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Aus dem Zentrum für Pathologie der Universität zu Köln
Allgemeine Pathologie und Pathologische Anatomie
Direktor: Universitätsprofessor Dr. med. H. P. Dienes
Molekulare Untersuchungen zu Virusinfektionen
als auslösende Faktoren
für Plazentitis, fetalen Hydrops und intrauterinen Fruchttod
Inaugural-Dissertation zur Erlangung der Doktorwürde
der Hohen Medizinischen Fakultät
der Universität zu Köln
vorgelegt von
Zuzana Amoakoova
aus Bratislava/Slowakei
Promoviert am 25. März 2009
Dekan:
Universitätsprofessor Dr. med. J. Klosterkötter
1. Berichterstatter:
Universitätsprofessor Dr. med H.P. Dienes
2. Berichterstatter:
Universitätsprofessor Dr. med. B. Roth
Erklärung:
Ich erkläre hiermit, dass ich die vorliegende Arbeit ohne unzulässige Hilfe Dritter und ohne
Benutzung anderer als der angegebenen Hilfsmittel angefertigt habe; die aus fremden Quellen
direkt oder indirekt entnommenen Gedanken sind als solche kenntlich gemacht.
Bei der Auswahl und Auswertung des Materials sowie bei der Herstellung des Manuskriptes habe
ich keine Unterstützungsleistungen erhalten.
Weitere Personen waren an der geistigen Herstellung der vorliegenden Arbeit nicht beteiligt.
Insbesondere habe ich nicht die Hilfe eines Promotionsberaters in Anspruch genommen. Dritte
haben von mir weder unmittelbar noch mittelbar geldwerte Leistungen für Arbeiten erhalten, die
im Zusammenhang mit dem Inhalt der vorgelegten Dissertation stehen.
Die Arbeit wurde von mir bisher weder im Inland noch im Ausland in gleicher oder ähnlicher
Form einer anderen Prüfungsbehörde vorgelegt und ist auch noch nicht veröffentlicht.
Köln, den 01.09.2008
Zuzana
Amoakoova
Die in dieser Arbeit vorgelegten Experimente sind nach entsprechender Anleitung durch Frau
Priv.-Doz. Dr. rer. nat. M. Odenthal und den medizinisch bzw. biologisch-technischen
Assistentinnen Frau Nicole Helmholdt und Frau Melanie Scheffler von mir selbst ausgeführt
worden.
Danksagung
Herrn Professor Dr. med. H. P. Dienes danke ich vielmals für die Überlassung des interessanten
Themas und für die wissenschaftliche Unterstützung bei dieser Arbeit.
Mein besonderer Dank gilt Frau Priv.-Doz. Dr. rer. nat. Margarete Odenthal für die großartige
Betreuung. Ihr unermüdlicher Einsatz während des ganzen Projektes, ihre hervorragende fachliche
Unterstützung sowie ihre uneingeschränkte Hilfsbereitschaft bei der Gestaltung und Umsetzung
dieser Arbeit waren außerordentlich bereichernd und hilfreich.
Danke für ihre Herzlichkeit, Geduld und Wärme und für das entgegengebrachte Vertrauen.
Herzlich gedankt sei Herrn Priv.-Doz. Dr. Fries für das Korrekturlesen dieser Arbeit und für die
hilfreichen Anmerkungen. Danke auch für die großartigen histologischen Fotos.
Bei dem Forschungsteam von Frau Priv.-Doz. Dr. rer. nat. Odenthal möchte ich mich für die mir
vor allem in der Anfangszeit entgegengebrachte Geduld im Labor bedanken und für die stete
Bereitschaft, mir mit Rat und Tat zur Seite zu stehen. Insbesondere Melanie Scheffler und Nicole
Helmholdt möchte ich für die hervorragende Einarbeitung danken.
Abschließend möchte ich mich bei meiner Mutter, die mich mein ganzes Leben uneingeschränkt
unterstützt hat bedanken, für ihren unerschütterlichen Glauben in mich und meine Fähigkeiten.
Z. Amoakoova
Inhaltsverzeichnis
1
Einleitung ________________________________________________________________ 1
1.1
Verlauf der Schwangerschaft......................................................................................1
1.2
Risikofaktoren im Verlauf der Schwangerschaft.........................................................2
1.2.1 Pathologischer Einfluss endogener Faktoren auf die Schwangerschaft ............3
1.2.2 Pathologischer Einfluss exogener Faktoren auf die Schwangerschaft..............3
1.2.3 Viren ..............................................................................................................4
1.2.3.1 HCMV.............................................................................................4
1.2.3.2 EBV.................................................................................................5
1.2.3.3 Humanes Adenovirus .......................................................................6
1.2.3.4 Humanes Parvovirus B19.................................................................7
1.3
Diagnostische Ansätze bei Spontanabort ....................................................................8
1.3.1 Immunologische Ansätze................................................................................9
1.3.2 Molekularbiologische Ansätze......................................................................10
1.3.3 Histomorphologische Befunde......................................................................11
2
Aufgabenstellung _________________________________________________________ 16
3
Material und Methoden ____________________________________________________ 17
3.1
Verwendete Materialien ...........................................................................................17
3.1.1 Glaswaren und Plastikwaren.........................................................................17
3.1.2 Reagenzien zur Entparaffinierung, Zelllyse und Nukleinsäureextraktion.......17
3.1.3 DNA-modifizierende Enzyme und Nukleotide für die PCR ..........................18
3.1.4 Reagenzien für die Gelelektrophorese...........................................................18
3.1.5 Geräte...........................................................................................................18
3.1.6 Untersuchungsmaterial .................................................................................19
V
3.2
DNA-Extraktion aus den in Paraffin eingebetteten Gewebeproben...........................20
3.3
Polymerase-Ketten-Reaktion (PCR).........................................................................21
Z. Amoakoova
Inhaltsverzeichnis
3.3.1 Verwendete Oligonukleotid-Primer ..............................................................21
3.3.2 PCR-Nachweis als Extraktionskontrolle .......................................................23
3.3.3 Durchführung der PCR zum Nachweis viraler Infektionen in Plazenten........25
3.4
4
Agarose-Gelelektrophorese ......................................................................................27
Ergebnisse _______________________________________________________________ 28
4.1
Auswahl von Plazentagewebeproben........................................................................28
4.2
Etablierung eines PCR-Nachweises für Parvovirus-Infektionen an formalin-fixiertem
Material ...................................................................................................................30
4.2.1 Sequenz- und Primerauswahl für das Humane Parvovirus B19 zur PCRAmplifikation ...............................................................................................31
4.2.2 Prüfung der ausgewählten Primerpaare.........................................................32
4.3
Nachweis von Parvoviren am ausgewählten Plazenta-Probenkollektiv .....................34
4.4
Nachweis von EBV und CMV am ausgewählten Plazenta-Probenkollektiv ..............34
4.5
Nachweis von Adenoviren .......................................................................................36
4.6
Durch PCR nachgewiesene Infektionen und der Vergleich zur Histologie ................37
4.6.1 Parvovirus B19.............................................................................................38
4.6.2 CMV ............................................................................................................39
4.6.3 Adenovirus ...................................................................................................39
4.6.4 Epstein-Barr Virus........................................................................................40
5
Diskussion _______________________________________________________________ 41
5.1
Etablierung der Nachweise viraler DNA mittels PCR an formalinfixierten und in
Paraffin eingebetteten Plazentagewebeproben ..........................................................41
5.1.1 Der Nachweis von Parvoviren durch die PCR...............................................41
5.1.2 Der Nachweis von Pathogenen durch die PCR..............................................44
5.2
Die Inzidenz viraler Infektionen im Zusammenhang mit intrauterinem Fruchttod und
Spontanabort............................................................................................................45
5.3
Die PCR als zusätzliches pathologisches Nachweisverfahren bei IUFT und
Spontanabort aufgrund begrenzter Aussagekraft der Histologie................................47
5.4
Psychologische Auswirkungen einer sensitiven Infektionsdiagnostik
auf die
Familienplanung ......................................................................................................48
VI
Z. Amoakoova
Inhaltsverzeichnis
6
Zusammenfassung ________________________________________________________ 50
7
Literaturverzeichnis_______________________________________________________ 52
VII
Z. Amoakoova
VIII
Z. Amoakoova
Abkürzungsverzeichnis
Abkürzungsverzeichnis
bp
Basenpaare
DNA
Desoxyribonukleinsäure
EBV
Epstein Barr Virus
ELISA
Enzyme Linked Immunosorbent Assay
HCMV
Humanes Cytomegalovirus
HHV 5
Humanes Herpes Virus 5
HIV
Human Immunodeficiency Virus
IgG
Immunglobulin G = Antikörper der Klasse G
IgM
Immunglobulin M = Antikörper der Klasse M
IUFT
Intrauteriner Fruchttod
pc
post conceptionem
PCR
Polymerase - Ketten (Chain) - Reaction
PV B19
Parvovirus B19
SSW
Schwangerschaftswoche
upm
Umdrehungen pro Minute
IX
1 1 Einleitung
Im Laufe einer Schwangerschaft gibt es eine Reihe potentieller Risikofaktoren, die den
physiologischen Verlauf beeinträchtigen können und im ungünstigsten Fall einen
Spontanabort, den frühzeitigen Verlust der Schwangerschaft, bewirken. Hierzu zählen neben
chromosomalen, anatomischen und endokrinologischen Anomalien auch Infektionen mit
embryo- bzw. fetotoxischen Viren. Davon sind manche als potenziell schädlich anerkannt,
wie das Parvovirus B19, Humanes Cytomegalievirus und das Epstein Barr Virus. Anderen
Viren, wie zum Beispiel dem Adenovirus, konnten bisher keine schädigenden Einflüsse
nachgewiesen werden. Jedem Virus kommt eine unterschiedliche Bedeutung in der
Pathogenese der Schwangerschaft zu. Die möglichen diagnostischen Ansätze zur Abklärung
eines Spontanaborts und zum eventuellen Nachweis einer ursächlichen Infektion durch die
oben genannten Viren, sind vielfältig. Für deren Anwendung in der Routinediagnostik gibt es
jedoch keine klaren Leitlinien. Besonders beim sporadischen Abort wird häufig aus zeit- und
kostenökonomischen Gründen auf eine weiterführende Diagnostik verzichtet. Wir möchten
im Rahmen dieser Arbeit die Zuverlässigkeit und Praktikabilität einzelner diagnostischer
Verfahren zum Nachweis viraler Infektionen nach Spontanabort prüfen und anschließend
diskutieren, inwieweit es sinnvoll und notwendig ist, diese Tests bereits nach einmaligem
Abortereignis in der Routinediagnostik anzuwenden.
1.1 Verlauf der Schwangerschaft
Eine normale Schwangerschaft dauert beim Menschen 38 Wochen oder 9 ½ Monate post
conceptionem (p.c.). Bestimmt man den Geburtstermin, von dem ersten Tag der letzten
Regelblutung ausgehend, so beträgt die Schwangerschaftsdauer 40 Wochen oder 10
Mondmonate. In der Medizin wird die Schwangerschaft üblicherweise in drei Abschnitte zu
jeweils drei Monaten (Trimena) eingeteilt. Das erste Trimenon entspricht der 1.-13.
Schwangerschaftswoche (SSW) und wird auch Embryonalperiode genannt. Der Embryo ist in
dieser vulnerablen Phase, in der die Organe angelegt werden (Organogenese), sehr anfällig
gegenüber Störungen aller Art. Nach dieser kritischen Entwicklungsphase, am Ende des
ersten Schwangerschaftsdrittels, ist der größte Teil der Organbildung abgeschlossen und die
Embryonalperiode wird von der Fetalperiode abgelöst. Im zweiten Trimenon (14.-26. SSW)
1
Z. Amoakoova
entwickeln sich unter anderem die äußeren Geschlechtsorgane und erste Anteile des Skeletts
verknöchern. Am Ende dieses Drittels ist die Differenzierung fast aller Organe so weit
fortgeschritten, dass im dritten Trimenon (26.-40. SSW) vornehmlich das Längenwachstum
und die Lungenreifung im Vordergrund stehen (zusammengefasst aus dem Lehrbuch
„Embryologie“ von Keith L. Moore (51)).
Kommt ein Kind vor Vollendung der 37. SSW zur Welt, spricht man per definitionem von
einer Frühgeburt. Bis zu einem Gestationsalter von 22 Schwangerschaftswochen liegt die
Mortalität bei Frühgeborenen trotz hohen intensivmedizinischen Aufwands bei fast 100 % (4).
Erst ab der 23. SSW. hat ein Frühgeborenes eine reelle Chance zu überleben, wobei sich mit
wachsendem Gestationsalter auch die Prognose stetig verbessert. Vor vollendeter 24. SSW
liegt die Überlebensrate noch bei 50 bis 60 % (4, 32, 79), ab der 25. SSW sind es schon 80 %
und ab einem Gestationsalter von 28 SSW überleben 90 bis 95 % der Fälle (29, 34, 79). Die
Gliederung der Schwangerschaft in Schwangerschaftswochen oder auch in erstes, zweites und
drittes Trimenon ist insofern sinnvoll, als bestimmte physiologische Veränderungen des
mütterlichen Organismus, Entwicklungsstadien des Kindes aber auch pathologische Prozesse
bei Mutter und Kind nicht selten typischerweise in für sie charakteristischen Trimena
auftreten. Bei manchen schädigenden Faktoren oder Infektionen hat der Zeitpunkt ihres
Auftretens eine prognostische Bedeutung für das Ungeborene.
1.2 Risikofaktoren im Verlauf der Schwangerschaft
Die Inzidenz von Spontanaborten beträgt 10 bis 20 % aller Schwangerschaften, die mit einem
Ultraschall festgestellt werden (21, 26, 63), wobei mit zunehmender Dauer der
Schwangerschaft das Risiko einer Fehlgeburt abnimmt. Die wahre Inzidenz kann allerdings
nur geschätzt werden, da man davon ausgeht, dass 30 bis 50 % aller befruchteten Eizellen
absterben, ohne dass die Frau es bemerkt, da sie zusammen mit der Regelblutung abgehen
oder als Blutungsunregelmäßigkeit fehlinterpretiert werden. Obwohl die Pathogenese und
Pathophysiologie der Schwangerschaft mittlerweile besser erforscht ist und eine Vielzahl von
Gründen für eine Fehlgeburt, die exogener oder endogener Natur sein können, bekannt sind,
bleibt die Ursache in vielen Fällen ungeklärt.
2
Einleitung
1.2.1 Pathologischer Einfluss endogener Faktoren auf die Schwangerschaft
Zu den häufigsten Ursachen zählen seitens des Kindes genetische und chromosomale Defekte
(6, 26, 47, 49, 88) und die damit häufig verbundenen strukturellen Anomalien. Besonders
wenn ein Defekt nicht mit dem Leben vereinbar ist, kommt es hier meist zu einem
frühzeitigen Ende der Schwangerschaft. Auf der anderen Seite können anatomische und
funktionelle Anomalien der Gebärmutter (13), hormonelle Störungen oder schwere
Allgemeinerkrankungen der Schwangeren, wie zum Beispiel Diabetes mellitus ein
frühzeitiges Ende der Schwangerschaft provozieren (20). Erwähnenswert ist auch das Alter
der Mutter als einflussnehmender Faktor (72), da sich mit steigendem Alter auch die
Fehlgeburtenrate erhöht (55).
1.2.2 Pathologischer Einfluss exogener Faktoren auf die Schwangerschaft
Zu den exogenen Faktoren, die einen negativen Einfluss auf den Schwangerschaftsverlauf
ausüben, gehören unter anderem Noxen wie Nikotin, Alkohol, embryo- und fetotoxische
Medikamente und mütterliche Infektionen, die bakteriell, parasitär oder viral bedingt sein
können. Die typischen Erreger dieser Infektionen, die die Plazentaschranke passieren und zu
einer pränatalen Schädigung des Kindes führen können, werden unter dem Begriff „TORCH“
zusammengefasst:
3
Z. Amoakoova
Abbildung 1:
Pathogene, die unter dem Begriff TORCH zusammengefasst werden (die in dieser Arbeit
untersuchten Viren sind hervorgehoben)
1.2.3 Viren
Hier seien in Hinblick auf die vorliegende Arbeit insbesondere das Epstein-Barr-Virus (EBV),
das Adenovirus, Parvovirus B19 und das Humane Cytomegalovirus (HCMV) erwähnt.
