Etablierung eines SCID-Maus-Tumor-Xenograft
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Aus dem Anatomischen Institut der Tierärztlichen Hochschule Hannover und der Klinik für Allgemein- und Viszeralchirurgie der Heinrich-Heine-Universität Düsseldorf Etablierung eines SCID-Maus-Tumor-Xenograft-Modells zur Analyse einzelner disseminierter Tumorzellen unter Verwendung der humanen Ösophaguskarzinom-Zelllinie PT1590 INAUGURAL - DISSERTATION zur Erlangung des Grades einer Doktorin der Veterinärmedizin (Dr. med. vet.) durch die Tierärztliche Hochschule Hannover Vorgelegt von Julia Rose aus Hamburg Hannover 2005 Wissenschaftliche Betreuung: Univ.-Prof. Dr. W. Meyer Anatomisches Institut Abteilung Histologie und Embryologie Tierärztliche Hochschule Hannover Univ.-Prof. Dr. S. B. Hosch Klinik für Allgemein- und Viszeralchirurgie Heinrich-Heine-Universität Düsseldorf 1. Gutachter: Univ.-Prof. Dr. W. Meyer 2. Gutachter: Univ.-Prof. Dr. M. Hewicker-Trautwein Tag der mündlichen Prüfung: 24.11.2005 Meinen Eltern Inhaltsverzeichnis 1. Einleitung 13 2. Schrifttum 17 2.1. Das Ösophaguskarzinom 17 2.1.1. Klassifikation des Ösophaguskarzinoms 17 2.1.2. Ätiologie und Prädisposition des Ösophaguskarzinoms 24 2.1.3. Inzidenz und Epidemiologie des Ösophaguskarzinoms 27 2.1.4. Lymphatische Metastasierung 28 2.1.4.1. Anatomie des ösophagealen lymphatischen Systems 28 2.1.4.2. Lymphatisches Metasierungsmuster beim Ösophaguskarzinom 30 2.1.4.3. Hämatogene Metastasierung des Ösophaguskarzinoms 31 2.1.5. Prognose und Therapie des Ösophaguskarzinoms 31 2.2. Metastasierungsmodelle 34 2.2.1. Das green-fluorescent-protein (GFP) 41 2.3. Die Minimale Residuale Tumorerkrankung (MRD) 45 2.3.1. Nachweis „okkult“ disseminierter Tumorzellen im Knochenmark 47 2.3.2. Nachweis „okkult“ disseminierter Tumorzellen in Lymphknoten 50 3. MATERIAL UND METHODEN 52 3.1. Die Zellinie PT1590 52 3.1.1. Zellkultur 52 Inhaltsverzeichnis 3.2. Transfektion von PT1590 54 3.2.1. Nukleinsäurearbeiten 56 3.2.1.1. Enzymatische Verdauung der DNA mit Restriktionsendonukleasen 57 3.2.1.2. Elektrophoretische Auftrennung von DNA-Fragmenten 58 3.2.1.3. Isolierung von DNA aus Agarose 58 3.2.1.4. Ligation 59 3.2.1.5. Konzentrationsbestimmungen von DNA in Lösung 59 3.2.2. Bakterienarbeiten 60 3.2.2.1. Transformation kompetenter Bakterien 61 3.2.2.2. Plasmidpräparation im kleinen Maßstab (sog. Minipräparation) 62 3.2.2.3. Plasmidpräparation im großen Maßstab (sog. Maxipräparation) 62 3.2.2.4. Bakterien-Glycerin-Stocks 63 3.2.3. Transfektion von PT1590 durch Elektroporation 63 3.2.3.1. Restriktion von pIRESpuro2 und pEGFP-N1 64 3.2.3.2. Ligation von EGFP und pIRESpuro2 67 3.2.3.3. Bakterien-Transformation und Identifikation 68 von positiven Klonen 3.2.3.4. Gewinnung von Plasmid-DNA für die Elektroporation 70 3.2.3.5. Transfektion durch Elektroporation 71 3.2.3.6. Selektion der transfizierten PT1590-Zellen 72 3.2.4. Transfektion von PT1590 mittels FuGENE 6 73 3.3. Tierversuche 76 3.3.1. Versuchstiere 76 3.3.1.1. Versuchstierhaltung 76 3.3.2. Tierversuchsdurchführung 77 3.3.2.1. Vorbereitung der transfizierten PT1590-Zellen für die Xenotransplantation in SCID-Mäuse 3.3.2.2. 77 Xenotransplantation der PT1590-EGFP-Subklone in SCIDMäusen 78 Inhaltsverzeichnis 3.3.2.3. Tötung und Sektion der Versuchstiere 3.3.2.4. Aufbereitung der entnommenen Mausorgane und Organ- 79 tumoren 80 Detektion von disseminierten Tumorzellen in Sekundärorganen der SCID-Mäuse 82 Verwendete Chemikalien, Lösungen und Materialien für Zellkultur und Tierversuch 82 3.5. Statistik 83 4. Ergebnisse 84 4.1. Generierung von stabilen Transfektanten 84 4.2. Prüfung der Tumorigenität der EGFP-transfizierten 3.3.2.5. 3.4. PT1590-Subklone in der SCID-Maus 4.3. Etablierung des SCID-Maus-Xenograft-Modells mittels des Subklons PT1590-EGFP-H/4 4.3.1. 87 Untersuchung der lokalen Tumoren mittels Fluoreszenzmikroskopie 4.3.3. 86 Tumorentwicklung nach s.c. Applikation von PT1590-EGFP-H/4-Zellen in SCID-Mäuse 4.3.2. 85 92 Untersuchung der Sekundärorgane auf disseminierte Tumorzellen mittels Fluoreszenzmikroskopie 93 5. Diskussion 95 6. Zusammenfassung 105 7. Summary 107 8. Schrifttumsverzeichnis 109 Verzeichnis der verwendeten Abkürzungen Abb. Abbildung Abk. Abkürzungen abs. absolut ATP Adenosin-Triphosphat Aqua bidest. bidestilliertes Wasser Aqua dest. destilliertes Wasser bp Basenpaare bzw. beziehungsweise °C Grad Celsius Ca Karzinom CaCl2 Kalziumchlorid cDNA complementary Desoxy Ribonucleic Acid CGH comparative genomic hybridisation CO2 Kohlendioxid cm Zentimeter cm2 Quadratzentimeter ddH20 bidestilliertes Wasser d.h. das heißt DNA Desoxy Ribonucleic Acid ECM Extrazellularmatrix EDTA Ethylendiamintetraacetat EGFP enhanced-green-fluorescent-protein FCS Fetales Kälberserum FISH Fluoreszenz-in-situ-Hybridisierung g Gramm GFP green-fluorescent-protein Gy Gray HCl Chlorwasserstoff H3PO4 Phosphorsäure IVM Intravitale Mikroskopie IVVM Intravitale Video Mikroskopie kb Kilobasen KCl Kaliumchlorid kDa Kilodalton K2HPO4 Kaliumhydrogenphosphat LF Luciferin mg Milligramm ml Milliliter mm3 Kubikmillimeter mM Millimolar MM Mikro-Metastasen mm Millimeter MRD Minimal residuale Tumorerkrankung ITC isolierte Tumorzellen mRNA Messenger Ribonucleic Acid MgCl2 Magnesiumchlorid µF (Mikro-)Farad µg Mikrogramm µM Mikromolar µl Mikroliter µmol Mikromol n Anzahl der Probanden n.u. nicht untersucht nm Nanometer NaCl Natriumchlorid NaOH Natronlauge RT-PCR reverse transcriptase polymerase chain reaction SDS Natriumdodecylsulfat O2 Sauerstoff s.c. subkutan sog. sogenannt SCID severe combined immunodeficency Stdabw. Standardabweichung Tab. Tabelle Upm Units per minute UICC Unio Internationalis Contra Cancrum u.a. Unter Anderem u.U. Unter Umständen UV Ultraviolett PBS Phosphatgepufferte Kochsalzlösung PCR polymerase chain reaction pH potentia Hydrogenii PDT Photodynamische Therapie V Volt v/v Volumenprozent w/v Massenprozent WHO Weltgesundheitsorganisation z.B. Zum Beispiel ~ ungefähr # Nummer < kleiner als ≥ größer gleich > größer als Ø Durchmesser % Prozent Weitere in der Arbeit verwendete Abkürzungen finden sich in den Legenden zu den Abbildungen und Tabellen. Einleitung 1. Einleitung Trotz verbesserter operativer Techniken, Fortschritten in der Frühdiagnostik und Anwendung multimodaler Therapiestrategien, konnte die Prognose von Patienten mit einigen operablen Karzinomerkrankungen in den letzten Jahrzehnten nur unwesentlich verbessert werden. So liegen beispielsweise beim ÖsophagusKarzinom die postoperativen 5-Jahres-Überlebensraten nahezu unverändert zwischen 20% und 36% (EARLAM 1988; LERUT et al. 1992; SIEWERT et al. 1992; WATANABE 1992; GOLDMINC et al. 1993; REED 1999; HEADRICK et al. 2002). Da das lokale Tumorgeschehen bei Patienten mit operablen Tumorstadien meist chirurgisch gut unter Kontrolle gebracht werden kann, wird die Gesamtprognose von Krebspatienten, welche einer kurativ intendierten chirurgischen Therapie zugeführt werden konnten, meist durch eine zum Operationszeitpunkt bereits stattgehabte systemische Tumorzellaussaat bestimmt, welche jedoch mit derzeitigen prä- und postoperativen Stagingmodalitäten nicht verifiziert werden kann. Diese okkulte Tumorzellaussaat kann aber mit neuen sensitiven immunzytooder histochemischen bzw. molekularbiologischen Techniken aufgespürt werden. Als Indikatororgane zur Detektion dieser okkult disseminierten Tumorzellen haben sich hierbei insbesondere die Lymphknoten und das Knochenmark bewährt. Darüber hinaus konnte die klinische Relevanz einer okkulten Tumorzelldissemination in Lymphknoten und Knochenmark in einer Vielzahl von Studien belegt werden, wobei Patienten mit okkult disseminierten Tumorzellen in Lymphknoten oder Knochenmark signifikant früher und häufiger Tumorrezidive entwickelten bzw. signifikant früher und häufiger tumorbedingt verstarben als Patienten ohne diese Zellen (TROJANI et al. 1987; SCHLIMOK et al. 1990; LINDEMANN et al. 1992; JAUCH et al. 1996; THORBAN et al. 1996A; THORBAN et al. 1996B; HOSCH et al. 1997B; IZBICKI et al. 1997; CALALUCE et al. 1998; LIEFERS et al. 1998; PASSLICK et al. 1999; RODER et al. 1999; WEITZ et al. 1999; HOSCH et al. 2000; JANNI et al. 2000; LEINUNG et al. 2000; BONAVINA et al. 2001; HOSCH et al. 2002). 13 Einleitung Trotz dieser Ergebnisse wird aber weiterhin sehr kontrovers über die biologische Relevanz dieser immunzyto- und immunhistochemisch bzw. molekularbiologisch detektierten „Tumorzellen“ diskutiert, da diesen Zellen häufig tumortypische zytomorphologische Charakteristika fehlen (HERMANEK 1994; HERMANEK et al. 1999). Weiterführende Analysen an diesen Zellen sind zwar prinzipiell möglich, gestalten sich jedoch aufgrund der extrem niedrigen Zellfrequenz äußerst schwierig. So werden im Knochenmark etwa eine Zelle pro 105-106 normaler mononukleärer Knochenmarkszellen bzw. in pathohistologisch „unauffälligen“ Lymphknoten etwa eine Zelle pro 104-105 normaler Lymphknotenzellen gefunden (PANTEL et al. 1992). Bei der weiterführenden Analyse dieser Einzelzellen kommen verschiedene Techniken zum Einsatz. Hierzu gehören beispielsweise immunzytochemische Doppelfärbetechniken (PANTEL et al. 1993A), die in vitro-Expansion (PANTEL et al. 1995; SCHEUNEMANN et al. 1999), die Fluoreszenz-in-situ-Hybridisierung (FISH) (MÜLLER et al. 1996) und seit Neuestem auch die komparative genomische Hybridisierung auf Einzelzellniveau (Einzelzell-CGH; SCOMP) (KLEIN et al. 2002). Insgesamt konnten durch diese Analysen erste Hinweise erbracht werden, dass es sich bei einem Grossteil dieser immunzyto- bzw. histochemisch detektierbaren Einzelzellen wahrscheinlich tatsächlich um Tumorzellen handelt (SCHEUNEMANN 1999; HOSCH et al. 2003; SCHMIDT-KITTLER et al. 2003). Da maligne Tumoren während ihrer Progression in einem komplexen, mehrstufigen Prozess letztendlich die Fähigkeit zur Metastasierung erwerben und Tumormetastasen während ihrer Proliferation in den Sekundärorganen wiederum immer neue Zellvarianten ausbilden, scheinen diese okkult disseminierten Tumorzellen als Frühformen der zur Dissemination und Metastasierung befähigten Krebszelle besonders geeignete Ziele darzustellen, um die molekularen Grundlagen von Metastasierungsvorgängen weiter aufzuklären. Da die derzeit zur Verfügung stehenden Einzelzell-Analysetechniken aber aufgrund der äußerst geringen Ausgangsmengen an Zellen nach wie vor äußerst anspruchsvoll und zeitaufwendig sind, stellt hier die Etablierung geeigneter Modellsysteme weiterhin einen legitimen Ansatz dar. 14 Einleitung Die hier vorliegende Arbeit beschreibt die Etablierung eines SCID-Maus-TumorXenograft-Modells zur Analyse einzelner, disseminierter Tumorzellen unter Einsatz der erst kürzlich etablierten humanen Ösophagus-Adenokarzinom-Zelllinie PT1590 (SCHEUNEMANN et al. 1999; HOSCH et al. 2000). Diese Zelllinie hatte sich in Vorversuchen nach subkutaner Xenotransplantation in SCID-Mäuse als tumorigen und metastatisch erwiesen (SCHEUNEMANN et al. 1999). Der Nachweis der Metastasierungsfähigkeit der Zellinie PT1590 nach subkutaner Applikation in SCID-Mäuse war hierbei sowohl indirekt durch die erneute Inkulturnahme von Maus-Sekundärorganen (Lunge, Knochenmark, Leber) als auch direkt durch histopathologische Untersuchungen an den Lungen der Mäuse erbracht worden (SCHEUNEMANN et al. 1999; HOSCH et al. 2000), wobei sich disseminierte bzw. metastasierte PT1590-Zellen bei etwa 10% der untersuchten SCID-Mäuse nachweisen ließen. Da sich eine direkte immunzytochemische Detektion disseminierter Tumorzellen in Maus-Sekundärorganen als Voraussetzung für weiterführende Analysen an diesen Zellen in Vorversuchen aufgrund unspezifischer Kreuzreaktionen als nicht geeignet erwies, wurden PT1590-Zellen zur besseren Detektion bzw. zur Durchführung weiterführender Analysen in mehreren Ansätzen mit dem Markergen für das green-fluorescent-protein (GFP) transfiziert. Dieses aus der Hydromeduse Aequoria victoria isolierte Gen, kodiert für ein aus 238 Aminosäuren bestehendes Protein, welches mit UV-Licht im Wellenlängenbereich von 395 bis 470 nm angeregt, grün fluoresziert. In der vorliegenden Arbeit wurde die Codon-optimierte Variante, das sogenannte enhanced-green-fluorescent-protein (EGFP), gewählt. Dieses erreicht gegenüber dem Wildtyp eine 5-10fach stärkere Expression. Bei der Transfektion von PT1590 wurde auch darüber hinaus die Wirksamkeit der Elektroporation und der Lipofektionsmethode verglichen. 15 Einleitung Die Tumorigenität der EGFP-transfizierten PT1590-Zellen wurde in einem Vorversuch durch Implantation der Tumorzellen in die SCID-Maus überprüft. Der anschließende Tierversuch diente der sicheren Detektionsmöglichkeit disseminierter PT1590-Zellen in den Sekundärorganen der Maus (Lunge, Milz, Niere, Leber, Knochenmark). Die erfolgreiche Etablierung eines validen und verlässlichen Kleintier-XenograftModells zur weiterführenden Analyse einzelner humaner, disseminierter Tumorzellen, kann letztlich prinzipiell für die Untersuchung der molekularen Grundlagen und Mechanismen von Metastasierungsvorgängen genutzt werden. 16 Schrifttum 2. Schrifttum 2.1. Das Ösophaguskarzinom In den westlichen Ländern, einschließlich Deutschland, ist die Mehrzahl der Krebsneuerkrankungen und krebsbezogenen Todesfälle durch maligne epitheliale Tumoren bedingt. Unter diesen Tumorentitäten stellt das Ösophaguskarzinom einen besonders aggressiven Tumortyp dar, welcher sich durch eine schlechte Prognose auszeichnet (LERUT et al. 1992; SIEWERT et al. 1992). Charakteristisch für das Ösophaguskarzinom ist eine hinsichtlich der Inzidenz und Geschlechterverteilung sehr ausgeprägte geographische Variabilität, welche durch ein Zusammenwirken von regionalen, genetischen und soziokulturellen Faktoren bedingt zu sein scheint (MÜHLHÖFER und ZOLLER 2002). So besteht in den westlichen industrialisierten Ländern beim Ösophaguskarzinom beispielsweise eine eindeutige Präferenz für das männliche Geschlecht mit einer vom histologischen Typ unabhängigen Ratio von 8:1 bis 4:1. In den Hochinzidenzgebieten wie dem Iran oder China besteht dagegen eine relativ ausgeglichene Geschlechterverteilung, was auf ein regionales kanzerogenes Risikoprofil hindeutet, welches sich von den westlichen industrialisierten Ländern unterscheidet (MÜHLHÖFER und ZOLLER 2002). Ösophaguskarzinome entstehen vornehmlich im höheren Lebensalter, wobei der Häufigkeitsgipfel in der siebenten Lebensdekade liegt. Manifestationen der Erkrankung unterhalb des 40. Lebensjahrs stellen insgesamt eine Ausnahme dar. 2.1.1. Klassifikation des Ösophaguskarzinoms Eine standardisierte Klassifikation von malignen Tumoren ist für die Therapieplanung, die Prognoseabschätzung sowie als Grundlage für die Beurteilung des Therapieerfolges generell unumgänglich. Die Tumorklassifikation der Ösophaguskarzinome erfolgt dabei international einheitlich nach den Empfehlungen der Weltgesundheitsorganisation (WHO) 17 Schrifttum (WATANABE et al. 1990) und der Unio Internationalis Contra Cancrum (UICC) (UICC 1997, 1998, 2001, 2002). Diese Einteilung berücksichtigt dabei folgende Kriterien: 1. Tumorlokalisation 2. Histomorphologie mit Tumortyp und Differenzierungsgrad 3. Anatomische Ausbreitung vor Therapie (TNM / pTNM) 4. Anatomische Ausbreitung nach Therapie (Residualtumor=R-Klassifikation) Tumorlokalisation Der Ösophagus wird nach den Richtlinien der UICC (1997, 2002) in einen zervikalen und einen intrathorakalen Abschnitt unterteilt, wobei sich der intrathorakale Anteil der Speiseröhre wiederum in einen oberen, mittleren und unteren Abschnitt einteilen lässt. Der intraabdominelle Anteil des Ösophagus gehört bei dieser Klassifikation zum unteren thorakalen Abschnitt. Die Grenze zwischen oberem und mittlerem thorakalen Abschnitt bildet die Trachealbifurkation, während die Mitte zwischen Trachealbifurkation und ösophagogastralem Übergang als Grenze zwischen mittlerem und unterem Abschnitt definiert wird. Insgesamt sind etwa zwei Drittel aller Ösophaguskarzinome im unteren Ösophagusdrittel lokalisiert; etwa 25% der Karzinome befinden sich im mittleren und weniger als 10% im oberen Ösophagusdrittel (EARLAM 1988). Während Adenokarzinome ganz überwiegend im unteren Ösophagusdrittel lokalisiert sind, werden Plattenepithelkarzinome jeweils in den Bereichen der physiologischen Ösophagusengen zu 45% bzw. 40% im mittleren bzw. unteren Ösophagusdrittel und zu etwa 15% im oberen Ösophagusdrittel gefunden (MAYER 1997). 18 Schrifttum Histomorphologie Die beiden histologischen Haupttypen des Ösophaguskarzinoms stellen das Plattenepithelkarzinom und Adenokarzinom dar. Weniger als 10% der Fälle maligner Speiseröhrentumoren werden durch Sonderformen wie Spindelzellkarzinome (Karzinosarkome), Basaloidzellkarzinome, adenomatös-zystische, mucoepidermoidale oder kleinzellige Karzinome sowie Lymphome repräsentiert (MCKEOWN 1952; JERECZEK-FOSSA et al. 2000). Hinsichtlich ihrer strukturellen und zellulären Ähnlichkeit mit dem Normalgewebe, sowie der Kernanomalien und Mitoseaktivität erfolgt eine Einteilung der Plattenund Adenokarzinome in drei Differenzierungsstufen: G1 Gut differenziert G2 Mäßiggradig differenziert G3 Schlecht differenziert G4 (entdifferenziert) Das kleinzellige und das undifferenzierte Ösophaguskarzinom werden aufgrund ihres hohen Malignitätsgrades als G4 (entdifferenziert) beurteilt. Tumoren mit einer G1- oder G2-Differenzierung weisen einen niedrigen, Karzinome mit einem G3oder G4-Differenzierung dagegen einen hohen Malignitätsgrad auf. TNM / pTNM- und R-Klassifikation Wie alle soliden epithelialen Tumoren werden auch die Ösophaguskarzinome unabhängig von ihrem histologischen Typ nach dem TNM / pTNM-System der UICC klassifiziert (1997, 1998). In die TNM-Klassifikation gehen neben den Resultaten der prätherapeutisch durchgeführten bildgebenden und endoskopischen Diagnostik (cTNM) auch die postoperative pathohistologische Beurteilung (pTNM) ein. 19 Schrifttum Primärtumor T / pT – Klassifikation: Als Kriterium für die Einteilung der Primärtumorstadien (T / pT) gilt die Infiltrationstiefe in die Ösophagusschichten und in benachbartes Gewebe. Hieraus ergeben sich folgende Kategorien: T / pTX Primärtumor kann nicht beurteilt werden T / pT0 kein Anhalt für einen Primärtumor T / pTis Carcinoma in situ ohne Infiltration der Lamina propria T / pT1a Infiltration des Tumors in die Lamina muscularis mucosae T / pT 1b Infiltration des Tumors in die Submucosa T/ pT 2 Infiltration des Tumors in die Tunica muscularis T/ p T 3 Infiltration des Tumors in die Adventitia T / p T4 Infiltration des Tumors von Nachbarstrukturen Um eine Klassifikation der pT-Kategorie vornehmen zu können, sind folgende Voraussetzungen erforderlich (UICC 1997, 2001, 2002): pT 1-3 Die histopathologische Untersuchung des resezierten Primärtumors ohne makroskopisch erkennbaren Tumor an den Resektionsrändern ist Voraussetzung. pT 4 Die Infiltration von Nachbarorganen muss histologisch bestätigt sein. Regionäre Lymphknoten N / pN - Klassifikation: Zur Beurteilung der lymphatischen Tumorzellstreuung werden die Lymphknoten des zervikalen und intrathorakalen Ösophagusabschnittes als regionäre Lymphknoten definiert. Laut UICC sind für den zervikalen und den intrathorakalen Ösophagus verschiedene Lymphknoten als regionäre Lymphknoten definiert. 20 Schrifttum Zu dem zervikalen Abschnitt werden ausschließlich die zervikalen Lymphknotengruppen (laterale zervikale, zervikale paraösophageale, tiefe zervikale, retropharyngeale und supraklavikuläre Lymphknoten) als regionäre Lymphknoten gezählt. Zu den regionären Lymphknoten des intrathorakalen Ösophagus zählen die mediastinalen Lymphknoten (obere thorakale paraösophageale, thorakale paratracheale, Lymphknoten an der Trachealbifurkation, mittlere thorakale paraösophageale, Lymphknoten am Lungenhilus, untere thorakale para- ösophageale, diaphragmale sowie hintere mediastinale Lymphknoten), sowie die perigastrischen Lymphknoten (rechte kardiale, linke kardiale, Lymphknoten der kleinen Kurvatur, Lymphknoten der großen Kurvatur, suprapylorische, infrapylorische und Lymphknoten entlang der Arteria gastrica sinistra). Treten Lymphknotenmetastasen am Truncus coeliacus auf, so werden diese als Fernmetastasen gewertet. Folgende Kategorien sind laut UICC vorgesehen: N / pNX Regionäre Lymphknoten können nicht beurteilt werden N / pN0 Es besteht kein Hinweis auf regionäre Lymphknotenmetastasen N / pN1 Regionäre Lymphknotenmetastasen sind nachweisbar Nach dem TNM-Supplement der UICC von 2001 sind fakultativ folgende Erweiterungen vorgesehen: N / pN1a Es sind 1-3 regionäre Lymphknoten befallen N / pN1b Es sind 4-7 regionäre Lymphknoten befallen N / pN1c Es sind mehr als 7 regionäre Lymphknoten befallen pN1 (mi) Regionärer Lymphknotenbefall, bei welchem keine Lymphknoten- metastase größer als 2 mm ist (ausgeschlossen sind einzelne Tumorzellen) 21 Schrifttum Fernmetastasen M / pM – Klassifikation: M / pMX M / pM0 M / pM1 Fernmetastasen können nicht beurteilt werden keine Fernmetastasen Fernmetastasen Für Tumoren des unteren thorakalen Ösophagus M1a M1b Metastase(n) in zoeliakalen Lymphknoten Andere Fernmetastasen Für Tumoren des oberen thorakalen Ösophagus M1a M1b Metastase(n) in zervikalen Lymphknoten Andere Fernmetastasen Für Tumoren des mittleren thorakalen Ösophagus M1a M1b Nicht anwendbar Nichtregionäre Lymphknoten oder andere Fernmetastasen Eine Zusammenfassung der einzelnen TNM / pTNM-Kategorien ermöglicht die einheitliche Einteilung der Tumoren in Stadien, die das Ausmaß Tumorerkrankung darstellen sollen: Tab. 1: TNM-Kategorisierung Stadium 0 Tis / pTis N0 / pN0 M0 / pM0 Stadium I T1 / pT1 N0 / pN0 M0 / pM0 Stadium IIA T2 / pT2 N0 / pN0 M0 / pM0 T3 / pT3 N0 / pN0 M0 / pM0 T1 / pT1 N1 / pN1 M0 / pM0 T2 / pT2 N1 / pN1 M0 / pM0 T3 / pT3 N1 / pN1 M0 / pM0 T4 / pT4 jedes N / pN M0 / pM0 Stadium IVA jedes T / pT jedes N / pN M1a / pM1a Stadium IVB jedes T / pT jedes N / pN M1b / pM1b Stadium IIB Stadium III 22 der Schrifttum Zur Erfassung des Tumorstatus nach Therapie kommt die R-Klassifikation zur Anwendung: RX Der Residualtumor kann nicht beurteilt werden R0 Es findet sich kein Residualtumor R1 Es findet sich mikroskopisch ein Residualtumor R2 Es findet sich makroskopisch ein Residualtumor 23 Schrifttum 2.1.2. Ätiologie und Prädisposition des Ösophaguskarzinoms Hinsichtlich der Ätiologie des Ösophaguskarzinoms muss zwischen den beiden histologischen Haupttypen, dem Plattenepithelkarzinom und dem Adenokarzinom, unterschieden werden. Sie stellen in Bezug auf die ätiologischen Faktoren unterschiedliche Entitäten dar. Das Plattenepithelkarzinom nahm bis in die achtziger Jahre des 20. Jahrhunderts mit 90% den größten Anteil unter den malignen Tumoren des Ösophagus ein. Zu seinen ätiologischen Risikofaktoren gehören vor allem exogene Noxen, wie Zigaretten- und Alkoholkonsum sowie in der Nahrung enthaltene Nitrosamine (COIA et al. 1994; ZAMBON et al. 2000). Rauchen erhöht das Risiko an einem Plattenepithelkarzinom zu erkranken um den Faktor 5 im Vergleich zur nichtrauchenden Bevölkerung. Nach GAMMON et al. (1997) zeigt sich hierbei eine deutliche Dosisabhängigkeit, wobei starker Nikotinkonsum das Risiko an einem Ösophaguskarzinom zu erkranken sogar um das 10fache erhöht. Bezüglich des Alkoholkonsums als ätiologischer Risikofaktor konnte nachgewiesen werden, dass bereits die tägliche Aufnahme von 40-80g Alkohol das Ösophaguskarzinom-Risiko um den Faktor 7 erhöht, eine Zufuhr von mehr als 120g pro Tag lässt das Risiko um das 50fache ansteigen. Nach SHOTTENFELD (1984) bewirkt die Kombination von Alkohol- und Nikotinkonsum sogar eine Risikoerhöhung um das 155fache. Während in den Entwicklungsländern die mangelnde Versorgung mit Obst, Gemüse und pflanzlichen Ballaststoffen einen unabhängigen Risikofaktor bei der Entstehung eines Ösophaguskarzinom darstellt, liegt das Risiko in den westlichen Ländern in einer Fehlernährung, wie sie z.B. bei einem Alkoholabusus auftritt. So untersuchten beispielsweise FRANCESCHI et al. (2000) in einer Fall-Kontrollstudie insgesamt 304 Plattenepithelkarzinompatienten. Hierbei wurden die Patienten zu ihren Nahrungsgewohnheiten befragt, wobei sich eine deutliche Assoziation zwischen einer mangelhaften Aufnahme der Vitamine C und E, Niacin, sowie Carotin und dem Risiko an einem Plattenepithelkarzinom zu erkranken nachweisen ließ. Zusätzlich zeigte sich, dass eine ausreichend hohe Aufnahme 24 Schrifttum monoungesättigter Fettsäuren das Ösophaguskarzinomrisiko zu senken schien, während es Retinol ansteigen ließ. Dieser prokanzerogene Effekt des Retinols wird durch dessen erhöhte Toxizität bei gesteigerter Alkoholaufnahme erklärt. Diese Ergebnisse konnten in einer schwedischen Studie (TERRY et al. 2000) bestätigt werden. Auch hier ließ sich nachweisen, dass das Risiko ein Plattenepithelkarzinom des Ösophagus zu entwickeln, durch die erhöhte Zufuhr von Vitamin C, E und ß-Carotin um 50% verringert war. Auch Eisenmangel, wie er in einer weiblichen schwedischen Population mit Plummer-Vinson-Syndrom vorkam, ist mit einer erhöhten Inzidenz von Ösophaguskarzinomen assoziiert (LARSON et al. 1975). Daneben wird besonders in den zentralasiatischen Regionen die Aufnahme von polyzyklischen aromatischen Kohlenwasserstoffen, sowie nitrathaltiger Pflanzen als Risikofaktor beschrieben (ROTH et al. 1998). Als ein weiterer Risikofaktor für die Entwicklung von Ösophagus-Plattenepithelkarzinomen werden Laugeningestionsverätzungen der Speiseröhre beschuldigt. So ist das geschätzte Ösophaguskarzinom-Risiko bei Patienten, die eine Verätzung erlitten haben, etwa um das 1000fache erhöht. Mit einer Latenzzeit von 40-50 Jahren entstehen in diesen ehemals geschädigten Bereichen gehäuft Plattenepithelkarzinome (ISOLAURI et al. 1989). Des weiteren ist die sehr seltene autosomal-dominant vererbte Tylosis, der ein Gendefekt auf Chromosom 17q-23 zugrunde liegt, und bei welcher es u.a. zur Entwicklung einer Papillomatose des Ösophagus kommt, mit einem deutlich erhöhten Ösophagus-Plattenepithelkarzinom-Risiko assoziiert (RISK et al. 1994; MONTESANO et al. 1996). Betroffene Merkmalsträger weisen ab dem 60.-65. Lebensjahr ein kumulatives Risiko von 90-95% für die Entwicklung eines Plattenepithelkarzinoms auf (MARGER und MARGER 1993; RIBEIRO et al. 1996). Ob auch bestimmte Papillomavirus-Arten, welche in ösophagealen Plattenepithelkarzinomen nachgewiesen werden können, als ätiologischer Faktor eine Rolle spielen ist aufgrund der uneinheitlichen Datenlage bislang unklar (IARC 1995; LAVERGNE und DE VILLIERS 1999). 