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Aus der Klinik für Anästhesiologie und Intensivmedizin der Medizinischen Hochschule Hannover Direktor: Univ.-Prof. Dr. med. Wolfgang Koppert, M.A. Allogene Erythrozytenkonzentrate und ihr Einfluss auf die Zytokinfreisetzung im menschlichen Vollblut in vitro DISSERTATION zur Erlangung des Doktorgrades der Humanmedizin (Dr. med.) in der Medizinischen Hochschule Hannover vorgelegt von Matthias Schaland aus Lohne (Oldenburg) Hannover 2014 Angenommen vom Senat der Medizinischen Hochschule Hannover am 20.01.2015 Gedruckt mit Genehmigung der Medizinischen Hochschule Hannover Präsident: Prof. Dr. med. Christopher Baum Betreuer der Arbeit: PD Dr. med. Björn Jüttner Referent: PD Dr. med. Hans-Gert Heuft Korreferent: Prof. Dr. med. Jörn Heine Tag der mündlichen Prüfung: 20.01.2015 Prüfungsausschussmitglieder: Prof. Dr. Wolfgang Koppert PD Dr. Christoph Schröder Prof. Dr. Hans Heinrich Wedemeyer Kathrin und meiner Familie INHALTSVERZEICHNIS Tabellen und Abbildungsverzeichnis ................................................................................... 3 Abkürzungsverzeichnis ......................................................................................................... 4 1 EINLEITUNG ..................................................................................................................... 6 1.1 HISTORIE DER BLUTTRANSFUSION ................................................................................. 6 1.2 BLUTGRUPPENSYSTEME ................................................................................................ 6 1.3 TRANSFUSION UND HERSTELLUNG VON ERYTHROZYTENKONZENTRATEN ........................ 8 1.4 TRANSFUSIONSASSOZIIERTE IMMUNMODULATION ......................................................... 10 1.5 VERWENDUNG LEUKOZYTENDEPLETIERTER ERYTHROZYTENKONZENTRATE UND DER EINFLUSS DER LAGERUNGSDAUER........................................................................................ 12 2 1.6 UNSPEZIFISCHES UND SPEZIFISCHES IMMUNSYSTEM .................................................... 14 1.7 ZIELSETZUNG DER ARBEIT ........................................................................................... 20 MATERIAL UND METHODEN ........................................................................................ 21 2.1 LABORMATERIALIEN ..................................................................................................... 21 2.1.1 Geräte und Apparaturen ...................................................................................... 21 2.1.2 Verbrauchsmaterialien ........................................................................................ 21 2.1.3 Cytometric Bead Array ........................................................................................ 22 2.2 BLUTPRODUKTE .......................................................................................................... 23 2.2.1 Vollblut ................................................................................................................. 23 2.2.2 Erythrozytenkonzentrate ..................................................................................... 23 2.3 QUANTIFIZIERUNG DER ZYTOKINKONZENTRATIONEN MITTELS CYTOMETRIC BEAD ARRAY 25 2.4 DURCHFLUSSZYTOMETRIE ........................................................................................... 25 2.5 DURCHFÜHRUNG DER STUDIE ...................................................................................... 28 2.5.1 Versuchsablauf .................................................................................................... 29 2.6 STATISTISCHE AUSWERTUNG ....................................................................................... 32 2.6.1 Signifikanzniveau ................................................................................................ 32 2.6.2 Datenexploration ................................................................................................. 32 2.6.3 Untersuchung der Parameterintensität................................................................ 32 3 ERGEBNISSE .................................................................................................................. 34 3.1 EINFLUSS DES ERYTHROZYTENKONZENTRATALTERS AUF DIE ZYTOKINFREISETZUNG ..... 34 3.1.1 Erythrozytenkonzentrat 0 Rh pos / Vollblut A Rh pos ......................................... 34 3.1.2 Erythrozytenkonzentrat 0 Rh pos / Vollblut B Rh pos ......................................... 36 3.1.3 Erythrozytenkonzentrat 0 Rh pos / Vollblut 0 Rh neg .......................................... 36 3.2 EINFLUSS DES TRANSFUSIONSVOLUMENS AUF DIE ZYTOKINFREISETZUNG ..................... 37 1 3.2.1 Erythrozytenkonzentrat 0 Rh pos / Vollblut A Rh pos ......................................... 38 3.2.2 Erythrozytenkonzentrat 0 Rh pos / Vollblut B Rh pos ......................................... 38 3.2.3 Erythrozytenkonzentrat 0 Rh pos / Vollblut 0 Rh neg .......................................... 38 3.3 EINFLUSS DES ERYTHROZYTENKONZENTRATALTERS UND DES TRANSFUSIONSVOLUMENS AUF DIE ZYTOKINFREISETZUNG ............................................................................................. 39 3.3.1 Erythrozytenkonzentrat 0 Rh pos / Vollblut A Rh pos ......................................... 40 3.3.2 Erythrozytenkonzentrat 0 Rh pos / Vollblut B Rh pos ......................................... 40 3.3.3 Erythrozytenkonzentrat 0 Rh pos / Vollblut 0 Rh neg .......................................... 40 4 DISKUSSION ................................................................................................................... 42 4.1 ÜBERBLICK.................................................................................................................. 42 4.2 WISSENSCHAFTLICHE EINORDNUNG DER ERGEBNISSE ................................................. 50 4.3 AUSBLICK .................................................................................................................... 56 4.4 SCHLUSSFOLGERUNGEN .............................................................................................. 57 5 ZUSAMMENFASSUNG ................................................................................................... 59 6 LITERATURVERZEICHNIS ............................................................................................. 60 7 LEBENSLAUF ................................................................................................................. 74 8 ERKLÄRUNG .................................................................................................................. 75 9 DANKSAGUNG ............................................................................................................... 76 2 Tabellen und Abbildungsverzeichnis TABELLE 1: HAUPTKOMPONENTEN DES UNSPEZIFISCHEN IMMUNSYSTEMS ................................. 14 TABELLE 2: HAUPTKOMPONENTEN DES SPEZIFISCHEN IMMUNSYSTEMS ...................................... 16 TABELLE 3: EINZELNE ZYTOKINE UND IHRE FUNKTIONEN ........................................................... 19 TABELLE 4: GERÄTE UND APPARATUREN .................................................................................. 21 TABELLE 5: VERBRAUCHSMATERIALIEN ..................................................................................... 22 TABELLE 6: BESTANDTEILE DES HUMAN INFLAMMATION KIT ....................................................... 22 TABELLE 7: STREULICHTINFORMATIONEN .................................................................................. 28 TABELLE 8: PROTOKOLL ZUR STUDIENDURCHFÜHRUNG FÜR ERYTHROZYTENKONZENTRATE ...... 31 ABBILDUNG 1: HÄUFIGKEIT DER BLUTGRUPPEN DES AB0-SYSTEMS IN DEUTSCHLAND ................. 7 ABBILDUNG 2: BLUTGRUPPENKOMPATIBILITÄT IM AB0-SYSTEM ................................................... 8 ABBILDUNG 3: AUFBAU EINES DURCHFLUSSZYTOMETERS .......................................................... 26 ABBILDUNG 4: DARSTELLUNG DER ZYTOKINKONZENTRATIONEN (MFI) IM BLUTPLASMA IN ABHÄNGIGKEIT VOM ERYTHROZYTENKONZENTRATALTER .................................................. 35 ABBILDUNG 5: DARSTELLUNG DER ZYTOKINKONZENTRATIONEN (MFI) IM BLUTPLASMA IN ABHÄNGIGKEIT VOM ERYTHROZYTENKONZENTRATALTER .................................................. 36 ABBILDUNG 6: DARSTELLUNG DER ZYTOKINKONZENTRATIONEN (MFI) IM BLUTPLASMA IN ABHÄNGIGKEIT VOM ERYTHROZYTENKONZENTRATALTER .................................................. 37 ABBILDUNG 7: DARSTELLUNG DER ZYTOKINKONZENTRATIONEN (MFI) IM BLUTPLASMA IN ABHÄNGIGKEIT VOM TRANSFUSIONSVOLUMEN................................................................... 39 ABBILDUNG 8: DARSTELLUNG DER ZYTOKINKONZENTRATIONEN (MFI) IM BLUTPLASMA IN ABHÄNGIGKEIT VOM ERYTHROZYTENKONZENTRATALTER UND TRANSFUSIONSVOLUMEN ..... 41 3 Abkürzungsverzeichnis % Prozent APC Antigen-präsentierende Zellen ARDS acute respiratory distress syndrome bzw. beziehungsweise C Celsius CD cluster of differentiation d dezi (x 10-1) D Deutschland DRK Deutsches Rotes Kreuz EK-Alter Erythrozytenkonzentrat-Alter et al. und andere etc. et cetera FACS fluorescence-activated cell sorting FSC forward scatter channel g Gramm GM-CSF granulocyte macrophage colony-stimulating factor Hb Hämoglobin HLA Humane Leukozyten Antigene IFN Interferon Ig Immunglobulin IL Interleukin l Liter Lyso-PC Lysophosphatidylcholine µ mikro (x 10-6) m milli (x 10-3) MFI mittlere Fluoreszenzintensität MHC major histocompatibility complex MHH Medizinische Hochschule Hannover MZP Messzeitpunkt n= Anzahl der Einzelbeobachtungen neg negativ NK-Zellen Natürliche Killerzellen 4 nm Nanometer NSTEMI Nicht-ST-Hebungsinfarkt p piko (x 10-12) PE Phycoerythrin pos positiv Rh Rhesus SIRS systemic inflammatory response syndrome SSC side scatter channel TNF Tumornekrosefaktor TRALI transfusion-related acute lung injury TRIM transfusion-related immunomodulation u.a. unter anderem USA Vereinigte Staaten von Amerika z.B. zum Beispiel 5 Einleitung 1 Einleitung 1.1 Historie der Bluttransfusion Mit der Entdeckung des Blutkreislaufs im Jahr 1628 durch William Harvey begann die Geschichte und Erforschung der Bluttransfusion, die in der heutigen Medizin etablierte Methode ist1. Die erste dokumentierte Bluttransfusion wurde 1666 in England durch Richard Lower von Hund zu Hund erfolgreich durchgeführt. Nach weiteren zunächst erfolgreich durchgeführten Tier-zu-Tier Transfusionen wurde 1667 durch Jean Denis in Paris die erste Blutübertragung vom Tier auf den Menschen vollzogen2. Die ersten transfundierten Patienten zeigten sich beschwerdefrei, jedoch kam es in der Folge vermehrt zu Komplikationen, die nicht selten tödlich endeten. So wurde in Frankreich 1668 jede Art von Bluttransfusion verboten und auch in anderen Ländern fortan nicht mehr praktiziert1,2. Erst 1818 wurde durch den Engländer James Blundell bei Patientinnen mit postpartalen Blutungen eine Bluttransfusion von Mensch zu Mensch durchgeführt. Allerdings kam es auch hier zu tödlichen Komplikationen, die zu dieser Zeit noch nicht hinreichend zu erklären waren. Mit der Entdeckung des AB0- Blutgruppensystems durch den Österreicher Karl Landsteiner im Jahr 1901 begann schließlich die moderne Transfusionsmedizin1. 1.2 Blutgruppensysteme Erythrozyten-Antigene werden als Blutgruppenantigene definiert, wenn sie auf der Oberfläche des Erythrozyten vorhanden und durch spezifische Antikörper nachweisbar sind und zudem vererbt werden. Diese Antigene setzen sich aus sehr vielen verschiedenen Epitopen zusammen, welche die Bindungsstellen für die Antikörper bilden. Ein monoklonaler Antikörper bindet nur an ein bestimmtes Epitop. 6 Einleitung Zur Zeit werden 30 Blutgruppensysteme unterschieden (z.B. AB0, Rhesus, Kell, Kidd, Duffy, Indian) von denen das AB0 und das Rhesus-System die höchste klinische Relevanz besitzen3. Gegen die Antigene A und B des AB0-Systems sind im Blutplasma stets die korrespondierenden natürlichen Antikörper (Isoagglutinine) vorhanden, aufgrund derer nicht AB0-inkompatibel transfundiert werden kann. Bei inkompatibler Transfusion kommt es zur Hämagglutination (Verklumpung) und zur Hämolyse. Im Rhesussystem gibt es die Antigene C, c, D, d, E, e und K. Die höchste immunogene Wirkung hat das Antigen D (der „Rhesusfaktor“). Bereits nach einmaliger Transfusion eines Antigen D enthaltenden Erythrozytenkonzentrats werden bei 80 Prozent (%) der Empfänger Anti-D-Antikörper gebildet. Auch hier kann bei inkompatibler Transfusion eine Hämolyse verursacht werden3,4. Im folgenden Diagramm ist die prozentuale Verteilung der Blutgruppen des AB0-Systems in Deutschland dargestellt. Blutgruppen in Deutschland Blutgruppe B 11% Blutgruppe AB 5% Blutgruppe A 43% Blutgruppe 0 41% Abbildung 1: Häufigkeit der Blutgruppen des AB0-Systems in Deutschland5 7 Einleitung 1.3 Transfusion und Herstellung von Erythrozytenkonzentraten Bei der elektiven Bluttransfusion wird in der klinischen Routine blutgruppenidentisch in Bezug auf das AB0- und Rhesussystem transfundiert. In Notfallsituationen ist eine blutgruppenkompatible Transfusion möglich. Hierbei ist das Erythrozytenkonzentrat der Blutgruppe 0 Rhesus negativ der universelle Spender, da auf seinen Erythrozyten die Wahrscheinlichkeit antigener Strukturen, gegen die sich Antikörper des Empfängerplasmas richten könnten, am niedrigsten ist3. Aus Bestandsgründen muss jedoch z.B. bei einer Massivtransfusion häufig auf ein Erythrozytenkonzentrat der Blutgruppe 0 Rhesus positiv zurückgegriffen werden. Abbildung 2 demonstriert die Blutgruppenkompatibilität im AB0-System. Empfängerblutgruppe Antikörper im Plasma Spenderblutgruppe 0 A B AB - + + + (Antigene auf Erythrozyten) 0 Anti-A Anti-B A Anti-B - - + + B Anti-A - + - + AB --- - - - - + = Agglutination - = keine Agglutination Abbildung 2: Blutgruppenkompatibilität im AB0-System Wie der Abbildung zu entnehmen ist, werden Erythrozytenkonzentrate majorkompatibel transfundiert. Hierbei sind im Spenderkonzentrat nur die Antigene vorhanden, welche auch auf den Empfängererythrozyten zu finden sind. Somit finden sich im Empfängerplasma keine Antikörper gegen Erythrozyten des Spenders. Blutplasma hingegen wird minor-kompatibel transfundiert, d.h. im Plasma des Spenders befinden sich keine Antikörper, die sich gegen Antigene des Empfängers richten könnten3. 