Dokument_4.

Synthese und Struktur
von viralen Regulatorproteinen
Der Naturwissenschaftlichen Fakultät
der Friedrich-Alexander-Universität Erlangen-Nürnberg
zur
Erlangung des Doktorgrades
vorgelegt von
Diplom-Chemiker René Röder
geboren am 11.05.1979 in Berlin
-1-
Als Dissertation genehmigt von der Naturwissenschaftlichen
Fakultät der Universität Erlangen-Nürnberg
Tag der mündlichen Prüfung:
27. 04. 2010
Vorsitzender der
Promotionskommission:
Prof. Dr. Eberhard Bänsch
Erstberichterstatter:
Prof. Dr. Andreas Hirsch
Zweitberichterstatter:
Prof. Dr. Ulrich Schubert
-2-
Für meine Familie
-3-
Inhaltsverzeichnis
Seite
1
Zusammenfassung............................................................................................................. 6
2
Summary............................................................................................................................ 8
3
Einleitung ......................................................................................................................... 10
3.1
Peptidsynthese – gegenwärtiger Stand....................................................................... 11
3.2
Die Methode der „Native Chemical Ligation“ als Weg zur effizienten Synthese von
langen Peptiden .......................................................................................................... 13
3.3
Die Aspartimidbildung als Nebenreaktion bei der Peptidsynthese und deren
Verhinderung durch die Backbone Amidschutzgruppen Hmb und Dmb .................. 20
3.4
Die Backbone Amidschutzgruppe Dcpm in der Peptidsynthese................................ 25
3.5
NMR Untersuchungen von Peptiden ......................................................................... 26
4
Zielstellung....................................................................................................................... 29
5
Experimenteller Teil ....................................................................................................... 31
5.1
Material und Methoden .............................................................................................. 31
5.2
Peptidsynthesen.......................................................................................................... 33
5.2.1
Herstellung der Gag Peptide p6 (HIV) und p9 (EIAV) ...................................... 33
5.2.2
Herstellung des Humanen Immundefizienzvirus Peptids Vpr mit klassischer
SPPS und mit NCL sowie dessen anschließende N-terminale Biotinylierung ... 41
5.2.3
Herstellung der Influenza A Virus PB1-F2 Peptide PR8, SF2, BF2(Y42ÆC) und
BF2(S47ÆC) von verschiedenen Stämmen ....................................................... 52
5.3
Ausgewählte Dcpm geschützte Aminosäuren............................................................ 58
5.3.1
Herstellung des Dicyclopropylmethanimin-Hydrochlorid.................................. 59
5.3.2
Allgemeine Vorschrift zur Herstellung der entsprechenden Benzylester
geschützten Dicyclopropyl-Ketiminaddukte....................................................... 61
5.3.3
Allgemeine Vorschrift zur Herstellung der Benzylester geschützten (Dcpm)Aminosäuren aus den entsprechenden Ketiminen .............................................. 63
5.3.4
Allgemeine Vorschrift zur Herstellung der freien (Dcpm)-Aminosäuren .......... 65
5.3.5
Allgemeine Vorschrift zur Herstellung der Fmoc geschützten (Dcpm)Aminosäuren in Lösung ...................................................................................... 70
5.3.6
Alternativer Syntheseweg für die Herstellung der Fmoc geschützten (Dcpm)Aminosäuren an der festen Phase ....................................................................... 77
5.3.7
Herstellung von Fmoc-Asp(OtBu)-(Dcpm)Gly-OH an der festen Phase ........... 81
-4-
6
Ergebnisse und Diskussion ............................................................................................. 88
6.1
Anwendungsmöglichkeiten der NCL zur Synthese der viralen Regulatorproteine ... 88
6.1.1
Die Gag Peptide p6 (HIV) und p9 (EIAV) ......................................................... 88
6.1.2
Das HIV Peptid Vpr und die verschiedenen Influenza A Virus PB1-F2 Peptide
PR8, SF2 und BF2 .............................................................................................. 88
6.2
Strukturuntersuchungen mittels 1H NMR vom Peptid SF2 ....................................... 90
6.2.1
Bestimmung der Struktur des mittleren Fragments SF2(30-70)....................... 100
6.2.2
Bestimmung der Struktur des C-Terminus SF2(50-90).................................... 104
6.2.3
Zusammenfassung der Strukturelemente für das full-length Peptid SF2(1-90) 108
6.3
Die Anwendung von Dcpm geschützten Aminosäuren in der Peptidsynthese ........ 111
6.3.1
Stabilitätsuntersuchungen für den Einsatz bei der Peptidkupplung am Beispiel
von Fmoc-(Dcpm)Ala-OH................................................................................ 111
6.3.2
Fmoc-OAt als neues Reagenz zur Einführung der Fmoc Schutzgruppe .......... 112
6.3.3
NMR Untersuchungen zum Abspaltungsprozess der Dcpm-Gruppe am Beispiel
von Fmoc-(Dcpm)Gly-OH................................................................................ 114
6.3.4
Der neue Synthesebaustein Fmoc-Asp(OtBu)-(Dcpm)Gly-OH für die
Anwendung in der Peptidsynthese.................................................................... 119
6.3.5
Einfluss der Seitenketten auf das cis/trans-Verhältnis der Peptidbindung beim
neuen Dipeptidbaustein Fmoc-Asp(OtBu)-(Dcpm)Gly-OH............................. 123
7
Verzeichnis der verwendeten Abkürzungen............................................................... 125
8
Literaturverzeichnis...................................................................................................... 129
9
Danksagung ................................................................................................................... 137
10 Curiculum Vitae ............................................................................................................ 138
11 Publikationen................................................................................................................. 139
12 Eidesstattliche Erklärung............................................................................................. 140
-5-
1
Zusammenfassung
Ein Schwerpunkt dieser Arbeit war die Synthese von langen viralen regulatorischen Peptiden
sowie von Fragmenten dieser Peptide. Neben der Synthese standen dabei die Optimierung von
bekannten Synthesestrategien und die Anwendung von neuen Konzepten, wie beispielsweise
die „Native Chemical Ligation“ (NCL), bei den im Rahmen dieser Arbeit erstmalig
synthetisch hergestellten Peptiden im Vordergrund. So wurden vom Influenza A Virus (IAV)
Protein PB1-F2 zwei humane H1N1 Varianten synthetisiert. Ein PB1-F2 Peptid entstammt
einem Isolat vom Mount Sinai [1], im Weiteren bezeichnet als PR8. Das zweite humane PB1F2 Peptid entstammt der „Spanischen Grippe“ [2], im Weiteren bezeichnet als SF2. Eine
weitere aviäre H5N1 Variante [3] des PB1-F2 Peptids, bezeichnet als BF2, wurde als
Vertreter der „Vogelgrippe“ synthetisiert. Vom Humanen Immundefizienzvirus Typ-1 wurden
zum einen das Gag Protein p6 [4] synthetisiert. Von diesem Peptid wurden zur Herstellung
von verschiedenen p6-Mutanten (Ser14,25,40ÆAsn) die Peptidkupplungen bei höheren
Temperaturen unter Verwendung eines Mikrowellensyntheseautomaten (Liberty, Firma
CEM) durchgeführt. Eine von Khurana et al. [5] modifizierte p6 Sequenz (in dieser Arbeit als
p6_neu bezeichnet) wurde für Vergleichsstudien synthetisiert, die von Patricia Klingler in der
Gruppe von Prof. Dr. U. Schubert (Universität Erlangen-Nürnberg) durchgeführt wurden. Ein
weiteres Gag Peptid p9 mit einer Länge von 51 Aminosäuren vom Equine Infectious Anemia
Virus wurde mittels step-by-step Methode erstmalig synthetisch hergestellt [6,7]. Im Rahmen
der vorliegenden Arbeit wurde ebenfalls das HIV-1 Protein Vpr mit einer Kettenlänge von 96
Aminosäuren synthetisch hergestellt, wobei hier die bekannte Synthese [8] durch die
Verwendung von Pseudoprolinen optimiert wurde. Dieses Peptid wurde im Rahmen dieser
Arbeit erstmalig durch die Methode der „Native Chemical Ligation“ erfolgreich synthetisiert.
Neben der Synthese dieser Peptide wurde im Rahmen der Arbeit von einem ausgewählten
Peptid, dem PB1-F2 Peptid der „Spanischen Grippe“, genannt SF2, die Struktur in Lösung
unter hydrophoben Bedingungen (TFE:Wasser, 1:1) berechnet. Dazu wurden von den
überlappenden
Fragmenten
SF2(1-40),
SF2(30-70)
und
SF2(50-90)
1
H
NMR
spektroskopische Untersuchungen durchgeführt und die erhaltenen quantitativen und
qualitativen NOE-Signale für die weitere Berechnung verwendet. Diese für das Peptid SF2
erhaltenen Strukturinformationen wurden anschließend mit der von Bruns et al. für das PB1F2 Peptid PR8 publizierten Struktur verglichen [9].
Zur Vermeidung von Schwierigkeiten bei der Synthese von langen Peptiden, hervorgerufen
durch
die
Aggregation
der
wachsenden
-6-
Peptidkette
infolge
von
Wasserstoffbrückenbindungen,
werden
im
Allgemeinen
„Backbone“
geschützte
Aminosäurebausteine eingesetzt. Die am häufigsten in der Literatur eingesetzten Bausteine
enthalten
dabei
die
2-Hydroxy-4-methoxybenzyl
(Hmb)
[10,11,12]
bzw.
deren
Weiterentwicklung die 2,4-Dimethoxybenzyl (Dmb) Schutzgruppe [12,13]. Auf Grund der
relativ stark sauren Bedingungen zur Abspaltung der Hmb und Dmb-Gruppe und der
Erkenntnis, dass bei der Verwendung der Hmb-Gruppe an deren freien Hydroxylfunktion
ungewünschte Nebenreaktionen auftreten können, wurde nach einer neuen Schutzgruppe für
die Peptidbindung des Peptidrückgrates gesucht. Als besonders geeignet erwies sich die von
Carpino für den Schutz der Amidfunktion von Glutamin und Asparagin sowie als
Carboxylschutzgruppe entwickelte Dicyclopropylmethyl (Dcpm) Gruppe [14]. Im Rahmen
dieser Arbeit wurden zu diesem Zweck die drei Dcpm geschützten Aminosäuren Glycin,
Alanin und Leucin synthetisiert und für die Peptidsynthese eingesetzt. Die Einführung der
Fmoc-Gruppe erwies sich auf Grund der Säurelabilität der eingeführten Dcpm-Gruppe als
schwierig. Zur Verbesserung der Ausbeute wurde nach einem alternativen Syntheseweg für
die Synthese der Fmoc geschützten (Dcpm)-Aminosäuren in Lösung [15] unter Verwendung
anderer Methoden zur Einführung der Fmoc-Gruppe an der festen Phase gesucht. Als
günstigste Methode stellte sich die Umsetzung unter neutralen Bedingungen mit einem in
unserer Arbeitsgruppe (Henklein et al.) entwickelten Einführungsreagenz Fmoc-OAt heraus.
Von Vorteil erwies sich, dass kein HCl während der Reaktion generiert wird, wie es im
Gegensatz zur Umsetzung mit Fmoc-Cl der Fall ist.
Neben der Vermeidung von Strukturproblemen durch die Hmb- und Dmb-Gruppe wird die
Verwendung dieser Gruppen als Dipeptidbaustein Fmoc-Asp(OtBu)-(Hmb)Gly-OH bzw.
Fmoc-Asp(OtBu)-(Dmb)Gly-OH zur Verhinderung der Aspartimid-Bildung während der
Synthese von Peptiden mit dem Sequenzmotiv Asp-Gly beschrieben [16,17,18]. Wegen den
bereits erwähnten Nachteilen der Hmb-Gruppe schien es daher interessant, die zuvor bereits
als „Backbone“ Schutzgruppe mit Erfolg eingesetzte Dcpm-Gruppe in einen derartigen
Dipeptidbaustein zu integrieren. Zu diesem Zweck wurde der Synthesebaustein FmocAsp(OtBu)-(Dcpm)Gly-OH entwickelt und bei der Synthese von Peptiden erfolgreich getestet
[19]. Ein Vorteil der Dcpm-Gruppe besteht darin, dass während der Abspaltung mit TFA
keine Nebenreaktionen mit dem zu synthetisierenden Peptid auftreten. Es konnte auch keine
Bildung von eventuell störenden Kationen beobachtet werden. Außerdem sind die
entstehenden Produkte aus der Abspaltung der Dcpm-Gruppe entweder flüchtig oder leicht
abtrennbar.
-7-
2
Summary
A main topic was the synthesis of long viral regulation Peptids and fragments thereof. Besides
these syntheses the optimisation of known synthetic strategies and the usage of new concepts
like the “Native Chemical Ligation” (NCL) was our focus of research for the Peptids made
within the framework of this dissertation for the first time. From the Influenza A Virus (IAV)
protein PB1-F2 two different human H1N1 strains were synthesized; one from the Mount
Sinai [1], named as PR8, and the second from the 1918/19 “Spanish flu” [2], named as SF2.
Additionally one avian H5N1 strain [3], named as BF2, was synthesized. From the human
immunodeficiency virus typ 1 the Gag protein p6 was synthesized [4]. For the synthesis of
various mutants (SerÆAsn) of the p6 protein the coupling reactions were also carried out at
higher temperatures by using a microwave assisted automated Peptids synthesizer (Liberty,
company CEM). A recently by Khurana et al. described modified sequence (named as
p6_neu) [5], was synthsized for comparable experiments done by Patricia Klinger in the
group of Prof. Dr. U. Schubert (university of Erlangen-Nürnberg).
One additional 51 amino acids long Gag protein p9 from the Equine Infectious Anemia Virus
was synthesized for the first time via the “step-by-step” method [6,7]. In the content of this
dissertation the HIV-1 regulatory protein Vpr with a length of 96 amino acids was synthesized
by using pseudoprolines to optimise the known strategy [8]. Besides for the synthesis of the
Vpr protein we used successfully the strategy of the „Native Chemical Ligation“for the first
time.
Besides the syntheses of all these Peptids, the structure of the PB1-F2 IAV peptide from the
“Spanish flu”, named SF2, was calculated under hydrophobic conditions (TFE:water 1:1). For
this 1H NMR analysis was done of the three overlapping fragments SF2(1-40), SF2(30-70)
und SF2(50-90) and the quantitative and qualitative NOE signals received from the spectra
were taken for the further calculation. The obtained results for the structure of the SF2 peptide
were then compared with known structure of the PB1-F2 IAV peptide PR8 published recently
by Bruns et al. [9].
The protection of the “Backbone” amide position of presynthesized amino acid building
blocks is normally done to overcome or to prevent problems during the synthesis of long
Peptids like the aggregation of the growing peptide chain caused by hydrogen bonds between
them. The mostly cited building blocks in the literature contain the 2-Hydroxy-4methoxybenzyl (Hmb) [10,11,12] or their improvement the 2,4-Dimethoxybenzyl (Dmb)
protecting group [12,13]. Because of the strong acidic conditions for deblocking the Hmb-8-
and Dmb-group and the fact that by using the Hmb group side reactions could occur with their
free hydroxyl group we searched for a new protecting group for the backbone amide position
in Peptids. As the most promising group we found the Dicyclopropylmethyl (Dcpm)
protecting group, which was originally developed by Carpino for the protection of the amide
function of glutamine and asparagine and as a general protection for the carboxyl function
[14]. In the content of this work the three Dcpm protected amino acids glycine, alanine and
leucine were synthesized and used for the peptide synthesis. The introduction of the Fmoc
group via Fmoc-Cl analogue to the work of Carpino was difficult because of the acid
sensitivity of the introduced Dcpm group. To increase the yield an alternative strategy was the
aim of research for the synthesis of the Fmoc protected Dcpm-amino acids in solution [15] by
using other methods for the introduction of the Fmoc group on the solid support. The best
method was the reaction under neutral conditions with the new reagent Fmoc-OAt developed
in our group (Henklein et al.). It was advantageous that no HCl gas was generated during the
reaction compared the the conditions by using Fmoc-Cl.
Besides the prevention of structure problems by using the Hmb and Dmb group both groups
were also used as the dipeptide building block Fmoc-Asp(OtBu)-(Hmb)Gly-OH or FmocAsp(OtBu)-(Dmb)Gly-OH to prevent the aspartimide side reaction in the synthesis of Peptids
containing the Asp-Gly motiv [16,17,18]. Because of the mentioned disadvantages of the
Hmb group it was interesting to incorporate the Dcpm group, which was used successfully as
backbone protecting group, in such a dipeptide building block. For that purpose the new
dipeptide building block Fmoc-Asp(OtBu)-(Dcpm)Gly-OH was developed and tested
successful in peptide synthesis [19]. One advantage of the Dcpm group is that during the
cleavage with TFA no side reactions with the desired peptide occur and also no creation of
maybe violating cations were observed. Besides the products of the deblocking process of the
Dcpm group are either volatile or easy to remove.
-9-
3
Einleitung
Peptide beeinflussen beispielsweise bei Vertebraten durch Wechselwirkung mit ihren
entsprechenden Rezeptoren die Kommunikation zwischen den Zellen und sind an der
Regulierung von Stoffwechsel, Reproduktion oder Immunabwehr beteiligt. Durch die
wachsende Kenntnis über die Wirkungsweise von bioaktiven Peptiden ist das Interesse an
dieser Stoffklasse vor allem in der Pharmazeutischen Industrie stark gestiegen. Die
Gewinnung von ausreichenden Mengen an Material dieser hochwirksamen Peptide aus
natürlichen Quellen ist oftmals problematisch, da diese in sehr geringen Konzentrationen
zwischen 10-12 bis 10-15 mol pro mg Frischmasse vorkommen können [20]. Der Einsatz von
verschiedensten Extraktionsverfahren zur Anreicherung und Gewinnung der Peptide aus
natürlichem Ausgangsmaterial stellt außerdem ein Risiko dar, weil das Material z.B. mit
pathogenen Keimen kontaminiert sein kann. Dies erhöht den Aufwand der Isolation des
gewünschten Peptids erheblich und erschwert die Gewinnung reiner Produkte. Bei der
Herstellung von Medikamenten, die auf isolierten Peptiden aus tierischen Quellen basieren,
können außerdem Unverträglichkeiten bei Patienten mit geschwächtem Immunsystem
auftreten, wenn mögliche Allergien von Menschen gegen bestimmte Tiere existieren.
Beruhend auf diesen Erkenntnissen hat man schon früh versucht, diese Peptidwirkstoffe auf
synthetische Weise zu gewinnen (z.B. Insulin, Somatostatin, Oxytocin, GnRH). Bei der
klassischen Peptidsynthese in Lösung erfolgt hierbei der Einsatz von verschieden orthogonal
geschützten Aminosäuren. Das heißt, dass beispielsweise für die Synthese eines beliebigen
Dipeptids Xxx1-Xxx2 die eine Aminosäure an ihrer α-Aminofunktion geschützt vorliegen
muss (z.B. Fmoc-NH-Xxx1-OH) und die andere Aminosäure muss an ihrer Carboxylfunktion
eine Schutzgruppe tragen (z.B. H2N-Xxx2-OtBu), so dass nur eine Reaktion zum
gewünschten Dipeptid Xxx1-Xxx2 möglich ist. Der Vorteil dieser beiden Schutzgruppen
beruht darauf, dass die Fmoc-Gruppe im alkalischen Milieu und die tBu-Gruppe im sauren
Umfeld abgespalten werden kann. Solche sogenannten orthogonalen Schutzgruppen liegen
dann vor, wenn jede Schutzgruppe für sich unter Bedingungen abgespalten werden kann, bei
denen die jeweils andere Schutzgruppe innert ist. Für die Synthese von relativ kleinen
Peptiden ist diese Verfahrensweise der schrittweisen Anknüpfung der nächsten Aminosäure in
Lösung grundlegend möglich. Durch die Notwendigkeit der Isolierung und Aufreinigung
jeder einzelnen Zwischenstufe während einer solchen Synthese ist diese Vorgehensweise
jedoch sehr zeitintensiv und mühselig. Dennoch gelang es auf diesem Weg biologisch aktive
Peptide wie beispielsweise das Neuropeptid Oxytocin, ein Nonapeptid mit einer
- 10 -
Disulfidbrücke zwischen dem Cys-1 und dem Cys-6 in seiner Sequenz (Abbildung 1), zu
synthetisieren [20,21].
S
S
H2N-Cys-Tyr-Ile-Asn-Cys-Pro-Leu-Gly-CONH2
Abbildung 1:
Schematische Darstellung der Aminosäuresequenz von Oxytocin [20,21]
Neben Oxytocin gelang auch die Chemosynthese von weiteren pharmakologisch bedeutenden
Peptiden wie GnRH, dem synthetischen Analogon des Neurohormons GonadotropinReleasing-Hormon, das zur Absenkung des Testosteronspiegels eingesetzt wird [22], oder
auch Cholecystokinin, ein Peptidhormon das die Wirkungsweise des Darms, die
Gallenblasenkontraktion und das Sättigungsgefühl steuert [23]. Mit der Einführung der
Festphasenpeptidsynthese (SPPS) [24] wurde es möglich, eine Vielzahl an Peptiden und
anderen Wirkstoffen in relativ kurzen Zeiträumen zu synthetisieren. Mit dem Einsatz von
Syntheseautomaten und neuen wirksameren Kopplungsreagenzien werden dabei Zykluszeiten
für die einzelnen Kupplungsreaktionen von ca. 30 min realisiert. Die Anfangs existierenden
Schwierigkeiten
zur
Reinigung
der
anfallenden
Peptidgemische
konnten
durch
Weiterentwicklungen der analytischen Methoden z.B. der präparativen HPLC überwunden
werden. Der Einsatz von neuen Säulenmaterialien wie z.B. C4-, C8-, C18-, Amino-, CN-,
Phenyl- oder Silica-Material [25] und die Anwendung von erhöhten Temperaturen zur
Reinigung der Peptidgemische stellten wichtige Fortschritte dar. Neue Techniken wie die
UPLC ermöglichen es dabei, mit noch geringeren Probenmengen auszukommen und
gleichzeitig die Analysenzeiten zu verringern.
3.1
Peptidsynthese – gegenwärtiger Stand
Die Synthese von langen Peptiden mit mehr als 50 Aminosäuren stellt nach wie vor eine
Herausforderung an den Synthesechemiker dar. Ein Grund für dieses Problem ist dabei vor
allem die Ausbildung von sekundären Strukturelementen (z.B. β-Faltblatt [26]),
hervorgerufen durch Wasserstoffbrückenbindungen zwischen den Wasserstoffatomen des
Peptidrückgrats und den Aminosäureseitenketten. Durch diese zwischenmolekularen
Wechselwirkungen kann es zur Aggregation der Peptidketten kommen [27], wodurch die Nterminale Aminogruppe für die weiteren Kupplungen abgeschirmt wird. Dadurch kommt es
- 11 -
zur unvollständigen Acylierung durch die nachfolgende Aminosäure. Die Anwendung von
reaktiveren Kondensationsreagenzien wie z.B. HATU oder die Verwendung von
Aminosäurechloriden und -fluoriden verbessert die Umsatzraten. Ein Weg zur Vermeidung
dieser Probleme ist der Einsatz von Pseudoprolinen während der Synthese [28,29], die durch
ihre
strukturbrechenden
Eigenschaften,
ebenso
wie
Prolin
selbst
[30],
die
Seitenkettenaggregation der stetig wachsenden Peptidkette verhindern können [28,29]. Die
Pseudoproline stellen cyclische Oxazolidine von Serin bzw. Threonin dar, die mit der jeweils
nachfolgenden benötigten Aminosäure verknüpft sind. Die fünfgliedrigen Pseudoproline
werden bei der Abspaltung des synthetisierten Peptids mit 95% TFA geöffnet, so dass sich die
ursprüngliche Sequenz mit den Aminosäuren Serin bzw. Threonin ausgebildet (Abbildung 2).
H3C
N
H
R
O
H3C
R
TFA
X
N
N
H
O
O
X = H, CH3
O
Abbildung 2:
O
H
N
X
OH
Schematische Darstellung der Ringöffnung der fünfgliedrigen Oxazolidine durch TFA [27]
Die Verwendung von niedrig beladenen Harzen für die Festphasenpeptidsynthese und die
Wahl von polaren aprotischen Lösungsmitteln (z.B. DMF oder NMP) für die Reaktion helfen
ebenso bei der Umgehung der beschriebenen Syntheseprobleme.
Für die erfolgreiche Synthese von Peptiden ist es notwendig, dass die Ausbeuten der
einzelnen Kupplungsreaktionen annähernd quantitativ verlaufen. Bei der linearen Methode
können beispielsweise Fehlsequenzen durch unvollständige Kupplungsreaktionen auftreten,
die dann die Reinigung des Zielpeptids behindern, da sie durch ihr ähnliches Verhalten meist
sehr schwer abzutrennen sind.
Im Gegensatz zur klassischen Methode der linearen Kettenverlängerung [31,32] ist es durch
Kondensation von geschützten Peptidfragmenten möglich, die Anzahl der einzelnen
Kupplungsreaktionen während der Synthese von langen Peptiden zu verringern. Durch die
separate Synthese dieser geschützten Peptidfragmente ist es möglich, diese aufzureinigen, so
dass bei der finalen Kupplung zum gewünschten Peptid relativ wenige Nebenprodukte
anfallen. Ein wesentlicher Nachteil dieser Methode ist die begrenzte Löslichkeit geschützter
Peptidfragmente und die erhöhte Racemisierungsgefahr.
- 12 -
3.2
Die Methode der „Native Chemical Ligation“ als Weg zur effizienten Synthese von
langen Peptiden
Trotz der Verwendung all dieser Hilfsmittel stellt die Länge des zu synthetisierenden Peptids
nach wie vor eine große Herausforderung dar. Statistisch gesehen nimmt mit zunehmender
Peptidkettenlänge auch die Wahrscheinlichkeit zu, dass Fehlsequenzen durch die
unvollständige Kupplung der einzelnen Aminosäuren auftreten. Um die Ausbeute und auch
die Reinheit des erhaltenen Rohproduktes zu erhöhen, ist es deshalb sinnvoll, solche Peptide
mit einer Länge von mehr als 50 bis 60 Aminosäuren durch die Kondensation von mehreren
kleineren ungeschützten Segmenten aufzubauen [27,33]. Eine Möglichkeit, um dies zu
erreichen, ist die von Kent und Dawson eingeführte Methode der „Native Chemical Ligation“
(NCL) [34,Review 35]. Es handelt sich hierbei um eine chemoselektive Kupplung zweier
ungeschützter Peptide, wobei das eine Fragment einen C-terminalen α-Thiolester und das
andere Fragment N-terminal einen Cysteinrest aufweist. Bei dieser Reaktion, die bereits von
Wieland et al. beschrieben wurde [36], erfolgt im ersten Schritt eine Thiolesterübertragung
von der Thiolgruppe der Seitenkette des Cysteins des C-terminalen Fragments auf das
Carboxylkohlenstoffatom des α-Thiolesters des N-terminalen Fragments. Im nächsten Schritt
folgt eine spontane intramolekulare SÆN Acylverschiebung über einen fünfgliedrigen
Übergangszustand, die sehr schnell abläuft im Vergleich zur Thiolesterübertragung und damit
das Gleichgewicht zu Gunsten der sich neu ausgebildeten Amidbindung verschiebt. Diese
resultierende Amidbindung stellt dann die neue Peptidrückgratbindung des Peptids an der
Ligationstelle dar [37,38,Review 39] (Abbildung 3).
Eine alternative Methode wurde von Tam et al. beschrieben, bei der das eine Fragment als
Thiolcarbonsäure vorliegt und das andere Fragment ein N-terminales α-Brom-Alanin
aufweist. Durch die Reaktion der beiden Fragmente über eine Thioalkylierung erfolgt die
Bildung eines intramolekularen α-Thiolester, gefolgt von der gleichen spontanen
intramolekularen SÆN Acylverschiebung wie bei der NCL [40,41].
- 13 -
N-terminaler Thiolester
HS
O
H
N
SR
R'
C-terminales Cys-Peptid
H2N
H2O; pH 7 O
R'
S
N
H
O
H2N
O
neu gebildete Peptidbindung
N-terminales Peptid
HS
O
H
N
R'
C-terminales Peptid
N
H
O
Cys
Abbildung 3:
Schematische Darstellung des Mechanismus der NCL über eine spontane SÆN
Acylverschiebung [34,37]
Eine große Einschränkung für den universellen Einsatz der NCL in der Peptidsynthese ist,
dass in der Sequenz des zu synthetisierenden Peptids ein Cysteinrest an geeigneter Stelle
vorhanden sein muss. Erste Entwicklungen, um das Anwendungsgebiet der NCL von XxxCys Sequenzmotiven auf Xxx-Gly und Gly-Xxx zu erweitern, wurden von Canne et al.
beschrieben, wobei die Hilfsgruppen Nα(ethanthiol) bzw. Nα(oxyethanthiol) am N-Terminus
des mittels SPPS synthetisierten C-terminalen Fragments angeknüpft wurden [42]. Durch
diese Alkylthiol-Hilfsgruppen (Auxiliare) war es möglich zwei Peptidfragmente durch NCL
miteinander zu verknüpfen. Das Nα(oxyethanthiol)-Auxiliar ist ein säurestabiler Baustein, der
nach erfolgter NCL durch Zink reduktiv in saurem Milieu vom fertigen Peptid abgespalten
werden kann. Diese Reaktion verläuft jedoch mit sehr viel langsameren Reaktionszeiten, als
die NCL ohne Verwendung von Auxiliaren mit dem Sequenzmotiv Xxx-Cys, wie
Ligationszeiten der α-Thiolester aller 20 natürlich vorkommenden Aminosäuren mit Cystein
zeigten [43]. Die Verwendung von Nα(ethanthiol) hingegen wies bessere Umsatzzeiten auf.
Jedoch war es hier nicht möglich, die Thiol-Hilfsgruppe nach der NCL wieder leicht
abzuspalten [42]. Eine Weiterentwicklung auf diesem Gebiet stellen die von Botti et al.
beschriebenen substituierten Nα-(1-phenyl-2-mercaptoethyl) Verbindungen dar, die nach
erfolgter NCL Reaktion durch TFA wieder leicht abgespalten werden können [44] (Abbildung
4).
- 14 -
SH
R
O
R
CH3
O
DIEA
Br
1) H2N-O-CH2CO2H
S
2) Reduktion
DMF
H3CO
H3CO
CH3
O
R
NH2
1) Br
geschütztes
Peptid
H3CO
R
H
N
SR'
2) saure Abspaltung/Entschützung
z.B. mit TFA
H3CO
O
Peptid
SH
R = H oder R = OCH3
R' = para-Methylbenzyl
Abbildung 4:
Schematische Darstellung der allgemeinen Synthese der Nα-(1-phenyl-2-mercaptoethyl) ThiolHilfsgruppe und deren Anknüpfung an das C-terminale Peptidfragment nach Botti et al. [44]
Bei der Verwendung der Thiol-Hilfsgruppen (Auxiliare) erfolgt im ersten Schritt eine
Thiolesterübertragung auf den α-Thiolester des N-terminalen Fragments, so dass sich die zu
verknüpfenden Fragmente annähern. Im zweiten Schritt folgt dann die spontane SÆN
Acylverschiebung zur Ausbildung der Peptidbindung [38] (Abbildung 5).
abspaltbare Thiol-Hilfsgruppe
N-terminaler Thiolester
SH
O
H
N
SR
Aux
R1
R1
H2O; pH 7
NH
S Aux
O
R2
N
H
C-terminales Cys-Peptid
O
NH R2
R2
HN
Aux
O
O
HS
-Aux
neu gebildete Peptidbindung
N-terminales Peptid
H
N
R2
O
R1
Abbildung 5:
O
N
R1
N
H
C-terminales Peptid
O
Schematische Darstellung des Einsatz von Thiol-Hilfsgruppen (Auxiliar) bei der NCL über
eine spontane SÆN Acylverschiebung und anschließender Abspaltung der Thiol-Hilfsgruppe
[38]
Die von Offer et al. beschriebene Tmb Gruppe (4,5,6-Trimethoxy-2-mercaptobenzyl) [45],
die eine Weiterentwicklung der Dmmb Thiol-Hilfsgruppe (4,5-Dimethoxy-2-mercaptobenzyl)
[46] darstellt, ist eine aromatische Thiol-Hilfsgruppe vom 2-Mercaptobenzyl System [47].
- 15 -
Durch die gezielte Auswahl der Substituenten des aromatischen Ringsystems lässt sich die
Elektronendichte und folglich auch die Säureempfindlichkeit der gesamten Thiol-Hilfsgruppe
erhöhen, wodurch eine bessere Umsatzrate während der NCL Reaktion erreicht wird. Die
Tmb Gruppe lässt sich anschließend durch TFA sehr leicht wieder abspalten. Werden diese
Thiol-Hilfsgruppen bei NCL Reaktionen eingesetzt, die nicht das Sequenzmotiv Xxx-Gly
oder Gly-Xxx aufweisen, dann ist nicht mehr die Thiolesterübertragung der eigentliche
geschwindigkeitsbestimmende Schritt, sondern die Hydrolyse des α-Thiolesters tritt in den
Vordergrund [38]. Wu et al. kombinierten die beiden Methoden der auf Cystein basierenden
NCL und der cysteinfreien NCL bei der Synthese eines komplexen Glycopeptids in
eindrucksvoller Weise [48]. Bei der cysteinfreien NCL wurde bei dem Sequenzmotiv Gly-Gln
die Tmb Thiol-Hilfsgruppe eingesetzt. Durch die sauren Bedingungen während der
Abspaltung mit TFA wurde eine NÆS Acylverschiebung initiiert, gefolgt von der
irreversiblen Protonierung der resultierenden benzylischen Amingruppe. Die Folge war, dass
die eingesetzte Tmb Gruppe nicht mehr abgespalten werden konnte. Durch eine vorherige
Methylierung
der
freien
Thiolfunktion
der
Tmb
Gruppe
mit
para-
Nitrobenzensulfonsäuremethylester konnte die Nebenreaktion der NÆS Acylverschiebung
verhindert werden [38,48] (Abbildung 6). Auch wenn die Anwendung von solchen ThiolHilfsgruppen bei der Anwendung von Ligationsreaktionen bisher wenig verbreitet ist, so
könnte diese Art der Maskierung der Thiolfunktion mit der Tmb Gruppe für deren Einsatz
von Vorteil sein. Um die für die NCL nötige freie Thiolfunktion vom Cysteinrest bzw. von
den Thiol-Hilfsgruppen vor der Oxidation zu disulfidverbrückten Dimeren zu schützen, wurde
von Burns et al. die Verwendung von TCEP als reduktives Phosphin beschrieben [49].