25 Schrifttum Als gesichert gilt hingegen, dass Erkrankungen, welche die Passage des Speisebreis durch den Ösophagus verzögern, ebenfalls zu den prädisponierende Faktoren für die Entwicklung eines Plattenepithelkarzinoms gerechnet werden müssen. Hierzu gehören u.a. die Achalasie, Ösophagusdivertikel (STREITZ et al. 1995) und das Plummer-Vinson-Syndrom. Bei Achalasie-Patienten wird das Ösophaguskarzinom-Risiko im Vergleich zur Normalbevölkerung als 16fach erhöht angegeben (SANDLER et al. 1995; PORSCHEN et al. 1995; ASGE 1998). Bei Patienten mit Plummer-Vinson-Syndrom lassen sich in ca. 10% der Fälle Karzinome in Ösophagus oder Pharynx finden (RIBEIRO et al. 1996). Als Sonderform des Plummer-Vinson-Syndroms gilt die postkrikoidale siderpensische Dysphagie. Bei dieser auch als Paterson-Kelly-Syndrom bezeichneten Erkrankung ist das Karzinomrisiko deutlich erhöht (LARSSON et al. 1975). Hierbei kommt es durch die Ausbildung von intraösophagealen Membranen zu Stenosierungen des Ösophagus, von denen Plattenepithelkarzinome häufig ihren Ausgang nehmen. Dem Adenokarzinom des Ösophagus liegen andere ätiologische Faktoren zu Grunde. Als Hauptursache gilt hier ein durch langjährigen gastroösophagealem Reflux bedingter chronischer Entzündungsprozess im Bereich der Speiseröhre (WINTERS et al. 1987; COIA et al. 1994). Etwa 10% aller Patienten mit chronischem gastroösophagealem Reflux entwickeln im Laufe ihrer Erkrankung einen sog. Barrett-Ösophagus (LAGERGREN 1999; MORALES und SAMPLINER 1999). Hierbei wird das normale Ösophagusplattenepithel im Bereich des distalen Ösophagus durch ein Zylinderepithel mit schleimproduzierenden Zellen metaplastisch umgebaut (HAGGITT 1994). Innerhalb dieser metaplastischen Bezirke können sich Dysplasien entwickeln, welche ihrerseits neoplastisch transformieren können (Metaplasie-Dysplasie-Karzinom-Sequenz) (MACDONALD und MACDONALD 1987; FALK 1999). Der Barrett-Ösophagus muss somit als fakultative Präkanzerose gewertet werden und ist insgesamt mit einem 30 bis 125fach erhöhtem Adenokarzinom-Risiko assoziiert (CAMERON et al. 1990; LAMBERT 1999; MORALES und SAMPLINER 1999). Betroffen sind hierbei insbesondere Patienten ab dem 50. Lebensjahr. 26 Schrifttum Des Weiteren werden bestimmte pharmazeutische Substanzen für die Entstehung von Ösophagus-Adenokarzinomen verantwortlich gemacht. So zeigte sich in einer Studie von LAGERGREN, dass die Inzidenz von ÖsophagusAdenokarzinomen bei Patienten mit langjähriger Einnahme von Nitroglycerinen, Aminophyllinen oder ß-Rezeptor-Agonisten um den Faktor 2-4 höher lag als in der medikamentennegativen Patientengruppe (LAGERGREN et al. 2000). Auch bei Adipositas scheint das Risiko für Adenokarzinome des Ösophagus erhöht zu sein. Eine Ursache hierfür könnte sein, dass übergewichtige Personen vermehrt zur Refluxkrankheit neigen, sodass die Adipositas nur indirekt die Entstehung von Ösophagusadenokarzinomen begünstigt (BLOT 1999). Auf der anderen Seite werden diätetische Faktoren, wie hohe Nahrungsanteile von tierischen Fetten, durchaus als pathogenetische Ursachen für die Entstehung von Ösophagus-Adenokarzinomen diskutiert (KABAT et al. 1993; COIA et al. 1994). 2.1.3. Inzidenz und Epidemiologie des Ösophaguskarzinoms Das Ösophaguskarzinom ist weltweit betrachtet die sechsthäufigste Todesursache (PISANI et al. 1999). Seine Inzidenz unterliegt dabei starken geographischen Schwankungen. In Europa variiert die Inzidenz zwischen 2,3 Fällen pro 100.000 Einwohner und Jahr in Griechenland und 10,7 Fällen pro 100.000 Einwohner und Jahr in Frankreich (EARLAM 1988). Die Inzidenz liegt in den USA bei 4,5 Fällen pro 100.000 Einwohnern und Jahr (SEER PROGRAM 2003). In den westlichen Ländern gehört das Ösophaguskarzinom somit zu den selteneren gastrointestinalen Tumorentitäten. In Japan hingegen liegt die Inzidenz mit über 50 Fällen pro 100.000 Einwohnern und Jahr deutlich höher (EARLAM 1988) und steigt im nördlichen Iran und im Norden Chinas auf 100 Fälle pro 100.000 Einwohner und Jahr. An der Spitze der Inzidenzraten steht die chinesische 27 Schrifttum Provinz Linxian mit 130 Neuerkrankungen pro 100.000 Einwohner und Jahr (LI et al. 1989). In den letzten Jahrzehnten konnte in den westlichen Industrieländern eine relative Zunahme der Inzidenz des distalen Ösophagus-Adenokarzinoms insbesondere für Männer verzeichnet werden (MOLLER und JENSEN 1988; POWELL und MC CONKEY 1990; BLOT et al. 1991; HANSSON et al. 1993; HANSEN et al. 1997; LORD et al. 1998), bei denen es mittlerweile etwa 50% aller Ösophaguskarzinome ausmacht (BLOT 1993). 2.1.4. Lymphatische Metastasierung 2.1.4.1. Anatomie des ösophagealen lymphatischen Systems Der Ösophagus weist zwei unterschiedliche embryonale Ursprünge auf. Er entsteht während der Embryonalentwicklung durch die Vereinigung beider Kiemenbögen mit dem Dottersack auf Höhe der Trachealbifurkation. Infolgedessen weist er zwei Hauptlymphabflussgebiete auf: nach abdominal im Bereich des Truncus coeliacus und nach zervikal. Bereits 1903 konnte SAKATA (1903) die anatomische Ausbildung der ösophagealen Lymphgefäße beschreiben. Diese verlaufen in der Submucosa nicht segmental, sondern in longitudinaler Ausrichtung. Zum Anderen stellt das Auftreten lymphatischer Gefäße in der Tunika mucosa des Ösophagus im Vergleich zu anderen gastrointestinalen Organen eine Besonderheit dar (BOGOMOLETZ et al. 1989; GOSEKI et al. 1992; SUGIMACHI et al. 1993; SABIK et al. 1995). Diese besondere Anatomie begünstigt eine massive lokale Ausdehnung der Tumoren in der Längsrichtung und erklärt das Fehlen einer Obstruktion in der Frühphase der Erkrankung (KUBIK 1990). 28 Schrifttum Abb. 1: Lymphanatomie des Ösophagus beim Menschen (nach RICE et al. 1998) Die Lymphbahnen des mittleren und oberen Abschnitts der Speiseröhre drainieren nach kranial in die tiefen zervikalen Lymphknoten, sowie in die Lymphknoten entlang des Nervus laryngeus recurrens. Die Lymphbahnen des unteren Ösophagusabschnitts drainieren nach distal in die kardialen Lymphknoten um den Truncus coeliacus. Die longitudinale Anordnung der in Verbindung stehenden Lymphbahnen erstreckt sich auch auf die Adventitia und Muscularis. Mukosale und submukosale Lymphbahnen bilden ein kommunizierendes Netzwerk. Innerhalb dieses Netzwerkes durchbrechen die Lymphgefäße in Abständen die Lamina muscularis mucosae und drainieren über die regionalen Lymphknoten des periösophagealen Gewebes letztendlich in den Ductus thoracicus (MURAKAMI et al. 1994). Diese Anordnung der Lymphgefäße ermöglicht eine frühe und weitreichende Tumorzelldissemination (NISHIMAKI et al. 1996). 29 Schrifttum 2.1.4.2. Lymphatisches Metasierungsmuster beim Ösophaguskarzinom Der Nachweis von Lymphknotenmetastasen stellt beim Ösophaguskarzinom den wichtigsten Prognoseparameter dar (SIEWERT et al. 1990). Dabei scheint die lymphatische Tumorzelldissemination beim Ösophaguskarzinom ein frühes Ereignis im Rahmen der Tumorprogression darzustellen. In mehreren Studien konnte gezeigt werden, dass sich zum Zeitpunkt der chirurgischen Intervention bereits in 57% bis 74% der Fälle ein metastatischer Befall der Lymphknoten nachweisen lässt (ISONO et al. 1991; AKIYAMA et al. 1993; IDE et al. 1994; NISHIHIRA et al. 1995; IZBICKI und HOSCH 1997). Insbesondere die Adenokarzinome des distalen Ösophagus bzw. der Kardia zeigen ein frühes und ausgedehntes regionales Metastasierungsmuster. Die Lymphknotenmetastasierung erfolgt bei diesen Tumoren insbesondere in die paraösophagealen und parahiatal gelegenen Lymphknoten entlang der kleinen und großen Magenkurvatur sowie im Bereich des Truncus coeliacus und der Arteria hepatica. Im Bereich der Milzarterie und des Milzhilus finden sich ebenfalls häufig tumorbefallene Lymphknoten. Zusätzlich kann beim Ösophaguskarzinom eine diskontinuierliche lymphatische Tumorzelldissemination mit „Überspringen“ (skipping) tumornaher Lymphknotenstationen beobachtet werden. So zeigen etwa 10% aller Patienten mit Karzinomen im zervikalen Ösophagusabschnitt, sowie etwa 44% aller Patienten mit Tumoren im mittleren Ösophagusdrittel Lymphknotenmetastasen im Bereich des Truncus coeliacus (ROSENBERG et al. 1982). Diese Ergebnisse konnten in einer Studie von AKIYAMA et al. (1993) bestätigt werden. Hierbei wurde das lymphatische Metastasierungsmuster bei insgesamt 236 Patienten untersucht, die im Rahmen der Ösophagusresektion einer radikalen zerviko-thorako-abdominalen Lymphknotendissektion (sog. „Dreifeld“-Lymphadenektomie) unterzogen worden waren, wobei 29,4% der Patienten mit distalem Ösophagus einen zervikalen Lymphknotenbefall aufwiesen. Auch HOSCH et al. (2001) konnten zeigen, dass bei 30 Schrifttum 34% aller Patienten Lymphknotenmetastasen in tumorfernen Stationen nachweisbar waren, während tumornahe Lymphknotenstationen keine Metastasen aufwiesen. 2.1.4.3. Hämatogene Metastasierung des Ösophaguskarzinoms Die hämatogene Disseminierung von Tumorzellen scheint zu einem deutlich früheren Zeitpunkt in der Tumor-Progression stattzufinden als bislang angenommen (PANTEL und BRAKENHOFF 2004). Dieser mehrschrittige, komplexe Prozess ist gekennzeichnet durch das Ablösen einer Tumorzelle aus dem Primärtumorverband, die Extravasation durch das umgebende Stroma und dem anschließenden Eintritt in das Blutgefäßsystem (Intravasation). Über das Blutgefäßsystem erfolgt das Abschwemmen der Tumorzelle zum Zielorgan, wo diese nach erfolgreicher Extravasation zur Metastase proliferiert (WOODHOUSE et al. 1997). Entsprechend den lymphatischen und venösen Abflusswegen der Speiseröhre manifestieren sich Fernmetastasen beim Ösophaguskarzinom am häufigsten in den nicht-regionären intraabdominalen Lymphknoten mit einer Inzidenz von 45%, gefolgt von der Leber (35%), der Lunge (20%), den supraklavikulären und zervikalen Lymphknoten (18%) und dem Skelettsystem (9%) (DALY et al. 1996). 2.1.5. Prognose und Therapie des Ösophaguskarzinoms Das Ösophaguskarzinom stellt eine besonders aggressive Tumorentität mit einer im Wesentlichen unverändert schlechten Prognose dar. Bleibt es unbehandelt, überleben nur 5,9% der Patienten das erste Jahr nach der Diagnosestellung. Das zweite Jahr erleben 0,3% der Patienten und bereits nach 3 Jahren sind alle erkrankten Patienten verstorben (MÜLLER et al. 1990). Da Symptome der Erkrankung beim Ösophaguskarzinom in aller Regel erst spät auftreten, erfolgt die Diagnosestellung meist erst in fortgeschritteneren Tumorstadien (OJALA et al. 1982; MÜLLER et al. 1990; ALTORKI et al. 1994; FINK et al. 1995). 31 Schrifttum Das Hauptsymptom des Ösophaguskarzinoms stellt dabei die Stenose-bedingte Dysphagie dar. Diese wird erst ab einer Lumeneinengung von > 50% klinisch manifest (HOFFMANN und GRUND 1996). Begleitende Symptome sind Übelkeit, Regurgitation, postprandiales Erbrechen und das Horner-Syndrom (BOHLE und ZOLLER 2002). Einen wesentlichen Faktor Ösophaguskarzinom-Patienten bei stellt der die Abschätzung Frage der nach der Prognose von chirurgischen Resektabilität des Tumors dar. Diese stellt nach wie vor die einzige Therapieform mit kurativer Intention dar. Trotz verbesserter und radikalerer chirurgischer Operationstechniken konnte die Überlebensrate von Patienten mit operablem Ösophaguskarzinom in den letzten Jahrzehnten insgesamt aber nur unwesentlich verbessert werden. So konnte die 5-Jahres-Überlebensrate nach kurativ intendierter chirurgischer Therapie von etwa 12% in den 80er Jahren auf derzeit etwa 20-40% gesteigert werden (EARLAM 1988; LERUT et al. 1992; SIEWERT et al. 1992; WATANABE et al. 1992; FOK et al. 1993; GOLDMINC et al. 1993). Ein weiterer Aspekt, der insgesamt zur Verbesserung der Operationsergebnisse beigetragen hat, ist der Fortschritt im präoperativen staging durch die Entwicklung verfeinerter bildgebender und endoskopischer Verfahren wie Bronchoskopie, Ösophagogastroskopie, Endosonographie und Computertomographie, was insgesamt sowohl zu einer verbesserten Frühdiagnostik als auch zu einer präziseren Selektion von Patienten geführt hat, die einer operativen Therapie zugeführt werden. Zusätzlich werden bei der Behandlung des Ösophaguskarzinoms zunehmend multimodale Behandlungskonzepte angewandt, wodurch die 5-Jahres- Überlebensraten insgesamt aber nicht wesentlich verbessert werden konnten. So konnten beispielsweise FORASTIERE et al. (1993) mittels eines neoadjuvanten Radiochemotherapie-Ansatzes 5-Jahres-Überlebensraten von 34% erzielen. Auch die adjuvante Radiochemotherapie konnte bislang zu keiner Prognose- verbesserung beitragen (ADELSTEIN et al. 1994). Patienten, bei denen ein nichtresektables Ösophaguskarzinomstadium diagnostiziert wird, werden palliativen bzw. symptomatischen Therapieformen zugeführt. 32 Schrifttum Die Inoperabilität kann begründet sein in einer funktionellen Inoperabilität (Vorliegen schwerer Begleiterkrankungen), einer lokalen Inoperabilität (T4-Tumor mit Infiltration von Trachea und Herz), sowie einer prognostischen Inoperabilität aufgrund von Fernmetastasenbildung (DECKER und DECKER 2003). Abzugrenzen von diesen Patienten sind primär nicht-operable Patienten, bei denen durch präoperativ durchgeführte Behandlungsformen wie Radiatio und Chemotherapie ein Downstaging, d.h. eine Tumorreduktion mit anschließender Resektion des Tumors erfolgen soll. Eine geeignete Palliation für die individuelle Situation des Patienten lässt sich durch Kombination verschiedener Therapieformen wie Operation, Chemotherapie, Radiochemotherapie, StentEinlage und/oder photodynamischer bzw. endoskopischer Lasertherapie erreichen (HEIER und HEIER 1994; TIETJEN et al. 1994; LIGHTDALE et al. 1995; BOURKE et al. 1996; ABDEL-WAHAB et al. 1998). Die Ziele dieser nicht kurativen Therapieansätze stellen die Verlangsamung des Tumorwachstums und den Erhalt bzw. die Verbesserung der Lebensqualität für die Patienten dar (GIESELER und FÖLSCH 2004). Nach FUNAMI et al. (1999) und SHIMI (2000) soll sich die Lebensqualität der Patienten durch eine Kombination von Radio- und/oder Chemotherapie mit nachfolgender Primärtherapie Implantation die eines Kombination Stents erhöhen. von Fluorouracil Hierbei und hat sich Cisplatin als mit Remissionsraten von 30-40% durchgesetzt (ENZINGER et al. 1999). Erst bei einer deutlichen Progredienz sollte eine Zweitlinientherapie mit einer Radiatio begonnen werden. Bei sehr starken Schluckbeschwerden hat sich die intraluminale Bestrahlung in Afterloading-Technik bewährt. Bei starken thorakalen Schmerzen und/oder Kompression des Ösophaguslumens kann begleitend die kleinvolumige perkutane Radiotherapie mit 36-45 Gy als Palliativmaßnahme eingesetzt werden (GIESELER und FÖLSCH 2004). Zusätzlich lässt sich die Photodynamische Therapie (PDT) als minimalinvasive Therapieform sowohl bei Frühkarzinomen des Ösophagus, als auch bei den Karzinomvorformen des metaplastischen bzw. dysplastischen Ösophagusepithels einsetzen (SAVARY 1998). 33 Schrifttum 2.2. Metastasierungsmodelle Die Metastasierung maligner Tumoren stellt nach wie vor die Haupttodesursache und die Hauptursache für Therapiemisserfolge in der Behandlung von Krebspatienten dar. Der Metastasenentstehung liegt ein komplexer, mehrstufiger Prozess zugrunde. Hierbei kommt es in einem ersten Schritt innerhalb des Primärtumors zur Entwicklung von Zellvarianten, welche sich aus dem Tumorzellverband lösen, durch das umgebende Gewebe migrieren und nach Invasion und Penetration von Lymph- und Blutgefässen in die Zirkulation gelangen (FIDLER und HART 1982; HART und SAINI 1992). Während ihrer Zirkulation im Blutgefässsystem sind disseminierte Tumorzellen besonders hohen physikalischen Scherkräften ausgesetzt, so dass lediglich ein sehr geringer Anteil an Tumorzellen die Passage durch den kleinen Kreislauf, über das Herz in die Sekundärorgane überleben (WEISS und WARD 1988). Nach Erreichen der Sekundärorgane erfolgen in den letzten drei Schritten der Metastasierungskaskade die Adhäsion am Gefäßendothel, gefolgt von Extravasion und Proliferation, wobei die Proliferation in der neuen Gewebsumgebung stark von gewebespezifischen Faktoren abhängig ist (ZETTER 1990). Auch nach ihrer Etablierung in den Sekundärorganen entstehen immer neue Zellvarianten. Auf molekularer Ebene konnten eine Reihe von Proteinen identifiziert werden, die im Rahmen der Metastasierungskaskade eine Rolle zu spielen scheinen. So führt zunächst eine Herunterregulierung (down-regulation) von desmosomalen Adhäsionsmolekülen, wie E-Catherin und Plakoglobin, zum Verlust der wechselseitigen Adhäsion im Tumorzellverband (BEHRENS et al. 1992; BOYER et al. 1992). Anschließend wird die Invasion der Tumorzellen durch die Basalmembran und das umgebende Stroma durch die Expression vom Motilitätsfaktoren, wie den scatter factor und transforming growth factors, sowie durch Sekretion von Proteasen, wie Cathepsin D, Metalloproteinasen und Plasminogenaktivator begünstigt (STOKER und GHERARDI 1991; BIRCHMEIER und BIRCHMEIER 1993; STETLER-STEVENSON 1993; NEKARDA et al. 1994). 34 Schrifttum In diesem Zusammenhang stellt die Etablierung geeigneter in vitro- und in vivoModellsysteme einen möglichen Ansatz zur Identifizierung metastasierungsassoziierter, molekularer Veränderungen dar. Durch die Etablierung spezieller dreidimensionaler Zellkultur-Systeme ist es möglich, die Pathophysiologie von Tumorzellen in Bezug auf ihre Motilität und ihre Interaktion mit kokultivierten Stromazellen modellhaft zu untersuchen. Hierbei kommen Zellkulturflaschen zum Einsatz, deren Böden u.a. mit Agarosegel, Kollagengel oder anderen Extrazellularmatrixprotein-(ECM-)haltigen Gelen beschichtet sind bzw. aus speziellen ECM-haltigen „Schwämmchen“ bestehen (KIM et al. 2004). Zusätzlich zu dem Einfluss der Mikro-Umgebung des Kultursystems auf die zelluläre Differenzierung, Proliferation, Apoptose und Gen-Expression von Tumorzellen, erlaubt das dreidimensionale Zellkultursystem die Erforschung von Zell-Zell und Zell-Extrazellularmatrix-Interaktionen. SO demonstrierten CHISHIMA et al. den Einsatz eines dreidimensionalen Zellkultursystems zur Darstellung des Metastasierungsprozesses unter Verwendung GFP-markierter humaner Lungen-Adenokarzinomzellen (ANIP 973Zellen) (CHISHIMA et al. 1997A). Diese Autoren transfizierten durch Einschleusung eines Vektors, der die cDNA des GFP enthielt, stabil die ANIP 973-Zellen, um sie im Anschluss Nacktmäusen intravenös zu applizieren. Nach einer definierten Zeit wurden die Mäuse getötet, die Lungen reseziert und fragmentiert. Die mit Metastasen durchsetzten Organanteile wurden im Anschluss in einem dreidimensionalen KollagenSchwamm-Matrix-Zellkultursystem kultiviert. Es gelang ihnen, den Prozess der Tumorzellkolonisation in dem verwendeten dreidimensionalen Zellkultursystem darzustellen. Im Gegensatz zu der komplexen Wirtsumgebung eines in vivo-Modells, zeigt das in vitro-Modell definierte Bedingungen, so dass es für spezifische Fragestellungen in der Krebsforschung häufig besser geeignet ist. 35 Schrifttum Dreidimensionale Zellkultursysteme imitieren eher die geweblich-strukturellen Eigenschaften als Monolayer-Zellkultursysteme und erlauben somit eine den in vivo-Verhältnissen angepasste Reaktion im Hinblick auf die Erprobung medikamentöser Therapieformen. Da aber auch metastasierte bzw. disseminierte Tumorzellen im Rahmen ihrer Progression zur manifesten Tumormetastase ähnlich wie die Zellen im Primärtumor - unterschiedliche Zellvarianten ausbilden, scheinen insbesondere einzelne disseminierte Tumorzellen als Frühformen der zur Metastasierung befähigten Zelle für die molekulare Analyse von Metastasierungsvorgängen geeignete Zielstrukturen zu sein. Zur Erforschung dieser molekulargenetischen Eigenschaften metastasierter Tumorzellen, stellen in vivo-Modellsysteme, welche die einzelnen Schritte der Metastasierungskaskade bis zur Bildung einer Metastase ermöglichen, das geeignete System dar. In vivo-Transplantationsmodelle lassen sich in Syngenetische- und in XenograftModelle einteilen. Im Falle der syngenetischen Modelle werden in der Regel Mäuse oder Ratten als Wirtstiere eingesetzt. Ihnen werden murine Tumorzellen oder tumorös veränderte Gewebe appliziert, so dass die entstehenden Tumore im Wirtstier den gleichen genetischen Hintergrund wie die implantierten Tumorzellen aufweisen. Die andere große Gruppe der Transplantationsmodelle repräsentieren XenograftModelle. Hierbei werden immuninkompetenten Tieren humane Tumorzellen injiziert, bzw. humane tumoröse Gewebestücke implantiert (z.B. orthotope Implantation). Der in dem Transplantationstier entstehende Tumor, stellt histologisch eine Mischung aus humanen Tumor- sowie murinen Stromazellen dar (KHANNA und HUNTER 2005). In der Mehrzahl der bestehenden in vivo-Metastasierungsmodelle werden Nacktmäuse eingesetzt. Diese immundefizienten Tiere (FLANAGAN 1966; PANTELOURIS 1968) bilden eine ideale Grundlage für Xenograft-Metastasierungsmodelle humaner Krebszellinien (SHARKEY und FOGH 1984). 36 Schrifttum Die erste erfolgreiche Transplantation humaner Tumorzellen in Nacktmäuse gelang RYGAARD und POVLSEN im Jahre 1969. Des Weiteren werden SCID (severe combined immunodefiency)-Mäuse als Wirtstiere verwandt. Sie weisen kombinierte Gendefekte in der Anzahl und Funktion von T- und B-Zellen auf. Bisherige Modellversuche zur in vivo-Simulation des mehrstufigen Metastasierungsprozesses waren bislang durch die nur sehr begrenzt mögliche Detektion einzelner disseminierter Tumorzellen limitiert und beschränkten sich größtenteils auf den histologischen Nachweis von manifesten Organfernmetastasen. Eine Weiterentwicklung der Modelle im Hinblick auf die Detektion singulärer Tumorzellen im Wirtsgewebe, stellte die Einschleusung von Marker-Genen in die Tumorzellen dar. So wurden verschiedene Methoden etabliert, einzelne Tumorzellen in vitro zu markieren, sie anschließend in das Modell-Tier zu implantieren und die Tumorzellen optisch darzustellen. Auf diese Weise lassen sich Tumorzellen detektieren und ihre Interaktionen mit den umgebenden Wirtszellen untersuchen. FIEDLER (1970) und JUACABA et al. (1989) markierten die Tumorzellen mit Radioisotopen, um deren Verteilung in den Organen zu beurteilen. FROST et al. (1987), HU et al. (1987) und MCMORROW et al. (1988) verwendeten in ihren Studien spezifische Chromosomen-Marker, die eine Detektion der Tumorzellen im Wirtsgewebe ermöglichten. Eine weitere Methode setzten TALMADGE et al. (1987), KERBEL et al. (1988) und ITAYA et al. (1989) ein. Sie transfizierten fremde DNASequenzen in die Tumorzellen, um deren klonalen Ursprung zu untersuchen. Der Nachteil dieser Modellsysteme stellt die Ausschließlichkeit in der Anwendung entweder als geno- oder als phänotypischer Marker dar. Diese Einschränkung wurde durch den Einsatz des Escherichia coli (lacZ)-Gens aufgehoben. Durch diese Methode lassen sich einzelne metastatische Herde auf Einzelzellniveau detektieren (LIN et al. 1990A; LIN et al. 1990B; BRUNNER et al. 1992; KOBAYASHI et al. 1997; CULP et al. 1998A; CULP et al. 1998B; KRUGER et al. 1998-1999; MAURER-GEBHARD et al. 1999; ZHANG et al. 1999; HOLLERAN et al. 2002). 37 Schrifttum So schleusten LIN et al. im Jahre 1990(A) das Escherichia coli ß-galactosidase (lacZ)-Gen in humane EJ Ha-ras onkogen-transfizierte BALB/c 3T3-Zellen, die im Anschluss athymischen Nacktmäusen injiziert wurden. Unter Verwendung eines chromogenetischen Substrates, liessen sich die lacZmarkierten Zellen sowohl im entstandenen Primärtumor, als auch in den Fernmetastasen blau anfärben. Damit gelingt eine Unterscheidung der Tumorzellen von den Wirtszellen. Das lacZ-Gen erscheint als ein stabiler Marker während der Tumorprogression in vivo. Der genotypische Nachweis des lacZ-Gens gelingt mit Southern-blot Analysen, der Phänotypische durch Anfärbung. Obwohl durch diese Methode eine optische Darstellung selbst kleiner Zellgruppen möglich ist (CULP et al. 1998B), zeigen sich Limitierungen: die Methode ist sehr zeitaufwendig, es ist schwierig eine einzelne maligne Zelle zu detektieren und die Probenaufbereitung ist komplex. Ferner verhindert die endogene ß-Galactosidase Aktivität einiger Zellen in vielen Fällen eine sichere Interpretation der Ergebnisse (ZDENEK 1970). FUKUMURA et al. (1997) und CHAMBERS et al. (1995) färbten das Tumorgewebe mit Fluoreszenzfarbstoffen und stellten den Tumor mittels Videomikroskopie über eine Gewebefenestrierung in der Maus dar. Diese Methode eignet sich lediglich für kurze Untersuchungen, nicht für Langzeitmetastasierungsstudien. Eine Alternative zu den bisher genannten Verfahren der optischen Darstellung von Tumorzellen, stellt das Luciferase-Reporter-System dar (VOOIJS et al. 2002; ADAMS et al. 2002). Hierbei werden Luciferase-Gene in Tumorzellen insertiert, so dass diese Licht emittieren (SWEENEY et al. 1999). Diese Luciferase-Enzyme, welche in Säugetierzellen transferiert werden, benötigen aber über eine exogene Injektion zugeführtes spezifisches LuciferinSubstrat. Dadurch wird diese Methode unpraktikabel und zeitintensiv. Ein weiterer Nachteil stellt die geringe optische Auflösung, sowie die Zeitspanne dar, die 38 Schrifttum vergeht, bis ein Signal von dem anästhesierten Tier entsteht. Trotz dieser Limitierungen lassen sich mit dieser Methode einzelne Tumorzellen detektieren. Die bisher beschriebenen Methoden zur Tumorzelldetektion stellen im Hinblick auf die Untersuchungsmöglichkeit einer einzelnen Tumorzelle noch nicht das Idealsystem dar. Vor diesem Hintergrund begann die Suche nach einem System, welches eine höhere Spezifität, ein stärkeres optisches Signal und eine höhere optische Auflösung unter physiologischen Bedingungen zeigen kann. Die Optimierung dieser beschriebenen Methoden fand sich mit dem Einsatz des green-fluorescent-protein (GFP) als ein Indikator-Gen für Tumorzellen. Durch die Anwendung des GFP als Marker ist es mittlerweile möglich, einzelne disseminierte Tumorzellen in entsprechenden Modellsystemen aufzuzeigen (PARIS et al. 2004). Die Arbeitsgruppe um R. M. HOFFMAN nutzte als Erste den Vorteil der GFPMarkierung zur Detektion singulärer disseminierter Tumorzellen, um innovative Metastasierungsmodelle zu entwickeln. Erstmalig in diesem Kontext wurde die GFP-Transfektion von CHISHIMA et al. (1997B) durchgeführt. Sie transfizierten stabil chinese-hamster-ovary-Zellen mit einem Vektor, der die cDNA des GFP enthielt. Nach orthotoper Implantation dieser GFP-markierten Tumorzellen wiesen sie als Erste einzelne GFP-exprimierende Tumorzellen in vitalem Gewebe nach. Im Anschluss an diese erfolgreiche Studie führten sie stabile Transduktionen des GFP-Gens in eine Vielzahl humaner Tumorzelllinien durch (CHISHIMA et al. 1997C; CHISHIMA et al. 1997D; CHISHIMA et al. 1997E; YANG et al. 1998; YANG et al. 1999A; YANG et al. 1999B; YANG et al. 1999C; YANG et al. 2000). Der Hauptvorteil GFP-basierter Metastasierungsmodelle liegt in der Einfachheit der Anwendung. So lassen sich GFP-markierte vitale Zellen direkt im gesunden Gewebe ohne weitere aufwendige Präparation darstellen. Dafür wird das unfixierte Gewebe in dünne Scheiben zerteilt, zwischen Glasplatten eingebettet und dann mittels eines Fluoreszenz-Mikroskopes betrachtet (PARIS et al. 1999). 