1.2.3.1 HCMV
Das humane Cytomegalovirus (HCMV), auch als Humanes-Herpes-Virus 5 (HHV 5)
bezeichnet, ist mit einem Durchmesser von 150 bis 200 nm das größte der humanpathogenen
Herpesviren. Es enthält als Genom eine doppelsträngige DNA, mit einer Größe von zirka
230.000 Basenpaaren, die von einem ikosaedrischen Proteinkapsid umgeben ist. Um das
Kapsid befindet sich eine amorphe Masse, die als Tegument bezeichnet wird und die
ihrerseits von einer Lipidmembran umschlossen wird. Diese Virushülle enthält mindestens
acht verschiedene Glykoproteine, gegen die der Wirtsorganismus Antikörper bilden kann
(69).
Die Seroprävalenz HCMV-spezifischer Antikörper gegen das ubiquitär (weltweit) verbreitete
HCMV weist in Abhängigkeit von der geographischen Lage und vom sozioökonomischen
4
Einleitung
Standard eines Landes eine große Variationsbreite auf. In Ländern der Dritten Welt wird sie
im Erwachsenenalter mit 100 % angegeben, während die Prävalenz HCMV-spezifischer
Antikörper in den Industrieländern bei 40 bis 70 % liegt (71).
Das HCMV wird parenteral übertragen und gelangt über Transfusion zellhaltiger
Blutbestandteile oder bei Stammzell- bzw. Organtransplantationen in den Organismus.
Andere mögliche Übertragungswege sind die durch Speichel, sexuell über Samenflüssigkeit
und zervikale Sekrete, transplazentar (intrauterine kongenitale Infektion) und die Übertragung
durch Muttermilch (postnatale Infektion) (30). Wie alle Herpesviren geht HCMV nach der
Primärinfektion in den Zustand der Latenz über und persistiert lebenslang im Organismus.
Die Primärinfektion (Erstinfektion) mit HCMV verläuft bei immunkompetenten Personen
meistens asymptomatisch. Dagegen kann eine Primärinfektion oder eine Reaktivierung von
CMV insbesondere bei Störung der T-Lymphozyten gesteuerten Immunität, wie dies zum
Beispiel im Rahmen maligner Lymphome, erworbener Immunerkrankungen wie AIDS oder
bei Patienten nach Chemotherapie und Organtransplantationen der Fall ist, lebensbedrohlich
sein.
Im Falle einer Primärinfektion oder einer Reaktivierung des Virus während der
Schwangerschaft kommt es in 40 % der Fälle zu einer Übertragung des Virus auf das Kind.
Die kongenitale Infektion mit HCMV stellt die häufigste Ursache für intrauterine
Fruchtschädigungen dar und man nimmt an, dass etwa ein Prozent aller Neugeborenen
infiziert ist (kongenitale CMV-Infektion). Davon zeigen ca. 7-10 % klinische Symptome
(kongenitale Zytomegalie). Sie fallen postnatal durch ein niedriges Geburtsgewicht,
Trinkschwäche,
Mikrozephalus,
intrazerebrale
Verkalkungen,
Chorioretinitis,
Hepatosplenomegalie, Hautblutungen, Ikterus, Pneumonie und neurologische Störungen, wie
psychomotorische Retardierung, Krämpfe und Hörschäden auf (3, 22, 61).
1.2.3.2 EBV
Der Aufbau des ca. 120-180 nm großen Epstein-Barr-Virus (EBV), der ebenfalls zur Familie
der humanpathogenen Herpesviren, Subgruppe Gammaherpesvirinae, gehört, ist mit dem
anderer Herpesviren vergleichbar. Sein Genom in Form einer doppelsträngigen DNA enthält
die genetische Information für mehr als 70 Proteine und wird von einem Kapsid umgeben,
welches seinerseits von einer Lipidmembran umhüllt ist. Zwischen ihnen befindet sich das
Tegument. Die am häufigsten in der Lipidhülle vertretenen Glykoproteine, gp340/220, dienen
unter anderem der Einschleusung des Virus in die Wirtszelle (86). Auch EBV hat die
5
Z. Amoakoova
Eigenschaft, lebenslang im Organismus des Wirtes zu persistieren. Dies kann in Form einer
latenten Infektion innerhalb einiger weniger zirkulierender B-Lymphozyten geschehen oder in
Form einer aktiven/produktiven Infektion. In letzterem Fall werden infektiöse Virionen in
Zellen des Urogenitaltrakts, des Oropharynxs oder der Speicheldrüsen produziert und auch
nach einer durchgemachten Infektion weiter sezerniert (46, 87).
Die Seroprävalenz für EBV ist in Entwicklungsländern sehr hoch. Bereits im vierten
Lebensjahr können je nach Region bei bis zu 99,9 % der Kinder EBV-Antikörper
nachgewiesen werden. Letzteres ist der serologische Beweis für eine durchgemachte
Infektion. In Industrieländern findet die Durchseuchung je nach sozioökonomischem Status
und individuellen hygienischen Standards im Kindes-, Jugend- oder erst im frühen
Erwachsenenalter statt.
EBV wird am häufigsten durch Tröpfchen übertragen. Seltener ist die Übertragung des Virus
bei Bluttransfusionen oder Organtransplantationen (31). EBV besitzt einen spezifischen
Tropismus für Epithelzellen des Nasopharynx (66) und für B-Lymphozyten. Das heißt, dass
es sich besonders in diesen Zellen in die DNA integriert. Es kann aber auch in TLymphozyten und anderen Zellen des hämatopoetischen Systems nachgewiesen werden (43).
EBV ist Erreger der Mononucleosis infectiosa (Syn. „Pfeiffersches Drüsenfieber“ oder
„kissing disease“) und wird mit der Entstehung von malignen Erkrankungen wie dem BurkittLymphom, dem Nasopharynxkarzinom und verschiedenen lymphoproliferativen Syndromen
assoziiert.
1.2.3.3 Humanes Adenovirus
Das humanpathogene Adenovirus, von dem bisher 51 verschiedene Serotypen isoliert werden
konnten, gehört zur Familie der Adenoviridae und hat einen Durchmesser von 80 bis 110 nm.
Adenoviren bestehen aus einem ikosaedrisch angeordneten Proteinkapsid, das gruppen- und
typspezifische Antigene enthält. Im Kern befindet sich die linear angeordnete,
doppelsträngige DNA. Das Virus weist keine Hülle auf und ist damit, wie die meisten
unbehüllten Viren, besonders resistent gegenüber äußeren physikalischen und chemischen
Einflüssen.
Das humane Adenovirus ist weltweit verbreitet und die Erstinfektion erfolgt früh. Bereits im
Alter von fünf Jahren haben die meisten Kinder eine Infektion mit mindestens einem Serotyp
durchgemacht. Die Übertragung erfolgt fäkal-oral durch Schmierinfektion oder durch direkten
6
Einleitung
Kontakt. Nicht selten kommt es in Gemeinschaftseinrichtungen zu örtlich gehäuftem
Auftreten bis hin zu Kleinepidemien (86).
Typische, von humanen Adenoviren verursachte Krankheitsbilder sind vor allem Infektionen
der
oberen
und
unteren
Luftwege
(Rhinitis,
Pharyngitis),
Konjunktivitiden
(Keratokonjunktivitis epidemica, follikuläre Konjunktivitis, Pharyngokonjunktivalfieber) und
Gastroenteritiden (mit und ohne begleitende mesenteriale Lymphadenopathie) (58). Seltener
sind Infektionen der Harnwege in Form einer hämorraghischen Zystitis.
1.2.3.4 Humanes Parvovirus B19
Parvovirus B19 ist ein kleines, hüllenloses DNA-Virus aus der Familie der Parvoviridae,
Gattung Erythrovirus. Seine Einzelstrang-DNA wird von einem kubischen Kapsid umgeben
und es hat einen Durchmesser von 18-26 nm (86). Unter den Parvoviren ist es das einzige mit
humanpathogener Wirkung und einem ausgeprägten Tropismus für sich teilende erythropoide
Vorläuferzellen. Das Blutgruppe P-Antigen (Globosid, Tetrahexoseceramid) ist ein
Oberflächenrezeptor und entscheidender Faktor für das Binden von PV B19 an die Zelle (8082). Man findet P-Antigen vor allem auf der Oberfläche von Vorläuferzellen der roten
Blutzellreihe aber auch auf Megakaryozyten, Endothelzellen und fetalen Myokardzellen (16).
Die Übertragung von Parvovirus B19 erfolgt in erster Linie als Tröpfcheninfektion oder als
Kontaktinfektion, das heißt durch direkten Kontakt mit infektiösem Blut, Speichel oder
andere Körperflüssigkeiten.
Parvovirus B19 ist weltweit verbreitet. In den entwickelten Ländern haben 2-10 % der Kinder
unter fünf Jahren eine Infektion durchgemacht, Personen über 20 zeigen in 40 bis 60 % und
über 70-Jährige in über 85 % der Fälle Antikörper gegen PV B19 (9, 23, 90).
Die durch das humanpathogene Parvovirus B19 verursachten Krankheiten reichen vom
Erythema infectiosum bei Kindern, auch Ringelröteln oder Fifth Disease genannt, über akute
Arthropathie bei sonst gesunden Personen bis hin zu chronischer Anämie und aplastischen
Krisen bei vorgeschädigten Patienten. Die besonders schweren Verläufe in dieser
Patientengruppe, die an Erkrankungen wie der chronischen hämolytischen Anämie oder
unterschiedlichen
Immundefizienzsyndromen
leidet,
werden
durch
die
Zerstörung
erythropoetischer Knochenmarkzellen hervorgerufen.
Infiziert sich eine Schwangere mit dem Parvovirus B19, besonders wenn es sich hierbei um
eine Erstinfektion handelt, ist eine transplazentare Übertragung des Virus mit nachfolgender
Schädigung des ungeborenen Kindes möglich. Häufig bleibt der Schwangerschaftsverlauf
7
Z. Amoakoova
dennoch unbeeinflusst, denn eine Infektion der Mutter kann klinisch unbemerkt verlaufen und
muss nicht zwingend eine Infektion der Frucht nach sich ziehen (16, 28). Die meisten Frauen
sind wegen der hohen Prävalenzrate nicht gefährdet eine Primärinfektion während der
Schwangerschaft zu erleiden. Die Inzidenz einer mütterlichen PV B19 Infektion während der
Schwangerschaft beträgt 3 bis 7 %. Das Risiko einer Übertragung dieser Infektion auf den
Fetus durch transplazentare Transmission liegt bei 30 % (75, 83). Im Falle einer maternofetalen Transmission des Parvovirus ist die Entwicklung und Ausprägung einzelner
Symptome beim ungeborenen Kind unterschiedlich. Sie reichen von asymptomatischen
Verläufen bis zur Ausbildung einer schweren Anämie und in 25 % der Fälle zur Entwicklung
eines nicht immunvermittelten Hydrops fetalis. In 5 bis 9 % der Fälle führt dieser zu einem
Abort oder mündet in einen intrauterinen Fruchttod (83). Nach Schätzungen kommt es in
Deutschland jährlich zu 300 bis 500 Fällen von PV B19 verursachten Aborten.
1.3 Diagnostische Ansätze bei Spontanabort
Nach einem Spontanabort oder einem intrauterinen Fruchttod existieren unterschiedliche
Herangehensweisen in der Routinediagnostik. Ereignet sich der Abort früh, also in den ersten
Schwangerschaftswochen, und handelt es sich außerdem um die erste Fehlgeburt bei einer
Frau, wird der Ursache im Allgemeinen nicht nachgegangen. Je später der Abort im
Schwangerschaftsverlauf erfolgt oder je höher die Anzahl der durchgemachten Fehlgeburten
einer Frau, desto ausgedehnter und intensiver wird man die Diagnostik zur Klärung der
Ursache betreiben. Die Routinediagnostik umfasst in der Pathologie die makroskopische,
gegebenenfalls auch die mikroskopische Untersuchung von Plazentagewebe sowie
embryonalem bzw. fetalem Gewebe (38, 63) und kann je nach Verdacht durch
immunologische Untersuchungen, molekularbiologische Methoden oder molekulargenetische
Diagnostik ergänzt werden. Die genannten Verfahren unterscheiden sich in ihrer Spezifität
und Sensitivität, sind in ihrer Durchführung und Finanzierung unterschiedlich aufwendig und
führen in vielen Fällen nicht zur sicheren Benennung der Abortursache. Zudem gibt es keinen
einheitlichen Konsens darüber, welche Untersuchungen zwingend in die Routinediagnostik
aufgenommen werden sollten und welche überflüssig sind. Veröffentlichungen zu diesem
Thema sind rar. Ziel dieser Arbeit war es deshalb zu untersuchen, ob die Durchführung einer
PCR zum Nachweis der Viren CMV, EBV, Parvovirus B19 und Adenovirus zusätzliche
8
Einleitung
Erkenntnisse bringen und zur Ursachenaufklärung im Rahmen der Abortdiagnostik beitragen
kann und folglich als ergänzende diagnostische Methode in die Routinediagnostik
aufgenommen werden sollte.
1.3.1 Immunologische Ansätze
Für die Diagnostik nach einem ungewollten Schwangerschaftsabbruch stehen unter anderem
immunologische Ansätze zur Verfügung, durch die eine Infektion der Mutter oder des Kindes
mit Erregern wie CMV, EBV, Humanes Parvovirus B19, Adenovirus und anderen Erregern
aus der TORCH-Gruppe nachgewiesen werden kann.
Ein Verfahren ist der Immunoassay. Das gemeinsame Grundprinzip aller Immunoassays ist
die Erkennung und somit der Nachweis einer Substanz durch die Bindung eines Antikörpers
an ein Antigen. Man macht sich dabei die hohe Spezifität eines jeden Antikörpers zu seinem
korrespondierenden Antigen und die Stärke der Verbindung zwischen Antigen und
Antikörper zunutze (85). Bei einem Immunoassay wird eine flüssige Probe, die auf ein
bestimmtes Antigen hin geprüft werden soll, auf eine feste Phase aufgetragen, auf der ein
Antikörper als Fänger angebracht ist. Befindet sich nun in der flüssigen Probe das
korrespondierende Antigen, bindet es an den Antikörper und bleibt an der festen Phase haften.
Nach einer Inkubationszeit folgt die Separationsphase, bei der überschüssiges Material, das
keine Bindung eingegangen ist, ausgewaschen wird. Im letzten Schritt erfolgen der Nachweis
und die quantitative Bestimmung des Analyts.
Je nach Art des Immunoassays kann der gesuchte Analyt ein Antigen und der „Fänger“ ein
Antikörper sein. Ebenso können Antigene als Fänger fungieren, wenn in einer zu
untersuchenden Probe Antikörper nachgewiesen werden sollen. Allen Immunoassays
gemeinsam ist die Verwendung markierter Reagenzien, so genannter Tracer, die Signale in
Form von Radioaktivität, Lumineszenz oder Fluoreszenz erzeugen und mit deren Hilfe am
Ende des Immunoassays der zu bestimmende Analyt sowohl qualitativ als auch quantitativ
nachgewiesen werden kann (85). Dabei können als Marker Enzyme oder radioaktive Isotope
verwendet werden. In letzterem Fall handelt es sich um Radioimmunoassays. Auf
Enzymmarkierungen basierende Assays werden als Enzyme-Linked Immunosorbent Assay
(ELISA) bezeichnet.
