Direktor Univ.- Prof. Dr. med F. Dombrowski

Aus dem Institut für Pathologie
(Direktor Univ.- Prof. Dr. med F. Dombrowski)
Abteilung für Neuropathologie (Leiter: Univ.-Prof. Dr. med. R. Warzok)
der Medizinischen Fakultät der Ernst-Moritz-Arndt-Universität Greifswald
Thema: Die Expression von P-Glycoprotein, Survivin, Ki-67 und Caspase-3 in
menschlichen Astrozytomen und Oligodendrogliomen unterschiedlicher WHO-Grade
Inaugural - Dissertation
zur
Erlangung des akademischen
Grades
Doktor der Medizin
(Dr. med.)
der
Medizinischen Fakultät
der
Ernst-Moritz-Arndt-Universität
Greifswald
2008
vorgelegt von:
Alexandra Dreßler
geb. am: 19.06.1976
in: München
Dekan: Prof. Dr. rer. nat. H. K. Kroemer
1. Gutachter: Prof. Dr. R. Warzok (Greifswald)
2. Gutachter: Prof. Dr. Ch. Hagel (Hamburg)
Ort, Raum: Universitätsklinikum Greifswald, Klinik und Poliklinik für Neurochirurgie,
Raum D 0.31
Tag der Disputation: 29.06.2009
Torsten Dreßler gewidmet.
München, November 2008
Inhaltsverzeichnis
II
Inhaltsverzeichnis
Inhaltsverzeichnis
I
Abkürzungsverzeichnis
III
1. Einleitung
1
1.1
Astrozytäre und oligodendrogliale Hirntumoren
1
1.2
Genetische Grundlagen der Hirntumorentstehung
3
1.3
P-Glycoprotein (P-gp)
4
1.4
Apoptose
6
1.5
Survivin
8
1.6
Zielsetzung dieser Arbeit
11
2. Material und Methoden
12
2.1.
Puffer und Lösungen
12
2.2
Chemikalien
13
2.3
Kits und Fertiglösungen
13
2.4
Antikörper
14
2.5
Primer
14
2.6
Gewebeproben
14
2.7
Methoden
15
2.7.1
Immunhistochemie
15
2.7.1.1
Nachweis von P-Glycoprotein (P-gp)
15
2.7.1.2
Nachweis von Survivin
16
2.7.1.3
Nachweis von Caspase-3
16
2.7.1.4
Nachweis von Ki-67
17
2.7.2
In situ Hybridisierung
17
2.7.2.1
Herstellung der DIG-markierten RNA-Sonden
17
2.7.2.2
In situ Hybridisierung von P-Glycoprotein (P-gp) und Survivin
19
2.8
Auswertung der immunhistochemischen Färbungen und in situ
2.9
Hybridisierung
20
Statistische Auswertung
20
Inhaltsverzeichnis
III
3. Ergebnisse
21
3.1
Aufteilung der Gewebeproben
22
3.2
Lokalisation der Hirntumoren
22
3.3
Die Expression von P-Glycoprotein (P-gp)
24
3.4
Die Expression von Survivin
27
3.5
Die Expression von Ki-67
30
3.6
Die Expression von Caspase-3
34
3.7
Die Expression von P-Glycoprotein-RNA
38
3.8
Die Expression von Survivin-RNA
41
3.9
Korrelationen
44
4. Diskussion
47
4.1
Astrozytäre Hirntumoren
48
4.2
Oligodendrogliale Hirntumoren
53
5. Zusammenfassung
57
6. Literaturangabe
58
7. Eidesstattliche Erklärung
69
8. Lebenslauf
70
9. Danksagung
71
Abkürzungsverzeichnis
IV
Abkürzungsverzeichnis
Abb.
=
Abbildung
APAF 1
=
Apoptose protease activating factor 1 (Apoptose Protease
aktivierender Faktor 1)
AIF
=
Apoptose inducing factor (Apoptose induzierender Faktor)
ABC
=
Adenosin-Triphosphat-binding-casette (Adenosin
Triphosphat bindende Kasette
Anti-DIG-AP =
Anti-Digoxigenin Antikörper, verbunden mit alkalischer
Phosphatase
ATP
=
Adenosintriphosphat
Bcl-2
=
B-cell lymphoma 2 (B-Zell Lymphom 2)
BCIP
=
5-Bromo-4-Chloro-Indolyl-Phosphatase
BCRP
=
Breast cancer resistance proteine (Brustkrebs-Resistenz-Protein)
Bid
=
Bcl-2 interacting domain (B-Zell Lymphom 2 interagierende
Domäne)
BIR
=
Baculovirus inhibitor of apoptosis repeat
BIRP
=
BIR-domain containing proteins
bzw.
=
beziehungsweise
CBTR-US
=
Central brain tumor registry of the United States (Zentrales
Hirntumorregister der Vereinigen Staaten von Amerika)
CD
=
Cluster of differentiation (Differenzierungscluster)
CDK4
=
Cyclin dependant Kinase 4 (Cyclin abhängige Kinase 4)
CDKN2A
=
Cyclin dependant Kinase 2A-Gene (Cyclin abhängige Kinase 2AGen)
DAB
=
Diaminobenzidin
DD
=
Death domain (Todesdomäne)
DED
=
Death effector domain (Todeseffektordomäne)
d.h.
=
das heißt
DISC
=
Death induced signalling complex (Zelltod induzierender
Signalkomplex)
DNA/DNS
=
Desoxyribonucleinacid/-säure
cDNA
=
Codierende DNA
DIG
=
Digoxenin
DIG-dUTP
=
digoxigenin-markiertes Deoxyuridintriphosphat
Abkürzungsverzeichnis
DNT
=
Dysembryoplastischer neuroepithelialer Tumor
dNTP
=
Deoxinukleotid
DR
=
Death receptor (Todesrezeptor)
EGFR
=
Epidermal growth factor receptor (Rezeptor für epidermalen
Wachstumsfaktor)
EGFP
=
Enhanced Green Fluorescent Protein
FAS
=
Apoptosis stimulating fragment (Apoptosestimulierendes
Fragment)
FADD
=
Apoptosis stimulating fragment-associated death domain
(Apoptosestimuliernedes Fragment assoziierte Todesdomäne)
Hep G2
=
Zellkultur eines Leberzellkarzinoms
HL 60
=
Zellkultur aus humanen promyelozytischen Leukämiezellen
HRP
=
Horse raddish peroxidise (Meerettichperoxidase)
IAP
=
Inhibitor of apoptosis protein (Apoptoseinhibierendes Protein)
IHC
=
Immunhistochemie
ISH
=
In situ Hybridisierung
kDalton
=
Kilo Dalton
Ki 67
=
Kiel 67 Antigen
LSAB
=
Labeled (Markierte) (Strept)avidin Biotin Methode
LOH
=
loss of heterocygosity (Verlust der Heterozygotizität)
M
=
Mol (Masseneinheit)
MDM2
=
Murine-double-minute-2
MiB 1
=
Made in Borstel (Antikörper gegen Ki 67)
MOD
=
mittlere optische Dichte
MDR
=
multidrug resistance (Multidrug-Resistenz)
MRP
=
multidrug resistance associated protein (Multidrug-Resistenzassoziiertes-Protein)
NBD
=
Nucleotid binding domain (Nukleotidbindende Domäne)
NBT
=
Nitroblue Tetrazolium (Nitroblautetrazolium)
PDGF
=
Platelet derived growth factor (Wachstumsfaktor aus
Blutplättchen)
PDGFR
=
Platelet derived growth factor receptor (Rezeptor für
Wachstumsfaktor aus Blutplättchen)
PCR
=
Polymerase chain reaction (Polymerasekettenrekation)
V
Abkürzungsverzeichnis
P-gp
=
P-Glycoprotein
P-TEN
=
Phosphatase and tensin homologue (Phosphatase und Tensin
VI
Homolog)
Rb
=
Retinoblastom-Gen
RNA/RNS
=
Ribonucleinacid/-säure
mRNA
=
messenger RNA (Boten-RNA)
RT-PCR
=
Reverse transcriptase polymerase chain reaction
(Reverse Transkriptase Polymerase Kettenreaktion)
SMAC
=
Second mitochondrial activator of caspases
Tab.
=
Tabelle
TNF
=
Tumor necrosis factor (Tumor Nekrose Faktor)
TNFR
=
Tumor necrosis factor receptor (Tumor Nekrose Faktor Rezeptor)
TP 53
=
Tissue Polypetide 53 (Gewebspolypeptid 53)
TRADD
=
TNF receptor associated death domain protein (Tumor Nekrose
Faktor Rezeptor assoziiertes Todesdomänenprotein)
WHO
=
World Health Organisation (Weltgesundheitsorganisation)
z. B.
=
zum Beispiel
ZNS
=
Zentrales Nervensystem
Einleitung
1
1. Einleitung
Der Anteil von primären Hirntumoren an der Gesamtzahl aller an malignen
Neubildungen verstorbenen Patienten macht etwa 3-5 % aus. Die Inzidenz beträgt
durchschnittlich 10,2 Neuerkrankungen pro 100000 Einwohner pro Jahr in
Industrieländern. Das bedeutet für Deutschland in etwa 8000 Neuerkrankungen an
primären Hirntumoren pro Jahr. Exakte Zahlen existieren jedoch nicht, da es in
Deutschland kein nationales Krebsregister gibt [STEINER et al., 1998].
Hirntumoren werden nach histologischen Kriterien in WHO-Grade eingeteilt, welche
auch Aussagen über die Dignität bzw. die Prognose liefern (Tabelle 1).
Tab. 1 : Übersicht über die WHO-Grade bei Hirntumoren.
(aus: WHO Classification of Tumors, Pathology and Genetics, Tumors of the Nervous System, 2007)
WHO Grad I
WHO Grad II
WHO Grad III
WHO Grad IV
gutartig, langsam wachsend, Heilung durch
Operation möglich, gute Prognose
noch gutartig, langsam wachsend, Tendenz zu
Rezidiv und maligner Progression
bereits
bösartig,
schnell
anaplastisch
wachsend
hochgradig bösartig, rasch fatal anaplastisch
wachsend, sehr schlechte Prognose
Statistisch ist eine gewisse Häufung in Ländern der Ersten Welt im Vergleich zu
Entwicklungsländern erkennbar. Dies wird unter anderem auf die wesentlich besser
entwickelten diagnostischen Möglichkeiten in den Industrienationen zurückgeführt.
Allgemein ist aber das Risiko eines Angehörigen der kaukasischen Rasse für die
Entwicklung eines Hirntumors höher [OHGAKI et al., 2005].
Sogenannte Risikoberufsgruppen konnten ebenfalls bestimmt werden. Hierzu
gehören Ärzte, besonders Anatomen und Pathologen, Feuerwehrleute und
Landwirte. Hingegen konnte kein Umweltkarzinogen identifiziert werden, das
reproduzierbar zur Entwicklung eines Hirntumors führt. Insbesondere die Strahlung
von Mobiltelefonen oder Nikotinabusus waren hier in den Mittelpunkt des Interesses
geraten [OHGAKI et al., 2005].
1.1 Astrozytäre und oligodendrogliale Hirntumoren
Bei Erwachsenen stehen die neuroepithelialen Tumoren bei den intrakraniellen
Raumforderungen im Vordergrund. Die größte Gruppe bilden die Tumoren, die sich
aus Astrozyten bzw. Oligodendrogliazellen entwickeln, die sogenannten Gliome.
Abgesehen von ihrem unterschiedlichen zellulären Ursprung unterscheiden sich
Einleitung
astrozytäre
2
und
oligodendrogliale
Tumoren
in
ihrer
Häufigkeit
und
ihrem
Malignitätsverhalten bzw. in der Prognose [WHO Classification of Tumors, Pathology
and Genetics, Tumors of the Nervous System, 2007] (Tabellen 2 und 3).
Astrozytäre Hirntumoren sind mit etwa 60 % häufiger als oligodendrogliale Tumoren,
die etwa 10 % der Gliome ausmachen (Tabelle 2). Zu den neuroepithelialen Tumoren
werden auch neuronale Tumoren, glioneuronale Mischtumoren, Pinealistumoren und
embryonale Tumoren gezählt.
Tab. 2: Häufigkeiten von Hirntumoren astrozytären und oligodendroglialen Ursprunges und der
Subtypen [nach: Central Brain Tumor Registry of the United States, 2000 und WHO Classification of
Tumors, Pathology and Genetics, Tumors of the Nervous System, 2007]
ca. 60 %, davon
Astrozytäre Tumoren
Pilozytisches Astrozytom
ca. 6 %
Diffuses Astrozytom
ca. 10 – 15 %
Anaplastisches Astrozytom
ca. 10 – 19 %
Glioblastoma multiforme
ca. 50 – 60 %
Oligodendrogliale Tumoren
ca. 10 %, davon
Low grade Oligodendrogliom
ca. 77 %
Anaplastisches Oligodendrogliom
ca. 23 %
Männer sind häufiger betroffen als Frauen. Die verschiedenen Malignitätsgrade
zeigen eine unterschiedliche Altersverteilung, mittlere Überlebensdauer und
Langzeitüberlebensraten (Tabelle 3).
Tab. 3: Mittleres Alter bei Diagnosestellung sowie Überlebensdauer bei Hirntumoren astrozytären und
oligodendroglialen Ursprunges [OHGAKI et al., 2005]
Tumor
Pilozytisches
Astrozytom
Diffuses
Astrozytom
Anaplastisches
Astrozytom
Glioblastoma
multiforme
Low grade
Oligodendrogliom
Anaplastisches
Oligodendrogliom
WHOGrad
Mittleres Alter bei
Diagnosestellung
(Jahre)
Mittelwert
Überlebensdauer
(Monate)
1- bzw. 5JahresÜberlebensrate
20
142
95 % / 89 %
41
77
92 % / 58 %
44
30
65 % / 11 %
61
7,3
18 % / 1,2 %
40
106
98 % / 78 %
49
37
50 % / 30 %
I
II
III
IV
II
III
Einleitung
3
Trotz aggressiver, multimodaler Behandlungskonzepte, bestehend aus Operation,
Bestrahlung, Chemotherapie und Immuntherapie sind die Daten bei astrozytären
Hirntumoren vor allem der WHO-Malignitätsgrade III und IV alles andere als
zufrieden stellend [BURTON et al., 2000]. Die 5-Jahres-Überlebensrate bei
Glioblastoma multiforme liegt unter 2 % (Tabelle 3). Die Rezidivneigung von
Glioblastomen beträgt trotz (soweit möglich) radikaler Tumorentfernung und
anschließender kombinierter Radio-Chemotherapie 90 % [CANNON et al., 2007].
Die
Prognose
von
oligodendroglialen
Tumoren,
vor
allem
die
5-Jahres-
Überlebensrate, ist günstiger [FORTIN et al., 2001; VAN DEN BENT, 2001, 2007].
1.2 Genetische Grundlagen der Hirntumorentstehung
Der Unterschied in der Prognose von Tumoren astrozytären und oligodendroglialen
Ursprunges
wird
unter
anderem
in
den
zugrunde
liegenden
genetischen
Veränderungen gesehen, die zur Tumorentstehung und -progression führen. Man
geht bei den astrozytären Hirntumoren von einer stufenartigen Entdifferenzierungsreihe aus, die den WHO-Malignitätsgraden II - IV entspricht und deren maligner
Endpunkt das Glioblastoma multiforme (sekundäres Glioblastoma multiforme)
darstellt. Das Glioblastoma multiforme kann auch de novo entstehen (primäres
Glioblastoma multiforme). Molekulargenetisch sind die sekundären Glioblastome vor
allem durch Mutationen des TP53-Gens gekennzeichnet, während die primären
Glioblastome eine Polysomie des Chromosoms 7, Deletionen des Chromosoms 10
sowie eine Amplifikation des EGFR-Gens bzw. eine Deletion des PTEN-Gens
aufweisen (Abbildung 1) [SCHLEGEL et al., 2004; OHGAKI et al., 2007; CASKEY et al.,
2000; KLEIHUES et al., 1999].
Hiervon zu trennen ist das dem WHO-Malignitätsgrad I zugehörige pilozytische
Astrozytom, das vorwiegend bei Kindern und Jugendlichen auftritt. Hier konnten
bisher sichere, zur Tumorenstehung führende genetische Veränderungen nicht bewiesen werden [SCHLEGEL et al., 2004].
