EP 0490383 B1

Europäisches Patentamt
(19)
European Patent Office
Office europeen
brevets
en des brevets
EP
0 490
383
B1
EUROPÄISCHE PATENTSCHRIFT
(12)
(45) Veröffentlichungstag und Bekanntmachung des
Hinweises auf die Patenterteilung:
09.10.1996 Patentblatt 1996/41
(51) intci.6: C07K 14/16, C 0 7 K 7 / 0 8 ,
A61K 38/04, A 6 1 K 3 8 / 1 6
(21) Anmeldenummer: 91121362.7
(22) Anmeldetag: 12.12.1991
(54) Peptide des HlV-gag Proteins, ihre Herstellung und Verwendung
Peptides of the HlV-gag protein, their preparation and use
Peptides de la proteine gag d'HIV, leur procede de preparation et leur utilisation
(84) Benannte Vertragsstaaten:
AT BE CH DE DK ES FR GB GR IT LI LU NL SE
(30) Priorität: 14.12.1990 DE 4039925
(43) Veröffentlichungstag der Anmeldung:
17.06.1992 Patentblatt 1992/25
(60) Teilanmeldung: 96100385.2
(73) Patentinhaber: BEHRINGWERKE
Aktiengesellschaft
35001 Marburg (DE)
(72) Erfinder:
• Niedrig, Matthias, Dr.
W-3550 Marburg (DE)
• Modrow, Susanne, Dr.
W-8000 München 71 (DE)
• Wolf, Hans, Prof. Dr.
W-81 30 Starnberg (DE)
(56) Entgegenhaltungen:
WO-A-86/06414
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Anmerkung: Innerhalb von neun Monaten nach der Bekanntmachung des Hinweises auf die Erteilung des europäischen
Patents kann jedermann beim Europäischen Patentamt gegen das erteilte europäische Patent Einspruch einlegen.
Der Einspruch ist schriftlich einzureichen und zu begründen. Er gilt erst als eingelegt, wenn die Einspruchsgebühr
entrichtet worden ist. (Art. 99(1) Europäisches Patentübereinkommen).
Printed byJouve, 75001 PARIS(FR)
EP 0 490 383 B1
Beschreibung
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Die Erfindung betrifft ausgewählte Peptide der HlV-gag-Sequenz, die eine Inhibition der Virussynthese bewirken.
Bei Testung von 41 sequenziellen Peptiden auf Hemmung der HIV-Vermehrung wurde gefunden, daß die überlappenden Peptide 4 und 5 mit der Aminosäuresequenz
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aus dem p17 Submembranprotein und die beiden Peptide 28 und 29 mit den Aminosäuresequenzen
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aus dem p24 Coreprotein die Vermehrung von HIV hemmen (überlappende Bereiche sind jeweils unterstrichen). Solche
oder ähnliche Peptide, die mindestens die überlappenden Bereiche enthalten, sind als Arzneimittel zur Bekämpfung
von HIV-Infektionen geeignet.
Die durch das HIV verursachte Erkrankung AIDS stellt eine große Anforderung an die wissenschaftliche Forschung
bei der Entwicklung therapeutisch wirksamer Substanzen und neuer Vakzinen dar. Auch wenn sich die Forschung über
das gesamte Spektrum möglicher Therapieansätze erstreckt, versprechen doch nur sehr wenige Substanzen Aussicht
auf eine neue erfolgreiche Therapie. Bisher ist als einzige zugelassene anti-HIV wirksame Substanz RRetrovir mit dem
Wirkstoff Zidovudin der Firma Wellcome auf dem Markt. Dieses Nukleotidanalog, Azidothymidin (AZT) hemmt sehr
wirkungsvoll in vitro und in vivo die HIV-spezifische Reverse Transkriptase, ist jedoch nicht frei von nachteiligen Eigenschaften. Bisher bestehen keine Alternativen zu der AZT-Therapie.
Untersuchungen über die HlV-Virusstruktur und die Rolle der verschiedenen Virusstrukturproteine bei der Virusreifung führten zu der Erkenntnis, daß sich hier mehrere Ansätze für eine wirkungsvolle Inhibition der Virussynthese
bieten, wobei die Inhibition der viralen Protease durch Chemotherapeutika nur ein Beispiel darstellt, das zur Zeit von
verschiedenen Arbeitsgruppen bearbeitet wird. Die Tatsache, daß die gag-Sequenz zu den hochkonservierten Regionen im HIV-Genom zählt, läßt vermuten, daß es sich hierbei um ein für die Virusvermehrung sehr wichtiges Protein
handelt; die geringen Sequenzunterschiede bei verschiedenen HlV-lsolaten unterstützen diese Vermutung (siehe Tab.
