Histologische und immunhistochemische Charakterisierung einer
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Aus der Abteilung Infektionspathologie des Deutschen Primatenzentrums Göttingen ___________________________________________________________________ Histologische und immunhistochemische Charakterisierung einer experimentellen persistierenden Helicobacter pylori-Infektion bei Rhesusaffen (Macaca mulatta) INAUGURAL–DISSERTATION Zur Erlangung des Grades eines DOKTORS DER VETERINÄRMEDIZIN (Dr. med. vet.) durch die Tierärztliche Hochschule Hannover Vorgelegt von Frank Runge aus Liebenau Hannover 2004 Wissenschaftliche Betreuung: Univ. Prof. Dr. F.-J. Kaup 1. Gutachter: Univ. Prof. Dr. F.-J. Kaup 2. Gutachter: PD Dr. R. Goethe Tag der mündlichen Prüfung: 22.11.2004 Inhaltsverzeichnis 1 Einleitung .......................................................................................................... 11 2 Literaturübersicht............................................................................................. 13 2.1 Helicobacter pylori ........................................................................................ 13 2.1.1 Vakuolisierendes Zytotoxin VacA ........................................................... 13 2.1.2 cag-Pathogenitätsinsel ........................................................................... 14 2.1.3 Lipopolysaccharide und Membranproteine ............................................. 15 2.1.4 Flagellen ................................................................................................. 16 2.2 Tiermodelle für Helicobacter pylori-Infektionen............................................. 16 2.2.1 Mäuse (Mus musculus)........................................................................... 17 2.2.2 Ratten (Rattus norvegicus) ..................................................................... 20 2.2.3 Gerbile (Meriones unguiculatus) ............................................................. 21 2.2.4 Meerschweinchen (Cavia aperea) .......................................................... 23 2.2.5 Katzen (Felis silvestris catus) ................................................................. 25 2.2.6 Hunde (Canis lupus familiaris) ................................................................ 27 2.2.7 Schweine (Sus scrofa domesticus)......................................................... 29 2.2.8 Nichthumane Primaten ........................................................................... 32 2.2.8.1 Paviane (Papio spp.) und Schimpansen (Pan troglodytes).................. 32 2.2.8.2 Japanmakaken (Macaca fuscata) ........................................................ 33 2.2.8.3 Rhesusaffen (Macaca mulatta) ............................................................ 35 3 Eigene Untersuchungen .................................................................................. 41 3.1 Material und Methoden ................................................................................. 41 3.1.1 Tiermaterial............................................................................................. 41 3.1.2 Infektiöse Bakterienstämme ................................................................... 42 3.1.3 Eradikationstherapie ............................................................................... 43 3.1.4 Apparative Hilfsmittel der Probengewinnung .......................................... 44 3.1.5 Gastroskopie .......................................................................................... 45 3.1.5.1 Vorbereitung der Tiere und Narkose.................................................... 45 3.1.5.2 Durchführung der Gastroskopie........................................................... 45 3.1.6 Endoskopische Probennahme ................................................................ 46 3.1.6.1 Biopsiezange ....................................................................................... 46 3.1.6.2 Zytologiebürste .................................................................................... 47 3.1.7 Infektion und Superinfektion der Rhesusaffen ........................................ 47 3.1.8 Versuchsplan der Infektionen und Biopsienahmen................................. 48 3.1.9 Anlegen einer Bakterienkultur zur Infektion ............................................ 50 3.1.10 Bestimmung der infektiösen Dosis.......................................................... 50 3.1.11 Mikrobiologische Untersuchungen.......................................................... 51 3.1.11.1 Bakterienkultur.................................................................................. 51 3.1.11.2 Ureasetest ........................................................................................ 51 3.1.12 Lichtmikroskopische Untersuchungen .................................................... 52 3.1.12.1 Biopsiematerial ................................................................................. 52 3.1.12.2 Nachweis von Large Gastrointestinal Spirals.................................... 53 3.1.12.3 Objektträgerausstriche...................................................................... 53 3.1.13 Immunhistochemische Untersuchungen................................................. 53 3.1.13.1 Immunhistochemische Markierung von Zellen.................................. 53 3.1.13.2 Quantitative Bestimmung der immunhistochemischen ..................... 54 Untersuchungen ............................................................................... 54 3.1.14 Serologische Untersuchungen................................................................ 55 3.1.15 Auswertung und Dokumentation............................................................. 56 3.1.16 Elektronenmikroskopische Präparation .................................................. 56 3.1.16.1 Biopsien ............................................................................................ 56 3.1.16.2 „Negative staining“............................................................................ 57 3.1.17 Molekularbiologische Untersuchungen ................................................... 57 3.1.17.1 DNA-Isolierung von H. pylori aus Magenbiopsien............................. 58 3.1.17.2 Primer ............................................................................................... 59 3.1.17.3 Polymerase-Kettenreaktion (PCR).................................................... 61 3.1.17.4 Sequenzierung.................................................................................. 62 3.1.17.5 Parameter der Stammidentität von H. pylori ..................................... 64 3.1.18 Bewertungsschema zur Einteilung in Gastritisgrade............................... 65 3.2 Ergebnisse.................................................................................................... 67 3.2.1 Klinische Untersuchungen und allgemeiner Sektionsbefund .................. 67 3.2.2 Gastroskopische Untersuchung.............................................................. 68 3.2.3 Ureasetest .............................................................................................. 69 3.2.4 Kulturelle Untersuchungen ..................................................................... 69 3.2.5 Elektronenmikroskopische Darstellung................................................... 71 3.2.6 Analyse und Sequenzierung der Reisolate............................................. 72 3.2.7 Histologische Beurteilung der Magenbiopsien ........................................ 76 3.2.8 Immunhistochemische Ergebnisse der Biopsieproben ........................... 88 3.2.9 Serologische Untersuchungen................................................................ 96 3.2.10 Auswertung des Kontrolltiers 9048 ......................................................... 96 4 Diskussion ........................................................................................................ 98 4.1 Bewertung des Tiermodells Rhesusaffe ....................................................... 98 4.2 Aussagekraft des Untersuchungsmaterials .................................................. 99 4.3 Erfolg der Inokulation der H. pylori-Stämme ............................................... 100 4.4 Gewichtsentwicklung der Tiere ................................................................... 102 4.5 Bewertung histologischer Befunde ............................................................. 102 4.6 Auftreten von Lymphfollikeln und lymphofollikulären Herden ..................... 105 4.7 Immunhistochemische Überlegungen......................................................... 106 5 Zusammenfassung......................................................................................... 109 6 Summary ......................................................................................................... 111 7 Literaturverzeichnis ....................................................................................... 113 8 Anhang ............................................................................................................ 129 8.1 Protokolle für die Mikrobiologie................................................................... 129 8.2 Protokolle der histologischen Präparationen .............................................. 131 8.3 Protokoll der Paraplast-Einbettung (Hypercenter XP)................................. 133 8.4 Lösungen für die Immunhistochemie .......................................................... 133 8.5 Protokolle für die Immunhistochemie.......................................................... 134 8.6 Protokoll für die Westernblot-Serologie ...................................................... 136 8.7 Lösungen für die Molekularbiologie ............................................................ 137 8.8 Protokoll der elektronenmikroskopischen Präparation................................ 138 Abkürzungsverzeichnis °C Grad Celsius µg Mikrogramm µl Mikroliter µm Mikrometer % Prozent Abb. Abbildung AG Aktiengesellschaft akt. aktiv Anh. Anhang Aqua bidest. zweifach destilliertes Wasser Aqua dest. destilliertes Wasser ATCC „American Tissue Culture Collection“ atroph. atrophisch AZ Aktenzeichen B Bursa fabricii bzw. „bone marrow“ bab Blutgruppenantigen bindendes Gen bzw. beziehungsweise ca. circa cagA Zytotoxin assoziiertes Gen A CagA Zytotoxin assoziiertes Protein A CD „cluster of differentiation“ chron. chronisch cm Zentimeter DAB Diaminobenzidin DNA Desoxyribonukleinsäure dNTP’s Desoxyribonukleotidtriphosphate dpsi Tage („days“) post superinfectionem ELISA „enzyme-linked immunosorbent assay“ et al. und Mitarbeiter Fa. Firma Fas F7 assoziiertes Oberflächenprotein („F7 associated surface protein“) flaA Flagellin Gen A FlaA Flagellin Protein A flaB Flagellin Gen B FlaB Flagellin Protein B follik. follikulär g Gramm GERD gastroösophageale Refluxkrankheit ggr. geringgradig GM II Göttinger Mischung II h Stunde H. Helicobacter HE Hämatoxylin-Eosin herdf. herdförmig hgr. hochgradig H+/K+-ATPase Wasserstoff/Kalium-Adenosintriphosphatase Hop Helicobacter Außenmembranproteine („Helicobacter outer membrane proteins“) IFN Interferon i.g. intragastral Ig Immunglobulin IHC Immunhistochemie IL Interleukin i.m. intramuskulär i.v. intravenös Kap. Kapitel KBE koloniebildende Einheiten kD Kilodalton kg Kilogramm KGW Körpergewicht L. Lamina LGIS große Magen-Darm-Schraubenbakterien („large gastrointestinal spirals“) LPS Lipopolysaccharidketten LT hitzelabiles Escherichia coli-Toxin („heat labile toxin of Escherichia coli“) M molar MALT Schleimhaut assoziiertes Lymphgewebe („mucosa associated lymphoid tissue“) mg Milligramm MgCl2 Magnesiumchlorid mgr. mittelgradig min Minute ml Milliliter mm Millimeter mM Millimol mpi Monate post infectionem mpsi Monate post superinfectionem NaCl Natriumchlorid ng Nanogramm NIH „National Institutes of Health“ nm Nanometer n.u. nicht untersucht o.b.B. ohne besonderen Befund OD optische Dichte p.a. pro analysis PAI Pathogenitätsinsel PAS Perjodsäure-Schiff-Reagenz PCR Polymerase-Kettenreaktion p.i. post infectionem pmol Picomol RAPD „random amplified polymorphic DNA“ rDNA ribosomale DNA RNA Ribonukleinsäure rUrease rekombinante Urease s Sekunde bzw. Signalpeptid s.c. subkutan sLex Sialyl-Dimer-Lewis-x Glycosphingolipid SabA Sialinsäure bindendes Adhäsin SABC Streptavidin-Biotin-Komplex spp. Subspezies s.u. siehe unten T Thymus Tab. Tabelle Th1 T-Helfer-Zellen 1 TNF-α Tumor-Nekrose-Faktor-α U Umdrehung bzw. „Unit“ u. und vacA vakuolisierendes Zytotoxin Gen A VacA vakuolisierendes Zytotoxin Protein A VT vakuolisierendes Zytotoxin WHO „World Health Organisation“ wpi Wochen post infectionem wpsi Wochen post superinfectionem z. B. zum Beispiel EINLEITUNG 1 11 Einleitung Zu den am häufigsten vorkommenden Infektionskrankheiten des Menschen gehört die H. pylori-Infektion. Bis zu 50 % der menschlichen Bevölkerung der Industrieländer und etwa 80 % der Bevölkerung der Entwicklungsländer ist mit dem Bakterium H. pylori infiziert (MOSS u. SOOD 2003). Ein enger Zusammenhang zwischen der H. pylori-Infektion und der Entwicklung von Gastritiden, Magenulzera, Adenokarzinomen und MALT-Lymphomen konnte nachgewiesen werden (SANDERS u. PEURA 2002; KASHIWAGI 2003). 1994 stufte die World Health Organisation (WHO 1994) H. pylori als Karzinogen ein. Daher ist es wichtig, neue Strategien zur Bekämpfung des pathogenen Erregers zu entwickeln. Aufgrund der Komplexibilität des Organismus und des Immunsystems sind für die Entwicklung von Impfstoffen und von neuen Therapeutika Tiermodelle unverzichtbar, die in den vergangenen Jahren entwickelt wurden. Da aber für die Erforschung der durch das Bakterium hervorgerufenen Krankheitsbilder und der Reaktion des menschlichen Immunsystems ein Tiermodell sinnvoll ist, dass dem Menschen möglichst nahe steht, bieten nicht humane Primaten, insbesondere Rhesusaffen (Macaca mulatta), ein sinnvolle Alternative. Ihr Immunsystem ist dem des Menschen sehr ähnlich (DUBOIS 1998), die Tiere stellen einen natürlichen Wirt für H. pylori dar, ein weiterer Tatbestand, der die experimentelle Infektion erheblich erleichtert (WHARY u. FOX 2004). Vergleichbare anatomische Voraussetzungen und die Größe der Tiere erlauben endoskopische Eingriffe und Biopsieentnahmen. Die lange Lebenspanne der Tiere schafft die Voraussetzung für longitudinale Studien, welche gerade bei chronischen Infektionskrankheiten sehr wichtig sind. In vorhergehenden Arbeiten von STEUERWALD (1999) und KUNZ (2000) am Deutschen Primatenzentrum Göttingen konnte die Infektion von Rhesusaffen mit Helicobacter-Bakterien mit den notwendigen assoziierten Techniken etabliert werden. 12 EINLEITUNG In diesem Zusammenhang ist das Ziel dieser Arbeit, die Ergebnisse einer fünfjährigen Langzeitstudie einer experimentellen H. pylori-Infektion am Rhesusaffen zusammenzustellen und auszuwerten. Dazu gehört die Frage, ob die experimentelle Infektion über diesen langen Zeitraum persistent war und welche Auswirkungen dies für das Tier hatte. Darüber hinaus sollten immunhistochemische Untersuchungen am Magenschleimhautimmunsystem im Verlaufe der H. pylori-Infektion durchgeführt werden, um Einblicke in immunologische Abläufe zu gewinnen. LITERATURÜBERSICHT 2 2.1 13 Literaturübersicht Helicobacter pylori Im folgenden Abschnitt erfolgt eine kurze Charakterisierung des Bakteriums Helicobacter pylori. Eine ausführliche Darstellung dieses Themas findet sich in den vorausgegangenen Dissertationen von STEUERWALD (1999) und KUNZ (2000). H. pylori ist ein gram-negatives, bewegliches, gebogenes oder spiralig gewundenes Bakterium mit unipolarer Begeißelung aus der Familie der Spirillaceae. Es hat bei einer Länge von etwa 2,5 - 5 µm einen Durchmesser von etwa 0,5 µm. Die 4 - 6 behüllten unipolaren Geißeln oder Flagellen enden in einer charakteristischen keulenförmigen Auftreibung. Das Bakterium ist mikroaerophil und hat die besten künstlichen Wachstumsbedingungen in einer Gasatmosphäre, die 4 - 6 % Sauerstoff enthält (GOODWINN u. ARMSTRONG 1990; VANDAMME et al. 1991). Neben den Flagellen als Virulenzfaktor sind noch VacA, cag-Pathogenitätsinsel, Lipopolysaccharide und Membranproteine als weitere Virulenz- und Pathogenitätsfaktoren vorhanden und werden im Folgenden aufgeführt. 2.1.1 Vakuolisierendes Zytotoxin VacA Als wichtigen Pathogenitätsfaktor beschrieben COVER und BLASER (1992) das vakuolisierende Zytotoxin Gen A (vacA). Das korrespondierende vakuolisierende Zytotoxin (VacA) wurde durch die Epithelzellen der Mukosa aufgenommen und bewirkte eine Vakuolisierung der Zellen durch Verschmelzung von Endosomen und Lysosomen (MOLINARI et al. 1997). Es sind verschiedene Allele des vacA-Gens aufgetreten, die möglicherweise mit dem Auftreten von Krankheitssymptomen 14 LITERATURÜBERSICHT assoziiert sind. Zum einen spielte dabei die Genregion des Signalpeptides eine wichtige Rolle und zum anderen die m-Region (ATHERTON et al. 1997), die in der Mitte des Gens zu finden war. LETLEY und ATHERTON (2000) beschrieben eine Einteilung der Signalpeptide in zwei Familien s1 (s1a, s1b, s1c) und s2, wobei nur Proteine mit dem s1- Signalpeptid eine vakuolisierende Wirkung besaßen. Der Allelstatus des Signalpeptids vom Typ s1, welcher statistisch mit dem Vorhandensein der cag-Pathogenitätsinsel korreliert (VAN DOORN et al. 1999), ist zudem als ein wichtiger Marker in der klinischen Diagnostik anzusehen. Eine Aufklärung des Zusammenhangs zwischen dem s1-Signalpeptid des vacA-Gens und dem Vorhandensein des Zytotoxin assoziierten Gens (cag)-Pathogenitätsinsel konnte noch nicht geleistet werden. 2.1.2 cag-Pathogenitätsinsel CENSINI et al. (1996) beschrieben die cag-Pathogenitätsinsel als einen etwa 40 Kilobasen großen Gencluster. Die Pathogenitätsinsel war nicht in allen H. pyloriStämmen anzutreffen, jedoch konnte eine Assoziation zwischen dem Vorhandensein der cag-Pathogenitätsinsel und dem Auftreten von Erkrankungen nachgewiesen werden. Bei 90 % der aus Erkrankten isolierten H. pylori-Stämme trat die Pathogenitätsinsel auf (COVACCI et al. 1997). Das Protein CagA des zuerst identifizierten Gens cagA (Zytotoxin assoziiertes Gen A) dieses Clusters hatte verschiedene intrazelluläre Auswirkungen auf die Wirtszelle. Beispielsweise konnte die Ausstülpung von Pseudopodien durch Rearrangierung des Zytoskeletts und eine Verlängerung der Wirtszelle nachgewiesen werden (SEGAL et al. 1996, 1999). Die Anwesenheit der Pathogenitätsinsel hatte auch ohne die Aktion des CagA-Proteins unterschiedliche Wirkungen auf die Wirtszelle, wie z. B. die Ausschüttung von Interleukin-8 (CRABTREE 1998; GUILLEMIN et al. 2002). Die Wirkungsweisen innerhalb der Wirtszelle sind noch weitgehend unbekannt. genauen LITERATURÜBERSICHT 15 2.1.3 Lipopolysaccharide und Membranproteine In der äußeren Membran von H. pylori sind Lipopolysaccharidketten (LPS) verankert, die einen bedeutenden Faktor der bakteriellen Pathogenität darstellen (MORAN 1996). Es zeigten sich einige LPS-Oberflächenstrukturen von H. pylori mit Ähnlichkeiten zu Antigenen (Mimikri), die auch auf Zellen des Wirtes zu finden waren. Die Lewis-Blutgruppen-Antigene Lewis-x und Lewis-y zählen zu diesen Oberflächenstrukturen (APPELMELK et al. 1997). Durch diese Mimikri ist es H. pylori möglich, eine Tarnung vor dem Immunsystem im Magen zu etablieren und über die Lewis-Blutgruppen-Antigene eine Adhäsion der Bakterien an die Wirtszellen zu induzierten (BOREN et al. 1993; MORAN et al. 1996). Andererseits führt die Bildung von spezifischen Antikörpern gegen Oberflächenantigene des Bakteriums durch die humorale Immunabwehr dazu, dass diese Antikörper auch auf die Oberflächenantigene der Wirtszellen (H+/K+-ATPase der Belegzellen) reagieren und eine Autoimmunreaktion ausgelöst wird, die mit Schädigungen der Magenschleimhaut einhergeht (CLAEYS et al. 1998). H. pylori ist mit vielen Genen versehen, die der Familie der sogenannten „Helicobacter outer membrane proteins“ (Hop) angehören. Eine Anzahl dieser Gene kodiert für Membrankanäle (Porine), andere sind elementar für die Adhäsion an die Wirtszelle (z. B. bab-Gene, MAHDAVI et al. 2002). Eine Regulation vieler der HopGene erfolgt durch das sogenannte „slipped strand mispairing“ (BLASER u. BERG 2001). Die Gene dieser Proteine haben eine Sequenz gleicher Basen (z. B. acht aufeinander folgende Guanine) oder Basentandems in unterschiedlicher Länge zur Verfügung. Durch das Hinzufügen oder den Verlust eines Basentandems kommt es zu einer Verschiebung des Leserahmens mit der Folge, dass das Gen abgelesen werden kann (Anschalten) oder nicht (Abschalten). H. pylori wird durch diesen Mechanismus die Möglichkeit gegeben, schnell auf sich ändernde Umweltbedingungen (Abwehrreaktion gegen ein Oberflächenantigen) zu reagieren und sich einen Selektionsvorteil zu verschaffen. 16 LITERATURÜBERSICHT 2.1.4 Flagellen JOSENHANS und SUERBAUM (2002) konnten feststellen, dass die Beweglichkeit von H. pylori auf das Vorhandensein von 4 - 6 unipolaren Flagellen zurückzuführen ist. Im Tiermodell waren die Bakterien ohne Flagellen nicht in der Lage den Wirt zu besiedeln (EATON et al. 1996). Nicht nur in der akuten Phase einer Infektion sondern auch während einer persistierenden Infektion muss sich H. pylori im viskosen Mukus bewegen können, um ein Ausschwemmen in den saureren Magenbereich zu verhindern (HAZELL et al. 1986). JOSENHANS et al. (1995) wiesen nach, dass die Flagellenfilamente aus zwei Flagellinen, FlaA und FlaB bestehen, die beide für ein voll funktionstüchtiges Flagellenfilament benötigt werden. GEIS et al. (1993) äußerten die Vermutung, dass die Membranhülle (entsprechend der äußeren Zellmembran), die die Flagellen ummantelt, ein Schutz vor dem sauren Milieu des Magenlumens darstellt. Die Funktion der terminalen Auftreibung der Flagellen konnten die letztgenannten Autoren noch nicht aufklären. 2.2 Tiermodelle für Helicobacter pylori-Infektionen Mit der Erkenntnis der Zusammenhänge zwischen einer H. pylori-Infektion der Magenschleimhaut und dem damit verbundenen Auftreten von chronischen Gastritiden, peptischen Ulzera und Magenkarzinomen ist die Etablierung eines geeigneten Tiermodells dieser komplexen Erkrankung eines der vordringlichen Ziele der Gastroenterologie geworden (MARSHALL u. WARREN 1984). Seit der ersten Einführung eines Tiermodells mit gnotobiotischen Ferkeln (KRAKOWKA et al. 1987) wurde in den vergangenen Jahren mit verschiedenen Modellen auf diesem Gebiet gearbeitet, um die verschiedenen Gastritisformen sowie die Helicobacter assoziierte Kanzerogenese zu erforschen und geeignete therapeutische und prophylaktische Maßnahmen zu testen. Die Auswahl geeigneter Tiermodelle ist von einigen Voraussetzungen abhängig. Die Haltung und Aufzucht der Modellspezies sollte wenig aufwendig sein. Eine weitere Vorbedingung ist eine vergleichbare Anatomie LITERATURÜBERSICHT 17 und Physiologie der Modellspezies. Die Möglichkeit einer Infektion der jeweiligen Spezies mit humanen Stämmen von H. pylori sollte gewährleistet sein. Weiterhin wird eine Übertragbarkeit der Ergebnisse des Tiermodells auf den Menschen gefordert. Des Weiteren war es notwendig, eine Standardisierung des Tiermodells zur Vergleichbarkeit erhaltener Ergebnisse zu erreichen (EATON 1999). Die Infektionsversuche mit diversen Tierarten führen zu den unterschiedlichsten Bewertungen über die Brauchbarkeit der jeweiligen Tiermodelle. Die gängigsten Modelle werden im Folgenden aufgeführt. Es handelt sich dabei im Einzelnen um Infektionsversuche mit Mäusen, Ratten, Gerbilen, Meerschweinchen, Katzen, Hunden, Schweinen und nicht humanen Primaten. Studien mit anderen Tiermodellen scheitern häufig an dem vergleichsweise hohen finanziellen und zeitlichen Aufwand, der betrieben werden muss, um solche Untersuchungen durchzuführen. 