In mehreren Studien konnte
nachgewiesen
werden,
dass
Deletionen der
Chromosomen 1p und 19q mit dem oligodendroglialen Phänotyp und einem
besseren Ansprechen auf eine chemotherapeutische Behandlung assoziiert sind
[SCHLEGEL et al., 2004; CASKEY et al., 2000].
Einleitung
4
Differenzierte Astrozyten / neuroepitheliale Vorläuferzellen
TP 53-Mutation (> 65%)
PDGF-A, PDGFR-a
EGFR
Überexpression (> 60%)
Amplifikation (ca. 40%)
Überexpression (ca. 60%)
Niedriggradiges
Astrozytom
MDM2
Amplifikation (<10%)
Überexpression (50%)
LOH19q (50%)
CDKN2A
Rb-Alteration (25%)
Deletionen (40%)
Transkriptive Inaktivierung
Anaplastisches
Astrozytom
LOH10 (80%)
PTEN-Mutationen (30%)
LOH10q
PTEN-Mutation (5%)
CDK4-Amplifikation
(15%)
PDGFR-a-Amplifikation
Rb-Alteration (25%)
(> 10%)
Sekundäres
Glioblastoma
multiforme
Primäres Glioblastoma
multiforme
Abb. 1: Genetische Veränderungen in astrozytären Tumoren (WHO-Malignitätsgrad II – IV) [modifiziert
nach SCHLEGEL et al., 2004]
Ein wichtiger Aspekt für die Prognose von Hirntumoren ist das Vorhandensein bzw.
die Entwicklung von Resistenzmechanismen gegen die zur Verfügung stehenden
Behandlungsmöglichkeiten. Zu diesen Mechanismen gehört die aktive Blockierung
der Aufnahme von Wirkstoffen in das Tumorgewebe durch Transportproteine, wie
z. B. P-Glycoprotein.
1.3 P-Glycoprotein (P-gp)
P-Glycoprotein ist ein 170 kDalton großes, Adenosin-tri-Phosphat (ATP)-abhängiges,
membranständiges
Transportprotein
aus
der
Familie
der
„ATP-binding-
casette“(ABC)-Transporter, von der aktuell 48 Mitglieder bekannt sind [BORST et al.,
2002]. P-gp besteht aus zwei durch eine Polypeptidkette miteinander verbundenen
Hälften,
die
ihrerseits
aus
einer
transmembranalen
α-Helix
und
der
charakteristischen, zytoplasmatischen ATP-Bindungsstelle zusammengesetzt sind.
Des Weiteren findet sich eine Bindungsstelle für die zu transportierenden Substrate
(Abbildung 2). In gesundem humanem Gewebe ist P-gp an den apikalen Membranen
verschiedener Organe mit exkretorischen oder Barriere-Funktionen, z. B. im Dünndarm, in der Leber und in den Nieren wie auch an den Endothelien der Blut-HirnSchranke nachzuweisen.
Einleitung
5
Abb. 2 : Schematische Darstellung der Struktur von P-Glykoprotein [aus: SCHINKEL ET JONKER, 2003].
Dargestellt sind die zwei homologen Hälften des Proteins mit jeweils sechs Transmembransegmenten,
sowie die N-Glykosylierungen (Äste) an der extrazellulären Seite, das N- und C-terminale Ende des
Proteins und die ATP-Bindungsdomäne (nucleotide binding domain, NBD) an der cytoplasmatischen
Seite der Zellmembran.
P-gp fungiert als aktive Effluxpumpe, die in die Zelle aufgenommene Substanzen
unter ATP-Verbrauch wieder heraustransportiert. Dadurch schützt es die Zellen vor
möglicherweise schädlichen Effekten [LÖSCHER et al., 2005; AMBUDKAR et al., 2003;
BORST et al., 2002]. Weiterhin ist bekannt, dass P-gp zur Arzneimittelresistenz
(„multidrug-resistance“) von Tumorzellen beiträgt, indem es Chemotherapeutika, die
sich chemisch und funktionell unterscheiden, aus den Zellen entfernt [AMBUDKAR et
al., 2003; BORST et al., 2002; SAUNA et al., 2001]. Die durch P-gp vermittelte
Resistenz gegenüber Chemotherapeutika konnte an verschiedenen Tumoren, vor
allem auch Tumoren des ZNS [MOHRI et al., 2000; TEWS et al., 2000] gezeigt werden.
Zudem
sind
P-gp-positive
Tumorzellen
oft
auch
kreuzresistent
gegenüber
Bestrahlung. Die genauen Mechanismen sind aber nicht vollständig geklärt [DENECKE
et al., 1997]. Darüber hinaus gibt es auch Hinweise, dass P-gp bestimmte Caspasen
inhibiert, wodurch es zur Hemmung der Apoptose kommt und so zusätzlich zur
Tumorprogression beitragen kann [RUEFLI et al., 2002; SMYTH et al., 1998;
JOHNSTONE et al., 1999; MATARRESE et al., 2001]. Dieser Zusammenhang wird aber
höchst kontrovers diskutiert, denn dieses Phänomen konnte in anderen Arbeiten
nicht bestätigt werden [SAGOL et al., 2005; WU et al., 2005].
Zellen, die genetische Veränderungen aufweisen, wie z. B. Tumorzellen, werden
normalerweise durch ein körpereigenes System, den „programmierten Zelltod“
(Apoptose), eliminiert.
Einleitung
6
1.4 Apoptose
Die Apoptose ist ein zelluläres Suizidprogramm, das für die Aufrechterhaltung der
physiologischen Zell- und Organfunktionen unerlässlich ist. Durch Apoptose kann der
Körper Zellen eliminieren, die genetische Veränderungen aufweisen oder die für den
Körper schädlich sind, wie Tumorzellen oder autoaggressive Lymphozyten.
Außerdem spielt die Apoptose in der Embryonalphase für die Organ- bzw.
Gewebeentwicklung eine wesentliche Rolle
[KERR et al., 1972; JACOBSON et al.,
1997]. Der Begriff Apoptose (griechisch: „das Abfallen von Laub“) wurde erstmals zu
Beginn der 70er Jahre von Kerr und Wyllie geprägt [KERR et al., 1972].
Histologisch können apoptotische Zellen durch ihre stereotypen morphologischen
Veränderungen identifiziert werden. Die Zelle schrumpft und verliert den Kontakt zu
den benachbarten Zellen. Das Chromatin kondensiert und findet sich randständig
entlang der nukleären Membran. Die Zellmembran wird bläschenartig eingeschnürt.
Zuletzt liegen von der Zelle kleine Fragmente mit Zellmembranumhüllung vor, die
Apoptosekörperchen genannt werden. Diese werden von Makrophagen phagozytiert
[THORNBERRY et al., 1998].
Diese beschriebenen, histologisch fassbaren Veränderungen sind die Folge von
bestimmten molekularen und chemischen Reaktionen, die im Folgenden beschrieben
werden. Das zentrale Element der Apoptose ist die kaskadenartige Aktivierung von
Proteinasen, den sogenannten Caspasen, an deren Endpunkt die Spaltung von DNA
und von wichtigen Funktionsproteinen steht. Die Bezeichnung „Caspasen“ leitet sich
von der
Funktion
der
Proteine ab:
Cystein-abhängige
Aspartat-spezifische
Proteinasen. Bei Säugetieren wurden bisher 14 verschiedene Caspasen identifiziert,
die man in Initiatorcaspasen (Caspase 2, 8, 9 und 10) und Effektorcaspasen
(Caspase 3, 6 und 7) unterteilt [DENAULT et al., 2002; RICHARDSON et al., 2002]. In der
Zelle liegen sie zunächst als inaktive Procaspasen vor, die durch Spaltung aktiviert
werden.
Nach der auf die Zelle einwirkenden Schädigung kann man bei der Aktivierung der
Caspase-Kaskade
einen
„extrinsic
pathway“
und
einen
„intrinsic
pathway“
unterscheiden. Der „extrinsic pathway“ wird ausgelöst, indem transmembranale,
sogenannte Todesrezeptoren („death receptors“, DR) durch Bindung ihres
spezifischen Liganden aktiviert werden. Diese DR gehören zur Gruppe der TumorNekrose-Faktor-Rezeptoren
(TNFR)
[ASHKENAZI,
2002].
Der
weitere
Übermittlungsweg läuft über den zytoplasmatischen Anteil des Rezeptors, der eine
Einleitung
7
Sequenz enthält, die Todesdomäne („death domain“, DD) genannt wird. Intrazelluläre
Adaptermoleküle wie FADD und TRADD enthalten korrespondierende DD, mit denen
sie an die DD des Rezeptors binden und so gemeinsam den „death inducing
signalling complex“ (DISC) bilden. FADD besitzt zudem eine „death effector domain“
(DED), mit der Procaspase-8 an den DISC gebunden wird. Durch die Konzentration
von vielen Procaspase-8 Molekülen im DISC kommt es zur autolytischen Aktivierung
und Freisetzung von Caspase-8 [SCAFFIDI et al., 1998]. Wenn das Signal stark genug
ist, wird durch die Spaltung und Aktivierung der nachgeschalteten Effektorcaspasen
sofort der Zelltod eingeleitet. Ein schwaches Signal bedarf der Verstärkung durch
mitochondrienabhängige Reaktionen. Das Bindeglied ist hier Bid, ein Mitglied der
Bcl-2-Familie. Es wird durch Caspase-8 gespalten und aktiviert, wonach es sich an
die Mitochondrien anlagert. Es bewirkt mit weiteren Mitgliedern der Bcl-2-Familie die
Freisetzung von Cytochrom c in das Zytosol [LUO et al. ,1998]. Cytochrom c bindet
an APAF1-Moleküle, die unter ATP-Verbrauch eine Konformationsänderung
durchlaufen und sich zum sogenannten Apoptosom zusammenschließen. Es löst die
Aktivierung der Initiatorprocaspase-9 aus und somit den Beginn der Kaskade der
nachgeordneten Effektorcaspasen [SLEE et al., 1999].
Beim „intrinsic pathway“ führen DNA-Schäden, oxidativer Streß oder ein Mangel an
Nährstoffen
zur
Unterbrechung
des
transmembranalen
Potentials
und
zur
Durchlässigkeit der inneren Mitochondrienmembran mit der Folge eines osmotischen
Anschwellens und der Ruptur der äußeren Mitochondrienmembran. Proapoptotische
Proteine wie Cytochrom c oder AIF (apoptosis inducing factor) aus dem
intermembranalen mitochondrialen Raum werden in das Zytoplasma abgegeben
[LOEFFLER et al., 2000]. Die weitere Aktivierung der Caspasekaskade verläuft wie
oben beschrieben.
Die aufeinander folgenden Reaktionsschritte der Apoptose erlauben es den
„Inhibitors-of-apoptosis-proteins“ wie z. B. Survivin, regulierend in den Ablauf
einzugreifen und den Zelltod zu verhindern.
Einleitung
8
1.5 Survivin
Survivin ist eines von acht Mitgliedern der Familie der „Inhibitor of apoptosis proteins“
(IAP). Ihr gemeinsames Charakteristikum ist das Vorhandensein einer oder mehrerer
BIR-Domänen („baculoviral-IAP-repeat“). Durch diese erlangen die IAP die Fähigkeit,
die Apoptose zu verhindern. Das Survivin-Gen befindet sich auf dem Chromosom 17
und kodiert für ein 16,5 kDa Protein. Zunächst wurde es bei Baculoviren entdeckt.
Survivin besitzt im Gegensatz zu den anderen IAP nur eine BIR-Domäne und liegt
als Dimer vor [REED, 2001; SCHIMMER, 2004; VERHAGEN et al., 2001; JOHNSON et al.,
2004] (Abbildung 3).
Abb. 3: Struktur des Survivindimers [nach: Chantalat L et al. (1999)]
Abgebildet sind die β-Stränge (lila), α-Helices (grün), Schlingen (braun), Zink-Atome (blau), TrypsinSchneidestellen (schwarze Pfeile).
a) Die doppelt gefaltete Dimerachse liegt in der Betrachtungsebene
b) 90° Drehung von (A)
In sich entwickelndem, fetalem Gewebe konnte eine hohe Survivinexpression
nachgewiesen werden [ADIDA et al., 1998]. In ausdifferenzierten adulten Geweben ist
Survivin nur in Gewebe mit hohem Zellumsatz feststellbar, wie CD34-positiven
Knochenmarkstammzellen, basalem Kolonepithel oder der Magenschleimhaut
[CHIOU et al., 2003; CARTER et al., 2001].
Im Unterschied zu den anderen beim Menschen entdeckten IAP zeigt Survivin eine
klar nachgewiesene Assoziation mit malignen Erkrankungen, z. B. Mammakarzinom,
Einleitung
9
Kolonkarzinom, Neuroblastom und ZNS-Tumoren [ADIDA et al., 1998; CHAKRAVARTI et
al., 2002; KAWASAKI et al., 1998; PREUSSER et al., 2005; SASAKI et al., 2002; TANAKA
et al., 2000; UEMATSU et al., 2005; XIE et al., 2006; YAMADA et al., 2003]. Bei den
meisten dieser malignen Erkrankungen konnte statistisch belegt werden, dass eine
hohe Survivinexpression mit einer schlechteren Prognose einhergeht [KAJIWARA et
al., 2003; ROUSSEAU et al., 2006; SCHULTZ et al., 2003; UEMATSU et al., 2005].
Survivin ist für eine korrekt ablaufende Mitose unerlässlich. Es bindet mit seiner
carboxy-terminalen α-Helixstruktur an die Mikrotubuli der mitotischen Spindel und
stabilisiert diese, so dass es zur Zellteilung kommen kann [SKOUFIAS et al., 2000;
WHEATLEY
et al., 2001]. Survivin wird besonders stark in der G2/M-Phase des
Zellzyklus exprimiert [LI et al., 2006]. Dies unterscheidet Survivin von den anderen
IAPs, da diese unter physiologischen Bedingungen nicht zellzyklusabhängig
exprimiert werden.
Der genaue Mechanismus, mit dem Survivin den Ablauf der Apoptose inhibiert, ist
bislang nicht abschließend geklärt. In einem zellfreien Medium konnten TAMM et al.
(1998) nachweisen, dass Survivin die Aktivierung von Procaspase 3 und 7 inhibieren
kann und auch an die bereits aktivierte Caspase 3 und 7 bindet. In einem anderen
Versuch konnten SONG et al. (2003) eine Apoptoseinhibition von Survivin
durch
Bindung an den „second mitochondrial activator of caspases“ (Smac) zeigen. Eine
direkte Bindung an Caspasen ließ sich aber auch unter physiologischeren
Bedingungen nicht darstellen [BANKS et al., 2000; VERDECIA et al., 2000].
In den letzten 5 Jahren konnten vier Survivin-Splicevarianten identifiziert werden, die
zum Teil unterschiedlichen subzellulären Lokalisationen zugeordnet werden können.
Ebenso wie Survivin (sogenanntes Wildtyp-Survivin) lässt sich Survivin2β im
Zytoplasma lokalisieren, während Survivin-δEx3 nukleär nachweisbar ist. Zu den
speziellen subzellulären Lokalisationen von
Survivin2α und Survivin3β gibt es
derzeit noch keine abschließenden veröffentlichten Forschungsergebnisse. Man geht
aktuell aufgrund der unterschiedlichen Lokalisationen und der Molekularstruktur von
Survivin und der Splicevarianten von einer inaktiven Heterodimerformierung aus,
bestehend aus Wildtyp-Survivin und Survivin3β bzw. Survivin-δEx3. Dies könnte der
Feinregulierung der Apoptose dienen. Bislang gelang aber weder in vitro noch in vivo
ein sicherer Nachweis dieser vermuteten Heterodimerbildung [MAHOTKA et al., 2002;
LI, 2005; NOTON et al., 2006; SPAN et al., 2006].
