für die Messung
Nach der vorgesehenen Inkubationszeit wurde der Ansatz mit R10F+ und Zusatz
von 250µM SPy 1:5 verdünnt und zweimal gewaschen. Zur Messung wurden die
Zellen in Ansätze von 1ml mit je 2 Millionen Zellen in R10F+ aufgeteilt und
unmittelbar vor der Messung erneut abzentrifugiert und in Ringerlösung
resuspendiert, wenn das Experiment unter Anwesenheit von extrazellulärem
Kalzium stattfinden sollte. Für Experimente in kalziumfreiem Medium wurden die
Zellen in 0,9% NaCl-Lösung resuspendiert.
Für die Messung wurde die so vorbereitete Zellsuspension in eine Messküvette,
in der sich ein Magnetrührer befindet, überführt und unverzüglich in den
Messschacht eingesetzt.
4.5.4 Ablauf der Messung
Die Messung erfolgte an einem Fluoreszenz-Messplatz bei einer Wellenlänge von
505nm. Die Fluoreszenz wurde bei 530nm gemessen. Zur Steuerung der
Messung wurde das Programm Felix verwendet. Als Startpunkt wurde ein Intervall
von mindestens 100s gewählt, in dem die Fluoreszenz sich nicht wesentlich
verändern darf, d.h. eine waagrechte baseline gemessen wird.
Als erstes Ereignis erfolgte nach 100s die Zugabe von, je nach Versuch, αhuCD28-mAb bzw. α-mCD28-mAb in einer Konzentration von 5µg/ml. In
Abhängigkeit von der Reaktion wurde nach 200 bis 300 Sekunden α-CD3-mAb
(5µg/ml)
zugegeben.
Für
die
Umrechnung
von
Fluoreszenz
in
Kalziumkonzentration wurde am Ende der Messung Ionomycin (IoM) in einer
Konzentration von 5µM zugegeben, was einen maximalen Kalziumeinstrom in die
Zellen
und
eine
vollständige
Freisetzung
aus
den
intrazellulären
Kalziumspeichern bewirkt. Bei kalziumfreiem Medium wurden zusätzlich noch
40
2mM Kalziumchlorid zugegeben.
Zwischen allen Messungen wurde die Küvette mit Methanol gereinigt, um das
Ionomycin vollständig zu entfernen, und anschließend mehrmals mit destilliertem
Wasser gespült. Die Ansätze mit den gelabelten Zellen für die nächsten
Messungen wurden während des laufenden Messvorgangs lichtgeschützt auf Eis
aufbewahrt.
4.5.5 Leerwert
Um die Autofluoreszenz zu bestimmen, wurde von Beginn an ein Ansatz mit
ungelabelten Zellen mitgeführt, die auf eine Zelldichte von 2 Millionen Zellen pro
ml eingestellt wurden. Im Anschluss an die letzte Messung wurden diese Zellen
wurden als letzte Messung ebenfalls in Ringerlösung überführt und in die
Messküvette eingesetzt. Nach Einstellen einer konstanten baseline wurde über
200 Sekunden die Fluoreszenz gemessen.
41
5. Ergebnisse
5.1 Messung von Interleukin-2 nach Stimulation
Durch Messung der IL-2-Produktion nach Stimulation mit unterschiedlichen
Ansätzen kann kontrolliert werden, ob eine effektive Kostimulation stattfindet. Bei
allen
verwendeten
Klonen
der
transfizierten
Jurkat-Zelllinien
wurde
die
Interleukin-2-Produktion jeweils im Vergleich mit nicht-transfizierten Zellen
gemessen. Es wurden vier Messreihen jeweils mit einem untransfizierten, mit
einer mit mCD28WT und mit einer mit mCD28TL transfizierten Zelllinie
durchgeführt.
Das arithmetische Mittel der IL-2-Produktion nach PMA/IoM wurde dabei als 100
gesetzt, um die Veränderung durch Zugabe eines monoklonalen Antikörpers zu
erfassen.
Bei unstimulierten Jurkat-Zellen (unabhängig ob transfiziert oder nicht) war in dem
verwendeten Messansatz keine relevante IL-2-Produktion nachweisbar.
5.1.1 Untransfizierte Jurkats
Die IL-2-Produktion untransfizierter Jurkat-Zellen bei Stimulation mit PMA/IoM lag
im Mittel bei 4,4 ng/ml pro 250000 Zellen. Bei Zugabe von anti-humanCD28-mAb
wurde ein Anstieg auf 13,5 ng/ml gemessen, entsprechend 303 % der IL-2Produktion nach Stimulation lediglich mit PMA/IoM.
Bei Zugabe von anti-mouseCD28-mAb zu PMA/IoM lag die IL-2-Produktion
durchschnittlich bei 4,0 ng/ml und unterschied sich damit nicht signifikant von der
Produktion bei Stimulation mit PMA/IoM alleine.
5.1.2 mCD28WT-transfizierte Jurkats
Die IL-2-Produktion von mit mCD28WT-transfizierten Jurkat-Zellen bei Stimulation
mit PMA/IoM lag durchschnittlich bei 4,5 ng/ml. Bei Zugabe von anti-humanCD2842
mAb wurde ein Anstieg auf 13,8 ng/ml, entsprechend 307 % der IL-2-Produktion
nach Stimulation nur mit PMA/IoM, gemessen.
Bei Zugabe von anti-mouseCD28-mAb zu PMA/IoM kam es zu einem Anstieg der
IL-2-Produktion auf durchschnittlich 16,1 ng/ml bzw. auf 358 % der IL-2Produktion nach Stimulation mit PMA/IoM.
5.1.3 mCD28TL-transfizierte Jurkats
Die IL-2-Produktion von mit mCD28TL-transfizierten Jurkat-Zellen bei Stimulation
mit PMA/IoM lag im Mittel bei 3,4 ng/ml. Bei Zugabe von anti-humanCD28-mAb
wurde ein Anstieg auf 12,5 ng/ml, entsprechend 372 % der IL-2-Produktion nach
Stimulation nur mit PMA/IoM, gemessen.
Bei Zugabe von anti-mouseCD28-mAb zu PMA/IoM lag die IL-2-Produktion
durchschnittlich bei 2,9 ng/ml und unterschied sich nicht signifikant von der
Produktion bei Stimulation mit PMA/IoM alleine.
