vts_8630_12787. - oparu

Universitätsklinikum Ulm
Institut für Naturheilkunde und klinische Pharmakologie
Ärztlicher Direktor: Prof. Dr. med. Thomas Simmet
Klinische Pharmakologie
Leiterin: Prof. Dr. med. Julia Stingl
Einfluss von Expression und Variabilität der Apoptosegene Bcl-2 und Bax auf die
Toxizität von Cytarabin in mononukleären Zellen des peripheren Blutes
Dissertation zur Erlangung des Doktorgrades der Medizin
der Medizinischen Fakultät der Universität Ulm
Sarah Mödl
Memmingen
2012
Amtierender Dekan: Prof. Dr. Thomas Wirth
1. Berichterstatter: Prof. Dr. Julia Stingl
2. Berichterstatter: Prof. Dr. Richard Schlenk
Tag der Promotion: 12.07.2013
Für Benjamin
Inhaltsverzeichnis
Abkürzungsverzeichnis ....................................................................................................... III
1. Einleitung .......................................................................................................................... 1
1.1 Die Bedeutung der Pharmakogenetik in der Behandlung von malignen Erkrankungen
........................................................................................................................................... 1
1.2 Die Auswahl von mononukleären Zellen des peripheren Blutes zur Analyse der
Toxizität von Cytarabin ..................................................................................................... 2
1.3 Akute myeloische Leukämie ....................................................................................... 3
1.4 Das Zytostatikum Cytarabin........................................................................................ 4
1.5 Apoptose...................................................................................................................... 5
1.6 Die Bcl-2 Proteinfamilie.............................................................................................. 6
1.6.1 Die Entdeckung des Bcl-2 Gens........................................................................... 6
1.6.2 Der Aufbau des Bcl-2 Gens.................................................................................. 7
1.6.3 Die Bedeutung des Bcl-2 Proteins für die Apoptose............................................ 7
1.6.4 Das Bcl-2 associated X-Protein: Bax ................................................................... 8
1.7 Der Bcl-2 -938 C>A Polymorphismus ........................................................................ 8
1.8 Der Bax -248 G>A Polymorphismus .......................................................................... 9
1.9 Herleitung der Aufgabenstellung............................................................................... 10
2. Material und Methoden ................................................................................................... 11
2.1 Studiendurchführung ................................................................................................. 11
2.2 Bestimmung der Toxizität ......................................................................................... 11
2.2.1 Zellkultur ............................................................................................................ 11
2.2.2 Messung der Toxizität ........................................................................................ 11
2.3 Molekularbiologische Methoden zur Genexpressionsanalyse .................................. 12
2.3.1 Isolierung der RNA ............................................................................................ 12
2.3.2 RNA-Konzentrationsbestimmung ...................................................................... 13
2.3.3 RNA-Transkription / reverse Transkription ....................................................... 13
2.3.4 Real-Time PCR .................................................................................................. 14
2.4 Durchführung der Genotypisierung........................................................................... 16
2.4.1 DNA-Extraktion ................................................................................................. 16
2.4.2 Polymerase-Ketten-Reaktion (PCR)................................................................... 17
2.4.3 Restriktionsfragmentlängenpolymorphismus (RFLP)........................................ 17
I
2.4.4 Bestimmung des Bcl-2 Allels durch den PCR-RFLP-Test ................................ 18
2.4.5 Bestimmung des Bax Allels durch den PCR-RFLP-Test................................... 19
2.5 Chemikalien und Geräte ............................................................................................ 21
2.6 Analyse der Messdaten und Statistik......................................................................... 23
3. Ergebnisse........................................................................................................................ 24
3.1 Die Toxizität von Cytarabin ...................................................................................... 24
3.2 Die Genexpression von Bcl-2 und Bax ..................................................................... 27
3.2.1 Die Genexpression von Bcl-2............................................................................. 27
3.2.2 Die Genexpression von Bax ............................................................................... 28
3.2.3 Die Bax/Bcl-2 Ratio ........................................................................................... 29
3.3 Zusammenhang der Genexpression von Bcl-2, Bax und der Bax/Bcl-2 Ratio mit der
Toxizität von Cytarabin ................................................................................................... 30
3.4 Verteilung des Bcl-2 -938 C>A und des Bax -248 G>A Polymorphismus .............. 32
3.5 Assoziation der untersuchten single nucleotide Poly-morphismen mit der
Genexpression von Bcl-2, Bax und der Bax/Bcl-2 Ratio............................................... 32
3.6 Zusammenhang der genetischen Polymorphismen Bcl-2 -938 C>A und Bax -248
G>A mit der Zytotoxizität von Cytarabin ....................................................................... 36
4. Diskussion ....................................................................................................................... 37
4.1 Periphere mononukleäre Blutzellen als Modell zur Untersuchung der Zytotoxizität
von Cytarabin .................................................................................................................. 37
4.2 Zusammenhang der Bcl-2 Genexpression mit der Zelltoxizität von Cytarabin ........ 37
4.3 Zusammenhang der Bax Genexpression mit der Toxizität von Cytarabin................ 38
4.4 Zusammenhang der Bax/Bcl-2 Ratio mit der Toxizität von Cytarabin..................... 39
4.5 Die Bedeutung des Bcl-2 -938C>A Polymorphismus............................................... 39
4.6 Die Bedeutung des Bax -248G>A Polymorphismus................................................. 41
4.7 Apoptosegene – Ausblick und klinische Relevanz.................................................... 43
4.8 Limitationen .............................................................................................................. 44
4.9 Fazit ........................................................................................................................... 45
5. Zusammenfassung ........................................................................................................... 46
6. Literaturverzeichnis......................................................................................................... 48
Lebenslauf ........................................................................................................................... 57
II
Abkürzungsverzeichnis
ALL
Akute lymphatische Leukämie
AML
Akute myeloische Leukämie
APAF1
Apoptotic protease activating factor 1
Bax
Bcl-2 associated X-Protein
Bcl-2
B-Cell Lymphoma 2
BH
Bcl-2 Homologie
B-NHL
B-Non-Hodgkin Lymphom
bp
Base pair (Basenpaar)
CLL
Chronische lymphatische Leukämie
dATP
Desoxyadenosintriphosphat
DNA
Desoxyribonukleinsäure
dNTP
Desoxyribonukleosidtriphosphat
EDTA
Ethylendiamintetraacetat
et al. (u.a.)
Et alii (und andere)
HCT-CI
Hematopoietic stem cell transplantation comorbidity index
kb
Kilobasen
kD
Kilodalton
Mcl-1
Myeloid cell leukemia sequence 1
MgCl2
Magnesiumchlorid
MOMP
Mitochondrial outer membrane permeabilization
n.s.
Nicht signifikant
p
Signifikanzniveau
PBMCs
Peripheral blood mononuclear cells (Mononukleäre Zellen
des peripheren Blutes)
PBS
Phosphate-buffered saline (Phosphat gepufferte Salzlösung)
PCR
Polymerase Chain Reaction (Polymerase-Ketten-Reaktion)
PI
Propidiumiodid
PPAR
Peroxisome proliferator-activated receptors
RFLP
Restriktionsfragmentlängenpolymorphismus
RNA
Ribonukleinsäure
ROS
Reaktive oxygen species
SD
Standard deviation (Standard-Abweichung)
III
SNP
Single nucleotide polymorphism
SPSS
Statistical Package for the Social Sciences
Taq
Thermus aquaticus
TBE-Puffer
Tris-Borat-EDTA-Puffer
TBP
TATA-Box binding protein
TNF
Tumornekrosefaktor
Tris
Tris-(Hydroxymehtyl-)Aminomethan
UTR
Untranslated region
UV
Ultraviolett
VDAC1
Voltage-dependent anion channel 1
IV
1. Einleitung
1.1 Die Bedeutung der Pharmakogenetik in der Behandlung von
malignen Erkrankungen
Der Einsatz von Chemotherapie in der Behandlung von Krebs ist durch variables
Therapieansprechen sowie das Auftreten von ernsthaften toxischen Nebenwirkungen
limitiert [80]. Um Tumorzellen effektiv zu vernichten, sind möglichst hohe Dosen an
Zytostatika erforderlich. Mit einer höheren Dosierung steigen aber auch die unspezifischen
toxischen Nebenwirkungen insbesondere auf schnell proliferierende Gewebe [17]. Das
Ausmaß der Wirkung und Nebenwirkung von Medikamenten unterscheidet sich stark
zwischen verschiedenen Individuen und hängt von einer Vielzahl genetischer und nicht
genetischer Faktoren ab. Genetische Varianten beeinflussen sowohl die Effektivität einer
Chemotherapie, als auch die Häufigkeit und Schwere von unerwünschten Medikamentenwirkungen im gesunden Gewebe. Dies ist bei Zytostatika von besonders großer Bedeutung,
da diese eine enge therapeutische Breite haben. Die Dosierung, mit der ein relevanter
zytostatischer Effekt erzielt werden kann, und die Dosierung, bei der bereits toxische
Nebenwirkungen auftreten, liegen meist eng zusammen [65]. Die Pharmakogenetik
untersucht
den
Einfluss
von
individuellen
genetischen
Vorraussetzungen
auf
Medikamentenwirkung und –nebenwirkung mit dem Ziel, die Krebstherapie zu
individualisieren. Risikopatienten, die Gefahr laufen, besonders schwere Nebenwirkungen
zu bekommen, sollen bereits vor Therapiebeginn identifiziert werden. Durch die
Entwicklung von prädiktiven Markern, die auf der individuellen genetischen Ausstattung
basieren, soll die Tumortherapie so individualisiert werden, dass eine möglichst große
Wirkung bei möglichst geringer Nebenwirkung erzielt werden
kann.
In der
pharmakogenetischen Forschung werden hierfür Veränderungen in der DNA-Sequenz und
Expressionsprofile von mRNA-Molekülen und Proteinen analysiert [17, 65, 80]. Die
Kenntnis darüber, welche genetischen Varianten diese Unterschiede im Wirkungsprofil
verursachen, könnte dazu beitragen, starke toxische Medikamentenwirkungen im normalen
Gewebe zu reduzieren [42]. Die häufigste Art dieser genetischen Varianten sind single
nucleotide Polymorphismen (SNPs) [28, 86], sie machen über 90% der genetischen
Variation im menschlichen Genom aus [17]. Diese genetischen Polymorphismen sind
weitverbreitete Varianten in der DNA-Sequenz und können sowohl zu einer
Aktivitätssteigerung als auch –verminderung des codierten Gens führen. Im Gegensatz zu
1
somatischen Mutationen sind sie stabil und werden vererbt. Ein SNP entsteht durch den
Austausch einer einzelnen Base in der DNA-Sequenz und kann zu dem Einbau einer
anderen Aminosäure im codierten Protein führen [17]. Die meisten SNPs sind allerdings
nicht funktionell und nur wenige sind in Bezug auf Medikamentenwirkung und
-nebenwirkung klinisch relevant. Genetische Polymorphismen stellen eine mögliche
Prädisposition für das Auftreten von schweren Nebenwirkungen dar [65].
Die unterschiedlichen Wirkungen der Tumortherapie sind aber auch durch somatische, also
nicht vererbte Veränderungen im Tumorgewebe, bedingt. So sind zum Beispiel Mutationen
in Apoptosegenen einer der molekularen Faktoren der Karzinogenese und Krebstherapie
[26]. Mutationen sind im Vergleich zu Polymorphismen seltene Veränderungen in der
DNA-Sequenz. Sie können ebenfalls als Austausch einer einzelnen Base auftreten [17].
Die
somatischen
Mutationen
des
Tumorgewebes
beeinflussen
vorwiegend
die
Medikamentenwirkung im Tumorgewebe. Die toxischen Nebenwirkungen sind hingegen
weitgehend unabhängig von der genetischen Ausstattung des Tumorgewebes, da diese im
gesunden Gewebe auftreten [65].
1.2 Die Auswahl von mononukleären Zellen des peripheren Blutes
zur Analyse der Toxizität von Cytarabin
Um den Einfluss von individuellen genetischen Varianten auf die Toxizität von
Chemotherapeutika zu untersuchen, sind geeignete Studienmodelle erforderlich. Aufgrund
der hohen Toxizität von Zytostatika kann der Zusammenhang von genetischen Varianten
und der individuellen Reaktion auf Chemotherapie nicht an freiwilligen Probanden
untersucht werden. Die Verwendung von Zellen könnte ein geeignetes Modell darstellen,
um den Zusammenhang von Medikamentenwirkungen und individuellen genetischen
Faktoren ex vivo zu analysieren. Da für pharmakogenetische Analysen eine relativ große
Probenzahl benötigt wird, sollte das ausgewählte Gewebe leicht zugänglich sein. Die
Zellen sollten mit dem Gewebe, an dem die Medikamentenwirkung oder -nebenwirkung
erwartet wird, vergleichbar sein und die am Medikamentenstoffwechesel beteiligten
Proteine sollten exprimiert werden [82]. Weiterhin hat die Verwendung von Zellen den
Vorteil, dass die Versuchsbedingungen streng kontrolliert und wiederholt werden können
[86]. Hämatotoxizität ist eine häufige Nebenwirkung von Zytostatika. Periphere
mononukleäre Blutzellen sind dem Zielgewebe dieser toxischen Nebenwirkung ähnlich,
und deshalb nach unserer Einschätzung besonders geeignet, um den Einfluss von
2
individuellen genetischen Faktoren auf die Zytotoxizität von Chemotherapeutika zu
untersuchen. Für diese Arbeit wurden mononukleäre Zellen des peripheren Blutes
(PBMCs) verwendet und der toxische Effekt von Cytarabin auf diese nativen und
unveränderten Zellen wurde ex vivo analysiert.