1). Der Vorgang der Virussynthese wird eingeleitet durch die gag-Proteinsynthese und die notwendige Myristoylierung
des gag-Proteins. Der weitere Zusammenbau findet an der Lipidmembran der infizierten Zelle statt. Durch Aneinanderlagern von gag-Proteinen kommt es zur Ausstülpung der Zellmembran und zur Abschnürung ("Büdding") von "Teilchen" bzw. unreifen Viren. Daß dieser Vorgang auch abläuft, wenn nur das gag-Gen in die Zelle eingeschleust wird,
konnte durch Untersuchungen mit rekombinanten gag-Sequenzen in Vaccinia-bzw. Baculovectoren gezeigt werden
(Karacostas et al. (1 989) Human immunodeficiency virus-like particles produced by vaccinia virus expression vector.
Proc. Natl. Acad. Sei. USA, Vol. 86, 8965-8967; Gheysen et al. (1 989) Assembly and release of Hl V-1 precursor prgag55
virus-like particles from recombinant baculovirus-infected insect cells. Cell, 59, 103-112). Andere Publikationen belegen, daß es innerhalb der gag-Sequenz für das "Processing" wichtige Bereiche gibt. Durch Einführung gezielter Mutationen innerhalb der gag-Sequenz, wurden mehrere für das "Processing" relevante Bereiche identifiziert (Göttlinger
et al. (1990) Role of capsid precursor processing and myristoylation in morphogenesis and infectivity of human immunodeficiency virus type 1. Proc. Natl. Acad. Sei. USA, Vol. 86, 5781-5785).
Die internationale Patentanmeldung WO 86/06414 beschreibt Peptide mit einer Länge von mindestens 5 Aminosäuren, die in spezifischen Bindungstests für die Messung von Antikörper gegen das LAV/HTLV-III Virus und für die
Messung von LAV/HTLV-III Antigen oder as Immunogen Verwendung finden können.
Allerdings gab es keinerlei Hinweise darauf, daß bestimmte Bereiche der gag Sequenz für Peptide kodieren, die
die Virussynthese von HIV hemmen.
In den der Erfindung zugrunde liegenden Versuchen wurden 41 einander überlappende synthetische Peptide der
HIV-1 gag Sequenz auf ihre die Virussynthese hemmende Funktion in einem in vitro Test untersucht. Die 24 Aminosäuren langen Peptide wurden analog der von Ratner et al. (Complete nucleotide sequence of the AIDS virus, HTLVIII, Nature, 313, 277-284 (1985)) publizierten Sequenz synthetisiert.
Diese Peptide wurden in unterschiedlichen Konzentrationen (200-40 u,g/ml) auf frisch infizierte Jurkat Zellen gegeben Die Infektion erfolgte mit 100-1000 TCID50. Die Analyse der Infektion erfolgte durch mikroskopische Beurteilung
und Untersuchung des Überstandes auf Gehalt an infektiösem HIV. Hierfür wurde Zellüberstand auf nicht infizierte
Jurkatzellen gegeben. Nach zwei Wochen Inkubation wurde diese Nachweiszellkultur mikroskopisch und durch Reverse Transkriptase Assay auf HIV untersucht. Hierbei wurde gefunden, daß es zwei gag-Bereiche gibt, die einen
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hemmenden Effekt auf die Virussynthese ausüben. Diese beiden Bereiche sind jeweils durch zwei Peptide repräsentiert, der erste (Peptid 4+5) liegt innerhalb des p17, der zweite (Peptid 28+29) innerhalb des p24.
Wie aus Tab. 4 ersichtlich, läßt sich in HlV-infizierten Zellen nach Behandlung mit diesen Peptiden kein p24 nachweisen. Der überstand dieser Zellkulturen enthält kein infektiöses HIV, das zur Infektion einer Kontrollkultur in der Lage
wäre. Die Figuren 1 und 2 geben die Reverse Transkriptase (RT) Aktivität der beiden Nachweiszellkulturen wieder.
Die vier ausgewählten Peptide vermögen die HIV-Synthese in Konzentrationen von 200-40 u.g/ml sehr wirkungsvoll
zu inhibieren. (Einzelheiten zum Nachweis der HIV-Inhibition siehe Beispiele).