2.2.1 Mäuse (Mus musculus) Ein erstes Hauptziel dieses Modellansatzes war es, ein Tiermodell mit kleinen Labortieren zu etablieren, da diese in der Haltung und im Handling günstiger sind und so Voraussetzungen geschaffen werden können, schnelle und reproduzierbare Forschungsresultate zu erarbeiten. Darauf aufbauend konzentriert sich die neuere Forschung bei diesem Tiermodell auf die Entwicklung von Vakzinen. Auch Therapiestudien waren schon früh ein Forschungsziel. In der Etablierungsphase dieses Tiermodells galten Mausmodelle lange als nicht empfänglich für H. pylori oder die Mäuse waren nur transient sporadisch infiziert und das Krankheitsbild war nicht assoziiert mit Gastritis (EATON 1999). Deshalb beschränkten sich die Arbeiten lange auf andere Helicobacter-Stämme wie H. heilmannii. Doch auch in aktuelleren Studien wurde noch mit H. heilmannii gearbeitet. In einer Studie zur Erforschung der Immunantwort verglichen PETERSON et al. (2001) weibliche BALB/c Mäuse (normaler Thymus) und weibliche NIH Nacktmäuse (thymusektomiert). Nach orogastrischer Inokulation von 107 H. 18 LITERATURÜBERSICHT heilmannii-infizierten Belegzellen in 0,2 ml steriler Brucella Bouillon wurden die Mäusegruppen in Abständen von zwei Wochen, sechs Monaten, zwölf Monaten und 18 Monaten seziert. Die Autoren konnten feststellen, dass die Ausbildung von lymphoplasmazellulärer Gastritis und Lymphfollikeln bei der thymusektomierten Nacktmäusegruppe deutlich geringer war als bei den BALB/c Mäusen mit normalem Thymus. Aus diesem Resultat folgerten PETERSON et al. (2001), dass eine vollständige CD4+ T-Lymphozyten Immunkompetenz wie bei den BALB/c Mäusen notwendig war, um eine Magenschleimhauthypertrophie und noduläre Hyperplasie nach experimenteller H. heilmannii-Infektion hervorzurufen. TELFORD et al. (1994) gelang es als eine der ersten Arbeitsgruppen in einer Studie mit ultraschallbehandelten Extrakten und ureasebereinigten Zelltoxinen (94 kD Protein) von H. pylori, eine erfolgreiche Simulation einer Infektion von kleinen Labortieren (BALB/c Mäuse) zu etablieren. Eine einfache und wenig aufwendige Übertragung auf das menschliche Krankheitsbild zur Erforschung der Pathogenese war dadurch möglich. Als erste Gruppe gelang es LEE et al. (1997) mit der Strategie kontinuierlicher Passagen von multiplen H. pylori-Humankulturen durch Mäusemägen einen Stamm, den sogenannten „Sydney Strain“, zu isolieren. Ein für die humane Infektiosität wichtiges genetisches Merkmal dieses spezifischen Stammes war der Nachweis von cagA- und vacA-Regionen. Es zeigte sich eine überdurchschnittlich hohe Kolonisationsfähigkeit im C57BL/6-Mäusestamm im Vergleich zu anderen Teststämmen und im Verlauf vom 8 Monaten kam es zur Entwicklung einer chronisch aktiven, atrophischen Gastritis. Darüber hinaus sind Therapiestudien bei diesem Tiermodell angefertigt worden. Eine Tripeltherapie mit Amoxicillin (2,5 µg/Tier), Metronidazol (0,16 mg/Tier) und Plaunotol (0,63 mg/Tier) mit oraler Applikation einmal täglich über eine Woche bei männlichen, thymusektomierten BALB/c Nacktmäusen schlugen KARITA et al. (1993) vor. Diese Therapie erwies sich als die effektivste Methode zur Eradikation von H. pylori (Stamm CPY2052), wenn sie anschließend noch von einer 4wöchigen PlaunotolMonotherapie (0,63 mg/Tier/Tag) abgeschlossen wurde. LITERATURÜBERSICHT 19 Auch Studien zur Erforschung der Pathogenese wurden an diesem Tiermodell durchgeführt. LEE und Mitarbeiter (1997) stellten fest, dass die Langzeitpathologie viel mehr Gemeinsamkeiten mit der humanen, chronisch aktiven Gastritis hat als andere H. pylori-Mausmodelle, obwohl die „Sydney Strain“-infizierten Mäuse nicht exakt den menschlichen Krankheitsverlauf imitierten. Eine H. pylori-Infektion des Menschen zeigt sich häufig als Gastritis mit Infiltration von neutrophilen Granulozyten, Lymphozyten und Plasmazellen, intestinaler Metaplasie, Follikelbildung und Atrophie der Magenschleimhaut. Im weiteren Verlauf der Krankheit kann es zur Bildung der gastroösophagealen Refluxkrankheit (GERD), Ulzera und Tumoren kommen (STOLTE u. MEINING 1998; CREMONINI et al. 2001; SANDERS u. PEURA 2002; SCHUSTER 2002; KASHIWAGI 2003; WANG et al. 2004). Unterschiede zum Menschen bestanden in einem geringeren Gastritisgrad der Mäuse mit vorwiegend lymphoplasmazellulärer Infiltration, wenig Bildung neutrophiler Granulozyten und kaum Anzeichen der Gastritis im Antrum des Magens, wie das in der Humanmedizin der Fall ist (DUBOIS 1998; EATON 1999; LEE 2000). BLANCHARD et al. (1999) stellten die Wichtigkeit von antikörperunabhängigen, zellulären Immunmechanismen durch Studien mit IgA- oder Immunglobulindefizienten Mäusen bei der Protektion gegen eine H. pylori-Infektion heraus. Vakzinestudien mit H. pylori-Whole Cell Sonicate und TiterMax® Gold oder Aluminiumhydroxid deuteten an, dass eine Typ 2-Helfer T-Zell-(CD4+ Th1)vermittelte Immunität eine Rolle bei der Reduzierung der bakteriellen Besiedlung von chronischen H. pylori-Infektionen spielt (MAEDA et al. 2002). EISENBERG et al. (2003) stellten in ihrer Studie Complete Freund’s Adjuvant und Incomplete Freund’s Adjuvant mit subkutaner oder intraperitonealer Applikation gegenüber. Die Autoren kamen zu dem Schluss, Kleinkinder zu impfen, um perinatale Infektionen mit H. pylori zu verhindern. Die intranasale Applikation eines Impfstoffes aus ultraschallbehandeltem Antigen vom H. pylori-Sydney Strain-Stamm zeigte eine deutliche Reduzierung der bakteriellen Besiedlung mit einer vollständigen Regeneration der Magenschleimhaut (GARHARD et al. 2002). Nicht immunisierte Tiere wiesen in dem gleichen Zeitraum auch eine reduzierte bakterielle Besiedlung 20 LITERATURÜBERSICHT auf, bildeten aber eine Gastritis aus. Die Autoren stellten fest, dass eine Prävention vor bakterieller Kolonisation durch eine prophylaktische Vakzination nicht gegeben war, aber eine Vakzination in der Lage war, die Infektion zu begrenzen. 2.2.2 Ratten (Rattus norvegicus) Besonders in der Erforschung der lokalen Entzündungsantwort der Magenschleimhaut und der Ulkusgenese von mit H. pylori-infizierten Ratten hat sich diese Spezies als Tiermodell bewährt. Doch auch die pathologischen Veränderungen sind früh beschrieben worden. So bewerteten SAITA et al. (1992) diese Veränderungen als chronische Gastritis mit Schleimhautischämie und hämorrhagischer Ulzeration. Im Rahmen der Tumorforschung veröffentlichten KOGA et al. (2002) Studien mit spezifisch pathogenfreien Ratten (Praomys natalensis). Die Autoren präsentierten Ergebnisse, die auf eine Abnahme der Karzinoidinzidenz bei vorherrschender Kolonisation von H. pylori (Stamm 9818, CagA+, VacA+) im Antrum schließen ließen. Auch bei Gastritis mit hoher Magensäureproduktion schien die Karzinoidinzidenz reduziert. Im Rahmen der Ulkusgenese sind in jüngerer Zeit von nachfolgend genannten Forschungsgruppen Arbeiten mit dem Rattenmodell durchgeführt worden. In einer Studie von KONTUREK et al. (2000) wurden Ratten über eine Magenfistel der toxische H. pylori-Stamm Typ I (CagA+, VacA+, 2 × 109 KBE) und der nicht-toxische H. pylori-Stamm Typ II (CagA-, VacA-, 2 × 109 KBE) inokuliert. Die Autoren konnten zeigen, dass es speziell durch den H. pylori-Stamm Typ I im Rattenmagen durch Ischämie und Reperfusion zu akuten Läsionen der Magenmukosa kam. Die Läsionen beruhten auf einer Beeinträchtigung der gastrischen Mikrozirkulation, hochgradiger entzündungsfördernder Zytokinfreisetzung, Reduktion der Magensaftsekretion und Suppression ulkushemmender Transforming Growth Faktor-α Expression. Die Arbeitsgruppe vermutete die Ursache der Reduktion der Magensaftsekretion in der beobachteten Weiterverbreitung der H. pylori-Infektion während der Entwicklung von LITERATURÜBERSICHT 21 akuten Erosionen zu chronischen Magengeschwüren. KALIA et al. (2002) beschrieben markierte Störungen der Mikrozirkulation in der Magenschleimhaut von Ratten, die mit unterschiedlich toxischen Stämmen (CagA+ und VacA+) von H. pylori infiziert worden waren. Die nicht immer identischen Störungen der Mikrozirkulation führten die Autoren auf die unterschiedliche Virulenz der Bakterienstämme zurück. Einen immer größeren Untersuchungsumfang nahmen Studien auf dem Gebiet der lokalen Entzündungsantwort der Magenschleimhaut und der Erforschung der Signalwege ein. Dabei kamen SLOMIANY und SLOMIANY (2001) bei einer mit H. pylori-Lipopolysacchariden (50 µg/Tier) induzierten Gastritis zu folgenden Ergebnissen. Sie stellten die überragende Rolle von p38-mitogenaktivierter Proteinkinase in der mukosalen Freisetzung von Tumor-Nekrose-Faktor-(TNF-α) und Endothelin-1 bei der lokalen Signalübertragung heraus. SLOMIANY et al. (2001) verabreichten mit H. pylori-Lipopolysacchariden (50 µg/Tier) okulierten Ratten Aspirin® (Azetylsalizylsäure) in der Dosierung von 20 mg/kg. Die Autoren stellten fest, dass Aspirin® eine Erhöhung der Entzündungsantwort der Magenschleimhaut induziert und zu einem Anstieg der löslichen Form von TNF-α in der Magenmukosaexpression führt. Dieser Anstieg verursachte eine verstärkte Apoptose im Magen. Nach der Applikation des nichtsteroidalen Antiphlogistikums Indomethacin (2 mg/kg) hingegen konnten die Autoren keine signifikanten Abweichungen bei den Versuchstieren von vorhergehenden Normalbefunden aufzeigen. 2.2.3 Gerbile (Meriones unguiculatus) Erste Untersuchungen mit Gerbilen als Tiermodell wurden in der Regel zur Pathogeneseforschung und Entwicklung von Eradikationsstrategien genutzt. Im Laufe mehrerer Jahre hat sich dieses Tiermodell einen hervorragenden Stellenwert bei der Tumorforschung gesichert. Auch in genetischen Studien bei der H. pyloriVirulenzforschung findet dieses Modell Anwendung. 22 LITERATURÜBERSICHT Die ersten erfolgreichen Infektionsversuche mit H. pylori bei Gerbilen gelangen YOKOTA et al. (1991). Die sieben bis acht Wochen alten Tiere wurden teilweise mit und teilweise ohne Vorbehandlung mit Indomethacin (20 mg/kg s.c.) mit dem H. pylori-Stamm (ATCC43504, 108 KBE) in 0,5 ml Carboxymethyl-Zellulose- Phosphatpuffer oral inokuliert. Es gelang bis zum Versuchsende nach 60 Tagen eine erfolgreiche Etablierung des Bakterienstammes in allen Versuchstiergruppen. In Studien zur Erforschung der Pathogenese gelang es CHI et al. (1999), mit dem gleichen Bakterienstamm die Entwicklung einer chronisch aktiven Gastritis mit neutrophiler Infiltration, Lymphfollikelbildung und gastrischer Ulkusbildung bei den Tieren nachzuweisen. Die Autoren hielten durch die exzellente Nachahmung der Krankheitssymptome Gerbile für nahezu ideale Kandidaten für ein H. pyloriTiermodell. In einer Magenulkusstudie von MIYATA et al. (1999) wurden die Tiere durch Bauchinzision und Injektion mit 20 µl Essigsäure (10%ig) unter der Magenserosa zur Ulkusinduktion präpariert. Nach oraler Infektion mit dem H. pyloriStamm (ATCC43504, 1,8 × 108 KBE) waren die Bakterien vorwiegend in der Pylorusdrüsenzone anzutreffen. Die Autoren begründeten dies mit der Tatsache, dass in der Pylorusdrüsenzone aufgrund der Zusammensetzung der Kohlenhydrate des Magenmuzins reichlich L-Fucose (Beziehungsglied des H. pylori-Adhäsivfaktors) anzutreffen ist. Auch Studien der Therapieentwicklung zur Eradikation von H. pylori-Infektionen wurden beschrieben. So empfahlen KETO et al. (2001) zur Reduzierung der Krankheitssymptomatik und zur Prävention der Karzinogenese eine frühzeitige Therapie mit Omeprazol (60 mg/kg oral) und Clarithromycin (100 mg/kg oral). BRZOZOWSKI et al. (2003) bevorzugten statt dessen eine Kombinationstherapie mit Omeprazol (10 mg/kg s.c.), Clarithromycin (5 mg/kg i.g.) und Tinidazol (5 mg/kg i.g.). Neuere Studien widmeten sich der Magenkarzinomforschung von H. pylori alleine oder in Kombination mit anderen karzinogenen Substanzen. FUJIOKA et al. (2000) sahen in ihren Studien in dem immunhistochemischen Nachweis von Mutationen des LITERATURÜBERSICHT 23 p53-Tumorsuppressorgens einen Karzinogeneseeffekt der H. pylori-Infektion. Im Gegensatz zu den Untersuchungen der letztgenannten Autoren bezweifelten NOZAKI et al. (2002) verschiedene Studien über den Zusammenhang von H. pyloriInfektionen und der Magenkarzinogenese bei Gerbilen. Die Autoren wiesen darauf hin, dass submukosale, heterotope, proliferative Drüsen regelmäßig bei H. pyloriInfektionen vorkamen. Nach Eradikation der Bakterien zeigte diese Veränderung einen reversiblen Charakter und war eher als ein Zeichen einer hochgradigen Gastritis, als das einer Karzinogenese zu sehen. Die festgelegten Kriterien von heterotopen, proliferativen Drüsen wiesen große Unterschiede zu gut differenzierten Adenokarzinomen auf, so dass bei der überwiegenden Anzahl der Magenläsionen von regenerativen Veränderungen durch Entzündungsprozesse ausgegangen werden konnte. In genetischen Untersuchungen zu den Kolonisationsfaktoren von H. pylori arbeiteten KAVERMANN et al. (2003) mit 12 Wochen alten spezifisch pathogenfreien Gerbilen. Die Tiere wurden mit dem Streptomycin resistenten H. pylori-Humanstamm P149 (cagA+, cag-PAI partiell gelöscht) mit 109 KBE oral inokuliert und nach 21 Tagen seziert. Mittels der Polymerase-Kettenreaktion (PCR) konnten sie als erste Arbeitsgruppe die Kollagenase HP0169 am Genort hp0169 als Virulenzfaktor identifizieren. Die kürzlich identifizierte ATPase ComB4 konnte ebenso nachgewiesen werden. KAVERMANN et al. (2003) waren der Meinung, dass die Entdeckung dieser beiden Kolonisationsfaktoren neue Therapiemöglichkeiten durch das Verständnis des Infektionsprozesses ermöglicht. 2.2.4 Meerschweinchen (Cavia aperea) Meerschweinchen als Tiermodelle sind kaum zur Anwendung gekommen und werden in der H. pylori-Forschung hauptsächlich zum Studium der Pathogenese verwendet. Aber auch eine frühe Untersuchung zur Pharmakokinetik therapeutischer Substanzen existiert. 24 LITERATURÜBERSICHT Anfang der neunziger Jahre begannen Forschungen an dieser Tierart mit der Messung von dem über die Magenschleimhaut sezernierten Antibiotikum Clindamycin (10 mg/kg i.m. bzw. 100 mg/kg i.m.) zum Studium der Pharmakokinetik (WESTBLOM et al. 1990). Zu allen Messzeitpunkten übertrafen die Schleimhautkonzentrationen die Serumkonzentrationen des Clindamycins bis annähernd zum 100fachen acht Stunden nach Injektion des Medikamentes. Die Autoren bewerteten aufgrund der hohen Schleimhautkonzentrationen von Clindamycin die Therapie mit diesem Medikament zur H. pylori-Eliminierung als exzellent und schlugen eine Clindamycingabe alle sechs Stunden vor. Dabei legten sie eine Dosis von 100 mg/kg Clindamycin zugrunde, welche beim Meerschweinchen einen Serumspiegel hervorrief, der beim Menschen als therapeutische Dosis angenommen wurde. Im Rahmen von Untersuchungen zur Pathogenese beschrieben STUREGARD et al. (1998) die Veränderungen der Magenmukosa in dieser Spezies als hochgradige Gastritis mit Kryptabszessen, Schleimhauterosionen, polymorphkernigen Leukozyten und Lymphozyten. Unter Berücksichtigung der Anatomie und Physiologie sind Meerschweinchen dem Menschen wahrscheinlich ähnlicher als andere kleine Labortiere. Auf eine interessante Parallele verwiesen SHOMER et al. (1998) aufgrund der Tatsache, dass Meerschweinchen durch den Mangel an GulonolactonOxidase wie der Mensch auf die supplementäre Aufnahme von Vitamin C angewiesen sind. Die Tiere in ihrer Studie wurden mit Omeprazol (1 mg/kg oral) vorbehandelt und mit dem „Sydney Strain“ (108 KBE) oral infiziert. Messungen von Ascorbinsäure im Magensaft bei den infizierten Individuen zeigten eine Beeinträchtigung der Ascorbinsäuresekretion und eine signifikante Reduzierung der Säurekonzentration im Magen. Durch die nicht gegebene Funktion als Antioxidant und Radikalfänger stellten die Autoren die Vermutung auf, dass ein erhöhtes Risiko zur Entwicklung von Magenkarzinomen bestand. Abschließend kann zu den Vorteilen kleiner Labortiere (Mäuse, Ratten, Gerbile und Meerschweinchen) als Tiermodell gesagt werden, dass durch die einfache Haltung LITERATURÜBERSICHT 25 dieser Tiere schnelle und kostengünstige Forschungsresultate möglich sind. Durch die Möglichkeit, dass eine große Anzahl der Tiere in eine Studie eingebunden wird, können außerdem statistische Berechnungen mit größerer Sicherheit durchgeführt werden. Der Nachteil von kleinen Labortieren liegt in ihrer relativ kurzen Lebensdauer. Dies beschränkt ihren Einsatz in Langzeitstudien, wie sie für eine H. pylori-Infektion notwendig sind, um eine chronische Erkrankung zu induzieren. 2.2.5 Katzen (Felis silvestris catus) Die H. pylori-Forschung an dem Katzenmodell stößt bei Forschern auf Interesse, weil Katzen als ein Reservoir natürlich vorkommender H. pylori-Infektionen angesehen werden. Die Untersuchungen zielen hauptsächlich auf die Etablierung und Transmission der Infektion, die Pathogenese und in neuerer Zeit auf die Entwicklung von Vakzinen ab. In Studien von HANDT et al. (1994, 1995) konnte der Nachweis einer natürlichen Infektion von Katzen geführt werden. Die 29 Katzen stammten von vier kommerziellen Händlern und wurden drei bis sieben Monate in isolierten Einzelkäfigen des Forschungsinstitutes gehalten. Nach der Sektion aller Tiere stellten HANDT et al. (1994) eine gemischte Kolonisation von H. pylori und „H. pyloriähnlichen Bakterien“ (wahrscheinlich H. felis oder „Large Gastrointestinal Spirals“) fest, wobei H. pylori bei sechs Katzen sicher diagnostiziert wurde. Bei 15 weiteren Katzen wurden H. pylori-ähnliche Bakterien gefunden. HANDT und Mitarbeiter (1994) sahen es als Vorteil für dieses Tiermodell an, dass Katzen ein natürliches Erregerreservoir für H. pylori darstellen. Doch die Autoren erwähnten auch den Nachteil der Mischkolonisation mit anderen Spiralbakterien. FOX et al. (1995) verwendeten für ihre Studien zur Etablierung der Infektion und Transmission einen felinen H. pylori-Stamm 94-2728, den sie aus einer natürlich infizierten Katze isoliert hatten. Sie infizierten damit eine Gruppe spezifisch 26 LITERATURÜBERSICHT pathogenfreier Katzen dreimal mit 4,5 × 108 KBE in vier Tagesabständen. Es gelang, bei den zuvor mit Cimetidin (10 mg/kg i.m.) vorbehandelten Tieren eine erfolgreiche, persistente Infektion zu etablieren. Die Autoren befürworteten neue Studien zur Frage, ob ein humaner H. pylori-Stamm bei Katzen kolonisiert werden kann. Die Untersuchungen sollten bestätigen, dass Katzen als ein Erregerreservoir für die Transmission von H. pylori auf den Menschen zu sehen sind. In seiner Transmissionsstudie hielt NEDRUD (1999) es für wahrscheinlicher, dass die Infektion vom Menschen in Richtung Katze erfolgt. Er ging davon aus, dass ein Tierpfleger in dieser Studie eine Gruppe spezifisch pathogenfreier Katzen infiziert hat. Der Autor bewertete die Verwendung spezifisch pathogenfreier Katzen in diesem Tiermodell der experimentellen H. pylori-Infektion als sehr aufwendig und teuer. Umfangreiche Pathogenesestudien führten PERKINS et al. (1998) an diesem Tiermodell durch. Die Autoren arbeiteten in ihrer Versuchsanordnung mit acht Monate alten, spezifisch pathogenfreien Katzen, die mit einem H. pylori-Stamm (Humanisolat 95-983, CagA+) eines Patienten mit Magenulkus infiziert wurden. Nach einer Vorbehandlung mit Cimetidin (5 mg/kg zweimal täglich i.m.) erfolgte die Inokulation von 3 ml H. pylori-Bouillon (1,5 × 108 KBE/ml) orogastrisch per Sonde dreimal im Abstand von zwei Tagen. Nach 15 Wochen Studiendauer wurden die Tiere euthanasiert. Es zeigten sich als pathologische Befunde eine hauptsächlich multifokale Gastritis mit Lymphfollikelbildung und neutrophilen und eosinophilen Infiltraten. Ebenso wie PERKINS et al. (1998) verglich auch LEE (1995) die von H. pylori-verursachten Magenläsionen bei Katzen mit denen von H. pylori-infizierten Humanpatienten. Neuere Studien beschäftigen sich mit der Immunantwort und der Vakzineentwicklung. KLEANTHOUS und Mitarbeiter (1998) vakzinierten zwei Gruppen von Katzen mit rUrease+LT (10 mg rekombinante Urease + 25 µg heat labile toxin of E. coli) bzw. nur mit LT. Es erfolgte dann eine Inokulation des humanen H. pylori-Stammes (CagA+). Zwei Monate später war eine signifikante Abnahme der LITERATURÜBERSICHT 27 Bakteriendichte und eine Verringerung der entzündlichen Reaktion bei den zuvor mit rUrease+LT vakzinierten Tieren im Gegensatz zu der nur mit LT vakzinierten Kontrollgruppe nachzuweisen. Die artifizielle Immunisierung und nicht die natürliche Infektion resultierte in der Bildung einer gastrischen Urease-spezifischen IgAImmunantwort. Die Autoren hielten weitere Forschungsarbeit für nötig, um aus einer Kombination von Urease-Antigen und anderen bakteriellen Antigenen einen potenten Impfstoff zu entwickeln. Zusammenfassend sind die Vorteile eines Katzentiermodells darin zu sehen, dass Katzen natürlich mit H. pylori infiziert sind und somit die Etablierung der experimentellen Infektion leicht gelingt. Als nachteilig zu sehen ist der höhere Aufwand bei der Haltung der Katzen im Vergleich zu kleinen Labortieren, insbesondere wenn spezifisch pathogenfreie Katzen verwendet werden. Auch die Anatomie und Physiologie der Katzen zeigt nur eine begrenzte Verwandtschaft zum Menschen. 