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Jahrbuch 2004/2005 | Meyer, Thomas F.; Achtman, Mark; Aebischer, Anton; Moese, Stefan | Helicobacter pylori – ein nahezu ubiquitärer Infektionserreger Helicobacter pylori – ein nahezu ubiquitärer Infektionserreger Helicobacter pylori – one of the most frequnet bacteriel pathogens Meyer, Thomas F.; Achtman, Mark; Aebischer, Anton; Moese, Stefan Max-Planck-Institut für Infektionsbiologie, Berlin Korrespondierender Autor E-Mail: [email protected] Zusammenfassung Helicobacter pylori als vielseitiges Modell der W irt-Pathogen-Interaktion: Genetische Fingerabdrücke w eltw eit isolierter Stämme reflektieren Völkerw anderungen; Transfer bakterieller Pathogenitätsfaktoren (CagA) irritiert Magenzellen; Impfstoffgew innung ergibt Einblick in Prinzipien der Immunabw ehr des Magens. Summary Helicobacter pylori comprises a multi-faceted model of host-pathogen interactions: Genetic fingerprints of w orldw ide collected strains reflect historical human migrations; translocation of bacterial CagA protein provokes changes in gastric cells; vaccine development uncovers principles of gastric immune protection. Mehr als die Hälfte der Weltbevölkerung ist mit Helicobacter pylori, dem bakteriellen Erreger diverser Erkrankungen des Magens, infiziert. Die Ansteckung erfolgt meist im Kindesalter. Über Jahrzehnte der asymptomatischen Besiedlung hinw eg treten später bei etw a 10 bis 20% der Infizierten ernsthafte Symptome auf, von der chronischen Gastritis bis hin zum Magengeschw ür und Magenkarzinom. So beispielsw eise in der Volksrepublik China, einem Land mit besonders hoher Durchseuchungsrate (ca. 90%), w o etw a alle 2 bis 3 Minuten ein Mensch den Folgen des H. pylori induzierten Magenkarzinoms erliegt. Aber nicht nur w egen seiner immensen - und vermutlich noch immer unterschätzten - medizinischen und sozioökonomischen Bedeutung, sondern auch als global verbreitetes und molekularbiologisch interessantes, trickreiches infektiöses Agens bilde t H. pylori ein herausforderndes Studienobjekt für die infektionsbiologische Forschung. Viele unserer Arbeiten zur Verbreitung und molekularen Pathogenese des Erregers w erfen ein Licht auf Vorgänge, die auch für andere Felder der modernen Infektionsforschung Geltung haben. Außerdem liefern unsere Arbeiten innovative Ansatzpunkte zur Infektionsbekämpfung und zur Vorbeugung der Entstehung von Magenkrebs. Phylogeographie von H. py lori Die Phylogeographie beschreibt die Evolution (Phylogenie) bezogen auf geographisch-verteilte Populationen. Bakterien w urden bisher nicht unter diesem Gesichtspunkt untersucht, obw ohl geographische Unterschiede für die Erreger von Meningitis, Tuberkulose und Lepra sow ie H. pylori bekannt sind. Basierend auf ersten Hinw eisen mit w enigen Isolaten aus Europa und Asien, w urden in der Forschergruppe Achtman DNA© 2005 Max-Planck-Gesellschaft w w w .mpg.de 1/5 Jahrbuch 2004/2005 | Meyer, Thomas F.; Achtman, Mark; Aebischer, Anton; Moese, Stefan | Helicobacter pylori – ein nahezu ubiquitärer Infektionserreger Sequenzen für mehrere Gene aus einer Vielzahl von Isolaten aus aller Welt bestimmt. In enger Zusammenarbeit mit Prof. Sebastian Suerbaum (Medizinische Hochschule Hannover) sow ie zahlreichen Mikrobiologen und Gastroenterologen w urde eine Stammsammlung mit 1.050 Isolaten