43
5.2 Messung der intrazellulären Kalzium-Konzentration
5.2.1 Aussagen über die Verwertbarkeit der Ergebnisse
Eine
wichtige
Kontrolle
jeder
einzelnen
Messung
ist
eine
stabile
Kalziumkonzentration zu Beginn der Messung, die Baseline. Als Baseline wird die
basale Fluoreszenz der unstimulierten Zellen bezeichnet.
Eine steigende Baseline wurde dabei als ständiger Kalzium-Einstrom in die Zellen
interpretiert, entweder auf Grund einer Schädigung während des Label-Vorgangs
oder der Waschschritte, oder durch eine unspezifische Aktivierung der Zellen. In
diesen Fällen wurde die Messung abgebrochen.
Wenn die Baseline über mindestens hundert Sekunden um nicht mehr als 10%
des Ausgangswertes anstieg oder stabil blieb, wurde dies als Hinweis auf
funktionell intakte Zellen gewertet und die Messung durchgeführt.
Als Positivkontrolle wurde der Anstieg der Fluoreszenz nach OKT3- bzw. αmCD3-Zugabe gewertet. Als Zeichen für die Vitalität der eingesetzten Zellen
wurde ein deutlicher Anstieg der Fluoreszenz innerhalb von 50 Sekunden mit
anschließendem raschem Abfall gewertet.
5.2.2 Messungen mit Jurkat-Zellen
5.2.2.1
Untransfizierte Jurkats
Insgesamt wurden 22 unterschiedliche Messungen in neun von einander
unabhängigen Experimenten ausgewertet.
Durchgeführtes
Anzahl der
Einzelmessungen
Unabhängige
Experimente
α-huCD28
12
9
α-huCD28 in NaCl
4
4
α-mCD28
5
4
mouse-IgG1
1
1
Experiment
44
Die intrazelluläre Kalziumkonzentration zu Beginn der Messungen, die Baseline,
lag bei den 18 ausgewerteten Messungen in Ringer-Lösung zwischen 226nM und
404nM (durchschnittlich 307nM, Standardabweichung 46,6).
In kalziumfreiem Medium ergab sich eine deutlich niedrigere Baseline mit einer
durchschnittlichen intrazellulären Kalziumkonzentration von 57nM
5.2.2.1.1 Stimulation mit α-humanCD28-Antikörper
Bei allen ausgewerteten Messungen war ein deutlicher Anstieg des intrazellulären
Kalziums
nach Zugabe von 5µg/ml
durchschnittliche
Anstieg
betrug
in
α-huCD28-mAb zu erkennen.
Ringer-Lösung
32,4%
bei
Der
einer
Standardabweichung von 24,1, das entspricht einem durchschnittlichen Anstieg
von 305nM auf 396nM. Der geringste Anstieg betrug 10,4% (336nM auf 371nM),
der größte 82,2% (264 auf 481nM).
Der Anstieg war bereits in den ersten fünf bis zehn Sekunden nach Zugabe zu
erkennen. Nach etwa 100 Sekunden ging der Anstieg in eine Plateauphase über.
Dieser Anstieg der intrazellulären Kalziumkonzentration war signifikant (p = 0,11%
im t-Test für verbundene Stichproben).
Um eine unspezifische Stimulation durch die Antikörperzugabe auszuschließen,
wurde eine Messung mit Maus-IgG1 durchgeführt. Dabei kam es nicht zu einem
Anstieg der Fluoreszenz. Auch die Zugabe von α-mouseCD28 in der gleichen
Konzentration
bewirkte
keine
messbare
Erhöhung
der
intrazellulären
Kalziumkonzentration. Diese Messung wurde insgesamt fünfmal durchgeführt.
In kalziumfreiem Medium (0,9%NaCl + 1mM EGTA) durchgeführte Messungen
mit
α-huCD28
zeigten
ebenfalls
einen
Anstieg
der
intrazellulären
Kalziumkonzentration mit einem Maximum nach 80 bis 100 Sekunden, aber im
Gegensatz zu Messungen in Ringer-Lösung kam es nach diesem Anstieg nicht zu
einer anschließenden Plateauphase, sondern zu einem Absinken der Fluoreszenz
auf etwa Baseline-Niveau.
45
5.2.2.1.2 Stimulation mit OKT3-Antikörper
Die charakteristische Reaktion auf Zugabe von α-CD3-Antikörper (5µg/ml) stellte
sich als schmaler, hoher Peak mit anschließendem Abfall und Plateauphase dar,
wobei die Fluoreszenz nach OKT3-Zugabe höher war als die vorher gemessenen
Werte. Dieser Peak erreichte sein Maximum nach etwa 50 Sekunden, die
intrazelluläre Kalziumkonzentration stieg dabei um durchschnittlich 168%
(Minimum: 80%, Maximum: 288%, Standardabweichung 62,0%) an auf Werte
zwischen 577nM und 1034nM (Durchschnitt: 776nM, Standardabweichung 143).
Die Höhe des OKT3-Peaks bei Experimenten, bei denen vor OKT3-Gabe mit αhuCD28 stimuliert worden war, lag dabei bei 803nM (Standardabweichung 146),
während bei Experimenten, bei denen dies nicht der Fall war, der OKT3-Peak nur
722nM (Standardabweichung 119) erreichte. Dieser Unterschied war jedoch nicht
signifikant (p=0,068 im zweiseitigen ungepaarten t-Test).
Das sich anschließende Plateau lag im Mittel bei allen Messungen mit Jurkat um
72% über der Baseline zu Beginn der Messung. Nach Zugabe von αhumanCD28-mAb
und
anschließender
Stimulation
mit
OKT3
lag
die
Plateauphase bei durchschnittlich 561nM (Standardabweichung 98,0), was einem
Anstieg von 86% im Vergleich zur Baseline bei Beginn der Messung entspricht.
Bei vorhergehender Zugabe von α-mouseCD28-Antikörper, bei denen es nicht zu
einem
Anstieg
der
Fluoreszenz
gekommen
war,
lag
die
intrazelluläre
Kalziumkonzentration nach dem Peak durch OKT3 lediglich um 37% höher als
Baseline-Niveau, im Mittel bei 561nM (Standardabweichung 54,1). Dieser
Unterschied war signifikant mit p = 0,0069 (zweiseitig ungepaarter t-Test).
46
Jurkat-plain:
Stimulation +/-a-huCD28, OKT3
2+
[Ca ]i nM
1000
800
600
400
200
baseline
okt3 peak
a-huCD28/OKT3
okt3 plateau
a-mCD28/OKT3
Der Verlauf der Fluoreszenz bei Stimulation mit OKT3 in kalziumfreiem Medium
unterschied sich zum einen durch die Höhe des Peaks, zum anderen dadurch,
dass die Fluoreszenz nach OKT3 – ebenso wie nach α-huCD28 – wieder bis auf
Baseline-Niveau oder noch weiter absank.