39 Schrifttum Die derzeitigen Forschungsergebnisse, einschließlich der Entwicklung orthotoper GFP-Metastasierungsmodelle zum humanen Lungen- (YANG et al. 1998), Prostata- (YANG et al. 1999A), Pankreas- (BOUVET et al. 2000) und KolonKarzinoms (YANG et al. 2000) sowie des Melanoms (YANG et al. 1999B) demonstrieren, dass GFP-transfizierte Tumorzellen das ideale System darstellen, um die Stufen Angiogenese, des Metastasierungsprozesses, Latenzzustand von Tumorzellen wie Tumorwachstum, (engl. dormancy), Tumorzelldisseminierung, Invasion, Metastasierung und Tumorprogression, in vivo darzustellen. Ein weiterer Ansatz zur Detektion GFP-transfizierter Tumorzellen im Modellsystem sind die Möglichkeiten von Intravitaler Mikroskopie (IVM) (KIKKAWA et al. 2002; STURM et al. 2003), Intravitaler Video Mikroskopie (IVVM) (KAN et al. 1999; NAUMOV et al. 1999; ITO et al. 2001; MOOK et al. 2003) und der GanzkörperDarstellung (YANG et al. 2000; BOUVET et al. 2002; YAMAMOTO et al. 2003; WANG et al. 2003). Diesen Verfahren ist gemeinsam, dass sie bereits eine Untersuchung des Metastasierungsvorganges am lebenden Tier erlauben. Durch Fenestrierung bestimmter Körperareale der Versuchstiere werden mit Hilfe spezieller Fluoreszenz-Mikroskope und Fluoreszenz-Licht-Boxen in regelmäßigen Abständen die Tiere betäubt und der progrediente Metastasierungsprozess in seiner jeweiligen Stufe betrachtet. So konnten KAN et al. (1999) und NAUMOV et al. (1999) eindrücklich demonstrieren, dass der Einsatz von IVVM eine real-time-Betrachtung GFP-markierter Zellen in lebenden Tieren auf Einzelzellniveau ermöglicht. YANG et al. (2000) entwickelten Ganzkörper-Metastasierungsmodelle, in denen die Metastasierung in lebenden Tieren optisch dargestellt werden kann. Hierfür werden den Mäusen GFP-markierte Tumorzellen injiziert und im Anschluss Fragmente der entstandenen Tumoren orthotop implantiert. In einer FluoreszenzLicht-Box ist es möglich, die gewachsenen Metastasen optisch zu erkennen. Hierbei lässt sich die Metastasierungskaskade während ihrer Dauer im selben Tier untersuchen, einschließlich der Arretierung der malignen Kapillargefäßen, der Extravasation und des Metastasenwachstums. 40 Zellen in Schrifttum 2.2.1. Das green-fluorescent-protein (GFP) Das erstmalig von SHIMOMURA et al. (1962) beschriebene biolumineszierende green-fluorescent-protein (GFP) stammt aus der Leuchtmeduse Aequorea victoria. Generell wird bei der Biolumineszenz chemische Energie mit einer hohen Quantenausbeute in Lichtenergie umgewandelt. In der Regel dient ein Luciferin (LF) als Substrat für eine Luciferase, die das Luciferin unter Quantenemission oxidiert (WEHNER und GEHRING 1995). Abb. 2: Dreidimensionale Struktur des green-fluorescent-protein (GFP) (Quelle: http://www.biochemtech.uni-halle.de) 41 Schrifttum Aequorea victoria benötigt zur Umsetzung des Luciferins keine Luciferase. Als Reaktionspartner seines Luciferins (Aequorin) dienen Ca2+-Ionen. Sobald Calcium an das Photoprotein Aequorin bindet, wird Licht emittiert (SHIMOMURA et al. 1962; WEHNER und GEHRING 1995). LF · H2 + ½ O2 ------------> Ca2+ LF + H2O + hv (Gleichung 1: aus WEHNER und GEHRING 1995) Das GFP von Aequorea victoria besteht aus 238 Aminosäuren und stellt ein kompaktes Monomer mit einem relativen Molekulargewicht von 27.000 bis 30.000 kDa dar (PRENDERGAST und MANN 1978). Dabei ist das GFP außerordentlich konformationsstabil und denaturiert erst unter extremen Bedingungen (BOKMAN und WARD 1981; SHIMOMURA und SHIMOMURA 1981; WARD und BOKMAN 1982). Sein Absorptionsmaximum liegt bei 395 nm (MORISE et al. 1974). Nach Anregung durch UV-Licht liegt der Emissionspeak von GFP bei 509 nm, mit einer geringen Schulterbildung bei 540 nm (MORISE et al. 1974). Abb. 3: Emissionsspektrum des green-fluorescent protein (GFP) (Quelle: http://www.biochemtech.uni-halle.de) 42 Schrifttum PRASHER et al. klonierten und sequenzierten 1992 das GFP-Gen der Aequorea victoria und ermöglichten damit seine Expression in heterologen Organismen (PRASHER et al. 1992). CHALFIE et al. (1994) konnten zeigen, dass GFP durch Anregung mit Licht im Wellenlängenbereich von 395 bis 470 nm (blaues Licht) sowohl in prokaryotischen (Escherichia coli) als auch eukaryotischen Zellen eine starke, grüne Fluoreszenz aufwies. Abb. 4: Grün fluoreszierende GFP-markierte Zellen in einer Suspension (Quelle: http://www.biochemtech.uni-halle.de) Ein großer Vorteil bei der GFP-Transfektion ist, dass es keine toxischen Effekte auf Zellen ausübt und weder die Zellfunktion noch den Zellstoffwechsel zu beeinflussen scheint (CHALFIE et al. 1994). Eine Steigerung des Expressionslevels von GFP in Säugetierzellen gelang ZOLOTUKHIN et al. (1996) durch die Entwicklung einer humanisierten Mutante des GFP (hGFP-S65T). Diese Mutante zeigt eine im Vergleich zum GFP-Wildtyp 35fach stärkere Fluoreszenz und wird zudem effektiver in Säugetierzellinien exprimiert. 43 Schrifttum Die Fluoreszenzfähigkeit des GFP von Aequorea victoria ist intrinsisch in seiner primären Proteinstruktur begründet. Zur Aktivierung der GFP-Fluoreszenz bedarf es keiner zusätzlichen Transkriptionsfaktoren, Kontrastmittel oder ionisierender Strahlung (CODY et al. 1993); ferner ist sie spezies-unabhängig (KAIN et al. 1995). Eine weitere Besonderheit des GFP stellt sein kovalent gebundenes Chromophor dar, welches sich aus modifizierten Aminosäureresten zusammensetzt und innerhalb des Polypeptids befindet (CODY et al. 1993). 44 Schrifttum 2.3. Die Minimale Residuale Tumorerkrankung (MRD) Trotz verbesserter Operationstechniken und Anwendung multimodaler Therapiekonzepte erleidet ein hoher Prozentsatz von Patienten mit malignen Tumoren, die einer kurativ intendierten chirurgischen Therapie unterzogen wurden, nach wie vor frühzeitig ein Tumorrezidiv. Da das Auftreten lokoregionärer Rezidive durch radikale operative Strategien weitgehend verhindert werden kann, manifestieren sich Rezidivtumoren häufig als fernmetastatische Rezidive (SANO et al. 1993; HOSCH et al. 1998). Es muss daher davon ausgegangen werden, dass es bei einem Teil dieser Patienten bereits zum Zeitpunkt der Primärtumoroperation zu einer „okkulten“ Streuung von Tumorzellen gekommen ist, die mit derzeitigen bildgebenden Verfahren sowie routinemäßig durchgeführten histopathologischen Untersuchungen nicht erfasst werden kann. Durch den Einsatz sensitiver immunzyto- bzw. immunhistochemischer sowie molekularbiologischer Techniken ist es aber mittlerweile möglich, diese „okkulte Tumorzellstreuung“ in Indikatororganen, wie Knochenmark und Lymphknoten, zu detektieren. Hierbei hat sich der Nachweis dieser „okkulten Tumorzellstreuung“ in einer Vielzahl von Studien als klinisch relevanter und vom Tumorstadium unabhängiger Prognosefaktor erwiesen. Der Nachweis von okkult disseminierten Tumorzellen scheint in diesem Rahmen Ausdruck eines latenten Stadiums der Krebserkrankung zu sein und wird daher auch als Minimale Residuale Tumorerkrankung (engl.: minimal residual disease, MRD) benannt (KLEIN et al. 2002). Trotz der sich abzeichnenden klinischen Relevanz dieser minimalen residualen Tumorerkrankung bei Patienten mit Karzinomen der Lunge (PASSLICK et al. 1994), des Pankreas (HOSCH et al. 1997A), des Ösophagus (IZBICKI et al. 1997; HOSCH et al. 2000), der Mamma (TROJANI et al. 1987; NO AUTHOR: Prognostic importance of occult axillary lymph node micrometastases from breast cancer. 1990; MCGUCKIN et al. 1996; COTE et al. 1999) des Kolons (GREENSON et al. 1994), des Magens (MAEHARA et al. 1996), der Prostata (FREEMAN et al. 1995; EDELSTEIN et al. 1996) und beim Melanom (COCHRAN et al. 1988), ist wenig bekannt über die Biologie 45 Schrifttum dieser okkult disseminierten Tumorzellen. Da sich weiterführende Analysen an solchen Zellen auf Grund ihrer extrem niedrigen Frequenz äußerst schwierig gestalten, ist nach wie vor nicht eindeutig geklärt, ob es sich bei ihnen (1) auch tatsächlich um Tumorzellen handelt und (2), ob diese Tumorzellen vital und proliferationsfähig sind und somit als "Stammzellen" späterer Makrometastasen angesehen werden müssen, oder ob sie (3) lediglich tote, abgeschilferte und lymphatisch drainierte bzw. hämatogen abgeschwemmte Zellen des Primärtumors darstellen. Unterstützt wird diese Skepsis dabei auch dadurch, dass diesen immunhisto- bzw. immunzytochemisch zu detektierenden Zellen in Lymphknoten und Knochenmark häufig tumorzelltypische morphologische Charakteristika fehlen (HOSCH et al. 2000). Des Weiteren wird eine Beurteilung der MRD durch die große Anzahl unterschiedlicher Nachweismethoden, sowie fehlende Standards bei der Durchführung dieser Detektionsansätze erschwert. Nach derzeitigem Wissensstand scheinen okkult disseminierte Tumorzellen überwiegend ruhende, d.h. in der G0-(G1-)Phase befindliche Zellen zu sein, die evtl. zu einem späteren Zeitpunkt durch exogene und/oder endogene Faktoren eine Wandlung zur proliferierenden Zelle erfahren (SCHLIMOK et al. 1987; RIETHMÜLLER et al. 1992; PANTEL et al. 1993A). Die Ruhephase kann dabei mehrere Jahre bis Jahrzehnte betragen (tumor cell dormancy), bevor es zum Auftreten klinisch manifester Metastasen kommt. Welche wachstumsvermittelnden bzw. wachstumshemmenden Faktoren dabei die Biologie der Zellen bestimmen, ist ebenso ungeklärt wie die Beobachtung, dass sich individuelle „Tumorzellen“ im Knochenmark auch bei Tumorentitäten nachweisen lassen, bei denen manifeste Knochenmetastasen nur äußerst selten anzutreffen sind. So finden sich beispielsweise bei etwa 30-40% aller Patienten mit kolorektalem Karzinom im Knochenmark individuelle „Tumorzellen“ (SCHLIMOK et al. 1990; LINDEMANN et al. 1992; PANTEL et al. 1994), eine manifeste ossäre Metastasierung macht hingegen nur etwa 5% aller hämatogenen Fernmetastasen dieses Tumortyps aus (SCHUBERT und BETHKE 1981). In jüngster Vergangenheit wurden wiederholt Versuche unternommen, pathohisto- bzw. pathozytologische Kriterien für die „okkulten“ disseminierten Tumorzellen in Lymphknoten und Knochenmark zu 46 Schrifttum definieren (PANTEL et al. 1994; HERMANEK 1999). Einigkeit besteht seither weitgehend darin, dass zwischen „okkulten (Mikro-)metastasen (MM)“ und „isolierten Tumorzellen (ITC)“ unterschieden werden sollte. So ist beispielsweise nach einer Empfehlung der UICC (HERMANEK et al. 1999) vom Vorliegen einer Lymphknoten-„Mikrometastase“ auszugehen, wenn diese Anzeichen für Proliferation aufweist, d.h. mehrzellig ist, dabei einen maximalen Durchmesser von 2 mm nicht überschreitet und sich im Lymphknoten implantiert hat, d.h. außerhalb von Blutgefäßen bzw. extrasinusoidal lokalisiert ist. Fakultativ kommt als weiteres Unterscheidungsmerkmal eine desmoplastische Stromareaktion hinzu. Weisen immunhistochemisch detektierte „Tumorzellen“ in Lymphknoten diese Kriterien nicht auf, sollte von „isolierten Tumorzellen“ gesprochen werden. 2.3.1. Nachweis „okkult“ disseminierter Tumorzellen im Knochenmark Da das Knochenmark einen Ort mit intensivem Zellaustausch zwischen zirkulierendem Blut und mesenchymalem Interstitium darstellt, scheint es ein besonders geeignetes und leicht zugängliches Kompartiment zur Detektion einzelner disseminierter Tumorzellen zu sein (SOLAKOGLU et al. 2002). Bei der Gewinnung von Knochenmark hat sich insbesondere die Aspiration aus dem vorderen und hinteren Beckenkamm bewährt (REDDING et al. 1983). Ein weiterer Vorteil des Knochenmarks ergibt sich aus der Anatomie seines Gefäßsystems. Dieses besteht aus einem sinusoidalen Geflecht, welches wie ein Filter wirkt, so dass hier mit einer insgesamt höheren Anzahl an Tumorzellen zu rechnen ist. Dennoch lassen sich einzelne disseminierte Tumorzellen im Knochenmark nur in einer äußerst niedrigen Frequenz nachweisen. So finden sich bei einem Patienten mit disseminierten Tumorzellen im Knochenmark in der Regel nicht mehr als 1-10 Tumorzellen vor dem Hintergrund von 106 normalen mononukleären Knochenmarkszellen. Insgesamt können disseminierte Tumorzellen im Knochenmark bei etwa 30% aller Patienten mit lokal begrenzten epithelialen Tumoren (M0) 47 Schrifttum nachgewiesen werden (LINDEMANN et al. 1992; BRAUN et al. 2000; PANTEL und WOELFLE 2004). Bei der Detektion von disseminierten Tumorzellen im Knochenmark kommen prinzipiell schiedener immunzytochemische anti-epithelialer Analysetechniken Detektionsantikörper unter oder Verwendung ver- molekularbiologische Techniken wie die Polymerase-Kettenreaktion (PCR) bzw. Reverse Transkriptase(RT-)PCR zum Einsatz . Hierbei konnte die prognostische Relevanz des Nachweises von disseminierten Tumorzellen im Knochenmark in einer Vielzahl von prospektiven klinischen Studien belegt werden. In diesen überwiegend immunzytochemischen Studien zeigte sich, dass Patienten mit disseminierten Tumorzellen im Knochenmark signifikant früher und häufiger Tumorrezidive entwickelten und/oder signifikant früher und häufiger tumorbedingt verstarben, als Patienten ohne diese Zellen (siehe Tab. 2). 48 Schrifttum Tab. 2: Nachweis epithelialer Tumorzellen im Knochenmark Tumorentität Mamma-Ca KolorektumCa Magen-Ca Pankreas-Ca Prostata-Ca DetektionsMarker DetektionsTechnik Lungen-Ca (NSCLC) Blasen-Ca Nieren-Ca Referenzen CK ICC + COTE et al. 1991 BRAUN et al. 2000 WIEDSWANG et al. 2003 JANNI et al. 2005 TAG12 ICC + DIEL et al. 1992 EMA ICC + MANSI et al. 1991 CEA RT-PCR Keine Angabe GERHARD et al. 1994 CK ICC + SCHLIMOK et al. 1990 LINDEMANN et al. 1992 CEA RT-PCR CA19-9 ICC CK ICC CEA RT-PCR CEA RT-PCR CK CA 19-9 ICC + JUHL et al. 1994 CK ICC Keine Angabe RIESENBERG et al. 1993 OBERNEDER et al. 1994 PANTEL et al. 1995B Keine Angabe MANSI et al. 1988 CK, PSA, EMA Lungen-Ca (SCLC) PrognoseWert Keine Angabe Keine Angabe + Keine Angabe Keine Angabe GERHARD et al. 1994 JUHL et al. 1994 SCHLIMOK et al. 1991 JAUCH et al. 1996 GERHARD et al. 1994 GERHARD et al. 1994 SM1 ICC Keine Angabe LCA 1 – 3 ICC Keine Angabe HUMBLET et al. 1988 CK ICC + PANTEL et al. 1993B CK ICC CK ICC Keine Angabe Keine Angabe STAHEL et al. 1985 OBERNEDER et al. 1994 OBERNEDER et al. 1994 Abk.: CK= Zytokeratin; CEA = Carcinoembryonales Antigen; Ca= Karzinom; EMA= epithelial membrane antigen; ICC= Immunzytochemie; LCA 1-3= leucocyte-common Antigen; NSCLC= non-small cell lung cancer; PSA= Prostata-spezifisches Antigen; SM1=muriner monoklonaler Antikörper gegen das Oberflächenantigen des SCLC (small-cell lung cancer) 49 Schrifttum 2.3.2. Nachweis „okkult“ disseminierter Tumorzellen in Lymphknoten Ein weiteres Indikatororgan für den Nachweis einer MRD stellen Lymphknoten dar. Hierbei werden resezierte Lymphknoten, welche in der konventionellen histopathologischen Untersuchung als „tumorfrei“ klassifiziert wurden, mittels Immunhistochemie oder molekularbiologischen Techniken auf „okkult“ disseminierte Tumorzellen hin untersucht (IZBICKI et al. 1997). Diese „okkulten“ Tumorzellen können sich immunhistochemisch als isolierte Einzelzellen (engl.: isolated tumor cells, ITC) oder kleine Tumorzellcluster darstellen (PASSLICK et al. 1994). Lassen sich diese Zellen in „tumorfreien“ Lymphknoten nachweisen, liegt ihre Frequenz bei etwa 1-10 Zellen vor dem Hintergrund von 105 normalen Lymphknotenzellen. Neben immunhistochemischen Verfahren unter Einsatz verschiedener antiepithelialer Antikörper, kommen bei der Detektion von okkult disseminierten Tumorzellen in Lymphknoten ebenfalls molekularbiologische Techniken, wie PCR oder RT-PCR, zum Einsatz (siehe Tab. 3). Ähnlich wie beim Knochenmark konnten zahlreiche Studien zeigen, dass die Detektion disseminierter Tumorzellen in „tumorfreien“ Lymphknoten mit einer ungünstigen postoperativen Prognose assoziiert ist (GREENSON et al. 1994; PASSLICK et al. 1994; MAEHARA et al.1996; MCGUCKIN et al. 1996; IZBICKI et al. 1997; HOSCH et al. 1997A; HOSCH et al. 1997B; COTE et al. 1999; CAI et al. 2000; LEE et al. 2002). 50 Schrifttum Tab. 3: Nachweis epithelialer Tumorzellen in konventionell histopathologisch „tumorfreien“ Lymphknoten Tumorentität Mamma-Ca Lungen-Ca (NSCLC) Ösophagus-Ca Pankreas-Ca Magen-Ca Prostata-Ca Kolorektum-Ca Referenzen DetektionsMarker DetektionsTechnik PrognoseWert CK, EMA, MUC1 IHC + DE MASCAREL et al. 1992 CK, MUC1 IHC + MCGUCKIN et al. 1996 CK IHC + COTE et al. 1999 Ber-EP4 IHC + Ber-EP4 IHC + KUBUSCHOK et al. 1999 IHC + IZBICKI et al. 1997 Ber-EP4 IHC + HOSCH et al. 2000 Ber-EP4 IHC + HOSCH et al. 1997A CK IHC + MAEHARA et al. 1996 CAI et al. 2000 LEE et al. 2002 PSA RT-PCR Keine Angabe DEGUCHI et al. 1993 CEA RT-PCR + LIEFERS et al. 1998 CK, CEA IHC Keine Angabe CUTAIT et al. 1991 GREENSON et al. 1994 Ber-EP4 PASSLICK et al. 1994 Abk.: CEA= Carcinoembryonales Antigen; CK= Zytokeratin; Ber-EP4= Marker gegen das epithelial adhesion molecule (EpCAM); IHC= Immunhistochemie; NSCLC= non-small cell lung cancer; PSA= Prostata-spezifisches Antigen 51 Material und Methoden 3. Material und Methoden 3.1. Die Zelllinie PT1590 Grundlage der vorliegenden Studie bildete die spontan immortale humane Tumorzelllinie PT1590. Diese war 1997 im Chirurgischen Forschungslabor der Klinik für Allgemein-, Viszeral- und Thoraxchirurgie (Direktor: Prof. Dr. med. J. R. IZBICKI) am Universitätsklinikum Hamburg-Eppendorf aus dem Primärtumor eines Patienten mit Ösophagus-Adenokarzinom generiert worden. Tumorigenität und Metastasierungsfähigkeit dieser Zelllinie waren durch subkutane Xeno- transplantation in SCID-Mäuse nachgewiesen worden (SCHEUNEMANN et al. 1999; HOSCH et al. 2000). 2 Aliquots dieser Zelllinie mit jeweils 2x106 Tumorzellen, die am 19.09.1997 unter standardisierten Einfrierbedingungen in RPMI 1640 mit 10% Dimethylsulfoxid (DMSO) und 10% hitzeinaktiviertem fetalen Kälberserum (FCS) in 2 ml Einfrierröhrchen in flüssigem Stickstoff tiefgefroren worden waren, bildeten das Ausgangsmaterial zu den Zellkulturarbeiten der vorliegenden Studie. 3.1.1. Zellkultur Die in flüssigem Stickstoff asservierten Einfrierröhrchen mit den PT1590-Zellen wurden nach der Entnahme aus dem Stickstofftank zunächst für etwa 20 Minuten auf Nasseis und anschließend im Wasserbad bei +37°C aufgetaut. Die anschließenden Zellkulturarbeiten wurden unter sterilen Bedingungen unter einer Reinraumwerkbank durchgeführt. Die Zellsuspension wurde in 10 ml RPMI 1640 Medium, welches 10% hitzeinaktiviertes fetales Kälberserum enthielt, aufgenommen und bei Raumtemperatur für 8 Minuten bei 1.250 Upm zentrifugiert. Nach Verwerfen des Überstands wurde das Zellpellet in 2 ml eines speziellen Kulturmediums resuspendiert und in 25-cm2Zellkulturflaschen überführt. Dieses Kulturmedium enthielt neben dem RPMI 1640 Trägermedium 10% FCS, 1000 µg/ml Penicillin/Streptomycin, 10 mg/ml Gentamycin, 100x200 mM L-Glutamine, 10 µmol/ml Transferrin, 1 µg/ml Insulin, 52 Material und Methoden sowie die Wachstumsfaktoren basic fibroblast growth factors bFGF (1 µg/ml), epithelial growth factors EGF (1 µg/ml) (siehe Tab. 4) und war in dieser Zusammensetzung bereits bei der initialen Generierung der Zellinie PT1590 verwendet worden (HOSCH et al. 2000). Tab. 4: Zusammensetzung des Kulturmediums (berechnet für 500 ml Medium) (HOSCH et al. 2000) Reagenzien [Konzentration] Volumen [ml] RPMI 1640 w/o L-Glutamine Fetales Kälberserum Penicillin / Streptomycin [10 000/10 000 µg/ml] Insulin [1 µg/ml] Basic Fibroblast Growth Factor [1µg/ml] Epithelial Growth Factor [1 µg/ml] L-Glutamine 200 mM Gentamycin [10 mg/ml] Transferrin [10 µmol/ml] 422,5 50,0 5,0 5,0 5,0 5,0 5,0 5,0 2,5 Die Kultivierung der Tumorzellen erfolgte anschließend bei einem konstanten Stickstoffanteil von 5% bei +37°C und gesättigter Luftfeuchtigkeit in einem Inkubator. Alle 2 bis 3 Tage bzw. beim Umschlag des im Kulturmedium enthaltenen pHabhängigen Indikatorfarbstoffs Phenolrot wurde das Kulturmedium mit Hilfe einer Vakuumpumpe und sterilen Pipetten abgesaugt und durch frisches Nährmedium ersetzt. Die adhärent wachsenden Tumorzellen wurden nach Erreichen einer Konfluenz von 70-80% der Kulturflaschenoberfläche durchschnittlich alle 4-5 Tage passagiert. Nach Absaugen des Zellkulturmediums wurden die Zellen hierbei mit 5 ml Phosphat-gepufferter Kochsalzlösung (engl. Phosphate-buffered saline, PBS, pH 7,4) gewaschen. 53 Material und Methoden Nach Entfernen des PBS wurden die Zellen mit 2-5 ml steriler Trypsin-EDTALösung überschichtet und für 1 Minute bei +37°C inkubiert. Die Trypsinierung wurde im Anschluss durch Zugabe von 10 ml Kulturmedium gestoppt. Unter dem Auflichtmikroskop erfolgte eine Kontrolle der Zellablösung. Die vom Flaschenboden gelösten Zellen wurden mit einer Pipettierhilfe aufgenommen, in ein 15 ml Zentrifugenröhrchen überführt und für 5 Minuten bei 1.250 Upm und Raumtemperatur zentrifugiert. Der Überstand wurde verworfen, das Zellpellet in 10 ml PBS aufgenommen und anschließend erneut für 5 Minuten bei 1.250 Upm zentrifugiert. Nach Abnahme des Überstands erfolgte die Zellzählung mittels eines Haemozytometer nach Neubauer. Anschließend wurde ein Teil der Zellen für die weitere Expansion in Kulturmedium resuspendiert und in Kulturflaschen verbracht, während ein anderer Anteil zu Aliquots von je 2x106 Zellen weggefroren wurde. Hierfür wurden die Zellen mit 1,5 ml Einfriermedium, welches RPMI 1640, FCS und 10%iges DMSO im Verhältnis 5:3:2 enthielt, resuspendiert und in vorgekühlte 1,5 ml Nunc-Röhrchen überführt. Anschließend wurden die Zellen zunächst für 15 Minuten auf +4°C heruntergekühlt, um hiernach für 24 Stunden in einem bereits vorgekühlten Isopropanolbad bei -80°C gelagert zu werden. Abschließend erfolgte eine Asservierung der Zellen in flüssigem Stickstoff. 3.2. Transfektion von PT1590 Die Einschleusung von Fremd-DNA in eukaryote Zellen wird allgemein als Transfektion bezeichnet. Zur stabilen Expression des Markergens enhancedgreen-fluorescent-protein (EGFP) wurde dessen codierende DNA mittels verschiedener Vektorkonstrukte in PT1590-Zellen eingeschleust. Bei EGFP handelt es sich um eine humanisierte Form des green-fluorescent-protein (GFP), welches nach Transfektion und Expression in humanen Zellen gegenüber dem Wildtyp-GFP eine 25-30fach erhöhte Biolumineszenz aufweist (CODY et al. 1993; CHALFIE et al. 1994; CORMACK et al. 1996). 54 Material und Methoden Die Transfektion der Zelllinie PT1590 mit EGFP erfolgte mit zwei unterschiedlichen Techniken: Neben der Elektroporation wurde zusätzlich eine Transfektion mit dem lipidbasierten Transfektionsreagenz FuGENE 6 (Roche Diagnostics GmbH, Mannheim) durchgeführt. Einen Überblick zu den verwendeten Vektoren bzw. Vektorkonstrukten liefert Tabelle 5. Tab. 5: Vektoren und Vektorkonstrukte* Vektor bzw. Vektorkonstrukt pIRESpuro2EGFP pEGFP-N1 pLEGFP-N1 β-Lactamase; Puromycin-NAcetyltransferase β-Lactamase; AminoglykosidPhosphotransferase β-Lactamase; AminoglykosidPhosphotransferase Resistenzgene Puromycin G418 G418 Größe des Vektors 5,9 (kb) 4,7 6,9 Insert EGFP - - Herkunft des Inserts pEGFP-N1 - - Größe (bp) 741 - - Antibiotikum Selektion des zur Inserts * Alle Vektoren wurden über Clontech, BD Biosciences, Heidelberg, bezogen 55 Material und Methoden 3.2.1. Nukleinsäurearbeiten Tab. 6: Enzyme Enzym Hersteller BamH I (Puffer E) Promega, Madison, WI, USA Not I (Puffer D) Promega, Madison, WI, USA Sac I (Puffer J) Promega, Madison, WI, USA Xho I (Puffer D) Promega, Madison, WI, USA T4-DNA Ligase Tab. 7: Promega, Madison, WI, USA Pufferlösungen und Mischansätze Puffer/Mischansätze Zusammensetzung Hersteller Ligase-Puffer 30 mM Tris/HCl (pH 7,8) Promega GmbH, Mannheim 1 mM ATP 10 mM MgCl2 10 mM Dithiothreitol 50 x TAE-Lösung 2 M Tris-Acetat Serva GmbH, Heidelberg 50 mM EDTA (pH 8,0) Serva GmbH, Heidelberg ad 1 Liter mit Aqua dest. TE-Puffer 10x Gel-Ladepuffer 10 mM Tris/HCl (pH 7,5) Serva GmbH, Heidelberg 2 mM EDTA Serva GmbH, Heidelberg 50% (v/v) Glycerin Sigma-Aldrich GmbH, Steinheim 0,25% (w/v) Merck KGaA, Darmstadt Bromphenolblau Merck KGaA, Darmstadt 0,25% (w/v) Xylencyanol Marker-Mischansatz 50 µl SmartLadder Eurogentec s.a., Seraing, Belgien 50 µl 10x Gel-Ladepuffer 400 µl Aqua bidest. 56 Material und Methoden Tab. 8: Weitere verwendete Chemikalien Chemikalien peqLab Agarose Gold Hersteller Universal peqLab Biotechnologie GmbH, Erlangen MinElute PCR Purification Quiagen GmbH, Hilden Kit MinElute Gel Extraction Kit 3.2.1.1. Quiagen GmbH, Hilden Enzymatische Verdauung der DNA mit Restriktionsendonukleasen Die zur restriktionsenzymatischen Spaltung von DNA verwendeten Restriktionsendonukleasen und Puffer wurden ausschließlich über die Firma Promega GmbH, Heidelberg, bezogen. Alle Reaktionen wurden nach den Empfehlungen des Herstellers (Promega Corporation, Madison, WI, USA) durchgeführt. Das Gesamtvolumen der Reaktion betrug mindestens das Zehnfache des Volumens der eingesetzten Enzymlösung, damit keine inhibitorischen Effekte durch das im Lagerungspuffer der Enzyme enthaltene Glycerin auftreten konnten. Die Verdauung wurde bei +37°C für mindestens 2 Stunden in einem Standardansatz von 20 µl durchgeführt. Im Anschluss wurden die Ansätze mit dem MinElute PCR Purification Kit (Qiagen, Hilden) nach Herstellerangaben aufgereinigt und mit Aqua bidest. eluiert. Abschließend wurde das Ergebnis der Restriktion durch AgaroseGelelektrophorese kontrolliert. 