Einleitung
10
Es gibt einige Hinweise, dass ein Zusammenhang zwischen Survivin und P-gp bei
der Entstehung von Multidrug-Resistenz besteht. Die genauen Mechanismen der
Zusammenhänge sind nicht bekannt. LIU et al. (2007) untersuchten die mRNA
Expression
von
P-gp
und
Survivin
in
Zellkulturen
einer
Zellinie
eines
Adenokarzinoms der menschlichen Brustdrüse und der dazugehörigen Adriamycinresistenten Variante. Im Vergleich beider Zelllinien fiel auf, dass sowohl die
Expression von P-gp als auch von Survivin bei der resistenten Zelllinie höher war als
bei der nichtresistenten. Durch Zugabe von Verapamil, einem P-gp-Inhibitor, zu der
resistenten Zellinie, konnte die P-gp-mRNA-Expression gesenkt werden; zugleich
verringerte sich auch die mRNA-Expression von Survivin um über 90%. Durch die
Transfektion der nichtresistenten Karzinomzellen mit einem EGFP/Survivin-Plasmid
verringerte sich die Sensibilität gegenüber Adriamycin deutlich. LIU et al. stellten
daher die Hypothese auf, dass bei verstärkter Expression von P-gp der intrazelluläre
Transport von Survivin in die verschiedenen Zellkompartimente erleichtert ist und das
Protein somit die Zielorte seiner promitotischen und antiapoptotischen Wirkung
vermehrt erreicht und dass Survivin seinerseits den Umsatz von P-gp moduliert.
Das Ki-67-Antigen zeigt im Zellzyklus ein Auftreten, das zeitlich mit dem von Survivin
vergleichbar ist. Es handelt sich dabei um einen nukleären Proliferationsmarker, der
während des Zellzyklus in der G1-, S-, G2- und der M-Phase exprimiert wird,
wohingegen er in der Ruhephase, der G0-Phase des Zellzyklus, nicht nachweisbar
ist. Zellpopulationen, die stark proliferieren und sich zu einem großen Teil in einer
aktiven Phase des Zellzyklus befinden, exprimieren somit sehr viel Ki-67. Dieses
Antigen kann mit dem gegen Ki-67 gerichteten Antikörper MiB-1 spezifisch
nachgewiesen werden und erlaubt somit eine Aussage über die Proliferationsaktivität
eines Gewebes [MC CORMICK et al., 1993].
Einleitung
11
1.6 Zielsetzung dieser Arbeit
Verschiedene
Untersuchungen
Survivinexpression
mit
einer
konnten
einen
Zusammenhang
von
hoher
schlechten Langzeitprognose von astrozytären
Hirntumoren nachweisen. Mit steigendem WHO-Grad konnte eine Zunahme der
P-gp-Expression und somit der Arzneimittelresistenz gezeigt werden, was letztlich
eine schlechtere Prognose für den Patienten bedeutet. Auch die Expression von Ki67 und Caspase-3 wurde von einigen Arbeitsgruppen für Astrozytome untersucht,
dabei gilt ein hoher Proliferationsindex als prognostisch ungünstig, ein hoher
Apoptoseindex hingegen als vorteilhaft. Für oligodendrogliale Hirntumoren gibt es
kaum bzw. keine entsprechenden Daten. Oligodendrogliome haben im Vergleich zu
Astrozytomen eines vergleichbaren WHO-Malignitätsgrades eine bessere Prognose.
Ziel dieser Arbeit ist die Untersuchung der pro- bzw. antiapoptotischen Proteine
Caspase-3 sowie Survivin in gliösen Hirntumoren verschiedener WHO-Grade unter
Berücksichtigung des Proliferationsindex und der P-gp Expression. Dadurch sollen
mögliche Beziehungen zwischen diesen Faktoren sowie ihr Einfluss auf die
Tumorprogression und auf eine mögliche Chemoresistenz aufgedeckt werden.
Hierdurch sollen weitere Erkenntnisse über das unterschiedliche Ansprechen auf die
antitumorale Therapie bzw. die unterschiedliche Prognose von astrozytären und
oligodendroglialen Hirntumoren gewonnen werden sowie möglicherweise ein
Ansatzpunkt für die postoperative Kontrolle und Therapie der Patienten geliefert
werden.
Es werden folgende Versuche durchgeführt:
Menschliche Hirntumoren astrozytären und oligodendroglialen Ursprunges werden
auf das Vorhandensein von Survivin und P-Glycoprotein mittels Immunhistochemie
bzw. In-situ-Hybridisierung untersucht. Mit dem immunhistochemischen Nachweis
von aktivierter Caspase-3 als Schlüsselposition der Apoptose wird aufgezeigt, ob mit
steigender Proteinexpression die Apoptoserate abnimmt. Durch Anfärbung mit dem
gegen Ki-67 gerichteten Antikörper MiB-1 wird der Proliferationsindex bestimmt.
Material und Methoden
12
2. Material und Methoden
Für die Durchführung und Auswertung der Versuche wurden die nachfolgend
aufgeführten Materialien und Kits verwendet. Gebräuchliche Chemikalien wurden mit
der Spezifikation „reinst“ eingesetzt.
2.1. Puffer und Lösungen
10x PBS (pH 7,4)
NaCl
KCl
Na2HPO4
K2HPO4
1,37 M
26,8 mM
100 mM
17,6 mM
20x SSPE (pH 7,4)
NaCl
NaH2PO4
EDTA
3,6 M
0,2 M
0,2 M
Lösung D (pH 7,0)
Guanidinthiocyanat
Natriumcitrat
4,0 M
25 mM
20x SSC (pH 7,0)
NaCl
Natriumcitrat
2,0 M
0,3 M
10x Maleatpuffer (pH 7,5)
Maleinsäure
NaCl
1,0 M
1,5 M
10x AP-Puffer (pH 9,5) mit MgCl2
Tris Base
NaCl
MgCl2
1,0 M
1,0 M
0,5 M
TE-Puffer (pH 7,5)
Tris Base
EDTA
10 mM
1 mM
Prähybridisierungslösung
deionisiertes Formamid
Lösung D
10 % Blockingsolution
tRNA (100 µg/µl)
25 µl
25 µl
2,5 µl
0,12 µl
Material und Methoden
13
Blockierungslösung
Tween
Triton X 100
Blockingsolution
NaCl
Maleatpuffer
Waschpuffer
Maleatpuffer
Tween
Triton
10 mM Citratpuffer (pH 6,0)
Lösung A:
Lösung B:
18 ml Lösung A, 82 ml Lösung B,
Aqua dest. ad 1l
0,10%
0,20%
1,00%
20 mM
1x
1x
0,30%
0,20%
0,1 M Citronensäure
0,1 M Natriumcitrat
Tris-HCl (pH 7,4)
Tris-Base
Tris-HCl
NaCl
70 mM
430 mM
1,5 M
2.2 Chemikalien
Chemikalien
Hersteller
Formaldehyd
Roti®-Histokitt
Aquatex
Blocking Solution
Roth
Roth
Merck
Roche
2.3 Kits und Fertiglösungen
Kits und Fertiglösungen
Target Retrieval Solution
DAKO REAL™ Detection System
DAKO Antibody Diluent
i-VIEW DAB Paraffin Kit
XT ultraView DAB Kit
innuPREP RNA Mini Kit
First-Strand cDNA-Synthesis Kit
Gel-Band-Purification Kit
DIG RNA Labeling Kit
Hersteller
DAKO Cytomation
DAKO Cytomation
DAKO Cytomation
Ventana
Ventana
Analytik Jena
Fermentas Life Science
Amersham
Roche
Material und Methoden
14
2.4 Antikörper
Antikörper
Anti-ABCB1 (P-gp) (JSB-1), monoclonal, mouse
IgG1
Anti-Survivin (FL-142: sc-10811) polyclonal,
rabbit
Anti-Caspase-3 (Rabbit x Caspase, CPP 32),
polyclonal, rabbit
Anti-Ki67 (MiB-1, M7240), monoclonal, mouse
Anti-DIG-AP AK
Hersteller
Alexis
Santa Cruz
Zytomed Systems
DAKO Cytomation
Roche Diagnostics
2.5 Primer
Primer
Survivin
P-gp
Gen-BankFragmentlänge Sequenz
Nr.
331 bp
NM-001168
Sur fw neu: 5' ctg tca cac ctg tgc ctc
3'
Sur rv neu: 5' cac tgg gcc tgt cta atc 3
292 bp
M 14758
P-gp f: 5' tga ttg cat ttg gag gac aa 3'
P-gp r: 5' tgc ttc aat gct tgg aga tg 3'
2.6 Gewebeproben
Aus dem Archiv des Institutes für Pathologie der Universität Greifswald wurden aus
den
Jahren
1995
bis
2007
insgesamt
172
Fälle
von
astrozytären
und
oligodendroglialen Hirntumoren ausgewählt, die von 118 Patienten stammten. Von
manchen Patienten existieren mehrere Gewebsproben, da Tumorrezidive oder ein
Malignitätsprogress auftraten. Bei den ausgewählten Fällen handelte es sich um
formalinfixiertes und in Paraffin eingebettetes Gewebe.
Proben, bei denen 50 % und mehr des Tumorgewebes Nekrosen aufwiesen, wurden
nicht untersucht, da die Aussagekraft der Untersuchungsmethoden bei ausgedehnter
Nekrose stark eingeschränkt ist. Das untersuchte Material ist in Tabelle 4 im
Ergebnisteil aufgelistet.
Da seit 1995 die Klassifikation der Hirntumoren durch die WHO aktualisiert wurde
(2007), wurden alle ursprünglich angefertigten Präparate erneut durch einen
Neuropathologen beurteilt, es musste jedoch in keinem der Fälle eine Änderung der
ursprünglichen Klassifikation vorgenommen werden.
Material und Methoden
15
2.7 Methoden
2.7.1 Immunhistochemie
Mit Hilfe der Immunhistochemie kann in Gewebsschnitten die Lokalisation von
Proteinen bestimmt werden. Die Basis der Immunhistochemie ist eine AntigenAntikörper-Reaktion, bei der markierte Antikörper mit einer Affinität zu einem
bestimmten Epitop eines Proteins an dieses binden und es so sichtbar gemacht
werden kann. Der spezifische Antikörper, der gegen das Epitop gerichtet ist, wird als
Primärantikörper bezeichnet. In einem weiteren Schritt wird ein zweiter Antikörper
(Sekundärantikörper), der gegen den Primärantikörper gerichtet ist, aufgebracht.
Dieser Sekundärantikörper ist enzymgekoppelt, so dass bei entsprechender
Substratzugabe eine Färbung durch eine Enzym-Substrat-Reaktion entsteht. Für die
immunhistochemische Färbung in den durchgeführten Versuchen wurde die Labeled
(Strept)avidin-Biotin-Methode (LSAB) benutzt, die auf der hohen Affinität von
Streptavidin und Avidin für Biotin basiert. Dabei wird zum Primärantikörper ein
biotinylierter Sekundärantikörper gegeben und anschließend ein Avidin-BiotinEnzymkonjugat hinzugegeben. Bei dem Enzym handelt es sich um eine Peroxidase
(Meerettich-Peroxidase, „horse raddish- peroxidase“ = HRP), die Wasserstoffperoxid
spaltet,
so
dass
hochreaktive
Sauerstoffradikale
entstehen.
Diese
können
Chromogene oxidieren, wodurch es zur Färbung kommt. Die Farbreaktion entsteht
nach entsprechender Substratzugabe.
Um eine möglichst standardisierte Durchführung zu erreichen, wurden die
immunhistochemischen Färbungen für Survivin mit dem NexEs IHC Färbemodul der
Firma Ventana und für MiB-1 und Anti-Caspase-3 mit dem BenchMark XT IHC/ISH
Färbemodul
der
Firma
DAKO
vorgenommen.
Die
immunhistochemische
Untersuchung von P-gp erfolgte manuell, da mit dem Automaten keine optimalen
Ergebnisse zu erzielen waren.
Die 2 µm Gewebeschnitte wurden mit dem HM 360 Rotationsmikrotom der Firma
MICROM hergestellt.
2.7.1.1 Nachweis von P-Glycoprotein (P-gp)
Die Gewebeschnitte wurden 3 x 5 min in Xylol entparaffiniert und durch eine
absteigende Ethanolreihe rehydriert (2 x 5 Minuten 99 % Ethanol, 1 x 3 Minuten
96 % Ethanol). Zur Demaskierung wurden die Schnitte 3 Minuten in Citratpuffer (pH
6) im Dampfdrucktopf gekocht. Nach Abkühlen der Proben wurde 3 x 5 Minuten in
Material und Methoden
16
Aqua dest. gewaschen und zur Blockade der endogenen Peroxidasen in 3 %-iger
Wasserstoffperoxidlösung inkubiert. Es folgten je 3 fünfminütige Waschschritte in
Aqua dest. und Tris-HCL. Die Inkubation mit dem Primärantikörper (1:100 in DAKO
Antibody Diluent) wurde über Nacht bei 4 °C durchge führt.
Am folgenden Tag wurden die Proben 5 Minuten mit Tris-HCl/Tween gewaschen. Die
Detektion erfolgte mit dem DAKO REAL™ Detection System (HRP/DAB,
rabbit/mouse)
nach
folgendem
Verfahren:
10-minütige
Inkubation
mit
dem
biotinylierten Sekundärantikörper, 5 Minuten waschen mit Tris-HCl/Tween, 20
Minuten Streptavidin Peroxidase HRP und 5 Minuten waschen mit Tris-HCl/Tween.
Die Färbung wurde mit DAB in HRP Substrat Puffer bis zur Braunfärbung
durchgeführt. Die Reaktion wurde mit Aqua dest. gestoppt. Nach 3 x 5 Minuten
Waschen in Aqua dest. wurde für 30 Sekunden mit Mayers Hämalaun gegengefärbt.
Anschließend wurden die Schnitte 2 Minuten unter fließendem Leitungswasser
gebläut und nach kurzen Entwässerungsschritten in 99 % Alkohol, 96 % Alkohol,
Isopropanol und Xylol in Histokitt eingedeckt.
2.7.1.2 Nachweis von Survivin
Der Nachweis von Survivin erfolgte mit dem Färbeautomaten. Es wurde eine 25minütige Vorbehandlung der Gewebsschnitte mit Target Retrieval Solution der Firma
DAKO durchgeführt. Die immunhistochemische Färbung und Detektion erfolgte mit
dem i-VIEW DAB Paraffin Kit (Ventana) nach modifiziertem Herstellerprotokoll. Der
Survivin-Antikörper wurde bei 37 °C in einer Verdün nung von 1:100 für 32 Minuten
aufgetragen. Die Gegenfärbung erfolgte manuell für 5 Minuten in Hämatoxilin gefolgt
von je zwei kurzen Inkubationsschritten in Aqua dest. und einer wässrigen
Ammoniaklösung. Nach 5-minütigem Spülen mit Leitungswasser wurde in einer
aufsteigenden Ethanolreihe bis hin zu Xylol dehydriert und mit Histokitt eingedeckt.
2.7.1.3 Nachweis von Caspase-3
Der Nachweis von Caspase-3 und die Gegenfärbung erfolgten mit dem
Färbeautomaten. Hierzu wurde der XT ultraView DAB Kit (Ventana) nach
Herstellerangaben verwendet. Die Antikörperinkubation erfolgte bei 37 °C in einer
Verdünnung von 1:100 für 32 Minuten.
Material und Methoden
17
2.7.1.4 Nachweis von Ki-67
Der Nachweis von Ki-67 und die Gegenfärbung erfolgten mit dem Färbeautomaten.
Hierzu wurde der XT ultraView DAB Kit (Ventana) nach Herstellerangaben
verwendet. Die Antikörperinkubation erfolgte bei 37 °C in einer Verdünnung von
1:100 für 32 Minuten.
2.7.2 In situ Hybridisierung
Mit der in situ Hybridisierung lassen sich Nukleinsäuren in Chromosomen, Zellen und
Geweben nachweisen. Die Technik basiert auf der Hybridisierung einer spezifischen,
markierten Nukleotidsonde an ihre komplementären Sequenzen an DNA oder RNA.
Hier soll mRNA mit Digoxigenin(DIG)-markierten RNA-Sonden nachgewiesen
werden. Der Versuch kann in vier Abschnitte unterteilt werden: Herstellung der
markierten
RNA-Sonden,
Fixierung
und
Vorbehandlung
der
Gewebe
auf
Objektträgern, Hybridisierung und Nachweis der hybridisierten Sonde.
2.7.2.1 Herstellung der DIG-markierten RNA-Sonden
Die Markierung der Sonden erfolgte mittels in vitro Transkription. Hierzu wird das
gewünschte
DNA-Fragment
über
PCR
generiert,
in
einen
geeigneten
Transkriptionsvektor ligiert und in Escherichia coli vermehrt. Nach Gewinnung der
Plasmid-DNA folgt die Linearisierung des Vektors sowie die Transkiption durch RNAPolymerasen. Wird DIG-dUTP in den dNTP-Mix gegeben, werden die Transkripte an
jedem 20. – 30. Nukleotid mit Digoxigenin markiert.