8 Einleitung Vor einer Bluttransfusion werden die folgenden blutgruppenserologischen Routinemaßnahmen im Sinne des Transfusionsgesetzes durchgeführt3: Transfusionsmedizinische Anamnese Gab es Vortransfusionen? Gibt es bekannte Antikörper? Blutgruppenbestimmung und Antikörpersuchtest Mit Hilfe von monoklonalen Testreagenzien wird nach den Antigenen A und B, dem Rhesusantigen D sowie den entsprechenden Antikörpern gesucht. Nach Inkubation des Empfängerserums mit speziellen Testerythrozyten wird nach weiteren, selteneren Antikörpern gesucht. Serologische Verträglichkeitsprobe / Kreuzprobe Das Empfängerserum wird mit Erythrozyten des Spenders inkubiert. Tritt hierbei nach 20 Minuten eine makroskopisch und mikroskopisch erkennbare Agglutination ein, ist die Transfusion unverträglich. AB0-Identitätstest / Bedsidetest Direkt „am Bett“ wird durch den transfundierenden Arzt kurz vor der Transfusion die Blutgruppe des Patienten mittels Testkarten ermittelt, welche mit Testseren beschichtet sind und mit der Blutgruppe des Spenders verglichen, um inkompatible Transfusionen zu vermeiden. Zur Herstellung von Erythrozytenkonzentraten werden heute im Rahmen der Blutspende sterile Kunststoffbeutel verwendet. Nachdem ca. 500 ml Vollblut in diese entnommen wurde, werden durch Zentrifugation die zellulären (hauptsächlich Erythrozyten) von den plasmatischen Bestandteilen getrennt. Die Erythrozyten werden von Plasma und buffy-coat (Zellschicht zwischen Plasma und Erythrozyten, enthält ca. 70% der Leukozyten und ca. 90% der Thrombozyten) separiert und anschließend mit einer Additivlösung resuspendiert. Diese enthält unter anderem Adenin, Glucose, Natriumchlorid, Mannitol und Wasser für Injektionszwecke und verbessert die Lebensfähigkeit der Erythrozyten durch Stabilisierung des Stoffwechsels und verlängert somit die mögliche Lagerungsdauer3. Zur Vermeidung Leukozyten-vermittelter Komplikationen wie der febrilen, nichthämolytischen Transfusionsreaktion, Übertragung von Infektionen (z.B. Zytomegalie-Virus, EpsteinBarr-Virus) oder der Alloimmunisierung gegen Humane-Leukozyten-Antigene (HLA) werden die Erythrozytenkonzentrate mittels eines mehrschichtigen Filters 9 Einleitung leukozytendepletiert. Das Risiko der Graft-versus-Host-Disease kann dagegen nur durch Bestrahlung verringert werden3,6. In den aktuell genutzten Erythrozytenkonzentraten befinden sich bei ca. 200 – 350 ml Volumen weniger als 1x106 Leukozyten bei einem Hämatokrit von ca. 50-70 Prozent. Andere, zum Teil lebensbedrohliche Transfusionsreaktionen sind der anaphylaktische Schock, allergische Reaktionen, akute und verzögerte hämolytische Transfusionsreaktion, posttransfusionelle Purpura und die transfusions-assoziierte akute Lungeninsuffizienz (TRALI, transfusion-related acute lung injury)3,7. Im Rahmen einer Massivtransfusion (Austausch des gesamten Blutvolumens des Patienten innerhalb von 24 Stunden) kann es des Weiteren zu einer Hypothermie, Hyperkaliämie, Hypokalzämie, Azidose und Gerinnungsstörungen kommen8. Letztlich lässt sich auch die Übertragung von Infektionen mit dem Humanen Immundefizienz-Virus, Hepatitis C, Hepatitis B, Bakterien oder Protozoen nicht vollständig ausschließen3,9,10. Angesichts der nicht unerheblichen Nebenwirkungen im Rahmen der Bluttransfusion wird heute ein restriktives Transfusionsregime befürwortet. So wird in den aktuellen Querschnittsleitlinien der Bundesärztekammer für stabile, nicht kardial vorbelastete Patienten eine Transfusion erst ab einem Hämoglobin (Hb)-Wert von ≤ 6 g/dl empfohlen. Bei eingeschränkter Kompensation mit Symptomen wie Tachykardie oder Hypotension bzw. vorhandenen kardiovaskulären Risikofaktoren ist eine Transfusion bei einem Hb-Wert zwischen 6 - 8 g/dl angezeigt. Bei Hinweisen für eine anämische Hypoxie wie Tachykardie, EKG-Ischämiezeichen oder Hypotonie gegebenenfalls auch bei Werten zwischen 8 – 10 g/dl11. 1.4 Transfusionsassoziierte Immunmodulation Neben den oben beschriebenen Transfusionsreaktionen können Blutprodukte immunmodulatorische Effekte induzieren. Hierbei kann es durch die Übertragung von zellulären oder gelösten fremden Antigenen zur Immunsuppression oder zur verstärkten Immunreaktion des Empfängers kommen. Bei zum Teil übereinstimmenden HLA-Eigenschaften zwischen Spender und Empfänger kam es 10 Einleitung eher zu Toleranz und Immunsuppression, bei sehr unterschiedlichen HLAEigenschaften zu proinflammatorischen Effekten12. Die genauen Mechanismen der transfusionsassoziierten Immunmodulation (TRIM, transfusion-related immunomodulation) konnten bis heute nicht sicher identifiziert werden. Jedoch scheinen übertragene Leukozyten, hier vor allem die Antigenpräsentierenden Zellen (APC), von Leukozyten freigesetzte lösliche Mediatoren wie Zytokine und lösliche HLA eine bedeutende Rolle zu spielen13,14. Bereits 1973 konnten Opelz et al. zeigen, dass bei Patienten, die vor einer Nierentransplantation Bluttransfusionen erhielten, eine signifikant höhere Transplantatüberlebenszeit zu beobachten war. Dieser für den Patienten positive Effekt der Immunmodulation wurde in einigen folgenden Studien bestätigt15–17. Ist beim Spender ein hoher Anteil nicht-funktionsfähiger APC festzustellen und fehlen co-stimulatorische Signale, kann dies zu einer verminderten T-Zell-Reaktion des Empfängerorganismus führen, welche weitreichende immunsuppressive Folgen hat18,19. Die Art der Lagerung und die Lagerungsdauer der Erythrozytenkonzentrate scheinen einen Einfluss auf die Qualität der APC zu haben20. Weitere Studien haben gezeigt, dass durch die Anwesenheit von Alloantigenen vermehrt immunsuppressive Zytokine freigesetzt werden21. Baumgartner et al. konnten eine erhöhte Produktion von regulatorischen T-Zellen nach Bluttransfusionen feststellen, welche ebenfalls für die herabgesetzte Immunreaktion verantwortlich sein könnte22. 1981 postulierte Gantt einen Zusammenhang zwischen vermehrten Tumorrezidiven nach curativer chirurgischer Intervention und perioperativen Bluttransfusionen23. In einer aktuellen Metaanalyse wurde das klinische Outcome von 20.795 Patienten mit colorektalem Carcinom und operativer Therapie untersucht. Hierbei konnte bei transfundierten Patienten eine signifikant höhere Tumor-Rezidivrate sowie eine signifikant höhere Mortalität festgestellt werden24. Eine weitere Metaanalyse wies ein deutlich erhöhtes Risiko für postoperative bakterielle Infektionen nach Transfusionen nach.25 11 Einleitung Pedersen et al. zeigten, dass bei Patienten, welche im Rahmen einer HüftTotalendoprothese-Operation Erythrozytenkonzentrate erhielten, eine erhöhte Inzidenz an postoperativen Pneumonien zu beobachten war26. Eine Studie bei nichtherzchirurgischen Patienten konnte ein nahezu doppelt so hohes postoperatives Risiko für Wundinfektionen nach Transfusionen ermitteln27. Nach neurochirurgischen Operationen bei Subarachnoidalblutungen war eine höhere Rate an septischen Krankheitsbildern nach Transfusionstherapie zu beobachten28. Gong et al. konnten einen signifikanten Anstieg an acute respiratory distress syndrome (ARDS)-Erkrankungen sowie eine höhere Mortalität bei diagnostiziertem ARDS nach Transfusion von Erythrozytenkonzentraten bei Patienten auf Intensivstationen nachweisen29. 1.5 Verwendung leukozytendepletierter Erythrozytenkonzentrate und der Einfluss der Lagerungsdauer Interessanterweise ist die Studienlage in Bezug auf die Verwendung leukozytendepletierter Blutprodukte nicht eindeutig. Eine 2003 veröffentliche, retrospektive Kohortenstudie verglich das klinische Outcome von 6.982 Patienten, die vor der Einführung der Leukozytendepletion in Kanada Erythrozytenkonzentrate erhielten, mit 7.804 Patienten, die nach der Einführung der Leukozytendepletion transfundiert wurden. Untersucht wurden hierbei Intensivpatienten, herzchirurgische und Hüftgelenkersatz-Patienten mit dem Ergebnis einer zwar geringen, aber statistisch signifikanten Reduktion der Mortalität und des Auftretens von Fieber bei der Verwendung leukozytendepletierter Produkte30. Ein deutlich geringeres Risiko für postoperative bakterielle Infektionen, das Entstehen eines Multiorganversagens und eine deutliche Reduktion der Mortalität konnten van de Watering et al. bei herzchirurgischen Patienten bei der Verwendung von leukozytendepletierten Erythrozytenkonzentraten aufzeigen31. In einer englischen Studie konnte dagegen kein Vorteil der depletierten Konzentrate in Bezug auf postoperative Infektionen bei herzchirurgischen Patienten festgestellt werden32. Die Inzidenz eines ARDS oder einer TRALI im traumatologischen Setting 12 Einleitung war unabhängig von der Art der verwendeten Erythrozytenkonzentrate33. Jedoch konnte eine um bis zu 45 % geringere Inzidenz an nosokomialen Pneumonien bei chirurgischen Patienten bei der Nutzung leukozytendepletierter Konzentrate nachgewiesen werden. Am deutlichsten war dieser Effekt nach einer 34 Massivtransfusion zu beobachten . Auch die Lagerungsdauer von Erythrozytenkonzentraten scheint einen Einfluss auf das Outcome von transfundierten Patienten zu haben. So konnten Zallen et al. bei traumatologischen Patienten ein erhöhtes Risiko für ein Multiorganversagen nach Transfusion von Konzentraten, die älter als 14 und 21 Tage waren, feststellen35. Das Risiko postoperativer Infektionen nach einer Rektumcarcinom-Operation war nach der Therapie mit über 21 Tage alten Konzentraten erhöht36. Leal-Noval et al. stellten eine erhöhte Inzidenz an nosokomialen Pneumonien bei herzchirurgischen Patienten nach Transfusion fest. Hier waren Erythrozytenkonzentrate, welche älter als 28 Tage waren, ein Risikofaktor37. In einer retrospektiven Kohortenstudie wurden durch Basran et al. 434 herzchirurgische Patienten untersucht. In dieser Studie konnte eine erhöhte Mortalität nachgewiesen werden, welche abhängig vom Durchschnittsalter der transfundierten Konzentrate und dem Alter des ältesten transfundierten Konzentrats war38. Grund für das erhöhte Komplikationsrisiko bei der Verwendung älterer Erythrozytenkonzentrate könnte eine Akkumulation von proinflammatorischen Zytokinen während der Lagerung sein. Zytokine spielen eine wichtige Rolle sowohl im unspezifischen als auch im spezifischen Immunsystem. So konnte gezeigt werden, dass die Konzentration von Interleukin (IL)-1, IL-8 und Tumornekrosefaktor (TNF)-α während der Lagerung über 42 Tage signifikant anstieg39,40. Wurden leukozytendepletierte Konzentrate auf Zytokine untersucht, konnten signifikant geringere Konzentrationen von IL-1, IL-6, IL-8 und TNF-α im Vergleich zu nicht leukozytendepletierten Konzentraten detektiert werden. Zudem stieg die Konzentration der Zytokine während der Lagerung nicht an40. In weiteren Studien wurden diese Ergebnisse bestätigt41–43. Andere Arbeiten untersuchten den Einfluss von Erythrozytenkonzentraten auf die Liberation von Zytokinen nach einer Transfusion. So konnten Schneider et al. in 13 Einleitung einem in-vitro-Setting nachweisen, dass es zu einer vermehrten Freisetzung von IL10 und TNF-α im Empfängerblut nach Transfusion von leukozytendepletierten Konzentraten kam44. Bei traumatologischen Patienten wurden signifikant höhere Konzentrationen von IL-6 und IL-10 nach Transfusionen festgestellt, welche zudem mit einer höheren Inzidenz an Multiorganversagen assoziiert waren45. In einer Studie von Baumgartner et al. wurden durch Lipopolysaccharide stimulierte Mononukleäre Zellen mit dem Plasma von Erythrozytenkonzentraten inkubiert. Hierbei kam es nach der Inkubation zu einer vermehrten Sekretion von IL-1, IL-6 und TNF-α. Die Freisetzung von IL-1 und IL-6 stieg zudem mit dem Alter der verwendeten Konzentrate an46. 