57 Material und Methoden 3.2.1.2. Elektrophoretische Auftrennung von DNA-Fragmenten DNA-Fragmente wurden in horizontalen Elektrophoresekammern (Bio-Rad, München) in Gelen mit 1% Agarosegehalt aufgetrennt. Für das Herstellen der Gele sowie als Elektrophorese-Laufpuffer wurde 1x TAE-Pufferlösung (50x TAE: 2 M Tris-Acetat, 1 M Essigsäure, 100 mM EDTA, pH 8,0) verwendet. Agarose (Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Steilsheim) wurde mit dem entsprechenden Volumen 1x TAE-Puffer versetzt und aufgekocht. Nach kurzer Abkühlung wurden 2 µl Ethidiumbromid-Lösung (Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Steilsheim) je 100 ml zugegebenen TAE-Puffers hinzugefügt. Durch Zugabe des fluoreszierenden DNAInterkalationsfarbstoffs wird die spätere Visualisierung der aufgetrennten DNAFragmente auf einem UV-Leuchtschirm ermöglicht. Die abgekühlte Lösung wurde zur Aushärtung in einen Gelschlitten gegossen und nach Polymerisation zu einem Gel in eine Elektrophoresekammer mit 1x TAE eingebracht. Je 1 µl einer DNA-Probenlösung wurde mit 8 µl Aqua bidest. und 1 µl Laufpuffer in die Vertiefungen des Agarosegels pipettiert. Als Referenz und zur Abschätzung der Länge der DNA-Fragmente in den Probenlösungen wurde zusätzlich eine Lösung mit verschiedenen DNA-Fragmenten von bekannter Länge (SmartLadder, Eurogentec s.a., Seraing, Belgien) aufgetragen. Anschließend wurde eine Spannung von 10-15 V/cm für 30-60 Minuten angelegt und der Verlauf der Indikatorsubstanzen beobachtet. Die aufgetrennten DNA-Fragmente wurden abschließend auf einem UV-Leuchttisch dargestellt und fotodokumentiert. 3.2.1.3. Isolierung von DNA aus Agarose Die Isolierung der DNA aus Agarosegelen erfolgte mit dem MinElute Gel Extraction Kit (Qiagen, Hilden) gemäß der Herstellerangaben. Die DNA wurde in einem Volumen von 10 bzw. 30 µl PCR-Wasser eluiert und das Eluat bis zur weiteren Verwendung bei -20°C aufbewahrt. 58 Material und Methoden 3.2.1.4. Ligation Die Ligationsreaktion zum Einschleusen eines DNA-Fragments in einen linearisierten Vektor wurde in einem Standardansatz von 20 µl bei +16°C über Nacht nach Angaben des Herstellers durchgeführt. Der Ansatz enthielt 1 Einheit T4-DNA-Ligase, Ligationspuffer, 100-200 ng linearisierte Vektor-DNA und den zwei- bis vierfachen molaren Überschuss an DNA-Fragment; als Blindprobe diente ein Ansatz ohne Fragment. 3.2.1.5. Konzentrationsbestimmungen von DNA in Lösung Die Konzentrationsbestimmung erfolgte durch Messung der optischen Dichte (OD) der DNA-Lösung bei einer Wellenlänge von 260 nm Mithilfe eines Photometers (GeneQuant, Pharmacia). Ein OD-Wert von 1,0 bei λ=260 entspricht einer DNAKonzentration von 40 µg/ml. Zur Überprüfung der Reinheit der DNA wurde das Verhältnis OD260/OD280 ermittelt, dessen Wert für eine optimale Reinheit möglichst nahe bei 1,8 liegen sollte. Lediglich DNA-Präparationen mit einem Verhältnis zwischen 1,6 und 2,0 wurden weiter verwendet. 59 Material und Methoden 3.2.2. Bakterienarbeiten Tab. 9: Puffer und Mischansätze Puffer/Mischansätze Reagenzien Hersteller LB-Medium 10 g Pepton Difco Laboratories, Detroit, MI, USA 10 g NaCl Merck KGaA, Darmstadt 5 g Hefeextrakt Difco Laboratories, Detroit, MI, USA Ad 1 Liter mit Aqua dest. pH auf 7,5 eingestellt, autoklaviert Ampicillin-Lösung 50 mg/ml Ampicillin, steril filtriert Sigma-Aldrich GmbH, Steinheim Je 2 µl Lösung pro ml LB-Medium S1- Lösung 50 mM Tris/ HCl, pH 8,0 10 mM EDTA Macherney-Nagel GmbH & Co KG, Düren 100 µg/ml RNAse A S2- Lösung 0,2 M NaOH Macherney-Nagel GmbH & Co KG, Düren 1,0% SDS S3- Lösung 3 M Kaliumacetat, pH 5,5 Macherney-Nagel GmbH & Co KG, Düren N2- Lösung 100 mM Tris-H3PO4 Macherney-Nagel GmbH & Co KG, Düren 900 mM KCl 15% Ethanol 0,15% Triton-X 100 pH 6,3 N3- Lösung 100 mM Tris-H3PO4 1,15 M KCl Macherney-Nagel GmbH & Co KG, Düren 15% Ethanol pH 6,3 N5- Lösung 100 mM Tris-H3PO4 1 M KCl Macherney-Nagel GmbH & Co KG, Düren 15% Ethanol pH 8,5 Cytomix 120 mM KCl Merck KGaA, Darmstadt 150 µM CaCl2 10 mM K2HPO4/KH2PO4, pH 7,6 25 mM HEPES, pH 7,6 2 mM EGTA, pH 7,6 1 mM MgCl2, pH 7,6 2 mM ATP, pH 7,6 5 mM Gluthation (reduziert) 10% (v/v) FCS 60 Material und Methoden Tab. 10: Sonstige angewandte Chemikalien und Materialien Chemikalien und Materialien Hersteller Isopropanol Merck KGaA, Darmstadt Ethanol Merck KGaA, Darmstadt 1,22 M ß-Mercaptoethanol Stratagene, La Jolla, CA, USA Bactoagar Difco Laboratories, Detroit, MI, USA Nucleobond AX 500 Säulen Macherney-Nagel GmbH & Co KG, Düren 3.2.2.1. Transformation kompetenter Bakterien Bakterien eines kompetenten Stamms von Escherichia coli (100 µl Stratagene XL2 blue, Stratagene GmbH, Heidelberg) wurden nach dem Auftauen auf Eis mit 2 µl 1,22 M ß-Mercaptoethanol versetzt und 10 Minuten auf Eis inkubiert. Nach Zugabe von je 10 µl einer Plasmid-DNA-Lösung wurde die Bakteriensuspension 30 Minuten auf Eis inkubiert. Nach einem Hitzeschock von 30 Sekunden bei +42°C wurde der Ansatz für 2 Minuten auf Eis gestellt und nach Zugabe von 500 µl LB-Medium unter Schütteln für 30 Minuten bei +37°C inkubiert. Danach wurde die Lösung auf die vorgewärmten, Ampicillin-haltigen LB-Platten (LB-Medium mit 1,5% Bactoagar und 100 µg/ml Ampicillin) mittels einer sterilen Glaspipettenspitze ausgestrichen und die Platten über Nacht bei +37°C im Brutschrank (Heraeus Instruments GmbH, Hanau) umgedreht inkubiert. 61 Material und Methoden 3.2.2.2. Plasmidpräparation im kleinen Maßstab (sog. Minipräparation) Für die Identifizierung erfolgreich transformierter Klone wurden pro Ligation 8 Bakterienkolonien mit einer sterilen Pipettenspitze von der LB-Ampicillin-Platte gepickt und in 5 ml steriles Antibiotika-haltiges LB-Medium (100 µg/ml Ampicillin) überführt. Nach Inkubation im Thermo-Schüttler bei 200 Upm und +37°C über Nacht wurden jeweils 1,5 ml der erhaltenen Bakteriensuspensionen in ein 1,5 ml Eppendorf®-Reaktionsgefäß (Eppendorf AG, Hamburg) transferiert und bei 14.000 Upm und Raumtemperatur für 3 Minuten in einer Tischzentrifuge (Centrifuge 5417C, Eppendorf AG, Hamburg) sedimentiert. Das Bakteriensediment wurde in 300 µl kalter S1-Lösung resuspendiert, nach Zugabe von 300 µl der S2-Lösung vorsichtig gemischt und 5 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert. Anschließend wurden 300 µl der S3-Lösung hinzugefügt, der Ansatz gründlich durchmischt und für 10 Minuten auf Eis inkubiert. Nach Zentrifugation bei +4°C, 14000 Upm für 15 Minuten (Centrifuge 5417R, Eppendorf AG, Hamburg) wurde der Überstand in ein 1,5 ml Eppendorf®-Reaktionsgefäß mit 630 µl Isopropanol übertragen, dieses invertiert und für 30 Minuten bei 14000 Upm und +4°C zentrifugiert. Der Überstand wurde verworfen und das DNA-Pellet mit 500 µl 70% Ethanol (70% Ethanol in Aqua bidest.) überschichtet und erneut für 15 Minuten bei 14.000 Upm und Raumtemperatur zentrifugiert. Im Anschluss wurde der Überstand abgenommen, das DNA-Pellet bei +37°C für 10-20 Minuten getrocknet und die Plasmid-DNA anschließend in 20 µl sterilem Aqua bidest. resuspendiert. 3.2.2.3. Plasmidpräparation im großen Maßstab (sog. Maxipräparation) Es wurden jeweils 150 ml LB-Medium, 300 µl Ampicillin und 300 µl einer Minipräparation, deren Bakterien das gewünschte Vektorkonstrukt enthalten, in einen 1-Liter-Erlenmeyerkolben gegeben und bei +37°C sowie 200 Upm über Nacht im Thermo-Schüttler inkubiert. Am Folgetag wurde die Bakteriensuspension bei 5.000 Upm und +4°C für 15 Minuten in einem GS-3 Rotor zentrifugiert (Sorvall Hochgeschwindigkeitskühlzentrifuge RC-5B Zentrifuge (Du Pont GmbH, Bad 62 Material und Methoden Homburg). Im Anschluss wurde der Überstand abpipettiert, das Pellet mit 12 ml kalter S1-Lösung gelöst und in ein 50 ml-Zentrifugenröhrchen (BDFalcon, Heidelberg) überführt. Anschließend wurden 12 ml der S2-Lösung hinzugegeben, vorsichtig gemischt und für 5 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert. Nach Zugabe von 12 ml der S3-Lösung wurde die Suspension gründlich gemischt, 5 Minuten auf Eis inkubiert und anschließend bei +4°C und 15.000 Upm für 30 Minuten zentrifugiert. Der Überstand wurde durch einen Faltenfilter auf eine Nucleobond AX 500 Trennsäule gegeben, die zuvor mit 6 ml N2-Lösung äquilibriert worden war. Die Säule wurde zwei Mal mit jeweils 12 ml der N3-Lösung gewaschen, bevor die gebundene Plasmid-DNA mit 6 ml der N5-Lösung eluiert werden konnte. Das Eluat wurde mit dem 0,7fachen Volumen Isopropanol versetzt und bei +4°C und 6000 Upm für 60 Minuten zentrifugiert. Das Pellet wurde in 400 µl Aqua bidest. gelöst, mit 40 µl Natriumacetat-Lösung (Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Steilsheim) und 1 ml absolutem Ethanol versetzt und bei +4°C und 14.000 Upm für 30 Minuten zentrifugiert. Anschließend wurde das Pellet mit 500 µl 70% Ethanol überschichtet und bei +4°C und 14.000 Upm für 10 Minuten zentrifugiert. Das Pellet wurde 10-20 Minuten bei +37°C getrocknet und abschließend in 100 µl TEPuffer aufgenommen. 3.2.2.4. Bakterien-Glycerin-Stocks Zur längerfristigen Aufbewahrung wurde ein Aliquot der in selektivem Medium dicht gewachsenen Einzelkolonien vor jeder Maxi-Präparation mit der gleichen Menge an 86%igem Glycerin (Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Steilsheim) versetzt, gemischt und bei -80°C gelagert. 3.2.3. Transfektion von PT1590 durch Elektroporation Für die Transfektion durch Elektroporation wurde ein Vektorkonstrukt hergestellt. Als Quelle für EGFP diente der Plasmidvektor pEGFP-N1. Die DNA von EGFP wurde durch die enzymatische Verdauung mit den Restriktionsenzymen BamH I 63 Material und Methoden und Not I aus dem Vektor herausgeschnitten, mittels Gelelektrophorese isoliert und nach Aufreinigung gerichtet in die multiple cloning site (MCS) des Expressionsvektors pIRESpuro2 kloniert, welcher zuvor mit den gleichen Restriktionsenzymen geschnitten worden war (siehe Abb. 5). Abb. 5: Das für EGFP codierende DNA-Fragment wurde mithilfe der Restriktionsenzyme BamH I und Not I aus dem Plasmidvektor pEGFP-N1 ausgeschnitten und gerichtet in die multiple cloning site (MCS) des Expressionsvektors pIRESpuro2 kloniert, welcher zuvor mit den gleichen Endonucleasen linearisiert worden war. Die in den Plasmidvektoren enthaltenen CMV-Sequenzen dienen allein als Promoter zur eukaryoten Expression von EGFP. (Darstellungen entstammen den im Internet zugänglichen Datenblättern der verwendeten Vektoren, Clontech, BD Biosciences, Heidelberg). 3.2.3.1. Restriktion von pIRESpuro2 und pEGFP-N1 Zunächst wurden pIRESpuro2 (3,75 µg/ml) und pEGFP-N1 mit dem Restriktionsenzym BamH I für 2 Stunden bei 37°C inkubiert und im Anschluss mit dem MinElute PCR Purification Kit aufgereinigt und mit Aqua bidest. eluiert (siehe Tab. 11). 64 Material und Methoden Tab. 11: Restriktionsverdauung von pIRESpuro2 und pEGFP-N1 mit BamH I Vektor pIRESpuro2 pEGFP-N1 DNA-Lösung 5,0 µl 10,0 µl BamH I 2,0 µl 2,0 µl Puffer E (10x) 2,0 µl 2,0 µl Aqua bidest. 11,0 µl 6,0 µl Total 20,0 µl 20,0 µl Es wurden 16 µl des Eluats mit dem Enzym Not I für 2 Stunden bei 37°C inkubiert (siehe Tab. 12): Tab. 12: Restriktionsverdauung von pIRESpuro2 und pEGFP-N1 mit Not I Vektor pIRESpuro2 pEGFP-N1 Eluat 16,0 µl 16,0 µl Not I 2,0 µl 2,0 µl Puffer D (10x) 2,0 µl 2,0 µl Aqua bidest. Total – – 20,0 µl 20,0 µl Nach der Restriktionsverdauung wurden jeweils 2 µl Gel-Ladepuffer zu den Ansätzen gegeben und diese gemeinsam mit 10 µl des Marker-DNA-Mix mittels Gelelektrophorese aufgetrennt. Die im UV-Licht als helle, gerade Banden in 65 Material und Methoden Erscheinung tretenden linearen DNA-Fragmente konnten anhand der bekannten Fragmentgrößen der Marker-DNA identifiziert werden. Anschließend wurden die gesuchten Banden von EGFP (741 bp) und pIRESpuro2 (5185 bp) auf dem UV-Leuchttisch mit einem sterilen Skalpell (Feather, Japan pfm, Köln) aus dem Agarosegel ausgeschnitten und mit dem MinElute Gel Extraction Kit eluiert. Die Zusammensetzungen der im Kit enthaltenen Puffer wurden vom Hersteller nicht bekannt gegeben. Die Lösung der Gelstücke erfolgte in Puffer QG für 10 Minuten bei +50°C gelöst, wobei 3 µl QG-Puffer für je 1 mg Gel eingesetzt wurden. Maximal 750 µl der Lösung wurden auf eine MinEluteSäule gegeben, anschließend bei 13.000 Upm für 1 Minute zentrifugiert und der Durchfluss verworfen. Danach wurde die an die Säule gebundene DNA mit 740 µl PE-Puffer gewaschen. Es erfolgte eine erneute Zentrifugation bei 13.000 Upm für 1 Minute, wiederum wurde der Durchfluss verworfen. Abschließend wurde die Säule auf ein frisches 1,5 ml Eppendorf®-Reaktionsgefäß gesetzt und die DNA mittels Zentrifugation (13.000 Upm für 1 Minute) in 10 µl EB-Puffer eluiert. 1 µl des jeweiligen Eluats wurden mit 8 µl Aqua dest. und 1 µl Gel-Ladepuffer versetzt und auf ein Agarosegel aufgetragen und aufgetrennt (siehe Abb. 6). Das verbliebene Eluat wurde bis zur weiteren Verwendung bei -80°C aufbewahrt. 66 Material und Methoden Abb. 6: DNA-Fragmente nach Gelextraktion und Aufreinigung. Die gesuchten linearen DNAFragmente für EGFP (741 kb) und pIRESpuro2 (5185 kb) stellten sich nach Gelextraktion und anschließender Aufreinigung in der Gelelektrophorese als gerade, intensiv angefärbte Banden dar, die aufgrund der bekannten Fragmentlängen im Abgleich mit der parallel aufgetrennten Marker-DNA sicher identifiziert werden konnten. 3.2.3.2. Ligation von EGFP und pIRESpuro2 Entsprechend den unter 3.2.1.4. aufgeführten Vorgaben wurde EGFP mit dem linearisierten Vektor pIRESpuro2 mit der einfachen sowie mit der doppelten DNAMenge des EGFP enthaltenden DNA-Fragments in zwei Ansätzen durchgeführt (siehe Tab. 13). 67 Material und Methoden Tab. 13: Ligation von EGFP und pIRESpuro2 Ansatz 1 Ansatz 2 EGFP 2,5 µl 5,0 µl pIRESpuro2 0,8 µl 0,8 µl Ligationspuffer (5x) 4,0 µl 4,0 µl Aqua bidest. 11,7 µl 9,2 µl Ligase (1 U/µl) 1,0 µl 1,0 µl Total 20,0 µl 20,0 µl 3.2.3.3. Bakterien-Transformation und Identifikation von positiven Klonen Wie in Abschnitt 3.2.2.1 beschrieben, wurden Bakterien des Stamms XL-2 blue mit je 10 µl der beiden Ligationsansätze transformiert und auf LB-Ampicillin-AgarPlatten ausgestrichen, die über Nacht zu Kolonien auswuchsen. 8 Kolonien wurden mit einer sterilen Pipettenspitze in 5 ml LB-Medium überführt, welches Ampicillin (100 µg/ml) enthielt, und über Nacht bei +37°C und 200 Upm im Thermoschüttler inkubiert. Anschließend wurden 1,5 ml von jedem Ansatz in ein 2,0 ml Reaktionsgefäß transferiert. Entsprechend den Angaben in Abschnitt 3.2.2.2 (Mini-Präparation) wurde aus den expandierten Bakterienklonen jeweils die Plasmid-DNA extrahiert. Durch Restriktionsverdauung mit dem Enzym Sac I wurden die isolierten Plasmide auf die korrekte Insertion des EGFP-Fragments überprüft (siehe Tab. 14). 68 Material und Methoden Tab. 14: Restriktionsverdauung isolierter Plasmide mit Sac I Ansatz Abb. 7: Plasmid-Extrakt 8,0 µl Sac I 1,0 µl Puffer J (10x) 1,0 µl Aqua bidest. – Total 10,0 µl Identifikation geeigneter Bakterienklone durch Verdauung der isolierten Plasmid-DNA mit Sac I. Die Verdauung von pIRESpuro2 mit Sac I liefert DNA-Fragmente mit den Längen von 3342 bp, 1763 bp und 87 bp. EGFP-tragende Plasmide hingegen weisen anstelle des 1763 bp großen Fragmentes ein Fragment von 2473 bp Länge auf. Die DNA der Bakterienklone 4 und 7 wies in der Gelelektrophorese nach Restriktion mit Sac I die gewünschten Banden auf, welche im Abgleich mit der parallel aufgetrennten Marker-DNA identifiziert werden konnten. Die Plasmid-DNA des Klon 6 wies zusätzlich eine schwache Bande bei ca. 1800 bp auf, so dass dieser Klon nicht für eine Maxi-Präparation herangezogen wurde. 69 Material und Methoden 3.2.3.4. Gewinnung von Plasmid-DNA für die Elektroporation Geeignete Bakterienklone, welche das gewünschte Vektorkonstrukt trugen, wurden wie in Abschnitt 3.2.2.3 beschrieben, in großem Maßstab amplifiziert (Maxi-Präparation) und die enthaltene Plasmid-DNA isoliert und aufgereinigt. Die Konzentrationen und die Qualität der Plasmid-DNA-Lösungen wurden abschließend photometrisch bestimmt (siehe Abschnitt 3.2.1.5). Durch Restriktionsverdauung der isolierten Plasmid-DNA mit Sac I wurde erneut das Vektorkonstrukt pIRESpuro2-EGFP nachgewiesen (siehe Abb. 8). Abb. 8: Nachweis des Vektorkonstruktes pIRESpuro2-EGFP in den DNA-Extraktionen nach Maxipräparation. Das Konstrukt pIRESpuro2-EGFP wird bei einer theoretischen Gesamtlänge von 5902 bp durch Restriktion mit Sac I in drei DNA-Fragmente mit den Längen 3342 bp, 2473 bp und 87 bp gespalten. Diese wurden durch gelelektrophoretische Auftrennung in den restringierten DNA-Extrakten von Klon 4 und 7 nachgewiesen. Die aus der Maxipräparation zu Klon 4 gewonnene DNA zeigte eine zusätzliche Bande mit einer Größe von ca. 6000 bp. Ein Teil der isolierten Plasmid-DNA scheint lediglich einfach – im Sinne einer Linearisierung – geschnitten worden zu sein. Zum Vergleich lieferte die Restriktion von pIRESpuro2 mit Sac I drei DNA-Fragmente mit den Längen 3342 bp, 1763 bp und 87 bp. Neben den restringierten DNA-Proben wurde jeweils auch unverdaute Plasmid-DNA aufgetrennt. Die ungeschnittene, zirkuläre DNA bildet verschiedene Superstrukturen aus (engl. „Supercoiling“), die in der Gelelektrophorese ein anderes Wanderungsverhalten aufwies, als es bei linearisierten Fragmenten gleicher Größe zu beobachten war. 70 Material und Methoden 10 µg des Vektorkonstrukts wurden mit dem Restriktionsenzym Xho I linearisiert und anschließend mit dem MinElute DNA Purification Kit nach Angaben des Herstellers aufgereinigt. Tab. 15: Linearisierung des Vektorkonstrukts mit Xho I Ansatz 3.2.3.5. Vektorkonstrukt x µl Xho I 5,0 µl Puffer D 5,0 µl Aqua bidest. (20,0 – x) µl Total 20,0 µl Transfektion der PT1590-Zellen durch Elektroporation Adhärent wachsende PT1590-Zellen aus zwei 75-cm2-Zellkulturflaschen (Nunc GmbH & Co. KG, Wiesbaden) wurden bei einer Konfluenz von ca. 70-90% nach Waschen mit PBS durch Zugabe von Trypsin-EDTA-Lösung (Biochrom AG, Berlin) von der Kulturoberfläche abgelöst, in 10 ml Zellkulturmedium aufgenommen, in ein 50 ml-Zentrifugenröhrchen überführt und bei 1.200 Upm und +4°C für 10 Minuten zentrifugiert. Anschließend wurde das Pellet in 10 ml PBS resuspendiert und die Zellzahl in der Suspension bestimmt. Nach der erneuten Zentrifugation der Zellsuspension bei 1.200 Upm und +4°C für 10 Minuten wurden die Zellen mit eiskaltem Cytomix auf eine Konzentration von 30 x 107 Zellen/ml eingestellt. Nun wurden 10 µg der zu transfizierenden Plasmid-DNA mit ddH2O auf ein Volumen von 25 µl gebracht, die DNA-Lösung mit 225 µl Zellsuspension gemischt, in Gene Pulser Küvetten (0,4 cm Breite) gegeben und 10 Minuten auf Eis inkubiert. Die Elektroporation wurde mit einem Gene Pulser II mit einem Capacitance Extender II 71 Material und Methoden (BioRad Laboratories GmbH, München) bei 250 V und 975 µF durchgeführt. Anschließend wurden die Zellen für 10 Minuten bei +37°C inkubiert und dann in 1 ml Zellkulturmedium aufgenommen. Aliquots dieser Zellsuspension wurden in Kulturmedium verdünnt, in Zellkulturschalen ausgesät und bei +37°C im Brutschrank inkubiert. 3.2.3.6. Selektion der transfizierten PT1590-Zellen 48-72 Stunden nach der Transfektion wurde das Zellkulturmedium in den Zellkulturschalen durch frisches Medium ausgetauscht, welches das Antibiotikum Puromycin (Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Steilsheim) mit den Konzentrationen 0,5 µg/ml, 1,0 µg/ml oder 2,0 µg/ml enthielt. Die transfizierten Zellen wurden anschließend täglich unter dem Auflicht-Fluoreszenz-Mikroskop Orthoplan Labor Lux S (Leica Vertrieb GmbH, Bensheim) begutachtet, wobei das Puromycinhaltige Medium mit der jeweiligen Konzentration alle 2-3 Tage oder bei Umschlag der Indikatorsubstanz zu wechseln war. Die Selektion wurde über einen Zeitraum von 4-6 Wochen durchgeführt, bis sich keine nicht-transfizierten Zellen mehr nachweisen ließen und sich Kolonien aus überlebenden Transfektanten bildeten. Kolonien, die sich mit einer intensiven Leuchtkraft von den übrigen PT1590-Zellen abhoben, wurden im Verlauf mit sterilen Pipettenspitzen aufgenommen und in 24er-Nunclon-Multischalen (Nunc GmbH Co. KG, Wiesbaden) überführt. Dort wurden diese unter Fortführung der Puromycin-Behandlung mit einer Konzentration von 0,5 µg/ml expandiert und bei ausreichender Zellzahl zunächst in 12er- und anschließend in 6er-Multischalen überführt. Kontinuierlich wachsende Transfektanten wurden schließlich in 25-cm2-Zellkulturflaschen (Nunc GmbH Co. KG, Wiesbaden) ausgesät, nach mehrmaliger Passagierung in 75-cm2- Zellkulturflaschen transferiert und fortwährend mit Puromycin-haltigem TumorzellMedium kultiviert. Aliquots der selektierten Transfektanten wurden regelmäßig in Kulturmedium mit 20% DMSO (Serva Feinbiochemica, Heidelberg) tief gefroren und in flüssigem Stickstoff aufbewahrt. 72 Material und Methoden 3.2.4. Transfektion von PT1590 mittels FuGENE 6 Neben der Transfektion durch Elektroporation wurde ein zweiter Ansatz zur stabilen Transfektion der Zelllinie PT1590 mit EGFP gewählt. Die Plasmidvektoren pEGFP-N1 und pLEGFP-N1 (Clontech, BD Biosciences, Heidelberg) wurden mithilfe des Transfektionsreagenz FuGENE 6 (Roche Diagnostics GmbH, Mannheim) in PT1590-Zellen transfiziert. FuGENE 6 besteht aus einer Mischung verschiedener Lipide, die in 80% Ethanol gelöst sind. Die DNA-Fragmente der vorliegenden Studie komplexieren mit Liposomen-ähnlichen Strukturen und gelangen durch Fusion mit der Zellmembran zunächst in das Zytoplasma und weiter in den Zellkern der Zellen. Bei pLEGFP-N1 handelt es sich um ein EGFP-tragenden DNA-Plasmidvektor, der im Gegensatz zu den übrigen verwendeten Vektorkonstrukten retrovirale Elemente aus dem Moloney murine leukemia virus (MoMuLV) trägt (siehe Abb. 9). pLEGFP-N1 enthält sogenannte Long terminal repeats (LTRs), welche die Integration von Fremd-DNA in das Genom der zu transfizierenden Zielzellen erleichtern können. Da weder pLEGFP-N1 noch die zu transfizierenden PT1590Zellen die Gene gag, pol und env besitzen, besteht keine Gefahr, dass in den Zielzellen nach Integration des Plasmids replikationsfähige infektiöse Viruspartikel entstehen könnten. 73 Material und Methoden Abb. 9: pLEGFP-N1 enthält sogenannte Long terminal repeats (LTRs), welche die Integration von Fremd-DNA in das Genom der zu transfizierenden Zielzellen erleichtern können. Ψ+ als RNA-Verpackungssignal allein ist ohne die im Vektor nicht enthaltenen Gene für gag, pol und env nicht in der Lage, nach genomischer Integration des Plasmids replikationsfähige infektiöse Viruspartikel herzustellen. Die enthaltene CMV-Sequenz dient lediglich als Promoter zur eukaryoten Expression von EGFP. Die Darstellung des Vektors entstammt dem im Internet zugänglichen Datenblatt, Clontech, BD Biosciences, Heidelberg.) PT1590-Zellen wurden auf 10 ml-Zellkulturschalen in Kulturmedium (siehe Tab. 4) mit einer zuvor bestimmten Zelldichte (~0,25 x 106/ml) ausgesät und über Nacht inkubiert, so dass diese am Tag der Transfektion in den Vertiefungen eine Konfluenz von etwa 80% zeigten. 10 µg der zu transfizierenden Vektor-DNA wurden in Lösung in ein 1,5 ml Eppendorf®-Reaktionsgefäß vorgelegt. In einem weiteren Reaktionsgefäß wurde serumfreies Kulturmedium, welches keine Antibiotika enthielt, mit dem gemessen an der DNA-Menge [µg] 3fachen oder 6fachen Volumen in µl der FuGENE-6-Lösung versetzt (siehe Tab. 16). Dabei wurde die FuGENE 6 direkt in das Medium pipettiert, ohne mit der Wand des Reaktionsgefäßes in Kontakt zu kommen. Nach einmaligem Invertieren des Reaktionsgefäßes wurde das verdünnte Transfektionsreagenz tropfenweise zur DNA-Lösung gegeben und der entstandene Transfektionsansatz für 15 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert. Während dieses Zeitraums konnten sich Komplexe 74 Material und Methoden aus FuGENE 6 und Vektor-DNA bilden. Anschließend wurde der Transfektionsansatz einmal invertiert und tropfenweise zu den Zellen gegeben. Tab. 16: Unterschiedliche Ansätze zur Transfektion von PT1590 mit FuGENE 6 Ansatz Vektor DNA SFM* FuGENE 6 DNA : FuGENE 6 1 pLEGFP-N1 5 µg 300 µl 30 µl 1:6 2 pLEGFP-N1 10 µg 300 µl 30 µl 1:3 3 pLEGFP-N1 20 µg 300 µl 60 µl 2:6 4 pEGFP-N1 5 µg 300 µl 30 µl 1:6 5 pEGFP-N1 10 µg 300 µl 30 µl 1:3 6 pEGFP-N1 20 µg 300 µl 60 µl 2:6 * SFM: Serumfreies Medium Nach 24 Stunden erfolgte die Zugabe von frischem Kulturmedium zu den Zellen, wobei die unterschiedlichen Ansätze zur initialen Selektion anschließend auf 6erMultischalen (Nunc GmbH & Co. KG, Wiesbaden) aufgeteilt wurden. Diese wurde mit unterschiedlichen Konzentrationen des Aminoglykosid-Antibiotikums G418 (100-800 µg/ml) durchgeführt, gegen welches Transfektanten mit Aufnahme der Plasmid-DNA und der damit verbundenen Expression des AminoglykosidPhosphotransferase-Gens eine Resistenz erworben hatten. Analog zur Transfektion der PT1590-Zellen durch Elektroporation (siehe Abschnitt 3.2.3.4) wurde die Selektion und Subklonierung von stabilen, stark exprimierenden Transfektanten über einen Zeitraum von 4-6 Wochen mit G418 in einer Konzentration von 500-1000 µg/ml durchgeführt. Aliquots der selektierten Transfektanten wurden regelmäßig in Kulturmedium mit 20% DMSO tief gefroren und in flüssigem Stickstoff aufbewahrt. 75 Material und Methoden 3.3. Tierversuche 3.3.1. Versuchstiere Der nachfolgend beschriebene Tierversuch wurde initial entsprechend des § 8 des Tierschutzgesetzes vom 25. Mai 1998 im Universitätsklinikum HamburgEppendorf beantragt und genehmigt. Von August bis September 2003 fanden hier die Vorversuche zur Prüfung der Tumorigenität der PT1590-Transfektanten in 10 sechs Wochen alten, weiblichen SCID-Mäusen statt. Im September 2003 erfolgte die Übertragung des in Hamburg genehmigten Versuchsvorhabens an die Heinrich-Heine-Universität Düsseldorf (Aktenzeichen: 50.05-230-00/03). Hier wurden alle weiteren tierexperimentellen Arbeiten an insgesamt 60 sechs Wochen alten, weiblichen SCID-Mäusen durchgeführt. Die 10 SCID-Mäuse des Vorversuches stammten aus der Zucht des Instituts für Versuchstierkunde des Universitätsklinikums Hamburg-Eppendorf. Die 60 SCIDMäuse des Tierversuches in Düsseldorf stammten aus der Zucht des Instituts für Versuchstierkunde des Heinrich-Heine-Universitätsklinikums Düsseldorf. 3.3.1.1. Die Versuchstierhaltung 10 SCID-Mäuse Tierversuchsanlage des Vorversuches wurden in der zentralen (TVA) des Universitätsklinikums Hamburg-Eppendorf ge- meinsam in einem Edelstahlkäfig unter standardisierten Bedingungen gehalten (Raumtemperatur +20°C, relative Luftfeuchtigkeit 55% ± 5%, Tag-Nacht-Rhythmus 12 Stunden durch Kunstlicht bei 300 Lux). Entkeimtes Trinkwasser aus Flaschen, sowie pelletiertes Futter stand den Mäusen ad libitum zur Verfügung. Während der gesamten Versuchszeit wurden die Tiere im Abstand von zwei Tagen tierärztlich auf ihren Habitus und pathologische Veränderungen an der Implantationsstelle kontrolliert. Die 60 SCID-Mäuse für die in der zentralen Tierversuchsanlage (TVA) der Heinrich-Heine-Universität Düsseldorf durchgeführten Nachfolgeversuche wurden 76 Material und Methoden in Gruppen zu jeweils vier Tieren in Edelstahlkäfigen ebenfalls unter den oben definierten Bedingungen gehalten. Auch diese Tiere standen während der Versuchszeit unter tierärztlicher Kontrolle. 