Hydrolyse von Harnstoff / Michaelis-Menten

Hydrolyse von Harnstoff / Michaelis-Menten-Kinetik
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Hydrolyse von Harnstoff / Michaelis-Menten-Kinetik
Ziel dieses Versuches ist es, die mit dem Michaelis-Menten-Mechanismus verbundene Kinetik sowie eine Methode zur Bestimmung der Enzymaktivität zu erlernen. Dies geschieht anhand der Hydrolyse von Harnstoff unter Katalyse durch das Enzym Urease.
Stichworte
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Kinetik
Reaktionsordnung
Geschwindigkeitskonstante
Reaktionsgeschwindigkeit
Gleichgewichtskonstante
pH-Wert
Enzym
Enzymaktivität
Michaelis-Menten-Kinetik
L. Pasteur zitierte in einem Vortrag im April 1864 an der Sorbonne folgenden Ausspruch des
Mediziners und Alchemisten J.B. van Helmont (1577/9 - 1644): "Das reinste Quellwasser verschimmelt und produziert Würmer, wenn sein Behälter mit dem Duft eines Fermentes imprägniert wird. Die Gerüche, die aus der Tiefe eines Sumpfes aufsteigen, produzieren Frösche,
Schnecken, Blutegel, Pflanzen usw. Graben sie ein Loch in einen Ziegel, legen sie in das
Loch Königskraut, decken das Loch mit einem zweiten Ziegel zu, lassen sie die zwei Ziegel
an der Sonne! In einigen Tagen erscheint der Geruch des Königskrautes, der, als Ferment wirkend, die Pflanze in Skorpione verwandelt." Nach dieser mystischen und lückenhaften Versuchsanleitung ist offenbar die Funktion des Fermentes, die Lebensprozesse in Gang zu setzen, die zur Bildung der "Skorpione" führen (in der Alchemie steht der Begriff Skorpione für
den Vorgang, wenn aus absterbendem, faulendem Material wieder neues Leben entsteht). Mit
fortschreitender Erforschung der Lebensprozesse wurde der Begriff enger gefasst und heute
ist er synonym mit "Enzym".
Enzyme sind bestimmte Proteine, deren Aufgabe es ist, spezifische, biochemische Reaktionen
zu katalysieren, was in der Regel unter sehr hoher Substrat- und Produktspezifität geschieht,
d.h., dass nur ausgewählte Edukte zu ganz bestimmten Produkten umgesetzt werden. Auf diese Weise vollzieht sich also die geheimnisvolle Steuerung der Lebensvorgänge: durch spezifische Katalyse. Der entscheidende Schritt ist dabei die Wechselwirkung des Substrats mit dem
so genannten "aktiven Zentrum" des Enzyms, die dafür sorgt, dass die Energie des Übergangszustands, der zu den gewünschten Produkten führt, erniedrigt wird (d.h. nur ein bestimmter Reaktionsweg wird eingeschlagen).
Die in diesem Versuch untersuchte Reaktion ist die Hydrolyse von Harnstoff,
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TU Braunschweig, Institut für Physikalische und Theoretische Chemie, Dr. Christof Maul
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O
2
O
Urease
NH2
+
2
2 H2O
+
NH4
+
O
-
O
H2N
-
(1)
die durch das Enzym Urease katalysiert wird. Zwar taucht das Enzym Urease in obiger Bruttogleichung nicht auf (hat also keinen Einfluss auf das Gleichgewicht!), experimentell wurde
jedoch beobachtet, dass die Reaktionsgeschwindigkeit entscheidend von der Enzymkonzentration abhängt. Ein plausibler Mechanismus, mit der sich die beobachtete Kinetik beschreiben lässt, ist der Michaelis-Menten-Mechanismus, der sich in seiner einfachsten Form wie
folgt darstellt:
U + S
k1
US
k2
U + P
k-1
(2)
S steht hier für das Substrat, U für Urease und P für die Produkte. Im ersten Schritt wird also