Der Einfluß von unterschiedlichen Konzentrationen an infektiösem Virus auf den Versuchsablauf ist relativ gering
und spiegelt sich hauptsächlich in der Höhe der gemessenen RT-Aktivität wieder (vgl. Versuch 1, Fig. 1; Versuch 2,
Fig. 2). Auch die unterschiedlichen Konzentrationen an zugesetzten Peptiden haben keinen signifikanten Einfluß auf
die Inhibition, was vermuten läßt, daß die Konzentration der zugegebenen Peptide noch weiter abgesenkt werden
kann, ohne die Wirkung zu beeinflussen. Das Ergebnis des dritten Versuches ist in Fig. 3 wiedergegeben. Die hier
dargestellten Reverse Transkriptase Aktivitäten sind nach zwei Wochen Inkubation der Nachweiszellkulturen aus dem
Zellkulturüberstand nach fünffacher Konzentration gemessen. Auch hier zeigt sich der starke inhibierende Einfluß der
Peptide 2, 4, 5, 9, 28, 29 auf die HIV-1 Synthese. Die Inhibition der HIV-2 Synthese durch die Peptide 4, 5, 28, 29 ist
auch sehr deutlich zu erkennen. Dennoch scheinen hier die zugegebenen Peptide schwächer in ihrer inhibierenden
Wirkung zu sein. So kommt es bei den Peptiden 2 und 9 zu keiner Inhibition, bei 28 ist nur die 200 u.g/ml Dosis zu
einer vollständigen Hemmung der Virussynthese in der Lage. Bei allen 41 untersuchten Petiden konnte nur für das
Peptid Nr. 9 eine Zelltoxizität festgestellt werden.
Die Erfindung betrifft folglich Peptide, die die Peptidsequenz NPGLLETSEGCRQ enthält und nicht größer als 50
Aminosäuren, insbesondere nicht größer als 40 Aminosäuren, vor allem nicht größer als 30 Aminosäuren, vorzugsweise nicht größer als 20 Aminosäuren sind. Insbesondere bevorzugt sind Peptide, die die Peptide 4, 5, 28 oder 29,
enthalten.
Eine weitere Ausführungsform der Erfindung sind Peptide, die die Peptidsequenz NPGLLETSEGCRQ enthalten,
wobei die Sequenzen am N- und/oder am C-Terminus um bis zu 7 Aminosäuren, vorzugsweise um bis zu 4 Aminosäuren verkürzt werden können, ohne jedoch eine Länge von 6 Aminosäuren zu unterschreiten. Häufig ist es auch
vorteilhaft, das erfindungsgemäße Peptid um eine oder mehrere Aminosäuren, beispielsweise Cystein, zu verlängern,
um das Verknüpfen der Peptide untereinander oder an einen Träger zu erreichen.
Des weiteren umfaßt die Erfindung Derivate der Peptidsequenz NPGLLETSEGCRQ, bei denen eine oder mehrere
der folgenden Substitutionen nach dem Fachmann bekannten Methoden durchgeführt werden können: Asparagin gegen Glutamin, bzw. Glutamin gegen Asparagin, Prolin gegen Hydroxyprolin, Leucin gegen Isoleucin oder Norleucin,
Glutaminsäure gegen Asparaginsäure, Threonin gegen Serin bzw. Serin gegen Threonin, Cystein gegen Serin, Arginin
gegen Lysin, Alanin gegen Glycin und/oder Methionin gegen Norleucin. Bevorzugt ist der Ersatz einer natürlichen
Aminosäure durch eine nicht natürliche Aminosäure, wie beispielsweise Hydroxyprolin oder Norleucin.
Dadurch kann verhindert werden, daß körpereigene Proteasen das Derivat spalten, was im allgemeinen zu einer
Verlängerung der Halbwertszeit führt. Auch können die Derivate eine verbesserte Löslichkeit und/oder eine bessere
Resorption besitzen im Vergleich zu der erfindungsgemäßen Peptidsequenz.
Weitere Gegenstände der Erfindung sind die proteinchemische oder gentechnische Herstellung sowie die Verwendung des erfindungsgemäßen Peptids als Arzneimittel.
Vorzugsweise wird das erfindungsgemäße Peptid proteinchemisch hergestellt, beispielsweise nach BARANI, G.
und MERRIFIELD, R.B. in "The Petides, Analysis, Synthesis and Biology", Vol. 2, Academic Press 1980, Ed. Erhard
Gross, Johannes Meyerhof er.
Die Erfindung ist in den Beispielen näher erläutert und in den Patentansprüchen enthalten.