3.3.2. Tierversuchsdurchführung 3.3.2.1. Vorbereitung der transfizierten PT1590-Zellen für die Xenotransplantation in SCID-Mäuse Für die Xenotransplantation in SCID-Mäuse wurden ausschließlich Tumorzellen verwendet, die in den Zellkulturflaschen eine Konfluenz von 80-90% aufwiesen. Zwölf Stunden vor der geplanten Applikation der Tumorzellen wurde das Trägermedium Growth Factor Reduced BD Matrigel Matrix (BD Bioscience, Bedford, MA, USA) auf eine Temperatur von +4°C gekühlt. Alle weiteren für die Zellapplikation in SCID-Mäuse notwendigen Verbrauchsmaterialien (Pipettenspitzen, PBS-Pufferlösung, Spritzen und Injektionskanülen) wurden ebenfalls 12 Stunden vor Versuchsbeginn bei einer Temperatur von +4°C gelagert. Die transfizierten PT1590-Zellen wurden zunächst mit PBS-Pufferlösung gewaschen und hiernach mit Trypsin-EDTA-Lösung vom Flaschenboden gelöst. Die abtrypsinierten Zellen wurden dann für 5 Minuten in 10 ml PBS-Lösung überführt und bei 1.250 Upm für 8 Minuten bei +4°C zentrifugiert. Anschließend wurde der Überstand entfernt und das Zellpellet in 1 ml gekühlter PBS-Lösung resuspendiert. Von dieser Zellsuspension wurden 10 µl entnommen und die Zellzahl mittels Neubauer-Zählkammer ermittelt. Hiernach erfolgte die erneute Zentrifugation der Zellen für 8 Minuten bei 1.250 Upm. Nach Entfernen des Überstandes wurde das Zellpellet wiederum mit PBS-Lösung resuspendiert, wobei genau soviel PBS-Lösung verwandt wurde, dass die gewünschte Zellkonzentration von 2x106 Zellen/100µl PBS-Lösung erreicht wurde. Jeweils 100 µl dieser Zellsuspension wurden dann in Eppendorf Zentrifugenröhrchen überführt und hiernach mit jeweils 100 µl Matrigel versetzt. Die MatrigelZellsuspension wurde mittels 1 ml Spritzen gemischt und dann zu jeweils 200 µl in 77 Material und Methoden selbiger Spritze aufgezogen. Anschließend wurden die so vorbereiteten Spritzen bis zur Injektion in die SCID-Mäuse ohne Unterbrechung auf Eis gelagert. Bis zur Tumorzellinjektion vergingen hiernach maximal 45 Minuten. 3.3.2. 2. Xenotransplantation der PT1590-EGFP-Subklone in SCID-Mäusen Um die Tumorigenität der transfizierten PT1590-Zellen zu überprüfen, wurden die Subklone PT1590-EGFP-H/1, PT1590-EGFP-H/4 bzw. PT1590-EGFP-10 in einem Vorversuch in insgesamt 9 sechs Wochen alte, weibliche SCID-Mäuse appliziert, wobei jeweils 3 Mäusen Zellen des gleichen Subklons implantiert wurden. Jedem Versuchstier wurden 2x106 in 200 µl Matrigel®/PBS gelöste Tumorzellen subkutan in die Flankenregion injiziert. Der Negativkontroll-Maus wurden 200 µl 0,9%iger Natriumchlorid (NaCl)-Lösung ohne Tumorzellen s.c. in die Flankenregion injiziert. Während der Versuchszeit wurden die Mäuse täglich auf pathologische Veränderungen des Verhaltens, sowie einsetzende Kachexie, Bewegungs- einschränkungen, Apathie, gesträubtes Haarkleid und Veränderungen an der Implantationsstelle untersucht. Kongruent zu den Vorversuchen, wurden jedem Versuchstier des anschließenden Tierversuchs an der TVA des Universitätsklinkums Düsseldorf, jeweils 2x106, in 200µl Matrigel®-PBS-Lösung gelöste PT1590-EGFP-H/4-Zellen subkutan in die Flankenregion appliziert, wobei pro Versuchstag maximal 4 Mäuse injiziert wurden. Auch hier erfolgten im Anschluss an die Injektionen tägliche Kontrollen der Mäuse auf pathologische Veränderungen. Das Vermessen der lokalen Tumoren im Bereich der Implantationsstellen erfolgte in zweitägigen Abständen mit einer Schieblehre, wobei alle Tumoren jeweils in 2 Dimensionen vermessen wurde. 78 Material und Methoden 3.3.2.3. Tötung und Sektion der Versuchstiere Vier bis 6 Wochen nach der Implantation der Tumorzellen bzw. nach Erreichen einer kritischen Tumorgröße von ≥ 15 mm im Durchmesser wurden die Tiere euthanasiert und anschließend seziert. Hierzu wurden die Mäuse zunächst durch Inhalation eines CO2-/O2-Gasgemisches betäubt und im Anschluss durch zervikale Dislokation getötet. Neben der Tumorgröße galten als weitere Kriterien für eine durchzuführende Tötung der Mäuse Verhaltensauffälligkeiten, Kachexie, gesträubtes Haarkleid und lokale Hautveränderungen im Sinne von Ulzerationen oder Abszessen im Bereich der Injektionsstelle. Bei der Sektion der Mäuse wurden diese in Rückenlage mit Nadeln auf einer festen Unterlage fixiert. Zunächst erfolgte dann mit einem Skalpell die Inzision der Haut vom Schambein bis zum Unterkiefer. Um ein Verschleppen von Tumorzellen während der Sektion zu vermeiden erfolgte die Schnittführung hierbei stets in ausreichender Entfernung zu den im Bereich der lateralen Bauchwand lokalisierten subkutanen Tumoren. Anschließend erfolgte das stumpfe Abpräparieren der Haut von Bauch- und Thoraxwand, wobei auch hierbei darauf geachtet wurde, die lokalen Tumoren der Mäuse nicht zu verletzen. Hiernach wurde zunächst die Bauchhöhle eröffnet und auf pathologische Veränderungen hin untersucht. Anschließend erfolgte die Entnahme von Leber und Nieren. Bei drei Mäusen wurde zusätzlich die Milz entnommen. Nun erfolgte die transsternale Eröffnung des Thorax und die Entnahme der Lungen. Hiernach wurden jeweils beide Oberschenkelknochen der Mäuse freipräpariert und ebenfalls entnommen. Abschließend erfolgte die Entnahme der Bauchwandtumoren. Nach jedem Sektionsschritt wurde das Sektionsbesteck in 80%igem Ethanol desinfiziert. Die entnommenen Organe sowie die Tumoren wurden bis zur weiteren Verarbeitung in entsprechend beschrifteten Zentrifugenröhrchen, welche 5 ml 10%FCS/RPMI 1640 enthielten, auf Nasseis gelagert. 79 Material und Methoden 3.3.2.4. Aufbereitung der entnommenen Mausorgane und -tumoren Die weitere Verarbeitung der entnommenen Organe erfolgte unter der Reinraumwerkbank im Chirurgischen Forschungslabor des Universitätsklinikums Düsseldorf. Lungen, Nieren, Milzen und Bauchwandtumoren der Mäuse wurden zunächst in sterile Petrischalen überführt und mit einem Skalpell geteilt, wobei ein Teil der Organe für spätere Analysen in flüssigem Stickstoff schockgefroren und anschließend bei -80°C asserviert wurde, während der andere Teil mechanisch unter Verwendung der sog. Medimachine (DakoCyomation GmbH, Hamburg) weiter zu Einzelzellsuspensionen disaggregiert wurde. Der eigentliche Vorgang der Disaggregation erfolgt in diesem halbautomatischen System in speziellen Polyethylen-beschichteten Disaggregationskammern (sog. Medicons). Diese sind in der Mitte durch eine starre Metallplatte unterteilt, in welcher bis zu 100 hexagonale Löcher um sechs Mikromesser angeordnet sind. Dabei führt ein rotierendes Element oberhalb der Metallscheibe mit 80 Upm die in den oberen Bereich der Disaggregationskammer eingebrachten Gewebestücke den Messern zu. Die durch die Rotation und die Schneidewirkung der Messer entstehende Zellsuspension gelangt dann durch die hexagonalen Löcher der Metallscheibe auf den Boden der Disaggregationskammer, wobei eine Mikropumpe unterhalb der Metallscheibe für Flüssigkeitszufuhr sorgt und damit die Reinigung der Zellen sichert. Die Disaggregationskammern sind in zwei Formaten erhältlich, die sich in der Unterstützung durch die 35 oder 50 µm Separatoren-Scheiben voneinander unterscheiden. Für den hier beschriebenen Versuch wurden Disaggregationskammern im Format 50 µm verwendet. Um eine möglichst vollständige Disaggregation der präparierten Mausgewebe zu Einzelzellsuspensionen zu erzielen, wurde das Disaggregationsprotokoll in einem Vorversuch zunächst optimiert. Hierzu wurden Lungen, Nieren, Leber und Milz der Negativkontroll-Maus verwendet, welcher in dem ersten Vorversuch zur Prüfung der Tumorigenität der 1590-Transfektanten s.c. NaCl-Lösung injiziert worden war. In den Vorversuchen mit den Organen dieser Maus zeigte sich, dass sich die Zellausbeute insgesamt 80 Material und Methoden erhöhen ließ, wenn die Organproben vor dem Einbringen in die Disaggregationskammer der Medimachine mit dem Skalpell in etwa 1 mm3 große Gewebsstücke zerkleinert wurden. Zusätzlich ließen sich Qualität und Quantität der Einzelzellsuspensionen noch durch einen sequentiellen Disaggregationsvorgang steigern. Hierbei wurde das in die Disaggregationskammer zugeführte RPMI 1640-Medium fraktioniert zu jeweils 1 ml appliziert und der Disaggregationsvorgang mehrfach für je 30 Sekunden wiederholt, wobei am Ende jedes dieser Disaggregationsvorgänge jeweils 1 ml Zellsuspension abgezogen und durch eine entsprechende Menge RPMI 1640-Medium ersetzt wurde. Anschließend wurden die Einzelzellsuspensionen in Zentrifugenröhrchen überführt und bei 1.500 Upm für 8 Minuten zentrifugiert. Hiernach wurde der Überstand unter der Reinraumwerkbank mit einer Motorpipette abgesaugt und das Zellpellet in 7 ml 10%FCS/RPMI1640 resuspendiert. Im Anschluss erfolgte eine erneute Zentrifugation bei 1.500 Upm für 8 Minuten. Nach Absaugen des Überstandes und Resuspension des Zellpellets wurde die Suspension in eine Petrischale überführt und unter dem Invert-Auflicht-Fluoreszenz-Mikroskop auf grün-fluoreszierende Tumorzellen hin untersucht. Während der Aufbereitung der einzelnen Mausorgane zeigte sich, dass sich Leber und Milz aufgrund ihrer geweblichen Textur nicht für eine mechanische Disaggregation mit der Medimachine eigneten. Diese Organe wurden für spätere Untersuchungen komplett in flüssigem Stickstoff schockgefroren und anschließend bei -80°C asserviert. Bei der Präparation des Knochenmarks aus den Oberschenkelknochen der Mäuse erfolgte zunächst mit der Präparierschere die Eröffnung der Markhöhle in Höhe der Trochanteren. Anschließend wurde das Knochenmark durch Einführen einer 20G- Kanüle in die Markhöhle mittels einer Spritze mit 5-10 ml 10%FCS/RPMI 1640-Medium herausgespült und in einer sterilen Petrischale aufgefangen. 81 Material und Methoden 3.3.2.5. Detektion von disseminierten Tumorzellen in Sekundärorganen der SCID-Mäuse Die Maus-Organzellsuspensionen wurden unter einem Auflicht-FluoreszenzMikroskop Orthoplan Labor Lux S (Leica Vertrieb GmbH, Bensheim) auf die Anwesenheit von grün-fluoreszierenden Tumorzellen untersucht. Bei dem zur Tumorzell-Detektion verwendeten Fluoreszenzfilter handelte es sich um einen Filter mit einem Anregungsbereich von 480 ± 30 nm und einem Emissionsbereich von 527 ± 30 nm Wellenlänge, welcher üblicherweise für die Visualisierung des Fluorochroms Fluorescein-Isocyanat (FITC) eingesetzt wird. 3.4. Verwendete Chemikalien, Lösungen und Materialien für Zellkultur und Tierversuche Chemikalien und Lösungen Aqua ad injectabilia…………………………..…... Dimethylsulfoxid(DMSO).................................... Ethanol 80%ig: Selbstherstellung aus abs. Ethanol; Ethanol abs. zur Analyse...................... Fetales Kälberserum (FCS)................................ Gentamycin 50 mg/ml……………………………. Growth Factor Reduced BD Matrigel Matrix®…. human epidermal growth factors (EGF)………. human basic fibroblast growth factors (BFGF). Insulin……………………………………………… Isopropanol………………………………………... L-Glutamine……………………………………….. Natrium-Chlorid-Lösung 0,9%ig (NaCl).............. Phosphatgepufferte Kochsalzlösung (PBS)....... Penicillin/Streptomycin…………………………… RPMI 1640 Medium w/o L-Glutamine………….. Transferrin, humanes......................................... Trypanblau-Lösung............................................. Trypsin-EDTA-Lösung........................................ 82 Hersteller B. Braun AG, Melsungen Serva Feinbiochemica, Heidelberg Merck KGaA, Darmstadt Invitrogen GmbH, Karlsruhe Gibco BRL, Paisley, Scotland BD Bioscience, Bedford, MA, USA Boehringer Ingelheim, Ingelheim Roche, Mannheim Sigma-Aldrich, München Roth, Karlruhe Invitrogen GmbH, Karlsruhe B. Braun AG, Melsungen Life Technologies, Karlsruhe Biochrome AG, Berlin Invitrogen GmbH, Karlsruhe Sigma-Aldrich, München Invitrogen GmbH, Karlsruhe Invitrogen GmbH, Karlsruhe Material und Methoden Geräte und Materialien Brutschrank B 5061............................................ Elektrische Pipettierhilfe, Pipettus-Standard...... Einfrierröhrchen 1,5 ml....................................... Eppendorf-Röhrchen.......................................... Fluoreszenz-Mikroskop Orthoplan Labor Lux S. Kanülen, 20G...................................................... Medicon, 50 µm.................................................. Medimachine...................................................... Mikroskop Olympus BH...................................... Neubauer Haemozytometer............................... Pipetten, 5,10 ml................................................. Pipettenspitzen................................................... Petrischalen........................................................ Reinraumwerkbank............................................. Skalpelle............................................................. Spritzen, 1 ml.................................................. Vakuumpumpe .................................................. Zellkulturflaschen, 25-cm2, 75-cm2..................... Zentrifuge Universal 30RF.................................. Zentrifugenröhrchen, 15 ml................................ 3.5. Alle Hersteller Heraeus Instruments GmbH, Hanau Hirschmann, Eberstadt Nunc GmbH & Co. KG, Wiesbaden Eppendorf, Hamburg Leica Vertrieb GmbH, Bensheim BD Bioscience, Belgien DakoCytomation, Hamburg DakoCytomation, Hamburg Olympus Europa GmbH, Hamburg Brand GmbH & Co. KG, Wertheim Greiner GmbH, Frickenhausen Greiner GmbH, Frickenhausen Greiner GmbH, Frickenhausen Heraeus Instruments GmbH, Hanau Feather, Japan pfm, Köln B. Braun AG, Melsungen Neolab® GmbH, Heidelberg Nunc GmbH & Co. KG, Wiesbaden Hettich, Tuttlingen Nunc GmbH & Co. KG, Wiesbaden Statistik in dieser Arbeit erstellten Ergebnisse wurden mit Hilfe des Koordinationszentrum für Klinische Studien des Universitätsklinikums Düsseldorf statistisch ausgewertet. 83 Ergebnisse 4. Ergebnisse 4.1. Generierung von stabilen Transfektanten Mit Hilfe beider Transfektionsmethoden konnten Transfektanten generiert werden, die überwiegend eine stabile und intensive GFP-Expression zeigten und ein Wachstumsverhalten aufwiesen, welches der Proliferation von nicht-transfizierten Zellen entsprach. Die einzelnen Klone wurden hinsichtlich ihrer Zellmorphologie, ihrer Leuchtintensität und ihres geschätzten prozentualen Anteils an exprimierenden Zellen (Positivität), gemessen an der jeweiligen Gesamtzellzahl charakterisiert (siehe Tab.17). Tab. 17: PT1590-Transfektanten mit stabiler EGFP-Expression Klon Enthaltenes Vektor-Konstrukt Zellmorphologie Expressionsstärke Expressionsmuster Positivität H/1 pLEGFP-N1 Epitheloidfibroblastoid ++ - +++ Homogen 80% H/2 pLEGFP-N1 Epitheloidfibroblastoid + - +++ Inhomogen 50% H/3 pLEGFP-N1 Epitheloidfibroblastoid + - +++ Inhomogen 10% H/4 pEGFP-N1 Epitheloid ++ - +++ Homogen 90% H/5 pEGFP-N1 Epitheloidfibroblastoid + - +++ Homogen 90% 1/4 pIRESpuro2EGFP Epitheloid + - ++ Homogen 95% 1/7 pIRESpuro2EGFP Epitheloid + - ++ Homogen 95% Klon 3 pLEGFP-N1 Epitheloidfibroblastoid ++ - +++ Inhomogen 95% Klon 6 pLEGFP-N1 Fibroblastoid + - ++ Homogen 95% Klon 10 pLEGFP-N1 Fibroblastoid ++ - +++ Homogen 95% 84 Ergebnisse 4.2. Prüfung der Tumorigenität der EGFP-transfizierten PT1590Subklone in der SCID-Maus 4 Wochen post injectionem ließen sich bei 7 von 9 Mäusen, denen die PT1590Subklone injiziert worden waren, subkutan im Bereich der Implantationsstelle Tumoren nachweisen (siehe Tab. 18). Dabei wiesen die Mäuse, denen PT1590EGFP-H/1-Zellen injiziert wurden, nach vier Wochen Tumoren mit einer durchschnittlichen Tumorgröße von 11,66 mm (9-15 mm) auf. Die Tumoren der Mäuse, denen PT1590-EGFP-H/4-Zellen injiziert worden waren, wiesen nach vier Wochen eine durchschnittliche Größe von 14 mm (9-19,5 mm) auf. Von den 3 Mäusen, denen PT1590-EGFP-10-Zellen injiziert worden waren, entwickelte nur eine Maus einen sichtbaren Tumor mit einer Größe von 7,5 mm. Die 2 anderen Mäuse dieser Gruppe entwickelten auch im weiteren Verlauf keine makroskopisch sichtbaren Tumoren im Bereich der Implantationsstellen (siehe Tab. 18). Alle 7 Tiere mit lokaler Tumorentwicklung wurden nach Ablauf von 4 Wochen getötet. Abgesehen von der lokalen Tumorentwicklung wies keines der Versuchstiere während der gesamten Versuchszeit weitere äußerlich erkennbare Anzeichen einer Tumorerkrankung auf. 85 Ergebnisse Tab. 18: Lokale Tumorgröße 4 Wochen nach s.c. Applikation der PT1590-EGFP-Subklone H/1, H/4 und 10 Applizierter Maus-Nr. Lokale Tumordurchmesser [mm] PT1590-EGFP-Subklon Tumorbildung Subklon H/1 #1 + 15 #5 + 9 #9 + 11 #3 + 9 #7 + 19,5 #10 + 13,5 #2 + 7,5 #4 - - #6 - - Subklon H/4 Subklon 10 4.3. Etablierung des SCID-Maus-Xenograft-Modells mittels des Subklons PT1590-EGFP-H/4 Aufgrund seiner eher epitheloiden Zellmorphologie (siehe Tab. 17) und der erfolgreichen SCID-Maus-Vorversuche mit Nachweis der nach Transfektion weiterhin bestehenden, zuverlässigen Tumorigenität, sowie des im Vergleich zu den anderen getesteten Zellklonen schnelleren Wachstums in der SCID-Maus (siehe Tab. 18), wurde für die weiteren Tierversuche der Subklon PT1590-EGFPH/4 verwendet. 86 Ergebnisse 4.3.1. Tumorentwicklung nach s.c. Applikation von PT1590-EGFP-H/4Zellen in SCID-Mäuse Alle 60 Mäuse entwickelten nach s.c. Applikation von PT1590-EGFP-H/4-Zellen lokale Tumoren im Bereich der Implantationsstelle. 11 dieser Tiere wurden vor Erreichen einer lokalen Tumorgröße von ≥ 15 mm aufgrund von tumorassoziierten Symptomen, wie Tumorexulzerationen (n=7) oder Kachexie (n=4), getötet. Von diesen 11 Mäusen zeigten 7 Mäuse zum Zeitpunkt der Tötung lokale Tumoren von 14 mm Durchmesser, 3 Tiere zeigten Tumoren mit einer Größe von 13 mm und eine Maus wies einen lokalen Tumor von 12 mm auf. Abb. 10: Subkutan lokal gewachsener Primärtumor nach Applikation von PT1590-EGFP-H/4-Zellen am Beispiel der Maus #9 87 Ergebnisse Seitens der s.c. Tumorwachstumsdynamik erwies sich, dass bis zum Erreichen eines erstmalig palpablen s.c. Tumorknötchens von ca. 3-4 mm Durchmesser im Mittel 7,23 Tage vergingen. Bis zum Erreichen einer mittleren Tumorgröße von 514 mm vergingen im Mittel 29,72 Tage, während bis zum Erreichen einer terminalen Tumorgröße von > 15 mm im Mittel 46,24 Tage benötigt wurden (siehe Tab. 19; Abb. 11). Die Sektion der Mäuse offenbarte, dass bei keiner der 60 sezierten Tiere zum Zeitpunkt der Tötung eine makroskopisch sichtbare Organfernmetastasierung vorlag. Keines der für die weiteren Versuche entnommenen Organe (Lungen, Leber, Milz, Nieren, Femura) wies Metastasen auf. 88 Ergebnisse 80 70 60 Zeit [Tage] 50 40 30 20 10 58 55 52 49 46 43 40 37 34 31 28 25 22 19 16 13 10 7 4 1 0 Maus Nr. Abb. 11: Dauer bis zum Erreichen einer lokalen Tumorgröße von ≥ 15 mm oder Auftreten klinischer tumorassoziierter Symptome nach s.c. Applikation von PT1590-EGFP-H/4. (Maus # 4,8,15,18,27,29,37 weist zum Zeitpunkt der Tötung eine lokale Tumorgröße von 14 mm; Maus # 13,26,28 weist 13 mm und Maus # 46 weist eine lokale Tumorgröße von 12 mm auf). 89 Ergebnisse Tab. 19: Lokales Tumorwachstum in SCID-Mäusen nach s.c. Injektion von PT1590- EGFP-H/4-Zellen Zeit [Tage] bis zum Erreichen einer lokalen Tumorgröße Maus- Nr. #1 #2 #3 #4 #5 #6 #7 #8 #9 #10 #11 #12 #13 #14 #15 #16 #17 #18 #19 #20 #21 #22 #23 #24 #25 #26 #27 #28 #29 #30 #31 #32 #33 Lokale Tumorbildung + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + T1* T2* 7 7 7 7 7 7 7 15 10 10 4 4 10 4 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 9 9 9 9 9 9 9 9 7 90 T3* 15 29 29 19 34 23 34 34 29 29 36 29 50 36 43 36 31 31 31 31 31 31 38 31 30 30 16 37 30 37 30 37 35 40 43 44 50 44 43 50 53 53 50 50 53 42 43 42 42 43 51 42 43 48 46 48 51 Ergebnisse #34 #35 #36 #37 #38 #39 #40 #41 #42 #43 #44 #45 #46 #47 #48 #49 #50 #51 #52 #53 #54 #55 #56 #57 #58 #59 #60 + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + n=60 60/60 7 7 7 7 7 7 7 6 6 6 6 6 6 6 6 5 5 5 5 4 4 4 4 4 4 4 4 Mittelwert: 7,23 Median: 7 Stdabw.: ± 2,37 28 21 21 42 28 21 21 34 20 34 13 27 21 34 20 35 28 35 28 20 27 20 27 34 34 34 34 51 46 42 42 42 42 44 41 48 43 48 48 42 46 48 41 42 47 47 49 47 52 49 52 53 Mittelwert: 29,72 Mittelwert: 46,24 Median: 30,5 Median: 46 Stdabw.: ± 7,13 Stdabw.: ± 3,98 *Tumorgröße T1: < 5 mm ∅ / T2: 5-15 mm ∅ / T3: >15 mm ∅ (Die Mäuse mit der Nummer 4,8,13,15,18,26,27,28,29,37und 46 wurden vor Erreichen der Tumorstufe 3, aufgrund von tumorassoziierten Symptomen, euthanasiert). 91 Ergebnisse 20 18 Tumorgröße [mm] 16 14 12 10 8 6 4 2 0 0 10 20 30 40 50 60 70 Zeit [ Tage] Abb. 12: Wachstumsdynamik der lokalen Tumoren nach s.c. Applikation von PT1590-EGFP-H/4 in SCID-Mäusen 4.3.2. Untersuchung der lokalen Tumoren mittels Fluoreszenzmikroskopie Bei der fluoreszenzmikroskopischen Untersuchung der aus den lokalen Tumoren der SCID-Mäuse gewonnenen Zellsuspensionen ergab sich, dass alle 60 Tumoren auch nach der Mauspassage weiterhin GFP-positiv waren. 92 Ergebnisse 4.3.3. Untersuchung der Sekundärorgane auf disseminierte Tumorzellen mittels Fluoreszenzmikroskopie Von den insgesamt 60 Mäusen konnte bei 53 Tieren das Knochenmark, bei 52 Tieren die Lungen, bei 46 Tieren die Nieren und bei 3 Mäusen die Milz mittels Fluoreszenzmikroskopie auf disseminierte Tumorzellen hin untersucht werden. Disseminierte Tumorzellen waren hiernach in 46 (86,8%) von 53 untersuchten Knochenmarks-Proben (siehe Abb. 13), in 36 (69,2%) von 52 Lungen-Proben, in 40 (87%) von 46 untersuchten Nieren sowie in einer (33,3%) von 3 Milz-Proben nachzuweisen (siehe Tab. 20). Tab. 20: Detektion von disseminierten PT1590-EGFP-H/4-Zellen in Sekundärorganen der SCID-Mäuse Kompartiment Knochenmark Lunge Niere Milz Leber n untersuchte Tiere n positive Befunde/n untersuchten Organen (%) 53/60 52/60 45/60 3/60 0/60 46/53 (86,8) 36/52 (69,2) 40/46 (87,0) 1/ 3 (33,3) n.u. Abk.: n.u. = nicht untersucht 93 n positive Zellen Mittelwert (Minimum- detektierter Maximum) Tumorzellen 1-90 2-30 1-64 12 n.u. 45,5 16 32,5 n.u. Ergebnisse Abb. 13: Transfizierte PT1590-EGFP-H/4-Zelle in einer Knochenmarkssuspension 94 Diskussion 5. Diskussion Zur Erforschung der komplexen Metastasierungskaskade stehen u.a. in vivo- und in vitro-Modellsysteme zur Verfügung. Dabei scheinen in vitro-Modelle mit zweioder dreidimensionalen Kultursystemen (KIM et al. 2004) aber nur bedingt als Modellsysteme zur Analyse des Metastasierungsverhaltens maligner Tumoren geeignet zu sein, da sich in ihnen jeweils nur partielle Abschnitte der Kaskade simulieren lassen. Im Gegensatz hierzu können im in vivo-Tiermodell komplexere Zusammenhänge dargestellt und nachvollzogen werden. Der Einsatz von Tieren in der Erforschung humaner pathophysiologischer Vorgänge lässt aber immer wieder die Frage aufkommen, in wie weit die im Tierversuch erzielten Ergebnisse auf den Menschen übertragbar und damit auch ethisch gerechtfertigt sind. Ziel der vorliegenden Arbeit war es, unter Verwendung der humanen ÖsophagusAdenokarzinom-Zelllinie PT1590 (SCHEUNEMANN et al. 1999; HOSCH et al. 2000) ein SCID-Maus-Xenograft-Modell zur weiterführenden Analyse singulärer, disseminierter Tumorzellen zu etablieren. Diese mit Hilfe des hier vorgestellten Tiermodells geplanten Analysen, können mittlerweile durch den Einsatz neuer Techniken durchgeführt werden, welche eine umfangreiche chromosomale bzw. Genexpressions-Analysen auf Einzelzellniveau ermöglichen (KLEIN et al 2002; BURGEMEISTER et al. 2003). Zur besseren Detektion der disseminierten Tumorzellen wurde in zwei unterschiedlichen Transfektionsansätzen das Markergen EGFP in die Zellen eingeschleust. Da die Metastasierungskaskade aus einer Vielzahl komplexer und aufeinander aufbauenden Schritten besteht und dabei insbesondere auch die Interaktionen zwischen der Tumorzelle und den sie umgebenden Geweben von essentieller Bedeutung sind, bot ein in vivo-Metastasierungsmodell zur größtmöglichen Annäherung an diese biologischen Verhältnisse ein geeignetes System für die Ziele dieser Studie. 