O
R
NH2
S
O
O
SH
R
H
H3CO
N
OCH3
OCH3
H3CO
O
OCH3
OCH3
R
O
O
SCH3
NO2
R
N
N
H
O
O
H3CO2S
H3CO
OCH3
OCH3
Abbildung 6:
Schematische Darstellung des Einsatz von para-Nitrobenzensulfonsäuremethylester bei der
Abspaltung der Tmb Thiol-Hilfsgruppe unter sauren Bedingungen bei der Synthese eines
Glycopetids von Wu et al. [38,48]
- 16 -
Die Oxidation der Thiolfunktionen und die Hydrolyse des α-Thiolesters können durch den
Zusatz von aromatischen Thiolen, wie z.B. (4-Carboxylmethyl)thiophenol [38], verringert
werden [50]. Dabei erfolgt eine in situ Generierung der Arylthiolester aus den eingesetzten
Alkylthiolestern. Diese können durch SPPS z.B. unter Verwendung des „backbone amide
linker“ [51] oder des „safety catch linker“ [52] erhalten werden. Beim „backbone amide
linker“ ist die C-terminale Aminosäure über das α-Stickstoffatom am Harz verankert und nach
der SPPS des Peptids mittels der Fmoc/tert-Butyl Strategie wird der α-Thiolesters vor der
Abspaltung mit TFA generiert [Review 53,54,55]. Beim „safety catch linker“ handelt es sich
um einen N-acylsulfonamidlinker [56,Review 53], der im Anschluss an die Peptidsynthese
durch Diazomethan oder Iodacetonitril am Stickstoff alkyliert und somit aktiviert wird. Durch
die Abspaltung vom Harz mit nucleophilen Thiolen werden dann die α-Thiolester gebildet
[57,58]. Eine alternative Strategie, wie sie auch im Rahmen dieser Arbeit angewendet wurde,
besteht darin, die Synthese des Peptids an einem säureempfindlichen 2-Chlortrityl Harz
durchzuführen, danach das Peptid geschützt mit intakten Seitenkettenschutzgruppen
abzuspalten und anschließend den Arylthiolester in Lösung am C-Terminus zu generieren
[59,60]. Die Seitenkettenschutzgruppen werden dann mit TFA abgespalten und der αThiolester mittels RP-HPLC gereinigt. Die unterschiedlichen Reaktionsgeschwindigkeiten
während der NCL bei der Verwendung von Alkyl- oder Arylthiolestern wurden von Bang et
al. [61] unter kinetisch kontrollierten Bedingungen untersucht. Die Reaktivitätsunterschiede
wurden dabei auf die unterschiedlichen pKs-Werte der Thiolkomponenten des jeweiligen αThiolesters zurückgeführt (pKs(Benzolthiol) = 6.6; pKs(2-Mercaptoethansulfonsäure) = 9.2)
[38,61]. Daran ist zu erkennen, dass die Arylthiole als stärkere Säuren die besseren
Abgangsgruppen im Gegensatz zur den Alkylthiolen während der Thiolesterübertragung
darstellen.
Sie
werden
leichter
abgespalten,
wodurch
sich
die
höheren
Reaktionsgeschwindigkeiten ergeben.
Eine Erweiterung der Anwendung für die NCL wurde durch den Austausch von Cystein für
Alanin in Peptiden, die normalerweise kein Cystein in ihrer Sequenz enthalten erreicht. Nach
erfolgter Ligation wird hier das zwischendurch eingeführte Cystein wieder in die Alanin
„wild typ“ Sequenz durch katalytische Hydrierung mit Raney-Nickel oder mit diversen
Palladiumkatalysatoren transformiert [62]. Die Verwendung von 10% Pd/Al2O3 in 6 M
Guanidiniumhydrochlorid-Lösung zeigte in diesem Fall sowohl bei der Synthese von linearen
als auch cyclischen Peptiden die besten Resultate und ist zusätzlich relativ einfach in der
Handhabung im Gegensatz zu Raney-Nickel, das im Allgemeinen vor jeder Anwendung
immer frisch hergestellt werden sollte [62]. Mit Hilfe dieser Methode kann die NCL auch auf
- 17 -
die Anwendung für das Sequenzmotiv Xxx-Ala ausgedehnt werden. Das Konzept, für die
Ligation auch andere Aminosäurebausteine einzusetzen und diese dann anschließend zu
modifizieren, wurde von Tam et al. [63] durch den Einsatz von Homocystein und
anschließender Methylierung der Thiolfunktion mit para-Nitrobenzol-sulfonsäure-methylester
zum Methionin gezeigt. Mit Hilfe dieser Methode ist auch der Zugang zu Peptiden mit dem
Sequenzmotiv Xxx-Met vorbereitet worden.
Durch die Modifizierung von verschiedenen Aminosäurebausteinen mit der benötigten
Thiolfunktion kann das Anwendungsgebiet der NCL auf weitere Sequenzmotive ausgedehnt
werden. Von Crich et al. [64] wurde gezeigt, dass durch die Integration der benötigten
Thiolfunktion auch andere Aminosäuren als Bausteine für die N-terminale Aminosäure des Cterminalen Fragments bei der NCL Reaktion fungieren können. Nach Verseifung mit LiOH
des Nα-Boc-threo-β-hydroxy-L-phenylalaninmethylester, der aus L-Phenylalanin erhalten
wurde [65,66], erhielt Crich et al. [64] Nα-Boc-threo-β-hydroxy-L-phenylalanin als
modifizierte Aminosäure, die er anschließend bei der Synthese des C-terminalen Fragments
eingesetzt
hat.
Die
Thiolfunktion
der
erythro-Thiolphenylalaninverbindung
wurde
zwischenzeitlich mit Ethyldisulfid und meta-Chlorperbenzoesäure als Disulfid geschützt [67],
um die Ausbildung von Dimeren zu verhindern (Abbildung 7).
HO
HS
1)MsCl, Et3N, DCM
2)AcSH, DBU, DMF
3)1N NaOH, DBU, DMF
HN
H
Boc
CO2CH3
HN
H
Boc
EtS
EtS
S
EtS-SEt, mCPBA
Et3N, DCM
S
LiOH
HN
H
Boc
Abbildung 7:
CO2CH3
CO2CH3
THF
HN
H
Boc
CO2H
Schematische Darstellung der Synthese der modifizierten Phenylalaninverbindung mit
geschützter Thiolfunktion gemäß Crich et al. [64]
Bei der eigentlichen Ligation in Gegenwart vom Natriumsalz der 2-Mercaptoethansulfonsäure
(MESNa) und TCEP*HCl zur Reduktion der Disulfidbindungen zur freien Thiolfuktion [49]
wurden auch hier die reaktiveren Arylthiolester des N-terminalen Fragments eingesetzt. Die
abschließende Entschwefelung der im Ligationsprodukt resultierenden Thiolfunktion wurde
in diesem Fall durch die Umsetzung mit Nickelborid erreicht, welches in situ durch die
Reduktion von Nickelchlorid mit Natriumborhydrid erzeugt wurde [68]. Die Autoren konnten
- 18 -
zeigen, dass diese Variante der Entschwefelung auch in Gegenwart vom Methionin und Acm
geschütztem Cystein ohne Nebenreaktionen durchführbar ist [64]. Außerdem konnten die
Autoren auch die analogen mit der Thiolfunktion modifizierten Verbindungen von Histidin,
Tyrosin und Tryptophan herstellen [65,66]. Durch die Herstellung dieser Verbindungen war
es möglich, dass neben dem Sequenzmotiv Xxx-Phe ebenfalls die Motive Xxx-His, Xxx-Tyr
und Xxx-Trp mit dem beschriebenen Prinzip eine Anwendung in der NCL finden sollten [64].
Andere orthogonale Ligationsmethoden, die nicht auf dem Prinzip der NCL beruhen, wurden
bereits für die Aminosäuren Tryptophan [69] und Histidin [70] beschrieben.
Eine interessante Weiterentwicklung der NCL ist die Möglichkeit der Durchführung an der
festen Phase (SPCL), woraus sich eine einfachere Handhabung des am polymeren Träger
gebundenen Ligationsprodukts ergibt [71]. Die schrittweise Durchführung von mehreren
Ligationen hintereinander und der Kombination mit anderen Ligationstechniken wie
beispielsweise
der
Oxaprolin-
[72]
und
Thiaprolin-Ligation
[73]
erweitern
das
Anwendungsgebiet der NCL auf die so genannte Tandemligation [74,75]. Dadurch können
auch an einem Trägermolekül verzweigte Peptide erhalten werden [76]. Die Verwendung von
sekundär geschützten Thiol-Hilfsgruppen wie beispielsweise durch die Acm Gruppe
zusätzlich geschützte Dmmb Thiol-Hilfsgruppe am N-Terminus des bei der NCL eingesetzten
α-Thiolester ist es möglich, durch Entschützen der Thiolfunktion der Dmmb Gruppe eine
zusätzliche NCL Reaktion als Tandemligation mit einem weiteren α-Thiolester durchzuführen
[77].
Zusätzlich zu der Verwendung der 20 natürlich vorkommenden Aminosäuren werden auch
modifizierte Aminosäuren wie Selenocystein [78] und Selenohomocystein [79] als Bausteine
in Peptide durch die Anwendung der NCL integriert.
Bei der „Expressed Protein Ligation“ (EPL) werden die Vorteile der Molekularbiologie mit
denen der chemischen Peptidsynsthese kombiniert. Hierbei werden die mit rekombinanten
Methoden erhaltenen α-Thiolester mit durch SPPS synthetisierte am N-Terminus ein Cystein
enthaltenen
Peptiden
unter
den
Bedingungen
der
NCL
miteinander
verknüpft
[80,81,82,Review 83]. Eine Übersicht über die Verbreitung der NCL bei der Anwendung in
der Peptidsynthese wurde kürzlich von Haase et al. beschrieben [84].
- 19 -
3.3
Die Aspartimidbildung als Nebenreaktion bei der Peptidsynthese und deren
Verhinderung durch die Backbone Amidschutzgruppen Hmb und Dmb
Bei der SPPS mittels Fmoc/tert-Butyl Strategie von Peptiden, die in ihrer Aminosäuresequenz
die Kombination Asp-Gly bzw. Asn-Gly enthalten, ist es möglich, dass als Nebenreaktion
Aspartimidbildung [27,85,86,87,88,89] auftreten kann. Bei der von Henklein et al. [90]
beschriebenen Synthese des PB1-F2 Peptids PR8 (A/Puerto Rico/8/1934) [1] konnte diese
Nebenreaktion beobachtet werden. Neben dem Vorhandensein des erwähnten Sequenzmotivs
hat auch die Sekundärstruktur des entsprechenden Peptids einen Einfluss auf das Ausmaß der
Aspartimidbildung, je nachdem wie leicht sich der fünfgliedrige Übergangszustand ausbilden
kann (Abbildung 8).
O
O
X
H
N
β
N α
H
O
N
N
H
O
X = OtBu, NH2
N α
H
OH
O
H
N
N α
H
N
H
O
N
O
β-Piperidid
α-Piperidid
O
OH
H
N
O
richtiges Peptid;
α-aspartyl Peptid
Abbildung 8:
β
O
O
N
H
β
N
N
H
N
H
N
H
OH
O
β-aspartyl Peptid
Schematische Darstellung der Aspartimidbildung als Nebenreaktion bei der Peptidsynthese
[27]
Ein Nachteil dieser ungewünschten Reaktion ist, dass nach dem Einbau der „Asp-Gly oder
Asn-Gly Einheit“, bei jeder weiteren Kupplung einer nachfolgenden Aminosäure die FmocGruppe durch 20 %ige Piperidinlösung in DMF abgespalten wird. Durch das eingesetzte
Piperidin besteht die Möglichkeit, dass sich zum einen weiteres Aspartimid bildet. Und zum
anderen können sich aus dem entstandenen Aspartimid α- und β-Piperidide ausbilden. Diese
Nebenprodukte weisen eine Massendifferenz von +67 Da auf. Als weiterer Nachteil muss
angesehen werden, dass nach der Bildung des fünfgliedrigen cyclischen Imides, dieses sich
wieder öffnen kann, wobei sowohl das gewünschte α-Peptid resultiert und auch das
entsprechende β-Peptid gebildet werden kann. Die Bildung des cyclischen Imids erfolgt dabei
- 20 -
durch
den
nucleophilen
Angriff
des
Stickstoffatoms
vom
Glycin
an
das
β-
Carboxylkohlenstoffatom der Ester- oder Amidseitenkettenfunktion von der geschützten
Fmoc-Aminosäure Asparaginsäure oder auch Asparagin, welche im nächsten Cyclus an die
Peptidkette gekuppelt wird. Da die Möglichkeiten zur Bildung der erwähnten Nebenprodukte
bei jedem weiteren Reaktionscyclus vorliegen, sinkt die Ausbeute des gewünschten Peptids in
erheblichem Maße. Eine sehr effektive Methode zur Verhinderung dieser Nebenreaktion
besteht in der temporären Maskierung des Stickstoffatoms der Peptidbindung mit der 2Hydroxy-4-methoxybenzyl-Amidschutzgruppe (Hmb) [10,11,12,91]. Durch die Verwendung
der Hmb-Gruppe wird neben der Verhinderung der Aspartimidbildung auch die Ausbildung
von Sekundärstrukturen der wachsenden Peptidkette am Harz während der Synthese
verhindert [92]. Die dadurch erreichte Unterdrückung der Aggregation der Peptidketten am
Harz während der Synthese ermöglicht die Synthese von Peptiden, die allgemein als
„Difficult Sequences“ bezeichnet werden [93]. Als eindruckvolles Beispiel sind dafür in der
Litertur beispielsweise die Synthesen der „Jung-Redemann“-Sequenz [94], das Alzheimer
Amyloid Peptid Aβ(1-42) [95,96] oder die Teilsequenz des Acyl Carrier Proteins ACP(65-74)
[97] beschrieben worden. Das Decapeptid ACP(65-74) gilt gegenwärtig als „Testsequenz“ für
die Leistungsfähigkeit der Anwendung von z.B. neuen Kupplungsmethoden [98], neuen
Additiven [99], neuen Harzen [100] und auch die Anwendung von neuen Amidschutzgruppen
für das Peptidrückgrat [10].
Bei der Entwicklung der Hmb-Gruppe durch Quibell und Johnson [27] wurden anfangs nur
methoxy-substituierte Arylreste als Amidschutzgruppe verwendet, wodurch die Acylierung
des Stickstoffatoms bei der Kupplung der folgenden Aminosäure nur sehr schlecht ablief und
nicht mehr quantitativ erfolgte. Durch die Einführung der 2-Hydroxylfunktion am Arylrest
wurde die Acylierung durch die nächste Aminosäure erleichtert. Der Grund liegt darin, dass
sich durch eine intramolekulare Wasserstoffbrückenbindung mit dem freien Elektronenpaar
des Stickstoffatoms eine tautomere Grenzstruktur ausbildet, bei der die O-H-Bindung der
Hydroxyfunktion leicht destabilisiert wird (Abbildung 9). Bei dieser Grenzstruktur verläuft
die Acylierung mit Hilfe der sehr reaktiven Pentafluorphenylester der entsprechenden
Aminosäure schneller, als es ohne diesen elektronenziehenden Einfluss der Fall wäre. Als
abschließender Schritt erfolgt dann ein intramolekularer OÆN Acyltransfer, wodurch die
Amid-Peptidbindung gebildet und gleichzeitig die 2-Hydroxylfunktion regeneriert wird
(Abbildung 9).
- 21 -
Fmoc
H3CO
O
R2
O
F
H2N
O
R1
Fmoc
N
F
Fmoc
F
O
N
O
F
R2
O
H
N
H3CO
F
R1
Fmoc
O
20% Piperidin/DMF
R2
H
O
H
R2
O
H
N
N
O
O
H
O
H
N
NH
O
R1
H3CO
H3CO
O
Fmoc
Fmoc
O
O
O
R2
O
H
N
N
O
Abbildung 9:
H
N
NH
R3
H3CO
R1
Fmoc
H
N
R1
R3
R2
O
R3
O
Aktivester
O
H
N
HN
O
R1
H3CO
OH
Schematische Darstellung der Kupplung der nächsten Aminosäure über eine tautomere
Grenzstruktur der Hmb-Gruppe mit anschließendem OÆN Acyltransfer [27]
Die freie Hydroxylfunktion der Hmb-Gruppe kann bei der SPPS von biotinylierten Peptiden
während der Biotinylierung am N-Terminus des am Harz verankerten Peptids in Gegenwart
von DIEA ebenfalls durch Biotin acyliert werden [101]. Diese biotinylierte Hmb-Gruppe
verbleibt nach der anschließenden Abspaltung des Peptids mit TFA am Peptid, wohingegen
alle anderen Standardschutzgruppen (siehe Kapitel Material und Methoden) unter diesen
Bedingungen abgespalten werden. Dieser Effekt lässt sich zum einem durch den stark
gestiegenen sterischen Anspruch der durch Biotin acylierten Hmb-Gruppe erklären, wodurch
eine Abschirmung gegen die angreifende TFA resultiert (Abbildung 11). Zum anderen wird
ein stark elektronenziehender Substituent an Stelle der Hydroxylfunktion eingeführt, wodurch
ebenfalls die Abspaltbarkeit durch TFA herabgesetzt wird [102]. Den Effekt der Umkehr der
Säurelabilität in eine Säurestabilität der Hmb-Gruppe gegenüber TFA wurde bereits von
Quibell et al. [103] und Johnson et al. [104] beschrieben. Mit Hilfe der Acetylierung der
freien Hydroxylfunktion vom Hmb geschützten Glycin mit Ac2O in Gegenwart von DIEA
konnte er die Abspaltung der nunmehr 2-Acetoxy-4-methoxybenzyl Gruppe (AcHmb) von
Glycin durch TFA verhindern. Durch die anschließende Umsetzung des AcHmb geschützten
Peptids mit 20 % Piperidin in DMF (oder 5 % Hydrazin in DMF), den standardmäßigen
Bedingungen zur Abspaltung der Fmoc-Gruppe, wurde die Acetylgruppe wieder abgespalten
und so die säurelabile Hmb-Gruppe regeneriert [103] (Abbildung 10). Der Einbau der
- 22 -
AcHmb-Gruppe während der SPPS verbesserte die Löslichkeit nach der Abspaltung vom
Harz von ansonsten sehr schwer löslichen Peptiden wie des Amyloid Peptids Aβ(1-42)
erheblich, wodurch die anschließende Reinigung mittels RP-HPLC sehr vereinfacht wurde
[105]. Diese starke Verbesserung der Löslichkeit von Peptiden durch den Einbau der AcHmbGruppe konnte auch auf ansonsten vollständig geschützte Peptide übertragen werden, was
Quibell et al. [106,107] eindrucksvoll zeigen konnten.
O
O
N
N
Ac2O, DIEA
H3CO
OH
O
20% Pieridin/
DMF
H3CO
O
CH3
Gly(AcHmb)
Gly(Hmb)
Abbildung 10: Schematische Darstellung der reversiblen Modifizierung der Hmb-Gruppe durch Ac2O gemäß
Quibell et al. [103]
Asp(OtBu)
Asp(OtBu)
O
O
OtBu
O
H
N
O
N
H
O
OtBu
O
N
H
N
H
Biotinylierung
H
N
O
N
H
O
O
OH
H3CO
H3CO
TFA
HN
Gly(Hmb)
Gly(Hmb)+Biotin
Asp
OH
N
H
O
H
N
O
NH
O
O
O
S
O
N
H
Gly
Abbildung 11: Schematische Darstellung der Acylierung der Hmb-Gruppe während der Biotinmarkierung des
Peptids und anschließender Abspaltung des Peptids vom Harz mit TFA
Eine Weiterentwicklung der Hmb-Gruppe stellt die 2,4-Dimethoxybenzyl Gruppe (Dmb)
[12,13,108] dar, die ebenso wie die Hmb-Gruppe die Ausbildung von geordneten βFalttblattstrukturen während der SPPS verhindert. Mit der Verwendung der Dmb-Gruppe als
- 23 -
Backbone Amidschutzgruppe für die Aminosäure Glycin ist eine Acylierung nicht möglich
[109]. Durch die Einführung einer dritten Methoxygruppe kommt man zu der 2,4,6Trimethoxybenzyl Gruppe (Tmob) [110,111], bei welcher auf Grund des noch größeren
sterischen Anspruches die Kupplung der nächstfolgenden Aminosäure sehr erschwert wird.
Für die Abspaltung der drei als Backbone Amidschutzgruppe eingesetzten Hmb, Dmb und
Tmob Gruppe werden relativ harsche Bedingungen wie lange Reaktionszeiten in TFA
[102,112] benötigt, was für die Synthese von empfindlichen Peptiden ein Nachteil sein kann.
Beispielsweisen könnten Nebenreaktionen bei längeren Reaktionszeiten in den Vordergrund
treten, wodurch die Ausbeute des gewünschten Peptids verringert wird. Bei der Abspaltung
verbleibt außerdem ein intaktes Molekül in Form eines Benzylkations in der Abspaltlösung.
Auch wenn bei der Abspaltung Silane wie Triisopropylsilan (TIPS) als Scavanger zugegeben
werden [113,114], die diese reaktiven Kationen abfangen sollen, so verbleibt immer ein
gewisses Restrisiko, dass diese Kationen an anderer Stelle mit dem synthetisierten Peptid eine
kovalente Bindung eingehen und dann nicht mehr entfernt werden können.
Zur Verhinderung der Aspartimidbildung wurden kürzlich auch andere Schutzgruppen für die
Seitenkettenfunktion der Asparaginsäure wie beispielsweise die 4-{N-[1-(4,4-dimethyl-2,6dioxocyclohexyliden)-3-methylbutyl]amino}benzyl Gruppe (Dmab) [115] oder die neuen
Backbone Schutzgruppen 3,4-Ethylendioxy-2-thenyl (EDOTn) und 1-Methyl-3-indolylmethyl
(MIM) [112] beschrieben (Abbildung 12).
CH3
H3C
O
O
H3C
S
N
HN
H3C
O
CH3
O
MIM
EDOTn
Dmab
Abbildung 12: Die zur Verhinderung der Aspartimidbildung eingesetzten Backbone Amidschutzgruppen
Dmab [115]; EDOTn und MIM [112]
Die Verwendung einer Schutzgruppe, die unter den Bedingungen der SPPS stabil ist und sich
während der Abspaltung in unreaktive Moleküle zersetzt, wie die von Carpino et al. [14,15]
eingeführte Dicyclopropylmethyl Gruppe (Dcpm), stellt in diesem Fall eine sehr viel
elegantere Lösung des Problems dar.
- 24 -
3.4
Die Backbone Amidschutzgruppe Dcpm in der Peptidsynthese
Die Dicyclopropylmethyl (Dcpm) und die Dimethylcyclopropyl (Dmcp) Schutzgruppen
wurden ursprünglich sowohl als Amidseitenkettenschutz für Asparagin und Glutamin, als
auch als Carboxylschutzgruppe am C-Terminus von Peptiden entwickelt [14]. Für die
Darstellung von Dcpm geschützten Aminosäuren in der SPPS mittels der Fmoc/tert-Butyl
Strategie entwickelten Carpino et al. [15] ein fünfstufiges Synthesekonzept. Im ersten Schritt
wird dabei ausgehend vom Dicyclopropylketon das entsprechende Iminhydrochlorid,
katalysiert durch TiCl4, zuerst durch die Einleitung von gasförmigem Ammoniak und
anschließend durch Chlorwasserstoffeinleitung generiert [116,117]. Als nächstes folgt dann
die Kondensation mit der jeweiligen Benzylester geschützten Aminosäure gefolgt von der
Reduktion mit NaCNBH3 zur N-Dcpm und O-Benzylester geschützten Aminosäure. Durch
katalytische Hydrierung mit Wasserstoff über Pd/C gefolgt von der Acylierung durch FmocCl wird die entsprechende Fmoc-(Dcpm)-Aminosäure erhalten (Abbildung 13).
O
O
Cl
1) NH3, TiCl4
2) HCl
H2N
NH2
O
O
R
N
O
R
NaCNBH3
O
H
N
H2
O
O
H
N
Pd/C
OH
R
R
Fmoc-Cl
N
R
Fmoc
O
OH
Abbildung 13: Schematische Darstellung des Synthesekonzepts gemäß Carpino et al. für Fmoc-(Dcpm)
geschützte Aminosäuren [15]
Im Gegensatz zu den bekannten Backbone Amidschutzgruppen Hmb und Dmb, bei denen
relativ stark saure Bedingungen für deren Abspaltung vom Peptid nötig sind [102,112], ist es
möglich, die Dcpm-Gruppe unter sehr schwach sauren Bedingungen vom gewünschten Peptid
abzuspalten. So konnte durch NMR-Untersuchungen gezeigt werden, dass bereits
Konzentrationen von z. B. 5 % TFA in Chloroform für die Abspaltreaktion ausreichend sind
[19,101].
- 25 -
3.5
NMR Untersuchungen von Peptiden
Um Strukturinformationen über Peptide in Lösung zu erhalten, können Untersuchungen mit
Hilfe von CD- und auch NMR Spektroskopie durchgeführt werden. Ziel dieser
Untersuchungen ist, ein Strukturmodell des entsprechenden Peptids zu erhalten und somit
einen möglichen Einblick in dessen biologische Wirkungsweise zu gewinnen.
Bei der Probenvorbereitung ist es dabei sehr wichtig, dass man so gut wie möglich versucht,
die physiologische Umgebung des zu untersuchenden Peptids bei den Messbedingungen zu
simulieren. Bei 1H NMR Untersuchungen von Peptiden weisen die eindimensionalen
Spektren eine sehr starke Überlappung der Signale auf, was eine eindeutige Zuordnung
meistens nicht möglich macht. Durch zweidimensionale 1H NMR Untersuchungen kann eine
Art „Entzerrung“ der Spektren in dem Sinn erreicht werden, dass die Überlappung der
Resonanzsignale der Protonen aufgehoben wird. Bei der PFT-Methode (Puls-FourierTransform) der NMR Spektroskopie wird der Abfall der transversalen Magnetisierung (FID,
free induction decay) als Signal gemessen. Dabei ist das Empfängersignal eine Funktion der
Detektionszeit t2. Erfolgt eine Variation der Evolutionszeit t1, die zwischen dem ersten
Impuls und der Datenaufnahme liegt, so ist das Empfängersignal eine Funktion von t1 und t2.
Die anschließende Fourier-Transformation beinhaltet dann ebenfalls zwei Frequenzvariablen
F1 und F2, was die Grundlage der zweidimensionalen NMR Spektroskopie darstellt [118]. Es
wird bei den zweidimensionalen NMR Spektren im Allgemeinen zwischen den J-aufgelösten
(J-resoveld) und den korrelierten (correlated) 2D Spektren unterschieden [118]. Die
homonuklearen J-aufgelösten 2D Experimente enthalten nach einem primären 90°-Impuls
eine Evolutionszeit t1, in derren Mitte ein weiterer 180°-Impuls liegt. Nach jeden Impulspaar
nimmt t1 um einen konstanten Betrag zu. Während der Evolutionszeit t1 wird nur die skalare
Kopplung entwickelt, so dass die F1-Information ausschließlich Kopplungen enthält. Die F2Information hingegen enthält das gesamte Spektrum. Nach entsprechender mathematischer
Umformung (Fourier-Transformation) enthält man dann ein Konturdiagramm, in dem die
Spinmuster von oben betrachtet werden (in Abbildung 14 für ein Dublett und ein Triplett
veranschaulicht). Eine Projektion auf die F2-Achse liefert dann ein vollständig entkoppeltes
1
H NMR Spektrum, wo jede Resonanz als Singulett widergegeben ist. Mit dieser Methode ist
die Zuordnung von stark überlappenden Multipletts möglich. Ein Nachteil besteht aber in der
relativ langen Messzeit und dem Auftreten von Signalartefakten bei stark gekoppelten
Spinnsystemen. Eine größere Bedeutung haben die korrelierten zweidimensionalen NMR
Spektren.
- 26 -
+10Hz
0Hz
F1
-10Hz
δ1
δ2
F2
Abbildung 14: Schematisches Konturdiagramm eines J-aufgelösten 2D 1H NMR Spektrum für ein Dublett
und ein Triplett mit Projektionen auf die F1- und F2-Achse [118]
Die korrelierten 2D NMR Spektren enthalten in beiden Frequenzachsen (F1 und F2) die
chemischen Verschiebungen. Es gibt hierbei verschiedene Verfahren wie beispielsweise
COSY, TOCSY, NOESY etc., die alle eine unterschiedliche Pulssequenz und graphische
Darstellungen aufweisen. Es werden mit diesen Methoden homonukleare
1
1
H Shift-
1
Korrelationen erhalten, die die H- H-Kopplungen eines Moleküls widergeben.
F2
δ1
δH
δ2
δ3
δ3
δ2
δ1
F1
δH
Abbildung 15: Schematisches Konturdiagramm eines 1H korrelierten zweidimensionalen NMR Spektrums
eines Drei-Spin-Systems mit zwei Kopplungen [118]
In Abbildung 15 ist als Beispiel ein 1H korreliertes 2D Spektrum eines Drei-Spin-Systems
dargestellt. Das normale 1D 1H NMR Spektrum liegt im Konturdiagramm auf der Diagonale.
Die ausgefüllten schwarzen Kreise stellen Kreuzungspunkte (cross-peaks) dar. In diesem Fall
koppelt δ3 mit δ1 und mit δ2. Die leeren Kreise symbolisieren dagegen, dass zwischen δ1 und
- 27 -
δ2 keine Kopplung vorliegt. Bei den COSY und TOCSY Experimenten werden dabei
Korrelationen (cross peaks) zwischen den Protonen beobachtet, die auf der Konektivität über
die chemischen Bindungen (skalare Kopplungen) beruhen. Im NOESY Spektrum hingegen
zeigen die Kreuzsignale (cross peaks) die räumliche Nachbarschaft der Kerne an, und sind auf
deren dipolaren Wechselwirkungen begründet. Diese NOE-Signale können bis zu einer
Entfernung von ca. 5Å nachgewiesen werden [118,119,120,121]. Mit Hilfe der
zweidimensionalen NMR Experimenten (COSY, TOCSY, NOESY) lassen sich die
Spinsysteme der einzelnen Aminosäuren zuordnen [119,120,121].
Die anschließenden Berechnungen zur Moleküldynamik und Energieminimierung mit Hilfe
der erhaltenen NOE-Daten sollen dann ein möglichst repräsentatives Ergebnis des
untersuchten Peptids in Lösung liefern.
- 28 -
4
Zielstellung
Das vorangige Ziel dieser Arbeit bestand darin, relativ lange virale Regulatorpeptide bzw.
Proteine synthetisch herzustellen. Diese synthetischen Peptide sollten anschließend für
biologische Experimente im Arbeitskreis von Prof. Dr. U. Schubert an der Universität
Erlangen-Nürnberg und für Untersuchungen zur Strukturbestimmung in Lösung in der
Arbeitsgruppe von Dr. V. Wray am Helmholtz-Zentrum für Infektionsforschung in
Braunschweig eingesetzt werden. Es wurden Peptide mit einer Länge von bis zu 96
Aminosäuren resultierend vom Humanen Immundefizienzvirus Typ 1 (HIV-1) synthetisiert,
aber auch schwerpunktmäßig Influenza A Virus (IAV) Peptide von drei verschiedenen
Stämmen (humane und aviäre). Bei den IAV Peptiden handelte es sich um verschiedene
Peptide, die alle zu der Gruppe der PB1-F2 Peptide mit einer Länge von bis zu 90
Aminosäuren gehören.
Bei der Synthese von Peptiden mit einer Länge von mehr als 50 Aminosäuren stellen die
Wechselwirkungen zwischen den einzelnen Peptidketten, wie beispielsweise die Ausbildung
von Wasserstoffbrückenbindungen, am polymeren Träger ein gravierendes Problem dar.
Durch die damit verbundene Aggregation der Peptidketten wird das so genannte reaktive
Zentrum für die Kupplung der nächsten folgenden Aminosäure sehr stark abgeschirmt.
Dadurch wird ein Angriff der als Aktivester vorliegenden Aminosäure entweder sehr stark
behindert oder sogar ganz unterbunden. Im Gegensatz zu der klassischen kontinuierlichen
Methode der Festphasenpeptidsynthese (SPPS) sollte im Rahmen dieser Arbeit die
konvergente Methode der „Native Chemical Ligation“ (NCL) auf die Synthese von viralen
Regulatorproteinen mit einer Länge von bis zu 96 Aminosäuren (Synthese von Vpr)
angewendet werden. Bei diesem Konzept werden Fragmente des eigentlich zu
synthetisierenden Peptids, die auf Grund ihrer kürzeren Aminosäuresequenz mit Hilfe der
SPPS leichter zu erhalten sind, zum fertigen „full-length“ Peptid kondensiert. Darüber hinaus
sollten die gewonnenen Erkenntnisse (Synthese von PR8) dann auch auf die Gewinnung von
bisher nicht synthetisierten Peptiden (Synthese von SF2 und Mutanten von BF2) angewendet
werden.
Um die Aggregation von Peptidketten während der Synthese am Harz zu verhindern, war es
das Ziel, die Amidfunktion von Glycin mit der Dicyclopropylmethyl (Dcpm) Gruppe zu
schützen und anschließend für die Synthese eines Modellpeptids einzusetzen. Die urspünglich
von Carpino et al. [14] als Carboxylschutzgruppe und als Schutzgruppe für die
Amidseitenkettenfunktionen von Glutamin und Asparagin entwickelte Dcpm Schutzgruppe
- 29 -
sollte in der vorliegenden Arbeit für die Maskierung des Stickstoffatoms von Glycin im
Peptidrückgrat verwendet werden. Mit Hinblick auf die in der Literatur bekannte
Nebenreaktion der Aspartimidbildung bei Peptiden war es ein Ziel, durch die Entwicklung
eines neuen Synthesebausteins die Anwendung von Dcpm geschütztem Glycin als Dipeptid
Fmoc-Asp(OtBu)-(Dcpm)Gly-OH
zu
vereinfachen.
Durch
die
Verwendung
des
Dipeptidbausteins wird das Risiko einer unvollständigen Acylierung durch Asparaginsäure
während der nächsten Kupplung minimiert. Die bei diesem neuen Dipeptidbaustein integrierte
Dcpm-Gruppe kann unter sehr milden leicht sauren Bedingungen nach erfolgreicher
Peptidsynthese problemlos mit abgespalten werden. Die Entwicklung des Dipeptids FmocAsp(OtBu)-(Dcpm)Gly-OH stellt eine Alternative dar, zu den kommerziell erhältlichen Hmb
und Dmb Derivaten Fmoc-Asp(OtBu)-(Hmb)Gly-OH und Fmoc-Asp(OtBu)-(Dmb)Gly-OH
(Novabiochem, Merck Biosciences und NeoMPS), für deren Abspaltung drastischere
Abspaltbedingungen, das heißt längere Reaktionszeiten in stark saurem Milieu, nötig sind.
Um den sterischen Einfluss der Seitenkettenfunktion der Aminosäure auf die Dcpm-Gruppe
zu untersuchen, wurden neben Glycin auch Alanin und Leucin mit dieser neuen BackboneSchutzgruppe modifiziert und mittels NMR Spektroskopie analysiert.
- 30 -
5
5.1
Experimenteller Teil
Material und Methoden
Die verwendeten Lösungsmittel von technischer Qualität wurden vor der Benutzung
destilliert. Für die Reaktionen verwendete Lösungsmittel wurden durch Destillation wie folgt
getrocknet: DCM über Calciumhydrid, Benzol und Toluol über Natrium / Benzophenon.
Die SPPS wurden entweder bei Raumtemperatur mit einem automatischen Peptidsynthesizer
ABI 433A mit UV-Detektor von Applied Biosystems oder bei höheren Temperaturen mit dem
Mikrowellen Peptidsynthesizer Liberty von CEM durchgeführt. Die Synthesen erfolgten
jeweils im 0.1 mmol Maßstab unter Verwendung der Fmoc/tert-Butyl Strategie. Die
folgenden Schutzgruppen für die Seitenketten der entsprechenden Aminosäuren wurden
während
der
automatischen
Synthesen
verwendet:
2,2,4,6,7-pentamethyl-dihydro-
benzofurane-5-sulfonyl (Arg), tert-butyloxycarbonyl (Trp, Lys), tert-butyl ether (Thr, Ser,
Tyr), tert-butyl ester (Asp, Glu), und trityl (Asn, Cys, Gln, His). Lösungsmittel, die für die
Peptidsynthese eingesetzt wurden, waren von der Qualität „peptide synthesis grade“.