2+
[Ca ]i nM
Jurkat-plain: OKT3 in NaCl
150
125
100
75
50
baseline
a-CD3 50s
a-CD3 100s
5.2.2.1.3 Weitere Messungen
Es wurde noch je eine Stimulation mit α-huCD28-mAb und OKT3 in RingerLösung durchgeführt, der die Kalziumkanal-Inihibitoren M-β-Cyclodextrin bzw.
SK&F 36365 zugesetzt waren. Allerdings stellte sich dabei keine stabile Baseline
47
ein, so dass diese Experimente nicht verwertbar sind und keine weiteren
Messungen mit SK&F 36365 durchgeführt wurden.
Jurkat-plain:
Stimulation mit a-huCD28/OKT3 in Ringer/SK&F
2+
[Ca ]i (nM)
500
400
300
200
0
100
200
300
400
500
600
700
time (s)
Jurkat-plain:
Stimulation mit a-huCD28, OKT3 in Ringer/MßCD
2+
[Ca ]i (nM)
700
600
500
400
300
0
100
200
300
time (s)
2+
2+
[Ca ]i (nM)
300
[Ca ]i (nM)
0
100
time (s)
200
500
Jurkat-plain:
Stimulation mit a-huCD28 in
Ringer/SK&F
Jurkat-plain:
Stimulation mit a-huCD28,
in Ringer/MßCD
380
360
340
320
300
400
280
260
240
220
0
48
100
200
time (s)
5.2.2.2
mCD28WT-transfizierte Jurkats
Insgesamt wurden 19 unterschiedliche Messungen in sechs von einander
unabhängigen Experimenten ausgewertet.
Anzahl der
Einzelmessungen
Unabhängige
Experimente
9
8
α-huCD28 in NaCl 3
3
α-mCD28
5
5
mouse-IgG1
1
1
hamster-IgG
1
1
Durchgeführtes
Experiment
α-huCD28
Wir verwendeten drei verschiedene mit mCD28WT-transfizierte Klone.
Einzelmessungen / unabhängige Experimente
α-mCD28
α-huCD28 (NaCl)
EWT A1 4 / 4
3/3
3/3
EWT A3 3 / 2
1/1
∅
A4 1A10 2 / 2
1/1
∅
Gesamt
5/5
3/3
Klon
α-huCD28
9/8
Die Baseline lag zwischen 265nM und 370nM, durchschnittlich bei 302nM
(Standardabweichung 43,3). In kalziumfreien Medium lag die intrazelluläre
Kalziumkonzentration zu Beginn der Messung bei durchschnittlich 57nM
(Standardabweichung 9,2).
49
5.2.2.2.1 Stimulation mit α-huCD28-Antikörper
Die Reaktion auf die Zugabe von α-huCD28-mAb war je nach Klon
unterschiedlich. Bei dem Klon EWT A1 zeigte sich in vier Messungen ein Anstieg
der Fluoreszenz um durchschnittlich 21% (9,9% bis 30,4%). Dieser Anstieg verlief
im Wesentlichen wie der Anstieg nach CD28-Stimulation bei untransfizierten
Jurkats, auch wenn der Mittelwert signifikant niedriger lag.
Er war bereits wenige Sekunden nach der Zugabe des Antikörpers zu erkennen
und erreichte sein Maximum nach ca. 100 Sekunden mit durchschnittlich 346nM,
um dann in eine Plateauphase überzugehen. Dieser Anstieg war signifikant im tTest für verbundene Stichproben (p= 3,1%). Ein unspezifischer Effekt wurde
durch Vergleichsmessungen mit mouse-IgG1ausgeschlossen. Allerdings war der
Anstieg der intrazellulären Kalziumkonzentration niedriger als bei untransfizierten
Zellen.
Im Vergleich zum Klon EWT A1 war dagegen bei den Klonen EWT A3 und A4
1A10 in keinem Experiment eine signifikante Veränderung der Fluoreszenz zu
beobachten.
Auch bei den Messungen, die in kalziumfreiem Medium durchgeführt wurden,
zeigte
sich
beim
Klon
EWT
A1
ein
Anstieg
der
intrazellulären
Kalziumkonzentration, der deutlich niedriger war als bei untransfizierten Jurkats.
Auch hier kam es nach etwa 100 Sekunden wieder zum Abfall der Fluoreszenz
auf ungefähr dieselben Werte wie vor der Zugabe des Antikörpers.
Mit den beiden anderen untersuchten Klonen EWT A3 und A4 1A10 wurden keine
Messungen in kalziumfreiem Medium durchgeführt.
5.2.2.2.2 Stimulation mit α-mCD28-Antikörper
Insgesamt wurde in fünf unabhängigen Experimenten die Reaktion auf α-mCD28Antikörper gemessen. Dafür wurden dreimal Zellen des Klons EWT A1 verwendet
und je einmal Versuche mit den Klonen EWT A3 und A4 1A10 durchgeführt. In
50
keinem Experiment wurde innerhalb von 100 Sekunden nach Zugabe des
Antikörpers ein Anstieg der intrazellulären Kalziumkonzentration beobachtet.
Wurden die Zellen länger beobachtet, kam es gelegentlich zum kontinuierlichen
Ansteigen der Fluoreszenz, nie jedoch zu einer Plateauphase.
5.2.2.2.3 Stimulation mit OKT3-Antikörper
Ebenso wie bei untransfizierten Jurkat-Zellen kam es bei den mCD28WTtransfizierten Jurkats innerhalb von Sekunden nach OKT3-Zugabe zu einem
schnellen Ansteigen der Fluoreszenz, die nach einem Maximum ca. 50 Sekunden
nach Zugabe wieder rasch abfiel. Im Durchschnitt stieg Kalziumkonzentration um
143%
über
Baseline-Niveau
(Standardabweichung
323,7).
100
und
erreichte
Sekunden
nach
Werte
von
Stimulation
744nM
lag
der
Durchschnittswert bei 447nM, was einem Wert 44% über der Baseline entspricht.