95 Diskussion Grundlage aller Xenograft-Modelle stellen spezies-fremde, meist humane Tumorzelllinien dar, welche immundefizienten Tieren implantiert werden. Der entstandene Tumor stellt hier eine Mischung aus spezies-fremden Tumor- und wirtseigenen Stromazellen dar. Zahlreiche Studien belegten die Notwendigkeit der Interaktionen zwischen Tumorzellen und Stromazellen im Rahmen der Tumorprogression und Metastasierung. Viele dieser Schritte in der Metastasierungskaskade sind spezies-spezifisch und eine Übertragung der Interaktionen auf fremde Spezies ist nicht immer möglich. Wählt man ein Xenograft-Modell, müssen diese eingeschränkten Tumorzell-Stromazell-Interaktionen bei der Interpretation der Ergebnisse berücksichtigt werden (COOPER et al. 2003; DE W EVER et al. 2003; SCHMIDT-HANSEN et al. 2004). So konnte in mehreren Studien beispielsweise gezeigt werden, dass signifikante Unterschiede in der Angiogenese zwischen xenotransplantierten und autochthonen (wirtseigenen) Tumoren bestehen, welche das „Anwachsen“ bzw. die Wachstumsgeschwindigkeit von Xenograft-Tumoren im Vergleich mit autochthonen bzw. klinischen Tumoren reduzieren (SIKDER et al. 2003; ALANI et al. 2004). Diese und andere Einschränkungen müssen bei der Übertragung der erzielten Ergebnisse beachtet werden und stellen potentiell wichtige Faktoren dar, welche die Aussagekraft der Xenograft-Modelle, insbesondere in der präklinischen Testung von Medikamenten reduziert haben (JOHNSON et al. 2001). Auf der anderen Seite bieten in vivo-Modelle im Gegensatz zur Analyse von Patienten-Proben die Möglichkeit grundsätzliche pathophysiologische Vorgänge in einem standardisierbaren und damit reliablen Versuchsansatz mit im Prinzip minimalen interindividuellen Abweichungen durchführen zu können. Damit im Versuchstier durch die Injektion humaner Tumorzellen ein proliferatives Tumorwachstum erfolgen kann, muss eine reaktive Immunantwort des Wirtstieres verhindert werden. Zu diesem Zwecke werden für Xenograft-Modelle eine Reihe von immunkompromittierten murinen Wirtstieren verwendet. Ein Nachteil dieses Ansatzes besteht dabei darin, Reaktionen des Immunsystems bei der Tumorprogression nicht untersuchen zu können. In der vorliegenden Studie 96 Diskussion wurden severe combined immunodeficency (SCID)-Mäuse verwendet. Die Vorteile in der Verwendung von SCID-Mäusen bestehen neben vergleichsweise niedrigen Anschaffungs- und Haltungskosten, in einer guten und schnellen Möglichkeit der Nachzüchtung, sowie in der ebenfalls vergleichsweise anspruchsarmen Versorgung und Unterbringung während der Versuchsphase. Des Weiteren stammten die eingesetzten Mäuse aus etablierten Mauslinien. SCID-Mäuse zeigen kombinierte Defizite in Anzahl und Funktion von T- und BZellen. Bei ihrem Einsatz muss jedoch beachtet werden, dass trotz ausgeprägter Immundefizienz durch die hohe Restaktivität der Natürlichen Killer-(NK-)Zellen sowie einer altersabhängigen „Schwäche“ in der SCID-Mutation dennoch eine immunvermittelte Elimination von injizierten humanen Tumorzellen erfolgen kann. Zusätzlich zeigt jede immunkomprimierte Mauslinie spezifische Eigenheiten, welche die Biologie und das Metastasierungsverhalten injizierter humaner Tumorzellen beeinflussen können (MUELLER und REISFELD 1991; GAROFALO et al. 1993). Alternativ werden neben SCID-Mäusen auch Nacktmäuse und andere Mauslinien mit Immunsuppressionen eingesetzt (CLARKE 1996; TAKIZAWA et al. 1997). Darüber hinaus werden zur Erforschung der Metastasierungskaskade neben murinen Wirtstieren auch Hunde und Katzen verwendet. So zeigen insbesondere Hunde signifikante anatomische und physiologische Ähnlichkeiten mit der humanen Spezies. Zusätzlich konnte kürzlich im Rahmen des Caninen-GenomProjektes (PENNISI 2002; zwischen Mensch und LINGAAS Hund et al. 2003) eine starke genetische Ähnlichkeit aufgezeigt werden. Hunde mit spontaner Tumorbildung wurden daraufhin zur Identifikation Krebs-assoziierter Gene in der Forschung herangezogen. Hierbei zeigte sich, dass maligne Tumoren des Hundes und des Menschen grosse Ähnlichkeiten in ihrer Tumorbiologie, und zwar auch insbesondere im Metastasierungsverhalten, aufweisen. Ein Unterschied in der Nutzung des Hundes als Wirtstier im Vergleich zu murinen Wirtstieren liegt in der Wachstumszeit des Tumors und somit auch in der Versuchsdauer. Die Tumorprogression einer Tumorart verläuft in einem murinen Wirtstier vergleichsweise schneller als in einem Hund. 97 Diskussion Aufgrund dieser Tatsache nutzt man die murinen Modellsysteme häufig für eine schnelle Generierung von Metastasen, wohingegen Hunde mehr in der Erforschung von Therapiemöglichkeiten maligner Tumorerkrankungen Anwendung finden. Auch wenn KIRKNESS et al. (2003) in einer Studie in vielen Bereichen große Homologien zwischen Hund und Mensch im Vergleich zu anderen Spezies einschließlich der Maus vermutet, bleibt der Einsatz von Hunden in der Krebsforschung weiterhin nur ausgewählten Projekten vorbehalten. In Abhängigkeit vom Applikationsort der wirtsfremden Zellen werden heterotope und orthotope Xenograft-Modelle unterschieden. Heterotope Modellsysteme sind definiert durch die Implantation von Tumorzellen bzw. Tumorfragmenten an einer anderen Körperstelle als dem eigentlichen Ursprungsort dieser Zellen, wohingegen in orthotopen Modellen die Tumorzellen in das Organ ihres originären Ursprungs implantiert werden. In unserer Studie erfolgte die heterotope Applikation der transfizierten Ösophagus-Adenokarzinom-Zelllinie PT1590-EGFPH/4 durch s.c. Injektion in die Flankenregion der SCID-Mäuse. Jede der 60 Mäuse des Hauptversuches, sowie 7 Mäuse des Vorversuches entwickelten hiernach einen lokalen Tumor im Bereich der lateralen Bauchwand. Im Gegensatz hierzu, werden bei den orthotopen Xenotransplantationsmodellen die Interaktionen zwischen den implantierten Tumorzellen und den sie umgebenden Ursprungsgeweben berücksichtigt. Grundlage dieses Ansatzes bildet dabei die über 100 Jahre alte „seed and soil“ -Hypothese von PAGET (1889), wonach das Auswachsen disseminierter Tumorzellen zu manifesten Metastasen maßgeblich von den „spezifischen Verhältnissen“ im jeweiligen Sekundärorgan abhängt. Sicherlich stellen diese Modelle eine anatomisch und pathophysiologisch realitätsnähere Situation dar, sind jedoch logistisch und methodisch erheblich aufwendiger. Im Falle der vorliegenden Studie hätte dies für die Versuchstiere eine Laparotomie in Allgemeinnarkose bedeutet. Darüber hinaus bestand in der vorliegenden Studie für eine orthotope Tumorzell-Implantation keine Notwendigkeit, da das Ziel nicht in der Generierung eines ÖsophaguskarzinomModells bestand, sondern mit Hilfe dieses Tiermodells eher grundsätzliche 98 Diskussion Aspekte der Dissemination und Metastasierung von Tumorzellen untersucht werden sollten. Ein weiterer experimenteller Ansatz zur Erforschung von Metastasierungsvorgängen stellt die direkte oder indirekte Applikation von Tumorzellen in die „Zielorgane“ von Versuchstieren dar. Hierbei werden die Tumorzellen entweder direkt in das Sekundärorgan bzw. transabdominell in die Peritonealkavität zur Induktion einer Peritonealkarzinose oder aber indirekt über venöse Gefäße (z.B. Schwanzvene, Portalvene) in das entsprechende Sekundärorgan injiziert. Vorteil dieser Methode ist die in Abhängigkeit von den verwendeten Tumorzellinien sichere und reproduzierbare Generierung von manifesten metastatischen Absiedlungen. Ein entscheidender Nachteil dieses Ansatzes ergibt sich aus der Tatsache, dass hier die initialen Schritte der Metastasierung, wie das Herauslösen einzelner Zellen aus dem „Primärtumor“-Zellverband, die Migration und Intravasion, nicht berücksichtigt werden und so erste, u.U. limitierende und selektive Schritte der Metastasierungskaskade umgangen werden. Da es in der vorliegenden Arbeit um die Etablierung eines Tiermodells zur weiteren Analyse gerade eben dieser initialen Schritte der Metastasierung gehen sollte, bot sich dieser Ansatz nicht an. Für das in vorliegender Studie vorgestellte SCID-Maus-Xenograft-Modell wurde die Ösophagus-Adenokarzinom-Zelllinie PT1590 verwendet (SCHEUNEMANN et al. 1999; HOSCH et al. 2000). Grund für die Auswahl dieser Zelllinie war ihre bereits erfolgte umfangreiche molekularzytogenetische Charakterisierung (HOSCH et al. 2000). Im Gegensatz zu kommerziell erhältlichen Zelllinien, wie z.B. die Kolonkarzinom-Zelllinie HT29, welche zum Teil seit Jahrzehnten im Einsatz sind, handelt es sich bei PT1590 um eine relativ „junge“ Zelllinie, von welcher anzunehmen ist, dass sie noch eine gewisse „Nähe“ zum ursprünglichen Primärtumor aufweist. Dies war u.a. mittels Multiplex-Fluoreszenz in situ Hybridisierung (M-FISH) nachweisbar, mit Hilfe derer bei PT1590 eine Reihe von charakteristischen Veränderungen erfasst werden konnten, wie sie typischerweise 99 Diskussion für Ösophagus-Adenokarzinome vorzufinden sind: (z.B. 8q-Zugewinne, 5q- und YChromosomen-Verluste) (HOSCH et al. 2000). Da sich das Genexpressionsprofil von Tumorzelllinien darüber hinaus mit zunehmender Anzahl von Passagen häufig verändert, wurden für die Transfektionsversuche frühe Passagen von PT1590Zellen ausgewählt. Ein weiterer, entscheidender Grund für die Wahl von PT1590 war ihr im SCID-Maus-Versuch nachgewiesenes metastastisches Potential (SCHEUNEMANN et al. 1999; HOSCH et al. 2000). Zur besseren Detektion disseminierter Tumorzellen in den Sekundärorganen wurde PT1590 mit dem Gen für das enhanced-green-fluorescent-protein (EGFP) transfiziert. Die Verwendung des EGFP-Gens als Markergen für die Detektion von disseminierten Tumorzellen in in vivo-Modellen stellt dabei einen weitgehend etablierten Ansatz dar, wie dies bereits in zahlreichen Studien demonstriert werden konnte (CHISHIMA et al. 1997B; YANG et al. 1998; FILLMORE et al. 1999; YANG et al. 1999C; HASEGAWA et al. 2000; YANG et al. 2002, YAMAMOTO et al. 2003). Im Gegensatz zu anderen etablierten Methoden der Zellmarkierung, wie die Einschleusung des Escherichia coli lacZ-Gens (LIN et al. 1990A; LIN et al. 1990B; BRUNNER et al. 1992; KOBAYASHI et al. 1997; CULP et al. 1998A; CULP et al. 1998B; KRÜGER et al. 1998-1999; MAURER-GEBHARD et al. 1999; ZHANG et al. 1999; HOLLERAN et al. 2002), des Luciferase-Reporter-Systems (VOOIJS et al. 2002; ADAMS et al. 2002), sowie der Chromosomen- (FROST et al. 1987; HU et al. 1987; MCMORROW et al. 1988) und Radioisotopen-Zellmarkierung (FIDLER 1970; JUACABA et al. 1989), ermöglicht die EGFP-Transfektion eine unmittelbare und direkte Detektion singulärer Tumorzellen, ohne weitere aufwendige Maßnahmen zur Visualisierung der Transfektanten. Dies hat den Vorteil, dass eine methodisch einfache und vor allem zeitnahe Detektion und Isolation der markierten Zellen erfolgen kann, was insbesondere bei der Gewinnung von RNA-fähigem Material von entscheidender Bedeutung ist. Die EGFP-markierten Zellen sind mittels Fluoreszenz-Mikroskop oder Fluoreszenz-Durchflußzytometer (FACS) sofort nach der Probenaufbereitung zu detektieren. Eine Isolierung der markierten Zellen für 100 Diskussion weiterführende Analysen auf DNA-, mRNA- und Proteinebene kann mit Hilfe von Mikromanipulator oder FACS erfolgen. Zweck der Etablierung des hier vorgestellten Tiermodells sollen später durchzuführende vergleichende molekular(zyto)genetische Analysen zwischen einzelnen disseminierten Tumorzellen in Sekundärorganen und den Zellen aus dem Bauchwandtumor („Primärtumor“) sein, mit dem Ziel, neue metastasierungsbzw. disseminierungsrelevante Veränderungen zu detektieren. So konnten beispielsweise DELLACASAGRANDE et al. (2003) durch den Vergleich von in der Maus hepatisch metastasierten, EGFP-markierten Plasmazytomzellen und den parentalen Plasmazytomzellen nachweisen, dass Erstere im Gegensatz zu den parentalen Zellen eine außerordentlich hohe Expression des Chemokin-Rezeptors CCR6 aufwiesen. Über diesen Mechanismus der CCR6-Expression könnten Tumorzellen in die Leber metastasieren, welche CCL20, den natürlichen Liganden von CCR6, exprimiert. Obwohl EGFP-basierte Metastasierungsmodelle eine Reihe von Vorteilen gegenüber Metastasierungsmodellen mit anderen Markergenen aufweisen, bleibt die Detektion disseminierter Tumorzellen bei diesem Ansatz trotz allem schwierig. Um die markierten Tumorzellen mittels Fluoreszenzmikroskopie bzw. FACS eindeutig von unmarkierten Normalzellen unterscheiden zu können, muss der EGFPExpressionslevel der transfizierten Zellen ausreichend hoch sein. In unserer Studie zeigten lediglich 4 von 10 generierten Subklonen (H/1, H/4, Klon 3 und Klon 10) eine starke EGFP-Expression (++ - +++) (siehe Tab. 17). Des Weiteren kann die Autofluoreszenz einiger Gewebe die Analysen beeinträchtigen und zu falsch positiven Ergebnissen führen. Diese Schwierigkeiten konnten allerdings durch die Verbesserungen der modernen Fluoreszenzmikroskope bzw. Durchflusszytometer sowie der computer-basierten Bildausrüstung minimiert werden (W ACK et al. 2003; TROY et al. 2004). Ein weiterer Kritikpunkt bei der Verwendung von transfizierten Zellen betrifft die über die reine Insertion des Transgens hinaus gehende Modifikation der 101 Diskussion transfizierten Zelle. So demonstrierten LIU et al. (1999) im Gegensatz zu anderen Studien (MARSHALL et al. 1995; W AHLFORS et al. 2001), einschließlich unserer Eigenen, dass die GFP-Transfektion in verschiedenen Zelllinien unter Verwendung unterschiedlicher Vektoren den programmierten Zelltod (Apoptose) durch Förderung der Kaspaseaktivität induzieren kann. Entscheidender als diese letalen Veränderungen sind jedoch „subletale“ Modifikationen, welche zu funktionellen Änderungen der Zelle führen. Die in der vorliegenden Studie generierten Transfektanten zeigten in vitro ein zumindest identisches Wachstumsverhalten mit identischer Passagezeit und eine ähnliche Morphologie wie die parentalen PT1590-Zellen. In vivo allerdings zeigte sich, dass die verwendete Transfektante PT1590-EGFP-H/4 eine im Vergleich zur parentalen Zelllinie deutlich verzögertes Wachstum bezogen auf die Dynamik am Applikationsort aufwies. Während PT1590-EGFP-H/4-Zellen nach s.c. Applikation bis zum Erreichen einer terminalen Tumorendgröße von ≥ 15 mm im Mittel 46,24 Tagen benötigten, vergingen bis zum Erreichen einer Tumorgröße von ≥ 15 mm bei der Applikation von PT1590 im Mittel lediglich 8,6 Tage. Eine Erklärung für diese Diskrepanz könnten Transfektions-bedingte molekulare Veränderungen sein. Eine vergleichende Genexpressionsanalyse zwischen parentalen und transfizierten Zellen zur Klärung dieser Unterschiede, wurde in der vorliegenden Arbeit nicht durchgeführt. Auf das Disseminations- bzw. Metastasierungspotential von PT1590 scheint die EGFP-Transfektion hingegen keinen Einfluss gehabt zu haben. Nach s.c. Applikation ließen sich sowohl bei PT1590-EGFP-H/4, wie auch bei der parentalen Zelllinie PT1590, Tumorzellen in Sekundärorganen nachweisen (HOSCH et al. 2000). Dass Tumorzellen nach EGFP-Transfektion prinzipiell ihre Metastasierungsfähigkeit behalten, belegt auch eine Arbeit von CHISHIMA et al. (1997B). In dieser Studie wurden EGFP-transfizierte chinese-hamster-ovaryKarzinomzellen in SCID-Mäuse appliziert. Sechs Wochen post injectionem ließen sich bei den SCID-Mäusen multiple Metastasen in Lunge, Pleura, Leber, Niere, Peritoneum und den Nebennieren nachweisen. 102 Diskussion Ein weiteres Problem bei der Verwendung von transfizierten Zellen betrifft Studien, in welchen immunkompetente Tiere eingesetzt werden. Hierbei kann durch die Expression des „fremden Proteins“ eine endogene, T-Zell-vermittelte Immunreaktion induziert werden, welche auch für das GFP-Gen beschrieben wurde (STEINBAUER et al. 2003; RE et al. 2004). Bei der Untersuchung der Maus-Sekundärorgane ließen sich disseminierte Tumorzellen in einem hohen Prozentsatz in Lungen, Nieren und Knochenmark der SCID-Mäuse nachweisen. Ob es sich bei diesen Zellen um relevante Tumorzellen handelt, kann allerdings zum jetzigen Zeitpunkt nicht beantwortet werden. So wäre zum Einen ein „passives Abschwemmen“ der Tumorzellen aus dem Bauchwandtumor in die Sekundärorgane während der Sektion denkbar. Um dies zu umgehen, wurden Manipulationen an den Bauchwandtumoren während der Sektion vermieden und die Bauchwandtumoren erst am Ende der Sektionen nach Entnahme der Sekundärorgane präpariert. Zum Anderen erscheint es wenig wahrscheinlich, dass zum Zeitpunkt der Sektion durch Manipulationen am Bauchwandtumor Tumorzellen in die Nieren und das Knochenmark abgeschwemmt werden, wohingegen ein manipulationsbedingtes Abschwemmen von Tumorzellen in die Lungen durchaus denkbar wäre, da der vermeintlich wahrscheinlichste hämatogene Metastasierungsweg bei diesem Tiermodell über die venösen Bauchwandgefäße in die obere und/oder untere Hohlvene zum rechten Herz in den kleinen Kreislauf führt, und die Lungen hierbei quasi als „Filter“ wirken. Der Nachweis von Tumorzellen in Nieren und Knochenmark ließe sich hiernach nicht so ohne weiteres durch ein passives Abschwemmen erklären. Zum Anderen muss zum jetzigen Zeitpunkt offen bleiben, ob die in den Sekundärorganen der Mäuse detektierten Tumorzellen das Potential zur Bildung manifester Metastasen besitzen. Bekannt ist, dass nur ein sehr geringer Anteil disseminierter Tumorzellen zu manifesten Metastasen auswächst. So konnte beispielsweise in einem Tierexperiment nachgewiesen werden, dass zur Bildung von hepatischen Makrometastasen mindestens 1x106 in die Portalvene der 103 Diskussion Versuchstiere injizierte Tumorzellen notwendig waren. Wurden hingegen weniger als 1x106 Tumorzellen appliziert, konnten in diesem Experiment keine Lebermetastasen nachgewiesen werden (TAYLOR 1996). Um die Frage nach der Relevanz der in diesem Tiermodell nachweisbaren disseminierten Tumorzellen zu klären, sind daher weitere Untersuchungen notwendig. Zum Einen müssten histopathologische Untersuchungen an den asservierten Sekundärorganen der Versuchstiere mit der Frage nach (mikro)metastatischen Absiedlungen durchgeführt werden. Hierdurch ließe sich klären, ob es sich bei den in den Organsuspensionen nachgewiesenen Tumorzellen um isolierte, disseminierte Tumorzellen mit unklarer biologischer Relevanz oder aber um ehemals mehrzellige Zellverbände gehandelt hat. Zum Anderen sind weitere Tierversuchsreihen denkbar, bei welchen der Bauchwandtumor der SCID-Maus chirurgisch entfernt wird. In der Folge wären die operierten Mäuse im Hinblick auf die Entwicklung von manifesten Metastasen weiter zu beobachten. Abschließend lässt sich bei der Beurteilung der Ergebnisse feststellen, dass dieses SCID-Maus-Tumor-Xenograft-Modell ein durchaus anwendungs- freundliches, praktikables und reproduzierbares Metastasierungssystem darstellt. Die Ergebnisse nach Abschluss der beiden Transfektionsmethoden zeigen, dass die Lipofektion durch Unterstützung eines retroviralen Vektors noch bessere Transfektionsergebnisse Detektion disseminierter erzielte als die Elektroporation. PT1590-EGFP-H/4-Zellen in Die allen erfolgreiche untersuchten Sekundärorganen stellt die Basis für weitere molekulargenetische Analysen der Zelllinie PT1590 dar. 104 Zusammenfassung 6. Zusammenfassung Julia Rose (2005) Etablierung eines SCID-Maus-Tumor-Xenograft-Modells zur Analyse einzelner disseminierter Tumorzellen unter Verwendung der humanen Ösophaguskarzinom-Zelllinie PT1590 Das Ziel dieser Studie stellte die Etablierung eines SCID-Maus-Tumor-XenograftModells zur Analyse einzelner, disseminierter Tumorzellen unter Verwendung der erst kürzlich etablierten humanen Ösophagus-Adenokarzinom-Zelllinie PT1590 dar. Die Tumorigenität und Metastasierungsfähigkeit der Zelllinie PT1590 wurde bereits nach subkutaner Applikation in SCID-Mäuse nachgewiesen (SCHEUNEMANN et al. (1999), N. Engl. J. Med. 340, 1687; HOSCH et al. (2000), Cancer Res. 60, 6836-6840). Zur besseren Detektion und Durchführung weiterführender Analysen der PT1590Zellen in der SCID-Maus, erfolgte die Transfektion der Zellen unter Verwendung des Markergens für das green-fluorescent-protein (GFP). Hierfür wurde in dieser Studie die Codon-optimierte Variante, das sogenannte enhanced-green- fluorescent-protein (EGFP) gewählt, welches gegenüber dem Wildtyp eine 510fach stärkere Expression aufweist. Die Transfektion der PT1590-Zellen wurde sowohl unter Anwendung der Elektroporation, als auch mit der Lipofektionsmethode, bei der zusätzlich ein retroviraler Vektor eingesetzt wurde, durchgeführt. Hierbei gelang die Generierung 10 stabiler PT1590-EGFP-Subklone, von denen 3 Subklone aufgrund ihrer starken EGFP-Expression für die anschließenden SCID-Mausexperimente ausgewählt wurden. In einem Vorversuch erfolgte die Überprüfung der Tumorigenität dieser 3 Subklone in SCID-Mäusen. Es zeigte sich, dass alle 3 Subklone nach subkutaner Applikation zur lokalen Tumorbildung befähigt waren. 105 Zusammenfassung Für den nachfolgenden Hauptversuch wurde der Subklon PT1590-EGFP-H/4 ausgewählt. Insgesamt 60 weiblichen SCID-Mäusen wurden jeweils 2x106 der PT1590-EGFP-H/4-Zellen subkutan appliziert. Sobald eine lokale Tumorgröße von ≥ 15 mm erreicht wurde, erfolgte die Euthanasie mit anschließender Obduktion der Mäuse. Hierbei wurden jeder Maus die Sekundärorgane (Lungen, Knochenmark, Leber, Milz, Nieren) entnommen und diese sowohl auf eine makroskopische Metastasierung hin, als auch die EGFP-Expression dieser subkutanen Tumoren unter dem Invert-Auflicht-Fluoreszenzmikroskop untersucht. Nach mechanischer Disaggregation der Sekundärorgane unter Einsatz der Medimachine (DakoCytomation, Hamburg) zu Einzellzellsuspensionen, wurden diese unter dem Invert-Auflicht-Fluoreszenzmikroskop auf die Anwesenheit disseminierter Tumorzellen hin analysiert. Es ließen sich zum Einen bei allen 60 applizierten Mäusen lokale subkutane Tumoren nachweisen, des Weiteren blieb die Fluoreszenzfähigkeit von PT1590EGFP-H/4-Zellen in allen subkutanen Tumoren der Mäusen erhalten. Einen deutlichen Erfolg dieser Studie stellt, im Vergleich mit der vorhandenen Literatur, der fluoreszenzmikroskopisch durchgeführte Nachweis disseminierter PT1590EGFP-H/4-Zellen in allen Sekundärorganen dar. Insgesamt sprechen diese Ergebnisse für eine erfolgreiche Etablierung eines validen und verläßlichen Kleintier-Xenograft-Modells zur weiterführenden Analyse einzelner humaner, disseminierter Tumorzellen. Dieses Modell ermöglicht die Untersuchungen molekularer Grundlagen Metastasierungsvorgängen. 106 und Mechanismen von Summary 7. Summary Julia Rose (2005) Establishment of a SCID-mouse-tumor-xenograft-model to analyse single disseminated tumor cells using the human esophageal carcinoma cell line PT1590. The study was aimed to establish a SCID-mouse-tumor-xenograft-model to analyse single and disseminated tumor cells using the recently established human esophageal carcinoma cell line PT1590. The tumorigenicity and ability to metastasise of this cell line, has already been proved after a subcutaneous injection of these cells in SCID-mice [SCHEUNEMANN et al. (1999), N. Engl. J. Med. 340, 1687; HOSCH et al. (2000), Cancer Res. 60, 6836-6840]. With the purpose of a better detection and for continuing analyses of PT1590 cells within SCID-mice, the cells were transfected with the gene for the greenfluorescent-protein (GFP). Our study was based on the codon-optimized variant, the so-called enhanced-green-fluorescent-protein (EGFP). This type shows a 5-10 times stronger expression compared to the wildtypus. The transfection of PT1590-cells was carried out by the application of electroporation and with the lipofection-method, which additionally uses a retroviral vector. In this way, we achieved to generate 10 stable PT1590–EGFP-subclones of which 3 subclones were chosen for subsequent mouse experiments, due to their strong EGFP-expression. A pilot test had shown, that all of these 3 subclones were able to induce local tumors after subcutaneous application. The main experiment focussed on the PT1590-EGFP-H/4-subclone. Each of in total 60 female SCID-mice got subcutaneous injections of 2x106 PT1590-EGFPH/4-cells. As soon as the local tumors had reached a size of 15 mm, the mice were sacrificed and subsequently underwent autopsy. The secondary organs (lung, bone marrow, liver, spleen, kidney) were taken out and examined macroscopically in respect of the presence of metastases, as well 107 Summary as microscopically regarding the EGFP-expression of the subcutaneous tumors using an inverted microscope equipped with an epi-fluorescence condensor. After a mechanical disaggregation of the secondary organs by using the Medimachine (DakoCytomation, Hamburg) to bring about single cell suspensions, these were controlled in the inverted microscope for the presence of disseminated tumor cells. In the 60 mice used, the injection of PT1590-cells caused local tumors; additionally, the ability for GFP fluorescence could be demonstrated in all of the subcutaneous tumors found. Thus, one of the most remarkable results obtained during the course of this study, in comparison with the available literature, was the clear demonstration of disseminated PT1590-cells in all of the examined secondary organs. In summary, the results corroborate the view that a reliable and valid model for a laboratory animal-xenograft system to detect disseminated tumor cells could be established in humans. This model makes it possible to get a better insight into the molecular mechanisms of the process of metastasis. 108 Schrifttumsverzeichnis 8. Schrifttumsverzeichnis ABDEL-WAHAB, M., N. GAD-ELHAK, A. DENEWER, G. EL-EBIDY, A. SULTAN, A. ABOUELENIN, O. FATHY, M. ABOU-ZID, N. EL-GHAWALBY, F. ETZZAT (1998): Endoscopic laser treatment of progressive dysphagia in patients with advanced esophageal carcinoma. Hepatogastroenterology 45, 1509-1515 ADAMS, J. Y., M. JOHNSON, M. SATO, F. BERGER, S. S. GAMBHIR, M. CAREY, M. L. IRUELA-ARISPE, L. WU (2002): Visualization of advanced human prostate cancer lesions in living mice by a targeted gene transfer vector and optical imaging. Nat. Med. 8, 891-897 ADELSTEIN, D. J., T. W. RICE, M. TEFFT, A. KOKA, M. A. VAN KIRK, T. J. KIRBY, M. E. TAYLOR (1994): Aggressive concurrent chemotherapy and surgical resection for proximal esophageal squamous cell carcinoma. Cancer 74, 1680-1685 AKIYAMA, H., M. TSURUMARU, Y. ONO, H. UDGAW (1993): Background of lymph node dissection for squamous cell carcinoma of the esophagus. In: SATO, T., T. IIZUKA (eds.): Color Atlas of Surgical Anatomy for Esophageal Cancer. Springer Verlag, Berlin, Heidelberg, New York, 9-24 ALANI, R. M., C. F. SILVERTHORN, K. OROSZ (2004): Tumor angiogenesis in mice and men. Cancer Biol. Ther. 3, 498-500 ALTORKI, N. K., L. GIRARDI, D. B. SKINNER (1994): Squamous cell carcinoma of the esophagus: therapeutic dilemma. World J. Surg. 18, 308-311 AMERICAN SOCIETY OF GASTROENTEROLOGY (1998): The role of endoscopy in the surveillance of premalignant conditions of the upper gastrointestinal tract. Guidelines for clinical application. Gastrointest. Endoscop. 34, 18-20 BEHRENS, J., U. FRIXEN, J. SCHIPPER, M. WEIDENER, W. BIRCHMEIER (1992): Cell adhesion in invasion and metastasis. Semin. Cell Biol. 3, 169-178 BIRCHMEIER, C. B., B. M. BIRCHMEIER (1993): Molecular aspects of mesenchymal- epithelial interactions. Ann. Rev. Cell Biol. 9, 511-540 109 Schrifttumsverzeichnis BLOT, W. J., S. S. DEVESA, J. F. FRAUMENI JR. (1993): Continuing climb in rates of esophageal adenocarcinoma: an update (letter). J. Amer. Med. Ass. 270, 1320 BLOT, W. J., S. S. DEVESA, R.W. KNELLER, J. F. FRAUMENI (1991): Rising incidence of adenocarcinoma of the esophagus and gastric cardia. J. Amer. Med. Ass. 265, 1287-1289 BLOT, W. J., J. K. MCLAUGHLIN (1999): The changing epidemiology of esophageal cancer. Semin. Oncol. 26, (suppl. 15) 2-8 BOGOMOLETZ, W. V., G. MOLAS, B. GAYET, F. POTET (1989): Superficial squamous cell carcinoma of the esophagus. A report of 76 cases and review of the literature. Am. J. Surg. Pathol. 13, 535-546 BOHLE, W., W. G. ZOLLER (2002): Diagnostik, Endoskopie, Endosonographie und Radiologie. In: ZOLLER, W.G., U. KÖPPEN: Ösophaguskarzinom. Schattauer Verlag, Stuttgart, 10-27 BOKMAN, S. H., W. W. WARD (1981): Renaturation of Aequorea green-fluorescent-protein. Biochem. Biophys. Res. Commun. 101, 1372-1380 BONAVINA, L., D. SOLIGO, N. QUIRICI, P. BOSSOLASCO, B. CESANA, G. LAMBERTENGHI DELILIERS, A. PERACCHIA (2001): Bone marrow-disseminated tumor cells in patients with carcinoma of the esophagus or cardia. Surgery 129, 15-22 BOURKE, M. J., R. L. HOPE, G. CHU, P. E. GILLESPIE, C. BULL, L. O’ROURKE, S. J. WILLIAMS (1996): Laser palliation of inoperable malignant dysphagia: initial and at death. Gastrointest. Endosc. 