Will man in der Klinik den Immunstatus einer Schwangeren gegenüber eines Virus abklären
oder besteht der Verdacht einer akuten viralen Infektion der Mutter und Gefährdung des
ungeborenen Kindes, kommen vor allem serologische Verfahren, die auf dem ELISA-Prinzip
9
Z. Amoakoova
beruhen, zum Einsatz. Das Serum der Patientin wird hierbei auf zirkulierende IgG- und IgMAntikörper, die sich gegen virale Proteine, zum Beispiel gegen das Strukturprotein VP1 beim
Humanen Parvovirus B19 richten, untersucht. Durch die Bestimmung dieser Antikörper lässt
sich eine Aussage über den Immunstatus der Patientin machen.
Hinweisend auf eine Infektion sind ein erhöhter IgG-Titer oder der Nachweis einer
Serokonversion. Die Serokonversion ist das Umschlagen einer negativen AntigenAntikörperreaktion in eine positive und Ausdruck einer kürzlich stattgefundenen
Erstinfektion.
Im Falle einer aktuellen Infektion kann man mit Hilfe serologischer Tests unterscheiden, ob
es sich um eine Erstinfektion oder um eine rekurrente Infektion handelt. Diese
Unterscheidung ist besonders bei unbekanntem Immunstatus der Mutter wichtig, denn im
Falle einer Primärinfektion ist die Übertragungsrate auf das Kind und damit das Risiko einer
Schädigung ungleich höher als bei einer rekurrenten Infektion. Insgesamt ist die Spezifität
und Sensitivität dieser Tests unter Kenntnis und Beachtung möglicher Fehlerquellen sehr
hoch (35, 60).
In der Pathologie hingegen kommen in der Abortdiagnostik neben der mikro- und
makroskopischen Diagnostik immunhistochemische Verfahren zum Einsatz. In der
Immunhistochemie nutzt man die Spezifität von Antikörpern, um die Verteilung von
bestimmten Antigenen am histologischen Schnitt oder in der Zelle sichtbar zu machen. Dazu
eignen sich besonders Antigene, die spezifisch nur in bestimmten Zelltypen oder nur in
bestimmten Geweben auftreten. Diese Verfahren werden jedoch eher in experimentellen
Bereichen, als in der Routinediagnostik nach einem Spontanabort angewandt. Besonders,
wenn es sich dabei um die erste Fehlgeburt handelt.
1.3.2 Molekularbiologische Ansätze
Das Prinzip von Verfahren wie der PCR oder der in situ Hybridisation ist der Nachweis von
DNA oder RNA in einer Probe.
Die viel verwendete Polymerase Chain Reaction (PCR) ist ein molekularbiologisches
Verfahren, mit dem sowohl in nativem Material, wie frischem Gewebe, Serum und
Amnionflüssigkeit als auch bereits fixiertem Material spezifische Nukleotidsequenzen
innerhalb eines DNA-Moleküls detektiert und vervielfältigt werden können. Soll ein Fet auf
10
Einleitung
eine virale Infektion getestet werden, ist das Gewinnen von Amnionflüssigkeit für den
Nachweis viraler DNA mittels PCR eine Möglichkeit. Die PCR hat eine hohe Spezifität und
Sensitivität und liefert in einer Vielfalt von diagnostischen Fragestellungen zuverlässige
Ergebnisse.
Ein anderes molekularbiologisches Verfahren, die in situ Hybridisierung, weist direkt im
Gewebe, in einer Zelle oder in Chromosomen spezifische Nukleinsäuresequenzen nach. Auch
diese Methode ist für die Detektion viraler DNA oder RNA geeignet. Die Verwendung dieser
Verfahren beschränkt sich jedoch zumeist auf experimentelle Diagnostik oder retrospektive
Studien. Weder die in situ Hybridisierung noch die PCR werden bislang routinemäßig zur
Aufklärung ungewollter Schwangerschaftsabbrüche eingesetzt.
1.3.3 Histomorphologische Befunde
Nach einem Abort kann das Abortmaterial, das aus der Plazenta und der Frucht besteht, auf
pathologische Veränderungen hin untersucht werden. Im Allgemeinen ist der makroskopische
und mikroskopische Aspekt der Plazenta und des Feten bei einer viralen Infektion relativ
unspezifisch. Dennoch können manche mikroskopische Veränderungen hinweisend auf eine
Infektion mit EBV, CMV, Adenoviren oder Parvoviren sein. Unter den Mikroorganismen
sind es vor allem Viren, die für sie charakteristische, manchmal spezifische Veränderungen
innerhalb eines Gewebes bewirken und je nach Grad ihrer Ausprägung und der Erfahrung des
Pathologen mikroskopisch erfasst werden können.
Bei einer hämatogenen transplazentaren Infektion mit PV B19 kommt es durch den
ausgeprägten Zelltropismus des Virus vor allem zu einer Zerstörung der Erythroblasten. Das
histologische Bild der Plazenta zeigt eine Vermehrung der roten Blutzellen innerhalb der
fetalen Blutgefäße, von denen manche intranukleäre Einschlusskörperchen aufweisen. Diese
bestehen aus einem hellen oder eosinophilen Zentrum mit peripherer Chromatinkondensation
(19, 41, 65).
11
Z. Amoakoova
Abbildung 2:
Plazentitis bei Parvovirus B19-Infektion. Reifungsretardierte Plazenta mit Erythroblasten
in z. T. regressiv veränderten intravillösen Kapillaren (Insert: Pfeil).
Abbildung 3:
Lampionzellen. Linke Bildhälfte: virale, intranukleäre Einschlüsse in Zellen des Stromas einer
Plazentazotte mit Ausschnitt (Insert). Rechte Bildhälfte: Erscheinungsformen von Lampionzellen (obere Bildreihe). Regressive Kapillarveränderungen und Erythroblasten (untere Bildreihe).
12
Einleitung
Die CMV-Infektion ist histologisch durch sogenannte Eulenaugenzellen, bei denen es sich um
große intranukleäre Viruseinschlußkörper handelt, charakterisiert.
Abbildung 4:
Cytomegalie-Virus
Infektion.
Bild A:
infizierte
Epithelzellen (proximales
Tubulus-
epithel, Niere) mit sog. Eulenaugenzellen. Bild B: immunhistologischer Nachweis mittels
eines spezifischen Antikörpers
Abbildung 5:
Cytomegalie-Virus
Infektion:
In
(A)
Plazentarzotte
mit
nukleär/cytoplasmatischen
Einschlüssen, vergrößert in (B) [siehe Pfeile].
13
Z. Amoakoova
Das Epstein-Barr Virus kann unter anderem mit einer Perivaskulitis und Nekrosen der
Dezidua, ebenso wie mit einer Chorionitis einhergehen (54).
Abbildung 6:
Epstein-Barr Virus Infektion: In (A) Plazentagewebe mit einzelnen positiven Zellkernen [siehe
Pfeil]. In (B) immunhistologische Reaktion mit positivem roten Niederschlag [siehe Pfeile].
14
Einleitung
Infektion mit Adenoviren: Pathologisch wird besonders bei sog. smugded nuclei, d.h. Kernen
mit verschmiertem Chromatin aber auch bei nukleären Einschlüssen an eine solche Infektion
gedacht (1, 5).
Abbildung 7:
Adenovirus Infektion: In (A) intestinales Epithel mit nukleären Einschlusskörperchen (siehe
Pfeile). In (B) immunhistologische Reaktion mit positivem roten Niederschlag (siehe Pfeile).
15
2 Aufgabenstellung
Virale
Infektionen
während
der
Schwangerschaft
können
zu
schwerwiegenden
Komplikationen im Rahmen der Entwicklung des ungeborenen Kindes führen, bis hin zum
vorzeitigen, ungewollten Schwangerschaftsabbruch.
Die Aufgabe der vorliegenden Arbeit bestand darin, durch eine molekulargenetische
Angehensweise die Bedeutung viraler Infektionen bei Aborten mit unklarer Genese zu
untersuchen. Für die Probenauswahl sollte die Datenbank des Instituts für Pathologie der
Universität zu Köln zunächst nach Plazentaproben gesichtet werden, die von Müttern mit
Spontanabort ungeklärter Ursache stammten und anschließend nochmals mikroskopisch
nachkontrolliert werden.
Für die Zielsetzung sollten genetische PCR-Nachweise zur Darstellung von Adenoviren,
CMV, EBV und Parvovirus B19 in Paraffin eingebettetem, formalinfixiertem Gewebe
herangezogen werden.
Der Nachweis von Parvovirus B19 war bislang noch nicht für formalinfixiertes Gewebe
etabliert; daher sollte für die retrospektive Studie ein PCR-Assay aufgebaut und geprüft
werden.
Nach Analyse der Proben auf virale Infektionen sollten positive Plazentaproben abschließend
nochmals auf histologische Anzeichen der jeweiligen viralen Infektion geprüft werden.
16
3 Material und Methoden
3.1 Verwendete Materialien
Alle Grundchemikalien wurden, falls nicht anders angegeben, von der Firma Merck
(Darmstadt)
oder
Sigma
(Sigma-Aldrich
Chemie,
Deisenhofen)
bezogen.
Das
ionenausgetauschte Wasser aus der Milliporanlage wurde vor Gebrauch autoklaviert. Alle
Lösungen waren, falls nicht anders angegeben, ebenfalls autoklaviert.
3.1.1 Glaswaren und Plastikwaren
Für alle Arbeitsschritte wurden Einwegplastikwaren (Eppendorfgefäße und Falcons) von der
Firma Eppendorf (Hamburg) und der Firma Falcon (vertrieben durch VWR, Darmstadt)
benutzt und, falls sie nicht steril verpackt waren, vor Gebrauch autoklaviert. Glaswaren
wurden bei 180 °C sechs Stunden gebacken.
3.1.2 Reagenzien zur Entparaffinierung, Zelllyse und Nukleinsäureextraktion
Folgende Reagenzien wurden für die Aufbereitung des in Paraffin eingebetteten
Patientenmaterials verwendet:
Xylol
Ethanol 100 %
Cell Lysis Solution
Proteinase-K
Protein Precipitation Solution
Isopropanol
Glykogen
DNA Hydratation Solution
Baker (Deventer, Holland)
Baker (Deventer, Holland)
Purgene (Biozym)
Invitrogen
Purgene (Biozym)
Baker (Deventer, Holland)
Roche
Purgene
17
Z. Amoakoova
3.1.3 DNA-modifizierende Enzyme und Nukleotide für die PCR
Für die PCR wurde eine Red Taq Polymerase der Firma Sigma ( Deisenhofen ) gewählt, die
inklusive PCR-Puffer und Nukleotide (dNTP) geliefert wurde. Alle Oligonukleotid Primer
(Kapitel 3.3.1) wurden in Auftrag gegeben und von der Firma MWG Biotech (Ebersberg)
synthetisiert.
3.1.4 Reagenzien für die Gelelektrophorese
Folgende Reagenzien wurden bei der Gelelektrophorese eingesetzt:
LE-Agarose
Seakem, Biozym (Oldendorf)
TAE-Puffer
wird selber gemacht (s. Kapitel 3.4)
Ethidiumbromid
Amersham (Buckinghamshire, England)
Leitermarker (Marker 23)
MBI
DNA-Ladepuffer/Farbpuffer
MBI
3.1.5 Geräte
Folgende Geräte kamen zum Einsatz:
Mikrotom
Leica (Nussloch)
Schüttler bei 65 °C
Mikrozentrifuge mit einer Leistung bis 14000 rpm
Eppendorf (Hamburg)
Vortexer
Trockenschrank bei 37 °C
Heraeus (Dormagen)
Thermocycler
Biometra (Göttingen)
Submarine-Elektrophoresekammern
Biotel-Fischer (Frankfurt)
Geldokumentationssystem
MWG-Biotech (Ebersberg)
18
Erreur ! Style non défini.
Reaktionsgefäße und Pipettenspitzen wurden von der Firma Eppendorf (Hamburg),
Filterpipettenspitzen von der Firma Biozym (Oldenburg) bezogen.
3.1.6 Untersuchungsmaterial
Als Untersuchungsmaterial dienten 61 in Paraffin eingebettete Gewebeproben der Jahre 1996
bis 2004 aus dem Archiv des Instituts für Pathologie der Universitätsklinik zu Köln. Die
pathologieinterne Datenbank DC-Pathos enthielt zu dem Zeitpunkt insgesamt mehr als 2500
Einträge zum Stichwort „Plazenta“. Diese Auswahl wurde weiter eingegrenzt, in dem man
innerhalb des Ergebnisses nach folgenden Befunden unklarer Ursache suchte: „Plazentitis“,
„Villitis“, „Hydrops fetalis bzw. universalis“ und IUFT. 66 Proben entsprachen diesen
Kriterien. Zusätzlich wurden diesem Patientenkollektiv noch 5 weitere Proben hinzugefügt,
bei denen aufgrund einer positiven klinischen Anamnese der Verdacht auf eine
Parvovirusinfektion bestand. Alle Gewebeproben waren in 10 %igem, neutral-gepufferten
Formaldehyd fixiert und in Paraffin eingebettet worden.
Histologische
Charakterisierung
des
Probenkontingents:
Nachdem
man
die
Patientenauswahl mittels Datenbankrecherche getroffen hatte, mussten nun die dazugehörigen
histologischen Plazentaschnitte durchgeschaut werden, wobei es bei jeder Patientin
mindestens zwei jedoch oft drei (und mehr) Schnitte gab, die jeweils unterschiedlichen
Plazentaregionen entsprachen.
Die Auswahl der verwendeten Plazentagewebeproben orientierte sich an folgenden Kriterien:
Die Gewebefläche musste mindestens 1x1cm betragen. Zu jedem histologischen Schnitt
musste ein entsprechender in Paraffin eingelegter Gewebeblock mit genügend Restmaterial
vorhanden sein. Bei der mikroskopischen Durchsicht wurde darauf geachtet, dass das Gewebe
keine Thromben oder größere Infarktareale enthält. Ein weiteres Kriterium war möglichst gut
erhaltenes Material, da sich bei zu stark fortgeschrittener Autolyse keine vernünftige DNA
mehr amplifizieren lässt. Ebenso wurde bei der mikroskopischen Durchsicht darauf geachtet,
dass die Gewebeproben gut erhalten und nicht lytisch waren (Beispiel siehe Kapitel 4.1), um
später bei der DNA-Extraktion mit den korrespondierenden, in Formaldehyd fixierten und in
Paraffin eingebetteten Proben genug DNA zu gewinnen und somit die Chancen auf ein gutes
PCR-Amplifikat zu erhöhen.
19
Z. Amoakoova
3.2 DNA-Extraktion aus den in Paraffin eingebetteten Gewebeproben
Vor der Extraktion wurden von jedem Paraffinblöckchen mit dem Mikrotom je nach
Gewebemenge ein bis drei Schnitte von 7,5 µm Dicke angefertigt und in ein 1,5 ml fassendes
Reaktionsgefäß aufgenommen. Als Kontaminationskontrolle wurde vor jeder Probe ein
Leerblock geschnitten, um eine eventuelle DNA-Verschleppung zu detektieren. Außerdem
wurde vor jeder Leerprobe die Klinge gewechselt und der Blockhalter sowie der
Klingenhalter mit 100 %igem Ethanol gereinigt.
Die DNA-Extraktion wurde mit Reagenzien der Firma Purgene und nach dem Protokoll der
Firma durchgeführt. Das Prozedere beinhaltete folgende Schritte:
Für die Entparaffinierung wurden die Proben fünf Minuten im Schüttler bei 65 °C erwärmt,
um das Paraffin zu verflüssigen. In jedes Reaktionsgefäß wurden 500 µl Xylol hinzugegeben,
kurz gevortext und erneut fünf Minuten bei 65 °C geschüttelt. Dann wurde das Gewebe zwei
Minuten bei 13000 upm mit der Mikrozentrifuge abzentrifugiert und der Xylol-ParaffinÜberstand dekantiert und verworfen. Dieser Vorgang wurde drei Mal durchgeführt. Im
Anschluss wurden die Proben zweimal mit absolutem Ethanol gewaschen, der Überstand
sorgfältig abpipettiert und verworfen. Die nun entparaffinierten Gewebeproben wurden ca.
eine Stunde in einem Trockenschrank bei 37 °C getrocknet.