1.3 Akute myeloische Leukämie
Die akute myeloische Leukämie (AML) ist eine seltene Erkrankung. Die Inzidenz nimmt
mit steigendem Lebensalter zu und liegt bei circa 4/100000 Einwohnern [90]. Für ältere
Patienten über 60 Jahre ist die Prognose nach einer intensiven Chemotherapie mit einer 5Jahres-Überlebensrate von circa 15% deutlich schlechter als für Patienten unter 60 Jahren
[8]. Ursache dieser schlechteren Prognose ist neben dem Vorliegen ungünstigerer
Risikomerkmale wie zytogenetischen Hochrisikoveränderungen oder der Überexpression
von Genen, die eine Medikamentenresistenz verursachen, die erhöhte Toxizität einiger
Medikamente. Infektiöse Komplikationen während einer Neutropenie treten bei älteren
Patienten gehäuft auf [35]. Bei AML-Patienten über 60, die im Rahmen einer
Postremissionstherapie
mit
hochdosiertem
Cytarabin
behandelt
wurden,
traten
Beschwerden im Bereich des Zentralnervensystems besonders häufig auf [39]. Weiterhin
liegen durch Komorbiditäten Kontraindikationen gegen eine intensive Therapie vor. Der
hematopoietic stem cell transplantation comorbiditiy index (HCT-CI) fasst relevante
Komorbiditäten zusammen und korreliert mit der Sterblichkeit von AML-Patienten nach
einer intensiven Induktionstherapie [18]. In einer Studie von Giles et al. (2007) lag die 28Tages-sterblichkeit von Patienten mit einem niedrigen Risiko nach dem HCT-CI Score bei
3 %, von Patienten mit mittlerem Risiko bei 11% und von Patienten mit hohem Risiko bei
29 %. Die Aussicht auf ein langfristiges Überleben bei der AML kann, abgesehen von
wenigen Ausnahmen, nur durch eine intensive Chemotherapie erreicht werden. Diese ist
jedoch mit einem hohen Risiko für Nebenwirkungen behaftet. Bei älteren Patienten liegt
die Sterblichkeit während einer intensiven Remissionsinduktionstherapie bei etwa 15-20%
[19]. Es wurden bereits Prognosescores für Patienten, bei denen prinzipiell eine intensive
Chemotherapie möglich ist, entwickelt. Diese sollen die Wahrscheinlichkeit des
Ansprechens auf eine intensive Chemotherapie und das Risiko einer therapieassoziierten
Mortalität voraussagen [36]. Eine intensive Chemotherapie beginnt mit der Induktion einer
Remission. Diese basiert in der Regel auf der Kombination von Cytarabin mit einem
Anthrazyklin oder Daunorubicin. Es konnte gezeigt werden, dass die Behandlungsergebnisse verschiedener Induktionstherapien weitgehend gleich sind [87]. Die typischen
3
Risiken einer Induktionstherapie bei der AML sind infektiöse Komplikationen während der
Neutropenie, welche unter Umständen letal sein können, eine Hauttoxizität durch
Cytarabin sowie kardiale Nebenwirkungen durch Anthrazykline. Patienten, die eine
komplette Remission erreicht haben, erhalten einen oder mehrere Zyklen einer
Konsolidierungstherapie. Diese basiert oftmals ebenfalls auf Cytarabin in unterschiedlicher
Dosierung. Eine Postremissionstherapie soll Voraussetzung für ein krankheitsfreies
Langzeitüberleben sein. Gegebenenfalls schließt sich eine Erhaltungstherapie an, die auf
klassischen zytotoxischen Substanzen oder experimentellen Studientherapeutika basiert
[35].
1.4 Das Zytostatikum Cytarabin
Cytarabin wird überwiegend in der Behandlung von hämatologischen Malignomen, wie
der akuten myeloischen Leukämie (AML), der akuten lymphatischen Leukämie (ALL) und
Non-Hodgkin-Lymphomen eingesetzt [31]. Bei der AML gehört es seit Jahren zur
Standardtherapie [75]. Cytarabin (Ara-C/Cytosin-Arabinosid/1-β-D-ArabinofuranosylCytosin) gehört zu der Gruppe der Antimetabolite und hemmt selektiv die DNA-Synthese.
Es hemmt kompetitiv DNA-Polymerasen und wird aufgrund seiner Strukturähnlichkeit mit
Pyrimidinbasen in die DNA eingebaut, ist aber nicht funktionsfähig [41]. Es wird davon
ausgegangen, dass die meisten klassischen Antitumormedikamente wirken, indem sie in
malignen Zellen Apoptose induzieren. Eine Schädigung der DNA führt zur Induktion des
Mitochondrien-vermittelten Apoptosewegs [29]. Eine Behandlung mit Cytarabin geht mit
vielen unerwünschten Medikamentenwirkungen einher. Die Hauptnebenwirkung von
Cytarabin ist die Hämatotoxizität. Die Knochenmarkssuppression führt zu einer
Megaloblastose, Retikulozytopenie, Leukopenie, Thrombozytopenie und Anämie. Weitere
Nebenwirkungen sind gastrointestinale Beschwerden, Mukositis, schwere Hautreaktionen,
Keratitis und Leberschäden [73]. Die Hämatotoxizität ist der dosislimitierende Faktor und
schränkt die klinische Anwendung von
Cytarabin ein [22]. Vor allem die
Hochdosischemotherapie mit Cytarabin geht mit toxischen Nebenwirkungen einher [37].
Für die Postremissionstherapie mit Cytarabin bei AML-Patienten konnte ein klarer
Zusammenhang zwischen der Cytarabin-Dosis und der Hämatotoxizität gezeigt werden
[39].
4
1.5 Apoptose
Abgesehen von der unterschiedlichen chemischen und physikalischen Struktur sowie der
biologischen Aktivität von Chemotherapeutika gibt es im Wesentlichen drei Mechanismen,
die deren Wirkung ausmachen [16]. Mechanismen, die vor dem eigentlichen Angriffspunkt
der Medikamente eine Rolle spielen, sind Medikamententransporter und Arzneimittelmetabolisierende
Enzyme.
Angriffspunkt
der
Chemotherapeutika
sind
je
nach
Substanzklasse die DNA, RNA oder spezifische Proteine. Antimetabolite hemmen die
Enzyme der DNA-Biosynthese. Nach Wirkung des Medikaments am Angriffspunkt hängt
der Effekt von nachgeschalteten intrazellulären Mechanismen ab. Der wichtigste
Mechanismus hierbei ist die Apoptose [17].
Apoptose bezeichnet den programmierten Zelltod und dient der Eliminierung nicht länger
nützlicher oder schädlich gewordener Zellen [69]. Sie läuft sowohl unter normalen
physiologischen als auch unter pathologischen Bedingungen ab [11]. Es kommt zu einer
Selbstzerstörung der Zelle, ohne dass dabei umliegendes Gewebe geschädigt oder
Sekundärreaktionen wie Entzündungen ausgelöst werden. Neben Differenzierung und
Proliferation dient auch die Apoptose der Wachstumskontrolle und spielt somit eine
wichtige Rolle in der Entwicklung und Aufrechterhaltung der Gewebshomöostase [69].
Die Apoptose wird über zwei verschiedene Signalwege reguliert, den extrinsischen, von
Todesrezeptoren vermittelten Weg, und den intrinsischen, mitochondrialen Weg. Beide
münden in der Aktivierung von Caspasen und werden von zelltoxischen Einflüssen
aktiviert.
Der intrinsische Apoptoseweg wird durch Stressfaktoren wie DNA- oder Zellschaden,
Mangel an Wachstumsfaktoren und Hypoxie ausgelöst [7]. Dabei ändert sich das
elektrische Potential der inneren Mitochondrienmembran, und spannunungsabhängige
Ionenkanäle (z.B. VDAC1) der inneren Mitochondrienmembran sowie Porenproteine in
der äußeren Membran werden in einen Daueroffenzustand versetzt. Die äußere Membran
wird durchlässig (MOMP), es kommt zu einer gesteigerten Produktion von reaktiven
Sauerstoffspezies (ROS), und die Mitochondrien schwellen aufgrund des osmotischen
Gradienten an. Dadurch tritt eine Reihe proapoptotischer Faktoren, die sich im Raum
zwischen innerer und äußerer Membran befinden, ins Zytosol aus. Zu diesen gehören
Cytochrom C, Adenylatzyklase, Smac/Diablo, Serin-Protease HtrA2/Omi, Procaspasen
und der Apopotose-induzierende Faktor [4]. Eine Schlüsselrolle spielt hierbei das
Cytochrom C. Dieses verbindet sich nach seinem Austritt aus dem Mitochondrium mit
dem zytosolischen Adaptermolekül APAF1. Zusammen mit dATP bilden diese Moleküle
5
das sogenannte Apoptosom. An dieses lagert sich Pro-Caspase 9 an und wird dabei zu
Caspase 9 aktiviert. Caspase 9 zerstört elementare Zellproteine und aktiviert proteolytisch
die Pro-Caspasen 3, 6 und 7. Diese Effektor-Caspasen setzen weitere destruierende
Enzyme und Prozesse in Gang [4, 13, 49].
Der mitochondriale Apoptoseweg wird strikt von der Bcl-2 Proteinfamilie reguliert und
kontrolliert. Diese Familie setzt sich aus einer Reihe pro- und antiapoptotischer Proteine
zusammen, von denen die zwei bedeutendsten Bax und Bcl-2 sind [11]. Vor allem die
relative Konzentration und das Verhältnis der einzelnen Proteine zueinander bestimmen
die Auslösbarkeit der Apoptose durch verschiedene Stimuli [49].
1.6 Die Bcl-2 Proteinfamilie
Die Bcl-2 Familie umfasst eine sehr gut konservierte Gruppe von Proteinen, die in
strukturellen und funktionellen Eigenschaften Gemeinsamkeiten mit dem Bcl-2 Protein
aufweist. Dieses wurde als erstes Mitglied der Familie entdeckt. Alle Proteine der Bcl-2
Familie besitzen mindestens eine Bcl-2 Homologie-Domäne (BH-Domäne). Die Proteine
können nach ihrer Struktur und Funktion in drei Untergruppen eingeordnet werden. Zu der
ersten Gruppe gehören die antiapoptotischen Proteine Bcl-2, Bcl-XL, Mcl-1, Bcl-w und
A1/Bfl 1. Die zweite Gruppe setzt sich nur aus proapoptotischen Mitgliedern wie Bax und
Bak zusammen [88]. Die dritte Gruppe umfasst die BH3-only-Moleküle, die mit den
anderen Proteinen der Familie nur die Sequenz der BH3-Domäne gemeinsam haben [27].
Die Aufgabe der BH3-only-Proteine besteht darin, apoptotische Signale aufzunehmen und
sie an die anderen Familienmitglieder weiterzugeben [2]. Vermutlich inhibieren sie
antiapoptotische Bcl-2 Proteine, indem sie komptetitiv an diese binden und deren Bindung
an Bax oder Bak lösen. Es gibt Hinweise, dass einige BH3-only-Proteine auch direkt mit
Bax oder Bak interagieren und diese aktivieren können [11].
1.6.1 Die Entdeckung des Bcl-2 Gens
Die Bezeichnung Bcl-2 leitet sich von B-cell lymphoma/leukemia-2 ab. Das Bcl-2 Gen
wurde
erstmals
1985
von
Tsujimoto
et
al.
entdeckt,
da
es
an
einer
Chromosomentranslokation beteiligt ist, die häufig beim follikulären Non-HodgkinLymphom beobachtet wird. Bei dieser Translokation t(14:18) wird das Bcl-2 Gen von
seiner normalen Position auf Chromosom 18 auf Chromosom 14q32 verlagert. Dadurch ist
es nahe dem Genort für Immunglobulin-Schwerketten (IgH) lokalisiert [77]. Es entsteht ein
6
Bcl-2-IgH Fusionsgen. Dies führt zu einer Deregulierung und Überproduktion der Bcl-2
mRNAs und des Genprodukts Bcl-2 [63].
1.6.2 Der Aufbau des Bcl-2 Gens
Das Bcl-2 Gen liegt auf dem Chromosom 18q21.3. Es besteht aus drei Exons und zwei
Promotoren. Die beiden Promotoren üben jeweils unterschiedliche Funktionen aus und
sind für die Initiation der Transkription verantwortlich [84]. Der erste Promoter, P1,
steigert die Genexpression des Bcl-2 Gens. Der zweite Promotor, P2, liegt ungefähr 1400
bp vor der Translationsinitationsstelle und reguliert die Transkription negativ durch
Verminderung der Aktivität des P1-Promotors [6, 84].
Bcl-2 wird gewebsspezifisch und abhängig vom Entwicklungsstand der Zelle reguliert und
exprimiert. Dennoch ist bisher wenig über die molekularen Mechanismen, welche die
Genexpression regulieren, bekannt [84].
1.6.3 Die Bedeutung des Bcl-2 Proteins für die Apoptose
Bcl-2 ist ein 26 kD großes, antiapoptotisches Protein, das an der zytoplasmatischen Seite
der äußeren Mitochondrienmembran, dem endoplasmatischen Retikulum und der
Zellkernmembran vorkommt [49].
Verschiedene Wirkmechanismen von Bcl-2 sind bekannt. Bcl-2 kann mit anderen
Mitgliedern der Bcl-2 Familie Heterodimere bilden und durch Bindung an proapoptotische
Moleküle wie Bax und Bak die Apoptose unterdrücken. Bcl-2 interagiert aber auch mit
Proteinen außerhalb der Bcl-2 Familie wie z.B. dem Caspase-aktivierenden Apaf-1. Des
Weiteren können Proteine aus der Bcl-2 Familie Poren bilden. Diese Poren stabilisieren die
Mitochondrienmembran und verhindern somit die Freisetzung von Cytochrom C und der
damit einhergehenden sekundären Aktivierung von Caspasen [64].
Als zentraler antiapoptotischer Faktor spielt Bcl-2 eine wichtige Rolle in der Regulation
des Überlebens einer Zelle. Im Gegensatz zu klassischen Onkogenen wirkt das Bcl-2 Gen
nicht über eine gesteigerte Wachstumsrate, sondern über eine Erniedrigung der Zelltodrate
[63]. Eine erhöhte Konzentration von Bcl-2 verlängert die Lebenszeit bestimmter
hämatopoietischer Zelllinien in Abwesenheit von Wachstumsfaktoren, ohne dabei die
Zellproliferation zu beeinflussen [78]. Verminderte
Bcl-2 Genexpression hingegen
beschleunigt den Vorgang des Zelltods in Lymphom- und leukämischen Zellen in der
Zellkultur [62].
7
1.6.4 Das Bcl-2 associated X-Protein: Bax
Die Bezeichnung Bax leitet sich von Bcl-2 associated X-Protein ab. Das Bax Gen liegt auf
Chromosom 19q13.3 [11],
enthält sechs Exons und einen Promotor mit vier p53
Bindungsstellen [45] und kodiert für das 21 kD große Bax Protein [53]. Bax ist ein
proapoptotisches Mitglied der Bcl-2 Proteinfamilie und ist im Zytoplasma der Zelle verteilt
[1]. In vitro und in vivo kann es die Freisetzung von Cytochrom C aus Mitochondrien
triggern [4]. Löst ein Stimulus Apoptose aus, verändert sich die Konformation von Bax
und es transloziert in die äußere Mitochondrienmembran [15]. Auf welchem Weg genau
Bax die Permeabilität der äußeren Mitochondrienmembran reguliert, ist noch unklar, es
wird jedoch vermutet, dass die Fähigkeit von Bax, Poren in synthetischen Lipidmembranen
zu bilden, eine wichtige Rolle spielt [66]. Es wird angenommen, dass Bax Oligomere
bildet, die als Kanäle in der äußeren Mitochondrienmembran fungieren oder mit bisher
unbekannten Porenproteinen dieser Membran interagieren [4]. Es konnte gezeigt werden,
dass Bcl-2 die Homodimerisation von Bax verhindern kann [54]. Wahrscheinlich
unterbindet Bcl-2 die Konformationsänderung von Bax, die der Aktivierung und dem
Einfügen in die Membran vorausgeht [4]. Außerdem kann Bax Heterodimere mit z.B.