Zunächst wurde RNA aus HL-60 Zellen (promyeloblastische Leukämiezelllinie) und
HepG2-Zellen (humane Leberzelllinie) (Institut für Pharmakologie und Toxikologie,
Universität Greifswald) mit dem innuPREP RNA Mini Kit (Analytik Jena) nach
Herstellerangaben isoliert. Die cDNA-Synthese wurde mit dem First-Strand cDNASynthesis Kit (Fermentas Life Science) nach Herstellerprotokoll durchgeführt. Die
cDNA wurde in die PCR mit spezifischen Primern für Survivin bzw. P-Glycoprotein
eingesetzt.
Material und Methoden
18
Der Standard-PCR-Ansatz setzt sich folgendermaßen zusammen:
•
cDNA
5,0 µl
•
10 x Reaktionspuffer
5,0 µl
•
MgCl2 (25 mM)
3,0 µl
•
dNTPs (je 10 mM)
1,0 µl
•
5`-Primer (10 pmol/µl)
2,0 µl
•
3`-Primer (10 pmol/µl)
2,0 µl
•
InnuTaq-Polymerase (5U/µl)
0,5 µl
•
Aqua bidest.
Ad 50,0 µl
Survivin PCR
2 Minuten
94 °C
30 Sekunden
94 °C
45 Sekunden
53 °C
1 Minute
72 °C
7 Minuten
72 °C
∞
35 x
4 °C
P-Glycoprotein PCR
3 Minuten
94 °C
30 Sekunden
94 °C
1 Minute
51 °C
1 Minute
72 °C
7 Minute
72 °C
∞
35 x
4 °C
Die PCR-Produkte wurden mittels Agarosegel-Elektrophorese aufgetrennt und mit
dem Gel-Band-Purification Kit (Amersham) nach Herstellerangaben aufgereinigt. Die
Klonierung der PCR-Produkte in den pGEM –T Easy Vektor (Promega) wurde von
Frau Dr. Kunert-Keil im Institut für Pathophysiologie (Universität Greifswald)
durchgeführt. Dort erfolgte auch die Sequenzierung und die Spaltung der Plasmide.
Die gespaltenen Plasmide wurden in die in vitro Transkription mit dem DIG RNA
Labeling Kit (Roche) nach Herstellerangaben eingesetzt. Die DIG-markierten Sonden
wurden
nach
Herstellerprotokoll
aufgereinigt
und
der
Gehalt
und
die
Material und Methoden
19
Markierungseffizienz photometrisch bzw. mittels Tüpfeltest überprüft. Spezifische
Bindungseigenschaften der Sonden wurden im Northern Blot analysiert.
2.7.2.2 In situ Hybridisierung von P-Glycoprotein (P-gp) und Survivin
Für die in-situ-Hybridisierung stand formalinfixiertes und in Paraffin eingebettetes
Gewebe zur Verfügung. Die 2 µm Gewebeschnitte wurden mit dem HM 360
Rotationsmikrotom der Firma MICROM hergestellt. Durchgeführt wurde die in situ
Hybridisierung unter möglichst RNAse-freien Bedingungen
Die Schnitte wurden 30 Minuten in Xylol entparaffiniert und in einer absteigenden
Ethanol-Reihe rehydriert (je 5 Minuten 100 % Ethanol, 95 % Ethanol, 70 % Ethanol).
Nach 2 x 5 Minuten Waschen in PBS wurde 5 Minuten in 4 % ParaformaldehydLösung (in 10 x PBS) auf Eis nachfixiert und erneut 3 x 5 Minuten in PBS
gewaschen. Der Verdau erfolgte mit Pepsin (60 mg / 70 ml 0,2 M HCl) in 0,5 M HCl
für 20 Minuten bei 37 °C. Es wurde 2 x 5 Minuten in PBS gewaschen und erneut für
20 Minuten in 4 % Paraformaldehyd-Lösung auf Eis fixiert. Nach 3 x 5 Minuten
Waschen in PBS wurde mit 0,1 M Triethanolamin und Essigsäureanhydrid für 15
Minuten acetyliert. Essigsäureanhydrid wurde zu Beginn und nach 5 Minuten
zugesetzt. Es folgten drei 5-minütige Waschschritte in PBS und 1,5 x SSPE in 50 %
Formamid. Die Prähybridisierung erfolgte mit 50 µl Prähybridisierungslösung in einer
feuchten Kammer bei 56 °C für 1 Stunde. Hybridisier t wurde über Nacht mit
Hybridisierungslösung (Prähybridisierungslösung + 150 – 300 ng Sonde) in einer
feuchten Kammer bei 56 °C. Nach der Hybridisierung wurde 2 x 5 Minuten mit
Prähybridisierungslösung, 3 x 5 Minuten mit 2 x SSC, 3 x 5 Minuten mit 0,1 x SSC
und 3 x 5 Minuten mit PBS gewaschen. Anschließend wurden die Schnitte für eine
Stunde mit Blockierungslösung behandelt und eine Stunde mit dem Anti-DIG-AP
Antikörper (1:500) inkubiert. Nach 3 x 5 Minuten Waschen im Waschpuffer, 2 x 5
Minuten und 10 Minuten Inkubation in AP-Puffer erfolgte die Visualisierung mit
NBT/BCIP in AP-Puffer bei 37 °C im Dunklen. Die Fär bung wurde 1 Stunde in TE
Puffer gestoppt, die Schnitte je 5 Minuten in 10 x PBS, PBS und Wasser gewaschen,
luftgetrocknet und in Aquatex eingedeckt.
Material und Methoden
20
2.8 Auswertung der immunhistochemischen Färbungen und in situ Hybridisierung
Zur Quantifizierung der immunhistochemischen Färbungen von P-gp, Survivin und
der in-situ-Hybridisierung von P-gp und Survivin wurden mit der Image-Pro Plus
Software von Media Cybernetics pro Objektträger sechs digitale Bilder des Tumors
aufgenommen (200-fache Vergrößerung). Die mittlere optische Dichte wurde mit der
KSRun Software (KSRun Version 3.0, Zeiss, Germany) bestimmt und ausgewertet.
Dazu
wurden
mit
einer
speziellen
Matrix
die
minimalen
und
maximalen
Färbungsintensitäten definiert und auf alle digital erstellten Bilder angewendet. Aus
der als positiv gewerteten Fläche und der Färbeintensität wurde die mittlere optische
Dichte (= mod) berechnet, die ein Maß für die Expressionsstärke darstellt. Zur
Quantifizierung der immunhistochemischen Färbung von MiB-1 und Caspase-3
wurden mit der Image-Pro Plus Software (Media Cybernetics) von 10 Gesichtsfeldern
jeweils die Gesamtzellzahl ermittelt und dann der Anteil der immunhistochemisch
positiven Zellen berechnet. Hierzu wurden zuvor mit einer speziellen Maske die
maximalen und minimalen Färbungsintensitäten definiert, die als positiv gezählt
werden sollten. Aus je 10 Gesichtsfeldern pro Objektträger wurde dann ein Mittelwert
erstellt.
2.9 Statistische Auswertung
Die statistische Auswertung wurde mit dem Statistikprogramm SPSS 12.0.1 der
Firma SPSS durchgeführt. Es wurden unterschiedliche Gruppen definiert, die auf
signifikante Unterschiede überprüft wurden. Zunächst wurden Vergleiche zwischen
den Untergruppen der Astrozytome und Oligodengrogliome angestellt. Als nächstes
wurden die astrozytären und die oligodendroglialen Hirntumoren verglichen und
zuletzt wurden Korrelationsanalysen zwischen den untersuchten Parametern
durchgeführt.
Mit dem Kolmogorov-Smirnov-Anpassungstest wurden die erhobenen Daten auf
Normalverteilung
überprüft.
Da
nicht
für
alle
erhobenen
Parameter
eine
Normalverteilung vorlag, wurde die anschließende Auswertung mit dem nichtparametrischen Mann-Whitney-Test für zwei unabhängige Stichproben durchgeführt.
Für die Korrelationsanalyse wurde der Korrelationstest nach Pearson angewandt. Als
Irrtumswahrscheinlichkeit wurde p ≤ 0,05 festgelegt.
Ergebnisse
21
3. Ergebnisse
3.1 Aufteilung der Gewebeproben
Es wurden Gewebsproben von 118 Patienten untersucht, davon waren 47 Proben
von Frauen und 71 Gewebsproben von Männern. Der Altersmittelwert lag für alle
Tumoren zusammen bei 42,8 Jahren (Standardabweichung +/- 14,5 Jahre). In
Tabelle 4 sind die Geschlechtsverteilung und das mittlere Alter bei Diagnosestellung
dargestellt. In Tabelle 5 sind die Daten zur Häufigkeit der verschiedenen
Untergruppen der Astrozytome und Oligodendrogliome aufgeführt und Daten der
CBTR-US bzw. von OHGAKI et al. (2005) gegenübergestellt.
Tab. 4: Geschlechts- und Altersverteilung der untersuchten Gewebsproben.
Anzahl
♀
♂
Pilozytisches Astrozytom
Diffuses Astrozytom
Anaplastisches Astrozytom
Glioblastoma multiforme
Low grade
Oligodendrogliom
Anaplastisches
Oligodendrogliom
10
31
15
49
4
12
5
22
6
19
10
27
Mittelwert Alter in Jahren
(+/- Standardabweichung)
14,1 (+/- 6,5)
39,7 (+/- 17,8)
46,9 (+/- 14,2)
61,5 (+/- 9,6)
9
3
6
51,3 (+/- 14,8)
4
1
3
43,3 (+/- 20,6)
Summe
118
47
71
Tumor
Tab. 5: Häufigkeiten der unterschiedlichen Subgruppen von Astrozytomen und Oligodendrogliomen im
untersuchten Gewebe, Gegenüberstellung mit Daten aus: [Central Brain Tumor Registry of the United
States (CBTR-US), 2000 und WHO Classification of Tumors, Pathology and Genetics, Tumors of the
Nervous System, 2007].
Hirntumor (WHO Grad)
Pilozytisches Astrozytom (WHO I)
Diffuses Astrozytom (WHO II)
Anaplastisches Astrozytom (WHO III)
Glioblastoma multiforme (WHO IV)
Low grade Oligodendrogliom (WHO II)
Anaplastisches Oligodendrogliom (WHO III)
Daten der WHO bzw.
CBTR-US
Anteil aller Astrozytome
ca. 6 %
ca. 10 – 15 %
ca. 10 – 19 %
ca. 50 – 60 %
Anteil aller
Oligodendrogliome
ca. 77 %
ca. 23 %
eigene Daten
Anteil aller
Astrozytome
9,5 %
29 %
14 %
46 %
Anteil aller
Oligodendrogliome
69 %
30 %
Ergebnisse
22
In Tabelle 6 wurden die erhobenen Daten zum mittleren Alter bei Diagnosestellung
der untersuchten Fälle mit den Angaben von OHGAKI et al. (2005) verglichen.
Tab. 6: Mittleres Alter bei Diagnosestellung der unterschiedlichen Subgruppen von Astrozytomen und
Oligodendrogliomen, Gegenüberstellung mit Daten nach: [OHGAKI et al., 2005].
Hirntumor (WHO Grad)
Mittleres Alter bei
Diagnosestellung
(in Jahren)
[nach: OHGAKi et al.(2005)]
Pilozytisches Astrozytom (WHO I)
Diffuses Astrozytom (WHO II)
Anaplastisches Astrozytom (WHO III)
Glioblastoma muliforme (WHO IV)
Low grade Oligodendrogliom (WHO II)
Anaplastisches Oligodendrogliom (WHO III)
Mittleres Alter bei
Diagnosestellung
(in Jahren)
[eigene Daten]
20
41
44
61
40
14,1
39,7
46,9
61,5
51,3
43,3
49
In dem in der vorliegenden Arbeit untersuchten Probenkollektiv war ein höherer
Anteil an Astrozytomen WHO Grad I und WHO Grad II zu verzeichnen als in der
Literatur beschrieben. Der Anteil an Oligodendrogliomen WHO Grad II lag etwas
unter
dem
Durchschnittswert
aus
den
Literaturangaben,
der
Anteil
an
Oligodendrogliomen WHO Grad III war etwas höher. Bei der Gegenüberstellung des
durchschnittlichen mittleren Alters bei Diagnosestellung zeigt sich eine weitgehende
Übereinstimmung bei den Astrozytomen der WHO Grade II- IV. Das durchschnittliche
Alter bei Diagnosestellung lag bei den Astrozytomen WHO Grad I und den
Oligodendrogliomen WHO Grad III des untersuchten Kollektivs deutlich niedriger als
in der Literatur beschrieben, während bei den Oligodendrogliomen WHO Grad II das
durchschnittliche Alter bei Diagnosestellung höher war.
3.2 Lokalisation der Hirntumoren
Die Lokalisationsangaben der Hirntumoren wurden den Patientenakten der Klinik für
Neurochirurgie der Universität Greifswald (Prof. H. Schröder) entnommen, sofern
diese
verfügbar
waren.
Eine
Übersicht
über
verschiedene
Lokalisationen
unterschiedlicher Hirntumoren gibt Abbildung 4. A - D. Dabei zeigte sich, dass
Astrozytome der WHO- Grade II und III überwiegend fronto-parietotemporal gelegen
waren.
Glioblastome
fanden
sich
in
allen
Oligodendrogliome lagen bevorzugt frontotemporal.
Hirnlappen
gleichermaßen.
Ergebnisse
A
23
links
rechts
frontal
5
temporo-parietal
4
occipital
Kleinhirn
multiple Lokalisationen
3
temporo-parietal
3
1
occipital
temporo-parietal
6
occipital
Kleinhirn
multiple Lokalisationen
4
4
andere Lokalisationen
8
9
1
multiple Lokalisationen
rechts
D
4
1
Kleinhirn
links
7
rechts
1
3
5
frontal
links
frontal
1
andere Lokalisationen
C
B
links
frontal
8
temporo-parietal
9
occipital
rechts
1
5
3
Kleinhirn
5
Abb.: 4A - D: Lokalisationen der unterschiedlichen Hirntumoren (A: Astrozytome WHO Grad II; B: Astrozytome
WHO Grad III; C: Astrozytome WHO Grad IV; D: Oligodendrogliome WHO Grad II)
Es wurden die Lokalisationen der Astrozytome WHO Grad II-IV bzw. der
Oligodendrogliome Grad III dargestellt. Von den Astrozytomen WHO Grad I bzw.
Oligodendrogliomen Grad II waren die Lokalisationsangaben uneinheitlich bzw. nur
teilweise dokumentiert, so dass die Angaben sich nicht grafisch vereinheitlichen
ließen.
Ergebnisse
24
3.3 Die Expression von P-Glycoprotein (P-gp)
Die Expression von P-Glycoprotein wurde an Gewebsproben von 118 Patienten
immunhistochemisch untersucht. Als Maß für die Expression, dargestellt durch die
Intensität der Färbung, wurde die mittlere optische Dichte (mod) mit Hilfe des KSRun
Programmes, wie in Abschnitt 2.8 erklärt, ermittelt.
In den Abbildungen 5 A - F sind beispielhaft einige immunhistochemische Nachweise
für P-Glycoprotein dargestellt.
A
C
E
B
Abb. 6
D
F
Abb. 5 A - F: Immunhistochemischer Nachweis von P-Glycoprotein an Gewebsproben verschiedener Hirntumoren
(200fache Vergrößerung)
A: Astrozytom WHO Grad I, B: Astrozytom WHO Grad II, C: Astrozytom WHO Grad III, D: Astrozytom WHO Grad
IV, E: Oligodendrogliom WHO Grad II, F: Oligodendrogliom WHO Grad III.
Ergebnisse
25
Eine für die unterschiedlichen Hirntumoren getrennte Aufschlüsselung der mittleren
optischen Dichte (= mod) für P-Glycoprotein (P-gp) ist in Tabelle 7 dargestellt.
Tab. 7: Darstellung der mittleren optischen Dichte von P-gp (Immunhistochemie) für die unterschiedlichen
Hirntumoren.
Astrozytom Astrozytom
WHO Grad WHO Grad
I
II
Astrozytom
WHO Grad
III
Astrozytom
WHO Grad
IV
Oligodendrogliom Oligodendrogliom
WHO Grad II
WHO Grad III
Mittelwert
54,14
51,97
67,19
32,86
81,75
112,6
Minimum
5,3
0
14,28
0
19,47
12,12
Maximum
102,56
242,93
249,43
129,82
191,82
288,39
Standardabweichung
28,89
43,59
60,06
27,82
45,26
114,67
Bei der immunhistochemischen Reaktion färben sich Gefäßendothelien sowie die
Plasmamembranen der Tumorzellen.