1.6 Unspezifisches und spezifisches Immunsystem Die Zellen des Immunsystems sind die weißen Blutkörperchen (Leukozyten), von denen beim gesunden Erwachsenen etwa 4.000 bis 10.000 pro µl im Blut vorhanden sind. Diese werden nach morphologischen Kriterien in Granulozyten (60-70 %), Lymphozyten (20-30 %) und Monozyten (2-6 %) unterteilt. Ein Infektionserreger hat zunächst die physikalisch-chemischen und nichtimmunologischen Abwehrmechanismen des Körpers zu überwinden, wie etwa die Fettsäuren und Talgbeimengungen der Haut, welche bakterizid und virustatisch wirken, das saure Milieu des Magens oder auch Enzyme wie das Lysozym der Tränenflüssigkeit. Das erste immunologische Hindernis ist das unspezifische oder auch angeborene Immunsystem. Die Hauptkomponenten des unspezifischen Immunsystems sind in der folgenden Tabelle dargestellt: Zelluläre Elemente Dendritische Zellen, Makrophagen, Natürliche Killerzellen (NK-Zellen), Basophile, eosinophile und neutrophile Granulozyten, Mastzellen, Monozyten Humorale Elemente Akute-Phase-Proteine, Komplementsystem, Zytokine (z.B. IL-1, IL-6, TNF-α), Interferone Tabelle 1: Hauptkomponenten des unspezifischen Immunsystems 14 Einleitung Aufgabe der phagozytären Zellen (Granulozyten, Monozyten, Makrophagen, Dendritische Zellen, Mastzellen) ist die Phagozytose fremder Antigene. Die zum Teil gemeinsamen molekularen Strukturen dieser Pathogene werden durch Oberflächenrezeptoren auf den Phagozyten erkannt. Durch von Ihnen freigesetzte Chemokine werden weitere Phagozyten an den Ort des Geschehens geleitet, welche die Immunreaktion verstärken. Dieser Vorgang nennt sich Chemotaxis und kann unter anderem auch durch das Komplementsystem initiiert werden. Eine Opsonierung eingedrungener Antigene durch Akute-Phase-Proteine und das Komplementsystem führt zu zusätzlichen Bindungsstellen für phagozytäre Zellen und zu einer Verstärkung der Phagozytoseleistung47,48. Des Weiteren werden von den Zellen des unspezifischen Immunsystems Zytokine produziert (u.a. IL-1, IL-6, TNF-α), welche zu einer weiteren Aktivierung der Komponenten des unspezifischen Immunsystems (z.B. Produktion der Akute-PhaseProteine in der Leber, Mobilisation zusätzlicher Phagozyten etc.) führen. Über diese Ausschüttung kommt es jedoch auch zu einer Aktivierung von Zellen des spezifischen Immunsystems, weshalb Zytokine eine wesentliche Rolle bei der Interaktion von unspezifischem und spezifischem Immunsystem spielen48,49. Makrophagen, Monozyten und vor allem Dendritische Zellen haben die Fähigkeit zur Antigenpräsentation und zählen deshalb zu den APC. Das durch diese Zellen prozessierte Antigen wird an der Zelloberfläche befindliche HLA-Klasse-II-Moleküle gebunden und kann dann von T-Zell-Rezeptoren der CD4-positiven T-Lymphozyten erkannt werden. Werden zudem co-stimulatorische Signale z.B. über den CD28Rezeptor ausgelöst, können sich diese Zellen durch die folgende Aktivierung zu TGedächtniszellen oder T-Helferzellen differenzieren. Die Gedächtniszellen spielen eine wesentliche Rolle im spezifischen Immunsystem als Teil des immunologischen Gedächtnisses. In der nachfolgenden Tabelle sind die Hauptkomponenten des spezifischen Immunsystems aufgeführt, welches vor allem durch eine Antigen-spezifische Immunantwort gekennzeichnet ist, welche bei erneutem Antigen-Kontakt eine stärkere und schnellere Reaktion zur Folge hat: 15 Einleitung Zelluläre Elemente T-Lymphozyten, B-Lymphozyten Humorale Elemente Antikörper (Immunglobulin (Ig) E, IgG, IgA, IgM, IgD) Zytokine (z.B. IL-2, IL-4, IL-5, IL-6), Interferon-γ Tabelle 2: Hauptkomponenten des spezifischen Immunsystems Die CD4-positiven T-Helferzellen lassen sich je nach sezerniertem Zytokinmuster in TH1-Zellen (vornehmlich IL-2, Interferon-γ, TNF-β) und TH2-Zellen (IL-4, IL-5, IL-9, IL-10, IL-13) unterteilen. Durch Zell-Zell-Kontakte, co-stimulatorische Signale und die Wirkung der Zytokine werden durch sie die B-Lymphozyten aktiviert, welche sich in der Folge zu B-Gedächtnis-Zellen und Plasmazellen differenzieren. Unter anderem beeinflusst durch das vorliegende Zytokinmuster produzieren die Plasmazellen verschiedene Immunglobulinklassen. Diese Antikörper sind jeweils spezifisch für ein bestimmtes Antigen. Nach Bindung eines Antigens an den antigenbindenden FabTeil erfolgt die Wirkung des Antikörpers über unterschiedliche Mechanismen. So kann durch die Antigenbindung das Antigen neutralisiert und in seiner Funktion deaktiviert werden. Durch eine Opsonierung wird die Phagozytose des Antigens durch Phagozyten erleichtert. Zudem können durch Antikörper markierte Zielzellen leichter von NK-Zellen und CD8-positiven zytotoxischen T-Zellen erkannt und zur Apoptose geführt werden. Ebenso wird die Immunabwehr durch die Aktivierung des Komplementsystems verstärkt. Im Gegensatz zu den T-Lymphozyten, welche nur prozessierte Antigene erkennen können, zählen die B-Lymphozyten zu den APC und können auch komplette Antigene verarbeiten. Nach Bindung eines Antigens an das transmembranöse Immunglobulin der B-Zelle wird dieses prozessiert und über HLA-Klasse-II-Moleküle den CD4-positiven T-Lymphozyten präsentiert. Diese Funktion als APC wird von verschiedenen Zytokinen verstärkt47–50. Eine weitere Untergruppe der T-Lymphozyten sind die CD4-positiven regulatorischen T-Zellen. Diese haben eine immunsuppressive Wirkung und reduzieren unter anderem das Risiko für Autoimmunreaktionen oder allergische Reaktionen. Eine 16 Einleitung durch regulatorische T-Zellen vermittelte verminderte Sekretion von IL-10 führte beispielsweise zu einer Suppression der IgE-Produktion51. Eine Übersicht der verschiedenen Wirkungen und Produktionsorte ausgewählter Zytokine gibt die folgende Tabelle: Zytokin Zellen, die das Zielzellen Immunologische Effekte Zytokin sezernieren IL-1 Monozyten/ T- Makrophagen, Monozyten, T, B u. u. B-Zellen, Klassisches NK Granulozyten, proinflammatorisches Fieber, Zytokin, Akutphasereaktion, Zellen, Hepatozyten, Zellaktivierung Granulozyten, Knochen von Effektorfunktionen, fördert Epithelzellen, und Induktion Hämatopoese Fibroblasten IL-2 T- Zellen T-, B- und NK-Zellen, T-Zellaktivierung, klonale Monozyten, Expansion, Induktion von Granulozyten Apoptose, Differenzierung zu zytotoxischen T-Zellen, Aktivierung von NK- und BZellen sowie Monozyten und Granulozyten IL-3 Aktivierte T- Hämatopoetische Zellen, Stamm- Mastzellen, Progenitorzellen, Eosinophile Granulozyten, Synergie mit IL-5 und GM-CSF und für myeloische Zellproliferation und Differenzierung Monozyten, Mastzellen IL-4 T-Zellen B-, T- und NK-Zellen, B-Zellaktivierung, Verstärkung Monozyten, der Expression von IgG1 und Progenitorzellen, IgE, Regulation der Expression Mastzellen von CD23 auf Zellen und 17 Einleitung Monozyten, Induktion einer TH2 Antwort, Wachstumsfaktor für Mastzellen. IL-5 T-Zellen, Eosinophile und Regulation der Expansion von Mastzellen, Basophile (B-Zellen) Eosinophilen und Chemotaxis Eosinophile IL-6 T- und B-Zellen, B-, T- und NK-Zellen, Klassisches Monozyten, Thymozyten proinflammatorisches Zytokin, Akutphasereaktion, Effekte auf breite Zellwachstum, Differenzierung und Aktivierung, Osteoklastenaktivierung IL-8 T-Zellen, T- und Monozyten, Mastzellen Granulozyten Thymozyten B-Zellen, Mediator einer und Entzündung, akuten Leukozyten- aktivierung, -chemotaxis und adhäsion IL-10 T-Zellen und T-, NK- und B-Zellen, Begrenzung Mastzellen, Mastzellen Keratinozyten Monozyten Monozyten, der Entzündung und durch Effekte auf Monozyten, inhibiert IL-12 und reguliert Wachstum und Differenzierung von B-, T- und NK Zellen sowie Mastzellen und Granulozyten IL-12 B-Zellen, Zellen Monozyten, einer TH1 Dendritische proinflammatorisches Zytokin, und Makrophagen, Granulozyten Zellen, Zellen Induktion B- Immunantwort, Induktion der Produktion von Interferon-γ und anderen Zytokinen der NK- und T-Zellen, Verbindung zwischen unspezifischem und spezifischem Immunsystem IFN- γ T-Zellen, Zellen, NK- T-, B Monozyten, Zellen Zellen, Zellaktivierung und NK Differenzierung, Hochregulation von der MHC Expression, 18 Einleitung Verstärkung der zytolytischen Aktivität, Selektion des Ig- Isotyps TNF- α Monozyten, und Zellen TNF- β Zellen, T- Monozyten, Proinflammatorisches NK- Granulozyten, Zytokin, Antitumoreffekte Gefäßendothel Tabelle 3: Einzelne Zytokine und ihre Funktionen52 Eine vermehrte Freisetzung von proinflammatorischen und anti-inflammatorischen Zytokinen nach der Transfusion von Erythrozytenkonzentraten könnte einen wesentlichen Einfluss auf das Outcome der Patienten haben. Die Ausschüttung des potenten proinflammatorischen Zytokins IL-1 bewirkt unter anderem die Liberation weiterer entzündungsfördernder Zytokine wie IL-6 und IL-8. Ein Anstieg der IL-1-Konzentration konnte beispielsweise im Rahmen von chronischentzündlichen Darmerkrankungen, Arthritis oder der Graft-versus-Host-Disease beobachtet werden53. Verschiedene Studien konnten erhöhte Konzentrationen von IL-6, welches zum Beispiel ein wichtiger Mediator der Akute-Phase-Reaktion ist, in Zusammenhang mit einem steigenden Risiko für die Entwicklung eines Multiorganversagens bringen54,55. TNF-α hat ebenfalls wichtige proinflammatorische Effekte und so werden Anti-TNF-α-Therapien zur Behandlung der Rheumatoiden Arthritis oder chronisch-entzündlicher Darmerkrankungen genutzt56. Jean-Baptiste konnte nachweisen, dass IL-1, IL-6 und TNF-α eine wesentliche Rolle bei der Immunantwort im Rahmen einer Sepsis spielen57. Bei Verbrennungspatienten konnten erhöhte Spiegel des anti-inflammatorischen Zytokins IL-10 festgestellt werden. Eine vermehrte Sekretion war mit einem höheren Risiko für schwere Komplikationen und einer erhöhten Mortalität verbunden58. 19 Einleitung 1.7 Zielsetzung der Arbeit Basierend auf den zitierten Vorarbeiten wurde der Einfluss von Erythrozytenkonzentraten auf die Kompetenz des menschlichen Immunsystems dargestellt und insbesondere die Bedeutung der Zytokine in diesem Zusammenhang aufgezeigt. Aufgrund der sehr häufigen klinischen Anwendung von Bluttransfusionen soll in der vorliegenden Arbeit untersucht werden, welchen Einfluss Erythrozytenkonzentrate auf die Zytokinfreisetzung des Empfängerbluts in vitro ausüben. Es sollen hierbei folgende Fragestellungen beantwortet werden: Beeinflusst das Alter der transfundierten Erythrozytenkonzentrate die Liberation von Zytokinen? Beeinflusst das Transfusionsvolumen von Erythrozytenkonzentraten die Liberation von Zytokinen? Ist eine mögliche Zytokinfreisetzung abhängig von der Blutgruppe des Erythrozytenkonzentrats oder des Empfängers? 20 Material und Methoden 2 Material und Methoden 2.1 Labormaterialien Dieses Kapitel gibt eine Übersicht über die genutzten Laborgeräte und Verbrauchsmaterialien. 2.1.1 Geräte und Apparaturen In Tabelle 4 sind die in dieser Arbeit verwendeten Laborgeräte aufgeführt. Gerät Hersteller Durchflusszytometer EPICS XL Beckman Coulter, Fullerton, USA Zentrifuge Eppendorf AG, Hamburg, D Zentrifuge FACS Heraeus, Hanau, D Wärmeschrank 37°C Memmert GmbH, Schwabach Kühlschrank 4°C Liebherr GmbH, Ochsenhausen, D Eisbereiter Ziegra GmbH, Isernhagen, D Absauganlage Vacuubrand GmbH, Wertheim, D Research Pipette Eppendorf AG, Hamburg, D Minishaker MS 2 Omnilab GmbH Bremen, D Schüttelgerät Vortex-Genie 2 Scientific Industries, Bohemia, USA Tabelle 4: Geräte und Apparaturen 2.1.2 Verbrauchsmaterialien Tabelle 5 führt die in diesem Versuchsaufbau genutzten Verbrauchsmaterialien auf. Material Hersteller FACS-Röhrchen Fa. Sarstedt, Nümbrecht, D 21 Material und Methoden SafeSeal-Reagiergefäße Fa. Sarstedt, Nümbrecht, D S-Monovette Fa. Sarstedt, Nümbrecht, D Pipettenspitzen Eppendorf AG, Hamburg, D Safeskin Einmalhandschuhe Kimberly-Clark, Koblenz, D Parafilm American National Can, Menasha, USA Zellstoff Hartmann AG, Heidenheim, D Aluminiumfolie Alujet GmbH, Düsseldorf, D Tabelle 5: Verbrauchsmaterialien 2.1.3 Cytometric Bead Array Die folgende Tabelle zeigt die Komponenten des Cytometric Bead Arrays (Human Inflammation Kit™) des Herstellers BD Biosciences, San Diego, USA. Material Hersteller Human IL-8 Capture Beads BD Biosciences, San Diego, USA Human IL-1β Capture Beads BD Biosciences, San Diego, USA Human IL-6 Capture Beads BD Biosciences, San Diego, USA Human IL-10 Capture Beads BD Biosciences, San Diego, USA Human TNF Capture Beads BD Biosciences, San Diego, USA Human IL-12p70 Capture Beads BD Biosciences, San Diego, USA Human Inflammation Phycoerythrin BD Biosciences, San Diego, USA Detection Reagenz Human Inflammation Standards BD Biosciences, San Diego, USA Cytometer Setup Beads BD Biosciences, San Diego, USA Waschpuffer BD Biosciences, San Diego, USA Assay Diluent BD Biosciences, San Diego, USA Serum Enhancement Puffer BD Biosciences, San Diego, USA Tabelle 6: Bestandteile des Human Inflammation Kit™ 22 Material und Methoden 2.2 Blutprodukte 2.2.1 Vollblut Das in dieser Arbeit verwendete Vollblut wurde im Rahmen der Blutspende des Blutspendedienstes der Medizinischen Hochschule Hannover (Institut für Transfusionsmedizin, Leitung Prof. Dr. med. Rainer Blasczyk) gewonnen. Gesunden Probanden wurde im Verlauf der Blutspende 7,5 ml Vollblut aus der Vena mediana cubiti entnommen. Bis zur anschließenden Weiterverarbeitung wurde das Blut in einer heparinisierten S-Monovette auf Eis gelagert. Über den Inhalt der Studie wurden die Probanden informiert. Alle Probanden stimmten der Nutzung der gewonnenen Vollblutprodukte im Rahmen der Arbeit zu. Das Kollektiv bestand aus 36 Frauen und 54 Männern im Durchschnittsalter von 35 Jahren ± 14 Jahre. Es wurde Blut der Blutgruppen 0 Rhesus (Rh) negativ (neg) (n=30), A Rh positiv (pos) (n=30) und B Rh pos (n=30) verwendet. 