2.2.6 Hunde (Canis lupus familiaris) Hunde als Tiermodelle fanden in der Anfangsphase der H. pylori-Untersuchungen Verwendung. Es wurde zunächst mit gnotobiotischen Welpen gearbeitet. Später befasste sich auch eine Studie mit konventionell gehaltenen Hunden. Sie dienten hauptsächlich der Erforschung der Pathogenese und der Übertragbarkeit des Modells auf den Menschen. Die erste Untersuchung Beaglewelpen statt. Die an diesem Tiere Tiermodell wurden von fand an Hündinnen gnotobiotischen unter spezifisch pathogenfreien Bedingungen geboren und mit einer Milchersatzdiät in isolierten Einheiten aufgezogen (RADIN et al. 1990). Es erfolgte die orale Applikation von 3 × 108 KBE H. pylori (Humanstamm 26695) mit 2 ml Peptonwasser am siebten Lebenstag für Gruppe A (fünf Hunde). Nach der Kontaktaufnahme der Gruppe A am 28 LITERATURÜBERSICHT 23 Tag p.i. mit der nicht infizierten Kontrollgruppe B (zwei Hunde) konnte eine Woche später durch Sektion aller Hunde und Bestimmung der Serum IgG-Titer die Transmission der Bakterien auf die Beaglewelpen der Gruppe B festgestellt werden. Ob die Übertragung fäkal-oral oder oral-oraler Natur war, vermochten die Autoren nicht festzustellen. Trotz der Ausbildung einer lymphoplasmazellulären Gastritis mit Follikelanbildung und neutrophiler und eosinophiler Infiltration zeigten alle Tiere keinerlei klinische Zeichen und waren vergleichbar mit H. pylori-positiven, asymptomatischen Humanpatienten. Das von ROSSI et al. (1999) verwendete Modell konventioneller Beaglezuchten setzte sich aus 4 - 6 Monate alten Tieren zusammen. Nach einer Vorbehandlung mit Tagamet® 200 (Cimetidin 10 mg/kg i.m.) wurden die Hunde mit einem Mäuseadaptierten H. pylori-Stamm (SPM326s, CagA+ und VacA+) oral infiziert. Im Gegensatz zur Versuchsgruppe von RADIN et al. (1990) zeigten die Hunde über ein bis zwei Wochen seit Beginn der Infektion eine akute klinische Symptomatik mit Vomitus und Diarrhoe. Die pathologische Untersuchung zeigte in der Hauptsache eine chronisch aktive Gastritis, Lymphfollikelbildung und Interleukin-8-Induktion in der immunhistochemischen Markierung. Es konnte der Nachweis von IgA-(Speichel) und IgG-(Speichel und Serum)-Antikörpern gegen H. pylori geführt werden. Durch die weitgehende Übereinstimmung mit dem humanen Krankheitsbild hielten die Autoren es für sinnvoll, ein präventives oder therapeutisches Vakzinationsregime mit diesem Tiermodell zu entwickeln. Vorteilhaft für ein Tiermodell unter Verwendung von Hunden erweist sich die Ähnlichkeit zur menschlichen Pathogenese. Dem gegenüber muss der Nachteil gestellt werden, dass Hunde nicht natürlich mit H. pylori infiziert sind, was eine Etablierung der Infektion erschwert. Zu berücksichtigen sind außerdem die aufwendigen Bedingungen. Notwendigkeiten Der schon einer bei Hundehaltung Katzen aufgeführte unter experimentellen nachteilige geringe Verwandtschaftsgrad von Hunden zum Menschen trifft für das Hundemodell ebenso zu. LITERATURÜBERSICHT 29 2.2.7 Schweine (Sus scrofa domesticus) Grundlegende Forschungen mit diesem Tiermodell begannen mit der Etablierung einer H. pylori-Infektion, dem Studium der Pathogenese und der Therapieentwicklung. Spätere Untersuchungen widmeten sich der Erforschung der Immunantwort und damit einhergehend der Entwicklung von Vakzinen. Die ersten Studien zur Etablierung einer experimentellen H. pylori-Infektion am Schwein begannen mit gnotobiotischen Ferkeln. KRAKOWKA et al. (1987) verwendeten nach den Vorgaben von WAXLER und Mitarbeitern (1966) für ihre Studie geburtssynchronisierte trächtige Yorkshire-Hausschweine, die unter sterilen Bedingungen per Kaiserschnitt entbunden wurden. In beheizten, sterilen Isolationseinheiten erfolgte die Fütterung der gewonnenen Ferkel dreimal täglich (100 - 150 ml pro Fütterung) mit einer sterilen Milchersatzdiät in den ersten Lebenswochen. Nach vorausgehender Behandlung mit dem H2-Antihistaminikum Cimetidin (60 mg/kg oral) wurde den Tieren eine Suspension aus 109 KBE von Campylobacter pylori (später in Helicobacter pylori umbenannt) in 2 ml Peptonwasser oral appliziert. Es gelang der Arbeitsgruppe von KRAKOWKA et al. (1987) in dieser Versuchsanordnung eine Infektion mit Campylobacter pylori bei diesen Tieren zu etablieren. In Pathogenesestudien mit diesem Tiermodell zeigten DRIESSEN et al. (2002) lymphatische Gewebestrukturen in der Magenschleimhaut schon in normalen Ferkeln. Die Autoren bestätigten eine Relation zwischen der Lage des lymphatischen Gewebes und dem Auftreten H. pylori-induzierter Gastritisherde. EATON et al. (1989) und EATON und KRAKOWKA (1992) beschrieben die pathologischen Veränderungen einer lymphoplasmazelluläre experimentellen follikuläre Infektion Gastritis mit mit diffusen H. pylori als lymphozytären Entzündungsherden und Kryptabszessen. KRAKOWKA et al. (1995) beobachteten die Entwicklung von Magenulzera in einer Gruppe H. pylori-infizierter gnotobiotischer 30 LITERATURÜBERSICHT Ferkel, während bei den nicht infizierten Tieren der Kontrollgruppe keine Ulkusentwicklung zu verzeichnen war. Darüber hinaus wurden verschiedene therapeutische Ansätze in diesem Tiermodell untersucht. Die Entwicklung neuartiger Therapien zur Behandlung von H. pyloriInfektionen gelang KRAKOWKA et al. (1998) durch die Erprobung von Mono-, Dualund Tripelstrategien. Ziel der Arbeitsgruppe war die Festlegung von Mindestdosen zur vollständigen Eradikation. Mit der oralen Tripelstrategie aus einer Kombination von Pepto-Bismol® (Bismutsalicylat 5,7 mg/kg viermal täglich), Flagyl® (Metronidazol 4,4 mg/kg viermal täglich) und Amoxil® (Amoxicillin 6,8 mg/kg viermal täglich) konnte eine vollständige Eradikation des H. pylori-Humanstammes 26695 zwei Wochen nach Ende der Therapie erzielt werden. Die orale Dualtherapie aus Prilosec® (Omeprazol 5,0 mg zweimal täglich) und Amoxil® (Amoxicillin 5,6 mg/kg viermal täglich) zeigte ebenso eine umfassende Eradikation von H. pylori. Mit den angegebenen Mindestdosen von Amoxil® (Amoxicillin 0,9 mg/kg viermal täglich), Biaxin® (Clarithromycin 5 mg/kg viermal täglich), Flagyl® (Metronidazol 2,5 mg/kg viermal täglich) und Cipro® (Ciprofloxacin 7,3 mg/kg viermal täglich) als orale Monotherapien erzielten die Autoren die gleichen Ergebnisse. Ein Hauptaugenmerk von Tiermodellen mit gnotobiotischen Ferkeln lag in der Erforschung der anfänglichen Immunantwort. KRAKOWKA und Mitarbeiter (1996) infizierten die Ferkel mit dem H. pylori-Stamm 26695. Mittels ELISA-Diagnostik wurden Antikörpertiter in Kulturen von Magenexplantaten mit in-vivo-Antikörpertitern von Serum, Gallenflüssigkeit und Magensaft verglichen. Die Autoren kamen zu dem Schluss, dass entzündliche Vorgänge in der Magenschleimhaut durch ein lokales immunologisches Geschehen vermittelt wurden. KRAKOWKA und EATON (2002) beschrieben die Entwicklung einer lokalen Immunantwort bis hin zu einer generalisierten IgA-dominierten Schleimhautimmunantwort dominierten humoralen Immunantwort. und einer IgG- LITERATURÜBERSICHT 31 Auch in Vakzinestudien lag schon früh ein Schwerpunkt der H. pylori-Forschung bei Schweinen. EATON und KRAKOWKA (1992) beobachteten bei gnotobiotischen Ferkeln nach parenteraler Impfung mit in Formalin abgetöteten H. pylori hauptsächlich die Bildung von Serumantikörpern, neutrophilen Granulozyten und Kryptabszessen in der Magenmukosa. Die Schwere und Aktivität der Gastritis war bei parenteral immunisierten Ferkeln am ausgeprägtesten. Die nicht immunisierten Kontrolltiere und oral mit lebenden Bakterien vakzinierte Tiere wiesen nur zu einem geringen Teil Gastritisbefunde auf. EATON und KRAKOWKA (1992) kamen zu dem Ergebnis, dass die Infektion eines immunisierten Tieres zu einer Intensivierung des Grades und der Aktivität der Gastritis führte. Die einzige Studie zur Etablierung einer experimentellen oralen Infektion mit konventionellen Ferkeln veröffentlichten POUTAHIDIS und Mitarbeiter (2001). Die vier Wochen alten Ferkel (Kreuzung aus Large White und Pietrain Schweinen) wurden mit dem H. pylori-Bakterienstamm 31A/93 eines Humanpatienten mit Pylorusulkus infiziert. Dazu wurden die Tiere mit Tagamet® (Cimetidin 60 mg/kg oral) und TAD® (Dexamethason 0,2 mg/kg i.m.) zur Unterdrückung der Magensäuresekretion und Suppression der Immunantwort vorbehandelt. Die pathologischen Befunde der Tiere zeigten in der Hauptsache eine hochgradige lymphozytäre Gastritis mit Follikelbildung, hochgradige Kongestion und Hämorrhagien, submuköse Ödeme und Vergrößerung der Magenfalten. Die Autoren stellten bis auf die neutrophile Entzündung der Magenschleimhaut und das Fehlen von Neoplasien ähnliche Magenläsionen wie in der Humanpathologie fest, wobei die relativ kurze Zeit des Experiments (21 Tage) zu berücksichtigen ist. Zusammenfassend ist zum H. pylori-Schweinemodell zu bemerken, dass sich eine Limitierung aufgrund der hohen Wachstumsgeschwindigkeit der Tiere ergab, da gnotobiotische Ferkel nur für einen dreimonatigen Zeitraum steril in Inkubatoren gehalten werden können (DUBOIS 1998). Dies schließt eine Durchführung von Langzeitstudien, wie sie für eine H. pylori-Infektion angezeigt sind, aus. Bei 32 konventionell LITERATURÜBERSICHT gehaltenen Ferkeln sind dagegen nach POUTAHIDIS und Arbeitsgruppe (2001) Langzeit- und Verlaufsstudien gut möglich. 2.2.8 Nichthumane Primaten Für die Erforschung der durch H. pylori hervorgerufenen Krankheitsbilder und der Reaktion des Immunsystems ist ein Tiermodell notwendig, dass dem Menschen möglichst nahe verwandt ist. Daher bieten nicht menschliche Primaten ideale Möglichkeiten, um verschiedene humanrelevante Fragestellungen zu bearbeiten. 2.2.8.1 Paviane (Papio spp.) und Schimpansen (Pan troglodytes) Paviane und Schimpansen sind für die Helicobacter-Forschung von Interesse, weil sich diese Tierspezies neben anderen nicht humanen Primaten durch ihre verwandtschaftliche Nähe zum Menschen anbietet. Dies gilt insbesondere für Schimpansen, deren evolutionäre Nähe sich in einer bis zu 99%igen Genomähnlichkeit widerspiegelt. Andererseits sind ethische Überlegungen bei dieser Versuchstierspezies von herausragender Bedeutung. In ihrer Studie zum natürlichen Vorkommen von Helicobacter-Bakterien bei Pavianen beschrieben MACKIE und O’ROURKE (2003) den Nachweis von H. pylori und H. heilmannii in Pavianmägen. Mit Hilfe von PCR-Proben des Antrums entdeckten sie eine 99 - 100%ige Übereinstimmung mit H. pylori-Genen und in Fundusproben eine 98 - 99%ige Übereinstimmung mit H. heilmannii-Genen. Die Autoren empfahlen weitere Studien dieser Art zur Verifikation der Verbreitung von H. pylori-Infektionen und Mischinfektionen mit anderen Helicobacter-Spezies bei Pavianen. In einer Vergleichsstudie von Pavianen und Schimpansen wurden fünf vorher seronegative Schimpansen mit jeweils einem von fünf verschiedenen LITERATURÜBERSICHT 33 Humanstämmen von H. pylori infiziert. HAZELL et al. (1992) beobachteten ausschließlich eine Kolonisation mit einem wenig passagierten H. pylori-Wildtyp (Stamm 8801, 2,5 × 109 KBE, orale Inokulation) bei den Schimpansen. Zwei vorher seronegative Paviane wurden nicht infiziert, aber zusammen mit den Schimpansen endoskopisch untersucht. Die Schimpansen zeigten eine spezifische Antikörperreaktion (IgG), die auf eine H. pylori-Infektion oder auf andere „Magenmukosa-assoziierte, spiralförmige Bakterien“ hinwies. Bei den H. pyloriseronegativen Pavianen war eine gastrische Kolonisation von „großen, spiralförmigen Bakterien“ ähnlich H. felis oder H. heilmannii (früher Gastrospirillium hominis) feststellbar. HAZELL und Mitarbeiter (1992) vertraten die Ansicht, dass diese spezifische Antikörperreaktion von Schimpansen die Identifizierung von Kandidaten für spätere Projekte in der Helicobacter-Forschung erleichtert und dies zu einer Bevorzugung von Schimpansen gegenüber Pavianen als Tiermodell führt. Trotz der hohen Kosten, die die Forschung mit Schimpansen mit sich bringt, waren HAZELL et al. (1992) der Meinung, dass dieses Tiermodell die Möglichkeit bietet, geeignete Ergebnisse zur Erforschung von Virulenzeigenschaften verschiedener H. pylori-Stämme, Therapiestrategien und Impfstoffentwicklung zu erlangen. Allerdings ist zu berücksichtigen, dass unter Arten- und Tierschutzaspekten der Einsatz dieser Spezies an höchste ethische Überlegungen gebunden ist. Auch Kosten- und Haltungsanforderungen limitieren den Einsatz dieser Spezies. 2.2.8.2 Japanmakaken (Macaca fuscata) Bedingt durch die geographische Nähe greifen insbesondere japanische Forschungsgruppen häufig auf Japanmakaken zurück. Dieses Tiermodell findet Verwendung in Studien zu Eradikationsstrategien. Auch auf dem Gebiet der Magenkarzinomforschung werden Japanmakaken erfolgreich eingesetzt. 34 LITERATURÜBERSICHT Im Rahmen der Eradikation von H. pylori und Regenerationsstudien an der Magenschleimhaut verwendeten SHUTO und Mitarbeiter (1993) Ampicillin (30 mg/kg oral), Natriumbikarbonat (1 g/Tier oral) und Famotidin (20 mg/kg i.m.) als Prämedikation. Vier H. pylori-Stämme (MCO 88155, MCO 88099, MCO 88142, MCO 88156 mit jeweils 109 KBE/ml) von jeweils zwei Humanpatienten mit Magen- und Duodenumulzera wurden per Gastroskop inokuliert. 28 Tage nach Etablierung der Infektion trat eine chronisch aktive Gastritis mit Pylorusdrüsenatrophie auf. Nach der Eradikation der Bakterien mit Ampicillin (30 mg/kg oral) konnte kulturell kein H. pyloriNachweis erbracht werden und der Grad der Gastritis reduzierte sich deutlich. In Studien zur Untersuchung der Regeneration von Magenulzera verwendeten KODAMA et al. (1996) die gleiche Versuchsanordnung wie die letztgenannten Autoren. KODAMA und Mitarbeiter (1996) beobachteten eine durch endoskopische Injektion von Essigsäure ausgelöste Ulkusbildung am Magen. Eine signifikante Verzögerung der Heilungstendenz in Anwesenheit von H. pylori war erkennbar. Der Nachweis wurde durch eine reduzierte Anzahl von PAS-positiven Schleimhautepithelzellen im Bereich des Ulkusrandes erbracht. Zu dem gleichen Ergebnis kamen OKUI et al. (1998). Bei vorausgegangener intragastrischer Injektion von 0,1 ml Ammoniumlösung (10%ig) zur Magenulkusinduktion verwendeten sie den H. pylori-Stamm mit den Virulenzfaktoren CagA+, VacA+ und vakuolisierendes Zytotoxin (VT+) zur Infektion der Japanmakaken. Zahlreiche Forschungsergebnisse aus Japan zur Karzinogenese an diesem Tiermodell liegen ebenso vor. FUJIOKA et al. (1997) war es in einer fünfjährigen Studie gelungen, eine persistente Kolonisation mit gleicher Prämedikation wie SHUTO et al. (1993) zu etablieren. Dabei verwendeten FUJIOKA und Mitarbeiter (1997) den H. pylori-Stamm OMU 92070 (CagA+, VacA+, VT+). Durch Messung der Zellproliferation über den immunhistochemischen Ki-67-Nachweis vermuteten die Autoren einen karzinogenen Effekt von H. pylori. Auch über Untersuchungen zum p53-Tumorsuppressorgen wurde ein Zusammenhang zwischen einer H. pylori- LITERATURÜBERSICHT 35 Infektion und der Bildung von Magenkarzinomen bei Japanmakaken nahegelegt (KODAMA et al. 1998; FUJIOKA et al. 2002; MURAKAMI et al. 2002). Japanmakaken bieten als Tiermodell sowohl Vorteile als auch Nachteile. Als Vorteil ist die nahe Verwandtschaft zum Menschen in Bezug auf Anatomie, Physiologie und Lebensdauer zu werten. Eine an die Situation beim Menschen angelehnte Simulation der chronischen H. pylori-Infektion über mehrere Jahre ist dadurch möglich. Neben der grundsätzlichen ethischen Problematik beim Einsatz nicht menschlicher Primaten wirken sich die hohen Anschaffungs- und Unterhaltskosten auf die Verwendung als Tiermodell nachteilig aus, so dass häufig nur kleine Tierzahlen in die Untersuchungen eingehen können. 2.2.8.3 Rhesusaffen (Macaca mulatta) Auch zum Rhesusaffen liegen Untersuchungen zur Pathogenese experimenteller H. pylori-Infektionen vor. In jüngerer Zeit hat sich dieses Tiermodell eine hervorragende Stellung zur Forschung auf dem Gebiet der Impfstoffentwicklung und der medizinischen Grundlagenforschung gesichert. Anfängliche Arbeiten mit diesem Tiermodell beschäftigten sich mit der Frage, ob Makaken-assoziierte H. pylori-Bakterienstämme bei Rhesusaffen natürlich vorkommen und ob sich Rhesusaffen mit humanisolierten H. pylori-Stämmen infizieren lassen (EULER et al. 1990; DUBOIS et al. 1991, 1994; HANDT et al. 1997; MATTAPALILL et al. 2000; SOLNICK et al. 2003). HANDT et al. (1997) führten an einer Kolonie von 23 adulten Rhesusaffen (ein bis drei Jahre alt) verschiedene Nachweismethoden wie die kulturelle Anzüchtung der Bakterien, histologischer Nachweis, Ureaseschnelltest, Serum IgG-Titerbestimmung, ELISA (humaner Pyloristat Test), modifizierter ELISA (benutzt homologes H. pyloriAntigen und Anti-Rhesusaffen-Antikörper Konjugat) und PCR Analyse durch. Mit 36 LITERATURÜBERSICHT einer Treffergenauigkeit von jeweils 91 % des PCR Testes und des modifizierten ELISA für H. pylori bewerteten die Autoren diese beiden Tests als wichtigste Methoden zur Überwachung und Selektion von Rhesusaffen für klinische Studien oder Langzeituntersuchungen zur Pathogenese. SOLNICK und Mitarbeiter (2003) untersuchten 20 neugeborene Rhesusaffen und Muttertiere mittels Gastroskopie alle vier Wochen mit regelmäßigen Magenbiopsien. Bereits im Alter von 12 Wochen waren acht neugeborene Rhesusaffen (40 %) kulturell H. pylori-positiv und nach einem Jahr lag die Prävalenz der Jungen bei 90 %. Aufgrund der signifikant hohen Infektionsrate von Neugeborenen mit infizierten Müttern in der 12. Lebenswoche vermuteten die Autoren, dass eine Übertragung der Bakterien in der peripartalen Periode stattfand. EULER und Mittarbeiter (1990) berichteten von natürlich vorkommenden H. pylori-Infektionen bei 12 Rhesusaffen. Die Arbeitsgruppe inokulierte über eine Nasenschlundsonde zwei Tiergruppen mit dem humanisolierten H. pylori-Stamm UC12228 (6 × 108 KBE) oder dem Rhesusaffen-isolierten H. pyloriStamm UC12476 (6 × 106 KBE). Im Vergleich dazu wurde eine Gruppe mit Javaneraffen (Macaca fascicularis) mit dem humanisolierten H. pylori-Stamm 30785 (5 × 109 KBE Inokulum) inokuliert. Die Versuchsgruppe der Javaneraffen konnte nicht mit einem H. pylori-Stamm infiziert werden, während die Rhesusaffengruppen für beide Stämme hochempfänglich (34 %) waren. Während EULER et al. (1990) in ihrer Studie ein natürliches Vorkommen von H. pylori bei Javaneraffen nicht bestätigen konnten, kamen REINDEL und Mittarbeiter (1999) zu einem anderen Ergebnis. Sie führten kulturelle, histologische und immunhistochemische Nachweise nach der Sektion der Tiere durch. Als Ergebnis stellten sie fest, dass sieben von 44 (16 %) Javaneraffen mit multifokalen Rötungen der Magenschleimhaut mit H. pylori infiziert waren. Darüber hinaus waren alle 63 untersuchten Javaneraffen dieser Studie Träger von „Large Gastrointestinal Spirals“ (LGIS). DUBOIS et al. (1996) kamen zu ähnlichen Resultaten wie EULER et al. (1990). Bei Arbeiten mit vier humanen H. pylori-Stämmen (92-26, CagA+, VT+; 88-23, CagA+, VT+; U-1, Phänotyp unbekannt; U-2, CagA+, VT-) und einem Rhesusaffenassoziierten H. pylori-Stamm (788-2, CagA+, VT+) stellten sie fest, dass eine LITERATURÜBERSICHT 37 experimentelle Infektion unterschiedlicher Dauer mit Human- und Makakenassoziierten Bakterienstämmen möglich war, diese aber von dem Genotyp, der Physiologie und dem immunologischen Status des Wirtes und der Charakteristika des H. pylori-Stammes abhing. SOLNICK et al. (2001) versuchten vor einer experimentellen H. pylori-Infektion H. heilmannii-ähnliche Bakterien zu eradizieren. Als Prämedikation wurden die Tiere mit Omeprazol (0,3 mg/kg oral), Clarithromycin (11 mg/kg oral), Bismuth Subsalicylat (20 mg/kg oral) und Amoxicillin (14 mg/kg oral) behandelt. Anschließend erfolgte eine weitere Behandlung der Tiere mit Cimetidin (10 mg/kg) eine Stunde vor der bakteriellen Inokulation mit dem humanen H. pyloriStamm J166 (VacA+, CagA+). Die Mindestdosis einer oralen Infektion mit Cimetidinvorbehandlung lag bei 104 KBE. Ohne eine Prämedikation konnte eine H. pylori-Infektion bei allen Versuchstieren mit 105 KBE dieses Stammes etabliert werden. MÄTZ-RENSING et al. (2001) versuchten über eine Vorbehandlung mit Amoxicillin (30mg/kg oral) und Metronidazol (30 mg/kg oral) die sogenannten „Large Gastrointestinal Spirals“ (LGIS) zu eradizieren, bevor zwei humanpathogene H. pylori-Stämme (BO417 und BO418, jeweils VacA+, CagA+, FlaB+) über ein Gastroskop appliziert wurden. Zwar gelang der Gruppe über 18 Monate eine persistente Infektion mit einem der beiden humanpathogenen Bakterienstämme (BO417), sogenannte LGIS wurden aber erneut festgestellt. DUBOIS et al. (1995) wiesen auf die Frage der Übertragungswege hin, die Autoren gingen aber von einer oral-oralen und fäkal-oralen Transmission ähnlich wie beim Menschen aus. Studien zur Pathogenese zeigten, dass die krankhaften Veränderungen des Magens denen des Menschen sehr nahe kommen. Zu den Alterationen bei Rhesusaffen gehören eine chronisch aktive Gastritis mit Lymphfollikelbildung in der Lamina propria und damit einhergehender mononukleärer und neutrophiler Granulozyteninfiltration unter Ausbildung einer Schleimhautatrophie (DUBOIS 1998; EATON 1999; MÄTZ-RENSING et al. 2001). 38 LITERATURÜBERSICHT Große Bedeutung kommt inzwischen der Entwicklung von Impfstoffen unter Verwendung von rekombinanten H. pylori-Urease-Vakzinen zu. DUBOIS et al. (1998) zeigten bei zwei zu vergleichenden Tiergruppen mit oraler Applikation von entweder 8 mg rUrease + 25 µg LT oder Placebo + 25 µg LT eine deutliche Reduzierung des Gastritisgrades und der bakteriellen Besiedlung der Magenschleimhaut in der erstgenannten Gruppe. Die Autoren sprachen die Empfehlung aus, eine Impfung für Kleinkinder in Gebieten mit hohem Infektionsdruck durchzuführen. In einem ähnlichen Versuchsansatz kamen LEE et al. (1999) zu dem Schluss, dass die orale Vakzination mit 4 mg rUrease + 100 µg LT und anschließender parenteraler Boosterung mit 100 µg rUrease + 1 mg Alum® (Aluminiumhydroxid) eine deutliche protektive Immunität gegen eine H. pylori-Infektion bewirkte. In jüngster Zeit konzentrieren sich einige Untersuchungen unter Verwendung von Rhesusaffen auf die medizinische Grundlagenforschung. So gelang es MAHDAVI et al. (2002) das Sialyl-Dimer-Lewis-x Glycosphingolipid (sLex) als Wirtsrezeptor zu identifizieren. Die Autoren konnten zeigen, dass eine H. pylori-Infektion (dominanter Stamm J166, CagA+, Lewis-B-Blutgruppenantigen- und sLex-bindendes Isolat) die Bildung von Sialyl-Lewis-x Antigenen in der Magenmukosa stimuliert. Das entsprechende H. pylori-SabA-Adhäsin ermöglichte dem Bakterium die Adhärenz an die Magenschleimhaut. Dieses Adhäsin sahen die Autoren als mögliche Erklärung für die Virulenz und außerordentliche Chronizität der Infektion an. Eine signifikante Reduzierung der Adhärenz von H. pylori an Magenepithel und -drüsen konnten die Autoren mit einer nicht näher beschriebenen Vorbehandlung der Tiere mit einem sLex-Konjugat erreichen. MATTAPALLIL et al. (2000) infizierten orogastrisch vier Rhesusaffen mit einem Rhesusaffen-isolierten H. pylori-Stamm N246C3 (CagA+, 2 x 108 KBE). Die natürlich infizierten Tiere mußten sich vor der Inokulation einer Eradikationstherapie mit Omeprazol (0,3 mg/kg), Clarithromycin (11 mg/kg) Bismutsalicylat (20 mg/kg) und Amoxicillin (14 mg/kg) über zwei Wochen unterziehen. Die Autoren konnten zeigen, dass es unter einer akuten H. pylori-Infektion hauptsächlich zu einer CD4+-T- LITERATURÜBERSICHT 39 Helferzellen-(Th1)-dominierten Immunantwort mit der Produktion von TumorNekrose-Faktor-(TNF)-α, Interferon (IFN)-γ und Interleukin (IL)-2 kam. In der anormalen Dominanz der T-Helfer-Zellen-1 (Th1)-dominierten Immunantwort vermuteten MATTAPALLIL und Mitarbeiter (2000) den Grund, dass innerhalb von 12 Wochen noch keine Heilung erkennbar war. DANDEKAR et al. (2003) verwendeten in ihrem Versuchsansatz einen humanisolierten H. pylori-Stamm (J 166, CagA+, VacA+) und inokulierten 105 KBE in H. pylori-freie Affen. Sie beobachteten in den ersten acht Wochen einer H. pyloriInfektion eine deutliche Erhöhung der Fas-(F7 associated surface protein)-LigandenExpression von CD4+-und CD8+-T-Zellen. Damit einhergehend war eine gesteigerte Apoptose von gastrischen T-Lymphozyten festzustellen. Die Autoren vermuteten, dass eine transiente Fas-vermittelte Apoptose bei gastrischen Lymphozyten eine kompensatorische Immunantwort auf die initiale T-Zell-Entzündungsantwort einer akuten H. pylori-Infektion war. Zusammenfassend lässt sich sagen, dass das Tiermodell Rhesusaffe viele Vorteile im Vergleich zu anderen Tiermodellen hat. Das Immunsystem dieser Affen reagiert ähnlich wie das des Menschen und ist für den Rhesusaffen als wichtigsten Vertreter der in der biomedizinischen Forschung eingesetzten Altweltaffen sehr gut charakterisiert. Die Tiere stellen einen natürlichen Wirt für H. pylori dar, was die experimentelle Infektion erleichtert. Vergleichbare anatomische Voraussetzungen und die Größe der Tiere erlauben endoskopische Untersuchungen mit Biopsieentnahmen. Die lange Lebensspanne erlaubt Longitudinalstudien, was bei einer chronischen Infektionskrankheit sinnvoll ist. Allerdings wirken sich hohe Anschaffungs- und Unterhaltskosten negativ aus, so dass nur begrenzte Studien an kleinen Tierzahlen durchgeführt werden. Vergleicht man die verschiedenen in der Literatur dokumentierten Einsatzmöglichkeiten der verschiedenen Tierspezies im Rahmen der H. pylori- 40 LITERATURÜBERSICHT Forschung, so fällt auf, dass Makaken (M. mulatta, M. fuscata) eine herausragende Stellung einnehmen (Tab.1). Tab. 1: Übersicht zur Verwendung von H. pylori-Tiermodellen in der Literatur Helicobacter pylori -Forschungsansatz Tierart natür- EtablieUlkuslokale EntPharmaTrans- PathoKanzeroVirulenz- Immun- VakzineTherapie liche rung der forzündungskokinetik mission genese genese faktoren antwort regime Infektion Infektion schung antwort + Mäuse Ratten + Gerbile Meerschweinchen Katzen + + + + + ++ + + + ++ ++ + + + + ++ + + Hunde Schweine + ++ + + + + + + Paviane + + Schimpansen + + Japanmakaken + + + + + ++ ++ ++ + + + + Rhesusaffen + + + + + ++ ++ ++ + ++ ++ ++ + = Eignung, ++ = besondere Eignung MATERIAL UND METHODEN 41 Eigene Untersuchungen 3 3.1 Material und Methoden 3.1.1 Tiermaterial Für die Untersuchungen einer experimentellen H. pylori-Infektion standen vier Rhesusaffen (Macaca mulatta) zur Verfügung, wobei ein Tier als Kontrolltier diente (Tab. 2). Die Rhesusaffen stammten aus dem Zukauf (Fa. Laboratory Universal Breeders and Services, Yemasee, USA) eigens für Versuchszwecke gezüchteter Tiere und wurden in Einzelkäfigen mit verschiebbarer Rückwand in der Abteilung Virologie und Immunologie des Deutschen Primatenzentrums in einem Raum gehalten. Die Affen waren vor Beginn der Versuchsreihe zwischen zweieinhalb und vier Jahre alt und wogen zwischen 2,2 kg und 4,3 kg. Sie wurden vor Beginn des Experimentes untersucht und waren klinisch gesund. Im Differentialblutbild waren keine Abweichungen von der Norm zu bemerken. Die Mägen der Tiere waren klinisch unauffällig, frei von einer natürlichen H. pylori-Infektion, wiesen aber eine latente Besiedlung mit Large Gastrointestinal Spirals (LGIS) (Kap. 3.1.12.2) auf. Die Affen wurden mit Primatenkuchen (ssniff Spezialitäten GmbH, Soest) und Obst gefüttert, Wasser stand ihnen ad libitum zur Verfügung. Die Versuche wurden von der Bezirksregierung Braunschweig genehmigt (AZ 509.42502/08-08.98 V 3). Tab. 2: Tiermaterial Tiernummer 7743 Geburtsdatum 16.04.1994 Geschlecht männlich Gewicht 4,3 kg 8156 01.01.1994 männlich 3,2 kg 9050 01.01.1996 männlich 2,2 kg 9048 01.01.1996 männlich 2,5 kg 42 EIGENE UNTERSUCHUNGEN 3.1.2 Infektiöse Bakterienstämme Die H. pylori-Bakterienstämme NCTC11637, BO417 und BO418, die für die erste Infektion der Tiere eingesetzt wurden, wurden von der Bochumer Universitätsklinik, Abteilung Medizinische Mikrobiologie, unter der Leitung von PD Dr. S. Suerbaum zur Verfügung gestellt. Bei dem Stamm NCTC11637 handelte es sich um einen Streptomycin-resistenten Standardstamm, der mehrfach passagiert wurde. Die Stämme BO417 und BO418 werden mit ihren Eigenschaften in Kapitel 3.1.17.5 näher beschrieben. Aus dem Institut für Hygiene und Mikrobiologie der JuliusMaximilians-Universität Würzburg unter der Leitung von Prof. Dr. S. Suerbaum stammten die H. pylori-Bakterienstämme BO238, CC28c und RE7006 mit denen die Superinfektion dreieinhalb Jahre nach der ersten Infektion durchgeführt wurde. Stamm MM1303 war ein Isolat eines Rhesusaffen aus eigener Zucht des DPZ. Eine nähere Definition der Stämme wird in Kap. 3.1.17.5 gezeigt. Die in dieser Studie an drei Rhesusaffen (Tiernummern 7743, 8156 und 9050) getesteten H. pylori-Stämme werden hinsichtlich ihrer Herkunft und ihrer Virulenzeigenschaften nachfolgend beschrieben (siehe dazu AKOPYANZ et al. 1992; SUERBAUM et al. 1998). Bei drei Stämmen handelte es sich um humanpathogene Stämme, die von deutschen Patienten mit Oberbauchbeschwerden gewonnen wurden. Alle zeigten die Virulenzeigenschaften VacA+, CagA+ und FlaB+. Sie trugen die Bezeichnungen NCTC11637, BO417 und BO418. Der H. pylori-Stamm BO238 zeigte ausschließlich die Virulenzeigenschaften VacA+ und FlaB+ und stammte ebenso von einem deutschen Patienten mit Oberbauchbeschwerden. Der von einem afrikanischen Patienten mit Oberbauchbeschwerden isolierte H. pylori-Stamm CC28c besaß die Virulenzeigenschaften VacA+, CagA+ und FlaB+. MATERIAL UND METHODEN 43 Das Isolat des H. pylori-Stammes RE7006 zeigte ebenfalls die Virulenzeigenschaften VacA+, CagA+ und FlaB+ und stammte von einem asiatischen Patienten mit Oberbauchbeschwerden. Als einziger Bakterienstamm eines Rhesusaffen fand das Isolat des H. pyloriStammes MM1303 mit den Virulenzeigenschaften VacA+, CagA+ und FlaB+ Verwendung. Eine Übersicht gibt Tabelle 3. Tab. 3: Übersicht der eingesetzten H. pylori-Stämme Virulenzfaktoren CagA VacA FlaB NCTC11637 deutscher Patient mit Oberbauchbeschwerden + + + BO417 deutscher Patient mit Oberbauchbeschwerden + + + BO418 deutscher Patient mit Oberbauchbeschwerden + + + BO238 deutscher Patient mit Oberbauchbeschwerden + + CC28c afrikanischer Patient mit Oberbauchbeschwerden + + + RE7006 asiatischer Patient mit Oberbauchbeschwerden + + + MM1303 Rhesusaffe + + + Stamm-Nr. Herkunft des Helicobacter pylori -Stammes 3.1.3 Eradikationstherapie Vor der experimentellen Infektion mit H. pylori wurden die vier Rhesusaffen einer Eradikationstherapie unterzogen, um vorhandene LGIS zu eliminieren. Dabei wurden drei verschiedene Therapien angewendet: Monotherapie Amoxicillin-Sirup (Amoxypen® 250 Saft, Fa. Grünenthal, Stollberg) einmal täglich über drei Wochen in einer Dosierung von 30 mg/kg per os. Dualtherapie Amoxicillin-Sirup (Amoxypen® 250 Saft) zusammen mit Metronidazol einmal täglich über 7 Tage in einer Dosierung von jeweils 30 mg/kg per os. 44 EIGENE UNTERSUCHUNGEN Quadrupeltherapie Amoxicillin (7 mg/kg), Clarythromycin (10 mg/kg), Omeprazol (0,4 mg/kg) und Wismutsubsalicylat (10 mg/kg) zweimal täglich per os über die Dauer von 10 Tagen. Amoxicillin, Omeprazol und Wismutsubsalicylat wurden zusammen in Form einer schmackhaften Tablette (MD’s, Fa. bioserv, Frenchtown, USA) verabreicht, während der Clarythromycin-Saft Klacid Saft® (Fa. Abbot, Wiesbaden) einem Brei zugesetzt wurde. 