Zu den getrockneten, entparaffinierten Proben wurden nun pro Reaktionsgefäß 300 µl Cell
Lysis Solution/Proteinase-K Mix (= 295 µl Cell Lysis Solution + 5 µl Proteinase-K 20 mg/ml)
hinzugegeben. Die Proben wurden über Nacht bis zur vollständigen Lyse im Schüttler bei
65 °C inkubiert.
Zur eigentlichen Extraktion der DNA wurde jeder Proteinase-K-Ansatz mit 100 µl Protein
Precipitation Solution versetzt, 20 Sekunden kräftig gevortext, fünf Minuten auf Eis gestellt
und danach drei Minuten bei 13000 upm zentrifugiert, um die wässrige von der organischen
Phase zu trennen. Die in der oberen, wässrigen Phase gelöste DNA wurde abgenommen und
in ein frisches Reaktionsgefäß überführt, in das vorher 300 µl Isopropanol und 0,5 µl
Glykogen (10 mg/10 ml) gegeben wurden. Anschließend wurden die Proben vorsichtig
geschüttelt, fünf Minuten bei 13000 upm zentrifugiert und der Überstand vorsichtig
abpipettiert. Zu dem im Cup verbliebenen, präzipitierten DNA-Pellet wurden 300 µl 70 %iges
Ethanol hinzugegeben, kurz gevortext und eine Minute bei 13000 upm zentrifugiert. Der
Überstand wurde abpipettiert und verworfen. Die isolierte, genomische DNA wurde bei 37 °C
getrocknet, danach mit 25 µl DNA Hydratation Solution versetzt und bei -20 °C gelagert.
20
Erreur ! Style non défini.
Die Extraktion wurde durch PCR-Amplifikation des humanen Hämochromatose-Gens
kontrolliert (Kap. 3.3.2)
3.3 Polymerase-Ketten-Reaktion (PCR)
Die PCR wird verwendet, um eine spezifische Nukleotidsequenz der DNA zu vervielfältigen.
Dabei besteht die Möglichkeit, ein einziges DNA-Molekül mittels spezifischer Primer
(komplementärer Oligonukleotide) zu amplifizieren (Saiki et al., 1988). Benötigt werden je
ein „forward“ - und ein „reverse“- Primer, die den gewünschten DNA-Bereich flankieren und
komplementäre Oligonukleotide, um mittels der Taq-Polymerase, einer thermostabilen DNAabhängigen Polymerase, die spezifischen Nukleotidsequenzen unter den entsprechenden
Pufferbedingungen zu amplifizieren.
Die eigentliche Vervielfältigung erfolgt in drei Schritten, die in 20 bis 40 Zyklen wiederholt
werden: Im ersten Schritt wird die doppelsträngige DNA thermisch bei 95 °C denaturiert und
in zwei Einzelstränge zerlegt. Danach wird je nach Primer eine Annealing-Temperatur von 55
bis 61 °C gewählt, bei der die Primer mit den komplementären Sequenzen der Einzelstränge
hybridisieren. Bei 72 °C folgt als dritter Schritt die Extension, in der die Polymerase den
komplementären DNA-Strang in 5`→ 3`-Richtung mittels der zugegebenen Nukleotide
synthetisiert.
Zur Verbesserung der Spezifität und vor allem der Sensitivität wurde an jede primäre PCR
(PCR I) eine weitere sogenannte „nested“ PCR (PCR II) angeschlossen. Hierbei wurden die
primär synthetisierten Amplifikate als Ausgangsmaterial verwendet und die OligonukleotidPrimer in 3`Richtung in den spezifischen DNA-Abschnitt eingerückt. Dadurch wurde erreicht,
dass eine Nukleotidsequenz innerhalb des ersten PCR-Produktes nochmals amplifiziert
werden konnte.
3.3.1 Verwendete Oligonukleotid-Primer
Die Auswahl der Primer-Paare zur Erkennung von Parvoviren erfolgte nach bestimmten
Kriterien:
Alle Primer sollten absolute Spezifität bezüglich ihrer zu untersuchenden GenDomäne besitzen. Daher wurden mögliche Wechselwirkungen mit anderen Sequenzen
mittels Gendatenbankrecherche (NCBI, Bethesda, USA) ausgeschlossen.
21
Z. Amoakoova
Zudem sollten sie einen relativ ausgewogenen Basengehalt an C-G und A-T aufweisen
und nicht kürzer als 20 bp sein.
Alle Primer zur Erkennung von Parvoviren wurden bei der Firma MWG Biotech (Ebersberg)
in Auftrag gegeben. Alle anderen Primersequenzen wurden vom Molekulardiagnostischen
Labor des Instituts für Pathologie der Universitätsklinik zu Köln zur Verfügung gestellt.
22
Erreur ! Style non défini.
Tabelle 1:
Liste aller verwendeten Primer mit ihren spezifischen Nukleotidsequenzen, ihrer
Annealing-Temperatur und der Länge der PCR-Produkte
Primer-
Basensequenz von 5`nach 3`
Ta*
Name
Produkt
(bp)
CMV-spezifische Primer
F1
CMV3
GTG ACC AAG GCC ACG ACG TT
58,0
R1
CMV4
TCT GCC AGG ACA TCT TTC TC
58,0
CMV5
GCA GAC TAT GTT GAG GAA GG
54,0
CMV6
TCG TTG CAA TCC TCG GTC AC
54,0
F2
R2
167 bp
117 bp
EBV-spezifische Primer
F1
gp340s2
GGG ACG TGA AGC AAA GAA AGT G
55,0
R1
gp340as1
TAG TAC TGC AGT GGG CCT CTC T
58,0
F2
EBVs2
ACA TAG GTC TCG GCG TCA TCA T
57,0
R2
gp340as2
TGT GCT GAC CCT TCT GCT GCT
55,0
136 bp
111 bp
Adenovirus-spezifische Primer
Adeno-F
CTC CTT TTG GCT TCC TTC CAG
59,8
R1
AV-R1
GTC C (CT) G CGA CTC AAC CCT TG
62,4
F
Adeno-F
CTC CTT TTG GCT TCC TTC CAG
59,8
R2
Adeno-R2
GAA AAT AAC CCT CCG GCT ACA G
60,3
F
148 bp
135 bp
Parvovirus B19-spezifische Primer
F1
PV-B19-A-F1
CAT CCT AAC ATG GAG CTA TTT AGA GG
58,0
R1
PV-B19-A-R1
TAT GAG TTA GTG GTT CCC AGT CAG
58,0
F2
PV-B19-A-F2
AGA GGG GTG CTT CAA GTT TCT TC
54,0
PV-B19-A-R1
TAT GAG TTA GTG GTT CCC AGT CAG
54,0
R1
126 bp
105 bp
*Ta: optimale Annealingtemperatur
3.3.2 PCR-Nachweis als Extraktionskontrolle
Man kann die PCR zu Hilfe nehmen, um nachzuweisen, dass die DNA-Extraktion erfolgreich
war und von jeder Probe amplifikationsfähige DNA in genügender Menge extrahiert werden
23
Z. Amoakoova
konnte. Als Zielgen zur Kontrolle der humanen Infektionsdiagnostik zieht man Genbereiche
des humanen Genoms heran, die in der extrahierten Nukleinsäurefraktion genügend
vorhanden sein sollten. Dazu gehört das ß-Globin Gen und das Hämochromatose-Gen (HFEGen). In dieser Arbeit diente das HFE-Gen als Extraktionskontrolle.
Tabelle 2: HFE-spezifische Primer
F1
HaD4
R1
HS1
F2
HaD3c
R2
HS2
64,6
GCC ATA ATT ACC TCC TCA GGC AC
234 bp
64,6
ATG GAT GCC AAG GAG TTC GAA CC
62,1
TTC TCA GCT CCT GGC TCT CAT C
173 bp
60,6
TCG AAC CTA AAG ACG TAT TGC CC
Zur Amplifikation des HFE-Gen-Abschnitts wurden die folgenden Ansätze für die PCR I und
die nested-PCR II zusammenpipettiert:
Tabelle 3: PCR-I und PCR-II-Ansatz zur PCR-Amplifikakion des HFE-Genabschnitts
DNA
PCR I
1,0 µl
PCR I-Produkt
PCR II
0,5 µl
Primer F1
0,5 µl
Primer F2
0,5 µl
Primer R1
0,5 µl
Primer R2
0,5 µl
H2O
10,5 µl
H2O
11 µl
Red Taq Polymerase
12,5 µl
Red Taq Polymerase
12,5 µl
Gesamt
25 µl
gesamt
25 µl
Anschließend wurde die PCR zur Amplifikation des HFE-Lokus unter den nachfolgenden
Bedingungen in einem Thermocycler der Firma Biometra (Göttingen) durchgeführt:
24
Erreur ! Style non défini.
Hämochromatose:
PCR I
PCR II
Denaturierung
94 °C 5 min
94 °C 5 min
Denaturierung
94 °C 30 sec
94 °C 30 sec
Annealing
60 °C 30 sec
Synthese
72 °C 30 sec
72 °C 30 sec
Extension
72 °C 5 min
72 °C 5 min
58 °C 30 sec
30x
30x
3.3.3 Durchführung der PCR zum Nachweis viraler Infektionen in Plazenten
Für den Nachweis von CMV, EBV, Adenoviren und Parvoviren wurden mit den
erregerspezifischen Primern (Kapitel 3.3.1) die folgenden Ansätze für PCR I und die nestedPCR II zusammenpipettiert:
Tabelle 4: PCR-I und PCR-II-Ansatz zur nested PCR-Amplifikakion viraler Genabschnitte
DNA
PCR I
2,0 µl
PCR I-Produkt
PCR II
1,0 µl
Primer F1
0,5 µl
Primer F2* 1
0,5 µl
Primer R1
0,5 µl
Primer R2*
2
0,5 µl
H20
9,5 µl
H20
10,5 µl
Red Taq Polymerase
12,5 µl
Red Taq Polymerase
12,5 µl
Gesamt
25 µl
gesamt
25 µl
*1 F1 statt F2 bei PCR II Adenovirus
*2 R1 statt R2 bei PCR II Parvovirus B19
*Da es sich bei der PCR II beim Parvovirus B19 und beim Adenovirus um eine seminestedPCR handelte, wurde für das Parvovirus B19 anstelle des Primers R2 der reverse-Primer aus
der PCR I (R1) benutzt. Bei der PCR II für die Adenoviren wurde anstelle des Primers F2 der
forward-Primer aus der PCR I (F1) benutzt.
Die Amplifikationsbedingungen sind in der nachfolgenden Tabelle zusammengefasst:
25
Z. Amoakoova
Tabelle 5: Amplifkationsbedingungen zur Amplifikation viraler Genabschnitte
CMV
PCR I
PCR II
Denaturierung
94 °C 5 min
95 °C 5 min
Denaturierung
94 °C 1 min
94 °C 30 sec
Annealing
58 °C 1 min x 30
54 °C 30 sec
Synthese
72 °C 1 min
72 °C 30 sec
Extension
72 °C 5 min
72 °C 5 min
EBV
PCR I
PCR II
Denaturierung
94 °C 5 min
95 °C 5 min
Denaturierung
94 °C 1 min
94 °C 30 sec
Annealing
58 °C 1 min x 35
57 °C 30 sec
Synthese
72 °C 1 min
72 °C 30 sec
Extension
72 °C 5 min
72 °C 5 min
Adenovirus
PCR I
PCR II
Denaturierung
94 °C 5 min
94 °C 5 min
Denaturierung
94 °C 1 min
94 °C 1 min
Annealing
60 °C 1 min x 30
60 °C 1 min
Synthese
72 °C 1 min
72 °C 1 min
Extension
72 °C 5 min
72 °C 5 min
26
x 30
x 40
x 30
Erreur ! Style non défini.
Parvovirus
PCR I
PCR II
Denaturierung
94 °C 5 min
94 °C 5 min
Denaturierung
94 °C 1 min
94 °C 1 min
Annealing
60 °C 1 min x 30
60 °C 1 min
Synthese
72 °C 1 min
72 °C 1 min
Extension
72 °C 5 min
72 °C 5 min
x 30
3.4 Agarose-Gelelektrophorese
Um die Länge der amplifizierten DNA-Fragmente festzustellen, wurden sie mittels der Gelelektrophorese in 3 %igen Agarosegelen nach ihrer Größe aufgetrennt. Dazu wurden 3 g
Agarose durch kurzes Aufkochen in einem Mikrowellenherd in 150 ml 1x TAE-Puffer
(40 mM Tris, 20 mM Na-Acetat, 1,25 mM EDTA) gelöst und anschließend mit 5 µl
Ethidiumbromid (10 mg/ml) versetzt. In vorgefertigte Gelträger wurden nach Abkühlung auf
ca. 60 °C Flachgele gegossen. In die entstandenen Geltaschen wurden jeweils 7 µl der PCR
II-Produkte aufgetragen, die mit je 1 µl DNA-Probenpuffer (6x loading dye) gemischt worden
waren. Die Auftrennung der Fragmente erfolgte bei 80 Volt für 60 min, als Laufpuffer diente
1x TAE-Puffer. Die aufgetrennten Banden wurden im UV-Licht bei 302 nm mit Hilfe des
Geldokumentationssystems Gel Print 2000i der Firma MWG Biotech dokumentiert. Als
Molekulargewichtsstandard diente ein pUC 19 DNA Leitmarker, der mit MSP1 (Hpa2)
restringiert war und von der Firma MBI Fermentas bezogen wurde (Marker 23). Die
Standard-DNA des Marker 23 beinhaltete DNA-Fragmenten der Größe 500 bp, 404 bp,
331 bp,
242 bp,
190 bp,
147 bp
und
110 bp.
27
4 Ergebnisse
In der vorliegenden Arbeit wurden vier verschiedene Viren, das Parvovirus B19, das Humane
Cytomegalovirus, das Adenovirus, und das Ebstein-Barr-Virus in Hinblick auf ihre
Bedeutsamkeit und Häufigkeit bei einem Spontanabort untersucht und verschiedene
Methoden zu ihrer Diagnostik miteinander verglichen bzw. neu etabliert.
4.1 Auswahl von Plazentagewebeproben
Die Datenbank des Instituts für Pathologie der Universitätsklinik zu Köln (DC-Pathos)
erfasste zum Zeitpunkt der hier vorgelegten Studie über 2500 Plazenten. Beim Durchsuchen
der Datenbank unter den Befunden Spontanabort nach: „Plazentitis“, „Villitis“, „Hydrops
fetalis“, „Hydrops universalis“ und „IUFT“ mit jeweils unklarer Ursache fanden sich 71
Gewebeproben, davon fünf mit Verdacht auf eine Parvovirus B19-Infektion aufgrund
positiver klinischer Anamnese.
Danach wurden
die dazugehörigen histologischen
Plazentaschnitte mikroskopisch durchgeschaut, wobei meist drei verschiedene histologische
Aufarbeitungen zur Verfügung standen. Es wurden die Schnitte ausgesucht, deren Fläche
mindestens 1 cm2 betrug und die unter dem Mikroskop keine Thromben oder größeren
Infarktareale aufwiesen. Ebenso wurde darauf geachtet, dass das Material möglichst gut
erhalten war, da bei einer zu weit fortgeschrittenen Autolyse eventuell nicht mehr ausreichend
DNA zu extrahieren ist bzw. diese sich nicht mehr amplifizieren lässt.
28
Erreur ! Style non défini.
Die nachfolgende Abbildung soll den Unterschied zwischen gut erhaltenem und lytischem
Material verdeutlichen:
Abbildung 8:
Lichtmikroskopische Aufnahmen von Plazentazotten (Hämatoxilin-Eosin Färbung).