Die P-gp Expression zeigte keine Unterschiede zwischen den Astrozytomen WHO
Grad I und II, stieg dann bei den Astrozytomen WHO Grad III an und fiel bei den
Astrozytomen WHO Grad IV wieder ab.
Es zeigte sich eine insgesamt höhere P-gp Expression bei den Astrozytomen WHO
Grad I, II und III im Vergleich zu den Astrozytomen WHO Grad IV, wobei der
Unterschied zwischen den Astrozytomen WHO Grad I und WHO Grad IV,
Astrozytomen WHO Grad II und IV sowie WHO Grad III und IV statistisch signifikant
war (p= 0,018; p= 0,002 bzw. p= 0,001).
Beim Vergleich von Astrozytomen mit Oligodendrogliomen vergleichbaren Malignitätsgrades war die P-gp-Expression bei den Oligodendrogliomen höher, wobei der
Unterschied bei den Tumoren des WHO Grades II statistisch signifikant war (p=
0,016). Gleiches galt beim Vergleich aller Astrozytome auf der einen Seite und aller
Oligodendrogliome auf der anderen Seite (p= 0,001).
Bei den übrigen angestellten Vergleichen zeigte sich bei den Astrozytomen ein
Anstieg der mod von WHO Grad II zu WHO Grad III und bei den Oligodendrogliomen
ein Anstieg zwischen WHO Grad II und WHO Grad III, die Unterschiede waren
jedoch nicht statistisch signifikant. Grafisch sind die Ergebnisse in Abbildung 6
dargestellt.
mittlere optische Dichte P-Glycoprotein Immunhistochemie
Ergebnisse
26
p =0,001
p =0,018
300
p =0,002
p =0,001
200
p =0,016
100
0
A1
A2
A3
A4
OII
OIII
Abb. 6: Expression von P-Glycoprotein (Vergleich von Astrozytomen WHO Grad I –IV sowie Oligodendrogliomen
WHO Grade II –III) (A1 = Astrozytome WHO Grad I; A2 = Astrozytome WHO Grad II, A3 = Astrozytome WHO
Grad III, A4 = Astrozytome WHO Grad IV, OII = Oligodendrogliome WHO Grad II, OIII = Oligodendrogliome WHO
Grad III ). In der Darstellung sind jeweils die Primärtumoren und ihre Rezidive zusammengefasst.
Ergebnisse
27
3.4 Die Expression von Survivin
Für die immunhistochemische Untersuchung von Survivin standen Gewebsproben
von 118 Patienten zur Verfügung. Als Maß für die Expression, dargestellt durch die
Intensität der Färbung, wurde die mittlere optische Dichte (mod) mit Hilfe des KSRun
Programmes, wie in Abschnitt 2.8 erklärt, ermittelt. In den Abbildungen 7 A - F sind
beispielhaft einige immunhistochemische Nachweise für Survivin dargestellt.
A
Abb. 4
C
Abb. 6
E
Abb. 8
B
Abb. 12
D
F
Abb. 7
Abb. 9
Abb. 7 A - F: Immunhistochemischer Nachweis von Survivin an Gewebsproben verschiedener Hirntumoren
(200fache Vergrößerung).
A: Astrozytom WHO Grad I, B: Astrozytom WHO Grad II, C: Astrozytom WHO Grad III, D: Astrozytom WHO Grad
IV, E: Oligodendrogliom WHO Grad II, F: Oligodendrogliom WHO Grad III
Eine für die unterschiedlichen Hirntumoren getrennte Aufschlüsselung der SurvivinExpression zeigt Tabelle 8.
Ergebnisse
28
Tab. 8: Darstellung der mittleren optischen Dichte von Survivin (Immunhistochemie) für die unterschiedlichen
Hirntumoren.
Astrozytom Astrozytom Astrozytom Astrozytom
WHO Grad WHO Grad WHO Grad WHO Grad Oligodendrogliom Oligodendrogliom
I
II
III
IV
WHO Grad II
WHO Grad III
Mittelwert
290,78
307,42
312,28
243,19
77,17
199,38
Minimum
9,49
12,4
37,52
12,11
14,1
48,29
Maximum
2647,81
2050,89
992,64
1113,87
406,24
674,93
Standardabweichung
782,8
460,74
301,51
269,89
110,97
222,33
Mit dem verwendeten Antikörper ließ sich sowohl eine nukleäre als auch eine
zytoplasmatische Anfärbung der Tumorzellen erzielen.
Die Survivinexpression war bei den Astrozytomen WHO Grad III größer als beim
WHO Grad I (p= 0,008) und bei den Astrozytomen WHO Grad IV niedriger als beim
WHO Grad I (p= 0,007). Bei Oligodendrogliomen fand sich ein Anstieg von WHO
Grad II zu WHO Grad III (p= 0,019).
Die Survivin-Expression war bei Astrozytomen WHO Grad II und III im Vergleich zu
den Oligodendrogliomen WHO Grad II und III höher, der Unterschied war jedoch nur
für die Tumoren des WHO Grades II signifikant (p= 0,021). Ein ähnliches Bild ergab
sich
beim
Vergleich
aller
Astrozytome
auf
der
einen
Seite
und
aller
Oligodendrogliome auf der anderen Seite; hier war die mod bei den Astrozytomen
höher als bei den Oligodendrogliomen (p= 0,009). Diese Unterschiede waren jeweils
statistisch signifikant.
Der Mittelwert der mod als Maß für die Expression stieg von den Astrozytomen WHO
Grad I zu WHO Grad III an und fiel bei den Astrozytomen WHO Grad IV wieder ab,
wobei der Anstieg von WHO Grad I zu WHO Grad II, von WHO Grad II zu WHO Grad
III und von WHO Grad II und zu WHO Grad IV jeweils nicht statistisch signifikant war.
Auch die niedrigere mod bei Astrozytomen WHO Grad IV im Vergleich zu WHO Grad
III zeigte keinen statistisch signifikanten Unterschied.
In Abbildung 8 sind die Ergebnisse grafisch dargestellt.
Ergebnisse
29
p =0,009
mittlere optische Dichte Survivin Immunhistochemie
2500
p =0,008
2000
p =0,007
1500
p =0,007
1000
p =0,019
500
0
A1
A2
A3
A4
O2
O3
Abb. 8 : Expression von Survivin (Vergleich von Astrozytomen WHO Grad I – IV sowie Oligodendrogliomen WHO
Grade II – III) (A1 = Astrozytome WHO Grad I; A2= Astrozytome WHO Grad II, A3 = Astrozytome WHO Grad III,
A4 = Astrozytome WHO Grad IV, O2 = Oligodendrogliome WHO Grad II, O3 = Oligodendrogliome WHO Grad III).
In der Darstellung sind jeweils die Primärtumoren und ihre Rezidive zusammengefasst.
Ergebnisse
30
3.5 Die Expression von Ki-67
Für die Bestimmung der Zellproliferation durch den gegen Ki-67 gerichteten
Antikörper MiB-1 wurden Gewebsproben von 118 Patienten analysiert.
Eine
für
die
unterschiedlichen
Hirntumoren
getrennte
Aufschlüsselung
der
prozentualen Anteile für Ki-67-positive Zellen ist in Tabelle 9 dargestellt. Mit der
immunhistochemischen Reaktion färben sich typischerweise die Zellkerne. In den
Abbildungen 9 A - F sind Beispiele immunhistochemischer Nachweise für Ki-67
dargestellt.
A
BB
A
C
Abb. 6
D
EE
Abb. 8
F
Abb. 9 A - F: Immunhistochemischer Nachweis von Ki-67 an Gewebsproben verschiedener Hirntumoren
(200fache Vergrößerung).
A: Astrozytom WHO Grad I, B: Astrozytom WHO Grad II, C: Astrozytom WHO Grad III, D: Astrozytom WHO Grad
IV, E: Oligodendrogliom WHO Grad II, F: Oligodendrogliom WHO Grad III
Ergebnisse
31
Tab. 9: Darstellung der Mittelwerte von Ki67-immunhistochemisch positiven Zellen (in %) für die
unterschiedlichen Hirntumoren.
Astrozytom Astrozytom Astrozytom Astrozytom
WHO Grad WHO Grad WHO Grad WHO Grad Oligodendrogliom Oligodendrogliom
I
II
III
IV
WHO Grad II
WHO Grad III
Mittelwert
1,67
1,78
14,21
8,24
1,81
5,56
Minimum
0
0
1,03
0
0
0,84
Maximum
Standardabweichung
3,02
7,6
34,89
22,91
4,5
11,18
0,97
1,97
8,61
6,13
1,44
3,87
Der Anteil an Ki67-positiven Zellkerne stieg bei Astrozytomen mit steigendem
Malignitätsgrad an, und fiel dann bei den Astrozytomen WHO Grad IV wieder ab,
wobei dieser Abfall von WHO Grad III zu WHO Grad IV signifikant war (p= 0,004).
Der prozentuale Anteil von Ki-67-positiven Zellkernen war bei den Astrozytomen
WHO Grad III und IV höher als beim WHO Grad I und II (p= 0,008; p= 0,007 bzw.
p= 0,00; p= 0,004).
Die Werte der Oligodendrogliome lagen niedriger als die der Astrozytome (p= 0,029),
beim Vergleich der Astrozytome WHO Grad II und III mit den Oligodendrogliomen
vergleichbaren Malignitätsgrades zeigte sich ein höherer prozentualer Anteil an Ki67-positiven Zellkerne bei den Astrozytomen WHO Grad III im Vergleich zu den
Oligodendrogliomen WHO Grad III (p= 0,005). Die Werte der Astrozytome WHO
Grad II lagen auf dem Niveau der Oligodendrogliome WHO Grad II. Bei den
Oligodendrogliomen war der Anstieg von WHO Grad II nach WHO Grad III signifikant
(p= 0,037).
Diese Ergebnisse sind zur besseren Übersicht in zwei Grafiken (Abbildungen 10 A
und 10 B) dargestellt.
Ergebnisse
32
10 A
p =0,029
40
Anteil an MiB-1 positiven Zellen (in %)
p =0,008
p =0,005
30
20
p =0,037
10
0
A1
A2
A3
A4
O2
O3
Abb. 10 A: Anteil an Ki67-positiven (MiB-1 positiven) Zellen in % (Vergleich von Astrozytomen WHO Grad I –IV
sowie Oligodendrogliomen WHO Grade II – III) (A1 = Astrozytome WHO Grad I; A2 = Astrozytome WHO Grad II,
A3 = Astrozytome WHO Grad III, A4 = Astrozytome WHO Grad IV, O2 = Oligodendrogliome WHO Grad II, O3 =
Oligodendrogliome WHO Grad III). In der Darstellung sind jeweils die Primärtumoren und ihre Rezidive
zusammengefasst.
Ergebnisse
40
33
10 B
p =0,007
Anteil an MiB-1 positiven Zellen (in %)
p =0,00
**
* p = 0,004
** p = 0,00
*
30
=
20
10
0
A1
A2
A3
A4
O2
O3
Abb. 10 B: Anteil an Ki67-positiven (MiB-1 positiven) Zellen in % (Vergleich von Astrozytomen WHO Grad I – IV
sowie Oligodendrogliomen WHO Grade II – III) (A1 = Astrozytome WHO Grad I; A2= Astrozytome WHO Grad II,
A3 = Astrozytome WHO Grad III, A4 = Astrozytome WHO Grad IV, O2 = Oligodendrogliome WHO Grad II, O3 =
Oligodendrogliome WHO Grad III). In der Darstellung sind jeweils die Primärtumoren und ihre Rezidive
zusammengefasst.
Ergebnisse
34
3.6 Die Expression von Caspase-3
Es standen Gewebsproben von 118 Patienten für die immunhistochemische
Untersuchung des Apoptoseindex mittels des gegen Caspase-3 gerichteten
Antikörpers zur Verfügung.
Eine
für
die
unterschiedlichen
Hirntumoren
getrennte
Aufschlüsselung
der
prozentualen Anteile an für Caspase-3 positiven Zellen ist in Tabelle 10 dargestellt.
Bei
der
immunhistochemischen
Reaktion
ließ
sich
eine
zytoplasmatische
Anfärbbarkeit von Tumorzellen erzielen. Beispielhaft wird in den Abbildungen 11 A –
F der immunhistochemische Nachweis von Caspase-3 dargestellt.
AA
B
C
D
E
F
Abb. 11 A - F: Immunhistochemischer Nachweis von Ki-67 an Gewebsproben verschiedener Hirntumoren
(200fache Vergrößerung).
A: Astrozytom WHO Grad I, B: Astrozytom WHO Grad II, C: Astrozytom WHO Grad III, D: Astrozytom WHO Grad
IV, E: Oligodendrogliom WHO Grad II, F: Oligodendrogliom WHO Grad III
Ergebnisse
35
Tab. 10: Darstellung der Mittelwerte (in %) von für Caspase-3 immunhistochemisch positiven Zellen für die
unterschiedlichen Hirntumoren.
Astrozytom Astrozytom Astrozytom Astrozytom
WHO Grad WHO Grad WHO Grad WHO Grad Oligodendrogliom Oligodendrogliom
I
II
III
IV
WHO Grad II
WHO Grad III
Mittelwert
57,65
46,72
42,42
38,9
32,56
32,33
Minimum
41,57
15,92
7,49
0,7
10,78
18,38
Maximum
Standardabweichung
80,81
86,13
93,87
65,38
52,88
49,97
10,96
17,6
23,08
16,76
14,43
12,4
Der Mittelwert des prozentualen Anteiles von Caspase-3 positiven Zellen nahm bei
den Astrozytomen mit steigendem Malignitätsgrad ab. Der Anteil der Caspase-3
positiven Zellen war bei Astrozytomen WHO Grad IV geringer als bei WHO Grad I
und II (p= 0,002 bzw. p= 0,043). Beim Vergleich der zu einer Gruppe
zusammengefassten Astrozytome mit den Oligodendrogliomen war der Anteil an
Caspase-3 positiven Zellen bei den Oligodendrogliomen geringer als bei den
Astrozytomen (p= 0,01), was auch beim direkten Vergleich der Astrozytome mit den
Oligodendrogliomen vergleichbaren Malignitätsgrades festzustellen war, wobei der
Unterschied nur zwischen Astrozytomen WHO Grad II und Oligodendrogliomen WHO
Grad II statistisch signifikant war (p= 0,012).
Diese Ergebnisse sind zur besseren Übersicht in zwei Grafiken (Abbildungen 12 A
und 12 B) dargestellt.
Ergebnisse
Anteil an Caspase-3 positiven Zellen (in %)
100
36
*
12 A
* p = 0,01
80
60
40
20
0
A1
A2
A3
A4
O2
O3
Abb. 12 A: Anteil an Caspase-3 positiven Zellen in % (Vergleich von Astrozytomen WHO Grad I – IV sowie
Oligodendrogliomen WHO Grade II – III) (A1 = Astrozytome WHO Grad I; A2 = Astrozytome WHO Grad II, A3 =
Astrozytome WHO Grad III, A4 = Astrozytome WHO Grad IV, O2 = Oligodendrogliome WHO Grad II, O3 =
Oligodendrogliome WHO Grad III).
Ergebnisse
100
37
12 B
*
Anteil an Caspase-3 positiven Zellen (in %)
**
* p=0,002
** p=0,043
*** p=0,012
***
80
60
40
20
0
A1
A2
A3
A4
O2
O3
Abb. 12 B: Anteil an Caspase-3 positiven Zellen in % (Vergleich von Astrozytomen WHO Grad I – IV sowie
Oligodendrogliomen WHO Grade II – III) (A1 = Astrozytome WHO Grad I; A2 = Astrozytome WHO Grad II, A3 =
Astrozytome WHO Grad III, A4 = Astrozytome WHO Grad IV, O2 = Oligodendrogliome WHO Grad II, O3 =
Oligodendrogliome WHO Grad III).
Ergebnisse
38
3.7 Die Expression von P-Glycoprotein-RNA
Für den Nachweis der RNA von P-gp mittels in situ Hybridisierung standen
Gewebsproben von 38 Patienten zur Verfügung. Davon stammten 29 Gewebsproben
aus den Gruppen der Astrozytome WHO Grad I – IV und 9 Gewebsproben aus den
Gruppen der Oligodendrogliome WHO Grad II und III. Als Maß für die Expression
wurde die mittlere optische Dichte (= mod) mit dem KSRun Programm, wie in
Abschnitt 2.8 erklärt, ermittelt. In den Abbildungen 13 A – F sind beispielhaft einige in
situ Hybridisierungen für RNA von P-gp dargestellt.