43, 29-32 BOUVET, M., S. R. NARDIN, D. W. BURTON, N. C. LEE, M. YANG, X. WANG, E. BARANOV, C. BEHLING, A. R. MOOSSA, R. M. HOFFMAN, L. J. DEFTOS (2002): Parathyroid hormone-related protein as a novel tumor marker in pancreatic adenocarcinoma. Pancreas 24, 284-290 BOUVET, M., M. YANG, S. NARDIN, X. WANG, P. JIANG, E. BARANOV, A. R. MOOSSA, R. M. HOFFMAN (2000): Chronologically-specific metastatic targeting of human pancreatic tumors in orthotopic models. Clin. Exp. Metastasis 18, 213-218 110 Schrifttumsverzeichnis BOYER, B., A. M. VALLES, J. JOUANNEAU, A. DELOUVEE, G. MOENS, J. P. THIERY (1992): In vitro conversion of carcinoma cells into fibroblastic cells. Induction, mechanism of action and importance in invasion and metastasis. Pathol. Biol. 39, 862-863 BRAUN, S., K. PANTEL, P. MÜLLER, W. JANNI (2000): Cytokeratin-positive cells in the bone marrow and survival of patients with stage I,II, or III breast cancer. N. Engl. J. Med. 342, 525-533 BRUNNER, N., E. W. THOMPSON, M. SPANG-THOMSEN, J. RYGAARD, K. DANO, J. A. ZWIEBEL (1992): lacZ transduced human breast cancer xenografts as an in vivo model for the study of invasion and metastasis. Eur. J. Cancer. 28A, 1989-1995 BURGEMEISTER, R., R. GANGNUS, B. HAAR, K. SCHUTZE, U. SAUER (2003): High quality RNA retrieved from samples obtained by using LMPC (laser microdissection and pressure catapulting) technology. Pathol. Res. Pract . 199, 431-436 CAI, J., M. IKEGUCHI, M. MAETA, N. KAIBARA (2000): Micrometastasis in lymph nodes and microinvasion of the muscularis propria in primary lesions of mucosal gastric cancer. Surgery 127, 32-39 CALALUCE, R., B. W. MIEDEMA, Y. W. YESUS (1998): Micrometastasis in colorectal carcinoma: a review. J. Surg. Oncol. 67, 194-202. CAMERON, A. J., A. R. ZINSMEISTER, D. J. BALLARD, J. A. CARNEY (1990): Prevalence of columnar-lined (Barrett’s) esophagus. Comparison of populationbased and autopsy findings. Gastroenterology 99, 918-922 CHALFIE, M., Y. TU, G. EUSKIRCHEN, W. W. WARD, D. C. PRASHER (1994) : Green fluorescent protein as a marker for gene expression. Science 263, 802-805 CHAMBERS, A. F., I. C. MACDONALD, E. F. SCHMIDT, S. KOOP, V. L. MORRIS, R. KHOKHA, A. C. GROOM (1995): Step in tumor metastasis: new concepts from intravital videomicroscopy. Cancer Metastasis Rev. 14, 279-301 CHISHIMA, T., Y. MIYAGI, L. LI, Y. TAN, E. BARANOV, M. YANG, H. SHIMADA, A. R. MOSSA, R. M. HOFFMAN (1997C): The use of histoculture and green fluorescent protein to visualize tumor cell host interaction. In Vitro Cell. Dev. Biol. Anim. 33, 745-747 111 Schrifttumsverzeichnis CHISHIMA, T., Y. MIYAGI, X. WANG, E. BARANOV, M. YANG, Y. TAN, H. SHIMADA, A. R. MOOSSA, R. M. HOFFMAN (1997D): Metastatic patterns of lung cancer visualized live and in process by green fluorescent protein expression. Clin. Exp. Metastasis 15, 547-552 CHISHIMA, T., Y. MIYAGI, X. WANG, Y. TAN, H. SHIMADA, A. R. MOOSSA, R. M. HOFFMAN (1997E): Visualization of the metastatic process by green fluorescent protein expression. Anticancer Res. 17, 2377-2384 CHISHIMA, T., Y. MIYAGI, X. WANG, H. YAMAOKA, H. SHIMADA, A. R. MOOSSA, R. M. HOFFMAN (1997B): Cancer invasion and micrometastasis visualized in live tissue by greenfluorescent-protein expression. Cancer Res. 57, 2042-2047 CHISHIMA, T., M. YANG, Y. MIYAGI, L. LI, Y. TAN, E. BARANOV, H. SHIMADA, A. R. MOOSSA, S. PENMAN, R. M. HOFFMAN (1997A): Governing step of metastasis visualized in vitro. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94, 11573-11576 CLARKE, R. (1996): Human breast cancer cell line xenografts as models of breast cancer. The immunobiologies of recipient mice and the characteristics of several tumorigenic cell lines. Breast Cancer Res. Treat. 39, 69-86 COCHRAN, A. J., D. R. WEN, D. L. MARTON (1988): Occult tumor cells in the lymph nodes of patients with pathological stage I malignant melanoma. An immunhistological study. Am. J. Surg. Pathol. 12 , 612-618 CODY, C. W., D. C. PRASHER, W. M. WESTLER, F. G. PRENDERGAST, W. W. WARD (1993): Chemical structure of the hexapeptide chromophore of the Aequorea greenfluorescent protein. Biochemistry 32, 1212-1218 COIA, L. R., E. R. SAUTER (1994) : Esophageal Cancer. In: OZOLS, R. F., B. EISENBERG, T. J. KINSELLA (eds.): Current problems in Cancer. Mosby, St. Louis, 191-247 COOPER, C. R., C. H. CHAY, J. D. GENDERNALIK, H. L. LEE, J. BHATIA, R. S. TAICHMAN, L. K. MCCAULEY, E. T. KELLER, K. J. PIENTA (2003): Stromal factors involved in prostate carcinoma metastasis to bone. Cancer 97, 739-747 112 Schrifttumsverzeichnis CORMACK, B. P., R. H. VALDIVIA, S. FALKOW (1996): FACS-optimized mutants of the green fluorescent protein (GFP). Gene 173, 33-38 COTE, R. J., H. F. PETERSON, B. CHAIWUN, R. D. GELBER (1999): Role of immunhistochemical detection of lymph-node metastases in management of breast cancer (International Breast Cancer Study Group). Lancet 354, 896-900 COTE, R. J., P. P. ROOSEN, M. C. LESSER, L. J. OLD (1991): Prediction of early relapse in patients with operable breast cancer by detection of occult bone marrow micrometastases. J. Clin. Oncol. 9 , 1749-1756 CULP, L. A., W. C. LIN, N. R. KLEINMAN, N. M. CAMPERO, C. J. MILLER, J. L. HOLLERAN (1998A): Tumor progression, micrometastasis, and genetic instability tracked with histochemical marker genes. Prog. Histochem. Cytochem. 33, XI-XV, 329-348 CULP, L. A., W. LIN, N. R. KLEINMAN, K. L. O’CONNOR, R. LECHNER (1998B): Earliest steps in primary tumor formation and micrometastasis resolved with histochemical markers of gene-tagged tumor cells. J. Histochem. Cytochem. 46, 557-568 CUTAIT, R., V. A. ALVES, L. C. LOPES, D. E. CUTAIT (1991): Restaging of colorectal cancer based on the identification of lymph node micrometastases through immunperoxidase staining of CEA and Cytokeratin. Dis. Colon Rectum 34, 917-920 DALY, J. M., L. H. KARNELL, H. R. MENCK (1996): National Cancer Data Base report on esophageal carcinoma. Cancer 78, 1820-1828 DECKER, P., D. DECKER (2003): Ösophagusstent. In: BOESE-LANDGRAF, J., U. GALLKOWSKI, G. LAYER, A. SCHALHORN (eds.): Regionale Tumortherapie. Springer Verlag, Berlin, Heidelberg, New York, 249-254 DEGUCHI, T., T. DOI, H. EHARA, S. ITO (1993): Detection of micrometastatic cancer cells in lymph nodes by reverse transcriptasepolymerase chain reaction. Cancer Res. 53, 5350-5354 DELLACASAGRANDE, J., O. J. SHREURS, P. O. HOFGAARD, H. OMHOLT, S. STEINSVOLL, K. SCHENCK, B. BOGEN, Z. DEMBIC (2003): Liver metastasis of cancer facilitated by chemokine receptor CCR6. Scand. J. Immunol. 57, 534-544 113 Schrifttumsverzeichnis DE MASCAREL, I., F. BONICHON, J. M. COINDRE, M. TROJANI (1992): Prognostic significance of breast cancer axillary lymph node micrometastases assessed by two special techniques: reevaluation with linger follow-up. Br. J. Cancer 66, 523-527 DE WEVER, O., M. MAREEL (2003): Role of tissue stroma in cancer cell invasion. J. Pathol. 200, 429-447 DIEL, I. J., M. KAUFMANN, R. GOERNER, S. D. COTTA (1992): Detection of tumor cells in bone marrow of patients with primary breast cancer: a prognostic factor for distant metastasis. J. Clin. Oncol. 10, 1534-1539 EARLAM, R. (1988): Epidemiology of esophageal cancer from the european point of view. In: SIEWERT, J. R., A. H. HÖLSCHER (eds.): Diseases of the Esophagus. Springer Verlag, Berlin, Heidelberg, 11-18 EDELSTEIN, R. A., A. L. ZIETMAN, A. DE LAS MORENAS, R. J. KRANE (1996): Implications of prostate micrometastases in pelvic lymph nodes: an archival tissue study. Urology 47, 370-375 ENZINGER, P. C., D. H. ILSON, D. P. KELSEN (1999): Chemotherapy in esophaeal cancer. Semin. Oncol. 26, 12-20 FALK, G. W. (1999): Reflux disease and Barrett’s esophagus. Endoscopy 31, 9-16 FIDLER, I. J., I. R. HART (1982): Recent observations on the pathogenesis of cancer metastasis. Prog. Clin. Biol. Res. 85, 601-619 FIEDLER , I. J. (1970): Metastasis: quantitative analysis of distribution and fate of tumor emboli labeled with 125 I-5-iodo-2’-deoxyuridine. J. Natl. Cancer Inst. 45, 773-782 FILLMORE, H. L., J. SHURM, P. FURQUERON, S. S. PRABHU, G. T. GILLIES, W. C. BROADDUS (1999): An in vivo rat model for visualizing glioma tumor cell invasion using stable persistent expression of the green fluorescent protein. Cancer Lett. 141, 9-19 FINK, U., H. J. STEIN, H. WILKE, J. D. RODER, J. R. SIEWERT (1995): Multimodal treatment for squamous cell esophageal cancer. World J. Surg. 19, 198-204 114 Schrifttumsverzeichnis FLANAGAN, S. (1966): ‘Nude’, a new hairless gene with pleiotropic effects in the mouse. Genet. Res. 8, 295-309 FOK, M., J. S. T. SHAM, D. CHOY, S. W. K. CHENG, J. WONG (1993): Postoperative radiotherapy for carcinoma of the esophagus: a prospective, randomized controlled study. Surgery 113, 138-147 FORASTIERE, A., M. ORRINGER, C. PEREZ-TAMAYO, S. G. URBA, M. ZAHURAK (1993): Preoperative chemoradiation followed by transhiatal esophagectomy for carcinoma of the esophagus: final report. J. Clin. Oncol. 11, 1118-1123 FRANCESCHI, S., E. BIDOLI, E. NEGRI, P. ZAMBON, T. TALAMINI, A. RUOL, M. PARPINEL, F. LEVI, L. SIMONATO, C. LA VECCHIA (2000): Role of macronutrients, vitamins and minerals in the aetiology of squamous-cell carcinoma of the oesophagus. Int. J. Cancer 86, 626-631 FREEMAN, J. A., D. ESRIG, G. D. GROSSFELD, J. P. STEIN (1995): Incidence of occult lymph node metastases in pathological stage C (pT3N0) prostate cancer. J. Urol. 154 (2PT1), 474-478 FROST, P., R. S. KERBEL, B. HUNT, S. MAN, S. PATHAK (1987): Selection of metastatic variants with identifiable karyotypic changes from a non metastatic murine tumor after treatment with 2’-deoxy-5-azacytidine or hydroxyurea: implications for the mechanisms of tumor progression. Cancer Res. 47, 2690-2695 FUKUMURA, D., F. YUAN, W. L. MONSKY, Y. CHEN, R. K. JAIN (1997) : Effect of host microenvironment on the microcirculation of human colon adenocarcinoma. Am. J. Pathol. 151, 679-688 FUNAMI, Y., N. TOKUMOTO, H. MIYAUCHI, K. KUGA, S. SATO (1999): Improvement of oral ingestion in patients with inoperable esophageal cancer treated with radiotherapy, chemotherapy and insertion of a self-expanding nitinol stent. Dis. Esophagus 12, 289-292 GAMMON, M. D., J. B. SCHÖNBERG, H. AHSAN, H. A. RISCH, T. L. VAUGHAN, W. H. CHOW, H. ROTTERDAM, B. A. WEST, R. DUBROW, J. L. STANFORD, S. T. MAYNE, D. C. FARROW, S. NIWA, W. J. BLOT, J. F. FRAUMENI JR. (1997): Tobacco, alcohol, and socioeconomic status and adenocarcinomas of the esophagus and the gastric cardia. J. Natl. Cancer Inst. 89, 1277-1284 115 Schrifttumsverzeichnis GAROFALO, A., R. G. CHIRIVI, E. SCANZIANI, J. G. MAYO, A. VECCHI, R. GIAVAZZI (1993): Comparative study on the metastatic behaviour of human tumours in nude, beige/nude/xid and severe combined immunodeficient mice. Invasion Metastasis 13, 82-91 GERHARD, M., H. JUHL, H. KALTHOFF, H. W. SCHREIBER (1994): Specific detection of carcinoembryonic antigen-expressing tumor cells in bone marrow aspirates by polmerase chain reaction. J. Clin. Oncol. 12, 725-729 GIESELER, F., U. R. FÖLSCH (2004): Internistische Therapie maligner Tumoren des Gastrointestinaltraktes. In: BRUHN, H. D., U. R. FÖLSCH, M. KNEBA, H. LÖFFLER (Hrsg.): Onkologische Therapie. Schattauer Verlag, Stuttgart, New York, 290-311 GOLDMINC, M., G. MADDERN, E. LE PRISE, B. MEUNIER, J. P. CAMPION, B. LAUNOIS (1993): Oesophaegectomy by a transhiatal approach or thoracotomy : a prospective randomized trial. Br. J. Surg. 80, 367-370 GOSEKI, N., M. KOIKE, M. YOSHIDA (1992): Histopathologic characteristics of early stage esophageal carcinoma. A comparative study with gastric carcinoma. Cancer 69, 1088-1093 GREENSON, J. K., C. E. ISENHART, R. RICE, C. MOJZISIK (1994): Identification of occult micrometastases in periolic lymph nodes of Dukes’s B colorectal cancer patients using monoclonal antibodies against cytokeratin and CC 49. Correlation with long-term survival. Cancer 73, 563-569 GU, C. D., T. OSAKI, T. OGAMA, M. INOUE, M. KODATE, K. DOBASHI, T. OKA, K. JASUMOTO (2002): Detection of micrometastatic tumor cells in pN0 lymph nodes of patients with completely resected nonsmall cell lung cancer: impact on recurrence and survival. Ann. Surg. 235, 133-139 HAGGITT, R. C. (1994): Barrett’s esophagus, dysplasia, and adenocarcinoma. Hum. Pathol. 25, 982-993 HANSEN, S., J. N. WIIG, K. E. GIERCKSKY, S. TRETLI (1997): Esophageal and gastric carcinoma in Norway 1958-1992: incidence time trend variability according o morphological subtypes and organ subsites. Int. J. Cancer 71, 340-344 116 Schrifttumsverzeichnis HANSSON, L-E., P. SPAREN, O. NYREN (1993) : Increasing incidence of both major histological types of esophageal carcinomas among men in Sweden. Int. J. Cancer 54, 402-407 HART, I. R., A. SAINI (1992): Biology of tumour metastasis. Lancet 339, 1453-1457 HASEGAWA, S., M. YANG, T. CHISHIMA, Y. MIYAGI, H. SHIMADA, A. R. MOOSSA, R. M. HOFFMAN (2000): In vivo tumor delivery of the green fluorescent protein gene to report future occurrence of metastasis. Cancer Gene Therapy 7, 1336-1340 HEADRICK, J. R., F. C. NICHOLS 3RD, D. L. MILLER, M. S. ALLEN, V. F. TRASTEK, C. DESCHAMPS, C. D. SCHLECK, A. M. THOMPSON, P. C. PAIROLERO (2002): High-grade esophageal dysplasia: long-term survival and quality of life after esophagectomy. Ann. Thorac. Surg. 73, 1697-1702 HEIER, S. K., L. M. HEIER (1994): Tissue sensitizers. Gastrointest. Endosc. Clin. N. Am. 4, 327-352 HERMANEK, P. (1994): What’s new in TNM ? Pathol. Res. Pract. 190, 97-102 HERMANEK, P., R. V. P. HUTTER, L. H. SOBIN, CH. WITTEKIND (1999): International Union against Cancer. Classification of isolated tumor cells and micrometastasis. Cancer 86, 2668-2673 HOFFMAN, W., K. E. GRUND (Hrsg.) (1996): Ösophaguskarzinom. Empfehlungen zur Diagnostik, Therapie und Nachsorge. Interdisziplinäres Tumorzentrum der Universität Tübingen, Selbstverlag HOLLERAN, J. L., C. J. MILLER, N. L. EDGEHOUSE, T. P. PRETLOW, L. A. CULP (2002): Differential experimental micrometastasis to lung, liver, and bone with lacZ-tagged CWR22R prostate carcinoma cells. Clin. Exp. Metastasis 19, 17-24 HOSCH, S. B., J. R. IZBICKI, U. PICHLMEIER, N. STOECKLEIN, A. NIENDORF, W. T. KNOEFEL, C. E. BROELSCH, K. PANTEL (1997B): Expression and prognostic significance of immunregulatory molecules in esophageal cancer. Int. J. Cancer 74, 582-587 117 Schrifttumsverzeichnis HOSCH, S. B., W. T. KNOEFEL, S. METZ, N. H. STOECKLEIN, A. NIENDORF, C. E. BROELSCH, J. R. IZBICKI (1997A): Early lymphatic tumor cell dissemination in pancreatic cancer: frequency and prognostic significance. Pancreas 15, 154-159 HOSCH, S. B., J. KRAUS, P. SCHEUNEMANN, J. R. IZBICKI, C. SCHNEIDER, U. SCHUMACHER, K. WITTER, M. R. SPEICHER, K. PANTEL (2000): Malignant potential and cytogenetic characteristics of occult disseminated tumor cells in esophageal cancer. Cancer Res. 60, 6836-6840 HOSCH, S. B., K. PANTEL, J. R. IZBICKI (1998): Cryptic tumor cells in lymph nodes of patients with esophageal cancer. N. Engl. J. Med. 338, 550-550 HOSCH, S. B., K. D. STEFFANI, P. SCHEUNEMANN, J. R. IZBICKI (2002): Micrometastases from HBP malignancies and metastatic cancer. J. Hepatobil. Pancreat. Surg. 9, 583-591 HOSCH, S. B., N. H. STOECKLEIN, J. R. IZBICKI (2003): Molecular markers and staging of early esophageal cancer. Langenbecks Arch. Surg. 388, 77-82 HOSCH, S. B., N. H. STOECKLEIN, U. PICHLMEIER, A. REHDERS, P. SCHEUNEMANN, A. NIENDORF, W. T. KNOEFEL, J. R. IZBICKI (2001): Esophageal cancer: the mode of lymphatic tumor cell spread and its prognostic significance. J. Clin. Oncol. 19, 1970-1975 HU, F., R.-Y. WANG, T. C. HSU (1987): Clonal origin of metastasis in B16 murine melanoma: a cytogenetic study. J. Natl. Cancer Inst. 78, 155-163 HUMBLET, Y., J. L. CANON, M. SEKHAVAT, A. M. FEYENS, P. MANOUVRIEZ, A. M. LEBACQ-VERHEYDEN, H. BAZIN, J. PRIGNOT, M. SYMANN (1988): Detection of small cell lung cancer bone marrow metastases by immunfluorescence. Pathol. Biol. 36, 25-28 IARC (1995): Human papillomaviruses. IARC monograph on the evaluation of carcinogenetic risk to humans, No. 64 IDE, H., T. NAKAMURA, M. D. HAYASHI, T. ENDO, A. KOBAYASHI, R. DEGUCHI, F. HANYU (1994): Esophageal squamous cell carcinoma: pathology and prognosis. World J. Surg. 18, 321-330 118 Schrifttumsverzeichnis ISOLAURI, J., H. MARKKULA (1989): Lye ingestion and carcinoma of the esophagus. Acta Chir. Scand. 155, 269-271 ISONO, K., H. SATO, K. NAKAYAMA (1991): Results of a nationwide study on three-field lymph node dissection of esophageal cancer. Oncology 48, 411-420 ITAYA, T., J.-G. JUDDE, B. HUNT, P. FROST (1989): Genotypic and phenotypic evidence of clonal interactions in murine tumor cells. J. Natl. Cancer Inst. 81, 664-668 ITO, S., H. NAKANISHI, Y. IKEHARA, T. KATO, Y. KASAI, K. ITO, S. AKIYAMA, A. NAKAO, M. TATEMATSU (2001): Real-time observation of micrometastasis formation in the living mouse liver using green fluorescent protein gene-tagged rat tongue carcinoma cell line. Int. J. Cancer 93, 212-217 IZBICKI, J. R., S. B. HOSCH (1997): Minimal dissemination of solid epithelial tumours: impact on staging and therapeutic strategy. Br. J. Surg. 48, 411-420 IZBICKI, J. R., S. B. HOSCH, U. PICHLMEIER, A. REHDERS, C. BUSCH, A. NIENDORF, B. PASSLICK, C. E. BROELSCH, K. PANTEL (1997): Prognostic value of immunohistochemically identifiable tumor cells in lymph nodes of patients with completely resected esophageal cancer. N. Engl. J. Med. 337, 1188-94. JANNI, W., S. GASTROPH, F. HEPP, C. KENTENICH, D. RJOSK, C. SCHINDLBECK, T. DIMPFL, H. SOMMER, S. BRAUN (2000): Prognostic significance of an increased number of micrometastatic tumor cells in the bone marrow of patients with first recurrence of breast carcinoma. Cancer 88, 2252-2259 JANNI, W., B. RACK, C. SCHINDLBECK, B. STROBL (2005): The persistence of isolated tumor cells in bone marrow from patients with breast carcinoma predicts an increased risk for recurrence. Cancer 103, 884-891 JAUCH, K. W., M. M. HEISS, U. GRÜTZNER, I. FUNKE, K. PANTEL, R. BABIC, G. RIETHMÜLLER, F. W. SCHILDBERG (1996): Prognostic significance of bone marrow micrometastases in patients with gastric cancer. J. Clin. Oncol. 14, 1810-1817 119 Schrifttumsverzeichnis JERECZEK-FOSSA, B., M. AIROLDI, E. VASARIO, M. G. REDDA, G. VALENTE (2000): Small cell carcinoma of the esophagus: a case report and review of the literature. Tumori 86,174-177 JOHNSON, J. I., S. DECKER, D. ZAHAREVITZ, L. V. RUBINSTEIN, J. M. VENDITTI, S. SCHEPARTZ, S. KALYANDRUG, M. CHRISTIAN, S. ARBUCK, M. HOLLINGSHEAD, E. A. SAUSVILLE (2001): Relationsships between drug activity in NCI preclinical in vitro and in vivo models and early clinical trials. Br. J.Cancer 84, 1424-1431 JUACABA, S. F., E. HORAK, J. E. PRICE, D. TARIN (1989): Tumor cell dissemination patterns and metastasis of murine mammary carcinoma. Cancer Res. 49, 570-575 JUHL, H., M. STRITZEL, A. WROBLEWSKI, D. HENNE-BRUNS, B. KREMER (1994): Immuncytological detection of micrometastatic cells: Comparative evaluation of findings in the peritoneal cavity and the bone marrow of gastric, colorectal and pancreatic cancer patients. Int. J. Cancer 57 , 330-335 KABAT, G. C., K. C. NG, E. L. WYNDER (1993): Tobacco, alcohol intake, and diet in relation to adenocarcinoma of the esophagus and gastric cardia. Cancer Causes Control 4, 123-132 KAIN, S. R., M. ADAMS, A. KONDEPUDI, T.-T. YANG, W. W. WARD, P. KITTS (1995): Green fluorescent protein as a reporter of gene expression and protein localization. BioTechniques 19, 650-655 KAN, Z., T. J. LIU (1999): Video microscopy of tumor metastasis: using the green fluorescent protein (GFP) gene as a cancer-cell-labeling system. Clin. Exp. Metastasis 17, 49-55 KERBEL, R. S., C. WAGHORNE, B. KORCZAK, A. LAGARDE, M. L. BREITMAN (1988): Clonal dominance of primary tumours by metastatic cells: genetic analysis and biological implications. Cancer Surv. 7, 597-629 KLEIN, C. A., T. J. F. BLANKENSTEIN, O. SCHMIDT-KITTLER, M. PETRONIO, B. POLZER, N. H. STOECKLEIN, G. RIETHMÜLLER (2002): Genetic heterogeneity of single disseminated tumour cells in minimal residual cancer. Lancet 360, 683-689 KHANNA, C., K. HUNTER (2005): Modeling metastasis in vivo. Carcinogenesis 26, 513-523 120 Schrifttumsverzeichnis KIKKAWA, H., M. KAIHOU, N. HORAGUCHI, T. UCHIDA, H. IMAFUKU, A. TAKIGUCHI, Y. YAMAZAKI, C. KOIKE, R. KURUTO, T. KAKIUCHI, H. TSUKADA, Y. TAKADA, N. MATSUURA, N. OKU (2002): Role of integrin alpha(v)beta3 in the early phase of liver metastasis: PET and IVM analyses. Clin. Exp. Metastasis 19, 717-725 KIM, J. B., R. STEIN, M. J. O’HARE (2004): Three-dimensional culture models of breast cancer-a review. Breast Cancer Res. Treat. 85, 281-291 KIRKNESS, E. F., V. BAFNA, A. L. HALPERN, S. LEVY, K. REMINGTON, D. B. RUSCH, A. L. DELCHER, M. POP, W. WANG, C. M. FRASER (2003): The dog genome: survey sequencing and comparative analysis. Science 301, 1898-1903 KOBAYASHI, K., H. NAKANISHI, A. MASUDA, N. TEZUKA, M. MUTAI, M. TATEMATSU (1997): Sequential observation of micrometastasis formation by bacterial lacZ gen-tagged Lewis lung carcinoma cells. Cancer Lett. 112, 191-198 KRUGER, A., V. SCHIRRMACHER, R. KHOKHA (1998-1999): The bacterial lacZ gene: an important tool for metastasis research and evaluation of new cancer therapies. Cancer Metastasis Rev. 17, 285-294 KUBIK, S. (1990): Embryologie und Anatomie des Ösophagus. In: P. LANGHANS, H. W. SCHREIBER, R. HÄRING, R. REDING, J. R. SIEWERT, H. BÜNTE (Hrsg.): Aktuelle Therapie des Ösophaguskarzinoms. Springer Verlag, Berlin, Heidelberg, 11-49 KUBUSCHOK, B., B. PASSLICK, J. R. IZBICKI, O. THETTER, K. PANTEL (1999): Disseminated tumor cells in lymph nodes as a determinant for survival in surgically resected non-small-cell lung cancer. J. Clin Oncol. 17, 19-24 LAGERGREN, J., R. BERGSTRÖM, H. O. ADAMI, O. NYREN (2000): Association between medications that relax the lower esophageal sphincter and risk for esophageal adenocarcinoma. Ann. Int. Med. 133, 165-175 LAGERGREN, J., R. BERGSTRÖM, A. LINDGREN, O. NYREN (1999): Symptomatic gastroesophageal reflux as a risk factor for esophageal adenocarcinoma. N. Engl. J. Med. 340, 825-831 LAMBERT, R. (1999): The role of endoscopy in the prevention of esophagogastric cancer. Endoscopy 31, 180-199 121 Schrifttumsverzeichnis LARSSON, L. G., A. SANDSTROM, P. WESTLING (1975): Relationship of Plummer-Vinson disease to cancer of the upper alimentary tract in Sweden. Cancer Res. 35, 3308-3316 LAVERGNE, D., E. M. DE VILLIERS (1999): Papillomavirus in esophageal papillomas and carcinomas. Int. J. Cancer 80, 681-684 LEE, E., Y. CHAE, I. KIM, J. CHOI, B. YEOM, A. S. LEONG (2002): Prognostic relevance of immunhistochemically detected lymph node micrometastasis in patients with gastric carcinoma. Cancer 94, 2867-2873 LEINUNG, S., P. WURL, C. L. WEISS, I. RODER, M. SCHÖNFELDER (2000): Cytokeratin-positive cells in bone marrow in comparison with other prognostic factors in colon carcinoma. Langenbecks Arch. Surg. 385, 337-343 LERUT, T., P. DE LEYN, W. COOSEMANS, D. VAN RAEMDONCK, I. SCHEYS, E. LESAFFRE (1992): Surgical strategies in esophageal carcinoma with emphasis on radical lymphadenectomie. Ann. Surg. 216, 583-590 LIEFERS, G. J, A. M. CLETON-JANSEN, C. J. VAN DE VELDE, J. HERMANS, J. H. VAN KRIEKEN, C. J. CORNELISSE, R. A. TOLLENAAR (1998): Micrometastases and survival in stage II colorectal cancer. N. Engl. J. Med. 339, 223-228. LIEFERS, G. J., R. A. TOLLENAR, A. M. CLETON-JANSEN (1999): Molecular staging of colorectal cancer: a step forward. Gastroenterology 116, 769-770 LIGHTDALE, C. J., S. K. HEIER, N. E. MARCON, J. S. MCCAUGHAN JUN., H. GERDES, B. F. OVERHOLT, M. V. SIVAK JR., G. V. STIEGMANN, H. R. NAVA (1995): Photodynamic therapie with porfimer sodium versus thermal ablation therapy with Nd:YAG laser for palliation of esophageal cancer: a multicenter randomized trial. Gastrointest. Endosc. 42, 507-512 LI, J. Y., A. G. ERSHOW, Z. J. CHEN, S. WACHOLDER, W. GUO, B. LI, W. BLOT (1989): A case control study of cancer of the esophagus and gastric cardia in Linxian. Int. J. Cancer 43, 755-761 LIN, W. C., T. P. PRETLOW, T. G. PRETLOW 2ND, L. A. CULP (1990A): Bacterial lacZ gene as a highly sensitive marker to detect micrometastasis formation during tumor progression. Cancer Res. 50, 2808-2817 122 Schrifttumsverzeichnis LIN, W. C., T. P. PRETLOW, T. G. PRETLOW 2ND, L. A. CULP (1990B): Development of micrometastases: earliest events detected with bacterial lacZ gene-tagged tumor cells. J. Natl. Cancer Inst. 82, 1497-1503 LINDEMANN, F., G. SCHLIMOK, P. DIRSCHEDL, J. WITTE, G. RIETHMÜLLER (1992): Prognostic significance of micrometastatic tumor cells in bone marrow of colorectal cancer patients. Lancet 340, 685-689 LINGAAS, F., K. E. COMSTOCK, E. F. KIRKNESS, A. SORENSEN, T. AARSKAUG, C. HITTE, M. L. NICKERSON, L. MOE, L. S. SCHMIDT, R. THOMAS, M. BREEN, F. GALIBERT, B. ZBAR, E. A. OSTRANDER (2003): A mutation in the canine BHD gene is associated with hereditary multifocal renal cystadenocarcinoma and nodular dermatofibrosis in the german shepherd dog. Hum. Mol. Genet. 23, 3043-3053 LIU, H. S., M. S. JAN, C. K. CHOU, P. H. CHEN, N. J. KE (1999): Is green fluorescent protein toxic to the living cells? Biochem. Biophys. Res. Commun. 260, 712-717 LORD, R. V. N., M. G. LAW, R. L. WARD, G. G. GILES, R. J. S. THOMAS, V. THURSFIELD (1998): Rising incidence of oesophageal adenocarcinoma in men in Australia. J. Gastroenterol. Hepatol. 13, 356-363 MACDONALD, W. C., J. B. MACDONALD (1987): Adenocarcinoma of the esophagus and/or gastric cardia. Cancer 60, 1094-1098 MAEHARA, Y., T. OSHIRO, K. ENDO, H. BABA (1996): Clinical significance of occult micrometastasis lymph nodes from patients with early gastric cancer who died of recurrence. Surgery 119, 397-402 MANSI, J. L., U. BERGER, P. WILSON, R. SHEARER, R. C. COOMBES (1988): Detection of tumor cells in bone marrow of patients with prostate carcinoma by immuncytochemical techniques. J. Urol. 139, 545-548 MANSI, J. L, D. EASTON, U. BERGER, J. C. GAZET (1991): Bone marrow micrometastases in primary breast cancer: prognostic significance after 6 years’ follow-up. Eur. J. Cancer 27, 1552-1555 MARGER, R. S., D. MARGER (1993): Carcinoma of the esophagus and tylosis: a lethal genetic combination. Cancer 72, 17-19 123 Schrifttumsverzeichnis MARSHALL, J., R. MOLLOY, G. W. MOSS, J. R. HOWE, T. E. HUGHES (1995): The jellyfish green fluorescent protein: a new tool for studying ion channel expression and function. Neuron 14, 211-215 MAURER-GEBHARD, M., M. SCHMIDT, M. AZEMAR, E. STOCKLIN, W. WELS, B. GRONER (1999): A novel animal model for the evaluation of the efficacy of drugs directed against the ErbB2 receptoron metastasis formation. Hybridoma 18, 69-75 MAYER, R. J. (1997): Gastrointestinal tract cancer. In: A. S. FAUCI, E. BRAUNWAD, K. ISSELBACHER et al. (eds.): Harrison's Principles of Internal Medicine, Vol. 1. McGraw-Hill, New York, 568-578 MCGUCKIN, M. A., M. C. CUMMINGS, M. D. WALSH, B. G. HOHN (1996): Occult axillary node metastases in breast cancer: their detection and prognostic significance. Br. J. Cancer 73, 88-95 MCKEOWN, F. (1952): Oat-cell carcinoma of the oesophagus. J. Pathol. Bacteriol. 