Bild A: gut erhaltenes Gewebe mit Plazentazotten aus dem 1. Trimenon: typische
Doppelreihigkeit des Trophoblastenbesatzes, einzelne, kleine Kapillaren sowie retikuläres
Stroma. Bild B: autolytische Veränderungen mit Auflösung des retikulären Stromas
Schließlich wurden die entsprechenden, in Paraffin eingebetteten Gewebeproben aus dem
Archiv herausgesucht. Unter den 71 Proben fanden sich 61, die den oben genannten Kriterien
entsprachen und von denen im Gewebeblock noch genügend Restmaterial vorhanden war.
Das Patientengut stammt ausschließlich aus der Routinediagnostik des Instituts für Pathologie
der Universitätsklinik zu Köln der Jahre 1996-2004. Für den Nachweis einer erfolgreichen
DNA-Extraktion wurde jede Patientenprobe einer HFE-PCR unterzogen. Das HFE-Gen liegt
auf Chromosom 6 und ist in jeder Zelle des menschlichen Körpers vorhanden. Das vom HFEGen kodierte Protein interagiert mit dem Transferrin-Rezeptor und ist beteiligt an der
Regulation der Eisenabsorption. Mit dem Nachweis des HFE-Gens konnte eine einfache und
zuverlässige Kontrolle der Extraktion durchgeführt werden. Nach jeder DNA-Extraktion
wurde eine HFE-PCR ausgeführt. Nach der PCR ließ sich bei der gelelektrophoretischen
Auftrennung ein 173 bp großes Amplifikat erkennen. Die HFE-Amplifikation zeigte, dass in
allen 61 Fällen DNA in PCR-tauglicher Qualität und Quantität extrahiert worden war. Die
Abbildung 9 zeigt ein repräsentatives Bild einer gelelektrophoretischen Auftrennung, bei der
die Banden den Produkten der HFE-PCR II entsprechen.
29
Z. Amoakoova
Abbildung 9:
Exemplarische Darstellung einer Extraktionskontrolle. Bei allen Proben lässt sich das 173 bp
große Produkt der Hämochromatose-PCR nachweisen (Pfeile). Ein positiver Nachweis der
DNA-Extraktion ist somit erbracht.
4.2 Etablierung eines PCR-Nachweises für Parvovirus-Infektionen an
formalin-fixiertem Material
Da es zum Zeitpunkt des Beginns dieser Arbeit am Institut für Pathologie der
Universitätsklinik zu Köln noch kein standardisiertes Verfahren gab, um das humane
Parvovirus B19 in formalinfixiertem Gewebe mittels PCR nachzuweisen, musste zunächst ein
zuverlässiges PCR-Nachweisverfahren etabliert werden. Hierfür begann man zunächst mit der
Wahl einer spezifischen Sequenz im Genom des Virus und eines zuverlässigen Primer-Paares,
das diese spezifische Sequenz in einer PCR-Amplifikation erkennen würde.
30
Erreur ! Style non défini.
4.2.1 Sequenz- und Primerauswahl für das Humane Parvovirus B19 zur PCRAmplifikation
Zur Suche und Gestaltung der für die PCR-Amplifikation verwendeten Primer wurden die in
der Literatur und in den Gendatenbänken des National Center for Biotechnology Information
(NCBI, Bethesda, USA) beschriebenen Nukleotidsequenzen für das Parvovirus B19
herangezogen.
ORIGIN
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421 tgttaacatc ctaacatgga gctatttaga ggggtgcttc aagtttcttc taatgttcta
481 gactgtgcta acgataactg gtggtgctct ttactggatt tagacacttc tgactgggaa
541 ccactaactc atactaacag actaatggca atatacttaa gcagtgtggc ttctaagctt
601 gactttaccg gggggccact agcagggtgc ttgtactttt ttcaagtaga atgtaacaaa
661 tttgaagaag gctatcatat tcatgtggtt actggggggc cagggttaaa ccccagaaac
(...)
Abbildung 10: Ausschnitt aus der genomischen Organisation des Humanen Parvovirus (NCBI) mit Lage der
verwendeten Primer F1 (grau unterlegt), R1 (fett gedruckt), F2 (fett gedruckt und durch einen
Unterstrich gekennzeichnet)
Die Auswahl der einzelnen Primer-Paare erfolgte nach bestimmten Kriterien. Als wichtigste
Anforderung sollten alle Primer eine absolute Spezifität bezüglich der zu untersuchenden
Domäne besitzen. So wurde jedes Oligonukleotid mit Hilfe der Gendatenbanksuchmaschine
BLAST (NCBI) auf mögliche Wechselwirkungen mit anderen veröffentlichten Sequenzen
überprüft. Ein unspezifisches Bindeverhalten konnte somit weitgehend ausgeschlossen
werden. Durch die Fixierung in Formaldehyd war die extrahierte DNA stark fragmentiert.
Aus diesem Grund wurde die Länge des zu amplifizierenden Sequenzbereichs/PCR-Produkts
bewusst niedrig gewählt; sie lag zwischen 100 und 200 bp. Das erste PCR-Produkt war in der
Regel aufgrund der geringen Menge amplifizierter DNA im Agarosegel nicht nachzuweisen
und wurde dementsprechend nicht auf das Gel aufgetragen. Mit Hilfe einer anschließenden
seminested-PCR konnte die Empfindlichkeit des Domänennachweises erfolgreich gesteigert
werden.
Letztendlich unterlag die Auswahl der Primer weiteren, allgemeingültigen Kriterien;
normalerweise sollten Primer einer Standard-PCR folgende Eigenschaften haben:
31
Z. Amoakoova
eine Länge von 18 bis 24 Nukleotiden
keine Ausbildung von internen Haarnadelschleifen (hairpin loops) oder anderer
Sekundärstrukturen
keine Bildung von Homodimeren mit sich selbst (self-dimers) oder Heterodimeren mit
dem anderen Primer (cross-dimers)
einen ausgeglichenen A/T : G/C Gehalt, d.h. ein GC-Gehalt von 50 % sollte nicht
überschritten werden
möglichst keine oligo-A oder oligo-G Abschnitte, d.h. gleichmäßige Verteilung der
Purine und Pyrimidine
die Schmelztemperaturen (Tm) der Primer sollten gleich sein und im Bereich von 55
bis 65 °C liegen
Gegenseitige Wechselwirkungen und mögliche Sekundärstrukturbildungen wurden mit Hilfe
des Internetprogramms „Netprimer“ ausgeschlossen (89).
4.2.2 Prüfung der ausgewählten Primerpaare
Nachdem man sich mit Hilfe der obengenannten Maßnahmen und unter den angegebenen
Kriterien für ein Primerpaar entschlossen hatte, musste dieses auf seine Zuverlässigkeit
geprüft werden, bevor man es am Gewebekollektiv anwenden konnte. Dies geschah durch
Austestung der Primer an Plazentagewebe, das zu einem Patientenkollektiv gehörte, das
vorher serologisch positiv auf das Humane Parvovirus B19 getestet worden war. Es wurden
drei Protokolle angefertigt, die sich nur in der Annealing-Temperatur voneinander
unterschieden. Anhand dieser Protokolle wurde die PCR I und die darauffolgende seminested
PCR II mit den Positivkontrollen durchgeführt.
32
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Nach der gelelektrophoretischen Auftrennung des PCR II-Produkts zeigte sich bei allen
Proben wie erwartet eine kräftiges Signal auf Höhe der Standardbande (Abbildung 11).
Abbildung 11: Hier die gelelektrophoretische Auftrennung der Parvovirus-Amplifikate. A PCR I-Produkt
(126 bp) nach dem Protokoll 1und 2 mit einer Annealingtemperatur von 56 bzw. 58 °C
B PCR II-Produkt nach dem Protokoll 3 mit einer Annealing-Temperatur von 60 °C. Auf
allen Gelbildern ist im Bereich der Markerposition 105 bp eine deutliche Bande zu erkennen
Da man mit allen Protokollen ein gutes Ergebnis erzielt hatte, wählte man das Protokoll mit
der höheren Annealingtemperatur aus (60 °C), um näher am Schmelzpunkt des Primers und
seiner Zielsequenz zu arbeiten. Bei der PCR ist die Annealingtemperatur entscheidend für die
Spezifität der Bindung an die Zielsequenz, da sich die Wahrscheinlichkeit für spezifische und
damit feste Bindungen zwischen den korrespondierenden Basen erhöht, je näher man am
Schmelzpunkt des Primers arbeitet.
Mit
der
durchgeführten
Probe-PCR
hatten
wir
das
serologische
Ergebnis
des
Probekontingents belegt. Zur weiteren Absicherung wurde die Sequenzierung des
Parvovirusgenoms in Auftrag gegeben. Dabei konnte bestätigt werden, dass die
primerspezifischen Sequenzen mit den Sequenzen aus dem PV B19-Genom übereinstimmen.
Die
PCR
zum
Nachweis
von
Parvovirus
B19-Infektionen
an
formalinfixiertem
Plazentagewebe war etabliert.
33
Z. Amoakoova
4.3 Nachweis von Parvoviren am ausgewählten Plazenta-Probenkollektiv
Mit der neu etablierten PCR zum Nachweis von Parvoviren wurde das Patientengut nun auf
Parvoviren durchsucht. Nachdem man die DNA extrahiert und den Extraktionsnachweis
mittels HFE-PCR erbracht hatte, wurde die Parvovirus-PCR nach dem in Kapitel 3.3.3
beschriebenen Protokoll durchgeführt. Dabei waren in der gelelektrophoretischen Auftragung
der PCR II-Produkte 4 von 61 Proben positiv.
Abbildung 12: Ein repräsentatives Beispiel für ein Parvovirusamplifikat in einer gelelektrischen Auftren nung:
A positive Patientenprobe Nr. 18 (Pfeil) B Parvovirus Positivkontrolle (Pfeil)
4.4 Nachweis
von
EBV
und
CMV
am
ausgewählten
Plazenta-
Probenkollektiv
Nun wurde das Patientenkollektiv mittels PCR nach Infektionen mit dem Zytomegalievirus
und dem Epstein-Barr-Virus durchsucht. Die Produkte der zweiten PCR wurden auf ein Gel
aufgetragen und waren bei CMV in einem Fall von 61 positiv. Das Amplifikat der PCR II bei
CMV hatte eine Größe von 117 bp.
34
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Abbildung 13: Ausschnitt aus der Gelelektrophorese mit den Amplifikaten der CMV-PCR II. A die positive
Patientenprobe ist bei 117 bp gut zu sehen. In Bild B ist exemplarisch eine CMV-PositivKontrolle dargestellt.
Die Amplifikate der PCR II zur Detektion von Epstein-Barr-Viren wurden ebenfalls auf ein
Gel aufgetragen. Dabei konnte bei 2 von 61 Patienten eine EBV-Infektion nachgewiesen
werden. Das PCR-Produkt entsprach einer Größe von 111 bp und war in der
Gelelektrophorese gut als Bande an entsprechender Stelle zu erkennen.
35
Z. Amoakoova
Abbildung 14: Gelelektrophoretische Auftragung der EBV–Produkte mit A einer positiven Patientenprobe
und B mit einer weiteren positiven Patientenprobe (Blockpfeil) und der EBV-Positivkontrolle
(schlanker Pfeil)
4.5 Nachweis von Adenoviren
Schließlich wurden alle Proben nach der Extraktionskontrolle mit HFE auf das
Vorhandensein von Adenoviren untersucht. Bei der gelelektrophoretischen Auftragung der
PCR II-Produkte zur Detektion von Adenoviren fand sich eine positive Patientenprobe bei
135 bp.
Abbildung 15: gelelektrophoretische Auftragung der positiven Patientenprobe bei 135 bp
(Blockpfeil) und die Positivkontrolle für Adenoviren (schlanker Pfeil)
36
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4.6 Zusammenstellung der PCR-nachgewiesenen Infektionen im Vergleich
zur Histologie
In Tabelle 6 sind die positiven Ergebnisse aller gelelektrophoretischen Auftragungen
zusammengetragen:
Tabelle 6: positiv getestete Proben bei einem Gesamtkollektiv von 61 Patienten
positive Proben
Anteil (%) (n = 61)
Parvovirus B19
4
6,6
CMV
1
1,6
EBV
2
3,3
Adenovirus
1
1,6
Insgesamt
8
13,1
Somit beträgt der Gesamtanteil viraler Infektionen innerhalb des Patientenkollektivs 13 %.
Doppelinfektionen, bei denen in einer Probe virale DNA von zwei oder mehr der hier
geprüften Viren nachgewiesen worden wären, kamen nicht vor.
Nachdem uns die Plazentaproben vorlagen, die positiv auf EBV-, CMV-, Adenovirus- oder
Parvovirus B19-DNA getestet worden waren, wurden alle dazugehörigen histologischen
Schnitte
nochmals
lichtmikroskopisch
untersucht.
Bei
der
Frage
inwieweit
das
lichtmikroskopische Bild mit dem molekularbiologischen Ergebnis korreliert und ob es
eventuell möglich gewesen wäre, das PCR-Ergebnis durch alleinige Durchsicht der
histologischen Schnitte vorherzusagen, richteten wir unser Augenmerk besonders auf die
lichtmikroskopischen Veränderungen, die für das jeweilige Virus spezifisch sind (Kap. 1.3.3).
37
Z. Amoakoova
4.6.1 Parvovirus B19
Von 61 Plazentaproben konnten wir in 4 Fällen parvovirale DNA nachweisen. Abbildung 16
zeigt repräsentative Ausschnitte dieser vier Proben:
Abbildung 16: Lichtmikroskopische Ansichten von Zotten der auf Parvovirus B19 positiv getesteten
Plazentaproben. A SSW nicht bekannt, B 40. SSW; C 28. SSW, D 23. SSW Für eine
Parvovirusinfektion typische, morphologische Veränderungen finden sich nicht.
Die histologische Analyse der vier Plazenten ergab bei der routinemäßig durchgeführten
Evaluierung keine morphologischen Anzeichen einer Parvovirusinfektion. Demgegenüber
fanden
sich
Veränderungen,
die
für
das
angegebene
Gestationsalter
für
eine
Reifungsretardierung des Gewebes sprechen. Dies betrifft insbesondere das Plazentagewebe
in der Abbildung 16 A bis C. Hier fällt besonders die geringgradig ausgeprägte
Vaskularisierung auf, während die Entwicklung des Zottenbäumchens altersentsprechend
erschien. Zusätzlich fanden sich aber in Plazenta B eine Chorionitis, sowie eine weitgehend
fehlende Verschmelzung syncytialer-kapillärer Membranen (SSW 40). Weitere Hinweise auf
eine infektiöse Genese des klinisch angegebenen Hydrops fetalis ließen sich mikroskopisch
38
Erreur ! Style non défini.
nicht erkennen. Demgegenüber handelt es sich bei der Abb. D um eine normgerecht
ausgereifte Plazenta bei gleichzeitiger subchorialer, eitriger Plazentitis mit ausgeprägter
hämorrhagischer Komponente.
4.6.2 CMV
Von 61 Proben erwies sich eine als CMV-positiv. Bei der mikroskopischen Durchsicht des
dazugehörigen histologischen Schnittes zeigt sich eine Plazenta des letzten Trimenons mit
einer kleinherdigen Zottenstromafibrose, einer dissoziierten Zottenreifungsstörung mit
Prävalenz unreifer Endzotten, vermehrten Mikrofibrinabscheidungen und Kernknospen sowie
einer kleinherdigen Zottenreifungsarretierung. Die für das Zytomegalievirus typischen
Eulenaugenzellen waren im gesamten Schnitt nicht zu sehen. Abbildung 17 zeigt einen
repräsentativen Ausschnitt:
Abbildung 17: Lichtmikroskopischer Ausschnitt eines auf CMV positiv getesteten Plazentagewebes.