Die Schmelzpunkte wurden mit einem Schmelzpunktbestimmer von Apotec mit einer offenen
Glaskapillare ermittelt und sind unkorrigiert.
Die Reinigung der Peptide erfolgte auf einem Shimadzu LC8 System. Deren analytische
Kontrolle mittels RP-HPLC wurde mit einem Shimadzu LC10 System durchgeführt. Für die
Reinigung mittels HPLC wurden Lösungsmittel der Qualtität „HPLC grade“ verwendet.
Die eindimensionalen NMR Spektren wurden entweder mit einem Bruker DPX 300 mit
Autosampler bei 300 MHz für 1H und 75 MHz für
1
13
C, mit einem Bruker AV 400 mit
13
Autosampler bei 400 MHz für H und 100 MHz für C oder mit einem Bruker AV 600 bei
600 MHz für 1H und 150 MHz für
13
C gemessen. Die Messung der zweidimensionalen
homonuclearen 1H NMR Spektren (TOCSY und NOESY) der synthetisierten Peptide erfolgte
mit einem Bruker Avance Gerät bei 600 MHz ausgestattet mit einem UltraShield Plus
Magneten
und
einem
dreifachen
Resonanzcryoprobenkopf
(1H/13C/15N)
mit
Gradienteneinheit. Für die Messungen der Peptide SF2(1-40), SF2(30-70) und SF2(50-90)
wurden diese in 50%igem wässrigem TFE-d2 bei einem pH-Wert von ca. 3 gelöst. Die
Peptidlösungen hatten eine Konzentration von 1.4, 1.6 bzw 1.1 mmol. Die Messungen
erfolgten bei einer Temperatur von 300 K. Die Spektren wurden mit Mischzeiten von 110 ms
beim TOCSY und 250 ms beim NOESY jeweils ohne Rotation aufgenommen. Die
Datenaufnahme, Prozessierung und die Spektrenanalyse erfolgten mittels einer Standard
- 31 -
Bruker Software. Die chemischen Verschiebungen sind in ppm angegeben und beziehen sich
auf das restliche Protonensignal des jeweiligen Lösungsmittels bzw. auf das interne
Methylensignal bei 3.95 ppm bei den Spektren in 50%igem TFE-d2. Die Identifizierung der
eindeutigen Spinsysteme der jeweiligen Aminosäuren und deren sequentielle Zuordnung
erfolgte in Anlehnung an die Vorgehensweise von Wüthrich [121]. Die für die
Peptidstrukturberechnungen benötigten Abstände zwischen den Protonen wurden durch die
Umwandlung der entsprechenden NOE-Signale mit dem Bruker Programm AURELIA
bestimmt, wobei nur eindeutige NOE-Signale für diese Analyse berücksichtigt wurden [122].
Dabei wurde der Abstand der Amidprotonen in den Seitenketten der Aminosäuren Gln oder
Asn auf 0.19 nm kalibriert. Die Peptidstrukturen wurden auf einer Octane Workstation von
Silicon Graphics berechnet unter Verwendung des Programms CNS 1.0 mit den
Standardparametern für CNS [123]. Die Bestimmung der jeweiligen Kernstrukturen erfolgte
mit den Programmen LSQMAN und MOLEMAN2 von Uppsala Software Factory [124,125].
Die graphische Darstellung der Strukturen wurde mit dem Programm PYMOL durchgeführt
[126]. Die oben beschriebenen Verfahren zur Strukturaufklärung von Peptiden in Lösung
wurden bereits in Arbeiten von Bruns et al. [9,127] und Fossen et al. [128] erfolgreich
angewendet und beschrieben.
Matrix assisted laser desorption ionization mass spectra (MALDI-MS) wurden aufgenommen
an einem Voyager-DE PRO BioSpectrometry Workstation von Applied Biosystems. Die
Peptidproben wurden in 50%igem wässrigem Acetonitril gelöst. Als Matrix wurde α-Cyano4-hydroxyzimtsäure verwendet. Positive ion electrospray ionization mass spectra (ESI-MS)
wurden mit einem Micromass Q-Tof-2 Massenspektrometer gemessen. Die Proteinproben
wurden in 70%igem wässrigem Methanol gelöst und in die Electrospraykammer mit einer
Nadelspannung von 0.9 kV bei einer Flussrate 40 nl/min injiziert.
Hochaufgelöste Massenspektren (HR-MS) wurden mit einer LCT Premier XE UPLC-Anlage
von Waters mit einer ACQUITY ACR UI HSST3 Säule (100 x 2.1 mm, 1.8 µm) bei einer
Säulentemperature von 35 °C gemessen bei einem Gradienten von 5 % Acetonitril / 95 %
Wasser auf 95 % Acetonitril / 5 % Wasser in 10.5 min bei einer Flussrate von 0.6 ml/min.
- 32 -
5.2
Peptidsynthesen
Bei den regulatorischen Viruspeptiden, die im Rahmen dieser Arbeit zum Teil erstmalig
synthetisch hergestellt wurden, handelt es sich zum einen um Peptide des Humanen
Immundefizienzvirus Typ 1 (HIV-1) [4,5,8], wie Vpr und p6. Zum anderen wurden drei
verschiedene PB1-F2 Peptide von humanen und aviären Influenza A Virus Stämmen [1]
synthetisiert, sowie das p9 Peptid vom Virus der infektiösen Anämie der Einhufer (EIAV)
[6,7].
5.2.1
Herstellung der Gag Peptide p6 (HIV) und p9 (EIAV)
Das HIV Gag Peptid p6 (HIV-1NL4-3) mit einer Länge von 52 Aminosäuren und auch das
EIAV Gag Peptid p9 (Isolat EIAWYOMING) mit einer Länge von 51 Aminosäuren wurden
mittels klassischer step-by-step Methode am Trägerharz synthetisiert.
P6
A
1
10
20
30
40
50
L QS R PE P TA P -P E E S FR F G E E -T T T PS Q K Q E P- ID K EL Y PL A S - LR S L F G SD P S- S Q
B
1
P9
10
20
30
40
50
P IQ Q KS Q HN K - S V VQ E T P Q TQ - NL Y PD L SE I K- KE Y NV K EK D Q- V ED L NL D SL W -E
Abbildung 16: Aminosäuresequenz der Peptide p6(1-52) (A): (Die unterstrichenen Aminosäuren markieren
die Positionen, wo zur Syntheseoptimierung Pseudoproline bzw. für Thr-22 die sterisch
anspruchsvollere Trt-Seitenkettenschutzgruppe eingesetzt wurden.); und p9(1-51) (B): (Die
unterstrichenen Aminosäuren markieren die Position, wo zur Syntheseoptimierung
Pseudoprolin verwendet wurde.)
Synthese von p9 (EIAV)
Für die Synthese wurden 300 mg TentaGel S Trt-Glu(tBu)-Fmoc Harz (Beladung 0.17
mmol/g, Rapp Polymere) verwendet. Zur Erhöhung der Syntheseeffizienz wurden nach der
Kupplung der 4. Aminosäure Ser-48 Doppelkupplungen durchgeführt und HATU als
Kupplungsreagenz verwendet. Die Abspaltung der temporären Fmoc Schutzgruppe erfolgte
während der gesamten Synthese mit 20 % Piperidin in DMF. Zur Verringerung der
- 33 -
Interaktionen zwischen den Peptidketten und deren Aggregation am Harz während der
Synthese wurde Fmoc-Lys(Boc)-Ser(ΨMe,Mepro)-OH an der Position Lys-10/Ser-11 eingesetzt
(Abbildung 16). Die Abspaltung des so synthetisierten Peptids erfolgte mit TFA : Wasser :
TIPS (95:3:2, v/v/v) für 1.5 h bei Raumtemperatur. Nach dem Einengen der Abspaltlösung
am Rotationsverdampfer wurde das Rohprodukt durch die Zugaben von eiskaltem Et2O
ausgefällt, abgesaugt und anschließend aus 10 %iger Essigsäure : MeCN (3:1, v/v)
lyophilisiert.
Ausbeute Rohprodukt:
173 mg (28.57 µmol, 56 %), weißer Feststoff, Reinheit laut RP-HPLC 52 %
Die Reinigung von jeweils ca. 35 mg Rohprodukt mittels RP-HPLC erfolgte bei einem
Gradienten von 35 % B auf 65 % B in 50 min (A: 2000 ml MeCN + 500 ml H2O + 5 ml TFA;
B: 2500 ml MeCN + 5 ml TFA) mit einer Zorbax 300SB_C18 Säule (250 x 21.2 mm, 7 µm)
bei einer Flussrate von 10 ml/min und einer Wellenlänge von λ = 220 nm.
Ausbeute nach Reinigung mittels RP-HPLC:
6.7 mg (1.11 µmol, 20 % bezogen auf die zur Reinigung eingesetzte Menge Rohprodukt)
A
B
Rt = 19.342 min
p9(1-51)
0
5
10
15
20
25
Rt [min]
Rt = 19.393 min
p9(1-51)
0
5
10
15
20
25
Rt [min]
Abbildung 17: Analytische HPLC Chromatogramme vom Rohpeptid (A) und vom gereinigten Peptid p9(151) (B): Gradient: 10% B Æ 100% B in 45 min (A: 2000 ml MeCN + 500 ml H2O + 5 ml
TFA; B: 2500 ml MeCN + 5 ml TFA); Fluss: 1 ml/min; λ = 220 nm; Säule: Nucleosil C18 (125
x 4.6 mm, 5 µm)
- 34 -
MALDI-MS:
berechnet: 6055.72 Da
gefunden: 6056.46 Da (M+)
3027.54 Da (M2+)
Voyager Spec #1[BP = 6055.9, 42496]
6056.46
100
4.2E+4
90
80
% Intensity
70
60
50
40
30
20
10
0
999.0
6093.75
3027.54
2399.4
3799.8
5200.2
6600.6
8001.0
Mass (m/z)
Abbildung 18: MALDI-MS Spektrum vom gereinigten Peptid p9(1-51)
Synthese von p6 (HIV)
Für die Synthese wurden 300 mg TentaGel S Trt-Gln(Trt)-Fmoc Harz (Beladung
0.20 mmol/g, Rapp Polymere), verwendet. Zur Erhöhung der Syntheseeffizienz wurden nach
der Kupplung der 8. Aminosäure Phenylalanin Doppelkupplungen durchgeführt. Als
Kondensationsreagenz wurde HBTU verwendet. Die Abspaltung der Fmoc Schutzgruppe
erfolgte während der Synthese mit 20 % Piperidin in DMF. Zur Verringerung der
Interaktionen zwischen den Peptidketten und deren Aggregation am Harz während der
Synthese wurden die Pseudoproline Fmoc-Glu(OtBu)-Ser(ΨMe,Mepro)-OH an der Position
Glu-13/Ser-14 und Fmoc-Ala-Ser(ΨMe,Mepro)-OH an Position Ala-39/Ser-40 eingesetzt.
Weiterhin wurden in dem Sequenzmotiv Thr-21/Thr-22/Thr-23 die Doppelkupplungen in
folgender Weise modifiziert. Für Thr-21 wurde als Seitenkettenschutzgruppe die tert-Butyl
Gruppe verwendet. Bei Thr-22 wurde für die erste Kupplung die sterisch anspruchsvollere
Trityl Gruppe eingesetzt, wobei nur von einem Reaktionsumsatz von ca. 80 % ausgegangen
werden kann. Durch den Einsatz der größeren Trityl Schutzgruppe soll die Ausbildung von
Sekundärstrukturen und die Interaktion der Peptidketten untereinander verhindert werden, um
so die Reinheit und Ausbeute des Rohproduktes zu erhöhen. Im zweiten Reaktionsschritt
wurde dann erneut die kleinere tert-Butyl Gruppe als Seitenkettenschutz für Thr-22
eingesetzt, um eine vollständige Kupplung an der Position Thr-22 zu erreichen. Die Kupplung
von Thr-23 wurde dann wieder als Doppelkupplung mit der standardmäßig verwendeten tertButyl Seitenkettenschutzgruppe für Threonin durchgeführt. Die Abspaltung des Peptids vom
Harz erfolgte mit TFA : Wasser : TIPS (95:3:2, v/v/v) für 3.5 h bei Raumtemperatur. Nach
dem Einengen der Abspaltlösung am Rotationsverdampfer wurde das Rohprodukt durch die
- 35 -
Zugabe von eiskaltem Et2O ausgefällt, abgesaugt und anschließend aus 10 %iger Essigsäure :
MeCN (3:1, v/v) lyophilisiert.
Ausbeute Rohprodukt:
18 mg (3.1 µmol, 5 %), weißer Feststoff, Reinheit laut RP-HPLC 77 %
Die Reinigung mittels RP-HPLC erfolgte bei einem Gradienten von 39 % B auf 64 % B in
50 min (A: 2000 ml MeCN + 500 ml H2O + 5 ml TFA; B: 2500 ml MeCN + 5 ml TFA) mit
einer Agilent C-18 Säule (250 x 30.0 mm, 10 µm) bei einer Flussrate von 20 ml/min und einer
Wellenlänge von λ = 220 nm.
Ausbeute nach Reinigung mittels RP-HPLC:
2.7 mg (0.465 µmol, 15 % bezogen auf die zur Reinigung eingesetzte Menge Rohprodukt)
A
B
Rt = 21.270 min
p6(1-52)
0
5
10
15
20
25
30
Rt [min]
Rt = 21.246 min
p6(1-52)
0
5
10
15
20
25
30
Rt [min]
Abbildung 19: Analytische HPLC Chromatogramme vom Rohpeptid (A) und vom gereinigten Peptid p6(152) (B): Gradient: 10 % B Æ 100 % B in 45 min (A: 2000 ml MeCN + 500 ml H2O + 5 ml
TFA; B: 2500 ml MeCN + 5 ml TFA); Fluss: 1 ml/min; λ = 220 nm; Säule: Zorbax
300SB_C18 (150 x 4.6 mm, 5 µm)
- 36 -
MALDI-MS:
berechnet: 5807.39 Da
gefunden: 5811.21 Da (M+)
2905.97 Da (M2+)
Voyager Spec #1[BP= 5810.7, 28001]
5811.21
100
2.8E+4
90
80
%Intensity
70
60
50
40
30
20
10
2905.97
0
1999.0
2999.4
5792.12
5768.00
3999.8
5000.2
6000.6
7001.0
Mass (m/z)
Abbildung 20: MALDI-MS Spektrum vom gereinigten Peptid p6(1-52)
Synthese der Mutanten p6(1-52; S14ÆN), p6(1-52; S25ÆN), p6(1-52; S40ÆN) und p6(152; S14, S25, S40ÆN)
Neben der Synthese des Wildtyps vom Peptid p6(1-52) wurden unter Verwendung des
Mikrowellen-Peptidsyntheseautomaten Liberty von CEM die in Tabelle 1 angegebenen
Mutanten des full-length p6(1-52) Peptids synthetisiert. Mit Hilfe dieser Mutanten, in denen
die Aminosäure Serin durch Asparagin an den Positionen 14, 25 und 40 ausgetauscht wurden,
erfolgten dann im Arbeitskreis von Prof. Dr. U. Schubert (Universität Erlangen-Nürnberg,
Institut für Molekulare und Klinische Virologie) Untersuchungen zur Phosphorylierung des
Peptids p6(1-52).
70 mg, 12.0 µmol, 24 %
Reinheit vom
Rohpeptid laut
HPLC
24 %
3.1 mg, 0.53 µmol, 4.4 %
p6(1-52; S25ÆN)
67 mg, 11.5 µmol, 23 %
33 %
3.0 mg, 0.51 µmol, 4.5 %
p6(1-52; S40ÆN)
40 mg, 6.9 µmol, 14 %
11 %
1.8 mg, 0.31 µmol, 4.5 %
p6(1-52; S14,S25,S40ÆN)
77 mg, 13.0 µmol, 26 %
37 %
1.3 mg, 0.22 µmol, 1.7 %
Peptid
Ausbeute an Rohpeptid
p6(1-52; S14ÆN)
Tabelle 1:
Ausbeute nach HPLCReinigung#
Synthetisierte Mutanten (SerÆAsn) vom Peptid p6(1-52), #Die prozentualen Angaben sind auf die
jeweils erhaltene Menge an Rohpeptid bezogen.
Die Synthesen der p6-Mutanten wurden jeweils an einem TentaGel S Trt-Gln(Trt)-Fmoc Harz
(250 mg, Beladung 0.20 mmol/g, Rapp Polymere) durchgeführt. Die Abspaltung der FmocGruppe erfolgte während der Synthese mit 20 % Piperidin in DMF, wobei für 210 Sekunden
- 37 -
bei einer maximalen Temperatur von 70 °C Mikrowellen mit einer Leistung von 35 W
eingestrahlt wurden. Zur Erhöhung der Effizienz wurden alle Aminosäurekupplungen als
Doppelkupplungen durchgeführt. Als Kondensationsreagenz wurde HBTU verwendet. Die
Kupplungsreaktionen wurden erst für 120 Sekunden bei Raumtemperatur und dann für 240
Sekunden bei einer maximalen Temperatur von 70 °C unter Mikrowelleneinstrahlung mit
einer Leistung von 35 W durchgeführt. Die Abspaltung der Peptide vom Harz erfolgte mit
TFA : Wasser : TIPS (95:3:2, v/v/v) für 3.5 h bei Raumtemperatur. Nach dem Einengen der
Abspaltlösung am Rotationsverdampfer wurden die Rohprodukte durch die Zugaben von
eiskaltem Et2O ausgefällt, abgesaugt und anschließend aus 10 %iger Essigsäure : MeCN (3:1,
v/v) lyophilisiert. Die Reinigung mittels RP-HPLC erfolgte dabei analog zur Vorgehensweise
wie sie bei der Synthese von p6(1-52) zuvor beschrieben wurde.
Synthese von p6_neu (HIV)
Die Synthese des Gag Peptids p6_neu(1-52) erfolgte an einem TentaGel S Trt-Gln(Trt)-Fmoc
Harz (350 mg, Beladung 0.20 mmol/g, Rapp Polymere) unter Verwendung des MikrowellenSyntheseautomaten Liberty. Die Abspaltung der Fmoc-Gruppe wurde mit 20 % Piperidin in
DMF durchgeführt, wobei für 210 Sekunden bei einer maximalen Temperatur von 50 °C
Mikrowellen mit einer Leistung von 35 W eingestrahlt wurden. Zur Erhöhung der Effizienz
wurden alle Aminosäuren durch Doppelkupplungen verknüpft. Als Kondensationsreagenz
wurde HBTU verwendet. Die Kupplungsreaktionen wurden erst für 120 Sekunden bei
Raumtemperatur und dann für 240 Sekunden bei einer maximalen Temperatur von 50 °C
unter Mikrowelleneinstrahlung mit einer Leistung von 25 W durchgeführt. Eine Ausnahme
bildet die Anknüpfung der Aminosäure Arginin. Arginin wurde erst für 25 Minuten bei
Raumtemperatur und anschließend für 300 Sekunden unter Mikrowellenstrahlung bei einer
maximalen Temperatur von 50 °C und einer Leistung von 25 W gekoppelt.
P 6_ neu
1
10
20
30
40
50
S RP E PT A PP A - E S FR F GE E IT - PT P SQ K QE P K - D KE LY P PL A S - L RS L FG N DP S -S Q
Abbildung 21: Aminosäuresequenz vom Peptid p6_neu(1-52)
- 38 -
Im Gegensatz zu den Synthesen der p6-Mutanten wurde hier die Temperatur für die
Kupplungsreaktionen und für die Abspaltung der Fmoc-Gruppe auf maximal 50 °C reduziert,
wodurch eine höhere Ausbeute des Rohpeptids im Verhältnis zur eingesetzten Harzmenge
erzielt werden konnte. Wahrscheinlich erfolgte bei Temperaturen oberhalb von 50 °C ein
partieller Verlust des Linkers am Harz, da bei allen Synthesen der p6-Mutanten und bei der
Synthese von p6_neu(1-52) das gleiche TentaGel S Trt-Gln(Trt)-Fmoc Harz verwendet
wurde.
Ausbeute Rohprodukt:
291 mg (50.6 µmol, 72 %), weißer Feststoff, Reinheit laut RP-HPLC 52 %
Die Reinigung von 25 mg Rohprodukt mittels RP-HPLC erfolgte bei einem Gradienten von
37 % B für 5 min isokratisch dann von 37 % B auf 62 % B in 50 min (A: 2000 ml MeCN +
500 ml H2O + 5 ml TFA; B: 2500 ml MeCN + 5 ml TFA) mit einer Zorbax 300SB_C-18
Säule (250 x 21.2 mm, 7 µm) bei einer Flussrate von 15 ml/min und einer Wellenlänge von
λ = 220 nm.
Ausbeute nach Reinigung mittels RP-HPLC:
7.3 mg (1.27 µmol, 29 % bezogen auf die zur Reinigung eingesetzte Menge Rohprodukt)
A
B
Rt = 20.754 min
p6_neu(1-52)
0
5
10
15
20
25
Rt = 20.849 min
p6_neu(1-52)
0
30
5
10
15
20
25
30
Rt [min]
Rt [min]
Abbildung 22: Analytische HPLC Chromatogramme vom Rohpeptid (A) und vom gereinigten Peptid
p6_neu(1-52) (B): Gradient: 10 % B Æ 100 % B in 45 min (A: 2000 ml MeCN + 500 ml H2O
+ 5 ml TFA; B: 2500 ml MeCN + 5 ml TFA); Fluss: 1 ml/min; λ = 220 nm; Säule: Zorbax
300SB_C18 (150 x 4.6 mm, 5 µm)
- 39 -
MALDI-MS:
berechnet: 5756.39 Da
gefunden: 5753.02 Da (M+)
2877.54 Da (M2+)
Voyager Spec #1[BP = 5752.9, 2165]
5753.02
100
2165.1
90
80
% Intensity
70
60
50
40
30
5776.55
5852.96
20
10
2877.54
563.73
0
499.0
1799.4
3099.8
4400.2
Mass (m/z)
Abbildung 23: MALDI-MS Spektrum vom gereinigten Peptid p6_neu(1-52)
- 40 -
5700.6
7001.0
5.2.2
Herstellung des Humanen Immundefizienzvirus Peptids Vpr mit klassischer
SPPS und mit NCL sowie dessen anschließende N-terminale Biotinylierung
Beim regulatorischen HIV Peptid Vpr (HIV-1NL4-3) handelt es sich um ein Peptid mit einer
Kettenlänge von 96 Aminosäuren. Die klassische Synthese mittels SPPS, wie sie Henklein et
al. beschrieben haben [8], wurde durch die Verwendung eines neuartigen auf
Polyethylenglycol (PEG) basierenden Aminomethyl-Harzes H-Ser(OtBu)-HMPB (260 mg,
Beladung 0.21 mmol/g, ChemMatrix) und durch den Einsatz von Pseudoprolinen optimiert.
Dieses neue Harz, im Weiteren als CM-Harz bezeichnet, weist bessere Quelleigenschaften in
vielen gängigen organischen Lösungsmitteln auf, als es bei herkömmlichen PS-Harzen der
Fall ist [129].
Um die Effizienz der Synthese zu erhöhen wurden nach der Kupplung der 5. Aminosäure
Glycin Doppelkupplungen durchgeführt. Als Kupplungsreagenz wurde HBTU verwendet. Die
Fmoc Schutzgruppe wurde mit 20 % Piperidin in DMF abgespalten. Zur Verhinderung der
Aggregation der sich stetig verlängernden Peptidkette während der Synthese wurden die
Pseudoprolin-Bausteine Fmoc-Trp(Boc)-Thr(ΨMe,Mepro)-OH für Trp-18/Thr-19, FmocLys(Boc)-Ser(ΨMe,Mepro)-OH für Lys-27/Ser-28, Fmoc-Asp(OtBu)-Thr(ΨMe,Mepro)-OH für
Asp-52/Thr-53 und Fmoc-Val-Thr(ΨMe,Mepro)-OH für Val-83/Thr-84 eingesetzt (Abbildung
24). Die Abspaltung des fertigen Peptids erfolgte mit TFA : Wasser : TIPS (95:3:2, v/v/v) für
3.5 h bei Raumtemperatur. Nach dem Einengen der Abspaltlösung am Rotationsverdampfer
wurde das Rohprodukt durch die Zugaben von eiskaltem Et2O ausgefällt, abgesaugt und
anschließend aus 10 %iger Essigsäure : MeCN (3:1, v/v) lyophilisiert.
Vpr
1
10
20
30
40
50
M E QA P E DQ G P -Q R E P YN E W T L - E LL E E L K S E A- V R H FP R I WL H - N LG Q H IY E T Y60
70
80
90
96
G D T W A G VE A I -I R I LQ Q L L FI - H FR I G C RH S R -I G V T R Q R RA R - N GA S R S
Abbildung 24: Aminosäuresequenz der Peptids Vpr(1-96): (Die unterstrichenen Aminosäuren markieren die
Positionen, an denen der Einsatz von Pseudoprolinen zur Syntheseoptimierung erfolgte.)
Ausbeute Rohprodukt:
60 mg (5.273 µmol, 19 %), weißer Feststoff, Reinheit laut RP-HPLC 48 %
- 41 -
Die Reinigung von jeweils ca. 20 mg Rohprodukt mittels RP-HPLC erfolgte bei einem
Gradienten von 61 % B für 5 min isokratisch dann von 61 % B auf 91 % B in 50 min (A:
2000 ml MeCN + 500 ml H2O + 5 ml TFA; B: 2500 ml MeCN + 5 ml TFA) mit einer Zorbax
300SB_C18 Säule (250 x 21.2 mm, 7 µm) bei einer Flussrate von 15 ml/min und einer
Wellenlänge von λ = 220 nm.
Ausbeute nach Reinigung mittels RP-HPLC:
2.8 mg (0.246 µmol, 4.6 % bezogen auf die gesamte Menge an erhaltenem Rohprodukt)
A
B
Rt = 34.042 min
Vpr(1-96)
0
10
20
30
40
Rt = 34.176 min
Vpr(1-96)
0
10
Rt [min]
20
30
40
Rt [min]
Abbildung 25: Analytische HPLC Chromatogramme vom Rohpeptid (A) und vom gereinigten Peptid Vpr(196) (B): Gradient: 10 % B Æ 100 % B in 45 min (A: 2000 ml MeCN + 500 ml H2O + 5 ml
TFA; B: 2500 ml MeCN + 5 ml TFA); Fluss: 1 ml/min; λ = 220 nm; Säule: Nucleosil C18 (125
x 4.6 mm, 5 µm)
MALDI-MS:
berechnet: 11377.98 Da
gefunden: 11375.33 Da (M+)
5685.14 Da (M2+)
3124.54 Da (Fragment)
Voyager Spec #1[BP= 3124.4, 266]
3124.54
100
266
5685.14
90
11375.33
% Intensity
80
11365.95
70
60
50 1084.53
40 1109.61
30
1326.23
11405.54
3665.39
3202.70
20
5639.97
4488.70
11492.28
5596.59
10
0
1000.0
3400.6
5801.2
8201.8
Mass (m/z)
Abbildung 26: MALDI-MS Spektrum vom gereinigten Peptid Vpr(1-96)
- 42 -
10602.4
13003.0
Biotinylierung am N-Terminus
Für biologische Untersuchungen im Arbeitskreis von Prof. Dr. U. Schubert (Universität
Erlangen-Nürnberg, Institut für Molekulare und Klinische Virologie) wurde am N-Terminus
von Vpr(1-96) Biotin angeknüpft. Dafür wurde ein Teil des Harzes vor der Endabspaltung
abgenommen. Das Harz mit dem verankerten Peptid Vpr(1-96) wurde dazu in 4 ml DMF
gequollen und anschließend wurden 67 mg (10 eq, 0.273 mmol) Biotin, 104 mg (10 eq, 0.273
mmol) HATU und 92 µl (20 eq, 0.546 mmol, 70.6 mg, ρ = 0.76 g/cm3) DIPEA zugegeben
und die Reaktionsmischung über Nacht bei Raumtemperatur geschüttelt. Nach gründlichem
Waschen des Harzes mit DCM und DMF erfolgte die Abspaltung des biotinylierten Peptids
Vpr(1-96) mit TFA : Wasser : TIPS (95:3:2, v/v/v) für 3.5 h bei Raumtemperatur. Nach dem
Einengen der Abspaltlösung am Rotationsverdampfer wurde das Rohprodukt durch die
Zugaben von eiskaltem Et2O ausgefällt, gewaschen und abgesaugt. Anschließend wurde aus
10 %iger Essigsäure : MeCN (3:1, v/v) lyophilisiert.
Ausbeute Rohprodukt:
60 mg (5.170 µmol, 19 %), weißer Feststoff, Reinheit laut RP-HPLC 36 %
Die Reinigung von jeweils ca. 20 mg Rohprodukt mittels RP-HPLC erfolgte bei einem
Gradienten von 61 % B für 5 min isokratisch dann von 61 % B auf 91 % B in 50 min (A:
2000 ml MeCN + 500 ml H2O + 5 ml TFA; B: 2500 ml MeCN + 5 ml TFA) mit einer Zorbax
300SB_C18 Säule (250 x 21.2 mm, 7 µm) bei einer Flussrate von 15 ml/min und einer
Wellenlänge von λ = 220 nm.
Ausbeute nach Reinigung mittels RP-HPLC:
5.1 mg (0.439 µmol, 8.5 % bezogen auf die gesamte Menge an erhaltenem Rohprodukt)
- 43 -
A
B
Rt = 34.228 min
Vpr(1-96)+Biotin
0
10
20
30
Rt = 34.155 min
Vpr(1-96)+Biotin
0
40
10
20
30
40
Rt [min]
Rt [min]
Abbildung 27: Analytische HPLC Chromatogramme vom Rohpeptid (A) und vom gereinigten Peptid Vpr(196)+Biotin (B): Gradient: 10 % B Æ 100 % B in 45 min (A: 2000 ml MeCN + 500 ml H2O +
5 ml TFA; B: 2500 ml MeCN + 5 ml TFA); Fluss: 1 ml/min; λ = 220 nm; Säule: Nucleosil C18
(125 x 4.6 mm, 5 µm)
MALDI-MS:
berechnet: 11604.3 Da
gefunden: 11609.09 Da (M+)
5803.20 Da (M2+)
3873.12 Da (M3+)
Voyager Spec #1[BP = 5802.5, 1305]
5803.20
100
1305
5811.75
90
% Intensity
80
70
60
50
40
3873.12
30
20
1116.64
10
0
999
3881.92
3917.25
2217.75
2707.24
3599
5823.82
5782.75
11609.09
11598.48
5871.37
5722.99
5568.25
6199
8799
11399
13999
Mass (m/z)
Abbildung 28: MALDI-MS Spektrum vom gereinigten N-terminal biotinyliertem Peptid Vpr(1-96)+Biotin
- 44 -
Synthese mittels Native Chemical Ligation (NCL)
Um die Synthese des Peptids Vpr(1-96) zu vereinfachen wurde die Methode der „Native
Chemical Ligation“ (NCL) angewandt [34]. Die für die klassische NCL Reaktion nötige
Aminosäure Cystein ist in der Sequenz von Vpr(1-96) an Position 76 vorhanden. Die
Unterteilung des Gesamtpeptids Vpr(1-96) in zwei Fragmente sollte zur Verbesserung der
Synthese und der Erhöhung der Gesamtausbeute beitragen. Die Reduzierung der Länge des
N-Terminus immerhin um 20 Aminosäuren, sollte eine Vereinfachung für die Synthese dieses
Fragments erwarten lassen. Die Synthese des N-Terminus Vpr(1-75) wurde an einem 2Chlortrityl Harz durchgeführt, welches zuvor mit der ersten Aminosäure Glycin beladen
wurde. Dazu wurden 1 g des 2-Chlortritylchlorid Harzes (CBL Patras Griechenland) in 3 ml
DCM 5 min gequollen und anschließend mit 178.4 mg (0.6 mmol) Fmoc-Gly-OH versetzt
und 90 min bei Raumtemperatur geschüttelt. Anschließend wurde das Harz gründlich mit
DMF und DCM gewaschen und die freien Reaktionsstellen am Harz durch die Zugabe von
MeOH : DIEA (9:1, v/v) 15 min lang „gecappt“. Die Fmoc-Gruppe wurde anschließend mit
20 % Piperidin in DMF abgespalten und durch UV-Spektroskopie der Abspaltlösung bei
λ = 301 nm die Absorption und daraus die Harzbeladung bestimmt. Die Beladung betrug in
diesem Fall 0.217 mmol/g. Für die Synthese des N-Terminus Vpr(1-75) wurden 250 mg des
beschriebenen Gly-2-Cl-Trt Harzes und HBTU als Kupplungsreagenz verwendet. Zur
Verhinderung der Aggregation der sich stetig verlängernden Peptidkette wurden, wie auch
schon bei der „step-by-step“ Synthese des gesamten Peptids Vpr(1-96), Fmoc-Trp(Boc)Thr(ΨMe,Mepro)-OH für Trp-18/Thr-19 und Fmoc-Lys(Boc)-Ser(ΨMe,Mepro)-OH für Lys27/Ser-28 eingesetzt. Als Variation wurde jedoch Fmoc-Glu(OtBu)-Thr(ΨMe,Mepro)-OH für
Glu-48/Thr-49 an Stelle von Asp-52/Thr-53 verwendet (Abbildung 29).
- 45 -
Vpr
1
A
10
20
30
40
50
M E QA P E DQ G P -Q R E PY N E W T L -E L L EE L K S E A- V R HF P R I WL H - NL G Q HI Y E T Y 60
70
80
90
96
G D TW A G VE A I -I R I LQ Q L L FI - H FR I G CR H S R -I G V TR Q R RA R - NG A S R S
B
M1
G 75 C 76
V p r( 1 - 75 )
V p r( 7 6 -9 6 )
S 96
Abbildung 29: Aminosäuresequenz der Peptids Vpr(1-96); (A) Die unterstrichenen Aminosäuren markieren
die Positionen, wo der Einsatz von Pseudoprolinen zur Syntheseoptimierung erfolgte. (B)
Schematische Darstellung der beiden Fragmente für die NCL Reaktion zum Vpr(1-96)
Zur Vereinfachung wurde Met-1 bei der Synthese des α-Thiolesters von Vpr(1-75) als Bocgeschützte Aminosäure eingesetzt. Nach beendeter SPPS wurde das Peptid Vpr(1-75) unter
milden Bedingungen vom sehr säurelabilen 2-Cl-Trt Harz mit DCM : TFE : AcOH (3:1:1,
v/v/v) 2 h bei Raumtemperatur abgespalten, so dass alle Seitenkettenschutzgruppen noch am
Peptid vorhanden waren. Die Abspaltlösung wurde unter Zusatz von n-Heptan am
Rotationsverdampfer entfernt. Durch Zugabe von eiskaltem Et2O wurde das Rohprodukt
ausgefällt und anschließend aus Wasser : MeCN (1:1, v/v) lyophilisiert.
Für die Darstellung des α-Thiolester vom N-Terminus wurden 100 mg vom vollständig
geschützten Rohpeptid in 5 ml trocknem DCM zuerst mit 4 µl (3 eq, 21 µmol, ρ =
0.806 g/cm3) DIC dann mit 3 mg (3 eq, 21 µmol) HOBt*H2O und anschließend mit 17.5 mg
(15 eq, 0.105 mmol) para-Acetamidothiophenol versetzt [59]. Die Reaktionsmischung wurde
dann bei Raumtemperatur über Nacht geschüttelt. Anschließend wurde die Lösung am
Rotationsverdampfer eingeengt und die verbliebenen Schutzgruppen wurden mit TFA :
Wasser : TIPS (95:3:2, v/v/v) für 3.5 h bei Raumtemperatur abgespalten. Die Abspaltlösung
wurde am Rotationsverdampfer eingeengt und das Rohprodukt durch die Zugaben von
eiskaltem Et2O ausgefällt, abgesaugt und anschließend aus 10 %iger Essigsäure : MeCN (3:1,
v/v) lyophilisiert.