aus 53 Ländern und allen Kontinenten etabliert. Von diesen Isolaten w urden jew eils Segmente von sieben Genen sequenziert, deren Produkte am intermediären Metabolismus beteiligt sind. Diese Sequenzen mit einer Gesamtlänge von 3.500 Basenpaaren beinhalten ungefähr 1.500 polymorphe Stellen, die eine gute Basis für populationsgenetische Untersuchungen darstellen. Um die Populationstruktur von H. pylori anhand solcher Sequenzen zu analysieren und um die moderne und historische Populationstruktur von rekombinationsaktiven Bakterien unterscheiden zu können, w urde ein bioinformatisches Programm, „Structure“ genannt, auf das spezifische Vorhaben angepasst. So w urden fünf urstämmige Bakterienpopulationen identifiziert, die w ahrscheinlich in Afrika, dem Nahen Osten und Asien ihren Ursprung hatten. Einige H. pylori w urden geographisch derart isoliert vorgefunden, dass sie ihren Urahnen noch stark ähnelten, w ie z.B. Isolate aus Ostasien. Kontakte zw ischen Menschen aus verschiedenen Regionen führten aber auch zu Mischinfektionen mit H. pylori aus verschiedenen Quellen. Nachfolgende genetische Rekombination zw ischen diesen Bakterien ergaben w iederum Mosaikgene, die Nukleotide aus verschiedenen Urpopulationen beinhalteten („Admixture“). W ährend in Afrika und Zentralasien immer noch Isolate vorgefunden w erden, deren Nukleotide größtenteils aus einer Urpopulation stammen, ist in Europa die Admixture zw ischen zw ei dieser Urpopulationen so w eit fortgeschritten, dass man alle modernen Isolate als Hybride betrachten muss. Die modernen Populationen w urden mit Namen versehen, die ihre jetzige Verteilung w iderspiegeln: hpEastAsia, hpAsia2 (Zentralasien), hpAfrica1, hpAfrica2 und hpEurope. Historische Völkerw anderungen haben auch eine isolierte Entw icklung bestimmter H. pylori- Stämme begünstigt, w as schließlich zur Separation von Subpopulationen führte. So entstand durch die Besiedlung Amerikas vor etw a 13.000 Jahren die Subpopulation hspAmerind; sie ist heute noch bei einigen Ureinw ohnern Nord- und Südamerikas zu finden. Auf ähnliche Weise entstand die hspMaori- Subpopulation durch die pazifischen Seereisen der Polynäsier vor einigen Tausend Jahren. Auch diese Subpopulation kann noch heute in Maoris und Tongans in Neuseeland isoliert w erden. Ebenso haben die Bantu-Migrationen von West- nach Süd-Afrika vor einigen Tausend Jahren zu einer Spaltung von hpAfrica1 in hspW Africa und hspSAfrica geführt. Migrationen aus noch jüngerer Zeit sind anhand der H. pylori-Sequenzen ebenfalls deutlich erkennbar. Isolate aus Nord- und Südamerika gehören zu hpEurope, w egen der europäischen Kolonisierung aber noch häufiger zu hpAfrica1, also H. pylori, die mit den Sklaven aus Afrika eingeführt w urden. Es ist auch leicht möglich, Isolate von Muslims und Buddhisten in Ladakh (Nordindien) zu unterscheiden. Ursprünglich trugen w ahrscheinlich alle Einw ohner Ladakhs hpAsia2-Isolate, aber die Einw anderung buddhistischer Schafhirten aus Tibet brachte zusätzlich zu der buddhistischen Religion auch so viele hpEastAsia H. pylori, dass alle modernen Isolate von Buddhisten nur ein Gemisch zw ischen hpAsia2 und hpEastAsia darstellen. Umgekehrt scheint der Einstrom des Islams nicht über eine große Zahl muslimischer Missionare aus Saudi-Arabien (hpEurope) vollzogen w orden zu sein, da nur drei