2.2.2 Erythrozytenkonzentrate Die zur Studie verwendeten Erythrozytenkonzentrate der Blutgruppe 0 Rh pos (n=10) wurden vom Institut für Transfusionsmedizin der Medizinischen Hochschule Hannover (MHH) zur Verfügung gestellt. Es wurden ausschließlich leukozytendepletierte und in Additivlösung resuspendierte Erythrozytenkonzentrate genutzt. Das Institut für Transfusionsmedizin hält Konzentrate aus eigener Herstellung sowie durch den Blutspendedienst des Deutschen Roten Kreuzes (DRK) hergestellte Konzentrate vor. Die Erythrozytenkonzentrate wurden bis zum Erreichen der für die Arbeit benötigten Lagerungsdauer stets im Institut für Transfusionsmedizin unter den vorgeschriebenen Qualitätsstandards gelagert. 23 Material und Methoden Bei 4° Celsius (C) ± 2°C beträgt die maximale Lagerungszeit für die vom DRK hergestellten Erythrozytenkonzentrate 5 Wochen, für die von der MHH hergestellten 6 Wochen. Für diese Untersuchung wurden Konzentrate mit einer Lagerungsdauer von 1 Woche, 3 Wochen und 5 Wochen verwendet. 2.2.2.1 Bestandteile des Erythrozytenkonzentrats der MHH Erythrozyten: Humanerythrozyten aus einer Vollblutspende (Hämatokrit 0,54 – 0,66) Leukozyten: < 1x106 / Einheit Thrombozyten: < 3x109 / Einheit PAGGS-M-Additivlösung bestehend aus Natriumchlorid, Mannitol, GlucoseMonohydrat, Adenin, Guanosin, Natriumhydrogenphosphat-Dihydrat, Natriummonohydrogenphosphat-Dihydrat, Wasser für Injektionszwecke) CPD-Stabilisatorlösung (enthält Citronensäure, Natriumcitrat, Glucose, Natriumhydrogenphosphat, Wasser für Injektionszwecke) 2.2.2.2 Bestandteile des Erythrozytenkonzentrats des DRK Erythrozyten: Humanerythrozyten aus einer Vollblutspende (Hämatokrit 0,50 – 0,70) Leukozyten: < 1x106 / Einheit Thrombozyten: < 5x109 / Einheit CPD-Stabilisatorlösung SAG-M-Additivlösung bestehend aus Natriumchlorid, Adenin, GlucoseMonohydrat, Mannitol, Wasser für Injektionszwecke) Blutplasma 24 Material und Methoden 2.3 Quantifizierung der Zytokinkonzentrationen mittels Cytometric Bead Array Zur Konzentrationsbestimmung sechs verschiedener Zytokine im Blutplasma (IL-8, IL-1ß, IL-6, IL-10, TNF-α, IL-12p70) wurde ein Cytometric Bead Array (Human Inflammation Kit™ CBA, BD Biosciences, San Diego, USA) verwendet. Grundlage dieses Verfahrens sind sechs unterschiedliche Arten antikörperbeschichteter Latexpartikel (Beads), welche durch eine Antigen-Antikörper-Reaktion spezifisch an eines der oben genannten Zytokine binden. Im Durchflusszytometer zeigt jede Latexpartikelart nach Anregung durch einen Laserstrahl eine charakteristische Fluoreszenzintensität, wodurch sich jeder Intensität ein bestimmtes Zytokin zuordnen lässt. Um die entsprechende Zytokinkonzentration bestimmen zu können, wird ein Phycoerythrin (PE)-konjugierter Antikörper genutzt, welcher als Sekundärantikörper an Zytokin-gebundene Latexpartikel bindet. Hat ein Latexpartikel eines der sechs Zytokine spezifisch gebunden, verursacht der Laserstrahl zwei unterschiedliche Fluoreszenzsignale: Zum einen das oben erwähnte spezifische Fluoreszenzsignal zur Diskriminierung der Zytokine, zum anderen das PE-Fluoreszenzsignal, dessen Fluoreszenzintensität sich proportional zur Zytokinkonzentration verhält. Nach der durchflusszytometrischen Analyse werden die erhaltenen Daten durch Software der Fa. BD Biosciences ausgewertet. Als Ergebnis erhielten wir die Konzentrationen der gemessenen Zytokine in pg/ml. 2.4 Durchflusszytometrie Eine aktuelle Methode zur Analyse optischer Eigenschaften von Zellen bzw. Partikeln ist die fluoreszenzaktivierte Zellanalyse (FACS, fluorescence-activated cell sorting). Nach Anregung mit Laserlicht ist es möglich, unterschiedliche Streulichteigenschaften und Fluoreszenzsignale von Zellen zu detektieren. Ein Durchflusszytometer besteht aus den 3 folgenden Hauptanteilen: 25 Material und Methoden Flüssigkeitssystem Optisches System Signalverarbeitung Voraussetzung für die Zelluntersuchung mittels Durchflusszytometrie ist das Vorliegen der Zellen in Suspension. Die Zellsuspension wird mittels Überdruck über eine Stahlkapillare in die Messküvette transportiert. Durch die umgebende Trägerflüssigkeit beschleunigen die Zellen so stark, dass sich Zellaggregate auftrennen und ein konstanter Einzelzellfluss (perlschnurartig aufgereihte Zellen) entsteht. Dieser Vorgang wird auch als hydrodynamische Fokussierung bezeichnet. Im anschließenden optischen System, welches sich in einen Anregungs- und einen Detektionsteil gliedert, können dann die Streulicht- und Fluoreszenzeigenschaften der einzelnen Zellen registriert werden. Abbildung 3 stellt schematisch den Aufbau eines Durchflusszytometers dar: Abbildung 3: Aufbau eines Durchflusszytometers59 Als Fluoreszenz wird die Lichtemission von Molekülen nach Absorption energiereicher Strahlung verstanden. Diese Strahlung muss im Wellenlängenbereich 26 Material und Methoden der charakteristischen Anregungsenergie des Fluoreszenzfarbstoffes liegen. Nach Anregung durch einen gebündelten Laserstrahl werden die Elektronen der Fluoreszenzfarbstoffe auf ein höheres Energieniveau gehoben. Unter der Aussendung von Photonen kehren die Elektronen in ihren energetischen Ausgangszustand zurück. Durch Photoröhren werden diese emittierten Fluoreszenzsignale detektiert. Die Farbstoffe verfügen über charakteristische Emissionsspektren und werden entsprechend der Wellenlänge von unterschiedlichen Kanälen des Durchflusszytometers registriert. In dieser Arbeit wurde ein Durchflusszytometer (EPICS XL, Beckman Coulter, USA) mit Argonlaser (Wellenlänge 488 nm) als monochromatischer Lichtquelle verwendet. Dieser Laserstrahl verursacht, wie in Kapitel 2.3 beschrieben, bei jedem Zytokingebundenen Latexpartikel des in dieser Studie genutzten Human Inflammation Kits™ zwei unterschiedliche Fluoreszenzsignale. Die Eigenfluoreszenz der Partikel zur Differenzierung der Zytokine wird in Kanal 3 (FL 3) detektiert, während das PEFluoreszenzsignal zur Konzentrationsbestimmung der Zytokine in Kanal 2 (FL 2) gemessen wird. Das Emissionsspektrum hierbei lag zwischen 576 und 670 nm. Ein weiterer Faktor von Bedeutung neben der Fluoreszenzerfassung ist die Detektion der Lichtstreuung. Sobald ein Lichtstrahl auf eine Zelle trifft, wird er unter anderem bedingt durch Zelleigenschaften wie Zellform, Zellgröße, Membranstruktur und Granularität in unterschiedliche Richtungen gestreut. Zum größten Teil wird das Licht in Vorwärtsrichtung gestreut (Vorwärtstreulicht, erfasst vom forward scatter channel, FSC), zum geringeren Teil in Seitwärtsrichtung (Seitwärtsstreulicht, erfasst vom side scatter channel, SSC). Wiederum durch Photoröhren (beim SSC) bzw. Photodioden (beim FSC) werden die Streulichtsignale detektiert. Die daraus abzuleitenden Informationen stellt Tabelle 7 dar: 27 Material und Methoden Streulicht erhaltene Information Vorwärtsstreulicht (FSC) Zellgröße Seitwärtsstreulicht (SSC) Zellform Zellmembranfaltung Granularität Tabelle 7: Streulichtinformationen Hierdurch lassen sich beispielsweise Makrophagen und Granulozyten von Lymphozyten differenzieren, da sie deutlich mehr Granula enthalten und folglich ein deutlich höheres SSC-Signal aufweisen. Die Kombination von FSC, SSC und Fluoreszenzemission erlaubt eine detaillierte Analyse der intra- und extrazellulären Zelleigenschaften. Die durch die Detektoren registrierten optischen Signale werden zur weiteren Verarbeitung in einen elektrischen Impuls umgewandelt, dessen Höhe proportional zur Stärke des Lichtsignals ist. Dieses elektrische Signal wird linear (FSC und SSC) oder logarithmisch (Fluoreszenzsignale) verstärkt. Eine Konvertierung durch einen Analog-/ Digitalwandler ermöglicht eine computergestützte Auswertung der so erhaltenen Rohdaten. 2.5 Durchführung der Studie In dieser Studie wurde der Einfluss von Erythrozytenkonzentraten auf die menschliche Inflammationsreaktion in drei unterschiedlichen Blutgruppenkombinationen in vitro untersucht. Hierzu wurden insgesamt zehn verschiedene Erythrozytenkonzentrate der Blutgruppe 0 Rh pos verwendet. Diese wurden bis zum Erreichen der erforderlichen Lagerungsdauer im Institut für Transfusionsmedizin vorgehalten. Nach einer 28 Material und Methoden Lagerungsdauer von 1 Woche wurde unter sterilen Bedingungen aus den Konzentraten (n=10) die für die Studie notwendige Konzentratmenge entnommen und mit Vollblut der Blutgruppen 0 Rh neg (n=10), A Rh pos (n=10) und B Rh pos (n=10) inkubiert. Die eigentlichen Konzentrate verblieben nach der sterilen Entnahme im Institut für Transfusionsmedizin. Nach 3 Wochen Lagerungsdauer wurde von den gleichen Erythrozytenkonzentraten (n=10) erneut die erforderliche Konzentratmenge unter sterilen Bedingungen abgenommen und mit Vollblut der Blutgruppen 0 Rh neg (n=10), A Rh pos (n=10) und B Rh pos (n=10) inkubiert. Die Konzentrate verblieben wiederum im Institut für Transfusionsmedizin. Abschließend wurde nach 5-wöchiger Lagerung die aus den Erythrozytenkonzentraten (n=10) steril gewonnene Konzentratmenge erneut mit Vollblut der Blutgruppen 0 Rh neg (n=10), A Rh pos (n=10) und B Rh pos (n=10) inkubiert. Durch dieses Vorgehen war es möglich neben dem Einfluss des Transfusionsvolumens auch lagerungsabhängige Effekte auf die menschliche Inflammationsreaktion zu beobachten. Zur Negativkontrolle wurde zu jedem Untersuchungszeitpunkt (1 Woche, 3 Wochen, 5 Wochen) die Zytokinkonzentration des Vollbluts der verschiedenen Blutgruppen ohne Zugabe von Erythrozytenkonzentrat bestimmt. 2.5.1 Versuchsablauf Das von den Probanden zur Verfügung gestellte Vollblut wurde nach dem unten aufgeführten Protokoll, welches den gesamten Ablauf der Studie für ein Erythrozytenkonzentrat zeigt, mit Erythrozytenkonzentrat 30 Minuten bei 37°C inkubiert. Zusätzlich wurde das Vollblut zur Negativkontrolle ohne vorherige Konzentratzugabe inkubiert. Nach abgelaufener Inkubation wurde das Blut mit 2000 x g bei 4°C für 20 Minuten zentrifugiert. Das entstandene Blutplasma wurde im Anschluss mittels Human Inflammation Kit™ Kit auf Zytokine untersucht. 29 Material und Methoden Dazu wurde gemäß Herstelleranleitung zunächst ein Master-Bead-Mix hergestellt, indem für jedes untersuchte Probenröhrchen (Plasma und Standards) jeweils 10 µl von jedem einzelnen Capture Bead in ein Röhrchen pipettiert wurden. Die Beads wurden zuvor mit einem Minishaker kurz geschwenkt. Dieser Mastermix wurde nun 5 Minuten bei Raumtemperatur mit 200 x g zentrifugiert und der Überstand anschließend abgesaugt. Das verbliebene Pellet wurde mit dem Enhancement-Puffer resuspendiert, wobei das Puffervolumen äquivalent zum Beadvolumen war. Es folgte eine 30-minütige Inkubation bei Raumtemperatur im Dunkeln. Zwischenzeitlich wurde das Standardlyophilisat mit 200 µl Assay Diluent rekonstituiert und 15 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert. Daraus wurde eine Standardreihe der folgenden Verdünnungsstufen hergestellt: 5000 pg/ml, 2500 pg/ml, 1250 pg/ml, 625 pg/ml, 312 pg/ml, 156 pg/ml, 80 pg/ml, 40 pg/ml, 20 pg/ml, 10 pg/ml, 5 pg/ml, Negativkontrolle. Nach abgeschlossener Inkubationszeit des Mastermix wurden für jeden Standard bzw. jede Plasma-Probe 50 µl Mastermix in FACS-Röhrchen vorgelegt. Jeweils 50 µl Plasma bzw. Standard wurden hinzu pipettiert, die Röhrchen kurz geschwenkt und im Anschluss 1 Stunde 30 Minuten bei Raumtemperatur im Dunkeln inkubiert. Nach dieser Inkubation wurden 1000 µl Waschpuffer in jedes Röhrchen pipettiert und diese anschließend bei Raumtemperatur 5 Minuten mit 200 x g zentrifugiert. Der Überstand wurde vorsichtig bis auf ca. 100 µl abgesaugt und in jedes Röhrchen wurden 50 µl PE Detection Reagenz pipettiert und diese danach kurz geschwenkt. Es folgte wiederum eine Inkubation im Dunkeln bei Raumtemperatur für 1 Stunde 30 Minuten. Nach Ablauf dieser Zeit wurden erneut 1000 µl Waschpuffer in jedes Röhrchen pipettiert und diese für 5 Minuten bei Raumtemperatur mit 200 x g zentrifugiert. Der Überstand wurde abgesaugt und es wurden 300 µl Waschpuffer in jedes Röhrchen pipettiert. Alle Röhrchen wurden anschließend auf Eis gestellt, abgedunkelt und im Durchflusszytometer analysiert, wobei jedes Röhrchen vor der Analyse kurz 30 Material und Methoden geschwenkt wurde. Es folgt eine tabellarische Übersicht des Protokolls zur Studiendurchführung für die Erythrozytenkonzentrate: Probe Blutgruppe Vollblut µl EK µl EK-Alter in Wochen 1 0 Rh neg 500 0 Neg. Kontrolle 2 0 Rh neg 375 125 1 3 0 Rh neg 250 250 1 4 A Rh pos 500 0 Neg. Kontrolle 5 A Rh pos 375 125 1 6 A Rh pos 250 250 1 7 B Rh pos 500 0 Neg. Kontrolle 8 B Rh pos 375 125 1 9 B Rh pos 250 250 1 10 0 Rh neg 500 0 Neg. Kontrolle 11 0 Rh neg 375 125 3 12 0 Rh neg 250 250 3 13 A Rh pos 500 0 Neg. Kontrolle 14 A Rh pos 375 125 3 15 A Rh pos 250 250 3 16 B Rh pos 500 0 Neg. Kontrolle 17 B Rh pos 375 125 3 18 B Rh pos 250 250 3 19 0 Rh neg 500 0 Neg. Kontrolle 20 0 Rh neg 375 125 5 21 0 Rh neg 250 250 5 22 A Rh pos 500 0 Neg. Kontrolle 23 A Rh pos 375 125 5 24 A Rh pos 250 250 5 25 B Rh pos 500 0 Neg. Kontrolle 26 B Rh pos 375 125 5 27 B Rh pos 250 250 5 Tabelle 8: Protokoll zur Studiendurchführung für Erythrozytenkonzentrate 31 Material und Methoden 2.6 Statistische Auswertung Die erfassten Daten und Messwerte wurden in das Tabellenkalkulationsprogramm Microsoft® Excel® 2007 eingegeben60. Die anschließende statistische Auswertung erfolgte mit dem Programm SPSS Statistics 17.0.061. 