A
B
C
D
E
F
Abb. 13 A - F: Nachweis von RNA von P-Glycoprotein an Gewebsproben verschiedener Hirntumoren mittels in
situ Hybridisierung (200fache Vergrößerung).
A: Astrozytom WHO Grad I, B: Astrozytom WHO Grad II, C: Astrozytom WHO Grad III, D: Astrozytom WHO Grad
4, E: Oligodendrogliom WHO Grad II, F: Oligodendrogliom WHO Grad III.
Wie auch bei der immunhistochemischen Untersuchung war bei P-gp innerhalb der
Gefäßendothelien und des Zytoplasmas von Tumorzellen nachweisbar. Eine für die
unterschiedlichen Hirntumoren getrennte Aufschlüsselung der P-gp-Expression der in
situ Hybridisierung ist in Tabelle 11 dargestellt.
Ergebnisse
39
Tab. 11: Darstellung der mittleren optischen Dichte von P-Glycoprotein (in situ Hybridisierung) für die
unterschiedlichen Hirntumoren.
Astrozytom Astrozytom Astrozytom Astrozytom
WHO Grad WHO Grad WHO Grad WHO Grad Oligodendrogliom Oligodendrogliom
I
II
III
IV
WHO Grad II
WHO Grad III
Mittelwert
716,57
1229,19
1699,03
718,69
819,61
792,55
Minimum
192,81
392,32
145,2
178,35
321,51
236,1
Maximum
Standardabweichung
1647,25
2303,42
4228,16
1359,19
1381,09
1584,6
600,8
799,46
1530,59
485,81
459,91
567,22
Der Mittelwert der P-gp-Expression stieg bei den Astrozytomen von WHO Grad I bis
WHO Grad III an, und fiel dann von WHO Grad III zu WHO Grad IV wieder ab. Bei
den Oligodendrogliomen fiel die P-gp-Expression mit zunehmendem Malignitätsgrad
ab. Die Expression lag bei den Oligodendrogliomen niedriger als bei den
Astrozytomen, was auch beim Vergleich der Astrozytome WHO Grad II und III mit
den Oligodendrogliomen von vergleichbarem WHO Grad erkennbar war. Bei diesen
Ergebnissen ließ sich jedoch keine statistische Signifikanz nachweisen. Die
Ergebnisse sind in Abbildung 14 dargestellt.
Mittlere optische Dichte P-Glycoprotein in-situ-Hybridisierung
Ergebnisse
40
5000
4000
3000
2000
1000
0
A1
A2
A3
A4
O2
O3
Abb. 14: Mittlere optische Dichte bei in-situ-Hybridisierung für P-Glycoprotein (Vergleich von Astrozytomen WHO
Grad I – IV sowie Oligodendrogliomen WHO Grade II – III) (A1 = Astrozytome WHO Grad I; A2 = Astrozytome
WHO Grad II, A3 = Astrozytome WHO Grad III, A4 = Astrozytome WHO Grad IV, O2 = Oligodendrogliome WHO
Grad II, O3 = Oligodendrogliome WHO Grad III).
Ergebnisse
41
3.8 Die Expression von Survivin-RNA
Für den Nachweis der RNA von Survivin mittels in situ Hybridisierung standen
Gewebsproben von 39 Patienten zur Verfügung. Davon stammten 29 Gewebsproben
aus den Gruppen der Astrozytome WHO Grad I – IV und 10 Gewebsproben aus den
Gruppen der Oligodendrogliome WHO Grad II und III. Als Maß für die Expression
wurde die mittlere optische Dichte (mod) mit Hilfe des KSRun Programmes, wie in
Abschnitt 2.8 erklärt, ermittelt.
In den Abbildungen 15 A - F sind beispielhaft einige in situ Hybridisierungen für RNA
von Survivin dargestellt. Die Reaktion in den Tumorzellen war zytoplasmatisch
lokalisiert.
A
B
C
D
E
F
Abb. 15 A - F: Nachweis von RNA von Survivin an Gewebsproben verschiedener Hirntumoren mittels in situ
Hybridisierung (200fache Vergrößerung).
A: Astrozytom WHO Grad I, B: Astrozytom WHO Grad II, C: Astrozytom WHO Grad III, D: Astrozytom WHO Grad
IV, E: Oligodendrogliom WHO Grad II, F: Oligodendrogliom WHO Grad III.
Ergebnisse
42
Eine für die unterschiedlichen Hirntumoren getrennte Aufschlüsselung der mittleren
optischen Dichte (= mod) für die Survivin in situ Hybridisierung ist in Tabelle 12
dargestellt.
Tab. 12: Darstellung der mittleren optischen Dichte von Survivin (in situ Hybridisierung) für die unterschiedlichen
Hirntumoren.
Astrozytom Astrozytom Astrozytom Astrozytom
WHO Grad WHO Grad WHO Grad WHO Grad Oligodendrogliom Oligodendrogliom
I
II
III
IV
WHO Grad II
WHO Grad III
Mittelwert
896,84
1163,12
2451,29
1358,37
825,99
1120,93
Minimum
150,02
291,3
1206,27
269,18
480,31
349,18
Maximum
Standardabweichung
2658,44
3106,84
7294,4
1979,34
1548,77
2271,55
879,85
914,15
2163,38
573,47
417,96
960,63
Der Mittelwert der Survivin-Expression stieg bei den Astrozytomen von WHO Grad I
bis WHO Grad III an, und fiel dann von WHO Grad III zu WHO Grad IV wieder ab.
Die höhere Expression bei den Astrozytomen WHO Grad III im Vergleich zu den
WHO Graden I und II war statistisch signifikant (p= 0,026 und p= 0,017). Bei den
Oligodendrogliomen stieg der Mittelwert der Expression mit zunehmendem
Malignitätsgrad an. Er lag insgesamt jedoch niedriger als bei den Astrozytomen, was
man auch bei dem direkten Vergleich von Oligodendrogliomen der WHO Grade II
und III mit den Astrozytomen vergleichbaren WHO-Grades nachweisen konnte.
Diese Unterschiede zeigten jedoch keine statistische Signifikanz. Die Ergebnisse
sind in Abbildung 16 dargestellt.
Ergebnisse
43
*
Mittlere optische Dichte Survivin in-situ-Hybridisierung
8000
p=0,017
6000
p =0,026
*
4000
2000
0
A1
A2
A3
A4
O2
O3
Abb. 16: Mittlere optische Dichte bei in-situ-Hybridisierung für Survivin (Vergleich von Astrozytomen WHO Grad I
– IV sowie Oligodendrogliomen WHO Grade II – III) (A1 = Astrozytome WHO Grad I; A2 = Astrozytome WHO
Grad II, A3 = Astrozytome WHO Grad III, A4 = Astrozytome WHO Grad IV, O2 = Oligodendrogliome WHO Grad
II, O3 = Oligodendrogliome WHO Grad III )
Ergebnisse
44
3.9 Korrelationen
Mit dem Korrelationskoeffizienten nach Pearson konnten statistisch signifikante
positive Korrelationen zwischen der Expression von Survivin und Ki-67 (Koeffizient:
0,152; p= 0,048) (Abb. 17 A), zwischen Survivin und Caspase-3 (Koeffizient: 0,197;
p= 0,01) (Abb. 17 B), zwischen Ki-67 und der RNA-Expression von P-Glycoprotein
(Koeffizient: 0,417; p= 0,009) (Abb.17 C), zwischen Ki-67 und der Expression der
RNA von Survivin (Koeffizient: 0,633; p= 0,00) (Abb.17 D) und schließlich auch
zwischen der RNA-Expression von P-Glycoprotein und Survivin (Koeffizient: 0,503;
p= 0,001) (Abb.17 E) festgestellt werden. Die Korrelationen sind in den Abbildungen
17 A bis E graphisch dargestellt.
Zwischen der Expression der RNA und des Proteins konnte weder für P-Glycoprotein
noch für Survivin eine statistisch signifikante Korrelation nachgewiesen werden.
MiB-1 (in %) (Immunhistochemie)
40
17 A
Koeffizient: 0,152;
p = 0,048
30
20
10
R-Quadrat linear =
0,023
0
0
500
1000
1500
2000
2500
3000
Mittlere optische Dichte Survivin (Immunhistochemie)
Abb. 17 A Korrelation zwischen der Survivin-Expression und dem Anteil an MiB-1 positiven Zellen
Ergebnisse
Koeffizient: 0,197;
p = 0,01
17 B
100
Mittlere optische Dichte Caspase-3 (in %)
(Immunhistochemie)
45
80
60
40
20
R-Quadrat linear =
0,039
0
0
500
1000
1500
2000
2500
3000
Mittlere optische Dichte Survivin (Immunhistochemie)
Abb. 17 B Korrelation zwischen der Survivin-Expression und dem Anteil an Caspase-3 positiven
Zellen
Mittlere optische Dichte P-Glycoprotein (in-situHybridisierung)
5000
Koeffizient: 0,417;
p = 0,009
17 C
4000
3000
2000
1000
R-Quadrat linear =
0,174
0
0
5
10
15
20
25
30
Mittlere optische Dichte MiB-1 (Immunhistochemie)
Abb. 17 C Korrelation zwischen dem Anteil an MiB-1 positiven Zellen und der RNA-Expression
von P-Glycoprotein
Mittlere optische Dichte Survivin (in-situ-Hybridisierung)
Ergebnisse
8000
46
Koeffizient: 0,633;
p = 0,00
17 D
6000
4000
2000
R-Quadrat linear =
0,401
0
0
5
10
15
20
25
30
Mittlere optische Dichte MiB-1 (Immunhistochemie)
Abb. 17 D Korrelation zwischen dem Anteil an MiB-1 positiven Zellen und der RNA-Expression
von Survivin
Mittlere optische Dichte P-Glycoprotein (in-situHybridisierung)
5000
Koeffizient: 0,503;
p = 0,001
17 E
4000
3000
2000
1000
R-Quadrat linear =
0,253
0
0
2000
4000
6000
8000
Mittlere optische Dichte Survivin (in-situ-Hybridisierung)
Abb. 17 E Korrelation zwischen der RNA-Expression von Survivin und P-Glycoprotein
Diskussion
47
4. Diskussion
Bei astrozytären Hirntumoren wurde in unterschiedlichen Studien bereits der Zusammenhang einer hohen Survivinexpression mit einer schlechten Langzeitprognose
untersucht [CHAKRAVARTI et al., 2002; ROUSSEAU et al., 2006; SASAKI et al., 2002].
Andere Untersuchungen konnten bei Astrozytomen eine Zunahme der PGlycoprotein (P-gp)-Expression und somit der Arzneimittelresistenz mit steigendem
WHO-Malignitätsgrad belegen [ASHMORE et al., 1999; DEMEULE et al., 2001; LEE et
al., 2004], was letztlich eine schlechtere Prognose für den Patienten bedeutet. Auch
die Expression von Ki-67 und Caspase-3 wurde von einigen Arbeitsgruppen für
Astrozytome untersucht. Dabei gilt ein hoher Proliferationsindex als prognostisch
ungünstig, ein hoher Apoptoseindex hingegen als vorteilhaft [KAYASELCUK et al.,
2004; KOBAYASHI et al., 2007; PREUSSER et al., 2005]. Im Vergleich zu Astrozytomen
wird den Oligodendrogliomen eine bessere Prognose zugeschrieben [BAEHRING J M,
2005; ENGELHARDT et al., 2003; FORTIN et al., 2001; HARTMANN C et al., 2004; TROST
D et al, 2007; VAN
bezüglich
der
DEN
BENT, 2001, 2007], es gibt jedoch kaum bzw. keine Daten
Expression
von
Survivin,
P-gp,
Ki-67
und
Caspase-3
bei
Oligodendrogliomen.
In der vorliegenden Arbeit wurden daher astrozytäre und oligodendrogliale
Hirntumoren unterschiedlicher WHO Grade auf die Expression von Survivin, P-gp, Ki67 und Caspase-3 untersucht und die Ergebnisse quantifiziert.
Die Häufigkeitsverteilung der Hirntumorsubtypen in den untersuchten Fällen verhält
sich ähnlich zu bereits publizierten Daten. Nach Angaben der WHO bzw. des Central
Brain Tumor Registry (CBTR-US) sind Astrozytome häufiger als Oligodendrogliome.
Dieses konnte bei den in der vorliegenden Arbeit untersuchten Gewebsproben
bestätigt werden. Es wurden 105 Fälle von astrozytären Hirntumoren und 13 Fälle
von Oligodendrogliomen untersucht. Insbesondere bei den Astrozytomen lag die
Fallzahl an archivierten Fällen jedoch ursprünglich viel höher, allerdings wurden in
einer ersten Vorauswahl bereits die Fälle eliminiert, bei denen 50 % und mehr des
Gewebes
Nekrosen
aufwiesen.
Der
Altersdurchschnitt
der
Patienten
bei
Diagnosestellung der astrozytären Hirntumoren liegt weitgehend im Rahmen der von
OHGAKI et al. (2005) ermittelten Werte. Die Lokalisationen der unterschiedlichen
Hirntumoren sind, soweit sie aus den Akten ermittelt werden konnten (vergleiche
Abb. 4 A - D im Ergebnisteil), in Einklang mit Untersuchungen von WELLER et al.
(2006) bzw. WICK et al. (2006). Diese geben folgende bevorzugte Lokalisationen an:
Diskussion
48
Astrozytome
WHO
Grad
I:
Kleinhirn,
Astrozytome
WHO
Grad
II:
Großhirnhemisphären, Astrozytome WHO Grad III: Frontal- und Temporallappen,
Astrozytome WHO Grad IV: Frontal- und Temporallappen, aber auch multiple
Lokalisationen,
Oligodendrogliome
WHO
Grad
II:
Großhirnhemisphären,
Oligodendrogliome WHO Grad III: Frontallappen. Damit korreliert unser Material mit
den publizierten Daten.
Im Vergleich zu den Daten der WHO bzw. der CBTR-US und den von OHGAKI et al.
(2005) veröffentlichten Daten ergeben sich für das untersuchte Kollektiv an
Oligodendrogliomen
Diagnosestellung
kleinere
und
der
Abweichungen
beim
Häufigkeitsverteilung.
Das
mittleren
mittlere
Alter
bei
Alter
bei
Diagnosestellung liegt bei dem untersuchten Kollektiv für die Oligodendrogliome
Grad II geringfügig über und für Grad III etwas unter den von OGAHKI angegebenen
Werten. Die Häufigkeiten für Oligodendrogliome Grad II sind etwas geringer bzw für
Oligodendrogliome des WHO Grades III etwas häufiger im Vergleich zu den von der
WHO bzw. CBTR-US angegebenen Zahlen. Diese Abweichungen sind mit den relativ
geringen Fallzahlen des untersuchten Kollektivs zu erklären. Bei einem größeren
Kollektiv wären die Daten mutmaßlich ausgewogener (vergleiche Tab. 5 im
Ergebnisteil).
4.1. Astrozytäre Hirntumoren
In der vorliegenden Arbeit fanden sich bei der Untersuchung der astrozytären
Hirntumoren auf die Expression von P-gp immunhistochemisch und durch in situ
Hybridisierung mit zunehmendem Anaplasiegrad steigende P-gp-Expressionslevel.
Diese Ergebnisse sind vereinbar mit den Daten der Arbeitsgruppen von DIETZMANN
und von
VON
BOSSANYI, die bei astrozytären Hirntumoren eine vermehrte Expression
von P-gp mit zunehmendem WHO Grad feststellen konnten [DIETZMANN et al., 1994;
VON BOSSANYI
et al. 1997].