Isolate von Muslimen hpEurope zugeordnet w erden konnten und der Rest reine hpAsia2 darstellte. Auf der Basis dieser Beobachtungen w erden jetzt Isolate verschiedener Urvölker mit dem Ziel untersucht, w eitere Einsichten in humane Migrationen zu erhalten (Abb. 1). Eindrucksvoll ist, w ie präzise sich geschichtliche Ereignisse in der Populationsstruktur von H. pylori abgebildet haben. Ein w ichtiges Element dieses historischen ‚Imprintings’ beruht auf dem effizienten Vollzug eines Genaustauschs zw ischen unterschiedlichen H. pylori-Stämmen. Es w ird angenommen, dass bei diesem Prozess die natürliche Transformierbarkeit der Erreger, also die Fähigkeit, nackte DNA zw ischen Bakterien zu übertragen, eine entscheidende Rolle spielt. Unsere neusten molekulargenetischen Befunde, die w ir kürzlich zusammen mit Dr. Steffen Backert, Magdeburg, erhalten haben, legen allerdings nahe, dass neben DNA© 2005 Max-Planck-Gesellschaft w w w .mpg.de 2/5 Jahrbuch 2004/2005 | Meyer, Thomas F.; Achtman, Mark; Aebischer, Anton; Moese, Stefan | Helicobacter pylori – ein nahezu ubiquitärer Infektionserreger Transformation spezielle konjugative Prozesse eine zentrale Rolle beim horizontalen Genaustausch von H. pylori spielen könnten. He licoba cte r pylori-Migra tione n. © MP I Infe k tionsbiologie / Achtm a n Molekularbiologie der H. py lori-Wirtszell-Interaktion H. pylori hat einzigartige Mechanismen entw ickelt, im feindlichen Milieu des Magens zu überleben. Charakteristisch für den menschlichen Magen ist die Ausbildung einer dichten Schleimschicht, w elche die mukosale Epithelzelloberfläche vor dem Angriff der Magensäure schützt. In dieser Schleimschicht, die der Erreger mittels seiner ‚motorisierten’ Flagellen durchdringt, aber auch in direktem Kontakt mit den Epithelzellen hält sich H. pylori vorzugsw eise auf. Ein w ichtiges Enzym des Erregers ist die Urease, die verfügbaren Harnstoff spaltet und durch die Bildung von Ammoniak ein neutrales Mikromilieu erzeugt. Die Pathologie der Infektion hingegen w ird w eitgehend durch die direkte Wechselw irkung mit dem Magenepithel bestimmt. Es ist daher ein besonderes Anliegen, diese Interaktion der Bakterien mit den W irtszellen genau zu untersuchen. Die Mehrzahl aller schw eren Infektionen, die mit Ulzerationen des Magens oder Zw ölffingerdarms, dem MALT(„mucosa associated lymphoid tissue“) Lymphom oder dem Magenkarzinom einhergehen, w ird durch so genannte Typ-I H. pylori Stämme hervorgerufen. Typ-I-Stämme unterscheiden sich von den vermutlich harmloseren Typ-II-Stämmen durch Gegenw art eines 40 kb langen Gensegments, der Zytotoxin-assoziierten Pathogenitätsinsel (CagPAI), die ein Typ-IV-Sekretionssystem kodiert. W ir konnten zeigen, dass ein bakterielles Protein, CagA, mithilfe dieses Sekretionsystems über einen noch w enig verstandenen Prozess in die W irtzellen injiziert w ird. Sobald CagA in der W irtszelle angelangt ist, w ird es durch Kinasen der Src-Familie an einer definierten Stelle phosphoryliert. Dabei w ird die Src-Kinase selbst inaktiviert, und in der Folge kommt es dann zur Dephosphorylierung verschiedener W irtszellproteine, die mit dem Aktin-Zytoskelett in Verbindung stehen. Dies führt zu starken Veränderungen im Zytoskelett der W irtszellen, die durch eine extreme Elongation der Zellen („Kolibri“-Phänotyp, Abb. 2) charakterisiert