2.6.1 Signifikanzniveau Bei der Überprüfung von Verteilungen, Homogenitäten der Varianzen und Testentscheidungen wurde die Nullhypothese bis zu einer Irrtumswahrscheinlichkeit von 5 % angenommen. 2.6.2 Datenexploration Im ersten Schritt wurde eine explorative Datenanalyse für die ermittelten Parameter und Variablen durchgeführt. Hierbei sind die Kennwerte zur Beurteilung von mittlerer Lage, Verteilung und Varianzhomogenität berechnet worden. Die objektive Überprüfung der Daten auf Vorliegen einer Normalverteilung wurde für alle stetigen Merkmale mit Hilfe des Kolmogorov-Smirnov-Anpassungstests durchgeführt62. Das Ergebnis zur Homogenität der Varianzen lieferte der Levene-Test. 2.6.3 Untersuchung der Parameterintensität Eine orientierende multivariate Blutgruppenkombination, Varianzanalyse Transfusionsvolumen und wurde für die Variablen Erythrozytenkonzentratalter durchgeführt. Die Tests Wilks-Lambda, Hotelling-Spur, Pillai-Spur und größte charakteristische Wurzel nach Roy zeigten einen Zusammenhang zwischen der Datenverteilung und der Variable Blutgruppenkombination. Weiterhin konnte ein Einfluss auf die Messergebnisse in Abhängigkeit von der Blutgruppenkonstellation und dem Konservenalter nachgewiesen werden (größte charakteristische Wurzel nach Roy). Die Zytokinproduktion wurde im Weiteren mit einer einfaktoriellen ANOVA (analysis of variance) für die beeinflussenden Faktoren Blutgruppenkombination, Transfusionsvolumen und Konservenalter untersucht. Konnte mit einer der 32 Material und Methoden berechneten Prüfgrößen eine Signifikanz auf dem Niveau p≤0,05 nachgewiesen werden, wurde ein post-hoc-Test berechnet, um festzustellen, welche Mittelwerte zwischen den Untersuchungsgruppen voneinander abwichen. Zur Anwendung kam bei Homogenität der Varianzen der Bonferroni Test; konnte keine Varianzgleichheit vorausgesetzt werden, der Games-Howell Test. 33 Ergebnisse 3 Ergebnisse Kapitel 3 führt die Ergebnisse dieser experimentellen Studie auf. 3.1 Einfluss des Erythrozytenkonzentratalters auf die Zytokinfreisetzung Im Folgenden wird für jede untersuchte Kombination von Erythrozytenkonzentrat und Vollblut die Auswirkung des Erythrozytenkonzentratalters (EK-Alter) auf die Zytokinfreisetzung im Vollblut dargestellt. Hierbei wurden 1 Woche, 3 Wochen und 5 Wochen alte Erythrozytenkonzentrate miteinander verglichen. Zusätzlich wurde die Zytokinkonzentration im Vollblut ohne vorherige Transfusion bestimmt. 3.1.1 Erythrozytenkonzentrat 0 Rh pos / Vollblut A Rh pos In der Messreihe Vollblut der Blutgruppe A Rh pos / Erythrozytenkonzentrat der Blutgruppe 0 Rh pos konnte bei allen im Blutplasma bestimmten Zytokinen zunächst ein Abfall der mittleren Zytokinkonzentration zwischen den Messzeitpunkten (MZP) „keine Transfusion“ und „EK-Alter 1 Woche“ festgestellt werden, welcher jedoch nicht statistisch signifikant war. Ein deutlicher Anstieg der mittleren Konzentration von IL-12p70 war nach der Transfusion von 3 Wochen alten Erythrozytenkonzentraten und 5 Wochen alten Erythrozytenkonzentraten zu beobachten. Dieser war mit p=0,033 statistisch signifikant. Signifikante Konzentrationserhöhungen von TNF-α konnten zwischen den MZP „1 Woche“ und „5 Wochen“ mit p=0,003 sowie zwischen den MZP „3 Wochen“ und „5 Wochen“ mit p=0,004 nachgewiesen werden. Zu einem ebenfalls signifikanten Anstieg der Konzentration von IL-10 kam es zwischen den MZP „3 Wochen“ und „5 Wochen“ mit p=0,025. 34 Ergebnisse Die Konzentration von IL-6 stieg zwar ab dem Messzeitpunkt „1 Woche“ konstant an, eine statistische Signifikanz hatte dieser Anstieg jedoch nicht. Dagegen konnte für IL-1ß ein mit p=0,042 signifikanter Konzentrationsanstieg zwischen der Transfusion 1 Woche alter Erythrozytenkonzentrate und der Transfusion 5 Wochen alter Erythrozytenkonzentrate festgestellt werden. Zu einem messbaren und mit p<0,001 statistisch signifikanten Anstieg der Konzentration von IL-8 kam es zwischen den MZP „3 Wochen“ und „5 Wochen“. Abbildung 4 illustriert die Zytokinkonzentrationen in Abhängigkeit vom EK-Alter. Zur besseren Übersicht ist die mittlere Fluoreszensintensität (MFI) dargestellt. 0), *UXSSH5KSRV$5KSRV NHLQH7UDQVIXVLRQ :RFKH :RFKHQ :RFKHQ (.$OWHU Abbildung 4: Darstellung der Zytokinkonzentrationen (MFI) im Blutplasma in Abhängigkeit vom Erythrozytenkonzentratalter 35 Ergebnisse 3.1.2 Erythrozytenkonzentrat 0 Rh pos / Vollblut B Rh pos Wurden Erythrozytenkonzentrate der Blutgruppe 0 Rh pos mit Vollblut der Blutgruppe B Rh pos inkubiert, hatte das Alter des transfundierten Erythrozytenkonzentrats keinen statistisch signifikanten Einfluss auf die Konzentrationen der bestimmten Zytokine im Blutplasma. Abbildung 5 demonstriert die Zytokinkonzentrationen in Abhängigkeit vom EK-Alter. Zur besseren Übersicht ist die MFI dargestellt. 0), *UXSSH5KSRV%5KSRV NHLQH7UDQVIXVLRQ :RFKH :RFKHQ :RFKHQ (.$OWHU Abbildung 5: Darstellung der Zytokinkonzentrationen (MFI) im Blutplasma in Abhängigkeit vom Erythrozytenkonzentratalter 3.1.3 Erythrozytenkonzentrat 0 Rh pos / Vollblut 0 Rh neg Bei der Transfusion von Erythrozytenkonzentraten der Blutgruppe 0 Rh pos und Empfängern der Blutgruppe 0 Rh neg hatte das Alter des Erythrozytenkonzentrats 36 Ergebnisse keinen signifikanten Einfluss auf die Zytokinkonzentrationen im Blutplasma. Auch der in Abbildung 6 deutlich scheinende Konzentrationsunterschied von IL-8 zwischen den MZP „keine Transfusion“ und „1 Woche“ bzw. „1 Woche“ und „3 Wochen“ war statistisch nicht signifikant. Abbildung 6 zeigt die Zytokinkonzentrationen in Abhängigkeit vom EK-Alter. Zur besseren Übersicht ist die MFI dargestellt. 0), *UXSSH5KSRV5KQHJ NHLQH7UDQVIXVLRQ :RFKH :RFKHQ :RFKHQ (.$OWHU Abbildung 6: Darstellung der Zytokinkonzentrationen (MFI) im Blutplasma in Abhängigkeit vom Erythrozytenkonzentratalter 3.2 Einfluss des Transfusionsvolumens auf die Zytokinfreisetzung Nachfolgend wird für jede untersuchte Kombination von Erythrozytenkonzentrat und Vollblut der Einfluss des Transfusionsvolumens auf die Zytokinfreisetzung im Vollblut ohne Berücksichtigung des EK-Alters dargestellt. 37 Ergebnisse 3.2.1 Erythrozytenkonzentrat 0 Rh pos / Vollblut A Rh pos Ein signifikanter Einfluss des Transfusionsvolumens auf die Zytokinfreisetzung konnte bei der Konstellation Erythrozytenkonzentrat der Blutgruppe 0 Rh pos und Vollblut der Blutgruppe A Rh pos nicht nachgewiesen werden. Zwischen einem Transfusionsvolumen von 25 % und der Massivtransfusion (Transfusionsvolumen 50%) zeigten sich keine statistisch signifikanten Konzentrationsveränderungen der untersuchten Zytokine im Blutplasma. In Abbildung 7 (Seite 39) werden die Zytokinkonzentrationen in Abhängigkeit vom Transfusionsvolumen veranschaulicht. Zur besseren Übersicht wird die MFI dargestellt. 3.2.2 Erythrozytenkonzentrat 0 Rh pos / Vollblut B Rh pos Bei der Transfusion von Erythrozytenkonzentraten der Blutgruppe 0 Rh pos und Empfängern der Blutgruppe B Rh pos zeigten sich zwischen einem Transfusionsvolumen von 25 % und der Massivtransfusion (Transfusionsvolumen 50%) keine statistisch signifikanten Konzentrationsunterschiede der untersuchten Zytokine. Abbildung 7 (Seite 39) zeigt die Zytokinkonzentrationen in Abhängigkeit vom Transfusionsvolumen. Zur besseren Übersicht wird die MFI dargestellt. 3.2.3 Erythrozytenkonzentrat 0 Rh pos / Vollblut 0 Rh neg In der Messreihe Erythrozytenkonzentrat der Blutgruppe 0 Rh pos / Empfänger der Blutgruppe 0 Rh neg konnten zwischen einem Transfusionsvolumen von 25 % und der Massivtransfusion (Transfusionsvolumen 50%) keine statistisch signifikanten Veränderungen der Zytokinkonzentrationen im Blutplasma festgestellt werden. Die nachfolgende Abbildung demonstriert die Zytokinkonzentrationen in Abhängigkeit vom Transfusionsvolumen. Zur besseren Übersicht wird die MFI dargestellt. 38 Ergebnisse *UXSSH 0 Rh pos/0 Rh neg 5KSRV$5KSRV 0 Rh pos/B Rh pos 12 IL10 IL12p70 IL10 TNF IL6 IL1b IL8 10 8 0), IL10 IL12p70 IL10 TNF IL6 IL1b IL8 6 4 2 0 NHLQH 7ransfusion 50% 7ransfusion NHLQH7UDQVIXVLRQ 50% 7ransfusion NHLQH7UDQVIXVLRQ 50% 7ransfusion 25% 7ransfusion 25% 7ransfusion 25% 7ransfusion 7UDQVIXVLRQVYROXPHQ Abbildung 7: Darstellung der Zytokinkonzentrationen (MFI) im Blutplasma in Abhängigkeit vom Transfusionsvolumen 3.3 Einfluss des Erythrozytenkonzentratalters und des Transfusionsvolumens auf die Zytokinfreisetzung In diesem Abschnitt werden die beiden Variablen EK-Alter und Transfusionsvolumen zusammen betrachtet und ihr Einfluss auf die Zytokinfreisetzung im Vollblut dargestellt. 39 Page 1 Ergebnisse 3.3.1 Erythrozytenkonzentrat 0 Rh pos / Vollblut A Rh pos Wie unter Punkt 3.1.1 bereits ausführlich dargestellt, konnte bei der Transfusion von Erythrozytenkonzentraten der Blutgruppe 0 Rh pos und Empfängerblut der Blutgruppe A Rh pos ein statistisch signifikanter Einfluss des Erythrozytenkonzentratalters auf die Zytokinfreisetzung nachgewiesen werden. Dieser war unabhängig vom Transfusionsvolumen. Sowohl ein Transfusionsvolumen von 25 % als auch die Massivtransfusion (Transfusionsvolumen 50 %) führten zu signifikanten Konzentrationsveränderungen. In Abbildung 8 (Seite 41) sind die Zytokinkonzentrationen in Abhängigkeit vom EKAlter und Transfusionsvolumen dargestellt. Zur besseren Übersicht wird die MFI gezeigt. 3.3.2 Erythrozytenkonzentrat 0 Rh pos / Vollblut B Rh pos Wurde Vollblut der Blutgruppe B Rh pos mit Erythrozytenkonzentraten der Blutgruppe 0 Rh pos inkubiert, kam es zu keinen signifikanten Konzentrationsveränderungen der untersuchten Zytokine. Sowohl das EK-Alter als auch das Transfusionsvolumen hatten keinen signifikanten Einfluss auf die Zytokinkonzentrationen im Blutplasma. Abbildung 8 (Seite 41) illustriert die Zytokinkonzentrationen in Abhängigkeit vom EKAlter und Transfusionsvolumen. Zur besseren Übersicht wird die MFI dargestellt. 3.3.3 Erythrozytenkonzentrat 0 Rh pos / Vollblut 0 Rh neg In der Messreihe Vollblut der Blutgruppe 0 Rh neg und Erythrozytenkonzentrat der Blutgruppe 0 Rh pos konnten keine statistisch signifikanten Veränderungen der Zytokinkonzentrationen registriert werden. Das EK-Alter und das Transfusionsvolumen hatten keinen statistisch signifikanten Einfluss auf die Konzentrationen der untersuchten Zytokine. 40 Ergebnisse In der folgenden Abbildung werden die Zytokinkonzentrationen in Abhängigkeit vom EK-Alter und Transfusionsvolumen dargestellt. Zur besseren Übersicht wird die MFI gezeigt. IL10 IL12p70 IL10 TNF IL6 IL1b IL8 0), 0), 0), 0), 0 Rh pos/0 0 Rh pos/A 0 Rh pos/B Rh neg Rh pos Rh pos NHLQH 7ransfusion 1 :RFKH 3 :RFKHQ (.$OWHU -5 0 5 1015 -5 0 5 1015 -5 0 5 1015 -5 0 5 1015 *ruppe IL10 IL12p70 IL10 TNF IL6 IL1b IL8 5 :RFKHQ 50% 7ransfusion 25% 7ransfusion NHLQH 7ransfusion 50% 7ransfusion 25% 7ransfusion NHLQH 7ransfusion 50% 7ransfusion 25% 7ransfusion NHLQH 7ransfusion 7ransfusiRQVYROXPHQ Abbildung 8: Darstellung der Zytokinkonzentrationen (MFI) im Blutplasma in Abhängigkeit vom Erythrozytenkonzentratalter und Transfusionsvolumen 41 Diskussion 4 Diskussion 4.1 Überblick Die Bluttransfusion ist in der heutigen klinischen Medizin eine häufig angewandte und etablierte Methode. Sie wird jedoch auch als Ursache vieler Komplikationen betrachtet63. Insbesondere im Bereich der Intensivmedizin ist die Transfusion von Erythrozytenkonzentraten Alltag. 95 Prozent aller kritisch kranken Patienten, die auf einer Intensivstation aufgenommen wurden, entwickeln nach dem 3. Behandlungstag eine Anämie. 40 Prozent dieser Patienten erhalten im Verlauf ihres Aufenthaltes auf der Intensivstation eine Bluttransfusion64,65. Gerade bei massiven Blutungen ist die Transfusion von Erythrozytenkonzentraten essentiell, um ein Überleben des Patienten zu ermöglichen66. Wu et al. konnten 2010 in einer retrospektiven Kohortenstudie bei 239.286 Patienten ab dem 65. Lebensjahr zeigen, dass Bluttransfusionen bei großen, nicht-herzchirurgischen Operationen mit einer geringeren postoperativen 30-Tages-Mortalität assoziiert sind, falls es zu größeren intraoperativen Blutverlusten kam oder ein geringer präoperativer Hämatokrit von weniger als 24 Prozent vorhanden war67. Auch für kardial kompromittierte Patienten konnte ein Benefit nach Transfusionen nachgewiesen werden. In einer retrospektiven Studie bei 39.922 Patienten konnten Sabatine et al. eine Anämie als Risikofaktor für eine erhöhte Mortalität bei Patienten mit einem STHebungsinfarkt und einem Nicht-ST-Hebungsinfarkt (NSTEMI) feststellen. Ebenso wurden mehr rezidivierende Ischämien und akute Myokardinfarkte bei NSTEMIPatienten mit einer vorhandenen Anämie beobachtet68. Für Patienten einer operativen Intensivstation, welche der Altersgruppe 66-80 Jahre zugehörten oder unter einer schweren Sepsis litten, konnte die Transfusion von Erythrozytenkonzentraten mit einem geringeren Risiko des Versterbens im Krankenhaus in Zusammenhang gebracht werden69. Die Verwendung von Bluttransfusionen wird jedoch auch sehr kritisch gesehen. Carson et al. verglichen in einer randomisierten Studie ein liberales (Transfusionstrigger Hb-Wert < 10 g/dl) mit einem restriktivem (Transfusionstrigger 42 Diskussion Hb-Wert < 8 g/dl) Transfusionsregime nach Hüftoperationen bei kardiovaskulären Risikopatienten. Es konnte hierbei keine Reduktion der Mortalität unter Anwendung eines liberalen Transfusionsregimes detektiert werden70. Hébert et al. stellten in der randomisierten, kontrollierten TRICC (Transfusion Requirements in Critical Care)Studie ebenfalls einem liberalem ein restriktives Transfusionsregime bei internistischen und chirurgischen Intensivpatienten gegenüber. Transfusionstrigger waren ein Hb-Wert von 10 g/dl im Vergleich zu 7 g/dl und der Ziel Hb-Wert lag bei 10-12 g/dl im Vergleich zu 7-9 g/dl. Das restriktive Regime zeigte keine Nachteile bezüglich der Mortalität. Bei weniger schwer erkrankten Patienten (APACHE [acute physiology and chronic health evalution] II-Score < 20) und Patienten unter 55 Jahren kam es zu einer signifikanten Reduktion der Mortalität unter dem restriktiven Transfusionsregime71. In der viel beachteten CRIT-Studie wurde der volumenabhängige Einfluss von Erythrozytenkonzentraten auf das Outcome von Intensivpatienten untersucht. 