In kalziumfreiem Medium wurden drei Messungen mit dem Klon EWT A1
durchgeführt. Der Verlauf der Fluoreszenz nach Stimulation mit OKT3 entsprach
den Verhältnissen bei untransfizierten Zellen:
Es kam nach schnellem Anstieg mit Peak bei etwa 50 Sekunden innerhalb von
100 bis 200 Sekunden wieder zum Abfall auf Baseline-Niveau, bei einem Teil der
Messungen auch noch tiefer. Der Mittelwert lag nach 50 Sekunden bei 128nM,
nach 100 Sekunden bei 71nM. Das entspricht einem durchschnittlichen Anstieg
von 121% über Baseline, nach dem Peak fiel der Wert innerhalb von 100
Sekunden auf 22% über Baseline.
5.2.2.3
mCD28TL-transfizierte Jurkats
Insgesamt wurden 21 unterschiedliche Messungen in sechs von einander
unabhängigen Experimenten ausgewertet.
51
Durchgeführtes
Experiment
Anzahl der
Einzelmessungen
Unabhängige
Experimente
α-huCD28
10
6
α-huCD28 in
NaCl
3
3
α-mCD28
7
6
mouse-IgG1
1
1
hamster-IgG
1
1
Wir verwendeten drei verschiedene mit mCD28TL-transfizierte Klone.
Einzelmessungen / Unabhängige Experimente
Klon
α-huCD28
α-mCD28
α-huCD28 (NaCl)
D5I B2
5/2
4/3
1/1
B5 A5
3/2
2/2
∅
C1II B6
1/1
1/1
∅
Gesamt
9/5
7/6
1/1
Die Baseline lag zwischen 238nM und 337nM, durchschnittlich bei 286nM
(Standardabweichung 36,3). In kalziumfreien Medium wurde lediglich eine
Messung durchgeführt; dabei lag die intrazelluläre Kalziumkonzentration zu
Beginn der Messung bei 56nM.
5.2.2.3.1 Stimulation mit α-huCD28-Antikörper
Bei keinem der drei untersuchten Klone konnte nach Zugabe von α-huCD28 ein
deutliches
Ansteigen
der
intrazellulären
52
Kalziumkonzentration
beobachtet
werden, wie es bei untransfizierten Jurkats der Fall war. Lediglich ein
kontinuierliches Ansteigen der Fluoreszenz, wie es auch ohne Zugabe von
Antikörper beobachtet werden konnte, wurde gelegentlich gemessen.
Jurkat-mCD28TL:
Stimulation mit a-huCD28 bei
unterschiedlichen Klonen
Jurkat-C 1 IIB 6:
S tim ulation m it a-huC D 28
[Ca ]i nM
2+
360
2+
[Ca ]i (nM)
380
340
400
300
200
100
0
320
D5I B2
(n=5)
300
0
100
tim e (s )
200
B5 A5
(n=3)
baseline
C1II B6
(n=1)
a-huCD28
In kalziumfreiem Medium wurde eine Messung mit Zellen des Klons D5I B2
durchgeführt. Dabei blieb die Baseline unverändert stabil. Weitere Experimente
mit mCD28TL-transfizierten Klonen wurden nicht durchgeführt.
Jurkat-D5I B2:
Stimulation mit a-huCD28 in NaCl
2+
[Ca ]i (nM)
65
60
55
50
0
100
time (s)
200
53
5.2.2.3.2
Stimulation mit α-mCD28-Antikörper
Bei insgesamt sieben Einzelmessungen mit Stimulation durch α-mCD28 ergaben
sich aussagekräftige Resultate bei mCD28TL-transfizierten Jurkats; viermal mit
dem Klon D5I B2, zweimal mit dem Klon B5 A5 und einmal mit dem Klon C1II B6.
Nie konnte ein Ansteigen der Fluoreszenz mit anschließender Plateau-Phase wie
bei untransfizierten Jurkats beobachtet werden.
Jurkat-D5I B2:
Stimulation mit a-mCD28
[Ca ]i (nM)
Jurkat-mCD28TL:
Stimulation mit a-mCD28
(n=7)
300
2+
[Ca 2+]i nM
400
200
100
320
300
280
0
0
baseline a-huCD28
100s
100
200
time (s)
5.2.2.3.3 Stimulation mit OKT3-Antikörper
Bei allen untersuchten Klonen wurden nur die Experimente ausgewertet, bei
denen ein deutliches Ansteigen der Fluoreszenz nach Zugabe von OKT3
beobachtet wurde. Dieses Signal war entsprach qualitativ dem Signal bei
untransfizierten oder mCD28WT-transfizierten Jurkats, d.h. ein schnelles
Ansteigen der intrazellulären Kalziumkonzentration innerhalb von 50 Sekunden
nach Zugabe von OKT3, danach Absinken auf Werte, die oberhalb der Baseline
zu Beginn der Messung lagen.
54
Jurkat-mDC28TL:
Stimulation mit OKT3
[Ca2+]i nM
1000
800
600
400
200
a-CD3
100s
a-CD3
50s
baseline
0
Jurkat-mCD28TL: a-huCD28/OKT3
600
2+
[Ca ]i (nM)
800
400
200
0
100
200
300
time (s)
400
500
Der durchschnittliche maximale Anstieg der Fluoreszenz lag bei 147%, die
intrazelluläre Kalziumkonzentration erreichte im Mittel Maximalwerte von 730nM
(Standardabweichung 210,5). Nach 100 Sekunden lag der Wert noch 45% über
den Ausgangswerten; durchschnittlich bei 440nM (Standardabweichung 94,2).
Es wurde eine Messung mit dem Klon D5I B2 in 0,9%-NaCl-Lösung durchgeführt.
Dabei zeigte sich der charakteristische Verlauf in kalziumfreiem Medium mit
raschem Anstieg nach Zugabe von OKT3 und Abfall auf Werte auf BaselineNiveau.
55
[Ca 2+] i (nM)
Jurkat-D5I B2:
Stimulation mit a-huCD28/OKT3
70
60
50
0
100
200
time (s)
300
400
300
200
100
a-CD3
100s
a-CD3
50s
0
baseline
[Ca 2+]i nM
Jurkat-D5I B2:
Stimulation mit OKT3 in
NaCl
56
6. Diskussion
In der vorliegenden Arbeit wurde der Zusammenhang zwischen der spezifischen
Aktivierung von T-Lymphozyten und dem intrazellulären Ansteig der KalziumKonzentration nach Stimulation des Oberflächenmoleküls CD 28 untersucht. Das
Modell der Kostimulation geht davon aus, dass zwei Signale notwendig sind, um
eine Zelle effektiv zu aktivieren. Am Besten untersucht ist dieses Modell für das
Zusammenspiel von CD 3/ T-Zell-Rezeptor und CD 28, dem Liganden von CD 80
und CD 86. Da durch Stimulation dieser Oberflächenmoleküle eine Erhöhung der
intrazellulären Kalziumkonzentration ausgelöst wird, war das Ziel dieser Arbeit,
die Rolle dieses intrazellulären Signals für die Aktivierung zu untersuchen.