Auffallenderweise fehlen einerseits typische aber auch unspezifische und prinzipiell auf eine
Plazentitis verdächtige Veränderungen, wie z.B. eine unspezifische Villitis
4.6.3 Adenovirus
In Abbildung 18 ist ein Ausschnitt der einzigen, auf Adenovirus positiv getesteten
Patienten/Plazentaproben, zu sehen:
39
Z. Amoakoova
Abbildung 18: Die auf Adenovirus positiv geteste Plazenta war lichtmikroskopisch gestationsgerecht
ausgereift mit teilweise noch doppeltem Trophoblastenbesatz und retikulärem Stroma, das
mehrere sog. Hofbauer Zellen beinhaltet. Eine entzündliche Reaktion war weder in den
Plazentazotten noch an den Eihäuten oder den Gefäßen nachweisbar.
4.6.4 Epstein-Barr Virus
Das Epstein-Barr-Virus konnte in zwei Plazentaproben nachgewiesen werden. In
Abbildung 19 sind Ausschnitte dieser Proben dargestellt:
Abbildung 19: Diese Abbildung zeigt lichtmikroskopische Schnitte repräsentativ für beide, auf EBV positiv
getestete Plazentafälle. Während die Zottenreife dem Gestationsalter entsprach (in A), ergaben
sich als wesentlich auffälliger Befund kleinste Mikrokalzifikationen, die selten auch
intravaskulär nachweisbar sind (B).
40
5 Diskussion
In der vorgelegten Arbeit wurden PCR-Nachweise zur Detektion viraler Infektionen in
Plazentagewebe etabliert und an einem Kollektiv von 61 Patienten eingesetzt. Insgesamt
zeigte sich, dass dreizehn Prozent der Patientinnen eine Infektion der Plazenta besaßen, die
auf Parvovirus B19, Adenovirus, CMV oder EBV zurückzuführen war. Damit sind in dieser
Arbeit grundlegende Voraussetzungen geschaffen und die Notwendigkeit dargelegt worden,
die viralen Infektionsnachweise in die pathologische Diagnostik aufzunehmen, um so zur
Ursachenaufklärung des spontanen Aborts beizutragen und die psychische und emotionale
Erholung der betroffenen Eltern zu erleichtern und ihre Betreuung zu verbessern.
5.1 Etablierung der Nachweise viraler DNA mittels PCR an formalinfixierten und in Paraffin eingebetteten Plazentagewebeproben
5.1.1 Der Nachweis von Parvoviren durch die PCR
Bei der vorliegenden Arbeit musste für die PCR zum Nachweis von Parvovirus B19 in
formalinfixiertem Gewebematerial ein Primer-Set ausgewählt und die PCR auf die Ansprüche
pathologischen Materials abgestimmt werden. Die ausgewählten Primerpaare waren auf
Spezifität geprüft worden. Mit ihrer Hilfe wurde ein DNA-Fragment mit einer Länge von
126 bp nach dem ersten PCR-Durchgang und von 105 bp im zweiten Durchgang amplifiziert.
Bereits in früheren Arbeiten diente die PCR dazu, ein Gen oder einen Genabschnitt von
Parvoviren zu detektieren und zu amplifizieren. Die Zielsequenzen der in diesen Studien
verwendeten Primer haben oft eine Länge von über 200 bp (12, 77, 78). Bei diesen Studien
wurden aber zur Parvovirusdetektion native Gewebe und Flüssigkeiten wie zum Beispiel
Amnionflüssigkeit, fetales Blut, Plazenta oder fetales Gewebe benutzt. Da diese Proben
unfixiert eingesetzt werden, ist ihre DNA gut erhalten und auch molekularbiologischen
Ansätzen zugänglich. Bei fixierten Gewebeproben kommt es jedoch je nach Art der
angewandten Fixierungsmethode zu einer Fragmentierung der DNA (59). Bei Fixierung durch
quervernetzende Reagenzien (cross-linked fixative) wie Formaldehyd oder Glutaraldehyd
werden sehr enge Bindungen vor allem zwischen den Proteinen aber auch zwischen Proteinen
und Makromolekülen wie DNA, erzeugt. Diese Bindungen sind umso fester, je länger das
41
Z. Amoakoova
Gewebe fixiert ist und können dazu führen, dass bei der Isolierung ausgeübte Scherkräfte zu
Strangbrüchen führen und daher die DNA fragmentiert wird (59).
Die aus fixiertem Material extrahierte DNA ist trotz ihrer Fragmentierung für die PCR und
eine Reihe von anderen Standardverfahren der Molekularbiologie geeignet (25). Allerdings
müssen für den Einsatz der formalinbehandelten DNA in die PCR die Primerpaare - wie in
der vorgelegten Arbeit - bewusst so gewählt werden, dass ein kurzes Fragment (<200 bp)
amplifiziert wird. Das Amplikon, das zur Detektion von Parvoviren benutzt wurde, hatte
daher in der ersten PCR eine Länge von 126 bp und im zweiten PCR-Durchgang eine Länge
von 105 bp. Dies entspricht den Angaben von Ren et al. (2000), der in seiner Studie bei
formalinfixiertem Material eine PCR-Fragmentlänge um 120 bp empfiehlt (59). So wird die
Wahrscheinlichkeit erhöht, dass die Zielsequenz nach komplementärer Primeranlagerung
auch vollständig von der Taq-Polymerase abgelesen werden kann.
Da in dieser Arbeit zum Nachweis von Parvovirus B19 eine semi-nested PCR verwendet
wurde, konnte eine hohe Sensitivität erreicht und ca. 1 – 100 Kopien der Parvoviren noch
detektiert werden (mündliche Mitteilung Priv.-Doz. Dr. Odenthal, Institut für Pathologie,
Köln ) (8, 64). Ebenfalls diente die semi-nested PCR dazu, die Spezifität der PCR zu erhöhen.
In einer Sequenzierung wurde bestätigt, dass das PCR-Amplikon einen Genabschnitt der B19Parvoviren repräsentierte. Daher verbindet die hier verwendete semi-nested PCR die Vorteile
von hoher Spezifität und Sensitivität.
Es gibt außer dem semi-nested PCR-Verfahren eine Reihe anderer molekularer
Nachweismethoden für Parvoviren, die im Vergleich zur konventionellen PCR sowohl Vorals auch Nachteile im Hinblick auf Zeitaufwand, Handhabung und vor allem bezüglich
Sensitivität und Spezifität besitzen. So werden zur Darstellung von Parvoviren z.B.
immunologische Untersuchungen eingesetzt wie der ELISA (Enzyme-Linked Immunosorbent
Assay), der Western Blot und immunchemische Untersuchungen. Bei der ELISAUntersuchung werden im Patientenserum Antikörper gegen rekombinante Strukturproteine
des Parvovirus B19 wie VP1 bzw. VP2 nachgewiesen. Die diagnostische Sensitivität liegt je
nach bei dem Test verwendeten Epitop, zwischen 90 und 97 % und die Spezifität bei bis zu
95 % und ist daher bereits hoch (40). Allerdings kann diese Untersuchung ähnlich wie das
wenig sensitive und aufwendige Western Blot-Verfahren, nur am nativen nicht aber am
formalin-fixierten Material durchgeführt werden.
Im Immunfluoreszenztest werden wie im ELISA PV B19-Antikörper im Serum oder Plasma
von Patientinnen nachgewiesen und daher keine akuten Infektionen erfasst.
42
Erreur ! Style non défini.
Mit den konventionellen Antikörpersuchtests wie ELISA oder Immunfluoreszenz können
Antikörper sowohl qualitativ als auch quantitativ bestimmt werden. Bei der Detektion einer
Parvovirus B19 Infektion im Rahmen einer Schwangerschaft ergeben sich jedoch folgende
Nachteile:
Antikörpersuchtests sind bei der Detektion einer mütterlichen Parvovirus B19
Infektion nur begrenzt zuverlässig, da im Moment der ersten Symptome beim Feten
der mütterliche IgM Titer bereits gefallen und der Anstieg von IgG verzögert sein
kann (53). Es können also falsch negative Ergebnisse vorkommen.
Ein positiver serologischer Befund bei der Mutter mit Antikörpern gegen das
Parvovirus B19 spricht entweder für eine frische (IgM-Nachweis bzw. IgG nach
erfolgter Serokonversion) oder für eine vorangegangene Parvovirus B19 Infektion
(IgG-Nachweis), aber er sagt nichts darüber aus, ob die Plazenta oder ein anderes
Organ mitbefallen ist. Es gibt momentan keinen Anhalt für eine Korrelation zwischen
einer Serokonversion bei der Mutter und den Folgen für das ungeborene Kind bzw.
dem Ausgang der Schwangerschaft (39). Somit ist die alleinige Kenntnis des
serologischen Status der Patientinnen nicht ausreichend, um einen kausalen
Zusammenhang mit dem Spontanabort vermuten zu können.
Deshalb wurde in dieser Arbeit eine semi-nested PCR an formalinfixierten Plazenten
durchgeführt, um im Gewebe selbst virale DNA nachzuweisen. Aber selbst ein positiver PV
B19 DNA-Befund in Plazentagewebe muss nicht immer für eine Infektion des Feten
sprechen, da das Plazentagewebe mit mütterlichem Blut kontaminiert ist. Um eine Parvovirus
B19 Infektion als mögliche Ursache für einen Fruchttod annehmen zu können, wird deshalb
in der Arbeit von Nyman et al. (2002) die PCR am fetalen Gewebe empfohlen (53). Dies ist
jedoch insofern problematisch, als nicht immer fetales Gewebe verfügbar ist: zum Beispiel ist
bei unbemerktem Fruchtabgang (missed abortion) kein Plazentagewebe mehr vorhanden.
Andererseits steht beim intrauterinen Fruchttod (IUFT), durch die Verweildauer des
abgestorbenen Gewebes im Mutterleib bei 37 °C, oft nur noch autolytisches Material zur
Verfügung. Zudem stimmen betroffene Eltern nicht immer einer Obduktion zu, da sie es als
zusätzliche Belastung empfinden.
Bei Verdacht auf eine kongenitale Parvovirus B19 Infektion kann aus der Nabelschnur
gewonnenes Blut auf spezifische IgM-Antikörper untersucht werden. Die Aussage dieser
serologischen Tests bei Neugeborenen mit kongenitaler PV B19 Infektion sind ebenfalls sehr
beschränkt (53). Bei Infektion in utero entwickeln nicht alle Feten messbare Antikörpertiter.
43
Z. Amoakoova
Je früher es zu einer Infektion im Mutterleib kommt desto unwahrscheinlicher ist die
Ausbildung spezifischer IgM-Antikörper. Die Ursache liegt entweder am noch unreifen
fetalen Immunsystem oder an den mütterlichen IgG-Antikörpern, die transplazentar in den
kindlichen Kreislauf gelangen und hier die Produktion eigener Antikörper hemmen können.
Wenn der molekularbiologische DNA-Nachweis allerdings nicht in Nukleinsäure-Extrakten
der Plazenta sondern in situ d.h. direkt im zu untersuchenden Gewebe durchgeführt wird,
kann die Infektion lokalisiert werden. Daher ist die auf Gewebeschnitten durchgeführte in situ
Hybridisierung auch ein wichtiges virales Nachweisverfahren. Allerdings ist die in situ
Hybridisierung gegenüber der hier verwendeten semi-nested PCR weniger robust,
kostenintensiv und bei einer Dauer von zwei Tagen bis zum Vorliegen des Ergebnisses sehr
zeitaufwendig. Die Darstellung des Virus selbst in wenigen Zellen ist aber ein Vorteil
gegenüber den verschiedenen PCR-Verfahren.
In einigen PCR-Nachweisen werden auch Hybridisierungsverfahren mit der PCR verknüpft.
Diese Verfahren werden allerdings nicht in situ sondern in vitro verwendet. Während die in
situ Hybridisierung den Vorteil besitzt, die Erreger zu lokalisieren, sind die PCR
kombinierten in vitro Hybridisierungsverfahren, in denen das Amplikon durch spezifische
Sonden
eingefangen
wird
und
dann
durch
enzym-
oder
radioaktivverbundene
Detektionsverfahren (ELISA oder RIA-PCR) dargestellt wird, besonders sensitiv und
spezifisch (Nascimento et al 1991) (64). Während direkte Hybridisierungsverfahren 0,3 bis
0,5 pg virale DNA nachweisen, was 104 viralen Partikeln entspricht (8, 64), können durch
kombinierte PCR-Hybridisierungsverfahren 10 bis 100 Viruspartikel detektiert werden.
Ähnlich wie die in meiner Arbeit verwendete semi-nested PCR sind dieses PCR-Nachweise
100 bis 1000 mal sensitiver als die direkte in vitro Hybridisierung (8).
5.1.2 Der Nachweis von Pathogenen durch die PCR
In der vorgelegten Arbeit wurde für den Nachweis von verschiedenen Pathogenen in
formalin-fixiertem Plazentagewebe die PCR verwendet. Ähnlich wie für den in 5.1.1
besprochenen Nachweis für Parvoviren stellte sich auch für die Detektion anderer Erreger die
PCR als eine einfache, zuverlässige und besonders sensitive Methode dar. Ein Vorteil
gegenüber der Bestimmung von Antikörpern im Patientenserum ist, dass die virale DNA
unabhängig vom Stadium der viralen Reproduktion und unabhängig vom Immunstatus des
Patienten im untersuchten Gewebe nachgewiesen werden kann (33). Außerdem ist eine
44
Erreur ! Style non défini.
positive Serologie nicht beweisend für den gleichzeitigen Befall eines Gewebes. Hingegen
macht ein positiver PCR-Befund eine lokale Infektion der Plazenta wahrscheinlich. Für die
genaue Lokalisation des Virus innerhalb des untersuchten Gewebes eignet sich ein
immunologischer Nachweis, wenn erregerspezifische, auf pathologischem Material
funktionierende Antikörper kommerziell erhältlich sind oder die in situ Hybridisierung.
Letztere hat zwar eine hohe Sensitivität (74), aber beide Verfahren sind gegenüber dem PCRNachweis aufwendig.
5.2 Die Inzidenz viraler Infektionen im Zusammenhang mit intrauterinem
Fruchttod und Spontanabort
Wir untersuchten insgesamt 61 Plazenten mittels PCR auf virale DNA, wobei mit
erregerspezifischen PCR-Ansätzen gezielt nach Parvovirus B19, EBV, CMV und Adenoviren
gesucht wurde. Die Gewebeproben stammten von Frauen, die einen intrauterinen Fruchttod
erlitten hatten, ohne dass hierfür eine Ursache eruiert werden konnte. Bei wenigen Fällen
konnten leichte histologische Veränderungen der Plazenta festgestellt werden, die aber nur
bedingt auf eine Infektion hindeuteten. In 8 der 61 Proben konnte virale DNA nachgewiesen
werden, was einem Anteil von 13 % entspricht. Die Verteilung auf die einzelnen Viren ist in
Tabelle 7 dargestellt:
Tabelle 7: Prozentuale Verteilung der positiven Proben auf das Patientenkollektiv
Virus
Anzahl positiver Proben Anteil in %
Parvovirus B19
4/61
6,6
CMV
1/61
1,6
EBV
2/61
3,3
Adenovirus
1/61
1,6
In vier von 61 Proben konnte PV B19-DNA nachgewiesen werden. Bei zwei Proben stammte
das Material aus dem dritten Trimenon (28. und 40. Schwangerschaftswoche = SSW), bei
einer weiteren Probe aus dem zweiten Trimenon (23. SSW). Bei der vierten positiven Probe
war das Gestationsalter nicht bekannt. In der Literatur gilt eine Infektion mit Parvovirus B19
während der Schwangerschaft als die häufigste virale Infektion, die mit einem intrauterinen
45
Z. Amoakoova
Fruchttod assoziiert ist und dies besonders im zweiten und dritten Trimenon (7, 68, 73).