Bcl-2 und Mcl-1 bilden und so beeinflusst das Verhältnis von Bcl-2 zu Bax die
Empfindlichkeit gegenüber Apopotose auslösenden Stimuli [49]. Der Zusammenhang des
Bcl-2/Bax Verhältnisses wurde auch bei der chronisch lymphatischen Leukämie (CLL)
untersucht. Zellen mit einer hohen Bcl-2/Bax Ratio waren resistenter gegen die in vitro
Induktion von Apoptose durch Chlorambucil [59].
Aufgrund seiner proapoptotischen Funktion gilt Bax als Tumorsuppressor. Bei Bax
defizienten knockout Mäusen zeigte sich eine Hyperplasie des Lymphgewebes, jedoch
keine lymphatischen Malignome. Dies deutet darauf hin, dass Bax das Wachstum bei der
Hämatopoiese negativ reguliert [33].
Es wurde beschrieben, dass eine erniedrigte Bax Proteinkonzentration mit einer
verminderten Apoptoserate und beschleunigtem Tumorwachstum einhergeht [83] und die
Empfindlichkeit gegen Chemotherapie beeinflusst [40].
1.7 Der Bcl-2 -938 C>A Polymorphismus
Funktionelle single nucleotide Polymorphismen im Bcl-2 Gen, die die Proteinexpression
verändern, können den komplexen Vorgang der Apoptose vermutlich beeinflussen [50].
Der Polymophismus Ala43Thr (G>A) im Exon 2 des Bcl-2 Gens soll zu einer angeborenen
8
verringerten Anfälligkeit für Autoimmunerkrankungen wie Typ 1 Diabetes in der
japanischen Bevölkerung führen [34]. Park et al. (2004) identifizierten sechs genetische
Polymorphismen im Bcl-2 Gen durch direkte Sequenzierung der DNA von koreanischen,
kaukasischen
und
afroamerikanischen
Probanden.
Diese
Studie
diente
der
Charakterisierung neuer, zusätzlicher Polymorphismen in den Cyclin D1 (CCND1) und
Bcl-2 Genen. Im Bcl-2 Gen war ein Polymorphismus im Promotor, drei im Exon 1 und
zwei in der 3`-UTR-Region zu finden (-938C>A, +21A>G, +127G>A, +300C>T,
+221280G>A und +223227G>A) [57].
Bei den meisten Patienten mit CLL kann eine erhöhte Bcl-2 Expression, jedoch keine
Chromosomentranslokation wie beim follikulären B-NHL beobachtet werden. Individuelle
genetische Faktoren, wie verschiedene single nucleotide Polymorphismen, sollen die Bcl-2
Expression in CLL-Zellen und den Verlauf der CLL beeinflussen. Nückel et al. (2007)
untersuchten den -938C>A SNP im Promotor des Bcl-2 Gens. Hierbei konnte gezeigt
werden, dass CLL-Patienten mit dem Bcl-2 -938 AA-Genotyp im Schnitt ein kürzeres
Gesamtüberleben und eine kürzere Zeit von der Erstdiagnose bis zum Beginn der
Chemotherapie (entspricht dem Fortschreiten der Krankheit) aufwiesen, als CLL-Patienten
mit dem Bcl-2 -938 AC/CC-Genotyp. Deshalb wurde der Bcl-2 -938 AA-Genotyp mit
einer ungünstigen Prognose assoziiert. Außerdem wiesen Patienten mit dem Bcl-2 -938
AA-Genotyp eine höhere Bcl-2 Proteinexpression verglichen mit dem CC-Genotyp auf.
Dies deutet auf eine ursächliche Verbindung zwischen AA-Genotyp und schlechter
Prognose hin. Die Verteilung der Genotypen zwischen Patienten mit CLL und gesunden
Kontrollen unterschied sich allerdings nicht signifikant. Daraus lässt sich schließen, dass
die verschiedenen Genotypen dieses Polymorphismus somit nicht die Wahrscheinlichkeit
erhöhen, an einer B-CLL zu erkranken [50].
1.8 Der Bax -248 G>A Polymorphismus
Saxena et al. (2002) identifizierten einen neuen -248G>A Polymorphismus in der 5`-UTRRegion des Bax Gens in einer Studie mit 34 CLL-Patienten. Dieser SNP liegt 248
Nukleotide vor dem open-reading frame (ORF) und 146 Nukleotide hinter der TATA-Box.
Der GA/AA-Genotyp des Bax SNP führte zu einer erniedrigten Bax Proteinexpression,
einem Fortschreiten der Krankheit zu höheren Stadien (96% der CLL-Patienten im
Stadium RAI I-IV wiesen den GA Genotyp auf während nur 5% der Patienten im Stadium
0 und 4% der gesunden Kontrollen diesen Genotyp zeigten) und es konnte kein
vollständiges Ansprechen auf konventionelle Chemotherapie erreicht werden. Außerdem
9
kam der SNP bei den an einer CLL erkrankten Patienten häufiger vor als bei den gesunden
Kontrollen. Daraus ließe sich schließen, dass der SNP an der Ätiologie der Erkrankung
beteiligt ist [68]. Starczynski et al. (2005) zeigten in einer größeren Studie mit 203 CLLPatienten, dass der GA/AA-Genotyp mit einer erniedrigten Bax Proteinexpression
einhergeht. Zusätzlich war das Gesamtüberleben in der Gruppe mit dem GA/AA-Genotyp
signifikant verkürzt. Die Allelfrequenz des Bax Polymorphismus unterschied sich
zwischen den CLL-Patienten und den gesunden Kontrollen nicht signifikant, so dass der
Polymorphismus nicht an der Entwicklung einer CLL beteiligt zu sein scheint [72].
1.9 Herleitung der Aufgabenstellung
Die interindividuellen Unterschiede bei der Wirkung und Nebenwirkung von
Chemotherapie sind groß. Genetische Faktoren können eine Ursache für diese
Unterschiede sein. Da Chemotherapeutika in Zellen Apoptose induzieren, könnten
Veränderungen in Apoptosegenen die individuelle Reaktion auf eine Chemotherapie
beeinflussen. Bisher sind wenige genetische Faktoren bekannt, welche vorhersagen
könnten, welche Patienten zur Entwicklung von starken Nebenwirkungen prädisponiert
sind.
In dieser Studie soll die Zelltoxizität von Cytarabin in Abhängigkeit von der
Genexpression der Apoptosegene Bcl-2 und Bax sowie der Bax/Bcl-2 Ratio an den
Blutzellen gesunder Probanden untersucht werden. Hierfür werden mononukleäre Zellen
des peripheren Blutes aus Blutproben von 100 gesunden Probanden für 48 Stunden mit
Cytarabin inkubiert und die Menge apoptotischer und nekrotischer Zellen gemessen. Der
Prozentsatz apoptotischer Zellen gilt als Maß für die Toxizität von Cytarabin. Die
Genexpression von Bcl-2 und Bax in den mononukleären Zellen des peripheren Blutes
wird mittels real-time PCR gemessen.
Weiterhin wird der Einfluss genetischer Polymorphismen in den Apoptosegenen Bcl-2 und
Bax, in diesem Fall der single nucleotide Polymorphismen Bcl-2 -938C>A und Bax
-248G>A, auf die Genexpression von Bcl-2 und Bax und ihre Auswirkung auf die
Toxizität von Cytarabin untersucht. Die Proben von 100 gesunden Probanden wurden
hinsichtlich dieser Polymorphismen genotypisiert.
10
2. Material und Methoden
2.1 Studiendurchführung
Die Studie wurde nach Zustimmung der Ethikkommission der Universität Ulm
durchgeführt. Nach einer mündlichen Aufklärung wurden die Blutproben von 100
gesunden Probanden, die nach eigenen Angaben kaukasischer Abstammung sind,
entnommen. Unter den Teilnehmern befanden sich 34 Männer und 66 Frauen in einem
durchschnittlichen Alter von 31 Jahren (range 20-60).
2.2 Bestimmung der Toxizität
Die Zellvitalität wurde durch eine Zweifachfärbung mit Annexin-V und Propidiumiodid
(PI) und anschließender Analyse der Zellen mit Hilfe der Durchflusszytometrie bestimmt.
2.2.1 Zellkultur
Die mononukleären Zellen wurden unmittelbar nach der Abnahme peripheren Bluts in
Heparin-Röhrchen isoliert. Dies wurde mittels der Ficoll densitiy gradient centrifugation
nach Standard-Vorgehen durchgeführt. Anschließend wurden die Zellen manuell gezählt
und in RPMI 1640 resuspendiert. Davon wurden 5 x 106 Zellen für die RNA-Isolation
verwendet. Danach wurden die verbliebenen Zellen für die Zellkultur in RPMI 1640
resuspendiert und mit 10% fetalem Kälberserum und 1% Penicillin/Streptomycin ergänzt,
so dass sich eine Konzentration von 1 x 106 Zellen/µl ergab. Davon wurde je ein ml in die
Tube einer Sechs-Loch Platte gegeben und bei 37°C und 5% CO2 für 48 Stunden mit
Cytosine β-D-arabinofuranoside (Cytarabin/Ara-C) inkubiert. Das Cytarabin wurde in
phophatgepufferter Salzlösung (PBS; pH 7,4) gelöst. Es wurde eine Cytarabinkonzentration von 3 µM gewählt, diese entspricht in etwa den Plasmaspiegeln einer
Hochdosischemotherapie mit Cytarabin. Die beobachteten steady-state Plasmaspiegel von
Cytarabin während einer Standardchemotherapie liegen bei 0,5-1 µM.
2.2.2 Messung der Toxizität
Die Toxizität wurde mittels einer Zweifachfärbung mit Annexin V und Propidiumiodid
(PI) erfasst. Annexin V bestimmt quantitativ den Prozentsatz an Zellen, die aktiv Apoptose
durchmachen. Es erfasst sehr frühe Apoptosestadien, da es an Phosphatidylserin bindet.
Phosphatidylserin transloziert kurz nach der Induktion von Apoptose an die Zelloberfläche.
PI ist eine interkalierende Substanz und kann die beschädigte Zellmembran von
11
apoptotischen Zellen, nicht jedoch die von intakten Zellen durchdringen. Somit sind vitale
Zellen sowohl für Annexin V als auch für PI negativ, Zellen in frühen Apoptosestadien
sind Annexin V positiv und PI negativ und Zellen in fortgeschrittenen Stadien oder bereits
tote Zellen sind Annexin V und PI positiv. Für die Färbung wurden die Zellen mit 2 ml
Annexin V–bindendem Puffer (BB) gewaschen und anschließend in 100 µl BB zusammen
mit 1 µl FITC(Fluorochrom)-markiertem Annexin V resuspendiert und für 15 Minuten bei
Raumtemperatur im Dunkeln inkubiert. Anschließend wurden die Zellen noch einmal mit 2
ml BB gewaschen, in 250 µl BB resuspendiert und mit 1 µl Propidiumiodid unmittelbar
vor der Durchführung der Durchflusszytometrie gefärbt. Der Anteil an apoptotischen
Zellen, der verglichen mit der Kontrolle, zusätzlich positiv für Annexin V und
Propidiumiodid war, galt als Maß für den Zelltod. Die für Cytarabin spezifische Toxizität
wurde dann nach der folgenden Formel berechnet: Cytarabin Toxizität = 100 x ((tote
Zellenbehandelt[%] – tote ZellenKontrolle [%]) / (100 – tote ZellenKontrolle[%])).
Um
tagesabhängige
Toxizitätsunterschiede
innerhalb
eines
Individuums
zu
berücksichtigen, wurde die Toxizität an den PBMCs von neun Probanden zusätzlich zu
drei verschiedenen Zeitpunkten gemessen.
2.3 Molekularbiologische Methoden zur Genexpressionsanalyse
Zur Durchführung der Genexpressionsanalysen wurde zunächst Gesamt-RNA aus den
PBMCs der Probanden isoliert. Anschließend wurde eine real-time PCR in zwei Schritten
durchgeführt. Dabei wurde zuerst die RNA mithilfe einer Reversen Tanskriptase in
komplementäre DNA (cDNA) umgeschrieben. Danach wurde zur quantitativen
Genexpressionsanalyse eine real-time PCR mit Hilfe von auf der SYBR®-Green Methode
basierenden Genexpressionsassays durchgeführt. Um Kontaminationen mit RNAsen zu
vermeiden wurde mit Handschuhen und RNAse freiem Wasser gearbeitet.
2.3.1 Isolierung der RNA
Die Gesamt-RNA wurde aus
5 x 106 mononukleären Zellen des peripheren Blutes
(PBMCs) unmittelbar nach deren Zellisolation isoliert. Zur Isolierung der RNA wurde das
RNeasy® Mini Kit verwendet. Die Lymphozyten wurden mit 350 µl des Puffers RLT, in
dem 1% β-Mercaptoethanol enthalten war, lysiert und anschließend homogenisiert. Der
Puffer RLT inaktiviert unmittelbar RNAsen und stellt so eine Isolierung von intakter RNA
sicher. Anschließend wurden dem homogenisierten Lysat 350 µl 70% Ethanol hinzugefügt,
um optimale Bindungsverhältnisse zu schaffen,
12
und durch Auf- und Abpipettieren
vermischt. 700 µl der Probe wurden in eine RNeasy® spin-Säule mit einem 2 ml
Sammelgefäß überführt und für 15 Sekunden bei 8000 x g (10000 rpm) zentrifugiert.
Dadurch bindet die Gesamt-RNA an die Membran. Das Filtrat wurde verworfen. Um
Kontaminationen wegzuwaschen wurden zuerst 350 µl RW1-Puffer auf die Säule
gegebenen, zentrifugiert (15s bei 8000 x g) und das Filtrat verworfen. Danach wurde diese
Prozedur noch zweimal wiederholt, indem je 500 µl RPE-Puffer hinzugefügt wurden,
zentrifugiert wurde (erst 15 s bei 8000 x g und dann 2 min bei 8000 x g) und das Filtrat
jeweils verworfen wurde. Anschließend wurde die Säule in ein 1,5 ml Sammelgefäß
gestellt, 30 µl RNAse-freies Wasser hinzugefügt und für drei Minuten bei Raumtemperatur
inkubiert. Um die RNA abzulösen wurde danach für eine Minute bei 8000 x g zentrifugiert
und das entstehende Eluat nochmals auf die Säule gegeben. Es wurde wiederum für eine
Minute bei Raumtemperatur inkubiert und für eine Minute bei 8000 x g zentrifugiert.
2.3.2 RNA-Konzentrationsbestimmung
Die Konzentration der RNA-Proben wurde spektrophotometrisch mittels NanoDrop
ermittelt. Verwendet man RNA, entspricht ein bei einer Wellenlänge von 260 nm
gemessener Absorptionswert von 1 (bei einer Schichtdicke/detection path von 1 cm) einer
Konzentration von 40 µg/ml. Die Reinheit der RNA kann anhand des Quotienten aus den
Absorptionswerten bei 260 nm und 280 nm eingeschätzt werden. Bei reinen Proben liegt
der Quotient zwischen 1,9 und 2,1. Niedrigere Werte weisen darauf hin, dass
Kontaminationen, wie z.B. Proteine vorhanden sind.