3.1.4 Apparative Hilfsmittel der Probengewinnung Alle endoskopischen Maßnahmen erfolgten mit einem Endoskop des Typs Fiberskop FG-100FP (Fa. Fujinon, Düsseldorf). Die Gesamtlänge des Gerätes betrug 1350 mm, die Arbeitslänge lag bei 1030 mm. Der Einführungsschlauch hatte einen Durchmesser von 9,8 mm, der Tiefenschärfebereich des Endoskops lag bei 5 - 100 mm. Die Biopsiezange FB 19K (Fa. Olympus, Hamburg) sowie die Biopsiezange K 2416 RP (Fa. Fujinon, Düsseldorf) wurden zur Entnahme von Probeexzisionen verwendet. Dabei handelte es sich um runde bzw. ovale Zangen, mit denen 1,8 mm bzw. 2,4 mm große Biopsien entnommen werden konnten. Ein Mindestdurchmesser des Arbeitskanals von 2 mm war für die endoskopischen Geräte erforderlich. Die Zytologiebürste „focus“ (Fa. Fujinon, Düsseldorf) und die Zytologiebürste der Fa. Wiesner Med. Technik in Göttingen wurde zur Durchführung oberflächlicher Schleimhautabstriche verwendet. Zur Infektion der Tiere mit H. pylori wurde die Sonde PR 6Q (Fa. Olympus, Hamburg) verwendet, die an ihrem Ende über einen Anschluss für einen Spitzenkonus verfügt. MATERIAL UND METHODEN 45 3.1.5 Gastroskopie 3.1.5.1 Vorbereitung der Tiere und Narkose Zur Leerung des Magens vor einer Biopsieentnahme wurde eine Nahrungskarenz von 24 Stunden für die Tiere eingehalten. Trinkwasser stand den Tieren ad libitum zur Verfügung. Zum Erreichen einer vollständigen Sedation und Analgesie wurde eine Injektionsnarkose durchgeführt. Den Tieren wurde dazu die „Göttinger Mischung II“ (GM II) in einer Dosierung von 0,1 ml/kg KGW intramuskulär injiziert. Göttinger Mischung II setzte sich zusammen aus: 5 ml Ketamin (100 mg/ml) 1 ml Xylazin (10%ig) 0,1 ml Atropin (1%ig) 3,9 ml Aqua ad injectionem Bei Bedarf wurde Ketamin während der endoskopischen Untersuchung in einer Dosierung von 0,1 ml/kg KGW nachdosiert. 3.1.5.2 Durchführung der Gastroskopie Zur endoskopischen Untersuchung wurde der Rhesusaffe in die linke Seitenlage gebracht. Der Untersucher stand rechts neben dem Tier, den Blick auf den Kopf des Affen gerichtet. Nach dem Einfügen eines Beißringes zwischen die Kiefer des Tieres erfolgte das Einführen des leicht abgewinkelten Distalendes des Endoskops (Kap. 3.1.4) durch die Öffnung des Beißringes. Unter Sichtkontrolle wurde der Endoskopschlauch vorsichtig an der Kehlkopföffnung vorbei in den Ösophagus vorgeschoben. Dabei wurde zur besseren Sichtkontrolle minimal Luft insuffliert. Nach 46 EIGENE UNTERSUCHUNGEN der Passage des Ösophagus und der Kardia wurde der Endoskopschlauch in den Magen vorgeschoben. Unter Adspektion der einsehbaren Schleimhautabschnitte wurde das Endoskop unverzüglich weiter in Richtung Antrum vorgeschoben. An dieser Lokalisation wurde mit der Ausführung der verschiedenen endoskopischen Techniken begonnen. Mit der Zytologiebürste (Kap. 3.1.4) konnte ein Schleimhautabstrich und anschließend eine Magenbiopsie mit der Biopsiezange entnommen werden. Im Falle der Infektion wurde hier mit der Sonde die infektiöse Dosis von H. pylori appliziert. Durch Zurückziehen und eine Achsendrehung des Endoskopschlauches konnte anschließend die Kardiaregion eingesehen werden. Auch hier wurde eine Bürstenzytologie und eine Probeexzision vorgenommen. Nach weiterem Zurückziehen des Endoskopschlauches konnten die entsprechenden Proben auch im Fundusbereich entnommen werden. Mit der Entfernung des Endoskops und des Beißringes war die Probenentnahme an dem Versuchstier abgeschlossen. 3.1.6 Endoskopische Probennahme 3.1.6.1 Biopsiezange Um das Ziel einer bestmöglichen Biopsie zu erreichen, wurde die Biopsiezange erst nach Erreichen der gewünschten Lokalisation aus der Optik ausgefahren. Nach der rechtwinkligen Positionierung der Zange zur Schleimhautoberfläche wurde die geöffnete Zange unter leichtem Druck auf die Schleimhaut geschoben und geschlossen. Die erfasste Schleimhaut wurde mit dem Zurückziehen der Zange an die Biopsiekanalöffnung herangezogen und durch einen schnellen Ruck abgerissen. Nach Entfernung der geschlossenen Biopsiezange aus dem Biopsiekanal konnte das Bioptat durch Abschütteln in den Flüssigmedien oder mit Hilfe einer Kanülenspitze in die Probengefäße überführt werden. Nach der Reinigung der Zange in Spülflüssigkeit wurde die nächste Biopsie entnommen. MATERIAL UND METHODEN 47 3.1.6.2 Zytologiebürste Um einer unerwünschten vorzeitigen Verunreinigung der Bürste vorzubeugen, blieb die Bürste bis zum Erreichen der ausgewählten Entnahmeregion im Arbeitskanal zurückgezogen. In einem möglichst flachen Winkel wurde die Bürste an die Schleimhaut angesetzt und durch Vorwärts- und Rückwärtsbewegungen mehrfach über die Schleimhautoberfläche bewegt. Außerhalb des Tieres wurde die Bürste auf einem Objektträger ausgestrichen und anschließend auf ganzer Breite auf Blut- oder H. pylori-Agarplatten abgerollt. Nach gründlicher Reinigung der Bürste unter fließendem Wasser konnte der nächste Abstrich genommen werden. 3.1.7 Infektion und Superinfektion der Rhesusaffen Die erste intragastrale Infektion mittels Endoskop wurde am 02.11.1998 durchgeführt. Dabei standen die H. pylori-Stämme BO417 und BO418 mit einem Inokulum von 2,56 × 106 KBE in 3 ml Brucella Bouillon zu Verfügung. Die Superinfektion der gleichen Bakterienstämme erfolgte drei Tage später am 05.11.1998 mit einem Inokulum von 3,32 × 106 KBE in 4 ml Brucella Bouillon. Eine Kolonisation mit dem H. pylori-Stamm NCTC11637 unter gleichen Bedingungen schlug fehl (MÄTZ-RENSING et al. 2001), so dass dieser Stamm keine weitere Berücksichtigung fand. Etwa dreieinhalb Jahre nach der ersten Infektion erfolgte die Superinfektion mit den H. pylori-Stämmen BO238, CC28c, RE7006 und MM1303 als gemischte Suspension am 09.04.2002. Das Inokulum betrug 106 - 108 KBE resuspendiert in 1 ml Brucella Bouillon. Bei der Infektion mit H. pylori wurden die gleichen Vorbereitungen wie bei der endoskopischen Untersuchung getroffen (Kap. 3.1.5.2). Nach der Einführung des Endoskops in den Magen des Rhesusaffen wurde es vor dem Pylorus plaziert. 48 EIGENE UNTERSUCHUNGEN Mittels einer aufgesetzten Spritze über die in den Arbeitskanal eingeführte Sonde (Kap. 3.1.4) konnten nachfolgende Flüssigkeiten im Magen verabreicht werden. Nacheinander wurden 5 ml Natriumbikarbonat zur Abpufferung des Magenmilieus, 1 ml der mit H. pylori angereicherten Brucella Bouillon zur Infektion und 2 ml Wasser zum Nachspülen appliziert. Unter langsamem Zurückziehen der Sonde während der Applikation konnte die Brucella Bouillon vom Pylorus bis zum Korpus verteilt werden. Danach wurde das Endoskop vollständig entnommen, gereinigt und desinfiziert. 3.1.8 Versuchsplan der Infektionen und Biopsienahmen Nach einem zeitlich genau festgelegten Versuchsplan wurden alle Abläufe von Infektion, Superinfektion, Probenentnahmen und Sektion systematisch durchgeführt. Es muss erwähnt werden, dass die Etablierung des Tiermodells, die erste Infektion der Rhesusaffen und die Auswertung der Proben des ersten Jahres nach der Infektion Gegenstand der Dissertation von Frau Emanuela Kunz waren (KUNZ 2000). Die vorliegende Dissertation schließt sich mit der Auswertung der Proben an die Arbeit von Frau Kunz an und beginnt mit dem Entnahmezeitpunkt 19 Monate nach der Infektion (Tab. 4). Die in dieser Arbeit häufig zitierte Literatur von MÄTZRENSING et al. (2001) stellt eine Zusammenfassung von der Infektion der Rhesusaffen bis zur Auswertung der Proben eineinhalb Jahre nach der Infektion dar. Eine vollständige Probenentnahme begann mit der Gastroskopie zur makroskopischen Beurteilung der Magenschleimhaut. Anschließend erfolgte die Entnahme der Magenbiopsien an drei Magenlokalisationen (Kardia, Fundus und Antrum). An den drei Regionen des Magens wurden jeweils ein Bürstenabstrich und acht Magenbiopsien genommen. Jeweils eine der Magenbiopsien gelangte in ein Röhrchen mit Brucella Bouillon (Bakteriologie, Anh.), in 4%iges Formaldehyd (Pathomorphologie, Anh.), in 2,5%iges Glutaraldehyd (Pathomorphologie) und in ein Ureasetest-Medium (Anh.). Des Weiteren wurde jeweils eine Biopsie der drei MATERIAL UND METHODEN 49 Magenlokalisationen in einem Röhrchen mit Einfriermedium (PCR, Anh.), RPMIMedium (PCR, Anh.), ohne Einfriermedium (PCR) und in einem leeren Röhrchen (RNA-Untersuchung) aufbewahrt. Die Bürstenabstriche wurden sofort auf Blutagarund H. pylori-Agarplatten ausgestrichen. Darüber hinaus wurden von den Tieren noch Blutproben in Serumröhrchen genommen. Diesem Entnahmeschema folgend wurden die Proben zu festgelegten Zeitpunkten gewonnen (Tab. 4). Tab. 4: Arbeitsplan Zeitpunkt 02.11.1998 05.11.1998 16.06.2000 10.11.2000 06.11.2001 26.02.2002 09.04.2002 12.04.2002 16.04.2002 23.04.2002 13.05.2002 04.06.2002 02.07.2002 06.08.2002 27.08.2002 17.09.2002 05.11.2002 26.11.2002 17.12.2002 12.05.2003 15.09.2003 17.09.2003 1) Zeit nach Infektion 19 mpi 24 mpi 36 mpi 39 mpi 42 mpi 3 dpsi 1 wpsi 2 wpsi 4 wpsi 8 wpsi 12 wpsi 16 wpsi 20 wpsi 23 wpsi 30 wpsi 33 wpsi 36 wpsi 57 wpsi 75 wpsi 75 wpsi Maßnahme bei Tier 7743 Tier 8156 Tier 9050 Tier 9048 1. Infektion 2. Infektion 1) vollständige Probenentnahme vollständige Probenentnahme vollständige Probenentnahme vollständige Probenentnahme Superinfektion vollständige Probenentnahm e vollständige Probenentnahm e vollständige Probenentnahm e vollständige Probenentnahm e vollständige Probenentnahm e vollständige Probenentnahm e vollständige Probenentnahm e vollständige Probenentnahm e vollständige Probenentnahm e vollständige Probenentnahm e vollständige Probenentnahm e vollständige Probenentnahm e vollständige Probenentnahm e Sektion Sektion Sektion Sektion - Die ersten 12 Monate der Infektionsphase sind Gegenstand der Dissertationsarbeit KUNZ (2000) und aus diesem Grund nicht näher aufgeführt und bearbeitet. 50 EIGENE UNTERSUCHUNGEN 3.1.9 Anlegen einer Bakterienkultur zur Infektion Die für die Superinfektion vorgesehenen H. pylori-Kulturen stammten von Herrn Dr. Christian Kraft aus dem Institut für Hygiene und Mikrobiologie der Julius-MaximiliansUniversität Würzburg. Die als Einfrierkultur (-80° C) vorliegenden Helicobacter-Stämme wurden angetaut, ca. 50 µl der Kultur entnommen und auf eine Blutagarplatte aufgetropft. Die Agarplatten wurden anschließend bei 37° C für 48 Stunden in einem Anaerobiertopf unter mikroaerophilen Bedingungen (5 % O2, 5 % CO2, 90 % N2) durch Benutzung eines Anaerocult C-Beutels (Merck, Darmstadt) angezüchtet. Die angewachsenen Bakterien wurden bei der ersten Überimpfung auf eine komplette Agarplatte expandiert und im Folgenden alle zwei Tage auf eine frische Agarplatte überimpft. 3.1.10 Bestimmung der infektiösen Dosis Für die Anzucht von H. pylori im Flüssigmedium wurden die Bakterien auf 3 Agarplatten für 20 - 24 Stunden unter mikroaerophilen Bedingungen angezüchtet. Der Zellrasen dieser Agarplatten wurde in 5 ml Flüssigkulturmedium transferiert. Als Kulturmedium wurde Brain-Heart-Infusion Medium (Anh.) verwendet. Das Medium enthielt die Antibiotika Vancomycin (10 µg/ml), Polymyxin B (3,2 µg/ml), Trimethoprim (5 µg/ml) und Amphotericin B (4 µg/ml) sowie 5 % hitzeinaktiviertes Pferdeserum (Fa. Oxoid, Wesel). Zur Bestimmung der Zellzahl wurde die optische Dichte (OD) bei 600 nm mit dem Photometer Uvikon 810 (Fa. Kontron, Neufahrn) gemessen. Dabei entsprach eine OD600 = 1 der Bakterienzahl von 3 x 108 Bakterien. Die Start-OD der Bakterienkultur wurde ausgehend von der Messung auf eine OD600 von 0,05 (1,5 x 107 Bakterienzellen/ml) eingestellt und in einem Anaerobiertopf in mikroaerophiler Atmosphäre bei 37° C in einem Schüttelinkubator durchgeführt. MATERIAL UND METHODEN 51 3.1.11 Mikrobiologische Untersuchungen 3.1.11.1 Bakterienkultur Die Aufbewahrung von Biopsien, von denen eine Kultur angelegt werden sollte, erfolgte bis zur weiteren Bearbeitung in Brucella Bouillon. Anschließend wurden die Biopsien mit einer Pinzette zerquetscht, um eine größere Oberfläche zu erzielen. Die so bearbeitete Biopsie wurde auf einer H. pylori-Agarplatte ausgestrichen und der verbleibende Rest der Biopsie aufgelegt. Anschließend wurden die Agarplatten in einem Anaerobiertopf unter mikroaerophilen Bedingungen für 3 - 5 Tage bei 37° C kultiviert. Eine Inkubation der während der Endoskopie von den bürstenzytologischen Abstrichen angelegten Blutagarplatten (aerobe Bebrütung bei 37° C) und H. pyloriAgarplatten erfolgte in gleicher Weise. Die gewachsenen Kulturen, die der Morphologie von H. pylori entsprachen, wurden vereinzelt und in Reinkultur gebracht. Eine molekularbiologische Untersuchung von gewachsenen Kulturen erfolgte für die Identifizierung der Bakterien als H. pylori-Stämme und die genaue Benennung des Bakterienisolats (Kap. 3.1.17). 3.1.11.2 Ureasetest Eine Biopsie jeder Magenlokalisation wurde direkt nach der Entnahme in ein Ureasetest-Medium aus Urea Brooth Base und 40 % Harnstoff (Fa. Oxoid, Wesel) überführt. Dabei handelt es sich um einen Farbindikatortest, der mittels Farbumschlag die Verstoffwechselung des Harnstoffs zu Ammoniak signalisiert. Ein daraus resultierender Anstieg des pH-Wertes wird durch Farbumschlag des beigefügten Indikators Phenolrot von gelb zu rot ersichtlich. Eine Inkubation des 52 EIGENE UNTERSUCHUNGEN Ureasetest-Mediums maximal 24 Stunden bei Zimmertemperatur vor Ablesen und Bewerten des Ergebnisses ist dazu erforderlich. 3.1.12 Lichtmikroskopische Untersuchungen 3.1.12.1 Biopsiematerial Zur Vorbereitung für die lichtmikroskopischen Untersuchungen wurden die bei den endoskopischen Untersuchungen gewonnenen Probeexzisionen nach 24stündiger Fixierung in 4%igem, neutral gepufferten Formaldehyd zunächst in Kunststoffkapseln überführt. Aufgrund der geringen Größe der Biopsien wurden diese zuvor in ein flüssigkeitsdurchlässiges Papier eingeschlagen, um einen Verlust der Biopsien während der Einbettung zu verhindern. Im weiteren Verlauf erfolgte nach laborüblicher Methode (Anh.) im Hypercenter XP (Fa. Shandon, Frankfurt) eine automatische Einbettung in Paraplast. Die Ausrichtung der Gewebeproben wurde beim Ausgießen in die Formen berücksichtigt. Unter Zuhilfenahme einer Lupe wurden die endoskopischen Probeexzisionen nach ihrer Schleimhautoberfläche ausgerichtet und so ausgegossen, dass beim späteren Anschneiden der Paraplastblöcke ein Anschnitt des Schleimhautquerschnittes gewährleistet war. Als nächster Arbeitsschritt folgte die Anfertigung von 2 µm dicken Gewebeschnitten mit dem Schlittenmikrotom HM 400 R (Fa. Microm, Heidelberg). Zur lichtmikroskopischen Auswertung der histomorphologischen Befunde wurden die Schnitte auf Standardobjektträger aufgezogen und nach Trocknung im Wärmeschrank nach laborüblichem Protokoll automatisch im Färbeapparat (Fa. Shandon, Frankfurt) Immunhistochemie mit Hämalaun-Eosin (Anh.) gefärbt. Im Rahmen der wurden die Gewebeschnitte auf Adhäsionsobjektträger aufgezogen. Bei der abschließenden lichtmikroskopischen Untersuchung wurden die Befunde protokolliert sowie fotografisch dokumentiert (Kap. 3.1.15). MATERIAL UND METHODEN 3.1.12.2 53 Nachweis von Large Gastrointestinal Spirals Der Nachweis von Large Gastrointestinal Spirals (LGIS) wurde im ersten Jahr der Studie als Teil der Arbeit von KUNZ (2000) mit der Warthin-Starry-Silberfärbung (STEINER u. STEINER 1944) mit einer Modifikation nach Steiner geführt. In der vorliegenden Arbeit wurden LGIS ab 19 Monate nach der Infektion lichtmikroskopisch nachgewiesen. Mit Hilfe des Lichtmikroskopes Axiolab (Fa. Carl Zeiss AG, Oberkochen) unter Benutzung eines 63er Objektives konnten LGIS anhand der Größe und Morphologie identifiziert werden. 3.1.12.3 Die Objektträgerausstriche während der endoskopischen Untersuchungen angefertigten Objektträgerausstriche wurden für die lichtmikroskopische Untersuchung hitzefixiert und anschließend nach Giemsa (Anh.) gefärbt. Von den gewonnenen Magenschleimhautproben wurde zusätzlich ein Ausstrich angelegt, der nach Hitzefixation mit Gram (Anh.) gefärbt wurde. Bei der abschließenden Untersuchung wurden die Ausstriche ausgewertet und die Befunde protokolliert. 3.1.13 Immunhistochemische Untersuchungen 3.1.13.1 Immunhistochemische Markierung von Zellen An allen Proben wurden immunhistochemische Untersuchungen durchgeführt. Zur Charakterisierung der Entzündungszellinfiltration werden die Antikörper gegen CD3, CD20 und CD68 eingesetzt. Mit Hilfe des CD3-Antikörpers Rabbit Anti-Human T Cell (Fa. DakoCytomation, Hamburg, Bestell-Nr. A0452) können CD3-Antigen exprimierende T-Lymphozyten markiert werden. Nach der gleichen Vorgehensweise sind CD20-Antigen präsentierende B-Lymphozyten mit dem CD20-Antikörper 54 EIGENE UNTERSUCHUNGEN Monoclonal Mouse Anti-Human B Cell (Fa. DakoCytomation, Hamburg, Bestell-Nr. M0755) darstellbar. CD68-Antigen präsentierende Makrophagen können mit Hilfe des CD68-Antikörpers Monoclonal Mouse Anti-Human Macrophage (Fa. DakoCytomation, Hamburg, Bestell-Nr. M0814) markiert werden. Die CD3-, CD20- und CD68-Markierung wurde nach den Angaben des Herstellers (Anh.) an entparaffinierten und rehydrierten Schnitten durchgeführt. Zur AntigenDemaskierung wurden die Schnitte in Citratpuffer (Anh.) im Schnellkochtopf einer Hitzevorbehandlung unterzogen. Anschließend wurden die Schnitte in das NexESIHC-Färbemodul (Fa. VENTANA, Illkirch, Frankreich) eingespannt, wo alle weiteren Reaktionen stattfanden (Anh.). Pro Versuchsdurchlauf konnten 18 Proben, sowie eine Positiv- und eine Negativkontrolle im NexES-IHC-Färbemodul bearbeitet werden. Als Kontrollgewebe wurde ein Lymphknoten vom Rhesusaffen verwendet. 3.1.13.2 Quantitative Bestimmung der immunhistochemischen Untersuchungen Eine Definition für die Auszählung der markierten Zellen wurde wie folgt festgelegt. Die Auszählung der markierten Zellen erfolgte lichtmikroskopisch mit 400facher Vergrößerung. Da es bei etwas zu dicken Schnitten zu übereinander liegenden Zelllagen kommen konnte, wurde eine Bildebene festgelegt und diese Ebene beibehalten und nicht mehr verändert. Aus dem jeweiligen histologischen Schnitt wurde ein repräsentatives Gesichtsfeld ausgewählt und die markierten Zellen vollständig ausgezählt. Mit Hilfe des Tabellenkalkulationsprogrammes Microsoft Excel 97 wurden die Ergebnisse der Auszählung in Tabellen übertragen und als Diagramme mit den Nummern 8 - 10, 12 - 14 und 16 - 18 dargestellt. Nach DIXON et al. (1996) fehlen universelle Standards für die quantitative Bestimmung von mononukleären Leukozyten in der normalen Magenmukosa. MATERIAL UND METHODEN 55 Deshalb ist die präzise Definition einer chronischen Gastritis anhand von mononukleären Leukozyten nicht möglich. Die Lokalisation des Magens, das Untersuchungsobjekt und subjektive Eindrücke des Untersuchers können die Quantifizierung der mononukleären Leukozyten stark beeinflussen. Trotzdem legten DIXON et al. (1996) Normalbefunde der Magenmukosa (zusammen 2 - 5 Lymphozyten, Plasmazellen und Makrophagen in der Lamina propria bzw. 2 - 3 Lymphozyten oder Plasmazellen zwischen den Foveolae gastricae) für ein ausgezähltes Gesichtsfeld unter dem Lichtmikroskop (40er Objektiv) fest. Durch den Mangel einer Standardgraduierung für aufgefundene Zellzahlen wurde für diese Arbeit eine Definition für die Grade ohne besonderen Befund (o.b.B.), geringgradig (ggr.), mittelgradig (mgr.) und hochgradig (hgr.) festgelegt (Tab. 5). Dabei fanden für die quantitative Graduierung von Lymphozyten und Makrophagen die Ausführungen von DIXON et al. (1996) Berücksichtigung. Tab. 5: Quantitative Graduierung der immunhistochemisch markierten Lymphozyten und Makrophagen Quantitative T-Zellen in der B-Zellen in der Makrophagen in L. propria L. propria der L. propria Graduierung o.b.B. <5 <2 <3 ggr. 5 - 14 2-4 3-7 mgr. 15 - 30 5-9 8-15 hgr. > 30 >9 >15 3.1.14 Serologische Untersuchungen Das gewonnene Blutserum der drei Tiere 7743, 8156 und 9050 wurde auf H. pyloriAntigen untersucht. Dazu wurde der Westernblot-Test ViraBlot® (Fa. Viramed Biotech AG, Planegg, Anh.) verwendet. Bei diesem Test handelt es sich um einen Westernblot-Test zum Nachweis von IgG- bzw. IgA-spezifischen Antikörpern gegen H. pylori. Darüber hinaus kann zwischen hoch- und gering-pathogenen Helicobacter- 56 EIGENE UNTERSUCHUNGEN Stämmen differenziert werden. Für den Westernblot-Test werden deutsche Patientenisolate mehrerer Helicobacter-Stämme verwendet, wodurch eine Erkennung unterschiedlicher Antikörperspezifitäten gewährleistet wird. Die spezielle Antigen-Präparation enthält stammspezifische Varianten der hochspezifischen Proteine CagA (136 kD), VacA (87 kD und 30 kD), UreA (26 kD und 24 kD). Dadurch können patientenabhängig individuelle Immunreaktionen gegen diese Proteine erfasst werden. 