Auffällig war, dass sich sowohl in der immunhistochemischen Untersuchung als auch
in der in situ Hybridisierung bei den Astrozytomen jeweils ein Abfall der Expression
von WHO Grad III zu WHO Grad IV zeigte. Das Absinken der P-gp-Expression von
Astrozytomen des WHO Grades III zu WHO Grad IV widerspricht zunächst der
Annahme, dass hohe P-gp-Expressionslevel mit hoher Malignität und einer
schlechten Prognose vergesellschaftet sind. Obwohl die Gewebsproben sorgfältig
ausgewählt wurden, waren bei den Glioblastomen (Astrozytom WHO Grad IV) immer
Diskussion
49
wieder auch größere Nekrosen und Einblutungen vorhanden, da diese, neben
zellmorphologischen Kriterien, die entscheidende Voraussetzung für die Diagnose
„Glioblastoma multiforme“ darstellen. Die nekrotischen bzw. eingebluteten Areale
können sich bei den verschiedenen Nachweismethoden färberisch „stumm“
darstellen, woraus niedrigere Expressionslevel resultieren. Dies würde erklären, dass
der Expressionsabfall alle in der vorliegenden Arbeit untersuchten Proteine betrifft.
Außerdem ist es möglich, dass P-gp nur einer von zahlreichen Faktoren ist, die bei
der „multidrug-resistance“ (MDR) maligner Hirntumoren von Bedeutung sind, so dass
es vorstellbar ist, dass gerade bei den hochmalignen Astrozytomen des WHO
Grades IV (Glioblastoma multiforme) die Überexpression von P-gp nicht (mehr) die
wichtigste Rolle spielt.
In unterschiedlichen Studien wurde die Expression von P-gp an verschiedenen
primären Hirntumoren untersucht [BECKER et al., 1991; LEWEKE et al., 1998; HENSON
et al., 1992; NABORS et al., 1991]. Die Überexpression von P-gp an der Blut-HirnSchranke bzw. den Tumorzellen selbst wird mit verantwortlich gemacht für das sehr
schlechte Ansprechen von Hirntumoren auf Chemotherapie [LEWEKE et al., 1998].
P-gp transportiert in seiner Eigenschaft als aktive Effluxpumpe in die Zelle
aufgenommene Substanzen wieder heraus und schützt das ZNS dadurch vor
möglicherweise schädlichen Effekten [LÖSCHER et al., 2005; AMBUDKAR et al., 2003;
BORST et al., 2002]. Diese Funktion stellt auch das Korrelat der P-gp-vermittelten
Chemoresistenz von Tumorzellen dar. Chemisch und funktionell verschiedene
Chemotherapeutika (wie z.B. Doxorubicin, Daunorubicin, Vincristin, Vinblastin,
Actinomycin-D, Paclitaxel, Docetaxel, Etoposide, Teniposide, Bisantrene oder
Gleevec) werden von P-gp am Eintritt in das Gliom gehindert bzw. aus den Zellen
entfernt [AMBUDKAR et al., 2003; BORST et al., 2002; SAUNA et al., 2001]. Die durch Pgp vermittelte Resistenz gegenüber Chemotherapeutika konnte an verschiedenen
Tumoren (z.B. Adenokarzinomen des Gastrointestinaltraktes und der Lunge,
Ovarialkarzinomen sowie Tumoren des ZNS) gezeigt werden [SHI et al., 2008; YEH et
al., 2005;
MOHRI et al., 2000; TEWS et al., 2000; MEIJER GA et al., 1999]. Die
Bedeutung der P-gp-Expression bei malignen Hirntumoren wird jedoch kontrovers
diskutiert, da in den verschiedenen Studien erhebliche Streuungen in der P-gpExpression bei den unterschiedlichen Malignitätsgraden auftraten [TEWS et al., 2000].
Die
Ergebnisse
sind
zudem
nur
bedingt
miteinander
vergleichbar,
da
unterschiedliche Methoden zum Nachweis und zur Auswertung benutzt wurden. Die
Diskussion
50
Arbeitsgruppe um SPIEGL-KREINECKER untersuchte die P-gp-Expression mittels RTPCR an Zellkulturen von unterschiedlichen Hirntumoren und fand bei Astrozytomen
nur in wenigen Fällen eine Expression [SPIEGL-KREINECKER et al., 2002]. TEWS und
seine Mitarbeiter konnten in ihrer immunhistochmischen Untersuchung von 44 in
paraffingebetteten Gewebsproben astrozytärer Hirntumoren zwar ansteigende
Expressionslevel mit zunehmendem Malignitätsgrad nachweisen, die Ergebnisse
waren jedoch nicht statistisch signifikant [TEWS et al., 2000]. Des Weiteren finden
sich in der Literatur Beschreibungen von Kreuzreaktionen des auch in dieser
Untersuchung verwendeten Antikörpers JSB-1 mit Pyruvatcarboxylase, einem
Enzym, das reichlich in Mitochondrien vorkommt, wodurch in Tumoren z. T. sehr
hohe Expressionslevels gemessen wurden [ASHMORE et al., 1999]. Andererseits
berichten
VON
BOSSANYI et al. (1997) über die überlegene Nachweismethode mittels
JSB-1 im Vergleich zu anderen monoklonalen Antikörpern. Insgesamt ist die isoliert
betrachtete Aussagekraft der P-gp-Expression bei astrozytären Hirntumoren in
Hinblick auf die Prognose als eingeschränkt zu werten, weil aus einem schwachen
oder
negativen
Ausfall
der
immunhistologischen
Reaktion
vor
allem
bei
höhergradigen Hirntumoren nicht mit ausreichender Sicherheit eine günstige
Prognose und eine bessere Chemosensitivität abgeleitet werden kann [DIETZMANN et
al., 1994; TEWS et al., 2000].
Ein weiterer Kandidat als prognostischer Marker ist Survivin, ein Mitglied der Familie
der „Inhibitors-of-Apoptosis-Proteins“ (IAP), das mutmaßlich durch Inhibition der
Caspase-Kaskade den programmierten Zelltod (Apoptose) von Tumorzellen
verhindert. Es gibt einige Hinweise, dass zwischen Survivin und P-gp eine
Wechselbeziehung bei der Entstehung von „multidrug-resistance“ (MDR) besteht,
wobei die genauen Mechanismen der Zusammenhänge nicht bekannt sind. LIU et al.
(2007) stellten aufgrund ihrer Untersuchungen der mRNA-Expression von P-gp bzw.
Survivin an Zellkulturen eines Adenokarzinomes der menschlichen Brustdrüse und
der dazugehörigen Adriamycin-resistenten Variante die Hypothese auf, dass eine
verstärkte Expression von P-gp den intrazellulären Transport von Survivin in die
verschiedenen Zellkompartimente erleichtert und Survivin so die Zielorte seiner
promitotischen und antiapoptotischen Wirkung leichter erreichen kann. Sie
vermuteten zudem einen modulierenden Einfluß von Survivin auf den P-gp-Umsatz in
der Zelle.
Diskussion
51
Daher wurden in der vorliegenden Untersuchung die Hirntumoren immunhistochemisch und durch in situ Hybridisierung auch auf die Expression von Survivin
untersucht.
An zahlreichen unterschiedlichen Tumorerkrankungen wie z. B. Karzinomen des
Gastrointestinaltraktes, Mammakarzinomen, Prostatakarzinomen oder Lymphomen
wurde die Expression von Survivin untersucht [CHIOU et al., 2003; KAJIWARA et al.,
2003]. Von unterschiedlichen Arbeitsgruppen konnte gezeigt werden, dass eine
höhere Survivinexpression mit einer höheren Malignität und somit mit einer
schlechteren Prognose einhergeht. Die Arbeitsgruppe um CHAKRAVARTI untersuchte
die Protein-Expressionslevels von Survivin an 92 Gliomen mittels des Western Blot
Analyseverfahren. KAJIWARA und seine Mitarbeiter führten eine PCR-Analyse der
mRNA-Expression von Survivin an 43 astrozytären Hirntumoren durch. Insbesondere
für Astrozytome konnte nachgewiesen werden, dass die Survivinexpression mit einer
schlechteren Prognose assoziiert ist [KAJIWARA et al., 2003; CHAKRAVARTI et al.,
2002]. SASAKI et al. (2002) fanden bei immunhistochemischen Untersuchungen von
112 primären Hirntumoren in allen Hirntumoren eine Expression von Survivin, wobei
die Expression bei den Glioblastomen am höchsten war.
In der vorliegenden Arbeit konnte bei den Astrozytomen ebenfalls ein Anstieg der
Survivinexpression (Protein und RNA) mit zunehmendem Anaplasiegrad gezeigt
werden. Jedoch war ein Abfall der Expression bei den Astrozytomen des WHOGrades III zu WHO Grad IV erkennbar. Die Arbeitsgruppe um CHAKRAVARTI (2002)
stellte bei einer Untersuchung von 92 Gliomen fest, dass bei etwa 40 % der
Glioblastome keine Expression von Survivin nachzuweisen war. Es gibt Hinweise,
dass vor allem die Glioblastome nicht nur Survivin exprimieren, sondern dass auch
andere Proteine aus der „Inhibitors-of-apoptosis“-(IAPs)-Familie aktiviert werden, um
der Apoptose zu entgehen. Neben der Annahme, dass die bei den Glioblastomen
naturgemäß auftretende Nekrose sich immunhistochemisch „stumm“ verhält, ist dies
eine weitere Erklärung für das Absinken der Survivin-Expressionslevel bei den
Astrozytomen WHO Grad III zu WHO Grad IV.
Die Frage nach der Wertigkeit von Survivin als prognostischer Faktor wird durchaus
kontrovers diskutiert. Die Arbeitsgruppe von UEMATSU (2005) stellte bei einer
immunhistochemischen Untersuchung von 29 Astrozytomen fest, dass der
Survivinindex im Vergleich zum Proliferationsindex bei den niedrigmalignen
Astrozytomen ein sensitiverer Marker zur Abschätzung der Prognose ist. ROUSSEAU
Diskussion
52
et al. (2006) untersuchten 20 Gangliogliome immunhistochemisch auf eine
Expression von Survivin und empfehlen bei hohen Survivinexpressionslevel eine
besonders engmaschige Nachkontrolle, da hohe Survivinlevel mit einer höheren
Malignität der Tumoren gleichzusetzen waren. Dagegen fanden PREUSSER et al.
(2005) in einer immunhistochemischen Untersuchung von 104 Glioblastomen keinen
signifikanten Zusammenhang der Survivinexpression mit dem Gesamtüberleben bei
malignen Hirntumoren. Die Ergebnisse der vorliegenden Arbeit erlauben keine
Aussage über die Korrelation des Survivin-Expressionslevels mit der Überlebenszeit
der Patienten, da keine einheitlich erhobenen Verlaufsdaten vorliegen. Dies hängt
auch
mit
der
oftmals
andernorts
durchgeführten
Weiterbehandlung
bzw.
Weiterbetreuung der Patienten, vor allem auch in der Palliativsituation, zusammen.
Zur weiteren Charakterisierung der proliferativen Aktivität wurden die Präparate auf
die Expression des Ki-67-Antigens untersucht. Das Ki-67-Antigen zeigt im Zellzyklus
ein Auftreten, das zeitlich mit dem von Survivin vergleichbar ist. Es handelt sich dabei
um einen nukleären Proliferationsmarker, der während des Zellzyklus in der G1-, S-,
G2- und der M-Phase exprimiert wird, wohingegen er in der Ruhephase, der G0Phase des Zellzyklus, nicht nachweisbar ist. Zellpopulationen, die stark proliferieren
und sich zu einem großen Teil in einer aktiven Phase des Zellzyklus befinden,
exprimieren somit sehr viel Ki-67. Dieses Antigen kann mit dem gegen Ki-67
gerichteten Antikörper MiB-1 spezifisch nachgewiesen werden und erlaubt somit eine
Aussage über die Proliferationsaktivität eines Gewebes [MC CORMICK et al., 1993].
Mit steigendem Malignitätsgrad war bei den Astrozytomen ein Anstieg des
Proliferationsindex nachweisbar, wobei auch hier ein Abfall des Index von
Malignitätsgrad III zu IV zu erkennen war. Die Zunahme des Proliferationsindex als
Maß für die Aggressivität des Tumors und somit für eine schlechtere Prognose wurde
für astrozytäre Hirntumoren der verschiedenen WHO-Grade auch von der
Arbeitsgruppe um RALTE (2001) nachgewiesen. Der MiB-1-Index stellt eine
Messeinheit für die Proliferation eines Gewebes, d.h. für die mitotische Aktivität bzw.
für die Malignität dar. Somit überrascht die in der vorliegenden Arbeit festgestellte
positive Korrelation der Expression von Survivin und des MiB-1-Index nicht, da
Survivin eine wichtige Rolle in der Zellteilung spielt [LI et al., 2005; SKOUFIAS et al.,
2000; WHEATLEY et al., 2001].
Über die prognostische Wertigkeit des Proliferationsindex gibt es unterschiedliche
Ansichten. UEMATSU et al. (2005) kamen zu dem Schluss, dass sich insbesondere für
Diskussion
53
die niedrigmalignen Astrozytome der Survivinindex für Prognoseaussagen eher
eignet. Bislang die Frage ungeklärt, welche Grenzwerte des Proliferationsindexes für
die jeweiligen Malignitätsgrade gelten. Da selbst innerhalb einer Gewebsprobe bei
der Durchmusterung mehrerer Gesichtsfelder Unterschiede in der Proliferation
auftreten und zudem noch die Methoden zur Auswertung (Anzahl der untersuchten
Gesichtsfelder, ausschließliche Berücksichtigung von Arealen mit der höchsten
Proliferation)
erheblich
variieren,
konnte
bisher
auch
beim
Vergleich
der
verschiedenen Publikationen kein eindeutiger Grenzwert für den Proliferationsindex
festgelegt werden [REAVEY-CANTWELL et al., 2001; RICKERT et al., 2005].
Als Gegenprobe zum Proliferations- bzw. Survivinindex wurde immunhistochemisch
der Apoptoseindex ermittelt. Die aktivierte Caspase-3 ist eine der Effektorcaspasen
und eines der Schlüsselproteine der Apoptose. Sie wird zur Ermittlung des
Apoptoseindex in einem Gewebe verwendet [DUAN et al., 2003; GOWN et al., 2002].
Die hohe Expression von aktivierter Caspase-3 gilt als Anhaltspunkt für eine
niedrigere Malignität [KOBAYASHi et al., 2007]. Umgekehrt bedeutet dies, dass mit
ansteigendem Malignitätsgrad die Expression von aktivierter Caspase-3 absinken
sollte.
In der vorliegenden Arbeit fand sich bei den Astrozytomen ein mit steigendem
Malignitätsgrad sinkender Apoptoseindex. Dies steht im Einklang mit unserer
Hypothese sowie mit anderen Daten. So fanden KOBAYASHI et al. (2007) ebenfalls
sinkende Apoptoseindices bei steigendem Anaplasiegrad in Gewebsproben von 65
Patienten mit unterschiedlichen astrozytären Hirntumoren.
Bislang gibt es erst wenige Publikationen hinsichtlich der prognostischen Bedeutung
des Apoptoseindex bei malignen Hirntumoren. KOBAYASHi et al. (2007) halten die
immunhistochemische Bestimmung von aktivierter Caspase-3 für eine nützliche
Untersuchung, um Aussagen über das Langzeitüberleben von Patienten mit
Astrozytomen treffen zu können.
4.2. Oligodendrogliale Hirntumoren
In der vorliegenden Arbeit fanden sich bei der immunhistochemischen Untersuchung
der Oligodendrogliome ebenfalls mit steigendem Malignitätsgrad ansteigende P-gpLevel. Im Vergleich mit den Astrozytomen waren die P-gp-Expressionslevel höher.
Zur Expression von P-gp in Oligodendrogliomen gibt es nur wenige veröffentlichte
Daten. Die Arbeitsgruppe um DEMEULE konnte mittels Western Blot Analyse an
Diskussion
54
Homogenisaten von unterschiedlichen primären und sekundären Hirntumoren,
darunter auch anaplastische Oligodendrogliome, eine Expression von P-gp
nachweisen [DEMEULE et al, 2001]. Nach ASHMORE et al. (1999), die Zellkulturen
einer Reihe unterschiedlicher Hirntumoren immunzytochemisch mit verschiedenen
P-gp-Antikörpern untersuchten, ist die Expression von P-gp bei Oligodendrogliomen
im Allgemeinen niedrig, vergleichbar mit benignen Hirntumoren. Allerdings scheint
diese Aussage sehr allgemein gehalten, da es auch relativ gutartige Hirntumoren
gibt, die eine Überexpression von P-gp aufweisen können. Dysembryoplastische
neuroepitheliale Tumoren (DNT), die oft eine Ursache für eine medikamentös nur
unzureichend therapierbare Epilepsie darstellen, sind verhältnismäßig benigne
Hirntumoren. In einer Studie von 14 DNT-Fällen untersuchten VOGELGESANG et al.