2.3.3 RNA-Transkription / reverse Transkription
Die Umschreibung der RNA in komplementäre DNA erfolgte unter der Verwendung der
SuperScript® II Reversen Transkriptase (RT) und den Oligo(dt)12-18-Primern. Hierzu
wurden dem in Tabelle 1 dargestellten Reaktionsmix 0,5 µg RNA (je nach Konzentration x
µl RNA) hinzugefügt, so dass sich ein Gesamtvolumen von 12 µl ergab. Nachdem der Mix
für fünf Minuten bei 65° C inkubiert und dann schnell auf Eis abgekühlt wurde, wurden 4
µl 5 x First-Strand Puffer, 2 µl 0,1M DTT und 1 µl RNAse-Inhibitor beigefügt. Diese
Mischung wurde durch leichtes Umkippen gemischt und für zwei Minuten bei 42° C
inkubiert. Anschließend wurde 1 µl Reverse Transkriptase hinzugefügt und die
Transkription im Thermocycler gestartet. Zusätzlich wurde bei jedem Lauf eine Kontrolle
mittels einer Probe ohne Reverse Transkriptase durchgeführt. Die cDNA kann
weiterverwendet oder bei -20° C gelagert werden.
13
Tabelle 1: Reaktionsansatz- und bedingungen für die Durchführung der reversen
Transkription
dNTP: Desoxyribonukleosidtriphosphat, RNA: Ribonuclein acid
RNA-Transkription
Reaktionsmix
Thermocycler
Oligo(dt)12-18 Primer
1 µl
dNTP-Mix (je 10mM)
1 µl
RNAse-freies Wasser
x µl (je nach RNA-Konzentration)
Inkubieren bei 42° C für 50 Minuten
Inaktivieren bei 70° C für 15 Minuten
2.3.4 Real-Time PCR
2.3.4.1 Prinzip der Real-Time PCR (SYBR®-Green Detection)
Die real-time PCR wird auch als quantitative Polymerasekettenreaktion bezeichnet und
misst die Amplifikation im Gegensatz zur herkömmlichen PCR unmittelbar, während sie
auftritt. Während der exponentiellen Phase der real-time PCR ist die Menge an
entstehendem RNA-Produkt direkt proportional zur ursprünglich in der Probe enthaltenen
Menge an Zielnukleinsäure. Da in dieser Phase gemessen wird, kann auf die
Ausgangskonzentration rückgeschlossen werden. Die SYBR®-Green-Methode basiert auf
der Verwendung eines fluoreszierenden Farbstoffes. Dieser bindet unspezifisch an jede
doppelsträngige Nukleinsäure und fluoreszeiert, wenn er an diese gebunden ist. Wenn die
DNA im Verlauf der PCR denaturiert, löst sich der SYBR® Green I-Farbstoff und die
Fluoreszenz ist deutlich vermindert. Durch die HotStarTaq® DNA Polymerase wird eine
Zielsequenz amplifiziert und es entstehen neue PCR-Produkte, sogenannte Amplicons. Da
der SYBR® Green I-Farbstoff an diese doppelsträngigen Produkte bindet, nimmt die
Intensität der Fluoreszenz proportional zur Menge des PCR-Produktes zu. Die Fluoreszenz
kann fortlaufend gemessen werden. In dieser Arbeit wurden die Zielsequenzen relativ
quantifiziert, indem das Verhältnis aus der Menge an Zielsequenz und Menge einer
Referenz-Nukleinsäure bestimmt wurde. Als Referenz-Nukleinsäure werden passende
nicht regulierte Gene, sogenannte housekeeping Gene verwendet. Hier wurde die
Genexpression von Bcl-2 und Bax mit der Expression des housekeeping Gens TATA-BoxBinding-Protein (TBP) normalisiert.
14
2.3.4.2 Auswertung der Real-Time PCR
Trägt man das nach jedem Zyklus gemessene Fluoreszenssignal gegen die Zykluszahl auf,
erhält man einen Amplification Plot. Je höher die ursprüngliche Menge an Zielsequenz ist,
desto früher sieht man eine Zunahme der Fluoreszenz. Das Fluoreszenzsignal wird als
∆Rn-Wert angegeben, wobei die Fluoreszenzzunahme des Farbstoffs gegen das Signal
eines Referenzfarbstoffs (ROX) normalisiert wird (dies kompensiert nicht PCR-bezogene
Veränderungen der Fluoreszenz). Während der exponentiellen Phase der real-time PCR
wird vom Cycler der Schwellenwert (Threshold Line) bestimmt. Dieser wird erreicht,
wenn die Intensität des Fluoreszenzsignals (∆Rn) über die Hintergrundfluoreszenz
ansteigt. Die Hintergrundfluoreszenz kann man in den ersten Zyklen der PCR sehen, in
denen sich das Fluoreszenzsignal kaum verändert. Der PCR Zyklus, bei dem die Probe
diesen Schwellenwert erreicht, heißt Threshold Cycle (Ct).
Um die Genexpression von Bcl-2 und Bax zu quantifizieren, wurde in dieser Arbeit die
2-(∆Ct) - Auswertungsmethode gewählt. Hierbei wurde der Ct-Wert des Zielgens (Bcl-2,
Bax) gegen den Ct-Wert des Haushaltsgens TATA box-binding-Protein (TBP)
normalisiert, die sogenannte endogene Kontrolle (∆Ct = Ct Zielgen – Ct Referenzgen). Um
zu zeigen, dass die Effizienz der Ziel- und Kontrollamplifikation annähernd gleich waren,
wurden Experimente zur Validierung mit cDNA von QPCR Human Reference Total RNA
durchgeführt.
2.3.4.3 Amplifikation der cDNA mittels Real-Time PCR
Die Durchführung der Realtime PCR erfolgte mittels des QuantiFast® SYBR® Green PCR
Kit und den QuantiTect® Primer Assays für Bcl-2 (QT00997409) und Bax (QT00031192)
unter der Verwendung eines Real-Time PCR Cyclers.
Hierfür wurde zunächst der in Tabelle 2 dargestellte Reaktionsmix hergestellt. Dieser
wurde gemischt und je 12,5 µl in die Tuben einer 96-Loch Platte pipettiert. Dann wurde
jeder Tube 1µl DNA hinzugefügt. Die Platte wurde dann in den Real-Time-Cycler gestellt
und folgendes Cycling-Programm gestartet: zunächst wurde die Polymerase bei 95°C für
fünf Minuten aktiviert. Anschließend folgte die Denaturierung der DNA-Stränge bei 95°C
für zehn Sekunden und in einem kombinierten Schritt das Annealing der Primer sowie die
Elongation bei 60°C für 30 Sekunden. Dieser Zyklus wurde 40 mal wiederholt.
15
Tabelle 2: Reaktionsansatz für die Amplifikation der Bcl-2- oder Bax-cDNA mittels realtime PCR
Bax: Bcl-2 associated X-Protein, Bcl-2: B-Cell Lymphoma 2, cDNA: complementary Desoxyribonucleinsäure, PCR: Polymerase-Ketten-Reaktion, RNA: Ribonuckleinsäure
Reaktionsmix Bcl-2 / Reaktionsmix Bax
2 x QuantiFast SYBR Green PCR Master Mix 12,5 µl
Primer QT00997409/ Primer QT00031192
Konzentration 1,25 µl
RNase-freies Wasser
4 µl (je nach DNA-Konzentration)
2.4 Durchführung der Genotypisierung
2.4.1 DNA-Extraktion
Die DNA-Extraktion erfolgte mittels des QIAamp DNA Blood Mini Kit. Dieses Verfahren
beruht auf vier Schritten. Zunächst werden in einer EDTA-Blutprobe enthaltenen Zellen
lysiert, um die DNA freizusetzen. Hierfür werden 40 µl Protease, 400 µl Blutprobe und
400 µl Lysepuffer nacheinander in ein Eppendorfgefäß pipettiert, gut vermischt und
anschließend bei 56° C für 10 Minuten inkubiert. Im zweiten Schritt wird die genomische
DNA an die Membran eines speziellen Gefäßes, der sogenannten QIAamp Mini SpinSäule gebunden. Um die Bindung zu optimieren, und zur Fällung des Proteins, werden
dem Lysat zunächst 400 µl Ethanol hinzugefügt und die gesamte Lösung in das QIAamp
Mini Spin-Gefäß gegeben. Durch Zentrifugieren bei 6000 x g (8000 rpm) für eine Minute
wird die genomische DNA an die Silika-Membran adsorbiert. Das Spin-Gefäß wird in ein
Waschgefäß gesteckt und das Filtrat wird verworfen. Im nächsten Schritt werden
Kontaminationen von der Membran weggewaschen, die DNA bleibt an der Membran
gebunden. Hierfür werden der QIAamp Mini Spin Säule erst 500 µl Waschpuffer 1 (AW1)
und dann 500 µl Waschpuffer 2 hinzugefügt. Nach der Zugabe von Waschpuffer 1 wird
das Spin Gefäß für 1 Minute bei 6000 x g zentrifugiert und nach Zugabe von Waschpuffer 2 für eine Minute bei 20800 x g. Das Filtrat wird jeweils verworfen und das SpinGefäß in ein neues Waschgefäß gesteckt. Anschließend wird für drei Minuten bei
maximaler Geschwindigkeit zentrifugiert, um die Membran vollständig zu trocknen. Das
Filtrat wird wieder verworfen und das Spin Gefäß in ein Eppendorf Gefäß gestellt. Im
lezten Schritt wird die DNA durch die Zugabe von 100 µl Elution-Puffer (AE), Inkubieren
16
bei Raumtemperatur für eine Minute und Zentrifugieren für eine Minute bei 6000 x g von
der Membran des Spin Gefäßes losgelöst. Das Spin Gefäß wird nun verworfen und die
DNA im Eppendorf Gefäß bei 4° C bis zur PCR aufbewahrt.
2.4.2 Polymerase-Ketten-Reaktion (PCR)
Die Polymerasekettenreaktion dient der Amplifizierung spezifischer DNA-Sequenzen. Für
den Start der PCR werden sogenannte Primer eingesetzt, einzelsträngige Oligonukleotide,
die den beiden Enden des zu amplifizierenden Fragments entsprechen (sense- und
antisense-Primer). Weiterhin werden DNA-Polymerasen benötigt, die den Primer in 5´- 3´Richtung entlang dem Matrizenstrang verlängern und so die denaturierten Einzelstränge zu
einem Doppelstrang komplementieren. Die Amplifizierung der DNA-Fragmente erfolgt in
temperaturgesteuerten Reaktionszyklen, wobei jeder Zyklus aus drei Schritten besteht. Im
ersten Schritt wird der DNA-Doppelstrang durch Erhöhen der Temperatur auf 94° C
denaturiert. Nach raschem Abkühlen auf 55 - 60° C lagern sich die Primer an die
entsprechenden Sequenzen an den Enden des DNA-Stücks, das amplifiziert werden soll, an
(Annealing). Im letzten Schritt werden durch die DNA-Polymerase die komplementären
DNA-Stränge entlang der Matrize synthetisiert (Elongation), so dass nun zwei
Doppelstränge vorliegen. Dieser Reaktionszyklus wird 20- bis 40-mal wiederholt. Bei
jedem Zyklus verdoppelt sich der zwischen den Primern liegende DNA-Abschnitt, so dass
ab dem vierten Zyklus das gesuchte Nucleinsäurefragment exponentiell amplifiziert wird.
2.4.3 Restriktionsfragmentlängenpolymorphismus (RFLP)
Nach der PCR wird das Verfahren der RFLP-Analyse eingesetzt, bei der die betreffende
Genregion an bestimmten Basenpaarmustern mit spezifischen Restriktionsenzymen
geschnitten wird. Diese Restriktionsendonukleasen verdauen die PCR-Produkte und
zerschneiden sie entsprechend ihrer Basensequenz. Durch eine Mutation in der DNA kann
sich die Schnittstelle eines Restriktionsenzyms verändern, so dass die ursprüngliche
Schnittstelle nicht mehr erkannt wird oder zusätzliche Schnittstellen entstehen. Die
entstehenden DNA-Fragmente unterschiedlicher Länge können mittels Gelelektrophorese
analysiert
werden,
da
sie
unterschiedlich
schnell
durch
die
netzähnlichen
Polysaccharidstrukturen des Agarosegels wandern. Durch interkalierende Farbstoffe wie
Ethidiumbromid können diese Banden sichtbar gemacht werden. Mit diesem Verfahren
können bekannte Mutationen, wie die in dieser Arbeit untersuchten Bcl-2 und Bax single
nucleotide Polymorphismen, analysiert werden.
17
2.4.4 Bestimmung des Bcl-2 Allels durch den PCR-RFLP-Test
Die Bestimmung des Bcl-2 -938C>A Allels erfolgte mittels des PCR-RFLP-Tests, wie er
von Chen et al. (2007) beschrieben worden ist [11]. Zur Bestimmung des Bcl-2 Genotyps
wurde dem in der Tabelle 3 beschriebenen Mastermix (24 µl) 1 µl genomische DNA
hinzugefügt. Im Thermocycler wurde die DNA danach in 35 Zyklen amplifiziert. Der
erfolgreiche Ablauf der PCR wurde kontrolliert, indem im nächsten Schritt 10 µl PCRProdukt auf 2% Agarosegel aufgetragen wurden. Nach 40-minütiger Elektrophorese bei
120 V sollte sich eine 262 bp-Bande zeigen. Im Erfolgsfall wurden 10 µl des PCRProdukts 10 µl Enzymmastermix beigefügt und bei 37° C über Nacht schüttelnd inkubiert.
Zur Auswertung wurde das Produkt auf 2% Agarosegel aufgetragen und bei 120 V für 40
Minuten aufgetrennt. Die entstehenden Bandenmuster für die unterschiedlichen Genotypen
konnten dann abgelesen werden (Tabelle 4).
Tabelle 3: Reaktionsansatz und -bedingungen zur Durchführung des PCR-RFLP von Bcl-2
-938C>A
Bcl-2: B-Cell Lymphoma 2, f: forward, MgCl: Magnesiumchlorid, PCR: Polymerase-Ketten-Reaktion, r:
reverse, RFLP: Restriktionsfragmentlängenpolymorphismus, RNA: Ribonuckleinsäure, Taq: Thermus
aquaticus
Bcl-2 -938 C>A
PCR-Mastermix
Cycler
10*Puffer
2,5 µl
MgCl (50mM)
0,75 µl
dNTPs (2mM)
2,5 µl
Primer Bax f (10µM)
1,25 µl
Primer Bax r (10µM)
1,25 µl
TaqPolymerase
0,4 µl
H2O
15,35 µl
5 min 96°C – 35 x (45 s 96° C – 40 s 60° C – 30 s 72° C) – 7 min
72°C
Restriktionsenzym
BccI
Enzymmastermix
7,5 µl H2O
2,0 µl New England Puffer 1
1,2 µl BSA
0,3 µl BccI
18
Tabelle 4: Ergebnis des PCR-RFLP von Bcl-2
Bandenmuster (bp) in Abhängigkeit vom Genotyp (CC, CA oder AA)
Bcl-2: B-Cell Lymphoma 2, Bp: Basenpaare, PCR: Polymerasekettenreaktion, RFLP: Restriktionsfragmentlängenpolymorphismus
Genotyp
Muster (bp)
CC
CA
AA
-
262
262
154
154
-
108
108
-
2.4.5 Bestimmung des Bax Allels durch den PCR-RFLP-Test
Die Bestimmung des Bax -248 G>A Allels erfolgte mittels des PCR-RFLP-Tests, wie er
von Starczynski et al. (2005) beschrieben wurde [72]. Dem Enzymmastermix (24 µl), der
in Tabelle 5 beschrieben ist, wurde 1 µl genomische DNA hinzugefügt und diese im
Thermocycler in 35 Zyklen amplifiziert. Danach wurden zur Kontrolle 10 µl des PCRProdukts mit 2 µl Ladepuffer (Bromphenolblau) sowie 2 µl 1 % SDS vermischt und in die
Taschen eines 2 % Agarosegels aufgetragen. Nach 40-minütiger Elektrophorese bei 120 V
sollte sich eine 280 bp–Bande zeigen. Anschließend wurden weitere 10 µl PCR-Produkt
dem in Tabelle 5 beschriebenen Enzymmastermix beigefügt und bei 55°C für drei Stunden
im Thermocycler verdaut.