der Enzymsubstratkomplex US mit der Geschwindigkeitskonstanten k 1 gebildet, bzw. zerfällt
mit der Geschwindigkeitskonstanten k-1 wieder in die Edukte. Im zweiten Schritt werden die
Produkte in einer irreversiblen Reaktion von US und Wasser mit der Geschwindigkeitskonstanten k2 gebildet (die Konzentration von Wasser bleibt konstant  Reaktion pseudo-erster
Ordnung, k2=k'2 [H2O]2).
Die entsprechenden Reaktionsgeschwindigkeiten der für die Herleitung des Geschwindigkeitsgesetzes interessanten Spezies ergeben sich dann wie folgt:1
d [US]
= k 1 [S][U]−k−1 [US ]−k 2 [US ]
dt
(3)
d [P]
= +k 2 [ US]
dt
(4)
Die Ureasekonzentration lässt sich hierbei nicht einfach aus der einfachen Bedingung
m U / M U V berechnen, da das Enzym je nach Qualität unterschiedlich viele aktive Zentren
pro Molekül besitzt. Die Enzymqualität wird daher umgekehrt durch die mit einer bestimmten
Enzymeinwaage erreichbaren Reaktionsgeschwindigkeit charakterisiert werden.
Die Bildungsgeschwindigkeit v= ddt[ P] der Produkte kann durch Ermittlung von [US] unter
Annahme des Bodensteinschen Stationaritätsprinzips – hierunter versteht man die Annahme,
dass pro Zeiteinheit genauso viel Zwischenprodukt [US] gebildet wird, wie abgebaut wird,
wodurch d[US]/dt gleich 0 wird - und der Substitution
[U] = [U]0 - [US]
(5)
bestimmt werden.
1
zur Aufstellung von Geschwindigkeitsgesetzen für Elementarschritte chemischer Reaktionen s. Lehrbücher
der Physikalischen Chemie, z.B. Atkins / de Paula, Physikalische Chemie, 4. Aufl. Wiley-VCH 2006, Kap. 22
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d [US]
= k 1 [S][U]−k −1 [US ]−k 2 [US ] = 0
dt
[US] =
k 1 [U][S]
k ([U]0 −[ US])[S]
= 1
k 2 +k −1
k 2+k−1
(6a)
(6b)
Auflösen von Gl. 6b nach [US] und Einsetzen in Gl. 4 ergibt für die Reaktionsgeschwindigkeit v:
v =
d [P]
=
dt
k 2 [U]0 [S]
k +k
[S]+ −1 2
k1
(7)
Gl. 7 ist als Michaelis-Menten-Gleichung bekannt und beschreibt die Bildungsgeschwindigkeit der Produkte in Abhängigkeit der momentanen Harnstoffkonzentration und der eingesetzk +k
ten Konzentration des Enzyms. Die Größe k
wird zu einer Konstanten, der MichaelisMenten-Konstante KM zusammengezogen.
2
−1
1
KM =
k−1+k2
k1
(8)
Da die Konzentration [S] zum Zeitpunkt t=0 durch die Einwaage an Harnstoff festgelegt ist,
können die Konstanten KM und k2 durch Messung der Anfangsgeschwindigkeit v0 ermittelt
werden.
v0 = (
k [ U]0 [S]0
d [P]
)
= 2
dt t=0
[S]0+K M
(9)
In Abb.1 sind nach Gl. 7 berechnete Werte (Einheiten willkürlich) für die Reaktionsgeschwindigkeit in Abhängigkeit von der Substratkonzentration aufgetragen. Betrachtet man den
Grenzwert
lim (
[S] → ∞
d [P]
)
= k 2 [U]0 = v max
dt t =0
(10)
so sieht man, dass durch für eine Substratkonzentration [S] = K M in Gl. 9 v= ddt[ P] den Wert
vmax
2
annimmt.
Das Geschwindigkeitsgesetz (7), das zu dem Michaelis-Menten-Mechanismus gehört, stellt
einen fließenden Übergang von einer Kinetik erster Ordnung zu einer Kinetik nullter Ordnung
dar. Anschaulich lässt sich dies wie folgt erklären:
I)
Ist im Verhältnis zum Substrat sehr viel Enzym vorhanden, so wird die Enzymkonzentration kaum durch die Bildung des Substratkomplexes verringert. In der Folge nimmt
auch die Bildungsgeschwindigkeit von P zu, die linear von der Konzentration [US] abhängt.
II)
Wenn allerdings die Substratkonzentration so hoch wird, dass wenig freies Enzym übrig ist, so hängt die Reaktionsgeschwindigkeit nur noch von der Menge des eingesetz-