Ausbeute Rohprodukt:
83 mg (9.0994 µmol, 17 %), weißer Feststoff, Reinheit laut RP-HPLC 50 %
- 46 -
Die Reinigung von jeweils 28 mg Rohprodukt mittels RP-HPLC erfolgte bei 74 % B
isokratisch für 5 min und dann durch einen Gradienten von 74 % B auf 99 % B in 50 min (A:
2000 ml MeCN + 500 ml H2O + 5 ml TFA; B: 2500 ml MeCN + 5 ml TFA) mit einer Zorbax
300SB_C18 Säule (250 x 21.2 mm, 7 µm) bei einer Flussrate von 15 ml/min und einer
Wellenlänge von λ = 220 nm.
Ausbeute nach Reinigung mittels RP-HPLC:
7.0 mg (0.7674 µmol, 8 % bezogen auf die gesamte Menge an erhaltenem Rohprodukt)
A
B
Rt = 38.923 min
Vpr(1-75)_Thiolester
0
10
20
30
40
Rt = 38.981 min
Vpr(1-75)_Thiolester
0
10
20
Rt [min]
30
40
Rt [min]
Abbildung 30: Analytische HPLC Chromatogramme vom Rohprodukt (A) und vom gereinigten α-Thiolester
des Peptids Vpr(1-75) (B): Gradient: 10 % B Æ 100 % B in 45min (A: 2000 ml MeCN +
500 ml H2O + 5 ml TFA; B: 2500 ml MeCN + 5 ml TFA); Fluss: 1 ml/min; λ = 220 nm; Säule:
Nucleosil C18 (125 x 4.6 mm, 5 µm)
MALDI-MS:
berechnet: 9121.47 Da
gefunden: 9117.47 Da (M+)
4559.13 Da (M2+)
Voyager Spec #1[BP = 4558.8, 576]
4559.13
100
576
90
9117.47
% Intensity
80
2241.84
70
60
2376.18
50
40
2147.82
30
2782.75
20
2816.23
4488.59
4006.76
10
0
1999.0
3999.4
5999.8
8000.2
10000.6
Mass (m/z)
Abbildung 31: MALDI-MS Spektrum vom gereinigten α-Thiolester des Peptids Vpr(1-75)
- 47 -
12001.0
Die Synthese des für die NCL erforderlichen C-terminalen Peptid Vpr(76-96) wurde auf dem
Liberty-System von CEM durchgeführt. Die Kupplungen erfolgten erst für 120 Sekunden bei
Raumtemperatur und anschließend für 240 Sekunden unter Mikrowelleneinstrahlung bei einer
Leistung von 25 W und einer maximalen Reaktionstemperatur von 50 °C. Eine Ausnahme
bildete in dieser Sequenz die Aminosäure Arginin, die mit diesen Einstellungen nicht
ausreichend genug gekuppelt werden konnte. Aus diesem Grund erfolgte die Kupplung von
Arginin erst 25 Minuten bei Raumtemperatur und dann für 300 Sekunden unter
Mikrowelleneinstrahlung
mit
einer
Leistung
von
25
W
und
einer
maximalen
Reaktionstemperatur von 50 °C. Die Temperatur wurde nicht über 50 °C erhöht, weil es bei
einigen Harzen zu Komplikationen mit dem entsprechenden Linker am Harz kommen kann.
Bei der Verwendung von TCP Harzen (PepChem, Tübingen) wurde der Trityllinker
beispielsweise abgespalten und das Harz verfärbte sich rot bei Temperaturen oberhalb von
50 °C, so dass keine weiteren Aminosäuren an dieses Harz gekuppelt werden konnten. Die
Synthese des C-Terminus Vpr(76-96) wurde an 300 mg TentaGel S Trt-Ser(tBu)-Fmoc Harz
(Beladung 0.23 mmol/g, Rapp Polymere) mit HBTU als Kupplungsreagenz durchgeführt. Die
Abspaltung der temporären Fmoc-Gruppe erfolgte mit 20 % Piperidin in DMF, wobei für 210
Sekunden bei einer maximalen Temperatur von 50 °C Mikrowellen mit einer Leistung von 35
W eingestrahlt wurden. Nach der Kupplung von Aminosäure Asn-91 wurden für die
nachfolgenden Aminosäuren Doppelkupplungen durchgeführt, um die Effizienz der Synthese
zu erhöhen. Die Abspaltung des fertigen Peptids erfolgte mit TFA : Wasser : TIPS (95:3:2,
v/v/v) für 3.5 h bei Raumtemperatur. Nach dem Einengen der Abspaltlösung am
Rotationsverdampfer wurde das Rohprodukt durch die Zugaben von eiskaltem Et2O
ausgefällt, abgesaugt und anschließend aus 10 %iger Essigsäure : MeCN (3:1, v/v)
lyophilisiert.
Ausbeute Rohprodukt:
140 mg (57.76 µmol, 84 %), weißer Feststoff, Reinheit laut RP-HPLC 89 %
Die Reinigung von 140 mg Rohprodukt mittels RP-HPLC erfolgte bei 17 % B isokratisch für
5 min und dann mittels eines Gradienten von 17 % B auf 42 % B in 50 min (A: 2000 ml
MeCN + 500 ml H2O + 5 ml TFA; B: 2500 ml MeCN + 5 ml TFA) mit einer Kromasil C18
Säule (250 x 40 mm, 10 µm) bei einer Flussrate von 50 ml/min und einer Wellenlänge von
λ = 220 nm.
- 48 -
Ausbeute nach Reinigung mittels RP-HPLC:
62.5 mg (25.79 µmol, 45 % bezogen auf die gesamte Menge an erhaltenem Rohprodukt)
A
B
Rt = 9.632 min
Vpr(76-96)
0
2
4
6
8
10
12
Rt = 9.642 min
Vpr(76-96)
0
14
2
4
6
8
10
12
14
Rt [min]
Rt [min]
Abbildung 32: Analytische HPLC Chromatogramme vom Rohprodukt (A) und vom gereinigten C-Terminus
Vpr(76-96) (B): Gradient: 10 % B Æ 100 % B in 45 min (A: 2000 ml MeCN + 500 ml H2O +
5 ml TFA; B: 2500 ml MeCN + 5 ml TFA); Fluss: 1 ml/min; λ = 220 nm; Säule: Nucleosil C18
(125 x 4.6 mm, 5 µm)
MALDI-MS:
berechnet: 2423.75 Da
gefunden: 2422.82 Da (M+)
1211.97 Da (M2+)
Voyager Spec #1[BP = 2423.0, 6587]
2422.82
100
6587
90
% Intensity
80
70
60
50
40
30
2445.17
20
10
0
499.0
660.05
1211.97
1182.90
1399.4
2485.27
2540.14
2299.8
3200.2
4100.6
5001.0
Mass (m/z)
Abbildung 33: MALDI-MS Spektrum vom gereinigten C-Terminus Vpr(76-96)
Für die Ligation vom α-Thiolester des N-Terminus Vpr(1-75) mit dem C-Terminus Vpr(7696) wurden von beiden Fragmenten separat jeweils 7 mg in 0.5 ml einer 6 M
Guanidinhydrochlorid Lösung gelöst, wobei das Verhältnis vom α-Thiolester (0.76742 µmol)
zu C-Terminus (2.888 µmol) 1 zu 3.7 betrug. Um ein vollständiges Abreagieren des 75
Aminosäuren langen α-Thiolester zu gewährleisten, wurde bei der Ligation nicht mit
äquimolaren Mengen beider Fragmente gearbeitet, sondern ein großer Überschuss des
kürzeren und damit leichter zu synthetisierenden C-Terminus eingesetzt. Dadurch wurde das
- 49 -
Gleichgewicht der Ligationsreaktion weiter in Richtung des „full-length“ Peptid Vpr(1-96)
verschoben. Nachdem sich beide Peptide gelöst hatten, wurden die Lösungen vereint und eine
katalytische Menge von ca. 1 mg (3.49 µmol) von TCEP*HCl zugegeben, um die Oxidation
des Cystein und die Bildung von unerwünschten Dimeren zu verhindern [49]. Anschließend
wurde der pH-Wert der Reaktionslösung mit 0.1 M NaHCO3-Lösung auf 7 eingestellt, um
eine
ausreichende
Reaktionsgeschwindigkeit
für
die
Ligation
zu
erreichen.
Der
Reaktionsverlauf wurde dann mittels RP-HPLC kontrolliert (Abbildung 34 A). Trotz der
Zugabe von TCEP*HCl zeigte sich bereits nach 60 min Reaktionszeit eine Verdopplung der
Peaks von beiden Edukten, was zum einen auf die Oxidation des Cystein vom C-Terminus
Vpr(76-96) und die Bildung von unerwünschten Dimeren schließen lässt. Und zum anderen
wahrscheinlich der Zerfall (Hydrolyse) oder Oxidation des α-Thiolester von Vpr(1-75) erfolgt
ist. Nach 120 min Reaktionszeit konnte fast kein HPLC Signal vom α-Thiolester Vpr(1-75)
mehr detektiert werden, so dass der Reaktionsansatz mittels RP-HPLC gereinigt wurde. Die
Reinigung
des
Ligationsproduktes
Vpr(1-96)
erfolgte
nach
Zentrifugieren
des
Reaktionsansatzes bei 61 % B isokratisch für 5 min und dann mittels eines Gradienten von 61
% B auf 91 % B in 50 min (A: 2000 ml MeCN + 500 ml H2O + 5 ml TFA; B: 2500 ml MeCN
+ 5 ml TFA) mit einer Zorbax 300SB_C18 Säule (250 x 21.2 mm, 7 µm) bei einer Flussrate
von 15 ml/min und einer Wellenlänge von λ = 220 nm.
Ausbeute nach Reinigung mittels RP-HPLC:
0.4 mg (0.03516 µmol, 4.6 % bezogen auf die eingesetzte Menge an α-Thiolester Vpr(1-75))
A
B
Vpr(1-96)
Rt =34.082 min
Vpr(1-96)
120min
60min
Vpr(1-75)_Thiolester
start
Vpr(76-96)_C-Terminus
0
10
20
30
0
40
10
20
30
40
Rt [min]
Rt [min]
Abbildung 34: Analytische HPLC Chromatogramme von der Reaktionskontrolle der NCL Reaktion (A) und
vom Peptid Vpr(1-96) (B): Gradient: 10 % B Æ 100 % B in 45min (A: 2000 ml MeCN + 500
ml H2O + 5 ml TFA; B: 2500 ml MeCN + 5 ml TFA); Fluss: 1 ml/min; λ = 220 nm; Säule:
Nucleosil C18 (125 x 4.6 mm, 5 µm)
- 50 -
MALDI-MS:
gefunden: 11384.02 Da (M+)
berechnet: 11377.98 Da
5692.09 Da (M2+)
3790.40 Da (M3+)
Voyager Spec #1[BP = 5692.1, 95]
5692.09
100
95.0
90
% Intensity
80
70
60
50
515.74
11384.02
501.97
624.21
30
978.91
20
40
5712.65
3790.40
5769.38
10
0
499.0
2999.2
5499.4
7999.6
10499.8
13000.0
Mass (m/z)
Abbildung 35: MALDI-MS Spektrum vom gereinigten Peptid Vpr(1-96)
In beiden Fällen, das heißt sowohl mittels der Methode der „step-by-step SPPS“ als auch mit
Hilfe der NCL konnte das „full-length“ Peptid Vpr(1-96) hergestellt werden. Die analytischen
Daten wie die Retentionszeit der analytischen RP-HPLC als auch die MALDI-MS Ergebnisse
stimmen überein.
- 51 -
5.2.3
Herstellung der Influenza A Virus PB1-F2 Peptide PR8, SF2, BF2(Y42ÆC) und
BF2(S47ÆC) von verschiedenen Stämmen
Das PB1-F2 Peptid des Influenza A Virus wurde als elftes Protein identifiziert, das durch die
8 RNA Gensegmente des Virus kodiert ist. Das PB1-F2 Peptid PR8(1-87) wurde als erstes
dieser neuen PB1-F2 Peptide von Chen et al. beim H1N1 Influenza A Virus vom Mount Sinai
(A/Puerto Rico/8/1934) gefunden [1]. Es konnte gezeigt werden, dass eine synthetische
Version des Peptids PR8(1-87) bei der Exposition von humanen Monozyten Apoptosis bei
den Zellen ausgelöst hat. Für weitere Untersuchungen der Eigenschaften von PR8(1-87)
wurde die Synthese in Anlehnung an die von Henklein et al. [90] beschriebene
Vorgehensweise durchgeführt. Für die Untersuchung der Eigenschaften von PB1-F2 Peptiden
von anderen Influenza A Virus Stämmen/Isolaten wurden die Peptide SF2(1-90) von der
„Spanischen Grippe“ und BF2(1-90) als ein Vertreter der „Vogelgrippe“ synthetisiert [130].
Die Darstellung des 87 Aminosäuren langen Peptids PR8(1-87) erfolgte hierbei wiederum
unter Anwendung der Ligation des α-Thiolester des N-Terminus PR8(1-41) mit dem CTerminus PR8(42-87).
PR8
1
A
10
20
30
40
M G QE Q D TP W I -L S T GH I S T QK - R Q D G Q QT P K L- E H RN S T R LM G - HC Q K T
50
60
70
80
87
M N QV V - MP K Q IV Y W KQ - W L SL R N PI L V -F L K T R V L KR W - R LF S K HE
B
M1
P R 8( 1 - 41 )
H 41
C 42
P R 8( 4 2 -8 7 )
E 87
Abbildung 36: Aminosäuresequenz der Peptids PR8(1-87); (A) Die unterstrichenen Aminosäuren markieren
die Positionen, an denen der Einsatz von Pseudoprolinen zur Syntheseoptimierung erfolgte. Für
Asp-23/Gly-24
wurde
Fmoc-Asp(OtBu)-(Hmb)Gly-OH
eingesetzt.
(B)
Schematische
Darstellung der beiden Fragmente für die NCL Reaktion zum PR8(1-87)
Die Synthese des N-Terminus PR8(1-41) erfolgte mit HBTU als Kupplungsreagenz an einem
2-Chlortrityl Harz, welches mit der ersten Aminosäure Histidin bereits beladen war (350 mg,
Beladung 0.67 mmol/g, Iris Biotech). Die Abspaltung der Fmoc-Gruppe erfolgte mit 20 %
Piperidin in DMF. Zur Vermeidung der Aspartimidbildung wurde Fmoc-Asp(OtBu)(Hmb)Gly-OH für die Positionen Asp-23/Gly-24 eingesetzt. Um die Effizienz der Synthese
- 52 -
zu erhöhen, wurden nach der Kupplung der Aminosäure Leu-38 Doppelkupplungen
durchgeführt. Für die Kupplung der letzten Aminosäure Met-1 bei der Synthese von PR8(141) wurde Boc-geschütztes Methionin eingesetzt. Anschließend wurde das vollständig
geschützte Peptid PR8(1-41) mit DCM : TFE : AcOH (3:1:1, v/v/v) für 2 h bei
Raumtemperatur abgespalten. Die Abspaltlösung wurde unter Zusatz von n-Heptan am
Rotationsverdampfer entfernt. Durch Zugabe von eiskaltem Et2O wurde das Rohprodukt
ausgefällt und anschließend aus Wasser : MeCN (1:1, v/v) lyophilisiert.
Für die Darstellung des α-Thiolester vom N-Terminus wurden 690 mg von dem vollständig
geschützten Rohpeptid in 5 ml trocknem DCM zuerst mit 35.7 µl (3 eq, 0.228 mmol,
ρ = 0.806 g/cm3) DIC und anschließend mit 190.6 mg (15 eq, 1.14 mmol) paraAcetamidothiophenol versetzt [59]. Die Reaktionsmischung wurde dann bei Raumtemperatur
über Nacht geschüttelt. Anschließend wurde die Lösung am Rotationsverdampfer eingeengt
und die verbliebenen Schutzgruppen wurden mit TFA : Wasser : TIPS (95:3:2, v/v/v) für 3.5
h bei Raumtemperatur abgespalten. Die Abspaltlösung wurde am Rotationsverdampfer
eingeengt und das Rohprodukt durch die Zugabe von eiskaltem Et2O ausgefällt, abgesaugt
und anschließend aus 10 %iger Essigsäure : MeCN (3:1, v/v) lyophilisiert.
Ausbeute Rohprodukt:
355 mg (0.07278 mmol, 32 %), weißer Feststoff, Reinheit laut RP-HPLC 18 %
Die Reinigung von jeweils 40 mg Rohprodukt mittels RP-HPLC erfolgte bei einem
Gradienten von 30 % B auf 55 % B in 50 min (A: 2000 ml MeCN + 500 ml H2O + 5 ml TFA;
B: 2500 ml MeCN + 5 ml TFA) mit einer Zorbax 300SB_C18 Säule (250 x 21.2 mm, 7 µm)
bei einer Flussrate von 10 ml/min und einer Wellenlänge von λ = 220 nm.
Ausbeute nach Reinigung mittels RP-HPLC:
93.0 mg (0.0191 mmol, 26 % bezogen auf die gesamte Menge an erhaltenem Rohprodukt)
- 53 -
A
B
Rt = 17.110 min
PR8(1-41)_Thiolester
0
5
10
15
20
25
Rt = 17.319 min
PR8(1-41)_Thiolester
0
5
10
Rt [min]
15
20
25
Rt [min]
Abbildung 37: Analytische HPLC Chromatogramme vom Rohprodukt (A) und vom gereinigten α-Thiolester
PR8(1-41) (B): Gradient: 10 % B Æ 100 % B in 45 min (A: 2000 ml MeCN + 500 ml H2O +
5 ml TFA; B: 2500 ml MeCN + 5 ml TFA); Fluss: 1 ml/min; λ = 220 nm; Säule: Nucleosil C18
(125 x 4.6 mm, 5 µm)
MALDI-MS:
gefunden: 4877.55 Da (M+)
berechnet: 4878 Da
Voyager Spec #1[BP = 4877.1, 5998]
4877.55
100
5998.0
90
% Intensity
80
70
60
50
40
30
4867.37
4845.14
4826.19
20
10 518.29
0
500.0
2146.76
1169.28
1800.2
3100.4
4400.6
5700.8
7001.0
0
Mass (m/z)
Abbildung 38: MALDI-MS Spektrum vom gereinigten α-Thiolester PR8(1-41)
Die Synthese des C-Terminus PR8(42-87) wurde mit HBTU als Kupplungsreagenz an einem
TentaGel S Trt-Glu(tBu)-Fmoc Harz durchgeführt (300 mg, Beladung 0.18 mmol/g, Rapp
Polymere). Die Abspaltung der Fmoc-Gruppe erfolgte mit 20 % Piperidin in DMF. Zur
Verhinderung der Seitenkettenaggregation der wachsenden Peptidkette am Harz, wurde
Fmoc-Lys(Boc)-Thr(ΨMe,Mepro)-OH für die Positionen Lys-44/Thr-45 sowie für Lys-73/Thr74 eingesetzt. Nach beendeter Synthese am Harz wurde das Peptid PR8(42-87) mit TFA :
Wasser : TIPS (95:3:2, v/v/v) für 3.5 h bei Raumtemperatur abgespalten. Die Abspaltlösung
wurde anschließend am Rotationsverdampfer eingeengt und das Rohpeptid durch Zugabe von
eiskaltem Et2O ausgefällt und aus 10 %iger Essigsäure : MeCN (3:1, v/v) lyophilisiert.
- 54 -
Ausbeute Rohprodukt:
206 mg (0.0357 mmol, 63 %), weißer Feststoff, Reinheit laut RP-HPLC 39 %
Die Reinigung von jeweils ca. 40 mg Rohprodukt mittels RP-HPLC erfolgte bei einem
Gradienten von 48 % B auf 68 % B in 50 min (A: 2000 ml MeCN + 500 ml H2O + 5 ml TFA;
B: 2500 ml MeCN + 5 ml TFA) mit einer Zorbax 300SB_C18 Säule (250 x 21.2 mm, 7 µm)
bei einer Flussrate von 10 ml/min und einer Wellenlänge von λ = 220 nm.
Ausbeute nach Reinigung mittels RP-HPLC:
68.0 mg (0.0117 mmol, 33 % bezogen auf die gesamte Menge an erhaltenem Rohprodukt)
A
B
Rt = 27.654 min
PR8(42-87)
0
10
20
30
Rt = 25.652 min
PR8(42-87)
0
40
10
20
30
40
Rt [min]
Rt [min]
Abbildung 39: Analytische HPLC Chromatogramme vom Rohprodukt; Säule: Nucleosil C18 (125 x 4.6 mm,
5 µm) (A) und vom gereinigten C-Terminus PR8(42-87); Säule: Zorbax C18 (120 x 4.6 mm, 5
µm) (B): Gradient: 10 % B Æ 100 % B in 45 min (A: 2000 ml MeCN + 500 ml H2O + 5 ml
TFA; B: 2500 ml MeCN + 5 ml TFA); Fluss: 1 ml/min; λ = 220 nm
MALDI-MS:
gefunden: 5771.90 Da (M+)
berechnet: 5771.08 Da
Voyager Spec #1[BP = 5771.2, 12032]
5771.90
100
1.2E+4
90
% Intensity
80
70
60
50
40
30
2826.02
20
10
0
499.0
713.18
1216.49
1799.4
3095.11
2900.70
3099.8
3665.93
4608.59
4400.2
Mass (m/z)
Abbildung 40: MALDI-MS Spektrum vom gereinigten C-Terminus PR8(42-87)
- 55 -
5789.38
5916.18
5700.6
7001.0
Für die Ligation zum Gesamtpeptid PR8(1-87) wurden vom α-Thiolester des N-Terminus
PR8(1-41) 18.8 mg (3.854 µmol) und vom C-Terminus PR8(42-87) 22.2 mg (3.847 µmol)
jeweils separat in 0.5 ml einer 6 M Guanidinhydrochlorid Lösung gelöst. Das Verhältnis der
beiden Fragmente zueinander betrug dabei in etwa 1:1. Nachdem sich beide Peptide gelöst
hatten, wurden die Lösungen vereint und 3 mg (10.47 µmol) TCEP*HCl zugegeben, um die
Oxidation des Cystein und die Bildung von unerwünschten Dimeren zu verhindern [49].
Anschließend wurde der pH-Wert der Reaktionslösung mit 0.1 M NaHCO3-Lösung auf 7
eingestellt, um eine ausreichende Reaktionsgeschwindigkeit für die Ligation zu erreichen. Der
Reaktionsverlauf wurde dann mittels RP-HPLC kontrolliert (Abbildung 41 A). Nach 45 min
Reaktionszeit konnte fast kein HPLC Signal vom α-Thiolester PR8(1-41) mehr detektiert
werden, so dass der Reaktionsansatz mittels RP-HPLC gereinigt wurde. Die Reinigung des
Ligationsproduktes PR8(1-87) erfolgte nach Zentrifugieren des Reaktionsansatzes durch
präparative HPLC bei einem Gradienten von 40 % B auf 60 % B in 50 min (A: 2000 ml
MeCN + 500 ml H2O + 5 ml TFA; B: 2500 ml MeCN + 5 ml TFA) mit einer Agilent Prep C18 Säule (250 x 30.0 mm, 10 µm) bei einer Flussrate von 15 ml/min und einer Wellenlänge
von λ = 220 nm.
Ausbeute nach Reinigung mittels RP-HPLC:
14.9 mg (2.58 µmol, 67 % bezogen auf die eingesetzte Menge an α-Thiolester PR8(1-41))
A
B
PR8(1-87)
45min
Rt = 24.979 min
PR8 (1-87)
PR8(42-87)_
C-Terminus
start
PR8(1-41)_Thiolester
0
10
20
30
40
Rt [min]
0
10
20
30
40
Rt [min]
Abbildung 41: Analytische HPLC Chromatogramme von der Reaktionskontrolle der NCL Reaktion (A) und
vom Peptid PR8(1-87) (B): Gradient: 10 % B Æ 100 % B in 45 min (A: 2000 ml MeCN +
500 ml H2O + 5 ml TFA; B: 2500 ml MeCN + 5 ml TFA); Fluss: 1 ml/min; λ = 220 nm; Säule:
Nucleosil C18 (125 x 4.6 mm, 5 µm)
- 56 -
MALDI-MS:
berechnet: 10482.36 Da
gefunden: 10488.37 Da (M+)
5260.36 Da (M2+)
Voyager Spec #1[BP = 10488.4, 2483]
10488.37
100
2483.0
90
% Intensity
80
10472.96
70
10455.53
60
50
10525.50
40
10545.83
30
20
10
0
2000.0
5260.36
2743.74
4000.2
6000.4
8000.6
10000.8
12001.0
Mass (m/z)
Abbildung 42: MALDI-MS Spektrum vom gereinigten Peptid PR8(1-87)
Die Synthese der Peptide SF2(1-90), BF2(1-90; Y42ÆC) und BF2(1-90; S47ÆC)
einschließlich der entsprechenden Fragmente SF2(1-40), SF2(30-70), SF2(50-90) sowie
BF2(1-40), BF2(30-70) und BF2(50-90) konnte bereits im Journal of Peptide Science [130]
publiziert werden, so dass an dieser Stelle auf eine ausführliche Darstellung verzichtet wird.
- 57 -
5.3
Ausgewählte Dcpm geschützte Aminosäuren
Wie bereits im Kapitel 3.4 erläutert wurde, erfolgte die Synthese der Dcpm geschützten
Aminosäuren Glycin, Alanin und Leucin über eine fünfstufige Synthese, deren einzelne
Zwischenstufen in den folgenden Unterkapiteln näher beschrieben sind. Zur Untersuchung
des sterischen Einflusses der Seitenkette der Aminosäuren auf die Acylierungsreaktion bei der
Einführung
der
Fmoc-Gruppe
wurde
als neue
Verbindung
Fmoc-(Dcpm)Leu-OH
synthetisiert. Die beiden anderen Verbindungen Fmoc-(Dcpm)Gly-OH und Fmoc(Dcpm)Ala-OH wurden in Anlehnung an die Protokolle von Carpino et al. [15] synthetisiert.
Auf der Basis der geschützten Aminosäure Fmoc-(Dcpm)Gly-OH wurde dann ein neuer
Dipeptidbaustein Fmoc-Asp(OtBu)-(Dcpm)Gly-OH hergestellt (Abbildung 43), der in der
Synthese von Peptiden mit dem Sequenzmotiv Asp-Gly zur Verhinderung der
Aspartimidbildung eingesetzt wurde.
H3C
CH3
CH3
N
OH
OH
N
N
Fmoc O
Fmoc O
Fmoc O
Fmoc-(Dcpm)Ala-OH
OH
Fmoc-(Dcpm)Leu-OH
Fmoc-(Dcpm)Gly-OH
Fmoc-Asp(OtBu)-OH
CH3
H3C
CH3
O
O
H
N
O
O
O
OH
N
O
Fmoc-Asp(OtBu)-(Dcpm)Gly-OH
Abbildung 43: Übersicht der drei synthetisierten Fmoc-(Dcpm)-Aminosäuren und des neuen Dipeptidbaustein
Fmoc-Asp(OtBu)-(Dcpm)Gly-OH ausgehend von Fmoc-(Dcpm)Gly-OH
- 58 -
5.3.1
Herstellung des Dicyclopropylmethanimin-Hydrochlorid
NH2
2
3
1
4
In 1500 ml wasserfreiem Benzol wurden bei -5 °C 50 ml TiCl4 (0.5 eq,
Cl
0.454 mol, 85.8 g, ρ = 1.72 g/cm3) vorgelegt. Anschließend wurden
3'
2'
4'
100 ml Dicyclopropylketon (0.908 mol, ρ = 0.977 g/cm3) so zugetropft,
dass die Temperatur nicht über 0 °C anstieg. Anschließend wurde in die
gelbe Reaktionslösung gasförmiges NH3 eingeleitet, welches zuvor zum Trocknen über KOH
Plättchen geleitet wurde. Die Einleitung erfolgte für mindestens 2 h, wobei sich die Lösung
langsam bräunlich verfärbte. Die Temperatur stieg während der NH3-Einleitung nicht über
20 °C an. Die Reaktionslösung wurde dann über Nacht bei Raumtemperatur gerührt. Dabei
löste sich das am TiO2 adsorbierte Imin (gelbes Öl), und der ausgefallene Niederschlag
entfärbte sich etwas. Dann wurde das Benzol am Rotationsverdampfer entfernt und der
Rückstand wurde in 1300 ml Chloroform aufgenommen und anschließend die Lösung mit
einer G3- Fritte über Celite 545 filtriert, um das TiO2 abzutrennen. Das Chloroform wurde am
Rotationsverdampfer entfernt und das erhaltene gelbe Öl des Dicyclopropylimin wurde in
500 ml trockenem Toluol gelöst und die Reaktionslösung mit einem Eisbad auf 0 °C gekühlt.
Anschließend wurde Chlorwasserstoffgas durch die Lösung geleitet, welches aus
NaCl/HCl/H2SO4 generiert und über konz. H2SO4 getrocknet wurde. Die HCl-Einleitung
erfolgte für mindestens 2 h. Die Reaktionslösung wurde über Nacht gerührt und dabei
langsam
auf
Raumtemperatur
erwärmt.
Anschließend
wurde
das
Toluol
am
Rotationsverdampfer entfernt und der Rückstand in 1000 ml Chloroform aufgenommen. Die
Lösung wurde über eine G3-Fritte filtriert, um das entstandene NH4Cl abzutrennen. Das
Chloroform wurde dann am Rotationsverdampfer entfernt und der erhaltene Feststoff des
Hydrochlorids mit Et2O gewaschen.
Ausbeute: 24.4 g (0.1675 mol, 19 %), weißer Feststoff
mp = 127 – 128 °C (Lit. 125 – 127 °C [116,117])
1
H NMR (300 MHz, CDCl3, δ in ppm): 11.87 (br s, 2H, NH2), 1.95-1.87 (m, 2H, CH), 1.65-
1.50 (m, 4H, CH2), 1.44-1.28 (m, 4H, CH2).
13
C NMR (75 MHz, CDCl3, δ in ppm): 200.0 (C1), 15.8 (C2/C2’), 13.8 (C3/C3’+C4/C4’).
- 59 -
EA (%)
berechnet:
C: 57.73
H: 8.31
N: 9.62
Cl: 24.34
gefunden:
C: 57.03
H: 8.16
N: 9.60
Cl: 24.28
Die spektroskopischen Daten stimmen mit den von Carpino beschriebenen Daten überein
[15].
4.04
4.05
2.00
2.00
1.50
ppm (t1)
4.04
4.05
2.00
1.94
15.0
10.0
5.0
0.0
ppm (t1)
1
250
ppm (t1)
Abbildung 45:
200
100
13
50
13.815
77.536
77.112
76.688
150
15.883
H NMR Spektrum von Dicyclopropylmethanimin–Hydrochlorid in CDCl3 bei 298 K
200.036
Abbildung 44:
0
C NMR Spektrum (oben) und DEPT(unten) von Dicyclopropylmethanimin–Hydrochlorid in
CDCl3 bei 298 K
- 60 -
5.3.2
Allgemeine
Vorschrift
zur
Herstellung
der
entsprechenden
Benzylester
geschützten Dicyclopropyl-Ketiminaddukte
In 200 ml trockenem DCM wurden 5 g (0.03434 mol) des Ketiminhydrochlorids gelöst.
Anschließend wurden 1 eq (0.03434 mol) des Aminosäure-O-Benzylester * para-tosylat und
4.8 ml Et3N (1 eq, 0.03434 mol, 3.475 g, ρ = 0.977 g/cm3) zugegeben. Die Reaktionslösung
wurde dann bei Raumtemperatur 48 h gerührt. Nach beendeter Reaktion wurde die Lösung
am Rotationsverdampfer eingeengt und mit 200 ml Et2O versetzt. Der ausgefallene weiße
Niederschlag wurde abfiltriert und nochmals mit Et2O gewaschen. Der Ether wurde dann am
Rotationsverdampfer entfernt und das Rohprodukt im Vakuum getrocknet. Das Rohprodukt
wurde ohne weitere Reinigung für die nächsten Stufen eingesetzt.
Glycin-Dicyclopropylketimin-Benzylester
5
O
4
6
N
7
2
1
3
O
9
8
4'
6'
1
10
Ausbeute: 7.6 g (0.0295 mol, 86 %), gelbliches Öl
11
5'
H NMR (300 MHz, CDCl3, δ in ppm): 7.34 (m, 5H, Harom.), 5.17 (s, 2H, CH2), 4.33 (s, 2H,
CH2), 1.68-1.59 (m, 1H, CH), 1.19-1.12 (m, 1H, CH), 0.99-0.94 (m, 2H, CH2), 0.87-0.81 (m,
4H, CH2), 0.65-0.59 (m, 2H, CH2).
13
C NMR (75 MHz, CDCl3, δ in ppm): 177.0/170.9 (C1/C3), 135.9 (C8), 128.4-128.1 (5C,
Carom.), 66.3/52.2 (C2/C7), 13.2/12.7 (C4/C4’), 7.6/6.1 (C5/C5’/C6/C6’).
Die spektroskopischen Daten stimmen mit den von Carpino beschriebenen Daten überein
[15].
- 61 -
Alanin-Dicyclopropylketimin-Benzylester
5
O
4
6
N
7
2
O
1
3
4'
9
8
10
CH3
Ausbeute: 8.3 g (0.0306 mol, 90 %), gelbliches Öl
11
12
6'
1
5'
H NMR (300 MHz, CDCl3, δ in ppm): 7.35-7.28 (m, 5H, Harom.), 5.15 (s, 2H, CH2), 4.58-
4.52 (q, 1H, CH, J = 6.77 Hz), 1.78-1.69 (m, 1H, CH), 1.42-1.40 (d, 1H, J = 7.05 Hz), 1.161.09 (m, 1H, CH), 0.97-0.93 (m, 2H, CH2), 0.89-0.74 (m, 4H, CH2), 0.64-0.54 (m, 2H, CH2).
13
C NMR (75 MHz, CDCl3, δ in ppm): 174.4/173.4 (C1/C3), 136.1 (C8), 128.4-127.8 (5C,
Carom.),
66.1/57.0
(C2/C7),
19.0
(C12),
12.9/12.4
(C4/C4’),
7.8/7.3/6.15/6.13
(C5/C5’/C6/C6’).
Die spektroskopischen Daten stimmen mit den von Carpino beschriebenen Daten überein
[15].
Leucin-Dicyclopropylketimin-Benzylester
5
6
O
4
N 2
1
3
4'
6'
1
7
O
8
9
12
13 CH
3
14'
5'
H3C
14
10
Ausbeute: 9.94 g (0.0317 mol, 93%), gelbliches Öl
11
H NMR (300 MHz, CDCl3, δ in ppm): 7.35-7.31 (m, 5H, Harom.), 5.26-5.09 (m, 2H, CH2),
4.56-4.48 (m, 1H, CH), 1.83-1.74 (m, 3H, CH und CH2), 1.65-1.52 (m, 1H,), 1.16-1.09 (m,
1H, CH), 0.97-0.92 (m, 5H, CH3 und CH2), 0.87-0.74 (m, 7H, CH3 und CH2), 0.63-0.57 (m,
2H, CH2).
13
C NMR (75 MHz, CDCl3, δ in ppm): 174.8/173.1 (C1/C3), 136.1 (C8), 128.5-127.9 (5C,
Carom.), 66.0/60.2 (C2/C7), 42.7 (C12), 24.7/23.1/21.8 (C13/C14/C14’), 13.2/13.3 (C4/C4’),
7.7/7.5/6.1/6.0 (C5/C5’/C6/C6’).