3.1.15 Auswertung und Dokumentation Für die lichtmikroskopische Auswertung und photographische Dokumentation der Gewebepräparate wurde das Mikroskop Axioplan 2 imaging (Fa. Carl Zeiss AG, Oberkochen) mit dem Kameraaufsatz AxioCam HRc (Fa. Carl Zeiss AG, Oberkochen) verwendet. Mit Hilfe des Computerprogramms AxioVision 3.1 (Fa. Carl Zeiss AG, Oberkochen) konnten die Fotos digital dargestellt werden. Das ZEISSElektronenmikroskop EM 10 C (Fa. Carl Zeiss AG, Oberkochen) wurde für die elektronenmikroskopische Analyse genutzt und die Fotos mit Hilfe von Planfilmmaterial und Photopapier der Firma Agfa, Leverkusen dokumentiert. 3.1.16 Elektronenmikroskopische Präparation 3.1.16.1 Biopsien Für die elektronenmikroskopische Darstellung von H. pylori-Bakterien wurden die Gewebebiopsien nach 24stündiger Fixation in 2,5%iger gepufferter Glutaraldehydlösung in Epon eingebettet. Die Einbettung in einem Epon-Gemisch nach LUFT (1961, Anh.) erfolgte im Lynx-Einbettautomaten (Fa. Leica, Bensheim) nach dem im Anhang angegebenen Protokoll. Die Proben wurden in Flacheinbettungsformen aus Silikongummi eingebettet. Danach schloss sich eine MATERIAL UND METHODEN 57 24stündige Polymerisation des Epoxidharzes bei 60° C an. Die auspolymerisierten Epon-Blöckchen wurden mit einer Fräse (Reichert Ultracut S, Fa. Leica, Bensheim) zugetrimmt. Dann wurden von diesen zugetrimmten Blöcken am Ultramikrotom (Reichert Ultracut S, Fa. Leica, Bensheim) unter Verwendung von Histodiamantmessern (Fa. Diatome, Bienne, Schweiz) 0,5 µm dicke Semidünnschnitte angefertigt, nach RICHARDSON et al. (1960, Anh.) gefärbt und nach dem Trocknen mit Eukitt eingedeckt. Die Semidünnschnitte wurden zur Vororientierung lichtmikroskopisch ausgewertet. Nach weiterem Zutrimmen der Blöcke per Hand wurden, unter Verwendung eines Diamantmessers (Fa. Diatome, Bienne, Schweiz), 60 - 80 nm dicke Ultradünnschnitte hergestellt und auf die Lochblenden single slot 1 x 2 (Fa. Plano, Marburg) aufgezogen. Diese wurden dann mit Uranylacetat und Bleicitrat nachkontrastiert. 3.1.16.2 „Negative staining“ Um die aus den Biopsien der Affenmägen kultivierten Bakterien besser darstellen zu können, wurde bei ausgewählten Fällen eine Kontrastierung der Bakterien mittels „Negative staining“ vorgenommen. Bei dieser Methode werden zur Kontrastierung der schlecht sichtbaren H. pylori schwere Metallionen an die Bakterien angelagert. Das Bakterium selbst wird dabei nicht verändert, sondern seine Struktur durch die elektronendichte Umgebung hervorgehoben. Als Metallionenspender eignen sich entweder Wolfram oder Uran. 3.1.17 Molekularbiologische Untersuchungen Die molekularbiologischen Untersuchungen der entnommenen und eingefrorenen Biopsien wurden mit der Hilfe von Herrn Dr. Christian Kraft im Institut für Hygiene und Mikrobiologie an der Julius-Maximilians-Universität in Würzburg durchgeführt. 58 3.1.17.1 EIGENE UNTERSUCHUNGEN DNA-Isolierung von H. pylori aus Magenbiopsien Aufbereitung der Magenbiopsien Eingefrorenes Magenbiopsiematerial (-80° C, Durchmesser 2 - 3 mm) von Rhesusaffen aus dem Deutschen Primatenzentrum Göttingen wurde umgehend auf Blutagarplatten aufgetragen und auf der gesamten Platte ausgestrichen. Befand sich das Biopsiematerial in Flüssigmedium, wurde in einigen Fällen 100 µl dieses Mediums auf der Blutagarplatte ausgebracht und nicht die Biopsie selbst. Die Agarplatten wurden in einem Anaerobiertopf unter mikroaerophilen Bedingungen für 3 - 5 Tage bei 37° C kultiviert. Die gewachsenen Kolonien wurden zunächst mit einem Binokular (Fa. Zeiss, Jena) betrachtet. Kolonien, die der Morphologie von H. pylori entsprachen, wurden vereinzelt und in Reinkultur gebracht. Isolierung genomischer DNA Die Isolation genomischer DNA aus den Bakterienkolonien wurde mittels DNeasy tissue kit (Fa. QIAgen, Hilden) vorgenommen. Eine wurde eine Übernachtkultur (3 ml) von H. pylori angelegt. Dem QIAgen Protokoll folgend wurden die Bakterienzellen (max. 2 x 109 Zellen) 10 min bei 5000 x g zentrifugiert. Der Überstand wurde verworfen und das Pellet mit 180 µl ATL-Puffer resuspendiert. Für die Lyse der Zellen wurden 20 µl Proteinase K (20 mg/ml) hinzugefügt, das Gemisch gevortext und bei 55° C für 1 - 3 Stunden inkubiert. Nach der Inkubation erfolgte eine RNaseBehandlung mit 4 µl RNase (100 mg/ml). Die Probe wurde gemischt und für 2 min bei Raumtemperatur inkubiert. Anschließend wurden 200 µl AL-Puffer der Probe zugeführt und bei 70° C für 10 min inkubiert. Darauf erfolgte die Zugabe von 200 µl Ethanol. Das Gesamtgemisch wurde dann zur Adsorption der DNA auf eine DNeasy Mini Spin Säule gegeben, für 1 min bei 6000 x g in einer Tischzentrifuge (Fa. Heraeus, Hanau) zentrifugiert und das Filtrat verworfen. Es folgten zwei Waschschritte mit zunächst Puffer AW1 bei 6000 x g für 1 min und danach mit AW2 bei 20000 x g für 3 min, um überschüssiges Salz zu entfernen. Dann wurde die DNA MATERIAL UND METHODEN 59 mit 200 µl AE-Puffer eluiert. Reinheit und Konzentration wurde durch eine Messung mit dem Photometer GeneQuant (amersham pharmacia biotech, Piscataway, USA) bestimmt. 3.1.17.2 Primer RAPD-PCR Primer ___________________________________________________________________ Name Sequenz 5‘→ 3‘ Annealing Temp. AP1247 AAGAGCCCGT 36° C AP1254 CCGCAGCCAA 36° C AP1281 AACGCGCAAC 36° C AP1283 GCGATCCCCA 36° C Primer für die Amplifikation der partiellen 16S rDNA ___________________________________________________________________ Name Sequenz 5‘→ 3‘ Annealing Temp. C97 GCTATGACGGGTATCC 46° C C98 GATTTTACCCCTACACCA 46° C____ 16S-3 AGTTTGATC(ACT)TGGCTCAG 52° C 16S-4 GGACTAC(ACT)AGGGTATCTAAT 52° C Primer für die Amplifikation der Kernfragmente von „housekeeping“- und virulenzassoziierten Genen ___________________________________________________________________ Primer Sequenz 5‘→ 3‘ Annealing Temp. atpA4 TGCCCGTCTGTAATAGAAATG 55° C atpA7 CGCTTTGGGTGAGCCTATTG 55° C____ 60 EIGENE UNTERSUCHUNGEN atpA1964 GGACTAGCGTTAAACGCACG 57° C atpA1965 CTTGAAACCGACAAGCCCAC 57° C____ efpF01 GGCAATTGGGATGAGCGAGCTC 53° C efpR02 CTTCACCTTTTCAAGATACTC 53° C____ efpF02 GGGCTTGAAAATTGAATTGGGCGG 57° C efpR01 GTATTGACTTTAATGATCTCACCC 57° C____ flaA4 ATTGATGCTCTTAGCGTC 47° C flaA9 CAAGCGTTATTGTCTGGTC 47° C____ flaB9 AAGGCATGCTCGCTAGCG 53° C flaB10 TAATGTCTCTAGCGTCGG 53° C____ mutY101 AGCGAAGTGATGAGCCAACAAAC 52° C mutY102 AAAGGGCAAATCGCACATTTGGG 52° C____ mutY1979 GTGGTTGTAG(CT)TGGAAACTTTACAC 53° C mutY1980 CAACGCCCAAGTAACGCTCTTC 53° C____ ppa1 GTGAGCCATGACGCTGATTCTTTGT 58° C ppa2 GCCTTGATAGGCTTTTATCGCTTTCT 58° C____ trpC6 TAGAATGCAAAAAAGCATCGCCCTC 57° C trpC7 TAAGCCCGCACACTTTATTTTCGCC 57° C____ trpC1968 AAAAGCATCGCCCTC(CT)AAAGGTT 52° C trpC1969 GCGTCTTTAAT(AG)(AG)TTGTAAGCCCG 52° C____ ureI71S1 CAATAAAGTGAGCTTGGCGCAACT 55° C ureI71AS1 TCCCTTAGATTGCCAACTAAACGC 55° C____ vacA3 ACAACCGTGATCATTCCAGC 53° C vacA4 ATACGCTCCCACGTATTGC 53° C____ vacA1958 CTGCTGTAGGAACGGTCTC 53° C vacA1959 GCGTGGCGCCATCATAAAGAG 53° C____ yphCF1 CACTATTACCACGCCTATTTTTTTGAC 57° C yphCR4 AAGCAGCTGGTTGTGATCACGGGGGC 57° C____ yphC1960 CACGCCTATTTTTTTGACTAAAAAC 55° C yphC1961 GCGTTTAAGAGCGARCTTTTGC 55° C MATERIAL UND METHODEN Zusätzliche Primer für die 61 Sequenzierung von „housekeeping“- und virulenzassoziierten Genen ___________________________________________________________________ Primer Sequenz 5‘→ 3‘ Annealing Temp. ppa-n1 GGCTTAATGGTGGATAGG 49° C ppa-n2 TTCACCCATTT(AG)TTAGGCTC 52° C____ ureI-1 TCAAGTATCGCACCATTTGAC 55° C ureI-2 GTTATTCGTAAGGTGCGTTTG 55° C ___________________________________________________________________ 3.1.17.3 Polymerase-Kettenreaktion (PCR) Standard-PCR Die Standard-PCR wurde zur Amplifikation für spezifische bakterielle Gene, sowie für das Gen, dass für die ribosomale 16S DNA kodiert, benutzt (siehe dazu MONSTEIN et al. 2000). Die Amplifikate wiesen typischerweise eine Länge von 400 - 1500 Basenpaaren auf. Die Reaktion wurde in einem Volumen von 50 µl in 0,5 ml Reaktionsgefäßen durchgeführt, die aus 5 µl 10x-PCR-Puffer, 8 µl dNTP's (200 µM), 3 µl MgCl2 (25 mM), je 0,5 µl Primer (20 pmol/µl), 0,2 µl Polymerase (1 U AmpliTaq Gold, Roche), 28 µl H2O und 5 µl einer DNA-Präparation bestand. Als DNA-Vorlage wurde genomische DNA verwendet. Die PCR wurde anschließend in einem TRIOThermoblock (Biometra, Göttingen) durchgeführt. Das Programm bestand aus folgenden Schritten: 1. Denaturierung bei 95° C für 5 min 2. zyklische Denaturierung bei 94° C für 60 s 3. Primerbindung („Annealing“) bei 49 - 60° C für 60 s 62 EIGENE UNTERSUCHUNGEN 4. Elongation bei 72° C für 1 - 2 min (30 Zyklen) 5. terminale Elongation bei 72° C für 7 min (Abkühlung bis auf 15° C) Die Annealing-Temperatur wurde für jedes Primerpaar aufgrund der Primersequenz berechnet. Die Zeit der Elongation ergab sich aus der zu erwartenden Länge der PCR. RAPD-PCR Die „Random Amplified Polymorphic DNA“-PCR (RAPD) ist eine „Fingerprint“Methode, da jedes Bakterium, im Fall von H. pylori jeder Stamm, ein charakteristisches Bandenmuster produziert (siehe dazu AKOPYANZ et al. 1992). Die Reaktion wurde in einem Volumen von 25 µl durchgeführt. Die Ansätze bestanden aus 2,5 µl 10x PCR-Puffer, 4,8 µl dNTP's (200 µM), 1,5 µl MgCl2 (25 mM), 5 µl Primer (5 pmol/µl), 0,2 µl Polymerase (1 U PharmaciaTaq) und 6 µl H2O. Diesem Mix wurden 5 ng genomische DNA zugegeben. Jede PCR wurde mit nur einem Primer durchgeführt. Es standen insgesamt vier unterschiedliche Primer zur Verfügung (AP1247, AP1254, AP1281, AP1283). Das PCR-Programm war für alle Primer gleich und erfolgte gemäß der Standard-PCR, die Elongation wurde auf 2 min beschränkt, abweichend wurde die Reaktion mit 40 Zyklen durchgeführt. 3.1.17.4 Sequenzierung Vorbereitung der Sequenzierproben Um nach den Infektionen die isolierten Bakterienstämme mit den inokulierten Stämmen vergleichen zu können, wurden Basensequenzen von bestimmten Virulenzgenen, 16S rDNA und „housekeeping“-Genen miteinander verglichen (Kap. 3.1.17.5) (Tab. 6). Zudem konnte durch diese Sequenzierung ein möglicher MATERIAL UND METHODEN 63 Genaustausch zwischen den Infektionsstämmen untersucht werden. Für die meisten Sequenzierungen dienten PCR-Produkte als Ausgangsmaterial. Die PCR-Ansätze wurden mit dem „QIAquick PCR purification Kit“ (Qiagen, Hilden) aufgereinigt. Die Aufreinigung erfolgte nach den Angaben des Herstellers. Wurde ein PCR-Fragment über ein Agarosegel aufgereinigt, wurde das gewünschte Fragment mit dem QIAquick Gel Extraction Kit (Qiagen, Hilden) aus dem Agarosegel eluiert. Für die Sequenzierung wurden ca. 50 ng DNA eingesetzt. Das Endvolumen der Sequenzprobe betrug 7,5 µl. Die entsprechende Menge aufgereinigte DNA wurde mit Wasser auf 7 µl aufgefüllt, dann wurden 0,5 µl des Sequenz-Primers (20 pmol/µl) zugegeben. Die fertigen Proben wurden dann im zentralen DNA-Labor des Instituts weiter bearbeitet. Die Sequenzreaktion wurde mit dem „Big Dye Terminator v1.1 Cycle Sequencing Kit“ (Applied Biosystems, Foster City, USA) nach Angaben des Herstellers durchgeführt, jedoch mit nur 25 % der vorgeschriebenen Reagenzienmenge. Die amplifizierten Proben wurden mit einem automatischen Sequenzierer ABI377 (Applied Biosystems, Foster City, USA) aufgetrennt. Die endgültigen Sequenzen wurden als Computerdateien zur Verfügung gestellt. Analyse der Sequenzen Jede Sequenzreaktion wurde in zwei Computerdateien abgelegt. Eine Datei enthielt die eigentliche Sequenzinformation, zudem wurde die Sequenz in einer Textdatei abgelegt. Zur schnellen Betrachtung der sequenzierten DNA wurde das Computerprogramm „Chromas“ verwendet. Die weitergehende Analyse wurde mit einem umfangreichen Software-Paket durchgeführt. Dazu wurden die Sequenzdaten via FTP-Server auf einen Unix-Server am Max-Planck-Institut für Molekulare Genetik in Berlin übertragen. Mit der STADENSoftware wurden die Sequenzen weiter bearbeitet. Die Qualität der Sequenzen wurde durch das PEARL-Script „qualityclip.pl“ beurteilt und die Rohdaten in neue Dateien umgewandelt (*.exp, *.scf). Alle Sequenzen eines PCR-Produkts (*.exp-Dateien) wurden in einer neuen Datei zusammengefasst (*.explist), die es 64 EIGENE UNTERSUCHUNGEN dem Programm „gap4“ ermöglichte einen „Contig“ zu erstellen (Sortierung von Sequenzen, die einen Überlappungsbereich besitzen), der die Sequenzen zusammenlagert und graphisch darstellt. Die bearbeiteten Sequenzen wurden anschließend in das „gcg“-Format konvertiert und so für das Programm „Seqlab“ lesbar gemacht. In diesem Programm waren sowohl multiple Sequenzvergleiche möglich („PileUp“-Alignment), als auch die Übersetzung der DNA-Sequenz in eine Aminosäuresequenz. Die Referenzsequenzen wurden aus Textdateien in ein „gcg“Format umgewandelt und dem Programm zugefügt. Je nach Anwendung wurden die sortierten Sequenzen auf eine zuvor festgelegte Länge gekürzt, gespeichert und gegebenenfalls in einer öffentlichen Datenbank abgelegt (z. B. Genbank, www.ncbi.nlm.nih.gov/genbank). 3.1.17.5 Parameter der Stammidentität von H. pylori Als Referenzstamm für Festlegung von Parametern diente der H. pylori-Stamm 26695 (Tab. 6), dessen komplette Genomsequenz analysiert wurde (TOMB. et al 1997). Die Gene, die für Proteine kodieren, die an Stoffwechselprozessen beteiligt sind („housekeeping“ Gene), unterliegen einem relativ geringen Selektionsdruck, während die virulenzassoziierten Gene einem höheren selektiven Druck ausgesetzt sind. Für diese Analyse wurden DNA-Fragmente von 16S rDNA und von 10 Genen, darunter sieben „housekeeping“ Gene (ACHTMAN et al. 1999) und drei virulenzassoziierte Gene (SUERBAUM et al. 1998) ausgesucht. Die für eine Multilokus-Sequenz-Typisierung ausgesuchten Gene waren über das gesamte Chromosom verteilt und stellten einen repräsentativen Querschnitt dar (Tab. 6). Sie wurden mittels PCR amplifiziert und anschließend sequenziert. Die Länge der einzelnen DNA-Fragmente lag zwischen 339 und 627 Basenpaaren (Tab. 6). Bei allen Genfragmenten, in denen sich Sequenzunterschiede zwischen den beiden Stämmen eines Paares ergaben, wurden zusätzlich die flankierenden Bereiche beiderseits des Kernfragments von etwa je 500 - 800 Bp sequenziert. MATERIAL UND METHODEN 65 Tab. 6: Für die Sequenzanalyse ausgewählte „housekeeping“ und virulenzassoziierte Gene Genlocus Stamm 26695 HP1134 HP0177 HP0601 HP0115 HP0142 HP0620 HP1279 HP0071 HP0887 HP0834 Fragmentlänge [Bp] atpA ATP Synthase, F1 Untereinheit 627 efp Elongationsfaktor P 410 flaA Flagellin A 471 flaB Flagellin B 339 mutY A/G-spezifische Adenin Glykosylase 420 ppa Anorganische Pyrophosphatase 396 trpC Anthranilat Isomerase 456 ureI Urease akzessorisches Protein 585 vacA Vakuolisierendes Zytotoxin 444 yphC GTP-bindendes Proteinhomolog 510 Gen Bezeichnung 3.1.18 Bewertungsschema zur Einteilung in Gastritisgrade Eine einheitliche Klassifikation für Gastritiden wurde von einer Reihe europäischer Pathologen mit der Erstellung des Sydney-Systems etabliert, die 1994 unter Einbeziehung amerikanischer Kollegen modifiziert wurde (PRICE 1991, DIXON et al. 1997). BAYERDÖRFFER et al. (1992) entwickelten ein Bewertungsschema auf der Grundlage des Sydney-Systems zur Graduierung von Gastritiden mit fünf Gastritisgraden (o.b.B., minimal, ggr., mgr. und hgr.). In der von DIXON et al. (1997) beschriebenen Einteilung von Gastritiden des modifizierten Sydney-Systems kommen nur vier Gastritisgrade (o.b.B., ggr., mgr. und hgr.) vor. Weiterhin wurde die grundsätzliche Einteilung der Gastritiden in akute, chronische und spezielle Formen berücksichtigt. Das dieser Arbeit zugrunde liegende Bewertungsschema basiert auf der von BAYERDÖRFFER et al. (1992) entwickelten Einteilung in Kombination mit der von DIXON et al. (1997) beschriebenen Modifizierung des Sydney-Systems. Die entsprechenden Kriterien sind in Tabelle 7 zusammengefasst. 66 EIGENE UNTERSUCHUNGEN Tab. 7: Bewertungsschema zu den Gastritisgraden Grad - o.b.B. Gastritis Aktivität H. pylori keine Lymphozyten in keine H. pylori keine neutrophilen der L. propria Granulozyten in der L. nachweisbar propria + ggr. ++ mgr. vereinzelte Infiltration wenige, gleichmäßig einzelne neutrophile mit Lymphozyten und verteilte H. pylori Granulozyten in der L. Plasmazellen in der propria ohne oberen L. propria Leukopedese mäßig dichte mäßig dichte H. pylori- mäßig neutrophile Infiltration mit Kolonisation Granulozyten in der L. Lymphozyten und propria mit mäßiger Plasmazellen in der Leukopedese oberen L. propria, Follikelanbildung +++ hgr. sehr dichte Infiltration sehr dichte H. pylori- massenhaft mit Lymphozyten und Kolonisation neutrophile Plasmazellen in der L. Granulozyten in der L. propria, propria mit Follikelanbildung ausgeprägter Leukopedese ERGEBNISSE 3.2 67 Ergebnisse 3.2.1 Klinische Untersuchungen und allgemeiner Sektionsbefund Während des gesamten Untersuchungszeitraumes wiesen die infizierten Versuchstiere keinerlei klinische Auffälligkeiten auf. Nahrungsaufnahme und das Wohlbefinden aller Affen erschien nicht gestört. Die Gewichtsdaten zeigten eine normale Gewichtsentwicklung, wenngleich im Zeitraum nach der Superinfektion ein Gewichtsverlust von etwa 200 g bis 600 g bei allen Tieren ersichtlich war (Abb. 1). Etwa 8 - 12 Wochen nach der Superinfektion konnte dieser Gewichtsverlust von allen Affen kompensiert werden. Bei der Sektion Ernährungszustand 75 Wochen aller drei nach der Superinfektion Affen attestiert konnte werden. ein Hauptbefund guter der makroskopischen Untersuchung war das Vorliegen einer diffusen chronischen Gastritis unterschiedlicher Ausdehnung in Fundus- und Antrumbereichen. Außer diesen genannten Veränderungen wurden makroskopisch besonderen Befunde an den Organsystemen erhoben. keine weiteren 68 EIGENE UNTERSUCHUNGEN Abb. 1: Gewichtsdiagramm 11000 10000 Körpergewicht in g 9000 8000 7000 6000 5000 4000 Tier 7743 Tier 8156 Tier 9050 3000 2000 1000 0 i ps w 75 si p w 57 si p w 48 si p w 36 si p w 33 si p w 30 si p w 23 si p w 20 si p w 16 si p w 12 i ps w 8 i ps w 4 i ps w 2 i ps w n 1 i s tio dp ek 3 rinf pe Su i p m 39 i p m 36 i p m 24 i p m 19 i p m 12 ion kt fe In Untersuchungszeitpunkt 3.2.2 Gastroskopische Untersuchung Endoskopisch zeigten sich bei allen drei Tieren vergleichbare Befunde. In der Frühphase der Infektion konnte eine geringgradige, herdförmige, erosive Gastritis im Fundus und Antrum pylori bei allen Versuchstieren festgestellt werden. Im Zeitraum drei Tage bis vier Wochen nach der Superinfektion traten flächige Hyperämien, petechiale Blutungen und kleine Erosionen der Magenschleimhaut auf (Abb. 2a). Großflächige Ödeme waren gerade in dieser akuten Phase der Infektion zu finden. Vier Wochen nach der Superinfektion konnte eine abklingende Symptomatik bei allen drei Tieren beobachtet werden. Es entwickelte sich das klinische Bild einer herdförmigen, chronischen Gastritis, die in ihrer Ausdehnung auf Antrum- und Fundusbereiche beschränkt war. ERGEBNISSE 69 Abb. 2a: Tier 8156, Fundus, 4 wpsi. Endoskopische Aufnahme einer mittelgradigen, chronischen Gastritis. Eine flächige Hyperämie der Schleimhaut mit Ödembildung und geringgradig petechialen Blutungen ist sichtbar. 3.2.3 Ureasetest Der Ureasetest fiel bei allen drei Tieren an den einzelnen Lokalisationen und zu den verschiedenen Entnahmezeitpunkten unterschiedlich aus, wobei er in der überwiegenden Anzahl der Proben positiv war. Hierbei konnten bei Tier 7743 elf positive Ergebnisse in der Fundusregion, fünf in der Kardiaregion und drei in der Antrumregion festgestellt werden. Bei Tier 8156 konnten neun positive Ureasetests in der Fundusregion ermittelt werden, während die Kardiaund die Antrumregion sechsmal positiv getestet wurden. Die Untersuchung der Magenbiopsien von Tier 9050 zeigte eine Häufung von zwölf positiven Ureasetests in der Fundusregion, wobei die Kardia- und die Antrumregion siebenmal positiv getestet wurden. Nähere Angaben zu den Ergebnissen der Ureasetests der einzelnen Tiere sind den Tabellen 10 - 12 zu entnehmen. 3.2.4 Kulturelle Untersuchungen H. pylori-Reinkulturen konnten zu unterschiedlichen Untersuchungszeitpunkten isoliert werden. Die größte Bakteriendichte zeigte sich jeweils in der Frühphase der 70 EIGENE UNTERSUCHUNGEN Erstinfektion bzw. der Superinfektion. Zwei Wochen, 10 Monate und 19 Monate nach der Infektion konnten H. pylori-Stämme aus allen drei Tieren angezüchtet werden. Nach zwei Jahren gelang der kulturelle H. pylori-Nachweis nur aus den Tieren 7743 und 9050. Nach drei Jahren konnte nur ein Stamm aus dem Tier 8156 isoliert werden. Die Reisolation der Stämme nach der Superinfektion wurde analog zur ersten Infektionsphase durchgeführt. Drei Tage nach der Superinfektion konnten nur aus Tier 8156 Stämme isoliert werden. Nach ein, zwei und vier Wochen gelang dies aus allen Tieren. Zu allen späteren Zeitpunkten war eine Reisolierung von H. pyloriStämmen aus Tier 7743 nicht mehr möglich. Aus Tier 9050 und 8156 konnten zu allen späteren Zeitpunkten aus unterschiedlichen Magenlokalisationen H. pyloriIsolate gewonnen werden. Detaillierte Angaben zum kulturellen Nachweis sind in den Tabellen 10 - 12 zu finden. Gewachsene Bakterienkolonien wurden anhand des Koloniewachstums identifiziert. Kleine punktförmige, weißlich glänzende Kolonien von etwa 0,5 mm Größe wurden lichtmikroskopisch und molekularbiologisch als H. pylori typisiert. Abb. 2b: Tier 8156, Kardia, 1 wpsi. Kleine, runde, farblose, stecknadelkopfgroße H. pylori-Kolonien auf H. pylori-Agarplatte. ERGEBNISSE 71 3.2.5 Elektronenmikroskopische Darstellung Ausgewählte Reisolate wurden elektronenmikroskopisch im „Negative staining“Verfahren untersucht. Dabei stellten sich die Bakterien als typische HelicobacterStrukturen dar. Durch die Ablagerung von Metallionen des Kontrastierungsmittels an der Bakterienoberfläche hoben sie sich deutlich vom Hintergrund ab. Die Bakterien waren s-förmig geschwungen oder mit einer deutlichen Krümmung versehen. An einem Pol besaßen sie durchschnittlich vier Geißeln, welche ebenfalls durch die Kontrastierung von einem dunklen Saum umgeben waren (Abb. 3). Vereinzelt fanden sich in dem Untersuchungsmaterial einzelne Flagellenbündel ohne Bakterienkörper. In ihrer Morphologie unterschieden sich die Humanstämme nicht vom Rhesusaffenstamm MM1303. Abb. 3: Tier 9050, Kardia, 2 wpsi. „Negative staining“ von H. pylori-Isolat MM1303. Vier unipolare Flagellen (F) und Teile der Glykokalix (Pfeil) sind erkennbar. TEM, Vergrößerung 40000x. 72 EIGENE UNTERSUCHUNGEN 3.2.6 Analyse und Sequenzierung der Reisolate Jeder H. pylori-Stamm besaß sein eigenes Bandenmuster bei der RAPD-PCR. Anhand dieses Musters konnte die Abstammung der Reisolate den jeweiligen Infektionsstämmen zugeordnet werden. Auch unterschied sich jeder H. pylori-Stamm in der Sequenz des Gens, welches die 16S rDNA kodiert. Daher konnten die Isolate bei der Sequenzierung dieses Genabschnitts eindeutig zugeordnet werden. Mit Hilfe von molekularbiologischen Untersuchungsmethoden (RAPD-PCR und 16S rDNA Sequenzanalyse) wurde aus der gewonnenen bakteriellen DNA die Identifizierung über angewachsene H. pylori-Stämme nach der ersten Infektion erbracht. Dabei gelang es nicht immer, die Isolate mit den beiden molekularbiologischen Untersuchungsmethoden zu identifizieren. Zu Beginn des Infektionsversuches zwei Wochen nach der Infektion konnte das Isolat BO417 bei allen drei Tieren nachgewiesen werden. Tier 8156 wies eine Mischinfektion mit dem Stamm BO418 auf. Nach diesem Zeitpunkt gelang es nicht mehr, das Isolat BO418 zu isolieren. Zwei Jahre nach der Infektion konnte Stamm BO417 bei den Tieren 7743 und 9050 nachgewiesen werden. Bei Tier 8156 gelang der Nachweis sogar über drei Jahre nach der Infektion (Tab. 8). Es konnten keine Bandenmuster oder Sequenzabweichungen ausgemacht werden, die auf einen Verlust oder Aufnahme von Genen oder Rekombination mit anderen Infektionsstämmen oder mit LGIS hindeuteten. ERGEBNISSE 73 Tab. 8: Nachweis der Isolate der ersten Infektionsphase. Diese Untersuchungen wurden in Zusammenarbeit mit Dr. Christian Kraft, Institut für Hygiene und Mikrobiologie, Julius-Maximilians-Universität Würzburg durchgeführt. Die ersten zehn Monate nach der Infektion waren Gegenstand der Arbeit von KUNZ (2000). Die Untersuchungen dieser Arbeit begannen 19 Monate nach der Infektion. Isolationszeitpunkt 2 wpi 5 mpi 10 mpi 19 mpi 24 mpi 36 mpi 1 Tier 7743 Tier 8156 BO417 1, 2 BO417 1, 2/BO418 BO417 1 BO417 1, 2 BO417 1, 2 1, 2 BO417 1 BO417 BO417 1, 2 BO417 2 Tier 9050 1 BO417 1, 2 BO417 1, 2 BO417 1 BO417 1 - Genanalyse mit der RAPD-PCR, 2 Genanalyse mit der 16S rDNA Sequenzanalyse, BO417 bzw. BO418 = H. pylori-Isolat, - = kein Isolatnachweis 74 EIGENE UNTERSUCHUNGEN Abb. 4: RAPD-PCR der Reisolate aus Rhesusaffen mit Primer AP1254. Die Infektionsstämme BO417 und BO418 zeigen ein deutlich voneinander abweichendes Bandenmuster. Mit Ausnahme des Isolats in Tier 8156 zwei Wochen nach Infektion, indem die Bandenmuster beider Infektionsstämme vorhanden sind (Mischinfektion), entsprechen alle weiteren Reisolate ausschließlich dem Bandenmuster des Stammes BO417. BO417, BO418 = Infektionsstämme; 7743, 8156, 9050 = Tiernummern; wpi = Wochen nach Infektion; mpi = Monate nach Infektion. Aus der Dissertation KRAFT (2004). Zur Stammidentifizierung der gewonnenen humanen Isolate diente die MultilokusSequenz-Typisierung (Kap. 3.1.17.5). Die Analyse der sequenzierten Isolate aus Menschen hat gezeigt, dass das am häufigsten von Rekombination oder Mutation betroffene Gen aller Infektionsstämme das ureI-Gen war (ACHTMAN et al. 1999). Jeden Infektionsstamm konnte man aufgrund der unterschiedlichen urel-Sequenz eindeutig identifizieren. Daher wurde dieses Gen von allen Isolaten der Superinfektion sequenziert. Alle Infektionsstämme trugen ein eigenes Allel dieses Gens, so konnten die Reisolate den Infektionsstämmen eindeutig zugeordnet und eventuell auftretende Rekombinationsereignisse festgestellt werden. Es genügte, sich bei der Identifizierung der Reisolate auf die ausschließliche Sequenzierung des urel-Gens zu verlassen, weil diese Analyse eine klare Aussage treffen konnte, ob die ERGEBNISSE 75 inokulierten Stämme mit den Isolaten aus den Magenbiopsien übereinstimmten. Mit Hilfe der Bandenmuster der RAPD-PCR (nur Primer AP1254, alle Isolate bis 4 wpsi) bzw. der urel-Sequenzierung wurde der Nachweis über angewachsene H. pyloriStämme nach der Superinfektion erbracht. So konnten nach der Superinfektion nur noch die H. pylori-Stämme CC28C und MM1303 festgestellt werden. Alle anderen inokulierten Stämme (BO417, BO418, BO238 und RE7006) wurden nicht mehr identifiziert. Wie schon im ersten Infektionsmodell war eine Reisolierung aus Biopsiematerial nicht zu allen Zeitpunkten möglich. Nach einer anfänglichen Etablierungsphase wurde es schwer, Reisolate nach vier bis acht Monaten zu erhalten. 