Außerdem ist sie eine Ursache für einen nicht-immunologischen Hydrops fetalis (7). Der
relative Anteil der PV B19-positiven Proben lag bei über sechs Prozent und korreliert damit
gut mit den Ergebnissen von Studien, die sich mit der Inzidenz der Parvovirus B19assoziierten Spontanaborte befassen. Tolfvenstam et al. ermittelten bei der Untersuchung von
Plazenten nach PV B19 mittels PCR einen Anteil von 5 % im ersten Schwangerschaftsdrittel
und bis zu 15 % im zweiten und dritten Trimenon (73). Im Hinblick auf die Einteilung der PV
B19-positiven Aborte in erstes, zweites und drittes Trimenon müssen die Angaben in dieser
Studie jedoch kritisch betrachtet werden, denn es handelt sich dabei um zu kleine Fallzahlen,
als dass man statistisch relevante Aussagen darüber machen könnte. In der vorgelegten Arbeit
war das Gestationsalter nicht in allen Fällen bekannt, so dass zwar die relative Verteilung der
PV B19-Infektionen innerhalb des Schwangerschaftsverlaufs bei wenigen Fällen angegeben
werden kann, aber die Aussagekraft auch hier aufgrund häufig fehlender Daten und der
geringen Fallzahl begrenzt ist.
Eine Zytomegalieinfektion der Plazenta wurde nur bei einer Probe diagnostiziert. Bei der
Patientin kam es im letzten Schwangerschaftsdrittel zu einem Hydrops fetalis. Das
Zytomegalievirus (CMV) hat die führende Rolle bei der Ätiologie von intrauterinen
Infektionen und die CMV-Infektion ist mit einer Inzidenz von 0,2 bis 2 % aller
Lebendgeburten die häufigste kongenitale Infektion weltweit (2, 14). Ob und welche Rolle die
intrauterine CMV-Infektion beim Spontanabort spielt, ist unklar. Es wurden Studien
veröffentlicht, darunter viele einzelne Fallberichte, die einen Zusammenhang für
wahrscheinlich halten (10, 11, 27, 37, 44, 45, 76, 84), doch größer angelegte Studien
unterstützen diese Hypothese nicht (18, 48, 52, 70). Nach der kürzlich erschienenen Fall Kontroll - Studie von Eskild et al. (2005) mit einer Fallzahl von 281 Frauen und einer
Kontrollgruppe aus 957 kam man zu dem Schluss, dass eine intrauterin erworbene CMVInfektion das Risiko eines intrauterinen Fruchttods nicht erhöht (18). Dies könnte auch unsere
niedrige Anzahl positiver CMV-Proben erklären. Die Durchseuchungsrate der Bevölkerung in
Deutschland (2. Lebensjahrzehnt) liegt bei etwa 40 bis 80 %. Während der Schwangerschaft
kommt es bei ca. 2 bis 3 % der seronegativen Frauen zu einer CMV-Primärinfektion bei einer
fetalen Infektionsrate von 40%. Folglich ist eine Primärinfektion mit CMV während der
Schwangerschaft ein seltenes Ereignis. Um hier aussagekräftige Daten zu erlangen, bräuchte
es eine Studie mit großer Fallzahl und bis jetzt gibt es noch keine Studie, die diesem
Anspruch gerecht wird (18).
46
Erreur ! Style non défini.
Von insgesamt 61 Plazenten enthielten zwei Proben EBV-DNA (3,2 %) und bei einer Probe
konnte Adenovirus-spezifische DNA nachgewiesen werden (1,6 %). Weder dem EpsteinBarr-Virus noch dem Adenovirus wird eine Rolle bei intrauterinem Fruchttod oder
Spontanabort zugeschrieben (17, 50, 56). Bei der Untersuchung von Abortmaterial
(Spontanabort-Gruppe) mittels PCR fand man DNA-Sequenzen von Adenoviren, doch die
Differenz zur Kontrollgruppe (Material von induziertem Abort) war statistisch nicht
signifikant (56). Die positiven EBV-Proben lassen sich dadurch erklären, dass das Virus bei
gesunden Personen, die schon einmal eine EBV-Infektion durchgemacht haben, in 1 bis 50
pro 106 infizierten B-Lymphozyten in der Blutbahn zirkuliert (42). Da die PCR ein sehr
sensitives Verfahren ist, kann dieser EBV-positive Lymphozyt ausreichen, um zu einem
positiven DNA-Nachweis zu führen, ohne dass tatsächlich eine EBV-Infektion vorliegt.
Durch die Untersuchung der Plazenten konnten also bei vier Patientinnen anhand des
positiven PV B19-Ergebnisses die wahrscheinliche Ursache für den Abort eruiert werden.
Dies entspricht einem Anteil von über 6 %. Bei den übrigen infizierten Patientinnen (ebenfalls
ca. 6 %), bei denen wir virale DNA gefunden haben, kann trotz des PCR-Ergebnisses nicht
ausgeschlossen
werden,
dass
andere
Ursachen
für den
negativen
Ausgang der
Schwangerschaft vorgelegen haben. Denn es gibt bis heute keine eindeutigen Hinweise, dass
Adenoviren, EBV oder CMV für einen Spontanabort verantwortlich gemacht werden können.
Incerpi et al (1998) messen einem Großteil der zur histologischen Befundung zusätzlich
durchgeführten Tests, die routinemäßig bei IUFT angewandt werden, eine geringe Bedeutung
bei, da sie bei der Ursachenforschung nicht zur Aufklärung beitragen (36). Auf der anderen
Seite wurde in einigen Studien auf die Wichtigkeit der Infektionsdiagnostik - hier
insbesondere PV B19 - bei intrauterinem Fruchttod und Spontanabort hingewiesen und
gefordert, diese in die Routinediagnostik aufzunehmen (57, 67, 73). Unser Ergebnis
unterstützt diese Meinung.
5.3 Die PCR als zusätzliches pathologisches Nachweisverfahren bei IUFT
und Spontanabort aufgrund begrenzter Aussagekraft der Histologie
In der vorgelegten Studie wird deutlich, dass die Vorhersagbarkeit einer viralen Infektion
anhand der histologischen Untersuchung des Plazenta- oder des fetalen Gewebes nur gering
47
Z. Amoakoova
ist. Nur in einem von acht positiven Fällen bestand der histologische Verdacht einer viralen
Infektion und in einem anderen Fall war der Verdacht dem falschen Virus zugeordnet.
Diese Erkenntnis wird durch die Arbeiten von Trincado et al. (2005) bestätigt, die mittels
PCR bei 11 von insgesamt 94 Plazenten CMV nachweisen konnten, obwohl diese Proben
zuvor von einem Pathologen im Rahmen einer Routineuntersuchung für CMV negativ
befundet worden waren. Hier waren vor allem die histologisch-diagnostischen Parameter wie
ein negativer Immunperoxidasetest und das Fehlen von Einschlusskörperchen herangezogen
worden (74). In anderen Arbeiten wurde bislang nicht auf die häufig fehlenden histologischen
Hinweise, die eine Indikation zur viralen Diagnostik gäben, eingegangen. Gerade daher ist die
Beobachtung in dieser Arbeit, dass es für eine Infektion mit Erregern wie Adenoviren, EBV,
CMV und PV B19 häufig keine histologischen Indizien gibt, von besonderer Tragweite für
die zukünftige diagnostische Angehensweise.
5.4
Psychologische Auswirkungen einer sensitiven Infektionsdiagnostik
auf die Familienplanung
In der zugrundeliegenden Arbeit konnten wir durch die PV B19-spezifische PCR bei über
sechs Prozent des untersuchten Patientenkollektivs die wahrscheinliche Ursache für den
Spontanabort aufdecken, nachdem zuvor in allen Fällen durch mangelnde Hinweise in der
Mikro- und Makropathologie keine Ursache angegeben werden konnte.
Der Verlust eines Kindes stellt in der Regel für die betroffenen Eltern und besonders für die
Frauen eine erhebliche psychische Belastung dar. Nicht selten stellen die Frauen ihren Körper
und ihre Fortpflanzungsfähigkeit generell in Frage, aber auch Männer zweifeln häufig an
ihrem „Erbgut“ (62). Besonders die Ungewissheit in Hinblick auf die Ursache des
unerwarteten Verlusts des Kindes ist sehr schmerzvoll und die Neigung zu Schuldgefühlen
und Depressionen groß bis hin zu einer erhöhten Suizidgefährdung (15, 24). In der Pathologie
der Geburtsmedizin sollte das Ziel eines jeden Arztes sein, bei unerwartetem Verlust des
Kindes während der Schwangerschaft eine effektive Ursachenforschung zu betreiben (57).
Auch wenn der Grund in über einem Drittel der Fälle selbst bei optimaler Diagnostik nicht
bestimmt werden kann (36), so kann doch auf diese Weise den Eltern in vielen Fällen
geholfen werden. Wenn der Arzt den Eltern eine plausible Begründung für den Tod ihres
Kindes geben kann, ergeben sich bei Eltern im Falle eines Infektionsnachweises Indizien,
dass eine genetische Ursache ausgeschlossen werden kann oder zumindest unwahrscheinlich
ist und auch kein Hinderungsgrund besteht, weitere Schwangerschaften anzugehen. Die
48
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Studien dieser Arbeit schaffen eine wichtige Basis, um die Routinediagnostik zu verbessern.
Trotz der bedeutenden Rolle des Parvovirus B19 beim IUFT gehört es an unserer Klinik bei
der Abklärung des Spontanaborts nicht zur Routinediagnostik. Deshalb ist es wichtig, dass
Eltern nicht allein gelassen werden, damit Schuldgefühle vermieden und zukünftige
Schwangerschaften positiv beeinflusst werden können.
Auf der Grundlage der erworbenen Ergebnisse konnten wir zeigen, dass es daher notwendig
und sinnvoll ist, die Parvovirus B19-PCR in die Routinediagnostik aufzunehmen.
49
6 Zusammenfassung
Eine virale Infektion der Mutter während der Schwangerschaft kann das ungeborene Kind
schädigen und einen ungewollten Schwangerschaftsabbruch hervorrufen. Nicht selten verläuft
eine solche Infektion der Mutter latent und bleibt klinisch unbemerkt. Kommt es zu einem
Spontanabort liefern routinemäßig angewandte Methoden wie Serologie und Histologie keine
zuverlässigen Hinweise. Ebenso gibt es keine einheitliche Empfehlung darüber, welche
diagnostischen Verfahren nach einem Spontanabort sinnvoll sind. Kann die Ursache für den
Abort nicht eruiert werden, ist dies gleichermaßen unbefriedigend für den betreuenden Arzt,
den Pathologen und besonders für die betroffenen Eltern.
Ziel dieser Arbeit war es deshalb zu untersuchen, ob die Durchführung einer PCR zum
Nachweis der Viren CMV, EBV, Parvovirus B19 und Adenovirus zusätzliche Erkenntnisse
bringen und zur Ursachenaufklärung im Rahmen der Abortdiagnostik beitragen kann und
folglich als ergänzende diagnostische Methode in die Routinediagnostik aufgenommen
werden sollte.
Hierfür untersuchten wir 61 formalinfixierte, in Paraffin eingebettete Plazentaproben aus dem
Archiv des Instituts für Pathologie der Universität zu Köln der Jahre 1996 bis 2004. Bei allen
Proben bestand ein IUFT, Hydrops fetalis bzw. universalis oder eine Plazentitis/Villitis
unklarer Ätiologie. Die zu den ausgewählten Proben korrespondierenden Plazentaschnitte
wurden lichtmikroskopisch durchgesehen. Anschließend wurde ein neuer PCR-Assay zum
Nachweis von Parvovirus B19 in fixiertem Gewebe erfolgreich etabliert und an den
ausgewählten Proben angewandt. Aus allen Paraffinblöcken konnte ausreichend DNA
extrahiert werden. Es folgten die PCRs zum Nachweis von EBV, CMV und Adenovirus.
Von 61 Gewebeproben wurde in vier parvovirale DNA nachgewiesen, zwei waren positiv für
EBV, und jeweils eine Probe positiv für Adenovirus bzw. CMV. Das entspricht etwa 13 %
des untersuchten Patientenguts. Die vorangegangene Histologie hatte bei keiner dieser Proben
den Hinweis auf eine virale Infektion geliefert.
Deshalb sollte in der Routinediagnostik nach jedem Abort unklarer Ätiologie mittels PCR
nach einer viralen Ursache gesucht werden. Immunologische Verfahren haben den Nachteil,
dass sie ausschließlich an nativem Gewebe durchführbar sind. Serologische Tests sind im
Vergleich weniger zuverlässig, weil sie nur einen indirekten Nachweis einer Infektion liefern.
Die PCR hingegen hat eine sehr hohe Spezifität und Sensitivität und kann sowohl bei nativem
als auch bei fixiertem Gewebe angewandt werden.
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51
7 Literaturverzeichnis
1.
2.
3.
4.
5.
6.
7.
8.
9.
10.
11.
12.
13.
14.
15.
16.
17.
18.
19.
Aherne W, Bird T, Court SD, Gardner PS, McQuillin J. Pathological changes in
virus infections of the lower respiratory tract in children. J Clin Pathol. 1970;23(1):718.
Ahlfors K, Ivarsson SA, Harris S. Report on a long-term study of maternal and
congenital cytomegalovirus infection in Sweden. Review of prospective studies
available in the literature. Scand J Infect Dis. 1999;31(5):443-57.
Alford CA, Stagno S, Pass RF, Britt WJ. Congenital and perinatal cytomegalovirus
infections. Rev Infect Dis. 1990;12 Suppl 7:S745-53.
Allen MC, Donohue PK, Dusman AE. The limit of viability--neonatal outcome of
infants born at 22 to 25 weeks' gestation. N Engl J Med. 1993;329(22):1597-601.
Becroft DM. Histopathology of fatal adenovirus infection of the respiratory tract in
young children. J Clin Pathol. 1967;20(4):561-9.
Brajenovic-Milic B, Petrovic O, Krasevic M, Ristic S, Kapovic M. Chromosomal
anomalies in abnormal human pregnancies. Fetal Diagn Ther. 1998;13(3):187-91.
Brown T, Anand A, Ritchie LD, Clewley JP, Reid TM. Intrauterine parvovirus
infection associated with hydrops fetalis. Lancet. 1984;2(8410):1033-4.
Clewley JP. Polymerase chain reaction assay of parvovirus B19 DNA in clinical
specimens. J Clin Microbiol. 1989;27(12):2647-51.
Cohen BJ, Buckley MM. The prevalence of antibody to human parvovirus B19 in
England and Wales. J Med Microbiol. 1988;25(2):151-3.
Cruz Spano L, Lima Pereira FE, Gomes da Silva Basso N, Mercon-de-Vargas
PR. Human cytomegalovirus infection and abortion: an immunohistochemical study.
Med Sci Monit. 2002;8(6):BR230-5.
Dehner LP, Askin FB. Cytomegalovirus endometritis: report of a case associated
with spontaneous abortion. Obstet Gynecol. 1975;45(2):211-4.
Dong ZW, Zhou SY, Li Y, Liu RM. Detection of a human parvovirus intrauterine
infection with the polymerase chain reaction. J Reprod Med. 2000;45(5):410-2.
Emmrich P, Horn LC, Seifert U. [Morphologic findings in fetuses and placentas of
late abortion in the 2nd trimester]. Zentralbl Gynakol. 1998;120(8):399-405.
Enders G, Bader U, Lindemann L, Schalasta G, Daiminger A. Prenatal diagnosis
of congenital cytomegalovirus infection in 189 pregnancies with known outcome.
Prenat Diagn. 2001;21(5):362-77.
Engelhard IM, van den Hout MA, Vlaeyen JW. The sense of coherence in early
pregnancy and crisis support and posttraumatic stress after pregnancy loss: a
prospective study. Behav Med. 2003;29(2):80-4.
Ergaz Z, Ornoy A. Parvovirus B19 in pregnancy. Reprod Toxicol. 2006;21(4):42135.