Beispiel 1: Allgemeine Grundlagen
Zellen. Es wurden permanent wachsende T-Lymphozyten (Jurkat- oder H9-Zellen) für die in vitro-Experimente
verwendet. Als Medium wurde konventionelles RPMI 1640 mit 10% FKS, 2% NaHC03 (5%ig), 1% Penicillin/Streptavidinlösung und 2 mg/l Polybrene verwendet. Die Experimente wurden wahlweise in 96 Loch-Mikrotiterplatten (Nunc)
oder 24 Loch-Platten (Nunc) durchgeführt.
Viren. Es wurde HIV-1 virus Stamm HTLV-IIIB und HIV-2 Stamm ROD verwendet.
Peptidsynthese und Peptidreinigung. Die Peptide wurden nach der von Ratner et al. (1985) publizierten HIV-1
Sequenz auf einem Syntheseautomaten (Miliigen 9050,
Miliigen GmbH, Eschborn, FRG) unter Einsatz von Fmocgeschützten Aminosäuren (Bachem AG, Heidelberg,
FRG) hergestellt (Atherton et al. (1978): A mild procedure for solid phase peptide synthesis; Use of Fluorenylmethyloxycarbonyl amino acids: J. Chem. Soc. Chem. Commun. 13, 539-540). Als Trägermaterial wurde
jeweils RTentagelharz mit säurestabilem AM-Linker verwendet (Rapp-Polymere, Tübingen, FRG). Die Aminosäuren
wurden jeweils vor der Kopplung in DMF gelöst und in Hydroxybenzotriazol-aktivierte Ester überführt. Zur Kopplung
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wurden Schnellsynthesezyklen mit 10-minütiger Raktionszeit eingesetzt. Die Fmoc -Gruppe wurde in Anschluß mit
20% Piperidin abgespalten. Die Vollständigkeit dieser Reaktion wurde fluorimetrisch überprüft.
Nach vollendeter Synthese wurde das Harz mit dem geschützten Peptid in 50% TFA/DCM suspendiert. Als Scavenger wurden 1% Anisol, 1% m-Kresol, 1% Phenol und, falls Trp in der jeweiligen Sequenz enthalten war, 5% Mercaptoethanol zugesetzt. Die Bindung zum Harz und die Trt- und tBoc-Schutzgruppen wurden in 4-stündiger Inkubationszeit bei Raumtemperatur unter Argon-Schutzgas abgespalten. Zur Entfernung der Mtr-Schutzgruppe des Arg wurde
das abgespaltene Peptid vom Harz abgetrennt, das Lösungsmittel im Rotationsverdampfer abgezogen, die verbleibende Festsubstanz in 100% incl. den übliche Scavenger (siehe oben) über Nacht inkubiert. Die entschützten Peptide
wurden nach Abzug des Lösungsmittel in 50% Essigsäure gelöst, in einem großen Volumen eiskalter t-Butyl-ethylether gefällt, mehrmals gewaschen und lyophilisiert. Die getrocknete Rohsubstanz wurde in 1,5% Ammoniumbicarbonat aufgenommen. Unlösliche Bestandteile wurden abfiltriert. Das Filtrat wurde erneut getrocknet. Die Reinigung der
Peptide erfolgte auf einer halbpräperativen Propep Reversed Phase HPLC-Säule (C^C-^q Copolymer, Pharmacia/LKB,
Freiburg, FRG), wobei zur Elution üblicherweise Gradienten von 0-70% Aceton itril in 0,1% TFA unter Heliumbegasung
eingesetzt wurden. Die Sequenzen der gereinigten Peptide wurden auf einem Gasphasensequenzer (Applied Biosystems, Westerstadt, FRG) überprüft. Die eingesetzten Peptide entsprechen den in Tab. 2 abgebildeten Aminosäuresequenzen. Es ist selbstverständlich möglich, die o.g. Peptide auch gentechnisch z.B. als geeignete Fusionsproteine
in pro- oder eukaryontischen Zellsystemen herzustellen.
Reverse Transkriptase Assay. Der Mikrotest zum Nachweis der viralen Reversen Transkriptase wurde nach
Gregersen et al. durchgeführt (Gregersen et al. (1988) Detection of human immunodeficiency virus and other retroviruses in cell culture supernatants by a reverse transcriptase microassay. J. Virol. Methods 19, 161 -1 68). Zellkulturüberstände wurden durch PEG-Fällung fünffach ankonzentriert. Als positive Kontrolle (VK) dienten Überstände unbehandelter infizierter Zellkulturen, als negative Kontrolle (NK) dienten Zellkulturüberstände nicht infizierter Zellen. Der bei
der NK gemessene Wert wurde verdoppelt und diente als Ausschlußwert für negative Zellen. Zur besseren Übersichtlichkeit sind die gemessenen RT-Werte in der logarithmischen Darstellung wiedergegeben (siehe auch Fig. 1, 2, 3).