sind und schließlich zu einer Auflösung sow ohl des Zellverbandes als auch der Zell-Matrix-Interaktion führen. Auf molekularer Ebene stehen beide Effekte in direktem Zusammenhang mit der Injektion und Phosphorylierung von CagA. Besonders interessant ist allerdings die Beobachtung, dass der Verlust der ZellMatrix-Interaktion eng mit der Dephosphorylierung eines der zellulären Proteine, dem Vinculin, in Verbindung steht. Schaltet man mit einem genetischen Trick (mittels RNA Interferenz) die Bildung von Vinculin aus und komplementiert die Zelle gleichzeitig © 2005 Max-Planck-Gesellschaft mit einem spezifisch w w w .mpg.de mutierten Vinculin, das sich nicht mehr 3/5 Jahrbuch 2004/2005 | Meyer, Thomas F.; Achtman, Mark; Aebischer, Anton; Moese, Stefan | Helicobacter pylori – ein nahezu ubiquitärer Infektionserreger phosphorylieren lässt, so bildet sich der Kolibri-Phänotyp bereits nach sehr kurzem Kontakt mit dem Erreger. In diesem Fall trat von vornherein ein Verlust der Bindung des Vinculins an den so genannten Arp2/3-Komplex auf, der für den Aufbau der fokalen Kontakte, den Bindungsstellen zur Zellmatrix, w ichtig ist. Diese Untersuchungen ergeben Einblicke in die molekularen Prozesse, die mit großer Wahrscheinlichkeit der Pathogenese von H. pylori Infektionen zugrunde liegen. Mole k ula re Einblick e e rk lä re n die P a thoge ne se von H. pyloriInfe k tione n. Link s: Die H. pylori-W ildtyp infizie rte n Ze lle n ze ige n e ine e x tre m e Elonga tion und Ak tin-Stre ssfa se rn. R e chts: nicht infizie rte Ze lle (n). Fa rb-C ode de r k onfok a le n Im m unfluore sze nza ufna hm e n: H. pylori (bla u), TyrosinP hosphorylie rung (rot) und Ak tin (grün). © MP I Infe k tionsbiologie / Moe se Ein Impfstoff gegen H. py lori Die zunehmende Resistenz von H. pylori gegen die in der Therapie angew endeten Antibiotika und die Tatsache, dass diese Therapie Neuinfektionen nicht verhindert, sind die Hauptgründe für die Entw icklung eines Impfstoffes. Im Tiermodell konnte gezeigt w erden, dass eine Impfung sow ohl als Prophylaxe w ie auch als Therapie im Prinzip w irksam sein könnte. H. pylori kolonisiert die Magenschleimhaut; ein Impfstoff sollte also eine schützende, mukosale Immunantw ort auslösen. Da sich Salmonellen besonders dafür eignen, eine humorale w ie auch zelluläre mukosale Immunantw ort zu induzieren, setzen w ir auf die Entw icklung einer rekombinanten Lebendvakzine auf der Basis von abgeschw ächten Salmonella-Impfstoffbakterien. Unsere Strategie hat vier Säulen: 1. Entw icklung geeigneter Impfstoffträger, d.h. Optimierung von Salmonellenstämmen für die Immunisierung. 2. Ausw ahl geeigneter Impfantigene von H. pylori. 3. Erforschung der Schutzw irkung mit dem Ziel, Impfstoffträger rational zu verbessern. 4. Durchführung klinischer Versuche, um die W irksamkeit unseres Impfstoffes zu untersuchen. Ein für die Anw endung beim Menschen geeigneter Impfstoffträger ist der gegen Typhus eingesetzte Lebendimpfstoff Salmonella enterica Serovar Typhi Ty21a, eine chemisch attenuierte Salmonelle. Für diesen Impfstoff entw ickelten w ir Plasmid-gestützte Expressionssysteme, um H. pylori-Antigene in immunogener Form zu exprimieren. Für die Immunreaktion sind die absolute Menge an H. pylori-Protein und der Zeitpunkt der Synthese der Impfantigene w ährend der Impfung von entscheidender