Die dabei verwendeten Zelllinien sind zunächst untransfizierte Jurkat-Zellen, also
T-Lymphozyten, die kultiviert werden können, ohne dass eine Stimulation
erforderlich ist. Um die Aktivierung bestimmen zu können, wurde die IL2Produktion nach unterschiedlicher Stimulation untersucht, da Jurkat-Zellen bei
normalem Wachstum kein IL-2 produzieren und dieses Zytokin auch in vivo eine
entscheidende Rolle bei Entzündungsprozessen spielt.
Dass dieses Modell ein etabliertes System zur Untersuchung der Mechanismen
der Kostimulation darstellt, wurde bereits von anderen Autoren gezeigt. Dies
konnte auch durch die im Rahmen dieser Arbeit durchgeführten Messungen
bestätigt werden: Bei Zugabe von PMA/Ionomycin zur Kultur kommt es zunächst
nicht zu relevanter Produktion von Interleukin-2, erst nach Zugabe von
Antikörpern gegen humanes CD28 reagieren die Zellen mit messbarer IL2Produktion.
Durch die Verwendung von transfizierten Zellen, die außer dem humanen CD 28
auch das murines CD 28 tragen, wurde die Rolle des CD 28 genauer untersucht.
Dabei wurden Konstrukte mit dem intakten murinen CD 28 verwendet ("wildtype")
und Zellen, die ein Konstrukt ohne intrazelluläre Domänen tragen ("tailless").
Um auszuschließen, dass Zellen verwendet würden, die die untersuchten
Signalmoleküle gar nicht exprimieren oder nicht auf der Zelloberfläche tragen,
wurden bei allen Zelllinien durchflusszytometrische Färbungen mit Antikörpern
57
gegen humanes CD28, murines CD28 und gegen CD3 durchgeführt. Für die
Färbungen wurden die selben monoklonalen Antikörper verwendet, die bei den
Kalziummessungen zum Einsatz kamen.
Die FACS-Analysen zeigten während der Kultur eine gute Expression von CD3
und humanem CD 28 auf allen Zellreihen. Bei den untransfizierten Zellen führte
die Färbung mit anti-mouseCD28 zu keinem Signal, so dass eine Kreuzreaktivität
dieses Antikörpers ausgeschlossen werden konnte.
Sowohl die Wildtyp-transfizierten Zellen als auch die Jurkats mit dem TaillessKonstrukt waren bei Färbung mit dem anti-mouseCD28-Antikörper deutlich
positiv, die jeweils transfizierten Oberflächenproteine konnten also auf den
verwendeten transfizierten Zellen nachgewiesen werden. Da sich die WTZellreihen dabei genauso verhielten wie die TL-transfizierten Zellreihen, konnte
außerdem gezeigt werden, dass der verwendete Antikörper an die mutierten
Tailless-Konstrukte gleichermaßen wie an die Wildtyp-Variante binden kann, also
für die Experimente prinzipiell geeignet war.
Die mit dem murinen CD 28 Wildtyp transfizierten Zellen reagierten auf die
Stimulation sowohl von humanem als auch von murinem CD 28 gleichermaßen
mit Produktion von IL2. Dass bedeutet, dass auch das transfizierte, murine
Molekül in der Lage ist, die intrazellulären Signalwege der humanen Zellen zu
aktivieren. Eine analoge Versuchsanordnung mit Jurkat-Zellen, die mit einem
Konstrukt des murinen CD 28 ohne intrazelluläre Domänen ("tail less") transfiziert
worden waren, zeigte dagegen keinen Anstieg der IL2-Produktion nach
Stimulation mit mAb gegen murines CD28.
Auf Stimulation durch PMA/Ionomycin und einen monoklonalen Antikörper gegen
humanes CD 28 reagierten sie ebenso wie die nicht-transfizierten und die mit
murinem CD28-Wildtyp transfizierten Jurkat-Zellen mit IL2-Produktion.
Dieser Zusammenhang wurde durch die Untersuchung der intrazellulären
Kalziumkonzentrationen nach Stimulation der verschiedenenen Zelllinien genauer
betrachtet.
Dabei wurden zunächst die unterschiedlichen Signale nach Stimualtion von
58
CD3/TCR und von CD28 betrachtet. Auf untransfizierten Jurkat-Zellen kommt es
nach Stimulation von CD3 bereits nach wenigen Sekunden zu einem starkem
Anstieg der intrazellulären Kalziumkonzentration. Die Konzentration fällt danach
rasch wieder auf ein niedrigeres Niveau ab und erreicht eine Plateau-Phase. Bei
Anwesenheit von Kalzium im verwendeten Medium liegt dieses Plateau signifikant
über dem Wert der intrazellulären Kalziumkonzentration vor Stimulation, während
in Kalzium-freiem Medium die Konzentration wieder auf das vorherige Niveau
sinkt. Die Höhe des Peaks war unabhängig vom verwendeten Medium.
Diese Ergebnisse stimmen mit Resultaten überein, die zeigen, dass der Peak
durch Freisetzung von Kalzium aus intrazellulären Speichern zustande kommt,
während für das anschließende Plateau der Einstrom von extrazellulärem
Kalzium durch Öffnung von Kalziumkanälen erforderlich ist, weshalb in Kalziumfreiem Medium dieses Plateau nicht entstehen kann.
Bei Stimulation durch einen Antikörper gegen humanes CD28 kam es auf den
untransfizierten Zellen in Anwesenheit von extrazellulärem Kalzium zu einer
anhaltenden
Erhöhung
der
intrazellulären
Kalziumkonzentration.
Nach
anschließender Zugabe von OKT3, einem spezifischen Antikörper gegen CD3
folgte ebenfalls ein schmaler hoher Peak mit raschem Abfall auf ein höheres
Niveau als vorher. Die Kalziumkonzentration in dieser Plateauphase lag auch
signifikant höher als nach Stimulation von CD28.