Beispiel 2: Nachweis der Inhibition der HIV-Synthese
Der Versuchsaufbau ist schematisch in der Tab. 3 wiedergegeben. Es wurden jeweils zwei Versuche zur Inhibition
der HIV-Synthese mit allen zur Verfügung stehenden 41 Peptiden durchgeführt.
Bei dem ersten Versuch wurden jeweils 50 u.l 1x106 Jurkat-Zellen/ml in die Vertiefung von 96 Loch-Platten pipettiert
und mit jeweils 50 u,l (1000 TCID50) HTLV-I II B infiziert. Die gag-Peptid-Konzentration wurde auf 200 u.g/ml bzw. 40 u.g/
ml eingestellt. Nach einer Woche wurden 100 u,l überstand abgenommen und eventuell noch vorhandene Zellen durch
Zentrifugation abgetrennt. Anschließend wurden 80 u,l überstand auf eine nicht infizierte Jurkat-Zellkultur gegeben.
Der Nachweis von Virusantigen in den infizierten Zellen erfolgte mittels Immunmarkierung nach Western Blot. Hierfür
wurden die nach dem Inhibitionsversuch verbleibenden Zellen in 2-fach SDS-PAGE Probenpuffer aufgenommen und
in einem 14%igem PAG aufgetrennt. Danach wurden die aufgetrennten Proteine auf eine Nitrocellulosemembran geblottet und zum Nachweis viraler Proteine mit einem anti-p24 HIV-1 monoklonalen Antikörper inkubiert. Die spezifische
Anfärbung erfolgte über einen zweiten anti-Maus Antikörper mit gekoppelter alkalischer Phosphatase. Die Analyse
von infektiösem HIV im überstand der Peptid behandelten Zellen erfolgte mittels Reverse Transkriptase Test.
Der zweite Versuch wurde analog dem ersten Versuchsansatz mit einer geringeren Konzentration an infektiösen
Einheiten (100 TCID50) durchgeführt. Die Analysen auf infektiöses Virus im Zellkulturüberstand bzw. HIV-Protein in
den infizierten Zellkulturen wurden analog dem ersten Versuch durchgeführt. In einem dritten Versuchsansatz wurden
ausgewählte Peptide (2, 4, 5, 9, 28, 29), die einen inhibierenden Einfluß auf die HIV-1 Synthese ausübten, unter gleichen Bedingungen auf ihre inhibierende Wirkung bei HIV-2 getestet. Für diesen Versuch wurden H9-Zellen mit 100
TCID50 HIV-2 infiziert. Die Analyse der Infektion erfolgte analog der zwei vorhergehenden Experimente.
In den ersten beiden Experimenten wurden zwei Bereiche innerhalb der gag-Sequenz identifiziert, die jeweils
durch zwei überlappende Peptide repräsentiert sind, welche einen inhibierenden Einfluß auf die HIV-Synthese ausüben. Die Peptide 4 und 5 liegen innerhalb der p1 7 Proteinsequenz, während 28, 29 innerhalb der p24 Proteinsequenz
liegen.
In Tab. 1 sind bei dem Vergleich verschiedener HlV-gag-Proteinsequenzen die durch die Peptide 4, 5 und 28, 29
dargestellten Bereiche durch Kästchen markiert. Tab. 2 listet die Aminosäuresequenz der 41 einander überlappenden
Sequenzen auf.
Legenden:
Tab. 1: Vergleich verschiedener HlV-gag-Proteinsequenzen. Die durch die Peptide 4, 5 und 28, 29 dargestellten
Bereiche sind durch Kästen markiert.
Tab. 2: Aminosäuresequenz der 41 einander überlappenden synthetischen gag-Peptide. Die Peptide wurden ana-
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log der von Ratner et al. publizierten Sequenz synthetisiert.
Tab. 3: Schematischer Versuchsaufbau der durchgeführten und geplanten Versuche zum Nachweis der Inhibition
der HIV-Synthese durch gag-Peptide.