Bedeutung. Optimierte Expression konnten w ir durch eine geeignete Kombination von Promotor und Translationseffizienz bereits erreichen. Durch eine umfassende Charakterisierung der immunogenen Proteine von H. pylori konnten w ir Kriterien ableiten, durch die sich Impfantigene mit hoher Wahrscheinlichkeit identifizieren lassen. Das von uns definierte Immunoproteom beschreibt mehr als 600 immunogene Molekülspezies. Diese Antigene w urden von Seren infizierter Patienten erkannt. Ein Vergleich mit dem gesamten Proteom ergab, dass immunogene Proteine vornehmlich solche sind, die in relativ hoher Kopienzahl von H. pylori synthetisiert w erden. Geeignete © 2005 Max-Planck-Gesellschaft w w w .mpg.de 4/5 Jahrbuch 2004/2005 | Meyer, Thomas F.; Achtman, Mark; Aebischer, Anton; Moese, Stefan | Helicobacter pylori – ein nahezu ubiquitärer Infektionserreger Impfantigene sind desw egen vor allem in den häufig vorkommenden Proteinklassen zu finden, die auch in der natürlichen Infektion vom Immunsystem erkannt w erden. H. pylori zeigt eine hohe genetische Variabilität und ein Impfstoff, der gegen alle H. pylori-Stämme w irken sollte, muss auf Impfantigene beruhen, die innerhalb der H. pylori-Stämme möglichst konserviert sind. Trotzdem sollte der Impfstoff spezifisch für H. pylori sein und ein Impfantigen desw egen nur w enige Homologien zu Proteinen anderer Erreger aufw eisen. Die Kombination dieser Kriterien erlaubte nicht nur, alle bisher experimentell gefundenen Impfantigene ‚vorherzusagen’, sondern auch zw ei völlig neue Antigene zu identifizieren. Diese konnten w ir erfolgreich im Tierversuch als Impfstoffkandidaten bestätigen. H. pylori ist ein humanspezifischer Krankheitserreger und entsprechend ist die Aussagekraft von Tiermodellen, insbesondere von Kleintiermodellen, unklar. Die Frage, ob eine Impfung auch beim Menschen w irken kann, ist unbeantw ortet. Aus diesem Grund haben w ir für die klinische Erprobung unseres Impfstoffes ein Studienprotokoll entw ickelt, bei dem freiw illige Probanden geimpft und danach experimentell mit H. pylori infiziert w erden. Die Infektion w ird nach einer Beobachtungsphase durch eine Antibiotikatherapie beendet. Dieses Protokoll hat anderen Ansätzen gegenüber entscheidende Vorteile: Der verw endete H. pylori-Stamm w urde speziell für diesen Einsatz von unseren Kooperationspartnern in Houston entw ickelt und ist zu 100% therapierbar. Im Unterschied zur Alternative einer therapeutischen Impfung bereits infizierter Patienten ist die Gefahr einer pathologischen Immunreaktion, w ie sie in Patienten durch die chronische Infektion vorliegen kann, nicht vorhanden. Mit dem von uns entw ickelten Studienprotokoll konnten w ir sodann erstmals zeigen, dass ein humaner, rekombinanter Lebendimpfstoff tatsächlich w irksam sein könnte. In einer Phase-I-Studie konnte in drei von neun geimpften Probanden nach einer experimentellen Infektion H. pylori nicht mehr nachgew iesen w erden, w ährend alle Kontrollprobanden bis zur Beendigung der Studie und der Eradikation der Infektion mit Antibiotika infiziert blieben. Diese noch anfänglichen Studien lassen auf die Entw icklung eines w irksamen Impfstoffs hoffen, der nicht nur gegen die Infektion gerichtet, sondern auch nachhaltig gegen Magenkrebs schützen könnte. © 2005 Max-Planck-Gesellschaft w w w .mpg.de 5/5