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ten Enzyms ab und nicht mehr von der Substratkonzentration. Das ist genauso, wie an
der Supermarktkasse, wenn alle Kassen besetzt sind. Dann kommt es auch nur auf die
Arbeitsgeschwindigkeit oder ″Turn-Over-Frequenz″ des Kassenpersonals an, wie viele
Kunden pro Zeiteinheit durchgeschleust werden können.
Abbildung 1:
Darstellung der Michaelis-Menten-Gleichung (Gl. 7): Abhängigkeit der Produktbildungsgeschwindigkeit v von der Substratkonzentration
Die durch Gl. 10 definierte Maximalgeschwindigkeit kann als Maß für die katalytische Aktivität A der Urease verwendet werden. Diese ist definiert als die Menge an Ammoniak, die pro
mg Enzym bei einer bestimmten Temperatur (oft 25° oder 30°C) und einem bestimmten pHWert (pH 6.1 oder pH 7) maximal pro Minute gebildet wird.
A =
v max V Lösung
m Enzym
(11)
Die katalytische Aktivität wird häufig noch in auf die Enzymmasse bezogenen "Enzymeinheiten" angegeben, die der Menge Enzym entspricht, die die Umwandlung von 1 µmol Substrat
µmol NH
pro Minute katalysiert. Für die Harnstoffhydrolyse ist 1 U=1 Minute ). Die SI-Einheit der Enzymaktivität ist das Katal, wobei gilt, dass 1 Katal=1 mol
=6⋅107 U .
s
3
Im Hauptteil des Versuchs wird die Anfangsgeschwindigkeit der Reaktion (diese ist nicht
durch Produkthemmung beeinflusst) dazu verwendet, um die Parameter KM und vmax zu ermitteln. Hierzu ist es hilfreich, die reziproke Form von Gl. 9 zu verwenden
K
1
1
1
=
+ M⋅
v0
v max v max [S]0
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und dementsprechend v1 gegen [S]1 aufzutragen (so genannter Lineweaver-Burk-Plot). Aus
dem Achsenabschnitt erhält man vmax, mit dessen Hilfe man dann KM aus der Steigung der
Ausgleichsgeraden ermitteln kann.
0
0
Alternativ besteht die Möglichkeit der Auftragung von v0 gegen S0 (Gl. (9) bzw. Abb. 1) mit
anschließendem nicht-linearen Origin-Fit an die Funktion "Hyperbl" (für die genaue Vorgehensweise siehe Auswertung).
Die Messung der Reaktionsgeschwindigkeit v erfolgt indirekt durch Messung der Änderung
der spezifischen Leitfähigkeit κ der Lösung im Verlauf der Reaktion. Aus der Reaktionsgleichung (1) ist ersichtlich, dass die Leitfähigkeit der Reaktionsmischung mit fortschreitender
Reaktionsdauer zunimmt. Die Konzentrationen zu Beginn der Umsetzung sind dabei so gering, dass Sie von einem linearen Zusammenhang zwischen Konzentration c der Lösung und
ihrer spezifischen Leitfähigkeit κ ausgehen können: c = Cκ·κ. Der Wert der Konstanten Cκ
hängt von den Einstellungen am Leitfähigkeitsmessgerät ab und ist am Gerät tabelliert.
pH-Abhängigkeit der Harnstoffhydrolyse
Ein wichtiger Punkt bei der Harnstoffhydrolyse ist der pH-Wert der Lösung. Führt man die
Experimente in einer ungepufferten Lösung aus, so stellt sich nach einiger Zeit der pH-Wert
für den Ammoniumcarbonat-Puffer ein. Die Aktivität der Urease hängt aber entscheidend
vom pH-Wert ab. Optimal wäre ein pH von 7,01 [1] (s.u.). Die Beeinträchtigung der Aktivität
lässt sich mit folgendem Mechanismus beschreiben:[2]
UH2
UH2S
KES,1
KE,1
-
UH + S
KE,2
U2Abbildung 2:
k1
UHS-
k-1
k2
UH- + P
KES,2
US2-
Mechanismus der pH-abhängigen Harnstoffhydrolyse nach Trypton und Dixon[2]
Die aktive Spezies des Enzyms ist damit das amphotere Anion einer zweibasigen Säure. Die
Behandlung dieses Mechanismus unter der Bedingung eines stabilen Zwischenzustandes für