10 Monate nach der Infektion wuchs die Zahl der Reisolate jedoch wieder an. Im Einzelnen wurden folgende Befunde erhoben. Nach der Superinfektion war bei Tier 7743 ausschließlich der H. pylori-Stamm CC28c nachzuweisen. Bis vier Wochen nach der Superinfektion konnte das Isolat nachgewiesen werden. Aus Tier 8156 konnten nach drei Tagen ebenfalls Isolate des CC28c-Stammes isoliert werden. Die Isolate, die nach einer Woche der Superinfektion isoliert wurden, zeigten eine Mischinfektion mit den Stämmen MM1303 und CC28c. Über den Zeitraum eines Jahres konnten nur noch Isolate des Stammes MM1303 identifiziert werden. Dann konnte 57 Wochen nach der Superinfektion Stamm CC28c wieder nachgewiesen werden. Die Isolate aus Tier 9050 zeigten nahezu das gleiche Bild wie bei Tier 8156. Eine Mischinfektion der Stämme MM1303 und CC28c konnte in der ersten und in der vierten Woche nach der Superinfektion festgestellt werden. Wiederum verging ein Jahr regelmäßiger molekularbiologischer Untersuchungen, ohne dass ein Nachweis von Isolaten gelang. Nach Ablauf dieser Zeitspanne konnte der Stamm MM1303 erneut isoliert werden (Tab. 9). Keine der erhaltenen ureI-Sequenzen wies eine Rekombination oder Punktmutation trotz zumindest zeitweiliger Co-Kolonisierung der Isolate CC28c und MM1303 auf. Alle Sequenzen waren identisch mit einem der Infektionsstämme. Es konnte ebenfalls keine Interspeziesrekombination mit den LGIS gefunden werden. Bei Untersuchungen des Kontrolltieres 9048 konnten über den gesamten 76 EIGENE UNTERSUCHUNGEN Untersuchungszeitraum nie Helicobacter-Stämme kulturell nachgewiesen werden, sodass auch keine molekularbiologischen Untersuchungen dahingehend erfolgten. Tab. 9: Nachweis der Isolate der Superinfektion. Diese Untersuchungen wurden in Zusammenarbeit mit Dr. Christian Kraft, Institut für Hygiene und Mikrobiologie, Julius-Maximilians-Universität Würzburg durchgeführt. Isolationszeitpunkt 3 dpsi 1 wpsi 2 wpsi 4 wpsi 16 wpsi 36 wpsi 57 wpsi 75 wpsi Tier 7743 Tier 8156 Tier 9050 CC28c 1, 2 1, 2 1, 2 1 1, 2 CC28c CC28c /MM1303 CC28c /MM1303 1, 2 1, 2 CC28c 1, 2 MM1303 MM1303 1, 2 CC28c 1 MM1303 1, 2 CC28c 1 /MM1303 1, 2 MM1303 2 MM1303 2 2 2 CC28c /MM1303 MM1303 2 - 1 Genanalyse mit der RAPD-PCR, 2 urel-Sequenzierung, CC28c bzw. MM1303 = H. pylori-Isolat, - = kein Isolatnachweis 3.2.7 Histologische Beurteilung der Magenbiopsien Nach der Superinfektion stellte sich bei allen drei Tieren eine herdförmige, chronisch aktive Gastritis ein, deren Ausprägung von Untersuchungszeitpunkt zu Untersuchungszeitpunkt und von Lokalisation zu Lokalisation leichte Schwankungen aufwies. Zum Versuchsende zeigte sich bei allen Tieren eine mittelgradige Ausprägung der Gastritis im Antrumbereich. Im Einzelnen konnten folgende Befunde erhoben werden. Tier 7743 Drei Tage nach der Superinfektion zeigte sich bei Tier 7743 eine akute, durch ausgeprägte Hyperämien gekennzeichnete Gastritis (Abb. 5a). Zu diesem Zeitpunkt wies die Lamina propria eine geringgradige Infiltration mit lymphoplasmazellulären ERGEBNISSE 77 Zellen auf. Ab der 20. Woche nach der Superinfektion konnte eine deutliche Zunahme einer mittelgradigen Gastritis in verschiedenen Magenlokalisationen beobachtet werden. Zu diesem Zeitpunkt wiesen Antrumregionen eine herdförmige, mittelgradige, chronisch aktive, atrophische Gastritis auf. Die atrophische Komponente des Alterationsmusters war gekennzeichnet durch eine Abnahme der Tiefe der Pylorusdrüsen bei gleichzeitiger Zunahme des interstitiellen Bindegewebes (Abb. 5b). Letzteres wies eine mittelgradig diffuse, überwiegend lymphozytäre Entzündungszellinfiltration auf. Zum Sektionszeitpunkt zeigte die Antrumregion einen vergleichbaren Befund, während in Fundus und Kardia eine eher geringgradige Gastritis beobachtet wurde. Tier 8156 Bei Tier 8156 zeigte sich eine Woche nach Superinfektion eine akute herdförmige Gastritis im Fundus. Es zeichnete sich eine deutliche Infiltration von neutrophilen Granulozyten in die Lamina epithelialis ab (Abb. 6a). Hieraus entwickelte sich im Versuchsverlauf ab der 20. Woche nach der Superinfektion eine überwiegend mittelgradige, chronisch aktive, herdförmige, auch atrophische Gastritis. Zum Teil waren Epithelerosionen auffindbar (Abb. 6b). Deutliche lymphofollikuläre Herde und Lymphfollikel konnten in dieser Lokalisation ab der 36. Woche nach der Superinfektion beobachtet werden (Abb. 6c). Zum Sektionszeitpunkt konnte das Vorliegen multipler kleiner Lymphfollikel in der Lamina mucosa des Fundus bestätigt werden (Abb. 6d). Am Versuchsende zeigte dieses Tier eine mittelgradige, chronisch aktive Gastritis, die in erster Linie Antrumregionen betraf. Tier 9050 Ab der ersten Woche nach der Superinfektion zeigte Tier 9050 eine chronisch aktive Gastritis, die in ihrer Intensität zwischen gering- und mittelgradig schwankte. Etwa ab der 12. Woche nach der Superinfektion konnte eine Zunahme einer mittelgradigen Gastritis beobachtet werden. Häufig konnten deutliche Drüsenatrophien in der Lamina propria gefunden werden (Abb. 7a). Zum Sektionszeitpunkt bestand eine mittelgradige, chronisch aktive Antrumgastritis, charakterisiert durch eine diffuse 78 EIGENE UNTERSUCHUNGEN lymphoplasmazelluläre Zellinfiltration. In dieser Lokalisation war die Ausbildung eines gemischtzelligen Entzündungszellinfiltrates, welches fokal auch die Lamina epithelialis infiltrierte, besonders deutlich (Abb. 7b). Der Beginn der histologischen Untersuchungen dieser Arbeit datiert ab dem Zeitpunkt 19 Monate nach der Infektion. Eine Übersicht zu den histologischen Befunden findet sich in den Tabellen 10 - 12. Tab. 10a: Histologische, bakteriologische und serologische Untersuchungen Tier 7743 Untersuchungszeitpunkt 19 mpi 24 mpi 36 mpi 39 mpi 3 dpsi 1 wpsi 2 wpsi 4 wpsi 8 wpsi Histolologische Beurteilung der Gastritis Magenlokalisation Kardia Fundus Antrum Kardia Fundus Antrum Kardia Fundus Antrum Kardia Fundus Antrum Kardia Fundus Antrum Kardia Fundus Antrum Kardia Fundus Antrum Kardia Fundus Antrum Kardia Fundus Antrum Grad ++ + ++ + + ++ + + + + + + ++ ++ + + ++ + + + + + + ++ ++ ++ ++ Art chron. akt. follik. chron. chron. akt. chron. chron. chron. akt. atroph. chron. chron. chron. chron. chron. chron. chron. akt. atroph. chron. akt. akut chron. akt. chron. akt. atroph. chron. akt. chron. chron. chron. chron. chron. chron. akt. atroph. chron. akt. chron. akt. atroph. chron. akt. Kultur Genanalyse BürstenBiopsie ausstrich Ureaseurel 16S rDNA RAPDtest Sequen- Sequenz- IgG IgA PCR zierung analyse + + + + + + + - + + + + + + + + - + + + + + + + + + - Serum BO417 n.u. - n.u. n.u. BO417 n.u. BO417 n.u. n.u. - n.u. - - n.u. - - - n.u. + - CC28c CC28c n.u. + - CC28c CC28c n.u. - - CC28c - n.u. + - - - n.u. + - + - n.u. n.u. + = positiv, - = negativ, n.u. = nicht untersucht, BO417 bzw. CC28c = H. pyloriBakterienstämme; Gastritisbeurteilung: + = geringgradig, ++ = mittelgradig ERGEBNISSE 79 Tab. 10b: Histologische, bakteriologische und serologische Untersuchungen Tier 7743 Untersuchungszeitpunkt 12 wpsi 16 wpsi 20 wpsi 23 wpsi 30 wpsi 33 wpsi 36 wpsi 57 wpsi 75 wpsi Histolologische Beurteilung der Gastritis Magenlokalisation Kardia Fundus Antrum Kardia Fundus Antrum Kardia Fundus Antrum Kardia Fundus Antrum Kardia Fundus Antrum Kardia Fundus Antrum Kardia Fundus Antrum Kardia Fundus Antrum Kardia Fundus Antrum Grad + + + ++ + ++ + + ++ + + n.u. ++ ++ ++ ++ ++ ++ + ++ ++ + ++ + + ++ Art chron. chron. chron. chron. akt. chron. akt. chron. akt. atroph. chron. akt. chron. akt. chron. akt. atroph. chron. chron. n.u. chron. akt. atroph. chron. akt. chron. akt. chron. akt. chron. akt. chron. akt. atroph. chron. akt. chron. akt. chron. akt. atroph. chron. akt. chron. akt. chron. akt. atroph. chron. akt. chron. akt.atroph. Kultur Genanalyse BürstenBiopsie ausstrich Ureaseurel 16S rDNA RAPDtest Sequen- Sequenz- IgG IgA PCR zierung analyse - - + + + + + + + + + + - Serum - - n.u. - - n.u. + - - - n.u. + - - - n.u. + - - - n.u. - - n.u. + - - - n.u. + - - - n.u. - - n.u. n.u. n.u. n.u. n.u. n.u. n.u. + - + = positiv, - = negativ, n.u. = nicht untersucht; Gastritisbeurteilung: - = ohne besonderen Befund, + = geringgradig, ++ = mittelgradig 80 EIGENE UNTERSUCHUNGEN Tab. 11a: Histologische, bakteriologische und serologische Untersuchungen Tier 8156 Histolologische Beurteilung der Gastritis UnterMagensuchungslokalisation zeitpunkt 19 mpi 24 mpi 36 mpi 39 mpi 3 dpsi 1 wpsi 2 wpsi 4 wpsi 8 wpsi Kardia Fundus Antrum Kardia Fundus Antrum Kardia Fundus Antrum Kardia Fundus Antrum Kardia Fundus Antrum Kardia Fundus Antrum Kardia Fundus Antrum Kardia Fundus Antrum Kardia Fundus Antrum Grad ++ + + + + ++ ++ ++ + ++ + + ++ ++ + ++ ++ ++ ++ ++ + + + Art chron. akt. chron. akt. atroph. chron. akt. chron. akt. chron. chron. chron. akt. chron. akt. follik. chron. chron. akt. chron. akt. chron. akt. chron. akt. atroph. akut akt. fokal herdf. chron. chron. akt. atroph. chron. atroph. chron. akt. chron. akt. chron. akt. chron. chron. akt. chron. Genanalyse Kultur Serum Ureaseurel 16S rDNA RAPDBürstentest Sequen- Sequenz- IgG IgA Biopsie PCR ausstrich zierung analyse + + + + + + + + + + + + - + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + - BO417 n.u. BO417 n.u. n.u. - n.u. - n.u. n.u. - n.u. BO417 - n.u. - CC28c CC28c n.u. - - CC28c MM1303 MM1303 n.u. + - MM1303 MM1303 n.u. + - MM1303 MM1303 n.u. + - n.u. - - - - + - n.u. n.u. + = positiv, - = negativ, n.u. = nicht untersucht, BO417 bzw. CC28c bzw. MM1303 = H. pylori-Bakterienstämme; Gastritisbeurteilung: - = ohne besonderen Befund, + = geringgradig, ++ = mittelgradig ERGEBNISSE 81 Tab. 11b: Histologische, bakteriologische und serologische Untersuchungen Tier 8156 UnterMagensuchungslokalisation zeitpunkt 12 wpsi 16 wpsi 20 wpsi 23 wpsi 30 wpsi 33 wpsi 36 wpsi 57 wpsi 75 wpsi Kardia Fundus Antrum Kardia Fundus Antrum Kardia Fundus Antrum Kardia Fundus Antrum Kardia Fundus Antrum Kardia Fundus Antrum Kardia Fundus Antrum Kardia Fundus Antrum Kardia Fundus Antrum Histolologische Beurteilung der Gastritis Grad Art ++ chron. akt. atroph. ++ chron. akt. fokal herdf. ++ chron. akt. fokal herdf. + chron. + chron. ++ chron. akt. ++ chron. akt. atroph. ++ chron. akt. fokal herdf. ++ chron. akt. fokal herdf. atroph. ++ chron. akt. + chron. akt. ++ chron. akt. fokal herdf. ++ chron. akt. follik. + chron. akt. ++ chron. akt. ++ chron. akt. + chron. ++ chron. akt. ++ chron. akt. follik. ++ chron. akt. fokal herdf. ++ chron. akt. ++ chron. akt. fokal herdf. atroph. + chron. akt. ++ chron. akt. atroph. + chron. akt. ++ chron. akt. follik. ++ chron. akt. Kultur Serum Genanalyse Ureaseurel 16S rDNA BürstenRAPDtest Sequen- Sequenz- IgG IgA Biopsie ausstrich PCR zierung analyse + + + - + + - + + + + + + + + + + - - - n.u. - MM1303 n.u. + + - - n.u. + + - - n.u. + - - - n.u. - - n.u. + - - MM1303 n.u. + - - CC28c MM1303 n.u. - - n.u. n.u. n.u. n.u. n.u. n.u. n.u. + - + = positiv, - = negativ, n.u. = nicht untersucht, CC28c bzw. MM1303 = H. pyloriBakterienstämme; Gastritisbeurteilung: + = geringgradig, ++ = mittelgradig 82 EIGENE UNTERSUCHUNGEN Tab. 12a: Histologische, bakteriologische und serologische Untersuchungen Tier 9050 UnterMagensuchungslokalisation zeitpunkt 19 mpi 24 mpi 36 mpi 39 mpi 3 dpsi 1 wpsi 2 wpsi 4 wpsi 8 wpsi Kardia Fundus Antrum Kardia Fundus Antrum Kardia Fundus Antrum Kardia Fundus Antrum Kardia Fundus Antrum Kardia Fundus Antrum Kardia Fundus Antrum Kardia Fundus Antrum Kardia Fundus Antrum Histolologische Beurteilung der Gastritis Grad Art + chron. akt. + chron. akt. fokal herdf. + chron. akt. ++ chron. akt. ++ chron. akt. follik. atroph. + chron. ++ chron. akt. ++ chron. akt. ++ chron. akt. ++ chron. akt. + chron. ++ chron. akt. atroph. n.u. n.u. + chron. + chron. ++ chron. akt. fokal herdf. atroph. + chron. akt. n.u. n.u. ++ chron. akt. atroph. + chron. akt. + chron. akt. + chron. akt. + chron. akt. + chron. ++ chron. akt. atroph. ++ chron. akt. fokal herdf. atroph. ++ chron. akt. atroph. Kultur Serum Genanalyse Ureaseurel 16S rDNA RAPDBürstentest Biopsie Sequen- Sequenz- IgG IgA PCR ausstrich zierung analyse + + + + + + + + + - + + + + + + + + + + + + - + + + + + + + + + + + + + + + - BO417 n.u. - n.u. n.u. BO417 n.u. - n.u. n.u. - n.u. - - n.u. - - - n.u. + - CC28c CC28c MM1303 MM1303 n.u. + - MM1303 MM1303 n.u. + - CC28c MM1303 MM1303 n.u. + - n.u. - - - - + - n.u. n.u. + = positiv, - = negativ, n.u. = nicht untersucht, BO417 bzw. CC28c bzw. MM1303 = H. pylori-Bakterienstämme; Gastritisbeurteilung: + = geringgradig, ++ = mittelgradig ERGEBNISSE 83 Tab. 12b: Histologische, bakteriologische und serologische Untersuchungen Tier 9050 UnterMagensuchungslokalisation zeitpunkt 12 wpsi 16 wpsi 20 wpsi 23 wpsi 30 wpsi 33 wpsi 36 wpsi 57 wpsi 75 wpsi Kardia Fundus Antrum Kardia Fundus Antrum Kardia Fundus Antrum Kardia Fundus Antrum Kardia Fundus Antrum Kardia Fundus Antrum Kardia Fundus Antrum Kardia Fundus Antrum Kardia Fundus Antrum Histolologische Beurteilung der Gastritis Grad Art + chron. akt. atroph. + chron. ++ chron. akt. atroph. ++ chron. akt. atroph. + chron. ++ chron. akt. ++ chron. akt. + chron. akt. ++ chron. akt. ++ chron. akt. fokal herdf. atroph. ++ chron. akt. atroph. ++ chron. akt. ++ chron. akt. + chron. akt. + chron. akt. ++ chron. akt. atroph. + chron. akt. + chron. akt. ++ chron. akt. follik. + chron. ++ chron. akt. atroph. ++ chron. akt. atroph. ++ chron. akt. atroph. ++ chron. akt. + chron. akt. + chron. akt. ++ chron. akt. Kultur Genanalyse Serum Ureaseurel 16S rDNA RAPDBürstentest Biopsie Sequen- Sequenz- IgG IgA PCR ausstrich zierung analyse + + - + - + + + + + + + + + + + - - - n.u. - - n.u. + - - - n.u. + - - - n.u. + - - - n.u. - - n.u. + - - - n.u. + - - MM1303 n.u. - - n.u. n.u. n.u. n.u. n.u. n.u. n.u. + - + = positiv, - = negativ, n.u. = nicht untersucht, MM1303 = H. pylori-Bakterienstamm; Gastritisbeurteilung: + = geringgradig, ++ = mittelgradig 84 EIGENE UNTERSUCHUNGEN Abb. 5a: Tier 7743, Antrum, 3 dpsi. Geringgradige, akute Gastritis mit mittelgradiger Hyperämie in der Lamina propria der Magenmukosa. Paraplast-Schnitt, HE, Scalebar = 40 µm. Abb. 5b: Tier 7743, Antrum, 20 wpsi. Entwicklung einer mittelgradigen, chronisch aktiven, atrophischen Gastritis mit oberflächlicher und tiefer Infiltration von Lymphozyten in die Lamina propria der Magenmukosa. Paraplast-Schnitt, HE, Scalebar = 40 µm. ERGEBNISSE 85 Abb. 6a: Tier 8156, Fundus, 1 wpsi. Entwicklung einer mittelgradigen, akuten, herdförmigen Gastritis mit Infiltration von neutrophilen Granulozyten (Pfeile) in die Lamina epithelialis der Magenmukosa. Paraplast-Schnitt, HE, Scalebar = 20 µm. Abb. 6b: Tier 8156, Fundus, 20 wpsi. Entwicklung einer mittelgradigen, chronisch aktiven Gastritis mit Infiltration von lymphoplasmazellulären Zellen in die Lamina propria und fokaler oberflächlicher Epithelerosion (Pfeile) der Magenmukosa. Paraplast-Schnitt, HE, Scalebar = 40 µm. 86 EIGENE UNTERSUCHUNGEN Abb. 6c: Tier 8156, Fundus, 36 wpsi. Entwicklung einer mittelgradigen, chronisch aktiven Gastritis mit Bildung eines lymphofollikulären Herdes (H) in der Lamina propria der Magenmukosa. Paraplast-Schnitt, HE, Scalebar = 40 µm. Abb. 6d: Tier 8156, Fundus, 75 wpsi. Entwicklung einer mittelgradigen, chronisch aktiven Gastritis mit Bildung eines Lymphfollikels (L) in der Lamina mucosa. Paraplast-Schnitt, HE, Scalebar = 40 µm. ERGEBNISSE 87 Abb. 7a: Tier 9050, Antrum, 12 wpsi. Entwicklung einer mittelgradigen, chronisch aktiven, atrophischen Gastritis (A) mit oberflächlicher und tiefer Infiltration von Lymphozyten in die Lamina propria der Magenmukosa. Paraplast-Schnitt, HE, Scalebar = 40 µm. Abb. 7b: Tier 9050, Antrum, 75 wpsi. Entwicklung einer mittelgradigen, chronisch aktiven Gastritis mit Infiltration von Lymphozyten (schwarze Pfeile) in die Lamina propria und granulozytären Entzündungszellinfiltraten (schwarze Pfeilspitze) in die Lamina epithelialis. Paraplast-Schnitt, HE, Scalebar = 20 µm. 88 EIGENE UNTERSUCHUNGEN 3.2.8 Immunhistochemische Ergebnisse der Biopsieproben Nach der Infektion unterschiedliche und Anstiege Superinfektion oder waren Abnahmen der bei allen Versuchstieren Lymphozytenzahlen und Makrophagenzahlen feststellbar. Dabei kam es von Untersuchungszeitpunkt zu Untersuchungszeitpunkt zu teilweise erheblichen Schwankungen der einzelnen Zellzahlen. Gegen Versuchsende zeigte sich bei allen Tieren ein deutlicher Anstieg der T-Zellen und der Makrophagen. Der Beginn der immunhistochemischen Untersuchungen dieser Arbeit datiert ab dem Zeitpunkt 19 Monate nach der Infektion. Bei den einzelnen Tieren konnten folgende Befunde erhoben werden. Ab dem dritten Tag nach der Superinfektion war bei Tier 7743 ein Anstieg der TZellen und der Makrophagen in allen Entnahmelokalisationen erkennbar. Nach diesem anfänglichen Peak folgte eine Phase mit nur leichten Schwankungen der Zellzahlen. Zwischen der 20. bis 30. Woche nach der Superinfektion konnte ein erneuter ausgeprägter Anstieg der T-Zellen und der Makrophagen beobachtet werden. In der 57. Woche nach Superinfektion waren die T-Zellen in allen Lokalisationen auf ein etwas über dem Ausgangswert liegendes Maß abgesunken. Die B-Zellen blieben in ihrer Anzahl nahezu konstant (Abb. 8 - 10). Die Untersuchungsergebnisse des Tieres 8156 zeigten in der Fundus- und Antrumregion die gleiche Tendenz wie die Ergebnisse des Tieres 7743. Auch bei diesem Tier fiel ab der 20. Woche nach der Superinfektion ein deutlicher Anstieg der T-Zellen und Makrophagen auf. Die Entwicklung der B-Zellzahlen zeigte sich in der Fundus- und Antrumregion fast über den gesamten Untersuchungszeitraum konstant niedrig mit einem starken Anstieg in der 20. Woche nach der Superinfektion. Die Kardiaregion wies ein abweichendes Bild zu den anderen Lokalisationen auf. Über den gesamten Untersuchungszeitraum fielen deutliche Anstiege aller Zellzahlen auf, ohne dass daraus eine Tendenz ersichtlich wurde (Abb. 12 - 14). ERGEBNISSE 89 Bei Tier 9050 konnte ein deutlicher Anstieg der T-Zellen und Makrophagen zwischen der 30. bis 33. Woche nach der Superinfektion in allen Entnahmeregionen festgestellt werden. Weiterhin auffällig waren ein hochgradiger Anstieg der Lymphozyten und Makrophagen 24 Monate nach der Infektion im Fundus sowie eine Woche nach der Superinfektion in der Kardia. Aus der Entwicklung der B-Zellzahlen war keine Tendenz eines Anstiegs ersichtlich (Abb. 16 - 18). 90 EIGENE UNTERSUCHUNGEN Abb. 8 - 10: Immunhistochemische Zellmarkierung Tier 7743 60 T-Lymphozyten 55 B-Lymphozyten 50 Makrophagen 45 Zellzahl 40 35 30 25 20 15 10 5 0 75 57 36 33 30 23 20 16 ps w ps w ps w ps w ps w ps w ps w ps w i ps i ps i ps si i ps ps w w w w w pi m pi m pi m pi m dp 12 8 4 2 1 3 39 36 24 19 i i i i i i i i i Entnahmezeitpunkt in der Kardia 60 T-Lymphozyten 55 50 B-Lymphozyten 45 Makrophagen Zellzahl 40 35 30 25 20 15 10 5 0 75 57 36 33 30 23 20 16 ps w ps w ps w ps w ps w ps w ps w ps w i ps i ps i ps si i ps ps w w w w w pi m pi m pi m pi m dp 12 8 4 2 1 3 39 36 24 19 i i i i i i i i i Entnahmezeitpunkt im Fundus 60 T-Lymphozyten 55 B-Lymphozyten 50 Makrophagen 45 Zellzahl 40 35 30 25 20 15 10 5 0 75 57 36 33 30 23 20 16 ps w ps w ps w ps w ps w ps w ps w ps w i ps i ps i ps si i ps ps w w w w w pi m pi m pi m pi m dp 12 8 4 2 1 3 39 36 24 19 i i i i i i i i i Entnahmezeitpunkt im Antrum ERGEBNISSE 91 Abb. 11a: Tier 7743, Antrum, 3 dpsi. Geringgradige, akute Gastritis mit CD3markierten T-Lymphozyten (Pfeile). Paraplast-Schnitt, IHC-SABC, Scalebar = 20 µm. Abb. 11b: Tier 7743, Antrum, 20 wpsi. Mittelgradige, chronische Gastritis mit Infiltration von CD3-markierten T-Lymphozyten (Pfeile) in die Lamina propria der Magenmukosa. Paraplast-Schnitt, IHC-SABC, Scalebar = 20 µm. 92 EIGENE UNTERSUCHUNGEN Abb. 12 - 14: Immunhistochemische Zellmarkierung Tier 8156 50 T-Lymphozyten 45 B-Lymphozyten 40 Makrophagen Zellzahl 35 30 25 20 15 10 5 0 75 57 36 33 30 23 20 16 ps w ps w ps w ps w ps w ps w ps w ps w i ps i ps i ps si i ps ps w w w w w pi m pi m pi m pi m dp 12 8 4 2 1 3 39 36 24 19 i i i i i i i i i Entnahmezeitpunkt in der Kardia 50 T-Lymphozyten 45 B-Lymphozyten 40 Makrophagen Zellzahl 35 30 25 20 15 10 5 0 75 57 36 33 30 23 20 16 ps w ps w ps w ps w ps w ps w ps w ps w i ps i ps i ps si i ps ps w w w w w pi m pi m pi m pi m dp 12 8 4 2 1 3 39 36 24 19 i i i i i i i i i Entnahmezeitpunkt im Fundus 90 T-Lymphozyten 80 B-Lymphozyten 70 Makrophagen Zellzahl 60 50 40 30 20 10 0 75 57 36 33 30 23 20 16 ps w ps w ps w ps w ps w ps w ps w ps w i ps i ps i ps si i ps ps w w w w w pi m pi m pi m pi m dp 12 8 4 2 1 3 39 36 24 19 i i i i i i i i i Entnahmezeitpunkt im Antrum ERGEBNISSE 93 Abb. 15a: Tier 8156, Antrum, 1 wpsi. Geringgradige, chronische Gastritis mit CD3markierten T-Lymphozyten (Pfeile) Paraplast-Schnitt, IHC-SABC, Scalebar = 20 µm. Abb. 15b: Tier 8156, Antrum, 30 wpsi. Nach dreißig Wochen hat sich eine mittelgradige Gastritis mit Zunahme von CD3-markierten T-Lymphozyten (Pfeile) entwickelt. Paraplast-Schnitt, IHC-SABC, Scalebar = 20 µm. 94 EIGENE UNTERSUCHUNGEN Abb. 16 - 18: Immunhistochemische Zellmarkierung Tier 9050 140 T-Lymphozyten 120 B-Lymphozyten Makrophagen Zellzahl 100 80 60 40 20 0 75 57 36 33 30 23 20 16 ps w ps w ps w ps w ps w ps w ps w ps w i ps i ps i ps si ps w i ps w w w w pi m pi m pi m pi m dp 12 8 4 2 1 3 39 36 24 19 i i i i i i i i i Entnahmezeitpunkt in der Kardia 90 T-Lymphozyten 80 B-Lymphozyten 70 Makrophagen Zellzahl 60 50 40 30 20 10 0 m m m pi pi i ps w 75 i ps w 57 i ps w 36 i ps w 33 i ps w 30 i ps w 23 i ps w 20 i ps w 16 i ps w 12 i ps w 8 i ps w 4 i ps w 2 i ps w 1 si dp 3 pi m pi 39 36 24 19 Entnahmezeitpunkt im Fundus 140 T-Lymphozyten 120 B-Lymphozyten Makrophagen Zellzahl 100 80 60 40 20 0 75 57 36 33 30 23 20 16 w w w w w w w w i ps i ps i ps i ps i ps i ps i ps i ps i ps i ps i ps i ps i ps pi pi si w w w w w m pi pi m m m dp 12 8 4 2 1 3 39 36 24 19 Entnahmezeitpunkt im Antrum ERGEBNISSE 95 Abb. 19a: Tier 9050, Fundus, 4 wpsi. Geringgradige, chronisch aktive Gastritis mit CD3-markierten T-Lymphozyten (Pfeile). Paraplast-Schnitt, IHC-SABC, Scalebar = 20 µm. Abb. 19b: Tier 9050, Fundus, 57 wpsi. Auch bei Tier 9050 ist eine deutlich ausgeprägte chronische Gastritis mit Zunahme von CD3-markierten T-Lymphozyten (Pfeile) im Verlaufe der Infektion erkennbar. Paraplast-Schnitt, IHC-SABC, Scalebar = 20 µm. 96 EIGENE UNTERSUCHUNGEN 3.2.9 Serologische Untersuchungen Die in regelmäßigen Zeitabständen durchgeführten serologischen Untersuchungen zum Nachweis von IgG-spezifischen Antikörpern gegen H. pylori verliefen über den gesamten Untersuchungszeitraum bei allen Tieren positiv. Ausnahmen bildeten die Untersuchungszeitpunkte zwei Wochen nach der Superinfektion (Tier 7743), drei Tage und acht Wochen nach der Superinfektion (Tier 8156) sowie acht Wochen nach der Superinfektion (Tier 9050). In dem Fall eines positiven Nachweises konnte immer das Vorliegen eines hochpathogenen H. pylori-Stammes (Typ I Stamm) durch Nachweis des CagA+-Proteins festgestellt werden. IgA-spezifische Antikörper gegen H. pylori wurden über den gesamten Untersuchungszeitraum bei allen Tieren nicht nachgewiesen. Eine vollständige Übersicht der serologischen Ergebnisse findet sich in den Tabellen 10 - 12. 