Zur Auswertung wurde das Produkt auf 2% Agarosegel
aufgetragen und bei 120 V für 40 Minuten aufgetrennt. Die entstehenden Bandenmuster
für die unterschiedlichen Genotypen konnten dann abgelesen werden (Tabelle 6).
Tabelle 5: Reaktionsansatz und -bedingungen zur Durchführung des PCR-RFLP von Bax
-248G>A
Bax: Bcl-2 associated X-Protein, Bcl-2: B-Cell Lymphoma 2, f: forward, MgCl: Magnesiumchlorid, PCR:
Polymerase-Ketten-Reaktion, r: reverse, RFLP: Restriktionsfragmentlängenpolymorphismus, RNA: Ribonukleinsäure, Taq: Thermus aquaticus
Bax -248 G>A
PCR-Mastermix
10*Puffer
2,5 µl
MgCl (50mM)
0,5 µl
dNTPs (2mM)
2,5 µl
Primer Bax f (10µM)
1,25 µl
Primer Bax r (10µM)
1,25 µl
19
Cycler
TaqPolymerase
0,4 µl
H2O
15,6 µl
5 min 94°C – 32 x (30 s 94°C – 30 s 53°C – 30 s 72°C) – 7 min
72°C
Restriktionsenzym
TauI
Enzymmastermix
1 µl TauI
1 µl Puffer (Buffer B)
8 µl H2O
Tabelle 6: Ergebnis des PCR-RFLP von Bax
Bandenmuster (bp) in Abhängigkeit vom Genotyps (GG, GA oder AA)
Bax:
Bcl-2
assiociated
X-Protein,
Bp:
Basenpaare,
PCR:
Polymerasekettenreaktion,
RFLP:
Restriktionsfragmentlängenpolymophismus
Genotyp
Muster (bp)
GG
GA
AA
-
280
280
234
234
-
46
46
-
Tabelle 7: verwendete Primer und deren Sequenz für den PCR-RFLP des Bcl-2 und Bax
Polymorphismus
Bax: Bcl-2 assiociated X-Protein, Bcl-2: B-Cell lymphoma 2, f: forward, PCR: Polymerasekettenreaktion,
r: reverse, RFLP: Restriktionsfragmentlängenpolymophismus
Gen bzw. Allel
Primer
Sequenz des Primers
Richtung
Bcl-2 -938 C>A
Bcl-2 f
5´-CTGCCTTCATTTATCCAGCA-3´
Forward
(rs2279115)
Bcl-2 r
5´-GGCGGCAGATGAATTACAA-3´
Reverse
Bax -248 G>A
Bax f
5´-TTAGAGACAAGCCTGGGCGT-3´
Forward
(rs4645878)
Bax r
5´-CAATGAGCATCTCCCGATAA-3´
Reverse
20
Tabelle 8: Restriktionsendonukleasen und deren Schnittstelle für den PCR-RFLP Test
PCR: Polymerasekettenreaktion, RFLP: Restriktionsfragmentlängenpolymorphismus
↑↓ Schnitstelle
Enzym
Konzentration
Puffer
Schnittstelle
BccI
10000U/ml
NEB1
5´- CCATC(N)4 ↓ - 3´
BSA
3´- GGTAG(N)5 ↑- 5´
Buffer B
5´ - G C ↓ G^C – 3´
TauI
3U/µl
3´ - C^G ↑ C G – 5´
2.5 Chemikalien und Geräte
Tabelle 9: Hersteller und Firmen der verwendeten Chemikalien
Chemikalie
Hersteller
10 x PCR-Pufffer
Invitrogen (Life Technologies)
50mM MgCl2
Fermentas (Thermo Fisher Scientific)
Agarose
Sigma-Aldrich
Annexin V
BD Biosciences
BB (Annexin V binding buffer)
BD Biosciences
Biocoll Separating Solution
Biochrom AG
(Ficoll Separating Solution)
Bromphenolblaupuffer
Fluka
Calf serum
PAA Laboratories (GE Healthcare)
cDNA
QPCR Human Reference Total RNA
Cytarabin
Sigma-Aldrich
DNA-Standard: 100 bp-DNA-Leiter
Fermentas (Thermo Fisher Scientific)
HdNTP`s
Fermentas (Thermo Fisher Scientific)
Ethanol 70%
Sigma-Aldrich
Ethanol 96%
Sigma-Aldrich
Ethidiumbromid
Fluka
FITC-markiertes Annexin V
BD Biosciences
Oligo(dt)12-18-Primer
Invitrogen (Life Technologies)
PBS
PAA Laboratories (GE Healthcare)
21
PCR-Primer
Biomers.net
Penicillin/Streptomycin
PAA Laboratories
Propidium iodid
Invitrogen (Life Technologies)
QIAamp® DNA Blood Mini Kit
Qiagen
QPCR Human Reference Total RNA
Agilent Technologies
QuantiFast®SYBR® Green PCR Kit
Qiagen
QuantiTect® Primer Assay QT 00031192
Qiagen
QuantiTect® Primer Assay QT 00997409
Qiagen
Restriktionsendonuklease BccI
New England Bio Labs
Restriktionsendonuklease TauI
Fermentas (Thermo Fisher Scientific)
RNeasy® Mini Kit
Qiagen
RPMI 1640
PAA Laboratories (GE Healthcare)
SDS
USB Products
SuperScript® II Reverse Transkriptase
Invitrogen (Life Technologies)
Taq-DNA-Polymerase
Invitrogen (Life Technologies)
TBP
Qiagen
Tabelle 10: Hersteller der verwendeten Geräte
Gerät
Hersteller
96-Loch-Platte
Applied Biosystems (life Technologies)
Elektorphoresekammern und –schlitten
Werkstatt Universität Ulm
Eppendorf Gefäß
Eppendorf
FACScan
BD Biosciences
Schüttelwasserbad
GFL
Inkubator/Thermomixer
Eppendorf
Mikroskop
Zeiss
NanoDrop 1000
Thermo Scientific
Pipetten
Eppendorf
Pipettenspitzen
Eppendorf
Real-time PCR Cycler 7300
Applied biosystems
Thermocycler PTC-225
MJ Research
Videosystem
Herolab, Easy win 32
Vortexer
USA Scientific
Zentrifugen
Sigma Aldrich, Heraeus, Thermo Scientific
22
2.6 Analyse der Messdaten und Statistik
Alle statistischen Analysen wurden mit SPSS 17.0 (SPSS Inc., Chicago, IL) durchgeführt.
Der Kolmogorov-Smirnov-Test wurde angewandt, um die Verteilung der Cytarabin
Toxizität, der Bax und Bcl-2 Genexpression und der Bax/Bcl-2 Ratio zu beurteilen. Das
arithmetische Mittel der Cytarabin Toxizität und der Genexpression von Bcl-2 und Bax
wurde berechnet und die statistische Bandbreite wurde als Standardabweichung berechnet.
Ob die Bcl-2 und Bax Genexpression und die Bax/Bcl-2 Ratio mit der Toxizität von
Cytarabin korrelieren, wurde mittels des Spearmanschen Rangkorrelationskoeffizienten
analysiert. Korrelationsanalysen über den Zusammenhang des Bcl-2 Genotyps mit der
Bcl-2 Genexpression und der Toxizität von Cytarabin wurden mittels des JonckheereTerpstra-Tests durchgeführt. Der Jonckheere-Terpstra-Test ist ein parameterfreier Test, mit
dem begutachtet wird, ob sich verschiedene unabhängige Stichproben hinsichtlich einer
ordinalskalierten Variablen unterscheiden. Ob zwischen dem Bax Genotyp und der Bax
Genexpression sowie der Toxizität von Cytarabin ein Zusammenhang besteht, wurde
mittels des Mann-Whitney-U-Tests analysiert. Der Mann-Whitney-U-Test ist einer der
stärksten Tests, um einen Zusammenhang zwischen einer nominalskalierten Variablen
(Bax Genotyp) und einer ordinalskalierten Variablen (Bax Genexpression/Cytarabin
Toxizität) zu testen. Es wird geprüft, ob ein Zusammenhang zwischen zwei unabhängigen
Stichprobenverteilungen existiert, oder genauer, ob die Verteilungen von zwei Stichproben
bis auf eine Konstante gleich sind. Um den Zusammenhang der Bcl-2 und Bax
Genexpression sowie der Bax/Bcl-2 Ratio mit der Cytarabin Toxizität zu untersuchen,
wurde außerdem eine lineare Regressionsanalyse durchgeführt. Der Zusammenhang der
Bcl-2 und Bax Genotypen mit der Bcl-2 und Bax Genexpression, der Bax/Bcl-2 Ratio
sowie der Cytarabin Toxizität wurde ebenfalls mittels der linearen Regressionsanalyse
untersucht. Ein nominaler P-Wert < 0,05 wurde in dieser Arbeit als statistisch signifikant
erachtet.
23
3. Ergebnisse
3.1 Die Toxizität von Cytarabin
Die interindividuellen Unterschiede der Zelltoxizität von Cytarabin wurden an den
mononukleären Blutzellen des peripheren Blutes untersucht. Dafür wurde der Anteil
apoptotischer Zellen nach 48-stündiger Inkubation mit Cytarabin gemessen. Um die
toxische Wirkung von Cytarabin auf die verschiedenen Individuen vergleichen zu können,
wurden alle Ergebnisse mit Kontrollen (Zellen, die nicht mit Cytarabin behandelt wurden)
normalisiert. Nach der Inkubation mit Cytarabin waren im Mittel 25,1% der Zellen von den
100 in die Studie eingeschlossenen Individuen positiv für Annexin V und negativ für PI.
Die Standardabweichung war ± 6.7%. Im Mittel waren lediglich 13,0% der Zellen der 100
Probanden mit einer Standardabweichung von ± 3,4% nekrotisch und somit positiv für
sowohl Annexin V als auch PI. Daher scheinen apoptotische Prozesse der quantitativ
bedeutendere Mechanismus der toxischen Wirkung von Cytarabin auf primäre Zellen zu
sein, wie dies auch bei der Wirkung von Chemotherapeutika in der Tumortherapie der Fall
ist. Unter den 100 Probanden wies die Toxizität von Cytarabin eine 21-fache Variation mit
einem Variationskoeffizienten von 40% auf.
45,00
C y ta ra b in T o x izitä t
40,00
35,00
30,00
25,00
20,00
15,00
10,00
5,00
89
47
86
65
99
63
82
40
90
18
98
97
46
87
68
75
49
56
10 0
83
25
88
6
71
70
54
4
80
50
84
91
14
41
8
3
55
59
73
13
10
11
96
39
93
52
85
57
7
78
92
60
64
45
9
67
62
95
53
66
58
74
94
72
61
23
2
12
15
1
38
42
77
81
37
76
29
20
5
30
51
35
27
24
44
28
21
17
79
22
19
43
32
33
31
48
16
26
69
36
34
0,00
Proband
Abbildung 1: 21-fache Variation der Toxizität von Cytarabin
Darstellung der Toxizität von Cytarabin in den PBMCs von jedem einzelnen der 100 Probanden (1-100) im
Histogramm
PBMCs: Mononukleäre Zellen des peripheren Blutes
24
Die mittlere Toxizität betrug nach Normalisierung gegen die Kontrollen 19,5% mit einer
Spannweite von 1,9 – 40,6% und entsprach einer Normalverteilung in der Studienpopulation (Kolmogorov-Smirnov-Test p>0,05).
Abbildung 2: Normalverteilung der Cytarabin Toxizität
Darstellung der Häufigkeitsverteilung der Toxizität von Cytarabin in den PBMCs von 100 Probanden im
Histogramm mit Verteilungskurve
PBMCs: Mononukleäre Zellen des peripheren Blutes
Zwischen Toxizität und Alter oder Geschlecht konnte kein Zusammenhang gefunden
werden (p>0,05).
25
Die intrapersonelle Toxizität der PBMCs von neun Probanden zu drei verschiedenen
Tageszeitpunkten variierte 1,2-fach mit einem mittleren Variationskoeffizient von 9,6%.
45,00
40,00
35,00
Toxizität
30,00
25,00
20,00
15,00
10,00
5,00
9a
9b
9c
8a
8b
8c
7a
7b
7c
6a
6b
6c
5a
5b
5c
4a
4b
4c
3a
3b
3c
2a
2b
2c
1a
1b
1c
0,00
Individuum
Abbildung 3: Intraindividuelle Toxizität von Cytarabin
Darstellung der Toxizität von Cytarabin in den PBMCs von neun Individuen (1-9) zu drei verschiedenen
Tageszeitpunkten (a,b,c)
PBMCs: Mononukleäre Zellen des peripheren Blutes
26
3.2 Die Genexpression von Bcl-2 und Bax
3.2.1 Die Genexpression von Bcl-2
Die
relative
Genexpression
von
Bcl-2
betrug
im
Mittel
0,61,
wobei
die
Standardabweichung ±0,35 war. Innerhalb der Kohorte variierte die Genexpression stark
mit einem Variationskoeffizienten von 57%. Im Kolmogorov-Smirnov-Test zeigte sich,
dass die Bcl-2 Genexpression rechtsschief und unimodal verteilt war (p<0,001).
Abbildung 4: Rechtschiefe und unimodale Verteilung der Bcl-2 Genexpression
Darstellung der Häufigkeitsverteilung der Bcl-2 Genexpression im Histogramm mit Verteilungskurve
Bcl-2: B-Cell lymphoma 2
27
3.2.2 Die Genexpression von Bax
Der Mittelwert der Bax-Genexpression relativ zu TBP war 0,29 mit einer Standardabweichung von ±0,16. Die relative Bax Genexpression variierte stark mit einem
Variationskoeffizienten von 56% und war ebenfalls nicht normal sondern rechtsschief
verteilt (Kolmogorov-Smirnov-Test; p<0,001).