UHS- liefert für die Größen vmax und KM in Abhängigkeit der Gleichgewichtskonstanten (Herleitung siehe Anhang):
v max
k *2 [U]0
v*max
= k 2 [ U]0 =
=
f (pH)
[H + ] KES,2
1+
+ +
K E ,1 [H ]
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v*max ist die (hypothetische) Maximalgeschwindigkeit für den Fall, dass alle Enzymmoleküle
in der einfach protonierten Form vorliegen würden, während vmax die im Experiment erzielbare
Maximalgeschwindigkeit für einen gegebenen pH-Wert darstellt, aus der die Aktivität des Enzyms nach Gl. (11) bestimmt werden kann. Die beiden Größen sind durch den Faktor
f (pH) = 1+
+
[H ] K ES,2
+
K E ,1 [H +]
(14)
miteinander verknüpft. Auf dem Umweg über v*max sind somit Maximalgeschwindigkeiten
und Enzymaktivitäten für beliebige pH-Werte ineinander umrechenbar.
Die Anbindung des Substrates hat hier keinen Einfluss auf die Säure-Base Eigenschaften der
Urease, so dass sich der Wert der Michaelis-Menten-Konstanten KM selbst nicht mit dem pHWert ändert.
Aufgabenstellung
1)
Bereitstellung der Lösungen
Stellen Sie zunächst 250 ml einer 0.1
mol
l
Harnstofflösung her. Stellen Sie dann daraus
eine Verdünnungsreihe mit je 100ml der Konzentrationen {0.5·10 -3, 1·10-3, 1.5·10-3,
2·10-3, 3·10-3, 4·10-3, 6·10-3, 8·10-3, 1·10-2, 1.2·10-2} mol
her.
l
Wiegen Sie außerdem 150 mg Urease ab und lösen Sie sie in 150 ml Wasser.
2)
Messungen
Die Messgröße, mit der die Ammoniumcarbonatkonzentration zeitaufgelöst gemessen
wird, ist die Leitfähigkeit der Lösung. Diese ist im betreffenden Konzentrationsbereich
in sehr guter Näherung proportional zur Ionenkonzentration (im Allgemeinen ist sie dies
natürlich nicht, da die molare Leitfähigkeit mit der Wurzel der Konzentration abnimmt:
Kohlrausch’sches Quadratwurzelgesetz!).
Nehmen Sie im Programm folgende Einstellungen vor: 10s/div (Erfassungszeit), 200mV
(Eingangsbereich), 8kS (Anzahl von Samples). Der blaue Kanal (A) misst die Leitfähigkeit. Der Kalibrierfaktor für die Umrechnung der gemessenen Spannungen in Leitfähigkeiten ist bei den hier auftretenden kleinen Konzentrationen konstant und beträgt für die
angegebenen Einstellungen 8⋅10−3 mol
. Füllen Sie jeweils 100 ml der Harnstofflösungen
l⋅V
in das temperierte (25°C) Reaktionsgefäß und hängen Sie die pH- und die Leitfähigkeitselektrode hinein. Achten Sie hierbei darauf, dass die Leitfähigkeitselektrode am
Rand des Gefäßes hängt und so tief wie möglich in die Lösung eintaucht.
Starten Sie die Messung und fügen Sie unter Rühren 10 ml der Ureaselösung hinzu, um
die Reaktion zu starten. Nehmen Sie die Spannungskurve für ca. 60 s auf und notieren
Sie den pH-Wert. WICHTIG: Die Messung wird durch Klicken auf Datei  ″Aktuelle
Wellenform speichern unter″ gespeichert und gleichzeitig beendet, sodass direkt im An-
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schluss eine neue Messung begonnen werden kann. Speichern Sie jede Verdünnungsreihe als ASCII-Datei (.txt), um sie später in Origin oder Excel zu öffnen. Am Ende jeder
Messung sollten Reaktionsgefäß, Elektroden und Rührer gut gespült werden.
3)
Auswertung
Bestimmen sie die Konstanten vmax, KM, k2 und die Aktivität des Enzyms sowie die jeweils dazugehörigen Fehler aus den Anfangssteigungen v0 und der zugehörigen Harnstoffkonzentration [S]0 der unter 2) aufgenommen Kurven, zunächst ohne den pH-Wert
zu berücksichtigen. Zur Ermittlung der Anfangssteigung verwerfen sie etwa die ersten