64, 889-891 MCMORROW, L. E., S. R. WOLMAN, S. BORNSTEIN, J. E. TALMADGE (1988): Irradiation–induced marker chromosomes in a metastasizing murine tumor. Cancer Res. 48, 999-1003 MOOK, O. R., J. VAN MARLE, H. VREELING-SINDELAROVA, R. JONGES, W. M. FREDERIKS, C. J. VAN NORDEN (2003): Visualisation of early events in tumor formation of eGFP-transfected rat colon cancer cells in liver. Hepatology 38, 295-304 MORISE, H., O. SHIMOMURA, F. H. JOHNSON, J. WINANT (1974): Intermolecular energy transfer in the bioluminescent system of Aequorea. Biochemistry 13, 2656-2662 MOLLER, H., O. MOLLER JENSEN (1988): Trends in incidence of oesophagus, cardia and stomach in Denmark, 1943-1982 (6th Annual ECP Symposium). Int. Symp. Gastric Carcinogenesis, London, o. S. MONTESANO, R., M. HOLLSTEIN, P. HAINAUT (1996): Genetic alterations in esophageal cancer and their relevance to etiology and pathogenesis: a review. Int. J. Cancer 69, 225-235 MORALES, T. G., R. E. SAMPLINER (1999): Barrett’s esophagus. Update on screening , surveillance, and treatment. Arch. Intern. Med. 159, 1411-1416 124 Schrifttumsverzeichnis MÜLLER, J. M., H. ERASMI, M. STELZNER, U. ZIEREN, H. PICHLMAIER (1990): Surgical therapy of esophageal carcinoma. Br.J. Surg. 77, 845-857 MÜLLER, P., D. WECKERMANN, G. RIETHMÜLLER, G. SCHLIMOK (1996): Detection of genetic alterations in micrometastatic cells in bone marrow of cancer patients by fluorescence in situ hybridization. Cancer Genet. Cytogenet. 88, 8-16 MÜHLHÖFER, A., W. G. ZOLLER (2002): Epidemiologie und Ätiologie des Ösophaguskarzinoms. In: ZOLLER, W. G., U. KÖPPEN (Hrsg.): Ösophaguskarzinom. Interdisziplinäre Diagnostik und Therapie. Schattauer Verlag, Stuttgart, New York, 1-9 MUELLER, B. M., R. A. REISFELD (1991): Potential of the scid mouse as a host for human tumours. Cancer Metast. Rev. 10, 193-200 MURAKAMI, G., I. SATO, K. SHIMADA, C. DONG, Y. KATO, T. IMAZEKI (1994): Direct lymphatic drainage from the esophagus into the thoracic duct. Surg. Radiol. Anat. 16, 399-407 NAKAJO, A., S. NATSUGOE, S. ISHIGAMI, M. MATSUMOTO, S. NAKASHIMA, S. HOKITA, M. BABA, S. TAKAO, T. AIKOU (2001): Detection and prediction of micrometastasis in the lymph nodes of patients with pN0 gastric cancer. Ann. Surg. Oncol. 8, 158-162 NAUMOV, G. N., S. M. WILSON, I. C. MACDONALD, E. E. SCHMIDT, V. L. MORRIS, A. C. GROOM, R. M. HOFFMAN, A. F. CHAMBERS (1999): Cellular expression of green fluorescent protein, coupled with high-resolution in vivo videomicroscopy, to monitor steps in tumor metastasis. J. Cell Sci. 112, 1835-1842 NEKARDA, H., J. R. SIEWERT, M. SCHMITT, K. ULM (1994): Tumour-associated proteolytic factors uPA and PAI-1 and survival in totally resected gastric cancer. Lancet 343, 117 NISHIHIRA, T., J. SAJAMA, H. UEDA, K. SUGAWARA, R. TAKANO, J. SAGAWA, M. KATAYAMA, R. SHINEHA, K. HIRAYAMA, S. MORI (1995): Lymph flow and lymph node metastasis in esophageal cancer. Jpn. J. Surg. 25, 307-317 NISHIMAKI, T., T. SUZUKI, Y. TANAKA, K. AIZAWA, K. HATAKEYAMA, T. MUTO (1996): Intramural metastases from thoracic esophageal cancer: local indicators of advanced disease. World J. Surg. 20, 32-37 125 Schrifttumsverzeichnis NO AUTHOR (1990): Prognostic importance of occult axillary lymph node micrometastases from breast cancers (International Breast Cancer Study Group). Lancet 335, 1565-1568 OBERNEDER, R., R. RIESENBERG, M. KRIEGMAIR, U. BLITZER, R. KLAMMERT (1994): Immuncytochemical detection and phenotypic characterization of micrometastatic tumour cells in bone marrow of patients with prostate cancer. Urol. Res. 22 , 3-8 OJALA, K., M. SORRI, K. JOKINEN, M. KAIRALUOMA (1982): Symptoms of carcinoma of the oesophagus. Med. J. Australia 1, 384-385 PAGET, S. (1889): The distribution of secondary growths in cancer of the breast. Lancet 23; 571-573 PANTEL, K., G. SCHLIMOK, S. BRAUN, D. KUTTER, F. LINDEMANN, G. SCHALLER, I. FUNKE, J. R. IZBICKI, G. RIETHMÜLLER (1993A) Differential expression of proliferation-associated molecules in individual micrometastatic carcinoma cells. J. Natl. Cancer Inst. 85, 1419-1424 PANTEL, K., J. R. IZBICKI, M. ANGSTWURM, S. BRAUN, B. PASSLICK, O. KARG, O. THETTER, G. RIETHMÜLLER (1993B): Immuncytological detection of bone marrow micrometastasis in operable nonsmall cell lung cancer. Cancer Res. 53, 1027-1031 PANTEL, K., G. SCHLIMOK, M. ANGSTWURM, D. WECKERMANN (1994): Methodological analysis of immuncytochemical screening for disseminated epithelial tumor cells in bone marrow. J. Hematother. Fall 3, 165-173 PANTEL, K., C. AIGNHERR, J. KOLLERMANN, J. CAPRANO, G. RIETHMÜLLER, M. W. KOLLERMANN (1995B): Immuncytochemical detection of isolated tumour cells in bone marrow of patients with untreated stage C prostatic cancer. Eur. J. Cancer 31A, 1627-1632 PANTEL, K., R. H. BRAKENHOFF (2004): Dissecting the metastatic cascade. Nat. Rev. Cancer 4, 448-456 PANTEL, K., A. DICKMANNS, A. ZIPPELIUS, C. KLEIN, J. SHI, W. HÖCHTLEIN-VOLLMAR, G. SCHLIMOK, D. WECKERMANN, R. OBERNEDER, E. FANNING et al. (1995A): Establishment of micrometastatic carcinoma cell lines: a novel source of tumor cell vaccines. J. Natl. Cancer Inst. 87, 1162-1168 126 Schrifttumsverzeichnis PANTEL, K., M. ANGSTWURM, D. KUTTER, S. BRAUN, O. KARG, J. R. IZBICKI, U. WERNER, G. SCHLIMOK, G. RIETHMÜLLER (1992): Down-regulation and neo-expression of cell surface antigens on individual micrometastatic carcinoma cells. In: Metastasis: Basic Research and its Clinical Applications (Contrib. Oncol., H. RABES, P. E. PETERS, K. MUNK, eds.). Karger Verlag, Basel, 283 PANTEL, K., U. WOELFLE (2004) : Micrometastasis in breast cancer and other solid tumors. J. Biol. Regul. Homeost. Agents 18, 120-125 PANTELOURIS, E. M. (1968) : Absence of thymus in a mouse mutant. Nature 217, 370-371 PARIS, S., C. CHAUZY, N. MARTIN-VANDELET, B. DELPECH, L. THIBERVILLE, J. P. MARTIN, M. DIARRA-MEHRPOUR (1999): A model of spontaneous lung metastases visualised in fresh host tissue by green fluorescent protein expression. Clin. Exp. Metastasis 17, 817-822 PARIS, S., R. SESBOUE (2004) : Metastasis models: the green-fluorescent revolution? Carcinogenesis 25, 2285-2292 PASSLICK, B., J. R. IZBICKI, B. KUBUSCHOK, W. NATHRATH (1994): Immunhistochemical assessment of individual tumor cells in lymph nodes of patients with non-small-cell lung cancer. J. Clin. Oncol. 12, 1827-1832 PASSLICK, B., B. KUBUSCHOK, J. R. IZBICKI, O. THETTER, K. PANTEL (1999): Isolated tumor cells in bone marrow predict reduced survival in node-negative nonsmall cell lung cancer. Ann. Thorac. Surg. 68, 2053-2058 PENNISI, E. (2002): Canine evolution. A shaggy dog history. Science 298, 1540-1542 PISANI, P., D. M. PARKIN, F. BRAY, J. FERLAY (1999): Estimates of the worldwide mortality from 25 cancers in 1990. Int. J. Cancer 83, 18-29 PORSCHEN, R., G. MOLSBERGER, A. KÜHN, M. SARBIA, F. BORCHARD (1995): Achalasia-associated squamous cell carcinoma of the esophagus: flow-cytometric and histological evaluation. Gastroenterology 108, 545-549 POWELL, J., C. C. MCCONKEY (1990): Increasing incidence of adenocarcinoma of the gastric cardia and adjacent sites. Br. J. Cancer 62, 440-443 127 Schrifttumsverzeichnis PRASHER, D. C., V. K. ECKENRODE, W. W. WARD, F. G. PRENDERGAST, M. J. CORMIER (1992): Primary structure of the Aequorea victoria green-fluorescent-protein. Gene 111, 229-233 PRENDERGAST, F. G., K. G. MANN (1978): Chemical and physical properties of aequorin and the green fluorescent protein isolated from Aequorea forskalea. Biochemistry 17, 3448-3453 RE, F., R. SRINIVASAN, T. IGARASHI, F. MARINCOLA, R. CHILDS (2004): Green fluorescent protein expression in dendritic cells enhances their immunogenicity and elicts specific cytotoxic T-cell responses in humans. Exp. Hematol. 32, 210-217 REDDING, W. T., R. C. COMMBES, P. MONAGHAN (1982): Detection of micrometastases in patients with primary differentiation: monoclonal antibody studies. Cell 30, 361-372 REED, C. E. (1999): Surgical management of esophageal carcinoma. Oncologist 4, 95-105 RIBEIRO, U., M. C. POSNER, V. SFATLE-RBEIRO, J. C. REYNOLDS (1996): Risk factors for squamous cell carcinoma of the oesophagus. Br. J. Surg. 83, 1174-1185 RICE, T. W., G. ZUCCARO, D. ADELSTEIN, L. A. RYBICKI, E. H. BLACKSTONE, R. GOLDBLUM (1998) : Esophageal carcinoma : depth of tumor invasion is predicive of regional lymph node status. Ann. Thorac. Surg. 65, 787-792 RIESENBERG, R., R. OBERNEDER, M. KRIEGMAIER, M. EPP, U. BLITZER (1993): Immuncytochemical double staining of cytokeratin and prostate specific antigen in individual prostatic tumour cells. Histochemistry 99 , 61-66 RIETHMULLER, G., G. SCHLIMOK, K. PANTEL, M. ANGSTWURM, J. R. IZBICKI, O. KARG, B. G. STADE, J. P. JOHNSON (1992). Metastasis formation in human solid tumors: phenotypic characteristics of early metastatic cells. Behring Inst. Mitt. 91, 204-209 128 Schrifttumsverzeichnis RISK, J. M., E. A. FIELD, J. K. FIELD, J. WHITTAKER, A. FRYER, A. ELLIS, J. M. SHAW, P. S. FRIEDMANN, D. BISHOP, J. BODMER, I. M. LEIGH (1994): Tylosis oesophageal cancer mapped. Nature (Genet.) 8, 319-321 RODER, J. D., S. THORBAN, K. PANTEL, J. R. SIEWERT (1999): Micrometastases in bone marrow: prognostic indicators for pancreatic cancer. World J. Surg. 23, 888-891 ROSENBERG, J. C., J. G. SCHWADE, V. K. VAITKEVICIUS (1982): Cancer of the esophagus. In: DEVITA, V. T. JR., S. HELLMAN, S. A. ROSENBERG (eds.): Cancer: Principles and Practice of Oncology, 5th ed. Lippincott-Raven, Philadelphia, 499-533 ROTH, M. J., W. GUO-QING, K. J. LEWIN, L. NING, S. M. DAWSEY, M. N. WESLEY, C. GIFFEN, X. YONG-QIANG, M. M. MAHER, P. R. TAYLOR (1998): Histopathological changes seen in esophagectomy specimens from the high-risk region of Linxian, China: potential clues to an etiologic exposure? Hum. Patholo. 29, 1294-1298 RYGAARD, J., C. O. POVLSEN (1969): Heterotransplantation of a human malignant tumour to “Nude” mice. Acta Pathol. Microbiol. Scand. 77, 758-760 SABIK, J. F., T. W. RICE, J. R. GOLDBLUM (1995): Superficial esophageal carcinoma. Ann. Thorac. Surg. 60, 896-902 SAKATA, K. (1903): Über die Lymphgefäße des Ösophagus und über seine regionären Lymphdrüsen mit Berücksichtigung der Verbreitung des Carcinoms. Mitt. Grenzgeb. Med. Chir. 11, 634-656 SANDLER, R. S., O. NYREN, A. EKBORN, G. M. EISEN, J. YUEN, S. JOSEFSSON (1995): The risk of esophageal cancer in patients with achalasia. JAMA 274, 1359-1362 SANO, T., M. SASKO, T. KINOSHITA, K. MARUYAMA (1993): Recurrence of early gastric cancer. Follow-up of 1475 patients and rewiew of the Japanese literature. Cancer 72, 3139-3140 SAVARY, J. F., P. GROSJEAN, P. MONNIER, C. FONTOLLIET, G. WAGNIERES, D. BRAICHOTTE, H. VAN DEN BERGH (1998) : Photodynamic therapy of early squamous cell carcinomas of the esophagus : a review of 31 cases. Endoscopy 30, 258-265 SCHEUNEMANN, P., J. R. IZBICKI, K. PANTEL (1999): Tumorigenic potential of apparently tumor-free lymph nodes. N. Engl. J. Med. 340, 1687 129 Schrifttumsverzeichnis SCHLIMOK, G., I. FUNKE, B. BOCK, B. SCHWEIBERER, J. WITTE, G. RIETHMÜLLER (1990): Epithelial tumor cells in bone marrow of patients with colorectal cancer: immuncytochemical detection, phenoypic characterization, and prognostic significance. J. Clin. Oncol. 8, 831-837 SCHLIMOK, G., I. FUNKE, B. HOLZMANN, G. GOTTLINGER, G. SCHMIDT, H. HAUSER, S. SWIERKOT, H. H. WARNECKE, B. SCHNEIDER, H. KOPROWSKI et al. (1987): Micrometastatic cancer cells in bone marrow: in vitro detection with anticytokeratin and in vivo labeling with anti-17-1A monoclonal antibodies. Proc. Natl. Acad. Sci. U S A 84, 8672-8676 SCHLIMOK, G., I. FUNKE, K. PANTEL, F. STROBEL, F. LINDEMANN, J. WITTE, G. RIETHMÜLLER (1991): Micrometastatic tumour cells in bone marrow of patients with gastric cancer: methodological aspects of detection and prognostic significance. Eur. J. Cancer 27, 1461-1465 SCHMIDT-HANSEN, B., J. KLINGELHOFER, B. GRUM-SCHWENSEN, A. CHRISTENSEN, S. ANDRESEN, C. KRUSE, T. HANSEN, N. AMBARTSUMIAN, E. LUKANIDIN, M. GRIGORIAN (2004): Functional significance of metastasis-inducing S100A4(Mts1) in tumor-stroma interplay. J. Biol. Chem. 279, 24498-24504 SCHMIDT-KITTLER, O., T. RAGG, A. DASKALAKIS, M. GANZOW, A. AHR, T. J. BLANKENSTEIN, M. KAUFMANN, J. DIEBOLD, H. ARNHOLDT, P. MÜLLER, J. BISCHOFF, D. HARICH, G. SCHLIMOK, G. RIETHMÜLLER, R. EILS, C. A. KLEIN (2003): From latent disseminated cells to overt metastasis: genetic analysis of systemic breast cancer progression. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 24, 7737-7742 SCHUBERT, G. E., B. A. BETHKE (eds.) (1981): Lehrbuch der Pathologie. Walter de Gruyter Verlag, Berlin, New York, 213-218 SHARKEY, F. E., J. FOGH (1984): Considerations in the use of nude mice for cancer research. Cancer Metastasis Rev. 3, 341-360 SHIMI, S. M. (2000): Self-expanding metallic stents in the management of advanced esophageal cancer: a review. Semin. Laparosc. Surg. 7, 9-21 SHIMOMURA, O., F. H. JOHNSON, Y. SAIGA (1962): Extraction, purification and properties of aequorin, a bioluminescent protein from the luminous hydromedusan, Aequorea. J. Cell Comp. Physiol. 59, 223-239 130 Schrifttumsverzeichnis SHIMOMURA, O., A. SHIMOMURA (1981): Resistivity to denaturation of the apoprotein of Aequorea and reconstitution of the luminescent photoprotein from the partially denatured apoprotein. Biochem. J. 199, 825-828 SHOTTENFELD, D. (1984): Epidemiology of cancer of the esophagus. Semin. Oncol. 11, 92-100 SIEWERT, J. R., H. BARTELS, E. BOLLSCHWEILER, H. J. DITTLER, U. FINK, A. H. HÖLSCHER, J. D. RODER (1992): Squamous cell cancer of the esophagus. Treatment concept at the surgical clinic of the Munich Technical University. Der Chirurg 63, 693-700 SIEWERT, J. R., A. H. HÖLSCHER, H. J. DITTLER (1990): Preoperative staging and risk analysis in esophageal carcinoma. Hepatogastroenterology 37, 382-387 SIKDER, H., D. L. HUSO, H. ZHANG, B. WANG, B. RYU, S. T. HWANG, J. D. POWELL, R. M. ALANI (2003): Disruption of ld1 reveals major differences in angiogenesis between transplanted and autothonous tumours. Cancer Cell 4, 291-299 SOLAKOGLU, O., C. MAIERHOFER, G. LAHR, E. BREIT, P. SCHEUNEMANN (2002): Heterogeneous proliferative potential of occult metastatic cells in bone marrow of patients with solid epithelial tumors. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 99, 2246-2251 STAHEL, R. A., M. MABRY, A. T SKARIN, J. SPEAK, S. D. BERNAL (1985): Detection of bone marrow metastasis in small-cell lung cancer by monoclonal antibody. J. Clin. Oncol. 3, 455-461 STEINBAUER, M., M. GUBA, G. CERNAIANU, G. KOHL, M. CETTO, L. A. KUNZSCHUGHART, E. K. GEISSLER, W. FALK, K. W. JAUCH (2003): GFP-transfected tumor cells are useful in examininig early metastasis in vivo, but immune reaction precludes long-term tumor development studies in immunocompetent mice. Clin. Exp. Metastasis 20, 135-141 STETLER-STEVENSON, W. G., L. A. LIOTTA, D. E. KLEINER JR. (1993): Extracellular matrix 6: role of matrix metalloproteinases in tumor invasion and metastasis. FASEB J. 7, 1434-1441 STOKER, M., E. GHERARDI (1991): Regulation of cell movement: the motogenic cytokines. Biochim. Biophys. Acta 1072, 81-102 131 Schrifttumsverzeichnis STREITZ, J. M., F. H. ELLIS, S. P. GIBB, G. M. HEATLEY (1995): Achalasia and squamous cell carcinoma of the esophagus: analysis of 241 patients. Ann. Thorac. Surg. 59, 1604-1609 STURM, J. W., M. A. KEESE, B. PETRUCH, R. G. BONNINGHOFF, H. ZHANG, N. GRETZ, M. HAFNER, S. POST, R. S. MCCUSKEY (2003): Enhanced green fluorescent protein-transfection of murine colon carcinoma cells: key for early tumor detection and quantification. Clin. Exp. Metastasis 20, 395-405 SUGIMACHI, K., M. IKEBE, K. KITAMURA, Y. TOH, H. MATSUDA, H. KUWANO (1993): Long-term results of esophagectomy for early esophageal carcinoma. Hepatogastroenterology 40, 203-206 SURVEILLANCE, EPIDEMIOLOGY, AND END RESULTS (SEER) PROGRAM 2003, NATIONAL CANCER INSTITUTE: BETHESDA, MARYLAND SWEENEY, T. J., V. MAILANDER, A. A. TUCKER, A. B. OLOMU, W. ZHANG, Y. CAO, R. S. NEGRIN, C. H. CONTAG (1999): Visualizing the kinetics of tumor-cell clearance in living animals. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 96, 12044-12049 TAKIZAWA, Y., T. SAIDA, Y. OKUDA, S. DOHI, Y. L. WANG, K. URANO, K. HIOKI, Y. UEYAMA (1997): New immunodeficient (nude-scid, beige-scid) mice as a excellent recipients of human skin grafts containing intraepidermal neoplasms. Arch. Dermatol. Res. 289, 213-218 TALMADGE, C., Y. TANIO, A. MEEKER, J. TALMADGE, B. ZBAR (1987): Tumor cells transfected with the neomycin resistance gene (neo) contain unique genetic markers useful for identification of tumor recurrence and metastasis. Invasion Metastasis 7, 197-207 TAYLOR, I. (1996): Liver metastases from colorectal cancer: lessons from past and present clinical studies. Br. J. Surg. 83, 456-460 TERRY, P., J. LAGERGREN, W. YE, O. NYREN, A. WOLK (2000): Antioxidants and cancers of the esophagus and gastric cardia. Int. J. Cancer 87, 750-754 TIETJEN, T. G., P. J. PASRICHA, A. N. KALLOO (1994): Management of malignant esophageal stricture with esophageal dilatation and esophageal stents. Gastrointest. Endosc. Clin. N. Am. 4, 851-862 132 Schrifttumsverzeichnis THORBAN, S., J. D. RODER, H. NEKARDA, A. FUNK, K. PANTEL, J. R. SIEWERT (1996A): Disseminated epithelial tumor cells in bone marrow of patients with esophageal cancer: detection and prognostic significance. World J. Surg. 20, 567-572 THORBAN, S., J. D. RODER, H. NEKARDA, A. FUNK, J. R. SIEWERT, K. PANTEL (1996B): Immuncytochemical detection of disseminated tumor cells in the bone marrow of patients with esophageal carcinoma. J. Natl. Cancer Inst. 88, 1222-1227 TROJANI, M., I. DE MASCAREL, J. M. COINDRE, F. BONICHON (1987): Micrometastases to axillary lymph nodes from invasive lobular carcinoma of breast: detection by immunohistochemistry and prognostic significance. Br. J. Cancer 56, 838-839 TROY, T., D. JEKIC-MCMULLEN, L. SSAMBUCETTI, B. RICE (2004): Quantitative comparison of the sensitivity of detection of fluorescent and bioluminescent reporters in animal models. Mol. Imaging 3, 9-23 UICC (1997): TNM Klassifikation maligner Tumoren, 5. Aufl., CH. WITTEKIND, G. WAGNER (Hrsg.). Springer Verlag, Berlin, Heidelberg, New York UICC (1998): TNM-Atlas . Illustrierter Leitfaden zur TNM / pTNM-Klassifikation maligner Tumoren, 4. Aufl., übersetzt von: P. HERMANEK, G. WAGNER, CH. WITTEKIND. Springer Verlag, Berlin, Heidelberg, New York UICC (2001): TNM supplement, 2nd ed.. A commentary on uniform use. WITTEKIND, CH., D. E. HENSON, R. V. P. HUTTER, L. H. SOBIN (eds.), John Wiley & Sons, New York UICC (2002): TNM classification of malignant tumours, 6th ed., SOBIN, L. H., CH. WITTEKIND (eds.), John Wiley & Sons, New York VOOIJS, M. J. JONKERS, S. LYONS, A. BERNS (2002): Noninvasive imaging of spontaneous retinoblastoma pathway-dependent tumors in mice. Cancer Res. 62, 1862-1867 133 Schrifttumsverzeichnis WACK, S., A. HAJRI, F. HEISEL, M. SOWINSKA, C. BERGER, M. WHELAN, J. MARESCAUX, M. APRAHAMIAN (2003): Feasibility, sensitivity, and reliability of laser-induced fluorescence imaging of green fluorescent protein-expressing tumours in vivo. Mol. Ther. 7, 765-773 WAHLFORS, J., S. LOIMAS, T. PASANEN, T. HAKKARAINEN (2001): Green fluorescent protein (GFP) fusion constructs in gene therapy research. Histochem. Cell Biol. 115, 59-65 WANG, J. W., M. YANG, X. WANG, F. X. SUN, X. M. LI, S. YAGI, R. M. HOFFMAN (2003): Antimetastatic efficacy of oral 5-FU imaged by green fluorescent protein in real time. Anticancer Res. 23, 1-6 WARD, W. W., S. H. BOKMAN (1982): Reversible denaturation of Aequorea green-fluorescent protein: physical seperation and characterization of the renatured protein. Biochemistry 21, 4535-4540 WATANABE, H. (1992): Plattenepithelkarzinom des Ösophagus. Der Chirurg 63, 689-692 WATANABE, H., J. R. JASS, L. H. SOBIN (1990): Histological typing of oesophageal and gastric tumours, 2nd ed. (WHO International Histological Classification of Tumours). Springer Verlag, Berlin, Heidelberg, New York, Tokyo WEHNER, R., W. GEHRING (1995): Zoologie, 23. Auflage. Georg Thieme Verlag, Stuttgart, New York, 459-460 WEISS, L., P. M. WARD (1988): Effects of metastatic cascades on metastatic patterns: studies on colon-26 carcinomas in mice. Int. J. Cancer 41, 450-455 WEITZ, J., P. KIENLE, A. MAGENER, M. KOCH, A. SCHRÖDER, F. WILLEKE, F. AUTSCHBACH, J. LACROIX, F. LEHNERT, C. HERFARTH, M. VON KNEBEL DOEBERITZ (1999): Detection of disseminated colorectal cancer cells in lymph nodes, blood and bone marrow. Clin. Cancer Res. 5, 1830-1836 WIEDSWANG, G., E. BORGEN, R. KARESEN, G. KVALHEIM (2003): Detection of isolated tumor cells in bone marrow is an independent prognostic factor in breast cancer. J. Clin. Oncol. 21, 3469-3478 134 Schrifttumsverzeichnis WINTERS, C., T. J. SPURLING, S. J. CHOBANIAN, D. J. CURTIS, R. L. ESPOSITOS, J. F. HACKER JR., D. A. JOHNSON, D. F. CRUESS, J. D. COTELINGAM, M. S. GURNEY et al. (1987): Barrett’s esophagus: a prevalent, occult complication of gastroesophageal reflux disease. Gastroenterology 92, 118-124 WOODHOUSE, E. C., R. F. CHUAQUI, L. A. LIOTTA (1997): General mechanisms of metastasis. Cancer 80 (Suppl.), 1529-1537 YAMAMOTO, N., M. YANG, P. JIANG, H. TSUCHIYA, K. TOMITA, A. R. MOOSSA, R. M. HOFFMAN (2003): Real-time GFP imaging of spontaneous HT-1080 fibrosarcoma lung metastases. Clin. Exp. Metastasis 20, 181-185 YANG, M., E. BARANOV, P. JIANG, F. X. SUN, X. M. LI, S. HASEGAWA, M. BOUVET, M. AL-TUWARIJRI, T. CHISHIMA, H. SHIMADA, A. R. MOOSSA, S. PENMAN, R. M. HOFFMAN (2000): Whole-body optical imaging of green fluorescent protein-expressing tumors and metastases. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97, 1206-1211 YANG, M., T. CHISHIMA, X. WANG, E. BARANOV, H. SHIMADA, A. R. MOOSSA, R. M. HOFFMAN (1999C): Multi-organ metastatic capability of Chinese hamster ovary cells revealed by green fluorescent (GFP) expression. Clin. Exp. Metastasis 17, 417-422 YANG, M., P. JIANG, Z. AN, E. BARANOV, L. LI, S. HASEGAWA, M. AL-TUWAIJRI, T. CHISHIMA, H. SHIMADA, A. R. MOOSSA, R. M. HOFFMAN (1999B): Genetically fluorescent melanoma bone and organ metastasis models. Clin. Cancer Res. 5, 3549-3559 YANG, M., S. HASEGAWA, P. JIANG, X. WANG, Y. TAN, T. CHISHIMA, H. SHIMADA, A. R. MOOSSA, R. M. HOFFMAN (1998) ; Widespread skeletal metastatic potential of human lung cancer revealed by green fluorescent protein expression. Cancer Res. 58, 4217-4221 YANG, M., P. JIANG, F. X. SUN, S. HASEGAWA, E. BARANOV, T. CHISHIMA, H. SHIMADA, A. R. MOOSSA, R. M. HOFFMAN (1999A): A fluorescent orthotopic bone metastasis model of human prostate cancer. Cancer Res. 59, 781-786 ZAMBON, P., R. TALAMINI, C. LA VECCHIA, L. DAL MASO, E. NEGRI, S. TOGNAZZO, L. SIMONATO, S. FRANCESCHI (2000): Smoking, type of alcohol beverage and squamous-cell oesophageal cancer in northern Italy. Int. J. Cancer 86, 39-43 135 Schrifttumsverzeichnis ZDENEK, L. (1970): Indigogenic methods for glycosidases I. An improved method for beta-Dgalactosidase and its application to localization studies of the enzymes in the intestine and in other tissues. Histochemie 23, 289-294 ZETTER, B. R. (1990): Cell motility in angiogenesis and tumor metastasis. Cancer Invest. 8, 669-671 ZHANG, L., S. KHARBANDA, S. W. MCLESKEY, F. G. KERN (1999): Overexpression of fibroblast growth factor 1 in MCF-7 breast cancer cells facilitates tumor cell dissemination but does not support the development of macrometastases in the lungs or lymph nodes. Cancer Res. 59, 5023-5029 ZOLOTUKHIN, S., M. POTTER, W. W. HAUSWIRTH, J. GUY, N. MUZYCZKA (1996): A “humanized” green fluorescent protein cDNA adapted for high-level expression in mammalian cells. J. Virol. 70, 4646-4654 136 Danksagung Herrn Prof. Dr. Stefan Benedikt Hosch danke ich für die Überlassung des Themas. Sehr herzlich danke ich Herrn Prof. Dr. Wilfried Meyer, sowohl für die Vertretung und Betreuung dieser Arbeit an der Tierärztlichen Hochschule Hannover, als auch für seine Unterstützung und stets entgegengebrachte Zuversicht während der Projektpausen. An dieser Stelle danke ich auch Frau Dr. Anke Schnapper für Ihre hilfreichen Anmerkungen zur Bearbeitung des Bildmaterials. Mein besonderer Dank gilt Herrn Dr. Peter Scheunemann für seine geduldige Begleitung und Betreuung dieser Arbeit, sowie sein Engagement für das Fortführen des Projektes an der Heinrich-Heine-Universität Düsseldorf. Christian Vay danke ich ganz herzlich für seine Solidarität, Geduld und stets entgegengebrachte Hilfe. Herzlich bedanken möchte ich mich auch bei Herrn Dr. Nikolas H. Stoecklein für die Unterstützung bei der Anfertigung und Bearbeitung der Fotos. Für die gemeinsame Arbeit und Hilfe im Chirurgischen Forschungslabor der Klinik für Allgemein-und Viszeralchirurgie der Heinrich-Heine-Universität Düsseldorf danke ich Sebastian Kraus, Hendrik Bulok und Herrn Dr. Mark Renter. Bei Hanna, Rosa und Klaus, möchte ich mich für ihre unermüdliche Motivation, insbesondere während der Endphase, bedanken. Dana und Leif, sowie Jutta und Jan, danke ich für „Rat und Tat“ bei den computerund formatierungsbedingten Krisen. Bei meinen Kollegen Ulf und Dirk möchte ich mich für das zu jeder Zeit entgegengebrachte Verständnis ganz herzlich bedanken. Meinen Freunden danke ich für ihre langanhaltende und immer selbstverständliche Geduld und Unterstützung Mein größter Dank gilt meinen Eltern, für ihre Begleitung auf meinem Lebensweg, ihre uneingeschränkte Unterstützung und Fürsorge und den stets gewährten moralischen Beistand in allen Lebenslagen.