- 62 -
5.3.3
Allgemeine Vorschrift zur Herstellung der Benzylester geschützten (Dcpm)Aminosäuren aus den entsprechenden Ketiminen
Es wurden 3 g (11.06 mmol) des jeweiligen Ketimins der Aminosäure in 50 ml des
Lösungsmittelgemisches 10 % AcOH in Methanol (5 ml AcOH/45 ml MeOH) gelöst.
Anschließend wurden 765 mg (1.1 eq, 12.17 mmol) 95 %iges NaCNBH3 zugegeben und die
Reaktionslösung bei Raumtemperatur für 45 Minuten gerührt. Anschließend wurde das
Lösungsmittel am Rotationsverdampfer entfernt und der Rückstand in 60 ml Wasser
aufgenommen. Dann wurde die Reaktionsmischung durch Zugabe von NaHCO3 auf pH 7.5
gebracht, bis keine Gasentwicklung mehr zu beobachten war. Die wässrige Phase wurde mit
DCM (2 x je 50 ml) extrahiert. Die vereinigten organischen Phasen wurden über MgSO4
getrocknet und das Lösungsmittel im Vakuum entfernt. Das Rohprodukt wurde ohne weitere
Reinigung für die nächsten Stufen eingesetzt.
(Dcpm)Glycin-Benzylester
5
O
H
N
4
6
7
2
1
3
O
9
8
4'
6'
1
10
Ausbeute: 2.58 g (9.95 mmol, 90 %), gelbliches Öl
11
5'
H NMR (300 MHz, CDCl3, δ in ppm): 7.34 (s, 5H, Harom.), 5.14 (s, 2H, CH2), 3.70-3.60 (m,
2H, CH2), 3.24 (br s, 1H, NH), 1.18-1.12 (m, 1H, CH), 0.90-0.78 (m, 2H, CH), 0.51-0.42 (m,
4H, CH2), 0.28-0.08 (m, 4H, CH2).
13
C NMR (75 MHz, CDCl3, δ in ppm): 172.1 (C1), 135.5 (C8), 128.6-128.3 (5C, Carom.), 66.9
(C3), 66.6 (C7), 48.1 (C2), 15.6 (C4/C4’), 3.2/1.8 (C5/C5’/C6/C6’).
Die spektroskopischen Daten stimmen mit den von Carpino beschriebenen Daten überein
[15].
- 63 -
(Dcpm)Alanin-Benzylester
5
O
4
6
7
H
N 2
1 O
3
4'
6'
1
9
8
10
CH3
12
Ausbeute: 2.55 g (9.33 mmol, 84 %), gelbliches Öl
11
5'
H NMR (300 MHz, CDCl3, δ in ppm): 7.31 (s, 5H, Harom.), 5.14-5.04 (m, 2H, CH2), 3.85-
3.78 (m, 1H, CH), 2.07 (br s, 1H, NH), 1.29 (d, 3H, CH3, J = 7.08 Hz), 0.88-0.70 (m, 3H,
CH), 0.51-0.30 (m, 4H, CH2), 0.15-0.06 (m, 4H, CH2).
13
C NMR (75 MHz, CDCl3, δ in ppm): 176.1 (C1), 135.8 (C8), 128.5-128.1 (5C, Carom.), 66.2
(C7), 66.0 (C3), 53.8 (C2), 19.8 (C12), 17.3/15.2 (C4/C4’), 4.0/3.3/2.1/0.3 (C5/C5’/C6/C6’).
Die spektroskopischen Daten stimmen mit den von Carpino beschriebenen Daten überein
[15].
(Dcpm)Leucin-Benzylester
5
6
O
H
N 2
4
1
3
4'
6'
1
7
O
8
9
12
13 CH
3
14'
5'
H3C
14
10
Ausbeute: 2.75 g (8.74 mmol, 79 %), gelbliches Öl
11
H NMR (300 MHz, CDCl3, δ in ppm): 7.33 (s, 5H, Harom.), 5.09 (s, 2H, CH2), 3.75 (t, 1H,
CH, J = 7.35 Hz), 1.96 (br s, 1H, NH), 1.80-1.71 (m, 1H, CH), 1.47.1.42 (t, 2H, CH2, J = 7.46
Hz), 1.05-0.81 (m, 8H, CH3/CH), 0.77-0.71 (m, 1H, CH), 0.52-0.30 (m, 4H, CH2), 0.14-0.01
(m, 4H, CH2).
13
C NMR (75 MHz, CDCl3, δ in ppm): 176.3 (C1), 135.9 (C8), 128.8-128.2 (5C, Carom.), 66.1
(C7), 57.0 (C2), 43.2 (C12), 24.8 (C13), 22.6/22.2 (C14/C14’), 17.4/15.3 (C4/C4’),
4.0/3.5/2.1/0.1 (C5/C5’/C6/C6’).
- 64 -
5.3.4
Allgemeine Vorschrift zur Herstellung der freien (Dcpm)-Aminosäuren
In einem Schlenkkolben mit Septum wurden in 50 ml absolutem Ethanol 11.3 mmol der
entsprechenden (Dcpm)Benzylester-Aminosäure gelöst und 0.565 mmol (5 %) von 10 %igen
Palladium auf Aktivkohle als Katalysator dazugegeben. Mit Hilfe eines Luftballons mit
Kanüle wurde der Kolben zweimal mit Wasserstoff so gespült, dass beim zweiten
Spülvorgang das H2-Gas durch die Flüssigkeit geleitet wurde. Danach wurde die
Reaktionsmischung unter Wasserstoffatmosphäre für mindestens 3.5 h bei Raumtemperatur
gerührt. Nach beendeter Reaktion wurde die Reaktionslösung filtriert und das Lösungsmittel
im Vakuum entfernt. Das Rohprodukt wurde aus MeOH:Et2O umkristallisiert und mit Et2O
gewaschen.
(Dcpm)Glycin-OH
5
O
H
N
4
6
3
2
1
OH
Ausbeute: 2.7 g (16 mmol, 60 %), weißer Feststoff
4'
6'
1
5'
mp = 218 - 220 °C
H NMR (300 MHz, D2O, δ in ppm): 3.80-3.72 (m, 2H, CH2), 3.64-3.57 (m, 1H, NH), 2.14-
2.07 (t, 1H, CH, J = 9.51 Hz), 1.10-1.00 (m, 2H, CH), 0.75-0.64 (m, 4H, CH2), 0.48-0.41 (m,
4H, CH2).
13
C NMR (75 MHz, D2O, δ in ppm): 171.64 (C1), 67,3 (C3), 46.2 (C2), 11.5 (C4/C4’),
3.0/2.4 (C5/C5’/C6/C6’).
Die spektroskopischen Daten stimmen mit den von Carpino beschriebenen Daten überein
[15].
- 65 -
2.0
4.23
3.0
4.14
4.0
2.04
1.00
2.06
5.0
ppm (t1)
1.0
5.0
4.23
4.14
2 .04
10.0
1.00
2.06
15.0
0.0
ppm (t1)
1
250
ppm (t1)
Abbildung 47:
200
100
13
50
3.085
2.427
11.570
67.392
150
46.213
H NMR Spektrum von (Dcpm)Gly-OH in D2O bei 298 K
171.633
Abbildung 46:
0
C NMR Spektrum (oben) und DEPT (unten) von (Dcpm)Gly-OH in D2O bei 298 K
- 66 -
(Dcpm)Alanin-OH
5
O
H
N 2
4
6
1 OH
3
4'
6'
1
CH3
7
Ausbeute: 1.72 g (9.4 mmol, 58 %), weißer Feststoff
mp = 246-248 °C unter Zersetzung
5'
H NMR (300 MHz, D2O, δ in ppm): 4.08-4.01 (m, 1H, CH), 3.76-3.70 (m, 1H, NH), 2.00-
1.94 (t, 1H, CH, J = 9.63 Hz), 1.45 (d, 3H, CH3, J = 7.38 Hz), 1.07-0.93 (m, 2H, CH), 0.710.56 (m, 4H, CH2), 0.42-0.29 (m, 4H, CH2).
13
C NMR (75 MHz, D2O, δ in ppm): 175.1 (C1), 67.2 (C3), 54.9 (C2), 16.0 (C7), 12.7/11.1
(C4/C4’), 3.9/3.3/2.7/1.4 (C5/C5’/C6/C6’).
Die spektroskopischen Daten stimmen mit den von Carpino beschriebenen Daten überein
[15].
1.50
1.00
4.13
2.00
4.24
2.50
2.15
3.00
3.20
3.50
1.03
1.00
4.00
ppm (t1)
0.50
5.0
Abbildung 48:
1
H NMR Spektrum von (Dcpm)Ala-OH in D2O bei 298 K
- 67 -
4.13
4.24
2.15
3.20
10.0
1.03
1.00
15.0
ppm (t1)
0.0
Abbildung 49:
200
150
100
50
1.463
3.938
3.346
2 .76 1
11.142
16.088
12.721
54.976
67.290
175.147
250
ppm (t1)
0
13
C NMR Spektrum (oben) und DEPT (unten) von (Dcpm)Ala-OH in D2O bei 298 K
(Dcpm)Leucin-OH
5
6
O
H
N 2
4
3
4'
6'
7
1
OH
8
CH3
9'
5'
Ausbeute: 1.64 g (7.3 mmol, 50 %), weißer Feststoff
mp = 212 - 213 °C
H3C
9
1
H NMR (300 MHz, D2O, δ in ppm): 3.96 (t, 1H, CH, J = 7.35 Hz), 3.66-3.59 (m, 1H, NH),
1.97-1.91 (t, 1H, CH, J = 7.46 Hz), 1.77-1.61 (m, 3H, CH2/CH), 1.15-1.10 (m, 2H; CH), 0.990.92 (m, 6H, CH3), 0.76-0.65 (m, 4H, CH2), ), 0.47-0.39 (m, 4H, CH2).
13
C NMR (75 MHz, D2O, δ in ppm): 174.6 (C1), 67.9/58.6 (C2/C3), 39.9 (C7), 24.4 (C8),
21.5/21.4 (C9/C9’), 12.6/11.0 (C4/C4’), 4.0/3.8/2.6/1.4 (C5/C5’/C6/C6’).
- 68 -
2.00
1.50
1.00
4.03
2.50
4.08
3.00
6.49
2.31
3.50
3.24
1.03
1.00
4.00
ppm (t1)
0.50
5.0
4.03
4.08
6.49
2.31
10.0
3.24
1.03
1.00
15.0
0.0
ppm (t1)
1
250
ppm (t1)
Abbildung 51:
200
100
13
50
1.402
2.696
4.031
3.892
11.030
24.481
21.598
21.409
12.692
39.975
67.965
150
58.675
H NMR Spektrum von (Dcpm)Leu-OH in D2O bei 298 K
174.621
Abbildung 50:
0
C NMR Spektrum (oben) und DEPT (unten) von (Dcpm)Leu-OH in D2O bei 298 K
- 69 -
5.3.5
Allgemeine Vorschrift zur Herstellung der Fmoc geschützten (Dcpm)Aminosäuren in Lösung
In 40 ml frisch destilliertem trockenem DCM wurden unter Schlenk-Bedingungen 13.1 mmol
der jeweiligen Dcpm-Aminosäure suspendiert. Dann wurden mit Hilfe einer Spritze 4.14 ml
(2.5 eq, 32.74 mmol, 3.56 g, ρ = 0.859 g/cm3) Trimethylsilylchlorid zugegeben und die
Reaktionsmischung ca. 4 h unter Rückfluss erwärmt. Dann wurde die Reaktionslösung mit
einem Eisbad auf 0 °C abgekühlt und anschließend unter Schlenk-Bedingungen erst 5.57 ml
(2.5 eq, 32.74 mmol, 4.23 g, ρ = 0.76 g/cm3) DIPEA und dann 4.07 g (1.2 eq, 15.72 mmol)
Fmoc-Cl gelöst in 10 ml DCM zugegeben. Die Reaktionsmischung wurde dann noch 1 h bei
0 °C gerührt und anschließend langsam über Nacht auf Raumtemperatur erwärmt. Nach
beendeter Reaktion wurde das Lösungsmittel am Rotationsverdampfer entfernt und der
Rückstand mit 100 ml Et2O versetzt und anschließend über Nacht im Kühlschrank stehen
gelassen. Es fiel das Hydrochlorid von DIPEA als ein weißer Feststoff aus, welcher über eine
G4-Fritte abgesaugt und gründlich mit Et2O gewaschen wurde. Die Et2O-Phase wurde
anschließend am Rotationsverdampfer eingeengt und der Rückstand, ein gelbliches Öl, mit
100 ml einer 10 %igen K2CO3-Lösung versetzt und dann mit ca. 150 ml 5 %iger
Zitronensäure angesäuert, wobei ein pH-Wert von 5 eingestellt wurde. Die milchig trübe
wässrige Phase wurde dreimal mit jeweils 120 ml Essigester extrahiert. Die vereinten
organischen Phasen wurden über MgSO4 getrocknet und das Lösungsmittel am
Rotationsverdampfer entfernt. Das Rohprodukt wurde anschließend im Hochvakuum
getrocknet, wobei ein gelblicher Feststoff als Rohprodukt erhalten wurde. Eine grobe
Vorreinigung des Rohproduktes erfolgte durch Flash-Chromatographie an Silicalgel, wobei
erst mit DCM als Laufmittel alle Verunreinigungen von der Säule gespült wurden.
Anschließend erfolgte durch die Umstellung des Laufmittels auf MeOH das Eluieren des
Produkts von der Säule. Durch erneutes Lösen des Produktes in DCM und anschließendem
Filtrieren der Lösung wurde eventuell durch MeOH gelöstes Silicagel abgetrennt. Das DCM
wurde am Rotationsverdampfer entfernt und das vorgereinigte Produkt im Hochvakuum
getrocknet. Anschließend wurde das erhaltene Rohprodukt mittels RP-HPLC unter
Verwendung eines 0.025 M Ammoniumacetatpuffer ohne Zusatz von TFA gereinigt.
- 70 -
Fmoc-(Dcpm)Glycin-OH
Ausbeute Rohprodukt:
Ring1
15
Ring2
14
13
O
11
15'
N
10
O
13'
14'
9
3.8 g (9.72 mmol, 75 %), gelblicher Feststoff, Reinheit
H3
6
12
16'
H4
H1
16
17
H2
7
Die Reinigung von ca. 150 mg Rohprodukt mittels RP-
8
O
laut RP-HPLC 60 %
H5
HPLC wurde mit einem Gradienten von 25 % B für
OH
5 min isokratisch dann von 25 % B auf 95 % B in 40 min (A: 0.025 M Ammoniumacetat in
H2O : MeCN 1000 ml : 350 ml; B: MeCN) mit einer VYDAC C18 Säule (250 x 40 mm, 1520 µm) bei einer Flussrate von 20 ml/min und einer Wellenlänge von λ = 220 nm
durchgeführt. Das gereinigte Produkt wurde anschließend zweimal lyophilisiert, um alle Reste
vom Ammoniumacetat zu entfernen.
Ausbeute nach Reinigung mittels RP-HPLC:
59.7 mg (0.153 mmol, 40 % bezogen auf die zur Reinigung eingesetzte Menge Rohprodukt)
mp = 120-122 °C (weißer Feststoff)
A
B
Rt = 29.350 min
Fmoc-(Dcpm)Gly-OH
Rt = 29.212 min
Fmoc-(Dcpm)Gly-OH
Rt = 21.788 min
Fmoc-Gly-OH
0
10
20
30
40
Rt [min]
0
10
20
30
40
Rt [min]
Abbildung 51: Analytische HPLC Chromatogramme vom Rohprodukt (A) und vom gereinigten Produkt
Fmoc-(Dcpm)Gly-OH (B): Gradient: 10 % B Æ 100 % B in 45 min (A: 2000 ml MeCN +
500 ml H2O + 5 ml TFA; B: 2500 ml MeCN + 5 ml TFA); Fluss: 1 ml/min; λ = 220 nm; Säule:
Nucleosil C18 (125 x 4.6 mm, 5 µm)
Die spektroskopischen Daten stimmen mit den von Carpino beschriebenen Daten überein
[15].
- 71 -
1
Atom
1
2
3
4
5
6
7
8
9
H NMR (400 MHz, CDCl3, δ in ppm)
cis
Atom
0.33
10
0.33
11
0.53
12
0.33
13 / 13’
0.80
14 / 14’
3.12
15 / 15’
4.00
16 / 16’
17 / 17’
-
trans
0.13
-0.32
0.42
-0.06
0.65
2.12
3.92
-
trans
4.57
4.16
7.47
7.28
7.36
7.71
-
cis
4.41
4.17
7.54
7.28
7.34
7.71
-
13
C NMR (100 MHz, CDCl3, δ in ppm)
Atom
trans
cis
Atom
trans
1
2.1
2.1
10
67.1
2
2.1
2.1
11
47.1
3
5.1
4.6
12
143.8
4
5.1
4.6
13 / 13’
124.4
5
13.4
13.1
14 / 14’
127.2
6
65.9
64.1
15 / 15’
127.7
7
45.7
44.3
16 / 16’
119.9
8
173.8
174.9
17 / 17’
141.4
9
157.0
157.0
Tabelle 2: Zuordnung der 1H und 13C NMR Signale von Fmoc-(Dcpm)Gly-OH
cis
67.5
47.3
144.0
125.0
127.0
127.6
119.9
141.3
Fmoc-Gly-Dcpm in CDCl3 bei 298 K 400 MHz
cis / tans 35% / 65%
cis Signale lassen sich leicht zuordnen
für cis und trans sind die 3-Ringe jeweils äquivalent, d.h.
ein 3-Ring für cis und ein 3-Ring für trans im Spektrum
Current Data Parameters
NAME
fmoc-gly-dcpm-ct-cdcl3
EXPNO
10
PROCNO
1
F2 - Acquisition Parameters
Date_
20070925
Time
14.45
INSTRUM
spect
PROBHD
5 mm PABBO BBPULPROG
zg30
TD
65536
SOLVENT
CDCl3
NS
32
DS
2
SWH
8223.685 Hz
FIDRES
0.125483 Hz
AQ
3.9846387 sec
RG
228.1
DW
60.800 usec
DE
6.00 usec
TE
296.3 K
D1
1.00000000 sec
TD0
1
======== CHANNEL f1 ========
NUC1
1H
P1
14.00 usec
PL1
-1.00 dB
SFO1
400.1324710 MHz
F2 - Processing parameters
SI
32768
SF
400.1300180 MHz
WDW
EM
SSB
0
LB
0.20 Hz
GB
0
PC
1.00
trans-H6
8
Abbildung 53:
7
1
6
5
4
3
2
1.16
1.92
1.11
1.91
2.93
1.88
1.82
1.78
1.00
0.61
1.77
1.03
2.64
1.02
1.75
2.74
2.56
cis-H6
1
H NMR Spektrum von Fmoc-(Dcpm)Gly-OH in CDCl3
- 72 -
0
ppm
Fmoc-(Dcpm)Alanin-OH
15
Ring2
14
H4
12
6
16'
11
15'
O 9
CH3
18
7
O
Reinheit laut HPLC 45 %
H5
N
10
13'
4.1 g (10.11 mmol, 77 %), gelblicher Feststoff,
H3
13
17
Ausbeute Rohprodukt:
Ring1
H1
16
14'
H2
Die Reinigung von ca. 150 mg Rohprodukt mittels RP-
8
O
HPLC wurde mit einem Gradienten von 20 % B für
OH
5 min isokratisch dann von 20 % B auf 100 % B in 40 min (A: 0.025 M Ammoniumacetat in
H2O : MeCN 1000 ml : 350 ml; B: MeCN) mit einer VYDAC C18 Säule (250 x 40 mm, 1520 µm) bei einer Flussrate von 20 ml/min und einer Wellenlänge von λ = 220 nm
durchgeführt. Das gereinigte Produkt wurde anschließend zweimal lyophilisiert, um alle Reste
vom Ammoniumacetat zu entfernen.
Ausbeute nach Reinigung mittels RP-HPLC:
55.3 mg (0.136 mmol, 37 % bezogen auf die zur Reinigung eingesetzte Menge Rohprodukt)
mp = 143-145 °C (weißer Feststoff)
Rt = 23.176 min
Fmoc-Ala-OH
A
0
10
20
Rt = 30.762 min
Fmoc-(Dcpm)Ala-OH
30
40
Rt [min]
B
Rt = 30.627 min
Fmoc-(Dcpm)Ala-OH
0
10
20
30
40
Rt [min]
Abbildung 54: Analytische HPLC Chromatogramme vom Rohprodukt (A) und vom gereinigten Produkt
Fmoc-(Dcpm)Ala-OH (B): Gradient: 10 % B Æ 100 % B in 45 min (A: 2000 ml MeCN +
500 ml H2O + 5 ml TFA; B: 2500 ml MeCN + 5 ml TFA); Fluss: 1 ml/min; λ = 220 nm; Säule:
Nucleosil C18 (125 x 4.6 mm, 5 µm)
Die spektroskopischen Daten stimmen mit den von Carpino beschriebenen Daten überein
[15].
- 73 -
1
Atom
trans
Ring1 / Ring2
0.16 / 0.10
-0.44 / -0.43
0.44 / 0.44
-0.12 / -0.12
0.72 / 0.64
1.89
3.94
-
1
2
3
4
5
6
7
8
9
H NMR (600 MHz, CDCl3, δ in ppm)
cis
Atom
trans
Ring1 / Ring2
Ring1 / Ring2
0.33 / 0.31
10
4.65 / 4.59
0.23 / 0.35
11
4.16
0.58 / 0.51
12
0.34 / 0.34
13 / 13’
7.48 / 7.47
0.84 / 0.72
14 / 14’
7.30 / 7.30
3.02
15 / 15’
7.38 / 7.38
3.94
16 / 16’
7.72 / 7.72
17 / 17’
18
1.52
cis
Ring1 / Ring2
4.65 / 4.59
4.15
7.58 / 7.57
7.29 / 7.29
7.36 / 7.36
7.72 / 7.72
1.21
13
C NMR (150 MHz, CDCl3, δ in ppm)
trans
cis
Atom
trans
Ring1 / Ring2 Ring1 / Ring2
Ring1 / Ring2
2.2 / 2.0
2.1 / 2.1
10
66.7
2.2 / 2.0
2.0 / 2.1
11
46.9
5.4 / 5.3
4.3 / 4.3
12
143.4 / 143.4
5.4 / 5.3
4.3 / 4.3
13 / 13’
124.3 / 124.3
13.6 / 13.4
13.2 / 13.2
14 / 14’
127.3 / 127.1
67.2
65.0
15 / 15’
127.8 / 127.7
53.9
51.1
16 / 16’
119.9 / 119.8
174.4
175.5
17 / 17’
141.2 / 141.2
156.3
155.9
18
15.6
1
13
Zuordnung der H und C NMR Signale von Fmoc-(Dcpm)Ala-OH
Atom
1
2
3
4
5
6
7
8
9
Tabelle 3:
cis
Ring1 / Ring2
66.7
47.2
143.4 / 143.4
124.7 / 124.8
127.0 / 127.1
127.4 / 127.5
119.7 / 119.7
141.1 / 141.1
16.2
Fmoc-Ala-Dcpm-OH in CDCl3 bei 298 K 600 MHz
cis / trans 25 % / 75 %
cis-Signale lassen sich zuordnen
bei cis und trans sind die 3-Ringe jeweils nicht äquivalent
Current Data Parameters
NAME
we_rrala
EXPNO
1
PROCNO
1
F2 - Acquisition Parameters
Date_
20070928
Time
15.47
INSTRUM
spect
PROBHD
5 mm PABBI 1H/
PULPROG
zg30
TD
65536
SOLVENT
CDCl3
NS
32
DS
2
SWH
7183.908 Hz
FIDRES
0.109618 Hz
AQ
4.5614252 sec
RG
362
DW
69.600 usec
DE
6.00 usec
TE
298.0 K
D1
1.00000000 sec
TD0
1
trans-H6
======== CHANNEL f1 ========
NUC1
1H
P1
14.50 usec
PL1
2.00 dB
SFO1
600.0324212 MHz
F2 - Processing parameters
SI
32768
SF
600.0300261 MHz
WDW
EM
SSB
0
LB
0.20 Hz
GB
0
PC
1.00
Abbildung 55:
6
5
3
2
1
3.00
1.09
0.37
1.28
1.30
2.34
1.48
0.39
2.02
1.92
1.93
4
1.04
0.36
7
1.31
1.31
8
0.97
1.54
2.46
0.64
1.90
2.53
2.50
cis-H6
1
H NMR Spektrum von Fmoc-(Dcpm)Ala-OH in CDCl3
- 74 -
0
ppm
Fmoc-(Dcpm)Leucin-OH
Ausbeute Rohprodukt:
Ring1
15
H2
Ring2
14
H1
16
12
6
16'
O
11
9
18
7
O
13'
19
CH3
20
8
O
Reinheit laut HPLC 16 %
H5
N
10
15'
5.1 g (11.4 mmol, 87 %), gelblicher Feststoff,
H3
13
17
14'
H4
CH3
OH
Die Reinigung von ca. 150 mg Rohprodukt
mittels RP-HPLC wurde mit einem Gradienten
von 25 % B für 10 min isokratisch dann von 25 % B auf 95 % B in 35 min (A: 0.025 M
Ammoniumacetat in H2O : MeCN 1000 ml : 350 ml; B: MeCN) mit einer VYDAC C18 Säule
(250 x 40 mm, 15-20 µm) bei einer Flussrate von 20 ml/min und einer Wellenlänge von
λ = 220 nm durchgeführt. Das gereinigte Produkt wurde anschließend zweimal lyophilisiert,
um alle Reste vom Ammoniumacetat zu entfernen.
Ausbeute nach Reinigung mittels RP-HPLC:
24 mg (0.054 mmol, 16 % bezogen auf die zur Reinigung eingesetzte Menge Rohprodukt)
mp = 145-150 °C (weißer Feststoff)
A
Rt = 35.170 min
Fmoc-(Dcpm)Leu-OH
B
Rt = 35.019 min
Fmoc-(Dcpm)Leu-OH
Rt = 28.382 min
Fmoc-Leu-OH
0
10
20
30
40
Rt [min]
0
10
20
30
40
Rt [min]
Abbildung 56: Analytische HPLC Chromatogramme vom Rohprodukt (A) und vom gereinigten Produkt
Fmoc-(Dcpm)Leu-OH (B): Gradient: 10 % B Æ 100 % B in 45 min (A: 2000 ml MeCN +
500 ml H2O + 5 ml TFA; B: 2500 ml MeCN + 5 ml TFA); Fluss: 1 ml/min; λ = 220 nm; Säule:
Nucleosil C18 (125 x 4.6 mm, 5 µm)
- 75 -
1
Atom
trans
Ring1 / Ring2
0.15 / 0.04
-0.63 / -0.50
0.44 / 0.44
-0.19 / -0.19
0.75 / 0.63
1.72 / 1.72
3.86
4.74 / 4.64
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
H NMR (600 MHz, CDCl3, δ in ppm)
cis
Atom
trans
Ring1 / Ring2
Ring1 / Ring2
n.z.
11
4.16
n.z.
12
n.z.
13 / 13’
7.49 / 7.46
n.z.
14 / 14’
7.32 / 7.31
n.z.
15 / 15’
7.40 / 7.39
2.97
16 / 16’
7.73 / 7.72
3.78
17 / 17’
18
2.16 / 1.49
19
1.58
n.z.
20
0.89 / 0.88
cis
Ring1 / Ring2
n.z.
7.57 / 7.57
n.z.
n.z.
n.z.
n.z.
n.z.
n.z.
13
C NMR (150 MHz, CDCl3, δ in ppm)
trans
cis
Atom
trans
Ring1 / Ring2 Ring1 / Ring2
Ring1 / Ring2
1
2.3
4.1
11
47.1
2
2.1
4.1
12
143.2 / 143.2
3
5.5
5.9
13 / 13’
124.2 / 124.1
4
5.4
5.9
14 / 14’
127.2 / 127.1
5
13.8 / 13.4
13.5 / n.z.
15 / 15’
127.8 / 127.7
6
68.0
65.5
16 / 16’
119.8 / 119.8
7
58.0
54.6
17 / 17’
141.3 / 141.3
8
174.0
n.z.
18
39.1
9
157.0
156.5
19
25.0
10
66.8
66.6
20
21.9 / 23.1
Tabelle 4: Zuordnung der 1H und 13C NMR Signale von Fmoc-(Dcpm)Leu-OH
Atom
cis
Ring1 / Ring2
47.4
n.z.
124.8 / 124.7
126.9 / 126.9
127.4 / 127.4
n.z.
n.z.
41.0
25.6
22.0 / n.z.
Fmoc-Leu-Dcpm-OH in CDCl3 bei 298K 600 MHz
cis/trans 5% zu 95 %
cis-Signale dementsprechend kaum zuordbar
beide 3-Ringe sind magnetisch nicht äquivalent
Current Data Parameters
NAME
we_rrleu
EXPNO
1
PROCNO
1
F2 - Acquisition Parameters
Date_
20070926
Time
12.44
INSTRUM
spect
PROBHD
5 mm PABBI 1H/
PULPROG
zg30
TD
65536
SOLVENT
CDCl3
NS
32
DS
2
SWH
7183.908 Hz
FIDRES
0.109618 Hz
AQ
4.5614252 sec
RG
362
DW
69.600 usec
DE
6.00 usec
TE
298.0 K
D1
1.00000000 sec
TD0
1
trans-H6
======== CHANNEL f1 ========
NUC1
1H
P1
14.50 usec
PL1
2.00 dB
SFO1
600.0324212 MHz
F2 - Processing parameters
SI
32768
SF
600.0291255 MHz
WDW
EM
SSB
0
LB
0.20 Hz
GB
0
PC
1.00
8
Abbildung 57:
7
6
5
4
3
2
1
5.91
1.54
1.08
2.02
1.05
1.01
2.00
1.01
1.00
1.15
1.63
1.39
0.99
1.00
1.03
1.03
1.08
2.03
1.97
2.08
2.10
cis-H6
1
0
H NMR Spektrum von Fmoc-(Dcpm)Leu-OH in CDCl3
- 76 -
ppm
5.3.6
Alternativer Syntheseweg für die Herstellung der Fmoc geschützten (Dcpm)Aminosäuren an der festen Phase
Bei der Synthese in Lösung der Fmoc geschützten (Dcpm)-Aminosäuren konnte zwar die
gewünschte Verbindung erhalten werden, aber bei allen drei Beispielen trat als Nebenreaktion
die Eliminierung der bereits vorhandenen Dcpm-Gruppe auf. Dabei konnte ein
Zusammenhang zwischen dem zunehmenden sterischen Anspruch der Seitenkette der
jeweiligen Aminosäure und dem Anteil der gewünschten Fmoc-(Dcpm)-Aminosäure im
Rohprodukt festgestellt werden. Da der Verlust der bereits integrierten Dcpm Schutzgruppe
ein nicht hinnehmbarer Nachteil der beschriebenen Strategie für die Synthese in Lösung mit
vorheriger Silylierung am Stickstoffatom mit TMSCl war, wurde nach einem alternativen
Syntheseweg für die Darstellung der Fmoc-(Dcpm)-Aminosäuren an der festen Phase gesucht.
Dabei wurde die freie Dcpm geschützte Aminosäure (0.3 mmol) an 0.5 g eines 2Chlortritylchlorid Harzes (CBL Patras, Griechenland) verankert. Die Einführung der Fmoc
Schutzgruppe erfolgte dann mit Hilfe von Fmoc-OAt (2 eq, 0.6 mmol) [131] und der Zugabe
von DIPEA (2 eq, 0.6 mmol, ρ = 0.76 g/cm3). Die Reaktion wurde in 5 ml eines
Lösungsmittelgemischs von DMF : DCM (3:2, v/v) durchgeführt, da sich die freie (Dcpm)Aminosäure nicht in reinem DCM gelöst hat. Durch die Verwendung von DCM zeigte das
verwendete
2-Chlortrityl
Harz
ein
besseres
Quelleverhalten,
weshalb
dieses
Lösungsmittelgemisch verwendet wurde. Die Reaktionsmischung wurde über Nacht bei
Raumtemperatur geschüttelt. Anschließend wurde das Harz gründlich mit DMF und DCM
gewaschen und das Rohprodukt geschützt mit DCM : TFE : AcOH (3:1:1, v/v/v) für 2 h bei
Raumtemperatur vom Harz abgespalten. Die Abspaltlösung wurde unter Zusatz von n-Heptan
am Rotationsverdampfer entfernt und das Rohprodukt anschließend aus Wasser : MeCN (1:1,
v/v) lyophilisiert.
Fmoc-(Dcpm)Glycin-OH
Ausbeute Rohprodukt:
62.7 mg (0.160 mmol, 54 %), weißer Feststoff, Reinheit laut RP-HPLC 92 %
- 77 -
MALDI-MS: berechnet: 391.46 Da
gefunden: 414.42 Da (+23, Natriumaddukt)
325.42, 379.35 Da (von Matrix CHCA)
A
Voyager Spec #1[BP = 379.3, 34848]
Rt = 28.566 min
Fmoc-(Dcpm)Gly-OH
100
325.42
B
379.35
3.5E+4
90
414.42
80
% In ten sity
70
60
50
40
30
326.43
415.33
20
10
336.37
0
299.0
381.33
471.46
429.48
399.4
499.8
600.2
700.6
801.0
Mass (m/z)
0
10
20
30
40
Rt [min]
Abbildung 58: Analytisches HPLC Chromatogramm (A): Gradient: 10 % B Æ 100 % B in 45 min (A:
2000 ml MeCN + 500 ml H2O + 5 ml TFA; B: 2500 ml MeCN + 5 ml TFA); Fluss: 1 ml/min;
λ = 220 nm; Säule: Nucleosil C18 (125 x 4.6 mm, 5 µm) und MALDI-MS (B) vom
Rohprodukt bei der Umsetzung von (Dcpm)Gly-OH mit Fmoc-OAt an der festen Phase
Fmoc-(Dcpm)Alanin-OH
Ausbeute Rohprodukt:
52.4 mg (0.1292 mmol, 43 %), weißer Feststoff, Reinheit laut RP-HPLC 83 %
MALDI-MS: berechnet: 405.49 Da
gefunden: 428.55 Da (+23, Natriumaddukt)
325.51, 379.45 Da (von Matrix CHCA)
656.61 (Verunreinigung)
A
Rt = 30.045 min
Fmoc-(Dcpm)Ala-OH
Voyager Spec #1[BP= 428.6, 36417]
100
B
428.55
325.51
3.6E+4
90
80
70
% In ten sity
Rt = 22.393 min
Fmoc-Ala-OH
60
50
379.45
40
30
20
10
0
299.0
429.56
326.53
334.47
380.44
399.2
445.46
430.56
656.61
657.61
499.68
499.4
599.6
699.8
800.0
Mass (m/z)
0
10
20
30
40
Rt [min]
Abbildung 59: Analytisches HPLC Chromatogramm (A): Gradient: 10 % B Æ 100 % B in 45 min (A:
2000 ml MeCN + 500 ml H2O + 5 ml TFA; B: 2500 ml MeCN + 5 ml TFA); Fluss: 1 ml/min;
λ = 220 nm; Säule: Nucleosil C18 (125 x 4.6 mm, 5 µm) und MALDI-MS (B) vom
Rohprodukt bei der Umsetzung von (Dcpm)-Ala-OH mit Fmoc-OAt an der festen Phase
- 78 -
Bei der analogen Reaktionsführung mit Fmoc-OSu als Reagenz zu Einführung der Fmoc
Schutzgruppe konnte am Beispiel für (Dcpm)-Alanin keine Umsetzung zum gewünschten
Produkt Fmoc-(Dcpm)Ala-OH festgestellt werden. Es wurden hierbei wiederum 0.5 g des 2Chlortritylchlorid Harzes (CBL Patras, Griecheland) eingesetzt und daran die freie Dcpm
geschützte Aminosäure (Dcpm)Ala-OH in DMF als Lösungsmittel verankert. Nach dem
Waschen des Harzes wurden in DMF : DCM (3:2, v/v) als Lösungmittelgemsich Fmoc-OSu
(2 eq, 0.6 mmol) und DIPEA (2eq, 0.6 mmol, ρ = 0.76 g/cm3) zur Reaktionsmischung
dazugegeben und über Nacht geschüttelt. Anschließend wurde das Harz gründlich mit DMF
und DCM gewaschen und das Rohprodukt geschützt mit DCM : TFE : AcOH (3:1:1, v/v/v)
für 2 h bei Raumtemperatur vom Harz abgespalten. Die Abspaltlösung wurde unter Zusatz
von n-Heptan am Rotationsverdampfer entfernt und das Rohprodukt anschließend aus Wasser
: MeCN (1:1, v/v) lyophilisiert.