Abbildung 5: Rechtsschiefe und unimodale Verteilung der Bax Genexpression
Darstellung der Häufigkeitsverteilung der Bax Genexpression im Histogramm mit Verteilungskurve
Bax: Bcl-2-associated X Protein, Bcl-2: B-Cell lymphoma 2
28
3.2.3 Die Bax/Bcl-2 Ratio
Üblicherweise wird zusätzlich die Genexpression beider Gene im Verhältnis zueinander
betrachtet, indem die sogenannte Bax/Bcl-2 Ratio bestimmt wird. Dadurch wird
berücksichtigt, dass beide Proteine miteinander interagieren, wobei das antiapoptotische
Bcl-2 die Wirkung des proapoptotischen Bax antagonisiert. Die Bax/Bcl-2 Ratio betrug im
Mittel 0,53 mit einer Standardabweichung von ±0,32 und zeigte eine starke Variation mit
einem Varationskoeffizienten von 60%. Auch die Bax/Bcl-2 Ratio war rechtsschief und
unimodal verteilt (Kolmogorov-Smirnov-Test; p<0,001).
Abbildung 6: Rechtsschiefe und unimodale Verteilung der Bax/Bcl-2 Ratio
Darstellung der Häufigkeitsverteilung der Bax/Bcl-2 Ratio im Histogramm mit Verteilungskurve
Bax: Bcl-2 associated X-Protein, Bcl-2: B-Cell lymphoma 2
29
3.3 Zusammenhang der Genexpression von Bcl-2, Bax und der
Bax/Bcl-2 Ratio mit der Toxizität von Cytarabin
Die relative Bcl-2 Genexpression korrelierte invers mit der Toxizität von Cytarabin
(Spearman; r = -0,306; p = 0,002).
relative Bcl-2 Genexpression
3,50
3,00
2,50
2,00
1,50
1,00
0,50
0,00
0,00
5,00
10,00
15,00
20,00
25,00
30,00
35,00
40,00
45,00
Cytarabin Toxizität
Abbildung 7: Assoziation der Toxizität von Cytarabin mit der relativen Bcl-2
Genexpression
Die Trendlinie im Streudiagramm zeigt die inverse Korrelation der Toxizität von Cytarabin in den PBMCs
von 100 Probanden mit der Bcl-2 Genexpression
Bcl-2: B-Cell lymphoma 2, PBMCs: Mononukleäre Zellen des peripheren Blutes
30
Die Bax Genexpression zeigte keine Korrelation mit der Toxizität von Cytarabin
(Spearman; r = -0,015; p = 0,884).
relative Bax-Genexpression
1,00
0,90
0,80
0,70
0,60
0,50
0,40
0,30
0,20
0,10
0,00
0,00
5,00
10,00
15,00
20,00
25,00
30,00
35,00
40,00
45,00
Cytarabin Toxizität
Abbildung 8: Assoziation der Toxizität von Cytarabin mit der relativen Bax
Genexpression
Im Streudiagramm zeigt sich keine Korrelation der Toxizität von Cytarabin in den PBMCs von 100
Probanden mit der Genexpression von Bax. Bax: Bcl-2 associated X-Protein, PBMCs: Mononukleäre Zellen
des peripheren Blutes
Die Bax/Bcl-2 Ratio zeigte eine moderate Korrelation mit der gemessenen Toxizität
(Spearman; r = 0,324; p = 0,001).
1,8
1,6
Bax/Bcl-2 Ratio
1,4
1,2
1
0,8
0,6
0,4
0,2
0
0,00
5,00
10,00
15,00
20,00
25,00
30,00
35,00
40,00
45,00
Cytarabin Toxizität
Abbildung 9: Assoziation der Toxizität von Cytarabin mit der Bax/Bcl-2 Ratio
Die Trendlinie im Streudiagramm zeigt eine moderate Korrelation der Cytarabin Toxizität in den PBMCs
von 100 Probanden und der Bax/Bcl-2 Ratio. Bax: Bcl-2 associated X-Protein, Bcl-2: B-Cell lymphoma 2,
PBMCs: Mononukleäre Zellen des peripheren Blutes
31
In der linearen Regressionsanalyse, unter der Verwendung der Bax und Bcl-2
Genexpression als unabhängige Variablen, konnten 15% der Variation der Werte der
Toxizität innerhalb der 100 Probanden erklärt werden (p<0,001).
3.4 Verteilung des Bcl-2 -938 C>A und des Bax -248 G>A
Polymorphismus
Von den 100 in die Studie eingeschlossenen Probanden trugen 28 zwei C-Allele (CC) des
Bcl-2 -938 C>A Polymorphismus, 53 waren heterozygot (AC) und 19 trugen zwei AAllele (AA). Diese Verteilung folgte dem Hardy-Weinberg-Gleichgewicht (p>0,05). Für
das A-Allel ergab sich eine Frequenz von 0,46.
Die Genotypisierung des Bax -248G>A Polymorphismus ergab, dass 83 von den 100
Individuen zwei G-Allele (GG) trugen, 16 heterozygot (GA) waren und ein Individuum
zwei A-Allele (AA) trug. Diese Verteilung folgte ebenfalls dem Hardy-WeinbergGleichgewicht (p>0,05) und die Allelfrequenz des A-Allels betrug 0,09. Beide
Allelfrequenzen waren mit denen in der Literatur beschriebenen vergleichbar. Da nur ein
Individuum homozygot für den Polymorphismus (AA-Genotyp) war, wurde der Einfluss
dieser genetischen Variante mit Hilfe des dominanten Modells analysiert. Hierfür wurde
der homozygote Träger (AA) der Gruppe der heterozygoten Individuen (AG) zugeordnet.
3.5
Assoziation
der
morphismen mit der
untersuchten
single
Genexpression von
nucleotide
Poly-
Bcl-2, Bax und der
Bax/Bcl-2 Ratio
Es wurde keine Assoziation zwischen dem Bcl-2 -938C>A Genotyp und der relativen
Bcl-2 Expression gefunden (Jonckheere-Terpstra-Test; p = 0,432).
32
Tabelle 11: Assoziation der genetischen Varianten mit der Bcl-2 oder Bax Genexpression
Darstellung der Mittelwerte und Standardabweichung der Bcl-2 und Bax Genexpression in Abhängigkeit
vom Bcl-2 (AA, CA und CC) und Bax (GA+AA und GG) Genotyp
A: Adenin, Bax: Bcl-2-associated X Protein, Bcl-2: B-Cell lymphoma 2, C: Cytosin, G: Guanin
Bcl-2 Genotyp
Bcl-2 Genexpression
Mittelwert
Standardabweichung
p-Wert
AA
0,5642
0,18455
n.s.
CA
0,6575
0,42740
n.s.
CC
0,6123
0,24682
n.s.
Bax Genotyp
Bax Genexpression
Mittelwert
Standardabweichung
p-Wert
GA+AA
0,2212
0,04910
0,095
GG
0,3019
0,17291
0,095
Der Bcl-2 -938 C>A Genotyp korrelierte auch nicht mit der Bax/Bcl-2 Ratio (JonckheereTerpstra-Test; p = 0,911).
Tabelle 12: Assoziation des Bcl-2 und Bax Genotyps und der Bax/Bcl-2 Ratio
Darstellung der Mittelwerte und Standardabweichung der Bax/Bcl-2 Ratio in Abhängigkeit vom Bcl-2 (AA,
CA und CC) und Bax (GA+AA und GG) Genotyp
A: Adenin, Bax: Bcl-2-associated X Protein, Bcl-2: B-Cell lymphoma 2, C: Cytosin, G: Guanin
Bax/Bcl-2 Ratio
Mittelwert
Standardabweichung
p-Wert
AA
0,5684
0,33011
n.s.
CA
0,5075
0,31683
n.s.
CC
0,5557
0,32765
n.s.
GA+AA
0,3588
0,13959
0,003
GG
0,5682
0,33536
0,003
Bcl-2 Genotyp
Bax Genotyp
33
Wurden die Individuen nach ihrem Bax -248 G>A Genotyp stratifiziert, konnte ein Trend
zu niedrigerer Bax Genexpression in der Gruppe der Individuen mit dem GA- und AAGenotyp beobachtet werden (Mann-Whitney-U; p = 0,095).
Abbildung 10: Assoziation des Bax -248 G>A Genotyps mit der relativen BaxGenexpression
Darstellung der Bax Genexpression für die zwei Gruppen des Bax Genotyps GA+AA und GG im Box Plot.
Box: Median und Interquartilenbereich (IQR) der Bax Genexpression, Fehlerbalken: IQRx1,5, Kreise:
Ausreißer mit der jeweiligen Probandennummer
Bax: Bcl-2-associated X Protein, Bcl-2: B-Cell lymphoma 2, IQR: Interquartilenbereich
34
In dieser Gruppe wurde außerdem eine signifikant reduzierte Bax/Bcl-2 Ratio beobachtet
(Mann-Whitney-U; p = 0,003).
Abbildung 11: Assoziation des Bax -248 G>A Genotyps mit der Bax/Bcl-2 Ratio
Darstellung der Bax/Bcl-2 Ratio für die zwei Gruppen des Bax Genotyps GA+AA und GG im Box Plot.
Box: Median und Interquartilenbereich (IQR) der Bax/Bcl-2 Ratio, Fehlerbalken: IQRx1,5, Kreise: Ausreißer
mit der jeweiligen Probandennummer
Bax: Bcl-2-associated X Protein, Bcl-2: B-Cell lymphoma 2, IQR: Interquartilenbereich
In der linearen Regressionsanalyse unter der Verwendung des Bcl-2 -938 C>A und des
Bax -248 G>A Genotyps als unabhängige Variablen konnten 6,3 % der Variation der
Werte der Bax/Bcl-2 Ratio innerhalb der 100 Probanden erklärt werden (p < 0,05). Für die
Bcl-2 und die Bax Genexpression konnte in der linearen Regressionsanalyse unter
Verwendung des Bcl-2 -938 C>A und des Bax -248 G>A Genotyps kein signifikanter
Zusammenhang gefunden werden (p = 0,350 und p = 0,139).
35
3.6 Zusammenhang der genetischen Polymorphismen Bcl-2 -938
C>A und Bax -248 G>A mit der Zytotoxizität von Cytarabin
Der Bcl-2 -938C>A Polymorphismus war nicht mit der gemessenen Toxizität von
Cytarabin assoziiert (Jonckheere-Terpstra-Test; p = 0,705.).
Tabelle 13: Assoziation des Bcl-2 -938 C>A Genotyps mit der Toxizität von Cytarabin
Darstellung der Mittelwerte und Standardabweichung der Toxizität von Cytarabin in Abhängigkeit vom
Bcl-2 Genotyp (AA, CA, CC)
A: Adenin, Bax: Bcl-2-associated X Protein, Bcl-2: B-Cell lymphoma 2, C: Cytosin
Bcl-2: B-Cell lymphoma 2
Bcl-2 Genotyp
Cytarabin Toxizität
Mittelwert
Standardabweichung
p-Wert
AA
20,8968
7,81131
n.s.
CA
18,3302
7,35783
n.s.
CC
20,7307
8,20000
n.s.
Obwohl der GA- und AA- Genotyp des Bax -248 G>A Polymophismus mit der BaxGenexpression und Bax/Bcl-2 Ratio assoziiert war, war diese Variante (GA- und AAGenotyp) nicht mit der Toxizität von Cytarabin assoziiert (Mann-Whitney-U; p = 0,752).
Tabelle 14: Assoziation des Bax -248 G>A Genotyps und der Toxizität von Cytarabin
Darstellung der Mittelwerte und Standardabweichung der Toxizität von Cytarabin in Abhängigkeit vom Bax
Genotyp (GG und GA+AA)
A: Adenin, Bax: Bcl-2-associated X Protein, Bcl-2: B-Cell lymphoma 2, G: Guanin
Bax Genotyp
Cytarabin Toxizität
Mittelwert
Standardabweichung
p-Wert
GG
19,9229
5,61616
n.s.
GA+AA
19,4013
8,09429
n.s.
In der linearen Regressionsanalyse, unter der Verwendung des Bcl-2 -938 C>A und des
Bax -248 G>A Genotpys als unabhängige Variablen, konnten 0,3% der Variation der
Werte der Toxizität innerhalb der 100 Probanden erklärt werden (p = 0,884).
36
4. Diskussion
4.1
Periphere
mononukleäre
Blutzellen
als
Modell
zur
Untersuchung der Zytotoxizität von Cytarabin
Die interindividuelle Variation bezüglich Medikamentenwirkung und -nebenwirkung in
der Tumorbehandlung mit Zytostatika ist groß. Um eine individualisierte Chemotherapie
auszuwählen, die effizient und nebenwirkungsarm ist, ist ein besseres Verständnis über die
individuelle genetische Prädisposition erforderlich. Chemotherapie geht häufig mit
therapieassoziierten toxischen Nebenwirkungen und einer hohen Mortalität einher. Es wäre
deshalb
besonders
wichtig,
anhand
der
individuellen
genetischen
Ausstattung
vorauszusagen, welche Patienten Gefahr laufen, ernste toxische Nebenwirkungen zu
erleiden [80].
Um den Zusammenhang von individuellen genetischen Varianten mit dem Auftreten von
Therapieresistenz und therapieassoziierter Toxizität zu untersuchen, eignen sich auf der
Verwendung von Zelllinien oder primären Blutzellen basierende Modelle. In dieser Studie
verwendeten wir ein solches Modell, um die Variabilität der Toxizität von Cytarabin zu
bestimmen. Wir untersuchten, ob die toxische Wirkung von Cytarabin auf die
mononukleären Zellen aus dem Blut gesunder Probanden von der Expression der
Apoptosegene Bcl-2 und Bax und single nucleotide Polymorphismen in diesen Genen
beeinflusst wird.
Die toxische Wirkung von Cytarabin auf die peripheren Blutzellen aus dem Blut der 100
gesunden Probanden variierte stark zwischen den einzelnen Individuen. Im Gegensatz dazu
zeigte die Toxizität für dasselbe Individuum zu verschiedenen Zeitpunkten eine geringe
Variabilität. Folglich kann man von einer guten technischen und biologischen
Reproduzierbarkeit der Toxizität in dieser Arbeit ausgehen.
4.2 Zusammenhang der Bcl-2 Genexpression mit der Zelltoxizität
von Cytarabin
In dieser Arbeit wurde in peripheren mononukleären Blutzellen aus dem Blut von
gesunden Probanden der Zelltod in vitro durch die Behandlung mit Cytarabin induziert, um
zu überprüfen, ob die Genexpression von Bcl-2, Bax oder die Bax/Bcl-2 Ratio das
Überleben der Zellen beeinflusst. Es konnte gezeigt werden, dass die individuelle
Expression des Apoptosegens Bcl-2 sowie das Verhältnis von Bax zu Bcl-2 mit der
37
Cytotoxizität von Cytarabin assoziiert ist. Die von Cytarabin induzierte Apoptose
korrelierte invers mit der relativen Bcl-2 Expression. In der linearen Regressionsanalyse,
unter der Verwendung der Bax und Bcl-2 Genexpression sowie der Bax/Bcl-2 Ratio als
unabhängige Variablen, konnten 15% der Variation der Werte der Toxizität innerhalb der
100 Probanden erklärt werden. Daher scheint die Expression von Bcl-2 sowie die Bax/Bcl2 Ratio ein möglicher prädiktiver Faktor für die Empfindlichkeit der Zellen gegenüber der
zelltoxischen Wirkung von Cytarabin zu sein.