4.892 Patienten von 284 verschiedenen Intensivstationen in den USA wurden in die Untersuchung eingeschlossen. Durchschnittlich nach 2,3 Tagen und bei einem HbWert von 8,6 g/dl höhere Anzahl wurde die erste Bluttransfusion durchgeführt. Dabei war eine von Krankenhausaufenthalt transfundierten Konzentraten mit einem längeren und einem Anstieg der Mortalität verbunden. Außerdem wurden nach Transfusionen vermehrt Komplikationen wie Fieber, Hypotonie, Sepsis oder ARDS festgestellt72. Trotz der kompatibel durchgeführten Transfusionen kommt es bei der Verwendung von Erythrozytenkonzentraten also nicht selten zu einer Erhöhung der Anzahl an Komplikationen und einem Anstieg der Mortalität. Die möglichen Ursachen hierfür sind aktuell Gegenstand einer intensiven Diskussion und noch unzureichend verstanden. Als Einflussfaktoren werden unter anderem die Lagerungsdauer von Erythrozytenkonzentraten und die Übertragung von Leukozyten durch Transfusionen diskutiert, welche wiederum eine transfusionsassoziierte Immunmodulation zur Folge haben kann13,38. Wir stellten in dieser Arbeit die Hypothese auf, dass die Transfusion von allogenen Erythrozytenkonzentraten die Freisetzung von proinflammatorischen und anti43 Diskussion inflammatorischen Zytokinen beeinflussen könnte. Wir untersuchten, ob diese mögliche Zytokinfreisetzung abhängig vom Transfusionsvolumen, vom Alter des transfundierten Erythrozytenkonzentrats oder der Blutgruppe des Empfängers oder des Konzentrats ist. Janz et al. stellten in einer retrospektiven Studie von 2013 fest, dass eine längere Lagerungsdauer von leukozytendepletierten Erythrozytenkonzentraten mit einem signifikant höheren Risiko für die Entwicklung eines ARDS bei septischen Patienten verbunden ist. Patienten, die ein ARDS entwickelten, erhielten durchschnittlich 25 Tage alte Blutkonserven. Bei den Patienten, die kein ARDS entwickelten, betrug die durchschnittliche Lagerungsdauer lediglich 21 Tage. Bei nicht-septischen Patienten auf Intensivstationen konnte dieser Einfluss der Lagerungszeit nicht bestätigt werden73. Durch das Studiendesign konnten allerdings die möglichen Ursachen des Einflusses der Lagerungsdauer nicht näher untersucht werden. Demgegenüber konnte in einer doppel-blinden, randomisierten und prospektiven Arbeit von Kor et al. bei 100 Intensivpatienten kein Nachteil bei der Transfusion von älteren Erythrozytenkonzentraten nachgewiesen werden. Eine Patientengruppe (n=50) erhielt frische (Durchschnittsalter 4 Tage), die andere (n=50) länger gelagerte Konzentrate (Durchschnittsalter 26,5 Tage). Zwischen diesen beiden Gruppen gab es keine signifikanten Unterschiede hinsichtlich der Lungenfunktion oder der Inzidenz eines ARDS74. Diese deutlich differenten Ergebnisse könnten auch den verschiedenen PatientenKohorten geschuldet sein. So inkludierten Janz et al. 96 septische Patienten, Kor et al. jedoch nur 6, so dass man die Hypothese eines größeren Einflusses der Lagerungsdauer bei septischen Patienten als bei nicht-septischen Patienten auf einer Intensivstation aufstellen könnte. Zudem erstreckte sich der Beobachtungszeitraum der Patienten bei Janz et al. über 96 Stunden, bei Kor et al. nur über 48 Stunden. Bei 6002 herzchirurgischen Patienten untersuchten Koch et al. den Einfluss der Transfusion von länger als 2 Wochen gelagerten Erythrozytenkonzentraten auf das Patientenoutcome in einer retrospektiven Kohortenstudie. Es konnten eine signifikant 44 Diskussion höhere Mortalität und ein vermehrtes Aufkommen von Nierenversagen, Sepsis und einer prolongierten Intubationsdauer von länger als 72 Stunden im Vergleich zu Patienten, welche frischere Konserven erhielten, festgestellt werden75. Auch bei traumatologischen Patienten konnten ein schlechteres Outcome und eine erhöhte Mortalität nach der Transfusion älterer Blutkonserven beobachtet werden76,77. Hierbei war die Anzahl der transfundierten Konzentrate entscheidend. Erhielten die Patienten 1-2 Erythrozytenkonzentrate, gab es keine Unterschiede hinsichtlich der Mortalität, nach mehr als 3 Konzentraten stieg die Mortalität jedoch signifikant an77. All diesen Studien gemeinsam ist ihr homogenes Patientenkollektiv, welches herzchirurgische und traumatologische Patienten umfasst, deren Outcome scheinbar in besonderem Ausmaß durch das Alter der transfundierten Erythrozytenkonzentrate beeinflusst wird. In dieser Gruppe ist mit einem deutlich erhöhten Transfusionsbedarf im Vergleich zu anderen Patientenkollektiven zu rechnen. Ebenso ist die Inzidenz anderer Vorerkrankungen wie Niereninsuffizienz, Diabetes mellitus oder Bluthochdruck vor allen Dingen bei herzchirurgischen Patienten höher. Als mögliche Confounder könnten diese Faktoren in den oben genannten Studien das schlechtere Outcome und die erhöhte Mortalität mitbedingen. Zudem könnte eine hohe Anzahl transfundierter Erythrozytenkonzentrate mit schwerwiegenderen postoperativen Komplikationen oder schwerer vorerkrankten Patienten in Zusammenhang stehen, so dass nicht zwingend die Bluttransfusionen ursächlich für eine höhere Mortalität wären. In eine prospektive Studie von Pettilä et al. wurden 757 Patienten von 47 verschiedenen Intensivstationen in Australien und Neuseeland aufgenommen. Dieses Patientenkollektiv war sehr heterogen und umfasste unter anderem Patienten mit einer Pneumonie, Sepsis, gastrointestinalen Blutungen, gastrointestinalen Neubildungen sowie herzchirurgische und traumatologische Patienten. Auch in dieser Studie war die Mortalität der Patienten, die ältere Konserven erhielten, signifikant erhöht78. Demgegenüber konnte in einer weitaus größeren Studie von Aubron et al. aus dem Jahr 2014 ebenfalls bei einer heterogenen Patienten-Kohorte kein Anstieg der Mortalität oder der Liegedauer nach Transfusion länger gelagerter 45 Diskussion Erythrozytenkonzentrate festgestellt werden. Hierbei wurden retrospektiv 8416 Intensivpatienten untersucht79. Die Ergebnisse der aktuell in der Literatur zu findenden Arbeiten bezüglich des Einflusses des Erythrozytenkonzentratalters auf das Outcome der transfundierten Patienten unterscheiden sich also erheblich. Ursächlich hierfür könnten die unterschiedlichen Patientenkollektive, das ungleiche Alter der transfundierten Blutkonserven, ein anderer Transfusionstrigger und auch das Herstellungsverfahren der Konzentrate sein. Die Verwendung leukozytendepletierter Konzentrate wird in den Studien zum Beispiel sehr uneinheitlich durchgeführt80. Umso interessanter ist deshalb die Suche nach der Ursache des möglichen Einflusses der Bluttransfusionen auf das Patientenoutcome. Neben seit längerem diskutierten Erkenntnissen wie den morphologischen und biochemischen Veränderungen von Erythrozyten während der Lagerung, welche zu einer verringerten Lebensdauer und Sauerstoffaufnahme- bzw. Sauerstoffabgabefähigkeit der Erythrozyten führen können81, liegt hier aktuell ein besonderer Forschungsschwerpunkt im Bereich der transfusionsassoziierten Immunmodulation. Durch die Übertragung von gelösten oder zellständigen fremden Antigenen im Rahmen einer Transfusion können proinflammatorische oder immunsuppressive Effekte beim Empfänger initiiert werden. Als mögliche Einflussfaktoren der TRIM werden unter anderem durch Bluttransfusionen übertragene Leukozyten in Betracht gezogen, hier im Speziellen die Mononukleären Zellen wie zum Beispiel die APC13,14. Nach der Transfusion können übertragene APC wie Makrophagen, Monozyten oder Dendritische Zellen fremde Antigene über HLA-Klasse-II-Moleküle präsentieren, was zu einer immunologischen Antwort des Empfängers führt. Die T-Zell-Rezeptoren der CD4-positiven T-Lymphozyten interagieren mit der APC. Wird die naive T-Zelle zusätzlich durch ein co-stimulatorisches-Signal zur Proliferation angeregt, differenziert sie sich zur T-Gedächtniszelle oder T-Helferzelle und ist in der Lage, Zytokine zu synthetisieren. 46 Diskussion Werden mit der Transfusion jedoch avitale, nicht-funktionsfähige APC übertragen oder fehlen die co-stimulatorischen Signale, kommt es zu einer Down-Regulation der Immunantwort und die jetzt anergische T-Zelle ist nicht fähig Zytokine freizusetzen18,19. Eine Immunsuppression durch Erythrozytenkonzentrate wäre also durch die Anwesenheit avitaler APC begünstigt. Die Qualität der APC könnte durch die Dauer der Lagerung und die Art der Lagerung beeinflusst werden20. Ist die Übertragung von Leukozyten tatsächlich für die immunmodulatorische Wirkung von Erythrozytenkonzentraten verantwortlich, so müssten nach der Leukozytendepletion diese Effekte in geringerem Ausmaß nachzuweisen sein. Durch Zentrifugation oder Filtration kann hierbei eine Reduktion der Leukozytenanzahl um bis zu 99,995 Prozent im Konzentrat erreicht werden82. Bilgin et al. konnten in einer doppel-blinden, prospektiven Kohortenstudie bei herzchirurgischen Patienten nachweisen, dass die Mortalität nach der Transfusion von depletierten Konzentraten im Vergleich zur Transfusion von nicht-leukozytendepletierten Konzentraten nahezu halbiert werden konnte. Die postoperative Infektionsrate war signifikant geringer, wenn die Patienten leukozytendepletierte Konserven erhielten83. In einigen weiteren klinischen Studien wurde die geringere Infektionsrate nach Leukozytendepletion bestätigt31,34,84,85. Romano et al. untersuchten in einer retrospektiven Arbeit den Einfluss der Leukozytendepletion ebenfalls bei herzchirurgischen Patienten. Sie stellten eine signifikante Reduktion der Mortalitätsrate und der Häufigkeit eines akuten Nierenversagens bei der Verwendung leukozytendepletierter Erythrozytenkonzentrate fest86. Fung et al. konnten postulieren, dass es nach der Wiedereinführung von nicht-leukozytendepletierten Konzentraten bei herzchirurgischen Patienten zu einem signifikanten Anstieg der postoperativen Krankenhaus-Verweildauer kam87. Die klinischen Endpunkte Infektionen, Multiorganversagen, Fieber, KrankenhausVerweildauer und Mortalität wurden von Nathens et al. in einer doppel-blinden, prospektiven Arbeit in Abhängigkeit von der Transfusion leukozytendepletierter oder nicht-leukozytendepletierter Erythrozytenkonzentrate innerhalb von 24 Stunden nach Verletzungen bei 238 Patienten analysiert. Bei keinem dieser Endpunkte zeigte sich 47 Diskussion ein statistisch signifikanter Vorteil der depletierten Konzentrate88. In einer retrospektiven Studie im traumatologischen Setting bei 495 Patienten beschrieben Englehart et al. den Einfluss der Leukozytendepletion auf die Endpunkte Krankenhaus-Verweildauer, Verweildauer auf Intensivstationen, Infektionsrate, Beatmungsdauer, Inzidenz eines ARDS und Mortalität. Auch hier konnte kein signifikanter Unterschied bei der Transfusion leukozytendepletierter Produkte festgestellt werden89. Eine weitere Untersuchung bei traumatologischen Patienten konnte keinen positiven Einfluss depletierter Erythrozytenkonzentrate auf die Mortalität ermitteln90. Womöglich hängen diese abweichenden Studienergebnisse mit einem unterschiedlichen Studiendesign oder den unterschiedlichen Patientenkollektiven zusammen. 