Im Rohprodukt konnte die gewünschte geschützte Aminosäure Fmoc-(Dcpm)Ala-OH nicht
nachgewiesen werden (Abbildung 60 A). Lediglich das Molekül ohne die Dcpm-Gruppe war
mittels analytischer RP-HPLC und durch den Vergleich mit einer Referenzverbindung
(sauberes kommerzielles Fmoc-Ala-OH wurde analysiert) zu detektieren gewesen. Die
Verbindung Fmoc-Ala-OH wurde mittels Referenzverbindung durch analytische RP-HPLC
identifiziert, weil auf Grund der geringen Masse von 311.33 Da mittels MALDI-MS und
CHCA als Matrix die Verbindung massenspektroskopisch auf diesem Weg nicht detektiert
werden konnte. Obwohl in diesem Versuch kein HCl während der Reaktion generiert wird,
konnte die Abspaltung der Dcpm-Gruppe nicht verhindert werden. Das Reaganz Fmoc-OSu
scheint außerdem nicht reaktiv genug zu sein, um die Fmoc-Gruppe an die sekundäre
Aminfuktion kovalent zu binden. Die Aminfuktion von Alanin ist durch die Dcpm-Gruppe
und die Methylgruppe der Seitenkettenfuktion sterisch zu sehr abgeschirmt.
- 79 -
MALDI-MS: berechnet: 405.49 Da
gefunden: 325.93, 379.87 Da (von Matrix CHCA)
445.90, 657.23, 672.56 (Verunreinigung)
A
Rt = 22.392 min
Fmoc-Ala-OH
Voyager Spec #1[BP = 212.9, 5315]
100
B
325.93
90
2437.0
379.87
80
% In ten sity
70
60
50
657.23
327.04
40
30
445.90
323.62
672.56
20
10
0
299.0
399.2
499.4
599.6
699.8
800.0
Mass (m/z)
0
10
20
30
40
Rt [min]
Abbildung 60: Analytisches HPLC Chromatogramm (A): Gradient: 10 % B Æ 100 % B in 45 min (A:
2000 ml MeCN + 500 ml H2O + 5 ml TFA; B: 2500 ml MeCN + 5 ml TFA); Fluss: 1 ml/min;
λ = 220 nm; Säule: Nucleosil C18 (125 x 4.6 mm, 5 µm) und MALDI-MS (B) vom
Rohprodukt bei der Umsetzung von (Dcpm)Ala-OH mit Fmoc-OSu an der festen Phase
Fmoc-(Dcpm)Leucin-OH
Ausbeute Rohprodukt:
63 mg (0.1409 mmol, 47%), weißer Feststoff, Reinheit laut RP-HPLC 23%
MALDI-MS: berechnet: 447.57 Da
gefunden: 495.58 Da (+46, 2 Natrium)
533.69 Da (+85, 2 Natrium + 1 Kalium)
579.66 Da (+131, 4 Natrium + 1 Kalium)
379.39 Da (von Matrix CHCA)
A
Rt = 27.582 min
Fmoc-Leu-OH
Rt = 33.803 min
Fmoc-(Dcpm)Leu-OH
Voyager Spec #1=>BC[BP= 533.7, 7906]
B
533.69
100
90
7906.1
579.66
495.58
80
% In ten sity
70
60
50
40
534.68
379.39
496.60
30
580.67
20
10
0
350.0
440.2
530.4
620.6
710.8
801.0
Mass (m/z)
0
10
20
30
40
Rt [min]
Abbildung 61: Analytisches HPLC Chromatogramm (A): Gradient: 10 % B Æ 100 % B in 45 min (A:
2000 ml MeCN + 500 ml H2O + 5 ml TFA; B: 2500 ml MeCN + 5 ml TFA); Fluss: 1 ml/min;
λ = 220 nm; Säule: Nucleosil C18 (125 x 4.6 mm, 5 µm) und MALDI-MS (B) vom
Rohprodukt bei der Umsetzung von (Dcpm)Leu-OH mit Fmoc-OAt an der festen Phase
- 80 -
5.3.7
Herstellung von Fmoc-Asp(OtBu)-(Dcpm)Gly-OH an der festen Phase
H5
H3
6
H4
22
N
24
O
17
24'
19'
23'
2.13 mmol, 275.3 mg, ρ = 0.76 g/cm3) DIPEA
und
O
11
O
ml DMF versetzt. Dann wurden 362.3 µl (2 eq,
O
15 10
HN
16
(CBL Patras, Griechenland, mesh 100-200) mit 5
O
9
20 Ring2
19
18
OH
8
7
21
23
22'
Es wurden 500 mg 2-Chlortritylchlorid Harz
H2 Ring1
H1
12
CH3
O
13
CH3
20'
21'
14
CH3
anschließend
(Dcpm)Gly-OH
Reaktionsmischung
180
mg
(1.065
mmol)
dazugegeben.
wurde
dann
Die
bei
Raumtemperatur für 1.5 h geschüttelt. Nach der
Reaktion wurde das Harz gründlich mit DCM
und DMF gewaschen und anschließend mit 10 ml einer Lösung von MeOH : DIPEA (9:1) für
15 min gecappt. Nach erneutem Waschen des Harzes mit DCM und DMF wurde ein KaiserTest durchgeführt [132], welcher als positives Ergebnis eine schwache Blaufärbung lieferte
und somit auf das Vorhandensein von freien Aminogruppen schließen ließ. Auch wenn beim
klassischen Kaisertest nur primäre Aminofunktionen detektiert werden [132], konnte durch
den Vergleich mit einer Blindprobe eine Farbänderung beim Harz mit dem verankerten
(Dcpm)Gly-OH festgestellt werden. Die am Harz verankerte Aminosäure (Dcpm)Gly-OH
wurde im nächsten Schritt mit der Fmoc geschützten Aminosäure Fmoc-Asp(OtBu)-OH
gekoppelt. Dazu wurde das Harz mit 10 ml DMF versetzt und dann 1.23 g (3 eq, 3 mmol)
Fmoc-Asp(OtBu)-OH dann 1.1 g (3 eq, 3 mmol) HATU und anschließend 1.02 ml (6 eq, 6
mmol, 775.5 mg, ρ = 0.76 g/cm3) DIPEA dazugegeben. Die Reaktionsmischung wurde dann
bei Raumtemperatur über Nacht geschüttelt. Um das vollständig geschützte Produkt vom
Harz abzuspalten, wurde das Harz mit einer Lösung von DCM : TFE : AcOH (3:1:1, 6 ml : 2
ml : 2 ml) versetzt und für 2 h bei Raumtemperatur geschüttelt. Das Harz wurde anschließend
über eine G3 Fritte abgesaugt und nochmals mit DCM gewaschen. Die erhaltene Lösung
wurde anschließend am Rotationsverdampfer unter Zusatz von n-Heptan eingeengt. Das
Rohprodukt wurde dann durch Zugabe von eiskaltem Et2O ausgefällt und anschließend aus
Wasser : Acetonitril (1:1) lyophilisiert.
Ausbeute:
Rohprodukt 93.5 mg (0.1664 mmol, 16 %), gelblicher Feststoff, Reinheit laut HPLC 72 %
- 81 -
Die Reinigung von 30 mg Rohprodukt mittels RP-HPLC wurde bei 20 % B für 5 min
isokratisch dann mittels eines Gradienten von 20 % B auf 90 % B in 45 min (A: 0.025 M
Ammoniumacetat in H2O : MeCN 1000 ml : 350 ml; B: MeCN) mit einer VYDAC C18 Säule
(250 x 40 mm, 15-20 µm) bei einer Flussrate von 20 ml/min und einer Wellenlänge von λ =
220 nm durchgeführt. Das gereinigte Produkt wurde anschließend zweimal lyophilisiert, um
alle Reste vom Ammoniumacetat zu entfernen.
Ausbeute nach Reinigung mittels RP-HPLC:
7.2 mg (12.8 µmol, 24 % bezogen auf die zur Reinigung eingesetzte Menge Rohprodukt)
weißer Feststoff
HR-MS:
berechnet:
562.27 g/mol
gefunden für Negativ-Mode: 561.26 g/mol
gefunden für Positiv-Mode: 563.27 g/mol
- 82 -
A
B
Rt = 32.213 min
0
10
20
30
Rt = 31,730 min
0
40
10
20
30
Rt [min]
Rt [min]
Abbildung 62: Analytische HPLC Chromatogramme vom Rohprodukt (A) und vom gereinigten Produkt
Fmoc-Asp(OtBu)-(Dcpm)Gly-OH (B): Gradient: 10 % B Æ 100 % B in 45 min (A: 2000 ml
MeCN + 500 ml H2O + 5 ml TFA; B: 2500 ml MeCN + 5 ml TFA); Fluss: 1 ml/min;
λ = 220 nm; Säule: Nucleosil C18 (125 x 4.6 mm, 5 µm)
Fmoc-Asp(OtBu)-Gly(Dcpm)-OH 7mg CH3CN 298K
trans-H6
7.5
Abbildung 63:
7.0
6.5
6.0
5.5
5.0
4.5
4.0
1
3.5
3.0
2.5
2.0
1.5
1.0
H NMR Spektrum von Fmoc-Asp(OtBu)-(Dcpm)Gly-OH in CD3CN bei 298 K
- 83 -
1.14
3.16
2.16
4.28
4.33
1.92
1.09
3.18
19.90
1.97
2.05
1.05
0.89
5.25
2.12
0.92
2.38
1.21
0.93
1.00
0.83
4.18
4.29
4.24
4.06
cis-H6
0.5
ppm
40
1
Atom
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
H NMR (600 MHz, CD3CN, δ in ppm)
trans
cis
Atom
trans
cis
Ring1 / Ring2 Ring1 / Ring2
Ring1 / Ring2 Ring1 / Ring2
0.42 / 0.26
0.26
13
0.38 / 0.23
0.14
14
1.38
1.38
0.58 / 0.52
0.49
15
6.27
6.15
0.44 /0.35
0.34
Fmoc-Bereich für cis / trans gleich
1.01 / 0.95
0.89
16
2.96
3.34
17
4.33 / 4.28
4.33 / 4.28
Gly
18
4.20
4.20
4.03 / 4.01
4.36 / 4.13
19
20
7.63
7.63
Asp(OtBu)
21
7.31
7.31
22
7.40
7.40
4.79
4.72
23
7.81
7.81
2.65 / 2.40
2.61 / 2.44
24
13
Atom
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
Tabelle 5:
C NMR (150 MHz, CD3CN, δ in ppm)
trans
cis
Atom
trans
cis
Ring1 / Ring2 Ring1 / Ring2
Ring1 / Ring2 Ring1 / Ring2
2.6
2.5
13
81.4
81.4
2.6
2.5
14
27.9
27.9
4.6
5.3
15
4.6
5.3
Fmoc-Bereich für cis / trans gleich
14.2 / 14.0
13.4
16
156.3
156.3
65.4
63.3
17
67.5
67.5
Gly
18
47.8
47.8
45.7
46.6
19 / 19’
144.8
144.8
171.4
172.9
20 / 20’
126.0
126.0
Asp(OtBu)
21 / 21’
128.0
128.0
171.2
172.1
22 / 22’
128.6
128.6
48.9
49.8
23 / 23’
120.8
120.8
39.5
39.6
24 / 24’
141.9
141.9
170.5
170.6
Zuordnung der 1H und 13C NMR Signale von Fmoc-Asp(OtBu)-(Dcpm)Gly-OH
- 84 -
MALDI-MS:
berechnet: 562.65 Da
gefunden: 586.10 Da (+23, Natriumaddukt)
602.04 Da (+39, Kaliumaddukt)
Voyager Spec #1[BP = 601.7, 11725]
602.04
100
1.2E+4
90
586.10
% Intensity
80
70
60
50
40
30
20
10 401.78
0
399.0
530.29
441.79
443.73
568.47
479.4
559.8
624.21
640.2
659.26
720.6
801.0
Mass (m/z)
Abbildung 64: MALDI-MS Spektrum vom gereinigten Produkt Fmoc-Asp(OtBu)-(Dcpm)Gly-OH
Abbildung 65: UPLC Chromatogramm vom gereinigten Fmoc-Asp(OtBu)-(Dcpm)Gly-OH.
- 85 -
Abbildung 66: ESI-MS Spektrum im Negative-Mode von Fmoc-Asp(OtBu)-(Dcpm)Gly-OH.
- 86 -
Abbildung 67: ESI-MS Spektrum im Positive-Mode von Fmoc-Asp(OtBu)-(Dcpm)Gly-OH.
- 87 -
6
Ergebnisse und Diskussion
6.1
6.1.1
Anwendungsmöglichkeiten der NCL zur Synthese der viralen Regulatorproteine
Die Gag Peptide p6 (HIV) und p9 (EIAV)
Da in beiden Sequenzen der Gag Peptide p6 (HIV) und p9 (EIAV) kein Cystein vorhanden
ist, war es nicht möglich, die klassische Ligationsmethode der NCL anzuwenden, ohne
entweder eine Aminosäure auszutauschen bzw. ein zusätzliches Cystein zu integrieren. Beide
Peptide wurden aus diesem Grund mittels der „step-by-step“ Methode synthetisiert.
Mit dem erhaltenen „full-length“ Peptid p9(1-51) wurden von Dr. Alok Sharma und Dr.
Victor Wray weitergehende NMR Untersuchungen zur Strukturaufklärung des Peptids in
Lösung im Helmholtz-Zentrum für Infektionsforschung Braunschweig durchgeführt [133].
Diese Ergebnisse wurden mit den bereits aus der Literatur bekannten Strukturdaten vom
Peptid p6(1-52) [128] verglichen.
6.1.2
Das HIV Peptid Vpr und die verschiedenen Influenza A Virus PB1-F2 Peptide
PR8, SF2 und BF2
Mit Hilfe der NCL Methode ist es möglich, sehr viel längere Peptide einfacher zu
synthetisieren, als es mit der klassischen SPPS Methode der Kettenverlängerung der Fall ist.
Ein sehr gutes Beispiel für diesen Fall stellt das HIV Peptid Vpr(1-96) dar. Dieses Peptid
wurde auf beiden Synthesewegen, der klassischen stetigen Verlängerung der Peptidkette um
die jeweils folgende Aminosäure und mit Hilfe der Ligationsmethode der NCL, hergestellt.
Dadurch ist der Vergleich beider Synthesestrategien am gleichen Peptid möglich. Das für die
Ligation benötigte Cystein kommt in der natürlichen Sequenz von Vpr(1-96) an Position 76
vor. Der ebenfalls benötigte α-Thiolester des N-terminalen Fragments weist damit eine Länge
von 75 Aminosäuren auf. Mit dieser Kettenlänge stößt man an die Grenzen der
Ligationsmethode. Wie erwartet, stellte in diesem Fall die Synthese des α-Thiolester Vpr(175) und dessen anschließende Reinigung mittels RP-HPLC das größte Problem dar. Die
Produktausbeute für dieses Fragment nach der Reinigung fiel mit nur 8 % sehr gering aus. Bei
der anschließenden Ligation zum „full-length“ Vpr(1-96) konnten jedoch 0.4 mg des
gewünschten Peptids erhalten werden. Trotz dieser geringen Menge an Material war durch die
Tatsache, dass für die Ligation bereits gereinigte Fragmente eingesetzt wurden, die
- 88 -
anschließende Reinigung des „full-length“ Peptids Vpr(1-96) mittels RP-HPLC einfacher im
Vergleich zur Reinigung des erhalten Rohpeptids aus der klassischen „step-by-step“ Synthese.
Die Synthese der beiden Influenza A Viruspeptide PR8(1-87) und SF2(1-90) erfolgte
ebenfalls unter Anwendung der „nativen chemischen Ligation“ (NCL). In beiden Peptiden
kommt ein Cystein in der Aminosäuresequenz an Position 42 vor. Durch die einfachere
Synthese der entsprechenden Fragmente für den N- und C-Terminus und die anschließende
Ligation dieser Fragmente konnte von beiden Peptiden ausreichend Material für weitere
biochemische Experimente und zur Strukturaufklärung mittels NMR Untersuchungen erhalten
werden. Bei dem Peptid BF2(1-90) kommt in der natürlichen Sequenz kein Cystein vor, so
dass das Wildtyp Peptid auf diesem Weg nur schwer erhalten werden kann. Auf Grund der
Tatsache, dass es sich beim BF2(1-90) ebenfalls um ein aus der Gruppe der Influenza A Virus
PB1-F2 Peptide stammendes Peptid handelt und bei ca. 30 % aller natürlich vorkommenden
Sequenzen dieser Peptide an Position 42 ein Cystein vorkommt, wie es auch bei PR8(1-87)
und SF2(1-90) der Fall ist, wurde die Mutation BF2(1-90, Y42ÆC) vorgenommen, um das
„full-length“ Peptid BF2 zu erhalten. Um den möglichen Einfluss der in der ersten Mutante
BF2(1-90, Y42ÆC) ausgetauschten Aminosäure Tyrosin auf das biologische Verhalten des
Peptids BF2 untersuchen zu können, wurde eine zweite Mutante BF2(1-90, S47ÆC)
synthetisiert. Hierbei erfolgte der Austausch der Aminosäure Serin gegen Cystein, um eine
möglichst geringe Änderung des sterischen Anspruchs der Seitenkette an dieser Position des
Peptids BF2 auszuüben. Beide Aminosäuren unterscheiden sich lediglich durch ihre
funktionelle Gruppe in der Seitenkette (Hydroxylgruppe beim Serin und Thiolgruppe beim
Cystein), so dass der sterische Einfluss durch das etwas größere Schwefelatom bei diesem
Aminosäureaustausch relativ klein sein sollte.
Es lässt sich abschließend festhalten, dass bei längeren Peptiden, die in Ihrer
Aminosäuresequenz ein Cystein an einer geeigneten Position enthalten, die Methode der
„nativen chemischen Ligation“ (NCL) eine wesentliche Vereinfachung der Synthese darstellt.
- 89 -
6.2
Strukturuntersuchungen mittels 1H NMR vom Peptid SF2
Zur Aufklärung der Struktur des PB1-F2 Peptids vom Influenza A Virus H1N1-Isolat der
„Spanischen Grippe“ von 1918, genannt SF2, wurden ein- und zweidimensionale (NOESY,
TOCSY) 1H NMR Spektren von den Fragmenten SF2(1-40), SF2(30-70) und SF2(50-90)
aufgenommen und ausgewertet. Um die Strukturbestimmung mittels NMR Untersuchungen
zu vereinfachen, wurden die Spektren von diesen drei Fragmenten aufgenommen und
ausgewertet. Die Spektren von Peptiden mit einer Länge von jeweils 40 Aminosäuren sind
sehr viel leichter zu interpretieren, als es für NMR Spektren vom „full-length“ Peptid SF2(190) der Fall wäre. Da die Peptide SF2(1-40), SF2(30-70) und SF2(50-90) als überlappende
Fragmente synthetisiert wurden, kann angenommen werden, dass durch den Mittelwert der
Signale in den überlappenden Bereichen SF2(30-40) und SF2(50-70) die chemischen
Verschiebungen des „full-length“ Peptids SF2(1-90) wiedergegeben werden. Die 1H NMR
Messungen für die Peptide SF2(1-40), SF2(30-70) und SF2(50-90) wurden in 50 %
wässrigem TFE-d2 als Lösungsmittel gemessen. TFE ist zum einen dafür bekannt, dass es die
hydrophoben Bedingungen, wie sie für Membranpeptide in physiologischer Umgebung
existieren, sehr gut imitiert. Andererseits wird TFE auch dafür verwendet, um die
hydrophoben Bedingungen zu simulieren, die durch die Wechselwirkung mit hydrophoben
Peptiden von anderen Proteinen auftreten. Durch TFE werden zusätzlich die intermolekularen
Wechselwirkungen der Peptide untereinander wie z.B. Oligomerisierung unterdrückt [134].
Für eine detaillierte Analyse der zweidimensionalen 1H NMR Spektren ist es notwendig, dass
die Spinsysteme aller Aminosäuren von den drei Fragmenten SF2(1-40), SF2(30-70) und
SF2(50-90) zugeordnet werden (siehe Tabelle 6, 7 und 8). Aus der chemischen Verschiebung
der α-Protonen lassen sich qualitative Informationen, wie die Art und die Position, von
eventuell vorhandenen sekundären Strukturmerkmalen des jeweiligen Peptids in der
gemessenen Lösung/Probe ableiten. Eine Verlagerung der chemischen Verschiebung der αProtonen zu höherem Feld (upfield shift) relativ zu den Werten für eine ungeordnete
Knäuelstruktur (random coil) [121] bei vier benachbarten Aminosäuren ist ein Anzeichen für
ein lokales α-helixartiges Strukturelement. Hingegen ist die Verlagerung zu tieferem Feld
(downfield shift) bei drei benachbarten Aminosäuren ein Hinweis auf ein lokales β-Faltblatt
[135]. Die graphischen Darstellungen der Differenz der chemischen Verschiebung der αProtonen für die drei Fragmente SF2(1-40), SF2(30-70) und SF2(50-90) sind in Abbildung 68
bis 70 wiedergegeben. Für die Darstellung des „full-length“ Peptids mix_SF2(1-90) wurden
die Werte von den drei Fragmenten zusammengefasst und in den überlappenden Bereichen
- 90 -
Leu-30 bis Asp-40 und Val-50 bis Val-70 wurden die Durchschnittswerte der chemischen
Verschiebungen der α-Protonen verwendet (Abbildung 71). Aus den graphischen
Darstellungen lässt sich folgende Vorhersage über das Vorhandensein von sekundären
Strukturelementen gewinnen.
Im N-terminalen Bereich des Peptids SF2(1-90) sind zwei kurze relativ schwache α-helikale
Bereiche von Trp-9 bis Thr-13, mit einer Länge von 5 Aminosäuren, und von Ile-16 bis Arg21, mit einer Länge von 6 Aminosäuren, zu erwarten. Diese Strukturvorhersage ist mit den
Angaben, wie sie für das PB1-F2 Peptid PR8 beschrieben worden sind [9], identisch. Dies
resultiert daher, dass sich die Aminosäuresequenzen der beiden Peptide PR8 und SF2 in
diesen Bereichen exakt gleichen. Die Werte für die Differenz der chemischen Verschiebungen
der α-Protonen ∆δHα liegen in diesen Bereichen nur sehr knapp unterhalb des Grenzwertes
von -0.1 ppm, so dass hier eine relativ schwach ausgeprägte α-Helix zu erwarten ist. Im
Gegensatz dazu gibt es im C-teminalen Bereich des Peptids SF2(1-90) zwei Bereiche von
Lys-52 bis Arg-65, mit einer Länge von 13 Aminosäuren, und von Val-70 bis His-86, mit
einer Länge von 16 Aminosäuren, in denen zwei sehr stark ausgeprägte α-Helices zu erwarten
sind. In diesen Bereichen der Peptidsequenz von SF2(1-90) wird der Grenzwert von -0.1 ppm
für das Vorhandensein von α-helikalen Strukturelementen von fast allen Aminosäuren sehr
deutlich unterschritten, wodurch sich die stärkere Ausprägung der beiden zu erwartenden αHelices erklären lässt.
- 91 -
Hβ
1.930
SF2(1-40) [δ in ppm]
Hγ
2.235
8.702
8.423
Hα
4.225
4.079
4.412
2.185 / 2.037
2.404
E
Q5
8.500
8.464
4.330
4.386
2.168 / 2.092
2.196 / 2.094
2.523
2.415
D
T
P
W
I10
8.287
7.940
7.598
7.742
4.911
4.275
4.352
4.456
3.712
3.009 / 2.961
4.144
2.338/1.881
3.419
1.899
L
S
T
G
H15
I
8.056
8.076
8.002
8.296
8.198
8.216
4.226
4.333
4.071
3.918
4.583
3.960
1.821
4.045 / 3.972
4.125
S
T
Q
8.293
7.956
8.073
4.330
4.159
4.163
4.049 / 3.987
4.345
2.189 / 2.132
K20
R
E
D
G
Q25
8.273
8.046
8.285
8.377
8.236
8.067
4.221
4.263
4.329
4.715
4.026
4.391
1.930
1.973 / 1.801
2.229 / 2.142
2.962
1.570
1.688
2.583 / 2.509
2.205 / 2.102
2.435
Q
8.274
4.474
2.231 / 2.083
2.449
T
P
R
7.969
4.561
4.453
4.310
4.309
2.359 / 2.119
1.908/1.770
1.309
2.040 / 1.930
1.696
Sequenz
M1
G
Q
HN
8.005
3.405 / 3.325
1.942
- 92 -
1.253
2.098 / 2.013
1.312 / 1.083 /
0.912
1.758
Hδ
Hε
1.930
Hζ
Hη
7.483 / 7.141
7.238
7.488 - 7.315 /
6.975 - 6.661
7.488 - 7.315 /
6.975 - 6.661
3.758
7.251
0.895
9.836 / 7.560
0.894 / 0.848
1.082
1.680 / 1.234 /
0.973
7.301
0.896
1.277
2.402
1.757
3.249
8.538
7.488 - 7.315 /
6.975 - 6.661
3.020
7.230
7.614
n.z.
7.488 - 7.315 /
6.975 - 6.661
7.488 - 7.315 /
6.975 - 6.661
3.861 / 3.742
3.255
7.225
n.z.
Sequenz
HN
Hα
Hβ
7.924
4.354
1.742
L30
8.101
4.307
2.059 / 1.998
E
8.321
4.666
3.332 / 3.228
H
8.480
4.710
3.363 / 3.255
H
8.563
4.693
2.903 / 2.853
N
8.324
4.545
4.026 / 3.938
S35
8.078
4.366
4.320
T
8.112
4.363
1.930 / 1.837
R
7.963
4.331
1.706
L
8.012
4.476
2.190 / 2.080
M
8.083
4.746
2.925 / 2.889
D40
Tabelle 6: Zuordnung der 1H NMR Signale des Peptids SF2(1-40)
Sequenz
L30
E
H
H
N
S35
T
R
L
M
D40
H
C
Q
K
T45
M
N
Q
V
HN
8.618
8.596
8.607
8.646
8.431
8.194
8.213
7.924
8.094
8.282
8.304
8.392
8.490
8.197
7.885
8.260
8.205
8.078
7.887
Hα
4.053
4.423
4.710
4.776
4.825
4.572
4.350
4.282
4.294
4.374
4.605
4.600
4.351
4.222
4.285
4.253
4.435
4.629
4.335
4.108
Hβ
1.585
2.050 / 1.992
3.316 / 3.205
3.271 / 3.182
2.902 / 2.847
4.052 / 3.954
4.346
1.932/1.885
1.734
2.180
2.950 / 2.890
3.502 / 3.354
3.089 / 3.019
2.179
1.910 / 1.733
4.310
2.152
2.853
2.188
2.227
- 93 -
Hγ
1.656
2.444
1.270
1.697
1.654
2.637 / 2.572
Hδ
0.970 / 0.920
Hε
7.328
7.350
7.551 / 6.815
8.586
8.600
3.243
0.969 / 0.920
7.206
2.499 / 2.435
1.590
1.237
2.672 / 2.611
3.257
0.969 / 0.926
Hε
n.z.
Hζ
Hη
8.591
8.601
7.251
n.z.
2.180
7.328
8.591
1.491
7.289 / 6.647
3.096
2.152
7.461 / 6.708
2.470 / 2.428
1.035 / 0.976
Hη
2.190
SF2(30-70) [δ in ppm]
Hγ
Hδ
1.498
1.073 / 0.951
2.436
7.328
7.334
7.577 / 6.866
1.311
1.778/1.707
1.690
2.681 / 2.596
Hζ
7.366 / 6.658
7.639
Sequenz
V50
M
P
K
Q
I55
V
Y
W
K
Q60
W
L
S
L
R65
S
P
T
P
V70
Tabelle 7:
Sequenz
V50
M
P
K
Q
I55
V
Y
HN
7.852
8.117
7.858
8.364
7.714
Hα
4.147
4.779
4.400
4.055
4.126
4.026
Hβ
2.176
2.138
2.403
1.930 / 1.748
2.223 / 2.140
2.081
7.663
7.990
8.299
8.640
8.337
8.519
8.679
7.918
7.538
7.527
7.722
3.687
2.177
4.286
3.090 / 2.160
4.649
3.502 / 3.354
4.004
2.063 / 1.978
4.053
2.307 / 2.111
4.180
3.502 / 3.106
3.911
1.851
4.261
4.047 / 3.971
4.249
1.707
4.243
1.762 / 1.569
4.753
3.889
4.550
2.297 / 2.020
7.857
4.743
4.248
4.490
2.306 / 1.988
7.654
4.163
2.111
Zuordnung der 1H NMR Signale des Peptids SF2(30-70)
HN
8.227
8.333
7.372
Hα
3.908
5.041
4.406
4.004
4.092
4.032
Hβ
2.227
2.204 / 2.046
2.440 / 2.209
1.841 / 1.735
2.246 / 2.063
2.133
7.670
8.021
3.657
4.277
2.156
3.104
8.524
- 94 -
Hγ
1.011 / 0.980
2.683 / 2.612
2.062 / 1.967
1.492
2.398 / 2.333
1.705 / 1.326 /
1.051
1.073 / 0.950
1.512
2.517 / 2.307
Hδ
Hε
Hζ
Hη
2.138
3.898 / 3.667
1.588
3.021
6.934 / 6.576
7.629
0.942
6.835
7.277
1.860 / 1.705
1.523
7.029
0.932 / 0.864
1.514
1.387
0.867
2.768 / 2.707
2.057
1.271
2.070 / 2.028
1.014 / 0.982
3.791
6.515
9.660 / 7.596
3.004
6.847 / 6.473
9.642 / 7.596
7.435 / 6.641
7.617
7.093
7.458 / 7.088
7.218
6.808
n.z.
3.821 / 3.742
SF2(50-90) [δ in ppm]
Hγ
Hδ
1.059
2.671
2.098 / 2.043
4.014 / 3.825
1.469
1.524
2.428 / 2.299
1.662 / 1.318 /
0.930
1.066
1.052 / 0.951
6.876
Hε
2.204
2.96 - 3.01
7.166 / 6.648
6.545
Hζ
Hη
Sequenz
HN
Hα
Hβ
8.251
4.649
3.507
W
8.662
3.986
2.072 / 1.971
K
8.359
4.048
2.315 / 2.120
Q60
8.572
4.131
3.510 / 3.100
W
8.723
3.864
1.841 / 1.771
L
7.979
4.223
4.092 / 3.982
S
7.626
4.251
1.801
L
7.516
4.236
1.777 / 1.515
R65
7.590
4.691
3.892
S
4.582
2.263
P
8.076
4.694
4.401
T
4.401
2.440 / 2.209
P
7.510
3.856
2.099
V70
8.123
4.280
4.087 / 4.032
S
7.945
4.225
1.760
L
8.108
3.968
2.277 / 1.991
K
8.046
3.982
4.340
T
7.659
4.081
2.120 / 2.031
R75
8.083
3.690
2.235
V
8.233
4.276
1.942
L
8.233
4.048
2.041 / 1.982
K
7.983
4.093
2.083 / 2.034
R
8.612
4.537
3.566 / 3.466
W80
8.651
3.839
2.074 / 1.999
R
8.038
4.155
1.826 / 1.710
L
8.436
4.426
3.188
F
8.205
4.083
3.735 / 3.471
S
7.664
4.181
1.867
K85
8.050
4.433
3.157 / 3.067
H
8.072
4.268
1.980 / 1.871
E
7.967
4.771
3.383 / 3.308
W
7.675
4.436
4.274
T
7.907
4.456
3.981 / 3.922
S90
Tabelle 8: Zuordnung der 1H NMR Signale des Peptids SF2(50-90)
- 95 -
Hγ
1.508
2.533
Hδ
7.257
1.724
1.490
7.020
0.911 / 0.827
1.725
1.352
0.867
2.696 / 2.602
2.063 / 1.995
1.345
2.098 / 2.043
1.074 / 1.003
3.831
1.715
1.890
1.345
1.961 / 1.739
1.088 / 0.918
1.857
1.471
1.782 / 1.653
1.896 / 1.737
1.573
1.427
Hε
9.603 / 7.588
2.960 - 3.010
6.820 / 6.463
9.663 / 7.587
Hζ
7.438 / 6.634
7.585 - 7.65
Hη
7.087
7.458 / 7.091
7.218
6.760
n.z.
4.014 / 3.825
0.931
1.937
2.96 - 3.01
3.225
7.190
0.965 / 0.924
1.730
3.188 / 3.127
7.198
3.220 / 3.180
0.917 / 0.868
7.229
2.960
7.154
9.683 / 7.644
7.205
7.585 - 7.65
n.z.
7.585 - 7.65
7.470 / 7.054
7.301
7.272
1.667
7.122
2.960 - 3.010
8.386
7.585 - 7.65
7.227
9.815 / 7.649
7.418 / 7.140
n.z.
7.206
n.z.
2.264
1.169
7.193
SF2(1-40)
0,6
0,5
0,4
0,3
∆δHα [ppm]
0,2
0,1
0,0
*
*
-0,1
-0,2
-0,3
-0,4
-0,5
-0,6
0
5
10
15
20
25
30
35
40
Sequenz
Abbildung 68: Hα-shift Plot des Peptids SF2(1-40); Die Sterne markieren die Positionen der in der Sequenz
enthaltenen Proline.
SF2(30-70)
0,6
0,5
0,4
∆δHα [ppm]
0,3
0,2
0,1
0,0
*
* *
-0,1
-0,2
-0,3
-0,4
-0,5
-0,6
30
35
40
45
50
55
60
65
70
Sequenz
Abbildung 69: Hα-shift Plot des Peptids SF2(30-70); Die Sterne markieren die Positionen der in der Sequenz
enthaltenen Proline.
- 96 -
SF2(50-90)
0,6
0,5
0,4
0,3
∆δHα [ppm]
0,2
0,1
0,0
* *
*
-0,1
-0,2
-0,3
-0,4
-0,5
-0,6
50
55
60
65
70
75
80
85
90
Sequenz
Abbildung 70: Hα-shift Plot des Peptids SF2(50-90); Die Sterne markieren die Positionen der in der Sequenz
enthaltenen Proline.
mix_SF2(1-90)
0,6
0,5
0,4
0,3
∆δHα [ppm]
0,2
0,1
0,0
*
*
* *
*
-0,1
-0,2
-0,3
-0,4
-0,5
-0,6
0
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
65
70
75
80
85
90
Sequenz
Abbildung 71: Hα-shift Plot von mix_SF2(1-90) als theoretisches „full-length“ Peptid; Die Sterne markieren
die Positionen der in der Sequenz enthaltenen Proline.