(2004) die Expression von P-gp bzw. anderen Multidrug-Transportern mittels
Immunhistochemie. Dabei fand sich eine erhöhte Expression aller untersuchten ABCTransporter
(P-gp,
BCRP,
MRP2,
MRP5)
innerhalb
des
Tumorgewebes.
Interessanterweise zeigte sich eine unterschiedliche Lokalisation der verschiedenen
Transportproteine, so dass anzunehmen ist, dass der Einfluss der ABC-Transporter
auf die Entwicklung einer Pharmakoresistenz nicht auf die Blut-Hirn-Schranke
begrenzt ist.
Bei der Untersuchung der Oligodendrogliome auf die Expression von Survivin fand
sich mit steigendem Malignitätsgrad ein Anstieg der Protein- und RNA-Level. Die
Survivin- Expressionslevel lagen bei den Oligodendrogliomen niedriger als bei den
Astrozytomen mit vergleichbarem WHO-Malignitätsgrad, was auf eine geringere
Hemmung der Apoptose hinweist. In ähnlicher Weise wie die Expression von
Survivin
verhielt
sich
auch
der
bei
den
Oligodendrogliomen
untersuchte
Proliferationsindex. Mit ansteigendem Malignitätsgrad nahm der Proliferationsindex
zu, er blieb jedoch auf einem niedrigeren Level als bei den Astrozytomen. Diese
Ergebnisse unterstützen die Aussage von ENGELHARD et al. (2003) bzw. TROST et al.
(2007), wonach Oligodendrogliome im Vergleich zu Astrozytomen eine bessere
Prognose aufweisen.
Wie auch bei den Astrozytomen wurde anhand der Caspase-3-Färbung die
antiproliferative Aktivität mit dem Apoptoseindex untersucht. Die Apoptoseindices
veränderten sich bei den Oligodendrogliomen mit steigendem WHO-Grad nicht, sie
lagen jedoch auf einem signifikant niedrigeren Niveau als die der Astrozytome. Die
niedrigeren Werte bei den Oligodendrogliomen stehen auf den ersten Blick im
Diskussion
55
Widerspruch zur Annahme, dass eine niedrigere Expression von aktivierter Caspase3 eine höhere Malignität bedeutet. Bei der Interpretation dieses Ergebnisses ist
allerdings zum einen die verhältnismäßig geringe Anzahl der Oligodendrogliome, die
in dieser Studie untersucht wurden, zu berücksichtigen. Zum anderen handelt es sich
bei den Tumoren, bei denen bislang hohe Level an aktivierter Caspase-3
nachgewiesen werden konnten, vor allem um hochmaligne Tumoren wie z. B.
maligne Lymphome, Ösophaguskarzinome und das kleinzellige Bronchialkarzinom
[KOBAYASHi et al., 2007]. Das bedeutet, dass bei der großen Zahl gering
differenzierter Tumorzellen auch die Anzahl der Zellen, die apoptotisch werden
können, größer ist. Hierin ergibt sich eine weitere mögliche Erklärung für die
verhältnismäßig
niedrigeren
Level
an
aktiverter
Caspase-3
bei
den
Oligodendrogliomen: da hier im Verhältnis weniger anaplastische Tumorzellen
auftreten, befinden sich von diesen Tumorzellen auch weniger in Apoptose. Dies wird
in der vorliegenden Untersuchung zudem durch die positive Korrelation zwischen der
Survivin-Protein-Expression und dem Nachweis der aktivierten Caspase-3 deutlich.
Die Daten der unterschiedlichen Expressionmuster für P-gp, Survivin, Ki-67 und
Caspase-3 der Oligodendrogliome im Vergleich mit den Astrozytomen erklären
zumindest zum Teil, dass sich oligodendrogliale Hirntumoren prognostisch günstiger
verhalten als Astrozytome.
Prognostisch
günstig
ist
das
Zusammentreffen
folgender
Parameter:
oligodendroglialer Tumor, niedrige P-Glycoproteinexpression, geringe Expression
von Survivin, niedriger Proliferationsindex, hoher Apoptoseindex.
Dementsprechend ungünstig ist folgende Konstellation: höhergradiger astrozytärer
Tumor, hohe Expression von P-Glycoprotein, hohe Expression von Survivin, hoher
Proliferationsindex, niedriger Apoptoseindex.
Um festzulegen, welche Grenzen der P-gp-, Survivin-, Caspase-3- und Ki-67Expression prognostisch relevant sind, sollten weitere prospektive Untersuchungen
durchgeführt werden, in denen der klinische Verlauf einheitlich erhoben und genau
untersucht wird. Dabei wären vor allem Untersuchungen an deutlich größeren
Kollektiven von Oligodendrogliomen wertvoll.
Die
erhobenen
Daten
lassen
Rückschlüsse
auf
mögliche
therapeutische
Konsequenzen zu. In den letzten Jahren wurden erhebliche Anstrengungen
unternommen, um die Chemoresistenz von Hirntumoren zu durchbrechen, um so die
Diskussion
56
therapeutischen Möglichkeiten besser nutzen zu können. BOROWSKI et al. (2005)
formulieren vier mögliche Strategien, um die P-gp-vermittelte Resistenz von
Tumorzellen aufzuheben: die Entwicklung von Chemotherapeutika, die aufgrund
ihrer Beschaffenheit kein Substrat für den aktiven Transport durch P-gp darstellen;
den Einsatz von P-gp-Inhibitoren; die Herstellung von Zytostatika, die sich durch eine
besonders schnelle Aufnahme in die Zelle auszeichnen, um so rein quantitativ den
Abtransport zu übertreffen sowie den Einsatz von Wirkstoffzusammensetzungen, bei
denen, neben dem Wirkstoff, mehrere Bestandteile ein Substrat für P-gp darstellen
und somit verhältnismäßig weniger Wirkstoff wieder aus der Zelle entfernt wird. Die
Entwicklung neuer Substanzen ist ein langwieriger Prozess und es besteht immer die
Gefahr einer erheblichen Toxizität im nicht-tumoralen Gewebe. Auch der Einsatz von
P-gp-Inhibitoren (z.B. Verapamil) ist nicht immer unproblematisch, da nicht nur der
Auswärtstransport
aus
der
Tumorzelle
gehemmt
wird,
sondern
auch
die
physiologische Funktion von P-gp an natürlichen Barrieren wie z.B. der Blut-HirnSchranke oder der Mukosa des Gastrointestinaltraktes (BOROWSKI E et al., 2005;
CHOI CH, 2005). P-gp unterliegt, wie auch andere Proteine, im Rahmen der
Apoptose einer caspase-abhängigen Spaltung (MANTOVANI et al., 2006). Ein weiterer
möglicher Therapieansatz wäre also in Form einer Umkehr bzw. Verhinderung der
Apoptose-Inhibition, wie sie z.B. durch Survivin vermittelt wird, denkbar. Möglich wird
die Inhibition von Survivin z.B. durch den Einsatz von Survivin-AntisenseOligonukleotiden, wie sie von SHANKAR et al. (2001) bzw. ANSELL et al. (2004) mit
Erfolg an Zellkulturen von Neuroblastom- bzw Oligodendrogliomzellen und an
Lymphomzellen eingesetzt wurden. Inwieweit sich diese Erkenntnisse auch in eine
am Patienten einsetzbare Therapie umsetzen lassen, werden künftige Studien
zeigen.
Da der Entstehung bzw. Aufrechterhaltung der Chemoresistenz von Tumorzellen
offenbar ein noch unzureichend verstandenes, multifaktorielles Geschehen zugrunde
liegt, das sich aus völlig unterschiedlichen Mechanismen, unter anderem dem aktiven
Abtransport von Chemotherapeutika und der Immortalisierung der Tumorzelle durch
Inhibition
der
Caspasekaskade,
zusammensetzt,
muss
weiter
intensiv
am
Zusammenwirken bzw. der Funktion der verschiedenen Komponenten, aber auch an
möglichen therapeutischen Optionen geforscht werden.
Zusammenfassung
57
5. Zusammenfassung
In Deutschland gibt es pro Jahr etwa 8000 Neuerkrankungen an primären
Hirntumoren. Bei Erwachsenen stehen die neuroepithelialen Hirntumoren, zu denen
die Astrozytome und die Oligodendrogliome zählen, im Vordergrund. Die größte
Gruppe stellen die Astrozytome. Diese Tumoren sind verhältnismäßig häufig und
hinsichtlich verschiedener prognostischer Marker eingehend untersucht worden.
Oligodendrogliome sind seltener und weniger ausführlich untersucht als Astrozytome.
Ihnen wird im Vergleich zu den Astrozytomen eine bessere Prognose zugeschrieben.
In der vorliegenden Arbeit wurden vier unterschiedliche Prognosemarker untersucht:
P-Glycoprotein (P-gp), Survivin, Ki-67 und Caspase-3. Bei den Astrozytomen fand
sich mit steigendem Malignitätsgrad eine Zunahme der Expression von P-gp,
Survivin und Ki-67, während die Expression von Caspase-3 abfiel. Bei den
Oligodendrogliomen stellten sich ebenfalls mit zunehmendem Anaplasiegrad
steigende Expressionslevel von P-gp, Survivin und Ki-67 dar, diese jedoch auf einem
signifikant niedrigeren Niveau als bei den Astrozytomen. Die Level für Caspase-3
waren niedriger als bei den Astrozytomen. Dies bedeutet, dass mit zunehmendem
Malignitätsgrad der Hirntumoren die proliferative Aktivität zu-, und die apoptotische
Aktivität abnimmt. Dies steht im Einklang mit dem biologischen Verhalten der Gliome
in Abhängigkeit vom Malignitätsgrad.
Die signifikant niedrigeren Expressionslevels bei den Oligodendrogliomen im
Vergleich
mit
den
Astrozytomen
untermauern
weiter
die
These,
dass
oligodendroglialen Hirntumoren eine bessere Prognose zukommt als astrozytären
Hirntumoren.
Um sichere, für die Prognose relevante Grenzwerte für die einzelnen Marker
bestimmen zu können, sollten weitere prospektive Studien durchgeführt werden, in
denen der klinische Verlauf einheitlich erhoben und analysiert wird. Hierbei wären vor
allem Untersuchungen an größeren Kollektiven von Oligodendrogliomen sinnvoll.
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(Frankreich), 2007
Ein Teil der Ergebnisse der vorliegenden Arbeit wurde als Poster bei der 52.
Jahrestagung der Deutschen Gesellschaft für Neuropathologie und Neuroanatomie
(DGNN) (05.09.2007 – 08.09.2007, Greifswald) vorgestellt.
Abstract in: Acta Neuropatholgica (2007), 114: 320.
Eidesstattliche Erklärung
69
7. Eidesstattliche Erklärung
Hiermit erkläre ich, dass ich die vorliegende Dissertation selbständig verfasst und
keine anderen als die angegebenen Hilfsmittel benutzt habe.
Die Dissertation ist bisher keiner anderen Fakultät vorgelegt worden.
Ich erkläre, dass ich bisher kein Promotionsverfahren erfolglos beendet habe und
dass eine Aberkennung eines bereits erworbenen Doktorgrades nicht vorliegt.
Datum
Unterschrift
Lebenslauf
70
8. Lebenslauf
Alexandra Dreßler (geb. Mesko)
Matterhornstr. 22 b
81825 München
Geboren am 19.06.1976 in München
Beruflicher Werdegang
01.08.2003 – 30.09.2004 Ärztin im Praktikum in der 1. Chirurgischen Abteilung,
Krankenhaus Neuperlach, München
01.10.2004 – 31.03.2005 Assistenzärztin in der 1. Chirurgischen Abteilung,
Krankenhaus Neuperlach, München
01.09.2005 - 30.11.2007 Assistenzärztin im Institut für Pathologie der Ernst-MoritzArndt-Universität, Greifswald
01.01.2008 – 31.05.2009 Assistenzärztin im Institut für Pathologie der LudwigMaximilian-Universität, München
seit 01.06.2009
Assistenzärztin im Institut für Pathologie des Klinikums
Memmingen
Berufsausbildung/Studium__________________________________
5/1996 – 8/1998
Vorklinisches Studium/ LMU München
9/1998 – 4/2002
Klinisches Studium/ LMU München
4/2002 – 8/2002
I. Tertial des Praktischen Jahres (Kinderheilkunde) im
Zentralklinikum Augsburg
II. Tertial des Praktischen Jahres (Innere Medizin) im
Zentralklinikum Augsburg (1. Hälfte)
II. Tertial des Praktischen Jahres (Innere Medizin)
University of Toronto (2. Hälfte)
III. Tertial des Praktischen Jahres (Chirurgie)
Krankenhaus Neuperlach München
Abschluß des Studiums durch bestandenes
III. Staatsexamen
8/2002 – 9/2002
9/2002 – 11/2002
12/2002 – 3/2003
08.05.2003
01.09.1995 - 30.11.1995 Krankenpflegepraktikum KKH Mering
01.03.1999-31.03.1999
01.10.1999-31.10.1999
16.08.2000-15.09.2000
18.09.2000-19.10.2000
Famulatur Innere Medizin KKH Mering
Famulatur Chirurgie KKH Mering
Famulatur Kinderchirurgie München Schwabing
Famulatur Kinderarztpraxis Dr. Riechert, München
Schulbildung________________________________________________
Sept .1982 - Jul.1986
Sept. 1986 - Jul.1987
Sept. 1987 - Jul.1989
Grundschule Penzberg
Gymnasium Penzberg
Rudolf-Diesel-Gymnasium Augsburg
Lebenslauf
71
Sept. 1989 - Mai 1995
Gymnasium Schondorf am Ammersee
Abitur im Mai 1995
9. Danksagung
Ich bedanke mich bei meinem Doktorvater, Herrn Prof. Dr. Rolf Warzok für die
freundliche Überlassung des Themas sowie für die fachliche Beratung und
Unterstützung, die er mir in vielen Gesprächen zuteil werden ließ. Dies gilt
insbesondere auch für Frau PD Dr. Silke Vogelgesang, die mir nicht nur bei der
statistischen Aufarbeitung der Ergebnisse sondern auch bei der Korrektur der Arbeit
mit Rat und Tat zur Seite stand.
Ohne die Unterstützung von Frau Dr. Michele Peters und Frau Dr. Christiane KunertKeil wäre weder die Planung noch die Umsetzung des experimentellen Teils der
Arbeit möglich gewesen. Von Frau Maria Grumbt und Frau Eva Simon kamen
zahlreiche
Vorversuche
und
Optimierungen
der
Protokolle
für
die
immunhistochemische Untersuchung und die in situ Hybridisierung. Frau Cathrin
Müller, Frau Anke Wolter, Frau Heike Reiter und Frau Sigrid Balk fertigten die
benötigten Serienschnitte an und führten die standardisierten Färbungen zum Teil
auch von Hand durch. Allen bin ich zu tiefem Dank verpflichtet.
In der vorliegenden Form wäre diese Arbeit nicht möglich gewesen ohne die
freundliche finanzielle Unterstützung durch das Department für Neurowissenschaften
der Universität Greifswald, welches diese Arbeit bezuschusste.
Die klinischen Angaben wurden den freundlicherweise von der Klinik für
Neurochirurgie (Direktor Prof. Dr. Henry W.S. Schröder), Universität Greifswald
überlassenen Patientenakten entnommen.
Auch ohne direkten Zusammenhang mit dieser Dissertation bin ich einigen
Menschen sehr dankbar, da ich ohne sie in meinem Leben nicht das erreicht hätte,
was ich bisher erreichen konnte. Daher geht auch ein besonderer Dank an meine
Eltern, die mir das Studium der Medizin durch jede Art der Unterstützung im In- und
Ausland ermöglichten.
Meinem Mann Torsten Dreßler, der die beruflich bedingte Trennung mit mir
gemeinsam durchgestanden hat und immer ein Fels in der Brandung war und ist,
danke ich für alles was war und was kommt.
Danksagung
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Nicht zuletzt danke ich Herrn Prof. Manfred Heuser aus München, der in seinen
Gesprächen mit mir mit einer Prise Humor und Weisheit immer wieder für die richtige
Balance gesorgt hat.
Ein herzlicher Dank gebührt auch Frau Dr. Frauke Steinmüller, mit der mich nicht nur
die Erfahrung der ersten „Gehversuche“ in der Pathologie verbindet.
In liebevoller Erinnerung an meine Großmutter, Dr. med. Gerlind I. Mesko.