Darüber hinaus wird in der Literatur beschrieben, dass die Genexpression von Bcl-2 und
Bax auch prognostische Bedeutung und Einfluss auf das Ansprechen einer Chemotherapie
hat. In einigen Studien konnte eine konstante Überexpression von Bcl-2 in verschiedenen
lymphatischen Zelllinien mit Resistenz gegen eine Vielzahl von DNA-schädigenden
Zytostatika (u.a. Nukleosidanaloga, Mitoseinhibitoren und Glukokortikoide) assoziiert
werden [43, 33]. Eine hohe Bcl-2 Expression korreliert mit ungünstiger Prognose,
fortgeschrittenem Krankheitsstadium und mit Therapieresistenz bei der CLL [5, 20]. Auch
bei der AML ist eine gesteigerte Bcl-2 Expression mit Therapieresistenz assoziiert [9].
Während der Induktionstherapie bei der AML nehmen die Bcl-2 Spiegel zu. Eine mögliche
Erklärung für diese Zunahme ist die Induktion der Bcl-2 Genexpression durch
Chemotherapie. Auch die Selektion von Bcl-2 überexprimierenden Zellen während einer
Chemotherapie kann zu ansteigenden Bcl-2 Proteinspiegeln führen [3]. Wird durch eine
Chemotherapie eine gesteigerte Bcl-2 Expression induziert,
kommt es zu gehäufter
Therapieresistenz in der Behandlung der AML [44]. Die Bedeutung von Bcl-2 für die
Entwicklung von Therapieresistenz wurde auch anhand von in vitro Versuchen untersucht.
Antisense-Medikamente, welche die Bcl-2 mRNA antagonisieren, können in vitro die
Sensitivität von AML-Zellen gegenüber der Wirkung von Cytarabin steigern [9, 10, 32].
4.3 Zusammenhang der Bax Genexpression mit der Toxizität von
Cytarabin
In dieser Studie konnte kein Zusammenhang zwischen der alleinigen individuellen Bax
Expression und der zytotoxischen Wirkung von Cytarabin auf die mononukleären
Blutzellen gefunden werden. Die Bax Expression scheint also die individuelle
Suszeptibilität zu einer toxischeren Nebenwirkung von Cytarabin nicht zu beeinflussen.
Hinsichtlich des Therapieansprechens wird aber in der Literatur eine Rolle der Bax
Expression beschrieben. Hohe Bax Proteinexpression ist ein Marker für eine bessere
38
Prognose bei der AML. Tumorzellen mit einer hohen Bax Expression sind sensibler gegen
Chemotherapie und die Bax Expression wäre als Marker denkbar um die Dosis/Intensität
einer Chemotherapie auszuwählen [55].
4.4 Zusammenhang der Bax/Bcl-2 Ratio mit der Toxizität von
Cytarabin
In dieser Arbeit konnte gezeigt werden, dass die Bax/Bcl-2 Ratio moderat mit der Toxizität
von Cytarabin korreliert. Auch bei Untersuchungen von Knochenmarkszellen von AMLPatienten
scheint die Bax/Bcl-2 Ratio am relevantesten für die Induzierbarkeit von
Apoptose bei der AML zu sein [74]. Eine hohe Bax/Bcl-2 Ratio in den
Knochenmarkszellen von AML-Patienten konnte sowohl mit einem häufigeren Erreichen
einer kompletten Remission als auch einem längeren Gesamtüberleben bei der AML
assoziiert werden [14].
Die Ergebnisse aus dieser Studie sind mit bereits beschriebenen Daten aus Studien mit
Tumorzellen vergleichbar. Die Apoptoserate war bei den mononukleären Blutzellen mit
einer hohen Bax/Bcl-2 Ratio höher. Thomas et al. (1996) zeigten, dass B-CLL-Zellen mit
einer hohen Bcl-2/Bax Ratio nach einer in vitro Behandlung mit Fludarabin weniger
apoptotisch und somit chemoresistenter waren, als Zellen mit einer niedrigen Ratio [76].
Allerdings wurde in dieser Arbeit die konstitutionelle Expression von Bax und Bcl-2
gemessen und deshalb nicht berücksichtigt, dass die Expression von Bcl-2 und Bax durch
eine Behandlung mit Chemotherapeutika beeinflusst wird. Zytostatika induzieren die
Expression von Bax in vitro [81] und auch während einer zytostatischen Behandlung in
vivo konnte eine erhöhte Bax Expression gefunden werden [71]. Die Tumorzellen von
bereits behandelten Patienten weisen tendenziell eine höhere Bcl-2/Bax-Ratio auf und sind
eher apoptoseresistent [58].
4.5 Die Bedeutung des Bcl-2 -938C>A Polymorphismus
Die beobachtete Variabilität in der Bcl-2 Genexpression konnte nicht durch den in dieser
Arbeit untersuchten Bcl-2 Genotyp erklärt werden. Der Bcl-2 -938 C>A Polymorphismus
korrelierte auch nicht mit der individuellen Variabilität in der Toxizität von Cytarabin.
Nückel et al. (2007) untersuchten erstmals in einer Studie mit 123 Patienten mit CLL die
prognostische Bedeutung des Bcl-2 -938C>A SNP im Promotor des Bcl-2 Gens. Der AAGenotyp ging, verglichen mit dem CC-Genotyp, mit einer signifikant erhöhten Bcl-2
Proteinexpression (Westernblotanalyse) in B-Zellen von noch unbehandelten CLL39
Patienten einher. Weiterhin waren bei Trägern des C-Allels verglichen mit Patienten, die
homozygot für das A-Allel waren, die Zeit bis zur ersten Behandlung (als Indikator für das
Fortschreiten der Krankheit) und das Gesamtüberleben signifikant länger. Deshalb wurde
der Polymorphismus bei CLL-Patienten als unabhängiger prognostischer Marker für die
Zeitdauer bis zur ersten Behandlung vorgeschlagen [50].
In einer weiteren Studie mit 268 CLL-Patienten konnte keine Auswirkung des Bcl-2
-938C>A Polymorphismus auf die Bcl-2 Expression auf RNA-Ebene gefunden werden.
Auch bestand kein Zusammenhang des Polymorphismus mit dem Gesamtüberleben oder
der Zeit bis zur ersten Behandlung [30].
Auch Majid et al. (2008) fanden keine Assoziation des Bcl-2 -938C>A SNP mit Bcl-2
Proteinspiegeln, untersucht mit quantitativen Westernblotanalysen an 100 CLL-Patienten,
sowohl in einer behandelten, als auch einer nicht behandelten Patientengruppe. Der SNP
hatte auch keinen Einfluss auf die Zeit bis zur ersten Behandlung [38].
Sowohl Zenz et al. (2009) als auch Rossi et al. (2008) konnten den SNP in einer Studie mit
einer unabhängigen Gruppe von 271 Patienten mit CLL nicht mit der Zeit bis zur ersten
Behandlung und dem Gesamtüberleben assoziieren [85, 67].
In unserer Studie wurde die Bcl-2 Expression sowie die toxische Wirkung von Cytarabin
auf Lymphozyten in Abhängigkeit von dem Bcl-2 -938C>A Polymorphismus an den
Proben von 100 gesunden Probanden untersucht. Entsprechend den Ergebnissen von
Kaderi et al. (2008) und Majid et al. (2008) bei der Untersuchung von Krebszellen von
CLL-Patienten [30, 38] konnte in dieser Arbeit keine Assoziation des Bcl-2 -938C>A
Genotyps mit der Expression von Bcl-2 in gesunden Zellen gefunden werden. Es wäre
möglich, dass die mit dem Bcl-2 -938 AA-Genotyp einhergehenden erhöhten Bcl-2
Proteinspiegel in den Zellen der CLL-Patienten in der Studie von Nückel et al. (2006)
durch posttranslationelle Veränderungen in den Krebszellen zu erklären sind, da die Bcl-2
Proteinspiegel
einem
komplexen
Zusammenspiel
von
transkriptionellen
und
posttranskriptionellen Regulationen unterliegen [50].
Zu der Vielzahl weiterer Mechanismen, welche die Bcl-2 Expression regulieren, gehören
die Hypomethylierung des Bcl-2 Promotors [24], der Verlust der Expression von
microRNA, vor allem der miRNA-15a und der miRNA-16-1 [12] und die Expression von
Nucleolin [56]. Weiterhin liegt in der 5´-UTR der Bcl-2 mRNA ein open-reading frame,
der die Translation hemmen könnte [25].
Auch bei der akuten myeloischen Leukämie wird das Bcl-2 Protein oder dessen
Genexpression mit der Entstehung der Leukämie, dem Fortschreiten der Krankheit und vor
40
allem mit Chemotherapieresistenz in Verbindung gebracht. Deshalb untersuchte eine
Studie mit 99 AML-Patienten, ob der Bcl-2 -938C>A SNP den Therapieerfolg dieser
Patienten beeinflusst. Der SNP war jedoch nicht mit den Langzeittherapieergebnissen
(ereignisfreies und leukämiefreies Überleben) oder dem Erreichen einer kompletten
Remission bei den AML-Patienten assoziiert [47]. Diese Ergebnisse deuten darauf hin,
dass der untersuchte SNP nicht ursächlich für die von Bcl-2 vermittelte Entwicklung einer
Therapieresistenz bei der AML ist.
Es ist denkbar, dass andere genetische Varianten und Polymorphismen im Bcl-2 Gen
dessen Auswirkungen erklären. So konnte zum Beispiel in derselben Studie [47] ein
Zusammenhang
ereignisfreiem
des
Bcl-2
Überleben
+21A>G
gezeigt
Polymorphismus
werden.
Dieser
mit
leukämiefreiem
Polymorphismus
wurde
und
als
prognostischer Marker für die Langzeittherapieerfolge bei AML-Patienten vorgeschlagen,
bisher konnte dieses Ergebnis jedoch nicht reproduziert werden.
Die Studienlage über die prognostische Bedeutung des Bcl-2 -938 C>A SNP hinsichtlich
Chemotherapieansprechen im Tumorgewebe und Gesamtüberleben bei der AML und CLL
ist widersprüchlich. Eine prognostische Bedeutung dieses Polymorphismus für die toxische
Wirkung von Cytarabin kann anhand der Ergebnisse dieser Arbeit nicht angenommen
werden.
4.6 Die Bedeutung des Bax -248G>A Polymorphismus
Der Bax -248 G>A Polymorphismus war mit der Bax Genexpression sowie der Bax/Bcl-2Ratio assoziiert. Die untersuchte Variante korrelierte jedoch nicht mit der Toxizität von
Cytarabin.
Die CLL ist durch einen klinisch variablen Verlauf und das Auftreten von
Therapieresistenz gekennzeichnet [46]. Vor allem das Verhältnis von Bcl-2 zu Bax scheint
den klinischen Verlauf und das Therapieansprechen sowohl in vivo als auch in vitro zu
beeinflussen [59]. Bisher wurde noch nicht geklärt, welche genetischen Veränderungen
möglicherweise zu der veränderten Expression von Bax in der CLL führen.
Saxena et al. (2002) untersuchten 34 CLL-Patienten, beschrieben als erstes den Bax
-248G>A SNP und wiesen eine Assoziation des A-Allels mit fortgeschritteneren
Krankheitsstadien, dem Ausbleiben einer kompletten Remission und einer erniedrigten
Bax Proteinexpression nach. Der AA-Genotyp war mit fehlendem Bax Protein, und der
heterozygote Status mit einer verminderten Bax Proteinexpression assoziiert, die mRNA41
Spiegel waren jedoch bei Patienten mit und ohne SNP vergleichbar. Diese Ergebnisse
deuten darauf hin, dass die veränderte Bax Proteinexpression eher auf einen
posttranskriptionellen Mechanismus zurückzuführen ist [68].
Auch Starczynski et al. (2005) assoziierten den GA- und AA-Genotyp des Bax -248 G>A
SNP mit einer niedrigeren Bax Genexpression in leukämischen B-Zellen, wobei die
mittlere Bax Expression in einer zuvor behandelten Patientengruppe signifikant niedriger
war als in der noch unbehandelten Gruppe [72]. Es ist möglich dass durch eine
Chemotherapie Subklone mit einer niedrigen Bax Expression selektiert werden [60].
Deshalb wurden die Daten, um die alleinige Auswirkung des Bax -248 G>A SNP auf die
Bax Proteinexpression herauszufinden, zusätzlich isoliert für die nicht behandelte
Patientengruppe analysiert. Auch hier war in der heterozygoten Gruppe die konstitutive
Expression von Bax in den leukämischen B-Zellen niedriger als in der Gruppe ohne den
Bax -248 G>A SNP. Allerdings konnten durch den Bax -248 G>A SNP nur 29% aus der
Gruppe mit niedriger Bax Expression erklärt werden und es wäre somit denkbar, dass
weitere genetische Veränderungen im Bax Gen die Proteinexpression beeinflussen.
Weiterhin wurde der SNP mit schlechterem Therapieansprechen und somit auch kürzerem
Gesamtüberleben assoziiert. Moshynska et al. (2005) zeigten, dass der Bax -248G>A SNP
in Lymphozyten von CLL-Patienten zu einer verringerten Transkription des Bax Gens
führt und die direkte Ursache für eine verringerte Menge von sowohl Bax mRNA als auch
Bax Protein ist [48].
In zwei weiteren Studien konnte die Assoziation des Bax -248 G>A Polymorphismus mit
kürzerem Überleben von CLL-Patienten nicht bestätigt werden, auch nicht in einer bereits
behandelten Patientengruppe [51, 70]. Außerdem fanden Skogsberg et al. (2006) keine
signifikanten Unterschiede in der RNA-Expression in Tumorgewebe von CLL-Patienten in
den
verschiedenen
Genotypgruppen.
Allerdings
wurde
in
dieser
Studie nicht
berücksichtigt, ob und wie viele Patienten bereits behandelt worden waren [70].
Weiterhin konnte gezeigt werden, dass die Zellen von noch unbehandelten CLL-Patienten,
die den Bax -248G>A Polymorphismus aufwiesen, resistenter gegen die in vitro
Behandlung mit Fludarabin waren [21].
Die Ergebnisse dieser Arbeit ähneln teilweise denen von Saxena et al. (2002), Starczynski
et al. (2005) und Moshynska et al. (2005), da in der Gruppe mit dem AA/GA-Genotyp ein
Trend zu niedriger Bax Expression sowie eine signifikant erniedrigte Bax/Bcl-2 Ratio
gefunden werden konnte. Allerdings war der Bax -248 G>A SNP nicht direkt mit der
Toxiziät von Cytarabin auf die Zellen der 100 Probanden assoziiert, die Zellen mit dem
42
Bax -248 G>A SNP waren also nicht unempfindlicher gegenüber der Toxizität von
Cytarabin. Da der Bax -248 G>A SNP mit der Bax-Genexpression sowie der Bax/Bcl-2
Ratio assoziiert war, und die Bax/Bcl-2 Ratio mit der Toxizität von Cytarabin korreliert
war, ergibt sich aus dieser Arbeit jedoch ein indirekter Hinweis auf einen Einfluss des
untersuchten Bax Genotyps auf die Cytarabin Toxzitiät. Eine indirekte prädiktive
Bedeutung des Bax -248 G>A SNP bezüglich der Toxizität von Cytarabin in gesunden
Blutzellen kann also vermutet werden.