Durch Stimulation mit antiCD28 in Kalzium-freiem Medium konnte gezeigt
werden, dass auch über CD28 zunächst intrazelluläre Kalzium-Speicher geöffnet
werden, wenn auch deutlich weniger ausgeprägt als bei Stimulation des T-ZellRezeptor. Bei einigen Experimenten kam dieser Peak auch bei Anwesenheit von
extrazellulärem Kalzium direkt nach Beginn der Stimulation von CD28 zur
Darstellung. Er ließ sich allerdings nicht genauer abgrenzen, da er direkt in die
folgende Plateauphase übergeht, ohne im Rahmen der Messgenauigkeit
signifikant höher zu liegen.
Die Signale bei Stimulation von humanem CD28 auf den transfizierten Zellen
unterschieden sich nicht signifikant von denen der untransfizierten Jurkats. Alle
verwendeten Klone zeigten nach Stimulation von CD 3 einen schmalen hohen
59
Peak
und
ein
anschließend
höheres
Niveau
der
intrazellulären
Kalziumkonzentration. Bei Zugabe von Antikörper gegen humanes CD 28 und
gegen CD3 stieg die Konzentration ebenso wie bei nicht-transfizierten JurkatZellen auf ein höheres Niveau. Auch in Kalzium-freiem Medium ergaben sich bei
diesen Experimenten keine Unterschiede.
Mit Hilfe der Durchfluss-Zytometrie wurde gezeigt, dass sich das transfizierte
murine CD 28 auf der Zelloberfläche befindet. Die Messung der IL-2-Produktion
vor und nach Zugabe von aktivierenden Antikörpern gegen murines CD 28
bewies eine funktionelle Einbindung in die Signaltransduktion der Zellen.
Mit monoklonalen Antikörpern gegen das murine CD28 konnte dagegen bei
keiner Zelllinie ein signifikantes Calcium-Signal abgeleitet werden. Dies gilt für
alle drei unterschiedlichen untersuchten Zelllinien in insgesamt 5 von einander
unabhängigen Experimenten. Eine generelle Beeinträchtigung der Kalziumkanäle
bei diesen transfizierten Stämmen kann ausgeschlossen werden, da nach
Zugabe von Antikörpern gegen CD3 sofort ein Kalzium-Signal abgeleitet werden
konnte, das dem Anstieg entsprach, der bei untransfizierten Jurkats beobachtet
worden war.
Diese Zelllinien ließen sich aber alle effektiv über das transfizierte CD28
stimulieren, wie die Messungen der IL-Produktion zeigten. Das bedeutet, dass
das Molekül nicht nur von den Zellen exprimiert wird, sondern auch über
Signaltransduktion Vorgänge in der Zelle beeinflussen kann. Allerdings zählt die
Regulation der Kalziumkanäle, die bei Aktivierung des humanen CD28 geöffnet
werden, nicht dazu, denn weder der kurzfristige, passagere Anstieg durch
Freisetzung von Kalzium aus intrazellulären Speichern direkt nach der Zugabe
noch die langanhaltende Erhöhung der intrazellulären Kalziumkonzentration lässt
sich durch die Stimulation des murinen CD28 erzeugen.
Die Erhöhung der intrazellulären Kalziumkonzentration nach Aktivierung von
CD28 ist gut beschrieben. Mit der Versuchsanordnung, die in dieser Arbeit
verwendet wurde, lässt sich aber zeigen, dass sie bei der Steigerung der IL-2
Produktion keine wesentliche Rolle spielt. Daraus ergibt sich zunächst die Frage,
welche Rolle Kalzium überhaupt in der T-Zell-Aktivierung spielt. Diese Frage wird
60
in der Literatur eindeutig beantwortet:
T-Zellen mit defekten Kalzium-Kanälen können nach Aktivierung von TCR/CD3
die Produktion von IL-2 und anderen Zytokinen nicht steigern, sie proliferieren
nicht stärker, und auch bei Syndromen wie dem Wiskott-Aldrich-Syndrom sind
inzwischen Mutationen der Kalziumkanäle von T-Lymphozyten als Ursache
identifiziert worden.
Auch
CD28-knock
out-Mäuse
zeigen
das
Bild
einer
ausgeprägen
Immunschwäche, und aus zahlreichen in vitro-Experimenten ergibt sich eine
mangelhafte Aktivierung von Lymphozyten, wenn die Signaltransduktion über
CD28 ausbleibt.
Als Schlussfolgerung ergibt sich also in unserem Modell, dass zwar sowohl CD28
als auch das intrazelluläre Kalzium eine entscheidende Rolle für eine effektive
Kostimulation spielen, aber beides unabhängig von einander.
Neben grundsätzlichen Problemen bei der Auswertung von standardisierten
Experimenten unter in-vitro-Bedingungen und der Situation in-vivo müssen auch
spezifische Fehlerquellen erwogen werden, die in dem für diese Arbeit
verwendeten Modell eine Rolle spielen können.
Die
Experimente
wurden
mit
Tumorzellen
durchgeführt.
Diese
Zellen
unterscheiden sich also in wesentlichen Merkmalen von T-Lymphozyten in vivo,
insbesondere benötigen sie keinen zusätzlichen Reiz zur Proliferation. Daher
können Effekte, die auf die Proliferation wirken, mit diesen Zellen nicht gemessen
werden, obwohl das ein wichtiger Effekt der Kostimualtion ist. Ein weitere
beobachtete Wirkung besteht in einem Schutz vor Apoptose. Auch das ist bei
Tumorzellen nur schwer zu überprüfen, da diese bereits vor Apoptose geschützt
sind.
Das transfizierte CD28 ist ein murines Molekül. Auch wenn es in Sequenz und
Struktur keine wesentlichen Unterschiede zu humanem CD28 aufweist, muss
ausgeschlossen werden, dass andere Signaltransduktionswege aktiviert werden.
Dies ist mit dem Ansatz dieser Arbeit nicht möglich.
Die ursprüngliche Fragestellung dieser Arbeit war, auf welche Weise die
61
Signaltransduktion bei CD28 verläuft, die zu einer Erhöhung der intrazellulären
Kalziumkonzentration führt. Da die transfizierten Zellen keinen Anstieg des
Kalziums zeigten, können hierzu nur im Umkehrschluss Aussagen getroffen
werden: Die Messungen der IL-2-Produktion nach Stimulation von murinem CD28
zeigen den gleichen Effekt wie die Zugabe von aktivierenden Antikörpern gegen
humanes CD28, also muss auch das transfizierte murine CD28 einen
intrazellulären Effekt bewirken. Zumindest eine Endstrecke der Kostimulation, die
IL-2-Produktion, wird erreicht, denn das transfizierte, murine CD28 kann die
Signaltransduktion über die Phosphatidyl-Inositol-3-Kinase anstoßen, die nach
übereinstimmenden Ergebnissen verschiedener experimenteller Ansätze der
entscheidende second messenger für die Steigerung der IL-2-Expression ist.