Tab. 4: Inhibition der HIV-Synthese mit gag-Peptiden. Auswertung des p24-Nachweises in HlV-infizierten Zellen
nach Peptidbehandlung zwei Wochen nach Infektion. Zellen der Ausgangsplatte wurden mit 2fachen Probenpuffer
versetzt und im 14%-igen PAG aufgetrennt. Nach dem Blotten auf Nitrocellulose erfolgte der Nachweis von HIV-Protein
durch spezifische anti-p24 MAbs. - = keine Reaktion nachweisbar, (+) = schwache Reaktion nachweisbar, + = gute
positive Reaktion nachweisbar, ++ = starke Reaktion nachweisbar.
Fig. 1: Inhibition der HIV Virussynthese durch gag Peptide (Versuch 1 ). Es wurden 1000 TCID50 HIV-1 für die
Infektion der Jurkat-Zellen eingesetzt. Reverse Transkriptase Aktivität gemessen in cpm im Zellkulturüberstand der
Nachweiszellkultur. Der Überstand wurde durch PEG-Fällung fünffach ankonzentriert. VK = Viruskontrolle; NK = Negativ-Kontrolle. Der doppelte NK-Wert diente als Ausschluß für negative Zellkulturen. Der besseren Übersichtlichkeit
wegen sind die RT-Werte in der Abbildung in der logarithmischen Darstellung wiedergegeben.
Fig. 2 Inhibition der HIV-Synthese durch gag Peptide (Versuch 2). Es wurden 100 TCID50 HIV-1 für die Infektion
der Jurkat-Zellen eingesetzt. Reverse Transkriptase Aktivität gemessen in cpm im Zellkulturüberstand der Nachweiszellkultur. Der Überstand wurde durch PEG-Fällung fünffach ankonzentriert. VK = Viruskontrolle; NK = Negativ Kontrolle. Der doppelte NK-Wert diente als Ausschluß für negative Zellkulturen. Der besseren Übersichtlichkeit wegen
sind die RT-Werte in der Abbildung in der logarithmischen Darstellung wiedergegeben.
Fig. 3 Inhibition der HIV-Synthese durch gag Peptide (Versuch 3). Es wurden 100 TCID50 HIV-1 bzw. HIV-2 für
die Infektion der Jurkat bzw. H9-Zellen eingesetzt. Reverse Transkriptase Aktivität gemessen in cpm im Zellkulturüberstand der Nachweiszellkultur. Der Überstand wurde durch PEG-Fällung fünffach ankonzentriert. VK = Viruskontrolle;
NK = Negativ Kontrolle. Der doppelte NK-Wert diente als Ausschluß für negative Zellkulturen. Der besseren Übersichtlichkeit wegen sind die RT-Werte in der Abbildung in der logarithmischen Darstellung wiedergegeben.
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U n t e r s u c h u n g der Z e l l e n :
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Analyse auf i n f e k t i ö s e s HIV:
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bei 3 7°C über zwei Wachen
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U n t e r s u c h u n g e n an u l t r a dünnen S c h n i t t e n
Reverse T r a n s k r i p t ase Assay und
mikroskopische
Auswertung
Analyse im ü b e r s t .
auf p24, P E G - F ä l i .
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Tab. 4
Inhibtion der HIV-Virussynthese mit gag-Peptiden:
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PeptidNr.:
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
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+
+
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++
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9
EP 0 490 383 B1
Tab. 4 (fortgesetzt)
Inhibtion der HIV-Virussynthese mit gag-Peptiden:
p24 Nachweis:
+
+
+
+
+
+
+
++
+
+
+
+
+
+
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++
++
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PeptidNr.:
11
12
13
14
15
16
17
18
19
20
21
22
23
24
25
26
27
28
29
30
31
32
33
34
35
36
37
38
39
40
41
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+
+
+
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++
++
+
+
+
+
+
Patentansprüche
Patentansprüche für folgende Vertragsstaaten : AT, BE, CH, DE, DK, FR, GB, IT, LI, LU, NL, SE
1.
Peptide des HlV-gag Proteins, die die Peptidsequenz NPGLLETSEGCRQ enthält und nicht größer als 50 Aminosäuren sind.
2.
Peptide nach Anspruch 1, die die Peptide P4 oder P5 enthalten.
3.
Peptide nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß die Peptidsequenz NPGLLETSEGCRQ am Nund/oder am C-Terminus um bis zu 7 Aminosäuren verkürzt ist, jedoch jeweils nicht kürzer als 6 Aminosäuren ist.
4.
Peptide nach mindestens einem der Ansprüche 1 bis 3, die eine oder mehrere der folgenden Aminosäureaustausche besitzen: Asparagin gegen Glutamin, bzw. Glutamin gegen Asparagin, Prolin gegen Hydroxyprolin, Leucin
gegen Isoleucin oder Norleucin, Glutaminsäure gegen Asparaginsäure, Threonin gegen Serin bzw. Serin gegen
Threonin, Cystein gegen Serin, Arginin gegen Lysin, Alanin gegen Glycin und/oder Methionin gegen Norleucin.