- 97 -
Im Bereich von Arg-37 bis Val-50 zeigt sich, dass ein Großteil der Verschiebungswerte der
Aminosäuren relativ knapp um den Grenzwert von -0.1 ppm gruppiert ist. Möglicherweise
liegt hier ebenfalls ein sehr schwach ausgeprägter α-helicaler Bereich des Peptids SF2(1-90)
vor. Ebenfalls auffällig ist, dass die Differenzwerte der chemischen Verschiebung der αProtonen ∆δHα von den Aminosäuren Thr-27, Met-51, Ser-66 und Thr-68 sehr deutlich
oberhalb des Grenzwertes von +0.1 ppm liegen. Hierbei handelt es sich um das Phänomen,
dass alle diese Aminosäuren direkt vor der Aminosäure Prolin in der Sequenz des Peptids
SF2(1-90) vorkommen. Prolin bewirkt, dass bei der in der Sequenz vorangegangenen
Aminosäure in Richtung N-Terminus ein Sprung der chemischen Verschiebung von +0.28 ±
0.1 ppm und ein etwas kleinerer Sprung von +0.08 ± 0.03 ppm für die Aminosäure zwei
Positionen vor dem entsprechenden Prolin in der Sequenz auftritt [9,127]. Eine graphische
Zusammenfassung der zu erwartenden sekundären Strukturelemente sowie die Sequenz für
das Peptid SF2(1-90) ist in Abbildung 72 wiedergeben.
SF2
A
M1
W
9
13 16
21
T I R
α1
1
B
R 37
α2
V 50 K
52
α4
α3
10
R 65 V 70
20
H 86 S
90
α5
30
40
M G QE Q D TP W I -L S T GH I S T QK - R ED G Q QT P R L- E H HN S T R LM D - HC Q K T
50
60
70
80
90
M N QV V - MP K Q IV Y W KQ - W L SL R S PT P V -S L K TR V L KR W - R LF S K H E W T S
Abbildung 72: Schematische Darstellung der erwarteten sekundären Strukturelemente des Peptids SF2(1-90)
(A), Aminosäuresequenz des Peptids SF2(1-90) (B)
PR8
A
M
1
13
W9 T I
α1
1
B
16
K
20
K 53
S
84
E 87
α3
α2
10
20
30
40
M G QE Q D TP W I -L S T GH I S T QK - R QD G Q QT P K L- E H RN S T R LM G - HC Q K T
50
60
70
80
87
M N QV V - MP K Q IV Y W KQ - W L SL R N PI L V -F L K TR V L KR W - R LF S K HE
Abbildung 73: Schematische Darstellung der Sekundärstruktur des Peptids PR8(1-87) gemäß der Angaben in
der Literatur von Bruns et al. [9] (A) Aminosäuresequenz des Peptids PR8(1-87) (B)
- 98 -
Für die weitere Untersuchung erfolgte die Zuordnung der NOE-Signale aus den NOESY
Spektren vom mittleren Fragment SF2(30-70) und vom C-Terminus SF2(50-90) des PB1-F2
Peptids SF2(1-90). Auf Grund der Ergebnisse der Hα-shift Plot’s ist zu erwarten, dass sich die
beiden zu vergleichenden PB1-F2 Peptide PR8 und SF2 in ihren N-Termini nicht sehr
unterscheiden, da in diesem Bereich eine sehr große Ähnlichkeit ihrer Aminosäuresequenzen
vorliegt (Abbildung 73). Die Berechnung der Strukturen von SF2(30-70) und SF2(50-90)
erfolgte in Anlehnung an das Standardprotokoll von Brunger et al. [123]. Mit Hilfe der
quantitativen NOE-Signale ist es möglich, eine genauere Struktur des jeweiligen Peptids zu
berechnen. Aus der Stärke der NOE-Signale der Protonen aus den Seitenketten der
Aminosäuren lassen sich die räumlichen Abstände dieser Protonen bzw. Seitenketten
zueinander bestimmen. Die Bestimmung der Interprotonenabstände liefert ein genaueres
Strukturmodell des Peptids in Lösung, als es durch den Vergleich der chemischen
Verschiebungen der α-Protonen der einzelnen Aminosäuren des Peptid (Hα-shift Plot’s) mit
den tabellarischen Werten für Aminosäuren in einer ungeordneten Struktur (random coil)
[121] erhalten werden kann. Für SF2(1-40), den N-Terminus des Peptids, wurden keine
Strukturberechnungen durchgeführt, weil zum einen im NOESY Spektrum dieses Peptids
nicht ausreichend eindeutig zuzuordnende NOE-Signale zu finden waren. Und zum anderen
zeigt SF2(1-40) in seinem Hα-shift Plot eine große Ähnlichkeit zum bereits literaturbekannten
Peptid PR8(1-40) [9].
- 99 -
6.2.1
Bestimmung der Struktur des mittleren Fragments SF2(30-70)
Für die Berechnungen zur Moleküldynamik und Energieminimierung wurden insgesamt 388
quantitative NOE-Signale benutzt, wovon 153 intraresiduale, 143 sequentielle und 92 medium
range Signale vorlagen (Abbildung 74). Der Abstand der Amidprotonen untereinander in den
Seitenketten von Glutamin oder Asparagin wurde auf 0.19 nm kalibriert und diente somit als
Bezugsgröße für die weiteren Signale. Nach Korrekturen für Pseudoatome gemäß den
Angaben von Wüthrich [121] wurden diese Signale direkt als Interprotonenabstände
verwendet. Es wurden anschließend 100 verschiedene Strukturen für das Peptid SF2(30-70)
berechnet und davon die 20 Strukturen, welche alle keine Störungen größer als 0.2 Å
aufwiesen, mit der niedrigsten Gesamtenergie Etotal für die weitere Fittinganalyse ausgewählt
(Tabelle 9).
30
intraresidual (i)
sequential (i-i+1)
medium range (i-i+2,3,4)
Anzahl der NOE-Signale
25
20
15
10
5
0
30
35
40
45
50
55
60
65
70
Aminosäureposition
Abbildung 74: Schematische Darstellung der Verteilung der Anzahl der NOE-Signale auf die entsprechende
Aminosäureposition für das Peptid SF2(30-70)
- 100 -
Anzahl der verwendeten Interprotonabstände (NOE’s)
Gesamt
388
Intraresidual (|i-j| = 0)
153
Sequentiell (|i-j| = 1)
143
Medium Range (2 ≤ |i-j| ≤ 4)
92
Anzahl der NOE Störungen ≥ 0.2 Å
0
Durchschnittliche Energien [kJ/mol]
Etotal
303.171
ENOE
81.661
Evan der Waals
76.381
Ebond + Eangle + Eimpropers
145.130
r.m.s.d. – Werte für die H-Atome des Peptidrückgrates [Å]
Fitting-Region M1 von Met 39 bis Asn 47
0.135
Fitting-Region M2 von Gln 54 bis Leu 62
0.025
Ramachandran Plot für Struktur mit niedrigster Etotal
Tabelle 9:
% Aminosäuren mit Φ,Ψ in äußerst günstigen Regionen
41.7
% Aminosäuren mit Φ,Ψ in zusätzlich erlaubten Regionen
50.0
% Aminosäuren mit Φ,Ψ in großzügig erlaubten Regionen
5.6
% Aminosäuren mit Φ,Ψ in verbotenen Regionen
2.7
Statistische Auswertung für die ausgewählten 20 finalen Strukturen von SF2(30-70)
Durch die Anwendung der „Methode der aufeinander folgenden Segmente“ bzw. “Methode
eines gleitenden Filters“ (consecutive segment approach) [136] können die Bereiche mit
ausgeprägten Strukturelementen visualisiert werden. Bei dieser Methode werden für kurze
Segmente mit einer Länge von zwei, drei, vier und fünf Aminosäuren die durchschnittlichen
quadratischen Unterschiede (r.m.s. differences) der Peptidrückgratprotonen (backbone)
systematisch paarweise miteinander verglichen. Dabei werden die kurzen Segmente von z.B.
einer Länge von 2 Aminosäuren den sequentiellen NOE-Signalen (i-i+1) und die längeren
Segmente von z.B. einer Länge von 5 Aminosäuren den medium range NOE-Signalen (ii+2,3,4) zugeordnet. Anschließend werden für jedes Intervall der ausgewählten 20 Strukturen
die mittleren quadratischen Abweichungen/Standardabweichungen (r.m.s. deviations) für die
Abstände der Peptidrückgratprotonen zueinander bestimmt. Dieser r.m.s.d.-Wert ist ein Maß
für den Abstand zwischen analogen Atomen im Raum in verschiedenen Molekülen, in diesem
Fall in den 20 verschiedenen Konformationen bzw. Strukturen für das jeweilige untersuchte
Peptidfragment. Diese erhaltenen Standardabweichungen (r.m.s.d.-Werte) werden dann gegen
- 101 -
die entsprechende Aminosäure des Peptids aufgetragen. Diese Analysenmethode ermöglicht
eine objektive Wiedererkennung von stabilen sekundären Strukturelementen bei den
ausgewählten 20 finalen Strukturen mit der geringsten Gesamtenergie Etotal. Je geringer der
jeweilige r.m.s.d.-Wert (Standardabweichung) ist, desto mehr gleichen sich die einzelnen
Konformationen der 20 ausgewählten Strukturen für den entsprechenden Bereich. Die
Bereiche, in denen der Wert der Standardabweichung (r.m.s.d.-Wert) kleiner als 0.2 Å ist,
werden als Fitting-Regionen für die Anlagerung der 20 ausgewählten Strukturen an eine
Standardabweichung (r.m.s. deviation) [Å]
zuvor bestimmte Kernstruktur benutzt (Abbildung 75).
1,2
1,0
0,8
0,6
0,4
Fitting Region M2
Fitting Region M1
0,2
0,0
30
35
40
45
50
55
60
65
70
Aminosäureposition
Abbildung 75: Darstellung der r.m.s.d.-Werte für die 1H Atome des Peptidrückgrats für Segmente mit einer
Länge von 2 bis 5 Aminosäuren für das Peptid SF2(30-70)
Die erwähnte Kernstruktur (central structure) wird mit Hilfe der Programme LSQMAN und
MOLEMAN2 ermittelt. Es handelt sich bei der Kernstruktur um diejenige Struktur, welche
von allen 20 ausgewählten Strukturen die geringste Abweichung vom berechneten
arithmetischen Mittel von eben diesen 20 Strukturen liegt. Diese Struktur zeigt von allen 20
Strukturen den niedrigsten r.m.s.d.-Wert auf und stellt eine Art Grundkörper dar, an den sich
durch die Anlagerung (anfitten) der anderen 19 verbleibenden Strukturen die graphischen
Darstellungen der Superposition für jede einzelne Fitting-Region ergeben (Abbildung 76 und
77).
- 102 -
V50
R37
Abbildung 76: Superposition von den 20 ausgesuchten finalen Strukturen nach der Anlagerung der
Rückgratatome für die Fitting-Region M1 (Met-39 bis Asn-47) dargestellt für den Bereich von
Arg-37 bis Val-50 für das Peptid SF2(30-70)
R65
K52
Abbildung 77: Superposition von den 20 ausgesuchten finalen Strukturen nach der Anlagerung der
Rückgratatome für die Fitting-Region M2 (Glu-54 bis Leu-62) dargestellt für den Bereich von
Lys-52 bis Arg-65 für das Peptid SF2(30-70)
FittingRegion M2
(E54-L62)
FittingRegion M1
(M39-N47)
L30
Abbildung 78: Struktur mit der niedrigsten Gesamtenergie Etotal des Peptids SF2(30-70)
- 103 -
V70
In der graphischen Darstellung der energetisch günstigsten Struktur für das mittlere Fragment
SF2(30-70) in Lösung ist zu erkennen, dass die Bereiche, die als Fitting-Regionen (M1 und
M2) ausgewählt wurden, einen α-helikalen Charakter zeigen (Abbildung 78). Beide FittingRegionen haben einen Abstand von 6 Aminosäuren Länge zueinander. Im Bereich der FittingRegion M1 sind jedoch die einzelnen Windungen weiter auseinander gezogen, als es im
Bereich von M2 der Fall ist. Dies in ein Anzeichen dafür, dass im Bereich von M1 keine
wirklich klassische α-Helix vorliegt, sondern es sich hier nur um einen leicht strukturierten
Bereich des Peptids SF2(30-70) mit α-helikalen Charakter handelt. Für die Fitting-Region M2
sind hingegen deutlich drei Windungen einer klassischen α-Helix zu erkennen. Die
beschriebenen Unterschiede zeigen sich ebenfalls in den Darstellungen der Superposition von
beiden Fitting-Regionen M1 und M2 (Abbildung 76 und 77). Durch die Untersuchung des CTerminus SF2(50-90) sollte sich der Charakter der α-Helix für den Bereich M2 bestätigen,
weil es sich hier um den überlappenden Bereich der beiden Fragmente SF2(30-70) und
SF2(50-90) handelt. In den Abbildungen der Superposition von allen 20 Strukturen zeigt sich
außerdem eine Art Auffächern der einzelnen Strukturen an den jeweiligen Enden der
ermittelten Fitting-Regionen. Dieses Auffächern ist ein Anzeichen dafür, dass sich die
Aminosäuren außerhalb der Fitting-Regionen in einem Abschnitt des Peptids SF2(30-70) mit
ungeordneter Struktur (random coil) befinden.
6.2.2
Bestimmung der Struktur des C-Terminus SF2(50-90)
Es wurden für die Berechnungen zur Moleküldynamik und Energieminimierung insgesamt
438 eindeutig zugeordnete Interprotonabstände verwendet, wovon 211 intraresiduale, 140
sequentielle und 87 medium range Signale vorlagen (Abbildung 79 und Tabelle 10). Die
Berechnungen zu den Strukturelementen für den C-Terminus SF2(50-90) erfolgten nach dem
gleichen Schema, wie sie für das mittlere Fragment SF2(30-70) durchgeführt wurden. Bei der
Ermittlung der r.m.s.d.-Werte (Standardabweichung der Abstände der
1
H Atome des
Peptidrückgrats) für den C-Terminus des Peptids SF2(1-90) kommt besonders dem
überlappendem Bereich der beiden Fragmente SF2(30-70) und SF2(50-90) große Bedeutung
zu (Abbildung 80). Beim Vergleich der Fitting-Regionen M2 und C1 fällt auf, dass die
Fitting-Region C1 um 3 Aminosäuren in Richtung N-Terminus länger ist. Dieses Phänomen
lässt sich dadurch erklären, dass bei dem Fragment SF2(50-90) die Fitting-Region C1 sehr
weit am Ende der Peptidkette zu finden ist und somit sehr flexibel ist.
- 104 -
30
intraresidual (i)
sequential (i-i+1)
medium range (i-i+2,3,4)
Anzahl der NOE-Signale
25
20
15
10
5
0
50
55
60
65
70
75
80
85
90
Aminosäureposition
Abbildung 79: Schematische Darstellung der Verteilung der Anzahl der NOE-Signale auf die entsprechende
Aminosäureposition für das Peptid SF2(50-90)
Anzahl der verwendeten Interprotonabstände (NOE’s)
Gesamt
438
Intraresidual (|i-j| = 0)
211
Sequentiell (|i-j| = 1)
140
Medium Range (2 ≤ |i-j| ≤ 4)
87
Anzahl der NOE Störungen ≥ 0.2 Å
0
Durchschnittliche Energien [kJ/mol]
Etotal
285.878
ENOE
77.153
Evan der Waals
74.324
Ebond + Eangle + Eimpropers
134.401
r.m.s.d. – Werte für die H-Atome des Peptidrückgrates [Å]
Fitting-Region C1 Met 51 – Ser 63
0.265
Fitting-Region C2 Leu 72 – Phe 83
0.074
Ramachandran Plot für Struktur mit niedrigster Etotal
% Aminosäuren mit Φ,Ψ in äußerst günstigen Regionen
52.8
% Aminosäuren mit Φ,Ψ in zusätzlich erlaubten Regionen
38.9
% Aminosäuren mit Φ,Ψ in großzügig erlaubten Regionen
8.3
% Aminosäuren mit Φ,Ψ in verbotenen Regionen
0
Tabelle 10: Statistische Auswertung für die ausgewählten 20 finalen Strukturen von SF2(50-90)
- 105 -
Der gleiche Sequenzbereich im mittleren Fragment SF2(30-70) ist hingegen weiter in der
Mitte der Peptidkette zu finden, so dass davon ausgegangen werden kann, dass erst ab der
Standardabweichung (r.m.s. deviation) [Å]
Aminosäure Gln-54 eine α-Helix vorliegt.
1,2
1,0
0,8
0,6
0,4
Fitting Region C1
Fitting Region C2
0,2
0,0
50
55
60
65
70
75
80
85
90
Aminosäureposition
Abbildung 80: Darstellung der r.m.s.d.-Werte für die 1H Atome des Peptidrückgrates für Segmente mit einer
Länge von 2 bis 5 Aminosäuren für das Peptid SF2(50-90)
V50
R65
Abbildung 81: Superposition von den 20 ausgesuchten finalen Strukturen nach der Anlagerung der
Rückgratatome für die Fitting-Region C1 (Met-51 bis Ser-63) dargestellt für den Bereich von
Val-50 bis Arg-65 für das Peptid SF2(50-90)
- 106 -
V70
K85
Abbildung 82: Superposition von den 20 ausgesuchten finalen Strukturen nach der Anlagerung der
Rückgratatome für die Fitting-Region C2 (Leu-72 bis Phe-83) dargestellt für den Bereich von
Val-70 bis Lys-85 für das Peptid SF2(50-90)
FittingRegion C2
(L72-F83)
FittingRegion C1
(M51-S63)
S90
V50
Abbildung 83: Struktur mit der niedrigsten Gesamtenergie Etotal des Peptids SF2(50-90)
- 107 -
Bei der Betrachtung der graphischen Darstellungen der Superposition der 20 Strukturen für
die Fitting-Region C1 ist sehr gut zu erkennen, dass die α-Helix erst ab der Position Gln-54
vorliegt (Abbildung 81). Im Bereich von Met-51 bis Gln-54 ist keine Windung einer α-Helix
dargestellt, sondern hier zeigt die Peptidkette eine gestreckte Struktur auf, die auf die hohe
Flexibilität am Ende der Peptidkette zurückzuführen ist. In der Darstellung der Superposition
der 20 Strukturen für die Fitting-Region C2 (Abbildung 82) wie auch in der Abbildung
derjenigen Struktur mit der geringsten Energie Etotal von SF2(50-90) (Abbildung 83) sind die
vier einzelnen Windungen der vorliegenden zweiten α-Helix im Bereich von Leu-72 bis Phe83 sehr deutlich erkennbar. Wie es schon bei den beiden Superpositiondarstellungen des
mittleren Fragments SF2(30-70) der Fall gewesen ist, so spreizen sich auch beim C-Terminus
die Enden der beiden Fitting-Regionen C1 und C2 auf, weil sich dort strukturell ungeordnete
Bereiche des Peptids befinden.
6.2.3
Zusammenfassung der Strukturelemente für das full-length Peptid SF2(1-90)
Um weitere Informationen über das Verhalten des C-Terminus des kompletten Peptids SF2(190) zu bekommen, wurden die Ergebnisse für die beiden Fragmente SF2(30-70) und SF2(5090) zusammengefasst. Dazu wurden die NOE-Signale von Leu-30 bis Trp-58 von dem Peptid
SF2(30-70) und die NOE-Signale von Lys-59 bis Ser-90 des Peptids SF2(50-90) verwendet
(Abbildung 84). Dabei handelte es sich um insgesamt 605 Interprotonabstände, von denen
268 intraresiduale, 205 sequentielle und 132 medium range Signale vorlagen (Tabelle 11).
30
intraresidual (i)
sequential (i-i+1)
medium range (i-i+2,3,4)
Anzahl der NOE-Signale
25
20
15
10
5
0
30
40
50
60
70
80
90
Aminosäureposition
Abbildung 84: Schematische Darstellung der Verteilung der Anzahl der NOE-Signale auf die entsprechende
Aminosäureposition für das „theoretische“ Peptid mix_SF2M(30-58)&SF2C(59-90)
- 108 -
Anzahl der verwendeten Interprotonabstände (NOE’s)
Gesamt
605
Intraresidual (|i-j| = 0)
268
Sequentiell (|i-j| = 1)
205
Medium Range (2 ≤ |i-j| ≤ 4)
132
Standardabweichung (r.m.s. deviation) [Å]
Tabelle 11: Statistische Auswertung für das „theoretische“ Peptid mix_SF2M(30-58)&SF2C(59-90)
1,2
1,0
0,8
0,6
0,4
Fitting Region F1
Fitting Region F2
Fitting Region F3
0,2
0,0
30
35
40
45
50
55
60
65
70
75
80
85
90
Aminosäureposition
Abbildung 85: Darstellung der r.m.s.d.-Werte für die 1H Atome des Peptidrückgrates für Segmente mit einer
Länge von 2 bis 5 Aminosäuren für das „theoretische“ Peptid mix_SF2M(30-58)&SF2C(5990)
In der Auftragung der r.m.s.d.-Werte für das theoretische Peptid mix_SF2M(3058)&SF2C(59-90) werden die Bereiche, die entweder nur einen α-helikalen Charakter
aufweisen (Fitting-Region F1) oder aber eine klassische α-Helix enthalten (Fitting-Regionen
F2 und F3) dargestellt (Abbildung 85). Nach den Ergebnissen der Berechnungen für die
Strukturen für das mittlere Fragment SF2(30-70) und den C-Terminus SF2(50-90) lässt sich
ein leicht verändertes Schema für die Struktur des kompletten Peptids SF2(1-90) erstellen
(Abbildung 86). Die Bereiche, in denen nach der Auswertung der Hα-shift Plot’s sekundäre
Strukturelemente erwartet wurden, müssen leicht in ihrer Länge gekürzt werden. Nach den
Hα-shift Plot’s ist eine größere Ausdehnung von ca. 2 Aminosäuren Länge in jede Richtung
der drei Bereiche α3, α4 und α5 erwartet worden. Auf Grund der ermittelten r.m.s.d.-Werte
(Standardabweichung der Abstände der Peptidrückgratprotonen) für beide Peptidfragmente
- 109 -
SF2(30-70) und SF2(50-90), mit denen die Übereinstimmung dieser Bereiche (FittingRegionen) für alle 20 finalen Strukturen des jeweiligen Fragments überprüft wird, mussten
die Längen für die Bereiche α3, α4 und α5 entsprechend korrigiert werden. Ein sehr großer
Unterschied zwischen den beiden Peptiden PR8(1-87) und SF2(1-90) besteht darin, dass die
α-Helix des C-Terminus im Peptid SF2(1-90) in zwei separate α-Helices unterbrochen ist und
eine Lücke von 9 Aminosäuren Länge aufweist im Gegensatz zum Peptid PR8(1-87), bei dem
eine kontinuierliche α-Helix vorliegt [9]. Dieser Unterschied beruht auf dem Vorhandensein
von zwei Prolinen an den Positionen Pro-67 und Pro-69 beim Peptid SF2(1-90), die sehr dicht
beieinander liegen und somit die α-Helix unterbrechen. Durch diese Unterbrechung der αHelix wird dem Peptid SF2(1-90) ein erhöhtes Maß an Flexibilität im Bereich um diese
beiden Proline gewährt. Beim Peptid PR8(1-87) hingegen reicht das Vorhandensein von nur
einem Prolin an Position Pro-67 für diese Unterbrechung der α-Helix nicht aus. Für das Peptid
PR8(1-87) liegt somit eine etwas mehr fixierte Struktur im Bereich des C-Terminus vor. Für
den N-Terminus SF2(1-40), von dem keine Strukturberechnungen durchgeführt wurden,
wurden die Ergebnisse von Bruns et al. [9] für den N-Terminus des Peptids PR8(1-40)
übernommen, weil beide Peptide SF2 und PR8 im Bereich des N-Terminus von Position Met1 bis Arg-21 eine exakt identische Aminosäuresequenz aufweisen. Auf Grund dieser
Sequenzgleichheit ist ein gleiches Strukturverhalten der beiden N-terminalen Fragmente
PR8(1-40) und SF2(1-40) zu erwarten, das in die schematische Darstellung der einzelnen
Bereiche, die sekundäre Strukturelemente enthalten integriert wurde (Abbildung 86).
SF2
M1
W 9 T 1 3I 1 6 K 2 0
α1
α2
M39
N47
Q54
S63
α4
α3
L72
F83
S90
α5
Abbildung 86: Schematische Darstellung der berechneten sekundären Strukturelemente des Peptids SF2(1-90)
- 110 -
6.3
Die Anwendung von Dcpm geschützten Aminosäuren in der Peptidsynthese
Bei
den
beiden
PB1-F2
Peptiden
PR8(1-87)
und
SF2(1-90)
liegt
in
deren
Aminosäuresequenzen eine so genannte „Asp-Gly Einheit“ im N-Terminus an Position Asp23 und Gly-24 vor. Auf Grund dieser Reihenfolge in der Aminosäuresequenz der beiden
Peptide PR8(1-87) und SF2(1-90), wird während der chemischen Synthese als Nebenreaktion
Aspartimidbildung begünstigt [27]. Diese Nebenreaktion wurde von Henklein et al. [90] auch
bei der Synthese des Peptids PR8(1-87) beobachtet und durch die Verwendung des bei
kommerziell erhältlichen Dipeptidbausteins Fmoc-Asp(OtBu)-(Hmb)Gly-OH (Novabiochem,
Merck Biosciences und NeoMPS) verhindert.
6.3.1
Stabilitätsuntersuchungen für den Einsatz bei der Peptidkupplung am Beispiel
von Fmoc-(Dcpm)Ala-OH
Für die Verwendung von Dcpm geschützten Aminosäuren bei der Peptidsynthese wurden
Stabilitätsuntersuchungen unter leicht sauren Bedingungen, wie sie bei der Kupplung von
Aminosäuren vorliegen können, am Beispiel von Fmoc-(Dcpm)Ala-OH durchgeführt. Dazu
wurden 5.2 mg (12.824 µmol) Fmoc-(Dcpm)Ala-OH in 1 ml DMF gelöst und anschließend
17 mg (10 eq, 128.4 µmol) HOBt*H2O zugegeben und die Reaktionslösung dann bei
Raumtemperatur geschüttelt. Die Reaktionsverlaufskontrollen wurden mittels analytischer
RP-HPLC Untersuchungen durchgeführt und zeigten, dass die Verbindung in DMF als
Lösungsmittel in Gegenwart von HOBt über einen Zeitraum von bis zu 2.5 h keine Anzeichen
für einen Verlust der Dcpm-Gruppe aufwies. Außer den angegebenen Reagenzien konnten
mittels RP-HPLC keine weiteren Zersetzungsprodukte im Reaktionsansatz gefunden werden
(Abbildung 87).
- 111 -
2.5h
DMF
HOBt
Rt = 30.029 min
Fmoc-(Dcpm)Ala-OH
0
10
20
30
40
Rt [min]
Abbildung 87: Analytisches HPLC Chromatogramm von Fmoc-(Dcpm)Ala-OH und HOBt in DMF nach
2.5 h: Gradient: 10 % B Æ 100 % B in 45 min (A: 2000 ml MeCN + 500 ml H2O + 5 ml TFA;
B: 2500 ml MeCN + 5 ml TFA); Fluss: 1 ml/min; λ = 220 nm; Säule: Nucleosil C18 (125 x
4.6 mm, 5 µm)
6.3.2
Fmoc-OAt als neues Reagenz zur Einführung der Fmoc Schutzgruppe
Für die Synthese der drei Modellverbindungen Fmoc-(Dcpm)Gly-OH, Fmoc-(Dcpm)Ala-OH
und Fmoc-(Dcpm)Leu-OH war die Einführung der Fmoc-Gruppe in Lösung problematisch.
Auf Grund des sterischen Anspruchs der bereits vorhandenen Dcpm-Gruppe im Molekül war
eine direkte Einführung der Fmoc-Gruppe mit Fmoc-Cl unter Schotten-BaumannBedingungen mit DIPEA als Base nicht erfolgreich gewesen. Die bei diesen Bedingungen
normalerweise durchgeführte saure Aufarbeitung durch die Zugabe von verdünnter Salzsäure
(0.1 M) zum Ausfällen der Aminosäure stellt für die sehr säureempfindliche Dcpm-Gruppe
ein erhebliches Problem dar. Bei der Reaktion über vorherige Silylierung am sekundären
Stickstoff der Aminosäure mit TMSCl und anschließender Einführung der Fmoc-Gruppe
durch eine Acylierung mit Fmoc-Cl unter Schlenk-Bedingungen gemäß den Protokollen von
Carpino et al. [15] war es möglich, die drei gewünschten orthogonal geschützten
Modellverbindungen herzustellen. Trotz der Zugabe von DIPEA, welche das entstehende HCl
bei der Verwendung von Fmoc-Cl abfangen sollte, und der Verwendung von nur 5%iger
Zitronensäure zur Generierung der freien Carboxylgruppe bei einem pH-Wert von 5, konnte
nicht verhindert werden, dass die Dcpm-Gruppe zu einem erheblichen Anteil abgespalten
wurde. Aus diesem Grund wurde nach einem alternativen Syntheseweg zur Herstellung der
Fmoc geschützten (Dcpm)-Aminosäuren gesucht. Um das Risiko auszuschließen, durch das
entstehende HCl die Dcpm-Gruppe abzuspalten, auch wenn es durch die Base DIPEA
- 112 -
abgefangen werden sollte, wurde für die Einführung der Fmoc-Gruppe als neues Reagenz
Fmoc-OAt verwendet [131] (Abbildung 88).
N
N
N
N
O
O
O
Abbildung 88: Verwendetes Fmoc-OAt als neues Reagenz zur Einführung der Fmoc-Gruppe [131]
Zur Einführung der Fmoc-Gruppe bei den Dcpm geschützten Aminosäuren Glycin, Alanin
und Leucin wurde die Synthesestrategie in Lösung auf eine Reaktionsführung an der festen
Phase durch Verankerung der entsprechenden freien (Dcpm)-Aminosäure an ein 2-Chlortrityl
Harz übertragen. Die Synthese am Harz erlaubt den Einsatz von größeren Überschüssen der
Reagenzien sowie deren einfache Abtrennung nach der Reaktion durch Waschen des Harzes.
Durch milde Abspaltung des Rohproduktes von dem sehr säureempfindlichen 2-Chlortrityl
Harz sollte kein Verlust der Dcpm-Gruppe auftreten. Eine Übersicht der Produktverteilungen
von der Synthese in Lösung mit Fmoc-Cl und vorheriger Silylierung durch TMSCl sowie der
Synthese an der festen Phase mit Fmoc-OAt ist in Tabelle 12 dargestellt.
Fmoc-(Dcpm)Gly-OH
Fmoc-Gly-OH
Fmoc-(Dcpm)Ala-OH
Fmoc-Ala-OH
Fmoc-(Dcpm)Leu-OH
Fmoc-Leu-OH
Synthese mit Fmoc-Cl
in Lösung
60 %
13 %
45 %
36 %
16 %
28 %
Synthese mit FmocOAt am Harz
92 %
0%
83 %
9%
23 %
25 %
Tabelle 12: Produktverteilung der Modellverbindungen bei der Einführung der Fmoc-Gruppe in Lösung und
an der festen Phase; bestimmt mittels analytischer RP-HPLC
Beim Vergleich der Reinheit der Rohprodukte ist zu erkennen, dass bei der Synthese am Harz
unter Verwendung von Fmoc-OAt als Reagenz zur Einführung der Fmoc-Gruppe deutlich
bessere Resultate erzielt werden konnten. Bei allen drei Modellverbindungen konnte der
Anteil des gewünschten Produkts mit den beiden orthogonalen Schutzgruppen Fmoc und
Dcpm im Molekül deutlich erhöht werden. Im Fall von Glycin war es möglich bei der
- 113 -
Verwendung von Fmoc-OAt am Harz den Verlust der Dcpm-Gruppe vollständig zu
unterdrücken. Im Gegensatz dazu ist im Fall von Leucin auch bei der Verwendung von FmocOAt die Abspaltung der Dcpm-Gruppe nicht zu verhindern gewesen. In beiden Fällen ist der
Anteil am gewünschten Produkt Fmoc-(Dcpm)Leu-OH geringer als der des Nebenproduktes
Fmoc-Leu-OH. Diese Tatsachen lassen sich durch den sterischen Anspruch der Seitenkette
von Leucin sowie der Dcpm-Gruppe erklären. Beide Substituenten, am sekundären Stickstoff
der Aminosäure und am α-Kohlenstoffatom, behindern die Einführung der Fmoc-Gruppe in
erheblichem Maße, woraus die angegebene Verteilung der beiden Verbindungen im
jeweiligen Rohprodukt resultiert. Betrachtet man bei allen drei Modellverbindungen die
Summe der prozentualen Anteile in der Produktverteilung fällt auf, dass mit zunehmendem
sterischen Anspruch der Aminosäureseitenkette der Anteil an Fmoc-(Dcpm)-Aminosäure und
Fmoc-Aminosäure abnimmt. Durch die Verwendung von Fmoc-OAt an Stelle von Fmoc-Cl
konnte bei den Modellverbindungen in allen Fällen eine Verbesserung der Produktausbeute
und Reinheit erzielt werden. Der Wechsel der Synthesestrategie von der Reaktionsführung in
Lösung mit vorheriger Silylierung gemäß Carpino et al. [15] zur Synthese am Harz ist
ebenfalls von Vorteil. Die Verankerung der Dcpm geschützten Aminosäuren über die
Carboxylgruppe am Harz erleichterte die Isolierung der gewünschten Fmoc und Dcpm
geschützten Aminosäuren sehr, da somit kein Ausfällen durch Ansäuern der Reaktionslösung
nötig war. Die feste Phase wurde als eine Art Schutzgruppe für die Carboxylfunktion benutzt.
6.3.3
NMR Untersuchungen zum Abspaltungsprozess der Dcpm-Gruppe am Beispiel
von Fmoc-(Dcpm)Gly-OH
Zur Untersuchung der Abspaltung der Dcpm-Gruppe wurden NMR Untersuchungen am
Beispiel von Fmoc-(Dcpm)Gly-OH durchgeführt. Die Abspaltung der Dcpm-Gruppe erfolgte
bereits unter sehr schwach sauren Reaktionsbedingungen von 5 % TFA in Chloroform
(CDCl3). Die Reaktion wurde sowohl mit Triisopropylsilan (TIPS) als auch ohne Zusatz
dieses Scavangers untersucht.
Nach ca. 24 h Reaktionszeit in CDCl3 mit Zusatz von 5 % TFA konnten im 1H NMR
Spektrum (Abbildung 90) die in Abbildung 89 dargestellten Verbindungen als
Reaktionsprodukte aus der Abspaltung der Dcpm-Gruppe identifiziert werden. Dabei entfällt
ein Großteil der Protonensignale auf die Verbindungen 1(E) und 2(Z), die beide im Verhältnis
von 1(E):2(Z) 88:12 vorliegen (Tabelle 13). Neben diesen beiden Verbindungen, die die E-
- 114 -
bzw. Z-Form der gleichen Verbindung darstellen, konnten noch zwei weitere Moleküle 3 und
4 identifiziert werden.