20 Studien, welche unter anderem den Einfluss leukozytendepletierter Konzentrate auf die postoperative Infektionsrate beschrieben, wurden von Blumberg et al. auf ihre wissenschaftlichen und statistischen Methoden untersucht. Bei der großen Mehrheit von ihnen wurde das Intention-to-treat-Prinzip angewandt, welches jeden Patienten, egal ob transfundiert oder nicht, in die Studienergebnisse einschloss. Nach diesem Verfahren wurde in vielen Studien kein Vorteil der depletierten Erythrozytenkonzentrate gesehen. Wurden jedoch nur die Patienten eingeschlossen, die auch wirklich Erythrozytenkonzentrate erhielten, konnte eine deutlich signifikante Reduktion der Infektionsrate bei der Verwendung der leukozytendepletierten Konzentrate aufgezeigt werden91. Eine mögliche Downregulation des spezifischen Immunsystems durch Erythrozytenkonzentrate trotz Leukozytendepletion wurde in einer Publikation von Bernard et al. beschrieben. Es wurden leukozytendepletierte Erythrozytenkonzentrate mit humanen T-Zellen inkubiert, welche zuvor durch Mitogene zur Proliferation angeregt wurden. Hier stellte sich eine signifikante Suppression der T-Zell-Proliferation nach Inkubation mit depletierten Konzentraten dar, wobei der Effekt volumenabhängig war92. Mit einer Transfusion übertragene lösliche HLA werden ebenfalls als möglicher Mechanismus der TRIM diskutiert. So stieg die Aktivität zytotoxischer T-Zellen an, wenn sich Spender und Empfänger in zwei HLA-DR Merkmalen unterschieden. War 48 Diskussion jedoch nur ein HLA-DR Merkmal unterschiedlich, konnte kein Aktivitätsanstieg erkannt werden93. Die Transfusion von Erythrozytenkonzentraten mit sehr unterschiedlichen HLA-DR-Eigenschaften führte zu einer Immunisierung, während die Transfusion von Konzentraten mit ähnlichen HLA-DR-Eigenschaften eher zu Toleranz und immunsuppressiven Effekten führte12. Die Beeinflussung des Immunsystems durch lösliche HLA-Moleküle ist Gegenstand vieler Studien. In einigen Arbeiten konnte gezeigt werden, dass nach der Bindung von löslichen HLA-I-Molekülen an die Rezeptoren von CD8-positiven T- Lymphozyten, natürlichen Killerzellen oder neutrophilen Granulozyten vermehrt FasRezeptoren exprimiert und Fas-Ligand und Transforming-Growth-Factor-β ausgeschüttet wurden. In der Folge kam es zur Induktion der Apoptose und Beeinträchtigung der Chemotaxis und Zytotoxizität94–96. In Erythrozytenkonzentraten, welche nach der Lagerung leukozytendepletiert wurden, konnten deutlich größere Mengen löslicher HLA gemessen werden, als in Konserven, die bereits vor der Lagerung leukozytendepletiert wurden97. Dies könnte mit einer lagerungsbedingten Membranschädigung der Erythrozyten zusammen hängen und einige differente Studienergebnisse bezüglich des Outcomes nach Transfusionen erklären. Nichtsdestotrotz kamen die Autoren der jeweiligen Studien auch bei ähnlichem Studiendesign und Verwendung von ähnlich prozessierten leukozytendepletierten Konzentraten zu unterschiedlichen Ergebnissen. Ein möglicher Ansatzpunkt könnte das Vorhandensein von löslichen CD8-Molekülen beim Empfänger sein. Diese werden von aktivierten CD8-positiven T-Lymphozyten ausgeschüttet und sind in der Lage, lösliche HLA-I-Moleküle zu binden und gegebenenfalls zu inaktivieren und die Effekte der TRIM zu modulieren98,99. Wären nun bei den untersuchten Patienten unterschiedlich hohe Titer von löslichen CD8Molekülen vorhanden, könnte dies eine potentielle Erklärung für das zum Teil schlechtere und zum Teil unbeeinflusste Outcome nach Transfusionen sein. Ghio et al. konnten in einer Studie aus dem Jahr 2014 feststellen, dass nach der Transfusion von nach der Lagerung depletierten Erythrozytenkonzentraten signifikant höhere Konzentrationen an löslichen CD8-Molekülen vorhanden waren, als nach der Transfusion von vor der Lagerung depletierten Konzentraten97. 49 Diskussion Womöglich sind jedoch auch von Leukozyten freigesetzte lösliche Mediatoren als Auslöser der TRIM anzusehen. Weiskopf und Kollegen stellten fest, dass in nichtleukozytendepletierten Erythrozytenkonzentraten signifikant höhere Konzentrationen von proinflammatorischen Zytokinen wie IL-1ß, IL-2, IL-4, IL-6, IL-8 und TNFα vorhanden waren, als in leukozytendepletierten Konzentraten100. Die Konzentration proinflammatorischer Zytokine stieg zudem während der Lagerung an39,40. In weiteren Studien konnte eine signifikante Reduktion von IL-1ß, IL-6, IL-8 und TNFα bei leukozytendepletierten Produkten bestätigt werden40,101. Außerdem war während der Lagerung der depletierten Produkte kein Konzentrationsanstieg der Zytokine festzustellen40,102. Somit wäre durch den heutzutage flächendeckenden Einsatz der Leukozytendepletion ein weiterer wichtiger Risikofaktor für ein verschlechtertes Outcome nach Transfusionen reduziert. Da es in der aktuellen Literatur trotz der mittlerweile verwendeten depletierten Konzentrate eine Vielzahl von Arbeiten gibt, die eine erhöhte beschreiben103–105, Mortalität sind bzw. andere Komplikationsrate Erklärungsansätze nach notwendig. Transfusionen So ist es beispielsweise denkbar, dass durch Erythrozytenkonzentrate nicht nur Zytokine übertragen werden, sondern auch die Freisetzung von Zytokinen beim Transfundierten stimuliert wird. 4.2 Wissenschaftliche Einordnung der Ergebnisse In der vorliegenden Studie untersuchten wir deshalb den Einfluss von Erythrozytenkonzentraten auf die Zytokinfreisetzung im menschlichen Vollblut in vitro. Es konnte eine signifikant höhere Konzentration der detektierten Zytokine im Vollblut nach der Inkubation mit Erythrozytenkonzentraten nachgewiesen werden. Dieser Einfluss war abhängig von der Lagerungsdauer der Erythrozytenkonzentrate und der untersuchten Blutgruppenkonstellation. Diese Erkenntnis könnte einen wichtigen Ansatzpunkt für das Verstehen der TRIM darstellen. Das Transfusionsvolumen hatte in unserer Arbeit keinen signifikanten Einfluss auf die Liberation von Zytokinen im Vollblut. 50 Diskussion Wie im Kapitel 3.1.1 beschrieben, kam es nach der Inkubation von Erythrozytenkonzentraten der Blutgruppe 0 Rh pos mit Vollblut der Blutgruppe A Rh pos zu einem signifikanten Konzentrationsanstieg der untersuchten Zytokine bei der Verwendung älterer Konzentrate. Die proinflammatorischen Zytokine IL-1ß, IL-8, IL12p70 und TNF-α waren jeweils nach der Transfusion von 5 Wochen alten Erythrozytenkonzentraten in der höchsten Konzentration beim Empfänger nachzuweisen. Die Konzentration des ebenfalls proinflammatorischen Zytokins IL-6 stieg ebenso in Abhängigkeit des Konservenalters an, dieser Anstieg war jedoch nicht signifikant. Die Konzentration des anti-inflammatorischen Zytokins IL-10 stieg nach der Inkubation von Vollblut mit älteren Erythrozytenkonzentraten signifikant an. In unserer Arbeit haben wir den Einfluss von Erythrozytenkonzentraten auf die Zytokinfreisetzung in verschiedenen Blutgruppenkonstellationen untersucht. Hier zeigten sich widersprüchliche Ergebnisse. So konnten wir nur in der Kombination Konzentrat der Blutgruppe 0 Rh pos und Vollblut der Blutgruppe A Rh pos signifikante Konzentrationsveränderungen der bestimmten Zytokine feststellen. In allen anderen Kombinationen zeigten sich keine signifikanten Konzentrationsunterschiede (siehe Kapitel 3.1.2 und 3.1.3). Denkbar ist, dass in der vorliegenden Studie eine zu geringe Anzahl von Erythrozytenkonzentraten untersucht wurde, um entsprechende Veränderungen der Zytokinfreisetzung zu detektieren. Auch die Anzahl der Probanden könnte nicht ausreichend gewesen sein. Hier sind zukünftige Studien mit größeren Kohorten wichtig, um etwaige Einflüsse der Blutgruppensysteme feststellen zu können. Auch andere Faktoren konnten wir in diesem in-vitro-Setting nicht berücksichtigen. Beispielsweise entwickeln Patienten im Rahmen einer Bypass-Operation regelhaft ein systemic inflammatory response syndrom (SIRS), welches zu einer exzessiven Liberation proinflammatorischer Zytokine führt. Synergistische Effekte der TRIM und des SIRS könnten für das schlechtere Outcome nach Transfusionen bei herzchirurgischen Patienten bedeutend sein106,107. Baumgartner und Kollegen konnten in einem in-vitro-Setting nach der Inkubation von durch Lipopolysaccharide stimulierten Mononukleären Zellen mit dem Plasma von Erythrozytenkonzentraten ähnliche Beobachtungen wie wir machen. Im Unterschied 51 Diskussion zu unserer Untersuchung stellten sie keine Konzentrationsunterschiede bei IL-8 nach Inkubation mit Erythrozytenkonzentraten fest. Jedoch stieg auch hier die Konzentration von IL-1ß, IL-6 und TNF-α signifikant an, wobei die höchsten Konzentrationen gleichfalls nach der Verwendung älterer Erythrozytenkonzentrate zu messen waren46. Ein Nachweis dieses Anstiegs der proinflammatorischen Zytokine nach Transfusionen auch im klinischen Setting könnte das schlechtere Outcome nach dem Erhalt von Erythrozytenkonzentraten womöglich erklären. Eine hohe Konzentration des anti-inflammatorischen Zytokins IL-10 war bei FieberPatienten und herzchirurgischen Patienten mit einem deutlich erhöhten MortalitätsRisiko verbunden108,109. Der bei uns beschriebene Konzentrationsanstieg von IL-10 nach der Transfusion älterer Erythrozytenkonzentrate bestätigte sich bei Baumgartner und Kollegen nicht, sie stellten nur proinflammatorische Effekte fest. Einen Grund für die abweichenden Ergebnisse könnte der unterschiedliche Versuchsaufbau darstellen. Im Gegensatz zu unserer Studie, in der Vollblut mit Erythrozytenkonzentraten inkubiert wurde, wurden bei Baumgartner et al. Mononukleäre Zellen aus Probandenblut gewonnen, mit dem Plasma von Erythrozytenkonzentraten inkubiert und anschließend durch Lipopolysaccharide stimuliert46. Zusätzlich wurde in der Studie von Baumgartner et al. der Einfluss der Leukozytendepletion beobachtet, mit dem Ergebnis einer signifikant geringeren Ausschüttung von IL-1ß durch Mononukleäre Zellen nach der Inkubation mit depletierten Konzentraten im Vergleich zu nicht-depletierten Konzentraten. Auf die Konzentrationen von IL-6, IL-8 und TNF-α hatte die Leukozytendepletion keine Auswirkung46. In einer Arbeit von Karam et al. wurde wie in unserer Studie Vollblut von gesunden Probanden verwendet. leukozytendepletierten Dieses inkubierten sie Erythrozytenkonzentraten mit dem Plasma unterschiedlich von langer Lagerungsdauer und bestimmten anschließend die Konzentrationen von IL-6, IL-10 und TNF-α. Es zeigten sich insgesamt sehr differente Ergebnisse. So war ein signifikanter Konzentrationsanstieg von IL-6 nach der Inkubation mit bis zu 15 Tage alten Erythrozytenkonzentraten zu beobachten, der bei der Verwendung noch älterer 52 Diskussion Konserven (EK-Alter bis zu 42 Tage) jedoch nicht mehr nachzuweisen war. Die höchste Konzentration von IL-10 war nach der Inkubation mit 42 Tage alten Konzentraten zu detektieren. Für TNF-α konnte ein Konzentrationsabfall nach der Inkubation mit 24 und 42 Tage alten Konserven nachgewiesen werden110. In den Studien von Baumgartner et al. und Karam et al. gibt es keine Hinweise auf die Blutgruppe der verwendeten Erythrozytenkonzentrate oder auf die Blutgruppe des Probandenbluts. Es könnte jedoch von großer Bedeutung sein, Effekte vor allem der klinisch bedeutendsten Blutgruppensysteme AB0 und Rhesus auf die Zytokinfreisetzung im Empfängerblut zu beobachten. Wurde ungleich, jedoch kompatibel in Bezug auf diese Blutgruppensysteme transfundiert, konnte zum Beispiel eine Abnahme des Respiratory Burst von neutrophilen Granulozyten beobachtet werden111. Möglicherweise lassen sich die unterschiedlichen Versuchsergebnisse mit der fehlenden Berücksichtigung dieses Parameters erklären. Im Jahr 2010 untersuchten Bilgin et al. 346 herzchirurgische Patienten im Rahmen einer Herzklappen-Operation (mit und ohne Anlegen eines Bypass) auf die Zytokinfreisetzung depletierten nach Transfusion Erythrozytenkonzentraten. von leukozytendepletierten Erhielten die Patienten und bis nichtzu 3 Blutkonserven, konnte kein Konzentrationsunterschied von IL-6, IL-10 oder IL-12 zwischen den beiden Studien-Gruppen gemessen werden. Nach der Transfusion von 4 oder mehr Konzentraten war jedoch eine signifikant höhere Konzentration von IL-6 in der Gruppe, welche nicht-depletierte Erythrozytenkonzentrate erhielt, zu beobachten109. Dies stützt die These, dass residuale Leukozyten in Konzentraten zu einer vermehrten Zytokinausschüttung beim Empfänger führen. Gruppenunabhängig konnten Bilgin et al. erhöhte Konzentrationen von IL-6, IL-10 und IL-12 mit einem höheren Risiko für postoperative Komplikationen, Multiorganversagen und einer höheren Mortalität assoziieren109. Den volumenabhängigen Effekt der Bluttransfusion auf die Inflammationsreaktion konnten wir in unserer Studie nicht nachweisen. Wie in Kapitel 3.2 und 3.3 bereits ausführlich aufgezeigt, zeigten sich zwischen einem Transfusionsvolumen von 25 Prozent und 50 Prozent in keiner der untersuchten Konstellationen beim Empfänger signifikante Konzentrationsunterschiede der gemessenen Zytokine. In der Gruppe 53 Diskussion Konzentrat 0 Rh pos und Vollblut A Rh pos führte sowohl ein Transfusionsvolumen von 25 Prozent als auch von 50 Prozent zu einem signifikanten Konzentrationsanstieg der Zytokine. Womöglich ist hier das grundsätzlich unterschiedliche Studiendesign eine Ursache der abweichenden Ergebnisse. Während wir Vollblut von gesunden Probanden in vitro in einem nicht-inflammatorischen Setting untersuchten, analysierten Bilgin et al. in ihrer Studie Patienten im prä-, intra- und postoperativen Verlauf unter anderem auf einer Intensivstation. Wie oben erwähnt, könnten auch synergistische Effekte der TRIM und eines entwickelten SIRS eine Rolle bei der Liberation der Zytokine beim Empfänger spielen, welche in unserer Arbeit nicht simuliert werden konnten. Zudem bleibt neben dem Alter der transfundierten Konzentrate ein möglicher Einfluss der Blutgruppe des Erythrozytenkonzentrats und des Empfängers in der Arbeit von Bilgin und Kollegen unberücksichtigt. Vor allem aber wurde bei Bilgin et al. der Einfluss des Transfusionsvolumens für nicht-leukozytendepletierte Konzentrate beschrieben. In der aktuellen Literatur lassen sich in diesem Zusammenhang nur sehr wenige Studien zu leukozytendepletierten Erythrozytenkonzentraten finden. Drosos et al. untersuchten 2012 in einer prospektiven Kohortenstudie bei 248 Patienten den Einfluss von intraoperativ transfundierten allogenen Erythrozytenkonzentraten auf die Zytokinfreisetzung nach Implantation einer Knie-Totalendoprothese im Vergleich zu nicht-transfundierten Patienten und Patienten, welche durch maschinelle Autotransfusion aufbereitetes Blut erhielten. Die Konzentrationen von IL-1ß, IL-6, IL8, IL-10 und TNF-α waren nach der Transfusion von allogenen Erythrozytenkonzentraten signifikant höher, als bei Patienten, die keine Transfusion erhielten. Zudem war die Rate an postoperativen Komplikationen im Vergleich zu nicht-transfundierten Patienten und Patienten, die aufbereitetes Blut erhielten, erhöht. Jedoch finden sich in der Arbeit von Drosos und Kollegen keine Angaben darüber, ob leukozytendepletierte oder nicht-leukozytendepletierte Konzentrate verwendet wurden. Auch zum Alter oder der Blutgruppe der Konzentrate werden keine Angaben gemacht112. 