10
EP 0 490 383 B1
5.
Peptide nach mindestens einem der Ansprüche 1 bis 4 als Arzneimittel.
6.
Therapeutische Zubereitung, enthaltend mindestens ein Peptid nach mindestens einem der Ansprüche 1 bis 5
zusammen mit inertem Trägermaterial.
7.
Verfahren zur Herstellung der Peptide nach mindestens einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet,
daß das Verfahren ein proteinchemisches Verfahren ist.
8.
Verwendung von Peptiden nach Anspruch 1 bis Anspruch 5 zur Herstellung eines Arzneimittels zur Bekämpfung
von AIDS.
Patentansprüche für folgende Vertragsstaaten : GR, ES
1.
Verfahren zur Herstellung von Peptiden des HlV-gag Proteins, dadurch gekennzeichnet, daß die Peptide die Peptidsequenz NPGLLETSEGCRQ enthalten und nicht größer als 50 Aminosäuren sind.
2.
Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Peptide P4 oder P5 enthalten.
3.
Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß die Peptidsequenz NPGLLETSEGCRQ am Nund/oder am C-Terminus um bis zu 7 Aminosäuren verkürzt ist, jedoch jeweils nicht kürzer als 6 Aminosäuren ist.
4.
Verfahren nach mindestens einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß die Peptidsequenz NPGLLETSEGCRQ eine oder mehrere der folgenden Aminosäureaustausche besitzt: Asparagin gegen Glutamin, bzw.
Glutamin gegen Asparagin, Prolin gegen Hydroxyprolin, Leucin gegen Isoleucin oder Norleucin, Glutaminsäure
gegen Asparaginsäure, Threonin gegen Serin bzw. Serin gegen Threonin, Cystein gegen Serin, Arginin gegen
Lysin, Alanin gegen Glycin und/oder Methionin gegen Norleucin.
5.
Verfahren zur Herstellung eines Arzneimittels, dadurch gekennzeichnet, daß Peptide, hergestellt nach mindestens
einem der Ansprüche 1 bis 4, verwendet werden.
6.
Verfahren zur Herstellung eines Arzneimittels nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, daß zusätzlich ein inertes Trägermaterial verwendet wird.
7.
Verfahren zur Herstellung eines Arzneimittels nach Anspruch 5 oder 6, dadurch gekennzeichnet, daß das Arzneimittel zur Bekämpfung von AIDS verwendet wird.
Claims
Claims for the following Contracting States : AT, BE, CH, DE, DK, FR, GB, IT, LI, LU, NL, SE
1.
A peptide of the HIV gag protein which contains the peptide sequence NPGLLETSEGCRQ and is not larger than
50 amino acids.
2.
A peptide as claimed in claim 1, which contains the peptide P4 or P5.
3.
A peptide as claimed in claim 1 or 2, wherein the peptide sequence NPGLLETSEGCRQ is truncated by up to 7
amino acids at the N and/or at the C terminus but is not shorter than 6 amino acids in each case.
4.
A peptide as claimed in at least one of Claims 1 to 3, which has one or more of the following amino-acid exchanges:
asparagine by glutamine, or glutamine by asparagine, proline by hydroxyproline, leucine by isoleucine or norleucine, glutamic acid by aspartic acid, threonine by serine or serine by threonine, cysteine by serine, arginine by
lysine, alanine by glycine and/or methionine by norleucine.
5.
A peptide as claimed in at least one of Claims 1 to 4 as pharmaceutical.
11
EP 0 490 383 B1
5
10
6.
A therapeutic composition containing at least one peptide as claimed in at least one of Claims 1 to 5, together with
an inert vehicle.
7.
A process for the preparation of a peptide as claimed in at least one of Claims 1 to 4, wherein the process is a
process of protein chemistry.
8.
The use of a peptide as claimed in claim 1 to claim 5 for the preparation of a pharmaceutical for Controlling AIDS.
Claims for the following Contracting States : GR, ES
1.
A process for the preparation of peptidesof the HIV gag protein, wherein the peptidescontain the peptide sequence
NPGLLETSEGCRQ and are not larger than 50 amino acids.
2.
The process as claimed in claim 1, wherein the peptides contain P4 or P5.
3.