20 Sekunden, da so lange etwa die Mischzeit beträgt! Zur besseren Übersicht ist es ratsam eine Tabelle in Origin oder Excel zu erstellen mit c, [S]0, mx, v0 (s. Abb. 3).
Benutzen Sie zur Auswertung entweder den linearisierten Lineweaver-Burk-Plot (Gl.
12) oder die nicht-lineare Fit-Funktion "Hyperbl" der OriginLab-Software (Analyse,
Anpassen, Nichtlinearer Fit, Registerkarte Einstellungen: Funktionsauswahl, Kategorie:
Hyperbola, Funktion Hyperbl). Die Funktions-Gleichung lautet
y=
P1 x
P2+x
(15)
Diese Gleichung repräsentiert die Michaelis-Menten-Gleichung (9), wobei y = v0,
x = [S]0, P1 = vmax und P2 = KM.
Ermitteln Sie mit einem geeigneten Mittelwert des pH-Wertes die Konstanten vmax* und
k2*, indem Sie die ermittelten Konstanten vmax und k2 um den Faktor f(pH) korrigieren
(Gl. 14). Berechnen sie die Aktivität des Enzyms (in U/mg) unter den Bedingungen (pH,
Temperatur), die auf der Flasche angegeben sind (bei 30°C ist die Reaktion ca. um den
Faktor 1,25 schneller als bei 25°C). Beachten sie, dass sie eventuell v max* noch durch
den entsprechenden pH-Faktor für die Angabe auf der Flasche teilen müssen.
Ermitteln Sie den experimentellen Fehler und vergleichen Sie Ihre Ergebnisse mit der
Angabe auf der Flasche!
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Abbildung 3:
8
Muster-Tabelle für die Auswertung zu 2a. c0 ist die Konzentration der angesetzten Harnstofflösungen, [S]0 ist die Substratkonzentration nach Zugabe der Ureaselösung, mx ist die der Konzentrationsänderung proportionale, gemessene Spannungsänderung an der Leitfähigkeitszelle
in mV/s und v0 ist schließlich die gesuchte Reaktionsgeschwindigkeit
Literatur
[1]
M. Fidaleo and R. Lavecchia, Kinetic Study of Enzymatic Urea Hydrolysis Kinetic
Study of Enzymatic Urea Hydrolysis in the pH Range 4–9, Chem. Biochem. Eng. Q. 17,
311 (2003)
[2]
K.F. Tipton and H.B.F. Dixon, Effects of pH on enzymes, Methods Enzymol. 63, 183
(1979)
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Anhang
Herleitung der pH-Abhängigkeit
Ziel der Ableitung ist, die Konzentration der Übergangsspezies UHS- unter der Annahme eines stationären Zustandes zu bestimmen, da sich die Produktbildungsgeschwindigkeit als
d[P]
 k 2 [ UHS  ]
dt
(A1)
schreiben lässt. Die Behandlung nach dem Bodensteinschen Quasistationaritätsprinzip ergibt
zunächst den zu Gl. 6 analogen Ausdruck:
[ UHS  ] 
[ UH  ][S]
KM
(A2)
Des Weiteren muss man nun die unbekannte Konzentration des freien [UH-] durch die eingesetzte Konzentration [U]0 ausdrücken. Dazu werden die (bekannten) Gleichgewichtskonstanten der beiden Säure-Base Gleichgewichte verwendet:
[ UH  ]  [ U]0  [ UH 2 ]  [ U 2  ]  [ UHS  ]  [ UH 2 S]  [ US 2  ]
(A3)
Ausdrücken der unbekannten Konzentrationen durch die Dissoziationskonstanten, die Hydroniumionenkonzentration, [UH-] und [UHS-] liefert:

[UH  ]  [U ]0 

[UH  ][ H  ] [UH ]K E , 2
[UHS  ][ H  ] [UHS ]K ES , 2



[
UHS
]


(A4)
K E ,1
K ES ,1
[H  ]
[H  ]
Einsetzen von Gl. A2 ergibt:
 [ H  ] K E ,2 [S ]
[UH  ]  [U ]0  [UH  ]


 K E ,1 [ H  ] K M

 [ H  ] K ES , 2





1

K

[
H
]
 ES ,1

(A5)
Benutzt man nun wiederum Gl. A2, um [UHS-] in Gl. A1 durch [UH-] zu ersetzen, erhält man
d [ P]

dt
k 2 [U ]0 [ S ]
 [H  ] K E ,2 
 

K
  [ S ]   [ H ]  ES , 2  1
K M 1 


K

K E ,1 [ H  ] 

 ES ,1 [ H ] 
(A6)
woraus unmittelbar Gl. (13) folgt.
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