Eskild A, Bruu AL, Stray-Pedersen B, Jenum P. Epstein-Barr virus infection
during pregnancy and the risk of adverse pregnancy outcome. Bjog.
2005;112(12):1620-4.
Eskild A, Jenum PA, Bruu AL. Maternal antibodies against cytomegalovirus in
pregnancy and the risk of fetal death and low birth weight. Acta Obstet Gynecol
Scand. 2005;84(11):1035-41.
Field AM, Cohen BJ, Brown KE, Mori J, Clewley JP, Nascimento JP, Hallam
NF. Detection of B19 parvovirus in human fetal tissues by electron microscopy. J
Med Virol. 1991;35(2):85-95.
52
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20.
21.
22.
23.
24.
25.
26.
27.
28.
29.
30.
31.
32.
33.
34.
35.
36.
37.
38.
Galindo A, Burguillo AG, Azriel S, Fuente Pde L. Outcome of fetuses in women
with pregestational diabetes mellitus. J Perinat Med. 2006;34(4):323-31.
Garcia-Enguidanos A, Calle ME, Valero J, Luna S, Dominguez-Rojas V. Risk
factors in miscarriage: a review. Eur J Obstet Gynecol Reprod Biol. 2002;102(2):1119.
Gaytant MA, Steegers EA, Semmekrot BA, Merkus HM, Galama JM. Congenital
cytomegalovirus infection: review of the epidemiology and outcome. Obstet Gynecol
Surv. 2002;57(4):245-56.
Gilbert GL. Parvovirus B19 infection and its significance in pregnancy. Commun Dis
Intell. 2000;24 Suppl:69-71.
Gissler M, Hemminki E, Lonnqvist J. Suicides after pregnancy in Finland, 1987-94:
register linkage study. Bmj. 1996;313(7070):1431-4.
Goelz SE, Hamilton SR, Vogelstein B. Purification of DNA from formaldehyde
fixed and paraffin embedded human tissue. Biochem Biophys Res Commun.
1985;130(1):118-26.
Griebel CP, Halvorsen J, Golemon TB, Day AA. Management of spontaneous
abortion. Am Fam Physician. 2005;72(7):1243-50.
Griffiths PD, Baboonian C. A prospective study of primary cytomegalovirus
infection during pregnancy: final report. Br J Obstet Gynaecol. 1984;91(4):307-15.
Guidozzi F, Ballot D, Rothberg AD. Human B19 parvovirus infection in an obstetric
population. A prospective study determining fetal outcome. J Reprod Med.
1994;39(1):36-8.
H. Schneider PH. Die Geburtshilfe. Springer; 2004:932.
Hamprecht K, Maschmann J, Vochem M, Dietz K, Speer CP, Jahn G.
Epidemiology of transmission of cytomegalovirus from mother to preterm infant by
breastfeeding. Lancet. 2001;357(9255):513-8.
Haque T, Thomas JA, Falk KI, Parratt R, Hunt BJ, Yacoub M, Crawford DH.
Transmission of donor Epstein-Barr virus (EBV) in transplanted organs causes
lymphoproliferative disease in EBV-seronegative recipients. J Gen Virol. 1996;77 ( Pt
6):1169-72.
Herber-Jonat S, Schulze A, Kribs A, Roth B, Lindner W, Pohlandt F. Survival
and major neonatal complications in infants born between 22 0/7 and 24 6/7 weeks of
gestation (1999-2003). Am J Obstet Gynecol. 2006;195(1):16-22.
Huang H, Weng X, Shen R. [Detection of intrauterine transmission of human
cytomegalovirus by nested polymerase chain reaction]. Zhonghua Fu Chan Ke Za Zhi.
1995;30(8):454-6.
Hummler HD, Poets C, Vochem M, Hentschel R, Linderkamp O. [Mortality and
morbidity of very premature infants in Baden-Wurttemberg depending on hospital
size. Is the current degree of regionalization adequate?]. Z Geburtshilfe Neonatol.
2006;210(1):6-11.
Huynen P, Melin P, Hayette MP, De Mol P. [Infectious serology: interpretation of
the results and traps to avoid]. Rev Med Liege. 2006;61(12):827-33.
Incerpi MH, Miller DA, Samadi R, Settlage RH, Goodwin TM. Stillbirth
evaluation: what tests are needed? Am J Obstet Gynecol. 1998;178(6):1121-5.
Inoue T, Matsumura N, Fukuoka M, Sagawa N, Fujii S. Severe congenital
cytomegalovirus infection with fetal hydrops in a cytomegalovirus-seropositive
healthy woman. Eur J Obstet Gynecol Reprod Biol. 2001;95(2):184-6.
Jindal P, Regan L, Fourkala EO, Rai R, Moore G, Goldin RD, Sebire NJ.
Placental pathology of recurrent spontaneous abortion: the role of histopathological
53
39.
40.
41.
42.
43.
44.
45.
46.
47.
48.
49.
50.
51.
52.
53.
54.
55.
56.
54
examination of products of conception in routine clinical practice: a mini review. Hum
Reprod. 2007;22(2):313-6.
Jordan JA, Huff D, DeLoia JA. Placental cellular immune response in women
infected with human parvovirus B19 during pregnancy. Clin Diagn Lab Immunol.
2001;8(2):288-92.
Kaikkonen L, Soderlund-Venermo M, Brunstein J, Schou, O, Panum Jensen I,
Rousseau S, Caul EO, Cohen B, Valle M, Hedman L, Hedman K. Diagnosis of
human parvovirus B19 infections by detection of epitope-type-specific VP2 IgG. J
Med Virol. 2001;64(3):360-5.
Kaplan C. The placenta and viral infections. Semin Diagn Pathol. 1993;10(3):232-50.
Khan G, Miyashita EM, Yang B, Babcock GJ, Thorley-Lawson DA. Is EBV
persistence in vivo a model for B cell homeostasis? Immunity. 1996;5(2):173-9.
Knecht H, Berger C, Rothenberger S, Odermatt BF, Brousset P. The role of
Epstein-Barr virus in neoplastic transformation. Oncology. 2001;60(4):289-302.
Ko HM, Kim KS, Park JW, Lee YJ, Lee MY, Lee MC, Park CS, Juhng SW, Choi
C. Congenital cytomegalovirus infection: three autopsy case reports. J Korean Med
Sci. 2000;15(3):337-42.
Kost BP, Mylonas I, Kastner R, Rack B, Gingelmaier A, Friese K. Congenital
cytomegalovirus infection in pregnancy: a case report of fetal death in a CMVinfected woman. Arch Gynecol Obstet. 2007;276(3):265-8.
Lewin N, Aman P, Masucci MG, Klein E, Klein G, Oberg B, Strander H, Henle
W, Henle G. Characterization of EBV-carrying B-cell populations in healthy
seropositive individuals with regard to density, release of transforming virus and
spontaneous outgrowth. Int J Cancer. 1987;39(4):472-6.
Ljunger E, Cnattingius S, Lundin C, Anneren G. Chromosomal anomalies in firsttrimester miscarriages. Acta Obstet Gynecol Scand. 2005;84(11):1103-7.
Matovina M, Husnjak K, Milutin N, Ciglar S, Grce M. Possible role of bacterial
and viral infections in miscarriages. Fertil Steril. 2004;81(3):662-9.
Menasha J, Levy B, Hirschhorn K, Kardon NB. Incidence and spectrum of
chromosome abnormalities in spontaneous abortions: new insights from a 12-year
study. Genet Med. 2005;7(4):251-63.
Moffat LE. Infectious mononucleosis. Prim. Care Update Ob Gyns. 2001;8(2):73-77.
Moore KL. Embryologie; 2007.
Moyo SR, Tswana SA, Nystrom L, Bergstrom S, Blomberg J, Ljungh A.
Intrauterine death and infections during pregnancy. Int J Gynaecol Obstet.
1995;51(3):211-8.
Nyman M, Tolfvenstam T, Petersson K, Krassny C, Skjoldebrand-Sparre L,
Broliden K. Detection of human parvovirus B19 infection in first-trimester fetal loss.
Obstet Gynecol. 2002;99(5 Pt 1):795-8.
Ornoy A, Dudai M, Sadovsky E. Placental and fetal pathology in infectious
mononucleosis. A possible indicator for Epstein-Barr virus teratogenicity. Diagn
Gynecol Obstet. 1982;4(1):11-6.
Osborn JF, Cattaruzza MS, Spinelli A. Risk of spontaneous abortion in Italy, 19781995, and the effect of maternal age, gravidity, marital status, and education. Am J
Epidemiol. 2000;151(1):98-105.
Penta M, Lukic A, Conte MP, Chiarini F, Fioriti D, Longhi C, Pietropaolo V,
Vetrano G, Villaccio B, Degener AM, Seganti L. Infectious agents in tissues from
spontaneous abortions in the first trimester of pregnancy. New Microbiol.
2003;26(4):329-37.
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57.
58.
59.
60.
61.
62.
63.
64.
65.
66.
67.
68.
69.
70.
71.
72.
73.
74.
Petersson K, Norbeck O, Westgren M, Broliden K. Detection of parvovirus B19,
cytomegalovirus and enterovirus infections in cases of intrauterine fetal death. J
Perinat Med. 2004;32(6):516-21.
R. Dörries HH. Medizinische Mikrobiologie; 2004.
Ren ZP, Sallstrom J, Sundstrom C, Nister M, Olsson Y. Recovering DNA and
optimizing PCR conditions from microdissected formalin-fixed and paraffinembedded materials. Pathobiology. 2000;68(4-5):215-7.
Revello MG, Gorini G, Gerna G. Clinical evaluation of a chemiluminescence
immunoassay for determination of immunoglobulin g avidity to human
cytomegalovirus. Clin Diagn Lab Immunol. 2004;11(4):801-5.
Revello MG, Zavattoni M, Furione M, Fabbri E, Gerna G. Preconceptional
primary human cytomegalovirus infection and risk of congenital infection. J Infect
Dis. 2006;193(6):783-7.
Rohde PDmA. Psychisches Empfinden nach einer Fehl- oder Totgeburt.
http://www.familienhandbuch.de/cmain/f_Aktuelles/a_Gesundheit/s_207.html. 2006.
Rushton DI. Examination of products of conception from previable human
pregnancies. J Clin Pathol. 1981;34(8):819-35.
Salimans MM, Holsappel S, van de Rijke FM, Jiwa NM, Raap AK, Weiland HT.
Rapid detection of human parvovirus B19 DNA by dot-hybridization and the
polymerase chain reaction. J Virol Methods. 1989;23(1):19-28.
Setubal S, de Oliveira SA, Pires AR, da Fonseca EC, Camacho LA, Serodio AC,
do Nascimento JP. Erythrovirus B19 infection in acquired immunodeficiency
syndrome: screening by histopathology, immunohistochemistry, and in situ
hybridization. Mem Inst Oswaldo Cruz. 2006;101(4):407-14.
Sixbey JW, Nedrud JG, Raab-Traub N, Hanes RA, Pagano JS. Epstein-Barr virus
replication in oropharyngeal epithelial cells. N Engl J Med. 1984;310(19):1225-30.
Skjoldebrand-Sparre L, Nyman M, Broliden K, Wahren B. All cases of
intrauterine fetal death should be evaluated for parvovirus B19 viral deoxyribonucleic
acid. Am J Obstet Gynecol. 1999;180(6 Pt 1):1595-6.
Skjoldebrand-Sparre L, Tolfvenstam T, Papadogiannakis N, Wahren B, Broliden
K, Nyman M. Parvovirus B19 infection: association with third-trimester intrauterine
fetal death. Bjog. 2000;107(4):476-80.
Somogyi T, Colimon R, Michelson S. An illustrated guide to the structure of the
human cytomegalovirus genome and a review of transcription data. Prog Med Virol.
1986;33:99-133.
Spano LC, Vargas PR, Ribeiro FS, Leite JP, Nascimento JP. Cytomegalovirus in
human abortion in Espirito Santo, Brazil. J Clin Virol. 2002;25 Suppl 2:S173-8.
Staras SA, Dollard SC, Radford KW, Flanders WD, Pass RF, Cannon MJ.
Seroprevalence of cytomegalovirus infection in the United States, 1988-1994. Clin
Infect Dis. 2006;43(9):1143-51.
Stein ZA. A woman's age: childbearing and child rearing. Am J Epidemiol.
1985;121(3):327-42.
Tolfvenstam T, Papadogiannakis N, Norbeck O, Petersson K, Broliden K.
Frequency of human parvovirus B19 infection in intrauterine fetal death. Lancet.
2001;357(9267):1494-7.
Trincado DE, Munro SC, Camaris C, Rawlinson WD. Highly sensitive detection
and localization of maternally acquired human cytomegalovirus in placental tissue by
in situ polymerase chain reaction. J Infect Dis. 2005;192(4):650-7.
55
75.
76.
77.
78.
79.
80.
81.
82.
83.
84.
85.
86.
87.
88.
89.
90.
56
van Gessel PH, Wildschut HI, Cohen-Overbeek TE, Vermeij-Keers C.
[Parvovirus B19 infection in pregnancy: a cause of non-immune hydrops fetalis]. Ned
Tijdschr Geneeskd. 1999;143(1):3-7.
Vogler C, Kohl S, Rosenberg HS. Cytomegalovirus infection and fetal death in a
twin. A case report. J Reprod Med. 1986;31(3):207-10.
Wattre P, Dewilde A, Subtil D, Andreoletti L, Thirion V. A clinical and
epidemiological study of human parvovirus B19 infection in fetal hydrops using PCR
Southern blot hybridization and chemiluminescence detection. J Med Virol.
1998;54(2):140-4.
Wattre P, Thirion V, Bellagra N, Subtil D, Andreoletti L, Hober D, Lion G,
Dewilde A. [PCR value in the diagnosis of feto-placental human parvovirus B19
hydrops fetalis: apropos of 10 cases]. Ann Biol Clin (Paris). 1997;55(4):327-31.
Weber C, Weninger M, Klebermass K. Mortality and morbidity in extremely
preterm infants (22 to 26 weeks of gestation): Austria 1999-2001. Wien Klin
Wochenschr. 2005;117(21-22):740-6.
Weigel-Kelley KA, Srivastava A. Recombinant human parvovirus B19 vectors.
Pathol Biol (Paris). 2002;50(5):295-306.
Weigel-Kelley KA, Yoder MC, Srivastava A. Recombinant human parvovirus B19
vectors: erythrocyte P antigen is necessary but not sufficient for successful
transduction of human hematopoietic cells. J Virol. 2001;75(9):4110-6.
Weigel-Kelley KA, Yoder MC, Srivastava A. Alpha5beta1 integrin as a cellular
coreceptor for human parvovirus B19: requirement of functional activation of beta1
integrin for viral entry. Blood. 2003;102(12):3927-33.
Weir E. Parvovirus B19 infection: fifth disease and more. Cmaj. 2005;172(6):743.
Wen LZ, Xing W, Liu LQ, Ao LM, Chen SH, Zeng WJ. Cytomegalovirus infection
in pregnancy. Int J Gynaecol Obstet. 2002;79(2):111-6.
Wild D. The Immunoassay Handbook Elsevier; 2005. (Wild D, ed.
Wilson T. Microbiology & Microbial Infections. Vol. 1; 2005 Virology).
Wilson T. Microbiology and Microbial Infections. Vol. 1; 2005 Virology).
Wolf GC, Horger EO, 3rd. Indications for examination of spontaneous abortion
specimens: a reassessment. Am J Obstet Gynecol. 1995;173(5):1364-8.
www.premierbiosoft.com.
Ziyaeyan M, Rasouli M, Alborzi A. The seroprevalence of parvovirus B19 infection
among to-be-married girls, pregnant women, and their neonates in Shiraz, Iran. Jpn J
Infect Dis. 2005;58(2):95-7.
Mein Lebenslauf wird aus Gründen des Datenschutzes in der elektronischen Fassung meiner
Arbeit nicht veröffentlicht.
57