Diese Aktivierung wird dabei über das YNMN-Motiv der zytoplasmatischen Kette
des CD28 vermittelt. Es handelt sich um ein hoch konserviertes Segment, das
sich sowohl auf dem murinen als auch auf dem humanen CD28 findet.
Da der Weg über die PI3K sowohl bei den nativen Jurkat-Zellen als auch bei den
mit dem Wildtyp-mCD28 transfizierten Zellen funktionsfähig ist, bei letzteren aber
dennoch keine Erhöhung der intrazellulären Kalziumkonzentration auf Aktivierung
von CD28 folgt, spielt dieser Weg der Signaltransduktion also keine wesentliche
Rolle bei der Öffnung von Kalzium-Kanälen.
Der am besten bekannte Weg, der zur Freisetzung von Kalzium aus
intrazellulären Speichern führt, verläuft über die Aktivierung der Phospholipase C.
Dieses Enzym führt zur Bildung von IP3 durch Spaltung von Zellmembranständigem PIP2. Das Isoenzym, das in Lymphozyten durch den CD3/TCRKomplex aktiviert wird, ist die PLCy1. Hinweise auf eine Verbindung von CD28
und PLCy1 finden sich jedoch in der Literatur nicht. Auch die second messenger
und Signaltransduktionswege, die die PLCy1 aktivieren, sind im Zusammenhang
mit CD28 bisher nicht beschrieben worden.
Ein
weiterer
Transmitter,
der
in
Verbindung
mit
Kalzium-Erhöhung
in
Lymphozyten beschrieben wurde, ist cAMP-R, das bei Aktivierung des CD3/TCR
62
ansteigt und einen Ryanodin-sensiblen Kalzium-Kanal öffnet. Ein Anstieg von
cAMP-R nach Stimulation von CD28 alleine als Hinweis auf eine Rolle dieses
Signaltransduktionsmoleküls bei der Freisetzung von Kalzium durch CD28 wurde
bisher nicht publiziert.
Aber
nicht
nur
der
Mechanismus
der
Anstieg
der
intrazellulären
Kalziumkonzentration nach Stimulation von CD28, sondern auch dessen
Bedeutung für CD4-positive Lymphozyten ist noch nicht geklärt. Wie lassen sich
die Ergebnisse dieser Arbeit in Zusammenschau mit der Literatur interpretieren?
Auch wenn keine Steigerung der intrazellulären Kalzium-Konzentration über
CD28 erfolgt, werden CD3-vermittelt Kalzium-Kanäle geöffnet, so dass CD28 hier
möglicherweise nur einen additiven Effekt hat, der sich im Rahmen der
Messgenauigkeit in unserem Ansatz nicht unterscheiden lässt. Das würde also
bedeuten, dass die CD28-vermittelte Kalzium-Erhöhung keinen spezifischen
Effekt erzeugt.
Eine Möglichkeit wäre, dass der Kalzium-Einstrom in T-Lymphozyten über den
TCR/CD3 geregelt wird, und der Effekt durch CD28 lediglich den Kalzium-Spiegel
etwas stärker anhebt, als über TCR/CD3 alleine, ohne dass er eine spezifische
Wirkung erzeugt.
Es ist aber auch möglich, dass der über CD28 vermittelte Anstieg der
intrazellulären Kalziumkonzentration bei einem Prozess eine Rolle spielt, der mit
dem experimentellen Ansatz der vorliegenden Arbeit nicht erfasst werden kann.
Das Zwei-Signale-Modell beschreibt nicht nur die verstärkte Produktion von
proinflammatorischen Zytokinen, v.a. von IL-2, sondern auch zwei weitere Effekte
der Kostimulation: Schutz vor Apoptose und eine verstärkte Proliferation der
aktivierten Zellen.
Die Bedeutung des Kalziums für diese beiden Effekte ist gut untersucht. Spielt es
hier eine Rolle, ob Kalzium CD3-vermittelt oder durch Stimulation von CD28
ansteigt? Schließlich führt die Aktivierung des TCR zu einem wesentlich stärkeren
63
Anstieg der intrazellulären Kalziumkonzentration als die von CD28. Die
Aktivierung des TCR/CD3-Komplexes alleine bewirkt entweder die Apoptose der
Zellen oder sie werden in den Zustand der Anergie versetzt. Erst bei gleichzeitiger
Stimulation von CD28 können die Zellen nicht nur maximal IL-2 produzieren,
sondern sind auch vor Anergie geschützt oder können proliferieren.
Bei den in unseren Experimenten verwendeten Jurkat-Zellen handelt es sich um
Tumor-Zellen, die zur Proliferation keinen spezifischen Stimulus benötigen und
die vor Apoptose besser geschützt sind, so dass ein Reiz, der in einer normalen
Körperzelle zur Apoptose führen würde, in einer Tumorzelle keine Auswirkungen
hat. Dieser Effekt, der über CD28 vermittelt wird, lässt sich demnach in unserem
Modell nicht messen.
Um die Ergebnisse in einem anderen Setting zu überprüfen, wurden auch aus
monozytären Zellen des peripheren Blutes (PBMC) durch Stimulation mit PHA
und IL2 CD4-Lymphozyten gezüchtet. Die Messungen des intrazellulären
Kalziums durch Fluoreszenzfärbung zeigten aber bereits ohne Zugabe eines
stimulierenden Antikörpers oder anderer Substanzen einen kontinuierlichen
Anstieg des intrazellulären Kalziums, der a.e. auf Lyse der Zellen zurückzuführen
ist.
Ausblick
Ursprünglich war das Ziel dieser Arbeit, Hinweise auf die intrazellulären Domänen
des Oberflächenmoleküls CD28 zu finden, die eine Rolle bei der Regulation der
intrazellulären
Kalziumkonzentration
spielen.