Möglicherweise trägt jedoch eine Vielzahl weiterer, noch nicht identifizierter genetischer
Varianten im Bax Gen zur Erklärung der beobachteten Variabilität bei.
4.7 Apoptosegene – Ausblick und klinische Relevanz
Die Analyse von Apoptoseproteinen in gesunden und malignen Zellen könnte zu einer
Einschätzung der Prognose, des zu erwartenden Therapierisikos und dem zu erreichenden
Ergebnis bei Behandlung mit Zytostatika führen. Bcl-2, Bax, und vor allem die Bcl-2/Bax
Ratio könnten als prognostische Parameter für hämatopoietische Malignome verwendet
werden. Sie könnten hilfreich sein, um die individuell nötige Intensität und Dosis einer
Therapie festzulegen [14].
Außerdem werden einige neue spezifische Therapiestrategien, die gezielt in die Regulation
von Bcl-2 und Bax eingreifen untersucht. Zielgerichtete Therapieverfahren sind
erforderlich, da die klassische Therapie mit Zytostatika mit einer Vielzahl an
Nebenwirkungen einhergeht und durch Auftreten von Therapieresistenz in ihrer Wirkung
eingeschränkt ist. Basierend auf der Annahme, dass Krebszellen nach der Behandlung mit
DNA schädigenden Medikamenten durch Induktion von Apoptose absterben, und der
Tatsache, dass der intrinsische Apoptoseweg von der Bcl-2 Proteinfamilie reguliert wird,
sind drei neue Therapiestrategien in Entwicklung. Diese sollen die zytoprotektive und
antiapoptotische Wirkung von Bcl-2 und verwandten Proteinen umgehen und die Apoptose
in Krebszellen wieder ermöglichen. Die erste Medikamentengruppe vermindert die
Transkription des Bcl-2 Gens und reduziert so dessen Genexpression. Dazu gehören einige
synthetische Retinoide, Verbindungen, die die Histon-Deacetylase inhibieren (HDAC),
Chromatin-verändernde Enzyme und PPARγ-modulierende Medikamente [61]. Weiterhin
durchlaufen vielversprechende antisense Oligodeoxynucleotid-Medikamente, die gezielt
die mRNA von Bcl-2, Bcl-XL und Mcl-1 angreifen, klinische Studien. Das Bcl-2 antisense
43
Nukleotid Oblimersen sodium/G3139 bindet an die ersten sechs Codons der Bcl-2 mRNA
[88] und wird mittlerweile in Phase III Studien klinisch untersucht [52].
Weitere neue Medikamente zur zielgerichteten Antitumortherapie sollen die Bindung von
BH3-only-Proteinen imitieren und direkt Bcl-2 Proteine angreifen. Diese Peptide sollen
proapoptotische Proteine wie Bax aktivieren oder als sogenannte small-molecule inhibitors
die Aktivität von antiapoptotischen Mitgliedern der Bcl-2 Familie behindern, indem sie an
deren BH-3-Domäne binden [79]. Der aktuell fortgeschrittenste Vertreter dieser Gruppe ist
Gossypol [61].
Allerdings stellen die Proteine der Bcl-2 Familie als therapeutische Angriffspunkte eine
große Herausforderung dar, da sie keine enzymatische Aktivität besitzen und sich so von
dem klassischen Bild von small-molecule-Medikamenten unterscheiden.
Ein weiterer
neuer Ansatzpunkt ist zum Beispiel die Tumor-Gentherapie, bei der Bax in Tumore
eingebracht werden soll [82].
4.8 Limitationen
Für
diese
Arbeit
wurden
mononukleäre
Zellen
des
peripheren
Blutes
statt
Knochenmarkszellen verwendet. Periphere mononukleäre Blutzellen sind ein relativ leicht
zugängliches Gewebe, und werden daher häufig für pharmakogenetischen Studien
verwendet. Dennoch ist ihre Relevanz in der Untersuchung von Medikamentenwirkungen
eingeschränkt. PBMCs sind, obwohl sie in einigen Merkmalen mit unreifen Blutzellen des
Knochenmarks übereinstimmen, nicht das Zielgewebe der myelosuppressiven und
hämatotoxischen Wirkung von Cytarabin.
Außerdem weichen die Versuchsbedingungen im Zellmodell von den klinischen
Bedingungen ab. In der Klinik hängt die Medikamententoxizität nicht nur von der
genetischen Ausstattung sondern auch von schwankenden Medikamentenspiegeln, und
dem
Allgemein-
und
Ernährungszustand,
dem
Alter,
Geschlecht,
Leber- und
Nierenfunktion, sowie den Begleiterkrankungen eines Patienten ab [80].
Die Toxizität von Cytarabin wurde in dieser Arbeit an den Blutzellen von gesunden
Probanden untersucht. Anhand der Ergebnisse kann lediglich der Zusammenhang der
individuellen genetischen Grundausstattung mit der toxischen Wirkung von Cytarabin in
gesunden
Zellen
beurteilt
werden.
Über
die
Wirkung
in
Tumorzellen
oder
Therapieansprechen aufgrund der genetischen Ausstattung des Tumors kann daher an
dieser Stelle keine Aussage getroffen werden.
44
Weiterhin wurden die Blutproben von nur 100 Probanden untersucht. Um Aussagen über
eine therapeutische Relevanz treffen zu können, werden für pharmakogenetische Studien
jedoch hohe Probenzahlen benötigt. Signifikante Unterschiede sind bei niedrigen
Probenzahlen häufiger fälschlicherweise vorhanden als bei hohen Probenzahlen [82].
Die Toxizität von Cytarabin wurde nur bei einer einzigen Konzentration gemessen. Diese
entspricht der Hochdosischemotherapie. In der Klinik bestimmen jedoch auch
schwankende Medikamentenspiegel die Wirkung der Chemotherapie.
Das Durchschnittsalter unserer Probanden lag bei 31 Jahren. Das mittlere Alter bei
Diagnosestellung der AML liegt jedoch bei 67 Jahren [90]. Toxische Nebenwirkungen
treten bei der Chemotherapie mit Cytarabin häufiger bei älteren AML-Patienten auf [35].
In dieser Arbeit wurde jedoch keine Assoziation der Toxizität und dem Alter der
Probanden gefunden.
4.9 Fazit
Anhand dieser Arbeit konnte gezeigt werden, dass die individuelle Genexpression von
Bcl-2 sowie die Ratio von Bax/Bcl-2 die zelltoxische Wirkung von Cytarabin auf die
Blutzellen von gesunden Probanden beeinflusst. Eine höhere relative Bcl-2 Genexpression
sowie eine niedrigere Bax/Bcl-2 Ratio gehen mit einer niedrigeren Apoptoserate der mit
Cytarabin behandelten Zellen einher. Diese Ergebnisse stehen in Einklang mit den
Aussagen von Studien, die an Krebszellen durchgeführt wurden. Die Messungen der
Genexpression von Bcl-2 und Bax sowie die Bestimmung der Bax/Bcl-2 Ratio in
peripheren Blutzellen könnten daher prognostische Bedeutung erlangen, um vor
Therapiebeginn
zu
unterscheiden,
welche Patienten
für das
Auftreten
starker
(hämato)toxischer Nebenwirkungen prädisponiert sind. Der vermutete Einfluss der
relativen Bax Expression alleine sowie der bestimmten genetischen Varianten im Bcl-2
und Bax Gen auf die Zytotoxizität von Cytarabin konnte durch diese Arbeit nur teilweise
bestätigt werden. Der Bax -248 AA/GA-Genotyp war mit einer niedrigeren Bax
Expression sowie einer signifikant erniedrigten Bax/Bcl-2 Ratio assoziiert. Da die
Bax/Bcl-2-Ratio wiederum mit der Toxizität von Cytarabin korreliert war, konnte in dieser
Arbeit ein indirekter Einfluss des Bax -248 G>A Genotyps auf die Toxizität gezeigt
werden. Für den Bcl-2 Genotyp und die Bax Expression alleine kann bezüglich der
toxischen Nebenwirkung von Cytarabin momentan keine prognostische Bedeutung
vermutet werden.
45
5. Zusammenfassung
Die Therapie insbesondere hämatologischer maligner Erkrankungen basiert auf dem
Einsatz von Chemotherapie. Diese ist jedoch vor allem in höherer Dosierung mit
ernsthaften toxischen Nebenwirkungen verbunden. Die Medikamentenwirkung und
-nebenwirkung
wird
von
individuellen
genetischen
Varianten
beeinflusst
Die
pharmakogenetische Forschung hat deshalb zum Ziel, prädiktive, auf der individuellen
genetischen
Ausstattung
beruhende
Marker
zu
finden,
anhand
derer
die
Medikamentenwirkung und -toxizität im Voraus besser eingeschätzt werden kann. In der
Behandlung der akuten myeloischen Leukämie ist das Chemotherapeutikum Cytarabin seit
Jahren Teil der Standardtherapie. Die klinische Anwendung insbesondere im
Hochdosisbereich ist jedoch durch das Auftreten von schwerwiegenden toxischen
Nebenwirkungen eingeschränkt. Aufgrund von starken interindividuellen Unterschieden in
der Reaktion auf eine Behandlung mit Cytarabin sind prädiktive Marker, die eine
toxischere Wirkung vorhersagen, erforderlich. Da Cytarabin in malignen und gesunden
Zellen Apoptose induziert, wurde in dieser Arbeit die Genexpression der beiden
bedeutendsten Apoptose-regulierenden Proteine Bax und Bcl-2 analysiert. Die Auswirkung
der Genexpression dieser Gene auf die Toxizität von Cytarabin wurde bestimmt. Hierfür
wurden die PBMCs von 100 Probanden für 48 Stunden mit Cytarabin inkubiert. Die Rate
an apoptotischen Zellen galt als Maß für die Toxizität von Cytarabin. Die relative
Genexpression von Bcl-2 und Bax wurde gemessen, sowie die Bax/Bcl-2 Ratio bestimmt.
Weiterhin wurden zwei genetische Varianten im Bax und Bcl-2 Gen, die aus Studien an
Krebszellen bekannt sind, untersucht. Die single nucleotide Polymorphismen Bcl-2
-938 C>A und Bax -248 G>A wurden mittels des PCR-RFLP genotypisiert. Es konnte
gezeigt werden, dass sich die Bcl-2 Expression auf die Toxizität von Cytarabin auswirkt.
Eine höhere Bcl-2 Expression geht mit einer geringeren Apoptoserate der mit Cytarabin
behandelten Zellen einher. Auch die Bax/Bcl-2 Ratio beeinflusst die Toxizität von
Cytarabin. Dies steht in Einklang mit den Ergebnissen von Studien an Krebszellen, in
denen ein Zusammenhang einer hohen Bcl-2 Expression mit Therapieresistenz und
ungünstiger Prognose beschrieben wurde. Anders als erwartet wurde in dieser Arbeit keine
Korrelation zwischen der alleinigen Bax Expression und der Toxizität von Cytarabin
gefunden. Obwohl in der Literatur durch Ong et al. (2000) beschrieben wurde, dass
Krebszellen mit einer hohen Bax-Expression sensibler gegen Chemotherapie sind [55],
46
konnte in dieser Arbeit nicht gezeigt werden, dass eine hohe Bax-Expression zu einer
höheren Apoptoserate der mononukleären Blutzellen des peripheren Blutes führt.
Die Toxizität von Cytarabin variierte stark unter den Probanden. Diese Variabilität konnte
aber nicht durch die hier untersuchten genetischen Varianten erklärt werden. Der Bcl-2
-938 C>A Polymophismus korrelierte auch nicht mit der Genexpression von Bcl-2. Dieser
SNP ist aus Studien mit den Tumorzellen von CLL-Patienten bekannt. Über eine
Assoziation des AA-Genotyps des -938 C>A SNP´s mit höheren Bcl-2 Proteinspiegeln in
Krebszellen sowie einer ungünstigen Prognose bei CLL-Patienten lieferten bisherige
Studien wiedersprüchliche Ergebnisse. Auch über eine Assoziation des A-Allels des Bax
-248 G>A SNP mit niedrigen Bax Proteinspiegeln und ungünstiger Prognose bei CLLPatienten wurden in Studien widersprüchliche Ergebnisse beschrieben. In dieser Arbeit
konnte gezeigt werden, dass der AA/GA-Genotyp des Bax -248 G>A SNP mit einer
erniedrigten Bax Genexpression und einer signifikant erniedrigten Bax/Bcl-2 Ratio
assoziiert war. Der Bax -248 G>A Genotyp könnte also als indirekter prognostischer
Parameter dienen, um die Toxizität von Cytarabin im Voraus besser einzuschätzen.
Anhand dieser Arbeit kann ein Zusammenhang zwischen der individuellen relativen Bcl-2
Genexpression und der Zytotoxizität von Cytarabin in gesunden Blutzellen angenommen
werden. Die prognostische Bedeutung der Analyse der individuellen Bcl-2 Genexpression
in
peripheren
Blutzellen
hinsichtlich
des
Auftretens
von
schweren
toxischen
Nebenwirkungen von Cytarabin sollte weiter untersucht werden. Ebenso kann für die
Bax/Bcl-2 Ratio eine prognostische Bedeutung für Therapienebenwirkungen vermutet
werden.
Anhand der Ergebnisse dieser Arbeit ergab sich kein Anhalt für einen Einfluss der BaxGenexpression alleine sowie des Bcl-2 -938 C>A Polymorphismus auf die Zytotoxizität
von Cytarabin in gesunden peripheren Blutzellen.
47
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Goyette M, Gupta S, Moore J, Nguyen H, Onofrio RC, Parkin M, Roy J, Stahl E,
Winchester E, Ziaugra L, Altshuler D, Shen Y, Yao Z, Huang W, Chu X, He Y, Jin L,
Liu Y, Shen Y, Sun W, Wang H, Wang Y, Wang Y, Xiong X, Xu L, Waye MM, Tsui
SK, Xue H, Wong JT, Galver LM, Fan JB, Gunderson K, Murray SS, Oliphant AR,
Chee MS, Montpetit A, Chagnon F, Ferretti V, Leboeuf M, Olivier JF, Phillips MS,
Roumy S, Sallée C, Verner A, Hudson TJ, Kwok PY, Cai D, Koboldt DC, Miller RD,
Pawlikowska L, Taillon-Miller P, Xiao M, Tsui LC, Mak W, Song YQ, Tam PK,
Nakamura Y, Kawaguchi T, Kitamoto T, Morizono T, Nagashima A, Ohnishi Y,
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