3.2.10 Auswertung des Kontrolltiers 9048 In dieser Studie wurde dem Kontrolltier kein H. pylori-Stamm inokuliert. Eine Besiedelung mit Large Gastrointestinal Spirals konnte beim Studienbeginn nachgewiesen werden (Kap. 3.1.1). Das Tier wies während des gesamten Untersuchungszeitraumes keinerlei Auffälligkeiten auf. Nahrungsaufnahme und Gewichtszunahme zeigten keine Unregelmäßigkeiten, das Wohlbefinden des Rhesusaffen erschien nicht gestört. Die Magenschleimhaut des Kontrolltieres war zu Beginn der Studie unauffällig. Der Ernährungszustand war einschließlich Sektionszeitpunkt gut. Das Tier hatte am Ende des Versuches ein Gewicht von 9,9 kg. Bei den kulturellen Untersuchungen konnten H. pylori-positive Ergebnisse bei dem Kontrolltier nicht erzielt werden, während der durchgeführte Ureasetest viermal positive Ergebnisse erbrachte (Tab. 13). ERGEBNISSE 97 Auffällig war, dass auch das Kontrolltier über den gesamten Untersuchungszeitraum von fünf Jahren histologisch Anzeichen einer Gastritis aufwies. Allerdings handelte es sich überwiegend um geringgradige Anzeichen. Das Auftreten der Gastritis hatte zum Zeitpunkt der Sektion einen mittleren Grad erreicht, wobei in allen Schleimhautabschnitten bei der lichtmikroskopischen Untersuchung (Kap. 3.1.12.2) eine hochgradige Besiedlung mit Large Gastrointestinal Spirals auffiel. Alle übrigen Befunde waren bei dem Kontrolltier unauffällig, obwohl zum Sektionszeitpunkt eine leichte chronische Enteritis und eine follikuläre Hyperplasie der Tonsillen und Körperlymphknoten vorlag. Ergebnisse von Untersuchungen vor dem 16.06.2000 liegen in der Dissertation von KUNZ (2000) vor. Tab. 13: Histologische und bakteriologische Untersuchungen Kontrolltier 9048. Histolologische Beurteilung Kultur UnterMagenUreaseder Gastritis Bürstensuchungstest Biopsie lokalisation ausstrich zeitpunkt Grad Art Kardia + chron. 16.06.2000 Fundus + chron. + Antrum n.u. n.u. Kardia + chron. akt. atroph. 10.11.2000 Fundus ++ chron. akt. fokal herdf. Antrum ++ chron. akt. Kardia + chron. akt. 06.11.2001 Fundus + chron. akt. Antrum + chron. akt. Kardia + 26.02.2002 Fundus + Antrum + chron. Kardia n.u. n.u. 17.09.2002 Fundus n.u. n.u. Antrum n.u. n.u. + Kardia ++ chron. akt. 15.09.2003 Fundus ++ chron. akt. Antrum ++ chron. akt. - + = positiv, - = negativ, n.u. = nicht untersucht, Gastritisbeurteilung: - = ohne besonderen Befund, + = geringgradig, ++ = mittelgradig 98 4 DISKUSSION Diskussion Ziel dieser Studie war es, an einem Tiermodell, welches genetisch und immunologisch dem Menschen sehr nahe kommt, eine experimentelle Helicobacter pylori Langzeitinfektionsstudie durchzuführen. Die vorliegende Arbeit dokumentiert die Ergebnisse dieser fünfjährigen Studie. Die Etablierung des Tiermodells, die erste Infektion der Rhesusaffen und die Auswertung der Proben des ersten Jahres nach der Infektion war Gegenstand der Dissertation von Frau Emanuela Kunz (KUNZ 2000). Diese Arbeit schließt sich mit der Auswertung der Proben an die Dissertation von Frau Kunz an und beginnt mit dem Entnahmezeitpunkt 19 Monate nach der Infektion (Kap. 3.1.8). Ein Untersuchungsschwerpunkt der eigenen Arbeit lag in der Darstellung der Schleimhautimmunantwort. Hierzu wurde Biopsiematerial histologisch und immunhistochemisch untersucht und ausgewertet. Darüber hinaus wurden kulturelle, molekularbiologische und elektronenmikroskopische Untersuchungen an dem regelmäßig entnommenen Biopsiematerial durchgeführt, um den Status der experimentellen Helicobacter-Infektion bei den Versuchstieren zu überprüfen. Mit molekularbiologischen Nachweisverfahren konnte nicht nur das Vorhandensein von Helicobacter-Stämmen verifiziert werden, sondern es war eine genaue Identifikation der inokulierten H. pylori-Stämme möglich. Mit Hilfe dieser parallel angewandten Untersuchungsmethoden ließ sich eine persistierende H. pylori-Infektion bei allen drei Rhesusaffen im Langzeitversuch bestätigen. 4.1 Bewertung des Tiermodells Rhesusaffe Einen wichtigen Beitrag in der Erforschung der Pathogenese von H. pylori leisten Tiermodelle. In verschiedenen Tiermodellen werden die Interaktionen des Bakteriums mit dem Wirt und die jeweiligen durch die Kolonisation hervorgerufenen Veränderungen sowohl seitens des Wirtes als auch seitens des Bakteriums studiert. Die meisten Tiermodelle nutzen Mäuse, Ratten oder Gerbile, die zwar mit einer großen Anzahl von Tieren durchgeführt werden können, jedoch den Nachteil DISKUSSION 99 besitzen, dem Krankheitsbild des Menschen nicht zu entsprechen und keine Longitudinalstudien zu ermöglichen (LEE et al. 1997). Die experimentelle H. pyloriInfektion der Rhesusaffen eignet sich daher als Tiermodell besonders, da die Rhesusaffen einen natürlichen Wirt für H. pylori darstellen (HANDT et al. 1997; MATTAPALILL et al. 2000; SOLNICK et al. 2003). Dies begünstigt die Infektion mit humanpathogenen Stämmen. Rhesusaffen ähneln in vielerlei Hinsicht der menschlichen Physiologie. Auch die Anatomie des Gastrointestinaltraktes ist gleich beschaffen (NATELSON et al. 1977). Ein weiterer Vorteil dieses Modells ist, dass durch die lange Lebensspanne der Rhesusaffen (ca. 35 Jahre) (GRZIMEK 1988) Longitudinalstudien ermöglicht werden. Aufgrund der Größe der Tiere können gastroskopische Untersuchungen problemlos durchgeführt werden. Biopsiematerial läßt sich in ausreichender Menge entnehmen, ohne dem Tier zu schaden. Ein Nachteil des Modells sind neben ethischen Erwägungen die hohen Anschaffungsund Unterhaltskosten. Versuche können im Vergleich zu Nagetiermodellen nur mit relativ kleinen Tierzahlen durchgeführt werden. Aus diesem Grund wurde auch in dem hier vorgestellten Tiermodell mit nur drei Versuchstieren gearbeitet. Dennoch können die Ergebnisse mit der humanen Situation in Relation gesetzt werden und liefern wertvolle Informationen über die Krankheitsentstehung und Entwicklung der Infektion. In dem hier etablierten experimentellen Rhesusaffenmodell für H. pyloriInfektionen konnte, im Gegensatz zu früheren Berichten (DUBOIS et al. 1996), erstmals gezeigt werden, dass eine Infektion mit humanpathogenen H. pyloriStämmen über einen Zeitraum von drei Jahren persistieren kann und die Affen über den ganzen Zeitraum Krankheitssymptome einer chronisch aktiven Gastritis entwickeln. 4.2 Aussagekraft des Untersuchungsmaterials Zum Nachweis einer H. pylori-Infektion gibt es keinen „Goldstandard“ (TOKUNAGA et al. 1998). Erst das Zusammenspiel eines unterschiedlichen Methodenspektrums erlaubt eine konstante Aussage über den Infektionszustand des einzelnen Tieres. 100 DISKUSSION Im verwendeten Methodenspektrum wurde die mikrobiologische Anzüchtung als Beweis für die erfolgreiche Infektion angesehen. Dabei muss berücksichtigt werden, dass die Anzucht aus Biopsiematerial nicht immer gelingt, da der Erreger sehr hohe Ansprüche an das Medium stellt. Außerdem sollte auch eine gewisse Bakteriendichte in der Biopsie vorhanden sein. Da die Erreger sich aber ungleichmäßig in der Schleimhaut verteilen (ENGSTRAND et al. 1992; TAKAHASHI et al. 1998), ist die Anzucht aus Biopsiematerial nicht immer erfolgreich. Deswegen wählt man eine Kombination mit molekularbiologischen, histologischen und immunhistochemischen Methoden um die Nachweissicherheit zu erhöhen. 4.3 Erfolg der Inokulation der H. pylori-Stämme Der erste Versuch einer Infektion mit dem H. pylori-Stamm NCTC11637 in der Etablierungsphase des Tiermodells war nicht erfolgreich. Dieser Stamm wurde von einem deutschen Humanpatienten mit einer schweren Gastritis isoliert und hatte bereits mehrere Laborpassagen hinter sich. Trotz der Erfolg versprechenden genotypischen Virulenzeigenschaften vacA+, cagA+ und flaB+ gelang es nicht, diesen H. pylori-Stamm im Magen zu etablieren. Möglicherweise war die Kolonisationsdichte zu gering, um messbare Werte zu produzieren. HOPKINS et al. (1996) beschrieben in ihrer Studie, dass häufige Laborpassagen von H. pylori zu einem Verlust der Infektiösität führen. Die Autoren konnten nachweisen, dass die Hämagglutination als wichtiger Kolonisationsfaktor des Bakteriums verloren ging. Einen Vergleich von invivo- und in-vitro-Passagen von H. pylori bei gnotobiotischen Ferkeln stellten MANKOSKI et al. (1999) an. Sie beobachteten eine deutlich bessere Ausprägung des Kolonisationsfaktors FlaA+ zur Verbesserung der Kolonisation bei den in-vivopassagierten H. pylori-Stämmen. Aufgrund zahlreicher möglicher Gründe für den Verlust der Infektiösität, konnte eine genaue Ursachenermittlung für das Fehlschlagen der Kolonisation von H. pylori-Stamm NCTC11637 nicht geleistet werden. DISKUSSION 101 Eine erfolgreiche Infektion der drei Versuchstiere gelang mit den H. pylori-Stämmen BO417 und BO418 (MÄTZ-RENSING et al. 2001). Der Nachweis des Stammes BO417 konnte über den Zeitraum von 36 Monaten geführt werden, während H. pylori-Stamm BO418 nur zwei Wochen post infectionem nachgewiesen werden konnte. Die Möglichkeit bestand, dass die H. pylori-Stämme, die eine in-vivoRekombination oder genetischen Drift durchmachten, eine persistente Besiedlung und eine hohe Kolonisationsdichte erreichten (DANON et al. 1998). Nach der Superinfektion gelang es nicht ständig, aber wiederholt den Nachweis von zwei Stämmen des H. pylori-Inokulats zu führen. Während die H. pylori-Stämme BO238 und RE7006 zu keinem Zeitpunkt nach der Superinfektion nachweisbar waren, so gelang dies mit den beiden H. pylori-Stämmen CC28c und MM1303. Bei Tier 7743 konnte nur H. pylori-Stamm CC28c identifiziert werden. Bei den Rhesusaffen 8156 und 9050 konnte in der Anfangsphase der Superinfektion noch eine Mischinfektion mit den Isolaten MM1303 und CC28c nachgewiesen werden. Nach dieser Anfangsphase einer hohen Nachweisrate der Isolate konnte erst wieder über ein Jahr später bei Tier 9050 ein MM1303-Isolat nachgewiesen werden. Möglicherweise hat sich dieser Stamm in Konkurrenz mit dem H. pylori-Stamm CC28c durchgesetzt. HUA et al. (1999) konnten die Dominanz eines Stammes, die zur Verdrängung der anderen Stämme führte, ebenfalls beobachten. Nachdem über ein Jahr lang nur der H. pylori-Stamm MM1303 bei Tier 8156 identifiziert werden konnte, lag auch bei diesem Tier die Vermutung nahe, dass dieses Isolat sich ebenfalls gegen die anderen Isolate durchsetze. Erstaunlich war, dass der Stamm CC28c nach einem Jahr ohne Nachweis wieder isoliert werden konnte. Etwa zehn Monate nach der Anfangsphase der Superinfektion, wuchs die Zahl der aus den Biopsien rekultivierten Isolate wieder an. Diese Erkenntnis der Einteilung in Infektionsphasen könnte auch für die H. pylori-Forschung eine wichtige Rolle bei der Betrachtung der chronischen Besiedlung und der Anpassung des H. pylori-Stammes an den Wirt darstellen. Die Ergebnisse dieses Langzeitinfektionsversuches untermauern die hervorragende Eignung des Rhesusaffentiermodells für eine H. pylori-Infektion und geben Anlass auch bei anderen Fragestellungen bezüglich einer H. pylori-Infektion auf dieses etablierte Tiermodell zurückzugreifen. 102 4.4 DISKUSSION Gewichtsentwicklung der Tiere Männliche Rhesusaffen können eine Kopfrumpflänge von 48 - 64 cm und ein Endgewicht von 6,5 - 12 kg erreichen. Im Alter von 4,5 Jahren sind die männlichen Tiere geschlechtsreif. Ihr Endalter wird auf über 30 Jahre angegeben (GRZIMEK 1988). Die Gewichtsdaten der Tiere 7743, 8156 und 9050 stellten sich über den Untersuchungszeitraum normal dar, wobei die rasche Gewichtszunahme in den ersten drei Jahren nach Versuchsbeginn auf das zunehmende Längenwachstum der juvenilen Tiere zurückzuführen war. Die Gewichtsentwicklung des Kontrolltieres 9048 wies keinerlei Auffälligkeiten auf, der Ernährungszustand dieses Tieres war jederzeit als gut zu bewerten. Im Zeitraum nach der Superinfektion war ein Gewichtsverlust von etwa 200 g bis 600 g bei allen H. pylori-infizierten Tieren ersichtlich. Es bestand der Verdacht, dass der Gewichtsverlust mit der akuten Infektion (DUBOIS 1998; EATON 1999) mit den H. pylori-Stämmen in Zusammenhang stand. Dazu muss in Betracht gezogen werden, dass die Tiere während dieses Zeitraumes erheblich unter Stress standen. Nicht nur die Superinfektion mit nachfolgenden erhöhten Gastritisgraden war bei diesem Gewichtsverlust zu berücksichtigen, sondern auch die anfangs engmaschigen Entnahmetermine für Magenbiopsien mit Narkose und vorausgehender Nahrungskarenz von 24 Stunden. Nahrungsaufnahme und das Wohlbefinden aller Affen erschienen in der Zeit nach der Superinfektion nicht gestört. Etwa 8 - 12 Wochen nach der Superinfektion ist dieser Gewichtsverlust von allen Affen kompensiert worden. 4.5 Bewertung histologischer Befunde Verschiedene Arbeitsgruppen haben sich besonders zu Beginn der Helicobacter pylori-Forschung mit der Pathogenese dieser Infektionskrankheit befasst. Dabei standen histopathologische Untersuchungen im Vordergrund. Tiermodelle mit DISKUSSION 103 Mäusen, Ratten, Gerbilen, Meerschweinchen, Katzen, Hunden, Schweinen und nicht humanen Primaten fanden Verwendung. Eines der interessantesten Tiermodelle war das der Rhesusaffen. Diese nicht humanen Primaten zeichneten sich durch ihre enge genetische Verwandtschaft zum Menschen und den vergleichbaren krankhaften Veränderungen des Magens aus (DUBOIS 1998; EATON 1999; LEE et al. 1999; MÄTZ-RENSING et al. 2001). Die verschiedenen Autorengruppen beschrieben die Pathogenese einer H. pylori-Infektion bei Rhesusaffen als chronisch aktive Gastritis mit Lymphfollikelbildung in der Lamina propria und damit einhergehender mononukleärer und neutrophiler Infiltration mit Schleimhautatrophie. Die in der vorliegenden Arbeit genommenen Magenbiopsien wurden nach dem von DIXON et al. (1997) beschriebenen „Sydney-System“ bewertet und nach ihrem Gastritisgrad ab dem Entnahmezeitpunkt 19 Monate nach der Infektion der Rhesusaffen eingestuft. Die Tiere 7743 und 8156 zeigten Gastritisgrade von ohne besonderen Befund bis mittelgradig, bei Tier 9050 traten gering- bis mittelgradige Gastritiden auf. Eine hochgradige Gastritis trat bei keinem der Tiere auf. Diese Ergebnisse bestätigen auch die klinischen Befunde, die über den Zeitraum von etwa fünf Jahren immer unauffällig waren. Gegen Ende der Untersuchungen nahm die Schwere der Gastritis allgemein zu. Diese deutliche Tendenz war übereinstimmend mit den Befunden der immunhistochemischen Markierung. Nur in wenigen Fällen konnte eine Diskrepanz zwischen der histologischen Bewertung und der immunhistochemischen Auszählung festgestellt werden. Es kam vereinzelt vor, dass die Auszählung eines immunhistochemisch markierten Schnittes eine hochgradige Infiltration von T-Lymphozyten, B-Lymphozyten und Makrophagen zeigte, während die histologische Bewertung derselben Biopsie nur eine mittelgradige Gastritis ergab. Eine Erklärung dieser Diskrepanz ist dahingehend zu sehen, dass durch die immunhistochemische Markierung Lymphozyten deutlich besser zu identifizieren waren als in der HE-Färbung, so dass eine subjektive Beeinflussung anzunehmen ist. Zum Anderen berücksichtigte die immunhistochemische Bewertung nur ein repräsentatives Gesichtsfeld des histologischen Schnittes, während bei der Gastritisklassifikation desselben Schnittes der gesamte Schnitt zur Bewertung 104 DISKUSSION herangezogen wurde. Weiterhin fanden noch andere Bewertungskriterien bei der Gastritisklassifikation Granulozyten, Eingang wie Drüsenatrophie, Lymphfollikelausbildung, Anzahl intestinale neutrophiler Metaplasie und Kolonisationsdichte von H. pylori. Diese Fülle der aufgezählten Kriterien bei der Gastritisklassifikation fand keine Bewertung bei der immunhistochemischen Markierung. Umgekehrte Beispiele dieser voneinander abweichenden Einteilung in Gastritisgrad und Bewertung der immunhistochemischen Auszählung waren gleichfalls vorhanden und konnten aus den schon genannten Gründen erklärt werden. Zieht man die histologischen Befunde des Kontrolltieres 9048 heran, so fällt auf, dass dieses Tier über die gesamte Studie Gastritisbefunde aufwies. Diese Befunde waren überwiegend geringgradig und zum Sektionszeitpunkt mittelgradig ausgeprägt. Wenn man berücksichtigt, dass ein Nachweis von H. pylori nie gelang, während LGIS zum Beginn und Ende der Studie (Kap. 3.2.10) nachgewiesen werden konnten, liegt die Vermutung nahe, dass die aufgefundenen Gastritisbefunde mit der LGIS-Kolonisation des Kontrolltieres zusammenhängen. Diese Problematik stellt die Tauglichkeit eines Rhesusaffentiermodells in Frage, wenn man bedenkt, dass auch ohne experimentelle H. pylori-Infektion eine Gastritis auftritt. In Betracht gezogen werden muss dabei, dass es sich überwiegend um geringe Gastritisgrade handelte. Auch stützt sich die Bewertung der Gastritis ausschließlich auf eine aus Tierschutzgründen gering gehaltene Zahl von Biopsien mit histologischen Befunderhebungen. Weiterhin ist bekannt, dass selbst die Mägen spezifisch pathogenfrei gehaltener Rhesusaffen, die einzeln und von Menschenhand aufgezogen wurden, mit LGIS besiedelt sind und Gastritisbefunde zeigen (SOLNICK et al. 2001). Bei Untersuchungen an verschiedenen Tiermodellen wurde von den Autoren (ENGSTRAND et al. 1992; DUBOIS et al. 1996; TAKAHASHI et al. 1998) die Antrum- und Fundusregion des Magens als eine bevorzugte Kolonisation von H. pylori genannt. In der vorliegenden Arbeit konnte festgestellt werden, dass die DISKUSSION 105 Gastritis relativ gleichmäßig in allen drei Entnahmelokalisationen (Kardia, Fundus und Antrum) vorlag. Die Entnahmeempfehlung von mindestens fünf Biopsien (Antrum, Fundus, Incisura angularis) pro Tier stellt eine hohe Wahrscheinlichkeit, aber keine Sicherheit, der Wiedergabe eines korrekten Gastritisstatus her (DIXON et al. 1997). Dass bei anderen Untersuchungen Kardiaregionen nicht so häufig vertreten waren, lag möglicherweise darin begründet, dass die Kardiadrüsenregion nur einen schmalen Bereich zwischen Ösophagus und Magenfundus darstellt und dieser Bereich bei der Entnahme der Biopsien leicht verfehlt werden kann. 4.6 Auftreten von Lymphfollikeln und lymphofollikulären Herden Das Auftreten von Lymphfollikeln in der Magenmukosa wurde prä und post infectionem mit H. pylori untersucht. DRIESSEN et al. (2002) zeigten an gnotobiotischen Ferkeln, dass zum Zeitpunkt der Geburt schon Mucosa Associated Lymphoid Tissue (MALT) vorhanden war. Es setzte sich aus Lymphfollikeln, diffusen mononukleären Zellinfiltraten und intraepithelialen Lymphozyten zusammen. ROSSI et al. (1999) berichteten im konventionellen Beagletiermodell von chronischer, follikulärer Gastritis mit charakteristischen Erhebungen der Magenwand. Lymphfollikel (1,5 - 2 mm im Durchmesser) traten acht Wochen p.i. mit H. pylori im Antrum auf. In ihrer Studie mit spezifisch pathogenfreien BALB/c Mäusen konnten ENNO et al. (1995) über 26 Monate folgendes Ergebnis präsentieren. Bei 38 % der mit H. pylori infizierten Mäuse konnten Lymphfollikel beobachtet werden, während die nicht infizierte Gruppe der Mäuse keine Lymphfollikel zeigte. In einer humanmedizinischen Studie mit 2692 Patienten verglichen EIDT und STOLTE (1993) Antrum- und Fundusregion bezüglich des Auftreten von Lymphfollikeln unter einer H. pylori-Infektion. Sie fanden in 53,8 % der Fälle im Antrum Lymphfollikel und Aggregationen, während dies im Korpusbereich nur in 14,8 % der Fälle vorkam. In den Untersuchungen der vorliegenden Arbeit konnten bei den Rhesusaffen eine unterschiedliche Anzahl von Lymphfollikeln oder lymphofollikulären Herden 106 DISKUSSION festgestellt werden. Dabei trat bei dem Tier 7743 nur einmal ein Lymphfollikel auf. Bei Tieren den 8156 und 9050 wurden bis zu vier Lymphfollikel festgestellt. Lymphfollikel traten über den gesamten Untersuchungszeitraum auf und waren vorwiegend in Kardia- und Fundusregionen anzutreffen. 