The process as claimed in claim 1 or 2, wherein the peptide sequence NPGLLETSEGCRQ is truncated by up to
7 amino acids at the N and/or at the C terminus but is not shorter than 6 amino acids in each case.
20
4.
The process as claimed in at least one of Claims 1 to 3, wherein the peptide sequence NPGLLETSEGCRQ has
one or more of the following amino-acid exchanges: asparagine by glutamine, or glutamine by asparagine, proline
by hydroxyproline, leucine by isoleucine or norleucine, glutamic acid by aspartic acid, threonine by serine or serine
by threonine, cysteine by serine, arginine by lysine, alanine by glycine and/or methionine by norleucine.
25
5.
A process for the preparation of a pharmaceutical, which comprises using peptides prepared as claimed in at least
one of Claims 1 to 4.
6.
The process for the preparation of a pharmaceutical as claimed in claim 5, wherein an inert vehicle is additionally
used.
7.
The process for the preparation of a pharmaceutical as claimed in claim 5 or 6, wherein the pharmaceutical is used
for Controlling AIDS.
is
30
35
Revendications
Revendications pour les Etats contractants suivants : AT, BE, CH, DE, DK, FR, GB, IT, LI, LU, NL, SE
40
45
50
55
1.
Peptides de la proteine gag du VIH, qui contiennent la sequence peptidique NPGLLETSEGCRQ et ne comportent
pas plus de 50 aminoacides.
2.
Peptides selon la revendication 1, contenant le peptide P4 ou P5.
3.
Peptides selon la revendication 1 ou 2, caracterises en ce que la sequence peptidique NPGLLETSEGCRQ est
raccourcie de jusqu'ä 7 aminoacides ä l'extremite N-terminale et/ou ä l'extremite C-terminale, mais dans chaque
cas n'est pas plus courte que 6 aminoacides.
4.
Peptides selon au moins l'une des revendications 1 ä 3, comportant un ou plusieurs des remplacements d'aminoacides suivants: l'asparagine par la glutamine ou la glutamine par l'asparagine, la proline par l'hydroxyproline,
la leucine par l'isoleucine ou la norleucine, l'acide glutamique par l'acide aspartique, la threonine par la serine ou
laserine par la threonine, la cysteine par laserine, l'arginine par la lysine, l'alanine par la glycine et/ou la methionine
par la norleucine.
5.
Peptides selon au moins l'une des revendications 1 ä 4, en tant que medicament.
6.
Composition therapeutique contenant au moins un peptide selon au moins l'une des revendications 1 ä 5, conjointement avec un vehicule.
12
EP 0 490 383 B1
7.
Procede pour la preparation des peptides selon au moins l'une des revendications 1 ä 4, caracterise en ce que le
procede est un procede de la chimie des proteines.
8.
Utilisation des peptides selon les revendications 1 ä 5, pour la fabrication d'un medicament destine ä combattre
le SIDA.
Revendications pour les Etats contractants suivants : GR, ES
1.
Procede pour la preparation de peptides de la proteine gag du VIH, caracterise en ce que le peptides contiennent
la sequence peptidique NPGLLETSEGCRQ et ne comportent pas plus de 50 aminoacides.
2.
Procede selon la revendication 1, caracterise en ce que les peptides contiennent P4 ou P5.
3.
Procede selon la revendication 1 ou 2,. caracterise en ce que la sequence peptidique NPGLLETSEGCRQ est
raccourcie de jusqu'ä 7 aminoacides ä l'extremite N-terminale et/ou ä l'extremite C-terminale, mais n'est pas plus
courte que 6 aminoacides.
4.
Procede selon au moins l'une des revendications 1 ä 3, caracterise en ce que la sequence peptidique NPGLLETSEGCRQ comporte un ou plusieurs des remplacements d'aminoacides suivants: l'asparagine par la glutamine ou
la glutamine par l'asparagine, la proline par l'hydroxyproline, la leucine par l'isoleucine ou la norleucine, l'acide
glutamique par l'acide aspartique, la threonine par la serine ou la serine par la threonine, la cysteine par la serine,
l'arginine par la lysine, l'alanine par la glycine et/ou la methionine par la norleucine.
5.
Procede pour la fabrication d'un medicament, caracterise en ce que l'on utilise des peptides prepares selon au
moins l'une des revendications 1 ä 4.
6.
Procede pour la fabrication d'un medicament selon la revendication 5, caracterise en ce que l'on utilise en outre
un vehicule inerte.
7.
Procede pour la fabrication d'un medicament selon la revendication 5 ou 6, caracterise en ce que le medicament
est utilise pour combattre le SIDA.
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