Dazu
existierten
bereits
verscheidene Klone mit unterschiedlichen transfizierten Konstrukten des murinen
CD28, z.T. Wildtyp-Konstrukte mit kompletter intraplasmatischer Domäne,
unterschiedliche Punktmutationen und ein Konstrukt ohne intrazelluläre Domäne,
lediglich mit einem Anker in der Zellmembran. Durch Messung der CalciumKonzentration mit Hilfe von Fluoreszenz während der Stimulation von CD28,
entweder bei Anwesenheit von extrazellulärem Kalzium oder in Kalzium-freiem
Medium, könnten Hinweise auf die Bereiche der intrazellulären Domänen
gewonnen werden, die eine entscheidende Rolle in der Signaltranduktion dieses
Moleküls spielen. Da sich in den bei uns durchgeführten Experimenten aber auch
64
durch Stimulation des Wildtyp-CD28, also des nicht mutierten murinen CD28, kein
Kalzium-Signal in den Zellen ableiten ließ, wurden die Experimente mit den
anderen Konstrukten nicht mehr durchgeführt.
Aus den Ergebnissen lässt sich aber schließen, dass in dem verwendeten Modell
der Kostimulation von T-Lymphozyten eine Erhöhung der intrazellulären
Kalziumkonzentration als Signaltransduktion über CD28 keine Rolle bei der
Produktion von Interleukin-2 spielt.
65
7. Literaturverzeichnis
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8. Abkürzungsverzeichnis
8.1 Rezeptoren, Proteine, intrazelluläre Signaltransduktion
ATF2
Activating transcription factor 2
BCL-XL
B-cell lymphoma-2-Protein XL
CD
Cluster of Differntiation, Oberflächen-Proteine
c-/p-SMAC
central/peripheral supramolecular activation cluster,
Regionen der immunologischen Synapse
CRAC-Kanäle
Calcium-Release-activated-Calcium-Kanäle
CTLA-4
Cytotoxic T-Lymphocyte Antigen-4, CD 152
DISC
Death-inducing signalling Complex
GSK-3
Glykogensynthase-Kinase 3
Il
Interleukin
ITAM
Immunoreceptor Tyrosine-based Activation-Motif
JNK
JUN N-terminal Kinase
LAT
Linker of activated T-Cells
LFA-1
Leucocyte function-associated Antigen 1
LCK
MHC
Major Histocompatibility Complex
NFAT
Nuclear factor of activated T-Cells
NFkB
Nuclear Factor-kB
NGFR
nerve growth-factor receptor
PDK-1
Phosphoinositol-dependent Kinase 1
PH-2-domain
Pleckstrin-homology-Domäne
PI3K
Phosphatidyl-Inositol-3-Kinase
PI3P
Phosphatidyl-Inositol-3,4,5-tris-Phosphat
PKB
Proteinkinase B
PLCγ1
Phospholipase Cγ1
SH-2
Src-homology-2
SLP-76
src-homology-2-domain containing leucocyte protein of
76 kDa
SYK
Spleen Tyrosine Kinase
71
TCR
T-Zell-Rezeptor
ZAP-70
ζ-chain associated protein of 70kDa
8.2 Reagenzien
BSA
Bovine Serum Albumin
DMSO
Dimethylsulfoxid
EGTA
Ethylenguanidin-tetra-acetat
FITC
Fluorescein-Isothiocyanat
Fluo-3AM
Fluorescein-3-A
IoM
Ionomycin
PBS
Phosphate-buffered Saline
PE
Phycoerythrin
PMA
Phorbol-12-Myristat-13-Acetat
SPy
Sulfinpyrazon
TMB
Tetramethylbenzidin
8.3 Sonstige Abkürzungen
APC
Antigen-presenting Cell(s)
FACS
Fluorescence-activated Cell Sorter
hu
human
IL
Interleukin
kDa
Kilo-Dalton, Einheit des Molekulargewichts
m
murin
mAb
monoclonal Antibody
NK-Zellen
Natural-Killer Cells, natürliche Killer-Zellen
RA
Rheumatoide Arthritis
SIRS
systemic inflammatory response syndrome
SLE
Systemischer Lupus erythematodes
Th1/Th2-Zellen
T-Helferzellen Klasse 1/2
TL
Tailless, Konstrukte ohne zytosplasmatische Domäne
eines transfizierten Proteins
WT
Wild type, Wildtyp-Variante eines transfizierten Protein
72
9. Danksagung
Für die Anregung zu dieser Arbeit danke ich Herrn Prof. Dr. Bernhard Manger und
Herrn Dr. Thomas Nagel. Die Kalzium-Messungen wurden mit Dr. Norbert Blank
durchgeführt, der mit viel Geduld auch hartnäckige Probleme lösen konnte. Bei
unserer technischen Assistentin Martina Rahmeh möchte ich mich bedanken, weil
ohne ihre Sorgfalt diese Experimente nicht möglich gewesen wären. Zuletzt
möchte ich mich auch bei Herrn Prof. Georg Schett für die Geduld bei der
Fertigstellung dieser Arbeit bedanken.
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10. Lebenslauf
Jochen Wacker,
geboren am 20. Juni 1975 in Nürnberg
Eltern:
Gudrun Wacker (geb. Sauter) und Ludwig Wacker
Geschwister:
Katrin Wacker, Bärbel Wacker, Birgit Herbst (geb. Wacker), Dr. Ingrid Wacker,
Marlis Wacker, Astrid Wacker, Marion Wacker, Ulrike Wacker
Familienstand:
Ledig
Schulausbildung:
Sept. 1981 – Juli 1985
Besuch der Grundschule Oberferrieden
(Nürnberger Land)
Sept. 1985 – Juni 1994
Besuch des Leibniz-Gymnasiums Altdorf bei Nürnberg
1. Juli 1994
Abitur (Notendurchschnitt 1,6)
Sept. 1994 – Nov. 1995
Zivildienst im Martha-Maria-Krankanhaus, Nürnberg
Studium:
Mai 1996 – Juni 2003
Studium
der
Humanmedizin
an
der
Alexander-Universität Erlangen-Nürnberg
April 1998
Physikum (Note 2,0)
März 1999
1. Staatsexamen (Note 2)
März 2002
2. Staatsexamen (Note 1,0)
Mai 2003
3. Staatsexamen (Note 1, Gesamtnote 1,16)
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Friedrich-
Praktika während des Praktischen Jahres (April 2002 – März 2003):
1. Tertial (Dermatologie): Dermatologische Universitätsklinik Erlangen
2. Tertial (Innere Medizin): Medizinische Universitätsklinik B, Kantonsspital Basel
3. Tertial (Chirurgie):
Hospital Viedma, Cochabamba/Bolivien
Beruf:
16. 11.2003 – 30.09.2004 Arzt im Praktikum an der Medizinischen Klinik III,
Universitätsklinikum Erlangen
seit 01.10.2004
Assistenzarzt an der Medizinischen Klinik III,
Universitätsklinikum Erlangen
Stand: 11. Juli 2010
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