4.7 Immunhistochemische Überlegungen Eine lokale immunologische Reaktion der Magenmukosa infolge einer H. pyloriInfektion ist schon mehrfach untersucht worden, aber noch nie bei Rhesusaffen über einen mehrjährigen Zeitraum wie in der vorliegenden Arbeit. Die Probenuntersuchungen dieser Arbeit schließen sich dabei an die Arbeit von KUNZ (2000) an und beginnen 19 Monate nach der Infektion der Rhesusaffen. CHI et al. (1999) konnten in einer Studie über 20 Wochen bei Gerbilen die TLymphozytenfraktion als häufigsten anzutreffenden Leukozytenanteil bei hochgradiger H. pylori-Kolonisation feststellen. MATTAPALLIL et al. (2000) haben bei Rhesusaffen gezeigt, dass es unter einer akuten H. pylori-Infektion hauptsächlich zu einer T-Helferzellen-(Th1)-dominierten Immunantwort kam. In der ungewöhnlichen Dominanz der Th1-dominierten Immunantwort vermuteten MATTAPALLIL und Mitarbeiter (2000) den Grund, dass innerhalb von 12 Wochen noch keine Heilung erkennbar war. Eine Vermutung der Autoren war, dass anormale immunologische Reaktionen bei akuten Infektionen den Wirt prädisponieren, eine chronische oder persistente H. pylori-Infektion zu entwickeln. DANDEKAR et al. (2003) beobachteten bei Rhesusaffen in den ersten acht Wochen einer H. pylori-Infektion eine gesteigerte Apoptose von gastrischen T-Lymphozyten. Die Autoren vermuteten eine kompensatorische Immunantwort auf die hohe initiale T-Zell-Entzündungsantwort einer akuten H. pylori-Infektion. Während die vorhergehenden Autoren nur die gesteigerte T-Zellantwort bis 12 Wochen nach der H. pylori-Infektion bestätigen können, war es in der vorliegenden DISKUSSION 107 Arbeit möglich, diesen Nachweis bis 75 Wochen nach einer Superinfektion mit H. pylori zu erbringen. Die hier durchgeführten Untersuchungen mit Hilfe der Immunhistochemie (CD3, CD20, CD68) zeigten allgemein eine eindeutige Tendenz. Nach der Superinfektion der drei Versuchstiere konnte ein deutlicher Anstieg der TLymphozyten bei allen drei Tieren in allen Entnahmeregionen (Kardia, Fundus und Antrum) verzeichnet werden. Vergesellschaftet mit dem Anstieg der T-Lymphozyten war ein Anstieg der Makrophagen. Der Grund für die Zunahme von Makrophagen könnte möglicherweise darin begründet sein, dass T-Lymphozyten Makrophagen zur Effektorzelle stimulieren (JANEWAY u. TRAVERS 1997). Dieser Anstieg der TLymphozyten (Abb. 8 - 10) bei Tier 7743 begann etwa ab der 20. Woche nach der Superinfektion und erreichte hochgradige T-Zellzahlen in allen Entnahmeregionen. In die gleiche Richtung wiesen die Ergebnisse bei Tier 8156 und Tier 9050. Beginnend ab der 23. Woche nach der Superinfektion stiegen die T-Lymphozyten (Abb. 12 - 14, 16 - 18) hochgradig an. Es fiel auf, dass in der Kardiaregion des Tieres 8156 immer wieder mittel- bis hochgradige T-Lymphozytenzahlen zu unterschiedlichen Entnahmeterminen beobachtet wurden. Zu berücksichtigen war hierbei, dass die Kardiadrüsenregion nur ein schmaler Streifen zwischen Ösophagus und Magenfundus ist und dieser bei der Entnahme der Biopsien leicht verfehlt werden konnte. Festzustellen war allerdings, dass bei allen infizierten Tieren die TLymphozytenwerte schwankten, so dass auch zu anderen Entnahmezeiten sporadisch Anstiege der T-Lymphozyten auftraten. Da auch Gastritiden beim Kontrolltier aufzufinden waren, stellte sich die Frage nach der lokalen Schleimhautimmunantwort dieses Tieres. Vergleichbar mit den H. pylori-infizierten Tieren ließ sich beim Kontrolltier ebenso die Tendenz einer T-Lymphozytendominierten Schleimhautimmunantwort feststellen. Aus Tierschutzgründen ist dieses Tier allerdings nicht so intensiv beprobt worden. Zusammengefasst lässt sich als Ergebnis der immunhistochemischen Studien annehmen, dass alle Affen der Studie eine T-Lymphozyten-dominierte lokale Schleimhautimmunantwort etwa ab der 20. Woche nach der Superinfektion mit H. pylori entwickelt haben. Dieses Resultat bietet die Möglichkeit immunologische 108 DISKUSSION Zusammenhänge einer chronischen H. pylori-Infektion zu verstehen und in dieser Richtung weiter zu forschen. Ein langfristiges Ziel sollte es sein, diese Erkenntnisse auf den Menschen zu übertragen, um wirksam Therapien gegen H. pylori zu entwickeln. ZUSAMMENFASSUNG 5 109 Zusammenfassung Frank Runge (2004) Histologische und immunhistochemische Charakterisierung einer experimentellen persistierenden Helicobacter pylori-Infektion bei Rhesusaffen (Macaca mulatta). Eine Infektion mit Helicobacter pylori gilt weltweit als eine der am häufigsten vorkommenden Infektionskrankheiten des Menschen. Bis zu 50 % der menschlichen Bevölkerung der Industrieländer und etwa 80 % der Bevölkerung der Entwicklungsländer ist mit dem Bakterium H. pylori infiziert. Um neue Strategien zur Bekämpfung dieses pathogenen Erregers entwickeln zu können, wurden in den vergangenen Jahren zahlreiche Tiermodelle etabliert. Dabei hat sich der Rhesusaffe als ein besonders geeignetes Tiermodell herausgestellt. Die Tiere stellen einen natürlichen Wirt für H. pylori dar und ihr Immunsystem ist dem des Menschen sehr ähnlich. Vergleichbare anatomische Voraussetzungen und die Größe der Tiere erlauben endoskopische Eingriffe und Biopsieentnahmen. Die lange Lebenspanne der Tiere schafft die Voraussetzung für longitudinale Studien, welche gerade bei chronischen Infektionskrankheiten sehr wichtig sind. Ziel der vorliegenden Arbeit war es, die Ergebnisse der fünfjährigen Langzeitstudie einer experimentellen H. pylori-Infektion an Rhesusaffen zusammenzustellen und auszuwerten. An diesem Tiermodell sollte untersucht werden, ob die experimentelle Infektion über diesen langen Zeitraum aufrecht erhalten werden konnte und welche Auswirkungen dies für das Tier hatte. Vor diesem Hintergrund wurden drei Rhesusaffen experimentell mit sechs humanpathogenen H. pylori-Stämmen und einem Rhesus-adaptierten H. pyloriStamm infiziert. In einer Primärinfektion wurden drei Stämme intragastral appliziert und über dreieinhalb Jahre mittels endoskopisch gewonnener Biopsien verfolgt. 110 ZUSAMMENFASSUNG Dabei stellte sich heraus, dass nur das humanpathogene Isolat BO417 über einen Zeitraum von mindestens zwei Jahren in allen drei Tieren zu reisolieren war. Bei der dreieinhalb Jahre nach der Primärinfektion erfolgten Superinfektion mit drei humanpathogenen und einem Rhesusaffen spezifischen H. pylori-Stamm konnte eine vollständige Verdrängung des Stammes BO417 erreicht werden, während der humanpathogene H. pylori-Stamm CC28c und das Rhesusaffenisolat MM1303 über ein Jahr nach der Superinfektion zu unterschiedlichen Zeitpunkten festgestellt wurden. Zum Nachweis der verschiedenen Isolate kamen unterschiedliche kulturelle, histologische und molekularbiologische Methoden zum Einsatz. Die verschiedenen Nachweismethoden wurden durch pathomorphologische Untersuchungen an den Biopsien ergänzt. Es ließen sich chronisch aktive Gastritiden in gering- bis mittelgradiger Intensität nachweisen, die im Verlaufe der Infektion graduell zunahmen. Untersuchungen (CD3, In Ergänzung CD20, CD68) dazu wurden durchgeführt, immunhistochemische die eine deutliche T- Lymphozyten-dominierte lokale Schleimhautimmunantwort ab der 20. Woche nach der H. pylori-Superinfektion zeigten. Allerdings ist in diesem Zusammenhang zu erwähnen, dass auch das eingesetzte Kontrolltier leichte Anzeichen einer Gastritis aufwies, die möglicherweise auf eine spontane Besiedlung mit Large Gastrointestinal Spirals (LGIS) zurückzuführen ist. Diese LGIS ließen sich durch eine bei allen Tieren durchgeführte Eradikationstherapie nicht dauerhaft zurückdrängen. Die vorliegenden Ergebnisse zeigen, dass eine persistierende Langzeitinfektion mit H. pylori experimentell über fünf Jahre aufrecht erhalten werden kann. Bei experimentellen Infektionen ist aber auch auf die Auswahl geeigneter H. pyloriStämme zu achten. Von Vorteil scheinen Rhesusaffen spezifische H. pylori-Stämme zu sein. Bei experimentellen Untersuchungen sind Interaktionen mit LGIS zu berücksichtigen. Unter diesen Voraussetzungen bietet der Rhesusaffe ein hervorragendes Tiermodell, um pathogenetische Abläufe bei der H. pylori-Infektion zu untersuchen und um neue Strategien zur Bekämpfung dieses humanpathogenen Erregers zu entwickeln. SUMMARY 6 111 Summary Frank Runge (2004) Histological and immunohistochemical characterization of an experimental persistent Helicobacter pylori infection in rhesus monkeys (Macaca mulatta). Nowadays a Helicobacter pylori infection is considered worldwide as one of the most often occurring infectious diseases of men. Up to 50 % of the human population of industrial countries and about 80 % of the population of developing countries are infected with the bacterium H. pylori. In the past few years numerous animal models were established in order to be in a position to develop new strategies for the controlling of this pathogenic agent. Here the rhesus monkeys proved to be a particularly suitable animal model. The animals are a natural host for H. pylori and their immune system is very similar to that of men. Comparable anatomical preconditions and the size of animals enable endoscopic interventions and the taking of biopsies. The long life span of the animals is the precondition for longitudinal studies, which are very important especially in chronic infectious diseases. The aim of the present paper was to compile and to analyze the results of a 5-year longterm study of an experimental H. pylori infection in rhesus monkeys. The study intended to investigate whether it was possible to maintain the experimental infection during this long period of time and to find out the effects for the animals. Three rhesus monkeys were experimentally infected with six human pathogenic H. pylori lines and a H. pylori line adapted to rhesus monkeys. For a primary infection three lines were applied intragastrically and were observed for 3,5 years by means of endoscopically taken biopsies. 112 SUMMARY Only the human pathogenic isolate BO417 could be reisolated throughout a period of at least two years in all three animals. The superinfection which was effected 3,5 years after the primary infection with three human pathogenic and one H. pylori line specific for rhesus monkeys resulted in a complete replacement of the line BO417 whilst the human pathogenic H. pylori line CC28c and the rhesus monkey isolate MM1303 were discovered at different times more than one year after the superinfection. Different cultural, histological and molecularbiological methods were used for the proof of the diverse isolates. The diverse methods of proof were supplemented by pathomorphological investigations of the biopsies. Chronically active gastritides could be proved in a mild to moderate intensity, which gradually increased in the course of the infection. Additionally immunohistochemical investigations (CD3, CD20, CD68) were effected as from week 20 after the H. pylori superinfection. They showed a clear local mucous membrane reaction, dominated by T-lymphocytes. However, it has to be mentioned in this context that the animal used as control also showed slight symptoms of a gastritis, which possibly can be traced back to a spontaneous colonization with large gastrointestinal spirals (LGIS). It was not possible to permanently repress these LGIS by means of an eradication therapy carried out in all animals. The present results show that it is possible to experimentally maintain a persistent longterm infection with H. pylori for five years. In experimental infections it also has to be taken into consideration to select suitable H. pylori lines. Rhesus monkey specific H. pylori lines seem to be advantageous. In experimental investigations interactions with LGIS have to be taken into consideration. In view of these facts the rhesus monkey is an excellent animal model for the investigation of pathogenetic courses in H. pylori infections and for the development of new strategies for the control of this human pathogenic agent. LITERATURVERZEICHNIS 7 113 Literaturverzeichnis ACHTMAN, M., T. AZUMA, D. E. BERG, Y. ITO, G. MORELLI, Z.-J. PAN, S. SUERBAUM, S. THOMPSON, A. VAN DER ENDE u. L. J. VAN DOORN (1999): Recombination and clonal groupings within Helicobacter pylori from different geographical regions. Mol. Microbiol. 32, 459 - 470 AKOPYANZ, N., N. O. BUKANOV, T. U. WESTBLOM, S. KRESOVICH u. D. E. BERG (1992): DNA diversity among clinical isolates of Helicobacter pylori detected by PCR-based RAPD fingerprinting. Nucleic Acids Res. 20, 5137 - 5142 APPELMELK, B. J., R. NEGRINI, A. P. MORAN u. E. J. 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Becton Dickinson, Heidelberg) Aqua dest. 28 g 1000 ml bei 121° C 15 min autoklavieren Blutagarplatten Columbia-Agar Basis (Fa. Merck, Darmstadt) Aqua dest. 42 g 1000 ml bei 121° C 15 min autoklavieren, auf 50° C abkühlen lassen Schafblut (Fa. Oxoid, Wesel) 80 ml in Petrischalen abfüllen H. pylori-Agarplatten Blood Agar base Nr. 2 (Fa. Oxoid, Wesel) Aqua dest. bei 121° C autoklavieren 20 g 450 ml 130 ANHANG H. pylori Selectiv Supplement (Fa. Oxoid, Wesel) Pferdeblut (Fa. Oxoid, Wesel) 1 Röhrchen 35 ml steril zumischen, in Petrischalen abfüllen • Zusammensetzung von H. pylori Selectiv Supplement Vancomycin 5 mg Trimethoprim 2,5 mg Cefsulodin 2,5 mg Amphotericin B 2,5 mg je Röhrchen aseptisch 2 ml steriles Aqua dest. zugeben Herstellung mikroaerophiler Bedingungen CampyPak Plus (Becton Dickinson, Heidelberg) Aqua dest. 1 Päckchen 10 ml mit Pipette 10 ml Aqua dest. in einen Brief eingeben und in Anaerobiertopf verbringen Gram-Färbung der Objektträger (BÖCK 1989) 1. Objektträger für 30 s mit Grams Kristallviolettlösung bedecken 2. Überschuß abkippen 3. mit Lugolscher Lösung abspülen 4. Objektträger für 1 min mit Lugolscher Lösung bedecken 5. Überschuß abkippen 6. kurz mit 96%igem Alkohol differenzieren 7. mit Wasser abspülen 8. Objektträger für 30 s mit Fuchsinlösung bedecken 9. mit Wasser abspülen 10. trocknen lassen ANHANG 131 Gebrauchslösung für Gram-Färbung • Lugolsche Lösung Kaliumjodid p.a. Jod, doppelt sublimiert Aqua dest. • Aqua dest. • 7g 2100 ml Fuchsinlösung Ziehl-Neelsen Karbolfuchsinlösung 8.2 14 g 10 ml ad 100 ml Protokolle der histologischen Präparationen 4%ige neutral gepufferte Formaldehydlösung nach LILLIE (BÖCK 1989) 35%ige Formalinlösung 114 ml Aqua dest. 386 ml Lösung A Phosphatpuffer (s. u.) 100 ml Lösung B Phosphatpuffer (s. u.) 400 ml Phosphatpuffer • Stammlösung A: (0,2 M) Natriumdihydrogenphosphat-Monohydrat (Fa. Merck, Darmstadt, Nr. 6346) 27,6 g Aqua bidest. • ad 1000 ml Stammlösung B: (0,2 M) di-Natriumhydrogenphosphat-Dihydrat (Fa. Merck, Darmstadt, Nr. 6580) 35,6 g Aqua bidest. ad 1000 ml 132 • ANHANG Gebrauchslösung: (0,1 M, pH 7,4 - 7,6) Stammlösung A 10 ml Stammlösung B 40 ml Aqua bidest. 50 ml Giemsafärbung der Objektträgerausstriche 1. luftgetrocknete Bürstenabstriche abflammen 2. Objektträger für 20 - 30 min in 10%ige Giemsalösung 3. Spülen in Aqua dest. 4. Differenzieren in 0,5%iger Essigsäure (200 ml Aqua dest. + 1 ml konzentrierte Essigsäure), wodurch die Schnitte einen rötlichen Schimmer annehmen 5. kurz in 90%igem Alkohol spülen 6. 2 x für 5 min in Isopropanol 7. in Xylol für 10 min 8. Eindecken mit Kanadabalsam • Giemsa-Gebrauchslösung Giemsalösung 100% Phosphatpuffer-Gebrauchslösung (pH 6,8) 10 ml ad 100 ml Giemsa-Gebrauchslösung immer frisch herstellen Hämalaun-Eosin-Färbung (HE) • Entparaffinierung und Rehydratation: 1. Xylol unter dreimaligem Wechsel (5 min, 2 min, 2 min) 2. absteigende Alkoholreihe(100%ig, 96%ig für je 2 min, 80%ig, 70%ig für je 1 min) 3. Aqua dest. für 1 min • Kernfärbung: 4. Hämalaun nach Mayer (Fa. Merck, Darmstadt) für 3 min ANHANG 133 5. fließend wässern für 10 min • Gegenfärbung 6. Eosin für 5 min 7. fließend wässern für 5 s • Entwässerung in der aufsteigenden Alkoholreihe: 8. 70%iger, 80%iger, 96%iger, 100%iger Alkohol für 1 min 9. 100%iger Alkohol für 2 min 10. Xylol unter dreimaligem Wechsel (1 min, 3 min, 3 min) 11. Eindecken mit Eukitt (Fa. Kindler, Freiburg) • Eosin-Färbelösung Instant Eosin (Fa. Shandon, Frankfurt am Main) Aqua dest. 8.3 35,6 g ad 1000 ml Protokoll der Paraplast-Einbettung (Hypercenter XP) 1. Wasser (entmineralisiert) für 2 h bei Zimmertemperatur 2. aufsteigende Alkoholreihe (50% - 70% - 80% - 96% - 96% - 100% - 100%) für jeweils 45 min bei 35° C 3. 2 x Chloroform für 1,5 h bzw. 1 h bei Zimmertemperatur und Vakuum 4. 2 x Paraffin für jeweils 1,5 h bei 60° C und Vakuum 8.4 Lösungen für die Immunhistochemie Citratpuffer • Stammlösung A: 0,1 M Zitronensäure (C6H8O7 H2O) Zitronensäure Aqua bidest. 21,01 g ad 1000 ml 134 • ANHANG Stammlösung B: 0,1 M Natriumcitrat (C6H5Na3O7 2H2O) Natriumcitrat Aqua bidest. • 29,41 g ad 1000 ml Gebrauchslösung: 0,01 M, pH 6,0 Stammlösung A 18 ml Stammlösung B 82 ml Aqua bidest. 8.5 900 ml Protokolle für die Immunhistochemie Versuchsprotokoll CD3, CD20 und CD68 • Schnitte entparaffinieren und rehydrieren durch absteigende Alkoholreihe im Färbeautomat VaristainGemini (Fa. Shandon, Frankfurt): 1. Xylol unter dreimaligem Wechsel (5 min, 2 min, 2 min) 2. 100%iger Alkohol: 2 min 3. 96%iger Alkohol: 2 min 4. 80%iger Alkohol: 1 min 5. 70%iger Alkohol: 1 min 6. endet im Aqua dest. • Schnellkochtopf (zur Antigen-Demaskierung): 7. 1 Liter Citratpuffer im Topf zum Kochen bringen 8. Paraffinschnitte in kochenden Puffer stellen, Deckel schließen, bei Erreichen des Maximaldruckes im Topf Schnitte noch 1 min kochen lassen 9. zum Druckausgleich Topf kalt wässern, Topfdeckel abnehmen und Schnitte ca. 20 min im Puffer stehen lassen • NexES-IHC-Färbemodul vorbereiten: 10. Etiketten drucken und Reagenzienkarussell bestücken 11. Waschpuffer und Öl auffüllen, sowie den Abfallbehälter kontrollieren ANHANG 135 12. Schnitte aus dem handwarmen Puffer entnehmen und in eine Küvette mit Aqua dest. stellen 13. Barcodeetiketten auf die Objektträger kleben, im NexES einspannen und mit APK-Waschpuffer bedecken • Durchführung: 14. Lauf starten, ab jetzt läuft die immunhistochemische Reaktion vollautomatisch im Gerät nach der SABC-Methode (Streptavidin-Biotin-Komplex) ab 15. Objektträger werden auf 37° C erwärmt 16. 4 min I-VIEW Inhibitor (3%ige H2O2-Lösung zur Hemmung der endogenen Peroxidase) 17. Option 1 für 10 min (Ziegenserum 1 : 5 mit Phosphatpuffer verdünnt, zum Blockieren unspezifischer Bindungsstellen) 18. 32 min CD3- bzw. CD20- bzw. CD68-Antikörper in der jeweiligen Verdünnung (CD3 1 : 100, CD20 1 : 300, CD68 1 : 100) 19. 2 min Fixative 1 (20 µl Glutardialdehyd in 10 ml 0,9%iger NaCl-Lösung) 20. 8 min I-VIEW Biotin Ig (Biotinylierter Sekundärantikörper, ein so genannter Multi- Link-Antikörper, der sowohl Maus- als auch Kaninchenimmunglobuline erkennt) 21. 8 min I-VIEW Streptavidin-Meerrettichperoxidase-Komplex 22. 8 min I-VIEW DAB und I-VIEW H2O2 (Enzymhistochemische Reaktion, DAB 2 g/l als Chromogen und 0,04 - 0,08%ige H2O2-Lösung) 23. 4 min I-VIEW Copper (Kupfersulfat 5 g/l) 24. 4 min Hämatoxylin (zur Gegenfärbung) 25. 4 min Bluing Reagent (zum Bläuen) 26. allen Inkubationsschritten im NexES-IHC-Färbemodul folgen definierte Waschschritte mit dem APK-Waschpuffer von VENTANA (Katalog 250-042) 27. Schnitte dem Gerät entnehmen, in einer Küvette mit Aqua dest. und Spülmittel schwenken, um das im NexES verwendete Öl zu entfernen und anschließend in eine Küvette mit Aqua dest. überführen 136 • ANHANG Aufsteigende Alkoholreihe im Färbeautomaten VaristainGemini (Fa. Shandon, Frankfurt am Main): 28. 70%iger, 80%iger, 96%iger und 100%iger Alkohol jeweils für 1 min 29. 100%iger Alkohol für 2 min 30. Xylol unter dreimaligem Wechsel (1 min, 3 min, 3 min) 31. Eindecken der Objektträger mit Eukitt (Fa. Kindler, Freiburg) 8.6 Protokoll für die Westernblot-Serologie 1. Inkubationswannen mit Proben-/Waschpuffer spülen und Puffer abgießen 2. je 1 Antigenstreifen in jede Wannenrinne geben 3. je 1,5 ml Proben-/Waschpuffer vorlegen und 5 min bei Raumtemperatur schütteln 4. je 20 µl Patientenprobe bzw. je 100 µl Kontrollserum zupipettieren 5. 30 min auf dem Schüttler bei Raumtemperatur inkubieren 6. Flüssigkeit abgießen 7. 3 x 5 min waschen (dabei je 1,5 ml Waschpuffer zugeben, 5 min bei Raumtemperatur inkubieren, Flüssigkeit abgießen) 8. je 1,5 ml frische Konjugat-Verdünnung zupipettieren 9. 15 min auf dem Schüttler bei Raumtemperatur inkubieren 10. Konjugat abgießen 11. 3 x 5 min waschen (dabei je 1,5 ml Waschpuffer zugeben, 5 min bei Raumtemperatur inkubieren, Flüssigkeit abgießen) 12. je 1,5 ml Aqua dest. zugegeben 13. 1 min auf dem Schüttler bei Raumtemperatur inkubieren 14. Flüssigkeit abgießen 15. je 1,5 ml Chromogen-/Substratlösung zupipettieren 16. Entwicklung auf dem Schüttler (IgG: 5 min, IgA: 10 min) 17. Stoppen: Flüssigkeit abgießen 18. 3 x mit je 1,5 ml Aqua dest. spülen ANHANG 137 19. Streifen trocknen und auswerten Proben-/Waschpuffer-Gebrauchsverdünnung Proben-/Waschpuffer-Konzentrat 100 ml Aqua dest. 900 ml Proben-/Waschpuffersalz 5g 15 min auf Magnetrührer mischen (pH 7,5) Konjugat-Gebrauchsverdünnung IgA- bzw. IgG-spezifisches Konjugat Proben-/Waschpuffer-Gebrauchsverdünnung 9 ml 81 ml mischen (immer frisch ansetzen) 8.7 Lösungen für die Molekularbiologie Einfriermedium mit Serum Brain-Heart-Infusion (Fa. Oxoid, Wesel) 37 g Yeast Extract (Fa. Oxoid, Wesel) 2,5 g Aqua dest. ad 1000 ml autoklavieren und abkühlen lassen Pferdeserum 100 ml steril filtrieren und Hitze inaktivieren steriles Glycerin 100 ml dazugeben und mischen Zellkulturmedium RPMI 1640 Medium L-Glutamin (Fa. Invitrogen GmbH, Karlsruhe) 138 8.8 ANHANG Protokoll der elektronenmikroskopischen Präparation Epongemisch nach LUFT (1961) • Mischung A Glycidether 100 (Fa. Serva, Heidelberg, Nr. 21045) 71,3 g Dodecenylsuccinicacidanhydrid (Fa. Serva, Heidelberg, Nr. 20755) 115,0 g auf einem Magnetrührer 1 h rühren • Mischung B Glycidether 100 (Fa. Serva, Heidelberg, Nr. 21045) Methylnadicanhydrid (Fa. Serva, Heidelberg, Nr. 29452) 100,0 g 89,0 g auf einem Magnetrührer 1 h rühren Mischung A und B im Verhältnis 1 : 1 mischen und 30 min rühren Beschleuniger Trisdimethylaminomethylphenol (Fa. Serva, Heidelberg, Nr. 36975) 1,8 % dazugeben und 15 min rühren Protokoll der Epon-Einbettung nach LUFT (1961) 1. Spülen in 0,1 M Phosphatpuffer (pH 7,4) über 1,5 h (3 x wechseln) bei 4° C 2. Nachfixieren in 1%iger Osmiumtetroxidlösung in 0,1 M Phosphatpuffer (pH 7,4) für 2 h bei 4° C 3. Spülen in 0,1 M Phosphatpuffer (pH 7,4) über 1,5 h (3 x wechseln) bei 4° C 4. Dehydrieren in einer aufsteigenden Ethanolreihe (6 Stufen, je Stufe 15 min) und Isopropanol (15 min) bei 4° C 5. Propylenoxid (30 min, 2 x wechseln) bei 4° C 6. Infiltration mit Propylenoxid-Epon 2 : 1 für 1 h bei 10° C 7. Infiltration mit Propylenoxid-Epon 1 : 1 für 2 h bei 10° C ANHANG 139 8. Infiltration mit Propylenoxid-Epon 1 : 2 für 4 h bei 10° C 9. Infiltration mit reinem Epon über Nacht bei 20° C 10. Infiltration mit reinem Epon über 3 h bei 20° C Kontrastierung durch „Negative staining“ 1. H. pylori-Kulturen von der H. pylori-Agarplatte mit einem Wattestäbchen abnehmen und in 0,1 ml Brucella Bouillon suspendieren 2. 2 ml 4%iges Formaldehyd zur Fixation hinzufügen 3. 5 bis 15 min fixieren lassen 4. Mit einer Pasteurpipette einen Mikrotropfen der Untersuchungslösung auf die mit Formvar-Folien (Fa. Merck, Darmstadt) überzogenen, kohlebedampften Trägernetze (Fa. Science Services, München) geben 5. 2 bis 4 min. antrocknen lassen 6. Flüssigkeit mit einem Stück Filterpapier vom Rand absaugen 7. Trägernetze mit einem Mikrotropfen einer 2%igen Phosphorwolframlösung (gepuffert mit NaOH, pH 7,2 - 7,5) oder alternativ 2%igem Uranylacetat (in Aqua bidest., frisch angesetzt, filtriert) beschicken 8. 1 bis 2 min einwirken lassen 9. Überschuß mit einem Stückchen Filterpapier vom Rand her absaugen 10. Trägernetze etwa 30 min gut trocknen lassen Gebrauchslösungen für das „Negative staining“ • 2%ige Phosphorwolframsäure Phosphorwolframsäure 2g mit NaOH gepuffert, pH 7,2 - 7,5 Aqua bidest. • ad 100 ml 2%iges Uranylacetat Uranylacetat Aqua bidest. 2g ad 100 ml Göttingen, den 30.08.2004 Eidesstattliche Erklärung Hiermit erkläre ich, dass ich die Dissertation mit dem Titel „Histologische und immunhistochemische Charakterisierung einer experimentellen persistierenden Helicobacter pylori-Infektion bei Rhesusaffen (Macaca mulatta)“ selbständig verfasst habe. Bei der Anfertigung wurden folgende Hilfen und Hilfsmittel in Anspruch genommen: • Technisch-methodische Einweisungen durch technische Assistentinnen der Abteilung Infektionspathologie, Deutsches Primatenzentrum Göttingen. • Asserviertes Archivmaterial aus der Abteilung Infektionspathologie, Deutsches Primatenzentrum Göttingen. • Die molekularbiologischen Untersuchungen wurden mit der Hilfe von Herrn Christian Kraft im Institut für Hygiene und Mikrobiologie an der Julius-MaximiliansUniversität in Würzburg durchgeführt. • Redaktionelle Überarbeitung durch wissenschaftliche Mitarbeiter und Leiter der Abteilung Infektionspathologie, Deutsches Primatenzentrum Göttingen. Ich habe keine entgeltliche Hilfe von Vermittlungs- bzw. Beratungsdiensten (Promotionsberater oder anderen Personen) in Anspruch genommen. Niemand hat von mir unmittelbar oder mittelbar entgeltliche Leistungen für Arbeiten erhalten, die im Zusammenhang mit dem Inhalt der vorgelegten Dissertation stehen. Die Dissertation wurde in der Abteilung Infektionspathologie des Deutschen Primatenzentrums Göttingen unter der Leitung von Univ. Prof. Dr. F.-J. Kaup angefertigt und bisher nicht für eine Prüfung oder Promotion oder für einen ähnlichen Zweck zur Beurteilung eingereicht. Ich versichere, dass ich die vorstehenden Angaben nach bestem Wissen vollständig und der Wahrheit entsprechend gemacht habe. Frank Runge Danksagung Zum Abschluss möchte ich allen danken, die zum Gelingen dieser Arbeit beigetragen haben. An erster Stelle möchte ich mich bei meinem Doktorvater Herrn Univ. Prof. Dr. F.-J. Kaup für die Überlassung des Themas und die uneingeschränkte Unterstützung bei der Durchführung der Arbeit und dessen kritischer Korrektur herzlich bedanken. Sehr herzlich bedanke ich mich bei Frau Dr. K. Mätz-Rensing für die wissenschaftliche Betreuung und Anregungen sowie für das Engagement und die Geduld bei der Durchsicht dieser Arbeit. Herrn Dr. C. Kraft von der Medizinischen Hochschule Hannover danke ich für die Unterstützung bei der Ausführung der molekularbiologischen Techniken. Mein besonderer Dank gilt auch Herrn W. Henkel, Frau K. Kaiser-Jarry, Frau N. Knöchelmann und Frau E. Lischka für die gute methodische Einarbeitung in die Bakteriologie, Histologie und Immunhistochemie sowie für die jederzeit gewährten Hilfen und Tipps bei allen technischen Belangen. Ebenso danke ich Frau I. Roßbach für ihre Hilfe bei den fremdsprachlichen Hindernissen. Ein großes Dankeschön für die vielen unterhaltsamen Momente geht an das „Doktorandenzimmer“ mit Frau A. Blankenburg, Herrn M. Caglar, Frau C. Kott, Frau A. Quohs und Frau M. Zöller. Insbesondere bedanken möchte ich mich bei Herrn M. Caglar, Frau C. Kott, Frau N. Veith und Frau M. Zöller für die Unterstützung in der „Endphase“ der Arbeit. Danke Halina für deine Geduld sowie deine moralische Unterstützung.