F3C
H
6
O
O
H
79%
F3C
1
3
7
5
H
10%
4
1
H
3,4
3
2
1
1,2
3
6
HO
6
H
7
<1%
7(Z)
6(E)
5
4%
5
2
5
4
H
1,2
6
11,12 O
H
2(Z)
3
7
<1%
O
O
1(E)
6
6
7,8
9,10
3
7
2
HO
2
1
4
H
5
3,4
OH
4
7%
5
4
Abbildung 89: Entstandene Produkte und deren prozentuale Verteilung nach der Dcpm Abspaltung von Fmoc(Dcpm)Gly-OH nach 24 h mit 5 % TFA in CDCl3 bei 298 K
CF3CO
O
7
H
1
3
5
CF3CO
2
7
H
H4
5
1, 2
6
O
2
3
6
O
7, 8
9, 10
11, 12
1
H4
6
5
1, 2
3, 4
6
OH
5
3, 4
Fmoc+NH
Fmoc-Gly-OH
8.0
Abbildung 90:
7.0
6.0
5.0
4.0
1
3.0
2.0
1.0
ppm
H NMR Spektrum von Fmoc-(Dcpm)Gly-OH nach 24 h mit 5 % TFA in CDCl3 bei 298 K
- 115 -
1H NMR (400 MHz, CDCl3, δ in ppm)
Atom
Verbindung 1(E) Verbindung 2(Z)
1
0.32
0.33
2
0.68
0.75
3
1.35
1.51
4
5.08
4.89
5
5.41
5.22
6
2.41
2.62
7
4.31
4.35
Atom
Verbindung 3
Verbindung 4
1
0.22
0.33
2
0.49
0.61
3
0.32
0.49
4
0.53
0.67
5
0.90
1.09
6
3.36
4.41
7
1.78
/
8
2.07
/
9
1.88
/
10
1.88
/
11
3.88
/
12
3.99
/
13C NMR (100 MHz, CDCl3, δ in ppm)
Atom
Verbindung 1(E) Verbindung 2(Z)
1
6.4
6.9
2
6.4
6.9
3
13.9
9.6
4
138.5
138.2
5
120.8
120.5
6
31.3
26.6
7
67.6
67.6
Atom
Verbindung 3
Verbindung 4
1
1.8
n.z.
2
1.8
n.z.
3
3.5
n.z.
4
3.5
n.z.
5
14.6
14.7
6
85.6
84.0
7
30.9
/
8
30.9
/
9
25.5
/
10
25.5
/
11
67.8
/
12
67.8
/
Tabelle 13: Zuordnung der chemischen Verschiebungen der Produkte nach der Abspaltung der Dcpm-Gruppe
von Fmoc-(Dcpm)Gly-OH nach 24 h mit 5 % TFA in CDCl3 bei 298 K.
Neben den Ester der Trifluoressigsäure 1(E) und 2(Z) sind auch die analogen Verbindungen
als Alkohole 6(E) und 7(Z) entstanden. Allerdings liegt der gemeinsame Anteil von 6(E) und
7(Z) bei unter 1 % im Verhältnis zu den anderen Reaktionsprodukten, wie an dem
Signalmuster bei 3.6 ppm zu erkennen ist. Diese beiden Tripletts sind im 1H NMR Spektrum
mit Silanzusatz deutlich stärker ausgeprägt, so dass die Zuordnung der chemischen
Verschiebungen auch nur in diesem Fall vorgenommen werden konnte.
Bei der analogen Reaktionsführung von 5 % TFA in CDCl3 unter Zusatz von
Triisopropylsilan, welches normalerweise als Scavanger bei der Abspaltung von Peptiden
vom Harz verwendet wird, konnten die in Abbildung 91 dargestellten fünf Verbindungen, als
Reaktionsprodukte im 1H NMR Spektrum (Abbildung 92) identifiziert werden. Neben dem
durch Hybridabstraktion vom Silan entstandenem Dicyclopropylmethan 5 sind wieder die
Verbindungen 1(E) und 2(Z) als Ester der Trifluoressigsäure sowie deren analoge
Verbindungen als Alkohol 6(E) und 7(Z) als Reaktionsprodukte entstanden (Tabelle 14).
- 116 -
F3C
H
6
O
H
H
10% 5
21%
2
1
F3C
O
O
2%
2(Z)
1
3
H
5
4
2
H
H
4
2
1
3
6
HO
2
H
7
1
6(E)
1(E)
3
6
4
3
7
2
5
H
6
HO
1
3
7
O
4
H
7
1%
7(Z)
H
4
5
66%
5
Abbildung 91: Entstandene Produkte und deren prozentuale Verteilung nach der Dcpm Abspaltung von Fmoc(Dcpm)Gly-OH nach 2 h mit 5 % TFA in CDCl3 unter Zusatz von Silan (TIPS) bei 298 K
Aus der abgespaltenen Dcpm Schutzgruppe entsteht zu ca. 66 % unter Zusatz von TIPS als
Hauptprodukt durch Hybridabstraktion das Dicyclopropylmethan 5. Bei den anderen
identifizieren Molekülen handelt es sich sowohl um die Ester der Trifluoressigsäure 1(E) und
2(Z) auch um die entsprechenden Alkohole 6(E) und 7(Z). Das Verhältnis von Ester zu
Alkohol liegt in dem Fall bei ca. 70 : 30. Das Verhältnis von der E-Form zur Z-Form liegt bei
ca. 90 : 10 zu Gunsten der stabileren E-Form. Die Alkohole 6(E) und 7(Z) entstehen auch bei
der Reaktionsführung ohne Silanzusatz (TIPS). Wegen der Überlagerung der sehr eng
beieinander liegenden Signalsätze ist es nicht möglich, diese Verbindungen im 1H NMR
Spektrum eindeutig zu identifizieren. Die Reaktionszeit unter Einwirkung von Silan wurde
hierbei nur auf 2 h begrenzt, da im Allgemeinen diese Zeitspanne für die Abspaltung von
Peptiden ausreichend ist. Mit Ausnahme von Verbindung 5 entstammen die übrigen
Verbindungen 1(E), 2(Z), 3, 4, 6(E) und 7(Z) aus der Ringöffnung von einem der beiden
Cyclopropylringe in der Dcpm-Gruppe bzw. aus der weiteren Umwandlung der entstehenden
Komponenten.
- 117 -
7
2
H4
6
H
1
3
5
H
5
H
1
1, 2
H H6
5
2
H
H
4
5
(iCH3CH)3Si+
3, 4
H4
3
6
H
2
7
5
7
1
3
6
O
CF3CO
(iPr)3SiH
H
2
3
(iCH3CH)3Si+
7
(iPr)3SiH
CF3CO
1
H4
6
O
Fmoc+NH
Fmoc-Gly-OH
7.5
Abbildung 92:
7.0
6.5
6.0
5.5
5.0
4.5
4.0
3.5
3.0
2.5
2.0
1.5
1.0
0.5
ppm
1
H NMR Spektrum von Fmoc-(Dcpm)Gly-OH nach 2 h mit 5 % TFA in CDCl3 unter Zusatz
von Silan (TIPS) bei 298 K
1
Atom
1
2
3
4
5
6
7
Verbindung 1(E)
0.33
0.68
1.35
5.08
5.41
2.41
4.33
H NMR (400 MHz, CDCl3, δ in ppm)
Verbindung 2(Z)
Verbindung 5
Verbindung 6(E)
0.33
0.03
n.z.
0.75
0.40
n.z.
1.51
0.76
n.z.
4.91
1.13
5.08
5.24
/
5.48
2.62
/
2.41
4.38
/
3.49
Verbindung 7(Z)
n.z.
n.z.
n.z.
4.91
5.30
2.41
3.55
Tabelle 14: Zuordnung der chemischen Verschiebungen der Produkte nach der Abspaltung der Dcpm-Gruppe
von Fmoc-(Dcpm)Gly-OH nach 2 h mit 5 % TFA in CDCl3 unter Zusatz von Silan (TIPS) bei
298 K.
Alle entstandenen Produkte aus der Abspaltung der Dcpm-Gruppe reagieren nicht mit dem
eigentlichen Syntheseziel, dem Peptid. Durch die durchgeführte Ausfällung des Peptids mit
eiskaltem Diethylether lassen sich die Reaktionsprodukte der Abspaltung der Dcpm-Gruppe
auch leicht vom Peptid abtrennen.
- 118 -
6.3.4
Der neue Synthesebaustein Fmoc-Asp(OtBu)-(Dcpm)Gly-OH für die Anwendung
in der Peptidsynthese
Der neue Synthesebaustein Fmoc-Asp(OtBu)-(Dcpm)Gly-OH wurde entwickelt, um zum
einen ein Werkzeug zur Verhinderung der Aspartimidbildung zu haben. Zum anderen wird
durch die Verwendung des Dipeptids das Risiko einer unvollständigen Kupplung der
folgenden Aminosäure verhindert, wenn diese Kupplung erst während der SPPS erfolgt.
Asparaginsäure konnte außerdem gut an das verankerte (Dcpm)Gly-OH gekoppelt werden.
Beim Versuch einen Fmoc-Ala-(Dcpm)Ala-OH Dipeptidbaustein durch eine analoge
Reaktionsführung zu erhalten, ist die Kupplung nicht gelungen. Durch den Einbau der
Backbone Dcpm Schutzgruppe wird auch die Kettenaggregation während der Peptidsynthese
verringert. Diese Ergebnisse wurden bereits teilweise auf dem 20. Amerikanischen
Peptidsymposium vorgestellt [101,137] und sind im Journal of Peptide Science [19]
ausführlicher beschrieben, so dass an dieser Stelle auf eine ausführlichere Darstellung
trans Hmb 5
5
cis Hmb
7
6
Ile NH
Val NH
1
Arg NH
15
cis Arg
13
cis Asp
trans Asp
13
verzichtet und nur ein kurzer Überblick gegeben wird.
1.
1
Biotin_1-CH2
2.
7
Biotin_2-CH2
3.
4.
pp
8.
8.
7.
7.
6.
6.
Abbildung 93: NOESY Spektrum (600 MHz) vom Modellpeptid Mon1 in DMSO-d6 bei 298 K; Biotin_1 ist
N-terminal gebunden und Biotin_2 ist an der Hmb-Gruppe verankert.
Die Nebenreaktion der Acylierung durch Biotin der Hydroxylfunktion der Hmb-Gruppe des
Dipeptidbaustein Fmoc-Asp(OtBu)-(Hmb)Gly-OH wurde bei der Synthese des Modellpeptids
Mon1 (Sequenz: Biotin-RQYRLIVHNGYCDGRSERNL-COOH) und dessen anschließende
1D und 2D NMR spektroskopische Untersuchung gefunden. In Abbildung 93 ist dazu das
NOESY Spektrum mit den hervorgehobenen Crosspeaks dargestellt.
- 119 -
S
16
15
14
11
12
HN
10
8
9
NH
13
7
O
HO2C
O
O
4
O
1,2
N
Biotin_1-RQYRLIVHNGYC
N
H
6
OCH3
5
3
RSERNL-CO2H
O
Abbildung 94: Darstellung der mit Biotin_2 acylierten Hmb-Gruppe im Modellpeptid Mon1
10
9
8
HN
O
S
5
6
NH
7
4
2
O
3
1
RQYRLIVHNGYCDG(Hmb)RSERNL-CO2H
Biotin
Abbildung 95: Darstellung vom N-terminal gebundenen Biotin_1 im Modellpeptid Mon1
Proton
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
15
16
Biotin_2 (an der Hmb-Gruppe)
cis [ppm]
trans [ppm]
4.44
4.45
4.06
4.36
7.10
7.35
6.75
6.84
6.65
6.72
3.72
3.74
2.54
2.54
1.63
1.63
1.41
1.41
1.64 / 1.49
1.64 / 1.49
3.12
3.12
4.16
4.16
6.45
6.45
6.45
6.45
4.32
4.32
2.82 / 2.58
2.82 / 2.58
Biotin_1 (N-terminal)
Biotin_1-Arg1
2.14
1.50
1.30
1.60 / 1.46
3.07
4.11
6.41
6.39
4.30
2.79 / 2.56
/
/
/
/
/
/
Tabelle 15: Zuordnung der chemischen Verschiebungen der Hmb-Gruppe mit dem verankerten Biotin_2 und
vom N-terminal gebundenen Biotin_1
- 120 -
Aminosäure
Arg1
Gln2
Tyr3
Arg4
Leu5
Ile6
Val7
His8
NH [ppm]
8.02
7.96
7.95
8.13
7.93
7.90
7.78
8.17
Hα [ppm]
4.21
4.14
4.41
4.29
4.34
4.17
4.11
4.61
Hβ [ppm]
1.63 / 1.63
1.83 / 1.65
2.85 / 2.66
1.66/ 1.66
1.41
1.69
1.91
3.03 / 2.93
Asn9
Gly10
8.17
8.19
4.50
3.68 / 3.59
2.52 / 2.44
Tyr11
Cys12
Asp13
Gly14
Arg15
Ser16
8.03
8.13
8.49
8.24
8.19
4.45
4.38
4.88
4.31 / 3.82
4.41
4.33
Tyr11
8.01
4.45
Cys12
Asp13
Gly14
Arg15
Ser16
Glu17
Arg18
Asn19
Leu20
8.12
8.59
8.04
8.08
8.12
7.95
8.11
7.95
4.34
5.10
3.69 / 3.60
4.37
4.30
4.26
4.25
4.54
4.15
cis-Bereich
2.89 / 2.67
2.73 / 2.66
2.76 / 2.51
1.65 /1.65
3.62 / 3.57
trans-Bereich
2.89 / 2.67
2,6H 7.02; 3,5H 6.62
γ 1.46; δ n.z.; NH n.z.
2,6H 7.02
3,5H 6.62
2.65 / 2.65
2.81 / 2.41
1.63 / 1.63
3.59 / 3.59
1.94 / 1.94
1.64 / 1.64
2.53 / 2.40
1.49
Tabelle 16: Zuordnung der chemischen Verschiebungen der Aminosäuren des ModellPeptids Mon1
- 121 -
andere H, Hγ,Hδ,Hε [ppm]
γ 1.46; δ 3.06; NH 7.50
γCH2 2.07 / 2.07; δNH2 7.29 / 6.84
2,6H 6.99; 3,5H 6.61
γ 1.48; δ 3.05; NH 7.50
γCH 1.58: δCH3 0.82 / 0.85
γCH2 1.03 / 1.39; γCH3 0.73; δCH3 0.77
γCH3 0.78
2H 8.91
4H 7.30
γNH2 7.43 / 6.97
γ 1.46; δ n.z.; NH n.z.
γCH 2.25 /2.25
γ 1.49; δ 3.05; NH 7.45
γNH2 7.36 / 6.93
γCH 1.62; δCH3 0.87 / 0.82
Bei der Zuordnung der chemischen Verschiebungen der einzelnen Aminosäuren des
Modellpeptids Mon1 (Tabelle 16) zeigt sich, dass zwischen den Aminosäuren Asp-13 und
(Hmb)Gly-14 eine stark ausgeprägte cis/trans-Isomerie der Peptidbindung vorliegt. Dies ist
aus der Verdopplung aller Signale für die Aminosäuren innerhalb dieses Bereichs und auch
der Signale der Hmb Schutzgruppe mit dem daran verankerten Biotin_2 zu erkennen (Tabelle
15). Im Gegensatz dazu ist solch eine Signalverdopplung bei den Verschiebungen für das Nterminal gebundene Biotin_1 nicht zu erkennen.
Als Folge dieser Acylierung lässt sich die Hmb Schutzgruppe anschließend nicht mehr mit
TFA abspalten, so dass als Hauptprodukt ein Peptid mit einer Massendifferenz von zusätzlich
362 Da erhalten wird. Bei Verwendung der Dcpm geschützten Aminosäure Glycin, sowohl
als einzelne Aminosäure als auch integriert im Dipeptidbaustein Fmoc-Asp(OtBu)(Dcpm)Gly-OH, konnte diese Nebenreaktion während der Biotinylierung verhindert werden.
Das gewünschte nur am N-Terminus mit Biotin markierte Peptid konnte unter diesen
Bedingungen als Produkt erhalten werden.
Die bereits beschriebene Säurelabilität der Dcpm-Gruppe beeinträchtigte die Aufreinigung
unter Standardbedingungen mit Eluenten, die Trifluoressigsäure als Zusatz enthalten.
Während des Lyophilisierens des gereinigten Produktes kam es zur teilweisen Abspaltung der
Dcpm-Gruppe durch die Aufkonzentration der TFA im Lyophilisat. Deshalb führten wir die
Aufreinigung des Dipeptidbausteins und auch der drei Dcpm geschützten Aminosäuren
Glycin, Alanin und Leucin unter Verwendung eines 0.025 M Ammoniumacetat-Puffer an
Stelle der normalerweise verwendeten 0.2 % TFA als Zusatz der Eluenten durch (A: 0.025 M
Ammoniumacetat in H2O : MeCN 1000 ml : 350 ml; B: MeCN). Es wurde ein
Ammoniumacetat-Puffer-System auch
deshalb gewählt, da es durch wiederholtes
Lyophilisieren vollständig entfernt werden kann.
Der neue Synthesebaustein Fmoc-Asp(OtBu)-(Dcpm)Gly-OH stellt eine gute Alternative zu
den
käuflichen
Dipeptiden
Fmoc-Asp(OtBu)-(Hmb)Gly-OH
und
Fmoc-Asp(OtBu)-
(Dmb)Gly-OH (Novabiochem, Merck Biosciences und NeoMPS) dar. Auch wenn durch die
Verwendung der Dmb an Stelle der Hmb-Gruppe die Problematik der ungewollten
Acylierung der Seitenkettenschutzgruppe verhindert wird, so sind für die Abspaltung der
Dmb-Gruppe dennoch sehr viel harschere Bedingungen wie beispielsweise die Verwendung
von starken Säuren und längeren Reaktionszeiten nötig [112]. Hier lässt sich FmocAsp(OtBu)-(Dcpm)Gly-OH vorteilhaft einsetzen, da zur Abspaltung der Dcpm Gruppierung
vergleichsweise milde Bedingungen erforderlich sind. Es konnte am Beispiel von Fmoc(Dcpm)Gly-OH gezeigt werden, dass sich die Dcpm-Gruppe bereits unter sehr schwach
- 122 -
sauren Bedingungen von beispielsweise 5 % TFA in Chloroform abspalten lässt, was durch
NMR Messungen bestätigt werden konnte [19,101]. Der Zerfall der Dcpm-Gruppe unter
diesen Bedingungen zu weitgehend unreaktiven Molekülen stellt einen weiteren Vorteil der
Dcpm-Gruppe dar. Es wird eine Kontamination des synthetisierten Peptids während der
Abspaltung vom Harz mit Resten dieser Schutzgruppe vermieden. Abschließend lässt sich
feststellen, dass der neue Dipeptidbaustein Fmoc-Asp(OtBu)-(Dcpm)Gly-OH bei der
Synthese von Peptiden, welche das Sequenzmotiv Asp-Gly enthalten, ein wirkungsvolles
Werkzeug darstellt [137]. Dieser Dipeptidbaustein vermeidet die Aspartimidbildung und
umgeht Nebenreaktionen, wie ungewünschte Acylierung der phenolischen OH-Gruppe, die
beim Einsatz der Hmb-Gruppe auftreten können.
6.3.5
Einfluss der Seitenketten auf das cis/trans-Verhältnis der Peptidbindung beim
neuen Dipeptidbaustein Fmoc-Asp(OtBu)-(Dcpm)Gly-OH
In den NMR Spektren (1H NMR Abbildung 63, 2D NMR siehe Supporting Information von
[19]) des neuen Dipeptidbaustein Fmoc-Asp(OtBu)-(Dcpm)Gly-OH sind zwei komplette
Signalsätze für alle Protonen zu finden (Tabelle 5). Diese beruhen auf der cis/trans-Isomerie
der Peptidbindung. Das Verhältnis zwischen dem thermodynamisch stabileren trans-Isomer
und dem cis-Isomer liegt gemessen bei 298 K in CDCl3 als Lösungsmittel bei 65:35. Neben
dem sterischen Einfluss der Schutzgruppen beeinflussen auch die Aminosäureseitenketten das
Verhältnis zwischen cis- und trans-Isomer, wie bei den drei Dcpm geschützten Aminosäuren
Glycin, Alanin und Leucin beobachtet werden konnte [19]. In Tabelle 17 sind die
Verhältnisse der Isomere der drei Aminosäuren sowie die Verteilung bei zwei verschiedenen
Lösungsmitteln
für
den
neuen
Dipeptidbaustein
Fmoc-Asp(OtBu)-(Dcpm)Gly-OH
wiedergegeben. Hierbei ist auch zu erkennen, dass die cis/trans-Isomerie unter anderem vom
gewählten Lösungsmittel abhängig ist.
- 123 -
Verbindung
Fmoc-(Dcpm)Gly-OH
Fmoc-(Dcpm)Ala-OH
Fmoc-(Dcpm)Leu-OH
Fmoc-Asp(OtBu)-(Dcpm)Gly-OH
Fmoc-Asp(OtBu)-(Dcpm)Gly-OH
Trans
65 %
75 %
95 %
65 %
55 %
Lösungsmittel
CDCl3
CDCl3
CDCl3
CDCl3
CD3CN
cis
35 %
25 %
5%
35 %
45 %
Tabelle 17: Verhältnisse der cis- und trans-Konformere beruhend auf der gehinderten Rotation um das tertiäre
Stickstoffatom der Amin bzw. Amidfunktion; bestimmt mittels 1H NMR Spektroskopie [19]
CH3
H3C
CH3
O
O
H
N
O
O
O
O
OH
N
O
HN
H3C
O
H3C
O
OH
N
O
O
CH3 O
9
8
Abbildung 96: Schematische Darstellung des cis- 8 und trans-Isomer 9 des neuen Dipeptidbaustein FmocAsp(OtBu)-(Dcpm)Gly-OH
Die äquivalenten Protonen der beiden Cyclopropylringe vom cis-Isomer 8 zeigen identische
chemische Verschiebungen im Gegensatz zu den Cyclopropylringen des trans-Isomer 9
(Tabelle 5 und 18; Abbildung 96). Hier wird die Möglichkeit zur freien Rotation der DcpmGruppe
durch
die
geschützte
Seitenkette
der
Asparaginsäure
behindert.
Durch
Temperaturerhöhung konnte ein „Shiften“ der chemischen Verschiebungen für beide Isomere
beobachtet werden. Jedoch wurde bei Messungen bis zu 70 °C der Koaleszenzpunkt nicht
erreicht, an dem nur noch ein kompletter Signalsatz für das thermodynamisch stabilste Isomer
zu erkennen wäre. In Tabelle 18 ist abschließend der Einfluss der Aminosäureseitenketten auf
die Signalsätze der Cyclopropylringe der Dcpm-Gruppe zusammengefasst.
Verbindung
Fmoc-(Dcpm)Gly-OH
Fmoc-(Dcpm)Ala-OH
Fmoc-(Dcpm)Leu-OH
Fmoc-Asp(OtBu)-(Dcpm)Gly-OH
Signalsätze für
Cyclopropylringe beim
trans-Isomer
verschieden
verschieden
verschieden
verschieden
Signalsätze für
Cyclopropylringe beim
cis-Isomer
gleich
verschieden
n.z. (Anteil unter 5 %)
gleich
Tabelle 18: Übersicht zur chemischen Verschiebung der beiden Cyclopropylringe der Dcpm geschützten
Verbindungen zum Einfluss der Aminosäureseitenketten auf die cis/trans-Isomerie
- 124 -
7
Verzeichnis der verwendeten Abkürzungen
Ac
-
Acetyl
Acm
-
Acetamidomethyl
AcHmb
-
2-Acetoxy-4-methoxybenzyl
Ac2O
-
Essigsäureanhydrid
AcOH
-
Essigsäure
ACP
-
Acyl Carrier Protein
Boc
-
tert-Butyloxycarbonyl
br s
-
breites Singulett
Bu
-
Butyl
BSA
-
N,O-Bis(trimethylsilyl)acetamid
Cbz
-
Carbobenzyloxy
CD
-
Circularer Dichroismus
CHCA
-
α-Cyano-4-hydroxyzimtsäure
d
-
Dublett
Da
-
Dalton
DBU
-
1,8-Diazabicyclo[5.4.0]undec-7-en
DCM
-
Dichlormethan
Dcpm
-
Dicylcopropylmethyl
DEPT
-
Distortionless Enhancement by Polarization Transfer
DIC / DIPCDI
-
Diisopropylcarbodiimid
DIEA / DIPEA -
Diisopropylethylamin
Dmab
4-{N-[1-(4,4-dimethyl-2,6-dioxocyclohexyliden)-3-
-
methylbutyl]amino}benzyl
Dmb
-
2,4-Dimethoxybenzyl
Dmmb
-
4,5-Dimethoxy-2-mercaptobenzyl
E
-
Energie in kJ/mol
EA
-
Elementaranalyse
EDOTn
-
3,4-Ethylendioxy-2-thenyl
EIAV
-
Equine Infectious Anemia Virus (Virus der infektiösen Anämie der
Einhufer)
EPL
-
Expressed Protein Ligation
eq
-
Äquivalent
- 125 -
ESI
-
Electrospray Ionization
Et
-
Ethyl
Et2O
-
Diethylether
Fmoc
-
9-Fluorenylmethoxycarbonyl
h
-
Stunde
HATU
-
N-[(dimethylamino)-1H-1,2,3-triazolo[4,5-b]pyridin-1-ylmethylene]N-methylmethanaminium hexafluorophosphate N-oxid
HBTU
-
N-[(1H-benzotriazol-1-yl)(dimethylamino)methylene]-Nmethylmethanaminium hexafluorophosphate N-oxid
H2O
-
Wasser
HIV
-
Humanes Immundefizienzvirus
Hmb
-
2-Hydroxy-4-methoxybenzyl
HMPB
-
4-(4-Hydroxymethyl-3-methoxyphenoxy)butyryl
HOBt
-
1-Hydroxybenzotriazol
Hrsg
-
Herausgeber
Hz
-
Hertz
IAV
-
Influenza A Virus
iPr
-
Isopropyl
J
-
Kopplungskonstante in Hz
m
-
Multiplett
M
-
molar [mol*l-1]
MALDI
-
Matrix Assisted Laser Desorption Ionization
mCPBA
-
meta-Chlorperbenzoesäure
Me
-
Methyl
MeCN
-
Acetonitril
MESNa
-
Natriumsalz der 2-Mercaptoethansulfonsäure
MIM
-
1-Methyl-3-indolylmethyl
min
-
Minute
mp
-
Schmelzpunkt
MS
-
Massenspektroskopie
MsCl
-
Methansulfonsäurechlorid (CH3SO2Cl)
NCL
-
Native Chemical Ligation
NMP
-
N-Methylpyrrolidon
NMR
-
Nuclear Magnetic Resonance
- 126 -
NOESY
-
Nuclear Overhauser and Exchange Spectroscopy
n.z.
-
nicht zugeordnet
OAt
-
O-(7-azabenzotriazol-1-yl)
OSu
-
N-hydroxysuccinimide
OtBu
-
tert-Butylester
PEG
-
Polyethylenglycol
PFT
-
Puls-Fourier-Transform
ppm
-
parts per million
PS
-
Polystyrol
q
-
Quartett
Reagent K
-
82.5 % TFA + 5 % Phenol + 5 % H2O + 5 % Thioanisol + 2.5 %
Ethandithiol
r.m.s.
-
root mean square:
r.m.s. deviation (mittlere quadratische Abweichung /
Standardabweichung)
r.m.s. differences (mittlere quadratische Unterschiede)
RP-HPLC
-
Reverse Phase High Performance Liquid Chromatography
RT
-
Raumtemperatur
Rt
-
Retentionszeit
SPPS
-
Solid Phase Peptide Synthesis (Festphasenpeptidsynthese)
SPCL
-
Solid Phase Chemical Ligation (NCL an der festen Phase)
s
-
Singulett
t
-
Triplett
T
-
Temperatur
tBu
-
tert-Butyl
TCEP
-
Tris-(2-carboxyethyl)-phosphin
tert
-
tertiär
TFA
-
Trifluoressigsäure
TFE
-
Trifluorethanol
THF
-
Tetrahydrofuran
TIPS
-
Triisopropylsilan
Tmb
-
4,5,6,-Trimethoxy-2-mercaptobenzyl
Tmob
-
2,4,6-Trimethoxybenzyl
TMSCl
-
Trimethylsilylchlorid
- 127 -
TOCSY
-
Total Correlation Spectroscopy
Trt
-
Trityl (Triphenylmethyl)
UPLC
-
Ultra Performance Liquid Chromatography
UV
-
Ultraviolett
v/v
-
Volumenverhältnisse zueinander
W
-
Watt
Xxx
-
Abkürzung für eine beliebige Aminosäure im Dreibuchstabencode
Å
-
Angström (1Å = 10-10 m)
δ
-
chemische Verschiebung in ppm
ρ
-
Dichte in g*cm-3
Die chiralen Aminosäuren wurden in Anlehnung an die Empfehlungen der IUPAC-IUB
Kommission der Biochemischen Nomenklatur bezeichnet [138]. Die Aminosäuren wurden
dabei durch den Ein- bzw. Dreibuchstabencode abgekürzt und sofern nicht anders angegeben
beziehen sich die Angaben jeweils auf das L-Isomer.
- 128 -
8
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- 136 -
9
Danksagung
Besonders bedanken möchte ich mich bei Dr. Peter Henklein dafür, dass ich einen Großteil
meiner Dissertationszeit in seinem Labor im Institut für Biochemie der Charité
Universitätsmedizin-Berlin arbeiten durfte, sowie für die zahlreichen konstruktiven
Diskussionen bei Fachproblemen und die sehr gute Betreuung. Ebenfalls möchte ich mich bei
Barbara Brecht-Jachan, Prisca Kunert, Manuela Dierenfeld und Dr. Petra Henklein für die
sehr gute Zusammenarbeit im Labor und die stete Hilfsbereitschaft bedanken.
Ich möchte mich bei meinem Doktorvater Prof. Dr. Ulrich Schubert für die Aufnahme in
seinen Arbeitskreis, die spannende und interessante Themenstellung und die sehr gute
Betreuung bedanken. Außerdem bedanke ich mich bei allen Mitgliedern der Arbeitsgruppe
von Prof. Schubert in der Virologie der Universität Erlangen-Nürnberg.
Ebenfalls möchte ich mich bei Prof. Dr. Andreas Hirsch für die Übernahme des
Erstgutachtens für meine Arbeit bedanken.
Mein Dank gilt auch Dr. Victor Wray vom Helmholtz-Zentrum für Infektionsforschung in
Braunschweig für die vielen hilfreichen Ratschläge bei Fachproblemen sowie Karsten Bruns
und Dr. Alok Sharma für die tatkräftige Unterstützung bei der Auswertung der
zweidimensionalen NMR-Spektren der Peptide und der anschließenden Berechnung der
Peptidstrukturen.
Ebenso bedanke ich mich bei Prof. Dr. Stefan Hecht für die Möglichkeit zur Durchführung
von diversen chemischen Synthesearbeiten in seinem Labor im Institut für Organische
Chemie der Humboldt Universität zu Berlin und Dr. Michael Pätzel für seine Unterstützung
vor Ort während dieser Zeit und Dr. Joachim Leistner für die UPLC und HR-MS Messungen.
Ich bedanke mich auch bei Dr. Hardy Weißhoff vom Institut für Chemie der Humboldt
Universität zu Berlin für die hilfreichen Diskussionen und die Unterstützung bei der
Auswertung der NMR-Spektren der Dcpm-Aminosäurebausteine.
Mein ganz besonderer Dank gebührt meiner Frau Sandra und meiner Familie, die mich immer
gefördert und in jeder erdenklichen Art unterstützt haben. Die Geburt meiner Tochter
Séraphie Joelie während meiner Dissertationszeit war dabei eine Bereicherung meines Lebens
in besonderem Maße. Meinen Eltern möchte nochmals für ihre Hilfe und Aufmunterung
danken, ohne die diese Arbeit niemals möglich gewesen wäre.
- 137 -
10 Curiculum Vitae
Name:
Röder
Vorname:
René
Geburtsdatum:
11. Mai 1979
Geburtsort:
Berlin – Lichtenberg
Familienstand:
verheiratet
Kinder:
eine Tochter
09/1985 bis 08/1991
Grundschule in Berlin – Prenzlauer Berg
09/1991 bis 07/1995
Heinrich-Schliemann-Oberschule (Gymnasium) in Berlin
08/1995 bis 06/1998
Alexander-von-Humboldt-Oberschule (Gymnasium) in Berlin
07/1998 bis 04/1999
Grundwehrdienst; 2. Kompanie des Panzergrenadierbatallion 72 in
Hamburg – Harburg
10/1999 bis 10/2005
Studium der Chemie an der Technischen Universität Berlin
Diplomarbeit in Organsicher Chemie unter Betreuung von Prof. Dr.
Karola Rück-Braun
Titel: „Darstellung von Heterocyclen ausgehend von Nitronen“
Note der Diplomarbeit: sehr gut (1,0)
seit 11/2005
Promotion unter Betreuung von Prof. Dr. Ulrich Schubert an der
Universität Erlangen-Nürnberg in Zusammenarbeit mit Dr. Peter
Henklein
vom
Institut
für
Biochemie
von
der
Charité
Universitätsmedizin-Berlin und Dr. Victor Wray vom HelmholtzZentrum für Infektionsforschung in Braunschweig
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11 Publikationen
1. Karsten Bruns, Nicole Studtrucker, Alok Sharma, Torgils Fossen, David Mitzner,
André Eissmann, Uwe Tessmer, René Röder, Peter Henklein, Victor Wray and Ulrich
Schubert. Structural Characterization and Oligomerization of PB1-F2, a Proapoptotic
Influenza A Virus Protein. Journal of Biological Chemistry, 2007, 282, 353-363.
2. René Röder, Karsten Bruns, Alok Sharma, André Eissmann, Friedrich Hahn, Nicole
Studtrucker, Torgils Fossen, Victor Wray, Peter Henklein, and Ulrich Schubert.
Synthesis of full-length PB1-F2 influenza A virus proteins from “Spanish flu” and
“bird flu”. Journal of Peptide Science, 2008, 14, 954-962.
3. Petra Henklein, René Röder, Hardy Weißhoff, Peter Henklein and Louis A. Carpino.
The Dcpm protecting group is a useful alternative to the Hmb residue. Advances in
Experimental Medicine and Biology, 2009, 611, 247-248.
4. Alok Sharma, Karsten Bruns, René Röder, Peter Henklein, Jörg Votteler, Victor Wray
and Ulrich Schubert. Solution structure of the Equine Infectious Anemia Virus p9
protein: a rationalization of its different ALIX binding requirements compared to the
analogous HIV-p6 protein. BMC Structural Biology, 2009, 9: 74.
5. René Röder, Petra Henklein, Hardy Weißhoff, Clemens Mügge, Michael Pätzel,
Ulrich Schubert, Louis A. Carpino and Peter Henklein. On the use of Ndicyclopropylmethyl aspartyl-glycine synthone for backbone amide protection.
Journal of Peptide Science, 2010, 16, 65-70.
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12 Eidesstattliche Erklärung
Die vorliegende Arbeit wurde in der Zeit vom November 2005 bis Dezember 2008. im
Institut für Biochemie der Charité Universitätsmedizin-Berlin, im Institut für Organische
Chemie
der
Humboldt
Universität
zu
Berlin
und
am
Helmholtz-Zentrum
für
Infektionsforschung in Braunschweig angefertigt.
Hiermit erkläre ich an Eides statt, dass ich die vorliegende Dissertation selbstständig und nur
unter Verwendung der angegebenen Quellen und Hilfsmittel angefertigt habe.
Weder diese noch eine andere Arbeit wurde von mir an einer anderen Universität oder
Hochschule zum Zwecke der Einleitung eines Promotionsverfahrens vorgelegt.
René Röder
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