2013 wurde durch Keir und Kollegen eine klinische Studie veröffentlicht, die den Einfluss von leukozytendepletierten Erythrozytenkonzentraten auf die 54 Diskussion Zytokinfreisetzung bei Frühgeborenen im Rahmen des Aufenthalts auf einer neonatalen Intensivstation analysiert. Auch hier kam es zu einer vermehrten Freisetzung von proinflammatorischen Zytokinen nach einer Transfusion. So waren die Konzentrationen von IL-1ß, IL-8 und TNF-α signifikant erhöht102. Allerdings blieben ebenso in dieser Arbeit das Alter der Konzentrate, deren Blutgruppe und die Blutgruppe der Empfänger unberücksichtigt. Zudem ist fraglich, inwieweit die Ergebnisse auf erwachsene Patienten übertragen werden können. Zur Zeit werden in der großen Mehrheit der Fälle leukozytendepletierte Erythrozytenkonzentrate transfundiert. Für die Zukunft wären deshalb klinische Studien, welche den Einfluss des Transfusionsvolumens der depletierten Konzentrate auf die Zytokinliberation beim Empfänger in großen Kohorten in Abhängigkeit des Konzentratalters und der Blutgruppenkonstellation untersuchen, von besonderem Interesse. Die ursächlichen Mechanismen der TRIM können trotz der intensiven Forschung auf diesem Gebiet letztlich nicht sicher benannt werden. Die Bedeutung von in Erythrozytenkonzentraten befindlichen löslichen HLA wurde in diesem Zusammenhang oben bereits ausführlich diskutiert. Desweiteren lässt sich die Hypothese aufstellen, dass eher in den Konzentraten vorhandene residuale Leukozyten als von Leukozyten während der Lagerung freigesetzte und akkumulierte Mediatoren verantwortlich für die TRIM sind, da sowohl direkt nach der Blutentnahme als auch erst nach der Lagerung leukozytendepletierte Erythrozytenkonzentrate die postoperative Komplikationsrate Zytokinkonzentration in senken107. depletierten Die Beobachtung, Erythrozytenkonzentraten Lagerung nicht ansteigt, stützt diese These 40,102 dass die während der . Überdies konnte demonstriert werden, dass es nach der Transfusion von leukozytendepletierten Konzentraten - unabhängig von der Lagerungsdauer - zu einer gesteigerten Induktion CD4-positiver regulatorischer T-Zellen kam22. Diese haben eine immunsuppressive Wirkung und hemmen die Immunantwort von CD4positiven T-Helferzellen und CD8-positiven zytotoxischen T-Zellen113,114. Neben positiven Effekten beispielsweise auf die Toleranz nach Transplantationen, werden 55 Diskussion erhöhte Konzentrationen von regulatorischen T-Zellen mit der Entstehung von septischen Krankheitsbildern in Verbindung gebracht115–117. Für einen Einfluss der Lagerungsdauer auf die TRIM spricht neben den oben bereits erwähnten Erkenntnissen der Nachweis einer erhöhten Konzentration von Lysophosphatidylcholinen (Lyso-PC) in gelagerten Erythrozytenkonzentraten118. Diese Phospholipide aktivieren Natürliche Killer T-Zellen, fördern den Reifungsprozess von Dendritischen Zellen und wirken stimulierend im Rahmen der Chemotaxis Zytokinen bei 119–122 NK-Zellen und der Liberation von proinflammatorischen . Zusammenfassend betrachtet könnten während der Lagerung von Erythrozytenkonzentraten entstehende Lyso-PC dementsprechend einen entscheidenden Einfluss auf das Outcome transfundierter Patienten haben. Vergleicht man europäische mit nordamerikanischen Studien bezüglich der Rolle der Lagerungszeit, fallen zum Teil sehr differente Ergebnisse auf, so dass auch das regional unterschiedliche Herstellungsverfahren der Erythrozytenkonzentrate von Bedeutung sein könnte123. Radwanski et al. konnten 2013 zeigen, dass eine spätere Prozessierung des bei der Blutspende gewonnen Vollbluts zu einer erhöhten Anzahl residualer Leukozyten im Erythrozytenkonzentrat führt. Ebenso war die Leukozytenkonzentration bei durch Apharese gewonnenen Konzentraten geringer124. Die Konzentration proinflammatorischer Zytokine war bei Erythrozytenkonzentraten, welche direkt nach der Blutentnahme prozessiert wurden, signifikant geringer im Vergleich zu nach einer nächtlichen Lagerung prozessierten125. 4.3 Ausblick Neben den zahlreichen Studien, die sich auf die immunmodulatorischen Effekte der Erythrozytenkonzentrate beziehungsweise auf die Ursachen der TRIM fokussieren, finden sich in der aktuellen Literatur auch Arbeiten zu einer möglichen pharmakologischen Beeinflussung des TRIM-Effekts. Bilgin et al. konnten demonstrieren, dass die perioperative Applikation von Corticosteroiden bei transfundierten herzchirurgischen Patienten zu einer signifikanten Reduktion der Konzentration des proinflammatorischen Zytokins IL-6 56 Diskussion führte. Die Konzentration des anti-inflammatorischen Zytokins IL-10 stieg unter der Kortison-Therapie an109. In einer klinischen Studie aus dem Jahr 2014 untersuchten Shu und Kollegen den Einfluss des Protease-Inhibitors Ulinastatin auf die perioperative Konzentration von IL-6, IL-8 und TNF-α sowie auf die postoperative Komplikationsrate und den SIRSScore bei transfundierten Patienten im Rahmen einer Leberresektion. Wurde vor der Transfusion Ulinastatin appliziert, kam es zu einer signifikanten postoperativen Konzentrationsreduktion von IL-6, IL-8 und TNF-α sowie einer signifikant geringeren SIRS-Rate. Auch die Krankenhaus-Verweildauer war kürzer, jedoch war dieser Unterschied nicht signifikant126. Ulinastatin kann als Protease-Inhibitor die Prozessierung von Pro-IL-1β zu bioaktivem IL-1β inhibieren. Für die Transkription von IL-6, IL-8 und TNF-α scheint jedoch bioaktives IL-1β Voraussetzung zu sein127–129. Somit könnte, wie in der Arbeit von Shu et al. proinflammatorischen gezeigt Zytokine wurde, hemmen Ulinastatin und das die Freisetzung Patientenoutcome dieser nach Transfusionen entscheidend verbessern. 4.4 Schlussfolgerungen Die Transfusion von allogenen Erythrozytenkonzentraten ist in vielen klinischen Situationen essentiell, lebensrettend und ohne Alternative. Jedoch zeigen Studien seit einigen Jahren, dass unter der Anwendung von restriktiven Transfusionsregimen eine Reduktion von Komplikationen wie der Infektionsrate, Nierenversagen, ARDS oder Sepsis und der Mortalität erreicht werden kann. Somit sollte dieses Vorgehen, auch vor dem Hintergrund der Knappheit von Blutprodukten, heute klinischer Standard sein. Die Effekte der TRIM wurden vor allen Dingen bei herzchirurgischen Patienten in großer Anzahl untersucht. Bei diesen Patienten kam es in einer Vielzahl von Arbeiten zu einer signifikanten Reduktion von postoperativen Komplikationen und der Mortalität bei der Verwendung von leukozytendepletierten Erythrozytenkonzentraten, 57 Diskussion so dass deren Verwendung für diese Patientengruppe empfohlen werden sollte. Für andere Patientenkollektive ist die Datenlage weniger eindeutig, jedoch gibt es in aktuellen experimentellen und klinischen Studien Hinweise, dass auch diese Patienten von leukozytendepletierten Konzentraten profitieren könnten. Bezüglich des Einflusses des Alters der transfundierten Erythrozytenkonzentrate auf das Patientenoutcome sind die Studienergebnisse uneinheitlich. In den letzten Jahren gab es in einigen Studien erste Hinweise, dass es nach der Verwendung von älteren Konzentraten zu Steigerungen der postoperativen Komplikationen und der Mortalität kam. Hier waren wieder insbesondere herzchirurgische Patienten, aber auch septische Patienten und Patienten anderer Kollektive betroffen. Vor einer generellen Empfehlung zur Zurückhaltung bei der Transfusion älterer Erythrozytenkonzentrate sind jedoch härtere Daten notwendig und es besteht noch weiterer Forschungsbedarf. In unserer und auch in anderen experimentellen Arbeiten konnte eine erhöhte Freisetzung proinflammatorischer Zytokine nach der Transfusion älterer Erythrozytenkonzentrate nachgewiesen werden. Um einen möglichen Einfluss dieser Zytokinfreisetzung auf das Patientenoutcome festzustellen, sind für die Zukunft klinische Studien in großen, heterogenen Patientenkollektiven wünschenswert. Ein eindeutiger Beleg für ein besseres Outcome nach der Transfusion frischer Erythrozytenkonzentrate könnte bei der häufigen klinischen Anwendung von Bluttransfusionen vielen Patienten hilfreich sein. 58 Zusammenfassung 5 Zusammenfassung Die Transfusion allogener Erythrozytenkonzentrate ist in der heutigen Medizin ein essentielles, jedoch auch komplikationsreiches Verfahren. In einigen Studien wurden die immunmodulatorischen Effekte von Bluttransfusionen und deren Bedeutung für das Patientenoutcome beschrieben. Proinflammatorischen und anti- inflammatorischen Zytokinen kommt bei der TRIM eine besondere Bedeutung zu. In der vorliegenden Arbeit untersuchten wir den Einfluss allogener Erythrozytenkonzentrate auf die Zytokinfreisetzung im menschlichen Vollblut in vitro. Zur durchflusszytometrischen Konzentrationsbestimmung sechs differenter Zytokine verwendeten wir einen Cytometric Bead Array. Die Transfusion wurde in unterschiedlichen klinisch relevanten Blutgruppenkombinationen mit verschiedenen Transfusionsvolumina in vitro simuliert, zudem wurde der Einfluss der Lagerungsdauer der Erythrozytenkonzentrate auf die Zytokinliberation beobachtet. Das Transfusionsvolumen hatte in dieser Studie in keiner der untersuchten Blutgruppenkombinationen einen signifikanten Einfluss auf die Zytokinfreisetzung. Bezüglich der Lagerungsdauer der Erythrozytenkonzentrate zeigten sich divergente Ergebnisse. Wir konnten einen signifikanten Anstieg der Zytokinkonzentrationen nach der Transfusion älterer Erythrozytenkonzentrate beobachten. Dieser Einfluss beschränkte sich jedoch nur auf eine Blutgruppenkombination, in den anderen Untersuchungsgruppen hatte die Lagerungsdauer der Konzentrate keinen signifikanten Einfluss auf die Zytokinfreisetzung. Zur Beurteilung des Einflusses der Blutgruppensysteme auf die TRIM besteht weiterer Forschungsbedarf, da die Fallzahl in unserer Arbeit nicht ausreichend groß gewesen sein könnte. Auch für die Beantwortung der Frage des Einflusses des Erythrozytenkonzentratalters und des Transfusionsvolumens auf die Zytokinfreisetzung sind weitere Untersuchungen in größeren Kohorten notwendig. Wünschenswert wären zukünftige klinische Studien, die den Einfluss dieser Parameter auf das Outcome der Patienten in heterogenen Gruppen analysieren. Diesbezügliche Erkenntnisse könnten durch die häufige Anwendung von Bluttransfusionen im klinischen Alltag das Outcome der Patienten positiv beeinflussen. 59 Literaturverzeichnis 6 1. Literaturverzeichnis Giangrande, P. L. The history of blood transfusion. British journal of haematology 110, 758–67 (2000). 2. Benedum, J. [History of the development of blood transfusion]. 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Dr. med. Björn Jüttner ohne sonstige Hilfe durchgeführt und bei der Abfassung der Dissertation keine anderen als die dort aufgeführten Hilfsmittel benutzt habe. Die Gelegenheit zum vorliegenden Promotionsverfahren ist mir nicht kommerziell vermittelt worden. Insbesondere habe ich keine Organisation eingeschaltet, die gegen Entgelt Betreuerinnen und Betreuer für die Anfertigung von Dissertationen sucht oder die mir obliegenden Pflichten hinsichtlich der Prüfungsleistungen für mich ganz oder teilweise erledigt. Ich habe diese Dissertation bisher an keiner in- oder ausländischen Hochschule zur Promotion eingereicht. Weiterhin versichere ich, dass ich den beantragten Titel bisher noch nicht erworben habe. Hannover, 18.08.2014 Matthias Schaland 75 Danksagung 9 Danksagung Ganz herzlich bedanken möchte ich mich bei Herrn PD Dr. med. Björn Jüttner für die Überlassung des Promotionsthemas, die große Unterstützung während der experimentellen Untersuchungen, die Hilfestellungen bei der statistischen Auswertung der Ergebnisse und allgemein für die äußerst freundliche und unkomplizierte Betreuung. Auch Herrn Prof. Dr. med. Dirk Scheinichen gilt mein großer Dank, der mir nicht minder behilflich bei der Umsetzung dieser Dissertation war. Ein großes Dankeschön an Frau Birgitt Haarmeijer und Frau Christiane Ritter für die freundliche und kompetente Einführung in die labortechnische Arbeit und Unterstützung während des Versuchsablaufs. Frau Dr. med. Lilia Goudeva und allen weiteren MitarbeiterInnen des Instituts für Transfusionsmedizin der Medizinischen Hochschule Hannover sowie allen Blutspendern möchte ich sehr herzlich danken. Durch ihre Hilfe war die Durchführung der Versuche überhaupt erst möglich. Dr. med. Torsten Voigtländer, Till Raguse und Dr. med. dent. Steffen Vial möchte ich besonderen Dank für die Durchsicht dieser Arbeit aussprechen. Nicht zuletzt möchte ich meiner Frau Kathrin Danke sagen, ohne deren unermüdliche und liebevolle Motivation diese Dissertation nicht fertiggestellt worden wäre. 76
